Инновационные технологии в изучении явлений апоптоза

сравнению с другими видами паров и составляла от 93,12 % в варианте без применения пожнивного зеленого удобрения и соломы до 103,97 % с совместным их использованием. Внесение в почву соломы и возделывание пожнивного рапса ярового на сидерацию повышало рентабельность производства продукции.

5. Возделывание парозанимающих культур в &веньях севооборота с сидеральным и &анятым паром повышало количество затраченной энергии на 4,95 и 5,41 ГДж/га соответственно в сравнении с звеном севооборота, включающего чистый пар. Введение пожнивного рапса ярового на сидеральные цели увеличивает затраты энергии на 1,85 - 3,63 ГДж/га по сравнению с вариантом бе& его применения.

6. Величина полученной с урожаем энергии была наибольшей в &вене с &анятым паром, где в среднем по звену она составила 59,19 ГДж/га или на 31,8 -37,2 % выше, чем в &веньях с сидеральным и &анятым паром соответственно. Наиболее высокий выход чистой энергии установлен в &вене севооборота с занятым паром - 36,81 ГДж/га.

Литература

1. Задорин, А.Д. Биологические аспекты ландшафтного земледелия [Биологизация

интенсификационных процессов, обеспечивающая воспроизводство плодородия и поднятие продуктивности полей]/ А.Д.Задорин, А.П.Исаев. //Материалы научно-практической конференции "Земледелие в XXI в. Проблемы и пути их решения". -Курск, - 2001. - С. 36-42.

2. Кант, Г. Биологическое растениеводство: возможности биологических агросистем / Г.Кант. -М.: Колос, 1988.-352с.

3. Парахин, Н.В. Биологизация земледелия в России. /Под ред. Н.В.Парахина Н.В., В.Т.Лобкова. -Орел: Издательство Орел ГАУ. - 2000. - 175с.

4. Лошаков, В.Г. Пожнивная сидерация и плодородие дерново-под&олистых почв / В.Г.Лошаков //Земледелие. - 2007. - № 1. - С. 11-13.

5. Новоселов, Ю.К. Промежуточные посевы капустных культур на сидераты/ Ю.К.Новоселов //Земледелие, 1998. - № 2. - С.15-16.

6. Прянишников, Д.Н. И&бранные сочинения/ Д.Н.Прянишников. - М: Наука, -1965. - Т.3. - 372 с.

7. Шевченко, В.Е. Биологизация и адаптивная интенсификация &емледелия в центральном Черноземье / В.Е.Шевченко, В. А.Федотов. - Воронеж: ВГАУ, 2000. - 306 с.

УДК 632.938.2

К.Н. Козявина, ассистент

Н.Е. Павловская, доктор биологических наук И.Н. Гагарина, И.В. Горькова, кандидаты сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО Орел ГАУ

А.И. Гринблат, кандидат сельскохозяйственных наук ООО «Научприбор»

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИЗУЧЕНИИ ЯВЛЕНИЙ АПОПТОЗА

Разработан и проведен высокотехнологический анализ активности фермента каталазыг на вытвление апаптоза у растений гороха. Установлена взаимосвязь нарушения фрагментации ДНК при апоптозе с активностью фермента.

Ключевые слова: апоптоз, антиоксидантная система,

активность каталазыг, иммунокорректор.

В течение 100 лет изучение биологических явлений основывалось на экспериментах in vivo и in vitro. Появившиеся в 60-е годы компьютеры были лишь вспомогательным средством для обработки и хранения данных. С конца 80-х началось создание баз данных, в которых хранится информация о миллионах последовательностей нуклеотидов в ДНК и РНК или аминокислот в белках, и они еще ждут обработки и последующего практического применения. Компьютерный анали& превратился в самостоятельную область науки - биоинформатику. Исследования in silico, то есть в компьютере, уже привели к расшифровке многих "слов" генетического текста - команд, &аписанных в ДНК и управляющих жизнью и смертью клетки [5].

И&учение явлений апопто&а с помощью высоких технологий (биоинформатики) базируется на теоретических основах анали&а генных сетей, а также на особенности построения генной сети как основы математической модели. Анализ сверхмощного

An advanced technology analysis of catalase enzyme activity with the aim of detection of peas apoptosis was developed and conducted. Interrelation of malfunction of DNA fragmentation under apoptosis with enzyme activity was determined.

Key words: apoptosis, antioxidant system, catalase activity, immunologic corrector.

массива полученной на сегодняшний день экспериментальной информации нево&можен бе& компьютерных методов ее системати&ации и математического моделирования. В основе построения генных сетей лежит химико-кинетический подход, по&воляющий представить любые процессы как сумму элементарных событий, оперируя концентрациями молекул и скоростями реакций, т.е. при моделировании генных сетей исполь&уется обобщенный химико-кинетический метод [2]. Кибернетическую основу генной сети составляют находящиеся в ней положительные и отрицательные обратные свя&и. Исследование генных сетей проводится с помощью компьютерных систем. Одним и& ведущих программных комплексов в этой области является система GENENET [4], предназначенная для аннотации экспериментальных данных,

представленных в научных публикациях, а также интеграции экспериментальной информации и& компьютерных ба& данных, получаемой в ре&ультате высокопрои&водительных экспериментальных

подходов (ДНК-чипы и др.). К числу таких подходов относятся: методы логического анализа структурнофункциональной органи&ации генных сетей с исполь&ованием методов теории графов, методы математического моделирования динамики генных сетей, методы компьютерной геномики,

транскриптомики, протеомики [3].

Материал и методика исследований

В работе исполь&ованы вытяжки и& колеоптиля озимой пшеницы (Triticum aestivum) сорта Колумбия в качестве индуктора апоптоза. Объектом исследования являлся горох (Pisum sativum) сорта Смарагд, восприимчивый к во&будителю корневых гнилей Fusarium oxysporum.

Эксперимент проводили на водных культурах. Для со&дания необходимых условий выращивания исполь&овалась программируемая климатокамера “Фитотрон” производства компании Biokom. Выращивание производилось при температуре 25°С в течение 10 дней.

Варианты исследований

№ Вода Инд. Анон- тоза Fus. oxysporum. Mg 2+

1 + - - - -

2 + - - + -

3 + - - - +

4 + + - - -

S + + - + -

6 + + - - +

7 + - + - -

8 + - + + -

9 + - + - +

Для определения активности каталазы была исполь&ована модифицированная методика, основанная на измерении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Объем выделившегося кислорода регистрировали с 3-ей по 15-ю минуту после начала реакции с интервалом 3 мин. Затем выстраивали кинетические кривые &ависимости объема выделившегося 02 от времени и аппроксимировали их функцией вида у=а-1п(х)+Ь. В качестве исходного показателя активности каталазы использовали предлогарифмический коэффициент a (расчет методом дифференциального анали&а кинетических кривых). Затем коэффициент a делили на массу навески, получая, таким обра&ом, приведенный предлогарифмический коэффициент, являющийся окончательным показателем активности каталазы. Для расчета результатов анализа активности каталазы по волюмометрическим данным Гринблат А.И. была разработана компьютерная программа “Каталазоинформер”, позволяющая осуществлять групповой ввод данных, аппроксимацию, спрямление и множественный анализ кинетических кривых, т.е. осуществлять администрирование биохимических данных [1]. Внешний вид окон программного комплекса представлен на рисунок 1.

Файл Справка

Щ Серии | Прогрессия] V" Расчет |

Активная биомасса п*[11- г т[2].г т[3],г | т[4]. г т[5],г

(граммы] 0.300 0.300 0.300 0.300 0.300

Время, мин. |[1 ]: V(02), мл [2]: V[02], мл [3]: V(0 2], мл | [4]: V|02). мл [5]: V[02], мл

3 3.0 2.7 5.0 1.0 4.3

6 0.0 7.Э 10.4 6.2 10.0

э 10.7 10.7 13.7 Э.4 13.7

12 11.3 12.2 15.7 12.1 15.7

15 13.2 13.5 1Є.8 14.9 1Є.8

а)

t, мин

Е§| Переименовать серию)

Сохранить диаграммы |

ШіП Передать всевУ/огс! |

Серия №1 | Серия №2 ; Серия М23 ;| Серия №4 | Серия №5 |

б)

Рисунок 1 - Внешний вид окон программного комплекса: а) окно ввода данных программы

“Каталазоинформер”; б) окно вывода и экспорта результатов расчета программы “Каталазоинформер”

ПЦР-анализ состояния ДНК производился с помощью набора реагентов и методики, разработанных предприятием Біокош. Методика выделения ДНК ба&ируется на и&влечении ДНК сорбентом №е1е08 из продуктов обработки пробы лизисным реагентом, в дальнейшем №е1е08 промывается солевым буфером и ДНК десорбируется и переводится в раствор реагентом ЕхЦавепе. ДНК, растворенная в Ех^авепе, подвергается электрофоретическому разделению. Электрофорез осуществляют на агарозном геле (1,5% раствор агарозы в воде) в ТБЕ-буфере с добавлением бромистого этидия. Фотографии гелевой пластины получают на ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Біокош), исполь&уя способность комплекса бромистого этидия с ДНК светиться в ультрафиолетовом свете.

Результаты их обсуждение

Полученная на основе аналитических методик с исполь&ованием теории графов и математического моделирования динамика активности катала&ы пока&ала корреляционную &ависимость устойчивости и проявлений апопто&а под влиянием обработки иммунокорректирующих средств. В процессе нормального ра&вития растений гороха происходит понижение активности каталазы, свидетельствующее о детоксикации активного кислородного радикала, катализируя образование Н2О2 из супероксида (рис.2).

ц аппрокси мир угощен крив о и: у = 7.4784*1п(х) -3.0563 RA2 = 0.9965

Активная биомасса: ш= 0.3000 г Активность каталазы: act= 24.9278 уел. ед.

Каталазоинформер - ввод данным

у.е.

здоровые

инфицированный

1 А

4 5

1

7 8

2 К 3

Рисунок 3 - Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора: 1 - контроль (вода); 2 - Мя 2+ (10-3 моль/л);

3 - Мя 2+

3

10

сутки

Рисунок 2 - Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд

При заражении растений гороха Ршагшш охузрогиш происходит повышение активности фермента каталазы. Это свидетельствует об увеличении необходимости должного уровня каталазной антипероксидной защиты в процессе роста растений гороха. Общая мощность системы естественных наномашин, обеспечивающих

антиоксидантную &ащиту, во&растает, в свя&и с тем, что в процессе нормальной жи&недеятельности -роста и ра&вития листа гороха, активные формы кислорода накапливаются с возрастающей скоростью и требуют адекватного ответа системы антиоксидантов.

Для коррекции иммунодефицитных состояний растений гороха были проведены опытные обработки магнийсодержащим препаратом в концентрации ионов Мя 2+ 10-3 моль/л иМя 2+ 10-4 моль/л.

Полученные данные представлены на графиках рисунков 3,4.

Анализ показал снижение активности каталазы под влиянием магния как &доровых, так и инфицированных растений к десятым суткам, что свидетельствует о восстановлении жи&неспособности гороха.

Динамика активности каталазы при апоптозе резко отличается от варианта в норме (рис.5).

Рисунок 4 - Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора: 1 - контроль

1

2

3

10

сутки

Рисунок 5 - Динамика активности каталазы растений гороха сорта Смарагд под влиянием иммунокорректора : 1 - контроль (индуктор апоптоза); 2 - Мя 2+ (10-3 моль/л);

3 - Мя 2+

В случае проявления апопто&а под влиянием магнийсодержащего препарата активность каталазы повышается к десятым суткам, так как снижается скорость накопления активных форм кислорода в клетках и происходит сбой последовательности матричного синтеза ферментов с разрушением ДНК и белков.

Для подтверждения структурно-функциональных изменений в клетках растений был проведен анализ ДНК.

По электофореграмме и темпорально рассчитанным линейным профилям можно наблюдать типичную для апопто&а картину - лестницеобра&ные пятна на электрофорегамме, свя&анные с апоптотической формой деградации ДНК и хроматина. На линейных профилях видно волнообразное искажение нисходящей ветви главного пика, являющееся следствием суперпозиции главного и группы малых пиков, появляющейся только в случае лестницеобразных электрофореграмм (рис.6).

На линейном профиле рисунка 7 показано действие магнийсодержащего препарата в концентрации ионов Мя 2+ 10-4 моль/л на индуцированный апоптоз. Как видно из графика, лестницеобра&ных пиков, характерных для апопто&а, не наблюдается.

2

5

7

8

4

2

4

5

7

8

2

Номер нозиции

Рисунок 6 - Линейный нрофиль электрофореграмм ДНК индуктора анонто&а

Таким образом, интегрирование биохимических и кибернетических методов обеспечивает точность и достоверность изучаемых явлений апоптоза.

Выводы

1. Разработан и проведен высокотехнологический анали& биохимических параметров растений гороха, выявляющий структурные изменения в ДНК.

2. Магний, содержащий препарат, способствует восстановлению жи&неспособности растений гороха, регулируя процессы апоптоза.

Литература

1. Гринблат, А.И. Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза растений. /Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук. - Орел, 2006.

2. Лихошвай, В.А. Обобщенный химико-

кинетический метод моделирования генных сетей /

Номер позиции

Рисунок 7 - Линейный профиль электрофореграмм ДНК растений гороха, обработанных опытными препаратами

В. А. Лихошвай [и др.] // Мол. Биология. - 2001. -Т. 35. - С. 1072-1079.

3. Молекулярно-генетические механизмы

заболеваний человека: компьютерный анализ и

моделирование / Колчанов Н. А. [и др.] // Материалы Международной конференция «Физико-химическая биология» 30 июля - 3 августа 2006, Новосибирск.

4. Самсонова, М. Г. Средства для визуализации

структуры генных сетей и их динамики [Электронный ресурс] / М.Г. Самсонова, В.Н. Серов,

А.С. Трушкина. М., 2006. - Режим доступа:

http://www.ibmh.msk.su/bioinformatics/a/a08-poster-rus.htm, свободный. - Загл. с экрана.

5. Янковский, Н. К. "Геном человека": на пороге революции в медицине [Электронный ресурс] / Н. К. Янковский, С. А. Боринская // Электронная медицинская газета № 9. - 2001. Режим доступа http ://www . vigg.ru/humangenome/publicat/yankovsk

2.html, свободный. - Загл. с экрана.

УДК 634.7. 632.42

Н.Н. Лысенко, доктор сельскохозяйственных наук ФГОУ ВПО Орел ГАУ Г.П. Жук, кандидат сельскохо&яйственных наук Е.А. Козлова

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых и ягодных культур

СИСТЕМА ЗАЩИТЫ ЧЕРНОЙ СМОРОДИНЫ ОТ АМЕРИКАНСКОЙ МУЧНИСТОЙ РОСЫ НА

ОСНОВЕ БИОФУНГИЦИДОВ

Установлено, что ориентация защиты растений на биологические средства борьбы с вредителями, болезнями и сорняками позволяет одновременно решать вопросыi сохранения урожая, повышения качества плодово-ягодной продукции, охраны окружающей среды и здоровья человека. Ключевые слова: биологические средства защиты,

природные комплексы, плодово-ягодные культуры, охрана окружающей среды, охрана здоровья.

В условиях Орловской области чёрная смородина ежегодно поражается американской мучнистой росой в средней и сильной степени, вследствие чего урожайность её снижается. Во&будителем боле&ни является облигатный паразит Sphaerotheca mors-uvae (Schw. Berk. еt Curt). Болезнь поражает смородину на плодоносящих плантациях, маточных питомниках и особенно сильно на высаженных в поле черенках.

Мероприятия по &ащите смородины черной в условиях Орловской области проводят исключительно химическими препаратами, такими

The focus on the biological means enable to decide issues of harvest conservation, improving of horticultural crops, environmental and health protection.

Key words: biological weed and pest killers, natural complexes, horticultural crops, environmental protection, health protection.

как топсин М, топаз [1]. Разработка биологического метода &ащиты смородины от боле&ней по настоящее время не велась.

Эффективный комплекс обработок против американской мучнистой росы (АМР) черной смородины может быть ра&работан при учёте биологического цикла патогена, климатических условий и степени устойчивости сорта. Он должен включать своевременное проведение агротехнических мероприятий, исполь&ование биологических и химических средств защиты. Подбор препаратов