Способ получения высокоусвояемой хелатной коллоидной формы эссенциального микроэлемента цинка
METHOD FOR OBTAINING HIGHLY DIGESTIBLE CHELATE COLLOID FORM OF ESSENTIAL MICROELEMENT OF ZINC

Область техники изобретения
Изобретение относится к новым способам получения высокоусвояемых органических хелатных коллоидных форм эссенциальных микроэлементов, в частности, микроэлемента цинка в виде тройного комплекса с лизином и рибофлавином – лизинаторибофлавината цинка.
Разработанное соединение будет использоваться для устранения и профилактики цинкдефицитных состояний у людей и животных и найдет применение в производстве кормовых добавок, витаминно-минеральных премиксов для животноводства, а также в пищевой промышленности для получения функциональных добавок для обогащения продуктов питания.
Особенностью изобретения является синтез высокоусвояемой коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка в виде тройного комплекса – лизинаторибофлавината цинка, и осуществление синтеза в условиях воздействия ультразвукового излучения.
Уровень техники
Микроэлемент цинк, являющийся центральным звеном разработанного тройного комплекса, относится к категории эссенциальных микроэлементов и играет важную роль в нормальном развитии, функционировании и росте организма человека и животных на всех этапах жизни [1]. Эссенциальный микроэлемент цинк выполняет следующие важные функции: иммуностимулирующую, регуляцию уровня мужских половых гормонов, зрительную, регуляцию нервной системы, нормализацию процессов пищеварения, хорошее протекание беременности, антиоксидантную, нормализацию уровня сахара в крови, гипохолестеринемическую, нормализацию обменных процессов, липотропную. Суточная потребность человека в микроэлементе цинке составляет 12 – 50 мг [2]. Однако, как показали результаты исследования микроэлементного статуса населения, существуют так называемые цинкдефицитные территории, к которым относятся и многие регионы нашей страны [3]. Профилактика и коррекция цинкдефицитных состояний посредством обогащения продуктов питания разработанным тройным цинксодержащим комплексом с целью доставки необходимого количества микроэлемента цинка является весьма целесообразным и перспективным решением.
Пищевыми источниками цинка являются морепродукты и продукты растительного происхождения. Однако, усвояемость цинка из продуктов растительного происхождения достаточно низкая [4]. В связи с этим разработка новых высокоусвояемых форм эссенциального микроэлемента цинка и их использование для восполнения дефицита цинка в организме является актуальным и востребованным направлением.
В настоящее время большую долю применяемых соединений цинка составляют неорганические формы, такие как сульфат, ацетат, хлорид, оксид и другие. У этих соединений есть преимущество – низкая себестоимость, но и существенный недостаток – низкая усвояемость цинка, для некоторых форм она составляет менее 10 %, и высокая токсичность.
В качестве пищевых, лечебно-профилактических и кормовых добавок в терапии цинкдефицитных состояний используют органические формы цинка, такие как аспарагинат, глицинат, лактат, аскорбат и другие. Данные соединения цинка являются хелатными формами.
Особенности получения некоторых органических форм цинка освещены в следующих патентах.
Так, известен «Способ низкотемпературного твердофазного синтеза аспарагината цинка» (См. пат. CN104326932 A, опубл. 04.02.2015), который включает в себя следующие стадии:
3
2
- равномерное смешивание порошка аспарагиновой кислоты и порошка основного карбоната цинка (ZnCO2Zn(OH)*2HO) в молярном соотношении 6 : 1 с добавлением дистиллированной воды,
- равномерное перемешивание реакционной смеси,
- контроль содержания воды (20 – 40 %),
- гомогенизация реакционной массе при температуре 50 – 100 °C
- высушивание аспарагината цинка;
- дробление с получением порошкообразного аспарагината цинка.
Синтез аспарагината цинка осуществляется в течение одних суток.
Недостатками указанного способа является продолжительность процесса синтеза и его многостадийность.
Большой интерес представляет изобретение «Способ получения аминокислотного хелата» (WO 2004050664 A1, опубл. 17.06.2004), в котором представлено получение хелатов металлов с аминокислотами путем взаимодействия карбоната металла и аминокислоты в водном растворе. В данном изобретении также описаны области применения указанных хелатов металлов с аминокислотами. Способ получения хелатов аминокислот включает в себя стадию взаимодействия природного или синтетического карбоната металла с аминокислотой в водном растворе. Карбонат металла представляет собой один или несколько карбонатов с валентностью II или более, выбранных из группы, состоящей из карбоната кальция, карбоната меди, карбоната цинка, карбоната железа, карбоната кобальта, карбоната хрома, карбоната магния и марганца. В качестве хелаторов выступают глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления может использоваться комбинация двух или более аминокислот.
Получаемые хелаты металлов с аминокислотами представляет собой один или несколько хелатов, состоящие из глутамата / аспарагината кальция, бисглутамата кальция, бисаспарагината кальция, глутамата / аспарагината меди, бисглутамата меди, бисаспарагината меди, глутамата цинка / аспарагинат, бисглутамат цинка, бисаспарагинат цинка, глутамат / аспарагинат железа, бисглутамат железа, бисаспарагинат железа, бисглутамат / аспарагинат железа, глутамат / бисаспарагинат железа, глутамат хрома / аспарагинат, бисглутамат хрома, бисглутамат кобальта, бисаспарагинат кобальта, глутамат / аспарагинат магния, бисглутамат магния, бисаспарагинат магния, глутамат / аспарагинат марганца, бисглутамат марганца и бисаспарагинат марганца. Полученные композиции могут применяться в фармацевтической, пищевой и косметической промышленности.
Недостатком указанного изобретения является то, что полученные аминокислотные хелатные соединения позиционируются как фармацевтические композиции, однако, сведений по исследованию их медико-биологических свойств в патенте не представлено.
Известен «Способ получения аминокислотных хелатных соединений, аминокислотные хелатные соединения и применение аминокислотных хелатных соединений» (См. пат. RU №2567057С2, опубл. 27.10.2015). Способ характеризуется тем, что оксиды металлов, и/или карбонаты металлов, и/или сульфаты металлов, и/или хлориды металлов, и/или гидроксиды металлов в твердой форме механически активируют и затем активированные оксиды металлов и/или карбонаты металлов, и/или гидроксиды металлов, и/или сульфаты металлов, и/или хлориды металлов совместно с аминокислотами переводят в твердую форму и превращают в аминокислотные хелатные соединения в процессе твердофазной реакции. Используемый металл представляет собой медь, и/или цинк, и/или марганец, и/или железо, и/или магний, и/или кальций, и/или никель, и/или кобальт. Также в данном изобретении предложены аминокислотные хелатные соединения, частицы которых имеют тонкодисперсную иглоподобную структуру.
Недостатком указанного синтеза является получение композиции, содержащей элементы-антагонисты, нарушающие усвоение друг друга, а также многостадийность процесса.
Существует изобретение на «Способ получения моно- и билигандных комплексных соединений ионов двухвалентных меди (II) и кальция, обладающих усиленной антиоксидантной активностью» (См. патент RU №2 553 428 С2, опубл. 10.06.2015). Изобретение относится к области химии природных соединений, их химических производных и биологических свойств новых соединений, а именно к способу получения моно- и билигандных комплексных соединений ионов двухвалентных металлов с (+)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавоном – дигидрокверцетином, флавоноидом, выделяемым из древесины лиственницы. Способ получения комплексного соединения дигидрокверцетина с ионом металла, выбранным из цинка, меди (II) или кальция, обладающего антиоксидантной активностью, из природного флавоноида (+)-дигидрокверцетина и солей цинка, меди (II) или кальция, состоит в том, что дигидрокверцетин и соль металла смешивают в сухом виде в реакторе в установленных молярных соотношениях 1:1-2, добавляют воду при температуре 80 °C или этиловый спирт или 50 – 70 % водно-спиртовой раствор при комнатной температуре при контролируемой кислотности среды, выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой и/или этиловым спиртом, затем сушат на воздухе, после в сушильном шкафу при температуре 105 – 110 °C. Данный способ позволяет получить стабильные металлосодержащие структуры и индивидуальные вещества в порошкообразном виде.
Недостатком предлагаемого способа является труднодоступность реагентов, необходимых для синтеза комплексов металлов с дигидрокверцетином, а также отсутствие сведений об их стабильности и усвояемости.
Десятичный логарифм (lg) константы нестойкости комплексных соединений, по мнению Скального А. В. [5], для успешного усвоения эссенциального микроэлемента цинка должен составлять lgβ ≈ 14 – 18.  Наиболее распространенным соединением цинка, обладающим lg константы нестойкости близким к «идеальному значению», является хелатный комплекс цинка с этилендиаминтетроуксусной кислотой (ЭДТА). Использование ЭДТА в качестве хелатора цинка позволяет значительно увеличить его усвоение, но при многократном применении ЭДТА способно накапливаться в организме, либо связываться с другими микроэлементами, у комплексов которых lgβ больше, чем у Zn-ЭДТА, тем самым блокируя их усвоение. В связи с этим возникает необходимость выбора хелатора не только с учетом его устойчивости, но и биологической активности и безопасности.
Использование тройных цинксодержащих комплексов для этой цели является достаточно перспективным. В настоящее время активный научно-практический интерес проявляется к смешаннолигандным соединениям биометаллов с витаминами и аминокислотами, которые представляют собой новый класс биологически активных соединений, содержащих в своем составе различные по своей химической природе и биологическому действию вещества. Кроме микроэлемента в состав указанных соединений входят разные витамины и аминокислоты. При образовании соединений витаминов и аминокислот с неорганическими веществами изменяются их химические и биологические свойства. Во многих случаях витамины, находясь в составе таких соединений, обнаруживают биологическую активность, не свойственную витаминам в свободном состоянии. С другой стороны, ионы металлов в сочетании с витаминами и аминокислотами приобретают новые химические и биологические свойства. Они становятся менее токсичными и приобретают способность катализировать различные биохимические процессы. Идея создания тройных комплексов между витаминами, аминокислотой и эссенциальным микроэлементом наиболее полно раскрыта в научных работах творческого коллектива Кебец Н.М., Сарбаева Дж.С, Фридман Я.Д., Серова В.М. и их коллег [6].
Заявленный способ получения высокоусвояемой формы эссенциального микроэлемента цинка в виде тройного комплекса и его прототип объединяет получение соединения типа «витамин-биометалл-аминокислота» в виде тройного цинксодержащего комплекса.
Принципиальным отличием заявленного изобретения от прототипа является синтез высокоусвояемой коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка в виде тройного комплекса – лизинаторибофлавината цинка, и осуществлении синтеза в условиях воздействия ультразвукового излучения.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 представлены химические реакции, протекающие в процессе синтеза лизинаторибофлавината цинка: первая стадия (а), вторая стадия (б).
На фиг. 2 представлена гистограмма распределения гидродинамических радиусов частиц в коллоидном растворе лизинаторибофлавината цинка, полученного по Примеру 1.
На фиг. 3 представлена гистограмма распределения гидродинамических радиусов частиц в коллоидном растворе лизинаторибофлавината цинка, полученного по Примеру 2.
На фиг. 4 представлена гистограмма распределения гидродинамических радиусов частиц в коллоидном растворе лизинаторибофлавината цинка, полученного по Примеру 3.
На фиг. 5 представлены дифрактограммы рибофлавина, лизинаторибофлавината цинка, лизина гидрохлорида.
На фиг. 6 представлены кристаллографические параметры.
На фиг. 7 представлены результаты исследования острой токсичности лизинаторибофлавината цинка.
На фиг. 8 представлена динамика изменения массы лабораторных животных за весь экспериментальный период: 1-ая, 2-ая и 3-я экспериментальные группы.
На фиг. 9 представлена средняя масса лабораторных животных на 21 экспериментальные сутки: 1-ая, 2-ая и 3-я экспериментальные группы.
На фиг. 10 представлены результаты биохимического анализа крови лабораторных животных.
Раскрытие изобретения
Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в получении высокоусвояемых органических хелатных коллоидных форм эссенциальных микроэлементов, в частности цинка.
Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к получению нового индивидуального соединения – лизинаторибофлавината цинка в коллоидной форме, обладающего высокой биологической активностью и безопасностью для человека и животных.
4
2
Сущностью изобретения является двустадийность получения препарата, содержащего органическую хелатную коллоидную форму эссенциального микроэлемента цинка. Первая стадия включает в себя приготовление раствора 0,3 н. гидроксида натрия (NaOH) в котором растворяют рибофлавин и лизина гидрохлорид. Затем в полученную реакционную смесь вносят семиводный сульфат цинка (ZnSO*7HO) и образовавшуюся пульпу, состоящую из осадков рибофлавината и лизината цинка и их растворов, механически перемешивают на магнитной мешалке при непрерывном барботировании азотом в течение 10 часов при температуре кипения водяной бани. Готовый продукт отфильтровывают, промывают холодной водой и сушат на воздухе в затемненном месте, который затем на второй стадии диспергируют в воде для получения коллоидного раствора под воздействием ультразвукового излучения со следующими значениями параметров:
Частота озвучивания рабочего раствора
20 – 48 кГц
Частота модуляции УЗ-излучения
5 – 100 Гц
Время озвучивания рабочего раствора
5 – 60 минут
Относительная мощность УЗ-излучения
50 – 100 Вт/л
Заявленный препарат представляет собой водную суспензию желто-оранжевого света, без запаха, не оказывающего местно-раздражающего и сенсибилизирующего действия.
Осуществление изобретения
Пример 1.
4
2
Синтез лизинаторибофлавината цинка состоит из двух основных стадий. На первой стадии в 1 литре 0,3 н. раствора гидроксида натрия (NaOH) растворяется 56,45 г. рибофлавина и 21,14 г. лизина гидрохлорида. На второй – в полученный раствор вносится 41,86 г. семиводного сульфата цинка (ZnSO*7HO) и образовавшуюся пульпу, состоящую из осадков рибофлавината и лизината цинка и их растворов, механически перемешивают на магнитной мешалке при непрерывном барботировании азотом в течение 10 часов при температуре кипения водяной бани. Готовый продукт отфильтровывается на нутч-фильтре, промывается холодной водой и сушится на воздухе в затемненном месте. Суть протекающих химических процессов показана на фиг. 1.
На второй стадии получают коллоидный раствор лизинаторибофлавината цинка путем диспергирования в водной среде, под воздействием ультразвукового излучения со следующими значениями параметров:
Частота озвучивания рабочего раствора
10 – 20 кГц
Частота модуляции УЗ-излучения
1 – 5 Гц
Время озвучивания рабочего раствора
1 – 5 минут
Относительная мощность УЗ-излучения
10 – 50 Вт/л
Пример 2.
Проводят аналогично примеру 1, но при следующих значениях параметров ультразвукового излучения:
Частота озвучивания рабочего раствора
20 – 48 кГц
Частота модуляции УЗ-излучения
5 – 100 Гц
Время озвучивания рабочего раствора
5 – 60 минут
Относительная мощность УЗ-излучения
50 – 100 Вт/л
Пример 3.
Проводят аналогично примеру 1, но при следующих значениях параметров ультразвукового излучения:
Частота озвучивания рабочего раствора
48 – 60 кГц
Частота модуляции УЗ-излучения
100 – 150 Гц
Время озвучивания рабочего раствора
60 – 120 минут
Относительная мощность УЗ-излучения
100 – 150 Вт/л
С целью определения влияния УЗ-излучения на дисперсный состав образцов коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка проводили исследования с помощью фотонной корреляционной спектроскопии динамического рассеяния света на установке Photocor Complex. По результатам исследования были получены гистограммы распределения гидродинамических радиусов частиц (фиг. 2 – 4).
Установлено, что в образце коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка – лизинаторибофлавината цинка, выполненного по Примеру 1, присутствует две фракции частиц. Гидродинамический радиус частиц первой фракции составляет 130±20 нм, второй – порядка 800±100 нм (фиг. 2).
В образце коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка – лизинаторибофлавината цинка, выполненного по Примеру 2, присутствует одна фракции частиц со средним гидродинамическим радиусом порядка 150 нм (фиг. 3).
В образце коллоидной хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка – лизинаторибофлавината цинка, выполненного по Примеру 3, присутствуют одна фракция частиц со средним гидродинамическим радиусом порядка 10 мкм, отличающаяся полидисперсностью от 20 нм до 100 мкм (фиг.4).
Также был исследован фазовый состав лизинаторибофлавината цинка, в качестве образцов сравнения выступали рибофлавин и L-лизина гидрохлорид. Исследования осуществляли с помощью рентгенофазового анализа методом порошковой дифрактометрии на ренгеновском дифрактометре «PANanytical Empyrean» (производство «PANalytical В.V.», Нидерланды), полученные дифрактограммы представлены на фиг. 5.
1
В результате рентгенофазового анализа было установлено, что лизинаторибофлавинат цинка представляет собой однофазное соединение с моноклинной кристаллической решеткой, пространственная группа P 121/c1, в отличие от рибофлавина с орторомбической кристаллической решетки и L-Лизина гидрохлорида с моноклинной кристаллической решеткой пространственная группа P2/c. Кристаллографические параметры элементарных ячеек исследуемых соединений также значительно отличаются, что отражено в фиг. 6.
Анализ полученных данных подтверждает, что лизинаторибофлавинат цинка представляет новое соединение – хелатный комплекс рибофлавина и лизина с эссенциальным микроэлементом цинком, а не механическую смесь рибофлавина с лизином и цинксодержащим прекурсором.
На следующем этапе исследований была изучена острая токсичность коллоидной, хелатной формы эссенциального микроэлемента цинка – лизинаторибофлавината цинка. Согласно методическим указаниям, было сформировано шесть групп лабораторных белых мышей по 10 особей в каждой. Первая группа служила контролем; лабораторным животным второй, третьей, четвертой, пятой и шестой групп перорально вводилась разработанная форма эссенциального микроэлемента цинка в дозе 5, 10, 20, 50 и 100 мг/кг соответственно. Полученные результаты представлены в фиг. 7.
При проведении исследований по определению острой токсичности лизинаторибофлавината цинка при внутрижелудочном введении в максимально допустимых объемах раствора, равного 0,5 мл для белых мышей, соответствующего 100 мг/кг по действующему веществу, не установлены признаки токсикологического воздействия. Следовательно, лизинаторибофлавинат цинка не обладает токсичными свойствами и относится к нетоксичным соединениям.
Так же проведены исследования влияния лизинаторибофлавината цинка на ростовые показатели лабораторных животных. В качестве лабораторных животных использовали самцов белых крыс породы Вистар, средняя масса которых составляла порядка 190 ± 10 грамм, животные содержались на базе вивария ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России. Было сформировано 3 группы лабораторных животных, животные 1-ой группы содержались на цинкдефицитном рационе; 2-ой группы – с включением в рацион лизинаторибофлавината цинка, а 3-й группы – с добавлением в рацион сульфата цинка. Концентрация микроэлемента цинка в рационе как с неорганической, так и с органической формой цинка составляла 10 мг/л. Ежедневно проводили измерение массы тела лабораторных животных. Динамика изменения средней массы лабораторных животных представлена на фиг. 8.
Анализ полученных данных показал, что в течение первых трех экспериментальных дней не наблюдалось разницы в массе лабораторных животных всех опытных групп. Начиная с четвертых суток и до конца эксперимента животные второй группы, в рационе которых присутствовала хелатная коллоидная форма цинка, показали наибольший прирост массы тела, затем животные третьей группы, а наибольшее отставание в росте было зафиксировано у животных, содержавшихся полностью на цинкдефицитном рационе.
Важно рассмотреть массу лабораторных животных на 21 экспериментальные сутки (фиг. 9). Установлено, что масса животных на 21 экспериментальные сутки во второй группе в рационе которых присутствовала неорганическая форма цинка выше контрольной группы на 8,33 %, а в третьей с использованием лизинаторибофлавината цинка выше на 1,92 %. Результаты исследования показывают улучшение ростовых показателей лабораторных животных при использовании лизинаторибофлавината цинка в качестве источника эссенциального микроэлемента цинка, что подтверждает большую биологическую активность и усвояемость цинка из лизинаторибофлавината цинка, чем из его неорганических аналогов.
В течение всего экспериментального периода лабораторные животные всех групп были активными, с нормальным аппетитом, отклонений в поведении зафиксировано не было, изменений состояния кожных покровов не было обнаружено, частота дыхания и сердцебиения были в норме.
По завершению эксперимента после 3-х недельного содержания лабораторных животных на различных рационах проводили отбор проб крови. Биохимический анализ крови лабораторных животных проводили на базе ФГБУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» (г. Ставрополь). Результаты анализа представлены в фиг. 10.
В результате анализа полученных данных установлено, что содержание общего холестерина в крови лабораторных животных 2 и 3 опытных групп, в рационе которых присутствовал микроэлемент цинк, ниже контрольной группы на 0,53 и 0,19 ммоль/л, соответственно. Так же наблюдается и уменьшение содержания мочевины на 2,7 и 1,9 ммоль/л и глюкозы на 0,47 и 1,32 моль/л. Установленное снижение содержания данных показателей в крови лабораторных животных указывает на улучшение усвояемости питательных веществ корма.
Так же обнаружено, что такой показатель как активность щелочной фосфатазы – цинксодержащего фермента, у лабораторных животных 2-ой экспериментальной группы составляет 733,8 ± 36,7 Е/л, в то время как у животных 3-й группы 1058,0 ± 52,9 Е/л. Данный факт связан с тем, что цинк, входящий в состав хелатного комплекса с лизином и рибофлавином, обладает большей биологической активностью, а, следовательно, и лучшей усвояемостью и биодоступностью и тем самым способен нормализовать активность цинкзависимых ферментов по сравнению с неорганической формой цинка, использование которой нарушает работу клеток печени, что приводит к увеличению активности щелочной фосфатазы в крови животных выше нормы.
Список литературы:
1. Ребров, В. Г. Витамины, макро- и микроэлементы / В. Г. Ребров, О. А. Громова. − М. : ГЭОТАР-Медия, 2008. – 968 с.
2.  Скальный, А. В. Биоэлементы в медицине / А. В. Скальный, И. А. Рудаков.– М. : МИР, 2004. – 272 с.
3. Сальникова, Е. В. Аккумуляция эссенциальных и условно эссенциальных микроэлементов в волосах жителей России / Сальникова Е. В., Детков В. Ю., Скальный А. В. // Микроэлементы в медицине. 2016. Т. 17. № 2. С. 24 – 31.
4. Сальникова, Е. В. Потребность человека в цинке и его источники (обзор) / Е. В. Сальникова // Микроэлементы в медицине. – 2016. – №17(4). – С. 11 – 15.
5. Оберлис. Д. Биологическая роль макро- и микроэлементов у человека и животных / Д. Оберлис, Б. Харланд, А. Скальный. – СПб : Наука, 2008. – 544 с.
6. Кебец, Н. М. Синтез смешаннолигандных комплексов металлов с витаминами и аминокислотами и изучение их биологических свойств на животных: дис. д-ра. биол. наук: 03.00.04, 03.00.13 / Нинэль Мансуровна Кебец. – М.: 2006. – 329 с.