УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО AAV

1. Способ выделения популяции частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) из технологических примесей в потоке исходных материалов, включающий стадии:
(a) приведения потока исходных материалов, содержащего частицы rAAV, в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG), где частицы rAAV связываются со средой хроматографии на апатите; и
(b) элюирования частиц rAAV, связанных со средой хроматографии на апатите с помощью буфера для элюирования, содержащего менее чем 3% (мас./об.) PEG.
2. Способ по п.1, в котором среда хроматографии на апатите представляет собой керамический гидроксиапатит (CHT).
3. Способ по п.1, в котором среда хроматографии на апатите представляет собой керамический фторапатит (CFT).
14
16
4. Способ по п.1, в котором специфическое связывание среды хроматографии на апатите с частицами rAAV характеризуется от 10 до 10 устойчивых к ДНКазе частиц на миллилитр (DRP/мл).
5. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию связывания частиц rAAV в потоке исходных материалов, элюированном со среды хроматографии на апатите, со средой анионной хроматографии.
6. Способ по п.1, в котором поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, на стадии (a) приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии полиэтиленгликоля (PEG) и основного буфера.
7. Способ по п.6, в котором основной буфер характеризуется pH между 7,6 и 10.
8. Способ по п.6, в котором основной буфер характеризуется pH между 8,0 и 10,0.
9. Способ по п.6, в котором основной буфер характеризуется pH между 9,0 и 10,0.
10. Способ по п.6, в котором основной буфер содержит борат.
11. Способ по п.1, в котором PEG характеризуется средней молекулярной массой между приблизительно 5000 (PEG5000) граммов на моль и приблизительно 15000 (PEG15000) граммов на моль.
12. Способ по п.11, в котором PEG характеризуется средней молекулярной массой приблизительно 6000 (PEG6000) граммов на моль.
13. Способ по п.1, в котором поток исходных материалов, содержащий частицы rAAV, на стадии (a) приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии между приблизительно 3% (мас./об.) и приблизительно 10% (мас./об.) PEG.
14. Способ по п.13, в котором поток исходных материалов приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 5% (мас./об.) PEG6000.
15. Способ по п.13, в котором поток исходных материалов приводят в контакт со средой хроматографии на апатите в присутствии приблизительно 10% (мас./об.) PEG6000.
16. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию промывки среды хроматографии на апатите буфером для промывки после того, как поток исходных материалов приведен в контакт со средой хроматографии на апатите, но до элюирования частиц rAAV со среды хроматографии на апатите.
17. Способ по п.16, в котором среду хроматографии на апатите отмывают один или более раз буфером для промывки, содержащим приблизительно 7,5% (мас./об.) PEG, и/или буфером для промывки, содержащим приблизительно 5% (мас./об.) PEG.
18. Способ по п.17, в котором среда хроматографии на апатите далее отмывается буфером для промывки, содержащим менее чем приблизительно 3% (мас./об.) PEG, и/или буфером для промывки, не содержащим PEG.
19. Способ по п.16, в котором буфер для промывки содержит буфер, выбранный из группы, состоящей из бората, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и Tris-HCl.
20. Способ по п.16, в котором буфер для промывки характеризуется основным pH.
21. Способ по п.20, в котором буфер для промывки содержит борат при pH между приблизительно 8,0 и приблизительно 10,0.
22. Способ по п.21, в котором буфер для промывки содержит борат при pH, приблизительно равном 8,0.
23. Способ по п.21, в котором буфер для промывки содержит борат при pH, приблизительно равном 9,0.
24. Способ по п.21, в котором буфер для промывки содержит борат при pH, приблизительно равном 10,0.
25. Способ по п.20, в котором буфер для промывки дополнительно содержит от 100 до 500 мМ фосфата.
26. Способ по п.20, в котором буфер для промывки дополнительно содержит от 50 до 250 мМ NaCl.
27. Способ по п.1, в котором частицы rAAV, связанные со средой хроматографии на апатите, элюируют буфером для элюирования, содержащим низкие концентрации PEC или не содержащим PEG.
28. Способ по п.27, в котором буфер для элюирования содержит буфер, выбранный из группы, состоящей из бората, N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) и Tris-HCl, при нейтральном pH.
29. Способ по п.27, в котором буфер для элюирования содержит менее чем приблизительно 3% (мас./об.) PEG6000.
30. Способ по п.29, в котором буфер для элюирования дополнительно содержит менее 100 мМ фосфата.
31. Способ по п.30, в котором буфер для элюирования дополнительно содержит 50 мМ фосфата.
32. Способ по п.31, в котором буфер для элюирования дополнительно содержит от 50 до 250 мМ NaCl.
33. Способ отделения популяции частиц рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) от технологических примесей в потоке исходных материалов, включающий стадии:
(a) приведения потока исходных материалов, содержащего частицы rAAV, в контакт со средой хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий (HIC) в буфере с высоким содержанием соли, где частицы rAAV и технологические примеси связываются со средой HIC; и
(b) элюирования частиц rAAV, связанных со средой HIC буфером со средним содержанием соли.
34. Способ по п.33, в котором среда HIC выбрана из группы, состоящей из смолы Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl и Tosoh Has(Butyl).
35. Способ по п.33, в котором буфер с высоким содержанием соли содержит приблизительно от 0,5 M приблизительно до 2,0 M цитрата.
36. Способ по п.35, в котором буфер с высоким содержанием соли дополнительно содержит между приблизительно 1 и приблизительно 100 мМ фосфата.
37. Способ по п.33, в котором буфер со средним содержанием соли содержит менее 0,5 M цитрата.
38. Способ по п.37, в котором буфер со средним содержанием соли дополнительно содержит между приблизительно 1 и приблизительно 100 мМ фосфата.
39. Способ по п.37, в котором буфер со средним содержанием соли содержит от 0,2 M до 0,5 M цитрата.
40. Способ по п.39, в котором популяция частиц rAAV с пустыми капсидами, частично денатурированными капсидами, менее инфекционным капсидным материалом и/или с частично полными капсидами связана со средой HIC после элюирования буфером со средним содержанием соли.
41. Способ по п.1 или 33, в котором частицы rAAV содержат белок капсида AAV из серотипа капсида AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 и AAV-16.
42. Способ по п.41, в котором частицы rAAV содержат белок капсида AAV из серотипа капсида AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV-1, AAV-4, AAV-5 и AAV-8.