НАБОР ДЛЯ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АНТИТЕЛ В ПРЕПАРАТАХ КРОВИ
KIT FOR MULTI-PURPOSE IMMUNOLOGICAL ANTIBODY ASSAY IN BLOOD PREPARATIONS

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа и направлено на усовершенствование тест-систем для выявления специфических антител в препаратах крови, в частности, для оценки у детей гуморального иммунитета к вакциноуправляемым вирусным инфекциям: кори, краснухе, эпидемическому паротиту и полиомиелиту. В России приняты и реализуются национальные программы по искоренению этих заболеваний, в которых одним из наиболее важных мероприятий является серологический мониторинг детского населения. В настоящее время такое обследование проводится с использованием моноспецифических тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) и требует выполнения четырех тестов, что предполагает одновременное наличие четырех тест-наборов и немалые затраты времени и средств.
Настоящее изобретение предполагает одновременное (в одном анализе) выявление в исследуемых образцах специфических, антител к нескольким возбудителям, в частности, к вирусам кори, паротита, коревой краснухи и полиомиелита. Сущность такого выявления заключается в образовании специфических комплексов между антителами исследуемого образца и известными антигенами, в определенном порядке дискретно зафиксированными на плотной подложке. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью вторичного иммунореагента, специфичного к антителам анализируемой сыворотки (антивидовые антитела, стафилококковые белки А и G и др.), и связанного с легко выявляемой меткой - щелочной фосфатазой или каталитически активными золями золота.
Известны наборы ИФА для определения суммарных антител к 4 инфекциям [1, 2]. В наборах используют смесь конъюгатов 4 антигенов с пероксидазой, выявляя антитела ко всем 4 инфекциям в одной лунке. Недостатком этих наборов является невозможность дифференцированного выявления отдельных возбудителей.
Известен также набор "Orgenics immunocomb HIV 1+2 bi-spot" фирмы «Orgenics» (Франция) для определения антител на непористых носителях [3]. Этот набор позволяет проводить одновременно выявление антител к вирусам имунодефицита человека 1 и 2 типов (HIV 1+2) в одном из вариантов дот-иммуноанализа на поверхности непористого носителя. Его рабочий элемент (твердая фаза) представлен в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антигены HIV 1 и 2, а также человеческие иммуноглобулины - контроль для проверки работы конъюгата. Набор содержит все рабочие растворы, готовые к применению. При положительном результате анализа в месте нанесения антигена образуются визуально определяемые синие пятна. Эту тест-систему можно рассматривать как набор для дифференциального, многопрофильного анализа, но только на две близкородственные инфекции.
Известен набор, описанный в Патенте США №5486452 [4], в состав которого входит устройство для иммунологического анализа, представляющее собой пористую подложку, содержащую множественные ограниченные области адсорбированных на ее поверхности различных антигенов, представленные в виде точек, микроточек или линий, расположенных в определенном геометрическом порядке, и полученные путем нанесения аликвот антигенов на подложку дозирующими устройствами. Свободные от антигенов участки подложки блокированы неспецифическим белком. Набор содержит также реактивы индикаторной системы, позволяющей выявлять комплексы антиген-антитело.
Приведенный выше набор имеет следующие недостатки:
В качестве плотной подложки устройства используется пористая матрица, предпочтительно из нитроцеллюлозы, с толщиной листа, предпочтительно, 0,1 мм. Такие матрицы отличаются хрупкостью и малой механической прочностью, что значительно затрудняет их рутинное использование. Другим недостатком таких подложек является сложность удаления не связавшихся компонентов реакции из мелких пор матрицы (длительная, многократная отмывка с активацией), что значительно усложняет методику и повышает вероятность фоновых явлений.
С целью миниатюризации описанного устройства, зоны адсорбции антигенов представлены в виде пятен диаметром менее 2 мм или линиями с шириной менее 2 мм (получаемые нанесением аликвот антигенов в объеме менее 1 мкл), что предполагает использование специальных считывающих устройств, и не позволят проводить достоверный прямой визуальный учет результатов анализа.
В качестве индикаторной системы используются антитела или белок комплемента, конъюгированные с изотопной, флюоресцентной или ферментной (пероксидазой хрена) меткой. Работа с изотопами требует обеспечения специальных условий безопасности и не может широко использоваться в рутинных анализах. Использование флюоресцентных меток требует специального оборудования для инструментального учета результатов анализа. Для анализов с применением в качестве метки пероксидазы хрена в сочетании с субстратами, дающими нерастворимые продукты (4-хлоро-1-нафтол или 3,3-диаминобензидин) характерна относительно невысокая чувствительность, примерно на порядок уступающая чувствительности планшетного варианта иммунопероксидазного теста с использованием субстратов, дающих растворимые окрашенные продукты [5].
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является набор, описанный в патенте РФ №2298795 [6], в состав которого входят следующие составные части.
1. Устройство для иммунологического определения, представляющее собой плоскую непористую подложку, изготовленную из синтетического материала (предпочтительно из синтетической бумаги Polylith или полистирола), на которой дискретно, в определенном порядке нанесены восемь антигенов возбудителей TORCH-инфекций (Toxoplasma gondii, Clamidia trachomatis, Rubella virus, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealytica, Treponema pallidum, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus-1), а также человеческие иммуноглобулины - контроль эффективности работы иммунозоля. Подложки имеют ширину от 7 до 10 мм и длину от 50 до 70 мм. Ширина подложки позволяет наносить антигены в два ряда аликвотами до 3 мкл, а длина - позволяет удобно работать с растворами, разлитыми в пенфлаконы. Отрицательным контролем служат участки, свободные от антигенов и положительного контроля. Природные или рекомбинантные антигены наносятся в виде дозированных аликвот объемом или в виде электроспрея на подложку в концентрации от 5 до 20 мкг/мл (предпочтительно - 10 мкг/мл). После фиксации антигенов свободные участки подложки блокируются одним или несколькими природными или синтетическими полимерами.
2. Конъюгат (иммунозоль), представляющий собой золь золота или серебра (средний диаметр частиц 10-20 нм), связанный с антителами против иммуноглобулинов человека или со стафилококковыми протеинами А или G.
3
3. Физический проявитель для усиления иммунологического сигнала, содержащий растворимую соль серебра и восстанавливающий агент. Предпочтительно в наборе используется двухкомпонентный проявитель, содержащий: сухую смесь метола и лимонной кислоты в соотношении по массе 2:5, соответственно, таблетированную или расфасованную по 35 мг, и 10%-ный раствор AgNO. Проявитель готовят непосредственно перед использованием, растворяя одну порцию сухой смеси в 5 мл дистиллированной воды и, затем, добавляя в полученный раствор 100 мкл раствора азотнокислого серебра.
4. Раствор для отмывок и для разведения конъюгата (ТСР-Т): 0,01 моль/л трис-HCl с 0,15 моль/л NaCl и 0,1% твин-20, pH 7,2-7,4.
5. Раствор для разведения образцов сывороток (РБР-С): ТСР-Т с добавкой 5% лизата клеток Е.coli, доведенный 1 моль/л раствором NaOH до pH 9,5-9,7.
Этот анализ осуществляется в пенфлаконах, предполагает применение разведения анализируемой сыворотки или плазмы крови 1:10 на РБР-С и последовательное выполнение 10 операций по инкубации и отмывке. Учет результатов производится визуально по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов. Возможен инструментальный учет с использованием сканирующего устройства и последующей компьютерной обработки изображения.
Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков проведения иммунологического анализа за счет одновременного анализа несколько проб сыворотки крови с использованием набора включающего подложку в виде гребенки с антигенами и многоячеистой аналитической ванны с иммунореагентами.
Указанный технический результат достигается тем, что в наборе для многопрофильного иммунологического анализа антител в сыворотке крови, включающем: устройство в виде подложки с набором дискретно нанесенных на ее поверхность антигенами возбудителей инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа; растворы для отмывок, разведения образца и конъюгата; конъюгат и систему проявления, согласно изобретения, подложка представляет собой пластину с зубцами в виде гребня, на поверхности каждого зубца которой расположены дискретно нанесенные набор антигенов возбудителей вирусных инфекций и положительный контроль в виде иммуноглобулинов человека для контроля качества конъюгата, причем, в качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений, а емкость для проведения анализа выполнена в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны.
Ванна заполнена готовыми рабочими растворами и герметизирована;
Между зубцами на пластине подложки может быть выполнена перфорация.
В качестве набора антигенов возбудителей вирусных инфекций используют набор антигенов вакциноуправляемых инфекций: краснухи, эпидемического паротита, кори и полиомиелита, Иммобилизованные на каждом зубце пластины антигены представлены рекомбинантными белками, или природными белками, или комбинацией рекомбинантных и природных белков.
Зона нанесения антигенов на каждом зубце пластины очерчена контрастной позиционирующей рамкой.
В качестве конъюгата используют вторичные иммунореагенты: антитела к иммуноглобулинам человека, или стафилококковый белок А, связанный со щелочной фосфатазой, (например, Protein A, Alkaline Phosphatase Conjugate фирмы «Merck», кат. №539251), а в качестве проявляющей системы - субстрат для выявления щелочной фосфатазы (предпочтительно, BCIP/NBT Liquid Substrate System фирмы «SIGMA-ALDRICH» кат. № В1911). В качестве конъюгата используют вторичные иммунореагенты: антитела к иммуноглобулинам человека, или стафилококковый белок А, связанный с каталитически активными золями золота, а в качестве проявляющей системы - состав "физического проявителя", включает: 0,2% - ментола; 0,2% - серебра азотнокислого; 0,5% - лимонной кислоты, бидистиллированную воду - остальное до 100%.
Для иллюстрации изобретения приведены графические фигуры.
На фиг.1 приведена схема подложки с нанесенными на ней антигенами и имммуноглобулинами. Все антигены и контроль нанесены в концентрации 10 нг/мл аликвотами по 2 мкл (20 нг белка на точку).
На фиг.2 приведен пример результатов многопрофильного анализа сывороток и капиллярной крови, полученных с использованием предлагаемого набора. Цифрами обозначены номера образцов.
На фиг.3 изображена схема подложки, размещенной в многоячеистой аналитической ванне.
Предлагаемый набор включает:
- плоскую подложку 1 для иммунологического анализа, выполненную в виде гребня, каждый зубец 2 которого содержит зону, графически выделенную рамкой 3, с нанесенным набором дискретно в виде пятен 4 нанесенных на ее поверхность антигенами возбудителей инфекционных заболеваний и положительный контроль в виде иммуноглобулинов и является аналитическим устройством;
- в качестве отрицательного контроля сегмент 5 каждого зубца 2 подложки 1 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений
- аналитическую многоячеечную ванну 6 с изолированными ячейками 7, заполненными готовыми рабочими растворами, которая герметизирована пленкой;
- между зубцами на пластине подложки может быть выполнена перфорация 8.
- перфоратор (на чертежах не показан) для вскрытия ячеек 7 аналитической ванны 6.
Описание конкретного выполнения заявляемого набора. Подложка 1 изготавливается из непористого синтетического материала (предпочтительно из синтетической бумаги) в виде плоского гребня, например, с пятью зубцами 2, на каждом из которых в определенном порядке нанесен набор (в виде пятен 4) из антигенов четырех возбудителей вирусных инфекций у человека: краснухи (Rubella virus), кори (Polinosa morbillarum virus), эпидемического паротита (Mumps virus) и полиомиелита (Poliovirus hominis I-III серотипов), а также положительный контроль (человеческие иммуноглобулины) - контроль эффективности работы конъюгата (см. фиг.1). Антигены на подложке могут быть представлены как нативными, так и рекомбинантными белками. Антигены и контроль на поверхности подложки нанесены в виде расположенных в определенном порядке отдельных точек (пятен 4) с диаметром от 2 до 5 мм (предпочтительно 3 мм), что позволяет прямой визуальный учет результатов анализа.
Аналитическая ванна 6 выполнена из инертной пластмассы и имеет несколько рядов, состоящих из пяти ячеек 7 каждый. Каждый ряд ячеек 7 заполнен определенным готовым к применению рабочим раствором и герметизирован.
Описание процесса использования заявляемого набора. При выполнении анализа ячейки 7 вскрывают перфоратором, в первый ряд ячеек вносят исследуемые образцы сыворотки (5 мкл) или цельной капиллярной крови (10 мкл) и погружают зубцы 2 подложки 1. Затем, через определенные интервалы времени подложку 1 передвигают и погружают в ячейки 7 следующего ряда ванны 6 и, после выемки из последнего ряда ячеек 7 визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения антигенов. Для одиночных анализов используют отдельные зубцы 2, которые отделяют от гребенки подложки 1 по перфорации 8. Анализ осуществляют при комнатной температуре.
В наборе могут быть использованы: конъюгаты вторичных иммунореагентов (антител к иммуноглобулинам класса G человека или белка A Staphylococcus aureus) со щелочной фосфатазой или коллоидным золотом и, соответственно, субстрат для проявления щелочной фосфатазы или физический проявитель для каталитического выявления золей золота.
Далее приведены примеры 1 и 2 конкретного применения набора.
В пробных экспериментах используют:
Подложку 1 (гребенку) для многопрофильного иммуноанализа анализа с нанесенными по схеме, приведенной на Фиг.1, антигенами:
- смесь рекомбинантных белков (Е1, Е2 и С) Rubella virus;
- натуральный антиген Polinosa morbillarum virus;
- натуральный антиген Mumps virus;
- смесь натуральных антигенов Poliovirus hominis I-III серотипов
- IgG из сыворотки крови человека - положительный контроль
Аналитическую ванну.
Ванну для анализа с применением конъюгатов щелочной фосфатазы заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т с 0,05% (в/о) казеина, pH 8,0;
- ряды 2, 3, 5, 6, 8 - раствор для отмывок (ТСБ-Т) - 0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, pH 7,2-7,4;
- ряд 4 - конъюгат антител против иммуноглобулинов человека или белка A Staphylococcus aureus со щелочной фосфатазой;
- ряд 7 - однокомпонентный субстрат для проявления щелочной фосфатазы (например, Sigma B1911-100ML BCIP/NBT Liquid Substrate System).
Ванну для анализа с применением конъюгатов коллоидного золота заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т с 0,05% (в/о) казеина, pH 8,0;
- ряды 2, 3, 5 - раствор для отмывок (ТСБ-Т) - 0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, pH 7,2-7,4;
- ряд 4 - конъюгат антител против иммуноглобулинов человека или белка A Staphylococcus aureus с коллоидным золотом;
- ряды 6 и 8 - дистиллированной водой;
- ряд 7 заполняется проявителем состава: 0,2% - ментол; 0,2% - серебро азотнокислое; 0,5% - лимонная кислота, бидистиллированная вода - остальное до 100%.
Заполненные ванны герметизируют. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором.
Выполнение анализа:
Все операции выполняются при температуре не ниже 20°С.
В ячейки первого ряда пипеткой вносят по 10 мкл исследуемых сывороток или по 20 мкл образцов цельной капиллярной крови, перемешивают, помещают белковые матрицы и инкубируют 20 мин. Затем матрицы переносят из ячейки в ячейку следующих рядов с инкубациями: 1 и 4 ряды - 20 мин; 2, 3, 5, 6 и 8 ряды - 2 мин, 7 ряд - 15 мин для субстратов щелочной фосфатазы или 8 мин для проявителя коллоидного золота. После выемки из последней ячейки визуально учитывают результаты анализа. Положительными по определенной инфекции считают образцы, дающие отчетливое темное пятно в месте нанесения соответствующего антигена.
ПРИМЕР 1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ПЛАНШЕТНЫХ ИФА-ТЕСТ-СИСТЕМАХ В И МНОГОПРОФИЛЬНОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗЕ
Многопрофильный анализ 5 образцов сывороток крови проводят с использованием предлагаемого набора в двух вариантах исполнения - с применением конъюгата вторичных антител со щелочной фосфатазой (ЩФ-a/IgG) и коллоидного золота, связанного с протеином A Staphylococcus aureus (Au-SpA). Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего антигена визуально определяется четко различимое темное пятно.
Иммунопероксидазный планшетный анализ проводят на моноспецифических тест-системах для определения антител к отдельным вирусным инфекциям, серийно выпускающихся ЗАО «Вектор Бест» (г.Новосибирск). Выполнение иммуноанализа и учет результатов проводят в соответствии с инструкциями производителя. Для определения титра антител, готовят серию двукратных разведении на РБР-С образцов сывороток (от 1:100) и анализируют каждое разведение. За титр антител принимают наибольшее разведение образца, в котором уровень сигнала превышает ОПкрит. Результаты, полученные с использованием предлагаемого набора, в сравнении с данными моноспецифического иммуноферментного анализа приведены в таблице.
Таблица
Сравнительные результаты определения в сыворотке крови антител к возбудителям вирусных инфекций с применением моноспецифических планшетных тест-систем для ИФА и многопрофильного дот-анализа с использованием конъюгатов на основе щелочной фосфатазы и коллоидного золота.
Тест-система
Обратные титры сывороток в моноспецифическом планшетном ИФА
Результаты многопрофильного дот-анализа
Конъюгат
ПХ-a/IgG
ЩФ-a/IgG
Au-SpA
Сыворотка
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Краснуха
400
отр
200
800
800
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
Корь
800
400
800
400
отр
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
Паротит
200
800
отр
200
100
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
Полиомиелит
100
400
100
200
400
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Примечание:
+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат),
- слабо определяемое пятно в месте нанесения антигена или чистый фон подложки (отрицательный результат).
ПРИМЕР 2. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ И ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МНОГОПРОФИЛЬНОГО АНАЛИЗА В ПОСТАНОВКЕ С КОНЪЮГАТАМИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ И КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА
Параллельно выполняют многопрофильный анализ 5 образцов сывороток крови и капиллярной крови (крови из пальца) от тех же пациентов, сыворотки которых были использованы в примере 1. Анализ проводят с использованием предлагаемого набора в двух вариантах исполнения - с применением конъюгата вторичных антител со щелочной фосфатазой (ЩФ-a/IgG) и коллоидного золота, связанного с протеином А Staphylococcus aureus (Au-SpA). При учете результатов сравнивают наличие или отсутствие четких темных пятен в местах нанесения соответствующих антигенов. Результаты в разных вариантах постановки анализа считают сходными, если наличие и локализация пятен на матрицах при анализе образцов от одного пациента совпадают. Полученные результаты приведены на Фиг.2.
Предлагаемый набор имеет следующие отличия от прототипа:
1. Подложка аналитического устройства выполнена в виде плоского гребня с пятью зубцами, на каждом из которых расположено аналитическое устройство (белковую матрицу) для выполнения одного многопрофильного анализа, а между зубцами на перемычке выполнена перфорация, позволяющая отделять от гребенки один или несколько (по числу выполняемых анализов) зубцов.
2. На белковую матрицу нанесены антигены возбудителей кори, краснухи, эпидемического паротита и полиомиелита.
3. Анализ выполняется не в пенфлаконах, а в многоячеечной аналитической ванне, заполненной готовыми к применению растворами и герметизированной, что делает набор автономным и пригодным к внелабораторному применению.
4. Набор для разведения образцов не содержит концентрат блокирующего раствора, что позволяет выполнять анализ в диапазоне разведения сывороток от 1:50 до 1:100 или использовать для анализа капиллярную кровь в объеме до 20 мкл (использование малых аликвот капиллярной крови важно в педиатрической практике, поскольку у детей малого возраста отбор даже 5 мл крови из вены представляет значительную кровопотерю).
5. Набор предполагает использование конъюгатов на основе щелочной фосфатазы и однокомпонентных субстратов для ее проявления, что позволяет полностью укомплектовать набор готовыми к употреблению растворами и сделать его автономным.
Предлагаемый набор содержит полный комплект компонентов, автономен и может использоваться не только в лабораториях, но и во внелабораторных условиях, как для массового скрининга сывороток, так и для индивидуальных анализов. Чувствительность многопрофильного анализа с использованием предлагаемого набора не уступает чувствительности серийно выпускающихся планшетных моноспецифических иммунопероксидазных тестов (см. Пример 1). Предлагаемый набор позволяет за счет определения в одном анализе сразу ряда параметров значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ с использованием предлагаемого набора эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, внедрение изобретения в широкую практику может дать значительный экономический эффект.
Источники патентной и научно-технической информации
1. Патент Китая №1286403, МПК G01N 33/53.
2. Патент Китая №1340712, МПК G01N 33/569.
3. www.biograd.ru; www.orgenics.com.
4. Патент США №5486452, МПК G01N 033/548.
5. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. школа, 1991. - с.360.
6. Патент РФ №2298795 «Набор для многопрофильного анализа сыворотки крови с целью одновременного выявления специфических антител к возбудителям TORCH-инфекций методом дот-иммуноанализа».