Модернизация флуоресцентного микроскопа для исследования биологических структур с субдифракционным разрешением

ПРИБОРЫ И ТЕХНИКА ФИЗИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТА

УДК 57.086.2

А.В. Сабанцев, Г.Е. Побегалов, С.В. Мурашов, А.С. Мельников, М.А. Ходорковский

МОДЕРНИЗАЦИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МИКРОСКОПА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СТРУКТУР С СУБДИФРАКЦИОННЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ

Флуоресцентная микроскопия находит широкое применение в биологии для исследования разнообразных биологических структур. Однако волновая природа света ограничивает разрешение этого метода величиной около Х/(2ИЛ), где X — длина волны флуоресценции, а ИЛ — числовая апертура используемого объектива. За последние 20 лет был предложен целый ряд методов, позволяющих обойти дифракционный предел разрешения флуоресцентной микроскопии [1—5]. Реализация многих из этих методов представляет сложную техническую задачу и требует значительных финансовых затрат. Наиболее легко на практике реализуются методы локализационной микроскопии (ЛМ), для использования которых требуется лишь незначительная модификация флуоресцентного микроскопа. К тому же ЛМ позволяет достичь наиболее высокого разрешения из всех существующих на данный момент методов субдифракционной флуоресцентной микроскопии.

Несмотря на это, реализация и тестирование методов ЛМ не является тривиальной задачей. Целью данной работы была выработка рекомендаций, которые должны существенно облегчить создание новых ЛМ-установок на базе серийных флуоресцентных микроскопов, на основании опыта, полученного при модернизации флуоресцентного микроскопа, являющегося частью установки FA-1 «Лазерный пинцет», для осуществления ЛМ.

В основе ЛМ лежит возможность определения положения точечного объекта (его размер много меньше длины волны регистрируемого света) по его изображению с субдифракционной точностью при условии, что оно не перекрывается с изображениями других объектов. Зная, что в формировании изображения принимала участие только одна молекула, можно определить ее положение с точностью, зависящей от отношения сигнал/шум в изображении молекулы и достигающей 1 нм, что легло в основу методики FIONA (Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy) [6].

Таким образом, для получения субдифракционного изображения объекта необходимо проводить регистрацию флуоресценции различных молекул так, чтобы дифракционные изображения отдельных молекул не перекрывались. Флуоресценцию единичных молекул можно дискриминировать либо спектрально [7 — 9], либо во времени [1, 4, 5]. В настоящее время повсеместно используется второй способ.

Такой подход предполагает получение серии кадров, в каждом из которых регистрируется флуоресценция лишь небольшой доли флуоресцентных молекул, количество которых достаточно мало, чтобы их дифракционные изображения не перекрывались. Эта серия изображений далее обрабатывается при помощи компьютерного алгоритма, который обнару-

живает изображения отдельных молекул и локализует их (например, по методу центра масс или аппроксимации функцией Гаусса). В итоге формируется таблица, содержащая положения всех локализованных молекул. Получаемое субдифракционное изображение объекта является графической репрезентацией данной таблицы.

Материалы и методы

Для осуществления ЛМ неинвертирован-ный микроскоп AxioImager.Zl (Carl Zeiss), являющийся частью лазерного комплекса FA-1 «Лазерный пинцет», был дооснащен DPSS-лазерами производства ALTECHNA с рабочими длинами волн 532 и 473 нм (мощность — 100 мВт, ТЕМ00, поляризация линейная), а также лазером мощностью 50 мВт с длиной волны 405 нм. Ввод излучения с длинами волн 532 и 473 нм в микроскоп осуществлялся через резервный порт микроскопа с помощью поляризационного кубика. Излучение с длиной волны 405 нм вводилось через порт для световода лампы возбуждения флуоресценции. Для регистрации флуоресценции использовались два набора фильтров Filter Set: 10 и 20 (Carl Zeiss). Входной фильтр в Filter Set 20 был демонтирован, поскольку он не пропускает излучение с длиной волны 532 нм.

Оптическая система настраивалась таким образом, что при работе с объективом 100* лазерами освещалась область в фокальной плоскости диаметром около 40 мкм. Это позволило получить среднюю освещенность до 4,0 кВт/см2 в плоскости объекта для излучения с длинами волн 473 и 532 нм, а также 2,0 кВт/см2 для излучения с длиной волны 405 нм.

Во всех экспериментах использовался масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой 1.46 «Plan-Apochromat» 100x/1.46 Oil DIC от фирмы Carl Zeiss. Для регистрации флуоресценции использовалась охлаждаемая ПЗС-камера с матрицей 1024*1024 пикселя и физическим размером пикселя 13 мкм, освещаемая со стороны подложки (Back-illuminated EM-CCD) Cascade II 1024 от Photometries. ПЗС-матрица охлаждается элементом Пельтье до -55 °C. Схема установки приведена на рис. 1. Установка для ЛМ смонтирована на антивибрационном оптическом столе с пневмоподвеской NewPort

Рис. 1. Схема экспериментальной установки для локализационной микроскопии: 1 - зеркала, 2 - дихроическое зеркало, 3 - линзы, 4 - нейтральные фильтры, 5 — поляризационный куб, 6 - объектив микроскопа, 7 - тубусная линза микроскопа, 8 - ПЗС-камера, 9 - набор фильтров для регистрации флуоресценции, 10, 11 - предметное и покровное стекла

Подробное исследование влияния масштаба изображения на ПЗС-камере и отношения сигнал/шум на точность локализации молекулы было проведено в работах [10 — 12]. Было показано, что отношение сигнал/шум в изображении отдельной молекулы является основным фактором, определяющим достигаемое разрешение. В связи с этим использование высокочувствительной, низкошумящей ПЗС-камеры с высокой квантовой эффективностью крайне важно для ЛМ, и лучше всего подходят для этой цели охлаждаемые ПЗС-камеры, освещаемые со стороны подложки (back-illuminated EM-CCD).

При выборе объектива и ПЗС-камеры следует учитывать два обстоятельства. Во-первых, для успешной реализации ЛМ необходим объектив с высокой разрешающей способностью (иммерсионный, с числовой апертурой 1, 2 или более). Во-вторых, микроскоп должен обеспечивать масштаб изображения на ПЗС-матрице в пределах от 50 до 150 нм/пиксель [11, 12]. Следует также уделить особое внимание подавлению вибраций. Установка должна быть смонтирована на виброизолирующем столе с пневмоподвеской.

Для обеспечения метода ЛМ в фокальной плоскости необходимо создать плотность излу-

чения в несколько кВт/см2. Размер освещаемого участка должен быть больше размера исследуемого объекта. В связи с тем, что последние обычно не превышают 5 — 10 мкм, размер освещаемой области 30—40 мкм является достаточным. Стоит отметить, что для осуществления ЛМ не предъявляется особых требований к стабильности источника света и однородности освещения, поскольку небольшие изменения освещенности (около 5—10 %) приводят к незначительному изменению времени, в течение которого молекулы флуорофора находятся во флуоресцентном состоянии и практически не влияют на точность локализации [13 — 15]. Поляризация возбуждающего излучения в большинстве практических случаев исследования биологических объектов не оказывает влияния на разрешение (подробный анализ можно найти в работе [16]). Таким образом, для реализации метода ЛМ можно использовать недорогие непрерывные диодные и DPSS-лазеры (стоимость менее 20000 руб.) и даже лазерные указки (стоимость от 3000 до 10000 руб.). Необходимая мощность составляет 50 — 200 мВт.

Важными шагами в создании установки для ЛМ являются определение аппаратной функции микроскопа во флуоресцентном режиме и величины разрешения, достигаемого в режиме ЛМ. Для получения аппаратной функции необходимы яркие точечные флуоресцентные объекты, жестко закрепленные на поверхности покровного стекла; для этих целей хорошо подходят квантовые точки и флуоресцентные микросферы малого диаметра (например 40 нм). В данной работе использовались покрытые стрептавидином квантовые точки QDot585 (Invitrogen), закрепленные на поверхности покровного стекла, покрытого полистиролом ПСМ-115Н (Нева-Реактив). Размер квантовых точек составляет 20 нм. Для тестирования микроскопа в режиме ЛМ и определения разрешения использовались молекулы ДНК бактериофага X (NEB), окрашенные YOYO-1 (Invitrogen) и выпрямленные на поверхности покровного стекла. Линейность ДНК позволяет легко оценить достигнутое разрешение как ширину на полувысоте поперечного сечения через изображение ДНК.

Для закрепления молекул ДНК на покровном стекле был выбран метод, описанный в ра-

боте [17], с использованием покровного стекла, покрытого полистиролом по методу центрифугирования. A-ДНК Fermentas (10 пМ) в буфере PBS инкубируется 15 минут с красителем YOYO-1 (Invitrogen) в концентрации 200 нМ. Покровное стекло при вращении промывается двумя миллилитрами воды MilliQ и высушивается в течение одной минуты по методу центрифугирования (скорость вращения 3000 об/мин). 60 мкл полистирола в дихлорметане (концентрация раствора 5 мг/мл) наносится по методу центрифугирования (в течение 30 секунд при скорости 3000 об/мин) на поверхность покровного стекла. На подготовленную таким образом поверхность наносится 100 мкл раствора ДНК, и препарат инкубируется в течение четырех минут. Затем стекло центрифугируется при той же скорости вращения, при этом на стекло наносится 2 мл воды MilliQ для удаления несвязавшихся молекул. Покровное стекло помещается обработанной поверхностью вниз на предметное стекло с каплей 10 мкл буфера GOC (500 мкг/мл глюкозоксидазы (Sigma), 50 мкг/мл каталазы (Sigma), 10 % глюкозы (Нева-Реактив) в PBS) c 50 мМ дитиотритола, после чего камера герметизируется при помощи лака для ногтей.

Длина молекулы A-ДНК составляет около 16 мкм (48502 пары оснований). Молекула, окрашенная YOYO-1, хорошо видна во флуоресцентном режиме микроскопа при освещении ксеноновой лампой и использовании соответствующего набора фильтров.

Для осуществления локализационной микроскопии ДНК использовался лазер с рабочей длиной волны 473 нм, создающий в фокальной плоскости освещенность 2 кВт/см2 в области диаметром 40 мкм. После начала лазерного облучения образца записывалась последовательность из 1000 кадров, которая использовалась для реконструкции ЛМ-изображения. Последняя осуществлялась с помощью алгоритма QuickPALM [ 18], реализованного в виде плагина для программы обработки изображений ImageJ [19] (плагин QuickPALM, а также ImageJ являются полностью бесплатными программами с открытым кодом). В этой программе реализован метод локализации, основанный на вычислении центра масс изображения молекулы. Более высокой точности можно добить-

ся, если использовать метод аппроксимации изображения молекулы двумерной функцией Гаусса, однако это требует существенно более трудоемких вычислений. Перед обработкой алгоритмом QuickPALM из изображения вычиталась низкочастотная компонента для коррекции фона, а также осуществлялась высокочастотная фильтрация при помощи свертки с функцией Гаусса.

Результаты и их обсуждение

Ширина на полувысоте графика аппаратной функции микроскопа во флуоресцентном режиме, определенной при помощи квантовых точек, составила 320 нм (теоретический предел для используемого объектива составляет 220 нм на длине волны 610 нм). При облучении лазером (473 нм) молекул ДНК, окрашенных YOYO-1 и закрепленных на поверхности покровного стекла, с освещенностью объекта 2 кВт/см2, наблюдается эффект обратимого перехода молекул красителя в долгоживущее нефлуоресцентное состояние.

В первый момент времени наблюдается высокая интенсивность флуоресценции, затем она быстро спадает, и наблюдается «мерцание» молекул YOYO-1, связанное с переходами молекул красителя в долгоживущее нефлуоресцентное состояние и обратно (рис. 2). Несмотря на интенсивно проводимые исследования в данном

Рис. 2. Примеры изображений молекул ДНК в обычном флуоресцентном режиме, полученных при проведении эксперимента по лазерному (473 нм) освещению объекта (1000 кадров): а — сразу после начала, б — последний примерно из 500 кадров, в — усредненное изображение по первым 300 кадрам

направлении, в настоящее время детальный механизм обратимого перехода многих красителей (в том числе YOYO-1) в нефлуоресцентное состояние в световых полях с интенсивностью порядка единиц кВт/см2 остается неясным [20 — 22, 14, 23]. Однако для цианиновых красителей было показано, что указанное состояние есть продукт фотохимического присоединения тиола к красителю [24].

На основании 1000 кадров молекулы ДНК при освещенности 2 кВт/см2, в которых наблюдалось «мерцание» отдельных молекул, удалось реконструировать при помощи алгоритма QuickPALM изображение молекул ДНК с разрешением, намного превосходящим таковое в обычном флуоресцентном режиме.

Молекула ДНК является удобным модельным объектом для ЛМ, так как представляет собой очень тонкий (толщина около 2 нм) линейный объект, в связи с чем получаемое разрешение можно легко определить как ширину на полувысоте (FWHM) поперечного профиля яркости изображения молекулы ДНК.

На рис. 3 представлены поперечные профили яркости изображений ДНК в обычном и ЛМ-режимах. Видно, что ЛМ позволяет достигнуть разрешения до 50 нм, что на порядок лучше обычного.

Итак, микроскоп Ахю Imager.Z1, являющийся частью установки ЕА-1 «Лазерный пинцет», был модернизирован для осуществления локализационной микроскопии.

На основе двух DPSS-лазеров с длинами волн 473 и 532 нм, работающих в непрерывном режиме, была изготовлена дополнительная система освещения, обеспечивающая плотность излучения в фокальной плоскости до 4кВт/см2 для обеих длин волн, при этом диаметр освещаемого участка составляет 40 мкм. Данная система позволяет освещать образец лазерными пучками одной или двух длин волн одновременно и может быть использована независимо от стандартной системы освещения образца, входящей в комплект микроскопа, или одновременно с ней. На основе диодного лазера (405 нм) реализовано облучение образца с плотностью излучения до 2 кВт/см2 (диаметр освещаемого участка составляет 40 мкм); при этом ввод излучения осуществляется через порт для световода лампы возбуждения флуоресценции.

Рис. 3. Изображение молекул ДНК

Использование молекул ДНК в качестве тестового образца позволило определить разрешение микроскопа в ЛМ-режиме, которое составило около 50 нм, что почти на порядок выше, чем разрешение в обычном флуоресцентном режиме.

Большинство современных исследовательских микроскопов оснащаются подходящими для ЛМ ПЗС-камерами и монтируются на виброизолирующих столах. В таком случае модернизация микроскопа для работы в режиме ЛМ состоит в изготовлении дополнительной системы освещения на основе лазеров, работающих в непрерывном режиме; данная система создает в фокальной плоскости плотность освещения более 2 кВт/см2 в области размером около 40 мкм. Такая модернизация требует относительно небольшого, по сравнению со стоимостью микроскопа, вложения средств, однако позволяет существенно расширить

возможности измерительной системы. Модернизированный таким образом микроскоп позволяет использовать целый ряд методов локализационной микроскопии, в частности, основанных на фотоактивируемых или фото-переключаемых белках или на «мерцании» распространенных флуоресцентных красителей. Для обработки результатов может быть использована бесплатная программа обработки изображений с открытым кодом ImageJ с плагином QuickPALM.

Удобным объектом для тестирования ЛМ-микроскопа являются молекулы ДНК бактериофага X, окрашенные при помощи красителя УОУО-1 и выпрямленные на поверхности покровного стекла, покрытого полистиролом. Эти образцы достаточно просты в приготовлении и позволяют легко определить разрешение микроскопа в режиме локализационной микроскопии.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт № 16.518.11.7045) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «УМНИК» с использованием научного обо-

рудования ЦКП «Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ» в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072013 годы».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution [Text] / E. Betzig, G.H. Patterson, R. Sougrat [et al.] // Science.- 2006.- Vol. 313.— Iss. 5793.— P. 1642—1645.

2. Gustafsson, M.G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy [Text] / M.G. Gustafsson // J. Microsc.— 2000.— Vol. 198.— Pt 2.— P. 82—87.

3. Hell, S.W. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy [Text] / S .W. Hell, J. Wichmann // Opt. Lett.— 1994.— Vol. 19.— Iss. 11.— P. 780—782.

4. Hess, S.T. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy [Text] / S.T. Hess, T.P. Girirajan, M.D. Mason // Biophys. J.— 2006.— Vol. 91.— Iss. 11.— P. 4258—4272.

5. Rust, M.J. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) [Text] / M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang // Nat. Methods.— 2006.— Vol. 3.— Iss. 10.— P. 793—795.

6. Yildiz, A. Fluorescence imaging with one nanometer accuracy: application to molecular motors [Text] / A. Yildiz, P.R. Selvin // Acc. Chem. Res.— 2005.— Vol. 38.— Iss. 7.— P. 574—582.

7. Burns, D.H. Strategies for attaining super-resolution using spectroscopic data as constraints [Text] / D.H. Burns, J.B. Callis, G.D. Christian, E.R. Davidson // Appl. Opt.— 1985.— Vol. 24.— Iss. 2.— P. 154—161.

8. Naumov, A.V. Far-field nanodiagnostics of solids with visible light by spectrally selective imaging [Text] / A.V. Naumov, A.A. Gorshelev, Y.G. Vainer, [et al.] // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.— 2009.— Vol. 48.— Iss. 51.— P. 9747—9750.

9. van Oijen, A.M. 3-Dimensional super-resolution by spectrally selective imaging [Text] / A.M. van Oijen, J. Köhler, J. Schmidt, [et al.] // Chem. Phys. Lett.— 1998.— Vol. 292.— Iss. 1—2.— P. 183—187.

10. Cheezum, M.K. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles [Text] / M.K. Cheezum, W.F. Walker, W.H. Guilford // Biophys. J.— 2001.— Vol. 81.— Iss. 4.— P. 2378—2388.

11. Ober, R.J. Localization accuracy in single-molecule microscopy [Text] / R.J. Ober, S. Ram, E.S. Ward // Biophys. J.— 2004.— Vol. 86.— Iss. 2.— P. 1185—1200.

12. Thompson, R.E. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes [Text] / R.E. Thompson, D.R. Larson, W.W. Webb // Biophys. J.— 2002.— Vol. 82.— Iss. 5.— P. 2775—2783.

13. Foiling, J. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return [Text] / J. Folling,

M. Bossi, H. Bock, [et al.] // Nat. Meth.— 2008.— Vol. 5.— Iss. 11.— P. 943—945.

14. Heilemann, M. Super-resolution imaging with small organic fluorophores [Text] / M. Heilemann, S. van de Linde, A. Mukherjee, [et al.] // Angew. Chem. Int. Ed.— 2009.— Vol. 48.— Iss. 37.— P. 6903—6908.

15. Zondervan, R. Photoblinking of rhodamine 6G in poly(vinyl alcohol): radical dark state formed through the triplet [Text] / R. Zondervan, F. Kulzer, S.B. Orlinskii, [et al.] // The Journal of Physical Chemistry A.— 2003.— Vol. 107.— Iss. 35.— P. 6770—6776.

16. Engelhardt, J. Molecular orientation affects localization accuracy in superresolution far-field fluorescence microscopy [Text] / J. Engelhardt, J. Keller, P. Hoyer, [et al.] // Nano Lett.— 2011.— Vol. 11.— Iss. 1.— P. 209—213.

17. Allemand, J.F. pH-dependent specific binding and combing of DNA [Text] / D. Bensimon, L. Jullien, A. Bensimon, V. Croquette // Biophys. J.— 1997.— Vol. 73.— Iss. 4.— P. 2064—2070.

18. Henriques, R. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ [Text] / R. Henriques, M. Lelek, E.F. Fornasiero [et al.] // Nat. Meth.— 2010.— Vol. 7.— Iss. 5.— P. 339—340.

19. Abramoff, M.D. Image processing with ImageJ [Text] / M.D. Abramoff, P.J. Magelhaes, S.J. Ram // Biophotonics Int.— 2004.— Vol. 11.— Iss. 7.— P. 36—42.

20. Flors, C. Photoswitching of monomeric and dimeric DNA-intercalating cyanine dyes for superresolution microscopy applications [Text] / C. Flors // Photochemical & Photobiological Sciences.— 2010.— Vol. 9.— Iss. 5.— P. 643—648.

21. Flors, C. DNA and chromatin imaging with super-resolution fluorescence microscopy based on single-molecule localization [Text] / C. Flors // Biopolymers.— 2011.— Vol. 95.— Iss. 5.— P. 290—297.

22. Flors, C. Super-resolution imaging of DNA labelled with intercalating dyes [Text] / C. Flors, C.N.J. Ravarani, D.T.F. Dryden // Chem. Phys. Chem.— 2009.— Vol. 10.— Iss. 13.— P. 2201—2204.

23. Lemmer, P. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range [Text] / P. Lemmer, M. Gunkel, Y. Weiland, [et al.] // J. Microsc.— 2009.— Vol. 235.— Iss. 2.— P. 163—171.

24. Dempsey, G.T. Photoswitching mechanism of cyanine dyes [Text] / G.T. Dempsey, M. Bates, W.E. Kowtoniuk, [et al.] // J. Am. Chem. Soc.— 2009.— Vol. 131.— Iss. 51.— P. 18192—18193.