СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ТРОМБОЭМБОЛИИ ЛЕГОЧНОЙ АРТЕРИИ
METHOD FOR ASSESSING GENETIC PREDISPOSITION TO THROMBOEMBOLIA OF PULMONARY ARTERY

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки персонифицированой предрасположенности к развитию тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА).
Тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) - закрытие просвета основного ствола или ветвей легочной артерии эмболом (тромбом), приводящее к резкому снижению кровотока в легких и развитию острой, в ряде случаев жизненно-угрожающей, но потенциально обратимой недостаточности правого желудочка [1]. Оценка вероятности ТЭЛА у конкретного пациента по клиническим проявлениям предельно важна в интерпретации результатов диагностических тестов и для выбора соответствующей диагностической стратегии. Европейское общество кардиологов рекомендует ориентироваться на три группы маркеров - клинические маркеры, маркеры дисфункции ПЖ и маркеры повреждения миокарда. В последние годы была предложена концепция о системном воспалении как предикторе неблагоприятного течения и высокого кардиоваскулярного риска. Согласно этой концепции, неспецифическая активация макрофагов и моноцитов, реализующаяся при тяжелых нарушениях микроциркуляции, является индуктором синтеза противовоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, интерлейкина-6 и др.) [2]. Новые знания о цитокиновом профиле больных с ТЭЛА могут использоваться при оценке вероятности ТЭЛА, а также становится необходимым для изучения вопроса о назначении препаратов ингибирущих цитокины и их синтез лимфоцитами.
На сегодняшний день лабораторные исследования в диагностике ТЭЛА имеют вспомогательное значение. Известны несколько способов прогнозирования риска развития ТЭЛА, основанных на определении молекулярных маркеров.
Один из них - способ предоперационной диагностики и профилактики гемокоагуляционных осложнений (Патент РФ №2256913, опубликован 20.07.2005). Для ранней диагностики и профилактики тромбоэмболии при эндопротезировании тазобедренного и коленного суставов проводят дооперационное определение уровня антитромбина III, внутривенно вводят тиосульфат натрия ежедневно по 10 мл, при этом дополнительно проводят манжеточную пробу, путем забора крови после наложения манжеты тонометра и нагнетания давления, равного систолическому, определения в ней уровня антитромбина III и при отсутствии изменений его уровня относительно исходного проводят предоперационную подготовку с введением тиосульфата натрия до момента повышения уровня антитромбина III во время манжеточной пробы. Данный способ позволяет мониторировать и модифицировать уровень антитромбина III. Область применения данного способа ограничена случаями подготовки пациентов к оперативному лечению, и он не является приемлемым для диагностики ТЭЛА при других клинических ситуациях.
Известен способ диагностики тромбоэмболии долевой легочной артерии у больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы (Патент РФ №2256913, опубликован 20.07.2005). Способ заключается в том, что сразу после появления клинических симптомов тромбоэмболии долевой легочной артерии в сыворотке крови больного определяют количество белково-связанного оксипролина и при повышении его уровня до 369,78 мкмоль/л и выше диагностируют тромбоэмболию долевой легочной артерии. Способ обеспечивает возможность ранней и точной диагностики тромбоэмболии долевой легочной артерии с целью ее своевременного лечения. Данный способ имеет ограничения: предназначен только для пациентов с заболеваниями сердечно-сосудистой системы с локализацией тромбоэмбола в долевых легочных артериях.
Наиболее близким к предлагаемому способу является определение в крови у больных с низкой или умеренной клинической вероятностью ТЭЛА уровня D-димера фибрина, одного из продуктов деградации фибриногена. Увеличение концентрации более 0,5 мг/л указывает на спонтанную активацию фибринолиза в ответ на венозный тромбоз и является диагностически значимым в отношении легочной тромбоэмболии при наличии клинических предпосылок. Нормальный уровень D-димера фибрина в плазме (менее 0,5 мг/л) позволяет с точностью выше 90% отвергнуть предположение о ТЭЛА [3]. Однако высокие значения D-димера в плазме (более 0,5 мг/л) не являются специфичными для ТЭЛА и не позволяют с уверенностью диагностировать данное заболевание. Данный способ имеет высокую отрицательную прогностическую значимость, но не позволяет дифференцировать ТЭЛА и другие заболевания и состояния, ассоциированные с повышением уровня D-димера фибрина, например, при тромбозе глубоких вен.
Известно, что развитие ТЭЛА ассоциировано с повышением уровня некоторых провоспалительных цитокинов [3, 4, 5].
Новая техническая задача - повышение точности и информативности ранней диагностики тромбоэмболии легочной артерии.
Для решения поставленной задачи в способе оценки генетической предрасположенности к развитию тромбоэмболии легочной артерии, заключающемся в том, что при наличии у пациента клинических факторов риска развития тромбоэмболии легочной артерии у пациента забирают 3 мл венозной крови и выполняют анализ полиморфизмов генов следующих цитокинов: гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) и гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)) методом полимеразной цепной реакции и результаты генотипирования оцениваются путем присвоения определенного числа баллов следующим образом: при выявлении генотипа GG гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 3 балла, при выявлении генотипа GC гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 1 балл, при наличии генотипа CC гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 0 баллов, при наличии генотипа GG гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 3 балла, при наличии генотипа GA гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 1 балл, при выявлении генотипа AA гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 0 баллов, затем баллы конкретного пациента суммируют и при числе баллов 4 и выше делают вывод о наличии индивидуальной предрасположенности к развитию тромбоэмболии легочной артерии.
Способ осуществляют следующим образом.
При наличии у пациента клинических признаков, указывающих на высокий риск ТЭЛА, выполняют анализ аллельных вариантов генов цитокинов IL-6 и TNFальфа путем проведения полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени. Результаты генотипирования оцениваются путем присвоения определенного числа баллов следующим образом: при выявлении генотипа GG гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 3 балла; при выявлении генотипа GC гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 1 балл; при наличии генотипа CC гена IL-6 (-174 G>C) присваивают 0 баллов; при наличии генотипа GG гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 3 балла; при наличии генотипа GA гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 1 балл; при выявлении генотипа AA гена TNFальфа (-308 G>A) присваивают 0 баллов; затем баллы конкретного пациента суммируют и при числе баллов 4 и выше делают вывод о наличии индивидуальной предрасположенности к развитию тромбоэмболии легочной артерии.
Новым является то, что для осуществления способа определяют генотипы цитокинов IL-6 и TNFальфа, оценивают выявленные генотипы в баллах и при сумме баллов 4 и выше делают вывод о наличии предрасположенности к тромбоэмболии легочной артерии.
Данные отличительные признаки не известны в научно-медицинской и патентной литературе. Таким образом, предложенный способ соответствует критерию «новизна».
Совокупность отличительных признаков не вытекает явным образом для специалиста из уровня техники. Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Данный способ прошел клинические испытания на клинической базе Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова - Республиканской клинической больнице им. Г.Я. Рямишевской. Таким образом, данное техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленно применимо».
Способ основан на анализе данных клинического наблюдения 33 пациентов с подозрением на ТЭЛА. В качестве метода для верификации наличия тромбоэмбола в бассейне легочной артерии использовали спиральную компьютерную томографическую ангиопульмонографию (СКТ-ангиопульмонографию). У 19 пациентов диагноз ТЭЛА был подтвержден по данным СКТ-ангиопульмонографии, у 14 отвергнут. У всех 19 пациентов с ТЭЛА, подтвержденной данными СКТ-ангиопульмонографии) присутствовали клинические признаки, указывающие на вероятность ТЭЛА (тахипноэ (100%), тахикардия (93%), боль в грудной клетке (53%), кровохарканье (5%)). Уровень D-димера у всех пациентов с ТЭЛА превышал пороговое значение - 0,5 мг/л. Всем пациентам путем проведения полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени определяли генотипы гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) и гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)). Результаты генотипирования представлены в таблице 1 (Приложение 1).
Основываясь на полученных данных можно утверждать, что аллель G гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) и генотипы его содержащие ассоциированы с более высоким риском развития тромбоэмболии легочной артерии. Относительный риск развития тромбоэмболии легочной артерии у лиц с генотипом GG гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) повышен в 1,9 раза (OR=1,91; 95% ДИ от 1,1 до 2,5). Данные таблицы 1 также демонстрируют, аллель G гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)) и генотипы, его содержащие, также ассоциированы с высоким риском развития тромбоэмболии легочной артерии. Относительный риск развития тромбоэмболии легочной артерии у лиц с генотипом GG гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)) повышен в 1,6 раза (OR=1,63; 95% ДИ от 1,0 до 2,2).
Предлагаемый способ апробирован на анализе результатов клинических наблюдений у 10 пациентов с подозрением ТЭЛА. Все пациенты поступили в рентгенологическое отделение с подозрением на ТЭЛА. В таблице 2 представлены результаты валидизации предлагаемого способа на группе пациентов с подозрением на ТЭЛА. Верификация результатов исследования осуществлялась с помощью спиральной компьютерной томографии при выполнении непрямой ангиопульмонографии (СКТ-ангиопульмонография), которая позволяла визуализировать наличие тромбоэмболов. При использовании предлагаемого способа диагностики ТЭЛА у 6 пациентов была установлена предрасположенность к данному заболеванию, у 4 пациентов сделан вывод об отсутствии предрасположенности к развитию ТЭЛА. Диагноз ТЭЛА подтвердился в дальнейшем (по данным СКТ-ангиопульмонографии) у 5 пациентов из 6 с предрасположенностью к ТЭЛА согласно предлагаемому способу, а в 1 случае диагноз ТЭЛА был отклонен. Среди 4 пациентов с отсутствием предрасположенности к развитию ТЭЛА согласно предлагаемому способу, при дальнейшем исследовании (СКТ-ангиопульмонография) подозрение на ТЭЛА было отклонено в 3 случаях, а 1 случае были выявлены прямые признаки ТЭЛА в виде тромбоэмбола в верхнедолевой легочной артерии справа. Таким образом, при использовании нового способа оценки предрасположенности ТЭЛА получили 5 истинно положительных, 3 истинно отрицательных, 1 ложноположительных и 1 ложноотрицательный результат. Таким образом, новый способ обладает достаточно высокой чувствительностью (83%), специфичностью (75%) и точностью (75%) в диагностике ТЭЛА.
Пример 1. Больной Ж., 48 лет, история болезни №110/12, дата поступления 30.03.11 г. Поступил в стационар с жалобами на резко развившуюся одышку, головокружение. При сборе анамнестических данных выявлено наличие ИБС. Клинически установлена тахикардия и симптомы тромбоза глубоких вен голени, на момент осмотра тахипноэ (ЧДД=18), тахикардия (ЧСС=108), АД=95/65. Уровень D-димера 0,67 мг/л.
Диагноз: ТЭЛА?
Проведено исследование согласно предлагаемому способу. В результате генотипирования получены следующие данные: установлено наличие генотипа GG гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) и генотипа GA гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)). Согласно предлагаемому способу наличие каждого генотипа оценено в баллах: наличие генотипа GG гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) оценено в 3 балла, наличие генотипа GA гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)) оценено в 1 балл. Таким образом, сумма баллов равна 4. Так как сумма баллов равна 4, то сделано заключение о наличии индивидуальной предрасположенности данного пациента к развитию тромбоэмболии легочной артерии.
Наличие ТЭЛА было подтверждено проведенными позже исследованиями. Пациенту выполнена СКТ-ангиопульмонография: при проведении СКТ-ангиопульмонографии выявлены тромбоэмболы в нижнедолевой артерии справа, а также тромбоэмболы в сегментарных артериях нижней доли слева. Пациенту назначено тромболитическая и антикоагулянтная терапия.
Пример 2. Больная Е., 51 год, направлена на исследование амбулаторно для исключения ТЭЛА. Анализ анамнестических данных выявил наличие гипертонической болезни II ст. По данным клинического осмотра выявлена одышка, тахикардия (ЧСС=105 в минуту), частота дыхания 14 в минуту, уровень D-димера фибрина 0,58 мг/л.
Диагноз: ТЭЛА?
Проведено исследование согласно предлагаемому способу. В результате генотипирования получены следующие данные: установлено наличие генотипа GC гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) и генотипа AA гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)). Согласно предлагаемому способу наличие каждого генотипа оценено в баллах: наличие генотипа GA гена интерлейкина 6 (IL-6 (-174 G>C)) оценено в 1 балл, наличие генотипа AA гена фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа (-308 G>A)) оценено в 0 баллов. Таким образом, сумма баллов равна 1. Так как сумма баллов равна 1, то сделано заключение об отсутствии индивидуальной предрасположенности данного пациента к развитию тромбоэмболии легочной артерии.
Наличие ТЭЛА было подтверждено дальнейшими наблюдениями и исследованиями. По данным СКТ-ангиопульмонографии наличие тромбоэмболов в малом круге не подтверждено, диагноз ТЭЛА снят.
Таким образом, применение предлагаемого способа позволит повысить точность эффективность диагностики ТЭЛА на ранних стадиях заболевания, что будет способствовать более своевременному назначению лечебно-профилактических мероприятий.
Источники информации
1. Верткин А.Л. / А.Л. Верткин, И.С. Родюкова, Е.А. Прохорович // «Молчащая эпидемия»: тромбоэмболия легочной артерии в практике клинициста. - 2003. - №4. - С.6-9.
2. Патогенетические механизмы и принципы лечения хронической тромбоэмболической легочной гипертензии / Н.А. Шостак, А.А. Клименко, Н.А. Демидова, И.В. Новиков // Рациональная Фармакотерапия в Кардиологии. - 2011. №7. - С.10-11.
3. К.А. Зыков, В.П. Масенко, С.Н. Наконечников, И.Е. Чазова. Фракталкин - новый маркер сердечно-сосудистой патологии // Кардиологический вестник. - 2008. - Том 3, №2. - С.34-37.
4. Vormittag R, Hsieh K, Kaider A et al. Interleukin-6 and interleukin-6 promoter polymorphism (-174) G>C in patients with spontaneous venous thromboembolism // Thromb Haemost. - 2006. - Vol.95, №5. - P.802-806.
5. Yang M., Liu G., Sun Y. et al. Changes of homocystiene and interleukin-8 in patients with massive pulmonary embolism before and after thrombolysis therapy // J. Forc. - 2011. - Vol.22, №9. - P.797-798.
Приложение
Таблица 1. Результаты исследования уровня полиморфизмов генов у пациентов с подозрением на ТЭЛА
Таблица 2. Результаты валидизации предлагаемого способа в группе пациентов с подозрением на ТЭЛА
Таблица 1
Полиморфизм
Частота выявления
ОШ
ТЭЛА, подтвержденная результатами СКТ-ангиопульмоноафии
Отсутствие ТЭЛА, подтвержденное результатами СКТ-ангиопульмоноафии
p
IL6: -174 G>C
GC
6
4
0,09
0,91
CC
3
8
0,005
0,10
GG
10
2
0,001
1,91
TNFA: -308 G>A
GA
5
5
0,41
0,86
GG
11
7
0,82
1,62
AA
2
2
0,24
0,00
Таблица 2
Пациент
Генотип гена IL-6(-174 G>C)
Генотип гена TNFальфа (-308 G>A)
Наличие индивидуальной предрасположенности к развитию ТЭЛА согласно предлагаемому способу
Заключение СКТ-ангиопульмонографии
№1
GG
GA
есть
ТЭЛА
№2
GC
GA
нет
ТЭЛА
№3
GC
GG
есть
ТЭЛА
№4
GC
GG
есть
ТЭЛА
№5
GG
GA
есть
ТЭЛА
№6
CC
GG
нет
нет данных за ТЭЛА
№7
GC
GG
есть
нет данных за ТЭЛА
№8
GG
GA
есть
ТЭЛА
№9
CC
AA
нет
нет данных за ТЭЛА
№10
GC
AA
нет
нет данных за ТЭЛА