Способ получения средства, обладающего нейропротективной, иммуномодулирующей активностью
METHOD FOR OBTAINING AN AGENT WITH NEUROPROTECTIVE, IMMUNOMODULATORY ACTIVITY

Изобретение относится к области фармации, и касается способа получения средства, обладающего иммуномодулирующей, нейропротективной активностью на основе травы горноколосника колючего Orostachys spinosa (L.) в виде экстракта сухого.
Флора Восточной Сибири богата перспективными лекарственными растениями народной медицины, проявившие тот или иной фармакологический эффект. Особое внимание заслуживают лекарственные растения, известные в народной медицине, а также обеспеченные природными запасами. К таким лекарственным растениям относится многолетнее суккулентное растение из семейства толстянковых (сем. Crassulaceae) - горноколосник колючий (Orostachys spinosa (L.) Sweet.). Растение применялось в народной медицине в свежем виде, в виде отваров. Из-за мясистости стеблей и листьев известен свежий сок растения. Средства на основе горноколосника колючего применяли при эпилепсии и как успокаивающее при нервных расстройствах. Отвар или свежий сок принимали при лихорадке, золотухе [10]. Свежие листья оказывают стимулирующее ранозаживляющее действие при порезах, ссадинах, мозолях и геморроидальных узлах. Сок горноколосника колючего применяли для лечения ожогов, укусов насекомых, а также применяли при кожных сыпях, опрелостях. Свежие листья первого года жизни применяли как витаминное при цинге. Кроме этого растение применяли в пищу и использовали как кормовую добавку [8]. Известны экспериментальные данные, выявлена выраженная адаптогенная активность извлечений из травы горноколосника колючего [5].
Известны средства на основе эхинацеи пурпурной Echinacea purpurea, обладающие иммуностимулирующим, противовоспалительным действием, в том числе в виде жидкой лекарственной формы Иммунал [4]. Известно средство Танакан, которое предложено в качестве ангиопротекторного, венотонизирующего и антиагрегативного средства [4]. Его применяют при энцефалопатиях, нарушениях мозгового и периферического кровообращения, астенических состояниях. Его получают из растения гинкго билоба в виде стандартизированного экстракта. В природных условиях России гинкго билоба не встречается, но культивируется в Крыму и на Кавказе. В качестве прототипа данного изобретения приняты Танакан и Иммунал. Недостатками Иммунала являются слабо выраженные иммуномодулирующая активность по сравнению со средством, полученным по предлагаемому способу.
Технический результат изобретения - расширение ассортимента лекарственных средств растительного происхождения, обладающих нейропротективной, иммуномодулирующей активностью, за счет использования широко распространенного отечественного растительного сырья травы горноколосника колючего Orostachys spinosa (L.), имеющей надежную и обеспеченную сырьевую базу.
При производстве сухих экстрактов первостепенное значение имеет процесс экстрагирования лекарственного растительного сырья. Изучено влияние технологических факторов на процесс экстрагирования растительного материала - природы экстрагента, его соотношение с сырьем, температурного режима, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности числа экстракций. Опыты выполняли в трехкратной повторности и использовали средние значения полученных данных. Эффективность экстракции оценивали по выходу экстрактивных веществ, полисахаридов, аминокслот.
Определение содержания экстрактивных веществ проводили согласно ОФС.1.5.3.0006.15 «Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» [6].
Определение содержания экстрактивных веществ проводят гравиметрическим методом 1. Метод 1 используется для определения содержания экстрактивных веществ в лекарственном сырье и лекарственных растительных препаратах, которые в последующем подвергаются процессу однократной экстракции.
25,0 мл извлечений из растительного сырья, полученных в опытах, пипеткой переносят в предварительно высушенную при температуре 100-105°С до постоянной массы и точно взвешенную фарфоровую чашку диаметром 7-9 см и выпаривают на водяной бане досуха. Чашку с остатком сушат при температуре 100-105°С до постоянной массы, затем охлаждают в течение 30 минут в эксикаторе, на дне которого находится кальция хлорид безводный, и немедленно взвешивают.
Содержание экстрактивных веществ в абсолютно сухом лекарственном растительном сырье (X, %) вычисляют по формуле:
1
где m - масса сухого остатка, г; m - навеска исходного сырья, г; W - влажность сырья, %.
Для оценки содержания полисахаридов в извлечениях использована методика количественного определения полисахаридов согласно ФС.2.5.0032.15 Подорожника большого листья [9].
К 5 мл извлечений, полученных в опытах, прибавляют 15 мл 95% этанола, перемешивают, подогревают на водяной бане до 30°С в течение 5 минут. Через час осадок количественно переносят на фильтр и последовательно промывают 15 мл раствора 95% спирта в воде (3:1), 10 мл ацетона, 10 мл этилацетата. Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100-105°С до постоянной массы.
Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в % (X) вычисляют по формуле:
1
2
где m - масса фильтра, г; m - масса фильтра с осадком, г; m - навеска сырья, г; W - влажность растительного сырья, %.
Для количественного определения свободных аминокислот в извлечениях использовали спектрофотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенного комплекса аминокислот с нингидрином.
В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 мл извлечения, полученного в опытах, прибавляют 4 мл фосфатного буферного раствора с рН=6,4; а также 2 мл 1% раствора нингидрина в 95% спирте этиловом и 2 мл 0,05% водного раствора аскорбиновой кислоты. Реакционную массу нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут; быстро охлаждают, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Параллельно проводят аналогичные опыты с 2 мл раствора рабочего стандартного образца (РСО) глутаминовой кислоты и 2 мл воды (контрольный опыт).
Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре при длине волны 568 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве сравнения воду.
Содержание суммы свободных аминокислот в пересчете на глутаминовую кислоту и абсолютно сухое сырье (X) вычисляют в % по формуле:
0
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D - оптическая плотность раствора РСО глютаминовой кислоты; m - навеска исходного сырья, г; W - влажность растительного сырья, %.
Приготовление раствора РСО глутаминовой кислоты. Около 0,05 г (точная навеска) глютаминовой кислоты (ФС 42-0229-07) помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл, растворяют в 50 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Приготовление фосфатного буферного раствора с рН=6,4 по ОФС 42-0072-47 «Буферные растворы». 1,79 г динатриягидрофосфата, 1,36 г калия дигидрофосфата и 7,02 натрия хлорида растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 1000,0 мл.
В качестве экстрагентов использовались вода холодная, вода горячая, спирт этиловый с различной концентрацией 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%. Полученные данные приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, наиболее лучший выход экстрактивных веществ наблюдался при экстракции 10% раствором спиртом этиловым и составлял 35,17%.
В продолжении исследований изучено влияние степени измельчения травы на извлечение экстрактивных веществ. Растительное сырье измельчали до 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Результаты представлены в таблице 2. Экстрагирование выполняли 10% этанолом.
Наибольший выход экстрактивных веществ наблюдается при степени измельчения сырья 1 мм и составляет 36,22%.
Изучена зависимость извлечения экстрактивных веществ при экстракции травы горноколосника колючего от соотношения сырье-экстрагент. Экстрагирование выполняли 10% этанолом, степень измельчения сырья 1 мм. Результаты представлены в таблице 3. Наиболее оптимальное соотношение сырье-экстрагент 1:12. Дальнейшее увеличение объема экстрагента нерационально.
Изучено влияние температурного режима экстракции на выход суммы экстрактивных веществ (табл. 4). С увеличением температуры повышается выход БАВ. Для получение экстракта нами выбрана оптимальная температура 60°С.
Чтобы установить продолжительность и кратность числа экстракций изучали время наступления равновесной концентрации в системе «сырье:экстрагент». Для этого проводили 3-хкратную 2-хчасовую экстракцию измельченного сырья травы горноколосника колючего 10% этанолом на водяной бане при температуре 60°С при соотношении сырья и экстрагента 1:12 при постоянном перемешивании с обратным холодильником. После первого контакта фаз 10%-ым этанолом через заданные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90 мин.) извлечения фильтровали, определяли содержание суммы экстрактивных веществ, полисахаридов и суммы свободных аминокислот. Результаты определения экстрактивных веществ, полисахаридов и аминокислот из травы горноколосника колючего при 1 контакте фаз представлены в таблице 5. В продолжении опыта проводили две последующие экстракции отжатого сырья при тех же промежутках времени, заливая во 2-ом и 3-ем контакте фаз 10% этанол в количестве, равном объему предыдущих слитых извлечений. Извлечения также анализировали на содержание суммы экстрактивных веществ, полисахаридов и суммы свободных аминокислот. Результаты определения экстрактивных веществ, полисахаридов и аминокислот из травы горноколосника колючего при 2 и 3 контакте фаз представлены в таблице 5. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что равновесное состояние в системе «сырье:экстрагент» для травы горноколосника колючего в I, II, III контакте фаз наступает через 30 минут каждый. Трехкратная экстракция обеспечивает максимальный выход как действующих, так и экстрактивных веществ.
В результате проведенных испытаний установлены оптимальные условия экстрагирования горноколосника колючего травы: экстрагент - 10% спирт, его соотношение к количеству сырья - 1:12, температурный режим - 60°С, степень измельчения сбора - 1 мм. Трехкратная экстракция. Продолжительность экстракции в системе «сырье:экстрагент» для травы горноколосника колючего составляет 30 минут в I, II, III контакте фаз.
Пример способа получения экстракта сухого: 1 кг травы горноколосника колючего измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1,0 мм. Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 10%-ным спиртом этиловым в соотношении сырье : экстрагент 1:12. Первую экстракцию выполняют при температуре 60°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Вторую и третью экстракцию выполняют в течение 30 мин при температуре 60°С, подавая в экстрактор 10%-ный спирт этиловый в количестве, равном слитому от предыдущей экстракций. Объединенное водно-спиртовое извлечение после экстракций последовательно порциями упаривают примерно до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70°С 8 ч. Получают 260,0 г экстракта сухого. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок коричневого цвета со специфическим запахом, потеря в массе при высушивании не более 5%. Гигроскопичен.
Оценка нейропротекторных свойств сухого экстракта горноколосника колючего.
Содержание животных, участвующих в экспериментах, соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г.).
Исследования выполнены на белых крысах линии Wistar с исходной массой 160-180 г. В первой серии экспериментов животным I-III опытных групп внутрижелудочно вводили в течение 10 дней экстракт сухой горноколосника колючего в дозах 50, 100 и 200 мг/кг соответственно. Животные IV опытной группы получали в аналогичном режиме препарат сравнения - Танакан в дозе 100 мг/кг, контрольной группы - воду очищенную в эквивалентном объеме На 10 сутки, через 30 минут после последнего введения исследуемых средств, у животных вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ). После выработки УРПИ животных помещали в герметическую емкость (объем 1 л) до атонального дыхания. О влиянии экстракта сухого горноколосника колючего на процессы памяти судили по количеству животных с сохранившимся рефлексом и латентному периоду (время захождения в темный отсек установки) через 1, 24 и 72 часа после гипоксического воздействия [7].
Во второй серии эксперимента животным I и II опытных групп внутрижелудочно вводили в течение 10 дней соответственно экстракт сухой горноколосника колючего и Танакан в дозе 100 мг/кг. Последнее введение осуществляли за 30 минут до воспроизведения гипобарической гипоксии. Острую гипобарическую гипоксию моделировали путем подъема лабораторных животных в барокамерной установке на «высоту» 9000 м со средней скоростью 50 м/с и нахождения их в этих условиях в течение 30 мин [7]. Через 3 ч после восстановления исходного режима кислородного обеспечения крыс декапитировали под эфирным наркозом. В сыворотке крови определяли содержание нейрон-специфической енолазы (NSE) с помощью набора «Can Ag NSE» на иммуноанализаторе «Multiskan Ascent». Интенсивность процессов свободнорадикального окисления, в гомогенате головного мозга, оценивали по содержанию вторичного продукта перекисного окисления липидов - малоновому диальдегиду (МДА) [2]. Состояние антиоксидантной системы характеризовали по каталитической активности каталазы [1] и содержанию восстановленного глутатиона [12] в ткани мозга. На гистологических срезах, окрашенных крезилвиолетом по Нисслю, проводили морфометрические исследования коры больших полушарий с помощью микроскопа «Axio LAB.A1» с программным обеспечением для анализа изображений Axio Vision SE64 Rel.4.8.3 и ZEN 2012. Во II-V слоях коры больших полушарий определяли процентное содержание нормохромных, резко гипохромных, резко гиперхромных (пикнотические) нейронов и «клеток-теней».
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0. Достоверность различий между контрольной и опытными группами оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для сравнения процента животных с сохранившемся рефлексом применяли критерий Фишера. Различия считали достоверными при р≤0,05.
Результаты исследований показали, что помещение животных в герметический сосуд до появления атонального дыхания способствует снижению у них процессов консолидации и воспроизведение памятного следа (таблица 6).
На фоне введения экстракта горноколосника колючего в дозе 100 мг/кг и Танакана в аналогичной дозе УРПИ сохранился у всех животных во II и IV опытных группах через 1 час и 24 часа, тогда как в контрольной и I опытной группе только у 10 из 14 животных. Латентный период у животных данных опытных групп был в среднем выше на 20 и 25% (р≤0,05) контрольных показателей соответственно срокам наблюдения. На 3 сутки эксперимента условный рефлекс отмечался у 71% животных в III и IV опытных группах; латентный период у них был выше в 1,5 раза такового у контрольных животных. Наиболее значимое влияние на сохранность УРПИ в отдаленные сроки проявлял экстракт горноколочника колючего в дозе 100 мг/кг. Так, через 72 часа УРПИ сохранился у 86% (р≤0,05) животных во II опытной группе, и латентный период у них был в 1,8 раза выше такового в контроле.
Во второй серии экспериментов было установлено, что на фоне гипоксии развиваются структурные изменения в коре больших полушарий, характеризующиеся увеличением количества регрессивных форм нейронов - гиперхромных (в 2,8 раза), гипохромных (в 1,6 раза) и «клеток-теней» (в 2,5 раза) по сравнению с показателями у животных интактной группы (таблица 7).
На фоне введения животным экстракта сухого горноколосника колючего и Танакана наблюдались менее выраженные структурные изменения в коре больших полушарий (таблица 7): количество гипохромных нейронов снижалось на 23 и 31%, гиперхромных нейронов - на 49 и 42% и «клеток-теней» - на 37 и 33% соответственно по сравнению с показателями у контрольных животных.
Данные, представленные в таблице 8, показывают, что на фоне гипоксии/реокисгенации наблюдалось повышение содержания в сыворотке крови белых крыс маркера повреждения нервной ткани - NSE на 34% по сравнению с данными у интактных животных. Курсовое введение животным экстракта сухого горноколосника колючего и Танакана снижало уровень NSE в среднем на 20% относительно такового показателя у контрольных животных.
Экстракт сухой горноколосника колючего проявляет антиоксидантное действие, снижает интенсивность реакций перекисного окисления липидов, оказывая протективное влияние на эндогенную антиоксидантную систему клеток головного мозга при гипоксии/реоксигенации (таблица 9).
Так, отмечается снижение содержания МДА на 26%, при этом каталитическая активность каталазы повысилась на 28%, а содержание восстановленного глутатиона на 39% по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных.
Таким образом, экстракт сухой горноколосника колючего оказывает нейропротективное действие на фоне гипоксических состояний различного генеза, улучшая когнитивные функции, ограничивая образование регрессивных форм нейронов в коре больших полушарий, снижая уровень NSE в сыворотке крови. Исследуемый экстракт способствует корригированию липид-липидных и белково-липидных взаимодействий в клетках головного мозга, посредством снижения интенсивности перекисного окисления липидов и повышения активности ферментов эндогенной антиоксидантной системы. Нейропротективное действие экстракта сухого горноколосника колючего соответствует таковому препарата сравнения - Танакана.
Оценка иммуномодулирующего свойства сухого экстракта горноколосника колючего выполнена на животных на модели иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном.
1
Определены иммуномодулирующие свойства сухого экстракта горноколосника колючего в отношении показателей клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа. Эксперименты проведены на мышах-самцах линии F (СВАхС57 В1/6) массой 18-20 г, полученных из питомника РАМН «Столбовая». Иммунодепрессию вызвали цитостатиком азатиоприном, который вводили контрольной группе животных в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней [3].
Сухой экстракт горноколосника колючего вводили 1-ой опытной группе мышей на фоне азатиоприна в дозе 100 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней. В качестве препарата сравнения использовали Иммунал, который вводили 2-ой опытной группе мышей на фоне азатиоприна в изоэффективной дозе 5 мл/кг перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней. Интактная и контрольная группы животных получали воду очищенную по аналогичной схеме. Исследования проводили на 20 день эксперимента.
р
р
оп
к
к
оп
к
Действие испытуемого средства на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике [7]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1% взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4 сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена - 50 мкл 50% взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице масс опытной и контрольной лап. Индекс реакции ГЗТ (И) рассчитывали по формуле: И=[(М-М)/М]×100%, где М - масса опытной лапы, М - масса контрольной лапы.
8
Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A.J.Cunningham (1965). Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2×10 клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации [11].
Состояние макрофагального звена иммунного ответа оценивали в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши. Оптическую плотность лизата клеток перитонеального экссудата, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными макрофагами, определяли на спектрофотометре «CECIL-2011» при длине волны 620 нм [7].
Результаты обработаны статистическим методом с помощью критерия t-Стьюдента.
6
6
При исследовании влияния сухого экстракта горноколосника колючего в дозе 100 мг/кг на процессы антителообразования установлено, что средство восстанавливает показатели гуморального иммунного ответа в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению как абсолютного числа АОК, так и числа АОК на 10 спленоцитов на 37% и 40%, соответственно, по сравнению с теми же показателями в интактной группе. При введении исследуемого средства на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10 спленоцитов в среднем в 1,5 раза. При введении препарата сравнения Иммунал достоверно возросло абсолютное и относительное числа АОК в 1,4 и 1,5 раза соответственно по сравнению с данными в контрольной группе (Табл. 10).
При исследовании влияния сухого экстракта горноколосника колючего на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что испытуемое средство восстанавливает индекс данной реакции (ИР ГЗТ) в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению ИР ГЗТ на 38% по сравнению с тем же показателем в интактной группе. При введении испытуемого средства на фоне иммунодепрессии наблюдали увеличение ИР ГЗТ в 1,4 раза по сравнению с контролем, тогда как использование препарата сравнения «Иммунал» приводило к увеличению данного показателя в 1,3 раза (Таблица 11).
При исследовании влияния сухого экстракта горноколосника колючего на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов на фоне азатиоприна установлено, что данное средство восстанавливает фагоцитарный индекс. Введение азатиоприна приводило к снижению фагоцитарного индекса на 51% по сравнению с тем же показателем в интактной группе. При введении исследуемого средства животным с иммунодефицитом наблюдали увеличение фагоцитарного индекса в 1,9 раза по сравнению с данными в контрольной группе; препарат сравнения «Иммунал» увеличивал данный показатель в 1,7 раза (Таблица 12).
Таким образом, исследование иммуномодулирующих свойств сухого экстракта горноколосника колючего выявило его эффективность по отношению к реакциям клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа при экспериментальном иммунодефиците, вызванном цитостатиком азатиоприном. Сухой экстракт горноколосника колючего в дозе 100 мг/кг способен ослаблять супрессивное действие азатиоприна на клеточно-опосредованную иммунную реакцию, антителогенез и фагоцитоз макрофагов. Эффективность исследуемого средства выражена в большей степени, чем действие препарата сравнения «Иммунала».
Литература
1. Гирин С.В. Модификация метода определения активности каталазы в биологических субстратах. Лабораторная диагностика. 1999; 4: 45-46.
2. Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М., 2009: 890.
3. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. - М.,1985.- 256 с
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 16-е изд., перераб., испр. и доп.- М.: Новая волна, 2012. - 1216 с.
5. Одинец А.Д. Фармакологическое исследование экстракта Горноколосника колючего, произрастающего в Восточной Сибири: Автореф.дисс…к-та фарм.наук. Томск, 2012. - 21 с
6. ОФС.1.5.3.0006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах.
7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятяна - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
8. Телятьев, В.В. Полезные растения Центральной Сибири. - Иркутск: Восточно-Сибирское книжное издательство, 1985. - 384 с.
9. ФС.2.5.0032.15 Подорожника большого листья.
10. Шретер, А.И. Лекарственная флора Советского Дальнего Востока. - М.: Медицина, 1975. - 328 с.
11. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells //Nature. - 1965. - Vol. 207. - №5001. - P. 1106-1107.
12. Shaik I.H., Mehvar R. Rapid determination of reduced and oxidized glutathione levels using a new thiol-masking reagent and the enzymatic recycling method: Application to the rat liver and bile samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2006; 385 (1): 105-113.