Роль бактериальных дегалогеназ в деградации хлорсодержащих ароматических ксенобиотиков

УДК 579.861;576.8

О. С. Игнатовец, мл. науч. сотрудник; В. Н. Леонтьев, доцент

РОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДЕГАЛОГЕНАЗ В ДЕГРАДАЦИИ ХЛОРСОДЕРЖАЩИХ АРОМАТИЧЕСКИХ КСЕНОБИОТИКОВ

In the article the results of researches of microbial degradation chlorocontents aromatic xenobiotic ferment systems bacteria genus Pseudomonas are presented. Describe method determination of dehalo-genase activity. The metabolites produced by selected strain during degradation 2-chlorophenol are identified by method HPLC-MS. The mechanism of degradation xenobiotic ferment systems bacteria genus Pseudomonas offered.

Введение. В окружающей среде в результате хозяйственной деятельности постоянно накапливаются ксенобиотики, которые представляют реальную и потенциальную опасность для человека и для биосферы в целом. Это различные пестициды, растворители и мономеры органического синтеза, красители и др. Многие из них являются галогенированными ароматическими соединениями. Наличие атомов галогенов обусловливает их высокую токсичность и устойчивость к деградации в окружающей среде. Основным фактором детоксикации ксенобиотиков в почве и воде является деятельность микроорганизмов, главным образом бактерий, и в частности тех, которые обладают ферментами, осуществляющими стадию дегалогенирования, -дегалогеназами. В литературе отмечена способность осуществлять дегалогенирование для многих родов основных почвенных бактерий: Pseudomonas, Bacillus, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces, Arthrobacter и др. [14]. У бактерий существуют разные механизмы дегалогенирования различных соединений. Чаще всего важные в промышленном отношении галогенированные органические соединения являются хлорпроизводными.

Известны три метаболических пути удаления атома хлора из ароматических соединений: 1) окислительное расщепление кольца, сопровождаемое либо нет стадией дегалогенирова-ния; 2) дегалогенирование через гидроксилиро-вание - расщепление кольца может иметь место прежде, чем все хлорзаместители будут удалены, или ароматическое кольцо расщепляется после того, как все атомы галогена удалены; 3) восстановительное дегалогенирование - ароматическое кольцо атакуется после удаления атома галогена.

Бактерии рода Pseudomonas в течение ряда лет привлекают исследователей реальными перспективами использования в биотехнологических целях. Они обладают уникальной способностью осуществлять биотрансформацию различных природных и синтезированных соединений, а также выступать в качестве деструкторов галогенсодержащих ароматических ксенобиотиков.

Целью настоящей работы являлось создание метода определения активности дегалоге-

наз в клетках бактерий, а также выяснение возможных механизмов деградации хлорсодержащих ароматических ксенобиотиков бактериями рода Pseudomonas.

Материалы и методы. В работе использовали следующие реактивы: 2-хлорфенол, 3,4-хлорфенол, 2,4 хлорфенол («Реахим», РФ), ди-этиловый эфир («Криохром», РФ), глюкозу (Fluka, Швейцария), метанол для ВЭЖХ (Merck, Германия). Симазин (2-хлор-4,6-бис(этиламино)-симм-триазин) был выделен из технического препарата экстракцией горячим ацетоном. Полученный таким образом симазин представлял собой белый мелкокристаллический порошок с Тпл = 224-225 °С.

В работе использовали штаммы микроорганизмов Pseudomonas fluorescens B-22, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aurantica В-162, отобранные из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ. Ранее нами была установлена способность штамма P. aurantica В-162 осуществлять деградацию симазина [5]. В работе [6] было продемонстрировано участие основного компонента монооксигеназной ферментной системы бактерий - цитохрома Р450 в трансформации алифатических и алициклических соединений у штаммов P. fluorescens B-22, P. aeruginosa PAO1.

Бактерии выращивали в колбах Эрленмейе-ра объемом 250 мл в 50 мл жидкой синтетической среды на основе солевого концентрата ММ9. В качестве источника углерода и энергетического субстрата использовали глюкозу (0,2%). Индукцию дегалогеназ вызывали внесением в питательную среду хлорсодержащего ароматического ксенобиотика (5 мг/л). Культивирование бактерий осуществляли при 30°С на установке Environmental Shaker-incubator ES-20 «BioSan» в условиях аэрации (200 мин-1). Время выращивания варьировали в зависимости от используемого штамма и косубстрата в соответствии с кинетикой роста бактерий. Для определения активностей дегалогеназ использовали клетки бактерий в экспоненциальной фазе роста. Клетки осаждали путем центрифугирования при 6000 мин-1 в течении 15 мин, от ионов Cl- отмывали трижды 0,85%-ным раствором KNO3, дезинтеграцию проводили

на установке УЗДН 2Т при частоте 44 кГц в течение 60 с. Объем полученной суспензии разрушенных клеток доводили до 20 мл 0,85% раствором KNO3. В гомогенаты вносили галогенсодержащие ксенобиотики в количестве

0,05% от объема суспензии. Параллельно ставили эксперимент по неферментативному дега-логенированию анализируемых ксенобиотиков. Изменение концентрации ионов СГ определяли с помощью иономера И-160, оснащенного хлорселективным электродом. Для калибровки электрода готовили стандартные растворы KCl с концентрациями, моль/л: 1  10-3; 5  10-4; 1  10-4; 5  10-5; 1  10-5. Регистрацию и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения для иономера «И-160». Количественное определение белка в суспензии бактерий проводили по методу Варбурга и Христиана на спектрофотометре «Specord М40»[7].

Удельную активность дегалогеназ рассчитывали по формуле:

А = АС / Ат  Сб,

где А - удельная активность дегалогеназы, моль/мин-мг белка; АС - разность концентраций Cl", г ион/л; Сб - концентрация белка, мг/мл; Ат - промежуток времени, мин.

Экстракцию интермедиатов и продуктов деградации анализируемых ксенобиотиков проводили равным объемом диэтилового эфира. Эфирный экстракт упаривали досуха, сухой остаток растворяли в 1 мл подвижной фазы и анализировали с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии. Исследование деградации ксенобиотиков ферментными системами бактерий проводили с использованием высокоэффективного жидкостного хроматомасс-спектрометра «Waters», оснащенного диодно-матричным детектором PDA 996 и масс-детектором «Micromass ZQ-2000» (ионизация - ESI) на колонке «BDS HYPERSIL C 18» длиной 250 мм и диаметром 4,6 мм, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали метанол. Скорость элюирования - 0,7 мл/мин. Объем анализируемой пробы - 25 мкл.

Регистрацию масс-спектров осуществляли в режиме отрицательных и положительных ионов. Параметры масс-спектрометрии были следующими: напряжение на капилляре - 3 кВ, напряжение на конусе - 25 В, напряжение на экстракторе - 1 В, температура десольвации -130°С, общий расход инертного газа - 400 л/ч, расход газа на конусе - 150 л/ч.

Результаты и их обсуждение. Как известно из литературных источников, первой стадией трансформации или деградации галогенсодержащих ароматических соединений является их дегалогенирование [4]. В связи с этим на первом этапе настоящей работы был разработан

метод определения дегалогеназной активности бактерий рода Pseudomonas.

В качестве модельных соединений использовали 2-хлорфенол, 3,4-хлорфенол, 2,4-хлорфе-нол, симазин. Выбор этих соединений обусловлен тем, что, во-первых, они являются структурными элементами многих ксенобиотиков; во-вторых, в литературе отсутствуют данные о зависимости активности дегалогеназ от типа замещения галогена. Кривые бактериального дегалогенирования анализируемых хлорфенолов представлены на рис. 1.

Рис. 1. Кинетические кривые дегалогенирования: 2-хлорфенола (а), 3,4-дихлорфенола (б), 2,4-дихлорфенола ферментными системами (в):

1 - P. fluorescens B-22; 2 - P. aeruginosa PAO1

Из рис. 1 видно, что скорость дегалогениро-вания зависит от структуры субстрата и более высокая для монохлорфенола. По мере увеличения числа атомов хлора в молекуле субстрата эффективность ферментативного дегалогени-рования снижается, что обусловлено стериче-скими затруднениями. Для всех хлорфенолов

характерна более высокая скорость дегалогени-рования ферментными системами штамма Р. fluorescens В-22.

На рис. 2 представлена кривая дегалогени-рования симазина ферментными системами штамма Р. аигапґіса В-162.

Рис. 2. Кинетическая кривая дегалогенирования симазина ферментными системами штамма Р. аигапґіса В-162

В таблице представлены значения удельных активностей дегалогеназ, рассчитанные в точке на кинетической кривой, соответствующей максимальной скорости дегалогенирования. Анализ приведенных данных показывает, что

все исследуемые штаммы обладают дегалоге-назной активностью, более высокая активность отмечена у дегалогеназ штамма Р. аигап^са В-162, выращенных в присутствии симазина. Мы склонны считать, что это связано со способностью этого штамма использовать симазин сво-бодноживущими клетками в качестве ростового субстрата, в результате чего клетки должны синтезировать дополнительное количество этого фермента для трансформации в более гидрофильные соединения с последующим включением в свой метаболизм.

Отмечается более существенное изменение активностей дегалогеназ в пределах одного штамма, выращенного на разных косубстратах, например для Р. fluorescens В-22 дегалогеназная активность при переходе от 2-хлорфенола к 3,4-хлорфенолу уменьшается примерно в 2 раза.

Следующим этапом работы явилось изучение возможных продуктов трансформации хлорфенолов штаммом Р. fluorescens В-22 с использованием метода ВЭЖХ-МС. На рис. 3 представлена хроматограмма продуктов трансформации 2-хлорфенола ферментными системами штамма Р. fluorescens В-22.

Пик, обозначенный цифрой 1, является пиком трансформируемого вещества, а пики, обозначенные цифрами 2-4, соответствуют продуктам деградации.

Удельная активность дегалогеназ А, х10-2 моль/мин-мг белка

Таблица

Штамм 2-Хлорфенол 3,4-Хлорфенол 2,4-Хлорфенол Симазин

P. fluorescens B-22 1,14 0,52 0,93 -

P. aeruginosa PAO1 0,97 0,40 0,8б -

P. aurantica В-162 - - - 4,8

Clfenol2HPLC 3: Diode Array

5.00 10. 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00

Рис. 3. Хроматограмма продуктов трансформации 2-хлорфенола ферментными системами штамма Р. /Іиоге^сет В-22

В связи с тем что молекулярная масса 2-хлорфенола составляет 128 Ба, его на хроматограммах идентифицировали в области отрицательных ионов по молекулярному иону [МН]- с 127,2 и в области положительных ионов - по иону [М+Н]+ с ш^ 129,2. Анализ хро-матомасс-спектров продуктов биодеградации всех анализируемых хлорфенолов в области отрицательных ионов показывает наличие пиков с ш/е 144,03 и 137,23. Можно предположить, что они обусловлены депротонирован-ными хлорпирокатехином и диенелактоном соответственно. Сигнал в области отрицательных ионов с ш/е 110,08 соответствует пирокатехину. Для дополнительной идентификации были записаны электронные спектры анализируемых соединений, что позволило однозначно подтвердить идентифицированные структуры.

В области низких молекулярных масс наблюдается достаточно интенсивный сигнал с 78,84, который является основным продуктом ферментативной реакции. Данное соединение можно отнести к двузарядному иону малеилацетата.

Рис. 4. Возможный механизм деградации хлорфенолов ферментными системами бактерий рода Pseudomonas

На основании полученных результатов и данных литературы [8] нами предложен возможный механизм деградации хлорфенолов (рис. 4) бактериями рода Pseudomonas.

Заключение. Разработан метод определения дегалогеназной активности в клетках бактерий рода Pseudomonas, идентифицированы продукты деградации и трансформации хлор-фенольных соединений ферментными системами отобранных штаммов.

Обнаружен путь деградации монохлорфе-нола, не описанный в литературе, протекающий, вероятнее всего, с участием цитохрома P450 и включающий одновременное дегалоге-нирование и гидроксилирование в ортоположение по отношению к 1-й гидроксильной группе 2-хлорфенола.

Литература

1. Haggblom, M. M. Chlorophenol degradation coupled to sulfate reduction / M. M. Haggblom, L. Y. Young // Applied and Environmental Microbiology. - 1990. - V. 56. - P. 3255-3260.

2. Reineke, W. Microbial degradation of haloaromatics / W. Reineke, H.-J. Knackmuss // Annual Review of Microbiology. - 1988. -№ 42. - P. 263-287.

3. Fetzner, S. Bacterial dehalogenase: Bio-chemystry, Genetics, and Biotechnological Applications / S. Fetzner // Microbiol. Rev. - 1994. -V. 58, № 4.- P. 641-685.

4. Fetzner, S. Bacterial dehalogenation / S. Fetzner // Appl. Microbiol. Biotechnol. -1998. - № 50. - P. 633-657.

5. Механизм деградации симазина бате-

риями рода Pseudomonas / О. С. Игнатовец [и др.] // Доклады НАН Беларуси. - 2006. -Т. 51, №. 2. - С. 61-64.

6. Роль цитохром р-450-зависимых мо-нооксигеназных ферментных систем в биодеградации ароматических галогенсодержащих ксинобиотиков / И. М. Бурак [и др.] // Труды БГТУ. Сер. IV, Химия и технология орган. в-в. - 2003. - Вып. Х1. - С. 118-121.

7. Практическая химия белка / под ред. А. Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 345 с.

8. Solyanikova, I. P. Bacterial Degradation of Chlorophenols: Pathways, Biochemica, and Genetic Aspects / I. P. Solyanikova, L. A. Golovleva // Journal of environmental science and health. Part B - Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes. - 2004. -V. 39, №. 3. - P. 333-351.