СИСТЕМА АНАЛИЗА ДЛЯ ОРТОГОНАЛЬНОГО ДОСТУПА К БИОМОЛЕКУЛАМ И ИХ МЕЧЕНИЯ В КЛЕТОЧНЫХ КОМПАРТМЕНТАХ

1. Способ проведения реакции информационной молекулы ядра клетки с аналитической биомолекулой, который включает приведение ядра клетки, содержащего информационную молекулу ядра клетки, в контакт с усилителем ядерной проницаемости и реакцию информационной молекулы ядра клетки с аналитической биомолекулой.
2. Способ анализа информационной молекулы ядра клетки, включающий:
(a) приведение в контакт ядра клетки, содержащей информационную молекулу ядра клетки, с усилителем ядерной проницаемости и аналитической биомолекулой;
(b) проведение реакции аналитической биомолекулы с информационной молекулой ядра клетки для того, чтобы предоставлять аналитический комплекс; и
(c) анализ аналитического комплекса, тем самым обнаруживая информационную молекулу ядра клетки.
3. Способ по п. 2, в котором сохраняющий близость элемент содержит ядро клетки.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой ДНК, РНК, белок или их смесь.
5. Способ по п. 4, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой ДНК.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором аналитическая биомолекула представляет собой транспозазу или транспосомный комплекс, или антитело, или олигонуклеотид, или нуклеотид, или праймер обратной транскрипции, или фермент.
7. Способ по п. 6, в котором олигонуклеотид или нуклеотид содержит по меньшей мере один меченный нуклеотид.
8. Способ по п. 6, в котором указанная аналитическая биомолекула представляет собой фермент, и указанный фермент представляет собой фермент амплификации, полимеразу, ДНК полимеразу, РНК полимеразу, фермент ПЦР, лигазу, ДНК полимеразу Taq, ДНК полимеразу Pfu, фермент, который опосредует транскрипцию in vitro, интегразу или никирующий фермент.
9. Способ по п. 6, в котором аналитическая биомолекула представляет собой транспосомный комплекс.
10. Способ по п. 9, в котором каждый транспосомный комплекс содержит транспозазу и две транспозонные концевые композиции, содержащие транспозонные концевые последовательности.
11. Способ по п. 10, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой целевую нуклеиновую кислоту, в котором реакция включает фрагментацию целевой нуклеиновой кислоты на двухцепочечные фрагменты нуклеиновой кислоты и мечение перенесенными нитями из транспозонных концевых композиций для того, чтобы формировать меченные аналитические комплексы.
12. Способ получения библиотеки меченных фрагментов нуклеиновой кислоты из клеточной ядерной целевой нуклеиновой кислоты:
(a) предоставление сохраняющего близость элемента, содержащего отдельное ядро клетки, где отдельное ядро клетки содержит целевую нуклеиновую кислоту;
(b) приведение в контакт сохраняющего близость элемента и отдельного ядра клетки с усилителем ядерной проницаемости и аналитической биомолекулой; и
(c) проведение реакции аналитической биомолекулы с информационной молекулой ядра клетки для того, чтобы предоставлять аналитический комплекс; и
(d) анализ аналитического комплекса, тем самым обнаруживая информационную молекулу ядра клетки.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором по меньшей мере одна информационная молекула представляет собой белок.
14. Способ по любому из пп. 1-13, который дополнительно включает анализ цитоплазматической информационной молекулы посредством приведения клетки, содержащей ядро клетки, в контакт со второй аналитической биомолекулой, проведение реакции второй аналитической биомолекулы с цитоплазматической информационной молекулой для того, чтобы предоставлять второй аналитический комплекс, и, необязательно, анализ второго аналитического комплекса, тем самым обнаруживая цитоплазматическую информационную молекулу.
15. Способ по п. 14, который включает, перед приведением в контакт, реакцию цитоплазматической информационной молекулы в клетке, содержащей ядро клетки, со второй аналитической биомолекулой в присутствии блокатора ядерных пор и в отсутствие усилителя ядерной проницаемости, посредством чего вводят первую метку в цитоплазматическую информационную молекулу, где указанная реакция с информационной молекулой ядра клетки вводит вторую метку в информационную молекулу ядра клетки.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором аналитическая биомолекула представляет собой транспосомный комплекс, и способ дополнительно включает обработку аналитического комплекса полимеразой, где полимераза представляет собой необязательно полимеразу с замещением цепи.
17. Способ по любому из пп. 2-16, в котором анализ включает секвенирование фрагментированных и меченных нуклеиновых кислот или их ампликонов или их копий.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором усилитель ядерной проницаемости выбирают из: соединений, которые нарушают гидрофобные взаимодействия комплекса ядерных пор (NPC), соединения, которые связываются с белками ядерных филаментов и/или ингибируют их, соединения, которые связываются с клатрином и/или ингибируют его, и пептиды сигналов ядерной локализации (NLS).
19. Способ по любому из пп. 1-17, в котором усилитель ядерной проницаемости представляет собой ингибитор клатрина или представляет собой Pitstop-2 (также известный как N-[5-(4-бромбензилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1,3-тиазол-2-ил]нафталин-1-сульфонамид), метил-b-циклодекстрин, фенотиазины, монодансилкадаверин, хлорохин, монензин, гиперосмотическую сахарозу или динасор или его синтетический аналог или представляет собой Pitstop-2.
4-10
20. Способ по любому из пп. 1-17, в котором усилитель ядерной проницаемости представляет собой нарушитель гидрофобности, или представляет собой алифатический спирт, или представляет собой C-алкилдиол, или представляет собой циклический диол, или представляет собой циклоалкандиол, или представляет собой вицинальный диол, или представляет собой транс-1,2-циклогександиол, н-гексан-1,2-диол или 1,6-гександиол.
21. Способ по любому из пп. 1-17, в котором усилитель ядерной проницаемости представляет собой пептид сигнала ядерной локализации (NLS), или представляет собой большой T-антиген SV40 (PKKKRKV), NLS нуклеоплазмина (KR[PAATKKAGQA]KKKK или AVKRPAATKKAGQAKKKLD), K-K/R-X-K/R, EGL-13 (MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN), c-Myc (PAAKRVKLD), TUS-белок (KLKIKRPVK), кислый домен M9 из hnRNP A1, KIPIK из репрессора транскрипции дрожжей Matα2, последовательность PY-NLS или ингибитор импортина β2 или представляет собой большой T-антиген SV40.
22. Способ по п. 21, в котором NLS ковалентно связывают с аналитической биомолекулой.
23. Способ по п. 21, в котором NLS нековалентно связывают с аналитической биомолекулой.
24. Композиция, содержащая одну или более клеток и/или одно или более ядер клеток, усилитель ядерной проницаемости и аналитическую биомолекулу.
25. Композиция по п. 24, в которой аналитическая биомолекула представляет собой транспозазу или транспосомный комплекс, или антитело, или олигонуклеотид, необязательно содержащий по меньшей мере один меченный нуклеотид, или необязательно меченный нуклеотид, или праймер обратной транскрипции, или фермент.
26. Композиция по п. 24, в которой аналитическая биомолекула представляет собой транспосомный комплекс.
27. Композиция по п. 25, в котором аналитическая биомолекула представляет собой фермент, где фермент представляет собой фермент амплификации, полимеразу, ДНК полимеразу, РНК полимеразу, фермент ПЦР, ДНК полимеразу Taq, ДНК полимеразу Pfu, фермент, который опосредует транскрипцию in vitro, интегразу или никирующий фермент.
4-10
28. Композиция по любому из пп. 24-27, в которой усилитель ядерной проницаемости представляет собой Pitstop-2, алифатический спирт, C-алкилдиол, циклический диол, циклоалкандиол, вицинальный диол, транс-1,2-циклогександиол, н-гексан-1,2-диол, 1,6-гександиол или дигитонин.
29. Композиция по п. 28, в которой усилитель ядерной проницаемости представляет собой Pitstop-2, циклогександиол или дигитонин.
30. Способ по п. 1, который включает:
(a) приведение ядра клетки, содержащего информационную молекулу ядра клетки, в контакт с усилителем ядерной проницаемости и аналитической биомолекулой;
(b) проведение реакции аналитической биомолекулы с информационной молекулой ядра клетки для того, чтобы предоставлять модифицированную информационную молекулу ядра клетки; и
(c) обнаружение модифицированной информационной молекулы ядра клетки.
31. Способ по п. 30, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой ДНК, РНК, белок или их смесь.
32. Способ по п. 30, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой целевую нуклеиновую кислоту, аналитическая биомолекула представляет собой транспосомный комплекс и указанная модифицированная информационная молекула ядра клетки представляет собой комплекс между транспосомным комплексом и целевой нуклеиновой кислотой, где транспосомный комплекс не фрагментирует целевую нуклеиновую кислоту.
33. Способ дифференциального мечения информационных молекул в клетках, включающий:
избирательную доставку первой аналитической биомолекулы, содержащей первую метку, в первый клеточный компартмент, выбранный из группы, состоящей из ядра клетки, цитоплазмы и митохондрий, где первый клеточный компартмент содержит первую информационную биомолекулу;
проведение реакции первой аналитической биомолекулы с первой информационной молекулой, чтобы предоставлять меченную первую информационную молекулу;
избирательную доставку второй аналитической биомолекулы, содержащей вторую метку, во второй клеточный компартмент, выбранный из группы, состоящей из ядра клетки, цитоплазмы и митохондрий, где второй клеточный компартмент содержит вторую информационную молекулу и отличается от первого клеточного компартмента; и
проведение реакции второй аналитической биомолекулы со второй информационной молекулой, чтобы предоставлять меченную вторую информационную молекулу, где первая и вторая метки различаются.
34. Способ по п. 33, в котором избирательная доставка первой аналитической биомолекулы в первый клеточный компартмент включает обработку клетки усилителем проницаемости для первого клеточного компартмента.
35. Способ по п. 33 или 34, в котором избирательная доставка первой аналитической биомолекулы в первый клеточный компартмент включает обработку клетки блокатором проницаемости для второго клеточного компартмента.
36. Способ по любому из пп. 33-35, в котором избирательная доставка второй аналитической биомолекулы во второй клеточный компартмент включает обработку клетки усилителем проницаемости для второго клеточного компартмента.
37. Способ по любому из пп. 33-36, в котором избирательная доставка первой аналитической биомолекулы происходит без существенной доставки первой аналитической биомолекулы во второй клеточный компартмент.
38. Способ по любому из пп. 33-37, в котором первый клеточный компартмент представляет собой цитоплазму и первая информационная молекула представляет собой цитоплазматическую информационную молекулу, и (a) второй клеточный компартмент представляет собой ядро клетки и вторая информационная молекула представляет собой информационную молекулу ядра клетки или (b) второй клеточный компартмент представляет собой митохондрии и вторая информационная молекула представляет собой митохондриальную информационную молекулу.
39. Способ по п. 38, в котором избирательную доставку первой аналитической биомолекулы в цитоплазму выполняют в присутствии блокатора ядерных пор и/или блокатора митохондриальных пор.
40. Способ по п. 38, в котором доставку второй аналитической биомолекулы выполняют в присутствии усилителя ядерной проницаемости или митохондриального усилителя проницаемости.
41. Способ по любому из пп. 38-40, в котором цитоплазматическая информационная молекула представляет собой РНК.
42. Способ по любому из пп. 38-40, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой ДНК или геномную ДНК (гДНК).
43. Способ по любому из пп. 33-37, в котором:
избирательная доставка первой аналитической биомолекулы включает реакцию первой аналитической биомолекулы с митохондриальной информационной молекулой для того, чтобы получать меченную митохондриальную информационную молекулу; и
избирательная доставка второй аналитической биомолекулы включает реакцию второй аналитической биомолекулы с информационной молекулой ядра клетки для того, чтобы получать меченную информационную молекулу ядра клетки.
44. Способ по любому из пп. 38-43, в котором митохондриальная информационная молекула представляет собой ДНК.
45. Способ по любому из пп. 38-44, в котором информационная молекула ядра клетки представляет собой ДНК или представляет собой геномную ДНК (гДНК).
46. Способ по любому из пп. 33-45, который дополнительно включает лизирование клеток для высвобождения меченных информационных молекул.
47. Способ по любому из пп. 12-23 или 33-46, в котором аналитическая биомолекула представляет собой транспозазу или транспосомный комплекс, или антитело, или олигонуклеотид, необязательно содержащий по меньшей мере один меченный нуклеотид, или необязательно меченный нуклеотид, или праймер обратной транскрипции, или фермент.
48. Способ по п. 47, в котором указанная аналитическая биомолекула представляет собой фермент, где указанный фермент представляет собой фермент амплификации, полимеразу, ДНК полимеразу, РНК полимеразу, фермент ПЦР, ДНК полимеразу Taq, ДНК полимеразу Pfu, фермент, который опосредует транскрипцию in vitro, интегразу или никирующий фермент.
49. Способ по п. 47, в котором аналитическая биомолекула представляет собой транспосомный комплекс.
50. Способ по любому из пп. 33-49, который дополнительно включает обнаружение меченных информационных молекул или их ампликонов, где обнаружение необязательно включает обнаружение последовательностей меченных информационных молекул или ампликонов.
51. Способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, где усилителем ядерной проницаемости является дигитонин.