БИОМАТЕРИАЛ ДЛЯ ХИРУРГИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
BIOMATERIAL FOR SURGERY AND ITS PRODUCTION METHOD

Изобретение относится к медицине, в частности, к трансплантологии и биотехнологии органов и тканей. Для восстановления функционально адекватных структур при различных повреждениях органов и тканей широко используются биоматериалы, которые изготавливаются из различных видов соединительной ткани. При введении в организм они играют роль матрицы и, постепенно замещаясь собственной тканью реципиента, обеспечивают репаративную регенерацию, реализуя генетические возможности самого организма - способности соединительной ткани к полному восстановлению. Наиболее подходящими для трансплантации признаны донорские человеческие (аллогенные) ткани, обладающие хорошей совместимостью и высоким регенераторным потенциалом. Однако, учитывая, что их забор, хранение и обработка сопряжены с рядом проблем законодательного, этического и эпидемиологического характера, для получения трансплантационных биоматериалов широко используются аналогичные ткани различных животных (ксенотрансплантаты).
Главной задачей при изготовлении биоматериалов для трансплантации является снижение антигенности исходных тканей, которая является одной из причин послеоперационных осложнений, включая воспаление, деградацию, рубцевание и отторжение. Известны способы получения биоматериалов, представляющих собой ацеллюлярный (лишенный клеточных элементов) матрикс различных видов соединительной ткани, например, консервированные трансплантаты на основе коллагена (US5336616A, US10906679B1), аллотрансплантаты для восстановления мягких тканей (US10238485B2, US10906679B2), алло- и ксенотрансплантаты мягких тканей (US10765703B2, US10850007B2), снижение антигенности которых и придание им определенных пластических свойств достигается комплексной физико-химической и/или ферментативной обработкой, приводящей к удалению большинства антигенных детерминант: форменных элементов крови и тканевой жидкости с растворенными низкомолекулярными белками, при сохранении их коллагенового каркаса. Как правило, для этих целей используются различные органические растворители (ацетон, метанол, этанол, изопропанол), солевые растворы (сульфид натрия, хлорид нария), кислоты (ЭДТА, надуксусная), щелочи (гидроксид натрия), перекись водорода, детергенты (додецилсульфат натрия, полиоксиэтилен, сапонин, Твин-80, Тритон Х100), протеолитические ферменты (эластаза, трипсин, термолизин) и др. (US4801299A, US5336616A, US6166288A).
Наиболее близким прототипом к заявляемому является «Биоматериал Аллоплант для регенеративной хирургии» (RU2189257C1), состоящий из консервированной донорской человеческой соединительной ткани с элиминированными клеточными элементами, которая соответствует по фиброструктуре замещаемой ткани на 70%, а в волокнистых компонентах донорской соединительной ткани на 80-90% разблокированы химические связи протеогликанов и гликопротеинов, структурированные в пучках коллагеновых волокон и частично элиминированы из пучков волокон гликозаминогликаны до остаточного содержания не менее 50%, что достигается путем механической очистки донорской ткани от жировой клетчатки и остатков мышечной ткани и дальнейшей последовательной обработке химическими реактивами.
Для приготовления биоматериала Аллоплант (там же, RU2189257C1) используют донорскую соединительную ткань, на 70% соответствующую структуре замещаемой ткани, что устанавливают с помощью поляризационно-оптического метода.
Донорскую ткань освобождают, при наличии, от жировой клетчатки и мышечной ткани, затем последовательно обрабатывают анионными и катионными детергентами с целью мембранолиза. Одновременно осуществляют контроль за разблокированием связей протеогликонов и гликопротеинов в пучках коллагеновых волокон и элиминацией гликозаминогликанов. Контроль проводят гистохимическим методом. По достижении 90%-го разблокирования связи протеогликанов и гликопротеинов и не более 50%-ой элиминации гликозаминогликанов обработку прекращают. Биоматериал отмывают от реагентов, фасуют в стеклянные флаконы, заливают консервантом и проводят радиационную стерилизацию с использованием ускорителя электронов.
Например, для приготовления биоматериала Аллоплант, используют биоматериал, представляющий собой комбинацию донорских тканей хряща и дермы, которые по фиброструктуре на 70% соответствуют замещаемым тканям. Донорские ткани освобождают от рогового слоя и подкожной жировой клетчатки, остатков костной ткани, промывают в проточной воде. Далее ткани последовательно обрабатывают детергентами, выбранными из группы (додсцилсульфат натрия, цетилпиридиния хлорид), с целью мембранолиза в течение 12-18 часов, затем в течение 1-5 часов - веществами, экстрагирующими жир и коагулирующими белки (диэтиловый эфир + этиловый спирт).
Указанное разблокирование на 80-90% химических связей протеогликанов и гликопротеинов и их удаление однозначно свидетельствует о значительном разрушении исходной фиброархитектоники, представленной прочной трехмерной разветвленной сетью волокон, состоящих из коллаген-протеогликановых комплексов. Это может привести к быстрому и сплошному замещению, при котором исключается роль формообразующего фактора волокнистого остова трансплантата. Известно, также, что гликозаминогликаны являются естественными радиопротекторами, уровень содержания которых в значительной степени определяет радиоустойчивость тканей (Куценко С.А., Бутомо Н.В., Гребенюк А.Н. и др. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита: Учебник / Под ред. Куценко С.А. - СПб.: Фолиант, 2004. 528с.; Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных М.: Высш. шк., 2004. 549 с.), поэтому их удаление крайне нежелательно.
Используемые при получении некоторых аналогоа и прототипа химические агенты (додецилсульфат натрия, цетилпиридиния хлорид, ТВИН 80, Тритон Х-100), являются дорогостоящими импортными реактивами, токсичными и трудноудаляемыми из обработанных биологических тканей, что приводит к существенным затратам при производстве биоматериала и нежелательным побочным эффектам: выраженной воспалительной реакции в месте введения и дополнительной аллергизации организма.
Для достижения бактериологической безопасности биоматериалов, изготовленных из донорских тканей, используются различные методы стерилизации, самым эффективным из которых признан метод радиационной стерилизации потоком быстрых электронов и гамма-излучением (Каушанский Д.А., Кузин A.M Радиационно-биологическая технология //М.: Энергоатомиздат, 1984.-151с.; Пономарев В.Н., Носкова Т.Н. Состояние промышленного внедрения радиационного способа стерилизации медицинских изделий однократного применения // Вестник АДС «Радтех-Евразия». 1993. - № 1.- С.18-21.; Туманян, М.А. Радиационная стерилизация как биотехнологический процесс и перспективы её развития //1 Всесоюзный радиобиологический съезд. Пущино, 1989. - Т. 3. - С. 805-806).
Однако, стандарты, регламентирующие дозы радиации не учитывают структурные особенности самих биологических тканей и методы их консервации, что часто приводит к нежелательным деструктивным изменениям в биоматериалах (Belkoff S., Haut R. Microstructurally based model analysis of gamma-irradiated tendon allografts // J. Orthop. Res. -1992. Vol. 10, № 3. - P. 461; Bogdansky S, et al. Effective use of optimized, high-dose (50 kGy) gamma irradiation for pathogen inactivation of human bone allografts //Biomaterials, 2005, № 26.- Р.2033-2042; Dziedzic-Goclawska A., Kaminski A. Is it possible to diminish the damage induced by radiation-sterilization to connective tissue grafts? //13th International Congress of the European Association of tissue Banks. Prague, 2004. - P. 108).
Известно, что наибольшие изменения фиброархитектоники биоматериалов и их пластических свойств находятся в прямой зависимости от вида и дозы ионизирующего излучения. Стерилизация потоком быстрых электронов оказывает более выраженное деструктивное воздействие, чем гамма-излучение. Сроки и характер замещения соединительнотканных материалов определяются степенью сохранности их волокнистого остова. Сохраненная фиброархитектоника биоматериала способствует его постепенному замещению адекватным регенератом, тогда как деструкция волокнистого каркаса приводит к его быстрой резорбции с формированием рубца (Шангина О. Р. Анализ структуры соединительной ткани при различных видах радиационного воздействия // Морфология. Научно-теоретический медицинский журнал. Санкт-Петербург.- №4, Т.129, 2006 г.- С.139).
Используемый в прототипе метод радиационной стерилизации потоком быстрых электронов не учитывает в этом смысле вид исходной соединительной ткани, которые различаются по своей фиброархитектонике и биохимическому составу и являются материалом с низким уровнем структурной стабильности, деструктивные изменения в котором проявляются даже при незначительных вариациях доз радиации. Это способствует неконтролируемым процессам радиолиза и деструкции, что существенным образом сказывается на механических и биохимических свойствах биоматериала, приводящим к его быстрому лизису после пересадки и формированию рубцового регенерата.
Определенным недостатком является использование для изготовления прототипа только донорских человеческих тканей, что значительно ограничивает его широкое клиническое применение. Для приготовления биоматериала Аллоплант используют только ту донорскую соединительную ткань, которая на 70% соответствующую структуре замещаемой ткани, что существенно сужает возможности выбора исходного материала.
Указанных недостатков можно избежать, если при изготовлении биоматериала для хирургии будут использованы как аллогенные, так и ксеногенные ткани с сохранением всех структурных компонентов соединительнотканного матрикса (коллагена различных типов, эластина, протеогликанов и гликопротеинов), физико-химическая обработка исходных тканей будет проводиться с использованием более доступных и безопасных химических реагентов, а вид и дозы радиационной стерилизации биоматериалов будут подбираться с учетом морфологических особенностей облучаемых тканей.
Задача изобретения - получение биоматериала, морфологически и биохимически адекватного органам и тканям организма реципиента из различных видов донорской соединительной ткани.
Технический результат - создание эффективного и безопасного биоматериала для хирургии из аллогенных и ксеногенных донорских тканей с предельно низкими антигенными свойствами, с учетом всех структурных компонентов соединительнотканного матрикса, и способ его получения с использованием щадящих химических реагентов и селективной радиационной стерилизации, не приводящей к нарушению фиброархитектоники и прочностных свойств донорской соединительной ткани.
Сохранение прочностных свойств соединительной ткани имеет принципиальное значение для трансплантатов. Например, плотная оформленная соединительная ткань (сухожилия, связки) характеризуется линейной (одноосной) ориентацией пучков коллагеновых волокон, что и определяет ее механические свойства. Испытания на прочность трансплантатов сухожилия проводили при одноосном растяжении, а рабочая часть образца была ориентирована вдоль пучков коллагеновых волокон. Величина относительного удлинения нативных трансплантатов сухожилия составляла 0,15±0,002; обработанных по предлагаемому способу - 0,1±0,004. Изменение предела прочности в данном ряду имело иную динамику. Наибольшее значение предела прочности отмечалось у нативных трансплантатов сухожилия - 104,5±3,3 МПа. У обработанных по предлагаемому способу трансплантатов сухожилия предел прочности равен 95,4±4,2 МПа. Сходная тенденция наблюдалась в изменении модуля упругости (Юнга). Наибольшее значение данного показателя отмечалось у нативных трансплантатов сухожилия - 1110±36 МПа (таблица 1).
Таблица 1. Прочностные свойства трансплантатов сухожилия
ТрансплантатыСухожилия
Предел прочности (МПа)(М±m) (М±L)
Относительное удлинение(М±m) (М±L)
Модуль упругости (Юнга) (МПа)(М±m) (М±L)
Нативные
104,5±3,3(101,2÷107,8)
0,15±0,002(0,148÷0,152)
1110,0±36,0(1074,0÷1146,0)
Обработанныепо заявляемому способу
95,4±4,2(91,2÷99,6)
0,1±0,004(0,096÷0,104)
954,0±29,0(925,0÷983,0)
Например, плотная неоформленная соединительная ткань (дерма) имеет многовекторную ориентацию пучков коллагеновых волокон. Испытания прочностных свойств данных трансплантатов проводили на растяжение. Анализ полученных результатов показал, что параметры относительного удлинения, предела прочности и модуля упругости не претерпевают выраженных изменений. Средняя величина относительного удлинения имеет одинаковое значение для всех исследуемых трансплантатов дермы и равна 0,6. Незначительные изменения наблюдались при обсчете параметров предела прочности и модуля упругости, цифровые значения которых представлены в таблице 2.
Таблица 2. Прочностные свойства трансплантатов дермы
Трансплантатыдермы
Предел прочности(МПа)(М±m) (М±L)
Относительное удлинение(М±m) (М±L)
Модуль упругости (Юнга) (МПа)(М±m) (М±L)
Нативные
12,9±0,7(12,2÷13,6)
0,6±0,06(0,54÷0,66)
23,5±1,2(22,3÷24,7)
Обработанныепо заявляемому способу
13,1±0,4(12,7÷13,5)
0,6±0,02(0,58÷0,62)
23,6±1,0(22,6÷24,6)
Упруго-прочностные свойства скелетной соединительной ткани (хрящ, кости), например, трансплантатов гиалинового хряща определяли двумя параметрами - предел прочности и деформация на сжатие (относительное укорочение). Так, для нативных и обработанных по предлагаемому способу трансплантатов гиалинового хряща величина предела прочности составляла 10,8±0,8 МПа и 10,1±0,6 МПа соответственно. Практически такая же величина среднего значения предела прочности наблюдалась у обработанных по предлагаемому способу. Среднее значение величины пластической деформации у нативных трансплантатов гиалинового хряща равно 0,26±0,08. У обработанных по предлагаемому способу трансплантатов данная величина составляла 0,23±0,05. Сводные данные по изменению прочностных показателей трансплантатов хряща, в зависимости от физико-химической обработки представлены в таблице 3.
Таблица 3. Прочностные свойства трансплантата гиалинового хряща
Трансплантатыхряща
Предел прочности (МПа)(М±m) (М±L)
Относительное укорочение(М±m) (М±L)
Нативные
10,8±0,8(10,0÷11,6)
0,26±0,08(0,18÷0,18)
Обработанныепо заявляемому способу
10,1±0,6(9,5÷10,7)
0,23±0,09(0,14÷0,32)
Таким образом, в ходе исследований прочностных свойств соединительнотканных трансплантатов, как нативных, так и подвергнутых физической и химической обработке и радиационной стерилизации по предлагаемому способу, получены следующие результаты: химическая и радиационная обработка соединительной ткани по предлагаемому способу не изменяет прочностных параметров трансплантатов.
Особенности фиброархитектоники и биохимического состава различных типов соединительной ткани позволили выделить три уровня структурной стабильности, соответствующие различной устойчивости тканей к химическому и радиационному воздействию. В зависимости от уровня структурной стабильности соединительной ткани, которая определяется морфологическими исследованиями и который, в свою очередь зависит от исходной фиброархитектоники и наличия межклеточных компонентов ткани, а также назначения получаемого биоматериала, используют тот способ обработки соединительной ткани, который иллюстрируют приведенные ниже примеры.
Пример 1. Рыхлая соединительная ткань (висцеральные оболочки). Относится к первому, наиболее лабильному, уровню структурной стабильности. Образована сетью тонких, хаотично расположенных коллагеновых волокон, связывающих пучки первого порядка, между которыми находится большое количество основного аморфного вещества, представленного гликозаминогликанами. Обладает невысокой механической прочностью, низкой радиорезистентностью и легкой проницаемостью для жидкостей. При обработке требуются низкие концентрации реактивов с небольшим временем экспозиции и щадящие дозы радиационной стерилизации. Изготавливается из висцеральных серозных оболочек некоторых органов человека (фиброзной капсулы почек, глиссоновой капсулы печени, париетальной брюшины и др.) или аналогичной ткани животных. Для этого висцеральные ткани подвергают механической очистке от остатков прилегающих тканей и посторонних загрязнений, промывают в проточной воде, помещают в 3% раствор перекиси водорода на непродолжительное время (не более 15 минут) для удаления кровяных элементов и отполаскивают в изотоническом растворе натрия хлорида. Затем, для обезжиривания ткани помещают в раствор 95 % этилового спирта и диэтилового эфира в соотношении 3:1, после чего несколько раз промывают в изотоническом растворе натрия хлорида. Обработанным тканям придают различные форму и размеры в зависимости от клинического назначения, помещают в стеклянные флаконы с консервирующим раствором этилового спирта и герметично укупоривают. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением потоком быстрых электронов в дозе не более 15 кГр (1,5 Мрад). Используется для изготовления биоматериалов для мембранной пластики, для покрытия резецированных поверхностей органов и тканей при различных хирургических вмешательствах.
Пример 2. Плотная оформленная соединительная ткань (сухожилия, связки). Относится ко второму уровню структурной стабильности. Состоит из плотно расположенных коллагеновых волокон, образуя параллельно идущие пучки, связанные небольшим количеством основного аморфного вещества и тонкой сетью эластических волокон. Обладает высокой линейной прочностью в направлении действия нагрузки, низкой радиорезистентностью и легкой проницаемостью для жидкостей. При обработке требуются низкие концентрации реактивов с небольшим временем экспозиции и щадящие дозы радиационной стерилизации. При стерилизации потоком быстрых электронов структурные изменения в виде разрушения оплетающей сети коллагеновых волокон и продольного расщепления пучков отмечаются уже при дозе радиационного воздействия до 10-15 кГр, что является недостаточным для обеспечения гарантированного стерилизующего эффекта. Увеличение же стерилизующей дозы неизбежно приводит к полной деструкции ткани. Стерилизация гамма-излучением в стандартных стерилизующих дозах до 25 кГр позволяет в значительной степени сохранить исходную фиброархитектонику. Используется для изготовления биоматериалов для фиксирующей пластики. Изготавливаются из сухожилий и фасций человека (ахиллово сухожилие, широкая фасция бедра, сухожилия мышц спины и др.) или аналогичной ткани животных. Для этого сухожилия подвергают механической очистке от остатков прилегающих тканей и посторонних загрязнений, промывают в проточной воде, помещают в 6% раствор перекиси водорода на непродолжительное время (не более 15 минут) для удаления кровяных элементов и тканевой жидкости и отполаскивают в воде. Затем помещают в гипертонический раствор натрия хлорида для окончательного разрушения и экстракции клеточных элементов, после чего отполаскивают в изотоническом растворе натрия хлорида. Обработанным тканям придают различные форму и размеры в зависимости от клинического назначения, помещают в стеклянные флаконы с консервирующим раствором этилового спирта и герметично укупоривают. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением гамма-лучами в дозе до 25 кГр (2,5 Мрад). Изготовленный таким образом целевой продукт применяется в хирургии в качестве шовного материала и для фиксации органов и тканей при реконструктивных операциях.
Пример 3. Жировая ткань. Относится к третьему уровню структурной стабильности. Представлена жировыми дольками, разделенными сетью коллагеновых волокон и, благодаря этому, имеющая прочную пространственную структуру с высокими упруго-деформационными свойствами. Обладает высокой прочностью, высокой радиорезистентностью и низкой проницаемостью для жидкостей. Для удаления антигенных детерминант требуется интенсивное физическое воздействие и длительная экспозиция в растворах при химической обработке. Также необходимы более высокие стерилизующие дозы. Используется для изготовления биоматериалов для объемной пластики, что обусловлено длительным нахождением биоматериала в зоне трансплантации с сохранением определенных объемов, размеров и формы. Изготавливаются из подкожно-жировой клетчатки подошвы человека или аналогичной ткани животных. Для этого жировую ткань подвергают механической очистке от остатков прилегающих тканей и посторонних загрязнений, промывают в проточной воде, помещают в 6% раствор перекиси водорода для удаления кровяных элементов и многократно последовательно отполаскивают в изотоническом растворе натрия хлорида. Затем, для частичного обезжиривания ткани помещают в ультразвуковую ванну с раствором этилового спирта в концентрации 95 % и подвергают действию ультразвука в течение нескольких часов, после чего несколько раз промывают в изотоническом растворе натрия хлорида до отсутствия опалесценции в промывном растворе. Обработанным тканям придают различные форму и размеры в зависимости от клинического назначения, помещают в стеклянные флаконы с консервирующим раствором этилового спирта и герметично укупоривают. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением потоком быстрых электронов в дозе до 25 кГр (2,5 Мрад). Изготовленный таким образом целевой продукт применяется в хирургии для замещения объемных дефектов тканей
Пример 4. Плотная неоформленная соединительная ткань (дерма). Относится к третьему уровню структурной стабильности. Состоит из большого количества беспорядочно расположенных в различных плоскостях коллагеновых и эластических волокон, которые переплетаясь между собой, формируют трехмерную сеть, обеспечивающую высокую прочность ткани при воздействии деформирующих сил любой направленности. Значительную часть дермы составляет основное вещество, главным компонентом которого является гиалуроновая кислота с выраженными радиопротекторными свойствами. Обладает высокой прочностью, высокой радиорезистентностью и очень низкой проницаемостью для жидкостей. Для удаления антигенных детерминант требуется интенсивное физическое воздействие и длительная экспозиция в растворах при химической обработке. Также необходимы высокие стерилизующие дозы. Используется для изготовления биоматериалов для каркасной пластики. Изготавливаются из дермы человека или животных. Для этого дерму подвергают механической очистке от остатков прилегающих тканей и посторонних загрязнений, промывают в проточной воде в течение длительного времени, помещают в 6% раствор перекиси водорода для удаления кровяных элементов и многократно последовательно отполаскивают в изотоническом растворе натрия хлорида. Затем, для частичного обезжиривания ткани помещают в ультразвуковую ванну с раствором этилового спирта и подвергают действию ультразвука в течение нескольких часов, после чего несколько раз промывают в изотоническом растворе натрия хлорида до отсутствия опалесценции в промывном растворе. Обработанным тканям придают различные форму и размеры в зависимости от клинического назначения, помещают в стеклянные флаконы с консервирующим раствором этилового спирта и герметично укупоривают. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением потоком быстрых электронов в дозе 30 кГр (3,0 Мрад). Изготовленный таким образом целевой продукт применяется в хирургии для пластики орбиты, пластики век и других пластических операций, где требуются материалы с высокими прочностными характеристиками.
Пример 5. Скелетная соединительная ткань (хрящ, кости). Относится к третьему уровню структурной стабильности. Состоит из разветвленной сети коллагеновых волокон и минерализованного межклеточного вещества. Обладает очень высокой механической прочностью, высокой радиорезистентностью и практически полным отсутствием проницаемости для жидкостей. Для удаления антигенных детерминант требуется интенсивное физическое воздействие и длительная экспозиция в растворах при химической обработке. Также необходимы высокие стерилизующие дозы. Используется для изготовления биоматериалов для костной пластики. Изготавливаются из костей и хрящей человека или аналогичной ткани животных. Для этого кости или хрящи подвергают механической очистке от остатков прилегающих тканей и посторонних загрязнений, промывают в проточной воде в течение минут, помещают в 3% раствор перекиси водорода для удаления кровяных элементов и многократно последовательно отполаскивают в изотоническом растворе натрия хлорида. Затем, для частичного обезжиривания ткани помещают в ультразвуковую ванну с раствором этилового спирта и подвергают действию ультразвука в течение нескольких часов, после чего несколько раз промывают в изотоническом растворе натрия хлорида до отсутствия опалесценции в промывном растворе. Обработанным тканям придают различные форму и размеры в зависимости от клинического назначения, помещают в стеклянные флаконы с консервирующим раствором этилового спирта и герметично укупоривают. Стерилизацию проводят ионизирующим излучением потоком быстрых электронов в дозе 35 кГр (3,5 Мрад). Изготовленный таким образом целевой продукт применяется в хирургии для костной пластики.
При таких способах обработки соединительной ткани нарушение химических связей в коллаген-протеогликановых комплексах волокнистых структур тканевого матрикса не превышает 20%, что позволяет получать более морфологически адекватный материал, на 90-100% соответствующий фиброструктуре замещаемой ткани, способствует ее замещению анатомически и функционально полноценным регенератом без выраженных негативных реакций в зоне трансплантации.