МОДИФИЦИРОВАННАЯ ЛИПИДОМ ДВУХЦЕПОЧЕЧНАЯ РНК, ОБЛАДАЮЩАЯ ЭФФЕКТОМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
LIIPID MODIFIED DOUBLE-STRANDED DNA HAVING EFFECT OF RNA INTERFERENCE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к модифицированной липидом двухцепочечной РНК, способной эффективно ингибировать экспрессию гена-мишени. Более конкретно, настоящее изобретение относится к модифицированной липидом двухцепочечной РНК, которая обладает высокой устойчивостью к нуклеазе, высокой эффективностью внутриклеточного накопления, и вызывает превосходный эффект РНК-интерференции.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Разработка лекарственных средств для эффективного лечения трудноизлечимых заболеваний, таких как рак и СПИД, является важной задачей в области медико-биологических наук. Одним из потенциальных способов решения данной задачи является использования генетических лекарств, воздействующих только на специфические гены. В особенности, в качестве подобного генетического лекарства в последнее время много внимания привлекает к себе способ РНК-интерференции (РНКи), использующий короткую двухцепочечную РНК длиной в 21 нуклеотидное основание (малая интерферирующая РНК: миРНК). Способ РНКи впервые описан Fire et al. в 1998 (смотри непатентный документ 1). Согласно отчету Fire et al., когда гомологичная специфической области гена, функцию которого необходимо ингибировать, двухцепочечная РНК из приблизительно 100 пар оснований доставляется внутрь клеток, она расщепляется под действием дайсера на фрагменты длиной приблизительно от 20 до 25 пар оснований, и затем взаимодействует с множеством белков с образованием комплекса РНК/белок (такой комплекс обозначается как RISC: РНК-индуцированный ингибирующий комплекс), который связывается с гомологичным участком мРНК, синтезированной с гена-мишени, и таким образом значительно ингибирует экспрессию гена. Однако было отмечено, что когда длинная двухцепочечная РНК из приблизительно 30 пар оснований или длиннее доставляется внутрь клеток млекопитающих, индуцируется интерфероновый ответ, являющийся противовирусным ответом, и тем самым вызывается процесс апоптоза. Таким образом, применение способа РНКи в отношении млекопитающих считалось сложным. Затем Tuschl et al. химическим способом синтезировали двухцепочечную РНК длиной в 21 основание, которая имеет выступающие концы на обоих 3'-концах, и отмечено, что когда такая двухцепочечная РНК напрямую доставляется внутрь клеток млекопитающих, двухцепочечная РНК способна специфично к последовательности значительно ингибировать экспрессию гена без развития интерферонового ответа (смотри непатентный документ 2). Tuschl et al. в дальнейшем синтезировали короткие двухцепочечные РНК, состоящие из двухцепочечного фрагмента из 19 пар оснований и выступающего конца(ов) различных протяженностей на 3' или 5'-концах, и изучали их эффекты РНК-интерференции. В итоге, наблюдения показывают, что миРНК длиной в 21 основание, имеющие выступающий конец из 2 оснований на обоих 3'-концах, проявляли очень сильный эффект РНК-интерференции, в то время как другие типы коротких двухцепочечных РНК не демонстрировали значимый эффект РНК-интерференции. Основываясь на данной работе, способ РНК-интерференции с использованием двухцепочечной РНК длиной в 21 основание, имеющей выступающий конец из 2 оснований на обоих 3'-концах, является общеупотребительным. Способ ингибирования экспрессии гена-мишени с использованием короткой двухцепочечной РНК длиной в 21 основание представляет собой способ, обозначаемый в настоящем документе как "миРНК способ", для разграничения его со способом РНКи.
Благодаря тому, что в способе миРНК используют синтетическую РНК, получение и хранение образцов является сравнительно легким; кроме того, могут быть получены очень сильные эффекты. Таким образом, способ миРНК привлекает к себе значительное внимание не только в области медико-биологических наук, но также и в области биотехнологического бизнеса.
Однако данный превосходный способ миРНК также имеет проблему, требующую решения. Как описано выше, миРНК состоит из молекулы РНК, уже разделенной под действием нуклеазы. По сравнению с одноцепочечной РНК, фрагмент двухцепочечной РНК обладает сравнительно высокой устойчивостью к нуклеазе, содержащейся в среде и/или клетке. Однако двухцепочечная РНК, состоящая из 19 пар оснований, почти не производит известные эффекты РНК-интерференции. По существу отмечено, что, будучи доставленной внутрь клеток, содержащая последовательность гена-мишени синтетическая миРНК хотя и производит сильный ингибирующий эффект на экспрессию гена в течение приблизительно от 2 до приблизительно 4 суток, ее эффект РНК-интерференции значительно снижается в дальнейшем и практически полностью исчезает через приблизительно семь суток.
Недавно было показано, что различные химические модифицикации миРНК снабжают синтетические миРНК повышенной эффективностью внутриклеточного накопления и пролонгированными высокоактивными эффектами РНК-интерференции. Например, для повышения устойчивости к экзонуклеазному расщеплению, миРНК модифицируют посредством аминогруппы, тиоловой группы или участка без оснований на конце синтезированной миРНК. Однако отмечено, что большинство терминально модифицированных миРНК длиной в 21 основание обладают значительно сниженными эффектами РНК-интерференции.
Недавно J. Rossi et al. отметили, что двухцепочечная РНК из 27 пар оснований производит эффект РНК-интерференции приблизительно в 100 раз больший, чем двухцепочечная РНК длиной в 21 основание (смотри непатентный документ 3). Это возможно происходит благодаря тому, что после расщепления РНК из 27 пар оснований РНКаза III-подобным ферментом дайсером на миРНК длиной в 21 основание, белковый комплекс RISC распознает миРНК таким образом, что миРНК способно производить эффекты с большой эффективностью.
Как описано выше, благодаря тому, что РНК длиной в 27 оснований может производить превосходные эффекты РНК-интерференции, повышаются ожидания, связанные с использованием такой РНК в качестве генетического лекарства. Однако совершенно неизвестен эффективный технический способ для увеличения эффекта РНК-интерференции РНК длиной в 27 оснований. Кроме того, также неясен технический способ для увеличения эффекта РНК-интерференции двухцепочечной РНК протяженностью короче или длиннее 27 оснований и обладающей эффектом РНК-интерференции.
Двухцепочечные РНК, имеющие эффекты РНК-интерференции, как правило, сконструированы с учетом выступающих концов. Для РНК без выступающих концов (т.е., имеющие тупые концы) также изучались их эффекты РНК-интерференции. Однако результаты указывают на то, что эффекты РНК-интерференции двухцепочечной РНК затупленной на 5'-концевой стороне смысловой цепи практически такие же или ниже, чем эффекты двухцепочечных РНК, имеющих выступающий конец на 5'-концевой стороне смысловой цепи (смотри непатентный документ 4).
Липиды обладают высокой проницаемостью для клеточной мембраны, и признаны практичными для доставки лекарственных средств внутрь клеток. Ожидается, что присоединение таких липидов к двухцепочечной РНК, обладающей эффектом РНК-интерференции, повысит эффективность внутриклеточного накопления и таким образом усилит эффекты РНК-интерференции. Однако, известно, что если липид просто присоединен к двухцепочечной РНК, обладающей эффектом РНК-интерференции, то это резко снижает ее эффект РНК-интерференции. На известном уровне техники все еще необходимо сконструировать модифицированную липидом двухцепочечную РНК, обладающую одновременно превосходным эффектом РНК-интерференции и практическим эффектом, основанным на липиде.
Непатентный документ 1: Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998)
Непатентный документ 2: Tuschl et al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001)
Непатентный документ 3: J. Rossi et al., Nature Biotech., 23, 222-226 (2005)
Непатентный документ 4: J. T. Marques et al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2005)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ЗАДАЧА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ ПОСРЕДСТВОМ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предмет настоящего изобретения обеспечивает новую двухцепочечную РНК, имеющую высокую устойчивость к нуклеазе и высокую эффективность внутриклеточного накопления, и способную производить превосходный эффект РНК-интерференции. Другой предмет настоящего изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую новую двухцепочечную РНК. Дополнительный предмет настоящего изобретения обеспечивает способ ингибирования экспрессии гена-мишени, заключающий в себе введение двухцепочечной РНК внутрь клеток для ингибирования экспрессии гена-мишени.
СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ
Авторы настоящего изобретения проводили многочисленные исследования для получения описанных выше объектов и обнаружили, что, если липид присоединен напрямую или через линкер, по меньшей мере, к одному из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой цепи двухцепочечной РНК, содержащей смысловую цепь, имеющую комплементарную целевой последовательности в гене-мишени нуклеотидную последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи нуклеотидную последовательность, двухцепочечная РНК способна ингибировать экспрессию гена-мишени, то сконструированная таким образом двухцепочечная РНК обладает высокой нуклеазной устойчивостью и высокой эффективностью внутриклеточного накопления и производит превосходный эффект РНК-интерференции. Настоящее изобретение стало результатом дальнейшего изучения, основанного на данном открытии.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к следующей модифицированной липидом двухцепочечной РНК, фармацевтическим композициям, содержащим новую двухцепочечную РНК, способам ингибирования экспрессии гена-мишени и т.д.
Пункт 1. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК, содержащая смысловую цепь, имеющую комплементарную целевой последовательности в гене-мишени нуклеотидную последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи нуклеотидную последовательность, причем двухцепочечная РНК способна ингибировать экспрессию гена-мишени, и смысловая цепь имеет липид, присоединенный напрямую или через линкер, по меньшей мере, к одному из первых шести нуклеотидов на 5'-конце.
Пункт 2. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 1, тупоконечная на 5'-концевой стороне смысловой цепи, и тупоконечная или имеющая выступающий конец на 3'-концевой стороне смысловой цепи.
Пункт 3. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 1, имеющая выступающие концы одновременно на 5'- и 3'-концевых сторонах смысловой цепи.
Пункт 4. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по любому из пп. 1-3, в которой смысловая цепь состоит из 21-27 нуклеотидов.
Пункт 5. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 2, тупоконечная одновременно на 5'- и 3'-концевых сторонах смысловой цепи, и в которой каждая из смысловой и антисмысловой цепей состоит из 27 нуклеотидов.
Пункт 6. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 2, тупоконечная одновременно на 5'- и 3'-концевых сторонах смысловой цепи, и в которой каждая из смысловой и антисмысловой цепей состоит из 23 нуклеотидов.
Пункт 7. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 2, тупоконечная на 5'-концевой стороне смысловой цепи, причем смысловая цепь, состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая цепь, состоит из 23 нуклеотидов.
Пункт 8. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п. 3, в которой каждая из смысловой и антисмысловой цепей состоит из 21 нуклеотида.
Пункт 9. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по любому из пп. 1-8, в которой липид представляет собой жирную кислоту, имеющую от 6 до 50 атомов углерода.
Пункт 10. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по любому из пп. 1-9, в которой липид представляет собой лауриновую кислоту, стеариновую кислоту, миристиновую кислоту или пальмитиновую кислоту.
Пункт 11. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по любому из пп. 1-10, в которой липид присоединен, по меньшей мере, к одному из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой цепи через линкер, причем линкер представлен структурной формулой
2
n1
-NH-(CH)- (L-4),
где n1 представляет собой целое число от 1 до 40.
Пункт 12. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированную липидом двухцепочечную РНК по любому из пп. 1-10 и фармацевтически приемлемую основу.
Пункт 13. Применение модифицированной липидом двухцепочечной РНК по любому из пп. 1-10 для производства фармацевтической композиции с целью ингибирования экспрессии гена-мишени.
Пункт 14. Способ ингибирования экспрессии гена-мишени, включающий введение модифицированной липидом двухцепочечной РНК по любому из пп. 1-10 внутрь клеток для ингибирования экспрессии гена-мишени.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по настоящему изобретению модифицирована липидом на 5'-концевой стороне смысловой цепи и вследствие этого производит существенно увеличенный эффект РНК-интерференции. Более конкретно, модифицированная липидом двухцепочечная РНК имеет липид, присоединенный к специфическому участку РНК, и таким образом обладает заметно повышенной устойчивостью к нуклеазе и эффективностью внутриклеточного накопления без ослабления процессинга дайсером или связывания РНК с RISC, и таким образом может значительно способствовать медицинскому применению.
Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по настоящему изобретению даже в случае самостоятельного использования обладает превосходной способностью к внутриклеточной доставке. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК может доставляться внутрь клеток без использования любых известных средств для генетической трансфекции или использования сниженного количества известного средства для генетической трансфекции. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК по настоящему изобретению способна снижать выраженность цитотоксичности, сопровождающую использование известных средств для генетической трансфекции, тем самым гарантируя высокий уровень безопасности для клинических применений.
Таким образом, экспрессия гена-мишени может более эффективно ингибируется или ослабляться посредством применения фармацевтической композиции по настоящему изобретению или посредством применения способа ингибирования экспрессии гена-мишени по настоящему изобретению.
НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данной спецификации "тупой конец" или "тупоконечный" относится к концевой структуре двухцепочечной РНК, в которой основания в концевых участках смысловой цепи и основания в концевых участках антисмысловой цепи, комплементарной смысловой цепи, спарены без образования одиночной цепочки. "Выступающий конец" относится к концевой части нуклеотидной последовательности, в которой находится одиночная цепочка, не формирующая двойную цепочку благодаря отсутствию комплементарных оснований в концевых участках смысловой цепи двухцепочечной РНК или в концевых участках антисмысловой цепи, комплементарной смысловой цепи.
Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению включает смысловую цепь, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности в гене-мишени.
Ген-мишень в настоящем документе относится к гену, экспрессию которого необходимо ингибировать посредством эффекта РНК-интерференции. Ген-мишень для модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению не определен строго, и его можно выбирать подходящим образом согласно предполагаемому применению модифицированной липидом двухцепочечной РНК.
Целевая последовательность в гене-мишени не определена строго при условии, что экспрессию гена можно ингибировать эффектами РНК-интерференции. Целевую последовательность можно определять подходящим образом согласно известному способу, например, используя поиск NCBI BLAST и т.д. Например, целевая последовательность может являться областью, состоящей из 19-30 оснований, следующих за основаниями "АА" в области экзона, находящегося на расстоянии 50-100 оснований от стартового кодона кодирующей области (ORF) гена-мишени, и содержащая приблизительно 50% GC. В данной области экспериментально показано, что превосходные эффекты РНК-интерференции можно получать при помощи цепочки, комплементарной такой целевой последовательности. Например, целевую последовательность можно определять согласно инструкциям IDT (Integrated DNA Technologies, Inc.; дайсер-субстратный дизайн РНКи). Недавнее сообщение показало, что двухцепочечную РНК, обладающую сильными эффектами РНК-интерференции можно получать посредством конструирования двухцепочечной РНК, которая содержит: (i) пару A/U на 5'-концевой стороне антисмысловой цепи; (ii) пару G/C на 5'-концевой стороне смысловой цепи; и (iii) приблизительно пять пар A/U на 5'-концевой стороне антисмысловой цепи; (iv) и не содержит девять и более пар G/C (Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)).
Если смысловая цепь модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению не имеет выступающего конца, то смысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности. Если смысловая цепь имеет выступающий конец на 5'-конце и/или 3'-конце, то смысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности и нуклеотидную последовательность выступающего конца, присоединенную к 5'-концу и/или 3'-концу комплементарной нуклеотидной последовательности.
При условии достижения эффекта РНК-интерференции количество нуклеотидов, составляющих смысловую цепь в модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению, не определено строго и может выбираться подходящим образом согласно требуемой структуре двухцепочечной РНК. Количество нуклеотидов обычно составляет от 21 до 27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21, 23 или 27. Если смысловая цепь не имеет выступающего конца, то количество нуклеотидов, составляющих смысловую цепь, соответствует общему количеству нуклеотидов, составляющих комплементарную целевой нуклеотидную последовательность. Если смысловая цепь имеет выступающий конец, то количество нуклеотидов, составляющих смысловую цепь, соответствует сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих комплементарную целевой нуклеотидную последовательность. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению включает антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи нуклеотидную последовательность.
Если антисмысловая цепь модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению не имеет выступающего конца, то антисмысловая цепь состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной части или всем "комплементарным целевой последовательности нуклеотидам" смысловой цепи. Если антисмысловая цепь имеет выступающий конец на 5'-конце и/или 3'-конце, то антисмысловая цепь состоит из: нуклеотидной последовательности, части или всем "комплементарным целевой последовательности нуклеотидам" смысловой цепи; и нуклеотидной последовательности выступающего конца, присоединенного к 5'-концу и/или 3'-концу комплементарной нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. При условии достижения эффекта РНК-нтерференции количество нуклеотидов, составляющих антисмысловую цепь в модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению, не определено строго и может выбираться подходящим образом согласно требуемой структуре двухцепочечной РНК. Количество нуклеотидов обычно составляет от 21 до 27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21, 23 или 27. Если антисмысловая цепь не имеет выступающего конца, то количество нуклеотидов, составляющих антисмысловую цепь, соответствует общему количеству нуклеотидов, составляющих комплементарную целевой последовательности нуклеотидную последовательность. Если антисмысловая цепь имеет выступающий конец, то количество нуклеотидов, составляющих антисмысловую цепь, соответствует сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих комплементарную целевой нуклеотидную последовательность.
Нуклеотиды, составляющие смысловую цепь и антисмысловую цепь модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению, в основном представляют собой рибонуклеотиды. Для повышения устойчивости к ферментативному расщеплению последовательность РНК может содержать различные химически модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, 2'-F-модифицированные нуклеотиды, LNA (замкнутая нуклеиновая кислота) нуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или т.п. В особенности, если модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению имеет выступающий конец, то выступающий конец смысловой цепи и/или антисмысловой РНК может состоять из дезоксирибонуклеотидов. Примеры таких химически модифицированных нуклеотидов включают нуклеотиды с фосфат-модифицированной структурой, такие как фосфотиоат-модифицированная ДНК/РНК и боранофосфат-модифицированная ДНК/РНК; 2'-модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-О-Ме-модифицированные РНК и 2'-F-модифицированные РНК; модифицированные нуклеотиды, полученные посредством сшивания сахара молекулы нуклеотида, такие как LNA (замкнутая нуклеиновая кислота) и ENA (2'-O-,4'-C-этилен- соединенные нуклеиновые кислоты); модифицированные нуклеотиды, имеющие различные структуры, такие как ПНК (пептидная нуклеиновая кислота) и морфолиннуклеотид; нуклеотиды с модифицированными основаниями, такие как 5-фторуридин и 5-пропилуридин; и т.п.
Структурно модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению не определена строго при условии, что смысловая и антисмысловая цепи гибридизованы в двойную цепь. Например, модифицированная липидом двухцепочечная РНК предпочтительно имеет следующую структуру: структура (A), в которой двухцепочечная РНК тупоконечная (т.е. имеет тупой конец) на 5'-концевой стороне смысловой цепи и тупоконечная или имеет выступающий конец (одноцепочечный фрагмент) на 3'-концевой стороне смысловой цепи; структура (B), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы на 5' и 3'- на 5'-концевых сторонах смысловой цепи. Структура, в которой двухцепочечная РНК имеет выступающий конец на 3'-концевой стороне смысловой цепи включает случаи, когда 3'-концевой фрагмент смысловой цепи образует выступающий конец, и случаи, когда 5'-концевой фрагмент антисмысловой цепи образует выступающий конец. Структура, в которой двухцепочечная РНК имеет выступающий конец на 5'-концевой стороне смысловой цепи включает случай, когда 5'-концевой фрагмент смысловой цепи образует выступающий конец, и случай, когда 3'-концевой фрагмент антисмысловой цепи образует выступающий конец.
Для достижения дополнительно усиленного эффекта РНК-интерференции среди двухцепочечных РНК, которые можно использовать для создания модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению, особенно предпочтительны двухцепочечные РНК, имеющие структуры с (A-1) по (A-3), представленные ниже, среди имеющих указанную выше структуру (A), и особенно предпочтительны двухцепочечные РНК со структурой (B-1), представленной ниже, среди имеющих указанную выше структуру (B). Структура (A-1), в которой двухцепочечная РНК тупоконечная на обоих 5' и 3'-концах смысловой цепи, и каждая из смысловых и антисмысловых цепей состоит из 27 нуклеотидов; структура (A-2), в которой двухцепочечная РНК тупоконечная на обоих 5' и 3'-концах смысловой цепи, и каждая из смысловых и антисмысловых цепей состоит из 23 нуклеотидов, соответственно; структура (A-3), в которой двухцепочечная РНК тупоконечная на 5'-концевой стороне смысловой цепи, и смысловая цепь состоит из 25 нуклеотидов, и антисмысловая цепь состоит из 23 нуклеотидов; и структура (B-1), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы, состоящие каждый из двух нуклеотидов на каждом 3'-конце смысловой цепи и 3'-конце антисмысловой цепи, и каждая из смысловых и антисмысловых цепей состоит из 21 нуклеотида.
Более конкретно, в структурах (A-1) и (A-2) смысловые и антисмысловые цепи гибридизованы без образования выступающих концов. В структуре (A-3) смысловые и антисмысловые цепи гибридизованы таким образом, что двухцепочечная РНК тупоконечная на 5'-конце смысловой цепи, и первые и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой цепи образуют выступающий конец. Структура (B-1) такова, что с первого по 19-й нуклеотиды с 5'-конца смысловой цепи и с третьего по 21-й нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой цепи гибридизованы таким образом, что первый и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой цепи и первый и второй нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой цепи образуют выступающие концы, соответственно.
Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению имеет, по меньшей мере, один липид, присоединенный, по меньшей мере, к одному из первых шести нуклеотидов с 5'-конца смысловой цепи. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению не имеет замещающих групп ни в какой другой позиции, кроме 5'-концевого фрагмента смысловой цепи. Более конкретно, замещающие группы не содержатся в иных областях, кроме 5'-концевого фрагмента смысловой и антисмысловой цепи, и эти области состоят из нуклеотидов. Присоединение липида(ов) только к 5'-концевому фрагменту смысловой цепи способно повысить эффективность внутриклеточного накопления и обеспечить исключительно превосходный эффект РНК-интерференции.
Присоединенный к смысловой цепи модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению липид не определен строго, и вследствие этого примеры включают простые липиды (сложные эфиры жирных кислот с различными спиртами); сложные липиды, такие как фосфолипиды и гликолипиды; производные липидов, такие как жирные кислоты, высшие спирты, жирорастворимые витамины, стероиды и углеводороды. Для повышения эффективности внутриклеточного накопления и эффекта РНК-интерференции, используемый липид является предпочтительно производным липида, более предпочтительно жирной кислотой, имеющей от 6 до 50 атомов углерода, еще более предпочтительно жирной кислотой, имеющей от 10 до 22 атомов углерода, особенно предпочтительно жирной кислотой, имеющей от 12 до 18 атомов углерода, более конкретно, предпочтительно лауриновой кислотой, стеариновой кислотой, миристиновой кислотой или пальмитиновой кислотой и наиболее предпочтительно пальмитиновой кислотой.
Способ присоединения липида к смысловой цепи для образования модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению не определен строго. Липид можно присоединять к смысловой цепи напрямую или через линкер. В настоящем изобретении, линкер, через который липид присоединен к смысловой цепи не является линкером, состоящим из нуклеиновой кислоты. Линкер не определен строго при условии, что посредством него можно соединять липид и смысловую цепь. Например, в качестве линкера можно использовать линкеры, имеющие следующие структуры:
-O-Co-O- (L-1)
-NH-CO-O- (L-2)
-NH-CO-NH- (L-3)
2
n1
-NH-(CH)- (L-4)
2
n1
-S-(CH)- (L-5)
2
n1
-CO-(CH)-CO- (L-6)
2
n1
-CO-(CH)-NH- (L-7)
2
n1
-NH-(CH)-NH- (L-8)
2
n1
-CO-NH-(CH)-NH-CO- (L-9)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-NH-CO- (L-10)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-NH-C-(=S)- (L-11)
2
n1
-CO-O-(CH)-0-CO- (L-12)
2
n1
-C(=S)-O-(CH)-O-CO- (L-13)
2
n1
-C(=S)-O-(CH)-O-C-(=S)- (L-14)
2
n1
-CO-NH-(CH)-O-CO- (L-15)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-O-CO- (L-16)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-O-C-(=S)- (L-17)
2
n1
-CO-NH-(CH)-O-CO- (L-18)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-CO- (L-19)
2
n1
-C(=S)-O-(CH)-NH-CO- (L-20)
2
n1
-C(=S)-NH-(CH)-O-C-(=S)- (L-21)
2
2
n2
2
-NH-(CHCHO)-CH(CHOH)- (L-22)
2
2
n2
2
-NH-(CHCHO)-CH- (L-23)
В указанных выше формулах (L-4)-(L-21), n1- это число от 1 до 40, предпочтительно число от 2 до 20, и более предпочтительно число от 2 до 12.
В указанных выше формулах (L-22) и (L-23), n2 это число от 1 до 20, предпочтительно число от 1 до 10, и более предпочтительно число от 1 до 6.
Линкеры в формулах (L-4)-(L-23) могут связывать смысловую цепь как с правой, так и с левой стороны. Предпочтительно, специфический участок смысловой цепи (или нуклеиновая кислота в конъюгате нуклеиновой кислоты) присоединен с правой стороны к линкерам по формулам (L-4)-(L-23), и липид присоединен к их левой стороне.
Участок присоединения липида к линкеру может выбираться соответствующим образом согласно типам используемых липидов и линкеров. Например, если в качестве липида используется жирная кислота, то ее можно присоединять посредством сложноэфирной связи, амидной связи или подобной связи, образуемой между карбоксильной группой жирной кислоты и линкером. Более конкретно, если в качестве липида используется жирная кислота, то липид предпочтительно присоединен посредством замены -OH карбоксильной группы жирной кислоты линкером.
Линкер выбирают подходящим образом согласно типу присоединяемого липида. Если в качестве липида используется жирная кислота, то предпочтительно использовать линкеры, представленные формулой (L-4).
В дополнение к указанным выше линкерам также применимы другие линкеры. Вследствие этого примеры включают линкеры двойного действия (линкеры, содержащие 2 функциональные группы), такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат, N-4-малеинимид масляной кислоты, S-(2-пиридилдитио)-цистамин, йодоацетоксисукцинимид, N-(4-малеинимидбутилокси)-сукцинимид, N-[5-(3'-малеинимидпропиламид)-1-карбоксипентил]-иминодиуксусная кислота, N-(5-аминопентил)-иминодиуксусная кислота и т.п. В смысловой цепи, нуклеотид, присоединенный к липиду или к линкеру, используемому для присоединения липида, не определен строго при условии, что это, по меньшей мере, один из первых шести нуклеотидов 5'-конца смысловой цепи, предпочтительно - по меньшей мере, один из первых четырех нуклеотидов 5'-конца, более предпочтительно первый и/или второй нуклеотиды 5'-конца, и особенно предпочтительно нуклеотид на 5'-конце (первый нуклеотид 5'-конца).
Участок присоединения смысловой цепи к липиду или к линкеру, используемому для присоединения липида, не определен строго. Предпочтительно она присоединена посредством замены атома водорода в гидроксильной группе остатка фосфорной кислоты специфического нуклеотида смысловой цепи.
Количество липидов, присоединяемых модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению, не определено строго. Например, можно присоединять от одного до трех липидов, предпочтительно один или два липида, и более предпочтительно один липид.
Модифицированную липидом двухцепочечную РНК по изобретению можно получать синтезом смысловой цепи, имеющей дополнительно, по меньшей мере, один присоединенный липид, и антисмысловой цепи соответственно, и гибридизацией смысловой и антисмысловой цепей согласно известным способам. Смысловую цепь, имеющую дополнительно присоединенный липид, также можно получать согласно известным способам синтеза.
Модифицированная двухцепочечная РНК по изобретению может вводиться внутрь клеток для ингибирования или ослабления экспрессии гена-мишени, и таким образом может использоваться в качестве фармацевтического препарата для ингибирования или ослабления экспрессии гена-мишени или композиции для генной терапии, т.е., фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция по изобретению может выпускаться в составе различных лекарственных форм. Примеры лекарственных форм фармацевтической композиции по изобретению включают жидкие препараты, такие как жидкости (такие как сиропы), капли, и инъекционные препараты; твердые препараты, такие как таблетки, пилюли, порошки, гранулы и капсулы (такие как мягкие капсулы); и т.п. Если фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой жидкий препарат, то композиция может замораживаться или сохраняться после удаления из него воды посредством лиофилизации и т.д. Лиофилизированные препараты и сухие сиропы и т.д. можно применять в виде растворов после добавления в момент применения дистиллированной воды для инъекций, стерильной воды или т.п. Если фармацевтическая композиция по изобретению представляет собой твердый препарат, то композицию можно использовать в виде раствора после добавления в момент применения дистиллированной воды для инъекций, стерильной воды или т.п.
фармацевтическая композиция может состоять только из модифицированной липидом двухцепочечной РНК, или при необходимости может также содержать приемлемый фармацевтический носитель. Используемый носитель не определен строго при условии, что он не нарушает ингибирующее влияние модифицированной двухцепочечной РНК по изобретению на экспрессию гена-мишени, и может выбираться подходящим образом соответственно дозировке. Примеры возможных носителей включают очищенную воду, водные растворы сахаров, буферы, физиологический раствор, водные растворы полимеров, вода, очищенная от РНКазы, и т.д. Если фармацевтическая композиция по изобретению содержит носитель, то пропорции этих компонентов в композиции не определены строго при условии, что они не нарушают ингибирующее и ослабляющее влияние модифицированной двухцепочечной РНК по изобретению на экспрессию гена-мишени, и могут выбираться подходящим образом соответственно дозировке.
Например, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать модифицированную двухцепочечную РНК в количестве от 0,001 до 50, более предпочтительно от 0,01 до 10, и еще более предпочтительно от 0,1 до 1. фармацевтическая композиция по изобретению может содержать носитель в количестве от 50 до 99,999 масс.%, предпочтительно от 90 до 99,99 масс.%, и еще более предпочтительно от 99 до 99,9 масс.% от общей массы композиции.
Ген-мишень и заболевание, в отношении которых применяют фармацевтическую композицию по изобретению, не определены строго. Известна взаимосвязь между геном-мишенью и заболеванием. Тип клетки, внутрь которой вводят фармацевтическую композицию по изобретению, не ограничен. Используемая клетка может быть человеческой или не принадлежащей человеку животной клеткой. Фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать in vitro или in vivo.
Количество и способ введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению внутрь клеток такие же, как в обычном способе миРНК. Например, если фармацевтическая композиция по изобретению используется для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь клеток in vitro, то можно использовать способ культивирования клеток в присутствии соответствующего количества фармацевтической композиции. Если фармацевтическая композиция по изобретению используется для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь культивируемых клеток или клеток, выделенных из живого организма in vitro, то модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению может вводиться в присутствии сыворотки. Если фармацевтическая композиция по изобретению используется для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь клеток in vivo, то можно использовать непосредственную инъекцию фармацевтической композиции внутрь ткани; внутривенную, подкожную, мышечную, внутрибрюшинную, внутриглазную, желудочно-кишечную или зубную инъекцию; ингаляционное введение внутрь носовой полости, ротовой полости, легких или т.п.; пероральное введение; трансдермальное введение через кожу; трансмукозальное введение через слизистую ротовой полости, слизистую влагалища, слизистую глаза, слизистую прямой кишки и слизистую матки; и т.п. способы.
Если используется фармацевтическая композиция по изобретению, то вместе с ней может необязательно использоваться известное средство для генетической трансфекции, применяемое для трансфекции миРНК внутрь клеток. Альтернативно, фармацевтическая композиция по изобретению может содержать средство для генетической трансфекции. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК, содержащаяся в фармацевтической композиции по изобретению, даже в случае самостоятельного использования имеет превосходную способность к трансфекции клеток. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК может вводиться внутрь клеток без помощи известного средства для генетической трансфекции, используемого для трансфекции миРНК внутрь клеток, или при помощи сниженного количества средства для генетической трансфекции.
Можно использовать эффективное количество фармацевтической композиции по изобретению, например, такое количество, что модифицированную липидом двухцепочечную РНК вводят в количестве от 0,001 до 10 пМ, предпочтительно от 0,001 до 1 пМ, и более предпочтительно от 0,01 до 0,1 пМ на клетку.
фармацевтическая композиция по изобретению способна ингибировать или ослаблять экспрессию гена-мишени и тем самым предотвращать, улучшать или лечить заболевание, вызванное экспрессией гена-мишени.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу ингибирования экспрессии гена-мишени. Способ ингибирования экспрессии гена-мишени включает трансфекцию модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь клеток.
Ген-мишень или заболевание не определено строго, и, как указано выше, известна взаимосвязь между геном-мишенью и заболеванием. Тип клетки, внутрь которой вводят модифицированную двухцепочечную РНК по изобретению, не ограничен. Используемая клетка может быть человеческой или не принадлежащей человеку животной клеткой. Фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать in vitro или in vivo.
В способе ингибирования экспрессии гена-мишени по изобретению количество и способ введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению внутрь клеток такие же, как в обычном способе миРНК, и может выбираться подходящим образом. Например, в способе ингибирования экспрессии гена-мишени по изобретению, для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению внутрь клеток in vitro, можно использовать прием культивирования клеток в присутствии соответствующего количества модифицированной липидом двухцепочечной РНК. В способе ингибирования экспрессии гена-мишени по изобретению, для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь культивируемых клеток или клеток, выделенных из живого организма in vitro, можно использовать прием введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК по изобретению внутрь клеток в присутствии сыворотки. В способе ингибирования экспрессии гена-мишени по изобретению, для введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК внутрь клеток in vivo, можно использовать описанный ниже прием; непосредственную инъекцию фармацевтической композиции внутрь ткани; внутривенную, подкожную, мышечную, внутрибрюшинную, внутриглазную, желудочно-кишечную или зубную инъекцию; ингаляционное введение внутрь носовой полости, ротовой полости, легких или т.п.; пероральное введение; трансдермальное введение через кожу; трансмукозальное введение через слизистую ротовой полости, слизистую влагалища, слизистую глаза, слизистую прямой кишки и слизистую матки; и т.п. приемы. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению может вводиться внутрь клеток посредством осуществления контакта эффективного количества модифицированной липидом двухцепочечной РНК с клетками. Например, модифицированную липидом двухцепочечную РНК вводят в количестве от 0,001 до 10 пМ, предпочтительно от 0,001 до 1 пМ, и более предпочтительно от 0,01 до 0,1 пМ на клетку.
Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по изобретению даже в случае самостоятельного использования имеет превосходную способность к трансфекции клеток. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК можно вводить внутрь клеток без помощи известного средства для генетической трансфекции, используемого для трансфекции миРНК внутрь клеток, или при помощи сниженного количества средства для генетической трансфекции.
Способ ингибирования экспрессии гена-мишени по настоящему изобретению может ингибировать или ослаблять экспрессию гена-мишени и тем самым предотвращать, улучшать или лечить заболевание, вызванное его экспрессией.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение детально описано с помощью следующих примеров; однако оно не ограничено этими примерами.
Пример 1: Ингибирующее влияние 5' модифицированной липидом двухцепочечной РНК на экспрессию гена люциферазы
1. Синтез модифицированной липидом двухцепочечной РНК, направленной на ген люциферазы
1-1. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей
Конструировали двухцепочечные РНК, содержащие смысловые цепи длиной от 21 до 27 оснований и антисмысловые цепи длиной от 21 до 27 оснований, имеющие гомологичную люциферазе Renilla последовательность и способные ингибировать экспрессию гена люциферазы Renilla. Такие двухцепочечные РНК в зависимости от комбинации антисмысловой и смысловой цепей могли образовывать различные типы двойных цепей. Двухцепочечные РНК получили следующие названия. "ДЦ (двухцепочечные) РНК": полностью двухцепочечные РНК, не содержащие выступающего конца (одноцепочечного фрагмента) (т.е., двухцепочечные РНК, имеющие тупые концы на обеих 5' и 3'-концевых сторонах смысловой цепи); "Ми РНК": двухцепочечные РНК, имеющие выступающие концы (выступы) на их обеих концевых сторонах; и "ПВ (правый выступ) РНК": двухцепочечные РНК, имеющие выступающий конец только на правой стороне смысловой цепи, если 5'-конец обозначен слева. Названия различных двухцепочечных РНК разграничены посредством обозначения смысловой цепи как "A" ("Al" или "A2") и антисмысловой цепи как "B", а также посредством указания количества оснований в каждой одноцепочечной РНК, т.е. в смысловой и антисмысловой цепях. Из-за того, что конструировали два типа смысловых цепей, с целью классификации каждую из них обозначали как "Al" и "A2". Что касается двухцепочечных РНК, модифицированных липидом на 5'-концевом фрагменте смысловой цепи, то после названия каждой смысловой цепи ставилось обозначение "Cx (x=16 или 12)". Последовательности используемых РНК были следующими:
1-2. Синтез немодифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы
Используя указанные выше смысловые и антисмысловые цепи, получали различные двухцепочечные РНК. Каждую двухцепочечную РНК получали посредством смешивания эквимолярных количеств смысловой и антисмысловой цепей в универсальном буфере (Hayashi Kasei Co., Ltd.), нагреванием смеси при 92°C в течение 2 минут и затем постепенным понижением температуры до 4°C. Полученные различные двухцепочечные РНК разделяли электрофорезом в 20% полиакриламидном геле при 250 В в течение 60 минут и затем подтверждали с помощью silver staining kit (GE Health Care Bioscience). ФИГ. 1A демонстрирует структуры немодифицированных двухцепочечных РНК.
1-3. Синтез модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы
Синтезировали модифицированные липидом смысловые цепи, в которых липид присоединяли к 5'-концу смысловых цепей двухцепочечных РНК, способных ингибировать экспрессию гена люциферазы. В этих модифицированных липидом смысловых цепях липид ковалентно связывали через аминоалкильную группу (Аминомодификатор C6; Glen Research), присоединенную к 5'-концу указанных выше смысловых цепей. Модифицированные липидом смысловые цепи синтезировали посредством реакции в жидкой фазе липидного соединения, содержащего активную сложноэфирную группу (здесь и далее обозначаемую как "липидное соединение, содержащее активный сложный эфир "), со смысловой цепью, модифицированной посредством аминирования 5'-конца (Схемы реакции 1 и 2).
2
6
2
3
Специфический способ синтеза описан ниже. Аминирование 5'-конца смысловой цепи можно осуществлять обычным способом (фосфорамидитный способ синтеза) в твердофазном синтезе РНК с использованием 5'-аминомодификатора C6 (Glen Research), чтобы с его помощью синтезировать смысловую цепь, модифицированную аминоалкильной группой на 5'-конце (длиной в 21 основание). Смысловую цепь, модифицированную аминоалкильной группой на 5'-конце, очищенную посредством ВЭЖХ и направленную на MALDI-TOF МС-анализ, получали от Hayashi Kasei Co., Ltd. Полученная в результате модифицированная аминоалкильной группой на 5'-конце смысловая цепь содержит -(CH)-NH, присоединенную к 5'-концу (фосфатному остатку первого нуклеотида 5'-конца). Концентрацию полученной в результате одноцепочечной РНК определяли измерением поглощения света при 260 нм с помощью УФ-спектрометра. Модифицированную аминоалкильной группой одноцепочечную РНК в условиях конденсации смешивали с липидным соединением, содержащим активный сложный эфир (сложный эфир N-гидроксисукцинимида пальмитиновой кислоты (Sigma-Aldrich), или сложный эфир 4-нитрофенила лауриновой кислоты (TCI)), растворенный в DMF (N,N-диметилформамид) с получением модифицированной липидом смысловой цепи. После проведения реакции, реакционный раствор очищали посредством ВЭЖХ для удаления нежелательных реагентов из реакционного раствора, содержащего модифицированную липидом смысловую цепь. Очистку при помощи ВЭЖХ осуществляли с буфером A: 100% 20 мМ TEAA (pH 7,0) и буфером B: 70% CHCN/20 мМ TEAA (pH 7,0), с линейным градиентом 10-100% буфера B в течение 50 минут. В качестве колонок для очистки использовали CAP CELL (4,6×150 мм, 5 мкм; Shiseido). ФИГ. 2 демонстрирует приблизительные результаты аналитической ВЭЖХ. Очищенную при помощи ВЭЖХ модифицированную липидом смысловую цепь лиофилизировали и растворяли в очищенной воде, после чего посредством УФ-спектрального анализа определяли концентрацию и выход синтеза.
Структурные модели и выходы полученных в результате модифицированных липидом смысловых цепей были следующими:
Полученные в результате модифицированные липидом смысловые цепи объединяли с антисмысловыми цепями с получением модифицированных липидом двухцепочечных РНК. Двухцепочечные РНК получали согласно аналогичному способу, как описано выше, и подтверждали электрофорезом в 20% полиакриламидном геле. ФИГ. 1B демонстрирует структуры модифицированных липидом двухцепочечных РНК. На ФИГ. 1B X равняется 16, если присоединено производное пальмитиновой кислоты, и X равняется 12, если присоединено производное лауриновой кислоты.
2. Устойчивость модифицированных липидом двухцепочечных РНК к ферментативному разрушению
Оценивали нуклеазную устойчивость модифицированной липидом 27нт дцРНК (ДЦ 27A1C16/27B). Сначала модифицированную липидом на 5'-конце смысловой цепи 27нт дцРНК, разведенную до конечной концентрации 2 мкМ, инкубировали при 37°C в среде RPMI-1640 (Invitrogen), содержащей 10% ЭТС (Sanko Junyaku, Co., Ltd.) (конечный объем: 110 мкл). Через каждые 0 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч отбирали аликвоту объемом 10 мкл и помещали внутрь пробирки для образца, содержащей 2 мкл загрузочного красителя. Для остановки дальнейшей реакции разрушения взятый образец быстро лиофилизировали в жидком азоте и хранили при -20°C. Полученный в результате опытный образец подвергали электрофорезу в 20% полиакриламидном геле в течение 70 минут при 250 В. Затем продукт окрашивали с помощью silver staining kit (GE Health Care Bioscience) (условия окрашивания смотри в инструкции набора) и анализировали на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). При сравнении установили, что широко используемая 21миРНК (ми 21A2/21B) длиной в 21 основание и немодифицированная 27нт дцРНК (ДЦ 27A1/27B) имеют сходную нуклеазную устойчивость. ФИГ. 3 показывает результаты электрофореза в геле.
В результате, 21миРНК быстро разрушалась в среде, содержащей сыворотку, и через приблизительно 1-2 часа регистрировалось ее полное исчезновение. С другой стороны, немодифицированная 27нт дцРНК и модифицированная липидом 27нт дцРНК обладали гораздо более высокой нуклеазной устойчивостью, чем 21миРНК, и эти двухцепочечные РНК сохранялись даже через 48 часов. Эти результаты привели к новому выводу о том, что модифицированная липидом двухцепочечная РНК обладала значительно более высокой стабильностью in vivo, чем широко используемая, как правило, 21миРНК.
3. Опосредованный дайсером процессинг модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы
2
Оценивали процессинг синтезированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК рекомбинантным дайсером. Эксперименты на расщепление дайсером проводили следующим образом. В пробирках для образцов в растворе с 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 15 мМ NaCl и 2,5 мМ MgCl помещали 10 мкл 0,5 МЕ рекомбинантного дайсера (Gene Therapy Systems) и немодифицированные двухцепочечные РНК или модифицированные липидом двухцепочечные РНК, разведенные до конечной концентрации 2 мкМ, и затем образцы инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение 12 часов. Для остановки реакций дальнейшего расщепления ферментом перед добавлением 2 мкл загрузочного красителя в реакционные растворы добавляли 2 мкл раствора, блокирующего дайсер, (Gene Therapy Systems). Полученные в результате опытные образцы подвергали электрофорезу в 20% полиакриламидном геле при 250 В в течение 70 минут. Затем продукты окрашивали silver staining kit (GE Health Care Bioscience) (условия окрашивания смотри в инструкции набора) и подвергали анализу на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). В качестве контроля немодифицированные 21миРНК (ми21A2/2lB) также анализировали посредством электрофореза в геле. Результаты представлены на ФИГ. 4.
Результаты показали, что среди двухцепочечных РНК, в которых смысловые цепи ДЦ РНК (ДЦ 27A1/27B, ДЦ 25A1/25B, ДЦ 23A1/23B и ДЦ 21A1/21B) модифицировали липидом, под действием рекомбинантного дайсера на ДЦ 27A1C16/27B и ДЦ 27A1C12/27B обнаруживали цепочки в одинаковых положениях с немодифицированными 21миРНК, и таким образом явно указывали на образование в результате расщепления дайсером миРНК длиной в 21 основание, содержащих выступающий конец из 2 оснований. Также у ДЦ 25A1C16/25B и ДЦ 23A1C16/23B в присутствии дайсера обнаруживали новые цепочки в одинаковых положениях с 21миРНК, свидетельствуя о том, что они образовывались с участием дайсера. С другой стороны, в присутствии дайсера не наблюдали значимых изменений в ДЦ 21A1C16/21B, выявляя тем самым, что она не процессировалась посредством дайсера.
Кроме того, похожим образом оценивали процессинг посредством дайсера двухцепочечных РНК, в которых каждую смысловую цепь ПВ РНК (ПВ 27A1/25B, ПВ 25A1/23B, ПВ 23A1/21B, и ПВ 21A1/19B), имеющую выступающий конец из 2 оснований на 3'-концевом фрагменте смысловой цепи, модифицировали липидом. В результате, в присутствии дайсера у 3 типов, т.е. ПВ 27A1C16/25B, ПВ 25A1C16/23B и RO23A1C16/21B, наблюдали цепочки в одинаковых положениях с 21миРНК, выявляя тем самым, что они процессировались посредством дайсера. ПВ 27A1C16/25B и ПВ 25A1C16/23B, в особенности, подвергались выраженному процессингу посредством дайсера. С другой стороны, даже в присутствии дайсера не обнаруживали никаких изменений у относительно короткой ПВ 21A1C16/19B, предполагая тем самым, что она не процессируется посредством дайсера.
Кроме того, оценивали процессинг посредством дайсера двухцепочечных РНК, в которых смысловые цепи ПВ РНК (ПВ 27A1/23B и ПВ 25A1/21B), имеющие выступающий конец из 4 оснований на 3'-концевом фрагменте смысловой цепи, модифицировали липидом, а также двухцепочечных РНК, в которых смысловые цепи ПВ РНК (ПВ 27Al/21B), содержащие выступающий конец из 6 оснований на 3'-концевом фрагменте смысловой цепи, модифицировали липидом. В результате, все указанные выше ПВ РНК процессировались посредством дайсера, и новые цепочки обнаруживали в одинаковых с 21нт миРНК положениях.
Кроме того, похожим образом оценивали процессинг посредством дайсера двухцепочечных РНК, в которых смысловые цепи ПВ РНК (ПВ 25A1/27B, ПВ 23A1/25B и ПВ 23A1/27B), содержащие выступающий конец на 5'-концевом фрагменте антисмысловой цепи, модифицировали липидом. В результате, у некоторых модифицированных липидом ПВ РНК, имеющих выступающий конец на 5'-концевом фрагменте антисмысловой цепи, обнаруживали новые цепочки как результат процессинга посредством дайсера; однако цепочки обнаруживались в тех же положениях, что и в отсутствие дайсера, указывая тем самым, что интенсивность процессинга посредством дайсера была ниже интенсивностей процессинга ДЦ РНК и других ПВ РНК.
4. Ингибирование экспрессии гена люциферазы посредством модифицированной липидом двухцепочечной РНК
5
2
Эффективность РНК-интерференции синтезированных немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК оценивали с помощью люциферазы Renilla в качестве мишени. Клетки HeLa (клетки рака шейки матки человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), разведенные до концентрации 1×10 клеток/мл предварительно рассеивали в 96-луночный планшет в 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день из лунок удаляли старую среду и в каждую лунку, содержащую клетки HeLa, добавляли 80 мкл новой среды без антибиотика и 10 мкл раствора комплекса вектора, экспрессирующего люциферазы светлячка и Renilla (psiCHECK™-2 Вектор; Promega) и Lipofectamine™ 2000 (коммерческое название; Invitrogen). Количество экспрессионного вектора доводили до 0,02 мкг на лунку, Lipofectamine™ 2000 доводили до 0,2 мкл на лунку и OptiMem (Invitrogen) использовали для доведения объема лунок до необходимого уровня. Для образования комплекса экспрессионный вектор и Lipofectamine™ 2000 смешивали с использованием OptiMem, и затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После добавления раствора комплекса, клетки инкубировали при 37°C в течение 4 часов в атмосфере 5% CO. После инкубации получали комплексы немодифицированных двухцепочечных РНК, содержащих антисмысловые последовательности гомологичные гену люциферазы Renilla, и двухцепочечных РНК, модифицированных на конце липидом, с Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) в конечных концентрациях 0 нМ, 0,2 нМ, 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ, 5 нМ и 10 нМ, и 10 мкл каждого из полученных в результате растворов комплекса добавляли клеткам HeLa, которым вводили экспрессионный вектор. Конечный объем составлял 100 мкл на лунку. Раствор комплекса каждой РНК и Lipofectamine™ 2000 получали путем смешивания 5 мкл на лунку водного раствора РНК, раствора Lipofectamine™ 2000 (0,2 мкл) и 5 мкл на лунку OptiMem, и инкубации смеси при комнатной температуре в течение 30 минут. После введения РНК клетки инкубировали в течение 48 часов и исследовали уровни экспрессии люциферазы светлячка и Renilla при помощи Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promega) и люминометра (MicroLumat LB96p; Berthold), и ингибирующее влияние на экспрессию люциферазы Renilla определяли исходя из уровня экспрессии люциферазы светлячка в качестве контрольного.
ФИГ. 5 показывает ингибирующее влияние немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК на экспрессию гена при концентрациях 0,2 нМ. В результате обнаружили, что, если двухцепочечные РНК, имеющие тупой конец на 5'-концевой стороне смысловой цепи, такие как ДЦ РНК и ПВ РНК, модифицировали липидом, то такие двухцепочечные РНК демонстрировали существенно усиленные эффекты РНК-интерференции по сравнению с эффектами, получаемыми посредством двухцепочечных РНК, имеющих такую же структуру, но не модифицированных липидом. Также обнаружили, что столь же сильные эффекты РНК-интерференции по сравнению с немодифицированными ПВ РНК такой же структуры получались посредством модификации 5'-конца смысловой цепи липидом независимо от длины цепочки или положения выступающего конца в ПВ РНК. Эти результаты привели к новому выводу о том того, что эффекты РНК-интерференции можно существенно улучшить посредством модификации липидом 5'-конца смысловой цепи молекулы интерферирующей РНК, содержащей тупой конец на 5'-концевой стороне смысловой цепи, такой как ДЦ РНК и ПВ РНК. Кроме того, обнаружили, что ми 21A2C16/21B и ми 21A2C12/21B, в которых 5'-конец смысловой цепи 21нт миРНК модифицировали липидом, также демонстрировали более сильные эффекты РНК-интерференции, чем получаемые посредством немодифицированных 21нт миРНК эффекты.
5. Эффекты РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы (без использования средства для трансфекции)
Модифицированные липидом двухцепочечные РНК трансфицировали внутрь клеток самостоятельно без использования средств для генетической трансфекции, таких как Lipofectamine™ 2000 или подобные, и оценивали их способность проявлять эффекты РНК-интерференции.
5
2
Клетки HeLa (клетки рака шейки матки человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), разведенные до 1 × 10 клеток/мл, предварительно рассеивали в 96-луночный планшет в 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день из лунок удаляли старую среду и в каждую лунку, содержащую клетки HeLa, добавляли 80 мкл новой среды без антибиотика и 10 мкл раствора комплекса вектора, экспрессирующего люциферазы светлячка и Renilla (psiCHECK™-2 Вектор; Promega) и Lipofectamine™ 2000 (коммерческое название; Invitrogen). Количество экспрессионного вектора доводили до 0,02 мкг на лунку, Lipofectamine™ 2000 доводили до 0,2 мкл на лунку и OptiMem (Invitrogen) использовали для доведения объема лунок до необходимого уровня. Для образования комплекса экспрессионный вектор и Lipofectamine™ 2000 смешивали с использованием OptiMem, и затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После добавления раствора комплекса, клетки инкубировали при 37°C в течение 4 часов в атмосфере 5% CO. Каждую лунку затем трижды промывали 100 мкл среды для удаления Lipofectamine™ 2000 из лунки. После этого клеткам добавляли среду, содержащую 90 мкл антибиотиков, и с помощью OptiMem получали образцы немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК, содержащих антисмысловые последовательности гомологичные последовательности гена люциферазы Renilla, в конечных концентрациях 0 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 600 нМ, 800 нМ и 1 мкМ, и 10 мкл каждого из полученных в результате образцов добавляли клеткам, после чего их инкубировали при 37°C в течение 48 часов. Уровни экспрессии люциферазы светлячка и Renilla исследовали при помощи Dual-Glo™ Luciferase Assay System (Promega) и люминометра (MicroLumat LB96p; Berthold). Для сравнения оценивали эффекты РНК-интерференции немодифицированных 21нт миРНК (ми 21A2/21B) и 27нт дцРНК (ДЦ 27A1/27B) в тех же условиях, как описано выше.
Эффекты РНК-интерференции определяли путем оценки уровня экспрессии люциферазы Renilla, исходя из уровня экспрессии люциферазы светлячка в качестве контрольного. ФИГ. 6A показывает результаты для ми 21A2/21B, ДЦ 27A1/27B и ДЦ 27A1C16/27B в конечных концентрациях от 50 нМ до 1 мкМ, и ФИГ. 6B показывает результаты для ДЦ 23A1/23B и ДЦ 23A1C16/23B в конечных концентрациях от 25 нМ до 800 нМ. В результате установили, что модифицированные пальмитиновой кислотой на 5'-концевом фрагменте смысловой цепи ДЦ 27A1C16/27B и ДЦ 23A1C16/23B ингибировали экспрессию люциферазы Renilla в зависимости от концентрации двухцепочечной РНК; таким образом, эти двухцепочечные РНК, благодаря модификации пальмитиновой кислотой, трансфицировались внутрь клеток самостоятельно и тем самым осуществляли реакции РНК-интерференции. С другой стороны, немодифицированные двухцепочечные РНК (ми 21A2/21B, ДЦ 27A1/27B и ДЦ 23A1/23B) даже в высоких концентрациях не оказывали значительного ингибирующего влияния на экспрессию гена. Это дополнительно подтвердилось тем, что модифицированные пальмитиновой кислотой двухцепочечные РНК обладали значительно более высокой эффективностью внутриклеточного накопления и демонстрировали превосходную способность к ингибированию экспрессии гена без использования средства для генетической трансфекции.
6. Оценка эффективности внутриклеточного накопления модифицированных липидом двухцепочечных РНК
5
5
2
2
Клетки HeLa (клетки рака шейки матки человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), клетки A549 (клетки рака легкого человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку) и клетки SH10-TC (клетки рака желудка человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), разведенные предварительно экспериментам до 1 × 10 клеток/мл, а также клетки Jurkat (клетки острого лимфолейкоза; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку) и клетки K-562 (клетки хронического миелолейкоза), разведенные предварительно экспериментам до 2 × 10 клеток/мл, рассеивали в 24-луночные планшеты по 1 мл на лунку, и клетки инкубировали в среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Sanko Junyaku, Inc.) и антибиотики, при 37°C в атмосфере 5% CO. Что касается используемых в настоящей работе антибиотика и сред, то для всех клеток использовали антибиотик стрептомицин, для клеток HeLa использовали среду MEM (Invitrogen) и для других клеток использовали среду RPMI-1640 (Invitrogen). Перед трансфекцией флуоресцентно меченных олигонуклеотидов эти среды замещали средой без антибиотика (450 мкл). Олигонуклеотиды, меченные 6-FAM на 5'-концевом фрагменте 27нт антисмысловой цепи, использовали в качестве флуоресцентно меченных олигонуклеотидов, и олигонуклеотиды объединяли с немодифицированной 27нт смысловой цепью или с 27нт смысловой цепью, модифицированной липидом на 5'-концевом фрагменте, с образованием двойных цепочек. Эксперименты на эффективность внутриклеточного накопления осуществляли следующим образом. 50 мкл смешанного раствора, полученного посредством объединения 25 мкл смешанного раствора, состоящего из 10 мкл 10 мкМ водного раствора флуоресцентно меченных олигонуклеотидов и 15 мкл раствора OptiMem, с 25 мкл смешанного раствора, состоящего из 2 мкл раствора Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) и 23 мкл раствора OptiMem, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут с образованием комплекса флуоресцентно меченных олигонуклеотидов и Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen). Если не использовали Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) (раздел F на ФИГ. 7; -LF2000), то вместо 2 мкл раствора Lipofectamine™ 2000 использовали раствор OptiMem при условии формирования описанного выше комплекса и получали образцы согласно описанному выше способу. 50 мкл полученного в результате комплекса флуоресцентно меченных олигонуклеотидов добавляли к 450 мкл подготовленных ранее клеток (конечная концентрация двухцепочечных РНК: 200 нМ), и инкубировали при 37°C в течение 4 часов в атмосфере 5% CO. После этого клетки трижды промывали PBS (-) или средой, и оценивали эффективность внутриклеточного накопления двухцепочечных РНК с помощью конфокального флуоресцентного лазерного микроскопа и проточной цитометрии.
В исследовании с помощью конфокального флуоресцентного лазерного микроскопа использовали систему Radiance 2000 (Bio Rad), и флуоресценцию определяли с использованием аргонового лазера. В ходе проточной цитометрии измеряли эффективность внутриклеточного накопления для 10,000 подсчитанных клеток с помощью цитометра coulter EPICS XL (Beckman coulter). Для анализа проточной цитометрии использовали программное обеспечение XL EXPO32™ (Beckman coulter).
Результаты представлены на ФИГ. 7-1 - 7-3. Раздел F (-LF2000) на ФИГ. 7-3 показывает результаты без использования Lipofectamine™ 2000, и разделы A-E (+LF2000) на ФИГ. 7-1 - 7-3 показывает результаты с использованием Lipofectamine™ 2000 в качестве средства для генетической трансфекции. Раздел A на ФИГ. 7-1 показывает результаты эффективности внутриклеточного накопления различных двухцепочечных РНК внутрь HeLa клеток при использовании Lipofectamine™ 2000 в качестве средства для генетической трансфекции; раздел B на ФИГ. 7-1 показывает результаты для клеток A549; раздел C на ФИГ. 7-2 показывает результаты для клеток SH10-TC; раздел D на ФИГ. 7-2 показывает результаты для клеток K-562; и раздел E на ФИГ. 7-3 показывает результаты для клеток Jurkat. Раздел F на ФИГ. 7-3 показывает результаты эффективности внутриклеточного накопления различных двухцепочечные РНК внутрь клеток HeLa без использования коммерчески доступного средства для генетической трансфекции. Таким образом, трансфекция немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК внутрь всех клеток (клеток HeLa, клеток A549, клеток SH10-TC, клеток Jurkat и клеток K-562) подтверждалась в присутствии Lipofectamine™ 2000. В особенности очень высокая эффективность внутриклеточного накопления определялась с помощью конфокального флуоресцентного лазерного микроскопа и проточной цитометрии для ДЦ 27A1C16/27B, модифицированных пальмитиновой кислотой на 5'-конце смысловой цепи, в сравнении с немодифицированными двухцепочечными РНК и двухцепочечными РНК, модифицированными лауриновой кислотой. Кроме того, наблюдение при помощи конфокального флуоресцентного лазерного микроскопа позволило предположить, что двухцепочечная РНК, модифицированная пальмитиновой кислотой, активно распределялась в цитоплазме клеток. Эффективность накопления была особенно заметна в адгезивных клетках (клетки HeLa, клетки A549 и клетки SH10-TC). Кроме того, проточный цитометрический анализ подтвердил, что двухцепочечная РНК, модифицированная пальмитиновой кислотой демонстрировала более высокую эффективность внутриклеточного накопления, чем немодифицированная двухцепочечная РНК также в присутствии Lipofectamine™ 2000. Эти результаты привели к новому выводу о том, что, если двухцепочечная РНК ковалентно связана 5'-концевым фрагментом смысловой цепи с липидом, таким как пальмитиновая кислота или тому подобные, то двухцепочечная РНК способна демонстрировать значительно повышенную эффективность внутриклеточного накопления, и может распределяться в цитоплазме клеток.
Пример 2: Ингибирующее влияние 5'- модифицированных липидом двухцепочечных РНК на экспрессию гена VEGF
1. Синтез модифицированной липидом двухцепочечной РНК, направленной на ген VEGF
1-1. Последовательности смысловых и антисмысловых цепей
Рассчитали двухцепочечные РНК, содержащие смысловую цепь длиной в 27 или 21 основание и антисмысловую цепь длиной в 27 или 21 основание и имеющие последовательность гомологичную VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) и способные к ингибированию экспрессии гена VEGF. С помощью таких двухцепочечных РНК проводили следующие эксперименты. 27нт дцРНК представляет собой полностью двухцепочечную РНК, не имеющую выступающего конца (одноцепочечного фрагмента) (т.е., двухцепочечная РНК, содержащая тупые концы одновременно на 5'- и 3'-концевых сторонах смысловой цепи), и 21миРНК представляет собой двухцепочечную РНК, имеющую выступающие концы из 2 оснований на 3'-концах одновременно смысловой и антисмысловой цепей. Использовали 27нт дцРНК и 21миРНК со следующими последовательностями:
27нт дцРНК:
смысловая цепь: v27A: 5'-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3' (SEQ ID NO: 10)
антисмысловая цепь: v27B: 3'-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5' (SEQ ID NO: 11)
21 миРНК:
смысловая цепь: v2lA: 5'-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3' (SEQ ID NO: 12)
антисмысловая цепь: v21B: 3'-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5' (SEQ ID NO: 13).
1-2. Синтез немодифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF
Указанные выше смысловые и антисмысловые цепи ренатурировали описанным в примере 1 способом с образованием двойных цепей, и тем самым получением немодифицированных липидом двухцепочечных РНК. Образование двойных цепей подтверждали электрофорезом в 20% акриламидном геле, согласно описанному в примере 1 способу.
1-3. Синтез модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF
Синтезировали способные к ингибированию экспрессии гена VEGF модифицированные липидом двухцепочечные РНК, в которых липид присоединяли к 5'-концу смысловой цепи указанных выше двухцепочечных РНК. В модифицированных липидом двухцепочечных РНК липид ковалентно связывали через аминоалкильную группу (Аминомодификатор C6; Glen Research), присоединенную к 5'-концу указанной выше смысловой цепи. Модифицированные липидом одноцепочечные РНК (смысловые цепи) синтезировали согласно способу, описанному в примере 1.
Структурные модели и выходы модифицированных липидом РНК, направленных на ген VEGF, представлены ниже:
Полученные в результате модифицированные липидом смысловые цепи объединяли с антисмысловыми цепями с получением модифицированных липидом двухцепочечных РНК. Образование двойных цепей подтверждали электрофорезом в 20% акриламидном геле согласно способу, описанному в примере 1. ФИГ. 8 показывает структуры модифицированных липидом двухцепочечных РНК. Время элюирования модифицированных липидом РНК, направленных на ген VEGF, в целом соответствовало описанному в примере 1.
2. Процессинг дайсером модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF
Оценивали процессинг синтезированных немодифицированных липидом двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК рекомбинантным дайсером. Эксперименты на расщепление дайсером проводили согласно способу, описанному в примере 1. Результаты показаны на ФИГ. 9.
В результате действия рекомбинантного дайсера на ДЦ v27ACl6/v27B и ДЦ v27AC12/v27B обнаруживали цепочки в одинаковых положениях с немодифицированными 21миРНК, что явно указывало на образование посредством расщепления дайсером миРНК длиной в 21 основание, содержащих выступающий конец из двух оснований. Эти результаты доказали, что присоединение липида к 5'-концу смысловой цепи 27нт дцРНК не препятствует процессингу дайсером. С другой стороны, даже в присутствии дайсера не наблюдали никаких изменений у ми V21AC16/V21B и ми v21AC12/v21B по сравнению с отсутствием дайсера, показав этим, что они не процессировались посредством дайсера.
3. Ингибирование экспрессии гена VEGF посредством модифицированных липидом двухцепочечных РНК
При помощи клеток HeLa (клетки рака шейки матки человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), клеток A549 (клетки рака легкого человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), клеток SH10-TC (клетки рака желудка человека; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку), клеток Jurkat (клетки острого лимфолейкоза; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку) и клеток K-562 (клетки хронического миелолейкоза; Институт развития, старения и рака, Университет Тохоку) оценивали ингибирующее влияние 21нт миРНК с немодифицированными концами, 27нт дцРНК с немодифицированными концами, 27нт дцРНК, модифицированной липидом на 5'-конце смысловой цепи (27нт дцРНК, модифицированной на конце липидом), и 21нт миРНК, модифицированной липидом на 5'-конце смысловой цепи (21нт миРНК, модифицированной на конце липидом) на экспрессию гена VEGF. Кроме того, также оценивали двухцепочечные РНК, не имеющие генетической последовательности, гомологичной гену VEGF (27нт дцРНК (случайная) и 21нт миРНК (случайная)), а также модифицированные липидом двухцепочечные РНК, в которых липид присоединяли к 5'-концу смысловых цепей этих двухцепочечных РНК.
5
5
2
Эксперименты осуществляли следующим способом. Клетки HeLa, клетки A549 и клетки SH10-TC, разведенные до 1 × 10 клеток/мл перед экспериментами, а также клетки Jurkat и клетки K-562, разведенные до 2 × 10 клеток/мл перед экспериментами, рассеивали в 500 мкл на лунку в 24-луночные планшеты и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день из лунок удаляли старую среду, и в лунки добавляли по 450 мкл новой среды без антибиотика. Для клеток HeLa использовали среду MEM, а для других клеток использовали среду PRMI-1640. Получали комплекс немодифицированных или модифицированных липидом двухцепочечных РНК (25 мкл), содержащих антисмысловую последовательность гомологичную генетической последовательности VEGF, с раствором Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) (25 мкл), и затем 50 мкл каждого из растворов двухцепочечной РНК добавляли к 450 мкл указанных выше клеток. Конечный объем составлял 500 мкл на лунку. Комплекс раствора каждой РНК и раствора Lipofectamine™ 2000 получали посредством смешивания 25 мкл на лунку водного раствора РНК и раствора Lipofectamine™ 2000 (2 мкл) и 25 мкл на лунку OptiMem, и инкубации смеси при комнатной температуре в течение 30 минут. После введения РНК клетки инкубировали при 37°C в течение 48 часов в атмосфере 5% CO. После инкубации клетки трижды промывали PBS (-), и с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) из клеток выделяли общую РНК. Затем для измерения количества VEGF мРНК проводили реакции ПЦР в реальном времени. Для ПЦР в реальном времени использовали набор Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen), и в качестве PCT праймеров для VEGF использовали 5'-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3' (SEQ ID NO: 14) и 5'-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3' (SEQ ID NO: 15). Ген GAPDH измеряли в качестве контрольного согласно описанному способу. 5'-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3' (SEQ ID NO: 16) и 5'-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3' (SEQ ID NO: 17) использовали в качестве праймеров для GAPDH. ПЦР в реальном времени осуществляли следующим способом. Реакцию обратной транскрипции проводили при 50°C в течение 30 минут, и затем проводили ПЦР, которая включала от 25 до 28 повторных циклов (в зависимости от используемых клеток), состоящих из стадии денатурации двойных цепей при 92°C в течение 30 секунд, стадии отжига при 55°C в течение 30 секунд и стадии элонгации при 68°C в течение 45 секунд. Наконец, проводили инкубацию при 68°C в течение 10 минут, снижали температуру до 4°C, и завершали реакцию. Реагенты, общую РНК, праймеры и т.п., использованные для ПЦР в реальном времени подготавливали согласно рекомендованным условиям Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen). После ПЦР в реальном времени добавляли 2 мкл загрузочного красителя, и продукты ПЦР, полученные из мРНК от VEGF и GAPDH, определяли с помощью 2% агарозного геля. Ингибирующее влияние на экспрессию гена оценивали посредством измерения уровня экспрессии VEGF в клетках, внутрь которых трансфицировали двухцепочечные РНК (как немодифицированные, так и модифицированные), предполагая, что уровень экспрессии гена VEGF ген в контрольных клетках (внутрь которых не трансфицировали двухцепочечные РНК) составлял 100%. Ошибка в уровнях экспрессии среди клеток исправлялась на основании уровня экспрессии контрольного гена (GAPDH).
ФИГ. 10-1 - 10-3 показывают результаты эффектов РНК-интерференции немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК в случаях, когда VEGF являлся мишенью, и концентрация двухцепочечных РНК составляла 200 нМ. График A на ФИГ. 10-1 показывает ингибирующее влияние немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК на экспрессию гена VEGF в клетках HeLa; график B на ФИГ. 10-2 показывает результаты для клеток A549; График C на ФИГ. 10-2 показывает результаты для клеток SH10-TC; График D на ФИГ. 10-3 показывает результаты для клеток Jurkat; и График E на ФИГ. 10-3 показывает результаты для клеток K-562. Эти результаты показали, что ДЦ v27AC16/v27B и ДЦ v27AC12/v27B, обе полученные посредством модификации липидом 5'-конца смысловой цепи двухцепочечной РНК (ДЦ v27A/v27B) длиной в 27 оснований, а также ми v21AC16/v21B и ми v21AC12/v21B, обе полученные посредством модификации липидом 5'-конца смысловой цепи двухцепочечной РНК (ми v21A/v21B) длиной в 21 основание, оказывали очень сильное ингибирующее влияние на экспрессию гена VEGF по сравнению с немодифицированными двухцепочечными РНК (ми v21A/21B и ДЦ v27A/v27B). Модифицированная пальмитиновой кислотой ДЦ v27AC16/v27B, в особенности, демонстрировала заметно более высокое ингибирующее влияние на экспрессию гена для всех клеток (клеток HeLa, клеток A549, клеток SH10-TC, клеток Jurkat и клеток K-562) по сравнению с немодифицированными двухцепочечными РНК (ми v21A/21B и ДЦ v27A/v27B). Это подтверждало, что эффекты РНК-интерференции можно значительно улучшать посредством модификации двухцепочечных РНК липидами, такими как пальмитиновая кислота и т.п. Также аналогично оценивали ингибирующее влияние на экспрессию гена немодифицированных двухцепочечных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК, не имеющих генетической последовательности гомологичной гену VEGF, но ни одна из двухцепочечных РНК не демонстрировала какого-либо значимого ингибирующего влияния на ген VEGF. Эти результаты показали, что использованные в настоящей работе двухцепочечные РНК, направленные против VEGF, ингибировали экспрессию гена-мишени с высокой специфичностью к его последовательности, и также позволили предположить, что побочные эффекты для клеток можно уменьшать посредством присоединения липида к двухцепочечным РНК.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
ФИГ. 1 показывает структуры немодифицированных и модифицированных липидом двухцепочечных РНК, синтезированных в примере 1.
ФИГ. 2 показывает результаты ВЭЖХ-анализа, проведенного на модифицированных липидом одноцепочечных РНК в примере 1.
ФИГ. 3 показывает измеренные в примере 1 нуклеазные устойчивости двухцепочечных РНК, модифицированных липидом на 5'-конце.
ФИГ. 4 показывает анализ результатов процессинга посредством дайсера каждой из модифицированных липидом двухцепочечных РНК в примере 1.
ФИГ. 5 показывает анализ результатов эффектов РНК-интерференции для модифицированной липидом 27нт дцРНК в концентрации 0,2 нМ в примере 1.
ФИГ. 6 показывает анализ результатов эффектов РНК-интерференции для двухцепочечные РНК, модифицированных липидом на 5'-конце (без использования средства для переноса генов) в примере 1.
ФИГ. 7-1 показывает анализ результатов внутриклеточного накопления модифицированных липидом двухцепочечных РНК внутри клеток HeLa и A549 в примере 1; где "FL" обозначает изображения, полученные на флуоресцентном микроскопе; " Trans" обозначает изображения, полученные на фазово-контрастном микроскопе в том же поле зрения, что и изображения FL; и "Merge" обозначает изображения, в которых совмещали изображение FL и изображение Транс.
ФИГ. 7-2 показывает анализ результатов внутриклеточного накопления модифицированных липидом двухцепочечных РНК внутри клеток SH10-TC и K562 в примере 1; где "FL" обозначает изображения, полученные на флуоресцентном микроскопе; "Trans" обозначает изображения, полученные на фазово-контрастном микроскопе в том же поле зрения, что и изображения FL; и "Merge" обозначает изображения, в которых совмещали изображение FL и изображение Trans.
ФИГ. 7-3 показывает анализ результатов внутриклеточного накопления модифицированных липидом двухцепочечных РНК внутри клеток Jurkat и HeLa в примере 1; где "FL" обозначает изображения, полученные на флуоресцентном микроскопе; "Trans" обозначает изображения, полученные на фазово-контрастном микроскопе в том же поле зрения, что и изображения FL; и "Merge" обозначает изображения, в которых совмещали изображение FL и изображение Trans.
ФИГ. 8 показывает структуры немодифицированных и модифицированных липидом двухцепочечных РНК, синтезированных в примере 2.
ФИГ. 9 показывает анализ результатов процессинга посредством дайсера каждой из модифицированных липидом двухцепочечных РНК в примере 2.
ФИГ. 10-1 показывает анализ результатов эффектов РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных РНК на ген VEGF в клетках HeLa в примере 2.
ФИГ. 10-2 показывает анализ результатов эффектов РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных РНК на ген VEGF в клетках A549 и SH10-TC в примере 2.
ФИГ. 10-3 показывает анализ результатов эффектов РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных РНК на ген VEGF в клетках Jurkat и K567 в примере 2.