Оптогенетические подходы в нейробиологии

D.M. Larkin1-2, N.S. Yudin1-3

IMPORTANCE OF GENOMIC RESEARCH IN STUDYING THE HISTORY OF DEVELOPMENT OF DOMESTIC ANIMALS

'The Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics The Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk; 2The Royal Veterinary College, University of London, NW1 0TU, London, United Kingdom; 3Novosibirsk State University, 630090, Novosibirsk

The use of mammalian genomes for identification of genes and polymorphisms (mutations) associated with important traits of domestic (livestock) animals is reviewed. Examples are given of how genetic analysis provided identification of the key genes associated with the quality and quantity of milk yield in cattle and beef cattle production. The review considers modern genome mapping techniques that allow the efficiency of identification of gene and regulatory DNA polymorphisms in genomes of domestic animals to be increased. The history of development of the main species of domesticated animals (cattle, sheep, swine) is also considered from the viewpoint of genetics. Keywords: genome, domestic animals.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-123-128

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.822.014.44:575

Борисова Е.В., Епифанова Е.А., Тутуков С.А., Салина В.А., Бабаев А.А. ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В НЕЙРОБИОЛОГИИ

ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 603950, Нижний Новгород, Россия

Оптогенетика — это новая и быстро развивающаяся технология, которая объединяет оптические методы с методами молекулярной биологии и может быть использована как для мониторинга различных оптических процессов в клетке, так и для контроля их активности с помощью света. Данная технология основана на экспрессии белков опсинов бактериального происхождения в нейронах млекопитающих. В обзоре мы более подробно остановились на применении оптогенетики для регулировании активности конкретных нейрональных популяций в различных областях головного мозга. Также в статье представлена информация о светочувствительных белках, генетически кодируемых оптических инструментах и их использовании в активации или ин-гибировании нейронов, исследованиях причинно-следственных связей между нейронными сетями и симптомами патологии.

Ключевые слова: оптогенетика, опсины, channelrhodop-sin-2 (ChR2), halorhodopsin (NpHR), археородопсин-3 (Arch), вирусные векторы, Cre-рекомбиназы, потеря двигательной функции, болезнь Паркинсона, эпилепсия.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-128-132

Растения и многие микроорганизмы зависят от света, который является для них главным внешним сигналом для развития, формообразования и метаболизма. Фотоны света могут действовать в качестве сигналов при поглощении их специализированными фоторецепторами [4]. Фоторецепторы обычно содержат в своей структуре хромофор, при поглощении фотонов происходят разрывы химических связей и изомеризация. Это приводит к изменению конформации и/или кинетики фоторецептора, что инициирует последующие события сигналинга. В ходе эволюции эти природные фотодатчики приобрели максимальную эффективность и специфику в преобразовании света в биохимические сигналы [37].

В последнее десятилетие наблюдается растущий интерес к данным фоторецепторам с точки зрения точного пространственного и временного контроля биологической активности светом. Так как эти белки генетически детерминированы, они могут быть легко введены в клетки-мишени и внеклеточные структуры. Стало возможным использовать свет как переключатель активно-

Для корреспонденции: Борисова Екатерина Владимировна (Bori-sova Ekaterina Vladimirovna), e-mail.ru: borisovakaterina17@gmail.com

сти в определенных популяциях нейронов с точностью до миллисекунды, что позволяет проводить фундаментальные эксперименты, которые выявляют роль конкретных нейронов в контроле деятельности нервной системы с высокой точностью [29].

Впервые обнаруженные у микроорганизмов светочувствительные белки channelrhodopsin-2 (^Я2), выделенные из водоросли Chlamydomonas reinhardtii, и halor-hodopsin (ПрНГ) из архебактерии Natronomonas phara-onis — два наиболее часто используемых инструмента в оптогенетике [20, 40].

относится к типу белков, 7 раз пересекающих мембрану, и содержит изомеризующийся под действием света хромофор. непосредственно формирует ионные каналы, является ионотропным белком. Данные белки обеспечивают быструю и мощную клеточную деполяризацию, что делает их полезными для биоинженерии и нейронаучных исследований, включая фотостимуляцию [28].

возбуждается при облучении синим светом с длиной волны 470 нм. При поглощении света ОДЯ2 открываются поры диаметром минимум в 6 А. В течение миллисекунд происходит возвращение к первоначальной конформации, при этом происходит закрытие пор и остановка потока ионов. Все природные ОД являются неспецифическими катионными каналами, проводящими Н+, П+, К+, и ионы Са2+ [12, 15].

Первые эксперименты показали, что белок ОДЯ2 включается в состав катион-селективного ионного насоса в ооцитах Xenopus laevis и в клетках млекопитающих [17, 28]. Для возможности визуализации ОДЯ2-экспрессирующих клеток к опсину на внутриклеточной стороне «пришивали» флуоресцентный белок (ФБ), который светится под воздействием зеленого света. Под воздействием синего света ОДЯ2 открывает доступ притоку Па+ в клетку (рис. 1) [28].

Однако при непрерывном освещении ОДЯ2 снижается его чувствительность. Восстановление после десенсибилизации может ускорить поток внеклеточных протонов и формирование отрицательного мембранного потенциала. Таким образом, ОДЯ2 может быть использован для деполяризации клеток [26, 27]. Созданы трансгенные мыши,

ОБЗОРЫ

Рис. 1. Химерный с дополнительным флуоресцентным белком для визуализации экспрессии.

синтезирующие ChR2, для светоиндуцированной активации нейронов и выявления нейронных связей [5].

Временное торможение различных типов клеток нервной системы стало возможным благодаря микробному галородопсину NpHR, который является электрогенным хлорным насосом, активируемым желтым светом с длиной волны 580 нм [13]. При использовании специфического промотора в нейронах на высоком уровне экспрессируются NpHR-YFP, приводящие к активации корковых пирамидальных нейронов с быстрым, обратимым фотоингибированием потенциала действия. Созданы также трансгенные мыши, экспрессирующие NpHR. [6, 11]. Высокий уровень экспрессии NpHR приводит к формированию агрегатов, накоплению их в эн-доплазматической сети, что является токсичным для клетки, проявляющимся в образовании межклеточных пузырьков и распухании дендритов [40]. Эти сложности существенно ограничили использование первого поколения галородопсинов как светочувствительных переключателей. Изменение локализации NpHR привело к существенному усилению ингибиторной активности [9, 10, 14].

Другим опсином, предлагаемым для целей оптогене-тики, является белок археородопсин-3 (Arch), выделенный из архебактерии Halorubrum sodomense, представляющий собой также протонную помпу, активируемую желто-зеленым светом. Arch может также опосредовать сильное и безопасное выключение нейрональной активности [16, 33]. Кроме того, Arch спонтанно восстанавливается от светозависимой инактивации в отличие от све-тозависимых хлорных насосов, которые в ответ на свет становятся на долгое время неактивными. Эти свойства Arch можно использовать при оптическом выключении значительных объемов головного мозга. Активность Arch в нейронах хорошо переносится, потому что сдвиг pH, созданный возбуждением Arch, может свести к минимуму механизмы самоограничения [7].

Точность пространственно-временного контроля над внутриклеточными сигнальными процессами достигается также за счет использования генетически кодируемых оптических инструментов на основе рецепторов, связанных с G-белками (G-protein-coupled receptors, GPCR). GPCR обеспечивают экспрессию в естественных условиях и функционирование нескольких различных опсинов [18]. Были разработаны и охарактеризованы два химерных GPCR — optoXRs, которые работают

избирательно и нацелены на определенные сигнальные пути, включающиеся в ответ на свет [2, 29].

Для доставки оптогенетических инструментов в ин-тактные нейрональные системы используются аденоас-социированные векторы (AAV) или лентивирусные векторы (LV) [32]. AAV и LV были успешно применены для экспрессии опсинов у многих животных (мыши, крысы, морские свинки, приматы) и способствовали высоким уровням экспрессии в течение длительного периода времени практически без каких-либо побочных эффектов [38]. При использовании вирусных векторов клеточная специфичность достигается с помощью промоторов

[23].

Оптогенетический контроль в настоящее время часто производят с помощью Cre-рекомбиназ (cyclic recombinase) — ферментов, обладающих способностью изменять расположение нуклеотидных последовательностей ДНК в сайт-специфической манере. Вырезание фрагмента ДНК происходит между двумя LoxP-сайтами (от англ. lo(cus) (of) X-(over of) P(1) — локус кроссинго-вера в фаге P1). Cre-рекомбиназы осуществляют специфическое вырезание фрагмента ДНК, расположенного между двумя LoxP-сайтами [35, 39].

Cre-рекомбиназы также сшивают с белками, чувствительными к определенным препаратам. В отсутствие препарата Cre-рекомбиназа находится в свободном состоянии в цитозоле, при этом она не может оказывать никакого действия на ДНК. Но при появлении препарата активируется белок, сшитый с Cre-рекомбиназой, и они вместе транспортируются в ядро. Оказавшись в ядре Cre-рекомбиназа вырезает гены, расположенные между LoxP-последовательностями, в результате чего животное становится по этому гену нокаутным [3, 14].

В одной из систем светорегулируемая Cre-рекомбиназа была сконструирована таким образом, что ее N-конец связан с одним дрожжевым белком (CRY2 криптохромный белок, несущий светоактивирующий домен), а C-конец — с другим дрожжевым белком (CIB1 — кальций и интегрин-связывающий белок), которые взаимодействуют друг с другом. В темноте Cre не хватает рекомбиназной активности (рис. 2). При освещении CRY2-CIB1 происходит взаимодействие N и C конца, и таким образом восстанавливается рекомбиназная активность [21].

В некоторых регулируемых светом системах светочувствительный модуль и связывающийся с ним партнер сшиты с модулем, связывающим ДНК и активирующим транскрипцию. Такая система работает как транскрипционный фактор. При воздействии на фотосенсор и связанного с ним партнера регулирующие компоненты взаимодействуют и инициируют транскрипцию (рис. 3) [19, 36].

Кроме того, применяется стратегия, при которой освещают аксон далеко от тела трансдуцированной

Рис. 2. Регуляция светом генетической транскрипции с использованием Crew-рекомбиназ.

Рис. 3. Система регулирования транскрипции. ДСД — ДНК-связывающий домен АД — активирующий домен

клетки (используя тем самым механизм перемещения светочувствительных молекул вниз по самому аксону). Концентрация источника света происходит не на теле клетки, а на аксоне, что позволяет модулировать активность нейронов в зависимости от их проекций, а не от схемы генетической экспрессии. Экспериментально доказано, что транспортируется в аксоны, где он

эффективно способен преобразовывать фотостимулы в потенциалы действия. Аксоны могут быть стимулированы, даже если они отделены от родительской сомы [31].

Оптогенетические инструменты могут быть использованы на живых, реагирующих на раздражители лабораторных животных, таких как крысы, приматы, что в дальнейшем дает возможность изучать эффекты переключения нейронных сетей при патологических мозговых симптомах.

Оптогенетику можно применить для изучения нейрональной основы сна и его нарушений. опосредованная активация орексин/гипокретин экс-прессирующих нейронов в латеральной области гипоталамуса мышей увеличивала время перехода от сна к бодрствованию в соответствии с данными о том, что дисфункция этих нейронов связана с нарушением сна и нарколепсией [1].

Предпринимаются попытки использования опто-генетики для изучения механизмов, лежащих в основе обучения и памяти [24].

В лаборатории К. Диссерота с помощью методов оптогенетики изучают этиологию шизофрении и болезни Паркинсона. Вирусными векторами инфицировали мозг мыши, в результате чего клетки-мишени экспрес-сировали светочувствительный белок на своей поверхности. Свет поступал через оптоволоконный кабель, непосредственно вживленный в моторную кору мозга мыши, отвечающую за движение влево. Мыши под действием синего света бежали влево и останавливались при отсутствии свечения.

К. Диссерот в сотрудничестве с Д. Хендерсоном применяли оптогенетику для контроля симптомов Паркинсона у лабораторных мышей, оснащенных волоконно-оптическими имплантами. При переключении воздействия на различные нейроны выяснилось, что наибольший терапевтический эффект достигался не стимуляцией клеток определенного вида, а воздействием на активность соединяющих их аксонов. Когда аксоны стимулировались светом с высокой частотой мигания, мыши вели себя нормально; когда мигание прекращалось, симптомы возобновлялись [9].

Ученые другой лаборатории разрабатывают методы помощи пациентам с параличами и травматическими повреждениями мозга и полагают, что оптогенетиче-ским методам можно будет найти практическое применение — от восстановления движений конечностей, парализованных вследствие инсульта, черепно-мозговых травм или травм спинного мозга, до борьбы со спастич-ностью, вызванной церебральным параличом [27].

Используя оптическую стимуляцию, был восстановлен естественный порядок сокращений волокон двигательных нервов. Ранее для восстановления потерянной двигательной функции использовали электрическую стимуляцию. Этот метод позволял парализованным людям двигаться в течение нескольких минут. Но следует учесть тот факт, что крупные нервные волокна более чувствительны к электрической стимуляции, и, следовательно, мышечное сокращение может происходить в неправильном порядке — сначала крупные, быстро сокращающиеся волокна, а затем мелкие, медленно сокращающиеся, что приводит к судорожным движениям, которые влекут за собой быстрое наступление усталости. Тогда была создана «оптическая манжетка», покрытая крошечными направленными внутрь светоизлучающи-ми диодами, которую располагали около седалищного нерва биоинженерных животных. Оптическая стимуляция приводила к правильному порядку сокращения мышечных волокон, включая сокращения, подобные тем, которые происходят в нормальных условиях. При оптической стимуляции мышцы сохраняли около одной трети от их начальной максимальной силы в течение 20 мин и оставались на этом уровне достаточно долго, в то время как при электрической стимуляции истощение на тех же мышцах наступало за 4 мин. На сегодняшний день этот подход главным образом применяется для различных исследований, но в будущем он может найти клиническое применение, если будет найден безопасный способ введения в геном человека генов, кодирующих светочувствительные белки [27].

Методы оптогенетики также применялись при изучении эпилепсии, когда чрезмерно синхронная активность возникает в одной или более областях головного мозга, что может привести к судорожным припадкам. Эпилептические припадки могут наступать в результате потери тормозных интернейронов или вследствие реорганизации или ненадлежащего укрепления возбуждающих путей. В любом случае использование опсинов смягчает аберрантную ритмическую активность нейронов во время приступов, что может оказывать положительное терапевтическое действие. Например, активация NpHR в органотипи-ческих культурах гиппокампа, в которых посредством электрической стимуляции была вызвана судорожная активность, значительно снижались эпилептиформ-ные пики [34]. Кроме того, у мышей со смоделированной височной эпилепсией активация в естественных условиях субпопуляции ГАМКергических интернейронов или ингибирование возбуждающих пирамидальных клеток приводила к быстрому прекращению приступов [25]. Эпилепсия может иногда возникать в результате реорганизации соединений большой дальности в пределах мозга после инсульта. У крыс опто-генетическая ориентация нейронов таламуса, соединенных с областями коры, подверженным эпилепсии, также уменьшала приступы [30].

ОБЗОРЫ

С помощью методов оптогенетики были идентифицированы комбинации генов, которые совместно способны приводить к возникновению психиатрических расстройств. Перспективным является изучение объединительных гипотез, которые могли бы помочь объяснить, как дискретные психиатрические симптомы могут возникнуть из разнообразных мультигенных эффектов. Например, исследования генетики шизофрении и аутизма последовательно указали на наличие генов, участвующих в регуляции баланса возбудимости в головном мозге. Эти данные совпадают с выводами, сделанными с помощью оптогенетики, о том, что изменения возбудимости, ориентированные на конкретные клетки или проекции, могут специфически модулировать социальное поведение у мышей. Точно так же доклинические оптогенетические эксперименты показали конкретные клетки и пути, которые могут модулировать беспокойство, депрессию, расстройства пищевого поведения и расстройства, связанные с поведением, наряду с многими другими, что имеет большое значение для психиатрии [8, 20].

Эти результаты могут быть применены в клинике по-разному. Во-первых, понимание на данном уровне психических симптомов позволяет строить более сложные патофизиологические гипотезы и дает более полное понимание этиологии. Во-вторых, путем совмещения интервью пациентов, данных тестов и персонализированных геномных исследований диагностика психиатрических заболеваний может быть существенно сбалансирована, что улучшит как профилактику, так и лечение. В-третьих, прямое знание клеток и их проекций, вовлеченных в развитие психиатрических симптомов, способствует идентификации клинически значимых биомаркеров, которые могут внести изменения не только в диагноз, но и в прогнозирование результатов лечения. В-четвертых, это быстрое выявление новых мишеней-целей для лекарств или стимуляции мозга в качестве лечения. Это может привести к существенному улучшению причинно-следственных целей патофизиологии [8].

Заключение

Благодаря оптогенетике стало возможным уменьшение или увеличение активности конкретных нейрональ-ных популяций в различных областях головного мозга. Таким образом, выявление причинно-следственных связей с помощью оптогенетических инструментов между нейронными сетями и симптомами патологии может помочь в разработке эффективной терапии и повышению эффективности препаратов, появлению новых менее инвазивных оперативных вмешательств для лечения различных нейродегенеративных заболеваний, а также позволит расширить нейрологические, биологические, неврологические и психиатрические исследования.

Финансирование. Работа выполнена в рамках проекта Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014— 2020 годы» по теме «Разработка методов, технологий и платформ для исследований функционирования нервных систем на основе создания высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга», соглашение № 14.581.21. 0016, уникальный идентификатор проекта RFMEFI58115X0016.

ЛИТЕРАТУРА

1. Adamantidis A.R., Zhang F., Aravanis A.M., Deisseroth K. et al.

Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of

hypocretin neurons. Nature. 2007; 450: 420—4.

2. Airan R.D., Thompson K.R., Fenno L.E., Bernstein H., Deisseroth K. Temporally precise in vivo control of intracellular signaling. Nature. 2009; 458: 1025—9.

3. Amos W.B. and White J.G. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biol. Cell. 2003; 85: 335—42.

4. Arenkiel B.R., Peca J., Davison I.G., Feliciano C. et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 2007; 54: 205—18.

5. Bendtsen J.D., Nielsen H., Von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides. J. Mol. Biol. 2004; 340: 783—95.

6. Bi A., Cui J., Ma Y.P., Olshevskaya E. et al. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 2006; 50: 23—33.

7. Chow B.Y., Han X., Dobry A.S., Qian X. et al. High-prformance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 2009; 463: 98—102.

8. Deisseroth K., Etkin A., Malenka R.C. Optogenetics and the Circuit Dynamics of Psychiatric Disease. J.A.M.A. 2015; 313(20): 2019—20.

9. Deisseroth K. Optogenetics. Nature Methods. 2011; 8: 26—9.

10. Derby M.C., Gleeson P.A. New insights into membrane trafficking and protein sorting. Int. Rev. Cytol. 2007; 261: 47—116.

11. Duschl A., Lanyi J.K., Zimanyi L. Anion binding to the chloride pump, halorhodopsin, and its implications for the transport mechanism. J. Biol. Chem. 1990; 265: 1261—7.

12. Evans, C.L., Potma, E.O., Puoris'haag, M., Cote, D. et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 16807—12.

13. Figueiredo M., Lane S., Tang F., Liu B.-H., Hewinson J. et al. Optogenetic experimentation on astrocytes. ExperimentalPhysiology. 2010; 96: 40—50.

14. Gradinaru V., Thompson K.R., Zhang F., Mogri M. et al. Targeting and readout strategies for fast optical neural control in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 2007; 27(52): 14231—8.

15. Gradinaru V., Thompson K.R., Deisseroth K. eNpHR: a Natronomnas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell. Biol. 2008; 36(1—4): 129—39.

16. Gradinaru V., Mogri M., Thompson K.R., Henderson J.M., Deisseroth K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 2009; 324: 354—9.

17. Hardie R.C., Raghu P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 2001; 186—93.

18. Hagglund M., Borgius L., Dougherty K.J., Kiehn O. Activation of groups of excitatory neurons in the mammalian spinal cord or hindbrain evokes locomotion. Nat. Neurosci. 2010; 13: 246—52.

19. Hong M., Fitzgerald M.X., Harper S., Luo C., Speicher D.W., Marmorstein R. Structural basis for dimerization in DNA recognition by Gal4. Structure. 2008; 16(7): 1019—26.

20. Iossifov I., O'Roak B.J., Sanders S.J., Ronemus M., Krumm N. et al. The contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder. Nature. 2014; 515(7526): 216—21.

21. Kato H.E., Zhang F., Yizhar O., Ramakrishnan C., Nishizawa T. et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 2012; 482: 369—74.

22. Kennedy M.J., Hughes R.M., Peteya L.A., Schwartz J.W., Ehlers M.D., Tucker C.L. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Meth. 2010; 7(12): 973—5.

23. Kienle et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 2012; 15: 793—802.

24. Kohl M., Shipton O., Deacon R., Rawlins J., Deisseroth K., Paulsen O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat. Neurosci. 2011; 14: 1413—5.

25. Krook-Magnuson E., Armstrong C., Oijala M., Soltesz I. On-demand optogenetic control of spontaneous seizures in temporal lobe epilepsy. Nat. Commun. 2013; 4: 1376.

26. Liu X., Davis R.L. Insect olfactory memory in time and space. Curr. Opin. Neurobiol. 2006; 16: 679—85.

27. Llewellyn M.E., Thompson K.R., Deisseroth K., Delp S.L. Orderly recruitment of motor units under optical control in vivo. Nature medicine. 2010; 16: 1161—5.

28. Nagel G., Szellas T., Huhn W., Kateriya S., Adeishvili N. et al. Channelrhodopsin-2 a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100(24): 13940—5.

29. Palczewski K. G protein-coupled receptor rhodopsin. Ann. Rev. Biochem. 2006; 75: 743—67.

30. Paz J., Davidson T., Frechette E., Delord B., Parada I., Peng K.

et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nat. Neurosci. 2013; 16: 64—70.

31. Petreanu L., Huber D., Sobczyk A., Svoboda K. Channelrhodopsin-2 — assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 2007; 10: 663—8.

32. Richter C.-P., Tan X. Photons and neurons. ELSEVIER. 2014; 1—17.

33. Shimizu-Sato S., Huq E., Tepperman J.M., Quail P.H. A lightswitchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 2002; 20(10): 1041—4.

34. T0nnesen J., S0rensen A., Deisseroth K., Lundberg C., Kokaia M. Optogenetic control of epileptiform activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 106: 12162—7.

35. Tsai H.C., Zhang F., Adamantidis A., Stuber D.G. et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral condition. Science. 2009; 324. № 5930: 1080—4.

36. Wang X., Chen X., Yang Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 2012; 9(3): 266—9.

37. Yin T., Wu Y. Guiding lights: recent developments in optogenetic control of biochemical signals. J. Physiol. 2013; 465: 397—408.

38. Yizhar O., Fenno L.E., Davidson T.J., Morgi M., Deisseroth K. Optogenetics in neuronal systems. Neuron. 2011; 71: 9—34.

39. Zeng H., Madisen L. Mouse transgenic approaches in optogenetics. Prog. Brain Res. 2012; 196: 193—213.

40. Zhao S., Cunha G., Zhang F., Liu Q. et al. Improved expression of

halorhodopsin for light-induced silencing of neuronal activity. Brain Cel.lBiol. 2008; 36(1—4): 141—54.

Поступила 17.09.15

E.V. Borisova, E.A. Epifanova, SA. Tutukov, VA. Salina, AA. Babaev

OPTOGENETIC APPROACHES IN NEUROBIOLOGY

Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, 603950, Nizhny Novgorod, Russian Federation

Optogenetics is a rapidly developing new technique that combines optic methods with techniques used in molecular biology. It can be used for monitoring various optic processes in cells and controlling their activity using light. The technique is based on bacterial opsin expression in mammalian neurons. In this review, the use of optogenetics for controlling the activity of specific neuron populations in different regions of the human brain is considered in detail. The paper also presents information about light-sensitive proteins, genetically encoded optical instruments and their use for activation or inhibition of neurons, and the research into the cause-and-effect relationship between neural networks and pathological symptoms.

Key words: optogenetics, opsins, сhannelrhodopsin-2 (ChR2), halorhodopsin (NpHR), archeorhodopsin-3 (Arch), virus vectors, Cre recombinases, loss of motor function, Parkinson s disease, epilepsy.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-128-132

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.842.11:579.22]:615.272.2.012.6

Карягина А.С.1-3, Бокша И.С.1, Грунина Т.М.1, Демиденко А.В.1, Попонова М.С.1, Сергиенко О.В.1'3, Лящук А.М.1, Галушкина З.М.1, Соболева Л.А.1, Осидак Е.О.1'4, Семихин А.С.1, Громов А.В.1, Лунин В.Г.1'3

оптимизация ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОЙ ФОРМЫ rhBMp-2 В ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ С ПОМОЩьЮ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

'ФГБУ «ФНИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия; 2НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГБОУ «МГУ им. М.В. Ломоносова», 119991, Москва, Россия; 3ФГБНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, 127550, Москва, Россия; 4ООО фирмы «Имтек», 121552, Москва, Россия

Рекомбинантный костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (rhBMP-2)) обладает выраженными остеоиндуктивными свойствами, что подтверждается результатами экспериментальной и клинической практики. Это относится как к белку, получаемому в клетках эукариот, так и к белку, синтезируемому в клетках бактерий. В эукариотических системах экспрессии выход белка крайне мал, и, как следствие, стоимость препаратов на его основе очень высока. Поэтому актуальной задачей является оптимизация гетерологичных систем экспрессии rhBMP-2. В настоящей работе проведена оптимизация кодонного состава нуклеотидной последовательности и вторичной структуры транскрипта гена rhBMP-2 и подобран штамм, обеспечивающий эффективную экспрессию гена. Полученный продуцент на основе Escherichia coli BP-21(DE3) обеспечивает высокий уровень синтеза rhBMP-2 (около 57% от суммарного белка клетки). Биологическую активность выделенных из полученного продуцента препаратов димерной формы rhBMP-2 определяли по индукции активности щелочной фосфатазы клетками С2С12. Она не уступает активности коммерческого препарата rhBMP-2 (R&D Systems, США), синтезированного в клетках E. coli. Очищенные препараты rhBMP-2 не содержат примесей эндотоксина E. coli и могут применяться в экспериментах по исследованию процессов остеоиндукции на лабораторных животных.

Ключевые слова: костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2, BMP-2); rhBMP-2; гетерологич-ная система экспрессии; кодонный состав, активная форма, димер.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-132-137 Введение

Костный морфогенетический белок-2 (Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2)) относится к суперсемейству белков трансформирующего фактора роста бета, которые играют важную роль в процессах регенерации костной ткани и в эмбриональном развитии [1]. В тканях млекопитающих BMP-2 синтезируется в виде гликозилированного белка-предшественника, состоящего из 396 а.о., который протеолитически гидро-лизуется и димеризуется, что приводит к образованию зрелой формы гомодимерного BMP-2, состоящей из двух субъединиц по 114 а.о. каждая. Подобно другим членам суперсемейства TGFP мономер BMP-2 включает 6 цистеиновых остатков, которые формируют 3 внутримолекулярные дисульфидные связи и один остаток