МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS FOR THEIR APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Методика относится к иммуногенам и к связывающим средствам, которые связываются с иммуногенами, таким как моноклональные антитела, для идентификации или выделения злокачественных клеток, которые содержат иммуногены, или лечения или профилактики злокачественных опухолей, содержащих злокачественные клетки, в частности, у собак.
ИНФОРМАЦИЯ О ПРЕДШЕСТВУЮЩЕМ УРОВНЕ ТЕХНИКИ
Связывающие средства, такие как моноклональные антитела, являются подходящими для диагностики и лечения заболеваний, таких как злокачественная опухоль. Например, у псовых (собак) тип злокачественной опухоли представляет собой B-клеточную лимфому, при которой неконтролируемая B-клеточная пролиферация может приводить к заболеванию и смерти. Лимфома также возникает у людей, и ее можно лечить антителами против CD20 человека, например, такими как ритуксимаб. Эти антитела, которые взаимодействуют или связываются с CD20 человека, как правило, не связываются с CD20 собак (Jubala et al., Vet. Pathol., Jul; 42(4):468-76, 2005; Impellizeri et al., Vet. J., May; 171(3):556-8, 2006; Gravanis et al., The Oncologist, Dec; 15:1335-1343, 2010). Таким образом, желательными являются связывающие средства, способные взаимодействовать с CD20 на поверхности B-клеток собаки. Описываемая в настоящем описании методика относится к таким реагентам и терапевтическим средствам, как продемонстрировано ниже.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к реагентам и способам профилактики и/или лечения болезненных состояний у собак (например, лимфомы). Например, были идентифицированы эпитопы CD20 собаки, которые можно использовать в качестве мишени для уменьшения B-клеточной лимфомы клеток в крови и/или ткани собак. Были идентифицированы иммуногены, как описано в настоящем описании, которые можно использовать для индукции и/или усиления иммунного ответа (например, продукции антител), подходящие для использования при профилактике и/или лечении таких заболеваний. Также описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногены и полипептидные/пептидные иммуногены по существу, и способы их получения. В определенных вариантах осуществления иммуногены представляют собой или содержат конкретные представляющие интерес эпитопы, такие как LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO:2). Эти иммуногены можно использовать самостоятельно и/или с другими иммуногенами, и/или ʺостовамиʺ (например, Fc собак) для индукции и/или усиления иммунного ответа, например, против CD20 собаки.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к связывающим средствам, подходящим для выделения и/или идентификации клеток, экспрессирующих CD20 собаки, или клеток, которые содержат белок клеточной поверхности, который взаимодействует с этими связывающими средствами (например, B-клеток, B-клеток лимфомы, CD20 собаки), и/или лечения и профилактики злокачественной опухоли у млекопитающего (например, у собак). В определенных вариантах осуществления связывающее средство может представлять собой антитело, реактивное против CD20 собаки, экспрессируемого на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления одно или более связывающих средств (например, антитело, такое как моноклональное антитело) связываются или взаимодействуют с CD20 собаки в его области, которая содержит аминокислотные последовательности или эпитоп(ы), LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO: 2).
Другие варианты осуществления относятся к способам детекции клеток собак с использованием таких связывающих средств. В определенных вариантах осуществления можно идентифицировать и/или выделять клетки, экспрессирующие CD20 на своей клеточной поверхности (например, B-клеточной лимфомы), у животного (например, собак) посредством приведения в контакт тестируемого биологического образца, содержащего клетки, со связывающим средством и детекции связывающего средства, связанного с биологическим образцом, или его компонентов (например, клеток лимфомы). В определенных вариантах осуществления способ может включать сравнение количества связывания в тестируемом биологическом образце с количеством связывания в контрольном биологическом образце, где повышенное связывание с тестируемым биологическим образцом относительно контрольного биологического образца может указывать на наличие одной или более клеток лимфомы в тестируемом биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления биологический образец представляет собой кровь собак или отобранный шприцем аспират. Эти способы также предоставлены в формате in vivo и/или in vitro.
Некоторые варианты осуществления также относятся к способам элиминации клеток, экспрессирующих CD20 собаки, с использованием таких связывающих средств. Также предоставлены способы лечения одного или более болезненных состояний (например, лимфомы) у животного (например, собак) посредством введения животному по меньшей мере одной или более эффективных доз связывающего средства или его производного. В некоторых вариантах осуществления, в которых связывающее средство представляет собой моноклональное антитело, моноклональное антитело можно вводить при величине дозы приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/кг массы тела животного, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/кг или приблизительно от 5 приблизительно до 30 мг/кг (например, приблизительно 10 мг/кг). Связывающие средства можно вводить более одного раза в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления связывающее средство можно вводить в сочетании с одним или более других средств (например, химиотерапевтических средств).
Также изобретение относится к наборам для использования связывающего средства для идентификации или детекции полипептидов и/или реагирующих с ними клеток и/или для использования таких связывающих средств для профилактики и/или лечения заболевания (например, лимфомы собак). Набор может содержать, например, связывающее средство или его производное в любой форме (например, в растворе, в лиофилизированной форме) необязательно совместно с инструкциями по использованию. Другие варианты осуществления станут понятны из описаний, предоставленных в настоящем описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. FACS-анализ аффинности связывания моноклональных антител с клетками B-клеточной лимфомы собак.
Фигура 2. A. Выравнивание внеклеточных доменов CD20 собаки и человека и вариантов гибридов человека/собаки V1-V4. B. Анализ связывания ELISA гибридомных антител 1E4, 1G1 и 1G10 с ECD2 CD20 собаки и V1-V4.
Фигура 3. FACS-анализ связывания гибридомного антитела 1E4 с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) собаки.
Фигура 4. A. Анализ SDS-PAGE очищенного химерного антитела 1E4-cIgGB против CD20 собаки, экспрессируемого клетками CHO. B. Анализ эксклюзионной хроматографией очищенного 1E4-cIgGB.
L
Фигура 5. Анализ ELISA связывания пептида ECD2 CD20 немодифицированным (WT) антителом 1E4-cIgGB и антителами с указанными заменами аминокислот на последовательность NG в V 1E4-cIgGB в увеличивающихся концентрациях.
Фигура 6. Дозозависимая элиминация B-клеток собаки in vivo с использованием иллюстративного антитела 1E4-cIgGB. Ритуксан-cIgGB включали в качестве отрицательного (изотипического) контроля.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Связывающие средства
Настоящее изобретение относится к связывающим средствам, которые связываются с CD20 собаки на поверхности клеток in vitro и/или in vivo. Связывающие средства могут также связываться с выделенными полипептидами и/или фрагментами и/или их производными CD20 собаки. Также предоставлены способы диагностики, лечения и/или профилактики одного или более заболеваний, связанных с наличием клеток, экспрессирующих CD20 собаки. Например, связывающие средства могут представлять собой антитела (например, моноклональные антитела), которые могут взаимодействовать и/или связываться с эпитопами SEQ ID NO: 1 и/или 2. Эти моноклональные антитела могут содержать любую одну или более из аминокислотных последовательностей, представленных в таблицах 1 и 4-5, например, (и/или один или более их фрагментов и/или производных), и их может кодировать любая одна или более нуклеотидных последовательностей, представленных в настоящем описании (и/или один или более их фрагментов и/или производных). Настоящее изобретение также относится к использованию таких моноклональных антител для выделения, идентификации, и/или клеток-мишеней, экспрессирующих CD20 собаки (например, клеток B-клеточной лимфомы собак) для ингибирования (например, цитотоксичности) для профилактики и/или лечения злокачественной опухоли у животных (например, у собак). В определенных вариантах осуществления эти моноклональные антитела могут быть реактивными против CD20 собаки, экспрессируемого на поверхности клеток.
Связывающие средства, как правило, взаимодействуют или специфически связываются с мишенью. Например, связывающие средства, описываемые в настоящем описании, как правило, специфически взаимодействуют с областями CD20 собаки в качестве мишени. Связывание ʺспецифическиʺ с CD20 означает, что количество связывания с CD20 является больше чем количество связывания с мишенями не-CD20 (т.е. существует фоновое неспецифическое связывание). Как правило, специфическое связывание связывающих средств с белком, например, можно получать посредством связывания с конкретной последовательностью аминокислот в белке-мишени. Эти последовательности можно обозначать как эпитопы. Молекулы, содержащие эпитопы, можно использовать для стимуляции связывающих средств, такие как антитела, и их можно обозначать как иммуногены. Связывающие средства могут также распознавать конкретные 2- и/или 3-мерные структуры в составе эпитопа. В одном из примеров моноклональные антитела, описываемые в настоящем описании, могут связываться с эпитопами CD20 собаки, такими как LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) и/или DIHNCD (SEQ ID NO:2).
d
d
d
d
Предполагают, что специфическое взаимодействие или связывание связывающего средства со своей мишенью представляет собой тип равновесной реакции. В одном из примеров можно количественно определять специфическое связывание. Для количественного определения можно использовать константу диссоциации или K. В данной области известно, что K представляет собой тип константы равновесия, которая описывает способность, в данном случае, антитела отделяться от антигена или эпитопа, с которым оно связалось. Таким образом, K описывает аффинность, которой обладает антитело по отношению к эпитопу. Чем ниже K, тем выше аффинность связывающего средства по отношению к своей мишени.
В определенных вариантах осуществления связывающее средство представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 1E4, 1G10 и 1G1, как описано в настоящем описании. Моноклональное антитело может содержать аминокислотную последовательность любую одну или более из SEQ ID NO: 3, 6, 9, 11, 13 и/или 15 (например, как в таблице 1) и/или любой один или более их фрагментов и/или производных. Антитела могут содержать любую из последовательностей CDR, указанных в таблице 4. Антитело (например, моноклональное антитело) также может быть любого подходящего изотипа или подкласса изотипа. В определенных вариантах осуществления антитело относится к подклассу IgG собаки, например, IgGA, IgGB (например, SEQ ID NO:55 или 57; таблица 5), IgGC и/или IgD, как описано у Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol., Aug; 80(3-4):259-70, 2001.
2
c
Связывающее средство также может представлять собой производное антитела (например, моноклонального антитела 1E4, 1G10 и/или 1G1), такое как, например, Fab, F(ab'), Fab', одноцепочечное антитело, Fv, одноцепочечное моноспецифическое антитело, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело, поливалентное антитело, химерное антитело, химерное антитело собаки-человека, химерное антитело собаки-мыши, антитело, содержащее F собаки, гуманизированное антитело, антитело человека, канинизированное антитело, CDR-трансплантированное антитело, антитело акулы, нанотело (например, антитело, содержащее одиночный мономерный вариабельный домен), антитело верблюда (например, семейства Camelidae), микротело, интраантитело (например, внутриклеточное антитело) и/или дефукозилированное антитело и/или его производное. Также предоставлены миметики связывающих средств и/или антител. Связывающее средство также может содержать детектируемую метку и/или эффекторную молекулу, обратимо связанную с ним.
Также предоставлены выделенные полинуклеотиды, кодирующие подходящие связывающие средства. Такие полинуклеотиды могут содержать, например, любую одну или более из SEQ ID NO:4, 5, 7, 8, 10, 12, 14 и/или 16 (например, таблица 1) и/или любой один или более их фрагментов и/или производных. Определенные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии и/или клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды, и/или кодирующим и/или экспрессирующим такие полипептиды.
Некоторые варианты осуществления также относятся к композициям, содержащим такие связывающие средства, полипептиды, пептиды, полинуклеотиды, векторы экспрессии и/или клетки-хозяева. В определенных вариантах осуществления композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель.
Моноклональные антитела, описываемые в настоящем описании, (обозначаемые как антитела ʺAʺ для этого примера), которые связываются с конкретным эпитопом или эпитопами, могут конкурировать за связывание с другими антителами (обозначаемыми как антитела ʺBʺ для этого примера), которые распознают такие же или аналогичные эпитопы, или которые распознают эпитопы, которые находятся по близости с эпитопами, распознаваемыми антителами ʺAʺ (например, перекрывающиеся эпитопы). Конкуренция означает, что одно из антител связывается в ущерб другому антителу, или по меньшей мере ингибирует до некоторой степени связывание другого антитела. Например, говорят, что антитело ʺAʺ, которое снижает или предотвращает связывание антитела ʺBʺ, конкурирует с ʺBʺ за связывание. Такие антитела ʺBʺ также представляют собой примеры антител, которые являются частью изобретения, описываемого в настоящем документе. Конкуренция между антителами ʺAʺ и ʺBʺ за связывание со своими эпитопами можно измерять с использованием так называемых конкурентных экспериментов. Как правило, в конкурентных экспериментах связывающие средства, которые необходимо сравнивать, добавляют/помещают по близости от мишени, с которой связывающие средства способны связываться, или предполагают, что они связываются. Эксперименты планируют таким образом, чтобы было возможно количественно определять связывание индивидуальных связывающих средств с мишенью. Конкуренцию выявляют, например, когда добавление по меньшей мере одного антитела ʺAʺ приводит к связыванию антитела ʺBʺ с меньшей степенью, чем если бы антитело ʺAʺ не присутствовало. В одном из примеров связывающее средство ʺAʺ конкурирует со связывающим средством ʺBʺ за связывание с мишенью. ʺBʺ также может конкурировать с ʺAʺ. Антитела ʺAʺ и ʺBʺ могут обладать или могут не обладать по существу одинаковыми Kd.
В случае, когда связывающее средство представляет собой антитело, его можно идентифицировать по отношению к нуклеотиду и/или аминокислотной последовательности, соответствующей его вариабельным и/или определяющим комплементарность областям (ʺCDRʺ). Например, иллюстративное связывающее средство, которое представляет собой, получают из или является родственным моноклональному антителу 1E4, 1G10 или 1G1, может содержать тяжелую и/или легкую цепь, каждая из которых содержит одну или более константных и/или вариабельных областей. Вариабельные области, как правило, содержат одну или более CDR, которые в значительной степени определяют специфичность связывания антитела. Такие моноклональные антитела можно идентифицировать анализом нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные области. Моноклональные антитела также можно идентифицировать анализом аминокислотных последовательностей (например, которые могут кодироваться нуклеотидными последовательностями) вариабельных областей. Например, иллюстративные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи 1E4, 1G10 и 1G1 и иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие их, представлены ниже:
Таблица 1
Описание
Последовательность
Вариабельная область легкой цепи (V<sub>L</sub>) 1E4
DVVMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYNNGNTYLHWYRQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:3)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:3 (1E4,V<sub>L</sub>)
GATGTTGTGATGACCCAAAACCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTATATACAATAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCGGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO:4)
Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:3 (1E4,V<sub>L</sub>)
GATGTCGTGATGACTCAGAATCCACTGTCCCTGCCTGTGTCCCTGGGCGATCAGGCTTCCATTAGCTGTCGTTCCTCTCAGTCCCTGATCTACAACAATGGTAACACCTACCTGCACTGGTATAGACAGAAGCCCGGCCAGTCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAAGTGAGTAATAGGTTCTCAGGAGTCCCAGACCGGTTTTCCGGCAGCGGATCTGGGACCGATTTCACACTGAAAATCTCTAGGGTGGAGGCCGAAGACCTGGGCGTCTACTTTTGTAGTCAGAGCACTCACGTCCCCTTCACCTTCGGCAGCGGAACAAAACTGGAAATCAAG (SEQ ID NO:5)
Вариабельная область тяжелой цепи (V<sub>H</sub>) 1E4
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYGMLWVRQAPEKGLEWIAYISSGSSTIYYADRVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCSTGTFAYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO:6)
Нуклеотидная последовательность, кодирующаяSEQ ID NO:6 (1E4, V<sub>H</sub>)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATGGAATGCTCTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGATTGCATACATTAGTAGTGGCAGTAGTACCATCTACTATGCAGACAGAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAAGAACACCCTGTTCCTGCAAATGACCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTTCAACTGGGACGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCCGGTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO:7)
Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:6 (1E4, V<sub>H</sub>)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGTGGTGGTCTGGTCAAGCCTGGAGGTTCCCTGAAACTGAGTTGTGCCGCATCTGGGTTTACATTCTCTGACTACGGAATGCTGTGGGTGAGGCAGGCACCAGAGAAGGGCCTGGAATGGATCGCTTATATTTCCAGCGGATCTAGTACTATCTACTATGCAGACAGGGTCAAGGGCCGGTTCACCATTAGCAGAGATAACGCCAAAAATACCCTGTTTCTGCAGATGACATCACTGAGGTCCGAGGATACCGCTATGTATTATTGCTCCACAGGGACTTTTGCTTACTGGGGACAGGGGACACCCGTGACCGTCAGCTCA (SEQ ID NO:8)
Вариабельная область легкой цепи (V<sub>L</sub>) 1G10
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSNKSLLHRNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:9)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:9 (1G10, V<sub>L</sub>)
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAATAAGAGTCTCCTGCATCGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTTCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAATCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGATTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTGGAATTTCCTTTCACGTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 10)
Вариабельная область тяжелой цепи (V<sub>H</sub>) 1G10
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGDTSYNQKFKGKAPLTVDKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCARGGVLRYPYYYVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 11)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 11 (1G10, V<sub>H</sub>)
GAGGTCCAGCTGCAACAATCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAAGGCTTCTGGATACACGTTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTAATCCTAACAATGGTGATACTAGCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCCCCTTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGGTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGGAGGAGTACTACGGTACCCGTATTACTATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO: 12)
Вариабельная область легкой цепи (V<sub>L</sub>) 1G1
DIVMTQSQKFMSRSVGDRVSVTCKASQNVGPNVAWYQQRPGQSPKPLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 13)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 13 (1G1, V<sub>L</sub>)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCAGATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTCCTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAATCTCCTAAACCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAACAACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 14)
Вариабельная область тяжелой цепи (V<sub>H</sub>) 1G1
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGHTKYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSLRHYYGSSYVSPHYYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 15)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO: 15 (1G1, V<sub>H</sub>)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAATATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTCATACTAAATATGCCTCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTTCCCTCCGGCATTACTACGGTAGTAGCTACGTATCGCCCCATTACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACTGTCAGCTCA (SEQ ID NO: 16)
При желании специалист в данной области также может заменять любую из аминокислот, представленных в таблице 1 (и/или любого одного или более их фрагментов и/или производных) на любую другую аминокислоту. Например, специалист в данной области также может проводить консервативные замены, заменяя конкретные аминокислоты другими, представленными в таблице 7, ниже. Иллюстративные аминокислоты, которые можно заменять, могут включать, например, остатки 26, 28, 33 и/или 34 SEQ ID NO:9 (вариабельная область легкой цепи 1G10), остатки 55 и/или 56 SEQ ID NO: 11 (вариабельная область тяжелой цепи 1G10), и/или остатки 52, 53, 55 и/или 56 SEQ ID NO: 15 (вариабельная область тяжелой цепи 1G1), которые можно заменять любой другой o аминокислотой, включая, но ими не ограничиваясь, консервативные замены, представленные в таблице 7, ниже. Нуклеотидные последовательности, кодирующие консервативные аминокислотные замены, можно конструировать с использованием генетического кода, как указано в таблице 6. Примеры таких замещенных аминокислотных последовательностей включают, например:
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSXKXLLHRXXNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEFPFTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 17), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области легкой цепи 1G10, указанную посредством SEQ ID NO:9);
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGDINPNXXDTSYNQKFKGKAPLTVDKSSSTAYMEVRSLTSEDSAVYFCARGGVLRYPYYYVMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области тяжелой цепи 1G10, указанную посредством SEQ ID NO: 11); и
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQRPEQGLEWIGWIXXEXXHTK YASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSLRHYYGSSYVSPHYYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 19), где X представляет собой любую аминокислоту (модификацию вариабельной области тяжелой цепи 1G1, указанную посредством SEQ ID NO: 15.
Любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или любые их фрагменты и/или производные можно также комбинировать с любой другой вариабельной областью и/или CDR в любом порядке и/или комбинации с получением гибридных и/или слитых связывающих средств и/или встраивать в другие вариабельные области тяжелых и/или легких цепей стандартными способами. Их можно использовать в сочетании с любыми константными областями (например, как в таблице 5).
CDR (определяющие комплементарность области) представляют собой аминокислотные последовательности из антител, которые по меньшей мере частично ответственны за связывание антитела с конкретной мишенью. Специалистам в данной области следует понимать, что CDR можно идентифицировать любым из некоторых способов и/или с использованием систем. CDR связывающих средств, продемонстрированных в настоящем описании, можно идентифицировать любые из таких способов. Например, специалист в данной области может идентифицировать CDR с использованием системы нумерации Kabat, системы нумерации Chothia, улучшенной системы нумерации Chothia и/или любой из доступных систем определения CDR (например, AbM, определение контакта, и/или как описано MacCullum et al., J. Mol. Biol., 262(5):732-745, 1996). Сущность различных систем, частично основанных, например, на Kabat et al., ʺSequences of Proteins of Immunological Interestʺ, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication No. 91-3242 (1991), и Al-Lazikani et al., ʺStandard conformations for the canonical structures of immunoglobulinsʺ, J. Mol. Biol., 273:927-948, 1997, приведена в таблице 2 ниже:
Таблица 2
CDR Петля*
Kabat
AbM
Chothia
Контакт
L1
L24--L34
L24--L34
L24--L34
L30--L36
L2
L50--L56
L50--L56
L50--L56
L46--L55
L3
L89--L97
L89--L97
L89--L97
L89--L96
H1
H31--H35B(нумерация по Kabat)
H26--H35B
H26--H32..34
H30--H35B
H1
H31--H35(нумерация по Chothia)
H26--H35
H26--H32
H30--H35
H2
H50--H65
H50--H58
H52--H56
H47--H58
H3
H95--H102
H95--H102
H95--H102
H93--H101
*L=легкая цепь; H=тяжелая цепь
CDR также можно идентифицировать, следуя следующему набору правил, таких как набор правил, указанный в таблице 3 ниже (как описано http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid):
Таблица 3
CDR*/Признак
Стандартная характеристика признака**
CDR-L1
Начало
приблизительно остаток 24
Остатки перед
как правило, Cys
Остатки после
как правило, Trp (например, Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu)
Длина
от 10 до 17 остатков
CDR-L2
Начало
как правило, 16 остатков после конца L1
Остатки перед
как правило, Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys или Ile-Phe
Длина
как правило, семь (7) остатков
CDR-L3
Начало
как правило, 33 остатка после конца L2
Остатки перед
как правило, Cys
Длина
как правило, Phe-Gly-X-Gly
Остатки после
от 7 до 11 остатков
CDR-H1
Начало
приблизительно остаток 26 (как правило, четыре (4) остатка после Cys) (определение по Chothia/AbM), в определении по Kabat начинают после 5 остатков
Остатки перед
как правило, Cys-X-X-X
Остатки после
как правило, Trp (например, Trp-Val, Trp-Ile, Trp-Ala)
Длина
от 10 до 12 остатков (определение AbM), в определении по Chothia исключают последние четыре (4) остатка
CDR-H2
Начало
как правило, 15 остатков после конца CDR-H1 согласно определению по Kabat/AbM
Остатки перед
как правило, Leu-Glu-Trp-Ile-Gly
Остатки после
как правило, Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
Длина
Определение по Kabat от 16 до 19 остатков, определение AbM (и последнее Chothia) от 9 до 12 остатков
CDR-H3
Начало
как правило, 33 остатка после конца CDR-H2 (как правило, два (2) остатка после Cys)
Остатки перед
как правило, Cys-X-X (как правило, Cys-Ala-Arg)
Остатки после
как правило, Trp-Gly-X-Gly
Длина
как правило, от 3 до 25 остатков
*L=легкая цепь; H=тяжелая цепь; **X=любая аминокислота
Эти системы определения CDR являются только иллюстративными, и подходящими могут быть другие системы, как понятно специалисту в данной области. Определяемые таким образом CDR можно использовать для идентификации подходящих связывающих средств. Например, эквиваленты одного или более моноклональных антител 1E4, 1G10 и/или 1G1 могут представлять собой связывающие средства, содержащие аминокислотные последовательности. Такие CDR также можно комбинировать друг с другом в любом порядке, и/или они могут представлять собой комбинации с образованием гибридных и/или слитых связывающих средств, и/или их можно встраивать стандартными способами в другие вариабельные области тяжелых и/или легких цепей. Аминокислотные последовательности, представленные в таблице 1, и/или любой один или более их фрагментов и/или производных могут быть кодированы любой из нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты. Такие последовательности нуклеиновой кислоты также можно использовать для идентификации и/или получения (например, в качестве молекул нуклеиновой кислоты) подходящих связывающих средств. Например, специалист в данной области может конструировать нуклеотидные последовательности, кодирующие любые такие аминокислотные последовательности на основании любой одной или более из таблиц 1-7 в настоящем описании. Иллюстративные нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области легкой цепи 1E4, 1G10 и 1G1, могут представлять собой такие, как описанные в таблице 1. Любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или их фрагменты и/или производные можно комбинировать друг с другом в любом порядке и/или комбинации для кодирования гибридных и/или слитых связывающих средств и/или введения в другие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные области легкой и/или тяжелой цепей (и/или их фрагменты и/или производные). Иллюстративные фрагменты могут представлять собой, например, любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из аминокислотных последовательностей, представленных в таблице 1, и/или любой ее фрагмент и/или производное (например, один или более ее CDR). Предполагаемые CDR моноклональных антител 1E4, 1G10 и 1G1 перечислены в таблице 4. Эти CDR были идентифицированы с использованием систем, указанных Kabat et al., ʺSequences of Proteins of Immunological Interestʺ, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, NIH publication No. 91-3242 (1991), и Al-Lazikani et al., ʺStandard conformations for the canonical structures of immunoglobulinsʺ, J. Mol. Biol., 273:927-948, 1997.
Таблица 4
CDR
Kabat CDR(Kabat et al. 1991)
Chothia CDR(Al-Lazikani et al. 1997)
1E4 CDRH1
DYGML(SEQ ID NO:20)
GFTFSDY(SEQ ID NO:21)
1E4 CDRH2
YISSGSSTIYYADRVKG(SEQ ID NO:22)
SSGSST(SEQ ID NO:23)
1E4 CDRH3
GTFAY(SEQ ID NO:24)
GTFAY(SEQ ID NO:24)
1E4 CDRL1
RSSQSLIYNNGNTYLH(SEQ ID NO:25)
SQSLIYNNGNTY(SEQ ID NO:26)
1E4 CDRL1от N33 до K
RSSQSLIYNKGNTYLH(SEQ ID NO:70)
SQSLIYNKGNTY(SEQ ID NO:71)
1E4 CDRL1от G34 до K
RSSQSLIYNNKNTYLH(SEQ ID NO:72)
SQSLIYNNKNTY(SEQ ID NO:73)
1E4 CDRL1от G34 до Q
RSSQSLIYNNQNTYLH(SEQ ID NO:74)
SQSLIYNNQNTY(SEQ ID NO:75)
1E4 CDRL1от G34 до A
RSSQSLIYNNANTYLH(SEQ ID NO:76)
SQSLIYNNANTY(SEQ ID NO:77)
1E4 CDRL2
KVSNRFS(SEQ ID NO:27)
KVS(SEQ ID NO:28)
1E4 CDRL3
SQSTHVPFT(SEQ ID NO:29)
STHVPF(SEQ ID NO:30)
1G1 CDRH1
DDYMH(SEQ ID NO:31)
GFNIKDD(SEQ ID NO:32)
1G1 CDRH2
WIDPENGHTKYASKFQG(SEQ ID NO:33)
DPENGH(SEQ ID NO:34)
1G1 CDRH3
LRHYYGSSYVSPHYY(SEQ ID NO:35)
LRHYYGSSYVSPHYY(SEQ ID NO:36)
1G1 CDRL1
KASQNVGPNVA(SEQ ID NO:37)
SQNVGPN(SEQ ID NO:38)
1G1 CDRL2
SASYRYS(SEQ ID NO:39)
SAS(SEQ ID NO:40)
1G1 CDRL3
QQYNNYPYT(SEQ ID NO:41)
YNNYPY(SEQ ID NO:42)
1G10 CDRH1
DYYMN(SEQ ID NO:43)
GYTFTDY(SEQ ID NO:44)
1G10 CDRH2
DINPNNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:45)
NPNNGD(SEQ ID NO:46)
1G10 CDRH3
GGVLRYPYYYVMDY(SEQ ID NO:47)
GGVLRYPYYYVMDY(SEQ ID NO:48)
1G10 CDRL1
RSNKSLLHRNGNTYLY(SEQ ID NO:49)
NKSLLHRNGNTY(SEQ ID NO:50)
1G10 CDRL2
RMSNLAS(SEQ ID NO:51)
RMS(SEQ ID NO: 52)
1G10 CDRL3
MQHLEFPFT(SEQ ID NO:53)
HLEFPF(SEQ ID NO:54)
В некоторых вариантах осуществления связывающее средство может содержать аминокислотные последовательности, указанные в таблице 4 выше. Подгруппы из этих комбинаций и/или других комбинаций CDR, представленные в таблице 4, также могут являться подходящими, как будет понятно специалистам в данной области. В одном из примеров, для получения канинизированных антител можно использовать различные комбинации указанных выше CDR.
Последовательности вариабельных областей, описываемые в настоящем описании (которые могут содержать их фрагменты и/или производные), включая, но ими не ограничиваясь, аминокислотные последовательности, представленные в таблице 1 (и/или их фрагменты и/или производные), и/или нуклеотидные последовательности, представленные в таблице 1 (и/или их фрагменты и/или производные), можно использовать в комбинации с одной или более аминокислотных последовательностей и/или нуклеотидных последовательностей, кодирующих одну или более константных цепей (и/или их фрагмент и/или производные) молекулы антитела. Например, аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные в таблице 1, можно присоединять к константным областям любой молекулы антитела того же самого или вида, отличного (например, человека, козы, крысы, овцы, курицы) от того для которого получали аминокислотную последовательность вариабельной области.
Дезаминирование остатков аспарагина до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты представляет собой широко распространенную посттрансляционную модификацию белков. Дезаминирование может возникать с высокой частотой, когда аспарагин является частью дипептида аспарагин-глицин (Asp-Gly или N-G, последовательность ʺNGʺ). Дезаминирование может оказывать неблагоприятное влияние на белки. В одном из примеров дезаминирование может потенциально приводить к изменению трехмерной структуры белка. В другом примере для антитела дезаминирование в области, которая влияет на связывание с антигеном (например, вариабельных областях и/или CDR), может потенциально приводить к более слабому или потери связывания антитела с антигеном.
L
Таким образом, благоприятным может быть замена аминокислотных остатков, потенциально подвергающихся посттрансляционному дезаминированию, на остатки, подвергающиеся в меньшей степени или неподвергающиеся. В одном из примеров аспарагин 33 (N33) и/или глицин 34 (G34) SEQ ID NO:3 (вариабельная область легкой цепи (V) 1E4) можно заменять для модификации последовательности NG (см., например, SEQ ID NO:71, 73, 75 и 77). SEQ ID NO:3 представлена ниже с подчеркнутыми N33 и G34 (последовательность NG):
DVVMTQNPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLIYNNGNTYLHWYRQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:3)
N33 и/или G34 можно заменять, например, любой аминокислотой, такой как аланин (A), глутаминовая кислота (E), фенилаланин (F), гистидин (H), изолейцин (I), лизин (K), лейцин (L), метионин (M), пролин (P), глутамин (Q), аргинин (R), треонин (T), валин (V) и/или тирозин (Y), в любой комбинации. В некоторых вариантах осуществления N33 можно заменять, например, аланином (A), глутаминовой кислотой (E), фенилаланином (F), гистидином (H), изолейцином (I), лизином (K), лейцином (L), пролином (P), глутамином (Q), аргинином (R), треонином (T), валином (V) или тирозином (Y). В некоторых вариантах осуществления G34 можно заменять, например, аланином (A), глутаминовой кислотой (E), фенилаланином (F), гистидином (H), изолейцином (I), лизином (K), лейцином (L), пролином (P), глутамином (Q), аргинином (R), валином (V), триптофаном (W) или тирозином (Y), в любой комбинации.
В одном из вариантов осуществления N33 (например, SEQ ID NO:9) можно заменять лизином (K) (замена N33K). В конкретных вариантах осуществления G34 (например, SEQ ID NO:9) можно заменять лизином (K) (G34K), глутамином (Q) (G34Q) или аланином (A) (G34A). В некоторых вариантах осуществления замены могут включать N33K и любую G34K, G34Q или G34A. Как будет понятно специалисту в данной области, другие замены также могут быть подходящими.
L
H
H
В других вариантах осуществления аспарагин 33 (N33) и/или глицин 34 (G34) SEQ ID NO:9 (вариабельная область легкой цепи (V) 1G10), аспарагин 55 (N55) и/или глицин 56 (G56) SEQ ID NO: 11 (вариабельная область тяжелой цепи (V) 1G10), или аспарагин 55 (N55) и/или глицин 56 (G56) SEQ ID NO: 15 (вариабельная область тяжелой цепи (V) 1G1) можно заменять любой подходящей аминокислотой. В другом примере один или более из аспарагинов 103 (N103), 183 (N183) и/или 270 (N270) и/или глицины 104 (G104), 184 (G184) и/или 271 (G271) SEQ ID NO:57 (константная область тяжелой цепи IgGB собаки) можно заменять любой подходящей аминокислотой. Дополнительная информация касательно определенных замен описана и исследована в “Примерах”. А также подходящими могут быть другие замены, как может определять специалист в данной области.
Константные области можно получать из любого из антител, например, человека (например, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1 и IgA2), IgD, и IgE), собаки (например, IgG (IgGA, IgGB, IgGC, IgGD) IgA, IgD, IgE, и IgM), курицы (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY), козы (например, IgG), мыши (например, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM), свиньи (например, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM), крысы (например, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM), кошки (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM), и/или его фрагмента и/или производного (например, в качестве химерных антител). Например, для получения химерного антитела одну или более аминокислотных последовательностей таблицы 1 и/или таблицы 4 можно присоединять или связывать с не принадлежащей собаке вариабельной и/или константной областью (например, человека). Связывающее средство, например, может содержать аминокислотную последовательность любой из последовательностей, указанных в таблице 1 (и/или их фрагменты и/или производные) и, например, константную область антитела собаки. Иллюстративные аминокислотные и нуклеотидные последовательности константных областей легкой и тяжелой цепей IgGB собаки, которые можно использовать, как описано в настоящем описании, приведены ниже в таблице 5.
Таблица 5
Описание
Последовательность
Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи собаки
RNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD (SEQ ID NO:55)
Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:55
CGTAACGACGCCCAGCCTGCCGTGTATCTGTTCCAGCCCTCCCCCGATCAGCTGCATACCGGGTCCGCCTCAGTGGTGTGCCTGCTGAACAGTTTCTACCCCAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAAGTGGACGGCGTCATCCAGGATACTGGCATCCAGGAGAGCGTCACCGAACAGGACAAAGATTCAACATATTCCCTGTCCAGCACCCTGACAATGTCTAGTACTGAGTACCTGAGCCACGAACTGTATTCTTGCGAGATTACCCATAAGAGCCTGCCATCCACCCTGATTAAGAGTTTCCAGCGTTCCGAATGCCAGAGAGTCGAT (SEQ ID NO:56)
Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи собаки от N2 до T
RTDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD (SEQ ID NO:78)
Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи собаки от N30 до S
RNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLSSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD (SEQ ID NO:79)
Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи собаки от N2 до T, от N30 до S
RTDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLSSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD (SEQ ID NO:80)
Аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgGB собаки
ASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQKSLSHSPGK (SEQ ID NO:57)
Кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая SEQ ID NO:57
GCGTCAACTACCGCTCCCTCCGTCTTCCCTCTGGCTCCTTCATGTGGTTCAACAAGTGGCAGTACCGTCGCCCTGGCTTGCCTGGTGTCAGGGTACTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGTCCTGGAACAGCGGGTCTCTGACAAGTGGTGTCCACACTTTTCCTTCAGTGCTGCAGTCCAGCGGTCTGTATTCCCTGTCTAGTATGGTCACTGTGCCATCATCCAGATGGCCCAGCGAAACTTTCACCTGTAACGTGGCACATCCAGCCTCTAAGACCAAAGTGGACAAGCCCGTGCCTAAACGAGAGAATGGAAGGGTGCCTCGACCACCTGATTGCCCAAAGTGTCCAGCACCAGAAATGCTGGGAGGACCATCCGTGTTCATCTTTCCACCCAAGCCTAAAGACACACTGCTGATTGCT
AGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTCGTGGACCTGGATCCCGAGGACCCTGAAGTCCAGATCAGCTGGTTCGTGGATGGGAAGCAGATGCAGACAGCAAAAACTCAGCCAAGGGAGGAACAGTTTAATGGTACTTACCGGGTCGTGTCTGTGCTGCCCATTGGCCACCAGGACTGGCTGAAGGGAAAACAGTTTACCTGCAAGGTGAACAACAAGGCTCTGCCTTCCCCAATCGAGCGAACAATTAGCAAGGCTCGTGGCCAGGCACATCAGCCCAGCGTCTACGTGCTGCCTCCATCCCGAGAGGAACTGAGCAAGAACACTGTGTCTCTGACCTGTCTGATCAAAGATTTCTTTCCCCCTGACATTGATGTGGAGTGGCAGTCTAATGGACAGCAGGAGCCTGAGAGTAAGTATCGGACCACACCACCCCAGCTGGACGAAGATGGCAGTTACTTCCTGTATAGTAAGCTGTCAGTGGACAAATCCAGATGGCAGCGCGGAGATACCTTCATCTGTGCCGTGATGCACGAAGCACTGCACAATCACTACACACAGAAGTCACTGAGCCACTCTCCAGGGAAA (SEQ ID NO:58)
Специалисту в данной области будет понятно, что константные области связывающих средств, которые представляют собой антитела, могут быть кодированы SEQ ID NO:56 и/или 58 и/или производным их нуклеотидной последовательностей. Константные области связывающих средств могут содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:55, 78, 79, 80 и/или 57 и/или производное их аминокислотных последовательностей. В одном из примеров нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, конструируют в векторную систему, а затем экспрессируют в клетках-хозяевах. В одном из примеров клетки-хозяева представляют собой культивируемые клетки. В одном из примеров векторную систему используют в культивируемых клетках млекопитающих в условиях, когда экспрессируются антитела. В примере 2 описан такой пример.
В некоторых вариантах осуществления связывающие средства могут связываться с CD20 собаки, но обладают измененной способностью связываться с рецепторами Fc (например, CD16) по сравнению со стандартными связывающими средствами. В одном из примеров связывающие средства представляют собой антитела, которые содержат модифицированные профили гликозилирования. Молекулы IgG, например, как правило, содержат N-связанные олигосахариды. Некоторые молекулы IgG содержат олигосахарид типа биантенарного комплекса, связанный с тяжелой цепью антитела. В IgG человека олигосахарид, как правило, связан с остатком аспарагина в положении 297 (N297) тяжелой цепи (в константной/Fc-области тяжелой цепи антитела). Как правило, фукоза связана с остатком GLcNAC в олигосахариде, который является ближайшим к N297. Отсутствие фукозы может усиливать способность антител опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Предположительно, отсутствие/удаление фукозы усиливает способность антитела взаимодействовать с рецепторами Fc. Антитела такого типа можно обозначать как ʺдефукозилированныеʺ. Дефукозилированные антитела можно получать способами, описываемыми в настоящем описании, и/или которые могут быть известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, можно экспрессировать в линии клеток, которые обладают модифицированными способностями гликозилирования (например, удаленной, модифицированной или меньшим количеством фукозилтрансферазы) и не способны добавлять характерные молекулы фукозы. Известны различные такие линии клеток. В некоторых вариантах осуществления антитела, описываемые в настоящем описании, связываются с CD20 собаки, но содержат дефукозилированные олигосахариды. В одном из вариантов осуществления антитело против CD20 собаки может содержать константную область тяжелой цепи IgGB собаки. В некоторых вариантах осуществления отсутствует молекула фукозы, как правило, связанная с GLcNAC, ближайшим к N183, в константной области тяжелой цепи IgGB собаки (SEQ ID NO:57). Для изменения характерного фукозилирования антител также можно использовать другие способы, и они могут быть подходящими, как будет понятно специалисту в данной области.
Связывающие средства (например, антитела) могут содержать другие модификации, которые могут приводить к снижению взаимодействия с рецепторами Fc (например, CD16). Например, в молекулах антител, описываемых в настоящем описании, можно проводить альтернативные или дополнительные замены аминокислот. В одном из вариантов осуществления константную область тяжелой цепи IgGB собаки (например, SEQ ID NO:57) можно заменять одним или обоими аминокислотными остатками M120 и L121. В определенных вариантах осуществления любой или оба таких остатка можно заменять аланином(A) или пролином (P). В одном из вариантов осуществления M (метионин) в положении 120 заменяли P (пролином) и L (лейцин) в положении 121 заменяли A (аланином), как представлено ниже:
ASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYS LSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEPAGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQKSLSHSPGK (SEQ ID NO:81).
В исследованиях по характеристике IgGB собаки, содержащего M120P и L121A, связывание с CD16a снижалось по сравнению с IgGB собаки, который не содержал замен (т.е., последовательность, как показано в SEQ ID NO:57). В качестве отрицательного контроля использовали тяжелую цепь IgGA собаки, т.к. она минимально связывается или не связывается с CD16a в этих условиях. Авторы также обнаружили, что тяжелая цепь IgGD собаки также минимально связывается или не связывается с CD16a, тогда как тяжелые цепи IgGB и IgGC собаки связываются с CD16a (также в экспериментах элиминации B-клеток, как описано в примере 3 и на фигуре 6, молекулы 1E4-cIgGB и 1E4-cIgGC элиминировали B-клетки, тогда как молекула 1E4-cIgGA не элиминировала). Измеряемое связывание молекулы, содержащей M120P и L121A, являлось аналогичным фоновому уровню связывания, измеряемого для молекулы IgGA.
В одном из вариантов осуществления N (аспарагин) константной области тяжелой цепи IgGB собаки (например, SEQ ID NO:57) в положении 183 заменяли A, как представлено ниже:
ASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEAL HNHYTQKSLSHSPGK (SEQ ID NO:82);
В исследованиях по характеристике IgGB собаки, содержащего замену N183A, связывание с CD16a снижалось по сравнению с IgGB собаки, который не содержал замен (т.е. последовательность, как показано в SEQ ID NO:57). В качестве отрицательного контроля использовали тяжелую цепь IgGA собаки. Измеряемое связывание с CD16a молекулы, содержащей замену N183A, являлось аналогичным фоновому уровню связывания, измеряемому для молекулы IgGA.
В одном из вариантов осуществления M константной области тяжелой цепи IgGB собаки (например, SEQ ID NO:57) в положении 120 заменяли на A и L в положении 121 заменяли на A, как представлено ниже:
ASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEAAGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQKSLSHSPGK (SEQ ID NO:83);
В исследованиях по характеристике IgGB собаки, содержащего M120A и L121A, связывание с CD16a снижалось по сравнению с IgGB собаки, который не содержал замен (т.е. последовательность, как показано в SEQ ID NO:57). В качестве отрицательного контроля использовали тяжелую цепь IgGA собаки. Измеряемое связывание с CD16a молекулы, содержащей M120A и L121A, снижалось по сравнению со связыванием IgGB, который не содержит замен. Однако связывание с CD16A молекулы, содержащей M120A и L121A, не снижалось настолько же, сколько для связывания молекулы M120P и L121A, или настолько же, сколько для связывания молекулы N183A.
В дополнение к указанным выше молекулам константная область тяжелой цепи IgGB собаки (SEQ ID NO:57) может содержать другие замены аминокислот, например, одного или обоих из M120 и L121. В одном из вариантов осуществления молекула может содержать замену M120A. В одном из вариантов осуществления молекула может содержать замену L121A. Возможными могут быть другие замены M120 и/или L121 на A и/или P. Кроме того, любую из этих замен можно комбинировать с заменой N183A. Как будет понятно специалисту в данной области, другие модификации также могут быть подходящими. Смеси антител, содержащих одну или более таких модификаций, также могут быть подходящими для различных применений.
2
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления связывающие средства могут представлять собой антитела. Термин ʺантителоʺ или ʺантителаʺ может относиться к целому или фрагментированному антителу в неочищенной или частично очищенной форме (например, гибридомный супернатант, асцит, поликлональная антисыворотка) или в очищенной форме. ʺОчищенноеʺ антитело может представлять собой антитело, которое отделяют по меньшей мере приблизительно от 50% белков, с которыми его изначально обнаруживают (например, в качестве части гибридомного супернатанта или препарата асцита). Очищенное антитело может представлять собой антитело, которое отделяют по меньшей мере от приблизительно 60%, 75%, 90% или 95% белков, с которыми его изначально обнаруживают. Подходящие производные также могут представлять собой фрагменты (например, Fab, F(ab') или одноцепочечные антитела, например, такие как Fv). Антитела могут быть любой подходящей природы или находиться в любой форме, включая, например, антитела мыши (например, получаемые посредством гибридомных клеток мыши), или экспрессироваться как канинизированные антитела, химерные антитела, антитела собаки и т.п.
Способы получения и применения различных типов антител хорошо известны специалистам в данной области и являются подходящими для практического осуществления настоящего изобретения (см., например, Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1, 1998; Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975; Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,2:593-596, 1992; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991; Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991; Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Morrison, Nature 368:812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826, 1996; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995; а также патенты США №№ 4816567, 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016). В определенных вариантах осуществления антитела могут содержаться в гибридомном супернатанте или асците, и их можно использовать непосредственно в таком виде или после концентрирования стандартными способами. В других вариантах осуществления антитела можно дополнительно очищать с использованием, например, фракционирования солью и ионообменной хроматографии или аффинной хроматографии с использованием лигандов белка A, белка G, белка A/G и/или белка L, ковалентно связанных с твердой подложкой, такой как агарозные гранулы, или комбинаций этих способов. Антитела можно хранить в любом подходящем формате, включая в виде замороженного препарата (например, -20ºC или -70ºC), в лиофилизированной форме или в условиях обычного охлаждения (например, 4ºC). При хранении в жидкой форме можно использовать подходящий буфер, такой как Tris-забуференный физиологический раствор (TBS) или фосфатно-солевой буфер (PBS).
d
d
d
Связывающие средства, описываемые в настоящем описании, не ограничены каким-либо образом антителами. Связывающие средства могут представлять собой любое соединение, обладающее аналогичными свойствами связывания как антитела (например, миметик). Например, иллюстративное связывающее средство может представлять собой связывающее средство, которое связывается с SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO:2 (или полипептидом, содержащим SEQ ID NO: 1 и/или 2), и/или которое может конкурировать с моноклональным антителом, связывающимся с ними (например, моноклональными антителами 1E4, 1G10 и/или 1G1). В некоторых вариантах осуществления связывающее средство может проявлять по существу аналогичную K в анализах связывания как связывающее средство (например, моноклональное антитело), с которым его сравнивают. Например, K конкретного связывающего средства можно измерять любым подходящим анализом, включая, но ими не ограничиваясь, FACS-анализ, описанный в примерах (например, фиг. 1). Можно говорить, что связывающее средство обладает ʺпо существу аналогичной Kʺ как другое, когда измерения находятся в пределах приблизительно любого из 1-20, 1-5, 5-10, 10-15 или 15-20 процентов друг от друга.
2
Иллюстративные миметики могут включать, например, органические соединения, которые специфически связываются с CD20 собаки (например, SEQ ID NO: 1, 2 и/или 59 и/или полипептидами, содержащими любые такие последовательности) (см., например, Gebauer et al., Curr. Opin. Chern. Biol., 13(3):245-255, 2009). Такие миметики могут представлять собой, например, аффибоди (Nygren, et al., FEBS J. 275(11):2668-76, 2008), аффилин (Ebersbach, et al., J. Mol. Biol. 372 (1):172-85, 2007), аффитин (Krehenbrink et al., J. Mol. Biol. 383(5):1058-68, 2008), антикалин (Skerra, A., FEBS J. 275(11):2677-83, 2008), авимер (Silverman et al., Nat. Biotechnol. 23(12): 1556-61, 2005), DARPin (Stumpp et al., Drug Discov. Today 13(15-16):695-701, 2008), финомер (Grabulovski et al., J. Biol. Chem., 282(5):3196-3204, 2007), пептид домена Кунитца (Nixon et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 9(2):261-8, 2006), и/или монотело (Koide et al., Methods Mol. Biol., 352:95-109, 2007). Другие миметики также могут включать, например, производное антитела (например, моноклонального антитела 1E4, 1G10 и/или 1G1), такое как, например, Fab, F(ab'), Fab', одноцепочечное антитело, Fv, однодоменное антитело, моноспецифическое антитело, биспецифическое антитело, триспецифическое антитело, поливалентное антитело, химерное антитело, химерное антитело собаки-человека, химерное антитело, собаки-мыши антитело, содержащее Fc собаки, гуманизированное антитело, антитело человека, канинизированное антитело, CDR-трансплантированное антитело, антитело акулы, нанотело (например, антитело, состоящее из одиночного мономерного вариабельного домена), антитело верблюда (например, антитела членов семейства Camelidae), микротело, интраантитело (например, внутриклеточное антитело) и/или дефукозилированное антитело и/или его производное. Как будет понятно специалисту в данной области в настоящем описании также предоставлены другие связывающие средства.
2
Определенные варианты осуществления относятся к препаратам связывающих средств. Такие препараты могут содержать, например, неочищенное антитело, как обнаруживают в гибридомных супернатантах или в препарате асцита, частично очищенные препараты или очищенные препараты. Таким образом, в настоящем описании предоставлены препараты антител, содержащие одно или более связывающих средств, очищенных приблизительно до 50%, 60%, 75%, 90% или 95% чистоты. Как правило, такие препараты содержат буфер, такой как забуференный фосфатом или tris-забуференный физиологический раствор (PBS или TBS, соответственно). Препараты также можно формулировать так, чтобы они содержали эксципиенты, например, такие как стабилизаторы. Препараты также могут содержать или альтернативно содержат производные таких связывающих средств, такие как, например, Fab, F(ab') или одноцепочечные антитела (например, Fv), канинизированные антитела, химерные антитела, антитела собаки и т.п. Когда связывающие средства представляют собой антитела, нуклеотидные последовательности, кодирующие его вариабельные области, также можно выделять из гибридом, экспрессирующих антитела, клонировать в векторы экспрессии с получением препаратов определенного антитела (например, канинизированных антител). Способы получения таких препаратов хорошо известны в данной области.
Специалист в данной области обладает многими подходящими способами применения связывающих средств (например, антител), описываемых в настоящем описании, для идентификации биологических образцов, содержащих белки, которые с ними связываются. Например, антитела можно использовать для выделения белка CD20 собаки с использованием, например, иммунопреципитации или другого анализа типа захвата. Эти хорошо известные способы проводят путем прикрепления антитела к твердой подложке или хроматографического вещества (например, гранулы, покрытой белком A, белком G и/или белком L). Затем связавшееся антитело вводят в раствор, содержащий или, для которого предполагают, что он содержит белок CD20 (например, лизат B-клеток собаки). Затем белок CD20 собаки может связываться с антителом, и несвязавшиеся вещества отмывают в условиях, в которых белок CD20 остается связанным с антителом. Связанный белок затем можно отделять от антитела и анализировать при желании. Аналогичные способы выделения белка с использованием антитела хорошо известны в данной области. Связывающие средства (например, антитела) также можно использовать для детекции белка CD20 в биологическом образце. Например, антитела можно использовать в анализах, таких как, например, проточный цитометрический анализ, ELISA, иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), детекция in situ, иммуноцитохимия и/или иммуногистохимия. Способы проведения таких анализов хорошо известны в данной области.
Для того, чтобы облегчить специалисту в данной области использование антител, описываемых в настоящем описании, антитела можно предоставлять в формате набора. Предоставлен набор, содержащий такие антитела и необязательно другие компоненты, необходимые для использования антител для детекции клеток, экспрессирующих CD20 собаки. Антитела набора можно предоставлять в любой подходящей форме, включая замороженные, лиофилизированные или в фармацевтически приемлемом буфере, таком как TBS или PBS. Набор также может содержать другие реагенты, необходимые для применения антител in vitro или in vivo, такие как буферы (например, TBS, PBS), блокирующие средства (растворы, включая обезжиренное сухое молоко, нормальную сыворотку, детергент Tween-20, BSA или казеин) и/или реагенты для детекции (например, конъюгаты биотин-антитело козы против IgG мыши, стрептавидин-HRP, аллофикоцианин, B-фикоэритрин, R-фикоэритрин, пероксидазу, детектируемые метки (например, флуоресцеины, такие как DyLight, Cy3, Cy5, FITC, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 647, 5-карбокси-2,7-дихлорфлуоресцеин, 5-карбоксифлуоресцеин (5-FAM), 5-HAT (гидрокситриптамин), 5-гидрокситриптамин (HAT), 6-JOE, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), FITC, 6-карбокси-1,4-дихлор-2',7'-дихлорфлуоресцеин (TET), 6-карбокси-1,4-дихлор-2',4',5',7'-тетрахлорфлуоресцеин (HEX), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'- диметоксифлуоресцеин (JOE); флуоресцирующие средства Alexa, такие как 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750; флуорофоры BODIPY, такие как 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL АТФ, FI-керамид, R6G SE, TMR, конъюгат TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR АТФ, TR-X SE; родамины, такие как 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-карбокситетраметилродамин (5-TAMRA), 5 GLD, 6-карбоксиродамин 6G, лиссамин, лиссамин-родамин B, фаллицидин, фаллоидин, Red, Rhod-2, ROX (6-карбокси-X-родамин), 5-ROX (карбокси-X-родамин), сульфородамин B can C, сульфородамин G Extra, TAMRA (6-карбокситетраметилродамин), тетраметилродамин (TRITC), WT, Texas Red, Texas Red-X) и другие метки и/или наборы для окрашивания (например, набор для окрашивания ABC, Pierce). Наборы также могут содержать другие реагенты и/или инструкции по использованию антител в общепринято используемых анализах, описанных выше, таких как, например, проточный цитометрический анализ, ELISA, иммуноблоттинг (например, вестерн-блоттинг), детекция in situ, иммуноцитохимия, иммуногистохимия. В одном из вариантов осуществления детектируемые метки могут быть обратимо связаны со связывающими средствами. В одном из примеров детектируемые метки обратимо связывают со связывающими средствами посредством химических связей. В одном из примеров химические связи представляют собой ковалентные химические связи. В одном из примеров детектируемые метки конъюгированы со связывающими средствами.
В одном из вариантов осуществления набор представляет собой моноклональное антитело в очищенной форме. В другом варианте осуществления моноклональное антитело может находиться в биотинилированной форме самостоятельно или совместно с конъюгированным с авидином реагентом для детекции (например, антителом). В другом варианте осуществления набор содержит флуоресцентно-меченые антитела, которые можно использовать для непосредственной детекции CD20 собаки. Буферы и т.п., необходимые для использования любой из этих систем, являются хорошо известными в данной области, и их может получать конечный пользователь, или их можно предоставлять в качестве компонента набора. Набор также может содержать твердую подложку, содержащую белок и/или образцы ткани положительного и отрицательного контроля. Например, наборы для проведения анализов с переносом на мембрану или анализов типа вестерн-блоттинг могут содержать лизаты контрольных клеток или тканей для применения в SDS-PAGE или для нейлоновых или других мембран, содержащих предварительно фиксированные контрольные образцы с дополнительным пространством для экспериментальных образцов. Наборы для визуализации CD20 собаки в клетках на срезах могут содержать предварительно форматированные срезы, содержащие образцы контрольных клеток или тканей, с дополнительным пространством для экспериментальных образцов.
Связывающие средства, описываемые в настоящем описании, и/или их производные также можно вводить в композиции для применения in vitro или in vivo. Антитела или их производные также можно обратимо связывать с функциональными/эффекторными молекулами, такими как цитотоксические лекарственные средства или токсины, или их активными фрагментами, такими как A-цепь дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина, A-цепь рицина, A-цепь абрина, курцин, кротин, феномицин, эномицин наряду с другими. Функциональные молекулы также могут включать радиоактивные химические вещества. В одном из вариантов осуществления эффекторные молекулы можно обратимо связывать со связывающими средствами. В одном из примеров, детектируемые метки обратимо связывают со связывающими средствами посредством химических связей. В одном из примеров, химические связи представляют собой ковалентные химические связи. В одном из примеров, эффекторные молекулы конъюгированы со связывающими средствами.
Связывающие средства можно использовать самостоятельно или в комбинации с другими средствами для профилактики и/или лечения заболевания. Одно из таких заболеваний представляет собой B-клеточную лимфому (например, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, лимфому мукозо-связанной лимфоидной ткани (MALT), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому Беркитта, медиастинальную крупноклеточную B-клеточную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, узловую B-клеточную лимфому маргинальной зоны (NMZL), лимфому маргинальной зоны селезенки (SMZL), внутрисосудистую B-крупноклеточную лимфому, первичную выпотную лимфому, лимфогранулематоз и т.п.), в частности, у животных, являющихся собаками. Связывающие средства также можно комбинировать или использовать в сочетании (например, в качестве части схемы лечения) с другими противораковыми средствами, такими как, например, циклофосфамид (например, цитоксан, неосар), адриамицин (например, доксорубицин/гидроксидоксорубицин), винкристин (например, онковин), преднизон (например, дельтазон, оразон), L-аспарагиназа, хлорамбуцил, ломустин (CCNU), цитозинарабинозид, митоксантрон и/или их сочетания. Комбинация таких противораковых средств может относиться к одновременному и/или последовательному введению.
Связывающие средства также можно использовать для лечения различных аутоиммунных заболеваний. Пример заболевания может включать, но ими не ограничиваться, аутоиммунную гемолитическую анемию, иммуноопосредованную тромбоцитопению, волчанку, аутоиммунную пузырчатку, иммуноопосредованный артрит и атопический дерматит.
Антитела, описываемые в настоящем описании, и/или их производные можно использовать в анализах для определения наличия состояния болезни у пациента, для прогнозирования или для определения эффективности химиотерапевтической или другой схемы лечения. Для определения относительного уровня экспрессии CD20 можно использовать анализы профиля экспрессии, проводимые, как описано в настоящем описании или иным образом, как известно в данной области. Затем можно проводить корреляцию уровня экспрессии с основными (например, контрольными) уровнями для определения наличия конкретного заболевания у пациента, прогноза для пациента, или является ли эффективной конкретная схема лечения. Например, если пациент получает конкретную химиотерапевтическую схему лечения, пониженный уровень экспрессии иммуногенной мишени в тканях пациента (например, в периферической крови, биопсии ткани молочной железы) может указывать на то, что схема лечения снижает нагрузку злокачественной опухоли у хозяина. Аналогично, если уровень экспрессии повышается, это может указывать на то, что схема лечения не оказывает желаемого действия, и можно выбирать другие терапевтические воздействия.
Антитела, описываемые в настоящем описании, также можно использовать в качестве реагентов в анализах скрининга лекарственных средств. Реагенты можно использовать для установления эффекта лекарственного средства-кандидата в отношении экспрессии иммуногенной мишени в линии клеток или в клетке или ткани пациента. Способ определение профиля экспрессии можно комбинировать со способами высокопроизводительного скрининга для обеспечения возможности быстрой идентификации подходящих соединений и наблюдения за эффективностью лечения лекарственным средством-кандидатом (см., например, Zlokamik et al., Science, 279:84-8, 1998). Лекарственные средства-кандидаты могут представлять собой химические соединения, нуклеиновые кислоты, белки, антитела или их производные природного или синтетического происхождения. Лекарственные средства-кандидаты, определяемые таким образом, можно использовать наряду с другими применениями в качестве фармацевтических композиций для введения пациентам или для применения в дополнительных анализы скрининга.
Антитела, описываемые в настоящем описании, можно получать в виде инъекционного препарата, такого как в виде суспензии в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Подходящие носители и растворители, которые можно использовать, включают наряду с другими воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия, TBS и PBS. Составы могут содержать эксципиенты, такие как, например, стабилизаторы. В определенных вариантах осуществления антитела подходят для использования in vitro. В других вариантах осуществления антитела подходят для использования in vivo. Препараты, подходящие для использования в любом из случаев, являются хорошо известными в данной области и могут изменяться в зависимости от конкретного применения.
Получение связывающих средств и иммунизация
В настоящем описании также раскрыты полипептиды CD20 собаки и/или их фрагменты и/или производные (совместно обозначаемые в настоящем описании как ʺCD20 собакиʺ), а также способы их получения и применения. Иллюстративные CD20 собаки могут содержать аминокислотную последовательность, представленную ниже:
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSLSIQYCGSI (SEQ ID NO:59).
Иллюстративные фрагменты SEQ ID NO:59 могут представлять собой SEQ ID NO: 1 и/или 2. Таким образом, иллюстративные CD20 собаки могут содержать SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2.
CD20 собаки, как правило, обладают способностью индуцировать антитела против CD20 у хозяина. Животные-хозяева, как правило, представляют собой млекопитающих, включая, но, не ограничиваясь ими, мышь, собаку, кошку, козу, овцу, человека и т.п. В одном из примеров хозяин может представлять собой мышь. Введение CD20 собаки (например, SEQ ID NO: 1, 2 и/или 59) приводит к продукции антитела против CD20 собаки у мыши. В одном из примеров хозяин может представлять собой собаку, и введение CD20 собаки может приводить к вызыванию иммунного ответа у собаки, который может являться специфическим по отношению к клеткам, экспрессирующим CD20. Антитела могут не представлять собой защитные и/или нейтрализующие и/или могут представлять собой защитные и/или нейтрализующие антитела после введения животному-хозяину.
В определенных вариантах осуществления антитела можно использовать для детекции и/или выделения CD20 собаки и/или для детекции, выделения и/или разрушения клеток, экспрессирующих CD20 собаки. В определенных вариантах осуществления CD20 собаки могут обладать идентичностью аминокислотных последовательностей (например, любой из приблизительно 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9%) с другими полипептидами CD20 (например, собаки или иного организма). Любые отличия аминокислотной последовательности между полипептидами CD20, как правило, но не обязательно являются фенотипически ʺмолчащимиʺ, но их следует использовать для получения иммунитета против CD20 (например, включая продукцию антител против CD20 у хозяина).
Также предоставлены нуклеиновые кислоты, кодирующие CD20, совместно с вариантами таких последовательностей (например, их вырожденными вариантами). В определенных вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CD20 собаки, можно встраивать в один или более векторов экспрессии, как обсуждается более подробно ниже. В таких вариантах осуществления CD20 собаки, может кодироваться нуклеотидами, соответствующими аминокислотной последовательности. Конкретные комбинации нуклеотидов, которые кодируют различные аминокислоты, хорошо известны в данной области, как описано в различных ссылках, используемых специалистом в данной области (например, Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994). Нуклеотидные последовательности, кодирующие CD20 собаки, можно устанавливать, например, на основании таблицы 6. В вариантах нуклеиновых кислот можно использовать любую комбинацию нуклеотидов, которые кодируют представляющий интерес полипептид.
Таблица 6
Phe (F)
TTT
Ser (S)
TCT
Tyr (Y)
TAT
Cys (C)
TGT
TTC
TCC
TAC
TGC
Leu (L)
TTA
TCA
TERM
TAA
TERM
TGA
TTG
TCG
TAG
Trp (W)
TGG
CTT
Pro (P)
CCT
His (H)
CAT
Arg (R)
CGT
CTC
CCC
CAC
CGC
CTA
CCA
Gln (Q)
CAA
CGA
CTG
CCG
CAG
CGG
Ile (I)
ATT
Thr (T)
ACT
Asn (N)
AAT
Ser (S)
AGT
ATC
ACC
AAC
AGC
ATA
ACA
Lys (K)
AAA
Arg (R)
AGA
Met (M)
ATG
ACG
AAG
AGG
Val (V)
GTT
Ala (A)
GCT
Asp (D)
GAT
Gly (G)
GGT
GTC
GCC
GAC
GGC
GTA
GCA
Glu (E)
GAA
GGA
GTG
GCG
GAG
GGG
Модифицированный CD20 может содержать по меньшей мере одну замену, вставку и/или делецию аминокислоты. Модифицированный CD20, как правило, остается по существу нетоксичным и/или индуцирует нейтрализующие антитела после введения хозяину. Такие антитела могут связываться с тем же самым эпитопом как антитела, индуцируемые после введение другого CD20 хозяину. Как описано в настоящем описании, CD20 собаки может быть подходящим в иммуногенных композициях или вакцинах для профилактики и/или лечении патогенных состояний, для которых благоприятным является направленное воздействие на клетки, экспрессирующие CD20, (например, злокачественной опухоли, такой как B-клеточная лимфома). Подходящими модификациями можно вводить консервативные замены в аминокислотной последовательности CD20 собаки. Консервативные аминокислотные замены могут включать замену нативного аминокислотного остатка на ненативный остаток, таким образом, чтобы существовало небольшое влияние или не существовало влияния на размер, полярность, заряд, гидрофобность или гидрофильность аминокислотного остатка в этом положении, и в частности, чтобы не приводило к снижению иммуногенности. Подходящие консервативные аминокислотные замены представлены в таблице 7.
Таблица 7
Исходные остатки
Иллюстративные консервативные замены
Предпочтительная консервативная замена
Ala
Val, Leu, Ile
Val
Arg
Lys, Gln, Asn
Lys
Asn
Gln
Gln
Asp
Glu
Glu
Cys
Ser, Ala
Ser
Gln
Asn
Asn
Glu
Asp
Asp
Gly
Pro, Ala
Ala
His
Asn, Gln, Lys, Arg
Arg
Ile
Leu, Val, Met, Ala, Phe, Норлейцин
Leu
Leu
Норлейцин, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Ile
Lys
Arg, 1,4 диамино-масляная кислота, Gln, Asn
Arg
Met
Leu, Phe, Ile
Leu
Phe
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Leu
Pro
Ala
Gly
Ser
Thr, Ala, Cys
Thr
Thr
Ser
Ser
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser
Phe
Val
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Норлейцин
Leu
Выбранная конкретная замена аминокислоты может зависеть от расположения выбранного участка.
Антитела против CD20 можно комбинировать с один или более фармацевтически приемлемых носителей перед введением хозяину. Фармацевтически приемлемый носитель представляет собой вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, например, вещество можно вводить индивидууму, не вызывая какого-либо нежелательного биологического действия или взаимодействия вредным образом с какими-либо другими компонентами фармацевтической композиции, в которой он содержится. Носитель обязательно выбирают для сведения к минимуму любой деградации активного ингредиента и сведения к минимуму любых неблагоприятных побочных эффектов у индивидуума, как хорошо известно специалисту в данной области.
st
Подходящие фармацевтические носители и их составы описаны, например, в Remingtons: The Science and Practice of Pharmacy, 21 Edition, David B. Troy ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Как правило, в составе используют походящее количество фармацевтически приемлемой соли для получения изотонического состава. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, но не ограничиваются ими, стерильную воду, физиологический раствор, забуференные растворы, такие как раствор Рингера, и раствор декстрозы. pH раствора, как правило, составляет приблизительно от 5 приблизительно до 8 или приблизительно от 7 приблизительно до 7,5. Другие носители включают препараты с длительным высвобождением, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих полипептиды или их фрагменты. Матрицы могут находиться в форме профилированных изделий, например, пленок, липосом или микрочастиц. Специалистам в данной области будет очевидно, что определенные носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимой композиции. Носители представляют собой носители, подходящие для введения полипептидов и/или их фрагментов людям или другим индивидуумам.
Фармацевтические композиции также могут содержать носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные средства, адъюванты, иммуностимуляторы наряду с иммуногенным полипептидом или антителами против CD20. Фармацевтические композиции также могут содержать один или более активных ингредиентов, таких как противомикробные средства, противовоспалительные средства и анестезирующие средства.
Композиции, описываемые в настоящем описании, можно вводить животным in vivo для индукции иммунного ответа против иммуногена (например, SEQ ID NO: 1, 2 и/или 59), для детекции клеток, экспрессирующих CD20 собаки, и/или для лечения состояния заболевания, при котором необходимым может являться элиминация клеток, экспрессирующих CD20 (например, B-клеточной лимфомы). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к связывающим средствам, таким как антитела (например, включая моноклональные антитела), подходящим для выделения и/или идентификации клеток, экспрессирующих CD20 собаки или белок клеточной поверхности, который взаимодействует с такими связывающими средствами, (например, B-клеток, В-лимфоидных клеток, CD20 собаки) и/или для лечения и профилактики злокачественной опухоли у млекопитающего (например, собаки). Таким образом, в определенных вариантах осуществления связывающее средство может представлять собой антитело, реактивное против CD20 собаки, экспрессируемого на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления одно или более связывающих средств (например, антитело, такое как моноклональное антитело) связываются или взаимодействуют с CD20 собаки на участке, который содержит SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 59 (и/или их фрагменты и/или производные).
Применения связывающих средств
Некоторые варианты осуществления относятся к способам детекции клеток собаки с использованием связывающих средств. В определенных вариантах осуществления клетки, экспрессирующие CD20 на своей клеточной поверхности (например, B-клеточной лимфомы) у животного (например, собаки), можно детектировать путем приведения в контакт тестируемого биологического образца со связывающим средством или его производным, и детектируя связывающее средство, связавшееся с биологическим образцом или его компонентами. В определенных вариантах осуществления способ может включать сравнение количества связывания с тестируемым биологическим образцом или его компонентами с количеством связывания с контрольным биологическим образцом или его компонентами, где повышенное связывание с тестируемым биологическим образцом или его компонентами относительно контрольного биологического образца или его компонентов свидетельствует о наличии лимфоидной клетки в тестируемом биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления биологические образец может представлять собой кровь собаки или отобранные шприцем аспираты. Такие способы также предоставлены в формате in vivo и/или in vitro.
Некоторые варианты осуществления также относятся к способам снижения жизнеспособности и/или количества клеток, экспрессирующих CD20 собаки, у хозяина с использованием таких связывающих средств. Также изобретение относится к способам лечения одного или более болезненных состояний (например, лимфомы) у являющегося млекопитающим хозяина, включающим введение млекопитающему по меньшей мере одной или более эффективных доз одного или более связывающих средств (и/или их производного(ых)), описываемых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления связывающее средство представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент или производное, содержащее одну или более аминокислотных последовательностей, представленных в таблицах 1, 4 и/или 5. Связывающее средство можно вводить в величине дозы приблизительно от 1 приблизительно до 50 мг/кг массы тела млекопитающего, приблизительно от 1 приблизительно до 30 мг/кг или приблизительно от 1 приблизительно до 15 мг/кг (например, приблизительно в любой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 или 40 мг/кг). В определенных вариантах осуществления связывающее средство можно вводить млекопитающему (например, интрадермально, внутривенно, перорально, ректально) при приблизительно 1,5 или 10 мг/кг один или более раз. Когда вводят многократные дозы, дозы могут содержать приблизительно одинаковые или различные количества связывающего средства в каждой дозе. Дозы также можно вводить раздельно во времени друг от друга в одинаковых или различных интервалах. Например, дозы можно разделять приблизительно любым интервалом из 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 или 96 часов, одной недели, двух недель, трех недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1,5 лет, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет или любого периода времени до, после и/или между любым из этих периодов времени. В некоторых вариантах осуществления связывающие средства можно вводить в сочетании с другими средствами (например, химиотерапевтическими средствами), как описано выше. Такие другие средства можно вводить приблизительно одновременно со связывающими средствами или в различные моменты времени и/или с различной частотой. Другие варианты осуществления таких способов также могут быть подходящими, как легко определит специалист в данной области.
Как правило, дозу моноклонального антитела, которая обладает эффектом снижения количества, пролиферации, неблагоприятным воздействием и т.д. на злокачественные клетки у собаки, называют эффективной дозой.
Также предоставлены наборы, содержащие любой из иммуногенов и/или связывающих средств, описываемых в настоящем описании, необязательно также включая инструкции по применению таких иммуногенов и/или связывающих средств, и они могут облегчать применение способов. Например, набор может содержать композицию, содержащую связывающее средство (например, препарат моноклонального антитела мыши или химерного антитела). Композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель (например, фосфатно-солевой буфер) и может находиться в растворе, в замороженной, лиофилизированной или другой подходящей форме. Набор также может содержать одно или более контрольных связывающих средств (например, отрицательный контроль, который не связывается с мишенью анализа, для которой конструируют набор, или положительный контроль, который можно поставлять совместно с образцом, для которого известно, что положительный контроль с ним связывается) и/или инструкции по применению. Вследствие того, что наборы можно использовать для анализов и/или лечений in vitro или in vivo (например, набор для введения млекопитающему), инструкции могут изменяться в зависимости от конкретного применения, для которого конструируют набор. Другие варианты осуществления таких наборов, которые можно предоставлять, вполне очевидны специалисту в данной области.
Следует отметить, что, как используют в описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на фрагмент может включать смеси фрагментов, и ссылка на фармацевтический носитель или адъювант может включать смеси двух или более таких носителей или адъювантов.
Термины ʺприблизительноʺ, ʺпримерноʺ и т.п., когда предшествует списку числовых величин или диапазону, относится к каждой индивидуальной величине в списке или диапазону независимо как, если бы этот термин непосредственно предшествовал каждой индивидуальной величине в списке или диапазоне. Термины означают, что величины, к которым они относятся, являются точными, близкими или аналогичными.
Как используют в настоящем описании, подразумевают, что индивидуум или хозяин представляет собой индивидуума. Индивидуум или хозяин может включать одомашненных животных, таких как кошки и собаки, домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошадей, свиней, овцу и коз), лабораторных животных (например, мышей, кроликов, крыс, морских свинок), птиц и/или, например, человека. В некоторых вариантах осуществления индивидуум или хозяин может представлять собой млекопитающее, такое как являющееся собакой животное.
Необязательные или необязательно означает, что описываемое событие или обстоятельство может возникать или может не возникать, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство возникает, и случаи, когда они не возникают. Например, фраза композиция необязательно может содержать комбинацию, означает, что композиция может содержать комбинацию различных молекул или может не содержать комбинацию, таким образом, описание включает комбинацию и отсутствие комбинации (например, индивидуальных членов комбинации).
Диапазоны можно выражать в настоящем описании как приблизительно от одной конкретной величины и/или приблизительно до другой конкретной величины. При таком выражении диапазона другой аспект включает от одной конкретной величины и/или до другой конкретной величины. Аналогично, когда величины выражают как приближенные значения посредством использования антецедента приблизительно или примерно, следует понимать, что конкретная величина образует другой аспект. Кроме того, также будет понятно, что конечные точки таких диапазонов являются значимыми по отношению к другой конечной точке и независимо от другой конечной точки. Предполагают, что диапазоны (например, 90-100%) включают диапазон сам по себе, а также каждую независимую величину в диапазоне, как если бы величину перечисляли индивидуально.
Когда в настоящем описании используют термины предотвращать, предотвращение и профилактика по отношению к проводимому лечению для данного паталогического состояния (например, профилактика инфекции Streptococcus sp.), он предназначен передавать, что у получающего лечение пациента совсем не развивается клинически наблюдаемый уровень патологического состояния или развивается более медленно и/или в меньшей степени, чем в случае, когда у него/нее отсутствует лечение. Эти термины не являются ограниченными только ситуацией, в которой пациент не испытывает какого-либо аспекта патологического состояния. Например, говорят, что лечение предотвращает патологическое состояние, если его проводят во время воздействия на пациента стимула, для которого ожидают, что он вызывает данную манифестацию патологического состояния, и оно приводит к тому, что пациент испытывает более слабые и/или более умеренные симптомы патологического состояния, чем ожидают в ином случае.
Все ссылки, цитируемые в настоящем описании, таким образом, включены в качестве ссылки в полном объеме. Определенные варианты осуществления дополнительно описаны в следующих ниже примерах. Такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примеров и не предназначены для ограничения каким-либо образом объема формулы изобретения. Все цитируемые в настоящем описании ссылки, таким образом, включены в качестве ссылки. Лучшее понимание настоящего изобретения и его многих преимуществ можно получить из следующих ниже примеров, приведенных в качестве иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
mAb, реактивные против CD20 собаки
A. Получение и отбор гибридом
c
Для получения моноклональных антител мыши против CD20 собаки из кДНК PBMC собаки клонировали 2-ой внеклеточный домен (ECD) CD20 собаки, экспрессировали как слитый белок F мыши (ʺECD2-mFcʺ) и использовали в качестве иммуногена. ECD2-mFC собаки содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 59 и 60, как представлено ниже:
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSLSIQYCGSI (SEQ ID NO: 59); и
RSLEVLFQGPGSPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK (SEQ ID NO: 60).
Иммуноген содержал линейное ранжирование SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 и указан как SEQ ID NO: 61:
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSLSIQYCGSI RSLEVLFQGPGSPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALPSPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQNYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSVVHEGLHNHLTTKTISRSLGK (SEQ ID NO: 61).
+
-
Гибридомы получали после иммунизации мышей слитым белком SEQ ID NO: 59/SEQ ID NO: 60 (SEQ ID NO: 61). Первичный скрининг ELISA проводили с использованием слитого белка ECD2-hFc в качестве антигена. Затем положительные гибридомы подвергали вторичному скринингу с использованием смеси свежих (CD20) и культивируемых (CD20) клеток B-клеточной лимфомы собаки. Для дополнительного скрининга выбирали клоны, которые демонстрировали раздвоенные профили FACS. Для дальнейшей характеризации выбирали три mAb, экспрессируемые гибридомами, получаемыми в этом подходе (1E4, 1G1 и 1G10).
d
d
d
Относительные аффинности связывания моноклональных антител мыши 1E4, 1G1 и 1G10 с CD20 собаки определяли посредством активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с использованием клеток B-клеточной лимфомы собак, которые экспрессируют CD20 собаки. Выявлено, что mAb 1E4 и 1G10 обладают самой высокой относительной аффинностью по отношению к CD20: 1G10 (K=0,29 нм)>1E4 (K=0,97 нм)>>1G1 (K=19,78 нм)) (фиг. 1).
Для идентификации эпитопа на CD20 собаки, который связывался с моноклональными антителами мыши 1E4, 1G1 и 1G10 (ни одно из которых не связывается с CD20 человека), получали несколько экспрессирующих конструкций, кодирующих варианты гибридов исходного иммуногена (ECD2-mFc cCD20) (фиг. 2A). Аминокислотные последовательности гибридных полипептидов CD20 также представлены ниже:
Гибрид
Аминокислотная последовательность
ECD2 CD20 собаки
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSLSIQYCGSI (SEQ ID NO: 62)
V1 ECD2 CD20 человека-собаки
NITISHFFKMENLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID NO: 63)
V2 ECD2 CD20 человека-собаки
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVNIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID NO: 64)
V3 ECD2 CD20 человека-собаки
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVDIHNCDPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID NO:65)
V4 ECD2 CD20 человека-собаки
NITISHFFKMENLNLIKAPMPYVNIYNCEPANPSEKNSLSIQYCGSI (SEQ ID NO:66)
ECD2 CD20 человека
NIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSI (SEQ ID NO:67)
Как проиллюстрировано на фиг. 2A, гибридные белки, экспрессируемые из этих векторов, содержали последовательности CD20 человека, рассеянные в CD20 собаки в различных участках внеклеточного домена 2. Такая стратегия обеспечивала возможность идентификации конкретных последовательностей в CD20 собаки, с которыми связывается каждое mAb. Связывание тестировали с использованием стандартного протокола ELISA. В кратком изложении, рекомбинантный слитый белок ECD2-mFc CD20 собаки и его варианты гибридов человека/собаки разбавляли в PBS и проводили связывание с 96-луночным планшетом для микротитрования при 200 нг/лунка посредством инкубации в течение ночи при 4°C. Планшет промывали три раза буфером PBST, блокировали раствором 3% BSA в PBS в течение одного часа при 37°C, затем однократно промывали PBST. Моноклональные антитела мыши 1E4, 1G1 и 1G10 разбавляли до концентрации 5 мкг/мл в PBS и 50 мкл этого разбавления наносили на планшет в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшет промывали три раза PBST и к каждой лунке добавляли специфический конъюгат антитела козы против легкой цепи IgG мыши-HRP от Jackson Immunoresearch (№115-035-174), разбавленный до 1:5000 в PBS (50 мкл), и инкубировали планшет в течение 45 минут при комнатной температуре. Планшет промывали три раза PBST, затем к каждой лунке добавляли 100 мкл субстрата SureBlueTMB (KPL №52-00-03) и инкубировали планшет в течение приблизительно 10 минут при комнатной температуре. Затем планшет считывали при 650 нм в спектрофотометре.
Данные, представленные на фиг. 2B, демонстрируют, что в анализе ELISA mAb 1E4 и 1G10 связывались лучше с вариантами гибридов ECD2-mFc cCD20, которые содержали эпитоп DIHNCD (SEQ ID NO:2) CD20 собаки, свидетельствуя о том, что эти mAb связываются с областью CD20 собаки, которая содержит аминокислотную последовательность DIHNCD (SEQ ID NO:2). В анализе ELISA mAb 1G1 связывалось лучше с белками CD20, которые содержали эпитоп LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1) CD20 собаки, свидетельствуя о том, что 1G1 связывается с областью CD20 собаки, которая содержит аминокислотную последовательность LIKAPMPYV (SEQ ID NO: 1).
Затем проводили FACS PBMC собаки с использованием очищенного 1E4-mAb (фиг. 3). PBMC собаки выделяли посредством лизиса эритроцитов, метили йодидом пропидия и окрашивали антителом 1E4 (1 мкг антитела/мл) и Fab-APC против мыши (1/200) от Jackson Immunoresearch №115-136-146 в качестве вторичного антитела (одно вторичное антитело использовали в качестве отрицательного контроля). Первичное окно FACS устанавливали на лимфоциты (левые панели). В анализ включали только живые лимфоциты (лимфоциты, которые не окрашивались йодидом пропидия) (средние панели). Клетки, положительные в отношении связывания с антителом, определяли путем установки окна, которое включало менее 1% положительных клеток в отрицательном контрольном образце (верхняя правая панель). В этом эксперименте приблизительно 10 процентов лимфоцитов окрашивались 1E4, что соответствует специфическому связыванию 1E4 с CD20 на поверхности B-клеток собаки.
B. Последовательность вариабельной области 1E4, 1G1 и 1G10
Вариабельную область ДНК из моноклональных антител мыши амплифицировали посредством ПЦР с обратной транскрипцией из РНК, получаемой из линий гибридомных клеток стандартными способами. Прямые праймеры, используемые для амплификации последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, представляли собой праймеры, опубликованные Chardes T. et al., FEBS Letters., Jun 11; 452(3):386-94, 1999. Обратные праймеры, используемые для амплификации последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, представлены ниже:
5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3' (праймер константной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:68)) и
5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3' (праймер константной области легкой цепи (SEQ ID NO:69)).
Затем продукты амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей клонировали в вектор pcDNA3.1 и секвенировали. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельных областей 1E4, 1G1 и 1G10 представлены в таблице 1.
Пример 2
A. Экспрессия химерных антител 1E4-cIgGB собаки и ритуксан-cIgGB в клетках CHO
Конструировали гены, кодирующие химерные легкие и тяжелые цепи антитела. Кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность мыши, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела 1E4 (SEQ ID NO: 5) (таблица 1), подвергали слиянию с кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей константную область легкой цепи от собаки (SEQ ID NO: 56) (таблица 5) с получением слитого гена, кодирующего химерную легкую цепь антитела.
Кроме того, кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность мыши, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела 1E4 (SEQ ID NO: 8) (таблица 1), подвергали слиянию с кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, кодирующей константную область тяжелой цепи IgGB собаки (SEQ ID NO: 58) (таблица 5) с получением слитого гена, кодирующего химерную тяжелую цепь антитела собаки.
Последовательности химерных легких и тяжелых цепей конструировали в одном плазмидном векторе экспрессии. Для экспрессии химерных легких и тяжелых цепей вектор конструировали таким образом, чтобы он содержал отдельные единицы транскрипции млекопитающего (энхансер/промотор на 5'-конце, последовательность поли-A на 3'-конце). 5'-кодирующая область каждой единицы транскрипции также кодировала лидерную/сигнальную последовательность для обеспечения процессинга и сборки кодируемых белков и секреции антитела против CD20 собаки, называемого 1E4-cIgGB. Плазмидный вектор экспрессии содержал отдельную единицу транскрипции, кодирующую белок, который является селектируемым в клетках млекопитающих. Плазмидные векторы экспрессии описаны в WO 2009/080720 (US 2011/0045536A1) и WO 2010/022961. В качестве контроля использовали отдельный аналогичный вектор, кодирующий химерный вариант собаки антитела против CD20 человека, называемого ритуксан-cIgGB.
Плазмиды, кодирующие 1E4-cIgGB и контрольный ритуксан-cIgGB, трансфицировали в клетки CHO и для каждого выбирали стабильные объединенные трансфектанты, как описано в WO 2010/022961. Антитела получали из таких совокупностей клеток, стабильно экспрессирующих антитело, с использованием стандартных протоколов для культуры с подпиткой. Секретируемые такими клетками антитела очищали на сефарозных колонках с белком G с использованием системы жидкостной хроматографии AKTA-FPLC от GE Healthcare. Выделенные препараты антител анализировали SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографией (см. фиг. 4 для анализа продуцируемого CHO 1E4-cIgGB).
B. Модификация легкой цепи 1E4
L
Указанными выше способами также проводили модификации описываемых антител. Аспарагин 33 (N33) или глицин 34 (G34) в последовательности дипептида аспарагин-глицин (Asp-Gly или N-G) вариабельной области легкой цепи (V) 1E4 (SEQ ID NO:3) модифицировали для удаления потенциального участка дезаминирования. В различных вариантах осуществления N33 заменяли аланином (A), глутаминовой кислотой (E), фенилаланином (F), гистидином (H), изолейцином (I), лизином (K), лейцином (L), пролином (P), глутамином (Q), аргинином (R), треонином (T), валином (V) или тирозином (Y). В некоторых вариантах осуществления G34 заменяли аланином (A), глутаминовой кислотой (E), фенилаланином (F), гистидином (H), изолейцином (I), лизином (K), лейцином (L), пролином (P), глутамином (Q), аргинином (R), валином (V) или тирозином (Y). Целые антитела (тяжелые плюс легкие цепи), содержащие одну из указанных выше замен, тестировали анализом ELISA на их способность связываться с пептидом ECD2 CD20 собаки (SEQ ID NO:62).
Ни одна из указанных выше замен не устраняла связывания антитела с пептидом ECD2, и во многих случаях эффект замены на связывание с антигеном являлся незначительным. На фиг. 5 проиллюстрированы результаты некоторых из таких антител: антитела, которые содержали одну из замен N33 на K (лизин), G34 на K (лизин), G34 на Q (глутамин) или G34 на A (аланин). Как продемонстрировано на фиг. 5, ни одна из этих замен значительно не влияла на связывание с CD20 собаки.
Пример 3
Активность in vivo химерного антитела 1E4-cIgGB против CD20 собаки
Эффективность химерного антитела 1E4-cIgGB в отношении элиминации B-клеток тестировали in vivo в исследовании зависимости доза-эффект. Показано, что антитело против CD20 человека ритуксимаб (Rituxan) не дает перекрестную реакцию/не связывается с CD20 собаки (Jubala et al., Vet. Pathol., Jul; 42(4):468-76, 2005; Impellizeri et al., Vet. J., May; 171(3):556-8, 2006). В связи с этим химерную форму ритуксана, содержащего Fc IgGB собаки (ритуксан-cIgGB), клонировали и экспрессировали, как описано выше в примере 2, и использовали в качестве отрицательного изотипического контроля в этом исследовании. Фармакодинамические эффекты измеряли в течение 59 суток лечения с использованием 1E4-cIgGB при уровнях многократного дозирования при введении посредством однократной внутривенной (в/в) инъекции нативным здоровым самцам собак Beagle. Данные предварительного исследования масс тела и предварительного исследования клинической патологии (клинической биохимии и гематологии) использовали для рандомизации собак в соответствующие им группы лечения. Схема эксперимента приведена ниже:
Группа (n=5)
Антитело
Доза (мг/кг массы тела животного)
1
ритуксан-cIgGB
10
2
1E4-cIgGB
0,1
3
1E4-cIgGB
1
4
1E4-cIgGB
10
5
1E4-cIgGB
30
На сутки 1 исследования животным вводили однократную дозу (0,1, 1, 10 или 30 мг/кг) 1E4-cIgGB или изотипического контрольного антитела ритуксан-cIgGB (10 мг/кг) посредством внутривенной болюсной инъекции. Кровь у животных собирали на сутки 0 (перед дозированием), сутки 3, сутки 7, сутки 10, сутки 14, сутки 28, сутки 42 и сутки 59. В этих образцах крови наблюдали параметры клинической патологии и анализировали процент CD21-положительных лимфоцитов (B-клетки) каждой собаки в трех повторениях посредством FACS на PBMC, выделяемых из цельной крови с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином (RPE) антитела мыши против CD21 собаки (AbDserotec, каталожный № MCA1781PE). Процентное содержание B-клеток, сохраняющихся в каждый момент времени, рассчитывали для каждой собаки путем деления процентного содержания лимфоцитов, которые являлись CD21-положительными в этот момент времени на процентное содержание, которое являлось CD21-положительным на сутки 0 (перед дозированием). Затем рассчитывали средние значения процентных содержаний B-клеток, остававшихся для каждой группы лечения, наносили на график (фиг. 6).
Все дозы антител являлись хорошо переносимыми у собак. Наблюдали заметное дозозависимое уменьшение процентных содержаний CD21-положительных клеток (B-клеток), и оно сохранялось до суток 59 у собак Beagle, получавших лечение 1, 10 или 30 мг/кг 1E4-cIgGB. На сутки 7 наблюдали более чем 70% элиминацию B-клеток у собак, получавших лечение 10 или 30 мг/кг 1E4-cIgGB. CD21-положительные клетки оставались элиминированными до суток 59 с 35% и >50% подавлением у животных, получавших лечение 10 или 30 мг/кг 1E4-cIgGB, соответственно. У собак, которым вводили однократную дозу изотипического контрольного антитела ритуксан-cIgGB (10 мг/кг) или самую низкую дозу 1E4-cIgGB (0,1 мг/кг), не выявляли достоверных изменений процентных содержаний CD21-положительных клеток (B-клеток) во время исследования.
Пример 4
Лечение собак, страдающих B-клеточной лимфомой, с использованием химерного антитела 1E4-cIgGB против CD20 собаки
Описанное выше химерное антитело 1E4 IgGB собаки вводят самцам собак Beagle, страдающим B-клеточной лимфомой, в соответствующей дозе (например, 10 мг/кг) посредством внутривенной болюсной инъекции. У животных собирают кровь на различные сутки, включая сутки 0 (перед дозированием) и, например, на сутки 1, сутки 2, сутки 3, сутки 4, сутки 7, сутки 10, сутки 14, сутки 28, сутки 42 и сутки 59. В этих образцах крови наблюдают параметры клинической патологии и анализируют процент CD21-положительных лимфоцитов (B-клеток) у каждой собаки в трех повторениях посредством FACS на PBMC, выделяемых из цельной крови с использованием конъюгированного с R-фикоэритрином (RPE) антитела мыши против CD21 собаки (AbDserotec, каталожный № MCA1781PE). Для каждой собаки рассчитывают процентное содержание B-клеток, сохраняющихся в каждый момент времени, путем деления процентного содержания CD21-положительных лимфоцитов в этот момент времени на процентное содержание, которое являлось CD21-положительным на сутки 0 (перед дозированием). Затем можно рассчитывать и наносить на график средние значения процентных содержаний оставшихся B-клеток для каждой группы лечения для подтверждения того, что лечение является эффективным.
Несмотря на то, что настоящее изобретение можно описать в отношении предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области следует понимать, что возникают изменения и модификации. Таким образом, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения включает все такие эквивалентные варианты, которые входят в объем изобретения, как заявлено.