СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

1. Способ in vitro для выявления присутствия нейтрализующих антител против рекомбинантного человеческого инсулина (rHI) посредством анализа образца сыворотки, включающий следующие стадии:
(а) предобработка образца сыворотки;
(б) анализ на основе клеток, где он включает следующие стадии:
i. посев клеток, имеющих рецептор рекомбинантного человеческого инсулина (rHI);
ii. голодание клеток;
iii. приведение в контакт популяции клеток с rHI и предобработанным образцом сыворотки;
iv. лизирование клеток и получение прозрачного лизата; и
v. оценка лизата в отношении фосфорилирования инсулинового рецептора; и
(в) соотношение количества фосфорилирования с плавающей точкой деления.
2. Способ по п. 1, в котором стадия (а) включает следующие стадии:
i. кислотная диссоциация и обработка углем;
ii.нейтрализация и обработка полиэтиленгликолем (PEG); и
iii. ресуспендирование осадка.
3. Способ по п. 2, в котором кислотная диссоциация включает обработку образца сыворотки уксусной кислотой и раствором декстрана с углем.
4. Способ по п. 3, в котором образец инкубируют в течение примерно 30 минут при комнатной темперауре со встряхиванием при примерно 180 об./мин.
5. Способ по п. 2, в котором нейтрализация и обработка PEG включает следующие стадии:
i. центрифугирование в течение примерно 10 минут при примерно 10000 об./мин при примерно 4°С;
ii. перенос супернатанта и добавление 1 М буфера Tris и 40%-ного раствора PEG; и
iii. инкубирование в течение примерно 30 минут при комнатной температуре с круговым встряхиванием при примерно 180 об./мин.
6. Способ по п. 2, в котором ресуспендирование осадка включает следующие стадии:
i. центрифугирование в течение примерно 20 минут при примерно 6000 об./мин при примерно 4°С;
ii. отбрасывание супернатанта;
iii. добавление фосфатно-солевого буферного раствора (PBS); и
iv. обработка ультразвуком в течение примерно 10 минут.
7. Способ по п. 1, в котором клетки выбирают из любой линии клеток, содержащей по меньшей мере один рецептор rHI.
8. Способ по п. 7, в котором линии клеток выбирают из MCF 10А и MCF-7, более предпочтительно из линии клеток аденокациномы молочной железы человека - MCF-7.
6
6
6
9. Способ по п. 7, в котором клетки имеют плотность, варьирующую от 0,05×10 до 0,5×10 клеток на лунку, предпочтительно примерно 0,2×10 клеток на лунку.
2
10. Способ по п. 1, в котором клетки высевают в ростовую среду DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко):F12 и инкубируют при примерно 37°С в увлажненном воздухе, содержащем примерно 5% CO, в течение периода времени от 12 до 16 часов.
11. Способ по п. 1, в котором голодание клеток осуществляется в течение от примерно 18 часов до примерно 26 часов в ростовой среде, не содержащей глюкозу.
2
12. Способ по п. 1, в котором стадию приведения в контакт осуществляют в течение от примерно 5 минут до примерно 30 минут при комнатной температуре в DMEM, не содержащей глюкозу, в увлажненном инкубаторе с CO.
13. Способ по п. 1, в котором концентрация rHI составляет от примерно 10 нг/мл до примерно 30 нг/мл, предпочтительно - 20 нг/мл.
14. Способ по п. 1, в котором лизис проводят в лизисном буфере при комнатной температуре в течение примерно 10 минут.
15. Способ по п. 1, в котором фосфорилирование инсулинового рецептора выявляют и оценивают с использованием анализа на основе электрохемилюминисценции (ECL).
16. Способ по п. 1, в котором на стадии соотношения, когда количество фосфорилирования меньше чем или равно плавающей точке деления, образец является позитивным.
17. Способ по п. 1 или 16, в котором определение плавающей точки деления включает следующие стадии:
i. приведение в контакт популяции клеток с индивидуальными образцами нормальной человеческой сыворотки в присутствии и в отсутствие рекомбинантного человеческого инсулина;
ii. определение величины ответа для каждого образца; и
iii. умножение средней величины ответа на нормирующий множитель.
18. Набор для способа in vitro выявления присутствия нейтрализующих антител против рекомбинантного человеческого инсулина (rHI) посредством анализа образца сыворотки, включающий следующие стадии:
(а) предобработка образца сыворотки;
(б) анализ на основе клеток, где он включает следующие стадии:
i. посев клеток, имеющих рецептор rHI;
ii. голодание клеток;
iii. приведение в контакт популяции клеток с rHI и предобработанным образцом сыворотки;
iv. лизирование клеток и получение прозрачного лизата; и
v. оценка лизата в отношении фосфорилирования инсулинового рецептора; и
(в) соотношение количества фосфорилирования с плавающей точкой деления,
где данный набор содержит PEG 6000 (40%), приготовленный в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор); уголь с декстраном (3%), приготовленный в PBS; поликлональное антитело против инсулина (PAb); 600 мМ ледяную уксусную кислоту (рН 2,5); 1 М буфер Tris (рН 9,5); фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) и рекомбинантный человеческий инсулин.