СПОСОБЫ РАЗДЕЛЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ, И ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ЭТОГО КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АПТАМЕРЫ ИЛИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью на сперматозоиде млекопитающего, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3-35 или их участка связывания с молекулой-мишенью;
(b) нуклеотидной последовательности, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности (a) или ее участку связывания с молекулой-мишенью, и обладает, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или у ее участка связывания с молекулой-мишенью; и
(c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по существу, такую же структуру, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью, и обладающей, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью.
2. Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35, или их участок связывания с молекулой-мишенью.
3. Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 и 12-35, или нуклеотиды 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью.
4. Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35, и/или где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотиды 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью.
5. Выделенная синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, где указанные ДНК-последовательности включают нуклеотиды 21-60 последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотиды 21-43 последовательности SEQ ID NO:11, или их участок связывания с молекулой-мишенью.
6. Композиция, включающая, по меньшей мере, одну из последовательностей нуклеиновых кислот, выбранных из группы, состоящей из:
(a) последовательности нуклеиновой кислоты по п.1;
(b) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35, или ее участка связывания с молекулой-мишенью;
(c) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 и 12-35, или нуклеотидов 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью;
(d) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35 и/или где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотидов 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью; и
(e) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где указанные ДНК-последовательности включают нуклеотиды 21-60 последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотидов 21-43 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью.
7. Способ разделения смеси сперматозоидов млекопитающего, содержащих, по меньшей мере, одну молекулу-мишень, включающий:
контактирование сперматозоидов млекопитающего с композицией по п.6 в течение подходящего периода времени для того, что допустить связывание последовательности нуклеиновой кислоты со сперматозоидами; и
разделение сперматозоидов на две или более популяции сперматозоидов на основе способности, по меньшей мере, одной последовательности нуклеиновой кислоты связываться с молекулой-мишенью на сперматозоиде.
8. Способ по п.7, дополнительно включающий отделение указанных двух или более популяций сперматозоидов, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, от последовательности нуклеиновой кислоты, и извлечение отделенных сперматозоидов.
9, Способ по п.8, где последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно связывается с X-сперматозоидами, и преимущественно извлекается популяция X-сперматозоидов.
10. Способ по п.8, где последовательность нуклеиновой кислоты предпочтительно связывается с Y-сперматозоидами, и преимущественно извлекается популяция Y-сперматозоидов.
11. Способ по п.7, где сперматозоиды млекопитающего представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота или сперматозоиды человека.
12. Способ по п.7, где, по меньшей мере, одна из популяций сперматозоидов включает Y-сперматозоиды или X-сперматозоиды.
13. Способ по п.8, где, по меньшей мере, одна из популяций сперматозоидов включает сперматозоиды, не связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты.
14. Способ по п.8, где, по меньшей мере, одна из популяций сперматозоидов включает сперматозоиды, связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты.
15. Способ по п.7, где композиция включает две или более различных последовательностей нуклеиновой кислоты.
16. Способ по п.7, где последовательность нуклеиновой кислоты связана с немагнитной частицей или связана с магнитной частицей.
17. Способ получения, по меньшей мере, одной последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью на поверхности сперматозоида млекопитающего, включающий стадии:
(a) контактирования коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с указанной молекулой-мишенью при условиях, благоприятных для связывания между, по меньшей мере, одной из указанных молекул нуклеиновых кислот, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну указанную молекулу нуклеиновой кислоты, связанную с молекулой-мишенью, где каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей;
(b) отделения указанных комплексов от несвязанных молекул нуклеиновых кислот и несвязанных молекул-мишеней; и
(c) извлечения связанных молекул нуклеиновых кислот из отделенного комплекса, где указанные связанные молекулы нуклеиновых кислот включают, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с указанной молекулой-мишенью; где, по меньшей мере, одна последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из:
(a) последовательности нуклеиновой кислоты по п.1;
(b) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35, или ее участка связывания с молекулой-мишенью;
(c) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 и 12-35, или нуклеотидов 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью;
(d) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 1-20 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-35 и/или где, по меньшей мере, участок нуклеотидов 61-80 удален из указанных последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотидов 44-63 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью; и
(e) последовательности нуклеиновой кислоты (a), где указанные ДНК-последовательности включают нуклеотиды 21-60 последовательностей SEQ ID NO:3-10 или 12-35, или нуклеотидов 21-43 последовательности SEQ ID NO:11, или их участка связывания с молекулой-мишенью.
18. Способ по п.17, дополнительно включающий стадию амплификации извлеченной молекулы нуклеиновой кислоты с созданием дополнительных молекул нуклеиновой кислоты.
19. Способ по п.17, где указанная стадия контактирования включает инкубацию указанных молекул с образованием равновесной смеси, и где указанная стадия отделения включает капиллярный электрофорез.
20. Способ по п.17, где указанная молекула-мишень выбрана из группы, состоящей из белка, пептида, фермента, липида, гликолипида, фосфолипида, гликопротеина, углевода, малой молекулы или молекулы клеточной поверхности.
21. Способ по п.20, где указанная молекула-мишень представляет собой молекулу-мишень, которая находится на сперматозоиде.
22. Способ по п.21, где указанная молекула-мишень отличает, по меньшей мере, один X-сперматозоид от, по меньшей мере, одного Y-сперматозоида.
23. Способ по п.21, где указанные сперматозоиды представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота или сперматозоиды человека.
24. Способ по п.17, где указанные извлеченные последовательности нуклеиновых кислот стадии (c) впоследствии применяются в качестве коллекции различных молекул нуклеиновых кислот в стадии (a).
25. Способ по п.17, где стадии (a), (b) и (c) повторяют 1 или более раз, 2 или более раз, 3 или более раз, 4 или более раз, 5 или более раз, 6 или более раз, 7 или более раз, или 8 или более раз с получением последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительной для Y-сперматозоидов или X-сперматозоидов.
26. Способ по п.17, дополнительно включающий инкубацию указанной коллекции различных молекул нуклеиновых кислот и указанных молекул-мишеней с праймером, который, по существу, комплементарен матричной последовательности нуклеиновой кислоты.
27. Способ по п.26, где указанная матричная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, которая соответствует сегменту указанной последовательности нуклеиновой кислоты, который является неизменным среди множества аптамеров.
28. Способ по п.27, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность из ДНК-библиотеки, и указанная матричная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой векторную последовательность.
29. Способ по п.17, где стадия (a) дополнительно включает стадию негативной селекции, за которой следует стадия позитивной селекции.
30. Способ по п.17, где указанная извлеченная последовательность нуклеиновой кислоты является очищенной.
31. Способ по п.17, где множество извлеченных последовательностей нуклеиновых кислот количественно оценивают с использованием проточной цитометрии.
32. Способ по п.22, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты позволяет отделение Y-сперматозоидов от X-сперматозоидов, где указанным способом получают первую группу последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается с Y-сперматозоидами в указанном первом образце, и вторую группу последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается с X-сперматозоидами в указанном втором образце; и указанный способ дополнительно включает:
(d) сравнение указанной первой и второй групп последовательностей нуклеиновых кислот для идентификации методом исключения, по меньшей мере, одной последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается или только с Y-сперматозоидами или только с X-сперматозоидами.
33. Способ по п.32, где указанные первый и второй образцы сперматозоидов млекопитающего получают с помощью проточной цитометрии и сортировки клеток.
34. Способ по п.32, где последовательность нуклеиновой кислоты получают с помощью способа, где стадия контактирования (a) дополнительно включает:
(al) контактирование первой коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с молекулой-мишенью, которая содержится в первом образце Y-сперматозоидов, при условиях, благоприятных для связывания между указанными молекулами нуклеиновых кислот и указанными Y-сперматозоидами, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним Y-сперматозоидом, где каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот, включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; и
(a2) контактирование второй коллекции различных молекул нуклеиновых кислот с молекулой-мишенью, которая содержится во втором образце X-сперматозоидов, при условиях, благоприятных для связывания между указанными молекулами нуклеиновых кислот и указанными X-сперматозоидами, с образованием, по меньшей мере, одного комплекса, включающего, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, связанную, по меньшей мере, с одним X-сперматозоидом, где каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот, включает, по меньшей мере, один сегмент случайных нуклеотидных последовательностей; и
где, таким образом, с помощью стадии извлечения (c) получают, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с Y-сперматозоидами, и/или, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая связывается с X-сперматозоидами.
35. Способ по п.34, где извлекают последовательности нуклеиновых кислот, которые связываются с Y-сперматозоидами.
36. Способ по п.34, где извлекают последовательности нуклеиновых кислот, которые связываются с X-сперматозоидами.
37. Способ по п.32, где перед стадией (a), проводят, по меньшей мере, 1 раунд контактирования указанных молекул нуклеиновых кислот с популяцией несортированных клеток, включающей оба типа сперматозоидов - X-сперматозоиды и Y-сперматозоиды.
38. Способ по п.32, где указанная стадия отделения (b) дополнительно включает стадию отделения указанных сперматозоидов, связанных с последовательностью нуклеиновой кислоты, от последовательности нуклеиновой кислоты, и указанная стадия извлечения (c) дополнительно включает извлечение отделенных сперматозоидов.
39. Способ по п.32, где сперматозоиды млекопитающего представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота или сперматозоиды человека.
40. Способ по п.17, где последовательность нуклеиновой кислоты связана с немагнитной частицей или с магнитной частицей.
41. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет отделение Y-сперматозоидов от X-сперматозоидов, включающий стадии:
(a) получения первого образца Y-сперматозоидов и второго образца X-сперматозоидов;
(b) получения первой группы последовательностей нуклеиновых кислот, которые связываются с Y-сперматозоидами в указанном первом образце, и получения второй группы последовательностей нуклеиновых кислот, которые связываются с X-сперматозоидами в указанном втором образце; и
(c) сравнения указанных первой и второй групп последовательностей нуклеиновых кислот для идентификации методом исключения, по меньшей мере, одной последовательности нуклеиновой кислоты, которая связывается или только с Y-сперматозоидами или только с X-сперматозоидами.
42. Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, которая позволяет отделение X-сперматозоидов от Y-сперматозоидов, включающий стадии:
(a) контактирования смешанной популяции X- и Y-сперматозоидов с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая предпочтительно связывается с X-сперматозоидами, с образованием комплексов из связанной нуклеиновой кислоты и X-сперматозоидов;
(b) отделения X-сперматозоидов от исходной смешанной популяции сперматозоидов, где X-сперматозоиды покидают обогащенную популяцию сперматозоидов, содержащих Y-хромосому; и
(c) высвобождения связанных X-сперматозоидов из комплексов нуклеиновой кислоты и X-сперматозоидов; и
(d) извлечения X-сперматозоидов.
43. Способ по п.42, где указанная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из:
(a) нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3-35 или их участков связывания с молекулой-мишенью;
(b) нуклеотидной последовательности, которая, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности (a) или ее участку связывания с молекулой-мишенью, и обладает, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или ее участка связывания с молекулой-мишенью; и
(c) нуклеотидной последовательности, имеющей, по существу, такую же структуру, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью, и обладающей, по существу, такой же способностью связываться с указанной молекулой-мишенью на указанном сперматозоиде, как у нуклеотидной последовательности (a) или (b) или у их участка связывания с молекулой-мишенью.
44. Способ по п.42, где указанные Y-сперматозоиды извлекают из стадии (b).
45. Популяция сперматозоидов, полученная с помощью способа по п.32, или набор реагентов для искусственного оплодотворения млекопитающего, содержащий указанную популяцию сперматозоидов, включающую сперматозоиды, связанные с указанным аптамером.
46. Популяция сперматозоидов, полученная с помощью способа по п.32, или набор реагентов для искусственного оплодотворения млекопитающего, содержащий указанную популяцию сперматозоидов, включающую сперматозоиды, не связанные с указанным аптамером.
47. Популяция сперматозоидов или указанный набор реагентов по п.45, где указанные сперматозоиды представляют собой сперматозоиды крупного рогатого скота.
48. Популяция сперматозоидов или указанный набор реагентов по п.45, где указанные сперматозоиды представляют собой сперматозоиды человека.
49. Популяция сперматозоидов или указанный набор реагентов по п.45, включающие X-сперматозоиды или Y-сперматозоиды.
50. Способ искусственного оплодотворения млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему популяции сперматозоидов, включающей сперматозоиды, связанные с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты или не связанные с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, полученной способом по п.32.