ПРОИЗВОДСТВО БИОТОПЛИВА И БЕЛКА ИЗ СЫРЬЯ
PRODUCTION OF BIOFUEL AND PROTEIN FROM RAW MATERIALS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу и системе получения выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья. В частности, настоящее изобретение относится к объединенным производству биотоплива из сырья и очистке белкового продукта от сырья с применением способа адсорбции на взвешенном слое (ЕВА).
Уровень техники изобретения
Биотопливо может быть использовано для централизованного и децентрализованного производства электричества и тепла или в качестве заместителя бензина.
С одной стороны, биотопливо запасается в растениях “улавливанием” энергии Солнца посредством фотосинтеза. Однако, в общем, одно из преимуществ биотоплива по сравнению с большинством других типов топлива заключается в том, что биотопливо является биоразлагаемым и, таким образом, относительно безвредным для окружающей среды в случае его утечки.
Биотопливо использовали на заре автомобильной промышленности. В Германии двигатель внутреннего сгорания был рассчитан на работу на этаноле, а дизельный двигатель был изначально разработан для работы на масле земляного ореха. Однако вследствие значительной дешевизны извлечения сырой нефти (сырой минеральной нефти) промышленность предпочитала создавать двигатели, работающие на более дешевых продуктах извлечения сырых минеральных нефтей, а не на более дорогих биотопливах.
Тем не менее биотопливо продолжало оставаться отчасти интересным горючим ингредиентом, в частности, в смеси с бензином или в качестве компонента смеси газолина со спиртом, получаемым ферментацией картофеля в некоторых странах, таких Германия и Британия.
Однако, вследствие возрастающего использования горючих топлив, и в то же время чтобы избежать или ограничить давление на окружающую среду, альтернативные топливные продукты, которые относительно безвредны для окружающей среды, такие как биотоплива, получили больше внимания. Следовательно, в 2005 году биоэнергия, такая как биотопливо, покрывает приблизительно 15% мирового потребления энергии, и ее потребление продолжает возрастать.
Одна из проблем способов производства биотоплива, доступных в настоящее время, заключается в том, что выход биотоплива, полученного этими способами, недостаточно высок для поддержания низкой цены биотоплива, чтобы обеспечить его конкурентоспособность относительно традиционно используемых минеральных нефтей.
Следовательно, представлялось интересным объединить производство биотоплива с производством альтернативных ценных побочных продуктов. Один такой продукт может представлять собой белок, который традиционно выделяют из дистиллята, например, после удаления дистилляцией этанола из суспензии. Проблема данного способа заключается в том, что белок будет денатурировать в ходе высокотемпературной дистилляционной обработки и полученный белок может быть использован только в качестве добавки к корму животных.
Чтобы преодолеть данную проблему, предлагалось отделять белки от суспензии перед дистилляцией, служащей для получения этанола. Однако белковые продукты, полученные данным способом, как оказалось, имели очень высокое содержание примесей вследствие использования неспецифических способов, что делает данные продукты неподходящими для потребления человеком. Применение стандартной хроматографии, методик с использованием уплотненных адсорбционных слоев предлагалось для получения более чистых белковых продуктов, однако, оно, как оказалось, является нежелательным, поскольку производственные затраты слишком сильно возрастали, возрастало также производственное время, достигая нежелательной степени.
Следовательно, обеспечивающим преимущество являлся бы усовершенствованный способ производства биотоплива и белка, который имеет высокую степень производительности на единицу затраты, который является быстрым, который является воспроизводимым, который требует минимального числа стадий манипулирования, который специфичен, что позволяет ограничить содержание примесей в белковом продукте, и который, предпочтительно, совместим с автоматизированными и полуавтоматизированными системами с целью оптимизации работ по выделению биотоплива и очистке белкового продукта.
Сущность изобретения
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предоставить способ и систему, которая решает вышеупомянутые проблемы известного уровня техники, связанные с производством биотоплива и белковых продуктов.
Следовательно, один аспект изобретения относится к способу получения выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья. Способ включает стадии:
(i) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной первичной обработки, высвобождающей биотопливо из сырья или из производного указанного сырья,
(ii) выделения биотоплива, высвобожденного на стадии (i), с получением выделенного биотоплива,
(iii) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной вторичной обработки, дающей суспензию материалов, и
(iv) проведения обработки суспензии материалов стадии (iii) способом адсорбции на взвешенном слое, получающим очищенный белковый продукт.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу получения выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья. Способ включает стадии:
(i) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной первичной обработки, высвобождающей биотопливо из сырья или из производного указанного сырья,
(ii) выделения биотоплива, высвобожденного на стадии (i), с получением выделенного биотоплива,
(iii) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной вторичной обработки, дающей суспензию материалов,
(iv) проведения обработки суспензии материалов стадии (iii) способом адсорбции с получением очищенного белкового продукта, и
где выход полученного белка представляет собой эквивалент по меньшей мере 10 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество.
Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, чтобы дать систему объединенного производства выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья. Система включает:
(a) первое средство для воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной первичной обработки для высвобождения биотоплива из сырья или из производного указанного сырья,
(b) второе средство для выделения высвобожденного биотоплива из сырья или из производного указанного сырья,
(c) третье средство для воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной вторичной обработки, дающей суспензию материалов, и
(d) колонну адсорбции на взвешенном слое для получения очищенного белкового продукта.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно следующим образом.
Подробное описание изобретения
Производство биотоплив, заменяющих горючую нефть и природный газ, весьма интересно, поскольку оно представляет собой эффективный путь получения высокого выхода энергии за счет эффективного производства жидких и газообразных биотоплив на основе дешевого органического материала (обычно, целлюлозы, сельскохозяйственных отходов и сточных вод). Более того, биотоплива рассматриваются как весьма экологически безопасные, поскольку углерод биотоплив, возможно, извлечен из атмосферного диоксида углерода растениями. Следовательно, сжигание данных растений не приводит к увеличению количества диоксида углерода в атмосфере Земли. Как результат, биотоплива могут рассматриваться многими как путь уменьшения количества диоксида углерода, высвобождаемого в атмосферу, посредством их использования для замещения невозобновляемых источников энергии.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья. Способ включает стадии:
(i) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной первичной обработки, высвобождающей биотопливо из сырья или из производного указанного сырья,
(ii) выделения биотоплива, высвобожденного на стадии (i), с получением выделенного биотоплива,
(iii) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной вторичной обработки, дающей суспензию материалов,
(iv) проведения обработки суспензии материалов стадии (iii) способом адсорбции с получением очищенного белкового продукта, и
где выход полученного белка представляет собой эквивалент по меньшей мере 10 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество.
В настоящем контексте термин “эквивалент по меньшей мере 10 грамм 100%-но чистого белкового продукта” относится к количеству белка, присутствующего в продукте, где количество небелкового материала не учитывается при расчете содержания белка. На это также указывает формулировка “100%-но чистого белкового продукта”, которая также показывает, что существенной является именно только белковая композиция продукта, а не небелковый материал.
Небелковый материал относится к материалу, не включающему больших органических соединений, построенных из аминокислот, организованных в линейную цепь и соединенных воедино между карбоксильным атомом одной аминокислоты и аминным азотом другой аминокислоты пептидной связью. Небелковый материал может представлять собой, но не ограничен ими: жир, сахар, ДНК, липиды и так далее.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выход полученного белка может представлять собой эквивалент по меньшей мере 10 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, как например по меньшей мере 20 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, например, по меньшей мере 30 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, как например по меньшей мере 40 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, например, по меньшей мере 50 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, как например по меньшей мере 75 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, например, по меньшей мере 100 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, как например по меньшей мере 150 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество, например, по меньшей мере 200 грамм 100%-но чистого белкового продукта на кг биотоплива в расчете на сухое вещество.
Способ настоящего изобретения может представлять собой непрерывный способ получения биотоплива и белкового продукта. В настоящем изобретении термин “непрерывный способ” относится к способу, который не включает каких-либо приостановок или перерывов при реализации способа или не вызывает каких-либо не являющихся необходимыми отсрочек между каждой из операций. Более того, термин “непрерывный способ” также может означать, что способ может работать или функционировать без необходимости привлечения человеческого физического труда.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья. Способ включает стадии:
(i) воздействия на сырье или производное указанного сырья по меньшей мере одной первичной обработки, высвобождающей биотопливо из сырья или из производного указанного сырья,
(ii) выделения биотоплива, высвобожденного на стадии (i), с получением выделенного биотоплива,
(iii) воздействия на сырье или производное указанного сырья вторичной обработки, дающей суспензию материалов, и
(iv) проведения обработки суспензии материалов стадии (iii) способом адсорбции на взвешенном слое с получением очищенного белкового продукта.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения стадии (i) и (ii) проводят до проведения стадий (iii) и (iv).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадии (iii) и (iv) проводят до проведения стадий (i) и (ii).
Сырье
Способ по настоящему изобретению может быть нацелен на промышленное или крупномасштабное фракционирование сырьевых материалов для производства биотоплива и белковых продуктов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения сырье или производное указанного сырья представляет собой сырье, включающее биотопливо, или производное указанного сырья, включающее биотопливо.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения сырье, подходящее для производства биотоплива или производного указанного сырья, выбрано из группы, состоящей из растительного материала, производного растительного материала, материала животного происхождения или производного материала животного происхождения.
Предпочтительно, растительный материал или производное растительного материала выбран из группы, состоящей из материалов-производных овощей, экстрактов-производных овощей, материалов-производных фруктов, экстрактов-производных фруктов, семян, углеводсодержащих материалов, крахмалсодержащих материалов, целлюлозосодержащих материалов, зерна, травы, люцерна, крупы, хлебного злака, соевых бобов, льняного семени, рапсового семени, сахарного тростника, пальмового материала, соломы, лесоматериала, навоза, риса, шелухи, нечистот, земляного ореха, плодов картофеля, биоразлагаемых нечистот и объедков.
Предпочтительно, материал животного происхождения выбран из рыбы, материалов-производных рыбы, молока, материалов-производных молока.
В контексте настоящего изобретения термин “производное указанного сырья” относится к любому сырью или любой фракции сырья, полученной из сырья. Производное указанного сырья может быть получено после воздействия на сырье любого вида обработки, в частности названных видов обработки, но без ограничения ими: экстракции, измельчения, помола, рубки, выжимки, нарезки слоями, обдирания, прессования, раздавливания, нарезки щепками, солюбилизационного суспендирования, сепарации или любого их сочетания.
Первичная обработка
В контексте настоящего изобретения термин “первичная обработка” относится к обработке сырья или производного указанного сырья, которая ведет к высвобождению биотоплива из сырья или производного указанного сырья. Впоследствии любое высвобожденное биотопливо может быть выделено из сырья.
В настоящем контексте термины “высвобожденное биотопливо” или “высвобождение биотоплива” использованы взаимозаменяемо, и они относятся к биотопливу, полученному из сырья после воздействия на сырье любого способа обработки, вызывающего образование, выделение, экстракцию биотоплива из сырья.
В общем, существует много различных способов высвобождения биотоплива из сырья, и первичная обработка сырья может быть выбрана из группы следующего неограничивающего списка способов, состоящей из экстракции, измельчения, помола, рубки, выжимки, нарезки слоями, обдирания, прессования, раздавливания, нарезки щепками или любого их сочетания, предпочтительно, сочетания измельчения, помола, рубки, нарезки слоями, обдирания, раздавливания или нарезки щепками с последующими экстракцией, выжимкой или прессованием.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо может быть высвобождено из сырья одним или более из способов, выбранных из группы, состоящей из прессования, экстракции, ферментации или любого их сочетания.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо может быть получено непосредственно из сырья или производного указанного сырья прессованием сырья или производного указанного сырья и/или воздействием на сырье или производное указанного сырья экстракции и/или воздействием на сырье или производное указанного сырья ферментативного способа.
Прессование
Биотоплива, естественным образом встречающиеся в сырье или производном указанного сырья, могут быть получены воздействием на сырье или производное указанного сырья прессования. В данном способе биотопливо может находиться в полученной жидкой фазе. Впоследствии оставшаяся твердая фаза может быть подвергнута экстракции и/или ферментации для получения дополнительного биотоплива из сырья или производного указанного сырья.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо может быть получено из сырья или производного указанного сырья, такого как масличные семена, воздействием на масличные семена механической обработки, такой как прессование с применением или без применения органического растворителя (например, гексана). Биотопливо может быть экстрагировано механически масличным прессом или экспеллером. Прессы изменяются от малых моделей с ручным приводом, которые может создать индивид, до промышленных прессов с механическим приводом. Экспеллеры имеют вращающийся винт в горизонтальном цилиндре, который с одного конца закрыт крышкой. Винт с силой нагнетает семена или орехи через цилиндр, постепенно увеличивая давление. Биотопливо покидает цилиндр через малые отверстия или щели, а прессованная масса выходит через конец цилиндра, когда снимают крышку. Температура и давление могут быть отрегулированы для различных типов сырья. Подготовка сырья может включать удаление шелухи и семенных оболочек с семян и отделение семян от соломы.
Экстракция
Биотоплива, естественным образом встречающиеся в сырье или производном указанного сырья, могут быть получены воздействием на сырье или производное указанного сырья экстракционного способа. Такой экстракционный способ может предпочтительно представлять собой способ водной экстракции, где биотопливо будет образовывать собственную жидкую фазу, поскольку оно в большинстве случаев не будет смешиваться с водой. Альтернативно, экстракционный способ может быть осуществлен с использованием органических растворителей. Впоследствии оставшаяся твердая фаза, полученная по экстракционному способу, может быть подвергнута прессованию и/или ферментации, чтобы получить дополнительное биотопливо из сырья или производного указанного сырья.
Когда биотопливо высвобождается из сырья или производного указанного сырья, такого как масличное семя, способом водной экстракции, можно избежать стадии механического прессования и возможного использования органических растворителей (таких как гексан). Методика водной экстракции может включать применение ферментов для того, чтобы увеличить выход экстракции биотоплива и/или выход экстракции белкового продукта. Биотопливо может быть отделено от водного экстракта, например, флотацией, декантацией или центрифугированием. В случае водной экстракции биотоплива, белок и биотопливо могут быть экстрагированы из твердых материалов одновременно или последовательно. Масло может быть отделено от водного экстракта до или после того, как белок адсорбирован и очищен от экстракта.
Ферментация
Биотоплива могут быть получены, высвобождены или синтетически получены воздействием на сырье или производное указанного сырья ферментативного способа, дающего ферментированный материал, включающий биотопливо.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативный способ выбран из группы, включающей спиртовое брожение (такое как метанольное брожение, этанольное брожение, пропанольное брожение или бутанольное брожение), метановое брожение и водородное брожение.
Чтобы осуществить ферментативный способ по настоящему изобретению, ферментация может быть проведена одним или более микроорганизмами, выбранными из группы, состоящей из дрожжей, бактерий и водорослей.
Предпочтительно, один или более микроорганизмов могут представлять собой продуцирующие метан бактерии. Продуцирующие метан бактерии могут быть выбраны из группы, состоящей из видов Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanothermus, Methanococcus, Methanomicrobium, Methanogenium, Methanospirillum, Methanoplanus, Methanosphaera, Methanosarcina, Methanolobus, Methanoculleus, Methanothrix, Methanosaeta, Methanopyrus и Methanocorpusculum.
Более того, один или более микроорганизмов могут быть выбраны из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp., Thermoanaerobacter spp и Zymomonas spp.
Ферментативный способ по настоящему изобретению дает ферментационный бульон, включающий биотопливо, и ферментационный бульон может включать биотопливо в количестве по меньшей мере 2% (мас./мас.), как например по меньшей мере 4% (мас./мас.), например, по меньшей мере 6% (мас./мас.), как например по меньшей мере 8% (мас./мас.), например, по меньшей мере 10% (мас./мас.).
Биотопливо, полученное по настоящему изобретению, предпочтительно, прессованием, экстракцией, ферментацией или их сочетанием, может быть отделено от ферментированного материала способом выделения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ выделения может быть выбран из группы, состоящей из испарения, экстракции, дистилляции, центрифугирования, декантации и любого их сочетания.
Углеводсодержащее сырье, необязательно подвергнутое различным предварительным обработкам, может быть подвергнуто ферментации с использованием, например, дрожжевого штамма, продуцирующего этанол. После ферментации этанол может быть выделен из ферментационного бульона, например, испарением/дистилляцией.
Белок, полученный при ферментации, может быть выделен на нескольких различных стадиях способа:
i) Если сырье включает белок, он может быть очищен способом адсорбции в подходящий момент до инициирования ферментации.
ii) Альтернативно, белок может быть очищен от ферментационного бульона после ферментации и до или после отделения биотоплива. После ферментации ферментационный бульон будет включать белки и пептиды, происходящие из сырья, и белки, происходящие из дрожжей, которые культивировались в ферментативной среде. Необязательно, дрожжевые клетки могут быть разрушены, чтобы высвободить больше белков в ферментационный бульон, подлежащий очистке. Клетки могут быть разрушены механическим или химическим способом, включающим гомогенизацию под высоким давлением, механическое разрушение в шаровой мельнице, разрушение ультразвуком и аутолиз (ферменты и/или органические растворители могут быть включены в данную стадию).
iii) Альтернативно, белки могут быть очищены от дрожжевых клеток, которые сначала выделяют из массы ферментационного бульона. Дрожжевые клетки могут быть впоследствии разрушены, чтобы эффективно высвободить белок, как описано выше.
Вторичная обработка
В контексте настоящего изобретения термин “вторичная обработка” относится к обработке сырья или производного указанного сырья, которая ведет к получению суспензии, которая может быть использована в способе адсорбции, предпочтительно в способе адсорбции на взвешенном слое, где способ может быть использован для очистки белкового продукта.
Существуют различные способы, подходящие для вторичной обработки сырья или производного указанного сырья для получения сырья в виде суспензии. Предпочтительно, вторичная обработка выбрана из группы, состоящей из экстракции, солюбилизации, измельчения, помола, рубки, выжимки, нарезки слоями, обдирания, прессования, раздавливания, нарезки щепками, суспендирования и сепарации или любого их сочетания.
Предпочтительно, сырье или производное указанного сырья может быть суспендировано в водном растворе, давая водную суспензию материалов.
Предпочтительно, первичная обработка и/или вторичная обработка может давать твердую и по меньшей мере одну жидкую фазу.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо и/или белковый продукт может быть выделен из/очищен от твердой фазы или производного твердой фазы.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо и/или белковый продукт может быть выделен из/очищен от жидкой фазы или производного жидкой фазы.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения твердую фазу, полученную в результате выделения высвобожденного биотоплива на стадии (ii), суспендируют в водной фазе до воздействия на нее вторичной обработки и/или до проведения ее обработки способом адсорбции, предпочтительно способом адсорбции на взвешенном слое, с получением очищенного белкового продукта.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения вторичная обработка может включать экстракцию белкового продукта из твердого материала, остающегося после отделения биотоплива. Твердый материал может быть разрушен любым механическим способом и добавленной водой или водным буфером, чтобы солюбилизировать белки твердого материала. Экстракция может быть проведена при изменяющихся температуре, pH и концентрациях солей и в течение изменяющихся отрезков времени, чтобы обеспечить наивысший выход растворимого белка. Также могут быть добавлены ферменты, чтобы увеличить выход экстракции белка.
Белковые продукты, полученные способом адсорбции (элюированные с адсорбента), могут быть подвергнуты необязательной стадии ультрафильтрации, чтобы сконцентрировать белки. Предпочтительно, фильтрат со стадии ультрафильтрации может быть возвращен назад для обработки дополнительных твердых материалов, чтобы минимизировать потребление воды.
Способ адсорбции
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белковый продукт может быть очищен способом адсорбции. Поскольку необходимо дать способ очистки белкового продукта, который является быстрым, специфичным для того, чтобы ограничить содержание примесей в белковом продукте, предпочтительно, способ адсорбции может представлять собой способ адсорбции на взвешенном слое или способ адсорбции в псевдоожиженном слое, периодическую адсорбцию, адсорбцию на суспендированном слое и адсорбцию на мембранной основе. Наиболее предпочтительно, способ адсорбции может представлять собой адсорбцию на взвешенном слое.
Среди различных технологий промышленного хроматографического разделения, разработанных в последние годы, адсорбция на взвешенном слое (EBA) успешно внедрена в определенных областях биотехнологической промышленности. EBA представляет собой тип адсорбции в псевдоожиженном слое, где уровень обратного смешения поддерживают минимальным. По сравнению с другими технологиями хроматографического разделения, EBA предлагает значительное преимущество, поскольку она может быть применена непосредственно к неочищенному питающему материалу.
При EBA слою адсорбента позволяют расшириться внутри хроматографической колонны, когда подводят поток жидкости. Расширение слоя часто проводят в колонне, имеющей установленную на каждом из ее концов сетчатую структуру, покрывающую площадь поперечного сечения колонны, или некоторые другие перфорированные устройства, которые не будут создавать турбулентность в потоке. Смотри, например, WO-A-9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Швеция). Тот же эффект также наблюдался в системе, использующей перемешиваемый входящий поток, WO-A-9200799 (UpFront Chromatography A/S). Кроме того, вероятно, подойдут и другие дистрибьюторы.
В состоянии расширенного слоя расстояния между частицами адсорбента обеспечивают свободное прохождение примесей в форме частиц, присутствующих в питающем потоке. Напротив, традиционные уплотненные слои работают как объемные фильтры, которые могут забиваться, что приводит к повышенному противодавлению, если только питающий материал тщательно не очищен. Поскольку в EBA-колонне не создается значительное давление, можно применять EBA без ограничений в размере и скорости потока, обычно имеющихся в случае колонн с уплотненным слоем.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ адсорбции не включает уплотненного слоя.
nd
Способ EBA может быть охарактеризован весьма ограниченным обратным смешением жидкости внутри колонны в противоположность хорошо известным турбулентным псевдоожиженным слоям. Обратное смешение в слое часто измеряется как осевая дисперсия (“дисперсионное число сосуда”), смотри Levenspiel, “Chemical Reaction Engineering” 2 Edition, John Wiley & Sons (1972).
Перед проведением обработки суспензии материалов способом адсорбции, способ может дополнительно включать стадию регулирования pH до проведения обработки суспензии материалов способом адсорбции на взвешенном слое с получением очищенного белкового продукта.
Очистка может быть эффективно проведена подачей суспензии материалов в колонну адсорбента при скорости линейного потока по меньшей мере 3 см/мин, как например по меньшей мере 5 см/мин, например, по меньшей мере 8 см/мин, как например 10 см/мин, например, 20 см/мин. Типично, скорость потока выбрана в диапазоне 5-50 см/мин, как например в диапазоне 5-15 см/мин, например, в диапазоне 10-30 см/мин, как например в диапазоне 25-50 см/мин.
Когда суспензия материалов введена в колонну адсорбента, соотношение между частицами адсорбента, присутствующими в колонне, и суспензией материалов может быть оптимизировано, чтобы сохранить высокую емкость колонны адсорбента и получить высокую чистоту белкового продукта, подлежащего очистке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения адсорбент, присутствующий в колонне, взят относительно содержащей белок смеси, подлежащей загрузке на колонну, так что их соотношение составляет по меньшей мере 1:1000, как например по меньшей мере 1:800, например по меньшей мере 1:600, как например по меньшей мере 1:400, например по меньшей мере 1:300, как например по меньшей мере 1:200, например по меньшей мере 1:100, как например по меньшей мере 1:50, например по меньшей мере 1:30, как например по меньшей мере 1:15, например 1:10, как например 1:5 в расчете на объем/объем.
Для получения очищенного белкового продукта элюирование может быть проведено любым способом, описанным как общепринятый и известным из уровня техники.
В альтернативном и весьма подходящем варианте осуществления настоящего изобретения элюирование адсорбированного белкового продукта может быть проведено раствором, типично выбранным из группы, состоящей из разбавленного основания, разбавленной кислоты и воды. В варианте осуществления, где стадию элюирования или промывки проводят таким раствором, раствор является разбавленным, чтобы минимизировать количество соли и других нежелательных веществ, присутствующих в элюированном продукте.
2
4
Предпочтительно, разбавленная кислота или разбавленное основание, использованная(ое) для элюирования биомолекулярного вещества, имеет концентрацию солей менее 50 мМ, предпочтительно, менее 30 мМ, еще более предпочтительно, менее 20 мМ. Определение концентрации солей проводят непосредственно для фракции элюата, содержащей белок или белки, подлежащие выделению, без дополнительного разбавления фракции элюата. В общем, подходят дешевые и нетоксичные кислоты и основания. Особенно предпочтительными основаниями являются гидроксид натрия (NaOH), гидроксид калия (KOH), гидроксид кальция (Ca(OH)), гидроксид аммония (NHOH).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения элюирование может быть проведено с использованием элюента, включающего менее 5% (об./об.) органических растворителей, как например менее 3% (об./об.) органического растворителя, например менее 1% (об./об.) органического растворителя, как например 0% (об./об.) органического растворителя.
Адсорбент
Способ адсорбции по настоящему изобретению включает адсорбент.
В настоящем контексте термин “адсорбент” относится ко всему слою, присутствующему в колонне адсорбента, а термин “частица адсорбента” использован взаимозаменяемо с термином “частица” и относится к индивидуальным единичным частицам, которые составляют адсорбент.
Скорость потока, размер частиц и плотность частиц, все, могут влиять на расширение жидкого слоя, и важно контролировать степень расширения таким образом, чтобы удерживать частицы внутри колонны. Степень расширения может быть определена как H/H0, где H0 представляет собой высоту слоя в состоянии набитого слоя, а H представляет собой высоту слоя в расширенном состоянии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения степень расширения H/H0 находится в диапазоне 1,0-20, таком как 1,0-10, например 1,0-6, таком как 1,2-5, например 1,5-4, таком как 4-6, таком как 3-5, например 3-4, таком как 4-6. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения степень расширения H/H0 составляет по меньшей мере 1,0, как например по меньшей мере 1,5, например по меньшей мере 2, как например по меньшей мере 2,5, например по меньшей мере 3, как например по меньшей мере 3,5, например по меньшей мере 4, как например по меньшей мере 4,5, например по меньшей мере 5, как например по меньшей мере 5,5, например по меньшей мере 6, как например по меньшей мере 10, например по меньшей мере 20.
Плотность частицы адсорбента может составлять по меньшей мере 1,3 г/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 1,5 г/мл, еще более предпочтительно по меньшей мере 1,8 г/мл, еще более предпочтительно, по меньшей мере 2,0 г/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 2,3 г/мл, еще более предпочтительно по меньшей мере 2,5 г/мл, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 2,8 г/мл, чтобы обеспечить высокую продуктивность способа.
В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения частица адсорбента имеет усредненный по частицам размер не более 150 мкм, конкретнее, не более 120 мкм, более конкретно, не более 100 мкм, еще более конкретно, не более 90 мкм, еще более конкретно, не более 80 мкм, еще более конкретно, не более 70 мкм. Типично, частица адсорбента имеет усредненный по частицам размер в диапазоне 40-150 мкм, такой как 40-120 мкм, например 40-100, такой как 40-75, например 40-50 мкм.
В сочетании предпочтительных вариантов осуществления, где средний диаметр частиц составляет 150 мкм или менее, плотность частиц составляет по меньшей мере 1,5 г/мл, как например по меньшей мере 1,8 г/мл. Когда средний размер частиц составляет 120 мкм или менее, плотность частиц составляет по меньшей мере 1,6 г/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 1,9 г/мл. Когда средний диаметр частиц составляет менее 90 мкм, плотность должна составлять по меньшей мере 1,8 г/мл или, более предпочтительно, по меньшей мере 2,0 г/мл. Когда средний диаметр частиц составляет менее 75 мкм, плотность должна составлять по меньшей мере 2,0 г/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 2,3 г/мл, более предпочтительно, по меньшей мере 2,5 г/мл и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 2,8 г/мл.
Высокая плотность частицы адсорбента в большой степени достигается включением определенной доли плотного непористого материала ядра, предпочтительно имеющего плотность по меньшей мере 4,0 г/мл, как например по меньшей мере 5,0 г/мл. Типично, непористый материал ядра имеет плотность в диапазоне примерно 4,0-25 г/мл, как например примерно 4,0-20 г/мл, например примерно 4,0-15 г/мл, как например 12-19 г/мл, например 14-18 г/мл, как например примерно 6,0-15,0 г/мл, например примерно 6,0-10 г/мл.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения адсорбент включает частицу, имеющую функционализированный матричный полимер, несущий множество ковалентно прикрепленных функциональных групп, включающих ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислотных групп.
Предпочтительно, функциональные группы, включающие ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, имеют молекулярную массу не более 500 Дальтон.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения функциональные группы, включающие ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, образуют лиганд или часть лиганда со сродством к белкам.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения гетероароматический фрагмент может быть выбран из моноциклических гетероароматических радикалов, выбранных из тиофенового, фуранового, пиранового, пиррольного, имидазольного, пиразольного, изотиазольного, изоксазольного, пиридинового, пиразинового, пиримидинового и пиридазинового радикалов; и бициклических гетероароматических радикалов, выбранных из индольного, пуринового, хинолинового, бензофуранового, бензимидазольного, бензтиазольного и бензоксазольного радикалов.
2
2
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения кислотная группа выбрана из карбоксильной кислой группы (-COOH), сульфоновой кислой группы (-SOOH), сульфиновой кислой группы (-S(O)OH), фосфиновой кислой группы (-PH(O)(OH)), фосфоновых кислых моноэфирных групп (-P(O)(OH)(OR)) и фосфоновой кислой группы (-P(O)(OH)).
Предпочтительно, функциональные группы, включающие ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, могут происходить из соединений, выбранных из дигидроксибензойных кислот, аминобензойных кислот, диаминобензойных кислот, меркаптобензойных кислот, меркаптоникотиновых кислот, меркаптотетразолуксусных кислот, бензимидазолов, бензтиазолов, бензоксазолов, дикислот, 2,5-дигидроксибензойной кислоты, 2-аминобензойной кислоты, 3-аминобензойной кислоты, 4-аминобензойной кислоты, 2-меркаптобензойной кислоты, 2-меркаптоникотиновой кислоты, 5-меркапто-1-тетразолуксусной кислоты, 2-меркаптобензимидазола, 4-аминофталевой кислоты и 5-аминоизофталевой кислоты.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация функциональных групп, включающих ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, находится в диапазоне 10-990 мкмоль/г сухого вещества твердофазной матрицы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация функциональных групп, включающих ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, находится в диапазоне 1-145 мкмоль/мл гидратированной, осажденной твердофазной матрицы.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация функциональных групп, включающих ароматическую или гетероароматическую циклическую систему и/или одну или более кислых групп, находится в диапазоне 1-130 мкмоль/г влажной, но высушенной отсасыванием твердофазной матрицы.
Непористое ядро составляет типично не более 50% суммарного объема частицы адсорбента, как например не более 40%, предпочтительно, не более 30%.
Частица адсорбента, использованная по изобретению, может быть по меньшей мере частично проницаемой для биомолекулярного вещества, подлежащего выделению, чтобы обеспечить значительную емкость связывания по сравнению с непроницаемыми частицами, которые могут связывать целевую молекулу лишь своей поверхностью, что имеет результатом относительно низкую емкость связывания. Частица адсорбента может иметь в своей основе ряд различных структур, композиций и форм.
Таким образом, частицы адсорбента могут быть образованы рядом химически дериватизированных пористых материалов, обладающих необходимой плотностью и емкостью связывания, чтобы непосредственно работать при данных скоростях потока. Частицы относятся либо к конгломератному типу, как описано в WO 92/00799, имеющему по меньшей мере два непористых ядра, окруженных пористым материалом, либо к пелликулярному типу, имеющему единственное непористое ядро, окруженное пористым материалом.
В настоящем контексте термин “конгломератный тип” относится к частице зернистого материала, которая включает бусины материала ядра различных типов и размеров, удерживаемые вместе полимерной матрицей-основой, например, к частице ядра, состоящей из двух или более частиц высокой плотности, удерживаемых вместе окружающей их агарозой (полимерной матрицей-основой).
В настоящем контексте термин “пелликулярный тип” относится к композиту частиц, в котором каждая частица состоит только из одного материала ядра высокой плотности, покрытого слоем пористой полимерной матрицы-основы, например, к бусине из нержавеющей стали высокой плотности, покрытой агарозой.
Соответственно, термин “по меньшей мере одно непористое ядро высокой плотности” либо относится к пелликулярному ядру, включающему единственную непористую частицу высокой плотности, либо относится к конгломератному ядру, включающему более одной непористой частицы высокой плотности.
Частица адсорбента, как указано, включает непористое ядро высокой плотности с пористым материалом, окружающим ядро, причем указанный пористый материал необязательно включает лиганд на своей внешней поверхности.
В настоящем контексте термин “ядро” относится к частице непористого ядра или частицам непористого ядра, находящимся внутри частицы адсорбента. Частица ядра или частицы ядра могут быть случайно распределены внутри пористого материала и их расположение не ограничено центром частицы адсорбента.
Примерами подходящих материалов непористого ядра являются неорганические соединения, металлы, тяжелые металлы, элементарные неметаллы, оксиды металлов, оксиды неметаллов, соли металлов и сплавы металлов и так далее, при условии, что выполняются вышеуказанные критерии плотности. Примерами таких материалов ядра являются силикаты металлов, боросиликаты металлов; керамика, включающая диборид титана, карбид титана, диборид циркония, карбид циркония, карбид вольфрама, карбид кремния, нитрид алюминия, нитрид кремния, нитрид титана, оксид иттрия, порошок металлического кремния и дисульфид молибдена; оксиды и сульфиды металлов, включающие оксид магния, алюминия, титана, ванадия, хрома, циркония, гафния, марганца, железа, кобальта, никеля, меди и серебра; оксиды неметаллов; соли металлов, включающие сульфат бария; металлические элементы, включающие вольфрам, цирконий, титан, гафний, ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, никель, индий, медь, серебро, золото, палладий, платину, рутений, осмий, родий и иридий, и сплавы металлических элементов, такие как сплавы, образованные между указанными металлическими элементами, например нержавеющая сталь; кристаллические и аморфные формы углерода, включающие графит, сажу и древесный уголь. Предпочтительными материалами непористого ядра являются бусины карбамида вольфрама, вольфрама, стали и титана, такие как бусины нержавеющей стали.
Пористый материал представляет собой полимерную матрицу-основу, использованную в качестве средства покрытия и удержания вместе многочисленных (или единственного) материалов(а) ядра и в качестве средства связывания адсорбирующего лиганда.
Поиск полимерной матрицы-основы можно вести среди определенных типов натуральных или синтетических органических полимеров, типично выбранных из i) натуральных и синтетических полисахаридов и других полимеров на основе углеводов, включая агар, альгинат, каррагенин, гуаровую камедь, гуммиарабик, гхатти камедь, трагакантовую камедь, карайа камедь, камедь плодов рожкового дерева, ксантановую камедь, агарозы, целлюлозы, пектины, муцины, декстраны, крахмалы, гепарины, хитозаны, гидроксикрахмалы, гидроксипропилкрахмалы, карбоксиметилкрахмалы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы; ii) синтетических органических полимеров и мономеров, дающих полимеры, включая акриловые полимеры, полиамиды, полиимиды, сложные полиэфиры, простые полиэфиры, полимерные винильные соединения, полиалкены и их замещенные производные, а также сополимеры, включающие более одного такого полимера с функциональной точки зрения, и их замещенные производные; и iii) их смесей.
Предпочтительная группа полимерных матриц-основ образована полисахаридами, такими как агароза.
Лиганд, прикрепленный к адсорбентам, типично обеспечивает емкость динамического связывания по меньшей мере 10 г биомолекулярного вещества на литр, более предпочтительно по меньшей мере 20 г на литр, еще более предпочтительно по меньшей мере 30 г на литр при тестировании в соответствии с условиями способа, использованными в релевантном применении. Емкость связывания адсорбента может быть определена в терминах его емкости связывания c бычьим сывороточным альбумином (BSA). Емкость связывания адсорбента типично такова, что по меньшей мере 10 г/л BSA связывается согласно тестовому способу A.
Способ A представляет собой способ, используемый для определения емкости связывания c бычьим альбумином выбранных адсорбентов, состоящий из следующей последовательности действий.
Раствор с pH 4,0 бычьего сывороточного альбумина (BSA pH 4,0): очищенный бычий сывороточный альбумин (A 7906, Sigma, США) растворяют до конечной концентрации 2 мг/мл в 20 мМ цитрате натрия с pH 4,0. Адсорбенты промывают 50 объемами 20 мМ цитрата натрия с pH 4,0 и высушивают на отсасывающем фильтре.
Образец объемом 1,0 мл высушенного отсасыванием адсорбента помещают в пробирку на 50 мл и затем добавляют 30 мл BSA, pH 4,0.
Затем пробирку закрывают пробкой и суспензию инкубируют на валковом смесителе в течение 2 часов при комнатной температуре (20-25ºC). Затем пробирку центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об/мин, чтобы полностью осадить адсорбент. Затем супернатант отделяют от адсорбента пипеттированием в отдельную пробирку, избегая переноса каких-либо частиц адсорбента, и фильтруют через малый неадсорбирующий 0,2 мкм-фильтр (Millipore, США). Вслед за этим, проводят определение концентрации несвязанного BSA в супернатанте, измеряя спектрофотометром оптическую плотность (OD) при 280 нм.
Количество BSA, связанного с адсорбентом, рассчитывают затем по следующей формуле:
мг связанного BSA на мл высушенного отсасыванием адсорбента=(1-(OD тестируемого супернатанта/OD исходного раствора BSA))×60 мг BSA/мл адсорбента.
Дополнительная обработка
Сырье или производное указанного сырья может быть подвергнуто дополнительной обработке, дающей частично гидролизованное сырье.
Такая дополнительная обработка включает влажное окисление, паровой взрыв или ферментативную обработку.
Предпочтительно, сырье и/или частично гидролизованное сырье подвергают гидролизу, выбранному из группы, состоящей из ферментативного гидролиза, кислого гидролиза или щелочного гидролиза, приводящего к повышенному высвобождению биотоплива и/или суспензии материалов, включающей повышенное количество способных к ферментации сахаров и/или повышенное количество растворимых белков.
Обработка способом влажного окисления традиционно имеет место в водной среде в присутствии окислителя, который реагирует, окисляя компоненты, присутствующие в твердой фазе. Паровой взрыв представляет собой термомеханохимический способ обработки, который сочетает присутствие тепла (в виде пара), механических сил (сдвиговой эффект) и химического действия (гидролиз). Результат двух предварительных обработок состоит в изменении микрофибриллярной упаковки внутри клеточной стенки и разрыве волокон, что служит повышению доступности целлюлозы для гидролитических ферментов. Оптимальные условия по температуре и времени реакции в способах изменяются в зависимости от типа материала.
После дополнительной обработки частично отделенный материал может быть обработан ферментами для высвобождения сахаров, которые могут быть ферментированы до этанола, а также биотоплива и/или белковых продуктов.
Как новая твердая фаза, так и новая жидкая фаза, полученные в результате данной дополнительной обработки, могут быть использованы для производства биотоплива и/или белковых продуктов в качестве производного сырья.
Биотопливо
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения биотопливо может быть выбрано из группы, состоящей из масла, метанола, метана, этанола, пропанола, бутанола, водорода и биодизеля, однако биотопливо не ограничено перечисленными биотопливами, другие очевидные биотоплива, которые могут быть произведены настоящим способом, также включены.
Белковый продукт
В настоящем контексте термин “белковый продукт” относится к единственному белку или смеси одного или более белков, включающих аминокислоты, организованные в линейную цепь и соединенные вместе пептидными связями между карбоксильным атомом одной аминокислоты и аминным азотом другой аминокислоты.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения белковый продукт включает ограниченное количество небелкового материала, такого как жир, сахар, ДНК, липиды и так далее. Предпочтительно, белковый продукт включает не более 20% (мас./мас.) небелкового материала, как например не более 15% (мас./мас.) небелкового материала, например не более 10% небелкового материала, как например не более 5% (мас./мас.) небелкового материала, например не более 2% небелкового материала, как например не более 1% (мас./мас.) небелкового материала, например не более 0,5% небелкового материала.
В одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 50% белкового продукта может быть образовано единственным белком, как например по меньшей мере 60% белкового продукта может быть образовано единственным белком, например по меньшей мере 70% белкового продукта может быть образовано единственным белком, как например по меньшей мере 80% белкового продукта может быть образовано единственным белком, например по меньшей мере 90% белкового продукта может быть образовано единственным белком, как например по меньшей мере 95% белкового продукта может быть образовано единственным белком, например по меньшей мере 98% белкового продукта может быть образовано единственным белком, как например по меньшей мере 99% белкового продукта может быть образовано единственным белком.
Система
Настоящее изобретение далее относится к системе комбинированного производства выделенного биотоплива и очищенного белкового продукта из сырья, подходящего для производства биотоплива или производного указанного сырья, и указанная система включает:
(a) первое средство для воздействия на сырье или производное указанного сырья первичной обработки для высвобождения биотоплива из сырья или из производного указанного сырья,
(b) второе средство для выделения высвобожденного биотоплива из сырья или из производного указанного сырья,
(c) третье средство для воздействия на сырье или производное указанного сырья вторичной обработки, дающей суспензию материалов, и
(d) колонну адсорбции для получения очищенного белкового продукта.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер и второй контейнер являются одинаковыми.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер, второй контейнер, средство для выделения высвобожденного биотоплива и колонна адсорбции могут сообщаться.
Первый контейнер, второй контейнер, средство для выделения высвобожденного биотоплива и колонна адсорбции могут образовывать закрытую систему производства биотоплива и белкового продукта. В настоящем контексте термин “закрытая система” относится к системе, где первый контейнер, второй контейнер, средство для выделения высвобожденного биотоплива и колонна адсорбции, все, соединены друг с другом. Это означает, что не существует промежутков или пробелов между первым контейнером, вторым контейнером, средством для выделения высвобожденного биотоплива и колонной адсорбции на взвешенном слое.
Предпочтительно, колонна адсорбента может быть выбрана из группы, состоящей из колонны адсорбции на взвешенном слое или колонны адсорбции на псевдоожиженном слое, колонны периодической адсорбции, колонны адсорбции на суспендированном слое и колонны адсорбции на мембранной основе. Наиболее предпочтительно, колонна адсорбции может представлять собой колонну со взвешенным слоем.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер соединен со средством для выделения высвобожденного биотоплива, которое соединено со вторым контейнером и, затем, соединено с колонной адсорбции.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер соединен со средством для выделения высвобожденного биотоплива, которое соединено с колонной адсорбции.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер соединен с колонной адсорбции, которая соединена со средством для выделения высвобожденного биотоплива.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер соединен со средством для выделения высвобожденного биотоплива и со вторым контейнером, а второй контейнер соединен с колонной адсорбции.
В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения первый контейнер соединен со средством для выделения высвобожденного биотоплива и с колонной адсорбции.
В еще одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения первое средство и третье средство могут быть выбраны независимо друг от друга из группы, состоящей из контейнера, устройства прессования, устройства экстракции, устройства фильтрации, устройства испарения, устройства ферментации и устройства дистилляции.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения второе средство может быть выбрано независимо от других средств из группы, состоящей из контейнера, устройства прессования, устройства экстракции, устройства фильтрации, устройства испарения и устройства дистилляции.
Дополнительные варианты осуществления
Белковый продукт по настоящему изобретению может быть очищен на многих различных стадиях способа. Эти различные стадии включают следующие, но не ограничены ими:
- белковый продукт может быть очищен до того, как может быть выделено биотопливо,
- сырье или производное указанного сырья может быть подвергнуто прессованию и, необязательно, экстракции с последующей очисткой белкового продукта до выделения биотоплива,
- биотопливо может быть выделено до того, как белковый продукт может быть очищен,
- сырье или производное указанного сырья может быть подвергнуто прессованию и, необязательно, экстракции с последующим выделением биотоплива до того, как белковый продукт может быть очищен,
- белковый продукт может быть очищен после того, как сырье или производное указанного сырья подвергнуто прессованию и, необязательно, экстракции, и до того, как может быть проведена ферментация на стадии (ii),
- сырье или производное указанного сырья может быть подвергнуто экстракции и, необязательно, прессованию с последующей очисткой белкового продукта до выделения биотоплива,
- сырье или производное указанного сырья может быть подвергнуто экстракции и, необязательно, прессованию с последующим выделением биотоплива до того, как белковый продукт может быть очищен, или
- белковый продукт может быть очищен после того, как сырье или производное указанного сырья подвергнуто экстракции и, необязательно, прессованию, и до того, как может быть проведена ферментация на стадии (ii).
Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам изобретения.
Теперь изобретение будет описано более подробно на примере следующего неограничивающего варианта осуществления.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Вариант осуществления 1: Производство белка и биотоплива из масличных семян. Способ включает следующие стадии:
i) Воздействие на масличные семена механической обработки, такой как прессование с применением или без него органического растворителя (например, гексана). Биотопливо может быть экстрагировано механически масличным прессом или экспеллером. Прессы изменяются от малых моделей с ручным приводом, которые может создать индивид, до промышленных прессов с механическим приводом. Экспеллеры имеют вращающийся винт внутри горизонтального цилиндра, который с одного конца закрыт крышкой. Винт с силой нагнетает семена или орехи через цилиндр, постепенно увеличивая давление. Биотопливо покидает цилиндр через малые отверстия или щели, а твердый остаток прессования выходит через конец цилиндра, когда снимают крышку. Температура и давление могут быть отрегулированы для различных типов сырья. Подготовка сырья или производного указанного сырья может включать удаление шелухи или семенных оболочек с семян и отделение семян от соломы.
ii) Экстракция белкового продукта из твердого материала, оставшегося после отделения биотоплива. Твердый материал может быть разрушен любым механическим способом и добавленной водой или водным буфером, чтобы солюбилизировать белки твердого материала. Экстракция может быть проведена при изменяющихся температуре, pH и концентрациях солей и в течение изменяющихся отрезков времени, чтобы обеспечить наивысший выход растворимого белка. Также могут быть добавлены ферменты, чтобы увеличить выход экстракции белка.
iii) Белковый экстракт может быть подвергнут обработке способом адсорбции, включающим адсорбент, который не уплотнен в колонне в ходе стадии адсорбции, но, предпочтительнее, суспендирован в перемешиваемом баке, в псевдоожиженном слое или взвешенном слое.
iv) Необязательно, белковый продукт, полученный способом адсорбции (элюированный с адсорбента), может быть подвергнут стадии ультрафильтрации, чтобы сконцентрировать белковый продукт. Фильтрат со стадии ультрафильтрации может быть возвращен назад для обработки дополнительной отжатой массы семян, чтобы минимизировать потребление воды.
v) Свободная фракция со стадии (iii) может быть сконцентрирована различными способами, включающими испарение, дистилляцию и мембранную фильтрацию, и любой конденсат или отфильтрованную воду можно возвратить для обработки/экстракции дополнительной твердой массы семян.
Биотопливо также может быть высвобождено из масличного семени способом водной экстракции, избегая, таким образом, стадии механического прессования и возможного применения органических растворителей (таких как гексан). Обработка способом водной экстракции может включать применение ферментов, чтобы повысить выход экстракции биотоплива и/или выход экстракции белка. Биотопливо может быть отделено от водного экстракта, например, флотацией, декантацией или центрифугированием. В случае водной экстракции биотоплива, белок и биотопливо могут быть экстрагированы из твердых материалов одновременно или последовательно. Биотопливо может быть отделено от водного экстракта до или после того, как белок адсорбирован и выделен из экстракта.
Вариант осуществления 2: Производство белка и биотоплива, полученных ферментацией сырья. Способ включает следующие стадии:
i) Углеводсодержащее сырье, необязательно подвергнутое различным предварительным обработкам, подвергают ферментации, используя, например, продуцирующий этанол штамм дрожжей. Вслед за ферментацией этанол может быть выделен из ферментационного бульона, например, испарением и/или дистилляцией.
ii) Белок может быть выделен на нескольких стадиях способа:
a) Если сырье включает белковый продукт, он может быть очищен способом адсорбции в подходящий момент до инициирования обработки ферментативным способом.
b) Альтернативно, белковый продукт может быть очищен от ферментационного бульона после ферментации и до или после отделения биотоплива.
После ферментации ферментационный бульон будет включать белки и пептиды, происходящие из сырья, и белки, происходящие из дрожжей, которые культивировали в ферментативной среде. Дрожжевые клетки могут быть разрушены механическим или химическим способом, включающим гомогенизацию под высоким давлением, механическое разрушение в шаровой мельнице, разрушение ультразвуком и аутолиз (ферменты и/или органические растворители могут быть включены в данную стадию).
c) Белковый продукт также может быть очищен от дрожжевых клеток, которые сначала выделяют из массы ферментационного бульона. Дрожжевые клетки могут быть разрушены, чтобы эффективно высвободить белок, как описано выше, и затем подвергнуты обработке способом адсорбции.
Примеры
Аббревиатуры
DEAE Диэтиламиноэтил
MBS Меркаптобензойная кислота
NaCi Цитрат натрия
NaCl Хлорид натрия
SDS-PAGE Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия
SP Сульфопропил
Пример 1:
Выделение белков и производство этанола из пшеницы
Выделение белков пшеницы с применением адсорбционной хроматографии на взвешенном слое при 25ºC.
Экстракция
Экстракт пшеницы получали смешением 1 кг тонко измельченных лущеных зерен пшеницы с 10 л 25 мМ NaCl в воде. Суспензию механически перемешивали при 100 об/мин в течение 1 часа при 25ºC. Затем экстракт пшеницы центрифугировали, получая прозрачную жидкую фазу и осадок, включающий нерастворимые материалы, такие как клейковина и крахмал. Суммарный объем собранного экстракта составлял 9,5 л. Осевший остаток, влажный материал, сохраняют для последующего производства этанола.
Адсорбент взвешенного слоя
Адсорбент основан на бусинах сшитой агарозы с интегрированными частицами карбида вольфрама, что давало матрицу высокой плотности приблизительно 2,8 г/мл. Размер частиц находился в диапазоне 40-200 мкм со средним объемным диаметром 150 микрон. На эффективность связывания было протестировано несколько адсорбентов, включающих варьирующиеся лиганды, которые обычно связывают белки в диапазоне pH 4-6.
Предварительная обработка экстракта пшеницы
В различных экспериментах pH экстракта регулировали до различных значений в диапазоне pH 4-6, используя 1М хлороводородную кислоту.
Эксперименты проводили в колонне со взвешенным слоем FastLine 10 (Ø=2 см), UpFront Chromatography A/S, Копенгаген, Дания. При 25ºC колонну набивали до H0=50 см адсорбентом (157 мл) и уравновешивали раствором 10 мМ NaCi, имеющим то же pH, что и исходный материал.
В различных экспериментах (эксперименты A-C) экстракт пшеничной муки при различных значениях pH загружали на колонну с линейной скоростью потока 10 см/мин. В каждом эксперименте загружали 3140 мл экстракта и вслед за краткой промывкой колонны водой (промывка приблизительно 150 мл) проводили элюирование связанных белков, используя 50 мМ NaOH.
Концентрацию белка в элюатах оценивали, определяя азот (N×6,25). Также проводили анализ SDS-PAGE (гели из SDS-PAGE не показаны).
Результаты
Эксперимент
Лиганд
Значение pH в ходе адсорбции
Выход белка в элюате, мг белка/мл экстракта
Выход белка в элюате, г белка/кг пшеничного зерна
A
SP 4%
4,0
2,3
21,4
B
4-MBS 6%
4,5
2,2
20,5
C
DEAE 6%
6,0
1,5
14,0
Максимальное количество белка в элюате составляло, таким образом, 21,4 грамма белка/кг сухого пшеничного зерна (эксперимент A).
Для каждого эксперимента проводили анализ SDS-PAGE, и было показано, что по существу все белки, присутствующие в исходном материале (экстракте пшеницы) связываются с колонной, поскольку обзорная фракция и промывочная фракция практически не содержат белка, тогда как элюат включает в значительной мере ту же белковую композицию, что и исходный материал. Похожие результаты получали в экспериментах B и C при несколько меньшем содержании связанного белка. Таким образом, показано, что все три адсорбента в высокой степени связывают белки, присутствующие в экстракте пшеницы, но несколько различаются по степени связывания. Элюированные белковые композиции, полученные во всех экспериментах A, B и C, также показали содержание небелкового материала менее 10% в расчете на сухое вещество.
Производство этанола
Обзорные фракции экспериментов A-C, которые были практически лишены белка описанной выше методикой адсорбции, объединяли и смешивали с осажденным материалом, полученным описанными выше экстракцией и седиментацией, чтобы получить суспензию, включающую пшеничный крахмал. К данной вновь объединенной суспензии затем прибавляли амилоглюкозидазу (300 AGU/кг крахмала), и нагревали до 55ºC в течение 8 часов, чтобы провести осахаривание крахмального материала. Вслед за осахариванием суспензию охлаждали до 35ºC и добавляли Saccharomyces cerevisiae для проведения ферментации в течение 56 часов. Вслед за ферментацией, этанол дистиллировали и собирали. Выход этанола соответствовал 0,3 л/кг сухого пшеничного зерна.
Максимальный выход белка на л полученного этанола, таким образом, соответствует соотношению:
21,4 грамма белка/0,3=71,3 грамма белка/л полученного этанола.
Пример 2:
Выделение белков и производство этанола из пшеницы
Тонко измельченное и лущеное зерно пшеницы экстрагировали как описано в примере 1. До центрифугирования экстракт разделяли на (i) концентрированную фракцию, богатую нерастворимым крахмалом (нижний слив), и (ii) другую фракцию, включающую нерастворимую клейковину и растворимые белки (верхний слив), пропусканием неочищенного экстракта через батарею гидроциклонов. Верхний слив гидроциклонов, включающий массу жидкого экстракта и растворимые белки, затем отстаивали и декантировали, получая осажденную клейковинную фракцию и осветленный экстракт, включающий растворимые белки. Затем из экстракта адсорбировали белки, как описано в примере 1b, и обедненную белками обзорную фракцию возвращали и смешивали с крахмальной фракцией, полученной из нижнего слива гидоциклонов. Крахмал суспендировали в возвращенной обедненной белками жидкости, добавляли амилоглюцидазу для осахаривания и ферментировали, используя Saccharomyces cerevisiae, как описано в примере 1.
Результаты
Выход белка со стадии адсорбции соответствовал 20,1 грамму на кг пшеничного зерна, а выход этанола соответствовал 0,3 л на 1 кг пшеничного зерна. Выход белка со стадии адсорбции соответствовал 67 грамм белка на 1 л произведенного этанола.
Пример 3
Выделение соевого масла и растворимых белков
Экстракция масла
Сухие соевые бобы мололи в муку в кофемолке. Приблизительно 100 грамм муки смешивали с 200 мл изопропанола и перемешивали в течение 30 мин. После предоставления возможности осесть в течение 10 мин получали катыш. Супернатант декантировали в стакан с большой площадью поверхности, чтобы испарить изопропанол. Катыш промывали 4 раза 100 мл изопропанола. Супернатант и промывки объединяли. Объединенную жидкость и катыш оставляли на ночь под тягой, чтобы испарить изопропанол. После испарения изопропанола желтая масляная фаза весила 16,5 г, что соответствует 0,165 л масла на кг молотых соевых бобов.
Экстракция белка
Высушенную соевую муку, лишенную масла экстракцией изопропанолом, смешивали с 300 мл воды и перемешивали в течение 1 часа. Экстракт соевых бобов собирали фильтрацией на 100-мкм сетке. Фильтрационную массу промывали 150 мл воды. Суммарный объем собранного экстракта составлял 350 мл.
Адсорбент взвешенного слоя
Адсорбент основан на бусинах сшитой агарозы с интегрированными частицами карбида вольфрама, что давало матрицу высокой плотности, равной приблизительно 2,8 г/мл. Размер частиц находился в диапазоне 40-200 мкм со средним объемным диаметром 150 микрон. На эффективность связывания было протестировано несколько адсорбентов, включающих варьирующиеся лиганды, которые обычно связывают белки в диапазоне pH 4-6.
Предварительная обработка экстракта
В различных экспериментах (эксперименты A-E) pH экстракта регулировали до различных значений в диапазоне pH 4-6, используя 1 М хлороводородную кислоту.

Эксперимент проводили в колонне со взвешенным слоем FastLine 10 (Ø=1 см), UpFront Chromatography A/S, Копенгаген, Дания. При 25ºC колонну набивали до H0=50 см адсорбентом (39,2 мл) и уравновешивали раствором 10 мМ NaCi, имеющим pH, такое же как исходный материал.
Экстракт соевых бобов при различных значениях pH загружали на колонну с линейной скоростью потока 10 см/мин. Загружали 60 мл экстракта, за чем следовала краткая промывка водой (50 мл). Элюирование связанного белка проводили, используя 50 мМ NaOH. Концентрацию белка в элюатах оценивали, определяя азот (Kjeldahl, N×6,25). Также проводили анализ SDS-PAGE.
Результаты
Эксперимент
Лиганд
Значение pH в ходе адсорбции
Выход белка в элюате, г белка/кг соевых бобов
A
SP
4,0
31,3
B
SP
5,0
47,0
C
4-MBS
4,5
54,8
D
4-MBS
5,0
76,1
E
DEAE
6,0
44,9
Для каждого эксперимента A-E проводили анализ SDS-PAGE образцов (отфильтрованных на 1-микронном фильтре), и было показано, что практически все белки, солюбилизированные и присутствующие в экстрактах, связывались с адсорбентом взвешенного слоя (поскольку обзорные фракции и промывочные фракции по существу не содержат белка) в различных степенях. Впоследствии, связанные белки элюировали в элюат. Элюированные белковые композиции, полученные во всех экспериментах A-E, также показали содержание небелкового материала менее 10% в расчете на сухое вещество.
Все анализы SDS-PAGE проводили как невосстановленные и окрашенные кумасси голубым.
Наивысший выход белка 76,1 г белка/кг соевых бобов получали в эксперименте D, используя адсорбент, включающий в качестве лиганда 4-меркаптобензойную кислоту при pH 5,0.
Таким образом, наивысший выход белка на 1 л соевого масла соответствует соотношению:
(76,1 г белка/кг)/(0,165 л масла/кг)=461 г белка/л соевого масла.
Ссылки
WO-A-9218237
WO-A-9200799.