КЛЕТОЧНАЯ СИСТЕМА НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ИЛИ МЕТКИ
CELLULAR SYSTEM FOR TARGETED DELIVERY OF A PHARMACEUTICALLY ACTIVE SUBSTANCE OR LABEL

+
В соответствии с настоящим изобретением предложена выделенная клеточная система направленной доставки, содержащая клетку, представляющую собой CD45 лейкоцит, при этом в указанной клетке содержится комплекс по меньшей мере одного железосвязывающего белка и фармацевтически активного вещества и/или метки, а также предложены способы получения указанной выделенной клеточной системы направленной доставки и применение указанной системы для профилактики, терапии, диагностики или терагностики, в частности, для профилактической или терапевтической вакцинации, терапии рака, в особенности метастатического рака, или воспалительных заболеваний.
Уровень техники
Современные средства визуализации способны обеспечивать обнаружение больших метастазов (размером более 0,5-1 см). Тем не менее, указанные средства редко обеспечивают обнаружение раннего распространения метастатических опухолевых клеток. У человека метастазы размером менее 0,5 см являются аваскулярными и поэтому не обеспечиваются надлежащим образом кровью и кислородом. Это означает, что доставка контрастных агентов через систему кровообращения для маркировки указанных метастазов и их визуализации является невозможной. Наличие гипоксии является общей характеристикой микрометастазов, при которых гипоксическая фракция может достигать 90% при незначительном или отсутствующем кровотоке (Li, et al., 2012, Journal of Solid Tumours, 2(2): 28-33). Таким образом, высокая степень гипоксии считается общим отличительным признаком микрометастазов.
Направленное воздействие на один или более микрометастазов, скрытых в большой популяции нормальных клеток, представляет собой уникальную проблему, поскольку доступ к микрометастазам затруднен несколькими биобарьерами, плохим кровоснабжением, при этом дополнительными препятствиями являются малые размеры микрометастазов и их распространение в органах.
По той же причине микрометастазы часто являются рефракторными к терапии. Тогда как солидные опухоли, из которых образуются микрометастазы, часто хорошо реагируют на традиционную терапию, часто наблюдается повторный рост в месте первичной опухоли или в местах метастазирования. Это представляет собой серьезную проблему в клинической онкологии (Muthana, et al., 2012, Cancer Res; 73(2); 490-495). Данная особенность связана с характеристиками микрокружения солидных опухолей, которые ограничивают проникновение лекарственных средств, тем самым подвергая опухоль воздействию более низких, чем эффективные, концентраций лекарственных средств (Hobbs, et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA: 4607-4612). Это вызвано ненормальной сосудистой системой, приводящей к: высокой гетерогенности раковых клеток, низкому кислородному потенциалу (гипоксии), низкому рН и низкой концентрации глюкозы в массе опухоли (Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12): 1021-1028). Кроме того, быстрая пролиферация опухолевых клеток в некоторых областях может опережать скорость роста новых кровеносных сосудов, способствуя формированию области гипоксии (Lewis and Murdoch, 2005, Am J Pathol 167(3): 627-635). Такая аномальная структура сосудов и, следовательно, их нарушенная функция, приводящая к гипоксии опухоли, ассоциирована с более злокачественным фенотипом и низкой выживаемостью у пациентов, страдающих солидными опухолями, и приводят как к неэффективности лечения из-за уменьшения усвоения лекарственного средства, так и к вызываемым гипоксией изменениям в раковых клетках (Sun, et al., 2012, Clin Cancer Res 18(3): 758-770; Sullivan, et al., 2008 Mol Cancer Ther 7(7): 1961-1973; Kizaka-Kondoh, et al., 2003, Cancer Sci 94(12): 1021-1028). Кроме того, химиотерапия или лучевая терапия дополнительно вызывают образование больших областей гипоксии опухоли, что делает лечение опухоли еще более затруднительным. Тот факт, что эффективность противоопухолевой терапии ограничена наличием опухолевых клеток в области гипоксии, привел к внедрению различных терапевтических подходов, направленных на преодоление указанной проблемы.
+
+
+
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, в частности активированные макрофаги, их предшественники моноциты, лимфоциты и гранулоциты, могут поглощать фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки в комплексе с одним или более железосвязывающими белками in vitro и доставлять указанные комплексы к клеткам или в клетки, предпочтительно к опухолевым клеткам in vivo или другим клеткам, подвергающимся стрессу (например, окислительному стрессу), или в указанные клетки. На основе результатов указанного исследования авторы настоящего изобретения решили по меньшей мере одну из указанных выше проблем, известных в уровне техники. Таким образом, система направленной доставки согласно настоящему изобретению обеспечивает, помимо прочего, одно или более из следующих преимуществ: (i) специфичную доставку одного или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток к тканям, которые привлекают упомянутые выше CD45 лейкоциты, предпочтительно в пораженные заболеванием клетки, (ii) защиту фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток от инактивации в системе кровообращения или от выведения из организма, (iii) доставку фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток к клеткам, предпочтительно в клетки, в слабо- или неваскуляризированных областях заболевания, например, метастазах, областях гипоксии внутри более крупных опухолей, очагах ревматического повреждения, воспаленных лимфатических узлах, аваскулярных ранах, коже, (iv) снижение токсичности фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, (v) доставку фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток с плохой фармакокинетикой, (vi) снижение побочных эффектов лекарственных средств благодаря их направленной доставке, (vii) обеспечение более высокой эффективности лечения более низкими дозами лекарственных средств благодаря их направленной доставке; и/или (viii) снижение риска локального повреждения ткани в месте введения лекарственного средства благодаря введению лекарственного средства, связанного с железосвязывающим белком, который загружен в CD45 лейкоцит; и/или (ix) возможность выявления небольших метастазов с высокой степенью гипоксии; и/или (x) раннее выявление воспалительных заболеваний.
Краткое описание изобретения
+
+
+
+
+
В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки, содержащей CD45 моноцит-макрофаг, CD45 лимфоцит, в частности, CD45 натуральные клетки-киллеры (NK-клетки), предшественников любых из указанных типов клеток, предпочтительно MDSC, и/или CD45 гранулоцит ("клетку, представляющую собой CD45 лейкоцит"), или их предшественники, предпочтительно MDSC, при этом в указанной клетке содержится комплекс одного или более железосвязывающих белков и фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки.
+
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки метки, содержащей клетку, представляющую собой CD45 лейкоцит, предпочтительно обеспечивающую возможность мечения, содержащей одну или более меток, предпочтительно радиоактивных меток, или их конъюгаты и комбинации.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения выделенной системы направленной доставки по пп. 1-25, включающему стадии:
a) обеспечения очищенного железосвязывающего белка;
b) ковалентного или нековалентного связывания фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки с железосвязывающим белком и/или инкапсулирования фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки в железосвязывающем белке;
+
c) обеспечения клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит; и
+
+
d1) инкубирования клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, в присутствии железосвязывающего белка, полученного на стадии b), до получения по меньшей мере частичной загрузки клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, комплексом железосвязывающего белка и фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки, полученного на стадии b); и/или
+
+
d2) инкубирования клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, в присутствии метки до получения по меньшей мере частичного связывания клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, с меткой.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки по первому аспекту или второму аспекту настоящего изобретения, или получаемой в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения, для применения в качестве лекарственного средства или для диагностики.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей выделенную систему направленной доставки по первому или второму аспекту настоящего изобретения, или получаемую в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемое вещество-носитель и/или подходящий(е) вспомогательное(ые) вещество(а).
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки по первому аспекту или второму аспекту настоящего изобретения, или получаемой в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения, для применения при предотвращении, лечении или диагностике заболевания, характеризующегося зонами гипоксии в пораженной ткани и/или областями окислительного стресса; опухолей, предпочтительно солидных опухолей и/или их метастазов, предпочтительно рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака толстой кишки или опухоли, характеризующейся наличием областей гипоксии, воспалительного заболевания, воспаленной ткани, предпочтительно воспаленных суставов или пораженных артритом суставов, воспаленных легких, воспаленного кишечника или других воспаленных тканей; лимфатических узлов, предпочтительно воспаленных лимфатических узлов, или других нефизиологических лимфатических узлов, которые развиваются во время заболевания, предпочтительно, но не только, во время инфекции, рака или аутоиммунного заболевания; или областей ишемии, в частности в ранах кожи, или после инфаркта органа (сердца) или ретинальной ишемии, или для профилактической или терапевтической вакцинации, в частности для предотвращения или лечения инфекционного заболевания или рака. Указанный аспект также включает антигены к физиологическим или нефизиологическим лимфатическим узлам для вакцинации индивидуума или индуцирования иммунной памяти.
Подробное описание предпочтительных вариантов реализации
Перед тем, как настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут изменяться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется только пунктами прилагаемой формулы изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в настоящем документе, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники.
Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Указанные элементы перечислены с конкретными вариантами реализации, тем не менее, следует понимать, что их можно комбинировать любым образом и в любом количестве для получения дополнительных вариантов реализации. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты реализации не ограничивают настоящее изобретение только явно описанными вариантами реализации. Следует понимать, что настоящее описание обосновывает и охватывает варианты реализации, которые объединяют явно описанные варианты реализации с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в указанной заявке раскрываются в описании настоящей заявки, если контекст не указывает на иное.
Несколько документов цитируются по всему тексту настоящей заявки. Содержание каждого из документов, процитированных в настоящем документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.п.), приведенные выше или ниже, включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Ничто в настоящем документе не должно рассматриваться как признание того, что такое раскрытие предвосхищало настоящее изобретение.
Определения
nd
Если не указано иное, для практической реализации настоящего изобретения применяют общепринятые способы из химии, биохимии и технологии рекомбинантных ДНК, которые объяснены в литературе из данной области (см., например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
Если контекст не требует иного, во всем объеме настоящей заявки и последующих пунктов формулы изобретения слово "содержит" и вариации, такие как "содержат" и "содержащий", подразумевают включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. Применяемые в настоящей заявке и в пунктах прилагаемой формулы изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не указывает на иное.
Термин "направленная доставка фармацевтически активного вещества" относится к доставке фармацевтически активного вещества пациенту, которая приводит к повышенной концентрации фармацевтически активного вещества в конкретной области тела по сравнению с другими областями тела указанного пациента. Предпочтительно относительные концентрации сравнивают для пораженной(ых) области(ей) тела и другими областями тела, имеющими аналогичный доступ к системе кровообращения. В предпочтительных вариантах реализации концентрация фармацевтически активного вещества в заданном количестве клеток или заданном объеме пробы для биопсии из пораженной области по меньшей мере на 10% превышает концентрацию в идентичном количестве клеток или объеме пробы для биопсии из не пораженной области после введения системы направленной доставки фармацевтически активного вещества согласно настоящему изобретению, предпочтительно через 2-24 ч. Более предпочтительно концентрация фармацевтически активного вещества в пораженной области тела пациента по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 250%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 450%, по меньшей мере на 500%, более предпочтительно по меньшей мере на 1000% превышает концентрацию в не пораженной области тела после введения системы направленной доставки фармацевтически активного вещества согласно настоящему изобретению, предпочтительно через 2-24 ч. При оценке на основе общего распределения в теле предпочтительно, чтобы по меньшей мере 5% фармацевтически активного вещества, вводимого пациенту, доставлялось в пораженную область тела, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 15%. Направленная доставка фармацевтически активного вещества ограничивает потенциальное вредное влияние фармацевтически активного вещества на пораженную область тела.
Термин "направленная доставка метки" или "направленная доставка контрастного агента" относится к доставке метки, в частности, контрастного агента, пациенту или индивидууму, подлежащему диагностированию, которая приводит к повышенной концентрации метки, в частности, контрастного агента, в конкретной области тела по сравнению с другими областями тела указанного пациента. Предпочтительно относительные концентрации сравнивают для пораженной(ых) области(ей) тела и другими областями тела, имеющими аналогичный доступ к системе кровообращения. В предпочтительных вариантах реализации концентрация метки, в частности, контрастного агента, в заданном количестве клеток или заданном объеме пробы для биопсии из пораженной области по меньшей мере на 10% превышает концентрацию в идентичном количестве клеток или объеме пробы для биопсии из не пораженной области после введения системы направленной доставки согласно настоящему изобретению, предпочтительно через 1-24 ч. Более предпочтительно концентрация метки, в частности, контрастного агента, в пораженной области тела пациента по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 250%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 450%, по меньшей мере на 500%, более предпочтительно по меньшей мере на 1000% превышает концентрацию в не пораженной области тела после введения системы направленной доставки согласно настоящему изобретению, предпочтительно через 2-24 ч. При оценке на основе общего распределения в теле предпочтительно, чтобы по меньшей мере 5% метки, в частности, контрастного агента, вводимого пациенту или индивидууму, подлежащему диагностированию, доставлялось в пораженную область тела, предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно по меньшей мере 15%. Направленная доставка метки, в частности, контрастного агента, ограничивает потенциальное вредное влияние метки, в частности, контрастного агента, на пораженную область тела.
Термин "направленная терагностическая доставка" имеет значение, аналогичное приведенному выше для "направленной доставки фармацевтически активного вещества" и "направленной доставки метки", тем не менее, вместо доставки только фармацевтически активного вещества или метки происходит доставка комплекса железосвязывающего белка, содержащего в указанном варианте реализации как фармацевтически активное вещество, так и метку, что позволяет одновременно доставлять фармацевтически активное вещество и метку.
Термин "система направленной доставки фармацевтически активного вещества" применяют в настоящей заявке для обозначения системы, которая способна доставлять фармацевтически активное вещество в целевую область, т.е. способна к направленной доставке в теле пациента, предпочтительно в пораженную область.
Термин "система направленной доставки метки" применяют в настоящей заявке для обозначения системы, которая способна доставлять метку в целевую область, т.е. способна к направленной доставке в теле пациента, предпочтительно в пораженную область.
Термин "система направленной терагностической доставки" применяют в настоящей заявке для обозначения системы, которая способна доставлять комплекс фармацевтически активного вещества и метки в целевую область, т.е. способна к направленной доставке в теле пациента, предпочтительно в пораженную область, и, таким образом, позволяет одновременно проводить лечение и диагностику и/или мониторинг лечения.
Термин "система направленной доставки" обычно применяют для обозначения терминов "система направленной доставки фармацевтически активного вещества", "система направленной доставки метки" и "система направленной терагностической доставки".
Термин "фармацевтически активное вещество" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения вещества, которое модифицирует или модулирует клеточную активность, предпочтительно клеточную активность, которая приводит к заболеванию у пациента. Термин охватывает как вещества, которые уже являются фармацевтически активными, так и вещества, которые можно активировать, т.е. пролекарства. Примеры таких фармацевтически активных веществ включают так называемые (i) "малые молекулы", (ii) полинуклеотиды и (iii) пептиды или белки. Термин "малая молекула" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения углеводорода с молекулярной массой менее 1500 г/моль или фармацевтически активных радиоактивных изотопов. Предпочтительные лекарственные средства, которые можно применять, включают противораковые лекарственные средства, фармацевтически активные радиоактивные изотопы или ферригидрит.
Термин "пролекарство", применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к любому активному ингредиенту, который после введения метаболизируется или иным образом превращается в биологически активный или более активный ингредиент (или лекарственное средство) в отношении по меньшей мере одного свойства. По сравнению с лекарственным средством пролекарство химически модифицировано таким образом, чтобы являться менее активным или неактивным по сравнению с лекарственным средством, но при этом химическая модификация является такой, что в результате метаболических или других биологических процессов после введения пролекарства пациенту образуется соответствующее лекарственное средство. По сравнению с лекарственным средством пролекарство может иметь, например, измененную метаболическую стабильность или транспортные характеристики, меньшее количество побочных эффектов или более низкую токсичность, или улучшенный вкус (см., например, ссылку Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392, включенную в настоящую заявку посредством ссылки). Пролекарство можно синтезировать с применением реагентов, отличных от соответствующего лекарственного средства.
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" применяют взаимозаменяемо и понимают как полимерную или олигомерную макромолекулу, полученную из нуклеотидных мономеров. Нуклеотидные мономеры состоят из нуклеотидного основания, пятиуглеродного сахара (таких как, но не ограничиваясь ими, рибоза или 2'-дезоксирибоза) и от одной до трех фосфатных групп. Как правило, полинуклеотид образуется через фосфодиэфирные связи между индивидуальными нуклеотидными мономерами. В контексте настоящего изобретения упомянутые молекулы нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваются ими, рибонуклеиновую кислоту (РНК), дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и их смеси, такие как, например, РНК/ДНК-гибриды. Например, нуклеиновые кислоты можно синтезировать химически, например, в соответствии с фосфотриэфирным способом (см., например, Uhlmann, Е. & Peyman, А. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584). "Аптамеры" представляют собой нуклеиновые кислоты, которые связываются с полипептидом с высокой аффинностью. Аптамеры можно выделять путем способов отбора, таких как SELEmir146-a (см., например, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981), из большого пула различных молекул одноцепочечных РНК. Аптамеры также можно синтезировать и выделять в виде их зеркальных форм, например, в виде L-рибонуклеотида (Nolte et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Формы, которые можно выделять таким образом, обладают тем преимуществом, что они не разлагаются встречающимися в природе рибонуклеазами и, следовательно, обладают большей стабильностью.
Термины "пептид" и "полипептид" в контексте настоящего изобретения применяют взаимозаменяемо для обозначения цепи из по меньшей мере двух аминокислот, соединенных пептидными связями. Таким образом, термин "пептид" в контексте настоящего изобретения также применяют для обозначения аминокислотных цепей, содержащих более 50, более 100 или более 150 аминокислот.
Термин "антитело", применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к гликопротеину, принадлежащему к суперсемейству иммуноглобулинов; термины "антитело" и "иммуноглобулин" часто применяют взаимозаменяемо. Антитело относится к белковой молекуле, продуцируемой плазматическими клетками, и используется иммунной системой для идентификации и нейтрализации инородных объектов, таких как бактерии и вирусы. Антитело распознает уникальную часть инородной мишени, ее антиген.
2
H
L
Термин "фрагмент антитела", применяемый в настоящем документе, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "фрагмент антитела" включают антигенсвязывающий фрагмент (Fab), фрагмент Fab', фрагмент F(ab'), антитело с тяжелыми цепями, однодоменное антитело (sdAb), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), вариабельный фрагмент (Fv), домен V, домен V, однодоменное антитело, нанотело, IgNAR (новый иммуноглобулиновый антигенный рецептор), ди-scFv, привлекающий Т-клетки биспецифичный активатор (BITE), молекулу переориентирующегося антитела с двойной аффинностью (DART), тройное тело, диатело, одноцепочечное диатело, альтернативный каркасный белок и их гибридные белки.
H
L
H
L
L
H
Термин "диатело", применяемый в настоящем описании, относится к гибридному белку или бивалентному антителу, которое может связывать различные антигены. Диатело состоит из двух отдельных белковых цепей, которые содержат фрагменты антитела, а именно вариабельные фрагменты. Диатела содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V) в той же полипептидной цепи (V-V или V-V). При использовании короткого пептида, соединяющего два вариабельных домена, домены вынуждены образовывать пары с комплементарным доменом другой цепи и, таким образом, образовывать два антигенсвязывающих сайта. Диатела могут направленно действовать на одни и те же (моноспецифичные) или разные антигены (биспецифичные).
Термин "однодоменное антитело" относится к фрагментам антитела, состоящим из одного мономерного вариабельного домена антитела. Т.е. они содержат только мономерные вариабельные области тяжелой цепи антител с тяжелыми цепями, продуцируемых верблюдами или хрящевыми рыбами. Из-за их различного происхождения они также относятся к фрагментам VHH или VNAR (новый вариабельный антигенный рецептор). В качестве альтернативы, однодоменные антитела можно получать мономеризацией вариабельных доменов обычных антител мыши или человека с применением генной инженерии. Они демонстрируют молекулярную массу приблизительно 12-15 кДа и, таким образом, являются наименьшими фрагментами антител, способными распознавать антигены. Дополнительные примеры включают нанотела или наноантитела.
ый
Термин "миметик антитела", применяемый в контексте настоящего описания, относится к соединениям, которые могут специфично связывать антигены, подобно антителу, но структурно не относящиеся к антителам. Обычно миметики антител представляют собой искусственные пептиды или белки с молярной массой приблизительно от 3 до 20 кДа, которые содержат один, два или более экспонированных доменов, специфично связывающихся с антигеном. Примеры включают, помимо прочих, ЛАКИ-D1 (липопротеин-ассоциированный коагуляционный ингибитор); аффилины, например, γ-В кристаллин человека или убиквитин человека; цистатин; Sac7D, полученный из Sulfolobus acidocaldarius; липокалин и антикалины, полученные из липокалинов; DARPins (сконструированные домены с анкириновым повтором); домен SH3 Fyn; домен Куница ингибиторов протеаз; монотела, например, 10 домен фибронектина III типа; аднектины: ноттины (минипротеины цистинового узла); атримеры; эвитела, например, связующие на основе CTLA4, аффитела, например, трехспиральный пучок из Z-домена белка А, полученного из Staphylococcus aureus; транстела, например, трансферрин человека; тетранектины, например, мономерный или тримерный домен лектина С-типа человека; микротела, например, ингибитор II трипсина; аффилины; белки с armadillo-повторами. Нуклеиновые кислоты и малые молекулы иногда также рассматривают в качестве миметиков антител (аптамеров), но не рассматривают искусственные антитела, фрагменты антител и гибридные белки, составленные из них. Характерными преимуществами по сравнению с антителами являются лучшая растворимость, лучшее проникновение в ткани, устойчивость к воздействию тепла и ферментов и сравнительно низкие издержки производства.
Термин "антиген" применяют для обозначения вещества, предпочтительно иммуногенного пептида, который содержит по меньшей мере один эпитоп, предпочтительно эпитоп, который вызывает ответ В- или Т-клеток или ответ В-клеток и Т-клеток.
"Эпитоп", также известный как антигенная детерминанта, представляет собой ту часть вещества, например, иммуногенного полипептида, которая распознается иммунной системой. Предпочтительно указанное распознавание опосредуется связыванием антител, В-клеток или Т-клеток с рассматриваемым эпитопом. В указанном контексте термин "связывание" предпочтительно относится к специфичному связыванию. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахара, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Термин "эпитоп" включат как конформационные, так и неконформационные эпитопы. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, нарушается в присутствии денатурирующих растворителей.
В предпочтительных вариантах реализации иммуногенный полипептид в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получают из патогена, выбранного из группы, состоящей из вирусов, бактерий и простейших. Тем не менее, в альтернативном варианте реализации настоящего изобретения иммуногенный полипептид представляет собой опухолевый антиген, т.е. полипептид или фрагмент полипептида, специфично экспрессируемый раком.
Термин "идентичность последовательностей" применяют во всем объеме настоящего описания при сравнении полипептидных и нуклеотидных последовательностей. При сравнении двух последовательностей, если не указана эталонная последовательность, в сравнении с которой рассчитывают процент идентичности последовательностей, идентичность последовательностей следует рассчитывать со ссылкой на более длинную из двух последовательностей, подлежащих сравнению, если конкретно не указано иное. Если эталонная последовательность указана, идентичность последовательностей определяют на основе полной длины эталонной последовательности, обозначенной SEQ ID, если конкретно не указано иное. Например, при сравнении полипептидной последовательности, состоящей из 200 аминокислот, с эталонной полипептидной последовательностью длиной 300 аминокислот максимальный процент идентичности последовательностей может составлять 66,6% (200/300), тогда как для последовательности длиной 150 аминокислот максимальный процент идентичности последовательностей может составлять 50% (150/300). Если 15 из указанных 150 аминокислот отличаются от соответствующих аминокислот эталонной последовательности длиной 300 аминокислот, уровень идентичности последовательностей снижается до 45%. Сходство нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, т.е. процент идентичности последовательностей, можно определять при помощи выравнивания последовательностей. Такие выравнивания можно проводить при помощи нескольких алгоритмов, известных в данной области техники, предпочтительно при помощи математического алгоритма Карлина и Альтшуля (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), при помощи hmmalign (пакет HMMER, http://hmmer.wustl.edu/) или при помощи алгоритма CLUSTAL (Thompson, J.D., Higgins, D.G. & Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), доступного, например, по адресу http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/, или по адресу http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html, или по адресу http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html. Предпочтительными применяемыми параметрами являются параметры по умолчанию, поскольку они установлены согласно http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ или http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html. Степень идентичности последовательностей (совпадение последовательностей) можно рассчитывать с применением, например, BLAST, BLAT или BlastZ (или BlastX). Поиск белков с применением BLAST осуществляют при помощи программы BLASTP, вес выравнивания = 50, длина слова = 3. Для получения gapped-выравнивания для целей сравнения применяют Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST примеряют параметры по умолчанию для соответствующих программ. Анализ совпадения последовательностей можно дополнять установленными техниками картирования гомологов, такими как Shuffle-LAGAN (Brudno М., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:I54-I62), или с применением марковских случайных полей. Также можно применять структурные выравнивания для множественных последовательностей белков и/или структур с применением информации, полученной по результатам поиска в базах данных последовательностей, доступных гомологов с трехмерными структурами и определяемых пользователем ограничений (Pei J, Grishin NV: PROMALS: towards accurate multiple sequence alignments of distantly related proteins. Bioinformatics 2007, 23: 802-808; 3DCoffee@igs: веб-сервер для комбинирования последовательностей и структур при множественном выравнивании последовательностей. Poirot О, Suhre K, Abergel С, , Notredame С. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1; 32: W37-40). При упоминании в настоящей заявке процентов идентичности последовательностей указанные проценты рассчитывают относительно полной длины более длинной последовательности, если конкретно не указано иное.
65
18
51
67
68
111
99m
140
175
153
166
88
89
90
149
177
47
142
159
212
72
72
97
109
105
101m15
119
128
123
124
131
197
211
169
203
212
64
67
188
186
198
199
18
18
89
64
65
Термин "метка", применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к любому виду соединения, подходящего для диагностических целей. Предпочтительные соединения выбирают из флуоресцентного красителя, радиоизотопа и контрастного агента. Контрастный агент представляет собой краситель или другое вещество, которое помогает визуализировать аномальные области внутри тела. В одном из вариантов реализации термин "метка" относится к соединению, которое содержит хелатирующий агент, который образует комплекс с катионами двухвалентного или трехвалентного металла. Предпочтительные радиоизотопы/изотопы, испускающие флуоресценцию, выбирают из группы, состоящей из изотопов, испускающих альфа-излучение, изотопов, испускающих гамма-излучение, изотопов, испускающих Оже-электроны, изотопов, испускающих рентгеновское излучение, флуоресцентных изотопов, таких как Tb, изотопов, испускающих флуоресценцию, таких как F, Cr, Ga, Ga, In, Tc, La, Yb, Sm, Ho, Y, Zr, Y, Pm, Lu, Sc, Pr, Gd, Bi, As, Se, Ru, Pd, Rh, Rh, Sb, Ba, I, I, I, Hg, At, Eu, Pb, Pb, Cu, Cu, Re, Re, Au и Ag, а также конъюгатов, соединений, содержащих такие изотопы, и комбинаций указанных выше изотопов с белками, пептидами, низкомолекулярными ингибиторами, антителами или другими соединениями, например, F-фтордезоксиглюкоза (F-ФДГ), Zr-оксид или Cu-порфирин. Предпочтительные флуоресцентные красители выбирают из следующих классов красителей: ксантены (например, флуоресцеин), акридины (например, акридин желтый), оксазины (например, оксазин 1), цинины (например, Су7/Су3), стириловые красители (например, Dye-28), кумарины (например, Alexa Fluor 350), порфины (например, хлорофилл В), комплексы металл-лиганд (например, PtOEPK), флуоресцентные белки (например, АРС, R-фикоэритрин), нанокристаллы (например, QuantumDot 705), перилены (например, люмоген красный F300) и фталоцианины (например, IRDYE™700DX), а также из конъюгатов и комбинаций указанных классов красителей или излучающих флуоресцентный Tb. Предпочтительные контрастные агенты выбирают из парамагнитных агентов, например, Gd, Eu, W и Mn, предпочтительно в комплексе с хелатирующим агентом. Другими вариантами являются суперпарамагнитные комплексы и частицы железа (Fe), соединения, содержащие атомы с высоким атомным числом, т.е. йод, для компьютерной томографии (КТ), микропузырьки и носители, такие как липосомы, которые содержат указанные контрастные агенты.
Термин "лейкоцит" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения клеток иммунной системы, которые участвуют в защите организма как от инфекционного заболевания, так и от инородных агентов. Все лейкоциты образуются в костном мозге и происходят из мультипотентных клеток, известных как гемопоэтические стволовые клетки. Лейкоциты обнаруживают во всем теле, включая кровеносную и лимфатическую системы. Все лейкоциты имеют ядра, которые отличают их от других клеток крови, безъядерных красных кровяных телец (ККТ) и тромбоцитов. Лейкоциты можно классифицировать по типам при помощи обычных способов. Две пары наиболее крупных категорий основаны на классификации по структуре (гранулоциты или агранулоциты) или по линии клеточного деления (миелоидные клетки или лимфоидные клетки). Указанные наиболее крупные категории можно дополнительно разделять на пять основных типов: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, лимфоциты и моноциты. Указанные типы отличаются по своим физическим и функциональным характеристикам. Моноциты и нейтрофилы являются фагоцитарными. Можно классифицировать дополнительные подтипы; например, среди лимфоцитов имеются В-клетки, Т-клетки и NK-клетки. Гранулоциты отличаются от агранулоцитов по форме ядра (дольчатая в сравнении с круглой, т.е. полиморфноядерные в сравнении с моноядерными) и по гранулам цитоплазмы (присутствующим или отсутствующим, более точно, видимым в световой микроскоп или не видимым таким образом). Другая дихотомия основана на линии дифференциации: миелоидные клетки (нейтрофилы, моноциты, эозинофилы и базофилы) отличаются от лимфоидных клеток (лимфоцитов) гемопоэтической линией дифференциации (линией дифференциации клеток).
+
+
+
+
Авторы настоящего изобретения наблюдали, что экспрессия CD45 характерна для подгруппы клеток лейкоцитов, т.е. моноцитов, моноцитов-макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов, NK-клеток, которые подходят для применения в контексте системы направленной доставки согласно настоящему изобретению, в частности, поскольку клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, притягиваются к определенным тканям и клеткам в теле, и способны доставлять комплексы одного или более железосвязывающих белков и одного или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток к клеткам или в них. Указанную подгруппу лейкоцитов в дальнейшем называют "клетками, представляющими собой CD45 лейкоцит" или "CD45 лейкоцитами". Предпочтительно моноцит не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IFN-регуляторный фактор 8 (IRF8), ядерный фактор, регулирующий белок интерлейкин (IL)-3 (NFIL3), основной фактор транскрипции лейциновой молнии, ATF-подобный 3 (BATF3) или фактор транскрипции RelB (субъединица NF-KB) - RELB, Spi-1 протоонкоген (PU/1), рекомбинантный связывающий белковый супрессор безволосых (RBPJ), IFN-регуляторный фактор 4 (IRF4) или фактор транскрипции Е2-2 (также известный как (TCF4)).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Специалисту будет понятно, что клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, как определено выше, за исключением случаев клонального происхождения, представляют собой смешанную популяцию различных лейкоцитов, которые обладают общим свойством экспрессии поверхностного антигена CD45. Соответственно, субпопуляции клеток в разнообразной группе клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты, как определено выше, характеризуют во всем объеме настоящего описания по дополнительным функциональным и/или структурным характеристикам. Термин "CD45" указывает, что большинство клеток в популяции клеток или по существу все клетки экспрессируют поверхностный антиген CD45. В указанном контексте, а также со ссылкой на другие клеточные поверхностные антигены, термин "экспрессирует" указывает на то, что поверхностный антиген продуцируется в клетке и экспонируется на поверхности клетки с возможностью обнаружения. Уровень экспрессии и, таким образом, количество поверхностных антигенов, экспонированных на поверхности клетки с возможностью обнаружения, может сильно варьироваться для разных лейкоцитов. В целом, клетку считают положительной, т.е. ее обозначают, как "", для клеточного поверхностного антигена, если по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10 копий поверхностного антигена экспонируются на поверхности клетки с возможностью обнаружения. Специалисту хорошо известно, как обнаруживать, количественно определять и производить отбор клеток, которые являются положительными (или отрицательными) для данного клеточного поверхностного антигена. Предпочтительные способы включают сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS). В указанной технологии антитела с флуоресцентной меткой применяют для связывания с клеточными поверхностными антигенами популяции клеток, причем указанные клетки затем выделяют в отдельные клетки и на основе интенсивности флуоресценции, измеренной для отдельной клетки, характеризуют, как положительные или отрицательные для данного клеточного поверхностного антигена. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указывается, что экспрессия данного белка является высокой или низкой. Это означает, что белок экспрессируется с возможностью обнаружения в обоих случаях, т.е. обозначается, как "", но на разных уровнях. Высокая и низкая экспрессии, соответственно, означают разные абсолютные количества белков на клетку для разных белков. Таким образом, можно считать, что данный белок экспрессируется на высоких уровнях, если имеется более 500 обнаруживаемых копий указанного белка на клетку, и экспрессируется на низких уровнях, если имеется от 1 до 50 обнаруживаемых копий указанного белка на клетку. Тем не менее можно считать, что другой белок экспрессируется на высоких уровнях, если имеется более 5000 обнаруживаемых копий, и экспрессируется на низких уровнях, если имеется от 1 до 500 обнаруживаемых копий на клетку. В данной области техники хорошо известно, как можно определять количество белков, экспрессируемых или продуцируемых в клетке, с применением проточной цитометрии и способа с применением калибровочных частиц Becton Dickinson Quantibrite™ (см., например, Pannu, K.K., 2001, Cytometry. 2001 Dec 1; 45(4): 250-8) или масс-спектрометрии (см., например, Milo, R., 2013, Bioessays, 35(12): 1050-1055). Для целей настоящего изобретения термин "высокая экспрессия" данного белка относится к обнаруживаемой экспрессии указанного белка, которая составляет по меньшей мере 70% от самого высокого обнаруженного уровня экспрессии, т.е. числа копий на клетку, в популяции здоровых CD45 лейкоцитов. Термин "низка экспрессия" данного белка относится к обнаруживаемой экспрессии указанного белка, которая 30% или менее от самого высокого обнаруженного уровня экспрессии, т.е. числа копий указанного белка на клетку, в популяции здоровых CD45 лейкоцитов. Предпочтительно "самый высокий уровень экспрессии" определяют, как среднее значение самых высоких уровней экспрессии, обнаруженных в здоровых CD45 лейкоцитах у разных субъектов. В некоторых вариантах реализации предпочтительные субпопуляции клеток характеризуются, как "продуцирующие" данный белок. Под этим понимают, что белок не обязательно обнаруживается на поверхности клетки, и он может присутствовать только внутри клетки. Специалисту понятно, как обнаруживать и/или количественно определять образование белка внутри клетки и/или выбирать клетки, продуцирующие такие белки. В качестве альтернативы, клеточные популяции можно определять по экспрессии специфичных факторов транскрипции. В данной области техники хорошо известно, как определять экспрессию данного белка или его кодирующей мРНК в популяции клеток или даже в отдельных клетках, например, с применением мечения антителами in vivo, анализов FISH, флуоресцентной микроскопии одиночных молекул in vivo (Crawford, R. et al. Biophys J. (2013) 105(11): 2439), отдельно или в комбинации с сортировкой клеток с активированной флуоресценцией (FACS), или при помощи метода PrimeFlow (eBioscience) (Adam S. Venable, et al., (2015) Methods in Molecular Biology).
+
-
+
+
+
-
++
++
+
+
++
Термин "дифференцированный моноцит" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения моноцита, дифференцированного от коммитированного предшественника, обозначаемого как предшественник макрофагов-ДК (MDP), который в основном содержится в костном мозге (но может также присутствовать в селезенке), и дифференцирующегося в дендритные клетки или макрофаги. У мышей они состоят из двух основных субпопуляций: (i) CD11b клетка с высокой экспрессией CX3CR1, низкой экспрессией CCR2 и Ly6C, и (ii) CD11b клетка с низкой экспрессией CX3CR1, высокой экспрессией CCR2 и Ly6C. После выхода из костного мозга Ly6C моноциты мыши дифференцируются в кровотоке в Ly6C моноциты. Аналогично, при дифференцировании моноцитов человека полагают, что классические CD14 моноциты выходят из костного мозга и дифференцируются в промежуточные CD14CD16 моноциты, а затем в неклассические CD14CD16 моноциты в периферическом кровотоке (Yang et al. 2014; Biomark Res 2(1) doi. 10.1186/2050-7771-2-1). Предпочтительно дифференцированный моноцит не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IRF8, NFIL3, BATF3, RELB, PU/1, RBPJ, IIRF4 и/или TCF4, и более предпочтительно не является дендритной клеткой.
Макрофаги представляют собой резидентные тканевые профессиональные фагоциты и антигенпрезентирующие клетки (АРС), которые отличаются от циркулирующих моноцитов периферической крови (РВМ). Термин "активированный макрофаг" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения любого поляризованного макрофага. Активацию макрофагов обычно достигают путем инкубирования с интерлейкинами, цитокинами и/или факторами роста. В частности, в качестве активирующих агентов можно применять IL-4 и М-КСФ. Активированные макрофаги разных фенотипов классифицируют на M1-макрофаги, классически активированные макрофаги (САМ) и М2-макрофаги, альтернативно активированные макрофаги (ААМ). Классически активированные M1-макрофаги включают иммунные эффекторные клетки с острым воспалительным фенотипом. Они очень агрессивны в отношении бактерий и продуцируют большое количество лимфокинов (Murray, and Wynn, 2011, J Leukoc Biol, 89(4): 557-63). Альтернативно активированные, противовоспалительные М2-макрофаги можно разделить по меньшей мере на три подгруппы. Указанные подтипы обладают множеством различных функций, включая регуляцию иммунитета, поддержание толерантности и восстановление тканей/заживление ран. Термин "M1-индуктор" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения соединения, которое управляет дифференцированием РВМ в макрофаги типа M1. Термин "М2-индуктор" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения соединения, которое управляет дифференцированием РВМ в макрофаги типа М2. Специалисту известно большое количество способов стимулирования дифференцирования в M1- или М2-макрофаги.
Термин "фагоцитоз макрофагами" представляет собой процесс, посредством которого макрофаг поглощает твердую частицу с образованием внутренней везикулы, известной, как фагосома.
Термин "железосвязывающий белок" применяют для обозначения белка, который нековалентно связывает ион железа. Примеры таких белков включают ферритин, гемоглобин, трансферрин и лактоферрин. Железосвязывающие белки связываются рецепторами клеточной поверхности, которые облегчают интернализацию указанных белков в клетки.
+
+
+
+
+
+
+
В первом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки, содержащей CD45 моноцит, CD45 моноцит-макрофаг, CD45 лимфоцит, CD45 NK-клетку и/или CD45 гранулоцит (далее называемый "клеткой, представляющей собой CD45 лейкоцит"), содержащей в указанной клетке комплекс одного или более железосвязывающих белков и фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки. Предпочтительно CD45 моноцит не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IRF8, NFIL3, BATF3, RELB, PU/1, RBPJ, IIRF4 и/или TCF4, и более предпочтительно не является дендритной клеткой.
+
18
18
89
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, предпочтительно активированные макрофаги, предпочтительно M1-макрофаги, более предпочтительно М2-макрофаги захватывают фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки и доставляют фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки в количестве, достаточном (i) для обнаружения с применением систем визуализации, позволяющих применять их для отслеживания их местоположения в теле. В случае F-ФДГ это особенно предпочтительно для моноцитов и активированных моноцитов, макрофагов, активированных макрофагов, предпочтительно M1-макрофагов и наиболее предпочтительно М2-макрофагов. Введение клеток, нагруженных меткой (F-ФДГ, Zr-оксид), предпочтительно радиоактивной меткой, можно визуализировать орган с накоплением меченых клеток, предпочтительно путем позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), (ii) для проявления профилактического или терапевтического эффекта или одновременного проведения терапии и диагностики заболевания.
+
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки метки, содержащей клетку, представляющую собой CD45 лейкоцит, предпочтительно способную нести одну или более меток, предпочтительно радиоактивных меток, или их конъюгатов и комбинаций. В предпочтительном варианте реализации второго аспекта настоящего изобретения клетка непосредственно связана с меткой или помечена меткой. Метка может находиться в указанной клетке или на ее поверхности, предпочтительно она находится на поверхности клетки.
Следующие предпочтительные варианты реализации в каждом случае дополнительно определяют как первый, так и второй аспекты настоящего изобретения.
+
+
+
Способность данной клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, или популяции клеток интернализировать железосвязывающие белки зависит от экспрессии рецепторов, участвующих в указанном процессе интернализации. Рецепторы, которые приводят к интернализации ферритина, включают, например, TfR, CXCR4, CD163 и TIM-2. Специалисту хорошо известно, как количественно измерять поглощение железосвязывающего белка, и предпочтительный способ измерения поглощения описан ниже в разделе "примеры". Авторы настоящего изобретения также отметили, что субпопуляции клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты, обладают определенной склонностью к интернализации одного железосвязывающего белка по сравнению с другим железосвязывающим белком и, таким образом, могут обеспечивать более высокие концентрации комплекса и/или демонстрировать меньшую утечку комплекса из клеток. Такие субпопуляции CD45 лейкоцитов более подробно описаны ниже.
2
+
Фраза "комплекс одного или более железосвязывающих белков и фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки", применяемая в контексте настоящего изобретения, относится к композиции, в которой одна или более молекул фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки ковалентно или нековалентно связаны с одним или более железосвязывающими белками. Ковалентное или нековалентное связывание между одним или более железосвязывающими белками и одним или более фармацевтически активными веществами, метками или фармацевтически активными веществами и метками может являться прямым или непрямым. В последнем случае фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка связаны с железосвязывающим белком через линкер или спейсер. Специалисту известны линкеры или спейсеры, такие как полиаланин, полиглицин, углеводы, группы (СН)n или полипептидные линкеры. Таким образом, специалист способен выбрать соответствующий(е) подходящий(е) линкер(ы) или спейсер(ы) в зависимости от соответствующего применения. Если железосвязывающие белки образуют кейдж-структуры, наподобие, например, ферритина, то термин "комплекс" также охватывает включения фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток в кейдж-структурах, даже при отсутствии ковалентной или нековалентной связи между белком(ами) и активным(и) соединением(ями). Образование комплекса позволяет переносить фармацевтически активное вещество, метку или фармацевтически активное вещество и метку в клетку, когда клетка интернализирует железосвязывающий белок. Таким образом, предпочтительно, чтобы фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки связывались с железосвязывающим белком таким образом, чтобы не препятствовать механизму переноса. Специалист легко может исследовать это с применением анализов поглощения, известных в данной области техники и описанных ниже в разделе "примеры". Предпочтительно, чтобы комплекс являлся достаточно стабильным для сохранения в процессе переноса в клетке до целевой области в теле. Таким образом, предпочтительно, чтобы комплекс, а не только фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка, доставлялся к клеткам или в клетки в целевой области. Указанное свойство также снижает возможные нежелательные эффекты, например, цитотоксичность фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки в отношении клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит. Если фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки ковалентно связаны с железосвязывающими белками, такое связывание предпочтительно осуществляется через аминокислотные остатки, которые, как известно, расположены в поверхностных областях, которые не участвуют в связывании с клеточными рецепторами, необходимыми для клеточного поглощения железосвязывающих белков. Железосвязывающие белки, применяемые в контексте настоящего изобретения, могут образовывать стабильные нековалентно связанные комплексы с широким спектром активных фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток. Если фармацевтически активное вещество или метка представляет собой пептид, например, антигенный пептид, предпочтительно, чтобы он не экспрессировался в виде гибрида с железосвязывающим белком, поскольку в указанном случае для освобождения пептида от железосвязывающего белка потребуется эндосомальная обработка всего гибридного белка на основе железосвязывающего белка и пептида.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, получают от пациента, который подлежит лечению, в таком случае клетка, нагруженная комплексом, будет аутологичной для пациента. Также предполагают, что пациентов распределяют по типам ГКГС перед лечением с применением направленной доставки согласно настоящему изобретению, и что тип клеток лейкоцитов, применяемый для данного пациента, совместим с ГКГС пациента. В двух указанных предпочтительных вариантах реализации клетка, представляющая собой CD45 лейкоцит, представляет собой первичную клетку, или ее получают из первичной клетки, прошедшей небольшое количество стадий дифференцирования. В качестве альтернативы, клетку, представляющую собой CD45 лейкоцит, можно получать из иммортализованной, но предпочтительно нетрансформированной линии клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты. Таким образом, кровь, применяемую для выделения клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты, т.е. CD45 моноцита, CD45 моноцит-макрофага, CD45 гранулоцита или CD45 лимфоцита, в частности, CD45 NK-клетки, предпочтительно получают от пациента, подлежащего лечению, или от здорового донора. В качестве альтернативы, кровь можно получать из банка крови. В настоящем документе также рассматривается применение пуповинной крови.
+
+
+
+
Авторы настоящего изобретения отметили, что субпопуляция клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты, которые можно получить из CD34 гемопоэтической клетки-предшественника, является особенно подходящей для специфичной направленной доставки фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки. Соответственно, предпочтительно, чтобы лейкоциты, применяемые для получения системы направленной доставки, получали из CD34 гемопоэтических клеток-предшественников. Специалисту хорошо известно, как выбирать CD34 гемопоэтические клетки-предшественники и как проводить дифференциацию указанных клеток в лейкоциты.
+
+
+
+
+
Как указано выше, термин "клетка, представляющая собой CD45 лейкоцит" применяют во всем объеме настоящего описания для обозначения CD45 моноцита, CD45 моноцит-макрофага, CD45 лимфоцита и/или CD45. Предпочтительно моноцит не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IRF8, NFIL3, BATF3, RELB, PU/1, RBPJ, IIRF4 и/или TCF4, и более предпочтительно не является дендритной клеткой. Предпочтительные субпопуляции в указанных общих категориях лейкоцитов далее определяют по структурным параметрам, например, наличие или отсутствие данного белка, функциональным свойствам и/или способу их образования/дифференцирования. Как указано выше, система направленной доставки согласно настоящему изобретению все еще обеспечивает описанные выше преимущества, если в популяции клеток не каждая клетка обладает конкретным свойством при условии, что большинство клеток в указанной популяции обладают указанным свойством. Таким образом, далее описано свойство одной из предпочтительных клеток системы направленной доставки согласно настоящему изобретению. Специалисту понятно, что фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит миллионы клеток, и что не каждая клетка в популяции имеет функциональные и/или структурные свойства, описанные в настоящем документе, но при этом фармацевтическую композицию, тем не менее, можно применять для лечения заболевания, если большинство клеток обладают соответствующими функциональными и/или структурными свойствами.
+
+
+
Авторы настоящего изобретения установили, что субпопуляции клеток, представляющих собой CD45 лейкоциты, обладают особенно предпочтительными свойствами, включая, помимо прочего, эффективность поглощения и/или количество поглощенного комплекса, в целом, способность удерживать комплекс в клетке, т.е. избегать утечки и нецелевого высвобождения фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки, эффективность поглощения конкретного железосвязывающего белка и/или направленной доставки к конкретным тканям или клеткам и, таким образом, применимость для лечения или облегчения конкретного заболевания. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что, например, клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, которые экспрессируют один или более из следующих антигенов: CD204, CD206, CD200R, CCR2, предпочтительно поглощают ферритин по сравнению с поглощением других железосвязывающих белков. Таким образом, если железосвязывающий белок в комплексе представляет собой ферритин, предпочтительно выбирать клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, которые экспрессируют один или более из следующих антигенов: CD204, CD206, CD200R, CCR2. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения:
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(i) моноцит представляет собой CD11b моноцит, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из CD11b CD14 моноцита, CD11b CD16 моноцита, CD11b CD14 CD16 моноцита, CD11b CD14 MHCII моноцита, CD11b CD14 CD115 моноцита, CD11b CD114 моноцита, CD11b CD116 моноцита, CD11b CCR1 моноцита, CD11b CCR2 моноцита, CD11b CX3CR моноцита, CD11b CXR4 моноцита, CD11b CXR6 моноцита и CD11b CD14 CD33 моноцита, предпочтительно моноцит не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IRF8, NFIL3, BATF3, RELB, PU/1, RBPJ, IIRF4 и/или TCF4, и более предпочтительно не является дендритной клеткой;
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(ii) дифференцированный моноцит или моноцит-макрофаг дифференцируется посредством М-КСФ и выбран из группы, состоящей из макрофага, активированного макрофага, предпочтительно CD11b макрофага, более предпочтительно CD11b CD16 макрофага, CD11b CD32 макрофага, CD11b CD64 макрофага, CD11b CD68 макрофага, предпочтительно CD11b CD86 M1-макрофага, предпочтительно продуцирующего индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS) и/или секретирующего интерлейкин 12 (IL-12), или предпочтительно CD11b CCR2 М2-макрофага, CD11b CD204 М2-макрофага, CD11b CD206 М2-макрофага, CD11b CD204 CD206 М2-макрофага, CD11b М2-макрофага (с низкой или высокой экспрессией) главного комплекса гистосовместимости II типа (MHCII), CD11b CD200R М2-макрофага, CD11b CD163 М2-макрофага или активированного макрофага, продуцирующего и/или секретирующего аргиназу-1 и/или интерлейкин 10 (IL-10); предпочтительно дифференцированный моноцит не является ксантомной клеткой, экспрессирующей лектин-подобный рецептор 1 окисленного липопротеина низкой плотности (Lox1), рецептор С-Х-С-хемокинов 7 типа (CXCR7) и ядерный фактор 2, подобный эритроидному деривату-2 (NRF2). Ксантомная клетка представляет собой тип макрофаг, который локализуется в жировых отложениях на стенках кровеносных сосудов, где они поглощают липопротеины низкой плотности и нагружаются липидами, что придает им пенистый вид. Указанные клетки секретируют различные вещества, участвующие в росте бляшек, и их гибель провоцирует воспаление, тем самым, способствуя сердечно-сосудистым заболеваниям;
(iii) моноцит-макрофаг или активированный моноцит-макрофаг дифференцируется посредством М-КСФ и предпочтительно экспрессирует по меньшей мере один рецептор хемокинов, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из CCR1, CCR2, CXCR4 и CXCR6, или по меньшей мере один рецептор фактора роста, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из рецептора макрофагального колониестимулирующего фактора (CD115), рецептора гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (CD114) и рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (состоящего из CD116 и CD131); моноциты с указанными характеристиками являются особенно подходящими для лечения воспалительных состояний и рака;
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
(iv) лимфоцит выбран из группы, состоящей из CD3 и CD4 или CD8 Т-лимфоцита; или CD19, CD20, CD21, CD19 CD20, CD19 CD21, CD20 CD21 или CD19 CD20 CD21 В-лимфоцита; или натуральной клетки-киллера (NK), предпочтительно NK-клетка выбрана из группы, состоящей из CD56 и без экспрессии CD3, или CD16CD56, CD56CD94, CD56CD158a, CD56CD158f, CD56CD314, CD56CD335 клетки; или
+
+
(v) гранулоцит выбран из группы, состоящей из нейтрофила, предпочтительно CD66b нейтрофила, эозинофила и базофила, предпочтительно CD193 эозинофила.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению активированный макрофаг:
(i) можно продуцировать путем инкубирования in vitro моноцита, или макрофага, или их предшественников с фактором, который способен изменять маркеры экспрессии на поверхности макрофагов, предпочтительно
(a) с по меньшей мере одним M1-индуктором,
(b) с по меньшей мере одним М2-индуктором,
(c) или с фактором, который способен изменять способность макрофагов секретировать цитокины, предпочтительно IL-10 и IL-12, хемокины и/или продуцировать iNOS, аргиназу или другие иммуномодулирующие ферменты; примеры таких факторов представляют собой: активированные тромбоциты, IL-4, IL-10, IL-13, иммунный комплекс антигена и антитела, IgG, термически активируемый гамма-глобулин, глюкокортикостероид, фактор роста опухоли-β (ФРО-β), IL-1R, лиганд СС-хемокина 2 (CCL-2), IL-6, макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-КСФ), агонист рецептора γ, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), фактор ингибирования лейкоцитов (ФИЛ), аденозин, гельминтную и грибковую инфекции, липополисахарид (ЛПС), интерферон-γ (IFN-γ), вирусную и бактериальную инфекции; в этом отношении было отмечено, что активация моноцита M1-индуктором, в частности, ЛПС, вызывает в клетке экспрессию iNOS, что активация моноцита M1-индуктором, в частности, ЛПС, не вызывает в клетке экспрессию аргиназы-1, что активация моноцита М2-индуктором, в частности, IL-4, вызывает в клетке экспрессию аргиназы-1, и что активация моноцита М2-индуктором, в частности, IL-4, не вызывает в клетке экспрессию iNOS,
(ii) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих антигенов: CD64, CD86, CD16, CD32, высокой экспрессией MHCII и/или продуцированием iNOS и/или IL-12;
(iii) можно продуцировать путем инкубирования in vitro моноцита или макрофага с фактором, который способен индуцировать способность макрофага к фагоцитозу, например, IL-18, опсонинами (например, полученными из комплемента белками, такими как iC3b, иммуноглобулин G), пептидом, связанным с геном кальцитонина (CGRP), липополисахаридом (ЛПС), интерфероном-γ (IFN-γ), вирусной инфекцией и/или бактериальной инфекцией;
(iv) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих антигенов: CD204, CD206, CD200R; CCR2, рецептор трансферрина (TfR), рецептор 4 СХС-мотива хемокинов (CXCR4), CD163 и/или домен Т-клеточного иммуноглобулина и домен муцина 2 (TIM-2), и/или демонстрирует низкую экспрессию MHCII; активированные макрофаги, обладающие указанными свойствами, являются особенно подходящими для комплексов, содержащих ферритин в качестве железосвязывающего белка;
(v) обладает способностью к фагоцитозу; и/или
(vi) способен секретировать цитокины, предпочтительно IL-12 или IL-10, или продуцировать индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS) (или другие провоспалительные соединения), аргиназу или другие иммуносупрессивные/противовоспалительные соединения.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению M1-индуктор для дифференцирования макрофагов в M1-макрофаги выбран из группы, состоящей из липополисахарида (ЛПС), интерферона-γ (IFN-γ) и вирусной и бактериальной инфекций, и М2-индуктор для дифференцирования макрофагов в М2-макрофаги выбран из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, иммунного комплекса антигена и антитела, IgG, термически активируемого гамма-глобулина, глюкокортикостероида, фактора роста опухоли-β (ФРО-β), IL-1R, лиганда СС-хемокина 2 (CCL-2), IL-6, макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ), агониста рецептора γ, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), фактора ингибирования лейкоцитов (ФИЛ), аденозина, гельминтной и грибковой инфекций.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что комплекс, нагруженный M1-макрофагами и М2-макрофагами, является подходящим для направленной доставки активного агента в гипоксические ткани, предпочтительно в опухоль или ее метастазы. В целом, авторы настоящего изобретения наблюдали, что от 3 до 5% вводимых M1-макрофагов локализируются в области опухоли, в то время как приблизительно 35% М2-макрофагов демонстрируют специфичное направленное воздействие на опухоль. Тем не менее, указанное общее преимущество М2-макрофагов пропадает при применении комплекса, содержащего гемоглобин и лекарственное средство, поскольку в M1-макрофаги можно нагружать значительно большие количества указанного комплекса по сравнению с М2-макрофагами. В целом, указанный специфичный тропизм делает М2-макрофаги более подходящими для лечения опухолей и заболеваний, характеризующихся гипоксической тканью.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что CCL2-активированные макрофаги (полученные из костного мозга) особенно подходят для направленного воздействия на лимфатические узлы, предпочтительно воспаленные лимфатические узлы. Таким образом, применение таких макрофагов является предпочтительным во всех случаях, в которых желательно направленное воздействие лимфатические узлы, в частности, для профилактической или терапевтической вакцинации, а также для диагностики воспаленных лимфатических узлов. Соответственно, загрузка CCL2-активированных макрофагов комплексами железосвязывающих белков и антигенов является предпочтительной.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению моноцит-макрофаг:
+
(i) можно продуцировать из CD34 гемопоэтической клетки-предшественника;
(ii) можно продуцировать путем инкубирования in vitro моноцитов с по меньшей мере одним индуктором, предпочтительно M1- или М2-индуктором, более предпочтительно по меньшей мере одним М2-индуктором;
(iii) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих антигенов: TfR, CD163, TIM-2, CD14, CD16, CD33 и/или CD115;
(iv) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих антигенов: TfR, CD163, TIM-2, CXCR4, CD14 и/или CD16; и/или
(v) обладает способностью к фагоцитозу; и/или
(vi) не является дендритной клеткой, дифференциация которой контролируется одним или более из следующих факторов транскрипции: IRF8, NFIL3, BATF3 или RELB, PU/1, RBPJ, IRF4 или TCF4.
В указанном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению M1-индуктор для дифференцирования клеток моноцит-макрофагов выбран из группы, состоящей из ЛПС, IFN-γ или вирусной или бактериальной инфекции, или М2-индуктор для дифференцирования моноцитов выбран из группы, состоящей из IL-4, IL-10, IL-13, иммунного комплекса антигена и антитела, IgG, термически активируемых гамма-глобулинов, глюкокортикостероидов, ФРО-β, IL-1R, CCL-2, IL-6, М-КСФ, агониста PPARγ, фактора ингибирования лейкоцитов (ФИЛ), среды, кондиционированной раковыми клетками, раковых клеток, аденозина и гельминтной или грибковой инфекции.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что моноциты являются подходящими для направленной доставки активного агента в гипоксические ткани, предпочтительно в опухоль или ее метастазы, при этом моноциты, обработанные М2-активаторами, являются более подходящими для направленной доставки активного агента в гипоксические ткани, предпочтительно в опухоль или ее метастазы. Указанные специфичные тропизмы делают моноциты, обработанные М2-активаторами, более подходящими для направленного воздействия на опухоли и гипоксические участки, например, участки воспаления.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению лимфоцит:
+
(i) можно получать из крови, селезенки или костного мозга или можно продуцировать из CD34 клетки-предшественника, как известно специалисту, а также описано, например, в Lefort and Kim, 2010, J Vis Exp 40: 2017; Tassone and Fidler, 2012, Methods in Molecular Biology 882: 351-357; Kouro et al. 2005, Current Protocols in Immunology, 66:F22F.1:22F.1.1-22F.1.9;
(ii) представляет собой иммунологически компетентный лимфоцит;
(iii) экспрессирует антигенспецифичные Т-клеточные рецепторы; и/или
(iv) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих антигенов: (a) CD3 и CD4 или CD8 или (b) CD19, CD20, CD21, CD19 CD20, CD19 CD21, CD20 CD21 или CD19 CD20 CD21 антиген, и предпочтительно способен продуцировать иммуноглобулины.
+
В особенно предпочтительном варианте реализации CD45 лимфоциты представляют собой NK-клетку, которую
+
(i) можно получать из крови, селезенки или костного мозга или можно продуцировать из CD34 клетки-предшественника; и/или
+
+
+
+
+
+
(ii) характеризуется отсутствием экспрессии CD3 и экспрессией по меньшей мере одного из следующих: CD56 и/или CD94, CD158a CD158f CD314 CD335.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению гранулоцит:
+
(i) можно получать из крови, селезенки или костного мозга или можно продуцировать из CD34 клетки-предшественника, как описано, например, в Kuhs et al. 2015, Curr Protoc Immunol 111:7.23-1-7.23.16; Coquery et al. 2012, Cytometry A 81(9): 806-814; Swemydas and Lionakis 2013, J Vis Exp 77: 50586;
(ii) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих: CD66b и/или CD193;
(iii) представляет собой полиморноядерный лейкоцит, характеризующийся наличием гранул в своей цитоплазме; и/или
(iii) характеризуется экспрессией по меньшей мере одного из следующих: TfR, CD163, TIM-2, и/или CXCR4.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению железосвязывающий белок выбран из группы, состоящей из ферритина, предпочтительно ферритина тяжелого (Н) типа, ферритина легкого (L) типа и/или митохондриального ферритина; гемоглобина, предпочтительно гемоглобина А, гемоглобина AS, гемоглобина SC, гемоглобина С, гемоглобина D, гемоглобина Е, гемоглобина F, гемоглобина Н; комплекса гемоглобин-гаптоглобин, гемопексина, трансферрина и лактоферрина. Термины "ферритин"; "гемоглобин", предпочтительно "гемоглобин А", "гемоглобин AS", "гемоглобин SC", "гемоглобин С", "гемоглобин D", "гемоглобин Е", "гемоглобин F", "гемоглобин Н"; "комплекс гемоглобин-гаптоглобин", "гемопексин", "трансферрин" и "лактоферрин" охватывают структурные варианты встречающихся в природе белков и, таким образом, относятся к белкам, которые обладают по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% более предпочтительно по меньшей мере 100% способностью соответствующего белка дикого типа связывать ион(ы) железа. Железосвязывающие белки, применяемые в контексте настоящего изобретения, предпочтительно имеют в качестве источника млекопитающее, более предпочтительно мышь, крысу, собаку, обезьяну, в частности, шимпанзе, или человека, наиболее предпочтительно человека. Консенсусные последовательности предпочтительных железосвязывающих белков, применяемых в контексте настоящего изобретения, показаны ниже на Фиг. 1. Предпочтительные структурные варианты основаны на последовательностях, указанных на Фиг. 1. Остатки, отмеченные X, варьируются для различных ферритинов, трансферринов и гемоглобинов млекопитающих. Изменение указанных остатков не оказывает решающего влияния на способность белков связываться с ионами железа. Соответственно, предпочтительно, чтобы мутации или делеции аминокислот влияли на один или более остатков, отмеченных X.
Белки плазмы всегда являлись предпочтительными носителями для доставки активных фармацевтических ингредиентов в терапии рака. Таким образом, альбумин, самый распространенный белок плазмы, в настоящее время применяют в терапевтических протоколах для доставки таксановых молекул и производных доксорубицина (Larsen МТ et al. 2016, Mol Cell Ther 27; 4:3).
Белки человека трансферрин и ферритин считаются эффективными носителями для доставки малых молекул или конъюгатов токсинов для специфичного направленного воздействия на раковые клетки. На сегодняшний день, несмотря на значительные усилия, эффективные комплексы лекарственных средств с трасферрином или ферритином не достигли клинического применения (Luck AN et al. 2013, Adv Drug Deliv Rev 65(8):1012-9).
+
Ферритин имеет архитектуру в виде кейдж-структуры и обладает способностью связывать железо, что можно использовать для инкапсулирования фармацевтически активных веществ и/или меток в его полости. Ферритины не содержатся в плазме в большом количестве, но их можно легко получать с высоким выходом в качестве рекомбинантных белков в общих векторах экспрессии белков, таких как клетки Escherichia coli. Н- или L-цепи ферритинов кодируются, как малый белок мономер (21 кДа и 19 кДа для Н- and L-целей, соответственно), который способен собираться в 24-мерную кейдж-подобную структуру, которая ограничивает полость диаметром 8 нм. Авторы настоящего изобретения в контексте работы согласно настоящему изобретению отметили, что гомополимеры Н-ферритина представляют собой предпочтительную белковую конструкцию для специфичной доставки инкапсулированных лекарственных средств в клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, экспрессирующие TfR. Кроме того, Н-ферритин обеспечивает направленную доставку комплекса фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток к ядру клетки (и, следовательно, непосредственно доставляет ДНК-связывающие белки в ядро).
Очищенный трансферрин можно эффективно конъюгировать с различными молекулами, включая противораковые лекарственные средства, посредством ковалентных линкеров, которые соответствующим образом высвобождаются внутри клеток (Beyer U et al. 1998, J Med Chem 41(15): 2701-2708). В случае трансферрина, только лизиновые группы на поверхности белка уже доступны для ковалентного присоединения.
+
В прошлом гемоглобин рассматривали в качестве возможного носителя для лекарственных средств из-за его универсальности при химическом конъюгировании с лекарственными средствами, его присутствия в большом количестве и относительно стабильности в крови (Somatogen, 1993, WO 1993008842 A1). Тем не менее отсутствие свойств направленного воздействия на рецепторы не способствовало его биомедицинским применениям, отличным от применения в качестве заменителей крови или агента против серповидно-клеточной анемии. На самом деле, Hb может распознаваться только эпитопами CD163 (гаптоглобиновый/гемоглобиновый рецептор) на лейкоцитах, особенно моноцитарно-макрофагального происхождения. CD45 лейкоцит, в частности, макрофаг для доставки белка, описанный в настоящей заявке, делает гемоглобин предпочтительным в качестве специфичного к мишени носителя фармацевтически активных веществ и/или меток. Гемоглобин можно легко ковалентно связывать с соответствующими фармацевтически активными веществами и/или метками, он может размещать гидрофобные фармацевтически активные вещества и/или метки в гемсвязывающем кармане или даже переносить малые молекулы, например, цитотоксические молекулы, связанные с гемовым железом. Hb можно легко модифицировать путем селективного присоединения соответствующего конъюгата лекарственного средства к остатку цистеина в положении 93 бета-цепи, единственному титруемому цистеину на поверхности белка. Лекарственные средства, функционализированные малеимидом, такие как ингибитор тубулина, монометилауристатин (ММАЕ), или лекарственное средство для перекрестного сшивания ДНК, пирролбензодиазепиновый димер (PBD), являются наиболее важными примерами чрезвычайно сильнодействующих цитотоксических препаратов, которые можно легко и специфично присоединять к соответствующему остатку цистеина в положении 93 бета-цепей.
В качестве альтернативы, остатки лизина на поверхности Hb (по меньшей мере 10 титруемых остатков лизина на тетрамер Hb) можно легко конъюгировать с лекарственным средством посредством расщепляемых сукцинимидных линкеров. Гемоглобин также обладает уникальной способностью к высвобождению нековалентно связанной гемовой группы при кислотных значениях рН. Получаемый таким образом апогемоглобин способен размещать в пустом гемовом кармане несколько гидрофобных молекул, как показано для паклитаксела (Meng Z et al. 2015 J Pharm Sci 104(3): 1045-55) или для меток с флуоресцентными свойствами (например, хлорин е6, гиперицин, производные фталоцианина) (Dong J et al. J Photochem Photobiol В 2014, 140: 163-172).
При любом способе конъюгирования/адсорбции/связывания гемоглобин (Hb), трансферрин (Tf) и ферритины представлены в настоящем изобретении в качестве предпочтительных носителей фармацевтически активных веществ и меток, нагруженных в соответствующие клеточные системы, обладающие свойствами направленного воздействия на опухоль, например, активированные макрофаги. Легкая, быстрая, дешевая и безопасная процедура очистки указанных белков также обеспечивает огромную практическую пользу.
+
+
На основе последовательностей ферритинов Н-типа, ферритинов L-типа, альфа-цепей гемоглобина, бета-цепей гемоглобина и трансферринов млекопитающих определяли консенсусную последовательность для каждого из указанных белков. Они показаны на Фиг. 1 в SEQ ID №: 2, 7, 9, 14, 16, 20 и 25, соответственно. Исходя из этого, а также на основе анализа делеции и структурного анализа, раскрытого в предшествующем уровне техники, определяли минимальный фрагмент для ферритинов Н-типа, ферритинов L-типа, альфа-цепей гемоглобина и бета-цепей гемоглобина млекопитающих, достаточный для поглощения CD45 лейкоцитами. Они показаны в SEQ ID №: 1, 3, 5 (ферритин Н-типа); 8, 10, 12 (ферритин L-типа), 15 и 17 (альфа-цепь гемоглобина) и 19 и 21 (бета-цепь гемоглобина). Трансферрин содержит домен в N-концевой области и домен в С-концевой области, которые необходимы для связывания железа и поглощения CD45 лейкоцитами, если они содержатся в одном полипептиде и расположены на расстоянии от 100 до 450 аминокислот друг от друга, предпочтительно от 150 до 400, более предпочтительно от 200 до 350 аминокислот и более предпочтительно от 250 до 320 аминокислот друг от друга. N-концевой домен содержит с 1 по 82 аминокислоты полноразмерного консенсусного трансферрина (SEQ ID №: 25) или полноразмерного трансферрина человека (SEQ ID №: 28). С-концевой домен содержит с 396 по 510 аминокислоты полноразмерного консенсусного трансферрина (SEQ ID №: 25) или полноразмерного трансферрина человека (SEQ ID №: 28). В каждом случае, когда X указывают в консенсусной последовательности, он независимо обозначает любую аминокислоту и характеризует аминокислоту, которая является не консервативной или слабо консервативной среди ферритинов Н-типа млекопитающих, которая может мутировать без ущерба или с незначительным ущербом в отношении железосвязывающих свойств соответствующего железосвязывающего белка. Предпочтительно, чтобы X в каждом случае принимал значение аминокислоты соответствующего железосвязывающего белка человека, выравненной с X. Указанную информацию можно взять, например, из Фиг. 1, на которой показаны выравнивания консенсусных последовательностей с белками человека, а в некоторых случаях с белками мыши.
+
Предпочтительные ферритины Н-типа содержат или состоят из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID №: 1, и ее вариантов, обладающих по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 1, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-лейкоцитами. В SEQ ID №: 1 X в положении 5 может присутствовать или отсутствовать, при этом в случае присутствия он обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ile, X в положении 6 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Asn, X в положении 14 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Tyr, X в положении 24 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Tyr или Cys, X в положении 66 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 68 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Gln, X в положении 75 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Arg или Cys, X в положении 90 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно His, X в положении 94 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ser или Asn, X в положении 120 может присутствовать или отсутствовать, при этом в случае присутствия он обозначает любую аминокислоту, предпочтительно His или Tyr, более предпочтительно His, X в положении 123 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Asn или Ser, более предпочтительно Asn, X в положении 128 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ala.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин Н-типа содержит или состоит из ферритина мыши в соответствии с SEQ ID №: 3. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 3, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин Н-типа содержит или состоит из ферритина человека в соответствии с SEQ ID №: 5. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 5, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин Н-типа содержит или состоит из консенсусной последовательности млекопитающего, полученной путем выравнивания полноразмерных ферритинов Н-типа в соответствии с SEQ ID №: 2 или 7, при этом 2 является предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 2 или 7, при этом 2 является предпочтительной, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами. В SEQ ID №: 2 X в положении 6 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro, X в положении 14 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно His, X в положении 16 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp, X в положении 21 может присутствовать или отсутствовать, при этом в случае присутствия он обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ile, X в положении 22 обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Asn, X в положении 30 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr, X в положении 40 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Cys, более предпочтительно Tyr, X в положении 82 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 84 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Gln, X в положении 91 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или Cys, более предпочтительно Cys, X в положении 106 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно His, X в положении 110 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asn или Ser, более предпочтительно Asn, X в положении 137 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно His или Tyr, более предпочтительно His, X в положении 140 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asn или Ser, более предпочтительно Asn, X в положении 145 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ala, X в положении 164 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ser, X в положении 166 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Leu, предпочтительно Leu, X в положении 178 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или His, более предпочтительно Asp, X в положении 181 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asn, X в положении 182 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu, X в положении 183 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser. В SEQ ID №: 7 X в положении 6 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro, X в положении 14 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно His, X в положении 16 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp, X в положении 21 может присутствовать или отсутствовать, при этом в случае присутствия он обозначает любую аминокислоту, предпочтительно Ile, X в положении 29 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr, X в положении 81 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 83 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Gln, X в положении 105 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно His, X в положении 144 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ala, X в положении 180 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asn, X в положении 181 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu, X в положении 182 отсутствует или представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин Н-типа содержит или состоит из полноразмерного ферритина мыши в соответствии с SEQ ID №: 4, являющейся предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина мыши Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 4, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин Н-типа содержит или состоит из полноразмерного ферритина человека в соответствии с SEQ ID №: 6, являющейся предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина человека Н-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 6, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
Предпочтительные ферритины L-типа содержат или состоят из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID №: 8, и ее вариантов, обладающих по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 8, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-лейкоцитами. В SEQ ID №: 8 X в положении 5 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Glu, более предпочтительно Asp, X в положении 12 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или Ser, более предпочтительно Ser, X в положении 17 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Arg, более предпочтительно Ser, X в положении 19 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 29 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 30 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Phe, более предпочтительно Tyr, X в положении 42 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Gly, более предпочтительно Ser, X в положении 56 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Tyr, более предпочтительно Tyr, X в положении 61 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Lys, более предпочтительно Lys, X в положении 62 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Phe, более предпочтительно Met, X в положении 65 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 75 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ilе или Val, более предпочтительно Ilе, X в положении 76 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Gln, более предпочтительно Lys, X в положении 79 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ala, X в положении 80 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 87 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro или Gln, более предпочтительно Pro, X в положении 88 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Asp, более предпочтительно Asp, X в положении 91 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Lys, более предпочтительно Lys, X в положении 94 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Leu, более предпочтительно Leu, X в положении 96 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Leu, более предпочтительно Met, X в положении 99 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Asn, предпочтительно Lys, X в положении 115 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Thr или Ala, более предпочтительно Thr, X в положении 119 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Leu, X в положении 125 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Thr, более предпочтительно Thr, X в положении 127 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Phe, более предпочтительно Phe, X в положении 130 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Glu, более предпочтительно Glu, X в положении 140 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Asn, более предпочтительно Asp, X в положении 146 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или His, более предпочтительно His, и X в положении 148 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Leu или Val, более предпочтительно Leu.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин L-типа содержит или состоит из ферритина мыши L-типа в соответствии с SEQ ID №: 10. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 10, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин L-типа содержит или состоит из ферритина человека в соответствии с SEQ ID №: 12. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 12, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин L-типа содержит или состоит из консенсусной последовательности млекопитающего, полученной путем выравнивания полноразмерных ферритинов Н-типа в соответствии с SEQ ID №: 9 или 14, при этом 9 является предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 9 или 14, при этом 9 является предпочтительной, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами. В SEQ ID №: 9 X в положении 12 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Glu, более предпочтительно Asp, X в положении 19 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Arg, более предпочтительно Ser, X в положении 24 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Arg, более предпочтительно Ser, X в положении 26 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 36 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 37 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Phe, более предпочтительно Tyr, X в положении 47 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Gly, более предпочтительно Ser, X в положении 63 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala or Tyr, более предпочтительно Tyr, X в положении 68 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Lys, более предпочтительно Lys, X в положении 69 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Phe, более предпочтительно Met, X в положении 72 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 82 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ilе или Val, более предпочтительно Ile, X в положении 83 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Gln, более предпочтительно Lys, X в положении 86 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala или Ser, более предпочтительно Ala, X в положении 87 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Gln, более предпочтительно Gln, X в положении 94 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro или Gln, более предпочтительно Pro, X в положении 95 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Asp, более предпочтительно Asp, X в положении 98 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Glu или Lys, более предпочтительно Lys, X в положении 101 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Leu, более предпочтительно Leu, X в положении 103 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Met или Leu, более предпочтительно Met, X в положении 106 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Asn, предпочтительно Lys, X может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, X в положении 126 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Leu, X в положении 132 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ser или Thr, более предпочтительно Thr, X в положении 134 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Phe, более предпочтительно Phe, X в положении 137 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Glu, более предпочтительно Glu, X в положении 147 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Asn, более предпочтительно Asp, X в положении 153 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Arg или His, более предпочтительно His, X в положении 155 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Leu или Val, более предпочтительно Leu, X в положении 161 может отсутствовать или представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Ala, X в положении 163 может отсутствовать или представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Thr, X в положении 166 может отсутствовать или представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro, и X в положении 168 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Gly или Ala, более предпочтительно Ala. В SEQ ID №: 14 X в положении 36 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Phe, X в положении 37 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Tyr или Phe, более предпочтительно Tyr, X в положении 94 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro или Gln, более предпочтительно Pro, X в положении 126 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Leu, X в положении 137 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Lys или Glu, более предпочтительно Glu, X в положении 147 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Asp или Asn, более предпочтительно Asp, X может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, X в положении 163 может отсутствовать или представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Thr, X в положении 166 может отсутствовать или представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Pro, X в положении 168 может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, предпочтительно Gly или Ala, более предпочтительно Ala.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин L-типа содержит или состоит из полноразмерного ферритина мыши в соответствии с SEQ ID №: 11, являющейся предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина мыши L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 11, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации ферритин L-типа содержит или состоит из полноразмерного ферритина человека в соответствии с SEQ ID №: 13, являющейся предпочтительной. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью ферритина человека L-типа, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 13, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из минимальной консенсусной последовательности млекопитающего, полученной в результате выравнивания полноразмерных альфа-гемоглобинов в соответствии с SEQ ID №: 15. Предпочтительно он содержит или состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID №: 15, и ее вариантов, обладающих по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью альфа-гемоглобина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 15, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из минимальной аминокислотной последовательности человека, полученной из альфа-гемоглобина в соответствии с SEQ ID №: 17. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью альфа-гемоглобина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 17, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из консенсусной последовательности млекопитающего, полученной в результате выравнивания полноразмерных альфа-гемоглобинов в соответствии с SEQ ID №: 16. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью альфа-гемоглобинов, состоящих из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 16, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из полноразмерного альфа-гемоглобина человека в соответствии с SEQ ID №: 18. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью полноразмерного альфа-гемоглобина человека, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 18, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из минимальной консенсусной последовательности млекопитающего, полученной в результате выравнивания полноразмерных бета-гемоглобинов в соответствии с SEQ ID №: 19, и ее вариантов, обладающих по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью бета-гемоглобина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 19, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации альфа-гемоглобин содержит или состоит из минимальной аминокислотной последовательности человека, полученной из бета-гемоглобина человека в соответствии с SEQ ID №: 21. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью бета-гемоглобина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 21, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации бета-гемоглобин содержит или состоит из консенсусной последовательности млекопитающего, полученной в результате выравнивания полноразмерных бета-гемоглобинов в соответствии с SEQ ID №: 20. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью бета-гемоглобина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 20, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации бета-гемоглобин содержит или состоит из полноразмерного бета-гемоглобина человека в соответствии с SEQ ID №: 22. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью полноразмерного бета-гемоглобина человека, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 22, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно М2-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации трансферрин содержит или состоит из консенсусной последовательности млекопитающего, полученной в результате выравнивания полноразмерных альфа-гемоглобинов в соответствии с SEQ ID №: 25. Таким образом, в частности, предпочтительные трансферрины содержат или состоят из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID №: 25, и ее вариантов, обладающих по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью трансферрина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 25, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
В предпочтительном варианте реализации трансферрин содержит или состоит из трансферрина человека в соответствии с SEQ ID №: 28. Соответственно, предпочтительные структурные варианты обладают по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, и в каждом случае по меньшей мере 70% способностью трансферрина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 28, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
+
Железосвязывающие свойства трансферринов зависят от доменов в N-концевой и С-концевой областях. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации трансферрин, применяемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере N-концевой домен в соответствии с SEQ ID №: 23 и С-концевой домен в соответствии с SEQ ID №: 24. Предпочтительный трансферрин содержит белки, которые содержат аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID №: 23 и 24, а также ее варианты, обладающие по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, в каждом случае по меньшей мере 70% способностью трансферрина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 23 и 24, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами. SEQ ID №: 23 или 24 обозначает консенсусную последовательность трансферринов млекопитающих.
+
Таким образом, в предпочтительном варианте реализации трансферрин, применяемый в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере N-концевой домен в соответствии с SEQ ID №: 26 и С-концевой домен в соответствии с SEQ ID №: 27. Предпочтительный трансферрин содержит белки, которые содержат аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID №: 26 и 27, а также ее варианты, обладающие по меньшей мере 70% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью аминокислот, в каждом случае по меньшей мере 70% способностью трансферрина, состоящего из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID №: 26 и 27, соответственно, поглощаться CD45 лейкоцитами, предпочтительно M1-макрофагами.
Предпочтительные ферритины также содержат белки, которые независимо от заданной аминокислотной последовательности собираются в состоящую из 24 субъединиц структуру белкового модуля в виде четырехспирального пучка, соответствующую выравниванию заданных последовательностей отдаленно родственных белков, что определяют путем выравниваний на основе трехмерных структур.
+
Авторы настоящего изобретения неожиданно наблюдали, что моноциты, макрофаги и предпочтительно М2-макрофаги способны поглощать количество метки, достаточное для придания им видимости при применении методов визуализации в месте их накопления (например, в опухоли или ее метастазах, области гипоксии). Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что лимфоциты и М2-макрофаги лучше поглощают комплексы, содержащие один или более ферритинов и одно или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, что M1-макрофаги лучше поглощают комплексы, содержащие один или более гемоглобинов и одно или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, и что макрофаги лучше поглощают комплексы, содержащие один или более трансферринов и одно или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток. Соответственно, на основе тканевого и клеточного тропизма CD45 лейкоцитов: моноциты, M1- и М2-макрофаги, гранулоциты и лимфоциты, описанные выше комплексы, содержащие один или более ферритины и одно или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, применяют для нагрузки М2-макрофагов, лимфоцитов или моноцитов, если желателен тропизм М2-макрофагов, лимфоцитов или моноцитов, и комплексы, содержащие один или более гемоглобинов и одно или более фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, применяют для нагрузки M1-макрофагов, если желателен тропизм M1-макрофагов.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка выбраны из группы, состоящей из белка, нуклеиновой кислоты, химического небелкового соединения, не являющегося нуклеиновой кислотой, с молекулярной массой менее 1,5 кДа, более предпочтительно менее 1 кДа, предпочтительно противоракового лекарственного средства, в частности, цитостатического лекарственного средства, цитотоксического лекарственного средства и их пролекарств; противоартериосклеротического лекарственного средства; и противовоспалительного лекарственного средства; и фотосенсибилизирующего соединения; вируса, в частности, онколитического вируса; и радиоизотопа, испускающего α- или β-излучение, который также испускает γ-излучение в количестве, вызывающем повреждение клеток, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из лютеция-177, иттербия-90, йода-131, самария-153, фосфора-32, цезия-131, палладия-103, радия-233, йода-125 и бора-10, или α-излучение в количестве, вызывающем повреждение клеток, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из актиния-225, висмута-213, свинца-212 и полония-212. Также предпочтительным является комплекс указанных выше соединений и изотопов, связанный с наночастицами (например, золота, серебра, графена), или указанные наночастицы.
Предпочтительные противораковые лекарственные средства выбраны из лекарственного средства, индуцирующего апоптоз/аутофагию или некроз. Лекарственное средство, индуцирующее апоптоз/аутофагию или некроз, может представлять собой любое лекарственное средство, которое способно эффективно индуцировать апоптоз/аутофагию или некроз даже в клетках с аномальной пролиферацией. Указанные лекарственные средства предпочтительно применяют в комплексах с одним или более ферритинами.
Предпочтительные противораковые лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из лекарственного средства, индуцирующего апоптоз, алкилирующего вещества, антиметаболитов, антибиотиков, эпотилонов, агонистов и антагонистов ядерных рецепторов, антиандрогена, антиэстрогена, соединения платины, гормона, антигормона, интерферона, ингибитора зависимых от клеточного цикла протеинкиназ (CDK), ингибитора циклооксигеназ и/или липоксигеназ, биогенной жирной кислоты, производного биогенной жирной кислоты, включая простаноиды и лейкотриены, ингибитора протеинкиназ, ингибитора протеинфосфатаз, ингибитора липидкиназ, координационного комплекса платины, этиленимина, метилмеламина, триазина, алкалоида барвинка, пиримидинового аналога, пуринового аналога, алкилсульфоната, аналога фолиевой кислоты, антрацендиона, замещенной мочевины, производного метилгидразина, ендиинового антибиотика, ингибитора полимеризации тубулина, такого как майтанзиноид или производное ауристатина, ингибитора иммунных контрольных точек и ингибитора опухолеспецифичного белка или маркера, предпочтительно ингибитора диссоциации Rho-GDP, более предпочтительно Grp94, или ингибитора AXL.
Другие предпочтительные противораковые лекарственные средства выбраны из группы, состоящей из ацедиасульфона, акларубицина, амбазона, аминоглютетимида, L-аспарагиназы, азатиоприна, баноксантрона, бендамустина, блеомицина, бусульфана, фолината кальция, карбоплатина, карпецитабина, кармустина, целекоксиба, хлорамбуцила, цисплатина, кладрибина, циклофосфамида, цитарабина, дакарбазина, дактиномицина, дапсона, даунорубицина, дибромпропамидина, диэтилстильбестрола, доцетаксела, доксорубицина, ендиинов, эпирубицина, эпотилона В, эпотилона D, эстрамустина фосфата, эстрогена, этинилэстрадиола, этопозида, флавопиридола, флоксуридина, флударабина, фторурацила, флуоксиместерона, флутамида, фосфоэстрола, фуразолидона, гемцитабина, аналога гонадотропин-высвобождающего гормона, гексаметилмеламина, гидроксикарбамида, гидроксиметилнитрофурантоина, гидроксипрогестеронкапроата, гидроксимочевины, идарубицина, идоксуридина, ифосфамида, интерферона-α, иринотекана, лейпролида, ломустина, луртотекана, мафенида сульфатоламида, мехлорэтамина, медроксипрогестерона ацетата, мегастролацетата, мелфалана, мепакрина, меркаптопурина, метотрексата, метронидазола, митомицина С, митоподозида, митотана, митоксантрона, митрамицина, налидиксовой кислоты, нифуратела, нифуроксазида, нифуралазина, нифуртимокса, нимустина, ниноразола, нитрофурантоина, азотистых ипритов, олеомуцина, оксолиновой кислоты, пентамидина, пентостатина, феназопиридина, фталилсульфатиазола, пипобромана, преднимустина, преднизона, преуссина, прокарбазина, пириметамина, ралтитрекседа, рапамицина, рофекоксиба, розиглитазона, салазосульфапиридина, скрифлавиния хлорида, семустина, стрептозоцина, сульфакарбамида, сульфацетамида, сульфахлорпиридазина, сульфадиазина, сульфадикрамида, сульфадиметоксина, сульфаэтидола, сульфафуразола, сульфагуанидина, сульфагуанола, сульфаметизола, сульфаметоксазола, ко-тримоксазола, сульфаметоксидиазина, сульфаметоксипиридазина, сульфамоксола, сульфаниламида, сульфаперина, сульфафеназола, сульфатиазола, сульфисомидина, стауроспорина, тамоксифена, таксола, тенипозида, тертипозида, тестолактона, тестостеронпропионата, тиогуанина, тиотепа, тинидазола, топотекана, триазиквона, треосульфана, триметоприма, трофосфамида, UCN-01, винбластина, винкристина, виндезина, винбластина, винорелбина и зорубицина, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ауристатина, баноксантрона, бендамустина, хлорамбуцила, халицеамицина, циклофосфамида, динемицина А, майтанзина, мелфалана, мертанзина и неоказиностатина, наиболее предпочтительно баноксантрона, бендамустина, хлорамбуцила, циклофосфамида, пирролбензодиазепина и мелфалана.
Особенно предпочтительно противораковое лекарственное средство представляет собой белок, ингибирующий пролиферацию, предпочтительно ингибитор клеточного цикла, или антитело, или антителоподобный связывающий белок, который специфично связывается с белком-промотором пролиферации, или нуклеиновую кислоту, предпочтительно кодирующую ингибирующий пролиферацию белок, или антитело, или антителоподобный связывающий белок, который специфично связывается с белком-промотором пролиферации, или миРНК, или ДНК-фермент.
Предпочтительными являются иммуномодулирующие лекарственные средства, которые активируют или ингибируют активность иммунных клеток. Они могут представлять собой природные или синтетические лиганды или антагонисты паттерн-распознающих рецепторов, в частности, Toll-подобных рецепторов, NOD-подобных рецепторов (NLR), RIG-I-подобных рецепторов (RLR). Физиологически указанные рецепторы распознают класс сигналов, известных, как молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами (РАМР), и молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждениями (DAMP).
2
H
L
Предпочтительные примеры антител, которые следует применять в контексте настоящего изобретения, представляют собой одноцепочечные антитела, фрагменты антител, нанотела, легкие или тяжелые цепи, вариабельные легкие или вариабельные тяжелые цепи или диатела. Предпочтительные фрагменты антител включают антигенсвязывающий фрагмент (Fab), фрагмент Fab', фрагмент F(ab'), антитело с тяжелыми цепями, однодоменное антитело (sdAb), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), вариабельный фрагмент (Fv), домен V, домен V, однодоменное антитело, нанотело, IgNAR (новый иммуноглобулиновый антигенный рецептор), ди-scFv, привлекающий Т-клетки биспецифичный активатор (BITE), молекулу переориентирующегося антитела с двойной аффинностью (DART), тройное тело, диатело, одноцепочечное диатело и их гибридные белки.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что воспаленные суставы являются мишенями для макрофаг-моноцитов, предпочтительно активированных макрофагов. Таким образом, в диагностических применениях, в которых детектируют воспаленные суставы, макрофаг-моноциты предпочтительно нагружены меткой или комплексом, содержащим железосвязывающий белок и метку. В терапевтических применениях предпочтительно, чтобы комплекс содержал фармацевтически активное вещество с противовоспалительной активностью для доставки противовоспалительного вещества к воспаленной ткани.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что система направленной доставки согласно настоящему изобретению направленно воздействует на лимфатические узлы, что делает ее особенно подходящей для доставки антигенов к дендритным клеткам, находящимся в лимфатических узлах. Направленное воздействие на лимфатические узлы особенно выражена, если клетки, нагруженные комплексом, представляют собой макрофаги, в частности, активированные макрофаги, более предпочтительно CCL-2-активированные макрофаги, полученные из костного мозга, или лимфоциты, в частности, В-клетки или Т-клетки. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации систему направленной доставки применяют для доставки одного или более антигенов для инициирования профилактического и/или терапевтического иммунного ответа на один или более антигенов. Предпочтительные антигены получают из патогенов, т.е. бактерий или вирусов, или они являются опухолеспецифичными антигенами. Термин "опухолеспецифичные антигены" относится к белкам или эпитопам (включая пептиды с измененными профилями гликозилирования), которые в большей степени экспрессированы на поверхности опухолевых клеток по сравнению с неопухолевыми клетками, предпочтительно к антигенам или эпитопам, которые экспрессируются только на поверхности опухолевых клеток. Предпочтительные антигены выбраны из группы, состоящей из рецептора эпидермального фактора роста (EGFR, ErbB-1, HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3/HER3, ErbB-4/HER4, семейства лигандов EGFR; семейства рецепторов инсулиноподобного фактора роста (IGFR), IGF-связывающих белков (IGFBP), семейства лигандов IGFR; семейства рецепторов фактора роста тромбоцитов (PDGFR), семейства лигандов PDGFR; семейства рецепторов фактора роста фибробластов (FGFR), семейства лигандов FGFR, семейства рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), семейства VEGF; семейства рецепторов HGF; семейства рецепторов TRK; семейства рецепторов эфрина (ЕРН); семейства рецепторов AXL; семейства рецепторов лейкоцитарных тирозинкиназ (LTK); семейства рецепторов TIE, ангиопоэтина-1, -2; семейства подобных рецепторной тирозинкиназе орфанных рецепторов (ROR); семейства рецепторов с дискоидиновым доменом (DDR); семейства рецепторов RET; семейства рецепторов KLG; семейства рецепторов RYK; семейства рецепторов MuSK; рецепторов трансформирующего фактора роста-α (ТФР-α), ФРО-β; рецепторов цитокинов, рецепторов класса I (семейство рецепторов гематопоэтина) и класса II (семейство рецепторов интерферонов/IL-10), суперсемейства (TNFRSF) рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО), семейства рецепторов смерти; раково-тестикулярных антигенов (СТ), линиеспецифичных антигенов, дифференцировочных антигенов, альфа-актитина-4, ARTC1, гибридных продуктов кластерного региона точечного разрыва/белка Абельсона (Bcr-abl), B-RAF, каспазы-5 (CASP-5), каспазы-8 (CASP-8), β-катенина (CTNNB1), белка цикла клеточного деления 27 (CDC27), циклинзависимых киназ 4 (CDK4), CDKN2A, СОА-1, гибридного белка dek-can, EFTUD-2, фактора элонгации 2 (ELF2), гибридного белка, кодируемого вариантом гена 6 Ets/геном острого миелоидного лейкоза 1 ETS (ETC6-AML1), фибронектина (FN), GPNMB, гибридного белка рецептор липидов низкой плотности/GDP-L-фукоза:β-D-галактоза 2-α-L-фукозилтрансфераза (LDLR/FUT), HLA-A2. замены аргинина на изолейцин в положении 170 в α-спирали α-2-домена в гене HLA-A2 (HLA-A*201-R170I), HLA-A11, мутированного белка теплового шока 70-2 (HSP70-2M), KIAA0205, MART2, убиквитарного мутированного белка меланомы 1, 2, 3 (MUM-1, 2, 3), простатической кислой фосфатазы (РАР), neo-РАР, миозина класса I, NFYC, OGT, OS-9, гибридного белка pml-RAR-альфа, PRDX5, PTPRK, K-ras (KRAS2), N-ras (NRAS), HRAS, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, гибридного белка SYT-SSX1 или -SSX2, триозофосфатизомеразы, BAGE, BAGE-1, BAGE-2,3,4,5, GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8, GnT-V (аберрантной N-ацетилглюкозаминилтрансферазы V, MGAT5), HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-1, LAGE, LAGE-1, распознаваемого CTL антигена на меланоме (CAMEL), MAGE-A1 (MAGE-1), MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-3, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, муцина 1 (MUC1), MART-1/Melan-A (MLANA), gp100, gp100/Pmel17 (SILV), тирозиназы (TYR), TRP-1, HAGE, NA-88, NY-ESO-1, NY-ESO-1/LAGE-2, SAGE, Sp17, SSX-1,2,3,4, TRP2-INT2, раково-эмбрионального антигена (РЭА), калликреина 4, маммаглобина-А, ОА1, простатспецифического антигена (ПСА), TRP-1/gp75, TRP-2, адипофилина, интерферон-индуцируемого белка 2, отсутствующего при меланоме (AIM-2), BING-4, CPSF, циклина D1, молекулы клеточной адгезии эпителия (Ер-САМ), EphA3, фактора роста фибробластов-5 (FGF-5), гликопротеина 250 (gp250), EGFR (ERBB1), HER-2/neu (ERBB2), цепи α2 рецептора интерлейкина 13 (IL13Ralpha2), рецептора IL-6, интестинальной карбоксилэстеразы (iCE), альфа-фетопротеина (АФП), М-КСФ, mdm-2, MUC1, р53 (ТР53), PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU2AS, SOX10, STEAP1, сурвивина (BIRC5), обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT), теломеразы, гена опухоли Вильмса (WT1), SYCP1, BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2, PAGE-5, LIP1, CTAGE-1, С SAGE, ММА1, CAGE, BORIS, HOM-TES-85, AF15ql4, HCA661, LDHC, MORC, SGY-1, SPO11, TPX1, NY-SAR-35, FTHL17, NXF2, TDRD1, TEX15, FATE, ТРТЕ, идиотипов иммуноглобулина, белка Бенса-Джонса, рецепторов эстрогена (ER), рецепторов андрогена (AR), CD40, CD30, CD20, CD19, CD33, ракового антигена 72-4 (СА 72-4), ракового антигена 15-3 (СА 15-3), ракового антигена 27-29 (СА 27-29), ракового антигена 125 (СА 125), ракового антигена 19-9 (СА 19-9), β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, 1-2 микроглобулина, антигена плоскоклеточной карциномы, нейронспецифичной енолазы, белка теплового шока gp96, GM2, сарграмостима, CTLA-4, 707 аланин-пролина (707-АР), антигена аденокарциномы, распознаваемого Т-клетками 4 (ART-4), белка-1 раково-эмбрионального антигена (САР-1), активируемого кальцием хлоридного канала-2 (CLCA2), циклофилина В (Сур-В), белка перстневидной опухоли-2 человека (HST-2), белков вируса папилломы человека (ВПЧ) (ВПЧ-Е6, ВПЧ-Е7, основного или минорного капсидных антигенов, других), белков вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ) (ВЭБ латентных мембранных белков LMP1, LMP2; других), белков вируса гепатита В или С и белков ВИЧ.
Если фармацевтически активное вещество представляет собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно, чтобы она представляла собой микроРНК, миРНК, химически модифицированную РНК, ДНК-фермент или нуклеиновую кислоту, кодирующую фармацевтически активный белок, например, антитело, миметик антитела, цитокин, превращающий пролекарство фермент, иммуногенный пептид и т.п.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению метка выбрана из флуоресцентного красителя, изотопа, испускающего флуоресценцию, радиоизотопа, детектируемого полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей такой детектируемый полипептид, и контрастного агента.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению метка содержит хелатирующий агент, который образует комплекс с катионами двухвалентных или трехвалентных металлов.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению хелатирующий агент выбран из группы, состоящей из 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N,N'-тетрауксусной кислоты (DOTA), этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA), триэтилентетрамина (ТЕТА), иминодиуксусной кислоты, диэтилентриамин-N,N,N',N',N''-пентауксусной кислоты (DTPA) и 6-гидразинопиридин-3-карбоновой кислоты (HYNIC).
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению контрастный агент включает парамагнитный агент, предпочтительно выбранный из Gd, Eu, W и Mn, или ферригидрит.
18
51
65
67
68
111
99m
140
175
153
166
88
90
149
177
47
142
159
212
72
72
97
109
105
101m15
119
128
123
124
131
197
211
169
203
212
64
89
67
188
186
198
199
18
89
64
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению радиоизотоп/изотоп, испускающий флуоресценцию, выбран из группы, состоящей из изотопов, испускающих альфа-излучение, изотопов, испускающих гамма-излучение, изотопов, испускающих Оже-электроны, изотопов, испускающих рентгеновское излучение, изотопов, испускающих флуоресценцию, таких как F, Cr, флуоресцентный Tb, Ga, Ga, In, Tc, La, Yb, Sm, Ho, Y, Y, Pm, Lu, Sc, Pr, Gd, Bi, As, Se, Ru, Pd, Rh, Rh, Sb, Ba, I, I, I, Hg, At, Eu, Pb, Pb, Cu, Zr, Cu, Re, Re, Au и Ag, а также конъюгатов и комбинаций указанных выше изотопов с белками, пептидами, низкомолекулярными ингибиторами, антителами или другими соединениями, (например, F-ФДГ, Zr-оксид или Cu-порфирин).
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению флуоресцентный краситель выбран из группы, состоящей из следующих классов флуоресцентных красителей: ксантены, акридины, оксазины, цинины, стириловые красители, кумарины, порфины, комплексы металл-лиганд, флуоресцентные белки, нанокристаллы, перилены и фталоцианины, а также конъюгатов и комбинаций указанных классов красителей.
В предпочтительном варианте реализации системы направленной доставки согласно настоящему изобретению детектируемый полипептид представляет собой аутофлуоресцентный белок, предпочтительно зеленый флуоресцентный белок, или любой его структурный вариант с измененным спектром адсорбции и/или эмиссии.
Как было указано выше, система направленной доставки согласно настоящему изобретению является особенно подходящей для доставки фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток в области гипоксии. Гипоксия характерна для различных заболеваний, включая рак и воспалительные заболевания, и, таким образом, позволяет направленно воздействовать на такие заболевания.
В дополнение к направленной доставке применение фармацевтически активных веществ, которые активируются в гипоксических условиях, обеспечивает дополнительную специфичность направленной доставке и/или дополнительно снижает неблагоприятные эффекты фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток. Таким образом, в особенно предпочтительных вариантах реализации фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка представляют собой пролекарство, активируемое гипоксией. В основе всех пролекарств, активируемых гипоксией, лежит наличие одного из пяти различных химических фрагментов (нитрогрупп, хининов, ароматических и алифатических N-оксидов и переходных металлов), которые под воздействием ферментов восстанавливаются в тканях при гипоксических условиях. Пролекарства, активируемые гипоксией, представляют собой любое пролекарство, которое менее активно или неактивно по сравнению с соответствующим лекарственным средством и содержат лекарственное средство и одну или более биовосстанавливаемых групп. Такие пролекарства, активируемые гипоксией, включают все пролекарства, активируемые различными восстанавливающими агентами и восстанавливающими ферментами, включая без ограничений ферменты, переносящие одиночные электроны (такие как цитохром Р450 редуктазы), и ферменты, переносящие два электрона (или переносящие гидрид). В соответствии с предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения пролекарство, активируемое гипоксией, представляет собой ТН-302. Способы получения ТН-302 описаны в заявках РСТ № WO 07/002931 и № WO 08/083101. Предпочтительно примеры таких пролекарств выбраны из группы I класса, состоящей из: N-оксидов бензотриазина, апазиквона (EO9), тирапазамина (TPN) и SN30000; или группы II класса, состоящей из: нитросоединений PR-104А, ТН-302, ТН-4000 и AQ4N.
В предпочтительном варианте реализации выделенной системы направленной доставки согласно настоящему изобретению связь(и) между железосвязывающим(и) белком(ами) и фармацевтически активным веществом, меткой или фармацевтически активным веществом и меткой, содержащимися в комплексе, является(ются) ковалентной(ыми) и/или нековалентной(ыми); и/или фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка, содержащиеся в комплексе, захватываются/инкапсулируются железосвязывающим белком, предпочтительно ферритином или его мультимерами. В одном из вариантов реализации ковалентное и/или нековалентное связывание осуществляется непрямым образом через линкер или спейсер. Если желательно образование ковалентных связей, для ковалентного связывания фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, прямым или непрямым образом, с одним или более железосвязывающими белками применяют соответствующие тиольные группы, аминогруппы или карбоксильные группы железосвязывающих белков.
Также предполагают, что в комплексе содержатся различные фармацевтически активные вещества, метки или фармацевтически активные вещества и метки. Например, один тип фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки может связываться с железосвязывающим белком (нековалентное связывание), тогда как другой тип является инкапсулированным. В данном подходе используют различные скорости высвобождения фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток из железосвязывающего белка после доставки в целевую ткань и/или клетки. Например, фармацевтически активное вещество, метка или фармацевтически активное вещество и метка могут ковалентно присоединяться к молекуле ферритина, на поверхности 24-мера или во внутренней полости, за счет реакционной способности соответствующих тиольных групп, аминогрупп или карбоксильных групп. Типы таких подходящих реакций хорошо известны в данной области техники, и специалист в данной области техники может адоптировать их для конкретного фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки без какой-либо дополнительной работы. Примеры таких реакций описаны в Behrens CR, Liu В. Methods for site-specific drug conjugation to antibodies. MAbs. 2014 Jan-Feb; 6(1):46-53.
В терагностических применениях, т.е. в которых комплекс содержит как метку, так и фармацевтически активное вещество, предпочтительно, чтобы метка ковалентно присоединялась к железосвязывающему белку, а фармацевтически активное вещество нековалентно связывалось с железосвязывающим белком и/или захватывалось внутренней полостью, образующейся при сборке железосвязывающих белков.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения выделенной системы направленной доставки по первому или второму аспектам, включающему стадии:
a) получения очищенного железосвязывающего белка;
b) ковалентного или нековалентного связывания фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки с железосвязывающим белком и/или инкапсулирования фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки в железосвязывающий белок;
+
c) получения клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит; и
+
+
d1) инкубирования клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, в присутствии железосвязывающего белка, полученного на стадии b), до получения по меньшей мере частичной загрузки клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, комплексом железосвязывающего белка и фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки, полученного на стадии b); и/или
+
+
d2) инкубирования клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, в присутствии метки до получения по меньшей мере частичного связывания клетки, представляющей собой CD45 лейкоцит, с меткой.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки, получаемой при помощи способа в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения.
Образование аддукта между белком и фармацевтически активным веществом и/или меткой предпочтительно осуществляется путем нековалентного связывания с железосвязывающим белком и может быть описано следующим образом: в случае ферритина фармацевтически активные вещества и/или метки обычно можно инкапсулировать во внутреннюю полость (физическое удерживание) за счет свойств ассоциации и диссоциации самой макромолекулы ферритина. Молекулы фармацевтически активного вещества и/или метки удерживаются на месте путем нековалентных взаимодействий с аминокислотными остатками на внутренней поверхности полости. Макромолекулы гемоглобина также обладают возможностью нековалентного связывания выбранных молекул фармацевтически активных веществ и/или меток, которые могут размещаться в гемсвязывающем кармане самого гемоглобина. Гем в кармане может замещаться и может заменяться на фармацевтически активные вещества и/или метки с соответствующим профилем гидрофобности. В дополнительном аспекте все белки, рассматриваемые в настоящем изобретении, можно ковалентно присоединять к молекулам фармацевтически активного вещества и/или метки, модифицированным при помощи конкретных активных линкерных фрагментов, реакционноспособных в отношении тиольных групп или аминогрупп самого белка. Таким образом, ферритины или гемоглобин можно связывать с реакционноспособными в отношении тиольной группы цистеина фармацевтически активными веществами и/или метками, несущими расщепляемый линкер на основе пептида (например, чувствительную к катепсину валин-цитруллиновую последовательность и пара-аминобензилкарбаматный спейсер). В качестве важнейшего примера применяли антимитотический агент монометилауристатин Е (ММАЕ). Линкер на основе пептида стабильно связывает белок с цитотоксическим соединением, так что лекарственное средство не может легко высвобождаться из белка в физиологических условиях, что помогает предотвращать токсичность в отношении здоровых клеток и обеспечивает эффективность дозировки. Образуемый таким образом аддукт белка и фармацевтически активного вещества и/или метки может присоединяться к выбранным типам рецепторов, т.е. CD163 в случае гемоглобина и TfR в случае ферритина или трансферрина, соответственно. После связывания аддукт белка и фармацевтически активного вещества и/или метки интернализируется путем эндоцитоза и, таким образом, избирательно поглощается клетками-мишенями. Везикула, содержащая лекарственное средство, сливается с лизосомами и лизосомальными цистеиновыми протеазами, в частности, катепсин В начинает разрушать валин-цитруллиновый линкер, и ММАЕ больше не является связанным с железосвязывающим белком и высвобождается непосредственно в среду опухоли.
В качестве альтернативы, DM1-SMCC представляет собой эффективное производное мертанзина, несущее линкер, который специфично связывается с лизиновыми остатками, образуя ковалентный комплекс с ферритином, гемоглобином или трансферрином в реакции, которая была успешно описана для антибиотиков. В частности, гемоглобин, ферритин или трансферрин могут взаимодействовать с DM1-SMCC, таким образом, обеспечивая получение ковалентного аддукта белка и лекарственного средства, который может расщепляться внутри клеток и высвобождать активное лекарственное средство зависящим от времени образом. Подавление динамики микротрубочек при помощи DM1 индуцирует блокировку митоза и гибель клеток.
+
Термин "полная загрузка" применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения максимального количества железосвязывающего белка, предпочтительно ферритина, находящегося комплексе с фармацевтически активным веществом, меткой или фармацевтически активным веществом и меткой, которое может поглощаться клеткой, представляющей собой CD45 лейкоцит, предпочтительно макрофагом, более предпочтительно активированным макрофагом.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки по первому аспекту или второму аспекту настоящего изобретения или получаемой в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения для применения в качестве лекарственного средства или для диагностики.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической или диагностической композиции, содержащей выделенную систему направленной доставки по первому или второму аспекту настоящего изобретения или получаемую в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения и фармацевтически приемлемое вещество-носитель и/или подходящий(е) вспомогательное(ые) вещество(а). Поскольку выделенная система направленной доставки содержит живые клетки, предпочтительно, чтобы носители и вспомогательные вещества были выбраны таким образом, чтобы оставлять клетки живыми.
"Фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в фармакопее США или другой общепринятой фармакопее для применения на животных, в частности, на людях.
Термин "носитель", применяемый в настоящем документе, относится к фармакологически неактивному веществу, такому как, но не ограничиваясь ими, разбавитель, вспомогательное вещество, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, физиологические буферные растворы или вещества-носители, с которыми вводят фармацевтически активное вещество. Такие фармацевтические носители могут быть жидкими или твердыми. Жидкие носители включают, но не ограничиваются ими, стерильные жидкости, такие как солевые растворы в воде или маслах, включая, но не ограничиваясь ими, масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно применять в качестве жидких носителей, в частности, для растворов для инъекций. Солевой раствор является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" за авторством Е.W. Martin.
Подходящие фармацевтические "вспомогательные вещества" включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерина моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.
"Поверхностно-активные вещества" включают анионогенные, катионогенные и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как, но не ограничиваясь ими, дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, Triton Х-100 и полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65 и полисорбат 80.
"Стабилизаторы" включают, но не ограничиваются ими, маннит, сахарозу, трегалозу, альбумин, а также антагонисты протеаз и/или нуклеаз.
"Физиологические буферные растворы" включают, но не ограничиваются ими, раствор хлорида натрия, деминерализованную воду, а также подходящие органические или неорганические буферные растворы, такие как, но не ограничиваясь ими, фосфатный буфер, цитратный буфер, трис-буфер (трис(гидроксиметил)аминометан), буфер HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфоновая кислота) или буфер MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновая кислота). Выбор соответствующего буфера, в целом, зависит от желаемой молярности буфера. Фосфатный буфер является подходящим, например, для растворов для инъекций или инфузий.
Термин "адъювант" относится к агентам, которые усиливают, стимулируют, активируют, увеличивают или модулируют иммунный ответ на фармацевтически активное вещество, содержащееся в композиции, на клеточном или гуморальном уровне, например, иммунологические адъюванты стимулируют ответ иммунной системы на фактический антиген, но сами по себе не обладают иммунологическим эффектом. Примеры таких адъювантов включают, но не ограничиваются ими, неорганические адъюванты (например, соли неорганических металлов, такие как фосфат алюминия или гидроксид алюминия), органические адъюванты (например, сапонины или сквален), адъюванты на масляной основе (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), цитокины (например, IL-1β, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, ГМ-КСФ и IFN-γ), адъюванты в виде частиц (например, иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), липосомы или биологически разлагаемые микросферы), виросомы, бактериальные адъюванты (например, монофосфориллипид А или мурамиловые пептиды), синтетические адъюванты (например, неионогенные блок-сополимеры, аналоги мурамиловых пептидов или синтетический липид А) или синтетические полинуклеотидные адъюванты (например, полиаргинин или полилизин).
+
Поразительным наблюдением являлось специфическое для заболевания направленное воздействие системы направленной доставки согласно настоящему изобретению. Клетки, представляющие собой CD45 лейкоциты, по-видимому, обладают тропизмом к областям гипоксии и областям окислительного стресса. Гипоксия является отличительной чертой различных заболеваний, как и окислительный стресс. Соответственно, в шестом аспекте настоящее изобретение относится к выделенной системе направленной доставки по первому аспекту или второму аспекту настоящего изобретения или получаемой в соответствии со способом по третьему аспекту настоящего изобретения для применения для предотвращения, лечения или диагностирования заболевания, характеризующегося областями гипоксии в пораженных тканях и/или областями окислительного стресса (Фиг. 27); опухолей, предпочтительно солидных опухолей, и/или их метастаз, предпочтительно рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака легкого, рака толстой кишки или опухоли, характеризующейся областями гипоксии, воспалительного заболевания, воспаленной ткани, предпочтительно воспаленных суставов или пораженных артритом суставов, воспаленных легких, воспаленного кишечника или других воспаленных тканей; лимфатических узлов, предпочтительно воспаленных лимфатических узлов, или других нефизиологических лимфатических узлов, которые развиваются во время заболевания, предпочтительно, но не только, во время инфекции, рака или аутоиммунного заболевания; или областей ишемии, в частности, в ранах кожи, или после инфаркта органа (сердца) или ретинальной ишемии, или для профилактической или терапевтической вакцинации, в частности, для предотвращения или лечения инфекционного заболевания или рака. Указанный аспект также включает антигены к физиологическим или нефизиологическим лимфатическим узлам для вакцинации индивидуума или для индуцирования иммунной памяти.
Термин "лечение", применяемый в настоящем документе, включает все типы профилактических и/или терапевтических вмешательств, разрешенных с медицинской точки зрения для лечения, временной ремиссии, предотвращения и различных других целей, включая задержку или остановку развития заболевания, регресс или исчезновение очага поражения, предотвращение начала развития заболевания или подавление рецидива.
Система направленной доставки в соответствии с настоящим изобретением позволяет осуществлять доставку к опухоли фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток, которые обычно не могут достигать опухоли (например, из-за проблем с растворимостью). Она также позволяет осуществлять доставку фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток в гипоксические опухоли или в области гипоксии опухоли. Указанная система также обеспечивает доставку фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки в любую область в организме, подверженную гипоксическим состояниям, например, во время ишемических инцидентов, или в которой происходит воспалительный процесс.
+
Как было указано выше, в настоящем изобретении также предложен способ направленной доставки в опухолевую массу. Указанный способ включает получение CD45 лейкоцитов, предпочтительно активированных макрофагов, которые обеспечивают высокоэффективное поглощение железосвязывающего белка (ферритина, гемоглобина и/или трансферрина) макрофагами, при этом указанный ферритин, гемоглобин и/или трансферрин несет фармацевтически активное вещество, метку или фармацевтически активное вещество и метку (например, лекарственное средство/пролекарство), обеспечивают направленное воздействие на опухоль и перенос железосвязывающего белка в раковую клетку, в которой происходит высвобождение фармацевтически активного вещества, метки или фармацевтически активного вещества и метки.
+
+
В настоящем изобретении применяют CD45 лейкоциты, предпочтительно активированные макрофаги, нагруженные железосвязывающими белками, связанными с лекарственным средством/пролекарством, в качестве системы направленной доставки к опухоли. Неудовлетворительный ответ опухолей на химиотерапию или трудности с их обнаружением с применением способов визуализации в основном связаны с изменениями в проникновении противораковых лекарственных средств в области гипоксии вследствие слабой сосудистой сети. Тем не менее, указанные аваскулярные участки привлекают CD45 лейкоциты, предпочтительно активированные макрофаги, для миграции даже в удаленные от кровеносных сосудов области. Таким образом, они образуют систему доставки частиц к опухолевой массе. Перспективным примером таких частиц является железосвязывающий белок. Тем не менее, при их применении в качестве единственных агентов они не достигают областей гипоксии, аналогично другим соединениям, и накапливаются в других органах.
+
+
Авторы настоящего изобретения связывали противораковые лекарственные средства, активируемые гипоксией пролекарства (с целью лечения), метки или изотопы с гемоглобином или трансферрином с применением химических способов и нагружали ими CD45 лейкоциты (моноциты, макрофаги, лимфоциты и/или гранулоциты), предпочтительно активированные макрофаги, обрабатывая клетки раствором железосвязывающего белка, как описано в примерах. Авторы настоящего изобретения наблюдали, что после введения животному нагруженные CD45 лейкоциты, предпочтительно активированные макрофаги, мигрируют в области гипоксии опухоли и высвобождают в раковых клетках железосвязывающий белок с инкапсулированными фармацевтически активными веществами, метками или фармацевтически активными веществами и метками. Указанный способ позволяет осуществлять точное введение фармацевтически активных веществ, меток или фармацевтически активных веществ и меток в опухолевый участок (особенно в области гипоксии), избегая их накопления в других органах.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: В секции (А) показан минимальный активный фрагмент консенсусной аминокислотной последовательности среди Н-цепей ферритинов млекопитающих и две полноразмерные консенсусные последовательности на основе нескольких Н-цепей ферритинов млекопитающих (см. SEQ ID №: 1, 2 и 7, соответственно), а также минимальная и полноразмерная аминокислотные последовательности Н-цепи ферритина мыши (SEQ ID №: 3 и 4) и человека (SEQ ID №: 5 и 6). В секции (В) показан минимальный активный фрагмент консенсусной аминокислотной последовательности среди L-цепей ферритинов млекопитающих и две полноразмерные консенсусные последовательности на основе нескольких L-цепей ферритинов млекопитающих (см. SEQ ID №: 8, 9 и 14, соответственно), а также минимальная и полноразмерная аминокислотные последовательности L-цепи ферритина мыши (SEQ ID №: 10 и 11) и человека (SEQ ID №: 12 и 13). В секции (С) показан минимальный активный фрагмент консенсусной аминокислотной последовательности среди альфа-цепей гемоглобина млекопитающих и одна полноразмерная консенсусная последовательность на основе нескольких альфа-цепей гемоглобина млекопитающих (см. SEQ ID №: 15 и 16, соответственно), а также минимальная и полноразмерная аминокислотные последовательности альфа-цепи гемоглобина человека (SEQ ID №: 17 и 18). В секции (D) показан минимальный активный фрагмент консенсусной аминокислотной последовательности среди бета-цепей гемоглобина млекопитающих и полноразмерные консенсусные последовательности на основе нескольких бета-цепей гемоглобина млекопитающих (см. SEQ ID №: 19 и 20, соответственно), а также минимальная и полноразмерная аминокислотные последовательности бета-цепи гемоглобина человека (SEQ ID №: 21 и 22). В секции (Е) показан N- и С-концевой минимальный активный фрагмент консенсусной аминокислотной последовательности среди трансферринов млекопитающих (SEQ ID №: 23 и 24) и полноразмерные консенсусные последовательности на основе нескольких трансферринов млекопитающих (SEQ ID №: 25), а также N- и С-концевой минимальный активный фрагмент трансферрина человека (SEQ ID №: 26 и 27) и полноразмерная аминокислотная последовательность трансферрина человека (SEQ ID №: 28). В консенсусных последовательностях X указывает на вариабельное положение и обозначает любую встречающуюся в природе аминокислоту. Предпочтительно в каждом случае X в зависимости от других X обозначает аминокислоту, присутствующую в белке человека.
Фиг. 2: Показан макрофаг внутри опухолевой массы мыши (окрашивали TRITC перед инъекцией, нагружали меченым при помощи FITC ферритином).
Фиг. 3: Показано полученное путем конфокальной микроскопии изображение опухолевой ткани мыши, которой путем инъекции вводили клетки рака молочной железы и внутривенно вводили макрофаги, нагруженные FITC-ферритином (звездочка), где отчетливо видно, не только в макрофагах, но и в раковых клетках, что ферритин-FITC распространяется по всей опухолевой массе.
Фиг. 4: Показаны моментальные снимки в одном канале (в исходном зеленом канале, преобразованном в изображение в градациях серого), полученные с применением конфокальной микроскопии макрофагов (обозначенных *; нагруженных FITC-ферритином) и раковой клетки (обозначенной стрелкой; окрашенной при помощи красной метки и, следовательно, не наблюдаемой в зеленом канале до поглощения ферритина) in vitro, полученные в начальный момент времени (А) и после прохождения времени, достаточного для заполнения раковой клетки ферритином (В). Осуществляется динамический перенос FITC-ферритина в раковую клетку (с накоплением сначала в везикулах,; а затем с распространением по всей цитоплазме, как видно на указанном изображении (клетка появилась в зеленом канале)).
Фиг. 5: Показана выживаемость мышей, получавших плацебо и макрофаги, нагруженные мелфаланом, связанным с ферритином, и хлорамбуцилом, связанным с ферритином.
Фиг. 6: Показан апоптоз опухолевых клеток, вызванный обработкой циклофосфамидом и циклофосфамидом, инкапсулированным в ферритинах, загруженных в макрофаги (приведены в одинаковых дозах).
Фиг. 7: Показаны МРТ-изображения опухоли молочной железы мыши. Мышь лечили (в момент времени 0 ч) макрофагами (внутривенная инъекция), нагруженными ферритином Fh. Затем авторы настоящего изобретения наблюдали увеличенный диаметр кровеносных сосудов (стрелка), заполненных инъецированными макрофагами (что приводило к значительному снижению Т2-сигнала), а затем макрофаги распространялись по ткани (пятнообразный рисунок; стрелки). Указанные изменения (в одинаковые моменты времени) наблюдали у всех испытываемых мышей.
Фиг. 8: Показано поглощение ферритина, гемоглобина и трансферрина макрофагами, поглощение ферритина и гемоглобина моноцитами и поглощение ферритина лимфоцитами и гранулоцитами.
Фиг. 9: Показана стабильность удержания ферритина макрофагами.
Фиг. 10: Показан перенос ферритина, гемоглобина и трансферрина из макрофага в различные раковые клетки.
Фиг. 11: Показан перенос ферритина из макрофага в раковые и нераковые клетки.
Фиг. 12: Показан перенос ферритина с инкапсулированным пролекарством, активируемым гипоксией, из макрофага в раковые клетки.
Фиг. 13: Показан апоптоз в раковых клетках, которые получали ферритин с различными инкапсулированными противораковыми агентами из совместно культивированных макрофагов или растворимого ферритина с теми же агентами.
Фиг. 14: Показан перенос ферритина, гемоглобина и трансферрина из моноцита в различные раковые клетки.
Фиг. 15: Показан перенос ферритина и гемоглобина из гранулоцита в различные раковые клетки.
Фиг. 16: Показан перенос ферритина и гемоглобина из лимфоцита в различные раковые клетки.
Фиг. 17: Показано изображение, полученное путем двухфотонной микроскопии, демонстрирующее опухоль, полученную от мыши, которой вводили предварительно меченые (перед введением) макрофаги, содержащие ферритин-FITC.
Фиг. 18: Показано полноразмерное изображение мышей, которым внутривенно вводили меченые макрофаги, на котором демонстрируется накопление макрофагов в опухолевом участке и их распределение в других органах.
Фиг. 19: Показана миграция макрофагов в гипоксическую ткань, поперечный срез опухоли, полученной от мыши, которой внутривенно вводили предварительно меченые макрофаги, области гипоксии опухоли визуализированы при помощи маркера гипоксии - пимонидазолона.
Фиг. 20: Показана наблюдаемая локализация везикул, содержащих меченый при помощи FITC ферритин (круглые объекты), в микроокружении внутри опухолевой массы. Макрофаги, содержащие меченый при помощи FITC ферритин, вводили мышам внутривенно.
18
18
18
18
18
Фиг. 21: Показан регистрируемый при помощи ПЭТ сигнал, получаемый путем анализа всего тела мышей с метастатическим раком 4Т1. Мышам внутривенно вводили макрофаги, нагруженные F-ФДГ. Накопление сигнала повышено в легких мышей с микрометастазами (подтверждается патологическим исследованием). В случае мышей, получавших просто F-ФДГ, или мышей без рака 4Т1 наблюдали более слабый ПЭТ сигнал. MQ-ФДГ: обозначает мышей с метастатической опухолью 4Т1 + внутривенное введение макрофагов, нагруженных F-ФДГ. ФДГ: обозначает мышей с метастатической опухолью 4Т1 + внутривенное введение свободного F-ФДГ. Интактные мыши MQ-ФДГ: обозначает мышей без опухоли + внутривенное введение макрофагов, нагруженных F-ФДГ.
+
+
+
+
Фиг. 22: Показано направленное воздействие на опухоль различных типов клеток CD45 лейкоцитов, применяемых в системах направленной доставки согласно настоящему изобретению. Мышам с опухолями СТ26 (отмеченными стрелками) внутривенно инъецировали ФСБ или флуоресцентно меченые клетки. Секция А - ФСБ, без добавления клеток, в секции В показано направленное воздействие субпопуляции CD45 лейкоцитов, в секции С показано направленное воздействие активированных CD4 Т-лимфоцитов, в секции D показано направленное воздействие макрофаг-моноцитарной клеточной линии. Через 24 часа после инъекции мышей анестезировали и делали снимок. В секции Е показано количественное определение направленного воздействия на опухоль различными клетками, представляющими собой CD45 лейкоциты.
3
Фиг. 23: Показана выживаемость мышей с опухолью СТ26, получающих терапию моноцитами, нагруженными ферритин-цисплатином. n=6-8 мышей/группа. Выживаемость мышей рассчитывали путем достижения (1500 мм) максимально допустимого объема опухоли (измеренного штангенциркулем в соответствии с формулой А × В2).
Фиг. 24: Показана направленная доставка введенных внутривенно клеток к воспаленным (артритным) суставам. Контрольной мыши (секция А) или мыши с тяжелым воспалением суставов (секция В) внутривенно инъецировали макрофаг-моноцитарную клеточную линию. Перед инъекцией клетки помечали флуоресцентным индикатором. Через 24 часа после инъекции суставы удаляли и готовили суспензию отдельных клеток. Клетки анализировали путем проточной цитометрии. Флуоресцентно меченые клетки представлены в области Р2. В секции С показано количественное определение флуоресцентных клеток в воспаленных суставах по сравнению с контрольными суставами. Макрофаг-моноцитарные клетки присутствуют в воспаленных суставах в большем количестве по сравнению с контрольными суставами.
Фиг. 25: Показана направленная доставка введенных внутривенно клеток к лимфатическим узлам. Контрольной мыши (секция А) или мыши с тяжелым воспалением суставов (секция В) внутривенно инъецировали активированные макрофаги (с М-КСФ и CCL2). Перед инъекцией клетки помечали флуоресцентным индикатором. Через 24 часа после инъекции мышей анестезировали и делали снимок. Мыши с воспалительным состоянием имеют положительный сигнал, полученный от клеток, меченых индикатором, в лимфатических узлах (отмеченных белыми стрелками).
89
89
Фиг. 26: Показано введение радиоактивной метки, просто Zr-оксината, в моноцитарно-макрофагальную клеточную линию, т.е. без железосвязывающего белка (~1,85 МБк), для получения ПЭТ изображения. Радиоактивность клеток после нагрузки Zr указана в МБк.
Фиг. 27: Перенос ферритина исследовали в раковых клетках (ЕМТ6), совместно культивированных с нагруженными ферритином макрофагами (RAW264.7) в течение 2 ч. Использовали три экспериментальных состояния: "контроль" (нормальное совместное культивирование, без стресса); "ЕМТ6 OS", когда клетки ЕМТ6 подвергали окислительному стрессу перед совместным культивированием, а затем совместно культивировали с макрофагами при условиях с нормальным содержанием кислорода, и "совместное культивирование и OS", когда оба типа клеток подвергали окислительному стрессу перед совместным культивированием. Результаты показали, что раковые клетки, подвергавшиеся окислительному стрессу, получали (от макрофагов) больше ферритинов, чем контрольные клетки. Поглощение являлось еще более эффективным, когда оба типа клеток подвергали окислительному стрессу. Это может быть связано с более высокой нагрузкой ферритином из-за окислительного стресса и, следовательно, более эффективным переносом, или с тем, что окислительный стресс инициирует более эффективную доставку ферритинов макрофагами к раковым клеткам для уменьшения окислительного стресса в соседних клетках. В секции А показано поглощение ферритина макрофагами (совместное культивирование в течение 2 ч) при окислительном стрессе (окисление глюкозы в течение 16 ч). В секции В показано поглощение ферритина макрофагами (совместное культивирование в течение 2 ч) при окислительном стрессе (окисление глюкозы в течение 16 ч).
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Активация макрофагов
Макрофаги для применения в соответствии с настоящим изобретением получали, дифференцировали и активировали следующим образом. Для активирования макрофагов их сперва получали из клеток-предшественников костного мозга (см., например, документ: Weischenfeld and Porse, 2008, CSH Protoc, doi. 10.1101/pdb.prot.5080) или моноцитов крови. В качестве альтернативы, их можно получать из брюшины. Способы выделения, культивирования, дифференцирования и поляризации/активирования макрофагов хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, они подробно описаны Мюрреем (Murray) et al. (Immunity, 2014, 41(1):14-20).
При указанной практической реализации настоящего изобретения макрофаги, полученные из костного мозга, получали у BALB/c или С57 В1/6 мыши, тем не менее, также применяли макрофаги, полученные из моноцитов собачьей крови, или коммерчески доступные макрофагальные клеточные линии (клетки моноцитарно-макрофагальной линии мышей: RAW 264.7, J744, человека: ТНР-1, U937, или клеточная линия собак DH82).
Вкратце, такие макрофаги, полученные из костного мозга, высеивали в пластиковую чашку Петри в 5 мл среды (3 мл клеток на чашку): DMEM:F12 + глутамин/глутамакс + 10% ФБС + пенициллин/стрептомицин и 20% кондиционированной среды L929 или М-КСФ (50 нг/мл). В течение последующих пяти дней указанную среду дополняли фактором роста и одним из активирующих соединений или их комбинацией в виде одного цитокинового коктейля.
В качестве альтернативы, макрофаги культивировали в "среде для образования М1/М2-макрофагов" (Promocell) или в эквивалентной коммерчески доступной или самостоятельно приготовленной среде, содержащей все необходимые цитокины и интерлейкины, чтобы считать их активированными.
2
2
2
Для получения макрофагов из моноцитов крови клетки свежей крови (не старше 12 часов) очищали путем центрифугирования с применением реагента Histopaque system 1,077 г/мл или эквивалента и белых кровяных телец (или, в качестве альтернативы, только белых кровяных телец, полученных из банка крови) в соответствующем количестве предварительно нагретой среды для присоединения моноцитов (или эквивалента, например, DMEM/RPMI, дополненной М-КСФ), например, 15 мл среды на Т-75 колбу. Плотность посева должна составлять 1-2 миллиона/см для мононуклеарных клеток при содержании моноцитов ≥ 25% и 1,5-3 миллиона/см при содержании моноцитов <25%. Затем клетки инкубировали в течение 1-1,5 часов в 5% атмосфере СО и при 37°С в инкубаторе без каких-либо дополнительных манипуляций.
2
После присоединения клеток их промывали по меньшей мере два раза, а затем к клеткам добавляли соответствующее количество полной "DXF-среды для образования M1- или М2-макрофагов" (например, 20 мл на Т-75 колбу) и клетки инкубировали в течение 6 дней при 37°С и в 5% атмосфере СО без изменения среды. Для активирования макрофагов всю среду заменяли на среду, дополненную активирующим соединением.
Активирующими соединениями, применяемыми в настоящем изобретении (для клеток, полученных из костного мозга, или для активирования клеток, полученных из моноцитарно-макрофагальных клеточных линий), являются следующие: IL-4 (20 нг/мл), IFN-γ (по меньшей мере 20 нг/мл), ЛПС (по меньшей мере 10 нг/мл), IL-13 (по меньшей мере 20 нг/мл), IL-10 (по меньшей мере 20 нг/мл), дексаметазон (по меньшей мере 20 мкг/мл), CCL2 (по меньшей мере 20 нг/мл), окЛПНП (по меньшей мере 20 нг/мл), ФНО-α (20 нг/мл), ФРО-β (20 нг/мл), кортизол (150-300 нг/мл) или их комбинации в виде одного цитокинового коктейля. Для получения неактивированных макрофагов не добавляли активирующее соединение.
Обратного процесса поляризации/активирования макрофагов (от классически активированных до альтернативно активированных) можно достигать, например, путем культивирования макрофагов в соответствующих цитокинах, перечисленных выше, в течение по меньшей мере 48 часов.
Пример 2. Выделение моноцитов
Для получения моноцитов для указанной практической реализации настоящего изобретения моноциты, полученные из костного мозга или селезенки, получали у BALB/c или С57В1/6 мыши, тем не менее, также применяли моноциты собачьей крови или коммерчески доступные моноцитарные клеточные линии (клетки моноцитарно-макрофагальной линии мышей: RAW 264.7, J744, человека: ТНР-1, U937 или собак DH82).
Для получения моноцитов крови клетки свежей крови (не старше 12 часов) очищали путем центрифугирования с применением реагента Histopaque system 1,077 г/мл или эквивалента, и белые кровяные тельца высеивали в соответствующем количестве предварительно нагретой среды для присоединения моноцитов (или эквивалента, например, DMEM/RPMI, дополненной 20 нг/мл М-КСФ), например, 15 мл среды на Т-75 колбу. В качестве альтернативы, можно применять только лейкоциты, полученные из банка крови (лейкоцитарная пленка). После присоединения клеток их промывали по меньшей мере два раза и адгезивные клетки считали моноцитами.
Для получения моноцитов, полученных из костного мозга, в указанной практической реализации настоящего изобретения моноциты получали у BALB/c или С57В1/6 мыши. Вкратце, такие клетки-предшественники, полученные из костного мозга, выделяли с применением набора Mouse Monocyte Enrichment Kit (StemCells) в соответствии с инструкциями производителя. Для получения моноцитов, полученных из селезенки, в указанной практической реализации настоящего изобретения селезенку механически диссоциировали для получения суспензии отдельных клеток и пропускали через 70 мкм сетчатый фильтр. Клетки центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. Необязательно проводили лизис эритроцитов перед выделением моноцитов при помощи набора EasySep™ Mouse Monocyte Enrichment Kit (StemCells) в соответствии с инструкциями производителя.
Для получения лучших эффектов от нагрузки их белком и миграции перед применением их можно предварительно обрабатывать стимулирующими веществами для активирования: IL-4 (20 нг/мл), IFN-γ (по меньшей мере 20 нг/мл), ЛПС (по меньшей мере 10 нг/мл), IL-13 (по меньшей мере 20 нг/мл), IL-10 (по меньшей мере 20 нг/мл), дексаметазоном (по меньшей мере 20 мкг/мл), CCL-2 (по меньшей мере 20 нг/мл), окЛПНП (по меньшей мере 20 нг/мл), ФНО-α (20 нг/мл), ФРО-β (20 нг/мл), кортизолом (150-300 нг/мл) или их комбинациями в виде одного цитокинового коктейля.
Пример 3. Выделение гранулоцитов
Для получения гранулоцитарных клеток из крови 9 частей крови разбавляли 1 частью ACD-буфера (содержащего 0,17 М d-глюкозы, 0,10 М лимонной кислоты, 0,11 М тринатрийцитрата). Кровь из указанной стадии дополнительно разбавляли ФСБ в отношении 1:1 и центрифугировали. После удаления плазмы и лейкоцитарной пленки оставшиеся клетки смешивали с ФСБ до 80% исходного объема, полученного на первой стадии (ACD-кровь), а затем разбавляли холодной дистиллированной водой в отношении 4:12. Затем добавляли 6 частей 2,7% раствора NaCl и центрифугировали. После удаления надосадочной жидкости клетки повторно суспендировали в среде RPMI-1640. Указанные клетки считали гранулоцитами.
Пример 4. Выделение лимфоцитов
+
Для получения лимфоцитов, полученных из селезенки, в указанной практической реализации настоящего изобретения селезенку механически диссоциировали для получения суспензии отдельных клеток и пропускали через 70 мкм сетчатый фильтр. Клетки центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. После лизиса эритроцитов лимфоциты выделяли с применением способа очистки с магнитными микроносителями при помощи набора EasySep™ CD4 Enrichment Kit (StemCells) в соответствии с инструкциями производителя.
Лимфоциты активировали путем культивирования в течение 3-5 дней в RPMI-среде, дополненной смесью глутамин/глутамакс, 10% ФБС, пенициллин/стрептомицин, в присутствии гранул, покрытых анти-CD3 и анти-CD28 (Gibco), в соответствии с инструкциями производителя.
Активирование лимфоцитов подтверждали на основании повышающей регуляции экспрессии CD25 и CD69 на клеточной поверхности, что отслеживали путем проточной цитометрии.
+
Пример 5. Выделение лейкоцитов (CD45 клеток)
Для получения макрофагов из моноцитов крови свежую кровь (не старше 12 часов) очищали путем центрифугирования с применением реагента Histopaque system 1,077 г/мл или эквивалента, и белые кровяные тельца (или, в качестве альтернативы, только белые кровяные тельца, полученные из банка крови) применяли для дальнейших стадий процедуры. В качестве альтернативы, лейкоциты получают после лизиса эритроцитов цельной крови, как это было осуществлено при практической реализации настоящего изобретения.
Пример 6. Получение ферритиновых комплексов
2
4
4
4
4
-1
-1
Для включения в ферритины противораковых лекарственных средств (например, классических лекарственных средств, таких как циклофосфамид, хлорамбуцил, мелфалан, бендамустин, баноксантрон, или активируемого гипоксией пролекарства, такого как ТН-302) или "контрастных агентов для визуализации" (например, ферригидрита или изотопа) ферритины следует получать до лечения макрофагами. Вкратце, получали рекомбинантные белки мыши в соответствии с SEQ ID №: 4 (Фиг. 1) следующим образом. Вектор экспрессии рЕТ-22b, содержащий синтетический ген, кодирующий белок ферритин SEQ ID №: 4, трансформировали в Е. coli BL21 (DE3). Культуру E.coli выращивали при 37°C до значения OD600 0,6 в 1 л бульоне Луриа-Бертани (LB) с добавлением ампициллина (100 мг/л). Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропилтио-β-D-галактозида (IPTG) и культуру инкубировали в течение ночи. Клетки собирали путем центрифугирования (15000 g в течение 15 мин), суспендировали в 20 мМ HEPES (рН 7,5), 150 Мм NaCl, 0,1 мг/мл ДНКазы, 10 мМ MgCl и разрушали ультразвуком. Лиза центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин и над осад очную жидкость обрабатывали в течение 10 мин при 50°С, центрифугировали для удаления денатурированных белков, а затем при 70°С в течение 10 мин и повторно центрифугировали. В надосадочную жидкость добавляли 30% (NH)SO при 4°С при перемешивании в течение 1 ч и центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляли 70% (NH)SO при 4°С при перемешивании в течение 1 ч и центрифугировали при 15000 g в течение 30 мин. Осадок повторно суспендировали в 20 мМ HEPES (рН 7,5), 150 мМ NaCl и диализировали в течение ночи при 4°С против того же буфера. Белок нагружали в гель-фильтрационную колонку HILOAD 26/600 SUPERDEX 200 (GE-Healthcare), а затем фильтровали в стерильных условиях и хранили при 4°С (Фиг. 9). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при 280 нм с применением молярного коэффициента экстинкции 21000 М м и путем анализа Бредфорда с измерением поглощения при 595 нм.
Указанные ферритины включают рекомбинантные Н- и/или L-гомополимеры белков ферритинов млекопитающих.
Ферритины, полученные, как описано ранее, очищали при помощи стандартных способов для получения продукта доклинического уровня, не содержащего эндотоксина (см., например: Ceci et al. 2011, Extremophiles 15(3):431-439; Vanucci etal. 2012, Int J Nanomed 7:1489-1509). Вкратце, ферритин, хранящийся в стерильном консервирующем растворе, содержащем 20 мМ HEPES рН 7,5, разбавляли до конечной концентрации 24-мера 4 мкМ в кислотных условиях (конечный рН<3,0) или, в качестве альтернативы, при сильно щелочных значениях рН (рН>9,5) (см., например, Pontillo et al., 2016), обеспечивая диссоциацию мультимера. Лекарственные средства растворяли при очень высоких концентрациях в соответствующем растворителе, а затем в небольшом объеме добавляли к раствору ферритина с 200-молярным избытком. Затем получали нейтральный рН путем добавления соответствующих количеств растворов NaOH/HCl для обеспечения восстановления мультимера. Существующие экспериментальные способы показывают, что три/четыре промывки с применением ФСБ (стадии концентрирования) при критической для 100 кДа концентрации позволяют быстро и полностью устранять как сорастворители, так и не инкапсулированные лекарственные средства, и полностью восстанавливать нагруженные лекарственным средством нанокейдж-структуры ферритинов. Затем полученный таким образом комплекс ферритин-лекарственное средство подвергали сверхбыстрому замораживанию в жидком азоте и лиофилизировали.
В зависимости от выбора сорастворителя и присущих молекулам лекарственного средства химических свойств можно оценить, что вплоть до 150-180 молекул лекарственного средства могут быть захвачены/адсорбированы 24-мерной кейдж-структурой ферритина.
Фармацевтически активные вещества или метки также можно ковалентно связывать с боковыми цепями аминокислот ферритина (лизинами или цистеинами) путем соответствующего выбора лекарственных средств, активируемых фенилгидразоном, сукцинимидом или малеимидом. Соответственно, i) производное фенилгидразона может отрывать и высвобождать лекарственное средство с поверхности ферритина, ii) связанные с лизином производные могут активироваться после полного разложения белка до аминокислот, или iii) связанное с цистеином производное может высвобождаться в клетке в результате восстановительного гидролиза тиоэфирной связи малеимида.
Пример 7. Получение комплексов соединений с гемоглобином
Гемоглобин человека получали из свежих эритроцитов, как описано Роззи-Фанелли (Rossi-Fanelli) et al. (Archives of biochemistry and biophysics 77:478-492, 1958). Вкратце, гепаринизированную кровь, полученную от здоровых доноров, центрифугировали при 1600 об/мин в течение 30 минут (4°С) для осаждения ККТ. Лейкоцитарную пленку аккуратно удаляли путем аспирации с поверхности осадка. Надосадочную плазму удаляли и осадок ККТ три раза промывали путем повторного суспендирования ККТ в изотоническом 0,9% соляном растворе и центрифугирования при 1600 об/мин в течение 30 минут при 4°С. После заключительной стадии промывки и центрифугирования осадок ККТ повторно суспендировали в дистиллированной воде, забуференной при рН 7,2 5 мМ калий-фосфатным буфером (РВ, рН=7,2), и оставляли лизироваться при 4°С в течение ночи при осторожном перемешивании. Затем диализированный лизат ККТ центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 мин при 4°С и надосадочную жидкость непосредственно загружали в систему  Explorer, снабженную колонкой XK 26/40, заполненной смолой Q-сефароза XL (GE Healthcare), при комнатной температуре. Колонки уравновешивали буфером А (20 мМ трис-HCl, рН=8,2) при скорости потока 12 мл/мин и три раза промывали тем же буфером. Элюирование в режиме линейного градиента осуществляли путем изменения состава подвижной фазы от 100% буфера А до 75% буфера В (20 мМ трис-Cl, плюс 0,2 М NaCl рН 8,20) с последующим режимом ступенчатого градиента с 100% буфера В. После элюирования для сбора белковых фракций применяли коллектор фракций. Полученный таким образом белок анализировали путем ДСН-ПААГ-электрофореза и хранили в замороженном виде при -80°С.
Гемоглобин человека (SEQ ID №: 18 или 22, см. Фиг. 1) может быть легко ковалентно связан с соответствующими конъюгатами лекарственных средств, может размещать гидрофобные молекулы лекарственного средства в гемсвязывающем кармане или даже переносить малые цитотоксические молекулы, связанные с гемовым железом. НЬ можно легко модифицировать путем селективного присоединения соответствующего конъюгата лекарственного средства к остатку цистеина в положении 93 бета-цепей, единственному титруемому цистеину на поверхности белка. Функционализированные малеимидом лекарственные средства, такие как ингибитор тубулина монометилауристатин (ММАЕ) или функционализированный сукцинимидом аналоги мертанзина (DM1-SMCC), являются наиболее важными примерами чрезвычайно сильнодействующих цитотоксических препаратов, которые можно легко и специфично присоединять к соответствующему остатку цистеина в положении 93 бета-цепей (для функционализированных малеимидом лекарственных средств) или к одному или более остаткам лизина (функционализированное сукцинимидом лекарственное средство), соответственно. Указанные лекарственные средства удобно конъюгировать с гемоглобином человека в соответствии со следующими процедурами:
Аналог ауристатина Е, малеимидокапроил-валин-цитруллин-и-аминобензоилоксикарбонил-монометил ауристатин Е (vcMMAE), получали от MedChem Express (Princeton, NJ). Аддукт гемоглобина и vcMMAE готовили следующим образом. Раствор гемоглобина человека доводили до концентрации гема 120 мкМ рабочим буферным раствором (50 мМ фосфатного буфера рН 6,8, содержащего 0,1 мМ EDTA) и конъюгировали с 10-кратным молярным избытком vcMMAE в присутствии 20% об./об. раствора ацетонитрила при 4°С в течение ночи. Малеимидные группы Maleimide эффективно и специфично взаимодействуют со свободными (восстановленными) сульфгидрилами при рН 6,5-7,5 с образованием стабильных тиоэфирных связей. Избыток vcMMAE очищали и буфер заменяли на ФСБ-Д с применением концентратора для ультрафильтрования РМ 100. Выход при конъюгировании составлял приблизительно 80% от общего количества цистеинов. Образование конъюгата vcMMAE подтверждали путем ЖХ-МС анализа и путем титрования остаточных свободных тиольных групп n-хлормеркурибензоатом. Концентрации конъюгатов Hb-vcMMAE определяли путем спектроскопического анализа в УФ- и видимой областях.
Аналог мертанзина DM1 SMCC (Alb Technology Ltd, Hederson, NV, USA), функционализированный для ковалентного присоединения лизина, готовили следующим образом. Раствор гемоглобина человека доводили до концентрации гема 400 мкМ рабочим буферным раствором (0,1 мМ фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,5 мМ EDTA) и конъюгировали с 20-кратным молярным избытком DM1-SMCC в присутствии 10% об./об. раствора ДМСО при 4°С в течение 16 часов. Сложный сукцинимидиловый эфир, реакционноспособный в отношении амина, связывался с аминами, что приводило к образованию ковалентного аддукта с лизиновыми группами на поверхности белка. Избыток DM1-SMCC удаляли и буфер заменяли на ФСБ-Д с применением концентратора для ультрафильтрования РМ 100. Выход при конъюгировании составлял приблизительно 2,4 молекулы мертанзина на тетрамер гемоглобина. Образование конъюгата DM1-SMCC подтверждали путем ЖХ-МС анализа. Концентрации конъюгатов Hb-DM1-SMCC определяли путем спектроскопического анализа в УФ- и видимой областях.
67
В качестве альтернативы, раствор апобелка следует содержать на ледяной бане в течение всего процесса восстановления. 1,5-кратный молярный избыток CuT-СРР (Cu-ТСРР 4,4',4'',4'''-(порфин-5,10,15,20-тетраил)тетракис(бензойная кислота) - Cu) в 0,1 М растворе NaOH следует добавлять по каплям в раствор апоглобина в 0,2 М буфере KPi при рН 7,0, быстро перемешивать на вортексе при комнатной температуре, а затем снова помещать на ледяную баню на 30 минут. Затем раствор белка следует профильтровать через шприцевой фильтр перед применением.
Пример 8. Получение комплексов соединений с трансферрином
Сыворотку получали от здорового донора и добавляли избыток железа в присутствии цитратных ионов в качестве хелатирующего агента и бикарбоната, который облегчает связывание железа с трансферрином. Реакционная смесь содержала 6,5 мг бикарбоната натрия и 153,16 цитрата трехвалентного железа при рН=8, 4°С в течение 1 часа на 100 мл сыворотки. Затем осаждали альбумин при помощи риванола (4%) путем добавления спиртового раствора к образцу сыворотки в отношении 3,5 об./об. при 4°С и рН=9,4 в течение 2 ч. Затем раствор центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин, а затем фильтровали через фильтр на 0,8 мм шприцевом фильтре. Затем удаляли избыток риванола путем гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-25 с 0,025 М сульфатом аммония. Первое осаждение проводили 50% насыщенным сульфатом аммония при рН=6,5 с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин (удаление иммуноглобулина). Затем проводили второе осаждение в 80% насыщенном сульфате аммония, что позволяло извлекать трансферрин в виде осадка. Затем твердый осадок растворяли в 0,06 М трис-HCl буфере, рН=8, содержащем 1 М NaCl. Раствор диализировали в том же буфере для обеспечения полного удаления сульфата аммония. Затем раствор белка концентрировали с применением центробежного концентратора Centricon РМ50 вплоть до 10-15 мг/мл (оценивали по методу Бредфорда) и загружали в гель-фильтрационную колонку Сефадекс G-100 (2,4×80 см), уравновешенную в 1 MNaCl, скорость потока 15 мл/ч. Полученный таким образом трансферрин имел 88-90% чистоту, что оценивали путем ДСН-ПААГ-электрофореза. Затем в качестве конечной стадии очистки применяли ионообменную хроматографию с применением анионита ДЭАЭ-сефадекс А-50. Образец трансферрина загружали в колонку, уравновешенную 0,06 М трис-HCl при рН=8, и элюировали в режиме линейного градиента концентрации с применением буфера для элюирования, 0,3 М трис-HCl, рН=8. Чистота белка составляла более 98% с выходом приблизительно 150 мг на 100 мл сыворотки.
Холотрансферрин человека (SEQ ID №: 28, Фиг. 1), аналогично гемоглобину, можно легко ковалентно связывать с соответствующими конъюгатами лекарственных средств, хотя для него возможны только модификации по лизину из-за отсутствия свободно титруемых цистеиновых групп. Таким образом, функционализированный сукцинимидом аналог мертанзина (DM1-SMCC) применяли для ковалентного присоединения к одному или более остаткам лизина (функционализированное сукцинимидом лекарственное средство). Лекарственное средство конъюгировали с трансферрином в соответствии со следующей процедурой:
Аналог мертанзина DM1 SMCC (Alb Technology Ltd, Hederson, NV, USA), функционализированный для ковалентного присоединения лизина, готовили следующим образом. Раствор трансферрина доводили до концентрации гема 100 мкМ рабочим буферным раствором (0,1 мМ фосфатного буфера с рН 7,4, в указанном случае без EDTA из-за возможных эффектов хелатирования железа) и конъюгировали с 20-кратным молярным избытком DM1-SMCC в присутствии 8% об./об. раствора ДМСО при 4°С в течение 16 часов. Сложный сукцинимидиловый эфир, реакционноспособный в отношении амина, связывался с аминами, что приводило к образованию ковалентного аддукта с лизиновыми группами на поверхности белка. Избыток DM1-SMCC удаляли и буфер заменяли на ФСБ-Д с применением концентратора для ультрафильтрования РМ 100. Выход при конъюгировании составлял приблизительно 1,5 молекулы мертанзина на димер трансферрина. Образование конъюгата DM1-SMCC подтверждали путем ЖХ-МС анализа. Концентрации конъюгатов трансферрин-DM1-SMCC определяли путем спектроскопического анализа в УФ- и видимой областях.
67
В качестве альтернативы, раствор апобелка следует содержать на ледяной бане в течение всего процесса восстановления. 1,5-кратный молярный избыток CuT-СРР (Cu-ТСРР 4,4',4'',4'''-(порфин-5,10,15,20-тетраил)тетракис(бензойная кислота) - Cu) в 0,1 М растворе NaOH следует добавлять по каплям в раствор апоглобина в 0,2 М буфере KPi при рН 7,0, быстро перемешивать на вортексе при комнатной температуре, а затем снова помещать на ледяную баню на 30 минут. Затем раствор белка следует профильтровать через шприцевой фильтр перед применением.
Пример 9. Получение клеток, нагруженных ферритином
Полученные клетки инкубировали в растворе ферритина в течение времени и при концентрации, достаточных для обеспечения надлежащего отношения ферритин/клетка для их полной нагрузки, а также для обеспечения надлежащего содержания лекарственного средства для получения терапевтического эффекта или контраста для надлежащей визуализации. Время и концентрация могут варьироваться в зависимости от числа молекул, инкапсулированных/адсорбированных в кейдж-структуру ферритина, состояния активации клеток, условий и количества их предполагаемых введений.
Например, для обеспечения надлежащей нагрузки ферритинами клетки инкубировали в течение 1-4 часов в 0,8 мг/мл растворе ферритина в стандартных условиях культивирования. Диапазон концентраций ферритина может варьироваться по меньшей мере от 0,01 до 4 мг/мл, а время инкубирования - от 5 мин до 6 часов или более. При регулировании времени и концентрации нагрузки клеток ферритином следует учитывать влияние ферритина и условий лечения на жизнеспособность клеток. Клетки, полученные указанным выше способом, очень легко поглощают ферритины за относительно короткое время (за минуты; Фиг. 8). После поглощения ферритинов они не высвобождают их в среду для культивирования (Фиг. 9).
Тем не менее, специалист в данной области техники способен отрегулировать указанные выше условия и оптимизировать протокол для собственных целей в собственной лаборатории.
Пример 10. Получение клеток, нагруженных гемоглобином
Полученные клетки инкубировали в растворе гемоглобина в течение времени и при концентрации, достаточных для обеспечения надлежащего отношения гемоглобин/клетка для их полной нагрузки, а также для обеспечения надлежащего содержания лекарственного средства для получения терапевтического эффекта или контраста для надлежащей визуализации. Время и концентрация могут варьироваться в зависимости от числа молекул, связанных с молекулой гемоглобина, состояния активации клеток, условий и количества их предполагаемых введений.
Например, для обеспечения надлежащей нагрузки гемоглобинами клетки инкубировали в течение 1-4 часов в 0,1 мг/мл растворе гемоглобина в стандартных условиях культивирования. Диапазон концентраций гемоглобина может варьироваться по меньшей мере от 0,01 до 0,2 мг/мл, а время инкубирования - от 5 мин до 4 часов или более. При регулировании времени и концентрации нагрузки клеток гемоглобином следует учитывать влияние ферритина и условий лечения на жизнеспособность клеток. Клетки, полученные указанным выше способом, очень легко поглощают гемоглобины за относительно короткое время (за минуты; Фиг. 8).
Тем не менее, специалист в данной области техники способен отрегулировать указанные выше условия и оптимизировать протокол для собственных целей в собственной лаборатории.
Пример 11. Получение клеток, нагруженных трансферрином
Полученные клетки инкубировали в растворе трансферрина в течение времени и при концентрации, достаточных для обеспечения надлежащего отношения трансферрин/клетка для их полной нагрузки, а также для обеспечения надлежащего содержания лекарственного средства для получения терапевтического эффекта или контраста для надлежащей визуализации. Время и концентрация могут варьироваться в зависимости от числа молекул, связанных с молекулой трансферрина, состояния активации клеток, условий и количества их предполагаемых введений.
Например, для обеспечения надлежащей нагрузки трансферринами клетки инкубировали в течение 1-4 часов в 0,1 мг/мл растворе трансферрина в стандартных условиях культивирования. Диапазон концентраций трансферрина может варьироваться по меньшей мере от 0,01 до 0,2 мг/мл, а время инкубирования - от 5 мин до 4 часов или более. При регулировании времени и концентрации нагрузки клеток трансферрином следует учитывать влияние трансферрина и условий лечения на жизнеспособность клеток. Клетки, полученные указанным выше способом, очень легко поглощают трансферрины за относительно короткое время (за минуты; Фиг. 8).
Тем не менее, специалист в данной области техники способен отрегулировать указанные выше условия и оптимизировать протокол для собственных целей в собственной лаборатории.
Пример 11. Комплекс ферритина/гемоглобина/трансферрина с макрофагом в качестве подходящего средства для доставки в раковые клетки
Макрофаги из Примера 1, полученные, как описано в Примерах 8, 9 и 10, очень легко переносят ферритины, гемоглобины, трансферрины в раковые клетки: клетки рака молочной железы и рака толстой кишки мыши, рака молочной железы собак, рака груди, поджелудочной железы и мочевого пузыря человека (Фиг. 4, 10). Более того, указанный перенос гораздо более специфичен в отношении раковых клеток по сравнению с нераковыми клетками (Фиг. 11). Тем не менее, в случае раковых клеток отношение обоих типов клеток имеет решающее значение. Чем больше макрофагов, тем лучше и быстрей происходит перенос.Наиболее эффективный перенос в раковые клетки наблюдали при отношении макрофагов к раковым клеткам 1:1 или более.
Указанный перенос происходил не только, когда проводили конъюгирование белков-носителей с флуоресцентной меткой (например, FITC или Alexa610), но также когда проводили их конъюгирование/инкапсулирование с применением других соединений, например, противораковых лекарственных средств (на Фиг. 12 показан указанный перенос ферритина, инкапсулированного с флуоресцентным пролекарством, активируемым гипоксией - баноксантроном). Указанный перенос соединений, конъюгированных с противораковыми лекарственными средствами, создавал эффект, индуцирующий апоптоз в раковых клетках (Фиг. 6, 13).
Пример 12. Комплекс ферритина/гемоглобина/трансферрина с моноцитом в качестве подходящего средства для доставки в раковые клетки
Моноциты из Примера 2, полученные, как описано в Примерах 8, 9 и 10, очень легко переносят ферритины, гемоглобины, трансферрины в раковые клетки (Фиг. 14). Тем не менее, отношение обоих типов клеток имеет большое значение. Чем больше моноцитов, тем лучше и быстрей происходит перенос. Наиболее эффективный перенос в раковые клетки наблюдали при отношении моноцитов к раковым клеткам 1:1 или более.
Пример 13. Комплекс ферритина/гемоглобина/трансферрина с гранулоцитом в качестве подходящего средства для доставки в раковые клетки
Гранулоциты из Примера 3, полученные, как описано в Примерах 8, 9 и 10, очень легко переносят ферритины, гемоглобины, трансферрины в раковые клетки (Фиг. 15). Тем не менее, отношение обоих типов клеток имеет решающее значение. Чем больше гранулоцитов, тем лучше и быстрей происходит перенос. Наиболее эффективный перенос в раковые клетки наблюдали при отношении гранулоцитов к раковым клеткам 1:1 или более.
Пример 14. Комплекс ферритина/гемоглобина/трансферрина с лимфоцитом в качестве подходящего средства для доставки в раковые клетки
Лимфоциты из Примера 4, полученные, как описано в Примерах 8, 9 и 10, очень легко переносят ферритины, гемоглобины, трансферрины в раковые клетки (Фиг. 16). Тем не менее, отношение обоих типов клеток имеет решающее значение. Чем больше лимфоцитов, тем лучше и быстрей происходит перенос. Наиболее эффективный перенос в раковые клетки наблюдали при отношении лимфоцитов к раковым клеткам 1:1 или более.
Пример 15. Введение в клетки радиоизотопных меток
18
89
18
89
18
89
89
В настоящем изобретении клетки помечали F-ФДГ или Zr-оксинатом для получения ПЭТ изображения. Клетки отделяли от планшета и инкубировали с раствором F-ФДГ или Zr-оксината в подходящей концентрации для обеспечения наиболее оптимального поглощения F-ФДГ или Zr-оксината клетками, обеспечивающего их радиообнаружение в месте скопления. В указанной практике настоящего изобретения клетки инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 90 мин в растворе Zr-оксината, характеризующемся 3-9 МБк на 5 млн. клеток. Тем не менее, отношение радиоизотопов и клеток существенно влияет на эффективность реакции (Фиг. 26). После введения метки клетки центрифугировали и надосадочную жидкость удаляли. Указанную стадию следует повторять до того момента, когда в надосадочной жидкости исчезнет детектируемая радиоактивность.
Пример 16. Комплекс ферритина/гемоглобина/трансферрина/метки с лейкоцитом в качестве подходящего средства для доставки в опухоль, артритные суставы и лимфатические узлы
Макрофаги из Примера 1, полученные, как описано в Примерах 9, 10, 11 и 11; моноциты из Примера 2, полученные, как описано в Примерах 9, 10, 11 и 12, гранулоциты из Примера 3, полученные, как описано в Примерах 9, 10, 11 и 12, и лимфоциты из Примера 4, полученные, как описано в Примерах 9, 10, 11 и 12, очень эффективно мигрируют в опухоли (Фиг. 22 и Фиг. 23), артритные суставы (Фиг. 24, в конкретном указанном примере применяли моноцитарно-макрофагальную клеточную линию) и воспаленные лимфатические узлы (Фиг. 25, в конкретном указанном примере применяли моноциты/молодые макрофаги, активированные с применением М-КСФ и CCL-2). При миграции в опухоли или другие ткани они очень легко транспортируют ферритины, гемоглобины, трансферрины и метки в опухоль в количестве, достаточном для детектирования с применением систем визуализации (Фиг. 2, 3, 7, 17 и 18).
Пример 17. Комплекс лейкоцита с белком-носителем в качестве подходящей системы направленной доставки фармацевтически активного вещества в области гипоксии
Макрофаги, полученные, как описано выше, инъецировали в хвостовую вену животного с опухолью (соответствующее количество макрофагов следует отрегулировать под размер опухоли, стадию развития и наличие метастаз). Как показано на Фиг. 2 и 17, они специфичным образом достигают опухоли (через несколько часов), а также распространяются по другим органам всего тела животного (Фиг. 18). Более того, как показано на Фиг. 19, в модели гипоксии они также способны мигрировать в аваскулярные и гипоксические участки и переносить белки-носители в раковые клетки (Фиг. 3 и 20).
Для целей визуализации в хвостовую вену животного с раковой опухолью молочной железы или толстой кишки инъецировали 1-50 миллионов макрофагов. До этого макрофаги предварительно помечали при помощи Cell Tracker и нагружали ферритин-FITC (как показано в Примере 8). С применением двухфотонной микроскопии опухолевой массы через 8 часов после введения макрофагов детектировали присутствие макрофагов, несущих ферритин-FITC (Фиг. 17). Их специфичное воздействие на опухоль, а также их миграция в другие области, была представлена с применением визуализации всего тела животных (IVIS) после предварительного введения в макрофаги метки с применением цитоплазматического красителя DIR (Фиг. 18).
Мышам с опухолью внутривенно инъецировали 1-10 миллионов макрофагов, нагруженных ферритином с инкапсулированным циклофосфамидом, мелфаланом, и ферритином с инкапсулированным хлорамбуцилом (300000-500000 клеток ЕМТ6, инъецированных через кожу в боковой области). Авторы настоящего изобретения осуществляли 3 инъекции макрофагов на каждый третий день (в 5, 8 и 11 дни после инъецирования раковых клеток или в 7, 10 и 13 дни после инъецирования раковых клеток) или пять последовательных инъекций каждый день и наблюдали увеличение выживаемости мышей (Фиг. 5).
Пример 18. Комплекс лейкоцита с белком-носителем или меченый лейкоцит в качестве подходящего агента направленной доставки метки
123
89
18
Направленное воздействие системы направленной доставки, описанной в настоящем изобретении, может сопровождаться присоединением ферритина к контрастному агенту. Как показано на Фиг. 21, после инъецирования 1-50 мл макрофагов, нагруженных ферритином, связанным, как описано в Примере 8, с контрастным агентом (в указанном случае: ферригидритом, тем не менее, такие же результаты получали для изотопа, например, I), или меченых изотопом (в указанном случае Zr-оксидом или F-ФДГ) (Фиг. 21), их можно легко детектировать путем МРТ, ПЭТ или ОФЭКТ. В указанном примере (Фиг. 7) мышей с опухолью молочной железы визуализировали с применением МРТ через 3, 22 и 24 часа после внутривенной инъекции макрофагов, нагруженных ферритином Fh. Мышь лечили (в момент времени 0 ч) макрофагами. Затем наблюдали увеличенный диаметр кровеносных сосудов (стрелка), заполненных инъецированными макрофагами (что приводило к значительному снижению Т2-сигнала), а затем макрофаги распространялись по ткани (пятнообразный рисунок; стрелки). Указанные изменения (в одинаковые моменты времени) наблюдали у всех испытываемых мышей.
89
18
Макрофаги также помечали Zr-оксидом или F-ФДГ (5-50 млн.) и их радиоактивность подтверждали путем визуализации с применением ПЭТ после внутривенного введения мышам с опухолью. Указанным мышам инокулировали метастатическую клеточную линию 4Т1 за 3 недели до эксперимента и гистопатологически подтверждали наличие метастаз в легких, печени и селезенке. На Фиг. 21 видно, что макрофаги мигрировали в области с метастатическими опухолями, что позволяет визуализировать их путем ПЭТ.
Хотя приведенное выше письменное описание настоящего изобретения позволяет специалисту создавать и применять то, что в настоящее время считается наилучшим способом, специалисты поймут и оценят существование вариаций, комбинаций и эквивалентов конкретного варианта реализации, способа и примеров, приведенных в настоящем документе. Следовательно, настоящее изобретение не должно ограничиваться описанным выше вариантом реализации, способом и примерами и охватывает все варианты реализации и способы в пределах объема и сущности настоящего изобретения.