Деполимеризация хитозана гидролитическими ферментами Trichoderma viride в бессолевых условиях

УДК 54.053

С. Н. Куликов, Р. З. Хайруллин, В. П. Варламов

ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИЯ ХИТОЗАНА ГИДРОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ TRICHODERMA VIRIDE В БЕССОЛЕВЫХ УСЛОВИЯХ

Ключевые слова: хитозан, ферментативная деполимеризация, Trichoderma viride.

Показана возможность проведения деполимеризации хитозана гидролитическими ферментами Trichoderma viride в бессолевых условиях. Необходимый уровень рН поддерживается благодаря буферным свойствам самого субстрата - хитозана. В результате проведения ферментативной деполимеризации из высокомолекулярного хитозана был получен низкомолекулярный продукт со средневязкостной молекулярной массой 6,9 кДа.

Keywords: chitosan, enzyme depolymerization, Trichoderma viride.

Depolymerization of chitosan by hydrolytic enzymes of Trichoderma viride was conducted in salt-free conditions. The required level of pH is maintained by buffering properties of the substrate - chitosan. As a result of the enzymatic depolymerization of high molecular weight chitosan a low molecular weight derivatives with average molecular weight of 6.9 kD were obtained.

Введение

Хитозан - природный высокомолекулярный гетерополимер й-глюкозоамина и Ы-ацетил-О-глюкозоамина, соединённых 1,4-р-гликозидной связью. Хитозан обладает антибактериальными, антигрибными, антивирусными и

иммуномодулирующими свойствами, может быть использован как адъювант, радиопротектор, компонент гелевых и мазевых композиций, как доставщик ДНК, лекарственных и других веществ, в качестве элиситора повышает устойчивость растений к бактериальным, грибным и вирусным заболеваниям [1, 2].

Исходный хитозан является биополимером, с молекулярной массой 1000 кДа (и выше), что соответствует степени полимеризации равной 5000, практическое использование которого затруднено из-за высокой вязкости его водных растворов даже при низкой концентрации (менее 0,01%), а также недостаточной растворимости при нейтральных значениях рН и, как следствие, низкой биологической активности.

Для снижения вязкости, улучшения растворимости и усиления биологической активности высокомолекулярный хитозан подвергают химической или ферментативной деполимеризации. Полученный в процессе деполимеризации низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой от 2 до 20 кДа приобретает высокую биологической активностью и способен растворяться в растворах со значениями рН близкими к нейтральным (рН 6,5-7,0) [3-5].

Ферментативную деполимеризацию

высокомолекулярного хитозана обычно проводят в 0,2-0,3М натрий-ацетатном или натрий-лактатном буферных системах при значениях рН 4,5-6,5 [6, 7]. Причиной наличия солей буфера является не только необходимость поддержания нужных параметров кислотности реакционной среды при проведении ферментативной деполимеризации, но также и технологические особенности перевода

высокомолекулярного хитозана в растворимое

состояние.

Дело в том, что высокомолекулярный хитозан для своего растворения требует большого количества кислоты, которая придаёт такому раствору низкую кислотность (рН<3,0), непригодную для использования ферментов. Поэтому после растворения хитозанового полимера избыток кислоты нейтрализуют щелочью до значений рН (4,5-6,5) оптимальных для работы ферментов, использующихся для деполимеризации хитозана. Это приводит к присутствию в реакционной среде и, следовательно, в конечном продукте значительных количеств солей, удаление которых в масштабах промышленного производства требует дополнительного процесса диализа и может сопровождаться существенными потерями наиболее ценных низкомолекулярных фракций хитозана.

В связи с этим целью работы являлась разработка способа ферментативной

деполимеризации хитозана в бессолевых условиях.

Экспериментальная часть

В качестве объекта исследования использовали высокомолекулярный крабовый хитозан со средневязкостной молекулярной массой (Ми) 750 кДа и степенью дезацетилирования 85% (ЗАО «Биопрогресс», Московская область).

Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали из уравнения Марка-Хаувинка для хитозанов с различной степенью дезацетилирования согласно [8], степень

дезацетилирования определяли по методике, описаной в работе [7].

Для оценки собственных буферных свойств хитозана исходный полимер в количестве 0,1г растворяли в 100 мл 0,3% уксусной кислоты. Затем к раствору при постоянном перемешивании добавляли аликвоты раствора гидроксида натрия фиксируя значение рН раствора с помощью рН-метра «Н1 83141».

Для деполимеризации хитозана использовался комплекс гидролитических энзимов входящий в состав ферментативного препарата Целловиридин

Г20х (на основе ферментов штамма Trichoderma чюбв). Содержание белков в препарате Целловиридин Г20х составляет около 2,5%, остальное составляет балластные вещества клеточных стенок гриба и хлорид натрия. Для получения чистой белковой фракции препарат Целловиридин Г20х растворяли в воде, белки осаждали сульфатом натрия. Осадок ресуспендировали в воде и диализовали против воды для удаления соли. Очищенный ферментный комплекс концентрировали в ячейке иНР-43 (Япония) с использованием мембраны РМ10 (МИПроге). Концентрированный ферментный препарат высушивали лиофильно и хранили при температуре минус 20°С.

Для деполимеризации хитозана

гидролитическими ферментами Trichoderma viride в бессолевых условиях использовали переосаждённый хитозан. Для этого взвешивали 10г высокомолекулярного хитозана. Растворяли его в 1000 мл 0,3% раствора уксусной кислоты. Осаждали растворённый хитозан добавлением 20 мл 10% раствора гидроксида натрия. Отмывали осаждённый хитозан с помощью крупнопористого фильтра дистиллированной водой до тех пор, пока значение рН промывных вод не достигало рН 5,5. К полученному таким образом переосаждённому хитозану добавляли дистиллированную воду, доводя объём смеси до 1000 мл. Затем, при постоянном перемешивании, добавляли в смесь раствор 5 % молочной кислоты доводя рН раствора до 5,5. При таком значении рН переосаждённый хитозан полностью растворяется. Затем к раствору добавляли очищенный ферментный препарат, в количестве 0,025г, достигая фермент-субстратного соотношения 1:400 (фермент:субстрат). Реакцию гидролиза вели при темературе +55°С в течение 4 часов при постоянном перемешивании. Реакцию останавливали нагреванием гидролизата (отобранной аликвоты) до температуры +100°С в течение 10 минут. Результаты реакции оценивали по падению динамической вязкости раствора гидролизуемого хитозана и средневязкостной молекулярной массы хитозана.

Определение динамической вязкости растворов хитозана проводили на ротационном вискозиметре Брукфильда с цилиндрическим ротором 6/РРМ при температуре +30°С согласно [9]. Для определения вязкости отбирались аликвоты раствора из реакционной смеси во время гидролиза в различное время. Реакцию останавливали кипячением отобранной аликвоты в течение 10 минут. Степень гидролиза оценивали по падению динамической вязкости в зависимости от времени гидролиза.

Результаты и их обсуждение

Для осуществления эффективного

ферментативного гидролиза, равно как и проведения иного ферментативного процесса, требуется создание оптимальных условий для работы ферментов. Для успешной работы ферментов важную роль играет подбор необходимого уровня кислотности реакционной среды. В большинстве

случаев для этого используют буферные системы на основе неорганических или органических низкомолекулярных веществ. В данном эксперименте роль вещества, который создаёт и поддерживает буферные свойства системы осуществлял субстрат ферментативной смеси-хитозан. Как показано на рис. 1 хитозан обладает в водных растворах буферными свойствами в диапазоне рН от 5,2 до 7,5.

0.1н ЫаОН, мл

Рис. 1 - Кривая титрования хитозана раствором щёлочи

Буферные свойства хитозана обусловлены наличием в его составе многочисленных аминогрупп, которые способны связывать протоны и приобретать положительный заряд. При значениях рН 6,2-6,4, которые равны рКа хитозанов, половина аминогрупп хитозанового полимера заряжены положительно, и способны нейтрализовать поступающую в среду основания, тогда как другая половина аминогрупп остаётся незаряженными и способна связывать и тем самым нейтрализовать поступающую кислоту, что приводит к резкому изменению уровня рН среды.

Благодаря возможности поддержания уровня рН 5,2-5,5, что необходимо для проведения ферментативной реакции был осуществлён гидролиз хитозана с помощью гидролитического комплекса ферментов Т. ш^е (табл. 1).

Таблица 1 - Ферментативный гидролиз хитозана в бессолевой среде

Время, мин Динамическая вязкость, сП Ми, кДа

0 >1000 750

15 135 120

30 31,2 38

60 15,8 17

120 8,4 9,5

180 5,9 6,9

Как видно из табл. 1 ферментативный гидролиз хитозана эффективно осуществляется в условиях отсутствия солей, что выражается прежде всего в уменьшении динамической вязкости раствора

хитозана. Наиболее сильное уменьшение динамической вязкости наблюдается в первые 30 минут реакции, когда её значение уменьшается более чем на 97% от исходного. Затем эффективность гидролиза заметно снижается, прежде всего по причине накопления в реакционной среде низкомолекулярных продуктов

деполимеризации хитозана.

В ходе ферментативной реакции уменьшается и молекулярная масса хитозана. После 3 часов гидролиза молекулярная масса хитозана (Ми) достигает 6,9 кДа. Тем самым достигается получение низкомолекулярного хитозана практически не содержащий солей.

Заключение

Таким образом, проведённое исследование продемонстрировало возможность получения низкомолекулярного хитозана при помощи ферментативной деполимеризации в бессолевых условиях благодаря свойствам самого хитозанового субстрата.

Работа выполнена за счёт средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров и при поддержке гранта РФФИ 15-29-05858 офи_м.

Литература

1. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана / С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Д.А. Долбин, Р.З. Хайруллин Вестник Казанского технологического университета. - 2007. - № 6. - С. 10-14.

2. Хитозан / Под. ред. К.Г. Скрябина, С.Н. Михайлова, В.П. Варламова. Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, 2013. - 593с.

3. Пат. РФ 2073016

4. Пат. РФ 2188829

5. Хайруллин, Р.З. Зависимость растворимости хитозана от молекулярной массы и значения рН среды / Р.З. Хайруллин, С.Н. Куликов, В.Е. Тихонов, Е.А., Степанова, С.А. Лопатин, В.П. Варламов / Вестник Казанского технологического университета. - 2010. -№ 7. - С. 148-152.

6. Il'ina A.V. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii / A.V. Il'ina, N.Yu. Tatarinova, V.P. Varlamov Process Biochemistry. - 1999. - V. 34. - P. 875-878.

7. Ильина, А.В. Деполимеризация хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х / А.В. Ильина, Ю.В. Ткачёва, В.П. Варламов// Прикл. биохимия и микробиология. -2002. -Т. 38. - №2. - С. 132-135.

8. Wang, W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation / W. Wang, S. Bo, S. Li, W. Qin Int. J. Biol. Macromol. - 1991. V.13. - № 5. - P. 281-285.

9.Ikeda I. Effects of chitosan hydrolyzates on lipid absorption and on serum and liver lipid concentration in rats / I. Ikeda, M. Sugano, K. Yoshida, K. Swaki, Y. Iwaamoto, K. Hatano J. Agric. Food Chem. - 1993. - V. 41. - № 3. - P. 431-435.

© C. Н. Куликов - к.б.н, в.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; доц. кафедры технологии пищевых производств КНИТУ; с.н.с. кафедры микробиологии К(П)ФУ; kuliks@yandex.ru; Р. З. Хайруллин - к.б.н., доц. каф. промышленной безопасности КНИТУ, khayrullinrz@gmail.com; с.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; В. П. Варламов - д.х.н, зав. лаб. инженерии ферментов, Центр «Биоинженерия» РАН, varlamov@biengi.ac.ru.

© S. N. Kulikov - Cand. Biol. Sci., Leading researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; associate professor, Department of Technology of Food Production KNRTU; scientific researcher of Department of Microbiology Kazan Federal University; kuliks@yandex.ru; R. Z. Khayrullin - Ph.D., associate professor of the Department of Industrial Safety, KNRTU; Senior Researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; khayrullinrz@gmail.com; V. P. Varlamov - Doctor of chemical sciences, Head of the laboratory of enzyme engineering, Institute of Bioengineering, Research Center of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences; varlamov@biengi.ac.ru.