Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в пленку из поливинилового спирта, модифицированного $n$-винилпирролидоном

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 1. С. 210-219

Химия =

УДК 579.222:602.1:53.082.9

Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в пленку из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном

В.А. Алферов, Н.М. Филатова, Л.Д. Асулян, И.В. Блохин,

А.А. Горячева

Аннотация. Синтезирована матрица на основе поливинилового спирта (ПВС), модифицированного N-винилпирролидоном (N-ВП) для иммобилизации бактериальных клеток. Предложен механизм образования сетчатого полимера с участием оксильных радикалов. Получены основные характеристики рецепторного элемента биосенсора: селективность, операционная и долговременная

стабильность, чувствительность, нижняя граница определяемых концентраций субстрата и экспрессность определения.

Ключевые слова: модификация, поливиниловый спирт, N -винилпирролидон, бактерии Gluconobacter оxydans, иммобилизация, рецепторный элемент, биосенсор.

Введение

В настоящее время пристальное внимание уделяется разработке экспрессных методов анализа, простых в применении и, вместе с тем, обладающих достаточными уровнями чувствительности и избирательности. Аналитическими системами, сочетающими в себе перечисленные качества, являются биосенсоры — устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. К преимуществам биосенсоров можно отнести короткое время ответа, портативность, удобство в работе, а также отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца.

Основным анализирующим элементом биосенсора, содержащим биологический материал (ферменты, клетки, срезы тканей, органеллы,

антитела/антигены, молекулы ДНК, РНК), реакция которого регистрируется преобразователем, является биорецептор, биорецепторный элемент.

Ключевым этапом в создании стабильного рецепторного элемента биосенсора является иммобилизация биологического материала, от успеха которой зависит сама возможность измерения сигнала, операционные характеристики сенсора, чувствительность и селективность определения биологических компонентов в смесях сложного состава.

Наиболее перспективными носителями для иммобилизации клеток микроорганизмов являются органические полимерные материалы: природные и синтетические полимеры. Природные полимеры, как правило, механически непрочные и биодеградируемые. Использование синтетических полимеров позволяет получать пленки и гели, длительное время удерживающие биологический материал, обеспечивает возможность варьирования размеров пор, введения различных функциональных групп при сохранении каталитической активности микроорганизмов. Среди синтетических полимеров широкое распространение получили поливиниловый спирт (ПВС), полиуретаны, полиакриламид.

Цель работы: создание синтетического носителя для получения

стабильного рецепторного элемента биосенсора.

Экспериментальная часть

1. Получение ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном. Для приготовления ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном к 20 мл 5% водного раствора ПВС (M = 30000 — 50000, марка 16/1) прибавляли 0,2

- 0,8 мл водного раствора нитрата церия-аммония (NH4)2Ce(NÜ3)6 (T = 0,1 г/мл) и 0,3 - 0,1мл N-винилпирролидона при постоянном перемешивании. Перемешивание проводили при 40°С в атмосфере азота в течение 3-х часов.

ИК-спектры измеряли на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201: N -винилпирролидон с помощью приставки МНВПО; ПВС, модифицированный N-винилпирролидоном в пленке; ПВС и поливинилпирролидон (ПВП) в таблетках KBr.

2. Иммобилизация бактериальных клеток в пленку из ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном. В раствор ПВС, модифицированного N-ВП, добавляли бактериальные клетки Gluconobacter охус1апз(30 мг биомассы на 250 мкл раствора полимера), смесь переносили на предметное стекло и высушивали в течение 2 часов при 20 С. Из полученной пленки вырезали рецепторные элементы размером 3x3 мм, которые хранили в сухом виде или помещали в фосфатно-цитратный буферный раствор (рН = 6, 0) и ставили в холодильник (+4°С).

Характеристики рецепторных элементов и биосенсоров на их основе получены на биосенсорной установке, основными элементами которой являются потенциостат IPC 2L, используемый в качестве преобразователя для измерения содержания молекулярного кислорода, и электрод Кларка.

Результаты и обсуждение

Ранее для иммобилизации микроорганизмов был использован поливиниловый спирт в виде криогеля и пленок, образующихся под действием УФ-излучения [1]. Однако, рецепторные элементы, полученные при замораживании растворов ПВС, показали неудовлетворительные результаты по долговременной стабильности, что объясняется недостаточной механической прочностью криогеля, образующегося за счет водородных связей. Для получения сшитого полимера обычно используют УФ-облучение, которое губительно влияет на микроорганизмы. В связи с этим в настоящей работе была предпринята попытка получения нового носителя модификацией поливинилового спирта N-винилпирролидоном.

Модификацию ПВС проводили в присутствии нитрата церия-аммония в качестве инициатора, выбор которого основан на литературных данных по аналогии с описанной реакцией взаимодействия ПВС с N-винилпиридином [2].

В ходе эксперимента варьировали соотношение ПВС: N-винилпирролидон: инициатор (табл. 1). Качество полученных пленок оценивали по их набуханию в буферном растворе. Исчезновение двойных связей в N-винилпирролидоне контролировали по ИК-спектрам, которые сравнивали со спектрами исходных веществ.

Как видно из приведенных в табл. 1 данных, увеличение содержания инициатора в реакционной смеси приводит к исчезновению в ИК-спектре полосы 1625 см-1 (табл. 1, опыт № 4-6), характерной для области валентных колебаний С=С — связи, что подтверждает разрыв двойных связей в N -винилпирролидоне.

Пленки, полученные простым смешиванием растворов ПВС и ПВП, после высушивания растворяются в буферном растворе, а пленки на основе ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном в присутствии инициатора (табл. 1, опыт № 4-6), набухают, но не растворяются, что служит доказательством сетчатой структуры полученного полимера.

Предполагаемый механизм сшивки с участием ионов Се+4 в качестве инициатора приведен ниже:

— на первой стадии происходит восстановление ионов церия с образованием оксильных радикалов [3]:

— далее образовавшиеся на первой стадии оксильные радикалы взаимодействуют с N-винилпирролидоном с образованием полимер-радикалов:

Таблица 1

Влияние соотношения реагентов на модификацию поливинилового спирта

N-винилпирролидоном

№ Мольные

опыта соотношения, ПВС: N -ВП:

инициатор

ИК-спектры

2400 : 280 : б

2400: 190 : б

2400 : 90 : б

2400 : 90 : 1б

2400 : 90 : 10

2400 : 90 : 7

1

2

4

б

б

— сшивка происходит за счет реакции рекомбинации образовавшихся полимер-радикалов:

Условия синтеза не исключают образование и разветвленного полимера при взаимодействии полимер-радикалов с N-винилпирролидоном.

В результате проведенных экспериментов получена полимерная композиция на основе ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, дающая тонкие, прочные, упругие пленки, набухающие, но не

растворяющиеся в буферном растворе.

Полимерная композиция была использована в качестве носителя для иммобилизации бактериальных клеток Gluconobacter oxydans sbsp. indus-trius B-1280 с целью получения биорецепторного элемента сенсора для определения содержания органических соединений в водных средах.

Оценка субстратной специфичности иммобилизованных микроорганизмов была проведена по 14 различным субстратам с концентрацией 1 моль/л. Для сравнения представлены данные по рецепторному элементу, полученному иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans методом адсорбции (рис. 1) [1].

Как можно видеть, иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans в полученный полимер практически не влияет на их субстратную специфичность: такие же результаты, кроме данных по лактозе, получены при адсорбции на стекловолоконном фильтре [1].

120

100

о сс 80

О о К 60

о

<1> Й 40

н

20

0

Ж

адсорбция на стекловолокон ном фильтре

включение в пленку ПВС, модифицирован ногоЫ-

винилпирроли

доном

* ¿У///<Г *

ЧЧ'° * \<! 4?

Субстраты

Рис. 1. Субстратная специфичность бактериальных клеток Gluconobacter oxydans sbsp. industrius Б-1280

Для определения операционной стабильности полученного биорецептор-ного элемента проведено 15 последовательных измерений ответов биосенсора на растворы этанола и глюкозы с концентрацией 5 ммоль/л. Относительное стандартное отклонение для этанола составило 0,8%, для глюкозы — 1,5%.

Для получения количественной информации о содержании анализируемых веществ были изучены зависимости аналитического сигнала сенсора от концентраций субстратов в кювете в разные дни функционирования биосенсора (рис. 2, 3).

Рис. 2. Зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозы в кювете

Полученные зависимости имеют гиперболический характер и подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен, параметры которого представлены в табл. 2. Из приведенных в таблице данных видно, что эффективные константы Михаэлиса для процессов окисления глюкозы и

(/ ’

Ту L т 1 1 —і

на 21 -ый день на 34-ый день на 63-ий день

Концентрация этанола в кювете, ммоль/л

Рис. 3. Зависимости ответа биосенсора от концентрации этанола в кювете

этанола в рецепторном элементе на 7, 21 и 34 дни практически одинаковы, а на 63 день функционирования биосенсора зависимости имеют низкий коэффициент корреляции, следовательно, протекающие процессы уже не описываются уравнением Михаэлиса-Ментен.

Таблица 2

Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен для зависимостей ответа биосенсора от концентраций глюкозы и этанола в кювете

№ градуировочных зависимостей Субстраты Максимальная скорость Vmax; нА/мин Эффективная константа Михаэлиса Км, ммоль/л Коэффициент корреляции И2

1 (7 день) глюкоза 187±7 2,7±0,2 0,9945

этанол 181±12 0,33±0,08 0,9957

2 (21 день) глюкоза 190±10 3,3±0,4 0,9916

этанол 144±4 0,3±0,1 0,9807

3 (34 день) глюкоза 116±5 2,7±0,3 0,9921

этанол 96±3 0,2±0,07 0,9875

4 (63 день) глюкоза 19,7±0,5 0,42±0,05 0,9775

этанол 95±2 0,2±0,05 0,9104

Коэффициент чувствительности биосенсора находили по тангенсу угла наклона линейных участков, верхняя граница которых определяется эффективной константой Михаэлиса. Оказалось, что коэффициент чувствительности глюкозы составил 35, а этанола — 340 нА л/мин-ммоль, что в целом согласуется с данными по субстратной специфичности и значениями констант Михаэлиса.

Зависимость интенсивности отклика биосенсора от концентраций субстратов, полученная на 63 день использования рецепторного элемента дает низкие коэффициенты корреляции, поэтому такой зависимостью нельзя пользоваться для анализа. Так как на 34 день работы биосенсор

обладает такими же характеристиками при определении органических субстратов, как на 7 и 21 дни, можно считать, что долговременная стабильность полученного рецепторного элемента составляет 30-40 дней. Пленка, полученная иммобилизацией клеток СЫсопоЪаЫвт охуйапв в синтезированный полимер, может храниться в сухом виде в холодильнике до 3-х недель. Вырезанные из нее рецепторные элементы обладают теми же характеристиками, что и свежеполученные.

Метрологические и аналитические характеристики биосенсоров и полученных рецепторных элементов на основе бактериальных клеток СЫсопоЪасЬет охуйапв в сравнении с аналогичными в криогеле ПВС [1] приведены в табл. 3.

Таблица 3

Сравнительная характеристика рецепторных элементов биосенсоров на основе бактериальных клеток аисопоЬасЬет охуйапв

Характеристика Способ иммобилизации

Криогель ПВС Пленка из ПВС, модифицированного N-винилпирроли-доном Адсорбция на стекловолоконном фильтре

глюкоза этанол глюкоза этанол глюкоза

Операционная стабильность, % 9,9 не определено 1,5 0,8 3

Долговременная стабильность, суток 10 10 30-40 30-40 8

Чувствительность, нА -л/ (мин ммоль) 4±1 8±3 35±2 340±20 950

Нижняя граница определяемых концентраций, моль/л 1, 8 • К-1 О 1 со чТ 1 0 1 • ОО 3 • К-1 О 1 05 7,2*10~7 чТ 1 0 1 • ,4 0,

Экспрессность, мин 7-10 7-10 5-7 5-7 8-12

Как видно из приведенных в табл. 3 данных, при иммобилизации бактерий в пленку из ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном, в 3-4 раза увеличивается долговременная стабильность сенсоров; в 9 и 40 раз чувствительность на глюкозу и этанол, соответственно; значительно уменьшается предел обнаружения определяемых субстратов, а также время проведения анализа, по сравнению с аналогичными характеристиками, полученными при иммобилизации бактерий СЫсопоЪаЫет охуйаив в криогель

ПВС и методом адсорбции на стекловолоконном фильтре, полученными в работе [1].

Выводы

Синтезирована матрица для иммобилизации микроорганизмов на основе пленки из ПВС, модифицированного N-винилпирролидоном.

Установлено, что биорецепторные элементы на основе бактериальных клеток Gluconobacter оxydans, иммобилизованных в пленку из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, сохраняют свои рабочие характеристики при хранении в сухом виде при температуре = +4°С в течение трех недель.

Использование нового носителя для иммобилизации бактерий Gluconobacter оxydans позволило улучшить основные характеристики рецепторных элементов и биосенсоров на их основе.

Список литературы

1. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных

рецепторных элементов биосенсоров / Л.Д. Асулян [и др.]. // Изв. ТулГУ. Сер.

Химия. 2006. Вып.6. С.137-144.

2. Synthesis of a Self-Gelatinizable Grafting Copolymer of Poly (vinyl Alcohol) for

Construction of an Amperometric Peroxidase Electrode / Bin Li [et al.]. // Analytical

Biochemistry. 1998. P.130-132.

3. Liu Y, Zhang J, Zhang R, Zhou W. Прививка 4-винилпиридина на ПВС,

инициируемая калийпериодкупратом (III) // Высокомолекулярные соединения.

2006. Т.48, №7. C.1190-1194.

Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Филатова Наталия Михайловна (kuzya-333@mail.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Асулян Людмила Дмитриевна (asuljan@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Блохин Игорь Васильевич (blokhiniv@mail.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Горячева Анастасия Анатольевна (goryachevanastya@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Obtaining stable receptor elements biosensor, immobilization of bacterial cells Gluconobacter oxydans the film from polyvinyl alcohol, modified N-vinylpyrrolidone

V.A. Alferov, N.M. Filatova, L.D. Asuljan, I.V. Blokhin, A.A. Goryacheva

Abstract. Synthesized matrix based on polyvinyl alcohol (PVA) modified with N -vinylpyrrolidone to immobilize bacterial cells. The mechanism of formation of network polymers with oksilnyh radicals. The basic characteristics of the receptor element of the biosensor: the selectivity, the operating and long-term stability, sensitivity, lower limit is determined by substrate concentration and rapid determination.

Keywords : modification, Poly (vinyl Alcohol) with N-vinilpirrolidon, sensor, immobilization, bioreceptor elements.

Alferov Valerij (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, department of chemistry, Tula State University.

Filatova Natasha (kuzya-333@mail.ru), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.

Asuljan Lyudmila (asuljan@rambler.ru), candidate of chemical sciences, department of chemistry, Tula State University.

Blokhin Igor (blokhiniv@mail.ru), candidate of chemical sciences, department of chemistry, Tula State University.

Goryacheva Anastasia (goryachevanastya@rambler.ru), candidate of chemical sciences, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 10.01.2011