СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У ЖИВОТНЫХ
METHOD OF SIMULATING AMYLOIDOSIS IN ANIMALS

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей.
Амилоидоз (амилоидная дистрофия) - нарушение белкового обмена, сопровождающееся образованием и отложением в тканях специфического белково-полисахаридного комплекса - амилоида.
Развитие амилоидоза связано с извращением белково-синтетической функции ретикуло-эндотелиальной системы, накоплением в плазме крови аномальных белков, служащих аутоантигенами. В результате взаимодействия антигена с антителом происходит осаждение грубодисперсных белков, участвующих в образовании амилоида. Откладываясь в тканях (например, в стенках сосудов, железистых и т.п.), амилоид вытесняет функционально специализированные элементы органа.
Амилоид является сложным гликопротеидом, в котором фибриллярные и глобулярные белки тесно связаны с полисахаридами. Амилоид состоит из полипептидных цепей, что определяет двойное лучепреломление при окраске конго красным, свойственное амилоиду. Кроме фибриллярного белка в состав амилоида входит другой белок - так называемый Р-компонент, который одинаков при всех формах амилоидоза.
Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan.-Mar. - 6 (1 Pt 2). P.107-116). В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов моделирования амилоидоза для получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза.
Известен классический способ моделирования экспериментального амилоидоза (Грицман А.Ю. Некоторые вопросы экспериментальной терапии амилоидоза и резорбции амилоида. // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук. М., 1974), заключающийся в введении белым мышам через день по 0,5 мл 5%-ного казеината натрия подкожно в течение 60 дней. Недостатком его является то, что приготовление раствора казеината связано с определенными сложностями, такими как поиск чистого казеина, необходимость растворения его точной навески в кипящем 0,25%-ном растворе гидроокиси натрия, фильтрование, стерилизация, хранение. Готовый раствор казеината натрия имеет щелочную реакцию, высокое содержание натрия, что резко ограничивает применение данной модели при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей, связанных с влиянием натрия и его определением.
За прототип нами взят способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение №2269825, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 10.02.2006, заявка №2004127649/14 от 15.09.04 г., МПК G09B 23/28), заключающийся в введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно в течение 30 дней.
Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая, то что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно.
Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для моделирования экспериментального амилоидоза используются старые крысы-самцы (возраст 18-24 мес., масса 350-400 г), которым проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. Введение нативного яичного альбумина приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением почек, селезенки, печени в течение 60 дней эксперимента.
Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела старых крыс-самцов линии «Вистар» (возраст 18-24 мес., масса тела 350-400 г) в течение 60 дней.
Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
Экспериментальным животным (старые крысы-самцы в возрасте 18-24 мес., массой тела 350-400 г) в качестве белкового препарата вводят нативный яичный альбумин через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
Для получения экспериментального системного амилоидоза в качестве экспериментальных животных выбраны крысы-самцы линии «Вистар» массой 350-400 г в возрасте 18-24 мес., так как именно старческая брадитрофия тканей позволяет ставить вопрос о моделировании амилоидоза. На молодых крысах амилоидоз не воспроизводится из-за особенностей обмена веществ, а крысы старше 24 мес. погибают в ходе эксперимента. Для моделирования системного амилоидоза экспериментальным животным проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней.
У контрольных и опытных животных исследуется 6-часовой спонтанный диурез. Клубочковая фильтрация определяется по клиренсу эндогенного креатинина, рассчитывается канальцевая реабсорбция воды. Содержание натрия и калия в моче определяется методом пламенной фотометрии, содержание кальция - спектрофотометрически. Основные процессы мочеобразования и экскреция электролитов определяются по истечении 2 недель, 1 и 2 месяцев.
По истечении времени эксперимента (2 мес.) животные забиваются под наркозом. Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго красным) подвергаются внутренние органы. Образцы тканей фиксируются в 10%-ном нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго красным. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.
Сущность заявляемого способа подтверждается функционально и морфологически.
Исследования показали, что в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения нативного яичного альбумина отмечается увеличение диуреза через 1 месяц и через 2 месяца (табл.1). Увеличение диуреза обусловлено повышением скорости клубочковой фильтрации (СКФ). В течение второго месяца эксперимента спонтанный диурез продолжает увеличиваться, несмотря на повышение канальцевой реабсорбции воды.
Экскреция натрия под влиянием амилоидогена в условиях спонтанного 6-часового диуреза повышается на протяжении обоих месяцев.
Экскреция калия и кальция под влиянием нативного яичного альбумина в условиях спонтанного диуреза возрастает на протяжении всего эксперимента, особенно по истечении 2 месяцев (табл.2).
Под влиянием введения нативного яичного альбумина отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии более чем в 2 раза на протяжении 2 месяцев (табл.1).
Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически.
Фиг.1. Отложение амилоида в клубочках и канальцах почек. Выраженная конгофилия клубочков и канальцев почек, отек интерстиция. Выраженная паренхиматозная дистрофия канальцев.
Фиг.2. Отложения амилоида в стенках сосудов почек, в основном в интиме и мышечном слое. Утолщение и разрыхление стенок сосудов.
Фиг.3. Отложение амилоида в печени преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. Отмечается очаговая диффузная конгофилия гепатоцитов.
Фиг.4. Отложение амилоида в селезенке преимущественно вокруг лимфоидных фолликулов и в стенке сосудов.
Пример №1.
Проведены серии опытов из 2-х групп:
1-я группа - (10 крыс-самцов линии «Вистар» - контрольная.
2-я группа (10 крыс-самцов линии «Вистар») - амилоидная - животным проводились подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела крыс-самцов в возрасте 18-24 мес. в течение 60 дней.
Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска конго красным) подвергнуты внутренние органы, кровеносные сосуды.
В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативного яичного альбумина для моделирования экспериментального амилоидоза у старых крыс-самцов.
Гистологически у 2-ой группы животных в почках (фиг.1) при окраске срезов конго красным отмечалась выраженная конгофилия медуллярных и кортикальных стромально-сосудистых структур (артериол и капилляров) почки, в большей степени проявлявшаяся в мальпигиевых клубочках, капсуле Шумлянского-Боумена, базальных мембранах канальцев, гистоструктурах почечной лоханки и чашечек. Выявлялась слабая эндотелиальная реакция капилляров клубочков и сосудов микроциркуляторного русла стромы почки, особенно коркового слоя.
Исходя из полученных результатов исследования обосновывается использование нативного яичного альбумина для моделирования амилоидоза у старых крыс.
Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде в приложении.
Подводя итог, следует отметить, что подкожное введение старым крысам нативного яичного альбумина является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.