СУБСТРАТ ДЛЯ УСИЛЕННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА
SUBSTRATE FOR SURFACE REINFORCED RANSCATTERING SPECTROSCOPY

Изобретение относится к области физических исследований и создания сенсоров, предназначенных для детектирования органических и неорганических молекул, в частности, для усиления сигнала комбинационного рассеяния (КР) света и повышения чувствительности, что позволяет исследовать и детектировать молекулы образца с высокой чувствительностью.
Усиленная поверхностью спектроскопия КР света, или, как ее еще называют, спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света, или, в английской версии, «усиленная поверхностью Рамановская спектроскопия» (Surface-enhanced Raman spectroscopy, или SERS), применяется для детекции и структурного анализа химических соединений, биологических молекул, лекарственных препаратов и т.д. При реализации усиленной поверхностью спектроскопии КР исследуемый образец должен быть расположен на так называемом ГКР-активном субстрате, который может представлять собой, в самом простом случае, пластину из серебра или золота, или более сложные полупроводниковые поверхности с различными упорядоченными или неупорядоченными наноразмерными неоднородностями. Во многом именно структура поверхности ГКР-активного субстрата, а также принцип связывания с этой поверхностью и расположения на нем исследуемого образца, определяют чувствительность усиленных поверхностью спектроскопических измерений.
Например, известна подложка для детектирования биологических макромолекул и комплексов радионуклидов в воде на основе ГКР света, описанная в [1]. Известная подложка представляет собой трехслойную структуру, состоящую из планарного слоя, на который нанесен слой листов графена, расположенных преимущественно перпендикулярно первому слою, и третьего слоя, выполненного в виде пленки из золота толщиной 50-200 нм. При этом для анализа исследуемого образца (авторами известного изобретения для примера выбран белок бычьего сывороточного альбумина (БСА)) его неспецифически адсорбируют на поверхности известного ГКР-активного субстрата из водного раствора. К недостаткам известного ГКР-активного субстрата стоит отнести то, что при исследовании органических молекул, например, белков, которые представляют собой глобулярную или фибриллярную структуру размером от нескольких нанометров и более, они прикрепляются к поверхности без какой-либо пространственной ориентации, что приводит к снижению воспроизводимости результатов, а чувствительность измерений оказывается сниженной в силу высокого уровня фонового сигнала.
Известно устройство, описанное в способе усиления сигнала КР света [2], когда на ГКР-активный субстрат наносят смесь исследуемого образца с наночастицами серебра размером порядка 32 нм. К недостаткам известного изобретения относится низкая воспроизводимость результатов, так как исследуемый белок (авторами для примера был выбран белок БСА) не имеет заданной пространственной ориентации, а также заниженная чувствительность, так как расстояние между исследуемым образцом и усиливающей поверхностью никак не нормируется.
Известно устройство, описанное в способе детекции заданных аналитов [3], основанное на комбинировании принципов иммуноанализа и ГКР света. В нем описан ГКР-активный субстрат, который покрыт антителами, специфичными к исследуемым аналитам, а также способными связывать ГКР-активные метки для детекции сигналов ГКР или гигантского резонансного КР (ГРКР) света (по-английски «surface-enhanced resonance Raman scattering)) -поверхностно-усиленное резонансное Рамановское рассеяние). Обнаружение целевого аналита происходит по принципу конкурентного анализа: когда искомый аналит присутствует в исследуемом образце, то он вытесняет ГКР-активные метки из антител, и при этом фактически детектируется падение ГКР или ГРКР сигнала. К недостаткам известного решения стоит отнести то, что оно не направлено на спектроскопическое исследование образца, а предназначено только для детекции отсутствия или наличия заданного аналита в исследуемом образце.
Ближайший аналог предлагаемому нами техническому решению, призванному повысить чувствительность при проведении исследований методами ГКР света, не обнаружен.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании ГКР-активного субстрата для проведения исследований методом спектроскопии ГКР света, который позволяет связывать биологические молекулы с поверхностью ГКР-активного субстрата пространственно-ориентированным образом на расстоянии необходимом для поверхностного усиления сигнала КР, а также обладает резонатор-подобной структурой, что совместно обеспечивает усиление сигнала КР света.
Технический результат достигается тем, что предложен субстрат для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света, состоящий из твердой плоской подложки, на поверхности которой иммобилизованы аффинные метки одного и более видов для связывания с аффинными группами на молекуле исследуемого образца, а также включающий слой металла, полученный путем напыления поверх поверхности образца.
-1
-1
-1
-1
2
Усиление спектра при ГКР света достигается за счет эффекта гигантского комбинационного рассеяния света на молекулах исследуемого образца, находящегося вблизи поверхности ГКР-активного субстрата. При этом усиление и сам вид спектра зависят как от свойств самого ГКР-активного субстрата (его материала, шероховатости, структуры, и т.д.), длины волны падающего излучения, оптических свойств и состава исследуемого образца, так и взаимного расположения, и взаимодействия образца и субстрата. Также известно, что при снятии спектров двух и более различных аналитов, результирующий спектр обусловлен молекулами аналита, которые обладают наиболее оптимальным размером, зарядом и другими параметрами для эффективного взаимодействия с поверхностью ГКР-активного субстрата и соответственно усилению их спектра. При исследовании биологических молекул на получаемом спектре можно детектировать пики характерные для различных аминокислот, например, триптофана (около 760 см), фенилаланина (около 1000 см), или для групп, например, Амид III (около 1240 см) или СН (около 1450 см). При этом на вид спектра и соотношение интенсивностей пиков влияет также конформация белка и его расположение относительно поверхности ГКР-активного субстрата. Таким образом, для получения воспроизводимых спектров необходимо обеспечить единообразное присоединение исследуемых белковых молекул. Лучше всего для этого подходят аффинные метки малого размера, так как они обеспечивают максимальное сближение поверхности ГКР-активного субстрата и молекул исследуемого образца. К примеру, при использовании в качестве аффинных меток антител, расстояние между аналитом и поверхностью будет ограничено размером антитела (порядка 15 нм, а в случае с однодоменными антителами - около 3-4 нм), если использовать пару стрептавидин-биотин, то расстояние будет около 7 нм, а аптамеры на основе нуклеиновых кислот или аминокислот обладают размером порядка 3 нм. Наиболее перспективным выглядит использование гексагистидиновой метки, которую можно ввести в последовательность исследуемого белка, так как она эффективно связывается с Ni- нитрилотриуксусной кислотой, что обеспечивает сближение анализируемого аналита и поверхности ГКР-активного субстрата на расстояния порядка 1,5-2 нм или применение тиол содержащих соединений, которые хорошо иммобилизуются на поверхности ГКР-активных субстратов и образуют дисульфидные связи с аминокислотными остатками цистеина в структуре исследуемого аналита, что позволяет располагать исследуемые белки на расстоянии менее 1 нм. Напыление слоя металла поверх поверхности образца необходимо для создания резонатор-подобной структуры, когда удается добиться образования сильной связи между собственной электромагнитной модой резонатора, образованного поверхностью ГКР-активного субстрата и напыленным слоем металла, и электронным или колебательным переходом молекул образца. Эта система образует плазмонный резонатор Фабри-Перо, который усиливает внутреннее электромагнитное поле и при лазерном освещении полость межу подложкой и напыленным слоем заполняется плазмонами, которые эффективно взаимодействуют с исследуемым объектом и вызывают ГКР. Благодаря высокому усилению спектроскопия ГКР света может использоваться для исследования аналитов практически на уровне единичных молекул. За счет пространственной ориентации молекул образца удается добиться одинаковой ориентации дипольных моментов отдельных молекул, что позволяет повысить средний дипольный момент ансамбля молекул аналита и увеличить силу связи энергетических состояний молекул аналита с локализованным электромагнитным полем в условиях сильной связи. Стоит отметить, что квантовая эффективность флуоресценции на два порядка выше, чем резонансного комбинационного рассеяния, а заключение аналита между поверхностью ГКР-активного субстрата и напыленным слоем металла приводит к гашению флуоресценции металлическими поверхностями за счет нерадиационных переходов в металле. Это позволяет снизить аутофлуоресценцию образца и, соответственно, повысить чувствительность за счет снижения фонового сигнала.
Существует первый частный случай, когда твердая плоская подложка выполнена из серебра, золота, меди, платины, алюминия, галлия, индия, щелочных металлов или их сплавов.
Существует второй частный случай, когда твердая плоская подложка выполнена из кремния или стекла, на поверхность которых нанесен слой серебра, золота, меди, платины, алюминия, галлия, индия, щелочных металлов или их сплавов толщиной от 1 до 100000 нм.
Существует третий частный случай, в котором твердая плоская подложка содержит на своей поверхности периодические, упорядоченные или неупорядоченные наноструктуры размером от 1 до 500 нм, в форме наностержней, нанокубов, наносфер, нанотреугольников, нанопластин, нанозвезд или их комбинаций.
Существует четвертый частный случай, характеризующийся тем, что в качестве аффинных меток, иммобилизованных на поверхности твердой плоской подложки, применены молекулы стрептавидина, биотина, глутатиона, молекулы кислот, для удержания ионов двухвалентных переходных металлов, аптамеры на основе олигонуклеотидов или пептидов, молекулы, содержащие тиольные группы, или их комбинации.
Существует пятый частный случай, когда в качестве металла для напыления использовано серебро, золото, платина, алюминий, галлий, индий, или щелочные металлы.
Существует шестой частный случай, в котором толщина слоя металла на поверхности образца составляет от 1 до 200 нм.
На фиг. 1 представлена принципиальная схема, иллюстрирующая конкретный пример субстрата для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света. На фиг. 1 цифрами обозначены следующие элементы: твердая плоская подложка - 1; 1-додекантиол - 2; исследуемая белковая молекула - 3; аминокислотный остаток цистеина в структуре исследуемой белковой молекулы - 4; дисульфидная связь - 5; слой металла, полученный напылением поверх поверхности образца.
-3
-4
-3
Принцип применения предлагаемого субстрата для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света раскрывается следующим примером. Изготовление ГКР-активного субстрата для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света и нанесение на него образца проводят следующим образом. На первом этапе изготавливается твердая плоская подложка, для чего из предметного стекла толщиной 1 мм вырезается прямоугольник размером 15×25 мм и проводится обезжиривание путем протирания изопропиловым спиртом. Затем образец размещается в вакуумной камере и откачивается воздух до остаточного давления 1 Па, после чего известным способом проводится обработка тлеющим разрядом при токе 0,3 А, мощности 1,5 кВт в течение 30 минут. После чего откачивается воздух до остаточного давления 2*10 Па и известным способом проводится напыление серебра из молибденового тигля с помощью нагрева от электроннолучевой пушки в режиме: ток 40 мА; напряжение 8 кВ в течение 1,5 минут, что позволяет создать слой серебра толщиной порядка 90-100 нм. На втором этапе проводится нанесение молекул 1-додекантиола на полученную твердую подложку, для чего она погружается в раствор 10% (3-аминопропил) триметоксисилана в этаноле на 5 минут при 60°С, а затем трижды промывается в этаноле и высушивается. Сухая подложка помещается на 1 час в раствор 1-додекантиола (10 моль/л) в этаноле, а затем трижды отмывается в этаноле и высушивается. На третьем этапе проводится нанесение образца, в качестве которого был выбран рецептор-связывающий домен гликопротеина S (RBD, от английского Receptor Binding Domain). Для разрушения существующих дисульфидных связей RBD предварительно обрабатывается трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлоридом. Затем белок адсорбируется из капли, на которую вертикально опускается полученная подложка, покрытая слоем 1-додекатиола, до момента растекания капли по ее поверхности. Спустя 5 минут проводится промывка дистиллированной водой (5 раз по 1 мл) с последующим высушиванием в разряженной атмосфере в течение 24 часов. На четвертом этапе проводится напыление серебра поверх поверхности аналита, для чего подложка помещается в вакуумную камеру и воздух откачивается до остаточного давления 2*10 Па без обработки тлеющим разрядом. Затем проводится напыление серебра из молибденового тигля с помощью нагрева от электроннолучевой пушки в режиме: ток 40 мА; напряжение 8 кВ в течение 30 секунд, что позволяет создать слой серебра толщиной порядка 10 нм. В результате чего получается образец предлагаемого субстрата для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света. В качестве контролей для сравнения используется субстрат, который не проходил второй этап изготовления, субстрат, который не проходил четвертый этап изготовления, и субстрат, который не проходил второй и четвертый этапы изготовления.
-1
-1
Получение спектров белка RBD на различных ГКР-активных субстратах проводилось с помощью спектрометра комбинационного рассеяния WITec 500 Alpha в режиме картирования. Площадь картирования составляла 25×25 мкм. К спектрометру был подсоединен оптический микроскоп, что позволяло фокусироваться на отдельных участках ГКР-активного субстрата с образцом. В ходе исследования были выбраны следующие параметры работы прибора: длина волны лазерного излучения 785 нм, мощность 2-3 мВт, объектив 50Х, время накопления сигнала 4 сек. Спектры поверхностно усиленного комбинационного рассеяния белка RBD приведены на фиг. 2, спектр RBD при его исследовании на предлагаемом субстрате - А; спектр RBD при его исследовании на субстрате который не проходил второй этап изготовления - Б; спектр RED при его исследовании на субстрате который не проходил четвертый этап изготовления - В; спектр RBD при его исследовании на субстрате который не проходил второй и четвертый этапы изготовления - Г. Из сравнения спектров А и Б и оценки интенсивности пика в районе 753 смвидно, что пространственно-ориентированное связывание молекул RBD дает усиление около 8 раз (рост высоты пика со 100 до примерно 800 относительных единиц) при условии напыления верхнего слоя серебра на оба субстрата с образцом. Из сравнения спектров В и Г и оценки интенсивности пика в районе 753 см видно, что пространственно-ориентированное связывание молекул RBD дает усиление примерно в 2,5 раза (рост высоты пика с 20 до 50 относительных единиц), когда напыление верхнего слоя серебра не проводилось. При этом видно, что напыление верхнего слоя серебра без пространственно-ориентированного связывания молекул RBD, дает усиление всего в 5 раз (сравнение спектров Б и Г, рост интенсивности с 20 до 100 относительных единиц), в то время как при пространственно-ориентированном связывании молекул RBD это усиление уже около 16 раз (сравнение спектров А и В, рост интенсивности с 50 до 800 относительных единиц). При этом эффект усиления от нанесения верхнего слоя серебра поверх молекул образа втрое выше при пространственно-ориентированном связывании молекул образца, чем без него, а эффект усиления от пространственно-ориентированного связывания молекул образца втрое выше при условии нанесения верхнего слоя серебра, чем без него. Таким образом, синергичный эффект от двух элементов предлагаемого ГКР-активного субстрата позволяет добиться усиления сигнала в 40 раз  в то время как суммарное усиление от двух этих элементов по отдельности дает усиление лишь в 12,5 раз  что свидетельствует о значительном повышении чувствительности детекции и усилении сигнала спектроскопии ГКР света с предлагаемым ГКР- активным субстратом.
Предложенный субстрат для усиленной поверхностью спектроскопии комбинационного рассеяния света позволяет пространственно-ориентированным образом плотно к подложке располагать биологические молекулы и обладает резонатор-подобной структурой, что в комплексе обеспечивает усиление получаемого сигнала и, следовательно, повышает чувствительность данного метода исследования.
Источники информации
1. Евгений Александрович Ширшин, Станислав Александрович Евлашин, Павел Викторович Дьяконов, Даниил Дмитриевич Лысухин. Подложка для детектирования биологических макромолекул и комплексов радионуклидов в воде на основе гигантского комбинационного рассеяния. Патент RU 182459 U1.
2. Андрей Юрьевич Зюбин, Елизавета Ивановна Константинова, Василий Анатольевич Слежкин, Карина Игоревна Матвеева, Илья Геннадьевич Самусев, Максим Викторович Демин, Валерий Вениаминович Брюханов. Способ получения усиленного сигнала комбинационного рассеяния света от молекул сывороточного альбумина человека в капле жидкости. Патент RU 2708546 С1.
3. Peter Cyril White, Salah Athmani, William Ewen Smith, Daran Antony Sadler. Immunoassays involving surface enhanced Raman scattering. Патент US 6750065 B1.