Штамм бактерий Streptococcus thermophiles T-5367, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов
STRAIN OF BACTERIA STREPTOCOCCUS THERMOPHILES T-5367 USED AS STARTER OF DIRECT APPLICATION FOR PREPARATION OF FERMENTED MILK PRODUCTS

Штамм бактерий Streptococcus thermophilus Т-5367, используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.
Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и представляет собой новый штамм Streptococcus thermophilus Т-5367, обладающий высокой ростовой активностью и используемый в качестве закваски прямого внесения для приготовления кисломолочных продуктов.
Молочнокислые термофильные стрептококки хорошо известны как представители заквасочных культур, используемых в производстве кисломолочных продуктов. Термофильный молочнокислый стрептококк является компонентом многих кисломолочных продуктов, таких как йогурт, ряженка, простокваша, варенец и др.
Основным производственно ценным свойством молочнокислых стрептококков является способность отдельных штаммов синтезировать экзополисахариды. Данные вещества обеспечивают реологические свойства образующегося при сквашивании молока сгустка. Также установлено, что микробные полисахариды обладают выраженными иммуностимулирующими свойствами.
Обеспечение продуктами питания, имеющими высокую биологическую ценность и способными оказывать лечебно-профилактическое действие (выполняя роль продуктов функционального питания), является важным аспектом пищевой промышленности. Особое место среди продуктов функционального питания занимают кисломолочные продукты.
Производство кисломолочных продуктов питания основано на использовании стартовых культур. Например, для производства продуктов молочнокислого брожения применяют стартовые культуры молочнокислых бактерий. В последнее время разрабатываются новые стартовые культуры молочнокислых бактерий с промышленно важными свойствами: обеспечение микробиологической безопасности и органолептические, технологические, пищевые и/или медицинские преимущества.
Качество и биологическая ценность кисломолочных продуктов напрямую зависят от применяемых стартовых культур. Культуры должны обеспечивать воспроизводимость технологического процесса, стабильное качество готовой продукции; кроме того, культуры должны быть устойчивы к бактериофагам, иметь высокую выживаемость, обеспечивать ферментируемый молочный продукт необходимыми свойствами, а также позволять проявлять больше гибкости на производстве, при комбинировании различных заквасочных микроорганизмов.
Для удовлетворения данных требований применяют закваски прямого внесения (Direct Vat Set (DVS) / Direct Vat Inoculation (DVI)), которые производятся в виде замороженных гранул или в лиофилизированной форме. Для обеспечения высокого качества заквасок прямого внесения, штаммы культур должны обладать высокой выживаемостью в процессе изготовления заквасок прямого внесения. Концентрированные или порошкообразные закваски обеспечивают двойное преимущество, заключающееся в сохранении жизнеспособности культур в течение длительного промежутка времени и, особенно, в их пригодности для прямого введения закваски в перерабатываемое молоко.
Основными компаниями-правообладателями в исследуемой области являются Chr. Hansen (Дания), Bright Dairy & Food Co. (Китай), Meiji Holdings Co (Япония), DuPont Nutrition & Biosciences (Дания), Gervais Danone (Франция), NESTEC (Швейцария).
Задачей изобретения является получение нового штамма, не являющегося генетически модифицированной культурой, обеспечивающего получение функциональных продуктов питания, а также обладающего высокой эффективностью в процессе получения сухой лиофилизированной микробной массы для изготовления заквасок прямого внесения.
Задача изобретения решается посредством селекции нового штамма Streptococcus thermophilus Т-5367 (регистрационный номер ГКНМ №1266), отвечающего современным требованиям, предъявляемым к компонентам кисломолочных продуктов, и обладающего высокой биохимической активностью.
Настоящее изобретение относится к культуре штамма молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus Т-5367, которая по ряду полезных качеств может быть использована в качестве монозакваски или компонента закваски прямого внесения для производства кисломолочных лечебно-профилактических продуктов питания.
Технический результат заключается в том, что предлагаемый к использованию штамм обладает высокой скоростью роста при культивировании и укороченной лаг-фазой при сквашивании молока по сравнению с аналогичными штаммами данного вида, а кисломолочные продукты на его основе обладают средней кислотностью (100-120°Т), которая сохраняется на протяжении 14 суток хранения, а также плотным, колющимся сгустком. При хранении кисломолочных продуктов с использованием данного штамма не образуется сыворотка.
Предлагаемый штамм Streptococcus thermophilus Т-5367 новый, в научной и патентной литературе не описан.
Штамм Streptococcus thermophilus Т-5367 выделен из домашней простокваши. Штамм Streptococcus thermophilus Т-5367 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки «Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора под коллекционным номером №1266.
1. Изучение анатомо-морфологических свойств штамма.
Изучение колоний в полужидкой среде проводили на протяжении 12 пересевов суточных культур. В полужидкой питательной среде форма единичных колоний - шарик диаметром 1 мм, на поверхности плотной питательной среды вырастают прозрачные непигментированные круглые, выпуклые в центре колонии с неровным краем (R-форма), мягкой консистенции. Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, крупные кокки, овальной формы, образующие длинные цепочки. Капсулу не образуют.
2. Идентификация изучаемого штамма.
Для идентификации изучаемого штамма по белкам клеточной стенки использовали Bruker Daltonik MALDI Biotyper. Для этого брали единичные колонии 24 часовых культур третьей генерации, выращенных на поверхности МРС-4 в анаэробных условиях.
По данным MALDI штамм Streptococcus thermophilus Т-5367 определен как Streptococcus thermophilus с высокой долей достоверности.
3. Изучение технологических свойств штамма.
Для определения особенностей штамма проводили культивирование при максимальной температуре 50°С. (Оптимальная температура развития для штамма 40-45°С, максимальная 45-50°С).
Наблюдается выраженный рост по всей толще среды без зоны аэробиоза, в полужидкой БС среде при высоких температурах. Данная культура растет в толще полужидких питательных сред и на поверхности плотных сред в присутствии кислорода, т.е. штамм относится к аэротолерантным микроорганизмам (микроаэрофилам).
4. Изучение протеолитической активности культуры.
Изучение протеолитических свойств, накопление титруемой кислотности в молоке проводили на стерильном 12% сухом восстановленном обезжиренном молоке, приготовленном в лаборатории питательных сред ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (СОМ по ГОСТ 33629-2015 "КОНСЕРВЫ МОЛОЧНЫЕ. МОЛОКО СУХОЕ. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ", поставщик Агропромышленный Союз «Алев»).
Кислотность кисломолочных продуктов определяли в условных единицах - градусах Тернера (Т) (ГОСТ 3624-67).
Ход определения: в колбу или стакан на 100-150 мл отмеряют пипеткой 10 мл исследуемого продукта. Остатки продукта на стенках пипетки смывают 20 мл дистиллированной воды, добавляют 3 капли 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1 Н раствором NaOH до появления бледно-розового цвета, не исчезающего в течение 1 минуты. Количество щелочи, израсходованное на титрование, умножают на 10 в пересчете на 100 мл продукта. Штамм к 16 часам сквашивает молоко с образованием равномерного сметанообразного сгустка приятного вкуса без синерезиса. В 1 мл сквашенного стерильного молока к 12 часам культивирования накапливается 108 микробных клеток. Каталазу не образует. Данные накопления титруемой кислотности представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице, заявляемый штамм термофильных стрептококков проявляет стабильные протеолитические свойства.
5. Изучение антибиотикочувствительности штамма.
Чувствительность штамма к антибиотикам изучали на модели 15 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации Назыровой Н.Р. с соавт., 2008 г., рекомендованной МУ 2.3.2.2789-10. В работе использовали диски производства HiMedia для определения чувствительности к антимикробным препаратам. Полученные данные представлены в таблице 2.
Streptococcus thermophilus Т-5367 чувствителен к стрептомицину, ампициллину, цефалотину, линкомицину, гентамицину, хлорамфениколу (левомицитину), пенициллину-G, тетрациклину, эритромицину, ванкомицину, имипенему, промежуточно-устойчив к ципрофлоксацину, полимиксину, канамицину, налидиксовой кислоте.
6. Изучение ферментативной активности штамма.
При изучении ферментативных свойств штамма сравнивали данные двух тест-систем API-50 CHL и АНАЭРОТЕСТ - 23. По результатам изучения ферментативных свойств штамма термофильных стрептококков с применением двух тест-систем было обнаружено, что заявляемый штамм ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу, мочевину, замедленно ферментирует D-арабинозу, ксилозу, фруктозу, рамнозу, маннозу, галактозу.
Оптимальная температура культивирования 37±1°С. В качестве сред для культивирования штамма использовали обезжиренное молоко, среду Блаурокка, ГМ-среду, МРС, МРС-2, МРС-4 и другие.
Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в защитной сахарозо-желатиновой среде при температуре 4±2°С не менее 12 месяцев.
Штамм не является генетически модифицированным, относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах СП 1.3.2322-08 и СП 1.3.2518-09. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
Генетическая идентификация штамма подтверждена с помощью анализа 16SpPHK.
7. Изучение антагонистической активности штамма.
Изучение антагонистической активности штамма проводили согласно МУ 2.3.2.2789-10 Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов. В качестве штамма-прототипа использовали штамм Streptococcus thermophilus ВКПМ В-7987, характеризующийся наиболее коротким временем сквашивания молока и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 3.
Полученные данные подтверждают, что заявляемый штамм проявляет более высокую антагонистическую активность в отношении основных патогенных микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления.
Для подтверждения высокой активности сквашивания заявляемого штамма по сравнению со штаммом-прототипом, в качестве которого использовали Streptococcus thermophilus ВКПМ В-7987, депонированный во Всеросийской коллекекции промышленных микроорганизмов, лиофилизаты каждого штамма в объеме 0,1% вносили в восстановленное сухое молоко. При этом наблюдаемый период лаг-фазы у заявляемого штамма был значительно короче (30 минут), чем у штамма-прототипа (2 часа), что является важным условием для промышленного производства кисломолочной продукции.
Аналогичным образом изучали скорость накопления биомассы у заявляемого штамма и штамма-прототипа, которая также показала, что изменение оптической плотности жидкой культуры заявляемого штамма через 6 часов культивирования в питательной среде на основе СОМ достигало 25 OD, в то время как у штамма-прототипа она составляла 13 OD, т.е. была выше примерно в 2 раза.
Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Для приготовления производственной закваски прямого внесения на первом этапе получали посевной материал для засева в ферментер, для этого ресуспендировали флакон лиофилизированной культуры штамма, а полученную суспензию вносили в среду Блаурокка и инкубировали при температуре 37°С 16-18 ч.
Полученную культуру использовали в качестве посевного материала для получения культуры 2-ой генерации. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации: 12-18 ч.
Для получения жидкой биомассы посевной материал 2-ой генерации вносили в биореактор в количестве ~ 5% от объема среды культивирования. Среда культивирования - СОМ. Время инкубации до 6 ч.
Для получения сухой лиофилизированной микробной массы жидкую биомассу концентрировали методом центрифугирования, смешивали со средой высушивания на основе сахарозы и желатины и проводили лиофильное высушивание.
Полученный лиофилизат может быть использован в качестве закваски, как в виде монокультуры или как компонент комплексной закваски для производства кисломолочной продукции.
Пример 2. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления простокваши.
Для приготовления простокваши использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат заявляемого штамма в количестве 0,1% вместе с лиофилизатом штамма Lactobacillus helveticus Т-5068 (штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под клллекционным номером №1263) также в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,4. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Образующийся сгусток - белый, плотный, колющийся, без признаков синерезиса. Вкус - кисломолочный, кислый. рН простокваши на 7 день хранения составила 4,0, на 14 день хранения 3,9. Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.
Пример 3. Использование штамма в составе сухой комплексной закваски прямого внесения для приготовления йогурта.
Для приготовления йогурта использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат заявляемого штамма в количестве 0,1% вместе с лиофилизатом штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Т-4809 (штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) Федерального бюджетного учреждения науки Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под коллекционным номером №1266.) также в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,5. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Образующийся сгусток - белый, не тянущийся, без признаков синерезиса. Вкус - кисломолочный, йогуртный, слабокислый, инертный. рН йогурта на 7 день хранения составила 4,3, на 14 день хранения 4,2. Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.
Пример 4. Использование штамма в виде моно-закваски прямого внесения для приготовления варенца.
Для приготовления варенца использовали нормализованное молоко жирностью 3,2%, подогретое до температуры 42°С. Вносили лиофилизат заявляемого штамма в количестве 0,1%. После внесения молоко тщательно перемешивали и инкубировали 5-6 часов при температуре 42°С до достижения значения рН кисломолочного продукта равного 4,4. После окончания инкубирования кисломолочный продукт охлаждали до температуры 2-8°С. Образующийся сгусток - белый, плотный, колющийся, без признаков синерезиса. Вкус - кисломолочный, нейтральный. рН варенца на 7 день хранения составил 4,3, на 14 день хранения 4,2. Срок годности получаемого продукта составляет не менее 14 дней.
Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования в составе моно- или поликомпонентной закваски прямого внесения.