Клеточные технологии в лечении заболеваний периферических артерий

ОБЗОРЫ

Клеточные технологии в лечении заболеваний периферических артерий

Я.Н. Шойхет, Н.Г. Хорев

ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития РФ, Барнаул

Cell-based therapy for peripheral arterial diseases

Ya.N. Shoykhet, N.G. Khorev

SEI of HPE «Altay State Medical University» of the Federal Agency of Public Health and Social Development, Barnaul

Число заболеваний периферических артерий остается в мире на высоком уровне. Поиск новых методов лечения проводится в направлении улучшения состояния дистального артериального русла, уменьшения периферического сопротивления и стимулирования развития капиллярной сети. Одним из возможных путей решения данной проблемы является использование клеточных технологий стимуляции ангиогенеза. Одним из новых перспективных методов лечения является аутологичная клеточная терапия с использованием мононуклеарных клеток костного мозга или периферической крови. Настоящий обзор посвящен исследованию аутологичной клеточной терапии в лечении заболеваний периферических артерий.

Ключевые слова: ишемия конечностей, аутологичная клеточная терапия, мононуклеарные клетки, стимуляция ангиогенеза.

The number of peripheral artery disease remains in the world. Search for new methods of treatment is to improve the condition of the distal blood stream, reduce peripheral resistance and stimulating capillary network. One possible solution to this problem is to use cellular technologies stimulate angiogenesis. A new promising treatments is autologous cell therapy using BMMNC or PBMNC. This overview focuses on the exploration of autologous cell therapy in treating diseases of the peripheral arteries.

Key words: limb ischemia, autologous cell-based therapy, mononuclear cells, angiogenesis stimulation.

Общая распространенность заболеваний периферических артерий (ЗПА), оцененная в нескольких эпидемиологических исследованиях, варьировала в пределах 3—10%, достигая 15—20% среди больных старше 70 лет [1]. Соотношение больных с манифестными и бессимптомными формами ЗПА вне зависимости от возраста находится в пределах 1:3—1:4 [2]. Обычно клиническое течение ЗПА носит стабильный характер и только у четверти наступает значительное ухудшение с развитием, в частности, перемежающейся хромоты. Высокая ампутация — сравнительно редкий исход патологии, необходимый менее 2% больным с ЗПА [3]. Такое стабильное течение процесса связано с реализацией компенсаторных механизмов — развитием коллатерального кровообращения. Ампутации конечности у больных с ЗПА проводятся как следствие неэффективного лечения критической ишемии (КИ). Арсенал медикаментозных воздействий не всегда эффективен. Можно сказать, что в настоящее время в лечении подобных вариантов поражения реконструктивная сосудистая хирургия и возможности лекарственных средств достигли определенного предела [4]. В процессе артериогенеза без дополнительной перфузии артериолы могут увеличиваться в 20 раз [5]. Появление новых артерио-артериальных коллатераль-

e-mail: starok@agmu.ru

ных связей приводит к увеличению числа и размера сосудов с формированием типичного трехслойного строения стенки. После окклюзии большой артерии реализация этого механизма происходит от 4 до 6 нед. [6]. Дальнейший поиск проводится в направлении улучшения состояния дистального артериального русла, уменьшения периферического сопротивления и стимуляции развития капиллярной сети с использованием методов клеточных технологий.

Результаты применения клеточных технологий на моделях ишемии конечностей

Большое количество экспериментальных исследований на мышах, крысах, а также на крупных животных показали возможность и эффективность клеточной терапии в восстановлении кровотока в ишемизированной конечности. Показано увеличение числа циркулирующих эндотелиальных прогени-торных клеток (endothelial progenitor cells, EPC) как ответ на экспериментально созданную ишемию [7]. Экспериментально продемонстрировано внедрение этих клеток в капилляры и артериолы [8]. Краткий обзор результатов экспериментальных исследований на животных приведен в табл.1.

Таблица 1. Результаты экспериментальных исследований

Ссылка Тип клеток Животные Результаты

[12] hEPC мыши Усиление кровотока, повышение плотности капилляров

[77] PBMNC, PMN крысы Формирование коллатеральных сосудов

[78] BMC мыши Увеличение числа капилляров, внедрение клеток в периваскулярное пространство

[79] MSC мыши Рост коллатерального кровотока, восстановление функции конечности, снижение числа ампутаций, уменьшение мышечной атрофии

[80] MSC мыши Внедрение клеток в периваскулярное пространство, увеличение уровней bFGF и VEGF

[81] Миобласты кролики Ускорение неоваскуляризации

[82] BMC мыши Усиление кровотока, повышение плотности капилляров

[83] BMC крысы Ускорение неоваскуляризации

[84] MSC, MNC крысы Увеличение перфузии

[85] ADSC мыши Рост индекса ангиогенеза

[86] EPC крысы Восстановление EPC

[87] EPC мыши Заживление трофических поражений и усиление роста сосудов

[88] BMC кролики Увеличение ангиографического индекса, повышение плотности капилляров, рост TcPO2 , заживление трофических язв

[90] PBMNC мыши Повышение плотности капилляров, внедрение клеток в периваскулярное пространство

[91] MSC мыши Увеличение длительности сохранения конечности

[92] hADSC мыши Увеличение плотности капилляров

[93] BMC мыши Усиление кровотока, увеличение плотности капилляров

[94] BMC мыши Рост уровней bFGF и VEGF

[95] BMC мыши Усиление кровотока (лазерная доплеровская флоуметрия) и плотности капилляров

Примечание: hEPC — человеческие эндотелиальные клетки-предшественницы (human endothelial progenitor cells); PBMNC — мононуклеарные клетки периферической крови (peripheral blood mononuclear cells); PMN — полиморфноядерные лейкоциты (polymorphonuclear leukocytes); BMC — клетки костного мозга (bone marrow cells); EPC — эндотелиальные клетки-предшественницы (endothelial progenitor cells); MSC — мезенхимальные стволовые клетки (mesenchymal stem cells); MNC — мононуклеарные клетки (mononuclear cells); ADSC — клетки, полученные из жировой ткани (adipose tissue-derived cells); hADSC — клетки, полученные из жировой ткани человека (human adipose tissue-derived cells).

Клинические результаты аутологичной клеточной терапии

Первый большой отчет по использованию аутологичной клеточной трансплантации в качестве метода терапевтического ангиогенеза (Therapeutic Angiogenesis using Cell Transplantation, TACT) был опубликован E. Tateishi-Yuyama с соавт. в 2002 г. В этом пилотном открытом рандомизированном контролируемом исследовании участвовало 25 больных ЗПА с хронической КИ, которым невозможно было провести реваскуляризацию или другие виды лечения. Терапия включала использование мононуклеарных клеток костного мозга (BMMNC) в количестве 1,6±0,6х109, которые вводились в 40 точек икроножной мышцы

«более ишемизированной» конечности с лодыжечноплечевым индексом (ЛПИ) < 0,6. Контролем служило аналогичное введение 0,9% раствора хлорида натрия в «менее ишемизированную» конечность с ЛПИ > 0,6. В период наблюдения от 4 до 24 нед. отмечен рост ЛПИ, повышение чрезкожного напряжения кислорода (transcutaneous oxygen pressure, TcPO2), а также исчезновение постоянных болей и увеличение дистанции безболевой ходьбы [9].

Следующая часть этого исследования включала 22 случайно набранных больных с двухсторонней критической ишемией. В одну ногу им вводились BMMNC (активное лечение), а в другую ногу (контроль) — нестимулированые PBMNC (получены

без предварительной мобилизации из костного мозга). Через 4 нед. после ведения BMMNC наблюдался рост ЛПИ и TcPO2 у 13 из 20 больных. Исчезновение боли и увеличение дистанции безболевой ходьбы отмечено у 16 человек. В то же время иньекции нестимулированных PBMNC не оказали благотворного влияния на клинические результаты, а также на параметры ЛПИ и TcPO2. Авторы предположили, что успех TACT связан с использованием BMMNC, содержащих примерно в 500 раз большее количество CD34+ гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и других клеток-предшественниц, по сравнению с фракцией нестимулированных PBMNC.

Дополнительный интерес к технологии TACT привлекла публикация B.E. Strauer с соавт. (2002), в которой приведены результаты трансплантации стволовых клеток у больных с инфарктом миокарда [10].

В дальнейшем количество исследований, посвященных терапевтическому ангиогенезу, увеличивалось, формируя полноценное направление в клеточных технологиях (табл. 2).

В исследованиях, приведенных в табл. 2, различны методы получения и пути введения клеток. Более того, степень ишемии конечностей у больных различалась от Rutherford-2/Fontaine-IIa до КИ — Rutherford-6/ Fontaine-IV [11]. Большинство исследований включали малое число наблюдений при отсутствии контрольных групп. Однако взятые вместе результаты клеточной терапии свидетельствуют об улучшении перфузии конечности (рост ЛПИ на 0,1—0,2 и TcPO2 на 10—20 mmHg O2) и клинической эффективности метода, проявляющейся в заживлении трофических язв и увеличении дистанции безболевой ходьбы на 100-200 м.

Таблица 2. Результаты клинических исследований по применению BМMNC в лечении пациентов с ЗПА

Ссылка Характеристика исследований Число больных, патология ЛПИ TcPO2 Боль А Результат

[9] 1 45 (ЗПА, СД) t t і і +

[95] 3 8 (ЗПА, ОТ) t 0 і і +

[41] 3 8 (ЗПА,СД) t t і і +

[39] 3 8 (ЗПА) t t і і +

[96] 3 12 (ЗПА, КИ) t 0 і t +

[97] 3 10 (ОТ, КИ) t t і і +

[40] 1 28(ОТ) t t і і +

[56] 3 10 (ЗПА, КИ) t t 0 0 +

[75] 3 8 (ОТ, КИ) 0 0 і t +

[98] 3 7 (ОТ, КИ) 0 0 і і -

[32] 2 74 (ЗПА, СД) t t і t +

[34] 3 12 (ЗПА, СД) t t і і +

[99] 3 16 (ЗПА, КИ) t t і і +

[100] 3 28 (ЗПА, КИ) t t і і +

[101] 3 8 (КИ) 0 0 і і +

[59] 3 27 (ЗПА) t t і +

[102] 3 16 (ЗПА) 0 t і -

[26] 3 51(КИ) t t і і +

[27] 3 37 (КИ, СД) t t і t +

Примечание: патологии: ЗПА — заболевания периферических артерий; СД — сахарный диабет; ОТ — облитерирующий тромбангиит; КИ — критическая ишемия. Параметры оценки: ЛПИ — лодыжечно-плечевой индекс; ТсР02 — чрезкожное напряжение кислорода; А — ампутации (большие или малые); X — рост показателя; 0 — отсутствие изменений показателя; і — уменьшение показателя. Характеристика исследования: 1 — рандомизированное открытое контролируемое; 2 — контролируемое; 3 — неконтролируемое. Итоговый результат: « + » — положительный, «—» — отрицательный.

Исходные клеточные популяции

для терапевтического ангиогенеза

Осуществлению клеточной терапии сердечнососудистых заболеваний предшествовала теоретическая концепция о возможности EPC костного мозга мигрировать в места поврежденного эндотелия сосудов. Образование сосудов (ангиогенез) на уровне капилляров реализуется за счет гемангиобластов (EPC). После первого описания EPC, сделанного T. Asahara с соавт. в 1997 г. [12], к настоящему моменту опубликовано уже более 800 научных статей о предполагаемой роли EPC в процессе ангиогенеза [13]. Однако до сих пор нет определенного стандартизированного описания этого типа клеток [14]. Кроме того, ангиогенез как истинное образование новых кровеносных сосудов никогда не был убедительно показан у людей. Как следствие, роль EPC человека в ангиогенезе при развитии периферической сосудистой обструкции остается дискуссионной [15].

В то же время достаточно хорошо обоснована концепция артериогенеза, в которой участвуют некоторые дифференцированные типы клеток костного мозга, объединенные моноцитарным фенотипом. Эти клетки мигрируют в периваскулярные пространства коллатеральных сосудов и обеспечивают рост артерии через реализацию ангиогенных факторов роста. По современным представлениям, терапевтический эффект лечения ЗПА основан на применении мобилизированных PBMNCs, CD133+-клеток [16] или высоко очищенной фракции мобилизированных G-CSF CD34+-клеток периферической крови [17].

Следует иметь в виду, что во всех вышеупомянутых исследованиях использовались аутогенные клетки костного мозга или периферической крови. Терапия аллогенными клетками донора проводится, главным образом, в рамках экспериментальных или первых фаз клинических исследований. Вместе с тем, различные аллогенные и собственные ткани были предложены в качестве альтернативных источников исходной клеточной популяции для терапевтического ангиогенеза, например, пульпа зуба [18], жировая ткань [19], эндометрий [20], плацента [21], пуповинная кровь [22]. Однако клинические результаты этих исследований не завершены.

Методы сепарации клеток

Для применения в клинической практике клеточная терапия должна быть простым и эффективным способом лечения ЗПА. Однако сложные требования к получению клеток препятствуют широкому применению метода. Залогом успеха является селективное выделение и обогащение клеток-предшественниц костного мозга или периферической крови, так как «цельный» костный мозг в любых дозах не будет эффективен.

В клинических исследованиях, приведенных в табл. 2, проводилась эксплантация 100—800 мл костного мозга с получением мононуклеарной фракции различными методами сепарации:

1) использование системы Ficoll™, основанной на создании градиента плотности при центрифугировании [23—25];

2) применение систем COBE Spectra (Gambro, Sweden); CS 3000-Plus (Baxter Healthcare, USA), созданных на принципах центрифугирования крови и плазмафереза [9]:

3) использование SmartPrep (Harvest Technologies, USA) — прикроватной системы центрифугирования [26, 27].

В среднем, при выполнении сепарации с помощью этих систем возможно получение от 1,5 до 10х109 мононуклеарных клеток костного мозга. Как система Ficoll™, так и другие сепараторы удовлетворяют требованиям GCP и проводятся специализированными службами переливания крови или в отделениях гематологии, а последующее культивирование клеток требует специального лабораторного оснащения [28, 29]. Учитывая эти трудности, разработана одноразовая прикроватная закрытая изолированная система, которая может быть использована в неспециализированных больницах без дополнительных правовых ограничений. При использовании этой системы общее время процедуры сократилось с 8—10 ч до 1 ч. Кроме того, эта система значительно дешевле, чем Ficoll™ или другие сепараторы [26, 27]. Как показано на моделях животных, артериогенный потенциал (концентрация BMMNC), создаваемый этой системой, по меньшей мере, эквивалентен или даже выше, чем у системы Ficoll™ [30]. Более того, субфракционирование, требующее сложной сепарации и прижизненного увеличения дозы клеток, не улучшает результаты, которые получены при использовании неселективных BMMNC или PBMNC [31, 32]. Подобные выводы сделаны в исследовании по использованию стволовых клеток у больных инфарктом миокарда — TOPCARE-AMI [33].

P. Hernandez с соавт. (2007) [34] сравнил клиническую эффективность сепаратора клеток крови и систему Ficoll™ разделения плотности центрифугированием. Автор обнаружил положительный клинический эффект при использовании обоих методов у больных ЗПА. При поражении коронарных артерий F.H. Seeger с соавт. (2007) [35] сравнили технологию Ficoll™ и метод получения клеток на системе Lymphoprep™. В отличие от Ficoll™ метод Lymphoprep™ позволяет получить градиент плотности путем центрифугирования в растворе полисахарида. Необходимость такого сравнения была обусловлена тем, что в исследовании AST-AMI не было обнаружено улучшения сердечной функции при внутрисердечных инъекциях BMMNC, полученных методом Lymphoprep™ [36]. С другой стороны, исследования TOPCARE-AMI [33] и REPAIR-AMI

[37] показали, что применение BMMNC, полученных с помощью системы Ficoll™, не улучшает сердечную функцию. На основании этого F.H. Seeger с соавт. сделали вывод, что различные стабилизаторы (солевые растворы, гепарин) приводят к уменьшению (примерно на треть) числа BMMNC, получаемых с использованием метода Lymphoprep™ [35].

Дозировка применяемых клеток

Количество вводимых мононуклеарных клеток (mononuclear cells, MNCs) у больных ЗПА может колебаться в довольно широких пределах: от 0,1 х109 до 50х109 MNCs [38]. В более ранних работах MNC вводились в количестве 1,6х109 [9, 39]. Позднее S. Durdu с соавт. (2006) применили 50-кратное увеличение числа MNCs при лечении больных облитери-рующим тромбангиитом [40].

До недавних пор не было данных относительно прямого дозозависимого эффекта клеточной терапии в ходе реализации терапевтического ангиогенеза. Только в одном исследовании на восьми больных

ЗПА сделана попытка установить связь между клиническими ответом и количеством введенных клеток [41]. MYSTAR — недавно опубликованное клиническое испытание, в котором показана положительная корреляция между количеством введенных стволовых клеток и темпом улучшения сердечной перфузии. Оно показало, что единственным предиктором сокращения размера инфаркта было число внутри-сердечных инъекций [42].

Доля Сй34+-ГСК обычно составляет от 0,6% и 2,4% от общего числа трансплантируемых MNC. Однако до сих пор убедительно не доказаны корреляции между количеством введенных Сй34+-кпеток и терапевтическим эффектом. Это связано с тем, что полученные Сй34--клетки имеют ангиогенный потенциал, сходный с CD34+ клеточной популяцией

[38], которая не является основной для осуществления процессов ангиогенеза.

Использование колониестимулирующих

факторов

Необходимость эксплантации большого объема костного мозга для получения достаточного количества клеток предопределила идею мобилизации клеток из костного мозга с дальнейшим получением их из периферической крови. Это достигается введением в течение нескольких дней таких факторов роста, как G-CSF или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF). В период стимуляции происходит выход стволовых и прогениторных клеток в кровоток, откуда они могут быть выделены путем лейкофереза [43]. Этот ме-

Пути введения клеток при реализации терапевтического ангиогенеза

Так как клеточная терапия ишемических заболеваний находится только на стадии исследований, то стандартизированного метода введения клеток нет: используются внутримышечный, внутривенный, вну-триартериальный и комбинированные пути введения в зависимости от патологии и предпочтений исследователей.

тод уже давно используется для доноров стволовых клеток при гематологических заболеваниях [44, 45]. В исследованиях in vitro показано, что PBMNC, мобилизованные с помощью G-CSF, обладают меньшей ангиогенной активностью, чем BMMNC. Несколько лет назад было высказано предположение, что блокада моноцитарного апоптоза GM-CSF повышает ангиогенную активность клеток [43], что является определенным преимуществом применения этого фактора роста [46]. Однако последующие клинические исследования не подтвердили подозреваемого ангиогенного потенциала GM-CSF [47].

Клинические исследования по использованию PBMNC, полученных после мобилизации из костного мозга в кровоток, приведены в табл.3.

Результаты, представленные в табл. 3, сходны с результатами работ по применению BMMNC (см. табл. 2). Тем не менее, ряд исследователей утверждают, что сосудистый регенераторный потенциал G-CSF-стимулированных клеток ниже, чем BMMNC [48]. Р.Р. Huang с соавт. (2007) провели сравнение клинических результатов лечения двух групп больных: первой (72 пациента) вводились G-CSF стимулированные PBMNC, второй (75 пациентов) — BMMNC. В обеих группах получено одинаковое увеличение перфузии и уменьшение ишемии [32]. В исследовании TOPCARE-AMI были проанализированы результаты интракоронарного введения BMMNC и EPC периферической крови больным после острого инфаркта миокарда. Не обнаружено различий в сократительной функции и коронарном резерве при введении этих двух популяций клеток [49].

На моделях животных (мыши, крысы, кролики) с ишемией конечности (см. табл. 1) BMMNC или PBMNC вводились внутривенно, в то время при моделировании ишемии миокарда у тех же животных клетки вводились в сердечную мышцу [50]. К сожалению, при анализе значительного объема литературных данных не удалось найти публикации, посвященные сравнению способов введения клеточных популяций при ишемии конечностей на

Таблица 3. Результаты исследований по применению мобилизованных PBMNC в лечении пациентов с ЗПА

Ссылка Характеристика исследований Больные ЛПИ TcPO2 Боль А Общий результат

[103] 2 5 (ЗПА) 0 t i +

[48] 2 30 (ЗПА, КИ) t t i i +

[28] 2 7 (КИ) t t i +

[104] 1 28(КИ, СД) t t i i +

[105] 2 6 (ОТ) t t i +

[31] 2 75(КИ) t t i i +

[32] 1 76 (ЗПА) t t i +

Примечание: патологии: ЗПА — заболевания периферических артерий; СД — сахарный диабет; ОТ — облитерирующий тромбангиит; КИ — критическая ишемия. Параметры оценки: ЛПИ — лодыжечно-плечевой индекс; ТсР02, чрескожное напряжение кислорода; А — ампутации (большие или малые). Характеристика исследования: 1 — контролируемое; 2 — неконтролируемое; X — рост показателя; 0 — отсутствие изменений показателя; X — уменьшение показателя.

более крупных животных. Внутримышечные или вну-триартериальные инъекции, а также их сочетания дали многообещающие результаты при лечении пациентов с ЗПА (см. табл. 2). Обоснованием внутримышечных инъекций является создание депо клеток с паракринной активностью в зоне ишемии. «Судьба» MNC, вводимых в скелетные мышцы, неизвестна. Но от 0,44% до 10% клеток сохраняется в мышцах до 4 сут., при кумулятивном времени выживания до двух недель [51, 52]. Введение в икроножную мышцу по принципу симметричной сетки с фиксированным числом инъекций (между 20 и 60) является более предпочтительным и примененным в большинстве работ (см. табл. 2 и 3), за исключением последних исследований: пилотного BONMOT-1 [26] и плацебо-контролируемого двойного слепого исследование BONMOT-CLI [53]. В этих испытаниях инъекции проводились вдоль пораженной артерии, так как наибольшая плотность коллатералей определяется в тканях, окружающих артерии, а рост коллатералей происходит, главным образом, по ходу сосуда [54]. В BONMOT-1 и 2 количество инъекций было увеличено соответственно длине артериальной окклюзии от 40 инъекций для инфраподколенного поражения, до 60 инъекций при бедренно-подколенно-берцовом поражении.

Исследователи, применяющие внутриартериаль-ный путь введения, закономерно выполняют инъекции клеток в сосуды, ответственные за кровоснабжение тканей зоны максимальной степени ишемии [126—128, 55—57]. Т. Bartsch с соавт. (2007) сообщил о лечении 13 больных со степенью ишемии Fontaine IIa/b путем комбинации внутриартериального и внутримышечного введения BMMNC. Авторы наблюдали увеличение дистанции безболевой ходьбы и рост ЛПИ [58]. R.B. Van Tongeren с соавт. (2008] сравнили внутримышечный с внутримышечно-внутриартериальным путями введения у 27 больных, придя к заключению, что оба способа доставки аутогенных клеток являются безопасными, приводят к увеличению дистанции безболевой ходьбы у больных с тяжелыми формами ЗПА, которым невозможно провести традиционные методы лечения [59].

Возможности воздействия на клеточные

популяции

Манифестация клинических симптомов ЗПА атеросклеротического генеза, по всей видимости, связана с декомпенсацией механизмов, ответственных за реализацию процессов ангиогенеза. В частности, несмотря на нуждаемость организма в клеточных источниках ангиогенеза, у большинства пациентов наблюдается сокращение функциональных способностей и числа циркулирующих клеток костного мозга [60—62]. В этой связи, описаны различные лекарственные препараты, стимулирующие пролиферативную активность EPC, в их числе статины [63—66], блокаторы рецепторов ангиотензина, вар-денафил, пуероранин, эстрогены, илопрост и эри-тропоэтин [67—71]. Наконец, генный трансфер VEGF в EPCs вызывает усиление пролиферации in vitro [72], что показано на моделях животных [73, 74]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что существуют возможности стимуляции функциональной активности аутогенных стволовых клеток, получаемых от пациентов с тяжелым атеросклерозом, диабетом и ишемической болезнью сердца.

Безопасность

Безопасность любой медицинской технологии — критический и основополагающий момент для её регистрации и последующего использования, поэтому оценка безопасности является главной задачей первой фазы любых клинических испытаний. Использование клеточной терапии с учетом предрассудков неосведомленной в области биотехнологий общественности требует еще более убедительного подтверждения безопасности метода, в связи с чем в исследованиях по терапевтическому ангиогенезу этому вопросу уделяется значительное внимание.

В некоторых клинических исследованиях в отдаленном периоде были выявлены нежелательные побочные эффекты клеточной терапии при лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. Так, ряд дискуссионных на предмет связи с введением клеток побочных явлений был показан в пилотном исследовании с участием восьми пациентов (у трех — двустороннее поражение) с об-литерирующим тромбангиитом [75]. Через 4 нед. уменьшение боли отмечено всеми больными с практически полным выздоровлением в 4 (36%) случаях. Боль (визуальная аналоговая шкала) снизилась с 5,1 ±0,7 до 1,5±1,3. Заживление трофических язв наблюдалось на 8 конечностях с полной эпителизацией в 7 (88%) случаях. Однако в ходе последующих наблюдений у половины пациентов были выявлены следующие «клинические события». У одного больного с неполным заживлением трофической язвы отмечено ухудшение через 4 мес. У другого пациента через 7 мес. после внутримышечного введения клеток появился бессимптомный артериовенозный шунт на голени, который закрылся самостоятельно через год. У третьего больного через 8 мес. наступило значимое уменьшение дистанции безболевой ходьбы. Один пациент умер от внезапной сердечной смерти на 20 мес. после трансплантации в 30-летнем возрасте [75].

Однако в других клинических исследованиях подобные явления не были зарегистрированы в срок наблюдения до 3,2 лет [26, 76]. В исследовании TACT проведена оценка долгосрочной безопасности и клинических результатов клеточной терапии [76]. Трехлетняя выживаемость больных с атеросклеротическими ЗПА составила 80% (умерло 11 из 74 пациентов). Среди 41 больного с тромбангиитом смертельных исходов за срок наблюдения не было. Трехлетний уровень ампутаций составил 60% у больных с атеросклерозом и 91% у пациентов с тромбангиитом. Более того, в TACT не сообщалось о случаях нежелательной неоваскуляризации и увеличения ожидаемой смертности. Исследование BONMOT-1 включало 51 больного с КИ, которым планировалась большая ампутация [26]. Для сохранения ног этим больным была проведена трансплантация клеток в ишемизированную конечность. Период наблюдения за этими больными также составлял 3,2 года. Показатель сохранения конечности был равен 59% через 6 месяцев и 53% в последующие периоды наблюдения. Более того, с клинической точки зрения у больных с сохраненной конечностью удалось добиться уменьшения средней категории по Rutherford с 4,9 в исходном состоянии до 3,3 через 6 мес.

В исследованиях TACT и BONMOT технология терапевтического ангиогенеза признана безопасной

процедурой с минимальными ближайшими и долгосрочными побочными эффектами.

Текущие рандомизированные контролируемые

исследования

Проводимые в настоящее время плацебо-контролируемые испытания позволят более четко определить роль и применимость аутогенных BMMNC в терапии больных ЗПА. В исследовании BONMOT-CLI проведена оценка терапевтического влияния клеток костного мозга на ангиогенез у больных с тяжелой ишемией нижних конечностей, не поддающихся традиционным методам лечения. Это двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое мультицентровое исследование, выполняемое в четырех клиниках Германии. Девяносто пациентов без каких-либо вариантов реваскуляри-зации или после неудачной реваскуляризации были включены и рандомизированы на получение концентрата аутогенных клеток костного мозга на сепараторе Harvest Smartprep2 BMAC system. Первой «конечной точкой» исследования была оценка уровня больших ампутаций и прогрессирования КИ (оценка клинических признаков + степень улучшения перфузии) через 3 мес. после лечения. Перекрестный вариант для пациентов, получающих плацебо, — через 3 мес. вводились BMMNC. Второй конечной точкой были показатели выживаемости, изменения в перфузии (ЛПИ и TcPO2), качество жизни (опросник EQ5D), дистанция безболевой ходьбы, малые (пальцев и стопы) ампутации, заживление трофических поражений, плотность коллатеральных артерий и случаи раковых заболеваний. Период наблюдения после окончания набора больных продолжался 2 года [53].

Другое рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование JUVENTAS проводится в Нидерландах. В нем будет установлена клиническая эффективность внутриартериальных введений BMMNC в бедренную артерию у 110—160 больных с КИ (NCT 00371371). Аспират костного мозга в объеме 100 мл вводится внутриартериально в основной и контрольной группе. Пациенты основной группы получают повторные внутриартериаль-ные инфузии аутогенных BMMNC через бедренную артерию. В группе сравнения будет вводиться 0,9% раствор хлорида натрия (плацебо). Первой конечной точкой будет определение числа больших ампутаций через 6 мес. Вторая конечная точка будет включать малые ампутации, уменьшение числа и размера язв,

исчезновение боли в покое, рост ЛПИ и TcPO2, а таже изменение качества жизни (опросник SF-36).

Технико-экономическое обоснование и безопасность метода изучается в исследовании BMAC. Это рандомизированное двойное слепое, контролируемое мультицентровое исследование, проводимое в США по применению концентрированного аспирата костного мозга для лечения ишемии нижних конечностей. В нем будут участвовать 48 больных, рандомизированных в отношении 2:1 для BMMNC и плацебо соответственно. Для получения клеток будет использоваться система Harvest Smartprep2 BMAC System. Больные основной группы получат инъекции аутогенных клеток костного мозга. Больным контрольной группы будут выполнены инъекции плацебо в ишемизированные ткани конечности. Результаты будут оценены по показателям сохранения конечности, уменьшения боли и увеличения дистанции безболевой ходьбы, TcPO2, ЛПИ и качества жизни (опросник SF-36).

В настоящее время в США и Европе проводится более десяти клинических испытаний, находящихся на разных стадиях, нацеленных на исследование безопасности и эффективности применения аутогенных клеток костного мозга (разные популяции, полученные различными методами) в лечении пациентов с критическими ишемическими поражениями (ACT34-CLI, RESTORE-CLI, ABC, BONMOT-2, SCRIPT-CLI и др.).

Заключение

Изучение новых стратегий лечения больных с ЗПА имеет первостепенное значение в связи с недостаточной эффективностью стандартных методов лечения, высоким риском инвалидизации и смертности больных. Аутогенная клеточная терапия с использованием BMMNC или PBMNC является одним из наиболее перспективных методов лечения пациентов с ишемическими поражениями, который может если не заменить, то успешно дополнить современную тактику лечения. Клинические испытания в этом направлении довольно последовательны, параметры оценки эффективности и клинических преимуществ (ЛПИ, TcPO2, дистанция безболевой ходьбы, снижение боли и количества ампутаций) вполне убедительны. Однако до сих пор существует потребность в крупных рандомизированных плацебо-контролируемых двойных слепых исследованиях с целью получения исчерпывающих данных, которые определят роль и место клеточной терапии в стандартизированной схеме лечения.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Criqui M.H., Fronec A., Barrett-Connor E. et al. The prevalence of peripheral arterial disease in a defined population. Circulation 1985; 71(3): 510-51.

2. Fowkes F.G., Houstley E., Cawood E.H. et al. Edinburgh artery study: prevalence of asymptomatic and symptomatic peripheral arterial disease in the general population. Int. J. Epidemiol. 1991; 20(2): 384-92.

3. Kannel W.B., Skinner Jr.J., Schwartz M.J. Intermittent claudication. Incidence in the Framingham study. Circulation 1970; 41(5): 875-83.

4. Adam D.J., Beard J.D., Cleveland T. et al. Bypass versus angioplasty in severe ischaemia of the leg [BASIL): multicentre randomised controlled trial. Lancet 2005; 366: 1925-34.

5. Buschmann I., Schaper W. The pathophysiology of the collateral circulation (arteriogenesis). J. Pathol. 2000; 190: 338-42.

6. Heilmann C., Beyersdorf F., Lutter G. Collateral growth: cells arrive at the construction site. Cardiovasc. Surg. 2002; 10: 570-8.

7. Shintani S., Murohara T., Ikeda H. et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation 2001; 103: 2776-9.

8. Takahashi T., Kalka C., Masuda H. et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat. Med. 1999; 5: 434-8.

9. Tateishi-Yuyama E., Matsubara H., Murohara T. et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet 2002; 360: 427-35.

10. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted

myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913-8.

11. Rutherford R.B., Baker J.D., Ernst C. et al. Recommended standards for reports dealing with lower extremity ischemia: revised version. J. Vasc. Surg. 1997; 26: 517-38.

12. Asahara T., Murohara T., Sullivan A. et al. Isolation of putative

progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 1997; 275: 964-7.

13. Timmermans F., Plum J., Yoder M.C. et al. Endothelial progenitor cells: identity defined? J. Cell Mol. Med. 2009; 13: 87—102.

14. Timmermans F., Van H.F., De S.M. et al. Endothelial outgrowth cells are not derived from CD133+ cells or CD45+ hematopoietic precursors. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 1572—9.

15. Purhonen S., Palm J., Rossi D. et al. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. PNAS USA 2008; 105: 6620-5.

16. Canizo M.C., Lozano F., Gonzalez-Porras J.R. et al. Peripheral endothelial progenitor cells (CD133+) for therapeutic vasculogenesis in a patient with critical limb ischemia. One year follow-up. Cytotherapy 2007; 9: 99-102.

17. Kudo F.A., Nishibe T., Nishibe M. et al. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34 + ) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Int. Angiol. 2003; 22: 344-8.

18. lohara K., Zheng L., Wake H. et al. A novel stem cell source for vasculogenesis in ischemia: subfraction of side population cells from dental pulp. Stem Cells 2008; 26: 2408-18.

19. Sanz-Ruiz R., Fernandez-Santos E., Dominguez-Munoa M. et al. Early translation of adipose-derived cell therapy for cardiovascular disease. Cell Transpl. 2009; 18: 245-54.

20. Murphy M.P., Wang H., Patel A.N. et al. Allogeneic endometrial regenerative cells: an «Off the shelf solution» for critical limb ischemia? J. Transl. Med. 2008; 6: 45.

21. Huang Y.C., Yang Z.M., Chen X.H. et al. Isolation of mesenchymal stem Cells from human placental decidua basalis and resistance to hypoxia and serum deprivation. Stem Cell Rev. Rep. 2009: 5(3): 247-55.

22. Finney M.R., Greco N.J., Haynesworth S.E. et al. Direct comparison of umbilical cord blood versus bone marrow-derived endothelial precursor cells in mediating neovascularization in response to vascular ischemia. Biol. Blood Marrow Transpl. 2006; 12: 585-93.

23. Boyum A. Separation of lymphocytes, lymphocyte subgroups and monocytes: a review. Lymphology 1977; 10: 71-6.

24. Boyum A. Separation of lymphocytes, granulocytes, and monocytes from human blood using iodinated density gradient media. Methods Enzymol. 1984; 108: 88-102.

25. Boyum A., Lovhaug D., Tresland L. et al. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Scand. J. Immunol. 1991; 34: 697-712.

26. Amann B., Luedemann C., Ratei R. et al. Autologous bone marrow cell transplantation increases leg perfusion and reduces amputations in patients with advanced critical limb ischemia due to peripheral artery disease. Cell Transpl. 2009; 18: 371-80.

27. Prochazka V., Gumulec J., Chmelova J. et al. Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot. Vnitr. Lek. 2009; 55: 173-8.

28. Lenk K., Adams V., Lurz P. et al. Therapeutical potential of blood-derived progenitor cells in patients with peripheral arterial occlusive disease and critical limb ischaemia. Eur. Heart J. 2005; 26: 1903-9.

29. Gastens M.H., Goltry K., Prohaska W. et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transpl. 2007; 16: 685-96.

30. Hermann P.C., Huber S.L., Herrler T. et al. Concentration of bone marrow total nucleated cells by a point-of-care device provides a high yield and preserves their functional activity. Cell Transpl. 2008; 16: 1059-69.

31. Kawamura A., Horie T., Tsuda I. et al. Clinical study of therapeutic angiogenesis by autologous peripheral blood stem cell (PBSC) transplantation in 92 patients with critically ischemic limbs. J. Artif. Organs. 2006; 9: 226-33.

32. Huang P.P., Yang X.F., Li S.Z. et al. Randomised comparison of G-CSF-mobilized peripheral blood mononuclear cells versus bone marrow-mononuclear cells for the treatment of patients with lower limb arteriosclerosis obliterans. Thromb. Haemost. 2007; 98: 1335-42.

33. Schachinger V., Assmus B., Britten M.B. et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction: final one-year results of the TOPCARE-AMI Trial. J. Am. Coll. Cardiol. 2004; 44: 1690-9.

34. Hernandez P., Cortina L., Artaza H. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation in patients with severe lower limb ischaemia: a comparison of using blood cell separator and Ficoll density gradient centrifugation. Atherosclerosis 2007; 194: 52-6.

35. Seeger F.H., Tonn T., Krzossok N. et al. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. Eur. Heart J. 2007; 28: 766-72.

36. Janssens S., Dubois C., Bogaert J. et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: doubleblind randomised controlled trial. Lancet 2006; 367: 113-21.

37. Schachinger V., Erbs S., Elsasser A. et al. Improved clinical outcome after intracoronary administration of bone-marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction: final 1-year results of the REPAIR-AMI trial. Eur. Heart J. 2006; 27: 2775-83.

38. Sprengers R.W., Lips D.J., Moll F.L. et al. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Ann. Surg. 2008; 247: 411-20.

39. Higashi Y., Kimura M., Hara K. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circulation 2004; 109: 1215-8.

40. Durdu S., Akar A.R., Arat M. et al. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation for patients with Rutherford grade II-III thromboangiitis obliterans. J. Vasc. Surg. 2006; 44: 732-9.

41. Saigawa T., Kato K., Ozawa T. et al. Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans, and the association between efficacy and the number of implanted bone marrow cells. Circ. J. 2004; 68: 1189-93.

42. Gyongyosi M., Lang I., Dettke M. et al. Combined delivery approach of bone marrow mononuclear stem cells early and late after myocardial infarction: the MYSTAR prospective, randomized study. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2009; 6: 70-81.

43. Honold J., Lehmann R., Heeschen C. et al. Effects of granulocyte colony simulating factor on functional activities of endothelial progenitor cells in patients with chronic ischemic heart disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26: 2238-43.

44. Dreger P., Schmitz N. Stem cell mobilization in healthy donors: current status. Infus. Transfus. 1999; 26: 92-5.

45. Johnsen H.E. Clinical practice and future needs in recombinant human granulocyte colony-stimulating factor treatment: a review of randomized trials in clinical haemato-oncology. J. Int. Med. Res. 2001; 29: 87-99.

46. Buschmann I.R., Hoefer I.E., van Royen N. et al. GM-CSF: a strong arteriogenic factor acting by amplification of monocyte function. Atherosclerosis 2001; 159: 343-56.

47. Terrovitis J., Charitos C., Dolou P. et al. No effect of stem cell mobilization with GM-CSF on infarct size and left ventricular function in experimental acute myocardial infarction. Basic Res. Cardiol. 2004; 99: 241-6.

48. Kawamura A., Horie T., Tsuda I. et al. Prevention of limb amputation in patients with limbs ulcers by autologous peripheral blood mononuclear cell implantation. Ther. Apher. Dial. 2005; 9: 59-63.

49. Lenk K., Adams V., Lurz P. et al. Therapeutical potential of blood-derived progenitor cells in patients with peripheral arterial occlusive disease and critical limb ischaemia. Eur. Heart. J. 2005; 26: 1903-09.

50. Thompson C.A., Reddy V.K., Srinivasan A. et al. Left ventricular functional recovery with percutaneous, transvascular direct myocardial delivery of bone marrow-derived cells. J. Heart Lung Transpl. 2005; 24: 1385-92.

51. Zhang M., Methot D., Poppa V. et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. J. Mol. Cell Cardiol. 2001; 33: 907-21.

52. Tran N., Li Y., Maskali F. et al. Short-term heart retention and distribution of intramyocardial delivered mesenchymal cells within necrotic or intact myocardium. Cell Transpl. 2006; 15: 351-8.

53. Amann B., Ludemann C., Ruckert R. et al. Design and rationale of a randomized, double-blind, placebo-controlled phase III study for autologous bone marrow cell transplantation in critical limb ischemia: the BONe Marrow Outcomes Trial in Critical Limb Ischemia tBONMOT-CLI). VASA 2008; 37: 319-25.

54. Unthank J.L., Sheridan K.M., Dalsing M.C. Collateral growth in the peripheral circulation: a review. Vasc. Endovascular. Surg. 2004; 38: 291-313.

55. Yoshida M., Horimoto H., Mieno S. et al. Intra-arterial bone marrow cell transplantation induces angiogenesis in rat hindlimb ischemia. Eur. Surg. Res. 2003; 35: 86-91.

56. Bartsch T., Brehm M., Zeus T. et al. Autologous mononuclear stem cell transplantation in patients with peripheral occlusive arterial disease. J. Cardiovasc. Nurs. 2006; 21: 430-2.

57. Strauer B.E., Brehm M., Zeus T. et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002; 106: 1913-8.

58. Bartsch T., Brehm M., Zeus T. et al. Transplantation of autologous mononuclear bone marrow stem cells in patients with peripheral arterial disease (the TAMPAD study). Clin. Res. Cardiol. 2007; 96: 891-99.

59. Van Tongeren R.B., Hamming J.F., Fibbe W.E. et al. Intramuscular or combined intramuscular/intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells: a clinical trial in patients with advanced limb ischemia. J. Cardiovasc. Surg. 2008; 49: 51-8.

60. Vasa M., Fichtlscherer S., Aicher A. et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circulation Res. 2001; 89: E1-E7.

61. Fadini G.P., Sartore S., Albiero M. et al. Number and function of endothelial progenitor cells as a marker of severity for diabetic vasculopathy. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26: 2140-6.

62. Heeschen C., Lehmann R., Honold J. et al. Profoundly reduced neovascularization capacity of bone marrow mononuclear cells derived from patients with chronic ischemic heart disease. Circulation 2004; 109: 1615-22.

63. Dimmeler S., Aicher A., Vasa M. et al. HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway. J. Clin. Invest. 2001; 108: 391—7.

64. Llevadot J., Murasawa S., Kureishi Y. et al. HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow-derived endothelial progenitor cells. J. Clin. Invest. 2001; 108: 399-405.

65. Vasa M., Fichtlscherer S., Adler K. et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation 2001; 103: 2885-90.

66. Assmus B., Urbich C., Aicher A. et al. HMG-CoA reductase inhibitors reduce senescence and increase proliferation of endothelial progenitor cells via regulation of cell cycle regulatory genes. Circulation Res. 2003; 92: 1049-55.

67. Shantsila E., Watson T., Lip G.Y. Endothelial progenitor cells in cardiovascular disorders. J. Am. Coll. Cardiol. 2007; 49: 741-52.

68. Pistrosch F., Herbrig K., Oelschlaegel U. et al. PPARgamma-agonist rosiglitazone increases number and migratory activity of cultured endothelial progenitor cells. Atherosclerosis 2005; 183: 163-7.

69. Wang C.H., Ting M.K., Verma S. et al. Pioglitazone increases the numbers and improves the functional capacity of endothelial progenitor cells in patients with diabetes mellitus. Am. Heart J. 2006; 152: 1051-8.

70. Di Stefano R., Barsotti M.C., Melillo E. et al. The prostacyclin analogue iloprost increases circulating endothelial progenitor cells in patients with critical limb ischemia. Thromb. Haemost. 2008; 100: 871-7.

71. Wadhwa M., Thorpe R. Haematopoietic growth factors and their therapeutic use. Thromb. Haemost. 2008; 99: 863-73.

72. Iwaguro H., Yamaguchi J., Kalka C. et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation 2002; 105: 732-8.

73. Yi C., Xia W., Zheng Y. et al. Transplantation of endothelial progenitor cells transferred by vascular endothelial growth factor gene for vascular regeneration of ischemic flaps. J. Surg. Res. 2006; 135: 100-6.

74. Choi J.H., Hur J., Yoon C.H. et al. Augmentation of therapeutic angiogenesis using genetically modified human endothelial progenitor cells with altered glycogen synthase kinase-3beta activity. J. Biol. Chem. 2004; 279: 49430-8.

75. Miyamoto K., Nishigami K., Nagaya N. et al. Unblinded pilot study of autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells in patients with thromboangiitis obliterans. Circulation 2006; 114: 2679-84.

76. Matoba S., Tatsumi T., Murohara T. et al. Long-term clinical outcome after intramuscular implantation of bone marrow mononuclear cells (Therapeutic Angiogenesis by Cell Transplantation [TACT] trial) in patients with chronic limb ischemia. Am. Heart J. 2008; 156: 1010-8.

77. Iba O., Matsubara H., Nozawa Y. et al. Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circulation 2002; 106: 2019-25.

78. Ziegelhoeffer T., Fernandez B., Kostin S. et al. Bone marrow-derived cells do not incorporate into the adult growing vasculature. Circ. Res. 2004; 94: 230-8.

79. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S. et al. Bone-marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical experiences. Circ. Res. 2004; 95: 354-63.

80. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms. Circulation Res. 2004; 94: 678-85.

81. Niagara M.I., Haider H.K., Ye L. et al. Autologous skeletal myoblasts transduced with a new adenoviral bicistronic vector for treatment of hind limb ischemia. J. Vasc. Surg. 2004; 40: 774-85.

82. Napoli C., Williams-Ignarro S., de Nigris F. et al. Beneficial effects of concurrent autologous bone marrow cell therapy and metabolic intervention in ischemiainduced angiogenesis in the mouse hindlimb. PNAS USA 2005; 102: 17202-6.

83. Takagi Y., Omura T., Yoshiyama M. et al. Granulocyte-colony stimulating factor augments neovascularization induced by bone marrow transplantation in rat hindlimb ischemia. J. Pharmacol. Sci. 2005; 99: 45-51.

84. Iwase T., Nagaya N., Fujii T. et al. Comparison of angiogenic potency between mesenchymal stem cells and mononuclear cells in a rat model of hindlimb ischemia. Cardiovasc. Res. 2005; 66: 543-51.

85. Nakagami H., Maeda K., Morishita R. et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue- derived stromal cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005; 25: 2542-47.

86. Aicher A., Heeschen C., Sasaki K. et al. Low-energy shock wave for enhancing recruitment of endothelial progenitor cells: a new modality to increase efficacy of cell therapy in chronic hind limb ischemia. Circulation 2006; 114: 2823-30.

87. Awad O., Dedkov E.I., Jiao C. et al. Differential healing activities of CD34+ and CD14+ endothelial cell progenitors. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26: 758-64.

88. Kobayashi K., Kondo T., Inoue N. et al. Combination of in vivo angiopoietin-1 gene transfer and autologous bone marrow cell implantation for functional therapeutic angiogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2006; 26: 1465-72.

89. Li S., Zhou B., Han Z.C. Therapeutic neovascularization by transplantation of mobilized peripheral blood mononuclear cells for limb ischemia. A comparison between CD34+ and. Thromb Haemost 2006; 95: 301-11.

90. Kim S.W., Han H., Chae G.T. et al. Successful stem cell therapy using umbilical cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model. Stem Cells 2006; 24: 1620-6.

91. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J. et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol. Biochem. 2006; 17: 279-90.

92. Sica V., Williams-Ignarro S., de Nigris F. et al. Autologous bone marrow cell therapy and metabolic intervention in ischemia-induced angiogenesis in the diabetic mouse hindlimb. Cell Cycle 2006; 5: 2903-8.

93. Jeon O., Song S.J., Bhang S.H. et al. Additive effect of endothelial progenitor cell mobilization and bone marrow mononuclear cell transplantation on angiogenesis in mouse ischemic limbs. J. Biomed. Sci. 2007; 14: 323-30.

94. Zhang H., Zhang N., Li M. et al. Therapeutic angiogenesis of bone marrow mononuclear cells (MNCs) and peripheral blood MNCs: transplantation for ischemic hindlimb. Ann. Vasc. Surg. 2008; 22: 238-47.

95. Esato K., Hamano K., Li T.S. et al. Neovascularization induced by autologous bone marrow cell implantation in peripheral arterial disease. Cell Transpl. 2002; 11: 747-52.

96. Miyamoto M., Yasutake M., Takano H. et al. Therapeutic angiogenesis by autologous bone marrow cell implantation for refractory chronic peripheral arterial disease using assessment of neovascularization by 99mTc-tetrofosmin (TF) perfusion scintigraphy. Cell Transpl. 2004; 13: 429-37.

97. Nizankowski R., Petriczek T., Skotnicki A. et al. The treatment of advanced chronic lower limb ischaemia with marrow stem cell autotransplantation. Kardiol. Pol. 2005; 63: 351-60.

98. Kajiguchi M., Kondo T., Izawa H. et al. Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplantation for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Circ. J. 2007; 71: 196-201.

99. Gu Y.Q., Zhang J., Guo L.R. et al. Transplantation of autologous bone marrow mononuclear cells for patients with lower limb ischemia. Chin. Med. J. (Engl) 2008; 121: 963-7.

100. Chochola M., Pytlik R., Kobylka P. et al. Autologous intra-arterial infusion of bone marrow mononuclear cells in patients with critical leg ischemia. Int. Angiol. 2008; 27: 281-90.

101. Wester T., Jorgensen J.J., Stranden E. et al. Treatment with autologous bone marrow mononuclear cells in patients with critical lower limb ischaemia. A pilot study. Scand. J. Surg 2008; 97: 56-62.

102. De Vriese A.S., Billiet J., Van Droogenbroeck J. et al. Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells for limb ischemia in a caucasian population with atherosclerosis obliterans. J. Intern. Med. 2008; 263: 395-403.

103. Huang P.P., Li S.Z., Han M.Z. et al. Autologous transplantation of peripheral blood stem cells as an effective therapeutic approach for severe arteriosclerosis obliterans of lower extremities. Thromb. Haemost. 2004; 91: 606-09.

104. Huang P., Li S., Han M. et al. Autologous transplantation of granulocyte colonystimulating factor-mobilized peripheral blood mononuclear cells improves critical limb ischemia in diabetes. Diabetes Care 2005; 28: 2155-60.

105. Ishida A., Ohya Y., Sakuda H. et al. Autologous peripheral blood mononuclear cell implantation for patients with peripheral arterial disease improves limb ischemia. Circ. J. 2005; 69: 1260-5.

Поступила 2.11.2010