НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR DETERMINING THE SEQUENCE OF HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 MAIN HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX GENES

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов. Набор предназначен для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и состоит из следующих праймеров:
HLA-A-F: AGAGAAGCCAATCAGTGTCGTCGCGGTC
HLA-A-R: CTCAGCCCCACCTCTCTGGAACAGG
HLA-B-F: CACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACT
HLA-B-R: TTCTTTTACTTCAGTGGTGTTCCCCAGATG
HLA-C-F: CTAGAGAAGCCAATCAGCGTCT
HLA-C-R: ACGCAGACACATTCAGGTGCCTTTGC
HLA-DQB1-F1: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTA
HLA-DQB1-F2: TTCACCTCAGATGTTCATCCAGTG
HLA-DQB1-F3: TTCACCTCAAATGTTCATCCAGTG
HLA-DQB1-R: AGTCTTGATCCTCATAGCAGCAAATA
HLA-DRB1-F1: CGCTTTCACTGCTCTTTAAGCT
HLA-DRB1-F2: CACTTTCACTGCTCTTTAAGCT
HLA-DRB1-F3: CACTTTCGCTGCTCTTTAAGCT
HLA-DRB1-R1: CGTCTCTGCAGGCCACAAGCTAT
HLA-DRB1-R2: CGTCTCTGTAGGCCACAAGCTAT.
Цель изобретения – разработка набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток – метод клеточной терапии, применяющийся для лечения гематологических, онкологических, генетических и ряда других заболеваний путем пересадки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), способных полностью восстановить систему гемопоэза и иммунитета в организме после высокодозной химиотерапии [1, 2, 3].
Риски отторжения трансплантата и возникновения реакции «трансплантат против хозяина» зависят от качества подбора донора ГСК, совместимого по HLA-системе, характеризующейся высокой вариабельностью [4].
По состоянию на 07 февраля 2019 г., число потенциальных доноров ГСК, зарегистрированных в объединенной базе данных о российских донорах BMDS (Bone Marrow Donor Search), составляет 94 204 человека, в неё включены 15 регистров из 11 регионов Российской Федерации [5]. Такое количество безвозмездных доноров на сегодняшний день обеспечило 282 трансплантации ГСК для пациентов российских клиник [6].
В последние пять лет наметился явный прогресс во взаимодействии трансплантационных клиник с BMDS, однако многие российские пациенты по-прежнему зависят от донорского материала, получаемого из-за рубежа, либо вообще остаются без совместимого неродственного донора [6].
Сложившаяся ситуация требует увеличения числа потенциальных доноров ГСК в короткие сроки, а трансплантационные центры диктуют необходимость HLA-типирования доноров молекулярно-генетическими методами как минимум по пяти HLA-локусам. Прогресс в расширении донорской базы ограничивается прежде всего высокой стоимостью реагентов, используемых для проведения массового HLA-типирования доноров и низкой производительностью анализа.
В настоящее время наибольшее распространение в практике получили четыре технологии HLA-типирования: SSP (Sequence Specific Primers), SSO (Sequence Specific Oligonucleotides), SBT (Sequence Based Typing) и NGS (Next Generation Sequence). Метод SSP характеризуется низкой производительностью, SSO – невозможностью определения отдельных точечных вариаций, что особенно актуально в условиях малоизученных популяций, к которым следует отнести и большинство популяций, проживающих на территории РФ [7]. Технология SBT признана «золотым стандартом» HLA-типирования, с точки зрения идентификации новых аллелей, а при использовании современных многокапиллярных секвенаторов обладает и высокой производительностью. Однако даже существенное масштабирование исследований, выполняемых методом SBT, практически не снижает стоимости типирования. При необходимости изучения дополнительных экзонов/интронов затраты на SBT-типирование возрастают. Наиболее перспективным, с точки зрения увеличения производительности и существенного снижения стоимости HLA-типирования, представляется применение технологии массового параллельного секвенирования (MPS - massive parallel sequencing).
Стандартный протокол проведения таргетного MPS исследования включает в себя следующие этапы: таргетное обогащение генов, приготовление библиотек, секвенирование, анализ данных.
Отдаленным аналогом предлагаемого изобретения является набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающего ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1) [8].
Техническим результатом заявляемого изобретения является изучение последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости с целью создания системы типирования HLA. Использование предлагаемого набора синтетических олигонуклеотидов позволит проводить таргетную амплификацию при HLA-типировании потенциальных доноров ГСК в высоком разрешении, с возможностью выявления ранее незарегистрированных аллелей.
Для достижения указанного результата проводят ПЦР длинных фрагментов образца ДНК. В отличие от отдалённого аналога, позволяющего получать только последовательность первого интрона генов HLA-A и HLA-DRB1, предлагаемый набор праймеров позволяет определять последовательности всего гена локусов HLA-A, HLA-B, HLA-C (за исключением участка 3’-UTR), участка гена с первого по пятый экзон локуса HLA-DQB1, участка гена со второго по четвертый экзон локуса HLA-DRB1, что сводит число возможных неоднозначностей типирования к минимуму.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предполагаемого изобретения.
Заявляемое изобретение разработано в ООО «ПАРСЕК ЛАБ».
Осуществление изобретения:
260
280
Материалом для исследования является геномная ДНК человека. Исследуемый препарат ДНК не должен содержать посторонних примесей, соотношение А/A должно составлять 1,7-1,9. Для анализа одного образца требуется 300 нг ДНК (30 мкл ДНК с концентрацией 10нг/мкл для анализа 5 локусов), концентрация геномной ДНК должна быть оценена флуоресцентным методом.
Использование изобретения возможно в двух форматах моноплексный и мультиплексный:
1. Формат – моноплексный.
4
4
2
4
2+
Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO, рН=8,9; 180 мМ (NH)SO, 20 мМ Mg, 10% глицерол).
В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующим профилям:
- для локуса HLA-A
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
35
67<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
3 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
- для локуса HLA-B
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
35
60<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
- для локуса HLA-C
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
35
65<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
- для локуса HLA-DQB1
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
35
60<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
6 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
- для локуса HLA-DRB1
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
30
62<sup>о</sup>С
30 сек
68<sup>о</sup>С
7 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
2. Формат – мультиплексный.
4
4
2
4
2+
Для получения последовательностей генов HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1 главного комплекса гистосовместимости используется постановка ПЦР длинных фрагментов с помощью набора специфичных праймеров. Дополнительно в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в конечной концентрации каждого 200 мкМ, Taq-полимеразу (AccuPrime или Encyclo), реакционный буфер (600 мМ Tris-SO, рН=8,9; 180 мМ (NH)SO, 20 мМ Mg, 10% глицерол).
В подготовленную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР длинных фрагментов по следующему профилю:
Температура
Время
Количество циклов
94<sup>о</sup>С
2 мин
1
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
70<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
69<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
68<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
67<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
66<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
65<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
64<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
63<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
62<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
61<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
60<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
3
59<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
58<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
98<sup>о</sup>С
10 сек
2
57<sup>о</sup>С
15 сек
68<sup>о</sup>С
5,5 мин
68<sup>о</sup>С
10 мин
1
4<sup>о</sup>С
не ограничено
Оценку наличия продукта реакции ПЦР длинных фрагментов осуществляют электрофорезом в агарозном геле. Размер ампликона должен соответствовать указанному в таблице:
HLA-локус
Размер продукта ПЦР, п.н
HLA-A
3 200
HLA-B
4 609
HLA-C
3 000
HLA-DQB1
6 100
HLA-DRB1
4 300
Примеры визуализации продуктов реакции ПЦР длинных фрагментов с использованием набора синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности генов главного комплекса гистосовместимости – HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1, HLA-DRB1.
Моноплексный формат:
<img file="00000002.jpg" he="44" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000003.jpg" he="36" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Мультиплексный формат:
Список литературы:
1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P.et al.; European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Hematopoietic SCT in Europe 2013: recent trends in the use of alternative donors showing more haploidentical donors but fewer cord blood transplants. Bone Marrow Transplant. – 2015. – 50 (4). P. 476–82.
2. Syed A. Abutalib, Parameswaran Hari. Clinical Manual of Blood and Bone Marrow Transplantation. – Chichester: Wiley-Blackwell, 2017. – 424 с.
3. Кокорев О.В., Чердынцева Н.В., Зайцев К.В., Волгушев С.В. Теоретические и практические аспекты трансплантации стволовых клеток в онкологии // Сибирский онкологический журнал. – 2005. – № 4 (16). – С. 53–61.
4. Афанасьев Б.В., Зубаровская Л.С., Алянский А.Л. и др. Выбор донора при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток // Российский журнал детской гематологии и онкологии. – 2016. – Т.3. – С. 30-36.
5. Счетчик регистра (2018). Доступен: http://www.rdkm.rusfond.ru/registr_stat/001 (обновление 10.08.2018).
6. Макаренко О.А., Алянский А.Л., Иванова Н.Е. и др. Эффективность поиска неродственного донора гемопоэтических стволовых клеток с помощью российской поисковой системы Bone Marrow Donor Search: опыт НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой // Клиническая онкогематология. – 2017. -№ 10. – С. 39-44.
7. Логинова М.А., Парамонов И.В. Новые HLA-аллели в российских популяциях // Трансфузиология. – 2016. - №3. Т.17. – С.13-20.
8. Патент Набор синтетических олигонуклеотидов для определения последовательности 1 интрона, примыкающей ко 2 экзону, генов системы HLA I и II классов (HLA-A и HLA-DRB1). RU 2649064.