СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ И ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В НЕМ НАБОР

1. Способ одновременной амплификации и детекции нуклеотидных последовательностей в реакционной смеси, включающий следующие стадии:
(i) предоставление образца, содержащего по меньшей мере одну нуклеотидную молекулу;
(ii) предоставление реагентов для осуществления реакции амплификации, причем реагенты включают по меньшей мере четыре зонда, причем
(а) каждый из зондов является специфическим к нуклеотидной последовательности;
(б) по меньшей мере два зонда несут одинаковую метку; и
m
(в) каждый из зондов, который несет одинаковую метку, имеет температуру плавления (Тпл, T), которая отличается более чем на 2°С от температуры плавления других зондов с такой же меткой, когда они диссоциируют от своей целевой нуклеотидной последовательности (нуклеотидной последовательности- мишени) при нагревании;
(iii) амплификацию нуклеотидных последовательностей в процессе реакции;
(iv) детекцию амплифицированных нуклеиновых кислот путем определения, связан ли меченый зонд со своей нуклеотидной последовательностью; и
(v) определение температуры, при которой каждый данный меченый зонд диссоциирует от нуклеотидной последовательности, с которой он связан.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что метки зондов представляют собой флуоресцентные метки.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что реакция амплификации представляет собой амплификацию методом полимеразной цепной реакции.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что зонды выбирают из группы, состоящей из зонда TaqMan, молекулярного маяка, зонда по типу "скорпион" и зонда системы LightCycler (лайтциклер), гибридизационного зонда и зонда замещения.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакционная смесь дополнительно содержит краситель, специфический к двухцепочечной нуклеиновой кислоте.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что краситель, специфический к двухцепочечной нуклеиновой кислоте, отличается от меток зонда спектральным методом.
7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что краситель, специфический к двухцепочечной нуклеиновой кислоте, выбирают из группы, состоящей из SYBR Green I, SYBR Gold, этидия бромида, пропидия бромида, Pico Green, Hoechst 33258, YO-PRO-I и YO-YO-I, Boxto, EvaGreen, LC Green, LC Green Plus и SYTO 9.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что метка представляет собой флуоресцентную метку, которую выбирают из группы, состоящей из FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеина), VIC, NED, флуоресцеина, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green (Орегон зеленый). Родамин зеленый. Родамин красный. Техасский красный (Texas Red), Yakima Yellow, Alexa Fluor PET, Biosearch Blue™, Marina Blue, Bothell Blue, Alexa Fluor 350 FAM™, SYBR Green 1, EvaGreen™, Alexa Fluor 488 JOE™, VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor Gold 540, Yakima Yellow, ROX™, CAL Fluor Red 610, Cy3.5™, Texas Red, Alexa Fluor 568 Cy5™, Quasar™ 670, LightCycler Red 640, Alexa Fluor 633 Quasar™ 705, LightCycler Red705, Alexa Fluor 680, SYTO9, LC Green, LC Green Plus+.
9. Способ по п.3, отличающийся тем, что
а. меченый зонд представляет собой группу, состоящую из гибридизационного зонда и TaqMan зонда,
б. зонд TaqMan несет указанную метку,
в. указанная метка представляет собой флуоресцентную метку,
г. зонд TaqMan дополнительно включает гаситель (тушитель),
д. гибридизационный зонд несет дополнительный гаситель, способный тушить флуоресценцию метки, связанной с зондом TaqMan,
е. указанный зонд TaqMan и указанный гибридизационный зонд способны связывать указанную нуклеотидную последовательность таким образом, что когда оба зонда связаны с соответствующими последовательностями, гаситель, находящийся на гибридизационном зонде по меньшей мере частично тушит флуоресценцию указанной метки на указанном зонде TaqMan.
m
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанные зонды с идентичными метками образуют группу с гибридизационными зондами, температура плавления (Тпл, T) которых отличается по меньшей мере на 2°С.
m
m
11. Способ по пп.9 и 10, отличающийся тем, что температура плавления (Тпл, T) гибридизационного зонда ниже температуры плавления (Тпл, T) зонда TaqMan.
m
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что гибридизационные зонды имеют температуру плавления (Тпл, T) более низкую, чем температура, при которой полимераза проявляет свою оптимальную активность.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что полимераза проявляет 5'-3' эндонуклеазную активность.
14. Набор, содержащий по меньшей мере четыре зонда, которые способны гибридизоваться в жестких условиях, с одной или более нуклеотидными молекулами, у которого
а. каждый из зондов специфичен к нуклеотидной последовательности;
б. по меньшей мере два зонда несут одинаковую метку; и
m
в. каждый из зондов, который несет одинаковую метку, имеет температуру плавления (Тпл, T), которая более чем на 2°С отличается от температуры плавления других зондов с такой же меткой, когда они диссоциируют от их нуклеотидной последовательности - мишени при нагревании.