Способ определения ремедиационной способности гуминовых продуктов
METHOD FOR DETERMINING THE REMEDIATION CAPACITY OF HUMIC PRODUCTS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к исследованию ремедиационной способности гуминовых продуктов в почвах, загрязненных тяжелыми металлами.
Уровень техники
Восстановление под влиянием гуминовых продуктов экологических функций почв, загрязненных химическими веществами, представляет собой сложный физико-химический и биологический процесс, включающий иммобилизацию (снижение биодоступности) токсикантов (тяжелых металлов), изменение показателей продуктивности фитомассы, активности почвенного микробиома.
Продолжающееся загрязнение природных сред тяжелыми металлами - одна из наиболее острых проблем современной экологии. Для обеспечения устойчивого функционирования экосистем необходим поиск действенных способов восстановления нарушенных почв и комплексная оценка эффективности и безопасности проводимых мероприятий. Большое внимание научного сообщества обращено к разработке подходов к оценке экологического состояния почв, основанной на диагностике изменений биогенных и абиогенных компонентов почв.
Гуминовые продукты (ГП) рекомендуются к практическому применению в агроценозах для разных целей, в том числе в качестве восстановителей почв, загрязненных тяжелыми металлами. Гуминовые продукты производят из разных сырьевых источников натурального происхождения. Благодаря своему составу и свойствам они легко включаются в естественные круговороты веществ и не только активируют рост и развитие живых организмов (растений и почвенных микроорганизмов), но и способны иммобилизовать и трансформировать загрязняющие вещества (Якименко О.С., Терехова В.А., Гуминовые препараты и оценка их биологической активности для целей сертификации. Почвоведение, 2011, №11, с. 1334-1343). Наличие в составе ГП различных функциональных групп, в том числе существенное содержание ароматических структур, обуславливает их способность активно участвовать в сорбционных процессах, в том числе снижении подвижности тяжелых металлов (Perminova I.V., Frimmel F.H., Kudryavtsev A.V., Kulikova N.A., Abbt-Braun G., Hesse S.,Petrosyan V.S. Molecular weight characteristics of humic substances from different environments as determined by size exclusion chromatography and their statistical evaluation // Environmental Science and Technology, 2003. Vol. 37. No 11. P. 2477-2485).
За последние годы удалось достичь заметных успехов по очистке загрязненных тяжелыми металлами воздушных выбросов от стационарных источников. Однако проблема гидрогенного загрязнения почв тяжелыми металлами остается актуальной. Во многом это касается пойменных почв сельскохозяйственного назначения. Кроме того, загрязненные аллювиальные почвы, становятся источником длительного загрязнения воды даже после того, как сброс неочищенных сточных вод прекращается (Варава О.А. Почвы речных долин городских территорий (на примере г. Москвы). Автореферат диссертации на соискание кандидата биологических наук. М.: Учебная полиграфия, 2010, 27 с.).
Кроме того в ряде работ показано наличие ингибирующего эффекта ГП на активность почвенного микробиома, зависящего от их дозы, природы и вида оцениваемого параметра (Таран Д.О., Жданова Г.О., и др., Влияние гуминовых веществ на тест-объекты, Acta Biomedica Scientifica, 2013; (6):164-168). Неоднократно поднимался вопрос о необходимости сертификации ГП. Наличие экспериментально обоснованных универсальных схем оценки качества и ремедиационных характеристик - важное условие их безопасного и эффективного использования в природных средах. В некоторых европейских странах в качестве показателя «здоровья» почв используется микробная биомасса и ее дыхательная активность (Goss, M.J., Tubeileh, A., Goorahoo, D. A review of the use of organic amendments and the risk to human health. Adv. Agron. 2013, 120, 275-379). Известна оценка качества ГП, характеризующая защитные свойства и детоксицирующую способность по отношению к растениям. Предпринимаются попытки введения более расширенных схем и различных интегральных индексов состояния почв для комплексной оценки воздействия ГП на почвы и экосистемы. Предложены вариации расчета индексов состояния почв, значения которых сопоставляются затем с уровнями техногенной нагрузки и/или категориями качества окружающей природной среды. В частности известный в мировой литературе «Триадный» подход (TRIAD approach), с 2017 года включен в систему международных стандартов (ISO 19204:2017 Качество почвы. Методика оценки экологического риска локального загрязнения почвы (триадный подход к оценке качества почвы). Он основан на методологии междисциплинарного уровня и учитывает данные химических, биоиндикационных и токсикологических исследований. Однако, не только для оценки качества почв, но и для оценки почвенных ремедиантов необходим единый подход, универсальная схема, позволяющая и производителям, и потребителям получать важную информацию, оперативно и многопланово оценивать гуминовые продукты.
В этой связи разработка универсального индекса и комплексной экспериментально - обоснованной системы оценки влияния ГП, рекомендуемых для ремедиации, загрязненных тяжелыми металлами почв, в которой будут учтены данные химических, биотических и экотоксикологических данных - необходимая мера по обеспечению устойчивого развития экосистем.
Известна оценка качества ГП, характеризующая защитные свойства и детоксицирующую способность по отношению к растениям. Качество ГП проведено путем количественной оценки кинетики поглощения ГП растениями с использованием меченных тритием препаратов (Куликова Н.А. Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов., Автореферат на соиск. учен. степ. докт. биол. наук, Москва, 2008, 48 с.). Недостатками этого способа является отсутствие комплексности, ограниченность подхода - лишь по оценке токсичности для растений.
2
Наиболее близким техническим решением к заявленному способу является оценка ремедиирующей способности гуминовых продуктов в почвах, загрязненных тяжелыми металлами путем создания экспериментального полигона, имитирующего территорию озеленения города Москвы. Опытный участок состоял из 83 делянок площадью 0,25 м (0,5×0,5 м), огороженных деревянными планками и имитирующими строение конструктоземов города. В почвы делянок по отдельности вносили NaCl (1% и 3%), дизельное топливо (1% и 5%) или сульфат меди (1000 мг/кг Cu), обрабатывали растворами гуматов (0,5 и 1,0 г/л) и высевали райграс пастбищный (Lolium perenne). После вегетации делали укосы с делянок и определяли биомассу трав. Биомасса растений опытных участков газонов вдоль автотрасс при обработке гуматами во всех случаях превышала биомассу на контрольных участках. В большинстве случаев наблюдали увеличение биомассы не менее чем в 1,5-2 раза, а на отдельных делянках, обработанных гуматами из торфа - в 4-8 раз по сравнению с делянками, не обработанными гуматами (Степанов А.А., Якименко О.С., Ремедиация загрязненных городских почв с применением гуминовых препаратов// «Живые и биокосные системы». - 2016. - №18. - URL: http://www.jbks.ru/archive/issue-18/article-5). Недостатками данного способа является длительность исследования и отсутствие комплексности в получении объективных данных о ремедиирующей способности гуминовых продуктов.
Задачей настоящего изобретения является создание универсальной меры оценки качества гуминовых продуктов в отношении их способности восстанавливать свойства почв при химическом загрязнении - индекс ремедиации (ИР).
Раскрытие изобретения
Технический результат заявленного способа заключается в расширении арсенала технических средств для оценки степени ремедиирующей способности гуминовых продуктов в почвах, загрязненных тяжелыми металлами с высокой точностью и значительным сокращением времени исследования.
Технический результат достигается тем, что определение степени ремедиирующей способности гуминовых продуктов в почвах, загрязненных тяжелыми металлами, осуществляют путем оценки состояния почвы, обработанной и необработанной гуминовым продуктом (ГП), при этом степень ремедиирующей способности ГП определяют путем сопоставления комплекса показателей в почвенной матрице - искусственной стандартной почве (ИСП) по протоколу ISO, содержащей 4 ОДК Pb, при этом измеряют показатели химической токсичности (Тх), определяя доступное для растений содержание Pb в образце ИСП до и после внесения гуминовых продуктов и рассчитывая индекс химической токсичности по формуле: Tx=1-|CPb-CkPb |/CkPb, где CPb - концентрация Pb в опытном образце ИСП с внесением ГП; CkPb - концентрация Pb в контрольном образце ИСП без внесения ГП, далее измеряют токсичность по биотестированию (Тэ) по результатам фитотеста (Тэ фт) и биотеста на гидробионтах (Тэ бт) до и после внесения гуминовых продуктов, определяют фитотоксичность почвы и изменение развития микроводорослей методом флуоресценции, при этом рассчитывают индексы фитотоксичности Тэ фт и Тэ бт как отношение разности токсичности опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного образца ИСП без внесения ГП к токсичности контрольного образца ИСП без внесения ГП, и далее рассчитывают среднее значение индекса токсичности по биотестированию (ИТэ) по формуле: ИТэ=(Тэ фт+Тэ бт)/2, после чего измеряют биоиндикационную токсичность (Тб) по результатам базального (ТбБД) и субстрат-индуцированного (ТбСИД) дыхания почвы до и после внесения гуминовых продуктов, определяют биоиндикационную токсичность и субстрат-индуцированную токсичность дыхания почвы, рассчитывая при этом индекс биоиндикационной токсичности (Тб) как отношение разности биоиндикационной токсичности опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного образца без внесения ГП к биоиндикационной токсичности контрольного образца ИСП без внесения ГП, и далее рассчитывают среднее значение индекса биоиндикационной токсичности (ИТб) по формуле: ИТб=(ТбБД+ТбСИД)/2, затем рассчитывают интегральный индекс токсичности (ИТ) для опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного (ИТк) без внесения ГП по формуле: ИТ и ИТк=(Тх+1,5*ИТэ+2,0*ИТб)/(1,0+1,5+2,0), где Тх - индекс химический токсичности; ИТэ - среднее значение индекса токсичности по биотестированию; ИТб - среднее значение индекса биоиндикационной токсичности; 1,0; 1,5 и 2,0 - весовые коэффициенты, а индекс ремедиации (ИР) рассчитывают по формуле: ИР=100-|ИТ*100|/ИТк, и при значении ИР<20 определяют отсутствие способности к ремедиации загрязненной почвы, при значении 20<ИР<50 - среднюю активность и при значении ИР≥50 - высокую активность ремедиирующей способности гуминовых продуктов в почвах.
Осуществление изобретения
Предварительно проводят подготовку почвенной матрицы - искусственной стандартной почвы ИСП, приготовленной в лабораторных условиях по протоколу ISO11268-2 (состав минеральной части: 10% торф, 20% каолин, 79% песок, рН-6.6) в количестве 400 г, в которую вносят нитрат свинца 81.84 г (в форме водного раствора), что соответствует 4 ОДК (ориентировочно допустимая концентрация, в песчаных и супесчаных почвах 1 ОДК=32 мг Pb на 1 кг почвы - согласно СанПиН 1.2.3685-21 ("Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания" утверждены от 28 января 2021 года), тщательно перемешивают совком (или шпателем), увлажняют до 55-60% полной влагоемкости, оставляют на прединкубацию в течение 5 суток, при 22°С, затем массу почвы делят на 2 равные части по 200 г и в одну часть добавляют ГП в дозе 0.25% (2.5 мг/г почвы или 500 мг на 200 г почвы). В образце ИСП с добавленной солью свинца и в образце почвы без свинца поддерживают влажность до 55-60% полной влагоемкости, оставляют еще на 5 суток для инкубации при комнатной температуре (22°С).
4
4
Измерение показателей химической токсичности осуществляют следующим образом. Для этого 5 г почвенной матрицы - искусственной стандартной почвы ИСП, прокаленной до постоянного веса при 104°С и просеянной через сито 1 мм и помещают в пробирки. Приливают по 20 мл дистиллированной воды (рН 6,5), и ставят на ротатор на 2 часа. Затем пробы центрифугируют при 3500 об/мин, в течение 10 минут. Затем к 5 г полученного осадка и приливают 50 мл 1 М ацетатно-аммонийного буфера (NHOAc, рН 4,8), ставят на ротатор на 1 час. Пробы вновь центрифугируют при 3500 об/мин, в течение 10 минут, супернатант сразу используют для анализа на атомно-адсорбционном масс-спектрометре (ICP - MS 7500а). После чего осуществляют измерение показателей химической токсичности то есть доступные для растений формы свинца в образце ИСП до и после внесения гуминовых продуктов - в экстрактах 1М NHOAc, рН 4.8; 0.01 М CaCl2 - методом масс-спектрометрии на индуктивно связанной плазме (ICP - MS 7500а). Индекс химической токсичности (Тх) рассчитывают по формуле: Tx=1-|CPb-CkPb|/CkPb, где CPb - концентрация Pb в опытном образце ИСП с внесением ГП; CkPb - концентрация Pb в контрольном образце ИСП без внесения ГП.
Далее измеряют токсичность по биотестированию (Тэ) по результатам фитотеста и биотеста до и после внесения гуминовых продуктов. Учитывают прирост численности клеток микроводорослей S. quadricauda (ФР. 1.39.2007.03223) и измеряют длину корней горчицы белой S. alba после 4-х дневного проращивания до и после внесения гуминовых продуктов в ИСП, размещенной в пластиковых планшетах. При этом рассчитывают индексы фитотоксичности (Тэ фт) и индексы биотеста (Тэ бт) как отношение разности токсичности опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного образца ИСП без внесения ГП к токсичности контрольного образца ИСП без внесения ГП. Среднее значение индекса токсичности по биотестированию (ИТэ) рассчитывают по формуле: ИТэ=(Тэ фт+Тэ бт)/2.
Далее измеряют биоиндикационную токсичность (Тб) по результатам базального и субстрат-индуцированного дыхания почвы до и после внесения гуминовых продуктов. Определяют биоиндикационную токсичность и субстрат-индуцированную токсичность дыхания почвы по эмиссии углекислого газа (отклик почвенных микроорганизмов) на газовом хроматографе «Кристаллюкс 4000 М». Затем рассчитывают индексы биоиндикационной токсичности по результатам базального (ТбБД) и субстрат-индуцированного (ТбСИД) дыхания почвы как отношение разности биоиндикационной токсичности опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного образца без внесения ГП к биоиндикационной токсичности контрольного образца ИСП без внесения ГП. Среднее значение индекса биоиндикационной токсичности (ИТб) рассчитывают по формуле: ИТб=(ТбБД+ТбСИД)/2.
Затем рассчитывают интегральный индекс токсичности (ИТ) для опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного (ИТк) без внесения ГП по формуле: ИТ или ИТк=(Тх+1,5*ИТэ+2,0*ИТб)/(1,0+1,5+2,0), где Тх - индекс химический токсичности; ИТэ - среднее значение индекса токсичности по биотестированию; ИТб - среднее значение индекса биоиндикационной токсичности; 1,0; 1,5 и 2,0 - весовые коэффициенты. После чего рассчитывают индекс ремедиации (ИР) по формуле: ИР=100-|ИТ*100|/ИТк, где ИТ - интегральный индекс токсичности для опытного образца ИСП с внесением ГП; ИТк - интегральный индекс токсичности для контрольного образца, без внесения ГП. Присвоении «весовых коэффициентов» в данном случае оправдано, поскольку именно биотические (токсикологические и биоиндикационные) показатели являются наиболее информативными с точки зрения поддержания устойчивого состояния экосистем и выполнения почвами экологических функций, в частности, такой как среда обитания для живых организмов.
При значении ИР<20 определяют отсутствие способности к ремедиации загрязненной почвы, при значении 20<ИР<50 - среднюю активность и при значении ИР≥50 - высокую активность ремедиирующей способности гуминовых продуктов в почвах. Такая градация ИР степени способности к ремедиации гуминовых продуктов загрязненной почвы в частности (градации 20-50-80) основана на оценке токсичности по стандартным методикам (например, ФР. 1.39.2007.03223: MP 2.1.7.2297-07; ISO 18763:2016), где значение 20% отклонения от контроля принято за пороговое, (максимальная наблюдаемая недействующая концентрация, МННК (no observed effect concentration, NOEC), то есть концентрация вещества, при действии которой измеряемый параметр отклоняется от контроля менее чем на 20%, считается неэффективной; от 20% до 50% отклонение от контроля рассматривается как средне-эффективное воздействие (полулетальная доза ЕС 50, LD 50); 50 и более % принимается (нами) как граница высокой активности.
В результате проведения эксперимента были получены следующие данные.
Pb
Pb
В подготовленной почвенной матрице - искусственной стандартной почве ИСП, приготовленной в лабораторных условиях по протоколу ISO11268-2 (состав минеральной части: 10% торф, 20% каолин, 79% песок, рН-6.6) проводили определение изменений химической токсичности, исходя из содержания свинца (Pb, г/кг) в образце ИСП с внесением Pb (контроль) 4 ОДК и в образцах ИСП с внесением Pb 4 ОДК и гуминовых продуктов. Расчет индекса химической токсичности (Тх) осуществляли по формуле:  где C - концентрация Pb в опытном образце ИСП с добавлением ГП; Ск - концентрация Pb в контрольном образце ИСП без добавления ГП.
В образце ИСП (контрольном) с добавлением свинца в биодоступной для растений форме (при экстракции 1 М ацетатно- аммонийным буфером) определено CkPb 25 мг Pb кг почвы.
При добавлении в опытный образец ИСП сравниваемых гуминовых продуктов определены следующие значения CPb (мг Pb кг почвы):
ИСП ГП 1: CPb=20
ИСП ГП 2: CPb=18
ИСП ГП 3: CPb=15
ИСП ГП 4: CPb=5,0
Соответственно, индексы химической токсичности, рассчитанные для ИСП с Pb без добавления ГП (контроль): Тхк=1-(25-25)/25=1
А для образцов ИСП с Pb и ГП (опытный):
для ГП 1 Тх=1-(20-25)/25=0,79
для ГП 2 Тх=1-(18-25)/25=0,73
для ГП 3 Тх=1-(15-25)/25=0,58
для ГП 4 Тх=1-(5,0-25)/25=0,20
Далее в этой же подготовленной почвенной матрице - искусственной стандартной почве ИСП, приготовленной в лабораторных условиях по протоколу ISO11268-2, содержащей 4 ОДК Pb измеряли токсичность по биотестированию (Тэ), по результатам фитотеста и биотеста до и после внесения гуминовых продуктов:
а) по результатам фитотеста (изменение длины корней (L, мм) проростков горчицы белой S.alba после 4-дневного проращивания).
В фоновом образце (без Pb и без ГП) Lф=26 мм. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу (без добавления ГП).
Таким образом, индекс Тэ фт определяют по формуле:  где Li - длина корней проростков горчицы в образце с добавлением Pb; Lф - длина корней проростков в фоновом образце (или контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП). В условно контрольном образце ИСП (с Pb и без ГП) Lк=16 мм. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу ИСП, загрязненному свинцом и с добавлением ГП. Измеренные значения в образцах с ГП и Pb после проращивания проростков горчицы белой S.alba в течение 4 дней представлены следующими показателями:
ГП 1: L1=30 мм
ГП 2: L2=21 мм
ГП 3: L3=25 мм
ГП 4: L4=25 мм
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): Тэк=(16-26)/26=0,39.
А для образцов со свинцом и ГП:
для ГП 1 Тэ фт1=(30-16)/16=0,88
для ГП 2 Тэ фт2=(21-16)/16=0,31
для ГП 3 Тэ фт3=(25-16)/16=0,60
для ГП 4 Тэ фт4=(25-16)/16=0,59
б) по результатам биотеста (изменение развития водорослей S.quadricauda методом флуоресценции).
Тэ после добавления свинца: в фоновом образце (без Pb и без ГП) показатель изменения флуоресценции микроводорослей Sф=0,019 (относительно начала экспозиции микроводорослей в образце). Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу и тогда индекс Тэ бт определяют по формуле:  где Si - изменение флуоресценции микроводорослей в образце с добавлением свинца; Sф - изменение микроводорослей в фоновом образце (или условно контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП).
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП) - Sк=0,025. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП). При добавлении в опытные образцы ИСП сравниваемых гуминовых продуктов определены следующие значения Si (изменение флуоресценции микроводорослей в образце):
ГП 1: Si1=0,020
ГП2: Si2=0,015
ГП3: Si3=0,019
ГП4: Si4=0,017
Соответственно для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): Тэк=(0,025-0,019)/0,019=0,28
А для образцов со свинцом и ГП:
для ГП 1 Тэ бт1=(0,020-0,025)/0,025=0,19
для ГП 2 Тэ бт2=(0,015-0,025)/0,025=0,39
для ГП 3 Тэ бт3=(0,019-0,025)/0,025=0,23
для ГП 4 Тэ бт4=(0,017-0,025)/0,025=0,31
Среднее значение индекса токсичности по биотестированию (ИТэ) определяется по формуле:
ИТэ=(Тэ фт+Тэ бт)/2
Контроль: ИТэ=(0,39+0,28)/2=0,34
для ГП 1 ИТэ1=(0,88+0,19)/2=0,54
для ГП 2 ИТэ2=(0,31+0,39)/2=0,35
для ГП 3 ИТэ3=(0,60+0,23)/2=0,41
для ГП 4 ИТэ4=(0,59+0,31)/2=0,45
2
Далее определяли изменение биоиндикационной токсичности, сравнивая базальное (БД) дыхание (мкг СO2/г*ч) и субстрат-индуцированное дыхание (СИД) почвы (мкл СO/г*ч) в загрязненном свинцом (условно контрольном, без ГП) и в образцах с ГП:
а) по результатам измерений базального дыхания (мкг СO2/г*ч).
Тб после добавления свинца:
2
в фоновом образце (без Pb и без ГП) ТбБДф=0,50 мкг СO/г*ч. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу, и тогда индекс биоиндикационной токсичности Тб определяют по формуле: , где ТбБДi - индекс биоиндикационной токсичности по базальному дыханию в образце с добавлением свинца; ТбБДф - индекс биоиндикационной токсичности по базальному дыханию в фоновом образце (или контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП).
2
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП) ТбБДк=0,44 мкг СO/г*ч. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП. Измеренные значения в образцах с ГП и Pb представлены следующими показателями:
ГП 1 Т6БД1=0,61
ГП 2 Т6БД2=0,61
ГП 3 ТбБД3=0,60
ГП 4 ТбБД4=0,50
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): Тбк=(0,44-0,50)/0,50=0,12
А для образцов со свинцом и ГП:
для ГП 1 ТбБД1=(0,61-0,44)/0,44=0,38
для ГП 2 ТбБД2=(0,61-0,44)/0,44=0,38
для ГП 3 ТбБД3=(0,60-0,44)/0,44=0,36
для ГП 4 ТбБД4=(0,50-0,44)/0,44=0,14
2
б) по результатам измерений субстрат-индуцированного дыхания (СИД) почвы (мкл СO/г*ч)
Тб после добавления свинца: в фоновом образце (без Pb и без ГП) ТбСИДф=2,3 мкг СO2/г*ч. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу, и тогда индекс биоиндикационной токсичности Тб определяют по формуле:  где ТбСИДi - индекс биоиндикационной токсичности по субстрат-индуцированному дыханию в образце с добавлением свинца; ТбСИДф - индекс биоиндикационной токсичности по субстрат-индуцированному дыханию в фоновом образце.
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП) - ТбСИДк=3,3 - это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП. Измеренные значения в образцах с ГП и Pb представлены следующими показателями:
ГП 1 ТбСИД1=6,7
ГП 2 ТбСИД 2=2,1
ГП 3 ТбСИД 3=2,7
ГП 4 ТбСИД 4=2,3
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): Тбк=(3,3-2,3)/2,3=0,46
А для образцов со свинцом и ГП:
для ГП 1 ТбСИД1=(6,7-3,3)/3,3=1,02
для ГП 2 ТбСИД2=(2,1-3,3)/3,3=0,36
для ГП 3 ТбСИД3=(2,7-3,3)/3,3=0,19
для ГП 4 ТбСИД4=(2,3-3,3)/3,3=0,32
Среднее значение биоиндикационного индекса токсичности (ИТб) определяется по формуле: ИТб=(Тб БД+Тб СИД)/2.
Соответственно:
Контроль: ИТб=(0,12+0,46)/2=0,29
для ГП 1 ИТб1=(0,38+1,02)/2=0,70
для ГП 2 ИТб2=(0,38+0,36)/2=0,37
для ГП 3 ИТб3=(0,36+0,19)/2=0,28
для ГП 4 ИТб4=(0,14+0,32)/2=0,23
Далее рассчитывали интегральный индекс токсичности ИТ по формуле для опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного (ИТк) без внесения ГП по формуле: ИТ и ИТк=(Тх+1,5*ИТэ+2,0*ИТб)/(1,0+1,5+2,0), где Тх - индекс химический токсичности; ИТэ - среднее значение индекса токсичности по биотестированию; ИТб - среднее значение индекса биоиндикационной токсичности; 1,0; 1,5 и 2,0 - весовые коэффициенты.
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИТк=(1+1,5*0,34+2,0*0,29)/(1,0+1,5+2,0)=0,47
А для опытных образцов со свинцом и ГП:
для ГП 1: ИТ1 (0,79+1,5*0,54+2,0*0,70)/(1,0+1,5+2,0)=0,67
для ГП 2: ИТ2 (0,73+1,5*0,35+2,0*0,37)/(1,0+1,5+2,0)=0,44
для ГП 3: ИТ3 (0,58+1,5*0,41+2,0*0,28)/(1,0+1,5+2,0)=0,39
для ГП 4: ИТ4 (0,20+1,5*0,45+2,0*0,23)/(1,0+1,5+2,0)=0,30,
а индекс ремедиации (ИР) рассчитывают по формуле: ИР=100-|ИТ*100|/ИТк,
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль):
А для образцов со свинцом и ГП:
Таким образом, в данном случае для ГП 2 и 3 отсутствует способность ГП к ремедиации почвы. А для ГП 1 и 4 имеется средняя активность ГП к ремедиации почвы.
Расчет ИР в агродерново-подзолистой среднесуглинистой почве Albie Glossie Retisols (Россия, Подмосковье).
Были использованы следующие гуминовые препараты:
ЛГ - лигногумат (0,8 мг/кг)
ГК - свободные гуминовые кислоты (0,4 мг/кг)
Ф - флексом (1,8 мг/кг).
В подготовленной почвенной матрице - в агродерново-подзолистой среднесуглинистой почве проводили определение изменений химической токсичности, исходя из содержания свинца (Pb, г/кг) в образце с внесением Pb (контроль) 4 ОДК и в образцах с внесением Pb 4 ОДК и гуминовых продуктов. Индексы химической токсичности рассчитывали по формуле: Tx=1-|CPb-CkPb|/CkPb, где CPb - концентрация Pb в опытном образце с внесением ГП; СkРb - концентрация Pb в контрольном образце без внесения ГП.
В контрольном образце с добавлением свинца в биодоступной для растений форме (при экстракции 1 М ацетатно-аммонийным буфером) определено СkРb 29 мг Pb кг почвы.
При добавлении сравниваемых гуминовых препаратов (ГП) определены следующие значения CPb (мг Pb кг почвы):
ЛГ: CPb=30
ГК: CPb=15
Ф: CPb=10
Соответственно, индексы химической токсичности Тх, рассчитанные для почвы с Pb без добавления ГП (контроль) составили: ИТхк=1-|29-29|/29=1,0.
А для опытных образцов со свинцом и ГП составили:
ЛГ: ИТх=1-|30-29|/29=0,97
ГК: ИТх=1-|15-29|/29=0,48
Ф: ИТх=1-(10-29|/29=0,34
Далее измеряли индекс токсичности почвы по биотестированию Тэ:
а) по результатам фитотеста (изменение длины корней (1, мм) проростков горчицы белой S.alba) ИТэ после добавления свинца определяли по формуле и тогда индекс Тэ фт определяют по формуле:  где Li - длина корней проростков горчицы белой в образце с добавлением Pb; Lф - длина корней проростков в фоновом образце (или контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП).
В фоновом образце (без Pb и без ГП) Lф=26 мм. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненным свинцом образцах.
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП) Lк=16. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП.
В фоновом образце (без Pb и без ГП) Lф=26 мм. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу (без добавления ГП).
Измеренные значения в образцах с ГП и Pb после проращивания проростков горчицы белой S.alba в течение 4 дней представлены следующими показателями:
ЛГ: 1=30 мм
ГК: 1=21 мм
Ф: 1=25 мм
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИТэк=116-261/26=0,39
А для образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИТэ фт=|30-16|/16=0,87
ГК: ИТэ фт=|21-16|/16=0,31
Ф: ИТэ фт=|25-16|/16=0,57.
б) по результатам биотеста (изменение развития водорослей S.quadricauda методом флуоресценции) ИТэ после добавления свинца определяется по формуле:  где Si - изменение флуоресценции водорослей в образце с добавлением свинца; Sф - изменение водорослей в фоновом образце (или условно контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП).
В фоновом образце (без Pb и без ГП) Sф=0,019. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу.
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП): Sк=0,025 - это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП).
Измеренные значения в образцах с ГП и Pb представлены следующими показателями:
ЛГ: Si=0,020
ГК: Si=0,015
Ф: Si=0,023
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль).
Контроль: ИТэк=|0,025-0,019|/0,019=0,23
А для образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИТэ бт=|0,020-0,025|/0,025=0,20
ГК: ИТэ бт=|0,015-0,025|/0,025=0,40
Ф: ИТэ бт=|0,023-0,025|/0,025=0,08
Среднее значение индекса токсичности по биотестированию (ИТэ) определяли по формуле: ИТэ=(Тэ фт+Тэ бт)/2.
Контроль: ИТэ=(0,39+0,23)/2=0,31
ЛГ: ИТэ=(0,87+0,20)/2=0,53
ГК: ИТэ=(0,31+0,40)/2=0,35
Ф: ИТэ=(0,57+0,08)/2=0,33
Далее измеряли биоиндикационную токсичность (Тб) по результатам базального (ТбБД) и субстрат-индуцированного (ТбСИД) дыхания данной почвы до и после внесения гуминовых продуктов.
Индекс биоиндикационной токсичности Тб определяли по формуле: , где ТбБДi - индекс биоиндикационной токсичности по базальному дыханию в образце с добавлением свинца; ТбБДф - индекс биоиндикационной токсичности по базальному дыханию в фоновом образце (или контрольном, в случае с вариантами с добавлением ГП).
2
В фоновом образце (без Pb и без ГП): ТбБДф=0,50 мкг СO/г*ч.
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП): ТбБДк=0,44. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП.
Измеренные значения в образцах с ГП и Pb представлены следующими показателями:
ЛГ: ТбБД=0,61
ГК: ТбБД=0,61
Ф: ТбБД=0,63
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИТбк=(0,44-0,50)/0,50=0,12
А для опытных образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИТб БД=|0,61-0,44|/0,44=0,39
ГК: ИТб БД=|0,61-0,44|/0,44=0,38
Ф: ИТб БД=|0,63-0,44|/0,44=0,43.
2
б) По результатам измерений субстрат-индуцированного дыхания (СИД) почвы (мкл СO/г*ч).
Индекс биоиндикационной токсичности Тб определяют по формуле:  где ТбСИДi - индекс биоиндикационной токсичности по субстрат-индуцированному дыханию в образце с добавлением свинца; ТбСИДф - индекс биоиндикационной токсичности по субстрат-индуцированному дыханию в фоновом образце.
2
В фоновом образце (без Pb и без ГП) Тб СИДф=2,3 мкг СO/г*ч. Это значение принимается за контроль по отношению к загрязненному свинцом образцу.
В условно контрольном образце (с Pb и без ГП): Тб СИДк=3,3. Это значение принимается за контроль по отношению к образцу, загрязненному свинцом и с добавлением ГП.
Измеренные значения в образцах с ГП и Pb представлены следующими показателями:
ЛГ: Тб СИД=6,7
ГК: Тб СИД=2,1
Ф: Тб СИД=2,7
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИТбк=|3,3-2,3|/2,3=0,43. А для образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИТб СИД=|6,7-3,3|/3,3=1,03
ГК: ИТб СИД=|2,1-3,3|/3,3=0,36
Ф: ИТб СИД=|2,7-3,3|/3,3=0,19.
Далее рассчитывали среднее значение индекса биоиндикационной токсичности (ИТб) по формуле: ИТб=(ТбБД+ТбСИД)/2.
Контроль: ИТбк=|0,12+0,43|/2=0,27
ЛГ ИТб=|0,39+1,03|/2=0,71
ГК ИТб=|0,38+0,36|/2=0,37
Ф ИТб=|0,43+0,19|/2=0,31
Затем рассчитывали интегральный индекс токсичности (ИТ) для опытного образца ИСП с внесением ГП и контрольного (ИТк) без внесения ГП по формуле: ИТ и ИТк=(Тх+1,5*ИТэ+2,0*ИТб)/(1,0+1,5+2,0), где Тх - индекс химический токсичности; ИТэ - среднее значение индекса токсичности по биотестированию; ИТб - среднее значение индекса биоиндикационной токсичности; 1,0; 1,5 и 2,0 - весовые коэффициенты.
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИТк=(1+1,5*0,31+2,0*0,27)/(1,0+1,5+2,0)=0,45
А для образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИТ1=(0,97+1,5*0,53+2,0*0,71)/(1,0+1,5+2,0)=0,70
ГК: ИТ2=(0,48+1,5*0,35+2,0*0,37)/(1,0+1,5+2,0)=0,38
Ф: ИТ3=(0,34+1,5*0,33+2,0*0,31)/(1,0+1,5+2,0)=0,32
После чего рассчитывали индекс ремедиации (ИР) по формуле: ИР=100-|ИТ*100|/ИТк.
Соответственно, для почвы с Pb без добавления ГП (контроль): ИРк=100-|0,45*100|/0,45=0
А для образцов со свинцом и ГП:
ЛГ: ИР=100-|0,70*100|/0,45=56
ГК: ИР=100-|0,38*100|/0,45=16
Ф: ИР=100-|0,32*100|/0,45=29
Таким образом, для лигногумата в дозе (0,8 мг/кг) степень ремедиирующей способности гуминовых продуктов данной почвы соответствует высокой активности ремедиирующей способности гуминовых продуктов. Для свободных гуминовых кислот в дозе (0,4 мг/кг) способность гуминовых продуктов к ремедиации данной почвы отсутствует. Для флексома в дозе (1,8 мг/кг) способность к ремедиации гуминовых продуктов данной почвы соответствует средней активности ремедиирующей способности гуминовых продуктов.
Таким образом, заявленный способ обеспечивает в течение 5 дней с высокой точностью оценить ремедиирующую способность гуминовых продуктов, за счет разносторонней и комплексной оценки их взаимодействия с почвами загрязненными тяжелыми металлами.