Способ получения гепатопротекторного средства на основе прописи «Семь драгоценных» и его фармакотерапевтическая эффективность

УДК 633.88 © Г.В. Чехирова, Т.А. Асеева, З.Г. Самбуева, В.Б. Хобракова

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПРОПИСИ «СЕМЬ ДРАГОЦЕННЫХ» И ЕГО ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

Разработан способ получения гепатопротекторного средства, представляющего собой сухой экстракт. Оптимальные технологические параметры установлены с использованием метода математического планирования эксперимента, позволяющего усовершенствовать способ производства. Полученное средство обладает выраженным фармакотерапевтическим влиянием при различных повреждениях печени, благодаря широкому спектру его фармакологической активности, оказывая не только специфическое холеретическое действие, но и благоприятное влияние на функциональное состояние печени, а также регулирующее влияние на функциональные системы адаптации организма в целом.

Ключевые слова: гепатопротекторное средство, оптимизация технологии, желчегонное, противовоспалительное, мембраностабилизирующее, антиоксидантное, иммуномодулирующее, гепатиты.

G.V. Chekhirova, Т.А. Aseeva, Z.G. Sambueva, V.B. Khobrakova

THE METHOD OF MAKING HEPATOPROTECTIVE REMEDY ON THE BASIS OF TIBETAN RECIPE «SEVEN PRECIOUS» AND ITS PHARMACOTHERAPEUTIC EFFICIENCY

The method of making hepatoprotective remedy that is a dry extract has been developed. The optimal process parameters have been determined by implying the method of mathematical modeling of experiment which allows to improve the way of its production. The remedy has the expressed pharmotherapeutic influence on the different liver damages due to the broad range of its pharmacological activity. It causes not only a specific choleritic effect, but also the favorable influence on the liver’s functional status and the regulatory influence on the whole on the functional systems of organism’s adaptation.

Keywords: hepatoprotective remedy, technology optimization, choleretic, antiinflammatory, membrane stabilizing activity, antioxidant, immunomodulating hepatitis.

В практике фитотерапии при многих острых и хронических заболеваниях наиболее часто применяются многокомпонентные сборы, сочетающие симптоматические и патогенетические средства. Это особенно характерно для тибетской медицины, в которой лекарственные препараты включают в среднем от 3 до 25 ингредиентов. В рецептурном справочнике «Большой Агинский жор» пропись под названием «Семи драгоценностей отвар» («нор-бу дун-тан») рекомендуется в качестве противовоспалительного и «очищающего» средства: «способствует созреванию, сбору и покорению жара, возвращает с пути незначительный жар», «собирает жар, рассеянный ветром», лечит «пустой жар кхругс» [4]. В монгольской народной медицине сбор «Норов-7» применяется при лечении «свежего и застарелого жара». Сбор «нор-бу дун-тан» является комбинацией двух широко используемых в тибетской медицине средств: «Девясил-4» («ма-ну ши-тан») и «Три плода». «Три плода», так называемый «очиститель», широко используется как отдельно, так и с добавлением различных ингредиентов при нарушениях обменных процессов. «Девясил-4» назначается при самых разных заболеваниях, сопровождающихся воспалительными процессами, чаще всего при лихорадочных состояниях в острый период [1, 2, 12].

В процессе предварительных исследований пропись «Семь драгоценных» была частично модифицирована с целью ее адаптации к российской сырьевой базе, в результате получена растительная композиция, состоящая из корневищ и корней девясила высокого (Inula helenium L.) и кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.), корневищ имбиря лекарственного (Zingiber officinale Roscoe), корней софоры желтоватой (Sophora flavescens Soland.), древесины бузины сибирской (Sambucus sibirica Nakai), плодов боярышника кроваво-красного (Crataegus sanguinea Pall.) и яблони ягодной (Malus baccata (L.) Borkh.). На основе данной композиции получен сухой экстракт (СЭ) с использованием ресурсосберегающей технологии: путем кратной мацерации растительного сырья водным этанолом при щадящем режиме нагрева, позволяющем сохранить термолабильные соединения [9]. Оптимизация технологических параметров получения сухого экстракта проведена с помощью метода математического планирования эксперимента, включающего регрессионный анализ с использованием части реплики от полного 6-факторного эксперимента [13].

В качестве независимых факторов, влияющих на процесс извлечения БАВ, были выбраны следующие: концентрация спирта этилового, %; соотношение твердой и жидкой фаз, мл/г; температура экстракции, 0С; время первого контакта фаз, мин; время второго и третьего контактов фаз, мин. В

качестве выходных контролируемых параметров (параметров оптимизации) выбрали выход суммы фенолкарбоновых кислот и флавоноидов в пересчете на коричную кислоту, % (по разработанной нами методике [11]); выход суммы экстрактивных веществ, % (по ГФ XI [3]).

Исследуемое пространство определяли путем установления пределов варьирования независимых факторов. Для концентрации экстрагента нижним пределом выбрали 20%-ный спирт этиловый, так как при более низкой концентрации спирта конечный продукт получался в виде вязкой массы, что противоречит поставленной задаче (получение сухого экстракта); верхним пределом - 50%-ный спирт этиловый, поскольку при использовании данного экстрагента извлекается максимальное количество ФКФ, но происходит неполное извлечение биологически активных веществ, также отвечающих за гепатопротекторную активность, лучше растворяющихся в спирто-водных смесях с большим содержанием воды (полисахариды, антоцианы и др.).

Для фактора, характеризующего соотношение сырье-экстрагент, нижним пределом было выбрано соотношение 1:10, поскольку при меньшем количестве экстрагента сырье смачивалось в недостаточной степени, верхним пределом - 1:30, так как дальнейшее увеличение количества экстрагента нерационально. Вследствие того, что в экстрагируемом растительном сырье содержатся термолабильные соединения (витамины, антоцианы, алкалоиды), максимум температуры экстракции ограничили 600С.

Для времени первой и второй экстракции установили следующие границы: 30 и 120 мин, для третьей - 0 и 90 мин. Выбор в качестве нижнего предела для времени третьего контакта фаз 0 мин позволил не использовать еще один дополнительный входной параметр, определяющий кратность экстракции - двух- или трехкратная.

С использованием выбранных пределов варьирования независимых факторов, влияющих на процесс получения сухого экстракта, была спланирована серия экспериментов по матрице, позволяющей варьировать одновременно все исследуемые параметры. В результате математической обработки экспериментальных данных получены уравнения регрессии, на основании которых исследовано пространство параметров расчетным способом при пошаговом варьировании всех исходных переменных. Проведенное расчетное моделирование позволило уточнить область оптимальных технологических режимов и значительно сузить область исследуемого пространства. В результате проведенного процесса оптимизации выбран оптимальный технологический режим процесса экстракции исходного сбора: концентрация этанола 30-35%, соотношение сырье-экстрагент 1:12 (1:16 с учетом коэффициента водопоглощения), температура экстракции 60 0С, время первого, второго, третьего контакта фаз - 120, 60, 60 мин соответственно.

Изучение желчегонной активности сухих экстрактов, полученных с использованием спиртоводных смесей различных концентраций (20-60%), подтвердило, что экстракт, полученный с применением 30%-ного этилового спирта, обладает наиболее выраженной активностью.

В процесс оптимизации не был включен такой важный фактор, как степень измельчения сырья вследствие того, что в исследуемый сбор входит 7 видов растений и измельчение каждого из них, а, следовательно, и изучение влияния степени измельчения на динамику извлечения биологически активных соединений, необходимо производить отдельно. Включение же еще 7 факторов в эксперимент привело бы к необоснованному усложнению модели, значительному увеличению количества необходимых экспериментов (как минимум, 2048) и снижению точности расчетов. Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили отдельно для каждого вида сырья с использованием 30%-ного этанола. На основании полученных данных, измельчение каждого вида сырья следует проводить отдельно до размера частиц: 2 мм для корневищ и корней девясила высокого, кровохлебки лекарственной, корней софоры желтоватой, древесины бузины сибирской, плодов яблони ягодной и 1 мм - для плодов боярышника кроваво-красного и корневищ имбиря лекарственного.

Таким образом, в результате использования метода математического планирования эксперимента установлены оптимальные технологические параметры получения сухого экстракта гепатопротек-торного, позволяющие усовершенствовать способ его производства.

С помощью общеизвестных методик проведено фитохимическое исследование полученного сухого экстракта на присутствие основных биологически активных веществ. Экспериментально подтверждено, что в сухом экстракте содержатся основные группы биологически активных веществ: флаво-ноиды, антоцианы, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, полисахариды (в т.ч. инулин), свободные сахара, сесквитерпеновые лактоны, аминокислоты, алкалоиды.

Проведено исследование основных фармакологических свойств СЭ - желчегонных, противово-воспалительных, мембраностабилизирующих, антиоксидантных и иммуномодулирующих, а также

изучено фармакотерапевтическое влияние данного экстракта на функции печени при экспериментальном гепатите, вызванном различными повреждающими факторами - тетрахлорметаном, тетрациклином, этанолом [5-8, 10]. Эксперименты проводили на интактных белых крысах линии Wistar обоего пола с массой 160-200 г, иммуномодулирующие свойства изучали на мышах обоего пола линий CBA и F1 массой тела 18-20 г.

Желчегонную активность СЭ исследовали в дозах 100 и 300 мг/кг массы тела животных. Интенсивность желчеотделения оценивали по скорости секреции, общему ее объему за 4 ч после введения исследуемых средств, а также определяли содержание в желчи ее основных ингредиентов: билирубина, холестерина и желчных кислот. В результате проведенных исследований установлено, что СЭ обладает выраженным желчегонным действием. При введении данного экстракта в дозе 100 мг/кг скорость секреции желчи возрастает на 32, 29, 33 и 31% (соответственно часам наблюдения) по сравнению с таковой у животных контрольной группы. Общее количество выделенной желчи превышало контроль на 31%. При увеличении дозы данного экстракта до 300 мг/кг скорость секреции желчи была почти аналогичной у животных при введении дозы 100 мг/кг. Холеретическая реакция при введении данного СЭ сохранялась в течение всего периода наблюдения (4-5 ч.). При этом СЭ способствовал стимуляции выделения холатов, концентрация которых в желчи превышала контроль на 35%. Данный экстракт также ускорял экскрецию билирубина, содержание его в желчи превышало контрольные показатели на 23% и 21%. Полученные результаты дают основание отнести данный СЭ по существующей классификации желчегонных средств к истинным холеретикам.

Определение противовоспалительной активности заключалось в оценке его влияния на экссудативную фазу воспаления, на фазу пpолифеpации и на ^оцесс альтеpации общепринятыми методами. В результате установлено, что при асептическом «формалиновом» отеке СЭ в дозе 0.1 г/кг массы тела животных оказывает антиэкссудативное действие. Через 24 ч после введения формалина исследуемый экстракт способствовал уменьшению отека воспаленной лапки на 22%, а препарат сравнения бутадион - на 32%. Курсовое введение СЭ в дозе 0.1 г/кг способствует уменьшению деструкции и стимулирует регенерацию тканей. В частности, на 9-е сутки опыта площадь некротизированной ткани уменьшалась на 33% по сравнению с контролем, а у крыс, получавших препарат сравнения - лишь на 15% (различие недостоверно). На 29-е сутки опыта отмечено уменьшение площади некротизиро-ванных тканей на 57%, тогда как у крыс, получавших препарат сравнения бутадион, площадь некроза уменьшалась на 27%. СЭ не оказывал существенного влияния на стадию пролиферации воспалительной реакции.

Мембраностабилизирующую активность СЭ определяли in vitro с использованием 1%-ной суспензии отмытых донорских эритроцитов. Гемолиз эритроцитов вызывали использованием реактива Фентона. Экстракт исследовали в концентрациях, рассчитанных с учетом объема циркулирующей крови в организме - 0.05; 0.1; 0.2 г/л. В иследованных концентрациях СЭ оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие, снижая степень гемолиза, вызванного реактивом Фентона, через 2 ч на 38-46% и на 24-30% - через 24 ч.

Антиокислительную активность экстракта определяли с применением метода индуцированной хемилюминесценции (ХЛ). В результате исследований установлено, что СЭ в исследуемых дозах (0.03; 0.1; 0.3; 1.0 г/л) оказывает ингибирующее влияние на кинетику Fe2+ - индуцированной ХЛ в тестируемой системе, о чем свидетельствовало уменьшение скорости нарастания «медленной вспышки» на начальной экспоненциальной стадии. Установлено, что концентрация полуингибирования Fe2+-индуцированной ХЛ - С1/2 составляет 0.11 г/л, антиокислительный эффект проявляется в концентрации 0.03 г/л и выше. Рассчитанное значение антиокислительной активности исследуемого СЭ составило 9 (г/л)-1, что позволило отнести его к группе растительных средств с антиоксидантными свойствами.

Исследование иммунокорригирующих свойств СЭ выявило его эффективность по отношению к реакциям клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа при экспериментальной азатиопри-новой иммуносупрессии. СЭ в дозе 0,3 г/кг массы тела животных способно ослаблять супрессивное действие азатиоприна на антителогенез и клеточно-опосредованную иммунную реакцию гиперчувствительности замедленного типа, что выражается в восстановлении иммунологических показателей, нарушенных азатиоприном, и свидетельствует о выраженных иммунокорригирующих свойствах СЭ.

Результаты исследований влияния СЭ на функции печени при экспериментальном гепатите, вызванном различными повреждающими факторами (тетрахлорметаном, тетрациклином, этанолом), свидетельствуют о выраженной фармакотерапевтической эффективности СЭ при остром токсическом повреждении печени животных. Курсовое введение СЭ в дозе 0,1 г/кг массы тела животных способ-

ствует ингибированию процессов ПОЛ, вызванных токсическими агентами, и стабилизации мембран гепатоцитов. Одним из важнейших молекулярно-клеточных механизмов в действии исследуемого экстракта является его антиоксидантная активность, что обусловливает его мембраностабилизирующее действие, установленное в условиях in vitro. СЭ, снижая проницаемость мембран гепатоцитов, препятствует развитию цитолиза, а также холестаза, вызываемыми токсическими агентами. Указанный СЭ, вероятно, повышая функциональную активность микросомальной ферментной системы (МФС), способствует нормализации метаболизма холестерина и желчных кислот и предотвращает развитие вторичных некрозов гепатоцитов. О повышении функциональной активности МФС под влиянием СЭ свидетельствует ускорение элиминации из организма гексенала. Холатостимулирую-щее влияние СЭ, вероятно, связано не только с улучшением синтетической функции печени, но и влиянием на энтерогепатическую циркуляцию желчных кислот.

Кроме того, введение СЭ благоприятно влияет также и на антитоксическую функцию печени, что характеризуется увеличением скорости элиминации из организма гексенала и, следовательно, снижением продолжительности «гексеналового» сна.

Таким образом, полученный СЭ обладает выраженным фармакотерапевтическим влиянием при различных повреждениях печени, благодаря широкому спектру его фармакологической активности, оказывая не только специфическое холеретическое действие, но и благоприятное влияние на функциональное состояние печени, а также регулирующее влияние на функциональные системы адаптации организма в целом.

Литература

1. Лекарствоведение в тибетской медицине / Т.А. Асеева [и др.]. Новосибирск: Наука, 19S9. 192 с.

2. Базарон Э.Г., Асеева Т.А. «Вайдурья-онбо» - трактат индо-тибетской медицины. Новосибирск: Наука, 19S4. 120 с.

3. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 19S7. ЗЗб с.

4. «Кунпан-дудзи» (Полезный для всех экстракт амриты): Большой рецептурный справочник Агинского дацана /Сумати Праджня; пер. с тиб., предисл., примеч., указ. Д.Б. Дашиева. М.: Восточная литература, 200S. 214 с.

5. Фармакотерапевтическое влияние «гепатофита» при экспериментальном гепатите / С.М. Николаев [и др.] // Сибирский медицинский журнал. 2003. Т. 39, № 4. С. 6S-71.

6. Николаев С.М., Самбуева З.Г., Чехирова Г.В. Желчегонные свойства сухого экстракта из растительного сбора тибетской медицины «Семь драгоценных» // Растительные ресурсы. 2004. Т. 40, вып. 2. С. 119-123.

7. Влияние гепатофита на желчевыделительную функцию печени при повреждении ее тетрациклином / С.М. Николаев [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 4S, № 4. С. 24-2б.

S. Фармакотерапевтическая эффективность сухого экстракта из комплексного растительного средства «норбу-дун-тан» при повреждении печени этанолом / З.Г. Самбуева [и др.] // Растительные ресурсы. 2001. Т. 37, вып. 2. С. 75-79.

9. Патент на изобретение № 2159123, Российская Федерация. Чехирова Г.В., Самбуева З.Г., Ер-баева Л.В., Асеева Т.А., Николаев С.М., Петров Е.В., Дашинамжилов Ж.Б. Способ получения средства, обладающего желчегонной и противовоспалительной активностью. 2000. Бюл. № 32.

10. Хобракова В.Б., Чехирова Г.В., Николаев С.М. Иммунокорригирующие свойства сухого экстракта из растительного сбора тибетской медицины «Семь драгоценных» // Растительные ресурсы. 200б. Т.42, вып. 3. С. 14б-150.

11. Чехирова Г.В. Разработка и стандартизация гепатопротекторного средства растительного происхождения: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Улан-Удэ, 2000. 23 с.

12. «Чжуд-ши»: Канон тибетской медицины / пер. с тиб., предисл., примеч., указатели Д.Б. Дашиева. М.: Восточная литература, 2001. 7бб с.

13. Экспериментально-статистическое исследование и оптимизация технологических объектов: метод. указания по курсу «Применение ЭВМ в химической технологии» // ЛХФИ. Л., 19SS. 52 с.

Чехирова Галина Владимировна, кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, г.Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 434743. E-mail: gchehirova@mail.ru.

Асеева Тамара Анатольевна, доктор фармацевтических наук, профессор, зав. лабораторией медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, профессор кафедры фармации медицинского факультета Бурятского государственного университета. 670047, г.Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 434743. E-mail: ta-aseeva@mail.ru.

Самбуева Зинаида Гомбожаповна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, г.Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 433463.

Хобракова Валентина Бимбаевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. 670047, г.Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, ИОЭБ СО РАН. Тел. (3012) 434743. E-mail: val0808@mail.ru.

Chekhirova Galina Vladimirovna, candidate of pharmaceutical sciences, senior research fellow, laboratory of medical and biological researches, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. (3012) 434743, e-mail: gchehirova@mail.ru.

Aseeva Tamara Anatolevna, doctor of pharmaceutical sciences, professor, head of the laboratory of med,ical and biological researches, Institute of General and Experimental Biology SB RAS professor, department of pharmacy, medical faculty, Buryat State University. 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. (3012) 434743, e-mail: ta-aseeva@mail.ru.

Sambueva Zinaida Gombozhapovna, candidate of veterinary sciences, senior researcher, laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. (3012) 433463.

Khobrakova Valentina Bimbaevna, candidate of biological sciences, senior research fellow, laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS. 670047, Ulan-Ude, Sakhyanova str., 6, tel. (3012) 434743, e-mail: val0808@mail.ru