Способ прогнозирования тяжести течения ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза
METHOD FOR PREDICTION OF SEVERITY OF EBV-ASSOCIATED INFECTIOUS MONONUCLEOSIS

Способ прогнозирования тяжести течения ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза
Изобретение относится к области медицины и к инфекционным болезням, касается способа прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ-ИМ), с помощью молекулярно-генетических маркеров и может быть использовано для оптимизации проводимой терапии.
Инфекционный мононуклеоз - вирусное заболевание, вызываемое представителями семейства Herpesviridae (чаще вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирусом (ЦМВ), вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ6)), характеризующееся лихорадкой, лимфаденопатией, тонзиллитом, гепато - и спленомегалией, заложенностью носа, одутловатостью лица, хрипящим дыханием, голосом с носовым оттенком, высыпаниями на коже, лимфомоноцитозом, появлением атипичных мононуклеаров в периферической крови и др. Возникает как первичная инфекция у иммунокомпетентных и иммуносупрессированных пациентов или как реактивация инфекции у иммуносупрессированных больных. ВЭБ относится к группе гамма-герпесвирусов. Широкий тканевой тропизм, способность к пожизненной персистенции и латенции в организме инфицированного человека являются уникальными биологическими свойствами всех герпесвирусов [D.L Sitki-Green, R.Н. Edwards, М.M.Covington, N. Raab-Traub Biology of Epstein-Barr virus during infectious mononucleosis // J. Infect. Dis.- 2004, V. 189, №3.- P. 483-492.]. ВЭБ преимущественно поражает B-лимфоциты, проникая внутрь клетки через специфический рецептор CD21; вирусная ДНК постоянно присутствует в ядре в виде экстрахромосомной эписомы, вызывая постоянную пролиферацию лимфоцитов и их трансформацию в атипичные мононуклеары [Иванова В.В., Родионова В.В., Железникова Г.Ф. и др. Пролонгированная иммуносупрессия и возможная хронизация инфекции у детей с инфекционным мононуклеозом // Рос. вестн. перинатол. и педиат.- 2003. - №4. - С. 50-59.]. ВЭБ может также инфицировать клетки эпителия носоглотки и желудочно-кишечного тракта, эпителиоциты сосудов, Т-лимфоциты, нейтрофилы, дендритные клетки, которые имеют на своей поверхности рецептор CD21 [Боковой А.Г., Домрачева М.Е. Клиническое значение иммунологических показателей при инфекционном мононуклеозе у детей // Детск. инфекции. - 2006.-№3. - С. 18-23.]. ВЭБ оказывает двоякое действие на программированную гибель клеток (апоптоз): повышая выживаемость В-лимфоцитов, он одновременно вызывает гибель Т-клеток, макрофагов и нейтрофилов, что лежит в основе вирус-опосредованной иммуносупрессии. Кроме регуляции апоптоза и пролиферации инфицированных иммунокомпетентных клеток, ВЭБ способен модулировать иммунные реакции организма за счет экспрессии вирусных белков - аналогов интерлейкинов человека [Л.А. Ходак, О.А. Ржевская Современные особенности инфекционного мононуклеоза // Междунар. мед. журнал. - №2006. - С. 85.].
Основной целью терапии является не только купирование симптомов, но и перевод острой инфекции в латентную стадию и тем самым снижение риска развития хронической ВЭБ-инфекции и ассоциированных с нею лимфопролиферативных, онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Подход к проведению противовирусной и иммуномодулирующей терапии должен учитывать тяжесть течения ИМ. Так, при легком течении не проводится противовирусная и иммунотропная терапия, при среднетяжелом течении (с тенденцией к затяжному течению и осложнениям) показана этиотропная терапия, больным с тяжелым течением рекомендуются глюкокортикостероиды. Применение иммуномодуляторов при тяжелом течении ВЭБ-ИМ следует считать нецелесообразным, так как их действие является неспецифичным, мало прогнозируемым и при развитии иммунопатологического гиперпролиферативного процесса может привести к непредсказуемым последствиям [Ю.Г. Притулина, В.В. Кунина, А.А. Монастырский, Т.Н. Малюткина, В.В. Малиновская, А.Н. Шувалов Новые подходы к терапии инфекционного мононуклеоза// Лечащий врач. - 2019. -№9. - С. 57-59.].
До настоящего времени нет четких критериев, позволяющих прогнозировать тяжесть течения ВЭБ-ИМ.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа прогнозирования тяжести течения ВЭБ-ИМ с применением молекулярно-генетических маркеров.
Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в повышении точности прогнозирования тяжелого течения ВЭБ-ИМ, что способствует своевременному проведению адекватной противовирусной и иммуномодулирующей терапии.
Технический результат достигается тем, что в лейкоцитах периферической крови пациентов с ВЭБ-ИМ детектируют экспрессию мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 и при повышении уровня их экспрессии по сравнению со здоровыми донорами прогнозируют среднетяжелую, а при снижении уровня экспрессии - тяжелую форму течения заболевания.
Молекулярно-генетические маркеры для прогнозирования тяжести течения ВЭБ-ИМ представляют собой матричные РНК (мРНК), продукты которых регулируют апоптоз, пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток.
мРНК гена FPGS (folylpolyglutamate synthase) кодирует фермент фолилполиглутаматсинтетазы, играющий центральную роль в установлении и поддержании цитозольной и митохондриальной концентрации фолилполиглутамата. Фермент необходим для регуляции гомеостаза фолата и выживания пролиферирующих клеток [Rosowsky A: Chemistry and biological activity of antifolates // Prog. Med. Chem.-1989, 26: 1- P. 252.]. Предположительно FPGS участвует в онкогенезе; снижение уровней его экспрессии наблюдали в опухолевых клеточных линиях, резистентных к антифолатам [Liani, Е. et al. Loss of folylpoly-gamma-glutamate synthetase activity is a dominant mechanism of resistance to polyglutamylation-dependent novel antifolates in multiple human leukemia sublines // Int. J. Cancer. - 2005. 103. - P 587-599.].
мРНК гена PCNA (proliferating cell nuclear antigen) кодирует белок, участвующий в регуляции гликолиза [S.N. Naryzhny, Н. Lee Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer // FEBS Lett. - 2010. №584. - P. 4292-4298.], синтеза ДНК и ее репарации, сборке хроматина и множества других процессов, сопровождающих деление клеток и апоптоз [V. Witko-Sarsat, J. Mocek, D. Bouayad, N. Tamassia et al. Proliferating cell nuclear antigen acts as a cytoplasmic platform controlling human neutrophil survival // J. Exp. Med. - 2010. 207(12). -P. 2631-2645.]. PCNA участвует в регуляции функций NK-клеток [В. Rosental, М. Brusilovsky, U. Hadad, D.Oz, et al. proliferating cell nuclear antigen is a novel inhibitory ligand for the natural cytotoxicity receptor NKp44 // J. Immunol. -2011.187(11). - P. 5693-5702.] и может служить маркером для определения степени агрессии опухолевого процесса, в частности, при раке желудка [В.Л. Чанг, А.А. Иванникова, И.В. Булычева, Н.А. Огнеруб Роль пролиферирующего ядерного антигена и р53 в опухолевом процессе при раке желудка // Вестник ТГУ. - 2015. - Т. 29, вып. 1. - С. 140-142.].
Сущность способа поясняется примером.
Пример. В исследование вошли дети и подростки в возрасте 6-17 лет с диагнозом «ВЭБ-инфекционный мононуклеоз». С помощью коммерческих тест-систем «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-VCA-IgG», «ВектоННV-6-IgG», «ВектоЦМВ-IgM», «ВектоЦМВ-IgG» производства «Вектор-Бест» (Россия) в образцах сыворотки крови пациентов определяли наличие специфических антител к ВЭБ, ВГЧ6 и ЦМВ; с применением коммерческого набора для ПЦР в реальном времени «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (ЦНИИЭ, Россия) - наличие ДНК вирусов. На основании результатов тестирования отбирали пациентов с ВЭБ-ИМ, образцы сыворотки крови которых содержали антитела и ДНК к ВЭБ, но не к двум другим герпесвирусам (группа ВЭБ-ИМ, n=27, средний возраст 12 лет). Контроль составили образцы периферической крови, полученные от практически здоровых доноров сопоставимого возраста и пола (группа НОРМ, n=50, средний возраст 11 лет).
Определение уровня экспрессии маркерных мРНК. Анализ относительных уровней экспрессии мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 провели с помощью технологии биочипов. В качестве материала использовали лейкоцитарную фракцию периферической крови, выделенную с применением раствора «Гемолитик» (ЦНИИЭ, Россия). Пул тотальной РНК выделяли с помощью набора «МАГНО-сорб» (ЦНИИЭ, Россия) и концентрировали смесью фенола и хлороформа в соотношении 1:1. Обратную транскрипцию тотальной РНК и амплификацию кДНК проводили с применением набора «Mint cDNA synthesis kit» («Евроген», Россия), при этом 3'-олиго-Т-праймер заменяли на содержащий Т7 промотор-олиго-Т-праймер («ДНК-синтез», Россия). Полученную кДНК транскрибировали с использованием Т7 РНК-полимеразы («Thermo Scientific)), ЕС), при этом добавляли биотинилированные УТФ («ДНК-синтез», Россия). Полученную меченую РНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна, выполненный на базовой платформе «CustomArray Inc.» (США), содержащий набор зондов к детектируемым мРНК и генам, селекцию которых осуществляли согласно описанному ранее алгоритму [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А., Князев Д.И., Уткин О.В. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология.- 2015. -Т. 49, №3.- С. 515-524.]. Считывание сигнала гибридизации целевой РНК на соответствующий зонд биочипа производили амперометрическим способом с применением устройства и программного обеспечения «ElectraSense» («CustomArray Inc.», США). Полученный сигнал рассматривали как относительный уровень экспрессии гена или транскрипта.
Провели сравнение уровней экспрессии мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 у пациентов с ВЭБ-ИМ и здоровых доноров. В 18 образцах периферической крови пациентов с ВЭБ-ИМ выявили снижение уровней экспрессии исследованных мРНК, а в 9 - повышение уровней экспрессии. В первом случае прогнозировали тяжелое течения ВЭБ-ИМ, а во втором случае - среднетяжелое течение ВЭБ-ИМ. Прогноз подтвердили результатами лабораторных исследований крови: повышение уровня трансаминаз АсАт и АлАт (в 3-6 раза в 1-ой группе и в 1-3 раза во 2-ой группе по сравнению с донорами), содержание в крови атипичных мононуклеарных клеток (более 20% в 1-ой группе и 10-20% - во 2-ой группе), и клиническими признаками: размер поднижнечелюстных, околоушных и заднешейных лимфатических узлов (2,6-6,0 см в 1-ой группе и 1,5-2,5 см - во 2-ой группе). Результаты представлены в таблице.
Выявлено, что у пациентов с ВЭБ-ИМ уровни экспрессии мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 изменялись по сравнению со здоровыми донорами, причем у пациентов с ВЭБ-ИМ паттерны экспрессии мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 различались в зависимости от тяжести течения заболевания. У пациентов с тяжелым течением заболевания наблюдали снижение уровня экспрессии исследованных мРНК по сравнению с донорами, у пациентов со среднетяжелым течением -повышение.
Проведенные исследования показали, что паттерны изменения уровней экспрессии мРНК FPGS.NM_00018078 и PCNA.NM_002592 могут служить прогностическим признаком тяжести течения ВЭБ-ИМ.