ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АНТИАНГИОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ
PHARMACEUTICAL ANTIANGIOGENIC COMPOSITION FOR TREATING EYE DISEASES

Изобретение относится к лекарственным средствам для коррекции нарушений ангиогенеза в офтальмологии и касается фармацевтической композиции, содержащей действующее вещество - фрагмент одного из рекомбинантных полипептидов: фрагмент эндостатина с аминокислотной последовательностью от 1 до 49 или фрагмент тумстатина - с аминокислотной последовательностью от 69 до 95 или фрагмент пигментного эпителиального фактора (PEDF) - с аминокислотной последовательностью от 44 до 77, имеющие на С-конце стабилизирующий ProGlyPro кластер, и фармацевтически приемлемый носитель.
Ангиогенез представляет собой процесс, при котором осуществляется миграция, прикрепление и адгезия эндотелиальных клеток, а затем их пролиферация и организация в сосуды с формированем сосудистой сети, необходимой для развития тканей.
В норме процессы ангиогенеза в организме протекают с умеренной интенсивностью и активизируются при регенерации поврежденных тканей, рассасывании тромбов, ликвидации очагов воспаления, рубцевании и других процессах восстановления, а также при росте и развитии организма.
Нарушения ангиогенеза имеют место при различных заболеваниях, в том числе, при заболеваниях глаз.
К основным эндогенным стимуляторам ангиогенеза относятся цитокины: фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста плаценты, фактор роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов, трансформирующий фактор роста, фактор роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста, фактор некроза опухолей, IL-8, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (Griffioen A.W., Molema G. Angiogenesis: Potentials for Pharmacologic Intervention in the Treatment of Cancer, Cardiovascular Diseases, and Chronic Inflammation // Pharmacological Reviews. - 2000. - Vol.52, Issue 2. - P.237-268; Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease // Nature Medicine. - 2003. - Vol.9. - P.653-660).
Неоваскуляризация сопровождает широкий спектр заболеваний глаз, таких как: диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, возрастная макулярная дегенерация, тромбоз центральной вены сетчатки, неоваскулярная глаукома, осложненная миопия высокой степени, гистоплазмоз, опухоли органа зрения, занимающих лидирующие позиции в перечне заболеваний, приводящих к инвалидизации и слепоте (Нероев В.В., Сарыгина О.И., Левкина О.А., Слепова О.С. Изучение локальной секреции про- и антиангиогенных факторов до и после проведения лазеркоагуляции сетчатки у пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией // Медицинская иммунология. - 2009. - Том 11, №4-5. - С.369-370. Сарыгина О.И., Нероев В.В., Левкина О.А. Роль сосудистого эндотелиального фактора роста в патогенезе диабетической ретинопатии // Офтальмология. - 2009. - Том 6, №2. - С.58-62. Agnes Noël, Maud Jost, Vincent Lambert, Julie Lecomte and Jean-Marie Rakic Anti-angiogenic therapy of exudative age-related macular degeneration: current progress and emerging concepts // Trends in Molecular Medicine. - 2007. - Vol.13. - Issue 8.- P.345-352)
Известно использование в офтальмологии препаратов Макуген и Луцентис; Авастин. (Anti-VEGF. Editors F. Bandello, M. Battaglia Parodi. KARGER. Basel (Switzerland). 2010. P.144. ISSN 978-3-8-55-9530-8. Carl DR, David MB, Prema A.et al. Randomized double-masked, sham-controlled trial of ranibizumab for neovascular age-related macular degeneration: PIER Study year 1. // Am J Ophthalmol. - 2008 - Vol.145 - P.239-248. Costa RA, Jorge R. Calucci D. t al: Intravitreal bevacizumab for choroidal neovascularization caused by AMD (IBNA Study): results of a phase I dose-escalation study. // Invest Ophthalmol Vis Sci - 2006 - Vol.46 - P.4569-4578). Эти препараты имеют узкую молекулярную направленность: они ингибируют, блокируют или препятствуют реализации биологических эффектов одной проангиогенной молекулы - фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), направленной на запуск ангиогенеза. Их мишенью служит VEGF или рецептор к нему, то есть они проявляют свое действие через VEGF-зависимый механизм действия (Anti-VEGF. Editors F. Bandello, M. Battaglia Parodi. KARGER. Basel (Switzerland). 2010. P.144. ISSN 978-3-8-55-9530-8).
Многоцентровыми клиническими исследованиями по изучению эффективности Луцентиса и Авастина при ВМД доказан факт существования природной тахифилаксии у 2% пациентов, для которых эти препараты исходно не эффективны, у 10% популяции выявлен факт формирования фармакокинетической толерантности со снижением лечебного эффекта препаратов при повторных инъекциях, лечебный эффект Авастина снижается вдвое после трех инъекций (Ziemssen F, Neuhann IM, Voelker M. Tachyphylaxis and bevacizumab. Ophthalmology 2009; 116:1591-2; author reply 1592-3. Avgikos KN, Horgan SE, Sivaraj RR, et al. Tachyphylaxis and bevacizumab. Ophthalmology 2009;116:1831-2; author reply 1832. Kopal Mithal, Raja Narayanan Switching anti-VEGFs in Tachyphylaxis Br J Ophthalmol published online January 17, 2012).
В связи с этим имеется необходимость поиска и разработки фармацевтических композиций, использование которых основано на стратегии сочетания ингибиторов VEGF с другими природными ингибиторами ангиогенеза. Мишенями для такой антиангиогенной терапии могут быть эндотелиальные клетки, пептиды-регуляторы, участвующие в ангиогенезе, рецепторы к ним или гены, отвечающие за синтез про- и/или антиангиогенных пептидов.
В этом аспекте является актуальной разработка более эффективных регуляторов нарушений ангиогенеза для офтальмологии на основе рекомбинантных пептидов целевого антиангиогенного назначения.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение антиангиогенного эффекта на разных этапах ангиогенеза, при этом опосредующегося через различные биологические мишени.
Пептиды целевого назначения фрагменты трех рекомбинантных пептидов: тумстатина с аминокислотной последовательностью от 69 до 95, эндостатина с аминокислотной последовательностью от 1 до 49 и фактора дифференцировки пигментного эпителия (PEDF) - с аминокислотной последовательностью от 44 до 77 - были получены с помощью биотехнологий. Искусственные гены целевых пептидов, оптимизированные для эффективной экспрессии в бактериальных клетках по составу кодонов, клонировали в плазмидных векторах, содержащих последовательность гена интеина под контролем сильного фагового промотора. В качестве штамма-носителя использовали коллекционный штамм E.coli ER2566, обеспечивающий суперэкспрессию гибридных генетических конструкций и высокую продукцию гибридного белка (Бейрахова К.А. Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом. Автореф. дисс. к.х.н. М., 2012).
Биологическую активность тестируемых пептидов изучали in vitro и in vivo с использованием экспериментальных моделей заболевания глаз, сопровождающихся ангиогенезом роговицы у лабораторных животных с оценкой ангиостатического потенциала изучаемых пептидов.
Биологические эффекты целевых пептидов изучали на двух видах культур эндотелиальных клеток (ЭК): SVEC4-10, полученной из регионарных лимфатических узлов мышей С3Н/HeJ (H-2k), трансформированных вирусом SV40, и человеческой линии ЭК-ЕА. Ну 926.
Методы изучения антиангиогенной активности пептидов in vitro включали: цитотоксический, пролиферационный и миграционный тест; а также тест на формирование капилляроподобных структур (КПС).
На мышиной культуре ЭК антиангиогенные свойства пептидов изучали в диапазоне концентраций от 0,1 до 20 нМ. В экспериментах с человеческой линией ЭК изучали концентрации от 2,5 до 10240 нМ. Миграцию ЭК для тумстатина определяли в диапазоне концентраций 1280-10240 нМ, для эндостатина 640-10240 нМ, для PEDF - 20-320 нМ. Выбор концентраций основывался на результатах предыдущего теста по оценке их антипролиферативной активности. Образование КПС изучали, добавляя те концентрации пептидов, которые подавляли миграцию ЭК. Они составляли для тумстатина и эндостатина - 1250, 2500, 5000 и 10000 нМ; для PEDF - 20, 40, 80 и 160 нМ. Активность пептидов на культуре ЭК ЕА. Ну 926 сравнивали не только между собой, но и с активностью препарата «Авастин», в концентрации от 10240 нМ до 2,5 нМ.
Экспериментальные исследования in vivo проводили на глазах кроликов породы шиншилла (половозрелые самцы, весом 2,5-3 кг). Первую модель ангиогенеза формировали путем прошивания роговицы викриловыми швами на двух глазах 30 кроликов (60 глаз). В день прошивания роговицы начинали вводить субконъюнктивально пептиды в расчетных дозах: 7,2 нг PEDF, 96 нг эндостатина, 70,2 нг тумстатина. Инъекции делали ежедневно, в течение 10 дней. В качестве контроля служили правые глаза животных, опытным был левый глаз. Животных выводили из эксперимента на 15 сутки.
В качестве второй модели использовали постожоговый ангиогенез роговицы, вводя интрастромально в apex роговицы 0,1 мл 10% раствора щелочи. Модель формировали на правом глазу 33 кроликов (n=33, по 10 глаз на каждый пептид). Пятерым опытным кроликам субконъюнктивально вводили препараты в расчетной дозе, начиная с 1-го дня эксперимента (ранний ангиогенез). Их выводили из эксперимента на 12-е сутки. Оставшимся пятерым кроликам вводили пептиды в десятикратной дозе, начиная с 7-го дня, когда сосудистая сеть уже была сформирована (поздний ангиогенез, аваскулогенная терапия). Инъекции делали в течение 10 дней. Из эксперимента выводили на 30-й день.
Ангиостатическую активность пептидов на глазах экспериментальных животных оценивали клинически (биомикроскопически, колориметрически), ангиографически и морфологически. Состояние сосудистой стенки изучали с помощью электронной микроскопии.
Применение 2-х моделей роговичного ангиогенеза на глазах экспериментальных животных позволило убедиться в наличии у тестируемых пептидов способности прерывать или подавлять процесс новообразования сосудистой сети, а также дать их количественную оценку.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований.
Для получения фармацевтической композиции, отвечающей изобретению, фрагмент одного из рекомбинантных полипептидов: эндостатина 1-49 или тумстатина - 69-95 или пигментного эндотелиального фактора (PEDF) 44-77, имеющие на С-конце стабилизирующий ProGlyPro кластер как действующее вещество смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, при этом действующее вещество и фармацевтически приемлемый носитель находятся в следующем соотношении в мас.%:
-7
-7
действующее вещество - 3.9×10 - 53×10
фармацевтически приемлемый носитель - до 100 мас.%.
Совокупность полученных in vitro экспериментальных данных наглядно иллюстрировала биологическую активность тумстатина, эндостатина, PEDF. Она проявлялась в их способности подавлять разные этапы ангиогенеза: пролиферации, миграции и образовании ЭК КПС. Установлено, что на ранних стадиях ангиогенеза все 3 рекомбинантных пептида в пределах анализируемых доз оказывают дозозависимый эффект. Наиболее мощный антиангиогенный потенциал проявил тумстатин (в дозе 70,2 нг) и PEDF (в дозе 7,2 нг). Экспериментальные данные подтвердили ангиостатическую активность тумстатина, эндостатина, PEDF. In vitro эта активность проявлялась в их способности подавлять пролиферацию (эндостатин, тумстатин, PEDF), миграцию (эндостатин) и формирование ЭК капилляроподобных структур (эндостатин, тумстатин, PEDF) в определенных концентрациях и условиях культивирования.
In vivo антиангиогенный потенциал тумстатина, эндостатина и PEDF выражался сокращением количества новообразованных сосудов на единицу площади, сужением диаметра их просвета и протяженности при одновременном введении с индукторами ангиогенеза. Аваскулогенный потенциал тумстатина проявлялся апоптозом эндотелиальных клеток с последующей резорбцией сосудистой стенки.
В качестве фармацевтически приемлемого носителя могут использоваться различные вещества, в зависимости от лекарственной формы препарата, вводимой в организм, и способа введения. В частности, для введения в конъюнктивальную или назальную полость, интравитреально можно использовать дистиллированную воду, возможно и использование других носителей, в частности, глазных пленок. В качестве консерванта может быть использован, в частности, бензалкония хлорид (0,005-0,01%).
Перед закапыванием раствор должен разбавляться буфером до конечной концентрации.
Капли для глаз должны быть изотоничными. Кислотность слезы человека составляет 7,14-7,82. Изотоничный раствор - это тот, который соответствует осмотическому давлению 305 мОсм/л. Для этого используют декстран 40 и 70, декстрозу, пропиленгликоль.
Сущность изобретения иллюстрируется чертежами и поясняется таблицами.
На табл.1 показано образование капилляроподобных структур ЭК линии ЕА.Ну 926 в присутствии фрагментов тумстатина, энддостатина и PEDF.
На Фиг.1 показана морфологическая оценка биологической активности, отражающей, что в концентрации 160 нМ PEDF подавляет пролиферацию ЭК ЕА. Ну 926 и в 4 раза сильнее Авастина; в высоких концентрациях его антимиграционная активность превышает активность терапевтических доз Авастина.
3
На Табл.2 отражены результаты экспериментальных исследований in vitro, позволившие произвести расчет предполагаемой терапевтической дозы тестируемых пептидов при субконъюнктивальном способе введения. Дозу пептида на одну инъекцию рассчитывали путем умножения трех составляющих: оптимальной концентрации пептида, полученной в экспериментах in vitro в культуре клеток SVEC 4-10, молярной массы пептида, объема глаза кролика (1,8 см).
На Табл.3 представлена количественная морфометрическая и колориметрическая оценка биологической активности антиангиогенных пептидов.
Изобретение иллюстрируется примерами по разработке и созданию моделей различных стадий ангиогенеза для оценки биологической активности тумстатина, эндостатина, PEDF (пример 1); по разработке способов количественной оценки биологической активности тумстатина, эндостатина, PEDF in vitro и in vivo (пример 2); по экспериментальной оценке биологической активности тумстатина, эндостатина, PEDF in vitro (пример 3); по экспериментальной оценке биологической активности тумстатина, эндостатина, PEDF in vivo (пример 4), по приготовлению растворов для введения в конъюнктивальную полость, субконъюнктивально и интравитреально (примеры 5-11).
Пример 1. Использована двухуровневая биологическая система тестирования, в которой первый уровень был представлен исследованиями in vitro, а второй уровень - экспериментами in vivo. Каждый из уровней был сформирован несколькими моделями ангиогенеза, представлявшими последовательные этапы сборки сосудистой сети. Доказательность экспериментальной базы, полученной in vitro, усиливали, используя два вида культур (мышиные ЭК SVEC4-10 и человеческие - ЕА. Ну 926) и серию контролей (базовый, положительный и дополнительный контроль).
Выявленный in vitro антиангиогенный потенциал рекомбинантных пептидов изучали in vivo на двух экспериментальных моделях заболеваний глаз, сопровождающихся ангиогенезом в роговице. На первой модели (30 кроликов, 60 глаз) потенциальные ангиостатики вводили одновременно с индукторами ангиогенеза. В качестве индуктора выступали викриловые нити. Известно, что реакция окружающих тканей на викрил умеренно выражена; викриловые нити рассасываются в процессе гидролиза с образованием гликолевой и молочной кислот, являющихся естественным компонентом жизнедеятельности тканей. Это исключает системную (общую) реакцию на викрил. Провоспалительный и ангиостимулирующий эффекты викрила при прошивании им роговицы кролика нарастают постепенно, а затем, также постепенно нивелируются в связи с рассасыванием. Процесс рассасывания начинается с 12 дня, что ограничивает сроки наблюдения за моделью ангиогенеза, и, как следствие, влияет на трактовку отдаленных результатов. Поэтому данная модель была использована для тестирования активности пептидов на ранних этапах ангиогенеза. При этом пептиды начинали вводить со дня прошивания роговицы. День индукции ангиогенеза и день его блокирования пептидами ангиостатического назначения совпадали.
3
На второй модели (36 кроликов, по 10 глаз на каждый пептид, 6 глаз-контроль) изучали возможность прерывания ангиогенеза на ранних и поздних стадиях (аваскулогенная терапия). Модель переднего ангиогенеза фомировали путем введения интрастромально в apex роговицы 0,1 мл 10% раствора едкого натрия. В отличие от предыдущей модели, щелочь признана более мощным индуктором ангиогенеза. Токсический парез капилляров и снижение циркуляции крови при щелочном ожоге роговицы приводят к развитию тканевой и клеточной гипоксии. Стимуляция ангиогенеза идет в 2 этапа: на этапе нанесения ожога (ранний ангиогенез) и на этапе репаративных процессов в условиях развивающейся и нарастающей гипоксии. В условиях гипоксии, запускающей рост новых сосудов, выраженность ангиогенеза достигает максимума. Процесс формирования новых кровеносных сосудов можно наблюдать в течение длительного периода времени, что позволяет использовать данную модель в качестве модели и раннего, и позднего ангиогенеза.
Ангиостатический потенциал рекомбинантных фрагментов тумстатина, эндостатина и PEDF тестировали на этапе раннего и позднего ангиогенеза. В первом случае тестируемые пептиды вводили одновременно с индукторами ангиогенеза, в качестве которых выступали викриловые швы (1 модель) или 10% раствор едкого натрия (щелочной ожог, 2 модель). Во втором случае тумстатин, эндостатин и PEDF вводили, начиная с 7-го дня, когда сосудистая сеть уже была сформирована (поздний ангиогенез, аваскулогенная терапия, 2 модель.) Вросшие в роговицу сосуды уже образовывали "венчик", в котором дифференцировались полноценные почти «зрелые» сосуды с кровотоком.
Применение 2-х моделей роговичного ангиогенеза на глазах экспериментальных животных позволяло убедиться в наличии у тестируемых пептидов способности прерывать или подавлять процесс новообразования сосудистой сети, а также дать их количественную оценку.
Пример 2. При проведении экспериментальных исследований in vitro были разработаны и апробированы следующие экспертные критерии, позволяющие дать комплексную количественную оценку биологической активности пептидов:
- индекс выживаемости ЭК (% от контроля, цитотоксический тест);
- индекс пролиферации (% от контроля, пролиферационный тест);
- изменение ширины линии монослоя (пиксели, % от исходной ширины, миграционный тест);
- изменение количества мигрировавших клеток (шт. миграционный тест);
- длину и количество тяжей (тест на формирование КПС);
- количество агрегатов (тест на формирование КПС).
При проведении экспериментальных исследований in vivo было использовано несколько следующих экспертных критериев, позволяющих дать комплексную количественную оценку биологической активности пептидов:
- плотность васкуляризации роговицы (в баллах, пикселях; клинически, ангиографически и колориметрически);
- площадь помутнения роговицы (в пикселях, колориметрически);
- количество новообразованных сосудов на единицу площади среза в зоне просмотра (морфометрически);
- показатель суммарного просвета сосудов на срезе (в пикселях, колориметрически и морфометрически);
- индекс васкуляризации лимбо-роговичной зоны (морфологически);
- полуколичественная оценка ИГХ-реакции с маркером ЭК-CD31.
Разработанная система тестирования, включающая в совокупности 4 модели ангиогенеза in vitro и 2 модели in vivo, позволила получить доказательную базу (13 экспертных количественных показателей) для обоснования подходов к альтернативной стратегии антиангиогенной терапии с помощью рекомбинантных эндогенных антиангиогенных пептидов, предназначенных для терапии глазных заболеваний, ассоциированных с ангиогенезом, исключающей или дополняющей лечение препаратами VEGF-зависимого механизма действия.
Пример 3. В экспериментальных исследованиях in vitro на культуре ЭК линии SVEC 4-10 все 3 тестируемых пептида проявили антиангиогенную активность в диапазоне изученных концентраций (0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ и 20 нМ):
Эндостатин в концентрациях 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ и 20 нМ не обладал цитотоксической активностью и способностью подавлять пролиферацию ЭК, но блокировал образование КПС в концентрации 10 нМ, рекомендуемой для дальнейших исследований. Тумстатин оказывал слабый цитотоксический эффект, но блокировал пролиферацию ЭК и образование КПС в концентрация 10 нМ, эта концентрация была использована для последующих исследований. PEDF оказывал максимальный цитотоксический эффект, блокировал пролиферацию ЭК и образование КПС в концентрации 1 нМ, она была выбрана для дальнейших исследований.
На культуре ЭК человеческой линии ЕА. Ну 926 все 3 тестируемых пептида в диапазоне изученных концентраций проявили биологическую активность. Характер биологического эффекта зависел от концентрации пептида и процентного содержания ЭТС в культуральной среде; а также, от этапа ангиогенеза (пролиферация/миграция /формирование КПС).
Эндостатин подавлял пролиферацию ЭК ЕА. Ну 926 в концентрациях 2,5, 5, 5120 и 10240 нМ (5% ЭТС, p<0,05), ингибировал миграцию в концентрациях 1280 и 10240 нМ (5% ЭТС, p<0,01), 2560 и 5120 нМ (10% ЭТС, p<0,05); ингибировал формирование КПС в концентрациях 1250 и 2500 нМ (5% и 10% ЭТС p<0,05 и p<0,05, соответственно).
Тумстатин подавлял пролиферацию ЭК ЕА. Ну 926 в концентрациях 2560 и 10240 нМ (5% ЭТС, p<0,05), не влиял на миграцию ЭК ни при каких условиях, ингибировал формирование КПС в концентрациях 1250, 2500, 5000 и 10000 нМ, достоверно уменьшая длину (2,5% ЭТС, p<0,05), количество тяжей (p<0,01) и клеточных агрегатов (p<0,01), что свидетельствовало об ингибировании и прямого/и разветвленного ангиогенеза.
PEDF ингибировал пролиферацию ЭК в концентрациях 20, 40, 80 и 160 нМ (5% ЭТС, p<0,01), в концентраци 160 нМ блокировал пролиферацию (10% ЭТС, p<0,05), подавлял формирование КПС в концентрациях 20 и 80 нМ (2,5% ЭТС), уменьшая количество тяжей (p<0,01) и агрегатов ЭК (p<0,01) и ингибируя разветвленный ангиогенез.
Авастин ингибировал пролиферацию ЭК ЕА.Ну926 в концентрациях 2,5, 5, 10 и 20 нМ (2,5%, 5% и 10% ЭТС, p<0,01), 640, 1280, 2560, 5120 и 10240 нМ (5% и 10% ЭТС, p<0,01), тормозил миграцию в концентрации 5 нМ (10% ЭТС, p<0,01) и ингибировал КПС в концентрации 5 нМ, снижая длину тяжей (2,5% ЭТС, p<0,01, табл.1).
Пример 4. Установлено, что на ранних стадиях ангиогенеза все 3 рекомбинантных пептида в пределах анализируемых доз оказывают дозозависимый эффект. Наиболее мощный антиангиогенный потенциал проявил тумстатин (в дозе 70,2 нг) и PEDF (в дозе 7,2 нг) (табл.2). Эффект проявлялся достоверным снижением индекса васкуляризации лимба и роговицы (p<0,001), уменьшением количества (p<0,001) и протяженности сосудов, распространяющихся с лимба в оптическую зону роговицы опытных глаз кроликов по сравнению с контрольными. Клинически (ad oculus) сосуды в опытных глазах не выявлялись. Биомикроскопически их удавалось идентифицировать на увеличении × 16. По степени выраженности биологических эффектов эндостатин уступал им. Морфологические исследования подтвердили клинически выявляемые эффекты. Кроме того, на световом уровне обращала на себя внимание различная степень выраженности отека (плотность и глубина распространения) и клеточной инфильтрации роговицы вокруг экспериментальных швов. Инфильтрат преимущественно состоял из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов (табл.3). Пептиды достоверно снижали количество клеточных элементов в инфильтрате, развившемся вокруг викриловых швов. Сравнительные аспекты количественной оценки противоотечного и противовоспалительного эффекта антиангиогенных пептидов продемонстрировали преимущества тумстатина и PEDF перед эндостатином вявленный биологический эффект тумстатина и PEDF, по-видимому, можно объяснить ингибированием секреции VEGF, ответственной за проницаемость сосудистой стенки.
Возможность подавлять поздние стадии ангиогенеза или аваскулогенный потенциал оценивали на второй модели ангиогенеза. Он выявлен у одного тумстатина в 10-кратной терапевтической дозе. Клинически значимый эффект развивался на глазах кроликов после 5 инъекций. Он проявлялся снижением плотности новообразованных сосудов в паралимбальной зоне роговицы, регрессией концевой части наиболее разветвленного отдела новообразованных сосудов, сокращением диаметра «зрелых» сосудов с циркулирующим кровотоком, запустеванием мелких сосудов. Эндостатин оказывал эффект исключительно на ранних стадиях постожогового ангиогенеза (1-5 день) и также в 10-кратной дозе. Он проявлялся снижением плотности сосудистой лимбальной сети. По мере того, как сосудистая сеть заканчивала свое формирование (с 7 дня), активность пептида нивелировалась.
Пример 5. Приготовление раствора для введения в конъюнктивальную полость с использованием фрагмента эндостатина.
-7
-7
В качестве активного начала используют фрагмент эндостатина 1-49 в концентрациях от 53,4 мкг пептида до 534 мкг на 1 л раствора; что соответствует 5,3×10 - 53×10мас.% действующего вещества. В качестве носителя можно использовать дистиллированную воду, которую добавляют до 100%. Перед закапыванием раствор должен разбавляться буфером до конечной концентрации.
Капли для глаз должны быть изотоничными. Кислотность слезы человека составляет 7,14-7,82. Изотоничный раствор - это тот, который соответствует осмотическому давлению 305 мОсм/л. Для этого используют декстран 40 и 70, декстрозу, пропиленгликоль.
Раствор может быть дополнен вискоэластичными веществами, удлиняющими продолжительность действия и удержания на поверхности глазного яблока, например, гелями или метилцеллюлозой. Для предотвращения распада активного вещества могут быть использованы антиоксиданты, например бисульфит или тиосульфат и др. Объем 1 капли для глаз и носа составляет 10 мкл.
Пример 6. Приготовление раствора для субконъюнктивального введения с использованием фрагмента эндостатина.
В качестве активного начала используют фрагмент эндостатина 1-49 в концентрациях от 53,4 мкг пептида до 534 мкг на 1 л раствора; в качестве растворителя можно использовать физиологический раствор, который добавляют до 100%. Расчет объема раствора для однократного введения производят с учетом рекомендуемой дозы: не - более 0,3-0,5 мл, тот же объем используется и для ретробульбарных инъекций.
Пример 7. Приготовление раствора для введения в конъюнктивальную полость с использованием фрагмента тумстатина.
-7
-7
В качестве активного начала используют фрагмент тумстатина 69-95 в концентрациях от 38,7 мкг пептида до 387 мкг на 1 л раствора; что соответствует 3.9×10 - 39×10 мас.% действующего вещества. В качестве раствора можно использовать дистиллированную воду, которую добавляют до 100%. Изотоничность капельного раствора достигают, добавляя декстран/декстроза/пропиленгликоль в количестве, достаточном для достижения осмотического давления 305 мОсм/л. Раствор может быть дополнен вискоэластичными веществами, удлиняющими продолжительность действия и удержания на поверхности глазного яблока, например, гелями или метилцеллюлозой. Для предотвращения распада активного вещества могут быть использованы антиоксиданты, например бисульфит или тиосульфат.
Пример 8. Приготовление раствора для субконъюнктивального введения с использованием фрагмента тумстатина.
-7
-7
В качестве активного начала используют фрагмент тумстатина в концентрациях от 38,7 мкг пептида до 387 мкг на 1 л раствора; что соответствует 3.9×10 - 39.0×10 мас.% действующего вещества. В качестве растворителя можно физиологический раствор, который добавляют до 100%. Расчет объема раствора для однократного введения производят с учетом рекомендуемой дозы: 0,1-0,3 мл.
Пример 9. Приготовление раствора для введения в конъюнктивальную полость с использованием фрагмента PEDF.
-7
-7
В качестве активного начала используют фрагмент PEDF 44-77 в концентрациях от 4,0 мкг пептида до 40 мкг на 1 л раствора; что соответствует 4.0×10 - 40.0×10 мас.% действующего вещества. В качестве раствора можно использовать дистиллированную воду, которую добавляют до 100%. Изотоничность капельного раствора достигают, добавляя декстран/декстроза/пропиленгликоль в количестве, достаточном для достижения осмотического давления 305 мОсм/л. Раствор может быть дополнен вискоэластичными веществами, удлиняющими продолжительность действия и удержания на поверхности глазного яблока, например гелями или метилцеллюлозой. Для предотвращения распада активного вещества могут быть использованы антиоксиданты, например бисульфит или тиосульфат. Рекомендуемая доза для однократной инстилляции - 10 мкл.
Пример 10. Приготовление раствора для субконъюнктивального введения с использованием фрагмента PEDF.
В качестве активного начала используют фрагмент тумстатина в концентрациях от 4,0 мкг пептида до 400 мкг на 1 л раствора; в качестве растворителя можно физиологический раствор, который добавляют до 100%. Расчет объема раствора для однократного введения производят с учетом рекомендуемой дозы: 0,1-0,3 мл.
Пример 11. Приготовление раствора для интравитреального введения.
-7
Доза, определенная для введения in vitro для PEDF - 1 нМ (Mr 4043 Да), то есть 4 мкг пептида на 1 л конечного объема (4×10 мас.%). Доза, определенная для введения in vitro для Тумстатина,- молекулярная масса 3872 Да. Рассчитанная доза: 10 нМ. 10 наномолей тумстатина весят 39 мкг. Количество тумстатина на одну инъекцию составляет 39 мкг/1000 мл*1,8 мл=70,2 нг. В качестве растворителя можно использовать физиологический раствор, который добавляют до 100%. Расчет объема раствора для однократного интравитреального введения производят с учетом рекомендуемой дозы: 0,05 мл.
Таким образом, предлагаемые пептиды включаются в универсальный механизм подавления ангиогенеза при глазной патологии на ключевых позициях: активации эндотелиальных клеток и могут быть использованы в составе фармацевтической композиции для введения в конъюнктивальную или назальную полость и для субъконъюнктивального или интравитреального введения.
Табл.1
Культивирование ЭК линии ЕА. Ну926 в присутствии:
Средняя длина тяжей, образованных ЭК линии ЕА. Ну926 (в пикселях)
Количество тяжей, образованных ЭК линии ЕА. Ну926
Количество агрегатов, образованных ЭК линии ЕА. Ну926
среды DMEM/F12 с добавлением 2,5% ЭТС (спонтанный уровень)
182,7±2,4
63,8±2,1
50,1±2,3
bFGF, 20 г/мл
258,6±4,8***
81±2,0*
67,1±2,1*
Авастин, 5 нМ
165,2±2,3***
73,3±3,1*
59,1±2,6**
Тумстатин 1250 нМ
169,1±5,6*
40,8±2,6***
30,9±2,4***
Тумстатин 2500 нМ
160,6±7,4**
34,6±2,1***
24,3±1,4***
Тумстатин 5000 нМ
154,1±10,2***
28,0±2,2***
20,9±1,3***
Тумстатин 10000 нМ
213,7±7,5***
41,4±3,3***
32,1±2,4***
Эндостатин 1250 нМ
154,1±2,7***
76,2±5,6*
65,1±5,7***
Эндостатин 2500 нМ
153,4±3,4***
71,1±7,0
59,8±6,4***
Эндостатин 5000 нМ
182,5±4,0
66,5±6,0
56,4±5,4***
Эндостатин 10000 нМ
183,1±4,0
55,9±5,9
47,1±5,3
PEDF, 20 нМ
187,3±4,4***
48,8±3,9**
37,7±4,2**
PEDF, 40 нМ
101,4±11,1***
10,9±5,6***
5,5±3,4***
PEDF, 80 нМ
72,4±14,0***
5,2±3,9***
3,6±2,9***
PEDF, 160 нМ
183,4±8,1
28,8±10,4***
22,2±8,0***
Достоверность отличий от спонтанного уровня: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.
Табл.2
Название пептида
Концентрация, нМ
Молярная масса, г/моль
Кол-во пептида на 1 инъекцию, нг
Десятикратная доза, нг
Тумстатин
10
3870
70,2
702
Эндостатин
10
5338
96
960
PEDF
1
4044
7,2
72
Табл.3
Тестируемый пептид
Тестируемый глаз
Колориметрическая оценка
Морфометрическая оценка
Количество пикселей (Mcp.±m)
Индекс васкуляризации (Mcp.±m)
Количество сосудов на срезе, шт. (Mcp.±m)
Тумстатин (n=10)
Контроль
128830±1115
0,03
90±17
Опыт
73788±1491*
0,01*
33±5*
PEDF (n=10)
Контроль
243734±1125
0,016
76±8
Опыт
64974±1234*
0,008*
38±5*
Эндостатин (n=10)
Контроль
102882±1112
0,02
83±6
Опыт
58886±1265*
0,01
24±4**
Примечание: * - достоверность различий показателей на опытном и контрольном глазу р<0,001; ** р<0,01.