Способ моделирования геморрагического инсульта у крыс
METHOD FOR MODELING HAEMORRHAGIC STROKE IN RATS

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования и изучения последствий геморрагического инсульта, а также для экспериментальной фармакотерапии.
Наиболее близкими аналогами к заявляемому изобретению являются способы моделирования внутримозговых гематом.
Известен способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта (RU № 2005133737, публ. 10.05.2007), включающего воздействие аутокровью на нервные клетки мозга, заключающегося в том, что переживающие срезы нервных клеток мозга после приготовления помещают в стеклянные виалы с кровью (без гепарина) объемом 1 мл на заданный интервал времени. Затем срезы извлекают из виалы с кровью, отмывают перфузионной средой от крови и регистрируют биоэлектрическую активность клеток в заданных структурах. Сопоставляя параметры активности клеток с их контрольными значениями, которые получают на интактной группе срезов (n=4-6), определяют степень их повреждения и оценивают возможность их восстановления.
Известен способ моделирования развития мелкоочаговых мозговых геморрагий в коре головного мозга у новорожденных крыс (RU № 2505865, публ. 27.01.2014),  включающий воздействие звуком, согласно решению выбирают крыс в возрасте трех дней после рождения, подвергают воздействию звука величиной 70 дБ, частотой 110 Гц непрерывно на протяжении 60 мин. В силу слабой подвижности новорожденных крыс (1-3 дня после рождения), животные не фиксируются, они помещаются в плексиглазовую камеру объемом 2000 см3 для звукоизоляции. Звук силой 70 дБ подается непрерывно на протяжении 60 мин. После завершения звукового воздействия у животных (n=37) проводили исследования церебральной гемодинамики с применением когерентной оптической томографии. Измерение диаметра венозных и артериальных сосудов мозга, скорости кровотока в них и перфузии осуществляли через родничок со снятым участком скальпа (2 мм × 2 мм) под эфирной анестезией.
Однако вышеуказанные способы не позволяют моделировать геморрагический инсульт с результатами смертности, приближенными к смертности у людей.
Прототипом предлагаемого способа является способ моделирования геморрагического инсульта у лабораторных животных (SU № 1767518, публ. 07.10.1992), включающий, моделирование геморрагического инсульта, которое осуществляют путем вживления в головной мозг лабораторного животного – кошки – по стереотаксическим координатам билатерально полых игл, введения в них изогнутых мандренов, разрушения ткани мозга и проходящие в ней сосуды несколькими вращательными движениями мандрена. Затем в образовавшиеся области механического повреждения вводится 0,2-0,3 мл аутологичной крови животного, и спустя 2-3 мин в эти же области дополнительно вводится еще раз 0,1-0,2 мл аутокрови.
Недостатками известных технических решений  является то, что моделирование осуществляется на примере лабораторных животных – кошках  и для крыс, повторяемости способа достичь не удалось. Также недостатком является высокая чувствительность способа как к типу лабораторного животного, так и к его линии, возрасту, полу и весу, что не может дать четких, повторяемых результатов при изучении активности нейропротективных препаратов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание  способа моделирования геморрагического инсульта у крыс, позволяющего моделировать данную патологию вне зависимости от  различных параметров животных, с повышением повторяемости результатов,  наиболее приближенного к модели человека.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа моделирования геморрагического инсульта у крыс, включающего выполнение отверстия в черепе лабораторного животного в области внутренней капсулы любого из  полушарий, введение полой иглы согласно стереотаксическим координатам, деструкцию сосудов и мозговой ткани вращательными движениями мандрен-ножа и введение аутологичной венозной крови, причем с помощью устройства для стереотаксиса, согласно стереотаксическим координатам у мелких лабораторных животных – крыс, в головной мозг вводится пункционная игла в области внутренней капсулы на глубину 3 мм, затем устройство фиксируется, внутрь иглы вводится мандрен-нож, и тремя оборотами по часовой и тремя оборотами против часовой стрелки осуществляется деструкция мозговой ткани, далее мандрен-нож извлекается, и в стерильных условиях струйно вводится аутокровь, взятая из хвостовой вены животного, в объеме 0,11 мл/100 г веса животного.
Техническим результатом является экспериментальная модель геморрагического инсульта у крыс, позволяющая моделировать данную патологию вне зависимости от  различных параметров животных, с повышением повторяемости результатов,  наиболее приближенного к модели человека.
Осуществление изобретения
Для воспроизведения модели использовались как линейные крысы Вистар, так и нелинейные, массой 150-350г, самцы и самки в соотношении 50/50%. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997 г). Животные были разделены на две группы: 1 – животные с геморрагическим инсультом, не получающие лекарственных препаратов (контрольная группа, 20 крыс); 2 группа – животные с геморрагическим инсультом, которым вводили мексидол (20 крыс).
Острый аутогеморрагический инсульт моделируется в области внутренней капсулы правого полушария. Операция выполняется в условиях общей анестезии. Анестезия осуществляется путем внутрибрюшинного введения «Xyla» в дозе 0,1 мл для премедикации, после лёгкой седации крысам в качестве базисного наркоза внутрибрюшинно вводится хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг. По достижению глубокого наркоза проводится забор крови с помощью шприца из хвостовой вены крысы. Затем проводится обработка операционного поля, линейный разрез кожи головы в теменной области. Разрез выполняется во фронтальной плоскости, с последующим проведением гемостаза. Длина разреза составляет 1,0 см. В дальнейшем выполняется скелетирование кости, отделение надкостницы. С помощью стоматологического бора накладывается трепанационное отверстие в правой теменной области. Диаметр трепанационного отверстия составляет 2 мм. В дальнейшем, с помощью пункционной иглы и устройства для стереотаксического введения, вводится пункционная игла в области внутренней капсулы (координаты H=4 мм, L=3.0 мм, А=1.5 мм от брегмы по атласу G. Paxinos) на глубину 3 мм. Затем устройство фиксируется, и внутрь иглы вводится мандрен-нож, осуществляется деструкция мозговой ткани (мандрен-нож проворачивается в три оборота по часовой и в три оборота против часовой стрелки). Мандрен-нож извлекается, и в стерильных условиях крысе вводится аутокровь, взятая из хвостовой вены животного, в объеме 0,11 мл/100 гр веса. Введение крови осуществляется струйно. Эффективность введения определяется по наличию стволовых судорог. После чего пункционная игла извлекается, рана осушается и производится послойное ушивание раны и контроль гемостаза.
Исследуемый препарат вводился животным внутрибрюшинно однократно за 1 час до операции. Препаратом – референсом был выбран мексидол в дозе 50 мг/кг (согласно межвидовому коэффициенту пересчёта средне-терапевтической дозы человека), используемые в клинической практике в терапии цереброваскулярных заболеваний. Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Наблюдения проводят в течение 14 суток после операции. Регистрируют особенности поведения и состояния животных на 1, 3, 7 и 14-е сутки. Для оценки нарушения поведения и состояния животных после геморрагического инсульта используют комплекс методов, традиционно применяемых для этих целей в эксперименте. Для оценки неврологического статуса использовался метод оценки неврологического дефицита по шкале оценки инсульта McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) и метод оценки мышечного тонуса путём измерения силы хвата конечностей животных посредством динамометра.
Для морфологической оценки животных выводят из эксперимента на 1, 3, 7 и 14 сутки после начала исследования. Крыс декапитируют, забирают головной мозг, фиксируют его в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24-48 часов и заливают в парафин. Фронтальные гистологические срезы головного мозга толщиной 7 мкм окрашивают гематоксилином и эозином.
Пример 1. Контрольная группа
Во время операции и в течение 1 суток после нее в контрольной группе погибло 50% крыс с геморрагическим инсультом. В первые сутки после операции при оценке неврологических нарушений практически у всех крыс с моделированной интрацеребральной гематомой наблюдались неврологические нарушения в виде вялости и замедленности движений. Выраженный неврологический дефицит, проявляющегося в виде манежных движений по кругу и параличей конечностей у животных с геморрагическим инсультом, был отмечен в 100% случаев (таблица 1). Шкала McGrow демонстрирует неврологический дефицит крысы. 0 – неврологический дефицит отсутствует. Чем выше баллы, тем хуже состояние лабораторного животного. Удельная сила хвата – это показатель силы хвата животного к массе и находится в обратной зависимости со шкалой McGrow.
Регистрация силы хвата у крыс с геморрагическим инсультом показала, что на первые сутки после инсульта ослабление мышечного тонуса в группе контроля составила в среднем 58.2%. Высокие показатели активности контрольной группы на 14 сутки можно объяснить высокой летальностью в данной группе и выживаемостью лишь наиболее сильных особей с высоким регенераторным потенциалом (таблица 2).
При морфологическом исследовании в контрольной группе в первые 1-3 суток после кровоизлияния в узкой зоне (0.5-1.0 мм), окружающей гематому, выявлялся периваскулярный и перицеллюлярный отек; нарушение гистоархитектоники шести слоев нейронов коры, выраженные ишемические, тяжелые изменения, кариолизис нейронов, также выражена перифокальная лейкоцитарная реакция и менее выраженная глиальная реакция.  Отек мозга сопровождался рядом последовательных морфологических изменений со стороны сосудистой стенки и микроциркуляторного русла. Первоначально отмечался спазм артериол с их запустеванием. К 3 дню после кровоизлияния это состояние сменялось паретическим расширением капилляров, артериол и венул. В просвете сосудов в этот период выявлялись скопление и краевое стояние форменных элементов крови, в частности лейкоцитов. Расширенные периваскулярные пространства, заполненные плазмой, свидетельствовали о значительно повышенной проницаемости сосудистой стенки, приводящие к вторичным диапедезным периваскулярным геморрагиям. Начиная с 7 дня, выраженная перифокальная лейкоцитарная реакция сменилась на выраженную глио-макрофагальную реакцию; начинали появляться скопления макрофагов с внутриклеточным скоплением кровяного пигмента (гемосидерофаги). Впоследствии к 14 суткам восстановительные процессы глиальных клеток приводили к формированию тонкой капсулы вокруг очага кровоизлияния со скоплением единичных гемосидерофагов и скоплением кровяного пигмента (таблица 3).
+ незначительно
++ умеренно
+++ выражено
Пример 2. Группа мексидола
В группе животных, получивших исследуемые вещества, смертность в течение 1 суток была ниже, чем в контрольной группе. В частности, в группах животных, получавших мексидол, суточная выживаемость составила 70%.
Крысы, получавшие мексидол на 1–7 сутки не имели достоверных различий по шкале МсGrow с группой контрольных животных. К 14 суткам все животные, получавшие исследуемое вещество, имели более чем в 1.5 раза более низкие показатели по шкале МсGrow, чем контрольная группа (таблица 4).
Регистрация силы хвата у крыс с геморрагическим инсультом показала, что на первые сутки после инсульта ослабление мышечного тонуса в группе мексидола достоверно составило в среднем 58.2%. На 3 сутки отмечался прирост мышечной силы во всех группах, причём в группе, получавших исследуемое вещество, прирост оказался достоверно выше, чем в контрольной группе. Показатели активности крыс, получавших мексидол, на 1 и 3 сутки после операции не имели достоверных различий с группой контроля. Однако к 14 суткам активность животных, получавших мексидол, нарастала (таблица 5).
Данные морфологических исследований в группе мексидола представлены в Таблице 6. Видимые отличия от данных контрольной группы наблюдались к 14 суткам.
+ незначительно
++ умеренно
+++ выражено
Полученные результаты данного способа моделирования геморрагического инсульта демонстрируют высокую повторяемость результатов на примере контрольной группы и группы с препаратом-референсом и нечувствительность методики к качеству животных, так как на выживаемость не повлияли ни линия, ни вес, ни пол, ни возраст животного и допустимыми оказались комбинации в возрасте и массе +/- 100 г.
Таким образом, предложенный способ отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень» и позволяет повысить повторяемость результатов при исследовании нейропротективных свойств на референсном препарате мексидол вне зависимости от  различных параметров животных