Применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, в ветеринарной офтальмологии

АКТУАЛЬНАЯ ТЕМА

УДК 619: 617.7

Применение плазмы, обогащенной тромбоцитами, в ветеринарной офтальмологии

А.Г. Шилкин, кандидат медицинских наук, ведущий врач-офтальмолофЬ11к1п555@таИ.ш), М.А. Войтеха (m.voy@bk.ru), кандидат биологических наук, врач-офтальмолог, Т.Н. Павлова, кандидат ветеринарных наук, врач-офтальмолог, ДА. Ротанов, кандидат ветеринарных наук, врач-офтальмолог, КА. Новикова, ветеринарный врач (mikoy88@gmail.com).

Центр ветеринарной офтальмологии доктора Шилкина А.Г. (129323, Москва, ул. Снежная, д. 13, корп. 1).

В настоящее время для лечения глазных заболеваний у животных применяют новый эффективный метод клеточной терапии — лечение плазмой, обогащенной тромбоцитами (PRP), которая содержит не менее 1 млн тромбоцитов на 1 мл, то есть содержание тромбоцитов в ней превышает физиологическую норму в 5 раз. Такая высокая концентрация тромбоцитов в пораженных тканях глаза животных обеспечивает стимулирующий эффект за счет запуска цитокиновых реакций и выделения множества факторов роста. Эти цитокины являются ведущими агентами в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и регенерации. При введении плазмы, обогащенной факторами роста, в патологический очаг происходит ускоренное восстановление поврежденных тканей глаза, уменьшаются воспалительные процессы и улучшается трофика непосредственно в очаге поражения. Данная методика безопасна (используют собственную кровь пациента), физиологична, не вызывает никаких токсических, аллергических реакций и хорошо переносится всеми животными. В российской ветеринарной офтальмологии этот метод для лечения заболеваний глаз у животных был разработан нами, и с успехом применяется только в нашей клинике. С использованием PRP было пролечено более 30 животных с синдромом сухого глаза, кератитами, язвами и хроническими, длительно не заживающими эрозиями роговицы. Кроме того, плазму назначали в послеоперационном периоде животным после тяжелых пересадок роговицы с использованием донорского трансплантанта. Осложнений не отмечено ни у одного пациента.

Ключевые слова: плазма, кровь, стволовые клетки, плазмолифтинг, тромбоциты, кошка, собака Сокращения: ЭРГ — электроретинография, EGF — epidermal growth factor

Введение

Кризис развития традиционных методик лечения в ветеринарии увеличил интерес врачей различных специальностей к передовым медицинским биотехнологиям, обеспечивающим регенерацию тканей. Авторы статьи, также во многом поддавшись новомодным тенденциям, несколько лет назад провели совместно с Федеральным Биофизическим центром им. Бур-назяна достаточно длительную, глубокую, но, к сожалению, во многом безрезультатную работу по внедрению стволовых клеток в ветеринарную офтальмологию. В условиях Центра ветеринарной офтальмологии доктора Шилкина А.Г. брали образцы ткани из зоны палисадов Фогта лимба (рис. 1), а также жировой ткани и крови животных.

Из полученных образцов выделяли и выращивали в лаборатории Федерального биофизического центра им. Бурназяна мезенхимальные или гемопоэтичес-кие стволовые клетки. В последующем стволовые клетки применяли для лечения различных неифекционных патологий: синдрома сухого глаза, дегенераций, помут-

Рис. 1. Зона палисадов Фогта лимба, откуда брали образцы тканей для выращивания мезенхимальных аутологичных стволовых клеток

Fig. 1. Zone of Vogt palisades limb, where we took tissue samples for growing mesenchymal stem cells autologous

Рис. 2. Интрастромальное введение стволовых клеток в роговицу для лечения эрозии

Fig. 2. Intrastromal administration of stem cells in the cornea for the treatment of erosion

нении, эрозии и изъязвлении роговицы путем интра-стромального введения в роговицу, окулярных инъекций или инсталляций в полость конъюнктивы (рис. 2).

Однако эта методика не получила распространения в ветеринарной офтальмологии в силу ряда недостатков. При лечении заболеваний глаз у животных с использованием гемопоэтических стволовых клеток констатировали практически полное отсутствие положительных результатов. При использовании мезенхимальных стволовых клеток отметили определенные проблемы, такие как малая эффективность и непредсказуемость результатов примерно у 40...50 % пациентов; дороговизна и сложность метода; длительное

Рис. 3. Тромбоциты в нормальной крови (слева) и в обогащенной плазме

Fig. 3. Platelets in normal blood (left) and in rich plasma

время выращивания клеточного материала; отсутствие маркеров стволовых клеток для животных, что давало бы возможность объективно отследить распределение введенных клеток в тканях глаза.

Все эти недостатки заставили искать более действенные, предсказуемые и доступные биотехнологии. Одним из наиболее многообещающих и интересных для ветеринарной офтальмологии методов клеточной терапии является новое направление — лечение глазных заболеваний с использованием PRP [3, 4].

Суть методики и механизм действия PRP

Основная функция тромбоцитов в макроорганизме — участие в обеспечении гемостаза. При увеличении количества тромбоцитов и их активации они изменяют свою форму и выделяют специфические биологические факторы роста. Тромбоциты также играют ключевую роль как промежуточное звено в процессе заживления поврежденной ткани за счет способности выделять из своих a-гранул цитокины, хемокины и многие другие белки, по-разному вовлеченные в стимулирование хемотаксиса, пролиферацию клеток и созревание, модуляцию молекул и привлечение лейкоцитов. Кроме того, тромбоциты хранят антибактериальные и фунгицидные белки, способные предотвращать развитие инфекции.

PRP содержит не менее 1 млн тромбоцитов на 1 мл плазмы, то есть содержание тромбоцитов в PRP превышает физиологическую норму в 5 раз. Научно доказано, что только такая высокая концентрация тромбоцитов и обеспечивает их стимулирующий эффект за счет запуска цитокиновых реакций и выделения множества факторов роста. При меньшей концентрации (меньше 1 млн клеток /мл) стимулирующий эффект тромбоцитов отсутствует. В богатой тромбоцитами плазме находятся все основные 6 факторов клеточного роста:

• PDGF активирует фибробласты и миоциты глад-комышечной ткани, клеточный рост; стимулирует синтез коллагена и гликозаминогликанов, ангиогенез; усиливает образование грануляционной ткани, формирование матрикса коллагена и кости с участием костных морфогенетических белков;

• TGF регулирует метаболизм костной ткани, апоп-тоз; усиливает синтез белков межклеточного мат-рикса;

• IGF стимулирует пролиферацию клеток костной и хрящевой тканей; активирует ангиогенез; стимулирует заживление мышечной ткани;

Рис. 4. Взятие крови из периферической вены в пробирку для плаз-молифтинга

Fig. 4. Taking blood from a peripheral vein in a test tube for plazmolifting

Рис. 5. Кровь до центрифугирования и разделение на фракции после центрифугирования. Стрелками показано (сверху вниз): плазма, гель, эритроцитарный сгусток. Пояснение в тексте

Fig. 5. The blood before centrifugation and separation into fractions after centrifugation. Arrows show (from top to bottom): plasma, gel, erythrocyte clot. Explanation in the text

• FGF стимулирует ангиогенез и пролиферацию фиб-робластов, экспрессию их в костную ткань; улучшает заживление мышечной ткани;

• VEGF стимулирует рост новых кровеносных сосудов, антиапоптоз;

• EGF активирует пролиферацию эпидермальных и эпителиальных клеток, закрытие кожной раны; стимулирует ангиогенез.

Тромбоциты также содержат различные белки, цитокины и другие биоактивные факторы, которые являются ведущими в процессах клеточной диффе-ренцировки, пролиферации и регенерации. Вышеуказанные структуры индуцируют миграцию и пролиферацию мезенхимальных клеток-предшественников, стимулируют неоангиогенез и регенерацию тканей глаза. Кроме факторов роста PRP содержит некоторые белки плазмы — фибриноген, протромбин и др., которые также влияют на процессы ре-

А.Г. Шилкин, М.А. Войтеха, Т.Н. Павлова, Д.А. Ротанов, К.А. Новикова

Рис. 6. Субконъюнктивальная инъекция плазмы Fog. 6. Рlasma subconjunctival injection

генерации, являясь матрицей для миграции клеток. При введении плазмы, обогащенной факторами роста в патологический очаг происходит ускоренное восстановление поврежденных тканей, уменьшаются воспалительные процессы и улучшается трофика непосредственно в очаге поражения. Кроме того, ци-токины вызывают опосредованно приток стволовых клеток к пораженному участку [4, 6, 7].

Концентрация факторов роста, которые поступят в ткани, прямо пропорциональна концентрации тромбоцитов, но до определенного уровня — не выше 1,5 млн клеток /мл. Дальнейшее увеличение концентрации тромбоцитов уже не приводит к пропорциональному увеличению эффективности. Преимущества данной методики — безопасность (используют собственную кровь пациента) с точки зрения инфекционных заболеваний и образования антител, физи-ологичность, простота, кроме того, она гораздо дешевле, чем использование стволовых клеток. Сегодня PRP применяют в медицине практически во всех направлениях: косметологии, стоматологии, отоларингологии, пластической, спортивной, эстетической, общей и челюстно-лицевой хирургии, ортопедии. Зачастую, в хирургии и стоматологии используют инъекцию в участок ткани, на котором производят хирургическую манипуляцию, либо помещают тромбоцитарный сгусток в полость, которую планируют заполнить костной тканью. В косметологии введение приготовленной плазмы осуществляется ме-зотерапевтическим методом при помощи тонких игл.

Буквально за несколько лет PRP стала быстро осваиваться зарубежными и отечественными ветеринарными клиниками, в первую очередь для лечения патологий суставов и конечностей у лошадей и собак. Сейчас в США появилось даже специальные обру-дование для применения плазмы в ветеринарии [4].

В медицинской офтальмологии метод стал распространяться только недавно, но уже появился ряд исследований (к сожалению, пока в основном в Европе и США) по применению плазмы у человека при синдроме сухого глаза и других патологиях. В рос-

сийской ветеринарной офтальмологии этот метод лечения применяют только в нашем Центре. В зарубежной литературе присутствуют ссылки на публикации ветеринарных американских офтальмологов об использовании этого метода. В личных беседах с несколькими ведущими офтальмологами из США выяснилось, что все они знают про этот метод лечения, но больше с научной точки зрения, а не с практической.

Цель исследования

Разработать теоретические обоснования и практическую методику получения плазмы, обогащенной факторами роста, для лечения патологий глаз у собак и кошек.

Материалы и методы

В нашем центре PRP используется около трех лет. С ее помощью нами было пролечено 30 животных в возрасте от 6 месяцев до 15 лет (собак — 25, основные породы: йоркширский терьер, английский и французский бульдог, боксер. Кошек — 5, в основном метисы) с различными дистрофическими заболеваниями глаз общим числом 43.

Перед применением плазмы и после него во всем периоде наблюдения животные проходили стандартное офтальмологическое обследование.

Передний отрезок глаза исследовали с помощью налобного биомикроскопа («Heine», Германия), щелевой лампы («Shin Nippon», Япония; и «KEELER», Британия). Внутриглазное давление измеряли тонометрами «Tonovet» и Маклакова. Количество слезопродукции определяли по тесту Ширмера. Размер роговичной эрозии контрастировали флюоресцеином.

Состояние сетчатки и зрительного нерва визуализировали с помощью прямого и обратного бинокулярного офтальмоскопа. При необходимости проводили ЭРГ («Retiport Acrivet» Германия).

Результаты и обсуждение

Предложены различные методики получения PRP: путем однократного, двукратного и даже трехкратного центрифугирования, применения пробирок с разделительным гелем и без него, с использованием частоты вращения от 1,5 до 6,5 тыс. мин-1. Эффективность каждой из методик носит диску-табельный характер и является благодатным полем для дальнейших исследований в ветеринарии и медицине.

Для лечения заболеваний в ветеринарной офтальмологии мы адаптировали и применили наиболее широко используемую в нашей стране медицинскую методику выделения PRP, предложенную профессором Р.Р. Ахмеровым. Ее несомненное преимущество — получение большего количества плазмы (пусть даже несколько более бедной тромбоцитами, чем при использовании методик двукратного центрифугирования. Это очень важно при лечении миниатюрных собак, склонных к эрозиям и синдрому сухого глаза. У таких животных зачастую бывает трудно набрать даже минимальные 8 мл крови для получения плазмы, не говоря о большем количестве крови, необходимом для двукратного центрифугирования).

Суть методики состоит в следующем. У животного брали кровь (8 мл) из вены в пробирки для плаз-молифтинга (рис. 4). Эти вакуумные пробирки запатентованы профессором P.P. Ахмеровым. Они содержат сепарационный разделительный гель и имеют высокий уровень очистки плазмы от эритроцитарно-го сгустка. В качестве антикоагулянта выступает гепарин. Сами пробирки сертифицированы для применения в медицине и полностью отвечают всем стандартам безопасности. Единственный недостаток пробирок для плазмолифтинга — их высокая стоимость, что ограничивает более широкое применение плазмы у животных [1, 3].

Пробирки с кровью устанавливали в центрифугу «ЕВА-20» («Hettich», Германия), которая разработана специально для получения плазмы, обогащенной факторами роста, так как обеспечивает быстрое разделение крови на фракции. Центрифуга очень удобна в работе, занимает мало места и не требует какой-либо специальной подготовки врача, поэтому и рекомендуется для использования всеми ведущими специалистами [3].

Пробирки центрифугировали однократно в течение 5 мин при 2,5 тыс. мин-1 (методические рекомендации для плазмолифтинга в центифуге «ЕВА-20»). Для других центрифуг частота вращения может быть иной. Большая частота вращения нецелесообразна, так как приводит к гибели клеток. После центрифугирования кровь разделялась на три основные составляющие: сверху желтоватая диффузная, богатая тромбоцитами плазма, в средней части непрозрачный гель белого цвета, внизу темно-красный тяжелый эритроцитар-ный сгусток (рис. 5) [1].

PRP полностью извлекали из пробирки с помощью шприцевой иглы. Основным препятствием для применения плазмы у миниатюрных собак служило следующее: было трудно, а порой и невозможно взять даже 8 мл крови. Плазму вводили животным в виде субконъюнктивальных инъекций в дозе 0,5...1 мл или в виде инстилляций от 3 до 6 раз в день, сроком до 14 дней, в зависимости от патологии (рис. 6). При инстилляциях для активации тромбоцитов и освобождения факторов роста использовали небольшое количество хлорида кальция, при инъекциях его не применяли из-за соображений безопасности.

При использовании PRP мы установили, что эта методика абсолютно безопасна при местном применении в офтальмологии. Инстилляции и инъекции плазмы в глаз не вызывают аллергических, воспалительных реакций и других нежелательных эффектов даже при длительном использовании. При осмотре роговицы, передней камеры, дна глаза после применения плазмы мы не визуализировали никаких

отклонений от нормы. Проведенные у нескольких животных ЭРГ до и после лечения плазмой ни в одном случае не выявили ухудшения функций сетчатки, еще раз подтвердив полное отсутствие токсичного влияния этой методики на ткани глаза у собак и кошек [5, 8].

Заключение

Таким образом, применение РБ.Р — это новое перспективное направление в ветеринарной офтальмологии при таких заболеваниях, как сухой керато-конъюнктивит, индолентные язвы роговицы, аллергические реакции, а также при состоянии после пересадки роговицы. При ее местном использовании нежелательные побочные реакции отсутствуют. Получение плазмы — достаточно простая и доступная манипуляция, не сопряженная с большими материальными затратами и необходимостью специальной подготовки врача.

Библиографию см. на сайте издательства htth://logospress.ru

ABSTRACT

A.G. Shilkin, M.A. Voitekha, T.N. Pavlova, D.A. Rotanov, K.A. Novikova

Center of Veterinary Ophthalmology Dr. Shilkina A.G.

Application of Platelet Rich Plasma in Veterinary Oph-thalomology. Currently, for treatment of eye infections in animals, there is a new effective method of cell therapy — treatment with platelet-rich plasma, containing at least 1 mill. 1 platelets per ml. That is, the platelet count in it exceed the physiological norm is 5 times. Such a high concentration of platelets in the affected tissues of the eyes of animals provides a stimulating effect due to the launch of cytokine responses, and select multiple growth factors. These cytokines are leading agents in the processes of cell differentiation, proliferation and regeneration. With the introduction of plasma enriched with growth factors in the pathological focus we can see more rapid recovery of damaged eye tissue, reducing of inflammation and improving of trophism directly into the lesion. This procedure is safe (own blood of patient is taken), physiologic, does not cause any toxic, allergic reactions and was well tolerated by all animals. In russian veterinary ophthalmology this method for the treatment of eye diseases in animals was developed by us and has been successfully used in our clinic only. We have used PRP in treatment of more than 30 animals with dry eye syndrome, keratitis, ulcers and chronic long-term healing erosions of the cornea. In addition, plasma was administered to animals in the postoperative period after severe corneal transplants using donor transplant. No complications were observed in any patient.

Keywords: plasma, blood, stem cells, plazmolifting, platelets, cat, dog.