СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ ЧАСТОТЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОСТРОЙ ЗАДЕРЖКИ МОЧИ
METHOD FOR PREVENTING ONSET OR REDUCING INCIDENCE OF ACUTE URINARY RETENTION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с обычной заявкой на патент США № 15/222365, поданной 28 июля 2016 года, под названием «Способ предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи», полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
1. Область техники изобретения
[0002] Варианты осуществления включают способы предупреждения острой задержки мочи с применением композиций, содержащих соединения на основе небольших пептидов и фармацевтически приемлемый носитель. Способы предусматривают без ограничения введение композиций внутримышечно, перорально, внутривенно, интрапростатически, внутрибрюшинно, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутриочагово, интраокулярно, интраартериально, интратекально, внутрь опухоли, интраназально, местно, трансдермально, интраназально, подкожно или внутрикожно нуждающимся в этом пациентам, причем у тех пациентов, которым вводили композиции, обеспечивается резкое снижение частоты возникновения острой задержки мочи (AUR).
2. Описание предшествующего уровня техники
[0003] Суть многих терапевтических способов лечения и процедур заключается в удалении или разрушении вредных или нежелательных тканей. Примеры таких способов лечения включают удаление хирургическим путем раковых или предраковых новообразований, разрушение метастатических опухолей с помощью химиотерапии и уменьшение железистой (например, предстательной) гиперплазии. Другие примеры включают удаление нежелательной растительности на лице, удаление бородавок и удаление нежелательных жировых тканей.
[0004] Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (BPH) часто встречается у пожилых мужчин с симптомами, которые влияют на качество жизни, включая нарушение деятельности и восприятие благополучия. BPH может быть прогрессирующей, с риском задержки мочи, инфекций, камней в мочевом пузыре и почечной недостаточности. Хотя многие мужчины с легкими или умеренными симптомами чувствуют себя хорошо без вмешательства, неприятные симптомы и осложнения могут прогрессировать у других, что приводит к применению лекарственной терапии или хирургического вмешательства.
[0005] Одним из осложнений BPH является острая задержка мочи (AUR), приводящая к катетеризации. Острая задержка мочи может быть классифицирована как спонтанная или спровоцированная. Пациенты часто считают спонтанную острую задержку мочи наиболее серьезным исходом BPH. Спонтанная острая задержка мочи представляет собой случай острой задержки мочи, который связан с BPH и не связан с провоцирующим явлением. Было показано, что ингибитор 5α-редуктазы финастерид является эффективным в лечении BPH и обеспечивает значительное снижение спонтанной острой задержки мочи у пациентов с BPH. Andersen et al., Urology, 49(6), 839-845 (1997).
[0006] Спровоцированная острая задержка мочи представляет собой случай острой задержки мочи, который спровоцирован по меньшей мере одним из следующих факторов: анестезией или хирургическим вмешательством в течение 72 часов; провоцирующим медицинским явлением, таким как инсульт или застойная сердечная недостаточность; медицинским состоянием, таким как простатит или инфекция мочевыводящих путей; или приемом внутрь лекарственных препаратов или лекарственных средств, которые, как известно, провоцируют задержку, например, гидрохлорида псевдоэфедрина, медикамента от простуды, обезболивающих лекарственных препаратов, таких как наркотические или успокаивающие средства, или бенадрил.
[0007] Существует потребность в эффективной композиции, которая будет разрушать и, следовательно, либо способствовать удалению, либо подавлять дальнейший рост вредных или нежелательных клеток и тканей, но будет иметь в основном местные эффекты и минимальную или отсутствующую системную токсичность, и которая является пригодной для предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи. Также существует потребность в уменьшении потребности в инвазивном хирургическом вмешательстве даже после лечения посредством эффективной композиции.
[0008] Некоторые средства, которые, как известно, обладают способностью разрушать и, следовательно, либо способствовать удалению, либо подавлять дальнейший рост вредных или нежелательных клеток и тканей, раскрыты в заявке на патент США № 14/808731, поданной 24 июля 2015 года, под названием СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ПОТРЕБНОСТИ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ У ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ; заявке на патент США № 14/606683, поданной 27 января, 2015 года, под названием СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ РАЗРУШЕНИЯ ИЛИ УДАЛЕНИЯ КЛЕТОК, заявке на патент США № 14/738551, поданной 12 июня, 2015 года, под названием КОМБИНИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ УДАЛЕНИЯ ИЛИ РАЗРУШЕНИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЛИФЕРАЦИЙ, публикациях заявок на патент США №№ 2007/0237780 (в настоящее время приостановлена); 2003/0054990 (в настоящее время приостановлена); 2003/0096350 (теперь патент США № 6924266); 2003/0096756 (теперь патент США № 7192929); 2003/0109437 (теперь патент США № 7241738); 2003/0166569 (теперь патент США № 7317077); 2005/0032704 (теперь патент США № 7408021) и 2015/0148303 (теперь патент США № 9243035), раскрытие каждой из которых включено в данном документе посредством ссылки во всей своей полноте.
[0009] Доброкачественный избыточный рост тканей представляет собой нарушения, при которых желательно удалять клетки из организма. Доброкачественные опухоли представляют собой клеточные пролиферации, которые не метастазируют по всему организму, но вызывают симптомы заболевания. Такие опухоли могут быть смертельными, если они расположены в недоступных областях в органах, таких как головной мозг. Существуют доброкачественные опухоли органов, в том числе опухоли легкого, головного мозга, кожи, гипофиза, щитовидной железы, коры надпочечников и мозгового вещества, яичника, матки, яичка, соединительной ткани, мышц, кишечника, уха, носа, горла, миндалин, рта, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, предстательной железы, сердца и других органов.
[0010] Хирургическое вмешательство часто является первой стадией в лечении рака. Цель хирургического вмешательства варьирует. Иногда его используют для удаления как можно большей части выраженной опухоли или по меньшей мере для «уменьшения ее объема» (удаление основной массы опухоли, чтобы уменьшить потребность в лечении другими способами). В зависимости от типа и локализации рака, хирургическое вмешательство может также обеспечивать пациенту некоторое облегчение симптомов. Например, если хирург может удалить большую часть растущей опухоли головного мозга, давление внутри черепа снизится, что приведет к улучшению симптомов пациента.
[0011] Однако не все опухоли поддаются хирургическому вмешательству. Некоторые могут быть расположены в тех частях тела, которые делают невозможным их полное удаление. Примерами таких могут быть опухоли в стволе головного мозга (часть головного мозга, которая контролирует дыхание) или опухоль, которая выросла в и вокруг крупного кровеносного сосуда. В этих случаях роль хирургического вмешательства ограничена из-за высокого риска, связанного с удалением опухоли.
[0012] В некоторых случаях хирургическое вмешательство не используется для уменьшения объема опухолевой ткани, поскольку это просто не является необходимым. Примером является лимфома Ходжкина, рак лимфатических узлов, который очень хорошо реагирует на комбинации химиотерапии и лучевой терапии. При лимфоме Ходжкина хирургическое вмешательство редко необходимо для достижения излечения, но почти всегда применяется для установления диагноза.
[0013] Химиотерапия является еще одной распространенной формой лечения рака. По существу, она включает применение лекарственных препаратов (обычно вводимых перорально или посредством инъекции), которые специфически воздействуют на быстро делящиеся клетки (например, обнаруженные в опухоли) по всему организму. Это делает химиотерапию пригодной в лечении видов рака, которые уже осуществили метастазирование, а также опухолей, которые характеризуются высокой вероятностью распространения через кровеносную и лимфатическую системы, но не проявляются за пределами первичной опухоли. Химиотерапию также можно применять для усиления реакции локализованных опухолей на хирургическое вмешательство и лучевую терапию. Это касается, например, некоторых видов рака головы и шеи.
[0014] К сожалению, другие клетки в организме человека, которые также обычно быстро делятся (такие как слизистая оболочка желудка и волосы), также подвержены химиотерапии. По этой причине многие химиотерапевтические средства вызывают нежелательные побочные эффекты, такие как тошнота, рвота, анемия, выпадение волос или другие симптомы. Эти побочные эффекты носят временный характер и существуют лекарственные препараты, которые могут помочь облегчить многие из этих побочных эффектов. Поскольку наши знания продолжают расти, исследователи разработали новые химиотерапевтические средства, которые не только лучше убивают раковые клетки, но и имеют меньше побочных эффектов для пациента.
[0015] Средство для химиотерапии вводят пациентам различными способами. Некоторые включают пилюли, а другие вводят внутривенно или посредством других инъекций. Для инъекционной химиотерапии пациент посещает медицинский кабинет или больницу для лечения. Другие химиотерапевтические средства требуют непрерывной инфузии в кровоток 24 часа в сутки. Для этих типов химиотерапии осуществляют малую хирургическую процедуру для имплантации небольшого насоса, предназначенного для ношения пациентом. Затем насос медленно вводит лекарственный препарат. Во многих случаях постоянный порт помещают в вену пациента для исключения необходимости повторных введений иглы.
[0016] Доброкачественные опухоли и мальформации также можно лечить различными способами, включая хирургическое вмешательство, лучевую терапию, терапию лекарственными средствами, термическую или электрическую абляцию, криотерапию и другие. Хотя доброкачественные опухоли не метастазируют, они могут стать большими и рецидивировать. Удаление хирургическим путем доброкачественных опухолей сопряжено со всеми трудностями и побочными эффектами хирургического вмешательства в целом и часто должно проводиться повторно для некоторых доброкачественных опухолей, таких как аденомы гипофиза, менингиомы головного мозга, гиперплазия предстательной железы и другие. Кроме того, некоторым пациентам, которые получают нехирургическое лечение для облегчения симптомов, вызванных доброкачественными опухолями, все еще необходимо последующее инвазивное хирургическое вмешательство. В Lepor, «Medical Treatment of Benign Prostatic Hyperplasia», Reviews in Urology, Vol. 13, No. 1, pp. 20-33 (2011) раскрыты различные исследования эффективности терапии лекарственным средством в лечении BPH и необходимости последующего инвазивного хирургического лечения.
[0017] Роль андрогенов в развитии доброкачественной гиперплазии предстательной железы у мужчин хорошо задокументирована (Wilson, N. Engl. J. Med. 317: 628-629, 1987). Фактически, доброкачественная гиперплазия предстательной железы не развивается при отсутствии яичек (упоминается в Wendel et al., J. Urol. 108: 116-119, 1972).
[0018] Известно, что блокада секреции андрогенов яичка с помощью хирургической или медикаментозной (агонистом LHRH) кастрации уменьшает размер предстательной железы (Auclair et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 855-862, 1977; Auclair et al., Endocrinology 101: 1890-1893, 1977; Labrie et al., Int. J. Andrology, suppl. 2 (V. Hansson, ed.), Scriptor Publisher APR, pp. 303-318, 1978; Labrie et al., J. Andrology 1: 209-228, 1980; Tremblay and Belanger, Contraception 30: 483-497, 1984; Tremblay et al., Contraception 30: 585-598, 1984; Dube et al., Acta Endocrinol. (Copenh) 116: 413-417, 1987; Lacoste et al., Mol. Cell. Endocrinol. 56: 141-147, 1988; White, Ann. Surg. 22: 1-80, 1895; Faure et al., Fertil. Steril. 37: 416-424, 1982; Labrie et al., Endocrine Reviews 7: 67-74, 1986; Huggins and Stevens, J. Urol. 43: 705-714, 1940; Wendel et al., J. Urol. 108: 116-119, 1972; Peters and Walsh, N. Engl. J. Med. 317: 599-604, 1987; Gabrilove et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64: 1331-1333, 1987).
[0019] Несколько исследований показали, что лечение посредством антиандрогена также уменьшает размер предстательной железы (Neri et al., Endocrinology, 82: 311-317, 1968; Neri et al., Investigative Urology, 10: 123-130, 1972; Tunn et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 91: 373-384, 1979; Seguin et al., Mol. Cell. Endocrinol., 21: 37-41, 1981; Lefebvre et al., The Prostate 3: 569-578, 1982; Marchetti and Labrie, J. Steroid Biochem, 29: 691-698, 1988; Lacoste et al., Mol. Cell. Endocrinol. 56: 141-147, 1988; Tunn et al., Invest. Urol. 18: 289-292, 1980; Scott and Wade, J. Urol. 101: 81-85, 1969; Caine et al., J. Urol. 114: 564-568, 1975; Stone et al., J. Urol. 141: 240A, 1989; Clejan et al., J. Urol. 141: 534A, 1989).
[0020] В патенте США № 3423507 раскрыто применение антиандрогена ципротеронацетата (1α,2β-метилен-6-хлор-17α-ацетокси-6-дегидропрогестерона) для лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Чистые антиандрогены (патент США № 4329364) вызывают увеличение секреции тестостерона, что может привести к более высокой степени ароматизации в эстрогены, что, как предполагается исходя из современных знаний, отрицательно влияет на гиперплазию предстательной железы (Jacobi et al., Endocrinology 102:1748-1755, 1978). Несколько исследований показало, что лечение посредством комбинации химической кастрации (агониста LHRH) и антиандрогена вызывает большее подавление размера предстательной железы, чем любое лечение, используемое отдельно (Seguin et al., Mol. Cell. Endocrinol. 21: 37-41, 1981; Lefebvre et al., The Prostate 3: 569-578, 1982; Marchetti and Labrie, J. Steroid Biochem. 29: 691-698, 1988.
[0021] В предстательной железе, а также во многих других тканях тестостерон необратимо превращается с помощью 5α-редуктазы в более активный андроген дигидротестостерон (Bruchovsky and Wilson, J. Biol. Chem. 243: 2012-2021, 1968; Wilson, Handbook of Physiology 5 (section 7), pp. 491-508, 1975). Установлено, что ингибиторы 5α-редуктазы подавляют рост предстательной железы (Brooks et al., Endocrinology 109: 830, 1981; Brooks et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 169: 67, 1982; Brooks et al., Prostate 3: 35, 1982; Wenderoth et al., Endocrinology 113,569-573, 1983; McConnell et al., J. Urol. 141: 239A, 1989); Stoner, E., Lecture on the role of 5.alpha.-reductase inhibitor in benign prostatic hypertropy, 84th AUA Annual Meeting, Dallas, May 8, 1989.
[0022] Ингибирующий эффект ингибитора 5α-редуктазы Merck L 652931 в отношении развития предстательной и семенной желез у препубертатных крыс был описан в Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc. abst. #1165, p. 314, 1989. Ингибирующий эффект МК-906 в отношении образования дигидротестостерона у мужчин был описан у мужчин Gormley et al. в Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. #1225, p. 329, 1989; Imperato-McGinley et al. в Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. #1639, p. 432, 1989; Geller и Franson в Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. #1640, p. 432, 1989 и Tenover et al. в Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. #583, p. 169, 1989. Активность ингибиторов 5α-редуктазы N,N-диэтил-4-метил-3-оксо-4-аза-5альфа-андростан-17бета-карбоксамида (4-МА) и 6-метилен-4-прегнен-3,20-диона (LY 207320) была описана Toomey et al., Proc. 71st Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. #1226, p. 329, 1989.
[0023] В дополнение к хорошо известному эффекту андрогенов в отношении роста предстательной железы, существует множество исследований, которые показывают, что эстрогены также играют роль в пролиферации предстательной железы (Walsh and Wilson, J. Clin. Invest. 57: 1093-1097, 1976; Robinette et al., Invest. Urol. 15: 425-432, 1978; Moore et al., J. Clin. Invest. 63: 351-257, 1979). Кроме того, было показано, что эстрогены усиливают андроген-индуцированный рост предстательной железы у собаки (Walsh and Wilson, J. Clin. Invest. 57: 1093-1097, 1976; Jacobi et al., Endocrinology 102: 1748-1755, 1978; Tunn et al., Urol. Int. 35: 125-140, 1980). Возможным объяснением этого усиливающего эффекта эстрогена в отношении андроген-индуцированного роста предстательной железы является наблюдение того, что, как было показано, 17β-эстрадиол увеличивает связывание андрогена в предстательной железе собаки (Moore et al., J. Clin. Invest. 63: 351-357, 1979).
[0024] Показано, что антиэстроген тамоксифен облегчает стероид-индуцированную доброкачественную гиперплазию предстательной железы у собаки (Funke et al., Acta Endocrinol. 100: 462-472, 1982). Введение антиэстрогена тамоксифена в сочетании со стероидным антиандрогеном ципротеронацетатом у пациентов, страдающих доброкачественной гиперплазией предстательной железы, показало положительный эффект в отношении симптомов заболевания (Di Silverio et al. в Ipertrofia Prostatica Benigna (F. Di Silverio, F. Neumann and M. Tannenbaum, eds), Excerpta Medica, pp. 117-125, 1986). В патенте США № 4310523 предлагается, что комбинация антиандрогена и антиэстрогена является эффективной для профилактики и/или терапии доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Однако тамоксифен обладает внутренней эстрогенной активностью, которая ограничивает его эффективность.
[0025] Образование эстрогена в результате ароматизации андрогенов происходит в нескольких сайтах. У мужчин ароматизация андрогенов была продемонстрирована в яичке, жировой и мышечной тканях, коже, печени, мозге и предстательной железе (Schweikert et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 40: 413-417, 1975; Folker and James, J. Steroid Biochem. 49: 687-690, 1983; Longcope et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 46: 146-152, 1978; Lacoste and Labrie, неопубликованные данные; Stone et al., The Prostate 9: 311-318, 1986; Stone et al., Urol. Res. 15: 165-167, 1987). Существуют данные об увеличении продуцирования эстрогенов в предстательной железе у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (Stone et al., The Prostate 9: 311-318, 1986). Такие данные указывают на то, что местное образование эстрогенов может играть решающую роль в стимулировании роста предстательной железы сверх действия, спрогнозированного для циркулирующих эстрогенов.
[0026] В патенте США № 4472382 раскрыто лечение BPH антиандрогеном и некоторыми пептидами, которые действуют как агонисты LH-RH. В патенте США № 4596797 раскрыты ингибиторы ароматазы в качестве способа профилактики и/или лечения гиперплазии предстательной железы. В патенте США № 4760053 описано лечение некоторых видов рака, в котором комбинируют агониста LHRH с антиандрогеном и/или антиэстрогеном и/или по меньшей мере одним ингибитором биосинтеза половых стероидов. В патенте США № 4775660 раскрыт способ лечения рака молочной железы посредством комбинированной терапии, которая может включать хирургическое или химическое предотвращение секреции яичников и введение антиандрогена и антиэстрогена.
[0027] В патенте США № 4659695 раскрыт способ лечения рака предстательной железы у восприимчивых особей мужского пола животных, включая людей, у которых гормональная секреция яичка блокируется хирургическим или химическим путем, например, с помощью агониста LHRH, который включает введение антиандрогена, например флутамида, в сочетании с по меньшей мере одним ингибитором биосинтеза половых стероидов, например аминоглутетимидом и/или кетоконазолом. Раскрытия каждого из вышеуказанных патентов (США 4472382, 4596797, 4760053, 4775660 и 4659695) включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0028] BPH вызвана повышенной активностью как андрогенов, так и эстрогенов. Из-за такой двойной этиологии BPH предлагаемая гормональная терапия была менее чем удовлетворительной и была непредсказуемой, часто вызывая неприемлемые побочные эффекты. Более того, лечение согласно предшествующему уровню техники редко приводило к уменьшению объема предстательной железы на более чем приблизительно 20-30% с неустойчивым эффектом в отношении симптоматики (Scott and Wade, J. Urol. 101: 81-85, 1969; Caine et al., J. Urol. 114: 564-568, 1975; Peters and Walsh, New Engl. J. Med. 317: 599-604, 1987; Gabrilove et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64: 1331-1333, 1987; Stone et al., J. Urol. 141: 240A, 1989; Clejan et al., J. Urol. 141: 534A, 1989; Stoner, E., Lecture on the role of 5α-reductase inhibitor in benign prostatic hypertrophy, 84th AUA Annual Meeting, Dallas, May 8, 1989.
[0029] Объяснение механизма, кратко изложенного выше, привело в результате к недавней разработке эффективных средств для контроля, а во многих случаях и наоборот, прогрессирования BPH. На переднем плане среди этих средств находится продукт PROSCAR (финастерид) от Merck & Co., Inc. Эффект этого соединения заключается в подавлении фермента тестостерона 5α-редуктазы, который превращает тестостерон в 5α-дигидротестерон, что приводит в результате к снижению скорости увеличения предстательной железы и часто к уменьшению массы предстательной железы.
[0030] Во всех или в большинстве этих случаев существует потребность в способах лечения, которые могут удалить, уничтожить или улучшить нежелательные состояния, которые могут вызвать острую задержку мочи, без риска и побочных эффектов, сопутствующих общепринятые средства терапии, или способах лечения, которые могут удалить, разрушить или улучшить нежелательные состояния с большей точностью. Также существует необходимость в разработке средств терапии, которые могут обеспечить предупреждение возникновения или снижение частоты возникновения острой задержки мочи, обычно ассоциированной с BPH.
[0031] Во всем данном описании, включая вышеизложенное описание предшествующего уровня техники, любые и все общедоступные документы, описанные в данном документе, включая любые и все опубликованные заявки на патент США, специально включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Вышеприведенное описание предшествующего уровня техники никоим образом не предназначено для признания того, что любой из документов, описанных в нем, включая находящиеся на рассмотрении заявки на патент США, является предшествующим уровнем техники для настоящего изобретения. Более того, описание в данном документе любых недостатков, связанных с описанными продуктами, способами и/или устройством, не предназначено для ограничения вариантов осуществления. Действительно, аспекты вариантов осуществления могут включать определенные признаки описанных продуктов, способов и/или устройств, не претерпевая от их описанных недостатков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0032] В данной области техники остается потребность в новых, менее токсичных и менее частых (например, избегая необходимости принимать лекарственные препараты ежедневно или еженедельно) способах лечения для предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи. Варианты осуществления, описанные в данном документе, удовлетворяют эти потребности.
[0033] Это изобретение частично основано на открытии того, что некоторые NTP-пептиды, включая специфический пептид, описанный аминокислотной последовательностью Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu способны предупреждать возникновение или снижать частоту возникновения острой задержки мочи.
[0034] Это изобретение также основано частично на открытии того, что некоторые NTP-пептиды, включая специфический пептид, описанный аминокислотной последовательностью Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu, либо отдельно, либо в комбинации с дополнительным активным средством, способным лечить и/или уничтожать нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих, обеспечивают неожиданное улучшение у пациентов, страдающих острой задержкой мочи или подверженных ее развитию.
[0035] Некоторые варианты осуществления направлены на способы предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у млекопитающих, предусматривающие введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NTP-пептид, либо отдельно, либо в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным средством, способным лечить и/или уничтожать нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих. Композиции можно вводить внутримышечно, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутрь опухоли, внутриочагово, внутрикожно, интратекально, интраназально, интраокулярно, интраартериально, местно, трансдермально, с помощью аэрозоля, ифузии, болюсной инъекции, имплантационного устройства, устройства замедленного высвобождения и т.д. В качестве альтернативы, NTP-пептиды можно экспрессировать in vivo путем введения гена, который экспрессирует NTP-пептиды, путем введения вакцины, которая индуцирует такую продукцию, или путем введения клеток, бактерий или вирусов, которые экспрессируют пептид in vivo, вследствие генетической модификации или иным образом.
[0036] В другом варианте осуществления введение композиции, содержащей NTP-пептид, либо отдельно, либо в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным средством, способным лечить и/или уничтожать нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих, обеспечивает снижение частоты возникновения острой задержки мочи на более чем 10% по сравнению с введением контрольной композиции, которая не содержит NTP-пептид.
[0037] Как вышеприведенное общее описание, так и последующее подробное описание являются иллюстративными и пояснительными и предназначены для обеспечения дополнительного объяснения вариантов осуществления, как заявлено. Другие объекты, преимущества и особенности будут очевидны для специалистов в данной области техники из следующего подробного описания вариантов осуществления.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0038] Прежде чем описать белки, нуклеотидные последовательности, пептиды, композиции, активные средства и т.д. и способы по настоящему изобретению, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными методологией, протоколами, линиями клеток, векторами и реагентами, так как они могут различаться. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена лишь с целью описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема вариантов осуществления настоящего изобретения, которые будут ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения.
[0039] Термины и фразы, используемые в данном документе, определены ниже, если не указано иное. Во всем данном описании формы существительного единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если контекст четко не определяет иное. Таким образом, например, ссылка на «клетку-хозяина» включает множество таких клеток-хозяев, а ссылка на «антитело» представляет собой ссылку на одно или более антител и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и т.д.
[0040] Аминокислоты и аминокислотные остатки, описанные в данном документе, могут упоминаться в соответствии с принятым одно- или трехбуквенным кодом, приведенным в таблице ниже.
Таблица 1
Трехбуквенная аминокислота
Однобуквенный символ
Символ
Аланин
A
Ala
Аргинин
R
Arg
Аспарагин
N
Asn
Аспарагиновая кислота
D
Asp
Цистеин
C
Cys
Глутамин
Q
Gln
Глутаминовая кислота
E
Glu
Глицин
G
Gly
Гистидин
H
His
Изолейцин
I
Ile
Лейцин
L
Leu
Лизин
K
Lys
Метионин
M
Met
Фенилаланин
F
Phe
Пролин
P
Pro
Серин
S
Ser
Треонин
T
Thr
Триптофан
W
Trp
Тирозин
Y
Tyr
Валин
V
Val
[0041] Выражение «NTP-пептид» относится к пептидам, содержащим аминокислотные последовательности, соответствующие по меньшей мере части аминокислотной последовательности белков нервной нити или фрагментам белков нейронной нити, и включает гомологи, производные, варианты, слитые белки и пептидомиметики таких пептидов, если в контексте не указано иное. Выражение «NTP-пептид» также относится к пептиду или другому химическому соединению, заявленным в одной или более из следующего: заявке на патент США № 14/808713, поданной 24 июля 2015 года, под названием СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ПОТРЕБНОСТИ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ У ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ; заявке на патент США № 14/606683, поданной 27 января, 2015 года, под названием СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ РАЗРУШЕНИЯ ИЛИ УДАЛЕНИЯ КЛЕТОК, заявке на патент США № 14/738551, поданной 12 июня, 2015 года, под названием КОМБИНИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ УДАЛЕНИЯ ИЛИ РАЗРУШЕНИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЛИФЕРАЦИЙ; публикациях заявок на патент США №№ 2007/0237780 (в настоящее время приостановлена); 2003/0054990 (теперь патент США № 7172893); 2003/0096350 (теперь патент США № 6924266); 2003/0096756 (теперь патент США № 7192929); 2003/0109437 (теперь патент США № 7241738); 2003/0166569 (теперь патент США № 7317077) и 2005/0032704 (теперь патент США № 7408021); и 2015/0148303 (теперь патент США № 9243035). Раскрытия каждая из данных заявок включены посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Конкретные пептиды перечислены ниже.
1) SEQ ID NO: 1: MEFSLLLPRLECNGA или Met-Glu-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-Arg-Leu-Glu-Cys-Asn-Gly-Ala
2) SEQ ID NO: 2: GAISAHRNLRLPGSS или Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro-Gly-Ser-Ser
3) SEQ ID NO: 3: DSPASASPVAGITGMCT или Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met-Cys-Thr
4) SEQ ID NO: 4: MCTHARLILYFFLVEM или Met-Cys-Thr-His-Ala-Arg-Leu-Ile-Leu-Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met
5) SEQ ID NO: 5: YFFLVEMEFLH или Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Glu-Phe-Leu-His
6) SEQ ID NO: 6: VGQAGLELPTS или Val-Gly-Gln-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Thr-Ser
7) SEQ ID NO: 7: DDPSVSASQSARYRTGH или Asp-Asp-Pro-Ser-Val-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Arg-Tyr-Arg-Thr-Gly-His
8) SEQ ID NO: 8: TGHHARLCLANFCG или Thr-Gly-His-His-Ala-Arg-Leu-Cys-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Gly
9) SEQ ID NO: 9: ANFCGRNRVSLMCPSWS или Ala-Asn-Phe-Cys-Gly-Arg-Asn-Arg-Val-Ser-Leu-Met-Cys-Pro-Ser-Trp-Ser
10) SEQ ID NO: 10: PELKQSTCLSLPKCWDYRR или Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
11) SEQ ID NO: 11: LKQSTCLSLPKCWDYRR или Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
12) SEQ ID NO: 12: STCLSLPKCWDYRR или Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
13) SEQ ID NO: 13: LSLPKCWDYRR или Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
14) SEQ ID NO: 14: KCWDYRRAAVPGL или Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu
15) SEQ ID NO: 15: KCWDYRRAAVPGLFILFFL или Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu
16) SEQ ID NO: 16: KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCP или Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro
17) SEQ ID NO: 17: KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS или Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser
18) SEQ ID NO: 18: WDYRR или Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
19) SEQ ID NO: 19: FILFFLRHRCPTL или Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu
20) SEQ ID NO: 20: FILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS или Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser
21) SEQ ID NO: 21: HRCPTLTQDEVQWCDHSSLQPSTPEIKHP или His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser-Leu-Gln-Pro-Ser-Thr-Pro-Glu-Ile-Lys-His-Pro
22) SEQ ID NO: 22: PASASQVAGTKDMH или Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met-His
23) SEQ ID NO: 23: DMHHYTWLIFIFIFNFLR или Asp-Met-His-His-Tyr-Thr-Trp-Leu-Ile-Phe-Ile-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg
24) SEQ ID NO: 24: HYTWLIFIFIFNFLRQSLN или His-Tyr-Thr-Trp-Leu-Ile-Phe-Ile-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Asn
25) SEQ ID NO: 25: SVTQAGVQWRNLGSLQPLPPGFKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANF или Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Arg-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe
26) SEQ ID NO: 26: PGFKLFSCPSLLSSWDYRR или Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
27) SEQ ID NO: 27: FKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANF или Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe
28) SEQ ID NO: 28: FSCPSLLSSWDYRR или Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
29) SEQ ID NO: 29: SLLSSWDYRR или Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
30) SEQ ID NO: 30: SSWDY или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr
31) SEQ ID NO: 31: SSWDYRR или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
32) SEQ ID NO: 32: SSWDYRRPPRLANFFVFLVEMGFTM или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met
33) SEQ ID NO: 33: FVFLVEMGFTM или Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met
34) SEQ ID NO: 34: MGFTMFARLILISGPCDLPASAS или Met-Gly-Phe-Thr-Met-Phe-Ala-Arg-Leu-Ile-Leu-Ile-Ser-Gly-Pro-Cys-Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser
35) SEQ ID NO: 35: ISGPC или Ile-Ser-Gly-Pro-Cys
36) SEQ ID NO: 36: DLPASASQSAGITGVSH или Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val-Ser-His
37) SEQ ID NO: 37: GVSHHARLIFNFCLFEM или Gly-Val-Ser-His-His-Ala-Arg-Leu-Ile-Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met
38) SEQ ID NO: 38: NFCLFEMESH или Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met-Glu-Ser-His
39) SEQ ID NO: 39: SVTQAGVQWPNLGSLQPLPPGLKRFSCLSLPSSWDYGHLPPHPANF или Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Pro-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe
40) SEQ ID NO: 40: PPGLKRFSCLSLPSSWDYG или Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly
41) SEQ ID NO: 41: FSCLSLPSSWDYGH или Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His
42) SEQ ID NO: 42: LSLPSSWDY или Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr
43) SEQ ID NO: 43: SSWDYGHLPPHPANFCIFIRGGVSPYLSGWSQTPDLR или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe-Cys-Ile-Phe-Ile-Arg-Gly-Gly-Val-Ser-Pro-Tyr-Leu-Ser-Gly-Trp-Ser-Gln-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg
44) SEQ ID NO: 44: PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR или Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
45) SEQ ID NO: 45: PELKQSTCLSLPKCWDYRR или Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
46) SEQ ID NO: 46: PPGLKRFSCLSLPSSWDYG или Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly
47) SEQ ID NO: 47: FSCLSLPSSWDYGH или Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His
48) SEQ ID NO: 48: STCLSLPKCWDYRR или Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
49) SEQ ID NO: 49: FSCPSLLSSWDYRR или Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
50) SEQ ID NO: 50: LSLPSSWDY или Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr
51) SEQ ID NO: 51: LSLPKCWDYRR или Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
52) SEQ ID NO: 52: SLLSSWDYRR или Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
53) SEQ ID NO: 53: LPSSWDYRR или Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
54) SEQ ID NO: 54: SSWDYRR или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg
55) SEQ ID NO: 55: SSWDY или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr
56) SEQ ID NO: 56: SSWDYRRFILFFL или Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu
57) SEQ ID NO: 57: WDYRRFIFNFL или Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
58) SEQ ID NO: 58: FNFCLF или Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe
59) SEQ ID NO: 59: FIFNFL или Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu
60) SEQ ID NO: 60: PASASPVAGITGM или Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met
61) SEQ ID NO: 61: PASASQVAGTKDM или Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met
62) SEQ ID NO: 62: PASASQSAGITGV или Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val
63) SEQ ID NO: 63: PASASPVAG или Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly
64) SEQ ID NO: 64: FFLVEM или Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met
65) SEQ ID NO: 65: SVTQAGVQW или Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp
66) SEQ ID NO: 66: IDQQVLSRIKLEIKRCL или Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu
67) SEQ ID NO: 67: LSRIKLEIK или Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys
68) SEQ ID NO: 68: GDHGRPNLSRLKLAIKYEVKKM или Gly-Asp-His-Gly-Arg-Pro-Asn-Leu-Ser-Arg-Leu-Lys-Leu-Ala-Ile-Lys-Tyr-Glu-Val-Lys-Lys-Met
69) SEQ ID NO: 69: QQSIAVKFLAVFGVSI или Gln-Gln-Ser-Ile-Ala-Val-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Gly-Val-Ser-Ile
70) SEQ ID NO: 70: GLLFPVFSVCYLIAPKSPLGL или Gly-Leu-Leu-Phe-Pro-Val-Phe-Ser-Val-Cys-Tyr-Leu-Ile-Ala-Pro-Lys-Ser-Pro-Leu-Gly-Leu
71) SEQ ID NO: 71: MMVCWNRFGKWVYFI или Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-Ile
72) SEQ ID NO: 72: SAIFNFGPRYLYHGV или Ser-Ala-Ile-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val
73) SEQ ID NO: 73: PFYFLILVRIISFLI или Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-Ile-Leu-Val-Arg-Ile-Ile-Ser-Phe-Leu-Ile
74) SEQ ID NO: 74: GDMEDVLLNCTLLKR или Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg
75) SEQ ID NO: 75: SSRFRFWGALVCSMD или Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp
76) SEQ ID NO: 76: SCRFSRVAVTYRFIT или Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr
77) SEQ ID NO: 77: LLNIPSPAVWMARNT или Leu-Leu-Asn-Ile-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr
78) SEQ ID NO: 78: MAQSRLTATSASRVQ или Met-Ala-Gln-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-Thr-Ser-Ala-Ser-Arg-Val-Gln
79) SEQ ID NO: 79: AILLSQPPKQLGLRA или Ala-Ile-Leu-Leu-Ser-Gln-Pro-Pro-Lys-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Ala
80) SEQ ID NO: 80: PANTPLIFVFSLEAG или Pro-Ala-Asn-Thr-Pro-Leu-Ile-Phe-Val-Phe-Ser-Leu-Glu-Ala-Gly
81) SEQ ID NO: 81: FHHICQAGLKLLTSG или Phe-His-His-Ile-Cys-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Thr-Ser-Gly
82) SEQ ID NO: 82: DPPASAFQSAGITGV или Asp-Pro-Pro-Ala-Ser-Ala-Phe-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val
83) SEQ ID NO: 83: SHLTQPANLDKKICS или Ser-His-Leu-Thr-Gln-Pro-Ala-Asn-Leu-Asp-Lys-Lys-Ile-Cys-Ser
84) SEQ ID NO: 84: NGGSCYVAQAGLKLLASCNPSK или Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Tyr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Ala-Ser-Cys-Asn-Pro-Ser-Lys
85) SEQ ID NO: 85: MWTLKSSLVLLLCLT или Met-Trp-Thr-Leu-Lys-Ser-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Leu-Thr
86) SEQ ID NO: 86: CSYAFMFSSLRQKTS или Cys-Ser-Tyr-Ala-Phe-Met-Phe-Ser-Ser-Leu-Arg-Gln-Lys-Thr-Ser
87) SEQ ID NO: 87: EPQGKVPCGEHFRIR или Glu-Pro-Gln-Gly-Lys-Val-Pro-Cys-Gly-Glu-His-Phe-Arg-Ile-Arg
88) SEQ ID NO: 88: QNLPEHTQGWLGSKW или Gln-Asn-Leu-Pro-Glu-His-Thr-Gln-Gly-Trp-Leu-Gly-Ser-Lys-Trp
89) SEQ ID NO: 89: LWLLFAVVPFVILKC или Leu-Trp-Leu-Leu-Phe-Ala-Val-Val-Pro-Phe-Val-Ile-Leu-Lys-Cys
90) SEQ ID NO: 90: QRDSEKNKVRMAPFF или Gln-Arg-Asp-Ser-Glu-Lys-Asn-Lys-Val-Arg-Met-Ala-Pro-Phe-Phe
91) SEQ ID NO: 91: LHHIDSISGVSGKRMF или Leu-His-His-Ile-Asp-Ser-Ile-Ser-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Arg-Met-Phe
92) SEQ ID NO: 92: EAYYTMLHLPTTNRP или Glu-Ala-Tyr-Tyr-Thr-Met-Leu-His-Leu-Pro-Thr-Thr-Asn-Arg-Pro
93) SEQ ID NO: 93: KIAHCILFNQPHSPR или Lys-Ile-Ala-His-Cys-Ile-Leu-Phe-Asn-Gln-Pro-His-Ser-Pro-Arg
94) SEQ ID NO: 94: SNSHSHPNPLKLHRR или Ser-Asn-Ser-His-Ser-His-Pro-Asn-Pro-Leu-Lys-Leu-His-Arg-Arg
95) SEQ ID NO: 95: SHSHNRPRAYILITI или Ser-His-Ser-His-Asn-Arg-Pro-Arg-Ala-Tyr-Ile-Leu-Ile-Thr-Ile
96) SEQ ID NO: 96: LPSKLKLRTHSQSHH или Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Lys-Leu-Arg-Thr-His-Ser-Gln-Ser-His-His
97) SEQ ID NO: 97: NPLSRTSNSTPTNSFLMTSSKPR или Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Ser-Asn-Ser-Thr-Pro-Thr-Asn-Ser-Phe-Leu-Met-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg
98) SEQ ID NO: 98: SSSLGLPKCWDYRHE или Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Glu
99) SEQ ID NO: 99: LLSLALMINFRVMAC или Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Leu-Met-Ile-Asn-Phe-Arg-Val-Met-Ala-Cys
100) SEQ ID NO: 100: TFKQHIELRQKISIV или Thr-Phe-Lys-Gln-His-Ile-Glu-Leu-Arg-Gln-Lys-Ile-Ser-Ile-Val
101) SEQ ID NO: 101: PRKLCCMGPVCPVKI или Pro-Arg-Lys-Leu-Cys-Cys-Met-Gly-Pro-Val-Cys-Pro-Val-Lys-Ile
102) SEQ ID NO: 102: ALLTINGHCTWLPAS или Ala-Leu-Leu-Thr-Ile-Asn-Gly-His-Cys-Thr-Trp-Leu-Pro-Ala-Ser
103) SEQ ID NO: 103: MFVFCLILNREKIKG или Met-Phe-Val-Phe-Cys-Leu-Ile-Leu-Asn-Arg-Glu-Lys-Ile-Lys-Gly
104) SEQ ID NO: 104: GNSSFFLLSFFFSFQ или Gly-Asn-Ser-Ser-Phe-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Phe-Phe-Ser-Phe-Gln
105) SEQ ID NO: 105: NCCQCFQCRTTEGYA или Asn-Cys-Cys-Gln-Cys-Phe-Gln-Cys-Arg-Thr-Thr-Glu-Gly-Tyr-Ala
106) SEQ ID NO: 106: VECFYCLVDKAAFECWWFYSFDT или Val-Glu-Cys-Phe-Tyr-Cys-Leu-Val-Asp-Lys-Ala-Ala-Phe-Glu-Cys-Trp-Trp-Phe-Tyr-Ser-Phe-Asp-Thr
107) SEQ ID NO: 107: MEPHTVAQAGVPQHD или Met-Glu-Pro-His-Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Val-Pro-Gln-His-Asp
108) SEQ ID NO: 108: LGSLQSLLPRFKRFS или Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Ser-Leu-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Arg-Phe-Ser
109) SEQ ID NO: 109: CLILPKIWDYRNMNT или Cys-Leu-Ile-Leu-Pro-Lys-Ile-Trp-Asp-Tyr-Arg-Asn-Met-Asn-Thr
110) SEQ ID NO: 110: ALIKRNRYTPETGRKS или Ala-Leu-Ile-Lys-Arg-Asn-Arg-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Ser
111) SEQ ID NO: 111: IDQQVLSRI или Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile
112) SEQ ID NO: 112: KLEIKRCL или Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu
113) SEQ ID NO: 113: VLSRIK или Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys
114) SEQ ID NO: 114: RIKLEIK или Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys
115) SEQ ID NO: 115: VLSRIKLEIKRCL или Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu и
116) SEQ ID NO: 116: IDQQVLSRIKLEI или Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile.
Выражение «NTP-пептид» также предпочтительно включает (без ограничения) аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 1-116.
[0042] Термин «фрагмент» относится к белку или полипептиду, которые состоят из непрерывной подпоследовательности аминокислотной последовательности белка или пептида, и включает встречающиеся в природе фрагменты, такие как сплайс-варианты и фрагменты, полученные в результате естественной активности протеазы in vivo. Такой фрагмент может быть усечен на амино-конце, карбокси-конце и/или внутри (например, путем естественного сплайсинга). Такие фрагменты могут быть получены с аминоконцевым метионином или без него. Термин «фрагмент» включает фрагменты, одинаковые или отличные от одного и того же белка или пептида, с общей непрерывной аминокислотной последовательностью или без нее, соединенные вместе, либо непосредственно, либо через линкер. Специалист в данной области техники сможет выбрать подходящий фрагмент для применения в вариантах осуществления без излишних экспериментов с использованием руководств и процедур, изложенных в данном документе.
[0043] Термин «вариант» относится к белку или полипептиду, в которых присутствуют одна или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с аминокислотной последовательностью белка или пептида, и включает встречающиеся в природе аллельные варианты или альтернативные сплайс-варианты белка или пептида. Термин «вариант» включает замену одной или более аминокислот в пептидной последовательности подобной или гомологичной аминокислотой(аминокислотами) или отличной аминокислотой(аминокислотами). Существует много шкал, по которым аминокислоты можно отнести к подобным или гомологичным. (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, N.Y. 1987). Предпочтительные варианты включают замены аланина в одном или более положениях аминокислот. Другие предпочтительные замены включают консервативные замены, которые оказывают незначительное влияние или не влияют на общий суммарный заряд, полярность или гидрофобность белка. Консервативные замены изложены в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Консервативные аминокислотные замены
Основные
АргининЛизинГистидин
Кислые
Глутаминовая кислотаАспарагиновая кислота
Незаряженные полярные
ГлутаминАспарагинСеринТреонинТирозин
Неполярные
ФенилаланинТриптофанЦистеинГлицинАланинВалинПролинМетионинЛейцинИзолейцин
В таблице 3 представлена другая схема аминокислотных замен.
Таблица 3
Исходный остаток
Замены
Ala
gly; ser
Arg
lys
Asn
gln; his
Asp
glu
Cys
ser
Gln
asn
Glu
asp
Gly
ala; pro
His
asn; gln
Ile
eu; val
Leu
ile; val
Lys
arg; gln; glu
Met
leu; tyr; ile
Phe
met; leu; tyr
Ser
thr
Thr
ser
Trp
tyr
Tyr
trp; phe
Val
ile; leu
[0044] Другие варианты могут состоять из менее консервативных аминокислотных замен, таких как выбор остатков, которые более значительно различаются по своему эффекту в отношении сохранения (a) структуры полипептидного остова в участке замены, например, такой как лист или спиральная конформация, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени, или (c) величины боковой цепи. Замены, которые, как правило, должны иметь более существенный эффект в отношении функции, представляют собой замены, в которых (а) глицин и/или пролин замещены другой аминокислотой или удалены или вставлены; (б) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, замещен (или заменен) гидрофобным остатком, например, лейцилом, изолейцилом, фенилаланилом, валилом или аланилом; (c) остаток цистеина замещен (или заменен) любым другим остатком; (d) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил, замещен (или заменен) остатком, имеющим электроотрицательный заряд, например, глутамилом или аспартилом; или (е) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например фенилаланин, замещен (или заменен) остатком, не имеющим такой боковой цепи, например, глицином. Другие варианты включают варианты, предназначенные либо для создания нового сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования, либо варианты, предназначенные для удаления существующего сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования. Варианты включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в сайте гликозилирования, сайте протеолитического расщепления и/или остатке цистеина. Варианты также включают белки и пептиды с дополнительными аминокислотными остатками до или после аминокислотной последовательности белка или пептида на линкерных пептидах. Например, остаток цистеина может быть добавлен как к амино-, так и к карбокси-концам NTP-пептида, чтобы обеспечить циклизацию пептида посредством образования дисульфидной связи. Термин «вариант» также охватывает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность NTP-пептида с по меньшей мере одной и не более 25 или больше дополнительными аминокислотами, фланкирующими либо 3'-, либо 5'-конец пептида.
[0045] Термин «производное» относится к химически модифицированным белку или полипептиду, которые были химически модифицированы либо естественными процессами, такими как процессинг и другие посттрансляционные модификации, но также посредством методик химической модификации, например, путем добавления одной или более молекул полиэтиленгликоля, сахаров, фосфатов и/или других таких молекул, где молекула или молекулы не связаны естественным образом с белками дикого типа или NTP-пептидами. Производные включают соли. Такие химические модификации хорошо описаны в основных текстах и в более подробных монографиях, а также в многочисленной исследовательской литературе, и они хорошо известны специалистам в данной области техники. Понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степени в нескольких сайтах данных белка или полипептида. Также данные белок или полипептид могут содержать множество типов модификаций. Модификации могут происходить в любом месте белка или полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Модификации включают, например, ацетилирование, ацилирование, ADP-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, гликозилирование, липидное присоединение, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислот, опосредованное транспортной РНК, к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование. См., например, Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) и Wold, F., «Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects», стр. 1-12 в Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) и Rattan et al., «Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging», Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992). Термин «производные» включает химические модификации, в результате которых белок или полипептид становятся разветвленными или циклическими, с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные кольцевые белки или полипептиды могут быть получены в результате посттрансляционных природных процессов и могут быть получены также посредством полностью синтетических способов.
[0046] Термин «гомолог» относится к белку, который на по меньшей мере 60 процентов идентичен по своей аминокислотной последовательности NTP-пептиду, что определяется стандартными способами, которые обычно используются для сравнения сходства в положении аминокислот двух полипептидов. Степень сходства или идентичности между двумя белками можно легко рассчитать известными способами, включая без ограничения способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. and Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48:1073 (1988). Предпочтительные способы определения идентичности предназначены для обеспечения наибольшего соответствия между протестированными последовательностями. Способы определения идентичности и сходства кодифицированы в общедоступных компьютерных программах.
[0047] Предпочтительные способы с использованием компьютерных программ, пригодные для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями, включают, без ограничения программный пакет GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN и FASTA, Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). Программа BLAST X общедоступна в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990). Например, используя компьютерный алгоритм, такой как GAP (Genetic Computer Group, Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин), два белка или полипептида, для которых должна быть определена процентная идентичность последовательности, выравнивают для оптимального соответствия их соответствующих аминокислот («длина совпадения», как определено алгоритмом).
[0048] Штраф за открытие гэпа (который рассчитывается как 3-кратная средняя диагональ; «средняя диагональ» представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; «диагональ» представляет собой оценку или число, присвоенные каждому идеальному совпадению аминокислот по конкретной матрице сравнения) и штраф за продолжение гэпа (который обычно равен {доле (1/10)} умножения на штраф за открытие гэпа), а также матрица сравнения, такая как PAM 250 или BLOSUM 62, используются в сочетании с алгоритмом. Стандартная матрица сравнения (см. Dayhoff et al. в Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 для матрицы сравнения PAM250; см. Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62) также может использоваться алгоритмом. Процент идентичности затем рассчитывается по алгоритму. Гомологи обычно имеют одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок по сравнению с белком или пептидом сравнения, в зависимости от обстоятельств.
[0049] Термин «слитый белок» относится к белку, в котором один или более пептидов рекомбинантно слиты или химически конъюгированы (включая ковалентно и нековалентно) с белком, таким как (без ограничения) антитело или фрагмент антитела, такой как F.sub.ab-фрагмент или Fv короткой цепи. Термин «слитый белок» также относится к мультимерам (т. е. димерам, тримерам, тетрамерам и высшим мультимерам) пептидов. Такие мультимеры включают гомомерные мультимеры, содержащие один пептид, гетеромерные мультимеры, содержащие более одного пептида, и гетеромерные мультимеры, содержащие по меньшей мере один пептид и по меньшей мере один другой белок. Такие мультимеры могут быть результатом гидрофобных, гидрофильных, ионных и/или ковалентных соединений, связей или сшивок, могут образовываться поперечными сшивками с использованием линкерных молекул или могут быть связаны опосредованно путем, например, образования липосом.
[0050] Термин «пептидомиметик» или «миметик» относится к биологически активным соединениям, которые имитируют биологическую активность пептида или белка, но уже не являются пептидными по химической природе, то есть они уже не содержат пептидных связей (то есть амидных связей между аминокислотами). В данном случае термин пептидомиметик используется в более широком смысле для включения молекул, которые уже не являются полностью пептидными по своей природе, таких как псевдопептиды, частичные пептиды и пептоиды. Примеры пептидомиметиков в этом более широком смысле (где часть пептида заменена структурой, в которой отсутствуют пептидные связи) описаны ниже. Независимо от того, являются ли они полностью или частично непептидными, пептидомиметики в соответствии с вариантами осуществления обеспечивают пространственное расположение реакционноспособных химических фрагментов, которые очень похожи на трехмерное расположение активных групп в пептиде, на котором основан пептидомиметик. В результате такой подобной геометрии активного сайта пептидомиметик обладает эффектом в отношении биологических систем, которые схожи с биологической активностью пептида.
[0051] Пептидомиметики согласно вариантам осуществления предпочтительно практически сходны как по трехмерной форме, так и по биологической активности с пептидами, описанными в данном документе. Примеры способов структурной модификации пептида, известных из уровня техники для создания пептидомиметика, включают инверсию хиральных центров остова, приводящих к структурированию остатка D-аминокислоты, что может, особенно на N-конце, приводить к повышенной стабильности для протеолитического разрушения без неблагоприятного влияния на активность. Пример приведен в статье «Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding», Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988). Второй способ заключается в изменении циклической структуры для стабильности, такой как межцепочечные имиды и лактамы от N до C (Ede et al. в Smith and Rivier (Eds.) «Peptides: Chemistry and Biology», Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). Пример этого приведен в конформационно ограниченных тимопентин-подобных соединениях, таких как раскрытые в патенте США № 4457489 (1985), Goldstein, G. et al., раскрытие которого включено посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Третий способ заключается в замене пептидных связей в пептиде псевдопептидными связями, что придает устойчивость к протеолизу.
[0052] Был описан ряд псевдопептидных связей, которые в целом не влияют на структуру и биологическую активность пептида. Одним из примеров такого подхода является замена ретроинверсо-псевдопептидных связей («Biologically active retroinverso analogues of thymopentin», Sisto A. et al в Rivier, J. E. и Marshall, G. R. (eds) «Peptides, Chemistry, Structure and Biology», Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) и Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, включенные в данный документ посредством ссылки). В соответствии с этой модификацией аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида, описанным выше, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены ретроинверсо-псевдопептидной связью. Предпочтительно большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец. Дополнительные модификации также можно осуществлять путем замещения химических групп аминокислот другими химическими группами с подобной структурой. Другой подходящей псевдопептидной связью, которая, как известно, повышает устойчивость к ферментативному расщеплению без потери или с незначительной потерей биологической активности, является уменьшенная изостерная псевдопептидная связь (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
[0053] Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены изостерной псевдопептидной связью. Предпочтительно большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец. Синтез пептидов с одной или более восстановленными изостерными псевдопептидными связями известен из уровня техники (Couder et al. (1993), упомянуто выше). Другие примеры включают введение кетометиленовых или метилсульфидных связей для замены пептидных связей.
[0054] Пептоидные производные пептидов представляют собой другой класс пептидомиметиков, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической активности, но устраняют пептидные связи, за счет чего обеспечивается придание устойчивости к протеолизу (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Пептоиды являются олигомерами N-замещенных глицинов. Был описан ряд N-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Simon, et al. (1992), упомянуто выше). Некоторые или все аминокислоты пептидов могут быть заменены N-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.
[0055] Термин «пептидомиметик» или «миметик» также включает обратные D-пептиды и энантиомеры, определенные ниже.
d
d
d
d
d
d
d
d
d
[0056] Термин «обратный D-пептид» относится к биологически активным белку или пептиду, состоящим из D-аминокислот, расположенных в обратном порядке по сравнению с L-аминокислотной последовательностью пептида. Таким образом, карбоксиконцевой остаток пептида из L-аминокислот становится аминоконцевым для пептида из D-аминокислот и так далее. Например, пептид ETESH становится HSETE, где E, H, S и T являются D-аминокислотами, соответствующими L-аминокислотам, E, H, S и T соответственно.
[0057] Термин «энантиомер» относится к биологически активному белку или пептиду, где один или более остатков L-аминокислоты в аминокислотной последовательности пептида заменены соответствующим остатком(остатками) D-аминокислоты.
[0058] «Композиция», как используется в данном документе, в широком смысле относится к любой композиции, содержащей указанный пептид или аминокислотную последовательность и необязательно дополнительное активное средство. Композиция может содержать сухой состав, водный раствор или стерильную композицию. Композиции, содержащие пептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов. Зонды могут храниться в лиофилизированной форме и могут быть связаны со стабилизирующим средством, таким как углевод. При гибридизации зонд может быть размещен в водном растворе, содержащем соли, например, NaCl, детергенты, например, додецилсульфат натрия (SDS), и другие компоненты, например, раствор Денхардта, сухое молоко, ДНК из молок лососевых и т.д.
[0059] Выражение «острая задержка мочи» обозначает состояние, при котором млекопитающее внезапно теряет способность мочиться. Обычно это болезненно и требует неотложного лечения посредством мочевыводящего катетера. У мужчин AUR может быть вызвана BPH, меатальным стенозом уретры, парафимозом, сужением полового члена, фимозом и раком предстательной железы. У женщин AUR может быть вызвана пролапсом (цистоцеле, ректоцеле, матки), опухолевидным образованием в малом тазу (гинекологическим злокачественным новообразованием, фибромой матки, кистой яичника) или загнутой назад беременной маткой. Как у мужчин, так и у женщин, AUR может быть вызвана камнями мочевого пузыря, раком мочевого пузыря, фекаломой, желудочно-кишечными или забрюшинными злокачественными новообразованиями, стриктурами уретры, инородными телами и камнями. AUR является осложнением BPH и причиной для хирургического вмешательства у 20-30% мужчин, перенесших простатэктомию. Она может быть спонтанной или также может быть спровоцирована рядом факторов у мужчин с BPH, такими как анестезия, лекарственные препараты и не связанное с ними хирургическое вмешательство.
[0060] В альтернативном варианте осуществления, в котором дополнительное активное средство используется в сочетании с NTP-пептидом, выражение «активное средство» используется для обозначения любого средства, способного удалять нежелательные клеточные пролиферации и/или новообразование ткани. Подходящие активные средства могут включать без ограничения (i) противораковые активные средства (такие как алкилирующие средства, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, антиметаболиты РНК/ДНК и антимитотические средства); (ii) активные средства для лечения доброкачественных новообразований, такие как активные средства против акне и бородавок; (iii) антиандрогенные соединения (ципротеронацетат (1α,2β-метилен-6-хлор-17α-ацетокси-6-дегидропрогестерон), тамоксифен, ингибиторы ароматазы); (iv) блокаторы альфа1-адренергических рецепторов (тамсулозин, теразозин, доксазозин, празозин, буназозин, индорамин, алфулзозин, силодозин); (v) ингибиторы 5α-редуктазы (финастерид, дутастерид); (vi) ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (PDE5) (тадалафил) и их комбинации.
[0061] Варианты осуществления направлены на способы предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи, предусматривающие введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей NTP-пептид, либо отдельно, либо в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным средством, способным лечить и/или уничтожать нежелательные клеточные пролиферации у млекопитающих. В одном варианте осуществления млекопитающими, лечение которых осуществляют, являются те, которые страдают BPH или подвержены ее развитию. В других вариантах осуществления млекопитающими, лечение которых осуществляют, являются те, которым был поставлен диагноз BPH, и в настоящее время лечение их осуществляют альфа-блокаторами, такими как тамсулозин, теразозин, доксазозин, или ингибиторами 5-альфа-редуктазы, такими как финастерид, дутастерид, или ингибиторами фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторами PDE5), такими как тадалафил. В другом варианте осуществления композиции вводят более одного раза.
[0062] Другие пептидные последовательности, полученные из NTP-пептида, которые, как установлено, являются эффективным средством, вызывающим гибель клеток, также могут быть использованы в качестве дополнительного активного средства в комбинации с NTP-пептидами, описанными в данном документе. Специалист в данной области техники может, используя представленные в данном документе руководства, синтезировать без излишних экспериментов фрагменты эффективного пептида, охватывающего всю аминокислотную последовательность этого белка, для идентификации других эффективных пептидных последовательностей.
[0063] Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил, что применение NTP-пептидов в лечении млекопитающих, нуждающихся в удалении или разрушении нежелательных клеточных элементов, обеспечивает неожиданно значительное снижение частоты возникновения острой задержки мочи. Автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил при проведении клинических испытаний для лечения BPH, что введение NTP-пептидов, отдельно или в сочетании с другим активным средством, обеспечило значительное снижение частоты возникновения острой задержки мочи по сравнению с контрольными пациентами и по сравнению с млекопитающими, которые не получали NTP-пептиды, но также получали активные средства, выбранные из альфа-блокаторов, таких как тамсулозин, теразозин, доксазозин, или ингибиторов 5-альфа-редуктазы, таких как финастерид, дутастерид, или ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторов PDE5), таких как тадалафил. В ходе клинических испытаний автор настоящего изобретения обнаружил, что частота возникновения острой задержки мочи у мужчин, страдающих BPH, при лечении композицией по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с другим активным веществом, составляла от приблизительно 0% до приблизительно 3%, или от приблизительно 0% до приблизительно 2,5%, или от приблизительно 0% до приблизительно 2,1%, или от приблизительно 0% до приблизительно 1,7%, или от приблизительно 0% до приблизительно 1%, или любое значение или диапазон от 0% до 3%.
[0064] У пациентов, лечение которых осуществляли композициями по настоящему изобретению, отмечалось резкое снижение частоты возникновения острой задержки мочи. Способ согласно вариантам осуществления может предупреждать возникновение острой задержки мочи (частота возникновения составляет 0%) или снижать частоту возникновения на более чем 10% по сравнению с контрольными пациентами. В одном варианте осуществления введение композиций, описанных в настоящем документе, с последующим введением дополнительного активного вещества, такого как общепринятые альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин, или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид, или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), обеспечило резкое снижение частоты возникновения острой задержки мочи по сравнению с контрольными пациентами, получавшими контрольную композицию с последующим введением дополнительного активного вещества, выбранного из указанных выше. Снижение острой задержки мочи может составлять от приблизительно 10% до полного предупреждения (100%), или от приблизительно 25% до 100%, или от приблизительно 40% до 100%, или от приблизительно 40% до приблизительно 95%, или от приблизительно 45% до приблизительно 90%, или от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 60% до приблизительно 75%, или любое значение или диапазон от приблизительно 10% до приблизительно 100%.
[0065] Автор настоящего изобретения также неожиданно обнаружил при проведении клинических испытаний для лечения неродственного нарушения, BPH, что введение NTP-пептидов, отдельно или в комбинации с другим активным средством, резко снижало частоту возникновения и/или предупреждало возникновение острой задержки мочи у пациентов с риском развития острой задержки мочи. Пациентом с риском развития острой задержки мочи является пациент, страдающий BPH, лечение которого осуществляют общепринятыми альфа-блокаторами, такими как тамсулозин, теразозин, доксазозин, или ингибиторами 5-альфа-редуктазы, такими как финастерид, дутастерид, или ингибиторами фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторами PDE5), пациент с острым мочевым простатитом, млекопитающее, принимающее такие лекарственные препараты, как антихолинергические средства, трициклические антидепрессанты, противоотечные средства для перорального введения, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, или любое млекопитающее, имеющее одно или более состояний, описанных в таблицах ниже.
Таблица 4
Отдельные причины задержки мочи
ПРИЧИНА
МУЖЧИНА
ЖЕНЩИНА
ОБА
Обструктивная
Доброкачественная гиперплазия предстательной железы; меатальный стеноз уретры; парафимоз; сужение полового члена; фимоз; рак предстательной железы
Пролапс органов (цистоцеле, ректоцеле, выпадение матки); опухолевидное образование в малом тазу (гинекологическое злокачественное образование, фиброма матки, киста яичника); загнутая назад беременная матка
Аневризматическая дилатация; камни в мочевом пузыре; новообразование в мочевом пузыре; фекалома; желудочно-кишечные или забрюшинные злокачественные новообразования/опухолевидные образования; стриктуры уретры, инородные тела, камни, отек
Инфекционная и воспалительная
Баланит; абсцесс предстательной железы; простатит
Острый вульвовагинит; красный плоский лишай влагалища; склеротический лишай влагалища; вагинальная пузырчатка.
Бильгарциоз; цистит; эхинококкоз; синдром Гийена-Барре; вирус простого герпеса; болезнь Лайма; периуретральный абсцесс; трансверсальный миелит; туберкулезный цистит; уретрит; вирус ветряной оспы
Другие
Травматическое повреждение или разрыв полового члена
Послеродовое осложнение; дисфункция сфинктера уретры (синдром Фаулера)
Разрушение задней части уретры и шейки мочевого пузыря при травмах таза; послеоперационное осложнение; психогенное нарушение
Таблица 5
Фармакологические средства, связанные с задержкой мочи
КЛАСС
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
Антиаритмические средства
Дизопирамид (Norpace); прокаинамид (Pronestyl); хинидин
Антихолинергические средства (избранные)
Атропин (Atreza); алкалоиды белладонны; дицикломин (Bentyl); флавоксат (Urispas); гликопирролат (Robinul); гиосциамин (Levsin); оксибутинин (Ditropan); пропантелин (Pro-Banthine*); скополамин (Transderm Scop)
Антидепрессанты
Амитриптилин (Elvail*); амоксапин; доксепин (Sinequan*); имипрамин (Tofranil); мапротилин (Ludiomil*); нортриптилин (Pamelor)
Антигистаминные средства (избранные)
Бромфернирамин (Brovex); хлорфенирамин (Chlor-Trimeton); ципрогептадин (Periactin*); дифенгидрамин (Benadryl); гидроксизин (Atarax*)
Антигипертензивные средства
Гидралазин; нифедипин (Procardia)
Противопаркинсонические средства
Амантадин (Symmetrel); бензтропин (Cogentin); бромокриптин (Parlodel); леводопа (Larodopa*)†; тригексифенидил (Artane*)
Нейролептики
Хлорпромазин (Thorazine*); флуфеназин (Prolixin*); галоперидол (Haldol); прохлорперазин (Compazine*); тиоридазин (Mellaril*); тиотиксен (Navane)
Гормональные средства
Эстроген, прогестерон, тестостерон
Миорелаксанты
Баклофен (Lioresal); циклобензаприн (Flexeril); диазепам (Valium)
Симпатомиметики (альфа-адренергические средства)
Эфедрин; фенилэфрин (Neo-Synephrine); фенилпропаноламин‡; псевдоэфедрин (Sudafed)
Симпатомиметики (бета-адренергические средства)
Изопотеренол (Isuprel); метапротеренол (Alupent); тербуталин (Brethine*)
Прочее
Амфетамины; карбамазепин (Tegretol); дофамин (Intropin*), ртутные диуретики; нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, индометацин [Indocin]); опиоидные анальгетики (например, морфин [Duramorph]); винкристин (Vincasar PFS)
ТАБЛИЦА 6
Неврологические причины задержки мочеиспускания и дисфункция мочеиспускания
ТИП ПОРАЖЕНИЯ
ПРИЧИНЫ
Вегетативный или периферический нерв
Вегетативная невропатия; сахарный диабет; Синдром Гийена-Барре; вирус опоясывающего герпеса; болезнь Лайма; пернициозная анемия; полиомиелит; радикальное хирургическое вмешательство в области таза; агенезия крестца, травма спинного мозга; сухотка спинного мозга
Головной мозг
Цереброваскулярное заболевание; сотрясение; рассеянный склероз; новообразование или опухоль; нормотензивная гидроцефалия; болезнь Паркинсона; синдром Шая-Дрейджера
Спинной мозг
Дисрафические поражения; заболевание межпозвонкового диска; менингомиелоцеле; рассеянный склероз; незаращение дужки позвонка; гематома или абсцесс спинного мозга; травма спинного мозга; стеноз позвоночного канала; спинно-сосудистые заболевания; поперечный миелит; опухоли или опухолевидные образования мозгового конуса или хвостообразного придатка
См. Selius BA, Subedi R., Urinary retention in adults: diagnosis and initial management. Am Fam Physician. 2008 Mar 1;77(5):643-50.
[0066] Автор настоящего изобретения обнаружил, что для этой группы пациентов введение композиций согласно вариантам осуществления приводило в результате к снижению частоты возникновения острой задержки мочи от приблизительно 0% до приблизительно 3%, или от приблизительно 0% до приблизительно 2,5%, или от приблизительно 0% до приблизительно 2,1%, или от приблизительно 0% до приблизительно 1,7%, или от приблизительно 0% до приблизительно 1%, или любое значение или диапазон от 0% до 3%. Автор настоящего изобретения также обнаружил, что для этой популяции пациентов введение композиций согласно вариантам осуществления приводило в результате к снижению частоты возникновения острой задержки мочи по сравнению с пациентами, подвергнутыми аналогичному лечению, которым не вводили композицию согласно вариантам осуществления, от приблизительно 10% до полного предупреждения (100%), или от приблизительно 25% до 100%, или от приблизительно 40% до 100%, или от приблизительно 40% до приблизительно 95%, или от приблизительно 45% до приблизительно 90%, или от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 60% до приблизительно 75%, или любое значение или диапазон от приблизительно 10% до приблизительно 100%.
[0067] Варианты осуществления включают способ лечения млекопитающего, страдающего состоянием, которое может привести к острой задержке мочи, предусматривающий введение один или более одного раза NTP-пептида млекопитающему, либо отдельно, либо в комбинации с введением дополнительного активного средства. Способ включает без ограничения введение NTP-пептидов внутримышечно, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутриочагово, интраокулярно, интраартериально, интратекально, внутрь опухоли, интраназально, местно, трансдермально, подкожно или внутрикожно, либо отдельно, либо конъюгированными с носителем. Состояние, которое может привести к острой задержке мочи, может включать присутствие нежелательных клеточных пролифераций, включая, среди прочего, доброкачественные и злокачественные опухоли, гиперплазию желез (например, предстательной железы) и рак. Предпочтительные NTP-пептиды включают один или более из следующих:
SEQ ID NO: 66 IDQQVLSRIKLEIKRCL Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu
SEQ ID NO: 111 IDQQVLSRI Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile
SEQ ID NO: 115 VLSRIKLEIKRCL Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu
SEQ ID NO: 116 IDQQVLSRIKLEI Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile
[0068] От применения настоящего изобретения может получить преимущество любое млекопитающее, в том числе люди, мыши, кролики, собаки, овцы и другой домашний скот, любое млекопитающее, лечение которого осуществляют ветеринар, сотрудник зоопарка или работник заповедника или поддающиеся лечению ими. Предпочтительными млекопитающими являются люди, овцы и собаки. На протяжении всего данного описания млекопитающие и пациенты используются взаимозаменяемо.
[0069] Специалисту в данной области техники будет очевидно, что другие меньшие фрагменты вышеуказанных NTP-пептидов могут быть выбраны таким образом, что эти пептиды будут обладать одинаковой или схожей биологической активностью. Специалист в данной области техники может выбрать другие фрагменты таким образом, чтобы эти пептиды обладали одинаковой или схожей биологической активностью. Пептиды согласно вариантам осуществления охватывают эти другие фрагменты. В общем, пептиды согласно вариантам осуществления имеют по меньшей мере 4 аминокислоты, предпочтительно по меньшей мере 5 аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере 6 аминокислот.
[0070] Варианты осуществления также охватывают способы предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи, предусматривающие введение композиции, содержащей NTP-пептиды, которая содержит два или более NTP-пептидов, соединенных вместе, совместно с дополнительным активным средством. Поскольку NTP-пептид обладает желаемой биологической активностью, из этого следует, что два таких пептида также будут обладать желаемой биологической активностью.
[0071] NTP-пептиды и фрагменты, варианты, производные, гомологи, слитые белки и их миметики, охватываемые этим вариантом осуществления, могут быть получены с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как технология рекомбинантной ДНК, синтез белка и выделение встречающихся в природе пептидов, белков, AD7c-белка и его фрагментов, вариантов, производных и гомологов.
[0072] NTP-пептиды и фрагменты, варианты, производные, гомологи, слитые белки и их миметики могут быть получены из других пептидов, белков и их фрагментов, вариантов, производных и гомологов с использованием способов, известных специалистам в данной области техники. Такие способы включают (без ограничения) использование протеаз для расщепления пептида или белка до желаемых NTP-пептидов.
[0073] NTP-пептид может быть получен с использованием хорошо известных способов технологии рекомбинантной ДНК, таких как те, которые изложены в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. и/или Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y.
[0074] Ген или кДНК, кодирующие NTP-пептид, можно получить, например, путем скрининга геномной библиотеки или библиотеки кДНК- или путем ПЦР-амплификации. Зонды или праймеры, пригодные для скрининга библиотеки, могут быть образованы на основе информации о последовательности для других известных генов или фрагментов генов из того же или родственного семейства генов, таких как, например, консервативные мотивы, обнаруженные в других пептидах или белках. Кроме того, если был идентифицирован ген, кодирующий NTP-пептид, весь этот ген или его часть можно использовать в качестве зонда для идентификации гомологичных генов. Зонды или праймеры могут быть использованы для скрининга библиотек кДНК из различных источников тканей, которые, как считается, экспрессируют ген NTP-пептида. Обычно для скрининга используются условия высокой строгости, чтобы свести к минимуму количество ложноположительных результатов, полученных при скрининге.
[0075] Другим способом получения гена, кодирующего NTP-пептид, является применение химического синтеза с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, таких как способы, описанные Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 . Эти способы включают, среди прочего, фосфотриэфирный, фосфорамидитный и H-фосфонатный способы синтеза нуклеиновых кислот. Предпочтительным способом такого химического синтеза является синтез на полимерной подложке с использованием стандартной фосфорамидитной химии. Как правило, ДНК, кодирующая пептид или белок, будет иметь длину несколько сотен нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты размером более 100 нуклеотидов могут быть синтезированы в виде нескольких фрагментов с использованием этих способов. Затем фрагменты могут быть лигированы вместе для образования полноразмерных пептида или белка. Обычно фрагмент ДНК, кодирующий аминоконец белка, имеет ATG, который кодирует остаток метионина. Этот метионин может присутствовать или не присутствовать в зрелой форме белка или пептида, в зависимости от того, предназначен ли белок, продуцируемый в клетке-хозяине, для секретирования из этой клетки.
[0076] Ген, кДНК или их фрагмент, кодирующие NTP-пептид, могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии или амплификации с использованием стандартных методик лигирования. Вектор обычно выбирают так, чтобы он был функциональным в конкретной используемой клетке-хозяине (т. е. вектор совместим с механизмом клетки-хозяина, таким образом, что может происходить амплификация гена и/или экспрессия гена). Ген, кДНК или их фрагмент, кодирующие NTP-пептид, могут быть амплифицированы/экспрессированы в прокариотических клетках, дрожжевых клетках, клетках насекомых (бакуловирусных системах) и/или эукариотических клетках-хозяевах. Выбор клетки-хозяина будет частично зависеть от того, должен ли NTP-пептид быть гликозилированым и/или фосфорилированым. Если это так, предпочтительными являются клетки-хозяева дрожжей, насекомых или млекопитающих.
[0077] Как правило, векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать по меньшей мере 5'-фланкирующую последовательность (также называемую промотором), а также другие регуляторные элементы, такие как энхансер(энхансеры), элемент начала репликации, элемент терминации транскрипции, полная последовательность интрона, содержащая донорный и акцепторный сайт сплайсинга, сигнальная пептидная последовательность, элемент сайта связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, область полилинкера для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подлежащий экспрессии, и селектируемый маркерный элемент. Каждый из этих элементов обсуждается ниже. Необязательно вектор может содержать последовательность метки, т. е. молекулу олигонуклеотида, расположенную на 5'- или 3'-конце кодирующей последовательности белка или пептида; молекула олигонуклеотида кодирует polyHis (такой как hexaHis) или другую метку, такую как FLAG, HA (гемагглютинин вируса гриппа) или myc, для которой существуют коммерчески доступные антитела. Эта метка обычно сливается с полипептидом при экспрессии полипептида и может служить средством для аффинной очистки белка или пептида из клетки-хозяина. Аффинная очистка может быть выполнена, например, посредством колоночной хроматографии с использованием антител к метке в качестве аффинной матрицы. Необязательно метка может быть впоследствии удалена из очищенного белка или пептида различными способами, такими как использование определенных пептидаз.
[0078] Специалист в данной области техники может осуществить слияние шарнирной области иммуноглобулина человека и Fc-области на N-конце или С-конце NTP-пептида. Последующий Fc-слитый белок может быть очищен с использованием аффинной колонки с белком А. Известно, что Fc проявляет длительный фармакокинетический период полужизни in vivo, и было обнаружено, что слитые с Fc белки проявляют существенно больший период полужизни in vivo, чем неслитый аналог. Кроме того, слияние с Fc-областью обеспечивает димеризацию/мультимеризацию молекулы, что может быть пригодно для биологической активности некоторых молекул.
[0079] 5'-фланкирующая последовательность может быть гомологичной (т. е. из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичной (т. е. из вида, отличного от вида или штамма клетки-хозяина), гибридной (т. е. комбинация из 5'-фланкирующих последовательностей из более чем одного источника), синтетической, или она может представлять собой 5'-фланкирующую последовательность гена нативного белка или пептида. Таким образом, источником 5'-фланкирующей последовательности может быть любой одноклеточный прокариотический или эукариотический организм, любой организм из позвоночных или беспозвоночных или любое растение при условии, что 5'-фланкирующая последовательность функционирует и может быть активирована аппаратом клетки-хозяина.
[0080] 5'-фланкирующие последовательности, пригодные в векторах этого варианта осуществления, могут быть получены любым из нескольких способов, хорошо известных из уровня техники. Как правило, 5'-фланкирующие последовательности, пригодные в настоящем документе, отличные от фланкирующей последовательности гена белка или пептида, будут предварительно идентифицированы путем картирования и/или расщепления рестрикционной эндонуклеазой и, таким образом, могут быть выделены из подходящего источника ткани с использованием соответствующих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях может быть известна полная нуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей последовательности. В данном случае 5'-фланкирующая последовательность может быть синтезирована с использованием способов, описанных выше для синтеза или клонирования нуклеиновой кислоты. Если известна вся или только часть 5'-фланкирующей последовательности, ее можно получить с использованием ПЦР и/или скрининга геномной библиотеки с подходящими олигонуклеотидами и/или фрагментами 5'-фланкирующей последовательности того же или другого вида.
[0081] Если 5'-фланкирующая последовательность не известна, фрагмент ДНК, содержащий 5'-фланкирующую последовательность, может быть выделен из большего фрагмента ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществлять путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой с использованием одного или более тщательно выбранных ферментов для выделения подходящего фрагмента ДНК. После расщепления необходимый фрагмент можно выделить с помощью очистки в агарозном геле, колонки Qiagen или других способов, известных специалисту в данной области техники. Выбор подходящих ферментов для достижения этой цели будет очевиден для специалиста в данной области техники.
[0082] Элемент начала репликации обычно является частью прокариотических векторов экспрессии, приобретаемых коммерчески, и способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Амплификация вектора до определенного числа копий может в некоторых случаях быть важной для оптимальной экспрессии белка или пептида. Если выбранный вектор не содержит сайта начала репликации, он может быть химически синтезирован на основе известной последовательности и лигирован в вектор. Элемент терминации транскрипции обычно расположен на 3'-конце кодирующей последовательности белка или пептида и служит для завершения транскрипции белка или пептида. Обычно элементом терминации транскрипции в прокариотических клетках является GC-богатый фрагмент, за которым следует поли-T-последовательность. Хотя элемент может быть клонирован из библиотеки или приобретен коммерчески как часть вектора, он также может быть легко синтезирован с использованием способов синтеза нуклеиновой кислоты, таких как описанные выше.
[0083] Селектируемый маркерный генный элемент кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, выращенной в селективной культуральной среде. Типичные маркерные гены селекции кодируют белки, которые (а) придают прокариотическим клеткам-хозяевам устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину, (б) дополняют ауксотрофный дефицит клетки или (c) поставляют существенно важные питательные вещества, недоступные в сложных средах. Предпочтительными селектируемыми маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину.
[0084] Элемент связывания рибосомы, обычно называемый последовательностью Шайна-Дальгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты), обычно необходим для инициации трансляции мРНК. Элемент обычно расположен на 3' от промотора и на 5' от кодирующей последовательности белка или пептида, подлежащих синтезу. Последовательность Шайна-Дальгарно варьирует, но, как правило, представляет собой полипурин (т. е. имеет высокое содержание AG). Было идентифицировано много последовательностей Шайна-Дальгарно, каждая из которых может быть легко синтезирована с использованием способов, изложенных выше, и использована в прокариотическом векторе.
[0085] В тех случаях, когда необходимо, чтобы NTP-пептид секретировался из клетки-хозяина, сигнальная последовательность может быть использована для направления пептида из клетки-хозяина, где он синтезируется, и карбокси-концевая часть белка может быть удалена для предотвращения закрепления мембраны. Как правило, сигнальная последовательность расположена в кодирующей области гена NTP-пептида или кДНК или непосредственно на 5'-конце кодирующей области гена пептида. Многие сигнальные последовательности были идентифицированы, и любая из них, которые являются функциональными в выбранной клетке-хозяине, может использоваться в сочетании с геном пептида или кДНК. Следовательно, сигнальная последовательность может быть гомологичной или гетерологичной по отношению к гену пептида или кДНК и может быть гомологичной или гетерологичной по отношению к гену пептида или кДНК. Кроме того, сигнальная последовательность может быть химически синтезирована с использованием способов, изложенных выше. В большинстве случаев секреция полипептида из клетки-хозяина посредством присутствия сигнального пептида приведет к удалению аминоконцевого метионина из полипептида.
[0086] Во многих случаях транскрипция гена NTP-пептида или кДНК увеличивается благодаря наличию одного или более интронов в векторе; это особенно верно, если пептид продуцируется в эукариотических клетках-хозяевах, особенно в клетках-хозяевах млекопитающих. Используемые интроны могут встречаться в природе внутри гена пептида, особенно если используемый ген представляет собой полноразмерную геномную последовательность или ее фрагмент. Если интрон не встречается в природе в гене (как для большинства кДНК), интрон(интроны) можно получить из другого источника. Положение интрона относительно фланкирующей последовательности и гена пептида, как правило, является важным, так как интрон должен быть транскрибирован, чтобы быть эффективным. В связи с этим, если ген пептида, вставленный в вектор экспрессии, представляет собой молекулу кДНК, предпочтительным для интрона положением является 3' от сайта инициации транскрипции и 5' от последовательности терминации транскрипции поли-А. Предпочтительно для кДНК пептида интрон или интроны будут располагаться на одной или другой стороне (т. е. 5' или 3') кДНК так, чтобы он не прерывал эту кодирующую последовательность. Любой интрон из любого источника, включая любые вирусные, прокариотические и эукариотические (растительные или животные) организмы, может быть использован для осуществления на практике этого варианта осуществления при условии, что он совместим с клеткой(клетками)-хозяином(хозяинами), в которую он вставлен. Также сюда включены синтетические интроны. Необязательно в векторе может использоваться более одного интрона.
[0087] Если один или более из вышеперечисленных элементов еще не присутствуют в векторе, подлежащем использованию, они могут быть получены отдельно и лигированы в этот вектор. Способы, используемые для получения каждого из элементов, хорошо известны специалисту в данной области техники и сопоставимы со способами, изложенными выше (т. е. синтез ДНК, скрининг библиотеки и тому подобное).
[0088] Конечные векторы, используемые для осуществления на практике этого варианта осуществления, могут быть сконструированы из начальных векторов, таких как коммерчески доступный вектор. Такие векторы могут содержать или не содержать некоторые элементы, которые должны быть включены в завершенный вектор. Если ни один из необходимых элементов не присутствует в исходном векторе, каждый элемент может быть отдельно лигирован в вектор путем разрезания вектора с помощью соответствующей рестрикционной(рестрикционных) эндонуклеазы(эндонуклеаз) так, чтобы концы элемента, подлежащего лигированию, и концы вектора были совместимы для лигирования. В некоторых случаях может быть необходимо затупить концы, подлежащие совместному лигированию, чтобы получить удовлетворительное лигирование. Затупление достигается путем первого заполнения «липких концов» с использованием ДНК-полимеразы Кленова или ДНК-полимеразы Т4 в присутствии всех четырех нуклеотидов. Эта процедура хорошо известна из уровня техники и описана, например, в Sambrook et al. выше. В качестве альтернативы, два или более элементов, подлежащие вставке в вектор, могут сначала быть лигированы вместе (если они должны быть расположены рядом друг с другом), а затем лигированы в вектор.
[0089] Дополнительный способ конструирования вектора состоит в том, чтобы проводить все лигирования различных элементов одновременно в одной реакционной смеси. В данном случае будет создаваться множество бессмысленных или нефункциональных векторов из-за неправильного лигирования или вставки элементов, однако функциональный вектор может быть идентифицирован и выбран путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой.
[0090] Предпочтительными векторами для осуществления на практике этого варианта осуществления являются векторы, которые совместимы с клетками-хозяевами бактерий, насекомых и млекопитающих. Такие векторы включают, среди прочего, pCRII, pCR3 и pcDNA3.1 (Invitrogen Company, Сан Диего, Калифорния), pBSII (Stratagene Company, Ла-Хойя, Калифорния), pET15b (Novagen, Мэдисон, Висконсин), PGEX (Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси), pEGFP-N2 (Clontech, Пало-Альто, Калифорния), pETL (BlueBachl; Invitrogen) и pFastBacDual (Gibco/BRL, Гранд-Айленд, Нью-Йорк).
[0091] После того, как вектор был сконструирован и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полноразмерные или процессированные белок или пептид, была вставлена в соответствующий сайт вектора, завершенный вектор может быть помещен в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками-хозяевами (такими как E.coli) или эукариотическими клетками-хозяевами (такими как дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки позвоночных). Клетка-хозяин, при культивировании в соответствующих условиях, может синтезировать белок или пептид, которые впоследствии могут быть выделены из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует их в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей их (если они не секретируются).
[0092] После выделения NTP-пептид может быть очищен с использованием таких способов, как хроматография на молекулярных ситах, аффинная хроматография и тому подобное. Выбор клетки-хозяина для продуцирования белка или пептида будет частично зависеть от того, должен ли пептид быть гликозилированным или фосфорилированным (в этом случае предпочтительными являются эукариотические клетки-хозяева), и от того, каким образом клетка-хозяин способна сворачивать пептид в его нативную третичную структуру (например, правильная ориентация дисульфидных мостиков и т.д.), таким образом, что биологически активный белок получают с помощью пептида, который обладает биологической активностью, пептид может сворачиваться после синтеза с использованием соответствующих химических условий, как обсуждается ниже. Подходящими клетками или линиями клеток могут быть клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки эмбриональной почки человека (НЕК) 293, клетки 293Т или клетки 3Т3. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающих и способы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также продуцирования и очистки продукта известны из уровня техники. Другими подходящими линиями клеток млекопитающих являются линии клеток обезьян COS-1 и COS-7 и линия клеток CV-1. Другие иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих включают линии клеток приматов и линии клеток грызунов, в том числе трансформированные линии клеток. Нормальные диплоидные клетки, штаммы клеток, полученные из культуры первичной ткани in vitro, а также первичные экспланты, также являются подходящими. Клетки-кандидаты могут быть генотипически дефицитными по селекционному гену или могут содержать доминантно действующий селекционный ген. Другие подходящие линии клеток млекопитающих включают без ограничения клетки нейробластомы мыши N2A, HeLa, клетки мыши L-929, линии 3T3, полученные от мышей Swiss, Balb-c или NIH, линии клеток хомячка BHK или HaK.
[0093] Такими же пригодными в качестве клеток-хозяев, подходящих для вариантов осуществления настоящего изобретения, являются бактериальные клетки. Например, различные штаммы E. coli (например, HB101, DH5.альфа., DH10 и MC1061) являются хорошо известными в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. В этом способе также могут использоваться различные штаммы B. subtilis, Pseudomonas spp., другие Bacillus spp., Streptomyces spp. и т. п. Многие штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, также доступны в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептидов согласно вариантам осуществления настоящего изобретения.
[0094] Кроме того, при необходимости, системы клеток насекомых могут быть использованы в способах согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Такие системы описаны, например, в Kitts et al. (Biotechniques, 14:810-817), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572) и Lucklow et al. (J. Virol., 67:4566-4579). Предпочтительными клетками насекомых являются Sf-9 и Hi5 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).
[0095] Введение (также называемое трансформацией или трансфекцией) вектора в выбранную клетку-хозяина может быть выполнено с использованием таких способов, как хлорид кальция, электропорация, микроинъекция, липофекция или способ DEAE-декстран. Выбранный способ будет частично зависеть от типа используемой клетки-хозяина. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области техники и изложены, например, в Sambrook et al. выше.
[0096] Клетки-хозяева, содержащие вектор (т. е. трансформированные или трансфицированные), можно культивировать с использованием стандартных сред, хорошо известных специалисту в данной области техники. Среда обычно содержит все питательные вещества, необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для культивирования клеток E.coli являются, например, бульон Лурия (LB) и/или бульон для взбалтывания (TB). Подходящими средами для культивирования эукариотических клеток являются RPMI 1640, MEM, DMEM, все из которых могут быть дополнены сывороткой и/или факторами роста, необходимыми для конкретной культивируемой линии клеток. Подходящей средой для культур насекомых является среда Грейса, дополненная дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и/или фетальной сывороткой теленка, если необходимо. Как правило, антибиотик или другое соединение, пригодное для селективного роста только трансформированных клеток, добавляют в качестве дополнения к среде. Соединение, подлежащее применению, будет обусловлено селектируемым маркерным элементом, присутствующим на плазмиде, с помощью которой трансформировали клетку-хозяина. Например, если селектируемый маркерный элемент обуславливает устойчивость к канамицину, соединение, добавляемое в культуральную среду, будет представлять собой канамицин.
[0097] Количество NTP-пептида, продуцируемого в клетке-хозяине, можно оценить с использованием стандартных способов, известных из уровня техники. Такие способы включают без ограничения вестерн-блот-анализ, электрофорез в SDS-полиакриламидном геле, электрофорез в неденатурирующем геле, разделение посредством HPLC, масс-спектроскопию, иммунопреципитацию и/или анализы активности, такие как анализы связывания ДНК по сдвигу в геле.
[0098] Если белок или пептид предназначен для секретирования из клеток-хозяев, большая часть белка или пептида может быть обнаружена в среде для культивирования клеток. Белки, полученные таким способом, обычно не содержат аминоконцевого метионина, поскольку он удаляется во время секреции из клетки. Однако если белок или пептид не секретируются из клеток-хозяев, они будут присутствовать в цитоплазме и/или ядре (для эукариотических клеток-хозяев) или в цитозоле (для клеток-хозяев грамотрицательных бактерий) и могут иметь аминоконцевой метионин.
[0099] Для NTP-пептида, расположенного в цитоплазме и/или ядре клетки-хозяина, клетки-хозяева обычно сначала разрушают механически или с помощью детергента для высвобождения внутриклеточного содержимого в буферный раствор. Затем пептид можно выделять из этого раствора.
[0100] Очистку NTP-пептидов из раствора можно осуществлять с использованием различных методик. Если NTP-пептид был синтезирован таким образом, что он содержит метку, такую как гексагистидин (например, пептид/гекса-His) или другой небольшой пептид, такой как FLAG (Sigma-Aldritch, Сент-Луис, Миссури) или кальмодулин-связывающий пептид (Stratagene, Ла-Холья, Калифорния) на своем либо карбоксильном, либо аминоконце, он может быть по существу очищен посредством одностадийного способа, путем пропускания раствора через аффинную колонку, где матрица колонки имеет высокую аффинность к метке или непосредственно к белку (т. е. моноклональное антитело, специфически распознающее пептид). Например, полигистидин связывается с большой аффинностью и специфичностью с никелем, цинком и кобальтом; таким образом, аффинную хроматографию с иммобилизованными ионами металлов, в которой используется аффинная смола на основе никеля (как используется в системе QlAexpress от Qiagen или системе Xpress от Invitrogen), или аффинная смола на основе кобальта (как используется в системе Talon от BD Biosciences-CLONTECH), можно использовать для очистки пептида/поли-His. (См., например, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York ).
[0101] Если NTP-пептид получают без прикрепленной метки и антитела не доступны, могут быть использованы другие хорошо известные процедуры очистки. Такие процедуры включают без ограничения ионообменную хроматографию, гидроксиапатитовую хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, хроматографию на молекулярном сите, HPLC, электрофорез в нативном геле в сочетании с элюированием гелем и препаративную изоэлектрическую фокусировку (Isoprime machine/technique, Hoefer Scientific). В некоторых случаях две или более из этих методик могут быть объединены для достижения повышенной чистоты.
[0102] Если ожидается, что NTP-пептид будет обнаружен главным образом внутриклеточно, то внутриклеточный материал (включая тельца включения для грамотрицательных бактерий) может быть извлечен из клетки-хозяина с использованием любой стандартной методики, известной специалисту в данной области техники. Например, клетки-хозяева можно лизировать для высвобождения содержимого периплазмы/цитоплазмы с помощью пресса Френча, гомогенизации и/или обработки ультразвуком с последующим центрифугированием. Если пептид образовал тельца включения в цитозоле, тельца включения могут часто связываться с внутренней и/или внешней клеточной мембраной и, таким образом, после центрифугирования будут обнаруживаться главным образом в осадочном материале. Материал осадка затем может быть обработан при крайних значениях pH или хаотропным средством, таким как детергент, гуанидин, производные гуанидина, мочевина или производные мочевины, в присутствии восстанавливающего средства, такого как дитиотреитол при щелочном pH или трис-карбоксиэтилфосфин при кислотном pH до высвобождения, разъединения и растворения телец включений. Затем пептид в его уже растворимой форме можно анализировать с помощью гель-электрофореза, иммунопреципитации или тому подобного. Если необходимо выделить пептид, выделение можно осуществить с использованием стандартных способов, таких как изложенные ниже и в Marston et al. Meth. Enz., 182:264-275.
[0103] В некоторых случаях NTP-пептид может не быть биологически активным после выделения. Различные способы рефолдинга или преобразования полипептида в его третичную структуру и образования дисульфидных связей могут быть использованы для восстановления биологической активности. Такие способы включают воздействие на солюбилизированный полипептид pH, обычно выше 7, и в присутствии определенной концентрации хаотропа. Выбор хаотропа очень подобен выбору, используемому для солюбилизации тельца включения, но обычно при более низкой концентрации и не обязательно тот же хаотроп, что и для солюбилизации. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления также будет содержать восстанавливающее средство или восстанавливающее средство плюс его окисленную форму в определенном соотношении, чтобы образовать определенный окислительно-восстановительный потенциал, обеспечивающие осуществление дисульфидной перетасовки при образовании цистеинового мостика(мостиков) белка. Некоторые из обычно используемых окислительно-восстановительных пар включают цистеин/цистамин, глутатион (GSH)/дитиобис GSH, хлорид меди, дитиотреитол (DTT)/дитиан DTT, 2-меркаптоэтанол (bME)/дитио-b (ME). Во многих случаях для повышения эффективности рефолдинга необходим сорастворитель, и более распространенные реагенты, используемые для этой цели, включают глицерин, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы и аргинин.
[0104] Если тельца включения NTP-пептидов не образуются в значительной степени в клетке-хозяине, NTP-пептид будет обнаруживаться главным образом в супернатанте после центрифугирования гомогената клетки, и NTP-пептид может быть выделен из супернатанта с использованием способов, таких как те, которые приведены ниже.
[0105] В тех ситуациях, когда предпочтительно частично или полностью выделить NTP-пептид, очистка может быть выполнена с использованием стандартных способов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Такие способы включают без ограничения разделение посредством электрофореза с последующим электроэлюированием, различные типы хроматографии (иммуноаффинная, на молекулярном сите и/или ионообменная) и/или жидкостной хроматографии высокого давления. В некоторых случаях может быть предпочтительным использовать более одного из этих способов для полной очистки.
[0106] В дополнение к получению и очистке NTP-пептидов с использованием методик рекомбинантной ДНК, NTP-пептиды и их фрагменты, варианты, гомологи, слитые белки, пептидомиметики и производные могут быть получены посредством способов химического синтеза (таких как твердофазный пептидный синтез) с использованием методик, известных из уровня техники, таких как изложенные в Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149, Houghten et al. Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132, и Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. Такие пептиды могут быть синтезированы с метионином или без него на аминоконце. Химически синтезированные NTP-пептиды могут быть окислены с использованием способов, изложенных в этих ссылочных материалах, с образованием дисульфидных мостиков. Предполагается, что NTP-пептиды обладают биологической активностью, сопоставимой с пептидами, полученными рекомбинантно или очищенными из природных источников, и, таким образом, могут использоваться взаимозаменяемо с рекомбинантным или природным пептидом.
[0107] Композиции на основе химически модифицированного NTP-пептида, в которых пептид связан с полимером, включены в объем вариантов осуществления настоящего изобретения. Выбранный полимер обычно является водорастворимым, так что белок, к которому он присоединен, не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Выбранный полимер обычно модифицируют так, чтобы он имел одну реакционноспособную группу, такую как активный сложный эфир для ацилирования или альдегид для алкилирования, так что степень полимеризации можно контролировать, как предусмотрено в способах по настоящему изобретению. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. В объем пептидных полимеров входит смесь полимеров.
[0108] В некоторых случаях может быть необходимо получить варианты нуклеиновой кислоты и/или аминокислоты встречающихся в природе NTP-пептидов. Варианты нуклеиновой кислоты могут быть получены с использованием сайт-направленного мутагенеза, ПЦР-амплификации или других подходящих способов, где праймер(праймеры) имеют необходимые точечные мутации (см. Sambrook et al. выше и Ausubel et al. выше для описания методик мутагенеза). Химический синтез с использованием способов, описанных Engels et al. выше, также может быть использован для получения таких вариантов. Также могут быть использованы другие способы, известные специалисту в данной области техники.
[0109] Предпочтительными вариантами нуклеиновых кислот являются варианты, содержащие нуклеотидные замены, учитывающие предпочтение кодонов в клетке-хозяине, которая подлежит использованию для получения NTP-пептидов. Такая оптимизация кодонов может быть определена с помощью компьютерных алгоритмов, которые включают таблицы частоты кодонов, такие как Ecohigh. Код для предпочтения кодонов высокоэпрессированных бактериальных генов предусмотрен пакетом Университета Висконсина версии 9.0, Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин. Другие используемые таблицы частоты кодонов включают Celegans_high.cod, Celegans_low.cod, Drosophila_high.cod, Human_high.cod, Maize_high.cod и Yeast_high.cod. Другими предпочтительными вариантами являются те, которые кодируют консервативные аминокислотные замены, как описано выше (например, в которых заряд или полярность встречающейся в природе аминокислотной боковой цепи существенно не изменяется путем замены другой аминокислотой) по сравнению с диким типом, и/или те, которые предназначены для создания нового сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования, или те, которые предназначены для делеции существующего сайта(сайтов) гликозилирования и/или фосфорилирования.
[0110] NTP-пептиды и фрагменты, гомологи, варианты, слитые белки, пептидомиметики, их производные и соли также могут быть получены с использованием общепринятых методик синтеза пептидов, известных специалисту в данной области техники. Эти методики включают способы химического сочетания (см. Wunsch, E: «Methoden der organischen Chemie», Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), и Barrany, G.; Marrifield, R. B.: «The Peptides», eds. E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp. 1-284, Academic Press (1980)), способы ферментативного сочетания (см. Widmer, F. Johansen, J. T., Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, pp. 37-46 (1979); Kullmann, W.: «Enzymatic Peptide Synthesis», CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987); и Widmer, F., Johansen, J. T. в «Synthetic Peptides in Biology and Medicines», eds. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., pp.79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), или комбинацию химического и ферментативного способов, если это обеспечивает преимущество для постановки процесса и экономии. Используя приведенные в данном документе руководства, специалисты в данной области техники способны варьировать пептидную последовательность NTP-пептида для получения гомолога, обладающего такой же или сходной биологической активностью (биоактивностью), что и исходный или нативный NTP-пептид.
[0111] Существуют преимущества использования миметика данного NTP-пептида, а не самого пептида. В целом, пептидомиметики являются более биодоступными, имеют более длительную продолжительность действия и могут быть дешевле в производстве, чем нативные белки и пептиды.
[0112] Пептидомиметики NTP-пептидов могут быть разработаны с использованием методик комбинаторной химии и других методик, известных из уровня техники (см., например, Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, ed. G. Jung, E. Bayer, pp. 289-336 и ссылки на них). Примеры способов, известных из уровня техники, структурной модификации пептида для создания пептидомиметика, включают инверсию хиральных центров остова, приводящих к структурированию остатка D-аминокислоты, что может, особенно на N-конце, приводить к повышенной стабильности для протеолитического разрушения без неблагоприятного влияния на активность. Пример приведен в статье «Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding», Smith C. S. et al., Drug Development Res. 15, pp. 371-379 (1988).
[0113] Второй способ заключается в изменении циклической структуры для стабильности, такой как межцепочечные имиды и лактамы от N до C (Ede et al. в Smith and Rivier (Eds.) «Peptides: Chemistry and Biology», Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). Пример этого приведен в конформационно ограниченных тимопентин-подобных соединениях, таких как раскрытые в патенте США № 4457489 (1985), Goldstein, G. et al., раскрытие которого включено посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.
[0114] Третий способ заключается в замене пептидных связей в NTP-пептиде псевдопептидными связями, что придает устойчивость к протеолизу. Был описан ряд псевдопептидных связей, которые в целом не влияют на структуру и биологическую активность пептида. Одним из примеров такого подхода является замена ретроинверсо-псевдопептидных связей («Biologically active retroinverso analogues of thymopentin», Sisto A. et al в Rivier, J. E. и Marshall, G. R. (eds) «Peptides, Chemistry, Structure and Biology», Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) и Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566, включенные в данный документ посредством ссылки). В соответствии с этой модификацией аминокислотные последовательности пептидов могут быть идентичны последовательностям пептидов, описанным выше, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены ретроинверсо-псевдопептидной связью. Предпочтительно большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец.
[0115] Синтез пептидов с одной или более восстановленными ретроинверсо-псевдопептидными связями известен из уровня техники (Sisto (1990) и Dalpozzo, et al. (1993), упомянутые выше). Таким образом, пептидные связи можно заместить непептидными связями, что позволит пептидомиметику принимать структуру, сходную со структурой исходного пептида, и, следовательно, обеспечит ему подобную биологическую активность. Дополнительные модификации также можно осуществлять путем замещения химических групп аминокислот другими химическими группами с подобной структурой. Другой подходящей псевдопептидной связью, которая, как известно, повышает устойчивость к ферментативному расщеплению без потери или с незначительной потерей биологической активности, является уменьшенная изостерная псевдопептидная связь (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Таким образом, аминокислотные последовательности этих пептидов могут быть идентичны последовательностям пептида, за исключением того, что одна или более пептидных связей заменены изостерной псевдопептидной связью. Предпочтительно большая часть N-концевой пептидной связи является замещенной, поскольку такая замена придает устойчивость к протеолизу экзопептидазами, действующими на N-конец. Синтез пептидов с одной или более восстановленными изостерными псевдопептидными связями известен из уровня техники (Couder et al. (1993), упомянуто выше). Другие примеры включают введение кетометиленовых или метилсульфидных связей для замены пептидных связей.
[0116] Пептоидные производные NTP-пептидов представляют собой другой класс пептидомиметиков, которые сохраняют важные структурные детерминанты для биологической активности, но устраняют пептидные связи, за счет чего обеспечивается придание устойчивости к протеолизу (Simon, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371 и включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Пептоиды являются олигомерами N-замещенных глицинов. Был описан ряд N-алкильных групп, каждая из которых соответствует боковой цепи природной аминокислоты (Simon, et al. (1992), упомянуто выше и включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Некоторые или все аминокислоты пептида заменены N-замещенным глицином, соответствующим замещенной аминокислоте.
[0117] Разработке пептидомиметиков может способствовать определение третичной структуры исходного пептида с помощью ЯМР-спектроскопии, кристаллографии и/или компьютерного молекулярного моделирования. Эти методики способствуют разработке новых композиций с более высокой эффективностью и/или большей биодоступностью и/или большей стабильностью, чем у исходного пептида (Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11: 166-173; Wiley and Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15: 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci. Am., 269: 92-98, все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).
[0118] Как только идентифицировано соединение, представляющее собой потенциальный пептидомиметик, оно может быть синтезировано и проанализировано с использованием способов, описанных в примерах ниже, для оценки его активности. Соединения, представляющие собой пептидомиметики, полученные посредством указанных выше способов, имеющие биологическую активность пептидов и схожую трехмерную структуру, охватываются данным вариантом осуществления. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что пептидомиметик может быть получен из любого из пептидов, несущих одну или более модификаций, описанных выше. Кроме того, будет очевидно, что пептидомиметики согласно данному варианту осуществления могут быть дополнительно использованы для разработки еще более активных непептидных соединений в дополнение к их применению в качестве терапевтических соединений.
[0119] В настоящее время существует ряд организаций, способных синтезировать пептиды, описанные в данном документе. Например, учитывая последовательность NTP-пептида, организация может синтезировать пептид и направить синтезированный пептид с сопроводительной документацией и доказательством идентичности пептида.
[0120] Варианты осуществления настоящего изобретения направлены на способы лечения млекопитающих с состояниями, которые могут привести к острой задержке мочи, где состояние может представлять собой состояние, требующее удаления клеток, такое как доброкачественные и злокачественные опухоли, гиперплазия желез (например, предстательной железы) или рак. Способы лечения снижают частоту возникновения острой задержки мочи, а в некоторых случаях предупреждают острую задержку мочи (т. е. частота возникновения составляет 0%). Такие способы предусматривают введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества NTP-пептида либо отдельно, либо в комбинации с дополнительным активным средством. Нуждающимися млекопитающими могут являться млекопитающие, страдающие доброкачественной гиперплазией предстательной железы, которые могут иметь повышенный риск развития рака предстательной железы или могут не иметь его, или млекопитающие с риском развития рака предстательной железы. Нуждающимися млекопитающими также могут быть любые млекопитающие, которые получат преимущество от снижения частоты возникновения острой задержки мочи, такие как млекопитающие, имеющие одно или более состояний, перечисленных в таблицах 4-6 выше.
[0121] Дополнительное активное средство, если оно используется, может представлять собой одно или более активных средств, выбранных из (i) противораковых активных средств (таких как алкилирующие средства, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, антиметаболиты РНК/ДНК и антимитотические средства); (ii) активных средств для лечения доброкачественных новообразований, таких как активные средства против акне и бородавок (салициловая кислота); (iii) антиандрогенных соединений (ципротеронацетат (1α,2β-метилен-6-хлор-17α-ацетокси-6-дегидропрогестерон)), тамоксифен, ингибиторы ароматазы); (iv) блокаторов альфа1-адренергических рецепторов (тамсулозин, теразозин, доксазозин, празозин, буназозин, индорамин, алфулзозин, силодозин); (v) ингибиторов 5α-редуктазы (финастерид, дутастерид); (vi) ингибиторов фосфодиэстеразы 5 типа (PDE5) (тадалафил) и их комбинаций. Предпочтительно дополнительное активное средство выбрано из группы, состоящей из тамсулозина, финастерида, теразозина, доксазозина, празозина, тадалафила, алфулзозина, силодозина, дутастерида, комбинации дутастерида и тамсулозина, и их смесей и комбинаций.
[0122] Состояние может представлять собой, например, опухоли легкого, молочной железы, желудка, поджелудочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, кости, яичника, кожи, почки, синуса, толстой кишки, кишечника, желудка, прямой кишки, пищевода, крови, головного мозга и его оболочек, спинного мозга и его оболочек, мышцы, соединительной ткани, надпочечника, паращитовидной железы, щитовидной железы, матки, яичка, гипофиза, репродуктивных органов, печени, желчного пузыря, глаза, уха, носа, горла, миндалин, рта, лимфатических узлов и лимфоидной системы и других органов. Другие состояния включают инсульт или застойную сердечную недостаточность, медицинское состояние, такое как простатит или инфекция мочевыводящих путей, или прием лекарственных препаратов или лекарственных средств, которые, как известно, провоцируют задержку, например, гидрохлорид псевдоэфедрина, медикамент от простуды, обезболивающие лекарственные препараты, такие как наркотические или успокаивающие средства, или бенадрил, или любые другие состояния для млекопитающих либо мужского, либо женского пола, перечисленные в таблицах 4-6 выше. В некоторых вариантах осуществления состояние представляет собой доброкачественную гиперплазию предстательной железы.
[0123] Используемый в данном документе термин «злокачественная опухоль» предназначен для охвата всех форм карцином, сарком и меланом человека, которые встречаются в слабо дифференцированных, умеренно дифференцированных и хорошо дифференцированных формах.
[0124] Терапевтические композиции на основе NTP-пептидов могут содержать терапевтически эффективное количество NTP-пептида в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых альтернативных вариантах осуществления дополнительное активное средство можно вводить в той же композиции на основе NTP-пептида, и в других вариантах осуществления при этом композицию, содержащую NTP-пептид, вводят в виде инъекции, тогда как дополнительное активное средство составляют в лекарственный препарат для перорального введения (гель, капсула, таблетка, жидкость и т.д.). Материалом носителя может быть вода для инъекций, предпочтительно дополненная другими материалами, общепринятыми в растворах для введения млекопитающим. Обычно NTP-пептид для терапевтического применения будет вводиться в форме композиции, содержащей очищенный пептид в сочетании с одним или более физиологически приемлемыми носителями, наполнителями или растворителями. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой иллюстративные соответствующие носители. Предпочтительно продукт составляют в виде лиофилизата с использованием соответствующих наполнителей (например, сахарозы). Другие стандартные носители, растворители и наполнители могут быть включены по желанию. Композиции согласно вариантам осуществления также могут содержать буферы, известные специалистам в данной области техники, с подходящим диапазоном значений pH, включая трис-буфер с pH приблизительно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с pH приблизительно 4,0-5,5, который может дополнительно включать сорбитол или подходящую его замену.
[0125] Применение NTP-пептидов, конъюгированных или присоединенных или связанных с антителом, фрагментом антитела, антителоподобной молекулой или молекулой с высокой аффинностью к определенному опухолевому маркеру, такому как клеточный рецептор, сигнальный пептид или сверхэкспрессированный фермент, для нацеливание на нежелательные клеточные элементы у интактного млекопитающего, также охватывается объемом вариантов осуществления. Антитело, фрагмент антитела, антителоподобную молекулу или молекулу с высокой аффинностью к конкретному опухолевому маркеру используют для нацеливания пептидного конъюгата на конкретную клеточную или тканевую мишень. Например, опухоль с характерным поверхностным антигеном или экспрессированным антигеном может быть нацелена антителом, фрагментом антитела или антителоподобной связывающей молекулой, и опухолевые клетки могут быть уничтожены пептидом. Такой подход, использующий нацеливание антителами, обладает ожидаемыми преимуществами снижения дозировки, увеличения вероятности связывания и поглощения клетками-мишенями и повышения пригодности для нацеливания и лечения метастатических опухолей и опухолей микроскопического размера.
[0126] Варианты осуществления также охватывают применение NTP-пептидов, конъюгированных или соединенных или связанных с белком или другой молекулой, для образования композиции, которая после расщепления в или вблизи сайта(сайтов) опухоли или других нежелательных клеток опухоль- или сайт-специфическим ферментом, или протеазой, или конъюгатом антитела, которые целенаправленно воздействуют на опухоль или другие нежелательные клетки, высвобождают пептид в или вблизи сайта(сайтов) опухоли или других нежелательных клеток.
[0127] Варианты осуществления также охватывают использование NTP-пептидов, конъюгированных или соединенных или связанных с белком или другой молекулой, для образования композиции, которая высвобождает пептид или некоторый биологически активный фрагмент пептида при воздействии на ткань, подлежащую лечению, света (как при способах лазерной терапии или другой фотодинамической или фотоактивированной терапии), других форм электромагнитного излучения, таких как инфракрасное излучение, ультрафиолетового излучения, рентгеновского или гамма-излучения, локализованного тепла, альфа- или бета-излучения, ультразвуковых излучений или других источников локализованной энергии.
[0128] Варианты осуществления также охватывают терапевтические композиции на основе NTP-пептидов, в которых используются дендримеры, фуллерены и другие синтетические молекулы, полимеры и макромолекулы, где пептид и/или его соответствующая молекула ДНК конъюгированы, присоединены или заключены в молекуле, полимере или макромолекуле, либо сами по себе, либо в сочетании с другими видами молекул, такими как опухолеспецифический маркер. Например, в патенте США № 5714166, Биологически активные и/или нацеленные дендримерные конъюгаты, описан способ получения и применения, среди прочего, конъюгатов дендритных полимеров, состоящих из по меньшей мере одного дендримера с целевым основным компонентом(компонентами) и по меньшей мере одним биоактивным средством, конъюгированным с ним. Раскрытие патента США № 5714166 включено посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.
[0129] Варианты осуществления также охватывают способы лечения млекопитающих терапевтическими композициями на основе NTP-пептидов и/или генов и сред-носителей для доставки лекарственных средств, таких как липидные эмульсии, мицеллярные полимеры, полимерные микросферы, электроактивные полимеры, гидрогели и липосомы, в комбинации с дополнительным активным средством.
[0130] Применение NTP-пептидов или родственных генов или эквивалентов генов, перенесенных в нежелательные клетки у млекопитающего, также охватывается вариантами осуществления. Сверхэкспрессия NTP-пептида в опухоли может быть использована, чтобы вызвать гибель клеток в опухоли и, таким образом, уменьшить популяцию опухолевых клеток. Предполагается, что перенос гена или эквивалентного гена NTP-пептида для лечения нежелательных клеточных элементов имеет преимущество в требовании меньшей дозировки и передачи его клеточному потомству целевых клеточных элементов, что требует менее частой терапии и меньшего общего терапевтического количества. Этот вариант осуществления также охватывает перенос генов, которые кодируют слитый белок, содержащий NTP-пептид, в нежелательные клетки или соседние клетки, где после экспрессии гена и продуцирования и/или секреции слитого белка слитый белок расщепляется либо нативными ферментами или протеазами, либо пролекарством для высвобождения NTP-пептида в нежелательных клетках или рядом с ними.
[0131] Применение клонированных конъюгатов рекомбинантного пептид и антитела; клонированных конъюгатов рекомбинантного пептида и фрагмента антитела; и клонированных конъюгатов рекомбинантного пептида и антителоподобного белка для введения не подвергнутым лечению млекопитающим, также охватывается объемом вариантов осуществления. Преимущества клонированного NTP-пептида, комбинированного с нацеливающим конъюгатом (таким как антитело, фрагмент антитела, антителоподобная молекула или молекула с высокой аффинностью к специфическому для рака рецептору или другому опухолевому маркеру), заключаются в том, что такая молекула объединяет целевые преимущества, описанные выше, в дополнение к преимуществам для изготовления и стандартизированного получения клонированной конъюгированной молекулы.
[0132] Варианты осуществления дополнительно включают применение терапевтических композиций на основе NTP-пептидов, или генов, или эквивалентов генов в качестве компонента покрытия медицинского устройства, такого как стент, для удаления, подавления или предупреждения нежелательной клеточной пролиферации или накопления, в комбинации с дополнительным активным средством.
[0133] Твердые лекарственные формы для перорального введения включают без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах дополнительное активное средство и/или NTP-пептид могут быть смешаны с по меньшей мере одним из следующего: (а) одним или более инертными наполнителями (или носителем), такими как цитрат натрия или дикальцийфосфат; (b) заполнителями или добавками, таким как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота; (c) связующими, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (d) увлажнителями, такими как глицерин; (е) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые сложные силикаты и карбонат натрия; (f) замедлителями растворения, такими как парафин; (g) ускорителями абсорбции, такими как четвертичные аммониевые соединения; (h) смачивающими средствами, такими как ацетиловый спирт и глицеролмоностеарат; (i) адсорбентами, такими как каолин и бентонит; и (j) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. Для капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать буферные средства.
[0134] Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и настои. Вдобавок к активным соединениям жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы. Примерами эмульгаторов являются этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла, такие как хлопковое масло, арахисовое масло, масло из зародышей кукурузы, оливковое масло, касторовое масло и кунжутное масло, глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли, сложные эфиры жирных кислот с сорбитаном или смеси этих веществ и тому подобное.
[0135] Помимо таких инертных разбавителей, композиция может также содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки.
[0136] Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в композициях согласно вариантам осуществления могут варьировать для получения количества NTP-пептида и дополнительного активного средства, которое эффективно для получения необходимого терапевтического ответа для конкретной композиции и способа введения. Следовательно, выбранный уровень дозировки зависит от необходимого терапевтического эффекта, пути введения, необходимой продолжительности лечения и других факторов.
2
[0137] Для млекопитающих, включая людей, эффективные количества можно вводить, основываясь на площади поверхности тела. Взаимосвязь дозировок для животных различных размеров, видов и людей (в пересчете на мг/м поверхности тела) описана в EJ Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50 (4):219 (1966). Площадь поверхности тела может быть примерно определена исходя из роста и веса индивидуума (см., например, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, NY pp. 537-538 (1970)).
[0138] Общая суточная доза NTP-пептида и дополнительного активного средства, вводимых хозяину, может быть в единичной или разделенной дозах. Единица дозирования композиции может содержать такое количество таких дольных единиц, которое можно использовать, для составления суточной дозы. Однако следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время и путь введения, эффективность вводимого лекарственного средства, скорость абсорбции. и экскреции, комбинацию с другими лекарственными средствами и тяжесть конкретного заболевания, лечение которого осуществляют. Предпочтительно, чтобы композицию вводили только один раз в виде инъекции или инфузии, или в другом предпочтительном варианте осуществления композицию вводят дважды. В этом варианте осуществления период времени между введением композиции может варьировать в любое время от 2 месяцев до 10 лет, или от 8 месяцев до 4 лет, или более чем приблизительно один год (например, от 1 до 2 лет).
[0139] Способ введения композиции на основе NTP-пептида в соответствии с вариантами осуществления предусматривает без ограничения введение соединений внутримышечно, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, интрацеребрально (интрапаренхимально), интрацеребровентрикулярно, внутрь опухоли, внутриочагово, внутрикожно, интратекально, интраназально, интраокулярно, интраартериально, местно, трансдермально, с помощью аэрозоля, инфузии, болюсной инъекции, имплантационного устройства, устройство замедленного высвобождения и т.д.
[0140] Другой способ введения NTP-пептида в соответствии с вариантами осуществления представляет собой трансдермальный или чрескожный путь. Дополнительное активное средство можно применять вместе с NTP-пептидом или можно вводить отдельно, как обсуждалось выше, или можно вообще не вводить. Одним примером такого варианта осуществления является использование пластыря. В частности, пластырь можно получать с тонкодисперсной суспензией пептида, например, в диметилсульфоксиде (DMSO),или смеси DMSO с хлопковым маслом и приводить в контакте с кожей млекопитающих, несущих опухоль, далеко от места расположения опухоли в кожаном мешке. Другие среды или их смеси с другими растворителями и твердыми носителями будут работать так же. Пластырь может содержать пептидное соединение в форме раствора или суспензии. Затем пластырь можно наносить на кожу пациента, например, путем введения его в кожный мешок пациента, образованный путем складывания и удерживания кожи вместе с помощью швов, зажимов или других удерживающих устройств. Этот мешок следует использовать таким образом, чтобы обеспечить постоянный контакт с кожей без вмешательства млекопитающего. Помимо использования кожного мешка, можно использовать любое устройство, которое обеспечивает надежное размещение пластыря в контакте с кожей. Например, липкопластырная повязка может быть использована для удержания пластыря на коже.
[0141] NTP-пептиды необязательно в комбинации с дополнительным активным средством, могут вводиться в составе или препарате с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме изделий определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением включают сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919, EP 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 и Langer, Chem. Tech., 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., выше) или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту (EP 133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые могут быть получены любым из нескольких способов, известных из уровня техники (например, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692; EP 36676; EP 88046 и EP 143949).
[0142] Другим способом введения NTP-пептида в соответствии с вариантами осуществления является прямая или непрямая инфузия NTP-пептида в опухоль или другую ткань, подлежащие лечению. Одним примером такого варианта осуществления является прямая инъекция NTP-пептида в опухоль или другую ткань, подлежащие лечению. Лечение может состоять из одной инъекции, нескольких инъекций в одном случае или серии инъекций в течение нескольких часов, дней или месяцев с регрессией или разрушением опухоли или другой ткани, подлежащих лечению, с контролем с помощью биопсии, визуализации или других способов контроля роста ткани. Инъекция в опухоль или другую ткань, подлежащие лечению, может осуществляться посредством устройства, вставленного в отверстие, такое как нос, рот, ухо, влагалище, прямая кишка или уретра, или через разрез, чтобы достичь опухоли или ткани in vivo, и может выполняться в сочетании с системой визуализации или оптической системой, такой как ультразвуковой или оптоволоконный эндоскоп, чтобы определить подходящее место для инъекции(инъекций). Другим примером такого варианта осуществления является использование устройства, которое может обеспечить постоянную инфузию NTP-пептида в ткань с течением времени.
[0143] Другой способ введения NTP-пептида связан с хирургической или аналогичной процедурой, применяемой для физического иссечения, удаления или иного уничтожения или разрушения опухоли или других тканевых или клеточных элементов, которые необходимо или желательно удалить или разрушить, где NTP-пептид согласно вариантам осуществления вводят в прилегающую(прилегающие) область(области), окружающую(окружающие) область(области), где опухоль или другая ткань были удалены, чтобы уничтожить или препятствовать росту любых опухолевых клеток или других клеточных элементов, не удаленных или не разрушенных в результате процедуры
[0144] Другим способом введения NTP-пептида в соответствии с вариантами осуществления является имплантация устройства в опухоль или другую ткань, подлежащие лечению. В этом варианте дополнительное активное средство обычно будут вводить другим путем введения, чем NTP-пептид. Одним примером такого варианта осуществления является имплантация капсулы-имплантата, содержащей пептид, в опухоль или другую ткань, подлежащие лечению, и введение дополнительного активного средства посредством перорального введения. Капсула-имплантат высвобождает терапевтическую дозу NTP-пептида в ткань с течением времени. В качестве альтернативы или дополнения, композицию можно вводить местно посредством имплантации в пораженный участок мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором был абсорбирован NTP-пептид. Если применяют имплантируемое устройство, то устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставка пептида может осуществляться непосредственно с помощью устройства посредством болюса, или посредством непрерывного введения, или посредством катетера с применением непрерывной инфузии.
[0145] Альтернативный способ введения заключается во введении одной или более копий гена, кодирующего NTP-пептид, в клетку-мишень и, если необходимо, индуцировании начала внутриклеточного продуцирования пептида копией(копиями) гена. В этом варианте дополнительное активное средство обычно будут вводить другим путем введения, чем NTP-пептид. Одним из способов применения генной терапии является использование гена, кодирующего NTP-пептид (либо геномная ДНК, кДНК и/или синтетическая ДНК, кодирующие пептид (или его фрагмент, вариант, гомолог или производное)), который может быть функционально связан с конститутивным или индуцибельным промотором для образования ДНК-конструкции для генной терапии. Промотор может быть гомологичным или гетерологичным гену, кодирующему эндогенный пептид, при условии, что он активен в клетке или типе ткани, в которую будет встроена конструкция. Другие компоненты ДНК-конструкции для генной терапии могут необязательно включать, при необходимости, молекулы ДНК, предназначенные для сайт-специфического встраивания (например, эндогенные фланкирующие последовательности, пригодные для гомологичной рекомбинации), тканеспецифический промотор, энхансер(энхансеры) или сайленсер(сайленсеры), молекулы ДНК, способные обеспечить избирательное преимущество по сравнению с родительской клеткой, молекулы ДНК, пригодные в качестве меток для идентификации трансформированных клеток, системы отрицательного отбора, специфические для клетки связывающие средства (как, например, для нацеливания на клетку), специфические для клетки факторы интернализации и факторы транскрипции для повышения экспрессию с помощью вектора, а также факторы, позволяющие производить вектор.
[0146] Средства доставки генов в клетку или ткань in vivo или ex vivo включают (без ограничения) прямую инъекцию голой ДНК, баллистические способы, липосома-опосредованный перенос, рецептор-опосредованный перенос (комплекс лиганд-ДНК), электропорацию и осаждение фосфата кальция. См. патенты США №№ 4970154, WO 96/40958, патент США № 5679559, патент США № 5676954 и патент США № 5593875, раскрытия каждого из которых включены посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Они также включают использование вирусного вектора, такого как ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, вирус оспы, лентивирус, вирус папилломы или вирус простого герпеса, использование конъюгата ДНК и белка и использование липосомы. Использование векторов генной терапии описано, например, в патентах США №№ 5672344, патенте США № 5399346, патенте США № 5631236 и патенте США № 5635399, раскрытия каждого из которых включены посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.
[0147] Ген, кодирующий NTP-пептид, может быть доставлен путем имплантации пациентам определенных клеток, которые были генетически сконструированы ex vivo, с использованием способов, таких как описанные в данном документе, для экспрессии и секреции NTP-пептида или его фрагментов, вариантов, гомологов или производных. Такие клетки могут быть клетками животного или человека и могут быть получены из собственной ткани пациента или из другого источника, либо человеческого, либо отличного от человеческого. Необязательно клетки могут быть иммортализированы или быть стволовыми клетками. Однако чтобы уменьшить вероятность иммунологического ответа, предпочтительно, чтобы клетки были инкапсулированы, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. Инкапсулирующие материалы обычно представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые обеспечивают высвобождение белкового продукта(продуктов), но предупреждают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредными факторами из окружающих тканей. Способы, используемые для мембранной инкапсуляции клеток, известны специалисту в данной области техники, и получение инкапсулированных клеток и их имплантация пациентам могут быть выполнены без чрезмерных экспериментов. См., например, патенты США №№ 4892538; 5011472 и 5106627, раскрытия каждого из которых включены посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Система для инкапсулирования живых клеток описана в РСТ WO 91/10425. Методики составления множества других средств для замедленной или контролируемой доставки, таких как липосомные носители, биоразлагаемые частицы или гранулы, также известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в патенте США №5653975, раскрытие которого включено посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте. Клетки с инкапсуляцией или без нее могут быть имплантированы в подходящие ткани организма или органы пациента.
[0148] Вариант осуществления включает способ снижения частоты возникновения острой задержки мочи у млекопитающих, включая млекопитающих, страдающих BPH и/или любым из состояний, перечисленных в таблицах 4-6, который предусматривает введение млекопитающему по меньшей мере один раз терапевтически эффективного количества NTP-пептида, в частности выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu). Другой вариант осуществления включает способ снижения частоты возникновения острой задержки мочи у млекопитающих, включая млекопитающих, страдающих BPH и/или любым из состояний, перечисленных в таблицах 4-6, который предусматривает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества NTP-пептида, в частности, выделенного пептида, содержащего аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu), с последующим введением одного или более активных ингредиентов, которые, как известно, являются пригодными в лечении острой задержки мочи. Другой вариант осуществления включает способ снижения частоты возникновения острой задержки мочи у млекопитающего, не страдающего BPH, и в других вариантах осуществления млекопитающее страдает одним или более состояниями, выбранными из группы, состоящей из меатального стеноза уретры, парафимоза, сужения полового члена, фимоза, рака предстательной железы, пролапса органов, выбранного из цистоцеле, ректоцеле и выпадения матки, опухолевидного образования в малом тазу, выбранного из гинекологического злокачественного новообразования, фибромы матки и кист яичника, загнутой назад беременной матки, аневризматической дилатации, камней в мочевом пузыре, новообразования в мочевом пузыре, фекаломы, желудочно-кишечных или забрюшинных злокачественных образований, стриктуры уретры, камней, отека, баланита, абсцесса предстательной железы, простатита, острого вульвовагинита, плоского лишая влагалища, склеротического лишая влагалища, вагинальной пузырчатки, бильгарциоза, цистита, эхинококкоза, синдрома Гийена-Барре, вируса простого герпеса; болезни Лайма, периуретрального абсцесса, поперечного миелита, туберкулезного цистита, уретрита, вируса ветряной оспы, травмы полового члена, повреждения полового члена, разрыва полового члена и синдрома Фаулера.
[0149] В определенных вариантах осуществления выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66 вводят в комбинации с по меньшей мере одним активным средством, выбранным из группы, состоящей из (1) ингибитора 5α-редуктазы и/или антиэстрогена, (2) ингибитора 5α-редуктазы и/или ингибитора ароматазы, (3) ингибитора 5α-редуктазы и/или ингибитора 17β-HSD, (4) ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (5) ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (6) ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (7) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и антиэстрогена, (8) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (9) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора 17β-HSD, (10) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (11) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы и ингибитора 17β-HSD, (12) ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (13) ингибитора 17β-HSD и антиэстрогена, (14) ингибитора 17β-HSD и ингибитора ароматазы, (15) ингибитора 17β-HSD, ингибитора ароматазы и антиэстрогена, (16) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и антиэстрогена, (17) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (18) ингибитора 17β-HSD, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (19) антиэстрогена и ингибитора ароматазы и (20) антиэстрогена, ингибитора ароматазы и антиандрогена, (21) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и антиэстрогена, (22) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и ингибитора ароматазы, (23) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы и ингибитора 17β-HSD, (24) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (25) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (26) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (27) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и антиэстрогена, (28) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (29) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена и ингибитора 17β-HSD, (30) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (31) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы и ингибитора 17β-HSD, (32) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 5α-редуктазы, антиандрогена, ингибитора ароматазы, антиэстрогена и ингибитора 17β-HSD, (33) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD и антиэстрогена, (34) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD и ингибитора ароматазы, (35) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, ингибитора ароматазы и антиэстрогена, (36) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и антиэстрогена, (37) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена и ингибитора ароматазы, (38) агониста или антагониста LHRH, ингибитора 17β-HSD, антиандрогена, антиэстрогена и ингибитора ароматазы, (39) агониста или антагониста LHRH, антиэстрогена и ингибитора ароматазы и (40) агониста или антагониста LHRH, антиэстрогена, ингибитора ароматазы и антиандрогена.
[0150] В других вариантах осуществления выделенный пептид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 66 вводят в комбинации с по меньшей мере одним активным средством, выбранным из группы, состоящей из альфа-адренергических блокаторов, таких как альфузозин или тамсулозин, дутастерид, тадалафил, теразозин, финастерид, доксазозин, комбинации финастерида и доксазозина и их смесей.
[0151] Следующие примеры предоставлены для иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что варианты осуществления не должны быть ограничены конкретными условиями или деталями, описанными в этих примерах. Во всем описании любые и все ссылки на общедоступный документ, включая патент США, специально включены посредством ссылки. В частности, варианты осуществления прямо включают посредством ссылки примеры, содержащиеся в находящейся на рассмотрении заявке на патент США № 14/808713, поданной 24 июля 2015 года, под названием СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ ПОТРЕБНОСТИ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ У ПАЦИЕНТОВ, СТРАДАЮЩИХ ДОБРОКАЧЕСТВЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ; заявке на патент США № 14/606683, поданной 27 января, 2015 года, под названием СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ РАЗРУШЕНИЯ ИЛИ УДАЛЕНИЯ КЛЕТОК, заявке на патент США № 14/738551, поданной 12 июня, 2015 года, под названием КОМБИНИРОВАННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ, ТРЕБУЮЩИХ УДАЛЕНИЯ ИЛИ РАЗРУШЕНИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЛИФЕРАЦИЙ, заявках на патент США №№ 2007/0237780 (в настоящее время приостановлена); 2003/0054990 (теперь патент США № 7172893); 2003/0096350 (теперь патент США № 6924266); 2003/0096756 (теперь патент США № 7192929); 2003/0109437 (теперь патент США № 7241738); 2003/0166569 (теперь патент США № 7317077); 2005/0032704 (теперь патент США № 7408021) и 2015/0148303 (теперь патент США № 9243035), в каждом из которых показано, что определенные пептиды, указанные в них, являются эффективными средствами, вызывающими гибель клеток in vivo в нормальной мышечной ткани грызунов, подкожной соединительной ткани, дерме и других тканях.
Пример один
[0152] Пациентам с BPH интрапростатическую инъекцию а) SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu) в фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2 («PBS») или b) только PBS в двойных слепых условиях вводил уролог в учреждении под ультразвуковым контролем. Пациенты наблюдались в течение от 1 до 6 лет с регулярными физическими осмотрами, лабораторными исследованиями и оценкой симптомов. Обоим группам субъектов впоследствии обеспечивали либо 1) отсутствие дополнительного лечения; 2) общепринятые лекарственные препараты для перорального введения, такие как альфа-блокаторы или ингибиторы 5-альфа-редуктазы; 3) интрапростатические инъекции SEQ ID NO: 66в количестве 2,5 мг или 4) более одного из предыдущих пунктов. Общая частота возникновения острой задержки мочи у всех пациентов, получавших интрапростатическую SEQ ID NO: 66в количестве 2,5 мг, была неожиданно ниже через 2 года, чем у пациентов, которые не получали SEQ ID NO: 66в аналогичных условиях. Результаты можно найти в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Лечение
Количество пациентов
Частота возникновения острой задержкой мочи
SEQ ID NO: 66<sup>1</sup>
635
1,4%*
Контроль<sup>2</sup>
188
3,7%
1. Пациенты, которые получали SEQ ID NO: 66 по меньшей мере один раз либо при первоначальном лечении (а), либо при последующем лечении (3).
2. Все остальные пациенты, которым не вводили SEQ ID NO: 66.
* p < ,05
[0153] Исходя из результатов этих исследований, можно ожидать, что введение NTP-пептидов по настоящему изобретению пациентам, нуждающимся в лечении или подверженным развитию острой задержки мочи, будет иметь еще более выраженный эффект в отношении предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у пациентов, подверженных развитию острой задержки мочи. Таким образом, композиции пригодны в лечении популяции пациентов, отличающихся только от пациентов, страдающих BPH, и пригодны для предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у этой популяции пациентов. По сравнению с контролями композиции и способы способны обеспечить снижение частоты возникновения острой задержки мочи на более чем 60%.
Пример два
[0154] Пациентам с BPH интрапростатическую инъекцию только среды-носителя, представляющей собой PBS pH 7,2, в двойных слепых условиях вводил уролог в учреждении под ультразвуковым контролем. Пациенты наблюдались в течение от 1 до 6 лет с регулярными физическими осмотрами, лабораторными исследованиями, оценкой симптомов и лечением. Неожиданно было обнаружено, что пациенты, которые получали двойные слепые инъекции только среды-носителя, представляющей собой PBS, и которые впоследствии получали общепринятые лекарственные препараты для перорального введения, используемые для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил, имеют более высокую частоту возникновения острой задержки мочи, требующей катетеризации мочевого пузыря, чем у пациентов, которые впоследствии получали интрапростатическую инъекцию SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu). Результаты можно найти в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Лечение
Частота возникновения острой задержкой мочи
Среда-носитель с последующим приемом лекарственных препаратов для перорального введения
4,4%
Среда-носитель с последующим приемом SEQ ID NO: 66<sup>2</sup>
2,1%
[0155] Исходя из результатов этих исследований, можно ожидать, что введение NTP-пептидов по настоящему изобретению пациентам, нуждающимся в лечении или подверженным развитию острой задержки мочи, будет иметь еще более выраженный эффект в отношении предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у пациентов, подверженных развитию острой задержки мочи. Таким образом, композиции пригодны в лечении популяции пациентов, отличающихся только от пациентов, страдающих BPH, и пригодны для предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у этой популяции пациентов. По сравнению с контролями композиции и способы способны обеспечить снижение частоты возникновения острой задержки мочи на более чем 50%.
Пример 3
[0156] В этом примере пациентам с BPH интрапростатическую инъекцию только среды-носителя, представляющей собой PBS pH 7,2, или инъекцию SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu), 2,5 мг в PBS, в двойных слепых условиях вводил уролог в учреждении под ультразвуковым контролем. Пациенты наблюдались в течение от 1 до 6 лет с регулярными физическими осмотрами, лабораторными исследованиями, оценкой симптомов и лечением. Неожиданно было обнаружено, что пациенты, которые получали двойные слепые инъекции только среды-носителя, представляющей собой PBS, и которые впоследствии получали общепринятые лекарственные препараты для перорального введения, используемые для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил, имеют значительно более высокую частоту возникновения острой задержки мочи, требующей катетеризации мочевого пузыря, чем у пациентов, которые получали SEQ ID NO: 66, и которые впоследствии получали общепринятые лекарственные препараты для перорального введения, используемые для лечения BPH, такие как классы утвержденных препаратов, перечисленных выше. Результаты можно найти в таблице 3 ниже.
Таблица 3
Лечение
Частота возникновения острой задержкой мочи
Среда-носитель с последующим приемом лекарственных препаратов для перорального введения
6,2%
SEQ ID NO: 66 с последующим приемом лекарственных препаратов для перорального введения
0%*
* p < ,02
[0157] Исходя из результатов этих исследований, можно ожидать, что введение NTP-пептидов по настоящему изобретению пациентам, нуждающимся в лечении или подверженным развитию острой задержки мочи, с последующим впоследствии введением общепринятых лекарственных препаратов для перорального введения, используемых для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил, будет иметь даже более выраженный эффект в отношении предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у пациентов, подверженных развитию острой задержки мочи. Таким образом, композиции пригодны в лечении популяции пациентов, отличающихся только от пациентов, страдающих BPH, и пригодны для предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у этой популяции пациентов.
Пример 4
[0158] Пациентам с BPH в двойных слепых условиях в учреждении под ультразвуковым контролем уролог вводил интрапростатическую инъекцию либо а) SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu) в фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2 («PBS»); либо b) SEQ ID NO: 66 в фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2 с последующей второй инъекцией SEQ ID NO: 66 в количестве 2,5 мг спустя от одного месяца до 2 лет; либо c) только среды-носителя, представляющей собой PBS, с последующим приемом общепринятых лекарственных препаратов от BPH для перорального введения, используемых для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил. Пациенты наблюдались в течение 2 лет с регулярными физическими осмотрами, лабораторными исследованиями и оценкой симптомов. Неожиданно у субъектов, которым вводили предварительную инъекцию SEQ ID NO: 66 с последующим приемом общепринятого лекарственного препарата или другой инъекции SEQ ID NO: 66, было на >75% меньше случаев возникновения острой задержки мочи по сравнению с субъектами, которым вводили только контрольную инъекцию только среды-носителя. Результаты показаны в таблице 4 ниже.
Таблица 4
Лечение
Частота возникновения острой задержкой мочи (< 24 месяцев)
Только среда-носитель
3,7%
SEQ ID NO: 66 с последующим приемом лекарственных препаратов для перорального введения или другой инъекции SEQ ID NO: 66
0,76%*
* p < ,03
[0159] Исходя из результатов этих исследований, можно ожидать, что введение NTP-пептидов по настоящему изобретению пациентам, нуждающимся в лечении или подверженным развитию острой задержки мочи, с последующим впоследствии введением NTP-пептидов или общепринятых лекарственных препаратов для перорального введения, используемых для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил, будет иметь даже более выраженный эффект в отношении предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у пациентов, подверженных развитию острой задержки мочи, при сравнении с контролями.
Пример 5
[0160] Пациентам с BPH в двойных слепых условиях в учреждении под ультразвуковым контролем уролог вводил интрапростатическую инъекцию а) SEQ ID NO: 66 (Ile-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ile-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys-Arg-Cys-Leu) в фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2 («PBS»), с последующим приемом общепринятых лекарственных препаратов от BPH для перорального введения, используемых для лечения BPH, включая альфа-блокаторы, такие как тамсулозин, теразозин, доксазозин или ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид, дутастерид или ингибиторы фосфодиэстеразы 5 типа (ингибиторы PDE5), такие как тадалафил. Пациенты наблюдались в течение не более 6 лет с регулярными физическими осмотрами, лабораторными исследованиями и оценкой симптомов; b) SEQ ID NO: 66 в фосфатно-солевом буферном растворе pH 7,2 с последующей второй инъекцией SEQ ID NO: 66 в количестве 2,5 мг спустя от одного месяца до 2 лет; или c) только среды-носителя, представляющей собой PBS. Неожиданно у субъектов, которым вводили предварительную инъекцию SEQ ID NO: 66 с последующим приемом общепринятого лекарственного препарата или другой инъекции SEQ ID NO: 66, было на >75% меньше случаев возникновения острой задержки мочи по сравнению с субъектами, которым вводили контрольную инъекцию только среды-носителя. Результаты показаны в таблице 5 ниже.
Таблица 5
Лечение
Частота возникновения острой задержкой мочи
Только среда-носитель
5,3%
SEQ ID NO: 66 с последующим приемом лекарственных препаратов для перорального введения или другой инъекции SEQ ID NO: 66
2%*
* p < ,04
[0161] Результаты вышеприведенных примеров иллюстрируют неожиданно превосходящий эффект NTP-пептидов в отношении предупреждения возникновения или снижения частоты возникновения острой задержки мочи у пациентов, подверженных развитию острой задержки мочи. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что могут быть сделаны различные модификации и изменения в способах и композициях согласно вариантам осуществления настоящего изобретения без отклонения от сущности или объема вариантов осуществления.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
<110> НЮМОКС КОРПОРЕЙШН
<120> СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ИЛИ СНИЖЕНИЯ ЧАСТОТЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ОСТРОЙ ЗАДЕРЖКИ МОЧИ
<130> 063307-0447524
<140> 15/222,365
<141> 2016-07-28
<160> 118
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 1
Met Glu Phe Ser Leu Leu Leu Pro Arg Leu Glu Cys Asn Gly Ala
1               5                   10                  15
<210> 2
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 2
Gly Ala Ile Ser Ala His Arg Asn Leu Arg Leu Pro Gly Ser Ser
1               5                   10                  15
<210> 3
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 3
Asp Ser Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met Cys
1               5                   10                  15
Thr
<210> 4
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 4
Met Cys Thr His Ala Arg Leu Ile Leu Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met
1               5                   10                  15
<210> 5
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 5
Tyr Phe Phe Leu Val Glu Met Glu Phe Leu His
1               5                   10
<210> 6
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 6
Val Gly Gln Ala Gly Leu Glu Leu Pro Thr Ser
1               5                   10
<210> 7
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 7
Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala Ser Gln Ser Ala Arg Tyr Arg Thr Gly
1               5                   10                  15
His
<210> 8
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 8
Thr Gly His His Ala Arg Leu Cys Leu Ala Asn Phe Cys Gly
1               5                   10
<210> 9
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 9
Ala Asn Phe Cys Gly Arg Asn Arg Val Ser Leu Met Cys Pro Ser Trp
1               5                   10                  15
Ser
<210> 10
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 10
Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp
1               5                   10                  15
Tyr Arg Arg
<210> 11
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 11
Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg
1               5                   10                  15
Arg
<210> 12
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 12
Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 13
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 13
Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 14
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 14
Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu
1               5                   10
<210> 15
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 15
Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu
1               5                   10                  15
Phe Phe Leu
<210> 16
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 16
Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu
1               5                   10                  15
Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro
20
<210> 17
<211> 38
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 17
Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Ala Val Pro Gly Leu Phe Ile Leu
1               5                   10                  15
Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln
20                  25                  30
Trp Cys Asp His Ser Ser
35
<210> 18
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 18
Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5
<210> 19
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 19
Phe Ile Leu Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu
1               5                   10
<210> 20
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 20
Phe Ile Leu Phe Phe Leu Arg His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp
1               5                   10                  15
Glu Val Gln Trp Cys Asp His Ser Ser
20                  25
<210> 21
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 21
His Arg Cys Pro Thr Leu Thr Gln Asp Glu Val Gln Trp Cys Asp His
1               5                   10                  15
Ser Ser Leu Gln Pro Ser Thr Pro Glu Ile Lys His Pro
20                  25
<210> 22
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 22
Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met His
1               5                   10
<210> 23
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 23
Asp Met His His Tyr Thr Trp Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe
1               5                   10                  15
Leu Arg
<210> 24
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 24
His Tyr Thr Trp Leu Ile Phe Ile Phe Ile Phe Asn Phe Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Asn
<210> 25
<211> 45
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 25
Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Arg Asn Leu Gly Ser Leu Gln
1               5                   10                  15
Pro Leu Pro Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser
20                  25                  30
Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe
35                  40                  45
<210> 26
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 26
Pro Gly Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp
1               5                   10                  15
Tyr Arg Arg
<210> 27
<211> 24
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 27
Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg
1               5                   10                  15
Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe
20
<210> 28
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 28
Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 29
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 29
Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 30
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 30
Ser Ser Trp Asp Tyr
1               5
<210> 31
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 31
Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5
<210> 32
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 32
Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Pro Pro Arg Leu Ala Asn Phe Phe Val
1               5                   10                  15
Phe Leu Val Glu Met Gly Phe Thr Met
20                  25
<210> 33
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 33
Phe Val Phe Leu Val Glu Met Gly Phe Thr Met
1               5                   10
<210> 34
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 34
Met Gly Phe Thr Met Phe Ala Arg Leu Ile Leu Ile Ser Gly Pro Cys
1               5                   10                  15
Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser
20
<210> 35
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 35
Ile Ser Gly Pro Cys
1               5
<210> 36
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 36
Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val Ser
1               5                   10                  15
His
<210> 37
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 37
Gly Val Ser His His Ala Arg Leu Ile Phe Asn Phe Cys Leu Phe Glu
1               5                   10                  15
Met
<210> 38
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 38
Asn Phe Cys Leu Phe Glu Met Glu Ser His
1               5                   10
<210> 39
<211> 46
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 39
Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp Pro Asn Leu Gly Ser Leu Gln
1               5                   10                  15
Pro Leu Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser
20                  25                  30
Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn Phe
35                  40                  45
<210> 40
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 40
Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp
1               5                   10                  15
Asp Tyr Gly
<210> 41
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 41
Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His
1               5                   10
<210> 42
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 42
Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr
1               5
<210> 43
<211> 37
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 43
Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His Leu Pro Pro His Pro Ala Asn Phe Cys
1               5                   10                  15
Ile Phe Ile Arg Gly Gly Val Ser Pro Tyr Leu Ser Gly Trp Ser Gln
20                  25                  30
Thr Pro Asp Leu Arg
35
<210> 44
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 44
Pro Gly Phe Phe Lys Leu Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp
1               5                   10                  15
Asp Tyr Arg Arg
20
<210> 45
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 45
Pro Glu Leu Lys Gln Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp
1               5                   10                  15
Tyr Arg Arg
<210> 46
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 46
Pro Pro Gly Leu Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp
1               5                   10                  15
Asp Tyr Gly
<210> 47
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 47
Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Gly His
1               5                   10
<210> 48
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 48
Ser Thr Cys Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 49
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 49
Phe Ser Cys Pro Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 50
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 50
Leu Ser Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr
1               5
<210> 51
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 51
Leu Ser Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 52
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 52
Ser Leu Leu Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5                   10
<210> 53
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 53
Leu Pro Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5
<210> 54
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 54
Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg
1               5
<210> 55
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 55
Ser Ser Trp Asp Tyr
1               5
<210> 56
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 56
Ser Ser Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Leu Phe Phe Leu
1               5                   10
<210> 57
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 57
Trp Asp Tyr Arg Arg Phe Ile Phe Asn Phe Leu
1               5                   10
<210> 58
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 58
Phe Asn Phe Cys Leu Phe
1               5
<210> 59
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 59
Phe Ile Phe Asn Phe Leu
1               5
<210> 60
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 60
Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly Ile Thr Gly Met
1               5                   10
<210> 61
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 61
Pro Ala Ser Ala Ser Gln Val Ala Gly Thr Lys Asp Met
1               5                   10
<210> 62
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 62
Pro Ala Ser Ala Ser Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val
1               5                   10
<210> 63
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 63
Pro Ala Ser Ala Ser Pro Val Ala Gly
1               5
<210> 64
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 64
Phe Phe Leu Val Glu Met
1               5
<210> 65
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 65
Ser Val Thr Gln Ala Gly Val Gln Trp
1               5
<210> 66
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 66
Ile Asp Gln Gln Val Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys
1               5                   10                  15
Leu
<210> 67
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 67
Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys
1               5
<210> 68
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 68
Gly Asp His Gly Arg Pro Asn Leu Ser Arg Leu Lys Leu Ala Ile Lys
1               5                   10                  15
Tyr Glu Val Lys Lys Met
20
<210> 69
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 69
Gln Gln Ser Ile Ala Val Lys Phe Leu Ala Val Phe Gly Val Ser Ile
1               5                   10                  15
<210> 70
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 70
Gly Leu Leu Phe Pro Val Phe Ser Val Cys Tyr Leu Ile Ala Pro Lys
1               5                   10                  15
Ser Pro Leu Gly Leu
20
<210> 71
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 71
Met Met Val Cys Trp Asn Arg Phe Gly Lys Trp Val Tyr Phe Ile
1               5                   10                  15
<210> 72
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 72
Ser Ala Ile Phe Asn Phe Gly Pro Arg Tyr Leu Tyr His Gly Val
1               5                   10                  15
<210> 73
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 73
Pro Phe Tyr Phe Leu Ile Leu Val Arg Ile Ile Ser Phe Leu Ile
1               5                   10                  15
<210> 74
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 74
Gly Asp Met Glu Asp Val Leu Leu Asn Cys Thr Leu Leu Lys Arg
1               5                   10                  15
<210> 75
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 75
Ser Ser Arg Phe Arg Phe Trp Gly Ala Leu Val Cys Ser Met Asp
1               5                   10                  15
<210> 76
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 76
Ser Cys Arg Phe Ser Arg Val Ala Val Thr Tyr Arg Phe Ile Thr
1               5                   10                  15
<210> 77
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 77
Leu Leu Asn Ile Pro Ser Pro Ala Val Trp Met Ala Arg Asn Thr
1               5                   10                  15
<210> 78
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 78
Met Ala Gln Ser Arg Leu Thr Ala Thr Ser Ala Ser Arg Val Gln
1               5                   10                  15
<210> 79
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 79
Ala Ile Leu Leu Ser Gln Pro Pro Lys Gln Leu Gly Leu Arg Ala
1               5                   10                  15
<210> 80
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 80
Pro Ala Asn Thr Pro Leu Ile Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Gly
1               5                   10                  15
<210> 81
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 81
Phe His His Ile Cys Gln Ala Gly Leu Lys Leu Leu Thr Ser Gly
1               5                   10                  15
<210> 82
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 82
Asp Pro Pro Ala Ser Ala Phe Gln Ser Ala Gly Ile Thr Gly Val
1               5                   10                  15
<210> 83
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 83
Ser His Leu Thr Gln Pro Ala Asn Leu Asp Lys Lys Ile Cys Ser
1               5                   10                  15
<210> 84
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 84
Asn Gly Gly Ser Cys Tyr Val Ala Gln Ala Gly Leu Lys Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ser Cys Asn Pro Ser Lys
20
<210> 85
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 85
Met Trp Thr Leu Lys Ser Ser Leu Val Leu Leu Leu Cys Leu Thr
1               5                   10                  15
<210> 86
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 86
Cys Ser Tyr Ala Phe Met Phe Ser Ser Leu Arg Gln Lys Thr Ser
1               5                   10                  15
<210> 87
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 87
Glu Pro Gln Gly Lys Val Pro Cys Gly Glu His Phe Arg Ile Arg
1               5                   10                  15
<210> 88
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 88
Gln Asn Leu Pro Glu His Thr Gln Gly Trp Leu Gly Ser Lys Trp
1               5                   10                  15
<210> 89
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 89
Leu Trp Leu Leu Phe Ala Val Val Pro Phe Val Ile Leu Lys Cys
1               5                   10                  15
<210> 90
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 90
Gln Arg Asp Ser Glu Lys Asn Lys Val Arg Met Ala Pro Phe Phe
1               5                   10                  15
<210> 91
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 91
Leu His His Ile Asp Ser Ile Ser Gly Val Ser Gly Lys Arg Met Phe
1               5                   10                  15
<210> 92
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 92
Glu Ala Tyr Tyr Thr Met Leu His Leu Pro Thr Thr Asn Arg Pro
1               5                   10                  15
<210> 93
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 93
Lys Ile Ala His Cys Ile Leu Phe Asn Gln Pro His Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
<210> 94
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 94
Ser Asn Ser His Ser His Pro Asn Pro Leu Lys Leu His Arg Arg
1               5                   10                  15
<210> 95
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 95
Ser His Ser His Asn Arg Pro Arg Ala Tyr Ile Leu Ile Thr Ile
1               5                   10                  15
<210> 96
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 96
Leu Pro Ser Lys Leu Lys Leu Arg Thr His Ser Gln Ser His His
1               5                   10                  15
<210> 97
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 97
Asn Pro Leu Ser Arg Thr Ser Asn Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Leu
1               5                   10                  15
Met Thr Ser Ser Lys Pro Arg
20
<210> 98
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 98
Ser Ser Ser Leu Gly Leu Pro Lys Cys Trp Asp Tyr Arg His Glu
1               5                   10                  15
<210> 99
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 99
Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Ile Asn Phe Arg Val Met Ala Cys
1               5                   10                  15
<210> 100
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 100
Thr Phe Lys Gln His Ile Glu Leu Arg Gln Lys Ile Ser Ile Val
1               5                   10                  15
<210> 101
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 101
Pro Arg Lys Leu Cys Cys Met Gly Pro Val Cys Pro Val Lys Ile
1               5                   10                  15
<210> 102
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 102
Ala Leu Leu Thr Ile Asn Gly His Cys Thr Trp Leu Pro Ala Ser
1               5                   10                  15
<210> 103
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 103
Met Phe Val Phe Cys Leu Ile Leu Asn Arg Glu Lys Ile Lys Gly
1               5                   10                  15
<210> 104
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 104
Gly Asn Ser Ser Phe Phe Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ser Phe Gln
1               5                   10                  15
<210> 105
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 105
Asn Cys Cys Gln Cys Phe Gln Cys Arg Thr Thr Glu Gly Tyr Ala
1               5                   10                  15
<210> 106
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 106
Val Glu Cys Phe Tyr Cys Leu Val Asp Lys Ala Ala Phe Glu Cys Trp
1               5                   10                  15
Trp Phe Tyr Ser Phe Asp Thr
20
<210> 107
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 107
Met Glu Pro His Thr Val Ala Gln Ala Gly Val Pro Gln His Asp
1               5                   10                  15
<210> 108
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 108
Leu Gly Ser Leu Gln Ser Leu Leu Pro Arg Phe Lys Arg Phe Ser
1               5                   10                  15
<210> 109
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 109
Cys Leu Ile Leu Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Arg Asn Met Asn Thr
1               5                   10                  15
<210> 110
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 110
Ala Leu Ile Lys Arg Asn Arg Tyr Thr Pro Glu Thr Gly Arg Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 111
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 111
Ile Asp Gln Gln Val Leu Ser Arg Ile
1               5
<210> 112
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 112
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys Leu
1               5
<210> 113
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 113
Val Leu Ser Arg Ile Lys
1               5
<210> 114
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 114
Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys
1               5
<210> 115
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 115
Val Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile Lys Arg Cys Leu
1               5                   10
<210> 116
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 116
Ile Asp Gln Gln Val Leu Ser Arg Ile Lys Leu Glu Ile
1               5                   10
<210> 117
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 117
Glu Thr Glu Ser His
1               5
<210> 118
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетическая
6xHis-метка
<400> 118
His His His His His His
1               5
<---