ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНА СЫВОРОТОЧНОГО АМИЛОИДА А В ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ГЛАУКОМЫ И ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИГЛАУКОМАТОЗНЫХ СРЕДСТВ
APPLICATION OF SERUMAL AMYLOID GENE A IN DIAGNOSTICS AND TREATMENT OF GLAUCOMA AND DETERMINATION OF ANTIGLAUCOMA AGENTS

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области диагностики и лечения глаукомы. В частности, изобретение включает способы и композиции для диагностики и лечения глаукомы и для определения средств, потенциально применимых для лечения глаукомы.
Уровень техники
Существует ряд состояний глаз, которые вызваны или осложняются повреждением диска зрительного нерва, дегенерацией тканей глаза и/или повышенным внутриглазным давлением. Например, «глаукомы» представляют собой группу инвалидизирующих заболеваний глаз, которые являются главной причиной необратимой слепоты в Соединенных Штатах и других развитых странах. Первичная открытоугольная глаукома («ПОУГ» («POAG»)) является наиболее частой формой глаукомы. Заболевание характеризуется дегенерацией трабекулярной сети, приводящей к обструкции нормальной способности водянистой жидкости покидать глаз без закрытия пространства (например, «угла») между радужкой и роговицей (Vaughan, D. еt al., (1992)). Особенностью такой обструкции при этом заболевании является повышенное внутриглазное давление («ВГД» («IOP»)), приводящее к прогрессирующей потере зрения и слепоте, если своевременно не проводится соответствующего лечения. По оценкам, заболевание поражает от 0,4% до 3,3% всех взрослых старше 40 лет (Leske, M.C. et al. (1986); Bengtsson, В. (1989)); Strong, N.P. (1992)). Более того, частота заболевания увеличивается с возрастом до более 6% в 75 лет и старше (Strong, N.P., (1992)).
Глаукома поражает три отдельных ткани глаза. Повышенное ВГД, ассоциированное с ПОУГ, возникает из-за морфологических и биохимических изменений в трабекулярной сети (ТС (ТМ)), ткани, расположенной в углу между роговицей и радужкой. Большая часть питательной водянистой жидкости выходит из переднего сегмента глаза через ТС. Прогрессирующая потеря клеток ТС и накопление внеклеточного дебриса в ТС глаза с глаукоматозными изменениями приводит к повышению резистентности оттоку жидкости, таким образом повышая ВГД. Повышенное ВГД, а также другие факторы, такие как ишемия, вызывают дегенеративные изменения в диске зрительного нерва (ДЗН) (ONP)), приводящие к прогрессирующему «углублению» ДЗН и потере ганглиозных клеток и аксонов сетчатки. Точные молекулярные механизмы, ответственные за глаукоматозное повреждение ТС, ДЗН и ганглиозных клеток сетчатки, неизвестны.
Двадцать лет назад взаимодействие внутриглазной гипертензии, ишемии и механического истощения зрительного нерва подробно обсуждалось в качестве основных факторов, вызывающих прогрессирование потери полей зрения при глаукоме. С тех пор другие факторы, включающие эксцитотоксичность, оксид азота, отсутствие жизненно важных нейтротрофических факторов, нарушенные глиальное/нейрональное взаимодействие и генетика, были включены в дегенеративный процесс заболевания. Рассмотрение молекулярной генетики заслуживает некоторого обсуждения, поскольку оно может в конечном счете определять механизм клеточной смерти и позволит выделить различные формы глаукомы. В течение последних 10 лет более 15 различных генов глаукомы были картированы и 7 генов глаукомы определены. Они включают шесть картированных генов (GLC1A-GLC1F) и два идентифицированных гена (MYOC и OPTN) для первичной открытоугольной глаукомы, два картированных гена (GLC3A-GLC3B) и один идентифицированный ген для врожденной глаукомы (CYP1B1), два картированных гена для пигментного рассасывания/пигментной глаукомы и ряд генов связанных с развитием или синдромных форм глаукомы (FOXC1, PITX2, LMX1B, PAX6).
Следовательно, каждая форма глаукомы может иметь уникальную патологию, и соответственно может требоваться различный терапевтический подход к ведению заболевания. Например, лекарственное средство, которое влияет на экспрессию ферментов, которые разлагают внеклеточный матрикс диска зрительного нерва, видимо, не предотвращает смерти ГКС, вызываемой эксцитотоксичностью. При глаукоме смерть ГКС происходит посредством процесса, называемого апоптозом (запрограммированная клеточная смерть). Было сделано предположение, что различные типы повреждений, которые могут вызывать смерть, могут делать это посредством объединения в несколько общих путей. Определение цели воздействия по ходу общего пути является стратегией, которая может расширить полезность лекарственного средства и увеличить возможность того, что оно будет полезным в ведении различных форм заболевания. Однако лекарственные средства, которые действуют на множество метаболических путей, более вероятно, вызывают нежелательные побочные эффекты. С появлением диагностических наборов на основе генов для определения специфических форм глаукомы, могут быть протестированы селективные нейропротективные средства с целью уменьшения степени вариабельности около измеряемого ответа.
В настоящее время глаукому диагностируют на основании специфических признаков заболевания (характерные изменения диска зрительного нерва и потеря полей зрения). Однако половина популяции с глаукомой не подозревают, что у них есть такое заболевание, приводящее к слепоте, и к моменту, когда им ставят диагноз, они уже имеют необратимую потерю приблизительно 30-50% ганглиозных клеток сетчатки. Следовательно, необходимы улучшенные методы для ранней диагностики глаукомы.
Существующее лечение глаукомы направлено на снижение ВГД, основной фактор риска развития и прогрессирования глаукомы. Однако ни одно из существующих вариантов лечения снижения ВГД фактически не вмешивается в процесс глаукомы, ответственный за повышение ВГД, и прогрессирующее повреждение переднего сегмента продолжается. Существует одна возможная причина, почему большинство пациентов становятся «резистентными» к обычному лечению глаукомы. Следовательно, существует необходимость в терапевтическом способе изменения (ингибирования или даже обращения) патологического процесса.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение преодолевает эти и другие недостатки предшествующего уровня техники посредством разработки способов диагностики и композиций для лечения глаукомы. В одном аспекте настоящее изобретение включает способ для лечения глаукомы посредством введения пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей средство, которое взаимодействует с геном, кодирующим белок сывороточный амилоид А (SAA), или с промоторной последовательностью гена. Взаимодействие между средством и геном, кодирующим SAA, или с его промоторной последовательностью модулирует экспрессию SAA таким образом, что глаукоматозное состояние пациента подвергается лечению. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения средством будет белок, пептид, пептидомиметик, небольшая молекула или нуклеиновая кислота.
В другом аспекте настоящее изобретение включает способ лечения глаукомы посредством введения пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей средство, которое ингибирует взаимодействие белка сывороточного амилоида А (SAA) с его рецептором. Предпочтительно средствами будут агонисты α-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARα), пептиды тахикининов и их непептидные аналоги или α-липоевая кислота. Наиболее предпочтительно средством будет фенофибрат, Wy-14643, (4-хлор-6-(2,3-ксилидино)-2-пиримидинилтиол)уксусная кислота), ципрофибрат, 2-бромгексадекановая кислота, безафибрат и циглитазон, бафиломицин, конканамицин и псевдоларовая кислота В.
Настоящее изобретение дополнительно включает фармацевтическую композицию для лечения глаукомы, содержащую терапевтически эффективное количество антагониста белка сывороточного амилоида А (SAA) и фармацевтический носитель. Антагонистом, содержащимся в композиции, может быть любое из соединений, определенных выше.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение включает способ диагностики глаукомы, предусматривающий следующие стадии:
а) получение биологического образца от пациента; и
b) анализ указанного образца для определения аберрантного уровня, аберрантной биоактивности или мутаций гена, кодирующего белок сывороточный амилоид А (SAA) или его промоторной области, или его генетических продуктов, где указанный ген, кодирующий SAA, включает последовательность, указанную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, где его промоторная область включает последовательность, указанную в SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, и где SAA включает последовательность, указанную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4;
где аберрантно высокий уровень, аберрантно высокая биоактивность или мутации генов SAA или генных продуктов указывают на диагноз глаукомы.
В предпочтительных аспектах биологическим образцом является ткань глаза, слеза, водянистая жидкость, спинномозговая жидкость, мазок из носа или щеки или сыворотка. Наиболее предпочтительно биологический образец включает клетки трабекулярной сети.
Альтернативно настоящее изобретение включает способ для диагностики глаукомы у пациента, предусматривающий стадии:
а) получение клеток от пациента;
b) выделение нуклеиновой кислоты из клеток;
с) контактирование образца с одним или более праймерами, которые специфически гибридизуются с 5'- и 3'-концами, по меньшей мере, одного аллеля SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13 в таких условиях, что осуществляется гибридизация и амплификация аллеля; и
d) определение продукта амплификации;
где аберрантный уровень или мутации SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13 в образцах указывают на диагноз глаукомы.
Настоящее изобретение также включает способ определения средств, потенциально применимых для лечения глаукомы, посредством стадий:
a) получение клеток, экспрессирующих SAA (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2) или клеток, содержащих промотор/репортер гена SAA, таким образом, что экспрессируется ген репортер;
b) смешивание вещества-кандидата с клетками; и
с) определение уровня белка SAA (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4) или уровня экспрессии гена в клетках;
где увеличение или снижение продукции белка SAA или экспрессии гена в присутствии указанного вещества-кандидата указывает на средство, потенциально применимое для лечения глаукомы.
В другом аспекте настоящее изобретение включает способ для определения средства, потенциально применимого для лечения глаукомы, посредством стадий:
a) формирование реакционной смеси, содержащей:
(i) белок SAA или клетку, экспрессирующую SAA или ген репортер, запускаемый промотором SAA;
(ii) компонент, связывающий белок SAA; и
(iii) тестируемое соединение; и
b) определение взаимодействия белка SAA и связывающего компонента или уровня продуктов гена репортера в присутствии тестируемого соединения и в отсутствие тестируемого соединения;
где снижение или увеличение во взаимодействии белка SAA с его связывающим компонентом в присутствии тестируемого соединения относительно взаимодействия в отсутствие тестируемого соединения указывает на потенциальную применимость средства для лечения глаукомы.
В другом аспекте настоящее изобретение включает способ для определения средства, потенциально применимого для лечения глаукомы, посредством стадий:
а) образование реакционной смеси, содержащей:
(i) клетки, включающие рекомбинантный белок SAA (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4) или клетки, включающие векторы экспрессии, включающие SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3; и
(ii) тестируемое соединение; и
d) определение воздействия на нижерасположенные участки пути передачи сигнала (ИЛ-8) в присутствии тестируемого соединения и в отсутствие тестируемого соединения;
где снижение или усиление передачи сигнала в нижерасположенных участках в присутствии тестируемого соединения относительно взаимодействия в отсутствие тестируемого соединения указывает на потенциальную применимость средства для лечения глаукомы.
В предпочтительных аспектах клетками, содержащими белок SAA или векторы экспрессии, будут клетки HL-60.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дальнейшей демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято посредством ссылок на эти чертежи в комбинации с подробным описанием специфических вариантов осуществления, представленных в настоящем описании.
Фиг.1. КПЦР анализ экспрессии SAA в 12 клетках с глаукоматозными изменениями по сравнению с 11 нормальными клетками ТС. НТС и ГТС представляют средний уровень экспрессии гена в нормальной группе и в группе с глаукомой соответственно.
Фиг.2А. КПЦР анализ экспрессии SAA в клеточных линиях ТС.НТС и ГТС представляют средний уровень экспрессии гена в нормальной группе и в группе с глаукомой соответственно.
Фиг.2В. КПЦР анализ экспрессии SAA в тканях диска зрительного нерва. НТС и ГТС представляют средний уровень экспрессии гена в нормальной группе и в группе с глаукомой соответственно.
Фиг.3. Белок SAA в тканях ТС от здоровых доноров и доноров с глаукомой (n=6). Значительное увеличение (в 3 раза) SAA наблюдали в тканях ТС при глаукоме по сравнению с нормальными тканями (р=0,031). Столбики показывают среднее ± s.e.m.
Фиг.4. Белок SAA, определенный посредством ELISA в человеческой водянистой жидкости от здоровых лиц и пациентов с глаукомой. Значения выражены как среднее SAA в нг/мл водянистой жидкости ± s.e.m. (p=0,005).
Фиг.5. Секреция ИЛ-8 клетками HL-60 в ответ на увеличение концентраций pSAA.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Глаукома представляет собой гетерогенную группу зрительных нейропатий, которые обладают определенными клиническими характеристиками. Потеря зрения при глаукоме происходит из-за селективной гибели ганглиозных клеток сетчатки в невральной сетчатке, что клинически диагностируется по характерным изменениям в поле зрения, дефектах слоя нервных волокон и прогрессивном углублении ДЗН. Одним из важных факторов риска для развития глаукомы является присутствие глазной гипертензии (повышенное внутриглазное давление, ВГД). Видимо, ВГД также вовлечено в патогенез нормотензивной глаукомы, когда пациенты имеют, что часто рассматривается как нормальное ВГД. Повышенное ВГД, ассоциированное с глаукомой, возникает из-за повышенной резистентности оттоку водянистой жидкости в трабекулярной сети (ТС), небольшой специализированной ткани, расположенной в углу радужки-роговицы передней камеры глаза. Глаукоматозные изменения в ТС включают потерю клеток ТС и отложение и накопление внеклеточного дебриса, включающих белковое бляшкоподобное вещество. Кроме того, также существуют изменения, которые появляются в диске зрительного нерва (ДЗН) при глаукоме. В глазах с глаукоматозными изменениями существуют морфологические и подвижные изменения в глиальных клетках ДЗН. В ответ на повышенное ВГД и/или преходящие ишемические повреждения возникают изменения в строении внеклеточного матрикса ДЗН и изменения морфологии глиальных клеток и аксонов нейронов сетчатки.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что экспрессия мРНК и белка сывороточного амилоида A (SAA) значительно повышается в тканях и клетках ТС с глаукоматозными изменениями. Авторы изобретения подтвердили дифференциальную экспрессию мРНК, наблюдаемую с использованием генных чипов Affymetrix количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (КПЦР) и повышенный уровень белка SAA посредством ELISA SAA. Таким образом, впервые было показано, что SAA экспрессируется в ТС.
Человеческий SAA включает ряд небольших дифференциально экспрессируемых аполипопротеинов, кодируемых генами, расположенными на коротком плече хромосомы 11. Существуют четыре изоформы SAA. SAA 1 (SEQ ID NO: 2), кодируемый SEQ ID NO: 1, и SAA2 (SEQ ID NO: 4), кодируемый SEQ ID NO: 3, известны как острой фазы вещества, как С-реактивный белок, то есть они значительно стимулируются провоспалительными цитокинами. 5' UTR промотерные участки генов SAA1 и SAA2 также представлены (SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно). SAA3 (SEQ ID NO: 3) является псевдогеном и SAA4 (SEQ ID NO: 6) геном, экспрессируемым на низком уровне постоянно, кодирующим конститутивный SAA4 (SEQ ID NO: 7). SAA2 имеет две изоформы, SAA2a (SEQ ID NO: 9), кодируемый SEQ ID NO: 8, и SAA2P (SEQ ID NO: 11), кодируемый SEQ ID NO: 10, которые отличаются только одной аминокислотой. Белки SAA1 и SAA2 являются на 93,5% идентичными на уровне аминокислот (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO:4 соответственно) и такие гены являются на 96,7% идентичными на уровне нуклеотидов (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3 соответственно).
SAA представляет собой вещество острой фазы, чей уровень в крови повышается приблизительно в 1000 раз как часть ответа тела на различные повреждения, включая травму, инфекцию, воспаление и неоплазию. В реакции острой фазы печень рассматривается как первичный источник экспрессии. Однако внепеченочная экспрессия SAA описана исходно в тканях мыши и позднее в человеческих атеросклеротических патологических изменениях (O'Hara et al., 2000). Впоследствии мРНК SAA была обнаружена широко экспрессирующейся во множестве гистологически нормальных человеческих тканей. Локализованная экспрессия была отмечена во множестве тканей, включая молочную железу, желудок, тонкий и толстый кишечник, предстательную железу, легкие, поджелудочную железу, почки, миндалины, щитовидную железу, гипофиз, плаценту, эпидермис кожи и нейроны головного мозга. Экспрессию также наблюдали в лимфоцитах, плазматических клетках и эндотелиальных клетках. Сообщали об экспрессии белка SAA совместно с экспрессией мРНК SAA в гистологически нормальных человеческих внепеченочных тканях (Liang et al. 1997; Urieli-Shoval et al. 1998).
Изоформы SAA являются аполипопротеинами, которые становятся главным компонентом липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме крови млекопитающих и замещают A-I (ApoA-I) и фосфолипид в частицах ЛПВП (Miida et al. 1999). SAA связывает холестерин и может служить в качестве транзиторного белка, связывающего холестерин. Кроме того, повышенная экспрессия SAA1 или SAA2 приводит к образованию линейных волокон в отложениях амилоида, которые могут приводить к патологии (Uhlar and Whitehead 1999; Liang et al. 1997). SAA играет важную роль в инфекциях, воспалении и в стимуляции восстановления тканей. Концентрация SAA может увеличиваться до 1000 раз после воспаления, инфекции, некроза и быстро снижаться после выздоровления. Следовательно, концентрация SAA сыворотки расценивается как применимый маркер, посредством которого отслеживается активность воспалительного заболевания. Печеночный биосинтез SAA стимулируется провоспалительными цитокинами, приводя к острофазовому ответу. Хронически повышенные концентрации SAA являются предпосылками в патогенезе вторичного амилоидоза, прогрессирующего и иногда смертельного заболевания, характеризующегося отложением в основных органах нерастворимых бляшек, состоящих преимущественно из протеолитически расщепленного SAA. Такой же процесс также может приводить к атеросклерозу. Существует требование для положительных и отрицательных контрольных механизмов SAA для поддержания гомеостаза. Такие механизмы делают возможной быструю индукцию экспрессии SAA для выполнения функций защиты организма-носителя, но они также должны обеспечить, чтобы экспрессия SAA быстро возвращалась к исходному уровню для предотвращения амилоидоза. Такие механизмы включают модуляцию промоторной активности, включающей, например, индуктор ядерный фактор kB (NF-kB) и его ингибитор IkB, стимуляции факторов транскрипции ядерного фактора для семейства интерлейкина-6 (NF-IL6), и гены-репрессоры транскрипции, такие как ин и ян 1 (YY1). Посттранскрипционная модуляция, включающая изменения стабильности и трансляционной эффективности мРНК, делает возможным достижение стимулирующего и подавляющего контроля синтеза белка SAA. На последних стадиях ОФ ответа экспрессия SAA эффективно подавляется посредством увеличенной продукции антагонистов цитокинов, таких как антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra) и растворимых рецепторов цитокинов, приводящих к меньшей передаче сигнала, осуществляемого провоспалительными цитокинами (Jensen and Whitehead 1998).
Существует несколько сообщений, предполагающих, что первичный амилоидоз может быть ассоциирован с глаукомой. Например, было обнаружено, что амилоид откладывался в различных тканях глаза, включая стекловидное тело, сетчатку, сосудистую оболочку глаза, радужку, хрусталик и ТС, у пациентов с первичным системным амилоидозом (Schwartz et al. 1982). Ermilov et al. (1993) сообщает, что в 478 глазах 313 пациентов, в возрасте от 25 до 90 лет с катарактой, глаукомой и/или сахарным диабетом, 66 (14%) глаз содержали амилоидный-псевдоэксфолиативный амилоид (ПЭА (PEA)). Krasnov et al. (1996) сообщают, что в 44,4% из 115 пациентов и открытоугольной глаукомой выявили внеклеточные отложения амилоида. Амилоидоз был выявлен в склере в 82% случаев и в радужке в 70% случаев. При ряде клинических состояний, включая болезнь Альцгеймера, проявляется нарушенное отложение амилоида в тканях, ассоциированное с заболеванием. Однако амилоиды являются молекулярно гетерогенными и кодируются различными генами амилоидов. Предыдущие сообщения являются неясными в отношении того, какой амилоид(ы) может быть ассоциирован с глаукомой. Авторы настоящего изобретения показали, во-первых, что экспрессия гена SAA значительно повышена в тканях ТС с глаукоматозными изменениями. Повышенный SAA может быть вовлечен в образование повышенного ВГД и повреждение зрительного нерва, приводящее к потере зрения у пациентов с глаукомой. Настоящее изобретение включает способы применения обнаружения повышенной экспрессии SAA для диагностики глаукомы. Настоящее изобретение, кроме того, включает способы определения средств, которые нарушают экспрессию или функцию SAA, с целью определения потенциальных антиглаукоматозных средств. В другом аспекте настоящее изобретение включает способы и композиции для применения средств, которые являются антагонистами эффектов SAA и/или взаимодействия SAA с другими белками, для лечения глаукомы.
Диагностика глаукомы
На основании открытия авторов изобретения, что отдельные пациенты с глаукомой имеют повышенный уровень экспрессии SAA, настоящее изобретение обеспечивает множество способов для диагностики глаукомы. Определенные способы изобретения могут определять мутации в последовательности нуклеиновой кислоты, которые приводят к несоответствующим образом высоким уровням белка SAA. Такая диагностика может быть разработана на основании известной последовательности нуклеиновой кислоты человеческого SAA или закодированной последовательности аминокислот (см. Miller 2001). Другие способы могут быть разработаны на основании геномной последовательности человеческого SAA или последовательности генов, которые регулируют экспрессию SAA.
Другие способы могут быть разработаны на основании изменения уровня экспрессии гена SAA на уровне мРНК.
В альтернативных вариантах осуществления изобретения способы по изобретению могут определять активность или уровень сигнальных белков SAA или генов, кодирующих сигнальные белки SAA. Например, могут быть разработаны способы, которые определяют несоответствующим образом низкую сигнальную активность SAA, включая, например, мутации, которые приводят к несоответствующему функционированию сигнальных компонентов SAA, включая индукцию SАA ИЛ-8. Кроме того, методики, не основанные на нуклеиновых кислотах, могут быть использованы для определения нарушений в количестве или специфической активности любого из этих сигнальных белков SAA.
Множество средств в настоящее время доступны специалисту в данной области для определения необычного уровня или активности генов и продуктов генов. Такие способы хорошо известны и стали рутинными для специалиста в данной области. Например, множество способов доступны для определения специфических аллелей человеческих полиморфных локусов. Предпочтительный способ определения специфических полиморфных аллелей будет зависеть частично от молекулярной природы полиморфизма. Различные аллельные формы полиморфного локуса могут различаться одной парой основания ДНК. Такие полиморфизмы одного нуклеотида (или SNP) являются основными вносящими вклад в генетическое разнообразие, включая почти 80% всех известных полиморфизмов, и их плотность в геноме человека оценивается как в среднем 1 на 1000 пар оснований. Множество способов доступны для определения присутствия определенного полиморфного аллеля однонуклеотидного у пациента. Успехи в этой области обеспечили точное, простое и недорогое широкомасштабное генотипирование SNP. Например, см. патент США № 4656127; Французский патент 2650840; заявку РСТ № WO91/02087; заявку РСТ № WO92/15712; Komher et al. 1989; Sokolov 1990; Syvanen et al. 1990; Kuppuswamy et al. 1991; Prezant et al. 1992; Ugozzoli et al 1992; Nyren et al. 1993; Roest et al. 1993; и van der Luijt et al. 1994).
Любой тип клеток или ткани может быть использован для получения образца нуклеиновой кислоты для применения в диагностике, описанной в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец ДНК получают из жидкости тела, например крови, полученной известными методиками (например, венопункция), или буккальных клеток. Наиболее предпочтительно образцы для применения в способах по настоящему изобретению получают из крови или буккальных клеток. Альтернативно исследование нуклеиновой кислоты может проводиться на сухих образцах (например, волосы или кожа).
Диагностические методики также могут быть проведены in situ непосредственно на сечениях тканей (фиксированных и/или замороженных) тканей пациента, полученных из биопсии или резекции, так что нет необходимости в очистке нуклеиновой кислоты. Реагенты нуклеиновой кислоты могут быть использованы в качестве зондов для таких методик in situ (см, например, Nuovo 1992).
В добавление к способам, которые акцентированы главным образом на определении одной последовательности нуклеиновой кислоты, также могут быть оценены профили в таких схемах определения. Профили пептидной карты могут быть созданы, например, посредством использования различных методик визуализации, нозерн-анализа и/или ОТ-ПЦР.
Предпочтительным способом определения является гибридизация с использованием аллелеспецифических зондов, перекрывающих участок по меньшей мере одного аллеля сигнального компонента SAA, который является показательным для глаукомы и имеет около 5, 10, 20, 25 или 30 соседних нуклеотидов вокруг мутации или полиморфного участка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения несколько зондов, способных гибридизоваться специфически с другими аллельными вариантами, включенными в глаукому, прикрепляются к твердофазной подложке, например «чипу» (который может нести до 250000 олигонуклеотидов). Олигонуклеотиды могут быть связаны с твердой подложкой посредством множества способов, включая литографию. Анализ определения мутации с использованием таких чипов, включающих олигонуклеотиды, также называемый «группа ДНК-зондов» описан, например, в Cronin et al. (1996). В одном варианте осуществления изобретения осколок включает все аллельные варианты по меньшей мере одного полиморфного участка гена. Затем твердофазная подложка контактирует с исследуемой нуклеиновой кислотой, и определяют гибридизацию со специфическими зондами. Соответственно идентификация множества аллельных вариантов одного или более генов может быть получена в простом эксперименте гибридизации.
Такие методики могут, кроме того, включать стадию амплификации нуклеиновой кислоты перед анализом. Методики амплификации известны специалисту в области техники и включают, но не ограничиваются перечисленными, клонирование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), полимеразную цепную реакцию специфических аллелей (ASA), лигазную цепную реакцию (ЛЦР), гнездную полимеразную цепную реакцию, самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Guatelli et al. 1990), транскрипционную систему амплификации (Kwoh et al. 1989), и Q-бета репликазу (Lizardi, et al. 1988).
Продукты амплификации могут быть оценены множеством путей, включая анализ размера, переработку рестриктазами после анализа размера, определение специфических заякоренных олигонуклеотидных праймеров в продукты реакции, гибридизацию олигонуклеотидов, специфичных к аллелям (ASO), определение 5'экзонуклеазы специфической для аллеля, секвенирование, гибридизацию, SSCP и подобные.
Определение на основании ПЦР может включать многократную амплификацию множества маркеров одновременно. Например, хорошо известен в области техники выбор праймеров ПЦР для получения продуктов ПЦР, которые не перекрывают друг друга по размеру и могут быть проанализированы одновременно. Альтернативно возможно амплифицировать различные маркеры с праймерами, которые метят различным образом, и следовательно, каждый может быть отдельно определен. Конечно, определение, основанное на гибридизации, обозначает возможность дифференциального определения множества продуктов ПЦР в образце. Другие методики известны в области техники для возможности множественного анализа множества маркеров.
Только в иллюстративных вариантах осуществления способ включает стадии (i) получения образца клеток от пациента, (ii) выделения нуклеиновой кислоты (например, геномной, мРНК или обеих) из клеток образца, (iii) контактирование образца нуклеиновой кислоты с одним или более праймерами, которые специфически гибридизуются с 5'- и 3'-концами по меньшей мере одного аллеля SAA, который является показательным для глаукомы в условиях, таких что возникает гибридизация и амплификация аллеля, и (iv) определения продукта амплификации. Такие схемы определения являются особенно применимыми для определения молекул нуклеиновой кислоты, если такие молекулы присутствуют в очень небольшом количестве.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения предмета анализа необычные уровни или активность SAA, которые являются показательными для глаукомы, определяют по изменениям в последовательности расщепления ферментом рестрикции. Например, выделяют ДНК образца и контроля, амплифицируют (необязательно), расщепляют одной или более рестрикционными эндонуклеазами и определяют размеры длины фрагментов посредством гель-электрофореза.
В еще одном варианте осуществления изобретения любая из множества реакций секвенирования, известных в области техники, может быть использована для непосредственного секвенирования аллеля. Примерные реакции секвенирования включают таковые, основанные на методиках, разработанных Maxim and Gilbert (1977) или Sanger (1977). Также рассматривается, что любая из множества автоматизированных методик секвенирования может быть использована при проведении анализов образца, включая секвенирование масс-спектрометрией (см., например, WO94/16101; Cohen et al. 1996; Griffin et al. 1993). Для специалиста в данной области очевидно, что для определенных вариантов осуществления изобретения возникновение только одного, двух или трех оснований нуклеиновой кислоты необходимо определять в реакции секвенирования. Например, А-полоска или подобные, например, где определяют только одну нуклеиновую кислоту, могут проводиться.
В следующем варианте осуществления изобретения защита от расщепляющих агентов (таких как нуклеаза, гидроксиламин или тетраоксид осмия и с пиперидином) могут быть использованы для определения несовпадающих оснований в гетеродуплексах РНК/РНК или РНК/ДНК или ДНК/ДНК (Myers et al. 1985b; Cotton et al. 1988; Saleeba et al. 1992). В предпочтительном варианте осуществления изобретения контрольная ДНК или РНК может быть помечена для определения.
В еще одном варианте осуществления изобретения реакция расщепления несоответствия использует один или более белков, которые распознают несоответствующие пары оснований в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты «восстановления несоответствия ДНК»). Например, фермент E. сoli mutY расщепляет А в несоответствиях А/G, и тимидин ДНК-гликозилаза из клеток HeLa расщепляет Т и несоответствия Т/G (Hsu et al. 1994; патент США № 5459039).
В других вариантах осуществления изобретения изменения электрофоретической подвижности используют для определения необычных уровней или активности SAA, которые являются показательными для глаукомы. Например, полиморфизм одноцепочечной структуры (SSCP) может быть использован для определения различий в электрофоретической подвижности между нуклеиновыми кислотами мутантными и дикого типа (Orita et al. 1989; Cotton 1993; Hayashi 1992; Keen et al. 1991).
В еще одном варианте осуществления оценивают движение аллелей в полиакриламидном геле, содержащем градиент денатурата с использованием гель-электрофореза с денатурирующим градиентом (DGGE) (Myers et al. 1985a). В следующем варианте осуществления используют температурный градиент вместо градиента денатурирующего агента для определения различий в подвижности ДНК контроля и образца (Rosenbaum and Reissner 1987).
Примеры других методик для определения аллелей включают, но не ограничиваются перечисленными, селективную олигонуклеотидную гибридизацию, селективную амплификацию или селективное удлинение праймеров. Например, могут быть получены олигонуклеотидные праймеры, в которых известную мутацию или различия в нуклеотидах (например, в аллельных вариантах) помещают по центру и затем гибридизуют до целевой ДНК в условиях, которые допускают гибридизацию, только если обнаруживается идеальное соответствие (Saiki et al. 1986; Saiki et al, 1989). Такие методики аллелеспецифической олигонуклеотидной гибридизации могут быть использованы для исследования одной мутации или полиморфного участка на реакцию, когда олигонуклеотиды гибридизуются с целевой ДНК, амплифицированной ПЦР, или ряда различных мутаций или полиморфных участков, когда олигонуклеотиды прикрепляются к гибридизующей мембране и гибридизуются с меченой целевой ДНК.
Альтернативно методика аллелеспецифической амплификации, которая зависит от селективной ПЦР амплификации, может быть использована в сочетании с настоящим изобретением. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для специфической амплификации, могут нести интересующую мутацию или полиморфный участок в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. 1989) или на крайнем 3'-конце одного праймера, где в соответствующих условиях несоответствие может предотвратить или уменьшить полимеразное удлинение (Prossner 1993). Кроме того, может быть желательно ввести новый участок рестрикции в участке мутации для создания определения, основанного на расщеплении (Gasparini et al. 1992). Предполагают, что в определенных вариантах осуществления изобретения амплификацию также можно проводить с использованием Tag лигазы для амплификации (Barany 1991). В таких случаях сшивание проявляется, только если существует идеальное соответствие на 3'-конце 5'-последовательности, делая возможным определять присутствие известной мутации в специфическом участке, наблюдая за присутствием или отсутствием амплификации.
В другом варианте осуществления изобретения определение аллельных вариантов осуществляют с использованием анализа сшивания олигонуклеотидов (OLA), как описано, например, в патенте США № 4998617 и Landegren et al. 1988). Nickerson et al. описали анализ определения нуклеиновой кислоты, который сочетает признаки ПЦР и OLA (Nickerson et al 1990). В таком способе ПЦР используют для достижения экспоненциальной амплификации целевой ДНК, которую затем определяют с использованием OLA.
Было разработано несколько методик на основании метода ОLA, и они могут быть использованы для определения необычного уровня или активности SAA, которые являются показательными для глаукомы. Например, патент США № 5593826 и Tobe et al (1996) описывают такие методики, которые часто используются.
В одном варианте осуществления изобретения фенофибрат, агонист рецептора, активируемого пролифератором пероксисом α (PPARα), может быть рецептирован в фармацевтически приемлемую композицию и использоваться для лечения глаукомы посредством регуляции экспрессии SAA. Исследования показали, что лечение фенофибратом и WY 14643 снижает концентрацию SAA в плазме (Yamazaki et al. 2002). Считают, что другие агонисты PPARα, такие как ципрофибрат, 2-бромгексадеканоевая кислоты, безафибрат, ципрофибрат и циглитазон, также могут быть применимыми для лечения глаукомы.
Настоящее изобретение далее постулирует, что агенты, которые предотвращают клеточную гибель, индуцированную амилоидом, могут быть применимыми для защиты ТС и других клеток глаза в передней сосудистой оболочке глаза и в заднем отделе глаза, особенно сетчатке и диске зрительного нерва.
Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в различные типы глазных композиций для доставки в глаз (например, местно, в камеру или посредством имплантата). Соединения предпочтительно включают в местные глазные композиции для доставки в глаз. Соединения могут быть смешаны с офтальмологически приемлемыми консервантами, поверхностно-активными веществами, усилителями вязкости, усилителями проницаемости, буферами, хлоридом натрия и водой для формирования водной стерильной офтальмологической суспензии или раствора. Композиции офтальмологического раствора могут быть получены растворением Соединения в физиологически приемлемом изотоническом водном буфере. Далее, офтальмологический раствор может включать офтальмологически приемлемое поверхностно-активное вещество для способствования растворению Соединения. Более того, офтальмологический раствор может содержать агент для увеличения вязкости, такой как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или подобные, для улучшения удержания композиции в конъюнктивальном мешке. Гелеобразующие агенты также могут быть использованы, включая, но, не ограничиваясь ими, геллановую и ксантановую камедь. С целью получения стерильных композиций глазной мази, активный ингредиент смешивают с консервантом в соответствующем носителе, таком как минеральное масло, жидкий ланолин или вазелиновое масло. Стерильные композиции глазного геля могут быть получены суспендированием Соединения в гидрофобном основании, полученном из комбинации, например, карбопола-974 или подобного в соответствии с опубликованными рецептурами для аналогичных глазных композиций; консерванты и агенты тоничности могут быть включены.
Соединения предпочтительно рецептируют в виде местных глазных суспензий или растворов, с рН около 4-8. Установление специфической схемы лечения для каждого пациента оставляют на решение врача. Соединения обычно содержатся в таких композициях в количестве от 0,01% до 5% по массе, но предпочтительно в количестве от 0,05% до 2% и наиболее предпочтительно в количестве от 0,1 до 1,0% по массе. Лекарственной формой может быть раствор, суспензия, микроэмульсия. Следовательно, для местного введения 1-2 капли таких композиций будут доставляться на поверхность глаза от 1 до 4 раз в сутки в соответствии с решением опытного врача.
2
Соединения также могут быть использованы в комбинации с другими агентами для лечения глаукомы, такими как, но не ограничиваясь, β-блокаторы, простагландины, ингибиторы карбоангидразы, α-агонисты, миотики и нейропротекторы.
Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалист в области техники должен принимать во внимание, что методики, описанные в следующих примерах, представляют собой методики, открытые автором изобретения для обычного применения в практике изобретения и, следовательно, могут рассматриваться как составляющие предпочтительные варианты для его осуществления. Однако специалист в области техники должен в свете настоящего описания принимать во внимание, что множество изменений могут быть сделаны в специфических описанных вариантах осуществления изобретения, и все еще получить такие же или сходные результаты без отклонения от тенденции и рамок изобретения.
ПРИМЕР 1. Повышенная экспрессия SAA1 и SAA2 в клетках и тканях ТС с глаукоматозными изменениями
Депо РНК тканей ТС от 13 здоровых доноров по сравнению с 9 донорами с глаукомой использовали для определения экспрессии гена с использованием набора Affimetric GeneChips (HG-U133). Экспрессию амилоида Д2 определили как увеличенную в 4 раза при глаукоме по сравнению с таковой в здоровых тканях ТС. Для подтверждения этого результата проводили КПЦР с использованием отдельной РНК из 12 тканей ТС с глаукомой и 11 нормальных. В пяти из 12 тканей ТС с глаукомой (42%) обнаружили значительное увеличение экспрессии SAA1/2. Средняя экспрессия SAA в 12 ТС с глаукомой была в 5,4 раза выше таковой в 11 нормальных ТС (Фиг.1). Кроме того, подобную тенденцию дифференциальной экспрессии SAA наблюдали в клетках ТС с глаукомой или тканях диска зрительного нерва при глаукоме. Наблюдали среднее увеличение в 5,4 раза в клетках ТС с глаукомой (14 с глаукомой по сравнению с 11 нормальными клеточными линиями ТС, Фиг.2А) и в 118 раз в тканях диска зрительного нерва при глаукоме (14 с глаукомой по сравнению с 12 нормальными. Фиг.2В) по сравнению со здоровыми соответственно. ELISA SAA в тканях ТС от 6 здоровых доноров и 6 доноров с глаукомой показал, что белок SAA также был значительно повышен в тканях ТС с глаукомой по сравнению со здоровыми. Существовала разница в 3 раза в концентрации SAA в ткани с глаукоматозными изменениями по сравнению с нормальной тканью (11,3 и 3,8 мкг/мг белка соответственно). Эти данные показаны на Фиг.3.
Ассоциация повышенной экспрессии SAA с глаукомой далее была продемонстрирована в человеческой водянистой жидкости. Белок SAA измеряли посредством SAA в водянистой жидкости от 16 здоровых и 20 лиц с глаукомой. Было обнаружено, что SAA был почти в 3 раза выше в водянистой жидкости при глаукоме, чем в нормальных образцах (10,0 нг/мл по сравнению с 3,7 нг/мл соответственно). Результаты показаны на Фиг.4.
ПРИМЕР 2. Композиция фенофибрата для местного применения
1% суспензия фенофибрата для местного снижения для снижения SAA и уменьшения ВГД глаза.
Описание
Конц.
Единицы
Назначение
Фенофибрат (AL18543), NOC
1%
Мас./об.%
Активный ингредиент
Гидроксипропилметилцеллюлоза
0,5%
Мас./об.%
Регулятор вязкости (2910) (Е4М), USP
Двухосновный фосфат натрия
0,2%
Мас./об.%
Буферный агент (безводный), usp
Хлорид натрия, usp
0,75%
Мас./об.%
Агент тоничности
ЭДТА динатрия
0,01%
Мас./об.%
Хелатная добавка (эдетат динатрия), usp
Полисорбат 80, nf
0,05%
Мас./об.%
Увлажняющий агент
Хлорид бензалкония, nf
0,01%
Мас./об.%
консервант
Гидроксид натрия, nf
q.s. pH
Мас./об.%
Регулятор pH
Соляная кислота, nf
q.s. pH
Мас./об.%
Регулятор рН
Очищенная вода, usp
q.s. 100%
Мас./об.%
Носитель
ПРИМЕР 3. Методика для скрининга и определения соединений, которые изменяют экспрессию мРНК SAA или белков SAA
in vitro
Одним способом, который может быть использован для скрининга агентов, которые изменяют экспрессию и функцию SAA, является определение изменений уровня белка SAA. Наборы для исследования  для количественного определения сывороточного амилоида А (SAA) в сыворотке, плазме, буферных растворах, культуральной среде клеток и экстрактах тканей или клеток животных или человека являются коммерчески доступными. Анализ представляет собой твердофазный сандвич-иммуноферментный анализ (ELISA). Моноклональные антитела, специфичные для SAA, наносят на ячейки пластины микротитратора. Образцы, включая стандарты с известным содержанием SAA или неизвестные, добавляют в эти ячейки вместе с вторичными антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой или пероксидазой. Антитела созданы таким образом, что ни одно не вмешивается в связывающий эпитоп другого. SAA захватывается на планшете иммобилизованным антителом и метится конъюгированным вторым антителом в одностадийной процедуре. После инкубационного периода планшет промывают для удаления всего несвязавшегося материала и добавляют субстрат (PNPP или пероксид). Интенсивность окрашенного продукта пропорциональна концентрации SAA, присутствующего в неизвестном образце.
ПРИМЕР 4. Индукция SAA в культурах клеточных линий для скрининга соединений, которые нарушают экспрессию мРНК или белка SAA
Клеточная линия человеческой гепатомы, HepG2, является широко используемой для исследований индукции SAA цитокинами для трансфекции плазмидами и анализами с использованием гена-репортера. Синтез мРНК и белка SAA может быть индуцирован различными цитокинами в нескольких человеческих клеточных линиях гепатомы, включая PCL/PRF/5, HepB и HepG2 (Uhlar and Whitehead 1999). Синтез SAA человеческими гладкомышечными клетками аорты (HASMC) индуцируется глюкокортикоидными гормонами, но не провоспалительными цитокинами, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-α, которые стимулируют продукцию SAA гепатоцитами (Kumon et al. 2002b; Kumon et al. 2001; Thorn and Whitehead 2002). SAA стимулирует хемотаксическую миграцию HASMC дозозависимым образом при оценке с использованием культуральной камеры Chemotaxicell (Kumon et al. 2002a). Экспрессия мРНК и продукция белка SAA продемонстрирована в первичных культурах синовиоцитов при ревматоидном артрите (O'Hara et al. 2000).
ПРИМЕР 5. Функциональный анализ SAA в культивируемых клетках
Цитокиноподобные свойства SAA включают индукцию секреции ИЛ-6 нейтрофилами (Furlaneto and Campa, 2002; He et al. 2003). Клетки HL-60, промиелоцитарная клеточная линия, была идентифицирована как отвечающая на SAA повышенной секрецией ИЛ-8 и может быть использована для in vitro анализа функции SAA. Клетки HL-60 обрабатывали в течение четырех часов увеличивающимися концентрациями рекомбинантного человеческого SAA и измеряли ИЛ-8 в среде посредством ELISA. Секреция ИЛ-8 увеличивалась дозозависимым образом (Фиг. 5). Клетки HL-60 могут быть использованы в качестве суррогатной клеточной линии для функционального анализа для определения агентов, которые нарушают функцию и уровень экспрессии SAA.
Все композиции и/или способы, описанные и заявленные в настоящем описании, могут быть выполнены и осуществлены без ненужных экспериментов в свете настоящего описания. Тогда как композиции и способы по настоящему изобретению описаны в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, будет очевидно специалисту в области техники, что могут быть применены изменения к композициям и/или способам и в стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в настоящем описании без отклонений от концепции, тенденции и рамок изобретения. В частности, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются и химически и структурно связанными, могут быть замещены агентами, описанными в настоящем описании для достижения подобных результатов. Все такие замещения и модификации, очевидные специалисту в области техники, рассматриваются как находящиеся в тенденции, рамках и концепции изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.
Ссылки
Следующие ссылки, в такой степени, что они могут обеспечить примерные методики и другие детали, дополнительные к указанным в настоящем описании, специфически включены в настоящее описание в виде ссылок.
Патенты Соединенных Штатов
Книги
Другие публикации
Furlenato, CJ, and Campa A, A novel function of serum amyloid A: a potent stimulus for the release of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 by human blood neutrophil, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN 268:405-408 (2002).
He, R, Sang H, Ye, RD, Serum amyloid A induces IL-8 secretion through a G protein-coupled receptor. FPRL1/LXA4R, BLOOD 101:1572-1581 (2003).
Jensen LE and Whitehead AS, BIOCHEM. J. 334:489-503 (1998).
Jordat MS, et al., PLANTA MED. 68:667-71 (2002).
Kane et al., J. NEUROCHEM., 72: 1939-1947 (1999).
Kumon, Y., Hosokawa, T., Suehiro, T., Ideda, Y., Sipe, J.D., and Hashimoto, K., Acute-phase, but not constitutive serum amyloid A (SAA) is chemotactic for cultured human aortic smooth muscle cells, AMYLOID 9:237-241 (2002a).
Kumon, Y., Suehiro, T., Faulkes, D.J., Hosakawa, T., Ideda, Y., Woo, P., Sipe, J.D., and Hashimoto, K., Transcriptional regulation of Serum Amyloid A1 gene expression in human aortic smooth muscle cells involves CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBP) and is distinct from HepG2 cells, SCAND. J. IMMUNOL. 56:504-511 (2002b).
Kumon, Y., Suehiro, T., Hashimoto, K., and Sipe, J.D., Dexamethasone, but not IL-1 alone, upregulates acute-phase serum amyloid A gene expression and production by cultured human aortic smooth muscle cells, SCAND J. IMMUNOL. 53:7-12 (2001).
Lambert et al., PROC. NAT. ACAD. Sci. USA 95: 6448-6453 (1998).
Liang, J.S., Sloane, J.A., Wells, J.M., Abraham, C.R., Fine, R.E., and Sipe, J.D., Evidence for local production of acute phase response apolipoprotein serum amyloid A in Alzheimer's disease brain, NEUROSCI LETT. 225:73-76 (1997).
Liu et al., J. NEUROCHEM. 69: 2285-2293 (1997).
Miida T., Yamada, T., Yamadera, T., Ozaki, K., Inano, K., Okada, M., Serum amyloid A protein generates pre-beta 1 high-density lipoprotein from alpha-migrating high-density lipoprotein, BIOCHEM. 38(51):16958-16962 (1999).
http://genomebiology.com/2001/3/1/reviews/3001.1).
Miller, Genome Biology 3(1):reviews 3001.1-3001.15 (2001) (also at
Nakagami et al., EUR. J. PHARMACOL. 457:11-17 (2002a).
Nakagami et al., BR. J. PHARMACOL., 137: 676-682 (2002b).
O'Hara, R., Murphy, E.P., Whitehead, A.S., FitzGerald, O., and Bresnihan, B., Acute-phase serum amyloid A production by rheumatoid arthritis synovial tissue, ARTHRITIS RES. 2:142-144 (2000).
Pike et al., J. NEUROSCI 13: 1676-1687 (1993).
Thorn, C.F. and Whitehead, A.S., Differential glucocorticoid enhancement of the cytokine-driven transcriptional activation of the human actue phase serum amyloid A genes, SAA1 and SAA, J. IMMUNOL. 169:399-406 (2002).
Uhlar, C.M., and Whitehead, A.S., Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant, EUR. J. BIOCHEM. 265:501-523 (1999).
Urieli-Shoval, S., Cohen, P., Eisenberg, S., and Matzner, Y., Widespread expression of serum amyloid A in histologically normal human tissue. Predominant localization to the epithelium, J. HISTOCHEM. CYTOCHEM. 46:1377-1384 (1998).
Yamazaki et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RES. COMM., 290:1114-1122 (2002).
Yankner et al., SCIENCE 250:279-282 (1990).
Zhang et al., NEUROSCI LETT. 312:125-128 (2001).