ВОДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИНСТИЛЛЯЦИЙ В МОЧЕВОЙ ПУЗЫРЬ
AQUEOUS COMPOSITION FOR INSTILLATION IN BLADDER

Изобретение относится к медицине и химико-фармацевтической промышленности и представляет собой раствор для временной защиты слизистой оболочки мочевого пузыря при различного рода манипуляциях: при уретро-цистоскопии, лучевой терапии, при лечении циститов различной этиологии, вызывающих раздражение стенки мочевого пузыря (хроническом цистите, лучевом цистите, интерстициальном цистите) и т.д.
Симптомы интерстициального цистита и других циститов различной этиологии возникают вследствие дефекта гликозаминогликанового (ГАГ) компонента муцинового слоя, покрывающего и защищающего уротелий мочевого пузыря. В основе лечения лежит использование "заменителей" гликозаминогликана, например гиалуроновой кислоты при внутрипузырном введении. Раздражающие вещества в моче, в частности ионы калия, могут проникать через уротелий, вызывая воспаление, раздражение и повреждение ткани, дегрануляцию тучных клеток и деполяризацию чувствительных нервов, что ведет к настоятельным и частым позывам на мочеиспускание и боли при интерстициальном цистите. Гликозаминогликаны сильно гидрофильны и оказывают защитное действие. Они обеспечивают устойчивый слой воды между уротелием и просветом мочевого пузыря и предотвращают прикрепление к уротелию и проникновение в него бактерий, микрокристаллов, ионов, белков и других веществ, находящихся в моче.
Под воздействием урогенитальных инфекций происходит повреждение уротелия мочевого пузыря с формированием плоскоклеточной метаплазии (лейкоплакии). В свете современных исследований лейкоплакия представляет собой патологический процесс, который характеризуется нарушением основных функций многослойного плоского эпителия: отсутствием гликогенообразования и возникновением ороговения, которые в норме отсутствуют. Инфекция является причинным фактором повреждения уротелия и формированием метаплазии.
Оперативное вмешательство, воспалительные изменения в мочевом пузыре и ложе аденомы, а также гормональный дисбаланс у мужчин и женщин пожилого возраста нарушают защитный слой уротелия. Применение препаратов гиалуроновой кислоты и в этом случае будет патогенетически обосновано, поскольку даст возможность восстановиться защитному слою стенки мочевого пузыря и уретры. Возникающий вязкоэластический протектор, или буфер, между уротелием и просветом мочевого пузыря будет способствовать уменьшению раздражающего действия мочи и ее компонентов на послеоперационную раневую поверхность и устранению дизурических явлений.
Гиалуроновая кислота - полисахарид из семейства глюкозаминогликанов (мукополисахарид), обладает способностью связывать в 1000 раз больше воды, чем весит сама. В силу своей высокой гидрофильности гиалуроновая кислота образует с водой высоковязкие гели, которые увлажняют слизистую оболочку. Гиалуроновая кислота нетоксична. В составе гелей гиалуроновая кислота оказывает антимикробное, и противовоспалительное действие, способствует регенерации эпителия, не вызывает клинических осложнений.
Полный аналог гиалуроновой кислоты - гиалуронат натрия (натриевая соль гиалуроновой кислоты), хорошо растворим в воде с образованием вязкого бесцветного геля с рН 6,0-7,5 (0,1% раствор).
Являясь одним из важнейших компонентов соединительной ткани, гиалуроновая кислота играет важную роль в процессе роста и регенерации тканей, оплодотворения и размножения, проницаемости клеточных мембран и во многих других процессах, обеспечивающих нормальное функционирование систем организма.
Известен большой ассортимент препаратов для наружного применения в качестве противовоспалительного средства и для заживления ран, содержащих гиалуроновую кислоту (Европейская заявка 0433817, патенты РФ 2048817, 2195262, патент США 5604200). Данные препараты не применяются в урологии для лечения слизистой оболочки мочевого пузыря. Также известны препараты, используемые для лечения данного заболевания, содержащие гиалуроновую кислоту и хондроитина сульфат (патент США 5591724, патент США 6083933, патент США 7772210).
Известны способы лечения гиперактивности мочевого пузыря путем инстилляции с использованием различных препаратов, например антихолинэнергического препарата, содержащего оксибутинина гидрохлорид (пат. РФ 2193401), аналогов гликозаминогликана, в качестве которого используют гепарин (пат. РФ 2390341), генно-инженерный аналог эндогенного цитокина (пат. РФ 2361607), раствора протаргола и раствора нитрата серебра (Родь О.И. Этиология, клиника и лечение негонорейных уретритов. Врачебное дело, 1964, №10, с. 141).
Известна композиция лечебного назначения для лечения цистита на основе гиалуроната натрия, разведенного физраствором (П.В. Глыбочко, Ю.Г. Аляев, З.К. Гаджиева, Миркин Я.Б. Применение гиалуроновой кислоты в лечении хронического цистита. ЭФ. Урология. 5/2011, с. 30-35). Недостатком этой композиции является кратковременная адгезия к уротелию мочевого пузыря, что снижает возможность эвакуации патогенных микроорганизмов, вызывающих цистит, требует частого введения препарата и не обеспечивает долговременное воздействие.
Известна лекарственная композиция для лечения цистита (пат. РФ 2519010). Композиция содержит 0,8-2,0% мас. гиалуроната натрия, 1-3% мас. альгината натрия и дистиллированную воду до 100% масс. Композиция обладает недостаточной пролонгированной адгезией. Отмечено наличие рецидивов цистита.
В настоящее время широко применяется препарат Уро-Гиал, имеющий следующий состав: гиалуронат натрия - 0,8 мг, буферный раствор, включающий натрия дигидрофосфат моногидрат - 0,45 мг, динатрия фосфат безводный - 2 мг, натрия хлорид - 8,5 мг (±0,05), и вода деионизированная. Препарат упруговязкий буферизованный физиологический раствор гиалуроната натрия неживотного происхождения. Применяется в урологии для лечения хронического рецидивирующего и интерстициального цистита, лучевого цистита, синдрома болезненного мочевого пузыря. Уро-Гиал является вязкоэластичным протектором межклеточного вещества уротелия мочевого пузыря, уретры. При введении в полость мочевого пузыря создает вязкоэластичную пленку на поверхности слизистой оболочки, защищающую ее от внешних воздействий при различного рода манипуляциях (уретроскопия, цистоскопия, ТУР предстательной железы и мочевого пузыря, лучевая терапия органов малого таза и т.д.). Недостаток известного препарата: отмечена несовместимость между гиалуронатом натрия и четвертичными солями аммония, такими как бензалкония хлорид. Не следует допускать контакт Уро-Гиала с такими препаратами или с медицинскими и хирургическими инструментами, обработанными такими препаратами. Способ применения и дозировка: Внутрипузырно, 1 раз в неделю в течение первого месяца, затем 1 раз в две недели в течение второго месяца, далее 1 раз в месяц до исчезновения симптомов заболевания. Курс составляет от 4-х до 12 инстилляций.
Известна водная композиция, содержащая гиалуроновую кислоту, хондроитина сульфат и соль соляной кислоты двухвалентного металла, а именно кальция хлорид (WO 2007138014). Композиция предназначена для использования в терапии интерстициального цистита для инстилляции в мочевой пузырь. Недостаток данной композиции - сложность контроля вязкости. Данная композиция выбрана в качестве прототипа.
Изложенное выше свидетельствует о целесообразности разработки нового препарата с более широким спектром действия исходя из основных патогенетических особенностей заболеваний инфекционно-воспалительного характера, сопровождающихся деструктивными процессами или предрасположенностью к ним.
Технической задачей предлагаемого изобретения является создание новой водной композиции, обладающей повышенным бактериостатическим и противовоспалительным действием, с контролируемой вязкостью, выраженной фармакологической активностью для лечения хронического рецидивирующего и интерстициального цистита, лучевого цистита, синдрома болезненного мочевого пузыря, обладающей высокой терапевтической активностью, позволяющей ослабить нежелательные побочные эффекты за счет обеспечения пролонгированной адгезии создаваемой композиции к гликозаминогликановому слою уротелия, а также создания препятствий адгезии бактерий к поврежденным тканям путем закрытия уротелия биополимерной пленкой.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание новой водной композиции, которая обладает:
- повышенным защитным эффектом в отношении клеток уротелия после окислительного стресса и повышенным опосредованным антимикробным действием за счет включения маннита или сорбита в композицию;
- повышенным прямым антимикробным действием и защитой уротелия за счет включения цинка хлорида;
- контролируемой вязкостью за счет включения маннита или сорбита и цинка хлорида.
Указанный технический результат достигается при использовании водной композиции для инстилляции в мочевой пузырь на основе гиалуроновой кислоты и хондроитина сульфата, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит маннит или сорбит в соотношении к сумме гиалуроновой кислоты и хондроитина сульфата, равном 0,014-4,2, при следующем содержании компонентов в водном растворе, масс. %:
гиалуроновой кислоты - 0,05-1,6
хондроитина сульфата - 0,07-2,0
маннит или сорбит - 0,05-0,5
вода - остальное до 100%
Кроме того, водная композиция дополнительно содержит цинка хлорид, взятого в количестве 0,7-1,9 масс. %.
Хронический цистит - это заболевание, которое характеризуется длительно существующим воспалительным процессом в ткани мочевого пузыря, как бактериальной, так и абактериальной природы. Хронический цистит может протекать в виде как экссудативной, так и продуктивной формы воспаления. При эксссудативном воспалении наступает фаза пролиферации или репаративной регенерации. Но, очень часто в тканях мочевого пузыря может развиваться несколько фокусов экссудативного воспаления через незначительные промежутки времени, т.е. происходит наслоение продуктивной фазы предшествующего эпизода острого экссудативного воспаления на экссудативную фазу последующего.
Таким образом, при хронических циститах различной этиологии, включая бактериальную природу заболевания, а также абактериальные формы хронического цистита, включая постлучевой цистит, хронический цистит у женщин в постменопаузе, изменения в слизистой оболочке мочевого пузыря носят однотипный характер. В основе воспалительного инфильтрата в слизистой оболочке и подслизистом слое стенки мочевого пузыря лежит повреждение межуточной субстанции соединительной ткани вследствие разных причин. Вне зависимости от этих причин исходом является нарушение физиологической регенерации уротелия мочевого пузыря, с нарушением барьерной функции переходного эпителия. Эти изменения приводят к дисрегенераторным процессам в уротелии с последующим изменением физиологически обоснованного распределения субпопуляций мононуклеаров. Данные изменения трактуются как интерстициальное воспаление с проявлением дефицита гликозаминогликанов.
Представляется перспективным разработка новой композиции с включением дополнительного вещества, которое может снижать воздействие свободных радикалов на гиалуроновую кислоту и хондроитина сульфат в условиях окислительного стресса с целью пролонгирования действия гиалуроновой кислоты и хондроитина сульфата в мочевом пузыре и повышения клинической эффективности лечения. Соответственно, композиция, обладающая пролонгированным действием будет проявлять улучшенные противовоспалительные и противомикробные свойства, что напрямую должно повышать эффективность лечения хронического рецидивирующего цистита, интерстициального цистита, лучевого цистита, хронического цистита у женщин в менопаузе, а также синдрома болезненного мочевого пузыря.
Дополнительно, имеется целесообразность включения в композицию компонента, который мог бы усилить антимикробное действие композиции за счет прямого антимикробного эффекта.
Хондроитин сульфат связывает молекулы воды на поверхности уротелия мочевого пузыря, создавая защитный водонепроницаемый барьер, а гиалуроновая кислота, в свою очередь, увеличивает количество связанных молекул воды, таким образом, создавая условия для быстрого восстановления и усиления защитной функции гликозаминогликанового слоя.
Более того, хондроитина сульфат обеспечивает противовоспалительное действие, подавляет активность ферментов, способных разрушить гиалуроновую кислоту, пролонгирую тем самым терапевтический эффект.
Хондроитин сульфат принимает участие в биосинтезе соединительной ткани и, благодаря этому, способствует предотвращению процессов разрушения соединительной ткани, стимулирует регенерацию тканей и оказывает противовоспалительное действие. Входит в структуру уротелия мочевого пузыря. Доказано, что хондроитин сульфат стимулирует образование гиалурона, синтез протеогликанов, подавляет активность эластазы, гиалуронидазы. Хондроитин сульфат препятствует коллапсу соединительной ткани.
При любых местных инфекционно-воспалительных процессах за счет деятельности микроорганизмов происходит выделение целого ряда токсических веществ - экзо- и эндотоксинов, энзимов, митогенов, липополисахаридов и др., что приводит к деструкции тканей, разрушению соединительной ткани, усилению реакции перекисного окисления липидов. Для купирования этих процессов требуется наличие в композиции вспомогательных соединений.
В качестве вспомогательных веществ, обеспечивающих необходимые реологические свойства раствору, способствующих пролонгированию эффекта основных компонентов авторы использовали маннит, сорбит. Маннит и сорбит являются шестиатомными спиртами и обладают антиоксидантными свойствами, которые способствуют лучшему сохранению композиции, ее физических и биологических параметров. Дополнительно маннит и сорбит препятствуют деструкции гиалуроновой кислоты под воздействием гиалуронидазы, тем самым пролонгируя эффект препарата.
Дополнительно предпочтительно использовать цинка хлорид для снижения вязкости водного раствора на основе гиалуроновой кислоты. Это вещество обладает противомикробным действием, что положительно сказывается при лечении повреждения уротелия, сопутствующее развитием патогенной микрофлоры.
Совместное использование этих компонентов в заявляемом растворе, как показали опыты, улучшает физические, в частности реологические свойства препарата и способствует пролонгированию действия.
Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Способ приготовления раствора
Для приготовления 100 мл раствора растворяют в 80 мл воды очищенной растворяют 1,3 г цинка хлорида, 0,1 г маннита (перемешивают не менее 15 мин). В полученный раствор добавляют 0,08 г гиалуроновую кислоту, 0,1 г хондроитина сульфата и оставшуюся воду до 100 мл. Смесь тщательно перемешивают до гомогенной массы (около 4 часов), отфильтровывают через фильтр 0,8 мкм. Проводят стерилизацию в автоклаве 15 мин при температуре 121°C. В таблице 1 приведены все составы заявляемой композиции.
Пример 2. Определение антибактериальной активности
Специфическую активность фармакологического средства определяют методом диффузии в агар. В чашку Петри с мясопептонным агаром заливают по 0,1 мл Е. coli, взвесь грамотрицательных микроорганизмов равномерно распределяют, на поверхность засеянной среды накладывают диски, на диски наносят предлагаемый раствор (состав 1). Чашки выдерживают в течение 24 ч при температуре 37°C. Учет результатов проводят измерением зон угнетения роста. При определении антибактериальных свойств раствора в отношении мл Е. coli было обнаружено наличие зон задержки роста микроорганизмов, диаметр зоны подавления роста колебался в пределах от 17,6 до 35,0 мм, что указывает на чувствительность данного микроорганизма к испытуемому препарату. Наличие цинка хлорида в составе раствора приводит к увеличению эффекта подавления мл Е. coli.
Для подтверждения лучшей адгезии к уротелию предлагаемого раствора при лечении цистита были проведены следующие исследования.
Пример 3. Подтверждения адгезии к уротелию
Для определения адгезии предлагаемого раствора к биологическим тканям по специально разработанной методике были отлиты тонкие коллаген-эластиновые пленки (коллаген и эластин - основа соединительной ткани). Пленки высушивали под прессом при 25-35°C, после чего на внешнюю сторону 1 пленки наносили водную композицию из гиалуроновой кислоты, хондроитина сульфата, маннита, цинка хлорида (в соотношении, указанном в формуле) и параллельно для сравнения - с препаратом Уро-Гиал. Затем пленку с нанесенным слоем полимерной композиции накрывали второй коллагеновой пленкой, выдерживали под прессом 10, 20, 30, 40, 50, 60 минут (6 образцов для каждой композиции). Затем соединенные композицией пленки устанавливали между неподвижным нижним зажимом и подвижным верхним и определяли работу отрыва пленок друг от друга. Испытания проводили на приборе анализа текстуры Brookfield СТ3. Проведенные эксперименты показали, что у предлагаемой композиции адгезия по сравнению с препаратом Уро-Гиал выше в 2-4 раза. Для определения степени защиты уротелия от агрессивного воздействия среды мочевого пузыря из предварительно отлитых коллагеновых пленок собирали семислойную мембрану, наносили на нее предлагаемую композицию, выдерживали от 15 до 60 минут, подвергали воздействию растворов щелочи и смотрели степень разрушения мембраны. Параллельно для сравнения проводили эксперимент с препаратом Уро-Гиал.
Проведенные эксперименты показали, что предлагаемая водная композиция на основе гиалуроновой кислоты обеспечивает защиту уротелия к агрессивной среде мочевого пузыря на 25% больше по сравнению с препаратом Уро-Гиал.
Пример 4. Изучение антиоксидантной активности
Для изучения антиоксидантной активности состава раствор подвергали окислительному стрессу, генерируемому путем добавления перекиси водорода в концентрации 2,5%. Реологические свойства растворов изучали после воздействия окислительного стресса переменной длительности при комнатной температуре на приборе Haake viscotester 7 plus (Thermo scientific, Германия). Вязкость измеряли с использованием конуса пластины реометра при 25°C (см. таблицу 2). Без маннита гиалуроновая кислота быстро разлагается под воздействием перекиси, что характеризуется снижением вязкости (состав 2).
Реологические параметры раствора гиалуроновой кислоты (0,08%) и хондроитина сульфата (0,1%) содержащего 0,1% маннита не изменились в присутствии перекиси водорода в течение 30 мин (состав 1).
Таким образом, присутствие маннита обеспечивает антиоксидантные свойства раствора, не позволяет свободным радикалам разрушать молекулы гиалуроновой кислоты и хондроитина сульфата, стабилизирует вязкость раствора, предотвращает разрушение глюкозаминогликановой пленки на внутренней стенке мочевого пузыря, что обеспечивает пролонгированный терапевтический эффект.
Пример 5. Исследования на животных моделях
С целью оценки эффективности композиции, содержащей гиалуроновую кислоту, хондроитин сульфат, манит или сорбит и, предпочтительно, цинка хлорид в заявляемых интервалах для восстановления уротелия мочевого пузыря была разработана экспериментальная часть, заключающаяся в моделировании патологического процесса в стенке мочевого пузыря, возникающего на фоне длительно существующего воспалительного процесса и окислительного стресса при интерстициальном цистите.
Суть ее заключалась в моделировании окислительного стресса и образованию чрезвычайно реактивных свободных радикалов, которые могут индуцировать деструкцию клеток уротелия мочевого пузыря за счет разрушения гликозаминогликанового слоя и, одновременно, снижают эффективность внутрипузырной терапии заменителями гликозаминогликов, т.к. разрушают молекулу гликозаминогликана, входящую в состав препарата.
В мочевой пузырь крыс (15 крыс, по пять крыс в каждой группе) вводили тампон на 10 секунд, смоченный раствором перекиси водорода в концентрации 10 мМ, при этом моделировали патологический очаг, морфологические изменения в котором можно трактовать как очаговый интерстициальный цистит. Затем животных разделяли на три группы. Через 24 часа через катетер в опорожненный мочевой пузырь животных вводили растворы:
1-я группа (n=5): исследуемая композиция (примеры 1, 5, 6, табл. 1),
2-я группа (n=5): раствор препарата «Уро-Гиал»,
3-я группа (контроль, n=5): физиологический раствор.
Указанные растворы вводили 1 раз в сутки в течение 5 дней, экспозиции указанных веществ находились в мочевом пузыре животных 30 минут. Затем крыс забивали передозировкой тиопентала натрия и извлекали мочевые пузыри.
Результат оценивался по степени повреждения клеток уротелия мочевого пузыря. Образцы ткани окрашивали с помощью 1% раствора красителя янус зеленый В (Sigma, Germany) в течение 90 секунд. Краситель янус зеленый В избирательно окрашивает области, поврежденные смоделированным процессом окислительного стресса, причем степень окрашивания (степень метахромазии) зависит от степени повреждения ткани. При электронно-микроскопическом исследовании также фиксировалась деструкция коллагеновых волокон с потерей их поперечной исчерченности, а также состоянием артериол и венул в межуточной соединительной ткани животных.
Наиболее выраженные повреждения наблюдались в группе контроля (физиологический раствор). Выраженная окраска янусом зеленым присутствовала в гистологических образцах животных, леченных препаратом «Уро-Гиал». Наименьшее повреждение и стабилизация коллагеновых волокон при электронно-микроскопическом исследовании наблюдалась в гистологическом образце животных, леченных исследуемой композицией, табл. 3. Стабилизация коллагеновых волокон характеризовалась частичным сохранением их поперечной структуры.
Наибольшая тенденция к увеличения среднего размера артериол и венул (табл. 4) наблюдалась в группе животных, леченных исследуемой композицией. Данная тенденция - положительная, т.к. можно говорить о повышении активности сосудов микроциркуляторного русла под действием композиции, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитин сульфат и манит или сорбит.
Таким образом, действие исследуемой композиции в сравнении с известным препаратом «Уро-Гиал» и контрольной группой при экспериментальном моделировании окислительного стресса заключалась в снижении влияния активных радикалов на клетки уротелия за счет более длительного действия образуемой защитной пленки, т.к. снижается воздействие свободных радикалов на гликозаминогликаны.
Пример 6. Применение предлагаемой композиции
Пациентка А., 36 лет, страдает рецидивирующим бактериальным циститом, частота рецидивов 10-12 рецидивов в год. Имела большой опыт лечения своего заболевания в виде стандартного консервативного лечения, но без удовлетворительного эффекта. Получила лечение заявленной композицией. Курс внутрипузырных инстилляций в течение 8 недель. Первый месяц раз в неделю. Далее препарат вводится 1 раз в 2 недели еще месяц, и после курса терапии данной композицией не наблюдалось ни одного рецидива в течение 1 года. Эффективность лечения оценивалась клинически, эндоскопически и морфологически. На фоне лечения пациентки отмечено значительное улучшение самочувствия: прекратились боли за лоном, исчезли ургентные позывы к мочеиспусканию, поллакиурия. При контрольной цистоскопии с биопсией наблюдалась регрессия лейкоплакии и плоскоклеточной метаплазии. Переносимость препарата была хорошей.
При лечении пациентов, включенных в наше исследование при применении предлагаемой композиции значительно снижается выраженность реакции отека стенок мочевого пузыря, увеличивается емкость мочевого пузыря в среднем на 40 мл, после лечения имеется ярко выраженная положительная динамика: у части больных боли купировались полностью, остальные пациенты отметили значительное уменьшение болевого синдрома. Существенно снизился показатель количества рецидивов цистита - более чем в 2 раза, что положительно сказалось на качестве жизни пациентов, улучшилось психоэмоциональное состояние.
ВЫВОДЫ. Анализируя полученные экспериментальные данные, можно заключить, что благодаря наличию в предлагаемой композиции сочетания гиалуроновой кислоты, хондроитина сульфата, маннита или сорбита, и предпочтительно цинка хлорида происходит усиление терапевтической активности препарата, что позволяет данному раствору противодействовать распространению и размножению бактерий, уменьшать микробную обсемененность слизистой оболочки, очищать ее от некротического налета, ускорять эпителизацию и созревание грануляционной ткани, уменьшать отек, гиперемию, эффективно снижать воспалительную реакцию. Добавление многоатомного спирта (маннита или сорбита) предотвращает воздействие свободных радикалов. Наличие в растворе цинка хлорида обеспечивает меньшую вязкость раствора гиалуроновой кислоты. Полученные растворы обладают новыми вязкоупругими свойствами и пролонгированным эффектом.
Полученные растворы обладают оптимальной вязкостью, что позволяет применять раствор через катетер и обеспечивает образование пленки на внутренней стенке мочевого пузыря и она остается стабильной при воздействии свободных радикалов.