Морфогенез, программируемая клеточная смерть и антибиотикобразование у стрептомицетов в условиях погруженного роста

Морфогенез, программируемая клеточная смерть и антибиотикобразование у стрептомицетов в условиях погруженного роста

К. А. ВИНОГРАДОВА', *С. Н. ФИЛИППОВА2, I А. Н. ПОЛИН1

1 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва

2 Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва

Morphogenesis, Programmed Cell Death and Antibiotic Formation in Streptomycetes Under Conditions of Submerged Growth

K. A. VINOGRADOVA1, S. N. FILIPOVA2, I A. N. POLINI1

1 Lomonosov Moscow State University, Moscow

2 Vinogradsky Institute of Microbiology, Fundamentals of Biotechnology of the Russian Academy of Sciences, Moscow

Стрептомицеты — мицелиальные организмы, которые проходят сложный жизненный цикл, сближающий их с многоклеточными организмами. Стрептомицеты, важные в биотехнологическом отношении объекты, являются продуцентами многих препаратов медицинского назначения, включая большое количество клинически значимых антибиотиков. В настоящем обзоре мы рассматриваем особенности морфогенеза стрептомицетов в погруженных условиях роста в связи с биосинтезом антибиотиков, а также событиями программируемой клеточной смерти (ПКС) — в ходе развития продуцента.

Ключевые слова: стрептомицеты, морфогенез в погруженной культуре, программируемая клеточная смерть, антибиотиков.

Members of the genus Streptomyces are mycelial bacteria that undergo a complex life cycle that makes them similar to multicellular organisms. Streptomycetes are important industrial microorganisms, as they produce a plethora of medically relevant natural products, including the majority of clinically important antibiotics. This review addresses the morphogenesis of streptomycetes in submerged growth conditions in connection with the biosynthesis of antibiotics, as well as the events of programmed cell death in the course of the producer's development.

Keywords: streptomycetes, morphogenesis in submerged cultures, programmed cell death, antibiotic production.

Мицелиальные бактерии — стрептомицеты — уникальны не только благодаря своему сложному циклу развития, но и благодаря своей исключительной способности продуцировать огромное количество самых разнообразных биологически активных веществ. В качестве продуцентов основного резерва антибиотиков и многих других важнейших соединений медицинского назначения, стрептомицеты являются, как и несколько десятилетий тому назад, наиболее значимыми объектами для фармацевтической промышленности. В силу ряда экстремальных обстоятельств, одним из которых является быстрое распространение патогенных микроорганизмов с множественной анти-биотикорезистентностью [1], потребность в новых эффективных препаратах в настоящее время такова, что внимание исследователей сосредоточилось на разработке неиспользуемых ранее алго-

© Коллектив авторов, 2017

*Адрес для корреспонденции: E-mail:svfilipova@mail.ru.

ритмов получения желаемых соединений, среди которых и нестандартные подходы к скринингу веществ природного происхождения на основе исследований микробного биоразнообразия и экологии продуцентов [2—6], и работа с аннотированными кластерами «спящих» («молчащих») генов вторичного метаболизма, и новые приёмы оптимизации промышленного получения препаратов на основе новых фундаментальных знаний о морфогенезе стрептомицетов [7, 8].

Сложный цикл развития и дифференцировки стрептомицетов обеспечивается согласованной работой молекулярных и генетических механизмов [9, 10]. Производителю, использующему биосинтетический потенциал стрептомицетов, приходится считаться при производстве желаемых веществ с такими условиями, как дисперсность роста продуцентов (ввиду его мицелиального характера), относительно большая длительность процесса синтеза продукта, гетерогенность культуры продуцента и др. факторами, которые осложняют промышленное получение конечного

продукта. Однако экспрессия биосинтеза вторичных метаболитов, продуцируемы« стрептомице-тами, в культурах других организмов, обладающих более «удобными» технологическими показателями, не оказалась успешной, и одной из причин этого является сложная структура биосинтетического аппарата стрептомицетов-проду-центов [7]. Индивидуальный подбор условий культивирования для отдельного продуцента пока остается наиболее распространённым и эффективным биотехнологическим приёмом. Понимание морфогенеза стрептомицетов, знание того, как морфология коррелирует с биосинтезом антибиотиков и/или других вторичных метаболитов, помимо ценности как фундаментального знания, имеет и практическое применение при рационализации промышленного получения практически важных продуктов. В частности, новейшие исследования событий и механизмов программируемой клеточной смерти стрептоми-цетов как одного из ключевых событий их морфогенеза могут быть использованы как инструмент при оптимизации биосинтеза практически ценных метаболитов.

В настоящем сообщении мы рассматриваем особенности морфогенеза стрептомицетов в связи с синтезом антибиотиков при росте их на жидких средах, а также события программируемой клеточной смерти (ПКС) — в ходе развития продуцента в погруженный условиях роста.

Особенности морфогенеза стрептомицетов в погруженных условиях роста

Промышленные ферментации с использованием стрептомицетов как продуцентов, как правило, осуществляются в условиях погруженного роста продуцента, в жидких средах. Анализ процессов ферментации и их оптимизация в основном фокусируются на таких параметрах, как характер мицелиального роста, динамика биосинтеза продукта, образование разного рода включений в клетках, динамика потребления компонентов питательной среды, рН, аэрация, температура, скорость перемешивания и др.

Линейный рост и ветвление гиф. Классическая схема жизненного цикла стрептомицетов описывает в качестве начала развития стрептомицетов — процесс прорастания спор [8, 11]. Трубки прорастания, а затем и молодые вегетативные гифы, растут путём удлинения в апикальной области, подчиняясь линейному закону роста, присущему стрептомицетам как мицели-альным организмам [12]. Линейный характер роста резко отличает стрептомицеты от одноклеточных бактерий [9]. С появлением новых точек роста, дающих начало новым гифам-ветвям, которые также растут в соответствии с законом ли-

нейного роста, — начинается ветвление гиф. На примере модельной культуры Streptomyces olivocinereus — продуцента антибиотика гелио-мицина, показано, что рост продуцента на жидких средах идет по экспоненте благодаря появлению новых точек роста мицелия [12]. Эта особенность морфогенеза стрептомицетов была охарактеризована следующим образом: «The combination of apical growth and branching ensures exponential growth» [13].

Генетический контроль роста гиф стрептомицетов в погруженной культуре. Апикальный рост, удлинение гиф в апикальной области регулируется сложным комплексом из нескольких белков, обозначенным как — TIPOC («tip-organizing center») — «центр, организующий верхушку» [7]. Этот сложный мультибелковый комплекс координирует апикальный рост, синтез новой клеточной стенки, репликацию и сегрегацию ДНК, деление гиф. В качестве компонентов TIPOC описаны следующие белки — DivIVA, который контролирует апикальный рост, белковый элемент цитоскелета — Scy, белки секреторной TAT-системы (the twin-arginine transport secretion system), белок SsgA, ре-моделирующий клеточную стенку, CslA-белок, синтезирующий экстрацеллюлярный целлюлозо-подобный полимер (cellulose synthase-like protein) и белок FilP. TIPOC взаимодействует с белками ParA и ParB, вовлечёнными в сегрегацию хромосом, и также, возможно, с белками SsgA, SsgB, FtsZ, контролирующими клеточное деление [14]. Внеклеточный целлюлозоподобный полимер, синтезируемый CslA, может формировать дополнительный защитный слой на внешней стороне верхушки гифы [15].

Сверхэкспрессия DivIVA резко изменяет морфологию гиф, приводя, в частности, к их усиленному ветвлению [13]. Показано, что уровень фос-форилирования DivIVA протеинкиназой AfsK значительно увеличивается на этапе «ареста» синтеза клеточной стенки, что приводит к исчезновению этого белка из верхушечной области гифы, способствуя, таким образом, развитию новых боковых ответвлений [16]. Белки Scy и FilP участвуют в тесной взаимосвязи с DivIVA в регуляции апикального клеточного роста [7, 14].

Типы мицелиальных структур. В процессе роста, ветвления и клеточного деления появляется синцитиальный мицелий, с относительно редкими перегородками, состоящий из многоядерных компартментов, и формируется сложная мицели-альная сеть, организующаяся в специфические мицелиальные структуры [8]. В погруженных условиях роста стрептомицеты образуют мицели-альные структуры различного типа, характерные для каждого продуцента — от рыхлых хлопьев, «пучков» до плотных «глыбок», шарообразных пеллет различной величины и плотности и др.

Внеклеточный матрикс. Гифы, составляющие отдельную мицелиальную структуру, удерживаются вместе благодаря наличию внеклеточного матрикса, который обеспечивает целостность всего образования. В его состав входят белки, ги-алуроновая кислота, полисахарида: и внеклеточная ДНК [7, 17, 18]. В одной из, по-видимому, первых работ, посвящённой открытию внеклеточного матрикса у стрептомицетов, пеллеты S.coelicolor, формируемые им в жидкой среде, подпадают под классическое определение микробных биоплёнок [2, 17]. Внеклеточный мат-рикс составлен фимбриальными структурами, которые представляют собой амилоидные фибриллы так называемых чаплин-белков (chaplin proteins). Другая составляющая его часть — цел-люлозоподобный полимер — выполняет роль каркаса, к которому крепятся фимбриальные структуры. Они осуществляют связывание и взаимодействие соседних гиф, результатом чего и является формирование уплотнённых микроколоний — пеллет [18]. Внеклеточный матрикс ми-целиальных структур в условиях погруженного роста обусловливает их прочность, ответственен за их морфологию и, в целом, за само их существование. Сделано предположение, что внеклеточная ДНК, которая высвобождается в ходе первого раунда программируемой клеточной смерти (ПКС) мицелия, используется как один из компонентов этого скрепляющего матрикса [7].

Спорообразование стрептомицетов в условиях погруженного роста. При росте на поверхности плотной среды одной из важнейших фаз, завершающих цикл развития, является формирование на субстратном вегетативном мицелии воздушных структур — воздушного мицелия и спор [9]. Имеется относительно небольшое число сообщений о спорообразовании стрептомицетов в условиях погруженного роста, однако способность образовывать споры при росте на жидких средах выявлена примерно у половины изученных стрептомицетов. После первого сообщения в 1947 г. о способности стрептомицетов образовывать споры в условиях глубинного культивирования — это явление затем было описано у разных представителей рода Streptomyces. В настоящее время считается, что спорообразование в погруженных условиях роста может иметь место не у всех видов стрептомицетов, причём для некоторых видов — только в определённых условиях культивирования [7]. Так, высокое содержание Са2+ в культуральной жидкости S.coelicolor и S.lividans индуцировало образование спороподобных структур. Эффект ионов кальция был объяснён снижением фосфатного пула в питательной среде в этих условиях [19, 20]. Выращивание S.avermitilis в питательной среде, лимитированной по источнику фосфора, инициировало формирование погруженных спор, устойчивых к

лизоциму и повышенным температурам [21]. В голодающих по фосфору культурах S.avermitilis также активируются процессы автолиза части клеток в суспензиях, в то время как в оставшихся интакт-ными участках мицелия начинается цитодиффе-ренцировка с образованием глубинных спор [21]. Сопряженность литических процессов с процессами клеточной дифференцировки стрептомице-тов в настоящее время не подвергается сомнению. Механизмы указанных процессов подробно рассмотрены в соответствующих обзорах [8, 22].

При анализе процессов образования глубинных спор в лимитированных культурах стрепто-мицетов нужно учитывать, что влияние основных источников питания в значительной степени определяется их природой и особенностями штаммов. Для ряда стрептомицетов показано, что снижение концентрации глюкозы до 0,2% не оказывало заметного влияния на их спорообразование в глубинных условиях [19, 23]. В случае S.viridochro-mogenes уменьшение количества глюкозы в среде подавляло образование глубинных спор [24]. Источники азотного питания, такие как соли аммония и органический азот обеспечивают высокую скорость роста стрептомицетов в жидкой культуре, но не способствуют спорообразованию [11]. В условиях фосфатного голодания происходит активация генов, контролирующих накопление в клетке белков «отклика» на стрессовое воздействие недостатка фосфора, необходимого для перестройки соответствующих клеточных структур при переходе клетки к дифференцировке [23, 25].

Основное отличие спорулирующих гиф, выросших в погруженных условиях, от спор воздушных гиф заключается в структуре поверхностного чехла, основу которого составляет так называемый палочковидный (rodlet) слой. Поверхностный чехол воздушных гиф и спор состоит из двух классов белков — родлинов и чаплинов [8]. Чаплин-белки образуют основные строительные блоки чехла, которые, соединяясь с родлин-белками, формируют фибриллярные структуры. Недавно было показано, что чаплин-белки способны формировать ас-симитричные фибриллярные двусторонние мембраны, которые имеют гидрофильную — гладкую и гидрофобную — фибриллярную стороны, посредством которых они могут взаимодействовать с жидкой и воздушной средами [26, 27]. Такие структуры необходимы при формировании воздушных гиф на разделе двух сред. Подобные мембранные структуры отсутствуют в спорулирующих гифах, выращенных в погруженных условиях [7].

Программируемая клеточная смерть стрептомицетов

Типы программируемой клеточной смерти (ПКС) стрептомицетов. К настоящему времени общеизвестная классическая схема жизненного

цикла стрептомицетов [8] дополнена данными о ПКС — как одной из важных фаз их развития. Впервые гибель мицелия стрептомицетов в процессе их жизнедеятельности, которая до того спорадически отмечалась разными исследователями, быша охарактеризована в работах нашего века как событие им присущее, закономерное и необходимое для нормального развития [28—31]. В них был представлен качественно новый взгляд на клеточную смерть стрептомицетов как на неотъемлемое событие, встроенное в программу всего цикла дифференцировки, как важнейшее событие, обеспечивающее нормальный ход развития. Термин ПКС используется при описании любой формы активной регулируемой смерти клеток, в которую вовлечены генетически детерминированные молекулярные механизмы, и которая является неотъемлемой частью программы развития организма [32].

Современное состояние исследований, по-свящённых событиям ПКС у стрептомицетов, представлено в обзоре [22]. Исторически первыми были отмечены процесс гибели субстратного мицелия при формировании воздушного мицелия и гибели части воздушных гиф в ходе спорообразования на плотных средах (названный «вторым раундом смерти»). Физиологическая роль этих процессов предположительно состоит в создании пула питательных веществ, обеспечивающих дальнейшую дифференциацию, и пула сигнальных соединений, инициирующих морфогенез и антибиотикообразование [8, 11]. Различные типы протеолитических ферментов стрептомице-тов и их ингибиторы, их роль в морфологических изменениях в клетке, генетическая детерминация протеолитического каскада и его взаимосвязь с дифференциацией стрептомицетов, также всесторонне обсуждены в указанном обзоре [22].

В течение последнего десятилетия представлен ранее неописанный у стрептомицетов лити-ческий процесс, происходящий на самых ранних этапах роста, — это так называемый «первый раунд смерти» ПКС [33—44]. Относительно недавнее открытие первого раунда ПКС стрептомице-тов, по-видимому, связано с тем, что эта короткая фаза в цикле развития, обычно не улавливалась исследователями. Массовое прорастание спор сменяется фазой ранней гибели части молодых гиф, в результате чего формируется мицелий, обозначенный авторами как мицелий М1 или «компартментализированный». Его отличительной особенностью является высокая степень компартентализации — закономерное чередование мертвых и живых участков на протяжении одной и той же гифы. Дальнейший процесс развития культуры включает и рост, и упорядоченную гибель большинства гиф мицелия М1, что завершается появлением многоядерного многокле-

точного мицелия, с редкими перегородками, обозначенного как мицелий М11 [33, 34]. Мицелий М1 не имеет поверхностного гидрофобного слоя клеточной стенки и назван авторами как вегета-тивныш [33, 37, 44, 45]. Мицелий М11 — авторами рассматривается как единая репродуктивная стадия дифференциации, в ходе которой осуществляется и споруляция, и образование антибиотиков [40, 42, 45]. Авторы описышают развитие мицелия М11 на плотныгх средах как проходящее в три стадии: на ранней стадии, без ещё несформи-рованной поверхностной гидрофобной оболочки клеточной стенки — мицелий М11 назван «традиционным субстратным»; после того, как на нём сформируется поверхностная гидрофобная оболочка — «традиционным воздушным», а на поздней стадии — при спорообразовании — «спорооб-разующим». Мицелий М11 морфологически и физиологически отличается от раннего мицелия М1. Таким образом, по этой концепции, в процессе роста и развития стрептомицетов происходит смена двух разных типов мицелия — раннего, компартментализированного М1 — многоклеточным М11, и переход от одного типа мицелия — к другому обусловливается «первым раундом смерти» [36, 44].

В гифах мицелия М1 у Streptomyces соеНсо1ог выявлена высокая субкомпартментализация: описано закономерное чередование «живых» и «мертвых» участков размером 1 мм на протяжении одной и той же гифы [33]. Клеточные сегмен-ты-компартмешы, закономерно чередуясь по ходу одной и той же гифы, разделены «барьерами проницаемости» с диффузионными свойствами мембран. Посредством этих поперечных мембран-перегородок и обеспечивается этот впервые описанныш новыш тип компартментализации мицелия стрептомицетов. Их образование не контролируется известным молекулярным механизмом клеточного деления, с ключевым участием белка О наличии мембранной системы в вегетативном мицелии стрептомицетов, образующей в его гифах новый тип перегородок — поперечные мембраны-перегородки — сообщается и другими исследователями [46].

К регулируемой клеточной смерти, по классификации МССБ [32], можно отнести также события «отсроченного лизиса» у стрептомицетов, несущие биохимические признаки апоптоза высших организмов [47]. Предполагается, что его механизмом является ингибирование одной или нескольких протеинкиназ стрептомицета, и, таким образом, ингибиторы СТПК эукариотичес-кого типа являются компонентами молекулярного механизма ПКС стрептомицетов [47]. Данное исследование является частью большого цикла инновационных работ группы российских исследователей [48], целью которых является по-

лучение оригинальных препаратов на основе новых подходов к скринингу эффективных лекарственных средств. Биоинформационный и экспериментальный анализ семейства протеинки-наз (ПК) Streptomyces показал перспективность их использования в качестве высокопроизводительных тест-систем для направленного поиска ингибиторов протеинкиназ, играющих ключевую роль в развитии опасных заболеваний человека. Биомишенью этих новых препаратов являются белки, участвующие в каскаде различных проявлений ПКС, как у про-, так и эукариотиче-ских организмов. С изучением механизмов бактериальной ПКС связаны большие надежды фармакологии — получение новых возможностей разработки новых эффективных лекарственных медицинских препаратов путём активирования отдельных этапов ПКС [47, 48].

ПКС при росте культуры на жидких средах

Важным тезисом предложенной новой концепции развития стрептомицетов является тезис о полной аналогии их дифференциации при росте на плотных средах и в условиях погруженной культуры, на жидких средах [36, 40, 42, 44]. Те стадии развития стрептомицетов, которые были выявлены на плотных средах, наблюдаются и в условиях погруженного роста. Это утверждение экспериментально подтверждено на модельной культуре S.coelicolor A3(2): на ранних стадиях погруженного роста (около 8 ч для данной культуры) в формирующихся пеллетах микроскопически определяется только компартментализирован-ный мицелий MI [36]. Пеллеты увеличиваются в диаметре, в центре их происходит гибель гиф, происходит временная остановка роста культуры (25—48 ч), которую авторы объясняют тем, что происходит процесс ПКС. Таким образом, как результат первого раунда ПКС размер пеллет уменьшается, и активный рост гиф внутри и на периферии пеллет возобновляется примерно к 50-му часу. Вновь образующийся мицелий микроскопически определяется как мицелий MII — синцитиальный, с редкими перегородками [36]. В поздней точке роста (90 ч) определяется только мицелий MII. При увеличении плотности посевного материала (суспензия спор) укорачивается процесс развития и уменьшается размер пеллет. Кривая роста содержит две фазы экспоненциального роста, разделённые фазой временной остановки роста, (что показано и для других стрепто-мицетов), причём первая волна описывает формирование мицелия MI, а вторая — мицелия MII, а временная остановка роста между ними — соответствует фазе ПКС — гибели мицелия MI.

На поперечных срезах пеллет Streptomyces ten-dae (диаметром 120 мкм) наблюдали пустоты, при-

чиной образования которых вероятно и служат описанные события ПКС внутри пеллет. Предполагается, что в результате ПКС происходит высвобождение специфических соединений — активаторов вторичного метаболизма, которые способствуют продукции нуклеотид пептидного антибиотика никкомицина [7]. Эти экспериментальные наблюдения хорошо коррелируют с описанием событий «первого раунда» ПКС у S.coelicolor A3(2), и само наличие пустот в центре пеллет стрептомицетов также связывается с процессом ПКС [36, 38].

Мицелий MII культуры S.coelicolor в условиях погруженного роста не формирует поверхностную гидрофобную оболочку. Один из характерных маркеров ПКС — активация специфических нуклеаз, вовлеченных в разрушение хромосо-мальной ДНК, при развитии S.coelicolor в условиях погруженного роста в лабораторном биореакторе — описан [44].

В модельных ферментациях S.coelicolor изучали дифференциацию продуцента и образование антибиотиков актинородина и ундецилпродигио-зина — в колбах на 100 мл [36, 45] и в лабораторных биореакторах объёмом 2 л [44]. Показано, что биофизические параметры ферментационного процесса, такие как парциальное давление растворённого кислорода и скорость поглощения кислорода хорошо коррелировали с различными стадиями дифференциации мицелия S.coelicolor при культивировании в биореакторе. Было установлено, что потребность в кислороде была наибольшей на стадии образования первичного мицелия (MI) — стадии интенсивного дыхания и роста гиф. С наступлением стадии отмирания гиф первичного мицелия (ПКС) этот показатель снижался и не восстанавливался до прежнего значения во время формирования мицелия MII. Авторы объясняют это частичным разрушением мице-лиальных группировок стрептомицета. Отмечено существование двух максимумов поглощения кислорода в течение ферментации, которые совпадали с двумя стадиями дифференциации мицелия. Снижение этого показателя приходилось на стадию ПКС и литические процессы. Процессы фрагментации и последующий лизис гиф в центральной части пеллет гиф могут быть результатом активации регуляторного белка SsgA. Было показано, что избыточный дезинтеграционный процесс в центральной части пеллет приводил к прекращению антибиотикообразования и активации образования глубинных спор S.coelicolor [44]. Основными путями оптимизации биосинтеза вторичных метаболитов стрептомицетов в промышленных условиях, по мнению авторов, являются: пролонгация стадии продуктивного, многоядерного мицелия (MII) и предотвращение спорообразования. Отметим, что аналогичные рекомендации были сделаны ещё А. А. Прокофье-

вой—Бельговской в 1963 г. [11] на основании цитологического контроля исследованных ею продуцентов антибиотиков. При этом подчёркивалось, что управление фазами развития стрептоми-цетов-продуцентов, их переходами и продолжительностью с целью повышения эффективности биосинтеза возможно осуществлять за счёт регуляции состава питательной среды с учётом динамики изменения компонентного состава культу-ральной жидкости и дифференцированной потребности культуры актиномицета в основных источниках питания на разныгх стадиях развития [11]

В рамках предложенной концепции развития стрептомицетов [36, 42, 44, 49] авторы считают, что есть прямая корреляция между переходом от стадии мицелия MI — к стадии мицелия MII и началом вторичного метаболизма — «strict correlation of MI/MII transition with the onset of secondary metabolism» [49]. Подчеркивается, что именно мицелий MII, в отличие от мицелия MI, является продуктивным мицелием, в ходе его развития формируется готовность биосинтетического аппарата к образованию вторичных метаболитов. Нормальное течение и завершение событий ПКС, обеспечивая формирование мицелия MII, являются надёжным показателем «готовности» культуры к образованию вторичных метаболитов. Исходя из того, в условиях погруженного роста выделение отдельных этапов дифференциации затруднительно и не столь очевидно, как при росте на плотных средах, предлагается рассматривать события первого раунда ПКС как надёжный маркёр готовности культуры продуцента к образованию вторичных метаболитов.

Значение процесса ПКС («первого её раунда») для нормального хода дифференциации стрептомицетов наглядно было показано в работе с двумя делеционными мутантами S.natalensis — AkatA1 и AcatR по генам, вовлечённым в ответ на окислительный стресс (katA1 и catR). Mутанты характеризовались изменённым ответом на окислительный стресс: у AkatA1 — ослабленный ответ (делеция гена katA1, контролирующего экспрессию монофункциональной каталазы KatA1), у AcatR-усиленныш ответ (увеличение суммарной каталазной активности — в результате дерепрес-сии гена katA1). Стадия ПКС была полностью подавлена у AkatA, а у AcatR наблюдалось её значительное торможение, и оказалось, что полная блокировка ПКС, или задержка этого процесса приводит к резкой дезорганизации типичного строения колонии, активации процессов первичного метаболизма, повышению степени проли-феративной активности мицелия [50].

Исследователям процессов биосинтеза антибиотиков хорошо известно, что к биосинтезу многие продуценты приступают после снижения скорости роста. В той фазе развития, когда ско-

рость накопления биомассы резко падает, происходят значительные изменениями в морфологическом и физиологическом состоянии продуцента. Протеолиз субстратного мицелия, инициированный истощением источников питания в среде, играет фундаментальную роль в морфогенезе стрептомицетов. В жидкой культуре остановка роста сопровождается активацией генов биосинтеза антибиотиков, генов антибиотикорезистент-ности, стимулонов стресс-ответа, остановкой синтеза рибосомальных белков [51].

Концепция двухфазного развития бактериальных культур в условиях погруженного роста впервые была сформулирована В. Н. Шапошниковым [52] для процесса ацетоно-бутилового брожения, и многократно затем подтверждена в экспериментальных работах с продуцентами антибиотиков [53]. Современные исследования ПКС как закономерного события в развитии стрептомицетов раскрышают молекулярные и генетические основы давно замеченной корреляции определённых событий: истощения питательных ресурсов в окружающей среде и инициированных этим истощением литических процессов в субстратном мицелии, которые, в свою очередь, создают энергетические и питательные ресурсы для следующего важнейшего этапа жизнедеятельности — формирования воздушных репродуктивных структур и биосинтеза антибиотиков [8, 22]. Глобальные перестройки в экспрессии генов, происходящие в фазе перехода к формированию воздушного мицелия и спор, связаны с накоплением в условиях истощения питательных веществ низкомолекулярных соединений — гуа-нозинтетрафосфата и гуанозинпентафосфата, которые оказывают специфическое регуляторное действие на развитие стрептомицетов [8]. Детали метаболического каскада при истощении питательных веществ в среде, приводящего к инициации спорообразования и начала биосинтеза антибиотика, представлены в обзоре [22].

Описана ключевая роль глобального регулятора дифференциации стрептомицетов — БазЯ в запуске спорообразования и биосинтеза антибиотика с участием М-ацетилглюкозамина (01сМДс) клеточной стенки, образующегося в ходе ПКС при гибели мицелия [8, 22, 54]. Дуалистический характер сигналлинга М-ацетилглюкозамином связышает события, происходящие в условиях избытка или, напротив, нехватки питательных веществ в окружающей среде, с принципиальной жизненной стратегией стрептомицетов — пребывать в состоянии активного роста или немедленно приступать к завершающей стадии развития — спорообразованию [54].

Есть экспериментальные доказательства прямой связи ПКС с началом биосинтеза антибиотика: показано, что в условиях минимальной среды

с низким содержанием источника углерода при добавлении GlcNAc (который появляется в среде, когда разрушается клеточная стенка продуцента, претерпевающего ПКС) происходит активация экспрессии кластера «молчащих или криптичес-ких» генов биосинтеза антибиотика коелимицина P1. Высказана идея, что в процессе ПКС возможна активация спящих биосинтетических путей, в том числе, активация кластеров спящих генов других антибиотиков [8]. Возможно, что будет разработан алгоритм, позволяющий активировать ранее аннотированные молчащие гены биосинтеза новых вторичных метаболитов, основанный на инициации процессов программируемой смерти стрептомицетов.

Блияние морфологии погруженной культуры продуцента на уровень биосинтеза антибиотика

Размер и форма образуемых мицелиальных группировок во многом определяются условиями ферментации, а также генетическими особенностями продуцента и носят видоспецифический и, даже, штаммоспецифический характер.

Давно согласованный взгляд на морфогенез состоит в том, что характер образовавшихся мицелиальных образований зависит не только от генетических особенностей вида или штамма продуцента, но и то, что морфология подвержена также сильному влиянию условий культивирования и физико-биотехнологических параметров ферментации (компоненты питательной среды, в частности, характер и концентрация источника азота, углерода и фосфора, наличие микроэлементов, значение рН — начальное и в ходе ферментации, характер и количество внесённого посевного материала, объём биореактора и интенсивность перемешивания, скорость подачи кислорода, вязкость среды, пеногасители и др.). Например, при увеличении плотности посевного материала (суспензия спор) укорачивается время развития культуры продуцента и уменьшается размер пеллет.

Тип мицелиальных группировок индивидуального продуцента считается важным показателем для оценки его биосинтетической активности при проведении процесса ферментации, и отмечено наличие определённой зависимости между морфологией продуцента и уровнем антибио-тикообразования. Однако нет однозначной, единообразной для всех продуцентов зависимости между размерами и типом мицелиальных образований, количеством накопленной биомассы, с одной стороны, и уровнем биосинтеза антибиотика, с другой стороны. Эта зависимость не является прямолинейной, и зависит и от вида (или штамма) продуцента, и от комплекса условий культивирование продуцента.

Гетерогенность культуры продуцента. Растущая на жидких средах культура стрептомицета-продуцента характеризуется определённой морфологической гетерогенностью. Эта особенность давно отмечена при лабораторном или промышленном культивировании продуцентов. Одной из причин может являться несинхронное прорастание спор (если посевным материалом является споровая суспензия) [7]. С другой стороны, морфологическая гетерогенность присуща стрепто-мицетам, и она будет иметь место даже при использовании в качестве посевного материала вы-сокосинхронизированной культуры спор, так как обусловлена особенностями их строения и развития [7]. Вегетативный мицелий стрептомицетов является синцитиальным — он образован ком-партментами, которые содержат многие копии хромосом, одноядерные споры в массе также содержат разный генетический материал [8].

Давно отмечено, что каждый вид стрептоми-цетов представлен несколькими морфологическими типами колоний (вариантами), которые различаются присущей только данному варианту способностью достичь определённого уровня развития (в релевантных условиях роста). Разные типы колоний различаются сложностью своей дифференциации: формирование характерного профиля колоний, степень развития воздушного мицелия, наличие и интенсивность спорообразования, синтез характерных пигментов и т.д. На основе большого массива экспериментального материала по изучению структуры популяций ак-тиномицетов-продуцентов антибиотиков на искусственных питательных средах было выдвинуто положение о существовании определённой закономерности в популяционной изменчивости ак-тиномицетов. Было показано, что в «кажущемся на первый взгляд неупорядоченном разнообразии вариантов (типов колоний) чётко обнаруживаются общие по ориентирным морфолого-куль-туральным признакам черты их сходства, позволяющие классифицировать варианты и распределять в параллельные (гомологические) ряды, а также прогнозировать в популяциях ещё не изученных видов такие же ряды вариантов» [55]. В биотехнологической практике отмечено, что способность продуцента к интенсивному образованию антибиотиков коррелирует, как правило, с его способностью к сложной морфологической дифференцировке. Вариант с наибольшей степенью морфологической дифференциации (сложный профиль колонии, обильный воздушный мицелий и интенсивное спорообразование, наличие пигментов, обуславливающих характерную окраску и др.), и, как правило, составляющий основу популяции штамма-продуцента, обладает наиболее высокой способностью к синтезу вторичных метаболитов по сравнению с другими ва-

риантами, что и было многократно продемонстрировано при изучении разных стрептомицетов-продуцентов, и, в частности, это было показано на примере продуцентов антибиотиков гелиоми-цина, абурамицина, триена [56—59].

Влияние состава питательной среды на морфологию погруженной культуры. Для практических целей, в частности, облегчения методических приёмов определения биомассы продуцента, предпочтительнее дисперсный, а не мицелиальный характер роста продуцента, однако высокий уровень биосинтеза многих антибиотиков наблюдается обышно при росте продуцента в виде пеллет. Образование некоторый антибиотиков и противоопухолевых веществ связано с неотъемлемой их способностью формировать мицелиальные пеллеты.

Характер источника углерода решающим образом влияет на морфологию, скорость роста и накопление биомассы погруженных культур стрептомицетов. Ключевая роль метаболизма источников углерода как для морфологии мицели-альных образований, так и для процесса накопления биомассы и биосинтеза самих антибиотиков многократно показана в исследованиях по изучению биосинтеза антибиотиков, и обобщающим заключением было то, что при разработке условий биосинтеза невозможно дистанцироваться от индивидуального подбора источника углерода (или от сочетании таковыгх) для каждого определённого продуцента [7]. В обзоре [7] собрано несколько примеров индивидуальной потребности продуцентов в оптимальном источнике углерода для образования антибиотика, а также существующей сложной корреляции между характером источника углерода в среде, накопленной биомассой и размером формирующихся мицелиаль-ных образований — пеллет. При росте S.akiyoshiensis на среде с лактозой размер пеллет превышал 600 мкм, при росте на среде с глюкозой размер составлял менее 200 мкм, однако при росте на этих источниках углерода накапливалось в пяты раз меньше биомассы, чем на среде с крахмалом [7]. При поиске наиболее благоприятного источника углерода для биосинтеза гелиомицина проведено ранжирование 18 испытанных соединений — по максимально накопленной биомассе, скорости роста продуцента и уровню синтезирующегося антибиотика гелиомицина. Отмечены разные группы источников углерода: источники, поддерживающие относительно высокие скорости роста продуцента и высокий уровень образования антибиотика (среди них — глицерин), источники углерода, поддерживающие низкие скорости роста при низком уровне синтеза антибиотика, а также группа соединений, поддерживающих относительно высокие скорости роста и при этом способные обеспечить лишь очень низкий уровень биосинтеза гелиомицина (среди них —

сахароза и L-арабиноза). Первая группа соединений наиболее интересна для оптимизации ферментационных сред [60]. Показано, что L-араби-ноза, на среде с которой наблюдается обратное соотношение процессов роста и биосинтеза, контролирует биосинтез гелиомицина по типу углеродной катаболитной репрессии. Она подавляет синтез ферментов, участвующих в катаболизме глицерина, являющегося оптимальным источником для биосинтеза антибиотика [61, 62].

Количество внесенного в среду источника углерода сильно влияет на ветвление вегетативных гиф [63]. При росте продуцента антибиотика гелиомицина S.olivocinereus на средах с относительно высоким содержанием глюкозы снижается радиальная скорость роста (линейная скорость удлинения гиф в апикальной области), при этом происходит усиление интенсивности ветвления гиф. В результате эти скоординированные события приводят к формированию более плотных колоний, с большей биомассой, но меньшего радиуса. На средах с низкими концентрациями источника углерода (глюкозы) резко возрастает радиальная скорость S.olivocinereus, снижается плотность колонии, но увеличивается её радиус [63]. Высказано предположение, что эта особенность морфогенеза стрептомицетов имеет приспособительный смысл для их выживания в меняющихся условиях окружающей среды. В почве, с её ограниченными в большинстве случаев ресурсами, именно снижение радиальной скорости роста колонии, в сочетании с интенсивным ветвлением гиф, даёт возможность популяции «оставаться» в микрозоне, обога-щённой источниками питания и энергии, для полного освоения имеющихся ресурсов. На бедной среде для жизнеобеспечения популяции большее значение имеет рост гиф в верхушечной области, их радиальное удлинение. Гифы с повышенной скоростью, растущие по радиусу, обеспечивающие радиальный рост и, следовательно, «продвижение» колонии в пространстве, названы «поисковыми» — «searching hyphae» [7].

При культивировании на жидких средах, в условиях перемешивания, подачи кислорода, изменениях вязкости среды, — пеллеты подвергаются механическому воздействию, оказывающему сильное влияние и на саму целостность, и на рост мице-лиальных образований продуцента. Дезинтеграция пеллет по механическим причинам может происходить в их периферической области, или пеллеты разрушаются целиком, распадаясь на отдельные фрагменты меньшего размера. При нарушении целостности уже сформировавшихся пеллет возникают и начинают свой рост и формирование новые мицелиальные образования — пеллеты. Так, в культуре появляются новые пеллеты — меньшего размера, что изменяет, усложняет общую картину роста и развития этой культуры и сказывается на

образовании антибиотика. Изучены условия, когда взаимодействие между гифами ослабляется. Среди таковых указываются изменения рН среды, нехватка питательных веществ, кислорода, или образование токсинов в центре пеллет [7].

С другой стороны, в результате ухудшения массообмена или других неблагоприятных факторов в процессе ферментации может происходить укрупнение пеллет, что может приводит к их дальнейшей дезинтеграции и снижению продуктивной способности продуцента. А. А. Прокофь-евой-Бельговской [11] были проанализированы возможные причины укрупнения уплотненных шарообразных микроколоний за счёт формирования интенсивно ветвящихся укороченных, утолщенных, иногда искривленных гиф мицелия. Примеры этих сложных взаимоотношений приведены в обзоре [7]: уменьшение диаметра пеллет ниже «критического» (менее 88 мкм) у продуцента эритромицина S.erythraea приводит к падению уровня синтезированного антибиотика, тогда как антибиотик авермектин синтезируется пел-летами небольшого размера, и образование антибиотика увеличивается при уменьшении размеров пеллет. Усиленная фрагментация мицелия погруженной культуры у S.coelicolor приводит к неспособности этого продуцента синтезировать актинородин, и в то же время усиленная фрагментация мицелия у погруженной культуры S.venez,uelae не снижает образование хлорамфе-никола. У высокопродуктивного штамма S.nour-sei образуются плотные пеллеты, а у дикого штамма — пеллеты имеют рыхлую структуру.

Показано, что критический размер пеллет определяется плотностью мицелиальной массы, концентрацией растворённого кислорода в куль-туральной жидкости и интенсивностью дыхания гиф мицелия. Увеличение размера пеллет приводит к ограничению доступа кислорода к центру мицелиальных группировок и, в конечном итоге, к их лизису. Плотность пеллет определяется интенсивностью ветвления гиф и частотой формирования поперечных перегородок в гифах, что, в свою очередь, зависит и от вида продуцента, и от условий его культивирования. Увеличение частоты образования перегородок на гифах способствует фрагментации, поскольку именно в местах их формирования клеточная стенка наиболее подвержена разрыву. Частота ветвления в результате образования многочисленных коротких веток увеличивает мицелиальную массу, препятствует росту гиф внутри пеллет, вызывая их искривление, и способствует развитию литических процессов внутри пеллет. Увеличение интервалов между поперечными перегородками способствует формированию более длинных ответвлений, что повышает пористость пеллет, улучшая их массообмен и продуктивность продуцента [46].

Важным фактором биосинтетической активности продуцента является сохранение баланса в обеспечении питательными веществами и кислородом различных зон внутри мицелиальной группировки, что необходимо для поддержания активного роста гиф на периферии и формирования продуктивного мицелия в процессе дифференциации внутри пеллет. Показано, что наибольшей продуктивностью обладают фракции околоверхушечных (субапикальных) и прилегающих к ним, так называемых, «гифальных» участков гиф. Их формирование связано с началом стадии ПКС в центральной части пеллет. На модельной культуре S.coelicolor была разработана математическая модель развития пеллет в процессе ферментации, где в числе основных параметров были использованы радиус мицелиальных группировок, концентрация ратворённого кислорода, гифальная единица роста (HGU), характеризующая рост и ветвление гиф, доля основных ростовых фракций мицелия (апикальной, субапикальной и «гифальной») в общей биомассе пеллет [46]. Предложенную модель развития ми-целиальных группировок авторы рекомендуют использовать в разработках системы контроля ферментаций стрептомицетов.

Как указывалось, с биотехнологической точки зрения предпочтителен рост не в виде пеллет, а более или менее гомогенный рост продуцента. Исследование генетических параметров формирования пеллет показало, что в геноме модельного штамма S.lividans 66 есть mat локус генов, контролирующий образование пеллет. Мутант S.lividans 66 с делецией в этом локусе не образовывал пеллет, характеризовался дисперсным ростом и повышенной продуктивностью. Однако только в некоторых случаях дисперсный рост продуцента коррелирует с повышенным уровнем синтеза антибиотика, и предпочтителен рост в виде пеллет.

Важной проблемой при культивировании ми-целиальных продуцентов в погруженных условиях является сама накапливающаяся масса мицелия в жидкой культуре. Она способна сильно изменить вязкость и густоту среды культивирования (её реологические свойства), тем самым ухудшая условия роста и развития самой культуры продуцента [7]. В условиях промышленных фер-ментаций в биореакторах повышенная вязкость питательного бульона в результате роста и развития мицелиальной массы стрептомицетов-проду-центов инициирует турбулентные потоки культу-ральной жидкости, которые оказывают травмирующее действие на гифы мицелия. В результате интенсифицируются литические процессы на самом раннем этапе роста, которые могут приводить к распаду гиф первичного, молодого мицелия MI и дезинтеграции пеллет на ранней стадии развития продуцента.

В отличие от ферментации в колбах [36], примерно после 50 ч ферментации S.coelicolor в биореакторе объёмом 2 л наблюдались фрагментация гиф, значительное падение уровня внутриклеточного белка, гибель мицелиальных клеток и дезинтеграция большой части пеллет, что приводило к значительному падению уровня антибиотикооб-разования [49]. Причины дезинтеграционных процессов мицелиальных группировок в биореакторах пока не имеют чёткого объяснения. Предполагается, что явление массового лизиса гиф может быть вызвано особенностями дифференциации стрептомицетов-продуцентов, гидродинамическими параметрами ферментаций в биореакторе и чувствительностью к ним мицели-альных группировок. Использование пеногасите-ля в процессе ферментации S.coelicolor позволило предотвратить раннюю дезинтеграцию мицели-альных группировок [44]. В результате подбора компонентов питательной среды, а также внесения в питательную среду соединений с антиокислительной активностью удавалось снизить интенсивность литических процессов на ранней стадии развития продуцента эритромицина Saccharopolyspora erythrae в условиях промышленного ферментёра и, таким образом, повысить уровень антибиотикообразования [65].

Установлено, что на морфологию пеллет и их целостность оказывает существенное влияние ре-гуляторный белок HyaS (hyphae-associated protein). С-терминальная часть этого белка обладает аминооксидазной активностью, которая способствует поддержанию нормальной морфологии пеллет [7]. У S.lividans делеция гена hyaS приводит к формированию пеллет неправильной формы и менее плотных.

Филогенетический анализ белков SsgA и SsgB позволил разделить стрептомицеты по характеру роста и развития в жидкой среде на два кластера: первый объединял стрептомицеты, не способные образовывать глубинные споры и формирующие мицелиальные группировки в виде глыбок или комков, во второй — попали стрептомице-ты, образующие глубинные споры и плотные пеллеты [7]. Установлено, что сверхэкспрессия SsgA активирует процессы формирования перегородок внутри гиф, ветвления гиф и инициирует образование глубинных спор при росте в погруженных условиях. SsgA контролирует процессы перестройки клеточной стенки гиф в процессе роста и развития стрептомицетов путём физической модификации пептидогликана. Последнее обстоятельство, как предполагается, делает клетки менее устойчивыми к лизису. Установлено также, что процессы фрагментации гиф в результате экспрессии SsgA наиболее активны в стационарной фазе роста и предопределяют события ПКС [7]. Плейотропное действие SsgA на

морфологию гиф в конечном итоге оказывает значительное влияние на уровень антибиотико-образования [64, 66].

Перспективы использования особенностей морфогенеза стрептомицетов для оптимизации биосинтеза антибиотиков

Наиболее уязвимые места в системе промышленной ферментации с использованием стреп-томицетов в качестве продуцентов связаны с характером роста этих мицелиальных организмов. Достаточно медленный рост, гетерогенность культуры-продуцента, высокая вязкость культу-ральной жидкости — все эти факторы неблагоприятно сказываются на выходе конечного продукта. Использование в качестве хозяев для гете-рологичной экспрессии продуктов биосинтеза стрептомицетов клетки с более благоприятными параметрами роста, такие как бациллы или дрожжи, вызывает большие трудности, связанные со сложной организацией биосинтетического аппарата, строго специфичного для стреп-томицетов.

Изменения основных биофизических параметров ферментации в биореакторах, например, скорости перемешивания, рН и состава источников питания сказываются на морфологии ми-целиального роста продуцента. Изменения ответа на условия ферментации могут происходить на штаммовом уровне и быть связаны с процессами фрагментации и агрегации мицелиальных группировок. В последнее время предпринимаются попытки смоделировать влияние совокупного действия генетических факторов морфогенеза стрептомицетов с условиями культивирования на выход конечного продукта. Так, была предложена компьютерная модель роста гиф стрептомицета и формирование мицелиальных пеллет различной морфологии [63]. В качестве основных параметров этой модели использовались: количество растворённого кислорода, рост и ветвление гиф, их фрагментация, формирование поперечных перегородок. Предложенная модель предусматривала возможность визуализации влияния этих факторов на морфологию пеллет и предоставляла пользователю возможность управления характером роста, однако не учитывала генетические параметры контроля морфогенеза стрептомицетов. Установлено, что основные компоненты Та^секреторной системы стрептомицетов локализованы непосредственно за верхушечной областью гифы, что предполагает благоприятное воздействие фрагмен-тированного роста, увеличивающего количество апикальных сайтов в гифе, на выход секретируе-мого продукта [66]. В настоящее время большое

внимание уделяется генетическим параметрам микроморфологии стрептомицетов, в то время как параметры формирования мицелиальных группировок не до конца ясны.

Процесс получения промышленных штаммов-продуцентов сопряжен с многочисленными мутациями, направленными на усовершенствование их технологических характеристик. Анализ мутаций позволил бы получить ценную информацию о профилях экспрессии генов нескольких генераций штамма, что дало бы возможность идентифицировать гены, на которых будут сосредоточены новые направления селекции штаммов-продуцентов.

Стрептомицеты — важнейшая в биотехнологическом отношении группа микроорганизмов. 70% препаратов, используемых в настоящее время в медицине, являются продуктами вторичного метаболизма стрептомицетов. Эти организмы характеризуются сложным жизненным циклом, включающем, как отмечала Прокофьева-Бель-говская [11] стадии одной клетки, частичного це-ноцита и многоклеточного образования. В процессе жизнедеятельности стрептомицетов происходит поэтапное образование мицелия разных

ЛИТЕРАТУРА

1. Виноградова К.А., Булгакова В.Г., Полин А.Н., Кожевин П.А. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам: резистома, её объём, разнообразие и развитие. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 5—6: 38—48. / Vinogradova K.A., Bulgakova V.G., Polin A.N., Kozhevin P.A. Ustojchivost' mikroorganizmov k antibiotikam: rezistoma, ee ob#em, raznoobrazie i razvitie. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 5—6: 38—48. [in Russian]

2. Виноградова К.А., Булгакова В.Г., Полин A.H., Кожевин П.А. О биопленках стрептомицетов. I. Распространение и формирование. Антибиотики и химиотер 2015; 60: 1—2: 44—55. / Vinogradova K.A., Bulgakova V.G., Polin A.N., Kozhevin P.A. O bioplenkakh streptomicetov.

I. Rasprostranenie i formirovanie. Antibiotiki i khimioter 2015; 60: 1—2: 44—55. [in Russian]

3. Виноградова К.А., Булгакова В.Г., Полин А.Н., Кожевин П.А. О биопленках стрептомицетов. II. Биотехнологическое использование. Антибиотики и химиотер 2015; 60: 5—6: 27—33. / Vinogradova K.A., Bulgakova V.G., Polin A.N., Kozhevin P.A. O bioplenkakh streptomicetov.

II. Biotekhnologicheskoe ispol'zovanie. Antibiotiki i khimioter 2015; 60: 5—6: 27—33. [in Russian]

4. Kolter R, van Wezel G.P. Goodbye to brute force in antibiotic discovery? 2016 Doi 10.1038/nmicrobiol.2015; 20.

5. Орлова Т.П., Булгакова В.Г., Полин A.H. Вторичные метаболиты морских микроорганизмов. ГВторичные метаболиты морских актино-мицетов. Антибиотики и химиотер 2015; 60: 7—8: 47—59. / Orlova T.I., Bulgakova V.G., PolinA.N.Vtorichnye metabolity morskikh mikroorganizmov. I.Vtorichnye metabolity morskikh aktinomicetov. Antibiotiki i khimioter 2015; 60: 7—8: 47—59. [in Russian]

6. Орлова Т.П., Булгакова В.Г., Полин A.H. Вторичные метаболиты микроорганизмов — потенциальный резерв фармацевтических препаратов. Антибиотики и химиотер 2014; 59: 3—4: 38—44. / Orlova T.I., Bulgakova V.G., Polin A.N.Vtorichnye metabolity mikroorganizmov — potencial'nyj rezerv farmacevticheskikh preparatov. Antibiotiki i khimioter 2014; 59: 3—4: 38—44. [in Russian]

7. Van DisselD, Claessen D, van Wezel G.P. Morphogenesis of Streptomyces in submerged cultures. Adv Appl Microbiol 2014; 89: 1—45.

8. Barka E.A., Vatsa P., Sanchez L. et al. Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2016; 80: 1—43. doi: 10.1128/MMBR.00019-15

9. Flärdh K, Buttner M.J. Streptomyces morphogeneticus: dissecting differentiation in a filamentous bacterium. Nat Rev Microbiol 2009; 7: 1: 36—49.

10. McCormick, J.R., Flärdh K. Signals and regulators that govern Streptomyces development . FEMS Microbiol Rev 2012; 36: 1: 206—231.

11. Прокофьева-Бельговская А.А. Строение и развитие актиномицетов. М.: Изд-во АН СССР; 1963.

типов, смена которых происходит в результате генетически запрограммированного литического процесса ПКС.

Таким образом, представленные материалы позволяют рассматривать характер преобразований морфологии промышленных штаммов-продуцентов актиномицетов в качестве важнейшего фактора, определяющего особенности их поведения в процессе ферментации и уровень биосинтетической активности. В свою очередь, ход морфологических изменений в процессе глубинного культивирования зависит от генетических особенностей штамма-продуцента, а также биофизических параметров ферментёра, состава питательной среды, которые обусловливают специфичность профиля экспрессии генов. Обусловленность морфологических особенностей роста и развития актиномицетов-продуцен-тов генетическими факторами и условиями культивирования определяет основные пути оптимизации ферментационных процессов, селекцию штаммов-продуцентов, а также совершенствование скрининговых исследований по поиску новых, практически ценных вторичных метаболитов актиномицетов.

12. Кожевина Л.С., Виноградова К.А., Кожевин П.А., Силаев А.Б. Изучение связи роста и морфологической дифференциации с антибиоти-кообразованием у культур — продуцентов гелиомицина. Антибиотики 1976; 21: 8: 709—714. / Kozhevina L.S., Vinogradova K.A., Kozhevin P.A., Silaev A.B. Izuchenie svjazi rosta i morfologicheskoj differenciacii s antibiotikoobrazovaniem u kul'tur — producentov geliomicina. Antibiotiki 1976; 21: 8: 709—714. [in Russian]

13. Flardh K, Richards D. M, Hempel A. M, Howard M, Buttner M.J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr Opin Microbiol 2012; 15: 6: 737—743.

14. Holmes N. A., Walshaw J., Leggett R. M, Thibessard A., Dalton K. A., Gillespie M. D. et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110: E397—E406.

15. Chater K. F, Biro S, Lee K. J., Palmer T, Schrempf H. The complex extracellular biology of Streptomyces. FEMS Microbiol Rev 2010; 34: 171—198.

16. Hempel A. M, Cantlay S, Molle V., Wang S. B, Naldrett M. J, Parker J. L.. et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109: E2371—E2379.

17. Kim Y.M., Kim J.H. Formation and dispersion of mycelial pellets of Streptomyces coelicolor A3 (2). J Microbiol 2004; 42: 1: 64—67.

18. de Jong W, Wosten H.A.B., Dijkhuizen L, Claessen D. Attachment of Streptomyces coelicolor is mediated by amyloidal fimbriae that are anchored to the cell surface via cellulose. Mol Microbiol 2009; 73: 6: 1128—1140.

19. Daza A., Martin J. F, Dominguez A., Gil J. A. Sporulation of several species of Streptomyces in submerged cultures after nutritional downshift. J Gen Microbiol 1989; 135: 2483—249120.

20. Glazebrook M. A., Doull J. L., Stuttard C., Vining L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae in submerged cultures. J Gen Microbiol 1990; 136: 581—588.

21. Филиппова С.Н., Горбатюк Е.В., Поглазова M.H., Соина В.С., В.Д.Кузнецов, Элъ-Регистан /.^.Образование эндоспор Streptomyces avermitilis в погруженной культуре. Микробиология 2005; 74: 2: 204—214. / Filippova S.N., Gorbatjuk E.V., Poglazova M.N., Soina V.S., V.D.Kuznecov, Jel'-Registan G.I. Obrazovanie jendospor Streptomyces avermitilis v pogruzhennoj kul'ture. Mikrobiologija 2005; 74: 2: 204—214. [in Russian]

22. Филиппова С.Н., Виноградова К.А. Программируемая клеточная смерть как одна из стадий дифференциации стрептомицетов. Микробиология 2017; 86: 4: в печати. / Filippova S.N., Vinogradova K.A. Programmiruemaja kletochnaja smert' kak odna iz stadij differenciacii streptomicetov. Mikrobiologija 2017; 86: 4: v pechati. [in Russian]

23. Kendrick, K. E, & Ensign, J. C. Sporulation of Streptomycesgriseus in submerged culture. J Bacteriol 1983; 155: 357—366.

24. Koepsel R., Ensign J.C. Microcycle sporulation of Streptomyces viri-dochromogenes. Arch Microbiol 1984; Nov; 140: 1: 9—14.

25. Kwak J., McCue L. A., Trczianka K, Kendrick K. E. Identification and characterization of a developmentally regulated protein, EshA, required for sporogenic hyphal branches in Streptomyces griseus. J Bacteriol 2001; 183: 3004—3015.

26. Bokhove M, Claessen D, de Jong W, Dijkhuizen L, Boekema E. J., Oostergetel G. T. Chaplins of Streptomyces coelicolor self-assemble into two distinct functional amyloids. J Struct Biol 2013; 184: 301-309.

27. Ekkers D. M, Claessen D, Galli F, Stamhuis E. J. Surface modification using interfacial assembly of the Streptomyces chaplin proteins. Appl Microbiol Biotechnol 2014; 98: 4491—4501.

28. MiguelezE.M., Hardisson C, ManzanalM.B. Hyphal death during colony development in Streptomyces antibioticus: morphological evidence for the existence of a process of cell deletion in a multicellular prokaryote. J Cell Biol 1999; 145: 3: 515—525

29. Miguelez E.M., Hardisson C, Manzanal M.B. Streptomycetes: a new model to study cell death. Internatl Microbiol 2000; 3: 3: 153—158.

30. Nicieza R. G, Huergo J., Connolly B. A., Sanchez J. Purification, characterization, and role of nucleases and serine proteases in Streptomyces differentiation: Analogies with the biochemical processes described in late steps of eukaryotic apoptosis. J biol chem. 1999; 274: 29: 20366—20375.

31. Fernandez M, Sanchez J. Nuclease activities and cell death processes associated with the development of surface cultures of Streptomyces antibioti-cus ETH 7451. Microbiology 2002; 148: 2: 405—412.

32. Galluzzi L, Bravo-San Pedro J.M., Vitale I., Aaronson S.A., Abrams J.M., Adam D. et al. Essential versus accessory aspects of cell death: Recommendations ofthe NCCD 2015. Cell Death Differ 2015; 22: 1: 58—73.

33. Manteca Á, Fernandes M, Sanchez J. Mycelium development in Streptomyces antibioticus ATCC11891 occurs in an orderly pattern which determines multiphase growth. BMC Microbiol 2005; 5: 51.

34. Manteca Á, Fernandez M, Sánchez J. Cytological and biochemical evidence for an early cell dismanting events in surface cultures of Streptomyces antibioticus. Res microbiol 2006; 157: 2: 143—152.

35. Manteca Á, Mader U, Connolly B.A., Sanchez J. A proteomic analysis of Streptomyces coelicolor programmed cell death. Proteomics 2006; 6: 22: 6008—6022.

36. Manteca Á, Alvarez R, Salazar N, Yagüe P., Sanchez J. Mycelium differentiation and antibiotic production in liquid cultures of Streptomycescoeli-color. Appl Environ Microbiol 2008; 74; 12: 3877—3886.

37. Manteca Á, Jung H.R, Schwammle V., Jensen O.N, Sanchez J. Quantitative proteomic analysis of Streptomyces coelicolor in liquid cultures reveals the switch in metabolism associated with hyphae differentiation. J Proteome Res 2010a; 9: 9: 4801—4811.

38. Manteca Á, Sanchez J, Jung H.R, Schwammle V., Jensen O.N. Quantative proteomic analysis of Streptomyces coelicolor development demonstrated that onset of secondary metabolism coincides with hypha differentiation. Moll Cell Proteomics 20106; 9: 7: 1423—1436.

39. Yagüe P., Lopez-Garcia M. T, Rioseras B. et al. New insights on the development of Streptomyces and their relationships with secondary metabolite production. Curr Trends Microbiol 2012; 8: 65—73.

40. Yagüe P., Lopez-Garcia M.T., Rioseras B. et al. Pre-sporulation stages of Streptomyces differentiation: state-of-the-art and future perspectives. FEMS Microbiol Lett 2013a: 342: 2: 79—88

41. Yagüe P., Rodriguez-Garcia A., Lopez-García M.T. et al. Transcriptomic analysis of Streptomyces coelicolor differentiation in solid sporulating cultures: first compartmentalized and second multinucleated mycelia have different and distinctive transcriptomes. PLoS One 2013; 8: 3: e60665.

42. Yagüe P., Rodriguez-Garcia A., Lopez-García M.T., Rioseras B., Martin J.F., Sanchez J. et al. Transcriptomic analysis of liquid non-sporulating Streptomyces coelicolor cultures demonstrates the existence of a complex differentiation comparable to that occurring in solid sporulating cultures. PLoS ONE 2014; 9: 1; e86296.

43. Yagüe P., Willemse J., Koning R.I., Rioseras B, Lopez-García M.T., Gonzalez-Quiñonez N. et al. Subcompartmentalization by cross-membranes during early growth of Streptomyces hyphae. Nat Commun 2016; 12: 7: 12467. doi: 10.1038/ncomms12467.

44. Rioseras B., Lopez-García M.T., Yagüe P. et al. Mycelium differentiation and development of Streptomyces coelicolor in lab-scale bioreactors: Programmed cell death, differentiation, and lysis are closely linked to undecylprodigiosin and actinorhodin production. Bioresource technol 2014; 151: 191—198.

45. Yagüe P., Manteca Á., Simon A., Diaz-Garcia M.E., Sanchez J. New method for monitoring programmed cell death and differentiation in submerged Streptomyces cultures // Appl Environ microbiol 2010; 76: 10: 3401—3404.

46. CellerK., Picioreanu C., vanLoosdrechtM. C, van Wezel, G. P. Structured morphological modeling as a framework for rational strain design of Streptomyces species. Antonie van Leeuwenhoek 2012; 102: 409—423.

47. Беккер О.Б., Мавлетова Д.А., Любимова И.К., Мирончева ТА, Штиль A.A., Даниленко В Н. Индукция программированного лизиса культуры Streptomyces lividans ингибиторами серин-треониновых протеин-киназ эукариотического типа. Микробиология 2012; 81: 2: 177—184. / Bekker O.B., Mavletova D.A., Ljubimova I.K., Mironcheva T.A., Shtil' A.A., Danilenko V.N. Indukcija programmirovannogo lizisa kul'tury Streptomyces lividans ingibitorami serin-treoninovykh proteinkinaz jeukarioticheskogo tipa. Mikrobiologija 2012; 81: 2: 177—184. [in Russian]

48. Danilenko V.N., Osolodkin D.I., Lakatosh S.A., Preobrazhenskaya M.N., Shtil A.A. Bacterial Eukaryotic Type Serine-Threonine Protein Kinases: From Structural Biology to Targeted Anti-Infective Drug Design. Curr Top Med Chem 2011; 11: 11: 1352—1369.

49. Sanchez J, Yagüe P., Manteca Ä. New insights in Streptomyces fermentation. Ferment technol 2012; 1: 2: 1000e105.

50. Beites T.,Oliveira P., Rioseras B, Pires S. D. S, Oliveira R, Tamagnini P. et al. Streptomyces natalensis programmed cell death and morphological differentiation are dependent on oxidative stress. Sci Rep 2015; DOI: 10.1038/srep12887.

51. Novotna J., Vohradsky J., Berndt P., Gramajo H, Langen H, Li X-M. et al. Article Proteomic studies of diauxic lag in the differentiating Prokaryote. Streptomyces coelicolor reveal a regulatory network of stress-induced proteins and central metabolic enzymes. Mol Microbiol 2003; 48: 5: 1289—1303. doi: 10.1046/j.1365-2958.2003.03529.x.

52. Шапошников В Н. Техническая микробиология. М.: Изд-во Совнау-ка; 1948. / Shaposhnikov V.N. Tekhnicheskaja mikrobiologija. M.: Izd-vo Sovnauka; 1948. [in Russian]

53. Егоров H.C. Основы учения об антибиотиках. 6-ое изд. М.: Изд-во МГУ; Наука; 2004. / EgorovN.S. Osnovy uchenija ob antibiotikakh. 6-oe izd. M.: Izd-vo MGU; Nauka; 2004. [in Russian]

54. Rigali, S, Titgemeyer F., Barends Sh, Mulder S, Thomae A.W., Hopwood D. A. et al. Feast or famine: the global regulator DasR links nutrient stress to antibiotic production by Streptomyces. EMBO Rep 2008; 9: 7: 670—675.

55. Кузнецов В.Н.Параллелизм в наследственной изменчивости и попу-ляционная концепция вида у представителей прокариот. Журн общей биологии 1987; 48: 4: 466—476. / Kuznecov V.N. Parallelizm v nasledstvennoj izmenchivosti i populjacionnaja koncepcija vida u pred-stavitelej prokariot. Zhurn obshhej biologii 1987; 48: 4: 466—476. [in Russian]

56. Соколова З.Г., Виноградова К.А., Полин A.H. Полиморфизм культуры Streptomyces olivocinereus — продуцента гелиомицина. Антибиотики и мед биотехнол 1987; 32: 1: 15—20. / Sokolova Z.G., Vinogradova K.A., Polin A.N. Polimorfizm kul'tury Streptomyces olivocinereus — producenta geliomicina. Antibiotiki i med biotekhnol 1987; 32: 1: 15—20. [in Russian]

57. Виноградова К.А., Кожевина Л.С. Изменчивость продуцента гелио-мицина Actinomyces variabilis при культивировании в лабораторных условиях. Биол науки 1974; 10: 89—92. / Vinogradova K.A., Kozhevina L.S. Izmenchivost' producenta geliomicina Actinomyces variabilis pri kul'-tivirovanii v laboratornykh uslovijakh. Biol nauki 1974; 10: 89—92. [in Russian]

58. Виноградова К.А., Нгуен Тхань Дат, Силаев А.Б. Внутривидовая изменчивость Actinomyces aburaviensis var. verrucosus. Биол науки 1975; 4: 89—93. / Vinogradova K.A., Nguen Tkhan' Dat, Silaev A.B. Vnutrividovaja izmenchivost' Actinomyces aburaviensis var. verrucosus. Biol nauki 1975; 4: 89—93. [in Russian]

59. Соколова З.Г., Полянская Л.М., Виноградова К.А., Силаев А.Б. Естественная изменчивость по биосинтезу антибиотика в связи с процессами морфогенеза у Actinomyces chromogenes var. thrienicus. Генетика 1975; 11: 8: 115—121. / Sokolova Z.G., Poljanskaja L.M., Vinogradova K.A., Silaev A.B. Estestvennaja izmenchivost' po biosintezu antibiotika v svjazi s processami morfogeneza u Actinomyces chromogenes var. thrieni-cus. Genetika 1975; 11: 8: 115—121. [in Russian]

60. Vinogradova K.A., Kirillova N.P., Sokolova Z.G., Nicolau P.A., Shulgina M.V., Skvortsova G.N. et al. Regulation of heliomycin biosynthesis by carbon sources. Antibiotiki i Meditsinskaya Biotekhnologiya 1985; 30: 4: 264—271.

61. Деянова О.А., Кириллова Н.П., Виноградова К.А., Королёв П.Н., Полин А.Н. Эффект L-арабинозы и сахарозы на биосинтез гелиомицина его продуцентом Streptomyces olivocinereus 11-98. Антибиотики и хи-миотер 1988; 33: 4: 248—252. / Dejanova O.A., Kirillova N.P., Vinogradova K.A., Koroljov P.N., Polin A.N. Jeffekt L-arabinozy i sakharozy na biosintez geliomicina ego producentom Streptomyces olivocinereus 11—98. Antibiotiki i khimioter 1988; 33: 4: 248—252. [in Russian]

62. Виноградова К.А., Деянова О.А., Кириллова Н.П. Разработка метода «покоящихся клеток» для изучения гелиомицин-синтезирующей системы Streptomyces olivocinereus 11—98. Антибиотики и химиотер 1988; 33: 12: 910—913. / Vinogradova K.A., Dejanova O.A., Kirillova N.P. Razrabotka metoda «pokojashhikhsja kletok» dlja izuchenija geliomicin-sintezirujushhej sistemy Streptomyces olivocinereus 11—98. Antibiotiki i khimioter 1988; 33: 12: 910—913. [in Russian]

63. Соколова З.Г., Виноградова К.А., Артюхова В.И. Влияние концентрации глюкозы на рост и морфологию колоний стрептомицетов на плотных средах. Вестник Mry 1985; Сер. 16: 1: 61—66. / Sokolova Z.G., Vinogradova K.A., Artjuhova V.I. Vlijanie koncentracii gljukozy na rost i morfologiju kolonij streptomicetov na plotnyh sredah. Vestnik MGU 1985; Ser. 16: 1: 61—66. [in Russian]

64. van Dissel D, Claessen D, Roth M, van Wezel G.P. A novel locus for mycelial aggregation forms a gateway to improved Streptomyces cell factories. Microbial Cell Factories 2015; 14: 44: 2—10.

65. Мичурина T.A., Миронов В.А. Взаимосвязь морфологических изменений и биосинтеза эритромицинов в глубинной культуре

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Виноградова Ксения Александровна — к.б.н., старший научный сотрудник кафедры микробиологии биологического факультета Mry им. M. В. Ломоносова, Mосква Филиппова Светлана Николаевна — к.б.н., и.о. ведущего научного сотрудника Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологий» РАН, Mосква

66.

Saccharopolyspora erythraea. /Антибиотики и химиотер 2005; 10—11: 58—63. / Michurina T.A., Mironov V.A. Vzaimosvjaz' morfologicheskikh izmenenij i biosinteza jeritromicinov v glubinnoj kul'ture Saccharopolyspora erythraea. /Antibiotiki i khimioter 2005; 10—11: 58—63. [in Russian] van Wezel G. P., Krabben P., Traag B. A., Keijser B. J. F., Kerste R, Vijgenboom E. et al. Unlocking Streptomyces spp. for use as sustainable industrial production platforms by morphological engineering. Appl Environ Microb 2006; 72: 8: 5283—5288.

\Полин Анатолий Николаевич\ — д.б.н., ведущий научный сотрудник кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва