ВАРИАНТЫ CTLA-4

1. Выделенный полипептид CTLA-4, имеющий большую аффинность связывания с CD80 человека, большую эффективность и/или большую стабильность по сравнению с SEQ ID NO: 35, при этом полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая является вариантом SEQ ID NO: 35, где вариант содержит пять или более из следующих мутаций аминокислот в SEQ ID NO: 35:
R, S, V или Τ в положении I16;
Τ в положении А24;
N или Ρ в положении S25;
S в положении G27;
I в положении V32;
G в положении D41;
G в положении S42;
Ε в положении V44;
K в положении М54;
S или G в положении N56;
A, G, S или Ρ в положении L58;
S или А в положении Т59;
Τ в положении F60;
Q или Ρ в положении L61;
G в положении D62;
V в положении D63; Ρ в положении S64;
Ν, D, V или Τ в положении I65;
Α, Τ, M или H в положении S70;
R в положении Q80;
Q, S, V, R, K или L в положении М85;
S в положении Т87;
Q, Η, Τ, Ε или M в положении K93;
R, Q или Ε в положении L104;
V в положении 1106;
D или S в положении N108;
V или F в положении I115;
S в положении С120;
делеция Т51.
2. Полипептид CTLA-4 по п. 1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 35.
3. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий пять или более из следующих мутаций аминокислот:
R, S или V в положении I16;
Τ в положении А24;
N в положении S25;
S в положении G27;
К в положении М54;
S в положении N56;
А или G в положении L58;
S в положении Т59;
Τ в положении F60;
Q в положении L61;
Y в положении D63;
Ρ в положении S64;
N или D в положении I65;
А в положении S70;
R в положении Q80;
Q или S в положении М85;
Q или H в положении K93;
S в положении С120.
4. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий замену S25N или S25P.
5. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий замену S25N, K93Q или K93H.
6. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную любой из SEQ ID NO: 36-55, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности CTLA-4, кодируемой нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948.
7. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий аминокислотный мотив SEQ ID NO: 69 в положении остатков 59-65, при этом нумерация остатков определена по отношению к SEQ ID NO: 35.
8. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий комбинацию мутаций, выбранных из:
- мутаций 1315, т.е. S в положении I16; N в положении S25; G в положении L58; А в положении S70; R в положении Q80; S в положении М85 и Q в положении K93;
- мутаций 1322, т.е. N в положении S25; S в положении G27; K в положении М54; S в положении N56; S в положении Т59; Τ в положении F60; Q в положении L61; Y в положении D63; Ρ в положении S64; N в положении 165 и Q в положении К93;
- мутаций 1321, т.е. S в положении I16; N в положении S25; K в положении М54; G в положении L58; А в положении S7 0; R в положении Q80; S в положении М85 и Q в положении K93;
- мутаций 1115, т.е. V в положении I16; N в положении S25; G в положении L58; А в положении S70; Q в положении М85 и Q в положении K93;
- мутаций 1299, т.е. R в положении I16; Τ в положении А24; N в положении S25; S в положении G27; А в положении L58; А в положении S70; Q в положении М85 и Q в положении K93; и
- мутаций 1227, т.е. S в положении I16; N в положении S25; S в положении G27; А в положении L58; А в положении S70; Q в положении М85 и H в положении K93.
9. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 36-55, или содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, или содержащий вариант любой из этих последовательностей, которые содержат до десяти мутаций аминокислот.
10. Полипептид CTLA-4 по по п. 1 или 2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 36-55, или содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, или содержащий вариант любой из этих последовательностей, которые содержат до пяти мутаций аминокислот.
11. Полипептид CTLA-4 по п. 10, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 36-55, или содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, или содержащий вариант любой из этих последовательностей, которые содержат до трех мутаций аминокислот.
12. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 36-55, или содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948.
13. Полипептид CTLA-4 по п. 12, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47, или аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948.
14. Выделенный полипептид CTLA-4, имеющий большую аффинность связывания с CD80 человека, большую эффективность и/или большую стабильность по сравнению с SEQ ID NO: 35, где полипептид содержит:
(i) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47;
(ii) аминокислотную последовательность, которая является вариантом (i), содержащим до десяти мутаций аминокислот, где остаток 25 не мутирован и представляет собой N;
(iii) аминокислотную последовательность, которая является вариантом (i), содержащим одну или несколько мутаций аминокислот, где остаток 25 не мутирован и представляет собой N, при этом вариант имеет по меньшей мере 7 0% идентичности последовательности с (i); или
(iv) аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером в NCIMB 41948.
15. Полипептид CTLA-4 по п. 14, содержащий SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47 или вариант любой из этих последовательностей, которые содержат до пяти мутаций аминокислот.
16. Полипептид CTLA-4 по п. 15, содержащий SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47 или вариант любой из этих последовательностей, которые содержат до трех мутаций аминокислот.
17. Полипептид CTLA-4 по п. 14, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47.
18. Полипептид CTLA-4 по п. 17, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47.
19. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, имеющий аффинность связывания с CD80 человека 50 нМ или менее, где аффинность выражена Kd, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
20. Полипептид CTLA-4 по п. 19, имеющий аффинность связывания с CD80 человека 20 нМ или менее, где аффинность выражена Kd, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
21. Полипептид CTLA-4 по п. 1 или 2, где полипептид имеет большую аффинность связывания с CD86 человека, чем CTLA-4 дикого типа (SEQ ID NO: 35).
22. Полипептид CTLA-4 по п. 14, содержащий:
- S в положении остатка 16; N в положении остатка 25; G в положении остатка 58; А в положении остатка 70; R в положении остатка 80; S в положении остатка 85 и Q в положении остатка 93;
- N в положении остатка 25; S в положении остатка 27; K в положении остатка 54; S в положении остатка 56; S в положении остатка 59; Τ в положении остатка 60; Q в положении остатка 61; Y в положении остатка 63; Ρ в положении остатка 64; N в положении остатка 65 и Q в положении остатка 93;
- S в положении остатка 16; N в положении остатка 25; K в положении остатка 54; G в положении остатка 58; А в положении остатка 70; R в положении остатка 80; S в положении остатка 85 и Q в положении остатка 93;
- V в положении остатка 16; N в положении остатка 25; G в положении остатка 58; А в положении остатка 70; Q в положении остатка 85 и Q в положении остатка 93;
- R в положении остатка 16; Τ в положении остатка 24; N в положении остатка 25; S в положении остатка 27; А в положении остатка 58; А в положении остатка 70; Q в положении остатка 85 и Q в положении остатка 93 или
- S в положении остатка 16; N в положении остатка 25; S в положении остатка 27; А в положении остатка 58; R в положении остатка 70; Q в положении остатка 85 и H в положении остатка 93.
23. Полипептид CTLA-4 по п. 14, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47, содержащую до трех мутаций аминокислот.
24. Полипептид CTLA-4 по п. 14, содержащий: R, I, S или V в положении 16; Τ или А в положении 24; S или G в положении 27; M или K в положении 54; N или S в положении 56; A, L или G в положении 58; Τ или S в положении 59; F или Τ в положении 60; L или Q в положении 61; D или Y в положении 63; S или Ρ в положении 64; I, N или D в положении 65; А или S в положении 70; Q или R в положении 80; Q, M или S в положении 85; Q или H в положении 93 и С или S в положении 120.
25. Полипептид CTLA-4 по п. 14, где мутации аминокислот выбраны из следующих: замена Τ в положении остатка 16; замена I в положении остатка 32; замена G в положении остатка 41; замена G в положении остатка 42; замена Ε в положении остатка 44; замена G в положении остатка 56; замена S или Ρ в положении остатка 58; замена А в положении остатка 59; замена Ρ в положении остатка 61; замена G в положении остатка 62; замена V
или Τ в положении остатка 65; замена Τ, M или H в положении остатка 70; замена V, R, K или L в положении остатка 85; замена S в положении остатка 87; замена Τ, Ε или M в положении остатка 93; замена R, Q или Ε в положении остатка 104; замена V в положении остатка 10 6; замена D или S в положении остатка 108; замена V или F в положении остатка 115; замена S в положении остатка 120; делеция остатка 51.
26. Полипептид CTLA-4 по п. 14, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 47 или содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948.
27. Выделенный полипептид CTLA-4, который имеет аффинность связывания с CD80, по меньшей мере в 10 раз превышающую аффинность связывания с CD86.
28. Полипептид CTLA-4 по п. 27, который имеет аффинность связывания с CD80, по меньшей мере в 50 раз превышающую аффинность связывания с CD86.
29. Полипептид CTLA-4 по п. 27 или 28, где полипептид является таким, как определено в любом из пп. 1-26.
30. Полипептид CTLA-4 по п. 1, 14 или 27, конъюгированный с аминокислотной последовательностью Fc IgG.
31. Полипептид CTLA-4 по п. 30, где Fc IgG представляет собой Fc IgG1 человека, модифицированный с целью снижения эффекторной функции Fc, и содержит нативную шарнирную область Fc IgG1 человека.
32. Полипептид CTLA-4 по п. 30, где аминокислотная последовательность Fc IgG содержит Fc-участок IgG1 человека, в котором одна или обе из следующих групп остатков замещены еле дующим образом:
F в положении остатка 20; Ε в положении остатка 21; S в положении остатка 117 и
Y в положении остатка 38, Τ в положении остатка 40, Ε в положении остатка 42,
при этом нумерация остатков определена по отношению к SEQ ID NO: 56.
33. Полипептид CTLA-4 по п. 30, где аминокислотная последовательность Fc IgG содержит SEQ ID NO: 59.
34. Выделенный полипептид CTLA-4, содержащий аминокислотную последовательность CTLA-4-Ig 1299, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948.
35. Полипептид CTLA-4 по п. 1, 27 или 34, где полипептид находится в мультимере.
36. Полипептид CTLA-4 по п. 35, где полипептид CTLA-4 находится в димере.
37. Полипептид CTLA-4 по п. 35, где полипептид CTLA-4 находится в тетрамере.
38. Полипептид CTLA-4 по п. 37, где тетрамер содержит две пары полипептидов CTLA-4, при этом каждая пара включает полипептид CTLA-4, слитый с константной областью легкой цепи антитела, и полипептид CTLA-4, слитый с константной областью тяжелой цепи антитела.
39. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты CTLA-4-Ig 1299, депонированную под номером доступа в NCIMB 41948.
40. Композиция, содержащая
полипептид CTLA-4 по любому из предыдущих пунктов и
один или несколько фармацевтических наполнителей.
41. Композиция, содержащая
полипептид CTLA-4, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 47 или аминокислотную последовательность CTLA-4, кодируемую нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, конъюгированную с аминокислотной последовательностью Fc IgG; и
один или несколько фармацевтических наполнителей.
42. Композиция по п. 40 или 41, отличающаяся тем, что полипептид CTLA-4 конъюгирован с аминокислотной последовательностью Fc IgG, содержащей SEQ ID NO: 59.
43. Композиция по п. 42, отличающаяся тем, что полипептид CTLA-4, конъюгированный с Fc IgG, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16.
44. Композиция, содержащая полипептид CTLA-4-Ig 1299, кодируемый нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, и один или несколько фармацевтических наполнителей.
45. Композиция по п. 40 или 41, содержащая полипептид CTLA-4 в концентрации по меньшей мере 70 мг/мл.
46. Композиция по п. 45, содержащая полипептид CTLA-4 в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл.
47. Полипептид CTLA-4 по п. 1, 14, 27 или 34 или композиция по п. 44 для применения в способе лечения пациента посредством подкожного или внутривенного введения.
48. Полипептид CTLA-4 по п. 1, 14, 27 или 34 или композиция по п. 44 для применения в способе лечения ревматоидного артрита, рассеянного склероза, астмы, болезни Крона, язвенного колита, системной красной волчанки или отторжения трансплантата.
49. Полипептид CTLA-4 по п. 1, 14, 27 или 34 или композиция по п. 44 для применения в способе лечения, включающем введение указанного полипептида CTLA-4 или указанной композиции пациенту с интервалами 28 дней.
50. Способ получения дополнительного полипептида CTLA-4 посредством мутации аминокислотной последовательности полипептида CTLA-4, выбранной из SEQ ID NO 36-55, или аминокислотной последовательности CTLA-4, кодируемой нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948, при этом способ включает:
обеспечение полипептида CTLA-4, содержащего или состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO 36-55 или аминокислотной последовательности CTLA-4, кодируемой нуклеиновой кислотой, депонированной под номером доступа в NCIMB 41948;
введение одной или нескольких мутаций в аминокислотную последовательность для обеспечения дополнительного полипептида CTLA-4;
исследование стабильности, аффинности и/или эффективности дополнительного полипептида CTLA-4 и
составление дополнительного полипептида CTLA-4 с получением композиции, содержащей один или несколько фармацевтических наполнителей.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что дополнительный полипептид CTLA-4 конъюгирован с Fc-участком.