ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕКРОБАКТЕРИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
PREPARATION FOR TREATMENT OF NECROTIC STOMATITIS OF CATTLE

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности - к средствам для лечения некробактериоза крупного рогатого скота.
Некробактериоз (necrobacteriosis) - хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся гнойно-некротическими поражениями кожи и подлежащих тканей, локализующимися преимущественно в дистальных частях задних конечностей, а в отдельных случаях - в ротовой полости, на половых органах, вымени, в печени, легких, мышцах и других органах и тканях. Заболевание распространено во всех частях мира, в том числе в России. Особую опасность некробактериоз представляет для крупного рогатого скота.
Возбудитель болезни - Fusobacterum necrophorum - строгий анаэроб, представляет собой грамотрицательную, неподвижную, не образующую спор и капсул палочку, весьма полиморфную. В почве и навозе сохраняется до 60, а в воде и моче до 15 дней (http://necrobacterin http://blogspot.ru/2010/04/necrobacteriosis.html).
Известен препарат для лечения некробактериоза животных (см. патент РФ №2295332 по кл. МПК A61K 31/045, опуб. 20.03.2007), содержащий левомицетин, тилозин, метронидазол, раствор хлористо-водородной кислоты, стабилизаторы - формальдегидсульфоксилат натрия и сернистокислый натрий и растворители - бензиловый спирт и 1,2-монопропиленгликоль.
Данный препарат является многокомпонентным химическим препаратом. Обладает рядом побочных эффектов (вызывает аллергию, расстройства желудочно-кишечного тракта и пр.).
Известна гипериммунная сыворотка для лечения некробактериоза животных (см. патент РФ №2195318 по кл. МПК A61K 39/40, опуб. 27.12.2002), содержащая антитела к Fusobacterium necrophorum в титре не ниже 1:128 в реакции агглютинации и полученная гипериммунизацией волов-продуцентов инактивированным формалином лейкоцидин-экзотоксином, представляющим собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кД и выделенный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ.
Сыворотка обеспечивает при однократном введении создание напряженного пассивного иммунитета против некробактериоза крупного рогатого скота.
Однако действие ее ограничено во времени (не более 10-14 дней), поскольку сывороточные антитела элиминируются, а повторное введение сыворотки может вызывать сенсибилизацию организма животных. Кроме этого, стоимость сыворотки высокая, а лечение требует значительного количества ее введения.
3
Наиболее близким к заявляемому является препарат «Нековак» против некробактериоза крупного рогатого скота (см. патент РФ №2098127 по кл. МПК A61K 39/116, опуб. 10.12.1997), содержащий инактивированные формалином культуры штаммов микроорганизмов Fusobacterium necrophorum, Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes, Clostridium perfringens типа A, отобранных по широте иммуногенного спектра и селекционированных по признаку максимальной иммуногенной и антигенной активности. Препарат вводят животным подкожно в дозе 5 см двукратно с интервалом 28-30 дней.
Однако данный препарат многокомпонентен (содержит 7 инактивированных культур различных штаммов микроорганизмов) и не содержит токсинообразующих компонентов микроорганизмов, которые являются определяющими при лечении некробактериоза крупного рогатого скота.
В прототипе используется набор культур микроорганизмов, в том числе против возбудителя некробактериоза (Fusobacterium necrophorum) и осложняющей микрофлоры (Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes, Clostridium perfringens типа A). Применение этой вакцины в благополучных хозяйствах обеспечит защиту животных от некробактериоза и осложняющей микрофлоры. В неблагополучных хозяйствах терапевтический эффект от использования этого препарата будет не эффективным, поскольку присутствие Fusobacterium necrophorum в вакцине спровоцирует инфекционный процесс у латентных животных и усугубит течение болезни.
Наличие в препарате других видов бактерий (Staphylococcus aureus, Corynebacterium pyogenes, Clostridium perfringens типа A), которые должны нейтрализовать действие осложняющих факторов при некробактериозе, не приведет к нейтрализации токсинов.
Кроме этого, препарат может вызывать воспалительные реакции на месте введения.
Изобретение направлено на решение задачи создания препарата для лечения некробактериоза, обладающего высокой терапевтической эффективностью, учитывающего разнообразие токсинообразующих факторов за счет синергизма входящих в его состав компонентов микроорганизмов, не вызывающего провокации инфекционного процесса у латентно-инфицированных животных и воспалительных реакций при сокращении сроков лечения.
8
9
8
9
Для решения поставленной задачи препарат для лечения некробактериоза крупного рогатого скота, содержащий инактивированные культуры микроорганизмов, согласно изобретению, дополнительно содержит поливалентный анатоксин против клостридиозов овец, а в качестве культур микроорганизмов он содержит культуральную жидкость с содержанием микробных клеток 7,0·10-1·10 КОЕ/мл, полученную в результате культивирования штамма Escherichia coli А-5, и культуральную жидкость с содержанием микробных клеток 7,0·10-1·10 КОЕ/мл, полученную в результате культивирования штамма Escherichia coli Б-5 (ДЕП) при соотношении поливалентного анатоксина, культуральных жидкостей из штаммов Escherichia coli А-5 и Escherichia coli Б-5 1:1:1.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической литературы не описано препарата для лечения некробактериоза крупного рогатого скота на основе смеси поливалентного анатоксина против клостридиозов овец с культуральными жидкостями, полученными из штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5, взятых в соотношении 1:1:1.
Основным этиологическим фактором при некробактериозе на начальной стадии заболевания являются анаэробы, которые размножаются без доступа кислорода и выделяют сильнодействующие токсины.
Эти токсины провоцируют размножение другой условно-патогенной и патогенной микрофлоры, в том числе и эшерихий. Они, в свою очередь, также выделяют токсины и осложняют течение основного заболевания.
Известно использование для лечения некробактериоза препарата, содержащего Clostridium perfringens типа A (см. патент РФ №2098127 по кл. МПК A61K 39/116, опуб. 10.12.1997).
С другой стороны, известно использование супернатанта культуры Clostridium perfringens типа С для стимулирования перекрестного иммунитета против инфекции Clostridium perfringens типа A и, как следствие, для защиты животных от инфекции Clostridium perfringens типа A (см. патент РФ №2462263 по кл. МПК A61K 39/08, опуб. 27.09.2012). Кроме этого, известно также использование для повышения эффективности защиты животных от Clostridium perfringens типа A комбинированной вакцины, содержащей супернатант культуры Clostridium perfringens типа C и компоненты вакцины Escherichia coli.
Авторами впервые предложено использовать в качестве основного компонента препарата для лечения некробактериоза клостридиозный анатоксин против овец (содержащий анатоксины Clostridium perfringens типов С и Д, Clostridium oedematiens и анавакцины Clostridium septicum) в сочетании с токсинообразующими штаммы - Escherichia coli А-5, продуцирующего термостабильный токсин и Escherichia coli Б-5, продуцирующего термолабильный токсин, которые совместно обеспечивают нейтрализацию токсинов микроорганизмов, особенно кишечной группы (эшерихий), осложняющих течение некробактериоза.
Таким образом, сущность изобретения заключается в воздействии препарата не на возбудитель заболевания (Fusobacterium necrophorum) и не на токсины, которые он выделяет, в отличие от общепринятых средств для лечения некробактериоза, а действие его направлено на активизацию иммунитета против токсинов, выделяющихся осложняющей микрофлорой, а именно: факультативными и облигатными анаэробами (клостридиями - Clostridium perfringens типов С и Д, Clostridium oedematiens и Clostridium septicum) и аэробами кишечной группы, выделяющими термолабильные и термостабильные токсины.
Таким образом, неизвестность выявленного свойства препарата для лечения некробактериоза нейтрализовать действия токсинообразующей осложняющей микрофлоры без провокации инфекционного процесса у латентно-инфицированных животных позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Поливалентный анатоксин против клостридиозов овец, изготовленный ФГУП «Ставропольская биофабрика» по СТО 00482861-0010-2006, предназначен для подкожного введения взрослым овцам и ягнятам. Состоит из осажденных гидратом окиси алюминия и концентрированных анатоксинов Clostridium perfringens типов С и Д, Clostridium edematiens и анавакцины Clostridium septicum. Представляет собой жидкость желтого цвета. Предназначен для профилактики клостридиозов у овец.
Штаммы E.coli А-5 и E.coli Б-5 выделены из паренхиматозных органов павшего поросенка 10-дневного возраста, хранятся в ГНУ Саратовском научно-исследовательском ветеринарном институте Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии).
Штамм E.coli Б-5 депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ): справка о депонировании №18707/15 от 10.10.2002.
Свойства штаммов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Свойства штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5
Свойства штамма
Штамм E.coli А-5
Штамм E.coli Б-5
Культуральные и морфологические признаки
На МПБ клетки растут диффузно, на МПА колонии S- и R-форм. На агаре Эндо колонии малинового цвета
На МПБ клетки растут диффузно, на МПА колонии S- и R-форм. На агаре Эндо колонии темно-красные
Ферментативные свойства
Микроорганизм: подвижен, ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу. Не ферментирует сахарозу.
Микроорганизм: подвижен, обладает каталазной активностью, дает поожительную реакцию с метилротом, продуцирует индол, ферментирует глюкозу, лактозу, арабинозу, маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, дульцит.
Токсигенные свойства
Продуцирует термостабильный экзотоксин
Продуцирует термолабильный экзотоксин.
Чувствительность к антибиотикам
Чувствителен к: ампициллину, карбенициллину, левомицетиту, фурадонину, рифампицину.
Чувствителен к: полимиксину, стрептомицину, левомицетину, рифампицину, карбенициллину;
Не чувствителен к: тетрациклину, олеандомицину, оксациллину, цефазолину, цефатоксину.
не чувствителен к: оксациллину, доксициклину, линкомицину, тетрациклину, олеандомицину,
Слабо чувствителен кполимиксину.
ампициллину, пенициллину.
Вирулентные свойства
LД<sub>50</sub> - 4,0·10<sup>9</sup> м.к./см<sup>3</sup>
LД<sub>50</sub> - 1,2·10<sup>10</sup> шм.к./см<sup>3</sup>
Гибель белых мышей наступает в течение двух суток.
Гибель белых мышей наступает в течение суток.
Антигенные свойства
Культура неоднородна по антигенным свойствам. Некоторые клоны агглютинируют сыворотку 0-1
Культура неоднородна по антигенным свойствам. Некоторые клоны дают агглютинацию с сывороткой 0-4.
Препарат готовят следующим образом.
8
9
1. Вначале готовят две культуральные жидкости: на основе штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5 с содержанием микробных клеток 7·10-1·10 КОЕ/мл каждая.
Для этого засевают отдельно суточные бульонные культуры штаммов на питательную среду и осуществляют наблюдение за их ростом.
8
9
Критерием выбора готовности культуральных (токсинсодержащих) жидкостей именно с таким количеством микробных клеток (7·10-1·10 КОЕ/мл) являлась максимальная их жизнеспособность, обусловленная разными сроками продуцирования необходимого количества термостабильного и термолабильного токсинов.
8
9
8
9
Экспериментальным путем установлено, что максимальная жизнеспособность клеток (7·10-1·10 КОЕ/мл в культуральной жидкости) при культивировании штамма E.coli А-5, продуцирующего термостабильный токсин, достигалась на начальной стадии токсинообразования, а в культуральной жидкости при культивировании штамма E.coli Б-5, продуцирующего термолабильный токсин, максимальная жизнеспособность клеток (7·10-1·10 КОЕ/мл в культуральной жидкости) достигалась на более поздней стадии.
2. При достижении необходимого количества микробных клеток в каждую культуральную жидкость добавляют формалин, смесь перемешивают и помещают в термостат на 14 суток. Затем осуществляют проверку на стерильность.
3. Смешивают в равных долях поливалентный анатоксин против клостридиозов овец и две инактивированных стерильных культуральных жидкости с заданным количеством микробных клеток. Компоненты тщательно перемешивают и взвесь разливают по флаконам.
Готовый препарат представляет собой жидкость светло-соломенного цвета, с белым осадком и специфическим запахом, имеет слабо кислую реакцию. При встряхивании образуется опалесцирующая взвесь.
Препарат хранят в сухом темном месте при температуре от 2 до 15°C. Срок годности 18 месяцев.
Препарат вводят животным 3-5 раз внутримышечно по 7 мл на голову в область крупа, независимо от веса и возраста животных с интервалом 2-4 дня.
Пример 1.
Пример приготовления культуральных жидкостей из штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5.
Брали две емкости с прогретой до 37°C питательной средой, в одну из которых вносили суточную бульонную культуру штамма E.coli А-5, а в другую - штамма E.coli Б-5. Культуры вносили из расчета на 1 литр среды по 1 мл бульона, содержащего 3-5-10 микробных клеток.
Питательная среда, на которую высевали культуру штаммов, состояла из 4-х компонентов: основы, перевара гидролизата кильки, раствора глюкозы и раствора Хенкса.
4
При этом, основу питательной среды готовили следующим образом. На 1 л дистиллированной воды брали 9 г NaCl, 1 г хлористого аммония (NHCl) и 10 г пептона, доводили раствор до кипения, фильтровали, стерилизовали при 126°C (1,5 атмосферы) в течение 30 минут.
Перевар гидролизата кильки готовили также из расчета 1 л дистиллированной воды. Для этого брали 40 г рыбной пасты, размешивали в воде, фильтровали, разливали по флаконам и стерилизовали при 121°C (1 атмосфера) в течение 20 минут.
Раствор глюкозы (40%-ный) автоклавировали при 112°C (0,5 атмосферы) в течение 20 минут.
Для получения необходимого количества питательной среды компоненты смешивали в следующих процентных соотношениях: основа 71%; перевар гидролизата кильки 12%; раствор глюкозы 3% и раствор Хенкса 14%.
Культуры штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5 инкубировали на данной питательной среде в термостате при 37°C и вели наблюдение за ростом культур.
Данные наблюдений представлены в таблице 2.
Наименование культуральной жидкости
Количество микробных клеток, КОЕ/мл
через 2 суток
через 4 суток
на 7 сутки
культуральная жидкость из штамма E.coli А-5
2,7·10<sup>5</sup>-4,3·10<sup>5</sup>
5,8·10<sup>8</sup>-7,6·10<sup>8</sup>
7,0·10<sup>8</sup>-1,0·10<sup>9</sup>
культуральная жидкость из штамма E.coli Б-5
3,5·10<sup>5</sup>-4,2·10<sup>5</sup>
5,5·10<sup>7</sup>-8,1·10<sup>7</sup>
7,0·10<sup>8</sup>-1,0·10<sup>9</sup>
Из таблицы 2 следует, что при культивировании на данной питательной среде необходимое количество токсинов в обеих культуральных жидкостях из штаммов E.coli А-5 и E.coli Б-5 достигается на 7 сутки.
При проведении исследований на другой питательной среде процесс культивирования может отличаться, но обязательно должны быть достигнуты указанные концентрации микробных клеток в культуральных жидкостях, определяющие необходимое количество токсинов для культур E.coli А-5 и E.coli Б-5.
При достижении необходимого количества микробных клеток в каждую емкость с культуральной жидкостью вносили формалин из расчета 0,4% к объему питательной среды (в данном случае 4 мл на 1 литр среды), перемешивали и помещали в термостат на 14 суток при температуре 37°C.
Далее из каждой емкости брали пробы на стерильность.
Пример 2.
Доказательство соотношения компонентов препарата.
На разных отделениях одного из неблагополучных хозяйств проводили обработку больных животных препаратом, компоненты которого взяты в разных соотношениях.
Во всех случаях (при разном соотношении компонентов) препарат вводили трехкратно по 7 мл на голову с интервалом 3 дня.
№ отделения в хоз-ве
Количество животных
Кол-во выздоровевших животных
Соотношение компонентов препарата клостридиозный анатоксин: культуральная жидкость из E.coli А-5: культуральная жидкость из E.coli Б-5:
всего в отделении
в т.ч. больных
голов
%
1.
798
23
18
78,3%
1:0,5:0,5
2.
878
18
12
66,6%
0,5:1:1
3.
421
10
9
90,0%
1:1:1
Таким образом, наибольшая эффективность лечения (90%) достигалась при введении препарата с компонентами, взятыми в равных соотношениях 1:1:1.
Кроме этого, выборочно в каждом отделении данного хозяйства производилась дополнительная обработка клинически здоровых животных препаратом с содержанием компонентов в равных долях: в 1 отделении было обработано 50 голов, во втором - 60 голов, в 3-30 голов. Обработку производили также трехкратно с дозе 7 мл с интервалом между инъекциями 3 дня.
Ни в одном случае из 140 обработанных здоровых животных проявлений клинических признаков некробактериоза зарегистрировано не было, что свидетельствует об отсутствии провокации инфекционного процесса у латентно-инфицированных животных, в отличие от применения известных вакцин, содержащих в своем составе возбудитель некробактериоза и вызывающих активизацию болезни в неблагополучных хозяйствах.
На месте введения препарата воспалительных реакций ни в одном случае зарегистрировано не было.
Пример 3.
Были проведены испытания препарата в 3-х неблагополучных по некробактериозу хозяйствах, где было зафиксировано 312 больных животных.
Препарат (с содержанием компонентов в равных долях) вводили трехкратно по 7 мл на голову с интервалом 2-4 дня.
Из 312 больных животных в разной стадии заболевания вылечилось 268, что составило 86%, при этом в 1 хозяйстве лечебная эффективность составила 99%, во втором - 96%, в третьем - 71%.
Таким образом, заявляемый препарат для лечения некробактериоза крупного рогатого скота обладает высокой терапевтической эффективностью, учитывает разнообразие токсинообразующих факторов за счет синергизма входящих в его состав компонентов микроорганизмов, не вызывает провокации инфекционного процесса у латентно-инфицированных животных, не вызывает воспалительных реакций на месте введения и сокращает сроки лечения в 2-2,5 раза.