СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИОКСИДАНТНЫМ, КАРДИОПРОТЕКТОРНЫМ, ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ И ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
MEDICATION, POSSESSING ANTIOXIDANT, CARDIOPROTECTIVE, ANTIDIABETIC, ANTI -INFLAMMATORY, HEPATOPROTECTIVE, ANTITUMORAL AND ANTIVIRAL ACTION

Изобретение относится к области медицины и пищевой промышленности и касается создания средств растительного происхождения широкого спектра биологического действия.
Биофлавоноид лютеолин, входящий в состав многих растений, является биологически активным веществом с разносторонним спектром действия [Ueda Н., Yamazaki С., Yamazaki M. Luteolin as an anti-inflammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens // Biol. Pharm. Bull. 2002. V.25, №.9. P.1197-1202; Ando C, Takahashi N, Hirai S, Nishimura K, Lin S, Uemura T, Goto T, Yu R, Nakagami J, Murakami S, Kawada T. Luteolin, a food-derived flavonoid, suppresses adipocyte-dependent activation of macrophages by inhibiting JNK activation // FEBS Lett. 2009. V.583, №22. P.3649-54; Mueller M, Lukas B, Novak J, Simoncini T, Genazzani AR, Jungbauer A. Oregano: A Source for Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma Antagonists // J Agric Food Chem. 2008. V.56, №24. P.11621-11630]. При этом показано, что водонерастворимый лютеолин, поступающий с пищей в организм человека, проходит ряд модификаций как эпителиальными клетками кишечника, так и клетками печени, где он превращается в такие водорастворимые метаболиты, как глюкоурониды, сульфаты и гликозиды [Gradolatto A. et al. // Drag, Metabolism and Disposition. 2004. V.32. P.58-64].
Что касается биологической активности природных аналогов лютеолина, то известно, что гликозилированные и глюкоуронидные производные этого флавона характеризуются высокой биоусвояемостью эпителиальными клетками кишечника [Mukinda JT, Syce JA, Fisher D, Meyer M. Effect of the Plant Matrix on the Uptake of Luteolin Derivatives-containing Artemisia afra Aqueous-extract in Caco-2 cells // Ethnopharmacol Ethnopharmacol. 2010. V.130, №3. P.439-449] и обладают выраженным антиоксидантным [Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009. V.9. P.31-59], антибиотическим и противовирусным [Jensen Р.R., Jenkins K.M. et al. // Applied and Environmental Microbiology, 1998. V.64, №4. P.1490-1496, Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009. V.9. P.31-59], противоопухолевым [Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009. V.9. P.31-59], кардиоваскулярным, противодиабетическим, антиаллергическим, противовоспалительным и иммуномодулирующим [Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry. 2009. V.9. P.31-59] действием.
Сульфатирование - другой важный путь метаболизма лютеолина как в тканях растений, так и животных. Сульфаты лютеолина широко распространены в высших наземных растениях. Однако среди морских растений они обнаружены только в морских травах семейства Zosteraceae (Zoster a marina и Z. Asiatic) [Harborne J.В. // Phytochemistry 1975. V.14. P.1147-1155] и в морской траве Thalassia testudinum [Jensen P.R., Jenkins K.M. et al. // Applied and Environmental Microbiology, 1998. V.64, №4, P.1490-1496]. В виде сульфатированных производных лютеолин циркулирует в плазме крови и проникает в различные клетки тканей человеческого организма. При этом сульфатированный лютеолин более эффективно всасывается клеточным эпителием, чем чистый лютеолин [Murota К, Shimizu S, Miyamoto S, Izumi Т, Obata A, Kikuchi M, Terao J. Unique uptake and transport of isoflavone aglycones by human intestinal caco-2 cells: comparison of isoflavonoids and flavonoids // J. Nutr. 2002. V.132, №7. P.1956-1961].
Задачей изобретения является разработка средства из морских трав семейства Zosteraceae, обладающих антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении арсенала средств из доступного, широко распространенного сырья - морских трав семейства Zosteraceae, обладающих широким спектром биологического действия.
Заявляемое средство представляет собой 7,3'-дисульфат лютеолина, полученный из водно-этанольного экстракта морских трав семейства Zosteraceae. Способ получения средства включает экстракцию морских трав семейства Zosteraceae 96% этиловым спиртом и очистку целевого продукта на гидрофобном сорбенте.
Можно предположить, что 7,3'-дисульфат лютеолина - это природная водорастворимая форма лютеолина, способная проникать в плазму крови человека через кишечник, минуя стадии модификации клетками кишечника и печени. Это позволяет создавать наивысшую концентрацию лютеолина в крови человека, повышая эффективность ее физиологического действия. Фармакологическая активность 7,3'-дисульфата лютеолина может быть выше, чем лютеолина, вероятно, из-за большей растворимости первого в воде. Однако в отличие от лютеолина медико-биологическая активность сульфопроизводных лютеолина до настоящего времени практически не изучена.
Поэтому исследовательская работа по лечебно-профилактическому применению этого препарата при экспериментальном моделировании патологических состояний, связанных с метаболическим синдромом, токсическим гепатитом, гиперлипидимией, диабетом и опухолевым ростом, представляется закономерной и оправданной.
Заявителем экспериментально установлено, что средство, представляющее собой 7,3'-дисульфат лютеолина, полученный из морских трав семейства Zosteraceae, обладает антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим, иммуномодулирующим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Исследование острой токсичности 7,3'-дисульфата лютеолина.
Определение острой токсичности заявляемого вещества проводили на мышах линии СВА. Число животных в каждой группе составляло не менее 6. Анализ действия препарата оценивали в течение 24 ч. При определении острой токсичности 7,3'-дисульфата лютеолина его вводили однократно при внутрибрюшинном маршруте введения. Максимальная доза препарата при пероральном введении составила 500 мг/кг.
Таким образом, заявляемый препарат 7,3'-дисульфат лютеолина, так же как и лютеолин, при внутрибрюшинном введении проявляет острую токсичность в дозах выше чем 500 мг/кг.
Пример 2. Определение противодиабетической активности 7,3'-дисульфата лютеолина на экспериментальной модели аллоксанового диабета.
Исследования проводили на мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г. Аллоксан, растворенный в стерильном физиологическом растворе, был введен после 16-часового голодания в дозе 200 мг/кг. Семьдесят два часа спустя после ночного голодания в крови мышей определен уровень глюкозы с использованием глюкометра «Сателлит» (ООО «Элта», Россия). Мыши с уровнем глюкозы в крови выше чем 11,1 ммоль/л были отнесены к диабетическим мышам и взяты для дальнейших исследований. Экспериментальные животные были подразделены на следующие группы по 8 голов в каждой: 1) интактные, 2) диабетические (отрицательный контроль), 3) диабетические, которым вводили вещества в течение 15 дней после индукции аллоксанового диабета. Препараты лютеолин и 7,3'-дисульфат лютеолина вводили перорально в дозах 0,5, 1 и 2 мг/кг и 0,1, 0,2 и 0,5 мг/кг соответственно. Затем проводили заборы крови и, используя глюкозотолерантный тест, определяли изменение углеводного обмена (глюкометр «Сателлит», Россия) через 60 мин после перорального введения глюкозы в дозе 4 г/кг массы.
Для определения концентрации общего билирубина и ферментативной активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) в плазме крови использовали диагностические наборы Новоглюк-К,М («Вектор-Бест», Россия). Анализ липопротеидов низкой и высокой плотности в сыворотке крови животных и расчет коэффициента атерогенности проводили с помощью биохимического анализатора "Cobas INTEGRA 400 plus" ("ROCHE", Швейцария). Состояние антиоксидантной системы защиты у диабетических животных определяли по уровню продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. - СПб.: Интер-Медика, 1999].
Статистическую и графическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием статистического пакета Microsoft Excel. Достоверность различий определяли с помощью параметрического критерия t-Стьюдента.
Анализ данных эксперимента позволил выявить ряд характерных особенностей действия заявляемого вещества и лютеолина, взятого нами в качестве вещества сравнения.
Как показал эксперимент, увеличение глюкозы по сравнению с группой интактных животных в отрицательном контроле возрастает примерно в 2,5 раза. Заявляемый препарат 7,3'-дисульфат лютеолина и лютеолин в дозах от 0,5 до 2 мг/кг снижают уровень глюкозы не менее чем на 20% по сравнению с отрицательным контролем. Наиболее эффективным в этом эксперименте показал себя 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 0,5 мг/кг (уменьшение на 30%).
Как показал эксперимент, введение аллоксана не менее чем на 20% уменьшает вес поджелудочной железы. Лечебное применение 7,3'-дисульфата лютеолина защищает этот орган. Наиболее эффективно протективная активность заявляемого вещества проявляется в дозе 0,5 мг/кг. Лютеолин по своему защитному действию в отношении поджелудочной железы (если судить по ее весу) не уступает 7,3'-дисульфату лютеолина.
В группе животных с индуцированным аллоксановым диабетом (отрицательный контроль) концентрация билирубина возрастает приблизительно на 20%. 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 0,2 мг/кг доводит его содержание до нормальных значений (группа интактных животных). Препарат лютеолин в исследуемом диапазоне не обладает нормализующим действием в отношении данного показателя.
После введения аллоксана в группе животных с аллоксановым диабетом (отрицательный контроль) наблюдается повышение приблизительно на 50% содержания малонового диальдегида (МДА). 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 0,1 и 0,2 мг/кг существенно уменьшают уровень МДА, который становится ниже примерно в 2 раза, чем в группе интактных животных. Защитное действие лютеолина по этому показателю, который применяли в дозах, в 10 раз выше (1,0 и 2,0 мг/кг) аналогично действию 7,3'-дисульфата лютеолина.
Таким образом, можно заключить, что заявляемое вещество обладает более выраженным лечебным действием при экспериментальном диабете, вызванном аллоксаном, чем лютеолин.
Пример 3. Определение кардиопротекторной активности заявляемого препарата на модели экспериментальной гиперлипидемии.
Исследования проводили на мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г. Гиперлипидемическая мышиная модель основана на Тритоне WR-1339 («Tyloxapol») и установлена согласно методу Ли и др. [Lee I.A., Min S.W., Kim D.H. Journal of microbiology and biotechnology. 2006. V.16. P.1084-1089]. Тритон WR-1339 был введен в солевом растворе после 16-часового голодания в дозе 200 мг на 1 кг массы тела внутрибрюшинно. Животные были подразделены на следующие группы по 6 голов в каждой: 1) интактные, 2) гиперлипидемические (отрицательный контроль), 3) гиперлимидемические. Последней группе животных вводили перорально исследуемые препараты один раз в день в течение 3-х дней. Заключительное назначение препаратов было выполнено за 1 час до инъекции препарата «Tyloxapol». Спустя восемнадцать часов после инъекции препарата «Tyloxapol» проводили заборы крови и определяли основные показатели липидного обмена (уровни триглицеридов (ТГ), общего холестерина (ХС общий), холестерина-липипротеидов высокой плотности (ХС-ЛПВП), холестерина-липипротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП), холестерина- липипротеидов очень низкой плотности (ХС-ЛПОНП), а также коэффициент атерогенности в плазме крови животных с помощью биохимического анализатора («ROCHE», Швейцария).
Анализ содержания общего билирубина, активности ферментов АсАТ, АлАТ и выраженность свободнорадикальных процессов в плазме крови животных проводили, как указано в примере 2.
Сравнительный анализ действия разных концентраций заявляемого средства и лютеолина показывает, что лютеолин слабо влияет на уровень ТГ в плазме крови животных. Действие 7,3'-дисульфата лютеолина более значимо: если в концентрации 1,0 мг/кг он уменьшает количество ТГ примерно на 20%, то в концентрации 10 мг/кг по сравнению с отрицательным контролем увеличивает уровень ТГ на 30%.
Показано, что 7,3'-дисульфат лютеолина (0,1 и 1,0 мг/кг) увеличивает приблизительно на 30% содержание ХС, а в концентрации 10 мг/кг снижает его до уровня интактных животных. Лютеолин в малых концентрациях (0,1 и 1,0 мг/кг) не оказывает влияния на уровень общего холестерина, а в концентрации 10 мг/кг увеличивает его уровень на 30% в сравнении с отрицательным контролем.
Следует отметить, что 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 1,0 мг/кг увеличивает примерно в 2 раза концентрацию ЛПВП в крови животных. Как 7,3'-дисульфат лютеолина, так и лютеолин в дозе 1,0 мг/кг оказывают слабое понижающее влияние на содержание ХС-ЛПОНП (около 15%).
Проведенные исследования также показали, что 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 1,0 мг/кг более чем в 2 раза уменьшает уровень ХС-ЛПНП по отношению к отрицательному контролю, при этом лютеолин в исследуемом диапозоне концентрации способствует значимому увеличению этого показателя.
Расчет коэффициента атерогенности показал, что заявляемое средство в исследуемом концентрационном диапазоне гораздо эффективнее, чем лютеолин, уменьшает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Сравнительный анализ действия данных препаратов на активность трансаминаз крови показывает, что они в исследуемом диапазоне слабо влияют на указанный показатель. Расчет коэффициента Де Ритиса показывает, что данный показатель колеблется в пределах нормы.
Следует отметить также, что заявляемый препарат и лютеолин в исследуемом диапазоне доз уменьшают более чем в 2 раза содержание МДА в плазме крови, при этом 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 1,0 мг/кг действует более чем в 2 раза эффективнее, чем лютеолин.
Таким образом, можно заключить, что заявляемое средство обладает выраженным профилактическим действием при экспериментальной гаперлипидимии, вызванной широко используемым индуктором «Tyloxapol».
Пример 4. Определение противовоспалительной активности 7,3'-дисульфата лютеолина.
Неспецифическое локальное воспаление индуцировали введением в физрастворе (100 мкл) 1 мг дельта-каррагинана (тип IV, Sigma) в подушечку задней лапы беспатогенным мышам линии СВА массой 19-22 г. Оценку противовоспалительного действия исследуемых препаратов проводили в дозе 2 мг/кг веса тела. Препарат вводили внутрибрюшинно за 1 ч до индукции воспаления каррагинаном. Контрольной группе животных вводили физраствор. Через 5 часов мышей подвергали эвтаназии, лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и взвешивали на аналитических весах с точностью до 4 знака. Уровень замедления роста ткани гранулемы рассчитывали по уравнению
с
в
с
Замедление воспаления (%)=Т-Т/Т×100,
с
в
где Т - вес ткани гранулемы в контрольной группе; Т - вес ткани гранулемы в группе, получившей противовоспалительные препараты.
Экспериментальные результаты представлены в табл. 1. Заявляемое средство и лютеолин вводились внутрибрюшинно и исследовались в дозе 2 мг/кг.
Из данных табл. 1 видно, что противовоспалительное действие 7,3'-дисульфата лютеолина примерно в 1,5 раза выше, чем у лютеолина. Таким образом, заявляемое средство обладает более высокой, чем лютеолин, противовоспалительной активностью.
Таблица 1
Сравнительное изучение противовоспалительной активности при отеке лап мышей, индуцированном каррагинаном
Группы (кол-во животных)
Доза (мг/кг)
Вес лапы через 5 ч после индукции каррагинаном, мг
Замедление воспаления, %
Контроль (4)
88,3±7,4
-
7,3'-дисульфата лютеолина (4)
2
77,0±6,6
12,74
Лютеолин (4)
2
80,3±8,5
8,97
Пример 5. Определение противоопухолевой активности.
6
Для определения противоопухолевой активности заявляемого средства использовали экспериментальную модель аденокарциномы Эрлиха. Перевивку, поддержание штаммов и оценку полученных результатов осуществляли по методике, принятой в РОНЦ АМН РФ (г.Москва) [Софьина З.П., Сыркин А.Б., Голдин А. Экспериментальные оценки противоопухолевых препаратов в СССР и США. М.: Медицина, 1980. - 296 с]. Лечение животных с асцитной опухолью начинали через сутки после трансплантации 3×10 опухолевых клеток. Препарат вводили перорально в течение 5 дней в расчетной дозе 10 мг/кг.
Эффект оценивали по средней продолжительности жизни (СПЖ, %) по сравнению с контролем по формуле
СПЖ (%)=(Т/С)×100, где
Т и С - средние значения (в днях) гибели животных в опытной и контрольной группах соответственно. При изучении противоопухолевой активности препарата мы оценивали его эффективность как при применении отдельно, так и в сочетании с коммерческим противоопухолевым средством циклофосфаном (Красфарма, Россия).
Как показал эксперимент, циклофосфан в дозе 100 мг/кг при однократном внутрибрюшинном введении увеличивает среднюю продолжительность жизни на 6,2% по сравнению с контролем. Заявляемый препарат 7,3'-дисульфат лютеолина при пероральном введении в дозе 10 мг/кг и пятикратном лечении так же, как и лютеолин, противоопухолевой активности не проявлял. При применении 7,3'-дисульфат лютеолина в сочетании с циклофосфаном был зарегистрирован слабый синергический противоопухолевый эффект данных препаратов, при котором увеличение средней продолжительности жизни составило 16,4%. Результаты приведены в табл. 2.
Таблица 2
Противоопухолевая активность 7,3'-дисульфат лютеолина отдельно и в сочетании с циклофосфаном
Вещество (маршрут введения)
Кол-во животных в группе
Доза (мг/кг) / интервал (ч) × количество введений
Средняя продолжительность жизни
СПЖ, %
Контроль
10
-
100
7,3'-дисульфат лютеолина (в/б)
10
10/24×5
94,9
Лютеолин (в/б)
10
10/24×5
89,8
Циклофосфан (в/б),
10
100/24×1
106,2
7,3'-дисульфат лютеолина (в/б) + Циклофосфан (в/б)
10
10/24×5+100/24×1
116,4
Лютеолин (в/б) + Циклофосфан (в/б)
10
10/24×5+100/24×1
86,4
Таким образом, заявляемое средство в сочетании с циклофосфаном обладает противоопухолевым эффектом, усиливая действие противоопухолевых цитостатиков.
Пример 6. Определение гепатопротекторной активности.
4
4
4
Определение гепатопротекторных свойств заявляемого средства и лютеолина проведено на модели токсического гепатита, индуцированного четыреххлористым углеродом (CCl), у экспериментальных животных (беспатогенные мыши линии CD-1 весом 20±2 г). Профилактическое действие препаратов изучено на 4-х группах мышей (по 6 особей в каждой группе). Двум опытным группам мышей вводили в течение 4 дней препараты в дозе 2 мг/кг. Две контрольные группы животных, интактные животные и отрицательный контроль, получали дистиллированную воду. Через 16 часов после последнего приема препаратов одной контрольной группе животных (отрицательный контроль) и двум опытным группам животных внутрибрюшинно вводили смесь CCl-растительное масло (1:1, по объему) по 300 мкл на 100 г массы тела животного. Через 2 ч после интоксикации CCI животных подвергали эвтаназии. Гепаринизированную кровь центрифугировали при 4000 об./мин в течение 15-20 мин. Полученную плазму крови использовали для биохимических исследований. Уровень билирубина, ферментативные активности АлАТ и АсАТ определяли с применением клинико-диагностических наборов (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск).
Полученные нами результаты, представленные в табл. 3, указывают на то, что заявляемое средство гораздо эффективнее защищает клетки печени от токсического действия сильного печеночного яда - четыреххлористого углерода, чем лютеолин, который, как было показано ранее, является эффективным протективным средством при печеночных патологиях разной этиологии [Lima CF, Fernandes-Ferreira M, Pereira-Wilson С. Phenolic compounds protect HepG2 cells from oxidative damage: relevance of glutathione levels // Life Sci. 2006. V.79, №21. P.2056-2068; Oh H., Kim D.H., Cho J.H., Kim Y.C. Hepatoprotective and free radical scavenging activities of phenolic petrosins and flavonoids isolated from Equisetum arvense // J. Ethnopharmacol. 2004. V.95, №2-3. P.421-424].
Таким образом, можно заключить, что заявляемое средство 7,3'-дисульфат лютеолина является новым эффективным гепатозащитным агентом.
Пример 7. Определение противовирусной активности in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита (КЭ).
7
В работе использовали вирус КЭ дальневосточного субтипа, штамм Р-73 (титр цитопатической инфекционной дозы (ТЦИД), вызывающий 50%-ную гибель клеток, составлял 10/0,2 мл). Этот штамм был выделен из мозга человека, умершего от КЭ с очаговой формой инфекции. Для анализа противовирусной активности препаратов использовали клетки перевиваемой линии клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), являющиеся высокочувствительными к вирусу КЭ. Клетки культивировали в 24-луночных пластиковых панелях с использованием ростовой среды 199 и RPMI (в равных соотношениях) с добавлением 10%-ной сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл гентамицина.
2
Монослой культуры клеток СПЭВ заражали 10-кратными разведениями вируса КЭ. 7,3'-дисульфат лютеолина и препарат сравнения - лютеолин - в различных концентрациях (от 1,0 мкг/мл до 0,0001 мкг/мл) вносили в культуру клеток через 1 час после их инфицирования вирусом и инкубировали в СО-инкубаторе в течение 7 суток. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по снижению инфекционного титра вируса (Δ, lg).
Оценка влияния 7,3'-дисульфата лютеолина на начальные стадии взаимодействия вируса с клеткой показала, что препарат способен защищать инфицированные клетки СПЭВ от цитопатического действия вируса КЭ. Полученные данные представлены в табл. 4.
Таблица 4
Вирусингибирующее действие различных концентраций препаратов 7,3'-дисульфат лютеолина и лютеолина на культуре клеток
Препараты
Дозы препаратов, мкг/мл
Подавление репродукции вируса, Δ, lg в присутствии препаратов
Лютеолин
1
4
0,1
3,5
0,01
3
0,001
1
0,0001
0
7,3'-дисульфат лютеолина
1
3,5
0,1
3,5
0,01
4
0,001
3
0,0001
2
Контроль вируса (без препаратов)
-
7
50
50
Данные по изучению влияния заявляемого препарата на репродукцию вируса КЭ свидетельствуют о том, что его применение приводит к значимому подавлению накопления вируса. Установлено, что в концентрациях от 1,0 до 0,01 мкг/мл 7,3'-дисульфат лютеолина и лютеолин подавляли накопление вируса на 3,0-4,0 lg ТЦИД/мл по сравнению с контролем. При более низких концентрациях препаратов (0,001 и 0,0001 мкг/мл) противовирусная активность 7,3'-дисульфат лютеолина была выше таковой лютеолина на 2,0 lg ТЦИД/мл.
50
Известно, что минимально эффективной вирусингибирующей концентрацией препарата считается концентрация, снижающая титр вируса не менее чем на 2,0 lg ТЦИД [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева, М.: 2005].
Таким образом, 7,3'-дисульфат лютеолина обладает способностью подавлять продукцию высокопатогенного штамма вируса КЭ на ранних стадиях развития инфекции, проявляя при этом более выраженную противовирусную активность, чем лютеолин.
Пример 8. Определение противовирусной активности in vivo на экспериментальной модели клещевого энцефалита.
50
В работе использовали тот же штамм вируса КЭ (Р-73). Для моделирования экспериментального КЭ использовали неинбредных мышей массой 20-22 г, которых инфицировали вирусом КЭ подкожно в дозе 10 ЛД/0,2 мл.
Препараты 7,3'-дисульфат лютеолина и лютеолин в дозах от 3,25 мг/кг до 25 мг/кг вводили животным интраперитонеально и перорально через 1 час после заражения вирусом и в дальнейшем на протяжении 5 дней. Контрольными группами служили неинфицированные мыши, получавшие испытуемые препараты, а также инфицированные вирусом КЭ мыши, не получавшие препараты. За животными наблюдали 21 день.
Оценку противовирусной эффективности используемых препаратов проводили согласно требованиям, изложенным в руководстве [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева, М.: 2005]. Основными критериями этой активности in vivo были показатели защиты животных от гибели, средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение СПЖ (%) животных в группе.
При оценке протективного действия различных доз 7,3'-дисульфат лютеолина (от 3,25 мг/кг до 25 мг/кг) и способов его введения было установлено, что этот препарат оказывает дозозависимое защитное действие и увеличивает среднюю продолжительность жизни инфицированных животных. Наибольший эффект был зарегистрирован при его пероральном (в дозе 12,5 мг/кг) применении.
Летальность мышей в контрольной группе составила 100% на 10 день наблюдения, СПЖ - 8,4 дня. В этот же срок среди животных, получавших лютеолин, наибольший процент выживших (50%) отмечался в группе мышей, получивших интраперитонеально 6,25 мг/кг препарата. Среди животных, получавших 7,3'-дисульфат лютеолина, больше всего выживших (60 и 50%) наблюдалось при применении препарата перорально в дозах 25 и 12,5 мг/кг (соответственно). К концу срока наблюдения (21 день) препарат сравнения - лютеолин - увеличивал среднюю продолжительность жизни животных, получавших его перорально, на 31-35,7%, а интраперитонеальное применение на 28,6% по сравнению с контрольной группой. В то же время пероральное применение 7,3'-дисульфат лютеолина увеличивало среднюю продолжительность жизни животных на 50-56%.
Таким образом, пероральное применение препарата 7,3'-дисульфат лютеолина в дозе 12,5 мг/кг эффективно защищает от гибели мышей, инфицированных высокопатогенным штаммом вируса КЭ. Исследуемый препарат по защитному действию превосходит препарат лютеолин.