Изучение биологических эффектов антимикробных пептидов из тромбоцитов кур методом атомно-силовой микроскопии

Изучение биологических эффектов антимикробных пептидов из тромбоцитов кур методом атомно-силовой микроскопии*

М.В. Сычёва, к.б.н., Ю.И.Пешкова, аспирантка, ФГБОУВО Оренбургский ГАУ; А.С. Васильченко, к.б.н., ОЛ. Карташова, д.б.н, профессор, ФГБУН ИКВС УрО РАН; Е.А. Рогожин, к.х.н, ФГБУН ИБХ РАН

Признанию существенной роли тромбоцитов в противоинфекционной защите макроорганизма способствовала обнаруженная способность последних активировать антигенпредставляющие клетки, стимулировать образование внеклеточных нейтрофильных ловушек, взаимодействовать с различными иммунокомпетентными клетками и продуцировать пептиды, обладающие антимикробной активностью [7]. Антимикробные пептиды (АМП) являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врождённого иммунитета, обеспечивающей первую линию защиты от инфекций человека и животных [1], и в перспективе могут рассматриваться в качестве дополнения общепринятым антибиотикам микроб-

ного происхождения и даже их замены в медицинской и ветеринарной практике [8]. Выделение, изучение механизма биологической активности и структурно-функциональная характеристика пептидных антибиотиков животного происхождения создаёт предпосылки для разработки и производства химически или биотехнологически синтезированных гомологов этих соединений [2].

В настоящее время установлен спектр антимикробной активности кислотных экстрактов из тромбоцитов животных [3], определено влияние на факторы вирулентности и персистенции микроорганизмов тромбоцитарных катионных белков [4–6]. Однако сведения о механизмах биологической активности очищенных АМП из тромбоцитов кур отсутствуют.

В этой связи целью исследования явилось изучение механизма антимикробного действия очищенных пептидных фракций из тромбоцитов кур, реализованное с использованием метода атомно-силовой микроскопии.

* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 14-04-97067 р_поволжье_а).

Материал и методы исследования. При проведении работы использованы антимикробные пептиды (очищенные пептидные фракции) из тромбоцитов курицы домашней (Gallus gallus).

Для исследования морфофункциональных реакций микроорганизмов на воздействие антимикробных пептидов использовали музейные штаммы Staphylococcus aureus P 209 и Escherichia coli K 12. Для атомно-силовой микроскопии выращенные клетки отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в дистиллированной воде, после чего к полученной суспензии добавляли АМП в минимальной ингибирующей концентрации, установленной нами ранее. После инкубации в течение часа клетки отмывали дистиллированной водой, в объёме 10 мкл наносили на свежий скол слюды и высушивали в течение 30—60 мин.

Полученные образцы исследовали методом атомно-силовой микроскопии в контактном режиме с использованием атомно-силового микроскопа SMM-2000 (ЗАО «ПРОТОН-МИЭТ», Россия). В процессе сканирования использовались кантилеверы MSCT-AUNM («Veeco», США) с жёсткостью балки 0,05 Н/м и радиусом кривизны зонда 10 нм.

Количественный морфометрический анализ полученных изображений проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа. Среднеквадратичную шероховатость (Rrms) поверхности бактерий рассчитывали по следующей формуле:

R

rms

f (Zt - Zm)2

Ш (N -1) ’

где N — общее количество точек на профиле высот;

Z — высота точки i;

Zm — средняя высота точек на профиле.

Упругие свойства бактериальных клеток исле-довали с использованием АСМ в режиме силовой спектроскопии с применением кантилеверов жёсткостью 1,0 Н/м.

Полученные результаты обрабатывали с помощью непараметрического рангового критерия Уилкоксона. Значения представлены в форме: среднее± стандартное отклонение.

Результаты исследования. Проведённая на атомно-силовом микроскопе визуализация интактных клеток S. aureus показала, что популяция бактерий контрольной группы была представлена достаточно однородными по морфологии клетками, расположенными преимущественно в группах (рис. 1а), размерные характеристики которых составляли 0,96+0,18 мкм по длине, 0,97+0,16 мкм по ширине и 0,82+0,12 мкм по высоте. Соответственно рассчитанный на этой основе объём бактериальных клеток равнялся 0,90+0,21 мкм3.

Атомно-силовая микроскопия ультраструктуры клеточной стенки интактных клеток стафилококков позволила охарактеризовать рельеф поверхности

как относительно гладкий (рис. 1б), среднеквадратичная шероховатость которой составила 1,17+0,11 нм. Исследование механических свойств клеток позволило оценить их упругость величиной 2,24+0,96 МПа.

Результаты исследований морфологических и механических свойств клеток S. aureus, обработанных антимикробными пептидами из тромбоцитов кур, свидетельствовали о деструкции клеточной стенки (рис. 1в). Детальное исследование ультраструктуры поверхности выявило частичное разрушение пептидогликанового слоя (рис. 1г). В количественном отношении качественные изменения были выражены среднеквадратичной шероховатостью поверхности, которая в этом случае была значимо больше стандартных значений: 3,42+1,17 нм против 1,1+0,11 нм в контроле (Р<0,05). Упругие свойства бактериальных клеток, обработанных антимикробными пептидами, оказались больше контрольных величин и составили 6,22+3,88 МПа.

Интактные клетки E. coli на сканах визуализировались как расположенные группами палочки (рис. 2а), имеющие длину 2,51+0,43 мкм, ширину 1,16+0,08 мкм и высоту 0,36+0,02 мкм. Средний объём бактериальных клеток был равен 1,03+0,02 мкм3. Рельеф клеточной поверхности эшерихий оказался несколько более развитым, чем у стафилококков (рис. 2б), среднеквадратичная шероховатость была равной 1,66+0,20 нм.

Морфофункциональная реакция грамотрица-тельных бактерий E. coli при обработке АМП из тромбоцитов кур также оказалась весьма выраженной. Так, большая часть клеток в популяции визуализировалась как уплощённые до 0,21+0,05 мкм образования с признаками нарушения целостности барьерных структур (рис. 2в).

Анализ размерных морфометрических показателей зафиксировал достоверное снижение значения объёма клеток E. coli до 0,86+0,2 мкм3 (Р<0,05). Упругие свойства клеток эшерихий также оказывались сниженными на 40% по сравнению с интактными бактериальными клетками (2,47+0,61 и 0,99+0,84 МПа соответственно) (Р<0,05), что, вероятно, связано с утратой значительной части клеточного содержимого.

Детальное изучение ультраструктуры поверхности E. coli выявило значимые изменения её морфологии. Так, на поверхности клеток посредством атомно-силовой микроскопии зарегистрировано образование пороподобных повреждений (рис. 2г). Шероховатость поверхности подобных объектов достоверно увеличивалась с 1,66+0,2 до 6,25+0,45 нм (P<0,01). Кроме того, большая часть клеток в популяции характеризовалась значительными повреждениями клеточной стенки и признаками выхода внутриклеточного содержимого в окружающую среду («клеточный мусор» вокруг бактерий).

Рис. 1 - АСМ-изображения интактных бактерий S. aureus

Рис. 2 – АСМ-изображения интактных клеток E. coli

Таким образом, использование метода атомносиловой микроскопии позволило выявить особенности взаимодействия АМП из тромбоцитов кур с микроорганизмами, заключающиеся в снижении объёма клеток, формировании пороподобных повреждений наружной мембраны у E. coli и деформации клеточной стенки у S. aureus бактерий. Силовое зондирование упругих свойств клеток показало, что воздействие АМП вело к снижению клеточного тургора у E. coli, в то время как S. aureus, напротив, характеризовались большей жёсткостью.

В качестве вероятной причины выявленного многообразия морфофункциональных реакций микроорганизмов на воздействие АМП можно назвать различия в строении их клеточных стенок.

Выводы. В результате проведённой работы установлено, что механизм антимикробного действия АМП из тромбоцитов кур связан с нарушением структурной организации клеточной стенки бактерий, вследствие чего микробные клетки становятся осмотически неустойчивыми. Выявленные поропо-добные повреждения поверхности бактериальных клеток позволяют отнести АМП из тромбоцитов

кур к классу пороформирующих катионных антимикробных пептидов.

Литература

1. Кокряков В.Н., Ковальчук Л.В., Алёшина Г.М., и др. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. № 2. С. 98-105.

2. Кокряков В.Н. Очерки о врождённом иммунитете. СПб.: Наука, 2006. 261 с.

3. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Жуков А.П., и др. Антибактериальный спектр тромбодефенсинов некоторых видов животных // Аграрный вестник Урала. 2010. № 7 (73). С. 50-51.

4. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова О.Л., и др. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биоплёнок // Вестник КрасГАУ. 2011. № 1. С. 130-132.

5. Галиуллина Л.Ф., Сычёва М.В., Карташова О.Л. Динамика антилизоцимной активности микроорганизмов под влиянием антимикробных пептидов // Вестник ветеринарии. 2013. № 1. С. 15-17.

6. Карташова О.Л., Дымова В.В., Сычёва М.В. Влияние пептидов из тромбоцитов животных на факторы вирулентности микроорганизмов // Вестник ветеринарии. № 4. 2012. С. 50-52.

7. Yeaman M.R. Platelets: At the nexus of antimicrobial defence // Nature Reviews Microbiology. 2014. Vol. 12(6). Р 426-437.

8. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E.W. Peptide Antimicrobial Agents // Clin. Microbiol. Rev. 2006. Vol. 19 (3). Р. 492.