Способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота
METHOD OF POST-MORTEM DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKEMIA

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, к послеубойной диагностике заболевания лейкоза крупного рогатого скота. Предлагается с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) выявить антитела в послеубойной туше животных к антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Предложенный способ в области ветеринарно-санитарной экспертизы мяса животных является, более простым, точным, недорогим, легким в использовании в послеубойной диагностике заболевания лейкоза крупного рогатого скота.
Заболевание лейкоз крупного рогатого скота вызывается вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), который относится к роду Deltaretrovirus, из семейства Retroviridae. ВЛКРС локализуется в организме животного в клетках крови непосредственно в В-лимфоцитах [1-2]. ВЛКРС распространяется горизонтальным и вертикальными путями, путем попадания в организм животного В-лимфоцитов с различными жидкостями (с молоком, спермой, кровью и т.д.) [3]. В организме животного ВЛКРС поражает кроветворную и лимфоидную ткани, вовлекая в патологический процесс костный мозг, селезенку и лимфатические узлы. На поздней стадии болезни путем пролиферации и малигнизации гемобластных клеток поражаются и другие органы животного (желудок, печень, кишечник, легкие и т.д.).
Прижизненная диагностика лейкоза крупного рогатого скота проводится различными методами, в том числе серологическим с применением реакций иммуноферментного анализа (ИФА) и РИД, а также молекулярно-генетическим (с помощью полимеразной цепной реакции), гематологическим, клиническим и цитоморфологическим методами [4].
Послеубойный (или от павших животных) диагноз на лейкоз крупного рогатого скота ставится на основании патологоанатомических, гистологических исследований. После вскрытия трупов фиксируются патологоанатомические изменения в органах и в тканях, исходя от форм и характера лейкозного поражения. При лимфоидном лейкозе происходит увеличение в размере селезенки, лимфатических узлов, а также метаплазия костного мозга. На поздней стадии лимфоидная гиперплазия происходит и в других органах. На начальной стадии моноцитарного лейкоза патологоанатомические изменения отсутствуют, а на поздней стадии увеличиваются лимфатические узлы, которые часто срастаются друг с другом. При остром течении гемоцитобластозной формы лейкоза происходят патологические изменения в органах и тканях: увеличиваются в размере и в массе селезенка и лимфатические узлы. В случаи миелоидной формы лейкоза крупного рогатого скота наблюдаются патологоанатомические изменения лимфатических узлов, селезенки и в печени, обнаруживаются очаги миелоидных клеток [5-6].
Недостатком патологоанатомического метода диагностики лейкоза крупного рогатого скота является то, что патологические изменения в органах животных не всегда происходят, особенно на ранних стадиях заболевания. Тяжело дифференцировать лейкоз крупного рогатого скота от других заболеваний. В случае, если патологическая картина заболевания лейкоза крупного рогатого скота недостаточно ясна, необходимо провести гистологические исследования. Определенное время требуется на подготовку материала, покраску, а также на проведение гистологических срезов.
Наиболее близко к заявленной теме относится молекулярно-генетическая методика с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данный способ применим как к прижизненной, так и к послеубойной диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Сущность данного метода заключается в обнаружение в пробах крови или мышечной ткани животного ДНК-провируса лейкоза крупного рогатого скота.
К недостаткам данного способа в послеубойной диагностике относятся неспецифические реакции: высокая внешняя температура губительно сказывается на ВЛКРС, а значит и на постановку ПЦР, высокая ценовая стоимость исследований.
Целью изобретения является применение нового способа послеубойной диагностики заболевания лейкоза крупного рогатого скота с применением РИД.
Поставленная цель достигается путем отбора проб из исследуемых туш и органов животных. Пробы отбирают путем смывов с туши и органов животного от разных частей тела. Смывы отбираются путем надрезов одноразовым стерильным скальпелем с помощью стерильного сухого тампона, сделанного из ваты. Тампоны со смывами помещают в пронумерованные стерильные пробирки и доставляют в лабораторию с сопроводительной. К пробирке со смывом добавляют от 0,5 до 0,7 мл изотонического раствора (0,85% раствор NaCI) в зависимости от размера тампона и оставляют на 3-4 часа для перехода в одноразовую субстанцию. Пробирки с содержимым необходимо держать при комнатной температуре (18-26°С) и периодически встряхивать, чтобы антитела к ВЛКРС со смыва переходили в изотонический раствор для дальнейшей постановки РИД. Реакцию предваряет штамп, пробитый в агаровом геле в лунки.
На фиг. 1 приведена схема постановки РИД с испытуемой субстанцией. При постановке РИД, из пробирки при помощи автоматической пипетки (дозатора), предварительно несколько раз надавив на тампон со смывом, исследуемая субстанция в количестве 0,04-0,06 мл (1, 2, 3, 4) вносится в чашки Петри. Соответственно, в центральную лунку вносится лиофилизированный антиген ВЛКРС (7), в противоположные лунки (2, 5) - специфическую преципитирующую сыворотку (по схеме, предусмотренной производителем ФГУП «Курская биофабрика»). После инкубации при температуре 20-26°С учет реакции проводится через 48 часов по линии преципитации.
В основе сопоставления прижизненной и послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением РИД является то, что в первом случае применяется сыворотка крови, а во втором - испытуемая субстанция (смыв с тканевой жидкостью, диффундированной изотоническим раствором). Таким образом, заявленный метод с применением РИД относится к новому способу послеубойной диагностики заболевания лейкоза крупного рогатого скота, что соответствует критерию «новизна».
Оценка послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением РИД проводилась по результатам лабораторных исследований смывов мяса (туш крупного рогатого скота) и субпродуктов (печени, селезенки, почек и т.д.) (Таблица №1).
Таким образом, проведенные исследования показали, что РИД можно применять как один из способов послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Данный способ (метод) выявляет антитела к антигену ВЛКРС, находящиеся в тканевой жидкости (в плазме и лимфе) и субпродуктах животных после убоя.
Список литературы
1. Таксономия вирусов [электронный ресурс], режим доступа: http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp.
2. Забережный А.Д. Современная таксономия вирусов / А.Д. Забережный [и др.] // Ветеринария и кормление. - М.: - 2017. - №1. - С. 4-13.
3. Gillet N. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. / Gillet N., Florins A., Boxus M. // Retrovirology. -2007. - Vol.4. - N. 18. - P. 1-32.
4. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин [и др.]// - М.: ВНИИЭВ, - 2000. - 22 с.
5. Ветеринарная гематология / Симонян Г.А., Хисамудинов Ф.Ф. // - М.: «Колос». - 1995. - 256 с.
6. Симонян Г.А. Дифференциальная диагностика различных форм гемобластозов // Ветеринария. - М. - 2013. - №9. - С. 21-25.