КАРТРИДЖ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА
CARTRIDGE AND APPARATUS FOR PREPARING A BIOLOGICAL SAMPLE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к картриджу для подготовки биологического образца, в частности для окрашивания образца ткани или группы клеток. Кроме того, оно относится к устройству для работы с таким картриджем.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В US 2012/230886 A1 описано накладное устройство с каналами на нижней стороне, которое можно поместить на предметное стекло с расположенным на нем биологическим образцом. Отверстия на концах каналов позволяют реагентам входить в указанные каналы с одно конца и выходить с другого конца. Предметное стекло с таким накладным устройством можно поместить в совмещающее крепление с входными и выходными каналами, совмещаемыми с соответствующими отверстиями накладного устройства.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полезно иметь средства, позволяющие проводить более надежную, простую и/или удобную для пользователя обработку биологического образца реагентами, например, красителями, с помощью которых можно обработать весь образец однородным способом, следуя сложным протоколам, требующим множество реагентов.
Эти задачи можно решить, используя картридж по п. 1, устройство по п. 11 и способы применения по пп. 14 и 15. Предпочтительные варианты осуществления описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения вышеуказанные задачи решаются с помощью картриджа для подготовки биологического образца, например, для окраски образца ткани или клеток для микроскопического исследования. Картридж включает корпус картриджа со следующими компонентами:
a) реакционная камера с отверстием, которое может закрываться подложкой, несущей образец (на стороне, направленной к реакционной камере);
b) система подачи текучей среды, обеспечивающая подачу по меньшей мере одного реагента в указанную выше реакционную камеру;
c) система отвода текучей среды для отвода текучей среды из реакционной камеры.
Указанные выше компоненты следует сконструировать таким образом, чтобы система подачи текучей среды, реакционная камера с подложкой, закрывающей ее отверстие, и система отвода текучей среды были (гидродинамически) соединены друг с другом и по существу замкнуты с точки зрения обмена жидкостями с окружающей средой. Другими словами, система подачи текучей среды, реакционная камера и система отвода текучей среды обычно образуют жидкостную систему, закрытую для окружающей среды (по отношению к обмену жидкостями), когда подложка закрывает отверстие реакционной камеры.
Термин "картридж" обозначает элемент или блок с внутренними полостями, в которых среду можно разместить для хранения, транспортировки и/или использования. Он представляет собой, как правило, сменный и одноразовый компонент, используемый только один раз для одного образца. Предпочтительно, картридж представляет собой цельный компонент и/или (по существу) состоит из монолитного материала. Он может, например, (по существу) состоять из одной или нескольких изготовленных литьем под давлением частей, неразъемным способом соединенных друг с другом. В принципе, картридж может включать или не включать подложку. В последнем случае "корпус картриджа" является, как правило, идентичным "картриджу".
Термин "реакционная камера" обозначает полость в картридже, при этом стенки картриджа, ограничивающие данную полость, в принципе, относятся к реакционной камере.
Термин "жидкостная система" в общем обозначает любую систему полостей (таких как каналы, камеры, клапаны или т.п.), по которой среду (в частности текучую среду) можно транспортировать и направлять.
Текучая среда, поступающая в систему отвода текучей среды, может, в частности, включать реакционную текучую среду, которую была ранее введена в реакционную камеру системой подачи текучей среды. Система отвода текучей среды может, таким образом, представлять собой или включать емкость для отходов, в которой хранятся использованные реагенты и/или другие химические отходы.
Система подачи текучей среды, реакционная камера и система отвода текучей среды могут, необязательно, являться полностью закрытыми для окружающей среды, когда подложка закрывает реакционную камеру, т.е. являться закрытыми по отношению к обмену текучими средами (жидкими или газообразными). Предпочтительно, некоторый обмен газообразными средами все-таки возможен, например, за счет вентиляционного сообщения с окружающей средой, которое упрощает конструкцию и позволяет избежать нарастания обратного давления.
Описанный картридж обладает преимуществом в том, что позволяет проводить подготовку биологического образца в закрытой системе, т.е. в системе, включающей только картридж и подложку, на которой расположен образец. Закрытость системы от окружающей среды позволяет избежать любой опасности внести загрязнение в образец из окружающей среды, а также загрязнить окружающую среду образцом. Это значительно упрощает работу с образцом. Дополнительные преимущества могут включать снижение потребления реагентов, ускорение реакции за счет увеличения интенсивности перемешивания в микроканалах и лучшую воспроизводимость за счет промышленного изготовления картриджей, содержащих ключевые реагенты.
В общем, подложка может представлять собой любое (твердое) тело из материала, пригодное для переноса биологического образца, предназначенного для обработки. Наиболее предпочтительно, чтобы подложка имела форму пластинки, например, представляла собой предметное стекло. Для обеспечения возможности использования такой пластинчатой подложки отверстие в реакционной камере картриджа предпочтительно следует разработать закрываемым плоской поверхностью (подложки).
Есть ряд возможных способов, которыми подложку можно прикреплять (или подложка может являться прикрепленной) к корпусу картриджа, при этом прикрепление должно быть достаточно прочным, чтобы противостоять силам, возникающим при прохождении текучей среды через реакционную камеру.
В одном из вариантов осуществления подложка может прикрепляться к корпусу картриджа за счет адгезии и/или приклеивания, т.е. за счет сцепления с материалом.
В другом варианте осуществления между подложкой и корпусом картриджа расположена промежуточная вакуумная камера, в которой может создаваться пониженное давление, т.е. давление ниже, чем давление окружающей среды (как правило, 1 бар). Давление окружающей среды, таким образом, прижимает подложку к корпусу картриджа. Пониженное давление может создаваться, например, с помощью трубки, соединяющей вакуумную камеру с откачивающим устройством. Вакуумная камера является, как правило, отличной от реакционной камеры и гидродинамически не соединенной с реакционной камерой.
В другом варианте осуществления подложка может прикрепляться к корпусу картриджа за счет прижатия, например, механическими пружинами, и/или за счет электромагнитных сил, например создаваемых (электро)магнитами.
Когда подложка закрывает отверстие реакционной камеры, внутренняя форма полости реакционной камеры становится окончательно определенной. В предпочтительном варианте осуществления эта форма является такой, что высота полости реакционной камеры над подложкой составляет менее чем приблизительно 200 мкм, предпочтительно менее чем 100 мкм, или наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 50 мкм. В случае подложки с плоской поверхностью, закрывающей отверстие реакционной камеры, итоговая полость имеет форму прямоугольного параллелепипеда, высота которого по определению является расстоянием между подложкой и противоположной стороной прямоугольного параллелепипеда. В случае полости реакционной камеры более общей формы (например, когда входная и выходная зоны разработаны такими, чтобы формировалась четко заданная структура потока среды) высоту можно определять как диаметр наибольшей сферы, целиком помещающейся в указанную полость.
Сравнительно небольшая высота реакционной камеры, составляющая менее чем приблизительно 200 мкм или даже 100 мкм, обеспечивает преимущество в том, что поток реагента, проходящий через камеру, вступает в тесный контакт с образцом на подложке за счет перемешивания во время прохождения, таким образом, увеличивается скорость желаемой реакции, такой как окрашивание, и в то же время потребляется только небольшое количество реагентов.
По меньшей мере один разделительный элемент можно дополнительно поместить между подложкой и корпусом картриджа, чтобы добиться желаемого расстояния между этими элементами. Разделительный элемент может включать, например, шарики строго определенного диаметра, погруженные в мягкий соединяющий материал, например, адгезив или клей.
2
2
Площадь, накрываемая реакционной камерой (на подложке), может составлять вплоть до приблизительно 1 см, предпочтительно вплоть до 5 см, таким образом обеспечивается возможность помещения в реакционную камеру образцов такого размера.
Картридж предпочтительно может включать по меньшей мере один управляющий элемент (например, клапан), который позволяет приводить в движение и/или изменять маршрут движения текучей среды. Дополнительно или альтернативно он может включать по меньшей мере один насосный элемент для создания движимого давлением потока текучей среды из системы подачи текучей среды, через реакционную камеру, к системе отвода текучей среды. В данном контексте термин "движимый давлением" обозначает то, что имеется по меньшей мере один элемент или определенное место в картридже (например, насосный элемент) в котором можно управляемо создавать точно заданное давление, при этом указанное давление вызывает поток текучей среды. Таким образом, возможность контролировать давление обеспечивает возможность контролировать поток текучей среды, в частности внутри реакционной камеры. Указанная управляемость является преимуществом по сравнению с другими механизмами создания потока (например, по сравнению с потоком, вызываемым гравитацией). Кроме того, движимый давлением поток обладает преимуществом в том, что создает высокое сдвиговое усилие, действующее на образец, таким образом обеспечивается тесное взаимодействие между протекающими реагентами и образцом.
Указанный выше насосный элемент можно изготовить, например, как элемент, который возможно перемещать и/или деформировать таким образом, чтобы он вызывал поток текучей среды, при этом указанный насосный элемент предпочтительно располагается рядом с системой подачи текучей среды, реакционной камерой и/или системой отвода текучей среды. Такой насосный элемент может представлять собой или включать, например, деформируемую или подвижную мембрану, способную вызывать потоки текучей среды. Эта мембрана может представлять собой стенку в системе подачи и/или системе отвода текучей среды, при этом сила, действующая на указанную мембрану, вызывает смещение мембраны и, таким образом, поток текучей среды в подключенной жидкостной системе. Подвижный и/или деформируемый насосный элемент обеспечивает простое средство для контроля потока текучей среды в картридже, не требующее вступать в прямой контакт с указанной текучей средой. Схожую гибкую мембрану также можно встроить в качестве клапана для направления потока в различных направлениях и/или для изоляции определенных частей жидкостной системы. Предпочтительно могут присутствовать два или более насосных элемента (или клапана) описанного типа. Кроме того, насосный элемент и/или система, содержащая насосный элемент, может работать как перистальтический насос, вызывающий пульсирующее давление, которое переводится в односторонний поток текучей среды другими компонентами, в частности (соответствующим образом регулируемыми) клапанами.
Картридж может необязательно включать по меньшей мере одну емкость для реагента, в которой размещаются реагенты в сухом или влажном виде для последующего использования при прикреплении подложки с образцом. Картридж можно, таким образом, изготовить готовым к использованию, освобождая пользователя от необходимости работать или контактировать с (возможно нестабильными и/или токсичными) реагентами. Емкость для реагента предпочтительно является герметически закрытой или герметически отделяемой от полости (например, реакционной камеры), в которую впоследствии выходит реагент.
В предпочтительном варианте осуществления указанная выше емкость для реагента содержит по меньшей мере один краситель и/или фиксатор для подготовки биологического образца. Картридж можно использовать для подготовки биологического образца для микроскопического исследования.
Подложку можно в принципе разработать являющейся частью картриджа или в виде отдельного от картриджа элемента. Как правило, картридж, не содержащий подложку в качестве своего компонента, можно комбинировать с изготовленной отдельно подложкой, которую также можно использовать для других целей (например, если подложка представляет собой предметное стекло). В любом случае подложка может являться прозрачной для обеспечения возможности визуального исследования образца в реакционной камере или после подготовки. Предпочтительно, такая прозрачная подложка имеет небольшую толщину, менее чем приблизительно 0,2 мм, таким образом облегчается непосредственное визуальное исследование с помощью микроскопа с высоким разрешением.
В другом варианте осуществления подложка может иметь по меньшей мере одну метку, например, знак (такой как крест), напечатанную или вытравленную на поверхности, при этом расположение указанной метки может распознаваться внешним детектором. Это позволяет точно разместить и/или выровнять образец, расположенный на подложке, относительно картриджа или другого устройства. На подложке могут иметься характерные особенности, помогающие контролировать высоту реакционной камеры после закрытия.
В соответствии с дополнительным вариантом осуществления картридж включает по меньшей мере один идентификатор, который может определяться внешним детектором. В данном контексте термин "идентификатор" обозначает элемент, представляющий собой символ или код, несущий информацию об идентификационных данных и/или о свойствах подложки и/или образца, расположенного на подложке. Идентификатор может представлять собой, например, RFID-метку или 2D штрихкод, содержащий данные о типе картриджа, реагентах и образце (тип ткани, имя пациента и т.д.).
В других дополнительных вариантах осуществления картридж может включать по меньшей мере один индикатор для указания статуса реагента и/или реакции в системе подачи текучей среды, реакционной камере и/или системе отвода текучей среды. Индикатор может представлять собой, например, сенсор или краситель, меняющий свой цвет в зависимости от параметров, таких как температура или значение pH. Таким же образом устройство, использующее картридж, может содержать средства для наблюдения за прогрессом реакции, проходящей внутри картриджа, регистрируя, например, пропускание или отражение света в емкости для реагента или в реакционной камере.
В соответствии с другим аспектом изобретения потребности, имеющиеся в существующем уровне техники, решаются с помощью обрабатывающего устройства, содержащего следующие компоненты:
a) устройство сопряжения, с помощью которого можно присоединить картридж описанного выше типа (т.е. картридж с реакционной камерой, которая может закрываться подложкой, системой подачи текучей среды и системой отвода текучей среды, при этом указанная камера с подложкой и указанные системы являются закрытыми для обмена жидкостями с окружающей средой);
b) по меньшей мере одно управляющее устройство для управления обработкой образца в картридже, присоединенном к указанному выше устройству сопряжения.
Картридж в соответствии с данным вариантом осуществления изобретения образует собой закрытую систему, содержащую весь образец и необходимые реагенты для подготовки образца. В случае, когда подготовка образца требует больше действий, чем просто воздействие на образец подходящими реагентами, эти этапы можно выполнить с помощью управляющего устройства (устройств) вышеуказанного обрабатывающего устройства.
Картридж и обрабатывающее устройство можно сконструировать таким образом, чтобы жидкостная система картриджа (с реакционной камерой, системой подачи текучей среды и системой отвода текучей среды) могла обратимо присоединяться к жидкостной системе устройства. Затем некоторые реагенты могут поступать из устройства в картридж по этим обратимым соединениям.
Картридж и устройство представляют собой различные реализации одного изобретательского замысла, а именно обработка образца в системе, являющейся закрытой за счет присоединения подложки, несущей образец. Пояснения и определения, приведенные для одной из этих реализаций, также действительны и для другой реализации.
Управляющее устройство (устройства) обрабатывающего устройства может включать, например, по меньшей мере один регулятор температуры для регуляции температуры в реакционной камере картриджа, когда последний присоединен к устройству сопряжения. Регуляция температуры часто является полезной или даже необходимой для обеспечения возможности протекания (био)химических реакций и/или для защиты образца от повреждений, или для его стабилизации. Регуляцию температуры можно обеспечить за счет контакта с элементами заданной температуры и/или за счет теплопередачи излучением.
Дополнительно или альтернативно управляющее устройство (устройства) может включать по меньшей мере один регулятор давления для регуляции потока текучей среды в картридже, присоединенном к устройству сопряжения устройства. Регулятор давления может включать, например, элемент, воздействующий на подвижный и/или деформируемый насосный элемент картриджа, как описано выше. Наиболее предпочтительно имеется одно или несколько таких управляющих устройств, которые совместно регулируют давление в системе подачи текучей среды и в системе отвода текучей среды, таким образом обеспечивая точно заданные характеристики потока в расположенной между ними реакционной камере.
В соответствии с другим вариантом осуществления обрабатывающее устройство может включать одно или несколько средств для оптического исследования, например, оптическое окно, для получения данных об образце в картридже и/или для обеспечения возможности наблюдения за процессами в реакционной камере картриджа, присоединенного к устройству сопряжения устройства. Таким образом, за реакциями, протекающими в картридже, можно наблюдать в режиме реального времени. Кроме того, такие окна позволяют исследовать образец после окрашивания без необходимости удаления образца из картриджа.
Изобретение дополнительно относится к применению картриджа или устройства, таких как описанные выше, для подготовки образца и/или специфического окрашивания в патологической гистологии, патологической цитологии, иммуногистохимии и гибридизации in situ, в частности для применения в онкологии для разделения пациентов на группы за счет определения молекулярных изменений в злокачественных клетках. Подготовка может в частности включать депарафинизацию, регидратацию, демаскировку антигена, денатурацию, окрашивание и/или фиксацию образца. Образец может включать тканевые срезы (свежезамороженные, фиксированные в формалине, фиксированные в формалине и залитые парафином) и/или скопления клеток (осажденные, перенесенные методом отпечатка или другим способом иммобилизованные и фиксированные).
Изобретение дополнительно относится к применению картриджа или устройства, таких как описанные выше, для совмещенных подготовки образца и микроскопического анализа биологического образца в патологической гистологии, патологической цитологии, иммуногистохимии и гибридизации in situ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными и понятными после рассмотрения вариантов осуществления, описанных ниже в настоящем документе.
На чертежах:
На Фиг. 1 показан картридж, присоединенный к устройству, в соответствии с вариантом осуществления изобретения;
На Фиг. 2 показан вариант осуществления крепления подложки к картриджу.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Патологическое диагностическое исследование материалов пациента (например, ткани и клеток) лежит в основе многих решений о лечении, в особенности в онкологии. Обычно тонкие срезы биопсийного материала размещают на предметных стеклах и окрашивают в соответствии с некоторыми протоколами для визуализации морфологии ткани, например, используя Гематоксилин - Эозин (H&E). Кроме того, окрашивание in situ на специфичные для заболевания биомаркеры можно использовать для сопровождающей диагностики для подбора адресной терапии, такое окрашивание основано на специфическом связывании антител с белками, присутствующими в ткани, так называемое иммуногистохимическое исследовани (IHC), а также для гибридизации разработанной последовательности нуклеотидов на частях хромосом или генах, или молекулах информационной РНК (гибридизация in-situ, ISH). Анализ, как правило, проводят с помощью светлопольной или флуоресцентной микроскопии, или используя цифровой сканер. Срезы необходимо хранить после исследования в течение долгого времени в качестве архивных данных на случай, если диагноз надо будет подвергнуть пересмотру.
Образцы ткани можно получать, нарезая тонкие срезы, толщиной приблизительно 2-8 микрон, погруженного в парафин биопсийного материала. Срезы помещают на предметное стекло с водяной пленкой для ослабления вызванных микротомом деформаций и затем оставляют для высыхания. Существует ряд протоколов окрашивания, доступных для различных применений. Протоколы окрашивания можно выполнять на рабочем месте вручную, погружая покровное стекло со срезом в различные растворы, содержащие реагенты (типичный протокол приведен ниже). Выполнение протоколов окрашивания требует, как правило, по меньшей мере 2,5 часа; в некоторых случаях требуется инкубация в течение ночи. При этом поток реагентов может вызываться межфазными и гравитационными силами, а система являться (полу-)открытой, что ограничивает управляемость и скорость потока.
Процедуры окрашивания в соответствии с существующим уровнем техники часто страдают от следующих недостатков:
- Неэффективное использование оборудования из-за периодической работы.
- Неэффективное использование реагентов из-за ограниченного срока годности хранящихся реагентов при низком потреблении.
- Риск ошибки из-за открытого доступа к реагентам и рабочим стадиям.
- Высокие усилия для содержания жидкостных устройств сопряжения и для предотвращения загрязнения из-за открытости системы.
- Ограниченный контроль потока текучей среды, приводящий к высокой времязатратности анализа и неравномерности окрашивания.
- Недостаток стандартизации/объективной оценки качества.
Для устранения этих недостатков предлагается новый подход к выполнению гистологических и цитологических протоколов окрашивания. В соответствии с вариантом осуществления данного подхода образец помещают на подложку, являющуюся частью картриджа, герметически закрывающегося после помещения образца. Формируется закрытая "реакционная камера" с узким зазором, порядка приблизительно 50 микрон. Необязательно, можно закреплять картридж в устройстве или приспособлении, контролирующем температуру в реакционной камере и поток реагентов, предпочтительно с помощью пневматических устройств сопряжения. Реагенты могут подаваться в реакционную камеру и протекать около образца за счет создания движимого давлением потока в замкнутых каналах. Это позволяет точно контролировать характеристики потока, ограничивать количество реагентов и увеличивать эффективность стадий отмывки и смены реагентов. Это приводит к более быстрому выполнению протоколов и к получению более воспроизводимых результатов. Реагенты можно размещать в картридже. Картридж может быть одноразовым. Необязательно, образец можно исследовать, не вынимая его из картриджа, с помощью оптического окна, расположенного в камере с образцом. В случае эпифлуоресценции образец можно исследовать сквозь подложку (если она является прозрачной); в случае светлопольной микроскопии окно также должно присутствовать на противоположной от подложки стороне, чтобы обеспечить возможность измерения пропускания.
На Фигуре 1 схематически показан вид сбоку в разрезе на картридж 100, прикрепленный к устройству сопряжения (плоская верхняя поверхность) обрабатывающего устройства 150 в соответствии с вариантом осуществления описанных выше принципов.
2
Картридж 100 предпочтительно состоит из цельного корпуса картриджа 110, который можно изготовить, например, с помощью литья под давлением (например, из двух или более частей, несъемным способом скрепленных друг с другом). На нижней стороне картриджа (на Фигуре) расположена полость, далее называемая "реакционной камерой" 116, имеющая по существу простую форму, форму прямоугольного параллелепипеда, с высотой h, составляющей менее чем приблизительно 100 мкм. Площадь реакционной камеры в проекции на плоскость x, y может достигать нескольких см. Боковые стенки реакционной камеры 116 образуются выступами или выпуклыми бордюрами 117, заканчивающимися в одной плоскости и, таким образом, в указанной плоскости образующими замкнутую кривую вокруг нижнего отверстия реакционной камеры. В показанном примере это нижнее отверстие реакционной камеры 116 является закрытым и герметизированным подложкой 140. Сцепления корпуса картриджа 110 и подложки 140 можно добиться, например, разместив адгезив или клей на верхнем крае выпуклых бордюров 117 (альтернативные возможности обсуждаются при рассмотрении Фигуры 2).
Указанная выше подложка 140 может представлять собой, например, предметное стекло, на котором может размещаться биологический образец 1, предназначенный для обработки или подготовки. Образец 1 размещают на верхней стороне подложки 140 и он, таким образом, оказывается обращенным ко внутреннему пространству реакционной камеры 116. Подложка 140 может в принципе являться составной частью картриджа 100 или представлять собой отдельный самостоятельный элемент. В другом предпочтительном варианте осуществления подложку изготавливают из аморфного полимера и, необязательно, наносят покровные слои для получения желаемых свойств поверхности для адгезии ткани и/или барьерных свойств, и/или просветляющих свойств. В предпочтительном варианте осуществления подложка является составной частью картриджа, неразъемное соединение между подложкой и картриджем может осуществляться с помощью шарниров.
Картридж 100, кроме того, содержит систему подачи текучей среды, гидродинамически соединенную с реакционной камерой. В показанном примере система подачи текучей среды содержит емкость для реагента 113, в которой хранятся реагенты (например, красители), необходимые для обработки образца 1. Емкость для реагента 113 соединена с первым концом реакционной камеры 116 с помощью канала 115. Стенка одной из сторон емкости для реагента 113 изготовлена из деформируемой мембраны 112, выполняющей роль подвижной стенки емкости для реагента 113, позволяющей изменять объем емкости (по мере оттока реагентов), сохраняя жидкостную систему закрытой от окружающей среды. Мембрана 112 может находиться в состоянии упругого растяжения или ее можно изготовить с достаточной площадью для обеспечения возможности нахождения в релаксированном состоянии и в условиях заполненной и в условиях пустой емкости для реагента 113.
Другая мембрана 114 расположена на одной из стенок канала 115. Внешняя сторона этой мембраны 114 соединена с помощью канала 111 с нижней стороной картриджа 100.
Картридж 100, кроме того, содержит систему отвода текучей среды, соединенную со вторым концом реакционной камеры (противоположным первому концу). Система отвода текучей среды содержит емкость для отходов 123 и канал 125, соединяющий указанную камеру со вторым концом реакционной камеры 116. Одна из стенок емкости для отходов 123, необязательно, представляет собой деформируемую мембрану 122. Аналогично мембране 112 в емкости для реагента 113, данная деформируемая мембрана 122 позволяет изменять уровень заполнения емкости для отходов 123, оставляя жидкостную систему изолированной от окружающей среды. Кроме того, другую гибкую мембрану 124 можно расположить в отводящем канале 125, внешняя сторона указанной мембраны соединяется с нижней стороной картриджа с помощью канала 121.
Когда подложка 140 с образцом 1 прикреплена к отверстию реакционной камеры 116 картриджа, выпуклые бордюры 117 отверстия плотно прилегают к подложке герметичным способом (например прикрепляются с помощью клея), таким образом формируя закрытую жидкостную систему вокруг образца 1. Данная жидкостная система содержит систему подачи текучей среды, реакционную камеру и систему отвода текучей среды и позволяет создавать контролируемый движимый давлением поток текучего реагента, выходящий из емкости для реагента 113, проходящий через реакционную камеру 116 и попадающий в емкость для отходов 123.
Для обеспечения возможности контролировать указанный выше поток текучей среды картридж 100 с подложкой 140 присоединяют к обрабатывающему устройству или приспособлению 150 с помощью устройства сопряжения указанного устройства. В показанном варианте осуществления указанное устройство сопряжения представляет собой по существу плоскую поверхность на которой можно разместить подложку 140 и картридж 100.
Когда картридж 100 помещают на приспособление, подложка оказывается расположенной над регулятором температуры 152 устройства 150, с помощью которого можно регулировать температуру в реакционной камере 116. Кроме того, каналы 111 и 121, ведущие, соответственно, к мембранам 114 и 124 системы подачи текучей среды и системы отвода текучей среды, располагаются над пневматическими регуляторами 151 и 153. Когда пневматический регулятор 153, расположенный на правой стороне устройства 150, создает повышенное давление, то это давление подается по каналу 111 к мембране 114, которая выпячивается в впускной канал 115, таким образом создавая поток реагентов к реакционной камере 116. Предпочтительно, мембрана 114 является частью перистальтического насоса, содержащего дополнительные элементы, такие как клапаны (не показано), для перевода пульсирующего давления в поток текучей среды, направленный к реакционной камере. Мембрана, таким образом, является управляющим устройством, выгибающимся в одну или другую сторону в зависимости от разницы давлений с одной и с другой стороны управляющего устройства. При приложении пониженного давления (обычно 0,1-0,2 бар) мембрана выгибается в направлении стороны приложения пониженного давления, при приложении повышенного давления (обычно от 1,5 до 2,0 бар) мембрана выгибается в противоположном направлении.
Аналогично, пневматический регулятор 151, расположенный с левой стороны устройства 150, может воздействовать через канал 121 на мембрану 124, вызывая (перистальтический) поток текучей среды (отходов) в емкость для отходов 123.
Мембраны 114 и 124, таким образом, выступают в роли насосных элементов, с помощью которых можно создать точно регулируемый движимый давлением поток текучей среды в реакционной камере 116.
Следует отметить, что мембраны 112 и 122 емкости для реагента 113 и емкости для отходов 123, соответственно, являются зафиксированными в различных положениях и, таким образом, исходно (без приложения внешнего давления) находятся в различных состояниях: мембрана 112 емкости для реагента 113 зафиксирована в отдаленном от канала 115 положении, таким образом, текучий реагент может полностью заполнять емкость для реагента 113, когда мембрана находится в исходном состоянии. В отличие от этого мембрана 122 емкости для отходов 123 зафиксирована приближенной ко входу в канал 124, таким образом, емкость для отходов является по существу пустой, когда мембрана находится в исходном состоянии.
Кроме того, система подачи текучей среды, необязательно, может содержать несколько емкостей для реагентов, которые могут независимо опорожняться в реакционную камеру.
На Фигуре 2 показан схематический боковой вид на альтернативный способ крепления подложки 240 (например, предметного стекла) к корпусу картриджа 210. Подробности строения жидкостных систем в картридже 200 могут совпадать с показанными на Фигуре 1 и поэтому не приведены на чертеже для упрощения.
В показанном варианте осуществления прикрепление подложки 240 к корпусу картриджа 210 достигается с помощью расположения присасывающейся камеры 219 между подложкой 240 и корпусом картриджа 210. Данная присасывающаяся камера 219 выполнена вокруг образца 1 (например, приклеенного) с помощью концентрических гребней 217. Высоту зазора h между подложкой 240 и корпусом картриджа 210 можно, необязательно, регулировать, вводя разделители (например, стеклянные шарики) точно заданного диаметра (если используется клей, то они могут входить в состав клея).
Кроме того, вакуумный канал 218, выполненный в корпусе картриджа 210, соединяет присасывающуюся камеру 219 с внешней стороной картриджа и/или с регулятором давления (не показан). Таким образом пониженное давление, например, приблизительно 0,1-0,2 бар, можно создать в присасывающейся камере 219, за счет чего достигается плотное присоединение подложки 240 к корпусу картриджа 210.
Сила соединения между подложкой и корпусом картриджа должна быть больше, чем сила, создаваемая движимым давлением потоком в реакционной камере. В случае использования вакуума это означает, что произведение давления и площади поверхности в вакуумной части должно уравнивать такое же произведение в реакционной камере, при условии, что подложка и картридж неподвижны. В случае клея сила склеивания, умноженная на площадь контактной поверхности гребня с нанесенным клеем должна равняться силе, создаваемой жидкостью в реакционной камере.
Прижатие подложки к корпусу картриджа представляет собой еще один вариант прикрепления. Его можно осуществить, используя пружинный прижим или (электро-)магниты, которые могут являться частью устройства (150 на Фигуре 1), в котором происходит обработка картриджа.
Существенная особенность описанных вариантов осуществления заключается в том, что образец вводят в закрытую камеру, содержащую только один микрожидкостной впускной порт и один отводящий порт, оба расположенные перпендикулярно (относительно плоскости) подложке, на которой размещен образец (например, ткань или цитологический материал). Реагенты прокачиваются около образца в движимом давлением потоке, позволяющем создать большую скорость сдвига, чем создаваемая в полуоткрытых системах. Увеличение скорости сдвига позволяет осуществить более интенсивную подачу и проникновение реагентов, и более эффективную отмывку, что приводит к увеличению качества окраски, при уменьшении требуемого времени.
Множество (дополнительных) особенностей можно включить в данный подход, например:
2
2
- Образец можно помещать на отдельной плоской подложке, такой как предметное стекло или, альтернативно, пластиковая подложка. Размер образца составляет, как правило, приблизительно от 1 см до 2 см.
- Толщина подложки может соответствовать толщине традиционных предметных стекол (1 мм) для возможности применения совместно с существующими решениями, или, предпочтительно, быть гораздо меньше (например, меньше чем приблизительно 0,2 мм) для обеспечения возможности проведения наблюдения с высоким разрешением сквозь подложку, что также позволит отказаться от покровных стекол.
- Подложка может нести особенности ("метки"), позволяющие точно и воспроизводимо располагать образец для облегчения оптического исследования после окрашивания. На Фигуре 1 одна такая метка 141 схематически показана.
- Как показано, подложка может представлять собой отдельную часть, которая после помещения в картридж прикрепляется, например, за счет приклеивания или прижатия. Альтернативно подложка может являться составной частью картриджа. Можно выполнить отверстие картриджа или крышку, позволяющие введение образца и способные закрываться после введения образца. Подложку с образцом можно отделить после обработки от остальной части картриджа для хранения.
- Реагенты могут храниться во влажном и/или сухом состоянии в картридже в отдельных герметичных отсеках, в частности специфичные дорогие красители и, необязательно, вредные для окружающей среды вещества. Отдельные контейнеры с реагентами могут присоединяться к картриджу, что придает больше гибкости в логистике и соблюдении условий хранения.
- Отходы могут собираться внутри картриджа, таким образом устройство не подвергается загрязнению жидкостями и не требуется чистка. Контейнер для отходов можно разработать в виде отделимой единицы для облегчения удаления.
- Одно или несколько дополнительных окон может находиться на картридже, например, напротив подложки для обеспечения возможности оптического исследования образца в проходящем свете или для исследования через дополнительное окно вместо подложки.
- Фиксатор можно вводить на последней стадии для консервации образца для увеличения стабильности и контрастности во время исследования.
- Перемещение текучей среды можно вызывать с помощью пневматических управляющих устройств, воздействующих на мембраны, расположенные внутри картриджа. Таким образом, отсутствует возможность прямого контакта жидкостей с инструментом.
- Картридж может содержать одно или несколько средств для идентификации, таких как штрихкод или RFID-чип, которые указывают тип картриджа и/или присутствующие реагенты. Кроме того, идентификационная информация может указываться на подложке, если образец вводится на отдельной подложке.
- Картридж может содержать индикаторы, указывающие статус реагентов и статус реакции.
- Картридж и устройство можно сконструировать таким образом, чтобы реагенты хранились также и в устройстве (например, простые буферы), при этом указанные реагенты могут передаваться в картридж по герметичным соединениям (не показаны).
Пример
Далее типичная процедура окрашивания описана более подробно. В данном примере FISH (флуоресцентную гибридизацию in situ) проводили в прототипе картриджа, следуя протоколу Kreatech (Kreatech Diagnostics, Amsterdam), зазор в реакционной камере 50 мкм и время инкубации 3,5 часа (для обеспечения возможности проведения двух протоколов в сутки). Для проверки успешно ли выполняется FISH, также выполняли протокол вручную, используя такое же время инкубации.
Клетки клеточной линии SKBR3 осаждали с помощью цитоцентрифуги, помещали на предметное стекло и хранили при -80° C. Коллекции клеток на предметных стеклах обрабатывали следующим способом:
- фиксировали в 4% формальдегиде в течение 10 мин;
- отмывали PBS;
2
- отмывали дистиллированной H0;
- полностью высушивали на предметном стекле;
- клейкую ленту наклеивали на картридж;
- предметное стекло приклеивали к клейкой ленте.
В нижеследующей Таблице 1 обобщены стадии, проводимые с установленным картриджем за первые сутки (температура поддерживалась устройством):
Таблица 1
Стадия
Температура (°C)
Время (с)
Прокачка/Инкубация
Реагент
1
RT
30
Прокачка
(MES) буфер
2
94
480*
Инкубация
(MES) буфер
3
38
30**
Прокачка
(MES) буфер
4
38
до t=~38°C
Инкубация
(MES) буфер
5
38
30
Прокачка
2xSSC/0,5% игепал
6
38
900
Инкубация
2xSSC/0,5% игепал
7
RT
30
Прокачка
70% этанол
8
RT
30
Прокачка
85% этанол
9
RT
30
Прокачка
100% этанол
10
RT
30
Инкубация
100% этанол
11
RT
воздушная сушка
воздушная сушка
воздух
13
RT
3,5 (2 цикла работы насоса)
Прокачка
Смесь зондов
14
83
450
Инкубация
Смесь зондов
15
38
86400 (24ч)
Инкубация
Смесь зондов
16
38
30
Прокачка
0,4xSSC/0,5% игепал
17
75
240***
Инкубация
0,4xSSC/0,5% игепал
18
RT
15
Прокачка
2xSSC/0,5% игепал
19
RT
30
Прокачка
70% этанол
20
RT
30
Прокачка
85% этанол
21
RT
30
Прокачка
100% этанол
22
RT
30
Инкубация
100% этанол
23
RT
до высыхания
Воздушная сушка
воздух
(*- требовалось приблизительно 180 сек для достижения 94°C)(**- прокачка для более быстрого охлаждения реакционной камеры и удаления пузырьков)
(***- требовалось приблизительно 2 минут для достижения данной температуры)(RT=комнатная температура)
После этого проводились следующие стадии:
- предметное стекло удаляли из картриджа;
- клейкую ленту удаляли с предметного стекла;
- убеждались в том, что образец и стекло полностью высохли;
- наносили небольшую каплю (10-20 мкл) содержащей DAPI фиксирующей текучей среды;
- прикладывали покровное стекло;
- через 10 мин получали изображения образца.
Эксперимент показал, что полученные флуоресцентные изображения демонстрировали сигнал FISH.
В кратком изложении, в настоящем документе описан вариант осуществления нового устройства, позволяющего проводить автоматическое окрашивание биологических образцов пациентов, в частности тканевые срезы. Образец можно вводить в виде микротомного среза свежезамороженного или фиксированного в формалине и залитого парафином биопсийного материала или в виде осажденной клеточной суспензии. После введения образца картридж закрывается, таким образом вокруг образца возникает полностью закрытый отсек с точно регулируемой высотой зазора. Одна из стенок отсека представляет собой тонкую прозрачную подложку, позволяющую проводить оптическое исследование образца в закрытом картридже. Доступ для текучих сред осуществляется через впускной и отводящий порты отсека. Различные протоколы обработки можно выполнять, активно прокачивая реагенты и растворы для отмывки около образца в отсеке. В предпочтительном варианте осуществления реагенты хранятся внутри картриджа и на текучие среды оказывается воздействие с помощью пневматических управляющих устройств. Пневматические управляющие устройства предпочтительно расположены рядом с отсеком для обеспечения возможности создания плоской и не дорогой конструкции. Картридж может состоять из комбинации изготовленных литьем под давлением и/или с помощью вакуумного литья пластиковых частей и гибких мембран, необязательно, с металлическими элементами и элементами стеклянной подложки. Частям можно придать специфические оптические свойства для обеспечения, например, защиты чувствительных химических соединений, органические и/или неорганические защитные слои можно нанести для обеспечения требуемого срока годности картриджа и реагентов, можно встроить теплопоглощающие и/или проводящие элементы.
Изобретение можно применять в патологической гистологии и патологической цитологии для проведения иммуногистохимических анализов, анализов методом близкого лигирования, анализов с помощью зондов типа висячий замок и гибридизации in-situ ДНК и/или РНК, или других биологических анализов с исследованием на основе светлополной и/или флуоресцентной микроскопии для анализа тканевых срезов и/или скоплений клеток (осажденных); в частности для применения в онкологии для разделения пациентов на группы за счет определения молекулярных изменений в злокачественных клетках и в сопроводительной диагностике.
Хотя изобретение проиллюстрировано и подробно описано на чертежах и в вышеприведенном описании, эти иллюстрации и описание следует рассматривать как пояснительные или приведенные в качестве примера и не ограничивающие объем изобретения; изобретение не ограничено описанными вариантами осуществления. Другие варианты описанных вариантов осуществления понятны и могут осуществляться специалистами в данной области при осуществлении описываемого в заявке изобретения, после рассмотрения чертежей, описания и прилагаемой формулы изобретения. В формуле изобретения слово "включает" не исключает другие элементы или стадии, и единственное число не исключает множественного числа. Один процессор или другой блок может выполнять функции нескольких элементов, указанных в формуле изобретения. Тот факт, что определенные величины приведены во взаимно различных зависимых пунктах формулы изобретения, не означает, что сочетание этих величин нельзя благоприятно использовать. Компьютерную программу можно записать/распространять на подходящем носителе, таком как оптическое запоминающее устройство или твердотельное запоминающее устройство, поставляемом вместе или как часть аппаратного обеспечения, но также можно распространять другими способами, такими как по сети Интернет или используя другие проводные или беспроводные телекоммуникационные системы. Любые ссылочные обозначения в формуле изобретения не должны быть истолкованы как ограничивающие объем.