СПОСОБ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR INHIBITING PLISS LYMPHOSARCOMA GROWTH EXPERIMENTALLY

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии и может быть использовано для оценки противоопухолевого действия наночастиц (НЧ) металлов и в экспериментальной противоопухолевой терапии.
Большое внимание в области создания новых противоопухолевых средств уделяется исследованию агентов на основе переходных металлов. Интерес к группе d-металлов определяется не только их способностью подавлять рост клеток, но и участием в разнообразных физиологических функциях, поскольку большинство элементов этой группы являются эссенциальными [Chen D., Milacic V., Frezza M., Dou Q.P. Metal complexes, their cellular targets and potential for cancer therapy // Curr Pharm Des. 2009. V. 15, N 7, P. 777-791; Garbutcheon-Singh K.B., Grant M.P., Harper B.W., Krause-Heuer A.M., Manohar M., Orkey N., Aldrich-Wright J.R. Transition Metal Based Anticancer Drugs // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2011. V. 11, N 5, P. 521-542].
Развитие нанотехнологий и внедрение их в медицину приобрело большое значение для онкологии. Использование различных наноконструкций d-металлов в качестве самостоятельных противоопухолевых средств может быть перспективным, поскольку в ультрадисперсной форме они проявляют выраженную биологическую активность, обладают пролонгированным действием и меньшей токсичностью по сравнению с солями [Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Химическая физика. 2002. Т.21 (4). С.79-85; Frezza M, Hindo S, Chen D, Davenport A, Schmitt S, Tomco D, Dou QP. Novel metals and metal complexes as platforms for cancer therapy // Curr Pharm Des. 2010 Jun; 16 (16). P. 1813-25].
В противоопухолевой терапии функционализированные различными лигандами наночастицы металлов, в частности антителами, различными пептидами, ДНК и/или РНК, используются для таргетной терапии опухолей [Mi Kyung Yu, Jinho Park, Sangyong Jo. Targeting Strategies for Multifunctional Nanoparticles in Cancer Imaging and Therapy // Theranostics. 2012. V. 2, N 1, P. 3-44]. Показана эффективность лечения рака печени с помощью нацеливания магнитных наночастиц, содержащих 5-фторурацил [Wang J.M., Xiao B.L., Zheng J.W., Chen H.B., Zou S.Q. Effect of targeted magnetic nanoparticles containing 5-FU on expression of bcl-2, bax and caspase 3 in nude mice with transplanted human liver cancer // World J. Gastroenterol. 2007. N 13. P. 3171-3175]. Металлические наночастицы также используются в качестве контейнеров для доставки лекарственных средств к тканям-мишеням и проведения гипертермии, фотодинамической и радиотерапии [Conde J., Doria G., Baptista P. Noble Metal Nanoparticles Applications in Cancer // J. of Drug Delivery. 2012. V. 2012, Article ID 751075, 12 p.].
В качестве самостоятельных лекарственных средств наночастицы переходных металлов пока не нашли применения в онкологии. Имеются лишь отдельные исследования по использованию наночастиц металлов в ветеринарии. Например, установлено, что введение нанодисперсионного железа нормализует показатели крови коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, которых авторы предлагают использовать в качестве биологической модели для исследования различных форм лейкоза человека [Павлов Г.В., Годвин Окпаттах А.К., Пчелин В.М., Павлова В.Г. Влияние нанодисперсионного железа при лейкозе животных // Нанотехнологии и информационные технологии - технологии XXI века: Материалы Международной научно-практической конференции (Москва, 24-26 мая 2006 г.). М., 2006. С. 117-118].
Поскольку наночастицы металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактериостатическое и бактерицидное действия, лекарственные формы на их основе уже используются для лечения трофических язв, ожогов, гнойных ран и угревой сыпи. Наночастицы железа как в виде водной суспензии при подкожном введении, так и в виде мази при нанесении на раны обладают ярко выраженным ранозаживляющим эффектом. На основе нанопорошков железа были получены и апробированы препараты для ускоренного заживления ран и лечения ожогов, которые позволяют ускорить до 1,5 раз процесс заживления, причем после лечения не остается рубцов [Байтукалов Т.А. Физико-химические особенности ранозаживляющих свойств наночастиц железа и магния в составе различных полимеров: Автореф. дис … к.х.н. М., 2006]. В то же время, использование наночастиц несет не только несомненные преимущества, но и потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы [Колесниченко А.В., Тимофеев М.А., Протопопова М.В. Токсичность наноматериалов - 15 лет исследований // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №3-4. С. 54-61].
Таким образом, исследование биологической активности, в том числе, противоопухолевой, нанокластеров переходных металлов и разработка противоопухолевых препаратов на их основе является актуальной задачей.
Известен «Способ определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте» [патент RU 2417453, опубл. 27.04.2011, Бюл. №12]. Показано, что введение крысам с перевиваемой саркомой 45 наночастиц меди приводит к полной регрессии опухоли в 50% случаев и к появлению признаков частичной регрессии у большей части остальных животных. Однако в данной работе не исследовано влияние введения наночастиц меди на уровень эндогенной интоксикации у животных-опухоленосителей и нет сведений об исследовании противоопухолевой активности наночастиц железа.
Известен также способ использования наночастиц меди, железа или цинка, приводящий к гибели опухолевых клеток линейных и свежевыделенных культур [патент RU 2392668, опубл. 20.06.2010, Бюл. №17]. В данном способе культуру клеток линии миеломы Х563 или клеток костномозгового пунктата больных множественной миеломой инкубируют с указанными наночастицами в течение 30-45 мин при 37°C, кроме того, ткань рака легкого культивируют с теми же наночастицами в диффузионных камерах, подшитых в брюшную полость крыс, в течение 6 дней. Однако, на наш взгляд, данный способ не позволяет оценить влияния наночастиц указанных металлов на рост опухоли в организме-опухоленосителе и определить потенциальную токсичность данного воздействия на организм.
Известно влияние наночастиц карбоната лития на рост экспериментальной гепатокарциномы 29 [Н.П. Богатова, Ю.И. Бородин, В.В. Макарова, А.А. Пожидаева, Л.Н. Рачковская, В.И. Коненков. Влияние наноразмерных частиц карбоната лития на интактную мышечную ткань и опухолевый рост. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. Том 157. №1, стр. 102-107]. Авторами показано, что ведение наночастиц карбоната лития по периферии опухолевого роста вызывает некроз опухолевых клеток, деструкцию сосудистого русла и инфильтрацию иммунокомпетентными клетками области опухолевого роста. Однако в данной работе авторы не приводят сведений о влиянии наночастиц карбоната лития на уровень эндогенной интоксикации и на динамику роста опухоли у животных-опухоленосителей. Таким образом, данные о самостоятельной противоопухолевой активности наночастиц железа в опытах in vivo в литературе отсутствуют.
Техническим результатом представленного изобретения является достижение противоопухолевого действия у крыс с перевиваемой лимфосаркомой Плисса путем введения животным наночастиц железа без повышения токсичности их воздействия на организм.
Данный технический результат достигается за счет того, что с 6 суток после перевивки лимфосаркомы Плисса осуществляют восьмикратное введение суспензии наночастиц железа: на 6, 7, 9, 10, 14, 15, 16 и 17 сутки в разовой дозе 1,25 мг/кг массы животного (суммарная доза 10 мг/кг).
В качестве экспериментальной модели использовали крыс, которым была перевита лимфосаркома Плисса (ЛСП), характеризующаяся быстрым агрессивным ростом с тенденцией к инвазии в окружающие ткани, прорастанием забрюшинной клетчатки, гематогенным метастазированием и некротизацией, а также сниженной чувствительностью к цитостатикам. Штамм ЛСП получен из банка опухолевых штаммов Российского Онкологического Центра РАМН.
Для индукции ЛСП нелинейным крысам-самцам массой 260-300 г осуществляли инъекцию 0,7 мл 50% взвеси опухолевых клеток в физиологическом растворе подкожно в область нижней части спины.
3
Порошок наночастиц железа суспендируют непосредственно перед введением в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл, полученную взвесь вводят крысам-самцам с перевиваемой лимфосаркомой Плисса, разделенным на три группы, в первой группе суспензию НЧ железа вводят локально в опухоль в количестве 1,25 мг/кг, во второй группе суспензию НЧ железа вводят внутрибрюшинно в количестве 1,25 мг/кг, в третьей группе, являющейся контрольной, вводят физиологический раствор внутрибрюшинно, в количестве 0,3 мл на крысу. С 6 суток после перевивки (когда объем опухоли в среднем достигает 0,4±0,05 см) начинают восьмикратное введение суспензии наночастиц железа (на 6, 7, 9, 10, 16, 17, 19 и 20 сутки) после перевивки опухоли, суммарная доза наночастиц железа в обеих экспериментальных группах составляет 10 мг/кг. В контрольной группе животным с лимфосаркомой Плисса в те же сроки внутрибрюшинно вводился физиологический раствор.
Использовали нанопорошки железа, полученные из крупнодисперсных порошков с помощью плазменной технологии, основанной на испарении сырья (крупнодисперсного порошка или прутка) в плазменном потоке с температурой 5000-6000 К и конденсации пара до ультрадисперсных частиц требуемого размера (дисперсность частиц 30-50 нм), форма частиц близка к сферической. Исследование структуры наночастиц и их раствора в 0,9% NaCl, проведенное с помощью метода спектроскопии рентгеновского поглощения на основе анализа тонкой структуры спектров рентгеновского поглощения в области края поглощения (XANES - X-ray absorption near edge spectroscopy), показало, что в исследуемом растворе наночастицы представляли собой металлическое железо.
3
3
Критериями оценки влияния наночастиц (НЧ) железа на рост ЛСП служили масса опухоли (М), объем опухоли (V), индекс эффективности (ИЭ), процент торможения роста опухоли (Т%), морфологические изменения в опухолевой ткани. Объем опухоли рассчитывали по формуле Шрека для эллипсоида: V=(α×b×c)×π/6, где a, b, c - линейные размеры опухоли (см), V - объем опухоли (см). В конце эксперимента производили взвешивание опухолей. Индекс эффективности рассчитывали как отношение среднего значения массы опухоли в контроле к среднему значению массы опухоли в опыте: ИЭ=Мк/Мо. Процент торможения роста опухоли оценивали по среднему объему и по средней массе опухоли (Tv%, Tm%) в опытных группах по сравнению с контролем: Tv%=[(Vк-Vo)/Vк]×100%, где Vк и Vo - средний объем (см) опухоли в контрольной и опытной группе в конце эксперимента; Tm%=[(Мк-Мо)/Мк]×100%, где Мк и Мо - средняя масса (г) опухоли в контрольной и опытной группе в конце эксперимента.
3
У контрольных животных (животные с ЛСП без введения наночастиц) средний объем опухоли составил 78,5 см, масса - 83,71 г.
3
3
3
У животных, которым было осуществлено 8-кратное внутриопухолевое введение наночастиц железа в дозе 1,25 мг/кг массы животного (суммарная доза 10 мг/кг), наблюдалась полная регрессия опухоли в 60% случаев, а при внутрибрюшинном введении - в 50% случаев. При этом из 22 животных с ЛСП, которым вводилась суспензия нанопорошка железа, у 12 животных (по 6 с внутриопухолевым и внутрибрюшинным способах введения) объем и масса опухоли на момент забоя были равны нулю, при внутриопухолевом введении у 2 животных составили в среднем 0,16 см и 0,03 г соответственно (снижение размеров опухоли относительно средних значений контрольной группы на 99,8% по объему и на 99,96% по массе, что также относится к полной регрессии) и у 2-х животных - 14 см и 27 г (снижение размеров опухоли относительно средних значений контрольной группы на 82,2% по объему и на 67,7% по массе) и лишь при внутрибрюшинном введении наночастиц у 6 животных был зафиксирован рост опухоли (средний объем 83,5 см, средняя масса 120,2 г). Таким образом, суммарно введение наночастиц железа привело к полной регрессии опухоли в 63,6% случаев, торможению роста в 9,1% и росту опухоли в 27,3%. Процент торможения роста опухоли в целом по группе составил: по объему опухоли (Tv%) - 66,3%, по массе опухолевого узла (Tm%) - 64,2%. Индекс эффективности воздействия наночастиц железа был равен 2,79 (таблица 1).
254
280
254
Для суждения о выраженности эндогенной интоксикации в обеих группах животных (опухолевый рост без введения и с введением наночастиц железа) изучены уровень молекул средней массы (МСМ и МСМ), общая концентрация альбумина (ОКА) и эффективная концентрации альбумина (ЭКА) и рассчитаны связывающая способность альбумина (ЭКА/ОКА×100%), индекс токсичности (ОКА/ЭКА-1) и коэффициент интоксикации (МСМ/ЭКА×1000). Индекс токсичности отражает функциональное состояние молекулы альбумина (сорбционную способность), зависящее от конформационных изменений его молекулы, и характеризует в значительной степени вклад недостаточности функций печени в развитие эндогенной интоксикации. Коэффициент интоксикации отражает баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов.
254
254
254
280
Как видно из таблицы 2, для животных с лимфосаркомой Плисса было характерно резкое снижение эффективной концентрации альбумина до 12,76±1,47 г/л, в то время как у интактных животных среднее значение данного показателя составляет 30,75±2,75 г/л. Это свидетельствует о загруженности альбумина продуктами интоксикации, образующимися при опухолевом росте. Наблюдается также и накопление в крови фракции молекул средней массы, определяемых при 254 нм, по концентрации которых принято судить о выраженности эндогенной интоксикации. Введение животным наночастиц железа оказывало выраженный нормализующий эффект на эти показатели. Уровень эффективной концентрации и связывающая способность альбумина у животных с полной регрессией опухоли, вызванной введением наночастиц железа, были увеличены на 73,9% и 129,9% соответственно по сравнению с опухолевыми животными, которым наночастицы не вводились. Содержание МСМ у животных с регрессией было ниже на 20,3%, чем в контрольной группе животных-опухоленосителей. При этом следует отметить, что даже у животных с продолженным ростом после введения наночастиц железа показатели, отражающие способность альбумина осуществлять связывание токсических продуктов, были значительно выше, чем в контрольной группе: уровень ЭКА - на 61%, ССА - на 156,5%, хотя содержание МСМ оказалось на том же уровне, что и у животных-опухоленосителей, которым наночастицы не вводились. Однако уровень МСМ у животных с ростом опухоли после введения наночастиц железа был статистически значимо выше (на 25%, p=0,014231), чем у животных с полной регрессией опухолевого узла. Уровень среднемолекулярных пептидов (МСМ) у животных с регрессией опухоли не отличался от значений в контрольной группе, но был значимо ниже (на 21,2%, p=0,009442), чем у животных с продолженным ростом после введения наночастиц железа.
Введение наночастиц железа привело к снижению индекса токсичности в 9,8 раз и коэффициента интоксикации на 58,2% у животных с полной регрессией опухоли по сравнению с контрольной группой. У животных, у которых введение наночастиц железа не сопровождалось регрессией опухоли, индекс токсичности снизился в 18 раз, коэффициент интоксикации - на 52%.
Таким образом, применение данного способа позволяет путем введения наночастиц железа крысам с лимфосаркомой Плисса достичь полной регрессии опухоли у 60% животных при внутриопухолевом введении и у 50% животных при внутрибрюшинном введении (при этом индекс эффективности по всем животным составляет 2,79). Это одновременно сопровождается значительным снижением эндогенной интоксикации, характерной для опухолевого процесса, у животных опытной группы вне зависимости от способа введения наночастиц и степени регрессии опухоли. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Авторами в доступных источниках информации не было обнаружено сведений об известности предлагаемого способа. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».
Изобретение может быть использовано в здравоохранении при проведении экспериментальных исследований в области наноонкологии. Таким образом, изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».