Разработка генетической конструкции для ДНК-вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней

ся, что является следствием воздействия неблагоприятных факторов [6]. У огурца Кураж F1, имеющего самую низкую стрессоустойчивость к перепадам освещенности, чем у других гибридов, степень отмирания завязей оказалась максимальной в опыте и была существенно выше по сравнению с Герман F1, СВ4097 F1, Артист F1, Гуннар F1 - на 1,6-3,0 %. Минимальную степень отмирания завязей мы наблюдали у огурца СВ 4097 F1 - 16,0 %.

Одной из важных хозяйственных характеристик овощной продук-ции является процент стандартных плодов в полученном урожае [5, 7]. Самый высокий выход стандартной продукции огурца мы получили при выращивании гибрида СВ 4097 F1, и показатель был существенно выше, чем у Герман F1, - на 3,9 %, Кураж F1 - на 10,7, Артист F1 - на 5,6, Гуннар F1 - на 8,4. Меньше всего стандартной продукции было получено при выращивании Кураж F1 - 73,4 %.

Изучаемые в опыте партенокарпические гибриды огурца имели высокую продуктивность. Максимальная урожайность огурца была по-лучена у гибрида СВ 4097 F1 - 15,4 кг/м2, что было существенно выше, чем у Герман F1, Кураж F1, Артист F1, Гуннар F1, - на 0,4-2,9 кг/м2. Урожайность огурца Гуннар F1 оказалась самой низкой в опыте и была существенно меньше, чем при выращивании других гибридов, - на 0,3-2,9 кг/м2.

Таким образом, сравнительная характеристика отечественных и зарубежных гибридов огурца позволяет рекомендовать для выращивания в защищенном грунте осенне-зимнего оборота шестой световой зоны СВ 4097 F1 и Герман F1, производство которых обеспечивает наибольшую урожайность.

Список литературы:

1. Влияние удобрений на структуру урожая огурца в защищенном грунте / М.В. Селива-нова, О.Ю. Лобанко-ва, В.В. Агеев, А.Н. Есаулко // Вестник АПК Ставрополья. - 2013. - № 1 (9). - С. 28-31.

2. Коваль, А. Особенности условий выращивания рассады партенокарпических гибридов огурца в условиях VI световой зоны/ А. Коваль, Н.А. Есаулко // В сб: Образование. Наука. Производ-ство - 2013, 77-я научно-практическая конференция. - 2013. - С. 69-70.

3. Повышение урожайности огурца в защищенном грунте / М.В. Селиванова, О.Ю. Лобан-кова, Е.С. Рома-ненко, Н.А. Есаулко, А.Ф. Нуднова, Е.А. Сосюра, Ю.С.Прудько //Ставрополь, 2015. - 112 с.

4. Селиванова, М.В. Влияние биологически активных веществ на урожайность и качество продукции огурца в условиях защищенного грунта/ М. И. Селиванова // Современные ресурсосбере-гающие инновационные технологии возделывания сельскохозяйственных культур в Северо-Кавказском федеральном округе: материалы 78-й науч.-практ. конф. 2014. С. 186-188.

5. Селиванова, М.В. Применение биологически активных веществ - один из факторов повышения продуктивности огурца гибрида Герман Р1/ М.В. Селиванова, О.Ю. Лобанкова // Совре-менные ресурсосберегающие инновационные технологии возделывания сельскохозяйственных куль-тур в Северо-Кавказском федеральном округе: сб. тр. Ставрополь. - 2012. - С. 76-78.

6. Селиванова, М.В. Эффективность применения удобрений ростостимулирующего дей-ствия в технологии выращивания огурца в защищенном грунте/ М.В. Селиванова, О.Ю. Лобанкова // Сб. науч. тр. Ставропольского научно-исследовательского института животноводства и кормопроиз-водства. Ставрополь. - 2012. - Т. 3. - № 1-1. - С. 172-174.

7. Учебный практикум по дисциплине «Плодоводство и овощеводство» / М.В. Селиванова, А.И. Чернов, Е.С. Романенко, Н.А. Есаулко, Е.А. Сосюра, А.Ф. Нуднова, Ю.С. Прудько // Ставрополь, 2015. - 124 с.

УДК 579.62

РАЗРАБОТКА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ДНК-ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ

Л.М. Кравченко, аспирантка, К.В. Кудин, м.н.с.,

UDC 579.62 DESIGN OF GENETIC CONSTRUCTION FOR DNA VACCINE AGAINST PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME

Kravchenko L.M., Kudin K.V., Prokulevich V.A., Govorovski V.V. Belarusian State University

В.А. Прокулевич, доктор биол. наук,

профессор,

В.В. Говоровский

Белорусский государственный университет

lidia_kracvhenko@tut.by

Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - это вирусное инфекционное заболевание, наносящее огромный экономический урон свиноводству по всему миру. Использование живых ослабленных и инактивированных вакцин не всегда успешно в борьбе с вирусом РРСС. В связи с этим надежды на повышение эффективности профилактики данного заболевания связывают с разработкой нового типа препаратов -ДНК-вакцин. В данной работе описано создание генетической конструкции, которая потенциально может стать основой для ДНК-вакцины против РРСС. Такая конструкция разработана на основе коммерческого плазмидного вектора pVAX1 и содержит нуклеотид-ные последовательности двух белков вируса РРСС, а также участок гена инвариантной цепи, кодирующий сигнал лизосомной локализации. Ключевые слова: репродуктив-но-респираторный синдром свиней, ДНК-вакцина, инвариантная цепь, МНС II

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a viral infectious disease causing enormous economic damage to swine industry worldwide. Live attenuated and inactivated vaccines are not always successful against PRRS virus. Therefore, hopes for more efficient prevention of this disease are associated with the development of new type of vaccines (DNA vaccines). Here we describe the creation of a genetic construct that could be potentially used as the basis for a DNA vaccine against PRRS virus. This construct is based on the commercial pVAXI plasmid vector and contains nucleotide acid sequences of the two proteins of the PRRS virus and region of the invariant chain gene encoding lysosomal localization signal.

Key words: porcine reproductive and respiratory syndrome, DNA vaccine, invariant chain, MHC II

Значительный экономический урон свиноводству по всему миру наносит репро-дуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС). Впервые РРСС был зарегистрирован в США в 1987 году, а позже случаи этого заболевания обнаружились и в Европе. Данное инфекционное заболевание вызывает одноцепочечный (+) РНК - вирус из семейства Arteriviri- dae. Вирусный геном размером около 15 кб содержит десять открытых рамок трансляции, которые кодируют четырнадцать неструктурных белков и восемь структурных. На основании генетических различий вирус РРСС разделен на два типа: европейский (тип 1) и североамериканский (тип 2). В организм животного вирус проникает через слизистые оболочки респираторного, пищеварительного или полового тракта и размножается в макрофагах в области ворот инфекции. Респираторные заболевания, нарушение репродукции, аборты, рождение мертвого потомства и высокая смертность молодняка являются клиническими проявлениями синдрома [4].

С целью снижения заболеваемости свиней репродуктивно-респираторным синдромом используются живые аттенуированные и инактивированные вакцины. Но

эффективность таких вакцин, особенно против некоторых штаммов вируса РРСС, остается низкой. В связи с этим большие надежды на увеличение эффективности профилактики данного синдрома связывают с разработкой ДНК-вакцин. Данные вакцины содержат плазмидный либо вирусный вектор, предназначенный для экспрессии клонируемых генов в эукариотических клетках, в который встраивается ген возбудителя инфекционного заболевания. При введении ДНК-вакцины в организм в цитоплазме клеток синтезируется белок патогена, который, в данном случае, выступает в качестве антигена и стимулирует иммунный ответ. Подобные вакцины обладают преимуществами по сравнению с вакцинами других типов, в частности, индуцируют клеточный и гуморальный иммунные ответы, активируют систему ин-терферонов, что способствует формированию длительного иммунитета. Также они могут использоваться без адъювантов, что удешевляет и упрощает производство профилактического препарата [2].

В данной статье описана разработка генетической конструкции, которая может стать основой для создания ДНК-вакцины против вируса РРСС. ДНК-вакцинная конструкция должна содержать вирусные гены, продукты которых будут активировать иммунный ответ. В связи с этим на начальных этапах работы необходимо было подобрать белки вируса РРСС, которые обладают наибольшей потенциальной имму-ногенностью. После анализа литературных данных были выбраны два белка патогена - М и GP5, консервативность и поверхностное расположение которых указывает на возможность их эффективного распознавания клетками иммунной системы. Гли-копротеин GP5 находится в оболочке вируса и ответственен за его прикрепление к клеткам-мишеням. Белок М - это наиболее консервативный белок из всех структурных вируса РРСС, который также участвует в формировании вирусной оболочки [3].

Исследования ДНК-вакцин показали, что добиться продукции антител только за счет синтеза вирусных белков достаточно сложно и не всегда удается. Запуск ан-тителозависимого иммунного ответа обеспечивается взаимодействием Т-лимфоци-тов с расположенными на поверхности антигенпредставляющих клеток молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC II, major histocompatibility complex), которые содержат фрагменты чужеродных белков. В связи с этим, для получения иммунного ответа с участием антител, необходимо повысить эффективность презентации кодируемых ДНК-вакциной антигенов белками MHC II. Это можно достигнуть путем направления чужеродных белков в лизосомы, так как взаимодействие антигенов с МНС II происходит в лизосомных компартментах клетки. Сами молекулы MHC II транспортируются в такие компартменты только в комплексе с инвариантной цепью (Ii). На N-концевой части белка Ii располагается сигнальная последовательность, которая способствует направлению пептидов в лизосомы [1]. Предполагается, что присоединение этой сигнальной последовательности к антигенам, кодируемым ДНК-вакциной, позволит обеспечить эффективное взаимодействие с белками МНС II, усилив тем самым их презентацию соответствующим имму-нокомпетентным клеткам.

В данном исследовании был разработан дизайн синтетической нуклеотидной последовательности, содержащей открытые рамки трансляции вируса РРСС, кодирующие белки М и GP5, перед которыми располагается участок гена инвариантной цепи, соответствующий сигнальной последовательности. Кроме того, к 5'-концу синтетического фрагмента присоединена последовательность Козак (ACCATGG), окружающая стартовый кодон и важная для инициации трансляции в клетках эукариот, а к З'-концу добавлен терминирующий кодон (TAG). Сконструированная последовательность размером 1323 пары оснований была синтезирована фирмой «Integrated DNA Technologies», США (рисунок).

Рисунок - Схема синтетической последовательности:

последовательность Козак (ACCATGG); старт-кодон (ATG); Ii - сигнал лизосом-ной локализации инвариантной цепи главного комплекса гистосовместимости класса II; M - мембранный белок вируса (522 п.о.); Gp5 - гликопротеин оболочки вируса (606 п.о.); стоп-кодон (TAG); Nhel, XhoI - сайты рестрикции, использованные для клонирования.

Полученная последовательность была клонирована в коммерческий плазмидный вектор pVAX1(«Thermo Fisher Scientific», США), предназначенный для экспрессии встраиваемых генов в клетках млекопитающих. Затем данным вектором трансформировали клетки E. coli XL-1 Blue, в которых происходила его наработка. Наличие нужной области в плазмидах, выделенных из трансформированных клеток бактерий, подтверждено с помощью ПЦР-анализа с использованием соответствующих праймеров. На электрофореграмме образцов после ПЦР были идентифицированы фрагменты ДНК размером около 1300 пар оснований, что соответствует размеру клонированной синтетической последовательности.

В результате проведенной работы был получен штамм E. coli XL-1 Blue, содержащий плазмидный вектор с нуклеотидной последовательностью, кодирующей два белка вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и сигнал лизосомной локализации. В ходе дальнейшей работы планируется оценить эффективность экспрессии целевых генов в составе ДНК-вакцинной конструкции на культуре клеток животных.

Список литературы:

1. Стародубова, Е. С. Встраивание сигнала направления в лизосомы инвариантной цепи изменяет деградацию обратной транскриптазы ВИЧ-1, повышая ее иммуногенность / Е. С. Стародубова, М. Г Исагулянц, Ю. В. Кузьменко, О. А. Кротова, В. Л. Карпов // Acta Naturae - 2014. - Т. 6. - № 1 (20). - 66-73.

2. Coban, C. Molecular and cellular mechanisms of DNA vaccines / C. Coban [et. al.] // Human Vaccines. - 2008. - № 4. - Р 453-456.

3. Li, J. Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes / J. Li, M. Murtaugh // Virology. - 2012. - V. 433. - P. 367-376.

4. Nam, H. Immune responses in mice vaccinated with virus-like particle composed of the GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / H. Nam [et. al.] // Arch Virol. - 2013. - V. 158(6). - P. 1275-1285.

УДК 579.6:663.18

ПРОБЛЕМЫ МАСШТАБИРОВАНИЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА КАПСИДА ЦВС-2

К.В. Кудин, магистр биол. наук В.А. Прокулевич, д-р биол. наук, про фессор

Белорусский Государственный Университет, биологический факультет

kiryl.kudin@gmail.com

UDC 579.6:663.18

SCALING ISSUES OF PRODUCTION OF THE RECOMBINANT PCV2 CAPSID PROTEIN

Kudin K.V/, Prokulevich V.A.

Belarusian State University, the faculty of

biology

Цирковирус свиней типа 2 является первичным этиологическим агентом цирковирусных болезней свиней и считается одним из наиболее экономически значимых патогенов в промышленном свиноводстве. В связи с

Porcine circovirus of type 2 is the primary etiological agent of porcine circovirus diseases and is considered to be one of the most significant pathogens in pork industry. Because of this, it has become an important object of studies aimed