Штамм A/chiken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц подтипа H5N2 Infuenza A virus рода Alphainfluenzavirus для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления антигенсодержащих диагностикумов
STRAIN A/CHIKEN/KOSTROMA/3175/17 H5N2 OF AVIAN INFLUENZA VIRUS SUBTYPE H5N2 INFUENZA A VIRUS OF GENUS ALPHAINFLUENZAVIRUS TO CONTROL ANTIGENIC AND IMMUNOGENIC ACTIVITY OF AVIAN INFLUENZA VACCINES AND FOR MAKING ANTIGEN-CONTAINING DIAGNOSTICUMS

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму Influenza A virus и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа А подтипа Н5, а также для изготовления антигенсодержащих диагностикумов, применяемых в вирусологических, молекулярно-генетических и серологических исследованиях.
Грипп птиц - это заболевание вирусной этиологии, которому подвержены различные виды птиц. Тяжесть болезни варьирует: от бессимптомной до острой генерализованной формы инфекции с высокой летальностью для домашней птицы [7, 8].
Вирус гриппа птиц (ВГП) (Influenza A virus) относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus [9].
Вирионы ВГП традиционно имеют округлую форму от сферической до плеоморфной, диаметром 80-120 нм. Вирусные частицы содержат: РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20% и углеводы - до 8%.
Геном вируса сформирован одноцепочечной негативной полярности (-) РНК, которая состоит из 8 сегментов и кодирует 11 белков вируса: внутренний белок нуклеопротеин (NP); белки полимеразного комплекса (РВ1, РВ2 и РА); матриксные белки (M1 и М2); неструктурные белки (NS1 и NS); поверхностные гликопротеины (гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA)). Общий размер генома составляет около 13600 нуклеотидов [7, 8, 15].
Поверхностные гликопротеины НА и NA несут в себе основные инвазивные функции вируса: прикрепление и проникновение генетического материала внутрь клетки. Согласно их строению, вирус гриппа А классифицируют на подтипы: на данный момент известно 18 подтипов по НА и 11 - по NA. Именно против указанных белков формируется антивирусный иммунитет.
Патогенность вируса определяют по показателю гибели цыплят при внутривенном заражении (тест IVPI) и по аминокислотному составу сайта нарезания гемагглютинина, в результате чего изоляты ВГП можно разделить на низкопатогенные и высокопатогенные, к последним относят только подтипы Н5 и Н7 [12].
В настоящее время эпизоотическая обстановка в мире по высокопатогенному гриппу остается напряженной. По данным Всемирной организации по охране здоровья животных в период 2017-2019 гг. случаи заболевания, вызванные вирусом гриппа А/Н5 и А/Н7, регистрировали среди домашних и диких птиц в 65 странах мира, за это время было зафиксировано более 300 вспышек и идентифицировано 10 подтипов вируса: H5N1, H5N2, H5N3, H5N5, H5N6, H5N8, H5N9, H7N1, H7N3, H7N9 [11].
Причиной такого глобального распространения вируса предположительно являются дикие перелетные водоплавающие птицы, многие из которых не восприимчивы к высокопатогенным формам гриппа птиц, однако, являются переносчиками данного заболевания. Поэтому занос вируса в неадаптированные популяции сельскохозяйственных птиц приводит к тяжелым эпизоотиям с колоссальным экономическим ущербом [7, 8, 15].
В мире вспышки высокопатогенной формы ВГП A/H5N2 нотиифицированы, начиная с 2011 г. в Южной Африке. С 2012 г. по настоящее время данный патоген является эндемичным для территорий КНР. [11].
В конце 2014 г. высокопатогенный грипп A/H5N2 получил распространение в странах Северной Америки (США и Канада). Выделенные при вспышках изоляты представляли собой реассортантный вариант ВГП, появившийся в результате обмена сегментами между высокопатогенным (предположительно H5N8) и низкопатогенным подтипами вируса [10]. В 2015-2017 гг. в Европе в птицехозяйствах Франции также отмечены случаи заболевания, вызванные ВГП A/H5N2. В 2019 г. вновь стало известно о появлении указанного патогена среди домашних птиц в Южной Африке (Египет) [11].
Данная проблема обозначилась впервые в России в 2017 г.: изолят A/H5N2, был выявлен при вспышке острой инфекции в крупном птицеводческом комплексе (около 500 тыс. голов) в Костромской области.
Известен ряд зарубежных штаммов ВГП A/H5N2, выделенных на территории Северной Америка в 80-90 гг. прошлого века, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов:
- A/Chicken/Mexico/232/94/CPA;
- A/chicken/Queretaro/14588-19/95;
- A/chicken/Mexico/31381-7/94;
- A/turkey/Minnesota/10734-5/95;
- A/chicken/Puebla/28159-474/95;
- A/chicken/Chiapas/28159-488/95;
- A/turkey/Minnesota/3689-1551/81 [13,14, 16].
Известен штамм А/утка кряква/Пенсильвания/10218/84 H5N2, используемый в исследованиях по изучению преодоления вирусом межвидового барьера от птиц к млекопитающим путем проведения серии пассажей исходного вируса через легкие белых мышей. На изобретение получен патент (правообладатель РФ) «Штамм вируса гриппа A/H5N2/TKB №2340 птиц для моделирования гриппозной инфекции» [1].
Все вышеуказанные штаммы являются низкопатогенными и были выделены более 25 лет назад на территориях географически отдаленных от России, поэтому актуальности для нашей страны в настоящее время не представляют.
Известен ряд отечественных штаммов высокопатогенного вируса гриппа птиц А/Н5:
- штамм №125-ДЕП H5N1 «Новосибирский», используемый для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц [3];
- штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 H5N1, используемый для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток [2];
- штамм A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 H5N1, используемый для изучения биологии вируса гриппа, а также эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа [4];
- штамм A/common gull/Chany/2006 H5N1, используемый для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата [5];
- штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8, используемый для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5 [6].
Недостатком ранее представленных изобретений на штаммы вируса гриппа птиц А/Н5 является то, что в настоящее время указанные патогены не охватывают в полной мере биологического разнообразия изолятов вируса гриппа, выявленных на территории России, что крайне актуально для совершенствования методов диагностики и профилактики гриппа птиц в стране.
Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала современных штаммов вируса гриппа А/Н5, обладающих высокой инфекционной и антигенной активностью, необходимой для тестирования протективных свойств вакцин в отношении циркулирующих штаммов, а также для изготовления биопрепаратов, повышающих качество методов диагностики высокопатогенного гриппа птиц.
Указанная задача решена получением вновь выделенного на территории России штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2, обладающего уникальными генетическими характеристиками и используемого для контроля иммуногенной активности вакцин и изготовления антигенсодержащих биопрепаратов для диагностики гриппа A/H5N2.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 был выделен из патологического материала от курицы, который поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 18.12.17 г. из ЗАО «Птицефабрика Костромская» Костромского района Костромской области.
Штамм способен размножаться в 10-суточных СПФ-эмбрионах кур (СПФ-КЭ) без предварительной адаптации и вызывать гибель эмбрионов в течение 24-48 ч инкубации. Вирусный препарат штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц в виде экстраэмбриональной суспензии получен после двух пассажей в СПФ-КЭ.
Экспериментально доказано, что штамм имеет оптимальные биотехнологические свойства (высокая антигенная и инфекционная активность; стабильные ростовые показатели после 4 последовательных пассажей в СПФ-КЭ) и обладает уникальными генетическими характеристиками, что предполагает его использование для изготовления диагностических антигенов и сывороток, для тестирования иммуногенности вакцин, а также для изучения биоразнообразия вируса гриппа.
Штамм A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц, депонирован 30 марта 2018 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным наименованием «Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 (диагностический - Д)».
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 с эпизоотическими и вакцинными штаммами (дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей участка гена гемагглютинина Н5 848-1105 н.п.).
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
SEQ ID NO: 1 - последовательность нуклеотидов фрагмента гена гемагглютинина (258 н.п.) штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2.
SEQ ID NO: 2 - последовательность аминокислот фрагмента гемагглютинина (86 а.к.) штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2.
Штамм A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологическая характеристика
Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа грипп А.
Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 100 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.
Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.
Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 и.о.; №2 - чуть менее 2350 и.о.; №3, как правило, - 2250 и.о.; №4 - 1780 и.о.; №5 - 1575 и.о.; №6 - 1420 и.о.; №7 - 1050 и.о.; №8 - 900 н.о.
На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся повторяющиеся отрезки, причем повторы 5'-концевого участка (у вирусов грипп А они имеют вид 5'-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3'-конце. Кроме того, 3'-концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [9].
Антигенные свойства
Антигенная вариабельность вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков - НА и NA.
Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 имеет антигенную формулу H5N2. Подтип H5N2 идентифицирован методами ПЦР, нуклеотидного секвенирования, РТГА (реакция торможения гемагглютинации) и РТНА (реакция торможения нейраминидазной активности) [12].
Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Гемагглютинирующая активность штамма составляет 1:32 и подавляется специфической сывороткой к ВГП A/H5N1 («IZSVe», Италия).
Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к ВГП A/H6N2 («IZSVe», Италия).
Гено- и хемотаксономическая характеристики
6
Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 250×10 Д.
Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности в виде 8 нитей (сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеином (NP).
Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 100 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°C), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.
После лиофильного высушивания штамм не теряет антигенной и инфекционной активности, и имеет стабильные ростовые показатели после 3 последовательных пассажей в СПФ-КЭ.
Дополнительные признаки и свойства
Патогенность - выражена для птиц: структура сайта расщепления НА содержит основные аминокислоты и имеет структуру REKRRKR (Arg Glu Lys Arg Arg Lys Arg), характерную для высокопатогенных форм гриппа.
Вирулентность - высокая: индекс внутривенного заражения цыплят (IVPI) равен 3 [12].
Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.
Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Определение подтиповой антигенной характеристики штамма проводили в РТГА с референтными сыворотками против ВГП подтипов H1-H16 по гемагглютинину и в РТНА с референтными сыворотками против ВГП подтипов N1-N9 по нейраминидазе. Образцы вирусной суспензии исследовали предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) для определения гемагглютинирующей активности вируса. Активность штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 в РГА составила 1:32. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку крови кур («IZSVe», Италия).
2
В РТГА гемагглютинирующая активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к ВГП A/H5N1 («IZSVe», Италия). Титр сыворотки составил 1:128 (7 log). В РТНА нейраминидазная активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к ВГП A/H6N2 («IZSVe», Италия). Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Согласно проведенным исследованиям, штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 был отнесен к вирусу гриппа птиц подтипа H5N2.
Пример 2
Для выявления генома ВГП из проб тканей птиц и экстраэмбриональной жидкости зараженных эмбрионов кур выделяли общую РНК, которую использовали для реакций полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Первичную индикацию гена М проводили, используя праймеры AIVM49F и AIVM941R.
Для подтверждения отсутствия в суспензии экстраэмбриональной жидкости штамма контаминации геномами вирусами болезни Ньюкасла, инфекционного бронхита кур, инфекционной бурсальной болезни, синдрома снижения яйценоскости, инфекционного ларинготрахеита птиц, реовирусом птиц, а также микоплазмами синовиа и галлисептикум применяли методы ПЦР и ОТ-ПЦР.
В результате испытаний было доказано, что штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 не контаминирован посторонними вирусами и микоплазмами и содержит в своем составе только геном вируса гриппа А подтипа Н5.
Пример 3
Исследования основывались на определении первичной структуры фрагмента гена НА испытуемого образца штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами ВГП подтипа H5N2.
После амплификации ДНК, полученной с применением указанных выше праймеров, в результате секвенирования была определена нуклеотидная (258 н. о.) и аминокислотная (86 а. о.) последовательности фрагмента гена НА штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2.
Сайт расщепления НА штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 содержал основные аминокислоты и имел структуру REKRRKR, характерную для высоковирулентных форм вируса.
При проведении сравнительного анализа нуклеотидной последовательности было установлено, что исследуемый изолят принадлежит к азиатской генетической линии вируса высокопатогенного гриппа птиц (линия A/Goose/Guangdong/96, клада 2.3.4.4).
Филогенетический анализ показал (Фиг. 1), что по фрагменту гена НА для штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 наиболее близкородственными являются выделенные в ряде субъектов Российской федерации, Египте, Южной Корее, Бельгии и Чехии в 2016-2017 гг. вирус гриппа птиц A/H5N8, а также вирусы подтипов H5N2, H5N6 и H5N8, выделенные на территории стран Юго-Восточной Азии в 2012-2014 гг. (98-99,5% сходства).
Таким образом, на основании молекулярно-биологических и филогенетических исследований установили, что штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 является потенциально высокопатогенным для птиц и относится к кладе 2.3.4.4. азиатской генетической линии (A/Goose/Guangdong/96).
Пример 4
3
Для оценки вирулентности штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц использовали метод определения индекса патогенности при внутривенном заражении 6-недельных цыплят (IVPI), рекомендованный Всемирной организацией охраны здоровья животных [12]. Вирусную суспензию штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 в разведении 1:10 на стерильном физиологическом растворе вводили внутривенно десяти 6-недельным цыплятам в дозе 0,1 см. За птицами вели ежедневное наблюдение в течение 10 суток и учитывали клиническое состояние каждой птицы при помощи коэффициента: 0 - птица клинически здорова; 1 - больная (отмечены некоторые признаки заболевания, такие, как угнетение, отказ от корма и воды, цианоз кожи или ее производных, нарушения со стороны респираторного или пищеварительного тракта, нервные явления); 2 - тяжелобольная (одновременно наблюдаются несколько ярких клинических признаков инфекции); 3 - птица погибла. Индекс патогенности вычисляли по формуле:
i
где Б - количество больных в сутки
i
ТБ - количество тяжелобольных в сутки г;
i
П  - количество погибших в сутки i;
N - общее количество птиц в эксперименте.
Через 1 сутки эксперимента погибли все зараженные птицы, что позволило сделать заключение об остром течении болезни. Результаты наблюдений за клиническим состоянием птиц и значение индекса патогенности представлены в таблице 3. Штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2, имел максимальное значение индекса патогенности 3,0, поэтому изучаемый вирус идентифицировали как высоковирулентный (индекс патогенности 1,2 и более) [12].
Пример 5
-1
-10
3
3
3
50
Инфекционную активность штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 определяли путем титрования в СПФ-КЭ. Готовили ряд 10-кратных последовательных разведений (от 10 до 10). Каждое разведение вируса инокулировали в аллантоисную полость четырем 9-11-суточным СПФ-КЭ в объеме 0,2 см. Четырем эмбрионам контрольной группы вводили ФБР тем же способом в объеме 0,2 см. Специфичность гибели подтверждали в РГА, исследуя экстраэмриональную жидкость от каждого зараженного эмбриона. Титр вируса в депонируемом образце определяли по методу Кербера и выражали в единицах ЭИД/см (таблица 4).
50
3
Таким образом, инфекционная активность штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 при 2-кратном титровании в СПФ-КЭ составила 8,38±0,12 lg ЭИД/см.
Пример 6
Стабильность штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 определяли путем репродукции лиофилизированного и восстановленного вируса в течение двух последовательных пассажей в 9-11-суточных СПФ-КЭ, определяя инфекционную активность каждого пассажа вируса в 2-кратной повторности в той же биосистеме. Методология подробно описана в примере 5. Титр вируса рассчитывали по методу Кербера (таблица 5).
50
3
На основании полученных данных установили, что показатель инфекционной активности штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 после лиофилизации в течение двух последовательных пассажей в 9-11-суточных СПФ-КЭ не снижался менее 8,25 lg ЭИД/см, что подтверждает его стабильность при репродукции в указанной биосистеме.
Пример 7
3
Получение ангенсодержащего препарата для диагностических целей. Вирусную суспензию штамма A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 инактивировали бета-пропиолактоном (БПЛ) в конечной концентрации 0,05%. Для инактивации вируса использовали 10%-ный рабочий раствор БПЛ, приготовленный на стерильной деминерализованной воде. Рабочий раствор БПЛ готовили непосредственно перед инактивацией и вносили в сосуд с вирусосодержащей жидкостью. Каждый сосуд с полученной смесью после осторожного перемешивания (без образования пены) инкубировали на шейкере при температуре (37±2)°C в течение 1 ч. Затем суспензию оставляли на ночь в холодильной камере при (4±2)°C. После этого из сосуда отбирали пробу сырья в объеме 2 см для определения полноты инактивации вируса, а вирусный материал хранили при температуре (4±2)°C до завершения контроля.
Полноту инактивации оценивали путем проведения двух последовательных пассажей в СПФ-КЭ. При тестировании экстраэмбриональной жидкости в РГА наблюдали отсутствие гемагглютинирующей активности.
Затем оценивали качество полученного инактивированного препарата в РГА, РТГА, РТНА и ОТ-ПЦР. Установили, что гемагглютинирующая активность штамма ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 не изменилась и составили 32 ГАЕ. С помощью РТГА и РТНА определили антигенную формулу исследуемого инактивированного препарата штамма ВГП H5N2. В реакции ОТ-ПЦР подтвердили наличие генома ВГП А/Н5 в образце. Все проведенные тесты позволили сделать заключение, что штамм ВГП A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 полностью инактивируется БПЛ в конечной концентрации 0,05%, при этом не теряет своей антигенной и гемагглютинирующей активности, поэтому является пригодным для изготовления антигенсодержащих диагностических препаратов.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм A/chicken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц подтипа H5N2 Influenza A virus, рода Alphainfluenzavirus для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления антигенсодержащих диагностикумов».
1. Пат. РФ №2163637; C12N 15/44, 7/00, C07K 14/11, A61K 39/145; 27.02.2001.
2. Пат. РФ 2309983; C12N 7/00; 27.05.2007 г.
3. Пат. РФ №2323740; A61K 39/145, C12N 7/00; 05.10.2008.
4. Пат. РФ 2366709; C12N 7/00; 10.09.2009 г.
5. Пат. РФ 2400536; C12N 7/00; 27.09.2010 г.
6. Пат. РФ 2647566; C12N 7/00, A61K 39/145, C12N 2760/16121; 16.03.2018.
7. Руководство по вирусологии. Вирусы и вирусные инфекции человека и животных / ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России; ред. Д.К. Львов. - М.: Мед. информ. агентство, 2013. - 1197 с.
8. A review of H5Nx avian influenza viruses Ivette A. Nunez and Ted M. Ross, Therapeutic Advances in Vaccines and Immunotherapy 2019, Vol. 7: 1-15.
9. ICTV 2018b EC 50, Washington, DC, July 2018; Email ratification February 2019 (MSL #34) https://talk.ictvonline.Org//taxonomy/p/taxonomy-history7taxnode_id=201853956
10. Infectivity, transmission and pathogenicity of H5 highly pathogenic avian influenza clade 2.3.4.4 (H5N8 and H5N2) United States index viruses in Pekin ducks and Chinese geese / M.J. Pantin-Jackwood, M. Costa-Hurtado, K. Bertran [et al.] // J. Vet. Research. - 2017. - P. 1-14.
11. OIE. Animal Health in the Word. Avian Influenza Portal. - URL: http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/update-on-avian-influenza/
12. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Chapter 2.3.4. Avian influenza (infection with avian influenza viruses) (NB: Version adopted in May 2015). - URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.03.04_AI.pdf
13. Swayne D.E., Beck J.R., Garcia M. et. al. Influents of virus strain and antigen mass on efficacy of H5 avian influenza inactivated vaccines. - Avian Pathol., 1999, 28, 245-255.
14. Swayne D.E., Beck J.R., Perdue M.L. et. al. Efficacy of vaccines in Chickens against Highly Pathogenic Hong Kong H5N1 Avian Influenza. - Avian Dis., 2001, 45, N2, 355-365.
15. Swayne, D.E. Influenza / D.E. Swayne, D.A. Halvorson // Diseases of Poultry / ed. Y.M. Saif [et al.]. - 12th ed. - Ames, IA, 2008. - Chap.6. - P. 153-184.
16. Van der Goot J A, van Boven M, de Jong MC, Koch G. / Effect of vaccination on transmission of HPAI H5N1: the effect of a single vaccination dose on transmission of highly pathogenic avian influenza H5N1 in Peking ducks // Avian Dis. 2007 Mar; 51(l Suppl):323-4.