Особенности исследования морфологии аномальных форм эритроцитов методами атомно-силовой микроскопии

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №3, 2015

УДК 612. Селимов М. A. [Selimov М. А.],

111.45 [53-57] Демченков Е. J1. [Demchenkov Е. I__],

Нагдалян A. A. [Nagdalian А. А.], Гатина Ю. С. [Gatina Y.S.]

ОСОБЕННОСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОЛОГИИ АНОМАЛЬНЫХ ФОРМ ЭРИТРОЦИТОВ МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ*

Features morphology abnormal forms of erythrocytes by atomic force microscopy

Изучалась возможность применения атомно-силовой микроскопии (ACM) для качественной оценки морфологии и визуализации аномальных форм красных кровяных телец (эритроцитов), в сравнении с традиционными методами оптической микроскопии. Проведено сопоставление методов пробоподготовки, предложенных другими авторами в ранее проведенных исследованиях, выбран оптимальный, не оказывающий существенного влияния на изменение морфологических особенностей клетки, метод. Воздействием на эритроциты солями тяжелых металлов получены формы эритроцитов, отличающиеся от физиологически нормальной. Установлено, что атомно-силовая микроскопия является важным инструментом, позволяющим визуализировать морфологию аномальных форм клеток крови, а при использовании программных инструментов (Nova РХ) возможно получение более полной картины размерных характеристик и параметров эритроцитов. Показана возможность применения атомно-силовой микроскопии в исследованиях морфологии и визуализации аномальных форм эритроцитов.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, красные кровяные тельца, размеры и морфология эритроцитов, соли тяжелых металлов.

Annotation The possibility of using atomic force microscopy (AFM) to qualitatively assess the morphology and the visualization of abnormal forms of red blood cells (RBCs), in comparison with traditional methods of optical microscopy, was studied in this article. The analysis of sample preparation methods of another authors showed what kind of methods are better and more useful. Based on that analysis, the authors chose optimal method without significant effect on morphological features of cells. The authors identified abnormal forms of the red blood cells under heavy metals salts effect. It was established that atomic force microscopy is an important tool for visualization the morphology of abnormal forms of red blood cells. The authors concluded that usage of software tools (Nova FX) provides researches by complete pictures of the dimensional characteristics and parameters of red blood cells.

Keywords: atomic force microscopy, red blood cells, the size and morphology of the red blood cells, salts of heavy metals.

* Исследования частично проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/216).

Введение.

Атомно-силовая микроскопия вид зондовой микроскопии, в основе работы которой лежит силовое взаимодействие между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль с острым зондом на конце. Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли, которая перемещаясь относительно поверхности и реагируя на силовое взаимодействие, регистрирует ее рельеф [8].

В настоящее время атомно-силовая микроскопия активно используется для изучения структурных особенностей биологических макромолекул (белков, ДНК), поскольку позволяет получать изображения с разрешением в несколько нанометров. Наряду с исследованием сухих образцов, АСМ позволяет исследовать молекулы и в буферных растворах. Для получения изображений методом АСМ, исследуемые объекты должны быть зафиксированы на какой-либо поверхности. При исследовании биологических объектов в качестве подложки обычно используется: кристаллическая слюда, стекло, сапфировые пластины и т.д. В большинстве случаев используются слюда, поскольку она имеет ато-марно-гладку ю поверхность [7].

На сегодняшний день АСМ становится одним из самых перспективных методов изучения структурных особенностей макромолекул, поскольку позволяет получать изображения объектов с высоким разрешением, сопоставимым с уровнем рентгеноструктурного анализа, в условиях, при которых макромолекулы не подвергаются жесткой обработке и проявляют свою природную активность. Кроме того, атомно-силовая микроскопия дает возможность не только визуализировать объекты на молекулярном уровне, но и изучать свойства индивидуальных макромолекул: распределение поверхностных зарядов, подвижность отдельных участков, конформационные изменения в зависимости от условий, силу специфического взаимодействия между молекулами. С помощью атомно силовой микроскопии можно наблюдать в реальном времени за сборкой макромолекулярных комплексов, распределением белков на поверхности клетки, особенностями внутриклеточного транспорта макромолекул [4].

Так, в последнее время наиболее интересные и полные экспериментальные данные о структуре эритроцита и строении цитоскелета были получены методами атомно-силовой микроскопии (АСМ). [3, 12]

В работе Нагорнова Ю.С. [9] так же связанной с атомно-силовой микроскопией, был проведен расчет объема эритроцита по данным измерения полученного скана поверхности мембраны, а затем произведен разрез скана эритроцита по диагонали с целью измерения его высотных геометрических характеристик.

АСМ визуализирует микрообъекты с высоким пространственным разрешением и позволяет проводить локальные микромеханические испытания. В работах [11, 13], авторами было показано, что АСМ, являясь современным нанотехнологическим инструментом для измерения локальной упругости мембран клеток, может быть использована для определения модуля Юнга и поверхностного потенциала эритроцитов, эрит-роцитсодержащих сред и других компонентов крови. В ходе другого исследования было выявлено статистически значимое сопряженное повышение значений модуля Юнга и поверхностного потенциала красных кровяных телец, сопровождающееся изменением их формы до эхиноцитов и сфероэхиноцитов после длительного хранения эритроцитсодержащих сред в течение 35 суток при стандартных температурных условиях +4 °С [5].

В работе [6] были рассмотрены три способа подготовки эритроцитов для исследования методами АСМ: без фиксации клеток и с фиксацией в растворах глута-рового альдегида с концентрациями 0,5 и 2,5 %, с целью выявления наиболее подходящего для получения качественных АСМ-изображений клеток крови.

Использование таких методов визуализации биологических объектов, как оптическая и электронная

микроскопия, позволяющих построить 2-мерное изображение объекта, оценить его длину и ширину, не могут в должной мере обеспечить достоверной информацией о параметрах исследуемого образца, в том числе его размерных характеристик, включая особенности рельефа и топографии поверхности. Еще одним минусом таких методов микроскопии можно считать процесс пробоподготовки образцов, который порой требует проведения целой серии манипуляций, обработки образцов контрастирующими агентами или напыления металлических частиц на поверхность исследуемого образца, что в конечном итоге может сказаться на достоверности результатов исследования.

Целью данной работы было рассмотрение возможности исследования особенностей морфологии, а так же визуализация размерных характеристик аномальных форм эритроцитов методами атомно-силовой микроскопии, которая, с одной стороны позволяет минимизировать процедуру пробоподготовки самого образца, а с другой - получить более наглядную картину особенностей рельефа и топографии поверхности. В задачи данного исследования входило:

— смоделировать объект исследования, а именно аномальную форму эритроцита, путем обработки взвеси из красных кровяных телец солями тяжелых металлов;

— визуализировать полученные эритроциты;

— сравнить сканы с изображениями, полученными с помощью оптического микроскопа;

— провести измерение морфологических особенностей аномальных форм клеток.

Материал и методы.

Для проведения эксперимента использовали эритроциты крыс линии Ш$&/г. Из множества вариантов нанесения эритроцитов на подложку - простой мазок, сдувание капли суспензии эритроцитов струей воздуха, создание монослоя путем центрифугирования, различные варианты осаждения эритроцитов из суспензии, был выбран последний. Поскольку данный метод подготовки образцов не оказывает существенного влияния на изменение формы эритроцитов [2]. Образцы были подготов-

лены путем осаждения из суспензии на покровные стекла, которые предварительно обработали 1 % глутаровым альдегидом. В проведенных исследованиях по созданию раствора для фиксации эритроцитов оптимальным было применение 2,5 % глутарового альдегида, приготовленного на 20 мМ Hepes буфере и растворе Рингера-Локка. Глутаровый альдегид снижает рН и оказывает существенное воздействие на эритроциты. Действие альдегидов сводится к образованию связей между молекулами клеточных мембран и мембран органелл, в прочную единую сеть за счет «сшивания», в основном, клеточных белков [10]. При данном методе фиксации клетка не распластывается по подложке и значения ее макро морфометрических параметров максимально приближены к значениям нативных эритроцитов (высота клетки, глубина центральной впадины). Однако, при получении изображений большей разрешающей способности отмечается сглаженность рельефа поверхности мембраны и оценить мембранные наноструктуры при данном способе фиксации не представляется возможным [1].

Подготовка препаратов для АСМ-сканирования.

Сухие препараты эритроцитов готовились из 50 мкл эритроцитов с 1950 мкл раствора 10 мкг/л CdCl2, Далее пробы были выдержаны в шейкер-термостате продолжительностью 1 час при скорости 300 об/мин и температуре 37 °С, после чего образцы были подвергнуты центрифугированию. По окончанию центрифугирования инкубационная среда была слита, и к образцам доливалось по 1мл фиксирующего раствора. Полученный состав наносили на покровное стекло и равномерно распределяли по поверхности. Препарат высушивали на воздухе в течении 20 мин. при комнатной температуре, после чего подвергали сканированию на АСМ. По такому же принципу, но без использования CdCl2 был подготовлен и контрольный образец.

Атомно-силовая микроскопия.

Сканирование проводилось с помощью атомно-силово-го микроскопа фирмы «NT-MDT» (г Зеленоград, Россия), модель «Ntegra Life». Для работы использовали кантилеверы модели HA_NC (Etalon) сторона В. Радиус закругления < 10 нм, длина балки 124 мкм. Обработка и подсчет данных производились с помощью специализированного программного обеспечения «Nova». Сканирование производилось в полуконтактном режиме при генерируемой частоте 153 кГц. Сканируемая площадь контрольного образца составила 6,2 х 6,2 мкм, а обработанного CdCl2 8,6 х 8,6 мкм.

На препарате, из равномерно распределенных по поверхности объектов, в случайном порядке выбирался эритроцит, на поверхности, которого явно выделялись несвойственные для физиологически нормальных форм образования. Полученные данные обрабатывались с использованием прилагаемой к микроскопу компьютерной программы «NovaPX» для построения горизонтального и вертикального профиля поверхности эритроцита.

Результаты и обсуждение.

В результате АСМ-сканирования поверхности покровного стекла исследуемого образца с зафиксированными эритроцитами получены изображения красных кровяных телец, форма, морфологические особенности и размеры которых имели несвойственную эритроцитам форму Физиологические аномалии в исследуемых образцах вероятнее всего обусловлено взаимодействием солей тяжелых металлов с мембранами клеток. Для сравнения с нормальной формой, опытные образцы при оптической и атомно-силовой микроскопии сопоставлялись с контрольными образцами.

На полученном с помощью оптического микроскопа изображении (рис. 1 а) представлена группа красных кровяных телец, которые имеют явные отклонения по форме от физиологически нормальных клеток. На поверхности клеток хорошо заметны «контрастные» области, которые представляют собой места с аномальной морфологией. В другой части рисунка (рис. 16) можно наблюдать эритроциты, имеющие физиологи-

Рис. 1. Красные кровяные тельца (эритроциты) под оптическим

микроскопом. а)поврежденные формы клеток; б)контроль-ный образец.

чески нормальную форму, которые так же получены с помощью оптической микроскопии. Данные эритроциты были идентифицированы в контрольных образах. С помощью оптической микроскопии достоверно визуализировать размерные параметры мест с аномальной морфологией не представляется возможным. На рисунке 1 представлен тот же образец, который впоследствии подвергался сканированию с помощью атомно-силовой микроскопии.

rs~iсвг=' •«— • оаива

а) 3с1 изображение единичных клеток нормальной и аномальной формы эритроцита;

б) 2-мерное изображение нормальной и аномальной клетки;

в) график сечения нормальной и аномальной клетки;

Рис. 2.

Изображение клетки эритроцита аномальной формы, полученное с помощью АСМ (отсканированная на воздухе).

При АСМ сканировании образцов для сравнения было получено 3-х мерное изображение единичного эритроцита нормальной и аномальной форм (рис. 2а). На изображении поврежденного эритроцита в районе впадины отчетливо наблюдается наличие «сросшихся выростов» холмистой формы, резко контрастирующих по отношению к поверхности образца. Возможность построения 3-мерной картины изображения позволяет отчетливо наблюдать форму и параметры несвойственных нормальной форме эритроцитов образований. На

2-мерном изображении эритроцитов (рис. 26) можно выявить незначительную разницу в диаметре представленных единичных клеток, что, скорее всего так же обусловлено повреждающим действием солей тяжелых металлов.

Пакет прикладных программ (NovaPX), позволяет оценить размеры, форму и характер изменений происходящих с клеткой под воздействием солей тяжелых металлов. На рисунке 2в представлен график сечения, характеризующий особенности изменений в морфологии клетки.

В рамках исследования единичной аномальной формы клетки, были построены вертикальный и горизонтальный профили сечения изучаемого объекта, на которых наглядно отображены форма, размер и высота аномальной клетки крови (рис. 3-4).

По данным атомно-силовой микроскопии (рис.

3-4) можно определить не только размеры объекта, но и размеры входящих в состав или состоящих во взаимодействии с исследуемым образцом компонентов. Так, ширина (диаметр) исследуемого образца эритроцита находится в пределах 6-6,5 мкм, а высота данной аномальной формы клетки крови составляет около 1,5 мкм. Отчетливо видны очертания объема самой клетки, а так

Рис. 3. АСМ изображение эритроцита: а) 2D изображение с про-

екцией вертикального профиля сечения; б) графическое изображение вертикального профиля сечения.

Рис. 4.

АСМ изображение эритроцита: а) 2D изображение с проекцией горизонтального профиля сечения; б) графическое изображение горизонтального профиля сечения.

же форма и расположение «выроста» в центральной части впадины эритроцита.

Поскольку традиционно используемые методы визуализации исследуемых объектов в микрометровом диапазоне (преимущественно оптическая микроскопия) не могут достаточно точно охарактеризовать его морфологические и параметрические характеристики, можно предположить перспективность использования в исследованиях биологических объектов малой величины методов атомно-силовой микроскопии.

Заключение.

Так, по результатам работы показано, что на основе простых способов пробоподготовки можно получать АСМ-изображе-ния отдельных объектов с детализацией морфологических параметров и использовать их для качественной оценки морфофункциональной активности этих клеток. Изучение особенностей изменения морфологии поверхности эритроцитов, проводили с помощью АСМ, а результаты противопоставляли данным полученным на основе оптической микроскопии. В данной работе впервые проведено исследование и сопоставление особенностей морфологии поверхности красных кровяных телец (эритроцитов) физиологически нормальной и деформированной взаимодействием с солями кадмия.

В рамках работы были получены поврежденные (аномальные) красные клетки крови, путем обработки отмытых эритроцитов солями тяжелых металлов (CdCL). Проведено сопоставление полученных на оптическом микроскопе изображений со сканами АСМ. При исследовании поврежденных эритроцитов с помощью атом-но-силового микроскопа было проведено параллельное измерение контрольного образца, с целью сравнения их

морфометрических особенностей, как в 3с1 версии, так и при построении графика по профилю сечения.

Необходимо учитывать, что некоторые размерные характеристики могут отличаться от эталонных значений, и в большую, и в меньшую сторону, как по причине того, что исследуемый образец был подвергнут воздействию солями тяжелых металлов и имеет аномальную форму, так и по причине возможных погрешностей связанных с пробоподготовкой. Но сам факт возможности изучить объект и визуализировать несвойственные ему изменения формы и объема, по сравнению с методами оптической микроскопии не может вызывать никаких сомнений.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Белоусова, О.Д, Толмачев И.А., Гайдаш A.A., Левичев В.В., Жуков M.B., Белоусов И.С. Особенности подготовки проб крови для исследования морфологических параметров и структуры мембран эритроцитов методом атомно-силовой микроскопии [Электронный ресурс] // Биомедицинский журнал Medline.ru. Судебная медицина. Т. 13. С. 954-966, 2012. Режим доступа: http://ns.deltakon.ru/public/art/tom13/art80.html (дата обращения 08 сентября 2015г.).

2. Демченков Е, П., Будкевич P.O. Особенности фиксации эритроцитов для атомно-силовой микроскопии // Материалы V съезда Биофизиков России (г. Ростов-на-Дону, 4-10 октября 2015 г.). г. Ростов-на-Дону. 2015: Издательство южного федерального университета. С. 186.

3. Дрозд Е.С., Чижик С.А., Константинова Е.Э. Атомно-силовая микроскопия структурно-механических свойств мембран эритроцитов // Российский журнал биомеханики. Т. 13. 2009. №4 (46). С. 22-30.

4. Кусельман Ю.Н., Басырова В.В., Светухин Б.В., Костишко Ю.С., Нагорнов И.Ю., Матвеева М.М., Джанджгава А.И. // Нанотехно-логии в педиатрии: перспективы использования атомно-сило-вой микроскопии для диагностики / Вопросы диагностики в педиатрии. Т. 2. 2010. № 1. С. 5-8.

5. Ламзин И. М., Харуллин Р. М. Исследование изменений биофизических свойств эритроцитов при хранении в эритроцитсодер-жащих средах с помощью атомно-силовой микроскопии // Саратовский научно-медицинский журнал. 2014 №10(1). С. 44-48.

6. Лобов И.А., Давлеткильдеев Н.А/ Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии // Вестник Омского университета. №2. 2013 С. 129-132.

7. Малюченко Н.В., Тоневицкий А.Г, Савватеев М.Н. // Биофизика. Т. 48. Вып. 5, 2003. С. 830-836.

8. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии: учеб. пособие / Миронов В. Л. - Н. Новгород. 2004 г. - 114 с.

9. Нагорнов Ю.С., Богомолов A.C., Аксенова Е.А., Анохина T.B., Корнеева С.А., Зотова М.А., Наумов В.В., Смирнова Т.Г., Наседкина A.A., Сокурова A.M., Юлдашев A.B. // Вычисление объема эритроцитов при анализе данных Атомно-силовой микроскопии /Fundamental research №1, 2013. С. 181-184.

10. Савченко С. В., Степанищев И. В., Кузнецов Е. В. Эффективность использования метода фиксации при заборе органов и тканей для электронного микроскопического исследования [Электронный ресурс]//Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Электронный судебно-медицинский журнал. Новосибирск, 2009. http://journal.forens-lit.ru/node/156 (дата обращения 20 октября 2015 г.).

11. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Забиняков H.A., Сладкова Е.А. Методика оценки морфометрических параметров нативных клеток крови с использованием атомно-силовой микроскопии // Бюлл. экспер. биол. и мед. Т. 150. 2010. №8. С. 238-240.

12. Dulinska I,, Targosz M. et al. Stiffness of normal and pathological erythrocytes studied by means of atomic force microscopy // J. Biochem Biophys Methods, 2006 Mar. 1-11.

13. Ebner A., Schillers H., Hinterdorfer P Normal and pathological erythrocytes studied by atomic force microscopy // Methods Mol Biol. Vol. 736 2011. P. 223-241.

14. Sawateev M.N., Kozlovskaya N.V., Moisenovich M.M. et al II AIP Conference Proceedings, V. 696, 2003 P. 428.

Исследования частично проведены при финансовой поддержке Министерства образования и науки России, в рамках выполнения базовой части государственного задания (2014/216).