БЫСТРЫЙ И ЭКОНОМИЧНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАССЕТНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ НЕСКОЛЬКО РНК-ШПИЛЕК, НА ПРИМЕРЕ СОЗДАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ВИЧ С ПОМОЩЬЮ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ

Способ получения кассетных генетических конструкций, одновременно экспрессирующих несколько shPHK,
отличающийся тем, что (1) исходные пары олигонуклеотидов, предназначенных для кодирования каждой shPHK, отжигаются только в области петель; (2) проводится две PCR-амплификации, что позволяет обогатиться полноразмерной ДНК, соответствующей кассете,
и представляющий собой следующую последовательность операций:
1. дизайн и синтез олигонуклеотидов;
2. попарный отжиг и достройка частично комплементарных олигонуклеотидов;
3. осаждение фрагментов ДНК, представляющих отдельные части кассеты, и рестрикция подходящими рестриктазами, которые создают липкие концы, необходимые для дотирования фрагментов кассеты в правильной последовательности;
4. одновременное лигирование отдельных фрагментов кассеты в одну линейную молекулу;
5. две PCR-амплификации, электрофорез в агарозном мини-геле и электроэлюция;
6. лигирование в вектор pGemT-easy;
7. трансформация и отбор позитивных клонов с помощью colony-гибридизации;
8. сиквенс клонов;
9. переклонирование кассет в вектор для экспрессии,
и позволяющий в течение 1-2 недель из набора коротких (размером не более 50 н) олигонуклеотидов получить требуемое количество кассетных генетических конструкций в экспрессирующем векторе.