Мастоциты в репродуктивной системе и возможности биотестирования факторов риска

УДК 576.6; 576.33

©2012 Л.П. Гниломедова

МАСТОЦИТЫ В РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЕ И ВОЗМОЖНОСТИ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ФАКТОРОВ РИСКА

Исследована динамика тучноклеточной популяции при послеродовой инволюции миометрия матки крыс. Использование при биотестировании факторов риска метода морфофункционального анализа активности тучных клеток позволит диагностировать изменения на клеточно-тканевом уровне, когда регистрировать физиологические сдвиги или структурные изменения еще невозможно.

Ключевые слова: мастоциты, биотестирование, факторы риска.

Актуальность проблемы сохранения экологической безопасности окружающей среды и ресурсов жизнеобеспечения (воды, продуктов, воздуха, кормов и т.д.), в настоящее время, прогрессивно возрастает. Появляется всё больше компонентов, которые прямо или опосредовано ведут себя как факторы риска для природной среды и здоровья человека. В условиях модернизации технологий сельскохозяйственного производства невозможно отказаться от использования удобрений, пестицидов, генномодифицированных продуктов, биологически активных добавок и других прогрессивных разработок.

Величайший ученый прошлого Ж.Б. Ламарк (не признанный современниками и недооцененный потомками) в книге «Философия зоологии», рисуя будущее человечества, предполагал возможность «гибели» природы не от воин, а в процессе «созидательного» труда. Ламарк предупреждал - человечество может уничтожить себя, сделав непригодной для жизни собственную среду существования.

Для обеспечения здоровья нации и безопасности будущих поколений необходимо иметь всеобъемлющую информацию о качестве окружающей среды, факторах риска и статусе живых систем (клеток, тканей, органов, организмов, экосистем). Критерии и методы оценки качества среды существования, мониторинга окружающей среды, расчеты экологических нагрузок антропогенных факторов и регистрация реакций животных на факторы риска - ключевые задачи ветеринарно-санитарной и экологической экспертизы сельскохозяйственных объектов. Особенно актуален в этой связи выбор методов и определение критериев оценки реакции позвоночных животных на стрессовые и экологические факторы [5, 10, 11].

В живой природе имеет место специфическая особенность - высокая степень дифференциации клеток, специализация тканей и органов Ме1а200, сложные многоуровневые механизмы регуляции функциями формируют скрытые компенсаторные реакции у высших животных, которые трудно соотнести с данными фитоиндикации, с результатами биотестирования на простейших или беспозвоночных. Слабые воздействия могут не вызывать у позвоночных регистрируемых ответных реакций до тех пор, пока, накопившись, они не приведут к развитию бурных динамических процессов. При этом в цепи «внешнее воздействие - отклик живой системы» нет линейной зависимости, и могут интегрироваться различные факторы. А изменения физиологических, морфологических, биохимических, иммунологических пока-

зателей в организмах фиксируют «post factum», когда анализируемые параметры уже имеют отклонения от нормы.

Метод дифференциального анализа топографии и функциональной активности тучных клеток в тканях и органах позвоночных может позволить диагностировать изменения на клеточно-тканево-органном уровне в случае, когда еще невозможно регистрирование физиологических сдвигов или структурных изменений [4, 7, 8, 9, 13, 14].

Как метод биотестирования реакций у позвоночных на клеточном уровне предлагаем использовать гистохимический метод морфофункционального анализа активности тучных клеток в тканях и органах позвоночных.

Цель работы: разработка адекватной модели для выявления воздействия факторов риска на клеточном уровне у позвоночных с последующей рекомендацией к внедрению в практику ветеринарно-санитарной и экологической экспертизы.

В соответствии с целью сформулированы задачи:

- изучение методом гистохимического дифференциального анализа динамики функциональной активности и топографии тучных клеток тканей животных в норме;

- выявление закономерностей изменения в популяциях тучных клеток при конструктивных перестройках на примере послеродовой инволюции миометрия матки крыс.

Материал и методы. Для морфофункционального анализа активности тучных клеток позвоночных использовались гистологические пробы от нелинейных 84 белых крыс-самок послеродового периода. Контрольная группа была сформирована из 8 виргинных крыс. Животные содержались в стандартных лабораторных условиях и забивались в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные и органы взвешивались. Для исследования брались фрагменты матки (на расстоянии 1/3 длины рога от шейки). Рассчитывался весовой коэффициент как относительная масса органа к массе тела.

Материал фиксировался в жидкости Буэна, фиксаторе Карнуа и после парафиновой проводки были приготовлены серии срезов с диапазоном между срезами не менее 100 мк. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым. Плотность тучных клеток измерялась на срезах при помощи сетки Вайбеля при увеличении х 400.

Для дифференциации функциональной активности тучных клеток была использована цитограмма тучной клетки, и в зависимости от количества (визуальной плотности) гранул и степени метахромазии их делили на классы:

1 класс - функционально неактивные, клетки темные, плотно заполнены гранулами, не видно ядра;

2 класс - стадия начальной активации, в клетках различимо ядро и рыхлое наполнение гранулами, в перицеллюлярном пространстве выявляются гранулы;

3 класс - активные клетки, гранул в цитоплазме мало, их нет перинуклеарном пространстве.

Функциональную активность популяции тучных клеток рассчитывали по индексу гранулярного насыщения и индексу дегрануляции.

Полученные данные вносили в базу данных и статистически обрабатывали с помощью электронных таблиц Excel. Определяли средние и относительные величины, проводили оценку их с помощью вычисления ошибки, достоверность различий оценивалась с использо-

ванием коэффициента Стьюдента. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05 и 0,01.

Результаты исследования и обсуждение. Окрашивание срезов крезиловым фиолетовым позволило нам визуализировать тканевые базофилы и другие тканевые компоненты органа, в том числе базальные мембраны тонких кровеносных сосудов, вплоть до капилляров, и базальные мембраны подслизистых оболочек (рис. 1).

Фенотип тучных клеток определяется особенностью микроокружения ткани, где они созревают. Мастоциты, расположенные по ходу микрососудов, как правило, имеют вытянутую, уплощенную форму (рис. 2), а если они локализованы в рыхлой соединительной ткани - округлую (рис 1).

Гистохимический анализ топографии тучных клеток тканей матки крыс в послеродовый период показал преимущественное представительство мастоцитов в миометрии. В эндометрии матки тучные клетки встречаются редко. Через циркулярный слой миометрия проходят отдельные мелкие сосуды в эндометрий, и нами было отмечено, что большинство мастоци-тов расположено вокруг кровеносных сосудов. Некоторые тучные клетки свободно лежат между миоцитами как продольных, так и циркулярных мышечных пучков.

Первые сутки после родов идет быстрая инволюция матки за счет редукции всех тканей. В период 4-6 суток отмечалась стабилизация морфометрических показателей матки (веса, толщины миометрия, весового коэффициента).

Рис.1. Тучная клетка (1) крупная, округлой формы. Поперечный срез капилляра (2). Микроокружение формируют структурные, биохимические и функциональные признаки ТК. Окраска крезиловым фиолетовым. х 400

Нами исследован период нормальной физиологической послеродовой инволюции матки у крыс - это 20 суток после родов. Гистохимический анализ органа показал тенденции в изменении числа тучных клеток в миометрии и позволил выявить два пика роста их плотности на 6-е и 16-е сутки (табл. 1). Полученные данные указывают на активную роль тучноклеточной популяции в ремодернизации тканевых структур органа.

Таблица 1

Динамика плотности тучных клеток на единицу площади миометрия матки крыс послеродового периода

Сутки после родов Плотность тучных клеток на ед. площади ± ошибка сред.

0 0,15 ± 0,09

2-4 0,59 ± 0,12*

00 1 1,13 ± 0,26*

10 -12 1,12 ± 0,23

ю 1 4 1,56 ± 0,39

18 -20 1,28 ±0,42

контроль 0,22 ± 0,09

* Достоверность Р< 0.01

Анализ метахромазии выявленных тучных клеток выявил тенденции в динамике функциональной активности популяции (табл. 2). В первые сутки после родов наблюдается пери-васкулярная локализация и незначительная степень дегрануляции мастоцитов, в основном встречаются клетки 1 и 2 класса. На четвёртые сутки более половины мастоцитов оказывается свободно лежащими вне сосудистой системы. Плотность их резко возросла - приблизительно в 4 раза (Р<0.05). Появились отдельные тучные клетки с высокой степенью дегрануляции.

На 6-8 сутки после родов - происходит значительное увеличение числа тучных клеток на единицу объема гладкой мускулатуры и диагностируется их активация.

Функциональную активность тучных клеток наблюдают как дегрануляцию внутриклеточных гранул в перицеллюлярное пространство. Значительная часть выявленных мастоцитов на 6-8 сутки позиционируются как пул функционально активных клеток 2-3 класса. В них отмечалось визуальное уменьшение плотности гранул, просматривалось ядро и наблюдались метахроматические ареолы в перицеллюлярном пространстве (рис. 2 и рис. 3). Дегрануляция в некоторых случаях достигала такой степени, при которой идентификация тучной клетки затруднена - в цитоплазме почти не остается гранул, нет их и в перицеллюлярном пространстве.

Полученные нами данные о динамике популяции тучных клеток миометрия крыс в послеродовый период показали высокую вариабельность активности пулов в исследуемых группах. Гистохимический анализ выявил тенденцию к возрастанию функциональной активности в тучноклеточных популяциях при перестройке ткани. Было показано их преимущественное представительство в периваскулярных областях. При анализе также учитывались сво-боднолежащие мастоциты в миометрии (табл. 2).

Рис. 2. Дегрануляция тучных клеток (1,2) миометрия матки крысы. Гранулы выявляются в перицеллюлярном пространстве клеток. Окраска крезиловым фиолетовым. х 400

". -

2

I

È

Рис. 3. Тучные клетки в миометрии матки крысы. ТК (1) плотно заполнены гранулами и опустошенные ТК (2) в стадии высшей функциональной активности. Окраска крезиловым фиолетовым. х 4GG

1

вв

Таблица 2

Динамика активности тучных клеток миометрия на единицу площади в % к общему числу выявленных клеток

Сутки после родов Активность тучных клеток на ед. площади в % ± ошибка средняя

контроль 15,8±3,2

0 13,4± 4,5

2-4 44,3± 10,3

00 1 128,1± 29,3

10 -12 130,9± 33,9

14 - 16 163,8± 33,9

18 -20 160,9±52,8

Выявленные тенденции в топографии, изменении плотности и активности тучных клеток указывают на их участие в компенсаторно-адаптивных процессах направленных на поддержание структурно-функционального гомеостаза.

В тканях и органах тучные клетки описывают как полифункциональных агентов, организующих нормальные физиологические и патологические процессы, например: инициируют аллергические реакции [1, 2], координируют реконструкцию и регенерацию тканей [8], инициируют и поддерживают хронические воспалительные процессы, регулируют постнаталь-ный ангиогенез в норме и в патологии [12, 13].

Популяции тучных клеток различных органов имеют выраженный полиморфизм, который определяется особенностями микроокружения ткани и органов, где они созревают и формируются их структурные, биохимические и функциональные признаки [1, 3, 8,].

Обобщение результатов ряда авторов [1-4, 6-9, 12-14] позволяет нам различать субпопуляции тучных клеток с учетом следующих признаков:

• тканевой локализации;

• формы и размеров клеток;

• количества, размеров, типа и ультраструктуры гранул;

• набора протеаз и других медиаторов;

• чувствительности к биологически активным веществам;

• по степени и формам дегрануляции клеток;

• чувствительности к активаторам/ингибиторам дегрануляции.

Дегрануляцию ТК могут вызывать факторы различной природы: гипоксия, сдвиг рН, белки, иммуноглобулины, амины, нейропептиды, охлаждение/нагрев, ультразвук, электромагнитное излучение, стресс.

Локальная активация секреторной деятельности тучных клеток может продемонстрировать провоспалительную реакцию на клеточном уровне. Показатели плотности тучных клеток на единицу площади, общая активность и индекс активности, локализация их в тканях дают информацию о функциональном напряжении органа и предпосылках к реконструкции архитектоники района, мобилизации в данный микрорайон факторов воспаления, направленности динамических процессов в органе.

В настоящее время накоплены данные об участии тучных клеток в перестройках половой системы самок животных. Топография и активность тканевых базофилов также коррелиру-

ется с гормональным статусом организма. Работы последних лет [3, 7, 8, 9] существенно дополнили и расширили представления о роли тканевых базофилов в морфофункциональных тканевых перестройках органов репродуктивной системы, что исключительно важно при решении проблем воспроизводства животных в экстремальных экологических и современных технологичных условиях.

Выводы. В настоящее время имеющиеся данные позволяют утверждать, что тучные клетки выступают в роли регуляторов местного гомеостаза как в экстремальных ситуациях, так и в нормальных конструктивных процессах. Полученные нами данные могут использоваться как модель локальной морфофункциональной регуляции на клеточном уровне в общей реакции адаптации системы и представляют несомненный интерес для биотестирования факторов риска специалистами в областях репродуктивной зоотехнии и ветеринарии, экологической физиологии, акушерства и гинекологии, адаптивной экологии.

Возможные области/направления применения данного метода.

Ветеринарная экспертиза. Метод позволит выявлять поллютанты, ксенобиотики, конта-минанты в продукции, подлежащей оценке на безопасность. Данным методом в комплексе с другими (биохимическими, микробиологическими, иммуногенетическими, физиологическими, морфометрическими, др.) можно оценивать характер и направленность изменений на клеточно-тканевом уровне у позвоночных.

Экологическая экспертиза и мониторинг окружающей среды. Метод позволит диагностировать экологические факторы, потенциально и реально входящие в группу факторов риска (аллергены, патогены, токсины, новые корма, стресс, поллютанты, пестициды, экоциды и т.п.) для здоровья высших животных и человека. Возможно проведение оценки воздействия антропогенных факторов (физических, химических, биологических, стрессовых) на клеточнотканевом уровне организмов. Выявление клеточных реакций высших организмов на стимулы в дозах ниже ПДК, ПДУ, ОБУВ (ориентировочный безопасный уровень воздействия), ДСД (допустимые суточные дозы) и т.п.

Производство экологически чистой/безопасной продукции растениеводства и животноводства. Метод позволит оценивать экологическую безопасность для человека и животных с/х продукции на промежуточных и конечных стадиях производства.

Оценка безопасности (антигенной, токсической, микробной, ксенобиотической) новых добавок и кормов в условиях интенсификации животноводства и при производстве экологически чистой/безопасной продукции.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Metcalfe D.D. Mast cells and mastocytosis // Blood. 2008.Aug. - V.112, - N.4, - P. 946-956.

2. Niedzwiedzka P. The role of mast cells in immunity / P. Niedzwiedzka, W. Deptula // Medycyna Wet. 2008, -V. 64, - N11, - P. 1291-1294.

3. Абрамова Л.Л. Морфологические особенности фенотипов тучных клеток молочной железы и яичника беременных крольчих // Известия Оренбургского гос. аграрного университета, 2007. - Т.3. - № 151. -

С. 104-106.

4. Арташян О.С., Изучение функциональной активности тучных клеток при иммобилизационном стрессе / О.С. Арташян, Б.Г. Юшков, Е.А. Мухлынина // Цитология. - 2006. - Т. 48. - № 8. - С. 665-669.

5. Мелехова О.П. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование /

О.П. Мелехова, Е.И. Егорова, Т.И. Евсеева [и др.]; под ред. О.П. Мелеховой и Е.И. Егоровой. -

М.: Изд.центр «Академия», 2007. - 288 с.

6. Быков С.Э. Гетерогенность популяции тканевых базофилов тощей кишки и её роль в формировании реакции на электромагнитное поле // Науч. мед. Вестник Центрального Черноземья. - 2004. - №16-17.

7. Гниломедова Л.П. Динамика активности тучно-клеточной популяции миометрия матки крыс в послеродовый период. // Известия СГХСА. - 2010. - Вып. 1. - С. 36-39.

8. Гниломедова Л.П. Представительство мастоцитов в миометрии матки крыс послеродового периода // Известия СГХСА. - 2010. - Вып. 1. - С. 27-31.

9. Григорьева Л. А. Тучные клетки половой системы самок белых мышей //Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: сборник науч. тр. МГАВМиБт. - М., 2003. - С. 131-134.

10. Другов Ю.С. Экспресс-анализ экологических проб: практическое руководство / Ю.С. Другов, А.Г. Муравьев, А. А. Родин. - М.: БИНОМ. Лабораторные знаний, 2010. - 424 с.

11. Каплин В.Г. Биоиндикация состояния экосистем: учебное пособие. - Самара: Самарская ГСХА, 2001. - 143 с.

12. Красавина Н.П. Тучные клетки органов дыхания и перспективы их изучения (обзор литературы) / Н.П. Красавина, С.С Целуйко., В. А. Доровских // Бюлл. Амурская ГМА - Благовещенск. - 2004. - Вып.19. - С. 75-79.

13. Садовников Н.В. Патологические изменения и тучноклеточная реакция в иммуннокомпетентных органах цыплят после вакцинации/ Н.В. Садовников, Н.И. Женихова, М.В. Столбикова // Аграрный вестник Урала. -2008. - № 11 (53). - С. 68-70.

14. Шеина Н.И. Методические подходы к использованию тучноклеточной популяции при гигиеническом нормировании вредных факторов окружающей среды // Токсикологический вестник. - 2007. - №5. - С. 2-6.