Модуляция каталитических свойств альдегидде-гидрогеназы эритроцитов экзогенным монооксидом азота

МОДУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АЛЬДЕГИДДЕ-ГИДРОГЕНАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ ЭКЗОГЕННЫМ МОНООКСИДОМ АЗОТА

А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева

ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России

Abstract

The aim of this work is estimation of effects and its mechanisms of gaseous nitric oxide and dinitrosyl iron complexes (DNIC) on catalytic activity of aldehyde dehydrogenase. We estimated the influence of different doses of free (NO concentration in gas flow - 20, 50, 100 and 800 ppm) and bounded (3 mM of DNIC) nitric oxide on aldehyde dehydrogenase activity in vitro.

It was observed that blood processing with gaseous nitric oxide from different NO-generators caused the moderate inhibition of aldehyde dehydrogenase activity. Use of DNIC low doses (lesser than 0,3 mcmol) led to dose-dependent stimulation of enzyme catalytic. Increasing of DNIC dose activated aldehyde dehydrogenase lesser clear, than its low doses. It was stated that erythrocyte aldehyde dehydrogenase is very sensitive to exogenic nitric oxide in gaseous phase and DNIC water solutions. We fixed that modification of aldehyde dehydrogenase activity by nitric oxide is dose dependent.

Key words: aldehyde dehydrogenase, nitric oxide, blood

Целью работы являлась оценка влияния и уточнение механизмов эффектов газообразного оксида азота на каталитическую активность альдегиддегидрогеназы. В условиях in vitro изучали влияние свободного (концентрация NO в газовом потоке - 20, 50, 100 и 800 ppm) и депонированного оксида азота (3 мМ водный раствор) на активность альдегиддегидрогеназы эритроцитов. Установлено, что при обработке образцов крови человека газообразным оксидом азота, полученным от различных генераторов, имеет место умеренное ингибирование активности изучаемого фермента в сочетании с минимальным нарастанием уровня малонового диальдегида. Применение низких доз ДНКЖ (до 0,3 мкмоль) способствует дозозависимому стимулированию каталитических свойств энзима. Повышение количества соединения уменьшает выраженность этой тенденции, хотя и сохраняет активность фермента на повышенном уровне. Альдегиддегидрогеназа эритроцитов человека чрезвычайно чувствительна к действию экзогенного NO как в газовой фазе, так и в составе ДНКЖ, причем характер модификации ее каталитических свойств непосредственно определяется количеством введенного оксида азота.

Ключевые слова: альдегиддегидрогеназа, оксид азота, кровь

Несмотря на многочисленность работ, опубликованных в последние

десятилетия относительно характера действия нитроглицерина и других органических нитратов при лечении различной сердечно-сосудистой патологии (более 15000 уже к 2008 г. [16]), связанного с высвобождением из них оксида азота [1-3], молекулярные механизмы данного эффекта раскрыты недостаточно полно. В этом плане важны данные, полученные преимущественно зарубежными исследователями для процессов биоактивации и биотрансформации нитровазодиляторов [1, 2, 4, 5]. В частности, установлено, что непосредственное участие в высвобождении молекулы монооксида азота из последних принимает альдегиддегидрогеназа (АлДГ), прежде всего - ее 2 фракция (митохондриальная) [3-6]. В то же время практически отсутствуют сведения об особенностях влияния продукта данной реакции (NO) на кинетические и каталитические свойства указанного фермента. Единичные подобные работы описывают лишь ингибирующее действие соединения на очищенный энзим [7, 8], а его «поведение» в гетерогенной биологической системе остается неизвестным. Так, исследованиями E.G. DeMaster et al. (1997) показано, что в отношении очищенной АлДГ, выделенной из Saccharomyces cerevisiae, газообразный NO проявляет выраженное ингибирующее действие, которое зависит от времени воздействия и концентрации физического агента [7]. В то же время присутствие в реакционной среде кислорода существенно снижает этот эффект, что указывает на непосредственную принадлежность последнего именно оксиду азота, а не нитрат- и/или нитрит-ионам, возникающим при его окислении. Авторами также продемонстрировано, что действие NO обусловлено модификацией (оксидацией) Cys-302 активного центра фермента. Это, согласно данным S. Dimmler et al. (1992), происходит в результате стимуляции оксидом азота ADP-рибозо-зависимой аутомодификации цистеина [9]. Следует отметить, что подобный эффект наблюдается и в отношении глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, но, в отличие от АлДГ, в этом случае указанный процесс является НАД-зависимым [9, 10]. Важно, что приведенные данные получены исключительно на очищенных ферментах, тогда как для реальных биологических систем сведения отсутствуют. В связи с этим целью работы являлась оценка влияния и уточнение механизмов эффектов газообразного оксида азота и ДНКЖ на каталитическую активность АлДГ.

Материал и методы исследования

Эксперименты были проведены на образцах консервированной крови человека, полученной от здоровых доноров (возраст 20-40 лет) без хронической патологии и персистирующих инфекций. Проведено две серии экспериментов. В первой серии изучали действие газообразного оксида азота в широком диапазоне концентраций на активность АлДГ эритроцитов (n=10). Для этого кровь делили на 5 порций, первую из которых барботировали воздухом (объем - 100 мл; контрольный образец), вторую, третью и четвертую - NO-содержащим газовым потоком (концентрация NO - 20, 50 и 100 ppm соответственно; объем аналогичен контрольному), пятую - NO-содержащей холодной плазмой (концентрация NO -800 ppm, 100 мл). NO-содержащий газовый поток создавали с помощью экспериментального генератора, разработанного в Российском федеральном ядерном центре - Всероссийском НИИ экспериментальной физики (г. Саров),

холодную плазму с оксидом азота - с использованием аппарата «Плазон».

Во второй серии экспериментов оценивали действие ДНКЖ как депонированной формы NO на кинетические и каталитические свойства эритроцитарной АлДГ. С этой целью в образцы консервированной крови (n=10) вносили 0; 0,05; 0,1 или 0,2 мл ДНКЖ-содержащего 0,9% водного раствора хлорида натрия (концентрация соединения, определенная спектрофотометрически по молекулярным экстинкциям при длинах волны 310 и 360 нм, - 3 ммоль/л). ДНКЖ синтезировали непосредственно перед проведением эксперимента по методике А.Ф. Ванина (2009) [12]. Экспозиция после воздействия в обеих сериях составляла 3 минуты.

В донорской крови спектрофотометрически определяли активность альдегиддегидрогеназы (АлДГ) - по методу Б.М. Кершенгольца, Е.В. Серкиной (1981). Содержание белка устанавливали по методу Лоури.

Результаты обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса. Данные представляли в формате M±m. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05. Рассчитывали истинный уровень статистической значимости различий средних значений показателей.

Результаты

Проведенные эксперименты позволили установить, что различные варианты обработки крови оказывают неодинаковое влияние на активность эритроцитарной АлДГ (рис. 1).

Рис. 1. Активность альдегиддегидрогенезы эритроцитов при действии свободного и депонированного оксида азота

В частности, введение в образцы биологической жидкости оксида азота в свободной газообразной форме приводит к умеренному угнетению каталитических свойств фермента (на 10-15% относительно уровня нативной крови; р<0,05 для всех случаев), причем эта тенденция не зависит от дозы воздействующего агента. Интересно, что данный эффект наблюдается также и вне зависимости от особенностей генератора оксида азота. Он отмечается как в случае использования аппарата «Плазон», создающего высокие концентрации N0 в сочетании с активными формами кислорода [14, 15], так и при применении экспериментального генератора, образующего N0-содержащий воздушный поток без примесей с существенно более низкими (на 1-2 порядка) концентрациями изучаемого соединения.

По нашему мнению, это обусловлено неспецифическим ингибированием каталитических свойств энзима при насыщении биологической жидкости продуктом реакции - монооксидом азота. Наличие дозозависимости ответа, не прослеживаемое при оценке общей активности АлДГ, может быть выявлено при анализе кинетических характеристик фермента.Эффекты, противоположные описанным выше, были обнаружены для депонированных форм оксида азота -динитрозильных комплексов железа, служащих естественными депо последнего (рис. 1). При воздействии на образцы крови человека растворов ДНКЖ при всех использованных концентрациях соединения наблюдали активацию АлДГ, однако степень выраженности этого влияния неодинакова (от 10 до 53% от уровня, характерного для интактного образца биологической жидкости) и нелинейно зависит от количества введенного источника оксида азота. Так, при введении 0,15-0,3 мкмоль ДНКЖ регистрировали дозозависимую стимуляцию каталитических свойств энзима, что, по нашему мнению, связано с необходимостью утилизации экзогенного субстрата. Можно предположить, что этому дополнительно способствует потенциальное сходство органических нитратов как основных субстратов фермента и экзогенных нитрозильных комплексов железа, деструкция которых в организме частично может также обеспечиваться функционированием АлДГ. Особого обсуждения, на наш взгляд, заслуживает снижение активирующего влияния ДНКЖ на каталитическую активность АлДГ при дальнейшем увеличении количества вводимого источника оксида азота. Эта тенденция может объясняться суммацией двух зависимых процессов: выраженной «компенсаторной» стимуляцией функционирования энзима при поступлении значительного количества субстрата и, следовательно, быстрым накоплением продукта реакции (N0), ингибирующего активность АлДГ по механизму обратной связи аналогично сдвигам, наблюдающимся при обработке образцов крови газообразным оксидом азота.

Обсуждение

Результаты проведенных исследований, а также критический анализ тематической литературы позволили предположить потенциальные механизмы действия оксида азота на активность АлДГ в биологической системе. В частности, согласно нашим представлениям, высокие действующие концентрации («избыток») N0 могут в присутствии кислорода и активных его форм (прежде всего - супероксид-анион-радикала) образовывать пероксинитрит

(ОКОО-), приводя к оксидации и/или нитроксилирования -БН-группы цистеина активного центра энзима. Кроме того, возможен и механизм, основанный на аллостерическом торможении каталитической активности АлДГ продуктом ее реакции - молекулой оксида азота. В то же время небольшие концентрации газообразного N0 (до 100 ррт, что составляет 1,5 мМ/л крови), проявляя преимущественно антиоксидантное действие и способствуя стимуляции энергетического обмена эритроцита [19], быстро утилизируются GSN0-редуктазой (тиоредоксиновая система), каталазой, дезоксигемоглобином, цитохромом С и др. молекулами [20].

Б. Действие более высоких концентраций ДНКЖ Рис. 2. Потенциальные механизмы действия экзогенных динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) на активность альдегиддегидрогеназы

В отношении ДНКЖ, проявивших нелинейную зависимость активности

изучаемого фермента от количества вводимого соединения, нами предполагается более сложный механизм действия. Так, небольшие количества ДНКЖ, лишь в минимальной степени спонтанно деградирующие в биосреде, сменяют лиганд с исходного носителя (глутатион) на белковые макромолекулы, включающие аминокислоты c -SH-группами, постепенно пополняя этим пул плазменных S-нитрозиотиолов, высвобождающихся при разрушении исходных ДНКЖ (рис. 2а). В свою очередь нарастание уровня данного антиоксидантного агента способствует поддержанию восстановленного состояния цистеина активного центра АлДГ, обеспечивая тем самым нарастание его каталитической активности и модификацию кинетических свойств.

При создании в биологической жидкости больших концентраций ДНКЖ имеют место, по нашему мнению, два противоположных процесса (рис. 2б). Так, значительное количество ДНКЖ, не успевая вступить во взаимодействие с белковыми молекулами плазмы (прежде всего - с альбумином), деградируют до свободного NO, который в кислородсодержащей среде моментально образует пероксинитрит с последующей окислительной инактивацией активного центра АлДГ. В то же время описанный выше процесс высвобождения S-нитрозиотиолов в этом случае также протекает, препятствуя окислительной модификации цистеина. По нашему мнению, результирующая указанных реакций и дает менее выраженную активацию каталитических свойств энзима при введении 0,6 мкмоль ДНКЖ по сравнению с 0,3 мкмоль соединения. С учетом этого мы предполагаем, что 0,3 мкмоль (1,5 мМ/л крови) - предельно возможное количество ДНКЖ, позволяющее реализовать позитивное действие соединения.

Заключение

В целом, проведенные исследования позволили получить интересные данные о том, что «пороговые» концентрации для свободного (газообразного) и депонированного в составе ДНКЖ оксида азота одинаковы и составляют 1,5 мМ/л крови, однако пороговый диапазон более широк для последних. Об этом косвенно свидетельствует то обстоятельство, что даже двухкратное превышение пороговой дозы агента вызывает лишь снижение выраженности его позитивного эффекта. Природу и молекулярные механизмы единого биологического «порога» для изученных форм NO еще предстоит установить, т. к. она, по нашему мнению, имеет непосредственное отношение к метаболической адаптации биологических систем, в т.ч. крови, к одному из основных химических биорегуляторов функционирования организма - оксиду азота и проблеме возникновения и преодоления толерантности к нитровазодиляторам.

Список литературы

1. Chen Z., Foster M.W., Zhang J., Mao L., Rockman H.A., Kawamoto T. et al. An essential role for mitochondrial aldehyde dehydrogenase in nitroglycerin bioactivation // PNAS. 2005. Vol. 102, N 34. P. 12159-12164.

2. Fung H.L. Biochemical mechanism of nitroglycerin action and tolerance: is this old mystery solved? // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. Vol. 44. P. 67-85.

3. Mayer B., Beretta M. The enigma of nitroglycerin bioactivation and nitrate tolerance: news, views and troubles // British Journal of Pharmacology. 2008. Vol. 155.

P. 170-184.

4. Lang B.S., Gorren A.C., Oberdorfer G., Wenzl M.V., Furdui C.M., Poole L.B. et al. Vascular bioactivation of nitroglycerin by aldehyde dehydrogenase-2: reaction intermediates revealed by crystallography and mass spectrometry // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, N45. P. 38124-38134.

5. Wenzl V.M., Beretta M., Griesberger M., Russwurm M., Koesling D., Schmidt K. et al. Site-directed mutagenesis of aldehyde dehydrogenase-2 suggests three distinct pathways of nitroglycerin biotransformation // Molec. Pharm. 2011. Vol. 80, N 2. P. 258-266.

6. de la Lande I.S., Stepien J.M., Philpott A.C., Hughes P.A., Stafford I., Horowitz J.D. Aldehyde dehydrogenase, nitric oxide synthase and superoxide in ex vivo nitrate tolerance in rat aorta // Eur J. Pharmacol. 2004. Vol. 496, N 1-3. P. 141149.

7. DeMaster E.G., Redfern B. Quast B.J., Dahlseid T., Nagasawa H.T. Mechanism for the inhibition of aldehyde dehydrogenase by nitric oxide // Alcohol. 1997. Vol. 14, N 2. P. 181-189.

8. Szabo C., Southan G.J., Thiemermann C., Vane J.R. The mechanism of the inhibitory effect of polyamines on the induction of nitric oxide synthase: role of aldehyde metabolites // Br. J. Pharmacol. 1994. Vol. 113, N 3. P. 757-766.

9. Dimmeler S., Lottspeich F., Brune B. Nitric oxide causes ADP-ribosylation and inhibition of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 16771-1674.

10. McDonald L.J., Moss J. Pleiotropic effects of nitric oxide on ADP-ribosylation, covalent binding of NAD, and catalytic activity of glyceraldehyde-3-phosphate and aldehyde dehydrogenases // Trans. Assoc. Am. Physicians. 1993. Vol. 106. P. 155-161.

11. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестник РАМН. 2000. №4. С. 3-5.

12. Ванин А.Ф., Писаренко О.И., Студнева И.М., Шульженко В.С., Пелогейкина Ю.А. Действие динитрозильного комплекса железа на метаболизм и клеточные мембраны ишемизированного сердца крысы // Кардиология. 2009. №12. С. 43-49.

13. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П. Влияние свободного и депонированного оксида азота на энергетический метаболизм крови // Современные технологии в медицине. 2013. Т. 5, №4. С. 33-38.

14. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Диденко Н.В. Анализ влияния оксида азота на физико-химические параметры крови in vitro // Врач-аспирант. 2013. №2. С. 218-222.

15. Martusevich A.K., Peretyagin S.P., Soloveva A.G., Vanin A.F. Estimation of some molecular effects of gaseous nitrogen oxide on human blood in vitro // Biophysics. 2013. Vol. 58, №5. P. 689-692.

16. Голиков П.П., Николаева Н.Ю., Гавриленко И.А. Оксид азота и перекисное окисление липидов как фактор эндогенной интоксикации при неотложных состояниях // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2000. №2. С. 6-9.

17. Koppaka V., Thompson D.C., Chen Y., Ellermann M., Nicolaou K.C., Juvonen R.O. et al. Aldehyde dehydrogenase inhibitors: a comprehensive review of the pharmacology, mechanism of action, substrate specificity, and clinical application // Pharmacol. Rev. 2012. Vol. 64, N 3. P. 520-539.

18. Tsou P.-S., Page N.A., Lee S.G., Fung S.M., Keung W.M., Fung H.L. Differential metabolism of organic nitrates by aldehyde dehydrogenase 1a1 and 2: substrate selectivity, enzyme inactivation, and active cysteine sites // The AAPS Journal. 2011. Vol. 13, N 4. P. 548-555.

19. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г., Перетягин С.П., Митрофанов В.Н. Оценка влияния некоторых физических факторов на энергетический метаболизм крови in vitro // Биомедицина. 2013. №1. С. 103-108.

20. Godoy L., Gonzalez-Duarte R., Albalat R. S-Nitrosogluthathione reductase activity of amphioxus ADH3: insights into the nitric oxide metabolism // Int. J. Biol. Sci. 2006. Vol. 2, N 3. P. 117-124.