Идентификация и основные биологические свойства молочнокислых бактерий

УДК 664.047(571.56) К.М. Степанов

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Представлены основные биологические свойства молочнокислых бактерий, их антагонистические и адгезивные свойства.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, антагонистические свойства, адгезивная активность.

K.M. Stepanov

IDENTIFICATION AND BASIC BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE LACTIC BACTERIA

The basic biological properties of the lactic bacteria, its antagonistic and adhesive properties are given.

Key words: lactic bacteria, antagonistic properties, adhesive activity.

Согласно современным представлениям, организм человека и животных находится в определенном экологическом равновесии с представителями нормальной микрофлоры и в тесной симбиотической связи с ней. Это позволяет рассматривать макроорганизмы и микробы, его населяющие, как сбалансированную экологическую систему, в которой стабильность микробных ассоциаций определяется как эубиоз [1-3].

Важная роль в поддержании функций некоторых органов принадлежит нормальной микрофлоре, которая благодаря выраженным ферментативным свойствам, способности синтезировать витамины, является одним из факторов естественной защиты макроорганизма [4].

Недостаточность сведений об основных биологических свойствах лактобактерий, в том числе определяющих их защитные функции, ограничивает возможности совершенствования препаратов-эубиотиков. Известно, что лактобактерии участвуют в создании колонизационной резистентности при помощи продукции антибиотических веществ, подавления прилипания и транслакации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [5].

Проблема адгезии микробов привлекает внимание исследователей как с точки зрения ее биологического значения в механизмах, обеспечивающих приживление микроорганизмов и формирования нормальной микрофлоры организма, так и участия ее в начальных этапах развития заболевания.

Все вышеуказанное определяет целесообразность комплексных исследований биологических свойств штаммов лактобактерий, особенно изучение степени выраженности антагонистических свойств и адгезивной активности, для конструирования пробиотиков с известным механизмом действия.

Целью настоящего исследования является изучение основных биологических свойств, антагонистической и адгезивной активности лактобактерий.

Методика исследований

В своих исследованиях всего выделено и идентифицировано 17 штаммов микроорганизмов семейства Lactobacillaceae, выделенных из фесец поросят: Lactobacterium acidophilum ЛС-1, ЛС-4, ЛС-5, ЛС-7, ЛС-10, ЛС-11, ЛС-13, ЛС-14, ЛС-17, Lactobacterium plantarum ЛС-3, ЛС-6, ЛС-8, ЛС-9, ЛС-16, Lactobacterium rhamnosus (casei) ЛС-12, ЛС-15, Lactobacterium brevis ЛС-2.

Для выделения и количественного учета молочнокислых бактерий засевали по 1 мл исследуемой суспензии (7-9 разведения) в следующие среды: стерильное обезжиренное молоко, гидролизованное молоко, среду Рогоза, агар с гидролизованным молоком и мелом [6].

Посевы культур на агар с гидролизованным молоком и мелом позволяли идентифицировать молочнокислые бактерии по зонам просветления вокруг колоний, которые образуются в результате растворения мела молочной кислотой.

К лактобактериям относили чистые культуры, которые положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны, не образуют каталазы, нуждаются в ростовых веществах, не вызывают видимого разложения белков молока, не разжижают желатину. Видовую идентификацию лактобактерий осуществляли на основании изучения их культуральных, морфологических свойств, энергии кислотообразования,

способности расти на питательных средах в присутствии NaCl, фенола, при щелочной реакции среды, а также с учетом их ферментативных свойств.

Штаммы молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в стерильное обезжиренное молоко каждые 10 дней. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при плюс 4-8°С.

Более удобным методом хранения молочнокислых микроорганизмов является их хранение в пробирках с гидролизованным молоком (pH 7,2) при температуре плюс 2-4°С. В таких условиях все исследуемые культуры хранились в течение двух месяцев, практически не изменяя своих свойств [7].

Изучение адгезивных свойств микроорганизмов проводили методом, основанным на способности микроорганизмов прилипать к соматическим клеткам [8].

В определении антагонистической активности бактериальных штаммов использованы методы совместного культивирования и штриховых посевов.

Результаты исследований

Девять штаммов, сбраживающих галактозу, лактозу, мальтозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу, целлобиозу, салицин, эскулин, глюкозу, глюконат и слабо раффинозу, отнесли в группу L acidophilum.

В окрашенном препарате они представляют собой неравномерно окрашенные палочки длиной до 3 мкм, толщиной 1 мкм, располагающиеся поодиночно и цепочками. При культивировании на гидролизованном агаре с мелом штаммы образуют мелкие с коричневатым оттенком блестящие колонии, зона газообразования просветления вокруг которых не превышала 0,4 мм. Оптимальная температура их развития - 38±1°С, они устойчивы к щелочной реакции (pH 8,3), наличию в среде 0,4% фенола, желчи до 40%, хлорида натрия (2,4%).

Пять изолятов сбраживали галактозу, лактозу, мальтозу, маннозу, раффинозу, рибозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу, целлобиозу, маннит, салицин, сорбит, эскулин, глюкозу и глюконат с образованием газа. Они вариабельно сбраживали арабинозу, ксилозу, мелецитозу. В окрашенном препарате представляли собой мелкие, грамположительные палочки от 2 до 4 мкм длиной, часто располагающиеся в виде цепочек или попарно. В гидролизованном молоке росли с помутнением среды, поверхностные колонии округлые, блестящие, глубинные - лодочкообразные. Оптимальная температура роста их составляет 32±1°С, они слабо росли при температуре 10 и 45°С, способны расти при pH 8,3, растут в гидролизованном молоке с 26% хлоридом натрия, с 20 и 40% желчью и не растут в обезжиренном молоке с 0,4 % фенола. Эти изоляты идентифицировали как L. plantarum.

Следующая группа изолятов с учетом их ферментативных свойств была отнесена к виду L rhamnosus.

Один штамм отнесен к виду L. brevis.

Образование лактобактериями органических кислот (молочной и уксусной) считается одним из механизмов антагонистической активности по отношению к условно-патогенным микроорганизмам [9].

В связи с этим изучение динамики кислотообразования рассматривается в качестве важного этапа при характеристике биологических свойств лактобактерий. Нами проводилось определение динамики изменения титруемой кислотности при культивировании лактобактерий в стерильном обезжиренном молоке.

Установлено, что наиболее активными кислотоп роду центами были штаммы L. acidophilum ЛГ-1 (370°Т), ЛС-5 (275°Т), ЛС-10 (280°Т), ЛС-11 (265°Т), ЛС-1 (240°Т), ЛС-17 (220°Т), ЛС-4 (205°Т), L. rhamnosus ЛС-15 (215°Т), умеренными кислотообразователями штаммы L acidophilum ЛС-7 (200°Т), ЛС-13 ( 190°Т), L. rhamnosus ЛС-12 (140°Т), L. plantarum ЛС-6 (135°Т), ЛС-8 (125°Т), ЛС-9 (110°Т), слабыми кислотообразователями L. brevis ПС-2 (40°Т), L. plantarum ЛС-16 (90°Т), ЛС-3 (100°Т), L. rhamnosus ЛС-15 (105°Т).

Согласно тесту активности кислотообразования, наиболее перспективными из изученных для использования их в качестве препаратов-эубиотиков являются штаммы вида L. acidophilum ЛГ-1, ЛС-1, ЛС-5, ЛС-10, ЛС-11, ЛС-17 сильные кислотообразователи.

Была изучена методом штриховых посевов антагонистическая активность 10 штаммов: L. acidophilum ЛГ-1, ЛС-5, ЛС-10, ЛС-7, ЛС-13, L. rhamnosus ЛС-12, ЛС-15, L plantarum ЛС-6, ЛС-9 и L. brevis ЛС-2, в зависимости от степени кислотообразования.

Большинство изучаемых штаммов лактобактерий независимо от видовой принадлежности обладают высокой или средней степенью антагонистической активности в отношении Е. coli, P. vulgaris, S. cholerae Suis, B. subtilis.

Штаммы - активные кислотообразователи L. acidophilum ЛГ-1, ЛС-5 и ЛС-10 - обладали выраженной антагонистической активностью по отношению всех изученных тест-культур.

Штамм L. brevis ЛС-2 - слабый кислотообразователь - обладал слабым антагонизмом по отношению к Е. coli и В. subtilis (9,0 ± 1,53, 9,7 ± 1,52).

Штаммы - умеренные кислотообразователи - L. acidophilum ЛС-7, ЛС-13, L plantarum ЛС-9, ЛС-6, L. rhamnosus ЛС-12 и ЛС-15 - умеренно проявили антагонизм ко всем тест-культурам.

Таким образом, в целом лактобактерии обладают наибольшей антагонистической активностью по отношению к E. coli и P. vulgaris, умеренно по отношению к S. cholerae suis u B. subtilis.

Многими исследователями установлена антибиотическая активность лактобактерий in vitro при их совместном культивировании с тест-культурами.

Поэтому в следующей серии опытов нами изучалась антагонистическая активность 11 штаммов лактобактерий, выделенных из фецес поросят: L. acidophilum ЛС-5, ЛС-10, ЛС-11, ЛС-1, ЛС-7, ЛС-13, L. rhamnosus ЛС-12, L plantarum ЛС-6, ЛС-16, ЛС-3 и L. brevis ЛС-2 и штамм L. acidophilum ЛГ-1, в зависимости от степени кислотообразования при совместном культивировании в гидролизованном молоке в отношении E. coli u

S. cholerae suis с коррекцией и без коррекции значения рН среды до нейтральных значений и с учетом степени кислотообразования.

Установлено, что антагонистическая активность лактобактерий - сильных кислотообразователей -при совместном культивировании без коррекции рН среды начинает проявляться через 48 часов по сравнению с контролем и составляет около 48%, через 96 часов около 69%, через 120 часов около 78%, а через 144 часов в конце наблюдения около 99%. При коррекции рН до нейтральных значений наблюдается значительная задержка антагонистической активности: - через 48 часов она равна 20%, через 72 часа - 33%, через 96 часов - 49 %, через 120 часов - 56%, а в конце наблюдения 66%. В целом по лактобактериям - сильным кислотообразователям - сравнительно слабый антагонизм проявили штаммы L acidophilum ЛС-10 и ЛС-11.

Аналогичная картина наблюдается и при изучении антагонистической активности лактобактерий слабых и умеренных кислотообразователей. Среди лактобактерий - слабых кислотообразователей, сравнительно сильный антагонизм проявил штамм L plantarum ЛС-3. Среди лактобактерий - умеренных кислотооб-разователей, сравнительно слабый антагонизм проявил штамм L. rhamnosus ЛС-12.

При изучении антагонистической активности лактобактерий в отношении S. cholerae suis установлено что, через 48 часов культивирования без коррекции рН среды она составляет 33%, через 72 часа 43%, через 96 часов - 55%, через 120 часов - 67%, через 144 часов - 78%. При коррекции рН до нейтральных значений активность лактобактерий снижается: через 48 часов она равна 24%, через 72 часа - 33%, через 96 часов -43%, через 120 часов - 55%, через 144 часа - 64%. Из лактобактерий - сильных кислотообразователей, сравнительно лучший антагонизм проявили штаммы L. acidophilum ЛГ-1, ЛС-5 и ЛС-1.

Аналогичная картина наблюдается и с лактобактериями - умеренными кислотообразователями, которые в конце наблюдения, т.е. через 144 часа, угнетают 67% сальмонелл в опыте без коррекции рН среды и 46% в опыте с коррекцией рН среды до нейтральных значений. Слабый антагонизм проявил штамм L. rham-nosus ЛС-12.

При наблюдении антагонистической активности лактобактерий - слабых кислотообразователей, в отношении S. cholerae suis, установлено, что в конце срока наблюдения (144 ч) в опыте без коррекции рН среды антагонизм лактобактерий составил 55%, а в опыте с коррекцией рН среды до нейтральных значений -51%. Следовательно, лактобактерии - слабые кислотообразователи, при совместном культивировании проявляют антагонизм в отношении сальмонелл лишь наполовину по сравнению с контролем. Сравнительно лучший антагонизм показал штамм L plantarum ЛС-3.

Из вышеуказанных результатов видно, что среди штаммов, подобранных по кислотообразованию, показатели внутри групп сильно варьировали, это показывает на то, что на антагонистическую активность лактобактерий при совместном культивировании фактор кислотообразования имеет косвенное значение.

При коррекции рН среды до нейтральных значений свойства, ингибирующие рост тест-бактерий, остаются наиболее выраженными лишь у тех штаммов, чей антагонизм связан не только с образованием органических кислот, изменяющих рН среды в кислую сторону, но и с образованием антибиотических веществ. Именно такие штаммы (L. acidophilum ЛС-5,ЛС-1,ЛГ-1, L plantarum ЛС-6, ЛС-3) более предпочтительны для изготовления пробиотиков.

В опытах с эритроцитами поросят установлено, что адгезивная активность не зависит от интенсивности кислотообразования штаммов лактобактерий. СПА лактобактерий - умеренных кислотообразователей -был от 2,46+0,66 до 6,24+0,38, сильных кислотообразователей - от 2,52+0,52 до 5,84+0,38, слабых кислотообразователей - от 1,67+0,78 до 5,61 ±0,26.

При изучении влияния рН среды на адгезивную активность лактобактерий выявлено, что при снижении pH среды с 9,0 в кислую сторону (до pH 4,0+0,1) адгезивность лактобактерий к эритроцитам поросят достоверно повышается (р>0,99).

Сравнительно высокой адгезивностью при изменении pH среды обладали штаммы L. acidophilum ЛС-10 (СПА от 2,64 до 6,44), ЛС-7 (СПА от 1,76 до 6,40), L. rhamnosus ЛС-12 (сПа от 2,52 до 6,04).

Исследование зависимости адгезивности от значения рН среды (от рН 9,0 до рН 4,0) установило, что изменения pH в кислую сторону способствует усилению адгезивности, причем у лактобактерий - сильных кислотообразователей, СПА достигает 8,32+2,56 - 20,01 ±1,72 (р>0,95), у умеренных кислотообразователей - 8,23±2,12 — 20,00±1,54 (р>0,95), у слабых кислотообразователей - 6,38±0,98 - 18,50±1,30 (р>0,95).

Более выраженной адгезивной активностью обладают штаммы L acidophilum ЛС-10, ЛС-11 и ЛГ-1, L plantarum ЛС-6.

Показатели, характеризирующие адгезивные свойства штаммов, полученные при использовании эритроцитов и энтероцитов, совпадают. Следовательно, при изучении адгезивных свойств лактобактерий можно использовать эритроциты как более простую, но достаточно достоверную модель.

Выводы

1. Антагонистические свойства лактобактерий не имеют прямой корреляции с интенсивностью кисло-тообразования. Поэтому признак кислотообразования не может являться решающим при отборе штаммов для изготовления пробиотиков.

2. При отборе штаммов по антагонистическим свойствам необходимо в каждом отдельном случае проводить их изучение методом совместного культивирования при коррекции рН среды до нейтральных значений. В этих условиях возможно обнаружение штаммов, чей антагонизм в большей степени обусловлен образованием активных веществ антибактериальной направленности.

3. Адгезивные свойства лактобактерий наиболее интенсивно проявляются в кислой среде. Для характеристики адгезивных свойств лактобактерий целесообразно использовать формалинизированные эритроциты, как более простую и обеспечивающую достоверные результаты модель.

4. При сравнительном изучении свежевыделенных штаммов лактобактерий и производственного штамма L. acidophilum ЛГ-1 установлено что, производственные штаммы имеют преимущество перед свежевыделенными, так как они обладают высокой адгезивной и антагонистической активностью, широким спектром биохимической активности, устойчивостью к поваренной соли, желчи, а также к основным антибиотикам.

Литература

1. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл, перспективных в качестве эубиотиков / Е.М. Горская [и др.] // ЖМЭИ. - 1992. - №3. - С. 17-20.

2. Карни, Т.В. Количественный состав лактофлоры и методика его определения / Т.В. Карни, Х.П. Ле-нупер // ЖМЭИ. - 1994. - № 4. - С. 28-34.

3. Коршунов, В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов // Микробиология. -1995. - № 3. - С. 48-55.

4. Панин, А.Н. Иммунобиология и кишечная микрофора / А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик. - М.: ИК "Родник”, 1998. - С. 5-37.

5. Определитель бактерий Берджи / Д. Хоул [и др.]. - М.: Мир, 1997. - Т. 2. - С. 538-574, 567-582.

6. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание / Б.А. Шендеров. - М.: Гранть, 1998. - 288 с.

7. Kimura, К. Analysis of fecal populations of bifidobacteria and lactobacilli and investigation of the immunological responses of their human hosts to the predominant strains / K. Kimura, A.L. McCartney, M.A. McConnel, G.W. Tannok // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - № 63 (9). - P. 3394-33998.

8. Методические возможности изучения роли адгезии в колонизирующей способности микроорганизмов / В.И. Брилис; под ред. В.П. Шишкова и Ю.Ф. Исакова // Теоретические и практические проблемы гното-биологии. - М.: Агропромиздат, 1986. - С. 206-212.

9. Барзашка-Попова, С.Н. Коррекция микрофлоры и местного иммунитета кишечника при дисбактериозах с помощью лактобацилл: автореф... канд. мед. наук / С.Н. Барзашка-Попова. - М., 1990. - 24 с.

'--------♦-----------