Генетическая конструкция на основе оптимизированного гена консенсусного гликопротеина вируса бешенства для профилактики бешенства
GENETIC CONSTRUCT BASED ON AN OPTIMIZED GENE OF RABIES VIRUS CONSENSUS GLYCOPROTEIN FOR PREVENTING RABIES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для разработки средств профилактики бешенства.
Уровень техники
Своевременная и доступная вакцинация от бешенства продолжает оставаться важным вопросом здравоохранения как в России, так и во всем мире. На сегодняшний день для предупреждения бешенства используют культуральную антирабическую вакцину, которая представляет собой препараты инактивированного вируса бешенства, выращенного в клеточных культурах или куриных эмбрионах. Такая вакцина иммуногенна и безопасна, но требует соблюдения строгих условий транспортировки, хранения (холодовая цепь), режима введения. Нарушение этих условий может привести к снижению эффективности соответствующих препаратов. В связи с этим разрабатываются различные рекомбинантные антирабические вакцины, среди которых важное место отводится ДНК-вакцинам [Стародубова Е.С., Преображенская О.В., Кузьменко Ю.В., Латанова А.А., Ярыгина Е.И., Карпов В.Л. 2015. Вакцины против бешенства: современное состояние и перспективы развития. Молекулярная биология, 49, 1-8]. К очевидным преимуществам препаратов ДНК-вакцин относятся достаточно простые технологии производства и нетребовательность к условиям хранения и транспортировки, что определяет их невысокую себестоимость.
В самом простом варианте ДНК-вакцина представляет собой плазмидный вектор, содержащий ген белка патогена и элементы, необходимые для транскрипции этого гена в клетках млекопитающих. ДНК-вакцины применяются для индукции протективного иммунного ответа против различных инфекций как у мелких животных, например, грызунов, так и у животных более крупных видов [Powell K. 2004. DNA vaccines-back in the saddle again? Nat Biotechnol, 22, 799-801.; Breathnach C.C., Clark H.J., Clark R.C., Olsen C.W., Townsend H.G. and Lunn D.P. 2006. Immunization with recombinant modified vaccinia Ankara (rMVA) constructs encoding the HA or NP gene protects ponies from equine influenza virus challenge. Vaccine, 24, 1180-1190.; Bahloul C., Taieb D., Diouani M.F., Ahmed S.B., Chtourou Y.,  Kharmachi H. and Dellagi K. 2006. Field trials of a very potent rabies DNA vaccine which induced long lasting virus neutralizing antibodies and protection in dogs in experimental conditions. Vaccine, 24, 1063-1072.]. Проводятся серии испытаний профилактических и терапевтических ДНК-вакцин против патогенов человека, таких как HIV-1 и HCV [Ulmer J.B., Wahren В. and Liu М.А. 2006. DNA vaccines for HIV/AIDS. Curr Opin HIV AIDS, 1, 309-313.; Liu Z., Singh D.K., Sheffer D., Smith M.S., Dhillon S., Chebloune Y., Hegde R., Buch S. and Narayan O. 2006. Immunoprophylaxis against AIDS in macaques with a lentiviral DNA vaccine. Virology, 351, 444-454.; Ahlen G., Soderholm J., Tjelle Т., Kjeken R., Frelin L., Hoglund U., Blomberg P., Fons M., Mathiesen I. and Sallberg M. 2007. In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis С virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 179, 4741-4753.].
В настоящее время разрабатываются и антирабические ДНК-вакцины, некоторые из них находятся на стадии клинических и доклинических испытаний [Kaur М., Garg R., Singh S. and Bhatnagar R. 2014. Rabies vaccines: where do we stand, where are we heading? Expert Rev Vaccines, 1-13.; Yang D.K., Kim H.H., Lee K.W. and Song J.Y. 2013. The present and future of rabies vaccine in animals. Clin Exp Vaccine Res, 2, 19-25.; Тучков И.В. и Никифоров A.K. 2010. ДНК-иммунизация против бешенства. Проблемы особо опасных инфекций, 104, 74-78.]. Для защиты организма от бешенства необходимым и достаточным условием является наличие нейтрализующих антител к гликопротеину (G-белку) вируса, поэтому ДНК-вакцины разрабатываются на основе гена именного этого белка. Однако, проведенные испытания демонстрируют, что антирабические ДНК-вакцины индуцируют иммунный ответ на гликопротеин, но не всегда способны обеспечить полную защиту от развития бешенства [Ferraro В., Morrow М.Р., Hutnick N.A., Shin Т.Н., Lucke С.Е. and Weiner D.B. 2011. Clinical applications of DNA vaccines: current progress. Clin Infect Dis, 53, 296-302.].
Так, например, было показано, что генная иммунизация мышей плазмидой, кодирующей гликопротеин вируса бешенства штамма Внуково-32, индуцирует у животных антитела, но обеспечивает защиту от развития болезни с эффективностью до 90% [Fodor I., Kucsera L., Fodor N., Palfi V. and Grabko V.I. 2000. Gene immunization of mice with plasmid DNA expressing rabies virus glycoprotein. Acta Vet Hung, 48, 229-236].
Важно отметить, что в настоящее время в Российской Федерации антирабические ДНК-вакцины не разрабатываются. Из российских генно-инженерных разработок по созданию вакцин против бешенства имеется патент №2008355 (дата публикации 28.02.1994) на фрагмент ДНК, кодирующий синтез гликопротеина G вируса бешенства, рекомбинантная плазмидная ДНК pvg18-1, кодирующая гликопротеин G вируса бешенства, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гликопротеина G вируса бешенства. Полученный рекомбинантный белок может быть использован в тесте ELISA, однако, использование гена в качестве вакцины не предполагается. Среди зарубежных исследований можно выделить работу [Fodor I., Kucsera L., Fodor N., Palfi V. and Grabko V.I. 2000. Gene immunization of mice with plasmid DNA expressing rabies virus glycoprotein. Acta Vet Hung, 48, 229-236], в которой было показано, что генная иммунизация мышей плазмидой, кодирующей гликопротеин вируса бешенства штамма Внуково-32, индуцирует у животных антитела, но обеспечивает защиту от развития болезни с эффективностью до 90%. В своей работе авторы использовали экспрессионный вектор pWS4 и фенольную очистку препаратов плазмидной ДНК, которыми иммунизировали мышей.
Ранее была составлена консенсусная аминокислотная последовательность гликопротеина штаммов вируса бешенства, зарегистрированных на территории РФ, и получена генетическая конструкция, содержащая кодон-оптимизированный ген такого консенсусного гликопротеина (патент РФ №2626605 С2). Предложенная ДНК-конструкция в составе вектора pVAX1 обеспечивает в трансфицированной культуре клеток человека увеличение экспрессии гена белка G по сравнению с экспрессией гена вирусного белка G штамма Внуково-32 в аналогичном векторе [Стародубова Е.С., Кузьменко Ю.В., Латанова А.А., Преображенская О.В., Карпов В.Л. Создание ДНК-вакцинного вектора на основе кодон-оптимизированного гена гликопротеина (белка G) вируса бешенства с консенсусной аминокислотной последовательностью. 2016. Молекулярная биология, 50, 376-380]. На эффективность экспрессии кодируемых плазмидами белков влияет много параметров. Так, помимо оптимизации гена по представленности кодонов значимое влияние оказывает GC-состав гена, наличие полиА участков и структура образуемой мРНК [Fath S., Bauer А.Р., Liss М., Spriestersbach А., Maertens В., Hahn P., Ludwig С., Schafer F., Graf M., Wagner R. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. 2011. PLoS One. 6(3), e17596]. В данном изобретении предложена новая генетическая конструкция на основе гена, оптимизированного не только по представленности коднов, но и по GC-составу и структуре образуемой мРНК, консенсусного гликопротеина вируса бешенства, которая предназначена для профилактики бешенства. Полученная плазмида протестирована на мышах. Сыворотки крови мышей однократно иммунизированных полученной плазмидой мышей проявляли антирабическую вируснейтрализующую активность, необходимую для защиты от развития бешенства (>0.5 МЕ/мл).
Раскрытие сущности изобретения
Задачей данного изобретения является создание рекомбинантной антирабической вакцины, стадии получения которой не включают работы с живым вирусом, и которая наиболее адаптирована против штаммов вируса, характерных для Российской Федерации. Предложенное нами изобретение направлено на решение задачи, которая заключается в создании высокоэффективной, недорогой и стабильной ДНК-вакцины против бешенства.
В настоящем изобретении предложена генетическая конструкция на основе плазмиды, содержащей оптимизированный ген гликопротеина (белка G) вируса бешенства с консенсусной аминокислотной последовательностью, для индукции антирабических вирус-нейтрализующих антител. Предложенный ранее кодон-оптимизированный ген консенсусного гликопротеина вируса бешенства (патент РФ №2626605 С2) был оптимизирован по GC составу, наличию полиА участков и структуре образуемой мРНК. На основе рассчитанной нуклеотидной последовательности методом сборки из синтетических олигонуклеотидов получен синтетический ген и клонирован в вектор в pVAX1, в окружение для эффективной экспрессии гена. Данная плазмида pGco получена клонированием ПРЦ-фрагмента, несущего сайт рестрикции BamHI, вариант измененнной последовательности Козак (ACCATGG) в начале гена, оптимизированный ген гликопротеина (длиной 1572 п.н.), и сайт рестрикции EcoRI, в вектор pVAX1 (фирма "Invitrogen" Cat. No V260-20) по сайтам BamHI / EcoRI. Получен препарат плазмиды, представляющий собой раствор (1 мг/мл плазмиды в физиологическом растворе), который был использован для антирабической вакцинации (однократная иммунизация, проведенная в виде двух внутримышечных инъекций) лабораторных мышей, которая вызывала уже через 21 день образование вирус-нейтрализующих антител в титре >0.5 МЕ/мл.
Из наиболее близких разработок можно отметить патент РФ 2319504 (дата публикации 20.03.2008) на вакцину против бешенства собак (варианты), способ вакцинации (варианты), набор для вакцинации (варианты). Данная вакцина против бешенства собак представляет собой плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок G вируса бешенства. В отличие от настоящей заявки в данном изобретении используется другой базовый вектор pVR1012, а также кодируемый гликопротеин относится к штамму ERA вируса бешенства, при этом ген гликопротеина был получен с помощью RT-PCR с РНК генома вируса бешенства.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание генетической конструкции, применяемой для антирабической вакцинации с обеспечением выработки антирабических вируснейтрализующих антител с активностью, превышающей необходимый для защиты от развития бешенства уровень.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Схематическое отображение плазмиды pGco для экспрессии в клетках млекопитающих оптимизированного гена гликопротеина с консенсусной аминокислотной последовательностью с указанием сайтов клонирования и других уникальных сайтов рестрикции.
Осуществление изобретения
Пример 1. Оптимизация нуклеотидной последовательности гена консенсусного гликопротеина вируса бешенства.
Предложенный ранее кодон-оптимизированный ген консенсусного гликопротеина вируса бешенства (патент РФ №2626605 С2) был проанализирован по GC-составу, наличию полиА участков и структуре образуемой мРНК. Сначала в гене были проведены нуклеотидные замены, повышающие GC-содержание, но не приводящие к изменению аминокислотной последовательности. Затем был проведен скрининг гена и сделаны замены нуклеотидов, позволяющие убрать полиА участки и при этом не изменять аминокислотной последовательности. Проведен анализ вторичной структуры мРНК на сервере RNAfold web server (http://rna.tbi.inivie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi) и внесены корректировки замен. В результате составлена последовательность, с которой образуется мРНК со следующими параметрами: минимальная свободная энергия оптимальной вторичной структуры (optimal secondary structure in dot-bracket notation with a minimum free energy) -540.80 kcal/mol; свободная энергия термодинамических структур (free energy of the thermodynamic ensemble) -562.80 kcal/mol; разнообразие структур (ensemble diversity) 516,01; минимальная свободная энергия центроидной вторичной структуры (centroid secondary structure in dot-bracket notation with a minimum free energy) - 364.80 kcal/mol.
По сравнению с исходным геном, полученный ген имел более высокое содержание GC, которое составило 54,5; не имел участков, содержащих более трех последовательных А; а также вторичная структура образуемой мРНК была более свободной, особенно на 5'-конце.
Пример 2. Получение генетической конструкции.
Оптимизированный ген консенсусного гликопротеина получали путем сборки синтетических олигонуклеотидов. С помощью ПЦР получали ДНК-фрагмент, несущий сайт рестрикции BamHI (GGATCC), измененная последовательность Козак (ACCATGG) в начале гена, кодон-оптимизированный ген гликопротеина (длиной 1572 п.н.) и сайт рестрикции EcoRI (GAATCC). Полученный фрагмент ДНК клонировали в вектор pVAX1 («Invitrogen») по сайтам рестрикции BamHI / EcoRI и получали плазмиду pGco (Фиг. 1). Правильность нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO 1) подтверждали секвенированием.
Таким образом, в данной плазмиде pGco для экспрессии в клетках млекопитающих ген гликопротеина находится под контролем раннего промотора цитомегаловируса человека (CMV), имея последовательность Козак в подобранном варианте ACCATGG для эффективного старта трансляции, содержит сигнал терминации трансляции TGA, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста для эффективной терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК. Также для селективной наработки плазмиды в клетках E.coli в плазмиде присутствуют ориджин репликации (pUC ori) и ген устойчивости к канамицину.
Пример 3. Препаративное выделение и очистка плазмиды. Приготовление вакцинного препарата.
Выделение плазмидной ДНК в условиях пониженного содержания эндотоксинов проводилось методом щелочного лизиса с последующей хроматографической очисткой с использованием ряда коммерчески доступных наборов «EndoFree Plasmid Kit» («Qiagen», США). На последнем этапе выделения осадок плазмидной ДНК растворяли в воде и измеряли концентрацию ДНК спектрофотометрически на приборе ND-1000 (NanoDrop Technologies, США).
Вакцинный препарат был получен в результате добавления 5 М NaCl и воды к растворенному в воде образцу плазмидной ДНК, таким образом, чтобы конечная концентрация плазмиды в препарате составляла 1 мг/мл в физиологическом растворе (0.9% водный раствор NaCl).
Пример 4. Иммунизация мышей и получение сывороток крови для определения специфической антирабической активности крови иммунизированных мышей.
Исследование выполнялось на мышах линии BALB/c (Питомник лабораторных животных "Пущино") в возрасте 6-8 недель. С животными проводились манипуляции типа А (манипуляции, причиняющие минимальную боль и дискомфорт): содержание животных в неволе, кратковременное ограничение подвижности (фиксация), однократный отбор крови, стандартные методы эвтаназии (приводящие к быстрой потере сознания), кратковременное (несколько часов) ограничение в пище и воде. В соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Совет Европы, Страсбург, 2004 г.), были соблюдены рекомендуемые параметры микроклимата и содержания лабораторных животных.
Для животных был установлен 10-дневный срок карантирования. В период карантина за животными велось ежедневное клиническое наблюдение, термометрия и регистрация общего состояния животных в специальном журнале регистрации поступления и распределения лабораторных животных. Случаев болезни и падежа выявлено не было.
Для оценки способности исследуемой ДНК-конструкции активировать иммунный ответ была проведена иммунизация мышей экспериментальными образцами. Было сформировано четыре группы по 16 особей. Для оценки эффективности исследуемого препарата pGco в эксперимент была включена вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения антирабического иммуноглобулина (КОКАВ, ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН»). Данный препарат утвержден в Российской Федерации для оказания лечебно-профилактической помощи людям, пострадавшим от укуса или контакта с зараженными или подозрительными животными, а также для профилактической вакцинации.
Кроме того, были сформированы две контрольные группы мышей: группа, получавшая вектор pVAX1 без гена гликопротеина, и группа, которой был введен только физиологический раствор.
Экспериментальные образцы вводили инсулиновым шприцом с иглой в четырехглавую мышцу бедра в количестве 50 мкг, растворенных в 50 мкл физиологического раствора, по две инъекции на мышь. Доза КОКАВ была определена с использованием коэффициента пересчета доз (мг/кг) с животных на человека («Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» под редакцией А.Н. Миронова). Данный объем вводили двумя инъекциями в четырехглавую мышцу бедра. Физиологический раствор вводили в четырехглавую мышцу бедра в количестве 50 мкл, по две инъекции на мышь.
Через 21 день после иммунизации у животных проводили посмертный отбор крови для получения сывороток. При этом кровь после взятия 25-30 мин выдерживали в термостате при +37°С, затем центрифугировали 10 мин при 2000*g и отбирали надосадочную жидкость, представляющую собой сыворотку. Полученные сыворотки хранили при +4°С для дальнейшего исследования на наличие антирабической вируснейтрализующей активности.
Определение титра антирабических нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей проводили биологическим методом в соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи и НД ЛСР-0080016\10-120810, а также методом FAVN согласно Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals, 2008. Метод FAVN использует флуоресцентный вируснейтрализующий тест, рекомендованный Всемирной Ассоциацией Здравоохранения.
В течение 1-2 дней после получения сывороток крови проводили определение титра антител методом FAVN. Для теста использовали пробы, представляющие собой смесь сывороток каждой группы мышей.
В ходе проведенного исследования полученных проб сывороток крови мышей было установлено, что антирабической вируснейтрализующей активностью обладали сыворотки мышей, иммунизированных pGco (титр 1.95 МЕ/мл) и КОКАВ (титр 0.85 МЕ/мл), что является выше порогового уровня 0.5 МЕ/мл, предписанным OIE. Остальные сыворотки крови мышей не обладали вируснейтрализующей активностью.