ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ И СОДЕРЖАЩЕЕ 2-МЕТИЛТИО-5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-a]ПИРИМИДИН-7(3Н)-ОН
MEDICATION POSSESSING ANTI-VIRAL ACTIVITY AND CONTAINING 2-METHYLTHIO-5-METHYL-6-NITRO-1,2,4-TRIAZOLO[1,5-a]PYRIMIDIN-7(3H)-ON

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается лекарственного средства, содержащего 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных вирусных заболеваний животных и человека, и может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, в животноводстве и птицеводстве.
Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью. В литературе описано получение 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она нитрованием 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Y.Makisumi Synthesis of potential anti-cancer agents. VII. 6-Nitro- and 6-amino-s-triazolo[2,3-a]pyrimidines, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1961, №9, p.873-877; Т.П.Кофман, Т.А.Уварова, Г.Ю.Карцева, Т.Л.Успенская 6-Нитро- и 6-бромпроизводные 4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, Журнал органической химии, 1997, т.33, вып.12, с.1784-1793); упоминается также натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а] пиримидин-7-она (М.Н.Кушнир, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, Н.А.Клюев, С.В.Шоршнев, Г.Г.Александров, О.Н.Чупахин Нитроазины. XXII. Алкилирование и прототропная таутомерия в ряду 6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинов, Журнал органической химии, 1993, т.29, вып.3, с.629-638); также имеются данные об анти-арбовирусной активности 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Виноград И.А., Пластунов В.А., Козловский М.М., Бенцель Л.В., Билецка Г.В., Лозинский И.М., Рогочий Е.Г., Шоломей М.Д. Микробioлогичнiй Журнал. 2001, т.63, №2, с.14-19).
В качестве изобретения предлагается лекарственное средство, содержащее активную составляющую, обладающую противовирусным действием и представляющую собой 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он формулы (1). Кроме соединения (1) лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемые компоненты: наполнители, разбавители и/или другие вспомогательные вещества.
Для оценки противовирусных свойств соединения (1) и лекарственного средства на его основе использованы известные противовирусные лекарственные препараты - ремантадин, арбидол и рибавирин.
Соединение (1) получено конденсацией 3-метилтил-5-амино-1,2,4-триазола (2) с ацетоуксусным эфиром с последующим нитрованием образующегося 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (3).
Соединение (1) представляет собой бледно-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, этаноле, диметилсульфоксиде, нерастворимое в этилацетате, хлороформе, гексане.
1
Данные элементного анализа, ЯМР Н и ИК-спектроскопии соединения (1) полностью соответствуют приписываемому строению (см. пример 1).
Лекарственное средство может быть использовано либо перорально, либо с помощью парентеральных инъекций в растворе. Оно может применяться самостоятельно, например в форме микрокапсул, либо с подходящими вспомогательными средствами и/или наполнителями.
Подходящие твердые или жидкие лекарственные формы включают, к примеру, гранулы, порошки, покрытые оболочкой таблетки, микрокапсулы, суппозитории, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии, капли или инъекционные растворы, а также препараты с целевой доставкой активной субстанции, в производстве которых обычно используются вспомогательные вещества, такие как наполнители, дезинтеграторы, связующие, создающие оболочку агенты, разрыхлители, смазочные добавки, отдушки или подсластители. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, диоксид титана, лактоза, маннитол и другие сахара, тальк, молочный альбумин, желатин, мука, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода, и моноатомные и полиатомные спирты, например глицерин.
Пример 1. Синтез 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]-пиримидин-7(3Н)-она (1)
1 стадия: 2-Метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (2). Смесь 130 г (1 моль) 3-метилтио-5-амино1,2,4-триазола (3) и 140 мл (1,1 моль) ацетоуксусного эфира в 300 мл уксусной кислоты кипятят в течение 2 часов. После охлаждения реакционной массы выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из воды и сушат на воздухе при комнатной температуре. Выход (2) 125,5 г (64%).
2 стадия: 2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (1). К смеси 76 мл (1,25 моль) концентрированной азотной кислоты (d 1,4 г/мл) и 250 мл концентрированной серной кислоты (d 1,83 г/мл), охлажденной до 0°С, добавляют порциями 98 г (0,5 моль) 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-она (3) таким образом, чтобы температура реакционной массы не превышала 40°С. После добавления всего вещества реакционную массу перемешивают 3 часа при комнатной температуре и выливают в 500 мл ледяной воды. Полученный раствор нейтрализуют концентрированным водным аммиаком и отфильтровывают выпавший осадок аммониевой соли. Аммониевую соль суспендируют в 40 мл воды, охлаждают до 5°С и аккуратно приливают концентрированную соляную кислоту до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход (1) 67,5 г (54%).
2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он имеет следующие физико-химические характеристики:
ПЛ
6
3
3
7
7
5
3
2
1
-1
Т>280°С; Н ЯМР-спектр в ДМСО-d δ, м.д.: 2,57 (3Н, т, С-СН), 3,02 (3Н, с, SCH), 10,2 (1Н, уш.с, NH). Найдено: С - 34.62, Н - 3,07, N - 29,22. Брутто-формула - СНNOS. Вычислено: С - 34.85, Н - 2.92, N - 29.03%. ИК-спектр, ν, см: 1365, 1558 (вал, NO), 1720 (вал, С=O), 3420 (вал, NH).
Пример 2. Оценка токсичности соединения (1)
1. Оценка цитотоксичности.
Цитотоксичность оценивали в отношении культуры клеток GМК-АН-1(Д) и СПЭВ. Плотность клеток составляла 250 тыс./мл. Суспензию клеток по 1 мл вносили в стеклянные пробирки, в течение 48 ч инкубировали при 37°С для формирования монослоя. Подготовленные на среде поддержания в концентрации от 500 до 2 мкг/мл соединение (1) вносили в пробирки с монослоем культуры клеток. На каждую дозу соединения (1) использовали по 4 пробирки с монослоем. Визуальный учет с помощью светового микроскопа проводили ежедневно. Начальные этапы цитопатического действия (ЦПД) характеризовались изменением морфологии клеток, далее наблюдали их округление и отслоение от стекла, разрушение монослоя. В зависимости от концентрации препарата ЦПД наступало на 1-7 сутки после внесения препаратов.
Деструктивные изменения 50% клеток СПЭВ наблюдали при внесении в питательную среду 500 мкг/мл соединения (1). В 25% случаях деструкцию монослоя клеток вызывало соединение в дозе 250 мкг/мл. В культуре клеток GMK-AH-(Д) 50% деструкцию монослоя вызывало внесение в питательную среду 500 мкг/мл соединения. При внесении соединения в концентрации 250 мкг/мл цитопатические изменения в культуре клеток СПЭВ и GMK-AH-1(Д) не были обнаружены.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что максимально-переносимая доза (МПД) соединения (1) для культуры клеток СПЭВ составляет 125 мкг/мл, GMK-AH-1(Д) - 25 мкг/мл.
2. Острая токсичность для лабораторных животных
50
Острую токсичность соединения (1) оценивали для неинфицированных 2-недельных белых мышей-сосунков при однократном пероральном введении соединения (1). Разведения соединения (1) в диапазоне от 30 мг/кг до 2000 мг/кг готовили на физ. растворе и вводили животным по 0.05 мл однократно. На каждое разведение использовали не менее 20 животных, за которыми осуществляли наблюдение в течение 14 дней. Рассчитывали ЛД по Керберу в модификации И.П.Ашмарина. Контролировали изменения в поведении животных, внешнего вида, веса, а также отсутствие или наличие гибели животных. Результаты оценки токсичности, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что соединение (1) в концентрации от 30 до 250 мг/кг нетоксично для белых мышей массой 4-5 г при однократном пероральном применении. При максимально используемой дозе 100% гибель животных при однократном применении соединения (1) также отсутствовала.
50
Таким образом, рассчитать ЛД для белых мышей не представляется возможным. В более высоких концентрациях в малом объеме растворителя соединение (1) плохо растворимо, густая консистенция их не позволяет использовать конюли для введения животным.
Таблица 1Оценка токсичности препаратов при однократном пероральном введении белым мышам - сосункам
Препарат
Концентрация препарата, мг/кг массы животного
2000
1000
500
250
125
62
31
количество животных павших/количество животных в опыте
Соединение (1)
-
2/20
1/20
0/20
0/20
0/20
0/20
Пример 3. Изучение эффективности соединения (1) в культурах клеток
1. В отношении вируса Западного Нила
Изучение противовирусной эффективности соединения (1) в отношении вируса Западного Нила (ЗН) проводили в культуре клеток GMK-АН-1(Д). Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 4 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Затем вносили свежую среду, содержащую исследуемые дозы соединения (1), и инкубировали в течение 2-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации клетки разрушали криодеструкцией: трехкратным быстрым замораживанием (в криостате при температуре минус 30°С) и быстрым оттаиванием (водяная баня при комнатной температуре). Уровень накопления возбудителя в исследуемых пробах определяли титрованием проб методом получения негативных колоний вируса в монослое культуры клеток GMK-AH-1(Д) под твердым агаровым покрытием.
Результаты оценки противовирусной эффективности представлены в таблице 2. При применении в максимально переносимой концентрации соединения (1) подавление репродукции вируса составило 60,0%.
Таблица 2Изучение влияния препаратов на репродукцию вируса ЗН, штамм Eg 101 в культуре клеток GMK-AH-1(Д)
Препарат
Доза препарата, мкг/мл
Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл
Уровень подавления репродукции вируса, Δ, lg
Коэффициент ингибирования, процент
2
3
4
5
6
Соединение (1)
100
6,5
0,4
60,0
10
6,7
0,2
37,5
1
6,8
0,1
18,8
Рибавирин
100
5,0
1,9
98,6
Контроль дозы вируса
-
6,9
-
-
2. В отношении вируса гриппа A (H5N1)
50
Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vitro в культуре клеток МДСК. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД/мл.
50
Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) и ремантадин вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 10 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,1 ЦПД/клетку. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, затем вносили свежую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов, и инкубировали в течение 3-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации визуально учитывали цитопатический эффект, вызванный в культуре клеток вирусом, с использованием светового микроскопа (объектив х 8-10, окуляр х 7-10).
Результаты изучения подавления цитопатической активности вируса гриппа препаратами в культуре клеток MDCK, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что при использовании соединения (1) через 1 ч после инфицирования культуры клеток уровень подавления ЦПД вируса составил 40%.
Таблица 3Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению цитопатического действия вируса
Препарат
Доза препарата, мкг/мл
Частота выявления ЦПД, Х
Подавление ЦПД, процент, Х±σ<sub>х</sub>
Соединение (1)
100,0
19/30
36,6±3,3
10,0
25/30
16,7±3,3
1,0
10/10
0
Ремантадин
25
3/30
86,7±3,3
Контроль дозы
-
30/30
-
Контроль среды
-
0/10
-
В таблице 4 проведены результаты изучения подавления репродукции вируса в культуре клеток MDCK. Уровень накопления вируса оценивали титрованием проб по гибели РКЭ. Соединение (1) в максимальной концентрации также статистически значимо подавляет репродукцию вируса гриппа. При этом коэффициент ингибирования составил 98,2%. Препарат сравнения ремантадин практически полностью подавлял репродукцию вируса.
Таблица 4Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению репродукции вируса
Препарат
Доза препарата, мкг/мл
Схема внесения препарата
Уровень накопления вируса, lg ЭЛД<sub>50</sub>/мл
Уровень подавления накопления вируса, Δ, lg
Коэффициент ингибирования, процент
Соединение (1)
100
+1 ч
5,3
1,7
98,2
Ремантадин
25
+2 ч
2,0
5,0
99,99
Контроль
-
-
7,0
-
-
Пример 4. Изучение эффективности препаратов на лабораторных животных 1. Изучение эффективности препаратов в отношении вируса гриппа А (H5N1)
50
50
50
Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vivo с использованием белых мышей массой 12-15 г. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД/мл, 9,01g ЭЛД/мл, 5,0 lg ЛД/мл.
Соединение (1) и соединение сравнения вводили белым мышам перорально по профилактической и лечебной схемам, а также по схеме экстренной профилактики.
Результаты изучения профилактической эффективности соединения в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1), представлены в таблицах 5. Защита от гибели при использовании соединения (1) составила в среднем 20%.
Таблица 5Изучение профилактической эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1)
Препарат
Схема введения препарата
Доза препарата,мг/кг
Количество животных в группе
Гибель животных
Защитная эффективность от гибели, процент
Среднее время жизни животных в группе, дни
Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни
-120 ч…
9,4
0,7
Соединение (1)
-24 ч, -1 ч
50
20
16
20
60
20
11
47
11,3
2,8
Арбидол
-24 ч, -1 ч
30
20
11
45
11,6
2,5
Контроль дозы
-
-
20
20
-
8,7
-
Контроль стада
-
-
20
0
-
14
-
Результаты изучения эффективности соединения (1) и препаратов сравнения при применении его по схеме экстренной профилактики и лечебной схеме, представленные в таблицах 6 и 7, свидетельствуют об эффективности заявляемого соединения.
Таблица 6Изучение эффективности в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) при введении его по схеме экстренной профилактики
Препарат
Схема введения препарата
Доза препарата, мг/кг
Частота гибели животных
Защитная эффективность от гибели, процент
Среднее время жизни животных в группе, дни
Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни
Соединение (1)
+1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч, +120 ч, 144 ч
50
10/20
50
11,7
3,5
Арбидол
30
16/20
20
9,4
1,2
Контроль дозы
-
-
20/20
-
8,2
Контроль стада
-
-
0/20
-
14,0
-
Таблица 7Изучение лечебной эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1)
Препарат
Схема введения препарата
Доза препарата, мг/кг
Частота гибели животных
Защитная эффективность от гибели, %
Среднее время жизни животных в группе, дни
Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни
Соединение (1)
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч,
15/20
25
8,4
1,7
+120 ч, +144 ч
50
Арбидол
+24 ч, +48 ч, +7
135
18/20
10
7,1
0,4
2 ч, +96 ч
Контроль дозы
-
-
20/20
-
6,7
-
Контроль стада
-
-
0/20
-
14,0
-
2. Изучение эффективности в отношении вируса Западного Нила
50
Для оценки протективной эффективности белых мышей инфицировали подкожно в дозе 10ЛД. Препараты вводили перорально в дозе 50 мг/кг по следующим схемам: профилактика - в течение 6 суток до инфицирования раз в день и за 1 ч до инфицирования; экстренная профилактика - через 1 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток; лечение - через 24 ч после инфицирования и далее в течение 6 суток. Результаты оценки эффективности, представленные в таблице 8, свидетельствуют о том, что соединение (1) эффективно в отношении экспериментальной формы ЛЗН у белых мышей и защищает от гибели 20% инфицированных животных. При этом удлинение СВЖ составило 2,3 суток. При экстренной профилактике защитная эффективность составила 20%.
Таблица 8Результаты оценки эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила у белых мышей
Препарат
Схема
Коэффици-ентзащиты, %
Среднее время жизни, сутки
Удлинение среднего времени жизни, Δ сутки
Уровень накопления вируса в головном мозгу павших животных
lg БОЕ/мл
Δ, lg
-144 ч, -120 ч, -96 ч,
20,0
14,5
2,3
7,4
0,9
-72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч
Соединение
+1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч,
20,0
14,0
1,8
7,5
0,8
(1)
+96 ч, +120 ч, +144 ч
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +9
0
12,1
0
8,5
0
6 ч, +120 ч, +144 ч
-72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч
50,0
17,1
4,9
6,1
2,2
+1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч,
85,0
21,0
8,8
0
8,3
Рибавирин
+96 ч, +120 ч, +144 ч
+24 ч, +48 ч, +72 ч, +9
10,0
12,3
0,1
7,8
0,5
6 ч, +120 ч, +144 ч
Контроль дозы
-
-
12,2
-
8,3
-
Контроль стада
-
-
21,0
-
-
Таким образом, лекарственное средство, содержащее в качестве активной составляющей соединение (1) - 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладает высоким противовирусным действием, превышающим действие известных лекарственных средств, и может быть использовано в качестве противовирусного средства.