КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СМЕСЬ ФЛАВОНОИДОВ СО СВОБОДНЫМ КОЛЬЦОМ И ФЛАВАНОВ, КОТОРАЯ ПРЕДНАЗНАЧЕНА ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ УХУДШЕНИЯ КОГНИТИВНОЙ СПОСОБНОСТИ И СВЯЗАННЫХ С ВОЗРАСТОМ ОСЛАБЛЕНИЙ ПАМЯТИ
COMPOSITION CONTAINING MIXED FREE-RING FLAVONOIDS AND FLAVANOV USED FOR PREVENTION AND TREATMENT OF IMPAIRED COGNITION AND AGE-SPECIFIC AMNESIA

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к заявляемой композиции, приготовленной для применения с целью предупреждения и лечения нейродегенерации, нейровоспаления и кумулятивного ухудшения когнитивной способности, нарушений, заболеваний и состояний, обусловленных воздействием реакционно-способных видов кислорода (ROS), воспалительных белков и эйкозаноидов. В частности, настоящее изобретение относится к новой заявляемой композиции, содержащей смесь представителей двух специфических классов соединений - флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, предназначенной для применения с целью предупреждения и лечения связанных с возрастом, когнитивных, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний и состояний, опосредуемых окислительным инсультом, воспалением и связанными с циклооксигеназой (СОХ) и липооксигеназой (LOX) путями. Заболевания и состояния включают (но не ограничиваясь ими) нейродегенеративные нарушения, «удар», деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический боковой склероз (АБС) и ухудшение познавательной способности в престарелом возрасте.
Предпосылки создания изобретения
Высвобождение и метаболизм арахидоновой кислоты (АК) из клеточной мембраны приводит к образованию провоспалительных метаболитов несколькими различными путями. По-видимому, два наиболее важных пути, приводящие к воспалению, опосредуются ферментами 5-липооксигеназой (5-LO) и циклооксигеназой (СОХ). Эти параллельные пути приводят к образованию лейкотриенов и простагландинов соответственно, которые играют важную роль в инициации и развитии воспалительного ответа. Эти вазоактивные соединения являются хемотаксинами, которые стимулируют инфильтрацию воспалительных клеток в ткани и обеспечивают пролонгированный воспалительный ответ. Вследствие этого ферменты, способные образовывать эти медиаторы воспаления, были выбраны в качестве мишени для многих новых лекарственных средств, предназначенных для лечения воспаления, которое участвует в патогенезе таких заболеваний, как ревматоидный артрит, остеоартрит, болезнь Альцгеймера и некоторые типы рака.
2
Ингибирование фермента СОХ представляет собой механизм действия, присущий большинству нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (НСПВЛ). Существует две различные изоформы фермента СОХ (СОХ-1 и СОХ-2), последовательности которых гомологичны примерно на 60%, но которые различаются профилями экспрессии и функцией. СОХ-1 представляет собой конститутивную форму фермента, связанную с продуцированием физиологически важных простагландинов, которые участвуют в регуляции обычных физиологических функций, таких как агрегация тромбоцитов, защита клеточной функции в желудке и поддержание нормальной функции почек (Dannhardt и Kiefer, Eur. J. Med. Chem., 36, 2001, с.109-126). Вторая изоформа, СОХ-2, представляет собой форму фермента, индуцируемую провоспалительными цитокинами, такими как интерлейкин-1β (IL-1β), и другими факторами роста (Herschmann, Cancer Metastasis Rev., 134, 1994, сс.241-256; Xie и др., Drugs Dev. Res., 25, 1992, сс.249-265). Эта изоформа катализирует производство простагландина Е2 (PGE) из АК. Ингибирование СОХ-2 обусловливает противовоспалительную активность обычных НСПВЛ.
2
Очевидно, что ингибиторы, обладающие двойной специфичностью в отношении и СОХ-2, и 5-LO, при сохранении избирательности в отношении СОХ-2 по сравнению с СОХ-1, имеют преимущество с точки зрения ингибирования нескольких путей метаболизма АК. Такие ингибиторы могут блокировать воспалительные действия простагландинов (PG), а также многих лейкотриенов (LT), путем ограничения их производства. Это относится к сосудорасширяющему, повышающему проницаемость сосудов и хемотаксическому действиям PGE, LTB4, LTD4 и LTE4, которые известны также в качестве обладающих медленной реакцией анафилактических субстанций. Среди них LTB4 обладает наиболее сильными хемотаксическим и хемокинетическим действиями (Moore, в Prostanoids: Pharmacological, Physiological and Clinical Relevance, изд-во Cambridge University Press, N.Y., 1985, cc.229-230).
Помимо указанных выше преимуществ двойных ингибиторов COX-2/5-LO многие двойные ингибиторы не вызывают некоторых побочных действий, типичных для НСПВЛ или ингибиторов СОХ-2, включая как желудочно-кишечные повреждения, так и дискомфорт, связанный с традиционными НСПВЛ. Было выдвинуто предположение, что индуцируемое НСПВЛ воспаление желудка в основном обусловлено метаболитами 5-LO, прежде всего LTB4, который привлекает клетки к месту желудочного повреждения, вызывая тем самым его дальнейшее развитие (Kircher и др., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 56, 1997, cc.417-423). Лейкотриены представляют собой первичные метаболиты АК в слизистой оболочке желудка после простаноидного ингибирования. По-видимому, эти соединения вносят значительный вклад в повреждение эпителия желудка, возникающего при применении НСПВЛ (Celotti и Laufer, Pharmacological Research, 43, 2001, cc.429-436). На модели артрита сердца у крыс установлено также, что двойные ингибиторы СОХ и 5-LO ингибируют сужение коронарных сосудов (Gok и др., Pharmacology, 60, 2000, cc.41-46). Взятые в совокупности эти данные позволяют предположить, что двойные ингибиторы СОХ-2 и 5-LO могут иметь выраженные преимущества по сравнению со специфическими ингибиторами СОХ-2 и неспецифическими НСПВЛ с точки зрения как более высокой эффективности, так и уменьшенных побочных действий.
Поскольку механизм действия ингибиторов СОХ частично совпадает с механизмом действия большинства обычных НСПВЛ, ингибиторы СОХ применяют для лечения тех же многочисленных симптомов, которые лечат с помощью НСПВЛ, таких как боль и опухание, связанные с воспалением при кратковременных состояниях и при хронических заболеваниях, в которых воспаление играет решающую роль. Лечение кратковременных состояний включает лечение воспаления, связанного с небольшими ссадинами, солнечным ожогом или контактным дерматитом, а также ослабление боли, связанной с повышенным давлением, мигренью и менструальными спазмами. К хроническим состояниям относятся артритные заболевания, такие как ревматоидный артрит и остеоартрит. Хотя ревматоидный артрит в основном представляет собой аутоиммунное заболевание, а остеоартрит обусловлен деградацией хряща в суставах, уменьшение воспаления, связанного с каждым из этих заболеваний, позволяет значительно повышать качество жизни индивидуумов, страдающих этими заболеваниями (Wienberg, Immunol. Res., 22, 2001, сс.319-341; Wollhiem, Curr. Opin. Rheum., 13, 2000, сс.193-201). Поскольку воспаление представляет собой компонент ревматических заболеваний в целом, применение ингибиторов СОХ было расширено и включило такие заболевания, как системная красная волчанка (SLE) (Goebel и др., Chem. Res. Tox., 12, 1999, сс.488-500; Patrono и др., J. Clin. Invest., 76, 1985, сс.1011-1018) и ревматические кожные состояния, такие как склеродерма. Ингибиторы СОХ применяют также для облегчения воспалительных кожных состояний, не имеющих ревматического происхождения, таких как псориаз, при которых уменьшение обусловленного сверхпродуцированием простагландинов воспаления может оказывать непосредственное благоприятное действие (Fogh и др., Acta Derm. Venereol (Oslo), 73, 1993, сс.191-193).
Научные исследования, проведенные в последнее время, позволили выявить корреляцию между экспрессией СОХ-2, общим воспалением и патогенезом болезни Альцгеймера (БА) (Но и др., Arch. Neurol., 58, 2001, сс.487-492). На моделях с использованием животных установлено, что у трансгенных мышей, в организме которых происходит сверхэкспрессия фермента СОХ-2, нейроны обладают повышенной чувствительностью к повреждению. Национальный институт по проблемам старения (The National Institute on Aging (NIA)) начал клинический опыт с целью определения того, могут ли НСПВЛ замедлять развитие болезни Альцгеймера. Планируется провести оценку напроксена (НСПВЛ неизбирательного действия) и рофекоксиба (Vioxx, специфическое НСПВЛ, обладающее избирательным действием в отношении СОХ-2). Ранее было установлено, что воспаление оказывает влияние на болезнь Альцгеймера. Согласно данным Ассоциации Альцгеймера и NIA от болезни Альцгеймера (БА) страдают примерно 4 миллиона людей в Соединенных Штатах и ожидается, что в середине столетия это количество увеличится до 14 миллионов.
2
Защитное действие НСПВЛ в патогенезе БА обусловлено ингибированием СОХ-2 и непосредственным предупреждением амилоидоза в головном мозге (Xiang и др., Экспрессия гена, 10, 2002, сс.271-278). В результате подавления производства провоспалительного простагландина PGE ферментом СОХ-2 обеспечивается также защита окружающих нейронов от окислительного и воспалительного инсульта, который может возникать при активации микроглии (Combs и др., Neurochem. Intl., 39, 2001, сс.449-457). Это действие исключает последующее образование микроглией цитокинов и ROS, которые питают цикл и распространяют (развивают!!) нейродегенерацию (Kalaria и др., Neurodegeneration, 5, 1996, сс.497-503; Combs и др., J. Neurosci., 19, 1999, сс.928-939). НСПВЛ ингибируют также активность γ-секретазы, предотвращая тем самым процессинг амилоидного белка-предшественника (АРР), повышение уровней амилоид-бета (Ab) пептида и развитие нейрофибриллярных сплетений (NFT) и невритных бляшек (Weggen и др., Nature, 414, 2001, сс.212-216; Takahashi и др., J. Biol. Chem., 278, 2003, сс.18664-18670).
Прогрессирующее нервное истощение, происходящее при воздействии ROS, цитокинов и провоспалительных эйкозаноидов, проявляется при многих болезненных состояниях, которые все имеют общие причины. Эти заболевания в настоящее время лечат с помощью НСПВЛ, которые обладают защитными в отношении познавательной способности и нейрозащитными свойствами, обусловленными их многофакторной активностью в отношении ROS, цитокинов и провоспалительных эйкозаноидов. Их действие заключается в ингибировании амилоидных отложений, уменьшении производства тромбоксана и простаноидов, снижении производства цитокинов, предупреждении активации микроглий, снижению производства ROS и, в некоторых случаях, они обладают высокой антиоксидантной активностью. Все эти виды активности могут предупреждать ухудшение когнитивной способности и замедлять кумулятивное действие в отношении нейродегенерации, обусловленной окислительным стрессом и старением.
Нейрозащитная активность НСПВЛ представляет собой основу современных теорий, касающихся соматического и нейродегенеративного ухудшения, происходящего при различных дегенеративных болезненных состояниях, старении, воспалении и окислительном стрессе. Уже первые исследования позволили установить, что воздействие ионизирующего излучения имитирует некоторые такие состояния, вызывая сходные гистопатологические изменения в подвергнутых облучению органах, и их антиоксидантный статус позволяет предположить, что причинным фактором является образование свободных радикалов (Gerschman и др. Science, 119, 1954, сс.623-626; Harman, J. Gerontol., 11, 1956, сс.289-300; Harman, J.Gerontol, 2, 1957, сс.298-300). Введение антиоксидантов перед воздействием излучения обеспечивает организм определенной защитой от его повреждающих воздействий. На основе этих исследований было сделано заключение о том, что пролонгированное воздействие окислительного стресса, вызванного свободными радикалами, которые образуются в результате ионизирующего излучения или окислительного метаболизма, нарушает внутриклеточный окислительно-восстановительный (REDOX) баланс и приводит к повреждениям внутри и на поверхности самой клетки, если оно не сдерживается антиоксидантной защитой. Исходя из этих данных были проведены основополагающие исследования по увеличению продолжительности жизни и нейрозащите на основе снижения уровней свободных радикалов в результате воздействия на основной обмен путем ограничения калорийности пищи (Berg и Simms, J.Nutr., 71, 1960, сс.255-261; Weindruch и Walford, The retardation of aging and disease by dietary restriction, изд-во С.С.Thomas, Springfield, IL, 1988).
Berg и Simms выдвинули предположение, что поддержание соматической функции коррелирует с ограниченным потреблением калорийной пищи и последующим сниженным производством свободных радикалов вследствие окислительного метаболизма, прежде всего с ограничением калорийности (ОК) (Berg и Simms, J. Nutr., 71, 1960, сс.255-261). Harman сделал предположение, что такая защита, осуществляемая с помощью антиоксидантов, может распространяться на нервную систему в результате предупреждения пероксидации липидов (Harman, J.Gerontol., 23, 1969, сс.476-482). Другие исследователи обнаружили, что повреждение клетки и ДНК, по-видимому, в целом коррелирует с интенсивностью основного обмена в организме (ИОО) и продемонстрировали, что чем выше ИОО, тем меньше продолжительность жизни и больше повреждение клетки и ДНК (Barja, Free Rad. Biol. Med., 33, 2002, сс.1167-1172). Объяснение заключается в том, что образование разрушительных ROS вследствие митохондриального и цитоплазматического окислительного метаболизма приводит к накоплению индуцируемых свободными радикалами повреждений как на клеточном, так и на молекулярном уровне и оно является одной из причин многих дегенеративных и связанных с возрастом нарушений. Однако повреждение, вызываемое ROS, можно уменьшать путем подавления ИОО с помощью ОК или путем усиления антиоксидантной защиты для конкуренции с производством ROS. Неоднократно было продемонстрировано, что ОК является эффективным методом увеличения продолжительности жизни многих видов животных (Weindruch и Walford, The retardation of aging and disease by dietary restriction, изд-во С.С.Thomas, Springfield, IL, 1988; Weindruch, Prog. Clin. Biol. Res., 287, 1989, сс.97-103). Это исследование стимулировало изучение антиоксидантного статуса организма с точки зрения прогрессирующей соматической деградации и нейродеградации, происходящей при старении, и последующую разработку теории старения, основанной на роли свободных радикалов (Harman, Ann. NY Acad. Sci., 717, 1994, сс.1-15).
Эта теория подкреплена другими исследованиями, в которых продемонстрирована нейрозащитная активность, связанная с усилением или дополнением антиоксидантной защиты организма. Было установлено, что кормовая добавка для грызунов, содержащая питательные микроэлементы (Liu и др., Ann. NY Acad. Sci., 959, 2002, сс.133-166), антиоксиданты (Floyd и Hensley, Ann. NY Acad. Sci., 899, 2000, сс.222-237; Joseph и др., Mech. Ageing Dev., 116, 2000, сс.141-153; Galli и др., Ann. NY Acad. Sci., 959, 2002, сс.128-132) и растительный экстракты (Bickford и др., Brain. Res., 866, 2000, сс.211-217; Cartford и др., J.Neurosci., 22, 2002, сс.5813-5816), помимо улучшения поведения в тестах на познавательную способность (Bickford и др., Mech. Ageing Dev., 111, 1999, сс.141-154) и восстановления электрофизиологических реакций ЦНС (Gould и др., Neurosci. Lett., 250, 1998, сс.165-168; Bickford и др., Free Rad. Biol. Med., 26, 1999, сс.817-824) защищает стареющую нервную систему от ионизирующего излучения (Lenton и Greenstock, Mech. Ageing Dev., 107, 1999, сс.15-20) или окислительного инсульта (Butterfield и др., Ann. NY Acad. Sci., 854, 1998, сс.448-462; Сао и др., J. Applied Physiol., 86, 1999, сс.1817-1822). Предполагается, что все эти терапевтические вмешательства изменяют антиоксидантный статус внутриклеточной среды и защищают имеющие решающее значение элементы цитоплазмы и митохондрий от деградации под действием ROS, восстанавливая и/или сохраняя тем самым гомеостаз. Было установлено, что в результате указанных изменений диеты соответствующим образом изменяются показатели антиоксидантного статуса. Например, установлено, что снижается уровень липидных пероксидных маркеров, малондиальдегида (МДА) (Gemma и др., J.Neurosci., 22, 2002, сс.6114-6120) и гидроксиноненала (ГНЕ) (Yoshimura и др., Free Rad. Res., 36, 2002, сс.107-112), уменьшаются уровни изопростанов (Montine и др., Biochem. Pharmacol., 65, 2003, сс.611-617), снижаются уровни 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (Lee и др., Cancer Lett., 132, 1998, сс.219-227), снижаются уровни остатков протеинкарбонилов (Carney и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, сс.3633-3636; Stadtman и Berlett, Drug Metab. Rev., 30, 1998, сс.225-243) и остатков нитротирозина (Whiteman и Halliwell, Free Rad. Res., 25, 1996, сс.275-283) и снижается реакционная способность спиновых акцепторных (spin trapping) антиоксидантов (Carney и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, сс.3633-3636).
Обработка спиновым акцепторным антиоксидантом N-трет-бутил-α-фенилнитроном (PBN) продемонстрировала возможность уменьшения с помощью фармакологических средств нейродегенерации, индуцируемой старением и ROS. PBN представляет собой акцептор свободных радикалов, который, как было установлено, уменьшает образование ROS (Floyd, Proc Soc Exp Biol Med., 222(3), 1999, сс.236-245), снижает образование протеинкарбонила на модели ускоренного старения с использованием мышей (Butterfield и др., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 94, сс.674-678), защищает головной мозг песчанок от ишемических реперфузионных повреждений (Floyd и Hensley, Ann. NY Acad. Sci., 899, 2000, сс.222-237), сохраняет реактивность мозжечка у старых крыс (Gould и Bickford, Brain Res., 660, 1994, сс.333-336) и уменьшает степень укорочения теломеров в человеческих фибробластах (von Zglinicki и др., Free Rad. Biol. Med., 28, 2000, сс.64-74). Установлено, что PBN обладают также эффективностью в отношении снижения содержания протеинкарбонилов у старых песчанок и улучшения их способности в поведенческом опыте с использованием лабиринта с радиальными ответвлениями (Carney и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, сс.3633-3636). Таким образом, сохраняется выраженная необходимость в разработке антиоксидантной защиты организма с использованием различных подходов на основе питания.
Старение и окислительный стресс приводят к ухудшению обработки информации в гиппокампе (Barnes, Prog. Brain Res., 86, 1990, сс.89-104; McGahon и др., Neuroscience, 81, 1997, сс.9-16; Murray и Lynch, J.Neurosci., 273, 1998a, cc.12161-12168), что проявляется в виде потерь навыков пространственной ориентации, формирования памяти и в ухудшении долговременной потенциации (LTP), необходимой для консолидации памяти. Композиция, предлагаемая в изобретении, содержащая ингибитор СОХ и LOX, а также сильный антиоксидант, может ослаблять ухудшение осуществляемой в гиппокампе обработки информации, обусловленное окислительным стрессом, воспалением или старением.
Наконец, воспалительные простаноиды ухудшают LTP в результате повышающей регуляции воспалительного цитокина IL-1β. Этот цитокин, уровень которого, как было установлено, повышается с возрастом и при окислительном стрессе, ингибирует LTP в области СА1 гиппокампа и DG (Murray и Lynch, J. Neurosci., 273, 1998a, cc. 12161-12168). С повышающей регуляцией экспрессии IL-1β связано усиление перокисления липидов в гиппокампе (Murray и др., Gerontology, 45, 1999, cc.136-142). Дальнейшее изучение этого процесса выявило, что у животных, которым давали обогащенный антиоксидантами корм, происходила реверсия связанных с возрастом изменений уровня IL-1β, перокисления липидов и связанного с этим дефицита LTP (Lynch, Prog. Neurobiol., 56, 1998, сс.571-589). Кроме того, при введении в корм добавок, содержащих антиоксидант, происходило также ослабление связанного с возрастом уменьшения концентрации АК в мембране (Murray и Lynch, J. Biol. Chem., 273, 1998b, cc.12161-12168). Все эти данные ясно свидетельствуют о том, что снижение познавательной способности, происходящее в результате воздействия окислительного стресса, воспаления и старения, можно замедлять или ослаблять с помощью питания и фармакологических вмешательств.
Флавоноиды или биофлавоноиды представляют собой широко распространенную группу натуральных продуктов, которые по литературным данным обладают антибактериальной, противовоспалительной, антиаллергической, антимутагенной, антивирусной, антинеопластической, антитромботической и сосудорасширяющей активностью. Структурная единица, общая для этой группы соединений, представляет собой два бензольных кольца, на любой стороне кольца содержащего 3 атома углерода, как это проиллюстрировано с помощью следующей общей структурной формулы:
Различные комбинации гидроксильных групп, сахаров, кислорода и метильных групп, присоединенных к этой общей трехкольцевой структуре, приводят к образованию различных классов флавоноидов, включающих флаванолы, флавоны, флаван-3-олы (катехины), антоцианины и изофлавоны.
Было установлено, что прием внутрь флавоноидов связан обратной зависимостью с риском возникновения случаев деменции. Хотя механизм действия в настоящее время не выяснен, было высказано предположение, что он обусловлен антиоксидантными свойствами флавоноидов (Commenges и др., Eur. J. Epidemiol., 16, 2000, cc.357-363). Полифенольные флавоны индуцируют запрограммированную гибель клеток и ингибирование дифференцировки и роста (Buckingham, The Combined Chemical Dictionary, изд-во Chapman & Hall CRC, версия 5:2, декабрь 2001 г.).
Фенольные соединения, прежде всего флаваны, обнаружены в концентрациях от умеренной до высокой во всех видах р. Acacia (Abdulrazak и др., Journal of Animal Sciences, 13, 2000, сс.935-940). Исторически большинство растений рода Acacia и экстрактов из них применяли в качестве вяжущих средств для лечения желудочно-кишечных нарушений, диареи, диспепсии и в качестве кровоостанавливающих средств (Vautrin, Universite Bourgogne (France) European abstract 58-01C:177, 1996; Saleem и др., Hamdard Midicus, 41, 1998, сс.63-67). Кора и стручки Acacia arabica Willd. содержат большие количества таннинов и их применяли в качестве вяжущих и отхаркивающих средств (Nadkarni, India Materia Medica, изд-во Bombay Popular Prakashan, 1996, cc.9-17). Опубликованы данные о том, что диарилпропанольные производные, выделенные из коры ствола Acacia tortilis, произрастающей в Сомали, обладают релаксирующим действием в отношении гладких мышц (Hagos и др., Planta Medica, 53, 1987, cc.27-31). Имеются также данные о том, что терпеноидные сапонины, выделенные из Acacia victoriae, обладают ингибирующим действием на индуцируемый диметилбенз(а)антраценом карциногенез кожи мыши (Hanausek и др., Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting, 41, 2000, с.663) и индуцируют апоптоз (Haridas и др., Proceedings American Association for Cancer Research Annual Meeting, 41, 2000, с.600). Опубликованы данные о том, что растительные экстракты из Acacia nilotica обладают спазмогенной, сосудосуживающей и гипотензивной активностью (Amos и др., Phytotherapy Research, 13, 1999, cc.683-685; Gilani и др., Phytotherapy Research, 13, 1999, cc.665-669) и антиагрегационной активностью в отношении тромбоцитов (Shah и др., General Pharmacology, 29, 1997, cc.251-255). Опубликованы данные о противовоспалительной активности A. nilotica. Было выдвинуто предположение, что активными компонентами могут являться флавоноиды, полисахариды и органические кислоты (Dafallah и Al-Mustafa, American Journal of Chinese Medicine, 24, 1996, cc.263-269). В настоящее время имеются данные только об одном ингибиторе 5-липооксигеназы, выделенном из растений р. Acacia, который представляет собой монотерпеноидный карбоксамид (Seikine и др., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 45, 1997, сс.148-11).
Экстракт из коры растений р. Acacia был запатентован в Японии в качестве отбеливающего средства для наружного применения (Abe, JP 10025238), в качестве ингибитора глюкозилтрансферазы для применения в стоматологии (Abe, JP 07242555), в качестве ингибитора синтеза белка (Fukai, JP 07165598), в качестве акцептора активного кислорода для препаратов для наружной обработки кожи (Honda, JP 07017847, Bindra, US 61266950) и в качестве ингибитора гиалуронидазы для орального введения с целью предупреждения воспаления, поллиноза и кашля (Ogura, JP 07010768).
В настоящее время авторам изобретения неизвестны никакие опубликованные данные о композиции, в которой объединены флавоноиды со свободным кольцом В и флаваны, предназначенной для применения с целью предупреждения и лечения нарушений и заболеваний, связанных с нейродеградацией, нейровоспалением и кумулятивными ухудшениями познавательной способности.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способам одновременного ингибирования двух ферментов, а именно, как циклооксигеназы (СОХ), так и липооксигеназы (LOX). Способ одновременного ингибирования двух ферментов СОХ и LOX заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят композицию, содержащую смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений. Эта заявляемая композиция в настоящем описании обозначена как Lasoperin™. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в заявляемой композиции можно регулировать на основе показаний и специфических требований в отношении предупреждения и лечения конкретного заболевания или состояния. Как правило, соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбирают из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений р. Scutellaria, а флаваны выделяют из растения или растений р. Acacia. Эффективность этого способа была продемонстрирована в опытах с очищенными ферментами на различных линиях клеток, многих моделях с использованием животных и в конечном итоге в клиническом опыте на людях.
Конкретно настоящее изобретение относится к способам предупреждения и лечения опосредуемых СОХ и LOX заболеваний и состояний, связанных с нейронной и когнитивной функциями, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов можно выбирать из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предупреждения и лечения общего ухудшения когнитивной способности, связанной с возрастом потери памяти, нейровоспалительных и нейродегенеративных нарушений, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из индивидуального растения или нескольких растений, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбирают из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Следующий вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу модуляции производства мРНК, участвующей в ухудшении когнитивных способностей и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояний, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из индивидуального растения или нескольких растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбирают из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Настоящее изобретение относится также к способу модуляции производства факторов транскрипции мРНК, которые контролируют производство мРНК цитокинов, участвующих в ухудшении когнитивных способностей и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояний, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбирают из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу модуляции производства факторов транскрипции мРНК, контролирующих производство мРНК сох-2, но не мРНК сох-1, участвующей в ухудшении когнитивных способностей и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояний, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбирают из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Не вдаваясь в теорию можно предположить, что композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, действует путем ингибирования провоспалительных цитокинов посредством понижающей регуляции фактора транскрипции ядерного фактора каппа В (NFκB), который контролирует экспрессию гена интерлейкина-1 бета (IL-1β), фактора некроза опухоли альфа (TNFα) и интерлейкина-6 (IL-6). Можно предполагать также, что композиция ингибирует экспрессию гена другого фактора транскрипции, рецептора гамма, активируемого пероксисомным пролифератором (PPARγ), который участвует в контроле экспрессии гена циклооксигеназы-2 (СОХ-2). Кроме того, композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, ингибирует активность СОХ-2 и 5-липооксигеназы (5-LO), подавляя тем самым превращение АК в простагландины, тромбоксаны и лейкотриены, каждый из которых усиливает воспаление. Композиция обладает также выраженной антиоксидантной способностью, нейтрализующей реакционно-способные виды кислорода (ROS), т.е. молекулы, которые могут повышать экспрессию NFκB и тем самым повышать экспрессию генов провоспалительных цитокинов.
Флавоноиды со свободным кольцом В, обозначенные также в настоящем описании как флавоны со свободным кольцом В и флавонолы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают соединения, имеющие следующую общую структуру:
в которой
1
2
3
4
5
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из ряда, включающего -Н, -ОН, -SH, OR, -SR, -NH, -NHR, -NR, -NR X, содержащий атом углерода, кислорода, азота или серы гликозид одного или комбинации нескольких сахаров, включая (но не ограничиваясь ими) альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные;
где
R обозначает алкильную группу, имеющую 1-10 атомов углерода; и
Х выбран из ряда фармацевтически приемлемых противоионов, включающих (но не ограничиваясь ими) гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид, карбонат и т.д.
Флавоноиды со свободным кольцом В, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать методами синтетеза или экстракцией из семейства растений, включая (но не ограничиваясь ими) Annonaceae, Asteraceae, Bignoniaceae, Combretaceae, Compositae, Euphorbiaceae, Labiatae, Lauranceae, Leguminosae, Moraceae, Pinaceae, Pteridaceae, Sinopteridaceae, Ulmaceae и Zingiberacea. Флавоноиды со свободным кольцом В можно экстрагировать, концентрировать и очищать из следующих родов высших растений, включая (но не ограничиваясь ими) Desmos, Achyrocline, Oroxylum, Buchenavia, Anaphalis, Cotula, Gnaphalium, Helichrysum, Centaurea, Eupatorium, Baccharis, Sapium, Scutellaria, Molsa, Colebrookea, Stachys, Origanum, Ziziphora, Lindera, Actinodaphne, Acacia, Derris, Glycyrrhiza, Millettia, Pongamia, Tephrosia, Artocarpus, Ficus, Pityrogramma, Notholaena, Pinus, Ulmus и Alpinia.
Флаваны, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают соединения, которые, как правило, описывают с помощью следующей общей структуры:
в которой
1
2
3
4
5
3
3
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из ряда, включающего -Н, -ОН, -SH, -ОСН, -SCH, -OR, -SR, -NH, -NRH, -NR, -NR X, сложные эфиры указанных выше замещающих групп, включая (но не ограничиваясь ими) сложные галлатные, ацетатные, циннамоиловые и гидроксилциннамоиловые эфиры, сложные тригидроксибензоиловые эфиры и сложные каффеоиловые эфиры и их химические производные; содержащий атом углерода, кислорода, азота или серы гликозид одного или нескольких сахаров, включая (но не ограничиваясь ими) альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные; димерные, тримерные и другие полимеризованные флаваны;
где
R обозначает алкильную группу, имеющую 1-10 атомов углерода; и
Х выбран из ряда фармацевтически приемлемых противоионов, включая (но не ограничиваясь ими) гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид и карбонат и т.д.
Флаваны, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать из растения или растений принадлежащих к роду Acacia. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение выбирают из ряда, включающего Acacia catechu, Acacia concinna, Acacia farnesiana, Acacia senegal, Acacia speciosa, Acacia arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata, A. mearnsii, A. picnantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia и A. mangium.
Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу предупреждения и лечения многих опосредуемых СОХ и LOX заболеваний и состояний, связанных с нейронной и когнитивной функциями, включая (но не ограничиваясь ими) общее ухудшение когнитивной способности, связанную с возрастом потерю памяти, нейровоспалительные и нейродегенеративные нарушения и другие состояния, связанные с нейронной и когнитивной функциями. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу модуляции производства мРНК, участвующей в ухудшении когнитивной способности и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояниях.
Способ предупреждения и лечения, предлагаемый в настоящем изобретении, заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят терапевтически эффективное количество комбинации, содержащей флавоноиды со свободным кольцом В и флаваны, выделенные из одного источника или нескольких источников. Чистота индивидуальных флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов и/или смеси нескольких таких соединений составляет (но не ограничена указанными параметрами) от 0,01 до 100% в зависимости от метода получения соединения(ий). В предпочтительном варианте осуществления изобретения величина дозы смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, представляет собой эффективное нетоксичное количество, которое, как правило, составляет от 0,001 до 100% в пересчете на общую массу композиции. Специалисты в данной области могут с помощью стандартных клинических тестов определять оптимальные дозы для конкретного недомогания, подлежащего лечению.
Под объем настоящего изобретения подпадает оценка различных композиций флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов с использованием ферментативных методов и опытов in vivo на моделях с целью оптимизации композиции и достижения требуемой физиологической активности. Эффективность и безопасность этих композиций продемонстрирована в клинических испытаниях на людях. Таким образом, под объем настоящего изобретения подпадают также терапевтические композиции, содержащие терапевтические агенты, предлагаемые в настоящем изобретении. Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить с помощью любого метода, известного обычному специалисту в данной области. Пути введения включают (но не ограничиваясь ими) энтеральное (оральное) введение, парентеральное (внутривенное, подкожное и внутримышечное) введение и местное нанесение.
Следует иметь ввиду, что как предыдущее краткое изложение, так и приведенное ниже подробное описание даны только в качестве примеров и с целью пояснения и не ограничивают объем заявляемого изобретения.
Краткое описание чертежей
На чертежах показаны:
На фиг.1А-1В - графическое изображение действия Lasoperin™, вводимого ежедневно в течение 13-недельного теста с использованием водяного лабиринта с радиальными ответвлениями (RAWM), старым самцам крыс линии Fisher 344, которые получали стандартный корм и корм с добавлением 3, 7 или 34 мг/кг Lasoperin™ соответственно, как описано в примере 2. Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis. В качестве контроля при оценке обычных связанных с возрастом изменений поведения использовали молодых самцов крыс линии Fisher 344, получавших стандартный корм. Данные представлены в виде зависимости средней общей ошибки от количества опытов (в каждый день эксперимента проводили по четыре опыта). На фиг.1А проиллюстрированы результаты, полученные перед экспериментом в течение 1-й и 2-й недель (исходный уровень). На фиг.1Б приведены результаты после недели 5 (сеанс II), а на фиг.1В представлены результаты после недели 11 (сеанс III).
На фиг.2 - действие Lasoperin™, вводимого ежедневно в течение 12 недель до опыта по контекстовому формированию условного рефлекса страха (CFC) старым крысам линии Fisher 344, получавшим стандартный корм или корм, дополненный 3, 7 или 34 мг/кг Lasoperin™, как описано в примере 3. Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis. В качестве контроля при оценке обычных связанных с возрастом изменений поведения использовали молодых самцов крыс линии Fisher 344, получавших стандартный корм. Данные представлены в виде среднего процента «замирания» для групп, подвергавшихся различным обработкам.
На фиг.3 - графическое изображение действия Lasoperin™ на время реакции при сложном выборе, полученное согласно методу, описанному в примере 4. Lasoperin™ вводили ежедневно 40 индивидуумам в течение 4-недельного клинического опыта. Приведено сравнение результатов с результатами, полученными для группы из 46 индивидуумов, которые получали плацебо в течение такого же периода времени. Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis. Данные представлены в виде процентного изменения по сравнению с исходным уровнем. На этом чертеже проиллюстрировано, что Lasoperin™ (300 мг/день) повышал скорость процесинга у пациентов, столкнувшихся со сложным выбором и информацией.
На фиг.4 - графическая иллюстрация действия Lasoperin™ на стандартное отклонение времени реакции (RTSD) в опыте, описанном в примере 5. Lasoperin™ вводили ежедневно 40 индивидуумам в течение 4-недельного клинического опыта. Приведено сравнение результатов с результатами, полученными для группы из 46 индивидуумов, которые получали плацебо в течение такого же периода времени. Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis. Данные представлены в виде процентного изменения по сравнению с исходным уровнем. На этом чертеже проиллюстрировано, что Lasoperin™ (300 мг/день) повышал стандартное отклонение времени реакции в течение опыта, что свидетельствует о способности оставаться сосредоточенным и более внимательным в течение предлагаемых задач на когнитивную способность.
50
50
На фиг.5 - график ингибирования СОХ-1 и СОХ-2 с помощью Lasoperin™. Композицию Lasoperin™ (50:50) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis. Lasoperin™ исследовали в отношении его способности ингибировать пероксидазную активность рекомбинантной овечьей СОХ-1 (♦) и овечьей СОХ-2 (). Данные представлены в виде зависимости процента ингибирования от концентрации ингибитора (мкг/мл). Значение IC для СОХ-1 составляло 0,38 мкг/мл/единицу фермента, в то время как IC для СОХ-2 составляло 0,84 мкг/мл/единицу.
50
На фиг.6 - график профиля ингибирования 5-LO очищенным флаваном катехином, выделенным из A. catechu. Соединение исследовали в отношении его способности ингибировать активность рекомбинантной 5-липооксигеназы из картофеля (♦). Данные представлены в виде зависимости процента ингибирования образца без ингибитора от концентрации ингибитора (мкг/мл). Значение IC для 5-LO составляло 1,38 мкг/мл/единицу фермента.
4
На фиг.7 - сравнение уровней LTB, сохранявшихся в неиндуцированных клетках линии НТ-29 после обработки 3 мкг/мл Lasoperin™ и 3 мкг/мл ибупрофена, которые были получены с использованием ELISA в опыте, описанном в примере 8. Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно описанному в примере 1 методу с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из коры Acacia catechu и корней Scutellaria baicalensis.
На фиг.8 - график действия смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов (80:20) на индуцируемый липополисахаридом (ЛПС) уровень TNFα в моноцитах периферической крови (РВМС) после обработки в течение 1 ч липополисахаридом в сочетании с различными концентрациями смеси флавоноида со свободным кольцом В и флавана. Уровень TNFα выражен в пг/мл.
На фиг.9 - график действия смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов (80:20) на индуцируемый липополисахаридом (ЛПС) уровень IL-1β в моноцитах периферической крови (РВМС) после обработки в течение 4 ч липополисахаридом в сочетании с различными концентрациями смеси флавоноида со свободным кольцом В и флавана. Уровень IL-1β выражен в пг/мл.
На фиг.10 - график действия смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов (80:20) на индуцируемый липополисахаридом (ЛПС) уровень IL-6β в моноцитах периферической крови (РВМС) после обработки в течение 4 ч липополисахаридом в сочетании с различными концентрациями смеси флавоноида со свободным кольцом В и флавана. Уровень IL-6 выражен в пг/мл. Для каждой экспериментальной точки приведено стандартное отклонение.
На фиг.11 - действие различных концентраций Lasoperin™ на экспрессию генов сох-1 и сох-2. Уровни экспрессии стандартизовали по отношению к уровням экспрессии 18S-pPHK (внутренний контроль), а затем стандартизовали относительно варианта без обработки, без ЛПС. На этом чертеже проиллюстрировано, что ЛПС-стимуляция и обработка Lasoperin™ приводила к уменьшению экспрессии гена сох-2, но не гена сох-1.
На фиг.12 - сравнение действия 3 мкг/мл Lasoperin™ и такой же концентрации другого НСПВЛ на экспрессию генов сох-1 и сох-2. Уровни экспрессии стандартизовали по отношению к уровням экспрессии 18S-pPHK (внутренний контроль), а затем стандартизовали относительно варианта без обработки, без ЛПС.
На фиг.13А и 13Б - действие различных концентраций Lasoperin™ на экспрессию генов tnfα-1 (фиг.13А) и il-1β (фиг.13Б). Уровни экспрессии стандартизовали по отношению к уровням экспрессии 18S-pPHK (внутренний контроль), а затем стандартизовали относительно варианта без обработки, без ЛПС. На этих чертежах продемонстрировано уменьшение экспрессии генов tnfα-1 и il-1β после ЛПС-стимуляции и обработки Lasoperin™.
На фиг.14 - действие Lasoperin™ на индуцируемый липополисахаридом (ЛПС) уровень сох-1, сох-2, il-1β, tnfα, il-6, nfκb и pparγ в моноцитах периферической крови (РВМС), взятых из организма трех пациентов, после обработки в течение 4 ч, согласно методу, описанному в примере 11.
На фиг.15 - промоторы генов tnfα, il-1β, il-6 и сох-2, которые подвергаются понижающей регуляции в результате понижения экспрессии генов nfκb и pparγ.
На фиг.16 - хроматограмма смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, полученная с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), в условиях, описанных в примере 14. В указанных условиях флавоноиды со свободным кольцом В элюировались в период времени от 11-й до 14-й минуты, а флаваны элюировались в период времени от 3-й до 5-й минуты.
На фиг.17 - хроматограмма, полученная с помощью ЖХВД, смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, в условиях, описанных в примере 14. В указанных условиях два флавана (катехины и эпикатехины) элюировались в период времени от 4,5 до 5,5 минут, а флавоноиды со свободным кольцом В (бакалеин и бакалин) элюировались в период времени от 12 до 13,5 минут. В условиях, описанных в примере 15, разделение происходило на основе различий молярной абсорбционной способности флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложены способы, позволяющие эффективно ингибировать одновременно ферменты циклооксигеназу (СОХ) и липооксигеназу (LOX), которые предназначены для применения с целью предупреждения и лечения заболеваний и состояний, связанных с нейронной и когнитивной функциями. Способ одновременного ингибирования двух ферментов СОХ и LOX заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят композицию, содержащую смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений. Эта заявляемая композиция обозначена в настоящем описании как Lasoperin™. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в заявляемой композиции можно регулировать на основе показаний и конкретных требований применительно к предупреждению и лечению определенного заболевания или состояния.
Для обозначения элементов настоящего изобретения в описании использованы различные понятия. Для пояснения описания компонентов настоящего изобретения приведены следующие определения.
Если не указано иное, то все технически и научные понятия, используемые в настоящем описании, имеют общепринятое значение, хорошо известное обычному специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Следует отметить, что в настоящем описании единственное или множественное число относится к одному или нескольким таким элементам; например, понятие «флавоноид» относится к одному или нескольким флавоноидам. В настоящем описании понятия единственного или множественного числа, "один или несколько" и "по меньшей мере один" используются взаимозаменяемо.
"Флавоноиды со свободным кольцом В" в настоящем описании обозначают определенный класс флавоноидов, которые не имеют замещающих групп на ароматическом кольце В, как это проиллюстрировано с помощью следующей общей структуры:
в которой
1
2
3
4
5
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из ряда, включающего -Н, -ОН, -SH, OR, -SR, -NH, -NHR, -NR, -NR X, содержащий атом углерода, кислорода, азота или серы гликозид одного или комбинации нескольких сахаров, включая (но не ограничиваясь ими) альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные;
где
R обозначает алкильную группу, имеющую 1-10 атомов углерода; и
Х выбран из ряда фармацевтически приемлемых противоионов, включая (но не ограничиваясь ими) гидроксил, хлорид, йодид, фторид, сульфат, фосфат, ацетат, карбонат и т.д.
В настоящем описании понятие "флаваны" относится к конкретному классу флавоноидов, которые, в целом, можно описать с помощью следующей общей структуры:
в которой
1
2
3
4
5
3
3
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из ряда, включающего -Н, -ОН, -SH, -ОСН, -SCH, -OR, -SR, -NH, -NRH, -NR, -NR X, сложные эфиры указанных выше замещающих групп, включая (но не ограничиваясь ими) сложные галлатные, ацетатные, циннамоиловые и гидроксилциннамоиловые эфиры, сложные тригидроксибензоиловые эфиры и сложные каффеоиловые эфиры и их химические производные; содержащий атом углерода, кислорода, азота или серы гликозид одного или нескольких сахаров, включая (но не ограничиваясь ими) альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные; димерные, тримерные и другие полимеризованные флаваны;
где
R обозначает алкильную группу, имеющую 1-10 атомов углерода; и
Х выбран из ряда фармацевтически приемлемых противоионов, включая (но не ограничиваясь ими) гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид и карбонат и т.д.
Понятие "терапевтический" в настоящем описании относится к лечению и/или профилактике. Когда используют понятие «терапевтический», то оно относится как к человеку, так и к другим животным.
"Фармацевтически или терапевтически эффективная доза или количество" обозначает уровень дозы, достаточный для достижения требуемого биологического результата. Этот результат может представлять собой облегчение признаков, симптомов или причин заболевания или любое другое требуемое изменение биологической системы. Точная доза должна варьироваться в зависимости от различных факторов, включая (но не ограничиваясь ими) возраст и размер индивидуума, заболевание и осуществляемое лечение.
Понятие "плацебо" обозначает замену фармацевтически или терапевтически эффективной дозы или количества, достаточного для достижения требуемого биологического действия, которое может облегчать признаки, симптомы или причины заболевания, на неактивную субстанцию.
Понятие "хозяин" или "пациент", или "индивидуум" обозначает живое млекопитающее, человека или животное, для которого требуется лечение. Понятие "хозяин", "пациент" или "индивидуум", как правило, относится к реципиенту, подвергающемуся лечению согласно способу, предлагаемому в изобретении.
В настоящем описании понятие "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому носителю, который не оказывает влияния на биологическую активность действующего вещества и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Примеры "фармацевтически приемлемых носителей" включают (но не ограничиваясь ими) любые стандартные фармацевтические носители, такие как физиологический раствор, т.е. раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, воду, декстрозный раствор, сывороточный альбумин и другие эксципиенты и консерванты для таблетированных и капсулированных композиций.
"Экспрессия гена" обозначает транскрипцию гена с образованием мРНК.
"Экспрессия белка" обозначает трансляцию мРНК с образованием белка.
"ОТ-кПЦР" в настоящем описании обозначает метод осуществления обратной транскрипции (ОТ) молекулы мРНК в молекулу кДНК и затем количественной оценки уровня экспрессии гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием флуоресцентного репортера.
Следует отметить, что в настоящем описании процитированы различные документы. Каждый из этих документов специально включен в настоящее описание в качестве ссылки во всей его полноте.
Настоящее изобретение относится к способам, позволяющим эффективно ингибировать одновременно ферменты СОХ и LOX, которые предназначены для применения с целью предупреждения и лечения заболеваний и состояний, связанных с нейронной и когнитивной функциями. Способ одновременного ингибирования двух ферментов СОХ и LOX заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят композицию, содержащую смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений. Эта заявляемая композиция обозначена в настоящем описании как Lasoperin™ и поступает в продажу также под товарным знаком Univestin™ и она описана в заявке на патент US, серийный номер 10/427746, поданной 30 апреля 2003 г., озаглавленной «Композиция, обладающая двойной ингибирующей активностью в отношении Сох-2 и 5-липооксигеназы» ("Formulation with Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity"), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбрано из ряда соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном из вариантов осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Выделение и идентификация флавоноидов со свободным кольцом В из растений рода Scutellaria описано в заявке на патент US 10/091362, поданной 1 марта 2002 г., озаглавленной «Идентификация флавоноидов со свободным кольцом В в качестве сильных ингибиторов Cox-2» ("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent Cox-2 Inhibitors"), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте. Выделение и идентификация флаванов из растений рода Acacia описано в заявке на патент US, серийный номер 10/104477, поданной 22 марта 2002 г., озаглавленной «Выделение двойного ингибитора Сох-2 и 5-липооксигеназы из растений р. Acacia» "Isolation of a Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhubitor from Acacia", которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте.
Настоящее изобретение относится к способам, обладающим эффективностью в отношении предупреждения и лечения связанных с возрастом, ухудшением когнитивной способности, нейродегенерацией и нейровоспалением заболеваний и состояний. Способ предупреждения и лечения этих когнитивных и нейронных заболеваний и состояний заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят композицию, содержащую смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов выбрано из ряда соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном из вариантов осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам предупреждения и лечения опосредуемых провоспалительными цитокинами нейронных и когнитивных заболеваний и состояний, причем указанный способ заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов можно выбирать из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Настоящее изобретение относится также к способу снижения уровней TNFα и IL-1β, двух компонентов, играющих решающую роль в связанных с возрастом, когнитивных, нейродегенеративных и нейровоспалительных заболеваниях и состояниях. Способ снижения уровней TNFα и IL-1β заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов можно выбирать из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Настоящее изобретение относится к способу предупреждения и лечения заболеваний и состояний, опосредуемых ROS, путем снижения уровня ROS. ROS является имеющим решающее значение продуктом окислительного стресса и метаболизма липидов, и его уровень может существенно повышаться при связанных с возрастом, когнитивной способностью, нейродегенерацией и нейровоспалением заболеваниях и состояниях. Способ лечения опосредуемых ROS заболеваний и состояний заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из индивидуального растения или нескольких растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов можно выбирать из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Наконец, настоящее изобретение относится к способу модуляции производства мРНК, участвующей в ухудшении когнитивных способностей и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояниях, включая способ модуляции производства мРНК факторов транскрипции, которые контролируют производство мРНК цитокинов, и способ модуляции производства мРНК факторов транскрипции, которые контролируют производство мРНК сох-2, но не сох-1. Способ модуляции производства мРНК, участвующей в ухудшении когнитивных способностей и других связанных с возрастом, нейродегенерацией и нейровоспалением состояниях, заключается в том, что хозяину, нуждающемуся в этом, вводят эффективное количество композиции, содержащей смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или нескольких видов растений, и фармацевтически приемлемый носитель. Соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции может составлять от 99,9:0,1 до 0,1:99,9 (флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны). В конкретных вариантах осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов можно выбирать из группы соотношений, составляющих примерно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В одном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноиды со свободным кольцом В:флаваны в заявляемой композиции составляет примерно 80:20.
Флавоноиды со свободным кольцом В, которые можно применять в соответствии с вышеизложенным, включают соединения, имеющие приведенную выше общую структуру. Флавоноиды со свободным кольцом В, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать методами синтеза или их можно выделять из семейств растений, включая (но не ограничиваясь ими) Annonaceae, Asteraceae, Bignoniaceae, Combretaceae, Compositae, Euphorbiaceae, Labiatae, Lauranceae, Leguminosae, Moraceae, Pinaceae, Pteridaceae, Sinopteridaceae, Ulmaceae и Zingiberaceae. Флавоноиды со свободным кольцом В можно выделять также из следующих родов высших растений, включая (но не ограничиваясь ими) Desmos, Achyrocline, Oroxylum, Buchenavia, Anaphalis, Cotula, Gnaphalium, Helichrysum, Centaurea, Eupatorium, Baccharis, Sapium, Scutellaria, Molsa, Colebrookea, Stachys, Origanum, Ziziphora, Lindera, Actinodaphne, Acacia, Derris, Glycyrrhiza, Millettia, Pongamia, Tephrosia, Artocarpus, Ficus, Pityrogramma, Notholaena, Pinus, Ulmus и Alpinia.
Флавоноиды со свободным кольцом В могут присутствовать в различных частях растений, включая (но не ограничиваясь ими) стебли, кору стеблей, стволы, кору стволов, ветви, клубни, корни, кору корней, молодые побеги, семена, ризомы, цветки и другие репродуктивные органы, листья и другие надземные части. Методы выделения и очистки флавоноидов со свободным кольцом В описаны в заявке на патент US, серийный номер 10/091362, поданной 1 марта 2002 г., озаглавленной «Идентификация флавоноидов со свободным кольцом В в качестве сильных ингибиторов COX-2» ("Identification of Free-B-Ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors"), и заявке на патент US, серийный номер 10/427746, поданной 30 апреля 2003 г., озаглавленной «Композиция, обладающая двойной ингибирующей активностью в отношении СОХ-2 и 5-липооксизеназы» ("Formulation with Dual Cox-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity"), каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте.
Флаваны, которые можно применять согласно способу, предлагаемому в настоящем изобретении, включают соединения, проиллюстрированные приведенной выше общей структурой. Флаваны, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать методами синтеза или их можно выделять из растения, выбранного из ряда, включающего (но не ограничиваясь ими) Acacia catechu, A. concinna, A. farnesiana, A. senegal, A. speciosa, A. arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata. A. mearnsii, A. picnantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia, A. mangium, Uncaria gambir, Uncaria tomentosa, Uncaria africana и Uncaria qabir.
Флаваны могут присутствовать в различных частях растений, включая (но не ограничиваясь ими) стебли, кору стеблей, стволы, кору стволов, ветви, клубни, корни, кору корней, молодые побеги, семена, ризомы, цветки и другие репродуктивные органы, листья и другие надземные части. Методы выделения и очистки флаванов описаны в заявка на патент US, серийный номер 10/104477, поданной 22 марта 2002 г., озаглавленной «Выделение двойного ингибитора СОХ-2 и 5-липооксигеназы из растений р. Acacia» ("Isolation of a Dual COX-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia"), которая включена в настоящее описание во всей ее полноте.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения флавоноиды со свободным кольцом В выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений рода Acacia.
Настоящее изобретение обеспечивает реализацию стратегии, которая объединяет несколько заданий на когнитивную способность in vivo, а также осуществляемые in vitro биохимический, клеточный скрининг и скрининг экспрессии гена для выявления активных растительных экстрактов, которые обладают способностью специфически ингибировать ферментативную активность СОХ и LOX, снижают уровень провоспалительных цитокинов посредством понижающей регуляции имеющих решающее значение факторов транскрипции, которые стимулируют производство мРНК указанных цитокинов, и производство ROS, поддерживают антиоксидантные свойства, оказывающие влияние на предупреждение и лечение нейродегенерации, нейровоспаления и кумулятивного ухудшения когнитивной способности, нарушений, заболеваний и состояний, возникающих при воздействии реакционно-способных видов кислорода (ROS), воспалительных белков и эйкозаноидов. Кроме того, экстракты оценивают в отношении их влияния на экспрессию гена мРНК. Флавоноиды со свободным кольцом В и флаваны тестировали в отношении их способности предупреждать связанное с возрастом ухудшение познавательных способностей при оральном введении в виде добавочного компонента к пище.
В примере 1 описан общий метод получения Lasoperin™ с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из растений р. Acacia и р. Scutellaria соответственно, в сочетании с одним или несколькими эксципиентом(ами). Как указано в таблице 1, эта конкретная партия Lasoperin™ содержит в целом 86% действующих веществ, включая 75,7% флавоноидов со свободным кольцом В и 10,3% флаванов. В заявляемую композицию можно добавлять один или несколько эксципиент(ов). Количество добавляемого эксципиента можно регулировать с учетом фактического содержания каждого требуемого действующего вещества.
Для оценки воздействий Lasoperin™ на когнитивную функцию проводили два специфических поведенческих теста на моделях с использованием животных, а именно тест с использованием водяного лабиринта с радиальными ответвлениями (RAWM) и тест на контекстовое формирование условного рефлекса страха (CFC), которые позволяют оценивать зависящую от гиппокампа рабочую память. В примере 2 проиллюстрировано воздействие Lasoperin™ на зависящую от гиппокампа когнитивную функцию, которую оценивали с помощью теста с использованием водяного лабиринта с радиальными ответвлениями (RAWM). Результаты представлены на фиг.1А-1В, на которых графически показано воздействие Lasoperin™, вводимого ежедневно в течение 13-недельного теста с использованием водяного лабиринта с радиальным ответвлением (RAWM), старым самцам крыс линии Fisher 344, которые получали стандартный корм и корм с добавлением 3, 7 или 34 мг/кг Lasoperin™ соответственно. В качестве контроля при оценке обычных связанных с возрастом изменений поведения использовали молодых самцов крыс линии Fisher 344, получавших стандартный корм. Данные представлены в виде зависимости средних общих ошибок от количества опытов (в каждый день эксперимента проводили по четыре опыта). На фиг.1А проиллюстрированы результаты, полученные перед тестированием в течение 1-й и 2-й недель (исходный уровень). На фиг.1Б приведены результаты после недели 5 (сеанс II), а на фиг.1В представлены результаты после недели 11 (сеанс III). Данные, представленные на фиг.1А-1В, свидетельствуют о том, что Lasoperin™ (в группах, которым вводили дозы 7 и 34 мг/кг) предупреждал связанное с возрастом ухудшение памяти.
Поскольку тест с использованием RAWM включает компонент моторной функции, то существует возможность, что улучшение, продемонстрированное в этом тесте, может быть обусловлено тем, что вводимая композиция ослабляет боль в суставах и дискомфорт. Для проверки этого проводили также CFC-тест, поскольку этот тест не требовал движения животного и поэтому служил для подтверждения когнитивного аспекта обеих задач (вследствие аналгезирующих свойств композиции при оценке результатов CFC-теста использовали порог болевого шока). В примере 3 проиллюстрировано воздействие Lasoperin™ на зависящую от гиппокампа когнитивную функцию, полученное в тесте на контекстовое формирование условного рефлекса страха (CFC). Как описано в примере 2, в этом опыте использовали 60 самцов крыс линии Fisher 344. Результаты, представленные на фиг.2, иллюстрируют воздействие Lasoperin™, который вводили ежедневно в течение 12 недель перед проведением теста на контекстовое формирование условного рефлекса страха старым самцам крыс линии Fisher 344 в виде добавки к корму, составляющей 3, 7 или 34 мг/кг Lasoperin™. В качестве контроля при оценке связанных с возрастом изменений поведения использовали молодых самцов крыс линии Fisher 344, получавших стандартный корм. Данные представлены в виде среднего процента «замирания» для различных групп обработки. Данные, приведенные на фиг.2, демонстрируют, что Lasoperin™ (в группах, которым вводили дозы 7 и 34 мг/кг) облегчал связанные с возрастом ухудшения.
В примерах 4 и 5 приведены результаты оценки воздействия Lasoperin™, который вводили ежедневно в дозе 300 мг/день в течение 4-недельного периода 40 индивидуумам, полученные в рандомизированном двойном проводимом вслепую с использованием для контроля плацебо клиническом опыте по исследованию когнитивной функции. Результаты сравнивали с результатами, полученными для 46 индивидуумов, которых обрабатывали плацебо. Измерения когнитивной способности проводили с помощью серий тестов на сохранение познавательной способности на основе принципа «запутывания» (web-based), которые позволяют оценивать психомоторную скорость, скорость рабочей памяти (принятие исполняемого решения, быстроту и гибкость) и непосредственную память (обработка вербальной и пространственной информации в памяти). Перед началом опыта участники должны были пройти практику в течение двух последовательных дней для установления исходных способностей. Анализ данных заключался в сравнении исходных способностей со способностями после лечения.
Тест на психомоторную скорость или физические рефлексы представляет собой простой тест на время реакции, который требует от индивидуума как можно более быстрого нажатия на клавишу после появления фигуры на экране компьютера.
В тесте на скорость рабочей памяти одновременно появляется слово и картинка и от индивидуума требуется решить, соответствуют ли они друг другу или нет. Случайным образом возникает также смена сигнального значения на противоположное и от индивидуума требуется дать ответ, противоположный правильному, так что ответ на правильную пару должен быть «нет», и наоборот. Это задание требует подавления или «ингибирования заученного ответа» и последующей отмены ("смена задачи") возможного ответа. Скорость переключения от одной задачи или одной формы ответа на другую часто эквивалентна умственной гибкости и когнитивной обработки информации более высокого порядка, а также более высокой способности принимать решение.
Тест на непосредственную память аналогичен классической задаче Стернберга, в которой за рядом элементов-стимулов, «мишеней», которые требуется запомнить, следует «проверочный» элемент. Индивидуум должен определить, находился ли проверочный элемент в предыдущем списке мишеней. Длину списка можно варьировать для оценки способности кратковременной памяти индивидуума. В этом задании используют как буквенные элементы, так и пространственное расположение.
Результаты приведены на фиг.3, на которой графически проиллюстрировано воздействие Lasoperin™ на время реакции сложного выбора, и на фиг.4, на которой графически проиллюстрировано воздействие Lasoperin™ на стандартное отклонение времени реакции (RTSD). Стандартное отклонение времени реакции представляет собой вариацию в течение опыта. Результаты, представленные на фиг.3 и 4, свидетельствуют о том, что Lasoperin™ повышает скорость обработки информации у индивидуумов, столкнувшихся со сложным выбором и информацией.
50
50
50
В примере 6 описан анализ ингибирования СОХ, проведенный с использованием Lasoperin™. Метод биохимического анализа, применяемый для измерения ингибирования СОХ, основан на оценке пероксидазной активности белка в присутствии гема и арахидоновой кислоты. Результаты измерения зависимости реакции от дозы и значения IC Lasoperin™ приведены на фиг.5. Значение IC для СОХ-1 составляло 0,38 мкг/мл/единицу фермента, а значение IC для СОХ-2 составляло 0,84 мкг/мл/единицу фермента.
50
В примере 7 описан анализ ингибирования LOX с использованием флавана катехина, выделенного из A. catechu. Ингибирование активности LOX оценивали с помощью анализа скрининга липооксигеназы in vitro. Результаты этого анализа приведены на фиг.6. Значение IC для ингибирования катехином 5-LO составляло 1,38 мкг/мл/единицу фермента.
4
4
4
В примере 8 описан проведенный клеточный анализ, направленный на оценку ингибирования соединений, образующихся при расщеплении арахидоновой кислоты в LOX-пути, а именно LTB. Результаты приведены на фиг.7. Из данных, приведенных на фиг.7, можно видеть, что Lasoperin™ ингибирует на 80% образование новых LTB, синтезируемых в клетках линии НТ-29. Ибупрофен вызывал только 20%-ное уменьшение количества LTB в течение такого же периода времени.
В примере 9 описано измерение воздействия Lasoperin™ на индуцируемые ЛПС уровни TNFα, IL-1β и IL-6 в моноцитах периферической крови. Результаты приведены на фиг.8-10. Из данных, приведенных на фиг.8, можно видеть, что экстракт в широком диапазоне концентраций от 2 до 100 мкг/мл приводил к уменьшению уровней TNFα, секретируемого в супернатант клеточной культуры. Из результатов, приведенных на этих чертежах, можно видеть, что концентрация ЛПС 10 мкг/мл индуцировала наибольший уровень TNFα и IL-1β после совместной инкубации с Lasoperin™ в течение 1 ч и 4 ч соответственно. Экстракт снижал уровни TNFα и IL-1β, секретируемых в супернатант клеточной культуры практически во всем широком диапазоне концентраций от 2 до 100 мкг/мл (см. фиг.8 и 9). Поскольку уровни TNFα, IL-1β и IL-6 повышены при воспалении и связанных с возрастом заболеваниях, то путем снижения уровней этих провоспалительных цитокинов и факторов транскрипции в примированных воспалительных клетках Lasoperin™ может оказывать существенное влияние на указанные нарушения.
В примере 10 описан эксперимент, проведенный для определения разницы между ингибированием гена сох-1 с помощью Lasoperin™ и с помощью других НСПВЛ. Данные о экспрессии гена получали с помощью полуколичественного ОТ-кПЦР-анализа ингибирования производства мРНК сох-1 и сох-1. Результаты приведены на фиг.11-13. Из данных, приведенных на фиг.11, можно видеть, что Lasoperin™ ингибировал производство мРНК сох-1, не оказывая влияния на экспрессию гена сох-1. Кроме того, сравнение с другими лекарственными средствами-ингибиторами сох-1 показывает, что Lasoperin™ обладал способностью понижать стимулируемое ЛПС повышение экспрессии генов сох-1 и сох-1. Важно отметить, что и целекоксиб и ибупрофен повышали экспрессию гена сох-1 (фиг.12). Наконец, из данных, приведенных на фиг.13А и 13Б, можно видеть, что обработка Lasoperin™ приводила к уменьшению производства как tnfα-1, так и il-1 αβ.
В примере 11 описан эксперимент, проведенный для определения воздействия Lasoperin™ на индуцируемый ЛПС уровень сох-1, сох-2, il-1β, tnfα, il-6, nfκb и pparγ в моноцитах периферической крови (РВМС), полученных из организма трех индивидуумов, после описанной в примере 11 обработки в течение 4 ч. Результаты приведены на фиг.14. Из данных, приведенных на фиг.14, можно видеть, что экстракт Lasoperin™ существенно снижал экспрессию генов для всех видов мРНК.
В примере 12 описана понижающая регуляция промоторных элементов воспалительных генов с помощью Lasoperin™. Эти промоторные элементы представлены на фиг.15.
В примере 13 описан способ оценки эффективности Lasoperin™ в качестве антиоксиданта с помощью теста для определения способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC). ORAC-анализ, в котором в качестве флуоресцентного зонда используют флуоресцеин, позволяет измерять способность антиоксидантов поглощать пероксильные радикалы, которые представляют собой один из наиболее распространенных реакционно-способных видов кислорода, обнаруженных в организме. Результаты приведены в таблице 2 в виде относительной абсорбционной способности по сравнению с концентратами нескольких широко известных антиоксидантов из пищевых продуктов. Lasoperin™ имел высокий ORAC-балл. Действительно, для Lasoperin™ ORAC-балл сравним с баллом антиоксиданта витамина С и поэтому он должен эффективно снижать уровни ROS в организме.
В примерах 14 и 15 описаны два метода, используемые для определения количества флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в стандартизованном экстракте. Результаты приведены на фиг.16 и 17.
Приведенные ниже примеры служат только для целей иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение Lasoperin™ из экстрактов, выделенных из растений р. Acacia и р. Scutellaria
Препаративную форму Lasoperin™ приготавливали с использованием двух стандартизованных экстрактов, выделенных из растений р. Acacia и р. Scutellaria соответственно, в сочетании с одним или несколькими эксципиентом(ами).
Используемый экстракт Acacia содержал >60% общих флаванов, представляющих собой катехин и эпикатехин, а экстракт Scutellaria содержал >70% флавоноидов со свободным кольцом В, которые в основном представляли собой баикалин. Экстракт Scutellaria содержал минорные количества других флавоноидов со свободным кольцом В, указанных в таблице 1. В заявляемую композицию добавляли один или несколько эксципиентов. Соотношение флаванов и флавоноидов со свободным кольцом В можно регулировать с учетом показаний и конкретных требований в отношении ингибирования СОХ-2 по сравнению с 5-LO и требованиями к эффективности продукта. Количество эксципиента(ов) можно регулировать с учетом фактического содержания каждого действующего вещества. Таблицу пропорций смешения для каждой индивидуальной партии продукта следует разрабатывать на основе спецификации продукта и результатов контроля качества (КК). Для соответствия спецификации продукта рекомендуется использовать дополнительные количества действующих веществ (2-5%).
Таблица 1 представляет собой таблицу пропорций смешения, разработанную для одной из партий Lasoperin™ (лот №G1702-COX-2). В целом, объединяли экстракт корней Scutellaria baicalensis (38,5 кг) (лот № RM052302-01), имеющий содержание флавоноидов со свободным кольцом В 82,2% (баикалин); экстракт коры Acacia catechu (6,9 кг) (лот № RM052902-01) с общим содержанием флаванов 80,4% и эксципиент кандекс (Candex) (5,0 кг) с получением композиции Lasoperin™ (50,4 кг), имеющей соотношение компонентов в смеси 85:15. В таблице 1 приведены количества действующих веществ, флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов, в этой конкретной партии Lasoperin™ (лот № G1702-COX-2), определенные с помощью методов, описанных в заявке на патент US, серийный номер 10/427746, поданной 30 апреля 2003 г., озаглавленной «Композиция, обладающая двойной ингибирующей активностью в отношении СОХ-2 и 5-липооксигеназы» ("Formulation With Dual Cox-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity"), которая включена в настоящее описание во всей ее полноте.
Таблица 1
Содержание флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов в композиции Lasoperin™
Действующие вещества
Содержание (%)
Флавоноиды
Баикалин
62,5%
Минорные флавоноиды
вогонин-7-глюкуронид
6,7%
ороксилин А 7-глюкуронид
2,0%
баикалеин
1,5%
вогонин
1,1%
хрисин-7-глюкуронид
0,8%
5-метилвогонин-7-глюкуронид
0,5%
скутелларин
0,3%
норвогонин
0,3%
хрисин
<0,2%
ороксилин А
<0,2%
Общее содержание флавоноидов со свободным кольцом В
75,7%
Флаваны
катехин
9,9%
эпикатехин
0,4%
Общее содержание флаванов
10,3%
Общее содержание действующих веществ
86%
Как видно из таблицы 1, эта конкретная партия Lasoperin™ содержала в общей сложности 86% действующих веществ, в том числе 75,7% флавоноидов со свободным кольцом В и 10,3% флаванов. Из этой партии Lasoperin™ (50,0 кг) приготавливали конечный продукт в форме капсул с двумя уровнями доз: 125 мг/дозу (60 капсул) и 250 мг/дозу (60 капсул). Используя аналогичный подход, приготавливали две дополнительные партии Lasoperin™ с соотношениями компонентов в смеси 50:50 и 20:80 соответственно.
Пример 2. Воздействие Lasoperin™ на зависящую от гиппокампа когнитивную функцию (RAWM)
Композицию Lasoperin™ (80:20) получали согласно методу, описанному в примере 1 (см. также пример 14 заявки на патент US, серийный номер 10/427746, поданной 30 апреля 2003 г., озаглавленной «Композиция, обладающая двойной ингибирующей активностью в отношении СОХ-2 и 5-липооксигеназы» ("Formulation With Dual COX-2 And 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity"), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей ее полноте) путем объединения стандартизованного экстракта флавоноида со свободным кольцом В, выделенного из корней Scutellaria baicalensis, и стандартизованного экстракта флавана, выделенного коры Acacia catechu, с соотношением компонентов в смеси 80:20. Для изучения воздействия Lasoperin™ на зависящую от гиппокампа когнитивную функцию оценивали способность 60 самцов крыс линии Fisher 344 (указанного ниже возраста) с помощью теста с использованием лабиринта с радиальными ответвлениями (RAWM). Этот тест позволяет оценивать изменения научения и памяти в процессе обработки лекарственным средством. Перед началом эксперимента с добавлением в корм тестируемых соединений (экспериментального кормления) проводили оценки исходного уровня и тест повторяли на 5 и 11 неделях после начала экспериментального кормления. Режим «без задержки» предназначен для демонстрации способности животного выполнять задачу и служит в качестве контроля при оценке различий в способности выполнять задачу (например, связанную с движением, зрением, мотивацией и т.д.). В режиме «с задержкой» вводится 4-часовая задержка между опытами 3 и 4, что усложняет задачу. Режим «с задержкой» предназначен для демонстрации связанного с возрастом ухудшения памяти.
Животные. Самцов крыс линии Fischer 344 (колония, созданная по контракту Национальным институтом по проблемам старения (National Institute on Aging contract colony); фирма Harlan Sprague Dawley, Индианаполис, штат Индиана) (возраст 6 месяцев, n=12, и возраст 17 месяцев, n=48) содержали попарно в камерах с контролируемыми условиями окружающей среды при световом цикле 12 ч света/12 ч темноты при 21±1°С и они имели свободный доступ к корму и воде. Молодым и старым контрольным животным давали корм для грызунов NIH-31 (TD 00365; фирма Harlan Teklab, Мэдисон, штат Висконсин). Подопытным группам давали корм для грызунов NIH-31 с добавлением Lasoperin™ (3, 7 или 34 мг/кг). Контрольный корм и экспериментальную композицию приготавливала фирма Harlan Teklab и поставляла в форме экструдированных гранул для животных. Крысам встраивали микрочипы для обеспечения правильной идентификации в процессе всех этапов опыта. Из-за большого количества животных эксперимент проводили параллельно для двух когорт по 30 крыс, разделенных на группы по 6 животных в каждой. Для получения исходного уровня животных оценивали с помощью RAWM перед началом экспериментального кормления. После завершения исходного RAWM-теста старых крыс разделяли на четыре группы (контрольная группа старых крыс (старые контрольные животные), 3, 7 и 34 мг/кг Lasoperin™) уравновешивающим образом, так что каждая группа имела неопределенные характеристики по данным RAWM-теста. Осуществляли еженедельно мониторинг веса животных и поглощения корма для определения общего состояния здоровья и потребления корма. Между группами не было обнаружено различий в этих показателях.
Водяной лабиринт с радиальными ответвлениями (RAWM). RAWM состоял из 12 ответвлений (ширина 15 см, длина 43 см), исходящих из круговой «области выбора» (диаметр 60 см), в заполненном водой баке размером 1,5 м. Спасательная платформа (10 см × 13 см) размещалась на конце одного из ответвлений на 2 см ниже поверхности воды. Крыс предварительно тренировали в лабиринте в течение 5 дней. Предварительная тренировка заключалась в формировании у животных путем последовательного приближения к конечной цели условного рефлекса поиска целевого ответвления, для чего сначала закрывали все не целевые ответвления и постепенно увеличивали количество доступных ответвлений до тех пор, пока не будут открыты все 12 ответвлений. Затем крыс тренировали в течение двух периодов времени по пять дней каждый. Полный процесс тренировки занимал три недели. Исходное (стартовое) ответвление в каждом опыте назначали псевдослучайным образом из 11 доступных ответвлений. Данное ответвление использовали только один раз в день, так что каждый день было по четыре различных стартовых ответвления. Для того чтобы избегать предпочтительного места и положения, стартовое и целевое ответвления для каждого животного в группе в течение каждого дня были разными, но одинаковыми во всех группах. В день проводили по четыре опыта (с максимальной продолжительностью по 180 с) с 30-секундными интервалами между опытами. Если крыса не могла найти спасательную платформу в течение 180 с, то ее осторожно направляли в правильное ответвление. Регистрировали количество ответвлений, в которые входило животное до тех пор, пока оно не попадало в ответвление, в котором находилась спасительная платформа (количество ошибок). Между опытами 3 и 4 в течение дней 6-10 вводили 3-часовую задержку. Во время задержки крыс возвращали в их клетку, в которой они содержались. Результаты приведены на фиг.1А-1 В. Данные представлены в виде зависимости среднего значения для каждого опыта от количества проведенных опытов.
Из данных, приведенных на фиг.1А-1В, видно, что во всех сеансах происходило существенное уменьшение общих ошибок при увеличении количества опытов, что свидетельствует о способности крыс обучаться выполнять задачу. При выполнении задачи «без задержки» не было обнаружено связанных с возрастом или применением лекарственного средства различий в способностях. При выполнении задачи «с задержкой» был выявлен существенный возрастной эффект во всех трех сеансах, проводимых с задержкой (исходный уровень, сеанс II и сеанс III; см. фиг.1А, 1Б и 1В соответственно). В опыте 4 старых животных выполняли задание существенно хуже, чем молодые контрольные животные. В тестах «с задержкой», проведенных при определении исходного уровня (фиг.1) и в сеансе II (фиг.1Б), не было выявлено эффекта, зависящего от лекарственного средства. Однако был выявлен существенный обусловленный лекарственным средством эффект в сеансе III теста «с задержкой» (фиг.1В). Группы, обработанные дозами 7 и 34 мг/кг, делали существенно меньше ошибок, чем группы старых контрольных животных. Они не отличались существенно от групп молодых контрольных животных, что позволяет предположить, что Lasoperin™ предупреждает связанное с возрастом ухудшение памяти. Анализ результатов осуществляли с помощью 2-направленного метода дисперсионного анализа (ANOVA) для повторных измерений.
Пример 3. Воздействие Lasoperin™ на зависящую от гиппокампа когнитивную функцию (CFC)
В этом опыте использовали 60 самцов крыс линии Fisher 344, которые описаны в примере 2.
Контекстовое формирование условного рефлекса (CFC). Через 1 неделю после завершения RAWM-тестов крыс помещали в ящик (30,5 см × 24,1 см × 21 см, фирма Med Associates, Сент-Альбанс, штат Вермонт) с сетчатым полом (прутья диаметром 4,8 мм на расстоянии 1,6 см друг от друга), соединенным с шокером, действующим от постоянного тока (фирма Med Associates). Перед помещением каждой крысы в ящик его промывали 3%-ной уксусной кислотой, которая выполняла функцию специфического ароматизатора для исходного контекста. Осуществляли две последовательные серии тренировок. Каждая серия тренировок имела продолжительность 180 с и включала условный стимул (стимул для выработки условного рефлекса, УС)в виде белого шума интенсивностью 85 дБ продолжительностью 30 с и действие электрического шока на лапу (2 с, 0,5 мА) (безусловный стимул, БС). Действие УС и БС прекращалось одновременно при окончании серии тренировок. Все крысы реагировали на действие электрического шока на ногу путем подпрыгивания. Крысы оставались в ящике для тренировок в течение 30 с после второй серии тренировок. Сохранение в памяти проверяли через 2 дня после тренировки, для чего сначала животных помещали в то же самое устройство, используя 3%-ную уксусную кислоту в качестве ароматизатора, в котором проводили тренировку в течение 5 мин без УС или БС. Через 2-3 ч крыс помещали в ту же самую камеру за исключением того, что сетчатый пол был накрыт куском черного пластика (Formica) и клетку промывали 3%-ным гидроксидом аммония (фирма Novel Context) в течение 6 мин, при этом в течение последних 3 мин применяли УС. «Замирание» оценивал визуально вручную каждые 10 с экспериментатор, который не имел сведений о том, к какой группе обработки относится крыса. Экспериментатор оценивал с 10-секундными интервалами «замерла» ли крыса или нет. Процент «замирания» вычисляли с использованием следующей формулы: количество интервалов, в которых крысу оценивали как находящуюся в состоянии «замирания»/общее количество интервалов × 100. Результаты приведены на фиг.2.
«Замирание» в контексте тренировки. При анализе этим методом было выявлено статистически достоверное уменьшение «замирания» у старых контрольных животных по сравнение с молодыми контрольными животными (см. фиг.2). Дозы 7 и 34 мг/кг Lasoperin™ облегчали это связанное с возрастом ухудшение. Для дозы 3 мг/кг выявлена статистически недостоверная тенденция к облегчению связанного с возрастом ухудшения. Ни у одной из обработанных Lasoperin™ крыс не было выявлено статистически достоверного отличия от молодых контрольных животных.
«Замирание» в ответ на действие шумового условного стимула (УС) позволяет оценивать память, не зависящую от гиппокампа. Результаты, полученные в этом опыте, свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий в «замирании» между любыми из групп животных (данные не приведены).
«Замирание» в ответ на новый контекст представляет собой контрольную оценку при определении исходного уровня «замирания». Для получения этой характеристики количество «застываний», зарегистрированное в контексте тренировки и при действии УС, сравнивали с исходным уровнем «замирания» с целью определения, имеет ли место обучаемость. Между любыми группами животных не было выявлено статистически достоверной разницы в «замирании» (данные не приведены).
Ноцицептивный порог. Устройство представляло собой камеру для опытов размером 30,5×25,4×30,5 см (фирма Coulbourn Instruments, Алленстоун, штат Пенсильвания). Потолок и две стенки камеры были изготовлены из алюминия. Две другие стенки были изготовлены из прозрачного пластика. Ящик был слабо освещен (хх лк). Пол был сделан из прутков из нержавеющей стали (диаметр 5 мм, расстояние между прутками 1,68 см). Электрический удар (шок) создавали с помощью точно регулируемого шокера (Precision Regulated Shocker, модель Model H12-16, фирма Coulbourn Instruments). Крыс помещали в клетку с металлическим решетчатым полом (размеры решетки). На противоположной от экспериментатора стороне камеры устанавливали зеркало для облегчения наблюдения. Всем крысам давали адаптироваться в течение 2-х минут перед началом эксперимента. Каждую крысу помещали в камеру за 2 мин до начала серии электрических ударов и затем пол клетки очищали с помощью стальной стружки для чистки посуды и воды. Продолжительность каждого электрического импульса составляла 0,5 с и электрические удары подавались с интервалом примерно 10 с. Интенсивности электрических ударов можно было регулировать ступенчатым образом по логарифмическому закону в диапазоне от 0,05 до 4,0 мА. При определении порогового значения полный диапазон не использовали. Границы интенсивностей, в пределах которых следовало искать пороговые значения, определяли на основе предыдущих измерений. Средние точки между этими границами служили в качестве исходных интенсивностей в экспериментах. «Вздрагивание» определяли как поднятие одной лапы, а «прыжок» - как быстрое движение трех или четырех лап, при этом обе реакции оценивали по отрыву лап от пола. Для определения порядка применения интенсивностей электрического удара в каждой серии электрических ударов использовали модификацию метода «вверх-и-вниз» ("up-and-down") применительно к малым выборкам.
10
10
50
50
f
f
Процедура включала следующие стадии: 1) первые серии начинали с интенсивности электрического удара, максимально близкого к пороговому значению для «вздрагивания» или «прыжка» для рассматриваемой обработки; 2) осуществляли серию опытов следующим образом: в случае наличия реакций («вздрагивание» или «прыжок») в следующем опыте уменьшали интенсивность электрического удара (на 0,1 log единицы), а в случае отсутствия реакций в следующем опыте увеличивали интенсивность электрического удара (на 0,1 log единицы). В каждой серии опыты продолжали до тех пор, пока не происходило изменение поведения и через четыре опыта после этого серию прекращали. Оценку средней эффективной интенсивности (EI) рассчитывали по формуле EI=X+kd, где X = последняя примененная интенсивность, k - значение из таблицы 1 публикации Dixon (Dixon, J. Am. Stat. Assoc., 60, 1965, сс.47-55) и d - логарифм интервала между интенсивностями электрического удара. Для оценки порогового значения для «вздрагивания» осуществляли две серии электрических ударов, после чего проводили две серии электрических ударов для определения порогового значения для «прыжка». Эти контрольные тесты по определению интенсивностей электрического удара создавали парадигму поведения при контекстовом формировании условного рефлекса страха и не представляли собой связанную с ней особую группу результатов.
Пример 4. Воздействие Lasoperin™ на скорость обработки информации
Для оценки воздействия Lasoperin™ на когнитивную функцию проводили в течение 4-недельного периода серию тестов на когнитивно интактных (неподготовленных) индивидуумах возрастом 35-65 лет. Индивидуумов обрабатывали дозой 300 мг/день композиции Lasoperin™ (80:20), которую приготавливали согласно методу, описанному в примере 1. Измерение когнитивной способности проводили с использованием серий тестов на сохранение когнитивной способности на основе принципа «запутывания», которые позволяют оценивать психомоторную скорость, скорость рабочей памяти (принятие исполняемого решения, быстроту и гибкость) и непосредственную память (обработку вербальной и пространственной информации в памяти). Перед началом опыта участники должны были практиковаться в выполнении теста в течение двух последовательных дней для определения исходных способностей. Анализ данных заключался в сравнении исходных способностей со способностями после обработки. Индивидуумов, подвергавшихся обработке, еженедельно экзаменовали с целью определения того, приводила ли пищевая добавка к изменению когнитивной функции. При анализе данных проводили сравнение исходных способностей индивидуумов, подвергавшихся обработке, с индивидуумами, которые получали плацебо в течение такого же периода времени. Анализировали данные только для тех индивидуумов, которые прошли все тесты, начиная с определения исходного уровня и в течение всех недель, когда им вводили дозы лекарственного средства. Отбрасывали выпавшие результаты, имеющие более чем 2 стандартных отклонений от среднего значения в опыте, и данные, внутренне не согласующиеся с другими полученными в опыте оценками. Для того чтобы исключить аномальные результаты, которые могли быть обусловлены отвлечением внимания или сбоями ("glitches") программы «запутывания» компьютера, что могло приводить к недостоверности результатов сеанса, данные анализировали с помощью метода дисперсионного анализа (ANOVA) для повторных измерений в дни проведения эксперимента и путем сравнения исходного уровня с уровнем когнитивных способностей на последней неделе тестирования с помощью соответствующих послеэкспериментальных тестов.
Тест на психомоторную скорость или физический рефлекс представляет собой простой тест на время реакции, который требует от индивидуума как можно более быстрого нажатия на клавишу после появления фигуры на экране компьютера. Общая способность выполнения психомоторной задачи для всех возрастов была очень стабильной и не характеризовалась какими-либо существенными различиями средних, медианных значений или стандартных отклонений между группами (р>0,05). Таким образом, тест на психомоторную скорость не выявил никаких различий между группами, подвергавшимися обработке, и контрольными группами. Однако было обнаружено общее улучшение способностей для всех групп в течение периода тестирования.
В тесте на скорость рабочей памяти, задании на время реакции сложного выбора, одновременно появляется слово и картинка и от индивидуума требуется решить, соответствуют ли они друг другу или нет. Случайным образом возникает также смена сигнального значения на противоположное и от индивидуума требуется дать ответ, противоположный правильному, так что ответ на правильную пару должен быть «нет», и наоборот. Это задание требует подавления или «ингибирования заученного ответа» и последующего изменения ("смена задачи") возможного ответа. Скорость переключения от одной задачи или одной формы ответа на другую часто эквивалентна умственной гибкости и когнитивной обработке информации более высокого порядка, а также более высокой способности принимать решение. Познавательные элементы этого теста позволяют оценивать исполнительную когнитивную функцию, включая скорость обработки информации, длительное внимание, когнитивную приспособляемость и способность принимать быстрые решения при сложной и требующей когнитивной способности задачи.
Тест на непосредственную память аналогичен классической задаче Стернберга, в которой за рядом элементов-стимулов, «мишеней», которые требуется запомнить, следует «проверочный» элемент. Индивидуум должен определить, находился ли проверочный элемент в предыдущем списке мишеней. Длину списка можно варьировать для оценки способности кратковременной памяти индивидуума. В этом задании используют как буквенные элементы, так и пространственное расположение.
Результаты приведены на фиг.3, на которой продемонстрировано, что Lasoperin™ может повышать скорость когнитивной обработки информации (принятие решений), не ухудшая точность выбора, т.е. повышать скорость реакции на когнитивную задачу или на ситуации со сложным выбором.
Пример 5. Воздействие Lasoperin™ на способность сосредоточиваться и внимание по данным измерения стандартного отклонения времени реакции
Для оценки воздействия Lasoperin™ на когнитивную функцию проводили в течение 4 недель серию тестов с участие когнитивно интактных индивидуумов возрастом 35-65 лет согласно методу, описанному в примере 4. Стандартное отклонение времени реакции (RTSD) часто используют в качестве критерия внимания и при исследовании когнитивных способностей и, как правило, считают, что оно отражает эффективность обработки информации и относящийся к нервной системе шум (Jensen). Из данных, представленных на фиг.4, можно видеть, что в течение 4-недельного тестирования происходило существенное улучшение RTSD. Это означает, что начиная с момента определения исходного уровня происходило уменьшение стандартного отклонения в течение 4-недельного периода введения индивидуумам Lasoperin™. У субъектов, которым вводили плацебо, также было выявлено улучшение, но не в такой степени. Это позволяет предположить, что действие обусловлено улучшением согласованности выполнения задачи, которая повышалась при обработке с использованием Lasoperin™, а не просто обучаемостью, приводящей к лучшему выполнению задачи. Эти результаты позволяют предположить, что Lasoperin™ может приводить к повышению длительного внимания, улучшая согласованность требующего когнитивных способностей реагирования на поставленную задачу или на ситуации со сложным выбором.
Пример 6. Ингибирование СОХ-1 и СОХ-2 с помощью Lasoperin™
50
50
50
50
Измерение IC Lasoperin™ осуществляли с помощью следующего метода. В анализе применяли расщепляемый хромофор, представляющий собой пероксид, для визуальной оценки пероксидазной активности каждого фермента в присутствии арахидоновой кислоты в качестве кофактора. Как правило, анализы проводили в 96-луночном формате. Каждый ингибитор, взятый из 10 мг/мл маточного раствора в 100%-ном ДМСО, тестировали в трех повторностях при комнатной температуре с использованием следующих концентраций: 0, 0,1, 1, 5, 10, 20, 50, 100 и 500 мкг/мл. В каждую лунку вносили по 150 мкл 100 мМ Трис·HCl, рН 7,5 в сочетании с 10 мкл 22 мкМ гематина, разведенного в Трис-буфере, 10 мкл ингибитора, разведенного в ДМСО, и 25 ед. либо фермента COX-1, либо фермента СОХ-2. Компоненты смешивали в течение 10 с на вращающейся платформе, после чего добавляли 20 мкл 2 мМ дигидрохлорида N,N,N'N'-тетраметил-пара-фенилендиамина (TMPD) и 20 мкл 1,1 мМ АК для инициации реакции. Планшет встряхивали в течение 10 с и затем инкубировали в течение 5 мин перед регистрацией абсорбции при 570 нм. Строили график зависимости процента ингибирования от концентрации ингибитора и определяли значение IC из ряда возрастающих концентраций, отложенных на Х-оси, как соответствующую точке, находящейся на половине максимума изотермы. Затем значения IC стандартизовали по отношению к количеству единиц фермента, использованных в анализе. Результаты измерения зависимости реакции от дозы и значения IC для Lasoperin™ представлены на фиг.5.
Пример 7. Ингибирование 5-липооксигеназы (5-LO) катехином, выделенным из A. catechu
50
Один из наиболее важных путей, участвующих в воспалительной реакции, опосредуется ненесущими гем железосодержащими липооксигеназами (5-LO, 12-LO и 15-LO), которые катализируют присоединение молекулярного кислорода к жирным кислотам, таким как арахидоновая кислота (АК), с образованием гидроксипероксидов 5-, 12- и 15-НРЕТЕ, которые затем превращаются в лейкотриены. Имеются данные о том, что флавановый экстракт из A. catechu может в определенной степени ингибировать 5-LO, предупреждая тем самым образование 5-НРЕТЕ. Для определения того, может ли очищенный флаван катехин из A. catechu непосредственно ингибировать 5-LO in vitro, применяли набор для скрининга ингибиторов липооксигеназы (A Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit) (фирма Cayman Chemical, Inc., каталожный номер 760700). После замены с помощью микрофильтрации фосфатного буфера на Трио-буфер заменяли 15-LO из сои, которую, как правило, используют в наборе, на 5-LO из картофеля. Этот анализ позволяет обнаруживать образование пероксидов с помощью хромагена, чувствительного к кислороду. В целом анализ проводили в трех повторностях путем добавления 90 мкл 0,17 ед./мкл 5-LO из картофеля, 20 мкл 1,1 мМ АК, 100 мкл чувствительного к кислороду хромагена и 1 мкл очищенного ингибитора флавана до конечных концентраций, находящихся в диапазоне от 0 до 500 мкг/мл. Результаты приведены на фиг.6. Было установлено, что значение IC для ингибирования 5-LO катехином составляло 1,38 мкг/мл/единицу фермента.
4
Пример 8. Измерение уровней LTB после обработки Lasoperin™
2
4
4
4
4
4
Композицию Lasoperin™ приготавливали согласно методу, описанному в примере 1, с использованием стандартизованного экстракта флавоноида со свободным кольцом В из корней S. baicalensis и стандартизованного экстракта флавана из коры A. catechu с соотношением компонентов в смеси 80:20 (Lasoperin™). Lasoperin™ и ибупрофен, другой известный ингибитор 5-LO, добавляли в концентрации 3 мкг/мл к клеткам линии НТ-29, представляющим собой клеточные линии моноцитов, экспрессирующие СОХ-1, СОХ-2 и 5-LO, и инкубировали в течение 48 ч при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО. Затем каждую обработанную линию клеток собирали центрифугированием и клетки осторожно разрушали с помощью двойной гомогенизации в физиологическом буфере для лизиса. С целью оценки воздействия Lasoperin™ на новые уровни синтезированного LTB, присутствующие в каждой линии клеток, которые отражают ингибирующее воздействие Lasoperin™ на 5-LO-путь, применяли конкурентный ELISA для LTB (LTB; фирма Neogen, Inc., каталожный номер 406110). Анализ проводили с дублированием путем добавления 160000-180000 клеток на лунку в 6-луночные планшеты. Результаты приведены на фиг.7. Как видно из результатов, представленных на фиг.7, Lasoperin™ ингибировал на 80% уровень вновь синтезируемого LTB в клетках линии НТ-29. Ибупрофен приводил лишь к 20%-ному уменьшению количества LTB в течение такого же периода времени.
Пример 9. Воздействие Lasoperin™ на индуцируемые ЛПС уровни TNFα и IL-1β в моноцитах периферической крови
Моноциты периферической крови (РВМС) из крови людей-доноров выделяли с помощью градиента гистопака (Histopaque, фирма Sigma). Затем клетки культивировали в течение примерно 12 ч в среде RPMI 1640, дополненной 1% бычьего сывороточного альбумина, после чего для индукции воспаления проводили обработку липополисахаридом (ЛПС) в возрастающих концентрациях в присутствии различных концентраций Lasoperin™ (80:20). Результаты приведены на фиг.8-10.
Пример 10. Сравнение избирательного ингибирования экспрессии гена сох-2 относительно ингибирования экспрессии гена сох-1 с помощью Lasoperin™ и с помощью других НСПВЛ
2

Для оценки того, может ли Lasoperin™ оказывать воздействие на геномном уровне, выделенные моноциты периферической крови человека (РВМС) стимулировали липополисахаридом (ЛПС), обрабатывали Lasoperin™, целекоксибом, ибупрофеном или ацетаминофеном и затем полученную общую РНК собирали и анализировали с помощью полуколичественной ОТ-кПЦР. Конкретно анализ состоял в том, что в каждую лунку 6-луночного планшета добавляли по 130000 клеток. Затем клетки стимулировали с помощью 10 нг/мл ЛПС и совместно инкубировали с Lasoperin™ в концентрации 1, 3, 10, 30 и 100 мкг/мл и целекоксибом, ибупрофеном и ацетаминофеном в концентрации 3 мкг/мл в течение 18 ч при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO. Затем каждую обработанную партию клеток собирали центрифугированием и полученную общую РНК выделяли с помощью реагента TRIzol(фирма Invitrogen™ Life Technologies, каталожный номер 15596-026) согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем реагента TRIzol. Осуществляли обратную транскрипцию общей РНК с помощью обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (M-MLV RT; фирма Promega Corp., каталожный номер M1701) с использованием случайных гексамеров (фирма Promega Corp., каталожный номер С 1181). qПЦР-эксперименты проводили с помощью системы обнаружения последовательности типа ABI Prism 7700 с использованием предварительно созданных сертифицированных продуктов, применяемых для анализа по требованию (Assays-on-Demand, AOD, фирма Applied Biosystems, Inc., каталожный номер 4331182), в качестве внутреннего стандарта для 18S-pPHK и специфического для гена метода анализа. Уровни специфической экспрессии гена стандартизовали по отношению к соответствующим им величинам экспрессии гена 18S-pPHK (внутренний контроль) и затем данные, полученные в условии без обработки ЛПС и лекарственным средством, стандартизовали до 100. Данные, полученные в условиях с обработкой, представляли собой относительные величины по сравнению с данными, полученными в этих «нулевых» условиях (без обработки). Lasoperin™ приводил к уменьшению стандартизованной экспрессии гена сох-2 более чем в 100 раз, в то время как стандартизованная экспрессия гена сох-1 претерпевала лишь небольшое изменение. В тех же условиях обработки стандартизованная экспрессия гена TNFα уменьшалась в 6 раз, а стандартизованная экспрессия гена IL-1β уменьшалась более чем в 100 раз. Когда РВМС обрабатывали 3 мкг/мл Lasoperin™, целекоксиба, ибупрофена или ацетаминофена, то только Lasoperin™ не приводил к увеличению экспрессии гена сох-2. Это исследование проводили совместно с анализами методом ELISA для оценки изменений уровней белка, а также анализами ферментативной функции для оценки изменений функции белка. В результате этих исследований были продемонстрированы как связанные с геномом, так и протеомные воздействия обработки с помощью Lasoperin™. В других процитированных публикациях применяли специфические для белка методы для того, чтобы сделать вывод о наличии экспрессии гена, а не для того, чтобы продемонстрировать ее непосредственно. Результаты приведены на фиг.11-13.
Пример 11. Понижающая регуляция мРНК имеющих решающее значение воспалительных белков с помощью Lasoperin™
2

РВМС из человеческой донорской крови (полученной из местного банка крови) выделяли с помощью градиента гистопака (Histopaque, фирма Sigma). Затем клетки культивировали в течение примерно 24 ч в среде RPMI 1640, дополненной 1% бычьего сывороточного альбумина, после чего обрабатывали ЛПС (10 мкг/мл) и возрастающими концентрациями Lasoperin™ (80:20). Конкретно анализ состоял в том, что каждую лунку 6-луночного планшета добавляли по 130000 клеток. Затем клетки стимулировали с помощью 10 нг/мл ЛПС и совместно инкубировали с Lasoperin™ в концентрации 100 мкг/мл в течение 18 ч при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО. Затем каждую обработанную партию клеток собирали центрифугированием и полученную общую РНК выделяли с помощью реагента TRIzol (фирма Invitrogen™ Life Technologies, каталожный номер 15596-026) согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем реагента TRIzol. Осуществляли обратную транскрипцию общей РНК с помощью обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (ОТ M-MLV; фирма Promega Corp., каталожный номер М1701) с использованием случайных гексамеров (фирма Promega Corp., каталожный номер С 1181). кПЦР-эксперименты проводили с помощью системы обнаружения последовательности типа ABI Prism 7700 с использованием предварительно созданных сертифицированных продуктов, применяемых для анализа по требованию (Assays-on-Demand, AOD, фирма Applied Biosystems, Inc., каталожный номер 4331182), в качестве внутреннего стандарта для 18S-рРНК и специфического для гена метода анализа. Уровни специфической экспрессии гена стандартизовали по отношению к соответствующим им уровням экспрессии гена мРНК циклофилина А (внутренний контроль) и затем данные, полученные в условии без обработки ЛПС и лекарственным средством, стандартизовали до 100. Данные, полученные в условиях с обработкой, представляют собой относительные величины по сравнению с данными, полученными в этих «нулевых» условии (без обработки). Результаты приведены на фиг.14.
Из данных, приведенных на фиг.14, можно видеть, что Lasoperin™ приводил к уменьшению стандартизованной экспрессии гена сох-2 в среднем в 3 раза, в то время как нормализованная экспрессия гена сох-1 претерпевала лишь небольшое изменение. В тех же условиях обработки стандартизованная экспрессия гена infα уменьшалась в среднем в 3 раза, стандартизованная экспрессия гена il-1β уменьшалась в среднем в 45 раз, а стандартизованная экспрессия гена il-6 уменьшалась в среднем в 37 раз. В других процитированных публикациях применяли специфические для белка методы для того, чтобы сделать вывод о наличии экспрессии гена, а не для того, чтобы продемонстрировать ее непосредственно. Результаты приведены на фиг.14.
Пример 12. Понижающая регуляция промоторных элементов воспалительных генов с помощью Lasoperin™
Промоторные области каждого из воспалительных генов tnfα, il-1β, il-6 и сох-2 содержат сайты связывания NFκB, которые могут оказывать влияние на понижающую регуляцию экспрессии гена, когда клетки обрабатывают Lasoperin™. Промоторная область гена сох-2 содержит также реактивный элемент PPARγ (PPRE), который взаимодействует с транскрипционным белком ретиноидного Х-рецептора. Lasoperin™ осуществляет понижающую регуляцию экспрессии гена pparγ, что, по-видимому, приводит к снижению уровня белка PPARγ, в результате чего он не может осуществлять действие, стимулирующее экспрессию гена сох-2. Кроме того, Lasoperin™ оказывает понижающую регуляцию на экспрессию гена nfκb. Таким образом, соединение действует на два фактора транскрипции, которые влияют на экспрессию гена сох-2 и, по-видимому, на производство белка СОХ-2. Эти промоторные элементы показаны на фиг.15.
Пример 13. Измерение способности Lasoperin™ абсорбировать кислородные радикалы (ORAC)
hydro
lipo
hydro
lipo
total
Lasoperin™ тестировали в отношении его способности абсорбировать кислородные радикалы (ORAC) по сравнению с некоторыми широко известными антиоксидантами из пищевых продуктов с помощью экспериментальных методов, описанных у Сао и др., Free Radic. Biol. Med., 16, 1994, сс.135-137 и Prior и Сао, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 220, 1999, сс.255-261. ORAC-анализ, в котором используют в качестве флуоресцентного зонда флуоресцеин, позволяет измерять способность антиоксидантов поглощать пероксильные радикалы, которые представляют собой один из наиболее распространенных реакционно-способных видов кислорода, обнаруженных в организме. ORACхарактеризует абсорбционную способность водорастворимых андиоксидантов, а ORAC - способность жирорастворимых антиоксидантов. В качестве калибровочного стандарта использовали тролокс, водорастворимый аналог витамина Е, результаты выражали в виде эквивалентного количества микромолей тролокса (ТЕ) на грамм. Lasoperin™ имел величину ORAC, составлявшую 5,517 мкмоля ТЕ/г, и величину ORAC, составлявшую 87 мкмолей ТЕ/г, при этом ORAC составляла 5,604 мкмоля ТЕ/г. Результаты приведены в таблице 2, из которой следует, что Lasoperin™ имел величину ORAC, сопоставимую с величиной ORAC витамина С и, таким образом, должен снижать уровни ROS в организме.
Таблица 2
Относительные величины ORAC Lasoperin™ по сравнению с обычными антиоксидантами
Обозначение образца
ORAC (мкмоли ТЕ/г)
Витамин С (водорастворимый)
5,000
Витамин Е (жирорастворимый)
1,100
Порошкообразный Lasoperin
5,517
Виноградный концентрат
133
Вишневый концентрат
79
Клюквенный концентрат
90
Черничный концентрат
125
Пример 14. Количественная оценка состава смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) с обращенной фазой (метод 1)
Смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов (20 мкл стандартизованного экстракта с концентрацией 1,13 мг/мл) в смеси 80% метанола:20% тетрагидрофурана вносили на Phenomenex Luna С-18-колонку (250×4,6 мм, размер гранул 5 мкм) и элюировали в течение 19 мин при скорости 1,0 мл/мин с использованием линейного градиента от 80% А до 20% А (элюент А - 0,1% (об./об.) фосфорная кислота; элюент В-ацетонитрил) при 35°С. Как можно видеть из данных, приведенных на фиг.16, в этих условиях флавоноиды со свободным кольцом В (бакалеин и бакалин) элюировались в виде основного пика в период между 11-й и 14-й минутами, а флаваны (катехины и эпикатехины) элюировались в виде минорного пика в период между примерно 3-й и 5-й минутами. Количество флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов определяли путем измерения площади под каждой кривой и сравнения с известными стандартами.
Пример 15. Количественная оценка состава смеси флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов с помощью изократической ЖХВД с обращенной фазой (метод 2)
Смесь флавоноидов со свободным кольцом В и флаванов (20 мл стандартизованного экстракта с концентрацией 3,55 мг/мл) в смеси 80% метанола: 20% воды вносили на Phenomenex Luna С-18-колонку (250×4,6 мм, размер гранул 5 мм) и элюировали в изократических условиях при 35°С с использованием 80% А (элюент А - 0,1% (об./об.) фосфорная кислота; элюент В-ацетонитрил). Как видно из данных, приведенных на фиг.17, в этих условиях два флавана (катехины и эпикатехины) элюировались в смыв в период между 4,5 и 5,5 минутами, а флавоноиды со свободным кольцом В (бакалеин и бакалин) элюировались в период между 12 и 13,5 минутами. Количественную оценку пиков флаванов осуществляли согласно методу, описанному в примере 14.