ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ПРОВИРУСОВ ЛЕЙКОЗА И ИММУНОДЕФИЦИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Диагностическая система для выявления ДНК провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающая проведение полимеразной цепной реакции при одновременном использования двух пар прямых и обратных олигонуклеотидных праймеров для выявления провирусов энзоотичесого лейкоза (pBLVf и pBLVr) и иммунодефицита крупного рогатого скота (pBIVf и pBIVr), у которых отсутствуют самокоплементарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным, отличающаяся тем, что праймеры имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
pBLVf - TATTCCACCCTCGCAAGGC и
pBLVr - GGGCAGTTGATCCAGAGTCGT;
pBIVf - GTCTTCCCACATCCGTAACATCTCCT и
pBIVr - CCCCAGGTCCCATCAACATTCATCAG,
2
температуру отжига 58°C для обоих пар олигонуклеотидов, GC состав для pBIVf и pBIVr - 50,5% и для pBLVf и pBLVr - 56,5%, и фланкируют область консервативного гена tax провируса энзоотичесого лейкоза крупного рогатого скота (pBLVf и pBLVr) размером 609 пар нуклеотидов и область консервативного гена gag провируса иммунодефицита крупного рогатого скота (pBIVf и pBIVr) размером 382 пар нуклеотидов, причем реакционная смесь имеет следующий состав: буфер 10-и кратный для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,4 мкл, праймеры pBLVf, pBLVr, pBIVf и pBIVr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, Taq полимераза (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl (50 мМ) - 1,5, мкл, бидистиллированной воды - 11,4 мкл и пробы ДНК - 5 мкл., а амплификация включает: тотальную денатурацию при 95°С - 3 мин., цикл денатурация/отжиг/элонгация (95°С - 20 или 60 сек.)/(58°С - 20 или 60 сек.)/(72°С - 40 или 60 сек.), повторяющийся 35 раз, и заключительную элонгацию при 72°С в течение 5 мин., а при проведении гельэлектрофореза по размерам амплифицируемых фрагментов длиной 382 пар нуклеотидов - для Bovine immunodeficiency virus и 609 пар нуклеотидов - для Bovine leukemia virus судят о наличии или отсутствии провирусов иммунодефицита и лейкоза в лимфоцитах крупного рогатого скота.