Оптимизация условий адсорбции моноклональных антител на твердую фазу в сэндвич-методе определения вирусных антигенов

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ АДСОРБЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА ТВЕРДУЮ ФАЗУ В СЭНДВИЧ-МЕТОДЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ

Д.А. Яковлева, Ю.Н. Тараканова, В.Ф. Лавров, А.Д. Дмитриев

OPTIMIZATION OF THE CONDITIONS OF MONOCLONAL ANTIBODIES PASSIVE ADSORPTION ONTO THE SOLID PHASE IN SANDWICH ELISA FOR VIRAL ANTIGENS

D.A. Yakovleva, Yu.N. Tarakanova, V.F. Lavrov, A.D. Dmitriev НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Показано, что более 30 % моноклональных антител существенно лучше сохраняют свою активность после адсорбции на полистироловые поверхности при рН 2,8, чем при рН 7,5 или 9,5. Использование буферов с низким значением рН для адсорбции антител может быть использовано в качестве полезного приема при конструировании и оптимизации иммуноферментных сэндвич-методов определения вирусных антигенов.

Ключевые слова: моноклональные антитела, вирусные антигены, иммунофермент-ный анализ, пассивная адсорбция.

It has been found that many monoclonal antibodies (more than 30 %) show higher biological activity after adsorption to polystyrene surfaces at pH 2,8, compared to pH 7,5 or 9,5. The use of coating buffers with low pH for antibody immobilization onto polystyrene surfaces may enable the construction and optimization of sandwich ELISAs for viral antigens.

Keywords: monoclonal antibodies, viral antigens, ELISA, passive adsorption.

Введение. Твердофазный иммунофермент-ный сэндвич-метод определения антигенов белковой природы находит широкое применение для выявления маркеров опасных вирусных инфекций. Традиционная схема указанного варианта иммуноферментного анализа (ИФА) основана на реакции моноклональных антител (МКА), иммобилизованных на твердой фазе, с антигеном в растворе и вторыми антителами, связанными с ферментной меткой (пероксидазой хрена или др.). Иммобилизованные и меченые МКА направлены к разным эпитопам определяемого антигена. Это позволяет образоваться на поверхности твердой фазы трехслойным иммунным комплексам («сэндвичам»), в которых антиген зажат

между двумя антителами. Путем проведения реакции фермента с субстратом ферментная метка «трансформируется» в соответствующий сигнал, регистрируемый различными физико-химическими методами (спектрофо-тометрическими и др.). Интенсивность регистрируемого сигнала зависит от концентрации аналита.

Поверхностная концентрация биологически активных и высокоаффинных МКА на твердой фазе (например, на поверхности полистироловых планшетов) — это один из основных факторов, определяющих эффективность твердофазных иммуноферментных диагностических систем [3]. Для прикрепления МКА к твердой фазе нередко используют метод пас-

сивной адсорбции [3]. Этот подход отличает доступность, простота исполнения и дешевизна. Однако его недостатком является то, что при соприкосновении с пластиком (твердой фазой) более 95—97 % адсорбированных МКА утрачивают свою антигенсвязывающую активность в результате денатурации или неправильной ориентации молекул [3]. Поэтому поиск методов оптимизации пассивной адсорбции МКА на твердую фазу остается актуальной задачей. В настоящей статье показано, что более 30 % МКА значительно лучше сохраняют свою биологическую активность, если их адсорбировать на поверхность полистироловых планшетов при низких значениях рН.

Материалы и методы. В исследовании использовались полистироловые иммунные планшеты «MaxiSorp» фирмы «Nunc» (Дания), стрептавидин-пероксидаза фирмы «Biosource» (США) и LC-LC-биотин фирмы «Pearce» (США). Прочие реактивы получены из фирмы Sigma (США). Рекомбинантные вирусные белки произведены НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород) и кампанией «Евроген» (Москва). Белки био-тинилировали, следуя рекомендациям фирмы «Pearce». Гибридомы, секретирующие МКА к рекомбинантным белкам, получали как описано ранее [1; 5]. МКА выделялись из асцит-ной жидкости с помощью хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе как описано ранее [5; 6]. Для анализа эффекта рН на свойства иммобилизованных антител очищенные МКА адсорбировали (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку, ночь при комнатной температуре) в следующих буферах: 0,05 М Na-гидрокарбонатном буфере, рН 9,5; 0,025 М Na-фосфатный буфере, рН 7,5; 0,1 М глицин-HCl буфере, рН 2,8 и 0,05 М цитратно-фосфатном буфере, рН 2,8. Указанной концентрации МКА было достаточно для достижения предельного насыщения поверхности полистироловых планшетов. После отмывок планшеты инкубировались (120 мин., 37 °) с серийными разведениями антигенов (0-64 нг/мл), меченных биотином или пероксидазой хрена. В первом случае иммунные комплексы выявлялись с помощью стрептавидин-пероксидазы (50 нг/мл, 100 мкл на лунку). Пероксидазная активность определялась как описано ранее [1; 5]. Оптическая плотность измерялась при 450 нм.

Результаты и обсуждение. На процесс пассивной адсорбции МКА значительное влияние оказывают свойства буферных систем, в которых происходит прикрепление антител к твер-

дой фазе [4]. Как правило, в сэндвич-методе для адсорбции МКА на полистироловые планшеты используют натрий-фосфатный (рН ~ 7,5) и карбонатный (рН ~ 9,5) буферы [2]. Однако в более ранних исследованиях были описаны отдельные примеры антител, которые лучше сохраняли свою активность, если их адсорбировали на пластик в буферах с рН 3—5 [4]. Систематического исследования гетерогенности МКА в отношении рН-чувствительности при адсорбции на пластиковые планшеты не проводилось.

Недавно была получена панель гибридом, продуцирующих МКА к поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg) [1]. Эти МКА успешно распознают как рекомбинант-ный, так и нативный HBsAg [1]. Их использовали для конструирования высокочувствительного сэндвич-метода определения HВsAg (различных серотипов) в сыворотке крови [1]. В процессе подбора пар МКА, образующих сэндвич с антигеном, было обнаружено «ацидофильное» антитело (МКА 18С8). Пассивная адсорбция МКА 18С8 (до достижения предельного насыщения полистироловой поверхности) в кислом буфере (рН 2,8) приводила к значительному увеличению аналитической чувствительности метода [1].

Представлялось интересным выяснить, являются ли подобные «ацидофильные» МКА редким исключением или эта особенность часто встречается среди МКА. Для выяснения данного вопроса была проанализирована панель из двадцати восьми МКА (продуктов секреции различных гибридом), специфичных к трем рекомбинантным белкам: HBsAg (10 МКА), еоге-белку р23 вируса гепатита С (7 МКА) и белку р24 ВИЧ-1 (11 МКА). Предварительно было установлено, что эти МКА сохраняли (хотя и в различной мере) свою биологическую активность после адсорбции на пластиковые планшеты в ^-фосфатном буфере, рН 7,5 (в отличие от других антител, полностью терявших активность при соприкосновении с полистироловыми поверхностями). Полистироловые планшеты («Maxisorp») насыщали антителами, растворенными в буферах е различными значениями рН: 7,5; 9,5 и 2,8. Концентрация МКА в адсорбирующем буфере во всех случаях составляла 3 мкг/мл, что, как показали предварительные опыты, было достаточно для достижения предельного насыщения. К адсорбированным антителам добавлялись нарастающие количества антигенов, меченых биотином или пероксидазой

хрена (в случае HBsAg). Типичные примеры полученных в этих опытах кривых связывания приведены на рисунке. Эффективность связывания меченого антигена с иммобилизованными антителами (аналитическую чувствительность метода) оценивалась по коэффициентам кривых связывания (рис. 1).

Результаты этих опытов показали, что замена «классических» буферов (№- фосфатного,

а) 1,5

1,2 -

0,9 -

0,6 -

0,3 -

y = 0,005x y = 0,003x y = 0,002x

120 240 360

р24-биотин, нг/мл

480

с) 1,5 1,2 0,9

О

ю <

0,6 0,3 0

рН 2,8 О рН 7,5 Д рН 9,5

pH 7,5 и карбонатного, pH 9,5) на кислый глициновый или цитратно-фосфатный буфер (pH 2,8) приводила к существенному увеличению (в 1,5—2,4 раза) антигенсвязываю-щей активности десяти из двадцати восьми (35,7 %) тестированных МКА. Этот усиливающий эффект был воспроизведен в трех и более экспериментах с обоими кислыми буферами (глициновым и цитратно-фосфатным). Так,

б) 1,5

1,2 -

0,9 -

0,6 -

0,3 -

рН 2,8

О рН 7,5

Д рН 9,5 f * Ж + ж * Ж * У * ж * + * * Ф ' z'

У * У Ф У

у * /Р У y = 0,006x

Г?' bs' № y = 0,004x

y = 0,002x

70 140 210 280 р23-биотин, нг/мл

y = 0,012x y = 0,005x y = 0,002x

60 120 180 240 HBsAg-HRP, нг/мл

0

0

0

0

0

Рис. 1. Связывание меченых антигенов с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхность иммунных планшетов при нейтральных, кислых и щелочных значениях рН»

а) связывание меченого биотином белка р24 ВИЧ с адсорбированными антителами клона Р6; б) связывание меченого биотином белка р23 к core-белку вируса гепатита С с адсорбированными антителами клона С11; в) связывание HBs-антигена, конъюгированного с пероксидазой хрена, с адсорбированными антителами клона 18С8. Указанные антитела (3 мкг/мл) адсорбировали на поверхность иммунных планшетов («Nunc», «MaxiSorp») в буферах, имеющих рН2,8 (), 7,5 (°) или 9,5 (А). После адсорбции тестировали связывание антител с мечеными

антигенами, как описано в «Материалах и методах

среди десяти тестированных антител к HBsAg три МКА показали статистически значимое возрастание аналитической чувствительности теста после адсорбции при рН 2,8: коэффициенты кривых связывания МКА 18С8, F14 и D22 с HВsAg возросли с 0,73 ± 0,18, 1,89 ± 0,17 и 1,15 ± 0,09 (адсорбция при рН 7,5) до 1,79 ± 0,25, 2,42 ± 0,10 и 1,75 ± 0,07 (адсорбция при рН 2,8) соответственно (р 95 %). Однако антигенсвязывающая активность остальных восемнадцати проанализированных МКА (включая 7 анти-HВsAg МКА) резко ухудшалась или не изменялась после адсорбции при рН 2,8 по сравнению с рН 7,5 или 9,5. Ни в одном случае адсорбция при рН 9,5 не приводила к улучшению параметров кривых связывания. Реакция МКА на изменение рН при адсорбции не зависела от изотипа IgG антител.

Среди 10 обнаруженных «ацидофильных антител» особо следует выделить МКА 18С8, специфичные к HBsAg. С ними был получен наиболее выраженный усиливающий эффект (коэффициент кривых связывания с антигеном возрастал приблизительно в 2,4 раза после адсорбции при рН 2,8) (рис. 1в). При конструировании сэндвич-метода тестирования HBsAg в сыворотке крови также обнаружили, что из всех возможных парных комбинаций анти-HВsAg антител, наиболее эффективной является система, основанная на использовании МКА 18С8, иммобилизованных при рН 2,8 [1]. Следует добавить, что усиливающий эффект наблюдался и после адсорбции МКА 18С8 в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере (рН 4 или рН 5), а также в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 6), однако в этих случаях он был выражен значительно слабее, чем при рН 2,8. Причем, если МКА 18С8 адсорбировали при рН 2,8, то минимальная достоверно определяемая доза HBsAg уменьшалась на порядок (с 0,1 нг/мл до 0,01 нг/мл) по сравнению с рН 7,5 или 9,5. Это важно с точки зрения практического использования данной системы [1].

В связи с полученными результатами закономерно вставал вопрос: связан ли наблюдаемый усиливающий эффект с лучшим сохранением активности некоторых МКА при рН 2,8 или же он обусловлен общим повышением концентрации антител на твердой фазе в этих условиях. Для ответа на данный вопрос было изучено связывание иммобилизованных био-тинилированных антител со стрептавиди-ном (меченым пероксидазой). В этих опытах использовались «ацидофильные» анти-HBsAg

МКА 18С8, D22 и F14. Кривые связывания стрептавидина с биотинилированными МКА, адсорбированными при рН 7,5; 9,5 и 2,8 практически совпадали. Сходные результаты были получены в аналогичных опытах и в предыдущей работе на модели МКА 18С8 [1]. В совокупности эти данные позволяют заключить, что усиливающий эффект, наблюдаемый с некоторыми МКА после их адсорбции при рН 2,8, обусловлен возрастанием доли биологически активных МКА на твердой фазе, в то время как суммарная поверхностная концентрация антител (активных и неактивных) не меняется по сравнению с рН 7,5 и 9,5.

Гетерогенность МКА в отношении их реакции на уменьшение рН адсорбирующего буфера может быть связана с различиями в заряде и степени гидрофобности вариабельных участков антител. Эти факторы могут определять ориентацию и конформационное состояние молекул антител на твердой фазе, в зависимости от условий их адсорбции. Представляется, что описанный в настоящей работе простой методический прием (использование буферов с низким значением рН для адсорбции антител на полистироловую поверхность в твердофазном ИФА) может быть рекомендован для оптимизации конкурентных и сэндвич-методов определения антигенов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Яковлева Д.А., Дмитриев А.Д, Дмитриев Д.А., Коляскина Г.И., Массино Ю.С., Павлова Е.В., Пыренкова И.Ю., Смирнова М.Б., Сегал О.Л., Тараканова Ю.Н., Уланова ТИ., Фартушная О.В., Шарипова И.Н., Лавров В.Ф. Использование рН-чувствительных иммобилизованных моно-клональных антител для оптизации иммунофер-ментного сэндвич-метода определения HBsAg вируса гепатита В. //Журн. микробиол. 2010. № 2. С. 85—89.

2. Assay development technical handbook. Rockford, IL USA. Thermo Fisher Scientific Inc., 2011, 76 p.

3. Butler J.E., Ni L., Joshi K.S., Suter M., Rosenberg B., Chang J., Brown WR., Cantarero L.A. The physical and functional behavior of capture antibodies adsorbed on polysterene. J. Immunol. Methods. 1992. № 150 (1—2). С. 77—90.

4. Cuvelier A., Bourguignon J., Muir J.F., Martin J.P., Sesboue R. Substitution of carbonate by acetate buffer for IgG coating in sanwhich ELISA. //J. Immunoassay. 1996. № 17 (14). P. 371—382.

5. Dmitriev A.D., Factor M.I., Segal O.L., Pavlova E.V., Massino Y.S., Smirnova M.B., Yakovleva D.A., Dmitriev D.A., Kizim E.A., Kolyaskina G.I., Brusov O.S. Western blot analysis of human and rat serotonin transporter in platelets and brain using

site-specific antibodies: evidence that transporter undergoes endoproteolytic cleavage. //Clin. Chim. Acta. 2005. № 356 (1-2), P. 76—94.

6. NikulinaV.A., Kizim E.A., Massino Y.S., Segal O.L., Smirnova M.B., Avilov W, Saprigin D.B., Smotrov S.P., Tichtchenko V.A., Kolyaskina G.I., Dmitriev A.D. Synergistic effects in antigen-capture ELISA using three monoclonal antibodies directed at different epitopes of the same antigen. //Clin. Chim. Acta. 2000. № 299 (1-2). P. 25—44.

Контактная информация:

Яковлева Динора Абдуллаевна, тел.: 8 (926) 549-33-21, e-mail: dykovleva@mail.ru

Contact information:

Yacovleva Dinora Abdullaevna, phone: 8 (926) 549-33-21, e-mail: dykovleva@mail.ru