Способ повышения продуктивности и стимуляции иммунного ответа организма рыб
METHOD FOR INCREASING PRODUCTIVITY AND STIMULATING THE IMMUNE RESPONSE OF THE FISH ORGANISM

Изобретение относится к рыбной промышленности и может быть использовано при производстве кормовых продуктов для обеспечения повышения продуктивности рыб и стимуляции иммунитета.
В настоящее время для повышения продуктивности и стимуляции иммунного ответа организма животных и рыб используют различные биодобавки: пробиотики, ферментные препараты, антиоксиданты, гормоны, витамины, микроэлементы и т.д.
Кремний признан важным элементом организма животных и человека. Особенно роль кремний играет в соединительной ткани, являясь основным ионом остеогенных клеток. Кроме того, кремний участвует в биохимии субклеточных ферментосодержащих структур и образует важные взаимосвязи с другими элементами (Carlisle EM. Silicon as an essential trace element in animal nutrition. Ciba Found Symp. 1986;121:123-39. doi: 10.1002/9780470513323.ch8.).
Наноматериалы на основе кремния продемонстрировали уникальные свойства для их применения в медицине (Peng F, Cao Z, Ji X, Chu B, Su Y, He Y. Silicon nanostructures for cancer diagnosis and therapy. Nanomedicine (Lond). 2015;10(13):2109-23. doi: 10.2217/nnm.15.53.), ветеринарии (Savage DJ, Liu X, Curley SA, Ferrari M, Serda RE. Porous silicon advances in drug delivery and immunotherapy. Curr Opin Pharmacol. 2013 Oct;13(5):834-41. doi: 10.1016/j.coph.2013.06.006.) и сельском хозяйстве (Carlisle EM. Silicon: an essential element for the chick. Science. 1972 Nov 10;178(4061):619-21. doi: 10.1126/science.178.4061.619.). В частности выявлено, что наночастицы кремния и его оксиды способны повышать продуктивность роста и стимулировать иммунный ответ организма рыбы (Zhang W, Zhu C, Xiao F, Liu X, Xie A, Chen F, Dong P, Lin P, Zheng C, Zhang H, Gong H, Wu Y. pH-Controlled Release of Antigens Using Mesoporous Silica Nanoparticles Delivery System for Developing a Fish Oral Vaccine. Front Immunol. 2021 Apr 19;12:644396. doi: 10.3389/fimmu.2021.644396.) и птицы (Dosoky WM, Fouda MMG, Alwan AB, Abdelsalam NR, Taha AE, Ghareeb RY, El-Aassar MR, Khafaga AF. Dietary supplementation of silver-silica nanoparticles promotes histological, immunological, ultrastructural, and performance parameters of broiler chickens. Sci Rep. 2021 Feb 18;11(1):4166. doi: 10.1038/s41598-021-83753-5.).
Известен способ получения кремнийсодержащего препарата (RU 2091071, МПК А61К 35/10, 1997 г.), включающий смешивание пирогенного кремнезема (96-97%) и гумата натрия (3-4%) с последующим диспергированием в шаровой мельнице в течении 2-3 часов.
Недостатком данного способа является её ограниченная область применения, так как используется только для крупного рогатого скота.
Известен способ повышения продуктивности животных (RU 2084178, МПК A23K 1/175, 1997 г.), путем скармливания стандартного комбикорма с измельченной минеральной добавкой размером 0,5-2 мм, содержащая аморфный кремнезем (опал-кристаболитовая порода) - 0,3-0,5 мас.%.
Известен способ повышения продуктивности животных (RU 2134042, МПК A23K 1/175, 1999 г.), путем скармливания корма совместно с опокой -горная измельченная порода нерудного месторождения природного минерала, включающая аморфный кремнезем (опал-кристаболитовая порода Красногвардейского месторождения в Свердловской области с содержанием кремнезема 50,0 - 85,8 %) измельченного до состояния муки в количестве 10-200 г на голову в сутки.
Известен способ повышения продуктивности животных (RU 2199883, A23K 1/16, A23K 1/175, 2003 г.), путем скармливания корма совместно с диатомитом Инзенского месторождения Ульяновской области (содержание кремнезема 81,3-85,6 %) или опокой Дубинского месторождения Ульяновской области (содержание кремнезема 84,10-89,62%).
Недостатком данных способов является трудоемкость приготовления опоки и диатомита, и соответственно ее высокая стоимость, а также их ограниченная область применения, так как используются только для крупного рогатого скота и птицы.
Известен способ повышения продуктивности животных (RU 2293472, A23K 1/175, 2007 г.), путем скармливания корма совместно с кремнесодержащим (цеолит на основе диоксида кремния (69-81%)) и серосодержащим компонентом (сера элементарная - отход установок сероочистки нефтепродуктов), и с сухим обезжиренным молоком.
Недостатком способа является её ограниченная область применения, так как используется для теплокровных животных и птицы.
Известен способ повышения продуктивности животных (RU 2729387, A23K 10/30, A23K 20/00, 2020 г.) путем скармливания корма совместно с препаратами «Йоддар-Zn» (доза 0,01 кг/100 кг добавки), «ДАФС-25» (доза 0,00016 кг/100 кг добавки), кремнесодержащим препаратом «Коретрон» (0,5 кг/100 кг добавки) и тыквенным жмыхом холодного прессования (остальное).
Недостатком способа является её ограниченная область применения, так как используется только для молодняка овец.
Известен способ повышения иммунитета животных (RU 2546222, A23K 1/14, A23K 1/16, A23K 1/18, 2015 г.), путем введения животному антиметаболита глюкозы, состоящей из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-О-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы и их комбинаций от 1 мг до приблизительно 50 мг манногептулозы на кг массы тела в день.
Недостатком данного способа является её ограниченная область применения, так как используется только для домашних животных.
Известен способ усиления обменных процессов и иммунитета у сельскохозяйственных животных и птицы (RU 2259832, A61K 31/714 A23K 1/22 A61P 3/00 A61P 37/04, 2005 г.), путем скармливания корма совместно с добавками, вес.%: рибоксин 10,0-40,0, кальция глицерофосфат 30,0-40,0, витамин B120,02-0,04, аскорбиновая кислота 2-4, лимонная кислота 2-4, янтарная кислота 2-4, фолиевая кислота 1-2, фруктоза 5-10, глюкоза – (остальное до 100).
Недостатком способа является её ограниченная область применения, так как используется только для теплокровных животных и птицы.
Lactobacillus acidophilus
Propionobacterium freundenreichii
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium adolescentis
Streptococcus termophilus
9
Известен способ повышения продуктивности животных и иммунного статуса организма (RU 2708161, A23K 10/16, A23K 10/30, A23K 20/28, 2019 г.) путем скармливания корма совместно с добавкой состоящей из порошка цеолита (30-32 %), пробиотика (8-18 %), включающий биомассу молочнокислых бактерий, выбранных из , или , или , или , или  с титром не менее 10 КОЕ/мл, пресноводной микроводоросли хлореллы (13-14 %), глюкозы кормовой (3-3,5 %) и отруби злаковые (остальное до 100%).
Недостатком способа является её ограниченная область применения, так как используется для теплокровных животных и птицы.
Известна кормовая добавка (RU 2374900, A23K 1/16, A23K 1/175, 2009 г.), для повышения продуктивности и иммунитета животных и рыб, состоящая из смеси препаратов Мивала с Крезацином при соотношении 1:9, при этом добавку вводят в дозе 0,01-5 мг/кг живой массы или в дозе 75 мг/кг корма.
Недостатком данного способа является низкая сохранность рыб.
Известна иммуномодулирующая композиция (RU 2322452, C07K 14/52, A61K 38/19, 2008 г.) для перорального введения, содержащая водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, солюбилизатор и воду.
Недостатком способа является трудоемкость получения композиции и ее высокая стоимость.
2
Наиболее близкий к предлагаемому по технической сущности является способ повышения продуктивности роста, согласно которому цыплятам-бройлерам в основной рацион вводят ультрадисперсные частицы SiO дозой 300 мг/кг комбикорма после диспергирования в физиологическом растворе продолжительностью 45 мин, и аминокислоты: аргинин – дозой 7 г/кг, лизин - 6 г/кг, метионин - 2 г/кг.
2
Недостатком данного способа является её ограниченная область применения, так как используется только для цыплят-бройлеров. Кроме того, применение аминокислот в форме сухих сыпучих компонентов и жидкого в физиологическом растворе ультрадисперсных частиц SiO приводит к неравномерному распределению компонентов в корме во время перемешивания.
Технический результат – увеличение продуктивности и стимуляция иммунного ответа организма рыб.
2
Способ был реализован следующим образом. Тонкий слой корма опрыскивают ультрадисперсными частицами SiO полученными методом плазмохимического синтеза, размером 388±117 нм, предварительно обработанные ультразвуком в дистиллированной воде в течение 30 мин с частотой 35 кГц, в количестве 200 мг/кг корма.
На базе кафедры биотехнологии животного сырья и аквакультуры Оренбургского государственного университета, методом аналогов было сформированы 4 группы (n=30) молоди карпа средней массой 20 г.
2
1
2
3
Рыбы контрольной группы получали основной рацион (ОР), рыбам опытных групп к ОР дополнительно вводили ультрадисперсные частицы (УДЧ) SiОв различных дозировках: 100 мг/кг корма (I опытная группа - O); 200 мг/кг (II опытная группа – O); 300 мг/кг (III опытная группа – O).
В качестве ОР использовался сбалансированный по основным питательным веществам корм для карповых рыб КРК-110-1 (ОАО «Оренбургский комбикормовый завод», г. Оренбург), содержащий 26,0 % протеина.
2
2
УДЧ SiO были получены методом плазмохимического синтеза (ООО «Плазмотерм» г. Москва), размером 388±117 нм, удельная поверхность частиц - 109 м/г, Z-потенциал - 27±0,1 мВ. УДЧ вводили после диспергирования препарата в дистиллированной воде в течении 30 мин с частотой 35 кГц с помощью УЗДН-2Т.
Обслуживание рыб и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с инструкциями Russian Regulations, 1987 (Order No.755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) и «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Washington, D.С. 1966)». При выполнении исследований были приняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.
Суточная норма кормления определялась еженедельно в зависимости от массы рыбы, температуры воды и значений растворенного в воде кислорода (Пономарев С.В. Индустриальное рыбоводство: учебник / С. В. Пономарев, Ю. Н. Грозеску, А. А. Бахарева. - Санкт-Петербург: Лань, 2013. – 448 с.).
Полученные результаты были статистически обработаны. Для выявления статистически значимых (достоверных) различий использовали критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при уровне вероятности ошибки не выше 5% (P≤0,05) (Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.).
2
1
2
3
2
2
В ходе экспериментальных исследований установлен ростостимулирующий эффект действия УДЧ SiO(таблица 1) - достоверные различия по динамике живой массы в опытных группах были зафиксированы на шестой неделе опыта и сохранились вплоть до конца эксперимента. К концу эксперимента в опытных группах констатировали увеличение живой массы рыб на 10,2% (О), на 14,1% (О) и на 11% (О), по сравнению с контрольной группой. Лучшие показатели по динамике роста были зафиксированы при дозировке УДЧ SiO- 200 мг/кг корма (О).
Для оценки физиологического состояния рыб и уровня метаболизма проводились морфо-биохимические исследования крови рыб с использованием оборудования ЦКП БСТ РАН http://цкп-бст.рф по стандартным методикам (аттестат аккредитации № RA.RU.21ПФ59 от 02.12.2015 г.). Анализ полученных данных показал, что добавление в корм молоди карпа используемых добавок не вызывает отклонений гематологических показателей от физиологической нормы.
Таблица 1 – Динамика живой массы молоди карпа, г
Неделя учетного периода
Группа
контроль
О<sub>1</sub>
О<sub>2</sub>
О<sub>3</sub>
Начало опыта
20,3±3,4
20,2±3,4
21,0±3,7
20,1±3,3
1
24,6±3,9
24,7±3,8
26±4,0
24,1±3,8
2
31,2±4,6
30,2±4,4
31,6±4,5
29,3±4,3
3
37,1±5,0
36,5±5,1
35,6±4,5
35,4±4,5
4
43,4±4,9
42,8±5,3
43,1±5,8
41,6±4,6
5
46,1±5,4
50,8±5,9
50,9±5,5
48,7±5,2
6
51,5±6,1
56,6±6,5*
55,3±5,6*
54,4±5,8
7
61,0±6,4
65,5±6,8*
65,4±6,1*
64,1±6,5*
8
65,4±7,3
72,1±6,9*
74,6±6,5*
72,6±6,8*
Примечание: * P ≤ 0,05
1
2
3
1
2
В опытных группах зафиксировано повышение уровня гемоглобина на 36 % (О), 85,3 % (О), 68 % (О); эритроцитов на 14,4 % (О) и на 15,6% (О); относительно контрольных значений (таблица 2), что говорит о повышении обменных процессов, в частности гемопоэза, в организме благодаря кремнию (Колбин, И.А. Изменение показателей функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови доноров после инкубации с наночастицами диоксида кремния / И.А. Колбин, О.Л. Колесников // Вестник ЮУрГУ. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. 2011. № 20(237). С. 116-119.). Повышение уровня гемоглобина и эритроцитов свидетельствует на благоприятное влияние заявленного препарата на стимуляцию гемопоэза.
Повышение количества лейкоцитов, лимфоцитов (центральное звено иммунной системы) и моноцитов в опытных группах относительно контрольных значений свидетельствуют об увеличении интенсивности метаболических процессов в организме рыб на фоне действия кремния в ультрадисперсной форме. Увеличение количества данных клеток играет важную роль в контроле иммунного ответа и устойчивости организма к различным патогенам, в частности моноциты составляют основную массу клеток мононуклеарной фагоцитарной системы, т. е. обладают способностью к фагоцитозу - основному механизму врожденной иммунной защиты организма (Estaiano de Rezende RA, Soares MP, Sampaio FG, Cardoso IL, Ishikawa MM, Lima Dallago BS, Rantin FT, Teixeira Duarte MC. Phytobiotics blend as a dietary supplement for Nile tilapia health improvement. Fish Shellfish Immunol. 2021 Jul;114:293-300. doi: 10.1016/j.fsi.2021.05.010.).
Таблица 2 – Морфологические показатели крови рыб
Группа
Показатели
Гемоглобин, г/л
Эритроциты, 10<sup>12</sup>/л
Лейкоциты, 10<sup>9</sup> л
Лимфоциты,10<sup>9</sup>/л
Моноциты, 10<sup>9</sup>/л
Контроль
75 ± 6,0
0,45 ± 0,03
33,8 ± 3,1
33,3 ± 3,0
0,4 ± 0,06
O<sub>1</sub>
102 ±8,5*
0,65 ±0,045**
71,2 ±4,5***
69,8 ±5,3***
1,2 ±0,2**
О<sub>2</sub>
139 ±11,7***
0,70 ±0,05**
115,8 ± 8,8***
111,9 ± 10,2***
3,4±0,4***
О<sub>3</sub>
126 ±9,8***
0,45 ±0,035
98,8 ±7,4***
95,7 ±9,5***
2,7±0,35***
Примечание: * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001
Об активации защитных функций организма, а также о повышении белкового обмена, свидетельствует высокий уровень белка сыворотки крови рыб (таблица 3).
2
Кроме того, анализ крови рыб показал в опытных группах высокое содержания такого важного элемента для гемопоэза, как железа. Максимальное количество которого зафиксировано при дозе введения УДЧ SiO200 мг/кг корма, в 10,6 раза (P≤0,001) выше контроля.
Таблица 3 - Биохимические показатели крови рыб
Группа
Показатели
Общий белок, г/л
Железо, мкмоль/л
Фосфор, ммоль/л
АСТ, Ед/л
АЛТ, Ед/л
Контроль
27,99 ± 1,23
3,9 ± 0,45
4,59 ± 0,33
483,7 ± 23,8
175,2 ± 5,4
O<sub>1</sub>
34,88 ± 1,8**
15,4 ± 1,9***
6,05 ± 0,4**
504 ± 26
165,9 ± 5,1
О<sub>2</sub>
33,43 ± 1,51*
41,4 ± 3,5***
5,67 ± 0,37*
487,4 ± 27,5
174 ± 7,4
О<sub>3</sub>
32,12 ± 1,29*
37,8 ± 3,2***
5,32 ± 0,35
324,4 ± 24,4**
109,5 ± 4,5***
Примечание: * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001
Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы:
2
- добавление в основной рацион УДЧ SiOв количестве200 мг/кг кормаположительно влияет на продуктивность и развитие рыб, повышая интенсивность обменных процессов в организме.
- способ повышения продуктивности и стимуляции иммунного ответа организма рыб путем включения в рацион ультрадисперсных частиц оксида кремния в количестве 200 мг/кг корма подтвержден возможностью его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов.
- заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».