СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ ХРЯЩЕВОЙ ГИАЛИНОВОЙ ТКАНИ СУСТАВОВ НА НАЧАЛЬНЫХ СТАДИЯХ ДЕСТРУКТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD OF CARTILAGE HYALINE NEOGENESIS ACCOMPANYING EARLY DESTRUCTIVE DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к области биомедицины, в частности к созданию способа регенерации хрящевой гиалиновой ткани с использованием стволовых клеток взрослого организма, и может найти применение в ортопедии для восстановления функций суставов на начальных стадиях деструктивных заболеваний.
Уровень техники.
На сегодняшний день клеточная терапия и тканевая инженерия являются наиболее перспективными направлениями биомедицины. С развитием этих направлений становится возможным восстановление утраченной функциональной активности тканей и поврежденных органов. В организме обновление и восстановление тканей происходит за счет стволовых клеток, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов. Известно, что с возрастом количество стволовых клеток в организме уменьшается. Кроме того, в результате различных заболеваний и неблагоприятных экологических условий, нарушаются сигнальные пути регуляции их активности (Rao M.S., Mattson M.P. Stem cell and aging: expanding the possibilities. // Mech. Ageing Dev. 2001. Vol.122. P.713-734). В последние годы, благодаря бурному развитию клеточной биологии, выделены и охарактеризованы практически все клеточные типы человеческого организма. Разработаны технологии, позволяющие использовать выделенные и размноженные в условиях in vitro клетки в медицине для восстановления поврежденных тканей и органов. Бесспорно, применение стволовых клеток взрослого организма является очень перспективным направлением биомедицины.
В частности, пристальное внимание исследователей направлено на изучение потенций мезенхимных стволовых клеток для их использования в репаративной медицине. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) отличаются относительной простотой выделения и культивирования, способностью пролиферировать в течение длительного времени in vitro и широким спектром дифференцировки не только в клетки тканей мезенхимного происхождения, но и в клетки тканей других зародышевых листков.
Впервые мезенхимные стволовые клетки были получены из костного мозга по их способности прикрепляться к поверхности культуральной посуды (Fridenshtein A.J., Deriglazova U.F., Kulagina N.N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. // Exp. Hematol. 1974. Vol.2. P.83-92). Co временем были отработаны методики выделения ММСК из других тканей организма (плацента, тимус, дерма, фетальные ткани и др.), наиболее легкодоступным источником является жировая ткань.
На данный момент предлагается несколько способов для лечения деструктивных заболеваний суставов с использованием клеточных технологий. Известно, что в организме разрушенный гиалиновый хрящ, если и восстанавливается, то только с образованием волокнистой хрящевой ткани. Поэтому основной задачей исследователей при разработке биотехнологических способов восстановления дефектов хряща является выбор оптимального сочетания источника клеток, способа их доставки в область повреждения, иммобилизации и адекватного носителя с целью образования гиалиновой хрящевой ткани в дефектной области.
Уже около 20 лет для лечения пациентов с повреждениями суставного хряща разрабатываются способы трансплантации аутогенных или аллогенных хондроцитов с различными модификациями. Например, известен способ восстановления хрящевой поверхности с использованием аутохондроцитов и ACT - мембраны. Мембрану закрепляют на области дефекта хряща и под нее вводят аутохондроциты (Steinwachs M.R., Kreuz Р.С. Clinical results of autologous chondroxyte transplantation (ACT) using a collagen membrane. // In: Henrich C., Nöth U., Eulert J. Cartilage surgery and future perspectives, Springer Berlin Heidelberg New York, 2003: 37-48). Однако все эти способы имеют существенный недостаток, т.к. предполагают нанесение дополнительной травмы здорового участка при заборе клеточного материала. Кроме того, существуют технические трудности при наращивании необходимого количества клеточного материала для трансплантации (Jennifer J. Wood, Mark A. Malek, Frank J. Frassica, Jacquelyn A. Polder, Aparna K. Mohan, Eda T. Bloom, M. Miles Braun and Timothy R. Autologous Cultured Chondrocytes: Adverse Events Reported to the United States Food and Drug Administration. // Cote. J Bone Joint Surg Am. 2006, 88: 503-507). Как показали предклинические и клинические испытания, эти технологии менее эффективны по сравнению, например, с общепринятой мозаичной хондропластикой (Knutsen G., Engebretsen L., Ludvigsen T.C., Drogset J.O., Grontvedt Т., Solheim E., Strand Т., Roberts S., Isaksen V., Johansen O. Autologous chondrocyte implantation compared with microfracture in the knee. A randomized trial. // J Bone Joint Surg Am. 2004 Mar; 86-A(3): 455-64). Следует отметить, что применение подобных способов лечения оправдано при запущенных, необратимых дегенеративных изменениях в структуре хрящевой ткани.
В связи с этим, разработка современных технологий для лечения суставов на начальных стадиях дегенеративных заболеваний подразумевает минимальное инвазивное вмешательство с максимальным лечебным эффектом и базируется в основном на использовании хондрогенных потенций мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК), выделенных из костного мозга или жировой ткани.
Известен способ заполнения дефекта коллагеновым гелем, заселенным ММСК с последующим закрыванием области дефекта лоскутом надкостницы (Wakitani S., Imoto К., Yamomoto Т., et al. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchimal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. // Osteoarthritis cartilage 2002; 10: 199-206). Недостаток предложенного метода в том, что данные манипуляции могут приводить к гипертрофии регенерата и его кальцификации.
Известен способ привлечения магнитно-маркированных мезенхимных стволовых клеток в область остеохондральных дефектов коленных чашечек после внутрисуставной инъекции ММСК под воздействием внешней магнитной силы (Kobayashi Т., Ochi М., Yanada S., Ishikawa М., Adachi N., Deie М., Arihiro К. A novel cell delivery system using magnetically labeled mesenchymal stem cells and an external magnetic device for clinical cartilage repair. // Arthroscopy. 2008 Jan; 24(1): 69-76). Недостаток этого метода состоит в том, что перед трансплантацией ММСК подвергаются нежелательной обработке, кроме того, в результате образуется волокнистая хрящевая ткань.
Известен способ, в котором перед трансплантацией в сустав ММСК подвергаются in vitro дифференцировке в хондроциты (Chen F.H., Rousche K.T., Tuan R.S. Technology Insight: adult stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering. // Nat. Clin Pract Rheumatol. 2006 Jul; 2(7): 373-82). Недостатком этого метода является его существенное удорожание, неизбежное уменьшение жизнеспособности клеток, а также неконтролируемые изменения на молекулярном уровне в результате воздействия на клетки индукторов дифференцировки.
Известен способ трансплантации ММСК в составе матрикса из полилактогликолевой кислоты (PLGA) (Uematsu К., Hattori К., Ishimoto Y., Yamauchi J., Habata Т., Takakura Y., Ohgushi H., Fukuchi Т., Sato М. Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a three-dimensional poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold. // Biomaterials. 2005 Jul; 26(20): 4273-9).
Существует способ введения ММСК в область дефекта в составе желатинового носителя (Ponticiello M.S., et al. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. // J Biomed Mater Res 2000; 52; 2: 246-255).
Показана возможность трансплантации в поврежденный сустав пациентов с остеоартритом аутологичных ММСК костного мозга в составе коллагенового матрикса (геля или пластинки) (Wakitani S., Imoto К., Yamamoto Т., Saito M., Murata N., Yoneda M. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. // Osteoarthritis Cartilage. 2002 Mar; 10(3): 199-206).
Недостатком всех вышеперечисленных способов является то, что, несмотря на явную репарацию дефекта, в результате образуется не гиалиновый, а фиброзный, либо фиброзно-гиалиновый хрящ, кроме того, процесс восстановления занимает довольно длительный временной промежуток.
Наиболее приближенным к заявленному является способ, в котором для репарации хряща использовался трансплантат, состоящий из ММСК, выделенных из жировой ткани, и носителя - альгинатного геля (Lin Y., Luo E., Chen X., Liu L., Qiao J., Yan Z., Li Z., Tang W., Zheng X., Tian W. Molecular and cellular characterization during chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and cartilage formation in vivo. // J Cell Mol Med. 2005 Oct-Dec; 9(4): 929-939).
Раскрытие изобретения.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, заключается в создании способа регенерации хрящевой гиалиновой ткани, с использованием собственного клеточного материала и носителя.
Техническим результатом изобретения является эффективное и быстрое восстановление хрящевой ткани сустава, которое достигается благодаря оптимальному подбору клеточного материала и носителя, уменьшению количества используемой популяции соматических клеток, низкой инвазивности и травматичности, низкой себестоимости и простоте воспроизведения. В результате дефектная область заполняется вновь образованной гиалиновой хрящевой тканью, что подтверждается данными морфологического и гистологического анализа.
Согласно данному изобретению, было обнаружено, что мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) обладают выраженными потенциями к репарации хрящевой гиалиновой ткани. При введении ММСК с носителем внутрисуставно происходит зарастание дефекта хряща гиалиновой хрящевой тканью, при этом эффективность и скорость восстановления зависят от компонентов вводимого трансплантата. Следовательно, целью данного изобретения, являлась разработка способа восстановления хрящевой гиалиновой ткани для его дальнейшего применения в ортопедии при лечении суставов на начальных стадиях деструктивных заболеваний, отличающегося тем, что в качестве клеточного материала использовались мультипотентные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани, а в качестве носителя гель «Линтекс-Мезогель».
Теоретический результат изобретения достигается за счет того, что мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК) выделяются из жировой ткани. Жировая ткань является наиболее доступной и универсальной, т.к. может быть довольно легко получена амбулаторно под местной анестезией от любого человека, в том числе от больного, или во время плановых или пластических операций. Кроме того, метод выделения ММСК из этого источника легко воспроизводим. В связи с этим, для восстановления тканей мезенхимного происхождения (костная, хрящевая, соединительная, мышечная и др.), наиболее предпочтительными являются мезенхимные стволовые клетки, выделенные из жировой ткани, которые по своим потенциям не уступают ММСК из других источников. Данные клетки имеют в культуре уникальные характеристики: способность пролиферировать в течение длительного времени и при индукции к дифференцировке формировать клетки тканей мезенхимного происхождения.
Выделенные и культивированные ММСК вводят в специализированный носитель.
Теоретическим основанием для использования геля «Линтекс-Мезогель» в качестве носителя для мультипотентных мезенхимных стволовых клеток служат несколько факторов. «Линтекс-Мезогель» - рассасывающийся стерильный гель, используемый в медицине на органах и тканях, имеющих серозное покрытие (в том числе на суставах), по консистенции аналогичен синовиальной жидкости, заполняющей сустав, при попадании в организм гель всасывается в ткани и выделяется из организма, не вызывая общетоксического, аллергизирующего и местно-раздражающего действия. В отличие от других носителей (физиологический раствор, коллаген) служит отличным искусственным временным «каркасом», обеспечивая эффективную защиту для клеток на время их адаптации и приживления, после чего рассасывается. Кроме того, производные целлюлозы, из которых состоит гель, способствуют поддержанию жизнеспособности, пролиферативной активности и хондрогенных потенций мультипотентных мезенхимных стволовых клеток внутри сустава.
Клетки в составе мезогелевого носителя трансплантируются непосредственно в поврежденный сустав.
Осуществление изобретения
Оценка эффективности способа регенерации хрящевой гиалиновой ткани была проведена в рамках предклинического испытания. Исследование проводилось поэтапно и включало стадии выделения мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из жировой ткани кроликов и человека и культивирования их in vitro до наращивания необходимой клеточной массы; подготовку различных комбинаций трансплантата; моделирования дефекта гиалинового хряща коленного сустава у лабораторных животных (кролики); введения внутрисуставно подготовленных трансплантатов; морфологического и гистологического анализа костно-хрящевых композитов исследуемых суставов.
Данное изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничение объема данного изобретения.
Пример 1. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из жировой ткани кролика.
2
6
2
6
2
2
ММСК выделяли из жировой ткани кролика. Для этого жировую ткань тщательно промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), измельчали механически и подвергали ферментативной обработке 0,075%-ным раствором коллагеназы тип I в среде Игла в модификации Дюльбеко (ДМЕМ) при 37°С в течение 30 минут. Коллагеназу отмывали эквивалентным объемом питательной среды (ДМЕМ, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка) и центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут. Полученный осадок ресуспендировали и пропускали через фильтры с диаметром пор 100 мкм и 10 мкм соответственно для удаления клеточных остатков и получения гомогенной популяции клеток. Полученную клеточную суспензию высевали во флаконы площадью 75 см из расчета 10 клеток/см. Доля прикрепившихся клеток составляла приблизительно 1-1,5%. Культивировали мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°С и 5% СО в воздухе. Среду меняли каждые 4 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляли субкультивирование: клетки снимали с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевали на культуральные флаконы из расчета 5×10 клеток/см в ростовой среде. Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 35% и 52-60 час соответственно.
Пример 2. Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) из жировой ткани человека.
2
6
2
6
2
2
ММСК выделяли из жировой ткани человека, полученной во время проведения плановой операции с информированного согласия пациента. Жировую ткань тщательно промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), измельчали механически и подвергали ферментативной обработке 0,075%-ным раствором коллагеназы тип I в среде Игла в модификации Дюльбеко (ДМЕМ) при 37°С в течение 30 минут. Коллагеназу отмывали эквивалентным объемом питательной среды (ДМЕМ, дополненной 10% эмбриональной сыворотки теленка) и центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут. Полученный осадок ресуспендировали и пропускали через фильтры с диаметром пор 100 мкм и 10 мкм соответственно для удаления клеточных остатков и получения гомогенной популяции клеток. Полученную клеточную суспензию высевали во флаконы площадью 75 см из расчета 10 клеток/см. Доля прикрепившихся клеток составляла приблизительно 1-1,5%. Культивировали мезенхимные стволовые клетки в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% эмбриональной сывороткой теленка, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) при 37°С и 5% СО в воздухе. Среду меняли каждые 4 суток и по достижении конфлуэнтного монослоя осуществляли субкультивирование: клетки снимали с субстрата раствором 0,05% трипсин-ЭДТА и высевали на культуральные флаконы из расчета 5×10 клеток/см в ростовой среде. Непосредственно перед процедурой подготовки трансплантата клетки снимали с субстрата, отмывали средой ДМЕМ, ресуспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и подсчитывали в камере Горяева. Результаты иммунофенотипирования показали, что популяция полученных клеток соответствует по экспрессии поверхностных антигенов мезенхимным стволовым клеткам. Митотический индекс и время цитогенерации составили 34% и 54-62 час соответственно.
Пример 3. Моделирование дефекта гиалинового хряща коленного сустава у кроликов
Хирургическое вмешательство проводилось под общей анестезией с применением правил асептики и антисептики в стерильной операционной. В качестве наркотического вещества применялись Рометар и Золетил по весу животного из расчета 0,1 мл на килограмм массы. Животное фиксировалось на специальном столике. Место оперативного вмешательства - левый коленный сустав кролика.
Доступ. Выбривали участок коленного сустава. Операционное поле обрабатывали спиртовым раствором йода 3%. Проводили рассечение кожи с латеральной стороны коленной чашечки. Так же рассекали подкожную фасцию и межфасциальную жировую ткань. Рассекали суставную сумку. Сустав сначала выпрямляли, приподнимали коленную чашечку из суставного блока и вывихивали ее приблизительно на 75-90°, затем сустав сгибали.
Моделирование дефекта. На внутренней суставной поверхности бедренной кости скальпелем срезали часть гиалинового хряща длиной около 1 см и шириной примерно 1-2 мм.
Затем рана закрывалась в обратном порядке. Сначала ушивали суставную сумку рассасывающимся шовным материалом Поликон №2. Накладывали кожные швы шелком №4. Швы обрабатывали перекисью водорода 3% и Террамицином-спреем. При выведении из наркоза применяли препараты: фуросемид в дозировке 0,3 мл внутримышечно и дексаметазон 0,2 мл внутримышечно на 1 голову для профилактики отека легких после применения наркотических средств. Внутримышечно прокалывался антибиотик Бициллин - 3 в дозе 100000 ЕД на 1 голову для предотвращения загноения операционной раны. Швы снимали на 10-е сутки после проведения операции. Все 20 операций были проведены успешно, без осложнений.
Пример 4. Получение трансплантатов
В эксперименте использовали различные варианты трансплантатов с целью изучения влияния различных факторов на процессы регенерации хрящевой гиалиновой ткани.
1. «Остенил» - изотонический раствор, содержащий 10.0 мг гиалуроната натрия, использующийся в ортопедии при лечении дегенеративных и травматических изменений синовиальных суставов.
2. Гель на основе карбоксиметилцеллюлозы (гель «Линтекс-Мезогель») - 2,2% раствор, используемый в медицине на органах и тканях, имеющих серозное покрытие (в том числе на суставах).
5
3. ММСКкролика - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки выделяли из жировой ткани кролика, наращивали in vitro до необходимого количества, осадок клеток ресуспендировали в физиологическом растворе. Для введения в один сустав использовали 400 мл суспензии клеток в физиологическом растворе, из расчета 10 клеток на 1 кг веса животного.
5
4. ММСК кролика+гель «Линтекс-Мезогель» - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани кролика вводили в 2,2% гель, пипетировали до гомогенного состояния. Для введения в один сустав использовали 400 мл суспензии клеток в геле, из расчета 10 клеток на 1 кг веса животного.
5
5. ММСК человека - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки выделяли из жировой ткани человека, наращивали in vitro до необходимого количества, осадок клеток ресуспендировали в физиологическом растворе. Для введения в один сустав использовали 400 мл суспензии клеток в физиологическом растворе, из расчета 10 клеток на 1 кг веса животного.
5
6. ММСК человека+гель «Линтекс-Мезогель» - мультипотентные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани человека вводили в 2,2% гель, пипетировали до гомогенного состояния. Для введения в один сустав использовали 400 мл суспензии клеток в геле, из расчета 10 клеток на 1 кг веса животного.
Пример 5. Введение трансплантатов в зону повреждения хряща.
Из прооперированных животных было сформировано 7 опытных групп по 3 животных в каждой (таблица 1).
Группа №1 являлась контрольной, заживление дефекта у животных происходило естественным путем, без проведения какой-либо терапии. Группе №2 вводили «Остенил», препарат, используемый в ортопедии при лечении дегенеративных заболеваний суставов. Остальным группам животных, с целью изучения влияния различных факторов на процессы регенерации хрящевой ткани, были введены трансплантаты по схеме (таблица 1). Введение препаратов производили через 7 суток после нанесения дефекта путем внутрисуставных инъекций однократно.
Техника проведения внутрисуставной инъекции. Инъекции проводили без применения общей или местной анестезии, при фиксации животного лежа на спине. Поле введения обрабатывали спиртовым раствором йода. Левый коленный сустав сгибали наполовину. Прокол делали у медиального края связки коленной чашки. Введенную иглу медленно продвигали в полость сустава и вводили необходимый препарат общим объемом жидкости не более 0,5 мл.
Таблица 1
Способы восстановления дефекта гиалинового хряща коленного сустава у кроликов.
№ группы
Количество животных (кролики, половозрелые самцы)
Состав трансплантата
1
3
-
контроль
2
3
«Остенил»
3
3
«Линтекс-Мезогель»
4
3
ММСК кролика
5
3
ММСК кролика+«Линтекс-Мезогель»
6
3
ММСК человека
7
3
ММСК человека+«Линтекс-Мезогель»
Пример 6. Морфологический и гистологический анализ костно-хрящевых композитов исследуемых суставов.
Для изучения в динамике процесса регенерации хрящевой ткани в зависимости от состава трансплантата забой животных (по одному животному из каждой группы) производили через 14, 28 и 56 суток после введения трансплантатов. Изолировали костно-хрящевой композит сустава, на который был нанесен дефект, и проводили визуальный и гистологический анализ (Таблица 2).
Таблица 2
Влияние состава трансплантата на регенерацию хрящевой гиалиновой ткани
№ группы
Состав трансплантата
Степень регенерации (%) волокнистая хрящевая ткань/гиалиновая хрящевая ткань
14 суток после введения трансплантата
28 суток после введения трансплантата
56 суток после введения трансплантата
1 (контр)
0/0
0/0
0/0
2
Остенил
0/0
0/0
0/0
3
«Линтекс-Мезогель»
20/0
25/8
40/15
4
ММСК кролика
20/10
25/25
50/40
5
ММСК кролика+«Линтекс-Мезогель»
0/80
0/100
0/100
6
ММСК человека
10/7
15/20
40/25
7
ММСК человека+«Линтекс-Мезогель»
0/20
0/35
0/70
Наиболее эффективным оказался трансплантат, состоящий из аутологичных ММСК жировой ткани (мультипотентные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани кролика) и носителя геля «Линтекс-Мезогель» (группа №5) - уже на 14 сутки после введения трансплантата наблюдалось заполнение дефекта на 80% исключительно хрящевой гиалиновой тканью, на 28 сутки дефект полностью восстанавливался.
Таким образом, использование заявленного изобретения позволяет улучшить восстановление функций суставов на начальных стадиях деструктивных заболеваний за счет увеличения скорости регенерации хрящевой гиалиновой ткани, без образования волокнистой хрящевой ткани, малоинвазивным, легко воспроизводимым и недорогим способом.