Показатели уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью двух иммуноферментных тест-систем

Показатели уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью двух иммуноферментных тест-систем

Т.Н. Фирсова, Г.С. Булыгина, Е.А. Шмелева

ФБУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

Резюме

С помощью двух тест-систем для ИФА, определяющих концентрацию антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови в абсолютных показателях (мкг/мл) и в МЕ/мл, изучено 80 сывороток крови здоровых взрослых людей (доноров). Выявлены высокие титры антитоксина. Идентичность показателей и напряженности противодифтерийного иммунитета доказана с помощью корреляционного анализа. Тест-система ИФА, выявляющая антитоксические антитела в сыворотках крови в абсолютных показателях, может быть использована для определения напряженности поствакцинального противодифтерийного иммунитета. Ключевые слова: дифтерия, антитоксический иммунитет, ИФА

Indicators of Antidiphtheritic Antitoxic Antibodies in the Sera of Healthy Adults Identified Using Different Immunoassay Test Systems

T.N. Firsova, G.S. Bulygina, E.A. Shmeleva

G.N. Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-Being, Moscow (info@gabrich.com) Abstract

Using of two ELISA tests determining concentration of antitoxic antidiphtheritic antibodies, 80 samples of blood sera of healthy adult people (donors) in absolute values (mkg/ml) and in ME/ml are studied. It is revealed high titer of antitoxin. Identity of indicators and intensity of antidiphtheritic immunity is proved by means of the correlation analysis. ELISA test revealing antitoxic antibodies in human blood sera in absolute values, can be used for intensity definition postvaccinal antidiphtheritic immunity. Key words: diphtheria, antitoxic immunity, ELISA

Введение

Во всех странах мира борьба с дифтерией осуществляется путем создания антитоксического иммунитета с помощью вакцинации в рамках национальных календарей прививок.

В мировой практике для определения поствакцинальных антитоксических антител в сыворотках крови людей используются иммунофермент-ный анализ (ИФА) и реакция биологической нейтрализации в культуре клеток Vero [8]. Состояние антитоксического иммунитета в РФ определяют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) [2, 6, 7]. В странах ЕС концентрацию антитоксических антител устанавливают с помощью иммуноферментных тест-систем в международных единицах (МЕ/мл). В МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского был разработан ИФА для выявления антитоксических антител в сыворотках крови людей в абсолютных показателях (мкг/мл).

Цель работы - сравнительная оценка показателей уровня антитоксических антител, выявленных с помощью тест-систем ИФА, одна из которых создана в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (далее -разработанная), а другая используется в странах ЕС (коммерческая).

Материалы и методы

Исследование антитоксических антител проводили в сыворотках крови 80-ти здоровых взрослых людей (доноров крови) в возрасте 18 - 50 лет, проживающих в Москве. Антитоксические противодифтерийные антитела определяли посредством непрямого твердофазного им-муноферментного анализа, разработанного нами в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского [1]. В качестве антигена использовали очищенный несор-бированный дифтерийный анатоксин, предоставленный ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Для определения антитоксических IgG применяли конъюгат антител к у-цепям иммуноглобулина человека, меченный пероксидазой хрена (производство фирмы МТК «Сорбент», Москва). Для сравнения показателей концентрации антитоксических антител была выбрана коммерческая тест-система фирмы Binding Site (Италия), предоставленная сотрудниками Instituto Superiore di Sanita (Рим, Италия).

Расчет количества (мкг/мл) антитоксических антител в сыворотках крови производили с помощью компьютерной программы MSFL ELA. exe, разработанной в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Л.В. Козлов, 1995). Для обработки полученных данных осу-

ществляли среднеарифметический расчет показателей концентрации антител [4].

Для сравнения показателей уровня антитоксических антител, определенных с помощью двух тест-систем ИФА, использовали корреляционный анализ, включающий определение коэффициента корреляции Пирсона и построение диаграммы рассеяния [9].

Результаты и обсуждение

Показатели концентрации антитоксических антител, выявленные с помощью разработанной тест-системы ИФА, представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Видно, что с возрастом происходит снижение концентрации антитоксических антител. Так, если в 18 - 20 лет уровень антитоксина составляет 180,4 ± 29,5 мкг/мл, то к 41 - 50 годам он падает до 81,6 ± 45,1 мкг/мл. Максимум содержания антитоксина наблюдался в группе доноров 21 - 30 лет (243,7 ± 36,3 мкг/мл), что, вероятно, связано с проводимой ревакцинацией среди взрослых [7]. Анализ показателей антител, выявленных в тех же сыворотках крови в МЕ/мл, представлен в таблице 2 и на рисунке 2.

Содержание антитоксических антител в показателях МЕ/мл отражает аналогичную тенденцию снижения уровня антитоксина в крови с возрастом. Так, самые высокие показатели антитоксических антител определяются в возрасте 21 - 30 лет (1,21 ± 0,23 МЕ/мл), а самые низкие - в 41 - 50 лет (0,55 ± 0,18 МЕ/мл). На рисунке 3 представлено сравнение показателей антитоксических антител (в мкг/мл и МЕ/мл), выявленных в сыворотке крови одних и тех же индивидуумов при использовании разных тест-систем ИФА (всего 40 сывороток). Полученные с помощью двух тест-систем результаты отражают идентичную напряженность антитоксического иммунитета. Так, в образце сыворотки № 8 - самая высокая концентрация антитоксина по обоим ИФА (498 мкг/мл и 3,20 МЕ/мл), то же и с образцом № 40, в котором установлена низкая концентрация антитоксина (10 мкг/мл и 0,12 МЕ/мл).

Метод корреляционного анализа подтвердил правомерность использования обеих тест-систем для определения уровня напряженности антитоксического противодифтерийного иммунитета.

Диаграмма рассеяния выявленных показателей содержания антитоксических антител в сыво-

Таблица 1.

Показатели концентрации антитоксических антител (в мкг/мл) в сыворотках крови здоровых людей разного возраста, определенные с помощью разработанной тест-системы ИФА

Возраст, лет 18 - 20 21 - 30 31 - 40 41 - 50

Концентрация антитоксина, мкг/мл 180,4 ± 29,5 243,7 ± 36,3 187,3 ± 34,9 81,6 ± 45,1

Количество образцов 21 30 19 10

Рисунок 1.

Уровни антитоксических антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью разработанной тест-системы ИФА

300 п

2 250 н

со i

о 200

^

о н

£ 150 Н

сс о;

<в

CP II

I

о

100 -

50

18 - 20

21 - 30 31 - 40

Возраст, лет

41 - 50

0

Таблица 2.

Показатели антитоксических антител (в МЕ/мл) в сыворотках крови здоровых людей разного возраста, определенные с помощью коммерческой тест-системы ИФА

Возраст, лет 18 - 20 21 - 30 31 - 40 41 - 50

Показатели антитоксина, МЕ/мл 1,0 ± 0,21 1,21 ± 0,23 0,91 ± 0,25 0,55 ± 0,18

Количество образцов 21 30 19 10

Рисунок 2.

Уровни антитоксических антител в сыворотках крови здоровых взрослых людей, определенные с помощью коммерческой тест-системы ИФА

¡§ 1,4 -

«1,2-1

i

s

о 1 ^ 1 о

ь 0,8 -

«

0,6 -

tu

§ 0,4 i

£ 1

с= 0,2 -

18 - 20

21 - 30 31 - 40

Возраст, лет

41 - 50

Рисунок 3.

Профили распределения антитоксических антител, определенные с помощью разработанного метода ИФА

0

ротках крови людей графически отражает корреляционную зависимость между абсолютным и выраженным в МЕ показателями концентрации антител, содержащихся в изученных сыворотках крови. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,873.

Следовательно, разработанная тест-система ИФА позволяет достоверно определить содержание антител в мкг/мл в сыворотке крови и может быть использована для выявления специфических антитоксических так как полученные с ее помощью результаты полностью соответствуют показателям коммерческой тест-системы.

Таким образом, в сыворотках крови здоровых взрослых людей, проживающих в Москве, определяются высокие концентрации антитоксических противодифтерийных антител, особенно в возрасте 21 - 30 лет (243,7 ± 36,3 мкг/мл; 1,21 ± 0,23 МЕ/мл). Снижение концентрации антитоксина с возрастом (от 180,4 ± 29,5 до 81,6 ± 45,1 мкг/мл; от 1,0 ± 0,21 до 0,55 ± 0,18 МЕ/мл) свидетельствует об изменении синтеза иммуноглобулина О в онтогенезе [3].

Известно, что защитный титр антитоксина в крови составляет 0,03 МЕ/мл [5]. В изученных сыворотках крови отмечаются гипервысокие показате-

ли содержания дифтерийного антитоксина, что свидетельствует о высокой напряженности гуморального антитоксического иммунитета.

Выводы

1. Разработанная в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского тест-система ИФА для выявления концентрации антитоксических антител в сыворотках крови идентична используемой в странах ЕС тест-системе ИФА, выявляющей антитоксические антитела в качественных показателях (МЕ/мл). Отечественная система может быть использована для определения напряженности поствакцинального противодифтерийного иммунитета.

2. С возрастом происходит снижение концентрации антитоксических антител (в 18 -20 лет - 180,4 ± 29,5 мкг/мл; в 41 - 50 лет -81,6 ± 45,1 мкг/мл). Самые высокие концентрации антитоксических антител выявляются в возрасте 21 - 30 лет, самые низкие - в возрастной группе 41 - 50 лет.

3. Максимум содержания антитоксина, который наблюдался в группе доноров 21 - 30 лет (243,7 ± 36,3 мкг/мл), вероятно, связан с проводимой ревакцинацией среди взрослых. ш

Литература

Макарова С.И. Выявление противодифтерийных антибактериальных антител с помощью ИФА: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 2005.

Максимова Н.М., Маркина С.С., Яцковский К.А. и др. Дифтерия в России в 2005 - 2009 годах // Эпидемиология и Вакцинопрофи-лактика. 2010. № 3 (52). С. 31 - 36.

Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология. - Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2009. С. 170 - 176.

Плохинский Н.А. Биометрия. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения АН СССР, 1961. С. 16 - 21.

Фаворова Л.А., Астафьева Н.В., Корженкова М.П. Дифтерия. - М.: Медицина, 1988. С. 54 - 75.

Шмелева Е.А., Фирсова Т.Н., Булыгина Г.С. и др. Содержание антитоксических противодифтерийных антител в сыворотках крови взрослых людей // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2009. № 4 (47). С. 49 - 56.

Эпидемиологический надзор за дифтерийной инфекцией: Методические указания МУ 3.1.1082-01. М.: Минздрав России, 2002. Di Giovine P., Pinto A., von Hunolstein C.; on behalf of all DIPNET WP9 participants. External quality assurance study of serological methods used in European countries for the detection of diphtheria antitoxin antibody, final report / Programme and Abstracts Book. Third Annual Meeting of Dipnet & Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria. Riga, Latvia, 7 - 9 October 2009. - 23 р.

http://www.aup.ru/books/m163/3_2_1.htm.

1

2

8

3

4

5