СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PSEUDOTUBERCULOSIS

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики инфекционных заболеваний, а именно псевдотуберкулеза.
Заболевания, вызываемые иерсиниями, в частности псевдотуберкулеза, составляют значительную проблему современной инфектологии. В последние десятилетия, несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза и создании новых методов диагностики кишечного и экстраинтестинального (псевдотуберкулеза) иерсиниозов, актуальность указанных инфекций сохраняется.
Официальные показатели заболеваемости в РФ псевдотуберкулеза за последние годы (7,1-7,3 на 100 тыс. населения) не отражают истинного уровня распространения инфекции, вследствие неравномерности распространения заболеваемости, сезонности инфекции и отсутствия достаточного количества лицензированных коммерческих диагностикумов, обладающих достаточными уровнями чувствительности и специфичности на разных стадиях заболевания.
В течение длительного времени в середине XX века эпидемический характер заболеваемости псевдотуберкулезом на Дальнем Востоке дал основание для описания его в качестве «дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки». Однако выраженные адаптационные свойства возбудителя - Yersinia pseudotuberculosis - привели к широкому распространению этой инфекции по всей территории РФ: в Приморском, Камчатском и Хабаровском краях, на Сахалине, Сибири, областях Северо-Западного Федерального округа. Различные по интенсивности вспышки и спорадические случаи за последние десятилетия были зафиксированы в странах ближнего зарубежья и Скандинавии.
За последние годы в связи с появлением новых диагностических технологий на рынке появился ряд новых тест-систем, позволяющих проводить индикацию возбудителя псевдотуберкулеза и антител к нему.
Вместе с тем, в практической медицине до настоящего времени используются традиционные методы, направленные на выявление возбудителя (бактериологический), его антигенов (иммунофлюоресцентный, иммуноферментный), и серологические методы, направленные на выявление антител в биосубстратах человека.
Диагностическая эффективность бактериологического метода ограничена его трудоемкостью, продолжительностью по времени и относительно длительными сроками исследования материала от начала заболевания, что связано с биологическими особенностями возбудителя, зависит от клинической формы и тяжести течения заболевания.
С 80-х годов прошлого века были предложены несколько диагностических тест-систем, основанных на иммуноферментном анализе (ИФА). В основе этих методов лежит образование комплекса «антиген-антитело» на полистероле (твердой фазе) с последующей трансформацией ферментной метки в фотосигнал, регистрируемый фотометрически. В указанный период были сконструированные системы Сбойчаковым В.Б., Королюк A.M. и соавт. (1989), Г.Я. Ценевой и соавт.(1995) для выявления антигенов возбудителя псевдотуберкулеза и специфических антител к возбудителю.
Авторы показали высокую чувствительность и специфичность тест-систем ИФА по сравнению с традиционными серологическими методами (РНГА, РА) и диагностическую эффективность предложенных диагностикумов с первых суток заболевания. Однако при конструировании данных систем в качестве антигена (сенситина) использовался только мембранный белок Yersinia pseudotuberculosis I серовара, что позволяет выявлять антитела в сыворотке крови человека только к этому белку и, следовательно, диагностировать инфекцию, вызванную только I серовариантом возбудителя. Это делает невозможным проводить диагностику псевдотуберкулеза, вызванного другими серовариантами (II-VIII и далее) возбудителя.
Известен иммуноферментный способ определения антител к Yersinia еnterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis классов А, М и G: три тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» и «Иерсиниоз-ИФА-IgG» ООО «Омникс», коды КС-040-042, описанные в инструкции по применению (09/05).
В указанных тест-системах в качестве антигенов, сорбированных на поверхности стрипов (сенситинов), используются несколько рекомбинантных белков наружной мембраны иерсиний. Тест-системы представляет собой наборы ингредиентов для проведения иммуноферментного анализа (ИФА): 1. Антигены иерсиний, сухие; 2. Антитела, меченные пероксидазой хрена, сухие; 3. Антитела к Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis классов А, М и G (положительный контрольный образец); 4. Отрицательный контрольный образец; 5. Набор солей для фосфатно-солевого буферного раствора; 6. Твин-80 (детергент); 7. Набор солей для карбонатно-бикарбонатного буферного раствора; 8. Субстратный буфер (ОФД); 9. Гидроперит; 10. Планшеты. 11. Конъюгат биотин, конъюгат авидин-пероксидазу или стрептавидин-пероксидазу, субстратный буфер с перекисью водорода, хромоген, стоп-реагент.
При изготовлении указанных известных тест-систем используется сложная биотин-стрептавидиновая технология введения ферментной метки, а также усложнен расчет концентрации антител - необходимо построение калибровочного графика. Кроме того, в этих тест-системах в качестве сенситина используются рекомбинантные белки наружной мембраны иерсиний, что приводит к повышению процента ложноположительных результатов и требует введения дополнительного реагента - блокатора. При этом положительный контрольный образец представлен лиофилизированной формой, что усложняет его производство и применение. Причем при сенсибилизации стрипов в качестве сенситина используются белки только I и III серотипов Yersinia pseudotuberculosis. Следовательно, выявляются только антитела к этим сероварам возбудителя. Это ограничивает возможности указанных способов диагностики, так как заболевание могут вызывать возбудители не только I и III серотипов Yersinia pseudotuberculosis, но и других сероваров.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ диагностики псевдотуберкулеза, основанном на иммуноферментном методе, который авторы позиционируют в качестве видоспецифического (патент РФ №2153172, G01N 33/53, G01N 33/569 «Способ диагностики псевдотуберкулеза»). При этом в прототипе в качестве сенситина использовали белок внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis порин, а в качестве реагента для предотвращения неспецифического связывания применяется 0,1% раствор желатина.
Способ осуществляется следующим образом: диагностику проводят по методике выявления специфических антител в сыворотке крови больного, используя твердо-фазный иммуноферментный анализ (непрямой, неконкурентный анализ антител).
Анализ включает в себя следующие этапы:
1. Посадка антигена (белка-порина) на твердый носитель (полистероловый планшет) в концентрации 100 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,0).
2. Отмывка планшета от несвязавшихся компонентов (3-5 раз по 5 мин фосфатно-солевым буфером рН 7,4 с твином-20 - буфер А).
3. Инактивация планшета блокиратором (0,1% раствор желатина на буфере А - буфер Б).
4. Внесение в лунки планшета исследуемой сыворотки в сериях разведений 1:400, 1:800.
5. Отмывка планшета (см. выше).
6. Нанесение коньюгата (вторых антител, меченных ферментом).
7. Отмывка планшета (см. выше).
2
2
8. Внесение субстратного раствора (0,04% ортофенилендиамина +5 мкл 33% раствора НО в 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0).
9. Остановка реакции (по 30 мкл 50 н. серная кислота).
10. Регистрация результатов реакции на фотометре.
Недостатки прототипа:
- белок внешней мембраны порин, который использован в качестве антигена в диагностикуме-прототипе в более поздних работах авторами позиционируется как «родоспецифический» (О.Д.Новикова Порообразующие белки рода Yersinia: структура и свойства; Автореф … докт. мед. наук. Владивосток, 2008. 58 с.). Одним из авторов изобретения признается, что антитела против порина выявляются не только при псевдотуберкулезе, но и при кишечном иерсиниозе.
Следовательно, тест-система, созданная на основе этого сенситина, не может считаться «видоспецифической»;
- длительность исследования - 3 ч 50 мин (описание изобретения);
- использование дополнительного этапа - инактивация планшета желатином, что удорожает и усложняет способ;
- использование в качестве субстратного раствора ортофенилендиамина (ОФД), который является высокоактивным канцерогеном, опасным для здоровья людей и требующим специальной технологии утилизации (запрещен для использования пр. МЗ №322 от 21.10.2002).
Задача изобретения - усовершенствование диагностики псевдотуберкулеза, за счет применения видоспецифического антигена, снижение длительности исследования, за счет сокращения стадий анализа, и увеличение безопасности здоровья обслуживающего персонала.
Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе, включающем определение специифических антител в сыворотке крови пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностического антигена и оценку результатов анализа, согласно изобретению в качестве диагностического антигена используют видоспецифический термостабильный летальный токсин У. pseudotuberculosis молекулярной массой 45 кДа, а результат расценивается как положительный, если оптическая плотность исследуемой пробы больше оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки на 0,2 и более условной оптической единицы.
Отличительными признаками предложенного способа являются использование в качестве диагностического антигена термостабильного летального токсина (ТсТ) молекулярной массой 45 кДа, который продуцируют 82,6% исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis всех известных серовариантов возбудителя (Н.Ф.Тимченко, Ю.В.Вертиев, Е.П.Недашковская и соавт., Журн. микробиол. 1995. №4. С.5-9).
В результате этого использования:
- возрастает специфичность метода;
- более, чем на 1/3 сокращается время исследования;
- убирается один из этапов - инактивация планшета желатином, что упрощает и удешевляет способ (медицинский желатин - является препаратом импортного производства);
- в качестве субстратного раствора вместо ортофенилендиамина (ОФД) применяется безопасный для здоровья реактив - 3, 3′,5, 5′ - тетраметилбензидин в диметилсульфоксиде (ТМБ).
Диагностику псевдотуберкулеза осуществляют на тест-системе, которая состоит из 96-луночного стрипированного полистиролового планшета с сорбированным ТсТ, ТсТ-конъюгата, положительного контрольного образца, отрицательного контрольного образца, промывающего раствора, субстратного буферного раствора с перекисью водорода, хромогена, стоп-реагента.
В качестве антигена для сорбирования планшета и для изготовления ТсТ-конъюгата, состоящего из токсина, конъюгированного непосредственно с ферментом пероксидазой хрена, использовали ТсТ, полученный из бактерий штамма 512 Y. pseudotuberculosis, выращенного при температуре 6-8°С (А.с. №1489185 от 22.02.1989 г.).
Расчет оптимальной концентрации ТсТ при сенсибилизации стрипов проводили опытным путем с учетом сорбционной емкости используемых планшетов и условий сорбирования. Она составила 4 мкг/мл при температуре 37°С в течение 1 часа. Определение рабочего титра конъюгата проводили для каждой серии поликлональных человеческих антител, меченных пероксидазой.
крит
В качестве положительного контрольного образца используют иммуноглобулин человека нормальный, содержащий Ig A, M и G против возбудителя псевдотуберкулеза оттитрованный по ОСО 42-28-320 до концентрации 50 мМЕ/мл, в качестве субстратного раствора и хромогена используют 0,2%-ный раствор 3, 3′, 5, 5′ - тетраметилбензидина в диметилсульфоксиде, разбавленный в 5 раз цитратным буфером с содержанием гидроперита в конечной концентрации 0,015% и 2-хлорацетамида в конечной концентрации 0,1%, а расчет критического значения оптической плотности (ОП) полуколичественного содержания суммарных антител к Y. pseudotuberculosis осуществляют по формуле:
крит
-
ОП≥ОПк+0,2,
-
где ПР - положительный результат, а ОПк - среднее значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки.
Таким образом, за положительный результат принимали те значения, которые превышали значения оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки на 0,2 и более условных оптических единиц.
Расчет количественного содержания суммарных антител осуществляют по формуле:
-
+
-
Сх=[(ОПх-ОПk)/(OПk-ОПk)]×50N,
-
+
где Сх - концентрация антител в мМЕ/мл, ОПк - среднее значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки, ОПк - среднее значение оптической плотности положительной контрольной сыворотки, а ОПх - среднее значение оптической плотности опытной сыворотки, N - исходное разведения опытной сыворотки.
Пример конкретного применения:
Приготовление компонентов тест-системы осуществляют следующим образом.
1. Получение ТсТ (А.с. №1489185 от 22.02.1989 г.).
Музейный штамм 512 Y. pseudotuberculosis культивируют в течение 72 часов на питательном агаре при температуре +10°С. Культуру отмывали забуференным физраствором, разрушали ультразвуком и выделяли фракцию токсина (молекулярной массы 45 кДа) ионообменной хроматографией на деэтиламиноэтил-целлюлозе, а затем гель-фильтрацией на сефадексе G-200. Выход белка определяли по М. Бредфорд (1976).
2. Посадка антигена на твердый носитель.
Полученный токсин разводили до рабочей концентрации 4 мкг/мл и вносили по 100 мкл в каждую лунку 96-луночного разборного полистиролового планшета фирмы "Dynatech" (Швейцария) в качестве антигена. Планшет герметично закрывают и выдерживают в течение суток при температуре 37°С, затем содержимое лунок удаляют. Полученный иммуносорбент высушивают на воздухе в течение суток при комнатной температуре и герметично запаивают под вакуумом в пакет из пленки металлизированной (фиг.1).
3. Приготовление ТсТ-конъюгата.
В каждую лунку вносят по 100 мкл меченных ферментом антител (коньюгат) в титре, подобранном экспериментально.
4. Приготовление положительных и отрицательных контрольных образцов. Отрицательная контрольная сыворотка. Используется сыворотка здорового донора.
Положительная контрольная сыворотка. Используют иммуноглобулин человека нормальный, содержащий антитела к ТсТ в концентрации 50 мМЕ/мл.
5. Субстратный раствор - 0,2%-ный раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) на диметилсульфоксиде - приобретается в готовом к применению виде.
6. Промывочный раствор - фосфатно-солевой раствор (рН 7,5±0,3) с твин-80 (ФСР-Т) - приобретается в виде 20-кратного концентрата. Разводится перед постановкой реакции дистиллированной водой.
7. Стоп-реагент - 2 н. р-р кислоты серной - приобретается в готовом к применению виде.
Проведение иммуноферментного анализа:
Установить в рамку планшета необходимое количество стрипов. Стрипы перед использованием промывают 2 раза добавлением в лунки по 250 мкл промывочного раствора в рабочей концентрации (1:20).
Положительную и отрицательную контрольные сыворотки вносят по 50 мкл в 3 лунки каждые. В оставшиеся лунки вносят по 50 мкл исследуемых образцов. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в ротационном шейкере (500 об/мин) 1 час при температуре 37°С, после чего промывают 5 раз промывочным раствором. Последнюю порцию тщательно вытряхнуть из лунок (фиг.2).
После отмывки лунок от не связавшихся (неспецифичных) субстанций в каждую лунку добавляются по 50 мкл раствора конъюгата (вторые антитела, связанные с ферментной меткой Е). Содержимое лунок перемешивают осторожным постукиванием по краям планшета в течение 20-30 сек (фиг.3).
Планшет накрывают крышкой и инкубируют в ротационном шейкере (500 об/мин) 1 час при температуре 37°С, после чего промывают 5 раз промывочным раствором. Последнюю порцию раствора тщательно вытряхнуть из лунок.
После отмывки стрипов в каждую лунку добавить по 100 мкл бесцветного субстратного раствора (ТМБ), с которым взаимодействует ферментная метка (пероксидаза). Стрипы инкубируются в темноте в течение 20 мин после чего субстрат превращается в окрашенный продукт (фиг.4).
2
4
Для остановки ферментной реакции во все лунки добавить по 50 мкл стоп-реагента (2 н. HSO), встряхнуть.
Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм.
Расчет результатов (предварительное разведение исследуемых сывороток от титра 1:400 и более).
-
+
-
Результаты оцениваются только в том случае, если среднее значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки (ОПk) не более 0,3 у.о.е., а среднее значение оптической плотности положительной контрольной сыворотки (ОПk) не менее, чем в 3 раза превышает среднее значение (ОПк).
Исследуемая сыворотка расценивается как положительная, если ее оптическая плотность (ОПх) больше или равна по величине критического значения ОП:
крит
-
ОП≥ОПк+0,2,
крит
-
где ОП- критическая оптическая плотность в у.о.е., а ОПк - среднее значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки.
Расчет количественного содержания суммарных антител осуществляют по формуле:
-
+
-
Сх=[(ОПх-ОПk)/(OПk-ОПk)]×50N,
-
+
где Сх - концентрация антител в мМЕ/мл, ОПк - среднее значение оптической плотности отрицательной контрольной сыворотки, ОПк - среднее значение оптической плотности положительной контрольной сыворотки, а ОПх - среднее значение оптической плотности опытной сыворотки, N - исходное разведения опытной сыворотки.
Пример клинического использования.
Заявляемый способ диагностики псевдотуберкулеза использовали в инфекционных отделениях гарнизонного госпиталя г.Фокино и Военно-морского клинического госпиталя Тихоокеанского флота. Исследовано 1086 сывороток от 816 доноров и больных с заболеваниями разной этиологии: псевдотуберкулез (224 больных и 334 сыворотки крови), иерсиниоз (соответственно, 95 и 119), 226 больных (327 сыворотки) сальмонеллезом, дизентерией, гепатитом, корью, ветряной оспой, ОРЗ и другими инфекциями.
В качестве контроля исследованы 244 донорские сыворотки крови. При отборе донорской крови преимущество отдавалось донорам-военнослужащим, прибывшим из центральных и западных областей страны. Возраст больных и доноров 18-47 лет, пол - мужской.
Иерсиниоз подтвержден серологически у 95 больных (119 сывороток), бактериологически и серологически у двух больных с выделением культур Y. enterocolitica О6 серовара IA биовара и нарастанием титров антител в крови.
Для подтверждения диагноза "псевдотуберкулез" использовали также ПЦР. Работа проведена в ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (Москва). У 45 больных, диагноз у которых был подтвержден бактериологически и серологически, в сыворотках крови выявлен амплифицированный фрагмент (праймер - 518 н.п. гена YopA плазмиды pCad У. pseudotuberculosis).
Взятие крови проводили двух-трех-кратно в разные периоды заболевания.
Все больные в период обследования получали этиотропную антибактериальную терапию, находились на стационарном лечении.
Псевдотуберкулез протекал у 104 больных со среднетяжелым течением болезни и в 93 случаях - в легкой форме. В 27 случаях заболевание носило рецидивирующий характер.
Для контроля специфичности исследовали сыворотки крови пациентов с верифицированными диагнозами других желудочно-кишечных инфекционных заболеваний.
Как свидетельствуют данные таблицы, тест-система позволяет выявлять антитела в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом в 78,5% случаев. Антитела, выявленные у двух больных иерсиниозом (2,8%), могут свидетельствовать либо о перенесенном ранее псевдотуберкулезе, либо о смешанной инфекции (таблица).
Показатели специфичности тест-системы ИФА с сыворотками больных (М±m, %)
Клинический диагноз
Количество обследованных больных
Серологически подтвержденный диагноз, %
Бактериологически подтвержденный диагноз, %
Положительный результат в ИФА, %
Псевдотуберкулез
88
36.7±3.1
14.9±1.4
78.5±4.9
Иерсиниозы
72
32.5±2.7
11.3±0.9
2.8±0.51
Дизентерия
81
75.5±3.3
82.7±6.4
0
Сальмонеллез
24
58.3±3.0
77.3±5,9
0
Энтероколит
33
51.5±3.6
69.5±5,6
0
Бруцеллез
11
36.4±2.4
0
0
Лептоспироз
9
44.4±2.6
0
0
Доноры
244
-
-
2,46±0.32
В сыворотках больных с другими клиническими диагнозами специфические антитела не выявлены.
Проведенные результаты клинического испытания показывают, что РНГА с псевдотуберкулезным диагностикумом - лишь в 36,7%, в период 2-3 недели болезни, с максимальной диагностической информативностью на 2-й неделе заболевания.
Таким образом, преимуществами разработанной тест-системы ИФА являются высокая видоспецифическая активность, сокращение стадий анализа, простота и удобство в применении и расчете полуколичественной и количественной концентрации антител к ТсТ Y. pseudotuberculosis. Использование в качестве сенситина термостабильного токсина, позволяет улучшить диагностику псевдотуберкулеза, вызванного разными серовариантами возбудителя.
Разработанная тест-система может быть использована как для количественного и полуколичественного определения титра антител к возбудителю псевдотуберкулеза с целью постановки диагноза, так и с целью контроля за динамикой течения заболевания.