СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА КОРМОВ В IN VIVO ТЕСТ-СИСТЕМЕ
METHOD OF EVALUATING QUALITY OF FODDER IN IN VIVO TEST SYSTEM

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности, к определению качества и полноценности кормов на комбикормовых заводах, комбинатах хлебопродуктов, в питомниках, в лабораториях ветеринарной и агрохимической экспертизы и др. на любой стадии приготовления кормовых смесей и кормления с.-х. животных.
В настоящее время разрабатываются и используются всевозможные рецепты сухих и влажных кормов. При этом полнорационные корма включают самые разнообразные ингредиенты: зерно злаковых и бобовых культур, мясо птицы, крупного рогатого скота, кролика, океаническую и речную рыбу, мясокостную, рыбную муку, сухое молоко, сухие овощи, витаминные и минеральные добавки, антибиотики и т.д. Корма и кормовые добавки готовят чаще всего в виде гранул, имеющих различную форму, размер, цвет и запах. Все корма и кормовые добавки имеют, как правило, высокую себестоимость.
Известны способы определения качества кормов, в частности комбикормов стандартными методами, предусматривающими мокрое озоление пробы кислотой при определении азота; сухое озоление - при определении серой золы, кальция, фосфора; экстрагирование навески пробы эфиром - при определении сырого жира и т.д. Эти методы трудоемки по выполнению. При этом на анализ каждой пробы по полной зоотехнической схеме затрачивает 2-3 дня. Кроме того, требуется использование химических реактивов, химической посуды, дорогостоящих приборов и оборудования. И эти способы не безопасны для исполнителей (Марков Д.И., Шумилин И.С., Горшков Г.И. и др. Руководство по анализам кормов. - М.: Колос, 1982).
Известно также определение качества кормов методом диффузного отражения проб в ближней инфракрасной области спектра (750-2500 нм) с использованием ИК-анализаторов (Метод определения содержания сырого протеина, сырой клетчатки, сырого жира и влаги с применением спектроскопии в ближней инфракрасной области. ГОСТ Р 50817-95. Метод определения содержания золы, кальция и фосфора с применением спектрометрии в ближней инфракрасной области. ГОСТ 50852-96. Крищенко В.П. Ближняя инфракрасная спектрометрия. - М. 1974. - С. 333, 336-339. Патент РФ №2138806. МПК G01N 33/43, A61K 1/00, опубл. 27.09.1999).
Недостатком указанного способа является то, что разработка градуировочных уравнений, по которым проводится анализ, требует большого объема работ по подбору проб кормов, подготовке их к анализу и сам анализ стандартными химическими методами. На выполнение этих работ затрачивается от 4 до 12 месяцев (Муллард И. Анализ кормов в ближней инракрасной области. - Сельскохозяйственное использование спетроскопии в ближней инфракрасной области (Сб. научн. Трудов по ИКС - М., 1986. - С. 37-42).
Известно, что биологическая полноценность корма в большей степени оценивается по уровню содержания в нем протеина. Кроме того, при составлении рационов для животных важное значение имеет сбалансированность кормов по сахару и протеину - отношение, которое выражается показателем количества легко ферментируемых сахаров на 1 г протеина. Протеин рационов используется лучше в кормах, где сахарно-протеиновое отношение составляет - 1,0:1,5 (Кормление сельскохозяйственных животных: Справочник под ред. А.П. Калашникова и Н.И. Клейменова. - М.: Росагропромиздат, 1988. - 366 с.).
Поэтому при разработке этого способа определения качества кормов используют метод лабораторного моделирования ключевых процессов превращения белка как на рубцовом, так и на пострубцовом участках пищеварительного тракта у животных.
Один из подходов к исследованию рубцового пищеварения, а именно культивирование рубцовых микроорганизмов в лабораторных условиях, дает возможность изучить метаболизм кормового белка на этом участке вне фона пищеварения по всей длине пищеварительной цепи.
При разработке методов in-vitro стремятся в той или иной степени моделировать условия жизнеобитания рубцовой микрофлоры в преджелудках животных, где за счет притока слюны, имеющей свои буферные свойства, стабилизируется pH (первое условие); минеральный состав среды (второе условие); стенка рубца обеспечивает ритмичное перемешивание (третье условие); отвод продуктов метаболизма (четвертое условие); анаэробность среды (пятое условие) и постоянная температура 39°C (шестое условие).
С учетом вышеизложенного разработан способ оценки биологической полноценности кормов в условиях in-vitro с использованием аппарата «искусственный рубец», обеспечивающего сохранение количества внесенной в аппарат рубцовой микрофлоры и учет образовавшегося в результате расщепления белка аммиака (Тютюнников А.И., Фадеев В.М. Повышение качества кормового белка. - М.: Россельхозиздат, 1964. - С. 17-19).
Недостатком способа является ограниченность получаемой информации о качестве и биологической полноценности кормов, поскольку она зависит не только от количества образовавшегося белка, но и других важнейших компонентов корма: ферментов, витаминов, углеводов, жирных кислот, минеральных веществ и т.д. Кроме того, лабораторная модель in-vitro весьма далека от оптимальной модели in-vivo, поскольку этот способ не обеспечивает получения информации об истинной биологической полноценности испытуемого корма - нет информации о получаемой продукции, а именно о прибавке живой массы и, кроме того, отсутствует количественная оценка синтеза биологически активных веществ.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, состоит в разработке оптимальной in-vivo тест-системы для оценки биологической полноценности кормов и кормовых добавок, упрощении метода анализа кормов и сокращении времени проведения исследований.
Для достижения вышеуказанного технического результата в способе оценки качества кормов в in-vivo тест-системе отобранные пробы исследуемых кормов предварительно измельчают, их помещают в марлевые мешочки по 4-5 г, мешочки завязывают нитками. Оценку качества кормов осуществляют путем инкубирования микроорганизма чайного гриба штамма Medusomyces Gisevii Lindau в растворе чая с сахаром с добавлением пробы исследуемого корма. Через 12-14 суток полученную биомассу в опытной и контрольной банках взвешивают и по отношению биомассы гриба в опыте (г) к массе контрольной пробы (г) определяют качество корма или кормовой добавки, выраженное в интегральном показателе - коэффициенте эффективности (КЭ). По коэффициенту эффективности, равному 1,1-1,6, судят о низком качестве кормов; 1,7-2,5 - среднем качестве; 2,6-3,0 - хорошем качестве и 3,1-4,0 - высоком качестве кормов, что обеспечивает в условиях in-vivo получение важнейшей информации, которой является прирост биомассы гриба при выращивании его с находящимися в растворе чайного гриба пробами исследуемых кормов или биодобавок. Вышеуказанный способ по сравнению с известными упрощает отбор, подготовку и проведение анализа кормов, биодобавок и их компонентов, сокращает время проведения исследований в 15-30 раз.
Способ осуществляется следующим образом. На первом этапе готовят пробы каждого из исследуемых сухих кормов (зерновых, бобовых, сухих биодобавок или комбикормов, сена, соломы и т.д.), их измельчают на мельнице типа «Циклон» с диаметром отверстий 1 мм, тщательно перемешивают, помещают в банки с притертыми пробками и хранят в холодильнике.
Испытания проводят с пробами массой 1, 2, 3, 4, 5, 7, 7, 8, 9 и 10 г, которые помещают в марлевые мешочки, завязывают нитками, оставляя свободный конец ниток длиной 10-15 см (в зависимости от условий выращивания и высоты инкубационных банок).
Моделирование in vivo тест-системы для оценки биологической полноценности кормов осуществляют путем инкубирования микроорганизма чайного гриба штамма Medusomyces Gisevii Lindau, используемого для получения напитка (кваса) чайного гриба. Для выращивания чайного гриба используют 3-литровые банки с широким горлышком, которые закрывают несколькими слоями марли. Для роста и развития гриба используют слабый раствор чая (1,5-2,0 л) с растворенным в нем сахаром. Его готовят из расчета: 100-120 г сахара на 1 литр кипяченой воды комнатной температуры.
В параллельных опытных банках гриб выращивают в присутствии исследуемых проб сухих и жидких кормов. Для этого предварительно на дно банок помещают пробы кормов, кормовых добавок или их компоненты (приготавливают как описано выше) массой от 1 до 10 г (жидкие пробы - от 1 до 10 мл), их заливают инкубационной жидкостью (раствор чая и сахара) и инкубируют в идентичных, как и контрольные банки, условиях.
Контрольные и опытные банки выдерживают при 23-25°C в расположенном подальше от окна месте (для исключения прямого попадания солнечных лучей) в течение 12-14 суток. По истечении указанной экспозиции проводят взвешивание образовавшейся биомассы гриба, предварительно проведя его обезвоживание, для этого гриб вынимают из банки, помещают на 3-5 мин на дно сита (для полного стекания остаточной жидкости), затем фильтровальной бумагой его просушивают, помещают на лабораторные весы и производят взвешивание образовавшейся биомассы гриба из контрольной и опытной банок.
Определение биомассы проводят путем прямого взвешивания, получая вес сырой биомассы. Параметр «биомасса» является фундаментальным показателем, отражает степень интенсивности роста гриба, выражается через важные интегральные характеристики - экономический и метаболический коэффициенты. Взвешивание гриба дает информацию о массе, объеме, линейном размере, массе потребленного субстрата, массе образованного продукта, скорости метаболизма и по отношению биомассы гриба в опыте (г) к биомассе контрольной пробы (г) определяют коэффициент эффективности (КЭ), который показывает, во сколько раз биомасса гриба в банке с исследуемым кормом превышает биомассу гриба контрольной пробы.
Результаты многочисленных опытов показали, что низкому качеству исследуемых кормов соответствует коэффициент эффективности 1,1-1,6; коэффициент эффективности, равный 1,7-2,5, соответствует среднему качеству; КЭ, равный 2,6-3,0, - хорошему качеству и КЭ=3,1-4,0 - высокому качеству или полноценности кормов, рациона, кормовых добавок или их компонентов, а также кормовых смесей, составленных в производственных или в экспериментальных условиях.
В практике животноводства различают сочные, грубые, концентрированные корма, корма животного и микробного происхождения, минеральные подкормки и комбикорма. При этом каждый вид кормов включает значительное количество подвидов. Например, зеленые корма, входящие в состав сочных кормов, насчитывают более 20 подвидов (люцерна, клевер, эспарцет, донник, овсянка луговая, кострец безостый, ежа сборная, вика, горох, вико-овсяная смесь, горохово-овсяная смесь, кукуруза, сорго, озимая рожь и др.) Аналогичное множество подвидов включают грубые, концентрированные, корма животного и микробного происхождения, минеральные подкормки и комбикорма. Это заставляет при составлении кормовых рационов учитывать удельный вес различных групп кормов, входящих в их состав. В связи с этим, использование в животноводческой практике ускоренной и объективной оценки качества и полноценности предлагаемого рациона, в зависимости от изменения состава его компонентов, является важной задачей в совершенствовании системы кормления с.-х. животных путем разработки полноценных рационов.
Для сравнительной оценки эффективности и полноценности предлагаемых рационов, кормов, кормосмесей и комбинированных кормов, в качестве эталона в предлагаемой тест-системе используют полнорационные комбинированные корма для выращивания бройлеров 1-го периода - ПККпт (тестирование рационов птиц) и полноценные комбинированные корма для крупного рогатого скота ПККкрс (тестирование кормов для крупного рогатого скота).
Осуществление способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Изучение влияния эталонного рациона (корма) - ПККкрс на накопление биомассы гриба Medusomyces Gisevii Lindau
Опыты проводили параллельно в двух 3-литровых банках, первая из которых служила опытом, вторая - контролем. На дно опытной банки помещали пробу (4-5 г) эталонного корма ПККкрс в марлевом мешочке, завязанном ниткой, свободный конец которой выносили наружу и фиксировали на горлышке банки. От материнского гриба отделяли нижние слои, помещали их в обе банки, наливали раствор чая с сахаром по 1,5-2,0 л. Обе банки помещали в теплое при 23-25°C место и инкубировали в течение 12-14 суток (время максимального накопления биомассы гриба). По истечении указанной экспозиции полученную биомассу извлекали из опытной и контрольной банок, помещали на дно сита, выдерживали 3-5 мин до полного стекания жидкости, высушивали фильтровальной бумагой, помещали на чашки лабораторных весов и проводили взвешивание биомассы гриба из контрольной и опытной банок. Результаты взвешивания биомассы гриба из опытной и контрольной банок и определение коэффициента эффективности показали, что кратность увеличения биомассы гриба при выращивании его в присутствии исследуемого корма (ПККкрс), по сравнению с контролем (КЭ), составляла 3,58 раза, при значениях биомассы гриба в опыте - 405,0 г и биомассы контрольной пробы - 113,0 г.
Пример 2. Зависимость прироста биомассы гриба от количественного содержания пробы испытуемого корма
При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба с размещением в культуральной среде различного количества испытуемых проб (от 1 до 10 г). Результаты взвешивания показали, что максимальное увеличение биомассы гриба в опыте происходило при внесении в культуральную среду исследуемой пробы в количестве 4-5 г. Дальнейшее увеличение количества вносимой пробы к приросту биомассы не приводило, избыточное количество внесенного субстрата микроорганизмом не усваивалось и оставалось на дне банки.
Пример 3. Изучение зависимости прироста биомассы гриба от времени культивирования
При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба путем выращивания микроорганизма в течение 3-14 суток. Результаты взвешивания биомассы показали, что максимальный рост гриба в опыте был зарегистрирован на 12 сутки, биомасса составляла - 401,9 г при значении показателя в контроле - 107,1 г; кратность (КЭ) составляла 3,75 раза. Дальнейшее увеличение времени культивирования гриба в опытной банке к значимому увеличению биомассы гриба не приводило. На 14 сутки биомасса в опытной банке составляла - 404,9 г, при значении в контроле - 113,1 г (КЭ=3,58).
Пример 4. Изучение влияния на прирост биомассы гриба одного из основных компонентов корма - сои
Одним из важнейших компонентов полноценного комбинированного корма при выращивании крупного рогатого скота является соя, которая имеет исключительное значение для решения белковой проблемы в животноводстве. В связи с этим было проведено изучение влияние этого компонента на прирост биомассы гриба при выращивании его в присутствии указанной культуры. При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба при внесении в культуральную среду 4-5 г сои. Процесс инкубирования микроорганизма продолжался в течение 14 суток. Результат определения биомассы в опытной и контрольной банках показал, что таковая в опытной банке составляла - 321,3 г, против 112,8 г в контроле, КЭ=2,85 раза.
Пример 5. Изучение влияния на прирост биомассы гриба одного из основных компонентов корма - порошка обрата
При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба при внесении в культуральную среду порошка обрата в количестве 4-5 г. Установлено, что на 14 сут биомасса гриба в опыте составляла 298,7 г против 112,5 г в контроле, КЭ был равен - 2,65 раза.
Пример 6. Влияние смеси соя-обрат на прирост биомассы гриба
При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба при внесении в культуральную среду смеси соя-обрат в соотношении - 1:1. Установлено, что данная смесь оказывала стимулирующее воздействие на прирост биомассы гриба. Вес гриба в опыте составлял 341,3 г против 113,1 г в контроле. Расчеты показали, что КЭ данной смеси составлял 3,01 раза.
Пример 7. Влияние биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М», на прирост биомассы гриба
Учитывая, что полноценность эталонного корма ПККкрс достигается путем включения в его состав кормовых добавок (премиксов, минеральных веществ, витаминов и т.д.), изучали влияние на рост и развитие гриба биологически-активной кормовой добавки «Вита-Форце М», содержащей продукты пчеловодства (прополис, пергу, обножку, пчелиный подмор, трутневый расплод), муку (кровяную, хвойную и травяную) и бентонит, которая обладает иммуностимулирующим, антиинфекционным, адаптогенным и радиозащитным свойствами, повышает усвояемость кормов, стимулирует рост и развитие молодняка, повышает сопротивляемость организма в условиях воздействия на него стресс-факторов - физического (облучение), химического (экотоксиканты) и биологического (патогенная и условно-патогенная микрофлора) и по химическому составу и биологическому действию превосходит известные кормовые добавки. При постановке опыта учитывали тот факт, что высокая биологическая активность препарата и многокомпонентный химический состав (наличие до 27 микроэлементов, витаминов групп A, B, C, D, E, PP, ферментов, аминокислот, жирных кислот, хитина, хитозана и др.) могут обеспечить эффект даже при минимальной концентрации биологически активного вещества. При сохранении условий примера 1 получали биомассу чайного гриба при внесении в культуральную среду проб препарата «Вита-Форце М» весом от 1 до 10 г. Установлено, что максимальный эффект был отмечен при добавлении в культуральную жидкость 3-5 г препарата. Прирост биомассы за 14 сут культивирования составлял 438,1 г против 115,3 г в контроле (КЭ=3,79). Дальнейшее увеличение количества исследуемого препарата к значительному приросту биомассы не приводило, избыток кормовой добавки микроорганизмом не усваивался, оставался на дне банки и не вступал в процесс метаболизма.
Пример 8. Оценка влияния смеси ПККкрс-«Вита-Форце М» на прирост биомассы гриба
При сохранении условий примера 1 в культуральную жидкость вносили различные количественные сочетания эталонного корма ПККкрс и биологически активной кормовой добавки «Вита-Форце М». При этом были составлены следующие количественные соотношения компонентов: 9,5:0,5; 9,0:1,0; 8,5:1,5; 8,0:2,0; 7,5:2,5; 7,0:3,0; 6,5:3,5; 6,0:4,0 (г). Установлено, что внесение в культуральную среду смеси корма и кормовой добавки в соотношении 8,5:1,5 обеспечивало наиболее эффективный прирост массы гриба - 465,3 г против 113,5 г в контроле, что соответствовало КЭ=4,1 раза.
Таким образом, использование "in-vivo" тест-системы обеспечивало объективную ускоренную экспресс-оценку качества и полноценности кормов, кормосмесей и биодобавок.
Предлагаемое изобретении, по сравнению с известными способами, имеет следующие преимущества:
- отпадает необходимость в использовании химических реактивов, химической посуды, дорогостоящих приборов и оборудования;
- способ безопасен для исполнителей;
- не требуется проведение сложных математических расчетов и разработки градуировочных уравнений;
- изучаемый показатель (измерение биомассы) является интегральным, важнейшим производственным показателем, позволяющим определение экономического и метаболического коэффициентов, получение информации о массе, объеме, линейных размерах, весе некоторых компонентов биомассы, массе потребленного субстрата и образовавшегося продукта (чайного напитка), его вкусовых качествах, скорости метаболизма и среднесуточного увеличения веса;
- невысокая стоимость, экологическая чистота, простота технического исполнения и высокая достоверность результатов.
- позволяет сократить время проведения исследований в 15-30 раз, упростить отбор, подготовку и определение качества кормов.
Способ апробирован в многократных лабораторных испытаниях с использованием значительного ассортимента кормов, рационов, пищевых и кормовых добавок, кормосмесей и их отдельных компонентов (более 150 наименований объектов) с полной их оценкой.