Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AIcAR — нового препарата широкого терапевтического применения

УДК 577.123.383:579.852.11

Реконструкция пуринового метаболизма у Bacillus subtilis с целью получения штамма-продуцента AICAR — нового препарата широкого терапевтического применения

К. В. Лобанов, Л. Эрраис Лопес, Н. В. Королькова, Б. В. Тяглов, А. В. Глазунов,

Р. С. Шакулов, А. С. Миронов*

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 117545, Москва, 1-й Дорожный пр., 1 *E-mail: alexmir@genetika.ru Поступила в редакцию 24.02.2011 г.

РЕФЕРАТ AICAR - природное соединение, аналог и предшественник аденозина. Будучи активатором про-теинкиназы, активируемой АМР (AMPK), AICAR имеет широкий терапевтический потенциал, поскольку он нормализует углеводный и липидный обмен и ограничивает пролиферацию опухолевых клеток. Синтез AICAR в клетках Bacillus subtilis контролируется ферментами биосинтеза пуринов, гены которых входят в состав пуринового оперона (pur-оперона). Проведена реконструкция пуринового метаболизма в клетках штамма B. subtilis, направленная на сверхпродукцию AICAR. С этой целью из генома B. subtilis удалили ген purH, кодирующий формилтрансферазу/1МР-циклогидролазу, фермент, контролирующий превращение AICAR в IMP, что обеспечивает накопление AICAR. Для увеличения продукции AICAR в хромосому бактерий внесли инсерцию, инактивирующую ген-регулятор purR и делетировали терминатор транскрипции, расположенный в лидерной области pur-оперона. Кроме того, сконструирован экспрессионный интегративный вектор, содержащий сильный промотор гена rpsF, кодирующего рибосомный белок S6. В этот вектор под контроль промотора гена rpsF клонирован гетерологичный ген purF Escherichia coli, кодирующий первый фермент биосинтеза пуринов со снятой аллостерической регуляцией, а также модифицированный ген prs E. coli, ответственный за синтез предшественника пуринов - фосфорибозилпирофосфата (PRPP). Модифицированные гены purF и prs встроили в хромосому штамма-продуцента. Полученный в результате проведенных генетических манипуляций штамм B. subtilis накапливает 11-13 г/л AICAR в культуральной жидкости.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА противоопухолевый препарат AICAR, метаболизм пуринов, реконструкция генома, штамм-продуцент Bacillus subtilis.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AICAR - 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофуранозид; AICAR-P - нуклеотид-AICAR-фосфат; IMP - инозинмонофосфат; AMP - аденозинмонофосфат; АМРК - AMP-активируемая протеинкиназа; PRPP - фосфорибозилпирофосфат; GAR - 5-фосфорибозилглицинамидрибонуклеотид; GMP - гуанозинмонофосфат; ПЦР - полимеразная цепная реакция; КЖ - культуральная жидкость.

ВВЕДЕНИЕ

При всем разнообразии структурной организации генов, кодирующих ферменты биосинтеза пуриновых нуклеотидов, у различных организмов биохимия этого процесса консервативна: формирование пуринового цикла осуществляется на платформе рибозо-5-фосфата (все интермедиаты - нуклеотиды) с использованием одноуглеродного компонента (формиата и/или Ш0-формилтетрагидрофолата) [1].

Одноуглеродные соединения востребованы на двух этапах биосинтеза пуринов и соответственно при их недостатке могут накапливаться предшественники - фосфорибозилглицинамидрибонуклеотид (GAR) и 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибонуклеотид (AICAR-P). Среди них AICAR-P занимает особое положение, так как его формилирование и последующая циклизация завершают формирование пуринового гетероцикла с образованием инозин-

монофосфата (IMP) (рис. 1). Процесс превращения AICAR-P в IMP в клетках прокариот контролируется геном purH, который кодирует два домена с активностями AICAR-P-формилтрансферазы и IMP-циклогидролазы [2, 3]. Дальнейшие модификации IMP приводят к образованию AMP и GMP.

Несмотря на незавершенность структуры пуринового гетероцикла, AIcAR-P является природным аналогом AMP, замещающим его в некоторых ферментативных реакциях in vivo. Наибольшее внимание за последнее десятилетие привлекает возможность замещения AMP в реакциях активации AMP-киназы (AMP-активируемая протеинкиназа) млекопитающих. AMPK - глобальный регулятор метаболических процессов, обеспечивающих энергетический статус организма эукариот [4, 5]. Для активации AMPK in vivo удобно использовать нуклеозид AIcAR, который в клетках быстро фосфорилируется с образованием AICAR-P, аналога AMP. Появление AIcAR-P имитирует накопление AMP и провоцирует перестройку энергетических процессов, направленную на преодоление мнимого энергетического стресса. Благодаря способности активировать AMPK препараты AIcAR обладают широким терапевтическим потенциалом, поскольку они нормализуют углеводный [6] и липидный обмен [7]. Имитируя состояние энергетического стресса, AIcAR подавляет рост опухолевых клеток [8]. Показана эффективность AIcAR в предупреждении сахарного диабета типа 2 [9]. AICAR индуцирует апоптоз, он эффективен при хронических [10] и острых лейкозах [11].

Цель настоящей работы состояла в получении штамма-продуцента AIcAR путем направленной реконструкции пуринового метаболизма в клетках B. subtilis. Выбор B. subtilis обусловлен тем, что генетический контроль и регуляция пуринового метаболизма у этих бактерий изучены достаточно подробно. Кроме того, штаммы рода Bacillus уже давно используются в качестве продуцентов пуриновых нуклео-зидов и нуклеотидов, таких, как инозин, инозиновая и гуанозиновая кислоты [12, 13].

Пуриновый оперон B. subtilis - purEKBCSQLFMNHD (далее обозначаемый как pur-оперон), кодирует ферменты синтеза IMP - главного промежуточного соединения при биосинтезе пуриновых нуклеотидов (рис. 1).

Группа из 12 сцепленных генов, образующих pur-оперон, локализована в районе 55° на хромосоме B. subtilis (рис. 2) [14]. Экспрессия pur-оперона B. subtilis находится под двойным негативным контролем, в котором участвуют белок-репрессор PurR [15] и терминатор транскрипции, расположенный в лидерной области оперона [16]. Показано, что низкомолекулярным эффектором белка PurR служит

PRPP

purF

у

PRA

purD

у

GAR

purN

у

FGAR

purQL

у

FGAM ------ AIR

purM

Рис. 1. Схема биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo. PRPP - 5'-фосфорибозил-1-пирофосфат, PRA - 5'-фосфорибозиламин,

GAR - 5'-фосфорибозилглицинамид,

FGAR - 5'-фосфорибозил-^формилглицинамид, FGAM - 5'-фосфорибозил-^формилглицинамидин, AIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол,

CAIR - 5'-фосфорибозил-5-аминоимидазол-4-карбоксилат, SAICAR - 5'-фосфорибозил-4^-сукцинокарбоксамид)-5-аминоимидазол, AICAR-P -5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-аминоимидазол, FAICAR - 5'-фосфорибозил-4-карбоксамид-5-формамидоимидазол, IMP - инозин-5'-монофосфат, AICAR - 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибофура-нозид.

PRPP [15], тогда как в качестве модулятора, усиливающего терминацию транскрипции перед первым структурным геном оперона, выступает гуанин [17]. Позднее выяснилось, что 5’-нетранслируемая область мРНК выполняет сенсорную функцию в отношении метаболита-эффектора гуанина и служит так называемым рибопереключателем [18, 19], обеспечивающим преждевременную терминацию транскрипции оперона [20, 21].

Таким образом, на первом этапе работы по получению штамма-продуцента AICAR необходимо было обеспечить максимальную экспрессию генов pur-оперона, устранив его негативную регуляцию под действием белка-репрессора PurR и терминатора транскрипции в лидерной области оперона. После этого из генома полученного штамма удалили ген purH, кодирующий формилтрансферазу/IMP-циклогидролазу, участвующую в синтезе AIcAR. Инактивация этого фермента должна обеспечивать внутриклеточное накопление AICAR (рис. 1). На следующем этапе работы необходимо было увеличить пул основного предшественника синтеза пуринов de novo - PRPP. PRPP синтезируется из рибозо-5-

IMP

А

purH

FAICAR

purH

purEK

CAIR

AICAR-P-A

purB

SAICAR A

purC

- AICAR

» O

L'IÍ'. ~P'"R ... ourE purK purB purC purS pu!Q purL purF purM purN purH. pur^:

Сайт связывания Сайт связывания -35 PurR PurR

10 +1

AT-purE SD

Рис. 2. Схема структурной организации ри^оперона и его регуляции. В верхней части рисунка показано относительное расположение 12 сцепленных структурных генов, образующих ри^оперон, и не сцепленный с ними ген PиrR, кодирующий белок-репрессор ри^оперона. В нижней части рисунка представлена лидерная область риґ-оперона с указанием сайтов связывания белка-репрессора Ри^, сайта связывания РНК-полимеразы (-35 - - 10), старта транскрипции (+1), терминатора транскрипции (в виде шпилечной структуры) и сайта связывания рибосом (SD); пунктиром обозначен делетированный участок (AT-риrE) лидерной области.

фосфата под контролем PRPP-синтазы, кодируемой геном prs. Этот фермент подвержен аллостериче-ской регуляции с участием пуриновых нуклеотидов. Структурно-функциональная организация PRPP-синтазы, более детально изучена у бактерий E. coli, у которых получен мутантный вариант этого фермента со снятой аллостерической регуляцией [22]. Учитывая эти данные, был проведен сайт-направленный мутагенез гена prs E. coli, направленный на получение мутантного фермента, не подверженного ретроингибированию пуриновыми нуклеотидами, с целью его последующего переноса в клетки B. subtilis.

Еще одно препятствие для повышения продукции AICAR представляет аллостерическая регуляция первого фермента собственно пуринового биосинтеза - глутамин-РГРР-аминотрансферазы, кодируемой геном purF [23]. Известно, что глутамин-PRPP-аминотрансфераза из E. coli, в отличие от фермента B. subtilis, не подвержена инактивации в стационарной стадии роста бактерий [24]. Кроме того, у E. coli описан мутантный вариант этого фермента, устойчивый к ингибированию пуриновыми нуклеотидами [25]. Поэтому и в этом случае было решено использовать модифицированную сайт-направленным мутагенезом глутамин-РГРР-аминотрансферазу из E. coli с целью последующего ее переноса в клетки B. subtilis. Для оптимальной экспрессии модифицированных генов prs и purF E. coli в клетках B. subtilis на основе плазмиды pDG268 был сконструирован экспресси-онный интегративный вектор, содержащий сильный промотор гена rpsF, кодирующего рибосомный белок S6. Наконец, на последнем этапе работы полученный вектор после клонирования в него генов prs и purF под контролем промотора гена rpsF встроили в хромосому штамма-продуцента AICAR B. subtilis.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные штаммы и плазмиды

Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 1. Штамм B. subtilis AM732 получен путем трансформации штамма Mu8u5u6 хромосомной ДНК, выделенной из штамма B. subtilis 168 с отбором трансформантов Pur+. Штамм АМ743 получен путем трансформации штамма АМ732 хромосомной ДНК, выделенной из штамма B. subtilis LCC28 с отбором трансформантов NeoH на среде с неомицином.

Среды и условия культивирования

В качестве полноценной питательной среды для выращивания бактерий использовали среду LB [31] или стандартную минимальную среду Спицайзена с необходимыми добавками [26]. Аминокислоты добавляли в количестве 50 мкг/мл. В качестве источника углерода использовали глюкозу (0.4%). При необходимости в среду добавляли: ампициллин (Amp) - 100 мкг/мл, хлорамфеникол (Cm) - 10 мкг/мл, эритромицин (Em) - 1 мг/мл, неомицин (Neo) - 5 мг/мл. Метионин и лейцин добавляли в концентрации 50 мкг/мл. В случае пуриновых ауксотрофов в качестве источника пуринов использовали гипоксантин, аденин или гуанин (20 мкг/мл).

Трансформирующую ДНК B. subtilis выделяли по методу Сайто и Миуры [32], эксперименты по трансформации проводили по Анагностопулосу и Спицайзену [26].

Манипуляции с плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК, клонирование, трансформацию в клетки E. coli и анализ рекомбинантных

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 1. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды

Штаммы, плазмиды Генотип Происхождение

Bacillus subtilis

168 trpC [26]

Mu8u5u6 leu met purF [27]

LCC28 purR::neo [28]

AM747 trpC purH::(pMutin2purH’-lacZ) AT-purE [21]

АМ732 leu met Данная работа

AM743 leu met purR::neo «

АМ764 leu met purR::neo AT-purE «

АМ778 leu met purR::neo AT-purE ApurH «

АМ793 leu met ApurH «

АМ811 leu met purR::neo AT-purE ApurH amyE::[PrpsF-prsE] «

АМ813 leu met purR::neo AT-purE ApurH amyE::[PrpsF-purFE] «

АМ815 leu met purR::neo AT-purE AT ApurH amyE::[PrsF-prsE-purFE] «

E. coli

TG1 thi supE hsdA5 A(lac-proAB)/Ftra A36 proAB(+) lacI(q) lacZ AM15 ВКПМ

MG1655 Прототроф [29]

Плазмиды

pDG268 Apr (E. coli) Cmr (B. subtilis) [18]

pNZT1 Emr [30]

pLE1 как pDG268, но содержит промотор PrTOF Данная работа

pLE2 как pLE1, но содержит ген prsE «

pLE3 как pLE1, но содержит ген purFE «

pLE4 как pLE1, но содержит гены prsE и purFE «

плазмид проводили с использованием стандартных методов [31].

Препараты ферментов

Эндонуклеазы рестрикции, Т4-ДНК-лигаза, термостабильная Taq-полимераза получены от компании «Fermentas».

Полимеразная цепная реакция

ПЦР проводили на приборе MyCycler (компания «BioRad Laboratories»). Температурный режим подбирали с учетом длины амплифицированного фрагмента, длины и состава используемых праймеров. Выделение и очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием набора Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (компания «Fermentas»).

Сайт-направленный мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью ПЦР с использованием специфических олигонукле-отидных праймеров. Состав праймеров и их характеристика приведены в табл. 2. Присутствие соответствующих мутаций проверяли секвенированием по методу Сэнгера [33].

Условия ферментации

Проверяли способность штаммов, полученных в ходе работы, накапливать А1САИ в культуральной жидкости (КЖ). Посевную культуру штаммов культивировали при 370С в течение 18 ч на LB-бульоне. Затем по 0.5 мл культуры добавляли к 4.5 мл ферментационной среды в пробирках 20 х 200 мм и культивировали при 370С в течение 72 ч на роторной качалке. Состав ферментационной среды (%): соевая мука -3, кормовые дрожжи - 1, кукурузный экстракт - 5, (ПН4)2НР04 - 0.6, мочевина - 0.4, сахар (пищевой) -15, рН 7.0.

Определение концентрации AICAR в культуральной жидкости

КЖ, полученную в процессе ферментации, центрифугировали для освобождения от клеток, после чего в супернатанте определяли концентрацию А1САБ методом количественной тонкослойной хроматографии на пластинках Сорбфил. Состав разработанной нами элюирующей системы: хлороформ-метанол-25% водный раствор аммиака в объемном соотношении 5 : 3 : 1. В качестве альтернативного метода использовали количественную ВЭЖХ на хрома-

Таблица 2 . Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе

Праймер Ген Нуклеотидная последовательность* Координаты**

5’ 3’

N1 purNB cccccgcgggcggaacgattccacat (SacII) + 135 + 154

N2 purNB cgcctgcagttcttttacgaaaggaacga ^stI) +652 +630

D1 purDB cgcctgcagcttcaaacattaaggggatgaaaa ^stI) -28 -5

D2 purDB cgcggtacctttttcctgcacatatgcc (Kpnl) +410 +389

F1 purFE cgcatcgataggaggtgcaaacagatgtgcggtattgtcggtatc (Clal) + 1 +22

F2 purFE cgcgctcagcgaaggcatcatcct (EspI) + 1530 + 1511

F3 purFE gggcttcgttCaaaaccgctat +968 +991

F4 purFE atagcggttttGaacgaagccc +991 +968

F5 purFE ggtattgatatgTGgagcgccacgg + 1216 + 1242

F6 purFE ccgtggcgctcCAcatatcaatacc + 1242 + 1216

Р1 prsE cgcggatccaaggaggttcttctcAtgcctgatatga (BamHI) -21 +3

Р2 prsE cccatcgatgccgggttcgattagtgttcga (ClaI) +949 +928

Р3 prsE ctgacagtggCtctgcacgctg +366 +377

Р4 prsE agcgtgcagaGccactgtcagc +377 +366

R1 rpsFB cgcgaattcttgcgggcggcggtat (EcoRI) -223 -205

R2 rpsFB cgcggatccataatgggcaaggagcaat (BamHI) -31 -51

последовательность праймеров дана в ориентации 5'—3'. Заглавными жирными буквами указаны нуклеотидные замены, введенные в праймеры для проведения сайт-направленного мутагенеза. Подчеркнуты сайты узнавания рестриктаз, приведенных в скобках.

**Координаты 5'- и З'-концов праймеров указаны относительно старта трансляции соответствующих генов. Гены B. subtilis обозначены знаком (в, а E. coli - знаком (Е.

тографе системы «ALLIANCE» (Séparations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Усиление экспрессии рот-оперона B. subtilis В работе, посвященной изучению регуляции экспрессии риг-оперона B. subtilis [21], мы показали, что при повреждении гена purR, кодирующего белок-репрессор оперона, наблюдается почти 20-кратное усиление экспрессии репортерного гена lacZ, встроенного в ген ригН, по сравнению с экспрессией в штамме дикого типа. При делетировании из генома штамма дикого типа 94 п.н., захватывающих Rho-независимый терминатор транскрипции (AT-ригЕ), который расположен в лидерной области риг-оперона (рис. 2), экспрессия репортерного гена lacZ увеличивалась примерно в 10 раз. Однако при объединении обеих мутаций обнаруживался ярко выраженный синергичный эффект: экспрессия гена lacZ возрастала более чем в 200 раз. Учитывая эти данные, на первом этапе конструирования штамма-продуцента AIcAR были проведены опыты

по инактивации гена purR и делеции терминатора транскрипции (AT-purE).

В качестве исходного материала использовали штамм АМ732 - Ри^-производный штамма Mu8u5u6 (табл. 1), охарактеризованного ранее [21]. Для перенесения в геном штамма АМ732 инсерции purR::neo, полностью инактивирующей синтез белка-репрессора PurR, штамм АМ732 трансформировали хромосомной ДНК, выделенной из штамма Lcc28 (purR::neo), с отбором устойчивых к неомицину (NeoR) рекомбинантов. В результате для дальнейшей работы отобрали штамм АМ743 purR::neo (табл. 1). Делецию AT-purE в геноме штамма АМ743 purR::neo получали по следующей схеме. Первоначально получили протяженную делецию AL-E, полностью перекрывающую лидерную область pur-оперона и частично первый структурный ген purE, что привело к появлению ауксотрофности по пуринам. Получение такой деле-ции детально описано в работе [21]. В делеционный вариант штамма АМ743 purR::neo AL-E с помощью трансформации ДНК, выделенной из штамма АМ747 (табл. 1), переносили делецию терминатора транскрипции AT-purE, отбирая трансформанты Pur+

Pstl Kpnl Sacll

Pstl

*'

Kpnl

EmR

PurN Sacl

^pnl

purD

RepAts

Pstl

Kpnl

EmR

Рис. 3. Схема получения делеции струк-БасН турного гена ригН с использованием метода, описанного в работе [30].

RepAts

37°C 24 ч LB

Отбор клонов с фенотипом EmR

*--- purN purD — RepAts- EmR — purN purH | purD - — — purN purH purD

ßPsubtilis

i30°C 48 ч LB

purN purD --

- purN purH purD------------------------

'^Em |-------------------:P^:Ats о

epAts

\ Отбор клонов с фенотипом EmS

+

на минимальной среде Спицайзена, не содержащей пуринов. В результате получили штамм АМ764, содержащий в геноме инсерцию рит^.'.пео и делецию терминатора транскрипции АТ-ритЕ.

Получение делеции гена ритН в составе хромосомы

В. subtilis

Из схемы биосинтеза пуринов (рис. 1) следует, что для внутриклеточного накопления А1САИ необходимо инактивировать формилтрансферазу/1МР-циклогидролазу, кодируемую геном ритН. Делеция гена ритН в составе хромосомы В. subtilis получена методом [30], основанным на использовании специально сконструированной плазмиды pNZT1 - производной интегративного вектора pKS1 [34]. Плазмида pNZT1 содержит маркер устойчивости к эритромицину (Етн) и полилинкер с множественными сайтами рестрикции для клонирования целевых фрагментов хромосомной ДНК, но, что самое главное, ее репликация чувствительна к температуре. при 30оС плазмида существует в автономном состоянии, однако при температуре 37оС репликация блокируется, и плазмида может встроиться в хромосому за счет гомологичной рекомбинации, если в ее составе клонирован какой-либо хромосомный фрагмент (рис. 3). Поскольку интеграция плазмиды в хромосому происходит в результате единичного акта рекомбинации в обла-

сти гомологии между клонированным фрагментом и хромосомой, сайт интеграции плазмиды в хромосому оказывается фланкированным гомологичными дуплицированными последовательностями. Культивирование таких бактерий при температуре 30оС (пермиссивной для репликации плазмиды pNZTl) может приводить к ее выщеплению из хромосомы с захватом одной из копий фланкированных последовательностей хромосомы, что позволяет заменять дикий аллель любого гена хромосомы на мутантный, клонированный в составе плазмиды pNZTl (рис. 3).

Указанное свойство плазмиды pNZTl использовано для делетирования гена purH. С этой целью проведена ПЦР-амплификация фрагментов хромосомы, фланкирующих ген purH. С использованием праймеров N1 и N2 (табл. 2) амплифицировали дистальный участок размером 517 п.н. гена purN, примыкающий к 5’-концу гена purH, и клонировали по сайтам узнавания рестриктаз SacII и Pstl в плазмиду pNZTl. На следующем этапе с участием праймеров D1 и D2 (табл. 2) амплифицировали проксимальный участок размером 442 п.н. гена purD, примыкающий к 3’-кон-цу гена purH, и клонировали по сайтам узнавания рестриктаз Pstl и Kpnl в полученную на предыдущем этапе плазмиду pNZTl, содержащую вставку фрагмента гена purN. Сконструированной таким образом плазмидой трансформировали штамм E. coli

TG1. Трансформанты EmR отбирали на среде с эритромицином (300 мкг/мл) при 30оС. С помощью ПЦР проверяли присутствие в полученных клонах плазмиды pNZTl с клонированными фрагментами генов purN и purD. Выделенными из проверенных клонов плазмидами pNZTl-purN-purD трансформировали штамм АМ764 purR.'.neo AT-purE. Отбор трансформантов EmR проводили на среде с эритромицином (3 мкг/мл). Несколько клонов EmR культивировали в жидкой среде LB с эритромицином (3 мкг/мл) при 37оС в течение ночи, а затем рассевали на чашки со средой LB с эритромицином (3 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч при 37оС. Рекомбинанты EmR формировались в результате интеграции плазмиды pNZTl-purN-purD в соответствующий хромосомный локус, что подтверждали ПЦР-амплификацией фрагмента размером 24l3 п.н. при использовании праймеров Nl и D2. Несколько клонов EmR засевали в жидкую LB-среду без антибиотика и инкубировали на качалке при 30оС в течение 48 ч, а затем рассева-ли на чашки со средой LB без антибиотика и инкубировали еще 24 ч при 30оС. Выросшие клоны проверялись на выщепление интегрированной плазмиды pNZTl, о чем судили по появлению эритромицинчув-ствительных клонов. Как отмечалось выше, выще-пление плазмиды может сопровождаться либо сохранением в составе хромосомы аллеля дикого типа гена purH, либо заменой этого аллеля на делецию ApurH (рис. 3). Интеграцию (перенос) делеции ApurH в хромосому штамма АМ764 purR. '.neo AT-purE подверж-дали наработкой ПЦР-фрагмента размером 24l3 п.н. с участием праймеров Nl и D2. Один из вариантов штамма АМ764 purR. '.neo AT-purE, включившего де-лецию ApurH и названный АМ778, накапливал до 4-5 г/л AICAR в КЖ и рос на минимальной среде только при добавлении гипоксантина, аденина или гуанина, что подтверждало наличие в его геноме дефектного гена purH. Параллельно был сконструирован контрольный штамм АМ793, содержащий ApurH, но не несущий мутаций purR..neo и AT-purE, которые обеспечивают дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов.

Для повышения продуктивности полученного штамма было целесообразно увеличить внутриклеточное содержание PRPP - ключевого предшественника биосинтеза пуринов (рис. 1). Известно, что PRPP-синтазы, ответственные за синтез PRPP в клетках как B. subtilis [35], так и E. coli [36], подвержены аллостерическому ингибированию пуриновыми нуклеотидами, в том числе, вероятно, и фосфорили-рованными производными AIcAR. Как отмечалось во «Введении», описан мутантный вариант PRPP-синтазы E. coli, не подверженный аллостерической регуляции [22]. Поэтому была поставлена задача по-

AmpR

amyE Espl

amyE

CmlR

Ecol

CmlR Ы PrP

prs

Хромосома . B. subtilis ;

локус amyE

Рис. 4. Схема клонирования генов prs и purF E. coli под контролем промотора гена rpsF B. subtilis в составе плазмиды pDG268 и их интеграции в хромосому B. subtilis.

лучить аналогичный мутантный фермент E. coli, клонировать его и оптимизировать экспрессию в клетках штамма-продуцента АМ778. Однако, прежде чем приступить к этой работе, необходимо было сконструировать интегративный экспрессионный вектор, обеспечивающий высокий уровень экспрессии гете-рологичных генов E. coli в клетках B. subtilis.

Конструирование интегративного экспрессионного вектора на основе плазмиды pDG268

В качестве исходного материала для получения интегративного экспрессионного вектора была выбрана плазмида pDG268. Эта плазмида способна реплицироваться в клетках E. coli, но не B. subtilis, однако при введении в клетки B. subtilis она может интегрироваться в хромосомный локус amyE B. subtilis. Плазмида pDG268 содержит кассету, которая включает полилинкер для клонирования, репортерный ген lacZ без собственного промотора и ген устойчивости к хло-рамфениколу (CmR) (рис. 4). Кассета фланкирована фрагментами гена amyE, что позволяет встраивать вектор с клонированным фрагментом в локус amyE на хромосоме B. subtilis.

В качестве промотора, способного обеспечить высокий уровень экспрессии клонированных генов

cgcgaa RI (EcoRI) tatgaggatcttcttgcgggcggcggtatggcaggagctaaagaggcaggaaaagtccgc atactcctagaagaacgcccgccgccataccgtcctcgatttctccgtccttttcaggcg

cttgaagggaaagaatatgtggtccaagacggagatg|ttattcatttccgatttaat|gta

gaacttccctttcttatacaccaggttctgcctctacaataagtaaaggctaaattacat

-35 -10 +1

taggatgcagTTGTAAagggacaagagctttggTATAATataaaattgtgagtaatagaa atcctacgtcaacatttccctgttctcgaaaccatattatattttaacactcattatctt

ttattgctccttgcccattatgg

aataacgaggaacgggtaatacc

R2 (BamHI) taggcgc

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность промотора гена rpsF. Жирным выделены последовательности -10 и -35 промотора и старт транскрипции (+1). Рамкой обведен иР-элемент промотора. Нуклеотидная последовательность праймеров, использованных для клонирования промотора, обозначена синим.

E. coli в клетках B. subtilis, был выбран промотор гена rpsF, кодирующего рибосомный белок S6 у бацилл. Известно, что промоторы генов рибосомных белков относятся к наиболее сильным промоторам B. subtilis, их экспрессия координирована со скоростью роста бактерий и достигает максимума на логарифмической стадии роста [37, 38]. Нуклеотидная последовательность промотора гена rpsF представлена на рис. 5. Как следует из рис. 5, промотор PrpsF содержит каноническую последовательность -l0, последовательность -35, близкую к канонической, а также АТ-богатую область в районе -70...-50 п.н., так называемый UP-элемент, обеспечивающий более эффективную инициацию транскрипции [39].

С целью клонирования промотора PrpsF в плазмиду pDG268 фрагмент ДНК, содержащий промоторную область гена rpsF, амплифицировали методом ПЦР с хромосомы B. subtilis l68 с использованием праймеров Rl и R2 (табл. 2). Полученный ПЦР-фрагмент обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRl и BamHI и клонировали в плазмиду pDG268, обработанную теми же рестриктазами (рис. 4). Лигазной смесью трансформировали штамм E. coli TGl. Трансформанты, несущие вставку искомого фрагмента, отбирали на индикаторной среде, содержащей ампициллин в концентрации l20 мкг/мл и X-gal. Колонии трансформантов имели ярко-голубую окраску, так как репортерный ген lacZ оказывался под контролем клонированного промотора PrpsF- Присутствие вставки подтверждали с помощью ПЦР с использованием праймеров Rl и R2. Затем полученную плазмиду встраивали в хромосомный локус amyE B. subtilis путем отбора устойчивых к хлорамфениколу (cmR) трансформантов. Схема интеграции вектора pDG268 с клонированным промотором гена rpsF представлена на рис. 4. Определение активности ß-галактозидазы в этих трансформантах показало, что экспрессия ре-

портерного гена lacZ под контролем промотора PrpsF почти на порядок превышала экспрессию этого гена под контролем обычных промоторов, например природного промотора pur-оперона (данные не представлены). Сконструированный вектор назван pLE1.

Сайт-направленный мутагенез гена prs E. coli (prsE) Согласно опубликованным данным, специфическая мутация в гене prsE, приводящая к замене Asp128 Ala в PRPP-синтазе, приводит к снятию ретроингибирования фермента пуриновыми нуклеотидами [22]. Для получения аналогичной мутации осуществлен синтез олигонуклеотидных праймеров P3 и P4 (табл. 2), содержащих замены нуклеотидов (обозначены заглавными буквами), приводящие к образованию мутантного белка с заменой Asp128 ^ Ala. На первом этапе амплифицировали ПЦР-фрагменты с участием двух пар праймеров: Р4—Р1 (фланкирует 5’-конец гена prsE и содержит сайт узнавания для ре-стриктазы BamHI) и Р3-Р2 (фланкирует З’-конец гена prsE и содержит сайт узнавания для рестрикта-зы ClaI). Затем состыковали полученные фрагменты и амплифицировали полноразмерный ген prsE с использованием праймеров P1 и P2 (табл. 2). Важно подчеркнуть, что в 5’-область праймера P1 включена оптимизированная для экспрессии в бациллах нуклеотидная последовательность сайта связывания рибосомы (SD). На следующем этапе ПЦР-фрагмент P1-P2, содержащий мутантный ген prsE, клонировали в полученный ранее вектор pLE1 с использованием рестриктаз BamHI и claI. В результате получили плазмиду pLE2, содержащую мутантный ген prsE под контролем промотора PrpsF- На заключительном этапе плазмиду pLE2 встроили в хромосомный локус amyE B. subtilis по описанной выше схеме (рис. 4). Полученный в результате интеграции плазмиды pLE2 штамм назван АМ811 (табл. 1).

Сайт-направленный мутагенез гена purF E. coli

Первый фермент пуринового биосинтеза - глутамин-PRPP-аминотрансфераза (ген purF), играет ключевую роль в обеспечении нормального функционирования пути биосинтеза пуринов у E. coli и B. subtilis и подвержен еще более сложной по сравнению с PRPP-синтазой аллостерической регуляции с участием нуклеотидов [40]. Поэтому можно было ожидать, что использование мутантной глутамин-PRPP-аминотрансферазы из E. coli, аналогичной описанной в работе [25], позволит повысить продукцию AICAR. Согласно данным [25], замена Lys326 ^ Gln в белке модифицирует сайт связывания GMP (A-сайт), а замена Pro410 Trp - сайт связывания AMP (С-сайт), причем комбинация этих мутаций делает фермент практически устойчивым к действию любых пуриновых нуклеотидов. Сайт-направленный мутагенез гена purFE проводили по схеме, описанной в предыдущем разделе. Для получения замены Lys326 ^ Gln синтезировали олигонуклеотидные праймеры F3 и F4, а для замены Lys326 ^ Gln - праймеры F4 и F5 (в табл. 2 соответствующие нуклеотидные замены выделены заглавными буквами и жирным шрифтом). После ПЦР-амплификации этих праймеров с фланкирующими праймерами F1 и F2 и последующей состыковкой ПЦР-фрагментов получен полноразмерный ген purFE, кодирующий белок с обеими аминокислотными заменами. Как и в случае гена prsE, в состав праймера F1 был введен оптимизированный для бацилл сайт SD. Модифицированный ген purFE клонировали в плазмиду pLE1 под контроль промотора PrpsF по ClaI- и EspI-сайтам. Таким же образом клонировали модифицированный ген purFE в плазмиду pLE2, содержащую ген prsE. Соответствующие плазмиды получили наименование pLE3 и pLE4 (табл. 1). На заключительном этапе плазмиды pLE3 и pLE4 встроили в хромосомный локус amyE B. subtilis по описанной выше схеме (рис. 4). Полученные в результате интеграции плазмид pLE3 и pLE4 штаммы названы АМ813 и АМ815 соответственно ( табл. 1 ).

Определение способности штаммов накапливать AICAR

Для оценки способности полученных в ходе работы штаммов накапливать AIcAR проводили опыты по ферментации в условиях, описанных в разделе «Экспериментальная часть». Результаты этих опытов суммированы на рис. 6.

Как следует из данных, приведенных на рис. 6, исходный штамм АМ732 практически совсем не накапливает AIcAR. Только после удаления из генома

III гамм Накопление AICAR в КЖ

АМ732 (дикий тип) <0.0001

i

АМ793 ApurH 0.5-0.8

АМ778 purRr.neo AT-purEApurH 4-5

I

АМ811 purRr.neo AT-purE ApurH amyE::[?n№F-prSE\ 7-8

I

АМ813 purRr.neo AT-purE ApurH amyE::[P^f-purFe] 9-10

I

AM815 purRr neo AT-purE ApurH amyE::[?rp^prst-purFE] 11 — 13

Рис. 6. Этапы конструирования штаммов-продуцентов AICAR и их продуктивность.

этого штамма гена purH (штамм АМ793) наблюдается незначительное (< 1 г/л) накопление AICAR в КЖ. Мутации purRr.neo и AT-purE (штамм АМ788), обеспечивающие полную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов, приводят к существенному увеличению накопления AICAR, до 4-5 г/л. Дальнейшее, почти двукратное, увеличение продуктивности отмечено у штаммов АМ811 и АМ813, экспрессирующих один из мутантных десенсибилизированных белков E. coli - PRPP-синтазу (ген prs) или глутамин-PRPP-аминотрансферазу (ген purF). Максимальное накопление AICAR - до 11-13 г/л, обнаруживается у штамма АМ815, характеризующегося полной дерепрессией ферментов биосинтеза пуринов и одновременно содержащего модифицированные гены prsE и purFE под контролем промотора PrpsF.

Интересно, что практически весь синтезируемый в клетках AICAR экскретируется в КЖ: в специально проведенных нами опытах показано, что внутриклеточная концентрация AIcAR составляет не более 2% от его концентрации в среде. Механизм экскреции AIcAR не известен, хотя имеются данные, что в процессе его экспорта из клеток бацилл принимает участие мембранный белок, кодируемый геном pbuE

[41].

Этапы конструирования продуцента AIcAR направлены на стимуляцию биосинтеза пуриновых нуклеотидов, следовательно, AIcAR, обнаруживаемый в КЖ, образуется при дефосфорилировании нуклеотида AICAR-Р, синтезированного de novo, а не является вторичным продуктом биосинтеза гистидина. Поскольку AIcAR-P - это природный аналог AMP, а AICAR - аналог аденозина, повышенное содержание этих соединений в клетках продуцента сопровождается, вероятно, множественными метаболическими эффектами (см. выше), значение кото-

рых для продукции AICAR далеко не ясно. В клетках микроорганизмов AICAR-P служит не только интермедиатом метаболизма пуринов, но и регуляторной молекулой общеклеточного значения. Превращение AICAR-P в IMP требует участия N10-формилтетрагидрофолата, поэтому повышенный уровень AIcAR-P в клетках может сигнализировать о нарушении одноуглеродного метаболизма, что позволяло ранее считать этот нуклеотид сигналом тревоги (alarmone) [42]. Несмотря на то что прокариоты не имеют для AICAR-P мишени, подобной AMPK животных, направленность физиологического действия этого аналога AMP в них сохраняется. В частности, инактивация гена purH в Salmonella enterica и накопление в клетках AIcAR-P приводит к подавлению активности фруктозо-1,6-бисфосфатфосфатазы, вследствие чего клетки теряют способность к глю-конеогенезу и не растут на глицерине и других глю-конеогенных субстратах [43]. В клетках прокариот и низших эукариот (например, дрожжей) некоторое количество AIcAR-P образуется как побочный продукт биосинтеза гистидина, что создает дополнительные возможности регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов [44]. Множественные и далеко не полностью изученные регуляторные связи AIcAR-P осложняют конструирование штаммов-продуцентов и требуют дальнейшего изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований на основе бактерий B. subtilis получен штамм-продуцент AICAR - нового препарата широкого терапевтического применения. Стратегия получения штамма-продуцента AIcAR основана на направленной реконструкции пуринового метаболизма в клетках B. subtilis. На первом этапе работы в ген purR, кодирующий белок-репрессор риг-оперона, внесена ин-серция, а также был удален терминатор транскрипции в лидерной области риг-оперона, что обеспечило максимальную дерепрессию ферментов биосинтеза пуринов de novo. Затем из генома бактерий удалили

ген purH, кодирующий формилтрансферазу/IMP-циклогидролазу. Инактивация этого фермента нарушает реакцию превращения AIcAR в IMP и приводит к его накоплению в клетке. На следующем этапе работы проведен сайт-направленный мутагенез генов prs и purF E. coli, кодирующих ключевые ферменты синтеза предшественников пуринов, с целью получения их мутантных вариантов, не подверженных ретроингибированию пуриновыми нуклеотидами. Наконец, на последнем этапе работы модифицированные гены prs и purF E. coli встроили в хромосому B. subtilis под контроль сильного промотора, обеспечивающего высокий уровень их экспрессии в клетках B. subtilis. В итоге получили штамм-продуцент, накапливающий 11-13 г/л AICAR в КЖ.

В заключение следует отметить, что совсем недавно появилось сообщение о том, что AIcAR успешно прошел вторую стадию клинических испытаний в качестве противоопухолевого средства [45]. AICAR оказывает положительный эффект при хроническом лимфоцитарном лейкозе, множественной миеломе и мантийно-клеточной лимфоме. Важно подчеркнуть, что приведенная в каталогах стоимость коммерческих препаратов AICAR составляет от $100 до $1000 за грамм, что, по-видимому, обусловлено его получением путем химического синтеза. Высокая стоимость делает AIcAR малодоступным для научноисследовательской работы и тем более для терапии метаболического синдрома. Сконструированный нами штамм-продуцент AIcAR может стать основой для разработки промышленного микробиологического производства общедоступного препарата AIcAR, стоимость которого будет на порядки ниже по сравнению с указанными выше ценами. •

Авторы выражают благодарность Н.П. Закатаевой за предоставление плазмиды pNZTl, а также В.А Муратовой и Г.И. Сергеевой за квалифицированную техническую помощь. Работа выполнена при частичной поддержке Фонда некоммерческих программ «Династия».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Buchanan J.M., Hartman S.C. // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 1959. V. 21. P 199-261.

2. Zalkin H., Nygaard P. Escherichia coli and Salmonella. Washington, DC.: ASM Press, 1996. P. 561-579.

3. Switzer R.L., Zalkin H., Saxild H.H. Bacillus subtilis and its closest relatives: from genes to cells. Washington, DC.: ASM Press, 2002. P. 255-269.

4. Hardie D.G., Carling D., Carlson M. // Ann. Rev. Biochem.

1998. V. 67. P. 821-855.

5. Hardie D.G., Salt I.P., Hawley S.A., Davies S.P. // Biochem. J.

1999. V. 338. P 717-722.

6. Rutter G.A., Xavier G.S., Leclerc I. // Biochem. J. 2003. V. 375. P. 1-16.

7. Gaidhu M.P., Fediuc S., Anthony N.M., So M., Mirpourian M., Ceddia R.B. // J. Lipid Res. 2009. V. 50. P. 704-715.

8. Swinnen J.V., Beckers A., Brusselmans K., Organe S., Segers J., Timmermans L., Vanderhoydonc F., Deboel L., Derua R., Waelkens E., et al. // Cancer Res. 2005. V. 65. P. 2441-2448.

9. Pold R., Jensen L.S., Jessen N., Buhl E.S., Schmitz O., Flyvb-jerg A., Fujii N., Goodyear L.J., Gotfredsen C.F., Brand C.L., et al. // Diabetes. 2005. V. 54. P 928-934.

10. Campas C., Lopez J.M., Santidrian A.F., Barragan M., Bel-losillo B., Colomer D., Gil J. // Blood. 2003. V. 101. P 3674-3680.

11. Sengupta T.K., Leclerc G.M., Hsieh-Kinzer T.T. // Mol. Cancer. 2007. V. 6. № 46. P. 1-12.

12. Matsuno K., Mori Y., Asahara T. // US Patent 7326546. 2008.

13. Asahara T., Mori Y., Zakataeva N.P., Livshits V.A., Yoshida K., Matsuno K. // Appl. Microb. Biotechnol. 2010. V. 87. P. 2195-2207.

14. Ebbole D.J., Zalkin H. //J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 82748287.

15. Weng M., Nagy P.L., Zalkin H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 7455-7459.

16. Ebbole D.J., Zalkin H. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 1089410902.

17. Johansen L.E., Nygaard P., Lassen C., Agerso Y., Saxild H.H. // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 5200-5209.

18. Mironov A.S., Gusarov I., Rafikov R., Lopez L.E., Shatalin K., Kreneva R.A., Perumov D.A., Nudler E. // Cell. 2002. V. 111. P. 747-756.

19. Nudler E., Mironov A.S. // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29.

P. 11-17.

20. Mandal M., Boese B., Barrick J.E., Winkler W.C., Breaker R.R. // Cell. 2003. V. 113. P. 577-586.

21. Лобанов К.В., Королькова Н.В., Еремина С.Ю., Эрраис Лопес Л., Миронов А.С. // Генетика. 2011. Т. 47. № 7. С. 890-899.

22. Hove-Jensen B., Nygaard P. // Eur. J. Biochem. 1982. V. 126.

P. 327-332.

23. Meyer E., Switzer R.L. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 53975402.

24. Turnbough C.L., Switzer R.L. // J. Bacteriol. 1975. V. 121.

P. 108-114.

25. Zhou G., Smith J.L., Zalkin H. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269.

P. 6784-6789.16. C.L.

26. Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. 1961. V. 81.

P. 741-746.

27. Yoshikawa H., Sueoka N. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1963. V. 49. P. 559-566.

28. Christiansen L.C., Schou S., Nygaard P., Saxild H.H. // J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 2540-2550.

29. Blattner F.R., Plunkett G. 3rd., Bloch C.A., Perna N.T.,

Burland V., Riley M., Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.F., et al. // Science. 1997. V. 277. P. 1453-1474.

30. Zakataeva N.P., Nikitina O.V., Gronskiy S.V., Romanenkov D.V., Livshits V.A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 85.

P. 1201-1209.

31. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning:

a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor. N.Y.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.

32. Saito H., Miura K.I. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. V. 42.

P. 619-629.

33. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

34. Shatalin K.Y., Neyfakh A.A. // FEMS Microbiol. Lett. 2005.

V. 245. P. 315-319.

35. Arnvig K., Hove-Jensen B., Switzer R.L. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 192. P. 195-200.

36. Hove-Jensen B., Harlow K.W., King C.J., Switzer R.L. // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 6765-6771.

37. Henkin T.M. // Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics / Eds Sonenshein A.L., Hoch J.A., Losick R. Washington, D.C.: American Soci. Microbiol. 1993. P. 669-682.

38. Linder C., Nijland R., Hartskamp M. // J. Bacteriol. 2004.

V. 186. P. 1097-1105.

39. Estrem S.T., Gaal T., Ross W. Gourse R.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9761-9766.

40. Chen S., Tomchick D.R., Wolle D., Hu P., Smith J.L., Switzer R.L., Zalkin H. // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 10718-10726.

41. Sheremet A.S., Gronskiy S.V., Akhmadyshin R.A., Novikova A.E., Livshits V.A., Shakulov R.S., Zakataeva N.P. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 38. P. 65-70.

42. Bochner B.R., Ames B.N. // Cell. 1982. V. 29. P. 929-937.

43. Dougherty M.J., Boyd J.M., Downs D.M. // J. Biol. Chem. 2006. V. 28. P. 33892-33899.

44. Rebora K., Laloo B., Daignan-Fornier B. // Genetics. 2005.

V. 170. P. 61-70.

45. Пресс-релиз компании «Advancell» от 16.02.2011.