Влияние фотодинамической терапии на ангиогенез в экспериментальной опухоли

Оригинальные исследования

щего эффекта на коллагеновые волокна в зоне воздействия [4, 7].

Литература

1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. — М. : Медицина, 1990. — 383 с.

2. Кубасова И. Ю., Вакуловская Е. Г., Ермакова К. В. и др. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга // Рос. биотерапевтический журнал. — 2006. — Т. 5, № 4. — С. 54-63.

3. Спиченкова И. С., Каплан М. А., Гулидов И. А. и др. Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия саркомы М1 у крыс // Рос. биотерапевтический журнал. — 2005. — Т. 4, № 3. — С. 62-68.

4. Странадко Е. Ф., Волгин В. Н., Ламоткин И. А.

и др. Фотодинамическая терапия базальноклеточного рака кожи с фотосенсибилизатором фотодитазином // Рос. биотерапевтический журнал. — 2008. — Т. 7, № 4. — С. 7-11.

5. Biel M. A. Photodynamic therapy of head and neck // Methods. Mol. Biol. — 2010. — Vol. 635. — Р. 283-293.

6. Palumbo G. Photodynamic therapy and cancer: a brief sightseeing tour // Expert Opin. Drug. Deliv. — 2007. — Vol. 4, № 2. — Р. 131-148.

7. Ting Lv., Zu-Fang Huang, Hong-Wei Wang et al. Evolution of collagen alteration after topical photodynamic therapy (PDT) using second harmonic generation (SHG) microscopy in vivo study in a mouse model // Photodiagnosis and photodynamic therapy. — 2012. — Vol. 9, № 2. — Р. 164-169.

УДК 616.13/16-006.6-085.849.19

ВЛИЯНИЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ НА АНГИОГЕНЕЗ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ

Н. М. Ростовцев 1, Б. Х. Мустакимов 1, А. Е. Пастернак 3, Н. А. Котляров 2

1 ГБУЗ ЧОДКБ, г. Челябинск, Россия

2 ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России, г. Челябинск, Россия

3 ГБУЗ ЧОПАБ, Челябинск, Россия

Ключевые слова: фотодинамическая терапия, карцинома Эрлиха, ангиогенез

INFLUENCE PHOTODYNAMIC THERAPY ON ANGIOGENESIS IN THE EXPERIMENTAL TUMORS

N. M. Rostovtsev 1, B. H. Mustakimov 1, А. Е. Pasternak 3, N. A. Kotliarov 2

1 SBHCI CRPCH, Chelyabinsk, Russia

2 SUSMU, Chelyabinsk, Russia

3 CRMB, Chelyabinsk, Russia

Keywords: photodynamic therapy, Ehrlich carcinoma, angiogenesis

Актуальность. Более 90 лет активно изучаются основные механизмы, принципы и эффекты фотодинамической терапии (ФДТ) [1, 5]. Известно, что существуют три механизма деструкции опухоли в процессе ФДТ: прямое цитотоксичное воздействие на опухолевые клетки, расстройство кровообращения в неопластической ткани и активация местного противоопухолевого иммунитета. Актуальность исследования влияния ФДТ на опухолевую ткань обоснована ее многофакторными эффектами, внедрением новых поколений фотосенсибилизаторов и необходимостью повышения избирательности действия. В настоящее время особое значение в прогрессии опухоли придается ее способности к васкуляризации, которая регулируется различными проангиогенными и антиангиогенными факторами [3-7].

Цель исследования. Охарактеризовать изменения в сосудах и процесс ангиогенеза в экспериментальной опухоли при фотодинамической терапии.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на белых беспородных, линий CBA, C57BI, C3HA, гибридах F(CBA*C57BI) мышах с перевитой в подкожную клетчатку спины асцитической карциномой Эрлиха. Животные были разделены на 5 групп: интактная (контроль), I группа — опухоль подвергалась ФДТ с плотностью энергии 100 Дж/см2, II группа — ФДТ в дозе 200 Дж/см2, III группа — в дозе 400 Дж/см2, в IV группе производилась резекция половины объема опухоли с интраоперационной ФДТ в дозе 400 Дж/см2.

Эвтаназию мышей опытных групп осуществляли дислокацией шейных позвонков на 7, 14, 21-е сутки

49

Педиатрический вестник Южного Урала № 2, 2015

после ФДТ, что соответствовало 14, 21, 28-м суткам после перевивки опухоли.

Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином. Сосудистое русло опухоли выявляли маркером к CD34 эндотелиальных клеток фАКО, QBEnd-10, 1 : 50). На условной единице площади стереометрической методикой производили выделение фаз, их измерение и расчет, в изображениях гистологических препаратов определяли площадь сосудистого русла опухоли с применением лицензионной программы анализа изображения микрообъектов «Видеотест-Морфология 5.0» («Видеотест», Россия). Относительный объем сосудистого русла опухоли определяли методом точкосчета [1, 2]. Для оценки ангиогенной активности опухоли исследовали уровень экспрессии Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, DАКО, VG, 1 : 40) — стимулятора ангиогенеза. Результаты иммуногистохимических реакций для VEGF оценивали с помощью полуколичественного метода. Интерпретация экспрессии VEGF осуществлялась: отрицательная — окрашивание отсутствует или окрашено менее 10 % клеток опухоли, слабая — 10-20 % опухолевых клеток, умеренная — 20-50 % клеток опухоли, интенсивная — свыше 50 % клеток опухоли.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью критерия Манна — Уитни и с вычислением Х-квадрата, использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft). Различия между сравниваемыми группами считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение. При иммуноморфологическом исследовании в интактной опухоли на 7-е сутки после трансплантации обнаружена развитая сеть капилляров (рис. 1).

Объем сосудистого русла в опухоли контрольной

Рисунок 1. Развитое сосудистое русло в интактной карциноме Эрлиха на 7-е сутки. Экспрессия CD34 в эндотелиальных клетках

группы достигал максимальных значений на 14-е сутки с момента трансплантации опухоли. Площадь васкуляризации снижалась с увеличением объема опухоли по мере нарастания сроков эксперимента (р > 0,05). После сеанса ФДТ в I группе относительный объем сосудистого русла опухоли уменьшался по сравнению с интактной карциномой только в течение первой недели после воздействия. Более выраженные изменения выявлялись после ФДТ во II группе в виде участков паретически расширенных и запустевших сосудов. Вместе с тем показатели площади сосудов в I-II группах достоверных отличий с контрольной группой не имели. Это обусловлено преходящей вазо-констрикцией и освобождением сосудорасширяющих медиаторов [4]. Достоверное снижение площади васкуляризации, относительного объема сосудов отмечалось при увеличении дозы ФДТ до 400 Дж/см2 — в III-IV группах (табл. 1).

Таблица 1

Относительный объем и площадь сосудистого русла в тканях опухоли по опытным группам

Он £г Сутки после лечения

7 14 21

Отн. объем сосудов, % Площадь сосудов, мкм2 Отн. объем сосудов,% Площадь сосудов, мкм2 Отн. объем сосудов,% Площадь сосудов, мкм2

I 12,2 ± 0,87 ° 8674,9 ± 1439,06 13,4 ± 0,84 8951,9 ± 1015,5 12,5 ± 0,77 8793,4 ± 1390,31

II 10,2 ± 0,77 ° 8251,0 ± 1892,75 10,3 ± 0,8 ° i 8430,8 ± 1269,57 9,3 ± 0,76 ° i 7842,0 ± 932,0

III 0,6 ± 0,13 ° i 2 456,5 ± 70,54 ° i 2 0,7 ± 0,14 ° i 2 538,3 ± 67,99 ° i 2 0,7 ± 0,13 ° i 2 376,2 ± 75,44 ° i 2

IV 0,3 ± 0,09 ° i 2 з 154,6 ± 116,58 ° i 2 з - - - -

Примечание: ° — р < 0,05 по сравнению с контрольной группой, 1 — р < 0,05 по сравнению с I группой, 2 — р < 0,05 по сравнению со II группой, 3 — р < 0,05 по сравнению с III группой.

При этом в сосудистом русле развивались стерео- литов, организация тромботических масс с облитера-типные распространенные сосудистые расстройства цией сосудов (рис. 2). в виде тромбозов, фибриноидного некроза и васку-

50

Оригинальные исследования

Рисунок 2. Организация тромба в сосуде, в ткани опухоли — полнокровие и стазы после ФДТ 400 Дж/см2

На заключительном сроке эксперимента пролиферации эндотелия и новообразования сосудов в опухоли животных III группы не регистрировалось. В IV группе на 14-е сутки в зоне воздействия формировалась грануляционная ткань, которая на 21-е сутки созревала в плотную волокнистую соединительную ткань. В контрольной группе максимальная выраженность экспрессии VEGF обнаруживалась на 14-е сутки с момента трансплантации опухоли. Экспрессировали VEGF преимущественно малодифференцированные клетки рыхлой соединительной ткани, расположенные группами. В опухоли мышей I-II групп количество VEGF-позитивных клеток достоверно снижалось на 14 и 21-е сутки после ФДТ, но статистически значимых различий с контрольной группой не обнаружено.

Наиболее существенным снижение экспрессии VEGF было в III-IV группах — на 7-е сутки регистрировалась только слабо выраженная реакция VEGF в отличие от интактной, I-II групп (р < 0,05). Причем экспрессия VEGF выявлялась в эндотелиальных клетках сосудов опухоли, в эпителии опухоли положительная иммуногистохимическая реакция отсутствовала (рис. 3).

Рисунок 3. Слабая экспрессия VEGF в эндотелии опухоли на 7-е сутки после ФДТ 400 Дж/см2

Преобладание отрицательной реакции к VEGF в сохранившихся клетках опухоли в III группе было обнаружено на 14, 21-е сутки после ФДТ (р < 0,05). Таким образом, проведенное исследование согласуется с мнением ряда авторов, что нарушение кровоснабжения в опухоли при ФДТ является одним из наиболее действенных эффектов ее фотодинамической деструкции [4, 7].

Выводы:

1. Расстройства кровообращения в опухолевой ткани при ФДТ приводят как к последовательным нарушениям реологии и течения крови (тромбоз, васкулит, облитерация сосудов), так и к преходящим изменениям кровенаполнения (ангиоспазм) и парезу сосудов.

2. Выраженное снижение сосудистой перфузии опухоли — уменьшение объема и площади сосудистого русла обусловлено необратимыми нарушениями реологии крови при ФДТ в дозе 400 Дж/см2.

3. ФДТ сопровождается не только стереотипными нарушениями кровообращения, а также подавляет экспрессию ростового фактора ангиогенеза в опухоли.

Литература

1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. — М. : Медицина, 1990. — 383 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. — М. : Практика, 1999. — 459 с.

3. Давиденко И. С., Пефти Е. Б., Фокин А. Н. Значение ангиогенеза в терапии метастатического рака молочной железы // Рос. биотерапевтический журнал. — 2007. — Т. 6, № 4. — С. 8-12.

4. Кудинова Н. В., Березов Т. Т. Фотодинамическая терапия опухолей: иммунологический аспект лечения // Рос. биотерапевтический журнал. — 2010. — Т. 9, № 1. — С. 69-76.

5. Juarranz A., Jaen P., Sanz-Rodriguez F. et al. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications // Clin. Transl. Oncol. — 2008. — Vol. 10, № 3. — Р. 148-154.

6. Mroz P., Hashmi J. T., Huang Y. Y. et al. Stimulation of anti-tumor immunity by photodynamic therapy // Expert Rev. Clin. Immunol. — 2011. — Vol. 7, № 1. — Р 75-91.

7. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T. et al. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy // Acta Biol. Pol. — 2005. — Vol. 52, № 2. — Р. 339-352.

51