Полиморфизм генов IL1B и IL6 при эндометриоз-ассоциированном бесплодии

цитокинов в механизмах формирования эндоме-триоидных очагов [2, 3, 16]. В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ функционального полиморфизма генов интерлейкинов 1ß (IL1B) и IL6 при эндометриозе в сочетании с бесплодием.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 236 пациенток репродуктивного возраста от 25 до 40 лет (средний возраст 30,22 ± 0,28 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России и в гинекологическое отделение ФГБУ НИИ акушерства, гинекологии и перинатологии СО РАМН в 2010-2012 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 145 пациенток с бесплодием и эндоме-триозом. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования, с последующим гистологическим подтверждением. Контрольная группа была сформирована из 91 пациентки с бесплодием, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключен генитальный эндометриоз, однако при проведении хромогидротубации установлено нарушение проходимости маточных труб. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).

У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях утром в день операции, стабилизированные образцы хранили при -70 оС до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («Интер-ЛабСервис», Россия). Исследование полиморфных участков генов цитокинов проводили с использованием аллель-специфической ПЦР. Были изучены два полиморфных варианта: C511T гена IL1B и G-174C гена IL6, локализованые в промо-торных участках генов и отвечающие за уровень экспрессии соответствующих цитокинов. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «Ампли-

Сенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф», используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе, на амплификаторе «Тер-цик МС2» («ДНК-технология», Россия). После проведения ПЦР 8 мкл амплификата разделяли в 2%-м агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидия бромида, при напряжении 150 B в течение нескольких минут для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Си-бэнзим», Россия).

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом и бесплодием сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий х2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность или точный критерий Фишера, статистически значимыми считали различия при р < 0,05. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR) с расчетом для него 95%-го доверительного интервала (CI).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Бесплодие при эндометриозе обусловлено нарушениями в иммунной системе, которые могут опосредоваться несколькими путями. В перито-неальной жидкости у женщин с эндометриозом и бесплодием значительно повышен уровень ингибитора миграции макрофагов, что способствует росту гетеротопий. Сами гетеротопии се-кретируют специфические вещества, стимулирующие макрофагально-макроцитарную систему, в результате чего происходит изменение уровня интерлейкинов, фактора некроза опухолей, факторов роста [2, 4, 8].

Провоспалительные цитокины при эндоме-триозе продуцируются и действуют на иммуно-компетентные клетки через свои рецепторы на ранней стадии воспалительного ответа, участвуют в запуске специфического иммунного ответа и в эффекторной его фазе. К ним относят в частности IL-ip, IL-6 [5, 9].

Ген IL1B располагается в регионе 2q13-q21 2-й хромосомы, содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные (т.е. имеют структурные варианты) и 9 интронов, в том числе 8 альтернативных. Ген имеет нетранслируемые области на 3'- и 5'-концах. Выявлен точечный маркер вы-сокопродуцирующего варианта гена IL1B - полиморфизм C-511T (замена нуклеотида цитози-на на тимин в регуляторной области гена). При

варианте -511Т продукция повышена, что

приводит к активации местных воспалительных реакций [8].

При изучении частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма С511Т гена ¡Ь1Б было установлено, что среди женщин, страдающих бесплодием без эндометриоза, генотип СС встречался в 69,2 %, генотип СТ - в 30,8 % случаев. При этом редкий аллель Т полиморфизма С511Т гена ¡Ь1Б наблюдали лишь в 15,4 %, а аллель С - в 84,6 % случаев. Исследование распределения генотипов полиморфизма С511Т гена ¡Ь1Б у инфертильных пациенток, страдающих эндометриозом, позволило установить, что гетерозиготный генотип встречался в 35,9 % случаев: 48,3 % больных этой группы оказались гомозиготами по аллелю С, а генотип ТТ был обнаружен у 15,9 % обследованных (табл. 1).

Следует также отметить, что у женщин с эн-дометриоз-ассоциированным бесплодием распределение генотипов (х2 = 19,74; р < 0,05) и аллелей (х2 = 19,36;р < 0,05) значимо отличалось от такового у пациенток только с бесплодием без эн-дометриоза: генотип ТТ и аллель Т полиморфизма С511Т гена ¡Ь1Б встречались значимо чаще, чем в контрольной группе. Также была выявлена положительная ассоциация эндометриоз-ассоци-ированного бесплодия с аллелем Т (OR = 2,81) и с генотипом ТТ (OR = 35,11) полиморфизма

С511Т гена ¡Ь1Б. Показано также, что протек-тивным эффектом обладает аллель С (OR = 0,36) (см. табл. 1).

Ген 1Ь6 располагается в регионе 7р15-21 7-й хромосомы. Наиболее часто исследуемый полиморфизм G-174C (замена нуклеотида гуанина на цитозин в регуляторной области гена) локализован в промоторной области гена, он приводит к функциональным изменениям, которые влияют на транскрипцию гена и, соответственно, уровень ^-6 в плазме. При варианте -174С продукция ^-6 понижена, что сопровождается нарушением элиминации инфекционных агентов и подавлением резорбции костной ткани. Показано, что аллель -174G ассоциирован с более высоким уровнем ^-6 в плазме [5, 18].

При изучении частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма G-174C гена 1Ь6 среди женщин с бесплодием без эндометриоза зарегистрировано преобладание генотипа GG (72,5 %), в то время как генотип GC и гомозиготный генотип по аллелю С встречались в 25,3 и 2,2 % случаев соответственно. Результаты ге-нотипирования аллельных вариантов гена 1Ь6 у больных с бесплодием, ассоциированным с эндо-метриозом, показали преобладание гомозиготного генотипа GG (47,6 %) над гетерозиготным GC (35,2 %) и гомозиготным СС (17,2 %) генотипами (табл. 2).

Таблица 1

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С511Тгена ^1В (абс., %) среди

обследованных женщин

Генотипы и аллели полиморфизма С511Т гена 111Б Характеристика обследованных лиц 2 X, Р ОЯ

Женщины с бесплодием, п = 91 Женщины с бесплодием и эндометриозом, п = 145

СС 63

СТ 28

ТТ 0

С 154

Т 28

Таблица 2

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G-174C гена ^6 (абс., %) среди

обследованных женщин

Генотипы и аллели полиморфизма в-174С гена ¡16 Характеристика обследованных лиц 2 х, Р ОЯ

Женщины с бесплодием, п = 91 Женщины с бесплодием и эндометриозом, п = 145

вв 66

вС 23

СС 2

в 155

С 27

При сопоставлении данных, полученных в результате генетического анализа женщин контрольной группы и группы пациенток, страдающих эндометриоз-ассоциированным бесплодием, было зарегистрировано значимое увеличение частоты генотипа СС и аллеля С полиморфизма G-174C гена 1Ь6 у женщин с бесплодием, ассоциированным с эндометриозом (х2 = 18,89; р < 0,001; х2 = 22,62; р < 0,001 соответственно). В ходе проведенного исследования было установлено, что фактором риска ассоциации бесплодия с эндометриозом являлись аллель С (OR = 3,07) и генотип СС (OR = 9,27), а защитным эффектом обладал генотип GG локуса G-174C гена 1Ь6 ДО = 0,34) (см. табл. 2).

Основной функцией иммунной системы организма является поддержание постоянства антигенной структуры, что подразумевает защиту как от чужеродных, так и от генетически измененных своих антигенов, в частности от эндометриоид-ных гетеротопий [14]. Взаимодействие участников иммунного ответа происходит путем обмена универсальными цитокиновыми сигналами. Нарушения в системе цитокинов необратимо влекут за собой невозможность кооперации и координации иммунной системы, что ведет к пролиферации и инвазии ткани, морфологически и функционально подобной эндометрии, за пределами слизистой оболочки полости матки [4, 12, 14]. Неоспоримо, что особенности реагирования организма заложены в нуклеотидной последовательности молекул ДНК, находящихся в ядре клетки. Но нельзя забывать о том, что регуляция генома клетки - процесс очень сложный и в настоящее время недостаточно изученный.

В заключение следует подчеркнуть, что изучение ассоциаций аллельных вариантов генов цитокинов с заболеваниями связаны с попытками установить иммуногенетические маркеры заболеваний. Подобные исследования перспективны в попытке установить причинно-следственные связи цитокиновых генов с заболеваниями, но из-за трудности выбора возможных претендентов из большого числа генов-кандидатов и из-за незначительного влияния любого отдельного гена на восприимчивость к заболеванию требуют продолжения. Зарегистрированные нами изменения соотношения в распределении аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов у больных генитальным эндометриозом и бесплодием могут обусловливать функциональные нарушения, которые приводят к количественным изменениям протекания защитных реакций, что сказывается на развитии эндометриоза и ассоциированного с ним бесплодия.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эн-дометриозы. М., 2006. 416 с.

2. Герасимов А.М. Причины бесплодия при наружном эндометриозе // Вестн. акушерства и гинекологии. 2008. (1). 31-35.

3. Ермошенко Б.Г., Крутова В.А., Надточий А.В. Восстановление репродуктивной функции у пациенток с эндокринным бесплодием // Кубанский науч. мед. вестн. 2009. (3). 46-50.

4. Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: диагностика и лечение. М., 2008. 176 с.

5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб., 2008. 552 с.

6. Крутова В.А., Галустян С.А., Белкина Н.В. Комплексное лечение женщин, страдающих бесплодием, ассоциированным с генитальным эндометриозом // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2008. (2). 59-63.

7. Кулаков В.И., Прилепская В.Н. Практическая гинекология. М., 2001. 720 с.

8. Симбирцев А.С., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления // Иммунология. 2005. (1). 67-72.

9. Симбирцев А.С., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных цитокинов // Цитокины и воспаление. 2005. 4. (1). 3-12.

10. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коненков В.И. Особенности полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов IL1, IL4, IL5, IL6, IL10 и TNFA у европеоидного населения Западной Сибири // Иммунология. 2010. (4). 176-181.

11. Alaina B.J.-M., Jennifer W.B., Keith A.F. Infertility // Am. Fam. Physician. 2007. 75. 849-856.

12. Allaire C. Endometriosis and infertility: a review // J. Reprod. Med. 2006. 51. (3). 164-168.

13. Fanta M., Koliba P., Hruskova H. Endometriosis // Ceska Gynekol. 2012. 77. 314-319.

14. Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. Steril. 2001. 76. (1). 1-10.

15. Missmer S.A., Hankinson S.E., Spiegelman D. et al. Incidence of laparoscopically confirmed endometriosis by demographic, anthropometric, and lifestyle factors // Am. J. Epidemiol. 2004. 160. 784-796.

16. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility // Gynec. Obstet. Invest. 2002. 53. (1). 19-25.

17. Macer M.L., Taylor H.S. Endometriosis and infertility: A review of the pathogenesis and treatment of endometriosis-associated infertility // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 2012. 39. 535-549.

18. Fishman D., Faulds G., Jeffery R. et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin 6 (IL6) gene on IL6 transcription and plasma IL6 levels, and an association with systemic"onset juvenile chronic arthritis // J. Clin. Invest. 1998. 102. 1369-1376.

IL1B AND IL6 GENE POLYMORPHISM IN ENDOMETRIOSIS-RELATED INFERTILITY

Tatyana Aleksandrovna AGARKOVA1, Konstantin Sergeevich KUBLINSKIY2, Irina Olegovna NASLEDNIKOVA2, Irina Dmitrievna EVTUSHENKO2, Lyubov' Aglyamovna AGARKOVA1, Vyacheslav Viktorovich NOVITSKIY2, Yekaterina Borisovna IL'YADI2, Ol'ga Ivanovna URAZOVA2, Ol'ga Vladimirovna VORONKOVA2

1 Institute of Obstetrics, Gynecology and Perinatology of SB RAS 634063, Tomsk, Sergey Lazo str., 5

2 Siberian State Medical University of Minzdrav of Russia 634050, Tomsk, Moscovskiy tract, 2

Clinical, molecular and genetic examination of 145 patients with the genital endometriosis, suffering infertility has been conducted. It is registered that distribution of allelic variants of cytokine genes among patients with endometriosis associated infertility is characterized by prevalence of genotypes of TT of a polymorphic site of C511T of a gene of IL1B and the CC polymorphism of G-174C of a gene of IL6. The positive association of endometriosis connected with infertility with allele in T and a genotype of a TT of polymorphism of C511T of a gene of IL1, and also with allele C and a genotype of the CC polymorphism of G-174C of a gene of IL6 is revealed.

Key words: endometriosis, infertility, interleukin-1p, interleukin-6, cytokine gene polymorphism.

Agarkova T.A. - practicing doctor obstetrician-gynecologist, e-mail: agarkina@mail.ru Kublinskiy K.S. - candidate of medical sciences, clinical gynaecologist, e-mail: kublinskiy@sibmail.com Naslednikova I.O. - doctor of medical sciences, professor of the chair for pathophysiology, e-mail: ira_naslednikova@mail.ru

Evtushenko I.D. - doctor of medical sciences, professor, head of the chair for obstetrics and gynaecology, e-mail:. evtushenko_1d@mail.ru

Agarkova L.A. - doctor of medical sciences, professor, director, e-mail: general@rd4.tomsk.ru Novitskiy V.V. - rector, academician of RAMS, doctor of medical sciences, professor, head of the chair for pathophysiology, e-mail: ira_naslednikova@mail.ru

Il'yadi Ye.B. - postgraduate student of the chair for pathophysiology, e-mail: ira_naslednikova@mail.ru Urazova O.I. - doctor of medical sciences, professor of the chair for pathophysiology, e-mail: ira_naslednikova@mail.ru

Voronkova O.V. - doctor of medical sciences, professor of the chair for pathophysiology, e-mail: ira_naslednikova@mail.ru