Ацидофильные штаммы Fusarium oxysporum, способы их получения и способы их применения
ACIDOPHILIC STRAINS FUSARIUM OXYSPORUM, METHODS FOR PRODUCING AND METHODS FOR THE USE THEREOF

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В данной заявке заявлен приоритет предварительной заявки США 62/020,607, поданной 3 июля 2014 года, и предварительной заявки США 62/061,076, поданной 7 октября 2014, каждая из которых включена в данную заявку посредством ссылки во всей полноте для всех целей.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Содержание текстового файла, представленного в электронном виде, включено в данное описание посредством ссылки во всей его полноте. Копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: MONT_151_03US_ST25.txt, дата записи: 1 июля, 2015, размер файла 2 килобайта).
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Эта заявка относится к новым выделенным штаммам грибов ацидофильного Fusarium oxysporum (например МК7), к их потомству, к способам получения таких выделенных штаммов грибов и их потомства, и к способам применения таких выделенных штаммов грибов и их потомства для создания полезных процессов и продуктов. Например, выделенные штаммы грибов и их потомство могут быть использованы для превращения лигноцеллюлозного сырья, биомассы водорослей и глицерина в высокоэнергетические метаболиты для производства биоэнергии, для получения ферментов, антибиотиков, более конкретно жирных кислот и липидов (например восков) для промышленного применения, для депарафинизации соломы и для нейтрализации кислоты и связывания тяжелых металлов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Fusarium (синонимы: Fusisporium, Pseudofusarium, Sporotrichella) представляет собой большой род нитчатых грибов, широко распространенных в почве и совместно с растениями. Большинство видов являются безвредными сапрофитами и относительно распространенными членами микробного сообщества почвы. Некоторые виды производят микотоксины в зерновых культурах, которые могут влиять на здоровье человека и животных, если они входят в пищевую цепь. Основные токсины, вырабатываемые этими видами Fusarium, представляют собой фумонизины и трихотецины.
Штаммы Fusarium, выделенные из природы, оказались полезными для людей в самых разнообразных технологиях, включая применение в качестве продуктов питания и для производства антибиотиков. Все еще существует необходимость в новых изолятах Fusarium для использования в новых и существующих применениях. В настоящем изобретении предложен уникальный выделенный штамм Fusarium и его потомство, которые пригодны для множества разных целей, включая, но без ограничения ими, производство биоэнергии, в качестве биологические смазок, для биоизвлечения драгоценных металлов посредством биосорбции, для ремедиации шахтных отходов, для депарафинизации пшеничной соломы, для расщепления биомассы водорослей, и глицерин-содержащих отходов и для получения антибиотиков, сидерофоров, и пластификаторов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены выделенные штаммы грибов ацидофильного Fusarium oxysporum, такие как выделенный штамм, обозначенный МК7, который был депонирован как АТСС депозит номер РТА-10698, и/или его потомство. "Потомство", при использовании здесь, относится к любому или ко всем потомкам линии, которая происходит от выделенного штамма, независимо от того, как и где они получены. В определение "потомства", используемого в данном описании, включены любые или все мутанты выделенного/депонированного штамма и его потомства, если эти мутанты имеют все физиологические и морфологические характеристики выделенного/депонированного штамма и его потомства.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен выделенный ацидофильный штамм гриба Fusarium oxysporum, расщепляющий лигноцеллюлозу, или его потомство, где выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum обладает по меньшей мере следующими идентифицирующими характеристиками:
а) выделенный штамм является ацидофильным и может расти при pH в диапазоне от примерно 0,7 до примерно 7,5; и
б) способен продуцировать липиды из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов или их комбинации в аэробных или по существу аэробных условиях;
В одном воплощении выделенный штамм по настоящему изобретению дополнительно имеет одну или более следующих дополнительных идентифицирующих характеристик:
в) способен продуцировать этанол и/или водород из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов или их комбинации в анаэробных или по существу анаэробных условиях;
г) способен выдерживать концентрации Mn вплоть до 25 мМ, концентрации As вплоть до 250 мМ или 300 мМ, и концентрации Hg вплоть до 100 мМ;
д) способен депарафинизировать пшеничную солому и другой растительный материал;
е) способен продуцировать липиды из водорослевого сырья и из отходов, образующихся при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) в аэробных или по существу аэробных условиях;
ж) способен продуцировать этанол и/или водород из водорослевого сырья и из отходов, образующихся при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) в анаэробных или анаэробных условиях;
з) способен продуцировать диизооктилфталат (DIOP);
и) способен продуцировать гександионовой кислоты моно(2-этилгексил)овый сложный эфир; и
к) содержит 18S рРНК и ДНК последовательность ITS (внутреннего транскрибируемого участка), которая обладает по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях лигноцеллюлозное сырье, используемое выделенным штаммом и его потомством, выбрано из группы, состоящей из остатков сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения деревьев с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения деревьев с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлоза-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна от пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, образующихся при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и их комбинации. В некоторых воплощениях углеводы выбраны из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их смеси.
В некоторых воплощениях указанный выделенный штамм гриба и его потомство могут расти и/или размножаться при pH в диапазоне от примерно 0,7 до примерно 7,0. Например, штаммы и потомство по настоящему изобретению способны расти и/или размножаться при pH, составляющим по меньшей мере примерно 7,0, по меньшей мере примерно 6,5, по меньшей мере примерно 6,0, по меньшей мере примерно 5,5, по меньшей мере примерно 5,0, по меньшей мере примерно 4,5, по меньшей мере примерно 4,0, по меньшей мере примерно 3,5, по меньшей мере примерно 3,0, по меньшей мере примерно 2,5, по меньшей мере примерно 2,0, по меньшей мере примерно 1,9, по меньшей мере примерно 1,8, по меньшей мере примерно 1,6, по меньшей мере примерно 1,4, по меньшей мере примерно 1,2, по меньшей мере примерно 1,0, по меньшей мере примерно 0,9, по меньшей мере примерно 0,8, по меньшей мере примерно 0,75, по меньшей мере примерно 0,7, по меньшей мере примерно 0,65, по меньшей мере примерно 0,6 или по меньшей мере примерно 0,55.
В некоторых воплощениях выделенный штамм гриба и его потомство устойчивы к высоким концентрациям других металлов, выбранных из группы, состоящей из Ag, Zn, Fe, A3., Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, Au, Se, Sb и Hg.
Выделенный штамм Fusarium oxysporum и его потомство по настоящему изобретению можно культивировать без антибиотиков с небольшим загрязнением или без загрязнения другими организмами, где указанные другие организмы могут быть выбраны из группы, состоящей из других бактериальных штаммов, родов или видов, других грибов (например дрожжей, плесени), морских водорослей, вирусов, растений, насекомых и любой их комбинации.
В настоящем изобретении также предлагается биологически чистая культура, имеющая одну или более идентифицирующих характеристик выделенного штамма гриба Fusarium oxysporum или его потомства, как описано в данном документе. В одном воплощении биологически чистая культура содержит выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum, обозначенный как МК7, который был депонирован как АТСС депозит номер РТА-10698, и/или его потомство. В одном воплощении указанный выделенный штамм гриба и/или его потомство находится в форме конидии, пикниды, хламидоспор, фрагментов гиф или любой и всех их комбинаций.
В настоящем изобретении кроме того предлагается композиция, содержащая выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum и/или его потомство, обладающий по меньшей мере одной или более идентифицирующими характеристиками, как описано в данном описании изобретения. В одном воплощении выделенный штамм гриба представляет собой МК7 и/или его потомство. В одном воплощении указанные композиции содержат выделенный штамм гриба и/или его потомство в форме конидии, пикниды, хламидоспор, фрагментов гиф или любой и всех их комбинаций. В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из среды, которая поддерживает рост штамма гриба, подкисляющего вещества, донора марганца, пищевой добавки и любой или всех смесей этих компонентов. В одном воплощении среда является твердой. В другом воплощении среда является жидкой.
В настоящем изобретении также предлагаются способы получения полезных продуктов с использованием указанного выделенного штамма грибов и/или его потомства, включающие:
а) получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или его потомства с исходным сырьем, выбранным из группы, состоящей из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих сельскохозяйственных и бытовых отходов, углеводов, мономеров сахара, дрожжевого экстракта, казаминовых кислот и их комбинации в контейнере, в котором указанное вещество может поддерживать рост указанного выделенного штамма гриба; и
б) выращивание указанного выделенного штамма гриба в указанной смеси с получением одного или более полезных продуктов.
В одном воплощении смесь находится в аэробных условиях или по существу в аэробных условиях. В другом воплощении, смесь находится в анаэробных условиях или по существу в анаэробных условиях.
В одном воплощении указанные полезные продукты представляют собой один или более высокоэнергетических метаболитов. Например, полезные продукты, продуцируемые с использованием грибов и способов по настоящему изобретению, включают, без ограничения ими, биотопливо и/или предшественников биотоплива. В одном воплощении смесь находится в аэробных условиях или по существу в аэробных условиях и указанные высокоэнергетические метаболиты представляют собой, главным образом, липиды, где липиды могут быть экстрагированы из биомассы выделенных штаммов грибов и/или его потомства. В одном воплощении указанные липиды представляют собой по существу жирные кислоты. В одном воплощении указанные жирные кислоты представляют собой, главным образом, ненасыщенные жирные кислоты и/или насыщенные жирные кислоты. В одном воплощении указанные ненасыщенные жирные кислоты выбраны из группы, состоящей из олеиновой кислоты (18:1), α-линоленовой кислоты (18:3), эйкозеновой кислоты (20:1) и их комбинации. В одном воплощении указанные насыщенные жирные кислоты выбраны из группы, состоящей из пальмитиновых кислот (16:0), стеариновых кислот (18:0), арахиновой кислоты (20:0), бегеновой кислоты (22:0), и любой или всех их комбинаций. В одном воплощении липиды экстрагируют и используют для получения биологических смазок. В одном воплощении смесь находится в анаэробных условиях или по существу анаэробных условиях и указанные высокоэнергетические метаболиты представляют собой, главным образом, спирты и/или водород. В некоторых воплощениях указанный спирт является этиловым спиртом, бутанолом и/или изобутанолом.
В одном воплощении указанные полезные продукты представляют собой нафтазариновые пигменты. В другом воплощении указанные нафтазариновые пигменты собирают и используют для получения пестицидов, выбранных из группы, состоящей из антибиотиков, фунгицидов, гербицидов, дрожжецидов и инсектицидов.
В одном воплощении указанные полезные продукты представляют собой сидерофоры.
В одном воплощении указанные полезные продукты представляют собой пластификаторы, например диизооктилфталат (DIOP, CAS 117-81-7) и/или гександионовую кислоту, моно(2-этилгексил)овый эфир (или 2-этилгексил-гидроадипат, CAS 4337-65-9).
По сравнению с методами, ранее известными в данной области техники, настоящее изобретение является уникальным по меньшей мере в том, что процесс производства, описанный в данном описании изобретения, является очень простым в исполнении, в результате чего исходное сырье превращается непосредственно в липиды с высоким выходом в кислых условиях. В одном воплощении лигноцеллюлозное сырье выбрано из группы, состоящей из остатков сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения дерева с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения дерева с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлоза-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна от пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, полученных при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и любой или всех их комбинаций. В одном воплощении указанные углеводы выбраны из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинации.
В одном воплощении указанные мономеры сахара выбраны из группы, состоящей из триоз, тетроз, пентоз, гексоз, гептоз и др. и любой и всех их комбинаций. В одном воплощении указанные пентозы выбраны из группы, состоящей из рибулозы, ксилулозы, рибозы, арабинозы, ксилозы, ликсозы, дезоксирибозы и любой и всех их комбинаций. В одном воплощении указанные гексозы выбраны из группы, состоящей из аллозы, альтрозы, глюкозы, маннозы, глюкозы, идозы, галактозы, талозы, псикозы, фруктозы, сорбозы, тагатозы и любой и всех их комбинаций.
В одном воплощении указанная смесь дополнительно содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из подкисляющих веществ, донора марганца, пищевых добавок, pH-буферных веществ и любой и всех их комбинаций.
2
В некоторых воплощениях указанная смесь имеет исходное значение pH от примерно 0,5 до примерно 3,0. В других воплощениях указанная смесь имеет исходное значение pH от примерно 3,0 до примерно 7,0. pH определяют на основе продуктов. Например, продуцирование высокого уровня липидов происходит в дипазоне pH 2,0-7,0, производство этанола происходит при pH 3-4,5 и производство H происходит в диапазоне 2,0-7,0.
В настоящем изобретении также предложены способы производства биотоплива или предшественника биотоплива с использованием одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, где указанные способы включают:
а) получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства с исходным сырьем, выбранным из группы, состоящей из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов, мономеров сахара и любых и всех их комбинаций в контейнере, в котором указанное сырье может поддерживать рост указанных выделенных штаммов грибов; и
б) выращивание указанного выделенного штамма гриба в указанной смеси с получения одного или более типов высокоэнергетических метаболитов в качестве биотоплива и/или предшественников биотоплива;
в) сбор указанных высокоэнергетических метаболитов; и
г) при необходимости получение биотоплива из указанных предшественников биотоплива.
В одном воплощении указанное биотопливо представляет собой биодизель. В другом воплощении указанное биотопливо представляет собой биоспирты. В еще одном воплощении указанное биотопливо представляет собой биогаз.
В настоящем изобретении также предложены способы предварительной обработки целлюлозных отходов и одновременного превращения в высокоэнергетические метаболиты с использованием одного или более выделенных грибных штаммов и/или их потомства, где указанные способы включают:
а) получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства с целлюлозными отходами в контейнере; и
б) выращивание указанного выделенного штамма гриба и/или его потомства в указанной смеси, где целлюлозные отходы разрушаются и одновременно образуются высокоэнергетические метаболиты.
В одном воплощении целлюлозные отходы могут поддерживать рост указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства. В другом воплощении в смесь также добавляют дополнительные соединения, которые необходимы для роста указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, где дополнительные соединения не обеспечиваются целлюлозными отходами. Такие соединения включают, без ограничения ими, макронутриенты, микронутриенты и их комбинацию. В еще одном воплощении в смесь также могут быть добавлены соединения, которые могут облегчать предварительную обработку. Такие соединения включают, без ограничения ими, подкисляющие вещества, источники марганца, питательные вещества, pH-буферные вещества.
В настоящем изобретении также предложены способы детоксикации жидких отходов, содержащих металлы и/или извлечения металлов из указанных жидких отходов посредством биосорбции с использованием одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, включающие получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства с отходами, содержащими один или более типов благородных металлов, где жидкие отходы детоксифицируют и/или металлы извлекают посредством биосорбции.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
В одном воплощении жидкие отходы могут поддерживать рост указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства. В другом воплощении также добавляют в смесь дополнительные соединения, необходимые для роста указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, где дополнительные соединения не обеспечиваются жидкими отходами. Такие соединения включают, без ограничения ими, макронутриенты, микронутриенты и их комбинации. В одном воплощении биосорбция осуществляется посредством сидерофоров, продуцируемых в выделенном штамме гриба. В одном воплощении отходы представляют собой стоки от добычи полезных ископаемых и промышленности. В одном воплощении металл выбран из группы, состоящей из Mn, Ag, Zn, Fe, Al, Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, Au, Hg и любой и всех их комбинаций. Общая концентрация иона(ов) металла или концентрация определенного иона металла в жидкости составляет по меньшей мере 0,1 млн, 1 млн, или 10 млн, или 100 млн, или 1000 млн, или 10000 млн, или 10000 млн, или 100000 млн по массе. Например, концентрация определенного иона металла в жидкости выше, чем требования в Federal Hazard Waste Codes EPA D004 - EPAD013.
В настоящем изобретении также предложены способы нейтрализации pH кислых жидкостей с использованием одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, включающие получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов с кислой жидкостью, где pH кислых жидкостей нейтрализуется. В одном воплощении кислая жидкость представляет собой кислый шахтный дренаж. В одном воплощении кислые жидкости могут поддерживать рост указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства. В другом воплощении в смесь также добавляют дополнительные соединения, необходимые для роста указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства, когда кислые жидкости не обеспечивают эти дополнительные соединения. Такие соединения включают, без ограничения ими, углеродсодержащее сырье, макронутриенты, микронутриенты и любую и все их комбинации.
В настоящем изобретении также предлагаются устойчивые к кислоте ферменты или части устойчивых к кислоте ферментов, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие ферменты, части устойчивых к кислоте ферментов или их варианты, где такие ферменты продуцируются выделенным штаммом и/или его потомством.
В настоящем изобретение также предлагаются мутантные или рекомбинантные грибные штаммы, происходящие от штамма грибов и/или его потомства по настоящему изобретению.
В настоящем изобретении также предложены способы использования выделенных штаммов грибов ацидофильного Fusarium oxysporum, такого как выделенный штамм, обозначенный как МК7, для прямого превращения широкого спектра сырья, такого как пшеничная солома, стебли кукурузы и промышленные побочные продукты (например мелассы, глицерин) в полезные липидные продукты, такие как омега-7 жирные кислоты и/или воски с высокой температурой плавления.
В настоящем изобретении также предлагаются простые, новые и рентабельные способы превращения лигноцеллюлозных и других отходов в ценные липиды с использованием выделенных штаммов грибов ацидофильного Fusarium oxysporum, таких как выделенный штамм, обозначенный как МК7, который способен выдерживать экстремальные кислотные условия и продуцировать эффективные ферменты для разложения целлюлозы, лигнина и гемицеллюлозы. Организм накапливает высокие концентрации ценных липидов в рентабельном "одностадийном" способе.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения раскрыт способ получения высокоэнергетического субстрата, включающий приведение источника углерода в контакт с выделенным штаммом Fusarium oxysporum с образованием смеси, инкубирование указанной смеси в течение некоторого периода времени и получение высокоэнергетического субстрата в результате такого контакта.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения раскрыт штамм МК7 Fusarium oxysporum, репрезентативный образец которого был депонирован как АТСС депозит номер РТА-10698.
В некоторых воплощениях в способах получения высокоэнергетических субстратов по настоящему изобретению используют штамм Fusarium oxysporum с последовательностью рРНК, раскрытой в SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях в данном описании изобретения раскрыто, что источник углерода, используемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой биомассу.
В некоторых воплощениях в данном описании изобретения раскрыто, что источник углерода, используемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой целлюлозную биомассу.
В некоторых воплощениях в данном описании изобретения раскрыто, что источник углерода, используемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой лигноцеллюлозное сырье или лигноцеллюлозные отходы.
В некоторых воплощениях в данном описании изобретения раскрыто, что источник углерода, используемый в способах по настоящему изобретению, представляет собой углевод.
В некоторых воплощениях в данном описании изобретения раскрыты, способы, в которых штамм Fusarium oxysporum и источник углерода инкубируют в анаэробных или микроаэробных условиях.
В некоторых воплощениях посредством способов по настоящему изобретению продуцируют высокоэнергетический субстрат, где указанный высокоэнергетический субстрат выбран из группы, состоящей из этанола и газообразного водорода.
В некоторых воплощениях в настоящем изобретении раскрыта стадия предварительной обработки, выбранная из группы, выбранной из: снижения pH смеси источника углерода и Fusarium oxysporum, добавления марганца к смеси источника углерода и Fusarium oxysporum, и добавления питательного вещества к смеси источника углерода и Fusarium oxysporum перед стадией инкубации.
В некоторых воплощениях высокоэнергетический субстрат, полученный способами по настоящему изобретению, представляет собой липид, этанол и/или водород.
В некоторых воплощениях высокоэнергетический субстрат, получаемый посредством способов по настоящему изобретению, представляет собой липид.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения раскрыт способ получения одного или более высокоэнергетических метаболитов с использованием штамма Fusarium oxysporum, включающий стадии: а) получения смеси штамма МК7 Fusarium oxysporum и/или его потомства с исходным сырьем, выбранным из группы, состоящей из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов и их комбинации, в контейнере, где сырье может поддерживать рост указанного штамма МК7 и/или его потомства; б) выращивание указанного штамма МК7 в указанной смеси с получением одного или более высокоэнергетических метаболитов; и в) возможно, выделение указанных одного или более высокоэнергетических метаболитов из смеси; где репрезентативный образец указанного штамма МК7 депонирован как АТСС депозит номер РТА-10698.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения раскрыты способы получения высокоэнергетических субстратов из сырья пшеничной соломы.
В некоторых воплощениях высокоэнергетический субстрат, полученный способами по настоящему изобретению, представляет собой этанол.
В некоторых воплощениях высокоэнергетический субстрат, полученный способами по настоящему изобретению, представляет собой газообразный водород.
В некоторых воплощениях, высокоэнергетический субстрат, полученный способами по настоящему изобретению, представляет собой метиловый эфир жирной кислоты (FAME).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения раскрыты FAME, выбранные из группы, состоящей из метилтетрадеканоата, метилгексадец-9-еноата, метилового эфира гексадекановой кислоты, олеиновой кислоты, линолевой кислоты, конъюгированной линолевой кислоты, линоленовой кислоты, метил-11-октадеценоата, метилового эфира октадекановой кислоты, метилового эфира эйкозановой кислоты, метилового эфира докозановой кислоты и метилового эфира тетракозановой кислоты.
В некоторых воплощениях в настоящем описании изобретения раскрыто, что FAME, полученный способами по настоящему изобретению, представляет собой омега-7 вакценовую кислоту.
В некоторых воплощениях в настоящем описании изобретения раскрыто, что смесь Fusarium и источника энергии (например источника углерода или сырья) инкубируют в анаэробных или микроаэробных условиях.
В некоторых воплощениях способы по настоящему изобретению включают стадию предварительной обработки, выбранную из группы, состоящей из: снижения рН смеси, добавления марганца к смеси и добавления питательного вещества к смеси.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 показан способ по изобретению, в котором используется штамм МК7 Fusarium oxysporum, новый ацидофильный гриб, и/или его потомство для непосредственного превращения лигноцеллюлозного сырья, 5- и 6-углеродных сахаров и биомассы водорослей в высокоэнергетические субстраты, включающие липиды, этанол и водород. Кроме того, гриб можно использовать для производства ферментов и антибиотиков для промышленного применения. Кроме того, гриб способен нейтрализовать кислоту и связывать тяжелые металлы для ремедиации кислого шахтного дренажа.
На Фиг. 2 показана грибная биомасса через 7 суток роста на пшеничной соломе при pH 2,5 в аэробных условиях. Этот грибной мат готов к экстракции липидов.
На Фиг. 3 показана общая продукция липидов штаммом Fusarium МК7 и/или его потомством в виде доли от исходной глюкозы или пшеничной соломы. Процентное содержание пшеничной соломы (4% или 8%) указывает исходную массу пшеничной соломы к объему воды. Величины ошибки показывают стандартные отклонения в трех экспериментах.
На Фиг. 4 показана оптическая микроскопия (слева) штамма Fusarium МК7 и/или его потомства, культивируемого на пшеничной соломе при pH 2,5 через 10 суток. Идентичное изображение, полученное с использованием флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных Nile Red (справа), ясно указывает на значительное продуцирование липидов (Nile Red specifically stains lipids, Cooksey et al., 1987).
На Фиг. 5 показан профиль жирных кислот штамма Fusarium МК7 и/или его потомства, культивированного на пшеничной соломе при pH 2,5 через 10 суток.
На Фиг. 6 показаны выходы этанола в граммах этанола, полученного на грамм сухого сырья пшеничной соломы или глюкозы.
На Фиг. 7 показаны профили липидов, продуцируемых штаммом МК7.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определение
При использовании в данном описании и в формуле изобретения глагол "содержать" и его спряжения используются в их неограничивающем смысле, означающем, что элементы, следующие за этим словом, включены, но элементы, не указанные конкретно, не исключены. Кроме того, ссылка на элемент посредством неопределенного артикля "a" или "an" не исключает возможности того, что присутствует более чем один элемент, если контекст явно не требует того, чтобы это был один и только один из элементов. Неопределенный артикль "a  или "an" таким образом обычно означает "по меньшей мере один".
При использовании здесь, термин "происходящий из (от)" относится к происхождению или источнику и может включать природные, рекомбинантные, неочищенные или очищенные молекулы. Белки и молекулы по настоящему изобретению могут происходить из гриппозных или негриппозных молекул.
При использовании здесь, термин "микроаэробный" относится к среде, в которой концентрация кислорода меньше, чем концентрация кислорода в воздухе.
При использовании здесь, термин "химерный белок" относится к конструкции, которая связывает по меньшей мере два гетерологичных белка в одной макромолекуле (слитого белка).
При использовании здесь, термин "нуклеиновая кислота" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или к их аналогам. Этот термин относится к первичной структуре молекулы и таким образом включает двух- и одноцепочечную ДНК, а также двух- и одноцепочечную РНК. Он также включает модифицированные нуклеиновые кислоты, такие как метилированные и/или кэппированные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, содержащие модифицированные основания, модификации каркаса и тому подобное. Термины "нуклеиновая кислота" и "нуклеотидная последовательность" используются взаимозаменяемо.
При использовании здесь, термин "ген" относится к нуклеиновой кислоте или части нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая кодирует белок. В данной области техники очевидно, что ген также содержит некодирующие последовательности, такие как 5'- и 3'-фланкирующие последовательности (такие как промоторы, энхансеры, репрессоры и другие регуляторные последовательности), а также интроны.
Используемые здесь термины "полинуклеотид", "полинуклеотидная последовательность", "нуклеиновокислотная последовательность", "фрагмент нуклеиновой кислоты" и "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" используются взаимозаменяемо в данном описании изобретения. Эти термины охватывают нуклеотидные последовательности и тому подобное. Полинуклеотид может представлять собой полимер РНК или ДНК, который является одноцепочечным или двухцепочечным, который возможно содержит синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Полинуклеотид в форме полимера ДНК может состоять из одного или более сегментов кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или их смесей. Нуклеотиды (обычно находящиеся в форме 5'-монофосфата) указаны посредством однобуквенного обозначения следующим образом: "A" для аденилата или дезоксиаденилата (для РНК или ДНК соответственно), "C" для цитидилата или дезоксицитидилата, "G" для гуанилата или дезоксигуанилата, "U" для уридилата, "T" для дезокситимидилата, "R" для пуринов (A или G), "Y" для пиримидинов (C или T), "K" для G или T, "H" для A или C или T, "I" для инозина, и "N" для любого нуклеотида.
При использовании здесь, термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяем и относятся к полимерам аминокислот любой длины. Эти термины также включают белки, которые являются посттрансляционно модифицрованными посредством реакций, включающих гликозилирование, ацетилирование и фосфорилирование.
При использовании здесь, термин "гомологичный" или "гомолог" или "ортолог" известен в данной области техники и относится к родственным последовательностям, которые имеют общего родоначальника или члена семейства и определяются, исходя из степени идентичности последовательности. Эти термины описывают взаимосвязь между геном, обнаруженным в одном виде, подвиде, разновидности, культиваре или штамме, и соответствующим или эквивалентным геном в другом виде, подвиде, разновидности, культиваре или штамме. В контексте настоящего изобретения гомологичные последовательности сравнивают. "Гомологичные последовательности", или "гомологи", или "ортологи", как полагают, считают или знают, являются функционально родственными. Функциональное родство может быть указано любым из ряда способов, включая, без ограничения ими: (а) степень идентичности последовательности, и/или (б) такая же или подобная биологическая функция. Предпочтительно, когда указаны оба (а) и (б). Степень идентичности последовательности может варьироваться, но в одном воплощении составляет по меньшей мере 50% (при использовании стандартных программ выравнивания последовательности, известных в данной области техники), по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере примерно 91%, по меньшей мере примерно 92%, по меньшей мере примерно 93%, по меньшей мере примерно 94%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере 98,5%, или по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере 99,5%, или по меньшей мере 99,8%, или по меньшей мере 99,9%. Гомология может быть определена с использованием компьютерных программ, доступных в данной области техники, таких как программы, обсуждаемые в Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al, eds., 1987) Supplement 30, section 7.718, Table 7.71. Некоторые программы выравнивания представляют собой Mac Vector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.) и ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Другая программа выравнивания представляет собой Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan) с использованием базовых параметров.
При использовании здесь, термин "изменение нуклеотида" относится, например, к замене, делеции и/или вставке нуклеотида, хорошо известным в данной области техники. Например, мутации могут представлять собой мутации, которые содержат изменения, вызывающие молчащие замены, добавления или делеции, но не изменяют свойства или активности кодируемого белка или то, каким образом получают эти белки.
При использовании здесь, термин "модификация белка" относится, например, к аминокислотным заменам, аминокислотным модификациям, делециям и/или вставкам, хорошо известным в данной области техники.
При использовании здесь, термин "происходящий из (от)" относится к происхождению или источнику и может включать природные, рекомбинантные, неочищенные или очищенные молекулы. Нуклеиновая кислота или аминокислота, имеющая какое-либо происхождение или происходящая из какого-либо источника, может иметь все виды нуклеотидных изменений или модификаций белка, определенные выше. Грибы, происходящие от конкретного выделенного штамма гриба и/или его потомства, могут содержать некоторые мутации, но по-прежнему сохраняют один, два или более, или все из характерных морфологических и физиологических характеристик выделенного гриба или его потомства, от которого они были получены.
При использовании здесь, термин "ацидофильный" относится к организму, чей оптимальный рост происходит в кислых условиях.
При использовании здесь, термин "агент", означает биологическое или химическое соединение, такое как простая или сложная органическая или неорганическая молекула, пептид, белок или олигонуклеотид, которые модулируют функцию нуклеиновой кислоты или полипептида. Широкий спектр соединений может быть синтезирован, например олигомеры, такие как олигопептиды и олигонуклеотиды, и синтетические органические и неорганические соединения на основе различных коровых структур, и все они также включены в термин "агент". Кроме того, различные природные источники, такие как растительные или животные экстракты и тому подобное, могут обеспечивать соединения для скрининга. Соединения могут быть протестированы отдельно или в комбинации друг с другом.
При использовании здесь, термин "по меньшей мере часть" в отношении нуклеиновой кислоты или полипептида означает часть, имеющую минимальные характеристики размера таких последовательностей или любой более крупный фрагмент полноразмерной молекулы, вплоть до и включая полноразмерную молекулу. Например, часть нуклеиновой кислоты может иметь 12 нуклеотидов, 13 нуклеотидов, 14 нуклеотидов, 15 нуклеотидов, 16 нуклеотидов, 17 нуклеотидов, 18 нуклеотидов, 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 22 нуклеотида, 24 нуклеотида, 26 нуклеотидов, 28 нуклеотидов, 30 нуклеотидов, 32 нуклеотида, 34 нуклеотида, 36 нуклеотидов, 38 нуклеотидов, 40 нуклеотидов, 45 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 55 нуклеотидов и так далее, вплоть до полноразмерной нуклеиновой кислоты. Аналогично, часть полипептида может иметь 4 аминокислоты, 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот и так далее, вплоть до полноразмерного полипептида. Длина используемого участка будет зависеть от конкретного применения. Часть нуклеиновой кислоты, полезной в качестве гибридизационного зонда, может быть такой короткой, как 12 нуклеотидов; в одном воплощении она составляет 20 нуклеотидов. Часть полипептида, пригодная в качестве эпитопа, может быть такой короткой, как 4 аминокислоты. Часть полипептида, который выполняет функцию полноразмерного полипептида, обычно длиннее чем 4 аминокислоты.
При использовании в данном описании изобретения "идентичность последовательности" или "идентичность" в контексте двух нуклеиновокислотных или полипептидных последовательностей включает в себя указание на остатки в этих двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании с максимальным соответствием в заданном окне сравнения. Когда процент идентичности последовательности используется в отношении белков, считается, что положения остатков, которые не идентичны, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, когда аминокислотные остатки заменены другими аминокислотными остатками с аналогичными химическими свойствами (например зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не меняют функциональных свойств молекулы. Если последовательности отличаются консервативными заменами, то процент идентичности последовательностей может быть скорректирован в сторону повышения для коррекции консервативного характера замещения. Про последовательности, которые отличаются такими консервативными заменами, говорят, что они имеют "подобие последовательности" или "подобие". Средства для такой коррекции хорошо известны специалистам в данной области техники. Как правило, они включают оценку консервативной замены как частичного, а не полного несоответствия, посредством чего процент идентичности последовательности увеличивается. Так, например, когда идентичной аминокислоте присваивают 1 балл, а неконсервативной замене присваивают 0 баллов, то консервативной замене присваивают балл между 0 и 1. Балл консервативных замен рассчитывают, например, в соответствии с алгоритмом Meyers и Miller, Computer Applic, Bioi, Sei,, 4: 11-17 (1988).
При использовании здесь, термин "по существу комплементарные" означает, что две нуклеиновокислотные последовательности имеют друг с другом по меньшей мере примерно 65%, предпочтительно примерно 70%, более предпочтительно примерно 80%, еще более предпочтительно 90% и еще более предпочтительно примерно 98%, примерно 98,5%, примерно 99%, примерно 99,1%, примерно 99,2%, примерно 99,3%, примерно 99,4%, примерно 99,5%, примерно 99,6%, примерно 99,7%, примерно 99,8% или примерно 99,9% комплементарность последовательности. Это означает, что праймеры и зонды должны обладать достаточной комплементарностью с их матрицей и целевой нуклеиновой кислотой соответственно, чтобы гибридизироваться в жестких условиях. Следовательно, последовательности праймера и зонда не должны отражать точную комплементарную последовательность области связывания на матрице и можно использовать вырожденные праймеры. Например, некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'-концу праймера, при этом остальная часть последовательности праймера комплементарна нити. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть рассеяны в праймере, при условии что праймер имеет достаточную комплементарность с последовательностью одной из нитей, подлежащей амплификации, чтобы гибридизоваться с ней и тем самым образовать дуплексную структуру, которая может быть удлинена посредством полимеризации. Некомплементарные нуклеотидные последовательности праймеров могут включать сайты ферментной рестрикции. Присоединение сайта ферментной рестрикции к концу(ам) целевой последовательности было бы особенно полезным для клонирования целевой последовательности. По существу комплементарной последовательностью праймера является такая последовательность, которая имеет достаточную комплементарность последовательности с матрицей для амплификации, чтобы привести к связыванию праймера и синтезу второй нити. Специалисту известно, что праймеры должны обладать достаточной комплементарностью последовательности с матрицей для амплификации.
Термины "по существу чистый" и "выделенный" используются взаимозаменяемо и описывают что-то, что по существу отделено от других. Например, он может быть использован для указания гриба, части или формы гриба (например конидии, пикниды, хламидоспоры и гиф), белка, пептида или нуклеиновой кислоты, которые по существу отделены от других клеточных и/или (суб)клеточных компонентов или загрязняющих веществ, которые сопровождают его в природе. Этот термин охватывает грибы, форму гриба или его часть, нуклеиновую кислоту или белок, которые были выделены из его природной среды. Обычно этот термин относится к очищенным объектам, имеющим чистоту по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98%, или по меньшей мере примерно 99% по массе. Минорные варианты или химические модификации обычно имеют такую же общую полипептидную или нуклеотидную последовательность. По существу чистый белок или нуклеиновая кислота, обычно составляют примерно 85-100% (масс/масс.) образца белка или нуклеиновой кислоты, чаще примерно 95%, и более предпочтительно имеют более чем примерно 99%-ную чистоту. Чистота или гомогенность белка или нуклеиновой кислоты может быть определена рядом способов, хорошо известных в данной области техники, таких как электрофорез белкового образца в полиакриламидном геле с последующей визуализацией единичного полипептидного бэнда на полиакриламидном геле при окрашивании, или электорфорез образца нуклеиновой кислоты в агарозном геле с последующей визуализацией единичного полинуклеотидного бэнда на агарозном геле при окрашивании. "Окрашивание" может либо относиться к использованию специфических пептидных или нуклеиновокислотных красителей, таких как серебро и краситель Кумасси или бромистый этидий и красители SYBR, либо может относиться к применению специфических пептидных или нуклеиновокислотных красителей, таких как приведение пептида в контакт с антителами и визуализация антитела с.использованием меченого вторичного антитела (например конъюгированного с щелочной фосфатазой) в случае белков или пептидов, или приведение нуклеиновой кислоты в контакт с комплементарным зондом, меченным для визуализации наличия гибридизации между нуклеиновой кислотой и зондом. Для некоторых целей более высокое разрешение может быть обеспечено путем использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или аналогичного средства очистки. Такие методы являются общеизвестными (см., например, Katz, et al., 1998).
Термины "жесткость" или "жесткие условия гибридизации" относятся к условиям гибридизации, которые влияют на стабильность гибридов, например к температуре, концентрации соли, рН, концентрации формамида и тому подобному. Эти условия эмпирически оптимизируют для максимального увеличения специфического связывания и минимизации неспецифического связывания праймера или зонда с его целевой нуклеиновокислотной последовательностью. Эти термины, при использовании здесь, включают указание условий, при которых зонд или праймер будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в обнаружимо большей степени, чем с другими последовательностями (например по меньшей мере в 2 раза по сравнению с фоном). Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных условиях. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Как правило, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были примерно на 5°C ниже, чем точка термического плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе и pH), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизуется с идеально совпадающим зондом или праймером. Обычно жесткими условиями являются такие, при которых концентрация соли составляет менее чем примерно 1,0 М Na+ иона, обычно концентрация примерно от 0,01 до 1,0 М Na+ иона (или других солей) при pH 7,0-8,3, и температура составляет по меньшей мере примерно 30°C для коротких зондов или праймеров (например от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°C для длинных зондов или праймеров (например более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Типичные условия с низкой жесткостью или "условия пониженной жесткости" включают гибридизацию с буферным раствором, состоящим из 30% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия), при 37°C и промывание в 2xSSC (раствор хлорида и цитрата натрия) при 40°C. Типичные условия с высокой жесткостью включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°C и промывание в 0,1xSSC при 60°C Процедура гибридизации хорошо известна в данной области техники и описана, например, в Ausubel et al., 1998 и Sambrook et ai., 2001.
При использовании в данном описании изобретения, "кодирующая последовательность" относится к последовательности ДНК, которая кодирует определенную аминокислотную последовательность. "Регуляторные последовательности" относятся к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше (5'-некодирующие последовательности), внутри или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, и влияющим на транскрипцию, РНК-процессинг или стабильность, или на трансляцию ассоциированной кодирующей последовательности.
При использовании в данном описании изобретения "регуляторные последовательности" могут включать, без ограничения ими, промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны и последовательности распознавания полиаденилирования.
При использовании в данном описании изобретения "промотор" относится к последовательности ДНК, способной контролировать экспрессию кодирующей последовательности или функциональной РНК. Последовательность промотора состоит из проксимально и более дистально расположенных выше элементов, где последние элементы часто называют энхансерами. Соответственно, "энхансер" представляет собой последовательность ДНК, которая может стимулировать активность промотора и может быть природным элементом промотора или гетерологичным элементом, встроенным для повышения уровня или тканевой специфичности промотора. Промоторы могут происходить в полном объеме из нативного гена или состоять из разных элементов, происходящих из разных промоторов, обнаруженных в природе, или даже могут содержать синтетические сегменты ДНК.. Специалистам в данной области техники понятно, что разные промоторы могут направлять экспрессию гена в разных тканях или типах клеток, или на разных стадиях развития, или в ответ на разные условия окружающей среды. Кроме того, считается, что поскольку в большинстве случаев точные границы регуляторных последовательностей не полностью определены, ДНК фрагменты с некоторыми вариациями могут иметь одинаковую промоторную активность. Промоторы, которые вызывают экспрессию гена в большинстве клеточных типов в большинстве случаев обычно называются "конститутивными промоторами".
При использовании здесь, "3'-некодирующие последовательности" относятся к последовательностям ДНК, расположенным ниже кодирующей последовательности, и включают последовательности распознавания полиаденилирования и другие последовательности, кодирующие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется воздействием добавления участков полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника мРНК. Использование разных 3'-некодирующих последовательностей представлено в Ingelbrecht, I. L, et al. (1989) Plant Ceil 1: 671-680.
При использовании здесь, термин "функционально связанный" относится к ассоциации нуклеиновокислотных последовательностей на единичном фрагменте нуклеиновой кислоты, так что функция одного регулируется другим. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он способен регулировать экспрессию этой кодирующей последовательности (то есть кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. В другом примере комплементарные области РНК по изобретению могут быть функционально связаны, или прямо или опосредованно, 5' с целевой мРНК или 3' с целевой мРНК, или внутри целевой мРНК, или первая комплементарная область находится 5', а его комплементарная область находится 3' по отношению к целевой мРНК.
При использовании здесь, термин "рекомбинантный" относится к искусственной комбинации двух, в иных случаях разделенных, сегментов последовательности, например посредством химического синтеза или путем манипуляций с выделенными сегментами нуклеиновых кислот с помощью методов генной инженерии.
При использовании здесь, выражения "рекомбинантная конструкция", "экспрессирующая конструкция", "химерная конструкция", "конструкция" и "рекомбинантная ДНК-конструкция" используются взаимозаменяемо. Рекомбинантная конструкция содержит искусственную комбинацию фрагментов нуклеиновых кислот, например регуляторные и кодирующие последовательности, которые не встречаются вместе в природе. Например, химерная конструкция может содержать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из разных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, происходящие из того же самого источника, но расположенные иначе, чем в природе. Такая конструкция может быть использована сама по себе или может быть использована в сочетании с вектором. Если используется вектор, то выбор вектора зависит от способа, используемого для трансформации клеток-хозяев, что хорошо известно специалистам в данной области техники. Например, можно использовать плазмидный вектор. Специалисту хорошо известны генетические элементы, которые должны присутствовать на векторе для того, чтобы успешно трансформировать, выбирать или размножать клетки-хозяева, содержащие любой из выделенных фрагментов нуклеиновой кислоты по изобретению. Специалисту также понятно, что разные независимые события трансформации приведут к разным уровням и паттернам экспрессии (Jones et al, (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida et al, (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86) и, таким образом, множество событий должны быть подвергнуты скринингу для получения линий, демонстрирующих нужный уровень и паттерн экспрессии. Такой скрининг, в числе прочих, может быть выполнен с помощью Саузерн-анализа ДНК, Нозерн-анализ экспрессии мРНК, иммуноблотинг-анализа экспрессии белка или фенотипического анализа. Термин "экспрессия", при использовании в данном описании изобретения, относится к продуцированию функционального конечного продукта, например мРНК или белка (предшественника или зрелого).
При использовании здесь, термин "трансформация" относится к передаче нуклеиновой кислоты (то есть нуклеотидного полимера) в клетку. При использовании здесь, термин "генетическая трансформация" относится к передаче и включению ДНК, особенно рекомбинантной ДНК, в клетку.
0
При использовании здесь, термин "трансформант" относится к клетке, ткани или организму, которые претерпели трансформацию. Исходный трансформант обозначают как "Т0" или "Т." Самовоспроизводство Т0 производит первое трансформированное поколение, обозначаемое как "Т1" или "T1"
При использовании здесь, термин "трансген" относится к нуклеиновой кислоте, которая включена в организм, клетку-хозяина или вектор способом, обеспечивающим его функционирование.
При использовании здесь, термин "трансгенный" относится к клеткам, культурам клеток, организмам (например растениям) и потомству, которые получили чужеродный или модифицированный ген с помощью одного из различных способов трансформации, где чужеродный или модифицированный ген происходит из того же самого или другого вида, чем вид организма, получившего этот чужеродный или модифицированный ген.
При использовании здесь, "антисмысловое ингибирование" или "антисмысловой сайленсинг" относится к продуцированию антисмысловых транскриптов РНК, способных подавлять экспрессию целевого белка. "Косупрессия" относится к продуцированию смысловых транскриптов РНК, способных подавлять экспрессию идентичных или по существу аналогичных чужеродных или эндогенных генов (патент US 5231020).
При использовании здесь, термин "вектор", "плазмида" или "конструкция" относится в широком смысле к любой плазмиде или вирусу, кодирующему экзогенную нуклеиновую кислоту. Этот термин также следует рассматривать, как включающий неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в вирионы или клетки, такие как, например, полилизиновые соединения и тому подобные. Вектор может быть вирусным вектором, который пригоден в качестве средства доставки нуклеиновой кислоты или ее мутанта в клетку, или вектор может быть невирусным вектором, который подходит для той же цели. Примеры вирусных и невирусных векторов для доставки ДНК в клетки и ткани хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746). Примеры вирусных векторов включают, без ограничения ими, рекомбинантный вирус осповакцины, рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный ретровирус, рекомбинантный аденоассоциированный вирус, рекомбинантный птичий поксвирус и тому подобное (Cranage et ah, 1986, EMBO J. 5: 3057-3063; международная патентная заявка WO 94/17810, опубликована 18 августа 1994 г; международная патентная заявка W0 94/23744, опубликована 27 октября 1994 г). Примеры невирусных векторов включают, без ограничения ими, липосомы, полиаминные производные ДНК и тому подобное.
При использовании здесь, выражение "лигноцеллюлозное сырье" относится к сырью, содержащему лигноцеллюлозу. Неограничивающие примеры лигноцеллюлозного сырья включают остатки сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения дерева с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения дерева с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлозо-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, полученных при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и их комбинации.
При использовании здесь,, если не указано иное, термин "углевод" относится к соединению углерода, водорода и кислорода, которое содержит альдегидную или кетогруппу в комбинации по меньшей мере с двумя гидроксильными группами. Углеводы по настоящему изобретению также возможно могут быть замещены или дезоксигенированы по одному или более положениям. Углеводы, таким образом, включают замещенные и незамещенные моносахариды, дисахариды, олигосахариды и полисахариды. Сахарид может представлять собой альдозу или кетозу и может содержать 3, 4, 5, 6 или 7 атомов углерода. В одном воплощении они представляют собой моносахариды. В другом воплощении они могут быть пиранозными и фуранозными сахарами. Они возможно могут быть дезоксигенированы в любом соответствующем С-положении и/или замещены одной или более группировками, такими как водород, галоген, галогеналкил, карбоксил, ацил, ацилокси, амино, амидо, карбоксильные производные, алкиламино, диалкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновая кислота, тиол, имин, сульфонил, сульфанил, сульфинил, сульфамоил, эфир, карбоновая кислота, амид, фосфонил, фосфинил, фосфорил, тиоэфир, простой тиоэфир, оксим, гидразин, карбамат. Эти сахаридные звенья могут быть расположены в любом порядке, и связь между двумя сахаридными звеньями может быть осуществлена любым из примерно десяти разных способов. В результате, число различных возможных стереоизомерных олигосахаридных цепей огромно. В одном воплощении указанные углеводы выбраны из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинации.
При использовании здесь, термин "моносахарид" относится к сахарным мономерам, выбранным из группы, состоящей из трехуглеродных Сахаров (триозы), четырехуглеродных Сахаров (тетрозы) пятиуглеродных Сахаров (пентозы), шестиуглеродных Сахаров (гексозы) и др. и их комбинации. В одном воплощении пятиуглеродные сахара выбраны из группы, состоящей из кетопентозы (например рибулозы, ксилозы), альдопентозы (рибозы, арабинозы, ксилозы, ликсозы), дезоксисахара (дезоксирибозы) и их комбинации. В одном воплощении шестиуглеродные сахара выбраны из группы, состоящей из альдогексоз (например аллозы, альтрозы, глюкозы, маннозы, глюкозы, идозы, галактозы, талозы), циклических полуацеталей, кетогексоз (например псикозы, фруктозы, сорбозы, тагатозы). В одном воплощении указанные моносахариды выбраны из группы, состоящей из триоз, тетроз, пентоз, гексоз, гептоз и др. и их комбинации. В одном воплощении моносахариды находятся в линейной форме; в другом воплощении моносахариды находятся в циклической форме.
При использовании здесь, выражение "сбраживаемые сахара" относится к сахарным соединениям, которые могут быть превращены в полезные, ценные продукты ферментации, неограничивающие примеры которых включают аминокислоты, витамины, фармацевтические средства, добавки к корму для животных, специальные химические агенты, химическое сырье, пластмассы, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту и этанол, включая топливный этанол. Конкретные ценные продукты, которые могут быть получены способами по изобретению, включают, без ограничения ими, биотопливо (в том числе этанол, бутанол и изобутанол); молочную кислоту; пластмассы; специальные химические агенты; органические кислоты, в том числе лимонную кислоту, янтарную кислоту и малеиновую кислоту; растворители; добавки к корму для животных; фармацевтические средства; витамины; аминокислоты, такие как лизин, метионин, триптофан, треонин и аспарагиновая кислота; промышленные ферменты, такие как протеазы, целлюлазы, амилазы, глюканазы, лактазы, липазы, лиазы, оксидоредуктазы, трансферазы и ксиланазы; и химическое сырье.
При использовании здесь, термин "гриб" или "грибы" относится к отдельной группе эукариотических, спорообразующих организмов с абсорбтивным питанием и не имеющим хлорофилл.
2
4
3
3
4
2
4
3
3
3
3
6
4
3
3
3
3
4
2
4
2
4
При использовании здесь, термин "подкисляющее вещество" относится к любым веществам, химическим соединениям, композициям, при добавлении которых в растворитель (например воду) получается раствор с ионной активностью водорода большей, чем в чистом растворителе (например воде). Вещество может находиться в газовой, жидкой или твердой форме. Вещество может быть органическим и/или неорганическим. Неограничивающие примеры подкисляющих веществ включают любое вещество, включая галогеноводороды и их растворы (например хлористоводородную кислоту (HO), бромистоводородную кислоту (HBr), иодистоводородную кислоту (HI)), галоидные оксокислоты (например хлорноватистую кислоту, хлорную кислоту, перхлорную кислоту, йодную кислоту и соответствующие соединения брома и йода), серную кислоту (HSO), фторсульфоновую кислоту, азотную кислоту (HNO), фосфорную кислоту (HPO), фторсурьмяную кислоту, фторборную кислоту, гексафторфосфорную кислоту, хромовую кислоту (HCrO), сульфоновые кислоты, метансульфоновую кислоту (синоним мезиловая кислота, MeSCOH), этансульфоновую кислоту (синоним эзиловая кислота, EtSOH), бензолсульфокислоту (синоним безиловая кислота, PhSOH), лара-толуолсульфокислоту (синоним тозиловая кислота) (CHCHSOH), трифторметансульфокислоту (синоним трифликовая кислота, CFSOH), карбоновые кислоты (например уксусную кислоту, лимонную кислоту, муравьиную кислоту, глюконовую кислоту, молочную кислоту, щавелевую кислоту, винную кислоту), винилогические карбоновые кислоты (например аскорбиновую кислоту, кислоту Мелдрума), кислые соли (например бикарбонат натрия (NaHCO), гидросульфид натрия (NaHS), бисульфат натрия (NaHSO), мононатрийфосфат (NaHPO) и динатрийфосфата (NaHPO)).
При использовании здесь, термин "высокоэнергетические метаболиты" относится к метаболитам, продуцируемым организмом (например грибом), где метаболит можно использовать непосредственно в качестве биотоплива (например спирт) или в качестве предшественника для получения биотоплива (например липиды для биодизеля).
При использовании здесь, термин "нейтрализовать", "нейтрализующий" и "нейтрализация" относится к химической реакции в водных растворах, где кислота и основание взаимодействуют с образованием воды и соли и, где pH раствора доведен до значения, близкого к 7.
2
10
5
6
2
2
2
2
3
3
3
3
3
2
6
9
6
3
3
3
2
6
11
2
3
2
2
2
2
5
6
2
2
2
2
2
2
3
5
3
2
4
3
2
4
2
32
16
8
4
3
3
32
16
8
48
28
4
8
5
4
3
3
5
4
2
5
2
16
22
При использовании здесь, термин "донор марганца" относится к композиции или соединению, которые могут обеспечить ион марганца (например марганец(I), марганец(II) и марганец(III)) в водном растворе. Неограничивающие примеры доноров марганца включают Mn(СО), K[Mn(CN)NO, MnCl, MnF, MnBr, MnO, MnO, MnCl, MnF, MnBr, MnCO, Mn(CHCOO), CHMnO, MnTiO, [СНСОСН=С(O)СН]Mn, [CH(CH)CO]Mn, (HCO)Mn, Mn(CHFO), Mn(PHO), Mnl, (CHO)Mn, MnMoO, Mn(NO), Mn(ClO), CHMnN, MnSO, (CHCOO)Mn, CHClMnN, CHClMnNO, СНСНМn(СО), Mn(CHCH) и CHMn.
2
3
2
4
3
4
2
4
2
4
3
3
4
2
4
2
4
3
2
2
3
2
3
3
3
3
2
2
При использовании здесь, выражение "pH-буферные вещества" относится к композициям, которые при добавлении в жидкую смесь могут поддерживать pH указанной жидкой смеси, где pH поддерживается около примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9, примерно 2,0, примерно 2,1, примерно 2,2, примерно 2,3, примерно 2,4, примерно 2,5, примерно 2,6, примерно 2,7, примерно 2,8, примерно 2,9, примерно 3,0, примерно 3,1, примерно 3,2, примерно 3,3, примерно 3,4, примерно 3,5, примерно 3,6, примерно 3,7, примерно 3,8, примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4, примерно 6,5 примерно 6,6, примерно 6,7, примерно 6,8, примерно 6,9 или примерно 7,0. Например, pH жидкой смеси находится в диапазоне от примерно 0,5 до примерно 3,0. Такая композиция может содержать такие соединения, как кислота, соли кислот, основания и соли оснований, например HCl, HNQ, HSO, NaHCO, NaHS, NaHSO, NaHPO, NaHPO, NaHSO, KHCO, KHS, KHSO, KHPO, KHPO, KHSO, NaOH, KOH, Mg(OH), NaCO, KCO, KHCO, CaCO, MgCO, NaS, KS и др.
При использовании здесь, термин "аэробные условия" относится к условиям, которые обеспечивают достаточное количество кислорода, и анаэробное дыхание у микроорганизмов, растущих в таких условиях, становится невозможным.
При использовании здесь, термин "по существу аэробные условия" относится к условиям, когда подача кислорода ограничена, но клеточное дыхание в организме представляет собой преимущественно аэробное дыхание.
При использовании здесь, термин "биотопливо" (также называемый биоэнергия) определяется как твердое, жидкое или газообразное топливо, полученное из относительно недавно умершего или умирающего биологического материала и отличается от ископаемого топлива, которое получено из давно умершего биологического материала. Теоретически оно может быть получено из любого биологического источника углерода.
Биотопливо может подразделяться на биотопливо первого поколения (которое получают из сахара, крахмала, растительного масла и животных жиров, включая, но без ограничения ими, растительное масло, биодизель, биоспирты, биоэфиры, биогаз, синтетический газ и твердое биотопливо), биотопливо второго поколения (которое получают из биомассы непищевых культур, также называемое целлюлозное биотопливо, включая, но без ограничения ими, биоводород, биометанол, DMF (диметилфуран), Bio-DME (био-диметиловый эфир), дизель Фишера-Тропша, биоводородный дизель, смешанные спирты и древесный дизель) и биотопливо третьего поколения (также называемое водорослевое топливо, которое получают из водорослей).
Термин "предшественник биотоплива" относится к органической молекуле, в которой весь содержащийся углерод получен из биомассы и биохимически преобразован. Он может быть дополнительно превращен, либо химически, либо биохимически, в биотопливо. Например, предшественник биотоплива включает, без ограничения ими, например, изобутанол, изопропанол, пропанол, 2-бутанол, бутанол, пентанол, 2-пентанол, 3-пентанол, 3-метил-1-бутанол, 2-метил-1-бутанол, 3-метил-2-бутанол и липид.
При использовании здесь, термин "биодизель" относится к растительному маслу или дизельному топливу на основе животного жира, состоящему из длинноцепочечных алкиловых (например метиловых, пропиловых или этиловых) сложных эфиров. Он может быть получен посредством химической реакции липидов с одним или более типами спирта в реакции переэтерификации. Химически он содержит смесь моноалкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот. Спирты, которые можно использовать для получения биодизеля, включают, без ограничения ими, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол и 2-этоксиэтанол. Для облегчения эстерификации жирных кислот можно использовать кислый или щелочной катализатор. Глицерин образуется как побочный продукт таких реакций.
При использовании в данном описании изобретения, выражение "жирные кислоты" относится к длинноцепочечным молекулам, имеющим метильную группу на одном конце и группу карбоновой кислоты на другом конце.
При использовании в данном описании изобретения, выражение "выделенный гриб" относится к любой композиции, содержащей популяцию грибов, полученную из природного источника.
При использовании здесь, термин "биоспирты" относится к спиртам, синтезируемым биологически, включая, но без ограничения ими, биоэтанол, биометанол, биобутанол и другие биоспирты.
n
2n+1
При использовании здесь, термин "спирт" относится к любому органическому соединению, в котором гидроксильная группа (-OH) связана с атомом углерода алкильной или замещенной алкильной группы. Важная группа спиртов образована простыми ациклическими спиртами, общей формулой которых является CHOH.
При использовании здесь, термин "биогаз" относится к газу, полученному посредством биологического разложения органического вещества в отсутствие кислорода. Биогаз происходит из биогенного вещества и является одним из типов биотоплива.
При использовании здесь, термин "сидерофоры" относится к малым, высокоаффинным хелатным соединениям, включающим ион металла, секретируемым микроорганизмами, такими как бактерии, грибы, и травами.
При использовании здесь, термин "сырье" относится к необработанному материалу или смеси необработанных материалов, поставляемых в процесс биокатализа или ферментации, из которых могут быть получены другие продукты. Например, источник углерода, такой как биомасса или углеродные соединения, полученные из биомассы, является сырьем для биокатализатора, который производит биотопливо и/или предшественник биотоплива в процессе ферментации. Кроме того, сырье может содержать питательные вещества, отличные от источника углерода. Сырьем также могут являться муниципальные, промышленные и сельскохозяйственные сточные отходы.
При использовании здесь, термин "биокатализатор" относится к живой системе или клетке любого типа, которые ускоряют химические реакции путем снижения энергии активации реакции и не разрушаются и не изменяются в процессе реакции. Биокатализаторы могут включать, без ограничения ими, микроорганизмы, такие как дрожжи, грибы, бактерии и археи. Например, выделенный штамм гриба по настоящему изобретению можно использовать в качестве биокатализатора при получении биотоплива.
При использовании здесь, термин "ферментация" или "процесс ферментации" относится к процессу, в котором биокатализатор культивируют в культуральной среде, содержащей исходные вещества, такие как сырье и питательные вещества, где биокатализатор превращает исходные вещества, такие как сырье, в продукты.
При использовании здесь, термин "источник углерода", как правило, относится к веществу, подходящему для использования в качестве источника углерода для роста прокариотических или эукариотических клеток. Источники углерода включают, без ограничения ими, гидролизаты биомассы, углеводы (например крахмал, сахарозу, полисахариды и моносахариды), целлюлозу, гемицеллюлозу, ксилозу и лигнин, а также мономерные компоненты этих субстратов. Источники углерода могут содержать различные органические соединения в различных формах, включая, но без ограничения ими, полимеры, углеводы, кислоты, спирты, альдегиды, кетоны, аминокислоты, пептиды и т.д. Они включают, например, различные моносахариды, такие как глюкоза, декстроза (D-глюкоза), мальтоза, олигосахариды, полисахариды, насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, сукцинат, лактат, ацетат, этанол и т.д., или их смеси. Фотосинтезирующие организмы могут дополнительно производить источник углерода, в качестве продукта фотосинтеза.
При использовании здесь, термин "биомасса" относится к биологическому веществу, полученному из живых или недавно живых организмов, например стеблей, листьев и крахмалсодержащих частей зеленых растений, или древесины, отходов, порубочных остатков (мертвых деревьев, веток и пней деревьев), дворовой щепы, деревянных стружек, или веществ, полученных из водорослей или животных, и состоит главным образом из крахмала, лигнина, пектина, целлюлозы, гемицеллюлозы и/или пектина. Биомасса может также включать в себя биоразлагаемые отходы, которые могут быть сожжены в качестве топлива. Она не включает органическое вещество, такое как ископаемое топливо, которое трансформировалось в результате геологических процессов в такие вещества, как уголь или нефть. Биомасса может быть разложена посредством химической или ферментативной обработки до мономерных Сахаров и фенолов, из которых она состоит (Wyman, С.Е. 2003 Biotechnological Progress 19: 254-62). Это полученное вещество, называемое гидролизатом биомассы, нейтрализуют и обрабатывают для удаления следовых количеств органического вещества, которые могут негативно воздействовать на биокатализатор, и затем используют в качестве сырья для ферментации с использованием биокатализатора.
При использовании здесь, термин "целлюлозная биомасса" относится к биомассе, состоящей, главным образом, из растительных волокон, которые являются несъедобными или почти несъедобными для людей, и важным компонентом которых является целлюлоза. Эти волокна могут быть гидролизованы с получением различных Сахаров, которые можно ферментировать микроорганизмами. Примеры целлюлозной биомассы включают траву, дерево и богатые целлюлозой остатки, полученные от сельского хозяйства или лесной промышленности.
При использовании здесь, термин "крахмал" относится к полимеру глюкозы, легко гидролизуемому пищеварительными ферментами. Крахмал обычно концентрируется в специализированных участках растений, таких как картофель, зерна кукурузы, рисовые зерна, зерна пшеницы и стебли сахарного тростника.
При использовании здесь, термин "лигнин" относится к полимерному веществу, состоящему главным образом из соединенных фенольных мономерных соединений, таких как лара-кумариловый спирт, конифериловый спирт и синапиловый спирт, которые являются основой структурной жесткости в растениях и часто называются древесной частью растений. Лигнин также считается неуглеводной частью клеточной стенки растений.
6
10
5
n
При использовании здесь, термин "целлюлоза" относится к длинноцепочечному полимерному полисахаридному углеводу бета-глюкозы формулы (CHO), обычно встречающемуся в стенках растительных клеток в комбинации с лигнином и какой-либо гемицеллюлозой.
При использовании здесь, термин "гемицеллюлоза" относится к классу полисахаридов клеточной стенки растений, который может представлять собой любой из нескольких гетерополимеров. Они включают ксилан, ксилоглюкан, арабиноксилан, арабиногалактан, глюкуроноксилан, глюкоманнан и галактоманнан. Мономерные компоненты гемицеллюлозы включают, без ограничения ими: D-галактозу, L-галактозу, D-маннозу, L-рамнозу, L-фукозу, D-ксилозу, L-арабинозу и D-глюкуроновую кислоту. Этот класс полисахаридов встречается практически во всех клеточных стенках наряду с целлюлозой. Гемицеллюлоза имеет меньшую массу, чем целлюлоза, и не может быть экстрагирована с помощью горячей воды или хелатирующих агентов, но может быть экстрагирована с помощью водного раствора щелочи. Полимерные цепи гемицеллюлозы связывают пектин и целлюлозу в сеть сшитых волокон, образующих клеточные стенки большинства растительных клеток.
Термин "пектин", при использовании здесь, относится к классу гетерогенных полисахаридов клеточной стенки растений, которые могут быть экстрагированы посредством обработки кислотами и хелатирующими агентами. Как правило, 70-80% пектина обнаруживается в виде линейной цепи мономеров α-(1-4)-связанной D-галактуроновой кислоты. Меньшая RG-I фракция пектина состоит из чередующихся (1-4)-связанной галактуроновой кислоты и (1-2)-связанной L-рамнозы, с существенным арабиногалактановым разветвлением, происходящим от остатка рамнозы. Другие моносахариды, такие как D-фукоза, D-ксилоза, апиоза, ацеровая кислота, Kdo (2-кето-3-дезокси-D-манно-октоновая кислота), Dha (3-дезокси-D-ликсо-гептулозаровая кислота), 2-O-метил-D-фукоза и 2-O-метил-D-ксилоза, встречаются либо во фракции пектина RG-II (<2%), либо в качестве минорных компонентов во фракции RG-I. Доли каждого из моносахаридов относительно D-галактуроновой кислоты варьируются в зависимости от конкретного растения и его микроокружения, вида и времени в цикле роста. По тем же самым причинам фракции моногалактуронана и RG-I могут значительно отличаться по содержанию в них метиловых эфиров на остатках GalA и по содержанию эфиров ацетильных остатков в положениях С-2 и С-3 GalA и нейтральных Сахаров.
При использовании в данном описании изобретения, выражение "факультативный анаэробный организм" или "факультативный анаэробный микроорганизм" или "факультативный анаэробный биокатализатор" определено как организм, который может расти в присутствии или в отсутствие кислорода, такой как штаммы грибов по настоящему изобретению.
При использовании здесь, термин "побочный продукт" означает нежелательный продукт, связанный с производством биотоплива и/или предшественника биотоплива. Побочные продукты, как правило, рассматриваются как отходы и увеличивают стоимость способа.
При использовании здесь, термин "сопутствующий продукт" означает второстепенный или побочный продукт, связанный с производством биотоплива и/или предшественника биотоплива. Сопутствующие продукты имеют потенциальную коммерческую стоимость, которая увеличивает полную стоимость получения предшественника биотоплива, и может быть решающим фактором в отношении рентабельности конкретного способа получения предшественника биотоплива.
При использовании здесь, термин "сушеная барда", сокращенно DDG, относится к твердым веществам, остающимся после ферментации, обычно состоящим из неизрасходованных твердых сырьевых веществ, оставшихся питательных веществ, белка, волокна и масла, а также биокаталитического клеточного дебриса. Этот термин также может включать растворимое остаточное вещество после ферментации и тогда упоминается как " сушеная барда и растворимые компоненты" (DDGS). DDG или DDGS являются примером сопутствующего продукта в процессе получения предшественника биотоплива.
При использовании здесь, термин "питательное вещество" определен, как химическое соединение, которое используется биокатализатором для роста и выживания. Питательные вещества могут быть органическими соединениями, такими как углеводы и аминокислоты, или неорганическими соединениями, такими как соли металлов.
При использовании здесь, термин "комплексное питательное вещество" определен как источник питательных веществ, содержащий в основном мономерные органические соединения, используемые биокатализатором для продуцирования белков, ДНК, липидов и углеводов. Термин "богатое питательное вещество" по всему описанию изобретения используются взаимозаменяемо с термином комплексное питательное вещество. Как правило, комплексные питательные вещества или богатые питательные вещества получают из биологических веществ, таких как отходы скотобоен, молочные отходы или сельскохозяйственные остатки. Комплексные питательные вещества или богатые питательные вещества включают, без ограничения ими: дрожжевой экстракт, триптон, пептон, соевый экстракт, кукурузный экстракт, соевый белок и казеин.
При использовании в данном описании изобретения, выражение "аэробный метаболизм" относится к биохимическому процессу, в котором кислород используется для получения энергии из углеводов, обычно в форме АТФ. Типичный аэробный метаболизм осуществляется посредством гликолиза и цикла ТСА (трикарбоновых кислот), когда одна молекула глюкозы в присутствии кислорода полностью метаболизируется в двуокись углерода.
При использовании в данном описании изобретения, выражение "анаэробный метаболизм" относится к биохимическому процессу, в котором кислород не является конечным акцептором электронов, содержащихся в NADH. Анаэробный метаболизм можно разделить на анаэробное дыхание, при котором соединения, отличные от кислорода, служат в качестве конечного акцептора электронов, и ферментации, при которой электроны от NADH, используются для создания восстановленного продукта "ферментативным путем".
При использовании здесь, термин "рекомбинантный микроорганизм" и "рекомбинантная клетка хозяина" используются взаимозаменяемо и относятся к микроорганизмам, которые были генетически модифицированы, чтобы экспрессировать и сверхэкспрессировать эндогенные полинуклеотиды, или экспрессировать гетерологичные полинуклеотиды, такие, как включенные в вектор, или такие, которые имеют уменьшенную экспрессию эндогенного гена. Полинуклеотид, как правило, кодирует целевой фермент, вовлеченный в метаболический путь, для получения нужного метаболита. Следует понимать, что термины "рекомбинантный микроорганизм" и "рекомбинантная клетка-хозяин" относятся не только к конкретному рекомбинантному микроорганизму, но и к потомству или к возможному потомству такого микроорганизма. Поскольку некоторые модификации могут происходить в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо влияния окружающей среды, такое потомство может на самом деле не быть идентичным родительской клетке, но все же включено в объем данного термина при использовании в данном описании.
При использовании здесь, термин "ферментация" относится к способу получения биотоплива и других продуктов, где биомассу (предварительно обработанную или предварительно необработанную) ферментируют с помощью микроорганизмов (например бактерий, цианобактерий, дрожжей, грибов или водорослей).
Используемые здесь термин "микробиологическая ферментация" относится к процессу, в котором органические вещества разлагаются и вновь собираются в продукты при помощи микроорганизмов. Эти вещества могут включать, без ограничения ими, глюкозу, сахарозу, глицерин, крахмал, мальтодекстрин, лактозу, жиры, углеводороды, белок, аммиак, нитраты, источники фосфора. Продукты могут включать, без ограничения ими, традиционные продукты (включающие, без ограничения ими, хлеб, пиво, вино, спиртные напитки, сыр, молочные продукты, ферментированные мясные продукты и овощи, грибы, соевый соус и уксус), сельскохозяйственные продукты (включающие, без ограничения ими, гиббереллины, фунгициды, инсектициды, силос, аминокислоты, такие как L-глутамин, L-лизин, L-триптофан, L-треонин, L-аспарагиновая кислота (+), L-арилглицины), ферменты (включающие, без ограничения ими, углеводы, целлюлозы, липазы, пектиназы, протеазы), топливо и химическое сырье (включающее, без ограничения ими, ацетон, бутанол, бутандиол, изопропиловый спирт, этанол, глицерин, метан, глицерин, масляную кислоту, метан, лимонную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, итаконовую кислоту, уксусную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, глюконовую кислоту, винную кислоту и L-глутаровую кислоту, или соли любой из этих кислот), нуклеотиды, органические кислоты, фармацевтические средства и родственные соединения (включающие, без ограничения ими, алкалоиды, антибиотики, гормоны, иммунодепрессант, интерферон, стероиды, вакцины, витамины) и полимеры (включающие, без ограничения ими, альгинаты, декстран, геллан, полигидроксибутират, склероглюкан и ксантан). Микроорганизмы, используемые для ферментации, могут включать как прокариотические микроорганизмы (в том числе бактерии, цианобактерий), так и эукариотические микроорганизмы (в том числе дрожжи, грибы и водоросли).
При использовании в данном описании изобретения, выражение "энергетическая культура" относится к растениям, выращиваемым в качестве низкозатратного и не требующего особого ухода урожая, используемого для получения биотоплива, или непосредственного используемых из-за содержания в них энергии. Коммерческие энергетические культуры, как правило, представляют собой плотно посаженные, высокоурожайные виды культур, где энергетические культуры сжигают для выработки энергии. Широко используются древесные культуры, такие как ива или тополь, а также тропические травы, такие как мискантус и пеннисетум красный (оба известны как слоновая трава). Если содержание углевода необходимо для получения биогаза, урожай растительной массы, такой как кукуруза, суданская трава, просо, донник белый и многие другие могут быть превращены в силос, а затем превращены в биогаз.
При использовании здесь, термин микроаэробные относится к среде, в которой концентрация кислорода меньше, чем в воздухе, но клеточное дыхание в организме в основном является аэробным дыханием.
Fusarium
Виды Fusarium могут продуцировать три типа спор, называемых макроконидии, микроконидии и хламидоспоры. Макроконидии продуцируются в специализированной структуре, называемой спородохий, где масса спор поддерживается поверхностной подушковидной массой коротких монофиалид, несущих макроконидии, или продуцируются на монофиалидах и полифиалидах в воздушном мицелии. Монофиалида представляет собой конидиофор только с одним отверстием или порой, через которое эндоконидии выдавливаются, в то время как полифиалида имеет два или более таких отверстий или пор. Некоторые конидии являются промежуточными по размеру и форме и их называют и макроконидии, и мезоконидии. Микроконидии продуцируются в воздушном мицелии, но не в спородохиях. Они могут продуцироваться только в фальшивых головках или фальшивых головках и цепочках на монофиалидах или полифиалидах. Фальшивые головки возникают, когда капля влаги образуется на кончике конидиеносца и содержит эндоконидии, как они продуцируются. Микроконидии бывают разных форм и размеров, а микроконидии, продуцируемые в цепочках, имеют усеченное основание. Третьим типом спор, образуемых видами Fusarium, является хламидоспора, которая представляет собой толстостенную спору, заполненную липидоподобным веществом, которое служит для поддержания грибов в течение зимы в почве, когда подходящий хозяин не доступен. Хламидоспоры могут находиться поодиночке, в парах, в комках или в цепочках, и внешняя стенка может быть гладкой или шероховатой. Морфологию этих спор можно использовать для разделения видов Fusarium.
Способы переноса и культивирования видов Fusarium хорошо известны в данной области техники. Например, односпоровый метод и или метод с использованием верхушки гифы являются основными средствами, используемыми для инициирования и переноса культур видов Fusarium. Метод верхушки гифы используют для переноса культур видов Fusarium, которые быстро мутируют после переноса единичными конидиями. Перенос выполняют под препаровальной лупой, во многом таким же образом, как и перенос одного прорастающего конидия. Четыре среды, используемой для выращивания видов Fusarium для идентификации, представляют собой агар с листом садовой гвоздики (Fisher et al., 1982, Carnation leaves as a substrate and for preserving Fusarium species. Phytopathology 72: 151-153), картофельный агар с декстрозой (Nelson et al., 1983. Fusarium species: an illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press, University Park), KCl среду (Fisher et al., 1983. Taxonomic importance of microconidial chains in Fusarium section Liseola and effects of water potential on their formation. Mycologia 75: 693-698) и почвенный агар (Klotz et al., 1988. A medium for enhancement of chlamydospore formation in Fusarium species. Mycologia 80: 108-109), каждый из которых включен посредством ссылки во всей своей полноте.
Большинство видов Fusarium, выделенных из природы, продуцирует свои макроконидии на спородохиях. Тип спородохий часто мутирует в культуре, особенно в среде, богатой углеводами. Мутации могут также происходить в природе, но являются редкими. Эти мутанты могут дать начало другим, так что образуется последовательность мутаций. В патогенных изолятах эти мутанты часто демонстрируют потерю вирулентности и способность продуцировать токсины может быть уменьшена или потеряна. Двумя основными типами мутантов, продуцируемых спородохиальным типом, являются пионнотальный тип (например продуцирующий незначительное количество воздушного мицелия или не продуцирующий его; продуцирующий многочисленные макроконидии на поверхности колоний, в результате чего поверхность выглядит блестящей и влажной; с более интенсивной пигментацией колоний, чем спородохиальные колонии; с продуцированием более длинных и более тонких макроконидий, чем макроконидии, продуцируемые спородохиальным типом; менее вирулентный, чем спородохиальный тип, а также может терять способность продуцировать токсины) и мицеллиальный тип (например продуцирующий обильный воздушный мицелий; продуцирующий очень незначительное количестве макроконидии или не продуцирующий их; с частым отсутствием спородохий, склероции и пигментации в культуре; мутанты, которые могут быть менее вирулентными, чем спородохиальный тип, а также могут терять способность продуцировать токсины).
Процедуры, которые уменьшают мутантные популяции, включают, без ограничения ими, инициацию культур из единичной конидии; инициацию культур из единичных верхушек гиф; не использование сред, богатых углеводами; и сокращение пересевов до минимума, как описано в Nelson et al. (1983, Fusarium species: an illustrated manual for identification, Pennsylvania State University Press, University Park).
Неограничивающие примеры видов Fusarium включает Fusarium angustum (синоним F. oxysporum), Fusarium aquaeductuum (например Fusarium aquaeductuum var. dimerum, синоним F. dimerum), Fusarium aquaeductuum var. media (например Fusarium bostrycoides, синоним F. oxysporum, Fusarium chlamydosporum (синоним Dactylium fusarioides, F. fusarioides, F. sporotrichioides var. chlamydosporum, F. tricinctum), Fusarium coeruleum (синоним F. solani var. coeruleum), Fusarium conglutinans (синоним F. oxysporum), Fusarium dianthi (синоним F oxysporum), Fusarium dimerum (синонимы F. aquaeductuum var. dimerum, F. episphaeha), Fusarium episphaeha (синоним F. dimerum), Fusarium eumartii (синоним F. solani), Fusarium fujikuroi (синоним F. moniliforme), Fusarium fusarioides (синоним F. chlamydosporum), Fusarium illudens (синоним F. solani), Fusarium incarnatum (синоним F. semitectum), Fusarium javanicum (синоним F. solani), Fusarium lini (синоним F. oxysporum), Fusarium moniliforme (синоним F. proliferatum, F. verticillioides, F. fujikuroi, F. verticillioides), Fusarium moniliforme var. intermedium (синоним F. proliferatum), Fusarium napiforme, Fusarium orthoceras (синоним F. oxysporum), Fusarium oxysporum (синоним F. angustum, F. bostrycoides, F. bulbigenum, F. conglutinans, F. dianthi, F. lini, F. orthoceras, F. tracheiphilum, F. vasinfectum), Fusarium pallidoroseum (синоним F. semitectum), Fusarium proliferatum (синоним F. moniliforme, F. moniliforme var. intermedium), Fusarium roseum (синоним F. semitectum), Fusarium roseum var. arthrosporioide (синоним F. semitectum), Fusarium sacchari, Fusarium semitectum (синоним F. incarnatum, F. pallidoroseum, F. roseum, F. roseum var. arthrosporioide, Pseudofusarium semitectum), Fusarium solani (синоним F. eumartii, F. illudens, F. javanicum, F. tumidum, F. ventricosum, Fusispohum solani, Nectria haematococca), Fusarium solani var. coeruleum (синоним F. coeruleum), Fusarium sporotrichiella var. sporotrichioides (синоним F. sporotrichoides), Fusarium sporotrichioides var. chlamydosporum (синоним F. chlamydosporum.), Fusarium sporotrichoides (синоним F. sporotrichiella var. sporotrichioides, F. tricinctum, Sporotrichella rosea), Fusarium sub glutinans, Fusarium tabacinum (телеоморф Plectosphaerella cucumerina), Fusarium tracheiphilum (синоним F. oxysporum), Fusarium tricinctum (синоним F. chlamydosporum, F. sporotrichoides), Fusarium tumidum (синоним F. solani), Fusarium vasinfectum (синоним F. oxysporum), Fusarium ventricosum (синоним F. solani) и Fusarium verticillioides (синоним F. moniliforme).
Более подробная информация о видах Fusarium, их способах выделения и культивирования описана в Nelson et al., (Taxonomy, Biology, and Clinical Aspects of Fusarium Species, 1994, Clinical Microbiology Reviews, 7 (4): 479-504), Toussoun and Nelson (1976, Fusarium), Booth (Fusarium; laboratory guide to the identification of the major species, 1977, Commonwealth Mycological Institute, ISBN 0851983839, 9780851983837) и Leslie et al. (The Fusarium laboratory manual, 2006, Wiley-Blackwell, ISBN 0813819199, 9780813819198), каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей полноте.
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum, также известный, как патоген панамской болезни или Agent Green, представляет собой гриб, вызывающий фузариозное увядание более чем ста видов растений. Он действует путем колонизации водопроводящих сосудов (ксилемы) растения. В результате такой закупорки и выхода из строя ксилемы у растений появляются такие симптомы, как увядание, пожелтение листьев и в конечном счете гибель растений. Интерес к Fusarium oxysporum как к гербициду впервые возник после обнаружения в 1960-ых, что он являлся причиной уничтожения популяции гавайской коки.
Представители комплекса видов Fusarium oxysporum (FOSC) представляют собой наиболее распространенные патогенные Fusaria. Они вызывают фузариозное увядание более 100 культурных видов растений, включая помидоры, картофель, сахарный тростник, бобы, вигну, финиковую и масличную пальму, а также кулинарные и десертные сорта бананов (Beckman, 1987. The Nature of Wilt Diseases of Plants. The American Phytopathological Society Press, St. Paul). Поскольку он является долгоживущим почвенным патогеном, зараженная почва остается загрязненной неопределенно долго, так что на этом месте можно выращивать только устойчивые разновидности.
Штамм 4287 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (штамм 2, VCG 0030) был полностью секвенирован. Размер генома оценивается в 59,9 Мб. Эта характеристика позволяет осуществить широкое исследование взаимодействий хозяин-патоген, патогенной инфекции и механизмов защиты растений с использованием модельной системы растений A. thaliana. В результате интенсивных исследований в течение последних 10 лет этот штамм продемонстрировал замечательную фенотипическую стабильность, включая рост мицелия на разных питательных средах, спорообразование и высокую вирулентность. Этот штамм также в высокой степени поддается трансформации, как с помощью протопластов, так и с помощью Agrobacterium tumefaciens, и опосредованному трансформацией разрушению гена. Карта митотического сцепления была создана на основании слияния протопластов двух штаммов F. oxysporum f, sp. lycopersici, VCG 0030 (Teunissen et al. 2003, A Near-Isogenic Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Strain with a Novel Combination of Avirulence Characteristics, Phytopathology, 93 (11): 1360-1367). Также были разработаны новая высокоэффективная техника нокаута гена и молекулярные цитологические способы (Khang et al, 2005, A dual selection based, targeted gene replacement tool for Magnaporthe ghsea and Fusarium oxysporum. Fungal Genet. Biol. 42: 483-492). Также имеется микроматричный анализ Fusarium oxysporum (Mcfadden et al, 2006, Fusarium wilt {Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum) genes expressed during infection of cotton (Gossypium hirsulum), Molecular Plant Pathology 7 (2): 87-101).
Макроскопическая морфология Fusarium oxysporum может существенно варьироваться на разных средах. Приведенное ниже описание основано на росте на агаре из картофельных хлопьев при 25°C и циклами включения/выключения люминесцентного света длительностью примерно 12 часов каждый. Гифы являются септатными и гиалиновыми. Конидиеносцы являются короткими (по сравнению с конидиеносцами F. solani) и простыми (обычно неразветвленными). Макроконидии обычно продуцируются обильно, являются слегка серповидными, тонкостенными, с вытянутой апикальной клеткой и имеющей форму ступни базальной клеткой. Они имеют от трех до пяти перегородок, составляющих 23-54×3-4.5 мкм. Микроконидии представлены изобильно, обычно не имеют перегородок, имеют форму от эллипсоидной до цилиндрической, слегка изогнуты или прямые, составляют 5-12×2,3-3,5 мкм, встречаются в фальшивых головках (скопление конидий на кончике фиалиды) из коротких монофиалид. Хламидоконидии присутствуют и часто в изобилии, при этом встречаются в одиночку или парами. В то время как F. solani является наиболее распространенным клиническим изолятом, Fusarium oxysporum является вторым по распространения выявленным видом. Сообщалось, что он присутствует при кожных и ногтевых инфекциях, подкожном заболевании, у ребенка с нейтропенией, контролируемой гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, в диссеминированной инфекции в гемофагоцитарном лимфогистиоцитозе, и в безнадежном случае включает перекрестную реакцию с зондом рода пан-Candida. Этот вид обычно легко определить по его лавандовому цвету на картофельном агаре с декстрозой, его коротким монофиалидам и микроконидиям, образующимся только в фальшивых головках.
Неограничивающие примеры ранее выделенных форм Fusarium oxysporum включают Fusarium oxysporum 247, Fusarium oxysporum CL57, Fusarium oxysporum f. cubense, Fusarium oxysporum f. perniciosum, Fusarium oxysporum f. sp. aechmeae, Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, Fusarium oxysporum f. sp. allii, Fusarium oxysporum f. sp. apii, Fusarium oxysporum f. sp. arctii, Fusarium oxysporum f. sp. asparagi, Fusarium oxysporum f. sp. basilici, Fusarium oxysporum f, sp. batatas, Fusarium oxysporum f. sp. betae, Fusarium oxysporum f. sp. bouvardiae, Fusarium oxysporum f. sp. bulbigenum, Fusarium oxysporum f. sp. callistephi, Fusarium oxysporum f. sp. canariensis, Fusarium oxysporum f. sp. cannabis, Fusarium oxysporum f. sp. carthami, Fusarium oxysporum f. sp. cassiae, Fusarium oxysporum f. sp. cattleyae, Fusarium oxysporum f. sp. cepae, Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi, Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, Fusarium oxysporum f. sp. colocasiae, Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans, Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Fusarium oxysporum f. sp. cucurbitacearum, Fusarium oxysporum f. sp. cyclaminis, Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis, Fusarium oxysporum f. sp. erythroxyli, Fusarium oxysporum f. sp. fabae, Fusarium oxysporum f. sp. foetens, Fusarium oxysporum f. sp. fragariae, Fusarium oxysporum f. sp. gladioli, Fusarium oxysporum f. sp. glycines, Fusarium oxysporum f. sp. hebes, Fusarium oxysporum f. sp. helioiropii, Fusarium oxysporum f. sp. koae, Fusarium oxysporum f. sp. lactucae, Fusarium oxysporum f. sp. lagenariae, Fusarium oxysporum f. sp. lentis, Fusarium oxysporum f. sp. lilii, Fusarium oxysporum f. sp. lini, Fusarium oxysporum f. sp. loti, Fusarium oxysporum f. sp. luffae, Fusarium oxysporum f. sp. lupini, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f. sp. matthiolae, Fusarium oxysporum f. sp. medicaginis, Fusarium oxysporum f. sp. melongenae, Fusarium oxysporum f. sp. melonis, Fusarium oxysporum f. sp. momordicae, Fusarium oxysporum f. sp. narcissi, Fusarium. oxysporum f. sp. nelumbicola, Fusarium oxysporum f. sp. niveum, Fusarium oxysporum f. sp. opuntiarum, Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae, Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, Fusarium oxysporum f. sp. pini, Fusarium oxysporum f. sp. pisi, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Fusarium oxysporum f. sp. rapae, Fusarium oxysporum f. sp. raphani, Fusarium oxysporum f. sp. rauvolfiae, Fusarium oxysporum f. sp. rhois, Fusarium oxysporum f. sp. ricini, Fusarium oxysporum f. sp. sesami, Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae, Fusarium oxysporum f. sp. strigae, Fusarium oxysporum f. sp. tracheiphilum, Fusarium oxysporum f. sp. tulipae, Fusarium oxysporum f. sp. vanillae, Fusarium oxysporum f. sp. vasinfecium, Fusarium oxysporum f. sp. voandzeiae, Fusarium oxysporum f. sp. zingiberi, Fusarium oxysporum f. tuberosi, Fusarium oxysporum Fo47, Fusarium oxysporum Fo5176, Fusarium oxysporum FOL 4287, Fusarium oxysporum Fov24500, Fusarium oxysporum II5, Fusarium oxysporum MN25, Fusarium oxysporum NRRL 25433, Fusarium oxysporum NRRL 26406, Fusarium oxysporum NRRL 32931, Fusarium oxysporum PHW808, Fusarium oxysporum PHW815 и Fusarium oxysporum var. meniscoideum.
Выделенный штамм гриба
В настоящем изобретении предложен выделенный, расщепляющий лигноцеллюлозу, ацидофильный штамм гриба Fusarium oxysporum и его потомство, где выделенный штамм гриба и его потомство имеют по меньшей мере следующие идентифицирующие характеристики:
а) выделенный штамм является ацидофильным и может расти при pH в диапазоне от примерно 0,7 до примерно 7,5; и
б) продуцирует липиды из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов или их комбинации в аэробных или по существу аэробных условиях.
В одном воплощении выделенный штамм по настоящему изобретению, кроме того, имеет одну или более следующих дополнительных идентифицирующих характеристик:
в) продуцирует этанол и/или водород из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов, или их комбинации в анаэробных или анаэробных условиях;
г) устойчив к концентрациям Mn вплоть до 25 мМ, концентрациям As вплоть до 250 мМ или 300 мМ, и к концентрациям Hg вплоть до 100 мМ;
д) способен депарафинизировать пшеничную солому и другие растительные материалы;
е) способен продуцировать липиды из водорослевого сырья и из отходов, образующихся при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) в аэробных или по существу аэробных условиях;
ж) способен продуцировать этанол и/или водород из водорослевого сырья и из отходов, образующихся при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) в анаэробных или анаэробных условиях;
з) способен продуцировать диизооктилфталат (DIOP);
и) способен продуцировать гександионовой кислоты моно(2-этилгексил)овый сложный эфир; и
к) содержит 18S рРНК и последовательность ДНК области ITS, которая обладает по меньшей мере 98% идентичностью с SEQ ID NO: 1.
В одном воплощении указанный выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum представляет собой штамм, обозначенный как МК7, который был депонирован как АТСС номер РТА-10698, или его потомство.
В некоторых воплощениях указанное лигноцеллюлозное сырье выбрано из группы, состоящей из остатков сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения дерева с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения дерева с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлозо-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, полученных при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и их комбинации. В некоторых воплощениях углеводы выбраны из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их смеси.
В некоторых воплощениях указанный выделенный штамм гриба и/или его потомство может расти при низком pH, равном не более чем примерно 7,0, примерно 6,5, примерно 6,0, примерно 5,5, примерно 5,0, примерно 4,5, примерно 4,0, примерно 3,5, примерно 2,0, примерно 1,8, примерно 1,6, примерно 1,4, примерно 1,2, примерно 1,0, примерно 0,9, примерно 0,8 или примерно 0,7, или примерно 0,6, или примерно 0,5. Например, указанный штамм гриба может расти при низком рН в диапазоне от примерно 0,7 до примерно 2,0.
Выделенный штамм по настоящему изобретению может продуцировать большое количество липидов в диапазонах низких значений pH, как описано выше. В одном воплощении выделенный штамм может превращать сырье с более высокой скоростью в пределах низкого значения pH, как описано выше, чем любой другой штамм Fusarium oxysporum, выделенный ранее в данной области техники. Ранее были описаны выделенные штаммы Fusarium oxysporum (см. Nairn et al, 1985, Bhatia et a!., 2006 и Naqvi et al, 1997). В одном воплощении выделенный штамм может превращать сырье в липиды со скоростью по меньшей мере 0,04 г липида/г сырья, 0,05 г липида/ г сырья, 0,06 г липида/г сырья, 0,07 г липида/г сырья, 0,08 г липида/г сырья, 0,1 г липида/г сырья, 0,12 г липида/г сырья, 0,14 г липида/г сырья, 0,16 г липида/г сырья, 0,18 г липида/г сырья, 0,2 г липида/г сырья, 0,25 г липида/ г сырья, 0,3 г липида/г сырья, 0,35 г липида/г сырья или 0,4 г липида/г сырья через 10 суток инкубации при pH 2,5 в аэробных условиях.
В одном воплощении выделенный штамм гриба по настоящему изобретению продуцирует более подходящий профиль липидов по сравнению с ранее выделенными грибами или микроводорослями. Например, выделенный штамм продуцирует больше насыщенных жирных кислот (например пальмитиновую (16:0) и стеариновую кислоты (18:0)) и мононенасыщенных жирных кислот (например олеиновую кислоту (18:1)), но меньше полиненасыщенных жирных кислот, которые более подвержены окислению.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
В некоторых воплощениях указанный выделенный штамм гриба и/или его потомство могут расти при более высокой концентрации металла, где металл выбран из группы, состоящей из Mn, Ag, Zn, Fe, Al, Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, An, Se, Sb и Hg. В одном воплощении выделенный штамм гриба может хорошо расти при высокой концентрации Mn, составляющей вплоть до 25 мМ. В одном воплощении два или более таких тяжелых металла(ов) (или тяжелых металлов, взятых вместе) могут присутствовать в количестве более чем 0,1 млн, или 1 млн, или 10 млн, или 50 млн, или 100 млн, или 200 млн, или 400 млн, или 500 млн, или 1000 млн, или 5000 млн, или 10000 млн, или 50000 млн, или 100000 млн по массе.
Выделенный штамм Fusarium oxysporum и/или его потомство по настоящему изобретению можно культивировать без антибиотиков с небольшими загрязнениями или без них, где указанные загрязнения другими организмами выбраны из группы, состоящей из контаминации бактериями, другими грибами (например дрожжами, плесенью), водорослями, растениями, насекомыми и их смесью.
Выделенный штамм Fusarium oxysporum и/или его потомство могут быть дополнительно модифицированы, например посредством мутагенеза и/или рекомбинантных способов (например трансформации). Способы мутагенеза грибов и рекомбинантные способы хорошо известны в данной области техники. Могут быть применены классические методы мутагенеза, которые включают, без ограничения ими, химический мутагенез, инсерционный мутагенез и радиационный мутагенез (например УФ- или гамма-облучение). В некоторых случаях можно выполнить генетические скрещивания, чтобы скомбинировать улучшения разных мутантов.
В одном воплощении настоящего изобретения выделенный штамм гриба и/или его потомство способны расти при высокой плотности клеток. В некоторых воплощениях настоящего изобретения микроорганизмы способны достигать плотности клеток по меньшей мере примерно 10 г/л, по меньшей мере примерно 15 г/л, по меньшей мере примерно 20 г/л, по меньшей мере примерно 25 г/л, по меньшей мере примерно 30 г/л, по меньшей мере примерно 50 г/л, по меньшей мере примерно 75 г/л, по меньшей мере примерно 100 г/л, по меньшей мере примерно 125 г/л, по меньшей мере примерно 135 г/л, по меньшей мере примерно 140 г/л, по меньшей мере примерно 145 г/л или по меньшей мере примерно 150 г/л. Например, выделенный штамм гриба способен достигать плотности клеток от примерно 10 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 15 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 20 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 25 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 30 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 50 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 75 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 100 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 125 г/л до примерно 300 г/л, от примерно 130 г/л до примерно 290 г/л, от примерно 135 г/л до примерно 280 г/л, от примерно 140 г/л до примерно 270 г/л, от примерно 145 г/л до примерно 260 г/л, от примерно 150 г/л до примерно 250 г/л, или от примерно 100 г/л до примерно 280 г/л. Высокая плотность роста выделенного штамма гриба по настоящему изобретению может быть увеличена путем регулирования условий ферментации (таких как температура, pH, концентрация ионов и концентрации газов).
Гены и белки выделенного штамма гриба
Могут быть очищены белки (например определенные ферменты) дикого типа выделенного штамма МК7 Fusarium oxysporum и/или его потомства. Специалисту в данной области техники известны способы очистки белков. Подробное описание способов очистки представлено в Janson and Ryden (Protein purification: principles, high-resolution methods, and applications; Wiley-VCH, 1998, ISBN 0471186260, 9780471186267), Deutscher (Guide to protein purification, Volume 182 of Methods in enzymology, Gulf Professional Publishing, 1990, ISBN 0121820831, 9780121820831) и Cutler (Protein purification protocols, Volume 244 of Methods in molecular biology, Humana Press, 2004 ISBN 1588290670, 9781588290670), которые включены посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
Нуклеотидные последовательности выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению могут быть клонированы, секвенированы, охарактеризованы и модифицированы с помощью биотехнологии. Клонированные последовательности могут быть перенесены в другой организм.
Неограничивающие примеры способов выделения ДНК из Fusarium oxysporum и способов анализа последовательности ДНК (например ПЦР (полимеразная цепная реакция), ПДАФ (полиморфизм длины амплифицированных фрагментов), SSR (микросателлитный анализ) и анализы последовательности ДНК, Саузерн-блот, ОТ-ПЦР и др.) показаны в Lee et al. (1990, Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, Academic Press, New York, pp. 282-287), Gale et al. (2003, Phytopathology 93: 1014-1022), Bogale et al. (2006, Characterization of Fusarium oxysporum isolates from Ethiopia using AFLP, SSR and DNA sequence analyses, Fungal Diversity, 25: 51-65). Кроме того, биологические материалы, экспериментальные процедуры, которые можно использовать для выращивания Fusarium oxysporum, выделение РНК, создание библиотеки кДНК, методы получения микропанели и микроматричного анализа данных были описаны в Dowd et al (2004, Gene expression profile changes in cotton root and hypocotyl tissues in response to infection with Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. MoL Plant-Microbe Interact. 17: 654-667).
Основные руководства, описывающие молекулярно-биологические методы, применимые к настоящему изобретению, такие как клонирование, мутации и тому подобное, включают Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. ("Berger"); Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") и Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, совместное предприятие Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Эти руководства описывают мутагенез, использование векторов, промоторы и многие другие релевантные темы, относящиеся, например, к клонированию и мутациям присутствующих генов, и т.д. Таким образом, данное изобретение также включает использование известных методов белковой инженерии и технологии рекомбинантной ДНК для улучшения или изменения характеристик белков, экспрессируемых штаммами Fusarium (например штаммом МК7). Различные типы мутагенеза можно использовать для получения и/или выделения различных нуклеиновых кислот, которые кодируют белковые молекулы, и/или для модификации/мутации белков по настоящему изобретению. Они включают, без ограничения ими, сайт-направленный, случайный мутагенез, гомологичную рекомбинацию (ДНК-шаффлинг), мутагенез с помощью урацилсодержащих матриц, олигонуклеотид-направленный мутагенез, фосфоротиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез с использованием дуплекса ДНК с разрывами или т.п. Дополнительные подходящие способы включают репарацию ошибочно спаренных оснований, мутагенез с использованием штаммов-хозяев с недостатком репарации, рестрикцию-селекцию и рестрикцию-очистку, делеционный мутагенез, мутагенез посредством общего генетического синтеза, репарацию двунитевых разрывов и тому подобное. Мутагенез, например, включающий химерные конструкции, также включен в настоящее изобретение. В одном воплощении мутагенез определяется известной информацией о природной молекуле или измененной или мутированной природной молекуле, например последовательности, сравнении последовательностей, физических свойствах, кристаллической структуре или тому подобное.
Методы клонирования генов известны в данной области. Ген может быть клонирован в виде вставки ДНК в вектор. Термин "вектор" относится к средству, посредством которого нуклеиновая кислота может быть размножены и/или перемещена между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагемиды, транспозоны, искусственные хромосомы и тому подобное, которые реплицируются автономно или могут интегрироваться в хромосому клетки-хозяина. Вектором также может быть голый РНК-полинуклеотид, голый ДНК-полинуклеотид, полинуклеотид, состоящий и из ДНК, и из РНК в пределах одной нити, полилизин-конъюгированная ДНК или РНК, пептид-конъюгированная ДНК или РНК, липосома-конъюгированная ДНК или тому подобное, то есть не реплицирующиеся автономно. Во многих, но не во всех, общих воплощениях векторы по настоящему изобретению представляют собой плазмиды или бакмиды.
В одном воплощении гены, кодирующие определенные ферменты, клонировали посредством экспрессионного клонирования (синоним клонирование активности). Например, выделенный штамм МК7 Fusarium oxysporum размножают и получают библиотеки кДНК с использованием полиаденилированной мРНК, выделенной из штамма МК7. Затем экспрессионные векторы в библиотеках кДНК трансформируют в подходящие клетки-хозяева (например клетки грибов, бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки растений, клетки насекомых и клетки животных) и указанные клетки-хозяева подвергают скринингу на предпочтительную ферментативную активность. В одном воплощении указанная ферментативная активность выбрана из группы, состоящей из ферментативных активностей целлюлазы, ксиланазы, лигниназы, глюкуронидазы, арабинофуранозидазы, арабиногалактаназы, эстеразы фуруловой кислоты, липазы, пектиназы, глюкоманназы, амилазы, ламинариназы, ксилоглюканазы, галактаназы, глюкоамилазы, пектатлиазы, хитиназы, экзо-β-D-глюкозаминидазы, целлобиозо-дегидрогеназы и ацетил ксилан-эстеразы, ксилозидазы, α-L-арабинофуранозидазы, ферулоил-эстеразы, эндоглюканазы, β-глюкозидазы, Mn-пероксидазы и лакказы.
В другом воплощении, благодаря доступности геномной последовательности Fusarium oxysporum, можно использовать метод геномики/биоинформатики для клонирования генов, кодирующих интересующие ферменты. Например, анализ данных о геномной последовательности Fusarium oxysporum для гомологов интересующих генов может выявить гены-кандидаты, кодирующие белок с определенными предпочтительными ферментативными активностями. Затем такие гены могут быть клонированы и их активность протестирована.
В еще одном воплощении гены, кодирующие белок с определенной предпочтительной ферментативной активностью, могут быть выделены с помощью традиционных методов молекулярного клонирования. Например, могут быть определены активности некоторых белков из банка культур и указанные белки могут быть очищены. Затем очищенные ферменты подвергают анализу и могут быть определены пептидные последовательности. Затем конструируют вырожденные праймеры и используют их в ПЦР или в ОТ-ПЦР для клонирования интересующих генов. Для конструирования вырожденных праймеров известные гомологичные аминокислотные последовательности могут быть выровнены с интересующим белком, чтобы идентифицировать консервативные области.
Выделенный ген, кодирующий фермент, устойчивый к кислому рН, можно клонировать в экспрессиойный вектор и трансформировать клетку-хозяина, выбранную из группы, состоящей из клетки гриба (например видов Fusarium, видов Aspergillus), бактериальной клетки (например видов бациллы), дрожжевой клетки, растительной клетки, клетки насекомых и животной клетки. Для выбора подходящей клетки-хозяина, необходимо учитывать несколько факторов: скорость роста клеток, стоимость ростовой среды, уровни экспрессии, способность к секреции и посттрансляционные модификации (например сворачивание белка, N-связанное гликозилирование, О-связанное гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование и ацилирование).
2
В одном воплощении указанный ген, кодирующий фермент, устойчивый к кислому рН, трансформируют в клетку гриба. Как правило, штамм гриба, имеющий (1) низкие уровни секретируемых протеаз, (2) низкий общий спектр секретируемых белков, (3) способность к высокому уровню гетерологичной экспрессии, (4) подходящую ферментационную морфологию, (5) "обычно рассматривается как безопасный" и (6) трансформируемость, является предпочтительным для экспрессии. Способы трансформации нитчатых грибов хорошо известны в данной области техники. В одном воплощении трансформацию осуществляют посредством бомбардировок (см. Aboul-Soud et al., Transformation of Fusarium oxysporum by particle bombardment and characterization of the resulting transformants expressing a GFP transgene, January 2005, Mycopathologia, 158 (4): 475-482). В другом воплощении трансформация опосредована агробактериями (см. Mullins et al., Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxyspomm: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer, 2001, Phytopathology, 91 (2): 173-180). В еще одном воплощении указанная трансформация является химически опосредованной (например полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опосредованная трансформация протопластов, см. Powell et al, Journal of Bacteriology, June 1990, 172 (6): 3163-3171). Например, конидии (споры) хозяина-гриба проращивают для получения сначала молодого зародышевого мицелия. Затем удаляют клеточную стенку мицелия с помощью смеси литических ферментов с образованием протопластов грибов, которые являются осмотически хрупкими. Указанные протопласты грибов смешивают с ДНК (кодирующей селективный маркер), CaCl и ПЭГ и, возможно, с ингибитором нуклеазы (например ауринтрикарбоновой кислотой). Разведения протопластов затем наносят на осмотически стабилизированную среду (например минимальную среду, содержащую сахарозу), чтобы обеспечить регенерацию и отбор трансформантов. Типичный экспрессионный вектор, используемый в клетке-хозяине гриба, содержит грибковый промотор (который обеспечивает инициацию транскрипции в грибе-хозяине), интересующий ген, грибковый терминатор (который обеспечивает прекращение транскрипции в грибе-хозяине) и селективный маркер. Также могут быть включены сигналы инициации трансляции и ДНК, кодирующая сигнальный пептид для секреции. Селективный маркер может быть выбран из группы, состоящей из пищевых маркеров (например argB (аргининовая прототрофность) и trpC (триптофановая прототрофность)), пищевых маркеров с прямой и обратной селекцией (например amdS (ацетамидаза), pyrG (уридиновая прототрофность), niaD (использование нитратов) и sC (использование сульфатов)), и доминантных селективных маркеров (например benA (беномил-резистентный β-тубулин), oliC (олигомицин-резистентная АТФ-синтаза), hygB (резистентность к гигромицину В), G418 (резистентность к генетицину), резистентность к флеомицину/блеомицину, bar (придает резистентность к BASTA (гербициду)). Неограничивающими примерами грибковых экспрессионных векторов являются pBARKS, pBARGEM, pBARMTE, pBARGP, pAn52-7Not uidA, pPFE2, p777, pAN, pTL, pUC19 и вектора, описанные в Cullen et al. (Molecular Cloning Vectors for Aspergillus ami Neurospora в A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworth Publishers, Stoneham, MA 1986). Трансформация грибов-хозяев является интегративной и обычно митотически стабильной.
Грибковые экспрессионные системы могут быть оптимизированы. Например, основные секретируемые белки хозяина могут быть удалены, так чтобы гетерологичный фермент составлял высокий процент от общего белка. Гены, кодирующие протеазы и микотоксины, также могут быть удалены, чтобы стабилизировать экспрессируемый белок и нежелательную побочную активность. Кроме того, могут быть использованы конститутивный/индуцируемый промотор, горячие точки, включенные в экспрессионные векторы, ectors, оптимизация последовательности Козак, манипуляция с различными сайтами связывания в промоторе.
Выделенный штамм гриба и/или его потомство по настоящему изобретению могут быть дополнительно подвергнуты мутагенезу и скринингу в отношении улучшенной экспрессии или удаления одной или более нежелательных побочных активностей. Могут быть применены методы классического мутагенеза, которые включают, без ограничения ими, химический мутагенез, инсерционный мутагенез и радиационный мутагенез (например УФ- или гамма-облучение). В некоторых случаях могут быть выполнены генетические скрещивания, чтобы объединить улучшения разных мутантов.
Получение биотоплива и/или предшественников биотоплива
Биотопливо, полученное из сахара, крахмала, растительного масла или животных жиров с использованием традиционной технологии, называют биотопливом первого поколения. Основным сырьем для этого биотоплива часто являются семена/зерна, содержащие крахмал (например пшеница, кукуруза) или растительное масло (например подсолнечное), которые представляют лишь небольшие части целых растений. В связи с ростом населения Земли, сырье для получения биотоплива критикуют за выведение пищи из пищевой цепи человека и животных, что приводит к нехватке продовольствия и росту цен.
Биотопливо второго поколения (например целлюлозное биотопливо, биоводород, биометанол, DMF, Bio-DME, дизель Фишера-Тропша, биоводородный дизель, смешанные спирты и древесный дизель), которое может быть получено из непродовольственных культур или несъедобных частей культур, включающих, без ограничения ими, биомассу отходов, стебли пшеницы, кукурузы, дерево и биомассу специальных культур (например мискантус), является публично и политически более популярным. Среди них целлюлозный этанол представляет собой тип биотоплива, получаемого из лигноцеллюлозы, конструкционного материала, который составляет большую часть биомассы растений. Он состоит главным образом из целлюлозы (31-49%), гемицеллюлозы (16-26%) и лигнина (19-26%). Лигнин делает растение жестким и устойчивым к сжатию и должен быть удален перед ферментацией. Солома культур (например листья и стебли кукурузы, сорго, сои и др.), просо прутьевидное, мискантус, щепа и побочные продукты ухода за газонами и деревьями являются одними из наиболее популярных целлюлозных материалов для получения этанола. Для производства целлюлозного этанола требуются дополнительные стадии переработки исходных материалов для высвобождения мономеров сахара для микробиологической ферментации из лигнина. По сравнению с биотопливом первого поколения, биотопливо на основе лигноцеллюлозы имеет ряд преимуществ. Во-первых, источники биотоплива на основе лигноцеллюлозы географически распределены более равномерно, чем для биотоплива на основе сахаров/крахмала. Во-вторых, лигноцеллюлозные исходные материалы минимизируют возможный конфликт между использованием земель для производства продуктов питания (и корма) и производством энергетического сырья. Исходный материал является более дешевым, чем обычное сельскохозяйственное сырье и может быть получен с более низкими затратами удобрений, пестицидов и энергии. В-третьих, биотопливо из лигноцеллюлозы образует низкой уровень выбросов парниковых газов, уменьшая воздействия на окружающую среду, в частности на изменение климата.
Как правило, сырье содержит органические и неорганические питательные вещества для поддержания роста и метаболизма выделенного штамма гриба. Однако, когда необходимые неогранические или органические питательные вещества отсутствуют или присутствуют в недостаточных количествах, сырье может быть дополнено водной фазой, содержащей указанные необходимые неорганические или органические питательные вещества для поддержания роста и метаболизма гриба.
Биоспирты
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагаются способы получения биоспиртов и/или предшественников биоспиртов из сырья с использованием выделенного штамма гриба по настоящему изобретению. Неограничивающими примерами получаемых биоспиртов являются биоэтанол, биометанол, биобутанол, изобутанол и др. В одном воплощении биоспирт представляет собой биоэтанол.
В одном воплощении указанные биоспирты получают при ферментации в анаэробных условиях. В другом воплощении указанные биоспирты получают при ферментации по существу в анаэробных условиях.
Неограничивающие примеры сырья включают лигноцеллюлозное сырье, углеродсодержащие отходы, углеводы или их комбинации. Например, лигноцеллюлозное сырье выбрано из группы, состоящей из остатков сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения дерева с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения дерева с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлозо-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, получаемых при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и их комбинации. В некоторых воплощениях углеводы выбраны из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их смеси. Например, углеводы представляют собой пяти- и шести-углеродные сахара.
Способы и стратегии производства товарного биотоплива и/или предшественников биотоплива и химических веществ из сырья известны в данной области техники. Основные стадии получения целлюлозных спиртов включают предварительную обработку (получение лигноцеллюлозного материала, такого как древесина или солома, подходящего для гидролиза), гидролиз целлюлозы (расщепление молекул на сахара), разделение (главным образом отделение раствора сахара от лигнина), ферментация и дистилляция. Методы предварительной обработки включают кислотный гидролиз, обработку паром, аммиачный взрыв волокна, щелочное влажное окисление и предварительную обработку озоном (Klinke et ah, 2004, Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl Microbiol Biotechnol 66: 10-26).
Ферментер (также называемый биореактор) может быть использован в качестве контейнера для получения биотоплива. Первая стадия ферментации заключается в стерилизации ферментера. Стерилизация может быть выполнена с помощью пара, химических агентов, моющих средств или их комбинации. Были зарегистрированы многочисленные конструкции реакторов, такие как реакторы периодического действия, последовательно-периодические реакторы, баковые реакторы с постоянным перемешиванием, анаэробные контактные реакторы, анаэробные реакторы с перегородками, реакторы с псевдоожиженным слоем, газлифтные реакторы, анаэробные реакторы с придонным слоем организмов и восходящим потоком жидкости и анаэробные реакторы с комбинированной структурой потока. Типичные ферментеры описаны в патентах US 3615253; 5205936; 5728577; 4530762; 4649117; 7446156 и 5228995. В соответствии с разными ферментерами имеются три основных способа проведения ферментации: периодическая ферментация, периодическая ферментация с добавлением субстрата (или непрерывная ферментация) и каскадная ферментация. Для периодической ферментации реактор заполняют стерильным субстратом и засевают ферментирующим организмом. Культуру оставляют расти до насыщения. Для периодической ферментации с добавлением субстрата (или непрерывной ферментации), субстрат подается непрерывно, а культуральную среду непрерывно удаляют. Для каскадной ферментации ферментационная "жидкость" проходит через ряд ферментов для создания все большего количества продуктов (например в пивоварении, пиво ферментируют за несколько стадий, чтобы увеличить содержание алкоголя).
Ферментация начинается с введения небольшого, активно растущего образца микроорганизма в ферментеры (биореакторы), содержащие стерильный субстрат. И прокариотические микроорганизмы (включая бактерии, цианобактерии), и эукариотические микроорганизмы (включая дрожжи, грибы и водоросли) используются в промышленной ферментации. В некоторых других биореакторах альтернативные организмы (включая клетки растений, клетки млекопитающих) используются для получения продуктов, таких как белки, особенно для фармацевтических целей. Например, клеточные культуры нескольких разных видов растений, в том числе Arahidopsis thaliana, Taxus cuspidata, Catharathus roseus и важные культурные растения, такие как табак, люцерна, рис, помидоры и соя, используются для получения рекомбинантного белка.
Микроорганизмы широко используются для получения большого круга продуктов и услуг: таких как традиционные продукты (включающие, без ограничения ими, хлеб, пиво, вино, продукты перегонки, сыр, молочные продукты, ферментированное мясо и овощи, грибы, соевый соус и уксус), сельскохозяйственные продукты (включающие, без ограничения ими, гиббереллины, фунгициды, инсектициды, силос, аминокислоты, такие как L-глутамин, L-лизин, L-триптофан, L-треонин, L-аспарагиновая кислота (+), L-арилглицины), ферменты (включающие, без ограничения ими, углеводы, целлюлозы, липазы, пектиназы, протеазы), топливо и химическое сырье (включающее, без ограничения ими, ацетон, бутанол, бутандиол, изопропанол, этанол, глицерин, метан, глицерин, масляную кислоту, метан, лимонную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, итаконовую кислоту, уксусную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, глюконовую кислоту, винную кислоту и L-глутаровую кислоту, или соли любой из этих кислот), нуклеотиды, органические кислоты, фармацевтические средства и родственные соединения (включающие, без ограничения ими, алкалоиды, антибиотики, гормоны, иммунодепрессант, интерферон, стероиды, вакцины, витамины) и полимеры (включающие, без ограничения ими, альгинаты, декстран, геллан, полигидрооксибутират, склероглюкан и ксантан).
Гидролиз целлюлозы в настоящее время выполняют путем выбора из химического гидролиза (например, патенты US 4427453; 4556430; 6022419), ферментативного гидролиза (например, патент US 5637502) и термического гидролиза (например, патент US 6692578). В химическом гидролизе используют разбавленную кислоту при высокой температуре и высоком давлении (или концентрированную кислоту при низкой температуре и давлении) для расщепления полисахаридных цепей. Целлюлазу, ксиланазу и гемицеллюлазу, которые могут быть получены из грибов (Trichoderma reesei) в большом количестве (например, патент US 6555335) используют для превращения биомассы, такой как стебли кукурузы, барда, пшеничная солома и жом сахарного тростника, или энергетических культур (например проса прутьевидного) в сбраживаемые сахара. На стадии ферментации пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) используют в промышленном производстве этанола из гексоз (6-углеродный сахар). Известны способы непрерывной ферментации Сахаров с получением спирта и способы этанольной ферментации с участием рециркуляции дрожжей (а именно, патенты US 1201062; 2054736; 2063223; 2122939; 2146326; 2169244; 2230318; 2272982; 2285130; 2155134; 2371208; 2657174; 2676137; 2967107; 3015612; 3078166; 3093548; 3177005; 3201328; 3207605; 3207606; 3219319; 3234026; 3413124; 3528889; 3575813; 3591454; 3658647; 3676640; 3705841; 3737323; 3940492; и 3984286).
Лигноцеллюлозные материалы содержат целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Целлюлоза представляет собой полисахарид, содержащий глюкопиранозные субъединицы, соединенные β-1→4 глюкозидными связями. Мономерной субъединицей является глюкоза. Гемицеллюлоза представляет собой группы полисахаридов, включающих четыре основных типа: D-ксилоглюканы, D-ксиланы, D-маннаны и D- галактаны. В каждом типе от двух до шести мономеров связаны посредством β-1→4 и β-1→3 связей в главной цепи и посредством α-1→2, 3 и 6 связей в ответвлениях. Мономерные субъединицы могут представлять собой D-ксилозу, L-арабинозу, D-маннозу, D-глюкозу, D-галактозу и D-глюкуроновую кислоту. Основные лигнины представляют собой высококонденсированные полимеры, образованные посредством дегидрирующей полимеризации гидроксикоричных спиртов, пара-кумариловых спиртов, конифериловых спиртов и синапиловых спиртов. Неосновной лигнин включает эстерифицированные или этерифицированные фенольные кислоты, связанные с основным лигнином или нецеллюлозными полисахаридами. В предпочтительных воплощениях вещество биомассы, содержащее целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин (то есть лигноцеллюлозную биомассу), обрабатывают с получением глюкозы, фруктозы, сахарозы, маннозы, мальтозы, сорбита, галактозы, ксилозы, а также их комбинаций.
В некоторых воплощениях вещества лигноцеллюлозной биомассы гидролизуют перед ферментацией. Настоящее изобретение не ограничено использованием какого-либо конкретного способа гидролиз. Действительно, рассматривается применение различных методов гидролиза, включая, но без ограничения ими, ферментативный гидролиз и химический гидролиз (такой как гидролиз разбавленной кислотой или гидролиз концентрированной кислотой) и их комбинации.
Некоторые примеры способов предварительной обработки сырья описаны в публикациях патентных заявок US 2007/0161095, WO 05/053812, WO 06/086757, US 2006/0182857, US 2006/177551, US 2007/0110862, WO 06/096834, WO 07/055735, US 2007/0099278, WO 06/119318, US 2006/0172405 и US 2005/0026262.
Примеры ферментов, подходящих для гидролиза целлюлозы, описаны в патенте или публикациях патентных заявок US 2003/0096342, WO 03/012109, US 7059993, WO 03/012095, WO 03/012090, US 2003/0108988, US 2004/0038334, US 2003/0104522, EP 1612267 и WO 06/003175.
Выделенный штамм гриба и/или его потомство по настоящему изобретению может прямо превращать лигноцеллюлозное сырье в высокоэнергетические метаболиты с несколькими стадиями предварительной обработки и без добавлений ферментов. Следовательно, использование этого нового способа является относительно простым и недорогим по сравнению с существующими методами. Однако, следует понимать, что стадии предварительной обработки и добавления ферментов можно использовать в качестве возможных стадий для повышения скоростей гидролиза и уменьшения времени получения высокоэнергетических метаболитов. Биодизель и биологическая смазка
Биодизель относится к дизельному топливу на основе липидов, состоящему из длинноцепочечных алкиловых (метиловых, пропиловых или этиловых) сложных эфиров, где липид происходит из живых или недавно живых организмов (например растительного масла, животного жира, масла микроорганизмов). Липиды могут быть использованы в качестве предшественников в производстве биодизелей, например посредством переэтерификации. При использовании здесь, термин переэтерификация относится к процессу замены органической группы R" сложного эфира на органическую группу R' спирта:
Эти реакции часто катализируются добавлением кислоты или основания. Биодизель обычно получают посредством взаимодействия химически взаимодействующих липидов (например растительного масла, животного жира) со спиртом. Неограничивающие примеры спиртов включают метиловый спирт, этанол, бутанол, изопропанол. Использование спиртов с более высокой молекулярной массой улучшает свойства холодной текучести полученного сложного эфира за счет менее эффективной реакции переэтерификации. Любые свободные жирные кислоты (FFA) в масляной основе либо превращаются в мыло и удаляются из процесса или их этерифицируют (с получением дополнительного биодизеля), используя кислотный катализатор. Побочным продуктом процесса переэтерификации является получение глицерина.
Липиды, как предшественники биодизеля, могут поступать из многих сырьевых источников. Неограничивающие примеры сырья включают рапсовое масло, соевое масло, ярутку полевую, ятрофу, горчицу, лен, подсолнечник, пальмовое масло, кокосовый орех, коноплю, касторовое масло, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, масло редиса, масло рамтила, масло из рисовых отрубей, сафлоровое масло, масло солероса, подсолнечное масло, тунговое масло, водорослевое масло, копайский бальзам, масло понгамии, масло ятрофы, масло жожоба, молочное дерево, масло орехов нефтяного дерева и животный жир.
Биодизель предназначен для использования в стандартных дизельных двигателях и, таким образом, отличается от растительных и отработанных масел, используемых для подачи топлива в переделанные дизельные двигатели. Биодизель можно использовать сам по себе или в смеси с нефтяным дизельным топливом. Смеси биодизеля и традиционного дизеля на углеводородной основе являются наиболее широко распространенными продуктами для использования на рынке розничной продажи дизельного топлива. Смеси 20 процентов биодизеля с 80 процентами нефтяного дизельного топлива (В20) можно, как правило, использовать в немодифицированных дизельных двигателях. Биодизель также можно использовать в чистом виде (В100), но могут потребоваться определенные модификации двигателя для того, чтобы избежать проблем технического обслуживания и работоспособности.
Биодизель также можно использовать в качестве отопительного топлива в бытовых и промышленных котлах, смесь мазута и биотоплива, стандартизованного и облагаемого несколько другим налогом, чем дизельное топливо, используемое для транспорта. Его иногда называют "биотеплом". Отопительный биодизель доступен в различных смесях; вплоть до 20% биотоплива считается приемлемым для использования в существующих печах без модификации.
Неограничивающие примеры способов получения биодизеля включают: периодический процесс, бесферментный сверхкритический процесс, способ с ультра- и большим сдвиговым усилием в поточной линии и с периодическим реактором, метод ультразвукового реактора и микроволновый способ. Другие системы и устройства для получения биодизеля описаны в патентах US 7452515, 7524982, 7420072, 6824682, 7169821, 6979426, 7514247, 7449313, 7605281 и в патентных заявках US 20080282606, 20070260079, 20070010681, 20090054701, 20030111410, 20080202021, 20050113467, 20050255013, 20030175182, 20080299633, 20080102503, 20090178330, 20080313955, 20080282687, 20070167642 и 20070122667, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
1M
Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы получения высокоэнергетических метаболитов с использованием выделенного штамма гриба по настоящему изобретению, где высокоэнергетические метаболиты представляют собой главным образом липиды в качестве предшественников биодизеля. Липиды могут быть экстрагированы из выделенных штаммов грибов для получения биодизеля. Выделенный штамм гриба по настоящему изобретению имеет более подходящий липидный профиль по сравнению с водорослями и другими липидо-продуцирующими организмами. В одном воплощении указанные липиды по существу представляют собой жирные кислоты. В одном воплощении указанные жирные кислоты по существу представляют собой ненасыщенные жирные кислоты и/или насыщенные жирные кислоты. В одном воплощении указанные ненасыщенные жирные кислоты выбраны из группы, состоящей из олеиновой кислоты (18:1), α-линоленовой кислоты (18:3), эйкозеновой кислоты (20:1) и их комбинации. В одном воплощении указанные насыщенные жирные кислоты выбраны из группы, состоящей из пальмитиновых кислот (16:0), стеариновых кислот (18:0), арахидиновой кислоты (20:0), бегеновой кислоты (22:0) и их комбинации. Другие типы липидов, которые могут быть получены, включают, без ограничения ими, насыщенные жиры (например масляную кислоту, капроновую кислоту, каприловую кислоту, декановую кислоту, додекановую кислоту, тридекановую кислоту, тетрадекановую кислоту, пентадекановую кислоту, гексадекановую кислоту, гептадекановую кислоту, октадекановую кислоту, нонадекановую кислоту, эйкозановую кислота, докозановую кислоту, тетракозановую кислоту), мононенасыщенные жиры (например тетрадеценовую кислоту, пентадеценовую кислоту, гексадеценовую кислоту, гептадеценовую кислоту, октадеценовую кислоту, эйкозеновую кислоту, докозеновую кислоту, цис-тетракозеновую кислоту) и полиненасыщенные жиры (например гексадекадиеновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, альфа-линоленовую кислоту, гамма-линоленовую кислоту, паринаровую кислоту, эйкозадиеновую кислоту, арахидоновую кислоту, тимнодоновую кислоту, брассидиновую кислоту, клупанодоновую кислоту и докозагексаеновую кислоту), омега-7 вакценовую кислоту (метил-11-октадеценоат), омега-7 пальмитолеиновую кислоту (метил-гексадец-9-еноат; торговое название Provinal) и тетракозановой кислоты метиловый эфир, и другие жирные кислоты, перечисленные в Таблице 1.
В одном воплощении указанные липиды в качестве предшественников биодизеля получают при ферментации в аэробных условиях. В другом воплощении указанные биоспирты получают при ферментации в по существу аэробных условиях.
В одном воплощении выделенный штамм гриба и/или его потомство способны эффективно продуцировать липиды. В некоторых воплощениях настоящего изобретения количество продуцируемых липидов составляет по меньшей мере примерно 1 г/л/сутки, 5 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 10 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 20 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 30 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 40 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 50 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 60 г/л/сутки, по меньшей мере примерно 70 г/л/сутки или более. Например, количество продуцируемого биологического масла составляет от примерно 1 г/л/сутки до примерно 5 г/л/сутки, от примерно 5 г/л/сутки до примерно 70 г/л/сутки, от примерно 10 г/л/сутки до примерно 70 г/л/сутки, от примерно 20 г/л/сутки до примерно 70 г/л/сутки, или от примерно 30 г/л/сутки до примерно 70 г/л/сутки.
Липиды в образце могут быть экстрагированы с использованием разных методов. Неограничивающие примеры экстракции липидов описаны в King et al. (Supercritical Fluid Extraction: Present Status and Prospects, 2002, Grasa Asceites, 53, 8-21), Folch et al. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, 1957, J. Biol. Chem,, 226, 497-509), Bligh and Dyer (A rapid method of total lipid extraction and purification. 1959, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917), Cabrini et al. (Extraction of lipids and lipophilic antioxidants from fish tissues - a comparison among different methods. 1992, Comp. Biochem. Physiol., 101B, 383-386), Hara et al. (Lipid extraction of tissues with a low toxicity solvent. 1978, Anal. Biochem., 90, 420-426), Lin et al. (Ethyl acetate/ethyl alcohol mixtures as an alternative to Folch reagent for extracting animal lipids. 2004, J. Agric. Food Chem., 52, 4984-4986), Whiteley et al. (Lipid peroxidation in liver tissue specimens stored at subzero temperatures. 1992, Cryo-Letters, 13, 83-86), Kramer et al. (A comparison of procedures to determine free fatty acids in rat heart. 1978, J. Lipid Res., 19, 103-106) и Somashekar et al. (Efficacy of extraction methods for lipid and fatty acid composition from fungal cultures, 2001, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17 (3): 317-320). В другом примере липид может быть выделен с помощью методов, аналогичных FRIOLEX (Westfalia Separator Industry GmbH, Germany) процессу, используемому для экстракции биологических масел, продуцируемых микроорганизмами. FRIOLEX© представляет собой способ физической экстракции на водной основе, посредством которого исходный материал, содержащий масло, можно использовать непосредственно для экстракции масла, не используя никаких обычных методов экстракции растворителем. В этом способе водорастворимый органический растворитель можно использовать в качестве технологической добавки, и масло отделяют от сырьевого бульона посредством сепарации по плотности с использованием силы тяжести или центробежных сил.
После выделения липидов, эти липиды могут быть извлечены или отделены от нелипидных компонентов любыми подходящими способами, известными в данной области техники. Например, недорогие физические и/или механические методы используются для отделения липидсодержащих композиций от нелипидных композиций. Если в метода экстракции, используемом для извлечения липидов, образуются несколько фаз или фракций, где одна или более фаз или фракций содержат липиды, способ извлечения липидсодержащих фаз или фракций может включать физическое отделение липидсодержащих фаз или фракций от нелипидных фаз или фракций или наоборот.В некоторых воплощениях настоящего изобретения используют метод FRIOLEX для экстракции липидов, продуцируемых микроорганизмами, и богатую липидами легкую фазу затем физически отделяют от богатой белком тяжелой фазы (например, снимая слой богатой липидами фазы, которая находится сверху богатой белком тяжелой фазы после разделения по плотности).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения лигноцеллюлозное сырье, которое используется для выращивания выделенного штамма гриба, содержит целлюлозу в количестве от примерно 5% до примерно 100%, от примерно 10% до примерно 95%, от примерно 20% до примерно 90%, от примерно 30% до примерно 85%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 50% до примерно 75%, или от примерно 60% до примерно 70% сухой массы углеродного сырья. В некоторых воплощениях настоящего изобретения целлюлозное сырье содержит целлюлозу в количестве по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, или по меньшей мере примерно 70% сухой массы углеродного сырья. В некоторых воплощениях настоящего изобретения целлюлозное сырье, используемое для роста выделенного штамма гриба, содержит от примерно 1% до примерно 50%, от примерно 5% до примерно 40%, или от примерно 10% до примерно 30% по массе компонента, выбранного из лигнина, гемицеллюлозы или их комбинации. В некоторых воплощениях настоящего изобретения целлюлозное сырье, используемое для роста микроорганизма, содержит по меньшей мере примерно 1%, по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, или по меньшей мере примерно 30% по массе компонента, выбранного из лигнина, гемицеллюлозы или их комбинации.
Получение липидов с использованием выделенного штамма гриба имеет по меньшей мере две стадии: стадию накопления биомассы и стадию получения липидов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения на стадии накопления биомассы получают биомассу штамма гриба, составляющую от примерно 10% до примерно 95%, от примерно 20% до примерно 95%, от примерно 30% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 95%, или от примерно 50% до примерно 95% общей биомассы штамма гриба, полученной на стадии накопления биомассы. В других воплощениях настоящего изобретения на стадии накопления биомассы получают от примерно 60% до примерно 95%, от примерно 70% до примерно 95%, или от примерно 80% до примерно 95% от общей полученной биомассы микроорганизмов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения на стадии накопления биомассы получают биомассу микроорганизмов, так что по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% от общей полученной биомассы микроорганизмов получают на стадии накопления биомассы. Например, от примерно 50% до примерно 95% от общей полученной биомассы микроорганизмов получают на стадии накопления биомассы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения на стадии накопления липидов получают липиды, так что от примерно 1,0% до примерно 95%, от примерно 20% до примерно 95%, от примерно 30% до примерно 95%, от примерно 40% до примерно 95% или от примерно 50% до примерно 95% от общего количества полученных липидов микроорганизмов получают на стадии накопления липидов. В других воплощениях настоящего изобретения от примерно 60% до примерно 95%, от примерно 70% до примерно 95% или от примерно 80% до примерно 95% от общего количества полученных липидов микроорганизмов получают на стадии накопления липидов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения на стадии накопления липидов получают липиды, так что по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% от общего количества полученных липидов микроорганизмов получают на стадии накопления липидов. Предпочтительно от примерно 50% до примерно 95% от общего количества полученных липидов микроорганизмов получают на стадии накопления липидов.
Когда липиды получены в соответствии с настоящим изобретением, различные способы, известные в данной области техники, могут быть использованы для превращения биологических масел в сложные эфиры жирных кислот для использования в качестве биодизеля, реактивного биотоплива или в качестве ингредиентов для пищевых или фармацевтических продуктов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения получение сложных эфиров жирных кислот включает переэтерификацию биологических масел, продуцируемых микроорганизмами. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, экстракция липидов из микроорганизмов и переэтерификация липидов могут быть выполнены одновременно, в одностадийном способе. Например, на культуру, содержащую выделенный штамм гриба, можно воздействовать условиями или воздействиями (или комбинацией условий или воздействий), которые способствуют как экстракции липидов, так и переэтерификации липидов. Такие условия или воздействия могут включать, но без ограничения ими, pH, температуру, давление, присутствие растворителей, присутствие воды, присутствие катализаторов или ферментов, присутствие моющих средств и физические/механические силы. Две совокупности условий или воздействий могут быть объединены с получением одностадийного способа экстракции и переэтерификации липидов, где одна совокупность условий или воздействий положительно способствует экстракции липидов, а другая совокупность условий или воздействий положительно способствует переэтерификации липидов, при условии что эти две совокупности условий и воздействий могут быть объединены, не вызывая значительного снижения эффективности либо экстракции, либо переэтерификации липидов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения можно выполнять гидролиз и переэтерификацию непосредственно цельноклеточной биомассы. В других воплощениях настоящего изобретения экстракцию липидов выполняют, как стадию, отдельную от стадии переэтерификации липидов. В одном воплощении такие реакции переэтерификации выполняют с использованием кислотных или основных катализаторов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения способы переэтерификации биологических липидов в сложные эфиры жирных кислот для использования в качестве биодизеля или ингредиентов пищевых или фармацевтических продуктов включает взаимодействие биологических масел, содержащих триглицериды, в присутствии спирта и основания с получением сложных эфиров остатков жирных кислот из триглицеридов.
Спирты, подходящие для использования в переэтерификации, включают любой низший алкиловый спирт, содержащий от 1 до 6 атомов углерода (то есть С1-6алкиловый спирт, такой как метиловый, этиловый, изопропиловый, бутиловый, пентиловый, гексиловый спирты и их изомеры). Не будучи связанными теорией, полагают, что в некоторых воплощениях настоящего изобретения при использовании низших алкиловых спиртов в способах по настоящему изобретению получают низших алкиловые эфиры остатков жирных кислот. Например, при использовании этанола получают этиловые эфиры. В некоторых воплощениях спирт представляет собой метанол или этанол. В этих воплощениях получаемые сложные эфиры жирных кислот представляют собой метиловый эфир и этиловый эфир остатка жирной кислоты соответственно. В способах по настоящему изобретению спирт обычно составляет от примерно 5 масс. % до примерно 70 масс. %, от примерно 5 масс. % до примерно 60 масс. %, от примерно 5% до примерно 50 масс. %, от примерно 7 масс. % до примерно 40 масс. %, от примерно 9 масс. % до примерно 30 масс. %, или от примерно 10 масс. % до примерно 25 масс. % от смеси липидной композиции, спирта и основания. В некоторых воплощениях композиция и основание могут быть добавлены либо к чистому этанолу, либо к чистому метанолу. Как правило, количество используемого спирта может варьироваться в зависимости от растворимости липидов или композиции, содержащей триглицериды в спирте.
В композиции, содержащей триглицериды, спирт и основание взаимодействуют вместе при температуре и в течение времени, которые позволяют получить сложный эфир из остатков жирных кислот и спирта. Подходящее время и температуры реакции для получения сложного эфира могут быть определены специалистом в данной области техники. Не будучи связанными с теорией, полагают, что остатки жирных кислот отщепляются от глицеринового каркаса триглицерида и на стадии взаимодействия образуются сложные эфиры каждого остатка жирных кислот. В некоторых воплощениях стадию взаимодействия композиции в присутствии спирта и основания выполняют при температуре от примерно 20°C до примерно 140°C, от примерно 20°C до примерно 120°C, от примерно 20°C до примерно 110°C, от примерно 20°C до примерно 100°C, или от примерно 20°C до примерно 90°C. В других воплощениях стадию взаимодействия композиции в присутствии спирта и основания выполняют при температуре по меньшей мере примерно 20°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C 95°C, 105°C или 120°C В некоторых воплощениях настоящего изобретения стадию взаимодействия композиции в присутствии спирта и основания выполняют при температуре примерно 20°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 105°C или 120°C. В некоторых воплощениях стадию взаимодействия композиции в присутствии спирта и основания выполняют в течение времени, равного от примерно 2 часов до примерно 36 часов, от примерно 3 часов до примерно 36 часов, от примерно 4 часов до примерно 36 часов, от примерно 5 часов до примерно 36 часов, или от примерно 6 часов до примерно 36 часов. В некоторых воплощениях стадию взаимодействия композиции в присутствии спирта и основания выполняют в течение примерно 0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 5,0, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 или 36 часов.
В одном воплощении стадия взаимодействия липидной композиции, спирта и основания может быть выполнена посредством дефлегмации компонентов с получением сложных эфиров жирных кислот, таких как сложные эфиры PUFA (полиненасыщенная жирная кислота). В других воплощениях стадию взаимодействия липидной композиции можно выполнять при температуре, которая не приводит к дефлегмации компонентов реакции. Например, выполнение стадии взаимодействия липидной композиции при давлении, превышающем атмосферное давление, может повысить температуру кипения растворителей, присутствующих в реакционной смеси. В таких условиях взаимодействие может протекать при температуре, при которой растворители будут кипеть при атмосферном давлении, но не будет происходить дефлегмации компонентов реакционной смеси. В некоторых воплощениях взаимодействие выполняют при давлении от примерно 5 до примерно 20 фунтов на квадратный дюйм (34,5-138 кПа); от примерно 7 до примерно 15 фунтов на квадратный дюйм (48,3-103 кПа); или от примерно 9 до примерно 12 фунтов на квадратный дюйм (62-82,7 кПа). В некоторых воплощениях реакцию выполняют при давлении 7, 8, 9, 10, 11 или 12 фунтов на квадратный дюйм (48,3; 55,1; 62; 69; 75,8 или 82,7 кПа). Реакции, проводимые под давлением, могут быть осуществлены при температурах реакции, представленных выше. В некоторых воплощениях реакции, проводимые под давлением, могут быть осуществлены при температуре по меньшей мере примерно 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C В некоторых воплощениях реакции, проводимые под давлением, могут быть осуществлены при 70°C, 75°C, 80°C, 85°C или 90°C.
В одном воплощении настоящего изобретения сложные эфиры жирных кислот отделяют от реакционной смеси посредством перегонки композиции для извлечения фракции, содержащей эфиры жирных кислот. Целевая фракция реакционной смеси, включающая представляющие интерес сложные эфиры жирных кислот, может быть отделена от реакционной смеси и извлечена. В некоторых воплощениях дистилляцию выполняют под вакуумом. Не будучи связаны теорией, дистилляция под вакуумом позволяет выполнять дистилляцию при более низкой температуре, чем в отсутствие вакуума и, таким образом, может предотвращать разрушение сложных эфиров. Типичный диапазон температуры дистилляции составляет от примерно 120°C до примерно 170°C. В некоторых воплощениях стадию дистилляции выполняют при температуре менее чем примерно 180°C, менее чем примерно 175°C, менее чем примерно 170°C, менее чем примерно 165°C, менее чем примерно 160°C, менее чем примерно 155°C, менее чем примерно 150°C, менее чем примерно 145°C, менее чем примерно 140°C, менее чем примерно 135°C или менее чем примерно 130°C. Типичное давление для дистилляции под вакуумом варьируется от примерно 0,1 мм рт.ст. до примерно 10 мм рт.ст (13,33 Па - 1333 Па). В некоторых воплощениях давление для дистилляции под вакуумом составляет по меньшей мере примерно 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4 мм рт.ст.(13,33; 66,6; 133,3; 200; 266,6; 333; 400; 466; или 533 Па). В некоторых воплощениях настоящего изобретения давление для дистилляции под вакуумом составляет примерно 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4 мм рт.ст.
Возобновляемые масла, воски и жирные кислоты имеют значительный спрос в широком ряде отраслей промышленности (например нутрицевтики, биологические смазки, косметические средства, свечи и мыло) и продаются по более высокой цене по сравнению с продуктами на нефтяной основе. Высокие прибыли, как правило, ожидаются для липидных продуктов, которые можно продать за более чем $ 2,00/фунт, что эквивалентно прибыли $ 600 на тонну сырья (пшеничная солома стоит $ 60/т). Очевидно, что потребители выиграют от этой технологии из-за снижения их зависимости от продуктов на нефтяной основе, при создании рынка сельскохозяйственных отходов и побочных продуктов. Так как несколько компаний и исследовательских групп исследуют продуцирование липидов грибами непосредственно из лигноцеллюлозной биомассы для получения более ценных продуктов, и промышленность, и научное сообщество выиграют от знаний, полученных с помощью данного изобретения.
Возобновляемые липиды являются идеальными для все большего числа потребителей, требующих углеродно-нейтральные, природные биопродукты, которые в настоящее время производятся, главным образом, из ограниченных растительных и животных источников. Способ по изобретению предлагает альтернативу этим возобновляемым источникам липидов и создает рынок отходов сельскохозяйственного сырья. Способ по настоящему изобретению дополнительно разработан для промышленного производства липидных продуктов из отходов органического сырья. Способ по настоящему изобретению оптимизирован с помощью настольной полупромышленной системы, с осуществлением технологической схемы и технико-экономического анализа промышленных производственных систем, детальным анализом липидных продуктов и нацеливанием соответствующих рынков/клиентов на эти продукты. Полупромышленная демонстрационная система предназначена для получения экономически перспективных выходов высококачественных липидов из различных субстратов для определенных целевых рынков и покупателей.
В другом воплощении использовали липиды, экстрагированные из выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению для получения биологических смазок. При использовании здесь, термин "биологические смазки" относится к смазкам, получаемым путем использования вещества, происходящего из живых или недавно живых организмов. При использовании здесь, термин "смазки" относится к веществам (как правило, жидкости в условиях эксплуатации), вводимым между двумя перемещающимися поверхностями для уменьшения их трения и износа. Базовые масла, используемые как моторные масла, обычно классифицируются Американским институтом нефти как минеральные масла (Группа I, II и III) или синтетические масла (Группа IV и V). См публикацию American Petroleum Institute Publication Number 1509. Одним из важнейших применений смазочных агентов в виде моторного масла является защита двигателей внутреннего сгорания в автомобилях и автоматическом оборудовании. Как правило, смазывающие агенты содержат 90% базового масла (наиболее часто нефтяные фракции, называемые минеральными маслами) и менее 10% добавок. Растительные масла или синтетические жидкости, такие как гидрогенизованные полиолефины, сложные эфиры, силиконы, фторуглероды и многие другие иногда используют в качестве базовых масел. Они представляют собой, прежде всего, триглицеридные эфиры, происходящие из растений и животных. Для смазочного базового масла предпочтительным является использование веществ, полученных из овощей. Обычные вещества включают масло канолы с высоким содержанием олеинового масла, касторовое масло, пальмовое масло, подсолнечное масло и рапсовое масло из овощей, а также талловое масло из животных источников. Многие растительные масла часто гидролизуют с получением кислот, которые затем избирательно объединяют с образованием специализированных синтетических сложных эфиров.
Добавки обеспечивают пониженное трение и износ, повышенную вязкость, улучшенный индекс вязкости, устойчивость к коррозии и окислению, старению или загрязнению, и т.д. Смазывающие агенты, такие как масло для двухтактных двигателей, также добавляют к некоторым видам топлива. Примеси серы в топливе также обеспечивают некоторые смазывающие свойства, которые следует принимать во внимание при переходе на дизель с низким содержанием серы; биодизель представляет собой популярную добавку к дизельному топливу, обеспечивающую дополнительную скользкость. Нежидкие смазывающие агенты включают густую смазку, порошки (сухой графит, PTFE (политетрафторэтилен), дисульфид молибдена, дисульфид вольфрама и т.д.), тефлоновую ленту, используемую в прокладке труб, воздушной подушке, и другие. Сухие смазывающие агенты, такие как графит, дисульфид молибдена и дисульфид вольфрама также обеспечивают смазку при температурах (вплоть до 350°C), более высоких, чем те, при которых могут работать жидкие и основанные на масле смазывающие агенты. Ограниченный интерес проявляется к низкофрикционным свойствам уплотненных слоев оксидной глазури, образованных при температуре в несколько сотен градусов Цельсия в металлических скользящих системах, однако, до их практического применения еще очень далеко из-за их физически нестабильного характера. Другим подходом к снижению трения и износа является использование подшипников, таких как шарикоподшипники, роликовые подшипники или воздушные подшипники, которые в свою очередь, сами требуют внутренней смазки, или использование звука в случае акустической смазки. В дополнение к промышленному применению смазывающие агенты используются для многих других целей. Другие применения включают биомедицинские применения (например смазки для искусственных суставов) и использование индивидуальной смазки для сексуальных целей.
Таким образом, липиды, экстрагированные из культуры выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению, можно использовать для изготовления композиций биологических смазок на основе сложных эфиров путем добавления подходящих добавок. Способы получения смазочных композиций на основе сложных эфиров известны специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера, некоторое количество масла биологического происхождения, содержащего триглицериды, берут и обрабатывают таким образом, чтобы гидролизовались по меньшей мере некоторые из триглицеридов и образовались свободные жирные кислоты, где жирные кислоты имеют тип, выбранный из группы, состоящей из насыщенных жирных кислот, мононенасыщенных жирных кислот и полиненасыщенных жирных кислот, и их комбинации. Жирные кислоты разделяют по их типу, так что по меньшей мере мононенасыщенные жирные кислоты по существу отделены от насыщенных жирных кислот и полиненасыщенных жирных кислот. Затем, по меньшей мере некоторые из мононенасыщенных жирных кислот модифицируют с образованием сложноэфирного продукта (например содержащего триэфиры) и по меньшей мере некоторые из насыщенных жирных кислот и/или полиненасыщенных жирных кислот гидрируют с получением алканов (парафинов). Следует отметить также, что в некоторых воплощениях такие сложноэфирные продукты могут включать один или более следующего: моно-, ди- и триэфиры и их гидроксилированные аналоги.
Биоводород
Термин биоводород в данном описании изобретения относится к водороду, полученному посредством биологических процессов, например посредством ферментации с использованием выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению. В настоящем изобретении предложены способы получения высокоэнергетических метаболитов с использованием выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению, где высокоэнергетические метаболиты представляют собой биогаз, например водород или метан. В одном воплощении водород получают в анаэробных условиях. В другом воплощении водород получают в по существу анаэробных условиях.
В одном воплощении сырье смешивают с выделенным грибковым штаммом и/или его потомством по настоящему изобретению в биореакторе с получением водорода. Для ускорения разрушения сырья можно использовать вакуум, например примерно 0,1 атм (9,8 кПа), примерно 0,2 атм (19,5 кПа), примерно 0,3 атм (29,4 кПа), примерно 0,4 атм (39,2 кПа), примерно 0,5 атм (49 кПа), для удаления газов, включая водород, из биореактора. В одном воплощении производство другого биогаза, такого как метан, ингибируют для увеличения производства водорода. Неограничивающие примеры систем и биореакторов для получения водорода описаны в патентах US 7473552 и 7083956, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Биотопливо из шламового вещества
Выделенный штамм и/или его потомство по настоящему изобретению устойчивы к высокой концентрации металлов и экстремальным условиям рН. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы получения биотоплива и/или предшественников биотоплива с использованием исходного сырья, городских, промышленных и/или фермерских отходов или шлама сточных вод в качестве углеродсодержащего сырья. Шлам может представлять собой обработанный коммунальный или промышленный сырой осадок или первичные твердые вещества или обработанный сельскохозяйственный шлам. То есть шлам в некоторых воплощениях претерпевает один или несколько процессов обработки, таких как анаэробное и/или аэробное расщепление, компостирование и/или по меньшей мере одну химическую или физическую обработку, такую как сушка, обезвоживание, сгущение, прессование, фильтрация, центрифугирование, ультрафиолетовая или химическая дезинфекция (например дезинфекция хлором), стабилизация известью и/или термическая обработка.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
В некоторых воплощениях шлам представляет собой трудноразлагаемый шлам с высоким содержанием тяжелых металлов, таких как один или более из Mn, Zn, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd и Hg. По меньшей мере один, два или три таких тяжелых металлов (или тяжелых металлов, взятых вместе), могут присутствовать в количестве более чем 10 млн, или 50 млн, или 100 млн, или 200 млн, или 400 млн, или 500 млн по массе в трудноразлагаемом шламе. По меньшей мере один такой тяжелой металл (или тяжелые металлы, взятые вместе) могут присутствовать в количестве от примерно 400 до примерно 1000 млн. Например, трудноразлагаемый шлам может быть загрязнен таким количеством свинца (Pb) и/или кадмия (Cd). В одном воплощении указанный шлам или отходы являются кислыми. В одном воплощении рН шлама или отходов варьируется от примерно 0 до примерно 8, например от примерно 0,7 до примерно 7,5.
В другом воплощении указанные тяжелые металлы в шламе или отходах извлекают посредством биосорбции при помощи выделенного штамма гриба по настоящему изобретению и указанный кислотный шлам или отходы нейтрализуют.
Выделенный штамм гриба и/или его потомство также устойчивы к загрязнениям благодаря антибиотикам, продуцируемым внутри (например нафтазариновым пигментам). Таким образом, в этих или других воплощениях шлам имеет высокое содержание по меньшей мере одного бактериального, вирусного и/или паразитического патогена, включая, среди прочих, различные кишечные патогены, например энтеропатогенные Е. coli, сальмонеллу, шигеллу, иерсинию, холерный вибрион, криптоспоридию, гиардию, энтамебу, норовирус и ротавирус.
В некоторых воплощениях шлам образуется в результате промышленного производства. То есть шлам является конечным продуктом станции обработки сточных вод производственного объекта, такого как химический, фармацевтический или бумагоизготовительный производственный объект или объект пищевого производства.
Шлам может быть образован фармацевтическим производственным объектом. В соответствии с настоящим изобретением, если соединения, производимые фармацевтическим производственным объектом являются подходящим сырьем для выделенного штамма гриба, их можно расщеплять посредством микробного метаболизма и превращать в биотопливо.
Шлам может быть образован бумагоизготовительным производственным объектом. Целлюлозно-бумажная промышленность несет ответственность за большие сбросы сильно загрязненных сточных вод. Эти загрязнители, основными характеристиками которых являются их высокая токсичность и низкая биоразлогаемость, включают различные таннины, лигнины, смолы, терпены и хлорфенольные соединения. Состав этих сточных вод, который оказывает большое влияние на их обрабатываемость, может значительно варьироваться в зависимости от сырья и технологического процесса. В настоящем изобретении, однако, предложены способы и системы, которые являются универсальными в отношении синтеза компонентов биотоплива из этих токсичных стоков.
В некоторых воплощениях шлам образован объектом пищевого производства.
В некоторых воплощениях шлам представляет собой сельскохозяйственный шлам, содержащий животный навоз. Большая часть животного навоза представляет собой фекалии. Обычные формы животного навоза включают FYM (стойловый навоз) или навозную жижу (жидкий навоз). Стойловый навоз также может включать растительный материал (часто солому), который используется в качестве подстилки для животных и который впитал кал и мочу. Сельскохозяйственный навоз в жидкой форме известен как навозная жижа и продуцируется в более интенсивных животноводческих системах, где вместо соломенной подстилки используется бетонный или планчатый пол.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы получения одного или более высокоэнергетических метаболитов в качестве биотоплива или предшественников биотоплива с использованием одного или более выделенных штаммов грибов, как описано выше, включающие:
а) получение смеси одного или более указанных выделенных штаммов грибов и/или их потомства с сырьем, выбранным из группы, состоящей из лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов и их комбинации, в контейнере, где указанное сырье может поддерживать рост указанного выделенного штамма гриба и/или его потомства;
б) рост указанного выделенного штамма гриба в указанной смеси с получением одного или более типов биотоплива и/или предшественников биотоплива; и
в) возможно, выделение указанных типов биотоплива и/или предшественников биотоплива из смеси.
В одном воплощении дополнительные соединения, необходимые для роста выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению, добавляют в смесь, где сырье не содержит или содержит недостаточное количество указанных соединений, необходимых для роста штамма гриба. Выделенный штамм гриба и/или его потомство по настоящему изобретению может быть использован для получения биотоплива и/или предшественников биотоплива из различных источников, таких как лигноцеллюлозное сырье, углеродсодержащие отходы, углеводы, мономеры сахара или их комбинации. В одном воплощении указанное биотопливо представляет собой биоспирт, биоводород и/или биодизель. В одном воплощении указанные предшественники биотоплива представляют собой липиды или сахара. В одном воплощении указанное сырье выбрано из группы, состоящей из лигноцеллюлозы (например тины, пшеничной соломы, ячменной соломы, стеблей кукурузы, проса, использованных зерен пивоварения, лесных продуктов, материала энергетических культур), углеводов (например моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов), отходов (например шлама коммунальных, промышленных и сельскохозяйственных сточных вод) и их комбинации.
Лигноцеллюлозное сырье может быть выбрано из группы, состоящей из остатков сельскохозяйственных культур (например пшеничной соломы, ячменной соломы, рисовой соломы, соломы мелкозерных злаков, стеблей кукурузы, кукурузных волокон (например камеди кукурузных волокон (CFG), сушеной барды (DDG), кукурузной глютеновой муки (CGM)), проса, сена люцерны, жома сахарного тростника), несельскохозяйственной биомассы (например тины, остатков городских деревьев), лесных продуктов и промышленных отходов (например остатков первичного/вторичного измельчения дерева с мягкой древесиной, остатков первичного/вторичного измельчения дерева с твердой древесиной, шлама бумажной массы вторичной бумаги), лигноцеллюлозо-содержащих отходов (например газетной бумаги, бумажных отходов, зерна пивоварения, использованной резиновой шины (UTR), городских органических отходов, дворовых отходов, клинических органических отходов и отходов, полученных при производстве биотоплива (например обработанной биомассы водорослей, глицерина) и их комбинации.
Углеродсодержащие отходы могут быть выбраны из группы, состоящей из коммунальных органических отходов, дворовых отходов, промышленных отходов, таких как отходы химического, фармацевтического или бумагоизготовительного промышленного объекта или пищевого предприятия и их комбинации.
Углеводное сырье может быть выбрано из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинации. В одном воплощении указанные мономеры сахара выбраны из группы, состоящей из триоз, тетроз, пентоз, гексоз, гептоз и тому подобного и их комбинации. В одном воплощении указанные пентозы выбраны из группы, состоящей из рибулозы, ксилулозы, рибозы, арабинозы, ксилозы, ликсозы, дезоксирибозы и их комбинации. В одном воплощении указанные гексозы выбраны из группы, состоящей из аллозы, альтрозы, глюкозы, маннозы, глюкозы, идозы, галактозы, талозы, псикозы, фруктозы, сорбозы, тагатозы и их комбинации.
В одном воплощении указанная смесь дополнительно содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из подкисляющих веществ, источников марганца и пищевых добавок, pH-буферных веществ.
В одном воплощении указанная смесь имеет исходное значение pH от 0,5 до 7,5, которое увеличивается в процессе ферментации, кроме ферментации в буферной среде или в культуральном сосуде с контролируемым pH, от примерно 0 до примерно 8,0, например от примерно 0,5 до примерно 7,5, от примерно 0,5 до примерно 3,0, или от примерно 3,0 до примерно 7,0.
Способы получения высокоэнергетических метаболитов с использованием выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению обладают и другими преимуществами. Например, в настоящем изобретении предложены новые способы получения высокоэнергетических метаболитов в качестве биотоплива или предшественников биотоплива из сырья, такого как лигноцеллюлозные материалы (например дерево или солома). Существующие на сегодняшний день способы получения биотоплива из лигноцеллюлозных веществ требуют различных дорогостоящих предварительных обработок и ферментных добавок. Одним преимуществом настоящего изобретения является то, что оно не требует стадий предварительной обработки сырья, таких как получение лигноцеллюлозного материала (например дерева или соломы), пригодного для гидролиза или целлюлолиза, и добавления ферментов, поскольку выделенный штамм гриба по настоящему изобретению сам может выполнять эти стадии. Таким образом, в способе, описанном в данном описании изобретения, лигноцеллюлозное сырье непосредственно преобразуется в высокоэнергетические метаболиты с немногими стадиями предварительной обработки и без добавлений ферментов. Следовательно, применение этого нового способа является относительно простым и недорогим по сравнению с существующими методами. В качестве другого примера выделенный гриб по настоящему изобретению можно использовать для получения высокоэнергетических метаболитов, таких как биотопливо или предшественники биотоплива, в широком диапазоне pH, таким образом устраняя необходимость в дорогостоящих стадиях нейтрализации pH. В качестве другого примера при получении липидов в качестве предшественников биодизеля, выделенный штамм гриба по настоящему изобретению имеет более подходящий липидный профиль по сравнению с водорослями и другими организмами, производящими липиды. В качестве еще одного примера выделенный штамм гриба и/или его потомство по настоящему изобретению обладает высокой устойчивостью к загрязнению другими организмами, так как известно, что представители рода Fusarium образуют нафтазариноидые пигменты, которые обладают мощными антибиотическими, инсектицидными и фитотоксическими свойствами (Brimble et ai., 1999). Таким образом, способы получения высокоэнергетических метаболитов по настоящему изобретению не требуют применения дорогостоящих и времязатратных способов для предотвращения загрязнения по сравнению с другими существующими в настоящее время способами микробного получения биотоплива. В качестве еще одного примера, выделенный штамм гриба и/или его потомство по настоящему изобретению устойчивы к высокой концентрации металлов, таких как Mn, который может быть использован для увеличения скорости разрушения лигнина.
Культуры и композиции, содержащие выделенный штамм гриба
Штамм МК7 Fusarium oxysporum представляет собой новый штамм ацидофильного гриба, который может непосредственно превращать лигноцеллюлозное сырье, углеводы (например 5- и 6-углеродные сахара) и биомассу (например биомассу водорослей) в высокоэнергетические субстраты, включающие липиды, этанол и водород.
В настоящем изобретении предлагается биологически чистая культура, обладающая одной, двумя, более или всеми идентифицирующими характеристиками выделенного штамма гриба Fusarium oxysporum и/или его потомства, как описано в данном описании изобретения. В одном воплощении биологически чистая культура содержит выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum, обозначенный как МК7, который был депонирован как АТСС номер РТА-10698, или его активные мутанты. В одном воплощении указанный выделенный штамм гриба и/или его потомство находятся в форме конидии, пикниды, хламидоспор, фрагментов гиф или их комбинации.
Заявитель создал депозит от имени Службы Национальных Парков, Национального Парка Йеллоустоун, США, 2 марта 2010, USA, состоящий из 25 флаконов штамма МК7 Fusarium oxysporum (как описано в данном описании изобретения) в рамках Будапештского договора в Американской коллекции типовых культур (АТСС), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA, АТСС номер РТА-10698. Штамм был депонирован до даты подачи настоящей заявки. Для того чтобы удовлетворить требования 35 U.S.С. 112 и подтвердить, что депозит выделенного штамма по настоящему изобретению удовлетворяет критериям, изложенным в 37 CFR 1.801-1.809, заявители настоящим документом делают следующие заявления, касающиеся депонированного штамма МК7 Fusarium oxysporum (депонированного как АТСС номер РТА-10698):
1. Во время рассмотрения этой заявки доступ к данному изобретению будет предоставлен Уполномоченному по запросу;
2. При выдаче патента штамм будет доступен для общественности при условиях, указанных в 37 CFR 1.808;
3. Депозит будет поддерживаться в общедоступном хранилище в течение 30 лет, или 5 лет после последнего запроса, или в течение возможного срока действия патента, который из них окажется дольше.
4. Будет определена жизнеспособность биологического материала на момент депонирования; и,
5. Депозит будет заменен, если он в каком-либо случае станет недоступным.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей выделенный штамм гриба Fusarium oxysporum, имеющий по меньшей мере один, два, более или все идентифицирующие характеристики, описанные в данном описании изобретения. В одном воплощении указанный выделенный штамм гриба и/или его потомство находятся в форме конидий, пикнид, хламидоспор, фрагментов гиф, или их комбинации. В некоторых воплощениях композиция дополнительно содержит один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из среды, которая поддерживает рост штамма гриба, подкисляющего вещества, источника марганца, питательной добавки и их смеси. В одном воплощении среда является твердой. В другом воплощении среда является жидкой.
В одном воплощении композиция содержит среду, поддерживающую рост выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению. Подходящая среда для выделения, роста и поддержания Fusarium oxysporum хорошо известна специалистам в данной области техники. Неограничивающие примеры такой среды для Fusarium oxysporum описаны в Gunner et al (1964, Anaerobic Growth of Fusarium oxysporum, J. Bacterial. 87: 1309-1316), Joshi et al (1987, The influence of various carbon and nitrogen sources on oil production by Fusarium oxysporum, 32 (2): 124-129), De La Broise et al (1989, Osmotic, biomass, and oxygen effects on the growth rate of Fusarium oxysporum using a dissolved-oxygen-controlled turbidostat, Biotechol. Bioeng. 33 (6): 699-705) и Norio et al (2007, Selected media for Fusarium oxysporum, Journal of General Plant Pathology, 73 (5): 342-348; 2002, Selective medium for Fusarium oxysporum and nitrate metabolic capacity defective strain, Kyushu Okinawa Nogyo Kenkyu Seika Joho, 17: 491.-492), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей полноте.
Добавки питательных веществ могут быть выбраны из группы, состоящей из углеводов (например моносахаридов, полисахаридов), источника аминокислот (например аминокислоты, полипептидов), микронутриентов (например кальция, аммония, меди, калия, натрия, буры, железа, цинка и т.д.) и их комбинации.
Ферменты, устойчивые к кислому рН, из штамма МК7 F. oxysporum
Современная технология получения этанола из лигноцеллюлозо-содержащих веществ требует нескольких стадий перед ферментацией дрожжами. Эти стадии могут включать термическое разложение, гидролиз разбавленной или концентрированной кислотой, щелочной гидролиз или окисление химическими веществами, такими как перекись водород (Hendricks and Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 100: 10-18.). Целью предварительной обработки является солюбилизация гемицеллюлозы и лигнина и декристаллизация целлюлозы. Однако перед ферментацией дрожжами рН смеси должна быть нейтрализован, и смесь должна быть обработана ферментами для деполимеризации целлюлозы в глюкозу.
Недавно был секвенирован геном штамма 4287 Fusarium oxysporum f. sp. liycopersici и было показано, что он несет различные гены, участвующие в разрушении лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы. Кроме того, ферменты, участвующие в разрушении этих веществ (например целлюлаза, ксиланаза, лигниназа, глюциронидаза, арабинофуранозидаза, арабиногалактаназа, эстераза феруловой кислоты, липаза, пектиназа, глюкоманназа, амилаза, ламинариназа, ксилоглюканаза, галактаназа, глюкоамилаза, пектатлиаза, хитиназа, экзо-β-D-глюкозаминидаза, целлобиоза-дегидрогеназа и ацетилксилан-эстераза, ксилозидаза, α-L-арабинофуранозидаза, ферулоил-эстераза, эндоглюканаза, β-глюкозидаза, Mn-пероксидаза и лакказа) были широко изучены в штамме F3 F. oxysporum (Xiros et al. 2009, Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnol Biofuels, 10: 4). Соответственно, штаммы F. oxysporum, в том числе штамм МК7, как ожидается, полностью оснащены для гидролиза сложных лигноцеллюлозных веществ, таких как пшеничная солома. Также ожидается, что, поскольку штамм МК7 способен расти при более низком значении pH (0,7-7,5), по сравнению с другими штаммами Fusarium (pH>2; Starkey, 1973), ферменты для разрушения лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы в штамме МК7 будут иметь более высокие активности при низком значении pH. Ферменты с высокой активностью в кислых условиях будут особенно подходящими для получения биотоплива, когда в качестве предварительной обработки лигноцеллюлозных веществ используют кислотный гидролиз.
Методы клонирования указанных ферментов известны в данной области техники. Например, ген, кодирующий конкретный фермент, может быть выделен посредством ОТ-ПЦР из полиаденилированной мРНК, экстрагированной из гриба, или посредством ПЦР из ДНК, экстрагированной из гриба. Полученный в результате продукт - ген может быть клонирован в качестве ДНК-вставки в вектор. Термин "вектор" относится к средству, посредством которого нуклеиновая кислота может быть размножены и/или перемещены между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагемиды, транспозоны, искусственные хромосомы и тому подобное, которые автономно реплицируются и могут встраиваться в хромосому клетки-хозяина. Вектором также может быть оголенный РНК-полинуклеотид, оголенный ДНК-полинуклеотид, полинуклеотид, состоящий из ДНК и РНК в пределах одной нити, полилизин-конъюгированная ДНК или РНК, пептид-конъюгированная ДНК или РНК, липосома-конъюгированная ДНК и т.п., которые автономно не реплицируются. Во многих, но не во всех распространенных воплощениях векторы по настоящему изобретению представляют собой плазмиды или бакмиды.
Таким образом, изобретение включает нуклеотиды, которые кодируют ферменты, устойчивые к кислому pH, включая химерные молекулы, клонированные в экспрессионный вектор, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, отличной от Fusarium oxysporum (например в клетке другого штамма гриба, дрожжевой клетке, бактериальной клетке, растительной клетке и др.). "Экспрессионный вектор" представляет собой вектор, такой как плазмида, который способен стимулировать экспрессию, а также репликацию, нуклеиновой кислоты, включенной в него. Как правило, нуклеиновая кислота, предназначенная для экспрессии, "функционально связана" с промотором и/или энхансером и подвергается транскрипционному регулирующему контролю со стороны промотора и/или энхансера. Промотором может быть промотор конститутивной экспрессии, промотор индуцибельной экспрессии, промотор тканеспецифической экспрессии или промотор экспрессии, специфичной для внутриклеточный органеллы. В одном воплощении нуклеотиды, кодирующие один или более ферментов, устойчивых к кислому pH, экспрессируются в одном экспрессионном векторе, трансформированном в клетку-хозяина, или в более чем одном экспрессионных векторах, совместно трансформированных в клетку-хозяина.
В одном воплощении ферменты, устойчивые к кислому рН, очищенные из выделенного штамма гриба и/или его потомства по настоящему изобретению или полученные в рекомбинантной клетке-хозяине, при тестировании in vitro, по сравнению с гомологичными ферментами из неустойчивых к кислому pH штаммов Fusarium oxysporum (например штаммов Fusarium, которые могут расти только при pH, равном по меньшей мере 3,0, см. Starkley et al., Effect of pH on toxcicity of copper to Scytalidium sp., a copper-tolerant fungus, and some other fungi. J, gen. Microbiol. 78: 217-225), обладают на примерно 5%, примерно. 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 100%, примерно 150%, примерно 200%, примерно 250%, примерно 300%, примерно 400%, примерно 500%, примерно 550%, примерно 600%, примерно 650%, примерно 700%, примерно 800%, примерно 850%, примерно 900% или примерно 1000% большей активностью при pH менее 3,0, менее 2,9, менее 2,8, менее 2,7, менее 2,6, менее 2,5, менее 2,4, менее 2,3, менее 2,2, менее 2,1, менее 2,0, менее 1,9, менее 1,8, менее 1,7, менее 1,6, менее 1,5, менее 1,4, менее 1,3, менее 1,2, менее 1,1, менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6 или менее 0,5.
Таким образом, ферменты, устойчивые к кислому pH, из штамма F. oxysporum и/или его потомства по настоящему изобретению и нуклеотиды, кодирующие такие ферменты, могут быть выделены и использованы для многих целей. В одном воплощении такие ферменты можно использовать в предварительной обработке лигноцеллюлозного сырья при получении этанола перед ферментацией другими организмами (бактериями, грибами, дрожжами и др.) для разрушения лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы. Например, эти ферменты используют непосредственно после гидролиза лигноцеллюлозного сырья (особенно кислотного гидролиза), где лигнин, целлюлоза и гемицеллюлоза разлагаются под действием ферментов. В отличие от традиционных методов, стадия нейтрализации не требуется, благодаря свойству устойчивости к кислому pH ферментов, полученных из выделенного штамма гриба по настоящему изобретению. В одном воплощении ферменты, устойчивые к кислоте, продуцируемые выделенным штаммом гриба по настоящему изобретению, могут быть использованы в современных способах получения биотоплива, которые включают предварительную кислотную обработку и ферментативное разрушение.
Токсины, продуцируемые F. oxysporum
1
В настоящее время для микробного получения биотоплива требуется использование дорогостоящих и времязатратных методов для предотвращения загрязнения. Штамм МК7 является высокорезистентным к загрязнению другими организмами, так как представители рода Fusarium, как известно, образуют токсины (например нафтазариновые пигменты), которые обладают мощными антибиотическими, инсектицидными и фитотоксическими свойствами. Таким образом, штамм МК7 требует незначительного или совсем не требует добавления внешних антибиотиков при использовании в получении биотоплива и/или предшественников биотоплива. Fusarium oxysporum в общем случае продуцирует девять разных токсинов, при этом продуцирование зависит от их взаимоотношения с разными растениями-хозяевами (Marasas et al., 1984, Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, ISBN 0271003480). Производство токсинов также меняется в зависимости от среды, используемой при ферментации in vitro. Токсины, продуцируемые и секретируемые видами Fusarium, включают, без ограничения ими, бикаверин, энниатины, фузаровую кислоту, ликомаразмин, монилиформин, оксиспорон, трихотецены, зеарелоны, различные нафтохиноны и антрахиноны (например нонакетидные нафтазариновые хиноны, бикаверин и норбикаверин, гептакетиды, нектриафурон, 5-O-метиляваницин и ангидрофусарубин-лактол). Например, токсины из видов Fusarium могут включать 4-ацетоксискирпендиол (4-3-ацетокси-3,15-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен. Аналогичное соединение, монодеацетилангвидин, то есть 4- или 15-ацетилскирпентриол), 3-ацетилдезоксиниваленол (дезоксиниваленола моноацетат, 3''-ацетокси-7'',15-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он), 8-ацетилнеозоланиол (неозоланиола моноацетат, 4'',8'', 15-триацетокси-3''-гидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), 4- или 15-ацетилскирпентриол (4-ацетоксискирпендиол), ацетил-Т-2 токсин (3'',4'', 15-триацетокси-8''-(3-метилбутирил(окси)-12,13-эпокситрихотец-9-ен), ангвидин (диацетоксискирпенол), авенацеин, боверицин, бутенолид (4-ацетамидо-4-гидрокси-2-бутеновая кислота-лактон), калонектрин (3'', 15-диацетокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), 15-деацетилкалонектрин (15-де-О-ацетилкалонектрин, 3''-ацетокси-15-гидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), дезоксиниваленол (Rd токсин, вомитоксин, 3'',7'',15-тригидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он), дезоксиниваленола диацетат (диацетилдезоксиниваленол), дезоксиниваленола моноацетат (3-ацетилдезоксиниваленол), диацетоксискирпендиол (7''-гидроксидиацетоксискирпенол), диацетоксискирпенол (ангвидин, 4,15-диацетокси-3'-гидрокси12,13-эпокситрихотец-9-ен), диацетоксискерпентриол (7',8''-дигидроксидиацетоксискирпенол), диацетилдезоксиниваленол (дезоксиниваленола диацетат, 3'',15-диацетокси-7-гидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он), диацетилниваленол (ниваленола диацетат, 4,15-диацетокси-3',7'-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он), 7'',8''-дигидроксидиацетоксискирпенол (диацетоксискирпентриол, 4,15-диацетокси-3'',7'',8''-тригидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), энниатины, фруктигенин, фумонизин B (1,2,3-пропантрикарбоновой кислоты 1,-1-[1-(12-амино-4,9,11-тригидрокси-2-метилтридецил)-2-(1-метилпентил)-1,2-этандиил]овый эфир; макрофузин), фузаренон (фузаренон-Х, фузаренон, моноацетилниваленол, ниваленола моноацетат, 4-ацетокси-3'',7'',15-тригидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он) фузаровая кислота (фузариновая кислота, 5-бутилпиколиновая кислота), фузариновая кислота (фузаровая кислота), F-2 (зеараленон), НТ-2 токсин, то есть 15-ацетокси-3'',4-дигидрокси-8''-(3-метилбутирилокси)-12-эпокситрихотец-9-ен. 7''-гидрокси-диацетоксискирпенол (диацетоксискирпендиол, 4,15-диацетокси-3'',7''-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), 8''-гидроксидиацетоксискирпенол (неозоланиол), 1,4-ипомеадиол (1-(3-фурил)-1,4-пентандиол), ипомеанин (1-(3-фурил)-1,4-пентантион), 1-ипомеанол (1-(3-фурил)-1-гидрокси-4-пентанон), 4-ипомеанол (1-(3-фурил)-4-гидрокси-4-пентанон), латеритин, ликомаразмин, монилиформин (калиевая или натриевая соль 1-гидроксициклобут-1-ен-3,4-диона), моноацетоксискирпенол (15-ацетокси-3'',4''-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), моноацетилниваленол (фузаренон-Х), монодеацетилангвидин (4-ацетоксискирпендиол), неозоланиол (8''-гидроксидиацетоксискирпенол, 4,15-диацетокси-3'',8''-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), неозоланиолацетат (8-ацетилнеозоланиол), неозоланиола моноацетат (8-ацетилнеозоланиол), ниваленол (3'',4'',7'',15''-тетрагидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен-8-он), ниваленола диацетат (диацетилниваленол), ниваленола моноацетат (фузаренон-Х), NT-1 токсин (Т-1 токсин, 4'',8''-диацетокси-3'',15-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), NT-2 токсин (4''-ацетокси- 3'',8'',15-тригидрокси-12, 13-эпокситрихотец-9-ен), Rd токсин (дезоксиниваленол), самбуцинин, скирпентриол (3'',4'',15''-тригидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), соланиол (неозоланиол), Т-1 токсин (NT-1 токсин), Т-2 токсин (4'',15''-диацетокси-3''-гидрокси-8''-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокситрихотец-9-ен), триацетокси-скирпендиол (4'',8'',15''-триацетокси-3'',7''-дигидрокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), триацетокси-скирпенол (3'',4'',15''-триацетокси-12,13-эпокситрихотец-9-ен), вомитоксин (дезоксиниваленол), яваницин, зеараленол (2,4-дигидрокси-6-(6,10-дигидрокси-транс-1-ундеценил)-бензойной кислоты лактон), зеараленон (6-(10-гидрокси-6-оксо-транс-1-ундеценил)-резорциловой кислоты лактон). Более подробно токсины, продуцируемые F. oxysporum, описаны в Tatum et al. (Naphthoquinones produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1985, Phytochemistry 24: 457-459), Tatum et al. (Naphthofurans produced by Fusarium oxysporum isolated from citrus. 1987, Phytochemistry, 26: 2499-2500), Baker et al. (Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum. 1998, J Ferment Bioeng 85: 359-361); Thrane (Fusarium species on their specific profiles of secondary metabolites, in Fusarium. Mycotoxins, taxonomy and pathogenicity, 1989, ed by Chelkowski J, Elsevier, NY, USA, pp 199-225); Baker et al., Antimicrobial activity of naphthoquinones from Fusaria, Mycopathologia 111: 9-15, 1990; Marasas et al. (Toxigenic Fusarium species, identity and mycotoxicology, 1984, Pennsylvania State University Press, University Park, PA, USA), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
В другом воплощении токсины (например нафтазариновые пигменты), продуцируемые штаммом МК7 также могут иметь другое промышленное применение. Например, токсины (например нафтазариновые пигменты), продуцируемые штаммом МК7, могут быть использованы как антибиотики, инсектициды и/или гербициды. В одном воплощении нафтазариновые пигменты, продуцируемые штаммом МК7, используют вместе со вторым химическим веществом, которое выбрано из других антибиотиков, инсектицидов и/или гербицидов.
Сидерофоры, продуцируемые F. oxysporum
Известно, что штаммы Fusarium oxysporum продуцируют сидерофоры, которые можно использовать для комплексообразования с металлами для промышленного применения. Ожидается, что сидерофоры, продуцируемые выделенным штаммом гриба по настоящему изобретению, будут функциональными при низком рН.
3+
3+
3+
3+
Сидерофоры (от греческого: "переносчик железа") представляют собой низкомолекулярные высокоаффинные железохелатирующие соединения, секретируемые микроорганизмами, такими как бактерии, грибы, и травами (Neilands et al., A Crystalline Organo-iron Pigment from a Rust Fungus (Ustilago sphaerogena), 1952. J. Am. Chem. Soc 74: 4846-4847, Neilands et al, Siderophores: Structure and Function of Microbial Iron Transport Compounds. 1995, J. Biol. Chem. 270: 26723-26726). Сидерофоры являются одними из самых сильных известных связывающих агентов растворимого Fe. Железо является необходимым почти для всех жизненных процессов, имеет наиважнейшее значение для таких процессов как дыхание и синтез ДНК. Несмотря на то, что железо является одним из самых распространенных элементов в земной коре, биодоступность железа во многих окружающих средах, таких как почва или море, ограничена очень низкой растворимостью иона Fe. Микроогранизмы высвобождают сидерофоры, чтобы захватить железо из этих минеральных фаз путем образования растворимых комплексов Fe, которые могут быть захвачены активными транспортными механизмами. Многие сидерофоры представляют собой нерибосомные пептиды (Miethke et al, 2007, Siderophore-Based Iron Acquisition and Pathogen Control. Microbiol, Mol. Bio. Reviews, 71: 413-451), хотя биосинтез некоторых из них осуществляется независимо (Challis et al., 2005, А widely distributed bacterial pathway for siderophore biosynthesis independent of nonribosomal peptide synthetases. ChemBioChem, 6: 601-611). Сидерофоры входят в число самых сильных веществ, связывающихся с Fe, при этом энтеробактин является одним из самых сильных среди них. Благодаря этому свойству они привлекли интерес медицинской науки для хелаторной терапии, при этом сидерофор десфероксамин В получил широкое применение в лечении отравления железом и талассемии. Сидерофоры также могут хелатировать другие металлы, которые включают, без ограничения ими, алюминий, галлий, хром, медь, цинк, свинец, марганец, кадмий, ванадий, индий, плутоний и уран.
3+
Сидерофоры обычно образуют гексадентатный, окстаэдрический комплекс с Fe предпочтительно по сравнению с другими природными, широко распространенными ионами металлов, хотя при наличии менее чем шести донорных атомов, вода также может координироваться. Наиболее эффективными сидерофорами являются те, которые имеют три бидентатных лиганда на молекулу, образуя гексадентатный комплекс и вызывая меньшее изменение энтропии, чем вызывает хелатирование одного трехвалентного иона железа отдельными лигандами. Типичную коллекцию сидерофоров см. в Miller et al. (Studies and Syntheses of Siderophores, Microbial Iron Chelators, and Analogs as Potential Drag Delivery-Agents. 2000, Current Medicinal Chemistry 7: 159-197). Сидерофоры обычно классифицируют по лигандам, используемым для хелатирования трехвалентного иона железа. Основные группы сидерофоров включают катехоляты (феноляты), гидроксаматы и карбоксилаты (например производные лимонной кислоты). Лимонная кислота также может действовать в качестве сидерофора. Широкое разнообразие сидерофоров может быть связано с эволюционным давлением, действующим на микроорганизмы, с получением структурно различающихся сидерофоров, которые не могут быть транспортированы активными транспортными системами других микроорганизмов, или в случае патогенов, дезактивированы организмом хозяина. Неограничивающие примеры сидерофоров включают гидроксаматные сидерофоры (например феррихром в Ustilago sphaerogena, десферриоксамин В (дефероксамин) в Streptomyces pilosus или Streptomyces coelicolor, десферриоксамин Е в Streptomyces coelicolor, фузаринин С в Fusarium roseum, орнибактин в Burkholderia cepacia), катехолатные сидерофоры (например энтеробактин в Escherichia coli и энтеробактериях, бацилибактин в Bacillus subtilis и Bacillus anthracis, вибриобактин в Vibrio cholerae), и сидерофоры со смешанными лигандами (например азотобактин в Azotobacter vinelandii, пиовердин в Pseudomonas aeruginosa, иерсиниабактин в Yersinia pestis). Большее количество грибковых сидерофоров описано в Renshaw et al, (Fungal siderophores: structures, functions and applications, 2002, Mycol. Res. 106 (10): 1123-1142).
Сидерофоры применяют в медицине для терапии перенасыщения железом и алюминием и лучшей адресности антибиотиков. Понимание механизма действия сидерофоров привело к возможности разработки ингибиторов с малыми молекулами, которые блокируют биосинтез сидерофоров и, следовательно, бактериальный рост и вирулентность в условиях недостатка железа (Ferreras et al,, 2005, Small-molecule inhibition of siderophore biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis. Nature Chemical Biology 1: 29-32). Сидерофоры полезны в качестве лекарственных средств в облегчении мобилизации железа у людей, особенно при лечении заболеваний, связанных с железом, благодаря их высокой аффинности к железу. Одно потенциально мощное применение заключается в использовании способностей сидерофоров транспортировать железо для переноса лекарственных средств в клетки путем получении конъюгатов сидерофоров с противомикробными агентами. Поскольку микроорганизмы идентифицируют и используют только определенные сидерофоры, ожидают, что такие конъюгаты будут обладать селективной противомикробной активностью.
Доставка лекарственного средства, опосредованная микробным транспортом железа (сидерофором), позволяет использовать идентификацию сидерофоров в качестве агентов доставки железа, чтобы иметь конъюгаты микробного сидерофора, ассимилированного с прикрепленными лекарственными средствами. Эти лекарственные средства являются летальными для микроорганизмов и заставляют микроорганизм совершить самоубийство, когда он поглотит конъюгат сидерофора. Благодаря включению железосвязывающих функциональных групп сидерофоров в антибиотики, их эффективность значительно возрастает. Это происходит благодаря системе сидерофор-опосредованного захвата железа бактерий.
Таким образом, в одном воплощении сидерофоры могут быть извлечены из выделенного штамма МК7 F. oxysporum. Например, штамм МК7 можно культивировать с использованием подходящей среды, как описано в настоящем изобретении, или лигноцеллюлозного сырья, углеродсодержащих отходов, углеводов или их комбинации в анаэробных или аэробных условиях. Способы выделения сидерофоров известны специалисту в данной области техники. Экстракцию сидерофоров органическим растворителем, этилацетатом в случае катехольного типа, и либо бензиловым спиртом или смесью хлороформ : фенол (1:1) для гидроксаматного типа, используют в качестве эффективных стадий очистки для многих типов сидерофоров, так как соли и макромолекулы эффективно удаляются (Neilands et al, Microbial iron compounds. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50, 715-731). Широко используют полистирольную смолу Amberlite XAD для очистки нейтрального, феррихромного типа сидерофоров (Horowitz et ai, Isolation and identification of the conidial growth factor of Neurospora crassa. 1976, J. Bacterial. 127, 135-140) и полиамидную смолу для хроматографического выделения катехольного типа.
-1
-1
-1
-1
Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы детоксификации жидкостей, содержащих ионы металлов, и/или извлечения ионов металлов из растворов посредством биосорбции. В одном воплощении композицию, содержащую выделенный штамм МК7 F. oxysporum, или композицию, содержащую сидерофоры, экстрагированные из выделенного штамма МК7 F. oxysporum, можно использовать для детоксификации жидкостей, содержащих металлы, как описано выше, и/или для извлечения таких металлов. В одном воплощении композицию, содержащую достаточное количество выделенного штамма МК7 F. oxysporum или сидерофоров, экстрагированных из выделенного штамма МК7 F. oxysporum, смешивали с образцом, содержащим металлы в течение некоторого времени, что позволяло большинству ионов металла в жидкостях связаться с сидерофорами. В одном воплощении такой образец может представлять собой сточную жидкость, содержащую один или более типов ионов металла (например жидкости горнорудных отходов, жидкости промышленных отходов и др.). В одном примере жидкости содержат по меньшей мере один ион металла, выбранный из группы, состоящей из Ag, Zn, Fe, Al, Be, Pb, Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Ni, Ma, Pd, Pt, U, Th, Mo, Sn, Ti, As, Au и Hg. В одном воплощении общая исходная концентрация ионов металлов варьируется от примерно 1 млн до примерно 100000 млн по массе. Например, общая концентрация ионов металлов варьируется от примерно 0,5 млн (например Cd) до примерно 250 млн (например Zn) в зависимости от металлического компонента. В одном воплощении жидкие отходы смешивают с выделенным штаммом МК.7 F. oxysporum в биореакторе, куда добавляют среду и питательные вещества для роста грибов для обеспечения пролиферации штамма МК7. Одним из наиболее важных требований к технологическому применению биосорбции является фиксация биомассы на среде для прикрепления, позволяющая биосорбенту удерживаться в реакторе, так что его можно использовать повторно. Это часто осуществляют путем иммобилизации микроорганизмов на матрице. Таким образом, в одном воплощении штамм МК7 или сидерофор иммобилизован на матрице. Есть много примеров применения этих методов, наиболее типичные можно найти в следующих научных исследованиях: Brierley, Production and application of a Bacillus-based product for use in metals biosorption. In: B. Volesky, Editor, Biosorption of Heavy Metals, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1990), pp. 305-312; Brierley, Immobilization of biomass for industrial application of biosorption. In: A.E. Torma, M.L. Apel and C.L. Brierley, Editors, Biohydrometallurgical Technologies, Proceedings of the International Biohydrometallurgy Symposium, The Minerals, Metals and Materials Society, Warrendale, Pa. (1993), pp. 35-44; Tsezos у Deutschmann (1990). An Investigation of Engineering Parameters for the use of Immobilized Biomass Particles in Biosorption. J. Chem. Technol. Biotechnol, 48, 29-39; Gilson у Thomas (1995), Calcium alginate bead manufacture: with and without immobilized yeast. Drop formation at a two-fluid nozzle. J. Chem. Technol. Biotechnol, 62 pp. 227-232; Bedell у Damall, (1990), Immobilization of nonviable, biosorbent, algal biomass for the recovery of metal ions. In: B. Volesky, Editor, Biosorption of Heavy Metals, CRC Press, Boca Raton, Fia., pp. 313-326; Figueira et al. (2000), Biosorption of metals in brown seaweed biomass. Water Res. 34 pp. 196-204; Kratochvil et al. (1997) Optimizing Cu removal/recovery in a biosorption column. Water Res. 31 pp. 2327-2339; Kratochvil у Volesky, (2000), Multicomponent biosorption in fixed beds. Water Res. 34 pp. 3186-3196; Trujillo et al, (1991), Mathematically modeling the removal of heavy metals from wastewater using immobilized biomass. Environ. Sci. Technol. 25 pp. 1559-1565. Иммобилизующими агентами или наиболее часто используемыми матрицами являются альгинат, полиакриламид, полисульфон, силикагель, целлюлоза и глутаральдегид.
2
4
Ионы металлов, которые связывались с биосорбентом (штаммом МК7 или сидерофорами, экстрагированными из штамма МК7) посредством стадии биосорбции, как описано выше, подвергают стадии десорбции, которая позволяет элюировать ионы металла из сидерофоров и регенерировать связывающую способность с металлами штамма гриба или экстрагированных сидерофоров. Это осуществляли путем обработки смеси штамма гриба и сточных жидкостей или смеси экстрагированных сидерофоров и сточных жидкостей кислым раствором и затем щелочным раствором для нейтрализации кислоты в смеси. Раствор кислоты (например концентрированную 95-97% HSO) добавляют в смесь для десорбции, при этом ионы металла высвобождаются из иммобилизованного биосорбента (штамма МК7 или сидерофоров, экстрагированных из штамма МК7). После стадии десорбции смесь нейтрализовали, используя раствор основания (например концентрированный раствора гидроксида натрия (например 50% NaOH).
Пластификатор
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что выделенный штамм F. oxysporum по настоящему изобретению может продуцировать пластификаторы, например диизооктилфталат (DIOP) и гександионовой кислоты моно(2-этилгексил)овый эфир (синоним 2-этилгексилгидроадипат).
Пластификаторы (диспергаторы) представляют собой добавки, которые повышают пластичность или текучесть вещества, к которому они добавлены; к ним относятся пластмассы, цемент, бетон, древесноволокнистая плита и глина. Хотя одни и те же соединения часто используются как для пластмасс, так и для бетона, желаемый эффект немного различается. Мировой рынок пластификаторов в 2004 имел общий объем примерно 5,5 млн тонн, что привело к обороту чуть более 6 млрд. фунтов.
Пластификаторы для бетона смягчают смесь до того, как она затвердеет, увеличивая ее пригодность или уменьшая количество воды и, как правило, не предназначены для влияния на свойства конечного продукта после того, как он затвердеет. Пластификаторы для древесноволокнистой плиты повышают текучесть смеси, что позволяет снизить использование воды и тем самым уменьшает количество энергии для высушивания досок. Пластификаторы для пластмасс смягчают конечный продукт, увеличивая его гибкость.
Пластификаторами для пластмасс являются добавки, наиболее часто фталаты, которые придают твердым пластмассам, таким как ПВХ (поливинилхлорид), необходимую гибкость и долговечность. Они часто основаны на сложных эфирах поликарбоновых кислот с линейными или разветвленными алифатическими спиртами со средней длиной цепи. Пластификаторы работают, встраиваясь между цепями полимеров, создавая пространство между ними (увеличивая "свободный объем"), и тем самым значительно снижая температуру стеклования для пластика и делая его мягче. Для пластмасс, таких как ПВХ, чем больше пластификатора добавлено, тем ниже температура гибкости при низкой температуре. Это означает, что он будет более гибким, хотя его прочность и твердость будет в результате уменьшаться.
Сложноэфирные пластификаторы служат в качестве пластификаторов, смягчителей, наполнителей и смазочных агентов, сложные эфиры играют значительную роль в производстве каучука. Основная функция сложноэфирного пластификатора состоит в модификации полимера или смолы, повышающей его полезность. Сложноэфирные пластификаторы позволяют достичь улучшенных характеристик при обработке соединения и в то же время обеспечивают гибкость конечного продукта. Выбор сложноэфирных пластификаторов основан на оценке эффективности затрат. Составитель каучуковой смеси должен оценить сложноэфирные пластификаторы с точки зрения совместимости, пригодности к обработке, долговечности и других эксплуатационных свойств. Широкий спектр производимых сложноэфирных химических соединений включает себацинаты, адипаты, глутараты, фталаты, азелаты и другие специальные смеси. Эта широкая линейка продуктов предоставляет широкий спектр преимуществ в показателях, необходимых для многих эластомерных изделий, таких как трубы и шланги, уплотнения и прокладки, ремни, провода и кабели, и печатные валы. Сложные эфиры от низкой до высокой полярности обеспечивают применение в широком диапазоне эластомеров, включая нитрил, полихлоропрен, EPDM (этилен-пропиленовый каучук), хлорированный полиэтилен, и эпихлоргидрин. Взаимодействие пластификатор-эластомер определяется многими факторами, такими как параметр растворимости, молекулярная масса и химическое строение. Атрибуты совместимости и производительности являются ключевыми факторами при разработке состава каучука для конкретного применения.
Неограничивающие примеры пластификаторов включают пластификаторы на основе фталата (например бис(2-этилгексил)фталат (DEHP), диизононилфталат (DINP), бис(н-бутил)фталат (DnBP, DBF), бутилбензилфталат (BBzP), диизодецилфталат (DIDP), ди-н-октилфталат (DOP или DnOP), диизооктилфталат (DIOP), диэтилфталат (DEP), диизобутилфталат (DIBP) и ди-н-гексилфталат), тримеллитаты (например триметилтримеллитат (TMTM), три-(2-этилгексил)тримеллитат (TEHTM-MG), три-(н-октил,н-децил)тримеллитат (ATM), три-(гептил,нонил)тримеллитат (LTM), н-октилтримеллитат (ОТМ)), пластификаторы на основе адипата (бис(2-этилгексил)адипат (DEHA), диметиладипат (DMAD), монометиладипат (MMAD), диоктиладипат (DOA)), дибутилсебацинат (DBS), дибутилмалеат (DBM), диизобутилмалеат (DIBM), бензоаты, эпоксидированные растительные масла, сульфаниламиды, N-этил-толуол-сульфонамид (ETSA), орто- и лара-изомеры, N-(2-гидроксипропил)бензолсульфонамид (HP BSA), N-(н-бутил)бензол-сульфонамид (BBSA-NBBS), органофосфаты (например трикрезилфосфат (TCP), трибутилфосфат (ТВР), гликоли/полиэфиры, триэтиленгликоль дигексаноат (3G6, 3GH), тетраэтиленгликоль дигептаноат (4G7)), полимерные пластификаторы и полибутен.
В качестве пластификатора DIOP представляет собой универсальный пластификатор для поливинилхлорида, поливинилацетата, каучуков, пластиков, целлюлозы и полиуретана.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими ниже примерами, которые не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных документов, указанных в данной заявке, а также графические материалы включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте для всех целей.
ПРИМЕР
Пример 1
Выделение и рост штамма МК7 Fusarium oxysporum
Выделенный штамм гриба МК7 Fusarium oxysporum по настоящему изобретению был выделен в Йеллоустонском национальном парке в рамках NPS-разрешенного проекта исследования номер YELL-2007-SCI-1976.
Способы выделения штамма МК7 Fusarium oxysporum были ранее описаны. Например, 0,5 г смеси водорослей-биомассы грибов вводили в 200 мл природной фильтрованной родниковой воды из Йеллостоунского национального парка при pH 2,5 и культивировали под солнечным светом в течение 10 суток, после чего водоросли были израсходованы. 50 мкл оставшейся розоватой биомассы сеяли штрихом на 1,2% агар с синтетической средой (Kozubal et ah, 2008) при pH 3,0.
Выделенный гриб изучили и подтвердили, что штамм относится к Fusarium oxysporum по морфологическим характеристикам, которые включают гифы, являющиеся перегородчатыми и гиалиновыми, короткие и неразветвленные конидиефоры; многочисленные и типичные Fusarium oxysporu/п-подобные серповидные макроконидии с 5-перегородками размером примерно 25-50×3-4,5 мкм; и многочисленные, слегка изогнутые не имеющие перегородок микроконидии размером примерно 5-10×2,0-3,5 мкм. Кроме того, результаты BLAST ДНК последовательностей 18S рРНК и ITS (внутреннего транскрибируемого участка-спейсера) (SEQ ID NO. 1) указывают на то, что организм представляет собой штамм Fusarium oxysporum.
В процессе роста штамма МК7 были произведены ферменты, которые разрушают лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозы. Гриб использует полученные в результате продукты разложения для получения липидов или производства этанола и водорода, в зависимости от условий.
SEQ ID NO: 1 18S рРНК и ДНК последовательность ITS участка штамма МК7 Fusarium oxysporum
Пример 2
Продуцирование липидов штаммом МК7 Fusarium oxysporum
Инокулят штамма МК7 Fusarium oxysporum и жидкую среду (содержащую 3,5 г/л нитрата аммония, 0,4 г/л 2-водного хлорида кальция, 0,30 г/л 7-водного сульфата магния, 2 г/л однозамещенного фосфата калия, 0,5 г/л сульфата марганца и микроэлементы до конечных концентраций, описанных в Kozubal et al., 2008, включенный в данный документ посредством ссылки во всей его полноте) можно смешать с лигноцеллобиозным сырьем, лигноцеллюлозным сырьем, углеродсодержащими отходами или мономерами сахара в аэробной системе. Через определенное количество суток организм можно собрать и использовать для экстракции липида. Запатентованный процесс может также быть проведен в анаэробной системе, в которой производится этанол и газообразный водород. На Фиг. 2 показана биомасса гриба штамма МК7 Fusarium oxysporum через 7 суток роста на пшеничной соломе при pH 2,5 в аэробных условиях. Грибковый коврик готов для экстракции липида.
В исследовании разные типы сырья смешивали с инокулятом штамма МК7 Fusarium oxysporum и жидкой средой, включающей глюкозу, ксилозу, люцерну, авицел, белую бумагу и пшеничную солому. Через 10 суток собирали биомассу грибов для экстракции липидов. Липиды из биомассы грибов экстрагировали, используя метод экстракции общих липидов с помощью смеси 2:1 хлороформ/метиловый спирт, описанный ранее (Bligh and Dyer, A rapid method of total lipid extraction and purification, 1959, Can. J. Biochem. Physiol, 37, 911-917).
Общий выход извлеченных липидов из штамма МК7, растущего в разных типах сырья, определяли с использованием гравиметрической аналитической процедуры. Выходы грибов, растущих на глюкозе (pH 2,5), 8% пшеничной соломе (pH 2,5), 4% пшеничной соломе (pH 2,5) и 8% пшеничной соломе (pH 2,5; 25 мМ Mn) представлены на Фиг. 3. Как показано, штамм МК7 может продуцировать липиды из глюкозы или пшеничной соломы и почти 8% исходной массы пшеничной соломы превращалось в липиды через 10 суток при pH 2,5. Оптическая и флуоресцентная микроскопия показала накопление больших липидных глобул в клетках штамма МК7 (Фиг. 4).
Жирнокислотный состав липидов, экстрагированных из культур, выращенных на пшеничной соломе при pH 2,5, определяли с использованием газовой хроматографии. Результаты показали, что примерно 44% от общего содержания липидов составляли кислая олеиновая кислота (18:1), мононенасыщенная жирная кислота, и примерно 46% пальмитиновая (16:0) и стеариновая кислоты (18:0), которые являются насыщенными жирными кислотами (Фиг. 5). Высокая концентрация мононенасыщенных жирных кислот, таких как олеиновая кислота, является желательным для получения биодизеля благодаря их подходящей вязкости и уменьшенных проблем с окислением (Pinzi et al., 2009. The Ideal Vegetable Oil-based Biodiesel Composition: A Review of Social, Economical and Technical Implications. Energy Fuels, 23 (5): 2325-2341). В связи с этим, профиль липидов, полученный с помощью штамма МК7 Fusarium, является более подходящим по сравнению с профилем других описанных грибов (Ya et al. 2008, Lipids of Filamentous Fungi as a Material for Producing Biodiesel Fuel. Applied Biochemistry and Microbiology. 44: 523-527; Meng et al., 2009, Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renewable Energy. 34: 1-5) и микроводорослями, которые производят намного больше полиненасыщенных жирных кислот, которые склонны к окислению (Christi, Biodiesel from microalgae, 2007, Biotechnology Advances. 25: 294-306).
Пример 3
Производство этанола штаммом МК7 Fusarium oxysporum Штамм MK7 Fusarium способен производить значительное количество этанола в анаэробных и микроаэробных условиях, используя пяти- и шести-углеродные сахара. Кроме того, он способен непосредственно превращать обработанную кислотами пшеничную солому в этанол.
На Фиг. 6 обобщены выходы этанола для 4% глюкозы (масс/об.) при pH 4,5 и 4% пшеничной соломы (масс/об.) при pH 3 и 4,5, при выращивании в анаэробных условиях в герметично закрытых сывороточных флаконах. Выходы этанола на глюкозе были аналогичны полученным для других видов Fusarium, выросших на глюкозе (Ruiz et al., 2007. Sugar fermentation by Fusarium oxysporum to produce ethanol. World J Microbiol Biotechnol. 23: 259-267), и pH-нейтрализованных сахарах, полученных из пшеничной соломы, стеблей сахарного сорго и гидролизатов отработанных пивных зерен после предварительной обработки щелочью (Christakopoulos et al., 1991, Direct ethanol Conversion of Pretreated Straw by Fusarium oxysporum, Bioresource Technology. 35: 297-300; Christakopoulos et al., 1993, Direct conversion of sorghum carbohydrates to ethanol by a mixed microbial culture. Bioresource Technology, 45: 89-92; Lezinou et al., 1994, Simultaneous saccharification and fermentation of sweet sorghum carbohydrates to ethanol in a fed-batch process. Biotechnology Letters. 16: 983-988; и Xiros et al., 2009, Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnol Biofuels. 10: 4). Выходы этанола при pH 2,5 и использовании пшеничной соломы в качестве исходного сырья были низкими для штамма МК7, что соответствовало результатам для других видов грибов и дрожжей, выросших при pH 4,5-5,5 (Christakopoulos et al., 1989, Direct fermentation of cellulose to ethanol by Fusarium oxysporum. Enzyme Microb Tech. 11: 236-239; Christakopoulos et al., 1991, Direct Ethanol Conversion of Pretreated Straw by Fusarium oxysporum. Bioresource Technology. 35: 297-300). Это, вероятно, связано с ингибированием этанольной ферментации фенольными соединениями, фурфуролами и другими соединениями, которые образуются при кислотном гидролизе (Palmqvist and Harm-Hagerdal, 2000).
Пример 4
2
2
Получение водорода штаммом МК7 Fusarium oxysporum Кроме получения этанола во время ферментации, штамм МК7 продуцирует газообразный водород при анаэробном росте в герметично закрытых сывороточных флаконах с использованием лигноцеллюлозного сырья. Хотя водород не продуцируется при ферментации глюкозы, но при использовании пшеничной соломы в качестве ростового субстрата концентрация газа Н достигала 4% в газовом свободном пространстве над продуктом. Наличие последовательности hyd3-подобного гена гидрогеназы, по-видимому, важное для получения H, было подтверждено в штамме МК7 путем использования полимеразной цепной реакции.
Пример 5
Продуцирование биотоплива или предшественников биотоплива штаммом МК7 Fusarium oxysporum с предварительными обработками
Различные виды предварительной обработки могут быть использованы для увеличения степени превращения штаммами МК7 в получении биотоплива или предшественников биотоплива. Предварительные обработки могут включать подкисление до pH менее 3,0, добавление Mn и добавление питательных веществ (например аммония и фосфата).
Предыдущая работа показала, что Mn(III) вероятно увеличивает разрушение лигнина через окисление фенольных групп лигнина в сочетании с восстановлением Mn(III) до Mn(II) (Kerem and Hadar, 1995, Effect of manganese on preferential degradation of lignin by Pleurotus ostreatus during solid-state fermentation. Appi Environ Microbiol. 61 (8): 3057-3062; Boominathan et al., 1992, cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5586-5590; Tebo et al., 1997, Bacterially-mediated mineral formation: Insights into manganese (II) oxidation from molecular genetic and biochemical studies. In: J.F. Banfield and K.H. Nealson (Eds.) Geomicrobiology: Interactions Between Microbes and Minerals. Reviews in Mineralogy. 35: 225-266). Окисление Mn(II) в Mn(III) различными ферментами может регенерировать Mn(III).
Эксперименты со штаммом МК7 показывают, что гриб может переносить очень высокие уровни Mn и что концентрации Mn 5, 10 и 25 мМ увеличивали расщепление пшеничной соломы и рост грибов. Точное количественное определение биомассы до сих пор не была выполнено, но визуальные оценки указывали на увеличение биомассы грибов примерно на 10-25%. оказалось, что продуцирование липида также было усиленным.
Штамм МК7 также переносит очень кислые значения pH. Для увеличения скоростей конверсии штаммом МК7 в производстве биотоплива или предшественников биотоплива с использованием лигноцеллюлозного сырья, в смесь инокулята штамма МК7 и лигноцеллюлозного сырья добавляют подкисляющее вещество, где pH смеси составляет менее 3,0, менее 2,9, менее 2,8, менее 2,7, менее 2,6, менее 2,5, менее 2,4, менее 2,3, менее 2,2, менее 2,1, менее 2,0, менее 19, менее 1,8, менее 1,7, менее 1,6, менее 1,5, менее 1,4, менее 1,3, менее 1,2, менее 1,1, менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6 или менее 0,5. Смесь инокулята штамма МК7 и лигноцеллюлозного сырья с pH 7,0 включена в качестве контроля. После инкубации в течение необходимого времени выделяют биотопливо или предшественники биотоплива из биомассы грибов и/или смеси биомассы грибов и сырья. По сравнению с контрольной смесью, подкисленная смесь инокулята штамма МК7 и лигноцеллюлозного сырья продуцирует примерно на 5%, примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%,, примерно 40%», примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%,, примерно 90%, примерно 95%, примерно 100%, примерно 150%, примерно 200%, примерно 250%, примерно 300%, примерно 400%, примерно 500%, примерно 550%, примерно 600%, примерно 650%, примерно 700%, примерно 800%, примерно 850%, примерно 900% или примерно 1000% больше биотоплива или предшественников биотоплива.
Пример 6
Производство ферментов и антибиотиков штаммом МК7 Fusarium oxysporum
Ферменты (например целлюлаза, ксиланаза, лигниназа, глюкуронидаза, арабинофуранозидаза, арабиногалактаназа, эстераза феруловой кислоты, липаза, пектиназа, глюкоманназа, амилаза, ламинариназа, ксилоглюканаза, галактаназа, глюкоамилаза, пектатлиаза, хитиназа, экзо-β-D-глюкозаминидаза, целлобиоза-дегидрогеназа, и ацетилксилан-эстераза, ксилозидаза, α-L-арабинофуранозидаза, феруоилэстераза, эндоглюканаза, В-глюкозидаза, Mn-пероксидаза и лакказа) в штамме МК7 Fusarium oxysporum потенциально резистентны к кислому pH. Ферменты и нуклеотиды, кодирующие эти ферменты, очень полезны в биотехнологии и, таким образом, могут быть выделены.
Для выделения устойчивых к кислоте ферментов из штамма МК7 F. oxysporum можно применять традиционные методы молекулярного клонирования. Например, ген, кодирующий конкретный фермент, можно выделить посредством ОТ-ПЦР из полиаденилированной мРНК, экстагированной из гриба, или посредством ПЦР из ДНК, экстрагированной из гриба. Праймеры, специфичные для гена, кодирующего интересующий фермент, сконструированы на основании информации о геноме Fusarium oxysporum, или пептидной последовательности очищенного фермента из штамма МК7 Fusarium oxysporum, или пептидной последовательности гомологичных ферментов из видов Fusarium. Полученный в результате продукт гена может быть клонирован в качестве ДНК-вставки в вектор. Вектор может представлять собой экспрессионный вектор, подходящий для клетки-хозяина (например грибковой клетки, бактериальной клетки, дрожжевой клетки, растительной клетки, клетки насекомых или животной клетки).
Ферменты, устойчивые к кислому pH, очищенные из Fusarium oxysporum МК7 или продуцируемые в рекомбинантной клетке-хозяина, при анализе in vitro по сравнению с гомологичным ферментом из вида Fusarium oxysporum, неустойчивым к кислому pH, имели на примерно 5%, примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45%, примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 100%, примерно 150%, примерно 200%, примерно 250%, примерно 300%, примерно 400%, примерно 500%, примерно 550%, примерно 600%, примерно 650%, примерно 700%, примерно 800%, примерно 850%, примерно 900% или примерно 1000% большую активность при pH менее 3,0, менее 2,9, менее 2,8, менее 2,7, менее 2,6, менее 2,5, менее 2,4, менее 2,3, менее 2,2, менее 2,1, менее 2,0, менее 19, менее 1,8, менее 1,7, менее 1,6, менее 1,5, менее 1,4, менее 1,3, менее 1,2, менее 1,1, менее 1,0, менее 0,9, менее 0,8, менее 0,7, менее 0,6 или менее 0,5.
Пример 7
Липидные профили, продуцируемые штаммом МК7
Производство всех внутриклеточных липидов определяли с использованием прямой переэтерификации в сочетании с анализом GC-MS (газовая хроматография-масс-спектрометрия), как описано в Lohman et al. (2013). Липидные профили штамма МК7 в высшей степени соответствовали воздействия (т.е. pH, температуре, субстрату для роста, продолжительности культивирования, содержанию влаги) и были преимущественно представлены С16:0 и С18:0, С18:1 и С18:2 триацилглицеридами (>95% общих липидов, Фиг.7 В). Общий топливный потенциал и извлекаемые липидные фракции показывают профили, идеальные для биодизеля (Фиг. 7А). Профили жирных кислот также показывают ряд высокоценных продуктов, включающих омега-7 вакценовую кислоту (метил-11-октадеценоат), омега-7 пальмитолеиновую кислоту (метил-гексадец-9-еноат; торговое наименование ProvinalTM) и метиловый эфир тетракозановой кислоты (Таблица 1). Они являются редкими жирными кислотами, как правило не содержащимися в растительных маслах, и могут обеспечивать значительно больший доход на тонну сырья, чем один биодизель.
На Фиг. 7A показано среднее количество общего содержания метиловых эфиров жирных кислот (FAME) в случае прямой переэтерификации (общий топливный потенциал) и экстрагируемые фракции липида в зависимости от соотношение C:N в среде (n=3). Полосы внутри диаграммы экстрагируемой липидной фракции представляют три-, ди- и моно-ацильные глицериды (TAG, DAG, MAG) и компоненты в виде свободных жирных кислот (FFA). На вставке показана хроматограмма GC-FID (газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором) липидной фракции с доминирующими молекулами TAG. На Фиг. 7B показан профиль липидов FAME, полученный при прямой переэтерификации всех жирных кислот (Прямые) в FAME, и FAME, полученные только из извлекаемых липидных предшественников (Экстрагируемые). На вставка показана хроматограмма GC-MS прямых и экстрагируемых фракций.
Если не определено иное, все технические и научные термины в настоящем документе имеют такое же значение, которое обычно подразумевается специалистом обычной квалификации в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и вещества описаны в настоящем документе. Все указанные публикации, патенты и патентные публикации включены в данное описание изобретения посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
Публикации, рассмотренные в настоящем документе, приведены исключительно в отношении их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в описании изобретения не следует расценивать как допущение того, что настоящее изобретение не дает право предвосхищать такую публикацию посредством предшествующего изобретения.
В то время как изобретение описано в связи с конкретными его воплощениями, следует понимать, что возможны дополнительные модификации и данная заявка охватывает все варианты, применения или адаптации изобретения, в целом соответствующие принципам изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания, которые находятся в пределах известной или обычной практики в данной области техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к вышеприведенным существенным признакам и включены в объем прилагаемой формулы изобретения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Abe Т., Hoshino Т., Nakamura A., and N. Takaya. 2007. Anaerobic elemental sulfur reduction by fungus Fusarium oxysporum. Biosci Biotechnol Biochem. 71: 2402-7.
Bligh, E.G and Dyer, WJ. 1959. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol 37: 911-917.
Bhatia, T.S., Arneja J.S. Lipid metabolism in Fusarium oxysporum, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 29 (7): 619-626.
Boominathan, K., Reddy, C.A. 1992. cAMP-mediated di-erential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxi-dase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5586-5590.
Briggs, Michael. UNH Biodiesel Group. 2004. "Wide scale Biodiesel Production from Algae". http://www.unh.edu/'p2/biodiesel/article_alge.html.
Brimble M.A., Letecia J. Duncalfband Michael R. Nairn. 1999. Pyranonaphthoquinone antibiotics - isolation, structure and biological activity. Nat. Prod. Rep. 16: 267-281
Chisti, Y. 2007. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25: 294-306.
Christakopoulos P, Maoris BJ, Kekos D. 1989. Direct fermentation of cellulose to ethanol by Fusarium oxysporum. Enzyme Microb Tech. 11: 236-239.
Christakopoulos P., D.P. Koullas, D, Kekos, E. G. Koukios and BJ. Maoris. 1991. Direct Ethanol Conversion of Pretreated Straw by Fusarium oxysporum. Bioresource Technology. 35: 297-300.
Christakopoulos P., Lian-Wu L., Kekos D., Macris BJ. 1993. Direct conversion of sorghum carbohydrates to ethanol by a mixed microbial culture. Bioresource Technology, 45: 89-92.
Cooksey, K.E., J.B. Guckert, S.A. Williams, and P.R. Calli. 1987. Fluorometric determination of the neutral lipid content of microalgal cells using Nile Red". Journal of Microbiological Methods, 6: 333-345.
Daviere J.M., Langin Т., and MJ. Daboussi. 2001. Potential role of transposable elements in the rapid reorganization of the Fusarium oxysporum genome. Fungal Genet Biol. 34: 177-92.
Gross S., and E.I. Robbins. 2000, Chemistry and Ecology of Highly Acidic Environments. Acidophilic and acid-tolerant fungi and yeasts Hydrobiologia 433: 91-109.
Hua-Van A., Daviere J.M., Kaper F., Langin Т., and M.J. Daboussi. 2.000. Genome organization in Fusarium oxysporum: clusters of class II transposons. Curr Genet. 37: 339-47.
Inskeep W.P., G.G. Ackerman, W.P. Taylor, M. Kozubal, S. Korf, and R.E. Macur. 2005. On the energetics of chemolithotrophy in nonequilibrium systems: case studies of geothermal springs in Yellowstone National Park. Geobiology. 3: 297-320.
Kerstetter J.D. and J.K. Lyons. 2001. Wheat straw for ethanol production in Washington: a resource, technical and economic assessment, Washington State University, Cooperative Extension Energy Program.
Kozubal M., Macur R.E., Korf S., Taylor W.P., Ackerman G.G., Nagy A., and W.P. Inskeep. 2008. Isolation and Distribution of a Novel Iron-Oxidizing Crenarchaeon from Acidic Geothermal Springs in Yellowstone National Park. Appl. Environ. Microbiol, 74: 942-949.
Lezinou V., Christakopoulos P., Kekos D., Maoris B.J. 1994. Simultaneous saccharification and fermentation of sweet sorghum carbohydrates to ethanol in a fed-batch process. Biotechnology Letters. 16: 983-988.
Li Q., Du W, Liu D. 2008. Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Appl Microbiol Biotechnol. 80: 749-56.
Kerem Z. and Y, Hadar. 1995. Effect of manganese on preferential degradation of lignin by Pleurotus ostreatus during solid-state fermentation. Appl Environ Microbiol. 61 (8): 3057-3062.
Meng X., Yang J., Xu X., Zhang L, Nie Q., and M. Xian. 2009. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renewable Energy. 34: 1-5.
Nairn N. Saad R.R., Nairn M., 1985, Production of lipids and sterols by Fusarium oxysporum (Schlecht). Utilization of some agro-industrial by-products as additives and basal medium, Agricultural Wastes 14 (3): 207-220.
Naqvi B.S., Hashmi K., Farooq A.K., Dilnawaz S., and A.M. Zafar. 1997. Production of Lipids by fermentation Preliminary Report, Journal of Islamic Academy of Sciences. 10: 13-18.
Palmqvist E., and Barbel Hahn-Hagerdal. 2000. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology 74: 25-33.
Panagiotoua G., P. Christakopoulosb, L. Olssona. 2005. Simultaneous saccharification and fermentation of cellulose by Fusarium oxysporum F3 - growth characteristics and metabolite profiling. Enzyme and Microbial Technology 36: 693-699.
Patrick, C, Hallenbeck and Dipankar Ghosh. 2009. Advances in fermentative biohydrogen production: the way forward? Trends in Biotechnology. In Press.
Pinzi S., I.L. Garcia, F.J. Lopez-Gimenez, M.D. Luque de Castro, G. Dorado and M.P. Dorado. 2009. The Ideal Vegetable Oil-based Biodiesel Composition: A Review of Social, Economical and Technical Implications. Energy Fuels
Ruiz E., I. Romero M. Moya S. Sanchez V. Bravo E. Castro. 2007. Sugar fermentation by Fusarium oxysporum to produce ethanol. World J Microbiol Biotechnol. 23: 259-267.
Seo H., Kim H., Lee O., Fia J., Lee H, and K. Jung. 2009. Measurement of ethanol concentration using solvent extraction and dichromate oxidation and its application to bioethanol production process. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 36: 285-292.
Seraphim P., Michael K., A. George, 2004. Single cell oil (SCO) production by Mortierella isabellina grown on high-sugar content media. Bioresour Technol. 95: 287-91.
Smith S.N, 2007. An Overview of Ecological and Habitat Aspects in the Genus Fusarium with Special Emphasis on the Soil-Borne Pathogenic Forms Plant Pathology Bulletin. 16: 97-120,
Starkey, R, L. 1973. Effect of pH on tocicity of copper to Scytalidium sp., a copper-tolerant fungus, and some other fungi. J. gen. Microbiol. 78: 217-225.
Tebo, B.M., W.C. Ghiorse, L.G. van Waasbergen, P.L. Siering, and R. Caspi, 1997. Bacterially-mediated mineral formation: Insights into manganese(II) oxidation from molecular genetic and biochemical studies. In: J.F. Banfield and K.H. Nealson (Eds.) Geomicrobiology: interactions Between Microbes and Minerals. Reviews in Mineralogy. 35: 225-266.
White J.S., Yohannan B.K., Walker G.M. 2008. Bioconversion of brewer's spent grains to bioethanol. FEMS Yeast Res. 8 (7): 1175-84. Epub 2008 Jun 10.
Xiros, C, and P. Christakopoulos. 2009. Enhanced ethanol production from brewer's spent grain by a Fusarium oxysporum consolidated system. Biotechnol Biofuels. 10: 4.
Xiros C, Topakas E, Katapodis P, Christakopoulos P. 2008. Evaluation of Fusarium oxysporum as an enzyme factory for the hydrolysis of brewer's spent grain with improved biodegradability for ethanol production. Ind Crops Prod, 28: 213-224.
Ya. E. Sergeeva, L.A. Galanina, D.A. Andrianova, and E.P. Feofilova. 2008. Lipids of Filamentous Fungi as a Material for Producing Biodiesel Fuel. Applied Biochemistry and Microbiology. 44: 523-527.
--->
Перечень последовательностей
<110>  Montana State University
<120>  АЦИДОФИЛЬНЫЕ ШТАММЫ FUSARIUM OXYSPORUM, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И
СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  MONT-151/02WO
<150>  62/020,607
<151>  2014-07-03
<150>  62/061,076
<151>  2014-10-07
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  962
<212>  ДНК
<213>  штамм MK7 Fusarium oxysporum
<400>  1
ccgcggggaa tactacctga tccgaggtca cattcagagt tgggggttta cggcttggcc       60
gcgccgcgta ccagttgcga gggttttact actacgcaat ggaagctgca gcgagaccgc      120
cactagattt cggggccggc ttgccgcaag ggctcgccga tccccaacac caaacccggg      180
ggcttgaggg ttgaaatgac gctcgaacag gcatgcccgc cagaatactg gcgggcgcaa      240
tgtgcgttca aagattcgat gattcactga attctgcaat tcacattact tatcgcattt      300
tgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa gagatccgtt gttgaaagtt ttgatttatt      360
tatggtttta ctcagaagtt acatatagaa acagagttta ggggtcctct ggcgggccgt      420
cccgttttac cgggagcggg ctgatccgcc gaggcaacaa ttggtatgtt cacaggggtt      480
tgggagttgt aaactcggta atgatccctc cgcagttctc acctacggat aggatcatta      540
ccgagtttac aactcccaaa cccctgtgaa catacccatt gttgcctcgg ccggatcagc      600
ccgctcccgg ttaaaacggg acggcccgcc agagtacccc taaactctgt ttctatatgt      660
aacttctgag taaaaccata aataaatcaa aactttcaac acgcatctct tgcttctgtc      720
atcgatgaag aacgcagcaa aatgcgatag tcatgtgatt gcacattcag tgaatcatcg      780
atcttgacgc acattgcgcc tgcagtattc tggcggtcat gcctgttcga gcgtcattca      840
gccctcagcc ctcggttgtg ttcgggatcg gcgagtcctg cgccagcgac cggatcagtg      900
gcgtctgcct gcgcctccat tgcggttaga gttaagccct cgcccacttg ttttacgcta      960
ac                                                                     962
<---