ДНК-КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПОСРЕДСТВОМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ

1. Экспрессионная конструкция ДНК для нацеленного ингибирования экспрессии генов с использованием РНК-интерференции, состоящая из следующих компонентов
а) первой структуры ДНК с замкнутыми концами (шпильками), при которой отдельная цепь из дезоксирибонуклеотидов укладывается обратно в двухцепочечную область таким образом, что эта область на одном конце имеет липкий выступ и на противолежащем конце одноцепочечную петлю,
b) второй структуры ДНК с замкнутыми концами (шпильками), которая построена аналогично первой структуре ДНК с замкнутыми концами (шпильками),
с) по меньшей мере одной Т-образной ДНК-структуры с тремя двухцепочечными ДНК-плечами, которые связаны через структуры Холлидея, причем
i. одно плечо содержит подлежащие транскрипции последовательности, и отдельные цепи этого двухцепочечного плеча ДНК на конце, который находится напротив соединения с другими плечами, связаны друг с другом одноцепочечной ДНК-петлей, и
ii. оба других плеча имеют липкие концы, причем одно плечо имеет подходящую последовательность терминации, а другое плечо имеет подходящую последовательность промотора.
2. Экспрессионная конструкция ДНК для нацеленного ингибирования экспрессии генов с использованием РНК-интерференции, состоящая из следующих компонентов
а) первой структуры ДНК с замкнутыми концами (шпильками), при которой отдельная цепь из дезоксирибонуклеотидов укладывается обратно в двухцепочечную область таким образом, что эта область на одном конце имеет липкий выступ, а на противолежащем конце образующие двойную цепь отдельные цепи связаны друг с другом одноцепочечной петлей,
b) второй структуры ДНК с замкнутыми концами (шпильками), которая построена аналогично первой структуре ДНК с замкнутыми концами (шпильками) и двухцепочечная и одноцепочечная область которой состоит из подлежащей транскрипции последовательности,
с) подходящей последовательности промотора и подходящей обращенно-комплементарной последовательности терминации, которые находятся между обеими описанными в а) и b) структурами ДНК с замкнутыми концами (шпильками) в двойной цепи ДНК.
3. Экспрессионная конструкция ДНК по п.1, в которой несколько Т-образных ДНК-структур в каждом случае связаны на одном конце линкером с использованием структур Холлидея.
4. Экспрессионная конструкция ДНК по п.2, в которой несколько линейных ДНК-структур в каждом случае связаны на одном конце линкером с использованием структур Холлидея.
5. Экспрессионная конструкция ДНК по меньшей мере по одному из предыдущих пунктов, в которой липкие концы отдельных компонентов специфически и различным образом выбраны для нацеленного соединения с другими компонентами.
6. Экспрессионная конструкция ДНК для нацеленного ингибирования экспрессии одного или нескольких генов по меньшей мере по одному из пп.1-4, в которой подлежащие транскрипции последовательности кодируют идентичные или различные гены.
7. Экспрессионная конструкция ДНК для нацеленного ингибирования экспрессии одного или нескольких генов по меньшей мере по одному из пп.1-4, в которой защита от расщепления экзонуклеазами достигается с использованием короткой одноцепочечной области из 3-8 дезоксинуклеотидов, которая ковалентно связывает друг с другом обе линейные двойные цепи.
8. Экспрессионная конструкция ДНК для нацеленного ингибирования экспрессии одного или нескольких генов по меньшей мере по одному из пп.1-4, причем эта конструкция в короткой одноцепочечной области ковалентно связана с одним или несколькими пептидами, белками, углеводами, антителами или стероидами.
9. Способ получения векторов, которые после их трансфекции в эукариотические клетки нацеленным образом ингибируют образование определенных белков посредством РНК-интерференции, отличающийся следующими стадиями опыта
а) смешиванием двойной цепи ДНК, которая содержит единственную копию с длиной 19-23 основания последовательности гена или ее обращенно-комплементарную последовательность, а также сигнал терминации для РНК-полимераз, и замкнута на одном ее конце последовательностью в виде петли с длиной 8-12 оснований, которую выбирают таким образом, что противолежащие основания ни в одном случае не являются комплементарными друг другу и фланкирующие отдельные цепи ДНК связаны друг с другом в двойную цепь ДНК, которая на другом конце содержит короткую выступающую отдельную цепь ДНК, с
b) олигодезоксинуклеотидом в виде шпильки, который имеет на конце короткие выступающие концы одноцепочечной ДНК, и с
с) промотором с короткими выступающими концами одноцепочечной ДНК, причем одноцепочечный 5'-конец промотора может спариваться с олигодезоксинуклеотидом в виде шпильки или с двойной цепью с длиной 10-1000 оснований, а одноцепочечный 3'-конец этого промотора комплементарен одноцепочечному 5'-концу описанной в а) двойной цепи ДНК, и
d) последующим лигированием этих ДНК-фрагментов,
e) а также последующей очисткой полученных векторов.
10. Способ получения по п.9, в котором после стадии b) добавляют двойную цепь ДНК с длиной 10-1000 оснований (= n) некодирующей последовательности с короткими выступающими концами одноцепочечной ДНК, причем одноцепочечный 3'-конец может спариваться с одноцепочечным 5'-концом промотора, а одноцепочечный 5'-конец комплементарен одноцепочечному 3'-концу олигодезоксинуклеотида в виде шпильки.
11. Способ получения векторов, которые после их трансфекции в эукариотические клетки нацеленным образом ингибируют образование определенных белков посредством РНК-интерференции, отличающийся следующими стадиями опыта
а) смешиванием Т-образной двойной цепи ДНК, которая содержит единственную копию с длиной 19-23 основания последовательности гена в направлении 5'-3', а также сигнал терминации для РНК-полимераз и замкнута на одном ее конце последовательностью в виде петли с длиной 8-12 оснований, которую выбирают таким образом, что противолежащие основания ни в одном случае не являются комплементарными друг другу и фланкирующие двухцепочечные области, таким образом, связаны друг с другом двумя отдельными цепями ДНК, и на другом конце имеют две короткие выступающие отдельные цепи ДНК, и одним олигодезоксинуклеотидом, последовательность которого комплементарна обеим коротким выступающим отдельным цепям ДНК и образует два коротких выступающих конца одноцепочечной ДНК, с
b) одним олигодезоксинуклеотидом в виде шпильки, который на конце имеет короткие выступающие концы одноцепочечной ДНК, и
с) с дополнительным олигодезоксинуклеотидом в виде шпильки, который на конце имеет короткие выступающие концы одноцепочечной ДНК, комплементарные Т-образной двойной цепи ДНК из а), и
d) с промотором с короткими выступающими концами одноцепочечной ДНК, причем одноцепочечный 5'-конец промотора может спариваться с олигодезоксинуклеотидом в виде шпильки из b), а одноцепочечный 3'-конец промотора комплементарен одноцепочечному 5'-концу Т-образной двойной ДНК, и
е) последующим лигированием ДНК-фрагментов, а также
f) последующей очисткой полученных векторов.
12. Способ получения по п.11, в котором после стадии опыта с) добавляют двойную цепь ДНК с длиной 10-1000 оснований (= n) некодирующей последовательности с короткими выступающими концами одноцепочечной ДНК, причем одноцепочечный 3'-конец может спариваться с одноцепочечным 5'-концом промотора, а одноцепочечный 5'-конец комплементарен одноцепочечному 3'-концу олигодезоксинуклеотида в виде шпильки из стадии опыта b), и/или добавляют двойную цепь ДНК с длиной 10-1000 оснований (= n) некодирующей последовательности с короткими выступающими концами одноцепочечной ДНК, причем одноцепочечный 5'-конец может спариваться с одноцепочечным 3'-концом Т-образной двойной цепи ДНК, а одноцепочечный 3'-конец комплеметарен одноцепочечному 5'-концу олигодезоксинуклеотида в виде шпильки из стадии опыта с).
13. Способ получения по меньшей мере по одному из пп.9-12, в котором перед началом способа частично комплементарные одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды гибридизуют с молекулой связывания (линкером), причем эта гибридизация происходит неполностью таким образом, что две или более двухцепочечные области с липкими концами связываются друг с другом с одинаковой или различной последовательностью оснований посредством структур Холлидея, с последующим проведением указанных стадий опыта.
14. Способ по меньшей мере по одному из пп.9 или 11, в котором промотор является частью бактериально амплифицированной плазмиды, которую перед смешиванием соответствующих компонентов разрезают рестрикционной эндонуклеазой, которая узнает сайт рестрикции фланкирующий промотор на плазмиде, который не присутствует на полученной экспрессионной конструкции.
15. Способ по п.14, в котором соответствующая стадия лигирования происходит в присутствии рестрикционной эндонуклеазы, которая вырезает промотор из этой плазмиды.
16. Способ по п.14, в котором перед окончательной стадией очистки осуществляют расщепление реакционной смеси с использованием специфической исключительно в отношении 3'- или 5'-концов ДНК экзонуклеазы.
17. Способ по п.14, в котором в случае рестрикционной эндонуклеазы речь идет о ферменте группы рестрикционных эндонуклеаз класса-II, предпочтительно о ферменте из группы BbsI, BbvI, BbvII, BpiI, BplI, BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI или их изошизомерах.
18. Способ по меньшей мере по любому из пп.9 или 11, в котором при смешивании компонентов добавляют двойную цепь ДНК, которую получают из частичного отжига частично самокомплементарных олигодезоксинуклеотидов или по меньшей мере двух олигодезоксинуклеотидов.
19. Способ по меньшей мере по любому из пп.9 или 11, в котором олигодезоксинуклеотиды в форме шпильки в их двухцепочечной области имеют последовательность узнавания для одной рестрикционной эндонуклеазы.
20. Способ по меньшей мере по любому из пп.9 или 11, в котором очистку осуществляют с использованием хроматографии и/или гель-электрофореза.
21. Набор для получения векторов, которые пригодны, после их трансфекции в эукариотические клетки, нацеленным образом ингибировать в них образование определенных белков посредством РНК-интерференции, по меньшей мере по одному из способов по пп.9-20, содержащий по меньшей мере один промотор, олигодезоксинуклеотиды в виде шпильки и ферменты.
22. Набор для получения экспрессионной конструкции по одному из пп.1-4, содержащий по меньшей мере подходящие для образования структур ДНК с замкнутыми концами (шпильками) олигодезоксинуклеотиды, подходящие для образования линкера олигодезоксинуклеотиды, Т-образные ДНК-структуры, в которые могут быть введены подлежащие транскрипции последовательности, а также ферменты и средства для проведения стадий лигирования, расщепления, деградаций ДНК и очистки.