Способ прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии у человека, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF A SKIN PATHOLOGY IN THE FORM OF MELANOSIS OR DYSCHROMIA ASSOCIATED WITH EXCESSIVE ARSENIC CONTAMINATION IN A HUMAN

Изобретение относится к области медицины, а именно к дерматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия мышьяка на проявление у человека кожной патологии в виде меланоза или дисхромии.
Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия мышьяка, поступающего из окружающей среды, на здоровье человека, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в питьевой воде.
Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ профилактики, а кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности, мышьяка, обуславливающего риск нарушения кожного покрова в виде меланоза или дисхромии.
Меланоз - это явление, возникающее в виде пигментных пятен на теле человека. Заболевание имеет код по Международной классификации болезней 10-ой редакции (МКБ-10) - С43. Проявляется избыточным меланином в человеческом организме - веществом, защищающим тело от ультрафиолетовых лучей. Темный цветовой оттенок кожи и глаз обусловлен количеством гранул данного пигмента. Меланин выполняет защитную функцию для клеток ДНК, оберегают ее от разрушительного влияния ультрафиолета. Меланоз кожи - когда цветовые пигменты начинают вырабатываться в превышенной концентрации. Также меланоциты выделяются в таких местах организма, где в норме не содержатся - в почках, слизистых оболочках, головном мозге. В отдельных случаях болезнь принимает предраковую форму, начальную стадию онкологии. (Источник: https://onko.guru/termin/melanoz.html | Онкология от А до Я на Onko.guru).
Дисхромия кожи - это состояние, при котором видоизменяется естественный цвет кожного покрова. Заболевание имеет код по МКБ-10 L81. Явление распространенное и в большинстве случаев не выступает патологическим нарушением. Дискомфорт от дисхромии носит эстетичный и психологичный характер (источник: https://promelanin.ru/bolezni/pjatna-na-kozhe/dishromiya-kozhi.html).
Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что повышенный уровень мышьяка в окружающей среде может явиться причиной дермопатологии.
В связи с широким использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия мышьяка особенно обусловлена на территориях, для которых характерна эндемичность его присутствия в природных водах (природная биогеохимическая провинция с повышенным содержанием мышьяка).
Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье человека, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики, актуальным является выделение маркерных показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием мышьяка, которые могут быть использованы в качестве индикаторов возможной кожной патологии и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.
Из уровня техники известен ряд генетических методов прогнозирования возможности заболеваний кожи под воздействием ряда факторов, в том числе, химических.
Из патента РФ №2454668 известен способ прогнозирования развития профессиональных злокачественных новообразований кожи у работников производства стекловолокна. Согласно известному способу из периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят анализ dup16bp полиморфизма 3 интрона и Arg72Pro полиморфизма 4 экзона гена ТР53. При выявлении сочетания генотипов *Arg/*Pro и *W/*dup16 прогнозируют риск развития злокачественных новообразований кожи. При обнаружении генотипов *Arg/*Arg и *W/*W прогнозируют устойчивость к формированию заболевания. Изобретение обеспечивает получение прогностических критериев развития злокачественных новообразований кожи или устойчивости к ним у работников производства стекловолокна на основе молекулярно-генетических маркеров.
Известен способ прогнозирования развития меланомы (злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов кожи) в европейских популяциях, заключающийся в том, что проводят анализ Arg72Pro полиморфизма гена ТР53, при выявлении носительства генотипа *Arg/*Arg прогнозируют повышенный риск развития меланомы (OR=1,28; 95% CI 1,05-1,55) [Chunying LI, Kexin chen, Zhengsheng Liu et al. Polymorphisms of TP53 Arg72Pro, but not p73 G4C14>A4TA4 and p21 Ser31Arg, contribute to risk of cutaneus melanoma. // J Invest Dermatol. - 2008. - V. 128. - N. 6. - P. 1585-1588]. Однако исследования предрасположенности к развитию эпителиальных злокачественных опухолей кожи (базальноклеточный рак, плоскоклеточная карцинома) не выявили связи ассоциации Arg72Pro полиморфизма гена ТР53 с заболеванием [Almquist LM, Kagaras MR, Welsh MM et al. The role of TP53 and MDM2 polymorphisms in TP53 mutagenesis and risk of non-melanoma skin cancer].
Известен способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 гена филаггрина (см. Хантимерова Э.Ф., Нуртдинова Г.М., Карунас А.С., Гималова Г.Ф. Клинико-генетическая характеристика больных атопическим дерматитом и крапивницей с мутациями в гене филаггрина // Фундаментальные исследования. - 2014. - №10 (4). - С. 752-756). Однако данный способ имеет низкую пропускную способность, ввиду невысокой скорости проведения обследования пациентов (время анализа 1-2 дня), ввиду сложности, трудоемкости используемых лабораторных технологий, являющихся к тому же вредными для медицинского персонала, проводящего их. Это затрудняет определение наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.
В патенте РФ №2585960 описан способ определения наследственной предрасположенности к нарушению барьерной функции кожи. Сущность способа состоит в том, что из венозной крови осуществляют выделение генетического материала. Проводят полимеразную цепную реакцию синтеза ДНК с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфного варианта 2282del4 филаггрина. При проведении полимеразной цепной реакции используют специфические праймеры: «FLG-2 F1» 5'Biotin-TgA-CCA-gCC-TgT-CCA-Tgg-C3'; «FLG-2 R1» 5'CAA-gTg-CAg-gAg-AAA-gAC-ATg-gAT3', размер ампликона - 205 пар оснований, а после проведения полимеразной цепной реакции проводят реакцию пиросеквенирования в режиме реального времени с использованием специфического праймера «FLG-2 S1» 5'gAC-ATT-CAg-AAg-ACT-CAg-АС3'. Детекцию нуклеотидной последовательности осуществляют с помощью хемилюминисцентного сигнала, далее проводят сравнение полученной нуклеотидной последовательности в положении 2282 с референсными последовательностями. При выявлении на полученной пирограмме отсутствия делеции в положении 2282 гена филаггрина при воздействии на организм вредного производственного фактора раздражающего и сенсибилизирующего действия определяют низкую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи. При выявлении на полученной пирограмме гетерозиготного варианта ins/del в положении 2282 гена филаггрина определяют высокую наследственную предрасположенность к нарушению барьерной функции кожи.
Недостатком указанного известного способа является то, что уровень барьерного функционала кожи является важным фактором, препятствующим попаданию и проникновению в организм вредных факторов, присутствующих в атмосферном воздухе или воздухе рабочей зоны, но не единственным. Если же вредный фактор присутствует в питьевой воде и его воздействие на кожу связано с процессами ферментации и метаболизма коньюгированного вредного химического фактора, такого как соединения мышьяка, оценки барьерной функции и дефекта гена филаггрина будет недостаточно, необходима оценка полиморфности генов, характеризующих обменные процессы, нарушение которых приводит к патологии кожных покровов.
Из уровня техники известен способ прогнозирования среднетяжелого течения хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ (Патент РФ №2578441). Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизмов генов -308G/A TNFα,+250A/G Ltα,+1663A/G TNFR2 и их сочетаний. Повышенный риск развития среднетяжелого течения хронической истинной экземы прогнозируют при наличии аллеля +250G Ltα или сочетании аллеля+250G Ltα с аллелем +1663G TNFR2, или сочетании аллеля -308A TNFα с аллелем +1663G TNFR2, или сочетании аллеля -308G TNFα с аллелем+250G Ltα. Прогнозируют пониженный риск развития среднетяжелого течения ХИЭ при сочетании аллеля -308G TNFα с генотипом +250АА Ltα. Однако, известный способ оценивает только генетический риск развития хронической истинной экземы, поскольку исследуются гены рецепторной системы фактора некроза опухоли, отражающие события апоптоза, а генетические особенности формирования и проявлений дисхромии и меланоза, характеризующих арсеникоз, сценарий которого предполагает участие генов ферментов детоксикации и внутриклеточных белковых субстанций, данным известным способом не отражены.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы определения прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии в условиях избыточной контаминации мышьяком, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении достоверности оценки влияния мышьяка на предрасположенность проявлений кожной патологии у человека в виде меланоза или дисхромии на основе выявления молекулярно-генетических маркеров, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии таких состояний уже на ранних стадиях их формирования.
3
3
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования риска возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии у человека, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком, характеризующийся тем, что производят отбор проб крови и мочи, определяют в пробе мочи содержание мышьяка, а в сыворотке крови - уровень С-пептида, также у указанного человека отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма гена теломеразы TERT, гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg и гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TERT (rs 10054203), гена ММР9 Gln279Arg (rs17576) и гена ZMPSTE24 (rs2076697), устанавливая при этом для каждого из указанных генов одно из следующих его состояний: нормальное гомозиготное СС, вариантное гомозиготное GG для гена TERT (rs 10054203); гетерозиготное AG, нормальное гомозиготное АА, вариантное гомозиготное GG для гена ММР9 Gln279Arg (rs17576); нормальное гомозиготное ТТ, вариантное гомозиготное СС для гена ZMPSTE24 (rs2076697), и при одновременном обнаружении следующих диагностических критериев: наличие вариантного гомозиготного генотипа гена TERT (rs 10054203), вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена ММР9 Gln279Arg (rs17576), вариантного гомозиготного генотипа гена ZMPSTE24 (rs2076697), при условии одновременного наличия мышьяка в моче выше 300 мкг/дм, а также при превышении уровня С-пептида в сыворотке крови выше диапазона нормы 0,5-3,2 нг/см, прогнозируют повышенный риск возникновения кожной патологии в виде меланоза или дисхромии, ассоциированной с избыточной контаминацией мышьяком.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
Роль мышьяка в организме проявляется во влиянии на нарушение тканевого дыхания и снижение энергетических ресурсов клетки в результате метаболического разобщения окислительного фосфорилирования.
Основные расстройства, вызываемые мышьяком:
- общий ацидоз, развивающийся вследствие угнетения окислительных процессов и накопления в тканях молочной, пировиноградной кислоты и других кислых продуктов обмена.
- нарушение гемодинамики из-за паралича капилляров, увеличения порозности стенок кровеносных сосудов, расстройства сердечной деятельности, местного токсического действия на выделительные органы, что приводит к значительному обезвоживанию организма, потере солей.
- гемолиз и анемия, усиливающее гипоксию тканей, обусловленную не только расстройством реакций окислительного фосфорилирования, но и нарушением транспорта кислорода вследствие включения мышьяка в молекулу Hb.
- дегенеративное и некротическое поражение тканей в местах их контакта с мышьяком.
- эмбриотоксические, гонадотоксический и тератогенный эффекты.
3
Последствия попадания избытка мышьяка зависят от физиологического состояния организма, путей поступления вещества, возраста человека, наличия сопутствующих заболеваний и от ряда других факторов. Чаще наблюдается хроническая интоксикация, связанная с употреблением воды с повышенной концентрацией мышьяка. Также встречаются случаи ингаляционного отравления при длительном производственном или бытовом контакте с мышьяксодержащими инсектицидами и пестицидами, керамикой, древесиной и стеклом. Хроническая интоксикация приводит к периферической невропатии (боль, слабость, парестезии), характерным изменениям пигментации кожи, гиперкератозу, линиям Ми, ломкости ногтей, алопеции и нарушению перистальтики кишечника. Кроме того, она ассоциирована со злокачественными новообразованиями печени, легких, кожи и почек. Референтные значения мышьяка в моче: 0-300 мкг/дм.
В качестве диагностического критерия прогнозирования риска формирования нарушений кожного покрова в виде меланоза и дисхронии у человека в условиях избыточной контаминации мышьяком рекомендуется использовать измененный генотип гена теломеразы TERT, гена матриксной металлопротеиназы ММР9 Gln279Arg и гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TERT (rs10054203), гена ММР9 Gln279Arg (rs17576) и гена ZMPSTE24 (rs2076697).
Ген теломеразы TERT отвечает за кодировку белка, регулирующего стабильность хромосом. Теломераза - фермент, добавляющий особые повторяющиеся последовательности ДНК. Теломеры содержат уплотненную ДНК и стабилизируют хромосомы. При каждом делении клетки теломерные участки укорачиваются. TERT- это обратная транскриптаза, то есть фермент, создающий одноцепочечную ДНК на основе шаблонной одноцепочечной РНК. Теломеры обеспечивают защиту главного фрагмента ДНК от поражения при репликации. Когда они заканчиваются, клетки не способны делиться. Однако некоторые из них не сталкиваются с подобными проблемами. Это обусловлено наличием в их составе другого фермента - теломеразы. Он все время удлиняет теломеры. Такие особенности характерны для раковых и стволовых клеток. Теломеры находятся на 4 окончаниях хромосом и напоминают кончики шнурков. Эти элементы предотвращают склеивание хромосомных концов друг с другом. Также они помогают избежать слипания с остальными хромосомами. При нарушении этого процесса клетки погибают или трансформируются в опухоли. По мере деления клеток окончания теломеразы укорачиваются. Как следствие, клетки прекращают процесс деления. Эти изменения являются генетическими и эпигенетическими. Это значит, что они зависят от наследственной предрасположенности и воздействия внешних факторов.
Многочисленные научные исследования помогли установить, что у некоторых людей процесс укорачивания теломеров является слишком быстрым. Это становится причиной возникновения серьезных патологий и преждевременного старения. Таким образом, поддерживается концепция возможного вовлечения прогрессирующего укорочения теломер в патогенез возрастных нарушений в человеческом организме. В этом смысле важен тот факт, что ослабление теломеразной активности или усиление изнашивания теломер наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз, синдром Вернера или телеангиэктатическая атаксия.
Теломеры с белками образуют защитную структуру шелтерин (телосома), не позволяющую клетке распознать концы линейной ДНК в качестве двунитевых разрывов, что предотвращает их репарацию. Повышение активности теломеразы наблюдается примерно при 90% злокачественных опухолей человека различного происхождения и могут быть следствием молекулярно-генетических нарушений, заключающихся в мутациях в кодирующем участке гена теломеразы, что является редким событием, а чаще - в мутациях промотора обратной транскриптазы теломеразы (TERT - от англ. «Telomerase Reverse Transcriptase»). Мутации промотора TERT обнаружены в злокачественных опухолях различного гистогенеза (глиобластомы, меланома кожи, рак мочевого пузыря и др.), включая эндокринные органы (щитовидная и околощитовидные железы, надпочечники).
ММР-9 является ферментом семейства цинк-металлопротеиназ, реализующим ремоделирование межклеточной среды фибробластами кожи. Протеазы семейства ММР участвуют в разрушении межклеточного матрикса в физиологических условиях (эмбриональное развитие, размножение, ангиогенез, развитие костной ткани, миграция клеток) и при патологии (артрит, внутримозговые кровотечения, метастазирование опухолей). Большинство ММР секретируется в виде неактивных пропротеинов, которые активируются внеклеточными протеиназами [Vandooren J., Van den Steen P.E., Opdenakker G. Biochemistry and molecular biology of gelatinase В or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9): the next decade // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2013. - V. 48. - N 3. - P. 222-272]. Индуцируемый ультрафиолетом синтез MMP-9 способствует разрушению фибриллярного коллагена типа I и III в дерме. Коэкспрессия ММР-2, 3, 9 приводит к деградации неколлагеновых компонентов дермы, в том числе гликопротеинов и протеогликанов базальной мембраны. При старении клеток кожи уровень тканевых ингибиторов ММР снижается, что способствует активации ремоделирования межклеточного матрикса [Wong V.W., Garg R.K., Sorkin М. et al. Loss of keratinocyte focal adhesion kinase stimulates dermal proteolysis through upregulation of MMP9 in wound healing // Ann Surg. - 2014. - Vol. 260. - N 6. - P. 1138-1146; Xue S.N., Lei J, Lin D.Z. et al. Changes in biological behaviors of 58 rat dermal fibroblasts induced by high expression of MMP9 // World J Emerg Med. - 2014. - V. 5. - N 2. - P. 139-143].
Ген ZMPSTE24 - цинкметаллопроиназа STE24, которая перерабатывает ламин А. Дефект этого гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения. Ламин А/С - белки человека, принадлежащие к семейству ламинов и кодируемые геном LMNA на первой хромосоме. Ламины (у позвоночных имеются три формы: А, В, С) сплетаются под мембраной клеточного ядра в слой, называемый ядерной ламиной. Мутации и вариации гена LMNA ассоциированы с мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса, семейной частичной липодистрофией, конечностно-поясной мышечной дистрофией, дилатационной кардиомиопатией, болезнью Шарко-Мари-Тута и синдромом прогерии Хатчинсона-Гилфорда. Синдром прогерии, исключительно редкое расстройство, вызывается синтезом ламина А неправильной формы, называемой прогерином. Генерация нормальной формы ламина А. Неспособность сгенерировать зрелый белок нормальной формы (справа) приводит к образованию патологического ламина под названием «прогерин». В свою очередь, прогерин нарушает функционирование клеточного ядра, приводя к изменениям кожи и ускоренному старению. Металлопротеиназы (а именно ZMPSTE24) в виде карбоксипептидаз участвуют в биосинтезе нейроэндокринных белков, таких как инсулин.
С-пептид (от англ. connecting peptide, «соединяющий» пептид) - пептид, образующийся при расщеплении проинсулина пептидазами (ZMPSTE24).
В качестве критерия возникновения нарушений кожных покровов (меланоз, дисхромия) в условиях избыточной контаминации мышьяком рекомендуется использовать:
- измененный генотип (вариантный гомозиготный) гена теломеразы TERT (rs10054203) C309G, отвечающего за сохранение и регенерацию теломеров, которые обеспечивают защиту главного фрагмента ДНК от поражения при репликации и зависят от активности теломеразы, а в случае мутации создаются условия для ослабления теломеразной активности или усиления изнашивания теломер, что наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз;
- измененный генотип (вариантный гомозиготный) гена цинкметаллопептидазы ZMPSTE24 (rs2076697) Т/С, отвечающего за биосинтез нейроэндокринных белков, таких как инсулин и С-пептид, а также способствует образованию вазопрессорного соединения ангиотензина II вызывающего сужение сосудов периферических артерий и повышающего артериального давления, а дефект гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения, предполагается связь гена с развитием синдрома гиперкератоза;
- измененный генотип (гетерозиготный или вариантный гомозиготный) гена матриксной металлопротеиназы ММР9 (rs17576) Gln279Arg, A/G, отвечающего за формировании и поддержании внеклеточного матрикса - тканевых структур, служащих каркасом, на котором развиваются клетки, полиморфизм ММР9 - риск дефекта синтеза коллагена, риск получения более рыхлого коллагена, снижение количества и качества коллагеновых волокон способствует уменьшению толщины дермального слоя, появлению морщин, складок, птоза тканей.
Совокупные проявления полиморфизма данных генов, отвечающих за ключевые ферментные реакции обмена веществ, способствуют формированию нарушений скорости метаболизма, снижению апоптоза и феномену кожных нарушений, как составляющего процесса ускоренного старения.
Также показателем, характеризующим сам феномен нарушения ферментативноопосредованных реакций обмена, является С-пептид, образующийся при расщеплении проинсулина пептидазами, возрастные повышения уровня которого сопровождают течение сахарного диабета 2-го типа и кожных нарушений.
3
Модулирующие указанные процессы ионы мышьяка (мышьяком производится замена цинка в молекуле металлопептидаз) в данном изобретении будут характеризовать 2 критерия: содержание мышьяка в моче и ответ на его контаминацию - уровень содержания IgG к мышьяку. Подтверждающим фактором нарушения ферментоопосредованного метаболизма и формирования кожных нарушений (меланоз, дисхромия) будет служить нарастание уровня С-пептида и специфического ответа на мышьяк по критерию содержания IgG к мышьяку. Реализующим или запускающим процесс нарушения фосфорного обмена служит экспозиция мышьяка, превышающая верхний предел референтной концентрации в моче (референтный диапазон мышьяка в моче 0,0-300,0 мкг/дм).
3
Таким образом, для установления ранних проявлений и формирования специфического нарушения кожных покровов в виде меланоза, дисхромии, ассоциированных с содержанием мышьяка в моче, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипов кандидатных генов и в случае вариантной гомозиготы GG участка гена TERT rs10054203; гетерозиготы AG или вариантной гомозиготы GG участка гена ММР9 rs 17576 Gln279Arg, и вариантной гомозиготы СС участка гена ZMPSTE24 rs2076697, отклонении от физиологической нормы содержания IgG специфического к мышьяку в виде его гиперпродукции, избыточном содержании мышьяка в моче выше 300 мкг/дм (т.е. выше верхней границы референтной концентрации) прогнозируют риск формирования кожных нарушений, выражающихся дисхромией, меланозом, ассоциированных с контаминацией мышьяком.
Это доказывается повышением экспрессии С-пептида, т.к. С-пептид является показателем, повышение уровня которого сопровождаются кожными нарушениями. Уровень С-пептида отражает функциональное состояние металлопептидаз (цинкметаллопептидазы ZMPSTE24, матриксной металлопротеиназы ММР-9), при дефекте которых возникают нарушения, характеризующиеся истончением дермального и гипертрофией рогового слоев кожи.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб крови и мочи, а также стандартных методик изучения генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.
Установление содержания химического контаминанта - мышьяка, именно в моче обусловлено тем, что моча является средой, имеющей реферируемые (фоновые) уровни в отношении техногенных химических веществ, а также стандартной средой используемой для протоколов интоксикаций, вызванных металлами.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TERT; ММР9 и ZMPSTE24.
Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать одновременно именно полиморфизм гена TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg и ZMPSTE24 (rs2076697), обеспечивается точность диагностики. Поэтому по данным показателям можно судить о генетически детерминированном характере нарушений кожных покровов в виде меланоза и дисхронии, и разрабатывать в последующем индивидуальные программы лечения.
Причем из уровня техники неизвестны методы выявления предрасположенности к риску нарушения пигментации кожи в условиях избыточной контаминации мышьяком с использованием одновременно именно полиморфизмов этих генов.
Уровень IgG к мышьяку характеризует сам феномен специфической сенсибилизации.
Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с полиморфными вариантами указанных генов, ассоциированных с генетическим дефектом, и врожденной чувствительностью к внешним факторам (например, мышьяк), одновременно с количеством химического токсиканта - мышьяк в моче, и превышением уровня IgG к мышьяку по сравнению с физиологической нормой, будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния мышьяка на потенциальное развитие кожной патологии у человека.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом
1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием природной биогеохимической провинции, характеризующей повышенным содержанием мышьяка в природных водах. Исследования были проведены на территории одного из промышленных регионов Российской Федерации, характеризующейся наличием в питьевой воде повышенных концентраций мышьяка (более 1 ПДК)
3
2. На указанной территории проводят отбор группы пациентов одной этнической популяции. Затем проводят отбор пробы мочи у обследуемых пациентов для определения содержания мышьяка. Содержание мышьяка в моче определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500сх с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе мочи над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории максимальным референтным значением по мышьяку был показатель равный 300,0 мкг/дм).
3. Затем определяют в пробе крови содержание IgG к мышьяку по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям / Методические рекомендации.- М., 2002. - С. 29. А также определяют в пробе крови содержание С-пептида по методике иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора DRG C-Peptide ELISA (EIA-1293).
4. Также у указанного пациента отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.
Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg и ZMPSTE24 (rs2076697).
2
Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного пациента готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TERT (rs10054203); ММР9 (rs17576) Gln279Arg, и ZMPSTE24 (rs2076697) (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма указанных генов ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПНР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.
При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.
Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).
Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).
Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.
По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена в исследуемом участке ДНК (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние гена.
3
3
5. И при выполнении следующих условий: наличие вариантной гомозиготы участка гена TERT (rs 10054203); гетерозиготы или вариантной гомозиготы участка гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg и вариантной гомозиготы участка гена ZMPSTE24 (rs 2076697), отклонении от физиологической нормы (0,5-3,2 нг/см) уровня С-пептида в сыворотке крови, избыточном содержании мышьяка в моче выше 300 мкг/дм, прогнозируют риск формирования кожных нарушений, выражающихся дисхромией, меланозом, ассоциированных с контаминацией мышьяком.
При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено обследование населения при различных условиях по содержанию мышьяка в бисредах (моча).
3
3
Были сформированы две группы: группа наблюдения, взрослые с избыточным содержанием мышьяка в моче более 300 мкг/дм, и группа сравнения, с содержанием мышьяка в моче менее 300 мкг/дм. В группу наблюдения вошли 35 взрослых (средний возраст 38,2±0,6 года; 52% женщин и 48% мужчин). В группу сравнения вошел 30 человек (средний возраст 40,4±0,3 года; 58% женщин и 42% мужчин). Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню, качеству и составу питания.
На территории проживания группы наблюдения отмечено превышение содержания мышьяка в воде более 2,0 ПДК.
У всех обследуемых взрослых была взята проба мочи и проба венозной крови, исследование которых проводилось по вышеуказанной схеме. Также была взята проба буккального эпителия для установления по реакции ПЦР полиморфизма исследуемых генов.
Для доказательства достоверности заявляемых критериев диагностики предрасположенности к дисхромии, меланозу, ассоциированных с контаминацией мышьяком, было установлено в пробе сыворотки крови содержание С-пептида и IgG к мышьяку. Эти показатели являются подтверждающим фактором избыточной нагрузки (контаминации) мышьяком с одной стороны и нарушением экспрессии металлопептидаз (ММР-9 и ZMPSTE24), с другой - мутации одноименных генов формируют нарушения, которые приводят к патологии кожных покровов.
Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблице 1.
Результаты приведены в таблице 1 в виде пяти блоков, в каждом из которых показано различное сочетание полиморфизмов указанных генов, содержание мышьяка в моче, уровень IgG в сыворотке крови к мышьяку и содержание С-пептида в крови.
3
3
Данные, приведенные в указанной таблице 1, показывают, что при одновременном сочетании вариантного гомозиготного состояния генотипа аллеля гена TERT (rs10054203); вариантного гомозиготного или гетерозиготного состояния генотипа аллеля гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg и вариантного гомозиготного состояния генотипа аллеля гена ZMPSTE24 (rs2076697), концентрации «виновного» фактора (мышьяка) в моче выше верхней границы референтной концентрации (0,0-300,0 мкг/дм), т.е. более величины 300 мкг/дм, и превышении выше физиологической нормы уровня IgG к мышьяку (пациенты 1-3), наблюдается повышение по сравнению с физиологической нормой содержания С-пептида. А это значит, что при этом фиксируется реализация мышьяком негативной генетической программы металлопептидазами у человека, выражающейся в риске формирования кожной патологии через проявление меланоза и дисхромии.
Тогда как при допустимом (на уровне ниже верхней границы референтной концентрации) содержании мышьяка в моче, даже в условиях наследования гетерозиготного или вариантного генотипа указанных генов (пациенты 4-6), уровень IgG и содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы.
В случае превышения содержания мышьяка в моче даже более чем 2 раза по сравнению с верхней границей референтного уровня, но при отсутствии полиморфных изменений указанных генов (пациенты 7-8), уровень IgG и содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы.
3
У пациентов с нормальными гомозиготными генотипами гена TERT rs10054203; ММР9 rs17576 Gln279Arg и ZMPSTE24 rs2076697 и уровнем As в моче ниже 300,0 мкг/дм, содержание С-пептида находятся в пределах физиологической нормы (пациенты 9-10).
3
У пациентов 11-13, которые характеризуются превышением содержания мышьяка в моче более 300 мкг/дм, превышением по сравнению с нормой уровня IgG к мышьяку, но при этом имеют наследование гетерозиготного генотипа только одного из указанных генов, а не одновременно всех вместе, вывод о предрасположенности к кожной патологии не диагностирован, при этом содержание С-пептида находится в пределах нормы, что указывает на отсутствие необходимых генетических условий (предрасположенности) для реализации имеющегося воздействия в виде дерматологического нарушения.
Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы с повышенным содержанием мышьяка в моче и с содержанием мышьяка в моче в пределах референтной концентрации.
3
3
3
Пример 1. Пациент, 38 лет, русский, дисхромия, меланоз. Установлен уровень мышьяка в моче более чем в 5 раз выше референтного уровня - 1542 мкг/дм. Установлено наличие гетерозиготного генотипа гена ММР9 (rs17576) Gln279Arg - AG, вариантного гомозиготного генотипа гена TERT (rs10054203) - GG и вариантного гомозиготного генотипа гена ZMPSTE24 (rs2076697) - СС. Значение содержания IgG к мышьяку: 0,201 у.е., т.е. в 2,0 раза выше верхней границы нормы. Содержание С-пептида в крови - маркера нарушений работы металлопептидаз, 6,5 нг/см, т.е. выше диапазона нормы (0,5-3,2 нг/см). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к мышьяку и избыток продукции С-пептида на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза содержания мышьяка в моче, а также наличие полиморфизма вышеуказанных генов, кодирующих ферменты, ответственные за изнашивание теломер, что наблюдается у человека при различных синдромах, связанных с преждевременным старением, таких как врожденный дискератоз; биосинтез нейроэндокринных белков, таких как С-пептид, что вызывает эффект выраженного преждевременного старения с развитием синдрома гиперкератоза; формирование и поддержание внеклеточного матрикса - тканевых структур, служащих каркасом, на котором развиваются клетки, дефект синтеза которых ведет к снижению количества и качества коллагеновых волокон и уменьшению толщины дермального слоя, что в совокупности создает условия, способствующие формированию патологии кожной ткани в виде меланоза и дисхромии, инициированной действием мышьяка.
Это говорит о том, что, согласно предлагаемому способу, у данного пациента состояние от воздействия мышьяка оценивается, как формирование проявлений кожной патологии (дисхромия, меланоз), имеющей генетическую предрасположенность, реализующуюся в условиях избыточной контаминации мышьяком.
3
3
3
Пример 2. Пациент, 37 лет, русский, патологии кожных покровов не выявлено. Определяется уровень мышьяка в моче более, чем в 2 раза выше референтного уровня - 500 мкг/дм. Отсутствуют полиморфные (вариантные) генотипы гена ММР9 (rs17576) - АА, гена TERT (rs10054203 - СС и гена ZMPSTE24 (rs2076697) - ТТ. Значение содержания IgG к алюминию: 0,066 у.е. - в диапазоне нормы. Содержание С-пептида в крови - маркера нарушений работы металлопептидаз, 2,9 нг/см, т.е. в диапазоне нормы (0,5-3,2 нг/см). Таким образом, отсутствие полиморфизма вышеуказанных генов на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем в 2 раза, содержания мышьяка в моче, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к мышьяку и С-пептида, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации мышьяка в моче не формирует развитие кожной патологии, и не приводит к развитию меланоза и дисхромии у данного пациента.
Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев обеспечивается его назначение.
Заявляемый способ позволяет с достаточной достоверностью установить предвестники кожных патологий, ассоциированные с влиянием мышьяка, по заявляемым генетическим критериям, содержанию мышьяка в моче и по уровню IgG к мышьяку, и начать заблаговременно профилактические мероприятия.