Способ получения надропарина кальция
METHOD FOR OBTAINING NADROPARIN CALCIUM

Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ), такого как надропарин кальция, и может быть использовано для производства лекарственных препаратов на его основе.
Гепарин представляет собой антикоагулянт прямого действия, который синтезируется тучными клетками, являющимися разновидностью клеточных элементов соединительной ткани. В связи с этим важнейшим источником для получения гепарина в фармакологических и медицинских целях является ткань легких и печени животных методом протеолиза или деполимеризации с последующей очисткой гепарина-сырца.
6
2
Гепарин является линейным гетерополисахаридом, построенным из чередующихся остатков a-D-глюкопиранозилуроновой (глюкуроновой) кислоты и 2-сульфамино-2-дезокси-а-D-глюкопиранозы (сульфатированного N-ацетилглюкозамина), связанных а-1,4-гликозидными связями. Кроме сульфатных групп гепарин содержит и сульфоэфирные группы (при С остатков сульфо-N-глюкозамина и, частично, при С глюкуроновой кислоты).
Для медицинских целей получают два типа гепарина: высокомолекулярный (ВМГ) и низкомолекулярный (НМГ) гепарины.
В настоящее время широкое применение получили препараты низкомолекулярного гепарина (НМГ), которые имеют достаточно высокую активность по фактору антикоагулянтной активности анти-Ха и низкую по анти-IIa активности (1).
В частности, используются препараты на основе субстанций дальтепарина, тинзапарина и эноксапарина натрия, надропарина, которые отличаются высокой антикоагуляционной активностью и имеют наиболее широкий спектр показаний.
Примером получения эноксипарина натрия является способ получения низкомолекулярного гепарина, включающий стадии получения бензетониевой соли гепарина, бензилирования этой соли в неводном растворителе, спиртового осаждения неполного бензилового эфира бензетониевой соли гепарина и щелочной деполимеризации этого продукта, при котором бензетониевую соль нефракционированного гепарина получают в 0,05-0,5 M водном растворе натрия хлорида при температуре 50-60°С, рН=8,2-8,8 и массовом соотношении гепарин/бензетоний хлорид 1/(2,35-2,70), бензилирование бензетониевой соли гепарина проводят в течение 2-3 часов в среде биполярного апротонного растворителя бензилхлоридом в соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-1,0), который предварительно подвергают активированию в апротонном растворителе в течение 15-20 мин, осаждение бензилового эфира гепарина проводят методом Спиро этиловым спиртом, предварительно насыщенным безводным натрия ацетатом, с последующим снятием защиты с сульфогрупп, проведение β-элиминирования бензилового эфира со степенью этерификации гепарина 9-13% 1±0,5 N щелочью NaOH при температуре 55±5°С, длительности процесса 40-60 мин и массовым соотношением реагентов бензиловый эфир/щелочь 1/(0,5-2) (2).
Данный способ иллюстрирует общие черты получения фракций НМГ, а именно процесс деполимеризации ВМГ с последующим осаждением и фильтрацией. В результате получаются полидисперсные фрагменты полимерных макромолекул исходного гепарина более низкой молекулярной массы, в среднем 2000-10000 Да, при этом они отличаются молекулярной массой и молекулярно-массовым распределением, строением концевых групп, активностью относительно минорных факторов свертывания крови и их соотношением.
Одним из таких препаратов на основе НМГ является надропарин кальция.
Используемый в качестве лекарственного препарата надропарин представляет собой кальциевую соль деполимеризованного гепарина с молекулярной массой от 4000 до 5000 Да.
Он обладает прямым антикоагуляционным действием, анти-Ха и анти-IIa активностью, непосредственно влияет на находящиеся в крови факторы свертывания. Усиливает блокирующий эффект антитромбина III на фактор Ха (активирует переход протромбина в тромбин). Анти-Ха активность приблизительно в 4 раза превосходит анти-IIa активность. Обладает противовоспалительными и иммуносупрессивными (подавляет кооперативное взаимодействие Т- и В-клеток) свойствами, незначительно понижает уровень холестерина и бета-липопротеидов в сыворотке крови. Улучшает коронарный кровоток.
Применяется при тромбозах глубоких вен, тромбоэмболии легочной артерии, остром коронарном синдроме, профилактике тромбозов у больных с высоким риском: а) при ортопедических, онкологических и общехирургических операциях, б) при гемодиализе и гемофильтрации у больных с хронической почечной недостаточностью.
Вводят в подкожную клетчатку живота (игла располагается перпендикулярно кожной складке).
Известно несколько способов получения надропарина кальция.
Так, известен способ, включающий деполимеризацию гепарина с получением НМГ. Далее проводят процесс очистки, в котором выполняется устранение нитрозных групп путем нагревания водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин при рН, составляющем от 3,0 до 13,0 при температуре, составляющей от 40°С и 90°С; в течение времени от 15 минут до 180 минут, или путем обработки водного раствора, содержащего низкомолекулярный гепарин излучением с помощью микроволн с частотой, находящейся между 900 и 2450 МГц при мощности 600-1000 Вт, в течение периода времени между 30 и 300 секунд (3).
-7
Также известен способ получения гепарина низкомолекулярной массы нитрозной деполимеризацией гепарина природного происхождения, при котором водный раствор натриевой соли гепарина природного происхождения концентрацией 5-15 мас./об. % обрабатывают раствором нитрита щелочного металла из расчета 1,5-6,9 мас. % нитрита по отношению к взятой соли гепарина в присутствии соляной кислоты при рН 1-5 в течение 20-50 мин, при этом реакцию проводят до появления отрицательного теста на нитроионы, полученный продукт восстанавливают добавлением боргидрида натрия в количестве 0,5-2,0 мас. % от количества взятой соли гепарина, избыток которого разрушают соляной кислотой, полученную реакционную среду нейтрализуют и осаждают из нее этанолом гепарин низкомолекулярной массы в виде натриевой соли, водный раствор которой обрабатывают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 180 до 350 нм при температуре 5-50°С и при рН 3-8 с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10 мг на мг продукта, или при рН 7 с направлением обработанного раствора на анионообменную колонку, которую промывают водой при рН приблизительно 7, и рекуперируют конечный продукт осаждением хлористым натрием и этанолом с получением гепарина низкомолекулярной массы, содержащего нитрозосоединения в количестве, менее или равном 5⋅10-8 мг на мг продукта (4).
Наиболее близким аналогом предлагаемого нами способа является способ получения надропарина кальция, гепарин растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем обработки соляной кислотой, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора, до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение, для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют, выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся первый продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, после чего осадок опять растворяют в воде, добавляют нитрит натрия и доводят рН раствора до 2-3 путем обработки соляной кислотой, выдерживают раствор до исчезновения нитрита и затем доводят рН раствора до 9-11 путем добавления гидроксида натрия, после чего в раствор вводят борогидрид натрия, реакционную смесь перемешивают несколько часов, избыток борогидрида натрия разрушают соляной кислотой, а полученную реакционную среду нейтрализуют, после чего осуществляют осаждение для чего добавляют этанол и выдерживают несколько часов, отделяют выделившийся продукт центрифугированием, к супернатанту добавляют спирт, перемешивают несколько часов, получившийся второй продукт отфильтровывают, промывают спиртом и сушат, затем первый и второй сухой продукт растворяют в воде, пропускают через сильнокислый катионит, эллюат доводят раствором гидроксида кальция до рН 6,6-7,2, фильтруют и сушат методом сублимационной сушки (лиофилизация) или с применением вакуумных сушильных шкафов (5).
Однако общим недостатком данных способов получения является то, что проведение процессов в таких условиях сопровождается избыточной деполимеризацией, и в результате наблюдается повышенное содержание низкомолекулярной фракции (меньше 2000 Да). Это приводит к снижению выхода целевого продукта и дополнительным затратам на его изготовление.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка такого способа получения надропарина, который бы позволил увеличить целевой выход продукта за счет снижения доли низкомолекулярной фракции.
Способ заключается в следующем:
Гепарин натрия растворяют в воде, охлаждают реакционную массу до температуры 15°С, доводят рН раствора до 2,3-2,5 концентрированной соляной кислотой и в один прием добавляют нитрит натрия, реакционную массу перемешивают 60-90 минут, по окончании перемешивания доводят значение рН реакционной массы до 10 путем добавления водного раствора гидроксида натрия, после чего в раствор добавляют борогидрид натрия и перемешивают реакционную массу в течение 2 часов, по окончании перемешивания доводят рН реакционной массы до 3,9-4,0 при помощи концентрированной соляной кислоты и перемешивают еще 20 минут, после чего реакционную массу нейтрализуют до рН 7,0 водным раствором гидроксида натрия, затем к раствору добавляют этиловый спирт, перемешивают 10 минут и оставляют на 300 мин до осаждения масла, раствор декантируют, оставшееся масло (не закристаллизовавшееся вещество) перемешивают в этиловом спирте, осадок отфильтровывают и сушат на воздухе до постоянной массы, получают надропарин натрия,
затем проводят переосаждение надропарина натрия, для этого высушенный осадок растворяют в воде, добавляют хлорид натрия и доводят рН раствора, до 4 концентрированной соляной кислотой, добавляют этанол, соотношение спирта к высаживаемому веществу составляет 35:1, перемешивают и оставляют до осаждения масла на 2 часа, полученный раствор декантируют, осадок затирают в этаноле, фильтруют, сушат при комнатной температуре до постоянной массы,
затем к полученному на предыдущем этапе надропарину натрия приливают воду, добавляют сильнокислый катионит в кальциевой форме, выдерживают 2 часа, затем раствор фильтруют, смолу промывают водой, раствор доводят до рН=6.8-7.0 раствором гидроксида кальция и подвергают сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С при остаточном вакууме 20 мм рт. ст. Получают надропарин кальция.
В частном случае в качестве катеонита используют ионообменную смолу КУ-2-80 Na, которую помещают в 2% раствор серной кислоты, перемешивают 1 час и декантируют раствор со смолы, повторяют эту процедуру 2 раза, затем промывают смолу дистиллированной водой, помещают в раствор хлористого кальция и перемешивают 1 час, повторяют эту процедуру 2 раза, затем промывают смолу дистиллированной водой и получают сильнокислый катионит в кальциевой форме.
На следующем этапе проводят дробное переосаждение кальциевой соли надропарина кальция. Для этого надропарин кальция, полученный на предыдущей стадии, растворяют в воде. К полученному раствору медленно приливают этиловый спирт, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разливают во флаконы и центрифугируют на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования декантируют раствор с выпавшего масла и упаривают его при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок Дополнительно сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов. Получают надропарин кальция.
Преимуществами способа (техническими результатами) является то, что:
- предлагаемый способ относится к расширению арсенала возможностей получения, надропарина кальция высокого качества.
- предлагаемый способ позволяет получать надропарин натрия с максимальным количеством фракций, требуемых для синтеза надропарина кальция.
- проведение повторного переосаждения надропарина кальция позволяет уменьшить содержащиеся в промежуточном продукте низкомолекулярные фракции.
- использование сильнокислого катионита в кальциевой форме для получения кальциевой соли надропарина позволяет провести реакцию с высоким выходом конечного продукта.
- сушка надропарина кальция путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 30°С и с применением остаточного вакуума снижает затраты на данный процесс по сравнению с использованием дорогостоящей лиофильной сушки.
- стадия дробного переосаждения кальциевой соли проводится с целью отделения высокомолекулярных фракций.
Краткое описание поясняющих материалов
Фиг. 1 - массово-молекулярное распределение фракций в полученном препарате надропарина кальция.
Изобретение поясняется следующими примерами его осуществления
Пример 1. Получение надропарина кальция
1) Получение надропарина натрия 8 г гепарина натрия растворяли в 36 мл воды, охлаждали реакционную массу до температуры 15°С, доводили рН раствора до 2,3 10% раствором соляной кислоты и немедленно, в один прием, добавляли 0,280 г нитрита натрия. Реакционную массу перемешивали строго 90 минут. По окончании перемешивания доводили значение рН реакционной массы до 10 с помощью 0,2 М раствора гидроксида натрия в воде. Затем добавляли 0,08 г боргидрида натрия и перемешивали реакционную массу в течение 2 часов. По окончании перемешивания доводили рН реакционной массы до значения 3,9 при помощи 10%-ного раствора соляной кислоты и перемешивали 20 минут, после чего нейтрализовали реакционную массу до рН 7,0 0,2М водным раствором гидроксида натрия. На протяжении всех этих проделанных манипуляций, температура реакционной смеси составляла 15°С. Затем к раствору добавляли 380 мл этилового спирта (с содержанием этанола около 95,5%), перемешивали 10 минут и оставляли до осаждения масла (около 300 мин). Раствор декантировали, а оставшееся масло затирали в 200 мл этилового спирта. Осадок отфильтровывали и сушили на воздухе до постоянной массы, получали 7,99 г надропарина натрия.
2) Переосаждение натриевой соли надропарина 7,99 г натриевой соли надропарина, полученного на предыдущей стадии, растворили в 142 мл воды. К полученному раствору добавили 1.6 г хлорида натрия, довели значение рН раствора до 4 концентрированной соляной кислотой. Общий объем раствора довели водой до 160 мл. Контролируя скорость (не более 3 мл/минуту), прилили 190 мл этанола, перемешали и оставили на 2 часа. Декантировали раствор выпавшего масла, а к оставшемуся раствору прилили 300 мл спирта, затерли в этаноле до образования твердого осадка, отфильтровали, сушили при комнатной температуре до постоянной массы. Получили 5,41 грамм образца.
3) Синтез надропарина кальция
а) Приготовление смолы КУ-2-80 (Са)
2
250 мл смолы КУ-2-80 (Na) поместили в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного 2%-ного раствора серной кислоты, перемешивали 1 час и декантировали раствор со смолы. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Смолу перенесли в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного раствора хлористого кальция (100 г CaCl в 1 литре воды) и перемешивали 1 час. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Перенесли в стакан и хранили до использования под слоем дистиллированной воды.
б) Синтез надропарина кальция
К 5,41 г переосажденной натриевой соли надропарина приливали 53 мл воды, перемешивали до полного растворения соли, прибавляли 53 мл смолы КУ-2-80 (Са), нагруженной ионами кальция, и выдерживали при перемешивании 2 часа. Далее раствор фильтровали от смолы, смолу промывали три раза по 50 мл воды. Маточный раствор подщелачивали до рН=6,8 0,1 M раствором гидроксида кальция, и подвергали сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С. Получили 5,22 г надропарина кальция.
в) Дробное переосаждение кальциевой соли надропарина
5,22 г надропарина кальция, полученного на предыдущей стадии, растворили в 218 мл воды. К полученному раствору медленно приливали 197 мл этилового спирта, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разлили во флаконы и центрифугировали на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования декантировали раствор с выпавшего масла и упаривали его при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок дополнительно сушили в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов.
Получили 3,625 г надропарина кальция.
Пример 2.
1 ) Получение надропарина натрия
8 г гепарина натрия растворяли в 72 мл воды, охлаждали реакционную массу до температуры 15°С, доводили рН раствора до 2,5 10%-ным раствором соляной кислоты и немедленно, в один прием, добавляли 0,280 г нитрита натрия. Реакционную массу перемешивали 60 минут. По окончании перемешивания доводили значение рН реакционной массы до 10 с помощью 0,2 М раствора гидроксида натрия в воде. Затем добавляли 0,08 г боргидрида натрия и перемешивали реакционную массу в течение 2 часов. По окончании перемешивания доводили рН реакционной массы до значения 4,0 при помощи 10% раствора соляной кислоты и перемешивали 20 минут, после чего нейтрализовали реакционную массу до рН 7,0 0,2 M раствором гидроксида натрия. На протяжении всех этих проделанных манипуляций, температура реакционной смеси составляла 15°С. Затем к раствору добавляли 380 мл этилового спирта, перемешивали 10 минут и оставляли до осаждения масла (около 300 мин). Раствор декантировали, а оставшееся масло затирали в 200 мл этилового спирта. Осадок отфильтровывали и сушили на воздухе до постоянной массы, получали 7,9990 г надропарина натрия.
2) Переосаждение натриевой соли надропарина
7,9990 т натриевой соли надропарина, полученного на предыдущей стадии, растворили в 27 мл воды. К полученному раствору добавили 0,3 г хлорида натрия, довели значение рН раствора до 4 концентрированной соляной кислотой. Общий объем раствора довели водой до 30 мл. Добавили 30 мл этанола, перемешали и оставили на 2 часа. Полученный осадок декантировали, затерли в этаноле, отфильтровали, сушили при комнатной температуре до постоянной массы. Получили 5,4070 г образца.
3) Синтез надропарина кальция
а) Приготовление смолы КУ-2-80 (Са)
2
250 мл смолы КУ-2-80 (Na) поместили в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного 2% раствора серной кислоты, перемешивали 1 час и декантировали раствор со смолы. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Смолу перенесли в 2-литровый стакан, прилили 500 мл предварительно приготовленного раствора хлористого кальция (100 г CaCl в 1 литре воды) и перемешивали 1 час. Повторяли эту процедуру 2 раза. Затем промывали смолу 1 л дистиллированной воды. Перенесли в стакан и хранили до использования под слоем дистиллированной воды.
б) Синтез надропарина кальция
К 5,4070 г переосажденной натриевой соли надропарина приливали 5 мл воды, перемешивали до полного растворения соли, прибавляли 5 мл смолы КУ-2-80 (Са), нагруженной ионами кальция, и выдерживали при перемешивании 2 часа. Далее раствор фильтровали от смолы, смолу промывали 25 мл воды. Маточный раствор подщелачивали до рН=7,0 ОДМ водным раствором гидроксида кальция и подвергали сушке путем испарения воды на роторно-пленочном испарителе при температуре бани 34°С и остаточном вакууме 20 мм рт.ст. Получили 5,22 г надропарина кальция.
в) Дробное переосаждение кальциевой соли надропарина
5.22 г надропарина кальция, полученного на предыдущей стадии, растворили в 218 мл воды. К полученному раствору медленно приливали 197 мл этилового спирта, контролируя температуру (20±1°С). По окончании дозирования реакционную массу разлили во флаконы и центрифугировали на скорости 3500 об/мин в течение 30 минут. После центрифугирования Декантировали раствор с выпавшего масла, которое упаривали при помощи роторно-пленочного испарителя (РПИ) при температуре бани 34°С и остаточном давлении 20 мм рт.ст. до образования порошка. Далее данный порошок дополнительно сушили в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С течение 72 часов. Получили 3,625 г надропарина кальция.
Пример 3. Сопоставление количества фракций в способе - прототипе и в заявляемом способе
Проводили получение надропарина кальция по технологии, согласно способу-прототипу и в соответствии с заявляемым способом. Согласно способу-прототипу получен надропарин кальция со средней молекулярной массой 3500-5000 Да, при этом наблюдается следующее соотношение фракций:
более 8000 Да - 10%, 2000-8000 Да - 75%, менее 2000 Да - 15 %.
Согласно заявленному способу получен надропарин кальция со средней молекулярной массой 3600-5000 Да, при этом наблюдается следующее соотношение фракций: менее 2000 Да - 5-13%, 2000-8000 Да -87-95%, из них содержание фракций с молекулярной массой от 2000 до 4000 - от 35 до 55% (фиг. 1).
Пример 4. Подтверждение подлинности надропарина кальция
13
Подтверждение структуры молекул проводили в рамках определения показателей качества: средняя относительная молекулярная масса, молярное соотношение сульфатных и карбоксильных групп, количественное определение (определение активности анти-фактор Ха и отношения активностей анти-фактор Ха и анти-фактор IIa, а также С ЯМР-спектроскопия.
Средняя молекулярная масса составляла 3600-5000 Да,
Активность анти-фактор Ха составляла 125 МЕ/мг в пересчете на сухое вещество.
По данным аналитических исследований выявлено, что полученные образцы соответствуют аналогичным параметрам, заданным в фармакопее для надропарина кальция.
Список литературы
1. В.А. Макаров и др., "Применение гепаринов в клинической практике", 1998, РМЖ, № 3, с. 4.
2. Патент РФ №2512768, опубл. 10.04.2014.
3. Европейский патент ЕР 1773890, опубл. 18.04.2007.
4. Патент РФ №2133253, опубл. 20.07.1999.
5. Патент РФ №2639574 С2, опубл. 28.11.2017.