Особенности цитокиновой регуляции при обострении хронического нефрита у больных с благоприятным и неблагоприятным исходами лечения

у интактных животных. Как следствие, отмечается значительное ухудшение регионарного кровотока в костной ткани (61,5±3,7 ПЕ по сравнению с 100,5±4,4 ПЕ у интактных крыс), приводящее к дисбалансу процессов костного ремоделирования и в конечном счете возникновению и развитию генерализованного остеопороза, сопровождающегося истончением костных трабекул в среднем на 39,4% и возникновением в них микропереломов. Подтверждением данному положению служит наличие прямой тесной зависимости между уровнем микроциркуляции в костной ткани проксимального ме-тафиза бедренной кости и шириной костных трабекул в данной локализации у крыс.

Это позволило нам прийти к выводу о значительной роли нарушения функции эндотелия сосудов микроцир-куляторного русла костной ткани в развитии генерализованного остеопороза. Следовательно, подтвердилась актуальность исследования остеопротективного действия наиболее часто применяемых в настоящее время препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью.

В ходе эксперимента было установлено, что эна-лаприл в дозе 0,5 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг через восемь недель после билатеральной овариэкто-мии, обладая эндотелиопротективным действием, что выражалось в усилении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эн-дотелиальной дисфункции по данным ЛДФ до уровня интактных животных (1,6±0,1 и 1,5±0,2 для эналаприла и лозартана соответственно), эффективно предотвращали снижение уровня регионарной микроциркуляции в костной ткани, сохраняя его на уровне интактных крыс (93,3±4,5 ПЕ и 100,0±2,3 ПЕ для эналаприла и лозарта-на соответственно).

Это позволило поддержать на адекватном уровне процессы костного ремоделирования при развивающемся генерализованном остеопорозе, свидетельством чего явилось замедление истончения костных трабекул в губчатой костной ткани (увеличение средней ширины костных трабекул по сравнению с группой животных с ос-теопорозом составило 29,5% и 45,9% для эналаприла и лозартана соответственно) и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. При этом достоверно более выраженным остеопротективным действием обладал лозартан, что может объясняться большим, нежели у эналаприла, сродством препарата к ренин-ангиотензин-альдостероновой системе.

В свете указанного представляются перспективными возможности разработки и изучения различных моделей остеопороза (гипоэстроген-индуцированной, глюкокортикоидной, гипергомоцистеинемической, ADMA-опосредованной, комбинированной), поиска новых патогенетических звеньев развития остеопоро-тических изменений костей, а также путей их эндотелий-опосредованной фармакологической коррекции препаратами различных групп, в том числе и при осте-опоротических переломах костей скелета.

ЛИТЕРАТУРА

1. Беневоленская Л. И. Руководство по остеопорозу. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. - 524 с.

2. Галаган М. Е., Широколова А. В., Ванин А. Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо- и эндогенных источников // Вопр. мед. химии. - 1991. - Т. 37, № 1. - С. 67-70.

3. Насонов Е. Л. Вторичный остеопороз: патогенез и клиническое значение при воспалительных заболеваниях суставов // Остеопороз и остеопатии. - 1998. - № 3. - С. 18-20.

4. Файтельсон А. В., Гудырев О. С., Дубровин Г. М. и др. Пат. 62505 Российская Федерация, МПК7 А61В 17/68. Канюлирован-ный стержень-кондуктор для проведения экспериментальных измерений / Заявители и патентообладатели А. В. Файтельсон, О. С. Гудырев. - № 2006144474/22; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07. -Бюл. № 12. - 3 с.: ил.

5. Файтельсон А. В., Гудырев О. С., Дубровин Г. М. и др. Пат. 62512 Российская Федерация, МПК7 A61D 3/00. Стол для хирургических манипуляций на мелких лабораторных животных / Заявители и патентообладатели А. В. Файтельсон, О. С. Гудырев. -№ 2006144475/22; заявл. 13.12.06; опубл. 27.04.07.-Бюл. № 12. - 4 с.: ил.

6. Alagiakrishnan K, Juby A, Hanley D. et al. Role of vascular factors in osteoporosis // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2003. -Vol. 58. - P. 362-366.

7. Laursen J. B., Rajagopalan S., Galis Z. Role of superoxide in angiotensin Il-induced but not catecholamine-induced hypertension // Circulation. - 1997. - Vol. 95. - P. 588-593.

8. Stimpel M., Jee W. S, Ma Y. et al. Impact of antihypertensive therapy on postmenopausal osteoporosis: effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor moexipril, 17beta-estradiol and their combination on the ovariectomy-induced cancellous bone loss in young rats // J. Hypertens. - 1995. -Vol. 13. - P. 1852-1856.

Поступила 02.04.2009

Н. А. ФЕДИЧЕВА1, Р. А. ХАНФЕРЯН2

ОСОБЕННОСТИ ЦИТОКИНОВОЙ РЕГУЛЯЦИИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО НЕФРИТА У БОЛЬНЫХ С БЛАГОПРИЯТНЫМ И НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ИСХОДАМИ ЛЕЧЕНИЯ

1Городская клиническая больница скорой медицинской помощи, Россия, 350042, г. Краснодар, ул. 40 лет Победы, 14; 2кафедра клинической иммунологии и лабораторной диагностики

Кубанского государственного медицинского университета, Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4. Тел. 8-918-464-27-31

В работе приведены результаты исследования баланса 1Ь4 и 1РЫ-у, участвующих в направлении дифференцировки наивных Т-хелперов в направлении ТИ1 и ТИ2 у больных с благоприятным и неблагоприятным течением обострения хронического нефрита. Показано, что у больных с неадекватным ответом на терапию, вероятно, наблюдается дифференциация

наивных хелперов в направлении Th2, что приводит к развитию аллергического воспаления и возрастанию концентрации Ig E in vivo и in vitro.

Ключевые слова: хронический нефрит в стадии обострения, адекватный и неадекватный ответы на терапию, IL-4, IFN-y, Ig E, аллергическое воспаление.

N. A. FEDICHEVA1, R. A. CHANFERAN2

FEATURES OF REGULATION OF THE CYTOKINES AT THE AGGRAVATION OF THE CHRONIC NEPHRITIS AT PATIENTS WITH FAVORABLE AND ADVERSE RESULT

OF TREATMENT

Clinical city emergency hospital, Russia, 350042, Krasnodar, 40-years of Victory st., 14; faculty of clinical immunology and laboratory diagnostics of Kuban state medical university, Russia, 350063, Krasnodar, Sedin st., 4. Tel. 8-918-464-27-31

In work of the was research of balance IL-4 and IFN-y, which participating in a direction of a differentiation naive Т-helper in direction Th1 and Th2 at patients of an aggravation of a chronic nephritis are resulted with favorable and adverse result of treatment. At patients with the inadequate answer to therapy, possibly, the differentiation naive helper in direction Th2 that leads to development of an allergic inflammation and increase of concentration Ig E in vivo and in vitro.

Key words: a chronic nephritis in stages of the aggravation, the adequate and inadequate answer to therapy, IL-4, IFN-y, Ig E, an allergic inflammation.

Нефрит является хроническим воспалительным заболеванием почек, имеющим в своем патогенезе выраженную аутоиммунную составляющую. Ткань почек синтезирует эритропоэтин, вследствие чего эритроидный росток кроветворения оказывается ком-митированным при хроническом нефрите. У больных наблюдается снижение показателей красной крови. В случае активного лечения в стадии обострения данное заболевание может перейти в стойкую ремиссию, а при неблагоприятном исходе привести к хронической почечной недостаточности (ХПН), в том числе требующей проведения программируемого гемодиализа. Эпидемиологические исследования последних лет свидетельствуют о неуклонном повышении числа больных с различными нефропатиями, переходящими в ХПН [6, 11], что зачастую происходит у лиц молодого и среднего возраста [1]. Такие последствия не только объясняют значительный социальный эффект обострений хронического нефрита, но и обуславливают важность выяснения иммунологических особенностей патогенеза данного заболевания у больных с различным его течением.

Нарушение сбалансированности цитокиновой регуляции с неизбежностью ведет к развитию патологии [5]. Значение иммуноглобулина Е (1д Е), интерлейки-на-4 (11--4) и интерферона-у (1ПМ-у) хорошо изучено в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит [9] и системная красная волчанка [8, 7], где показано влияние аллергического компонента иммунного ответа на прогноз и течение изучаемых заболеваний. Однако вопросы цитокиновой регуляции при хроническом нефрите, в том числе в фазе обострения, до сих пор не получили должного освещения в иммунологической литературе. В одной из работ показано, что при исследовании образцов биоптатов ткани почек методом иммунофлюоресцентного анализа у 20 больных из 373 обследованных с различными формами нефрита (менее 6%) были обнаружены следы 1д Е. В то же время при анализе концентрации 1д Е в сы-

воротке крови у больных с гломерулонефритом выявлено, что, хотя она не выходит за пределы нормальных значений, однако всегда находится на верхней границе нормы [10]. В немногочисленных работах, посвященных состоянию иммунитета у больных с нефритом [2, 4], нам не встретилось попыток интерпретировать полученные данные с позиций развития аллергического воспаления. Данных об изучении продукции цитокинов в культуре мононуклеаров у больных с нефритом в доступной литературе нами не обнаружено.

Целью настоящей работы явилось изучение динамики концентрации иммуноглобулина Е (Ig E) in vivo, а также спонтанной и стимулированной продукции Ig E in vitro у больных с хорошим и неудовлетворительным результатами лечения. Кроме того, в этих группах больных изучали концентрацию интерлейкина-4 и интерферона-у как in vivo, так и in vitro в момент поступления в стационар.

Материалы и методы

В работе изучены показатели иммунитета 20 больных с острым нефритом, находящихся на лечении в краевом нефрологическом центре. Результат лечения определяли путем экспертной оценки лечащими врачами по совокупности клинических признаков. В I группу, с удовлетворительными результатами лечения, и во II группу, с неадекватным ответом на терапию, вошло по 10 человек.

Всем больным при поступлении и при выписке проводили общий анализ крови на полуавтоматическом анализаторе Micros CA 620. Концентрации Ig E и цитокинов определяли методом иммуноферментно-го анализа (ИФА) на реактивах фирмы «Immunotech» (Чехия). У больных при поступлении изучали концентрацию Ig E, IL-4 и IFN-у в крови. Уровень Ig E в крови исследовали и при выписке на 21-й день. Для выяснения возможных механизмов патогенеза неадекватного ответа на терапию in vitro в 3-суточной культуре мононуклеаров изучали концентрацию IL-4 и IFN-y

5,0

4,8 -4,6 -4,4

° 4,0 I

£ 3,8

О. 3,6-

Is

а 3 4

m 3,4

3,2 3,0 2,8 2,6

О Median |25%-75% Min-Max

I до II до I после II после

Рис. 1. Динамика содержания эритроцитов крови у больных I и II групп с различным исходом заболевания

Примечание: стрелками указаны тренды динамики изучаемого показателя в ходе лечения.

при поступлении, а также Ig E при поступлении и при выписке.

Выделенные в асептических условиях мононуклеа-ры в концентрации 2*106/мл инкубировали 72 часа при температуре 37° C. Стимуляцию синтеза цитокинов и IgE при культивировании мононуклеаров in vitro проводили путем добавления в среду фитогемагглютинина (ФГА) в конечной концентрации 10 мкг/мл. После окончания инкубации среду центрифугировали и суперна-тант замораживали в морозильной камере при -20° C до момента проведения анализа. Сыворотку при исследовании in vivo также подвергали замораживанию. От момента замораживания биоматериала до проведения лабораторного исследования проходило не более 60 дней.

Статистическое исследование проводилось методами непараметрической статистики с помощью критерия Манна-Уитни для независимых признаков (сравнение групп между собой) и парного критерия Уилкоксона для зависимых признаков (динамика показателей внутри группы). Данные представлены в виде Ме(р25;р75), где Ме - медиана, р25 и р75 - нижний и верхний квартили распределения признаков соответственно. Различия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

При поступлении содержание эритроцитов и концентрация гемоглобина в крови больных обеих групп различались недостоверно (p>0,05). В группе с хорошим результатом лечения содержание эритроцитов и концентрация гемоглобина составили 3,30(3,20;4,50)*109/л и 111,0(108,0;140,0)г/л, тогда как в группе с неудовлетворительными результатами лечения - 3,70(3,60;4,00)*109/л и 116,0(110,0;124,0)г/л соответственно (рис. 1). Также не было выявлено достоверных различий между изучаемыми группами по уровню IgE in vivo (p>0,05), который составлял

у больных I группы 272,4(171,7;318,5), а II группы -280,2(231,9;521,0) ед./мл.

При исследовании спонтанного и стимулированного синтеза IgE in vitro у больных обследованных групп также не выявлено достоверных различий (p>0,05). В I группе концентрация IgEsp составила 0,05(0,05;0,07), а IgEst -0,06(0,05;0,08) ед./мл, во II группе - 0,07(0,03;0,11) и 0,08(0,07;0,12) ед./мл соответственно. Различия между спонтанным и стимулированным уровнем синтеза IgE мононуклеарами в условиях in vitro достоверны для обеих групп больных (p<0,05).

К моменту окончания лечения мы наблюдали достоверные отличия между группами по величине изучаемых показателей. На рисунке 1 показана динамика содержания эритроцитов крови у больных I и II групп в процессе лечения. В I группе медиана содержания эритроцитов выросла на 21%, достоверно отличаясь в динамике от показателя при поступлении (p<0,05) и увеличившись на 0,70*109/л, а во II группе - достоверно уменьшилась на 19% (p<0,05). Уменьшение медианы содержания эритроцитов во II группе составило 0,70*109/л. Различие в содержании эритроцитов между группами после окончания лечения по критерию Ман-на-Уитни также оказалось достоверным (p<0,01).

Подобные изменения имели место при анализе концентрации гемоглобина. В I группе больных медиана концентрации гемоглобина в среднем достоверно выросла (p<0,05) на 9%, увеличившись на 10,0 г/л, в то время как во II группе медиана концентрации данного аналита достоверно снизилась на 20% относительно уровня при поступлении (p<0,05). При этом величина уменьшения медианы концентрации составила 23,0 г/л. Различия между группами после окончания лечения по критерию Манна-Уитни оказались высоко достоверны (p<0,01).

Динамика концентрации IgE в крови больных исследуемых групп была противоположной (рис. 2).

В I группе больных с благоприятным течением заболевания концентрация этого аналита в динамике

1000 900 800 700 600

1 500

ш

Ш

i? 400 300 200 100 0

Median 25%-75% _ Min-Max

I до II до I после II после

Рис. 2. Динамика содержания !д Е у больных I и II групп с различным исходом заболевания Примечание: стрелками указаны тренды динамики изучаемого показателя в ходе лечения.

36

34

32

30

О 28 >

с

^ 26

24

22

20

I группа

II группа

Рис. 3. Содержание ^-4 в крови больных I и II групп при поступлении

уменьшилась в среднем на 43% (р<0,05), тогда как во II группе имел место реципрокный процесс, и медиана концентрации 1дЕ увеличилась на 150% (р<0,05). В I группе медиана изучаемого показателя уменьшилась на 118,0 ед./мл, тогда как во II - увеличилась на 420,5 ед./мл. Различия между концентрацией 1д Е у больных I и II групп являются высоко достоверными (р<0,01). Необходимо отметить, что абсолютная величина динамики концентрации изучаемого ана-лита имеет тенденцию к различию (0,05<р<0,10), т. е. увеличение концентрации 1дЕ во II группе имеет более выраженный характер, чем уменьшение данного показателя в I группе. Очевидно, это может свидетельствовать о большей интенсивности динамики

иммунологического ответа при прогрессировании тяжести состояния по сравнению с выздоравливающими больными.

Изучение синтеза IgE мононуклеарами in vitro после окончания лечения, также как и при поступлении, показало отсутствие различий между группами и при наличии и отсутствии фитогемагглютинина в среде инкубации. Величина спонтанного синтеза IgE в I группе больных составила 0,06(0,05;0,06), а во II группе -0,08(0,05;0,12) ед./мл (p>0,05). Аналогично стимулированный синтез IgE в группах составил 0,06(0,05;0,10) и 0,09(0,08;0,13) ед./мл (p>0,05). Сравнение данных показателей в динамике также показало отсутствие различий в величине концентрации Ig E при отсутствии

стимулятора в культуральной среде как у больных I, так и у больных II группы, а также при стимуляции ФГА у больных I группы (p>0,05). В то же время динамика концентрации Ig E in vitro у больных II группы была достоверна (p=0,05).

Отсутствие различий в спонтанной и стимулированной продукции IgE in vitro в культурах мононуклеаров больных с острым нефритом при наличии выраженных изменений у этих же больных in vivo заставляет искать другие изменения в системе цитокинов, которые позволят объяснить динамику концентрации Ig Е у больных с благоприятным течением заболевания и с неадекватным ответом на терапию.

При поступлении (рис. 3) концентрация IL-4 в крови больных I группы составила 28,3(21,5;30,5), тогда как у больных II группы - 33,1(31,4;34,8) пг/мл (p<0,05).

Изучение концентрации у-интерферона in vivo (рис. 5) показало, что у больных I группы при поступлении величина данного показателя составила 197,5(178,7;199,7), а у пациентов II группы -132,0(111,7; 152,2) пг/мл (p<0,05). Исследование продукции данного цитокина in vitro не выявило существенных различий между группами. При отсутствии стимуляции концентрация IFN-у в культуральной среде составила в I группе 26,3(23,6;45,1), а во II - 48,8(38,6;58,9) пг/мл (p>0,05). Стимулированный

6,0

5,5 -

5,0

4,5 -

с 4,0 -s

i

3,5

_J

3,0 -2,5 -2,0 1,5 -

с Median I 25%-75%

I-~п-1

I группа; sp II группа; sp I группа; st II группа; st

Рис. 4. Содержание ^-4 в культуральной жидкости мононуклеаров больных I и II групп при поступлении при отсутствии стимуляции и при наличии в культуральной среде ФГА

Примечание: линиями указаны достоверные отличия (p<0,05).

210 200  Median ^25%-75%

190

180

170

160

150

140

130 и

120

110

100

I группа II группа

Рис. 5. Содержание ^N-7 в крови больных I и II групп при поступлении

125

синтез IFN-y составил соответственно 47,9(39,8;59,9) и 62,3(54,5;70,1) пг/мл (p>0,05).

При анализе результатов обращает на себя внимание реципрокный характер концентрации изученных цитокинов у больных I и II групп. В крови лиц из группы с благоприятным течением заболевания (I) концентрация IFN-y достоверно выше, а концентрация IL-4 соответственно, ниже, чем в крови больных II группы. Учитывая функциональный антагонизм данных цитокинов, проявляющийся во взаимном торможении их физиологических эффектов, а также то, что они сдвигают диф-ференцировку наивных Th0 в направлении Th1 (IFN-y) и Th2 (IL-4), можно говорить о том, что во II группе больных наблюдается развитие аллергического воспаления [3]. Известно, что IL-4 является одним из главных регуляторов аллергических реакций и аллергического воспаления в тканях, так как помимо индукции синтеза IgE он является ростовым фактором для базофилов, тучных клеток и эозинофилов, попутно активируя их рецепторный аппарат. Это заключение подтверждается тем наблюдением, что при отсутствии достоверных различий между обследованными группами по величине Ig E in vivo в результате проведенного лечения в I группе больных концентрация его достоверно снизилась (p<0,05), а во II группе - возросла (p<0,05).

Изучение культур мононуклеаров, выделенных из крови больных обеих групп, показало, что в отсутствие стимуляции концентрации изученных цитокинов различаются недостоверно (p>0,05). В то же время при стимуляции ФГА in vitro концентрация IL-4 у больных I группы достоверно ниже (p<0,05), чем у больных с неблагоприятным течением заболевания, тогда как различия в концентрации IFN-y недостоверны (p>0,05). Возможно, объяснение этого факта кроется в особенностях механизмов стабильности клонов Th1 и Th2. Известно, что действие индукторов дифференцировки наивных Th0 в направлении Th2 доминирует над действием индукторов в направлении Th1 [3]. Кроме того, дифференцировка наивных Th0 в клон Th2 является необратимой, тогда как клон Th1 может регрессировать в Th2. Вероятно, такой результат исследований in vitro связан с отсутствием в культуральной среде дендритных клеток, являющихся основным продуцентом IL-12, запускающего каскад стимуляции синтеза клона Th1.

Таким образом, результаты проведенного исследования убедительно показали у больных с неблагоприятными результатами стандартной терапии острого нефрита наличие в патогенезе заболевания компонентов аллергического воспаления, что может оказать существенное воздействие на разработку новых, более эффективных схем терапии данного заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алиев Р. А. Роль этиологических и других факторов в развитии хронической почечной недостаточности // Нефрол. и диализ. - 2001. - № 3.- С. 358-364.

2. Калюжина Е. В., Гейниц О. А, Калюжин В. В., ПакЮ. Д. Состояние иммунного гемостаза у больных хронической почечной недостаточностью // Клиническая медицина. - 2006.- № 11. - С. 60-63.

3. Кетлинский С. А, Симбирцев А. С. Цитокины. - СПб: «Фолиант», 2008. - 552 с.

4. МанжосА. П., Панкратов К. Д., Бабков В. А. Динамика изменений показателей иммунного статуса у больных с хроническими нарушениями уродинамики и хронической почечной недостаточностью // Сборник трудов VIII Ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара. - СПб, 2000. - С. 183-184.

5. Фрейдлин И. С. Паракринные и аутокринные механизмы ци-токиновой иммунорегуляции // Иммунология. - 2001. - № 5. - С. 4-7.

6. Чупрасов В. Б. Программный гемодиализ. - СПб, 2001. - 268 с.

7. Atta A. M., Sousa C. P., Carvalho E. M. and Sousa-Atta M. L. B. Immunoglobulin E and systemic lupus erythematosus // Braz J Med Biol Res. - October 2004. - Vol. 37 (10). - P. 1497-1501.

8. Biagini R. E., Smith J. P., Sammons D. L., Mackenzie B. A. and Parks C. G. Elevated serum Ig E concentrations in systemic lupus erythematosus are related to history of childhood allergy, asthma, and hives // Journal of Allergy and Clinical Immunology. - February 2008. -Vol. 121, Issue 2, Supplement 1. - P. 228.

9. Rambert J., Mamani-Matsuda M., Moynet D., et al. Molecular blocking of CD23 supports its role in the pathogenesis of arthritis // PLoS ONE. - 2009. - № 1. - P. 4834.

10. Robertson M. R., Potter E. V., Roberts M. L., Patterson R. Immunoglobulin E in renal disease // Nephron. - 1999. - № 16. -P. 256-271.

11. Rutkowski B. Changing patient of end-stage renal disease in Central and Eastern Europe // Nephrol. Dial. Transplant. - 2000. -№ 15. - P. 156-160.

Поступила 15.05.2009

М. Н. ФУФЛЫГИНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭЛЕКТРОАКТИВИРОВАННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

Кафедра фармакологии ГОУ ВПО Воронежской государственной медицинской академии им. Н. Н. Бурденко Росздрава, ЦНИЛ ВГМА, Россия, 394000, г. Воронеж, ул. Студенческая, 10. E-mail: maria6996@rambler.ru

В работе исследовано влияние электроактивированных водных растворов на различные звенья системы гемостаза. Прием внутрь католита и анолита вызывает повышение свертываемости крови, что особенно выражено при дозированном их назначении. При моделировании коагулопатий антикоагулянтами прямого и непрямого действия эффекты ЭАВР имеют тенденцию к повышению свертывающей активности, более выраженной при варфарининдуцированной гипокоагуляции.

Ключевые слова: электроактивированные водные растворы, система гемостаза.