СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОДИНОЧНОЙ В-КЛЕТКИ

1. Способ отбора В-клетки, включающий следующие этапы:
а) совместное культивирование каждой В-клетки из популяции В-клеток, которые были сохранены как одиночные клетки, с фидерными клетками,
б) выбор В-клеточного клона, пролиферирующего и секретирующего антитело на этапе а).
2. Способ получения антитела, связывающегося с антигеном-мишенью, включающий следующие этапы:
а) совместное культивирование каждой В-клетки из популяции В-клеток, которые были сохранены как одиночные клетки в отдельных контейнерах, в присутствии фидерных клеток и фидерной смеси,
б) выбор В-клеточного клона, продуцирующего антитело, специфически связывающееся с антигеном-мишенью,
в) культивирование клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, которое продуцируется В-клеточным клоном, выбранным в этапе б), или его гуманизированный вариант, и выделение этого антитела из клетки или культурального супернатанта и тем самым получение антитела.
3. Способ по п.1 или 2, также включающий этап инкубации популяции В-клеток в среде для совместного культивирования перед сохранением одиночной клетки.
4. Способ по п.3, который характеризуется тем, что инкубация осуществляется при температуре 37°C в течение примерно одного часа.
5. Способ по п.1 или 2, также включающий этап центрифугирования одиночных сохраненных В-клеток перед совместным культивированием.
6. Способ по п.5, который характеризуется тем, что центрифугирование осуществляется в течение 5 мин со скоростью примерно 300 g.
7. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что популяцию В-клеток выделяют путем центрифугирования в градиенте плотности.
8. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что В-клетки являются зрелыми В-клетками.
9. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что мечение осуществляется двумя или тремя флуоресцентными метками.
10. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что мечению подвергается от 0,1% до 2,5% клеток от общей В-клеточной популяции.
11. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что В-клетки являются В-клетками мыши, В-клетками хомяка или В-клетками кролика.
12. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что фидерные клетки являются мышиными клетками EL-4 B5.
13. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что совместное культивирование осуществляется в среде RPMI 1640 с добавлением 10% (объем/объем) FCS, 1% (вес/объем) 200 мМ раствора глутамина, которая включает пенициллин и стрептомицин, 2% (объем/объем) 100 мМ раствора пирувата натрия и 1% (объем/объем) 1 М HEPES-буфера (2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин)-этансульфокислота).
+
+
-
+
14. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что В-клетки имеют мышиное происхождение, и мечение представляет собой IgGCD19-В-клетки и/или IgGCD138-B-клетки.
+
-
15. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что В-клетки получены от хомяка, и осуществляется мечение IgGIgM-B-клеток.
+
+
+
+
+
-
16. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что В-клетки получены от кролика, и осуществляется мечение IgG-B-клеток, и/или CD138-B-клеток, или CD138IgG-В-клеток, и/или IgGIgM-B-клеток.
17. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что совместное культивирование осуществляется в присутствии синтетической фидерной смеси, которая содержит интерлейкин-1 бета, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-10 и клетки золотистого стафилококка штамма Cowans.
18. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что совместное культивирование осуществляется в присутствии синтетической фидерной смеси, которая содержит интерлейкин-1 бета, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-10 и интерлейкин-21.
19. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что совместное культивирование осуществляется в присутствии синтетической фидерной смеси, которая содержит интерлейкин-1 бета, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин-2, интерлейкин-10 и В-клеточный фактор активации из семейства фактора некроза опухоли (BAFF).
20. Способ по п.1 или 2, который характеризуется тем, что совместное культивирование осуществляется в присутствии культурального супернатанта тимоцитов в качестве фидерной смеси.
21. Способ по п.20, который характеризуется тем, что культуральный супернатант тимоцитов получают из тимоцитов тимуса молодого животного.