Влияние термоденатурации белков подсолнечника на их атакуемость ферментами

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ: ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 4, 2003

43

678.562.577.156.1.001.4

ВЛИЯНИЕ ТЕРМОДЕНАТУРАЦИИ БЕЛКОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА ИХ АТАКУЕМОСТЬ ФЕРМЕНТАМИ

при

А .Д. МИНАКОВА, И.А. МОСКВИЧ, В.Г. ЩЕРБАКОВ

Кубанский государственный технологический университет

При технологической переработке семян подсолнечника в процессе извлечения из них растительного масла неизбежны интенсивные тепловые и влаготепловые воздействия, приводящие к денатурации запасных белков семян. Влияние глубины денатурации растительных белков, в том числе белков подсолнечника, на их биологическую ценность и перевариваемость организмом животных и человека, несмотря на обширные исследования в этой области, не может считаться окончательно выясненным, а понятие «оптимальная» степень денатурации продолжает оставаться недостаточно корректным.

Как следует из исследований [1, 2], соотношение водо-, соле- и щелочерастворимых белков в обезжиренных масличных семенах (на примере семян сои и хлопчатника) изменяется по мере увеличения интенсивности тепловой обработки циклически - путем превращения водорастворимых белков в соле-, щелоче- и нерастворимые белки, а затем опять в растворимые. Высказываемая многими авторами рекомендация ограничить тепловую обработку с целью сохранения растворимых групп белков - суммы водо-, соле-и щелочерастворимых белков - в свете этих данных теряет смысл. Еще более спорной становится подобная рекомендация в связи с обнаружением в семенах подсолнечника ингибиторов пищеварительных протеаз, аналогичных соевым ингибиторам Кунитца и Баума-на-Бирк, для снижения активности которых необходима интенсивная влаготепловая обработка.

В связи с этим представляет интерес изучение изменения перевариваемости термоденатурированных белков протеазами желудочно-кишечного тракта.

При проведении анализа освобожденные от плодовой оболочк обезжиренные петролейным эфиром и измельченные подсолнечные семена увлажняли до 21,5%, помещали в пробирки и нагревали до температуры 45,60 и 90°С в течение 45 мин. После охлаждения исследовали изменения в белковом комплексе, определяя групповой состав белков по [3], массовые доли общего азота и азота белковых фракций по микрометоду Къельдаля [4, 5]. Небелковый азот определяли после осаждения белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ) до конечной концентрации 5,0%.

Атакуемость белков in vitro комплексом протеоли-тических ферментов пепсин + трипсин проводили с применением установки «искусственный желудок» по усовершенствованному методу [6]. Использовалась установка на 4 сосуда, перемешивание вели раздельно

в каждом сосуде при частоте вращения мешалки 60 мин"1.

При этом белок последовательно гидролизовался пепсином в кислой среде при температуре 37°С, а затем трипсином, вводимым в концентрациях, равных их концентрации в процессах пищеварения. Навеску исследуемых белков, содержащую около 150 мг белка, тщательно растирали в фарфоровой ступке с 10 мл

0,02 н раствора соляной кислоты (pH 1,6) и количественно переносили во внутренний сосуд установки, доводя общий объем до 15 мл. В наружный сосуд наливали 50 мл этой же кислоты, так чтобы уровень жидкости в обоих сосудах был одинаковым. Прибор подключали к термостату и устанавливали для всей системы температуру 37°С. После достижения заданной температуры во внутренний сосуд вносили 15 мг пепсина, его концентрация составляла 1 мг/мл, что соответствовало реальным условиям пищеварения в живых организмах. Через каждый час из наружных сосудов отбирали пробы по 2 мл диализата, вводя такой же объем 0,02 н раствора соляной кислоты. Спустя 3 ч буферный раствор в наружном сосуде заменяли на бикарбонатный буфер с pH 8,2 (50 мл). Раствор во внутреннем сосуде нейтрализовали 3 мл ОД н раствора гидроокиси натрия и приливали 12 мл 0,1 н раствора углекислого натрия. Уровни растворов во внутреннем и внешних цилиндрах выравнивали. Затем систему термостатировали в течение 30 мин до температуры 37°С и вносили во внутренний сосуд 15 мг трипсина. После этого реакцию продолжали еще 2 ч. О ходе гидролиза судили по увеличению количества его продуктов - свободных аминокислот, определяемых по нингидриновой реакции. Продукты гидролиза удаляли диализом, что в упрощенной форме имитирует условия в пищеварительном тракте. О степени перевариваемости судили по соотношению между исходным и оставшимся белком.

Вязкость белковых растворов определяли с помощью вискозиметра Гепллера при температуре 20°С.

Активность ингибиторов протеаз, содержащихся в подсолнечных шротах, изучали по методу Кунитца [7]. Для этого приготавливали контрольный и опытный растворы. Первый готовили следующим образом. К 1 мл прогретого до 37°С казеина приливали 0,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл раствора трипсина. Смесь прогревали на водяной бане в течение 10 мин при 37°С. Затем приливали 3 мл ТХУ и настаивали в течение 1-1,5 ч. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 об/мин. Опытный раствор готовили точно так же, приливая вместо воды 0,5 мл образца (водной вытяжки). Полученные после центрифугирования надосадочные жидкости спектрофото-

Таблица

Г обработки семян, СС Активность Группы белков, азот, % на СВ Атакуемость Вязкость, мПа-С Я

ингибиторов протеаз, мг/г альбумины Псевдо- глобулины эвглобулины глюгелины Ч(V1ЛТТ> Г*Г»1 л_ мый остаток ферментами, % т V

До обработки 15,0 0,38 1,29 5,47 1,02 0,20 58,94 1,02 У

45 10,4 0,31 1,30 5,29 1,35 0,22 65,11 1,60 и

6?, 9,3 0,29 1,26 4,70 2,06 0,29 50,36 1,36

90 8,7 0,20 1,26 3,98 2,45 0,79 45,48 1,18

метрировали при длине волны 280 нм. Активность ингибитора выражали в единицах оптическои плотности.

Зависимость между условиями тепловой обработки, активностью ингибиторов протеаз, групповым составом белков и перевариваемостью (атакуемостью) их протеолитическими ферментами представлена в таблице. 1 '  --  -ч -

Как следует из полученных данных, температура нагревания обезжиренного материала при 45°С оказывает относительно небольшое влияние на групповой состав белков. В исходных семенах до обработки соотношение между альбуминами, глобулинами, эвглобу-линами и глютелинами составляло 0,4 : 1 : 5: 1. После нагревания до 45°С это соотношение практически не изменилось. Несмотря на отсутствие изменения растворимости белков, после тепловой обработки при 45°С атакуемость ферментами - пепсином и трипсином - увеличивалась на 6,17%, возросла и приобрела максимальное значение вязкость белковых растворов. Такие изменения свидетельствуют о начальных этапах денатурации. Как следует из работы [8], подобные изменения сопровождаются разрыхлением белковых глобул и увеличением их объема, что облегчает доступ пищеварительных ферментов к внутренним пептидным связям. Дальнейшее повышение температуры до 60°С сопровожу юте еще более глубокими конформа-ционными изм ни ш ми. Начинается заметное перераспределение азота белковых фракций: несколько снижается доля альбуминов и глобулинов, одновременно увеличивается массовоя доля труднорастворимых белков - глютелинов. Соотношение между белковыми фракциями становится 0,3 :1: 5 :2. Эго приводит к значительному снижению атакуемости белков ферментами. Сокращение доли водорастворимых белков коррелирует с инактивацией белков - ингибиторов протеаз. Прогревание материала при 90°С ведет к двукратному по сравнению с исходным снижению активности ингибиторов протеаз. В групповом составе белков ведущими по массовой доле становятся основные из растворимых белковых фракций - солерастворимые эвглобулины. Продолжается рост доли труднорастворимых белков - глютелинов, которая возрастает почти в два раза. Азот нерастворимого остатка у величивается в четыре раза по сравнению с исходным. 11родолжа-ется дальнейшее снижение физических свойств и физиологической активности белковых растворов - вязкости и атакуемости белков протеолитическими ферментами.

Проведенные исследования показывают, что нагревание высоковлажных обрушенных семян подсолнечника в условиях исключающих потерю ими влаги приводит к быстрому снижению трипсинингибирующей активности. Даже при относительно невысокой температуре - 45°С - нагревание высоковлажных белков снижает активность ингибиторов протеаз на одну треть, а нагревание при температуре 90°С в указанных условиях обработки уменьшает трипсинингибирую-щую активность вдвое.

Происходящая при нагревании белков при 45°С термоденатурация является, как можно судить на основании полученных данных, ограниченной. Она дочти не сказывается на фракционном составе белков - соотношение фракций по растворимости изменяется в пределах ошибки измерения.

Обращает на себя внимание высокая степень атакуемости белков протеолитическими ферментами, максимальная при тепловой обработке белков при 45°С. Не исключая объяснения этого как следствия начальной денатурации белковых молекул и роста доступности их для действия протеаз, не менее вероятной причиной высокой атакуемости белков можно считать снижение активности ингибиторов протеаз, способных тормозить протеолиз. К сожалению, полученные нами данные не дают оснований для однозначного объяснения - повышение интенсивности тепловой обработки сопровождается как снижением атакуемости белков по мере возрастания глубины их тепловой денатурации, так и снижением активности протеаз.

В то же время полученные результаты свидетельствуют,, что даже в условиях интенсивной продолжительной тепловой обработки белков подсолнечника, исключающих снижение их высокой начальной влажности, тепловая денатурация лишь в незначительной степени снижает перевариваемость белков протеазами желудочно-кишечного тракта. » ,

ВЫВОДЫ ,

1. Основной компонент белков семян подсолнечника - глобулиновая фракция - при тепловой денатурации в количественном отношении изменяется незначительно, атакуемость белков протеазами и после тепловой обработки остается достаточно высокой, что позволяет говорить о высокой термостойкости запасных белков подсолнечника.

В.1

Ку

В

но

пи

сы

КО;

НЫ

ГОЛ

I

fa 4,2.003 Таблица

кость,

ТаС

,02

,60

,36

,18

нагрело лнеч-'и при-ующей темпе-белков I одну ЙННЫХ

шрую-

I 45°С на ос-13 поч-

IB-CO-ется в

іь ата-нтами, в при іияна-а дос-

ІЯТНОЙ

штать

гособ-

енные

1ЧНОГО

ой обмости ідена-

ельст-

олжи-

шика,

влаж-

льной

азами

ечни-ітура-начи-епло-о по-

1СНЫХ

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 4, 2003______________________________________________________45

2. Наиболее заметным изменениям при тепловой денатурации подвергаются фракции щелоче- и нерастворимых белков, их доля закономерно растет по мере усиления денатурационного воздействия.

3. Активность ингибиторов протеаз коррелирует с изменением при тепловой денатурации водорастворимых белков, начиная снижаться уже при обработке семян при 45°С.

4. Интенсивные тепловые воздействия на белки приводят к снижению трипсинингибирующей активности, но даже при температуре 90°С сохраняется до 50% активности ингибиторов.

5. Изменение атакуемости белков ферментами коррелирует с изменением их вязкости. Максимальные значения атакуемости и вязкости белковых растворов наступают при температуре 45°С, что свидетельствует об изменении при тепловой денатурации нативной структуры белковой молекулы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ржехин В.П. Изменение белковых веществ масличных семян при действии на них тепла//Тр. ВНИИЖ. - 1959. - Вып. XIX. -С. 311-328.

2. Ржехин В.П., Красильников В.Н. К изучению превращений белковых веществ масличных семян при действии на них тепла и других агентов // Там же. - 1963. - Вып. XXIII,- С. 32-49.

3. Осборн Т.Б. Растительные белки. - М.; Л.: Биомедгиз, 1935.-219 с.

4. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. - Л.: Колос, 1972. - 456 е.

5. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. - М.: Колос, 1976.-255 с.

6. Покровский A.A., Ертанов И.Д. Атакуемость пищевых продуктов протеолитическими ферментами in vitro // Вопр. питания. - 1965. - № 3. - С 33-44.

7. Нортроп Д., Кунитц М., Херриот Р. Кристаллические ферменты. - М.: ИЛ, 1950. - 346 с.

8. Лобанов В.Г., Шаззо А.Ю., Щербаков В.Г. Теоретические основы хранения и переработки семян подсолнечника. - М.: Колос, 2002. - 592 с.

Кафедра биохимии и технической микробиологии

Поступила 28.02.03 г.

661.183.002.2

du!

1 ’ ^ СОРБЦИЯ КРАСЯЩИХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РАСТВОРОВ

ИВИНОМАТЕРИАЛОВ УГОЛЬНО-МИНЕРАЛЬНЫМИ СОРБЕНТАМИ

В.Т. ХРИСТЮК, Р.В. ДУНЕЦ

Кубанский государственный технологический университет

Красящие вещества пищевых продуктов участвуют в формировании вкусовых свойств и оказывают важное биологическое действие на организм человека. В пищевых средах их содержание зависит от исходного сырья и режимов его обработки. Для регулирования количества красящих веществ применяются различные технологические приемы и средства, прежде всего, методы физического воздействия. Удаление красящих веществ из жидких сред достигается в основном их сорбцией, в том числе и на углеродной поверхности (активированном угле).

Нами разработана технология получения сорбентов с моделируемыми в широких пределах свойствами на основе разнообразных растительных отходов АПК. Установлено, что угольно-минеральные сорбенты (УМС) по-разному изменяют состав жидких пищевых сред в зависимости от технологии их получения [1,2]. В работе применяли УМС из отходов винодельческого производства. Дрожжевые (ДО) и клеевые осадки

(КО), содержащие дисперсные минералы, сушили, измельчали, обрабатывали при 350-700°С в течение 5-60 мин без доступа кислорода воздуха. В результате получены следующие модификации УМС: 1 - КО + М, 600°С, 15 мин; 2 - ДО + М, 400°С, 60 мин; 3 - КО + М, 600°С, 30 мин; 4 - ДО + П, 600°С, 15 мин; 5 - КО + М, 600°С, 15 мин; 6 - ДО + П, 600°С, 15 мин; 7 - КО + М, 700°С, 5 мин.

Таблица 1

Краситель Характе- ристика Молекулярная масса Концентрация в модельном растворе, мг/дм3

Прямой чисто

голубой (ПЧГ) Анионный 904 50

Паронюроанилин (ПНА) Молеку- лярный 138 70

Малахитовый

зеленый (М3) Катионный 926 200

В качестве жидких сред применяли модельные водные растворы красителей различного состава и

Таблица 2

Объемная доля этилового спирта,% Массовая концентрация, на дм3

Виноматериал* pH титруемых кислот, г фенольных веществ (Ф), мг красящих веществ (К), мг белка (Б), мг сахаров, г

Красный сухой 11,2 3,20 8,1 1400 727 23 1

Красный кагорный 16,0 3,41 7,8 3866 1333 56  160

* Сорт винограда Каберне Совиньон.