Способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е
METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT CAPSID PROTEIN OF HEPATITIS E VIRUS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е. Капсидный белок получают методом автоиндуцируемой экспрессии в клетках E. coli для получения белка, сохраняющего свои антигенные свойства и способность к самосборке в вирусоподобные частицы. Для получения бактериальных штаммов-продуцентов модифицированного капсидного белка ВГЕ использована стратегия создания искусственного гена этого белка, оптимизированного для экспрессии и сворачивания (фолдинга) в клетках E. coli. Способ позволяет получить иммуногенный антиген вируса гепатита Е, обладающий свойствами природного белка.
Вирус гепатита Е относится к семейству Hepeviridae рода Hepevirus. Частицы вируса представляют собой сферические образования диаметром 27-34 нм, построенные из идентичных структурных элементов, и лишенные наружной оболочки. Вирусные частицы реагируют с антителами сыворотки инфицированных индивидуумов из географически различных регионов, что говорит о повсеместной распространенности HEV. Серологически и молекулярно-генетически HEV отличается от других вирусов гепатита. Последовательность генома HEV впервые была определена в 1991 г. (Tam A.W. et al., 1991 Virology, 185, 120-131). Геном вируса гепатита Е представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности. Анализ последовательности генома показал, что его размер 7.2 kb, и он содержит 3 открытые рамки считывания (ORF), каждая из которых кодирует синтез определенного белка или группы белков. ORF1 кодирует неструктурные белки вируса, ответственные за репликацию вируса, ORF2 кодирует структурный белок капсида вируса (ORF2-белок), ORF3 кодирует вспомогательный белок, функция которого еще не определена. С помощью картирования установлено, что линейные антигенные эпитопы локализованы в полипептидах, кодируемых ORF2 и ORF3 (Khydyakov Y.E. et al., Virology 1993, 194, 89-96). Рекомбинантный белок ORF2 способен к самосборке в вирусоподобные частицы (VLP), подобные по антигенным свойствам капсидному белку инфекционного вируса.
Филогенетический анализ, базирующийся на полной длине последовательности генома некоторых изолятов HEV, указывает на существование 4 различных генотипов, каждый из которых доминирует в определенной географической области. Генотип 1 включает штаммы из Азии и Африки, генотип 2 - мексиканский штамм и несколько вариантов из Африки, генотипы 3 и 4 включают HEV штаммы человека и свиньи из индустриальных стран и Азии. Генотипы 1 и 2 обнаружены только у человека, тогда как генотипы 3 и 4 у человека, а также свиней и других животных. Генотип 3 распространен повсеместно, генотип 4 чаще встречается в Китае и Японии. Открытие вирусов, подобных HEV, у свиней (свиной HEV) и кур (птичий HEV) предполагает, что вирус относится к зоонозу. Несмотря на существование различных генотипов, идентифицирован один серотип HEV. Все субтипы вируса имеют основные перекрестно реагирующие эпитопы, позволяющие создать рекомбинантную вакцину, основанную на капсидном белке, эффективную против многих штаммов HEV.
При проведении патентно-информационного поиска были выявлены следующие источники патентной информации:
Международная заявка WO 2001/46696, приоритет 21.12.1999, заявитель ABBOTT LABORATORIES, США. Документ описывает способы и композиции для обнаружения присутствия в образце US-типа или US-подтипа вируса гепатита Е, включая встречающиеся в природе варианты. В частности, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие геному US-типа или US-подтипа вируса гепатита Е, аминокислотных последовательностей, в том числе эпитопа последовательностей, кодируемого геном таких вирусов, и антител, которые специфически связываются с такими аминокислотными последовательности. Недостатком для данного технического решения является специфичность белковой последовательности, характерная только для США, и небольшая растворимость полученного белка в водной среде.
В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HEV бактериальной системы экспрессии на основе E. coli. Так, известно получение рекомбинантного химерного белка trpE-С2, содержащего 439 С-концевых аминокислот ORF2-белка HEV генотипа 1, слитого с N-концевой областью триптофансинтетазы, в бактериальной системе экспрессии в E. coli (Kamili S., Virus Research 2011, 161(1): 93-100). Экспрессируемый в E. coli белок обладает высокой иммунореактивностью и содержит перекрестно реактивные эпитопы, узнаваемые антителами к HEV.
Описано получение иммунореактивного полипептида рЕ2, происходящего из карбокситерминального района белка, кодируемого ORF2 генома китайского штамма D11092. Этот полипептид, благодаря присутствию конформационной антигенной детерминанты, способен из мономеров образовывать активные гомодимеры (US 7,204,989, 17.04.2007). Полипептид рЕ2 экспрессировали в клетках E. coli с использованием вектора pGEX. При клонировании в этом векторе последовательность, кодирующая рЕ2, была соединена в рамке с геном глютатион-S-трансферазы (GST). В результате был получен гибридный ген, кодирующий полипептид, на N-концевой части которого находилась GST, а на С-концевой - рЕ2. Такой составной белок, полученный в результате экспрессии гибридного гена в клетках E. coli, был растворим и мог быть выделен из лизата клеток путем связывания с глютатион-агарозой. Полипептид рЕ2 отделяли от GST при помощи специфической протеазы.
Патент РФ №2501568, приоритет 27.04.2012, правообладатель Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех", Россия. Документ описывает рекомбинантную вакцину для профилактики вирусного гепатита Е у животных. Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложена рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита Е у животных. Вакцина включает капсидный белок (rtHEV-ORF2), полученный путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Hansenula polymorpha КБТ-11/pHEV-001, содержащего интегрированную в геном клетки дрожжей последовательность ДНК, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности с 86 по 607 позицию капсидного белка вируса гепатита Е генотипа 3 (rtHEV-ORF2) под контролем промотора гена МОХ. Вакцина содержит эффективное количество rtHEV-ORF2 белка, масляный адъювант и физиологически приемлемый разбавитель.
Недостатком для данного технического решения является низкая растворимость белка в водных средах и необходимость культивирования клеток дрожжей.
Aye, Т.Т., Uchida, Т., Ma, X.Z., Iida, F., Shikata, Т., Zhuang, Н., & Win, K.М. (1992). Complete nucleotide sequence of a hepatitis E virus isolated from the Xinjiang epidemic (1986-1988) of China. Nucleic Acids Research, Volume 20, N 13, P. 3512.
Данная статья описывает полную нуклеотидную последовательность генома вируса гепатита Е, циркулирующего на территории Китая. Геном содержит 7194 пар нуклеотидов. Степень идентичности с известным ранее описанным штаммом составляет от 97,5% до 100%.
Fry KE, Tam AW, Smith MM, Kim JP, Luk KC, Young LM, Piatak M, Feldman RA, Yun KY, Purdy MA, et al. Hepatitis E virus (HEV): strain variation in the nonstructural gene region encoding consensus motifs for an RNA-dependent RNA polymerase and an ATP/GTP binding site. Virus Genes. 1992 Apr; 6(2): 173-85. PubMed PMID: 1589964.
Статья описывает исследование молекулярного клона полной последовательности cDNA вируса гепатита Е путем перевода основных открытых рамок считывания (ORF-1) из этих клонов. Молекулярные клоны, полученные из двух других географически различных изолятов ВГЕ, продемонстрировали неоднородность неструктурных генов в этой области. Схожесть известной аминокислотной последовательности и предмета поиска составляет 95%. Растворимость известного белка в водных средах незначительна.
Перспективным направлением развития технологии является конструирование аминокислотной последовательности, обладающей высокой растворимостью в водных средах, и которая может быть использована для формирования вакцины против вируса гепатита Е.
Прямая экспрессия эукариотической последовательности ORF2 ВГЕ приводит к образованию нерастворимых агрегатов, что требует денатурации и последующей частичной ренатурации белка в ходе выделения и очистки, а значит неизбежного снижения выхода конечного продукта и возможности неполной ренатурации белка. Для оптимизации гетерологичной экспрессии капсидного белка ОРС2 был использован уникальный подход к реконструкции генов. Этот алгоритм оптимизации принимает во внимание важность редких кодонов и их включения в соответствующие места оптимизированного гена для обеспечения правильного ритма трансляции, а, следовательно, правильного сворачивания образующегося полипептида. Использование подобного подхода приводит к высокому выходу правильно свернутых растворимых белков, экспрессируемых в гетерологичной системе.
Задачей изобретения является осуществление способа получения капсидного белка вируса гепатита Е повсеместно распространенных на территории РФ генотипов, обладающего иммуногенными свойствами природного белка.
Последовательность эукариотического гена ORF2, полученная секвенированием распространенного в регионе Российской Федерации штамма ВГЕ: вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10). Синтетический ген длиной 1719 пар нуклеотидов кодирует белок с молекулярным весом 60.9 кД. Ген собирался из 47 олигонуклеотидов длиной от 38 до 42 нуклеотидов каждый (Invitrogen Inc), после ПЦР клонировался в плазмидный вектор pUC57 по сайту BamHI.
Пять микрограмм плазмидной ДНК содержащей синтетический ген правильной последовательности затем использовалось для перенесения NdeI-BamHI фрагмента в экспрессионный вектор рЕТ3а под контроль гибридного промотора и регуляторных последовательностей Т7 РНК полимеразы, клонировались в штамме Е. coli DH5a. Полученная экспрессионная плазмида снова анализировалась рестрикционным анализом и трансформировалась в экспрессионный штамм BL21 (DE3). Этот штамм позволяет получить высокий уровень экспрессии гетерологичных белков после индукции РНК полимеразы Т7.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе получения капсидного белка вируса гепатита Е клонированный фрагмент длиной 1719 bp включает ген ORF2, представляющий вторую рамку считывания генома HEV. Вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10).
Сущность предложенного способа заключается в следующем:
Для получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е получена консенсусная последовательность гена, кодирующего данный белок, отражающая характерные для территории Российской федерации штаммы. На основе данной консенсусной последовательности получен синтетический ген: вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10). Вся остальная последовательность, кодирующая капсидный белок вируса гепатита Е, была систематически оптимизирована для экспрессии в E. coli. Синтетический ген длиной 1719 пар нуклеотидов кодирует белок с молекулярным весом 60.9 кДа. Затем полученный фрагмент перенесен в экспрессионный вектор рЕТ3а под контроль гибридного промотора и регуляторных последовательностей Т7 РНК полимеразы. Сведения о векторе рЕТ3а, на основе которого сконструирована плазмида: размер, генетическая и физическая карта вектора (с указанием литературных ссылок): 4640 bp (чертеж 1).
Трансформацией штамма реципиента BL21(DE3) плазмидой pET-ORF2 получен штамм-продуцент PORF2. Штамм-продуцент задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Для выделения и очистки рекомбинантного капсидного белка ВГЕ разработаны методики автоиндукции, метод лизиса и первичной очистки растворимого рекомбинантного белка, определены характеристики и параметры выделения белка на аффинной среде для IMAC. Разработаны варианты элюции рекомбинантного белка с аффинной среды и методики вторичной очистки белка гель-фильтрацией.
Плазмида выделена из клеток Е. Coli, есть ген устойчивости к ампициллину; наличие элементов, определяющих трансмиссивность плазмид - нет; круг хозяев аннотация выявленных рамок считывания (если вектор имеет происхождение из патогенных микроорганизмов) - отсутствует. Видовая принадлежность донорного организма: Hepatitis Е Virus, Род Hepavirus, семейство Hepaviridae.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro.
Пример 1. Способ получения штамма.
-
-
-
B
B
B
Штамм PORF2 получен трансформацией штамма реципиента BL21(DE3) плазмидой pET-ORF2. На плотной питательной среде образует круглые выпуклые колонии средней величины, влажные, с гладкой блестящей поверхностью с ровным краем. Колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. В жидких средах (LB) растет в виде интенсивного равномерного помутнения среды, образуя осадок. Штамм продуцирует 1 мг рекомбинантного белка с 1 л культуры. Культура хранится на -70°С (неограниченное время) в 15% глицерине, 7% DMSO. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: выращивание в среде LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 0.5% NaCl; рН 7.0) при 37°С, 150-170 об/мин. Генетические особенности штамма: генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности): F ompT gal dcm lon hsdS(r m) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]). Описание рекомбинантной плазмиды pET-ORF2: размер, генетическая и физическая карта плазмиды 6297 bp (чертеж 2). Плазмида выделена из клеток Е. Coli, есть ген устойчивости к ампициллину; наличие элементов, определяющих трансмиссивность плазмид - нет; круг хозяев аннотация выявленных рамок считывания (если вектор имеет происхождение из патогенных микроорганизмов) - отсутствует. Видовая принадлежность донорного организма: Hepatitis Е Virus, Род Hepavirus, семейство Hepaviridae.
Пример 2. Метод выращивания и индукции рекомбинантного растворимого капсидного белка ВГЕ на основе методики самоиндукции альфа-лактозой.
4
2
4
2
4
2
4
4
Для индукции готовят стандартную богатую среду для выращивания E. coli (среда Лурии-Бертани, LB) и следующие стерильные концентрированные растворы: 1) 20-кратный раствор NPS содержащий: 0.5М сульфата аммония (NH)SO, 1М фосфата калия KHPO, 1М фосфата натрия NaHPO. 2) 50-кратный раствор 5052, содержащий: 25% глицерина, 2.5% глюкозы, 10% альфа-лактозы. 3) 1000-кратный раствор, содержащий 1М сульфат магния MgSO.
Клетки штамма продуцента PORF2 предварительно рассевают методом исчезающего штриха на чашках Петри со средой LB и 1.8% агара и 75 μg/ml ампициллина. Жидкую среду LB с добавлением 75-100 мкг/мл ампициллина инокулируют единичной бактериальной колонией с чашки (предпочтительный метод) или из замороженного в 50% глицерине стока бактериальной культуры. Данную стартовую культуру выращивают в орбитальной качалке при 37°С и 300 об/мин до достижения поздней логарифмической фазы роста, измеряемой по поглощению в оптической области спектра 600 нм OD600=0.6-0.9. Для самоиндукции в конечном объеме 1 л используют 5 мл стартовой культуры в 50 мл одноразовых полипропиленовых пробирках с приоткрытой крышкой. Искомая плотность культуры достигается в таких условиях примерно за 3-4 часа. К моменту начала культивирования основной культуры готовят 1 л стерильной среды LB с добавлением 75-100 мкг/мл ампициллина и концентрированных растворов 1, 2 и 3 (соответственно, 1/20, 1/50 и 1/1000 объема среды). Среду подогревают в водяной бане до 37°С и разделяют на пять конических колб объемом 2 л, по 200 мл среды в каждой. Стартовую культуру инокулируют в приготовленную среду для самоиндукции из расчета 1/500-1/1000 и выращивается до насыщения (OD600~4) в орбитальной качалке при 37°С и 300 об/мин. Время выращивания в таких условиях составляет более 12 часов, обычно 16-18 часов. Для измерения OD600 после 12 часов культивации требуется разведение проб культуры в 10 раз в свежей среде LB, культивирование считается законченным тогда, когда плотность культуры перестает расти. Из выращенной культуры отбирают 2-3 пробы по 0.5 мл для анализа суммарной бактериальной массы и контроля экспрессии антигена, пробы центрифугируют при 12000 об/мин в настольной центрифуге, среду удаляют аспирацией, осадок бактериальной массы замораживают при -80°С до последующего анализа. Основную культуру объединяют в одной колбе и охлаждают в течение 20 минут при +4°С в мокром льду. Полученные 1000 мл культуры центрифугируют при 3500-4000 g в центрифуге с охлаждением при +4°С в четырех флаконах для центрифугирования объемом 250 мл. Жидкую среду удаляют аспирацией, бактериальную массу замораживают при -80°С до последующего выделения и очистки рекомбинантного белка.
Пример 3. Метод лизиса и первичной очистки растворимого рекомбинантного капсидного белка ВГЕ.
Осадок бактериальной массы после выращивания и автоиндукции в объеме 1 л культуры суспендируют при +4°С в 20 мл лизирующего буфера следующего состава: 50 mM Tris-HCL, рН 7.9, 0.1 mM EDTA, 5% glycerol, 0.1 mM DTT, 0.1М NaCl. В приготовленный лизисный раствор непосредственно перед применением добавляют ингибитор протеаз фенилметилсульфонил фторид (PMSF) до конечной концентрации 1 mM.
Бактериальную суспензию разделяют на 4 пробирки для ультразвукового лизирования. Условия ультразвукового лизирования зависят от мощности аппарата и параметров используемой насадки для лизирования. Критичным для сохранности выделяемого белка является возможность поддержания низкой (+4°С) температуры в ходе лизирования, что достигается уменьшением объема лизата. Бактериальную суспензию лизируют ультразвуком при +4°С и 60% мощности при помощи 8-10 пульсов по 30 секунд. После каждого пульса пробу выдерживают 1-2 минуты в мокром льду для охлаждения лизата. Отдельные фракции лизата объединяют в пробирке для центрифугирования. К лизату добавляют 10% стоковый раствор Triton Х-100 до 1% концентрации. Лизат инкубируют во льду при +4°С в течение 20 минут. Из лизата отбирают контрольную пробу объемом 0.2 мл для последующего анализа растворимости белка. Лизат центрифугируют в охлаждаемой центрифуге при 15000 об/мин в течение 30 минут для отделения нерастворимой фракции. Полученная растворимая фракция бактериального лизата готова для выделения растворимого рекомбинантного белка на аффинном носителе.
Пример 4. Метод выделения и очистки рекомбинантного капсидного белка ВГЕ методом аффинной хроматографии на иммобилизированных ионах металлов (IMAC).
2+
2+
2
4
2
4
К растворимой фракции клеточного лизата (20 мл лизата из 1 л культуры) после центрифугирования добавляют хлорид имидазола до концентрации 20 мМ, лизат фильтруют через 0.22 μМ фильтр и наносят на колонку с 2 мл носителя Profinity IMAC Ni (производства BioRad). Для эффективного связывания лизат пропускают через носитель 3 раза со скоростью 2-5 мл/мин при +4°С. Аффинную колонку промывают 50 объемами (100 мл) фосфатного буфера PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaHPO, 1.8 mM KHPO с добавлением 0.1 mM DTT, 1 mM PMSF и 20 mM хлорида имидазола) при +4°С. Поглощение OD280 после промывки должно быть на уровне фона (<0.01). После промывки колонку освобождают от буферного раствора. Элюцию рекомбинантного белка проводят при помощи буфера для элюции (250 mM раствора хлорида имидазола в буфере для промывки на основе PBS). Для этого к осушенной колонке добавляют равный объем (2 мл) буфера для элюции. Колонку инкубируют в течение 10 минут при +4°С, после чего добавляют еще 2 мл буфера для элюции и собирают элюат. Колонку носителя Profinity IMAC Ni регенерируют в соответствии с протоколом фирмы изготовителя (BioRad). Выделенный на аффинной среде рекомбинантный капсидный белок ВГЕ анализируют электрофорезом в денатурирующем ДСН-ПААГ.
Пример 5. Окончательная очистка полноразмерного белка от низкомолекулярных примесей и выделение вирусоподобных частиц методом гель-фильтрационной хроматографии с использованием носителя Sephacryl S-400 и Sephacryl S-200.
2
Оба носителя (Sephacryl S-400 и Sephacryl S-200) дают хорошие результаты для отделения фракций полноразмерного капсидного белка ВГЕ и фракции вирусоподобных частиц от низкомолекулярных компонентов. Для гель-фильтрации используют колонки емкостью 100 мл носителя длиной 50 см и систему для хроматографии среднего давления BioLogic DuoFlow™. Для стимулирования образования вирусоподобных частиц в элюат после аффинной хроматографии на носителе IMAC добавляют хлорид кальция (CaCl) до концентрации 5 mM, затем белковый раствор инкубируют в течении 3-6 часов при +4°С. Для выделения вирусоподобных частиц и полноразмерных субъединиц капсидного белка ВГЕ очищенный на аффинном носителе элюат наносят на колонку с носителем Sephacryl S-200 и промываются стандартным фосфатным буфером PBS при +4°С. С помощью коллектора фракций собирают фракции объемом 0,5 мл, которые затем анализируют электрофорезом в денатурирующем ДСН-ПААГ с последующей окраской Кумасси или иммуноблотом со специфическими антителами к ORF2 ВГЕ по стандартной методике для подтверждения чистоты и специфичности очистки.
Краткое описание чертежей
Чертеж 1. Сведения о векторе рЕТ3а, на основе которого сконструирована плазмида: размер, генетическая и физическая карта вектора (с указанием литературных ссылок): 4640 bp.
Чертеж 2. Описание рекомбинантной плазмиды pET-ORF2: размер, генетическая и физическая карта плазмиды 6297 bp.
--->
Последовательность
71): 17
SEQ ID #1:
(Met-10HIS-HEVORF2(121-619 bp) 562 аа:
<PleI
HinfI
>BspD6I
NdeI
<MlyI
|                                                                                   |
ggaaatatacatATGCACCATCATCATCACCACCATCATCACCACCTCACGGCAGTATCACCGGCACCGGACACCGCACCGGTTCCGGACGTGGACTCTC  < 100
M  H  H  H  H  H  H  H  H  H  H  L  T  A  V  S  P  A  P  D  T  A  P  V  P  D  V  D  S  R
cctttatatgtaTACGTGGTAGTAGTAGTGGTGGTAGTAGTGGTGGAGTGCCGTCATCGTGGCCGTGGCCTGTGGCGTGGCCAAGGCCTGCACCTGAGAG
10        20        30        40        50        60        70        80        90
>BseMII
>BspCNI
>Bpu10I
>BbvCI
<AquIV
<EciI
>PspPRI
BfaI
<BtgZI
ScaI
<BcgI
|               ||      |           |      |                    |            |
GCGGCGCCATACTCCGCCGCCAGTACAACCTCAGCACTTCCCCGTTAACTAGCAGCGTCGCAAGCGGTACCAACTTAGTACTATACGCAGCACCCTTAAA  < 200
G  A  I  L  R  R  Q  Y  N  L  S  T  S  P  L  T  S  S  V  A  S  G  T  N  L  V  L  Y  A  A  P  L  N
CGCCGCGGTATGAGGCGGCGGTCATGTTGGAGTCGTGAAGGGGCAATTGATCGTGGTAGCGTTGGCCATGGTTGAATCATGATATGCGTCGTGGGAATAG
110       120       130       140       150       160       170       180       190
PflMI
|
CCCGCTCCTCCCGCTCCAGGACGGAACCAACACCCATATAATGGCAACCGAAGCAAGCAACTACGCACAGTACCGTGTTGTTCGTGCAACCATACGCTAC  < 300
P  L  L  P  L  Q  D  G  T  N  T  H  I  M  A  T  E  A  S  N  Y  A  Q  Y  R  V  V  R  A  T  I  R  Y
CGGCGAGGAGGGCGAGGTCCTGCCTTGGTTGTGGGTATATTACCGTTGGCTTCGTTCGTTGATGCGTGTCATGGCACAACAAGCACGTTGGTATGCGATG
210       220       230       240       250       260       270       280       290
HaeIII
EaeI
<GdiII
||
CGCCCGCTCGTGCCGAACGCTGTTGGTGGGTACGCAATAAGCATAAGCTTTTGGCCGCAGACTACGACCACCCCGACCAGCGTTGACATGAACAGCATAA  < 400
R  P  L  V  P  N  A  V  G  G  Y  A  I  S  I  S  F  W  P  Q  T  T  T  T  P  T  S  V  D  M  N  S  I  T
GCGGGCGAGCACGGCTTGCGACAACCACCCATGCGTTATTCGTATTCGAAAACCGGCGTCTGATGCTGGTGGGGCTGGTCGCAACTGTACTTGTCGTATT
310       320       330       340       350       360       370       380       390
ZraI
AatII
AclI
|                                                      |
CCAGCACCGACGTCCGCATATTAGTTCAGCCGGGTATAGCAAGCGAGTTAGTGATACCGTCGGAACGTTTACATTACCGTAACCAGGGTTGGCGTTCCGT  < 500
S  T  D  V  R  I  L  V  Q  P  G  I  A  S  E  L  V  I  P  S  E  R  L  H  Y  R  N  Q  G  W  R  S  V
GGTCGTGGCTGCAGGCGTATAATCAAGTCGGCCCATATCGTTCGCTCAATCACTATGGCAGCCTTGCAAATGTAATGGCATTGGTCCCAACCGCAAGGCA
410       420       430       440       450       460       470       480       490
BstZ17I
>AcuI
MspA1I
AccI
SgrAI
|               |                   |                                          |
TGAAACCTCTGGCGTCGCTGAAGAAGAAGCAACCAGCGGTCTCGTCATGCTCTGTATACATGGGAGCCCGGTGAACAGCTACACCAACACGCCGTACACC  < 600
E  T  S  G  V  A  E  E  E  A  T  S  G  L  V  M  L  C  I  H  G  S  P  V  N  S  Y  T  N  T  P  Y  T
ACTTTGGAGACCGCAGCGACTTCTTCTTCGTTGGTCGCCAGAGCAGTACGAGACATATGTACCCTCGGGCCACTTGTCGATGTGGTTGTGCGGCATGTGG
510       520       530       540       550       560       570       580       590
SmlI
SciI
XhoI
<TaqII
PspXI
|                        ||
GGCGCCCTCGGTCTCCTCGACTTCGCTCTCGAACTCGAGTTTCGTAACCTCACGCCGGGTAACACTAACACTCGTGTTAGCCGTTACACCTCGACGGCTC  < 700
G  A  L  G  L  L  D  F  A  L  E  L  E  F  R  N  L  T  P  G  N  T  N  T  R  V  S  R  Y  T  S  T  A  R
CCGCGGGAGCCAGAGGAGCTGAAGCGAGAGCTTGAGCTCAAAGCATTGGAGTGCGGCCCATTGTGATTGTGAGCACAATCGGCAATGTCGAGCAGCCGAG
610       620       630       640       650       660       670       680       690
MluI
BspHI
|      |
GTCACGTGCTACGTCGAGGACCGGACGGTACCGCAGAACTTACCACTACCGCAGCAACGCGTTTCATGAAGGACTTACATTTTACCGGAACCAACGGTGT  < 800
H  R  L  R  R  G  P  D  G  T  A  E  L  T  T  T  A  A  T  R  F  M  K  D  L  H  F  T  G  T  N  G  V
CAGTGTTCGATGCAGCTCCTGGCCTGCCATGGCGTCTTGAATGGTGATGGCGTCGTTGCGCAAAGTACTTCCTGAATGTAAAATGGCCTTGGTTGCCACA
710       720       730       740       750       760       770       780       790
>BplI
>SapI
|                         |
TGGTGAAGTTGGTCGTGGTATCGCTCTCACCTTATTCAACTTAGCAGACACTTTATTAGGTGGATTACCGACGGAGCTTATCTCCTCCGCAGGGGGTCAG  < 900
G  E  V  G  R  G  I  A  L  T  L  F  N  L  A  D  T  L  L  G  G  L  P  T  E  L  I  S  S  A  G  G  Q
ACCACTTCAACCAGCACCATAGCGAGAGTGGAATAAGTTGAATCGTCTGTGAAATAATCCACCTAATGGCTGCCTCGAATAGAGGAGGCGTCCCCCAGTC
810       820       830       840       850       860       870       880       890
>EarI
>BsmBI
|                   |
CTCTTCTACTCCCGCCCGGTCGTCTCCGCAAACGGTGAACCGACGGTGAAGTTATACACCTCCGTAGAAAACGCACAGCAGGACAAGGGTATAGCAATCC  < 1000
L  F  Y  S  R  P  V  V  S  A  N  G  E  P  T  V  K  L  Y  T  S  V  E  N  A  Q  Q  D  K  G  I  A  I  P
GAGAAGATGAGGGCGGGCCAGCAGAGGCGTTTGCCACTTGGCTGCCACTTCAATATGTGGAGGCATCTTTTGCGTGTCGTCCTGTTCCCATATCGTTAGG
910       920       930       940       950       960       970       980       990
>SdeOSI
>ApyPI
>RceI
>NmeAIII
<BsmFI
||  |            |                                                                  |
CCCATGACATCGACTTAGGTGAAAGCCGAGTTGTGATCCAGGACTACGACAACCAACATGAACAAGACCGTCCGACCCCGAGCCCGGCACCGTCCCGCCC  < 1100
H  D  I  D  L  G  E  S  R  V  V  I  Q  D  Y  D  N  Q  H  E  Q  D  R  P  T  P  S  P  A  P  S  R  P
GGGTACTGTAGCTGAATCCACTTTCGGCTCAACACTAGGTCCTGATGCTGTTGGTTGTACTTGTTCTGGCAGGCTGGGGCTCGGGCCGTGGCAGGGCGGG
1010      1020      1030      1040      1050      1060      1070      1080      1090
PstI
>Bsp24I
SfcI
|                     |
GTTCTCCGTTTTACGTGCAAACGACGTGTTATGGTTATCCCTTACTGCAGCAGAGTACGACCAAACCACCTACGGTAGCAGCACCAACCCGATGTACGTT  < 1200
F  S  V  L  R  A  N  D  V  L  W  L  S  L  T  A  A  E  Y  D  Q  T  T  Y  G  S  S  T  N  P  M  Y  V
CAAGAGGCAAAATGCACGTTTGCTGCACAATACCAATAGGGAATGACGTCGTCTCATGCTGGTTTGGTGGATGCCATCGTCGTGGTTGGGCTACATGCAA
1110      1120      1130      1140      1150      1160      1170      1180      1190
AGCGACACCGTGACGTTTGTTAACGTAGCTACCGGTGCACAGGCAGTTGCACGCAGCTTAGACTGGAGCAAGGTTACCCTCGACGGTCGCCCGCTCACTA  < 1300
S  D  T  V  T  F  V  N  V  A  T  G  A  Q  A  V  A  R  S  L  D  W  S  K  V  T  L  D  G  R  P  L  T  T
TCGCTGTGGCACTGCAAACAATTGCATCGATGGCCACGTGTCCCTCAATCGGCGTCGAATCTGACCTCGTTCCAATGGGAGCTGCCAGCGGGCGAGTGAT
1210      1220      1230      1240      1250      1260      1270      1280      1290
<FokI
<StsI
<BtsCI
StyI
|                                                                         |
CCATCCAGCAGTACAGCAAGACCTTCTACGTTTTACCCTTACGTGGTAAGTTAAGCTTCTGGGAAGCAGGTACCACCAAGGCAGGTTACCCGTACAACTA  < 1400
I  Q  Q  Y  S  K  T  F  Y  V  L  P  L  R  G  K  L  S  F  W  E  A  G  T  T  K  A  G  Y  P  Y  N  Y
GGTAGGTCGTCATGTCGTTCTGGAAGAAGCAAAATGGGAATGCACCATTCAATTCGAAGACCCTTCGTCCATGGTGGTTCCGTCCAATGGGCATGTTGAT
1310      1320      1330      1340      1350      1360      1370      1380      1390
>SfaNI
>BscAI
BsaBI
RsrII
|          |                                                                 |
CAACACCACCGCATCGGACCAGATCCTAATCGAAAACGCTGCAGGTCACCGTGTTGCAATCAGCACCTACACCACCAGCTTAGGTAGCGGTCCGGTTGCC  < 1500
N  T  T  A  S  D  Q  I  L  I  E  N  A  A  G  H  R  V  A  I  S  T  Y  T  T  S  L  G  S  G  P  V  A
GTTGTGGTGGCGTAGCCTGGTCTAGGATTAGCTTTTGCGAGGCCCAGTGGCACAAACATAGTCGTGGATGTGGTGGTTGAATCCATCGCCAGGCCAATCG
1410      1420      1430      1440      1450      1460      1470      1480      1490
>BbsI
>Bbr7I
PmlI
PshAI
|                     |                   |
GTTAGCGCCGTCGGCGTCCTCGCTCCGCACTCTGCTCTCGCCCTCCTCGAAGACACCGTTGACTACCCGGCACGTGCACATACCTTTGACGACTTCTGTC  < 1600
V  S  A  V  G  V  L  A  P  H  S  A  L  A  L  L  E  D  T  V  D  Y  P  A  R  A  H  T  F  D  D  F  C  P
TATTCGCGGCAGCCGCAGGAGCGAGGCGTGAGACGAGAGCGGCGGGAGCTTCTGTGGCAACTGATGGGCCGTGCACGTGTATGGAAACTGCTGAAGACAG
1510      1520      1530      1540      1550      1560      1570      1580      1590
<BsmI
DraI
|                               |
CGGAATGTCGTAACTTAGGTTTACAGGGTTGTGCATTCCAATCCACCATCGCAGAACTCCAGCGTTTAAAGATGAAGGTGGGTAAGACCCGCGAATCCTA  < 1700
E  C  R  N  L  G  L  Q  G  C  A  F  Q  S  T  I  A  E  L  Q  R  L  K  M  K  V  G  K  T  R  E  S  *
GCCTTACAGCACGAAATCCAAATGTCCCAACACGTAAGGTTAGGTGGCAACGTCTTGAGGTCGCAAATTTCTACTTCCACCCATTCTGGGCGCTTATGAT
1610      1620      1630      1640      1650      1660      1670      1680      1690
BamHI
|
ATGAcggatccggctgcaa  < 1719
*  R  I  R  L  Q
TACTgcctaggccgacgtt
1710
<---