Эпигенетические нарушения импринтированного гена plagl1 (lot1/zac1) при ранней эмбриональной гибели у человека и их связь с отягощенным акушерским анамнезом

контроля на аппарате LOGIQ 100 PRO и результатах лабораторных исследований. При анализе истории родов нами были выявлены ошибки тактики ведения и лечения родильниц с гнойносептическими заболеваниями: неадекватная антибиотикопрофи-лактика, недооценка жалоб родильниц, данных параклинических исследований, что явилось причиной поздней диагностики заболевания, а так же нерациональное лечение локальных проявлений послеродовой инфекции, переходящей в генерализованный процесс. Все пациентки после кесарева сечения получали традиционную терапию, включавшую антибиотикотерапию, утерото-нические средства и т.д. Затем в условиях женской консультации всем пациенткам производилась магнитно-инфракрасная лазерная терапия по авторской методике. 60 женщинам, которые составили основную группу, после I и II этапа проводилось санаторно-курортное лечение. После лечения 90% женщин основной группы отмечали улучшение общего самочувствия, купирование болевого синдрома. По окончании трехэтапной терапии велось клиническое обследование с применением УЗИ, говорящего о регрессии явлений эндометрита. Прослеживалась положительная динамика лабораторных показателей: статистически достоверно снижалось до нормы количество лейкоцитов, уменьшалась СОЭ.

Нами было изучено состояние иммунного и интерферонового статуса у рожениц, получавших в комплексном лечении заболеваний послеродового периода лазеротерапию и санаторно-курортное лечение. При сравнительном анализе показателей иммунного и интерферонового статуса, фагоцитарной активности, нами было выявлено, что у рожениц после проведенной трехэтапной терапии, отмечалось достоверное повышение у-ИФН - 44,2±10,8 -108,4±1,3, МЕ и а-ИФН с 134,0±8,2 до 167,5±1,3 МЕ в сравнении с группой больных, получавших традиционное противовоспалительное лечение. Кроме того, на фоне лазеротерапии и санаторнокурортного лечения отмечалась тенденция к увеличению уровня общих Т-клеток и нормализации В-клеток, а также усиление начальной фагоцитарной активности с 55,2±0,3 до 75,0±2,4 и фагоцитарного числа с 1,4±0,1 до 3,3±0,1.

Таблица

Состояние иммунного и интерферонового статуса у родильниц после лечения

Показатели До лечения После лечения

Основная группа Контроль

а-ИФН (МЕ) 134,0±8,2 167,5±1,3 156,5±1,4

у-ИФН (МЕ) 44,2±10,2 108,4±1,3 86,8±2,2

Сыв. ИФН (МЕ) 5,5±1,8 6,4±0,3 6,2±1,5

Т-общие (%) 40,2±0,5 50,3±1,1 48,4±1,3

В-клетки (%) 25,4±0,6 28,4±1,5 27,1±1,8

Т-хелперы (%) 25,3±0,8 30,0±7,5 28,9±0,9

Т-супрессоры (%) 23,4±0,7 27,2±1,7 23,8±1,5

ФА (%) 55,2±0,3 75,0±2,4 65,4±1,6

Ф.Ч. 1,4±0,1 3,3±0,1 2,6±0,2

Проведена система восстановительного лечения перенесших операцию кесарева сечения, включающая использование антибио-тикопрофилактики в ранней послеоперационной реабилитации. На

I этапе и комплекса оздоровительных мероприятий с использованием общей магнитотерапии, на II и курортных факторов республики (Белореченских азотно-термальных вод) - на III этапах. В основной групппе родильниц после кесарева сечения и проведения

II и III этапов лечения была более выраженная нормализация клинического состояния и психоэмоциональной сферы, показателей центральной и региональной гемодинамики, иммунного статуса, чем у женщин в контрольной группе. Отдаленные результаты показали, что в основной группе частота гнойно-септических осложнений после кесарева сечения снизилась в 3 раза.

Выявлены преимущества использования курортных факторов г. Нальчик, в частности Белореченских азотно-термальных вод, позволяющих достичь полного восстановления репродуктивного здоровья женщин после кесарева сечения. Целесообразно рекомендовать их в качестве предгестационной подготовки при планировании следующей беременности.

Литература

1. Горин В.С., Серов В.Н. Семеньков Н.Н., Шин А.П. // Акуш и гин. 2001. №6. С.10-14.

2. Ершов Ф.И., Григорян С.С., Готовцева Е.П. Система интерферона в норме и при патологии. М., 1996. С. 135-146.

3. Методические рекомендации по применению аппарата квантовой терапии РИКТА / Под ред. Ю.Б. Хайфеца. М., 2002. С.132.

4. Назарова Е.К., ГиммельфарбЕ.И., Созаева Л.Г. // Клиническая лаб. диагностика. 2003. №2. С. 25-32.

5. Пальчик Е.А., Шустова О.Л., Снимщикова И А., Анненкова Т.В., Сидоренко И.А., Герасимов А.И. // Мат-лы 5 Рос. науч. форума «Охрана здоровья матери и ребенка». М.: 2003. С.213.

УДК 616-053.13

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ИМПРИНТИРОВАННОГО ГЕНА PLAGL1 (LOT1/ZAC1) ПРИ РАННЕЙ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ГИБЕЛИ У ЧЕЛОВЕКА И ИХ СВЯЗЬ С ОТЯГОЩЕННЫМ АКУШЕРСКИМ АНАМНЕЗОМ

Д.С. ОРЛОВ, М.В. ЛЕПШИН, Е.А. САЖЕНОВА*

Ключевые слова: геномный импринтинг, эмбрион

Геномный импринтинг (англ. imprint - отпечаток) является эпигенетическим феноменом, который характеризуется дифференциальной экспрессией гена в зависимости от его родительского происхождения. Молекулярной основой такой дифференциальной экспрессии родительских генов являются ковалентные модификации ДНК и гистоновых белков. К настоящему времени в геноме человека обнаружено около 100 импринтированных локусов. Известно, что у человека в структуре ДНК наряду с четырьмя азотистыми основаниями (аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C)) имеются метилированные основания: 5-метилцитозин (m5C). Цитозиновые основания ДНК метилируются в основном в симметричных CpG-участках, которые составляют около 1% всей геномной ДНК и около 80% всех CpG-участков [1]. Рисунки метилирования ДНК в клетках организма обладают пространственной, временной и тканевой специфичностью, специфика метилирования ДНК наследуется дочерними клетками. Специфические метки метилирования стираются в примордиальных половых клетках, в ходе их созревания происходит восстановление рисунков метилирования в соответствии с половой принадлежностью организма, после слияния половых клеток в доим-плантационной стадии эмбрионального развития происходит деметилирование генома, а в ходе дальнейших этапов развития зародыша - de novo метилирование ДНК соматических клеток. Активные гены в клетках не метилированы, в случае метилирования промоторов генов отмечается подавление их экспрессии.

Естественно, что все события, изменяющие моноаллельный характер экспрессии генов, такие как изменение статуса метилирования данных генов, будут сопровождаться определенными фенотипическими эффектами и, прежде всего, патологией внутриутробного развития организма и специфическими синдромами [2,3]. Так как одна из основных функций импринтированных генов заключается в участии в фетоплацентарном росте и развитии млекопитающих через контроль клеточной пролиферации и дифференцировки, а также через регуляцию метаболизма некоторых гормонов и ростовых факторов [4]. Эту функцию убедительно демонстрируют результаты экспериментальных работ с парте-ногенетическими эмбрионами мышей, сформированных только из двух женских или двух мужских пронуклеусов. Было показано, что отцовский геном в большей степени стимулирует развитие экстраэмбриональных тканей, тогда как материнский геном, напротив, обеспечивает больший вклад в дифференцировку собственно зародыша. Примерами импринтированных локусов, имеющих несомненное значение в регуляции процессов роста эмбриона и плаценты, являются гены, экспрессирующиеся только с отцовского (IGF2, MEST/PEG1, PEG3, INS1, INS2, MEST) или только с материнского (IGF2R, H19, GRB10) гомолога.

Существенная роль импринтинга в регуляции раннего эмбрионального развития человека определяет актуальность исследований, направленных на изучение разнообразия и частоты нарушений импринтированных локусов генома в этиологии репродуктивных потерь и невынашивании беременности. Следует отметить, что нарушения импринтинга могут происходить как на уровне целого генома, так и отдельных хромосом, несущих импринтированные локусы, а также на уровне самих импринтированных генов.

Нарушение импринтинга на уровне целого генома приводит к развитию пузырного заноса (ПЗ) - кистозной трансформации ворсин хориона, повышающей риск онкологических осложнений. В основе патогенеза пузырного заноса лежит увеличение дозы

* НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск, Лаборатория цитогенетики

импринтированных генов отцовского происхождения в геноме плода. ПЗ бывает полным и частичным, в зависимости от степени кистозной трансформации ворсин хориона в плаценте.

Механизмы возникновения ПЗ могут иметь цитогенетическую или эпигенетическую природу. В первом случае в основе лежат ошибки сегрегации целых хромосомных наборов при созревании гамет, а также аномалии оплодотворения. Во втором случае речь идет о биродительском полном пузырном заносе (БППЗ), который впервые был описан в 1999 г. Helwani et al.. Причиной БППЗ является глобальное нарушение характера метилирования импринтированных генов на материнских хромосомах, приводящее к потере импринтинга и к установлению биаллельной экспрессии импринтированных локусов. Результатом таких изменений является приобретение материнским гаплоидным геномом эпигенетического статуса, характерного для эпигенома отца. Установлено, что БППЗ обусловлен эпимутациями импринтированных генов в оогенезе у матери, которые нарушают процесс эпигенетического репрограммирования генома. БППЗ, в отличие от других форм ПЗ, обнаруживается в семьях с повторяющимися случаями патологии или у нескольких членов одной родословной.

Нарушение импринтинга в раннем эмбриогенезе на уровне отдельных хромосом может обнаруживаться через феномен однородительского наследования хромосом. Однородительская дисомия ^РД) - ошибочное наследование потомком двух гомологичных хромосом от одного родителя. Однако работы по поиску ОPД у спонтанных абортусов не показали существенного вклада данного феномена в этиологию ранней остановки эмбрионального развития. Необходимо отметить, что ОPД является лишь одним из механизмов, нарушающих дозу импринтированных генов. Поэтому решение вопроса о вкладе изменений импринтированных локусов генома в нарушение эмбрионального развития человека не должно ограничиваться анализом этого редкого, с цитогенетической точки зрения, феномена.

Действительно, образование ОPД зависит от целого ряда событий, связанных с последовательными нарушениями сегрегации хромосом в мейозе и при последующих митотических делениях эмбриональных клеток. Геномный импринтинг является эпигенетическим феноменом, а его молекулярные основы связаны с дифференциальным метилированием регуляторных последовательностей генов. Следовательно, нарушение экспрессии импринтированных локусов в раннем эмбриогенезе человека может быть связано в большей степени с их эпимутациями, чем с ошибками сегрегации хромосом, ведущими к формированию ОPД. В отношении затрагиваемого гена эффекты эпимутаций будут функционально эквивалентны однородительскому наследованию хромосом, содержащих импринтированные гены. Обсуждаемый в современной литературе вопрос о нарушениях геномного импринтинга при использовании методов репродуктивной медицины делает актуальными исследования механизмов и факторов, вызывающих подобные эпимутации [5,б].

Таблица

Структура и объем исследованных выборок

Группа эмбрионов Число обследованных эмбрионов

ЭМ ЦХ обследованы обе ткани

Дегенерация клеточных культур in vitro (n=87) 73 70 5б

Медицинские абортусы (контроль, n=30) 30 30 30

Проведено исследование нарушений эпигенетического статуса импринтированного гена PLAGL1 хромосомы 6 (q24-q25) при ранней внутриутробной гибели эмбрионов человека в группе 87 спонтанных абортусов первого триместра беременности с дегенерацией клеточных культур in vitro. В качестве контрольной группы были изучены 30 образцов медицинских абортусов первого триместра беременности, полученных от здоровых женщин без отягощенного акушерского анамнеза, не пожелавших сохранить нормально протекавшую беременность по социальным показаниям. Анализ статуса метилирования импринтированного гена проводили в образцах геномной ДНК, выделенных из некультивированных тканей цитотрофобласта хориона (ЦХ) и экстраэмбриональной мезодермы (ЭМ), как производных зародышевых листков, отличающихся по характеру эпигенетического репрограммирования генома на ранних этапах эмбриогенеза [7]. Выделение ДНК проводили по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей очисткой фе-

нол/хлороформом. Далее образцы подвергали обработке бисульфитом натрия и проводили метил-специфичную ПЦР. После амплификации фрагменты ДНК фракционировали в 3% агарозном геле и визуализировали в проходящем УФ свете на установке ОеШос («Вю-Яа^США). Структура обследованных выборок приведена в табл.

Характер метилирования PLAGL1 у 9 из 87 обследованных спонтанных абортусов (10,3%) отличался от нормального состояния: в плацентарных тканях было зарегистрировано снятие метилирования PLAGL1 на материнском гомологе (рис.).

Рис. Эпигенетические нарушения гена PLAGL1 при ранней эмбриональной гибели у человека: дорожки 1, 2 - гипометилированный материнский (1) и неметилированный отцовский (2) аллели у спонтанного абортуса в экстраэмбриональной мезодерме; дорожки 3, 4 - метилированный материнский (3) и неметилированный отцовский (4) аллели у спонтанного абортуса в цитотрофобласте хориона; дорожки 5, 6 - метилированный материнский (5) и неметилированный отцовский (6) аллели у медицинского абортуса в экстраэмбриональной мезодерме.

В настоящем исследовании у всех спонтанных абортусов с эпимутациями выявленные нарушения статуса метилирования затрагивали только одну ткань, другими словами обнаруживались либо в ЭМ (5 эмбрионов), либо в ЦХ (3 эмбриона). В одном случае для анализа был доступен только ЦХ. Данные результаты позволяют предположить, что наиболее вероятным периодом возникновения выявленных эпимутаций является постимплантационный этап развития эмбриона. Обнаруженные у спонтанных абортусов нарушения импринтинга были ограничены только одной тканью, а, следовательно, могли возникнуть уже после их обособления. Таким образом, соматические эпимутации могут являться одним из молекулярных механизмов нарушения функций импринтированных генов при патологии внутриутробного развития человека. PLAGL1 подавляет клеточный рост и экспрессируется только с отцовского гомолога. Продуктом гена является транскрипционный фактор, вовлеченный в контроль клеточного цикла и аутокринную регуляцию секреции инсулина в поджелудочной железе. Поэтому гипометелирование этого гена может привести к уменьшению пролиферативной активности клеток. Косвенным подтверждением роли гена PLAGL1 в пролиферации клеток служит тот факт, что гиперметилирование этого гена описано при раке яичников [8].

Эпимутации в гене PLAGL1 статистически значимо чаще встречаются у женщин с отягощенным акушерским анамнезом (ОАА) (P<0,05): у матерей, имевших спонтанных абортусов с эпимутацией гена PLAGL1 3 из 9 женщин имели ОАА (33%), а у матерей, имевших спонтанных абортусов без эпимутации гена PLAGL1 только 6 из 78 женщин имели ОАА (8%). В расчет были включены только те женщины, которые имели 3 и более беременности. Сведения о связи эпимутаций с ОАА подтверждают предположение о том, что ряд супружеских пар с нарушениями фертильности имеют расположенность к эпигенетической нестабильности, что делает геном их потомства подверженным эпигенетическим изменениям [9]. Данные факты наводят на мысль, что нарушения геномного импринтинга могут быть обусловлены определенными регуляторными последовательностями ДНК [10].

Изучение эпимутаций других импринтированных генов является актуальной проблемой для дальнейших исследований причин ранней эмбриональной гибели у человека.

Литература

1. Ehrlich, M. in human DNA from different types of tissues or cells / M. Ehrlich // Nucleic Acids Res. 1982. Vol. 10. P. 2709-2721.

2. Назаренко С. А. // Вестник РАМН. 2001. № 10. С. 43-48.

3. Лебедев И. Н. / И. Н. Лебедев, Е. А. Саженова // Генетика. 2008. Т. 44, № 10. С. 1356-1373.

4. TyckoB., MorisonR. // J. Cell Phys. 2002. Vol. 192. P. 245.

5. HorikawaM. et al. // Biol. Reprod. 2005. Vol. 72. P. 879.

6. Huang B., Prensky L., Thangavelu M., et al. // Eur. J. Hum. Genet. 2004. Vol. 12. P. 985-996.

7. LiE. // Nat. Rev. Genet. 2002. Vol. 3. P. 662-673.

8. Kamikihara, T. // Int. J. Cancer. 2005. Vol. 115. P. 690-700.

9. Horsthemke B., Ludwig M. // Hum. Reprod. Upd. 2005. Vol. 11. P. 473-482.

10. Serre D. et al. (2008) Differential allelic expression in the human genome. PLoS Genet. 4:e 1000006, doi:10.1371 / jour-nal.pgen. 1000006.