Способ увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных
METHOD FOR PROLONGING LIFESPAN OF EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к медицине, а именно к геронтологии и экспериментальной медицине и предназначено для увеличения продолжительности жизни.
Разработка методик, позволяющих увеличить продолжительность жизни - один из самых актуальных вопросов современной медицины. Старение организма связано с множеством изменений во всех органах и системах. Известно, что возрастные изменения иммунной системы, в первую очередь ее центрального органа - тимуса, могут привести к увеличению заболеваемости онкологической, аутоиммуной, инфекционной патологиями (Foster, A.D., Sivarapatna, А., & Gress, R.Е. The aging immune system and its relationship with cancer // Aging health - 2011. - V. 7. - №. 5. - P. 707-718.; Ventevogel, M.S., & Sempowski, G.D. (2013). Thymic rejuvenation and aging. Current opinion in immunology. - 2013 - V. 25. - №. 4. - P. 516-522.; Yager E.J. et al. Age-associated decline in T cell repertoire diversity leads to holes in the repertoire and impaired immunity to influenza virus // Journal of Experimental Medicine. - 2008. - V. 205. - №. 3. - P. 711-723.).
В литературе можно встретить точку зрения, рассматривающую инволюцию тимуса и возрастные измерения эпифиза как факторы, управляющие старением и влияющие на продолжительность жизни (Csaba G. The Immunoendocrine Thymus as a Pacemaker of Lifespan // Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. - 2016. - V. 63. - №. 2. - P. 139-158.; Csaba G. The role of the pineal-thymus system in the regulation of autoimmunity, aging and lifespan // Orvosi hetilap. - 2016. - V. 157. - №. 27. - P. 1065.). Поэтому крайне перспективной является разработка геропротекторов, эффект которых основан на компенсации возрастных изменений тимуса и эпифиза.
В нашей стране были разработаны низкомолекулярные пептиды из тимуса и эпифиза (препараты «Тималин» и «Эпиталамин»), увеличивающие среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных, кроме того, препараты замедляют старение репродуктивной системы, влияют на двигательную активность, физическую выносливость. (Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. 35-летний опыт исследований пептидной регуляции старения. Успехи геронтол. - 2011. - Т. 7. - №. 1. - С. 11-23.). Недостатком методик является необходимость парентерального курсового введения препарата, при введении возможны аллергические реакции.
Также изучаются трансплантационные способы увеличения продолжительности жизни, так V.A. Lesnikov, и W. Pierpaoli разработали метод кросс-трансплантации эпифиза от молодых мышей старым, и наоборот, при пересадке «молодого» эпифиза старым животным наблюдалось увеличение продолжительности жизни мышей-реципиентов (Lesnikov V.A., Pierpaoli W. Pineal Cross-Transplantation (Old-to-Young and Vice Versa) as Evidence for an Endogenous "Aging Clock" // Annals of the New York Academy of Sciences. - 1994. - V. 719. - №. 1. - P. 456-460). Центральная нервная система, как и передняя камера глаза, является иммунологически привилегированной областью, что позволяет минимизировать риск отторжения трансплантата. Однако недостатком данной методики является высокая инвазивность процедуры, по нашему мнению, описанная авторами процедура должна сопровождаться высоким риском нейроинфекций и неврологических осложнений.
Также из уровня техники известен способ увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных путем аллогенной трансплантации тимуса в область подмышечной впадины мышей-реципиентов (Basso A. et al. Noninvasive neonatal thymus graft into the axillary cavity extends the lifespan of old mice // Rejuvenation research. - 2010. - V. 13. - №. 2-3. - P. 288-291.). Методика основана на пересадке ткани тимуса, полученного от молодых животных пожилым особям. Недостатком метода является неизбежное отторжение чужеродного трансплантата, подсаженного в подмышечную впадину. Вероятно, именно это является причиной низкой эффективности прототипа - способ не позволил добиться статистически значимого увеличения выживаемости при оценке с помощью кривых Каплана-Майера и критерия Mantel-Cox, статистически значимое увеличение выживаемости было показано лишь при анализе с помощью параметрического критерия (Piantanelli model). Отсутствие «ложных» операций, проведенных на контрольной группе животных не позволяет корректно сравнивать контрольную и экспериментальную группы.
3
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных (Куликов А.В. и др., Увеличение средней и максимальной продолжительности жизни за счет трансплантации аллогенных клеток тимуса в переднюю камеру глаза животных, Успехи геронтологии, 2013 г., Т. 26, №4, с. 643-646), заключающийся в том, что взрослому лабораторному животному проводят аллогенную трансплантацию измельченных фрагментов тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрезы роговицы длиной 1,5-2 мм, помещая фрагменты трансплантата общим объемом 3-5 на радужную оболочку глаза с максимальным удалением от разреза, при этом животным-реципиентам непосредственно перед операцией закапывают в глаза препараты, обладающие мидриатическим и анестетическим действием. Недостатком данного способа является расположение разреза на 13 часах по воображаемому циферблату вне зависимости от оперируемого глаза, очевидно, что такое расположение разреза позволяет проводить успешную трансплантацию только в левый глаз, тогда как на правом глазу - неизбежно располагает к выдавливанию животными трансплантата при умывании, что может существенно снизить эффективность методики. Кроме того, в статье отсутствуют данные о том, какую часть передней камеры глаза должен занимать трансплантата, другими словами, не указан объем вводимого трансплантата по сравнению с объемом передней камеры глаза, что не позволяет адаптировать методику для животных с существенно большим или меньшим размером передней камеры глаза. Также авторы не указывают данных о проведении «ложных» операций у контрольной группы животных.
Таким образом, существует потребность в способе увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных, лишенном вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности способа за счет невозможности извлечения трансплантата животным-реципиентом и оптимального эффективного объема вводимого трансплантата, увеличение кумулятивной выживаемости, средней, максимальной, минимальной продолжительностей жизни у лабораторных животных.
Этот технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе увеличения продолжительности жизни у экспериментальных животных, заключающемся в том, что взрослому лабораторному животному проводят аллогенную трансплантацию измельченных фрагментов тимуса, забранного от животных препубертатного возраста того же вида, в переднюю камеру глаза через разрезы роговицы длиной 1,5-2 мм, помещая фрагменты трансплантата непосредственно на радужную оболочку глаза с максимальным удалением от разреза, при этом животным-реципиентам непосредственно перед операцией закапывают в глаза препараты, обладающие мидриатическим и анестетическим действием, разрезы делают на верхне-переднем участке роговицы глаз, на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу и на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу, а общий объем трансплантата составляет 10-20% от объема передней камеры глаза.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве доноров аллогенной ткани тимуса используют экспериментальных животных препубертатного возраста, чей потенциал пролиферации клеток тимуса еще достаточно велик, и не началась возрастная инволюция органа (например, крыс в возрасте 30-35 суток - что соответствует массе 100-120 г). В качестве реципиентов используют пожилых особей того же вида.
Для забора тимуса у доноров осуществляют эвтаназию экспериментальных животных путем введения летальной дозы анестетика (Золетил) - 200 мг/кг массы тела, после чего вскрывают грудную клетку и извлекают орган. В чашке Петри со средой Игла ткань тимуса механически измельчают до фрагментов размером 1-1,5 мм3. Выделение и подготовку ткани тимуса осуществляют непосредственно перед трансплантацией.
Трансплантацию ткани тимуса в переднюю камеру глаза животным-реципиентам проводят под общей анастезией (Золетил + Ксилазин), в качестве премедикации используют атропина сульфат в дозе 0,04 мг/кг подкожно за 15 мин до начала вмешательства.
Животным-реципиентам непосредственно перед операцией с целью достижения максимального мидриаза в оперируемый глаз закапывают препарат, обладающий мидриатическим действием (мы наносили по 1 капле 0,1% раствора атропина), эта манипуляция уменьшает площадь радужной оболочки и помогает избежать последующих повреждений структур глаза, богатых капиллярами; также для снижения чувствительности роговицы перед операцией в глаз закапывают препарат, обладающий анестетическим действием (мы наносили по 1 капле 0,5% раствора дикаина). Выбор препаратов внутри данных фармакологических групп не оказывает принципиального влияния на осуществление предлагаемого способа. Забор материала из чашки Петри и трансплантацию в переднюю камеру глаза осуществляют, например, с помощью микропипетки с изменяющимся объемом. На роговице одного глаза делают разрез длиной 1,5-2 мм. Разрез наносят на верхне-заднем участке роговицы, на 12-14 часах по воображаемому циферблату на левом глазу и на 10-12 часах по воображаемому циферблату на правом глазу. Такое расположение разреза позволяет минимизировать риск выдавливания трансплантата при умывании животного и добиться лучшего технического результата. В разрез роговицы вводят измельченные трансплантируемые фрагменты тимуса общим объемом 10-20% от объема передней камеры глаза и помещают их непосредственно на радужную оболочку глаза, удаляя как можно дальше от разреза. Выбор такого диапазона вводимого объема трансплантата обусловлен оптимальными результатами, поскольку больший объем трансплантата может перекрывать зрачок и влиять на зрительную функцию животных-реципиентов, меньший - может оказаться недостаточно эффективным.
3
Пример. Эксперимент был осуществлен на 42 крысах Wistar в возрасте 17 месяцев, животные были разделены на две равные группы (по 21 животному). Животным из экспериментальной группы (n=21) была осуществлена трансплантация ткани тимуса по предлагаемому способу с введением трансплантата в каждый глаз общим объемом 10-20% от объема передней камеры глаза (2-4,5 мм), контрольной группе (n=21) проводили ложные операции. Все животные были оставлены на выживание в стандартных условиях вивария с ежедневным контролем. На основании продолжительностей жизни животных в обеих группах были построены кривые кумулятивной выживаемости Каплана-Майера. В результате было достигнуто статистически значимое увеличения кумулятивной выживаемости после трансплантации ткани тимуса в ПКГ 17-месячным животным (р<0,01, критерий Кокса). В экспериментальной группе животных наблюдалось увеличение медианы выживаемости на 19,5% (экспериментальная группа - 26,4 месяцев, контрольная группа - 22,1 месяц), минимальной продолжительности жизни на 26% (экспериментальная группа - 21,8 месяцев, контрольная группа - 17,3 месяцев), максимальной продолжительности жизни на 32% (экспериментальная группа - 37,9 месяцев, контрольная группа - 28,7 месяцев) и средней продолжительности жизни на 26% (экспериментальная группа - 27,4 месяцев, контрольная группа - 21,7 месяцев) (фиг. 1).
Выбор места трансплантации основан на иммунологической привилегированности передней камеры глаза (Taylor A.W. Ocular Immune Privilege and Transplantation // Frontiers in immunology. - 2016. - T. 7.), это преимущество разработанного способа по сравнению с прототипом позволяет избежать отторжения трансплантата и обеспечивает длительное его функционирование без использования иммуносупрессивных препаратов и подбора гистосовместимого донора. Кроме того, выбранная локализация трансплантата позволяет производить визуальный контроль пересаженной ткани в ходе всего эксперимента. При анализе клеточного состава трансплантата, изъятого из передней камеры глаза через месяц после трансплантации, нами было показано наличие сохранных тимоцитов в трансплантате. Это свидетельствует, что донорская ткань тимуса содержит тимоциты, а не перерожденные клетки или соединительную ткань, что является доказательством длительной жизнеспособности трансплантата в передней камере глаза.
Также нами было доказано, что трансплантация фрагментов тимуса в переднюю камеру глаза в оптимальном объеме приводит к увеличению количества тимоцитов в собственном тимусе реципиента и замедлению возрастной инволюции тимуса. Эти данные дают основания предполагать, что при воздействии продуцируемых пересаженной тканью биологически активных веществ происходит активация собственных регенеративных ресурсов организма реципиента; трансплантат, помещенный в иммунопривилегированную область, интегрируется в систему физиологической регуляции функций организма и способен к длительному выживанию без использования иммунодепрессантов.
Таким образом, разработанный способ позволяет эффективно увеличивать как среднюю, так и максимальную, и минимальную продолжительность жизни, отличается технической простотой, отсутствием отторжения трансплантата без необходимости сопутствующего введения иммуносупрессивных препаратов и поиска гистосовместимого донора.