Лекарственное средство, стимулирующее регенерацию эндотелия легких при хронической обструктивной болезни легких
MEDICINAL AGENT STIMULATING PULMONARY ENDOTHELIAL REGENERATION IN CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в качестве средства, стимулирующего регенерацию эндотелия легких при хронической обструктивной болезни легких.
Хроническая обструктивная болезнь легких - это хроническое воспалительное заболевание, протекающее с преимущественным поражением дистальных отделов дыхательных путей и паренхимы легких, формированием эмфиземы, характеризующееся частично обратимым и необратимым ограничением скорости воздушного потока [1]. Существующие средства медикаментозного лечения способны улучшить качество жизни пациентов, уменьшить частоту и тяжесть обострений. Однако все известные лекарственные препараты не влияют на долгосрочное состояние легочной функции [1].
Согласно современным представлениям патогенез хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) включает в себя, воспаление дыхательных путей, разрушение внеклеточного матрикса и окислительный стресс, апоптоз эндотелиальных клеток и разрушение микроциркуляторного русла альвеол [2, 3]. По современным представлениям эндотелиальные прогениторные клетки играют важную роль в восстановлении поврежденного эндотелия [4, 5]. Известно, что количество, циркулирующих крови, эндотелиальных прогениторных клеток у пациентов с ХОБЛ снижается. Это коррелировало с гипоксемией, тяжестью обструкции дыхательных путей и пиковым потреблением кислорода [5]. Некоторые исследователи предполагают возможное ингибирующее действие воспаления на эндотелиальные клетки [6, 7]. До настоящего времени единой стратегии лечения ХОБЛ с использованием средств, стимулирующих регенерацию эндотелиальных клеток, не существует.
Задачей, которое решает данное изобретение, является стимуляция регенерации эндотелия легких при хронической обструктивной болезни легких.
Поставленная задача решается путем применения спиперона в качестве средства, способного стимулировать регенерацию эндотелия легких при хронической обструктивной болезни легких.
Новым в предлагаемом изобретении является курсовое введение спиперона на фоне развития хронической обструктивной болезни легких.
Нами впервые продемонстрирована способность спиперона стимулировать мобилизацию эндотелиальных прогениторных клеток, препятствовать развитию структурных изменений и стимулировать регенерацию эндотелия легких при хронической обструктивной болезни легких.
2
Спиперон - антипсихотическое средство, антагонист D-рецепторов дофамина, блокирует α-адренорецепторы, 5-НТ рецепторы серотонина. Спиперон проявляет иммуносупрессивную активность при контактном и атопическом дерматите, системной красной волчанке, склеродермии, псориазе [8], уменьшает интенсивность отложения соединительной ткани и активность воспаления при идиопатическом фиброзе легких [9]. Способность спиперона модулировать функцию кальций-активируемых хлорных каналов (calcium-activated chlorine channels, СаСС) может быть полезна для терапии заболеваний, связанных с дефектом СаСС, в том числе и муковисцидоза [10].
Применение спиперона по новому назначению стало возможным благодаря выявленному авторами новому свойству спиперона, а именно его способности стимулировать мобилизацию и миграцию эндотелиальных прогениторных клеток и увеличивать площадь микрососудистой сети в легочной ткани при хронической обструктивной болезни легких (эмфиземе легких).
Формирование эмфиземы легких сопровождается деструкцией межальвеолярных перегородок и уменьшением васкуляризации альвеол [11]. Ингибирующее влияние дофамина на ангиогенез связано с торможением мобилизации и миграции прогениторных клеток [12]. Бг-рецепторы дофамина обнаруживаются в легочных сосудах [13], на мембране стволовых и прогениторных клеток [14].
Развитие структурных изменений при эмфиземе легких сопровождается нарушением баланса в системе протеиназ и антипротеиназ (в том числе обусловленного нарушением синтеза ai-антитрипсина), окислительным стрессом, воспалением и клеточным апоптозом. Сигаретный дым индуцирует окислительный стресс [15], стимулирует образование провоспалительных цитокинов [16]. Эмфизема, вызванная экстрактом сигаретного дыма (ЭСД), наиболее релевантна клиническим ситуациям, так как воспроизводит воздействие основного фактора риска развития эмфиземы легких и ХОБЛ - сигаретного дыма.
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.
Изобретение может быть использовано как средство, стимулирующее мобилизацию и миграцию эндотелиальных прогениторных клеток и способствующее регенерации эндотелия при эмфиземе легких.
Исходя из вышеизложенного, заявляемое изобретение соответствует критериям патентоспособности изобретения «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».
Предполагаемое действие спиперона изучено в эксперименте на 60 мышах самках линии C57BL/6 в возрасте 8-10 недель. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН (ветеринарное удостоверение имеется). Содержание животных и экспериментальный дизайн одобрены этическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН и соответствуют международным правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Суть изобретения будет понятна из фигуры 1.
На фигуре 1 изображено легкое мыши с хронической обструктивной болезни легких, вызванной введением экстракта сигаретного дыма, при окрашивании ткани легкого гематоксилином и эозином: а, 6, в - интактной, г, д, е - получавшей ЭСД, ж, з, и -получавшей спиперон на фоне эмфиземы легких, вызванной введением ЭСД, 45 день эксперимента, ув. х 100.
Изобретение осуществляют следующим образом:
Хроническая обструктивная болезнь легких, вызванная экстрактом сигаретного дыма (ЭСД), моделируется путем интраназального введения экстракта в объеме 100 мкл/мышь на 1, 4, 7, 10, 13 и 16 сутки эксперимента [17]. Экстракт сигаретного дыма получен из сигарет марки L&MREDLABEL 2 сигареты на/мл (состав 1 сигареты: смола 10 мг/сигарета, никотин 0,8 мг/ сигарета, СО 10 мг/ сигарета). Сигаретный фильтр перед получением экстракта удаляется (длина сигареты с фильтром 80 мм, после удаления фильтра 55 мм). Экстракция осуществляется путем протягивания дыма зажженной сигареты через натрий-фосфатный буфер с постоянной скоростью, при помощи вакуумного насоса, сигарета сжигается до длины 5 мм. Время сжигания одной сигареты составляет 140 секунд. Для удаления частиц полученный экстракт фильтруется через бактериальный фильтр с величиной пор 45 нм. Для стандартизации полученного экстракта проводится измерение рН и оптической плотности на длине волны 405 и 540 нм.
Для индукции воспаления интраназально вводится липополисахарид (ЛПС) в дозе 3 мкг/мышь в 50 мкл натрий-фосфатного буфера на 0 и 3 сутки эксперимента.
Спиперон («Sigma», США) вводится внутрибрюшинно в дозе 0,15 мг/кг в 100 мл физиологического раствора с 1 по 45 сутки эксперимента. В качестве контроля используются интактные животные (интактный контроль).
Гистологическое исследование легких при ХОБЛ, вызванной ЭСД и липополисахаридом, проводится на 45 сутки эксперимента.
2
Мышей умерщвляют передозировкой СО. Для гистологического исследования левую долю легкого фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина и заливают в парафин по стандартной методике [18]. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивают гематоксилином и эозином.
Для оценки площади эмфизематозно измененной легочной ткани для каждого образца делается минимум 10 микрофотографии без перекрытия по всей поверхности среза легочной ткани при 100-кратном увеличении. Использованная система состоит из микроскопа Axio Lab.Al («CarlZeiss», Германия) с видеокамерой AxioCam ERc5s («CarlZeiss», Германия), подключенной к персональному компьютеру. Полученные изображения обрабатываются с помощью программного обеспечения Axio Vision Rel.4.8.2.
При помощи компьютерных средств анализа и обработки изображений (GIMP 2) измеряется общая площадь поверхности среза ткани и площадь эмфизематозно измененной ткани. Из расчетов исключаются крупные сосуды и бронхи.
Выраженность эмфизематозных изменений оценивается как процентное соотношение между площадью эмфизематозно измененной и нормальной ткани.
Σα - количество пикселей, занимаемых эмфизематозно измененной легочной тканью - общее количество пикселей на снимке (4915200 пикселя)
Σβ - количество пикселей, соответствующее пустой части предметного стекла
Для оценки экспрессии CD 16 и CD31 в легких используется иммуногистохимический метод. Для исследования левую долю легкого фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина и заливают в парафин по стандартной методике. Для каждого животного делаются срезы, соответствующие верхнему, среднему и нижнему легочному полю. Предварительно депарафинизированные срезы помещают в цитратный буфер (рН=6) для демаскировки антигена. Инкубирование с первичными антителами проводится во влажной камере при 37°С. Для детекции антител используется система визуализации в соответствии с инструкцией производителя («Spring bioscience))). Оценивается экспрессия на мембране клеток CD 16, CD31.
Экспрессию мембранных рецепторов мононуклеаров легких и периферической крови анализируют с использованием мышиных моноклональных антител методом проточной цитофлуориметрии. Для анализа используют прибор FACS Canto II с программным обеспечением FACS Diva («BD Biosciences)), США). Клеточные суспензии окрашивают следующими антителами: CD45 PerCP, CD31 АРС, CD34 FITC. В исследовании используют соответствующие изотипические контроли.
Статистическая обработка результатов производится с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивается при помощи t-критерия Стьюдента (при нормальном распределении признака) или U-критерия Уилкоксона (при ненормальном распределении признака). Пример.
На модели ХОБЛ, вызванной введением экстракта сигаретного дыма (ЭСД), при окрашивании легкого гематоксилином и эозином на 45 сутки эксперимента отмечается расширение альвеол и альвеолярных ходов с разрушением межальвеолярных перегородок, макрофагальная инфильтрация паренхимы легких (фигура 1 г, д, е).
Курсовое введение спиперона в дозе 0,15 мг/кг приводит к достоверному уменьшению площади эмфиземы (таблица 1).
+
На 45 сутки эксперимента количество CD16клеток в легких животных с эмфиземой увеличивается по сравнению с животными из группы интактного контроля. Параллельно с этим, уменьшается число клеток, экспрессирующих маркер эндотелиальных клеток CD31.
+
+
Спиперон снижает число CD16 клеток в легких. При этом, количество CD31 клеток в легких животных, получавших спиперон, не только достигает уровня, зарегистрированного у мышей из группы интактного контроля, но и превышает его (таблица 2).
На 45 сутки достоверного изменения числа эндотелиальных прогениторных клеток в легких животных, получавших ЭСД, и животных из группы интактного контроля не наблюдается. В крови в эти же сроки количество эндотелиальных прогениторных клеток достоверно снижается. На фоне эмфиземы легких, спиперон значительно увеличивает количество эндотелиальных прогениторных клеток в легких (таблица 3).
Таким образом, спиперон на модели ХОБЛ, вызванной введением экстракта сигаретного дыма и липополисахарида, стимулирует увеличение эндотелиальных прогениторных клеток в крови, препятствует разрушению альвеолярной ткани, стимулирует регенерацию альвеолярного эндотелия и уменьшает активность воспаления.
Литература
1. Vogelmeier, C.F. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary / C.F. Vogelmeier, G.J. Criner, F.J. Martinez et al. // American journal of respiratory and critical care medicine. -2017. - Vol. 195, №. 5. - P. 557-582.
2. Barnes, P.J. Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms / P.J. Barnes, S.D. Shapiro, R.A. Pauwels // Eur Respir J. - 2003. - Vol. 22, N 4. - P. 672-688.
3. Green, С.E. The role of the endothelium in asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) / C.E. Green, A.M. Turner // Respiratory research. - 2017. - Vol. 18, N 1. - P. 20.
4. Ingram, D.A. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells / D.A. Ingram, N.M. Caplice, M.C. Yoder // Blood. - 2005. - Vol. 106, N5. - P. 1525-1531.
5. Doyle, M.F. Endothelial progenitor cells in chronic obstructive pulmonary disease and emphysema / M.F. Doyle, R.P. Tracy, M.A. Parikh et al. // PloS one. - 2017. - Vol.12. - P. eO 173446.
6. Shi, Z. Intratracheal transplantation of endothelial progenitor cells attenuates smoking-induced COPD in mice / Z. Shi, Y. Chen, J. Cao et al. // Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. - 2017. - Vol.2017. - P. 947-960.
7. Palange, P. Circulating haemopoietic and endothelial progenitor cells are decreased in COPD / P. Palange, U. Testa, A. Huertas et al. // Eur Respir J- 2006. - Vol. 27, N 3. - P. 529-541.
8. Patent № ЕР 0489108B1 Use of spiperone derivatives for immunosuppression / R.J. Sharpe (Newtonville, MA), K.A. Arndt (Newton Centre, MA), S.J. Galli (Winchester, MA). - EP, 1992.
9. Патент № RU 2530651C1 Средство, обладающее противовоспалительным и антифибротическим действием в легочной ткани при цитостатическом воздействии / A.M. Дыгай (RU), Е.Г. Скурихин (RU), О.В. Першина (RU), A.M. Резцова (RU), Н.Н. Ермакова (RU), В.А. Крупин (RU), Е.С.Хмелевская (RU). - RU, 2014.
10. Patent №US 20120029005 A1 Spiperone derivatives and methods of treating disorders / W.B. Guggino (Baltimore, MD, US), E.M. Schwiebert (Birmingham, AL, US), L. Liang (Baltimore, MD, US). - USA, 2012.
11. Liebow, A.A. Pulmonary emphysema with special reference to vascular changes / Liebow A.A. // The American review of respiratory disease. - 1959. - Vol. 80, N 1. - P. 67-93.
12. Chakroborty, D. Dopamine regulates endothelial progenitor cell mobilization from mouse bone marrow in tumor vascularization / D. Chakroborty, U.R. Chowdhury, C. Sarkar et al. // The Journal of clinical investigation. - 2008. - Vol. - 118, N 4. - P. 1380-1389.
13. Ricci, A. Dopamine receptor subtypes in the human pulmonary arterial tree / A. Ricci, F. Mignini, D. Tomassoni et al. // Autonomic & autacoid pharmacology. - 2006. - Vol. 26, N 4. - P. 361-369.
14. Mirones, I. Dopamine Mobilizes Mesenchymal Progenitor Cells Through D2-Class Receptors and Their PI3K/AKT Pathway / I. Mirones, M. Angel Rodriguez-Milla, I. Cubillo et al. // Stem Cells. - 2014. - Vol.32, N 9. - P. 2529-2538.
15. Zuo, L. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments / L. Zuo, F. He, G.G. et al. // American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. - 2014. - Vol.307, N 3. - P. L205-L218.
16. Pappas, K. The role of macrophages in obstructive airways disease: chronic obstructive pulmonary disease and asthma / K. Pappas, A.I. Papaioannou, K. Kostikas et al. // Cytokine. -2013. - Vol.64, N 3. - P. 613-625.
17. He, Z.H. Comparison between cigarette smoke-induced emphysema and cigarette smoke extract-induced emphysema / Z.H. He, P. Chen, Y. Chen et al. // Tobacco induced diseases. - 2015. - Vol. 13, N 1. - P. 6.
18. Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники. / Г.А. Меркулов - СПб: Медицина, 1969. - 423 с.