Способ определения окислительно-модифицированных белков в биологических жидкостях
METHOD FOR THE DETERMINATION OF OXIDATIVELY MODIFIED PROTEINS IN BIOLOGICAL FLUIDS

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, предназначено для определения окислительно-модифицированных белков в сыворотке и плазме крови, эритроцитах, слюне и моче при патологических состояниях путем биохимического исследования.
В настоящее время показатель количества окислительно-модифицированных белков признан одним из наиболее ранних признаком поражения различных органов при патологии, индуцированной свободными радикалами кислорода. Под действием активных форм кислорода протекают два процесса – фрагментация белков его маркерами в биологических жидкостях являются альдегид-динитрофенилгидрозоны (АДНФГ), и на более поздних этапах происходит агрегация белков, маркерами которого являются кетон-динитро-финилгидрозоны (КДНФГ). По их количественному соотношению судят о стадии окислительного стресса в организме, прогнозируют развитие патологии, назначают лекарственные препараты и проводят мониторинг процесса восстановления организма.
Известен метод определения окислительно-модифицированных белков (авторы  Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О. и другие «Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения»// Вопросы медицинской химии. 1995. № 1. С.24-26.) заключающийся в реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенил-гидрозином (2,4-ДФГ)  с образованием производных 2,4-динитрофени-лгидрозана.
Недостатком этого метода является то, что для растворения осадка окислительно-модифицированных белков используется 8 М мочевина, которая быстро кристаллизуется в воздушной среде, что значительно сокращает время проведения спектрофотометрического анализа и вносит существенные искажения в результаты исследования.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче (патент № 2525437, G  01N 33/86, G 01N 21/27  «Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче» авт. Рубцов Г.К., Безручко Н.В, Генгин М.Т. и другие), который состоит из следующих этапов: забор биологической среды, осаждение белков путем прибавления 10% раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугирование при 1000 об/мин в течение 15 минут, добавление к супернатанту 0,05 М раствора 2,4-динитрофенилгидрозина (2,4-ДФГ), центрифугирование при 1000 об/мин в 20 минут, промывание осадка раствором этанол-этилацетатом, подсушивание на водяной бане в течение 10 минут и растворение в 8 М растворе мочевины, выдерживание пробы в кипящей водяной бане и анализ раствора спектрофотометрическим методом.
Недостатком данного способа является большое количество этапов и длительность проведения исследований, а также центрифугирование исследуемого раствора при 1000 об/мин и растворение  осадка в 8 М растворе мочевины. В результате проведения центрифугирования исследуемых образцов при вращении ротора 1000 об/мин белковые фракции осаждаются не полностью, что вносит неточности в процесс исследования. Применяемый для растворения реактив, 8 М раствор мочевины быстро кристаллизуется, что приводит к значительным ошибкам при проведении анализа спектрофотометрическим методом.
Технический результат изобретения – ускорение процесса проведения исследования количества окислительно-модифицированных белков в биологических жидкостях с улучшением качества проведения анализа спектрофотометрическим методом.
Технический результат достигается тем, что исследуемую биологическую жидкость помещают в центрифужную пробирку в количестве 50-100 мкл, окрашивание, содержащихся в ней окислительно-модифицированных белков, проводят путем внесения в пробирку 2,4-динитрофенил-гидрозина, в количестве 500 мкл, растворенного в 2 молярной соляной кислоте, инкубирование образцов проводят при температуре 18-20°С в течение 60 минут с периодом перемешивания15 минут и продолжительностью 1минута при помощи орбитальной мешалки Vortex FV1, частота вращений ротора 500 об/мин, с последующим осаждением белков 20% трихлоруксусной кислотой и центрифугированием при вращении ротора 3000 об/ мин в течение 20 минут, а полученный осадок растворяют в 2 мл. 2%-ного  раствора едкого натра.
Осуществление заявленного способа поясняется следующим примером проведения исследования. Биологическую  жидкость в количестве 50-100 мкл помещают в центрифужную пробирку, добавляют 500 кмл 0,05 М 2,4-ДФГ растворенного в 2 М соляной кислоте и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 минут. Образцы перемешивают каждые 15 минут в течение 1минуты при помощи орбитальной мешалки Vortex F1, частота вращений ротора 500 об/мин. Затем для осаждения белков к пробе прибавляют 0,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок промывают три раза раствором этанол-этилацетат для удаления липидов и 2,4-ДФГ, который не прореагировал с окислительно-модифицированными белками. Остатки этанол-ацетата удаляют высушиванием на водяной бане в течение 10 минут. Полученный осадок растворяют в 2 мл 2% едкого натра в кипящей водяной бане в течение 5-7 минут до полного растворения, Количество окислительно-модифицированных белков определяют спектрофотометрическим методом, в соответствующем диапазоне длин волн 230-530 нм против контрольных образцов.
Пример 1. Сыворотку крови лабораторных животных в количестве 50 мкл вносят в две центрифужные пробирки, одна из которых служит контролем. В опытную пробирку вносят 0,5 мл 2,4-ДФГ, в контрольную 0,5 мл физиологического раствора, пробирки инкубируют при температуре 18-20°С в течение 60 минут. Образцы перемешивают каждые 15 минут в течение 1 минуты при помощи орбитальной мешалки Vortex FV1, частота вращений ротора 500 об/мин, в контрольную пробирку вносили 0,5 мл физиологического раствора. Далее в опытную и контрольную пробирку вносят 0,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты, пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют, а осадки промывают три раза этанол-ацетатной смесью для удаления липидов и 2,4-ДФГ, и подсушивают на водяной бане в течение 10 минут. В опытную и контрольную пробирки прибавляют 2 мл 2% раствора едкого натра, пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-7 минут до полного растворения осадка. Количество окислительно-модифицированных белков в опытных образцах определяют при помощи спектрофотометра в диапазоне длин волн 230-530 нм против контрольных образцов.
Пример 2. Слюну пациента в количестве 100 мкл вносят в две центрифужные пробирки, одна из которых служит контролем. В опытную пробирку вносят 0,5 мл 2,4-ДФГ, в контрольную 0,5 мл физиологического раствора, пробирки инкубируют при температуре 18-20°С в течение 60 минут. Образцы перемешивают каждые 15 минут в течение 1 минуты при помощи орбитальной мешалки Vortex FV1, частота вращений ротора 500 об/мин, в контрольную пробирку вносили 0,5 мл физиологического раствора. Далее в опытную и контрольную пробирку вносят 0,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты, пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость удаляют, а осадки промывают три раза этанол-ацетатной смесью для удаления липидов и 2,4-ДФГ, и подсушивают на водяной бане в течение 10 минут. В опытную и контрольную пробирки прибавляют 2 мл 2% раствора едкого натра, пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-7 минут до полного растворения осадка. Количество окислительно-модифицированных белков в опытных образцах определяют при помощи спектрофотометра в диапазоне длин волн 230-530 нм против контрольных образцов.
Таким образом, предлагаемая совокупность отличительных признаков внесение 2,4-ДФГ в сыворотку крови на первом этапе исследования, проведение операции осаждения белков методом центрифугирования при 3000 об/мин и растворение осадка в 2 мл 2% раствора едкого натра взамен внесения 2,4-ДФГ на втором этапе исследования, осаждение белков при 1000 об/мин и растворение конечного осадка в 8 М мочевине позволяет:
- сократить время проведения исследования за счет сокращения количества этапов;
- повысить точность проведения спектрофотометрического анализа.