К вопросу изучения антиокислительной защиты высших растений в условиях влияния атмосферных выбросов предприятий Газпрома

К вопросу изучения антиокислительной защиты высших растений в условиях влияния атмосферных выбросов предприятий Газпрома

О.Н. Немерешина, к.б.н., Оренбургская ГМА;

Н.Ф. Гусев, д.б.н., Оренбургский ГАУ

Одной из распространённых причин повреждения и гибели растительных клеток является высокий уровень окислительного стресса, что проявляется на морфологическом уровне некротическими изменениями в тканях растений [1, 2]. Известно, что в тканях растений взаимодействие органических молекул с молекулой кислорода протекает достаточно медленно. Тем не менее, в клетках всегда существует вероятность образования некоторых форм активного кислорода,

которые обладают высокой «агрессивностью» и способны повреждать практически все компоненты клетки, включая белки, ферменты, ДНК и мембранные структуры.

Образование активных форм кислорода (АФК), которые представляют собой свободнорадикальные частицы (супероксидный анион-радикал, перекисные радикалы, гидроксильный радикал) или нейтральные молекулы (пероксид водорода и синглетный кислород), происходит как в неферментативных, так и ферментативных реакциях под действием многих токсических веществ, видимого света, ионизирующего, ультра-

фиолетового излучений. Эта проблема особенно интересна в приложении к растениям, так как в процессе фотосинтеза клетки листа постоянно подвергаются воздействию представляющего опасность светового излучения и существуют при высоких концентрациях молекулярного кислорода, выделяя его в хлоропластах. Благодаря этому у растений эволюционно сформировалась сложная и эффективная система защиты от свободных радикалов [3, 4, 5, 6, 7], изучение компонентов которой является одним из важных вопросов современной науки.

Несмотря на систему антиоксидантной защиты, интенсификация окислительных процессов

в клетках растений под действием интенсивного светового излучения (особенно УФ-радиации) может спровоцировать так называемую фото-окислительную смерть, что в условиях Южного Урала наблюдается летом (растительность «выгорает»). Ситуацию усугубляет присутствие фитотоксичных веществ в промышленных атмосферных выбросах. В техногенных зонах значительно чаще наблюдаются повреждения растительности (хлорозы, некрозы, падение тургора, завядание и раннее опадание листьев, отмирание и задержка развития почек и др.) [1, 8]. Наиболее агрессивно воздействуют на растения газообразные растворимые вещества (NO2, SO2, H2S, углеводороды,

Рис. 1 - Карта превышения ПДК ОГПЗ с указанием точек сбора растительного сырья в техногенной зоне

озон), которые относительно легко включаются в метаболические процессы [1].

Продукты горения углеводородов и другие загрязнители атмосферы, попадая в растения, повышают содержание свободных радикалов. Это относится к некоторым компонентам смога (пероксиацетилнитратам), диоксиду серы, озону. Например, диоксид серы в хлоропластах способствует образованию серосодержащих свободных радикалов ^0% S•, ^^). Поэтому виды с пониженным уровнем ферментативного и неферментативного звена антиокислительной защиты в условиях атмосферного загрязнения имеют невысокую жизненность в результате окислительных повреждений мембран и постепенно вытесняются из фитоценозов более экоустойчивыми видами. Следовательно, устойчивость растений к загрязнению окружающей среды во многом определяется состоянием систем обезвреживания свободных радикалов. Многие исследователи отмечают, что наиболее устойчивые формы растений отличаются повышенной активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Растения обладают способностью индуцировать активность антиоксидантных систем в неблагоприятных условиях [4, 9, 10].

Для понимания механизмов адаптации растений к загрязнению среды нами проведён анализ содержания антиоксидантов в травянистых растениях, произрастающих на техногенно-загрязнённых участках и в контроле.

Целью проводимого нами исследования было изучение влияния промышленных выбросов Оренбургского газоперерабатывающего завода ООО «Оренбурггазпром» (рис. 1) на накопление веществ-антиоксидантов: полифенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ) и аскорбиновой кислоты в надземной части Ме1атругит praten.se Ь. Все вышеперечисленные биологически активные вещества (БАВ) обладают выраженным анти-окислительным действием, и препараты на их основе издавна применяются в народной и офи-цинальной медицине как противовоспалительные, ранозаживляющие, иммуномодулирующие и противоопухолевое средства [1, 6, 7].

Марьянник луговой (Ме1атругит pratense Ь.) — однолетнее травянистое полупаразитное растение сем. Норичниковые (Scrophulariaceae Juss.), мезофит, в центральных районах Оренбургской области произрастает куртинами (обилие до

4—5 баллов), встречается рассеянно, в лесозащитных полосах с сомкнутостью крон 0,3—0,5, на опушках колков в злаково-разнотравных и разнотравных травостоях с проективным покрытием 30—70%, с обилием 1—4 балла по шкале Друде. В народной медицине применяется под названием «Чёрная трава», оказывает седативное, нейролептическое действие, нормализует пищеварение, обладает инсектицидным, противовоспалительным, ранозаживляющим действием [4].

На первом этапе исследования нами проведён фитохимический анализ травы М. pratense Ь. на основные группы биологически активных веществ. При этом особое внимание мы обращали на содержание в исследуемом сырье флавоноидов (наиболее распространённых в природе полифенолов), фенолкарбоновых кислот (в плане распространения находящихся на втором месте после флавоноидов), дубильных веществ и аскорбата.

Флавоноиды — наиболее обширная группа фенольных соединений и важная составная часть растительного организма, так как принимают активное участие в окислительновосстановительных процессах в растениях и играют роль поглотителей свободных радикалов, предотвращая гибель клеток [3, 5, 11, 12].

Для обнаружения флавоноидов нами были применены реакции окрашивания (цианидино-вая проба), в результате было установлено, что трава М. pratense Ь. содержит флавоноиды группы флавона в значительных количествах (табл. 1).

Идентификация флавоноидов и оценка их количества в растениях М. pratense Ь., произрастающих на территории ОГПЗ, на границе санитарно-защитной зоны и на контрольной территории, определялись методом двумерной хроматографии (системы БУВ 4:1:5 и 15% ацетат) на бумаге восходящим способом. Установлено, что состав флавоноидов М. pratense Ь. различается в зонах с различной техногенной нагрузкой: отмечается изменение концентрации (размеры пятен, интенсивность их флуоресценции на хроматограммах) и качественного состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот (табл. 2, 3, 4).

Трава М. pratense Ь. в промышленной зоне обнаруживает на хроматограмме не менее шести (участок вблизи установок 1-й очереди ГПЗ) и восьми (возле административного корпуса ГПЗ) флавоноидов. Соответственно четыре и шесть веществ обнаруживают себя до проявления раствором А1С13 по тёмной и тёмно-коричневой

1. Результаты исследования травы Melampyrum pratense Ь., собранной в зоне действия промышленных выбросов ОГПЗ, на содержание флавоноидов

Результаты реакций окрашивания Литературные сведения о наличии веществ Окраска соединений (проба Синода) Раствор карбоната натрия Оценка содержания веществ

Присутствие флавоноидов + оранжевое зеленовато-жёлтое +

2. Хроматограмма полифенольных соединений в траве Melampyrum pratense Ь., собранного в зоне влияния установок первой очереди ОГПЗ

№ Значение М1 Значение И2 Окраска пятен в УФ-свете

до проявления в парах аммиака проявление А1С13

1 0,21 0,06 фиолетовый тёмно-фиолетовый светло-жёлтый

2 0,38 0,20 фиолетовый грязно-фиолетовый светло-жёлтый

3 0,54 0,31 бледно-фиолетовый жёлто-зелёный светло-жёлтый

4 0,59 0,49 светло-голубой голубой -

5 0,68 0,38 жёлто-голубой жёлто-голубой -

6 0,77 0,68 ярко-голубой ярко-голубой -

7 0,82 0,80 - - светло-бурый

8 0,89 0,81 - - светло-бурый

3. Хроматограмма полифенольных соединений в траве Melampyrum pratense Ь., собранного на территории административного корпуса ОГПЗ

№ Значение М1 Значение И2 Окраска пятен в УФ-свете

до проявления в парах аммиака проявление А1С13

1 0,21 0,50 тёмно-фиолетовый тёмно-фиолетовый светло-жёлтый

2 0,38 0,20 фиолетовый грязно-фиолетовый светло-жёлтый

3 0,45 0,17 тёмно-фиолетовый тёмно-фиолетовый -

4 0,54 0,31 фиолетовый фиолетовый светло-жёлтый

5 0,59 0,49 тёмно-фиолетовый фиолетовый светло-жёлтый

6 0,75 0,61 фиолетовый жёлто-зелёный светло-жёлтый

7 0,82 0,80 - - светло-бурый

8 0,89 0,81 - - светло-бурый

4. Хроматограмма пятен полифенольных соединений в траве Melampyrum pratense Ь.,

собранного на контрольном участке

№ Значение М1 Значение И2 Окраска пятен в УФ-свете

до проявления в парах аммиака проявление А1С13

1 0,27 0,01 фиолетовый грязно-фиолетовый желтый

2 0,31 0,26 фиолетовый грязно-зелёный коричневый

3 0,38 0,20 фиолетовый фиолетовый светло-жёлтый

4 0,58 0,79 - - грязно-зелёный

5 0,64 0,83 - - светло- зелёный

5. Результаты количественного определения флавоноидов в сырье Melampyrum pratense Ь.

Место Год Июнь Июль Август

фенофаза вегетация бутонизация-начало цветения цветение- плодоношение

2008 1,43±0,03 1,66±0,07 1,83±0,03

ОГПЗ 2009 1,45±0,05 - 1,78±0,04

2010 1,67±0,05 - 1,89±0,03

Холодные 2008 1,50±0,05 1,74±0,09 1,79±0,07

Ключи 2009 1,46±0,05 1,97±0,04 2,02±0,04

2010 1,49±0,05 1,78±0,05 1,97±0,05

Контроль 2008 1,03±0,05 1,23±0,05 1,46±0,04

2009 1,01±0,04 0,97±0,04 1,21±0,05

2010 1,06±0,06 1,17±0,04 -

окраске в УФ-свете. Два вещества (№ 7 и 8) видны лишь после проявления хроматограммы, что указывает на их незначительное количество. В зоне установок 1-й очереди обнаружено две фенолкарбоновых кислоты. На хроматограммах растений контрольной зоны также выявлено два пятна, принадлежащих фенолкарбоновым кислотам, но обнаруживаются они лишь после проявления в парах аммиака, флавоноидов же выявлено всего три. Результаты, приведённые в таблицах 2, 3, 4, указывают на расширение спектра антиоксидантов в траве М. pratense Ь. в зоне влияния выбросов ОГПЗ, что наблюдается как для соединений группы флавона, так и для фенолкарбоновых кислот.

Количественная оценка содержания флаво-ноидов и фенолкарбоновых кислот проводилась

методом фотоколориметрии с использованием хромогенных реактивов. Максимальная общая сумма флавоноидов отмечена в районе установок 1-й очереди ОГПЗ и возле поселка Холодные Ключи (табл. 5).

Таким образом, результаты исследования флавоновых соединений свидетельствуют об адаптивных изменениях хода метаболических процессов и фитохимического состава растений, произрастающих в зоне действия ОГПЗ.

Хроматограмма со свидетелями позволили идентифицировать в надземной части Melampyrum pratense Ь. следующие флавоноиды группы флавона:

— 5, 7, 4'-триоксифлавон (апигенин);

— 5, 7, 3', 4'-тетраоксифлавон (лютеолин);

— 5, 3', 4'-триоксифлавон-7-0-в^-глюкопи-ранозид (цинарозид).

Лютеолин-7-глюкозид

Апигенин

Цинарозид

Хлорогеновая кислота

Кофейная кислота

Феруловая кислота

Тем же методом были идентифицированы кофейная, хлорогеновая и феруловая кислоты.

Все указанные биологически активные вещества относятся к полифенолам и, следовательно, обладают способностью тормозить перекисное окисление липидов клеточных мембран, которое условно отражено следующей схемой [2]:

1) образование R•

2) R + О2 > R02

3) R02• + RH > R00H + R•

Причины первичной генерации радикалов ^•) разнообразны: радикалы могут быть образованы при взаимодействии О2 с молекулами основного вещества, при гомолитическом рас-

паде примесных молекул, в результате реакций с участием соединений металлов переменной валентности, присутствующих в следовых концентрациях, при действии естественного света, ионизирующего излучения, в реакциях с участием озона и синглетного кислорода [6]. Фенольные соединения способны блокировать взаимодействие окисляющегося субстрата с пере-кисным радикалом и, следовательно, тормозить цепное окисление:

РЮН + R02• > РЮ- + R00H.

В результате при окислении фенолят-иона образуется феноксильный радикал, который претерпевает димеризацию с образованием связей С-С или С-О [9]:

Таким образом, исходя из химической структуры и свойств фенольных соединений, можно предположить, что индукция их синтеза в растениях техногенных зон вероятнее всего связана с мощным антиоксидантным (мембраностабилизирующим, цитозащитным) действием указанных соединений.

Из других групп полифенольных соединений в сырье М. praten.se Ь. обнаружены дубильные вещества (таниды). Наибольшее количество танидов в надземной части М. pratense Ь. отмечается на границе санитарной зоны и вблизи административного корпуса ГПЗ. В зоне промышленных установок ГПЗ содержание тани-дов ниже контрольного, что возможно связано с подавлением процессов синтеза и явлением дистресса у растений (табл. 6).

Аскорбиновая кислота способствует повышению устойчивости растений к неблагоприятным условиям обитания [4, 5, 9], что объясняется не в последнюю очередь ее антиокислительной способностью. Результаты проведённого нами количественного определения аскорбиновой кислоты свидетельствуют о повышении её синтеза в загрязнённой атмосфере (табл. 7).

По данным некоторых зарубежных и отечественных исследований, обводнённость листьев культурных растений служит одним из показателей загрязнения атмосферы [1, 2]. Как известно, недостаток увлажнения является дополнительным фактором, усиливающим уровень фото-окислительного стресса в тканях растений [2]. Наши экспериментальные данные указывают на дефицит влаги, испытываемый растениями марьянника в техногенной зоне (табл. 8).

Результаты исследований позволили нам сделать следующие выводы.

1. Анализ биологически активных веществ, содержащихся в траве (надземных органах) М. pratense Ь., выявил наличие в указанном растении полифенолов, алкалоидов и витаминов. В составе полифенольного комплекса обнаружены дубильные вещества, иридоиды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты.

2. Изменение метаболических процессов в тканях М. pratense Ь., произрастающих в техногенной зоне вблизи Оренбургского газоперерабатывающего завода, направлено на индукцию синтеза флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танидов и аскорбиновой кислоты.

6. Содержание дубильных веществ в траве Melampyrum pratense Ь.

№ Место сбора Содержание танидов

2008 2009

1 Пром. зона установок ОГПЗ 2,02±0,22 2,09±0,22

2 Территория административного корпуса ОГПЗ 2,51±0,30 2,68±0,24

3 Г раница санитарной зоны ГПЗ (п. Холодные Ключи) 2,65±0,25 3,10±0,26

4 Контроль 2,12±0,20 2,15±0,25

7. Содержание аскорбиновой кислоты в свежем и сухом сырье Melampyrum pratense Ь.

Год сбора Содержание в свежих листьях Содержание в сухих листьях

Установки 1-й очереди Контроль Установки 1-й очереди Контроль

2006 3,8±0,2 2,4±0,2 6,7±0,3 4,0±0,3

2008 2,7±0,2 2,1±0,2 5,2±0,4 3,3±0,2

8. Сравнительный анализ содержания влаги в растениях Melampyrum pratense Ь. техногенной и санитарно-защитной зон

Место и сроки сбора Промплощадка 1-й очереди Контроль Жилпосёлок Холодные Ключи

2QQ7 2QQ8 2QQ9 2QQ7 2QQ8 2QQ9 2QQ8 2QQ9

Содержание влаги в траве (%) 59±1 - 58±1 66±1 62±1 67±1 - 57±1

4. Способность к индукции синтеза важных компонентов неферментативной антиокисли-тельной защиты в условиях техногенного влияния является одним из механизмов адаптации высших растений к загрязнению окружающей среды.

Литература

1. Зайков Г.С. и др. Кислотные дожди и окружающая среда. М.: Химия, 1991.

2. Thomashov M.F. Free Radicals, xidative Stress and Antioxidants / M.F. Thomashov // Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. 1999. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50: 571-591.

3. Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений // Северо-Кавказский научный центр высш. шк. Ростов-на-Дону: Изд. Рост. ун-та, 1988. 143 с.

4. Гусев Н.Ф., Немерешина О.Н. О некоторых аспектах рационального использования лекарственных растений Предуралья // Известия ОГАУ. 2009. № 2(22). С. 308-311.

5. Благовещенский А.В. Биохимическая эволюция цветковых растений. М.: Наука, 1966. 327 с.

6. Sroka Z., Fecka I., Cisowski W. Antiradical and anti-H2O2 properties of polyphenolic compounds from an aqueous peppermint extract II Z. Naturforsch. 2005. Vol. 60, No. 11-12. P. 826-832.

7. Ueda H., Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an antiinflammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens II Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, No. 9. P. 1197-1202.

8. Vinson Joe A., Dabbagh Yousef A, Serry Mamdouh M. Plant Flavonoids, Especially Tea Flavonols, Are Powerful Antioxidants Using an in Vitro Oxidation Model for Heart Disease II Food Chem., 1995, 43 (11). P. 2800-2802.

9. Horhammer L., Hansel R. Zur Analytik der Flavone. II. Uber das Komplex-bildungs - vermgen einiger Oxyflavone und die Konstitution der in Polygonum hydropiper L. verkommenden Rhamnazinesters II Arch. Pharm. 1953. Vol. 286. № 8. S. 425.

10. Tomas-Barberan F., Girl M., Ferreres F. Title correlations between flavonoids composition and infrageneric taxonomy of some European Galeopsis species II Phytochem. 199.

11. Кенжебаева С.Т., Кульмагамбетова Э.А., Прибыткова ЛЛ. и др. Флавоноиды Achillea glabella Kar. Et Kir. II Физиологобиохимические аспекты изучения лекарственных растений: матер. междунар. совещ., посвящ. памяти В.Г. Минаевой. Швосибирск, 1998. С. 56.1. Vol. 30. № 10. P. 3311-3314.

12. Галишевская Е.Е., Петриченко В.М. Определение суммы флавоноидов б траве марьянника лугового II Фармация. 2004. №1. С. 24-25.