Пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера
PEPTIDE HAVING THERAPEUTIC EFFECT AGAINST ALZHEIMER'S DISEASE

Изобретение относится к области биохимии, конкретно, к новому биологически активному соединению - пептиду, обладающему лечебным действием против болезни Альцгеймера, и может быть использовано для создания препарата для терапии болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к потере памяти, психическим расстройствам и неизбежной смерти. В настоящее время в медицинской практике применяют препараты для симптоматического лечения БА методами компенсаторной терапии. Использование этих препаратов позволяет в некоторой мере задержать процесс прогрессирования болезни, но не излечить ее.
Известны широко применяемые препараты, относящиеся к классу ингибиторов ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Ингибиторы АХЭ увеличивают время действия нейромедиатора ацетилхолина на постсинаптические рецепторы, что ведет к усилению холинергической нейротрансмиссии [Гаврилова С.И. Фармакотерапия болезни Альцгеймера. М.: Пульс, 2007. 359 с.].
Недостаток ингибиторов АХЭ состоит в существенном снижении эффективности этих препаратов на поздних стадиях БА. Ингибиторы АХЭ характеризуются достаточно высокой токсичностью и рядом других побочных эффектов [Watkins, P.B. et all. J. Am. Med. Assoc. 1994. V. 271. P. 992-998].
Известен препарат другого класса для симптоматического лечения БА - модулятор глутаматэргической системы, мемантин [Raina P. at all // Ann. Intern. Med. 2008. V. 148(5). P. 379-397]. Наилучшие результаты дает его применение у больных с мягкой и умеренной деменцией альцгеймеровского типа, вместе с тем, препарат не обеспечивает полного излечивания БА.
Важным недостатком компенсаторной терапии является то, что используемые средства не воздействуют на механизм развития БА. Поэтому интенсивные исследования ведутся по поиску лекарств для радикальной терапии БА, которые способны не только компенсировать симптоматические нарушения, но и излечивать заболевание.
Принципиально новым подходом является использование фрагментов белка рецептора конечных продуктов гликозилирования (RAGE) для лечения БА. RAGE - мультилигандный рецептор, который при гиперэкспрессии способствует развитию ряда патологий, таких как сахарный диабет, рост опухолей, болезнь Альцгеймера.
∧
Известно, что кроме RAGE, закрепленного в мембране клеток, в организме существует растворимая форма рецептора - sRAGE, которая, конкурируя с RAGE за связывание с лигандами, обладает способностью противодействовать нейродегенеративному процессу. Использование этого механизма считается перспективным для поиска соединений с терапевтической активностью. В настоящее время на разных стадиях исследований и клинических испытаний находятся несколько веществ полипептидной природы и малых молекул, обладающих такими свойствами [N.A. Calcutt, М.Е. Cooper, Т.S. Kern, and А.М. Schmidt, "Therapies for gyperglycaemia-induced diabetic complications: from animal models to clinical trials," Nature Reviews Drug Discovery, vol. 8, no. 5, pp. 417-429, 2009. В.V. Zlokovic, "New therapeutic targets in the neurovascular pathway in Alzheimer's disease, "Neurotherapeutics, vol. 5, no. 3, pp. 409114, 2008.].
Прототипом данного изобретения является пептид формулы Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala (I) [Патент РФ №2558242. Пептид, обладающий лечебным действием против болезни Альцгеймера / Бобкова Н.В. с соавт. // Бюллетень 2015. - №19]. Пептид (I) представляет собой состоящий из 17 аминокислотных остатков фрагмент неструктурированной петли V-домена рецептора RAGE человека. Интраназальное введение данного пептида достоверно восстанавливает пространственную память у мышей с экспериментально индуцированной БА. Вместе с тем было выявлено, что прекращение введения пептида (I) животным приводит к немедленному исчезновению терапевтического действия, что может быть объяснено нестабильностью препарата в условиях живого организма.
По сравнению с прототипом, у заявляемого пептида (II) N- и С-терминальные функциональные группы модифицированы: N-концевая аминофункция защищена ацетильной группой, а С-концевая карбоксильная функция конвертирована в амидную группу. Целью данной модификации является повышение устойчивости пептида к действию протеаз и, следовательно, увеличение продолжительности терапевтического действия.
На животной модели болезни Альцгеймера было показано, что заявляемый пептид (II) оказывает сходное с прототипом терапевтическое действие на животных. Вместе с тем пептид (II) оказывал существенно более длительный терапевтический эффект по сравнению со своим прототипом (I). Т.о. заявляемый пептид (II) обладает повышенной устойчивостью к действию протеаз, что благоприятствует пролонгации его терапевтического действия.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов, обладающих лечебным действием против болезни Альцгеймера.
Поставленная задача решается за счет пептида, обладающего лечебным действием против болезни Альцгеймера, формулы
2
Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH, где Ас - ацетил.
2
Сущностью изобретения является новое производное пептидного фрагмента белка RAGE формулы Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH (II), получаемое с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Предлагаемый препарат относится к терапевтическим средствам лечения БА. При интраназальном введении заявляемый синтетический пептид восстанавливает пространственную память трансгенных животных и, в отличие от прототипа, обеспечивает сохранение пространственной памяти после полной отмены препарата.
Техническим результатом изобретения является высокая терапевтическая эффективность, продолжительность действия после отмены препарата и отсутствие побочных эффектов при использовании пептида.
Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием аминометиллированного полимера - смолы Ринка (RINK Amide-AM resin). Конденсации осуществляют при помощи гексафторфосфата бензтриазол-1-ил-14-окси-бис(диметиламино)урония. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды.
Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2
Пример 1. Синтез пептида Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH (II).
Операция 1. Подготовка аминометиллированного полимера.
2
0,3 г аминометиллированного полимера с содержанием NH-групп 0,7 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. В реактор добавляют 10 мл 20%-го раствора пиперидина в диметилформамиде. Полимер при периодическом перемешивании выдерживают 20 мин, затем отфильтровывают и промывают диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 2. Получение Fmoc-Ala-полимера (III).
а) 0,196 г (0,63 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,215 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
б) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 3. Получение Fmoc-Val-Ala-полимера (IV).
а) Полученный Fmoc-Ala-полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,214 г (0,63 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,215 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 4. Получение Fmoc-Ser(But)-Val-Ala-полимера (V).
а) Fmoc-Val-Ala-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,242 г (0,63 ммоль) Fmoc-Ser(But)-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 5. Получение Fmoc-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (VI).
а) Ser(But)-Val-Ala-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,259 г (0,63 ммоль) Fmoc-Asp(But)-OH и 0,257 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 6. Получение Fmoc-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (VII).
а) Fmoc-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,269 г (0,63 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 7. Получение Fmoc-Pro-Trp-Asp(But:)-Ser(But)Val-Ala-полимера (VIII).
а) Fmoc-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,213 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 8. Получение Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (IX).
а) Fmoc-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,187 г (0,63 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 9. Получение Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (X).
а) Fmoc-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,187 г (0,63 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 10. Получение Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XI).
а) Fmoc-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,187 г (0,63 ммоль) Fmoc-Gly-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 11. Получение Fmoc-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XII).
а) Fmoc-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,232 г (0,63 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 12. Получение Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Cly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XIII).
а) Fmoc-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,213 г (0,45 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 13. Получение Fmoc-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XIV).
а) Fmoc-Pro-Gln-Gly-Gly-Cly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер(XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,242 г (0,63 ммоль) Fmoc-Ser(But)-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 14. Получение Fmoc-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Cly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XV).
а) Fmoc-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,223 г (0,63 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 15. Получение Fmoc-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XVI).
а) Fmoc-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,214 г (0,63 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,215 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 16. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера(XVII).
а) Fmoc-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,295 г (0,63 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 17. Получение Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Tip-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера (XVIII).
а) Fmoc-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,269 г (0,63 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,257 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 18. Получение H-Ala-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера(XIX).
а) Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,196 г (0,63 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,215 г (0,63 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 19. Получение Ac-Ala-Trp-Lys(Boc)-Val-Leu-Ser(But)-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp(But)-Ser(But)-Val-Ala-полимера(XX).
а) Полимер обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) Полимер обрабатывают раствором 60 мкл (0,63 ммоль) уксусного ангидрида и 110 мкл (0,63 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
2
Операция 20. Получение целевого пептида Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH (XXI). 0,3 г пептидил-полимера (XVI) обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10μ С18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч., скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт лиофилизуют.
Данные аминокислотного анализа Asp 1,0 (1), Ser 1,8 (2), Glu 1,2 (1), Pro 1,6 (2), Gly 3,4 (3), Ala 1,6 (2), Val 1,8 (2), Leu 1,0 (1), Lys 1,0(1).
По данным масс-спектрометрии МН+ 1796.2. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 11,7 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5μ С18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 15 мин, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.
Пример 2. Проведение биологических испытаний.
Эксперименты проводят на трансгенных мышах 5XFAD возрастом 2 месяца с оверэкспрессией предшественника амилоида АРР(695) с мутациями K670N, M671L, V717I и мутациями по пресенилину PS1: M146L, L287V. Данная животная модель воспроизводит основные признаки амилоидоза характерного для БА и используется как модель индуцированной β-амилоидом (1-42) нейродегенерации и формирования амилоидных бляшек. Контролем служат нетрансгенные мыши той же линии и возраста.
а) Из пептида, полученного по изобретению, готовят раствор в концентрации 5 мг/мл в физрастворе и начинают вводить мышам интраназально в объеме 4 мкл на одно животное ежедневно.
б) Через 2 месяца после начала введения пептида, не прекращая введения пептида, проводят обучение животных в водном лабиринте Морриса. Экспериментальная камера представляет собой пластиковый круглый бассейн с диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой с температурой 23°С. Площадь бассейна условно делится на четыре равных сектора, в одном из которых находится спасательная платформа диаметром 5 см и погруженная на 0,5 см от поверхности воды. Вода забеляется молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.
Для опытов отбирают мышей, умеющих хорошо плавать и быстро находить видимую спасательную платформу. В течение 5 дней проводят по четыре сеанса обучения ежедневно.
Уровень пространственной памяти у обученных животных тестируют в течение одной минуты при отсутствии спасательной платформы. Состояние пространственной памяти каждого животного оценивают по его способности помнить отсек обучения и выделять его из 3-х других индифферентных отсеков. В течение 1 минуты учитывают время пребывания животных в каждом отсеке и число заходов в них. Животными с хорошей памятью считают тех, время нахождения которых в отсеке обучения достоверно превышает время пребывания в каждом из других отсеков.
Тестирование пространственной памяти у животных, прошедших сеансы обучения проводят в два этапа: первый - на следующий день после окончания обучения на фоне продолжающегося интраназального введения испытываемого пептида, второй - спустя 6 дней после полной отмены препаратов и окончания первого тестирования.
В эксперименте используют 4 группы животных.
1-я группа (6 животных) - трансгенные животные, которым на протяжении 2-х месяцев ежедневно интраназально вводят по 4 мкл раствора 20 мкг пептида (I) в физ. растворе на животное.
2-я группа (6 животных) - трансгенные животные, которым на протяжении 2-х месяцев ежедневно интраназально вводят по 4 мкл раствора 20 мкг пептида (II) в физ. растворе на животное.
3-я группа (6 животных) - нетрансгенные животные, которым на протяжении 2-х месяцев ежедневно интраназально вводят по 4 мкл физ. раствора.
4-я группа (6 животных) - трансгенные животные, которым на протяжении 2-х месяцев ежедневно интраназально вводят по 4 мкл физ. раствора.
Результаты тестирования пространственной памяти показаны на фиг. 1. В ходе первого этапа тестирования у животных, получавших прототип (I) и заявляемый пептид (II) и нетрансгенных животных (группы 1, 2 и 3 соответственно) выявлен сходный уровень пространственной памяти, т.е. они достоверно выделяли сектор обучения лабиринта Морриса как по времени пребывания (А), так и по числу заходов в секторы (Б)), трансгенные мыши из контрольной группы 4, получавшие физ. раствор, были не способны запомнить сектор лабиринта, в котором при обучении находилась спасательная платформа.
Фиг. 1. Результаты тестирования пространственной памяти трансгенных 5XFAD мышей, после интраназального введения прототипа (I) и заявляемого пептида (II).
А, Б - результаты тестирования по окончании курса введения исследуемых пептидов; В, Г - результаты тестирования спустя 6 дней после окончания курса введения исследуемых пептидов. Показано время нахождения мышей (А, В) и число заходов (Б, Г) в секторы 1-4 лабиринта Морриса, сектор обучения 3 соответствует черному столбику на гистограмме.
1 группа - трансгенные мыши после введения прототипа (I);
2 группа - трансгенные мыши после введения заявляемог пептида (II);
3 группа - нетрансгенные мыши;
4 группа - трансгенные мыши после введения физ. раствора.
Уровень значимости *р < 0.01; ** р < 0.001; *** р < 0.0001.
В ходе второго этапа тестирования было выявлено, что способность выделять сектор обучения лабиринта Морриса по времени пребывания в секторах (В) и числу заходов в них (Г) сохранялась только у мышей, получавших заявляемый пептид (II) и контрольных нетрансгенных животных (группы 2 и 3 соответственно). Мыши, получавшие прототип (I) (группа 1) способность выделять сектор обучения утратили. Результаты тестирования на втором этапе позволяют утверждать, что заявляемый пептид (II) по сравнению со своим прототипом (I) обладает более длительным терапевтическим действием.
г) Токсичность полученного пептида (II) исследуют на экспериментальных животных в системе in vivo. Исследование проводят на линейных мышах линии Balb/c весом 20 г с использованием максимальной дозы пептида 1 мг, вводимой подкожно. Животных держат под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности исследуемого препарата не выявлено.
2
Таким образом, получен новый пептид формулы Ac-Ala-Trp-Lys-Val-Leu-Ser-Pro-Gln-Gly-Gly-Gly-Pro-Trp-Asp-Ser-Val-Ala-NH, который обладает лечебным действием против болезни Альцгеймера.