ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ОСПЫ СВИНЕЙ
POLYVALENT RECOMBINANT SWINE POX VIRUS

Данное изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам оспы свиней и их применению в вакцинных композициях. Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению несут два генных дефекта и обеспечивают эффективную экспрессию одной или более нуклеотидных последовательностей чужеродных генов in vivo. Данное изобретению в особенности ценно для получения вакцин против инфекций свиней, в частности для вакцинации свиней против цирковирусной инфекции свиней типа 2 (PCV2).
Уровень техники
В данной области техники предлагались различные типы вирусов в качестве векторов для внедрения генов или экспрессии пептидов in vivo. В частности, были получены вакцины для ветеринарного применения, которые обеспечивали экспрессию по меньшей мере одного нужного антигена, с использованием рекомбинантных вирусов, например поксвирусов (Ogawa R. et al., Vaccine, 8:486-490 (1990)), аденовирусов (HSU, K. H. et al., Vaccine, 12; 607-612 (1994)), бакуловирусов, а также герпесвирусов (Shin, M.-F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:5867-5870 (1984)). Примеры специфичных вирусных векторов, обеспечивающих экспрессию гена чужеродного антигена, включают вирус болезни Ауески (вируса псевдобешенства; РRV) (Van Zijl M. et al., J. Virol., 65:2761-2765 (1991)), герпесвирус индеек (HVT) (Morgan R. W. et al., Avian Dis. 36:858-870 (1992)) и вирус болезни Марека (MDV). Интенсивно изучаются рекомбинантные вирусы на основе герпесвирусов.
Тем не менее в данной области техники имеется настоятельная потребность в новых векторах - продуктах на основе вирусов, которые можно было бы использовать для экспрессии рекомбинантных пептидов или белков in vivo. В этой связи проводились генноинженерные манипуляции с поксвирусами для придания им способности кодировать различные полипептиды. Поксвирусы, попав в кровоток из инфицированных ими клеток, способны заражать другие клетки, что потенциально ведет к повышенному уровню экспрессии вирусных белков. Рекомбинантные поксвирусы получены из различных природных поксвирусов, включая вирус коровьей оспы, вирус осповакцины и вирус оспы свиней (SPV). На сегодняшний день рекомбинантные вирусы оспы свиней получают в основном путем клонирования нуклеотидных последовательностей чужеродных генов в области вирусного генома, обозначаемой ТК (гены тимидинкиназы), которая считается не существенной для выживания вируса оспы свиней (Richard W. Moyer, Eladio Vinuela, E. P. J. Gibbs, US5,651,972 (1997)).
В патентной заявке PCT/EP2015/080468, поданной заявителем настоящей заявки, описывается нуклеотидная последовательность гена белка, связывающего интерлейкин-18 (IL18bp), в качестве нового и предпочтительного сайта клонирования в SPV.
Продолжая эти исследования, авторы данного изобретения обнаружили, что если вирус оспы свиней несет два генетических дефекта, а именно дефект гена IL18bp и какого-либо из генов TK или ARP, то обеспечивается эффективная и стабильная экспрессия нуклеотидных последовательностей нескольких чужеродных генов in vivo, причем вирус хорошо размножается в культуре и сильно ослаблен in vivo. Таким образом. эти SPV с двумя дефектами проявляют улучшенные с точки зрения вакцинации свойства и их можно использовать для создания терапевтических средств или вакцин для лечения любых млекопитающих, в частности свиней.
Раскрытие изобретения
Данное изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам оспы свиней и их применению для внедрения генов и их экспрессии in vivo, в частности в вакцинных композициях. Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению несут два генных дефекта, а именно в гене IL18bp и в каком-либо из генов TK и/или ARP. Варианты
SPV по данному изобретению предпочтительно содержат нуклеотидные последовательности одного или более чужеродных генов, предпочтительно клонированных в областях дефектных генов тимидинкиназы (TK), белка с анкириновыми повторами (ARP) или IL18bp вируса оспы свиней. Данное изобретение особенно ценно при создании вакцин для свиней, в частности для вакцинации свиней против инфекции PCV2.
Итак, первая задача данного изобретения относится к рекомбинантным вирусам оспы свиней (rSPV), у которых имеются по меньшей мере первый и второй дефектные вирусные гены, причем первый дефектный вирусный ген - это ген IL18bp, а второй - ген тимидинкиназы (TK) или ген белка с анкириновыми повторами (ARP).
В одном из конкретных воплощений данного изобретения предлагается рекомбинантный вирус оспы свиней (rSPV), содержащий дефектные гены IL18bp и ТК.
В другом конкретном воплощении данного изобретения предлагается рекомбинантный вирус оспы свиней (SPV), содержащий дефектные гены IL18bp и ARP/
Предпочтительно у рекомбинантного вируса оспы свиней (rSPV) по данному изобретению имеется делеция длиной по меньшей мере 50 пар нуклеотидов, по меньшей мере 100 пар нуклеотидов, по меньшей мере 200 пар нуклеотидов или даже по меньшей мере 300 пар нуклеотидов в каждой из нуклеотидных последовательностей указанных дефектных вирусных генов. Кроме того, в одном из предпочтительных воплощений данного изобретения rSPV также содержит нуклеотидную последовательность по меньшей мере одного чужеродного гена, которая может располагаться в любом месте генома rSPV, предпочтительно заменяя полностью или частично делетированную последовательность вирусного гена. В одном из конкретных воплощений данного изобретения предлагаемый rSPV содержит нуклеотидные последовательности двух чужеродных генов, их которых первая располагается на месте делетированной нуклеотидной последовательности вирусного гена IL18bp, а вторая - вставлена на место делетированной вирусной нуклеотидной последовательности гена TK или ARP.
Другой целью данного изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, содержащая геном рекомбинантного вируса оспы свиней (rSPV), описанного выше.
Другой целью данного изобретения является клетка-хозяин, несущая рекомбинантный вирус оспы свиней ((rSPV) или указанную молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению.
Данным изобретением также предлагается способ получения rSPV, включающий инфицирование компетентной клетки или введение в нее описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты и сбор вирионов rSPV.
Данным изобретением также предлагается способ распространения rSPV, включающий инфицирование компетентных клеток рекомбинантным вирусом оспы свиней, описанным выше, и сбор вирионов rSPV, произведенных указанными клетками.
Данное изобретение относится также к композиции, предпочтительно к композиции для применения в ветеринарии, содержащей описанные выше рекомбинантный вирус оспы свиней, или указанные клетки, или молекулы нуклеиновой кислоты и эксципиент.
Другой целью данного изобретения является вакцинная композиция, содержащая описанные выше рекомбинантный вирус оспы свиней (rSPV), или клетки-хозяева, или молекулы нуклеиновой кислоты, пригодный эксципиент и при необходимости адъювант.
Данное изобретение относится также к описанным выше рекомбинантному вирусу оспы свиней, или клеткам-хозяевам. или молекулам нуклеиновой кислоты для использования с целью внедрения в организм свиньи пептидов или белков с терапевтическим или вакцинирующим эффектом.
Данное изобретение относится также к описанным выше рекомбинантному вирусу оспы свиней, или клеткам-хозяевам, или молекулам нуклеиновой кислоты для использования при иммунизации или вакцинации млекопитающих, предпочтительно свиней, против патогенных агентов.
Данное изобретение относится также к способу вакцинации млекопитающих, предпочтительно свиней, против патогенных агентов, включающему введение в организм указанного млекопитающего описанных выше рекомбинантного вируса оспы свиней, или клеток-хозяев, или молекул нуклеиновой кислоты.
Данное изобретение относится также к набору для вакцинации, предназначенному для иммунизации свиней и включающему
a. эффективное количество описанных выше rSPV или вакцины и
b. средства для введения указанных rSPV или вакцины в организм свиньи.
Данное изобретение можно применять для внедрения в организм млекопитающего, в частности свиньи, нуклеотидной последовательности чужеродного гена и ее экспрессии. Данное изобретение особенно подходит для экспрессии чужеродных антигенов с целью иммунизации или вакцинации свиней (например, поросят, взрослых самок, взрослых самцов).
Краткое описание иллюстраций
Фиг. 1. Схема конструирования промежуточной плазмиды pSP91.
Фиг. 2. Схема конструирования гомологичных плазмид pSP911-Ess_ORF2cc и pSP911-ORF2cc.
Фиг. 3. Схема конструирования гомологичной плазмиды pSP53-ORF2.
Фиг. 4. Схема конструирования гомологичной плазмиды pSP72-ORF2.
Фиг. 5. Структура генома рекомбинантных вирусов оспы свиней.
Фиг. 6. Проверка SVR14 и SVR15, пассированных in vitrо, путем полимеразной цепной реакции.
(A) Результаты полимеразной цепной реакции (PCR). Для PCR использовали набор праймеров SP7450F и SP8552R. В качестве матриц использовали ДНК пассированных in vitrо SVR14 и SVR15 (+0р) или (+15p). Каждая из плазмид, использовавшихся при трансфекции для получения SVR12, SVR14 или SVR15 и pCR4-SPV6030/9574, служила матрицей для положительного (РС) или отрицательного контроля (NC) соответственно. В качестве маркеров молекулярной массы использовали ДНК длиной 10 килобаз (M1) и pHY. (B) Фланкирующие участки гена IL-18bp исходного SPV и рекомбинантных вирусов SVR14 и SVR15. Желтым цветом изображен ген IL-18bp.
Фиг. 7. Результаты вестерн-блоттинга очищенных рекомбинантных вирусов оспы свиней. Клетки ESK-4 заражали вирусом дикого типа (wtSPV), или SVR14 (14), или SVR15 (15). Через 6 суток лизаты клеток анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (15% SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга с использованием крысиной сыворотки против ORF2 (1:500), конъюгированных с биотином козьих антител против крысиного IgG (1:1000), авидин-биотин-пероксидазного комплекса (АВС) и щелочной фосфатазы (ALP) (Vecterstain). M - маркер молекулярной массы.
Фиг. 8. Проверка SVR16 и SVR17, пассированных in vitrо, путем полимеразной цепной реакции.
(A) Результаты полимеразной цепной реакции (PCR). Для PCR использовали набор праймеров P05-8 и P05-9. В качестве матриц использовали ДНК пассированных in vitrо SVR16 и SVR17 (+0р и +15p). Использовавшиеся при трансфекции плазмиды pSP53-ORF2 и pNZSP5 (описаны в Эксперименте 3 и на фиг. 3 патента Японии №2003-111591A) служили матрицами для положительного контроля (PC) и отрицательного контроля (NC) соответственно. В качестве маркеров молекулярной массы использовали ДНК длиной 10 килобаз (M1) и λ/HindIII (M2). (B) Фланкирующие участки гена ARP исходного SPV и рекомбинантных вирусов SVR16 и SVR17.
Фиг. 9. Проверка SVR20, пассированного in vitrо, путем полимеразной цепной реакции.
(A) Результаты полимеразной цепной реакции (PCR). Для PCR использовали два набора праймеров: (a) SP7450F и SP8552R, (b) SP55500F и SP56363R. В качестве матриц использовали ДНК SVR20 (+0р) или (+15p). Каждая из плазмид pCR4-SPV6030/9574 (N1) или pCR4-SPV54242/57617 (N2), и pSP911-ORF2cc (P1) или pSP72-ORF2 (P2) служила матрицей для отрицательного и положительного контроля. Продукты полимеразной цепной реакции (а) или (b) наносили на агарозный гель (2% или 0,8% соответственно) В качестве маркеров молекулярной массы использовали ДНК длиной 10 килобаз (M1) и pHY (М2). (B) Фланкирующие участки гена ТК вируса оспы свиней дикого типа (wtSPV) и SVR20. Желтым цветом изображен ген ТК.
Фиг. 10. Результаты вестерн-блоттинга очищенных рекомбинантных вирусов оспы свиней. Клетки ESK-4 заражали вирусом оспы свиней дикого типа (wtSPV) или рекомбинантными вирусами SVR14 (14), SVR15 (15), SVR16 (16), SVR17 (17) или SVR20 (20) с множественностью заражения (M.O.I.), составляющей 0,1. Через 6 суток клетки лизировали и с лизатами проводили электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (15% SDS-PAGE) и вестерн-блоттинг с использованием крысиной сыворотки против ORF2 (1:500), конъюгированных с биотином козьих антител против крысиного IgG (1:1000), авидин-биотин-пероксидазного комплекса (АВС) и щелочной фосфатазы (ALP) (Vecterstain). M - маркер молекулярной массы.
Фиг. 11. Изменение размеров участка покраснения кожи у свиней в месте иммунизирующей инъекции.
Осуществление изобретения
Данное изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам оспы свиней и их применению. Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению несут два генных дефекта, а именно в гене IL18bp и во втором гене, выбираемом из генов TK и ARP вируса оспы свиней, и предпочтительно содержат одну или более чужеродных нуклеотидных последовательностей. Как продемонстрировано в экспериментальной части настоящего документа, такие векторы с двумя генными дефектами на основе вирусов оспы свиней, обеспечивают эффективную генную экспрессию. Также рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению стабильны и способны вызывать усиленный иммунный ответ in vivo. Кроме того, векторы на основе SPV по данному изобретению сильно ослаблены. Наши публикации - первое сообщение о вирусах оспы свиней с двумя генным дефектами и первая демонстрация того, что такие вирусы обеспечивают экспрессию чужеродных нуклеотидных последовательностей, что позволяет создавать стабильные, иммуногенные, интенсивно размножающиеся рекомбинантные векторы на основе SPV. Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению могут содержать более одной чужеродной нуклеотидной последовательности; такие векторы можно использовать каждый сам по себе или в комбинации с другими рекомбинантными вирусами или антигенами с целью создания усовершенствованных вакцин. Данное изобретение, в частности, пригодно для создания вакцин для свиней, в том числе для вакцинации свиней против инфекции РCV2.
Рекомбинантные вирусы оспы свиней
В контексте данного изобретения термин «рекомбинантные вирусы оспы свиней (rSPV)» касается, как правило, вирусов оспы свиней, у которых геном искусственно подвергнут генноинженерному изменению по технологии рекомбинантных ДНК. Эти вирусы включают, в частности, вирусы оспы свиней, содержащие чужеродный генетический материал или встроенные в вирусный геном нуклеотидные последовательности. У рекомбинантных вирусов оспы свиней геном, как правило, содержит чужеродную нуклеотидную последовательность, упакованную в вирусный капсид или оболочку, которые могут также содержать чужеродный белок или пептид.
Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению получают, исходя из какого-либо SPV, например, любого природного SPV или какого-либо SPV, имеющегося в доступных коллекциях, например Американской коллекции типовых культур клеточных линий? штаммов и другой микробиологической продукции (ATCC), Французской национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) и др. Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению получают предпочтительно из штамма SPV Кasza (VR-363), изолят 17077-99 (идентификатор записи в GeneBank: AF410153.1) или штамма VTCC/AVA/121 (идентификатор записи в GeneBank: KJ725378.1). Такие вирусы можно найти в коллекциях или библиотеках, или клонировать по их доступным геномным последовательностям. Также изоляты вируса оспы свиней можно выделять из инфицированных животных и затем использовать для получения rSPV по данному изобретению.
2,
SPV или rSPV клонируют, или поддерживают, или размножают в культуре подходящих для этого клеток. Например, SPV можно культивировать, или поддерживать, или размножать в эмбриональных почечных клетках свиньи, например в клетках линии ESK-4 (CL-184); культивирование обычно проводят при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% COв среде Хэма F-12K (производства компании Gibco, номер по каталогу 21127-022), дополненной стрептомицином-пенициллином (1%) (Gibco, номер по каталогу 15140-122) и фетальной бычьей сывороткой (FBS; 5%) (Gibco, номер по каталогу 10437-028).
Чтобы сконструировать рекомбинантный вирус по данному изобретению, вначале вирус оспы свиней размножают в подходящих клетках-хозяевах и выделяют геномную ДНК. В ней идентифицируют области IL18bp, TK и/или ARP и делают их дефектными (например, частично или полностью удаляют). После этого или одновременно в геномную ДНК встраивают чужеродную нуклеотидную последовательность (или сайт клонирования, обеспечивающий вставку чужеродной нуклеотидной последовательности), при необходимости на месте удаленной эндогенной нуклеотидной последовательности. Полученный таким образом рекомбинантный геном SPV используют для получения rSPV путем трансформации подходящих компетентных клеток, применяя для этого обычные в таких случаях методы. Или же создают бифункциональный (челночный) вектор, содержащий чужеродную нуклеотидную последовательность (или сайт клонирования) в кодирующей области и фланкированной последовательностями, гомологичными областям генов IL18bp, TK и/или ARP. Челночный вектор вводят в компетентные клетки в присутствии SPV или его генома, и между ними происходит гомологичная рекомбинация, в результате чего получается rSPV, содержащий дефектные гены и чужеродную нуклеотидную последовательность. Созданный таким образом рекомбинантный вирус оспы свиней нетрудно размножить путем культивирования в каких-либо компетентных клетках.
2,
SPV можно культивировать, поддерживать или размножать в эмбриональных почечных клетках свиньи, например в клетках линии ESK-4 (CL-184); культивирование обычно проводят при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% COв среде Хэма F-12K (производства компании Gibco, номер по каталогу 21127-022), дополненной стрептомицином-пенициллином (1%) (Gibco, номер по каталогу 15140-122) и фетальной бычьей сывороткой (FBS; 5%) (Gibco, номер по каталогу 10437-028). ДНК выделяют из зараженных вирусом клеток любым обычно применяемым для такой цели методом. Например, указанные клетки выращивают в однослойной культуре, собирают со стенок культурального сосуда, проводят лизис клеток и центрифугируют, чтобы получить супернатант. После денатурации белков в буферном растворе для лизиса и их удаления выделяют ДНК путем экстракции фенолом и/или осаждения этиловым спиртом.
В контексте данного изобретения термин «дефектный ген» означает ген с делецией или полностью удаленный. Говоря конкретнее, SPV, содержащий дефектный ген, это вирус оспы свиней, у которого в кодирующей области определенного гена имеется делеция длиной по меньшей мере 20 пар нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 50 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 100 пар нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 150 пар нуклеотидов, по меньшей мере 200 пар нуклеотидов или даже по меньшей мере 300 пар нуклеотидов.
В нуклеотидной последовательности гена IL18bp вируса оспы свиней приблизительно 402 пары оснований; как правило, эта последовательность располагается в участке от 7745-го до 8146-го нуклеотида генома SPV. В качестве конкретного примера можно привести штамм SPV Кasza (VR-363), у которого ген IL18bp находится между 7745-м и 8146-м нуклеотидами геномной ДНК. Точное положение гена IL18bp у любого штамма SPV нетрудно установить обычными в таких случаях способами - путем секвенирования ДНК и/или выравнивания последовательностей.
В нуклеотидной последовательности гена ТК вируса оспы свиней приблизительно 543 пары оснований; как правило, эта последовательность располагается в участке от 55625-го до 56167-го нуклеотида генома SPV. В качестве конкретного примера можно привести штамм SPV Кasza (VR-363), у которого ген ТК находится между 55625-м и 56167-м нуклеотидами геномной ДНК. Точное положение гена ТК у любого штамма SPV нетрудно установить обычными в таких случаях способами - путем секвенирования ДНК и/или выравнивания последовательностей.
В нуклеотидной последовательности гена ARP вируса оспы свиней приблизительно 1455 пар оснований; как правило, эта последовательность располагается в участке от 137100-го до 138554 -го нуклеотида генома SPV. В качестве конкретного примера можно привести штамм SPV Кasza (VR-363), у которого ген ТК находится между 137100-м и 138554-м нуклеотидами геномной ДНК. Точное положение гена ТК у любого штамма SPV нетрудно установить обычными в таких случаях способами - путем секвенирования ДНК и/или выравнивания последовательностей.
Предпочтительные рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению содержат дефектный ген IL18bp, представляющий собой эндогенную нуклеотидную последовательность IL18bp, в которой отсутствуют по меньшей мере 50 пар нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 150 пар нуклеотидов, по меньшей мере 200 пар нуклеотидов, по меньшей мере 250 пар нуклеотидов, по меньшей мере 300 пар нуклеотидов, еще более предпочтительно от 320 пар нуклеотидов до 380 пар нуклеотидов. В конкретных предпочтительных rSPV по данному изобретению в гене IL18bp делетированы по меньшей мере 100-200 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 50-300 пар нуклеотидов, например нуклеотидные пары с 31-й по382-ю или с 19-й по 369-ю.
Предпочтительные рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению содержат также дефектный ген TK, представляющий собой эндогенную нуклеотидную последовательность ТК, в которой отсутствуют по меньшей мере 50 пар нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 150 пар нуклеотидов, по меньшей мере 200 пар нуклеотидов, по меньшей мере 250 пар нуклеотидов, по меньшей мере 300 пар нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 400 пар нуклеотидов, например от 420 до 500 пар нуклеотидов. В конкретных предпочтительных rSPV по данному изобретению в гене ТК имеется делеция длиной по меньшей мере 100-300 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 70-450 пар нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 60-500 пар нуклеотидов, например делетированы нуклеотидные пары с 59-й по 536-ю.
Предпочтительные рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению содержат также дефектный ген ARP, представляющий собой эндогенную кодирующую нуклеотидную последовательность ARP, в которой отсутствуют по меньшей мере 50 пар нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 100 пар нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 110 пар нуклеотидов. В конкретных предпочтительных rSPV по данному изобретению в гене ARP делетированы нуклеотидные пары по меньшей мере с 1150-й по 1200-ю, более предпочтительно по меньшей мере с 1130-й по 1220-ю, еще более предпочтительно по меньшей мере с 1116-й по 1228-ю. Можно вносить в ген ARP и более крупные делеции - длиной от 800 до 1300 пар нуклеотидов.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения в геноме rSPV делетированы нуклеотидные пары по меньшей мере с 50-й по 300-ю нуклеотидной последовательности гена IL18bp и нуклеотидные пары по меньшей мере с 70-й по 450-ю нуклеотидной последовательности гена TK. В одном из конкретных воплощений данного изобретения в геноме rSPV делетированы нуклеотидные пары с 31-й по 382-ю или с 19-й по 369-ю нуклеотидной последовательности гена IL18bp и нуклеотидные пары с 59-й по 536-ю нуклеотидной последовательности гена TK.
В другом конкретном воплощении данного изобретения в геноме rSPV делетированы нуклеотидные пары по меньшей мере с 50-й по 300-ю нуклеотидной последовательности гена IL18bp и нуклеотидные пары по меньшей мере с 11340-й по 1220-ю нуклеотидной последовательности гена ARP. В одном из конкретных воплощений данного изобретения в геноме rSPV делетированы нуклеотидные пары с 31-й по 382-ю или с 19-й по 369-ю нуклеотидной последовательности гена IL18bp и нуклеотидные пары с 11116-й по 1228-ю нуклеотидной последовательности гена TK.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения rSPV содержит одну чужеродную нуклеотидную последовательность, вставленную на место одного из указанных выше делетированных участков. В другом воплощении данного изобретения rSPV содержит по меньшей мере две чужеродных нуклеотидных последовательности, расположенных в разных местах генома, выбираемых из указанных выше делетированных участков.
Сконструировать rSPV по данному изобретению можно известными специалистам в данной области техники методами, следуя рекомендациям и сведениям, содержащимся в настоящем документе. В частности, можно встроить чужеродную нуклеотидную последовательность на место всей или части эндогенной последовательности TK, ARP или IL18bp, применяя такие методы, как мутагенез, полимеразная цепная реакция (PCR), гомологичная рекомбинация и др.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения, применяя технологию рекомбинантных ДНК, получают челночный вектор, в котором клонируют чужеродную нуклеотидную последовательность, фланкированную двумя гомологичными участками гена IL18bp или TK.Каждый из этих гомологичных участков содержит, как правило. от 50 до 1000 пар нуклеотидов из последовательности гена IL18bp или TK, что создает возможность гомологичной рекомбинации. Челночный вектор можно получить из любых известных и обычно используемых для такой цели плазмид, космид, фагов и проч., например из плазмид pBS, pBR322, pUC18, pUC19 и pHC79. Челночную плазмиду внедряют в клетки, зараженные SPV, применяя такие известные в данной области техники методы, как электропорация, соосаждение ДНК с фосфатом кальция, трансфекция с использованием липофектамина и др. Затем отбирают рекомбинантные вирусные частицы. в которые включилась чужеродная нуклеотидная последовательность. Полученную нуклеотидную последовательность проверяют путем секвенирования. После этого полученный rSPV поддерживают в каких-либо подходящих компетентных клетках; вирус можно сохранять в культуре клеток, либо выделять и очищать с последующим замораживанием или лиофилизацией.
В конкретных примерах rSPV по данному изобретению делетированы по меньшей мере 50 пар нуклеотидов в гене IL18bp и по меньшей мере 50 пар нуклеотидов в гене TK или ARP.
В предпочтительном варианте рекомбинантного вируса оспы свиней по данному изобретению делетированы по меньшей мере 100 пар нуклеотидов в гене IL18bp и по меньшей мере 100 пар нуклеотидов в гене TK или ARP.
В более предпочтительном варианте рекомбинантного вируса оспы свиней по данному изобретению делетированы по меньшей мере 200 пар нуклеотидов в гене IL18bp и по меньшей мере 200 пар нуклеотидов в гене TK или ARP.
Другой конкретный вариант вируса по данному изобретению - это рекомбинантный вирус оспы свиней (rSPV). в котором дефектен вирусный ген IL18bp и нет чужеродной кодирующей нуклеотидной последовательности. Такой вирус ослаблен, и его можно использовать для получения rSPV, содержащих чужеродные нуклеотидные последовательности, которые внедряют в участок генома. отличный от нуклеотидной последовательности гена IL18bp.
Чужеродные нуклеотидные последовательности
Чужеродной нуклеотидной последовательностью для внедрения в геном SPV может служить любая нуклеотидная последовательность или молекула нуклеиновой кислоты, в природе отсутствующая в геноме вируса оспы свиней или же не встречающаяся в природе в данном положении в геноме SPV. Чужеродная нуклеотидная последовательность для внедрения в геном SPV, как правило, содержит кодирующую последовательность для матричной молекулы рибонуклеиновой кислоты (мРНК), пептида или полипептида, или белка. Чужеродная нуклеотидная последовательность по данному изобретению может, например, кодировать различные активные молекулы, например антигены, адъюванты, цитокины, лимфокины, факторы роста, ферменты, метки и др.
В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует антиген (пептид, полипептид или белок) патогенного агента, вызывающего инфекционное заболевание у свиней, наиболее предпочтительно антиген вируса, бактерии, грибка или простейшего. В контексте данного изобретения пептидом называется молекула, состоящая из 4-30 аминокислотных остатков. Полипептидом считается полимер из аминокислот, содержащий более 30 мономеров (аминокислотных остатков). Термин «полипептид» включает полноразмерные белковые молекулы.
Чужеродная нуклеотидная последовательность по данному изобретению предпочтительно кодирует пептид или полипептид (например, вирусный гликопротеин, белок капсида вирусной частицы или их фрагменты) вируса или иного патогена, выбираемых из цирковирусов свиней (PCV1, PCV2, PCV2a, PCV2b, PCV2d, PCV3), Actinobacillus pleuropneunomia; аденовирусов; альфавирусов, например возбудителя восточного энцефаломиелита лошадей; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., предпочтительно B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, предпочтительно биоваров 1, 2 и 3; вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы (лихорадки) свиней; Chlamydia sp. и Chlamydophila sp., предпочтительно C. pecorum и C. abortus; Clostridium spp., предпочтительно Cl. difficile, Cl. perfringens типов A, B и C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; коронавирусов, поражающих пищеварительный тракт и дыхательные пути; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis (называемого также Mycoplasma haemosuis); Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипов 1 ,7 и 14; вируса гемагглютинационного энцефаломиелита; lsospora suis; вируса японского энцефалита; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., предпочтительно Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona и Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. предпочтительно M. avium, M. intracellular и M.bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; парвовирусов; Pasteurella multocida; цитомегаловируса свиней; парвовирусов свиней; вируса, вызывающего репродуктивно-респираторный синдром (поздний эпизоотологический аборт, «синее ухо») у свиней; вируса псевдобешенства; ротавирусов; вируса Сагияма; Salmonella spp. предпочтительно S. thyhimurium и S.choleraesuis; Staphylococcus spp., предпочтительно S. hyicus; Streptococcus spp., предпочтительно Strep, suis; цитомегаловируса свиней; вируса герпеса свиней; вируса свиного гриппа; вируса оспы свиней; Toxoplasma gondii; вируса везикулярного стоматита или вируса экзантемы свиней.
В одном из особенно предпочтительных воплощений данного изобретения чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует антиген PCV2, в частности белок или пептид PCV2, более предпочтительно белок или пептид капсида PCV2 (например, ORF2).
Чужеродная нуклеотидная последовательность по данному изобретению может содержать транскрипционный промотор, чтобы обеспечить или усилить экспрессию кодируемых мРНК или полипептида. Этот промотор может быть синтетическим либо природным, в том числе промотор вируса оспы свиней, поксвирусный промотор или промотор, происходящий из других вирусов или клеток, например промоторы, происходящие из эукариотических или прокариотических организмов. Конкретные примеры промоторов, используемых по данному изобретению, включают промотор 7,5 кД вируса осповакцины (P7,5k) (Davison A. J. et al., J. Mol. Biol., 210(4):749-69 (1989)), промотор 11 кД (P11k) (Bertholet et al., Proc. Nat. Acad. Sci.,82:2096-2100 (1985)) или промотор 28 кД (P28k) (Weir J. P. & Moss B., J. Virol. 61:75-80 (1987)), а также искусственный синтетический промотор поксвируса (Ps), промотор гена герпесвирусной тимидинкиназы (Ross L. J., Gen. Virol. 74:371-377 (1993)), промотор белка gB (см. выше) герпесвируса индеек (HVT) или вируса болезни Марека (МDV), промотор IE вируса цитомегаловируса человека (HCMV) (Alting-Mess M. A., Nucleic Acids Res., 17:9494 (1989)), промотор обезьяньего вакуолизирующего вируса (SV40) (Gunning P., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:4931-4835 (1987)), промотор β-актина (см. выше, а также Kost A. T., Nucleic Acids Res., 11:8287-8301 (1983)), промотор β-глобулина (Spitzner J. R., Nucleic Acids Res., 18:1-11 (1990)), промотор LTR вируса саркомы Рауса (Fiek A. et al., Nucleic Acids Res., 20:1785 (1992)), и др. Кроме того, можно использовать промоторы генов структурных и жизненно важных белков вируса оспы свиней.
Рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению могут содержать несколько чужеродных нуклеотидных последовательностей, расположенных в том же участке клонирования и/или в других сайтах клонирования.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения rSPV содержит по меньшей мере две чужеродные нуклеотидные последовательности, кодирующие два разных антигена (одного и того же патогенного агента или же разных). Так, в другом конкретном воплощении данного изобретения rSPV содержит по меньшей мере чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген PCV2, и чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую другой антиген. В другом конкретном воплощении данного изобретения rSPV содержит чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген, и чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую адъювант или цитокин.
В другом конкретном воплощении данного изобретения rSPV содержит по меньшей мере две чужеродные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антиген PCV2, в частности белок или пептид ORF2, причем эти два антигена могут быть одинаковыми либо разными.
Другое воплощение данного изобретения относится к рекомбинантным вирусам, содержащим по меньшей мере две чужеродные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует белок или пептид ORF2 PCV2 причем в каждой из указанных чужеродных нуклеотидных последовательностей имеется свой сигнальный агент, адресующий к определенным клеткам, благодаря чему белок или пептид ORF2 PCV2 экспрессируется в различных компартментах клетки. В частности в одном из предпочтительных воплощений данного изобретения одна из указанных чужеродных нуклеотидных последовательностей кодирует цитоплазматический белок или пептид ORF2 PCV2, а другая кодирует белок или пептид ORF2 PCV2, располагающийся на клеточной поверхности (экспрессия за пределами клеточной мембраны). Данным изобретением продемонстрировано, что при ко-экспрессия белка или пептида ORF2 PCV2 в двух разных компартментах клетки генерируется более сильный иммунный ответ in vivo, то есть организм животного защищен лучше. В одном из конкретных воплощений данного изобретения белок или пептид ORF2 адресуется к клеточной мембране путем использования пептида, адресующего к клеточной мембране, который происходит из гена B5R вируса осповакцины, как описано в публикации WO2014/167060. Возможны и другие сигнальные последовательности, служащие клеточным «адресом».
В одном из конкретных воплощений данного изобретения фигурирует rSPV, содержащий по меньшей мере две чужеродные нуклеотидные последовательности, каждая из которых кодирует антиген PCV2, в частности белок или пептид ORF2, причем одна из этих чужеродных нуклеотидных последовательностей расположена в вирусном геноме на месте делетированной последовательности вирусного гена IL18bp, и одна - на месте делетированной нуклеотидной последовательности вирусного гена тимидинкиназы (ТК) или гена ARP, и одна из этих чужеродных нуклеотидных последовательностей обеспечивает экспрессию антигена PCV2 в цитоплазме, а другая - на клеточной мембране.
В поливалентных rSPVs по данному изобретению по меньшей мере две чужеродные нуклеотидные последовательности находятся под управлением одного и того же промотора или же разных промоторов, ориентированных в одном и том же направлении или же в противоположных.
Молекулы нуклеиновых кислот
Данное изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, содержащим геном рекомбинантного вируса оспы свиней. Молекулы нуклеиновых кислот по данному изобретению могут быть представлены двухцепочечными или одноцепочечными РНК или ДНК. Одноцепочечные ДНК или РНК - это либо кодирующие (смысловые) цепи либо некодирующие (антисмысловые). Данное изобретение относится также к вариантам или аналогам указанных молекул нуклеиновых кислот, например к молекулам нуклеиновых кислот, нуклеотидная последовательность которых по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или более идентична последовательностям указанных молекул.
Степень гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с помощью известных в данной области техники компьютерных программ, например GAP в пакете программ GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5371 1 ) (Needleman, S. B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). При использовании GAP берутся следующие параметры: штраф за открытие делеции 5. 0 , штраф за продолжение делеции 0.3. Нуклеотидные последовательности выравнивают с помощью программы выравнивания PILEUP, доступной как часть пакета программ GCG; при этом используют следующие параметры по умолчанию: штраф за открытие делеции 5 и штраф за величину делеции 0.3.
Для того, чтобы установить, гибридизуется ли данная молекула нуклеиновой кислоты с определенным полинуклеотидом, подходят следующие условия. Фильтр, содержащий нужный образец нуклеиновой кислоты предварительно выдерживают в натрий-цитратном буферном растворе (5 SSC) в течение 10 минут и проводят предварительную гибридизацию этого фильтра в растворе 5xSSC, 5x(раствор Денхардта), 0,5% додецилсульфат натрия (SDS) and 100 мкг/мл денатурированной и разрушенной ультразвуком ДНК-носителя из спермы лосося. После этого проводят гибридизацию в том же растворе, содержащем 10 нг/мл зонда, меченного радиоактивным цитидин-3-фосфатом (P-dCTP), в течение 12 часов при температуре приблизительно 45°С по методу гибридизации, описанному в работе Sambrook et al. 1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, New York. Затем фильтр промывают два раза в растворе 2xSSC, 0,5% SDS при температуре по меньшей мере 55°С (условия пониженной жесткости), по меньшей мере 60°С (условия умеренной жесткости), по меньшей мере 65°С (условия умеренной/высокой жесткости), по меньшей мере 70°С (условия высокой жесткости) или по меньшей мере 75°С (условия очень высокой жесткости). Гибридизацию выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография).
Молекулы нуклеиновых кислот по данному изобретению могут быть представлены per se, то есть ни с чем не связанными полинуклеотидами; или вектором; или вирусом; или клеткой-хозяином и др. В данном контексте векторы включают экспрессионные векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот (полинуклеотиды/нуклеотидные последовательности) по данному изобретению.
Клетки-хозяева
В другом воплощении данного изобретения предлагаются клетки-хозяева. трансформированные полинуклеотидами или rSPV по данному изобретению. Такие клетки способны производить рекомбинантные вирусы оспы свиней по данному изобретению. Пригодные для этого клетки-хозяева известны в данной области техники или могут быть получены соответствующими специалистами. Клетками-хозяевами по данному изобретению служат предпочтительно эукариотические клетки, например клетки млекопитающих (например, свиные), грибов (например, Saccharomyces cerevisiae, Рichia, Аspergillus, Fusarium), насекомых или растений. Конкретными примерами клеток-хозяев по данному изобретению являются свиные почечные клетки, например линии ESK-4 (CL-184).
Вакцинные композиции и способы
В настоящем документе термин «вакцина» включает любые композиции, которые моно использовать для того, чтобы вызвать, стимулировать или усилить иммунный ответ в организме животного (например, у свиньи), направленный против патогенного агента. Конкретные примеры вакцин по данному изобретению - это композиции, способные вызывать, стимулировать или усиливать иммунную защиту против вируса PCV2. В вакцинах по данному изобретению имеется по меньшей мере одна чужеродная (для вируса) нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген или адъювант.
В настоящем документе термин «иммунизация» включает процесс введения иммуногенного агента в организм индивида. Иммунизация может, например, обеспечить продолжительно высокий уровень антител и/или клеточный ответ с участием Т-лимфоцитов, уничтожающих или подавляющих патогенный агент в организме иммунизированного животного (не человека, а например, свиньи), направленный против патогенного агента или антигена, с которым данная особь ранее контактировала.
Вакцины по данному изобретению содержат иммунологически эффективное количество описанных выше rSPV, или полинуклеотидов, или клеток в фармацевтически приемлемой несущей среде.
7
2
6
3
5
50
50
50
50
На практике точное количество указанных агентов, требующееся для иммунологически эффективной дозы, различно для разных индивидов и зависит от таких факторов, как возраст и общее состояние здоровья особи, состава вводимого препарата и способа его введения. Нужное в том или ином конкретном случае «эффективное количество» специалист в данной области техники может определить экспериментальным путем, применяя обычные для такой цели методы. Например, для определения нужной дозировки вакцины применяется метод титрования, позволяющий установить минимальную эффективную дозу препарата с учетом ассы тела животного, концентрации вакцинного препарата и других факторов. В одном из типичных воплощений данного изобретения вакцина содержит однократную дозу, составляющую от 10 до 10 тканевой цитопатической дозы rSPV по данному изобретению, при которой погибает 50% клеток (TCID), предпочтительно от 10 до 10 TCID, более предпочтительно от 10 до 10 TCID. Величина TCID отражает медианную инфекционную дозу вируса, то есть такое его количество, которое обеспечивает патологические изменения у 50% клеток зараженной культуры.
Обеспечивающие приемлемый иммунный ответ дозировка вакцины, концентрация ее компонентов и режим введения нуждающемуся в том индивиду определяют такими методами, как, например, титрование антител в сыворотке, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и/или серонейтрализация, и/или контрольное заражение.
Вакцины по данному изобретению могут содержать и другие ингредиенты, известные рядовым специалистам в данной области техники, например фармацевтически приемлемые носители, разбавители, адъюванты, стабилизирующие агенты для лиофилизации, смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие агенты, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, или консерванты, или иные эксципиенты в зависимости от пути введения вакцинного препарата в организм.
Примеры фармацевтические приемлемых носителей или разбавителей или иных подобных эксципиентов по данному изобретению включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) деминерализованную или дистиллированную воду; физиологический солевой раствор; растительные масла, например арахисовое, сафлоровое, оливковое, хлопковое, кукурузное, кунжутное или кокосовое; силиконовые масла в том числе полисилоксаны (например, метилполисилоксан, фенилполисилоксан и метилфенилполисилоксан; летучие силиконы; минеральные масла, например легкие или тяжелые вазелиновые масла; сквалены; производные целллюлозы (например метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или гидроксипропитлцеллюлоза); низшие алифатические спирты, например этиловый или изопропиловый; низшие жирно-ароматические спирты; низшие полиалкиленгликоли или низшие алкиленгликоли (например, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этиленгликоль, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль или глицерин); сложные эфиры жирных кислот, например изопропилпальмитат, изопропилмиристат или этилолеат; поливинилпирролидон; агар; каррагинаны; трагакантовая камедь, аравийская камедь; вазелин. Как правило, носитель (один или более) составляет от 10% до 99,9% (масса/масса) суммарной массы вакцинной композиции. Для забуферивания композиции используют известные в данной области техники агенты, например одно- или двузамещенный фосфат натрия, одно- или двузамещенный фосфат калия, или их смесь и др.
Примеры адъювантов, используемых по данному изобретению, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) эмульсии типа «масло в воде», гидроксид алюминия, иммуностимулирующие комплексы, неионные блок-полимеры или сополимеры, цитокины (например, интерлейкины IL-1, IL-2, IL-7, интерфероны α-IFN, β-IFN, γ-IFN), сапонины, монофосфорилллипид A (MLA), мурамилдипептиды (MDP) и др. Другие пригодные по данному изобретению адъюванты включают, например. сульфат алюминия-калия, термолабильные или термостабильные энтеротоксины из Escherichia coli, холерный токсин или его В-субъединица, дифтерийный токсин, столбнячный токсин, коклюшный токсин, полный или неполный адъювант Фрейнда и др. Адъюванты на основе токсинов, например дифтерийного, столбнячного или коклюшного токсина, перед использованием можно инактивировать, например путем обработки формальдегидом.
Примеры стабилизирующих агентов для лиофилизации, используемых по данному изобретению. - это, например, углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, сахароза, декстран или глюкоза), белки (например, альбумин или казеин) и их производные.
Вакцины по данному изобретению могут содержать антигены нескольких патогенных агентов, например PCV2, Actinobacillus pleuropneunomia; аденовирусов; альфавирусов, например возбудителя восточного энцефаломиелита лошадей; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., предпочтительно B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, предпочтительно биоваров 1, 2 и 3; вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы (лихорадки) свиней; Chlamydia sp. и Chlamydophila sp., предпочтительно C. pecorum и C. abortus; Clostridium spp., предпочтительно Cl. difficile, Cl. perfringens типов A, B и C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; коронавирусов, поражающих пищеварительный тракт и дыхательные пути; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis (называемого также Mycoplasma haemosuis); Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипов 1 ,7 и 14; вируса гемагглютинационного энцефаломиелита; lsospora suis; вируса японского энцефалита; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., предпочтительно Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona и Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. предпочтительно M. avium, M. intracellular и M.bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; парвовирусов; Pasteurella multocida; цитомегаловируса свиней; парвовирусов свиней; вируса, вызывающего репродуктивно-респираторный синдром (поздний эпизоотологический аборт, «синее ухо») у свиней; вируса псевдобешенства; ротавирусов; вируса Сагияма; Salmonella spp., предпочтительно S. thyhimurium и S.choleraesuis; Staphylococcus spp., предпочтительно S. hyicus; Streptococcus spp., предпочтительно Strep. suis; цитомегаловируса свиней; вируса герпеса свиней; вируса свиного гриппа; вируса оспы свиней; Toxoplasma gondii; вируса везикулярного стоматита или вируса экзантемы свиней.
Вакцинные композиции по данному изобретению могут быть в виде жидкого препарата, например водного раствора, эмульсии типа «вода в масле» или «масло в воде», сиропа, эликсира, настойки, препарата для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, введения путем инъекций), например стерильных суспензий или эмульсий. Такие препараты известны в данной области техники; их готовят, как правило, путем растворения антигена и других обычных в таких случаях добавок в подходящем носителе или системе растворителей. Жидкие препараты по данному изобретению включают суспензии и эмульсии, содержащие суспендирующие или эмульгирующие агенты.
Путь введения вакцинных препаратов по данному изобретению может быть чрескожным, через слизистые оболочки или парентеральным (внутрикожным, внутримышечным, подкожным, внутривенным или внутрибрюшинным). Вакцины по данному изобретению удобно вводить интраназально, через кожу (то есть путем нанесения на поверхность кожи для системного всасывания), парентерально, через глаза и др. Парентеральный путь введения включает (не ограничиваясь перечисленным здесь) внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное введение и др.
Вакцины по данному изобретению вводят однократно или же в несколько приемов. Вакцины по данному изобретению вводят сами по себе или одновременно либо последовательно с одной или более других композиций, например с другими иммуногенными или вакцинными композициями для свиней. Если разные композиции вводят в разное время, то периоды введения могут перекрываться или же не совпадать.
Данное изобретение относится также к способам иммунизации или индуцирования иммунного ответа у животных (не у человека, а например, у свиней), включающим введение указанным млекопитающим описанных выше rSPV, или полинуклеотидов, или клеток, или вакцин.
Вакцины по данному изобретению вводят предпочтительно взрослым свиньям, но также и молодняку, детенышам или беременным самкам. Вакцинация беременных самок предпочтительна, так как может обеспечить пассивный иммунитет у новорожденных поросят за счет антител материнского организма. Возраст свиней, подлежащих вакцинации по данному изобретению, составляет менее 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 недели; 1-6 недель; 2-5 недель или 3-4 недели. Желательно вакцинировать особей, ранее не сталкивавшихся с данным патогенным агентом.
Данным изобретением также предлагается емкость для иммунологически эффективного количества описанных выше rSPV, или полинуклеотидов, или клеток, или вакцин. Данным изобретением также предлагаются наборы для вакцинации, при необходимости включающие стерильную емкость, содержащую иммунологически эффективное количество вакцины, средства для введения вакцинного препарата животным и при необходимости руководство с инструкциями и информацией по введению иммунологически эффективного количества композиции по данному изобретению для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания.
Вакцина против PCV2
Данное изобретение подходит, в частности, для лечения или предотвращения инфекции PCV2 и связанных с ней заболеваний.
Разработанные в последнее время вакцины против PCV2, например Circovac (Merial), Ingelvac, CircoFLEX (Boehringer lngelheim Vetmedica) или Suvaxyn, представляют собой препараты либо на основе инактивированного PCV2, либо субъединичные вакцины. В субъединичных вакцинах против PCV2 обычно используется очищенный капсидный белок PCV2A, получаемый в результате достигнутой рекомбинантным путем экспрессии гена ORF2 PCV2A. В этой связи в Европейском патенте № 1741785 сообщалось о белке, кодируемом геном ORF2 изолятов PCV2 Imp1011. В публикации WO2010/061000 сообщалось о белке, кодируемом геном ORF2 изолята PCV2Rm. В Европейском патенте №1816200 сообщалось о белке, кодируемом геном изолята PCV2 412. В Европейских патентах №№ 1036180 и 2225367 сообщалось о другом белке, кодируемом ORF2 другого изолята PCV2. В публикациях WO2013/030320 и WO2014/167060 описаны усовершенствованные синтетические белки типа ORF2.
В одном из своих конкретных воплощений данное изобретение относится к описанным выше rSPV, в которых чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует антиген PCV2 , более предпочтительно белок, полипептид или пептид PCV2. В одном из более предпочтительных своих воплощений данное изобретение относится к описанным выше rSPV, в которых чужеродная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид ORF2 PCV2 или его фрагмент. В одном из конкретных воплощений данного изобретения ORF2 выбирают из ORF2 изолятов Imp1011, PCV2Rm или 412 PCV2, или ORF2, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательностям указанных белков, или их иммуногенных фрагментов, содержащих по меньшей мере 10, 15, более предпочтительно по меньшей мере 20 подряд расположенных аминокислотных остатков из последовательностей указанных белков.
В другом своем конкретном воплощении данное изобретение относится к rSPV, содержащим по меньшей мере две чужеродных нуклеотидных последовательности, каждая из которых кодирует антиген PCV2, в частности белок или пептид ORF2, причем одна из этих двух нуклеотидных последовательностей расположена в вирусном геноме на месте делетированной последовательности вирусного гена IL18bp, а другая - на месте делетированной последовательности вирусного гена TK или ARP, а также одна из указанных чужеродных нуклеотидных последовательностей обеспечивает экспрессию антигена PCV2 в цитоплазме клетки, а другая обеспечивает присутствие доступного антигена PCV2 на клеточной мембране.
В одном из воплощений данного изобретения rSPV содержит по меньшей мере две чужеродных нуклеотидных последовательности, каждая из которых кодирует белок или пептид ORF2, относящийся к определенному генотипу, отличному от второго, предпочтительно к PCV2b и PCV2d.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к способам лечения и/или предотвращения заболеваний, связанных с PCV2, у млекопитающих (не у человека) и к способам вакцинации или иммунизации животных, например свиней, в частности самок, самцов и поросят, против инфекции PCV2, включающим введение указанным животным описанных выше rSPV, полинуклеотидов, клеток или вакцинных композиций.
Инфекции PCV2 или ассоциированные с ними заболевания включают помимо прочего синдром мультисистемного послеотъемного истощения поросят (PMWS), дермо-нефротического синдрома у свиней (PDNS), репродуктивно-респираторного синдрома у свиней (PRDC), расстройства репродуктивной системы, гранулематозный энтерит, экссудативный эпидермит, некротический лимфаденит и врожденный тремор. Предпочтительно животные, например свиньи, получают защиту в такой степени, что от одного до всех негативных физиологических симптомов или эффектов инфекции PCV2 значительно сокращаются, ослабевают или полностью предотвращаются.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые вакцинные композиции вводят свиньям, восприимчивым к инфекции PCV2 или находящимся в группе риска в отношении этой инфекции, с целью усилить способность животного к генерации адекватного иммунного ответа против инфекционного агента.
Предпочтительно объектом воздействия по данному изобретению являются свиньи, нуждающиеся в вакцинации против мультисистемного послеотъемного истощения поросят (PMWS) и/или дермо-нефротического синдрома (PDNS).
Другие аспекты и преимущества данного изобретения раскрываются ниже в иллюстрирующей его экспериментальной части.
Примеры
Пример 1. Конструирование плазмид для получения рекомбинантных вирусов оспы свиней
(1) Конструирование pSP91 (фиг. 1)
Геномную ДНК вируса оспы свиней получали следующим образом.
2
2
4
2
4
2
2
Вирус SPV штамм Кasza (VR-363) и эмбриональные свиные почечные клетки ESK-4 cells (CL-184) приобретали в Американской коллекции типовых культур клеточных линий, штаммов и другой микробиологической продукции (ATCC). Клетки ESK-4 культивировали обычным путем при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% CO, в среде Хэма F-12K (Gibco, номер по каталогу 21127-022), дополненной стрептомицином-пенициллином (1%) (Gibco, номер по каталогу 15140-122) и FBS (5%) (Gibco, номер по каталогу 10437-028). Для получения геномной ДНК вируса оспы свиней сплошной монослой клеток ESK-4 в культуральном флаконе с площадью поверхности 225 cм заражали SPV и инкубировали 6 суток - до тех пор, пока цитопатический эффект (CPE) не достигал 100%. Инфицированные клетки собирали, соскребая их с поверхности флакона в среду, и центрифугировали со скоростью 1300 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, а клеточный осадок осторожно ресуспендировали в 2 мл солевого раствора, забуференного фосфатом (PBS; 1,5 г NaHPO, 0,2 г KHPO, 0,8 г NaCl и 0,2 г KCl на 1 л HO) и дважды замораживали и оттаивали. Обломки клеток удаляли путем центрифугирования со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин при температуре 4°C. Вирионы SPV, находящиеся в супернатанте, осаждали путем центрифугирования при 20 000 g в течение 20 мин при температуре 4°C. Полученный осадок суспендировали в буферном растворе (10 мМ Tris; pH7,5). Геномную ДНК SPV выделяли из вирионов SPV, для чего суспендировали их в буферном растворе для лизиса (20 мM Tris, pH 9; 0,1M NaCl; 5 мM EDTA; 0,1% SDS; 0,2 мг/мл протеиназа K) и инкубировали при температуре 60°C в течение 5 мин. Экстрагировали два раза смесью фенол:хлороформ (1:1) и осаждали образец, добавляя двойной объем этилового спирта, а затем центрифугировали. Супернатант отбрасывали; осадок, содержащий ДНК SPV, высушивали на воздухе и регидратировали в буферном растворе (10 мM Tris pH 7,5; 1 мM EDTA) при температуре 4°C.
Фланкирующие участки гена, кодирующего белок, связывающий интерлейкин-18 (IL-18bp), в геноме SPV клонировали путем полимеразной цепной реакции (PCR). Два праймера (синтетических олигонуклеотида) для этого - SP6030F и SP9574R, представленные последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2, - приобретали в компании Takara Bio. Для реакции PCR использовали полимеразу LA Taq (Takara Bio) и набор праймеров SP6030F и SP9574R с ДНК SPV в качестве матрицы, следуя протоколу производителя.
SEQ ID NO: 1
CGAATTCATTCCTTTATCTTTA
SEQ ID NO: 2
GGAACTACGTTATACGATCAT
Амплифицированную ДНК длиной около 3500 нуклеотидных пар проверяли путем электрофореза в агарозном геле (0,8%) и очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Очищенный фрагмент ДНК клонировали в векторе pCR4-TOPO (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Были отобраны 12 белых колоний трансформированных клеток, устойчивых к ампициллину; их культивировали в среде «бульон LB», содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Каждую плазмиду выделяли с помощью набора QuickLyse Miniprep Kit (Qiagen) и расщепляли рестриктазой ScaI. Были отобраны две плазмиды-кандидата (оба направления вставленной ДНК). Вставки ДНК секвенировали, используя цветной терминатор цикла секвенирования Dye Terminator Cycle Sequencing reagent (DTSC) и автоматический секвенатор CEQ2000XL (Beckman Coulter). Было показано, что одна из этих плазмид, а именно pCR-SPV6030/9574 (#1), содержит фрагмент ДНК, занимающий в геноме SPV нуклеотидные пары с 6030-й пo 9574-ю (GeneBank Acc: NC_003389); ее использовали как основную плазмиду (см. фиг. 1).
Затем проводили мутагенез с помощью PCR для того, чтобы удалить часть гена IL-18bp (нуклеотидные пары с 31-й по 382-ю) и ввести сайты узнавания несколькими рестриктазами, используя pCR-SPV6030/9574 (#1) в качестве матрицы и два разных набора праймеров - (1) SEQ ID NO: 3 и 4 или (2) SEQ ID NO: 5 и 6.
SEQ ID NO: 3
TTCGCCCTTACGGTACCATTCCTTTATCTTTATAAACG
SEQ ID NO: 4
CTATAATATTAAATAAGCTTTATGGAGTTGTTTAAATAC
SEQ ID NO: 5
CACACGATAACACTGCAGTCCACATATTACGGTTC
SEQ ID NO: 6
GCCGCGAATTCGCCCTCGAGGAGCTCACTACG
Каждый продукт полимеразной цепной реакции проверяли путем электрофореза в агарозном (0,8%) геле и очищали с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit. Очищенный фрагмент ДНК, амплифицированный путем PCR с набором праймеров, представленных SEQ ID NO: 3 и 4, расщепляли двумя рестриктазами (KpnI и HindIII) и сшивали с расщепленным теми же рестриктазами вектором pBluescript KS(+) (Stratagene). Полученную плазмиду pBS-9L(Kpn..Hin) (см. фиг. 1) расщепляли растриктазами SacI и PstI, и встраивали в нее расщепленный теми же рестриктазами фрагмент ДНК, амплифицированный путем PCR с использованием набора праймеров, представленных SEQ ID NO: 5 и 6. Полученную в итоге плазмиду обозначили pSP90 (см. фиг. 1).
Участок между сайтами рестрикции EcoRI и HindIII в pSP90 заменяли на олигонуклеотидный адаптер, полученный путем отжига двух синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, представленных SEQ ID NO: 7 и 8. Полученную таким образом плазмиду обозначили pSP91 (см. фиг. 1).
SEQ ID NO:
AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA
SEQ ID NO:
AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC
(2) Конструирование pSP911-ORF2cc и pSP911-Ess_ORF2cc (фиг. 2)
Последовательность между сайтами рестрикции KpnI и PstI плазмиды pSP91 заменяли на синтетический адаптер, представленный SEQ ID NO: 9, чтобы встроить промотор вируса осповакцины 11-kD, о котором сообщалось как о сильном промоторе поздних вирусных генов (A.J. Davison and B. Moss. J. Mol. Biol. 210, 771-784, 1989). Полученную плазмиду обозначили pSP911 (см. фиг. 2)
SEQ ID NO:9
GGTACCGAGCTCGGTAGCCCGGGCCATGGTAGATCCTCTAGAGGATCCAATTCATTTATAGCATAGAAAAAAACAAAATGAAATTCTACTATATTTTCTGCAG
Синтезировали чужеродные нуклеотидные последовательности, кодирующие ORF2 PCV2. Первая из них содержала ORF2 PCV2 с измененными кодонами (обозначена ORF2cc). Эта последовательность обеспечивала экспрессию кодируемого полипептида в цитоплазме. Вторая последовательность содержала такой же ORF2 PCV2 с измененными кодонами, но также включала последовательность, обеспечивающую адресовку в клеточную мембрану (обозначена Ess_ORF2cc). Эта последовательность обеспечивала экспрессию кодируемого полипептида в клеточной мембране. Последовательности синтезированных ORF2cc и Ess_ORF2cc представлены SEQ ID NO:10 и 11 соответственно.
SEQ ID NO:10
ATGACCTACCCTAGAAGAAGATATAGGAGGCGGAGGCATCGGCCACGGAGTCACCTGGGACAAATTCTGCGGAGAAGGCCATGGTTGGTGCATCCAAGACATAGATATAGGTGGAGGAGAAAGAACGGAATCTTTAATACAAGACTGTCTAGAACTTTTGGGTACACCGTGAAAAGAACAACCGTGAGGACCCCATCTTGGGCCGTTGATATGATGAGGTTTAACATCAACGATTTCTTCCCTCCTGGGGGAGGATCTAATCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTATTATAGGATCAGGAAAGTGAAAGTGGAGTTTTGGCCATGTAGCCCAATTACTCAAGGAGATAGAGGTGTTGGATCTAGCGCCGTGATCCTGGACGACAATTTCGTGACCAAAGCAACCGCACTGACTTACGATCCTTACGTGAATTATTCTAGCAGACACACTATTACTCAACCATTTAGCTATCACAGCAGATATTTCACTCCTAAGCCAGTGCTGGACAGCACCATCGACTATTTTCAGCCTAATAATAAGAGGAATCAACTTTGGCTTAGGCTTCAGACCGCCGGGAACGTGGATCACGTGGGATTGGGAACCGCATTTGAGAATTCTATTTATGATCAAGAGTATAACATTAGAGTGACTATGTACGTGCAGTTTAGGGAGTTCAACCTGAAAGATCCACCTCTGAATCCATAA
SEQ ID: NO:11
ATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCTGCTGTTGTTTATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCGAAACATCGTGGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAAGAGAACCACCGTCAAAACCCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGATTTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAAACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGGATCAACTGCCGTCATCTTGGATGACAACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGATCCTTACGTCAATTACTCTAGTAGACACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGATACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGACTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAAACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACCGCCTTCGAAAACTCCAAATACGACCAGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAATTCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAACCCATAA
Эти синтетические гены - ORF2cc и Ess_ORF2cc - соединенные с сайтами рестрикции BamHI или SalI на 5’- или же на 3’-конце, расщепляли ферментами BamHI и SalI и встраивали в pSP911, расщепленную BamHI и SalI. Полученные плазмиды обозначены pSP911-ORF2cc или pSP911-Ess_ORF2cc (см. фиг. 2), их использовали для создания рекомбинантных вирусов оспы свиней, а именно SVR15 или SVR14 соответственно.
(3) Конструирование pSP53-ORF2 (фиг. 3)
Ген белка с анкириновыми повторами (ARP) SPV получали из плазмиды pNZSP52L (JP2003-111591A). Участок между сайтами рестрикции HindIII и EcoRI в pNZSP52L заменили на синтетический адаптер, представленный SEQ ID NO: 12; полученную плазмиду обозначили pSP53.
Ген ORF2 PCV2, использовавшийся в данном случае, представлен последовательностью SEQ ID NO: 13. Этот ген синтезировали, расщепили ферментами BamHI и SalI и встроили по сайтам рестрикции BamHI и SalI в pSP53. Полученную плазмиду обозначили pSP53-ORF2 (см. фиг. 3); ее использовали для создания двух рекомбинантных вирусов оспы свиней - SVR16 и SVR17.
SEQ ID NO: 12
AAGCTTGGCCGGGGGGGCCAGCTCGGTACATAAAAATGTCGACGGATCCGAGTGCAATAAATTAGAATAGTTTTTCAATTTTTACGCGTAATTAATTATTGTATTTATTATTTATATGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTTCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCACCCGGGGATCGATCCAAAAAAATCTTTCGGCCTGCATGAATGGCCTTGTTGATCGCTTATTATTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGGAATTC
SEQ ID NO: 13
GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGCGTACCACGGTCACAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAAACTTGACGACTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCCATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTACCAAAGGCACCAGCCCTAACCTATGACCCATATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGTTACTTCACACCCAAACCTGTTCTTGACTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGGCTACAAACCTCTAGAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTAAATACGACCAAGACTACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCCTAAGTCGAC
(4) Конструирование pSP72-ORF2 (фиг. 4)
Фланкирующие участки гена тимидинкиназы (TK) в геноме SPV клонировали путем полимеразной цепной реакции (PCR). При этом использовали два праймера (синтетические олигонуклеотиды) - SP54242F и SP57617R, представленные последовательностями SEQ ID NO: 14 иd 15; их приобретали в компании Takara Bio. Для PCR использовали полимеразу LA Taq (Takara Bio), набор праймеров SP54242F и SP57617R и ДНК SPV в качестве матрицы согласно протоколу производителя.
SEQ ID NO: 14
AATATTACGGGTGCTGTTT
SEQ ID NO: 15
AAAAACATCGTATTCCTG
Амплифицированную ДНК длиной около 3400 нуклеотидных пар проверяли путем электрофореза в агарозном геле (0,8%) и очищали, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Очищенный фрагмент ДНК клонировали в векторе pCR4-TOPO (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Были отобраны 14 белых колоний трансформированных клеток, устойчивых к ампициллину; их культивировали в среде «бульон LB». Каждую плазмиду выделяли с помощью набора QuickLyse Miniprep Kit (Qiagen) и расщепляли рестриктазой SpeI. Были отобраны две плазмиды-кандидата (оба направления вставленной ДНК). Вставки ДНК секвенировали, используя цветной терминатор цикла секвенирования Dye Terminator Cycle Sequencing reagent (DTSC) и автоматический секвенатор CEQ2000XL (Beckman Coulter). Было показано, что одна из этих плазмид, а именно pCR-SPV54242/57617 (#2), содержит фрагмент ДНК, занимающий в геноме SPV нуклеотидные пары с 54 242-й по 57 617-ю (GeneBank Acc: NC_003389); ее использовали как основную плазмиду (см. фиг. 4).
Затем проводили мутагенез с помощью PCR для того, чтобы удалить часть гена ТК (нуклеотидные пары с 59-й по 536-ю) и ввести сайты узнавания несколькими рестриктазами, используя pCR-SPV54242/57617 (#2) в качестве матрицы и два разных набора праймеров - (1) SEQ ID NO: 16 и17 или (2) SEQ ID NO: 18 и19.
SEQ ID NO: 16
CGTTCATGTTAAGCTTAACCTGAAATATTG
SEQ ID NO: 17
GTTTAAACGAATTCGGTACCCTTAAAAACATCG
SEQ ID NO: 18
CGCCGAGCTCGAGAATATTACGGGTGCTGTTTTTAC
SEQ ID NO: 19
CCAGACTGCAGAGAACATAGGTCCTAATATAAG
Каждый продукт полимеразной цепной реакции проверяли путем электрофореза в агарозном (0,8%) геле и очищали с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit. Очищенный фрагмент ДНК, амплифицированный путем PCR с набором праймеров, представленных SEQ ID NO: 16 и17, расщепляли двумя рестриктазами (KpnI и HindIII) и сшивали с расщепленным теми же рестриктазами вектором pBluescript KS(+) (Stratagene). Полученную плазмиду pBS-TKR(Kpn..Hin) (см. фиг. 4) расщепляли растриктазами SacI и PstI, и встраивали в нее расщепленный теми же рестриктазами фрагмент ДНК, амплифицированный путем PCR с использованием набора праймеров, представленных SEQ ID NO: 18 и 19. Полученную в итоге плазмиду обозначили pSP70 (см. фиг. 4).
В pSP70 между сайтами рестрикции HindIII и EcoRI встраивали синтетический адаптер, представленный последовательностью SEQ ID NO: 12; полученную плазмиду обозначили pSP711. Фрагмент генной кассеты `промотор P7.5-LacZ’, происходящий из pNZ76, расщепленной ферментами HindIII и SmaI pNZ76 с последующим образованием тупых концов с помощью ДНК-полимеразы (как описано в патенте США № 5,387,519) встраивали по сайту рестрикции SmaI pSP711; полученную плазмиду обозначили pSP721 (см. фиг. 4), и генную кассету‘P7.5-LacZ’ встроили в ген TK. Синтетический ген ORF2 PCV2, представленный последовательностью SEQ ID NO: 13, снова расщепляли рестриктазами BamHI и SalI, и встраивали по сайтам BamHI и SalI в pSP721; полученную плазмиду обозначили pSP72-ORF2 (см. фиг. 4). Эту плазмиду использовали как гомологичную для получения рекомбинантного вируса оспы свиней SVR20.
Пример 2. Получение рекомбинантных вирусов оспы свиней (rSPV)
(1) Получение SVR14 и SVR15 (см. фиг. 5)
Рекомбинантные вирусы оспы свиней получали в клетках ESK-4 путем гомологичной рекомбинации между геномом SPV дикого типа и гомологичными плазмидными векторами. Субконфлуэнтные клетки ESK-4 на 6-луночных планшетах заражали вирусом оспы свиней дикого типа (wtSPV). Через 17 часов зараженные wtSPV клетки трансфицировали 2 мкг pSP911-Ess_ORF2cc или 2 мкг pSP911-ORF2cc с помощью реагента Lipofectamin Plus (Invitrogen) и инкубировали при температуре 37°C в течение 5 суток до наступления цитопатического эффекта (CPE). Лизаты трансфицированных зараженных клеток высевали (TFS), чтобы найти клетки с SVR14 и с SVR15 (TFS для SVR14 и TFS для SVR14 соответственно). Их разводили 1:20 средой Хэма F-12K без FBS, и заражали клетки ESK-4 на 96-луночных планшетах. Через 7 суток супернатанты из каждой лунки планшета переносили в новый в новые планшеты и лизировали зараженные клетки буферным раствором для лизиса (20 мM Tris-Cl; 0,1M NaCl; 5 мM EDTA; 0,1% SDS; 200 мкг/мл протеиназа К), после чего проводили тепловую обработку (5 мин при температуре 60°C и 2 мин при 98°C). Образцы ДНК лизированных зараженных клеток анализировали путем количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), используя реагент SYBR-Green (Bio-Rad; номер по каталогу 170-8882) и набор праймеров, представленных последовательностями SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.
SEQ ID NO: 20
AAGTGGAGTTTTGGCCATGT
SEQ ID NO: 21
TCCAGCACTGGCTTAGGAGT
Отбирали супернатанты, соответствующие образцам, в которых наблюдалась амплификация сигнала продукта реакции qPCR, и проводили с ними следующий этап скрининга, повторяя его до тех пор, пока при иммунофлуоресцентном анализе (IFA) с использованием свиной антисыворотки против PCV2 (PAB-PCV2, VMR) в качестве первого антитела и антител против свиного IgG, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (F1638-2ML, SIGMA), в качестве вторых антител.
В результате трех циклов скрининга из TFS для SVR14 и для SVR15 были очищены два рекомбинантных вируса оспы свиней, не содержавшие wtSPV (клоны G2C2C4 и D10E5F5), которые обозначили SVR14 и SVR15 соответственно.
(2) Получение SVR16 и SVR17 (фиг. 5)
Рекомбинантный вирус оспы свиней SPY16 получали путем гомологичной рекомбинации между рекомбинантным SPV, геномом SPV15 и плазмидным вектором pSP53-ORF2. Вирус SPY17 получали путем гомологичной рекомбинации между геномом SPV14 и гомологичным вектором pSP53-ORF2. Субконфлуэнтные клетки ESK-4 на 6-луночных планшетах заражали SPV15 или SPV14 и через 17 часов зараженные rSPV клетки трансфицировали 2 мкг pSP53-ORF2 с помощью реагента Lipofectamin Plus (Invitrogen). Когда появлялся цитопатический эффект (CPE), лизаты трансфицированных зараженных клеток (TFS для SVR16 и TFS для SVR17) проверяли на возникновение бляшек, в которых экспрессировалась β-галактозидаза, добавляя 0,5 мг/мл реагента Bluo-gal (Invitrogen; номер по каталогу 15519-028) в агарозном покрытии с питательными компонентами. В результате 3-4 циклов скрининга - до тех пор, пока все бляшки не окрашивались на β-галактозидазу - получали очищенные рекомбинантные вирусы; эти вирусы обозначили SVR16 и SVR17 соответственно.
(3) Получение SVR20 (фиг. 5)
Рекомбинантный вирус оспы свиней SVR20 получали путем гомологичной рекомбинации между рекомбинантным SPV, геномом SVR14 и гомологичным плазмидным вектором pSP72-ORF2. Субконфлуэнтные клетки ESK-4 на 6-луночных планшетах заражали SVR14 и через 17 часов зараженные SVR14 клетки трансфицировали 2 мкг pSP72-ORF2 с помощью реагента Lipofectamin Plus. Когда появлялся цитопатический эффект (CPE), лизаты трансфицированных зараженных клеток (TFS для SVR20) проверяли на возникновение рекомбинантных бляшек, в которых экспрессировалась β-галактозидаза, добавляя 0,5 мг/мл реагента Bluo-gal (Invitrogen; номер по каталогу 15519-028) в агарозном покрытии с питательными компонентами. В результате 3-4 циклов скрининга - до тех пор, пока все бляшки не окрашивались на β-галактозидазу - получали очищенный рекомбинантный вирус; этот вирус обозначили SVR20.
Пример 3. Анализ рекомбинантных вирусов оспы свиней in vitro
(1) Подтверждение структуры генома и стабильности при пассировании SVR14 и SVR15 путем полимеразной цепной реакции
Чтобы проверить структуру генома очищенных SVR14 и SVR15, получали их геномную ДНК, проводили процедуры, описанные в Примере 1 (1), и использовали в качестве матрицы для PCR (+0p - без пересева). Для проверки стабильности SVR14 и SVR15 их пассировали в клетках ESK-4 15 раз (+15p), и получали так же, как +0p. Эти геномные ДНК анализировали путем PCR, используя набор праймеров SP7450F и SP8552R, представленных последовательностями SEQ ID NO: 22 и 23 (см. фиг. 6).
SEQ ID NO: 22
CAATTGAAACATCTATATATCCTT
SEQ ID NO: 23
CAATGTGAAGCGATAAAATACAG
Результаты, полученные путем PCR (фиг. 6), показали, что очищенные SVR14 и SVR15 обладали ожидаемой структурой генома, не содержали вирус оспы свиней дикого типа (wpSPV) и были стабильны после 15 пересевов in vitro.
(2) Проверка белка ORF2 PCV2, экспрессируемого SVR14 и SVR15
Размеры молекул белков ORF2 PCV2, экспрессируемых SVR14 и SVR15, определяли путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (15% SDS-PAGE) и вестерн-блоттинга с использованием крысиной сыворотки против PCV2. Клетки ESK-4 заражали SVR14, либо SVR15, либо вирусом дикого типа (wtSPV). Через 6 суток проводили лизис и лизаты фракционировали путем 15% SDS-PAGE. Белки переносили на поливинилидиндифторидную (PVDF) мембрану для блоттинга Immobilon-P (Merk Millipore; номер по каталогу IPVH08130) и блокировали 0,5%-ным сухим молоком в PBS. Блотированные мембраны PDVF обрабатывали зондом - крысиной сывороткой против PCV2 (1:1000) в качестве первого антитела, после чего проводили реакцию со вторыми антителами - конъюгированными с биотином козьими антителами против крысиного IgG (1:1000) - и реагентами набора VECTASTAIN ABC-AP Standard Kit (Vector Labs; AK-5000). Блоты проявляли субстратом щелочной фосфатазы тетразолий нитросиний (NBT)/ 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).
Результаты вестерн-блоттинга показали, что SVR14 обеспечивал экспрессию двух видов белка ORF2 - с молекулярной массой 27 кДa и 25 кДa (см. фиг. 7). Белок с молекулярной массой 27 кДа предположительно является формой-предшественником, и белок с молекулярной массой 25 кДа образуется из него в результате отщепления концевого сигнального пептида. SVR15 обеспечивал экспрессию только белка с молекулярной массой 27 кДа, который в зараженных клетках локализовался в ядре (см. фиг. 7).
(3) Подтверждение структуры генома вирусов - продуктов двойной рекомбинации SVR16 и SVR17
Чтобы проверить структуру генома очищенных SVR16 и SVR17, получали их геномную ДНК, проводили процедуры, описанные в Примере 1 (1), и использовали в качестве матрицы для PCR (+0p - без пересева). Для проверки стабильности генома SVR14 и SVR15 их пассировали в клетках ESK-4 15 раз (+15p), и получали так же как +0p. Эти геномные ДНК анализировали путем PCR, используя набор праймеров P05-8 и P05-9, представленных последовательностями SEQ ID NO: 24 и 25 (см. фиг.8).
SEQ IDNO: 24
TATGTCTAAAGGTGCGTCTA
SEQ ID NO: 25
AGTGGCTATATTATCATCCTG
Результаты, полученные путем PCR (фиг. 8), показали, что очищенные SVR16 и SVR17 обладали ожидаемой структурой генома, и были стабильны после 15 пересевов in vitro.
(4) Подтверждение структуры генома вируса - продукта двойной рекомбинации SVR20
Чтобы проверить структуру генома очищенного SVR20, получали его геномную ДНК, проводя процедуры, описанные в Примере 1 (1), и использовали в качестве матрицы для PCR (+0p - без пересева). Для проверки стабильности генома SVR20 его пассировали в клетках ESK-4 15 раз (+15p), и получали так же как +0p. Эту геномную ДНК анализировали путем PCR, используя набор праймеров (а) SP7450F и SP8552R, представленных последовательностями SEQ ID NO: 22 и 23, для сайта IL18bp и (b) SP55500F и SP56363R, представленных последовательностями SEQ ID No: 26 и 27, для сайта TK (см. фиг. 9).
SEQ ID NO: 26
ATACGATTAAGCGATAGTGATA
SEQ ID NO: 27
ATATTATTTTCATTTGTTTCCTA
Результаты, полученные путем PCR (фиг. 9), показали, что очищенный SVR20 обладал ожидаемой структурой генома и был стабилен после 15 пересевов in vitro.
(5) Проверка белка ORF2 PCV2, экспрессируемого SVR16, SVR17 и SVR20
Белки ORF2 PCV2, экспрессируемые рекомбинантными вирусами оспы свиней, анализировали путем вестерн-блоттинга. Клетки ESK-4 в 6-луночных планшетах заражали вирусом дикого типа (wtSPV), SVR14, SVR15, SVR16, SVR17 или SVR20 с множественностью заражения (M.O.I.), составляющей 0,1. Через 6 суток клетки лизировали и с лизатами проводили электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (15% SDS-PAGE) и вестерн-блоттинг, используя поливинилидиндифторидные (PVDF) мембраны. Блоты блокировали 0,5%-ным сухим молоком, разведенным PBS, обрабатывали зондом - крысиной сывороткой против PCV2 (1:500) в качестве первого антитела, после чего проводили реакцию со вторыми антителами - конъюгированными с биотином козьими антителами против крысиного IgG (1:1000) - и реагентами набора VECTASTAIN ABC-AP Standard Kit (Vector Labs; AK-5000). Блоты проявляли субстратом щелочной форсфатазы тетразолий нитросиний (NBT)/5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).
Результаты вестерн-блоттинга (см. фиг. 10) показали, что, как ни странно, вирусы с двумя генными дефектами по данному изобретению обеспечивают экспрессию чужеродного гена более эффективно, чем вирусы с одним генным дефектом: SVR16 обеспечивал более высокий уровень экспрессии белка с молекулярной массой 25 кДа, нежели SVR15, а в случаях SVR17 и SVR20 экспрессировались два вида белка ORF2 (предшественник с молекулярной массой 27 кДа и укороченный белок с молекулярной массой 25 кДа) в большем количестве, чем в случае SVR14.
Пример 4. Проверка безопасности рекомбинантных вирусов оспы свиней в испытаниях на животных
1) Иммунизация свиней
4
50
Беспатогенных племенных свиней (12 особей), приобретенных в Национальной федерации сельскохозяйственных кооперативов Японии (ZEN-NOH; префектура Тиба, Япония), разделили на 4 группы по три особи (N=3). Каждое животное в возрасте 4 недели иммунизировали путем инъекции в шею с правой стороны (иглой 23G 1,5 дюйма), вводя 1мл 10 TCID/мл SVR16, SVR17, SVR20 либо вирусом дикого типа (wtSPV).
(2) Наблюдение за иммунизированными животными
2
Начиная с первого дня после вакцинации (1-DPV) вплоть до 18-го дня (18-DPV) ежедневно осматривали место инъекции. В течение эксперимента все особи оставались здоровыми и не проявляли никаких клинических признаков, например поноса или респираторных симптомов, за исключением кожной реакции в месте инъекции в случае вирусов SVR16, SVR17 или wtSPV. Степень покраснения кожи (проявление воспалительной реакции) измеряли по формуле [Длина (мм) x Ширина (мм) = мм]. Длину откладывали по оси X (более протяженное направление покраснения). Ширину откладывали по оси Y (менее протяженное направление покраснения). Размеры участков покраснения кожи в месте инъекции у вакцинированных свиней приведены в таблице 1; соответствующие графики представлены на фиг. 11.
Участки покраснения кожи в месте инъекции были наибольшими у свиней, получивших вирус дикого типа (wtSPV). В случае SVR20 у вакцинированных животных покраснения кожи в месте инъекции не наблюдалось. Эти результаты показывают, что рекомбинантные вирусы с двумя генными дефектами - в генах IL18-bp и TK - гораздо безопаснее, нежели вирус дикого типа (wtSPV). Особенно ослабленным оказался SVR20.
Пример 5. Проверка иммуногенности и безопасности рекомбинантных вирусов оспы свиней (второе испытание на животных)
(1) Иммунизация свиней
Беспатогенных племенных свиней (30 особей), приобретенных в Национальной федерации сельскохозяйственных кооперативов Японии (ZEN-NOH; префектура Тиба, Япония), разделили на 6 групп по пять особей (N=5).
5
50
Животных иммунизировали в возрасте 4 недели путем внутримышечной инъекции в шею с правой стороны. В группе 3 вводили 1мл 10 TCID/мл SVR20. В группе 4 свиньи получали 1 мл имеющейся в продаже вакцины против PCV2 Ingelvac CircoFLEX (Boehringer Ingelheim Vetmedica). В группах 5 и 6 животных не иммунизировали. Все особи, вакцинированные SVR20, выглядели здоровыми.
(2) Заражение свиней PCV2
5
50
Через 3 недели после вакцинации на свиней групп 1-5 воздействовали штаммом PCV2b Rm40 (приобретен в Ceva-Phylaxia Veterinary Biologicals Company, Венгрия) путем распыления 6 x 10 TCID внутрь правой ноздри. Свиней группы 6 не иммунизировали и не заражали указанным штаммом, так что они служили полным контролем.
(3) Вирусная (PCV2) нагрузка на органы лимфатической системы
Через три недели после заражения вирусом в нос (возраст свиней на этот момент составлял 10 недель) всех подопытных животных умертвили и вскрыли. У каждой особи брали срезы четырех лимфатических узлов: паховых (ILN), прикорневых (HLN), миндалин и брыжеечных (MLN); для каждого образца брали чистые ножницы и пинцет. Срезы помещали в стерильные пробирки типа Eppendorf объемом 50 мл и хранили при температуре -80°C вплоть до дальнейшей обработки.
3
Из образцов указанных органов выделяли ДНК, используя набор QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) по инструкциям производителя. ДНК PCV2 количественно анализировали путем полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR) по технологии TaqMan, описанной в работе J. Virol. Methods, 2004 Dec 15; 122 (2): 171-178 (PMID: 15542141). Данные об относительном количестве «положительных» по PCV2 свиней (PCV(+) > 1x10 копий на 1 мг органа) представлены в таблице 2.
Таблица 2. Свиньи PCV2 (+): данные по четырем органам лимфатической системы через 3 недели после воздействия вирусом
Группа
Число особей PCV2 (+)/Общее число особей (%)
#
Вакцина/Воздействие
HLN
ILN
Миндалины
MLN
G3
SVR20/ PCV2b Rm40
1/5 (20)
0/5 (0)
1/5 (20)
0/5 (0)
G4
CircoFlex/ PCV2b Rm40
4/5 (80)
1/5 (20)
3/5 (60)
1/5 (20)
G5
Без иммунизации/PCV2b Rm40
5/5 (100)
5/5 (100)
5/5 (100)
4/5 (80)
G6
Без иммунизации/Без воздействия PCV2b Rm40
0/5 (0)
0/5 (0)
0/5 (0)
0/5 (0)
Вакцинация вирусами с двумя генетическими дефектами по данному изобретению оказалась весьма эффективной для подавления вирусной (PCV2) нагрузки в лимфатических узлах. В частности, в прикорневых лимфатических узлах (HLN) у всех особей группы G5 (не вакцинированных) присутствовал PCV2 (100% PCV2(+)), тогда как в группе G3 (вакцинированные SVR20) - только у одной особи (20% PCV2(+)). В группе G4, в которой животные получали имеющуюся в продаже вакцину против PCV2, вирусная нагрузка была гораздо выше (80% PCV2(+)). В паховых лимфатических узлах (ILN) нагрузка PCV2 у свиней группы G5 (не вакцинированных) была полная (100% PCV2(+)), тогда как в группе G3 (вакцинированные SVR20) - ни у одной особи (0% PCV2(+)). В группе G4, в которой животные получали имеющуюся в продаже вакцину против PCV2, вирусная нагрузка была выше (20% PCV2(+)). В миндалинах у всех особей группы G5 (не вакцинированных) присутствовал вирус (100% PCV2(+)), тогда как в группе G3 (вакцинированные SVR20) - только у одной особи (20% PCV2(+)). Опять-таки в группе G4, в которой животные получали имеющуюся в продаже вакцину против PCV2, вирусная нагрузка была значительно выше (60% PCV2(+)). В брыжеечных лимфатических узлах (MLN) у большинства свиней группы G5 (не вакцинированных) имелся PCV2 (80% PCV2(+)), тогда как в группе G3 (вакцинированные SVR20) - ни у одной особи (0% PCV2(+)). В группе G4, в которой животные получали имеющуюся в продаже вакцину против PCV2, вирусная нагрузка была выше (20% PCV2(+)).
Эти результаты показывают, что вакцинация SVR20 создает гораздо более сильную защиту, чем существующие имеющиеся в продаже вакцины.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CEVA SANTE ANIMALE
<120> MULTIVALENT RECOMBINANT SPV
<130> B2263
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 1
cgaattcatt cctttatctt ta 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 2
ggaactacgt tatacgatca t 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 3
ttcgccctta cggtaccatt cctttatctt tataaacg 38
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 4
ctataatatt aaataagctt tatggagttg tttaaatac 39
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 5
cacacgataa cactgcagtc cacatattac ggttc 35
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 6
gccgcgaatt cgccctcgag gagctcacta cg 32
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 7
aattgcccgg gtaccgtcga tcgacttttt atggcccccc cggcca 46
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 8
agcttggccg ggggggccat aaaaagtcga tcgacggtac ccgggc 46
<210> 9
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 9
ggtaccgagc tcggtagccc gggccatggt agatcctcta gaggatccaa ttcatttata 60
gcatagaaaa aaacaaaatg aaattctact atattttctg cag 103
<210> 10
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic ORF2
<400> 10
atgacctacc ctagaagaag atataggagg cggaggcatc ggccacggag tcacctggga 60
caaattctgc ggagaaggcc atggttggtg catccaagac atagatatag gtggaggaga 120
aagaacggaa tctttaatac aagactgtct agaacttttg ggtacaccgt gaaaagaaca 180
accgtgagga ccccatcttg ggccgttgat atgatgaggt ttaacatcaa cgatttcttc 240
cctcctgggg gaggatctaa tcctagatcc gttccattcg agtattatag gatcaggaaa 300
gtgaaagtgg agttttggcc atgtagccca attactcaag gagatagagg tgttggatct 360
agcgccgtga tcctggacga caatttcgtg accaaagcaa ccgcactgac ttacgatcct 420
tacgtgaatt attctagcag acacactatt actcaaccat ttagctatca cagcagatat 480
ttcactccta agccagtgct ggacagcacc atcgactatt ttcagcctaa taataagagg 540
aatcaacttt ggcttaggct tcagaccgcc gggaacgtgg atcacgtggg attgggaacc 600
gcatttgaga attctattta tgatcaagag tataacatta gagtgactat gtacgtgcag 660
tttagggagt tcaacctgaa agatccacct ctgaatccat aa 702
<210> 11
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic ORF2
<400> 11
atgaaaacga tttccgttgt tacgttgtta tgcgtactac ctgctgttgt ttattcaaca 60
tgtactgtac ccactatgaa taacgctaaa ttgacgtcta ccgaaacatc gtggaaaaaa 120
gagaaaggag tcttgaacac cagattgtct agaaccttcg gttacaccat taagagaacc 180
accgtcaaaa ccccatcttg ggctgtcgat atgatgagat tcaacatcaa cgatttcgtc 240
ccacctggtg gtggatcaaa ccctagatcc gttccattcg agtactacag aatcagaaaa 300
gtcaaagtcg agttctggcc atgctctcct attactcagg gtgatagagg agttggatca 360
actgccgtca tcttggatga caacttcgtc actaaggcta ctgccttgac ctacgatcct 420
tacgtcaatt actctagtag acacaccatc acccaaccat tctcatacca ttccagatac 480
ttcactccaa aacctgtctt ggactcaacc atcgattact ttcaaccaaa caacaagaga 540
aaccaattgt ggttgagatt gcaaactgcc ggtaacgtcg atcatgtcgg attgggaacc 600
gccttcgaaa actccaaata cgaccaggag tacaacatta gagtcaccat gtacgtccaa 660
ttcagagagt tcaacttgaa ggacccacca ttgaacccat aa 702
<210> 12
<211> 288
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 12
aagcttggcc gggggggcca gctcggtaca taaaaatgtc gacggatccg agtgcaataa 60
attagaatag tttttcaatt tttacgcgta attaattatt gtatttatta tttatatgcc 120
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcttcataaa aagtcgatcg acggtaccac ccggggatcg 180
atccaaaaaa atctttcggc ctgcatgaat ggccttgttg atcgcttatt attatttttg 240
acaccagacc aactggtaat ggtagcgacc ggcgctcagc tggaattc 288
<210> 13
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic ORF2
<400> 13
ggatccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa gacaccgccc ccgcagccat 60
cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc cccgccaccg ctaccgttgg 120
agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca ccttcggata tactgtcaag 180
cgtaccacgg tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga tgagatttaa acttgacgac 240
tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac cctttgaata ctacagaata 300
agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca cccagggtga taggggagtg 360
ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaccaa aggcaccagc cctaacctat 420
gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc aacccttctc ctaccactcc 480
cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg attacttcca accaaataac 540
aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa atgtggacca cgtaggcctc 600
ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caagactaca atatccgtgt aaccatgtat 660
gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccactta acccctaagt cgac 714
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 14
aatattacgg gtgctgttt 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 15
aaaaacatcg tattcctg 18
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 16
cgttcatgtt aagcttaacc tgaaatattg 30
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 17
gtttaaacga attcggtacc cttaaaaaca tcg 33
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 18
cgccgagctc gagaatatta cgggtgctgt ttttac 36
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 19
ccagactgca gagaacatag gtcctaatat aag 33
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 20
aagtggagtt ttggccatgt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 21
tccagcactg gcttaggagt 20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 22
caattgaaac atctatatat cctt 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 23
caatgtgaag cgataaaata cag 23
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 24
tatgtctaaa ggtgcgtcta 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 25
agtggctata ttatcatcct g 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 26
atacgattaa gcgatagtga ta 22
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> oligonucleotide
<400> 27
atattatttt catttgtttc cta 23
<---