СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ
ANTIALLERGIC AGENT

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической иммунологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений в иммунной системе, наблюдающихся при аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваниях. Данные патологии являются большой медико-социальной проблемой и представляют собой неинфекционные заболевания иммунной системы, среди которых наиболее распространены различные формы реакции немедленного типа (атопический дерматит, бронхиальная астма, атопический ринит, крапивница, пищевые аллергии). Заболевания данной группы, как известно, обусловлены избыточным Th2 ответом, для которого характерен высокий уровень секреции интерлейкина-4, интерлейкина-5, интерлейкина-13, а также аллерген-специфических иммуноглобулинов классов Е и G4 (у мыши Е и G1).
Наиболее распространенными способами терапии IgE-зависимых патологий являются: аллерген-неспецифическое воздействие (например, применение блокаторов гистаминовых рецепторов, глюкокортикоидов, стабилизаторов мембран тучных клеток), направленное на предотвращение или уменьшение негативных эффектов иммуноглобулинов Е; специфическая иммунотерапия (СИТ), позволяющая переключить продукцию антител с иммуноглобулинов классов Е и G4 на иммуноглобулины класса G1 благодаря многократным десенсибилизирующим иммунизациям аллергеном. Несмотря на высокую эффективность СИТ, у нее имеются существенные недостатки: методика достаточно дорогая, для получения позитивного эффекта требуется несколько курсов (3-5 лет), необходимо точно выявить аллерген, что не всегда осуществимо [1]. Недавно появился еще один метод лечения с использованием моноклональных антител к иммуноглобулинам Е, фармакологический препарат на их основе получил название omalizumab или Е25 и показал свою высокую эффективность [2]. Однако его применение ограничено из-за высокой стоимости, необходимости повторных инъекций (каждые 2-3 недели) для поддержания клинического эффекта, а также из-за снижающейся по мере лечения эффективности за счет образования в организме пациента антител к вводимому препарату. Разрешенных к применению лекарственных средств, которые были бы направлены на ключевое звено патогенеза, а именно на подавление избыточной секреции Th2 цитокинов, пока не создано [3], однако необходимость их очевидна.
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих противоаллергической активностью и действующих на наиболее ранние этапы патогенеза Тh2-зависимых аллергических реакций, связанных с гиперпродукцией иммуноглобулинов Е и G1.
Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов, полученных из фармакопейного сырья аира болотного, в качестве средства, обладающего противоаллергической активностью за счет подавления продукции иммуноглобулинов Е и G1.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение водорастворимых полисахаридов, полученных из корня аира болотного, в качестве средства, обладающего противоаллергической активностью за счет подавления Тh2-зависимых реакций.
Новое свойство водорастворимых полисахаридов, полученных из корня аира болотного, установлено экспериментально.
Новое свойство полисахаридов явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве противоаллергического средства водорастворимые полисахариды, полученные из корня аира, можно использовать для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, таких как бронхиальная астма, аллергический бронхит, аллергический ринит, поллиноз, атопический дерматит, аллергический конъюнктивит, крапивница.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Полисахариды получены по стандартной методике [4]. Фармакопейное сырье аира болотного (Acorus calamus L.) измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С) при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Выход водорастворимых полисахаридов составлял 0,7 г (7%).
Эксперименты проведены на 60 линейных мышах ВАlb/с. Противоаллергические свойства изучены с использованием общепринятой модели общей анафилаксии, которую вызывали у мышей линии BAlb/с путем иммунизации овальбумином. Влияние исследуемых веществ оценивали по тяжести анафилактического шока, вызванного у иммунизированных таким образом мышей введением разрешающей дозы антигена, и по продукции иммуноглобулинов Е и G1, уровень продукции которых, как известно, является прогностическим и диагностическим критерием иммуноглобулин-Е-зависимых заболеваний [5].
Животным вводили под кожу бедра овальбумин (100 мкг/мышь) с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, оба «Sigma») в качестве адъюванта в 0,1 мл физиологического раствора хлорида натрия (ФР) с интервалом 2 недели между инъекциями. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.
Исследуемые вещества растворяли в ФР и вводили внутрибрюшинно по 10 мг/кг (доза подобрана в предварительных экспериментах). В качестве положительного контроля использовали мурамилдипептид (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамин, «Calbiochem»), который вводили по той же схеме в дозе 2 мг/кг (оптимальная доза, подобранная в предварительных экспериментах). При двукратной иммунизации инъекции полисахаридов делали в течение 5 дней после каждого введения овальбумина и за 5 дней до первого. При однократной иммунизации исследуемые вещества вводили 10 раз, начиная за 5 дней до инъекции овальбумина. Для оценки влияния исследуемых веществ на Тh2-зависимый иммунный ответ у части иммунизированных мышей вызывали анафилактический шок, у другой части забирали сыворотку крови из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20°С. Анафилактический шок развивался после инъекции разрешающей дозы овальбумина, которую вводили внутривенно (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус), что приводило к гибели некоторых мышей в течение 2-4 часов после введение разрешающей дозы. Содержание иммуноглобулинов Е и G1 в сыворотке иммунизированных овальбумином мышей определяли иммуноферментным методом с помощью коммерческих тест-систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемому протоколу.
Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.
Пример 1
Внутривенное введение разрешающей дозы антигена (овальбумина) вызывало развитие анафилактической реакции (анафилактического шока) с высокой степенью летальности. Действие водорастворимых растительных полисахаридов на Тh2-зависимый иммунный ответ оценивали по смертности в результате анафилактического шока. Было проведено 2 серии экспериментов (по 10 мышей в каждой группе), которые показали следующее (табл.1). Водорастворимые полисахариды аира и мурамилдипептид снижали летальность животных в результате анафилактического шока, при этом действие мурамилдипептида было незначительным (снижение на 10%), ПС аира уменьшали смертность на 25%.
Таблица 1
Влияние водорастворимых растительных полисахаридов и препарата сравнения (мурамилдипептид) на летальность животных в результате анафилактического шока
Исследуемое вещество
Группа
Летальность (%)
контроль
80
ПС аира
опыт
60
контроль
100
Мурамилдипептид
опыт
90
Таким образом, курсовое введение ПС аира приводило к уменьшению тяжести анафилактического шока.
Пример 2
Курсовое введение водорастворимых растительных полисахаридов приводило к снижению содержания иммуноглобулинов класса Е в сыворотке крови мышей, однократно или двукратно иммунизированных овальбумином (табл.2). Мурамилдипептид на фоне однократной сенсибилизации не влиял на данный показатель, а при двукратной иммунизации понижал его в 3,4 раза (до 2,17 мкг/мл, в контроле 7,36 мкг/мл). ПС аира уменьшали концентрацию IgE в 1,7 раза при однократной иммунизации (до 2,92 мкг/мл, в контроле 4,90 мкг/мл) и 3,4 раза при двукратной иммунизации (до 2,05 мкг/мл, в контроле 7,36 мкг/мл).
Таблица 2
Содержание IgE в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей, получавших курс полисахаридов и мурамилдипептида (Х±m)
Исследуемое вещество
Количество иммунизации
Группа
Содержание IgE (мкг/мл)
Мурамилдипептид
1
контроль
4,90±0,64
опыт
4,36±1,11
2
контроль
7,36±0,81
опыт
2,17±0,47*
ПС аира
1
контроль
4,90±0,64
опыт
2,92±0,45*
2
контроль
7,36±0,81
опыт
2,05±0,49*
Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.
Таблица 3
Содержание IgG1 в сыворотке крови дважды иммунизированных овальбумином мышей, получавших курс полисахаридов и мурамилдипептида (Х±m)
Исследуемое вещество
Группа
Содержание IgGl (мг/мл)
Мурамилдипептид
контроль
4,22±0,28
опыт
2,38±0,32*
ПС аира
контроль
4,22±0,28
опыт
2,00±0,50*
Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.
У дважды иммунизированных животных курсовое введение исследуемых веществ вызывало понижение концентрации IgGl (табл.3).
Мурамилдипептид уменьшал данный показатель в 1,8 раза (с 4,22 мг/мл до 2,38 мг/мл), ПС аира в 2,1 раза (с 4,22 мг/мл до 2,00 мг/мл).
Представленные результаты показывают, что водорастворимые полисахариды аира обладают способностью ингибировать продукцию В-лимфоцитами иммуноглобулинов классов Е и G1 и, как следствие этого, снижать тяжесть анафилактического шока.
Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что полисахариды, полученные из корня аира, обладают противоаллергическим действием. По сравнению с имеющимися противоаллергическими средствами исследованное нами вещество способно ингибировать развитие иммуноглобулин-Е-зависимых аллергий на самой первой - иммунологической - стадии их развития, вызывая снижение синтеза иммуноглобулинов классов Е и G1, что приводит к торможению развития дальнейших событий, связанных с выработкой и высвобождением биологически активных веществ, оказывающих повреждающее действие на клетки и ткани.
Использованная литература
1. Inführ D., Crameri R., Lamers R., Achatz G. Molecular and cellular targets of anti-IgE antibodies // Allergy. 2005. V.60 (№8). P.977-985.
2. Holgate S.T., Djukanovic R., Casale Т., Bousquet J. Anti-immunoglobulin E treatment with omalizumab in allergic diseases: an update on anti-inflammatory activity and clinical efficacy // Clin. Exp.Allergy. 2005. V.35. P.408-416.
3. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №3. С.199.
4. Методы исследования углеводов (пер. с английского В.А. Несмеянова, под. ред. проф. Харлина). М.: Мир, 1975. С.274.
5. Gehlhar К., Schlaak М., Becker W-M, Bufe A. Monitoring allergen immunotherapy of pollen-allergic patients: the ratio of allergen-specific IgG4 to IgGl correlates with clinical outcome // Clinical & Experimental Allergy. 1999. V.29 (4). P.497-506.