ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ШТАММ Bifidobacterium longum, КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ТАКОЙ ШТАММ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
PROBIOTIC STRAIN OF Bifidobacterium longum, COMPOSITION CONTAINING SUCH STRAIN AND USE THEREOF

Данное изобретение относится к штамму Bifidobacterium и его применению в качестве пробиотических бактерий, в частности в качестве иммуномодулирующего биотерапевтического агента.
11
12
Защитные механизмы для защиты желудочно-кишечного тракта человека от колонизации кишечными бактериями являются чрезвычайно сложными и включают как иммунологические, так и неиммунологические аспекты (1). Врожденные защитные механизмы включают низкий рН желудка, соли желчных кислот, перистальтику, слизистые слои и противомикробные соединения, такие как лизоцим (2). Иммунологические механизмы включают специализированные лимфоидные скопления, подстилающие М-клетки, именуемые пейеровыми бляшками, которые распространены по всей тонкой и толстой кишке (3). Антигены просвета (кишечника), представленные в этих участках, приводят к стимуляции подходящих субпопуляций Т- и В-клеток с установлением цитокиновых сетей и секрецией антител в желудочно-кишечный тракт (4). Кроме того, презентация антигенов внутриэпителиальным лимфоцитам и иммунным клеткам подлежащей собственной пластинки может происходить через эпителиальные клетки (5). Следовательно, организм "хозяина" осуществляет значительный вклад в иммунологическую защиту желудочно-кишечного тракта. Однако, поскольку слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта представляет собой наибольшую поверхность, на которой организм "хозяина" взаимодействует с внешней средой, должны существовать специфические контрольные механизмы для регуляции иммунологической реактивности на 100 тонн пищи, которые перерабатывает желудочно-кишечный тракт за среднюю продолжительность жизни. Кроме того, кишечник колонизирован более чем 500 видами бактерий, численность которых в толстой кишке составляет 10-10/г. Следовательно, эти контрольные механизмы должны быть способны отличать непатогенные прикрепленные бактерии от инвазивных патогенов, которые вызвали бы значительное поражение организма "хозяина". На самом деле, кишечная флора вносит вклад в защиту организма "хозяина" путем конкуренции с только что проглоченными потенциально патогенными микроорганизмами.
Бактерии, присутствующие в желудочно-кишечном тракте человека, могут стимулировать воспаление. Нарушенные иммунные ответы на собственную микрофлору связывали с определенными болезненными состояниями, такими как воспалительное заболевание кишечника. Антигены, ассоциированные с нормальной флорой, обычно приводят к иммунологической толерантности, и неспособность достичь этой толерантности является главным механизмом воспаления слизистой (6). Доказательство этого нарушения толерантности включает увеличение уровней антител, направленных против кишечной флоры, у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (IBD).
Настоящее изобретение направлено на штамм Bifidobacterium, который, как было показано, оказывает иммуномодулирующие эффекты путем модуляции уровней цитокинов или путем антагонизации и удаления провоспалительных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно данному изобретению предложен штамм Bifidobacterium АН1206 (NCIMB 41382) или его мутанты или варианты.
Мутантом может представлять собой генетически модифицированный мутант. Вариантом может представлять собой встречающийся в природе вариант Bifidobacterium.
Указанный штамм может быть пробиотическим. Он может находиться в форме биологически чистой культуры.
Согласно данному изобретению также предложен выделенный штамм Bifidobacterium NCIMB 41382.
В одном воплощении данного изобретения штаммы Bifidobacterium находятся в форме жизнеспособных клеток. В качестве альтернативы, штаммы Bifidobacterium находятся в форме нежизнеспособных клеток.
В одном воплощении изобретения штаммы Bifidobacterium выделены из кала младенцев, причем указанные штаммы Bifidobacterium являются в значительной степени иммуномодулирующими у людей после перорального потребления.
Согласно данному изобретению также предложен препарат, который содержит штамм Bifidobacterium по изобретению.
В одном воплощении изобретения препарат включает другое пробиотическое вещество.
В одном воплощении изобретения препарат включает пребиотическое вещество.
Предпочтительно препарат включает проглатываемый носитель. Проглатываемый носитель может представлять собой фармацевтически приемлемый носитель, такой как капсула, таблетка или порошок. Предпочтительно проглатываемый носитель представляет собой пищевой продукт, такой как сквашенное молоко, йогурт, замороженный йогурт, сухое молоко, концентрат молока, плавленые сыры, приправы или напитки.
В одном воплощении данного изобретения препарат по изобретению дополнительно содержит белок и/или пептид, в частности белки и/или пептиды, которые обогащены глутамином/глутаматом, липид, углевод, витамин, минеральный элемент и/или микроэлемент.
6
В одном воплощении данного изобретения штамм Bifidobacterium присутствует в препарате в концентрации более чем 10 КОЕ (колониеобразующая единица) на грамм системы доставки. Предпочтительно препарат включает любой один или более чем один из адъюванта, бактериального компонента, лекарственного средства или биологического соединения.
В одном воплощении данного изобретения препарат предназначен для протоколов иммунизации и вакцинации.
Кроме того, согласно данному изобретению предложен штамм Bifidobacterium или препарат по изобретению для применения в качестве пищевого продукта, в качестве лекарственного средства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной респираторной воспалительной активности, такой как астма, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности желудочно-кишечного тракта, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезнь Крона или язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, паучит или постинфекционный колит, для применения в профилактике и/или лечении ракового(ых) заболевания(ий) желудочно-кишечного тракта, для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит, для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, обусловленных нежелательной воспалительной активностью, для применения в профилактике и/или лечении рака, обусловленного нежелательной воспалительной активностью, для применения в профилактике рака, для применения в профилактике и/или лечении диареи, вызванной нежелательной воспалительной активностью, такой как диарея, ассоциированная с Clostridium difficile, диарея, ассоциированная с ротавирусом, или постинфекционная диарея, для применения в профилактике и/или лечении диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как Е. coli.
Согласно данному изобретению также предложен штамм Bifidobacterium или препарат по изобретению для применения в получении противовоспалительного биотерапевтического агента для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности или для применения в получении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности.
В одном воплощении данного изобретения штамм по изобретению действует путем антагонизации и удаления провоспалительных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта.
Согласно данному изобретению также предложен штамм Bifidobacterium или препарат по изобретению для применения в получении противовоспалительных биотерапевтических агентов для уменьшения уровней провоспалительных цитокинов.
Кроме того, согласно данному изобретению предложен штамм Bifidobacterium для применения в получении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней IL-10 (интерлейкин-10).
Согласно данному изобретению также предложено применение штамма Bifidobacterium в качестве противоинфекционного пробиотика благодаря его способности противодействовать росту патогенных видов.
Согласно данному изобретению также может быть предложено применение штамма Bifidobacterium в получении лекарственного средства для лечения астмы и/или аллергии. Данное лекарственное средство может находиться в форме, подходящей для ингаляции.
Кроме того, согласно данному изобретению может быть предложено применение штамма Bifidobacterium в получении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней IgE.
Авторы данного изобретения обнаружили, что конкретные штаммы Bifidobacterium вызывают иммуномодулирующие эффекты in vitro.
Поэтому данное изобретение может иметь потенциальное терапевтическое значение при профилактике или лечении нарушенных иммунных ответов, таких как нежелательные воспалительные реакции, например астма и/или аллергия.
Bifidobacterium представляют собой комменсальные микроорганизмы. Их выделяли из микробной флоры желудочно-кишечного тракта человека. Иммунная система в желудочно-кишечном тракте не может давать выраженную реакцию на представителей этой флоры, так как формирующаяся воспалительная активность также разрушила бы клетки хозяина и функцию ткани. Следовательно, существует(ют) некий(е) механизм(ы), посредством которого(ых) иммунная система может распознавать комменсальных непатогенных представителей желудочно-кишечной флоры как отличающихся от патогенных организмов. Это обеспечивает то, что повреждение тканей хозяина является ограниченным и защитный барьер все еще поддерживается.
Депонирование штамма Bifidobacterium longum АН1206 было произведено в NCIMB 15 марта 2006 года, и ему был присвоен регистрационный номер NCIMB 41382.
Bifidobacterium longum может представлять собой генетически модифицированный мутант, или он может представлять собой его встречающийся в природе вариант.
Предпочтительно Bifidobacterium longum находится в форме жизнеспособных клеток.
В качестве альтернативы, Bifidobacterium longum может находиться в форме нежизнеспособных клеток.
Понятно, что конкретный штамм Bifidobacterium по изобретению можно вводить животным (включая людей) в перорально проглатываемой форме в традиционном препарате, таком как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, порошок, лепешки, пилюли, суппозитории, суспензии и сиропы. Подходящие препараты могут быть получены стандартными способами с использованием традиционных органических и неорганических добавок. Количество активного ингредиента в медицинской композиции может находиться на уровне, который будет оказывать желательный терапевтический эффект.
Препарат также может включать бактериальный компонент, лекарственное средство или биологическое соединение.
Кроме того, вакцину, содержащую штаммы по изобретению, можно получать с использованием любого подходящего известного способа, и она может включать фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.
Во всем описании изобретения термины "мутант", "вариант" и "генетически модифицированный мутант" включают штамм бифидобактерий, генетические и/или фенотипические свойства которых изменены по сравнению с родительским штаммом. Встречающийся в природе вариант Bifidobacterium longum включает спонтанные изменения селективно выделенных целевых свойств. Преднамеренное изменение свойств родительского штамма осуществляется традиционными (in vitro) методами генетических манипуляций, такими как разрушение гена, конъюгативный перенос и т.д. Генетическая модификация включает введение экзогенных и/или эндогенных последовательностей ДНК в геном штамма бифидобактерий, например, путем вставки в геном бактериального штамма посредством векторов, включая плазмидную ДНК или бактериофаги.
Природные или индуцированные мутации включают по меньшей мере изменения одного основания, такие как делецию, вставку, трансверсию, или другие модификации ДНК, которые могут приводить к изменению аминокислотной последовательности, кодируемой последовательностью ДНК.
Термины "мутант", "вариант" и "генетически модифицированный мутант" также включают штамм бифидобактерий, который подвергался генетическим изменениям, которые накапливаются в геноме со скоростью, сопоставимой в природе для всех микроорганизмов и/или генетических изменений, которые происходят в результате спонтанной мутации и/или приобретения генов, и/или потери генов, которая не достигается преднамеренной (in vitro) манипуляцией с геномом, но достигается посредством естественного отбора вариантов и/или мутантов, которые обеспечивают селективное преимущество для поддержания выживания данной бактерии при воздействии давления окружающей среды, такого как антибиотики. Мутант можно создать с помощью преднамеренной (in vitro) вставки в геном конкретных генов, которые фундаментально не изменяют биохимическую функциональность организма, но продукты которых можно использовать для идентификации или отбора бактерии, например, по устойчивости к антибиотику.
Специалисту в данной области будет понятно, что мутантные или вариантные штаммы бифидобактерий можно идентифицировать посредством анализа гомологии последовательности ДНК с родительским штаммом. Штаммы бифидобактерий, имеющие близкую идентичность последовательности с родительским штаммом, считаются мутантными или вариантными штаммами. Штамм бифидобактерий с идентичностью (гомологией) последовательности 96% или более, такой как 97% или более, или 98% или более, или 99% или более с родительской последовательностью ДНК можно считать мутантным или вариантным. Гомологию последовательностей можно определять с использованием он-лайн алгоритма по поиску гомологии программы "BLAST", общедоступного на сайте http://www.ncbi.nlm.nih, gov/BLAST/.
Мутанты родительского штамма также включают штаммы, происходящие из бифидобактерий, имеющие по меньшей мере 85%-ную гомологию последовательности, такую как по меньшей мере 90%-ную гомологию последовательности, или по меньшей мере 95%-ную гомологию последовательности с межгенной спейсерной полинуклеотидной последовательностью 16s-23s родительского штамма. Эти мутации могут дополнительно содержать мутации ДНК в других последовательностях ДНК в бактериальном геноме.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1 представлен профиль штрихкода BOX ПЦР (полимеразная цепная реакция) (биоанализатор) для В. longum АН1206. Размеры пар оснований определяли с использованием программы Agilent2100;
На Фиг.2 представлен график, иллюстрирующий выход В. longum АН1206 из кала на протяжении 8-суточного периода кормления, и демонстрирует способность АН1206 выживать в желудочно-кишечном тракте мыши;
На Фиг.3 представлена гистограмма, показывающая эффект В. longum АН1206 на продукцию цитокина IL-10 человеческими РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови). Результаты выражены как среднее +/- SE (стандартная ошибка) (n=6);
4
На Фиг.4 представлена гистограмма, показывающая эффект кормления В. longum АН1206 на рекрутинг эозинофилов в легкие сенсибилизированных мышей. (А) общее число клеток, присутствующих в бронхоальвеолярном лаваже (BAL), снижалось у мышей, которых кормили АН1206; (Б) Лейкоцитарная формула BAL выявила, что снижение числа клеток происходило прежде всего в популяции эозинофилов. (Число клеток выражено по оси у (×10); *р<0,05 по сравнению с плацебо);
На Фиг.5А и Б представлены графики, показывающие эффект пробиотического бактериального штамма АН1206 (А) и плацебо (Б) на общее число клеток в бронхоальвеолярном лаваже после стимуляции овальбумином (OVA) у сенсибилизированных животных (n=10/группу, *=р<0,05 по сравнению со стимуляцией только OVA);
На Фиг.6А и Б представлены графики, показывающие эффект обработки пробиотическим бактериальным штаммом АН1206 (А) и плацебо (Б) на реактивность дыхательных путей к метахолину, как оценивали по изменениям форсированной паузы (Penh) у мышей, сенсибилизированных овальбумином (OVA), через 24 часа после интраназального стимула OVA или физиологическим раствором. Каждая точка данных представляет собой среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего) (n=10/группу, *р=<0,05 по сравнению с одним OVA);
На Фиг.7 представлен график, показывающий уровень цитокина TNF в бронхоальвеолярном лаваже (BAL) у мышей, сенсибилизированных овальбумином (OVA). Каждая колонка представляет собой среднее ±SEM (n=10, *р<0,05 по сравнению с OVA-стимулированным, обработанным бульоном MRS, контролем);
На Фиг.8А и Б представлены графики, показывающие эффект пероральной обработки пробиотическим штаммом АН1206 на продукцию цитокинов TNF (А) и IFNγ (Б) из активированных спленоцитов, выделенных из мышей, сенсибилизированных OVA (CD3/CD28-стимулированные спленоциты). Каждая колонка представляет собой среднее ±SEM (n=10, *р=<0,05 по сравнению с OVA-стимулированным, обработанным бульоном MRS, контролем);
На Фиг.9 представлен график, показывающий, что уровни OVA-специфического IgE в сыворотке, выделенной из мышей, которых кормили пробиотическими бактериями АН1206, были значительно ниже, чем у контрольных животных, которых не кормили пробиотиком (**р=<0,01);
На Фиг.10 представлен график, иллюстрирующий эффект пероральной обработки пробиотическим штаммом АН1206 на продукцию TNF-α активированными спленоцитами, выделенными из мышей, сенсибилизированных OVA (CD3/CD28-стимулированные спленоциты). Среднее проиллюстрировано для каждой группы (*р=<0,05, **р=<0,01 по сравнению с OVA и СТ стимулированным, обработанным бульоном MRS, контролем);
На Фиг.11 представлен график, иллюстрирующий, что CD4+CD25+ клетки от животных, которых кормили АН1206, значительно снижали пролиферацию (n=10 для всех групп, за исключением контроля, в котором n=20);
На Фиг.12 А и Б представлены графики, показывающие процент клеток в CD4+ популяции, которые также представляют собой CD25+, как оценивали проточной цитометрией (n=11 для группы, которую не кормили, n=20 для группы с плацебо и n=10 для группы, которую кормили АН1206); и
На Фиг.13. Процент CD4/CD25+клеток, экспрессирующих фактор транскрипции Foxp3, подвергается значительной повышающей регуляции у стерильных мышей, потребляющих АН1206 (n=8 или 9 на группу). *р<0,05 по сравнению с плацебо.
На Фиг.14 представлен график, иллюстрирующий стабильность пробиотического штамма АН1206 на протяжении 3 месяцев.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы данного изобретения обнаружили, что штамм АН1206 Bifidobacterium longum является не только устойчивым к кислоте и желчи и проходит через желудочно-кишечный тракт, но также неожиданно оказывает иммуномодулирующие эффекты путем модуляции уровней цитокинов или путем антагонизации и удаления провоспалительных или иммуномодулирующих микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта. В самом деле, потребление В. longum АН1206 значительно уменьшает рекрутинг клеток, вызывающих заболевание, в легкие в мышиной модели астмы.
Обычным применением пробиотических бактерий является применение в форме жизнеспособных клеток. Однако оно также может быть распространено на нежизнеспособные клетки, такие как убитые культуры или композиции, содержащие полезные факторы, экспрессируемые пробиотическими бактериями. Они могли бы включать микроорганизмы, убитые нагреванием, или микроорганизмы, убитые воздействием измененного рН или подвергнутые действию давления. Получение продукта с нежизнеспособными клетками проще, клетки можно легко включать в фармацевтические препараты, и требования к хранению являются значительно менее ограниченными, чем в случае с жизнеспособными клетками. Lactobacillus case/ YIT 9018 является примером эффективного применения клеток, убитых нагреванием, в качестве способа лечения и/или предупреждения роста опухолей, как описано в патенте США № US 4347240.
Не известно, требуются ли интактные бактерии для оказания иммуномодулирующего эффекта, или можно использовать только индивидуальные активные компоненты по изобретению. Были идентифицированы провоспалительные компоненты некоторых бактериальных штаммов. Провоспалительные эффекты грамотрицательных бактерий опосредованы липополисахаридом (LPS). Один LPS индуцирует провоспалительную сеть отчасти благодаря связыванию LPS с рецептором CD14 на моноцитах. Предполагается, что компоненты пробиотических бактерий обладают иммуномодулирующей активностью благодаря эффектам целой клетки. При выделении этих компонентов предполагается манипуляция фармацевтического уровня.
2
IL-10 продуцируется Т-клетками, В-клетками, моноцитами и макрофагами. Этот цитокин усиливает пролиферацию и дифференцировку В-клеток в клетки, секретирующие антитела. IL-10 демонстрирует главным образом противовоспалительные активности. Он осуществляет повышающую регуляцию экспрессии IL-1RA моноцитами и подавляет большую часть воспалительных активностей моноцитов. IL-10 ингибирует продукцию моноцитами цитокинов, реакционно-способных промежуточных соединений кислорода и азота, экспрессию МНС (главный комплекс гистосовместимости) II класса, киллинг паразитов и продукцию IL-10 через механизм обратной связи (7). Также было показано, что этот цитокин блокирует продукцию моноцитами интестинальной коллагеназы и коллагеназы типа IV, препятствуя PGE-cAMP-зависимому пути, и, следовательно, может быть важным регулятором разрушения соединительной ткани, наблюдающегося при хронических воспалительных заболеваниях.
Ответ организма "хозяина" на инфекцию характеризуется врожденными и приобретенными клеточными и гуморальными иммунными реакциями, предназначенными для ограничения распространения нежелательного организма и для восстановления гомеостаза органа. Однако для ограничения агрессивности сопутствующего повреждения тканей хозяина может быть активирован целый ряд регуляторных ограничений. Регуляторные Т-клетки (Treg) служат одним таким механизмом. Они происходят из тимуса, но также могут индуцироваться в периферических органах, включая слизистую кишечника. Преднамеренное введение клеток Treg подавляет воспалительное заболевание в различных мышиных моделях, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, воспалительное заболевание кишечника, индуцированный бактериями колит, артрит, индуцированный коллагеном, диабет 1 типа, эозинофильное воспаление дыхательных путей, заболевание "трансплантат против хозяина" и трансплантацию органов. Транскрипционный фактор forkhead (с функциональным доменом в форме "вилки") Foxp3 (forkhead box Р3), селективно экспрессирующийся в клетках Treg, требуется для развития и функции Treg и является достаточным для индукции фенотипа Treg в традиционных CD4 клетках (19). Мутации в Foxp3 вызывают тяжелый аутоиммунитет во многих органах как у человека, так и у мыши. Авторы данного изобретения описали штамм Bifidobacterium, который продуцирует CD25-положительные/Foxp3-положительные Т-регуляторные клетки in vivo.
Данное изобретение станет более понятным из следующих примеров.
Пример 1: Характеристика бактерий, выделенных из кала младенцев. Демонстрация пробиотических свойств
Выделение пробиотических бактерий
2
Свежий кал получали от 2-суточных грудных младенцев мужского пола и последовательные разведения переносили на чашки со средами TRY (триптиказа, пептон и дрожжевой экстракт) и MRS (deMann, Rogosa and Shape) с 0,05% цистеина и мупироцина. Чашки инкубировали в анаэробных сосудах (BBL, Oxoid) с использованием наборов, генерирующих CO (Anaerocult A, Merck), в течение 2-5 суток при 37°С. Изоляты грамположительных, отрицательных по каталазе стержневидных или раздвоенных/плеоморфных бактерий высевали штрихами для определения чистоты на сложные неселективные среды (MRS и TPY). Изоляты обычно культивировали в среде MRS или TPY, если не указано иное, при 37°С в анаэробных условиях. Предполагаемые Bifidobacterium концентрировали в 40%-ном глицерине и хранили при -20°С и -80°С.
После выделения чистого штамма бифидобактерий, которому было присвоено обозначение АН1206, оценили микробиологические характеристики и обобщили их в Таблице 1, приведенной ниже. АН1206 представляет собой грамположительную, отрицательную по каталазе бактерию плеоморфной формы, которая является положительной по фруктозо-6-фосфатфосфокетолазе, подтверждая ее идентичность в качестве бифидобактерий. При использовании минимальных сред, в которые был включен один источник углерода, АН1206 была способна расти на всех протестированных источниках углерода (глюкоза, лактоза, рибоза, арабиноза, галактоза, раффиноза, фруктоза, экстракт солода, манноза, мальтоза, сахароза).
Таблица 1
Физико-химические характеристики Б. longum AH1206
Характеристики штамма
В. longum AH1206
Окрашивание по Грамму
+
Каталаза
-
Подвижность
-
F6PPK*
+
Коагуляция молока
+
Анаэробная культура при 45°С
-
Аэробная культура при 45°С
-
Ферментация углеводов:
Глюкоза
+
Лактоза
+
Рибоза
+
Арабиноза
+
Галактоза
+
Раффиноза
+
Фруктоза
+
Экстракт солода
+
Манноза
+
Мальтоза
+
Сахароза
+
* означает анализ фруктозо-6-фосфатфосфокетолазы
Идентификация вида
Для идентификации видов выделенных бифидобактерий проводили секвенирование межгенного спейсера (IGS) 16s. Кратко, ДНК выделяли из АН1206 с использованием 100 мкл экстрагирующего раствора и 25 мкл раствора для приготовления ткани (Sigma, набор XNAT2). Пробы инкубировали в течение 5 минут при 95°С и затем добавляли 100 мкл нейтрализующего раствора (набор XNAT2). Раствор геномной ДНК количественно оценивали с использованием спектрофотометра Nanodrop и хранили при 4°С. ПЦР проводили с использованием IGS праймеров, IGS L (левый): 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' (SEQ ID NO. 3), который основан на SEQ ID NO. 1, и IGS R (правый): 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID NO. 4), который основан на SEQ ID NO. 2. Условия циклов представляли собой: 94°С за 3 мин (1 цикл), 94°С за 30 с, 53°С за 30 с, 72°С за 30 с (28 циклов). ПЦР реакция содержала 4 мкл (50 нг) ДНК, смесь для ПЦР (набор XNAT2), 0,4 мкМ праймеров IGS L и R (MWG Biotech, Германия). ПЦР реакции проводили в термоциклере Eppendorf. ПЦР-продукты (10 мкл) разделяли рядом с маркером молекулярной массы (лестница 100 п.н., Roche) на 2%-ном агарозном геле, окрашенном EtBr (бромистый этидий), в ТАЕ для определения профиля IGS. ПЦР-продукты Bifidobacterium (одна полоса) очищали с использованием набора для очистки Promega Wizard PCR. Очищенные ПЦР-продукты секвенировали с использованием последовательностей праймеров (приведенных выше) для межгенной спейсерной области. Данные по последовательностям затем искали в базе данных нуклеотидных последовательностей NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) для определения идентичности штамма по гомологии нуклеотидов. Полученные данные по ДНК последовательностям использовали в стандартной системе поиска нуклеотид-нуклеотидной гомологии BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Идентифицировали ближайшее соответствие с данной последовательностью и затем выравнивали последовательности для сравнения с использованием программы DNASTAR MegAlign. Полученные последовательности можно посмотреть в перечне последовательностей, в котором SEQ ID NO. 1 представляет собой прямую последовательность IGS и SEQ ID NO. 2 представляет собой обратную последовательность IGS. Поиск в базе данных NCIMB выявил, что АН1206 имеет уникальную последовательность IGS с ближайшей гомологией последовательностей с Bifidobacterium longum.
Для того чтобы выявить штрихкодовый профиль ПЦР для АН1206, ПЦР проводили с использованием праймеров BOX (8). Условия циклов представляли собой: 94°С за 7 мин (1 цикл), 94°С за 1 минуту, 65°С за 8 минут (30 циклов) и 65°С за 16 минут. ПЦР реакция содержала 50 нг ДНК, смесь для ПЦР (набор XNAT2), 0,3 мкМ праймер BOXA1R (5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (SEQ ID No. 5) (MWG Biotech, Германия). ПЦР реакции проводили на термоциклере Eppendorf. ПЦР-продукты (1 мкл) разделяли рядом с маркером молекулярной массы (лестница ДНК 7500, Agilent, Германия) с использованием DNA 7500 LabChip на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Германия). Штрихкод (профиль ПЦР-продуктов) определяли с использованием программы Agilent Bioanalyzer, где идентифицировали число и величину пиков (ПЦР-продуктов) (Фиг.1).
Профили чувствительности к антибиотикам
Профили чувствительности к антибиотикам штамма В. longum определяли с использованием анализа "чувствительности к дискам". Культуры выращивали в подходящей бульонной среде в течение 24-48 ч, не густо высевали на чашки (100 мкл) с агаровой средой и помещали на агар диски, содержащие известные концентрации антибиотиков. Штаммы исследовали на чувствительность к антибиотикам после 1-2-суточной инкубации при 37°С в анаэробных условиях. Штаммы считали чувствительными, если были видны зоны ингибирования 1 мм или более. Независимо оценивали минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) для каждого антибиотика. MIC для клиндамицина, ванкомицина и метронидазола составляли 0,32, 0,75 и 0,38 соответственно.
Прохождение через кишечник
Для определения того, могла ли Bifidobacterium longum выживать при низких значениях рН, эквивалентных значениям, обнаруженным в желудке, бактериальные клетки отбирали из свежих, выращенных в течение ночи культур, дважды промывали в фосфатном буфере (рН 6,5) и ресуспендировали в бульоне TPY, рН которого был доведен до 2,5 (1 М HCI). Клетки инкубировали при 37°С и выживание измеряли с интервалами 5, 30, 60 и 120 минут с использованием чашечного способа подсчета. АН1206 хорошо выживали в течение 5 минут при рН 2,5, тогда как через 30 минут жизнеспособных клеток не выделяли.
На выходе из желудка предположительные пробиотики подвергаются воздействию желчных солей в тонком кишечнике. Для того чтобы определить способность В. longum выживать при воздействии желчи, культуры высевали штрихами на чашки с TPY и агаром, дополненные 0,3% (мас./об.), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% или 10% свиной желчи. Рост В. longum AH1206 наблюдали на чашках, содержащих вплоть до 1% желчи.
9
В мышиной модели оценивали способность В. longum AH1206 проходить через желудочно-кишечный тракт. Мыши ежесуточно потребляли 1×10 AH1206 и фекальные комочки исследовали на присутствие скормленного микроорганизма. Определение AH1206 было облегчено выделением спонтанного рифампицин-устойчивого варианта бифидобактерий - включение рифампицина в чашки с TPY, используемые для оценки прохождения, гарантировало, что культивировали только скормленные бифидобактерии, устойчивые к рифампицину. Фекальные образцы собирали ежесуточно и подтверждали прохождение В. longum через желудочно-кишечный тракт (Фиг.2).
Антимикробная активность
Индикаторные патогенные микроорганизмы, используемые в этом исследовании, размножали в следующей среде при следующих условиях роста: Salmonella typhimurium (37°С, аэробные) - в триптон-соевом бульоне/агаре с добавлением 0,6%-ного дрожжевого экстракта (TSAYE, Oxoid), Campylobacter jejuni (37°С, анаэробные) и Е. coli O157:Н7 (37°С, анаэробные) - на среде с кровяным агаром, Clostridium difficile (37°С, анаэробные) - в улучшенной клостридиальной среде (RCM, Oxoid). Все штаммы инокулировали в свежую ростовую среду и выращивали в течение ночи перед использованием в экспериментах.
Антимикробную активность определяли с использованием замедленного способа (9). Кратко, В. longum AH1206 инкубировали в течение 36-48 ч. Десятикратные последовательные разведения не густо высевали на чашки (100 мкл) на среду TPY-агар. После инкубации в течение ночи чашки с отчетливыми колониями покрывали слоем с индикаторной бактерией. Индикаторный "газон" получали путем инокуляции расплавленного верхнего слоя 2% (об./об.) ночной индикаторной культуры, который выливали на поверхность инокулированных чашек с ТРY. Чашки снова инкубировали в течение ночи в условиях, подходящих для роста индикаторной бактерии. Индикаторные культуры с зонами ингибирования с радиусом более 1 мм считали чувствительными к тестируемой бактерии. В. longum AH1206 ингибировала рост всех протестированных патогенных организмов с измеренными зонами осветления 14, более 80, 13,33 и 17 мм для Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, E.coli O157:1-17 и Clostridium difficile соответственно.
Пример 2: Продукция цитокинов РВМС в ответ на В. longum
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от здоровых доноров посредством центрифугирования в градиенте плотности. РВМС стимулировали пробиотическим бактериальным штаммом в течение 72-часового периода при 37°С. В это время культуральные супернатанты собирали, центрифугировали, распределяли по аликвотам и хранили при -70°С до оценки на уровни IL-10 с использованием цитометрического анализа с шариками (BD BioSciences). AH1206 индуцировал значительную секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 человеческими РВМС (Фиг.3), что свидетельствует о том, что этот штамм может быть полезным в качестве противовоспалительного агента in vivo.
Пример 3: В. longum AH1206 ослабляет респираторное заболевание в мышиной модели астмы
В этом исследовании использовали сенсибилизированную овальбумином (OVA) мышиную модель Balb/c аллергического воспаления дыхательных путей. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинной инъекцией OVA и заболевание инициировали интраназальной стимуляцией OVA. Через двадцать четыре часа после последней стимуляции (15-е сутки) мышей подвергали измерениям реактивности дыхательных путей с последующей BAL процедурой. В качестве контролей служили OVA-сенсибилизированные, стимулированные физиологическим раствором мыши. Начиная с 1-х суток (т.е. во время первой OVA-сенсибилизации), животные получали В. longum АН1206 через иглу для искусственного вскармливания в течение 14 последующих суток. Животные, которых искусственно вскармливали бульоном MRS, служили в качестве контроля.
Воспаление дыхательных путей оценивали по количеству воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже (BAL). Клетки удаляли из BAL жидкости центрифугированием и ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (1 мл). Клетки BAL окрашивали трипановым синим и жизнеспособные клетки подсчитывали с использованием гемоцитометра. Мазки клеток BAL готовили с Cytospin (Thermo Shandon, Pittsburg, PA) и окрашивали реагентом НЕМА 3 (Biochemical Sciences, Swedesboro, NJ) для дифференциальных подсчетов клеток, где для каждого выделения подсчитывали всего 200 клеток. Потребление В. longum АН1206 значительно снижало общее число клеток BAL по сравнению с плацебо, причем основное различие наблюдается в популяции эозинофилов (Фиг.4).
Это исследование повторяли для дальнейшего исследования того, подавляет ли штамм пробиотических бактерий Bifidobacterium longum АН1206 аллергические ответы в OVA-сенсибилизированной мышиной модели аллергического воспаления дыхательных путей. Кратко, взрослых самцов мышей BALB/c сенсибилизировали внутрибрюшинной инъекцией OVA в 0-е сутки и на 6-е сутки. На 12-е и 14-е сутки мышей интраназально стимулировали OVA. Через двадцать четыре часа после последней стимуляции (15-е сутки) мышей подвергали измерениям реактивности дыхательных путей с последующей BAL процедурой. В качестве контролей служили мыши, сенсибилизированные OVA/алюминиевыми квасцами, стимулированные физиологическим раствором. На протяжении всего испытания животные получали пробиотик или плацебо. Воспаление дыхательных путей (цитокины и количество клеток) оценивали подсчетом воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже (BAL). Реактивность дыхательных путей также измеряли с использованием плетизмографа для целого организма Вuхсо. Также выделяли спленоциты из OVA-сенсибилизированных мышей и инкубировали в присутствии антител против CD3 и против CD28, после чего измеряли уровни цитокинов в супернатантах посредством проточной цитометрии.
Обработка В. longum АН1206 приводила к значимому уменьшению числа клеток, выделенных из BAL жидкости после стимуляции OVA по сравнению с животными, которых кормили бульоном (Фиг.5). Измеряли реактивность дыхательных путей, и стимуляция мышей, сенсибилизированных OVA, приводила к увеличению AHR (гиперчувствительность дыхательных путей) на метахолин по сравнению с мышами, стимулированными физиологическим раствором. Однако модуляции этой повышенной реактивности дыхательных путей на метахолин не наблюдали (Фиг.6), как оценивали по изменениям в форсированной паузе.
Уровни цитокинов BAL измеряли цитометрическим анализом с шариками, и не было замечено значимых различий для уровней IL-10, IFN-γ, IL-6 и CCL2. АН1206 значительно снижал уровни TNF-α по сравнению с OVA контролем (Фиг.7).
Уровни цитокинов в супернатантах спленоцитов количественно измеряли цитометрическим анализом с шариками после стимуляции in vitro OVA или анти-CD3 и анти-CD28. У мышей, которых кормили АН1206, не наблюдали повышенного высвобождения IL-10 из OVA-стимулированных спленоцитов, связанного с OVA сенсибилизацией in vivo. He было значимого различия в уровнях IL-6, TNF и МСР-1 (CCL2). Высвобождение IL-10 из CD3/CD28 спленоцитов у животных, которых кормили АН1206, не увеличивалось. Однако в супернатантах культуры спленоцитов животных, которых кормили АН1206, значимо уменьшалась секреция провоспалительных цитокинов TNF-α и IFN-γ (Фиг.8). Не заметили значимых изменений для других измеренных цитокинов.
Пример 4: Модель кормления OVA
2
2
Целью этого исследования было изучение того, подавляет ли пробиотическая бактерия Bifidobacterium longum АН1206 аллергические ответы в мышиной модели аллергии, индуцированной овальбумином (OVA). Мышей BALB/c разделяли на группы (8/группу) и кормили плацебо, Bifidobacterium longum АН1206 и дистиллированной НО в течение четырех недель. Всех мышей еженедельно подвергали пероральному искусственному вскармливанию овальбумином и холерным токсином в 300 мкл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), за исключением одной из групп дНO, которую подвергали пероральному искусственному вскармливанию только 300 мкл PBS в качестве контроля. После четырех недель обработки у каждой мыши брали образец крови через прокол лицевой вены и проводили последующий ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) для измерения уровней OVA-специфичных lgЕ. Выделяли селезенки и клетки брыжеечных лимфатических узлов и стимулировали in vitro LPS (липополисахарид), анти-CD3/CD28 и иммунодоминантным пептидом OVA. Th1- и Th2-цитокины измеряли с помощью цитометрического СВА (цитометрического анализа с шариками).
В группе, которую кормили пробиотиком, было значительно меньше индуцированного OVA-специфичного IgE по сравнению с группами плацебо и положительного контроля (Фиг.9). Группа отрицательного контроля и группы, которых кормили АН1206, не отличались, что свидетельствует о том, что кормление АН1206 полностью ингибировало индукцию OVA-специфичного IgE ответа. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия.
2
Спленоциты выделяли из мышей BALB/c, которых кормили пробиотиком, плацебо и дHО, и либо оставляли нестимулированными, либо стимулировали LPS, анти CD3/CD28 и иммунодоминантным пептидом OVA и затем анализировали на продукцию цитокинов TNF-α, IL-2, IFN-γ, IL-4 и IL-5 с помощью Th1/Th2 цитометрического анализа с шариками. Результаты по цитокинам обобщены в Таблице 2.
Таблица 2
Заключение по цитокинамНестимулированные спленоциты
Штамм
TNF-альфа
IL-2
IFN-гамма
IL-4
IL-5
АН1206
Спленоциты, стимулированные LPS
Штамм
TNF-альфа
IL-2
IFN-гамма
IL-4
IL-5
АН1206
↑отн. НК
↑отн. НК
Спленоциты, стимулированные анти-CD3/СD28
Штамм
TNF-альфа
IL-2
IFN-гамма
IL-4
IL-5
АН1206
↑ отн. ОК ↓ отн. ПК
↑ отн. ОК ↓ отн. ПК
↑ отн. ОК ↓ отн. ПК
↓ отн. ПК
↑ отн. ОК ↓ отн. ПК
отн. = относительно
ОК = отрицательный контроль (кормили водой, стимулировали PBS)
ПК = положительный контроль (кормили водой, стимулировали OVA и СТ)
В нестимулированных спленоцитах не наблюдали изменений по сравнению с контрольными животными. Высвобождение TNF-α и IFN-γ из спленоцитов, стимулированных LPS, было значительно большим для животных, которых кормили АН1206, по сравнению с отрицательными контролями, но эти уровни согласовались с уровнями, которые наблюдали с положительными контролями, сенсибилизированными OVA, которым вводился холерный токсин. CD3/CD28 стимуляция выявила глубокие изменения в лимфоцитной сигнализации у группы, которую кормили пробиотиком. Животные, которых кормили АН1206, секретировали значительно меньше TNF-α по сравнению с положительными контролями, но уровни были выше по сравнению с отрицательными контролями (Фиг.10). Животные, которых кормили АН1206, имели значительно меньшие уровни IFN-γ, IL-2, IL-4 и IL-5 по сравнению с положительными контролями, которых не кормили пробиотиком.
Пример 5: Тrеg-эффекторная модель
В этом исследовании изучали эффект потребления пробиотика на число и активность регуляторных Т-клеток у здоровых мышей. Мышей BALB/c (10/группу) кормили Bifidobacterium longum АН1206 или плацебо в течение трех недель. После потребления пробиотика/плацебо выделяли CD4+CD25+Т-регуляторные клетки и их подавляющую активность in vitro определяли путем измерения пролиферации анти-CD3/CD28-стимулированных CFSE-меченных CD4+ Т-клеток-респондеров, используя проточную цитометрию. В качестве контроля CD4+ Т-клетки-респондеры инкубировали вместе с CD4+CD25- Т-клетками. Процент CD4+CD25+ клеток (регуляторные Т-клетки) в мышиных спленоцитах, которые также являются РохР3-положительными, определяли в селезенках мышей, которых кормили пробиотиком или плацебо.
% CD4+ клеток, которые пролиферировали при инкубации вместе с CD4+CD25+ клетками от мышей, которых кормили пробиотиком/плацебо, сравнивали с % CD4+ клеток, которые пролиферировали при инкубации вместе с CD4+CD25- клетками от тех же испытуемых мышей. В каждом случае пролиферация Т-клеток была меньше в культурах, содержащих CD4+CD25+ клетки, по сравнению с культурами, содержащими только CD4 клетки и истощенными по CD25+ клеткам (Фиг.11).
Определяли % клеток в CD4+популяции, которые также были CD25+ (Фиг.12). Группа, которую кормили Bifidobacterium longum AH1206, имела значительно больше CD4+ Т-клеток, которые были CD25+ (т.е. Т-регуляторные клетки), чем группа, которую кормили плацебо (р=0,0081). Это говорит о том, что % Т-регуляторных клеток в CD4+ популяции значительно повышался при кормлении AH1206.
Также определяли число CD4+CD25+FoxP3+ клеток в полных популяциях спленоцитов мышей, которых кормили пробиотиком или плацебо. Число CD4+CD25+ Т-регуляторных клеток, экспрессирующих FoxP3, не изменялось в селезенках мышей, которых кормили пробиотиком, по сравнению с мышами, которых кормили плацебо или которых не кормили.
Пример 6: Стерильная модель
Стерильных мышей приобретали в возрасте 6 недель и содержали в стерильном блоке в блоке биологических служб в UCC. Животные потребляли пробиотический штамм Bifidobacterium longum AH1206 в течение 14 суток или оставались стерильными. Индукцию Т-регуляторных клеток оценивали по проточной цитометрии.
Количество CD4+CD25+Foxp3+клеток в селезенке стерильных животных, которых кормили AH1206, значительно увеличивалось после кормления (Фиг.13). Общее количество CD3/CD4 или CD3/CD8 оставалось неизменным.
Пример 7: Результаты по стабильности
Стабильность пробиотического штамма AH1206 оценивали на протяжении 3 месяцев при 30°С (Фиг.13).
Эти результаты показывают, что Lactobacillus rhamosus GG был плохим исполнителем на протяжении периода тестирования с 2 log падением на протяжении 3 месяцев, тогда как AH1206 был довольно стабильным без потери жизнеспособности, регистрируемой на протяжении данного периода.
Иммуномодуляция
Человеческая иммунная система играет важную роль в этиологии и патологии огромного числа человеческих заболеваний. Гипер- и гипоиммунореактивность приводит к большинству болезненных состояний или является их компонентом. Одно семейство биологических соединений, названных цитокинами, является особенно важным для контроля иммунных процессов. Нарушения этих тонких цитокиновых сетей все в большей степени связывают со многими заболеваниями. Эти заболевания включают, но не ограничиваются этим, воспалительные расстройства, иммунодефицит, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, рак (особенно раковые заболевания желудочно-кишечной и иммунной систем), диарею, диарею, ассоциированную с антибиотиками, педиатрическую диарею, аппендицит, аутоиммунные расстройства, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит, целиакию, сахарный диабет, трансплантацию органов, бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, пародонтоз, заболевание мочеполовой системы, заболевание, передающееся половым путем, ВИЧ-инфекцию, репликацию ВИЧ, диарею, ассоциированную с ВИЧ, травму, ассоциированную с хирургическим вмешательством, метастатическое заболевание, индуцированное хирургическим вмешательством, сепсис, потерю массы тела, анорексию, контроль лихорадки, кахексию, заживление ран, язвы, барьерную функцию кишечника, аллергию, астму, респираторные расстройства, расстройства кровообращения, коронарную болезнь сердца, анемию, расстройства системы свертывания крови, почечное заболевание, расстройства центральной нервной системы, заболевание печени, ишемию, расстройства питания, остеопороз, эндокринные расстройства, эпидермальные расстройства, псориаз и обыкновенные угри. Эффекты на продукцию цитокинов являются специфичными для исследованного пробиотического штамма. Таким образом, можно выбрать конкретные пробиотические штаммы для нормализации особого цитокинового дисбаланса, индивидуального для конкретного типа заболевания. Адаптацию терапий, специфичных для заболевания, можно осуществлять с использованием либо одного штамма АН1206 или его мутантов или вариантов, либо набора этих штаммов.
Обучение иммунной системы
Кишечная флора важна для развития и правильного функционирования кишечной иммунной системы. В отсутствие кишечной флоры кишечная иммунная система является недоразвитой, как продемонстрировано в стерильных животных моделях, и определенные функциональные параметры, такие как фагоцитирующая способность макрофагов и продукция иммуноглобулинов, снижаются (10). Важность кишечной флоры в стимуляции неповреждающих иммунных ответов становится более очевидной. Увеличение частоты возникновения и тяжести аллергий в западном мире связывали с улучшением гигиены и санитарии, сопровождающимся уменьшением числа и диапазона инфекционных стимулов, с которыми сталкивается организм "хозяина". Это отсутствие иммунной стимуляции может позволить организму "хозяина" реагировать на непатогенные, но антигенные агенты, приводя к аллергии или аутоиммунитету. Преднамеренное потребление ряда непатогенных иммуномодулирующих бактерий обеспечило бы организм "хозяина" необходимыми и подходящими обучающими стимулами для правильного развития и контроля иммунной функции.
Воспаление
Воспаление представляет собой термин, используемый для описания местного накопления жидкости, белков плазмы и лейкоцитов в участке, который имеет сохраняющееся физическое повреждение, инфекцию, или где имеет место продолжительный иммунный ответ. Контроль воспалительного ответа осуществляется на нескольких уровнях (11). Контролирующие факторы включают цитокины, гормоны (например, гидрокортизон), простагландины, реакционно-способные промежуточные соединения и лейкотриены. Цитокины представляют собой низкомолекулярные биологически активные белки, которые участвуют в генерации и контроле иммунологических и воспалительных ответов, в то же время регулируя также развитие, репарацию тканей и гематопоэз. Они обеспечивают средства коммуникации между самими лейкоцитами и также с другими типами клеток. Большинство цитокинов являются плейотропными и экспрессируют множество биологически перекрывающихся активностей. Цитокиновые каскады и сети контролируют воспалительный ответ, а не действие конкретного цитокина на конкретный тип клеток (12). Ослабление воспалительного ответа приводит к меньшим концентрациям подходящих активирующих сигналов и других воспалительных медиаторов, что приводит к прекращению воспалительного ответа. TNFα представляет собой основной провоспалительный цитокин, так как он инициирует каскад цитокинов и биологических эффектов, приводящих к воспалительному состоянию. Поэтому для лечения воспалительных заболеваний в настоящее время используют агенты, которые ингибируют TNFα, например инфликсимаб.
Полагают, что провоспалительные цитокины играют главную роль в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (IBD). Современные способы лечения IBD направлены на снижение уровней этих провоспалительных цитокинов, включая IL-8 и TNFα. Такие способы лечения также могут играть важную роль при лечении системных воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит.
Штаммы по настоящему изобретению могут иметь потенциальное применение в лечении целого ряда воспалительных заболеваний, особенно при использовании в комбинации с другими противовоспалительными способами лечения, такими как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) или инфликсимаб.
Цитокины и рак
Продукция многофункциональных цитокинов при широком спектре типов опухолей говорит о том, что значительные воспалительные ответы являются продолжительными у пациентов с раковым заболеванием. В настоящее время не ясно, какой защитный эффект против роста и развития опухолевых клеток in vivo имеет этот ответ. Однако эти воспалительные ответы могли бы оказывать вредное воздействие на организм "хозяина", имеющего опухоль. Сложные взаимодействия цитокинов вовлечены в регуляцию продукции цитокинов и пролиферации клеток в опухолевой и нормальной тканях (13, 14). Уже давно известно, что потеря массы (кахексия) является одной из самых обычных причин смерти пациентов с раковым заболеванием, и исходное нарушение питания указывает на плохой прогноз. Для того чтобы опухоль росла и распространялась, она должна индуцировать образование новых кровеносных сосудов и разрушать внеклеточный матрикс. Воспалительный ответ возможно играет важную роль в механизмах, описанных выше, способствуя, таким образом, ухудшению здоровья хозяина и развитию опухоли. Благодаря противовоспалительным свойствам Bifidobacterium longum infantis эти бактериальные штаммы могут снижать скорость злокачественной трансформации (малигнизации) клеток. Кроме того, кишечные бактерии могут продуцировать из пищевых соединений вещества с генотоксической, канцерогенной и опухолестимулирующей активностью, и кишечные бактерии могут активировать проканцерогены до ДНК-реакционно-способных агентов (15). В общем, виды Bifidobacterium имеют низкие активности ксенобиотик-метаболизирующих ферментов по сравнению с другими популяциями в кишечнике, такими как бактероиды, эубактерии и клостридии. Следовательно, увеличение числа бактерий Bifidobacterium в кишечнике могло бы полезным образом модифицировать уровни этих ферментов.
Доставка вакцины/лекарственного средства
Большинство патогенных организмов поступают через поверхности слизистых оболочек. Эффективная вакцинация этих участков защищает против инвазии конкретного инфекционного агента. К настоящему времени стратегии пероральной вакцинации концентрировались на применении живых ослабленных патогенных организмов или очищенных инкапсулированных антигенов (16). Пробиотические бактерии, модифицированные способами генной инженерии для продукции антигенов из инфекционного агента in vivo, могут обеспечивать привлекательную альтернативу, так как считается, что эти бактерии являются безопасными для потребления человеком (статус GRAS (вещества, признанные полностью безвредными).
Исследования на мышах продемонстрировали, что потребление пробиотических бактерий, экспрессирующих чужеродные антигены, может активировать защитные иммунные ответы. Ген, кодирующий фрагмент С столбнячного токсина (TTFC), экспрессировали в Lactococcus lactis и мышей иммунизировали пероральным путем. Эта система была способна индуцировать титры антител, достаточно высокие для защиты мышей от летального стимула токсином. Кроме презентации антигена, живые бактериальные векторы могут продуцировать биоактивные соединения, такие как иммуностимулирующие цитокины, in vivo. L. lactis, секретирующий биоактивные человеческие IL-2 или IL-6 и TTFC, индуцировал в 10-15 раз более высокие сывороточные титры IgG у мышей, иммунизированных интраназально (17). Однако при использовании этого конкретного бактериального штамма общий уровень IgA не увеличивался посредством коэкспрессии с этими цитокинами. Другие бактериальные штаммы, такие как Streptococcus gordonii, также проверяли на их пригодность в качестве вакцин слизистых. Рекомбинантный S. gordonii, колонизирующий полости рта и влагалища мышей, индуцировал и антительные ответы слизистых, и системные антительные ответы на антигены, экспрессируемые этой бактерией (18). Таким образом, пероральная иммунизация с использованием пробиотических бактерий в качестве векторов не только защитила бы организм "хозяина" от инфекции, но и могла бы заменить иммунологические стимулы, которые обычно вызывал бы патоген, способствуя, таким образом, иммунологическому обучению организма "хозяина".
Пребиотики
Введение пробиотических организмов осуществляется путем проглатывания микроорганизма в подходящем носителе. Было бы полезным предложить среду, которая стимулировала бы рост этих пробиотических штаммов в толстой кишке. Добавление одного или более олигосахаридов, полисахаридов или других пребиотиков стимулирует рост молочнокислых бактерий в желудочно-кишечном тракте. Пребиотиками называют любой нежизнеспособный компонент пищи, который специфически сбраживается в толстой кишке собственными бактериями, которые, как полагают, имеют положительное значение, например бифидобактериями, лактобациллами. Типы пребиотиков могут включать пребиотики, которые содержат фруктозу, ксилозу, сою, галактозу, глюкозу и маннозу. Комбинированное введение пробиотического штамма с одним или более пребиотическими соединениями может усиливать рост введенного пробиотика in vivo, приводя к более явной пользе для здоровья, и называется синбиотическим.
Другие активные ингредиенты
Понятно, что пробиотические штаммы можно вводить профилактически или в качестве способа лечения либо сами по себе, либо с другими пробиотическими и/или пребиотическими веществами, как описано выше. Кроме того, данные бактерии можно использовать как часть схемы профилактики или лечения с использованием других активных веществ, таких как вещества, используемые для лечения воспаления или других расстройств, особенно расстройств с участием иммунной системы. Такие комбинации можно вводить в одном препарате или в отдельных препаратах, которые вводят в то же самое или в разное время, и используя те же самые или разные пути введения.
Пример композиции
а) Пробиотическая композиция
В данной пробиотической композиции пробиотические бактерии представляли собой штамм Bifidobacterium longum AH1206, а проглатываемый носитель представляет собой йогурт.
8
Содержание Bifidobacterium longum AH1206 в йогурте составляло 5×10КОЕ/мл.
Состав йогурта был следующим:
Компонент
Количество (%)
Коровье молоко
75,0
Обезжиренное сухое молоко
3,0
Фруктовый сок
10,0
Жидкий фруктовый сахар
3,0
Гидратированный кристаллический виноградный сахар
4,0
Твердый фруктовый сахар
2,0
Дистиллированная вода
3,0
рН йогурта составлял около 4.
б) Способ получения пробиотической композиции
8
5×10 КОЕ/мл Bifidobacterium longum AH1206 добавляли к свежеприготовленному йогурту.
Данное изобретение не ограничивается воплощениями, описанными здесь выше, которые могут отличаться в деталях.