Рекомбинантный белок нуклеазы бактерий Serratia marcescens для гидролиза нуклеиновых кислот
RECOMBINANT SERRATIA MARCESCENS NUCLEASE PROTEIN FOR HYDROLYSIS OF NUCLEIC ACIDS

Настоящее изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и заключается в создании препарата рекомбинантной нуклеазы из грамотрицательной бактерии Serratia marcescens. Создание препарата включает экспрессию нуклеазы в цитоплазме клеток Escherichia coli в нерастворимой форме в виде «телец включения», последующий рефолдинг нативной конформации фермента и методику его очистки до гомогенного состояния.
Как известно, нуклеазы - гидролитические ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты, имеют большое экономическое значение. Неспецифические нуклеазы в основном используются для гидролиза нуклеиновых кислот в различных процессах. Нуклеаза, расщепляющая только ДНК, называется «ДНКазой», а расщепляющая только РНК - «РНКазой». Типичным представителем ДНКаз является ДНКаза I из поджелудочной железы млекопитающих. Типичными представителями РНКаз являются, например, РНКазы Т1 и Т2 из Aspergillus oryzae или РНКаза А из поджелудочной железы млекопитающих.
Помимо очистки ДНК или РНК с помощью РНКаз или ДНКаз соответственно, существуют другие представляющие экономический интерес приложения, в которых образец очищается от обеих нуклеиновых кислот. Это относится, например, к производству широкого спектра молекул белкового или небелкового происхождения, в которых продукт не состоит из нуклеиновых кислот: белков, таких как антитела или ферменты; полисахаридов; липидов; антибиотиков и др. Необходимость удаления нуклеиновых кислот становится особенно важной задачей, если продукция молекул происходит внутриклеточно или если часть продуцирующих клеток лизируется во время продукции. В результате этого во время получения нарабатываемого вещества в препарате оказываются большие количества нуклеиновых кислот, которые загрязняют нарабатываемое вещество или затрудняют его дальнейшую очистку. Очистка затрудняется, среди прочего из-за того, что нуклеиновые кислоты увеличивают вязкость препаратов до такой степени, что последующие стадии, такие как фильтрация или хроматография становятся невозможны.
Следовательно, существует интерес к способам полного или частичного удаления нуклеиновых кислот. Такие способы могут снять производственные ограничения на дальнейших стадиях наработки вещества и исключить присутствие нуклеиновых кислот в фармпрепаратах. Одним из подходов удаления нуклеиновых кислот является осаждение нуклеиновых кислот различными агентами. Другой подход состоит в расщеплении нуклеиновых кислот нуклеазами на достаточно малые фрагменты. Такой подход позволяет снизить вязкость образцов, а полученные продукты гидролиза могут быть в последующем удалены с использованием доступных методов, таких как ультрафильтрация или колоночная хроматография.
Использование нуклеаз, которые могут расщеплять как РНК, так и ДНК, особенно полезно для удаления всех видов нуклеиновых кислот, то есть как РНК, так и ДНК, из различных образцов. В этом случае используемая нуклеаза должна обладать высокой активностью и достаточной стабильностью. Фермент, который проявляет эти свойства, представляет собой нуклеазу грамотрицательной бактерии S. marcescens [ЕС 3.1.30.2; SEQ ID NO: 1, Филимонова М.Н. и др. Биохимия, 1980, 45(11): 2096-2104; Филимонова М. Н. и др. Биохимия, 1981, 46 (9): 1660-1666; Biedermann K et al. Res Commun. 1989, 54(1): 17-27]. Этот фермент также продается под торговой маркой Benzonase [Molin S et al. US 5,173,418 Dec. 22, 1992] и далее именуется «нуклеаза S. marcescens».
Известны многочисленные технические решения, имеющие отношение к биосинтезу нуклеазы бактериями Serratia marcescens (Авт. Св. СССР №230052, 1967 г.; Авт. Св. СССР №340691, 1970 г.; Авт. Св. СССР №992568; RU 2665550 С1.)
Недостатком описанных выше разработок является использование в качестве штамма продуцента Serratia marcescens. Данный продуцент является условно-патогенным организмом и требует особых условий культивирования, питательных сред сложного состава, а также использования в качестве индуктора антибиотика митомицина С.
Чтобы иметь возможность экономично производить белки в достаточных количествах и с требуемой чистотой, их часто получают с использованием промышленных организмов методом гетерологичной экспрессии, т.е. ДНК, кодирующая ген интересуемого белка вводится в организм-продуцент, который затем осуществляет экспрессию, т.е. синтез чужеродного для него белка. Это подход может иметь ряд преимуществ: повышенная продуктивность организма-продуцента по сравнению с исходным организмом, более оптимизированные процессы культивирования, наработки и очистки продукта.
Нуклеазы могут оказывать токсическое действие на организм-продуцент в случае внутриклеточной экспрессии. В цитоплазме активная нуклеаза гидролизует нуклеиновые кислоты клетки хозяина, что может привести к гибели или подавлению роста клеток. Нарушение секреции также может привести к гибели или задержке роста продуцента.
Рекомбинантная секреторная экспрессия нуклеазы S. marcescens в грамотрицательной бактерии Escherichia coli описана в патенте [Molin S et al. ЕР 229866 В1 1992] SEQ ID NO: 1 и представлена в сравнении с выходом экспрессии в диком штамме - S. marcescens W225. Показано, что в использованной системе экспрессии выход нуклеазы составлял 35000 ед/мл культуры, полученной с рекомбинантным штаммом Е. coli, и 7000 единиц/мл с исходным штаммом. Более того, показано, что приблизительно половина ферментативной активности остается в периплазме Е. coli и не секретируется в среду (таблица 4 в ЕР 229866 В1 1992). Biedermann K et al. (Appl. Environ. Microbiol. 1990, 56(6): 1833-1838) также описывают секрецию нуклеазы S. marcescens (из штамма S. marcescens W280 SEQ ID NO: 1) в синтезирующих ее клетках Е. coli. Исследование показывает сравнение скорости секреции нуклеазы в гомологичном грамотрицательном организме-хозяине S. marcescens и аналогичном грамотрицательном модельном организме Е. coli. Выход нуклеазы на мл культуральной жидкости в условиях ферментации штамма продуцента Е. coli составляет 17000 ед/мл.
Грамотрицательные бактерии в целом и кишечная палочка в частности отличаются некоторыми недостатками. С одной стороны, секреция часто возможна только с небольшими выходами и обычно ведется только в периплазму, а не непосредственно в среду, что затрудняет последующую очистку. В таком варианте приходится обрабатывать большие объемы препаратов, полученных из периплазмы бактерии.
Также известно изобретение, в котором при гетерологичной экспрессии нуклеазы S. marcescens в грамположительном хозяине Bacillus subtilis [Greiner-Stoeffele Т and Schoenert S US 9,796,994 B2 2017) выход нуклеазы составляет 7200 ед/мл культуральной жидкости.
Задачей заявленного технического решения является устранение недостатков прототипов, а именно - разработка способа биосинтеза нуклеазы S. marcescens в клетках E.coli, позволяющего достичь увеличения биосинтеза нуклеазы S. marcescens под действием индуктора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) с использованием стандартных сред и технологий, разработанных для Е. coli. Сущность изобретения заключается в создании непатогенного продуцента нуклеазы S. marcescens, экспрессирующего ген этого фермента без сигнальной последовательности в неактивной, нетоксичной и нерастворимой форме в виде телец включения в цитоплазме клеток Е. coli и получении препарата рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens, рефолдированного до нативной конформации, легко поддающегося очистке и обладающего высокой удельной активностью. Другая техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений, заключается в разработке препарата на основе указанного белка пригодного для применения в биотехнологической практике. Следует отметить, что аминокислотная последовательность рекомбинантного белка по данному изобретению соответствует зрелой (mature - англ.) форме нуклеазы S. marcescens с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Она соответствует последовательности SEQ ID NO: 1 без сигнала транспорта нуклеазы SEQ ID NO: 3 с добавленными аминокислотными остатками (выделено жирным шрифтом) для инициации трансляции и генно-инженерных манипуляций (введены сайты эндонуклеаз рестрикции для клонирования).
Указанный технический результат достигается за счет получения рекомбинантного белка с молекулярной массой 27 кДа SEQ ID NO: 2, включающего фрагмент белка нуклеазы S. marcescens SEQ ID NO: 1 без сигнальной последовательности SEQ ID NO: 3.
Технический результат также достигается за счет способа получения рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens, который включает:
- выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности в неактивной и нетоксичной форме - в виде телец включения внутри бактериальных клеток;
- разрушение клеток штамма Е. coli, выделение и отмывку телец включения от штаммовых белков;
- растворение телец включения в мочевине и последующую процедуру диализа - рефолдинга нуклеазы Serratia marcescens до нативной конформации;
- двухступенчатую хроматографическую очистку нуклеазы S. marcescens от побочных белков.
Таким образом, создан штамм Е. coli, экспрессирующий ген нуклеазы Serratia marcescens без сигнальной последовательности в неактивной, нерастворимой и нетоксичной форме - в виде телец включения в цитоплазме бактериальной клетки, разработана процедура рефолдинга нуклеазы Serratia marcescens до нативного состояния и высокоэффективная процедура очистки нуклеазы Serratia marcescens от побочных белков.
Заявленное техническое решение поясняется в перечне последовательностей, в которых представлены варианты аминокислотной последовательности нуклеазы S. marcescens.
Перечень последовательностей, поясняющих сущность изобретения:
В SEQ ID NO: 1 приведена полная аминокислотная последовательность нуклеазы S. marcescens, сигнальная последовательность подчеркнута.
В SEQ ID NO: 2 приведена аминокислотная последовательность зрелой формы нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности.
В SEQ ID NO: 3 приведена аминокислотная последовательность сигнальной последовательности нуклеазы S. marcescens
Изобретение поясняется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Получение рекомбинантной нуклеазы S. marcescens.
На первом этапе осуществлялось получение гена SEQ ID NO: 2, включающего фрагмент белка нуклеазы S. marcescens без сигнальной последовательности с последующим его клонированием.
Ген нуклеазы S. marcescens SEQ ID NO: 2 получен химико-ферментативным методом. Был создан олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген SEQ ID NO 2, оптимизированный для экспрессии в Е. coli. Затем осуществлено получение плазмиды pNucA, содержащей последовательность гена SEQ ID NO: 2 нуклеазы S. marcescens.
Пример 2. Получение штамма Е. coli - продуцента.
Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens клетки Е. coli BL21 трансформировали плазмидой pNucA, кодирующей ген SEQ ID NO: 2. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pNucA], с белками нетрансформированного штамма, выявили появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка нуклеазы S. marcescens массе - 27 кДа. Уровень синтеза белков в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок нуклеазы S. marcescens синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец включения. Уровень синтеза целевого белка составлял 10% от суммарного белка бактериальной клетки.
Пример 3. Отмывка телец включения и рефолдинг рекомбинантной нуклеазы S. marcescens
Разрушение клеток штамма продуцента проводили в стандартных условиях 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,25 М NaCl 0,5% на френч-прессе. Центрифугирование телец включения проводили при 10000 об/мин, 30 мин, 10°С. Отмывку телец включения проводили в лизирующем буфере (3 раза), осаждая центрифугированием в том же режиме.
Тельца включения растворяли в буфере: 8 М мочевины, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,1% Triton Х-100. Нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 10000 об/мин, 30 мин, 20°С. Раствор телец включения диализовали, снижая концентрацию мочевины от 8 М до 0 М в буфере 25 мМ ацетата натрия рН 5,3. Нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 10000 об/мин, 30 мин, 10°С.
Пример 4. Очистка на ионообменной смоле WorkBeads 40 S
Хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 S проводили в 25 мМ ацетате натрия, рН 5,3. Элюцию целевого белка проводили градиентом NaCl от 0 до 1 М в 25 мМ ацетате натрия, рН 5.3. Полученные фракции белка анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ-SDS по Лэммли. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Фракции, содержащие белок, диализовали против 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 с двукратной сменой буфера при температуре 4°С.
Пример 5. Очистка на ионообменной смоле WorkBeads 40 DEAE
Хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 DEAE, проводили в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Сорбент с иммобилизованным на нем белком промывают буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 до падения и стабилизации сигнала УФ-детектора. Элюцию целевого белка проводили градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0.
Полученные фракции белка анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ-SDS по Лэммли. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Очищенный белок диализовали против буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0.
Диализованный раствор белка фильтровали в стерильные флаконы через фильтр 0.20 мкм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда.
Пример 6. Измерение ДНКазной активности нуклеазы S. marcescens
4
Для измерения ДНКазной активности нуклеазы S. marcescens за основу был взят метод кислоторастворимых фракций [Лещинская И.Б. и др. Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122]. Реакционная смесь для определения активности нуклеазы S. marcescens в стандартных условиях содержала буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 2 мМ MgSO и 0,1% высокомолекулярную ДНК.
Реакционную смесь готовили, смешивая в пробирках, предварительно помещенных на ледяную баню. К приготовленной смеси добавляли тестируемый фермент в объемном соотношении 1:9 в различных разведениях и проводили гидролиз в термостате 15 мин. при 37°С. После этого гидролиз останавливали, помещали смесь в ледяную баню и добавляли равный со смесью объем 4%-раствор хлорной кислоты. Определяли количество образовавшихся в результате гидролиза ДНК низкомолекулярных фрагментов и рассчитывали ДНКазную активность, как описано в оригинальной методике [Лещинская И.Б. и др. Биохимия, 1974, Т. 39, №1, С. 116-122]. В качестве тестируемого препарата сравнения использовали Benzonase фирмы Merck США (прототип) и нуклеазу S. marcescens по данному изобретению, предварительно разведенную буфером 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0 так, чтобы в гидролизованные фрагменты превращалось не более 30-50% ДНК. Параллельно с тестируемыми растворами в реакционные смеси вместо этих растворов добавляли дистиллированную воду и, проведя все аналогичные манипуляции с тестируемыми образцами, оценивали гидролиз ДНК.
ДНКазная активность нуклеазы S. marcescens штамма Е. coli BL21 [pNucA] по данному изобретению составляла 48500 ед/мл культуральной жидкости. Сравнение с другими разработками: ЕР 229866 В1 - 35000 ед/мл, Biedermann K et al. - 17000 ед/мл, US 9,796,994 В2 - 7200 ед/мл показывает, что достигнутый уровень превышает описанный ранее в других изобретениях и статьях.
Достигнутая степень чистоты препарата нуклеазы S. marcescens по данному изобретению составляла 99%. Удельная активность - 250-300 ед/мкл. Препарат нуклеазы сохранял активность в течение года при хранении в 50% глицерине при температуре (-) 20°С.
Т.о., в предлагаемой разработке продемонстрировано, что рекомбинантный белок - нуклеаза S. marcescens без сигнальной последовательности, может синтезироваться в бактериях Е. coli в неактивной, нерастворимой и нетоксичной форме в виде «телец включения». Такое техническое решение обеспечивает высокий уровень биосинтеза нуклеазы бактериями Е. coli. Использование стандартных процедур рефолдинга и хроматографической очистки позволяет получить препарат соответствующей чистоты, пригодный для биотехнологической практики. Достигнутая степень чистоты препарата нуклеазы S. marcescens по данному изобретению составляла 99%. Удельная активность - 250-300 ед/мкл. Следует отметить, что созданный препарат нуклеазы сохранял активность в течение года при определенном хранении. Способ получения также позволяет сократить время технологического цикла очистки нуклеазы при увеличении выхода целевого белка. Настоящая разработка может быть применена в прикладной микробиологии, биотехнологии, а также в микробиологической и фармацевтической промышленности.
--->
Serratia marcescens
Последовательности нуклеазы из
SEQ ID NO: 1
Serratia marcescens
Аминокислотная последовательность нуклеазы из
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
Serratia marcescens
<213>
<400> 1
Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Ala Ser Ala
Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val
20                  25                  30
Gly Cys Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala
35                  40                  45
Tyr Thr Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala
50                  55                  60
Tyr His Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp
65                  70                  75                  80
Lys Thr Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp
85                  90                  95
Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala
100                 105                 110
Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr
115                 120                 125
Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp
130                 135                 140
Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly
165                 170                 175
Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp
180                 185                 190
Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala
195                 200                 205
Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe
210                 215                 220
Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp
225                 230                 235                 240
Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly
245                 250                 255
Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn
260                 265
SEQ ID NO: 2:
Serratia
Аминокислотная последовательность зрелой формы нуклеазы из
marcescens
<210> 2
<211> 248
<212> PRT
Serratia marcescens
<213>
<400> 2
Met Gly Ser
Asp Thr Leu Glu Ser Ile Asp Asn Cys Ala Val Gly Cys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gly Gly Ser Ser Asn Val Ser Ile Val Arg His Ala Tyr Thr
20                  25                  30
Leu Asn Asn Asn Ser Thr Thr Lys Phe Ala Asn Trp Val Ala Tyr His
35                  40                  45
Ile Thr Lys Asp Thr Pro Ala Ser Gly Lys Thr Arg Asn Trp Lys Thr
50                  55                  60
Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala Pro Leu
85                  90                  95
Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr Leu Ser
100                 105                 110
Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp Ala Arg
115                 120                 125
Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile Ser Ser
130                 135                 140
Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly Lys Leu
145                 150                 155                 160
Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp Lys Val
165                 170                 175
Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala Phe Leu
180                 185                 190
Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe Arg Val
195                 200                 205
Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp Ala Gly
210                 215                 220
Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly Val Leu
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn
245
SEQ ID NO: 3
:
Аминокислотная последовательность сигнала для транспорта нуклеазы
Serratia marcescens
из
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
Serratia marcescens
<213>
<400> 3
10         20
Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Ala Ser Ala
20
<---