СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА КОСТНОЙ ТКАНИ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF PREPARING BONE TISSUE PREPARATION AND SET FOR ITS REALISATION

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии и биологии.
Гистологическое исследование костной ткани является обязательным компонентом диагностики многих заболеваний и состояний и применяется как в клинических, так и в экспериментальных исследованиях. При этом качество препарата играет решающую роль в постановке диагноза и в установлении тканевых взаимоотношений.
Известен способ приготовления препарата кости, включающий распил кости и его шлифование (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.456).
К недостаткам данного способа следует отнести то, что получаемые препараты малопригодны для гистологических исследований, так как в толстых срезах плохо различима структура костной ткани, а при шлифовании также разрушаются клеточные элементы.
Также известен способ приготовления фрагментов костной ткани к исследованию, включающий фиксацию в забуференном 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 24-48 часов, промывку в воде в течение 24-48 часов, декальцинацию в 5-7.5%-ном растворе азотной кислоты до полной декальцинации, последующую обработку препарата костной ткани в 5%-ном растворе сульфата натрия или лития в течение 1 суток, промывку в воде в течение 24-48 часов, обезвоживание в спиртах и заливку в парафин (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.454, 457, 467).
Однако данный способ не позволяет добиться хорошей сохранности клеточных структур, особенно в окружающих мягких тканях (мышце, надкостнице, костном мозге), значительно ухудшает качество стандартных гистологичских окрасок, а также не позволяет проводить последующие иммуногистохимические и иммунофлюоресцентные исследования из-за повреждения вторичной структуры белковых эпитопов.
7
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ подготовки костных образцов к морфологической диагностике, включающий фиксацию образца, его декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах с возрастающей концентрацией и заливку в парафин (Медведева Н.Н., Николаев В.Г. и др. Способ подготовки костных образцов к морфологической диагностике. Пат. RU 2241994, МПКG01N 33/48, G01N 1/28, Заявка: 2003129253/15, 30.09.2003, Опубликовано: 10.12.2004).
Известный способ осуществляют следующим образом. После фиксации костных образцов в растворе формалина осуществляют их декальцинацию в течение 7-8 суток в 5%-ном растворе азотной кислоты на основе 5%-ого раствора формалина, после чего костные образцы в течение 2 часов промывают проточной водопроводной водой и на 12 часов погружают в 5%-ный раствор серно-кислого лития, затем в течение 20-30 минут снова промывают проточной водой и подвергают дегидратации в спиртах возрастающих концентраций.
К недостаткам известного способа следует отнести длительность процедуры декальцинации, использование в качестве фиксатора формалина, а в качестве декальцинатора - раствора азотной кислоты, что не позволяет в последующем проводить иммуногистохимическое и иммунофлюоресцентное исследования образцов вследствие значительных повреждений окружающих тканей и клеточных структур при проведении декальцинации.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа приготовления препарата костной ткани, пригодного для гистологического и иммуноморфологического исследования, и набора для его осуществления.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение сохранности гистологических структур кости и окружающих тканей, а также снижение трудоемкости и токсического воздействия при изготовлении препарата.
Технический результат достигается тем, что способ приготовления препарата костной ткани включает фиксацию образца, его декальцинацию, промывание водой, дегидратацию в спиртовых растворах и заливку в парафин.
Отличие заявляемого способа заключается в том, что фиксацию образца костной ткани проводят в течение 24-х часов в молекулярном фиксаторе, в состав которого не входят альдегиды, например, растровом FineFix на спиртовой основе, содержащем FineFix и 96° спирт в соотношении 1:2,5.
FineFix - бесформалиновый фиксатор, включающий в себя следующие компоненты: вода, 1,2-пропанедиол, поливиниловый спирт и от 0.05 до 2.00 wt.-% мономерного карбогидрата, содержащего не менее 3 атомов углерода и второе средство для сохранения этанола (патент ЕР 145 5174 B1 Fixative, Номер заявки EP20030005010, Дата публикации: 15 декабря 2004, Дата приоритета: 5 марта 2003. Другие номера патента: US 20050074422. Автор: Francesco Visinoni, Заявитель - Milestone S.r.L).
Отличительным приемом заявляемого способа является и то, что декальцинацию осуществляют в течение 2-5 суток в 5-8% забуференном растворе муравьиной кислоты при ежедневной смене декальцинирующего раствора и контроле полноты декальцинации, при этом соотношение образец:декальцинирующий раствор составляет 1:20.
К отличиям предлагаемого способа также относится прием повторного помещения образца костной ткани в спиртовой раствор молекулярного фиксатора на 6-12 часов, который осуществляют после завершения декальцинации и промывки образца водой.
Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».
Отличительные приемы заявляемого способа обеспечивают сохранность гистологических структур кости и окружающих тканей, сохранность антигенных эпитопов, а также позволяют снизить трудоемкость и сократить сроки изготовления препарата. Так, сроки декальцинации компактной кости мелких лабораторных животных (мышей, крыс) составляют 2-4 суток, кроликов - 4-5 суток, фрагментов костной ткани человека - 4-5 суток. При этом исключается токсическое воздействие формалина на исследователя.
Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение сохранности гистологических структур кости и окружающих тканей, снижение трудоемкости и сокращение сроков изготовления препаратов.
Следовательно, заявляемый способ позволяет получить препараты высокого качества, пригодных как для рутинного гистологического исследования, так и для проведения иммуногистологических исследований. Кроме этого исключается применение высокотоксичного формалина.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, ветеринарии и биологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.
Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Осуществление заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.
Образцы костной ткани фиксируют спиртовым раствором молекулярного фиксатора FineFix (280 мл FineFix+720 мл 96° спирта) в течение 24 часов. Затем без отмывки образцы помещают в индивидуальные хорошо закрывающиеся емкости в 5%-ный забуференный раствор муравьиной кислоты. Концентрированный раствор декальцинатора, так называемый матричный раствор, готовят из расчета 40 г лимоннокислого натрия, 100 мл 90% раствора муравьиной кислоты, 300 мл дистиллированной воды; перед употреблением раствор доводят дистиллированной водой до получения 5-8% раствора муравьиной кислоты. Для каждого образца соотношение образец:декальцинирующий раствор составляет 1:20.
Ежедневно оценивают полноту декальцинации кальций-оксалатным методом (3 мл использованной декальцинирующей жидкости, довести рН до 7.0 концентрированным (25%) раствором аммиака, затем добавить 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония, хорошо взболтать, оставить на 30 мин, если жидкость останется прозрачной - декальцинация завершена). При наличии кальция в использованном декальцинирующем растворе образцы помещают в свежую порцию декальцинатора.
После завершения декальцинации проводят промывку образцов водой в течение 5 минут и повторно помещают в спиртовой раствор FineFix на 12 часов.
Затем проводят дегидратацию в спиртах с возрастающей концентрацией, начиная с 70° раствора и заканчивая 100° спиртом. Заливку в парафин осуществляют по общепринятой методике (Микроскопическая техника / под ред. Саркисов Д.С., Петров Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - С.467).
Предлагаемым способом изготовлено 162 блока образцов костной ткани. Получены высококачественные гистологические препараты как при применении рутинных методов окрашивания (окрашивание гематоксилин-эозином), так и при применении иммуноморфологических методов окрашивания.
При приготовлении препарата костной ткани используют набор, содержащий молекулярный фиксатор FineFix на спиртовой основе, содержащий FineFix и 96° спирт в соотношении 1:2,5, концентрированный раствор декальцинацинатора и рабочие растворы для контроля полноты декальцинации: 25% раствор аммиака и насыщенный раствор оксалата аммония.
Сущность предлагаемого способа поясняется фигурами - гистологическими препаратами костной ткани, полученными по предлагаемому способу.
Так, на фиг.1 показан гистологический препарат кости, окрашенный гематоксилин-эозином. Показана сохранность структур кости и окружающих тканей: А - мышцы, В - надкостница, С - кость, D - костный мозг, Е - хрящ, увеличение 40х.
На фиг.2 показано окрашивание клеток костного мозга в декальцинированной кости иммуногистохимическим методом на карбоангидразу. Использованы первичные антитела СА2, Epitomics каталожный №5204-1. Продемонстрировано хорошее качество окрашивания. F - ярко окрашенные остеокласты, D - кость, увеличение 400х.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препараты костной ткани, пригодные как для гистологического, так и для иммуноморфологического исследования. При этом костные и окружающие ткани сохраняют свою структуру, сохраняются антигенные эпитопы, отсутствует использование высокотоксичных компонентов.