СПОСОБ РАННЕЙ ДНК-ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
EARLY DNA-DIAGNOSTIC TECHNIQUE OF PROSTATE CANCER

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может найти применение в диагностике рака предстательной железы (РПЖ).
Одним из основных генетических событий, необходимых для развития любого типа опухоли, является инактивация генов-супрессоров опухолевого роста. Инактивация этих генов является инициирующим событием и выявляется задолго до появления атипичных белков, используемых в качестве биохимических маркеров опухоли.
Наиболее распространенным механизмом подобной инактивации является аномальное метилирование CpG-островков промоторных и регуляторных областей этих генов. Гиперметилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, является одним из наиболее ранних событий опухолеобразования и часто обнаруживается во многих предраковых состояниях. Однако такой механизм инактивации генов-супрессоров опухолевого роста не проявляется при острых и хронических воспалительных заболеваниях. Гиперметилирование различных генов-супрессоров может служить молекулярным маркером ранней диагностики, мониторинга и клинического прогноза опухолей.
Существует несколько методов анализа аномального метилирования в диагностических целях, два из которых наиболее распространены.
1. Метилчувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР) основана на использовании рестрикционных эндонуклеаз, чувствительных и нечувствительных к метилированию остатков цитозина. Для анализа метилирования конкретных специфических последовательностей можно использовать метилчувствительные рестриктазы, наиболее эффективными являются часто щепящие HpaII и HhaI., т.к. районы CpG-островков имеют множество сайтов их узнавания, что практически устраняет возможность неполного гидролиза ДНК. Если фрагмент ДНК не содержит модифицированных оснований, то гидролиз проходит полностью, ПЦР не происходит и, соответственно, ее продукт не определяется. В то же время, если в сайте узнавания рестриктазы вместо цитозина присутствует метилцитозин, то гидролиз не происходит, и в геле выявляется фрагмент определенной длины. Большим достоинством метода является высокая, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа чувствительность (аналитическая чувствительность - 1 метилированная последовательность на 2000 неметилированных).
2. Метилспецифическая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) - метод, позволяющий оценить статус метилирования индивидуальных CpG-островков. Процедура состоит в предварительной обработке тестируемых образцов ДНК бисульфитом натрия, что при определенных условиях приводит к дезаминированию цитозина с образованием урацила, тогда как метилированные остатки цитозина остаются неизменными. При последующей ПЦР урацил заменяется на тимин. Таким образом, оказывается возможным конструировать праймеры, избирательно амплифицирующие последовательности, содержащие или не содержащие метилированные остатки цитозина в CpG-островках. Чувствительность метода составляет: 1 метилированный аллель на 1000 неметилированных. К недостаткам можно отнести не всегда эффективно проведенную модификацию ДНК, проблемы анализа при малом количестве ДНК и большие затраты времени при выполнении диагностики.
На сегодняшний день сертифицированных тест-систем и способов ДНК-диагностики не существует.
Описано несколько вариантов определения ДНК-маркеров у пациентов с предраковыми и онкологическими заболеваниями предстательной железы.
Описан анализ аномального метилирования трех генов (GSTP1, RASSF1A, RARβ2), вовлеченных в канцерогенез предстательной железы, показана значительная частота этого явления. Предполагается, что эти гены могут быть использованы для ранней диагностики и определения прогноза развития рака предстательной железы (Perry AS, Foley R, Woodson К, Lawler M. The emerging roles of DNA methylation in the clinical management of prostate cancer. Endocr Relat Cancer. 2006 Jun; 13 (2): 357-77).
Однако авторы не анализируют метилирование других генов, используют в своем анализе метилспецифическую полимеразную реакцию (МС-ПЦР). Кроме того, анализ проводился на опухолевом и биопсийном материале (что может приводить к занижению частот метилирования, если не использована микродиссекция опухолевых клеток).
В другой работе авторами сделана попытка собрать в систему различные маркеры (Papadopoulou Е, Davilas Е, Sotiriou V, Koliopanos A, Aggelakis F, Dardoufas К, Agnanti NJ, Karydas I, Nasioulas G. Cell-free DNA and RNA in plasma as a new molecular marker for prostate cancer. Oncol Res. 2004; 14 (9): 439-45). В качестве одного из них выступает общее количество свободной ДНК в плазме крови пациентов с раком простаты. Другим маркером выступает метилирование гена GSTP1. Наличие свободной РНК генов СЕА и PSMA, нехарактерное для контрольных индивидов, является молекулярным маркером для пациентов с различными стадиями рака предстательной железы. Комбинация увеличенного количества свободной ДНК и метилирования GSTP1 было определено в 83%, что является достаточно значимым показателем.
К недостаткам этого способа следует отнести следующие факты:
1) наличие свободной ДНК не является специфическим маркером, т.к. имеет место на всех стадиях канцерогенеза и при различных локализациях опухоли;
2) использована метил-специфическая ПЦР для определения метилирования GSTP;
3) свободная РНК генов СЕА и PSMA может являться молекулярным маркером любых стадий рака предстательной железы.
Еще в одном исследовании проведена значительная работа по количественному определению метилирования целого ряда генов (GSTP1, MGMT, р14, р16, RASSF1A, АРС, TIMP3, S100A2, CRBP1) в парных образцах карцином, интраэпителиальных неоплазий и доброкачественных гиперплазий предстательной железы (Jeronimo С, Henrique R, Hoque МО, Mambo Е, Ribeiro FR, Varzim G, Oliveira J, Teixeira MR, Lopes C, Sidransky D. A quantitative promoter methylation profile of prostate cancer. Clin Cancer Res. 2004 Dec 15; 10 (24): 8472-8). Было выявлено, что метилирование генов GSTP и АРС в карциномах достоверно отличается от гиперплазии и демонстрирует высокую чувствительность порядка 98,3%.
В описываемом способе диагностики для анализа используется биопсийный материал, что снижает точность диагностики. Кроме того, авторы предлагают определять метилирование с использованием метода метил-специфической ПЦР, что усложняет и удорожает диагностику.
Задачей изобретения является повышение точности ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы за счет использования для анализа ДНК из сыворотки крови.
Поставленная задача решается способом ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы, заключающимся в том, что исследуют сыворотку крови на метилирование промоторных районов генов GSTP, р16 и N33 методом метил-чувствительной ПЦР и при обнаружении аномального метилирования хотя бы двух из указанных генов, делают вывод о наличии заболевания.
Способ основан на патогенетическом факторе канцерогенеза - метилировании регуляторных районов генов, вовлеченных в злокачественный процесс, что приводит их к полной инактивации без нарушения структуры ДНК. Кроме того, использован подход определения указанных маркеров в сыворотке крови пациентов, в основе которого лежит твердо установленный факт увеличения количества свободной ДНК в сыворотке крови онкологических больных, содержащей ДНК-маркеры соответствующей опухоли.
Способ осуществляется следующим образом.
У пациента производят забор периферической венозной крови в объеме 10 мл. Образец цельной крови не замораживают и хранят не более 2 суток при температуре +4°С.
Выделение геномной ДНК из сыворотки крови
Для получения ДНК из сыворотки крови используют следующий метод выделения ДНК:
1. Цельную кровь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, отбирают около 5 мл сыворотки, находящейся в верхней фазе.
2. Последовательно проводят экстракцию ДНК сыворотки равными объемами фенола, смеси фенол-хлороформ и хлороформом.
3. Осаждают ДНК 2,5 объемами холодного 96% этанола, выдерживают образец 30 мин при температуре - 70°С.
4. Пробу центрифугируют при 0°С 15 мин при 12000 об/мин, высушивают осадок ДНК на воздухе и растворяют в 50 мкл деионизированной стерильной воды или 1х ТЕ-буфере.
5. После полного растворения ДНК измеряют ее концентрацию на спектрофлюориметре или спектрофотометре и снимают спектр поглощения в диапазоне от 220 до 320 нм, с целью определения чистоты ДНК. Максимум поглощения наблюдается в районе 260 нм.
Гидролиз ДНК, полученной из образца, метил-чувствительной рестриктазой HpaII (CCGG).
К 2 мкл растворенной геномной ДНК (100-200 нг/мкл) добавляют 5 ед.акт. рестриктазы HpaII (CCGG) и 2 мкл 10Х гидролизного буфера для HpaII. До конечного объема инкубационной смеси - 20 мкл доводят деионизированной или стерильной водой и инкубируют в течение ночи при 37°С. По окончании гидролиза пробирку хранят в морозильнике при -18-20°С.
Определение аномального метилирования CpG-островков промоторных областей р16, GSTP и N33 генов
Для определения метилирования CpG-островков промоторных областей исследуемых генов применяют метод метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Метод основан на способности метил-чувствительных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции используют ДНК, полученную из плазмы крови пациента, предварительно гидролизованную метил-чувствительной рестриктазой HpaII (CCGG).
При проведении ПЦР учитывают наличие внутренних сайтов узнавания для HpaII в амплифицируемом участке (для гена Р16 - 4 сайта, N33 - 10 сайтов, GSTP - 4 сайта узнавания для фермента HpaII). В том случае, если произошла модификация цитозинов в метилцитозин (аномальное метилирование), гидролиза ДНК не происходит, и продукт ПЦР определенной молекулярной массы, соответствующий каждому гену, может быть выявлен в геле. При отсутствии аномального метилирования, ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не определяется. В качестве контроля реакции ПЦР используют специфические праймеры на фрагмент гена. XLISS, который не содержит сайтов узнавания для фермента HpaII.
2
Многолокусную ПЦР проводят для двух пар праймеров (исследуемый ген и контроль). Используют следующую схему: к 2 мкл гидролизованной ДНК (50-200 нг) добавляют по 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы Taq-полимеразы, 50 мкл однократного буфера для ПЦР (50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl рН 8,4, 5 мМ MgCl, 10% DMSO). К полученной смеси добавляют 2 капли вазелинового масла, прогревают смесь при 95°С в течение 10 мин и проводят 33 цикла с параметрами: денатурация 95°С - 30 сек, отжиг и элонгация 58-62°С - 2 мин 30 сек. Нуклеотидная последовательность праймеров и режимы отжига представлены в таблице. После окончания реакции ПЦР продукт хранят при 4°С в холодильнике.
Последовательность праймеров для амплификации участков промоторных областей генов
Ген
Последовательность праймеров
Температура отжига, °С
Длина фрагмента
Р16
F: gaa cgc act саа аса cgc
60
352 п.н.
R: agc cag ccc с ctc ttt ctt с
GSTP1
F: acc tgg gaa aga ggg aaa ggc tt
60
609 п.н.
R: gaa gac tgc ggc ggc gaa act
N33
F: tgg gtt cag agc agg atg gc
60
336 п.н.
R: gca gga gaa gga agg gaa agc
Контроль XL3.2
F: ttg gct agc agc aac agt gc
60
180 п.н.
R: agt ttg atg gct tct gtg at
Разделение продуктов ПЦР в 8%-ном полиакриламидном геле методом вертикального электрофореза
Разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе при анализе метилирования проводят с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ следующего состава: 8.4 мл 30%-ного раствора акриламида, 0.6 мл 10%-ного персульфата аммония, 26 мкл ТЕМЕД, до 30 мл разведенного буфера ТВЕ. Персульфат аммония и ТЕМЕД вносят после всех остальных компонентов и тщательно перемешивают полученную смесь. Электрофорез проводят при напряжении 400 В с использованием камеры для вертикального электрофореза («Хеликон», Москва) в течение 2.0-3.0 часов.
В качестве контроля молекулярной массы ДНК используют ДНК стандартной молекулярной массы pUC19/Msp1. Визуальный контроль пробега проб ДНК проводят по ксиленцианолу и бромфеноловому синему. Окрашивание геля нитратом серебра для визуализации продуктов ПЦР проводят по приведенной ниже методике.
Ультратонкое окрашивание нитратом серебра.
3
4
Окрашивание гелей проводят по усовершенствованной методике Liberman. После электрофореза гель инкубируют в растворе 0,011 М AgNO в течение 10-15 минут, затем трижды промывают в дистиллированной воде. Проявление проводят в модифицированном растворе проявителя (увеличена концентрация НСНО) следующего состава: 0,75 М NaOH; 0,5 М НСНО; 2,3 мМ Na(BH) около 10-15 минут, в зависимости от интенсивности проявления геля.
Оптимальные критерии интерпретация результатов исследования
Если в опухолевой ДНК присутствует аномальное метилирование промоторов генов N33, р16 и GSTP1, то цитозины в составе CpG-динуклеотидов заменены на 5-метилцитозины, в том числе, в сайтах узнавания HpaII. В этом случае рестриктаза HpaII не в состоянии гидролизовать геномную ДНК в сайтах узнавания, матрица для МЧ-ПЦР остается интактной. В результате в окрашенном ПААГ видны фрагменты, соответствующие промоторным районам N33, р16 и GSTP1.
В тех образцах, где метилирование генов отсутствует, происходит гидролиз геномной ДНК в сайтах узнавания HpaII. При первой денатурации матрица для ПЦР разрушается и ПЦР-продукт, соответствующий промотору гена, отсутствует в ПААГ. Внутренний контроль МЧ-ПЦР, не содержащий сайтов узнавания HpaII, должен присутствовать во всех анализируемых образцах. Отрицательный контроль не должен содержать ПЦР-продуктов, в положительном контроле должны присутствовать ПЦР-продукты внутреннего контроля и промоторов исследуемых генов.
В случае выявления аномального метилирования промоторных районов генов N33, р16 и GSTP1, как всех сразу, так и в попарных сочетаниях в образцах ДНК из сыворотки крови пациентов делают вывод о высокой вероятности злокачественного процесса в предстательной железе, а в случае уже диагностированного рака диагностика является подтверждающей.
Эффективность предлагаемого способа диагностики
У пациентов с РПЖ мы обнаружили высокий процент метилирования малигнизированного эпителия. Высокие частоты метилирования были найдены для аденокарциномы: р16 - 50%, GSTP1 - 93%, N33 - 27%. В железах простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) высокой степени у пациентов с РПЖ частоты метилирования изученных генов близки к таковым в железах аденокарциномы: р16 - 53%; GSTP1 - 73%; N33 - 27%. Молекулярно-генетические изменения при ПИН соответствуют таковым при раннем инвазивном раке, хотя менее выражены.
Метилирование генов р16, N33 и GSTP1 проанализировано в 102-х биопсийных образцах ткани ПЖ. Образцы ткани ПЖ были условно поделены по наличию у пациента определенной гистологической картины. Так пациенты, имеющие хотя бы в одном из 12 фрагментов биопсии аденокарциному, относились к группе РПЖ. Пациенты, имеющие один или более участков ПИН в любом из 12 биопсийных фрагментов, были в группе ПИН, аналогичный принцип применяли для пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ).
Гиперметилирование промоторного района гена р16 обнаружено в 18% случаев гиперплазии, 48% ПИН и 42% аденокарциномы. Схожая частота метилирования гена GSTP1 найдена для аденокарциномы (41%). Однако, если частота метилирования гена р16 для ПИН также высока, как и для аденокарциномы, то между ПИН и аденокарциномой для GSTP1 найдено достоверное различие (р=0.007). В предраковых состояниях метилирование гена N33 не обнаружено, тогда как частота метилирования этого гена в аденокарциноме составила 22% (р=0.05).
Для исследования возможности неинвазивной диагностики проведен анализ метилирования генов Р16, N33 и GSTP в 112 образцах плазмы крови пациентов с РПЖ и пациентов с ДГПЖ, чтобы оценить диагностический потенциал выбранных эпигенетических маркеров. Образцы крови получены от пациентов с РПЖ до выполнения простатэктомии.
Метилирование гена GSTP1 у пациентов с ДГПЖ не обнаружено, в то же время для пациентов с аденокарциномой частота метилирования гена GSTP1 в плазме составила (28%) (р=0.05). В плазме пациентов с предраковыми состояниями метилирование гена Р16 не выявлено, тогда как частота метилирования этого гена в плазме пациентов с аденокарциномой составила 19%. Частота метилирования для гена N33 составила 30%.
Эффективность любого биологического маркера определяется параметрами чувствительность и специфичность. Эти критерии очень важны при оценке диагностической значимости маркеров для популяционного скрининга данного заболевания или для клинического наблюдения группы повышенного риска. Чтобы оценить потенциальную значимость выбранных маркеров метилирования (генов р16, GSTP и N33), была рассчитана чувствительность и специфичность данных маркеров. Показано, что GSTP имеет чувствительность 36%, Р16 - 25%, а N33 - 27%, в то же время все маркеры обладают 100% специфичностью. Таким образом, система молекулярных маркеров, состоящая из трех генов, обладает чувствительностью 75% и специфичностью в 100%.
Поскольку технологически система ДНК-маркеров является открытой, имеется реальная возможность увеличения ее чувствительности в результате добавления в нее еще 2-3 маркеров.
Нижеследующий пример иллюстрирует способ по изобретению.
При исследовании традиционными инструментальными и биохимическими методами диагностики пациенту 52 лет был поставлен диагноз доброкачественной гиперплазии предстательной железы. С использованием системы молекулярных ДНК-маркеров в сыворотке крови у пациента было определено метилирование гена GSTP. При детальном исследовании с использование 12-игольной биопсии в одном из столбиков ткани была обнаружена ПИН высокой степени/карцинома in situ. В этом образце, кроме гена GSTP, было выявлено метилирование гена N33, что позволило своевременно начать лечение пациента.
Способ по изобретению повышает точность ранней ДНК-диагностики рака предстательной железы за счет использования для анализа ДНК из сыворотки крови. Предлагаемый способ обладает более высокой специфичностью за счет правильного подбора генов в тест-системе, а также позволяет использовать экономичные методы детекции.