ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
DIAGNOSING AND TREATING BREAST CANCER

Данная заявка заявляет приоритет предварительных заявок 61/362021, поданной 7 июля 2010 года и 61/469890, поданной 31 марта 2011 года, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам диагностики, исследования и терапии рака, включая, но не ограничиваясь, маркерами рака. В частности, настоящее изобретение касается композиций и способов прогноза ответа субъекта на противораковые терапии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак молочной железы является второй по распространенности формой рака среди женщин в США, и второй основной причиной смертей от рака среди женщин. В то время как в 80-е годы наблюдался резкий скачок количества новых случаев рака молочной железы, в настоящее время, как представляется, это количество стабилизировалось. Снижение уровня смерти от рака молочной железы, по-видимому, происходит в связи с тем, что больше женщин получают маммограммы. При раннем обнаружении шансы на успешное лечение рака молочной железы намного лучше.
Рак молочной железы, который хорошо лечится оперативным путем, радиотерапией, химиотерапией и гормональной терапией, наиболее часто излечивается при обнаружении на ранних стадиях. Маммография является наиболее важным способом скрининга для раннего обнаружения рака молочной железы. Рак молочной железы классифицируется на различные подтипы, однако только немногие из них влияют на прогноз или на выбор терапии. Ведение пациента после первоначального подозрения на рак молочной железы, в основном, включает подтверждение диагноза, оценку стадии заболевания и выбор терапии. Диагноз может быть подтвержден аспирационной цитологией, трепан-биопсией под стереотаксическим или ультразвуковым контролем для непальпируемых поражений или инцизионной или эксцизионной биопсией. При хирургическом удалении опухолевой ткани ее часть обрабатывается для определения уровней РЭ и РП.
На прогноз и выбор терапии влияют возраст пациента, стадия заболевания, патологические характеристики первичной опухоли, включая некроз опухоли, уровни рецепторов к эстрогену (РЭ) или рецепторов к прогестерону (ПР) в опухолевой ткани, сверхэкспрессия статуса HER2 и показатели пролиферативной способности, наряду с менопаузальным статусом и общим состоянием здоровья. Пациенты с излишним весом могут иметь худший прогноз (Bastarrachea et al., Annals of Internal Medicine, 120: 18 [1994]). Прогноз также может варьировать в зависимости от расы, при этом афроамериканцы и, в меньшей степени, латиноамериканцы имеют худший прогноз по сравнению с белой расой (Elledge et al., Journal of the National Cancer Institute 86: 705 [1994]; Edwards et al., Journal of Clinical Oncology 16: 2693 [1998]).
Три основных способа лечения рака молочной железы - это операция, облучения и лекарственная терапия. Нет такого лечения, которое бы подходило каждому пациенту, и часто требуется два или более вида лечения. Выбор определяется многими факторами, включая возраст пациента и ее менопаузальный статус, тип рака (например, протоковый vs. дольковый), его стадия, имеет ли опухоль рецепторы к гормону или нет, и уровень ее инвазивности.
Способы лечения река молочной железы определяются как местные или системные. Операция и облучения считаются местными терапиями, поскольку они напрямую воздействуют на опухоль, молочную железу, лимфатические узлы или другие определенные участки. Лекарственная терапия называется системной терапией, потому что ее эффекты распространяются широко. Лекарственные терапии включают классические химиотерапевтические препараты, лечение, блокирующее гормоны (например, ингибиторы ароматазы, селективные модуляторы рецепторов эстрогена и ингибиторы рецепторов эстрогена) и лечение моноклональными антителами (например, против HER-2). Они могут использоваться по раздельности или, чаще всего, в различных комбинациях.
Существует необходимость в дополнительных способах лечения, в частности, в способах лечения, адаптированных под опухоль пациента.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам диагностики, исследования и терапии рака, включая, но не ограничиваясь, маркерами рака. В частности, настоящее изобретение касается композиций и способов прогноза ответа субъекта на противораковые терапии.
В некоторых вариантах воплощения композиции и способы настоящего изобретения находят применение в определении прогноза субъекта (например, субъекта, диагностированного как имеющего метастатический рак молочной железы) в отношении выживаемости или ответа на лечение (например, антиэстрогенное лечение). Такие способы находят применение как в исследовательских, так и в клинических применениях.
Например, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способ определения курса лечения, включающий обнаружение уровня циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в образце от субъекта, диагностированного как имеющего метастатический рак молочной железы; и определения курса лечения на основании уровня ЦОК в образце. В некоторых вариантах воплощения курс лечения содержит антиэстрогенную терапию (например, тамоксифен или ингибитор ароматазы, такой как летрозол, анастрозол или экземестан). В других вариантах воплощения курс лечения содержит химиотерапию. В некоторых вариантах воплощения способ далее содержит этап характеризации одного или более опухолевых маркеров, ассоциированных с ЦОК (например, рецептора эстрогена, рецептора человеческого фактора роста-2 - HER-2, регулятора апоптоза bcl-2, маркеров апоптоза, рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 - IGFR1, виментина или фактора пролиферации ki-67). В некоторых вариантах воплощения маркер апоптоза обнаруживается с использованием моноклонального антитела М30. В некоторых вариантах воплощения метастатический рак молочной железы является положительным по рецептору к эстрогену. В некоторых вариантах воплощения один или более опухолевых маркеров обнаруживаются с использованием множественной технологии (например, множественной ПЦР) или иммуномагнитного анализа. В некоторых вариантах воплощения анализы автоматизированы. В некоторых вариантах воплощения способ далее включает этап определения ЦОК-индекса эндокринной терапии (ЦОК-ИЭТ). В некоторых вариантах воплощения ЦОК-ИЭТ рассчитывается путем присвоения баллов уровням ЦОК и опухолевых маркеров. В некоторых вариантах воплощения низкий ЦОК-ИЭТ является индикатором того, что субъект, вероятно, отвечает на эндокринную (например, антиэстрогенную) терапию. В некоторых вариантах воплощения высокий показатель ЦОК-ИЭТ является индикатором того, что субъект, вероятно, не отвечает на эндокринную терапию, и что его лучше лечить химиотерапией.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 демонстрирует экспрессию рецептора эстрогена на линиях раковых клеток.
Фигура 2 демонстрирует экспрессию a) Bcl-2, b) Ki-67 и с) HER-2 на линиях раковых клеток.
Фигура 3 демонстрирует расчет баллов ЦОК-ИЭТ для линий раковых клеток.
Фигура 4 демонстрирует расчет баллов ЦОК-ИЭТ для трех пациентов.
Фигура 5 демонстрирует схему примерного клинического исследования баллов ЦОК-ИЭТ и клинического результата при раке молочной железы.
Фигура 6 демонстрирует схему примерного клинического исследования баллов ЦОК-ИЭТ и клинического результата при раке молочной железы.
Фигура 7 демонстрирует схему примерного клинического исследования баллов ЦОК-ИЭТ и клинического результата при раке молочной железы.
Фигура 8 демонстрирует результаты клинического исследования 8 пациентов, у которых проводился мониторинг баллов ЦОК-ИЭТ.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Чтобы способствовать пониманию настоящего изобретения, ниже определяется ряд терминов и фраз.
В данном контексте термины «обнаруживать» или «обнаружение» могут описывать как общее действие узнавания или распознавания, так и конкретное наблюдение композиции.
В данном контексте термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к любой молекуле, содержащей нуклеиновую кислоту, включая, но не ограничиваясь, ДНК или РНК. Термин охватывает последовательности, которые включают любые известные аналоги оснований ДНК и РНК, включая, но не ограничиваясь 4-ацетилцитозином, 8-гидрокси-N6-метиладенозином, азиридинилцитозином, псевдоизоцитозином, 5-(карбоксигидроксиметил) урацилом, 5-фторурацилом, 5-бромурацилом, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацилом, 5- карбоксиметиламинометилурацилом, дигидроурацилом, инозином, N6-изопентениладенином, 1-метиладенином, 1-метилпсевдоурацилом, 1-метилгуанином, 1-метилинозином, 2,2-диметилгуанином, 2-метиладенином, 2-метилгуанином, 3-метилцитозином, 5-метилцитозином, N6-метиладенином, 7-метилгуанином, 5-метиламинометилурацилом, 5-метоксиамино-метил-2-тиоурацилом, бета-D-маннозилквеуозином, 5'-метоксикарбонилметилурацилом, 5-метоксиурацилом, 2-метилтио-N6-изопентиладенином, урацил-5-оксиуксусная кислота метилэфиром, урацил-5-оксиуксусной кислотой, оксибутоксозином, псевдоурацилом, квеозином, 2-тиоцитозином, 5-метил-2-тиоурацилом, 2-тиоурацилом, 4-тиоурацилом, 5-метилурацилом, N-урацил-5-оксиуксусная кислота метилэфиром, урацил-5-оксиуксусной кислотой, псевдоурацилом, квеозином, 2-тиоцитозином и 2,6-диаминопурином.
Термин «ген» относится к последовательности нуклеиновой кислоты (например, ДНК), которая содержит кодирующие последовательности, необходимые для производства полипептида, предшественника или РНК (например, рРНК, тРНК). Полипептид может кодироваться полной длиной кодирующей последовательности или частью кодирующей последовательности, при условии, что желаемая активность или функциональные свойства (например, ферментативная активность, связывание лиганда, сигнальная трансдукция, иммуногенность и т.п.) полной длины или фрагмента сохранены. Термин также охватывает кодирующий участок структурного гена и последовательности, прилегающие к кодирующему участку как на 5', так и на 3' концах на расстоянии, приблизительно, 1 кб или более с любого конца, так, что ген относится к длине полноразмерной мРНК.
Последовательности, расположенные на 5' кодирующего участка и присутствующие на мРНК относятся к 5' не-транслируемым последовательностям Последовательности, расположенные на 3' или по ходу транскрипции кодирующего участка и присутствующие на мРНК, относятся к 3' не-транслируемым последовательностям. Термин «ген» охватывает как кДНК, так и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующий участок, прерываемый не-кодирущими последовательностями, называемыми «нитронами» или «интервенирующими участками» или «интервенирующими последовательностями». Интроны - это сегменты гена, которые транскрибируются в ядерную РНК (гяРНК); интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Интроны удаляются или «сплайсируются» из ядерного или первичного транскрипта; поэтому интроны отсутствуют в транскрипте матричной РНК (мРНК). Функции мРНК во время трансляции заключаются в определении последовательности или порядка аминокислот в образующемся полипептиде.
В данном контексте термин «гетерологичный ген» относится к гену, который не находится в своем природном окружении. Например, гетерологичный ген включает ген из одних видов, внедренный в другие виды. Гетерологичный ген также включает ген, природный для организма, который был изменен некоторым способом (например, подвержен мутации, добавлен в виде множественных копий, связан не-природной регуляторной последовательностью и т.п.). Гетерологичные гены отличаются от эндогенных генов тем, что последовательности гетерологичного гена, как правило, присоединены к последовательности ДНК, которая не обнаруживается в природе связанной с генными последовательностями в хромосоме, или они связаны с частями хромосомы, что не обнаруживается в природе (например, гены, экспрессированные в локусе, где ген в норме не экспрессируется).
В данном контексте термин «олигонуклеотид» относится к короткому участку однонитчатой полинуклеотидной цепи. Олигонуклеотиды, как правило, имеют менее 200 остатков в длину (например, между 15 и 100), однако, в данном контексте, термин так же, как подразумевается, охватывает более длинные полинуклеотидные цепи. Олигонуклеотиды часто именуются по своей длине. Например, олигонуклеотид с 24 остатками именуется «24-мер». Олигонуклеотиды могут образовывать вторичные и третичные структуры путем самогибридизации или гибридизации с другими полинуклеотидами. Такие структуры могут включать, но не ограничиваются, дуплексами, шпильками, крестами, загибами и триплексами.
В данном контексте термины «комплементарный» или «комплементарность» используются в применении к полинуклеотидам (т.е., последовательности нуклеотидов), связанным правилами пар оснований. Например, последовательность «5'-A-G-T-3'» комплементарна последовательности «3'-T-C-A-5'». Комплементарность может быть «частичной», при которой только некоторые из оснований нуклеиновых кислот соответствуют друг другу согласно правилам пар оснований. Или может существовать «полная» или «тотальная» комплементарность между нуклеиновыми кислотами. Степень комплементарности между нитями нуклеиновых кислот обладает значительным воздействием на эффективность и силу гибридизации между нитями нуклеиновой кислоты. Это имеет особое значение в реакциях амплификации, а также в способах обнаружения, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами.
Термин «гомология» относится к степени комплементарности. Это может быть частичная гомология или полная гомология (т.е. идентичность). Частично комплементарная последовательность - молекула нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной молекулы нуклеиновой кислоты с целевой нуклеиновой кислотой, является «в значительной степени гомологичной». Ингибирование гибридизации полностью комплементарной последовательности с целевой последовательностью может быть исследовано с помощью анализа гибридизации (Саузерн- или Нозерн-блоттинг, гибридизация в растворе и подобное) в условиях пониженной жесткости. В значительной степени гомологичная последовательность или зонд будут конкурировать за связывание и ингибировать связывание (т.е. гибридизацию) полностью гомологичной молекулы нуклеиновой кислоты с мишенью в условиях пониженной жесткости. Это не говорит о том, что условия пониженной жесткости являются таковыми, которые позволяют осуществляться неспецифическому связыванию; условия пониженной жесткости требуют, чтобы связывание двух последовательностей одна с другой было специфическим (т.е., селективным) взаимодействием. Отсутствие неспецифического связывания может быть проверено путем использования второй мишени, которая является в значительной степени некомплементарной (например, менее чем, приблизительно, 30% идентичность); в отсутствии неспецифического связывания зонд не будет гибридизироваться со второй некомплементарной мишенью.
При использовании в отношении двунитчатой последовательности нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, термин «в значительной степени гомологичный» относится к любому зонду, который может гибридизироваться с любой или с обеими нитями двунитчатой последовательности нуклеиновой кислоты в условиях пониженной жесткости, как описано выше.
Ген может производить множественные виды РНК, которые генерируются путем дифференциального сплайсинга первичного РНК транскрипта. кДНК, которые являются вариантами сплайсинга одного и того же гена, будут содержать участки идентичности или полной гомологии последовательностей (представляющих наличие одного и того же экзона на обеих кДНК) и участки полной не-идентичности (например, представляющие наличие экзона «А» на кДНК 1, в то время как кДНК 2 содержит вместо этого экзон «В»). Из-за того, что две кДНК содержат участки идентичности последовательности, они обе будут гибридизироваться с зондом, происходящим из цельного гена или частей гена, содержащих последовательности, обнаруживаемые в обеих кДНК; два варианта сплайсинга поэтому в значительной степени гомологичны такому зонду и один другому.
При использовании в отношении к однонитчатой последовательности нуклеиновой кислоты термин «в значительной степени гомологический» относится к любому зонду, который может гибридизироваться (т.е. он дополняет) последовательность однонитчатой нуклеиновой кислоты в условиях пониженной жесткости, как описано выше.
В данном контексте термин «гибридизация» используется в отношении образования пар комплементарных нуклеиновых кислот. На гибридизацию и силу гибридизации (т.е., силу ассоциации между нуклеиновыми кислотами) влияют такие факторы, как степень комплементарности между нуклеиновыми кислотами, жесткость вовлеченных условий, и Tm образовавшегося гибрида, и отношение Г:Ц нуклеиновых кислот. Единичная молекула, содержащая образование пар комплементарных нуклеиновых кислот в рамках своей структуры, называется «самогибридизирующейся».
В данном контексте термин «жесткость» используется в отношении условий температуры, ионной силы и наличия других соединений, таких, как органические растворители, при которых проводится гибридизация нуклеиновой кислоты. Под «условиями пониженной жесткости» искомая последовательность нуклеиновой кислоты будет гибридизироваться со своим точным дополнением, с последовательностями с единичными несовпадениями оснований, с близкородственными последовательностями (например, последовательностями с 90% или большей гомологией) и с последовательностями, имеющими только частичную гомологию (например, последовательностями с 50-90% гомологией). Под «условиями средней жесткости» искомая последовательность нуклеиновой кислоты будет гибридизироваться только со своим точным дополнением, с последовательностями с единичными несовпадениями оснований и с близкородственными последовательностями (например, с 90% или большей гомологией). Под «жесткими условиями» искомая последовательность нуклеиновой кислоты будет гибридизироваться только со своим точным дополнением и (в зависимости от таких условий, как температура) с последовательностями с единичными несовпадениями оснований. Другими словами, при условиях высокой жесткости температура может быть повышена с тем, чтобы исключить гибридизацию с последовательностями с единичными несовпадениями оснований.
2
4
2
«Жесткие условия» при использовании в отношении к гибридизации нуклеиновой кислоты содержат условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°C в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaHPO HO и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% ДСН, 5Х реагент Дейнхарда и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, отмытой в растворе, содержащем 0,1Х SSPE, 1,0% ДСН при 42°C при использовании зонда в, приблизительно, 500 нуклеотидов в длину.
2
4
2
«Условия средней жесткости» при использовании в отношении к гибридизации нуклеиновой кислоты содержат условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°C в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaHPO HO и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,5% ДСН, 5Х реагент Дейнхарда и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, отмытой в растворе, содержащем 1,0Х SSPE, 1,0% ДСН при 42°C при использовании зонда в, приблизительно, 500 нуклеотидов в длину.
2
2
«Условия пониженной жесткости» содержат условия, эквивалентные связыванию или гибридизации при 42°C в растворе, состоящем из 5Х SSPE (43,8 г/л NaCl, 6,9 г/л NaHPO4 HO и 1,85 г/л ЭДТА, рН доведена до 7,4 с помощью NaOH), 0,1% ДСН, 5Х реагент Дейнхарда [50Х реагента Дейнхарда рассчитано на 500 мл: 5 г Фиколл (Тип 400, Pharmacia), 5 г БСА (Фракция V; Sigma)] и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, отмытой в растворе, содержащем 5Х SSPE, 0,1% ДСН при 42°C при использовании зонда в, приблизительно, 500 нуклеотидов в длину.
В области техники хорошо известно, что могут быть применены многочисленные эквивалентные условия для содержания условий низкой жесткости; факторы, такие как длина и природа (ДНК, РНК, состав оснований) зонда и природа мишени (ДНК, РНК, состав оснований, наличие в растворе или в иммобилизированном виде, т.п.), и учитывается концентрация солей и других компонентов (например, наличие или отсутствие формамида, декстран сульфата, полиэтилен гликоля), и гибридизационный раствор может варьировать для создания условий гибридизации в условиях низкой жесткости, отличных от перечисленных выше, однако эквивалентных им. В дополнение, в области техники известны условия, которые способствуют гибридизации в условиях высокой жесткости (например, повышение температуры гибридизации и/или этапов отмывания, использование формамида в гибридизационном растворе и т.п.) (см. выше определение для «жесткости»).
В данном контексте термин «олигонуклеотид амплификации» относится к олигонуклеотиду, который гибридизируется с целевой нуклеиновой кислотой или с ее комплементарной нуклеиновой кислотой и участвует в реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Примером олигонуклеотида амплификации является «праймер», который гибридизируется с матричной нуклеиновой кислотой и содержит 3' ОН конец, которые удлиняется полимеразой в процессе амплификации. Другим примером олигонуклеотида амплификации является олигонуклеотидом, который не удлиняется полимеразой (например, по причине того, что он имеет заблокированный 3' конец), однако участвует в амплификации или ей способствует. Олигонуклеотиды амплификации могут необязательно включать модифицированные олигонуклеотиды или аналоги, или дополнительные нуклеотиды, которые участвуют в реакции амплификации, но не комплементарны им или содержатся в целевой нуклеиновой кислоте. Олигонуклеотиды амплификации могут содержать последовательность, которая не комплементарна целевой или матричной последовательности. Например, 5' участок праймера может включать промоторную последовательность, которая не комплементарна целевой нуклеиновой кислоте (называемая «промотор-праймер»). Специалисту в области техники будет понятно, что олигонуклеотид амплификации, который функционирует как праймер, может быть модифицирован с включением 5' промоторной последовательности и, таким образом, функционировать как промотор-праймер. Сходным образом, промотор-праймер может быть модифицирован путем удаления или синтеза без промоторной последовательности и все еще функционировать как праймер. Блокированный 3' олигонуклеотид амплификации может предоставить промоторную последовательность и служить в качестве матрицы для полимеризации (называемой «промотор-провайдер»).
В данном контексте термин «праймер» относится к олигонуклеотиду, как к встречающемуся в природе в очищенном рестрикционном расщеплении, так и к получаемому синтетическим путем, который способен действовать в качестве точки инициации синтеза при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного нити нуклеиновой кислоты {например, в присутствии нуклеотидов и агента индукции, такого, как ДНК полимераза, и при подходящей температуре и рН). Праймер, предпочтительно, является однонитчатым для максимальной эффективности амплификации, однако альтернативно может быть двунитчатым. Если он двунитчатый, праймер вначале обрабатывается для разделения нитей перед тем, как быть использованным для приготовления продуктов удлинения. Предпочтительно, праймер является олигодезоксирибонуклеотидом. Праймер должен иметь достаточную длину для затравки синтеза продуктов удлинения в присутствии индуцирующего агента. Точные длины праймеров будут зависеть от многих факторов, включая температуру, источник праймера и использование способа.
В данном контексте термин «зонд» относится к олигонуклеотиду (т.е. последовательности нуклеотидов), как к встречающемуся в природе в очищенном рестрикционном расщеплении, так и к получаемому синтетическим путем, рекомбинантным путем или путем амплификации ПЦР, который способен гибридизироваться с, по меньшей мере, частью другого искомого олигонуклеотида. Зонд может быть однонитчатым или двунитчатым. Зонды пригодны для обнаружения, идентификации и изолирования конкретной генной последовательности. Предполагается, что любой зонд, используемый в настоящем изобретении, будет помечен любой «репортерной молекулой» таким образом, что он может быть обнаружен любой системой обнаружения, включая, но не ограничиваясь, ферментной (например, ИФА, наряду с основанными на ферментах гистохимическими анализами), флуоресцентной, радиоактивной и люминесцентной системами. Не подразумевается, что настоящее изобретение будет ограничено любой конкретной системой обнаружения или меткой.
Термин «изолированный» при использовании в отношении к нуклеиновой кислоте, как «изолированный олигонуклеотид» или «изолированный полинуклеотид», относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и изолирована из, по меньшей мере, одного компонента или контаминанта, с которым она обычно ассоциирована в своем природном источнике. Таким образом, изолированная нуклеиновая кислота присутствует в форме или в окружении, отличных от тех, в которых она обнаруживается в природе. В отличие от этого, неизолированные нуклеиновые кислоты, такие нуклеиновые кислоты, как ДНК и РНК, обнаруживаются в состоянии, в котором они существуют в природе. Например, данная ДНК последовательность (например, ген) обнаруживается в хромосоме клетки хозяина вблизи от соседних генов; РНК последовательности, такие как специфическая мРНК последовательность, кодирующая специфический белок, обнаруживается в клетке в виде смеси с многочисленными другими мРНК, которые кодируют большое число белков. Однако изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая данный белок включает, в качестве примера, такую нуклеиновую кислоту в клетках, обычно экспрессирующих данный белок, где нуклеиновая кислота находится в локализации хромосомы, отличной от локализации в природных клетках, или она иным образом граничит с последовательностью нуклеиновой кислоты, отличной от той, которая обнаруживается в природе. Изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид могут присутствовать в однонитчатой или двунитчатой форме. Когда изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или полинуклеотид используется для экспрессии белка, олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать, как минимум, смысловую или кодирующую нить (т.е., олигонуклеотид или полинуклеотид может быть однонитчатым), однако могут содержать как смысловую, так и анти-смысловую нити (т.е., олигонуклеотид или полинуклеотид может быть двунитчатым).
В данном контексте термин «очищенный» или «очищать» относится к удалению компонентов (например, контаминантов) из образца. Например, антитела очищают путем удаления не-иммуноглобулиновых белков, их также очищают путем удаления иммуноглобулина, который не связывается с целевой молекулой. Удаление не-иммуноглобулиновых белков и/или удаление иммуноглобулинов, которые не связываются с целевой молекулой, приводит в результате к повышению в образце процента иммуноглобулинов, реагирующих с мишенью. В другом примере рекомбинантные полипептиды экспрессируются в бактериальных клетках хозяина, и полипептиды очищаются с помощью удаления протеинов клеток хозяина; тем самым в образце увеличивается процент рекомбинантных полипептидов.
В данном контексте термин «образец» используется в своем самом широком смысле. В одном смысле он, как означает, включает образчик или культуру, полученную из любого источника, наряду с биологическими образцами и образцами окружающей среды. Биологические образцы могут быть получены от животных (включая людей) и охватывают жидкости, твердые вещества, ткани и газы. Биологические образцы включают продукты крови, такие как плазма, сыворотка и подобное. Образцы окружающей среды включают материал окружающей среды, такой как вещество поверхности, грунт, вода, кристаллы и промышленные образцы. Такие примеры, однако, не следует истолковывать как ограничивающие типы образца, применимого к настоящему изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам диагностики, исследования и терапии рака, включая, но не ограничиваясь, маркерами рака. В частности, настоящее изобретение касается композиций и способов прогноза ответа субъекта на противораковые терапии.
В последние 30 лет смертность от рака молочной железы в западном мире снизилась, частично благодаря широкому применению адъювантной системной терапии. Однако в Соединенных Штатах в 2008 году более 40 000 женщин умрут от метастатического рака молочной железы. В то время как изредка пациент с метастатическим раком молочной железы оказывается излеченным, большинство в конечном счете умирает от своего заболевания. Несмотря на это, для пациентов с этим состоянием был введен ряд новых терапий, что в результате привело к умеренной пролонгации выживаемости и к значительным улучшениям в применении паллиативных средств.
Таким образом, целью терапии для большинства пациентов с метастатическим раком молочной железы является выбор терапии с наивысшей вероятностью ответа и наименьшей возможностью токсичности, тем самым уравновешивая симптомы рака с побочными эффектами лечения. Действительно, для лечения этих пациентов сейчас доступен широкий набор стратегий и агентов. Они включают химиотерапию (сейчас имеется более 10 различных агентов, утвержденных для лечения метастатического рака молочной железы), наряду с анти-НЕR2 терапией (трастузумаб, лапатиниб), и антиангиогенные терапии, хотя и не утвержденные Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA), также представляются довольно многообещающими. Однако одним из столпов лечения пациентов с метастатическим раком молочной железы является антиэстрогенная терапия.
Рак молочной железы можно лечить при помощи разнообразных антиэстрогенных подходов, которые, в основном, можно разделить на аддитивные и аблативные. Наиболее широко используемая аддитивная терапия - это селективный модулятор рецептора эстрогена (СМРЭ), тамоксифен, хотя эффективными также являются андрогенные терапии, такие, как флуоксиместерон и прогестагенные агенты, такие как мегестрола ацетат. Аблативные терапии были в прошлом, в основном, хирургическими, однако в более недавнее время стали осуществляться у женщин в предменопаузе при помощи агонистов и антагонистов гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон, таких как гозерелин или лейпролид, и у женщин в постменопаузе - при помощи агентов, ингибирующих индуцированную ароматазой конверсию предшественников дигидроэпиандростенидиона (ДГЭА) и тестостерона в эстрадиол и эстрон. В США имеются три доступных ингибитора ароматазы (ИА): летрозол, анастрозол и экземестан.
Выбор подходящего лечения для пациентов с метастатическим раком молочной железы базируется на двух факторах: прогнозе и предсказании. В этом отношении антиэстрогенная терапия может считаться самой ранней из «целевых» терапий. Последующие исследования продемонстрировали, что тамоксифен неактивен у пациентов с РЭ-отрицательными раками молочной железы. Однако антиэстрогенные терапии эффективны только у 30-50% женщин с РЭ-положительными (или «богатыми») опухолями, как метастатическими, так и ранними. Предполагается, что этих пациентов с РЭ-положительным, однако эндокринно-рефрактерным метастатическим раком молочной железы, было бы лучше лечить немедленной химиотерапией, несмотря на ее повышенный профиль токсичности, чем откладывая химиотерапию на несколько месяцев из-за попытки неэффективного, хотя и менее токсичного эндокринного лечения.
Как только выбран режим паллиативного лечения для пациента с метастатическим раком молочной железы, он прекращается, и пациенту назначают новую терапию по одной из двух причин: 1) выбранная терапия настолько токсична, что, даже когда она работает, маловероятно вызвать облегчение; или 2) она не работает и опухоль прогрессирует. Текущие способы определения этих явлений, в особенности, последнего, включают историю болезни, физикальное обследование, серологическое тестирование и радиографическую оценку. История болезни и физикальное обследование, как известно, ненадежны из-за субъективных вопросов и того факта, что более 50% пациентов имеют только метастатические поражения во внутренних органах, таких как кости, печень и легкие. Неспецифические серологические исследования, такие как ферменты, происходящие из кости (щелочная фосфатаза) и печени (щелочная фосфатаза, сывороточная глютамат оксалат трансфераза и т.п.) не имеют как достаточной чувствительности, так и специфичности, чтобы быть полезными для определения прогрессии. Для мониторинга таких пациентов используется, по меньшей мере, три категории опухоле-ассоциированных опухолевых маркера. Они включают анализы на белок MUC-1 (СА15-3, СА27.29), на карциноэмбриональный антиген (CEA) и на внеклеточный домен HER2. Комиссия по руководству по опухолевым маркерам Американского Общества Клинической Онкологии рекомендовала, чтобы для мониторинга пациентов с метастатическим раком молочной железы использовались бы, по меньшей мере, CA15-3 и СЕА. Однако во всех трех случаях раннее определение ответа на лечение или неудачи искажается феноменом «пика опухолевого маркера», при котором маркер фактически повышается в течение от нескольких недель до месяцев перед снижением до исходного уровня или ниже у вплоть до 25% пациентов, которые, в конечном счете, как полагалось, реагировали на терапию. Таким образом, результаты по циркулирующим опухолевым маркерам в настоящее время, по существу дела, не имеют ценности для определения прогрессии в течение одного или двух месяцев от начала новой терапии.
Радиографическая визуализация является наиболее высокоуважаемым способом определения клинического течения у пациента с метастатическим раком молочной железы. Для определения ответа, стабильности и прогрессии были разработаны строгие критерии для обзорных рентгенограмм, компьютерной томографии и магниторезонансной томографии. Однако радиографическая визуализация имеет несколько недостатков. Чувствительность к прогрессии у всех этих способов мала для большинства пациентов в течение первых одного или двух циклов терапии, и, в особенности, последние два способа неудобные, дорогие и связаны с дискомфортом для пациента. Поэтому эти тесты обычно не выполняются до периода, когда пациент уже находится на курсе в течение нескольких месяцев после начала новой терапии. Возможно, более важно, что только приблизительно 50% пациентов с метастатическим раком молочной железы будут иметь «измеримое» заболевание - скорее, они будут иметь «неизмеримые» поражения в коже и/или плевре либо поражения на коже и в легких, так называемые биологическим оружием, которые чересчур малы для точного количественного определения. Попытки проводить мониторинг пациентов с заболеванием «только костей» были особенно разочаровывающими. Костная сцинтиграфия при помощи технеция пирофосфата является наиболее широко используемым способом для мониторинга этих пациентов, однако она ограничена относительно слабой чувствительностью к обнаружению прогрессии и так называемым «сцинтиграфическим бликом», при котором у пациентов, отвечающих на терапию, в частности на эндокринную терапию, находят повышенное поглощение радиоизотопного индикатора в известных поражениях и даже появление новых зон поглощения как функции повышенной остеобластической восстанавливающей активности.
Существуют отдельные пациенты, у которых быстрая прогрессия легко определяется клиническими, серологическими и/или радиологическими способами. Однако многие пациенты с метастатическим раком молочной железы представляют собой клинический вызов в определении вероятности того, что вновь начатая терапия будет успешной в течение последующих нескольких месяцев, или что это будет бесполезный режим. Если это так, пациентов лучше лечить потенциально более эффективным, даже если более токсичным лечением, таким как химиотерапия.
Соответственно, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способы идентификации пациентов с РЭ-положительным метастатическим раком молочной железы, которые, вероятно, не отвечают на антиэстрогенные терапии. У таких пациентов традиционная химиотерапия может быть начата немедленно или после короткого испытания антиэстрогенной терапии. В некоторых вариантах воплощения способы настоящего изобретения позволяют проводить более ранний мониторинг эффективности текущего лечения. При этом могут быть выбраны ситуации, альтернативные лечения для субъектов, не отвечающих на свое текущее лечение.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способы, использующие анализ циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК). Например, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способы определения эффективности антиэстрогенной терапии путем количественного определения уровня ЦОК. В некоторых вариантах воплощения уровень ЦОК используется для определения прогноза и для направления курса лечения.
В некоторых вариантах воплощения уровни ЦОК сравниваются с уровнями субъекта, не имеющего рак, или со средним значением популяции субъектов, не диагностированных как имеющие рак. В некоторых вариантах воплощения ЦОК сравниваются со средним значением популяции субъектов, диагностированных как имеющие метастатический рак молочной железы, включая субъектов, которые отвечали на антиэстрогенные терапии, и субъектов, которые не отвечали. В других вариантах воплощения проводится мониторинг во времени уровней ЦОК у субъекта, диагностированного как имеющего не-метастатический рак молочной железы.
В других вариантах воплощения охарактеризовывается один или более опухолевых маркеров, ассоциированных с ЦОК, с целью отличить женщин, которым подойдет антиэстрогенная терапия, от женщин, которые окажутся рефрактерными к гормону, и тем самым определить прогноз или курс лечения. В некоторых вариантах воплощения опухолевые маркеры включают, но не ограничиваются РЭ, HER-2, bcl-2, апоптозом (окрашивание моноклональными антителами М30), IGRFR1, виментином и Ki-67. Могут быть использованы дополнительные опухолевые маркеры, известные специалисту в области техники. Настоящее изобретение рассматривает как известные, так и неизвестные (например, еще не открытые) опухолевые маркеры. Предпочтительные опухолевые маркеры - это те, которые присутствуют на ЦОК, и которые указывают (сами по себе или в комбинации) на ответ на антиэстрогенную терапию.
В некоторых вариантах воплощения статус опухолевых маркеров на ЦОК коррелирует со статусом тех же маркеров в первичной и/или метастатической ткани, полученной от тех же пациентов.
I. Циркулирующие опухолевые клетки
Опухолевые клетки были впервые распознаны в системе кровообращения человека, хотя и после смерти, более 150 лет тому назад. Недавние достижения в технологии позволили разработать высокоавтоматизированную и стандартизированную систему для отделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из цельной крови с использованием иммуномагнитного подхода. В некоторых вариантах воплощения способы настоящего изобретения используют систему CellSearch™ (Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA) для количественного определения ЦОК (Allard et al., Clin Cancer Res 2004;10(20):6897-904; Cristofanilli et al., N Engl J Med 2004;351(8):781-91; каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте). Система CELL SEARCH идентифицирует «события», которые затем характеризуются как эпителиальные по происхождению путем иммунофлуоресцентного окрашивания при помощи антицитокератиновых антител и определяется их клеточная природа в силу окрашивания DAPI. Контаминирующие лейкоциты идентифицируются иммунофлуоресцентным окрашиванием моноклональным антителом против CD45, и результаты представляются наглядно в цифровом формате.
Настоящее изобретение не ограничивается использованием системы CELL SEARCH. Может быть использован любой способ изолирования и/или количественного подсчета ЦОК.
II. Опухолевые маркеры
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способы идентификации опухолевых маркеров, ассоциированных с ЦОК. Примерные опухолевые маркеры описываются ниже более детально.
Рецептор эстрогена (РЭ). Среди других, избранные маркеры, которые указывают на независимость от эстрогенной терапии, включают относительные уровни РЭ, HER-2, bcl-2 и показатели апоптоза. Несколько исследований свидетельствуют о том, что ассоциация между экспрессией РЭ и выгодой от эндокринной терапии не является дихотомической, но скорее, она связана с количественным уровнем белка РЭ. Соответственно, были использованы различные заданные пределы для разделения «положительных» и «отрицательных» для различных тестов на РЭ. В некоторых вариантах воплощения относительные уровни РЭ, которые могут быть измерены в ЦОК, используются для помощи в определении вероятности ответа на эндокринную терапию.
HER2. Разнообразные доклинические и клинические исследования указывают, что сверх-экспрессия HER-2 и/или амплификация снижает чувствительность к чувствительности эстрогенного лечения в РЭ-положительных раках молочной железы. Настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом. Действительно, понимание механизма не является необходимым для применения на практике настоящего изобретения. Однако предполагается, что пациенты, имеющие РЭ-положительный, однако также HER-2 положительный рак молочной железы, вероятно, получат меньшую выгоду от антиэстрогенных лечений.
BCL-2. BCL-2 является антиапоптотическим белком, который защищает клетку от вхождения на путь программируемой клеточной смерти. BCL-2 обычно экспрессирован при раке молочной железы и ассоциирован с худшим прогнозом. Экспрессия BCL-2 более часто экспрессируется на РЭ-положительном, чем на РЭ-отрицательном раке молочной железы. Доклинические и некоторые клинические исследования указывают, что экспрессия BCL-2, по-видимому, связана с относительной резистентностью к антиэстрогенной терапии. Настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом. Действительно, понимание механизма не является необходимым для применения на практике настоящего изобретения. Однако предполагается, что РЭ-положительные, BCL-2 положительные раки молочной железы более вероятно рефрактерны к эндокринным лечениям.
Апоптоз. Один механизм действия антиэстрогенной терапии опосредуется через программируемую клеточную смерть с апоптозом. Поэтому последовательный мониторинг апоптоза предоставляет сведения о гибели клеток рака молочной железы. Предоперационные исследования, как с химиотерапией, так и с гормонотерапией, задокументировали, что ранняя индукция апоптоза ассоциирована с последующим клиническим ответом. Настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом. Действительно, понимание механизма не является необходимым для применения на практике настоящего изобретения. Однако предполагается, что серийная оценка апоптоза предоставляет указание на эффективность антиэстрогенной терапии.
Ki-67. Ki-67 - это антиген пролиферации, который отражает оборот клеток. Иммуногистохимическое окрашивание Ki-67 в первичных тканях ассоциировано с прогнозом на ранней стадии рака молочной железы. В неоадъювантных исследованиях снижение уровней Ki-67 связано с явной выгодой от антиэстрогенных терапий, включая как тамоксифен, так и ингибиторы ароматазы. Настоящее изобретение не ограничивается конкретным механизмом. Действительно, понимание механизма не является необходимым для применения на практике настоящего изобретения. Однако предполагается, что серийная оценка Ki-67, ассоциированная с ЦОК перед и во время эндокринного лечения предоставляет указание на вероятность получения выгоды.
В некоторых вариантах воплощения один или более из названных выше маркеров обнаруживается в составном или панельном формате. Например, в некоторых вариантах воплощения используется мультипараметрический анализ, основанный на ПЦР с обратной транскриптазой (от-ПЦР), такой как OncotypeDX™ (Genomic Health Inc, CA). Относительные значения экспрессии РЭ, BCL-2, HER2 и Ki67 направляют алгоритм, используемый для получения OncotypeDx «Показатель рецидива (ПР)». Хорошо обоснованные корреляционные исследования продемонстрировали, что пациенты, как отрицательные по лимфоузлам, так и положительные по лимфоузлам с низким ПР, отражающим высокий РЭ, низкий HER2, низкий BCL-2 и низкий Ki-67, имеют прогноз при лечении одним только тамоксифеном, в то время как пациенты с высоким показателем рецидива, отражающим низкий РЭ, высокий HER-2, высокий BCL-2 и высокий Ki-67, имеют значительно худший прогноз при лечении одним только тамоксифеном, однако намного более вероятно извлекут выгоду от химиотерапии (Paik et al., N Engl J Med 2004;351:2817-26; Paik et al., J Clin Oncol 2006;24:3726-34).
III. Способы обнаружения
Ниже предоставлены примерные способы обнаружения маркеров, ассоциированных с ЦОК. Однако может быть использован любой подходящий способ обнаружения нуклеиновых кислот или белков опухолевых маркеров.
А. Обнаружение ДНК и РНК
В некоторых вариантах воплощения опухолевые маркеры обнаруживаются в качестве мРНК с использованием разнообразных методик нуклеиновых кислот, известных обычному специалисту в области техники, включая, но не ограничиваясь: секвенированием нуклеиновой кислоты, гибридизацией нуклеиновой кислоты и амплификацией нуклеиновой кислоты.
1. Секвенирование
Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры методик секвенирования нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются, дидезокситерминаторным способом (Сэнгер) секвенирования и способом секвенирования с красителем в качестве терминатора. Обычный специалист в области техники признает, что поскольку РНК менее стабильна в клетке и более подвержена нуклеазной атаке, экспериментально РНК обычно перед секвенированием подвергается обратной транскрипции в ДНК.
Дидезокситерминаторный способ секвенирования использует специфическое для последовательности прекращение реакции синтеза ДНК с использованием модифицированных субстратов нуклеотидов. Удлинение начинается в специфическом сайте на матрице ДНК путем использования короткого олигонуклеотидного праймера, меченного радиоактивно или другим способом, комплементарного матрице в этом участке. Олигонуклеотидный праймер удлиняется с использованием ДНК полимеразы, стандартных четырех дезоксинуклеотидных оснований и низкой концентрации нуклеотида, прекращающего одну цепь, чаще всего ди-дезоксинуклеотида. Эта реакция повторяется в четырех отдельных пробирках с каждым из оснований, чередующихся ди-дезоксинуклеотидом. Ограниченная инкорпорация прекращающего цепь нуклеотида ДНК полимеразой приводит в результате к серии фрагментов родственных ДНК, которые прекращаются только в положениях, где используется конкретный ди-дезоксинуклеотид. Для каждой реакционной пробирки фрагменты разделяются по размеру путем электрофореза в пластинчатом полиакриламидном геле или в капиллярных трубках, наполненных вязким полимером. Последовательность определяется путем считывания того, какая линия дает визуализированную отметку от меченного праймера по мере сканирования геля сверху донизу.
При секвенировании с красителем в качестве терминатора альтернативно метится терминатор. Полное секвенирование может быть выполнено в единичной реакции путем мечения каждого из ди-дезоксинуклеотидов - терминаторов цепи отдельным флуоресцентным красителем, который флуоресцирует при различной длине волны.
2. Гибридизация
Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры методик гибридизации нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются гибридизацией in situ (ISH), микроматричным анализом и Саузерн- или Нозерн-блоттингом.
Гибридизация in situ (ISH) - это тип гибридизации, который использует меченую комплементарную нить ДНК или РНК в качестве зонда для локализации конкретной последовательности ДНК или РНК в части или срезе ткани (in situ), или, если ткань достаточно мала, во всей ткани (ISH в тотальном препарате). ISH ДНК может быть использована для определения структуры хромосом. ISH РНК изпользуется для измерения и локализации мРНК и других транскриптов в срезах ткани или в тотальных препаратах. Клетки и ткани образца обычно обрабатывают для фиксации целевых транскриптов на месте и для повышения доступа зонда. Зонд гибридизируется с целевой последовательностью при повышенной температуре и затем избыток зонда отмывается. Зонд, меченный радиоактивными, флуоресцентными или помеченными ферментами основаниями, локализовывается и количественно определяется в ткани, соответственно, с помощью ауторадиографии, флуоресцентной микроскопии или иммуногистохимии. ISH также может использовать два или более зондов, меченных радиоактивными или другими не-радиоактивными метками для одновременного определения двух или более транскриптов.
2.1 FISH
В некоторых вариантах воплощения последовательности опухолевых маркеров определяются с использованием флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Предпочтительные тесты FISH для настоящего изобретения используют бактериальные искусственные хромосомы (БИХ). Они широко использовались в проекте секвенирования генома человека (см. Nature 409: 953-958 (2001) и клоны, содержащие конкретные БИХ, доступны через дистрибьюторов, которых можно определить путем использования многих источников, например, Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Каждому клону БИХ из человеческого генома присвоено название, которое его однозначно определяет. Эти имена могут быть использованы для нахождения соответствующей последовательности GenBank и для заказа копий клона у дистрибьютора.
Конкретные протоколы для выполнения FISH хорошо известны в области техники и могут быть легко адаптированы для настоящего изобретения. Руководство, касающееся методологии, может быть получено из многих ссылок, включая: In situ Hybridization: Medical Applications (eds. G. R. Coulton and J. de Belleroche), Kluwer Academic Publishers, Boston (1992); In situ Hybridization: In Neurobiology; Advances in Methodology (eds. J. H. Eberwine, K. L. Valentino, and J. D. Barchas), Oxford University Press Inc., England (1994); In situ Hybridization: A Practical Approach (ed. D. G. Wilkinson), Oxford University Press Inc., England (1992)); Kuo, et al., Am. J. Hum. Genet. 49:112-119 (1991); Klinger, et al., Am. J. Hum. Genet. 57:55-65 (1992); и Ward, et al., Am. J. Hum. Genet. 52:854-865 (1993)). Имеются также коммерчески доступные наборы, и они предоставляют протоколы для выполнения тестов FISH (доступные от, например, Oncor, Inc., Gaithersburg, MD). Патенты, предоставляющие руководство по методологии включают U.S. 5225326; 5545524; 6121489 и 6573043. Все эти ссылки здесь приведены посредством ссылки во всей полноте и могут быть использованы вместе с подобными ссылками в области техники и с информацией, предоставленной здесь в разделе Примеры для установления этапов процедуры, удобных для конкретной лаборатории.
2.2 Микроматричные анализы
Различные виды биологических анализов носят название микроматричных анализов, включая, но не ограничиваясь: микроматричные анализы ДНК (например, микроматричные анализы кДНК и олигонуклеотидные микроматричные анализы); микроматричные анализы белка; микроматричные анализы ткани; трансфекционные или клеточные микроматричные анализы; микроматричные анализы химического компонента; и антительные микроматричные анализы. Микроматричный анализ ДНК, обычно называемый генным чипом, ДНК чипом или биочипом, представляют собой коллекцию микроскопических мазков ДНК, нанесенных на твердую поверхность (например, стеклянный, пластиковый или силиконовый чип) с образованием матрицы для целей профилирования экспрессии или мониторинга уровней экспрессии для тысяч генов одновременно. Фиксированные сегменты ДНК известны как зонды, тысячи из которых могут использоваться в микроматричном анализе единичной ДНК. Микроматричные анализы могут быть использованы для идентификации генов, связанных с заболеваниями, путем сравнивания экспрессии генов в больных и в нормальных клетках. Микроматричные анализы могут производиться с использованием разнообразных технологий, включая, но не ограничиваясь: печатью при помощи заостренных штифтов на стеклянных предметных стеклах; фотографически с использованием предварительно изготовленных трафаретов; фотолитографически с использованием динамических микрозеркальных устройств; чернильной печати; или электрохимически на микроэлектродных матрицах.
Саузерн- и Нозерн-блоттинг используются для обнаружения, соответственно, определенных последовательностей ДНК или РНК. ДНК или РНК, экстрагированные из образца, фрагментируют, разделяют электрофоретически на геле с подложкой и переносят на мембранный фильтр. ДНК или РНК, связавшиеся на фильтре, подвергают гибридизации с меченым зондом, комплементарным искомой последовательности. Проводят детекцию гибридизовавшегося зонда, связанного с фильтром. Вариантом процедуры является обратный Нозерн-блоттинг, при котором субстратная нуклеиновая кислота, прикрепленная к мембране, представляет собой набор изолированных фрагментов ДНК и зондом является РНК, экстрагированная из ткани и меченая.
3. Амплификация
Геномная ДНК и мРНК могут быть амплифицированы перед детекцией или одновременно с ней. Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры методик амплификации нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются, полимеразной цепной реакцией (ПЦР), полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), транскрипционно-опосредованной амплификацией (ТМА), лигазной цепной реакцией (ЛЦР), амплификацией с перемещением цепи (SDA), и амплификацией, основанной на последовательности нуклеиновой кислоты (NASBA). Обычный специалист в области техники признает, что определенные методики амплификации (например, ПЦР) требуют, чтобы РНК была обратно транскрибирована в ДНК перед амплификацией (например, ОТ-ПЦР), в то время, как другие методики амплификации напрямую амплифицируют РНК (например, ТМА и NASBA).
Полимеразная цепная реакция (патенты США под номерами 4683195; 4683202; 4800159 и 4965188, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте), обычно называемая ПЦР, использует множественные циклы денатурации, отжиг пар праймеров по различным цепям и удлинение праймера для экспоненциального увеличения количества копий целевой последовательности нуклеиновой кислоты. В вариации, называемой ОТ-ПЦР, для получения комплементарной ДНК (кДНК) из мРНК используется обратная транскриптаза (ОТ), и кДНК затем амплифицируется путем ПЦР для получения множественных копий ДНК. Другие изменения в ПЦР см., например, патенты США под номерами 4683195; 4683202 и 4800159; Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335 (1987); и Murakawa et al., ДНК 7: 287 (1988), каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте.
Транскрипционно-опосредованная амплификация (патенты США под номерами 5480784 и 5399491, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте), обычно называемая ТМА, синтезирует множественные копии целевой последовательности нуклеиновой кислоты автокаталитически при условиях в значительной степени постоянной температуры, ионной силы и рН, при которых множественные РНК копии целевой последовательности автокаталитически генерируют дополнительные копии. См., например, патенты США под номерами 5399491 и 5824518, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте. В варианте, описанном в публ. США №20060046265 (сюда включен посредством ссылки во всей полноте), TMA необязательно включает использование блокирующих функциональных групп, функциональных групп терминации и других модифицирующих функциональных групп для повышения чувствительности и точности процесса ТМА.
Лигазная цепная реакция (Weiss, R., Science 254: 1292 (1991), сюда включена посредством ссылки во всей полноте), обычно называемая ЛЦР, использует два набора комплементарных ДНК олигонуклеотидов, которые гибридизируются с прилегающими участками целевой нуклеиновой кислоты. ДНК олигонуклеотиды ковалентно соединяются ДНК лигазой в повторных циклах температурной денатурации, гибридизации и связывания для получения детектируемого двунитчатого связанного олигонуклеотидного продукта.
Амплификация с перемещением цепи (Walker, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992); патенты США под номерами 5270184 и 5455166, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте), обычно называемая SDA, использует циклы отжига пар праймерных последовательностей по противоположным цепям целевой последовательности, удлинение праймера в присутствии dNTPaS для продуцирования продукта удлинения дуплексного гемифосфоротиоатного праймера, опосредованный эндонуклеазой однонитчатый разрыв гемимодифицированного сайта распознавания эндонуклеазы, и опосредованное полимеразой удлинение праймера от 3' конца разрыва для перемещения существующей цепи и получения цепи для следующего раунда отжига праймера, однонитчатого разрыва и перемещения цепи, что в результате приводит к геометрической амплификации продукта. Термофильная SDA (tSDA) использует термофильные эндонуклеазы и полимеразы при более высоких температурах в, по существу, том же способе (Европейский патент №0 684 315).
Другие способы амплификации включают, например: амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновой кислоты (патент США под номером 5130238, сюда включен посредством ссылки во всей полноте), обычно называемую NASBA; ту, которая использует РНК репликазу для амплификации самой молекулы зонда (Lizardi et al., BioTechnol. 6: 1197 (1988),сюда включен посредством ссылки во всей полноте), обычно называемую QP репликаза; способ амплификации, основанный на транскрипции (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)); и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990), каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте). Для дальнейшего обсуждения известных способов амплификации см. Persing, David Н., "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp.51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993)).
4. Способы обнаружения
Не-амплифицированные или амплифицированные онкомаркерные нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены любым из традиционных способов. Например, в некоторых вариантах воплощения онкомаркерные нуклеиновые кислоты обнаруживаются путем гибридизации с детектируемо меченым зондом и измерения полученных в результате гибридов. Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры способов обнаружения описаны ниже.
nd
Один иллюстративный способ обнаружения, анализ защиты гибридизации (HPA), включает гибридизацию хемилюминесцентного олигонуклеотидного зонда (например, зонда, меченного акридиновым эфиром (АЭ)) с целевой последовательностью, селективный гидролиз хемилюминесценой метки, присутствующей на негибридизовавшемся зонде и измерение хемилюминесценции, производимой оставшимся зондом, на люминометре. См., например, патент США под номером 5283174 и Norman С.Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J. Kricka ed., 2 ed. 1995, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте).
Другой иллюстративный способ детекции предоставляется для количественной оценки процесса амплификации «в реальном времени». Оценка процесса амплификации «в реальном времени» задействует определение количества ампликона в реакционной смеси, постоянно или периодически, во время реакции амплификации, и использование определенных значений для расчета количества целевой последовательности, первоначально присутствующей в образце. В области техники хорошо известны разнообразные способы для определения количества первоначальной целевой последовательности, присутствующей в образце, на основе амплификации в реальном времени. Они включают способы, раскрываемые в патентах США под номерами 6303305 и 6541205, каждый из которых включен сюда посредством ссылки во всей полноте. Другой способ для определения количества целевой последовательности, первоначально присутствующей в образце, однако который не основывается на амплификации в реальном времени, раскрывается в патенте США под номером 5710029, включен сюда посредством ссылки во всей полноте.
Продукты амплификации могут быть обнаружены в реальном времени путем использования различных самогибридизирующихся зондов, большинство из которых имеет структуру стебель-петля. Такие самогибридизирующиеся зонды метятся таким образом, что они испускают сигналы с различной детекцией, в зависимости от того, находятся ли зонды в самогибридизирующемся состоянии или в измененном состоянии из-за гибридизации с целевой последовательностью. Путем не имеющего ограничительного характера примера, «молекулярные светочи» - это тип самогибридизирующегося зонда, который включает различные участки самокомплементарности (называемые «целевой связывающий домен» и «целевой замыкающий домен»), которые соединены соединяющим участком (например, не-нуклеотидным линкером) и которые гибридизируются сами с собой в предопределенных условиях гибридизационного анализа. В предпочтительном варианте воплощения молекулярные светочи содержат однонитчатые участки оснований в целевом связывающем домене, которые имеют в длину от 1 до приблизительно 20 оснований и доступны для гибридизации с целевой последовательностью, присутствующей в реакции амплификации в условиях перемещения цепи. В условиях перемещения цепи отдается предпочтение гибридизации двух комплементарных участков молекулярного светоча, которые могут быть полностью или частично комплементарными, кроме случаев присутствия целевой последовательности, которая будет связываться с однонитчатым участком, присутствующим в целевом связывающем участке, и перемещать весь или часть целевого замыкающего домена. Целевой связывающий домен и целевой замыкающий домен молекулярного светоча включают детектируемую метку или пару взаимодействующих меток (например, люминесцирующую/гасящую), расположенных таким образом, что генерируется различный сигнал когда молекулярный светоч самогибридизируется и когда молекулярный светоч гибридизируется с целевой последовательностью, тем самым позволяя проводить обнаружение пар зонд:мишень в тестируемом образце в присутствии негибридизировавшихся молекулярных светочей. Молекулярные светочи и разнообразные типы взаимодействующих пар меток раскрываются в патентах США под номерами 6534274, сюда включенных посредством ссылки во всей полноте.
Другим примером зонда обнаружения, имеющим самокомплементарность, является "молекулярный маяк». Молекулярные маяки включают молекулы нуклеиновой кислоты, обладающие комплементарной целевой последовательностью, аффинной парой (или плечами нуклеиновой кислоты), несущей зонд в закрытой конформации при отсутствии в реакции амплификации целевой последовательности, и пару меток, взаимодействующих в том случае, когда зонд находится в закрытой конформации. Гибридизация целевой последовательности и комплементарной целевой последовательности разделяет членов аффинной пары, тем самым переводя зонд в открытую конформацию. Переход в открытую конформацию определяется благодаря сниженному взаимодействию меченой пары, которая может представлять собой, например, флуорофор и гаситель (например, DABCYL и EDANS). Молекулярные маяки раскрываются в патентах США под номерами5925517 и 6150097, которые сюда включены посредством ссылки во всей полноте.
1
1
Другие самогибридизирубщиеся зонды хорошо известны обычному специалисту в области техники. Путем не имеющего ограничительного характера примера, связывающиеся пары зонда, обладающие взаимодействующими метками, такие, как те,  которые раскрыты в патенте США под номером 5928862 ( сюда включен посредством ссылки во всей полноте), могут быть адаптированы для применения в настоящем изобретении. Дополнительные системы обнаружения включают «молекулярные переключатели», как это раскрыто в публикации США №20050042638, включенной сюда посредством ссылки во всей полноте. Другие зонды, такие, как те, что включают интеркалирующие красители и/или флуорохромы, также пригодны для обнаружения продуктов амплификации в настоящем изобретении. См., например, патент США под номером 5814447 (сюда включен посредством ссылки во всей полноте).
Б. Обнаружение белка
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет способы обнаружения онкомаркерного белка и/или уровней онкомаркерного белка. Белки обнаруживаются путем применения разнообразных белковых методик, известных обычному специалисту в области техники, включая, но не ограничиваясь: секвенированием белка; и иммуноанализами.
1. Секвенирование
Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры методик секвенирования белка включают, но не ограничиваются, масс-спектрометрией и расщеплением по Эдману.
Масс-спектроскопия может, в принципе, секвенировать белок любого размера, однако расчет затрудняется с увеличением размера белка. Белок расщепляется эндопротеазой. и полученный в результате раствор пропускается через колонку жидкостного хроматографа высокого давления. В конце этой колонки из узкого сопла, заряженного высоким положительным потенциалом, распыляется раствор в масс-спектрометр. Заряд капель вызывает их фрагментацию до получения в остатке одних только единичных ионов. Пептиды затем фрагментируются и у фрагментов измеряются соотношения масса-заряд. Масс-спектр анализируется компьютером и часто сравнивается с базой данных ранее секвенированных белков с целью определения последовательности фрагментов. Процесс затем повторяется с другим расщепляющим ферментом, и наложения в последовательностях используются для построения последовательности для белка.
В реакции расщепления по Эдману пептид, подлежащий секвенированию, адсорбируется на твердой поверхности (например, стекловолокне, покрытом полибреном). К адсорбированному пептиду добавляется реагент Эдмана, фенилизотиоцианат (ФИТЦ) вместе со слегка щелочным буферным раствором 12% триметиламина, и происходит реакция с аминной группой N-концевой аминокислоты. Затем производное концевой аминокислоты может быть селективно отделено путем добавления безводной кислоты. Производное изомеризируется с получением замещенного фенилтиогидантоина, который может быть вымыт и идентифицирован хроматографически, и цикл может быть повторен. Эффективность каждого этапа составляет приблизительно 98%, что позволяет надежно определить приблизительно 50 аминокислот.
2. Иммуноанализы
Иллюстративные, не имеющие ограничительного характера примеры иммуноанализов включают, но не ограничиваются: иммунопреципитацией; Вестерн-блоттингом; ИФА; иммуногистохимией; иммуноцитохимией; проточной цитометрией; и иммуно-ПЦР. Для использования в иммуноанализах пригодны поликлональные или моноклональные антитела, детектируемо помеченные с использованием разнообразных методик, известных обычному специалисту в области техники (например, колориметрических, флуоресцентных, хемилюминесцентных или радиоактивных).
Иммунопреципитация - это методика осаждения антигена из раствора с использованием антитела, специфического по отношению к данному антигену. Данный процесс может быть использован для идентификации белковых комплексов, присутствующих в клеточных экстрактах, при направленности на белок, который, предположительно, присутствует в комплексе. Комплексы выделяются из раствора при помощи нерастворимых антителосвязывающих белков, первоначально выделенных из бактерий, таких как Протеин А и Протеин G. Антитела также могут быть присоединены к сефарозным шарикам, которые можно легко отделить из раствора. После отмывания преципитат может быть проанализирован с использованием масс-спектрометрии, Вестерн-блоттинга или любым количеством других способов для идентификации составляющих комплекса.
Вестерн-блоттинг или иммуноблоттинг - это способ для обнаружения белка в данном образце тканевого гомогената или экстракта. Он использует гель-электрофорез для разделения денатурированных белков по массе. Белки затем переносятся из геля на мембрану, как правило, поливинилдихлоридную или нитроцеллюлозную, где они исследуются с использованием антител, специфичных в отношении искомого белка. В результате исследователи могут изучить количество белков в данном образце и сравнить между собой уровни в нескольких группах.
ИФА, сокращение от иммуноферментного анализа - это биохимическая методика для обнаружения наличия антитела или антигена в образце. Она использует, как минимум, два антитела, одно из которых специфическое по отношению к антигену, и второе соединено с ферментом. Второе антитело будет вызывать выдачу сигнала хромогенным или флуорогенным субстратом. Вариации ИФА включают «сэндвич»-ИФА, конкурентный ИФА и способ иммуноферментных пятен ELISPOT. Благодаря тому, что ИФА может производиться для оценки наличия антигена или наличия антитела в образце, он является полезным инструментом для определения концентраций сывороточных антител и также для обнаружения присутствия антигена.
Иммуногистохимия и иммуноцитохимия относятся к процессу локализации белков, соответственно, в тканевых срезах или в клетках, основанной на принципе связывания антигенов в тканях или клетках со своими специфическими антителами. Визуализация делается возможным благодаря прикреплению ярлыков - дающих окрашивание или флуоресцентных - на антитела. Типичные примеры цветных ярлыков включают, но не ограничиваются, пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой. Типичные примеры флуорофорных ярлыков включают, но не ограничиваются, флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ) или фикоэритрином (ФЭ).
Проточная цитометрия - это методика для подсчета, исследования и сортировки микроскопических частиц, суспендированных в потоке жидкости. Она позволяют проводить одновременный мультипараметрический анализ физических и/или химических характеристик единичных клеток, проходящих через оптоэлектронное детекторное устройство. Луч света (например, лазера) одной частоты или цвета направлен на гидродинамически сфокусированный поток жидкости. К точке, где поток проходит через луч света, нацелен ряд детекторов, один в соответствии с потоком света (светорассеяние в направлении распространения или FSC) и несколько перпендикулярных ему (боковое светорассеяние (SSC) и один или более детекторов флуоресценции). Каждая частица в суспензии, проходя через луч, рассеивает неким образом свет, и флуоресцентные химические вещества в частице могут быть возбуждены с испусканием света более низкой частоты, чем у источника света. Комбинация рассеянного и флуоресцентного света улавливается детекторами и, путем анализа отклонений в яркости в каждом детекторе, по одному для каждого пика испускания флуоресценции, возможно вывести различные факты о физической и химической структуре каждой отдельной частицы. FSC коррелирует с объемом клетки и SSC коррелирует с плотностью или внутренней сложностью частицы (например, с формой ядра, количеством и типом цитоплазматических гранул или жесткостью мембраны).
Иммуно-полимеразная цепная реакция (ИПЦР) использует методики амплификации нуклеиновой кислоты для усиления выработки сигнала в иммуноанализах, основанных на антителах. Поскольку не существует никакого эквивалента ПЦР для белков, то есть, белки не могут реплицироваться тем же способом, что нуклеиновая кислота реплицируется во время ПЦР, единственным способом повышения чувствительности детекции является амплификация сигнала. Целевые белки связываются с антителами, которые конъюгированы прямым или непрямым способом с олигонуклеотидами. Несвязанные антитела вымываются, и у оставшихся связанных антител амплифицируются их олигонуклеотиды. Детекция белка происходит путем детекции амплифицированных олигонуклеотидов с использованием стандартных способов детекции полинуклеотидов, включая способы реального времени.
В некоторых вариантах воплощения используется иммуномагнитная детекция. В некоторых вариантах воплощения детекция автоматизирована. Примерные способы иммуномагнитной детекции включают, но не ограничиваются, способами, коммерчески доступными от Veridex (Raritan, NJ).
В. Анализ данных
В некоторых вариантах воплощения используется компьютерная программа анализа для перевода необработанных данных, сгенерированных в тестах обнаружения (например, наличие, отсутствие или количество экспрессии опухолевых маркеров и/или уровня ЦОК), в данные, обладающие прогностической ценностью для клинициста (например, выбор противораковой терапии). Клиницист может получить доступ к прогностическим данным с использованием любых подходящих средств. Так, в некоторых предпочтительных вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет дальнейшее преимущество того, что клиницист, который, вероятно, не получил подготовку по генетике или молекулярной биологии, не обязан понимать необработанные данные. Данные предоставляются непосредственно клиницисту в своей наиболее полезной форме. Клиницист затем способен немедленно использовать информацию с целью оптимизации лечения субъекта.
Настоящее изобретение рассматривает любой способ получения, обработки и передачи информацию в лаборатории и из лабораторий, производящих анализы, от провайдеров информации, медицинского персонала и субъектов, и им. Например, в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения образец (например, биопсия, или образец крови или сыворотки) получают от субъекта и предоставляют в службу профилирования (например, клиническую лабораторию в медицинском учреждении, заведение геномного профилирования и т.п.), расположенную в любой части света (например, в стране, отличной от той, где проживает субъект или где, в конечном счете, используется информация) для получения необработанных данных. Там, где образец содержит ткань или другой биологический образец, субъект может посетить медицинский центр для взятия образца и отсылки в профилирующий центр, или субъекты могут собрать образец самостоятельно (например, образец мочи) и непосредственно отослать его в профилирующий центр. Там, где образец включает предварительно определенную биологическую информацию, информация может быть непосредственно отослана в профилирующую службу субъектом (например, информационную карту, содержащую информацию, можно отсканировать компьютером и перевести данные в компьютер профилирующего центра с использованием систем электронной коммуникации). При получении профилирующей службой образец обрабатывается и создается профиль (т.е. данные экспрессии), специфический для диагностической или прогностической информации, требуемой субъекту.
Данные профиля затем готовятся в формате, подходящем для интерпретации лечащим клиницистом. Например, вместо того, чтобы предоставлять необработанные данные, подготовленный формат может представлять собой диагноз или оценку риска (например, вероятность успеха противоракового лечения) для субъекта наряду с рекомендациями для конкретных вариантов лечения. Эти данные могут быть представлены клиницисту любым подходящим способом. Например, в некоторых вариантах воплощения профилирующая служба создает отчет, который может быть распечатан для клинициста (например, в месте оказания медицинской помощи) или представлен клиницисту на мониторе компьютера.
В некоторых вариантах воплощения информация вначале анализируется в месте оказания медицинской помощи или в региональном учреждении. Необработанные данные затем отсылаются в центральное обрабатывающее учреждение для дальнейшего анализа и/или конвертации необработанных данных в информацию, пригодную для клинициста или пациента. Центральное обрабатывающее учреждение представляет собой преимущество для конфиденциальности (все данные сохраняются в центральном учреждении со стандартными протоколами безопасности), скорости и единообразия анализа данных. Центральное обрабатывающее учреждение может контролировать судьбу данных после лечения субъекта. Например, используя электронную систему коммуникации, центральное учреждение может предоставлять данные клиницисту, субъекту или исследователям.
В некоторых вариантах воплощения субъект способен напрямую получать доступ к данным, используя электронную систему коммуникации. Субъект на основе результатов может избрать дальнейшее вмешательство или консультирование. В некоторых вариантах воплощения данные используются для исследовательского применения. Например, данные могут быть использованы для дальнейшей оптимизации включения или исключения маркеров как полезных индикаторов конкретного состояния или стадии заболевания.
Г. Композиции и наборы
Композиции для использования в диагностических способах настоящего изобретения включают, но не ограничиваются зондами, амплификационными олигонуклеотидами и антителами. Особенно предпочтительные композиции обнаруживают присутствие уровня экспрессии опухолевых маркеров в образце ЦОК.
Любая из этих композиций, сама по себе или в комбинации с другими композициями настоящего изобретения, может быть предоставлена в форме набора. Например, единичный меченый зонд и пара амплификационных олигонуклеотидов могут быть предоставлены в наборе для амплификации и обнаружения опухолевых маркеров. Наборы далее могут включать соответствующие контроли и/или реагенты для обнаружения.
Композиции зондов и антител настоящего изобретения также могут быть предоставлены в форме матричного или панельного теста.
IV. Определение курса лечения
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение предоставляет системы, наборы и способы для определения курса лечения.
В некоторых вариантах воплощения определяется ЦОК-индекс эндокринной терапии (ЦОК-ИЭТ). В некоторых вариантах воплощения ЦОК-ИЭТ рассчитывается путем присвоения баллов уровням ЦОК и опухолевых маркеров (см. например, Пример 1). В некоторых вариантах воплощения низкий ЦОК-ИЭТ является индикатором того, что субъект, вероятно, отвечает на эндокринную (например, антиэстрогенную) терапию. В некоторых вариантах воплощения высокий показатель ЦОК-ИЭТ является индикатором того, что субъект, вероятно, не отвечает на эндокринную терапию и что его лучше лечить химиотерапией.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Следующие примеры предоставлены для демонстрации и дальнейшей иллюстрации определенных вариантов воплощения настоящего изобретения и их не следует истолковывать как ограничение его объема.
Пример 1
Разработка ЦОК-индекса эндокринной терапии (ЦОК-ИЭТ)
ЦОК могут быть воспроизводимо и надежно подсчитаны с использованием коммерчески доступной автоматизированной иммуномагнитной системы (например, системы CellSearch; Veridex LLC). Высокие уровни ЦОК предсказывают быструю прогрессию у пациентов с метастатическим раком молочной железы (МРМЖ) (Cristofanilli, et al. NEJM 2004). Только ~ 50% пациентов с РЭ-положительным МРМЖ получат выгоду от эндокринной терапии (ЭТ). Пациенты с эндокринно-рефрактерным МРМЖ получают большее облегчение при помощи химиотерапии. Этот пример описывает мультипараметрический анализ с использованием CellSearch, которая идентифицирует пациентов с РЭ-положительным МРМЖ, которые маловероятно получат выгоду от ЭТ, и которых лучше лечить химиотерапией.
Способы. Система CellSearch имеет четыре флуоресцентных канала. Три из них используются для того, чтобы отличить ЦОК от лейкоцитов (DAPI, анти-цитокератин, анти-CD45). Четвертый «пустой» канал был использован для измерения экспрессии РЭ, Bcl-2, HER-2 и Ki67 с помощью антиген-специфических антител с флуоресцентной меткой. Эти четыре маркера были избраны из-за их ассоциации с чувствительностью (РЭ, Bcl-2) или резистентностью (HER-2, Ki-67) в ЭТ. Культивируемые клетки рака молочной железы человека (MCF-7: ER+, BCL-2+, HER-2-, Ki67+; MDA-MB-231: ER-, Bcl-2-, HER-2-, Ki67+; ВТ-474: ER+, Bcl-2+, HER2+, Ki67+) были внесены в 7,5 мл человеческой цельной крови от нормальных доноров и охарактеризованы с использованием набора СХС CellSearch.
Таблица 1 демонстрирует ассоциацию различных маркеров с ответом на ЭТ.
Таблица 2 демонстрирует антитела и экспериментальные параметры.
Результаты. Каждая клеточная линия окрашена соответствующим образом на соответствующие маркеры, с соответствующими отрицательными контролями, хотя окрашивание было гетерогенным даже в пределах единичной клеточной линии (Фигуры 1-3).
Используя эти данные, был разработан ЦОК-ИЭТ, в котором присваиваются баллы отдельным категориям, состоящих из количества клеток, соединенных с относительным процентом и степенью положительности клеток к каждому маркеру, с более низкими баллами (ЦОК мало или они отсутствуют, или ЦОК с высоким % и интенсивностью РЭ и Bcl-2; низким HER-2 и Ki-67)=прогнозируемому благоприятному ответу на ЭТ (Таблицы 3 и 4 (а-в)).
ЦОК-ИЭТ был определен для 3 пациентов с метастатическим раком молочной железы с использованием описанных выше способов. Результаты показаны на Фигуре 4.
В дальнейших исследованиях был изучен 21 пациент. Дизайн исследования и результаты показаны на Фигурах 7-8. Один пациент был неподходящим. Пять из 20 пациентов имели низкие количества ЦОК (<5 ЦОК/7,5 мл цельной крови), и, как ожидается, имеют относительно благоприятный прогноз. ЦОК-ИЭТ был определен у 10 пациентов (50%): 2 пациента имели низкий, в то время как 3 имели промежуточный и 5 имели высокий ЦОК-ИЭТ. Технические сложности помешали точному установлению ЦОК-ИЭТ у оставшихся 4 пациентов. Следует отметить, что экспрессия биомаркеров среди ЦОК у отдельных пациентов была гетерогенной.
Более низкие баллы ЦОК-ИЭТ (низкий показатель ЦОК или его отсутствие, или ЦОК с высоким показателем РЭ и BCL-2 ЦОК и низким показателем HER2 и Ki-67 ЦОК) рассматривались как связанные с благоприятным ответом на ЭТ. ЦОК-ИЭТ рассчитывался у пациентов с МРМЖ для определения того, предсказывает ли высокий ЦОК-ИЭТ резистентность и быструю прогрессию на ЭТ.
Все публикации, патенты, заявки на патенты и номера доступа, упомянутые в вышеизложенном описании, сюда включены посредством ссылки во всей полноте. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными вариантами воплощения, следует понимать, что изобретение, как оно заявлено, не должно ненадлежащим образом быть ограниченным такими конкретными вариантами воплощения. В действительности, различные модификации и вариации описанных композиций и способов изобретения будут очевидными для обычного специалиста в области техники и, как подразумеваются, они подпадают под следующие пункты формулы изобретения.