Генетические маркеры метаболизма в оценке цитокинового статуса у больных с ожирением

© коллектив авторов, 2014 удк 616-056.257-092:612.015.3.6.05

Сенцова Т.Б., Кириллова о.о., Тутельян В.А., Ворожко и.В., Ревякина В.А., гаппарова К.М.

генетические маркеры метаболизма в оценке цитокинового статуса у больных ожирением

ФГБУ «Научно-исследовательский институт питания» РАМН Москва

Для изучения генетических маркеров метаболизма в оценке цитокинового статуса обследованы 180 больных (39 мужчин и 141 женщина) в возрасте от 18 до 66 лет, страдающих ожирением.

При гомозиготном генотипе е2/е2 гена аполипопротеида Е (ApoE) у пациентов выявляли повышенную концентрацию молекул адгезии sICAM и CRP, а также фактора некроза опухоли а (ФНОа), у носителей аллельного варианта е4 гена ApoE - уровень интерлейкина (ИЛ)-6. Цитокиновый профиль носителей аллельного варианта Ser447Ter гена липопротеинлипазы (LPL) характеризовался повышением содержания как sICAM, CRP, ИЛ-6, так и ФНОа. Результаты проведенного исследования показали, что изменения цитокинового статуса у больных ожирением зависели от индекса массы тела, а маркеры аллельного полиморфизма гена ApoE и LPL можно использовать в оценке их цитокинового статуса.

Ключевые слова: ожирение; ген; цитокин; аллель.

Sentsova T.B., Kirillova O.O., Tutelyan V.A., Vorozhko I.V., Revyakina V.A., Gapparova K.M.

GENETIC MARKERS OF METABOLISM IN EVALUATION OF CYTOKINE STATUS IN OBESE PATIENTS

Research Institute of Nutrition RAMS

Were examined 180 patients aged 18 to 66 years (39 men and 141 women) to study the genetic markers of metabolism for grade of cytokine status in patients with obesity.

We found that patients with homozygous genotype e2/e2 had ApoE gene increases the concentration of TNF-alpha, adhesion molecules SICAM and CRP. Patients with e4 allele of the ApoE gene also had elevated levels of IL -6. Cytokine profile of allelic variant Ser447Ter of LPL gene was characterized an increase in the content of sICAM, CRP, IL-6, and TNF-alpha.

The study found that changes in cytokine status is dependent on BMI in obese patients. Our research shown that markers of allelic polymorphism of LPL and ApoE genes can be used in the evaluation of the cytokine status in patients with obesity.

Keywords: obesity; gene; cytokin; allele.

Согласно современным требованиям, для адекватной оценки многофакторных изменений метаболического статуса у больных ожирением необходимо использовать данные иммунологических исследований. Успехи иммунологии позволили расширить спектр диагностических тестов, используемых в клинической практике, на основании которых сформировалось представление о жировой ткани как об активном эндокринном и иммунном органе [1, 2].

Получены данные, свидетельствующие о том, что при ожирении возникает дисбаланс в синтезе отдельных провоспали-тельных и противовоспалительных цитокинов, инициирующий развитие субклинического воспалительного процесса [3].

Доказано негативное влияние метаболических нарушений на функциональное состояние факторов клеточного иммунитета, фагоцитарного звена, экспрессию рецепторов различных цитокинов, цитотоксическую функцию иммуно-компетентных клеток и т. д. [4-6].

В последнее десятилетие большое внимание уделяют генетическим исследованиям, цель которых - получение научной информации об индивидуальных особенностях конкретного пациента, что позволяет определить характер и течение заболевания, особенности протеомного, метаболом-ного и иммунного статуса [7, 8]. Однако изучение геномных характеристик проводилось в основном у больных с аллергическими заболеваниями и касалось определения мутаций генов интерлейкина (ИЛ)-4, ИЛ-5, фактора некроза опухоли а (ФНОа) и др. [3].

Для корреспонденции: Кириллова Ольга Олеговна, e-mail: kirillova_o@list.ru; klinikakashir@yandex.ru

For correspondence: Kirillova Ol'ga Olegovna, e-mail: kirillova_o@list.ru; klinikakashir@yandex.ru

Известно, что ключевым звеном, объединяющим различные метаболические нарушения, которые развиваются при ожирении, являются изменения жировой ткани на уровне адипоцитов [9]. Принципиально важную роль в развитии механизмов, координирующих энергетический баланс в адипоцитах, играет аллельный полиморфизм генов, продукты которых участвуют в обеспечении метаболизма липидов [10]. Среди таких генов ген липопротеинлипазы (ЬРЬ) и ген аполипопротеида Е (АроЕ) [7, 11].

Учитывая тот факт, что генетические мутации могут оказывать влияние на активность адипоцитов посредством нарушения липидного метаболизма и опосредованно через активацию синтеза адгезинов и цитокинов, считаем перспективным использовать их в качестве маркеров в оценке иммунологических изменений у больных ожирением [7, 11, 12].

Цель работы - изучить генетические маркеры метаболизма в оценке цитокинового статуса у больных ожирением.

Материал и методы. Обследованы 180 больных (39 мужчин и 141 женщина) в возрасте от 18 до 66 лет, находящихся на лечении в отделении профилактической и реабилитационной диетологии ФГБУ "Научно-исследовательский институт питания" РАМН.

Всем больным проводили физикальное и антропометрическое исследование: определяли рост, массу тела с последующим расчетом индекса массы тела (ИМТ).

На основании ИМТ всех больных разделили на три группы: 1-я группа - больные с I степенью ожирения (п = 52), 2-я - со II степенью (п = 53), 3-я - с III степенью (п = 75).

В группу контроля вошли практически здоровые лица (п = 13) в возрасте от 20 до 62 лет, обратившиеся в поликлинику с целью диспансерного осмотра.

Содержание цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа), sICAM и

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2014

Содержание цитокинов и молекул адгезии у больных ожирением

Группа пациентов sICAM, нг/мл CRP, нг/мл ИЛ-6, пг/мл ИЛ-1а, пг/мл ФНОа, пг/мл

Контрольная (n = 13) 44,63±8,65 2532±602,50 2,92±0,11 6,40±1,13 17,93±3,01

1-я (I степень ожирения) (n = 52) 110,90±24,85 4606±618,50 2,38±0,52 6,92±1,04 24,73±3,88

2-я (II степень ожирения) (n = 53) 126,30±25,90 8279±636,90 4,44±1,04 9,09±1,25 35,44±13,36

3-я (III степень ожирения) (n = 75) 148±11,62 9569±760,90 16,55±13,15 10,22±1,20 36,88±6,45

Pl-к < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05

Р2-к < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05

Рз-к < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,001 < 0,05

CRP исследовали методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов фирмы eBioscience (Австрия) на спектрафотометре Tecan (Австрия).

Для выделения ДНК использовали набор "Проба-Рапид-Генетика" фирмы "ДНК-Технология" (Россия).

Анализ полиморфных вариантов Ser447Ter гена LPL, Cys112Arg (Е4) и Arg158Cys (Е2) гена ApoE проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при использовании детектирующего амплификатора ДТ-96, амплификатора "Терцик" и детектора "Джин" фирмы "ДНК-Технология" (Россия) с наборами для ДНК диагностики, разработанными ФГУП "Научно-исследовательский институт ГосГенетика".

Обработку результатов осуществляли с помощью пакета статистических программ SPSS (США) для персонального компьютера. В связи с тем что центральные тенденции и дисперсии имели нормальное распределение, при анализе определяли средние значения признака (M), стандартные ошибки среднего (m), среднеквадратичные отклонения (а). Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Стьюдента для независимых и связанных выборок при значениях вероятностиp < 0,05. Различия групп считали статистически значимыми при p < 0,05 или высокозначимыми при p < 0,01. Исследование являлось открытым, проспективным.

Результаты и обсуждение. Как показали результаты проведенного исследования цитокинового статуса, больные ожирением имели изменения в содержании провоспалитель-ных цитокинов и адгезивных молекул (табл. 1).

Так, при I степени ожирения отметили статистически достоверное (p < 0,05) повышение концентрации ФНОа, CRP и адгезивных молекул sICAM в сыворотке крови по сравнению с таковым в контрольной группе.

У больных со II и III степенью ожирения содержание ИЛ-1а, ИЛ-6, ФНОа, CRP и адгезивных молекул sICAM было статистически значимо выше, чем в контроле (p < 0,05).

При анализе исследованных показателей выявленные изменения носили неоднозначный характер. Если повышение концентрации ФНОа, CRP и адгезивных молекул sICAM зависело от ИМТ, то повышение синтеза ИЛ-1а и ИЛ-6 зафиксировали у пациентов со II степенью и особенно с III степенью ожирения.

Важной особенностью следует считать тот факт, что уже при I степени ожирения у пациентов отметили активацию межклеточной адгезии на ранней стадии воспалительной реакции при участии ФНОа и молекул sICAM, по-видимому, за счет участия макрофагов и адипоцитов.

Таким образом, увеличение ИМТ у пациентов с ожирением вызывало гиперпродукцию ИЛ-1а и ИЛ-6, что косвенным образом свидетельствовало об активации Т- и В-лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток.

В ходе генотипирования установили частоту встречаемости аллелей е2, е3, е4 гена ApoE и полиморфного маркера

Таблица 1 Ser447Ter гена LPL у больных ожирением (табл. 2).

Фактическая гетерозиготность исследуемой выборки по аллелю е2 гена ApoE не отличалась от ожидаемой, в то время как гетерозиготность по аллелю е4 была выше ожидаемой при условии выполнения закона Харди-Вайнберга.

Распределение полиморфных вариантов гена LPL в исследуемой выборке показало существенное снижение фактической гетерозиготности.

При изучении распределения полиморфного маркера Ser447Ter гена LPL обнаружили, что частота его встречаемости у пациентов с ожирением выше, чем у практически здоровых лиц (p < 0,05). У больных с III степенью ожирения аллельный полиморфизм Ser447Ter выявляли существенно чаще, чем в контрольной группе.

Известно, что полиморфизм Ser447Ter гена LPL фено-типически реализуется в виде активной изоформы LPL, обладающей высокой скоростью гидролиза триглицеридов до глицерина и свободных жирных кислот с последующим депонированием их в подкожную жировую клетчатку, что рассматривается как неблагоприятный фактор для развития ожирения [8].

При проведении сравнительного анализа полиморфных вариантов гена ApoE установили, что частота встречаемости полиморфного варианта е2/е2 имела тенденцию к снижению по мере увеличения ИМТ, в то время как большую частоту обнаружения генотипов е4/е3 и е2/е4 отметили у больных с III

Таблица 2

Распределение частоты генотипов Ser447Ter гена LPL и г4 и г2 гена АроЕ у обследованных пациентов

Аллель/ Частота алле- Н obs Н exp Частота аллеля в

генотип ля/генотипа популяции

ApoE E3 ^ E2

Е3 0,7833

Е2 0,2167 0,07*

Е3Е3 0,6833 0,2000 0,2000

Е2Е3 0,2000

Е2Е2 0,1167 ApoE E3 ^ E4

Е3 0,8722

Е4 0,1278 0,05*

Е3Е3 0,7444 0,2556 0,2000

Е4Е3 0,2556

Е4Е4 0

Ser447Ser ^ Ser447Ter

S 0,9444

T 0,0556 0,121**

SS 0,8889 0,1111 0,2000

ST 0,1111

TT 0

Примечание. Н exp - гетерозиготность, ожидаемая при выполнении равновесия Харди-Вайнберга в популяции; Н obs - фактическая гетерозиготность у обследованных пациентов; * - "The Genetic Basis of Common Diseases" J. Rotter, R. King; ** - по материалам базы данных Alfred Национального научного фонда США.

Таблица 3

Распределение частоты аллельных полиморфизмов Ser447Ter гена LPL и г4 и г2 гена ApoE у больных ожирением в зависимости от ИМТ

Группа пациентов

Генотип

Ser447Ter/Wt

Е3/Е3

Е2/Е3

Е2/Е2

Е4/Е3

Е2/Е4

Контроль

1-я

2-я

3-я (III степень ожирения) (n = 75) 9 (12) 24 (30,7) 11 (14,6) 5 (6,7) 18 (24) 9 (12) p1-K < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 p, < 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,05 > 0,05 > 0,05 pq < 0,01 < 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,01

Примечание. В скобках указан процент.

Таблица 4

Содержание цитокинов и молекул адгезии при полиморфных вариантах Ser/Ter гена LPL, г4 и г2 гена ApoE у больных ожирением

Генотип sICAM, нг/мл CRP, нг/мл ИЛ-6, пг/мл ИЛ-1а, пг/мл ФНОа, пг/мл

1. Е3/Е3 (n = 81) 61,91±6,628 6661±604,5 3,20±0,44 7,79±0,82 7,98±0,77

2. Е2/Е3 (n = 28) 79,9±13,21 6518±780,3 2,81±0,68 6,34±1,32 25,43±7,33

3. Е2/Е2 (n = 18) 90,6±20,67 6270±784,1 2,33±1,08 6,22±1,13 30,43±1,49

4. Е4/Е3 (n = 30) 117,1±19,97 6120±159,1 3,95±0,87 8,64±1,93 23,35±8,68

5. Е2/Е4 (n = 15) 133,5±46,4 7765±841,8 14,14±0,72 5,58±1,70 21,93±13,04

6. Ser447Ter/Wt 161,2±32,57 5244±169,6 121,1±118,6 7,95±3,22 83,74±72,09

Контроль 44,63±8,65 3411±945,8 2,92±0,11 8,33±1,62 17,93±3,01

Pk-1 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

P^2 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

p*-3 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05

P,<-4 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

P,<-5 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

P,<-6 < 0,05 < 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05

p1-2 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Л-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05

Л-4 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Л-5 < 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05

Л-6 < 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05

степенью ожирения (p < 0,05) (табл. 3). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что полиморфный маркер е4 гена АроЕ связан с развитием морбидного ожирения [9, 10].

При анализе цитокинового статуса у больных ожирением с различными генотипами выявили, что содержание адгезивных молекул sICAM было статистически достоверно выше у носителей всех полиморфных маркеров, чем у относительно здоровых лиц

Концентрация CRP была достоверно выше во всех исследованных группах больных ожирением по сравнению с таковой в контроле. Однако достоверных различий в содержании CRP у больных ожирением, носителей различных генотипов, не обнаружили.

При исследовании характера взаимосвязи между уровнем ИЛ-6 и аллельным полиморфизмом выявили достоверные различия у носителей аллеля Ser447Ter гена LPL и полиморфного варианта е4 гена АроЕ по сравнению с таковыми в контрольной группе (p < 0,05) и у носителей генотипа е3/е3 (p < 0,05).

Установили, что содержание ФНОа достоверно выше у носителей гомозиготного генотипа е2/е2 гена АроЕ и аллельного

полиморфизма Ser447Ter гена LPL, чем у относительно здоровых лиц (p < 0,05).

Принципиально важными следует считать выявленные особенности цитокинового статуса у больных ожирением при различным генотипах. Так, при гомозиготном генотипе е2/е2 гена АроЕ наряду с содержанием молекул адгезии sICAM и CRP существенно повышается концентрация ФНОа, а у носителей аллельного варианта е4 гена АроЕ также статистически достоверно возрастает уровень ИЛ-6. Цитокиновый профиль носителей аллельного варианта Ser447Ter гена LPL характеризовался повышением содержания как sICAM, CRP, ИЛ-6, так и ФНОа.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что влияние генома или его полиморфных вариантов на метабо-лом и протеом, в частности на синтез цитокинов, у больных ожирением - это взаимосвязанный и взаимообусловленный процесс. С одной стороны, геном определяет фенотипи-ческие особенности обменных процессов, в частности обмен липидов. С другой - гиперпродукция цитокинов усугубляет имеющиеся изменения метаболизма за счет формирования инсулинорезистентности через активацию высвобождения глюкозы и липидов и других механизмов. В связи с этим представляется перспективным использовать данные генетических исследований полиморфных вариантов Ser447Ter гена LPL, Cys112Arg (Е4) и Arg158Cys (Е2) гена АроЕ, что позволит прогнозировать выраженность изменений цитокинового статуса у больных ожирением.

Выводы. 1. Изменения цитокинового статуса у больных ожирением зависят от ИМТ.

2. Маркеры аллельного полиморфизма гена АроЕ и LPL можно использовать в оценке цитокинового статуса у больных ожирением.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гусова З.Р., Сизякина Л.П., Воробьев С.В. Сравнительный анализ клинико-иммунологических особенностей больных с избыточной массой тела и морбидным ожирением. Цитокины и воспаление. 2012; 11 (4): 56-61.

2. Шварц В. Жировая ткань как орган иммунной системы. Цитокины и воспаление. 2009; 8 (4): 3-10.

3. Беляева И.Г., Грицаенко Г.А., Терегулова А.М. и др. Субклиническое воспаление и цитокиновый статус у больных артериальной гипертонией с метаболическими факторами риска. Цитокины и воспаление. 2012; 6: 10-3.

4. Гусова З.Р., Сизякина Л.П., Алексеева А.А. Клинико-иммунологическая характеристика больных с различной степенью ожирения. Иммунология. 2012; 33 (3): 155-8.

5. Шварц В. Воспаление жировой ткани (часть 1). Морфологические и функциональные проявления. Проблемы эндокринологии. 2009; 55 (4): 44-9.

6. Шварц В. Воспаление жировой ткани: враг или друг? Цитокины и воспаление. 2013; 12 (1): 13-21.

7. Davies B.S.J., Beigneux A.P., Fong L.G. et al. New wrinkles in lipoprotein lipase biology. Curr. Opin. Lipidol. 2012; 1 (23): 35-42.

8. Liu H.W., Zhang F., Fan P. et al. Effects of apolipoprotein E genotypes on metabolic profile and oxidative stress in south-west Chinese women with polycystic ovary syndrome. Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 2013; 170 (1): 146-51.

9. El-Sayed M.J.S., Froguel P. From obesity genetics to the future of personalized obesity therapy. Nat. Rev. Endocrinol. 2013; 9 (7): 402-13.

10. Колчанов Н.А., Воевода М.И., Кузнецова Т.Н. и др. Генные сети липидного метаболизма. Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2006; 120 (2): 29-42.

11. Lee M.J., Chien K.L., Chen M.F. et al. Overweight modulates APOE and APoA5 alleles on the risk of severe hypertriglyceridemia. Clin. Chim. Acta. 2013; 416: 31-5.

12. Lee D.J., Kim K.M., Kim B.T. et al. ApoE polymorphism may determine low-density lipoprotein cholesterol level in association with obesity and metabolic syndrome in postmenopausal korean women. YonseiMed. J. 2011; 52 (3): 429-34.

Поступила 18.12.13

REFERENCES

1. Gusova Z.R., Sizyakina L.P., Vorob'ev S.V. Comparative analysis of clinical and immunological characteristics of patients with overweight and morbid obesity Tsitokiny i vospaleniye. 2012; 11

2. Shvarts V. Adipose tissue as an organ of the immune system. Tsitokiny i vospaleniye. 2009; 8

3. Belyaeva I.G., Gricaenko G.A., Teregulova A.M. et al. Subclinical inflammation and cytokine status in patients with arterial hypertension with metabolic risk factors. Tsitokiny i vospaleniye. 2012; 6: 10-3.

4. Gusova Z.R., Sizjakina L.P., Alekseeva A.A. Clinical and immunological characteristics of patients with various degrees of obesity. Im-munologiya. 2012; 33

5. Shvarts v. century adipose tissue Inflammation

6. Shvarts V. Adipose tissue Inflammation: enemy or friend? Tsitokiny i vospalenie. 2013; 12

7. Davies B.S.J., Beigneux A.P., Fong L.G. et al. New wrinkles in lipoprotein lipase biology. Curr. Opin. Lipidol. 2012; 1 (23): 35-42.

8. Liu H.W., Zhang F., Fan P. et al. Effects of apolipoprotein E genotypes on metabolic profile and oxidative stress in south-west Chinese women with polycystic ovary syndrome. Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 2013; 170 (1): 146-51.

9. El-Sayed M.J.S., Froguel P. From obesity genetics to the future of personalized obesity therapy. Nat. Rev. Endocrinol. 2013; 9 (7): 402-13.

10. Kolchanov N.A., Voevoda M.I., Kuznetsova T.N. et al. Gennye seti lipidnogo metabolizma. Bylleten' Sibirskogo otdeleniya RAMN. 2006; 120 (2): 29-42.

11. Lee M.J., Chien K.L., Chen M.F. et al. Overweight modulates APOE and APoA5 alleles on the risk of severe hypertriglyceridemia. Clin. Chim. Acta. 2013; 416: 31-5.

12. Lee D.J., Kim K.M., Kim B.T. et al. ApoE polymorphism may determine low-density lipoprotein cholesterol level in association with obesity and metabolic syndrome in postmenopausal korean women. YonseiMed. J. 2011; 52 (3): 429-34.

Received 18.12.13

© коллектив авторов, 2014 удк 612.6.02.017.1:615.38].083.33

Баратова Д.А. 1-2, Джапаркулова А.Д.3-2, Нурлыханов Е.Б.4-2, Баратова М.А.5

ИММУнОГЕнЕтИЧЕсКАЯ характеристика I И II классов аллелей HLA-главного комплекса гистосовместимости у потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток

1НМу «Евразийский центр онкогематологии, иммунологии и терапии», 195197, г. Санкт- Петербург; 2МОО «Национальный регистр гемопоэтических стволовых клеток Киргизии в Санкт-Петербурге», 195197, г. Санкт-Петербург; 3ГУ «Национальный госпиталь при Министерстве здравоохранения Киргизской Республики», 720040, г. Бишкек, Республика Киргизия; 4ГУ «Областная клиническая больница» , 160011, г Шымкент, Республика Киргизия; 5АО «Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи», 010000, г Астана, Республика Казахстан

В статье представлены сравнительные результаты исследований иммуногенетических характеристик доноров киргизской национальности относительно частоты встречаемости генов у здоровых доноров Северо-западного региона Российской Федерации из Российского регистра доноров костного мозга. При сопоставлении комплексными лабораторными методами генов Н1_А - локуса А и В и Н1_А - локуса DRB1* выявлены значимые Н1_А-маркеры у представителей киргизской национальности. Типирование впервые проводили по системе Н1.А-1 и II классов у здоровых доноров киргизской национальности, которое на современном этапе имеет практическое значение при планировании неродственной, близкородственной трансплантации костного мозга в лечении онкогематологиче-ских заболеваний.

На сегодняшний день далеко не для всех этнических групп можно найти совместимый костный мозг С этой целью крайне важно выявление иммуноселективными методами доноров по антигенам комплекса Н1.А- аллелей I и II класса, где идентичность костного мозга донора и больного свидетельствует об их полной совместимости. Таким образом, выявленные маркеры, характерные для представителей киргизской национальности в сопоставлении с контрольной популяционной группой, позволят своевременно выбрать лечение и подбор потенциальных доноров костного мозга.

Ключевые слова: гемопоэтические клетки, HLA, множественная миелома, доноры, представители киргизской национальности.