СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ В КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ И ВОДЕ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Способ дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций, характеризующийся выявлением и идентификацией в клинических образцах и элюатах, полученных в результате концентрирования из воды, одиннадцати групп кишечных вирусов: энтеровирусов (ЭВ), полиовирусов (ПВ), ротавирусов А и С (РВА и РВС соответственно), аденовирусов (АДВ), норовирусов (НВ), саповирусов (СВ), вирусов гепатита А и Е (ВГА и ВГЕ соответственно), астровирусов (АВ), ортореовирусов (ОРВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК), предусматривающий проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с детекцией в режиме реального времени, причем в качестве клинических образцов используют по выбору: 10-20% фекальные экстракты, образцы культуральной жидкости, элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из образцов сточной, водопроводной, речной воды и воды из других источников, отличающийся тем, что для его осуществления используют олигонуклеотиды - SEQ ID NO 1-61 на основе которых готовят смеси праймеров, зондов для проведения ПЦР-РВ; затем с использованием подобранных праймеров и зондов формируют реакционные смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ, в которых олигонуклеотиды распределены по реакционным смесям следующим образом: смесь №1: SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12; смесь №2: SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27; смесь №3: SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46; смесь №4: SEQ ID NO 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54; смесь №5: SEQ ID NO 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, причем флуоресцентномеченные зонды распределяют по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями в соответствии с таблицей:
Краситель
Реакционная смесь
№1
№2
№3
№4
№5
FAM
АДВ
РВА
СВ
-
-
ROX
ЭВ
НВ
-
-
ПВ
R6G
ВПК
АВ
ОРВ
ВГЕ
-
Cy5
-
-
РВС
ВГА
-
затем проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР-РВ (каждый образец анализируется в четырех реакционных смесях); наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного кишечного вируса определяют ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей; причем при проведении анализа проводят ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, для чего формируют пулы положительных контрольных образцов (ПКО), которые, наряду с внутренним положительным контролем (ВПК), анализируются при анализе каждой серии образцов, а в состав пулов положительных контролей входят нуклеиновые кислоты кишечных вирусов или РНК-транскрипты фрагментов геномов кишечных вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле; образец анализируют повторно в том случае, когда при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки при выделении РНК или постановке реакции.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждый вирусспецифический набор праймеров и зондов используют для выявления в образцах нуклеиновых кислот соответствующих вирусов в моноспецифическом формате, в том числе для выявления аденовирусов - SEQ ID NO 1, 2, 3, 4; энтеровирусов - SEQ ID NO 5, 6, 7, 8; ротавирусов А - SEQ ID NO 13, 14, 15, 16, 17; норовирусов - SEQ ID NO 18, 19, 20, 21, 22, 23; астровирусов - SEQ ID NO 24, 25, 26, 27; саповирусов - SEQ ID NO 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35; ортореовирусов - SEQ ID NO 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43; ротавирусов С - SEQ ID NO 44, 45, 46; вируса гепатита Е - SEQ ID NO 47, 48, 49, 50; вируса гепатита А - SEQ ID NO 51, 52, 53, 54; полиовирусов - SEQ ID NO 55, 56, 57; 58, 59, 60, 61.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в качестве которого используют дистиллированную воду.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что анализ предусматривает выявление внутреннего положительного контроля (ВПК), представленного РНК-содержащим вирусом или РНК-транскриптом фрагмента генома вируса с целью контроля эффективности и качества выделения нуклеиновых кислот, в том числе для выявления в образце ингибиторов реакций обратной транскрипции и ПЦР-РВ, и для исключения ложноотрицательных результатов.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исключения ложноотрицательных результатов анализ предусматривает выявление для каждой ПЦР-смеси соответствующего пула положительных контрольных образцов (ПКО), представляющего собой смесь нуклеиновых кислот кишечных вирусов или РНК-транскриптов фрагментов геномов кишечных вирусов, разведенных и смешанных в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 25-30 цикле.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что при анализе образцов в реакционных смесях №1 и №5, проводят дифференциальное выявление энтеровирусов и полиовирусов.
7. Набор для осуществления способа дифференциальной диагностики кишечных вирусных инфекций по п.1 включает праймеры и зонды для мультиплексной ПЦР-РВ со следующими нуклеотидными последовательностями:
5'-3'
SEQ ID NO 1
CTCCAGCAACTTCATGTCYATGGG
SEQ ID NO 2
CACTCTGACCACGTCGAARACTTC
SEQ ID NO 3
CGCACRACGTCGAAAACTTC
SEQ ID NO 4
FAM-AGGGTGGGCTCRTCCATGGGRTCCA-BHQ1
SEQ ID NO 5
GGATGGCCAATCCA
SEQ ID NO 6
CTCCGGCCCCTGAAT
SEQ ID NO 7
RATTGTCACCATAAGCAGCC
SEQ ID NO 8
R6G-GCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCG-BHQ1
SEQ ID NO 9
CAGGACTATGAAAACCATTTAC
SEQ ID NO 10
AAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC
SEQ ID NO 11
TGCAGGATTGATTGTGGC
SEQ ID NO 12
ROX-CTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTC-BHQ2
SEQ ID NO 13
AWGGAAAATACGCCAT
SEQ ID NO 14
CTGTTCCGAGAGAGCGC
SEQ ID NO 15
GGAAAATACGCCATTCCWGG
SEQ ID NO 16
FAM-CGGAAAGATGGAWAAGCTTGCCGACC-BHQ1
SEQ ID NO 17
FAM-CGGAAAGATGGAAAAGTTTACCGACC-BHQ1
SEQ ID NO 18
CAATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTC
SEQ ID NO 19
ATGTTCCGCTGGATGCG
SEQ ID NO 20
TCGACGCCATCTTCATTCAC
SEQ ID NO 21
TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC
SEQ ID NO 22
R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ1
SEQ ID NO 23
R6G-GAGATCGCRATCTCCTGCCCGA-BHQ1
SEQ ID NO 24
CTAGCCATCACACTYCTTT
SEQ ID NO 25
GTTGCTTGCTGCGTTCATG
SEQ ID NO 26
CTAGCCATCACACTYCTTTGGTCC
SEQ ID NO 27
ROX-CTCACAGAAGAGCAACTCCATCGCATTTG-BHQ2
SEQ ID NO 28
CAACAGCCARCTCCA
SEQ ID NO 29
CCATTGCAAGTTCCA
SEQ ID NO 30
AATGTSAACTAYGACCAGGCT
SEQ ID NO 31
AACACCAACTATGACCAGGC
SEQ ID NO 32
RAATACAAATTTTGATTTGGCC
SEQ ID NO 33
CCCTCCATYTCAAACACTAWTTTG
SEQ ID NO 34
FAM-TYGTAGGTGGCGAGAGCCTGG-BHQ1
SEQ ID NO 35
FAM-TTGTAGGTGGCGAGGGCCAAA-BHQ1
SEQ ID NO 36
ATGACTGCGACTGGAG
SEQ ID NO 37
ATGACGGCGACTG
SEQ ID NO 38
ATGACTGCGACTGGAGTTGC
SEQ ID NO 39
ATGACGGCGACTGGG
SEQ ID NO 40
GATGAGTTGACGCACCACG
SEQ ID NO 41
GATGAATTAACGTACGACAGCC
SEQ ID NO 42
ROX-ACGGTCAGCATGAGTCTACCGTGG-BHQ2
SEQ ID NO 43
ROX-ACGGTCAGCGTGAGTCTACCATGG-BHQ2
SEQ ID NO 44
GAAGCTGTCTGACAAACTGGTC
SEQ ID NO 45
GTATCAGTTATTAGGTGGAACATTTTTCTA
SEQ ID NO 46
Cy5-ATGGTTTGTACAACATTGTACACTGTTTGCG-BHQ3
SEQ ID NO 47
CGAYGCCATGGAGGCС
SEQ ID NO 48
CTGCCGGGGYTGCAT
SEQ ID NO 49
AGCTGSCGAGGTTGCAT
SEQ ID NO 50
ROX-ACYACCACAGCATTCGCCAAGGCGGA-BHQ2
SEQ ID NO 51
ATTGCATCATTTGTTTTAGC
SEQ ID NO 52
GTGTCAGGATGYCCAATGAGA
SEQ ID NO 53
CGATCAATTGCTTCCTTAACATAAAC
SEQ ID NO 54
Cy5-GGAGARGAAAAATGYCTGCCCTTCTCCTCAAG-BHQ3
SEQ ID NO 55
AGAGAGATGGACATCCTBGG
SEQ ID NO 56
AAGAGTATGAGCATGCTGGG
SEQ ID NO 57
GAGTGTGCTGGWCCACTGG
SEQ ID NO 58
GAATGCGCCGGGCCACT
SEQ ID NO 59
GARTGGGCTGGACCRCT
SEQ ID NO 60
R6G-CGCACRCTGAARTCATTACACGCTGACAC-BHQ1
SEQ ID NO 61
R6G-CGCACGCTGAAATCGTTACAYGCTGACAC-BHQ1
Пояснения:
FAM, ROX, R6G, Cy5 - флуоресцентные красители; BHQ1, BHQ2, BHQ3 - гасители флуоресценции; R - А или G, Y - С или Т, S - G или C, W - T или A, B - C, G и T.