СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ
WAY OF DIAGNOSTICS OF MALE STERILITY

Область применения: предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике.
Уровень техники
Аналогами данного изобретения являются описанные в отечественной и зарубежной литературе методы лабораторного исследования, имеющие своей целью диагностику мужского бесплодия.
1. Определение сывороточной концентрации ингибина В. Клинические исследования свидетельствуют о корреляции концентрации ингибина В с активностью сперматогенеза, что позволяет использовать его в качестве маркера локальных нарушений сперматогенеза (1,4).
2. Метод исследования повреждений ДНК сперматозоидов с применением красителя акридинового оранжевого (SCSA). Кроме индекса фрагментации ДНК метод позволяет определять процент сперматозоидов с незрелым ядром, обозначающийся как HDS. Не существует четкого референсного значения этого показателя: по данным разных авторов, нормальным считается значение HDS ниже 10% (5) либо ниже 15% (6).
Недостатком перечисленных методов является диагностика бесплодия у мужчин всего лишь по одному показателю, не применяя комплексный подход, что может неадекватно отразиться на постановке диагноза.
Прототипом предложенного способа данного изобретения является патент на изобретение «Способ диагностики мужского бесплодия» (2). В названном способе, как и в предложенном нами, оценивается состояние хроматина сперматозоидов до и после обработки гепарином, окрашенных бромистым этидием. Однако в этом способе не используется определение концентрации ингибина В и статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых. Таким образом, данный способ диагностики мужского бесплодия основан на оценке всего лишь одного лабораторного показателя, что можно отнести к недостаткам способа.
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа диагностики бесплодия у мужчин с нормальными показателями спермограммы, основанного на выявлении нарушений сперматогенеза при углубленном лабораторном исследовании, включающего определение степени компактизации хроматина сперматозоидов и относительного содержания дефектных клеток в эякуляте, а также уровня ингибина В в сыворотке крови.
Способ осуществляют следующим образом: эякулят собирают методом мастурбации после 4-6 дневного полового воздержания, непосредственно в лаборатории, транспортировка материала из дома недопустима. Рекомендуется накануне исследования исключить воздействие токсических факторов (алкоголь, курение, наркотики), тяжелые физические нагрузки, гипертермические состояния (бытовые, производственные).
Забор крови проводят натощак, в утренние часы, методом венепункции в сухую чистую пробирку в количестве 5 мл.
Для определения степени компактизации хроматина сперматозоидов и уровня погибших, разрушенных клеток эякулят после разжижения помещают в две пробирки в количестве 100 мкл и добавляют 500 мкл трис-буфера. Затем пробирки центрифугируют в течение 10 минут при 2000 об/мин, после чего удаляют надосадочную жидкость. Далее осадок в обеих пробирках ресуспендируют в 250 мкл трис-буфера.
Затем в обе пробирки добавляют по 500 мкл детергента, содержащего тритон Х-100, и непрерывно встряхивают в течение 30 секунд. С целью насильственной деконденсации хроматина в одну из пробирок добавляют 50 мкл гепарина (5000 ед./мл) и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. После инкубации в обе пробирки вносят 1500 мкл цитратного буфера и 1 мкл этидия бромида. Через 5 минут проводят измерение флуоресценции ДНК сперматозоидов на проточном цитофлуориметре в красной области спектра (λ=620 нм), используя программу CELLQuest. Скорость сортировки составляет 300 клеток в секунду.
Степень компактизации хроматина сперматозоидов оценивают на основании сравнения гистограмм распределения клеток до и после насильственной деконденсации гепарином по уровню специфической флуоресценции, используя статистический метод Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия двух кривых n.
Относительное содержание дефектных клеток определяют по уровню неспецифической флуоресценции (М).
Определение концентрации ингибина В (IB) в сыворотке крови проводят согласно инструкциям фирм-производителей.
Для определения содержания ингибина В образцы пациентов и необходимое количество реагентов доводят до комнатной температуры и тщательно перемешивают перед проведением анализа. В лунки планшета с сорбированными анти-ингибин антителами вносят по 50 мкл стандартов, контролей, образцов пациентов. Затем в каждую лунку добавляют по 25 мкл разбавителя образцов А и по 25 мкл разбавителя образцов В и инкубируют в течение ночи (14-18 часов) при комнатной температуре. После окончания инкубации промывают лунки 3 раза деионизированной водой. Затем в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора биотинового коньюгата, содержащего биотинилированные анти-ингибин α-субъединица антитела, и инкубируют в течение 1,5 часов при комнатной температуре. После окончания инкубации промывают лунки промывочным буфером 6 раз и в каждую лунку добавляют по 50 мкл раствора стрептавидин-ферментного коньюгата, содержащего стрептавидиновые детектирующие антитела, меченые пероксидазой хрена. Инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Промывают лунки промывочным буфером 6 раз. По окончании инкубации процедуру отмывки повторяют, как описано выше. Добавляют по 100 мкл хромогенного раствора ТМБ в каждую лунку и инкубируют в течение 15-30 минут при комнатной температуре, после чего для остановки ферментной реакции добавляют по 100 мкл стоп-реагента. В течение 30 минут после добавления останавливающего раствора измеряют оптическую плотность при 450 нм. Измеренное поглощение прямо пропорционально концентрации присутствующего ингибина В.
Оптическую плотность образцов измеряют, используя иммуноферментный анализатор.
Для диагностики мужского бесплодия полученные значения показателей степени компактизации хроматина сперматозоидов (n) и относительного содержания погибших и разрушенных клеток (М), а также концентрацию ингибина В в сыворотке крови вводят в формулу, выведенную на основании математической обработки полученных данных методом дискриминантного анализа для расчета диагностического индекса (DI):
DI=n×0,037+М×(-0,014)+IB×0,005-2,402, где
n - степень компактизации хроматина сперматозоидов (усл. ед.);
М - относительное содержание дефектных клеток (%);
IB - концентрация ингибина В (пг/мл).
При DI менее 0 диагностируют нарушение сперматогенеза, определяющее бесплодие у мужчин (патология), а при DI более 0 делают заключение об отсутствии нарушений сперматогенеза (норма).
Предлагаемый способ дает вероятность правильной классификации (специфичность метода) - 93,3% для нормы, для патологии (информативность метода) - 81,4%. Эффективность метода 84,5%.
Пример 1. Пациент Лошаков проходил обследование по поводу бесплодного брака. При стандартном лабораторном исследовании эякулята основные показатели спермограммы (концентрация, подвижность, морфология) соответствовали значениям нормы. При углубленном исследовании показатель n составил - 29,3 усл. ед., что согласно нашему патенту (3) характеризует нарушение компактизации хроматина и незрелое состояние сперматозоидов (n<48,5), М - 82,4%, что превышает значение нормы и характеризует наличие в эякуляте большого количества дефектных клеток, концентрация ингибина В соответствовала физиологической норме - 281,6 пг/мл. По формуле определили значение диагностического индекса (DI): 29,3×0,037+82,4×(-0,014)+281,6×0,005-2,402=-1,06, что меньше нуля, а значит, у пациента имеются нарушения сперматогенеза, верифицирующие бесплодие. Проведено лечение, после которого получены следующие результаты: n - 43,1 усл. ед., М - 14,0%, IB - 290,0 пг/мл и рассчитанный по формуле DI=0,45, что больше нуля и указывает на отсутствие нарушений сперматогенеза и восстановление фертильности. В настоящее время супруга Лошакова беременна.
Пример 2. Пациент Саетов обратился в консультативное отделение по поводу бесплодного брака. При стандартном лабораторном исследовании эякулята основные показатели спермограммы (концентрация, подвижность, морфология) соответствовали значениям нормы. При углубленном исследовании показатель n составил - 55,44 усл. ед., что согласно нашему патенту (3) свидетельствует о зрелом состоянии сперматозоидов (n>48,5), М - 48,99%, что превышает допустимое для присутствия в эякуляте количество дефектных клеток, концентрация ингибина В соответствовала нижней границе физиологической нормы - 134,6 пг/мл. По формуле определили значение диагностического индекса (DI): 55,44×0,037+48,99×(-0,014)+134,6×0,005-2,402=-0,37, что меньше нуля, а значит, имеются нарушения сперматогенеза, верифицирующие бесплодие. После курса лечения получены следующие результаты: n - 54,0 усл. ед., М - 19,5%, IB - 210,0 пг/мл. Рассчитанный по формуле DI=0,37, что больше нуля и указывает на отсутствие нарушений сперматогенеза и восстановление фертильности. В настоящее время супруга Саетова беременна.
Пример 3. Пациент Софронов проходил обследование по поводу бесплодного брака. При стандартном лабораторном исследовании эякулята основные показатели спермограммы (концентрация, подвижность, морфология) соответствовали значениям нормы. При углубленном исследовании показатель n составил - 29,2 усл. ед., что согласно нашему патенту (3) характеризует нарушение компактизации хроматина и незрелое состояние сперматозоидов (n<48,5), М - 80,9%, что свидетельствует о присутствии в эякуляте дефектных клеток в количестве, большем, чем допустимая норма, концентрация ингибина В - 78,1 пг/мл (при норме 140-350 пг/мл). По формуле определили значение диагностического индекса (DI): 29,2×0,037+80,9×(-0,014)+78,1×0,005-2,402=-2,06, что меньше нуля, а значит, имеются нарушения сперматогенеза, верифицирующие бесплодие. Проведено лечение, после которого получены следующие результаты: n - 49,3 усл. ед., М - 62,1,5%, IB - 155,0 пг/мл и рассчитанный по формуле DI=-0,67, что меньше нуля и характеризует нарушения сперматогенеза. Назначен повторный курс лечения.
Таким образом, приведенные выше примеры наглядно демонстрируют, что только совокупность лабораторных показателей, характеризующих нарушение сперматогенеза, позволяет повысить точность диагностики бесплодия у мужчин с нормальными показателями спермограммы и своевременно решить вопрос о необходимости проведения терапевтической коррекции выявленных нарушений.
Источники информации
1. Долгов В.В. Лабораторная диагностика мужского бесплодия. / В.В.Долгов, С.А.Луговская, Н.Д.Фанченко, И.И.Миронова, Е.К.Назарова, Н.Г.Ракова, С.С.Раков, Т.О.Селиванов, A.M.Щелочков. // Москва, 2006.
2. Способ диагностики мужского бесплодия. Патент на изобретение №2118822. (Авторы: Филатов М.В., Воробьева О.А., Семенова Е.В., Леонтьева О.А.).
3. Способ определения зрелости сперматозоидов. Патент на изобретение №2262107. (Авторы: Чистякова Г.Н., Беломестнов С.Р., Тарасова М.Н.).
4. Bradley D. Anawalt, Richard A. Bebb, Alvin М. Matsumoto, Nigel P. Groome, Peter J. Illingworth, Alan S. Mcnelly and William J. Bremner. Semm Inhibin В Levels Reflect Sertoli Cell Function in Normal Men and Men with Testicular Dysfunction. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 1996. VoL81, №9. 3341-3345.
5. Bungum M., Humaidan P., Jepson K., Bungum L., Giwercman A. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Human Reproduction Vol.19, №6, pp.1401-1408, 2004.
6. Schlegel P.N., Paduch D.A. Yet another test of sperm chromatin structure. Fertil Steril 2005; 84: 4: 854-859.