МИКРОБНЫЕ КОНСОРЦИУМЫ
MICROBIAL CONSORTIA

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки № США 62/126323, поданной 27 февраля 2015 года, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к микробным консорциумам и способам применения микробов, включенных в консорциумы, в частности, для биодеградации и сельскохозяйственных способов и применений.
Сведения о предшествующем уровне техники
Мировой спрос на продовольствие продолжает расти под давлением роста населения. Однако сельскохозяйственные работники среди других проблем сталкиваются с сокращением количества земли, доступной для сельского хозяйства, истощением почвы и изменением условий окружающей среды. Таким образом, существует потребность в разработке композиций и методов, которые могут увеличить производство продуктов питания, а также уменьшить использование потенциально опасных гербицидов, инсектицидов и фунгицидов.
Краткое описание изобретения
В настоящем документе предлагаются микробные консорциумы и композиции, включающие микробы, для применения в сельском хозяйстве или способах биодеградации. В некоторых вариантах осуществления микробная композиция согласно настоящему изобретению представляет собой микробный консорциум, депонированный в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA) 25 ноября 2014 года под номером доступа PTA-121750 (также называемый здесь как А1001), или композицию, включающую некоторые или все из микробов, содержащихся в А1001. В других вариантах осуществления композиция согласно настоящему изобретению включает микробы из пяти или более видов микробов, выбранных из Bacillus spp., Azospirillum spp., Pseudomonas spp., Lactobacillus spp., Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp. Ruminococcus spp., Aquabacterium spp., Leptolyngbya spp., Leptospirillum spp., Paenibacillus spp., Microcoleus spp., Clostridium spp., Xenococcus spp., Acetobacter spp., Candidatus spp. и Methanosaeta spp. В дополнительных вариантах осуществления композиция включает микробы из пяти или более (например, 5, 10, 15, 20 или более) видов микробов, указанных в таблице 1. Описанные композиции могут также содержать дополнительные компоненты, включая, но без ограничения, один или несколько дополнительных видов микробов, хитин, хитозан, глюкозамин и/или аминокислоты.
Также, предлагаются сельскохозяйственные применения раскрытых микробных консорциумов или композиций. В некоторых вариантах осуществления способы (применения) включают приведение в контакт почвы, растений и/или частей растений (таких как семена, саженцы, побеги, листья, стебли или ветви) с раскрытым микробным консорциумом (таким как А1001), композицией, включающей некоторые или все из микробов, содержащихся в А1001, или композицией, включающей пять или более из видов микробов, указанных в таблице 1. Микробные консорциумы или содержащие микробы композиции можно применять к почве, растениям и/или частям растений отдельно или в комбинации с дополнительными компонентами (такими как дополнительные микробы, хитин, хитозан, глюкозамин, аминокислоты и/или добавки в почву или удобрение, такое как жидкое удобрение).
В дополнительных вариантах осуществления раскрытые микробные консорциумы или композиции, включающие микробы, применяют в способах деградации биологических материалов, таких как хитинсодержащие биологические материалы. В некоторых примерах хитинсодержащие материалы смешивают с микробным консорциумом (таким как А1001) или композицией, включающей пять или более из видов микробов, указанных в таблице 1, и ферментируют с получением ферментированной смеси. Ферментированная смесь необязательно может быть разделена на твердую и жидкую фракции. Ферментированную смесь или полученные из нее фракции можно использовать в сельскохозяйственных применениях в комбинации с раскрытыми микробными консорциумами или композициями, или можно использовать в других способах деградации, например, для получения повышенных уровней содержания продуктов деградации во фракциях.
Вышеуказанные и иные признаки изобретения станут более очевидными из следующего далее подробного описания, которое представлено со ссылкой на сопровождающие чертежи.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 показано схематическое изображение иллюстративного способа ферментации, используемого для получения микробного консорциума А1001.
На фигуре 2 показано схематическое изображение иллюстративного способа биодеградации хитинсодержащего биологического материала (например, отходов креветок) с помощью раскрытого микробного консорциума или микробной композиции.
На фигуре 3 показано схематическое изображение иллюстративного способа биодеградации хитина с помощью раскрытого микробного консорциума или микробной композиции (такого как А1001).
На фигурах 4А-4G представлены графики, показывающие эффект на урожай обработки зерновых культур микробной композицией (фигуры 4А-4С и 4Е), HYTb (фигуры 4D и 4F) или микробной композицией в условиях дефицита воды (фигура 4G).
На фигурах 5A-5D показан эффект на урожай обработки пшеницы микробной композицией (фигуры 5А-5В) или микробной композицией плюс HYTb (фигура 5С). Фигура 5D представляет собой цифровое изображение корней растений пшеницы, обработанных микробной композицией плюс HYTb (тестируемые) по сравнению с контрольными растениями.
На фигурах 6А-6Е представлены серии графиков, показывающие эффект на урожай обработки томатов микробной композицией.
На фигуре 7 представлен график, показывающий эффект на урожай обработки подсолнечника микробной композицией.
На фигуре 8 представлен график, показывающий эффект на урожай обработки риса микробной композицией.
На фигурах 9А-9В показан эффект на урожай обработки сои микробной композицией (фигура 9А) или микробной композицией плюс HYTb (фигура 9В).
На фигуре 10 представлен график, показывающий эффект на урожай обработки клубники микробной композицией плюс HYTb.
На фигуре 11 представлен график, показывающий эффект на урожай обработки свеклы микробной композицией плюс HYTb.
На фигурах 12А и 12В представлены графики, показывающие эффект на урожай обработки белокочанной капусты микробной композицией плюс HYTb в двух испытаниях (фигуры 12А и 12В, соответственно).
На фигуре 13 представлен график, на котором представлен анализ силы роста огурцов, показывающий индекс листовой поверхности первого листа на день 18 у растений, обработанных HYTa (A1001). *p<0,001 с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA.
Список последовательностей
Любые последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот, перечисленные в настоящем документе или в прилагаемом списке последовательностей, приведены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и аминокислот, как определено в 37 C.F.R. § 1.822. По меньшей мере в некоторых случаях показана только одна нить каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но включение комплементарной нити подразумевается в виде любой ссылки на представленную нить.
SEQ ID NO: 1 и 2 представляют собой прямой и обратный праймеры, соответственно, используемые для амплификации 16S rDNA из A1001.
Подробное описание изобретения
В природе баланс видов микробов в почве зависит от типа почвы, плодородия почвы, влажности, конкурирующих микробов и растений (Lakshmanan et al., Plant Physiol. 166:689-700 2014). Дополнительно, на взаимодействие между видами микробов и растениями оказывают влияние агрономические приемы, которые могут улучшать или ухудшать микробиом почвы (Adair et al., Environ Microbiol Rep. 5:404-413 2013; Carbonetto et al., PLoS One 9:e99949 2014; Ikeda et al., Microbes Environ. 29:50-59 2014). Плодородные или высокопродуктивные почвы содержат композицию нативных микробов, которая отличается от композиции, содержащейся в почве, истощенной питательными веществами и связанной с низкой урожайностью сельскохозяйственных культур. Различные виды микробов тесно связаны с растениями на надземных поверхностях растений в филлосфере, на поверхности корней в ризосфере почвы или непосредственно в виде эндофитов. Крупномасштабный анализ ДНК этих микробных сообществ выявил неожиданную филогенетическую сложность (Rincon-Florez et al., Diversity 5:581-612 2013; Lakshmanan et al., Plant Physiol. 166:689-700 2014). Исследования показали, что сложные микробиомы могут быть связаны с продуктивностью растений, урожайностью, устойчивостью к стрессу, накоплением вторичных метаболитов и иммунностью к болезням (Bhardwaj et al., Microbial Cell Factories 13:66-75, 2014; Vacheron et al., Frontiers Plant Science 4:1-19 2014). Дополнительно, растения могут осуществлять специфический отбор микробных смесей из местной окружающей среды и потенциально тонко регулировать микробиом на уровне сортов сельскохозяйственных культур (Hartmann et al., Plant Soil 321:235-257 2009; Doornbos et al., Agron. Sustain. Dev. 32:227-243 2012; Marasco et al., PLoS One 7:e48479 2012; Peiffer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:6548-6553; Bulgarelli et al., Ann. Rev. Plant Biol. 64:807-838 2014).
Связанные с корнями микробы могут способствовать росту растений и корней путем стимулирования круговорота и поступления питательных веществ, путем прямой фитостимуляции, путем опосредования биологической подкормки или путем обеспечения преимуществ для роста посредством биологического контроля патогенов. Полезные с точки зрения сельского хозяйства популяции включают ризобактерии, способствующие росту растений (PGPR), подавляющие активность патогенов бактерии - микоризы, азотфиксирующие цианобактерии, повышающие устойчивость к стрессу эндофиты, а также микробы, обладающие рядом способностей к биодеградации. Микробы, участвующие в круговороте азота, включают азотфиксирующие бактерии родов Azotobacter и Bradyrhizobium, азотфиксирующие цианобактерии, окисляющие аммиак бактерии (например, родов Nitrosomonas и Nitrospira), нитрит-окисляющие бактерии, например, родов Nitrospira и Nitrobacter, и гетеротрофные денитрифицирующие бактерии (например, родов Pseudomonas и Azospirillum; Isobe and Ohte, Microbes Environ. 29:4-16 2014). Бактерии, которые согласно сообщениям являются активными в отношении солюбилизации и увеличения доступности фосфора для растений, включают Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus и Flavobacterium, плюс ряд родов грибов (Pindi et al., J. Biofertil. Biopest. 3:4 2012), в то время как виды Bacillus и Clostridium способствуют солюбилизации и мобилизации калия (Mohammadi et al., J. Agric. Biol. Sci. 7:307-316 2012). Фитостимуляция роста растений и ослабление биотического и абиотического стрессов осуществляется многочисленными сообществами бактерий и грибов напрямую посредством выработки стимулирующих вторичных метаболитов или опосредованно путем индукции на низком уровне защитных реакций у растений (Gaiero et al., Amer. J. Bot. 100:1738-1750 2013; Bhardwaj et al., Microbial Cell Factories 13:66-76 2014).
Дополнительно к активности в окружающей среде микробы могут также обеспечивать уникальные свойства биодеградации in vitro в условиях направленной ферментации. Применение специфических микробных смесей для разложения хитина и общего белка может обеспечить получение новых биологически активных молекул, таких как свободные L-аминокислоты, L-пептиды, хитин и хитозан, которые, как известно, усиливают рост или повышают устойчивость к стрессу посредством активации врожденного иммунитета у растений (Hill et al., PLoS One 6:e19220 2011; Tanaka et al., Plant Signal Behav. E22598-147 2013). Специфические микробные сообщества могут выполнять множество задач путем доставки уникальных продуктов ферментативного распада, которые сами по себе являются биологически полезными для сельскохозяйственных культур, а также конечный микробный консорциум, который может быть доставлен в качестве сельскохозяйственного продукта для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.
Как описано в настоящем документе, консорциумы аэробных и/или анаэробных микробов, полученных из плодородной почвы и морских источников, успешно совместно ферментировали и стабилизировали, обеспечивая прямые преимущества в отношении роста и урожайности сельскохозяйственных культур. Ферментативная активность этих микробных смесей дополнительно позволила получить продукты ферментации, содержащие хитин, глюкозамин, белок и/или аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления прямая доставка микробных консорциумов и/или композиций может обеспечить раннюю колонизацию корней и стимулировать ризосферные или эндофитные сообщества. В некоторых вариантах осуществления преимущества доставки микробных консорциумов в растения включают одно или несколько из следующего: усиленный рост корней, увеличение выработки корневых волосков, увеличенная площадь поверхности корней, более сильные растения, способные противостоять шоку пересадки, более быстрое становление травостоя, устойчивость к абиотическому стрессу, а также более высокая продуктивность и урожайность растений. Комплексные микробные смеси можно применять для растений различных видов и генотипов, взаимодействующих с почвенными микробными сообществами, обеспечивая преимущества для широкого спектра сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных сельскохозяйственных условиях.
I. Термины
Если не указано иное, технические термины используются в соответствии с общепринятым использованием. Определения терминов, распространенных в молекулярной биологии, можно найти в работе Krebs et al., Lewin’s Genes XI, опубликованной Jones and Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: Comprehensive Desk Reference, опубликованной Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789); и George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2nd Edition, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6).
Следующие пояснения терминов и способов представлены для более полного описания настоящего изобретения и ознакомления специалистов в данной области с осуществлением на практике настоящего изобретения. Формы единственного числа «a», «an» и «the» относятся к одному или более чем одному, если контекст ясно не диктует иначе. Например, термин «содержащий клетку» включает одну или множество клеток и считается эквивалентным выражению «содержащий по меньшей мере одну клетку». Используемый здесь термин «содержит» означает «включает». Таким образом, «содержащий А или В» означает «включающий А, В или А и В» без исключения дополнительных элементов. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, включены в виде ссылки во всей своей полноте для всех целей. В случае возникновения противоречий данное описание, включая пояснения терминов, будет служить контролем.
Несмотря на то что способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы при осуществлении на практике или тестировании раскрытой технологии, ниже описаны подходящие способы и материалы. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не ограничивают объем изобретения.
Для содействия рассмотрению различных вариантов осуществления данного изобретения представлены следующие пояснения конкретных терминов:
Водное животное. Животное, которое живет в соленой или пресной воде. В конкретных вариантах осуществления, раскрытых здесь, водное животное включает водных членистоногих, таких как креветка, криль, копеподы, усоногие раки, краб, омары и рак. В других вариантах осуществления водное животное представляет собой рыбу. Отходы водного животного включают любую часть водного животного, в частности, части, полученные в результате коммерческой обработки водного животного. Таким образом, в некоторых примерах отходы водного животного включают одно или несколько из следующего: головогрудный отдел или экзоскелет креветки, экзоскелет краба или омара, или рыбья кожа или чешуя.
Приведение в контакт. Помещение в непосредственное физическое взаимодействие как в твердой, так и в жидкой форме. Например, может возникать контакт одного или нескольких микробов (таких как микробы в микробном консорциуме) с биологическим образцом в растворе. Также, контакт может возникать одного или нескольких микробов (таких как микробы в микробном консорциуме) с почвой, растениями и/или частями растений (такими как листья, стебель, рассада, корни и/или семена).
Культивирование: намеренное выращивание одного или нескольких организмов или клеток в присутствии усвояемых источников углерода, азота и минеральных солей. В одном примере такой рост может происходить в твердой или полутвердой питательной среде, или в жидкой среде, в которой растворены или суспендированы питательные вещества. В следующем примере культивирование может происходить на поверхности или методом погруженного культивирования. Питательная среда может состоять из сложных питательных веществ или иметь определенный химический состав.
Ферментация. Способ, который приводит к распаду сложных органических соединений на более простые соединения, например, с помощью микробных клеток (таких как бактерии и/или грибы). Способ ферментации может возникать в аэробных условиях, анаэробных условиях, или в обоих случаях (например, в большом объеме, где некоторые порции являются аэробными, а другие - анаэробными). В некоторых неограничивающих вариантах осуществления ферментация включает ферментативный и/или неферментативный распад соединений, присутствующих в водных животных или отходах водных животных, таких как хитин.
Жидкое удобрение. Водный раствор или суспензия, содержащая растворимый азот. В некоторых примерах растворимый азот в жидком удобрении включает органический источник азота, такой как мочевина, или мочевину, полученную из безводного аммиака (например, в виде раствора мочевины и нитрата аммония (UAN)). Водный раствор аммиака (20-32% безводный аммиак) также можно использовать. В других примерах растворимый азот в жидком удобрении включает азотсодержащие неорганические соли, такие как гидроксид аммония, нитрат аммония, сульфат аммония, пирофосфат аммония, тиосульфат аммония или комбинации двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления жидкое удобрение включает неприродный источник азота (например, пирофосфат аммония или тиосульфат аммония) и/или другие неприродные компоненты.
Типичные жидкие неприродные смеси удобрений характеризуются содержанием азота-фосфата-калия (процентное содержание N-P-K) и включают добавление других компонентов, таких как сера или цинк. Примеры созданных человеком смесей включают 10-34-0, 10-30-0 с 2% серы и 0,25% цинка (в виде хелата), 11-37-0, 12-30-0 с 3% серы, 2-4-12, 2-6-12, 4-10-10, 3-18-6, 7-22-5, 8-25-3, 15-15-3, 17-17-0 с 2% серы, 18-18-0, 18-18-0 с 2% серы, 28-0-0 UAN, 9-27-0 с 2% серы и тиосульфатом калия.
Микроб. Микроорганизм, включающий, но без ограничения, бактерии, архебактерии, грибы и водоросли (например, микроводоросли). В некоторых примерах микробы представляют собой одноклеточные организмы (например, бактерии, цианобактерии, некоторые грибы или некоторые водоросли). В других примерах термин «микробы» включает многоклеточные организмы, такие как определенные грибы или водоросли (например, многоклеточные нитчатые грибы или многоклеточные водоросли).
Микробная композиция. Композиция (которая может быть твердой, жидкой или по меньшей мере частично и той и другой), которая включает по меньшей мере один микроб (или популяцию по меньшей мере одного микроба). В некоторых примерах микробная композиция представляет собой один или несколько микробов (или одну или несколько популяций микробов) в жидкой среде (например, среда хранения, культуральная среда или ферментационная среда), например, в виде суспензии в жидкой среде. В других примерах микробная композиция представляет собой один или несколько микробов (или одну или несколько популяций микробов) на поверхности или погруженных в твердую или желеобразную среду (включая, но без ограничения, культуральный планшет), или взвесь или пасту.
Микробный консорциум. Смесь, сообщество или ансамбль двух или более видов микроорганизмов, которые в некоторых случаях находятся в физическом контакте друг с другом. Микробы в консорциуме могут оказывать влияние друг на друга путем прямого физического контакта или посредством биохимического взаимодействия, или того и другого. Например, микробы в консорциуме могут обмениваться друг с другом питательными веществами, метаболитами или газами. Таким образом, в некоторых примерах по меньшей мере некоторые из микробов в консорциуме могут быть метаболически взаимозависимыми. Такие взаимозависимые взаимодействия могут изменяться по своему характеру и степени во времени и при изменении условий культивирования.
II. Микробные консорциумы и композиции
В настоящем документе раскрыто несколько микробных консорциумов. Иллюстративный микробный консорциум согласно настоящему изобретению депонирован в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA) 25 ноября 2014 года под номером депозита PTA-121750, называемый здесь как А1001. Консорциум А1001 включает Bacillus spp., Azospirillum spp., Pseudomonas spp., Lactobacillus spp., Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp. Ruminococcus spp., Aquabacterium spp., Leptolyngbya spp., Leptospirillum spp., Paenibacillus spp., Microcoleus spp., Clostridium spp., Xenococcus spp., Acetobacter spp., Candidatus spp., Methanosaeta spp., Paenibacillus spp и Brevibacillus spp., как определено с помощью анализа микрочипов и/или секвенирования 16S rDNA. Также, в настоящем документе раскрыты консорциумы или микробные композиции, включающие два или более (например, 2 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, или 50 или более), или все из микробов, содержащихся в А1001. В некоторых вариантах осуществления микробная композиция, раскрытая здесь, представляет собой композицию определенного состава, например, композицию, включающую определенные виды микробов и необязательно дополнительные немикробные компоненты (включая, но без ограничения, соли, микроэлементы, хитин, хитозан, глюкозамин и/или аминокислоты).
Как описано ниже, идентичность по меньшей мере некоторых микробов, присутствующих в А1001, определяли с помощью анализа микрочипов (пример 3) и/или секвенирования 16S rDNA (пример 4). Специалисту в данной области известны дополнительные методы идентификации микробов, присутствующих в микробной смеси или консорциуме, включая секвенирование или PCR-анализ нуклеиновых кислот, таких как 16S rDNA, из отдельных микробных колоний, выращенных из консорциума или смеси. Дополнительные методы идентификации микробов, присутствующих в микробной смеси или консорциуме, также включают: 1) способы на основе нуклеиновых кислот, основанные на анализе и дифференциации микробной ДНК (такие как анализ нуклеиновых кислот на ДНК-микрочипах, метагеномика или гибридизация in situ в сочетании с флуоресцентно-активируемой клеточной сортировкой (FACS)); 2) биохимические способы, основанные на разделении и идентификации ряда биомолекул, включая анализ сложных метиловых эфиров жирных кислот (FAME), анализ методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF) или анализ клеточной миколиновой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (MYCO-LCS); и 3) микробиологические способы, основанные на традиционных инструментах (например, селективное выращивание и микроскопическое исследование) для обеспечения большего количества общих характеристик сообщества как единого целого и/или сужения и идентификации только небольшого поднабора членов этого сообщества.
В некоторых примерах микробы в смеси или консорциуме разделяют (например, с использованием физического размера и/или методов клеточного сортинга) с последующим глубоким секвенированием ДНК или полного генома конечных микробов (или подгрупп или субпопуляций микробов). Использование различных микрочипов или других методов идентификации может выявить присутствие различных микробов (больше, меньше или различные микробные таксоны или виды) по сравнению с анализом микрочипов, выполненным на А1001, описанном здесь, из-за различий в чувствительности и специфичности выбранного метода анализа. Дополнительно, различные методы (включая анализ микрочипов или PCR-анализ ДНК) могут не обнаруживать определенные микробы (даже в случае их присутствия в образце), например, если зонды, способные детектировать определенные микробы, не включены в анализ. Дополнительно, специалисту в данной области будет понятно, что классификация микробов и названия могут со временем изменяться и приводить к повторной классификации и/или переименованию микробов.
В других вариантах осуществления раскрытые микробные консорциумы или композиции в основном состоят или состоят из 2 или более (например, 5 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более, или всех) микробов, указанных в таблице 1.
Таблица 1. Микробы
Микроб
Иллюстративные виды
<i>Desulfococcus spp.</i>
<i>Desulfotomaculum spp.</i>
<i>Marinobacter spp.</i>
<i>Marinobacter bryozoorum</i>
<i>Nitrosopumilus spp.</i>
<i>Azospirillum spp.</i>
<i>Bacillus spp.</i>
<i>Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Bacillus thuringiensis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pasteurii, Bacillus sphaericus</i>
<i>Lactobacillus spp.</i>
<i>Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus parafarraginis</i>
<i>Ruminococcus spp.</i>
<i>Leptolyngbya spp.</i>
<i>Aquabacterium spp.</i>
<i>Leptospirillum spp.</i>
<i>Leptospirillum ferrodiazotroph</i>
<i>Paenibacillus spp.</i>
<i>Paenibacillus amyloticus, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii</i>
<i>Microcoleus spp.</i>
<i>Pseudomonas spp.</i>
<i>Pseudomonas fluorescens</i>
<i>Clostridium spp.</i>
<i>Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium sphenoides, Clostridium bifermentans</i>
<i>Xenococcus spp.</i>
<i>Acetobacter spp.</i>
<i>Acetobacter aceti</i>
<i>Candidatus spp.</i>
<i>Methanosaeta spp.</i>
<i>Brevibacillus spp.</i>
<i>Brevibacillus choshinensis, Brevibacillus brevis, Brevibacillus parabrevis</i>
Консорциумы или композиции могут необязательно включать один или несколько дополнительных микробов. Дополнительные микробы включают, но без ограничения, один или несколько из Deinococcus spp., Acidisoma spp., Azotobacter spp. (например, Azotobacter vinelandii), Treponema spp. (например, Treponema primitia), Rhizobium spp. (например, Rhizobium japonicum), Bradyrhizobium spp., Rhodoferax spp., Halorhabdus spp., Cytophaga spp., Actinomyces spp., Devosia spp., Micrococcus spp. (например, Micrococcus luteus), Streptomyces spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Nitrobacter spp., Nitrosomonas spp., Nitrococcus spp., Proteus spp. (например, Proteus vulgaris), Trichoderma spp. (например, Trichoderma harzianum), Pediococcus spp. (например, Pediococcus pentosaceus), Brevibacterium spp., Saccharomyces spp. (например, Saccharomyces cerevisiae), Penicillium spp. (например, Penicillium roqueforti), Monascus (например, Monascus ruber), Aspergillus spp. (например, Aspergillus oryzae), Arthrospira spp. (например, Arthrospira platensis) и Ascophyllum spp. (например, Ascophyllum nodosum). Подходящие дополнительные микробы могут быть идентифицированы специалистом в данной области, например, на основе характеристик, желательных для включения в консорциумы или композиции.
2
4
2
4
2
4
3
4
2
4
Раскрытые микробные консорциумы или композиции могут включать один или несколько других компонентов дополнительно к микробам, включая, но без ограничения, соли, ионы металлов и/или буферы (например, одну или несколько из KHPO, KHPO, CaCl, MgSO, FeCl, NaMoO и/или NaMoO), микроэлементы (такие как сера, сульфат, сульфит, медь или селен), витамины (такие как витамины В или витамин К), сахара (такие как сахароза, глюкоза или фруктоза), хитин, хитозан, глюкозамин, белок и/или аминокислоты. Дополнительные компоненты, которые могут быть также включены в композиции, включают HYTb, HYTc и/или HYTd, одно или несколько удобрений (например, жидкое удобрение), один или несколько пестицидов, один или несколько фунгицидов, один или несколько гербицидов, один или несколько инсектицидов, один или несколько растительных гормонов, один или несколько элиситоров для растений, или комбинации двух или более из этих компонентов.
В некоторых вариантах осуществления микробный консорциум или композиция, включающая пять или более видов микробов, содержащихся в описанных здесь микробных консорциумах, находятся в жидкой среде (такой как культуральная или ферментационная среда) или инокуляте. В других вариантах осуществления микробные консорциумы или композиция, включающая пять или более видов микробов, указанных в таблице 1, присутствуют на твердой или желеобразной среде (такой как культуральный планшет), содержащей или поддерживающей микробы.
В еще других вариантах осуществления микробные консорциумы или композиция, включающая пять или более видов микробов, присутствует в сухих составах, таких как сухой порошок, пеллеты или гранулы. Сухие составы могут быть получены путем добавления осмопротекторного вещества (такого как сахар, например, трегалоза и/или мальтодекстрин) в микробную композицию в растворе в требуемом соотношении. Этот раствор объединяют с сухим носителем или абсорбирующим агентом, таким как древесная мука или глина, при желательной концентрации микробной композиции (такой как 2-30%, например, 2,5-10%, 5-15%, 7,5-20% или 15-30%). Гранулы могут быть получены путем включения глины или полимерных связующих веществ, которые служат для удержания гранул вместе или обеспечивают специфические физические свойства или свойства деградации. Гранулы могут быть получены путем ротационного гранулирования, гранулирования при помощи смесителя или экструзии, в качестве некоторых возможных способов. Дополнительные способы получения сухих составов, включающих один или несколько видов микробов, известны специалисту в данной области, например, как описано в Formulation of Microbial Biopesticides: Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments, Burges, ed., Springer Science, 1998; Bashan, Biotechnol. Adv. 16:729-770, 1998; Ratul et al., Int. Res. J. Pharm. 4:90-95, 2013.
В некоторых примерах композиции, включающие микробы или микробные консорциумы, можно хранить при температуре, при которой поддерживается рост микроба(ов), например, при температуре около 25-45°С (например, около 30-35°С, около 30-40°С или около 35-40°С). В других примерах композиции хранят при температурах, при которых микроб(ы) не растут или являются неактивными, например, при температуре ниже 25°С (например, 4°С, -20°С, -40°С, -70°С или ниже). Специалист в данной области сможет составить композиции для холодного хранения, например, путем включения стабилизаторов (таких как глицерин). В еще других примерах композиции хранят при температуре окружающей среды, такой как около 0-35°С (например, около 10-30°С или около 15-25°С).
III. Способы биодеградации
Раскрытые микробные консорциумы или композиции можно применять для разложения биологических материалов, таких как материалы, богатые хитином, например, водных животных или отходов водных животных, насекомых или грибов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в настоящем документе раскрыты способы, включающие смешивание одного или нескольких раскрытых микробных консорциумов или композиций с хитинсодержащим биологическим материалом с образованием смеси, и ферментацию этой смеси. В некоторых вариантах осуществления способы также включают разделение смеси на твердую, водную и необязательно липидную фракции (фигура 2).
В некоторых вариантах осуществления способ биодеградации, раскрытый здесь, включает смешивание микробного консорциума (такого как А1001, композиции, включающей некоторые или все из микробов, содержащихся в А1001, или композиции, включающей пять или более видов микробов, указанных в таблице 1) с одним или несколькими хитинсодержащими биологическими материалами. Хитинсодержащие биологические материалы включают, но без ограничения, водных животных или отходы водных животных, насекомых или грибы. В некоторых примерах хитинсодержащий биологический материал представляет собой водное животное, такое как водное членистоногое (например, член класса Malacostraca). Водные членистоногие, предназначенные для использования в раскрытых способах, включают креветку, краба, омара, рака или криль. В некоторых примерах в раскрытых здесь способах биодеградации используют целиком водное животное (такое как водное членистоногое) или отходы водного животного. Отходы водного животного включают любую часть водного животного, такую как любая часть, полученная при обработке водного животного. В некоторых примерах отходы водного животного представляют собой весь или часть экзоскелета водного животного, такого как креветка, краб, рак, или раковины омара. В других примерах отходы водного животного представляют собой часть водного животного, например, головогрудные отделы креветок.
В других примерах хитинсодержащий биологический материал включает грибы, такие как грибы из Phylum Zygomycota, Basidiomycota, Ascomycota или Deuteromycota. Конкретные примеры грибов включают Aspergillus spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Saccharomyces spp. и Schizosaccharomyces spp. Таким образом, отходы пекарни, пивоваренных производств и способов перегонки могут обеспечивать источники хитинсодержащего биологического материала. В еще других примерах хитинсодержащий биологический материал включает насекомых, которые содержат хитин в своих экзоскелетах, таких как кузнечики, сверчки, жуки и другие насекомые. Отходы, образовавшиеся в способе обработки таких насекомых, также рассматриваются в качестве источников хитина.
Хитинсодержащий биологический материал смешивают с композицией, включающей микробы, описанные в разделе II выше (например, микробным консорциумом А1001 или другим консорциум или композицией, описанной в разделе II), с образованием по существу гомогенной смеси. В некоторых примерах хитинсодержащий биологический материал измельчают, дробят, рубят, перемалывают или иным образом диспергируют перед смешиванием с микробами или микробными консорциумами, описанными в настоящем документе. В конкретных примерах смесь содержит около 10-50% (такое как около 10-20%, около 20-30%, около 30-40%, около 25-40%, например, около 25%, около 30%, около 35%, около 40%, около 45% или около 50%) хитинсодержащего материала (такого как головы креветок) (масса/объем) в инокуляте, содержащем около 0,1-5% (такое как около 0,1-1%, около 0,5-2%, около 1-2%, около 2-3%, около 0,1%, около 0.2%, около 0,3%, около 0,5%, около 0,8%, около 1%, около 1,25%, около 1,5%, около 1,75%, около 2%, около 2,5%, около 3%, около 4% или около 5%) микробов (объем/объем).
В некоторых примерах инокулят, хитинсодержащий биологический материал и сахар (или другой источник углерода) смешивают вместе, например, путем перемешивания или встряхивания. В других примерах один или несколько микробов в микробной композиции или консорциуме необязательно активируют перед смешиванием с хитинсодержащим биологическим материалом и ферментацией. Активация не требуется для способов, раскрытых в настоящем документе. Корректировки по времени и/или температуре ферментации могут быть проведены специалистом в данной области в зависимости от того, являются ли микробы активированными до ферментацией. Активация микробной композиции может быть осуществлена путем инкубации инокулята микробов с источником углерода (таким как сахар, например, глюкоза, сахароза, фруктоза или другой сахар) при температуре и в течение периода времени, достаточных для роста микробов. В некоторых примерах инокулят микробов (таких как микробный консорциум или композиция, описанная здесь) имеет концентрацию около 0,05-5 об.% (например, около 0,5-5%, около 0,5-2%, около 1-2% или около 2-3%) в жидкой среде. Инокулят разбавляют в растворе, содержащем около 0,1-1% сахара (например, около 0,1-0,5%, около 0,1-0,3%. около 0,2-0,6% или около 0,5-1%, такое как около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,4%, около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,8%. около 0,9% или около 1%) и инкубируют при температуре окружающей среды, например, при температуре около 20-40°С (например, около 20°С, около 25°С, около 30°С, около 35°С или около 40°С) в течение 1-5 дней (например, в течение около 24 часов, около 48 часов, около 72 часов, около 96 часов или около 120 часов). В других примерах активация микробной композиции может быть достигнута путем инкубации инокулята микробов при температуре и в течение периода времени, достаточных для роста микробов, например, инкубации при температуре около 20-40°С (например, около 25-35°С) в течение от 12 часов до 5 дней (например, в течение 1-4 дней или 2-3 дней). В некоторых неограничивающих примерах микробы считаются активированными, когда культура достигает оптической плотности >0,005 при 600 нм.
После смешивания хитинсодержащего биологического материала и микробов или микробного консорциума (которые необязательно активированы) смесь подвергают ферментации. В некоторых примерах значение рН смеси измеряют до ферментации. Значение рН регулируют до выбранного диапазона (например, рН в диапазоне примерно 3-4 или примерно 3,5-4), по необходимости, до ферментации. Смесь инкубируют при температуре около 20-40°С (например, около 30-36°С, такой как около 30°С, около 31°С, около 32°С, около 33°С, около 34°С, около 35°С, около 36°С, около 37°С, около 38°С, около 39°С или около 40°С) в течение примерно 1-30 дней (например, около 3-28 дней, около 7-21 дня, около 3, 5, 7, 10, 14, 16, 20, 24, 28 или 30 дней). Смесь периодически встряхивают (например, периодическое встряхивание). В некоторых примерах смесь встряхивают в течение периода времени, составляющего каждые 1-7 дней, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней. В некоторых неограничивающих примерах ферментация протекает до достижения титруемой кислотности (TTA), составляющей около 3-5%, и значения рН около 4-5.
После ферментации полученную ферментированную смесь разделяют по меньшей мере на твердую и жидкую фракции. В некоторых примерах ферментационная смесь проходит из резервуара в устройство для осаждения. Жидкость затем декантируют и центрифугируют. В одном неограничивающем примере ферментированную смесь центрифугируют при 1250 об/мин (930 х g) в течение 15 минут при температуре около 5°С с получением жидкой и липидной (например, пигмент) фракций. Жидкую (или водную) фракцию, полученную в результате способа биодеградации, можно хранить при температуре окружающей среды. В некоторых неограничивающих примерах в жидкую фракцию добавляют сахар, например, при 1-10 об.%.
Жидкая фракция может включать компоненты, такие как белок, аминокислоты, глюкозамин, микроэлементы (такие как кальций, магний, цинк, медь, железо и/или марганец) и/или ферменты (такие как молочнокислые ферменты, протеазы, липазы и/или хитиназы). В некоторых неограничивающих примерах жидкая фракция содержит около 1-5% (масса/объем) общих аминокислот, около 3-7% белка, около 0,1-2% азота, менее чем около 0,2% фосфора, около 0,5-1% калия, около 4-8% углерода, около 0,2-1% кальция, менее чем около 0,2% магния, менее чем около 0,2% натрия и/или около 0,1-0,4% серы. В дополнительных неограничивающих примерах жидкая фракция включает около 0,01-0,2% глюкозамина (например, около 0,1% или менее). Жидкая фракция может также содержать один или несколько микробов (например, из инокулята, используемого для начала способа ферментации) и/или следовые количества хитозана или хитина. Жидкая фракция в некоторых примерах в настоящем документе называется как «HYTb».
Твердая фракция, полученная в результате способа биодеградации, содержит хитин (например, около 50-70% или около 50-60% хитина). Твердая фракция может также содержать один или несколько микроэлементов (таких как кальций, магний, цинк, медь, железо и/или марганец), белок или аминокислоты, и/или один или несколько микробов из инокулята, используемого для начала способа ферментации. Твердая фракция в некоторых примерах в настоящем документе называется как «HYTc». HYTc необязательно микронизируют с образованием микронизированного хитина и остаточного хитина. В некоторых неограничивающих примерах твердая фракция содержит около 9-35% (масса/объем) общих аминокислот, около 30-50% сырого белка, около 5-10% азота, около 0,3-1% фосфора, менее чем около 0,3% калия, около 35-55% углерода, около 0,5-2% кальция, менее чем около 0,1% магния, около 0,1-0,4% натрия и/или около 0,2-0,5% серы.
В некоторых примерах липидную фракцию также отделяют от твердой и жидкой фракций. Липидная фракция представляет собой верхнюю фазу жидкой фракции. Липидная фракция содержит соединения, такие как стеролы, витамин А и/или витамин Е, жирные кислоты (такие как DHA и/или EHA), и в некоторых примерах каротиноидные пигменты (например, астаксантин). Липидную фракцию можно использовать для различных целей, включая, но без ограничения, производство косметических средств или питательных продуктов.
В дополнительных вариантах осуществления хитин ферментируют с микробным консорциумом (таким как А1001 или некоторые или все из микробов, содержащихся в А1001) или композицией, содержащей пять или более из видов микробов, указанных в таблице 1. В некоторых примерах хитин (такой как HYTc, или микронизированный и/или остаточный хитин, полученный, как описано выше) смешивают с микробным консорциумом или композицией, содержащей микробы, описанные здесь, и белковым гидролизатом (например, HYTb), и ферментируют с образованием ферментированной смеси. По меньшей мере часть хитина, содержащегося в исходной смеси, разлагается в результате ферментации. В некоторых примерах смесь инкубируют при температуре около 20-40°С (например, около 30-35°С, такой как около 30°С, около 31°С, около 32°С, около 33°С, около 34°С, около 35°С, около 36°С, около 37°С, около 38°С, около 39°С или около 40°С) в течение примерно 1-30 дней (например, в течение около 2-28 дней, около 4-24 дней, около 16-30 дней, около 10-20 дней или около 12-24 дней). В некоторых примерах смесь периодически встряхивают (например, периодическое встряхивание). В других примерах смесь встряхивают непрерывно. В одном неограничивающем примере смесь встряхивают в течение примерно 1-12 часов ежедневно (например, в течение около 2-8 часов или около 4-10 часов). Значение рН ферментационной смеси периодически контролируют. В некоторых примерах значение рН поддерживают в диапазоне около 4-5. В некоторых примерах ферментация протекает до достижения общей титруемой кислотности (TTA) по меньшей мере около 1-10% (например, около 2-8%, около 4-8% или около 5-10%).
После ферментации полученную ферментированную смесь разделяют по меньшей мере на твердую и жидкую фракции, например, путем декантации, фильтрации и/или центрифугирования. Жидкая фракция, образовавшаяся в результате ферментации HYTb и хитина с микробной композицией, в некоторых примерах в настоящем документе называется как «HYTd». В некоторых неограничивающих примерах жидкая фракция содержит около 0,5-2% (масса/объем) общих аминокислот, около 3-7% белка, около 0,5-1% азота, менее чем около 0,1% фосфора, около 0,4-1% калия, около 3-7% углерода, менее чем около 0,5% кальция, менее чем около 0,1% магния, менее чем около 0,3% натрия и/или менее чем около 0,3% серы. Дополнительно, HYTd содержит менее чем около 50% хитина (например, менее чем около 45%, менее чем около 40%, менее чем около 35% или менее чем около 30% хитина) и менее чем около 2% глюкозамина (например, менее чем около 1,5% или менее чем около 1% глюкозамина). В других примерах HYTd содержит около 25-50% хитина и около 0,5-2% глюкозамина.
IV. Способы для обработки почвы, растений и/или семян
Раскрытые микробные консорциумы, композиции, содержащие микробы, и/или продукты, раскрытые в настоящем документе (такие как HYTb, HYTc и/или HYTd), можно применять для обработки почвы, растений или частей растений (таких как корни, стебли, листья, семена или рассада). В некоторых примерах обработка микробными консорциумами, композициями, содержащими микробы, и/или продуктами улучшает рост растений, повышает устойчивость к стрессу и/или увеличивает урожай сельскохозяйственных культур.
В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение в контакт почвы, растений (таких как листья растений, стебли, корни, рассада или другие части растений) или семян с консорциумом (таким как А1001) или композицией, включающей микробы, присутствующие в одном или нескольких из раскрытых микробных консорциумов или композиций. Способы могут также включать выращивание обработанных растений, частей растений или семян и/или культивирование растений, частей растений или семян в обработанной почве.
Микробы необязательно активируют перед применением. В некоторых примерах активацию микробов осуществляют, как описано выше в разделе III. В других примерах микробы активируют путем смешивания 100 частей воды и 1 части микробного консорциума или композиции, и инкубации при температуре около 15-40°С (такой как около 20-40°С, около 15-30°С или около 25-35°С) в течение периода времени, составляющего примерно от 12 часов до 14 дней (такого как около 1-14 дней, 3-10 дней, 3-5 дней или 5-7 дней). Активируемая смесь может также необязательно включать 1 часть HYTb, если микробный консорциум или композиция подлежит применению в комбинации с HYTb.
В других вариантах осуществления способы включают приведение в контакт почвы, растений (или частей растений) или семян с продуктом раскрытых микробных консорциумов или композиций, таким как HYTb, HYTc, HYTd или их комбинации. В еще других вариантах осуществления способы включают приведение в контакт почвы, растений или семян с раскрытым микробным консорциумом или композицией, включающей раскрытые микробы и один или несколько из HYTb, HYTc и HYTd (например, один, два или все из HYTb, HYTc и HYTd). HYTb, HYTc, и/или HYTd можно применять по отдельности к почве, растениям (или частям растений) и/или семенам, например, последовательно, одновременно или по существу одновременно с раскрытыми микробными консорциумами или композициями, содержащими микробы.
В некоторых примерах способы дополнительно включают приведение в контакт почвы, растений (или частей растений) или семян с одним или несколькими дополнительными компонентами, включая, но без ограничения, хитин, хитозан, глюкозамин, белок, аминокислоты, жидкое удобрение, один или несколько пестицидов, один или несколько фунгицидов, один или несколько гербицидов, один или несколько инсектицидов, один или несколько растительных гормонов, один или несколько элиситоров для растений, или комбинаций двух или более из них. Дополнительные компоненты могут быть включены в композицию, включающую микробы, или в микробный консорциум, раскрытый в настоящем документе, или могут применяться по отдельности к почве, растениям (или частям растений), и/или семенам, например, последовательно, одновременно или по существу одновременно с раскрытыми микробными консорциумами или композициями, содержащими микробы.
В конкретных вариантах осуществления микробный консорциум или композицию объединяют с жидким удобрением (например, водный раствор или суспензия, содержащая растворимый азот). В некоторых примерах жидкое удобрение включает органический источник азота, такой как мочевина, или азотсодержащую неорганическую соль, такую как гидроксид аммония, нитрат аммония, сульфат аммония, пирофосфат аммония, тиосульфат аммония или их комбинации. Водный раствор аммиака (20-24,6% безводный аммиак) также может быть использован в качестве растворимого азота. В некоторых примерах микробный консорциум или композицию объединяют с жидким удобрением (например, смешивают с жидким удобрением) непосредственно перед применением или за короткий промежуток времени до применения (такой как от 10 минут до 24 часов до применения, например, около 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 18 часов или 24 часа до применения). В других примерах микробный консорциум или композицию объединяют с жидким удобрением (например, смешивают с жидким удобрением) по меньшей мере за 24 часа до применения (например, за промежуток времени, составляющий от 24 часов до 6 месяцев, например, по меньшей мере за 36 часов, по меньшей мере за 48 часов, по меньшей мере за 72 часа, по меньшей мере за 96 часов, по меньшей мере за одну неделю, по меньшей мере за две недели, по меньшей мере за четыре недели, по меньшей мере за восемь недель или по меньшей мере за 12 недель до применения).
В некоторых примерах рассчитывают количество композиции(й), подлежащей применению (например, на акр или гектар) и композицию разбавляют в воде (или в некоторых примерах в жидком удобрении) до количества, достаточного для распыления или орошения площади, подлежащей обработке (если композиция представляет собой жидкость, такую как микробные консорциумы или композиции, HYTb или HYTd). В других примерах композиция может быть смешана с разбавленными гербицидами, инсектицидами, пестицидами или химическими средствами, регулирующими рост растений. Если композиция, подлежащая применению, представляет собой твердое вещество (такое как сухой состав микробов, HYTc, хитин, глюкозамин, хитозан или аминокислоты), то это твердое вещество может быть нанесено непосредственно на почву, растения или части растений, или может быть суспендировано или растворено в воде (или другой жидкости) перед применением. В некоторых примерах HYTc сушат и микронизируют перед применением.
Раскрытые микробные композиции (по отдельности или в комбинации с другими компонентами, раскрытыми здесь, такими как HYTb, HYTc и/или HYTd) могут быть доставлены различными путями на разных стадиях развития растения в зависимости от ситуации с растениями и агрономических приемов. В некоторых примерах раскрытую микробную композицию и HYTb смешивают и разбавляют жидким удобрением, и применяют во время посадки семян при норме расхода 0,5:1:2 литров каждого на акр или, альтернативно, применяют индивидуально. В других примерах раскрытую микробную композицию и HYTb смешивают и разбавляют, и применяют во время посадки семян, а также вносят в почву вблизи корней несколько раз во время роста растений при норме расхода 0,5:1:2 литров каждого на акр или, альтернативно, применяют индивидуально. В еще других примерах раскрытую микробную композицию и HYTb разбавляют и доставляют вместе путем капельного орошения при низкой концентрации после укоренения рассады или саженцев, доставляют путем орошения затоплением, или распыляют на рассаду или укоренившиеся растения в виде разбавленной смеси с питательными веществами путем верхового или капельного орошения в теплицах, или, альтернативно, применяют индивидуально. В дополнительных примерах раскрытую микробную композицию добавляют к другим обработкам почвы в поле, например, в качестве дополнения к обработкам инсектицидами для простоты использования. В других примерах, таких как теплицы, раскрытую микробную композицию и HYTb применяют по отдельности или совместно в комбинации с жидким удобрением (таким как рыбное удобрение) и другими питательными веществами, и вводят в ирригационные системы верхового распыления воды или линии капельного орошения на протяжении роста растений. В одном примере теплиц раскрытую микробную композицию и HYTb используют вместе, например, разбавляют и наносят при норме расхода 0,2:1 литр путем верхового орошения или фертигации во время проращивании рассады, затем 0,25:1 литр во время фертигации в середине цикла роста и, наконец, 0,25:1 литр во время фертигации в течение 5-10 дней в конце цикла роста.
В некоторых вариантах осуществления раскрытую микробную композицию или консорциум и HYTb применяют вместе или индивидуально (например, последовательно) для стимулирования урожайности, силы роста, типичности, качества, развития корневой системы и устойчивости к стрессу сельскохозяйственных культур. В одном конкретном примере, в котором сельскохозяйственной культурой являются зерновые, 1-2 л/акр микробной композиции добавляют в борозды с жидким удобрением во время посадки семян или применяют в качестве подкормки во время внесения удобрений после стадии V3, с последующим применением HYTb при норме расхода 0,5-2 л/акр в виде внекорневого распыления после стадии V5 с добавлением или разбавлением гербицидами, внекорневыми пестицидами, микроэлементами или удобрениями.
В другом конкретном примере, в котором сельскохозяйственной культурой является картофель, 1-3 л/акр микробной композиции разбавляют и используют отдельно или с 1-3 л/акр HYTb при посадке клубней; после этого могут следовать последовательные внесения в почву микробной композиции и HYTb до клубнеобразования по отдельности (например, последовательно) или вместе. После появления всходов листья картофеля можно обрабатывать HYTb при норме расхода 1-2 л/акр отдельно в разбавленном виде или в сочетании с внесениями гербицидов, внекорневых пестицидов, питательных микроэлементов или удобрений, и применять в период вегетации один раз, два раза, три раза, четыре раза или более.
В еще другом конкретном примере, в котором сельскохозяйственной культурой является хлопок, 1-2 л/акр микробной композиции вносят в борозды при посадке в качестве подкормки, или на площади 2х2 (2 дюйма (1 дюйм = 2,5 см) в сторону и 2 дюйма ниже семени) с удобрением или без него. При появлении первого белого цветка хлопка можно применять опрыскивание листьев HYTb при норме расхода 0,5-2 л/акр отдельно в разбавленном виде или в сочетании с внесением других питательных веществ, гербицидов или пестицидов.
В другом конкретном примере, в котором сельскохозяйственной культурой является пшеница, микробную композицию (1-2 л/акр) применяют после зимнего покоя (стадия S4) и опрыскивают листья HYTb (0,5-2 л/акр; со стадии S4 по стадию S10).
В примере, в котором сельскохозяйственной культурой является сахарный тростник, в одном из способов применения используют раскрытую микробную композицию и HYTb при норме расхода 2-4 л /акр каждой, вносят в почву во время посадки тростника или в качестве подкормки в междурядья, при этом внекорневую обработку HYTb применяют при норме расхода 1-2 л /акр, смешивая с водой или удобрениями или питательными микроэлементами.
HYTb можно применять отдельно в качестве внекорневой обработки для всех сельскохозяйственных культур для улучшения свойств, таких как устойчивость растений к стрессу, вегетационная сила, качество собранного урожая и урожайность. В примере, в котором сельскохозяйственной культурой являются зерновые, HYTb можно применять при норме расхода ½-1 л/акр один раз или многократно, смешивая с водой или пестицидами, или гербицидами. В другом примере HYTb можно использовать для обработки пшеницы в виде внекорневого опрыскивания, смешивая с водой или пестицидами, или гербицидами, при норме расхода ½-1 л/акр один раз или многократно.
Для всех сельскохозяйственных культур HYTc можно вносить в почву при норме расхода около 0,5-2 кг/акр (такой как около 0,5 кг/акр, около 1 кг/акр, около 1,5 кг/акр или около 2 кг/акр) в период приживления или посадки сельскохозяйственных культур. В других примерах HYTc добавляют в раствор для капельного орошения, содержащий раскрытую микробную композицию и HYTb, или добавляют к вносимому удобрению, содержащему раскрытую микробную композицию и HYTb в теплицах, как описано в примерах выше.
В дополнительных вариантах осуществления HYTd (отдельно или в комбинации с микробами или другими компонентами, раскрытыми здесь) применяют при норме расхода около 1-20 л/гектар (такой как около 1-15 л/гектар, около 3-10 л/гектар или около 3-5 л/гектар). В других примерах HYTd (отдельно или в комбинации с микробами или другими компонентами, раскрытыми здесь) применяют для обработки семян для улучшения урожайности и характеристик (например, около 1-10 л/кг семян, такое как около 1-3 л/кг, около 3-5 л/кг или около 5-10 л/кг). Альтернативно HYTd можно вносить в почву (отдельно или в комбинации с микробами или другими компонентами, раскрытыми здесь) при норме расхода около 1-3 л/гектар для увеличения роста растений, например, чтобы помочь растениям сохранять продуктивность в условиях стресса.
В некоторых примерах обработка почвы, семян, растений или частей растений композицией, содержащей микробы в раскрытом микробном консорциуме, увеличивает рост растений (например, общий размер растений, количество листьев, количество корней, диаметр корней, длину корней, образование побегов, формирование плодов, пыльцевую продуктивность или семенную продуктивность) по меньшей мере примерно на 5% (например, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, или более). В других примерах раскрытые способы обеспечивают увеличение производства сельскохозяйственных культур примерно на 10-75% (такое как примерно 20-60% или примерно 30-50%) по сравнению с необработанными сельскохозяйственными культурами. Другие показатели урожайности включают качество плода, урожайность, содержание крахмала или твердых веществ, содержание сахара или содержание сухих веществ по ареометру Брикса, срок хранения плодов или собираемого продукта, получение товарного урожая или урожая заданного размера, качество плода или продукта, кущение злаков и устойчивость к вытаптыванию, опыление и завязывание плодов, цветение, количество цветов, продолжительность жизни цветов, качество цветения, укоренение и корневую массу, устойчивость культур к полеганию, устойчивость к абиотическому стрессу - жаре, засухе, холоду и восстановление после стресса, приспособляемость к бедным почвам, уровень фотосинтеза и зеленения, и здоровье растений. Для определения эффективности продуктов контроли включают такие же выполняемые параллельно агрономические приемы без добавления микробов.
Раскрытые способы можно применять в отношении любой сельскохозяйственной культуры (например, для прямой обработки сельскохозяйственных культур или обработки почвы до или после посадки). Иллюстративные сельскохозяйственные культуры включают, но без ограничения, люцерну, миндаль, банан, ячмень, брокколи, канолу, морковь, цитрусовые и фруктовые сады, кукурузу, хлопок, огурцы, цветы и декоративные растения, чеснок, виноград, хмель, садовые растения, лук-порей, дыню, масличную пальму, лук, арахис и бобовые, ананас, тополь, сосну и древесные деревья, картофель, малину, рис, кунжут, сорго, сою, тыкву, клубнику, сахарный тростник, подсолнечник, помидоры, дерновые и кормовые травы, арбуз, пшеницу и эвкалипт.
Следующие примеры представлены для иллюстрации некоторых конкретных признаков и/или вариантов осуществления. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение конкретными описанными признаками или вариантами осуществления.
Пример 1
Микробный консорциум A1001
В этом примере описано получение микробного консорциума A1001.
A1001 получали из посевной партии микробов, которые первоначально получали из плодородных почв и дополнительных микробов (таких как Bacillus spp.) (смотри, например, патент США 8748124, включенный в настоящее описание путем ссылки). «Посевную» культуру смешивали с суспензией, содержащей 5,5 масс.% белка молочной сыворотки и 1,2 масс.% йогурта в воде («C vat»), и суспензией, содержащей 0,1 масс.% спирулина и 0,1 масс.% экстракта морских водорослей в воде («A vat»). Каждую из суспензий A vat и C vat готовили индивидуально за 3 дня до смешивания с посевной культурой и инкубировали при температуре окружающей среды. Посевную культуру, C vat и A vat смешивали в соотношении около 81:9:9. После смешивания суспензию дополнительных компонентов, содержащую около 70 об.% мелассы, 0,5 об.% HYTb, 0,003% масса/объем аравийской камеди и 0,02% масса/объем пивных дрожжей (S. cerevisiae) смешивали со смесью посевной культуры, C vat и A vat, и дополнительным количеством воды в соотношении около 16:34:50. Смесь подвергали ферментации в течение примерно 7 дней при температуре окружающей среды (около 19-35°C). Через 7 дней резервуары подвергали аэрации через день в течение 30 минут. Добавляли дополнительное количество воды (примерно 10 об.%) и ферментацию продолжали в тех же условиях в течение еще примерно 10 дней. Добавляли дополнительное количество воды (еще примерно 4 об.%) и ферментацию продолжали в течение еще примерно 7 дней, после чего образцы собирали для анализа и депонирования в ATCC. A1001 впоследствии хранили в контейнерах при температуре окружающей среды.
Пример 2
Анализ микробов в A1001 путем высевания
В этом примере описан анализ микробов, присутствующих в A1001, путем параллельного высевания в аэробных и анаэробных условиях.
-2
-3
-9
Образцы (50 мл) отбирали из аэрируемого контейнера, содержащего A1001 (перемешивали с помощью лопастной мешалки из нержавеющей стали при 120 об/мин в течение 8 минут), с помощью подвергнутого санитарной обработке ручного сифонного насоса. На день 1 образец перемешивали на вортексе (например, в течение 60 секунд при 2000 об/мин) для обеспечения равномерного распределения микробов. В пробирку, содержащую 9,8 мл стерильной воды, добавляли 0,1 мл образца A1001 и 0,1 мл HYTb (в разведении 10). Пробирку инкубировали при 35°С в течение 72 часов без встряхивания. Через 72 часа (день 3) пробирку перемешивали на вортексе в течение короткого периода времени и готовили серии 10-кратных разведений в стерильной воде (в разведении от 10 до 10).
7
7
Каждое разведение высевали (100 мкл) на пластину с питательным агаром «Nutrient Agar plate» (для аэробной культуры микроорганизмов) и пластину с агаром для подсчета на чашках «Standard Methods Agar» (для анаэробной культуры микроорганизмов) в 3 повторах для каждого. Пластины с питательным агаром культивировали при 27°С в течение 48 часов. Пластины с агаром «Standard Methods Agar» инкубировали при 35°С в течение 72 ч в анаэробной камере. После инкубации для каждой культуры выбирали разведение, которое достигло менее 100 колоний. Для выбранного разведения подсчитывали все колонии на каждой из повторных пластин и рассчитывали количество колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Высевание A1001 показало 4,0 х 10КОЕ/мл в аэробных условиях и 4,3 × 10КОЕ/мл в анаэробных условиях.
Пример 3
Анализ микробов в A1001 с помощью микрочипов
В этом примере описан анализ микробов, присутствующих в A1001, с помощью микрочипов.
Анализ образца A1001 проводился компанией Second Genome (South San Francisco, CA) с использованием G3 PhyloChip™ Assay. ДНК выделяли из образца при помощи набора PowerSoil DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. 16S rRNA амплифицировали (35 циклов PCR) с использованием вырожденного прямого праймера 27F.1 (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG; SEQ ID NO: 1) и невырожденного обратного праймера 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT; SEQ ID NO: 2). Продукты амплификации концентрировали с использованием метода обратимой твердофазной иммобилизации и количественно оценивали с помощью электрофореза на биоанализаторе 2100 Bioanalyzer (Agilent). В каждый амплифицированный продукт добавляли PhyloChip Control Mix™. Ампликоны фрагментировали, метили биотином и гибридизовали на микрочипе PhyloChip™ G3, содержащем > 1,1 миллиона зондов, нацеленных примерно на 55000 индивидуальных микробных таксонов, со множеством подтверждений на операционную таксономическую единицу (OTU). Чипы отмывали, окрашивали и сканировали с использованием сканера GeneArray (GeneChip Microarray Analysis Suite, Affymetrix).
Приблизительно 330 миллиардов молекул тестировали и анализировали с использованием программного обеспечения PhyloChip processing software компании Second Genome. Интенсивность флуоресценции (FI) серий наборов зондов «perfect match» (РМ) и «mis-match» (ММ) каждого пикселя в изображении собирали в виде целого числа. Затем с помощью программного обеспечения проводили корректировку на фоновую флуоресценцию и оценку шума, и нормализовали результаты по рангу. Полученные результаты затем использовали в качестве входных данных для эмпирического подбора набора зондов. Эмпирическую операционную таксономическую единицу (OUT), определенную с помощью набора зондов, затем таксономически аннотировали против базы данных Greengenes (greengenes.lbl.gov) последовательностей гена 16S rRNA, опубликованной в мае 2013 года, из комбинации 8-mers, содержащейся во всех зондах набора. Таксоны затем идентифицировали по стандартному таксономическому названию или с помощью иерархического идентификатора таксонов.
После идентификации таксонов для включения в анализ, величины, используемые для каждого таксона-образца, получали двумя различными способами. В первом случае использовали показатель относительной численности для ранжирования численности каждого таксона относительно других. Во втором случае использовали бинарный показатель или показатель присутствия/отсутствия для определения, действительно ли каждый таксон присутствует в образце.
Данные, полученные в результате анализа микрочипов, также использовали для отбора микробов, предназначенных для включения в композиции, описанные здесь (например, микробы, указанные в таблице 1 и где-либо в других местах в настоящем документе). Микробы (таксон, род или виды) ранжировали в порядке относительной численности и отбирали исходя из желательных характеристик.
Пример 4
Анализ микробов в A1001 путем секвенирования
В этом примере описан анализ последовательностей микробов, присутствующих в A1001, путем секвенирования 16S rDNA.
Геномную ДНК экстрагировали из образца A1001. 16S rDNA амплифицировали с помощью PCR и секвенировали с использованием системы идентификации микроорганизмов MICROSEQ ID (Applied Biosystems/Life Technologies, Grand Island, NY). Данные, полученные в результате секвенирования, анализировали с использованием программного обеспечения SHERLOCK DNA (MIDI Labs, Newark, DE). Очищенные изоляты были идентифицированы и указаны в таблице 2. Сходство на уровне видов присваивали, если генетическое расстояние в процентах (%GD) между неизвестным и ближайшим сходством было меньше, чем приблизительное среднее генетическое расстояние в процентах (%GD) между видами в пределах этой конкретной генетической семьи, обычно составляющее 1%. Сходство на уровне рода присваивали, когда последовательность не отвечала требованиям сходства на уровне вида, но все же кластеризовалась в пределах ответвления определенного рода (GD более 1% и менее около 3%).
Таблица 2. Микробы, идентифицированные в A1001 путем секвенирования 16S rDNA
Образец
Микроб
Уровень достоверности
%GD
Пары оснований
1a
<i>Paenibacillus cookii</i>
Род
3,15
537
1b
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,84
538
1c
<i>Brevibacillus choshinensis</i>
Род
1,05
523
1d
<i>Brevibacillus brevis/</i><i>Brevibacillus parabrevis</i>
Род
1,91
523
1e
<i>Brevibacillus choshinensis</i>
Род
1,05
523
2a
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,37
538
2b
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,83
539
3a
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,37
538
3b
<i>Brevibacillus choshinensis</i>
Род
1,05
523
4b
Нет сходства
9,73
518
4c
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,84
538
5a
<i>Lactobacillus parafarraginis</i>
Виды
0,18
561
5b
<i>Paenibacillus chibensis</i>
Виды
0,65
538
5c
Нет сходства
9,73
518
Пример 5
Биодеградация хитинсодержащих материалов
В этом примере описаны иллюстративные способы биодеградации хитинсодержащих биологических материалов с использованием микробного консорциума A1001. Однако специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, могут быть также использованы для успешной биодеградации хитинсодержащих биологических материалов.
Отходы креветок получали с заводов по переработке креветок и транспортировали в закрытых охлажденных контейнерах. После проверки качества сырья отходы креветок гомогенизировали для уменьшения размера частиц до около 3-5 мм. Предварительно активированные микробные культуры A1001 (около 0,2-100 мл/л) и сахарозу (около 5 г/л) смешивали с гомогенизированными отходами креветок (около 50 г/л) и перемешивали до получения гомогенной смеси. При непрерывном перемешивании температуру поддерживали при температуре окружающей среды (примерно 19-35°C) и рН доводили до 3,5-4,0 с помощью лимонной кислоты. Смешанные ингредиенты переносили в подвергнутую санитарной обработке ферментационную емкость (25000 л) и подвергали ферментации при 30-36°С в течение 120 часов. Перемешивание проводили в течение 30 минут по меньшей мере два раза в день. В ходе способа ферментации контролировали уровень рН, и общую титруемую кислотность (ТТА,%) определяли путем титрования 0,1 N NaOH. Ферментацию останавливали при достижении значения ТТА около 3,5% и/или значения рН около 4-5.
Ферментированные культуры подавали в декантер непрерывного действия. Отделенный на стадии декантирования слой твердого вещества подвергали центрифугированию для удаления липидного слоя. Очищенную жидкость (HYTb) смешивали с сахаром (таким как меласса, 10 об.%), затем хранили в резервуарах или разливали в контейнеры. Твердые материалы, полученные на стадии декантирования, сушили перегретым воздухом при 120°С до достижения содержания влаги менее 8%, а затем измельчали до 200 меш. Высушенный продукт (HYTс) упаковывали в мешки или пакеты.
Пример 6
Биодеградация хитина
В этом примере описаны иллюстративные способы биодеградации хитина с использованием микробного консорциума A1001. Однако специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также могут быть использованы для успешной биодеградации хитина.
Микробную культуру A1001 предварительно активировали с помощью сахара (около 2,5 г/л) в резервуаре объемом 10000 л в течение трех дней. Активированный инокулят смешивали с белковым гидролизатом, таким как HYTb (около 500 мл/л), и хитином (HYTc, например, полученном, как описано в примере 5). Смесь осторожно перемешивали в течение 1 часа до достижения полной гомогенизации. Смесь ферментировали в течение 20 дней при температуре окружающей среды (например, около 19-35°С) при перемешивании в течение примерно 8 часов ежедневно и контроле рН (рН 4,0-5,0). Образцы можно собирать периодически, например, каждые два дня, для количественного определения глюкозамина и необязательно хитозана. После завершения ферментации смесь фильтровали через фильтр, удерживающий частицы размером 300 меш, в основном оставшийся хитин. Фильтрат сохраняли и бутилировали после определения характеристик продукта.
Пример 7
Обработка поля, занятого зерновыми культурами, микробными композициями
В этом примере описан иллюстративный способ получения повышенной урожайности зерновых культур с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также могут быть использованы для повышения урожайности.
Обработка поля, занятого зерновыми культурами, микробной композицией, аналогичной A1001, или HYTb, показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно для участков, обработанных микробной композицией или HYTb (Test), и контрольных участков (Check).
В испытании 1 оценивали урожай после добавления микробной композиции к типичной азотной подкормке (1 л/акр микробной композиции; жидкое удобрение 32 UAN; Test), вносимой на стадии V2, по сравнению с необработанным контролем (Check). В двух крупномасштабных испытаниях на повторных полосах (Replicated Strip Trials) (общая площадь 1 акр) урожай на тестируемых (Test) полосах был на 8%-10% выше, чем на параллельных контрольных полосах (Check) (фигура 4А).
Испытание 2 показало, что внесение в борозды и добавление в междурядья оказались одинаково эффективными в отношении увеличения урожая зерна. В испытании на полосах на площади в 1 акр большие участки обрабатывали микробной композицией, добавленной в борозды, во время посева семян (1 л/акр) или на стадии V2 в качестве подкормки в междурядья (3 галлона жидкого удобрения NPK, 1 литр смеси питательных микроэлементов). Оба способа применения показали, что тестируемые (Test) полосы имели увеличение урожая примерно на 5% , около 10 буш/акр по сравнению с контролями (фигура 4B). Добавление коммерческой смеси 10% гуминовой кислоты/биостимулятора в тестируемую (Actuate) борозду показало такое же увеличение урожая на 5%, как и добавление отдельно взятой микробной композиции, по сравнению с необработанным контролем (фигура 4В).
Испытание 3 показало, что добавление азот-стабилизирующих продуктов либо не оказало влияния, либо незначительно стимулировало эффект микробной композиции в отношении повышения урожая зерновых и дополнительно подтвердило стабильное стимулирование урожая микробной композицией, вносимой в борозду или в смеси с подкормкой (фигура 4С). В испытании на полосах на площади в 1 акр обработки борозд и междурядей показали увеличение урожая на 3% (8 буш/акр) по сравнению с контролем (Check). Добавление Actuate вызвало незначительное увеличение урожая (увеличение урожая на 4%, на 9 буш/акр выше по сравнению с контролем). Добавление азот-стабилизирующих продуктов, Instinct или N-Kress, не вызвало никакого эффекта (умеренное увеличение урожая на 2,5% для Instinct) или немного более высокое увеличение урожая (увеличение урожая на 4,6% для N-Kress, на 11 буш/акр выше по сравнению с контролем).
Испытание 4 показало, что HYTb, вносимый в борозду, также повысил урожай по сравнению с контрольными участками. В испытаниях на 20 акрах HYTb добавляли во вносимую в борозды смесь удобрения/питательных веществ (1 л/акр). По сравнению с параллельной контрольной площадью (Check) обработанные HYTb акры показали увеличение урожая на 3,5% (7 буш/акр) (фигура 4D).
Испытание 5 показало, что при оценке в испытании на повторных участках одна инокуляция почвы с зерновыми микробной композицией при норме расхода 1 л/акр в борозды на стадии V6, осуществляемая вместе с удобрением, содержащим 28% азота, путем капельного орошения, обеспечила увеличение урожая на 14% по сравнению с необработанным контролем на пяти повторных участках (фигура 4Е).
Испытание 6 показало, что отдельное применение HYTb в виде внекорневой обработки зерновых также обеспечило увеличение урожая на 9,5% по сравнению с необработанным контролем при испытании на рандомизированных повторных участках. Листья опрыскивали HYTb два раза при норме расхода 1 л/акр для каждого применения на стадии V8 и стадиях VT (фигура 4F).
Испытание 7 также представляло собой испытание, проводимое на рандомизированных и повторных участках зерновых в условиях дефицита воды. В этом испытании количество поливов было ограниченно 11 дюймами воды по сравнению с соответствующими обводненными участками, которые получали 17 дюймов орошения. Одна обработка микробной композицией при норме расхода 1 л/акр, проводимая на стадии V6 с удобрением, содержащим 28% азота, путем капельного орошения (Treated), показала увеличение урожая на 38% по сравнению с участками, обработанными только удобрением (необработанные Check). Увеличение собранного урожая, наблюдаемое при обработке микробной композицией, составляет потенциально 31 буш/акр (фигура 4G).
Пример 8
Обработка пшеницы микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенного урожая пшеницы с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, могут быть также использованы для повышения урожайности.
Обработка пшеницы микробной композицией, аналогичной A1001, или HYTb показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно на участках, обработанных микробной композицией или HYTb (Test) и контрольных участках (Check).
Испытание 1 показало значительное увеличение урожая пшеницы, стимулированное внесением в почву микробной композиции. В этом испытании, проводимом на 80 акрах, микробную композицию добавляли при норме расхода 1 л/акр в смесь удобрений для поверхностной подкормки на стадии S4. Собранный урожай показал увеличение на 11% (10 буш/акр) при использовании микробной композиции (фигура 5А).
В испытании 2 сравнивали три больших испытания в одной и той же географической области на общей площади в 271 акр, обработанной микробной композицией (test), и на площади в 354 акра параллельной необработанной пшеницы (control). Все испытания проводили одинаково, при этом микробную композицию (1 л/акр) добавляли в смесь удобрения для поверхностной подкормки и вносили на стадии роста пшеницы S4. По сравнению с параллельными контрольными акрами на той же самой ферме, обработанная пшеница показала более высокий урожай с увеличением в диапазоне от 6% до 17% до 36%, при этом среднее увеличение урожая на трех фермах составило около 16% (фигура 5В).
В испытании 3 оценивали обработку микробной композицией и HYTb пшеницы в комбинации и обнаружили, что комбинация повысила урожай. В большом круговом испытании (129 акров) микробную композицию применяли перед посевом при норме расхода 1 л/акр, вносимую с обычной питательной программой, и с последующим круговым внесением HYTb в виде внекорневого распыления (1 л/акр) плюс гербицид на стадии роста пшеницы S6. По сравнению с необработанным контролем (Check) обработанная площадь показала на 10% (14 буш/акр) более высокий по сравнению с контрольной площадью (фигура 5C). Дополнительно, типичные растения пшеницы с обработанных участков имели визуально больше корней, чем необработанные контроли (фигура 5D).
Пример 9
Обработка томатов микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенного урожая томатов с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области техники будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, могут быть также использованы для повышения урожайности.
Обработка томатов микробной композицией, полученной аналогично A1001, показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями были идентичными и проводились одновременно на участках, обработанных микробной композицией (Test), и на контрольных (Check) участках.
В испытании 1 оценивали обработку микробной композицией томатов, проводимую при норме расхода 1 л/акр с одним применением при пересадке (в воде, даваемой при пересадке растений) с последующим нанесением путем капельного орошения каждые три недели (четыре раза). На тестируемом участке в 10 акров по сравнению с контрольным участком в 10 акров обработанная площадь показала примерно на 8% более высокий урожай по сравнению с контролем (фигура 6A).
В испытании 2 оценивали обработку микробной композицией томатов, проводимую при норме расхода 1 л/акр путем капельного орошения каждые три недели (пять раз). На тестируемом участке в 49,6 акров по сравнению с контрольным участком в 4,45 акров, обработанная площадь показала примерно на 9% более высокий урожай по сравнению с контролем (фигура 6В).
В испытании 3 оценивали обработку микробной композицией томатов, проводимую при норме расхода 1 л/акр с одним применением при пересадке (в воде, даваемой при пересадке растений) с последующим нанесением путем капельного орошения каждые три недели (три раза). На тестируемом участке в 15,6 акров по сравнению с контрольным участком в 73,2 акров обработанная площадь показала примерно на 29% более высокий урожай по сравнению с контролем (фигура 6C).
В испытании 4 оценивали обработку микробной композицией томатов, проводимую при норме расхода 1 л/акр путем капельного орошения каждые три недели (четыре раза). На тестируемом участке в 8,7 акров по сравнению с контрольным участком в 6,57 акров обработанная площадь показала более низкий урожай по сравнению с контролем (фигура 6D). Однако на испытание повлияло серьезное заболевание (Fusarium), которое, по-видимому, повлияло на результат испытания. Дополнительно, это испытание проводилось на участке относительно небольшого размера, и также включало различную обработку сельскохозяйственных культур.
В испытании 5 оценивали обработку микробной композицией томатов, проводимую при норме расходе 1 л/акр в сочетании с обработкой удобрением. Одно внесение проводили при пересадке с 8-7-7, с последующим применением путем капельного орошения каждые три недели (три раза) с UAN. На тестируемом участке в 33,3 акров по сравнению с контрольным участком в 16,45 акров обработанная площадь показала урожай примерно на 5% выше по сравнению с контролем (фигура 6E).
Пример 10
Обработка подсолнечника микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности подсолнечника с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, могут быть также использованы для повышения урожайности.
Обработка культуры подсолнечника микробной композицией, приготовленной аналогично A1001, показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно на участках, обработанных микробной композицией (Test), и на контрольных (Check) участках.
В этом испытании оценивали обработку подсолнечника микробной композицией, проводимую при норме расхода 1 л/акр путем капельного орошения через 30 дней и 60 дней после посадки. На тестируемом участке в 93,5 акров по сравнению с контрольным участком в 97,13 акров обработанная площадь показала примерно на 50% более высокий урожай по сравнению с контролем (фигура 7). Дополнительно, обработка вызвала увеличение скорости прорастания.
Пример 11
Обработка риса микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности риса с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, могут быть также использованы для повышения урожайности.
Обработка риса микробной композицией, полученной аналогично A1001, показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно на участках, обработанных микробной композицией (Test), и на контрольных (Check) участках.
В данном испытании оценивали обработку микробной композицией риса, проводимую при норме расхода 1 л/акр водным раствором аммиака. На тестируемом участке в 61,8 акров по сравнению с контрольным участком в 100,7 акров обработанная площадь показала примерно на 6% более высокий урожай по сравнению с контрольным участком (фигура 8).
Пример 12
Обработка сои микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности сои с использованием микробного консорциума. Специалистам в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также можно применять для повышения урожайности.
Обработка сои микробной композицией, полученной аналогично A1001, или HYTb показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями были идентичными и проводились одновременно для участков, обработанных микробной композицией или HYTb (Test), и контрольных участков (Check).
Испытание 1 показало увеличение урожая сои, стимулированное применением HYTb при норме расхода 1 л/акр совместно с фунгицидом. В двух испытаниях на участке в 1 акр обработанная площадь показала примерно на 5% более высокий урожай по сравнению с контрольным участком (фигура 9А).
В испытании 2 оценивали обработку микробной композицией или микробной композицией плюс HYTb сои, проводимую при 1 л/акр путем внекорневого нанесения и внесения в междурядья. Обработанная площадь имела пониженный урожай по сравнению с контролем (фигура 9В). Однако на испытание повлиял малый размер участка, а также проблемы, связанные с дикими животными (олени размножались и потребляли бобы до сбора урожая).
Испытание 3 показало увеличение урожая сои, стимулированное применением HYTb при 0,5 л/акр, проводимым с фунгицидом путем внекорневого нанесения. На участке в 60 акров по сравнению с контрольным участком в 26,48 акров обработанная площадь показала примерно на 12% более высокий выход по сравнению с контролем.
Пример 13
Обработка клубники микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности клубники с применением микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также можно применять для повышения урожайности.
Обработка клубники микробной композицией, полученной аналогично A1001, плюс HYTb показала увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями были идентичными и проводились одновременно на обработанных участках (Test) и на контрольных участках (Check).
Увеличение кумулятивной товарной продукции было стимулировано применением микробной композиции и HYTb путем капельного орошения. В этих пяти независимых испытаниях оценивали сорт Sabrina в провинции Уэльва Испании. За неделю до пересадки рассады на участки с приподнятыми грядками 2 л микробной композиции плюс 4 л HYTb разбавляли в воде и добавляли в капельное орошение на гектар с такой же нормой расхода, как на неделях 2, 4 и 6 после посадки. На неделях 3, 5 и 7 разбавленную микробную композицию добавляли при норме расхода 1 л/га и разбавленный HYTb при норме расхода 2 л/га. С недели 9 до конца сезона сбора урожая разбавленную микробную композицию и HYTb добавляли при норме расхода 1 л/га каждой. Во всех пяти испытаниях стимулированный обработкой урожай был выше на 5-11% по сравнению с параллельными необработанными участками, при этом в среднем по пяти испытаниям урожай увеличился примерно на 8% (фигура 10).
Пример 14
Обработка свеклы микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности свеклы с применением микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также можно применять для повышения урожайности.
Обработка свеклы микробной композицией, полученной аналогично A1001, плюс HYTb, показала увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями были идентичными и проводились одновременно как на обработанных (Test), так и на контрольных (Check) участках.
Увеличение средней массы собранной массы собранного корнеплода была стимулирована применением микробной композиции (2 л/акр) и HYTb (2 л/акр), вносимых путем капельного орошения, и HYTb (1 л/акр) путем внекорневой подкормки. На тестируемом участке в 8 акров по сравнению с контрольным участком в 9 акров обработанная площадь показала примерно в 2,2 раза более высокий урожай по сравнению с контролем (фигура 11).
Пример 15
Обработка белокочанной капусты микробными композициями
В этом примере описан репрезентативный способ получения увеличенной урожайности белокочанной капусты с использованием микробного консорциума. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также можно применять для повышения урожайности.
Обработка белокочанной капусты микробной композицией, полученной аналогично A1001, или HYTb показала значительное увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно на участках, обработанных микробной композицией или HYTb (Test), и на контрольных участках (Check).
Испытания показали увеличение урожая капусты, стимулированное применением микробной композиции (2 л/акр) и HYTb (2 л/акр), вносимых путем капельного орошения, и HYTb (1 л/акр) путем внекорневой подкормки. Капусту собирали в два цикла, представленных как «первая срезка» кочанов капусты и более поздняя «вторая срезка» кочанов капусты. Как показано на фигуре 12A, на тестируемом участке в 10,9 акров по сравнению с контрольным участком в 14,9 акров обработанная площадь показала примерно на 18% более высокий урожай по сравнению с контролем (первая срезка) и примерно на 31% более высокий урожай по сравнению с контролем (вторая срезка). Как показано на фигуре 12B, на тестируемом участке в 3,7 акров по сравнению с контрольным участком в 1,5 акра обработанная площадь показала примерно на 61% более высокий урожай по сравнению с контрольным участком (первая срезка) и примерно на 64% более высокий урожай по сравнению с контрольным участком (вторая срезка).
Пример 16
Обработка семян и клубней HYTd
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенной урожайности пшеницы и картофеля с использованием предварительной обработки семян или семенных клубней HYTd. Специалисту в данной области будет понятно, что способы, которые отличаются от этих конкретных способов, также можно применять для повышения урожайности.
Обработка семян пшеницы или семенных клубней картофеля перед посадкой HYTd, полученным с использованием микробного консорциума, аналогичного A1001, показала увеличение конечного собираемого урожая. Все агрономические приемы внесения удобрений, культивирования, борьбы с сорняками и вредителями, были идентичными и проводились одновременно на обработанных (Test) и контрольных (Check) участках.
Для пшеницы семена обрабатывали в разбавленной суспензии HYTd, разбавленной при норме расхода 3 мл HYTd в воде на кг семян. После покрытия семян и сушки на воздухе обработанные семена высаживали и сравнивали с идентичными участками, засеянными необработанными семенами. Параллельные участки поля в один акр показали увеличение примерно на 22% собранного урожая пшеницы (таблица 3).
Обработку семенного картофеля выполняли путем разбавления HYTd в воде и обработки семенного картофеля при норме расхода 1 мл на кг семенного картофеля. После сушки на воздухе обработанный семенной картофель высаживали параллельно с необработанным контрольным семенным картофелем на повторных участках длиной 1200 метров. Обработанный HYTd семенной картофель показал увеличение от 32% до 35% урожая картофеля в двух отдельных испытаниях (таблица 4).
Таблица 3. Урожай, полученный после обработки HYTd семян пшеницы
Обработка
Доза(мл/кг семян)
Масса соломы/5 м<sup>2</sup> площади (кг)
Масса зерен/5 м<sup>2</sup> площади (кг)
Урожай (кг/акр)
HYTd
3,00
9,8
2,6
1980
Необработанные
нет
5,5
1,7
1610
Таблица 4. Урожай, полученный после обработки HYTd семенного картофеля
Обработка
Доза(мл/кг семян)
Кол-во клубней /растение
Масса клубней/м<sup>2</sup> (кг)
Конечный урожай (кг/акр)
% увеличения урожая клубней
Испытание 1
HYTd
1,00
11
3,15
12448
32
Необработанные
нет
6
1,68
9440
0
Испытание 2
HYTd
1,00
8
2,52
10720
35
Необработанные
нет
5
1,47
7932
0
Пример 17
Увеличенная устойчивость к стрессу у картофеля
В этом примере описан репрезентативный способ получения повышенного качества клубней картофеля путем обработки микробной композицией, аналогичной A1001, и HYTb во время роста в стрессовых полевых условиях.
Картофель сорта Russet Burbank выращивали в обычных условиях в испытании на повторных участках (четыре повтора) и обрабатывали (микробная композиция плюс HYTb при норме расхода 1 л каждого на акр при посадке, в борозды, с последующими двумя применениями HYTb путем внекорневого опрыскивания при норме расхода 1 л/акр через 55 дней и повторно через 85 дней после посадки) или не обрабатывали (контроль). Сорт Russet Burbank имеет тенденцию к снижению качества в условиях водного, теплового или питательного стресса. В этом испытании обработка микробной композицией и HYTb повысила устойчивость к индуцированному стрессом дефекту качества, называемому «hollow heart» (растрескивание и потемнение мякоти картофеля). Участки, обработанные микробной композицией, имели частоту появления дефекта «hollow heart» 1,68% среди собранных клубней по сравнению с контрольным участком, показавшим частоту появления дефекта «hollow heart» 8,35% (таблица 5).
Таблица 5. Дефекты качества картофеля «hollow heart»
Обработка
Урожай (кг/акр)
Процент с «hollow heart»
Необработанные (контроль)
32,181
8,35%
Микробная композиция плюс HYTb
32,636
1,68%*
* p<0,01 по сравнению с необработанными
Пример 18
Анализ силы роста огурцов
Быстрые функциональные анализы на основе растений могут быть использованы для быстрой оценки ответа растения на новые микробные композиции. Используя анализ силы роста огурцов и анализ роста растения, в этом примере показано, что А1001 повышает скорость роста и распространения листьев растений.
После предварительного проращивания в течение четырех дней рассады огурцов в свернутой в рулон бумаге для проращивания, пропитанной питательными веществами, проросшие и синхронизированные растения обрабатывали разбавленной смесью жидкого удобрения и микробного консорциума. Ростки пересаживали в подготовленную беспочвенную среду для выращивания, предварительно обработанную удобрением и тестируемым раствором. Микробную композицию А1001 разбавляли 1:2000 в питательной среде удобрения. В качестве контрольной обработки в питательную среду для сравнения добавляли эквивалентное количество воды. По меньшей мере 16 растений из каждой обработки, выращенных в горшках, включая контрольные растения, распределяли по ровной поверхности и выращивали при определенных условиях роста, контролируя температуру и освещение. Через 18 дней измеряли индекс листовой поверхности (Leaf Area Index, LAI) первого настоящего листка каждого растения. Также, записывали массу всего растения во влажном состоянии. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (Analysis Of Variance) и апостериорного теста Тьюкки для сравнения образцов в пределах эксперимента.
На день 18 показатель LAI первого листа, стимулированный обработкой А1001, был значительно выше по сравнению с контролем (фигура 13).
В дополнение или в качестве альтернативы вышесказанному описаны следующие варианты осуществления:
Вариант осуществления 1 относится к композиции, содержащей микробы, депонированные в АТСС под номером доступа РТА-121750 (A1001).
Вариант осуществления 2 относится к композиции, содержащей пять или более видов микробов, выбранных из Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp., Ruminococcus spp., Leptolyngbya spp., Aquabacterium spp., Leptospirillum spp., Paenibacillus spp., Microcoleus spp., Pseudomonas spp., Clostridium spp., Xenococcus spp., Acetobacter spp., Candidatus spp. и Methanosaeta spp.
Вариант осуществления 3 относится к композиции, содержащей десять или более видов микробов, выбранных из Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp., Ruminococcus spp., Leptolyngbya spp., Aquabacterium spp., Leptospirillum spp., Paenibacillus spp., Microcoleus spp., Pseudomonas spp., Clostridium spp., Xenococcus spp., Acetobacter spp., Candidatus spp. и Methanosaeta spp.
Вариант осуществления 4 относится к композиции, содержащей каждый из Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Lactobacillus spp., Ruminococcus spp., Leptolyngbya spp., Aquabacterium spp., Leptospirillum spp., Paenibacillus spp., Microcoleus spp., Pseudomonas spp., Clostridium spp., Xenococcus spp., Acetobacter spp., Candidatus spp. и Methanosaeta spp.
Вариант осуществления 5 относится к любому из вариантов осуществления 1-4, дополнительно содержащему один или несколько из хитина, хитозана, глюкозамина и аминокислот.
Вариант осуществления 6 относится к способу, включающему:
смешивание хитинсодержащего биологического материала с композицией по любому из вариантов осуществления 1-5 с образованием смеси;
ферментацию смеси; и
разделение ферментированной смеси на твердую, водную и липидную фракции.
Вариант осуществления 7 относятся к способу согласно варианту осуществления 6, отличающемуся тем, что хитинсодержащий биологический материал содержит водное животное или отходы водного животного, насекомое или грибы.
Вариант осуществления 8 относится к способу согласно варианту осуществления 7, отличающемуся тем, что водное животное представляет собой водного членистоногого.
Вариант осуществления 9 относится к способу согласно варианту осуществления 8, отличающемуся тем, что водное членистоногое представляет собой креветку, краба или криль.
Вариант осуществления 10 относится к водной фракции, полученной с помощью способа по любому из вариантов осуществления 6-9.
Вариант осуществления 11 относится к твердой фракции, полученной с помощью способа по любому из вариантов осуществления 6-9.
Вариант осуществления 12 относятся к способу, включающему приведение в контакт почвы, растений или частей растений с композицией по любому из вариантов осуществления 1-5.
Вариант осуществления 13 относится к способу согласно варианту осуществления 12, дополнительно включающему приведение в контакт почвы, растений или частей растений с одним или несколькими из хитина, хитозана, глюкозамина и аминокислот.
Вариант осуществления 14 относится к способу согласно варианту осуществления 12 или 13, дополнительно включающему приведение в контакт почвы, растений или частей растений с водной фракцией согласно варианту осуществления 10 или твердой фракцией согласно варианту осуществления 11.
Вариант осуществления 15 относится к способу согласно любому из вариантов осуществления 12-14, дополнительно включающему приведение в контакт почвы, растений или частей растений с жидким удобрением.
Ввиду многих возможных вариантов осуществления, к которым могут быть применены принципы настоящего изобретения, следует понимать, что приведенные варианты осуществления являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Скорее, объем настоящего изобретения определяется следующей формулой изобретения. Таким образом, можно утверждать, что настоящее изобретение находится в пределах объема и сущности этих требований.