ДИСПЛЕЙ НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК ПОЛИПЕПТИДНЫХ ИЗОФОРМ НА ОСНОВЕ ПРОЧИТЫВАНИЯ ТЕРМИНИРУЮЩЕГО КОДОНА

1. Способ селекции по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей представляющий интерес полипептид на искомом уровне, включающий:
а) получение набора эукариотических клеток-хозяина, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую по меньшей мере одну кассету (Cas-POI), содержащую хотя бы первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, а также второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант;
б) культивирование эукариотических клеток-хозяина с целью экспрессии представляющего интерес полипептида таким образом, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде гибридного полипептида, включающего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, причем указанный гибридный полипептид представлен на клеточной поверхности;
в) селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина по наличию или количеству гибридного полипептида, представленного на клеточной поверхности.
2. Способ получения представляющего интерес полипептида с высоким выходом, который включает:
а) получение набора эукариотических клеток-хозяина, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающий по меньшей мере одну кассету (Cas-POI), содержащую хотя бы первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, а также второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант;
б) культивирование эукариотических клеток-хозяина с целью экспрессии представляющего интерес полипептида таким образом, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде гибридного полипептида, включающего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант, причем указанный гибридный полипептид представлен на клеточной поверхности;
в) селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина по наличию или количеству гибридного полипептида, представленного на клеточной поверхности;
г) культивирование полученной в результате селекции эукариотической клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию представляющего интерес полипептида.
3. Способ по п.1 или 2, в котором экспрессия кассеты (Cas-POI) приводит к транскрипту, содержащему по крайней мере
- первый полинуклеотид, причем трансляция указанного первого полинуклеотида приводит к представляющему интерес полипептиду;
- по меньшей мере один терминирующий кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно упомянутого первого полинуклеотида;
- второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно упомянутого терминирующего кодона, причем трансляция указанного второго полинуклеотида приводит к иммуноглобулиновому трансмембранному якорному домену или его функциональному варианту,
где по меньшей мере часть транскрипта транслируется в гибридный полипептид, включающий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант в результате трансляционного прочитывания хотя бы одного терминирующего кодона.
4. Способ по п.1 или 2, в котором иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен выбран из группы, включающей
а) трансмембранный якорь, производный от IgA, IgE, IgM, IgG и/или IgD,
б) иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, включающий цитоплазматический домен,
в) иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 и/или SEQ ID NO:7 и
г) функциональные варианты вышеперечисленного, обеспечивающие закрепление гибридного полипептида не поверхности эукариотической клетки-хозяина.
5. Способ по п.1 или 2, в котором стадия в) включает взаимодействие набора эукариотических клеток-хозяина с детектирующим соединением, которое связывается с гибридным белком, а также селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина по наличию или количеству связанного детектирующего соединения.
6. Способ по п.3, в котором прочитывание терминирующего кодона приводит к приблизительно ≤50%, ≤25%, ≤15%, ≤10%, ≤5%, ≤2,5%, ≤1,5%, ≤1% или менее 0,5% гибридного полипептида.
7. Способ по п.1 или 2, в котором осуществляют два или более цикла селекции, причем на каждом цикле осуществляют селекцию по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина по наличию или количеству представленного на клеточной поверхности гибридного полипептида.
8. Способ по п.5, в котором связывание детектирующего соединения с поверхностью эукариотической клетки-хозяина определяется с помощью проточной цитометрии.
9. Нуклеиновая кислота-вектор, подходящая для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес полипептида в эукариотической клетке-хозяина, включающая
а) по меньшей мере одну кассету (Cas-POI), содержащую сайт встраивания для первого полинуклеотида (Pn-POI), кодирующего представляющий интерес полипептид, и/или первый полинуклеотид, представляющий интерес полипептид,
б) по меньшей мере один терминирующий кодон по направлению экспрессии относительно указанного сайта встраивания и/или по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, и
в) второй полинуклеотид по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант.
10. Нуклеиновая кислота-вектор по п.9, включающая хотя бы одну из нижеперечисленных характеристик:
- первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, в кассете (Cas-POI);
- экспрессионную кассету (MSM), включающую селектируемый маркерный ген млекопитающего; и/или
- экспрессионную кассету (MASM), включающую амплифицируемый селектируемый маркерный ген млекопитающего.
11. Нуклеиновая кислота-вектор по п.9 или 10 для экспрессии по меньшей мере одной молекулы иммуноглобулина или ее функционального варианта, включающий
- экспрессионную кассету (Ехр-POI), содержащую первый полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или его функциональный фрагмент, по меньшей мере один терминирующий кодон по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида и второй полинуклеотид по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант; и
- дополнительную экспрессионную кассету (Ехр-POI'), включающую полинуклеотид, кодирующий соответствующую легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент.
12. Способ получения нуклеиновой кислоты-вектора по п.9 или 10, который включает сборку по меньшей мере одной кассеты (Cas-POI) в векторе таким образом, что упомянутая кассета (Cas-POI) включает первый полинуклеотид (Pn-POI), кодирующий представляющий интерес полипептид, по меньшей мере один терминирующий кодон по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида и второй полинуклеотид по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант.
13. Эукариотическая клетка-хозяина, отвечающая по меньшей мере одной из ниже перечисленных характеристик:
а) получена способом по п.1;
б) включает кассету (Cas-POI), содержащую по крайней мере гетерологичный полипептид, кодирующий представляющий интерес полинуклеотид, по меньшей мере один терминирующий кодон по направлению экспрессии относительно указанного гетерологичного полипептида и полинуклеотид по направлению экспрессии относительно терминирующего кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен или его функциональный вариант; и/или
в) включает нуклеиновую кислоту-вектор по п.9 или 10.
14. Способ получения представляющего интерес полипептида, в котором для экспрессии представляющего интерес полипептида культивируют эукариотическую клетку-хозяина по п.13.
15. Способ получения представляющего интерес полипептида согласно п.2 или 14, в котором осуществляют по меньшей мере один из ниже перечисленных стадий:
- получают полипептид из клеточной культуры;
- полипептид секретируется в культуральную среду, и его получают оттуда;
- эукариотические клетки-хозяина разрушают для получения экспрессируемого полипептида;
- экспрессируемый полипептид выделяют;
- экспрессируемый полипептид подвергают очистке; и/или
- экспрессируемый полипептид подвергают дополнительным манипуляциям и/или модифицируют.