ОБЛАСТИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ МАТРИКСА (MAR) ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ТРАНСКРИПЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Экспрессионная система для экспрессии высокого уровня по меньшей мере одного гена, включающая:
промотор для оперативного сцепления с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интересующий ген, и
по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, для усиления экспрессии указанного гена в клетке, трансформированной указанной экспрессионной системой,
где указанная нуклеотидная последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, повышает экспрессию указанного гена примерно в 2, примерно в 3, примерно в 4, примерно в 5, примерно в 6, примерно в 7, примерно в 8, примерно в 9, примерно в 10 раз или более после трансформации указанной клетки указанной конструкцией.
2. Экспрессионная система по п.1, где экспрессионная кассета, содержащая указанный промотор и указанную нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий ген, оперативно сцеплена с промотором.
3. Экспрессионная система по любому из пп.1 и 2, где указанная по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, представляет собой нуклеотидную последовательность MAR грызунов, такую как нуклеотидная последовательность MAR мыши или хомячка.
4. Экспрессионная система по п.1 или 2, где указанная нуклеотидная
последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, включает:
(i) SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 10 или ее функциональный фрагмент; либо
(ii) нуклеотидную последовательность, имеющую примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% идентичности последовательности с любой из последовательностей (i).
5. Экспрессионная система по п.1 или 2, где указанный ген экспрессируется в клетке млекопитающего, отличного от человека, такой как клетка грызуна, в частности, клетка мыши или хомячка, или в человеческой клетке, такой как клетка HeLa.
6. Экспрессионная система по п.1 или 2, где указанная по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, действует в цис или транс положении на указанном гене.
7. Способ усиленного продуцирования белка в клетке, при котором
получают клетку человека или млекопитающего, отличного от человека,
вводят экспрессионную систему по любому из пп.1-6 в указанную клетку таким образом, что экспрессия гена повышается примерно в 2, примерно в 3, примерно в 4, примерно в 5, примерно в 6, примерно в 7, примерно в 8, примерно в 9, примерно в 10 раз или более.
8. Изолированная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая:
(а) нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3 или SEQ ID No. 10 или ее функциональный фрагмент, либо
(б) нуклеотидную последовательность, которая имеет по меньшей мере примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 98% идентичности последовательности с последовательностью (а) и обладает активностью MAR.
9. Способ идентификации последовательностей MAR млекопитающего, отличного от человека, при котором:
получают по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты млекопитающего, отличного от человека, предпочтительно геном млекопитающего, отличного от человека, или его часть,
подвергают указанную молекулу нуклеиновой кислоты методике сканирования на последовательности MAR, включающей:
установку размера окна для молекул нуклеиновой кислоты, подлежащих оцениванию,
выбор по меньшей мере 1 или по меньшей мере 2, предпочтительно 3, более предпочтительно 4 или более признаков, связанных с MAR,
установку пороговых значений для последовательностей, проявляющих этот/эти признаки, и
выбор нуклеотидных последовательностей-кандидатов MAR, превышающих эти пороговые значения,
подтверждение того, что указанная нуклеотидная последовательность MAR млекопитающего, отличного от человека, повышает экспрессию гена примерно в 2, примерно в 3, примерно в 4, примерно в 5, примерно в 6, примерно в 7, примерно в 8, примерно в 9, примерно в 10 раз или более после трансформации клетки человека и/или млекопитающего, отличного от человека, экспрессионной системой, содержащей указанные нукпеотидные последовательности MAR млекопитающего, отличного от человека.
10. Способ по п.9, где указанный по меньшей мере один признак может представлять собой угол изгиба ДНК, глубину большой бороздки, ширину малой бороздки, температуру плавления или их комбинации.
11. Способ по п.10, где значения угла изгиба ДНК включают значения между примерно 3 и примерно 5° (радиальные градусы), предпочтительно между примерно 3,8 и примерно 4,4°, включая примерно 3,9, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2 и примерно 4,3°.
12. Способ по п.10 или 11, где значения глубины большой бороздки находятся между примерно 8,9 и примерно 9,3 Е, а значения ширины малой бороздки находятся между примерно 5,2 и примерно 5,8 Е, предпочтительно значения глубины большой бороздки находятся между примерно 9,0 и примерно 9,2 Е, включая примерно 9,1 Е, а значения ширины малой бороздки могут находиться между примерно 5,4 и примерно 5,7 Е, включая примерно 5,5 Е и примерно 5,6 Е.
13. Способ по п.10 или 11, где температура плавления находится между примерно 55 и примерно 75°С, в частности, между примерно 55 и примерно 62°С, включая примерно 56, примерно 57, примерно 58, примерно 59, примерно 60 и примерно 61°С.
14. Способ по п.10, где значения угла изгиба ДНК составляют от примерно 4,0 до примерно 5,0°, включая примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8 и примерно 4,9°.
15. Способ по п.14, где указанные значения угла изгиба ДНК объединяют со значениями окна в интервале от примерно 50 п.о. до примерно 150 п.о., включая, например, примерно 80 п.о., примерно 100 п.о. и примерно 120 п.о.
16. Способ по п.10, где значение угла изгиба ДНК, умноженное на значение размера окна, равняется примерно от 320 до 1320, как, например, от примерно 420 до примерно 1220, от примерно 520 до примерно 1120, от примерно 620 до примерно 1020, от примерно 720 до примерно 920, значение глубины большой бороздки, умноженное на значение размера окна, равняется от примерно 900 до примерно 4000, как, например, от примерно 1200 до 3700, от примерно 1500 до примерно 3400, от примерно 1800 до примерно 3100, от примерно 2100 до примерно 2800 и/или значение ширины малой бороздки, умноженное на значение размера окна, равняется от примерно 500 до примерно 2500, как, например, от примерно 750 до примерно 2250, от примерно 1000 до примерно 2000, от примерно 1250 до 1750.
17. Способ по любому из пп.9-11 или 14-16, дополнительно включающий:
получение экспериментально подтвержденных MAR человеческого или не человеческого происхождения;
определение указанных пороговых значений, используя указанные экспериментально подтвержденные MAR человеческого или не человеческого происхождения.
18. Конструкция MAR, содержащая:
(а) (i) изолированную нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере часть концевой области идентифицированной MAR, и
(ii) дополнительную изолированную нуклеотидную последовательность, содержащую примерно 10%, примерно 15%, примерно 20%, примерно 25%, примерно 30% или более указанной идентифицированной MAR или другой идентифицированной MAR; либо
(б) (i) нуклеотидную последовательность, имеющую примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97% примерно 98%, примерно 99% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью (a)(i), и
(ii) нуклеотидную последовательность, имеющую примерно 70%, примерно 80%, предпочтительно примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97% примерно 98%, примерно 99% идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью (б)(i).
19. Конструкция MAR по п.18, где указанная нуклеотидная последовательность в (a)(ii) содержит АТ-богатую область.
20. Конструкция MAR по п.18 или 19, где указанная конструкция MAR содержит менее чем примерно 90%, предпочтительно менее чем примерно 80%, даже более предпочтительно менее чем примерно 70%, менее чем примерно 60% или менее чем примерно 50% числа нуклеотидов идентифицированной последовательности MAR.
21. Конструкция MAR по любому из пп.18 и 19, где указанная конструкция MAR содержит примерно такое же или по меньшей мере примерно 110% числа нуклеотидов идентифицированной последовательности MAR.
22. Конструкция MAR, содержащая
области идентифицированной последовательности MAR в последовательном расположении, где порядок и/или ориентация отличается от таковой идентифицированной последовательности MAR.
23. Конструкция MAR по п.22, где указанные области включают по меньшей мере одну АТ-богатую область и по меньшей мере одну область сайта связывания.
24. Конструкция MAR по п.22 или 23, где указанная конструкция MAR дополнительно содержит по меньшей мере часть по меньшей мере одной области сайта связывания, и где указанная по меньшей мере часть указанной по меньшей мере одной области сайта связывания возможно имеет происхождение из указанной идентифицированной последовательности MAR.
25. Конструкция MAR по п.22 или 23, где указанная идентифицированная последовательность MAR представляет собой человеческую или мышиную MAR.
26. Конструкция MAR по п.22 или 23, где указанные области идентифицированной последовательности MAR или ее частей имеют примерно 70% идентичности последовательности, примерно 80% идентичности последовательности, примерно 90% идентичности последовательности, примерно 95% идентичности последовательности или примерно 98% идентичности последовательности с областями встречающейся в природе человеческой 1_68 MAR или мышиной MAR S4 или их частями.
27. Конструкция MAR по п.22 или 23, где указанные области соответствуют парам оснований 1-1189, 1190-1952 и 1953-3600, соответственно, встречающейся в природе человеческой 1_68 MAR.
28. Конструкция MAR по п.22 или 23, где области представляют собой области специфичной последовательности.
29. Конструкция MAR, содержащая:
(а) внутреннюю нуклеотидную последовательность, содержащую
(i) по меньшей мере одну изолированную или синтетическую АТ-богатую область идентифицированной последовательности MAR; или
(П) по меньшей мере одну АТ-богатую область, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичности последовательности с АТ-богатой областью (а) (i),
(б) нуклеотидную последовательность, содержащую
по меньшей мере один сайт связывания ДНК-белок, прилежащий к указанной нуклеотидной последовательности (а), где указанный сайт связывания представляет собой
(i) сайт связывания ДНК-белок дополнительной идентифицированной последовательности MAR,
(ii) сайт связывания ДНК-белок идентифицированной последовательности MAR (а), где указанный сайт связывания ДНК-белок находится в идентифицированной последовательности MAR расположенным снаружи от внутренней нуклеотидной последовательности (а), либо
(iii) первый сайт связывания ДНК-белок, присутствующий во внутренней последовательности (а), но прилежащий по меньшей мере к одному дополнительному сайту связывания ДНК-белок, где первый и по меньшей мере один из указанных дополнительных сайтов связывания ДНК-белок не являются прилежащими к внутренней последовательности (а), либо
(iv) сайты связывания ДНК-белок последовательности, представляющей собой не MAR.
30. Конструкция MAR по п.29, где указанная конструкция усиливает экспрессию гена, оперативно сцепленного с промотором, примерно в 2, примерно в 3, примерно в 4, примерно в 5, примерно в 6, примерно в 7, примерно в 8, примерно в 9, примерно в 10 раз или более после введения указанной конструкции MAR в клетку.
31. Конструкция MAR по п.29, где указанная конструкция MAR имеет длину менее чем 500 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 250 нуклеотидов, даже более предпочтительно менее чем примерно 200, примерно 150 или примерно 100 нуклеотидов.
32. Конструкция MAR по п.29, указанная внутренняя нуклеиново-кислотная последовательность (а) содержит по меньшей мере один TFBS указанной идентифицированной MAR, где указанный по меньшей мере один TFBS фланкирует указанную АТ-богатую область в идентифицированной MAR с одной стороны или с двух сторон.
33. Конструкция MAR по п.29, где указанный по меньшей мере один сайт связывания ДНК-белок в (б) представляет собой TFBS и модифицирован 1, 2, 3, 4, 5 или большим количеством замен, добавлений и/или делеций и/или полностью или частично синтезирован.
34. Конструкция MAR по п.29, где указанный TFBS, который фланкирует указанную АТ-богатую область, модифицирован 1, 2, 3, 4, 5 или большим количеством замен, добавлений и/или делеций.
35. Конструкция MAR по п.33 или 34, где указанный TFBS представляет собой оптимизированный TFBS без известного природного прототипа.
36. Конструкция MAR по п.29, где указанные сайты связывания выбраны из группы, состоящей из SATB1, NMP4, НОХ, HOXF, Gsh, СЕВР, Fasti и SATB1 или комбинации двух или более чем двух из этих факторов транскрипции.
37. Конструкция MAR по п.29, где серия указанных сайтов связывания ДНК-связывающих белков (б) прилежит к указанной нуклеотидной последовательности (а).
38. Конструкция MAR по п.29, где указанная конструкция MAR представляет собой усиленную конструкцию MAR.
39. Экспрессионная система, содержащая
по меньшей мере одну конструкцию MAR по любому из предшествующих пунктов, и, возможно,
промотор и по меньшей мере один сайт связывания фермента рестрикции для встраивания интересующей нуклеотидной последовательности под контролем указанного промотора.
40. Клетка, содержащая экспрессионную систему по любому из предшествующих пунктов.
41. Трансгенное животное, отличное от человека, содержащее экспрессионную систему по любому из предшествующих пунктов.
42. Набор, содержащий:
экспрессионную систему по любому из предшествующих пунктов и инструкции по применению указанной экспрессионной системы.
43. Способ усиления экспрессии гена, при котором
получают экспрессионную систему, содержащую указанный ген под контролем промотора и конструкции MAR по любому из предшествующих пунктов;
трансфицируют клетку указанной экспрессионной системой, так что экспрессия указанного гена усиливается.
44. Способ по п.43, где указанная экспрессионная система дополнительно усиливает стабильность экспрессии указанного гена.
45. Применение конструкций MAR, экспрессионных систем, трансгенных животных, отличных от человека, наборов и/или способов по любому из предшествующих пунктов при продуцировании белков, таких как антитела, распознающие патогенные белки человека или белки клеточной поверхности человека, и белков, таких как эритропоэтин, интерфероны или другие терапевтические или диагностические белки.
46. Применение конструкций MAR, экспрессионных систем, трансгенных животных, отличных от человека, наборов и/или способов по любому из предшествующих пунктов при генотерапии in vitro и/или in vivo и/или при заместительной терапии клеток или тканей.