ШТАММ PSEUDOMONAS PUTIDA 131, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ДЕСТРУКЦИЮ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
PSEUDOMONAS PUTIDA 131 STRAIN DECOMPOSING PHENOL COMPOUNDS

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки сточных вод химических предприятий, содержащих фенольные соединения.
Известен штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, осуществляющий биологическую деградацию фенола в сточных водах предприятий нефтехимического профиля, а также производства дубильных экстрактов [пат. RU №2077575, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, 1993].
Недостатками данного штамма являются низкая эффективность и длительное время очистки.
Известен штамм бактерий Pseudomonas cepacia ВДК, депонированный под номером ВКПМ В-7559, способный использовать в качестве питательного субстрата одновременно фенол и формальдегид [пат. RU №2144079, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, 1998].
Известен штамм бактерий Aureobacterium saperdae 6-204, устойчивый в длительном непрерывном процессе биокаталитической деградации фенола [пат. RU №2201446, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 2001].
Известен штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa XP-25, депонированный под номером В-8613, осуществляющий биологическую деградацию ароматических соединений [пат. RU №2270806, МПК C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/385, 2004].
Недостатком данных штаммов является отсутствие адаптации их к средам с повышенным содержанием сульфид- и сульфат-ионов, содержащим фенольные соединения.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является штамм Pseudomonas putida GFS-8, депонированный под номером ВКПМ В-5248, разлагающий фенол [АС СССР №1792925 по заявке №4908727 от 08.02.91]. Однако известный штамм разлагает фенол в сточных водах фенольного производства или аналогичных по составу, который резко отличается от состава сульфидно-щелочных стоков нефтехимических и нефтеперерабатывающих производств, имеющих повышенное содержание сульфид- и сульфат-ионов.
Задачей изобретения является получение нового штамма, с высокой эффективностью обеспечивающего деструкцию фенольных соединений, в частности в сульфидно-щелочных стоках нефтехимических и нефтеперерабатывающих производств, и обладающего высокой адаптационной способностью; расширение арсенала штаммов микроорганизмов, применяемых для очистки сточных вод.
Поставленная задача реализуется выделением и использованием нового штамма Pseudomonas putida для деструкции фенольных соединений. Штамм Pseudomonas putida 131 был выделен из загрязненных фенолом почв ОАО «Газпром нефтехим Салават» путем культивирования почвенного образца в минерализованной среде, содержащей фенол, отбором наиболее активных форм и последующей адаптацией микроорганизмов к модельному стоку. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-10894, осуществляет эффективную деструкцию фенольных соединений и отличается от известных морфологическими, физиологическими и культуральными признаками.
Морфологические признаки. Палочковидные клетки. Грамотрицательны.
Культуральные признаки. На мясопептонном агаре (МПА) и селективном агаре для бактерий рода Pseudomonas растет обильно. МПА имеет состав, г/л:
Отвар мяса
- 500 г свежего мяса, отделенного от пленок и жира/литр воды
Агар
- 20
Пептон
- 10
NaCl
- 5
На МПА формирует круглые колонии с ровными краями, кремового цвета, выпуклые с возвышением в центре, однородной консистенции, диаметром до 5 мм. На селективной среде для бактерий рода Pseudomonas образует колонии кремового цвета, блестящие, выпуклые, однородной консистенции, с ровными краями и ровной поверхностью, диаметром до 10 мм. Штамм хорошо растет в минеральной среде состава, приведенного в таблице 1.
Таблица 1
Состав минеральной среды для культивирования бактерий
Вещество
Содержание, г/л
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
- 0,16
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
- 0,55
MgSO<sub>4</sub>
- 0,20
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
- 0,50
FeSO<sub>4</sub>
- 0,01
CaCl<sub>2</sub>
- 0,01
фенол
- 0,5
вода дистиллированная
- до 1 л
При этом образуется желтый пигмент с зеленоватым оттенком. Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 25-30°С, отсутствие деструкции фенольных соединений при 15°С.
Биохимические признаки. Культура оксидазоположительна, утилизирует глюкозу, сорбит, маннит, инозит, обладает каталазной и аргининдегидрогеназной активностями, дает положительную реакцию на β-галактозидазу, не утилизирует цитрат, малонат, лактозу, сахарозу, не способна к декарбоксилированию лизина и орнитина, не образует индол и сероводород, не обладает уреазной активностью. Штамм не образует поли-β оксибутират, не способен к денитрификации.
При культивировании в минеральной среде состава, указанного в таблице 1, на шейкере со скоростью 180 об./мин и при температуре 26°С штамм Pseudomonas putida 131 полностью деструктурирует фенол в концентрации 500 мг/л за 12 часов.
Культура может храниться на селективной среде для бактерий рода Pseudomonas и МПА, при рН 7,0 при 4÷8°С 3 месяца.
Культивирование в лабораторных условиях. Для деструкции фенольных соединений культуру смывают с поверхности скошенной агаризованной среды в пробирке небольшим объемом 0,5÷1,0 мл стерильной водопроводной воды или 0,9%-ного раствора хлористого натрия и вводят в 3-5 мл стерильного мясопептонного бульона следующего состава, г/л:
Отвар мяса
- 500 г свежего мяса, отделенного от пленок и жира/литр воды
Пептон
- 10
NaCl
- 5
Выращивают в течение 12-18 часов при температуре 25-30°С. Полученной культурой заражают описанную в таблице 1 минеральную среду, в которой при культивировании в колбах на качалках полная деструкция фенола проходит за 12 часов.
Штамм относится к группе невирулентных, нетоксичных и нетоксигенных согласно заключению Уфимского НИИ МТ и ЭЧ Роспотребнадзора.
Приведем примеры использования штамма Pseudomonas putida 131 для деструкции фенольных соединений.
2
4
Пример 1. Образец №1 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават» (состав приведен в таблице 2) разбавляли в 2 раза в конической колбе нестерильной водопроводной водой до конечного объема, равного 30%-му объему колбы. Затем добавляли соль КНPO в конечной концентрации 300 мг/л и 10% по объему культуры штамма Pseudomonas putida 131, выращенной, как описано выше, на минеральной среде с фенолом. Затем бактерии культивировали на шейкере 12 ч при температуре 25°С и скорости качания 180 об./мин. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Пример деструкции фенольных соединений в сульфидно-щелочном стоке штаммом Pseudomonas putida 131
Показатели
Сульфидно-щелочной сток
Исходный
После деструкции
рН среды
7,5
8,9
Массовая концентрация сульфид-ионов, мг/л
29,8
9,6
Массовая концентрация сульфат-ионов, мг/л
432,0
288,0
Массовая концентрация фенольных соединений, мг/л
204,6
отсутствие
2
4
Пример 2. Образец №2 сульфидно-щелочного стока ОАО «Газпром нефтехим Салават», содержащего фенольные соединения в концентрации 1200 мг/л, разбавляли в два раза водопроводной водой и доводили значение рН до 7,5 концентрированной серной кислотой. Затем вносили соль NaSO так, что конечная ее концентрация составляла 4650 мг/л (в пересчете на сульфат-ион 3143 мг/л), а общая минерализация - 5400 мг/л. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 3.
Таблица 3
Деструкция фенольных соединений бактериями Pseudomonas putida 131 в сульфидно-щелочном стоке с высоким содержанием сульфат-ионов
Вариант
Содержание фенольных соединений, мг/л, через
12 часов
18 часов
24 часа
Pseudomonas putida 131
459,0
437,8
0,6
Без бактерий
598,7
563,9
524,8
Пример 3. Для примера деструкции фенольных соединений использовалась минеральная среда состава, указанного в таблице 4. Бактерии штамма Pseudomonas putida 131 культивировали на качалках, как описано в примере 1. После 40 часов культивирования на минеральной среде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии фенольные соединения не определялись.
Таблица 4
Состав минеральной среды, содержащей фенольные соединения
Вещество
Содержание, мг/л
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
160
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
550
MgSO<sub>4</sub>
200
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
500
FeSO<sub>4</sub>
010
СаСl<sub>2</sub>
010
Фенол
352
П-крезол
029
O-крезол
017
Вода дистиллированная
до 1 л
Эффективная деструкция фенольных соединений в различных средах говорит о возможности быстрой адаптации штамма к изменяющимся условиям среды, т.е. подтверждает высокую адаптационную способность штамма Pseudomonas putida 131.
Таким образом, штамм Pseudomonas putida 131 с высокой эффективностью обеспечивает деструкцию фенольных соединений. Очищенные с помощью штамма сточные воды могут быть использованы для дальнейшей очистки с бытовыми сточными водами.