Некоторые показатели Т-клеточного иммунитета в различные промежутки после наступления смерти

© ДЕНИСЕНКО А.Г., 2010

НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА В РАЗЛИЧНЫЕ ПРОМЕЖУТКИ ПОСЛЕ НАСТУПЛЕНИЯ СМЕРТИ

ДЕНИСЕНКО А.Г.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»;

кафедра судебной медицины

Резюме. С целью установления давности наступления смерти определяли общее количество Т-лимфоцитов и так называемых «активных» Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-Рок), а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы-маркеры CD3, CD4, CD8, CD25. Количество Т-лимфоцитов (общих и «активных) определяли методом Е-Рок, в крови полученной от 31 трупа людей, умерших от ишемической болезни сердца (ИБС) - 11, от отравления этиловым алкоголем - 7 и от прочих причин смерти - 13. Дополнительно в крови умерших от прочих причин смерти (механических травм и асфиксий) - 10, методом фенотипирования определяли количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD25 с помощью анти-CD диагностикумов, на основе моноклональных антител, которые позволяют фенотипировать лимфоциты в лейкосуспензии с регистрацией их при обычной световой микроскопии. В ходе проведенных исследований выявлены статистически значимые изменения Т-клеточного звена иммунитета со снижением количества Т-клеток (Е-Рок), а также CD3, CD4, CD8 и экспрессии рецепторов к ИЛ-2 на Т-лимфоцитах (CD25) на протяжении до трех суток, что позволяет использовать данные показатели для определения давности наступления смерти.

Ключевые слова: давность наступления смерти, Т-лимфоциты, фенотипирование с CD-диагностикумами.

Abstract. To establish the remoteness of death the total level of T-lymphocytes and of the so-called «active» T-lymphocytes was determined by the method of spontaneous rosetting with ram red blood cells (E-RFC), the level of T-lymphocytes expressing molecules-markers CD3, CD4, CD8, CD25 was also determined. Blood levels of T-lymphocytes (general and “active”) were determined using the E-RFC method in 31 deceased including 11 persons who died of coronary heart disease, 7 - poisoning with ethyl alcohol, 13 - other causes. In 10 cases of death from other causes (mechanical traumas and asphyxias) we used additionally the phenotyping method to determine the quantity of T-lymphocytes expressing CD3-, CD4-, CD8-, CD25-receptors. Lymphocytes were phenotyped in leukosuspension using anti-CD sets based on monoclonal antibody technology. The results were recorded using conventional light microscopy. We observed statistically significant changes of T-cellular component of the immune system with the decrease of T-cells (E-RFC) and also of CD3-, CD4-, CD8-lymphocytes quantity and the decrease of expression of receptors to IL-2 on CD25-lymphocytes in the course of time up to three days. These results may be used to establish the remoteness of death.

Установление давности наступления смерти (ДНС) входит в число актуальных проблем судебной медицины [1-5]. Это связано с тем, что судебно-следственные органы во время расследования дел, связанных с раскрытием преступлений, интересует время наступления смерти. В настоящее время не существует универсальных ме-

Адрес для корреспонденции: 210027, г. Витебск, ул. Чкалова, д. 11, кор. 10, кв. 91, р.тел. 43-22-97, моб. 811-18-92 (МТС). - Денисенко А.Г.

тодов определения срока ДНС, так как судебные эксперты руководствуются лишь « визуальноописательными, субъективно оцениваемыми» признаками, характеризующими ранние и поздние трупные явления. Для установления ДНС необходимо учитывать ряд факторов: характер одежды на трупе, конституцию тела, различные климатические условия (влажность среды, температуру, скорость движения воздуха и т.д.), а также их изменения в различные интервалы времени. Данная проблема и

привела нас к изучению изменения иммунологических показателей крови трупов в разные промежутки после смерти, так как они в меньшей мере зависят от вышеперечисленных факторов.

В период агонии и после смерти организма нарушается гомеостаз, изменяются концентрации газов, химических элементов, а также ряда биологически активных веществ. В этих условиях лимфоциты крови, легко активирующиеся различными изменениями внутренней среды, реагируют на возникающие стимулы изменением функциональной активности [6, 8].

После наступления биологической смерти в иммунной системе происходят существенные изменения, динамика которой находится в зависимости от ДНС. В частности, ряд работ посвящен изучению аутолитических процессов, протекающих в лимфоцитах трупной крови [6-9].

Исследованиями [10] установлено, что лимфоциты крови человека в первые 20 часов после смерти от механической гипоксии или заболеваний сердца и сосудов сохраняют тинкториальные (при окраске трипановым синим - более 2/3 живых клеток в 70% суспензии) и иммунные свойства (в реакции с гетерогенной антилимфоцитарной сывороткой). Наряду с этим иммунная реактивность лимфоцитов консервированной крови сохраняется в течение 17 дней после смерти. Так МоПаЫо Б. [11] установил, что при действии ионизирующей радиации и фитогемагглюти-нина (ФГА) на лимфоциты трупной крови в течение 12 дней после смерти они не отличаются от лимфоцитов живых людей. Интенсивность ответа лимфоцитов на антиген, в том числе на ФГА, определялось митотической (репродуктивной) активностью.

Данные об активности репродукции лимфоцитов трупной крови подтверждают высокую устойчивость хроматина клетки и сохранение его способности к репродукции даже после действия экстремальных факторов [12].

Установлено, что в раннем посмертном периоде (до 3-х суток включительно) лимфоциты трупной крови отличаются от других клеточных ее элементов высокой устойчиво-

стью к аутолитическому процессу и сохраняют способность участвовать в реакции бласт-трансформации и розеткообразования. Это позволяет использовать их для установления сроков давности смерти [13, 14, 15].

В литературе не изучалось определение количества Т-лимфоцитов в трупной крови, экспрессирующих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD25 фенотипированием с помощью анти-CD диагностикумов и методом Е-Рок. Преимущество использования данных диагности-кумов заключается в проведении реакции в стандартных условиях [17], а для постановки реакции розеткообразования необходимы свежеприготовленные эритроциты барана, нуждающиеся в стандартизации.

Цель исследования - изучить показатели Т-клеточного иммунитета с помощью анти-CD диагностикумов, с моноклональными антителами, экспрессирующих моелкулы-марке-ры (CD3, CD4, CD8, CD25), а также применение данных показателей в качестве критерия установления ДНС.

Методы

Исследовали кровь, взятую из правой половины сердца и бедренной артерии (вены) от 31 трупа людей, умерших от ишемической болезни сердца (ИБС) - 11, от отравления этиловым алкоголем - 7 и от прочих причин смерти - 13 (механическая асфиксия, падение с высоты, множественные политравмы). Из них мужчин - 23, женщин - 8. Возраст умерших варьировал от 27 до 76 лет. Трупы находились в морге при температуре от 15 до 20°С (осенне-зимний период) и 20 до 25° (весенне-летний период). На момент забора крови ДНС умерших была известна по данным материалов проверки, выездов экспертов на места происшествий, результатам вскрытия трупов (ранние трупные явления, термометрия и т.д.) и констатаций смерти бригадой скорой медицинской помощи.

Забор крови осуществляли стерильными шприцами из правой половины сердца и бедренной артерии (вены) в объеме по 10 мл. Кровь от трупа брали в динамике с интервалами времени, начиная с момента забора, за-

тем в промежутке времени от 7 до 16; 17-36; 27-36; 37-50; 51-64; 65-78 часов.

Для определения общего количества Т-лимфоцитов кровь обрабатывали методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. К забранной крови (в количестве 10 мл) добавляли 0,1 мл гепарина, который был предварительно разведен в 0,9% растворе хлорида натрия (10 ЕД в 1 мл). Кровь центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин., затем собирали образовавшуюся пленку, обогащенную нейтрофильными лейкоцитами, в пластиковую пробирку. К осадку лейкоцитов добавляли 1-1,5 мл 0,84% раствора хлористого аммония, предварительного прогретого в термостате до 37°С, лизировали эритроциты 1-2 минуты, затем центрифугировали 2-3 минуты при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли и к осадку добавляли 3-4 мл 0,9% р-ра хлорида натрия и потом центрифугировали при 1000 об/мин 5 минут. Процедуру отмывания повторяли с раствором Хенкса, после чего осадок клеток ресуспензировали в 0,5 мл р-ра Хенкса. Проверяли суспензию клеток в камере Горяева на их жизнеспособность, для этого к капле суспензии клеток добавляли 1 -2 капли краски 0,1% раствора трипанового синего с эозином, смешивали и переносили часть смеси в камеру Горяева. Подсчитывали не менее 100 клеток, среди них определяли процент окрашенных (жизнеспособных клеток). Затем проверяли суспензию клеток в камере Горяева, где доводили концентрацию лимфоцитов раствором Хенкса до 2-2,5х109 кл/ л (8-10 клеток в 1 квадрате камеры Горяева). Смешивали в равных объемах 0,1 мл 0,1% суспензии эритроцитов барана и взвесь лейкоцитов. Смесь инкубировали в термостате при 37°С 15 минут, затем центрифугировали при 1000 об/мин 1-2 минуты. После центрифугирования клетки инкубировали в холодильнике при 4°С в течение 1 часа. К осадку клеток добавляли 0,1 мл 0,06% глютарового альдегида. После ресуспензирования оставляли на 1 минуту при комнатной температуре. Затем готовили мазки на предметных стеклах. После высыхания на воздухе мазки фиксировали 960 этанолом, которые окрашивали азур-эози-ном 10-15 минут. Подсчитывали количество

розеткообразующих клеток на 200 лимфоцитов, считая за розетку лимфоцит, прикрепивший 3 и более эритроцитов барана [16].

Определение количества так называемых «активных» Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана проводили аналогичным образом, как и общего количества Т-лимфоцитов, с той лишь разницей, что полученные клетки инкубировали только в термостате при 37°С и затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 1-2 мин. [16].

Количество же Т-лимфоцитов экспрессирующих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD25, в крови от 10 трупов, умерших от механических травм и асфиксий, определяли по вышеописанной методике. Отличия заключались в том, что взвесь лейкоцитов смешивали в таких же объемах 0,1 мл 0,1% с анти-CD диаг-ностикумами, любезно предоставленными профессором Д.К. Новиковым [17]. Подсчитывали процент розеткообразующих лимфоцитов при обычной световой микроскопии, явно имевших не менее 3-х прикрепившихся эритроцитов к диагностикумам с анти- CD моноклональными антителами [17].

Статистическую обработку данных проводили с помощью электронных таблиц Exel 7.4. (Microsoft), Statgraphics 2.1. (Statistical graphics Corp.) и BIOSTAT.EXE. Так как распределение изучаемых величин отличалось от нормального, для описательного статистического анализа применяли показатель медианы, 25 и 75 процентиль [18]. При сравнении достоверности отличий между группами был использован U-критерий Манна-Уитни [18]. Статистически достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований было выявлено, что после наступления смерти от ИБС происходило статистически значимое снижение показателей общего количества розеткообразующих Т-лимфоцитов с эритроцитами барана

Таблица 1

Показатели Т-клеточного иммунитета у лиц, умерших от прочих причин смерти

Показатель процентили 25-75 Время, прошедшее с момента наступления смерти

% (n=10) 7-16 17-26 27-36 37-50 51-64 65-78

СБЗ медиана 52(48-55) 46(43-50)*** 42(35-43)*** 36(31-39)*** 29(24-33)*** 23(21-28)*

CD4 36(31-38) 30,5(25-35)*** 28(22-30)* 23,5(20-27)** 18(17-20)*** 14(12-16)***

CDS 18(17-19) 15(12-17)*** 12(11-14)*** 11(8-12)** 7,5(5-9)*** 4,5(2-5)**

CD25 15,5(13-17) 13(10-14)*** 10(9-12)** 8(6-11)** 5(3-7)*** 3(2-5)*

Примечание: * - р< 0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки р>0,05 - различие недостоверно.

и спустя 51-б4 часов 34% [26,3s] (р<0,05) после наступления смерти. Статистически значимое снижение «активных» Т-лимфоцитов происходило в интервалах времени: от 17-26 часов 21% до 37-50 часов 15% [17,22;15,21;13,1б] (р<0,001) и спустя 51-64 часов после наступления смерти 12% [11,13] (р<0,05).

У лиц, погибших от отравления этиловым алкоголем, статистически значимое снижение показателей розеткообразования активных Т-лимфоцитов с эритроцитами барана отмечалось в промежутках времени после наступления смерти: 27-36 часов 16% [14,17] (р<0,001) и через 37-50 часов 14% [14,15] (р<0,05). Статистически значимое снижение показателей розеткообразования общих Т-лим-фоцитов с эритроцитами барана отмечалось после наступления смерти в интервалах времени: 27-36 часов 43% [36,45] (р<0,01) и через 51-64 часов 28% [29,43] (р<0,01).

При прочих причинах смерти также отмечались статистически значимые снижения показателей розеткообразования активных Т-лимфоцитов с эритроцитами барана в интервалах времени: от 17-26 часов 19% до 27-36 часов 15,5% [15,22;1З,20] (р<0,001), через 37-50 часов 13,5% [10,16] (р<0,05), 51-64 часов 9,5% [4,11] (р<0,001) и спустя 65-78 часов после наступления смерти 5% [1,S] (р<0,01). Статистически значимое снижение показателей общих розеткообразующих Т-лим-

фоцитов после наступления смерти отмечено в интервалах времени: 17-26 часов 45% [38,50] (р<0,001), от 27-36 часов 40,5% до 37-50 часов 35,5% [33,45;28,40] (р<0,01) и через 51-64 часов 25% [22,30] (р<0,001).

В группе умерших от прочих причин смерти (n=10) при определении количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD25, отмечалось статистически значимое снижение во всех интервалах времени (до 65-78 часов).

Снижения показателей Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор CD3 (таблица 2), отмечались в интервалах времени от 17-26 часов 46% до 51-64 часов 29% [43,50; 35,43;3 1,39; 24,33] (р<0,001) и спустя 65-78 часов после наступления смерти 23% [21,28] (р<0,05).

Количество CD4 (Т-хелперов) так же достоверно снижалось в интервалах времени: 17-26 часов 30,5% [25,35] (р<0,001), 27-36 часов 28% [22,30] (р<0,05), 37-50 часов 23,5% [20,27] (р<0,01), 51-64 часов 18% [17,20] (р<0,001) и через 65-78 часов после наступления смерти 14% [12,16] (р<0,001);

Статистически значимое снижение CD8 (маркера цитотоксических лимфоцитов) определялось в интервалах времени от 17-26 часов 15% до 27-36 часов 12%, через 51-64 часов 7,5% [12,17;11,14;5,9] (р<0,001), через 37-50 часов 11% и 65-78 часов 4,5% [8,12;2,5] (р<0,01) после наступления смерти.

Таблица 2

Показатели розеткообразования активных и общих Т-лимфоцитов с эритроцитами барана

Показатель процентили 25-75 Время, прошедшее с момента наступления смерти

7-16 17-26 27-36 37-50 51-64 65-78

ИБС розетки активные, %

ИБС розетки общие,%

ОЭА розетки активные,%

ОЭА розетки общие (п=7) 50(42-53) 43(36- 45)** 39,5(29- 43) 28(24- 29)**

ППС розетки активные,% (п=13) 23(20-25) 19(15- 22)*** 15,5(13- 20)*** 13,5(10- 1б)* 9,5(4- 11)*** 5(1-8)**

ППС розетки общие, % (п=13) 53(46-58) 45(38- 50)*** 40,5(33- 45)** 35,5(28- 40)** 25(22- 30)*** 20***

Примечание: * - р< 0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, отсутствие звездочки р>0,05 - различие недостоверно, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ОЭА - отравление этиловым алкоголем, ППС - прочие причины смерти.

Снижение экспрессии рецептора на Т-лимфоцитах к ИЛ-2 (СБ25) отмечалось в интервалах времени: 17-26 часов 13%, 51-64 часов 5% [10,14;3,7] (р<0,001), спустя 27-36 часов 10%, 37-50 часов 8% [9,12;6,11] (р<0,01), и через 65-78 часов после наступления смерти 3% [2,5] (р<0,05).

При анализе полученных результатов изменения Т-клеточного иммунитета в группе с ППС (механических травм и асфиксий в результате повешения) отмечена общая статистически значимая тенденция к снижению всех показателей, что привело нас к созданию регрессионной зависимости, отражающей взаимосвязь ДНС и указанных иммунологических параметров.

Для исследования показателя строились графики и рассчитывались уравнения регрессии, которые приводятся ниже. В каждом случае, методом подбора осуществляли выбор графика с наилучшими показателями: коэффициентами корреляции и силой влияния (таблица 3).

Для СБ3 и СБ8 график имел линейную зависимость, а для СБ4 и СБ25 использовали регрессионную зависимость общего вида У = V* .

Из полученных данных видно, что характер изменений показателей незначительно отличается друг от друга (по наибольшему коэффициенту корреляции и силе влияния), что позволяет применять их в судебно-медицинской

Таблица 3

Наиболее статистически значимые показатели Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы

CD3, CD4, CD8, CD25

Наиболее значимые показатели CD-диагностикумы

CD3 CD4 CD8 CD25

r -0,99 -0,99 -0,99 -0,99

P р<0,001 р<0,001 р<0,001 р<0,001

Сила влияния 99,87% 99,40% 99,57% 99,84%

Уравнения регрессии t = 192,1 - 25,167*? а. t = 10б,9- 2,7*а. t = 86- 4,23*а t=120,15- 27,74*?а

Примечание: где t (часы) - ДНС; а - процент CD3 положительных клеток.

80

0 .... .... .... .... .... .... 1~ 23 28 33 38 43 48 53

Рис.1. Содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор СБ3. Примечание: по оси X - среднее время наступления смерти, по оси У - процент содержащих СБ3 лимфоцитов.

практике. В результате анализа совокупности данных, нами для установления ДНС предложена реакция с анти СВ3-диагностикумом. В качестве примера приводится график (рис. 1) регрессионной зависимости времени наступления смерти (лиц, умерших насильственной смертью) от показателей функциональной активности Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор СБ3, методом розеткообразования.

Пример использования предложенного нами метода. Женщина, 29 лет, умершая от множественных повреждений. Исследуется кровь в промежутке времени от 27 часов до 32 часов после наступления смерти. Исследованием определяют содержание общих Т-лим-фоцитов, экспрессирующих рецептор СБ3 (43%). Используя формулу, находим, что с момента наступления смерти прошло 27 часов.

Применение данной методики позволяет определять ДНС в более ранние промежутки времени - до 3-х суток, что имеет большое прикладное значение для судебно-медицинской практики.

Заключение

1. В ходе проведенных исследований крови, взятой в динамике от трупов, людей

умерших от механических травм и асфиксий в результате повешения, отмечено достоверное снижение показателей Т-клеточного иммунитета с уменьшением их общего количества (CD3, CD4, CD8, CD25) в сроки до трех суток.

2. При определении наиболее значимых показателей для установления давности наступления смерти существенных различий, характеризующих изменение фенотипа клеток иммунной системы (CD3, CD4, CD8 и CD25), выявлено не было, что позволяет использовать любой из этих критериев. Оптимальным является оценка содержания CD3(+)-Т-лимфо-цитов.

Литература

1 The estimation of the death en early postmortem period / C. Henssge [et al.] -London: Edward Amold, 2002. -271 p.

2. Swift, B.. Methods of time since death estimation within

the early post-mortem interval / B. Swift // The journal of Homicide and waior incident investigation.-2010. -Vol.6. - iss. 1 - P. 97-112.

3. Mann, B. Time of death dependent criteria in vitreus

humor, accuracy of estimating the time since death /

B. Mann, A. Rudig // Forensic Science International. -2006. - Vol. 164, N (2-3). - P. 87-92.

4. Пашинян, Г. А. Анализ ошибок при установлении дав-

ности наступления смерти по трупным изменениям в ходе проведения первоначальных следственных

действий / Г.А. Пашинян, Е.С. Тучик // Судебно -медицинская экспертиза. - М. 1997. - №1. - С. 28-30.

5. Ботезату, Г. А. Судебно-медицинская диагностика дав-

ности наступления смерти / Г. А. Ботезату. - Кишинев: Штиинца, 1975. - C. 130-132.

6. Казарновская, М.Л. Лимфоциты крови в условиях

посмертного аутолиза / М.Л. Казарновская // Репродукция лимфоцитов трупной крови.- Кишинев: Штиинца. - 1983. - С. 22-37.

7. Widmar, M.B., Roopenian D.C., Bach F.H. Cytolytic

T-lymphocyte clones with helper cell characteristics / M.B. Widmar, D.C. Roopenian, F.H. Bach // Transpl. Proc. - 1983. - Vol. 15, N1. - P. 393-395.

8. Comparison of morphological changes in white blood

cells after death and in vitro storage of blood for the estimation of post-mortem interval / H. Dokgoz. [et al.] // Forensic Science International - 2001. - Vol. 124, N.1.

- P. 25-51.

9. Самойлина, Н.Л. Культивирование смешанных лейко-

цитов от большого числа доноров / Н.Л. Самойлина, H.H. Чернышова // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1971. - Т. 16, №4. - С. 43-47.

10. Говалло, В.И. Этот многоликий иммунитет /

В.И. Говалло. Сер. Биология. Ч. I. - М.: Знание, 1980.

- С. 63.

11. Montaldo, S.Studio comparativo degli effetti da radiasione, rnisurati come morte interfase tra limfociti periforrici ottenuti dal vivente e dal cadavere / S. Montaldo, G. Rombi, F. Cossu // Minerva Medicolegal.

- 1978. - Vol.98, N1. - P.145-149.

12. Прокофьева-Бельговская, А. А. Репродукция хромо-

сом / А.А. Прокофьева-Бельговская // Успіхи современной генетики. - Вып.3. - М., 1971. - С. 80-89.

13. Костылев, В .И. Реакция лимфоцитов к бласттранс-

формации в ранние сроки после смерти / В.И. Кос -тылев // Материалы II Всесоюз. съезда судебных медиков. - Иркутск. - М, 1987. - С. 236-237.

14. Себастіао, А.М. Посмертна динаміка вмісту імунних показників розеткоутворення крові осіб, що загинули від странгуляційної асфіксіі/ А.М. Себастіао // Укр. судово-мед. вісн. - 2000. - №-2.-

С. 26-27.

15. Костылев, В.И. Влияние алкоголя на состояние иммунных показателей при установлении давности наступления смерти / В.И. Костылев, Д.В. Костылев, О.В. Дунаєв // Вісн. МВС України. Спец. вип. -Луганськ, 1999. - №-2. - С.43-45.

16. Новиков, Д.К. Клеточные методы иммунодиагностики / Д.К. Новиков, В.И. Новикова. - Минск: Беларусь, 1979. -169 с.

17. Новиков, Д.К. Стабильные иммунодиагностикумы

на основе моноклональных антител для оценки иммунного статуса / Д.К. Новиков, П. Д. Новиков, А.В. Фролова // Иммунодиагностика и иммунотерапия: труды 1 Междунар. конф. - Витебск; ВГМУ 1995 -

С. 116-118.

18. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских

данных. Применение пакета прикладных программ 8ТЛТІ8ТІСЛ / О.Ю. Реброва. - М.: Медиа Сфера, 2006. - С. 9-312.

Поступила 22.11.2010 г. Принята в печать 06.12.2010 г.