ГИБРИДНЫЕ КУМАРИНЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ НЕПРЯМЫМ АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
HYBRID COUMARINS WITH INDIRECT ANTICOAGULANT ACTION

Изобретение относится к медицине и химико-фармацевтической промышленности, и касается новых непрямых антикоагулянтов на основе соединений гибридных молекул фенолокислота-кумарина, формулы 1-3,
которые обладают выраженным влиянием на систему свертывания крови и может найти применение в медицинской практике при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Тромботические окклюзии артерий и вен являются основной причиной смерти и инвалидизации большинства больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Инфаркт миокарда, различные виды ишемического инсульта, тромбоз левого желудочка, искусственные клапаны сердца, венозные тромбо-эмболические осложнения (ВТЭО) - тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) и тромбоз глубоких вен (ТГВ) - вот далеко не полный перечень заболеваний требующих, с позиции медицины доказательств, длительной анти-тромботической терапии [Кропачева, Е.С. Исследование фармакогенетики варфарина и клопидогрела для оптимизации антитромботической терапии: пособие для врачей. - ООО М., "Издательская группа "Дуэт", 2015. 76 с.]
Антикоагулянты непрямого действия чрезвычайно актуальны в современной антитромботической терапии. Известно, что варфарин является одним из наиболее часто применяемых препаратов - производных кумарина (2Н-хромен-2-она, 2Н-1-бензопиран-2-она). Варфарин, назначаемый для профилактики тромбоэмболических осложнений у больных с фибрилляцией предсердий (ФП), искусственными клапанами и пороками сердца, а также для длительного лечения пациентов, перенесших тромбоз глубоких вен или тромбоэмболию легочной артерии. [Eikelboom J. W., Hirsh J, Spence F. A. r, et. al. Antiplatelet Drugs. Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. CHEST 2012. 141(2) (Suppl). e89S-e119S; Диагностика и лечение больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST ЭКГ. Рекомендации ВНОК. Ред. Руда М. Я. // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2007. 6(8). Приложение 1. С. 415-500].
Однако использование варфарина в медицинской практике ограничено ввиду его тяжелых побочных эффектов. Среди них особое место занимает возможность возникновения серьезных кровотечений [Ageno W., et.al. Oral anticoagulant therapy. Antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 141(2). e44s-e88s; Ansell J., Hirsh J., Hylek E., et. al. The pharmacology and management of the vitamin K antagonists, 8th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. CHEST 2008. 133(6) (Suppl). 160s-198s].
Также известно, что антиагреганты используют в основном для профилактики артериальных тромбозов. Ацетилсалициловая кислота (АСК) является одним из наиболее часто применяемых антиагрегантов. Однако все чаще АСК используют в комбинациях с антикоагулянтами. Была показана эффективность сочетания аспирина с варфарином в низкой дозе (LoWASA) для профилактики повторных инфарктов миокарда, но при этом применение комбинации связано с повышенным риском геморрагических осложнений. [Herlitz J., Holm J., Peterson M. et al. Effect of fixed low dose warfarin added to aspirin in the long term after acute myocardial infarction; the LoWASA Study // Eur. Heart J. 2004. V. 25. No 3. P. 232-239; Hurlen M., Abdelnoor M., Smith P., et. al. Warfarin, aspirin, or both after myocardial infarction // N. Engl. J. Med. 2002. Vol. 347.13. P. 1019-1022].
Кроме того, за последние несколько лет с развитием фармацевтической химии, гибридный подход при создании новых высокоактивных гибридных лекарственных средств, получил значительное внимание, поскольку он позволил синтезировать целый ряд гибридных субстанций с улучшенной биологической активностью по отношению к исходным соединениям. [Calderone V. An update on hybrid drugs in cardiovascular drug research // Expert. Opin. Drug Discov. 2008. Vol. 3. №. 12. P. 1397-1408; Mishra S., Singh P. Hybrid molecules: The privileged scaffolds for various pharmaceuticals. European journal of medicinal chemistry. 2016. Vol. 124. P. 500-536].
В связи с изложенным, разработка новых непрямых антикоагулянтов из других групп гетероциклических или гибридных соединений на основе соединения новых гибридных производных кумарина, лишенных вышеперечисленных побочных действий, обладающих выраженной антикоагулятной активностью, является актуальной для практической медицины.
Задача изобретения - расширение арсенала антикоагулянтов непрямого действия, поиск новых средств на основе соединений гибридных молекул фенолокислота-кумарина, имеющих более низкую токсичность и обладающих выраженным влиянием на систему свертывания крови, чем препарат, применяющиеся в медицинской практике, а именно варфарин.
Изобретение иллюстрируется примерами синтеза, исследования острой токсичности и антикоагулянтной активности.
Пример 1. Общая методика синтеза гибридных соединений 1-3
В круглодонную колбу на 50 мл помещают 2,02 ммоль 7-(2-бром-этокси)кумарина, 7-(2-бромэтокси)-4-метил-кумарина и 4-(2-бромэтокси)-кумарина, соответственно, 0,14 г (1,01 ммоль) салициловой кислоты, 1,0 г (7,25 ммоль) карбоната калия и добавляют 12,5 мл ДМФА. Реакционную смесь нагревают и постоянно перемешивают на магнитной мешалке при температуре 100-110°С до полного исчезновения исходного вещества по ТСХ-контролю (около 12 часов). Затем реакционную массу вливают в 150 мл дистиллированной воды в стакане объемом 250 мл с работающей магнитной мешалкой. Осадок отфильтровывают и промывают 3 раза по 15 мл этанолом и перекристаллизуют из этилацетата.
Структуры полученных соединений установлены современными методами: ТСХ, ИК-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии (см. фиг. 1-9).
ТСХ-система: бензол - этилацетат (3:1). ТСХ-пластинка: Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ (силикагель СТХ-1А, УФ-254 нм). Детекция пятен осуществлялась с помощью УФ лампы при длине волны 254 нм или 365 нм.
[(7-кумаринил)окси]этил-2-[((7-кумаринил)окси)этокси]бензоата (1)
f
Выход 80.8%, бежевый порошок, т.пл. 145-147°С, R 0,22.
2
ИК спектр (KBr,ν, см-1): 3082,38 (сл., СН), 2928,07 (сл., СН), 1724,44 (оч.с, С=O сложного эфира), 1707,08 (оч.с, С=O α-пирона), 1612,56 (оч.с., СН=СН α-пирона), 1232,57-1126,48 (С(=O)-O), 1062,82-1049,32 (С-О) (см. фиг. 1).
1
6
2
2
Спектр ЯМР Н (ДМСО-d), δ, м. д. (J, Гц): 4,38 (м-комплекс, 8Н, -СН-СН), 6,23 (д, J=9,29 Hz, 2 Н, Н-3',3''), 6,86 (д, J=8,53 Hz, 4 Н, Н-6',6'',8',8''), 7,06 (т, J=7,03 Hz, 1 Н, Н-3), 7,22 (д, J=8,28 Hz, 1 Н, Н-5), 7,50 (д, J=8,03 Hz, 2 Н, Н-5',5''), 7,56 (т, J=7,53 Hz, 1 Н, Н-4), 7,70 (д, J=7,28 Hz, 1 Н, Н-6), 7,89 (д, J=9,03 Hz, 2 Н, Н-4',4'') (см. фиг. 2).
13
6
Спектр ЯМР С (ДМСО-d), δ, м. д.: 63,33 (С-11'), 66,96 (С-12'), 67,59 (С-11''), 67,72 (С-12''), 101,5 (С-8', 8''), 112,83 (С-6''), 112,86 (С-6'), 113,04 (С-10', 10'', 3', 3''), 114,54 (С-3), 120,56 (С-5), 121,12 (С-1), 129,8 (С-5', 5''), 131,56 (С-6), 134,32 (С-4), 144,54 (С-4,4''), 155,64 (С-9', 9''), 157,93 (С-2), 160,62 (С-7, 7''), 161,69 (С-2'), 161,84 (С-2''), 166,34 (-(С=O)-O-) (см. фиг. 3).
29
23
9
ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 515,150 [М+Н]+. СНО. Вычислено, m/z: 515,134.
[(4-метил-7-кумаринил)окси]этил-2-[((4-метил-7-кумаринил)окси)-эток-си]-бензоата (2)
f
Выход 78,5%, бежевый порошок, т.пл. 182-184°С, R 0,24.
-1
2
ИК спектр (KBr, ν, см): 3068,88 (ср, С-Н), 2930 (сл., СН), 1716,72 (оч.с., С=O сложного эфира), 1699,36 (оч. с, С=O α-пирона), 1612,56 (с, СН=СН α-пирона), 1284,65-1136,12 (С(=O)-O), 1076,33 (с, С-О) (см. фиг. 4).
1
6
3
2
2
Н-ЯМР-спектр (ДМСО-∂, δ, м.д.): 2,33 (д,.J=1,25 Hz, 6 Н, -2СН), 4,26-4,55 (м-комплекс, 8 Н, -СН-СН-), 6,11 (д, J=2,76 Hz, 2 Н, Н-3',3'', 6,74 (т, J=2,51 Hz, 2 Н, Н-8',8''), 6,85 (д, J=8,78 Hz, 2 Н, Н-6',6''), 7.07 (т, J=7,53 Hz, 1 Н, Н-3), 7.22 (д, J=8,28 Hz, 1Н, Н-5), 7,52 (д, J=8,78 Hz, 2Н, Н-5',5''), 7,58 (м-комплекс, 1 Н, Н-4), 7,73 (дд, J=7,78, 1,76 Hz, 1 Н, Н-6) (см. фиг. 5).
13
6
3
С-ЯМР-спектр (ДМСО-∂, δ, м.д.): 18,52 (-2СН), 63,43 (С-11'), 66,9 (С-12'), 67,47 (С-11''), 67,58 (С-12''), 101,2 (С-8' 8''), 111,61 (С-10'', 10'), 112,82 (С-6''), 112,86 (С-6'), 113,41 (С-3''), 113,45 (С-3'), 114,32 (С-3), 120,3 (С-4), 121,09 (С-1), 126,6 (С-5', 5''), 131,74 (С-6), 134,47 (С-4), 153,7 (С-4, 4''), 154,89 (С-9', 9''), 157,94 (С-2), 160,52 (С-7', 7''), 161,55 (С-2'), 161,7 (С-2''), 166,65 (-(С=O)-O-) (см. фиг. 6).
+
31
27
9
ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 543,158 [М+Н]. СНО. Вычислено, m/z: 543,166.
[(4-кумаринил)окси]этил-2-[((4-кумаринил)окси)этокси]бензоата (3)
t
Выход 75.4%, белый порошок, т.пл. 208-209°С, R 0,14.
-1
2
ИК спектр (KBr, ν, см): 3082,38 (сл., С-Н), 2931,93 (сл., СН), 1749,51 (оч. с, С=O сложного эфира), 1707,07 (с, С=O α-пирона), 1629,92 (ср., СН=СН α-пирона), 1234,50-1138,05 (С(=O)-O), 1091,76 (с, С-О) (см. фиг. 7).
1
6
2
H-ЯМР-спектр (ДМСО-∂, δ, м.д.): 4,38-4,68 (м-комплекс, 8Н, -СН-), 5,79 (д, J=15,81 Hz, 2Н, Н-3', Н-3''), 7,07 (т, J=7,53 Hz, 1Н), 7,16-7,34 (м-копмлекс, 5Н), 7,55 (т, J=6,78, 5,77 Hz, 4Н), 7,68 (кв., J=7,78, 1,76 Hz, 2Н, Н-5', Н-5'') (см. фиг. 8).
13
6
С-ЯМР-спектр (ДМСО-∂, δ, м.д.): 62,62 (С-11'), 67,35 (С-12'), 68,21 (С-11''), 68,65 (С-12''), 91,11 (С-3', 3''), 114,96 (С-10''), 115,33 (С-10'), 116,83 (С-8' 8''), 120,94 (С-5), 121,33 (С-1), 123,05 (С-5', 5''), 124,38 (С-6''), 124,51 (С-6'), 131,39 (С-6), 133,1 (С-7',7''), 134,23 (С-4), 153,08 (Н-9',9''), 157,85 (С-2), 161,81 (С-2''), 161,9 (С-2'), 164,89 (С-4''), 164,99 (С-4'), 166,25 ((С=O)-О-) (см. фиг. 9).
+
29
23
9
ЭСИ-масс-спектр: Найдено, m/z: 515,152 [М+Н]. СНО. Вычислено, m/z: 515,134.
Таким образом, приведенные хроматографические и спектральные данные полностью согласуются со структурой заявляемых соединений.
Пример 2. Определение острой токсичности заявляемых соединений.
50
Определение острой токсичности (ЛД) проводят на белых беспородных мышах массой 18-20 г, разделенных на 4 группы по 3 животных в каждой, по экспресс-методу Прозоровского [Прозоровский В.Б. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакол. и токсикол. 1978. №4. С. 497]. Исследуемые вещества вводят перорально в виде суспензий в смеси ДМСО - вода (1:5) с использованием стабилизатора - твин-80 в интервале доз от 300 до 2500 мг/кг и по таблице определяют острую токсичность.
Результаты эксперимента, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что заявляемые вещества по классификации Hodge и Sterner [Hodge, Н.С. Sterner J. Н. Tabulation of toxicity classes // American Industrial Hygiene Association Journal. 1949. Vol. 10. P. 93-96] относятся к 5-му классу токсичности и являются практически нетоксичными соединениями.
Пример 3. Испытание антикоагулянтной активности заявляемых соединений на тесте определения протромбинового времени у мышей.
Антикоагулянтную активность заявляемых соединений изучает на белых нелинейных половозрелых мышах-самцах массой 18-20 г. Животные получены из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область), прошли необходимый карантин и содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария на обычном пищевых рационе, со свободным доступом к воде.
Исследование выполнили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) а также с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», приказом Минздрава России от 01.04.2016 г.. №199н «Об утверждении Правил лабораторной практики», согласно утвержденному письменному протоколу.
Животных разделяют на группы по 6 особей в каждой: 1 - контрольная-интактные животные, получавшие очищенную воду с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО), 2 - мышей, получавшие препарат сравнения варфарин в дозе 5 мг/кг, остальные - мыши, получавшие заявляемые соединения (1, 2 и 3), соответственно. Расчет доз заявляемых соединений осуществляют путем пересчета по молярной эквивалентности дозе субстанции варфарина. Животные получают соответствующие вещества в течение 7 дней, после чего проводят взятие крови из глаз мышей с определением тромбоцитов и дальнейшим двукратным центрифугированием (1000 и 3000 об/мин) с целью получения плазмы и отделения форменных элементов. Состояние животных оценивают визуально, отслеживают летальность в ходе эксперимента. Для оценки антикоагулянтной активности исследуемых соединений используют готовые тест-системы к гемокоагулометру марки "Humaclot Duo Plus" (Human GmbH, Германия). Статистическую обработку проводят с использованием t-критерия Сьюдента, результаты считают достоверными при р<0,05.
На основании данных, приведенных в таблице 2 видно, что протромбиновое время всех заявляемых соединений оказываются выше протромбинового времени препарата сравнения - варфарина. Это свидетельствует о том, что все заявляемые соединения обладают выраженной антикоагулянтной активностью. Проведено вычисление MHO (международное нормализованное отношение) или INR (см. табл. 2).
Необходимо отметить тот факт, что применение испытуемых субстанций было более безопасным, нежели варфарин. В группе животных, получавших варфарин в течении недели погибло 40% мышей, у остальных отмечалась повышенная кровоточивость десен, кровь шла из носа, прямой кишки, гистологическое исследование выявило массовые кровоизлияния в легких, печени, почках, сердце и желудке "варфариновых" мышей. В опытной группе кровоизлияний и кровотечений не выявлено.
На фигуре 10 представлен гистологические срезы внутренних органов мышей, получавших заявленное соединение 1. При этом изучаемые органы фиксируются в 10% нейтральном забуференном формалине в течение недели. После фиксации объекты заливают парафином. Полученные парафиновые блоки нарезают на ротационном микротоме толщиной 10 мкм. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. Исследование проводят при увеличении в 200-400 раз на 5 областях. В контрольных опытах не наблюдаются отеки тканей, а при использовании варфарина наблюдаются многочисленные кровоизлияния на всех пяти областях. При использовании заявленных веществ выраженных отеков паренхимы тканей и кровоизлияний не наблюдается.
На срезах внутренних органов мышей, получавших заявленные вещества, наблюдаются следующие данные:
Мочевыделителъная система. Почки обычного строения. Клубочки с умеренно полнокровными капиллярами, без патологии. Эпителий канальцев коркового и мозгового вещества с мелкоочаговой вакуольной дистрофией. Интерстиций с крайне скудной инфильтрацией лимфоцитами или без нее. Слизистая чашечек и лоханок без патологии (см. фиг. 10.3).
Дыхательная система. Бронхи со слабо выраженной реактивной пролиферацией респираторного цилиндрического эпителия, в просвете - редко содержится небольшое количество слизи. Альвеолы с тонкими стенками, в просвете - немногочисленные альвеолярные макрофаги. Лимфоидный аппарат с признаками слабо выраженной гиперплазии или без нее. Плевра обычного строения (см. фиг. 10.6).
Сердечно-сосудистая система. Миокард левого и правого желудочков с явлениями слабо выраженного интерстициального отека, значимой воспалительной инфильтрации нет. Эндокард с явлениями слабо выраженного отека. Сосуды без патологии (см. фиг. 10.9).
Пищеварительная система. Слизистая желудка с рассеянной слабо выраженной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией. Лимфоидные фолликулы в части случаев с признаками слабо выраженной гиперплазии. Подслизистый, мышечный слои и адвентиция без особенностей. Печень с сохраненным дольковым и балочным строением, портальные тракты со скудной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией или без нее, гепатоциты с зернистой или очаговой слабо выраженной вакуольной дистрофией (см. фиг. 10.12, 10.15).
Таким образом, заявляемые вещества являются практически нетоксичными соединениями и обладают более высокой антикоагулянтной активностью, чем препарат сравнения варфарин. Выявленные свойства позволяют рекомендовать их для проведения клинических испытаний как новых относительно безопасных антикоагулянтов непрямых действий с целью дальнейшего внедрения в медицинскую практику.