Биопластический материала на основе гиалуроновой кислоты как матрица для создания биомедицинских клеточных экспресс-продуктов для восстановления кожи

68

Оригинальные исследования

БИОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ КАК МАТРИЦА ДЛЯ СОЗДАНИЯ

биомедицинских клеточных экспресс-продуктов для восстановления кожи

Н.В. Калмыкова 1, О.Г. Спичкина 1, В.Н. Эллиниди 1, Р.Р. Рахматуллин 2, С.И. Моисеев 1

1 Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург, Россия

2 Оренбургский государственный университет, Оренбург, Россия

Hyaluronan-based bioplastic material as a scaffold for biomedical cell-based express-product for skin regeneration

N.V. Kalmykova 1, O.G. Spichkina 1, V.N. Ellinidi1, R.R. Rakhmatullin 2, S.I. Moiseev1

1 A.M. Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, Saint-Petersburg, Russia

2 Orenburg State University, Orenburg, Russia

Представлены результаты исследования возможностей совмещения фибробластов и кератиноцитов кожи человека на биопластическом материале «G-DERM». Определена жизнеспособность и пролиферативная активность клеток кожи на матрице, а также секреция клетками кожи интерлейкина-6 и фактора роста кератиноцитов на разных сроках культивирования. Было показано, что «G-DERM» не является токсичным для клеток кожи обоих типов, обеспечивает их адгезию и распластывание. Гистологический анализ продемонстрировал, что свойства и пористая структура матрицы обеспечивают распределение клеток в соответствии с клеточным типом. Фибробласты в составе матрицы, находясь в состоянии покоя, сохраняют свою синтетическую активность, секретируя характерные для них биологически активные факторы — регуляторы раневого заживления. Результаты выполненной работы позволяют рассматривать материал «G-DERM» как трехмерный клеточный носитель для целей регенеративной медицины.

Ключевые слова: биопластический материал,

кератиноциты, фибробласты, кожа, цитокины, тканевая инженерия.

Введение

Кожа является наибольшим по площади поверхности органом человека, ее обширные повреждения приводят к драматическим последствиям и требуют незамедлительного закрытия и восстановления нормальной структуры и функций. Наилучшие результаты достигаются при использовании аутогенной или донорской кожи, однако основной проблемой является ее нехватка или недоступность. В качестве альтернативы рассматривают тканеинженерные продукты, содержащие различные клетки кожи.

Тканевая инженерия как часть регенеративной медицины начала свое успешное распространение именно с создания тканевых аналогов кожи — эпидермального эквивалента «Epicell» (Genzyme Biosurgery, США) и полного эквивалента кожи «Apligraf» (Organogenesis Inc., США). В настоящее время существует большое разнообразие продуктов, являющихся кожными эквивалентами; оно основано на использовании различных типов клеток, разнообразных матриц и их сочетаний [1, 2].

Первые кожные тканеинженерные продукты создавали, стараясь в основных чертах воспроизвести строение кожи, поэтому процесс «созревания» такого продукта с формированием стратифицированного эпидермиса был длительным, трудоемким и затратным. В настоящее время специалисты сходятся во

е-mail: kalnv@arcerm.spb.ru

This study is designed to investigate the behavior of human fibroblasts and keratinocytes on hyaluronan-based bioplastic material «G-DERM». Cell viability, proliferation, interleikin-6 and keratinocytes growth factor secretion were investigated. The results suggested that «G-DERM» was not toxic and supported cell adhesion and spreading. Histological analysis showed that «G-DERM» properties and porous structure provided distribution of skin cells by cell-type manner. Fibroblasts on «G-DERM», being quiescent, kept their synthetic activity and produced tissue-specific factors of wound healing. According to study results «G-DERM» can be used as 3D cell matrix for regenerative medicine.

Key words: bioplastic material, keratinocyte, fibroblast, skin, cytokines, tissue engineered.

мнении, что основное действие, которое продукты с использованием клеток оказывают на раны, заключается в стимуляции репаративных процессов за счет секреции различных факторов (цитокинов, матриксных белков и протеаз). Поэтому затраты на создание сложных тканеинженерных продуктов не всегда оправданы и на рынке появились такие экспресс-продукты, как спреи на основе клеток кожи (линейка продуктов «CellSpray» (Avita Medical, Австралия)) или суспензии клеток в фибриновом клее (продукт «BioSeed-S» (BioTissue Technologies, Германия)). Однако, будучи нанесенными на рану, клетки сами нуждаются в условиях, обеспечивающих их жизнеспособность и функционирование, а именно: влажная среда и механическая защита. Это требует специфического послеоперационного ведения раны (использование неадгезивных повязок, создание влажной камеры, исключение механического травмирования) и является очередным лимитирующим фактором широкого распространения данных технологий. В этой связи нам представляется оптимальной технология использования в качестве носителей для клеток кожи биопластических материалов. Биопластические материалы — это новая группа раневых покрытий, которые разрабатываются на основе макромолекулярных полимеров с учётом следующих критериев: морфологическое сходство

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

69

с эквивалентными тканями организма; заданный период биодеградации естественными метаболическими путями; способность поддерживать ключевые физико-химические параметры газообмена и гидробаланса, а также обеспечивать оптимальные условия для адгезии, миграции и пролиферации трансплантируемых клеток.

Целью настоящего исследования было тестирование биопластического материала «G-DERM» (ДЖИ-Групп, Россия) для последующего создания биомедицинского клеточного продукта. Материал «G-DERM» представляет собой биополимер на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и адгезивного пептидного комплекса (Arg-Gly-Asp) [3]. Материал «G-DERM» соответствует большинству требований, предъявляемых к раневым покрытиям: нетоксичен, проницаем для влаги и газов, механически прочен и эластичен, при этом обладает заданным периодом биодеградации и выраженной адгезией к подлежащим тканям [4, 5]. Данные характеристики делают «G-DERM» подходящими кандидатом для использования в качестве основы при создании клеточного экспресс-продукта для восстановления кожных покровов.

Материал и методы

Выделение и культивирование клеток кожи человека. Клетки были получены из биоптатов кожи здоровых доноров, полученных в ходе проведения пластических операций. Фибробласты выделяли путем ферментативной обработки кожи с использованием 0,1% раствора коллагеназы (Панэко, Россия) с последующим стандартным культивированием в среде DMEM с 10% сыворотки эмбрионов (плодов) коров (Hyclone, США), содержащей смесь пенициллина/ стрептомицина (100 мкг/мл) (Hyclone, США). Пассировали клетки с использованием 0,25% раствора трипсина в 0,02% ЭДТА (Hyclone, США). В эксперименте использовали фибробласты взрослых доноров на 4—6 пассажах культивирования.

Кератиноциты человека были выделены ферментативным методом с использованием смеси ферментов 0,5% диспазы (Gibco, США) и 0,05% коллагеназы (Панэко, Россия). После разделения эпидермиса и дермы по линии базальной мембраны, эпидермис обрабатывали 0,25% раствором трипсина и 0,02% ЭДТА (Hyclone, США) до получения суспензии клеток. Клетки высевали на предварительно сформированный фидерный слой фибробластов. Для формирования фидерного слоя фибробласты за сутки до посева кератиноцитов высевали на чашки Петри с плотностью 10 тыс./см2. Так как конечной целью исследования было сформировать на матрице слой синтетически и пролиферативно активных клеток обоих типов, то фибробласты перед посевом не облучали и не обрабатывали митомицином С. Кератиноциты культивировали в специализированной бессывороточной среде с ростовыми добавками для кератиноцитов «Defined keratinocytes-SFM» (Invitrogen, Великобритания).

Формирование трехмерных эквивалентов кожи. Для формирования трехмерных эквивалентов кожи в качестве носителя использовали «G-DERM» (далее по тексту-матрица) или фибриновый гель, заселенные фибробластами. Фибриновый гель готовили из плазмы крови человека при добавлении тромбина 5 МЕ/мл (Ренам, Россия). Фибробласты вноси-

ли в гель/на матрицу в концентрации 100 тыс./мл. На следующие сутки на поверхность эквивалентов высевали клетки первичной культуры кератиноцитов в концентрации 1х106/мл.

Оценка жизнеспособности и пролиферативной активности клеток кожи. Жизнеспособность и пролиферативную активность клеток кожи оценивали колориметрическим методом с использованием МТТ (- 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-тетразолия бромид) (Sigma, США). Для определения жизнеспособности фибробластов клетки высевали на чашки Петри в концентрации 20 тыс./см2, кератиноциты первичной культуры высевали в концентрации 250 тыс./см2 на предварительно сформированный фидерный слой фибробластов. Через определенные промежутки времени в среду культивирования добавляли раствор ММТ (0,5 мг/мл). Жизнеспособность оценивали визуально по формированию в цитоплазме клеток различимых окрашенных кристаллов формазана.

Для определения пролиферативной активности культуру фибробластов инкубировали с МТТ в течение 4 ч при 37°С в СО2-инкубаторе. Клетки промывали PBS и добавляли DMSO (Sigma, США). После полного растворения формазана (30 мин) производили измерение оптической плотности раствора при длине волны 540 нм.

Гистологические и иммуногистохимические исследования. Гистологические и иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах. Образцы эквивалентов кожи фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили стандартную проводку в изопропаноловом спирте с последующей заливкой в парафин. Для гистологического исследования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили полимерным методом с использованием набора полимера Novolink Min Polymer Detection System (Leica Biosystems, Германия). Наличие в клетках виментина — маркера клеток соединительнотканного происхождения — и панцитокератина — маркера эпителиальных клеток — определяли с применением мышиных антител к виментину (Primary antibody Vimentin, Clone SRL 33, Leica Biosystems, Германия) и панцитокератину (Primary antibody Multi-Cytokeratin, Clone AE1/AE3, Leica Biosystems, Германия). Результат реакции проявляли хромогеном диаминобензидином (DAB из набора Novolink Min Polymer Detection System), препараты докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло. Исследование препаратов проводили при помощи прямого микроскопа Leica DM.

Определение цитокинов в среде культивирования. Секрецию ростовых факторов и цитокинов в среде культивирования оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) согласно инструкции производителей наборов. В работе использовали наборы для определения фактора роста кератиноцитов (ФРК) (Human KGF Quantikine ELISA Kit (R@D, США), набор для определения интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) (Цитокин, Россия).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 с использованием параметрических критериев. Результаты представлены в виде значений средних арифметических и стандартных отклонений.

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

70

Оригинальные исследования

Результаты

Оценка жизнеспособности клеток кожи на матрице. «G-DERM» представляет собой тонкую хрупкую пергаментнообразную пленку, стерильную, хорошо смачиваемую жидкостями. После контакта с водой она становится эластичной. Структура матрицы (пористая, волокнистая) и свойства делают ее непрозрачной, что усложняет визуализацию адгезировавшихся клеток без их предварительной окраски. В качестве красителя был выбран МТТ, который позволяет одновременно оценивать жизнеспособность клеток и окрашивать клетки без фонового прокрашивания самой матрицы. «G-DERM» имеет две разные поверхности: гладкую, обращенную к внешней среде, и шероховатую, обращенную к ране. Клетки высевали на шероховатую поверхность. В качестве контроля использовали культивирование клеток кожи на пластике (Nunc, Дания). Наблюдения показали, что фибробласты, прикрепившиеся к поверхности матрицы, распластываются с характерной для данного типа клеток морфологией и остаются живыми на всем сроке испытания (до 7 сут.) (рис. 1).

Кератиноциты начинают свой рост из агрегатов и растут в виде колоний. В контрольном варианте на фидере из фибробластов колонии легко различимы по округлой морфологии эпителиальных клеток, формирующих «булыжную мостовую» (рис. 2А). В то же самое время кератиноциты на матрице остаются, по-видимому, в виде суспензии и гибнут, что определяется отсутствием эпителиальных клеток, окрашенных МТТ (рис. 2Б). При этом фибробласты фидерного слоя к 5 сут. культивирования на матрице остаются живыми и сохраняют характерную для них веретеновидную морфологию. Окраска МТТ не позволяет четко различить два типа клеток кожи: ке-ратиноциты и фибробласты, — т. к. сам МТТ реагент приводит к постепенному изменению морфологии клеток (округлению). Чтобы сделать окончательный вывод о поведении клеток кожи на «G-DERM», провели гистологические и иммуногистохимические исследования.

Оценка пролиферативной активности фибробластов. Как видно на графике оптической плотности (рис. 3), фибробласты в контроле активно пролиферируют, демонстрируя достоверный прирост клеток

Рис. 1. Фибробласты кожи человека на пластике (А) и на матрице «G-DERM» (Б), 3 сут. культивирования. Окраска: МТТ. Ув. х25

Рис. 2. Кератиноциты человека на фидере из фибробластов: А — контроль; Б — «G-DERM», 5 сут. 1 — кератиноциты, 2 — фибробласты. Окраска: МТТ. Ув. х125

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

71

каждые двое суток, при этом значения оптической плотности раствора, отражающие количество клеток на матрице, за 7 сут. культивирования не изменились. На основании этих данных можно сделать вывод, что «G-DERM» не способствует активному размножению фибробластов кожи.

Гистологические и иммуногистохимические исследования. Биопластический материал «G-DERM» имеет толщину 350 мм и пористую структуру и может рассматриваться как матрица для трехмерного культивирования. В качестве контроля поведения клеток в трехмерной матрице использовали фибриновый гель. Как видно на гистологическом препарате (рис. 4А), фибриновый гель с клетками кожи представляет собой классический пример полного эквивалента кожи, так как в основных чертах воспроизводит ее гистологическое строение. Полный эквивалент состоит из двух слоев — дермального, сформиро-

| 0,200 о ш

о 0,100

0,050

0,000

3 сут.

5 сут.

7 сут.

Рис. 3. Пролиферативная активность нормальных фибробластов кожи человека на культуральном пластике (синим) и материале «G-DERM».

* — различия между группами статистически значимы, р<0,01

ванного из геля и фибробластов, и эпидермального слоя, сформированного в результате дифференци-ровки и стратификации эпидермальных клеток. В эпидермальном слое видны многочисленные клетки с пикнотическими ядрами и гипертрофированные клетки с разрушенными ядрами, что отражает нормальную картину клеток, проходящих терминальную дифференцировку (рис. 4Б). При этом на границе с гелем видны растущие кератиноциты с четко очерченными ядрами, формирующие колонию. На этом же самом сроке (7 сут.) гистологическая картина клеток кожи на матрице «G-DERM» сильно отличается (рис. 5А). При сохранении дермального слоя, в данном варианте отсутствует многослойный пласт кератиноцитов. Эпидермальный слой представлен отдельными мелкими агрегатами, среди которых можно наблюдать только клетки с пикнотическими или разрушенными ядрами (рис. 5Б). Эти агрегаты могут быть как результатом клеточной дифференци-ровки, так и результатом гибели клеток после посева. Для того, чтобы подтвердить распределение клеток кожи в образцах, было произведено имуногистохи-мическое окрашивание с использованием антител к виментину и панцитокератину.

Распределение маркеров соответствует характеру расположения клеточных типов в трехмерных образцах: виментин преимущественно выявляется в клетках, распределенных по всей толщине образцов — фибробластах (рис. 6А и 7А), панцитокератин — в клеточных агрегатах и многослойных пластах на поверхности образцов — кератиноцитах (рис. 6Б и 7Б). При этом в препаратах «G-DERM» при окраске антителами на кератин, кроме агрегатов, выявляются участки, содержащие по несколько клеток, распластанных на поверхности матрицы (рис. 7Б). Очевидно, что это базальные кератиноциты, прикрепившиеся и распластавшиеся на поверхности матрицы, но не сформировавшие полного монослоя. Эти исследование показали, что клетки кожи, будучи посеянными на «G-DERM», распределяются характерным для их клеточного типа способом: фибробласты проникают в толщу матрицы, кератиноциты распластываются на ее поверхности.

Рис. 4. Клетки кожи в составе трехмерного эквивалента на основе, фибринового геля, 7 сут.: 1 — эпидермальный слой; 2 — дермальный слой; 3 — пикноз ядер; 4 — агрегат кератиноцитов. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: А х125; Б х250

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

72

Оригинальные исследования

Рис. 5. Клетки кожи в составе трехмерного эквивалента на основе матрицы «G-DERM», 7 сут.:

1 — эпидермальный слой; 2 — дермальный слой; 3 — пикноз ядер. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: А х125; Б х 250

ь

А Б

Рис. 6. Клетки кожи в составе трехмерного эквивалента основе фибринового геля. 7 сут.: результат иммуногистохимической реакции с антителами к виментину (А) и панцитокератину (Б). 1 — эпидермальный слой, 2 — дермальный слой. Докраска гематоксилином. Ув. х125

Рис. 7. Клетки кожи в составе трехмерного эквивалента на основе матрицы «G-DERM», 7 сут.: результат иммуногистохимической реакции с антителами к виментину (А) и панцитокератину (Б):

1 — эпидермальный слой, 2 — дермальный слой; 3 — базальные кератиноциты. Докраска гематоксилином. Ув. х125

Определение секреции цитокинов. Предварительный анализ данных показал, что ФРК выявляется только в вариантах с фибробластами, но не с керати-ноцитами. Количество ФРК, синтезируемое фибробластами в контроле (пластик) и на матрице через сутки культивирования не различаются (68±2,8 и 68±20,4 пг/мл соответственно) (рис. 8). К трем суткам культивирования наблюдается тенденция

к увеличению концентрации в обоих вариантах, однако эти значения статистически не достоверны (79±13,6 и 103±16,8 пг/мл соответственно).

Анализ данных секреции ИЛ-6 показал, что наибольшие значения ИЛ-6 определяются в вариантах с фибробластами (рис. 9), но не кератиноцитами. При этом разницы между матрицей и контролем нет (1070±10,0 и 1110±17,3 пг/мл соответственно),

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

73

также нет разницы между 1 и 3 сут. культивирования. По-видимому, при данной плотности посева фибробластов, уже к первым суткам культивирования достигается максимум концентрации интерлейкина. В контрольном варианте кератиноцитов на фидере на первые сутки культивирования в среде появляется детектируемый уровень ИЛ-6 (40±17,3 пг/мл), который увеличивается к третьим суткам до 193±51,3 пг/мл, однако его количество существенно ниже вариантов с одними фибробластами. Данные различия вполне объяснимы. В качестве фидерных клеток фибробласты сеяли в плотности в 10 раз ниже плотности, используемой в других вариантах, соответственно, при начальном низком уровне цитокина, его значение в среде по мере роста клеток постепенно нарастало. В аналогичном варианте с матрицей ИЛ-6 не обнаружен.

В среде культивирования клеток кожи, вне зависимости от варианта (матрица, контроль, сроки, комбинация клеток) ИЛ-10 не выявлен. ИЛ-10 использовали в качестве негативного контроля, его секреция присуща клеткам кроветворного ряда (моноцитам и лимфоцитам).

Рис. 8. Содержание ФРФ в среде культивирования фибробластов

Контроль G-DERM Контроль

Фибробласты Кератоциты/

фибробласты

Рис. 9. Содержание ИЛ-6 в среде культивирования клеток кожи.

* — различия между группами статистически значимы, р<0,01

Таким образом, при культивировании клеток кожи на биопластическом материале «G-DERM» выявлена секреция фибробластами двух цитокинов — ФРК и ИЛ-6. При этом уровень секреции данных цитокинов не отличается в вариантах фибробластов, посеянных на культуральный пластик и на матрицу.

Обсуждение

Использование клеток кожи для восстановления кожных покровов является признанным и широко используемым методом в лечении ожогов, трофических язв и других кожных ран [6—8]. Разработка продуктов с использованием клеток кожи идет в двух направлениях — в направлении усложнения состава и упрощения применения базовых продуктов. Усложнение заключается в максимальном приближении тканеинженерных продуктов по клеточному и внеклеточному составу к строению нормальной кожи с их предварительной васкуляризацией [9—12]. Полагают, что усложнение технологии должно окупиться получением результата, сравнимого с трансплантацией донорской кожи. Упрощение технологии идет по пути минимизации расходов, времени и используемых компонентов и основано на понимании механизмов действия клеточных продуктов. В таких экспресс-продуктах используют один-два типа клеток; эпидермальные клетки часто используют в виде первичной культуры или с минимальным сроком культивирования [13—16]. В настоящем исследовании использовали протокол смешанной культуры кератиноцитов и фибробластов (в соотношении 10 к 1) без предварительного культивирования эпидермальных клеток и без облучения фидерных клеток [17, 18]. В такой системе фибробласты выступают, с одной стороны, как фидерные клетки для кератиноцитов, с другой стороны, как самостоятельные полноценные биологически активные агенты.

Биопластический материал «G-DERM» (на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и особого пептидного комплекса) продемонстрировал высокую клиническую эффективность при лечении длительных и рефрактерных к традиционной терапии трофических язв на фоне варикозной болезни и сахарного диабета I типа, а также при термических травмах [19, 20]. Гиалуроновая кислота является одним из элементов внеклеточного матрикса соединительной ткани, сама кислота и ее производные активно используют при создании тканеинженерных продуктов, в том числе и с клетками кожи [21]. Так, итальянская фирма Fidia Advased Biopolymers производит два вида продуктов для оптимизации заживления кожных ран: эпидермальный аналог «Laserskin»

в виде пористой мембраны с растущими кератино-цитами и дермальный эквивалент «Hyalograft 3D» в форме геля, заселенный фибробластами.

В целях клинического использования достаточно 1—2 сут., чтобы получить готовый экспресс-продукт из свежевыделенных или криоконсервированных клеток. В нашем исследовании фибробласты на матрице на всем сроке испытания (до 7 сут.) оставались жизнеспособными, но находились в состоянии покоя. В норме в организме активно пролиферируют только клетки постоянно обновляющихся тканей, в том числе клетки эпидермиса, в то время как резидентные клетки дермы — фибробласты — находятся в состоянии покоя. Стимулом для пролиферации фибробластов может служить изменение

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

74

Оригинальные исследования

нормального гомеостаза ткани, приводящее к изменению микроокружения, в частности, в процессе повреждение кожи. Перевод клеток в условия in vitro также является стимулом для активного размножения. К факторам, влияющим на размножение клеток, относятся практически все составляющие микроокружения, начиная от ростовых факторов и цитокинов, заканчивая элементами матрикса, их химией и архитектоникой. Поверхность культуральной посуды представляет собой модель двухмерного культивирования. Материал «G-DERM» предоставляет возможности одновременно как двухмерного, так и трехмерного культивирования (на поверхности и в толще матрицы). Особенностью «G-DERM» является его двухфазная система, при которой внутренняя сторона формирует гидроколлоид. По литературным данным, влияние гиалуро-новой кислоты на клетки в культуре, в том числе на их пролиферацию, может быть в разных модельных системах прямо противоположным и определяется физико-химическими свойствами ее производных

[22] . В классических работах F. Grinnel (2008) по поведению фибробластов в коллагеновом геле было показано, что пролиферативная активность и синтез белков внеклеточного матрикса напрямую зависят от сил натяжения в геле. При слабом натяжении фибробласты находятся в состоянии покоя, что соответствует состоянию клеток в «мягких тканях» в обычных условиях. Напротив, сильное механическое натяжение приводит к формированию стресс-фибрилл и активации фокальных киназ, результатом является стимуляция пролиферации и синтез и (или) ремоделирование белков матрикса

[23] . Данное состояние отражает процессы, происходящие с фибробластами при заживлении ран. По-видимому, физические свойства гидроколлоида «G-DERM» не обеспечивают должных механических свойств и, соответственно, сигналов для клеточной пролиферации клеток. По этим показателям материал «G-DERM» будет неэффективен при создании полных эквивалентов кожи, так как не обеспечивает пролиферации кератиноцитов и, соответственно, формирования полноценного эпидермального слоя. С другой стороны, активное размножение клеток в матрице, предназначенной для трансплантации, и последующее размножение клеток в организме после трансплантации — явление неоднозначное с точки зрения онкобезопасности.

Известно, что клетки кожи в культуре синтезируют ряд биологически активных факторов: ФРФ (факторов роста фибробластов), ФРГ (фактор роста гепатоцитов), ФРТ (фактор роста тромбоцитов), ФРК, ТФР р (трансформирующий фактор роста бета), ИЛ-6, ИЛ-8 и другие [24—26]. При культиви-

ЛИТЕРАТУРА:

1. MacNeil S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature 2007; 44: 874—80.

2. Shevchenko R.V., James S.L., James S.E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. J.R. Soc. Interface 2010; 7 (43): 229-58.

3. Бурлуцкая О.И., Рахматуллин Р.Р, Бурцева Т.И., Адель-шин А.И. Гистоэквивалент-биопластический материал. Патент RU2513838. 20.04.2014.

4. Рахматуллин Р.Р. Биопластический материал на основе ги-алуроновой кислоты: биофизические аспекты фармакологических свойств. Фармация 2011; 4: 37-9.

5. Зиновьев Е.В., Рахматуллин Р.Р., Османов К.Ф. и др. Биопластические дерматотерапевтические системы на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса. Вест-

ровании клеток кожи на материале «G-DERM» выявлена секреция фибробластами двух цитокинов -ФРК и ИЛ-6.

ФРК, известный также как ФРФ-7, экспрессируется клетками мезенхимного происхождения (фибробластами, мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками, гладкомышечными клетками и др.), оказывает паракринное действие на клетки эпителиального происхождения. Так, в частности, в коже ФРК синтезируется дермальными фибробластами и стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки эпидермальных клеток. При раневом заживлении под влиянием факторов воспаления, таких как ИЛ-6 и ИЛ-1, происходит стимуляция секреции ФРК фибробластами [27]. ИЛ-6 продуцируется клетками лимфоидного и нелимфоидного происхождения, в том числе фибробластами и кератиноцитами. Являясь основным медиатором воспаления, он обладает множественным биологическим действием. Было показано, что ИЛ-6 вызывает пролиферацию кератиноцитов и его повышенная экспрессия связана с патологическими состояниями кожи [28]. В нашем исследовании синтез ИЛ-6 в варианте с кератиноцитами на матрице, в отличие от контроля, не обнаружен. Судя по контрольному варианту, присутствие цитокина в среде обеспечивается на данных сроках, по-видимому, только секреторной активностью фидерных фибробластов. Матрица имеет поры со средним размером 252,16±98,73 мкм, часть посеянных клеток пассивно проходит сквозь матрицу. Клеточные потери при изначально низкой плотности посева фидера могли сказаться на суммарном синтезируемом количестве цитокина в среде. Учитывать клеточные потери в образцах не представляется возможным, т. к. поры в матрице имеют гетерораспределение.

Таким образом, совместное действие ФРК и ИЛ-6 при их секреции клетками кожи в составе клеточных продуктов должны способствовать нормальному течению процессов раневого заживления, начиная с фазы воспаления и заканчивая эпителизацией раневой поверхности.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что биопластический материал «G-DERM» является подходящим и доступным для использования в качестве матрицы для создания экспресс-продуктов на основе клеток кожи. Свойства и пористая структура покрытия обеспечивают прикрепление и распластывание клеток кожи не только на его поверхности, но и в толще, при этом клетки сохраняют свою жизнеспособность и синтетическую активность, секретирую характерные для них биологические факторы-регуляторы раневого заживления.

ник Российской Военно-медицинской академии 2014; 1 (45): 147-51.

6. Boyce S.T., Kagan R.J., Yakuboff K.P. et al. Cultured skin substitutes reduce donor skin harvesting for closure of excised, fullthickness burns. Ann. Surg. 2002; 235: 269-79.

7. Спичкина О.Г., Калмыкова Н.В., Моисеев С.И. Клеточные технологии в лечении трофических язв и длительно незаживающих ран. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях 2012; 4: 61-9.

8. Wong V., Gurtner G. ^ssue engineering for the management of chronic wounds: current concepts and future perspectives. Exp. Dermatol. 2012; 21: 729-34.

9. Regnier M., Patwardhan A., Scheynius A. et al. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med. Biol. Eng. Comput. 1998; 36: 821-4.

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014

Оригинальные исследования

75

10. Ponec M., Ghalbzouri E., A., Dijkman R. et al. Endothelial network formed with human dermal microvascular endothelial cells in autologous multicellular skin substitutes. Angiogenesis 2004; 7: 295-305.

11. Tonello C., Vindigni V., Zavan B. et al. In vitro reconstruction of an endothelialized skin substitute provided with a microcapillary network using biopolymer scaffolds. FASEB J. 2005; 19: 1546-8.

12. Dezutter-Dambuyant C., Black A., Bechetoille N. et al. Evolutive skin reconstructions: from the dermal collagen-glycosaminoglycan-chitosane substrate to an immunocompetent reconstructed skin. Biomed. Mater. Eng. 2006; 16: S85-S94.

13. Mulekar S.V. Long-term follow-up study of 142 patients with vitiligo vulgaris treated by autologous, non-cultured melanocyte-keratinocyte cell transplantation. Int. J. Dermatol. 2005; 44: 841-5.

14. James S.E., Booth S., Dheansa B., et al. Sprayed cultured autologous keratinocytes used alone or in combination with meshed autografts to accelerate wound closure in difficult to-heal burns patients. Burns 2010; 36: 10-20.

15. Currie L. J., Martin R., Sharpe J. R. et al. A comparison of keratinocyte cell sprays with and without fibrin glue. Burns 2003; 29: 677-85.

16. Hernon C.A., Dawson R.A., Freedlander E. et al. Clinical experience using cultured epithelial autografts leads to an alternative methodology for transferring skin cells from the laboratory to the patient. Regen. Med. 2006; 1: 809-21.

17. Sun T., McMinn P., Holcombe M. et al. Agent based modeling helps in understanding the rules by wich fibroblasts support keratinocytes colony formation. PLoS ONE 2008; 3(5): e2129.

18. Jubin K., Martin Y., Lawrence-Watt D.J. et al. A fully autologous co-culture system utilizing non-irradiated autologous fibroblasts to support the expansion of human keratinocytes for clinical use. Cytotechnology 2011; 63: 655-62.

19. Зиновьев Е.В., Кисленко А.М, Сивожелезов К.Г. и др. Возможности биопластики трофических язв гистоэквивалент-био-пластическим материалом на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты. Хирург 2014; 4: 14-21.

20. Рева Г.И., Усов В.В., Митряшов К.В. Применение материала «G-DERM» для лечения «пограничных» ожогов. Сборник научных трудов IV съезда комбустиологов России 2013; 114-5.

21. Vindigni V., Cortivo R., lacobellis L. et al. Hyaluronan benzyl ester as a scaffold for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 2009; 10: 2972-85

22. Solis M.A., Chen Y-H., Wong T.Y. et al. Hyaluronan regulates cell behavior: a potential niche matrix for stem cells. Biochem. Res. Int. 2012; 2012: 346972.

23. Grinnel F. Fibroblast mechanics in three dimensional collagen matrices. J. Bodyw. Mov. Ter. 2008; 12 (3): 191-3.

24. Brem H., Young J., Tomic-Canic M. et al. Clinical efficacy and mechanism of bilayered living human skin equivalent (HSE) in treatment of diabetic foot ulcers. Surg. Technol. Int. 2003; 11: 23-31.

25. Kubo K., Kuroyanagi Y. A study of cytokines released from fibroblasts in cultured dermal substitute. Artif. Organs. 2005; 29 (10): 845-9.

26. Werner S., Krieg T., Smola H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J. Investig. Dermatol. 2007; 127: 998-1008.

27. Tang A., Gilchrest B.A. Regulation of keratinocyte growth factor gene expression in human skin fibroblasts. J. Dermatol. Sci. 1996; 11 (1): 41-50.

28. Grossman, R. M., Krueger J., Yourish D. et al. Interleukin-6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. PNAS USA 1989; 86: 6367.

Поступила 01.07.2014

Гены & Клетки Том IX, № 2, 2014