Оценка содержания каротиноидов у асцидий Halocynthia aurantium и Styela clava

2006

Известия ТИНРО

Том 147

УДК 577.1:594.95 А.А. Белорукова, П.А. Задорожный, Т.Н. Пивненко, Е.В. Якуш

ОЦЕНКА СОДЕРЖАНИЯ КАРОТИНОИДОВ У АСЦИДИЙ HALOCYNTHIA AURANTIUM И STYELA CLAVA

Изучено содержание каротиноидов в различных органах асцидий H. aurantium и S. clava. Установлено, что туника H. aurantium содержит наибольшее количество этих пигментов (36,8 мг/100 г сырой ткани) и может быть использована для производства концентратов каротиноидов. Исследована эффективность процессов экстракции пигментов, показана принципиальная возможность получения масляных концентратов. Установлено, что экстракты различных органов асцидии содержат сложную смесь каротиноидов различной полярности.

Belorukova A.A., Zadorozhny P.A., Pivnenko T.N., Yakush E.V. Estimation of carotenoid content in the ascidians Halocynthia aurantium and Styela clava // Izv. TINRO. — 2006. — Vol. 147. — P. 347-353.

Content of carotenoids in different organs of the ascidians H. aurantium and S. clava is investigated. Complex mixture of carotenoids with various polarity is determined in all organs of the ascidians. The tunic of H. aurantium contains the greatest amount of these pigments (36.8 mg/100 g wet tissue), so it can be used for the carotenoids concentrate production. Efficiency of the pigments extraction is investigated, and possibility of oil concentrate preparation is proved.

В настоящее время в нашей стране происходит существенное расширение списка промысловых объектов за счет видов, ранее не считавшихся пригодными для пищевого использования. К ним относятся многие виды моллюсков, иглокожих, ракообразных. В странах АТР ассортимент привлекаемых к пищевому использованию гидробионтов значительно шире. Помимо традиционных видов он включает также асцидий — животных, принадлежащих к типу хордовых, подтипу личиночнохордовых.

В дальневосточных и арктических морях широко распространена асцидия Halocynthia aurantium, и в нашей стране предпринимались попытки изготовления консервов из нее (Савватеева, 1990), однако они не получили дальнейшего развития.

Многие виды животных различных таксономических групп изучаются с целью использования в медицине. Особенно высок интерес к морским организмам как источнику биологически активных веществ, поэтому весьма актуальны вопросы привлечения асцидий для получения БАД и фармпрепаратов. Из асцидий получены имидазольные алкалоиды, обладающие противоопухолевой активностью (Попов, 2003). Из туники H. aurantium получена БАД к пище "Хаурантин", представляющая собой спиртовой экстракт. Показано, что она содержит биологически активные вещества различной природы, в том числе более 15 свободных аминокислот, фосфолипиды, жирные кислоты и нейтральные липиды, простаг-ландины и ряд микро- и макроэлементов, включая большое количество ванадия (Добряков, 2004).

К биологически активным веществам асцидии можно отнести и каротинои-ды — вещества, способные снижать вероятность возникновения онкологических, сердечно-сосудистых и некоторых других заболеваний (Carotenoids ..., 2004; Hix et al., 2004). Среди каротиноидов асцидии преобладают достаточно окисленные формы — астаксантин, аллоксантин, диатоксантин, галоцинтиаксантин, фукоксантинол, митилоксантинон и др. (Ребачук и др., 1985; Ookubo, Matsuno, 1985; Choi et al., 1994). Исследования Цусима с соавторами (Tsushima et al., 1995) показали, что галоцинтиаксантин является одним из наиболее активных в противоопухолевом отношении каротиноидов. Фукоксантинол также обладает подобной активностью, хотя и в меньшей степени. Роль и метаболизм фукоксан-тинола в организме человека и других млекопитающих в настоящее время интенсивно изучаются (Sugawara et al., 2002; Asai et al., 2004).

Кроме того, каротиноиды находят применение как пищевые красители и добавки в корма для аквакультуры. Чой с соавторами (Choi et al., 1996) предложили использовать экстракт туники асцидии как добавку в корм при выращивании креветки Penaeus japónicas.

Целью нашей работы явилось исследование содержания каротинодов в различных тканях и органах двух видов асцидий, предварительная оценка качественного состава этих пигментов, а также исследование различных методов экстракции каротиноидов для получения масляных концентратов пигментов.

Асцидия H. aurantium выловлена в зал. Посьета в августе 2004 г. водолазным способом. Свежевыловленную асцидию разделяли на органы (туника, мантия, гонады, пищеварительная железа) и замораживали. Образцы хранили при минус 25 °С до анализа (не более месяца). S. clava была выловлена в зал. Петра Великого в июне 2005 г.

Использовали различные варианты экстракции каротиноидов.

Экстракция ацетоном: к навеске гомогенизированной ткани (0,5-1,0 г) добавляли десятикратный объем ацетона, после чего смесь фильтровали через фильтр Шотта на водоструйном насосе. Остаток ткани промывали ацетоном до тех пор, пока растворитель, стекающий с фильтра, не становился бесцветным.

Экстракция спиртом: ткань экстрагировали этанолом так же, как описано выше.

Экстракция маслом: к навеске ткани добавляли десятикратный объем подсолнечного масла, смесь перемешивали и оставляли на ночь в холодильнике (4 °С). После этого раствор фильтровали на фильтре Шотта.

Реэкстракция каротиноидов гексаном: каротиноиды из ацетоновых экстрактов переводили в гексан, смешивая в делительной воронке ацетоновый раствор с гексаном (1-5 мл) и осторожно добавляя примерно 150 мл 5 %-ного водного раствора №Cl для разделения гексанового и водного слоев и предотвращения образования эмульсии. Гексановый слой сушили над безводным Na2SO4.

Реэкстракция каротиноидов растительным маслом: пигменты из ацетоновых и спиртовых экстрактов переводили в растительное масло так же, как описано выше для гексана. В случае спиртовых экстрактов реэкстракцию вели в течение 2-4 ч при 4 °С в темноте. Раствор сушили, фильтруя его через слой безводного Na2SO4.

Количественное определение каротиноидов и запись спектров поглощения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-2100. Масляные экстракты разбавляли гексаном, запись спектров вели против масла, разбавленного соответствующим количеством гексана.

Концентрацию каротиноидов (мг/100 г сырой ткани) рассчитывали по формуле:

С = (А450  V  100)/250  m,

где А450 — оптическая плотность исследуемого раствора при 450 нм; V — объем гексана или масла, мл; m — масса навески сырой ткани, г; 250 — средний удельный коэффициент поглощения каротиноидов, мл  см  мг-1 (Карнаухов, 1988).

Концентрация каротиноидов в пересчете на организм в среднем (мг/100 г сырой ткани) была рассчитана исходя из средней массы 1 экз. асцидии H. au-rantium 210 г, среднего процентного содержания (по массе) мантии (6,8 %), туники (17,6), гонад (1,8), пищеварительной железы (1,4 %) в изученной выборке (20 шт.). Средняя масса S. clava составила 15,4 г, выход туники — 16,6 %, остальное — внутренние органы, включая желудок и внутриполостную жидкость.

Разделение каротиноидов вели методом тонкослойной хроматографии, на пластинках Silica gel 60F 5 х 10 см (Merck) в системе дихлорметан—этилацетат 4 : 1 (Choi et al., 1994). На пластинки наносили концентрированный экстракт в гексане.

Стандарты эхиненона и фукоксантинола выделены из морского ежа Strongy-locentrotus intermedius, астаксантин приобретен у Sigma Corp.

Относительное содержание фракций после сканирования пластинки на сканере НР Scanjet 2004 определяли с помощью программы Image Master 1D Elite (Amersham Biosciences).

Экстракция ацетоном и последующий перевод каротиноидов в гексан или петролейный эфир обычно считается достаточным для их количественного извлечения (Schiedt, Liaaen-Jensen, 1995). Поэтому в настоящей работе количество пигментов, извлекаемых из ткани при использовании этой схемы экстракции, мы принимали за 100 %.

Содержание каротиноидов исследовали в различных тканях двух видов ас-цидий, данные представлены в табл. 1. Для сравнения приведены литературные сведения по этим и другим видам асцидий.

Из данных табл. 1 видно, что у асцидии H. aurantium содержание каротино-идов максимально в тунике, затем в порядке уменьшения следуют мантия, пищеварительная железа и гонады. Определенное нами содержание каротиноидов в пищеварительной железе, вероятно, завышено, так как оптическая плотность при 450 нм может быть частично обусловлена и желчными пигментами. В пересчете на содержание в целом организме большее, чем у H. aurantium, количество каротиноидов отмечено только у H. roretzi и колониальной формы Polycitor proliferus. Концентрация пигментов в тунике H. aurantium была примерно в 1,6 раза ниже, чем у образцов, изученных ранее (Ребачук и др., 1985), но сопоставима с близкородственным видом H. roretzi (Choi et al., 1994). В то же время асцидия S. clava, добытая в зал. Петра Великого, содержит значительно меньше каротиноидов, чем образцы, изученные японскими учеными (Ookubo, Matsuno, 1985). Изученные ими образцы S. clava имели тунику ярко-красного цвета, в нашем случае образцы были значительно бледнее. Возможно, на содержание каротиноидов оказывают влияние условия обитания, в частности глубина и кормовая база.

В целом туника асцидии H. aurantium, предлагаемая для получения БАД, содержит достаточно большое количество каротиноидов, даже при сравнении с беспозвоночными, что позволяет рекомендовать ее в качестве источника для получения концентратов каротиноидов, поэтому в дальнейшем были исследованы экстракты пигментов именно из этого вида.

Для разработки методики получения пищевого экстракта каротиноидов из асцидии мы использовали нескольких способов экстракции и сравнили выход каротиноидов в различных экстрактах. Были опробованы экстракция ацетоном и последующая реэкстракция растительным маслом, экстракция спиртом и реэкст-ракция маслом, а также отдельно масляная и спиртовая экстракции. Данные о выходе каротиноидов представлены в табл. 2.

Как и следовало ожидать, для полного извлечения каротиноидов необходима первоначальная экстракция полярным растворителем (Карнаухов, 1988). Использование только одного масла оказывается неэффективным — экстрагировалось от 0,5 до 9,0 % общего количества каротиноидов. Спиртовая экстракция дает хороший выход пигментов во всех случаях, может быть, за исключением

Таблица 1

Содержание каротиноидов в некоторых видах асцидий

Table 1

Carotenoid content in several species of Ascidian

Количество

Вид Орган каротиноидов, мг/100 г сырой ткани Источник данных

Halocynthia aurantium Гонады Пищеварительная железа Мантия Туника 3,2 10,8 16.7 36.8 Собственные данные

В среднем Туника 7,8 60,9* Ребачук и др., 1985

H. roretzi Туника Мантия** 41,0-55,4 2,4-3,0 Choi et al., 1994

В среднем 10,6 Ookubo, Matsuno, 1985

Styela clava Туника Остальные ткани** 3,2 1,0 Собственные данные

В среднем 1.4 7.5 Ookubo, Matsuno, 1985

S. plicata 1,6

Botryllus schlosseri 2,8

Botrylloides violaceus 2,2

Amaroucium pliciferum 3,5 "

Ciona intestinalis 1,4

Ascidia zara 1,5 "

Didemnum moseleyi 2,5 "

Polycitor proliferus 9,2 "

* Авторами приводится содержание 0,3 % от массы сухой ткани. Приведенная цифра получена с учетом определенного нами среднего содержания влаги 79,7 %. ** Вместе с содержимым желудка.

Таблица 2

Выход каротиноидов при использовании различных способов экстракции, %

Table 2

Yield of carotenoids under different extraction methods, %

Орган Ацетон—масло Спирт—масло Масло Спирт—гексан

Гонады 66,8 53,1 2,2 100,0

Пищеварительная железа 40,8 41,2 9,1 100,0

Мантия 57,5 50,5 Следы 68,5

Туника 66,3 34,1 0,5 66,7

Примечание. За 100 % принято количество пигментов, извлекаемое системой аце-

тон—гексан.

туники. В то же время при получении бесспиртовых масляных экстрактов система ацетон—масло оказывается более эффективной. Вероятно, это связано с тем, что ацетон лучше растворим в растительном масле, что делает реэкстракцию быстрой и эффективной. Другим фактором может быть стабильность образующихся эмульсий. При продолжительном контакте водной и масляной фаз (несколько десятков часов) эффективность реэкстракции в системах ацетон—масло и спирт—масло становится практически одинаковой. Тем не менее ответить на вопрос, почему в том или ином случае реэкстракция оказывается эффективной или наоборот, вряд ли возможно без знания качественного состава каротинои-

дов, присутствующих в растворе. Но в любом случае оба полярных растворителя могут быть использованы для первичного извлечения каротиноидов из тканей.

Для предварительной оценки состава каротиноидов мы использовали метод тонкослойной хроматографии на силикагеле, в системе дихлорметан—эти-лацетат 4 : 1, предложенной ранее для разделения каротиноидов туники асци-дии H. roretzi (Choi et al., 1994).

До разделения экстракты окрашены в яркие желто-оранжевые цвета и имеют типичный для каротиноидов спектр поглощения с максимумом 452-456 нм (рис. 1). В результате разделения нами получено 13 пятен различной интенсивности (рис. 2). Данные по количественному соотношению различных компонентов, определенные денситометрически, приведены в табл. 3. Даже принимая во внимание приблизительность количественной оценки содержания того или иного компонента, видна специфичность распределения каротиноидов по органам — менее полярные каротиноиды характерны для гонад и мантии, в то время как туника содержит большее количество полярных каротиноидов. Следует отметить, что в пищеварительной железе высокое содержание компонента со временем удерживания 0,03 (27,5 %) может быть обусловлено присутствием порфи-риновых пигментов, так как это пятно имело желто-зеленоватый оттенок. Учитывая сложный состав каротиноидов асцидии и близкие значения Rf хроматогра-фических зон, необходимо проведение качественного анализа пигментов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии.

° 360 420 480 540 600

Длина волны, нм

Рис. 1. Спектры поглощения экстрактов H. aurantium: 1 — пищеварительная железа, 2 — мантия, 3 — гонада, 4 — туника

Fig. 1. Absorbtion spectra of carotenoid extracts of H. aurantium: 1 — digestive gland, 2 — mantle, 3 — gonad, 4 — tunic

Следовательно, высокое количественное содержание каротиноидов у H. aurantium позволяет рекомендовать тунику и мантию этой асцидии как перспективный источник для извлечения каротиноидов. В то же время необходима дальнейшая идентификация пигментов и оптимизация условий экстракции для получения масляных концентратов с максимальным выходом каротиноидов.

Рис. 2. Тонкослойная хромато-грамма каротиноидов асцидии H. au-rantium: 1 — стандарты, 2 — пищеварительная железа, 3 — гонада, 4 — туника, 5 — мантия. Справа указаны номера фракций в табл. 3

Fig. 2. Thin layer chromatogram of carotenoids of H. aurantium: 1 — standards, 2 — digestive gland, 3 — gonad, 4 — tunic, 5 — mantle. Numbers of fractions (table 3) are shown on the right

Таблица 3

Количественное соотношение каротиноидов различной полярности

Table 3

Estimation of percentage of carotenoid bands on thin layer chromatogram

№ Rf Содержание компонентов, %

полосы полос Мантия Туника Гонады Пищеварительная железа

1 0,03 0,4 0,5 1,3 27,5

2 0,06 3,6 2,5 2,9 7,5

3 0,15 4,5 7,8 1,8 2,3

4 0,16 3,7 15,2 9,9 21,7

5 0,22 20,4 15,8 8,2 5,7

6 0,27 7,4 29,9 19,8 18,1

7 0,29 1,4 5,8 Следы Следы

8 0,38 0,7 4,8 Следы Следы

9 0,46 13,1 5,9 46,7 10,8

10 0,53 4,0 2,1 6,1 4,8

11 0,60 1,5 0,1 0,4 0,4

12 0,70 1,8 1,6 0,7 0,8

13 0,83 37,5 8,1 2,2 0,4

Литература

Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта из туники асцидии Halocynthia aurantium: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Владивосток, 2004. — 23 с.

Карнаухов В.Н. Биологические функции каротиноидов. — М.: Наука, 1988. — 240 с.

Попов A.M. Биологическая активность и механизмы действия вторичных метаболитов из наземных растений и морских беспозвоночных: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Владивосток, 2003. — 52 с.

Ребачук Н.М., Максимов О.Б., Богуславская Л.С., Федореев С.А. Каротино-иды асцидии Halocynthia aurantium // Химия природ. соединений. — 1985. — Т. 20, № 4. — С. 431-433.

Савватеева Л.Ю. Научно обоснованная товароведная характеристика гидробион-тов дальневосточных морей и продуктов их комплексной переработки: Автореф. дис. ... д-ра техн. наук. — Л., 1990. — 43 с.

Asai A., Sugawara T., Ono H., Nagao A. Biotransformation of fucoxanthinol into amarouciaxanthin A in mice and HEPG2 cells: formation and cytotoxicity of fucoxanthin metabolites // Drug Metabolism and Deposition. — 2004. — Vol. 32, № 2. — P. 205-211.

Carotenoids in health and disease (Oxidative stress and disease) / Eds N.I. Krinsky, S.T. Mayne, H. Sies. — N.Y.: Marcel Dekker, 2004. — 568 p.

Choi B.-D., Kang S.-J., Choi Y.-J. et al. Utilization of ascidian (Halocynthia roretzi) tunic. 3. Carotenoid composition of ascidian tunic // Bull. Korean Fish. Soc. — 1994. — Vol. 27, № 4. — P. 344-350.

Choi B.-D., Kang S.-J., Lee K.-H. Effect of ascidian tunic extracts on cholesterol accumulation and pigmentation of Kuruma prawn, Penaeus japonicus // Bull. Korean Fish. Soc. — 1996. — Vol. 29, № 3. — P. 393-408.

Hix L.M., Lockwood S.F., Bertram J.S. Bioactive carotenoids: potent antioxidants and regulators of gene expression // Redox Report. — 2004. — Vol. 9, № 4. — P. 181-191.

Ookubo M., Matsuno T. Carotenoids of Sea Squirts — II. Comparative Biochemical studies of carotenoids in Sea Squirts // Comp. Biochem. Physiol. — 1985. — Vol. 81B, № 1. — P. 137-141.

Schiedt K., Liaaen-Jensen S. Isolation and analysis // Carotenoids. Vol. 1A: Isolation and Analysis. — Basel: Birkhauser, 1995. — P. 81-108.

Sugawara T., Baskaran V., Tsuzuki W., Nagao A. Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed fucoxanthinol during absorption by Caco-2 human intestinal cells and mice // J. Nutr. — 2002. — Vol. 132. — P. 946-951.

Tsushima M., Maoka T., Katsuyama M. et al. Inhibitory effect of natural carotenoids on Epstein-Barr virus activation activity of a tumor promoter in Raji cells — A screening study for antitumor promoters // Biological and Pharmaceutical Bulletin. — 1995. — Vol. 18. — P. 227-233.

Поступила в редакцию 6.07.06 г.