Способ экологического мониторинга пасечных почв по состоянию диатомовых водорослей
METHOD OF ENVIRONMENTAL MONITORING OF APIARIAN SOILS BY DIATOMIC ALGAE STATE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Способ относится к области экологии пчеловодства и может быть использован для экологического мониторинга пасечных территорий, а также может быть рекомендован для аутэкологических исследований микроскопических организмов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Аналог 1. «Почвенные водоросли долины малой реки, стрессированной тяжелыми металлами» [14]. Сущность способа заключается в определении зависимости таксономической структуры и фитоценотической организации альгогруппировок от режима загрязнения почв тяжелыми металлами. Способ осуществляли отбором проб почвы в слое 0-5 см, учитывая различный режим загрязнения почв долины р. Ельцовка-2 тяжелыми металлами. При выявлении видового состава использовали классический метод чашечных культур со стеклами обрастания и световой микроскоп. Анализ таксономической структуры водорослей проводили на видовом уровне, а фитоценотический - с учетом видов и внутривидовых таксонов. Количественный учет водорослей проделан методом прямого счета. В модельных опытах вносили однократно растворы нитрата ртути (II) или нитрата серебра (I) различной концентрации. Оценку обилия вида проводили по 15-балльной шкале. Для выяснения степени токсичности ртути, серебра и их воздействия на почвенные водоросли использовали коэффициент токсичности.
Признаки аналогии: таксономическая структура и фитоценотическая организация альгогруппировок зависят от режима загрязнения почв долины малой реки тяжелыми металлами и могут быть использованы в качестве биологических критериев оценки экологической ситуации.
Недостаток способа: точечные пробы отбирали с очень малой глубины - в слое 0-5 см.
Аналог 2. «Изучение влияния ксенобиотиков на почвенную альгофлору» [6]. Сущность способа заключается в определении зависимости состоянии почвенной алгофлоры от наличия ксенобиотиков. Способ осуществляли отбором почв в слое 5-20 см, учитывая различный режим загрязнения почв. Для выявления видового состава применяли метод чашечных культур, используя стекла обрастания. По 3-бальной шкале оценивали обилие водорослей, просматривая под световым микроскопом стекла обрастания, определяли процент покрытия колониями водорослей чашечной культуры.
Признаки аналогии: на территории склада пестицидов был выявлен низкий видовой состав почвенных водорослей; на территории действующей нефтедобывающей установки наблюдалась явная перестройка альгоценоза; на территории заповедной зоны альгофлора отличалась высоким видовым составом.
Недостаток способа: ограниченность постановки цели исследования, которая заключается в том, что этот способ позволяет решить только одну задачу: выяснить, влияет или не влияет данный фактор на видовой состав альгосообщества на основании регистрации отсутствия или присутствия отдельных видов почвенных водорослей в фоновых и антропогенно нарушенных территориях. Он не позволяет определить границы устойчивости отдельных видов и внутривидовых таксонов микроскопических водорослей к действующим экотоксикантам.
Точечные пробы отбирали с очень малой глубины - в слое 5-20 см.
Аналог 3. (прототип) «Использование метода альгоиндикации в диагностике нефтезагрязненных торфяных почв» [7]. Сущность способа заключается в выделении видов и групп альгофлоры, диагностирующих те или иные техногенные нарушения путем установления особенностей их преобразования под влиянием нефти и определением видового состава водорослей микроскопированием почвы и культуральными методами. В качестве контроля изучались ненарушенные техногенным воздействием почвы. В качестве опытных объектов выступали экспериментальные площадки с дозированным внесением нефти.
Способ осуществлялся отбором проб почв вдоль векторов «розы ветров». Точечные пробы отбирали в 4-х углах и центре (методом конверта) на трех пробных площадках размером 10×10 м, расположенных по диагонали исследуемого участка. Поскольку нефть и нефтепродукты являются поверхностно распределяющимися веществами, точечные пробы отбирали послойно с глубины 0-5 см и 5-20 см массой 200 г каждая. Для анализа объединенную пробу составляли из пяти точечных проб, взятых с каждой пробной площадки. Масса объединенной пробы с каждой пробной площадки составляла 1 кг. Численность водорослей определялась методом прямого счета, биомасса - объемно-расчетным методом.
Признаки аналогии: нефтяное загрязнение резко снизило число видов водорослей, способных осваивать данные экотопы.
Недостаток способа: изучена лишь торфяная почва и один вид загрязнения - нефтяной, то есть поверхностно распределяющийся, следовательно, точечные пробы отбирались с небольшой глубины.
Общими недостатками аналогов и прототипа являются изучение ограниченных видов почв и загрязнений; неполное удаление примесей из тест-объекта; значительная часть исследований загрязнения тяжелыми металлами охватывает только поверхностные горизонты почвы и не учитывает внутрипрофильное распределение тяжелых металлов; трудоемкость из-за применения точных методов аналитической химии; отсутствие универсального тестового организма, дающего однозначную реакцию на широкий спектр загрязняющих веществ, что не позволяет оценить состояние почвенной экосистемы в целом.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Качество продуктов пчеловодства обуславливается полноценной работой пчел на экологически чистых медоносах. Антропогенное влияние на пасечные территории приводит к обеднению и загрязнению почв, негативному воздействию на медоносные растения и, соответственно, нарушению жизнедеятельности пчел, в том числе порокам их развития.
В Самарской области приоритетными техногенными загрязнителями почв являются тяжелые металлы и пестициды, менее распространенными - нефть и нефтепродукты [5].
Основными критериями, используемыми для оценки степени загрязнения почв, должны быть предельно допустимые концентрации химических веществ в почве.
Установлено, что почва для тяжелых металлов является емким акцептором. В составе почвенного раствора они мигрируют по профилю и поглощаются растениями [2]. Пестициды, нефть и нефтепродукты также обладают проникающей способностью как для почвы, так и для растений [5].
Задача способа экологического мониторинга пасечных почв по состоянию диатомовых водорослей направлена на то, чтобы сделать экологический мониторинг почвы универсальным и доступным для использования без территориального ограничения, независимо от географического местоположения исследуемой пасеки. Способ основан на сравнительной характеристике фонового и определяемого уровня диатомей территории и является расширяющим арсенал существующих методик оценки экологической безопасности пасек.
Способ направлен на предупреждение размещения пасек на контаминированных (экологически загрязненных) территориях.
Способ позволяет выявлять отклонения по числу родов и видов сообществ водорослей в зависимости от наличия и динамики экотоксикантов в почве.
Заявленный способ осуществляется следующим образом. Проводится отбор проб почвы ручным поршневым пробоотборником вдоль векторов «розы ветров» на глубину до 150 см в зависимости от предполагаемого загрязнения. Затем панцири диатомовых водорослей освобождают от минеральных примесей и органических частей клетки (протоплазмы) промыванием в азотной кислоте с последующим отстаиванием панцирей (створок) в воде и отфильтровыванием их. Идентификацию диатомей проводили под микроскопом заключением очищенных и отфильтрованных панцирей в высокопреломляющую смолу Кольбе с последующим подсчетом их обилия.
ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ: расширение определяемого видового диапазона контаминантов за счет увеличения глубины отбора почвенных проб до 150 см; повышение точности определения загрязняющих веществ и уровня их сосредоточения в пасечной почве за счет сохранения целостности панцирей почвенного биоиндикатора (диатомовых водорослей) при его обработке путем бережного отстаивания, что повышает возможность оценки его состояния при воздействии контаминантов.
СУЩЕСТВЕННЫЕ ПРИЗНАКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Взятие почвенных проб послойно до глубины 150 см позволяет определить вид контаминантов и уровень их распределения. Бережная подготовка пробы отстаиванием позволяет сохранить в целостности панцири диатомей для облегчения их видовой и таксономической идентификации. Фиксация панцирей диатомей в смоле Кольбе, позволяющей четко видеть их форму и структуру.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ заключается в анализе состояния почвенных диатомовых водорослей (отклонение по числу их родов и видов по сравнению с фоновым уровнем) в зависимости от степени и вида загрязнения пасечных почв.
Способ включает:
1. Послойный отбор точечных почвенных проб, через каждые 50 см, до глубины 150 см, вдоль векторов «розы ветров», на пасеках, расположенных в промышленной зоне и почвенных проб пасек фоновой зоны, не имеющей промышленных выбросов экотоксикантов. При выборе территории для отбора почвенных проб загрязненной экотоксикантами и фоновой зоны руководствовались данными государственного доклада о состоянии окружающей среды Самарской области [5]. При определении глубины взятия проб руководствовались данными проникающей способности пестицидов: 2,4-Д, далапона, трефлана, метафоса, ТХАН, симазина+атразина, прометрина [5], тяжелых металлов: хрома, никеля, кадмия, меди, свинца, цинка, железа, марганца [2], нефти и нефтепродуктов [1].
2. Осуществление моделирования процесса взаимодействия диатомей почв фоновой зоны с промышленными выбросами (пестицидами, тяжелыми металлами, нефтью и нефтепродуктами) в лабораторных условиях и получение стандартных эталонных образцов диатомей почв с последующим сравнением пробы промышленной зоны со стандартами. При внесении в почвенные пробы тяжелых металлов руководствовались ПДК (предельно-допустимой концентрацией) транслокационной (переход элемента в растение) способностью химических элементов, превышая ее на 10, 20 и 30% для каждого из элементов [3]. При внесении нефти и нефтепродуктов руководствовались МУК 4.1.1956-05 [8]. При внесении пестицидов руководствовались перечнем предельно-допустимых концентрация (ПДК) и ориентировочно-допустимых количеств (ОДК) химических веществ в почве [12]. При этом устанавливается устойчивость диатомовых водорослей к исследуемым экологическим токсикантам (пестицидами, тяжелыми металлами, нефтью и нефтепродуктами).
3. Подготовку проб путем очищения диатомовых водорослей, содержащихся в пробе от примесей фильтрованием, промыванием кислотой с последующим кипячением, промыванием от кислоты дистиллированной водой, отстаиванием и фильтрацией.
4. Приготовление препаратов диатомей (заключением очищенных створок в смолу Кольбе (n=1,63), состоящую из пиперина (алкалоид, экстрагируемый из черного перца) и канифоли (твердая смола хвойных деревьев) [10].
5. Видовую идентификацию и глазомерную оценку обилия диатомовых водорослей проводят с помощью светового микроскопа с последующим подсчетом панцирей.
6. Сравнение состояния диатомовых водорослей опытного участка (предположительно загрязненного) с контрольным (фоновое состояние почвы).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример:
Проводился экологический мониторинг почвы пасечных территорий по известному способу [4] следующим образом:
1. Отбирают почвенную пробу с пасечных территорий, расположенных в промышленной зоне и отбор почвенных проб с пасек, расположенных в фоновой зоне, не имеющей промышленных выбросов экологических токсикантов. Точечные пробы отбирают в 4-х углах и центре (метод конверта) на трех пробных площадках размером 10×10 м, расположенных по диагонали исследуемого участка. Точечные пробы отбирают послойно с глубины 0-5 и 5-20 см массой 200 г каждая.
2. Подготовку проб проводят по общепринятой методике [13] путем очистки створок диатомовых водорослей от протопластов с использованием 62% азотной кислоты, являющейся хорошим разрушителем органических веществ. Промывание проб от азотной кислоты проводят кипячением и центрифугированием пробы.
3. Приготовление препаратов диатомей проводят путем заключения очищенных створок в высокопреломляющую смолу реальгар (n=2,55), по химическому составу сернистый мышьяк (AsS). Несмотря на высокий показатель преломления, не вошел широко в практику ввиду его вредности.
4. Видовую идентификацию таксонов диатомовых водорослей проводят с использованием отечественных и зарубежных определителей [9] при помощи иммерсионного объектива 100 при увеличении ×1000. Работа выполнялась с использованием световых микроскопов Ergaval и Zeiss Axio Imager А2. Подсчет обилия диатомовых водорослей осуществляется глазомерно с использованием световых микроскопов Ergaval и Zeiss Axio Imager А2 и выражается в баллах по видоизмененной шестибалльной шкале Кольбе-Вислоуха [15].
Повторный экологический мониторинг почвы того же участка проводился по заявленному способу следующим образом:
1. Отбирают почвенную пробу с пасечных территорий, расположенных в промышленной зоне и отбор почвенных проб с пасек, расположенных в фоновой зоне, не имеющей промышленных выбросов экологических токсикантов. Точечные пробы отбирают в 4-х углах и центре (метод конверта) на трех пробных площадках размером 10×10 м, расположенных по диагонали исследуемого участка. Точечные пробы отбирают послойно, через каждые 50 см до глубины 150 см (Первое существенное отличие заявленного способа - большая глубина взятия проб; в прототипе глубина отбора проб - до 20 см). Масса почвенных образцов из каждого квадрата зоны составляет не менее 500 г. Затем отбирают средние пробы по 10 г для проведения видового и количественного учета диатомовых водорослей.
2. Проводят подготовку проб путем очистки створок диатомовых водорослей от протопластов с использованием 62% раствора азотной кислоты, являющейся хорошим разрушителем органических веществ. Промывание проб от азотной кислоты проводят кипячением, с последующим промыванием от кислоты дистиллированной водой, отстаиванием и фильтрацией (Второе существенное отличие заявленного способа - бережное отстаиванием диатомей в воде; в прототипе - центрифугирование, повреждающее часть панцирей диатомей).
3 Приготовление препаратов диатомей проводят путем заключения очищенных створок в высокопреломляющую смолу Кольбе, позволяющую четко видеть форму и структуру панциря диатомей (Третье существенное отличие заявленного способа - смола Кольбе; в прототипе - смола реальгар, состоящая из сернистого мышьяка и являющаяся экологически вредной [10]).
4. Видовую идентификацию таксонов диатомовых водорослей проводят с использованием отечественных и зарубежных определителей [9] при помощи иммерсионного объектива 100 при увеличении ×1000. Работа выполнялась с использованием световых микроскопов Ergaval и Zeiss Axio Imager А2. Подсчет обилия диатомовых водорослей осуществляется глазомерно с использованием световых микроскопов Ergaval и Zeiss Axio Imager А2 и выражается в баллах по шестибалльной шкале Кольбе-Вислоуха [15]. В доминирующий или основной комплекс нами были включены виды и внутривидовые таксоны с обилием от 3 до 6 баллов. Диатомовые с 6 баллами были признаны доминантами, субдоминанты имели 4-5 баллов, а представители с 3 баллами отнесены к числу сопутствующих.
Для характеристики сообществ диатомовых водорослей применялся коэффициент встречаемости, по которому устанавливалась роль отдельных видов и внутривидовых таксонов в группировках диатомовых водорослей и оценивалась степень их однородности и специфичности.
Постоянство (встречаемость) вида рассчитывали по формуле:
C(%)=n/N×100,
где n - число проб, в которых вид обнаружен, N - общее число проб.
Таксоны, содержащие число видов выше среднего, были выделены в ранг ведущих.
5. Сравнение состояния диатомовых водорослей опытного пасечного участка (предположительно загрязненного) с контрольным (фоновое состояние почвы) проводится по результатам их видового и численного изобилия.
Результаты исследований состояния диатомовых водорослей
Результат экологического мониторинга по заявленному способу показал, что пасечная почва исследуемого участка содержит нефтепродукты, что совпадает с оценкой по известному способу (прототипу). Дополнительно (к оценке по известному способу (прототипу)) выявлено наличие в почве тяжелых металлов, причем колебания числа видов и внутривидовых таксонов диатомовых водорослей свидетельствовало об изменении уровня территориального сосредоточения загрязнителей.
Сравнение результатов экологического мониторинга пасечных почв по известному (прототипу) и заявленному способам показывает полное совпадение оценок качества почв как «загрязненная». При экологического мониторинге известным способом (прототип) профильный учет загрязнения недостаточен и позволяет определять только поверхностное загрязнение, что исключает определение наличия мигрирующих контаминантов (пестицидов и тяжелых металлов) и не позволяет оценить состояние почвенной экосистемы в целом. Кроме того, подготовка пробы для приготовления препаратов диатомей по заявленному способу, где центрифугирование было заменено на отстаивание, позволила в большей степени сохранить в целостности панцири диатомей, что облегчило видовую и таксономическую их идентификацию. Фиксация панцирей диатомей в смоле Кольбе позволила также четко видеть их форму и структуру, как и в используемой в прототипе смоле реальгар, которая, однако, является экологически вредной.
При известном (прототип) способе диатомовых водорослей обнаружен не было, причем на незагрязненном участке (фоновом) их было обнаружено 3 вида.
При заявленном способе количество видов диатомовых водорослей, обнаруженное на загрязненных участках, составило 6 видов, причем на незагрязненном участке (фоновом) их было обнаружено 15 видов.
Результат экологического мониторинга по заявленному способу обладает более высокой достоверностью, так как охватывает слои почвы, в которых растения-медоносы берут помимо питательных веществ экологических токсиканты (контаминанты) и передают их через вегетативную часть в генеративную, откуда пчелы собирают нектар и пыльцу.
Новизна предлагаемого способа экологического мониторинга пасечных почв заключается в оценке состояния диатомовых водорослей в зависимости от вида и концентрации экологических токсикантов (пестицидами, тяжелыми металлами, нефтью и нефтепродуктами). Способ позволяет определить состояние почвы путем использования почвенных диатомовых водорослей-индикаторов независимо от географического расположения исследуемой пасеки. Достоверность результата осуществления способа обеспечивается наличием универсального тестового организма, дающего однозначную реакцию на широкий спектр загрязняющих веществ и их концентрацию.
Предлагаемый способ позволяет отслеживать влияние на почву антропогенных факторов и способствует своевременному принятию решения по предотвращению размещения пасек на экологически неблагоприятной местности.
Заявленный способ можно реализовать в промышленных масштабах для природоохранной и сельскохозяйственной деятельности посредством использования известных стандартных технических устройства и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Источники информации:
1. Вальков В.Ф. Экология почв. Часть 3. Загрязнение почв / В.Ф. Вальков, К.Ш. Казеев, С.И. Колесников - Учебное пособие для студентов биолого-почвенного и геолого-географического факультетов. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://window.edu.ru/catalog/pdf2txt/030/20030/3243?p_page=3.
2. Васильев А.А. Тяжелые металлы в почвах города Чусового: оценка и диагностика загрязнения: монография / А.А. Васильев, А.Н. Чащин. - М-во с.-х. РФ, ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА. - Пермь: ФГБОУ ВПО Пермская ГСХА, 2011. - 197 с. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://pgsha.ru/export/sites/default/faculties/agrohim_agrohim_files/monografiya_a.a_vasil_ev_a.n.chaschin.pdf.
3. Гигиенические нормативы ГН 2.1.7.2041-06. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.infosait.ru/norma_doc/46/46714/.
4. ГОСТ Р53123-2008 (ИСО 10381-5:2005) «Качество почвы. Отбор проб».
5. Государственный доклад о состоянии окружающей среды и природных ресурсов Самарской области за 2014 год. Выпуск 25. - Самара, 2015. - 298 с.
6. Доценко К.А. Изучение влияния ксенобиотиков на почвенную альгофлору» - К.А. Доценко, О.Д. Филипчук // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - вып. №41. - 2008.
7. Зимонина Н. Использование метода альгоиндикации в диагностике нефтезагрязненных торфяных почв. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://ib.komisc.ru/add/old/t/ru/ir/vt/02-60/02.html.
8. Определение концентрации нефти в почве методом инфракрасной спектрофотометрии. Методические указания. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.znaytovar.ru/gost/2/muk_41195605_opredelenie_konce.html
9. Определитель пресноводных водорослей СССР (Диатомовые водоросли, 1951, Ettl H. etal., 1995; Krammer K., Lange-Bertalot Н., 1986; 1988; 1991а; 19916.
10. Осадочные породы. Диатомовые водоросли. Электронный ресурс. Режим доступа: http://volimo.ru/books/item/f00/s00/z0000013/st023.shtml.
11. Отбор почвенных проб и их анализ в точном земледелии. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://svetich.info/publikacii/tochnoe-zemledelie/otbor-pochvennyh-prob-i-ih-analiz-v-toch.html.
12. Перечень предельно-допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно-допустимых количеств (ОДК) химических веществ в почве. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293852/4293852441.htm
13. Стенина А.С. Диатомовые водоросли (Bacillariophyta) в озерах востока Болынеземельской тундры. - Сыктывкар. - 2009. - 176 с.
14. Филонова Е.Н. Почвенные водоросли долины малой реки, стрессированной тяжелыми металлами». - Электронный ресурс. Режим доступа: http://earthpapers.net/pochvennye-vodorosli-doliny-maloy-reki-stressirovannoy-tyazhelymi-metallami.
15. Шкала Кольбе-Вислоуха. - Электронный ресурс. Режим доступа: http://enc-dic.com/word/sH/Shkala-vislouha-16948.html.