Способ выявления стимулирующего действия пектина на рост штаммов кисломолочных бактерий в неблагоприятных условиях
METHOD FOR DETECTING THE STIMULATING EFFECT OF PECTIN ON THE GROWTH OF STRAINS OF LACTIC ACID BACTERIA UNDER ADVERSE CONDITIONS

Настоящее изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к физиологии микроорганизмов.
Существуют пробиотические штаммы микроорганизмов (производственные штаммы микроорганизмов), которые широко используются для производства кисломолочных продуктов и пробиотиков - бактериальных препаратов для лечения дисбиотических состояний. (Liu J. et al. Systems biology-A guide for understanding and developing improved strains of lactic acid bacteria //Frontiers in Microbiology. - 2019. - Т. 10. - С. 876.) Известно, что, попадая в кишечник в составе кисломолочных продуктов или пробиотиков, пробиотические штаммы оказывают нормализующее действие на микробиоценоз кишечника. В то же время, в кишечнике бактерии оказываются в неблагоприятных условиях, которые определяются действием низкого уровня рН и желчь (Shehata M. G. et al. Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity //Annals of Agricultural Sciences. - 2016. - Т. 61. - №. 1. - С. 65-75.). При производстве кисломолочных продуктов и пробиотиков одной из важнейших задач является получение необходимой биомассы микроорганизмов. Поэтому предпринимаются попытки создания оптимальных условий и питательных компонентов и/или питательных сред для стимуляции роста микроорганизмов и их защиты от действия антибактериальных факторов таких как низкий уровень рН и желчь. Одним из важнейших пищевых компонентов, благоприятно влияющих на микробиоценоз кишечника является пектин (Larsen N. et al. Potential of pectins to beneficially modulate the gut microbiota depends on their structural properties //Frontiers in microbiology. - 2019. - Т. 10. - С. 223.). В связи с широким применением пектина стоит задача разработки способа выявления стимулирующего действия пектина на микроорганизмы в условиях роста в питательной среде при действии неблагоприятных факторов кишечника, влияющих на пробиотические штаммы, - низкого уровня pH и желчи. Т.к. это позволит осуществлять целенаправленный отбор штаммов пробиотиков, сохраняющих рост и размножение в условиях низкого уровня pH и желчи.
Существует способ оценки протективного действия пектина в отношении пробиотических штаммов кисломолочных бактерий, инкапсулированных с пектином и железом, в условиях действия факторов слюны, желудочного и кишечного соков. Недостатком этого способа является подход, связанный с формированием гранул путем ионотропного гелеобразования, для чего необходимо применение дополнительного сложного оборудования. В этом методе используется в качестве показателя эффективности протективного действия пектина выживаемость микроорганизмов, однако важным свойством для пробитиков является их размножение для последующей колонизации. В данном случае стимулирующий эффект не оценивается.
Gluconacetobacter xylinus
Lactobacillus spp
G
xylinus
Lactobacillus spp
Известен способ выявления выживаемости пробиотических молочнокислых бактерий, иммобилизованных в различных формах бактериальной целлюлозы, в искусственном желудочном соке и растворе желчных солей (Fijałkowski K. et al. Survival of probiotic lactic acid bacteria immobilized in different forms of bacterial cellulose in simulated gastric juices and bile salt solution //LWT-Food Science and Technology. - 2016. - Т. 68. - С. 322-328.), включающий применение бактериальной целлюлозы, продуцируемой , в качестве носителя для иммобилизации пробиотических штаммов . Недостатками этого способа являются сокультивирование .  с ., что требует наличие штамма-продуцента целлюлозы, его культивирования. Так же при условии совместного культивирования возможен антагонизм кисломолочных бактерий по отношению к штамму-продуценту. (Hütt P. et al. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero and uropathogens //Journal of Applied Microbiology. - 2006. - Т. 100. - №. 6. - С. 1324-1332.). Метод требует создание капсул, целлюлозы, что усложняет процесс. По сравнению с целлюлозой пектин имеет преимущество (Roberfroid M. Prebiotics: the concept revisited //The Journal of nutrition. - 2007. - Т. 137. - №. 3. - С. 830S-837S.), так как относится к пребиотикам. В этом методе стимулирующий эффект не оценивается, а в качестве показателя эффективности протективного действия пектина используется выживаемость микроорганизмов, однако важным свойством для пробитиков является их размножение.
Существует способ оценки протективного действия пектина в отношении пробиотических штаммов кисломолочных бактерий основанный на выявлении выживаемости кисломолочных бактерий, включенных в микрогель пектин-микрофибриллированной целлюлозы, в искусственном желудочно-кишечном тракте (Chen B. et al. Pectin-microfibrillated cellulose microgel: Effects on survival of lactic acid bacteria in a simulated gastrointestinal tract //International Journal of Biological Macromolecules. - 2020. - Т. 158. - С. 826-836.). Недостатками этого способа является применение сложного оборудования: микрофлюидизатора SPCH-EP-IC-16-30 для обработки образцов; лазерного дифракционного анализатора размера частиц (Mastersizer 3000, Malvern Panalytical Ltd., Великобритания), трансмиссионного электронного микроскопа, для анализа частиц микрофибрилированной соевой целлюлозы, а также использование инфракрасной спектроскопии и рентгеноструктурного анализа.
Недостатком является использование дополнительного компонента - сои в капсулах, и дополнительных процедур - применение высокого давления (150 МПа) и инкапсуляции путем ионотропного гелеобразования. В этом методе стимулирующий эффект на кисломолочные микроорганизмы в неблагоприятных усорвиях также не оценивается.
Lactococcus lactis subsp
Известен способ инкапсуляции на композитных микробусинах из альгината/пектина (Bekhit M. et al. Encapsulation of Lactococcus lactis subsp. lactis on alginate/pectin composite microbeads: Effect of matrix composition on bacterial survival and nisin release //Journal of food engineering. - 2016. - Т. 180. - С. 1-9.), в котором для оценки защитного эффекта в отношении . используется альгинатно-пектиновые гидрогелевые микросферы. Однако, для изучения протективного действия требуется дополнительные мероприятия для создания альгинатно-пектиновых гидрогелевых микросфер, а также применение дополнительного оборудования (инкапсулятор, ротационный реометр). В данном методе оценивают продукцию низина, тогда как у различных микроорганизмов встречаются разные бактериоцины и другие факторы антагонизма, что в данном случае ограничивает применение метода. В качестве показателя протективного действия пектина оценивают выживаемость бактерий по подсчету колониеобразующих единиц, выросших на плотной питательной среде, стимуляция роста в данном случае не оценивается.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является создание нового способа выявления стимулирующего действия пектина на штаммы кисломолочных бактерий в условиях действия низкой рН и желчи.
Данная задача решается за счет того, что авторами впервые был обнаружен стимулирующий эффект пектина на рост кисломолочных бактерий в условиях действия низкой рН и желчи.
Новым техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является выявление стимулирующего эффекта пектина на рост кисломолочных бактерий в условиях действия низкой рН и желчи.
Отличительным признаком предложенного способа является то, что результатом определения влияния пектина на кисломолочные бактерии в условиях действия низкой рН и желчи является выявление стимуляции роста кисломолочных бактерий.
Lactobacillus fermentum
Enterococcus hirae
Авторами в экспериментальном исследовании было впервые выявлено, что пектин оказывает стимулирующий эффект на рост кисломолочных бактерий в условиях действия низкой рН и желчи. Данные исследования указаны в Таблице 1, из которой видно, что в среде с 0,1% и 0,5% содержанием пектина происходит стимуляция роста штаммав условиях действия низкой рН=5; 4; 3 и желчи 0,125%; 0,25%; 0,5% по сравнению с контролем. При исследовании другого кисломолочного микроорганизма  выявлен стимулирующий эффект на рост в среде с 0,1% и 0,5% содержанием пектина в условиях действия низкой рН=4 и желчи 0,25%; 0,5% по сравнению с контролем.
Таким образом, авторами был выявлен стимулирующий эффект пектина на рост кисломолочных бактерий в условиях действия низкой рН и желчи.
Способ осуществляется следующим образом:
1. Готовят суточные культуры кисломолочных бактерий. Кисломолочные бактерии выращивают на плотной питательной среде MRS 24 ч. при t=37°C, а затем готовят взвесь микроорганизмов в MRS бульоне с OD=0,5 при λ = 630 нм.
2. Готовят MRS бульон с разными уровнями pH (5; 4; 3; 2; 1) и содержанием желчи (0,125; 0,25; 0,5; 1; 2) с добавлением пектина (0,1% и 0,5%) (опыт) и без добавления пектина (контроль).
3. Контрольные и опытные пробы раскапывают в 96 луночные планшеты по 180 мкл.
4. Во все лунки добавляют по 20 мкл взвеси испытуемых кисломолочных штаммов.
5. Планшет инкубируют при 37°С в течение 24 ч и затем измеряют OD контрольных и опытных лунок при λ = 630 нм. По изменению роста кисломолочных бактерий в опытных пробах по сравнению с контрольными судят о наличии или отсутствии стимулирующего эффекта пектина на рост кисломолочных штаммов в неблагоприятных условиях.
Пример 1.
L
fermentum
L
fermentum
1. Были приготовлены суточные культуры кисломолочных бактерий .. Кисломолочные бактерии . были выращены на плотной питательной среде MRS, а затем была приготовлена взвесь микроорганизмов в MRS бульоне с OD=0,5 при λ = 630 нм.
2. Был приготовлен MRS бульон с pH=4 и MRS бульон с 0,25% желчи с добавлением 0,5% пектина в указанные среды (опытные пробы) и без добавления пектина (контрольные пробы).
3. Контрольные и опытные пробы были раскапаны в 96 луночные планшеты по 180 мкл.
L
fermentum
4. Во все лунки была добавлена по 20 мкл взвесь .с0,5 OD при λ = 630.
L
fermentum
L
fermentum
L
fermentum
L
fermentum
5. Планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч и затем замерили оптическую плотность контрольных и опытных лунок при λ = 630 нм. По результатам измерения оптической плотности лунок получили следующие значения: OD . pH=4(без пектина, контроль)=1,05; OD . pH=4 (0,5% пектин, опыт)=1,29, OD . желчь 0,25% (без пектина, контроль)=1,01; OD . желчь 0,25% (0,5% пектин, опыт)=1,28. Таким образом, на основании того, что значения OD в опыте превышали значения OD в контроле было выявлено стимулирующее действие пектина при pH=4 и содержании желчи 0,25%.
Пример 2.
E
hirae
E
hirae
1. Были приготовлены суточные культуры кисломолочных бактерий .. Кисломолочные бактерии . были выращены на плотной питательной среде MRS, а затем была приготовлена взвесь микроорганизмов в MRS бульоне с OD=0,5 при λ = 630 нм.
2. Был приготовлен MRS бульон с pH=4 и MRS бульон с 0,125% желчи с добавлением 0,1% пектина в указанные среды (опытные пробы) и без добавления пектина (контрольные пробы).
3. Контрольные и опытные пробы были раскапаны в 96 луночные планшеты по 180 мкл.
E
hirae
4. Во все лунки была добавлена по 20 мкл взвесь .с0,5 OD при λ = 630.
E
hirae
E
hirae
E
hirae
E
hirae
5. Планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч и затем замерили оптическую плотность контрольных и опытных лунок при λ = 630 нм. По результатам измерения оптической плотности лунок получили следующие значения: OD .pH=4 (без пектина, контроль)= 0,54; OD . pH=4 (0,1% пектин, опыт)=0,40; OD .желчь 0,125% (без пектина, контроль)=0,49; OD . желчь 0,125% (пектин, опыт)=0,26. Таким образом, на основании того, что значения OD в опыте были меньше значений OD в контроле стимулирующее действие пектина при низких значениях рН (рН=4) и содержании желчи 0,125% выявлено не было.
Таким образом, приведенные примеры свидетельствуют об эффективности заявляемого способа для выявления стимулирующего действия пектина на кисломолочные бактерии в неблагоприятных условиях.
Tаблица 1
Выявление стимулирующего эффекта пектина на рост штаммов L. fermentum и E. hirae в условиях действия низкой рН и желчи.
Lactobacillus fermentum
Воздействие кислоты
Воздействие желчи
pH
0% пектина (контроль)
0,1% пектин
0,5% пектин
% желчи
0% пектина (контроль)
0,1% пектин
0,5% пектин
5
1,09
1,10
1,27
0,125
1,00
1,14
1,25
4
1,05
1,12
1,29
0,25
1,01
1,04
1,28
3
1,05
1,06
1,19
0,5
0,96
1,02
1,23
2
1,02
1,08
0,27
1
0,23
0,23
0,28
1
0,20
0,14
0,11
2
0,12
0,12
0,12
Enterococcus hirae
Воздействие кислоты
Воздействие желчи
pH
0% пектина (контроль)
0,1% пектин
0,5% пектин
% желчи
0% пектина (контроль)
0,1% пектин
0,5% пектин
5
0,53
0,40
0,51
0,125
0,49
0,26
0,30
4
0,54
0,40
0,58
0,25
0,45
0,55
0,51
3
0,53
0,45
0,27
0,5
0,51
0,53
0,56
2
0,38
0,26
0,30
1
0,47
0,22
0,21
1
0,08
0,07
0,12
2
0,12
0,13
0,12