Способ получения системы доставки фрагментов нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих
METHOD FOR MAKING SYSTEM OF DELIVERY OF NUCLEIC ACID FRAGMENTS TO MAMMALIAN CELLS

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биоорганической химии и медицины и может быть использовано для создания систем доставки лекарственных средств (в частности, олигонуклеотидов) в клетки.
Использование фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов (ФНК) для селективного воздействия на внутриклеточный генетический материал является одной из важнейших задач современной биологии и фундаментальной медицины. В случае решения этой проблемы открывается возможность широкого использования этого подхода в практической медицине. Однако до конца не решенной проблемой является отсутствие эффективного способа доставки фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов внутрь клетки, поскольку известно, что сами по себе они проникают в клетки в очень малой степени, в первую очередь, из-за гидрофобного характера клеточной мембраны.
Известны способы доставки ФНК в клетки с помощью вирусных векторов [Bouard, D. еt al., British Journal of Pharmacology, 2009, v. 157, 153-165], путем включения в липосомы [Deshpande, D. et al., Pharm. Res., 1998, v. 15, p. 1340-1347], путем конъюгирования с катионными полимерами различной природы [Smedt, S.C. et al., Pharm. Res., 2000, v. 17, 113-126], с помощью электропорации [Baum С.et al., Biotechniques. 1994, v. 17, 1058-1062] и др. Однако проблема доставки пока не нашла окончательного решения и продолжает оставаться актуальной задачей.
Известно использование наночастиц различной природы, в частности, неорганических наночастиц в качестве агентов доставки реакционноспособных олигонуклеотидов, обеспечивая тем самым высокоэффективное взаимодействие с внутриклеточными нуклеиновыми кислотами.
Описано использование наночастиц фосфата кальция для доставки плазмидной ДНК в стволовые клетки [Cao X, et al., Int. J. Nanomedicine, 2011; 6, 3335-3349]; наночастиц фосфатов магния и марганца для доставки олигонуклеотидов в клетки HeLa [Bhakta G, et al., Biomaterials. 2005, v. 26, 2157-2163], наночастиц карбонат-апатита для доставки ДНК в клетки млекопитающих [Hossain S, et al., Anal. Biochem., 2010, v. 397, 156-161]; наночастиц благородных металлов для детекции ДНК и их доставки в клетки [Chen XJ, et al., Wiley Interdiscip.Rev. Nanomed. Nanobiotechnol., 2012, doi: 10.1002/wnan. 1159].
2
Известен способ получения наноразмерной системы доставки ФНК в клетки млекопитающих, включающий синтез наночастиц диоксида титана (ТiO) размером ~5 нм и последующую иммобилизацию на них допамин-содержащего олигонуклеотида [Paunesku Т. et al., Nat. Mater. 2003, v. 2, 343-346; Thurn К.Т. et al., Small 2009, v. 5, 1318-1325; Kurepa, J. et al., Nano Lett. 2010, v. 10, 2296-2302].
2
2
2
2
Наиболее близким к заявляемому способу – прототипом - является способ получения наноразмерной системы доставки олигонуклеотидов, включающий синтез наночастиц диоксида титана, синтез конъюгатов наночастиц диоксида титана с полилизином (TiO2-PL), иммобилизацию олигонуклеотидов на TiO2-PL, при этом иммобилизацию олигонуклеотида проводят в водном растворе при комнатной температуре, а не связавшийся с частицами конъюгат отмывают раствором NaCl. ФНК связываются с TiO-PL за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных аминогрупп полилизина (NH) и отрицательно заряженных межнуклеотидных фосфатных групп олигонуклеотида (р). Получают наноразмерную систему доставки ФНК в клетки, представляющую собой нанокомпозит TiO-PL⋅ФНК с емкостью по ФНК, составляющей 0.2-60 нмоль/мг. Длительность способа получения системы доставки составляет 1.5-2 часа, а с учетом времени приготовления TiO-наночастиц -2-3 суток. Получаемая таким способом наноразмерная система доставки ФНК в клетки состоит из наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином, на которых иммобилизованы ФНК, способные проникать в эукариотические клетки путем обычного эндоцитоза. В качестве линкера используют полиамины, содержащие от 3 до 1000 аминогрупп в молекуле, преимущественно полилизин, полиэтиленимин или спермин (патент RU 2444571 С2, опубл. 10.03.2012).
2
2
Недостатками известного способа является необходимость предварительного синтеза конъюгатов наночастиц диоксида титана с полилизином (TiO-PL), что требует использования относительно дорогого реактива (полилизина) и дополнительного времени, а также ограниченные функциональные возможности вследствие того, что в качестве основы для системы доставки используются нестабильные золи диоксида титана, склонные к агрегации, что может быть препятствием для использования нанокомпозитов TiO-PL⋅ФНК в медицинской практике.
Техническим результатом является упрощение и сокращение длительности способа, а также расширение его функциональных возможностей.
Технический результат достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.
2
3
3
6
2
2
Предварительно получают основу (носитель) для системы доставки. Для этого 3-аминопропилтриэтоксисилан (в концентрации 1-4 мг/мл в пересчете на Si) гидролизуют добавлением его по каплям к дистиллированной воде при значениях рН 10-11 и температуре от 20 до 70°С и перемешиванием в течение 8-15 ч. Полученный аминозамещенный силанол (Si~NH) представляет собой прозрачный раствор, содержащий Si(OH)(CHNH) в виде мономера или димера или смеси мономера, димера и слабоконденсированных цепочек с соотношением Si/NH=1:1. Высушенный на воздухе гидролизованный продукт представляет собой бесцветную стекловидную пленку. По данным рентгенофазового анализа (РФА) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) сухой продукт является аморфным веществом.
2
2
2
2
2
2
-3
-7
Перед иммобилизацией ФНК к раствору гидролизованного продукта добавляют 0.5-1%-ную уксусную кислоту до значений рН 8-9 и получают раствор Si~NH с концентрацией 1-4 мг/мл в пересчете на Si и соотношением Si/NH=1:(0.4-0.5). К полученному раствору Si~NH (2-25 мкл, 1-4 мг Si/мл) добавляют 10-50 мкл 10-10 М раствора соответствующего ФНК длиной 10-1500 звеньев с соотношением 5-100 нмоль ФНК на 1 мг Si и инкубируют в 0.1-0.2М растворе NaCl, при комнатной температуре в течение 20-30 минут. ФНК количественно связываются с Si~NH за счет сильного электростатического взаимодействия положительно заряженных аминогрупп и отрицательно заряженных межнуклеотидных фосфатных групп олигонуклеотида. Получают систему доставки ФНК в клетки, представляющую собой нанокомпозит Si~NH⋅ФНК с размером частиц от 1 до 8 нм (по данным атомной силовой микроскопии) с концентрацией 0.25-1 мг/мл по Si и с емкостью по ФНК, составляющей 10-100 нмоль/мг. Длительность способа получения системы доставки ФНК составляет не более 0.5 часа, а с учетом приготовления основы для доставки (Si~NH) - не более 20 часов.
Получаемая заявляемым способом система доставки ФНК в клетки представляет собой растворимый нанокомпозит, состоящий из аминосиланола, с аминогруппами которого электростатически связаны ФНК, способные проникать в эукариотические клетки предположительно путем обычного эндоцитоза, без использования дополнительных внешних методов трансфекции, и направленно воздействовать на внутриклеточный генетический материал и подавлять его дальнейшее функционирование.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа от прототипа являются:
2
1) В качестве основы для доставки ФНК в клетки используют аминозамещенный силанол (Si~NH) в концентрации 1-4 мг Si/мл, который получают гидролизом в воде аминопропилтриэтоксисилана при рН 10-11 и температуре 20-70°С с последующей нейтрализацией до рН 8-9, что позволяет упростить способ и сократить его длительность за счет сокращения стадий, удешевить за счет исключения дорогого препарата полилизина и обеспечить получение растворимого препарата, что является преимуществом для использования в медицинской практике.
2
2
2
-3
-7
2) Последующую иммобилизацию ФНК на Si~NH осуществляют путем добавления рассчитанного количества 10-10М раствора соответствующего ФНК к прозрачному раствору Si~NH с концентрацией 1-4 мг/мл в пересчете на Si в 0.1-0.2 М NaCl при рН 8-9 и перемешивания при комнатной температуре в течение 20-30 минут, что обеспечивает прочное связывание ФНК с Si~NH за счет электростатического взаимодействия отрицательно заряженных фосфатных групп ФНК с положительно заряженными аминогруппами.
2
2
Заявляемый способ обеспечивает получение нанокомпозита с практически такой же емкостью по ФНК, как и известный способ (прототип), и высокой прочностью связывания ФНК с Si~NH, основанной на сильном электростатическом взаимодействии фосфатных групп с аминогруппами. Предлагаемый способ, как и известный способ (прототип), обеспечивает возможность присоединять к Si~NH любые ФНК и их аналоги, содержащие отрицательные заряды на межнуклеотидных фосфатных группах. Предлагаемый способ, как и известный способ (прототип), обеспечивает высокую противовирусную активность получаемых препаратов в отношении вируса гриппа А. Кроме этого, предлагаемый способ обеспечивает возможность получения прозрачных растворов нанокомпозитов, не содержащих агрегированных наночастиц, склонных к осаждению.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
2
Пример 1. Получение Si~NH.
2
2
2
К 120 мл нагретой на водяной бане до 70°С дистиллированной воде по каплям добавляют 4 г 3-аминопропилтриэтоксисилана (508 мг по Si) до рН 10 и перемешивают при этой температуре 8 ч. Концентрация продукта составляет 4.2 мг Si/мл. По данным титрования продукта мольное соотношение NH/Si в образце составляет 1:1. После охлаждения до комнатной температуры к раствору добавляют 0.5% раствор уксусную кислоту до рН 8. Концентрация наночастиц Si~NH после нейтрализации составляет 4 мг Si/мл. По данным титрования продукта мольное соотношение NH/Si после нейтрализации составляет 0.5. Размер наночастиц - 1-8 нм по данным атомной силовой микроскопии.
2
Пример 2. Получение Si~NH.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что гидролиз 3-аминопропилтриэтоксисилана проводят при 20°С и рН 11 и перемешивают при этой температуре 15 ч. После гидролиза раствор нейтрализуют 1%-ный раствор уксусной кислотой до значений рН 9.
2
Пример 3. Получение Si~NH.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что в реакции гидролиза используют 127 мг 3-аминопропилтриэтоксисилана (в пересчете на Si). Концентрация продукта после нейтрализации составляет 1 мг Si/мл.
2
Пример 4. Получение композита Si~NH⋅oligo1
2
2
-3
5'
*
К 25 мкл Si~NH, полученному по примеру 1, добавляют 65 мкл 0.16 М NaCl и 10 мкл 10 М (10 нмоль) раствора 10-звенного олигонуклеотида d(CATCCAGGATp) (oligo1). Реакционную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Получают продукт Si~NH⋅oligo1 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и емкостью по олигонуклеотиду 100 нмоль/мг Si.
2
2
Пример 5. Получение композитов Si~NH⋅oligo2 и Si~NH⋅oligo3.
-4
5'
5'
2
2
Способ осуществляют аналогично примеру 4, кроме того, что в качестве олигонуклеотидов используют 10 М растворы 21-звенных олигодезоксирибонуклеотидов d(GCAAAAGCAGGGTAGATAATCp) (oligo2) или d(GATCAACTCCATATGCCATGTp) (oligo3) (по 25 мкл, 2.5 нмоль), и реакцию проводят в 0.2 М NaCl, для чего в реакционную смесь добавляют 50 мкл 0.4 М NaCl. Получают композиты Si~NH⋅oligo2 и Si~NH⋅oligo3 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотиду 25 нмоль/мг Si.
2
2
Пример 6. Получение композита Si~NH⋅oligo4 и Si~NH⋅oligo5.
-4
5'
-4
5'
ps
2
2
Способ аналогичен примеру 5, отличается тем, что в качестве олигонуклеотида используют 50 мкл 10 М (5 нмоль) раствора 30-звенного олигорибонуклеотида CUGCUGUACAUGGCACAUGGAAUUGAUUA (oligo4) или 50 мкл 10 М раствора 16-звенного аналога олигодезоксирибонуклеотида d(CCGTCGGTACCGGCCG) (oligo5), содержащего межнуклеотидные тиофосфатные группы (ps), и реакцию проводят в 0.1 М NaCl, для чего в реакционную смесь добавляют 25 мкл 0.4 М NaCl. Получают нанокомпозиты Si~NH⋅oligo4 и Si~NH⋅oligo5 с концентрацией 1 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотидам 50 нмоль/мг Si.
2
Пример 7. Получение композита Si~NH⋅oligo5.
-7
-2
2
2
Способ аналогичен примеру 4, отличается тем, что в качестве олигонуклеотида используют 50 мкл 1500-звенного фрагмента ДНК (oligo5) с концентрацией 2⋅10 М (1⋅10 нмоль), 2 мкл Si~NH, полученного по примеру 3 и 48 мкл 0.4 М NaCl. Получают нанокомпозит Si~NH⋅oligo5 с концентрацией 0.02 мг/мл (по Si) и с емкостью по олигонуклеотиду 5 нмоль/мг Si.
2
Пример 8. Оценка способности нанокомпозита Si~NH⋅ФНК проникать в клетки.
2
2
2
В эксперименте используют клетки линий HeLa и MDCK (полученные из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская обл.), красители для окрашивания клеточных ядер и мембран (DAPI и Cell Mask Plasma Membrane Stain) и питательную среду для клеток DMEM, эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), антибиотики, буфер PBS (Invitrogen, США). Для приготовления образцов для конфокальной микроскопии клетки культивируют в полной среде DMEM в 8-луночных камерах до достижения 70% монослоя, после этого полную среду заменяют на среду без сыворотки, стрептомицина и пенициллина (160 мкл). Затем добавляют исследуемый нанокомпозит SiO Si~NH⋅oligo2(Flu), полученный, как описано в примере 5 с использованием олигонуклеотида, меченного флуоресцеином (40 мкл в лунку) до конечной концентрации 0.01 мг/мл по Si и 0.25 нмоль/мл по олигонуклеотиду. После 24-ч инкубации клетки отмывают буфером PBS, фиксируют и окрашивают красителями (DAPI для ядер, и Cell Mask Plasma Membrane Stain для клеточных мембран) в течение 10 мин. Препараты анализируют с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 UV MetaMicroscope (Carl Zeiss, Inc.). На фиг. 1 представлены изображения клеток HeLa (А) и MDCK (Б) (а - ядра, б - границы клеток и внутриклеточные актиновые филаменты, в - флуоресцеин-меченные нанокомпозиты). Видно, что в случае обоих типов клеток (HeLa и MDCK) нанокомпозит Sid Si~NH⋅oligo2(Flu) обнаруживается внутри клеток.
Пример 9. Оценка цитотоксичности нанокомпозитов.
2
Для тестирования цитотоксичности препаратов используют перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». По 100 мкл суспензии клеток MDCK с концентрацией 100 000 кл./мл в среде RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, вносят в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещают в термостат при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности на 2 сут до образования клеточного монослоя.
2
Для определения токсических концентраций образец разбавляют в несколько раз (в 2, 4, 8, 16, 20 раз, 32, 64 раза) средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы. Образец после каждого разведения вносят на монослой клеток MDCK в 4-х лунках по 100 мкл/лунку планшета и оставляют в термостате при температуре 37°С, 5% СО и 100% влажности. Токсическое действие образца на монослой клеток MDCK оценивают через 2 суток по соотношению живых и мертвых клеток с помощью инвертированного микроскопа.
2
2
50
Эксперименты повторены 2-3 раза. Результаты представлены на фиг. 2, где квадраты - Si~NH, треугольники - Si~NH⋅oligo2. Из фиг. 2 видно, что выживаемость клеток примерно одинакова для исследуемых образцов, и величина ТС (концентрация препарата, при которой гибнет 50% клеток) составляет ~0.65 мг/мл в пересчете на Si.
Пример 10. Исследование противовирусной активности нанокомпозитов.
6,5
50
2
2
2
2
В экспериментах используют вирус гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) с исходным титром 10 ТЦД/мл. Исследуют противовирусные свойства композитов Si~NH⋅oligo2 и Si~NH⋅oligo3, полученных как описано в примере 5, контрольного образца Si~NH, полученного как в примере 1, а также образца TiO-PL⋅oligo2, полученного известным способом (прототип). В качестве олигонуклеотидной части нанокомпозитов используют олигонуклеотиды: oligo2, комплементарный 3'-концу вирусной (-)РНК и имеющий выраженные противовирусные свойства по отношению к вирусу гриппа A H5N1, и oligo3, имеющий случайную последовательность той же длины.
50
2
2
Противовирусные свойства нанокомпозитов исследованы на культуре клеток MDCK. Используют среду DMEM с добавлением 2% FBS, глютамина и антибиотиков. Клетки культивируют, как описано в примере 13. Препараты разводят средой RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, и вносят на монослой отмытых от сыворотки клеток MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета из расчета 0.1 мкМ по олигонуклеотиду (4 мкг/мл по Si) в конечной реакционной смеси. Концентрация препарата примерно в 150 раз меньше значения ТС (фиг. 2), т.е. используется нетоксическая концентрация. Реакционные смеси инкубируют при 37°С и 100% влажности в СО-инкубаторе в течение 1 ч. Затем вносят вирус A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в разведениях на среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина, от -1 до -8 с десятикратным шагом в объеме 50 мкл/лунку. В качестве контроля используют вирус A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) без добавления исследуемых препаратов. Инкубируют в течение 2 суток в CO-термостате при 37°С и 100% влажности; определяют наличие вируса визуально под микроскопом по ЦПД и в РГА с 1% эритроцитами петуха. Все препараты были проверены на противовирусную активность при n=6.
50
2
2
2
2
На фиг. 3 приведены значения титра вируса (в единицах log ТЦД/мл) в клетках МДСК, зараженных вирусом и обработанных исследуемыми препаратами. Из фиг. 3 следует, что контрольные образцы Si~NН (исходный силанол) и Si~NH⋅oligo3 (содержащий случайную нуклеотидную последовательность, не комплементарную вирусной РНК) не проявляют заметной противовирусной активности, т.е. не происходит достоверно значимого снижения титра вируса в клетках. Образец Si~NH⋅oligo2 обладает высокой противовируной активностью, которая даже несколько превосходит таковую для образца TiO-PL⋅oligo2, полученного известным способом (прототип): разница между значениями титра вируса в контроле и опытах с соответствующими образцами составляет 3.2 log и 2.6 log, что соответствует подавлению репродукции вируса в 1000 и 400 раз соответственно.
Предлагаемый способ позволяет существенно упростить и сократить длительность, а также расширить функциональные возможности известного способа (прототипа) и обеспечить получение нанокомпозитов, представляющих собой систему доставки фрагментов нуклеиновых кислот и их аналогов в клетки млекопитающих. При этом получаемые заявляемым способом нанокомпозиты обладают свойствами, подобными нанокомпозитам, получаемым известным способом, а именно: такой же емкостью по ФНК, в частности олигодезоксирибонуклеотиду, высокой прочностью связывания олигонуклеотида с основой, способностью проникать через клеточную мембрану, низкой цитотоксичностью и специфической противовирусной активностью по отношению к вирусу гриппа А.