ПРИСОЕДИНЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗЫ К ПРОВОДЯЩЕМУ КАНАЛУ
ATTACHMENT OF POLYMERASE TO CONDUCTING CHANNEL

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Эта заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/862,767, поданной 18 июня 2019 года, полное содержание которой включено сюда по ссылке.
Предпосылки изобретения
[0002] Большинство существующих методов секвенирования, генотипирования и относящихся к ним платформ используют технологию "секвенирования посредством синтеза" (SBS) и основанные на флуоресценции способы обнаружения. В качестве дополнений к SBS желательны альтернативные способы секвенирования, которые предоставляют возможность более экономически эффективного, быстрого и удобного секвенирования и обнаружения нуклеиновых кислот. Секвенирование на основе заряда является привлекательным подходом. Что касается родственных способов и систем, то может быть полезной способность управляемым образом связывать полимеразу с подложкой и высвобождать полимеразу от связывания с подложкой, такой как подложка для обнаружения встраивания нуклеотида.
Сущность изобретения
[0003] В одном аспекте предложено устройство, включающее в себя проводящий канал и число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, причем это число составляет от одного до пяти, а проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы, и каждая из одной или более молекул полимеразы включают в себя гистидиновую метку, проводящий канал включает в себя комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты, и гистидиновая метка связана с комплексом никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0004] В одном примере число молекул полимеразы, связанных с упомянутым проводящим каналом, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
[0005] В другом аспекте предложен способ, включающий в себя присоединение от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты к проводящему каналу и присоединение полимеразы, включающей в себя гистидиновую метку, к одному или более комплексам никеля-нитрилотриуксусной кислоты, при этом проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы.
[0006] В одном примере число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере способ дополнительно включает в себя элюирование полимеразы из упомянутых от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриускусной кислоты, причем это элюирование включает в себя хелатирование никеля этилендиаминтетрауксусной кислотой или имидазолом. В еще одном примере способ дополнительно включает в себя перезагрузку фрагментов нитрилотриуксусной кислоты никелем с повторным образованием комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты и связывание полимеразы с повторно образовавшимися комплексами никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0007] В еще одном аспекте предложен способ, включающий в себя обнаружение встраивания, с помощью некоторого числа полимераз, одного или более нуклеотидов в одну или более образующихся полинуклеотидных цепей, комплементарных одной или более матричным полинуклеотидным цепям, причем каждая из одной или более полимераз присоединена к проводящему каналу, один или более из упомянутых одного или более нуклеотидов содержит зарядовую метку, а проводящий канал предназначен обнаруживать зарядовую метку во время встраивания, при этом каждая из упомянутых одной или более полимераз включает в себя гистидиновую метку, проводящий канал включает в себя комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты, и гистидиновая метка связана с комплексом никеля-нитрилотриуксусной кислоты.
[0008] В одном примере число молекул полимеразы, присоединенных к упомянутому проводящему каналу, составляет пять или меньше, такое как пять, четыре, три, две или одна. В другом примере число может быть более пяти. В ином примере комплекс никеля-нитрилотриуксусной кислоты включает в себя девять групп никеля-нитрилотриуксусной кислоты. В еще одном примере проводящий канал включает в себя нанонить, имеющую диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. В еще одном примере нанонить имеет диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм. В дополнительном примере поверхность проводящего канала дополнительно включает в себя множество фрагментов полиэтиленгликоля, непосредственно не связанных с комплексом групп нитрилотриуксусной кислоты.
Краткое описание чертежей
[0009] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения станут лучше понятными при прочтении последующего подробного описания со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых:
[0010] Фиг. 1 показывает полимеразу, присоединенную к датчику заряда.
[0011] Фиг. 2 показывает Ni-NTA, присоединенную к полигистидиновой метке.
[0012] Фиг. 3 показывает пример присоединения NTA-группы к поверхности.
[0013] Фиг. 4 показывает пример процесса присоединения NTA-группы к поверхности.
[0014] Фиг. 5A и фиг. 5B показывают примеры последовательностей операций способов в соответствии с аспектами настоящего изобретения.
[0015] Фиг. 6 - это график, представляющий результаты измерений, полученные для снабженного гистидиновой меткой белка, присоединенного к поверхности с помощью комплексов Ni-NTA в качестве присоединяющих фрагментов.
Подробное описание изобретения
[0016] В настоящее время существует необходимость в улучшенных устройствах, системах и способах для обнаружения в реальном времени нуклеотидов, встраиваемых посредством полимераз в таких способах. Привлекательным вариантом является обнаружение опосредованного полимеразами встраивания нуклеотидов с использованием проводящего канала, при этом полимераза привязывается к проводящему каналу, а нуклеотид включает в себя несущую заряд метку. Во время спаривания нуклеотида с комплементарным матричным нуклеотидом во время опосредованного полимеразой встраивания проводящий канал обнаруживает присутствие несущей заряд метки встраиваемого нуклеотида и, тем самым, идентичность встраиваемого нуклеотида.
[0017] В данном документе раскрыт способ управления числом молекул полимеразы, привязанных к данному проводящему каналу. Раскрытие предусматривает контролируемое привязывание достаточно малого числа полимераз к проводящему каналу, чтобы избежать обнаружения слишком многочисленных событий встраивания нуклеотидов, включая многократные, несопоставимые. Также предусмотрено привязывание полимеразы к проводящему каналу с достаточной прочностью связи, так что полимераза может оставаться связанной с проводящим каналом, причем столь долго, насколько это желательно.
[0018] Это раскрытие предоставляет примеры иммобилизации или присоединения нуклеотидной полимеразы к поверхности устройства для обнаружения встраивания нуклеотида в образующуюся нуклеотидную цепь или праймер, комплементарный матрице, для определения идентичности одного или более нуклеотидов в матрице. В одном примере присоединение является достаточно прочным или долговечным для того, чтобы предотвращать нежелательное отсоединение полимеразы от подложки, например, во время одного или более процессов, которые являются частью секвенирования, генотипирования или родственного способа идентификации одного или более нуклеотидов в матрице. Присоединение может также быть обратимым. Например, если достоверность, избирательность, эффективность, активность полимеразы или другие признаки полимеразы ухудшаются или имеют риск ухудшения, то полимераза может, как раскрыто здесь, быть контролируемым образом высвобождена с подложки, а новая полимераза присоединена к подложке.
[0019] Как также раскрыто здесь, можно управлять числом полинуклеотидов, иммобилизованных или присоединенных к подложке. В некоторых способах секвенирования посредством синтеза или родственных способах заранее заданное, низкое или иным образом в целом регулируемое число молекул полимеразы, прикрепленных или присоединенных к подложке, получается так, как раскрыто здесь. Например, в некоторых способах секвенирования посредством синтеза или родственных способах идентичность нуклеотида в молекуле-шаблоне, или молекуле-матрице (например, включает ли она в себя аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил в качестве своего азотистого основания), определяется посредством идентификации комплементарного с ним нуклеотида, встраиваемого в образующуюся полинуклеотидную цепь или праймер, гибридизируемую(ый) в матрицу, посредством полимеразы. В свою очередь, нуклеотиды для добавления в образующуюся нуклеотидную цепь или матрицу посредством полимеразы могут нести или включать в себя маркер или метку, обозначающий(ую) их идентичность. Обнаружение нуклеотида, встроенного посредством полимеразы таким образом, косвенно указывает на идентичность комплементарного нуклеотида матрицы.
[0020] Например, встраиваемые посредством полимеразы нуклеотиды могут содержать или включать в себя метку, которая несет заряд, или зарядовую метку. Когда такой помеченный зарядом нуклеотид сводится вместе с комплементарным ему основанием в матрице посредством полимеразы во время полимеризации, зарядовая метка может быть воспринята («почувствована») подложкой, к которой присоединена или иммобилизована полимераза, при этом подложка включает в себя проводящий канал. Проводящий канал для обнаружения модифицированного нуклеотида, включающего в себя заряд, может реагировать на окружающее электрическое поле. Это поле модулируется позиционированием модифицированного нуклеотида с зарядом в непосредственной близости к поверхности проводящего канала. Непосредственная близость зарядовых меток к поверхности может быть важной в некоторых случаях, например, если соль или другие ионы в растворе могут экранировать заряд от обнаружения проводящим каналом. Характерный радиус экранирования называется дебаевским радиусом, за пределами которого проводящий канал может быть неспособным обнаруживать заряд.
[0021] Например, проводящий канал может быть наноструктурированным транзистором, таким как нанонить или другая наномасштабная, стробируемая зарядом, электрически полупроводящая наноструктура. Нанонить может иметь диаметр между примерно 10 нм и примерно 100 нм и длину между примерно 50 нм и примерно 300 нм. Например, нанонить может иметь диаметр примерно 30 нм и длину между примерно 100 нм и примерно 150 нм, такую как примерно 130 нм. В других примерах нанонить может быть от примерно 50 нм до 5 мкм длиной, такой как от примерно 50 нм до примерно 100 нм, примерно 50 нм, примерно 60 нм, примерно 70 нм, примерно 80 нм, примерно 90 нм длиной, или примерно 100 нм длиной, или примерно 100-150 нм, примерно 100 нм, примерно 110 нм, примерно 120 нм, примерно 130 нм, примерно 140 нм длинной или примерно 150 нм длиной, или примерно 150-200 нм, примерно 150 нм, примерно 160 нм, примерно 170 нм, примерно 180 нм, примерно 190 нм длиной, или примерно 200 нм длинной, или примерно 200-250 нм, примерно 200 нм, примерно 210 нм, примерно 220 нм, примерно 230 нм, примерно 240 нм длиной или примерно 250 нм длиной, или примерно 250-300 нм, примерно 250 нм, примерно 260 нм, примерно 270 нм, примерно 280 нм, примерно 290 нм длиной, или примерно 300 нм длиной, или примерно 300-350 нм, примерно 300 нм, примерно 310 нм, примерно 320 нм, примерно 330 нм, примерно 340 нм длиной, или примерно 350 нм длиной, или от примерно 350 нм до примерно 400 нм, примерно 350 нм, примерно 360 нм, примерно 370 нм, примерно 380 нм, примерно 390 нм длиной или примерно 400 нм длиной, или от примерно 400 нм до примерно 500 нм, примерно 400 нм, примерно 410 нм, примерно 420 нм, примерно 430 нм, примерно 440 нм длиной или примерно 450 нм длиной, или от примерно 500 нм до примерно 750 нм, примерно 500 нм, примерно 550 нм, примерно 600 нм, примерно 650 нм, примерно 700 нм длиной или примерно 750 нм длиной, или от примерно 750 нм до примерно 1 мкм, примерно 750 нм, примерно 800 нм, примерно 850 нм, примерно 900 нм, примерно 950 нм длиной, или примерно 1 мкм длиной, или от примерно 1 мкм до примерно 1,5 мкм, примерно 1 мкм, примерно 1,1 мкм, примерно 1,2 мкм, примерно 1,3 мкм, примерно 1,4 мкм длиной, или примерно 1,5 мкм длиной, или от примерно 1,5 мкм до примерно 2 мкм, примерно 1,5 мкм, примерно 1,6 мкм, примерно 1,7 мкм, примерно 1,8 мкм, примерно 1,9 мкм длиной, или примерно 2,0 мкм длиной, или от примерно 2,0 мкм до примерно 2,5 мкм, примерно 2,0 мкм, примерно 2,1 мкм, примерно 2,2 мкм, примерно 2,3 мкм, примерно 2,4 мкм длиной, или примерно 2,5 мкм длиной, или от примерно 2,5 мкм до примерно 3 мкм, примерно 2,5 мкм, примерно 2,6 мкм, примерно 2,7 мкм, примерно 2,8 мкм, примерно 2,9 мкм или примерно 3,0 мкм длиной, или от примерно 3,0 мкм до примерно 3,5 мкм, примерно 3,0 мкм, примерно 3,1 мкм, примерно 3,2 мкм, примерно 3,3 мкм, примерно 3,4 мкм или примерно 3,5 мкм длиной, или от примерно 3,5 мкм до примерно 4,0 мкм, примерно 3,5 мкм, примерно 3,6 мкм, примерно 3,7 мкм, примерно 3,8 мкм, примерно 3,9 мкм или примерно 4,0 мкм длиной, или от примерно 4 мкм до примерно 5 мкм, примерно 4,0 мкм, примерно 4,2 мкм, примерно 4,4 мкм, примерно 4,6 мкм, примерно 4,8 мкм или примерно 5,0 мкм длиной, или длиннее или короче, или любой длины в пределах этих диапазонов или между этими диапазонами.
[0022] Временное присутствие зарядовой метки во время полимеризации посредством полимеразы может быть обнаружено проводящим каналом, регулируя протекание тока через него. В некоторых примерах различные нуклеотиды, включающие в себя отличающиеся друг от друга азотистые основания, могут включать в себя зарядовые метки, чей заряд отличается друг от друга, так что проводящий канал может реагировать по-разному на присутствие нуклеотидов, содержащих азотистые основания, которые отличаются друг от друга.
[0023] Используемый в данном документе термин "присоединен" или "связан" относится к состоянию двух сущностей, являющихся объединенными, скрепленными, сцепившимися или соединенными друг с другом. Например, компонент реакции, такой как полимераза, может быть присоединен к или связан с твердофазным компонентом, таким как проводящий канал, ковалентной или нековалентной связью. Ковалентная связь характеризуется совместным использованием атомами пар электронов. Нековалентная связь является химической связью, которая не подразумевает совместное использование пар электронов и может включать в себя, например, водородные связи, ионные связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофильные взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. Две сущности могут быть присоединены друг к другу или связаны друг с другом обратимо, что означает, что присоединение или связь между ними может быть образована, затем впоследствии разорвана или разрушена, затем, необязательно, образована повторно, возможно после замены одной из двух сущностей на другую сущность. В случае нековалентного присоединения, в некоторых примерах связывание двух сущностей друг с другом может требовать наличия другого фактора, такого как один или более металл или другой ион, чтобы предоставить возможность связывания двух сущностей вместе. В таких примерах присоединение или связь могут быть обратимыми в том, что удаление или хелатирование упомянутого одного или более металла или другого иона может приводить в результате к отсоединению двух сущностей друг от друга. Впоследствии, когда присутствие одного или более металла или другого иона возобновляется, две сущности могут снова становиться присоединенными или привязываются друг к другу.
[0024] Используемый в данном документе термин "электропроводящий канал" предполагается означающим участок устройства обнаружения, который преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Проводящий канал может быть электропроводящим каналом.
[0025] Неограничивающий пример полимеразы, присоединенной к датчику заряда, показан на фиг. 1. Вкратце, полимераза 1 может быть иммобилизована на затворе 5 полевого транзистора (FET) 2 с кремниевой нанонитью с помощью привязи 3. Необязательно, нанонить может быть выполнена из материала, отличного от кремния, или нанонить может быть заменена нанотрубкой. Примером матрицы является подлежащая секвенированию однонитевая ДНК (ssDNA) 4, которая связана с полимеразой 1 после ее введения в растворе вместе с нуклеотидами и другими реагентами. По мере того как комплементарная цепь синтезируется, создаются возмущения в распределении заряда поблизости от FET 2, либо в результате конформационных изменений полимеразы 1, либо вследствие присутствия нуклеотидов, возможно модифицированных электрически активной меткой, поблизости от FET 2. Такие модификации в распределении заряда воспринимаются FET 2 с нанонитью и обнаруживаются как модуляция в токе активной межэлектродной проводимости FET. Электропроводящий канал 5 может быть каналом проводящего канала 2. Проводящий канал 2 может включать в себя выводы S, D истока и стока и канал 5, соединяющий выводы S, D. Канал может иметь любые подходящие геометрические формы, например, форму трубки, нити, пластины и т.д.
2
Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on Design Automation Conference
Nature
[0026] Используемый в данном документе термин "проводящий канал" предполагается означающим устройство обнаружения, которое преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Например, проводящий канал может преобразовывать поступление или выбытие компонента реакции в электрический сигнал. Проводящий канал может также преобразовывать взаимодействия между компонентами реакции, или конформационные изменения в единственном компоненте реакции, в электрический сигнал. Проводящий канал может иметь любые подходящие геометрические формы. Например, канал может быть нанотрубкой, нанонитью, нанолентой и т.д. Проводящий канал может содержать любой подходящий электропроводящий материал. Этот проводящий материал может содержать органический материал, неорганический материал или тот и другой. Например, канал может содержать полупроводник. В одном примере канал содержит углерод. В другом примере канал содержит кремний. Примерный проводящий канал является полевым транзистором (FET), таким как FET на основе углеродной нанотрубки (CNT), одностенной углеродной нанотрубки (SWNT), FET с кремниевой нанонитью (SiNW), FET с графеновой нанолентой (и родственные FET с нанолентой, изготовленные из двумерных (2D) материалов, таких как MoS, силицен и т.д.), туннельный FET (TFET) и устройства с резкой допороговой крутизной характеристики (см., например, Swaminathan et al., , pg 1-6, ISBN: 978-1-4503-2730-5 (2014) и Ionescu et al.,  479, 329-337 (2011), каждая из которых включена сюда по ссылке во всей своей полноте). Примеры FET и SWNT-проводящих каналов, которые могут быть использованы в способах и приборах по настоящему изобретению, изложены в публикации заявки на патент США № 2013/0078622 A1, которая включена сюда по ссылке во всей своей полноте.
[0027] Выводы S, D на фиг. 1 могут содержать любой подходящий электропроводящий материал. Примеры подходящих материалов истока и стока включают кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия-олова (ITO), оксид индия-цинка, золото, платину, углерод и т.д.
[0028] Проводящий канал 5 может включать в себя любой проводящий или полупроводящий материал, который может окислять или восстанавливать редокс-активную зарядовую метку. Этот материал может содержать органический материал, неорганический материал или тот и другой. Некоторые примеры подходящих материалов канала включают кремний, углерод (например, стеклоуглерод, графен и т.д.), полимеры, такие как проводящие полимеры (например, полипиррол, полианилин, политиофен, поли(3,4-этилендиокситиофен), легированный поли(4-стиролсульфанатом) (PEDOT-PSS) и т.д.), металлы, биомолекулы и т.д. Электропроводящий канал 5 может преобразовывать поступление или выбытие компонента реакции (например, помеченного нуклеотида) в электрический сигнал. В раскрытых здесь примерах электропроводящий канал 5 может также преобразовывать взаимодействия между двумя компонентами реакции (матричной нуклеиновой кислотой и нуклеотидом помеченного нуклеотида) в обнаруживаемый сигнал посредством своего взаимодействия с редокс-активной зарядовой меткой помеченного нуклеотида.
[0029] В некоторых примерах проводящий канал 5 может также быть наноструктурой, которая имеет по меньшей мере один размер на наношкале (в диапазоне от 1 нм до менее чем 1 мкм). В одном примере этот размер относится к наибольшему размеру. В качестве примеров, электропроводящий канал 5 может быть полупроводящей наноструктурой, графеновой наноструктурой, металлической наноструктурой и наноструктурой из проводящего полимера. Наноструктура может быть много- или одностенной нанотрубкой, нанонитью, нанолентой и т.д.
Science
J. Amer. Chem. Soc.
NanoLett
[0030] В конкретных примерах прибор или способ по настоящему изобретению могут использовать глубоко масштабированные FinFET-транзисторы в качестве мономолекулярных проводящих каналов. Проводящие каналы FinFET получают выгоду от технологии уже на стадии разработки производителями самых современных полупроводников. Кроме того, могут быть использованы ранее опубликованные компоненты, включая, но не ограничиваясь ими, (1) компоненты, используемые для иммобилизации лизоцима на CNT, чтобы наблюдать процессивность фермента в реальном времени, как описано в Choi et al, , 335, 319 (2012), (2) компоненты, используемые для иммобилизации Pol 1 фрагмента Кленова на CNT и наблюдения процессивности ДНК в реальном времени, как описано в Olsen et al, , 135, 7885 (2013), (3) компоненты, используемые для объяснения механизма трансдукции как движущихся заряженных остатков вследствие аллостерического движения белка, как описано в Chi et al,  13, 625 (2013). Предложенные способы могут также применять прибор, компоненты прибора и способы, изложенные в публикации заявки на патент США № 2013/0078622 A1. Каждая из вышеупомянутых ссылок включена сюда по ссылке во всей своей полноте.
[0031] Используемый в данном документе термин "каждый", когда используется в указании на совокупность элементов, предназначен идентифицировать отдельный элемент в совокупности, но не обязательно ссылается на каждый элемент в совокупности. Исключения могут возникать, если явное раскрытие или контекст четко диктуют иное.
[0032] Используемый в данном документе термин "примерно", когда используется в указании на число, размер или результат измерения, включает в себя значение, которое может изменяться относительно указанного вслед за ним числового значения на величину вплоть до 5%, так что, например, "примерно 100" будет означать "от 95 до 105".
[0033] Используемый в данном документе термин "маркер", когда используется в указании на компонент реакции, предназначен означать обнаруживаемый компонент реакции или обнаруживаемый фрагмент компонента реакции. Полезным маркером является маркер заряда (также называемый зарядовой меткой), который(ая) может быть обнаружен(а) посредством проводящего канала. Маркер может быть присущим компоненту реакции, который должен обнаруживаться (например, заряженная аминокислота полимеразы), или маркер может быть неприсущим компоненту реакции (например, не встречающаяся в природе модификация аминокислоты). В некоторых примерах маркер может включать в себя множественные фрагменты, имеющие отдельные функции. Например, маркер может включать в себя связующий компонент, или линкер (такой как нуклеиновая кислота), и компонент зарядовой метки.
[0034] Используемый в данном документе термин "нуклеиновая кислота" подразумевается согласующимся с его использованием на данной области техники и включает в себя встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты или их функциональные аналоги. Особенно полезные функциональные аналоги способны гибридизоваться в нуклеиновую кислоту последовательным специфическим образом или пригодны для их использования в качестве матрицы для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, как правило, имеют скелет, содержащий фосфодиэфирные связи. Аналогичная структура может иметь чередующееся скелетное сцепление, включая любое из множества известных в данной области техники, такое как пептид-нуклеиновая кислота (ПНК или PNA) или закрытая нуклеиновая кислота (ЗНК или LNA). Встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты обычно имеют дизоксирибозный сахар (например, обнаруживаемый в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)) или рибозный сахар (например, обнаруживаемый в рибонуклеиновой кислоте (РНК)).
[0035] Нуклеиновая кислота может содержать любой из множества разнообразных аналогов этих фрагментов сахара, которые известны в данной области техники. Нуклеиновая кислота может включать в себя нативные или ненативные основания. В этом отношении, нативная дезоксирибонуклеиновая кислота может иметь одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из аденина, тимина, цитозина или гуанина, а рибонуклеиновая кислота может иметь одно или более оснований, выбранных из группы, состоящей из урацила, аденина, цитозина или гуанина. Полезные ненативные основания, которые могут быть включены в состав нуклеиновой кислоты, известны в данной области техники.
[0036] Используемый в данном документе термин "нуклеотид" предназначен включать в себя природные нуклеотиды, их аналоги, рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, дидезоксирибонуклеотиды и другие молекулы, известные как нуклеотиды. Этот термин может быть использован для указания на мономерное звено, которое присутствует в полимере, например, чтобы идентифицировать субзвено, присутствующее в цепи ДНК или РНК. Термин может также использоваться для указания на молекулу, которая не присутствует в полимере в обязательном порядке, например, молекулу, которая способна встраиваться в полинуклеотид зависимым от матрицы образом посредством полимеразы. Термин может относиться к нуклеозидному звену, имеющему, например, 0, 1, 2, 3 или более фосфатов на 5'-углероде. Например, тетрафосфатные нуклеотиды, пентафосфатные нуклеотиды и гексафосфатные нуклеотиды могут быть особенно полезными, как и нуклеотиды с более чем 6 фосфатами, такие как с 7, 8, 9, 10 или более фосфатами, на 5'-углероде. Примерные природные нуклеотиды включают в себя, без ограничения, ATP, UTP, CTP и GTP (совокупно NTP), и ADP, UDP, CDP и GDP (совокупно NDP), или AMP, UMP, CMP или GMP (совокупно NMP), или dATP, dTTP, dCTP и dGTP (совокупно dNTP), и dADP, dTDP, dCDP и dGDP (совокупно dNDP), и dAMP, dTMP, dCMP и dGMP (dNMP). Примерные нуклеотиды могут включать в себя, без исключения, любой NMP, dNMP, NDP, dNDP, NTP, dNTP и другой NXp и dNXP, где X представляет собой число от 2 до 10 (совокупно NPP).
[0037] Неприродные нуклеотиды, также упоминаемые в данном документе как аналоги нуклеотидов, включают в себя те, которые не присутствуют в природной биологической системе или практически не встраиваются в полинуклеотиды посредством полимеразы в своей естественной среде, например, в нерекомбинантной клетке, которая экспрессирует полимеразу. Особенно полезные неприродные нуклеотиды включают в себя те, которые встраиваются в полинуклеотидную цепь посредством полимеразы со скоростью, которая является значительно более быстрой или более медленной по сравнению со скоростью, с которой другой нуклеотид, такой как природный нуклеотид, который спаривает основание с одним и тем же комплементарным основанием Уотсона-Крика, встраивается в цепь посредством полимеразы. В качестве примеров таких значительно более быстрых или более медленных скоростей, неприродный нуклеотид может быть встроен со скоростью, которая по меньшей мере примерно в 2 раза отличается, например, по меньшей мере примерно в 5 раз отличается, примерно в 10 раз отличается, примерно в 25 раз отличается, примерно в 50 раз отличается, примерно в 100 раз отличается, примерно в 1000 раз отличается, примерно в 10000 раз или более отличается по сравнению со скоростью встраивания природного нуклеотида. Неприродный нуклеотид может быть способен далее удлиняться после его встраивания в полинуклеотид. Примеры включают в себя аналоги нуклеотида, имеющие 3'-гидроксил, или аналоги нуклеотида, имеющие обратимый терминаторный фрагмент в 3'-позиции, который может быть удален, чтобы предоставить возможность дальнейшего удлинения полинуклеотида, который имеет встроенный аналог нуклеотида. Примеры обратимых терминаторных фрагментов, которые могут быть использованы, описаны, например, в патентах США №№ 7,427,673; 7,414,116; и 7,057,026 и PCT-публикациях WO 91/06678 и WO 07/123744, каждый(ая) из которых включен(а) сюда по ссылке во всей своей полноте. Будет понятно, что в некоторых примерах аналог нуклеотида, имеющий 3'-терминаторный фрагмент или лишенный 3'-гидроксила (такой как дидезоксинуклеотидный аналог), может быть использован в условиях, где полинуклеотид, который имеет встроенный аналог нуклеотида, далее не удлиняется. В некоторых примерах нуклеотид(ы) могут не включать в себя обратимый терминаторный фрагмент, или нуклеотид(ы) не будут включать в себя необратимый терминаторный фрагмент, или нуклеотид(ы) не будут включать в себя какой либо терминаторный фрагмент вообще. Аналоги нуклеотидов с модификациями в 5'-позиции также являются полезными.
[0038] Используемый в данном документе термин "компонент реакции" предназначен означать молекулу, которая принимает участие в реакции. Примеры включают в себя реагенты, которые расходуются в реакции, продукты, которые создаются в ходе реакции, катализаторы, такие как энзимы, которые облегчают реакцию, растворители, соли, буферы и другие молекулы.
[0039] Используемый в данном документе термин "терминаторный фрагмент", когда используется в указании на нуклеотид, означает ту часть нуклеотида, которая ингибирует или предотвращает образование нуклеотидом ковалентной связи со вторым нуклеотидом. Например, в случае нуклеотидов, имеющих пентозный фрагмент, терминаторный фрагмент может предотвращать образование фосфодиэфирной связи между 3'-кислородом нуклеотида и 5'-фосфатом второго нуклеотида. Терминаторный фрагмент может быть частью нуклеотида, который является мономерным звеном, присутствующим в полимере нуклеиновой кислоты, или терминаторный фрагмент может быть частью свободного нуклеотида (например, трифосфат нуклеотида). Терминаторный фрагмент, который является частью нуклеотида, может быть обратимым, так что терминаторный фрагмент может быть модифицирован, чтобы сделать нуклеотид способным формировать ковалентную связь со вторым нуклеотидом. В конкретных примерах терминаторный фрагмент, такой как обратимый терминаторный фрагмент, может быть присоединен к 3'-позиции или 2'-позиции пентозного фрагмента аналога нуклеотида.
[0040] Любая из множества разнообразных полимераз может быть использована в способе или составе, изложенном в данном документе, включая, например, белковые энзимы, изолированные из биологических систем, и их функциональные варианты. Ссылка на конкретную полимеразу, такую как приведенные в качестве примера ниже, будет пониматься как включающая ее функциональные варианты, пока не указано иное. Особенной полезной функцией полимеразы является катализ полимеризации цепи нуклеиновой кислоты с помощью существующей нуклеиновой кислоты в качестве матрицы. Другие функции, которые являются полезными, описываются где-либо еще в данном документе. Примеры полезных полимераз включают ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы, их функциональные фрагменты и рекомбинантные пептиды слияния, включающие их. Примерные ДНК-полимеразы включают полимеразы, которые были классифицированы по структурной гомологии на семейства, идентифицированные как A, B, C, D, X, Y и RT. ДНК-полимеразы в семействе A включают в себя, например, T7 ДНК-полимеразу, эукариотическую митохондриальную ДНК-полимеразу гамма, E. coli ДНК Pol I (включая фрагмент Кленова), Thermus aquaticus Pol I и Bacillus stearothermophilus Pol I. ДНК-полимеразы в семействе B включают в себя, например, эукариотические ДНК-полимеразы a, 6 и E; ДНК-полимеразу C; T4 ДНК-полимеразу, Phi29 ДНК-полимеразу, 9°N™ и RB69-бактериофаг ДНК-полимеразу. Семейство C включает в себя, например, E. coli ДНК-полимераза III альфа-субзвено. Семейство D включает в себя, например, полимеразы, полученные из подобласти эуриархеота для археи. ДНК-полимеразы в семействе X включают в себя, например, эукариотические полимеразы Pol beta, Pol simga, Pol lamda и Pol mu и S.cereviasiae Pol4. ДНК-полимеразы в семействе Y включают в себя, например, Pol eta, Pol iota, Pol kappa, E. coli Pol IV (DINB) и E. coli Pol V (UmuD'2C). Семейство RT (обратная транскриптаза) ДНК-полимераз включает в себя, например, ретровирусные обратные транскриптазы и эукариотические телемеразы. Примерные РНК-полимеразы включают в себя, но не ограничены ими, вирусные РНК-полимеразы, такие как T7 РНК-полимераза; эукариотические РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза I, РНК-полимераза II, РНК-полимераза III, РНК-полимераза IV и РНК-полимераза V; и архейская РНК-полимераза. Другие полимеразы, описанные в патенте США № 8,460,910, который включен сюда во всей своей полноте, также входят в число полимераз, которые упомянуты в данном документе, как и любые другие функциональные полимеразы, включая полимеразы, имеющие последовательности, модифицированные по сравнению с какими-либо из вышеупомянутых энзимов полимеразы, которые приведены просто в качестве перечня неограничивающих примеров.
[0041] Может быть желательным формировать присоединение между полимеразой и проводящим каналом, которое является достаточно прочным, чтобы выдерживать многократные этапы промывки или обработки во время секвенирования или другой реакции, например, во время проводимых в последовательности введения и удаления растворов, содержащих различные реагенты реакции. Различные применения SBS и родственных технологий используют перемещение твердотельной подложки и переносящего реагенты раствора и/или микрожидкостного, имеющего положительное или отрицательное давление потока, пассивного потока или другие текучие перемещения реагентов в растворе для того, чтобы поддерживать связывание реагентов с соответствующими участками (сайтами), тщательное распределение или удаление буфера, компонентов реакции, реагентов и других соединений во время этапов применения реагента и промывки. Присоединение полимеразы к проводящему каналу может преимущественно быть достаточно устойчивым, чтобы противостоять такому перемещению проводящего канала относительно реакционного раствора, или просто прохождению времени, без отсоединения полимеразы от проводящего канала.
[0042] Как раскрыто здесь, полимераза может быть модифицирована посредством добавления связующего фрагмента, а присоединяющий фрагмент может быть связан с проводящим каналом, так что полимераза может становиться присоединенной к проводящему каналу или связанной с ним. Присоединение между связующим фрагментом и присоединяющим фрагментом может быть достаточно прочным, чтобы противостоять потенциальным разрушениям, как описано выше. В некоторых примерах связующий фрагмент может включать в себя полимер или другой повтор одного или более субзвеньев, причем этот полимер связывается более прочно или эффективно с присоединяющим фрагментом, чем это делает мономер. В дополнительных примерах полимераза может включать в себя множественные полимеры, образующие комплекс связывающего фрагмента. Аналогично, присоединяющий фрагмент может иметь химический состав, способный образовывать присоединение со связывающим фрагментом полимеразы. Химический состав может включать в себя совокупность функциональных групп, которые вместе могут присоединяться к связывающему фрагменту или связываться с ним. В некоторых примерах проводящий канал может включать в себя комплекс множественных присоединяющих фрагментов, таких как множественные копии единственного присоединяющего фрагмента, чтобы усилить или улучшить связывание со связывающим фрагментом полимеразы.
[0043] В некоторых примерах присоединение или связывание между одним или более присоединяющими фрагментами проводящего канала и одним или более связывающими фрагментами полимеразы может быть улучшено с помощью или требовать наличия иона металла или другого иона или связывающего кофактора, без которого полимераза и проводящий канал присоединялись бы друг к другу или связывались бы друг с другом лишь слабо или вообще не связывались. В таких примерах такой связывающий кофактор может быть добавлен к проводящему каналу и полимеразе, так что их присоединяющие фрагменты и связывающие фрагменты могут присоединяться друг к другу. Затем, если желательно удаление полимеразы с проводящего канала, ион металла или другой ион или связывающий кофактор могут быть удалены, тем самым разрывая или разъединяя присоединение между проводящим каналом и полимеразой. Например, может быть введен хелатообразователь, причем этот хелатообразователь блокирует ион металла или другой ион или связывающий кофактор, препятствуя его связыванию с присоединяющим фрагментом и связывающим фрагментом.
[0044] В другом примере, если желательно удаление полимеразы с проводящего канала, может быть добавлена молекула, которая конкурирует с присоединяющим фрагментом проводящего канала за связывание со связывающим фрагментом полимеразы, или конкурирует со связывающим фрагментом полимеразы за связывание с присоединяющим фрагментом проводящего канала, с тем чтобы разрушить связывание между присоединяющим фрагментом и связывающим фрагментом. Таким образом, в том случае, когда проводящий канал включает в себя присоединяющий фрагмент A, который связывается со связывающим фрагментом B, включенным в состав полимеразы, излишек добавленных свободных молекул A, не связанных с проводящим каналом, может победить в конкурентной борьбе A-фрагменты присоединяющего фрагмента проводящего канала за связывание со связывающим B-фрагментом полимеразы. Связывающие B-фрагменты полимеразы будут тогда связываться со свободным A-фрагментам вместо A-фрагментов присоединяющего фрагмента проводящего канала, отсоединяясь от проводящего канала. Или же излишек добавленных свободных молекул B, не связанных с полимеразой, может победить в конкурентной борьбе B-фрагменты связывающего фрагмента полимеразы за связывание с присоединяющим A-фрагментом проводящего канала. Присоединяющий A-фрагмент проводящего канала тогда связывался бы со свободным B-фрагментом вместо B-фрагмента связывающего фрагмента полимеразы, так что полимераза отсоединяется от проводящего канала.
[0045] После отсоединения полимеразы от проводящего канала, будь то за счет удаления или хелатирования иона металла или другого иона или другого связывающего кофактора, либо за счет введения излишка свободных молекул присоединяющего фрагмента или связывающего фрагмента, полимераза может впоследствии быть повторно присоединена к проводящему каналу. Например, ион металла или другой ион или другой связывающий кофактор может быть заменен, или хелатирующий его агент удален, или свободный присоединяющий фрагмент или свободные молекулы связывающего фрагмента могут быть удалены, так что при повторном введении полимераза, включающая в себя связывающий фрагмент, может присоединяться к присоединяющему фрагменту проводящего канала.
[0046] Неограничивающий пример присоединяющего фрагмента и связывающего фрагмента показан на фиг. 2. В этом примере присоединяющий фрагмент включает в себя нитролотриуксусную кислоту (NTA), также называемую N,N-бис(карбоксиметил)глицином:
.
NTA, в присутствии ионов никеля, образует присоединение к полигистидину, такому как гексапептидная метка, содержащая шесть последовательных гексидиновых аминокислот (6-His). Другие примеры могут содержать больше или меньше остатков гистидина в качестве связывающего фрагмента. Фиг. 2 показывает опору (такую как проводящий канал), включающую в себя присоединяющий фрагмент NTA, образующий комплексное соединение с ионом никеля (Ni-NTA), связанным со связывающим фрагментом 6-His. В соответствии с таким примером, проводящий канал может включать в себя один или более NTA-фрагментов, а молекулы полимеразы могут включать в себя гистидиновую метку, такую как 6-His-метка. Как описано здесь, один или более присоединяющих фрагментов, таких как NTA-фрагменты, могут быть связаны с проводящим каналом, ковалентно или нековалентно, для связывания с одним или более связывающими фрагментами, такими как остатки гистидина, связанные, ковалентно или нековалентно, с полимеразой.
[0047] В этом примере связывание Ni-NTA с 6-His-меткой может быть разорвано в присутствии хелатирующего никель агента (комплексона никеля), такого как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA). Хелатирование никеля посредством добавления EDTA разрывает присоединение NTA к 6-His, приводя к отсоединению полимеразы от проводящего канала. В другом примере может быть добавлен излишек свободного имидазола или свободных соединений, включающих группу имидазола. Гистидин включает в себя группу имидазола, которая связывается с Ni-NTA, как показано на фиг. 2. Излишек свободного имидазола может победить в конкурентной борьбе имидазольные группы гистидина за связывание с Ni-NTA проводящего канала, отсоединяя полимеразу от проводящего канала.
[0048] В некоторых применениях увеличенное число связей присоединяющий фрагмент-связывающий фрагмент в расчете на одну полимеразу может быть желательным с тем, чтобы упрочнять связывание полимеразы с проводящим каналом. Увеличенное число присоединяющих фрагментов в расчете на один проводящий канал может обеспечить возможность более прочного присоединения полимеразы к проводящему каналу, так что вероятность непреднамеренного или нежелательного отсоединения минимизируется. Одним способом добиться этого может быть беспорядочное увеличение числа присоединяющих фрагментов, индивидуально присоединенных к проводящему каналу. В одном примере, когда присоединяющие фрагменты, такие как NTA-фрагменты, индивидуально связываются с проводящим каналом, просто увеличение плотности NTA-фрагментов, связанных с проводящим каналом, могло бы привести в результате к большему количеству точек присоединения для связывающего фрагмента, такого как полигистидиновая метка, к проводящему каналу.
[0049] Однако, у такого способа может быть несколько неблагоприятных недостатков. Одним недостатком может быть то, что независимое связывание отдельных присоединяющих фрагментов, таких как NTA, с поверхностью проводящего канала может приводить в результате к NTA-фрагментам, пространственно отделенным друг от друга настолько, что они не способствуют увеличению прочности связывания гистидиновой метки. NTA-фрагменты, которые пространственно отделены друг от друга таким образом, могут, каждый, связываться с гистидиновой меткой полимеразы, но не делают возможным связывание множественных NTA-фрагментов в расчете на проводящий канал, чтобы связываться с данной гистидиновой меткой полимеразы. Как следствие, подразумеваемая выгода упрочнения связи между полимеразой и проводящим каналом не будет достигнута или не будет максимизирована просто посредством увеличения числа отдельно связанных присоединяющих фрагментов, таких как NTA, в расчете на проводящий канал.
[0050] Другим возможным недостатком попытки увеличить прочность связывания полимеразы с проводящим каналом посредством простого увеличения числа индивидуально связанных присоединяющих фрагментов в расчете на проводящий канал, может быть потеря контроля над числом молекул полимеразы, которые могут быть связаны в расчете на проводящий канал. В некоторых примерах может быть желательным иметь только одну связанную молекулу полимеразы на проводящий канал. Определение идентичности одной или более матричных молекул посредством проводящего канала, как объяснено выше, может происходить в результате ассоциирования полимеразой нуклеотида с матрицей и присоединения нуклеотида к образующейся цепи. Зарядовая метка на нуклеотиде может быть воспринята проводящим каналом, модифицируя протекание тока по каналу. В некоторых примерах различные типы нуклеотидов могут иметь зарядовые метки, которые отличаются друг от друга, так что проводящий канал реагирует по-разному в зависимости от того, какой тип нуклеотида встраивается в образующуюся растущую цепь посредством полимеразы. Посредством экстраполяции обнаружение типа встраиваемого таким образом нуклеотида предоставляет возможность идентификации комплементарного нуклеотида матрицы.
[0051] При таком способе, если в расчете на проводящий канал связано более одной активной полимеразы, может быть повышенный шум в обнаружении встраивания нуклеотида. Если имеются две или более связанных активных полимеразы на проводящий канал, каждая может связывать молекулу матрицы и катализировать формирование комплементарной образующейся цепи. В таком примере одна полимераза может встраивать один тип нуклеотида, комплементарный одному нуклеотиду матрицы, в то время как другая полимераза встраивает другой тип нуклеотида, комплементарный другому нуклеотиду другой матричной молекулы. Проводящий канал может обнаруживать оба нуклеотида, или зарядовые метки нуклеотидов могут мешать друг другу и приводить к неточному считыванию или конфликтующим считываниям проводящим каналом. Во избежание такого результата может быть желательным предотвращать связывание более чем одной полимеразы в расчете на проводящий канал. Если множественные присоединяющие фрагменты, такие как NTA, независимо связываются с проводящим каналом, некоторые могут связываться с отличными друг от друга молекулами полимеразы, вместо того, чтобы все такие связанные на проводящий канал присоединяющие фрагменты связывались с одной и той же полимеразой. Поэтому в расчете на проводящий канал может связываться более одной полимеразы вместо этого, тогда как подразумеваемое упрочнение связи между полимеразой и проводящим каналом может не быть достигнуто или может быть минимизировано.
[0052] В данном документе раскрыты проводящий канал и способ создания и применения такого проводящего канала, причем этот проводящий канал включает в себя множественные присоединяющие фрагменты, связанные с ним в комплекс. Комплекс присоединяющих фрагментов, присоединенный на проводящий канал, может преодолевать недостатки множественных присоединяющих фрагментов, индивидуально присоединенных к раскрытому выше проводящему каналу. В одном примере в расчете на проводящий канал может быть связан единственный комплекс множественных присоединяющих фрагментов. Таким образом, множественные присоединяющие фрагменты в комплексе присоединяющих фрагментов могут присутствовать в достаточной близости друг к другу, так что они будут совместно связываться со связывающим фрагментом или связывающими фрагментами одной и той же полимеразы как одно с другим. Связывание комплекса присоединяющих фрагментов с проводящим каналом может тем самым позволить добиться выгоды упрочнения связи полимеразы с проводящим каналом. Кроме того, контролирование числа комплексов присоединяющих фрагментов, связанных в расчете на проводящий канал, может минимизировать, или в одном случае полностью предотвратить, нежелательное связывание слишком многих полимераз или большего чем желательное количества полимераз с проводящим каналом.
[0053] Хотя одна активная полимераза на проводящий канал может быть желательной в некоторых примерах, в других примерах может быть желательной более чем одна предназначенная для связывания полимераза на проводящий канал. Например, в условиях, когда в расчете на проводящий канал доступна только одна матричная молекула для реакции полимеразы, риск мешающего воздействия от реакций множественных полимераз на проводящий канал, с которым связывается более чем одна молекула полимеразы, может быть минимизирован или устранен. И, в некоторых примерах, может быть желательным иметь более одной связанной полимеразы на каждый проводящий канал. Например, когда только одна матричная молекула доступна для реакции полимеразы на каждом проводящем канале, может быть желательным иметь более одной связанной активной полимеразы на проводящий канал, чтобы увеличить вероятность связывания матричной молекулы с полимеразой для того, чтобы произошла реакция полимеразы. В других примерах может быть желательным связывание более одной полимеразы с проводящим каналом, например, в том случае, когда существует пул полимераз, и некая доля полимераз может быть неактивной или иметь низкую эффективность или процессивность. В таких случаях связывание более одной полимеразы на проводящий канал может быть желательным для достижения желаемого уровня процессивности на проводящий канал без жертвования соотношением сигнал-шум. Как будет ясно из последующего, управление числом комплексов присоединяющих фрагментов на проводящий канал с более чем одной полимеразой на проводящий канал в соответствии с настоящим изобретением может предоставлять возможность связывания одной или более чем одной полимеразы на проводящий канал, что может быть желательным при данном обстоятельстве. Например, одна, две, три, четыре, пять или более молекул полимеразы могут быть связаны с проводящим каналом в соответствии с настоящим изобретением, контролируемым образом, но контролируя число связанных кластеров присоединяющих фрагментов на проводящий канал, тогда как каждый кластер может приводить в результате к увеличенной прочности связывания в расчете на полимеразу по своей природе, включающей некоторое число присоединяющих фрагментов в достаточно тесной близости друг с другом, что каждый из них, или большинство из них, связываются со связывающим фрагментом или связывающими фрагментами одной и той же полимеразы, как и друг с другом.
[0054] Комплекс присоединяющих фрагментов может быть связан с проводящим каналом за счет построения разветвленной древо- или дендримеровидной структуры. В одном примере NTA-фрагмент может быть связан с проводящим каналом как первое поколение NTA. Второе поколение NTA-фрагментов может быть присоединено к карбоксильным группам первого поколения NTA. Из единственной точки присоединения первого поколения NTA добавление второго поколения NTA приводит к трем потенциальным участкам присоединения Ni-NTA для гистидиновой метки. Третье поколение NTA-фрагментов может затем быть присоединено к карбоксильным группам второго поколения NTA. Из единственной точки присоединения первого поколения NTA добавление второго, затем третьего поколения NTA приводит к девяти потенциальным участкам присоединения Ni-NTA для гистидиновой метки. Дальнейшие поколения NTA могут затем быть добавлены к последнему поколению, тем самым поступательно увеличивая число присоединяющих фрагментов на проводящий канал, в кластере, для улучшения прочности связывания полимеразы. Четыре, пять или более поколений NTA могут быть добавлены, давая в результате 27, 81 или дополнительное утроение NTA-фрагментов в расчете на комплекс присоединяющих фрагментов.
2
2
[0055] Может быть использован любой подходящий способ присоединения первого поколения NTA к проводящему каналу. Иллюстративный пример присоединяющего фрагмента, присоединенного к твердотельной подложке 300, такой как поверхность проводящего канала, изображен на фиг. 3. Подложка 310 может быть поверхностью проводящего канала или модифицированной поверхностью проводящего канала. Множество разнообразных материалов могут быть включены в состав поверхности проводящего канала, к которому может быть присоединена полимераза, включая возможные компоненты поверхностного канала, как перечислено и описано выше. Примеры могут включать оксинитрид кремния (SiON), диоксид кремния (SiO) или диоксид гафния (HfO).
[0056] Поверхность подложки 310 может быть модифицирована модификатором 320 поверхности, который обеспечивает возможность присоединения линкера 330 к поверхности 310. Линкер 320 может иметь реакционноспособную функциональную группу на каждом своем конце, например, на проксимальном конце X, близком к подложке 310, и дистальном конце Y, дальнем по отношению к подложке. Реакционноспособная группа X линкера 330 может быть выбрана так, чтобы быть реагирующей с модификатором 320 поверхности. Присоединяющий фрагмент 340 может затем быть присоединен к линкеру 330. Присоединяющий фрагмент 340 может иметь реакционноспособную группу Z, которая может реагировать с дальней реакционноспособной группой Y линкера. Модифицировав поверхность 310 модификатором 320 поверхности, к ней можно присоединить линкер 330, и присоединяющий фрагмент 340, присоединяемый к линкеру 330, создавая мостик от присоединяющего фрагмента 340 к поверхности 310. В некоторых примерах может не быть линкера 330, и реакционноспособная группа Z, присоединенная к присоединяющему фрагменту 340, может вместо этого непосредственно связываться со линкером 320 проводящего канала 310. Может быть использовано много подходящих пар модификатора 320 поверхности и проксимальной реакционноспособной группы X линкера 330 и дистальной реакционноспособной группы Y линкера 330 и реакционноспособной группы Z, присоединенной к присоединяющему фрагменту 340,. Неисключительный перечень возможных пар приведен в таблице 1.
[0057] Таблица 1: Неограничивающие примеры пар реакционноспособных групп для присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу
Модификатор поверхности
Линкер
Реакционноспособная группа присоединяющего фрагмента
Концевая функциональная группа
Примеры
Проксимальная реакционноспособная группа X
Дистальная реакционноспособная группа Y
Z
Амин
APTMS или APTE
NHS
Малеимид
тиол
Азидосилан + фосфин (восстановление азида Штаудингера)
альдегид
Тиол
малеимид
Алкин
азид
Азид
Алкин, DBCO
DBCO
азид
Тетразин
TCO
TCO
тетразин
Азид
C3- или C11-азидосилан
Алкин
NHS
амин
Азидолиз эпокси- или бромосилана посредством NaN3
DBCO
альдегид
Амин, гидразин, гидразид
APTMS или APTES+NHS-азид
Амин, гидразин, гидразид
альдегид
малеимид
тиол
тиол
малеимид
тетразин
TCO
TCO
тетразин
Тетразин
APTMS или APTES + NHS-тетразин
TCO
NHS
амин
малеимид
тиол
альдегид
Амин, гидразин, гидразид
Амин, гидразин, гидразид
альдегид
тиол
малеимид
азид
Алкин, DBCO
DBCO
азид
Гидразин или гидразид
ATPMS или APTES + цианурхлорид + гидразин
альдегид
NHS
амин
APTMS или APTES + NHS-гидразид
Малеимид
тиол
C3- или C11-азидосилан + алкин-гидразид
Тиол
малеимид
APTMS или APTES + янтарный ангидрид или глутаровый ангидрид + карбогидразид + EDC
Алкин
азид
Азид
Алкин, DBCO
DBCO
азид
Тетразин
TCO
TCO
тетразин
NHS
APTMS или APTES + янтарный ангидрид или глутаровый ангидрид + DCC/NHS или EDC/NHS
нет
нет
амин
Эпокси
Эпоксисилан
Альдегид
Альдегид силан
Изотиоцианат
APTMS или APTES + PDITC
Изоцианат
(3-изоцианатопропил)триетоксилан
APTMS = (3-аминопропил)триметоксисилан; APTES = (3-аминопропил)триэтоксисилан; C3-азидосилан = 3-азидопропилтриэтоксисилан; C11-азидосилан = 11-азидоундецилтриметоксисилан; PDITC = p-фенилендиизотиоцианат; DBCO = дибензоциклооктин; TCO = транс-циклооктен.
[0058] В некоторых примерах линкер 330 может быть связан с модификатором 320 поверхности на одном этапе, за которым следует присоединение присоединяющего фрагмента 340 к линкеру 330 на другом этапе. В другом примере линкер 330 может быть связан с присоединяющим фрагментом 340 на одном этапе, затем линкер может быть связан с модификатором 320 поверхности на другом этапе. В еще одном примере линкер 330 может быть связан с модификаторам 320 поверхности и с присоединяющим фрагментом 340 на одном и том же этапе.
n
n
n
n
[0059] В одном примере аминогруппа может быть добавлена на поверхность проводящего канала в качестве модификатора поверхности посредством газофазной силанизации (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTMS). Затем может быть инкубирован бифункциональный N-гидроксисукцинимид-полиэтиленгликоль-малеимидный (NHS-PEG-малеимидный) линкер, чтобы позволить NHS реагировать с и образовывать связь с аминогруппой на поверхности проводящего канала, что приводит к присоединению малеимидной группы NHS-PEG-малеимидного линкера к поверхности проводящего канала. Тогда последующая инкубация тиола-NTA приведет к реакции тиол-малеимид, ведущей к ковалентному присоединению NTA-группы к NHS-PEG-малеимидному линкеру в качестве первого поколения NTA. В некоторых примерах может быть выполнена совместная инкубация амидированной поверхности проводящего канала с NHS-PEG-малеимидным линкером и тиолом-NTA, чтобы уменьшать число этапов обработки.
[0060] Второе поколение NTA может затем быть добавлено к первому поколению NTA посредством активации карбоксильных групп NTA карбонилдиимидидазолом (CDI), приводящей к присоединению трех имидазольных групп на NTA. Последующая инкубация с NTA-амином приводит к нуклеофильному замещению имидазольных групп и занятию каждого участка имидазола другой NTA. Таким образом, из первого поколения NTA может быть сформировано второе поколение NTA, включающее в себя комплекс трех присоединяющих фрагментов NTA. Примерные схемы, представляющие вышеупомянутые этапы, показаны ниже.
n
[0061] В этом примере, как описано выше, газообразная силанизация (3-аминопропил)триэтоксисиланом (APTMS) добавляет аминогруппу к гидроксигруппам на поверхности проводящего канала. Однокамерная инкубация с NHS-PEG-малеимидным линкером и тиолом-NTA приводит к присоединению первого поколения NTA к поверхности проводящего канала.
[0062] Добавление второго поколения NTA может затем быть выполнено так, как описано выше и проиллюстрировано ниже.
3
[0063] На вышеприведенном этапе 1) карбоксильные группы первого поколения NTA активируют путем инкубации всю ночь с CDI в DMSO при комнатной температуре, высвобождения имидазольной группы и диоксида углерода и присоединения имидазольной группы на каждую карбоксильную группу первого поколения NTA. На втором этапе 2) осуществляют реакцию NTA-амина в присутствии NaCO при pH 8,5 при комнатной температуре всю ночь, приводящую к замещению имидазольной группы амином из NTA-амина и приводящую к присоединению трех групп второго поколения NTA к группе первого поколения NTA. В этом примере повторение вышеупомянутых этапов 1) и 2) приводит к образованию второго поколения NTA, давая в результате комплекс девяти присоединяющих фрагментов NTA.
[0064] Формирование второго, третьего и последующих поколений NTA может также быть осуществлено с помощью химизма образования перекрестных связей карбодиимидов. Например, карбоксильная группа на первом поколении NTA может быть активирована с использованием дициклогексилкарбодиимида (DCC), N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIC) или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), в присутствии NHS или сульфо-NHS, образуя слабоустойчивый амин-реагирующий сложный эфир NHS, который может затем прореагировать с амином-NTA, образуя второе поколение NTA. Такой процесс может быть повторен с образованием многих поколений NTA, как раскрыто здесь для образования комплекса присоединяющих фрагментов. Могут быть использованы различные сочетания вышеупомянутых химических процессов добавления поколений NTA, например, в том случае, когда один тип химического процесса используется для добавления одного поколения NTA к предыдущему поколению NTA, а другой химический процесс может быть использован, чтобы сформировать последующее поколение NTA.
n
n
n
n
n
[0065] Модификация числа комплексов присоединяющих фрагментов в расчете на проводящий канал может быть осуществлена посредством модификации числа добавленных групп первого поколения NTA. Например, в вышеприведенных схемах, число добавленных малеимидных групп может быть модифицировано посредством инкубации с NHS-PEG монофункциональным линкером, обогащенным переменными количествами NHS-PEG-малеимидного бифункционального линкера. При более низких концентрациях NHS-PEG-малеимидного бифункционального линкера больше аминогрупп будут реагировать с и связываться с молекулами PEG, лишенными малеимидных групп, которые, следовательно, не будут противодействовать связыванию с тиольной группой во время последующей инкубации с тиолом-NTA, приводя к более низким числам комплексов присоединяющих фрагментов NTA, становящихся присоединенными в расчете на твердофазную подложку или проводящий канал. Наоборот, увеличение концентрации NHS-PEG-малеимидного бифункционального линкера относительно NHS-PEG монофункционального линкера приводит к большему количеству аминогрупп, занятых молекулами PEG, связанными с малеимидными группами, и, следовательно, более высоким числам комплексов присоединяющих фрагментов NTA в расчете на твердофазную подложку или проводящий канал, следом за последующей инкубацией с тиолом-NTA.
[0066] Процесс присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу 400 показан на фиг. 4. Поверхность подложки 410, такую как твердофазная поверхность проводящего канала, силанизируют и добавляют реакционноспособную группу в качестве модификатора 420 поверхности. Модификатор 420 поверхности может затем реагировать со смесью молекул монофункционального линкера 430 и молекул бифункционального линкера 440. Монофункциональный линкер 430 и бифункциональный линкер 440 могут, каждый, иметь проксимальную функциональную группу, которая может реагировать с модификатором 420 поверхности, образуя связь и присоединение к подложке 410. Бифункциональный линкер 440 может дополнительно иметь дистальную функциональную группу, которая может реагировать с реакционноспособной группой молекулы присоединяющего фрагмента 450, образуя связь и присоединение к ней, причем эта дистальная функциональная группа может отсутствовать в монофункциональном линкере 430. Изменяя относительные концентрации монофункционального линкера 430 и бифункционального линкера 440, задействованных в реакции с модификатором 420 поверхности, можно получить различные концентрации и количества первоначальных присоединений присоединяющего фрагмента к поверхности 410 проводящего канала, на которых далее развивать комплексы присоединяющих фрагментов.
[0067] Пример последовательности операций способа в соответствии с аспектами настоящего изобретения представлен на фиг. 5A. В этом примере от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты присоединяют к проводящему каналу. Проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы. Этот пример дополнительно включает в себя присоединение содержащей гистидиновую метку полимеразы к одному или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Другой пример показан на фиг. 5B. В этом примере от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты присоединяют к проводящему каналу. Проводящий канал предназначен обнаруживать встраивание содержащего зарядовую метку нуклеотида в образующийся полинуклеотид посредством полимеразы. Этот пример дополнительно включает в себя присоединение содержащей гистидиновую метку полимеразы к одному или более из комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Пример дополнительно включает в себя элюирование полимеразы из упомянутых от одного до пяти комплексов никеля-нитрилотриуксусной кислоты. Элюирование может включать в себя хелатирование никеля этилендиаминтетрауксусной кислотой или имидазолом.
n
n
n
n
[0068] В некоторых примерах, где NHS-PEG монофункциональный линкер вводится в этап реакции с NHS-PEG-малеимидным бифункциональным линкером, соотношение NHS-PEG-малеимидного бифункционального линкера с NHS-PEG монофункциональным линкером может быть где-то между 1:5 и 1:100000.
n
n
n
n
[0069] Как дополнительно раскрыто здесь, можно преимущественно добиться линкеров различных длин между присоединяющим фрагментом и поверхностью проводящего канала. В качестве неограничивающего репрезентативного примера, NHS-PEG-малеимидный бифункциональный линкер может включать в себя большее число остатков PEG, чтобы удлинять расстояние между присоединяющим фрагментом, таким как NTA, и поверхностью проводящего канала, тогда как меньшее количество остатков PEG может быть включено, чтобы сокращать расстояние между присоединяющим фрагментом и поверхностью проводящего канала. Например, для NHS-PEG-малеимида, n может быть любым числом между 0 и примерно 200, включая от 0 до примерно 24, или примерно 5, примерно 6, примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 11, примерно 12, примерно 13, примерно 14, примерно 15, примерно 16, примерно 17, примерно 18, примерно 19, примерно 20, примерно 21, примерно 22, примерно 23, примерно 24, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 95, примерно 100, примерно 110, примерно 120, примерно 130, примерно 140, примерно 150, примерно 160, примерно 170, примерно 180, примерно 190 или примерно 200. Длина PEG в NHS-PEG-малеимидном бифункциональном линкере и NHS-PEG монофункциональном линкере может быть различной. Расстояние между полимеразой и проводящим каналом может быть выбрано на основе ряда признаков, включая желаемую мобильность присоединенной полимеразы или желаемое расстояние реакции полимеразы от проводящего канала. Что касается последнего, то длина или расстояние, на которое простирается зарядовая метка от нуклеотида для встраивания в образующуюся цепь посредством полимеразы, может быть соотнесена с предпочтительным расстоянием полимеразы от проводящего канала, например. Расстояние полимеразы от проводящего канала может составлять между примерно 1 нм и примерно 20 нм, включая от примерно 3 до примерно 10 нм, или примерно 1 нм, примерно 2 нм, примерно 3 нм, примерно 4 нм, примерно 5 нм, примерно 6 нм, примерно 7 нм, примерно 8 нм, примерно 9 нм, примерно 10 нм, примерно 11 нм, примерно 12 нм, примерно 13 нм, примерно 14 нм, примерно 15 нм, примерно 16 нм, примерно 17 нм, примерно 18 нм, примерно 19 нм или примерно 20 нм.
[0070] В других примерах сцепление между проводящим каналом и присоединяющим фрагментом может включать химические признаки, которые улучшают или стимулируют ближнее ассоциирование зарядовой метки нуклеотида с проводящим каналом во время полимеризации, усиливая или улучшая ее обнаружение проводящим каналом. В некоторых примерах зарядовая метка присоединяется к нуклеотиду для встраивания в образующуюся цепь посредством полимеразы, исходя из комплементарности к матричной цепи, посредством сцепления. Кроме того, присоединение между присоединяющим фрагментом и проводящим каналом может быть, включать или называться привязью. Чтобы увеличивать, улучшать или стимулировать ближнее ассоциирование зарядовой метки с проводящим каналом, например, улучшать обнаружение зарядовой метки проводящим каналом, сцепление нуклеотида и привязи может включать химические признаки, которые имеют электростатическое притяжение друг к другу.
[0071] Например, привязь может включать в себя полинуклеотидную последовательность, называемую акцепторной областью, а сцепление между зарядовой меткой и нуклеотидом может включать в себя полинуклеотидную последовательность, называемую областью специфичности. Акцепторная область может дополнительно быть комплементарной или отчасти комплементарной к области специфичности, например, посредством включения нуклеотидов в последовательность, которая может гибридизоваться. В таком примере, во время встраивания помеченного зарядом нуклеотида в образующуюся цепь во время секвенирования или другого процесса, электростатическое притяжение между областью специфичности и акцепторной областью может служить для приведения зарядовой метки в непосредственную близость с проводящим каналом, чтобы улучшить, усилить обнаружение зарядовой метки проводящим каналом, или способствовать или иным образом помочь такому обнаружению. Примеры спаривающихся химических составов для включения в область специфичности и акцепторную область, включая комплементарные нуклеотиды (например, последовательности A, T, G или C, или инозина, универсального основания, которое может спариваться со всеми четырьмя природными нуклеотидами ДНК), раскрыты где-либо еще, например, в Международной патентной заявке PCT/US/2019/018565, полное содержание которой включено сюда по ссылке.
[0072] Как будет понятно, имеются другие присоединяющие химические вещества для присоединения присоединяющего фрагмента к проводящему каналу. Приведенные выше примеры амина-NHS и малеимида-тиола являются лишь репрезентативными примерами, и могут быть использованы другие известные присоединяющие химические вещества, такие как, например, описанные в таблице 1 выше, или другие. Любое из этих или других, в равной степени подходящих присоединяющих химических веществ может быть использовано для присоединения присоединяющих фрагментов к поверхности проводящего канала.
[0073] Числом точек крепления к поверхности можно управлять посредством обогащения NHS-PEG, который лишен малеимидной группы, чтобы создать NTA. Это дает поверхность первого поколения Ni-NTA с контролируемыми функциональными группами NTA (фиг. 3). Поверхность 2-го поколения NTA создается посредством сначала активации карбонилдиимидазолом (CDI) карбоксильных групп из NTA 1-го поколения, за которой следует реакция с амином-NTA (фиг. 4). Это можно повторять, чтобы создавать поверхность с 3-им или даже более высоким поколением дендримерной NTA.
[0074] Примеры, изложенные ниже и указанные в формуле изобретения, могут быть поняты с учетом вышеприведенных определений.
Примеры
[0075] Последующее иллюстрирует конкретные неограничивающие примеры в соответствии с аспектами настоящего изобретения, но никоим образом не предназначено ограничивать его объем.
2
3
4
[0076] В одном примере одно, два или три поколения NTA сформировали на подложке в качестве тестовых комплексов присоединяющих фрагментов, как раскрыто здесь, затем связанных с флюоресцирующим зеленым белком (GFP), содержащим 6-His в качестве связывающего фрагмента, как раскрыто здесь (с линкером, включающим в себя PEG). Затем количественно определили флуоресценцию после различных длительностей хранения при комнатной температуре вплоть до одной недели. Чтобы присоединять 6-His-помеченный GFP, поверхность с NTA кратковременно промыли с помощью 40 мМ NaOH или 100 мМ NaHCO, затем водой, обеспечив депротонированный COOH. Для загрузки Ni поверхность инкубировали в 1% NiSO при комнатной температуре в течение 30 мин или 1 ч, после чего следовала 3-хкратная промывка водой, затем 2-хкратная промывка буферным раствором для иммобилизации белка (HEPES-буфером: 50 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 0,05% твин-20). Высокая концентрация соли и детергента помогает уменьшать неспецифичное связывание его белка-метки. Поверхность затем инкубировали с 6-His-GFP при желаемой концентрации (например, 1 или 10 мкг/мл) в буферном растворе для иммобилизации в течение 1 ч, с последующей 5-кратной промывкой буферным раствором.
[0077] Флуоресценцию в GFP снимали при сканирования Typhoon с помощью канала изотиоцианата флуоресцеина (ФИТЦ или FITC). Концентрацию GFP количественно определяли путем сначала элюирования GFP с поверхности с помощью имидазола (100-500 мМ) или EDTA (100-500 мМ), затем измерения интенсивности флуоресценции элюированного GFP в планшете с использованием считывателя планшета, с кривой калибровки, выполненной с известной концентрацией GFP.
[0078] Результаты показаны на фиг. 6. Уровни GFP были измерены после присоединения к одному поколению NTA (слева), двум поколениям NTA (посередине) или трем поколениям NTA (справа). В каждом наборе флуоресценция была измерена после варьирующихся длительностей времени, следующих за промывкой буферным раствором для иммобилизации, которые были следующими (представлены слева направо для каждого набора столбцов в гистограммах, представленных на фиг. 6): 0 ч, 1 ч, 3,5 ч, 5 ч, 1 день, 2 дня, 5 дней и 7 дней. Комплекс присоединяющих фрагментов, включающий третье поколение Ni-NTA, привел в результате к наивысшему связыванию 6His-GFP, которое также было наиболее устойчивым в течение периода в 7 дней. Немедленное падение между 0 ч и 1 ч происходило, вероятно, вследствие небольшого процента неустойчиво связанного GFP, с уровнями, присутствующими от 2 ч до 7 дней, представляющими устойчивое, специфичное связывание.
[0079] Хотя выше были изображены и подробно описаны примеры, специалистам в соответствующей области техники будет понятно, что могут быть выполнены различные модификации, добавления, замены и т.п. без отступления от сути настоящего изобретения, и поэтому они рассматриваются попадающими в рамки объема настоящего изобретения, которые определены в нижеследующей формуле изобретения.
[0080] Следует принимать во внимание, что все комбинации вышеприведенных принципов и дополнительных принципов, обсужденных более подробно в данном документе (при условии, что такие принципы не являются взаимно несовместимыми), предусмотрены являющимися частью объекта изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце этого раскрытия, предусмотрены являющимися частью объекта изобретения, раскрытого в данном документе.