Способ выявления микобактерий туберкулеза Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing
METHOD FOR DETECTING MYCOBACTERIA TUBERCULOSIS CENTRAL ASIAN EPIDEMIC CLUSTER BEIJING GENOTYPE

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к Центрально-Азиатскому эпидемическому кластеру генотипа Beijing.
Генотип Beijing Mycobacterium tuberculosis остается наиболее изученным компонентом в структуре популяции этого важного патогена человека. В свою очередь, генотип Beijing охватывает многочисленные и отдаленные сублинии и субтипы, некоторые из которых привлекают особое внимание из-за опасного сочетания патогенетических свойств и определенных миграционных потоков, которые могут распространять такие штаммы далеко за пределы их областей происхождения. Страны бывшего Советского Союза характеризуются высоким уровнем заболеваемости туберкулезом и нарастающим уровнем первичной лекарственной устойчивости. Наиболее известные клональные кластеры циркулирующих штаммов относятся к генотипу Beijing: успешный российский эпидемический клон Beijing B0/W148 и Центрально-Азиатский/Российский генотип (Central Asian/Russian) (Mokrousov, 2013; Merker et al., 2015; Shitikov et al., 2017; Skiba et al., 2015). В свою очередь, в рамках Центрально-Азиатского/Российского генотипа наиболее значимым субтипом является Центрально-Азиатский эпидемический кластер генотипа Beijing иначе и более кратко называемый по-английски Beijing САО (САО - Central Asia Outbreak, англ. Центрально-Азиатская вспышка). Он эпидемически распространен в Средней Азии и выявляется и в России (Merker et al., 2018). Генотип М. tuberculosis Beijing САО ассоциирован с множественной лекарственной устойчивостью в Узбекистане (Merker et al., 2018) и широко распространен в местах лишения свободы в Кыргызстане (Mokrousov et al., 2009).
Разработка быстрого и простого способа детекции эпидемиологически и клинически значимого варианта М. tuberculosis - Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing (Beijing САО) - актуальная задача программы контроля туберкулеза в России и мире.
IS6110 является известным мобильным многокопийным генетическим элементом в геноме микобактерий туберкулеза. В то же время, некоторые из его копий отличает эволюционная стабильность, что определяет возможность их использования в качестве филогенетических маркеров для детекции определенных генотипов при условии, что их специфичность была доказана на большой коллекции изолятов как при биоинформационном анализе доступных геномов, так и при экспериментальном анализе географически репрезентативных коллекций клинических изолятов. В частности, методы ПЦР-детекции специфических элементов IS6110 в определенных локусах генома были разработаны для генотипов Latin-American Mediterranean (Marais et al., 2006), Beijing (Mokrousov et al., 2014), Beijing B0/W148 (Mokrousov et al., 2012).
Известен метод определения штаммов Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing (Beijing САО), основанный на филогенетическом анализе данных полногеномного секвенирования или при анализе набора однонуклеотидных замен в определенных генах (Merker et al., 2015). Метод ограничен трудоемкостью выполнения анализа, требующего секвенирование нескольких генов или полногеномного секвенирования, с последующей биоинформационной обработкой данных и филогенетическим анализом.
Проведенный нами биоинформационный и филогенетический анализ данных полногеномного секвенирования 1398 геномов изолятов М. tuberculosis, извлеченных из международных баз данных (National Center for Biotechnology Information и European Nucleotide Archive), позволил в результате применения опубликованного набора генотип-специфических маркеров (Merker et al., 2015; Shitikov et al., 2017) выявить характерную ветвь на филогенетическом древе, состоящую из 81 изолята Beijing САО. Идентификация сайтов интеграции элемента IS6110 в полных геномах для всех изученных штаммов была проведена с использованием программы ISMapper (Hawkey et al., 2015). В результате наложения выявленных локализаций элементов IS6110 на глобальное древо штаммов Beijing мы выявили инсерцию IS6110 специфическую для ветви Beijing САО и расположенную в межгенном участке между генами Rv1359 и Rv1360 в позиции 1531009 в геноме референтного штамма H37Rv (NC_000962.3 GenBank). Эта инсерция была выявлена только в геномах изолятов Beijing САО и для ее детекции нами были сконструированы праймеры и разработан способ с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции с последующим выявлением специфических продуктов ПЦР в агарозном гель-электрофорезе.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing.
Поставленная задача достигается выявлением специфической вставки элемента IS6110 в локусе генома Rv1359-Rv1360 с использованием ПЦР с тремя праймерами (5'-CGTACTCGACCTGAAAGACG, 5'-GGATGGTCCTTGCTGGGTG, 5'-GTATGAGCACAAGACACCGC), последующей оценкой результатов путем электрофореза продуктов ПЦР в горизонтальном агарозном геле и сравнения с маркером молекулярных масс и при амплификации фрагмента ДНК длиной 559 пн судят о принадлежности изолята Mycobacterium tuberculosis к Центрально-Азиатскому эпидемическому кластеру генотипа Beijing.
Преимущества предлагаемого способа: (1) быстрота (меньше одного дня от момента выделения ДНК); (2) простая и однозначная интерпретация результатов; (3) простое оборудование для стандартной ПЦР и агарозного гель-электрофореза; (4) возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к кластеру Beijing САО с диагностической целью и при популяционных исследованиях.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где Фиг. 1. Филогенетическое древо штаммов М. tuberculosis Восточно-Азиатской линии, построенное на основании полногеномных данных, с выделением Центрально-Азиатской/Российской сублинии и Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing (Beijing САО); Фиг. 2. Схема геномного локуса М. tuberculosis, содержащего элемент IS6110 специфический для Центрально-Азиатского эпидемического кластера генотипа Beijing (Beijing САО - Central Asia Outbreak) (приведено не в масштабе). Короткие стрелки обозначают положение праймеров. Фигурные скобки показывают продукты ПЦР, специфические для штамма Beijing САО (559 пн) и другого генотипа (275 пн); Фиг. 3. Агарозный гель-электрофорез продуктов ПЦР локуса Rv1359-Rv1360 штаммов М. tuberculosis.
Дорожки: 1-5, изоляты М. tuberculosis с интактным локусом Rv1359-Rv1360; 6-8, изоляты Beijing САО; М, маркер молекулярных весов Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder. Стрелки показывают продукты ПЦР, специфические для штамма Beijing САО (559 пн) и любого другого генотипа (275 пн).
Способ осуществляется следующим образом.
(1) Выделение ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. (1993): суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмоний-бромида. Полученный клеточный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ x1.
(2) Выявление Центрально-Азиатской/Российской сублинии генотипа Beijing (другое название - Beijing 94-32-кластер) проводят любым известным способом, например, методом сполиготипирования (Kamerbeek et al., 1994) для детекции генотипа Beijing, с последующим выявлением специфического полиморфизма в гене sigE (Mokrousov et al., 2018) или генотипирования по 24 локусам MIRU-VNTR (Supply et al., 2006). Дальнейший анализ проводят только для штаммов Центрально-Азиатской/Российской сублинии генотипа Beijing.
2
(3) Анализ фрагмента, специфического для генома штамма Beijing САО проводят с использованием мультиплексной ПЦР с праймерами Pr6110 (5'-CGTACTCGACCTGAAAGACG), PrF (5'-GGATGGTCCTTGCTGGGTG), PrR (5'-GTATGAGCACAAGACACCGC) (Фиг. 2). ПЦР проводят в термоциклере в 25 мкл (1 единица полимеразы Taq, 1,5 mM MgCl, по 15 пмоль каждого праймера) при следующем температурном режиме: 95°С, 2 мин, 40 циклов 95°С, 20 с, 63°С, 30 с, 72°С, 50 с и элонгация 72°С, 50 с. Продукты ПЦР (10 мкл) разделяют электрофорезом в 1,3% агарозном геле, окрашивают этидиумбромидом и визуализируют на УФ-трансиллюминаторе.
Оценка результатов. Анализ результатов проводится путем электрофореза продуктов ПЦР в горизонтальном агарозном геле и сравнения с маркером молекулярных масс (например, "100 bp ladder") (Фиг. 3). Для штаммов с интактным локусом генома Rv1359-Rv1360 характерна амплификация фрагмента длиной 275 пн праймерами PrF и PrR. Для штаммов с инсерцией IS6110 в данном локусе генома (т.е., для штамма Beijing САО) характерна амплификация фрагмента длиной 559 пн праймерами Pr6110 и PrR. Обязательная амплификация одного или другого продукта ПЦР является контролем качества: при отсутствии сигнала судят о деградированной ДНК или ингибировании реакции. При наличии одновременно двух продуктов амплификации судят о смеси штаммов (по причине лабораторной контаминации или реальной суперинфекции одного пациента двумя разными штаммами).
Примеры
Пример 1. Специфичность выявленной инсерции IS6110 как маркера генотипа Beijing САО была проверена посредством биоинформационного (in silico) анализа опубликованной коллекции 277 геномов изолятов Mycobacterium tuberculosis из Узбекистана (Merker et al., 2018). Файлы коротких нуклеотидных прочтений fastq были выровнены на полный геном референтного штамма H37Rv, для каждого штамма были получены файлы vcf, содержащие данные по однонуклеотидным полиморфизмам, и проведено картирование инсерций IS6110 в геномах штаммов. На основании полученных данных было построено филогенетическое древо, определены основные кластеры и их маркерные инсерций IS6110. Было выявлено 237 изолятов генотипа Beijing. Из них 173 изолята относились к кластеру Beijing САО и специфическая инсерция IS6110 в локусе генома Rv1359-Rv1360 была выявлена только у штаммов Beijing САО.
Пример 2. Анализ ДНК клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких на Северо-Западе России, Вьетнаме и Беларуси.
Способ выявления микобактерий туберкулеза кластера Beijing САО был апробирован на представительной и ранее охарактеризованной методами сполиготипирования и IS6110-RFLP типирования коллекции ДНК 188 штаммов М. tuberculosis различных генотипов. При этом все штаммы генотипа Beijing были типированы методом IS6110-RFLP или 24-локусного MIRU-VNTR-типирования, а штаммы других генотипов представляли различные генетические семейства (LAM, Haarlem, Т, Ural, X, EAI), установленные на основе сполиготипирования и детекции специфического маркера для выявления семейства LAM (мутация в гене Rv0129c).
Всего было проанализировано 275 штаммов (из них 155 штаммов генотипа Beijing). В результате, специфический продукт ПЦР длиной 559 пн, характерный для штамма Beijing САО, был выявлен у 7 штаммов (относившихся к Центрадьно-Азиатской/Российской ветви генотипа Beijing), что подтверждает наличие у них специфической инсерций IS6110, характерной для этого варианта М. tuberculosis. У остальных штаммов генотипа Beijing, а также всех остальных штаммов других генотипов был амплифицирован фрагмент длиной 275 пн, соответствующий интактному участку генома, не содержащему инсерцию IS6110. Одновременной амплификации двух продуктов ПЦР выявлено не было. Следует отметить, что все выявленные штаммы Beijing САО были устойчивы по крайней мере к двум противотуберкулезным препаратам, что подчеркивает клиническую значимость разработанного метода раннего выявления этого генотипа.
Пример 3. В исследование был включен 161 штамм М. tuberculosis, выделенный в Казахстане, по которым ранее были опубликованы профили сполиготирования и VNTR типирования (Skiba et al., 2015). На основании указанных маркеров, 93 штамма относились к генотипу Beijing, а из них 90 штаммов отнесены к ветви Beijing 94-32-кластер. Применение разработанного нами способа выявления микобактерий туберкулеза эпидемического кластера Beijing САО установило, что 61 штамм относился к Beijing САО. Этот результат согласуется с ожидаемым доминированием кластера Beijing САО в Казахстане, с учетом его географической и исторической близости к странам Средней Азии.
Список литературы
Hawkey J, Hamidian М, Wick RR, Edwards DJ, Billman-Jacobe H, Hall RM, Holt KE. 2015. ISMapper: identifying transposase insertion sites in bacterial genomes from short read sequence data. BMC Genomics 16:667.
Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, van Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Shaw R, Goyal M, van Embden J. 1997. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbio. 35:907-914.
Marais BJ, Victor TC, Hesseling AC, Barnard M, Jordaan A, Brittle W, Reuter H, Beyers N, van Helden PD, Warren RM, Schaaf HS. 2006 Beijing and Haarlem genotypes are overrepresented among children with drug-resistant tuberculosis in the Western Cape Province of South Africa. J Clin Microbiol 44:3539-3543.
Merker M, Barbier M, Cox H, Rasigade JP, Feuerriegel S, Kohl ТА, Diel R, Borrell S, Gagneux S, Nikolayevskyy V, Andres S, Nubel U, Supply P, Wirth T, Niemann S. 2018. Compensatory evolution drives multidrug-resistant tuberculosis in Central Asia. Elife 7:38200.
Merker M, Blin C, Mona S, Duforet-Frebourg N, Lecher S, Willery E, Blum MG,  S, Mokrousov I, Aleksic E,  C, Antierens A,  E, Ballif M, Barletta F, Beck HP, Barry CE 3rd, Bonnet M, Borroni E, Campos-Herrero I, Cirillo D, Cox H, Crowe S, Crudu V, Diel R, Drobniewski F, Fauville-Dufaux M, Gagneux S, Ghebremichael S, Hanekom M, Hoffner S, Jiao WW, Kalon S, Kohl ТА, Kontsevaya I,  T, Maeda S, Nikolayevskyy V, Rasmussen M, Rastogi N, Samper S, Sanchez-Padilla E, Savic B, Shamputa IC, Shen A, Sng LH, Stakenas P, Toit K, Varaine F, Vukovic D, Wahl C, Warren R, Supply P, Niemann S, Wirth T. 2015. Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat Genet 47:242-249.
Mokrousov I. 2013. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev 26:342-360.
Mokrousov I, Chernyaeva E, Vyazovaya A, Skiba Y, Solovieva N, Valcheva V, Levina K, Malakhova N, Jiao WW, Gomes LL, Suffys PN, Kutt M, Aitkhozhina N, Shen AD, Narvskaya O, Zhuravlev V. 2018. Rapid Assay for Detection of the Epidemiologically Important Central Asian/Russian Strain of the Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype. J Clin Microbiol 56(2). pii: e01551-17.
Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Otten T, Jiao WW, Gomes LL, Suffys PN, Shen AD, Vishnevsky B. 2012. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J Clin Microbiol 50:3757-3759.
Mokrousov I, Valcheva V, Sovhozova N, Aldashev A, Rastogi N, Isakova J. 2009. Penitentiary population of Mycobacterium tuberculosis in Kyrgyzstan: exceptionally high prevalence of the Beijing genotype and its Russia-specific subtype. Infect Genet Evol 9:1400-1405.
Mokrousov I, Vyazovaya A, Zhuravlev V, Otten T, Millet J, Jiao WW, Shen AD, Rastogi N, Vishnevsky B, Narvskaya O. 2014. Real-time PCR assay for rapid detection of epidemiologically and clinically significant Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype isolates. J Clin Microbiol 52:1691-1693.
Shitikov E, Kolchenko S, Mokrousov I, Bespyatykh J, Ischenko D, Ilina E, Govorun V. 2017. Evolutionary pathway analysis and unified classification of East Asian lineage of Mycobacterium tuberculosis. Sci Rep 7:9227.
Skiba Y, Mokrousov I, Ismagulova G, Maltseva E, Yurkevich N, Bismilda V, Chingissova L, Abildaev T, Aitkhozhina N. Molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population in Kazakhstan: a country-wide study. Tuberculosis (Edinb). 2015; 95:538-46.
Supply P, Allix C, Lesjean S, Cardoso-Oelemann M,  S, Willery E, Savine E, de Haas P, van Deutekom H, Roring S, Bifani P, Kurepina N, Kreiswirth B, Sola C, Rastogi N, Vatin V, Gutierrez MC, Fauville M, Niemann S, Skuce R, Kremer K, Locht C, van Soolingen D. 2006. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 44:4498-4510.