The perspectives of carbon nanotube usage as scaffold material in biological tissues

БИОМАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ

Перспективы использования углеродных нанотрубок в качестве каркасного материала в инженерии биологических тканей

И.И. Бобринецкий 1, Р.А. Морозов 1, А.С. Селезнёв 1, Р.Я. Подчерняева 2,

О.А. Лопатина 2

1 Московский государственный институт электронной техники (технический университет), Зеленоград, Москва

2 Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН,

Москва

The Perspectives of Carbon Nanotube Usage as Scaffold Material in Biological Tissues

I.I. Bobrinetskiy1, R.A. Morozov1, A.S. Seleznev1, R.la. Podcherniaeva2,0.A. Lopatina 2

1 Moscow Institute of Electronic Technology (Technical University), Zelenograd, Moscow

2 Research Institute of Virusology named after D.I. Ivanovskogo RAMN, Moscow

Целью работы является исследование биологической совместимости клеток и углеродных нанотрубок (УНТ) в процессе культивирования. Были использованы клетки линии Vero и УНТ различных производителей. По результатам исследования морфологии клеток показано, что при культивировании на модифицированных поверхностях образуется густой (плотный) клеточный монослой. В работе проведено комплексное исследование УНТ, модифицированных ими поверхностей и сформированных на них клеточных монослоев. В результате показано, что углеродные нанотрубки отечественного производства, зафиксированные на поверхностях, не обладают цитотоксичностью и могут быть использованы в качестве основы для культивирования клеток, а также в роли каркасного материала при тканевой инженерии.

Ключевые слова: биосовместимость, культивирование клеток, цитотоксичность, углеродные нанотрубки, клетки Vero.

The aim of the work is to research the biocompatibility of carbon nanotubes (CNT) and cells in the process of cultivation. Cell lines Vero and CNTs of different manufacturers were used. The cell morphology investigation demonstrate a dense cell monolayer formation during cultivation on modified surfaces. We made the complex research on CNT, modified surfaces and grown cells. In the result we show that domestic production nanotubes on surface are not cytotoxic and can be used as a basis for the cells cultivation, as well as a scaffold material for tissue engineering.

Key words: biocompatibility, cell cultivation, cytotoxicity, carbon nanotubes, Vero cells.

Введение

С развитием индустрии тканевой инженерии наряду с поиском новых биоматериалов ведется поиск новых инструментов контроля роста формируемых тканей. Углеродные нанотрубки — полые цилиндрические образования, диаметром единицы и десятки нанометров — могут являться перспективным каркасным материалам для проведения тканевой инженерии непосредственно в теле носителя. УНТ могут быть встроены в клеточный каркас, обеспечивая структурное упрочнение наряду с привнесением новых свойств, таких как электрическая проводимость, которая может быть использована для управления процессом роста клеток. В целом, УНТ могут выполнять интегральные функции как носителя, так и активного управляющего компонента при формировании тканей и органов [1]. В частности, большинство внеклеточных белков имеют волокнистую структуру, с диаметром волокон менее одного микрометра. Так,

e-mail: vkn@nanotube.ru

коллаген (наиболее распространенный белок соединительной ткани в теле животных) имеет диаметр волокон в диапазоне 50—500 нм, что сравнимо с диаметром углеродных нанотрубок [2]. Уникальные электрические свойства (высокая электропроводность), высокая механическая прочность, высокая гибкость и низкая плотность нанотрубок, позволяют создавать биосовместимые композитные материалы, обладающие новыми свойствами [3, 4], что определяет разработку синтетических биоматериалов для тканевой и клеточной инженерии, являющихся одним из ключевых факторов развития «Дорожной карты» регенеративной медицины [5].

На данный момент существует ряд работ, описывающих создание композитных материалов на основе нанотрубок для биоинженерии, в частности, для управления процессом регенерации костных и хрящевых тканей [6, 7]. Биоинженерия каркасного

материала на основе нанотрубок для роста тканей является основной тенденцией применения нанотрубок в хирургии и трансплантологии. В идеале, приемлемый каркасный материал для тканевой инженерии должен создавать благоприятное микроокружение клеток, обеспечивающее их пролиферацию и дифференциацию [2]. При этом регенерируемые ткани должны обладать всеми физиологическим функциями, которыми обладают ткани живого организма.

Существенный вопрос биологической совместимости нанотрубок касается их цитотоксичности [8, 9]. В общем случае, цитотоксичность определяется различными параметрами нанотрубок, такими как: их длина, присутствие металлических примесей, дисперсионное и агрегационное состояние, покрытие или функционализация, и другие [10]. Существенным прорывом в области взаимодействия нанотрубок и биологических объектов стало обнаружение окислительного ферментативного расщепления нанотрубок, позволяющего в течение восьми недель разложить нанотрубки с использованием естественных механизмов иммунной защиты человека [11].

Целью данного исследования является изучение биологической совместимости углеродных нанотрубок в культуре клеток. Решаются задачи разработки методик определения токсикологических параметров нанотрубок, исследования процесса формирования каркасного материала на основе углеродных нанотрубок и культивирования клеток на полученных каркасных структурах.

Материалы и методы

В качестве материала нанотрубок были использованы однослойные углеродные нанотрубки (ОСНТ) и многослойные углеродные нанотрубки (МСНТ) трёх крупнейших российских поставщиков. ОСНТ, полу-

ченные при дуговом процессе испарения графита, были предоставлены Институтом проблем химической физики РАН, г. Черноголовка [12]. ОСНТ, по оценке производителя имеют 95% чистоты, поставляется в виде бумаги, и по данным просвечивающей электронной микроскопии наблюдаются в виде пучков диаметром от 1 до 10 нм. Образец МСНТ № 1, полученный при каталитическом пиролизе углеводородов, предоставлен ООО «НТЦ «ГраНаТ», г. Электросталь. Образец МСНТ № 2, полученный при каталитическом пиролизе углеводородов, предоставлен ООО «НаноТехЦентр» (г. Тамбов) под торговой маркой «Материал углеродный наноструктурный «Таунит».

Исследования нанотрубок проводились методами растровой (РЭМ) и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) (рис. 1), атомно-силовой микроскопии (АСМ) — для выявления геометрических размеров и структуры; вторично-ионной масс-спектроскопии (ВИМС) — для определения концентрации и состава примесей, сорбометрии — для определения удельной поверхностной площади.

Измерение длины нанотрубок проводилось с использованием методов АСМ (Солвер-П47, ЗАО «Нанотехнологии-МДТ»). При этом нанотрубки растворялись в 2-пропаноле под действием ультразвука до образования коллоидной взвеси. Время, необходимое для растворения, зависело от степени агрегации нанотрубок: образец МСНТ № 2 растворялся за 30 мин, тогда как для растворения ОСНТ и МСНТ № 1 требовалось несколько часов. После растворения нанотрубки шприцом из раствора высаживались на кремниевую подложку микроэлектронной полировки (шероховатость 0,05 нм) и сканировались в по-луконтактном режиме АСМ. Отметим, что в случае наличия дефектов в нанотрубках, под действием

Рис. 1. Образцы углеродных нанотрубок: А, Б - ОСНТ; В, Г - МСНТ № 1; Д, Е - МСНТ № 2.

(А, В, Д - РЭМ изображения; Б, Г, Е - ТЭМ изображения).

На рис. 1Б слева направо проходит пучок ОСНТ диаметром 7 нм. Маркер: А, В, Д - 100 нм; Б, Г - 20 нм; Е - 50 нм

ультразвука может происходить их разламывание и укорачивание. В частности, при длительном воздействии на МСНТ № 2, состоящем из смеси нанотрубок и нановолокон, происходило разрушение последних до аморфного состояния.

Измерения удельной поверхности проводились для нанотрубок МСНТ на анализаторе удельной поверхности «Сорбометр-М», в качестве газа-адсор-бата использовался азот (р/р0 = 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; р0 = 757 мм. рт. ст.), в качестве газа-носителя гелий. Измерялся объем азота, адсорбированного на поверхность УНТ при Т = 77 К, и десорбированного при нагревании до 173 К.

Исследования примесного состава нанотрубок проводились на вторично-ионном масс-спектрометре IMS4f (САМЕСА, Франция).

Для роста клеток были использованы покровные стекла размером 24x24 мм2, толщиной 0,13— 0,17 мм. Стекла отмывались в 2-пропаноле механически и в ультразвуковой ванне (УЗ) в течение 15 мин (частота 35 кГц, мощность 75 Вт). 10 мкг нанотрубок растворялось в 5 мл 2-пропанола при УЗ обработке продолжительностью 10 ч. Раствор нанотрубок наносился на поверхность стекла методом многократного вытягивания подложек из раство-

ра до уменьшения прозрачности стекла на ~30% (контролировалось визуально). Далее образец высушивали в потоке теплого воздуха и отжигался при 500°С в течение 2 мин. Часть покровных стекол отдавалась на проведение АСМ — контроля качества нанесения нанотрубок на поверхность (рис. 2). Нанотрубки на поверхности стёкол сформировали плёнки различной пористости.

Процесс культивирования клеток на нанотрубках проводился на модели нормальной перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки (Vero), обладающей активной пролиферацией и высокой жизнеспособностью. Клетки Vero культивировали на питательной среде Игла МЕМ с добавлением 10% телячьей сыворотки (ЭТС) (ООО «НПО «ПанЭко», г. Москва) с посевной дозой 100 000 кл/мл.

Культивирование клеток проводили в сосудах объемом 10 мл, в которые помещали покровные стекла и инкубировали в термостате при t = 37°С и 5% СО2 в течение 72 ч. После образования монослоя на покровных стеклах клетки фиксировали в течение 20 мин в 70% спирте. Затем пробы окрашивали азур-эозином по Романовскому в течение 10—15 мин на воздухе, ополаскивали водопроводной водой, высушивали и заключали в канадский бальзам.

0 5 10 15 20 25 30

А jm

О 5 10 15 20 25 30 35 АО 45

В jm

Рис. 2.

АСМ-изображения нанотрубок на поверхности покровных стёкол: А - ОСНТ; Б - МСНТ № 1; В - МСНТ № 2

Результаты исследований

При проведении микроскопических исследований в образце ОСНТ обнаружены пучки одностенных углеродных нанотрубок с поперечным размером 1—10 нм (рис. 1А, Б) что соответствует ~1—20 одиночных ОСНТ. Диаметр ОСНТ в среднем 1,2—1,3 нм. Образец МСНТ № 1 содержит нанотрубки с несколькими слоями диаметром от 4 до 9 нм (рис. 1В). Некоторые трубки прямые с постоянным внешним и внутренним диаметром и внутренним каналом, а некоторые с изломами, искривлениями и изменяющимся диаметром. Стенки трубок в основном имеют небольшую толщину относительно внешнего диаметра трубок (см. рис. 1Г). Образец МСНТ № 2 имеет достаточно большое количество сильно искривленных (дефектных) нанотрубок (см. рис. 1Д) длиной от 0,2 до 5 мкм и волокон с коническими стенками, как с каналом, так и без него (см. рис. 1Е). Диаметр структур от 15 до 50 нм. Также имеются внутренние перемычки. На некоторых волокнах имеются каталитические частицы (как на окончаниях, так и отдельно от МСНТ) с различными размерами (8—20 нм).

Значения удельной поверхности, рассчитанные по методу Брунауэра — Эммета — Тейлора, а также геометрические размеры нанотрубок приведены в таблице 1.

Результаты исследований примесного состава нанотрубок приведены в таблице 2.

Обращает на себя внимание чрезвычайно сильная загрязнённость всех материалов, что может быть связано с наличием остаточных примесей от предыдущих процессов отработки технологии в реакторных камерах. Судя по процентному составу, рост нанотрубок осуществлялся на катализаторе, содержащем железо, и в случае МСНТ № 2 — с добавлением никеля. В случае МСНТ № 1 носителем катализатора являлся молибден. В спектре ОСНТ ярко выражены

серии пиков, соответствующих иттрию и титану. Это свидетельствует о том, что иттрий и титан были использованы в технологическом процессе в качестве носителей катализатора.

Было исследовано 3 варианта подготовленных подложек с углеродными нанотрубками: ОСНТ,

МСНТ № 1, МСНТ № 2. Покровные стекла с нанотрубками помещали в стеклянные культуральные сосуды и стерилизовали в автоклаве при температуре 120°С, 1 атмосфере 20 мин, с последующим внесением клеток Vero в концентрации 100 000 кл/мл. Культивирование проводили в термостате в течение 72 ч, затем покровные стекла были извлечены, фиксированы и окрашены для морфологического исследования.

В контроле культура клеток Vero состояла из эпи-телиоподобных и полигональных клеток. Ядра округлые, ядрышки крупные по 1—2 в ядре. Иногда встречались многоядерные клетки. Изучение морфологии клеток Vero на нанотрубках показало, что на образце ОСНТ наблюдается плотный слой клеток (рис. 3А). Клетки и ядра разноразмерные по величине, имеются скопления клеток, цитоплазма зернистая. На образце МСНТ № 1 образуется клеточный монослой с овальными ядрами и с одним ядрышком (рис. 3Б). Величина ядер разная. Местами скопления темных гранул, иногда в виде шаров. На образце МСНТ № 2 — клеточный монослой неравномерный, в основном более редкий. Видны темные частицы в виде отдельных образований, редко небольшие скопления, цитоплазма зернистая.

Из представленных данных видно, что при использовании ОСНТ отмечен более активный рост клеток с образованием плотного клеточного монослоя. Все варианты подложек с углеродными нанотрубками не токсичны и могут быть использованы для культивирования клеток.

Таблица 1. Результаты измерений диаметров и удельной поверхности УНТ

Образец ОСНТ МСНТ №1 МСНТ №2

Средний диаметр, нм 2,9±1,5* 4,9±0,5 36,0±6,0

Длина, нм 570±158 475±120 1203±400

Удельная поверхность, м2/г - 526,019 117,256

Средняя стоимость, руб./грамм 30 000 590 100

Примечание: * — диаметр пучков, измеренный по данным АСМ.

Таблица 2. Концентрации некоторых примесей в образцах УНТ, исследованных методом ВИМС

Образец Концентрация примесей, ppm

Fe Ni Co Y Mo Ti Cr

ОСНТ 3800 * - 2290 - 140000 -

МСНТ № 1 3500 <40 750 <3 1200 - -

МСНТ № 2 3400 3700 - - - - 83

Примечание: * — прочерк в ячейке означает, что в образце концентрация данной примеси не измерялась.

В

Рис. 3

Культура клеток Vero на покровных стеклах, модифицированных различными типами нанотрубок: А - ОСНТ; Б - МСНТ № 1; В - МСНТ № 2.

Ув.: А - х200; Б, В - х400.

Окраска: азур-2-эозином по Романовскому

Обсуждение результатов

Полученные плотные монослои клеток линии Vero на всех типах нанотрубок свидетельствуют о низкой роли примесного состава, а также геометрии на процесс образования клеточного монослоя. Исключение составляют однослойные нанотрубки, которые привели к формованию более плотных монослоев по сравнению с МСНТ, и позволили образовать многослойную структуру. Данный результат входит в противоречие с результатами работ [13], демонстрирующими более высокое негативное влияние на рост клеток однослойных нанотубок. При этом в [13] была выявлена прямо пропорциональная зависимость между потенциальным токсичным эффектом и удельной поверхностью нанотрубок, что связано с возможностью большего накопления нанотрубками в своём составе токсичных материалов. Отметим, что теоретические оценки удельной поверхности ОСНТ превышают МСНТ и могут составлять от 1500 до 3200 м2/г [14].

В общем случае, токсичность самих нанотрубок рассматривается, как способность нанотрубок проникать сквозь липидно-пептидную мембрану и приводить к разрушению клеток или отдельных органелл. Полученные результаты, демонстрируют низкую токсическую активность нанотрубок, представленных в виде каркасных структур, на которых происходит рост клеток. Данный результат коррелирует с результатами последних работ по сравнению токсического эффекта нанотрубок в виде организованного на

носителе каркаса и нанотрубок, находящихся в растворе в виде коллоида, когда последние обладают более ярко выраженным токсическим эффектом [10]. Данный результат может быть связан с большими силами взаимодействия нанотрубок с подложкой, составляющими величину порядка десятков и сотен наноньютонов [15]. При этом сила связи с подложкой тем выше, чем меньше диаметр нанотрубок. В связи с этим нанотрубке энергетически не выгодно разрывать связь со своим носителем. Вследствие этого, следует ожидать меньшего токсического эффекта со стороны ОСНТ на носители, по сравнению с МСНТ. Тем не менее, ускорение роста клеток на ОСНТ также не является очевидным и требует проведения дополнительных исследований.

Выводы

Исследование нанотрубок показало, что они обладают изначально различной структурой, геометрией и примесным составом. Более того, нанотрубки одного типа и полученные по одному методу (химического осаждения из газовой фазы), могут существенно различаться как по своим размерам, так и по структуре. Промышленное производство нанотрубок вносит в их состав огромное количество дефектов и примесей, роль которых может быть неоднозначна в процессе инженерии биологических тканей и последующем их функционировании. Вследствие этого, на данном этапе технологии производства нано-

трубок требуется тщательный входной контроль всех параметров при производстве каркасного материала, что в некоторой степени является ресурсоёмким.

В работе было продемонстрировано, что углеродные нанотрубки отечественного производства, закреплённые на поверхности подложки, не обладают токсичными свойствами и могут быть использованы для культивирования клеток. Тип нанотрубок, их структура и размер не оказывают значительного влияния на рост клеток. Однослойные нанотрубки

ЛИТЕРАТУРА:

1. Harrison B.S., Atala A. Carbon nanotube applications for tissue engineering. Biomaterials. 2007; 28tII): 344—53.

2. Ma P.X. Biomimetic materials for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008; 60(2): 184-98.

3. Dresselhaus M.S., Dresselhaus G., Avouris P. (Eds.) Carbon nanotubes: synthesis, structure, properties and applications. Berlin: Springer-Verlag; 2001: 448.

4. Харрис П. Углеродные нанотрубы и родственные структуры. Новые материалы XXI века. М.: Техносфера; 2003: 335.

5. Васильев А.В., Батин М. «Дорожная карта» регенеративной медицины. Клет. Транспл. Тканев. Инжен. 2010; 5(II): 89-90.

6. Zanello L.P., Zhao B., Hu H. Bone oeli proliferation on carbon nanotubes. Nano Lett. 2006; 6(III): 562-67.

7. Бобринецкий И.И., Агеева С.А., Неволин В.К. и соавт. Объемный альбуминовый композит на основе нанотрубок, получаемый действием непрерывного лазерного излучения. Известия ВУЗов. Электроника 2008; 5: 33-40.

8. Smart S.K., Cassady A.I., Lu G.Q., Martin D.J. The biocompatibility of carbon nanotubes. Carbon. 2006; 44: 1034-47.

вызывают более интенсивный рост клеток, по сравнению с многослойными.

Выражаем благодарность к.ф.-м.н. Артемову В.В. и к.ф.-м.н. Григорьеву Ю.В. (ИК РАН) за проведение ТЭМ и РЭМ исследований, Бессоновой А.В. (МИЭТ) за проведение измерения адсорбционных свойств нанотрубок.

Работа выполнена при проведении НИР в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (гос. контракт № П979).

9. Muller J., Huaux F., Lison D. Respiratory toxicity of carbon nanotubes: How worried should we be? Carbon. 2006; 44: 1048-56.

10. Hussain M.A., Kabir M.A., Sood A.K. On the cytotoxicity of carbon nanotubes. Current science. 2009; 96(5): 664-73.

11. Allen L.B ., Kotchey G.P., Chen Y. et al. Star mechanistic investigations of horseradish peroxidase-catalyzed degradation of single-walled carbon nanotubes. J. Am. Chem. Soc. 2009; 131:17194-205.

12. Крестинин А.В. Однослойные углеродные нанотрубки: механизм образования и перспективы технологии производства на основе электродугового процесса. Российский химический журнал 2004; 48(V): 21-7.

13. Furong T., Daxiang C., Heinz S. et al. Cytotoxicity of singlewall carbon nanotubes on human fibroblasts. Toxicol. In Vitro 2006; 20(VII): 1202-12.

14. Елецкий А.В. Сорбционные свойства углеродных наноструктур. Успехи физических наук 2004; 174(11): 1191-231.

15. Бобринецкий И.И., Неволин В.К. Микромеханика углеродных нанотрубок на подложках. Микросистемная техника 2002; 4: 20-1.

Поступила 14.10.2010