Способ прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте
METHOD OF LIFE-TIME MICROSTRUCTURE EVALUATION OF TUMOUR TISSUE IN EXPERIMENT

Предлагаемое изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности, может быть использовано для мониторинга эффективности противоопухолевой терапии опухолей с помощью метода компрессионной оптической когерентной эластографии (ОКЭ), основанного на определение модуля упругости ткани (модуля Юнга).
В настоящее время золотым стандартом для оценки ответа опухоли на лечение принято считать критерии классификации RECIST, которые основаны на определении изменений размеров опухоли (Kang H., et al. / Imaging-based tumor treatment response evaluation: review of conventional, new, and emerging concepts // Korean J Radiol 13, 371-390, 2012). Данная классификация разработана для оценки реакции опухоли на производимую цитотоксическую терапию, направленную на подавление клеточного деления (Eisenhauer E.A., et al. / New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1) // Eur J Cancer 45, 228-247, 2009). Однако применение новых методов противоопухолевой терапии требует новых способов оценки опухолевого ответа, включающих получение информации об изменениях гистологической микроструктуры опухолевой ткани, её биологических и физиологических процессах.
Экспериментальные прививаемые опухоли животных служат объектом для испытаний эффективности действия новых препаратов и возможностей новых методов визуализации. Микроструктура таких опухолей представляет собой скопление клеток разной степени дифференцировки, характеризующихся высоким полиморфизмом. При цитотоксическом воздействии на опухоль возникают различного рода повреждения клеток, приводящие к их гибели и образованию участков некроза. Такие процессы существенно изменяют микроструктуру и механические свойства опухолевой ткани. Согласно доклиническим исследованиям эффективности действия противоопухолевой химиотерапии, научно доказано возникновения различного рода патоморфологических изменений микроструктуры опухоли.
Известен способ прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте с помощью компрессионной оптической когерентной эластографии ткани, характеризующийся высокой разрешающей способностью, позволяющей различать небольшие скопления клеток и различные элементы ткани (A.A. Plekhanov et al. / Optical coherence elastography as a new method for estimation of chemotherapy efficacy on triple-negative breast cancer in the experiment // Proc. SPIE 11065, 1106506, 2019). Способ осуществляют следующим образом: в эксперименте на мышах с трансплантируемой опухолью на наружной части ушной раковины проводят эластографическое исследование в центре опухоли, используя скоростной спектральный оптический когерентный томограф с длиной волны зондирующего излучения 1300 нм, глубиной  сканирования до 1,2 мм в ткани, временем получения ОКЭ-изображения 50 секунд, сравнивают полученное ОКЭ-изображение с гистологическим изображением той же зоны интереса, визуально определяют распределения значений жёсткости, характерных для каждой микроструктуры.
Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, для дифференцировки 3-х и более различных микроструктур он весьма субъективен, поскольку объективных критериев значений жёсткости для разных микроструктур нет, и каждый исследователь может относить зоны отёка опухоли к некротическим участкам опухоли, зоны дистрофичных опухолевых клеток к зонам отёка опухоли, а зоны жизнеспособной ткани опухоли к зонам дистрофичных опухолевых клеток. Во-вторых, он не даёт количественной информации об особенностях микроструктуры ткани в области интереса.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа in vivo оценки различных микроструктур опухолевой ткани в эксперименте с помощью применения технологии компрессионной ОКЭ лишенного недостатков прототипа.
Техническим результатом является повышение точности оценки обнаружения различных микроструктур опухоли, устранение субъективности, получение количественной оценки особенностей микроструктуры ткани в области интереса.
Технический результат достигается тем, что в способе прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте, включающем проведение эластографического исследования в центре опухоли, получение ОКЭ-изображений и их анализ, производят сегментацию ОКЭ-изображений, выделяя жизнеспособные опухолевые клетки при жёсткости в диапазоне от 621 до 2000 кПа, дистрофичные опухолевые клетки при жёсткости в диапазоне от 411 до 620 кПа, отек опухолевой ткани при жёсткости в диапазоне от 231 до 410 кПа, некроз опухолевой ткани при жёсткости в диапазоне от 100 до 230 кПа, рассчитывают относительные к общей площади ОКЭ-изображения площади сегментов.
Способ осуществляют следующим образом:
В эксперименте на мышах с трансплантируемой опухолью на наружной части ушной раковины в центральной её части, проводят ОКЭ-исследования, используя скоростной спектральный оптический когерентный томограф с функцией эластографии, с длиной волны зондирующего излучения 1300 нм, пространственным разрешением 10-15 мкм, глубиной сканирования до 1,2 мм в ткани, время получения ОКЭ-изображения 50 секунд. Экспериментальное животное наркотизируют. Затем ухо с опухолью плотно фиксируют на подложке. Далее на поверхности опухоли размещают калибровочный силиконовый слой с заведомо изученным показателем жёсткости (100 кПа); опухоль смачивают 0,9% раствором NaCl для препятствия слипания поверхности опухоли и калибровочного слоя. 0,9% физиологическим раствором также смачивают поверхность силикона. Зонд оптического когерентного томографа размещают и прижимают к поверхности силикона и опухоли. Запускают запись в режиме эластографии и производят компрессию ОКТ-зондом на подлежащие калибровочный слой и опухолевую ткань. По истечению 50 секунд получают файл с ОКЭ-изображением в области интереса опухоли. Выполняют построение сегментированного ОКЭ-изображения при котором каждый пиксель (элемент разрешения) на эластографическом изображении окрашивают в заданный для определённого диапазона значений жёсткости цвет, соответствующий определённой морфологической структуре: пиксели в диапазоне жёсткости от 621 до 2000 кПа окрашивают в цвет 1 (например, синий) и определяют топографию скоплений жизнеспособных опухолевых клеток, пиксели в диапазоне жёсткости от 411 до 620 кПа окрашивают в цвет 2 (например, голубой) и определяют топографию скоплений дистрофичных опухолевых клеток, пиксели в диапазоне жёсткости от 231 до 410 кПа окрашивают в цвет 3 (например, жёлтый) и определяют топографию опухолевой ткани в состоянии отёка, и пиксели в диапазоне жёсткости от 100 до 230 кПа окрашивают в цвет 4 (например, красный) и определяют топографию опухолевой ткани в состоянии некроза. Рассчитывают значения относительных площадей каждой микроструктуры, где значение относительной площади каждой микроструктуры определено как частное между количеством пикселей, отнесённых к данной микроструктуре, и общего количества пикселей на ОКЭ изображении.
Предлагаемый способ использован в оценке эффективности противоопухолевой терапии антиангиогенного и цитотоксического действия. Предлагаемым способом исследовано 36 животных – самки линии Balb/c с привитым на ухо раком молочной железы мышей 4Т1 в дозе 200 тыс. клеток в 20 мкл буферного раствора PBS. Для подтверждения полученных методом ОКЭ результатов исследуемые опухоли подвергались гистологическому исследованию. Предварительно каждая зона интереса опухолей помечалась гистологической краской, для последующего ориентирования ОКЭ изображений. Помеченные участки опухолей, окрашенные гематоксилином и эозином, прицельно сопоставлялись с полученными ОКЭ изображениями. Площадь каждой микроструктуры, детектируемой в зоне интереса гистологического изображения, выделялась в программе QuPath software (v0.1.2). Затем вычислялись значения площадей детектируемых в опухолях микроструктур по отношению к полной области интереса. Такие относительные значения площадей каждой микроструктуры, определённые методом ОКЭ и гистологическим исследованием, сравнивались. Была установлена высокая корреляция значений для областей жизнеспособных опухолевых клеток (r=0,98), дистрофичных опухолевых клеток (r=0,94), отёка (r=0,97) и некроза (r=0,97), опухолевой ткани.
Примеры конкретного использования предлагаемого способа
Пример 1.
Выписка из протокола эксперимента № 39.
3
Самка мышей линии Balb/c № 16, контрольной группы, масса 21,0 г с привитой внутрикожно опухолевой моделью рака молочной железы мыши (4Т1). Прививку опухоли проводили тонкой иглой 32G (0,23х12мм) путем вкола суспензии культуры опухолевых клеток в дозе 200 тысяч клеток в 20 мкл среды PBS на наружной поверхности ушной раковины в центральной её части. ОКЭ исследование на 9 день роста опухоли, когда её объём составил 16,7 мм. Зона интереса отмечена гистологической меткой и опухоль отправлена на гистологическое исследование. Проведено прицельное сопоставление области интереса на гистологическом изображении (фиг. 1а) и соответствующем несегментированном ОКЭ-изображении (фиг. 1б). ОКЭ изображение, используемое в прототипе, не позволило точно определить границы жизнеспособных и дистрофичных опухолевых клеток и определить площади микроструктур. На полученном сегментированном ОКЭ изображении опухоли (фиг. 1в) чётко видны граница и топография жизнеспособных и дистрофичных опухолевых клеток. Значения площадей микроструктур, полученные предложенным методом и гистологическим исследованием в высокой степени схожи - гистологическим исследованием установлена площадь жизнеспособных опухолевых клеток 95% и дистрофичных опухолевых клеток 5%; ОКЭ исследованием установлена площадь жизнеспособных опухолевых клеток 93% и дистрофичных опухолевых клеток 7%. Наблюдалась стремительно-растущая жизнеспособная опухоль высокой степени злокачественности, о чём свидетельствуют слабо выраженные альтеративные изменения микроструктуры (области дистрофичных клеток).
Следует отметить, что на сегментированном ОКЭ-изображении был обнаружен обособленный участок дистрофичных опухолевых клеток, однако при первичном изучении области интереса на гистологическом изображении данный участок не был обнаружен. Для исключения артефакта было проведено повторное гистологическое обследование данного среза и обнаружен участок дистрофичных опухолевых клеток с чёткой топографией, изображённый на фигуре 1г.
Пример 2.
Выписка из протокола эксперимента № 39.
3
Самка мышей линии Balb/c № 13, группы антиангиогенной терапии препаратом Бевацизумаб, масса 23,0 г с привитой внутрикожно опухолевой моделью рака молочной железы мыши (4Т1). Прививку опухоли проводили как описано в примере 1. Сеансы терапии включали в себя внутрибрюшинные инъекции препарата Бевацизумаб в дозе 15 мг/кг на 2, 4 и 7 дни после привития опухоли. ОКЭ исследование на 9 день роста опухоли, когда её объём составил 12,3 мм. Зона интереса отмечена гистологической меткой и опухоль отправлена на гистологическое исследование. Проведено сопоставление области интереса на гистологическом изображении (фиг. 2а) и соответствующем сегментированном ОКЭ-изображении (фиг. 2б), на котором чётко видна топография жизнеспособных и дистрофичных опухолевых клеток, областей отёка и некроза ткани. Значения площадей микроструктур, получаемые методом ОКЭ и гистологическим исследованием в высокой степени схожи – гистологическим исследованием установлены значения для жизнеспособных опухолевых клеток 19%, для дистрофичных опухолевых клеток 9%, для отёка опухолевой ткани 71%, для некроза опухолевой ткани 1%; ОКЭ исследованием установлены значения для жизнеспособных опухолевых клеток 18%, для дистрофичных опухолевых клеток 14%, для отёка опухолевой ткани 67%, для некроза опухолевой ткани 1%. Наблюдалась опухоль с явлениями лечебного патоморфоза после антиангиогенного воздействия – обширные отёки ткани, участки дистрофичных клеток и слабо детектируемый некроз опухолевой ткани.
Пример 3.
3
Выписка из протокола эксперимента № 40. Самка мышей линии Balb/c № 15, группы цитотоксической терапии препаратом Цисплатин, масса 22,8 г с привитой внутрикожно опухолевой моделью рака молочной железы мыши (4Т1). Прививку опухоли проводили как описано в примере 1. Сеансы терапии включали в себя внутрибрюшинные инъекции препарата Цисплатин в дозе 6 мг/кг на 2, 4 и 7 дни после привития опухоли. ОКЭ исследование на 9 день роста опухоли, когда её объём составил 11,2 мм. Зона интереса отмечена гистологической меткой и опухоль отправлена на гистологическое исследование. Проведено сопоставление области интереса на гистологическом изображении (фиг. 3а) и соответствующем сегментированном ОКЭ-изображении (фиг. 3б), на котором чётко видна топография жизнеспособных и дистрофичных опухолевых клеток, областей отёка и некроза ткани. Значения площадей микроструктур, получаемые методом ОКЭ и гистологическим исследованием в высокой степени схожи – гистологическим исследованием установлены значения для жизнеспособных опухолевых клеток 23%, для дистрофичных опухолевых клеток 30%, для отёка опухолевой ткани 13%, для некроза опухолевой ткани 34%; ОКЭ исследованием установлены значения для жизнеспособных опухолевых клеток 21%, для дистрофичных опухолевых клеток 32%, для отёка опухолевой ткани 15%, для некроза опухолевой ткани 32%. Наблюдаем опухоль с явлениями лечебного патоморфоза после цитотоксического воздействия – преобладание зон дистрофичных опухолевых клеток над участками жизнеспособных клеток, слабый отёк и чётко различимые участки некроза опухолевой ткани.
Предлагаемый способ прижизненной оценки микроструктуры опухолевой ткани в эксперименте является надежным, объективным и позволяет в режиме реального времени по изменению жёсткости детектировать топографию микроструктур опухолевой ткани, возникших после проведения химиотерапии, что позволит неинвазивно мониторировать состояние и структуру изучаемых опухолей, определять эффективность и корректировать производимую терапию.
Предлагаемый способ может быть применен для определения эффективности и подбора доз химиотерапевтических препаратов, а также для определения эффективностей других типов противоопухолевой терапии, влияющей на структуру ткани (фотодинамической, лучевой и иммунотерапии), для разных опухолевых моделей в эксперименте.
Значения относительных значений площадей различных микроструктур опухолей в высокой степени схожи при определении методом ОКЭ и гистологическим методом. Предлагаемый способ может быть применен для определения эффективности и подбора доз терапевтических препаратов, а также для определения эффективностей других типов противоопухолевой терапии, влияющей на структуру ткани (фотодинамической, лучевой и иммунотерапии), для разных опухолевых моделей в эксперименте.