СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ/АНТИГЕНОВ ВИРУСОВ
METHOD FOR ELECTROCHEMICAL IMMUNOASSAY FOR DETECTING VIRUSES/VIRAL ANTIGENS

Заявляемое изобретение относится к биологи и медицине, а именно к иммуноанализу, в частности к электрохимическим способам определения содержания вирусов/антигенов вирусов в различных объектах и может быть использовано для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний.
Недостатками используемых в настоящее время способов иммуноанализа являются: необходимость создания специальных условий для их проведения, например способы анализа, основанные на полимеразной цепной реакции, а также высокая стоимость используемых реагентов и оборудования, например иммуноферментный анализ.
Из уровня техники известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях, испускающими долгоживущую флуоресценцию, добавление к смеси микрочастиц исследуемого образца и биоспецифического проявляющего реагента, меченного детектирующим флуорохромом, проведение реакции для образования биоспецифических комплексов, возбуждение флуорохромов и измерение в режиме временного разрешения количества долгоживущей эмиссии флуоресценции для идентификации категорий микрочастиц и количества эмиссии флуоресценции детектирующего флуорохрома для измерения количества искомых аналитов, при этом образовавшиеся биоспецифические комплексы осаждают на твердосплавный носитель, эмиссию флуоресценции всех флуорохромов возбуждают источниками излучения в двух спектральных диапазонах, для мечения биоспецифического проявляющего реагента используют детектирующий флуорохром с короткоживущей флуоресценцией, область возбуждения и эмиссии флуоресценции которого находится вне областей возбуждения и эмиссии флуоресценции флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией, при этом соотношение концентраций флуорохромов с долгоживущей флуоресценцией в микрочастицах для определения одного вида аналита постоянно, а для определения разных видов аналитов соотношение концентраций различается по крайней мере в два раза (см. патент РФ №2379691 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц», дата приоритета 07.07.2008 г., опубликовано 20.01.2010 г.)
Недостатки способа обусловлены необходимостью многостадийного проведения процесса, а также сложностью получения аналитического сигнала.
2
Известен способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий нанесение на поверхность пористой мембраны реакционной смеси, содержащей аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубирование смеси для образования биоспецифического комплекса, отмывание реакционной смеси от несвязавшихся реагентов и детектирование аналита в образце по световому сигналу детектирующего вещества, связанного с биоспецифическим комплексом, при этом используют, по крайней мере, два вида специфичных к искомым аналитам первых и вторых связывающих молекул, при этом каждый вид тех и других молекул специфичен только к одному искомому аналиту, каждый вид первой связывающей молекулы связан, по крайней мере, с двумя длительно люминесцирующими детектирующими веществами, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному искомому аналиту, регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах эмиссии детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ, и определяют искомый аналит по соотношению фосфоресцентных сигналов, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ (µ) определяют из следующего соотношения:
2
Δ≤S/10Nµ, где
2
S - площадь адсорбции частиц на мембране, µ;
N - заданное число латексных частиц в анализируемой пробе (см. патент РФ №2339953 на изобретение «Способ многоаналитного иммуноанализа с использование микрочастиц», дата подачи 13.06.2007 г., опубликовано 27.11.2008 г).
Данный способ позволяет обнаружить и количественно детектировать низкие концентрации биологических аналитов в пробах при проведении исследований на твердой поверхности. Необходимость использования мембраны предъявляет высокие требования к составу пробы.
Недостатками способа являются необходимость многостадийного проведения процесса, а также сложность получения аналитического сигнала.
Наиболее близким техническим решением к заявляемому изобретению, выбранным в качестве прототипа, является способ, осуществляемый с использованием электрохимического иммуносенсора, разработанного для обнаружения поверхностного антигена гепатита В. Сначала биотинилированные антитела к гепатиту В иммобилизируются на покрытых стрептавидином магнитных наночастицах. Затем добавляют антиген гепатита вируса B и после этого этапа вводят вторичные антитела, конъюгированные с сигналообразующей меткой, в качестве которой используют пероксидазу хрена. В результате происходит образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич». После этого добавляют рабочий субстрат, в качестве которого применяют буферный раствор Бриттона-Робинсона,содержащий перекись водорода и ортоаминофенол, при этом пероксидаза хрена катализирует окисление аминофенола до 3-аминофеноксазона. Затем берут аликвоту пробы, переносят ее в электрохимическую ячейку и регистрируют циклическую вольтамперограмму. Величина тока пика окисления пропорциональна количеству 3-аминофеноксазона, которое, в свою очередь, пропорционально содержанию меченных пероксидазой хрена «сэндвич»-структур, а следовательно, и содержанию антигена вируса гепатита В. Данный способ иммуноанализа позволяет определить от 0,001 до 0,015 нг/мл антигена, предел обнаружения 0,9 мкг/мл при отношении сигнал/шум 1/3 (см. Magnetic nanoparticle-based immunosensor for electrochemical detection of hepatitis В surface antigen / Sara Nourani, Hedayatollah Ghourchian, Seyed Mehdi Boutorabi // Analytical Biochemistry, 2013, V.441, P.1-7).
К недостаткам данного способа следует отнести многостадийность процесса анализа (предварительное биотинилирование антител, конъюгация антител с пероксидазой хрена), высокую трудоемкость процесса, большие временные затраты, а также высокие требования, предъявляемые к квалификации специалистов-операторов.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое к защите техническое решение, является упрощение процесса анализа, увеличение экспрессности и воспроизводимости.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляемый способ электрохимического иммуноанализа для определения вирусов/антигенов вирусов, включающий образование иммунокомплекса по схеме «сэндвич» между антителами и вирусом/антигеном вируса с последующим присоединением конъюгата антител с сигналообразующей меткой с целью определения наличия и концентрации вируса/антигена вируса путем получения электрохимического отклика за счет использования сигналообразующей метки, входящей в состав «сэндвич»-структуры, согласно изобретению в качестве сигналообразующей метки используют магнитные нанокомпозитные частицы, которые перед стадией образования иммунокомплекса получают путем создания на поверхности магнитных наночастиц оксида переходного металла оксидкремниевого покрытия с последующим получением конъюгата с антителами, при этом формирование иммунокомплекса (антитело - вирус/антиген вируса - антитело с сигналообразующей магнитной меткой) осуществляют путем его концентрирования на твердофазном химически инертном носителе за счет воздействия магнитным полем с последующим изъятием этого иммунокомплекса из среды, сформированной на носителе, а определение наличия и концентрации вируса/антигена вируса осуществляют по сигналу, генерируемому ионами переходного металла, образующимися в результате кислотной обработки иммунокомплекса, при этом в качестве переходного металла используют железо, а в качестве твердофазного химически инертного носителя - толстопленочный графитсодержащий электрод.
Для обеспечения взаимодействия между магнитными наночастицами и антителами магнитные наночастицы могут быть модифицированы аминопропилтриэтоксисиланом, формируя, тем самым, оксидкремниевое покрытие.
Для кислотной обработки, способствующей химическому разрушению иммунокомплекса, используют смесь азотной и серной кислот.
Время образования иммунокомплекса значительно сокращается за счет применения магнитного концентрирования иммунокомплекса на твердофазном носителе, что, в свою очередь, позволяет ускорить процедуру иммуноанализа. Кроме того, увеличивается чувствительность.
3+
Концентрацию вируса/антигена вируса определяют путем получения электрохимического отклика регистрируемого от ионов Fe, полученных в результате кислотной обработки углеродной подложки с иммобилизированным иммунокомплексом.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примере конкретного осуществления.
Заявляемое изобретение поясняется чертежами, где
Фиг.1
а) вид спереди углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);
б) - вид сбоку углеродной подложки - толстопленочного графитсодержащего электрода (ТГЭ);
3+
Фиг.2 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в модельных растворах, содержащих (а, 4-6) и не содержащих (б, 4-6) антиген вируса кори (NovO/96), где 4 - вольтамперограмма фонового электролита, 5 - вольтамперограмма модельного раствора, 6 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в модельный раствор добавки ионов Fe;
3+
Фиг.3 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 7-9), и не содержащих (б, 7-9) вирус кори, где 7 - вольтамперограмма фонового электролита, 8 - вольтамперограмма пробы, 9 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe.
3+
Фиг.4 - циклические вольтамперограммы, зарегистрированные в пробах, содержащих (а, 10-12), и не содержащих (б, 10-12) вирус кори, где 10 - вольтамперограмма фонового электролита, 11 - вольтамперограмма пробы, 12 - вольтамперограмма, зарегистрированная после введения в пробу добавки ионов Fe.
Толстопленочный графитсодержащий электрод - твердосплавный носитель состоит из углеродной подложки 1 (электрода), выполненной из стеклотекстолита, на которой размещена дорожка из токопроводящего материала 2, в качестве которого используют, например, графитовую композицию, углеродные чернила. На дорожку 2 нанесен слой изолятора 3 или цементита.
Заявляемое изобретение подтверждается примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
3
4
2
2
4
3
-2
Модельный раствор с антигеном вируса кори (NovO/96) инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами FeO-SiO, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1), модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М HSO и 0,28М HNO) для последующего разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют фосфатный буфер, не содержащий антигена вируса (NovO/96) (фиг.2). В модельном растворе обнаружено 8×10 мг/мл антигена.
Пример 2.
3
4
2
2
4
3
-3
Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами FeSO-SiO, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М HSO и 0,28М HNO) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.3). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 3×10 мг/мл антигена.
Пример 3.
3
4
2
2
4
3
-4
Пробу, содержащую смывы из носоглотки пациента, зараженного вирусом кори, инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°C с магнитными нанокомпозитными частицами FeO-SiO, на поверхности которых иммобилизированы поликлональные IgG к вирусу кори. После инкубации в раствор помещают ТГЭ (фиг.1) модифицированный IgG, и выдерживают в течение 20 минут при температуре 37°C. Для ускорения доставки к поверхности ТГЭ нанокомпозитных частиц с иммобилизированным на поверхности иммунокомплексом используют магнитное поле. Затем электрод промывают буферным раствором, содержащим нормальную лошадиную сыворотку (НЛС) и твин-20. Извлеченный из анализируемого раствора электрод помещают в смесь азотной и серной кислот (0,36М HSO и 0,28М HNO) для разрушения «сэндвича» и растворения нанокомпозитных частиц. В качестве сигнала, характеризующего содержание вирусов/антигенов вирусов в анализируемой пробе, используют электрохимический отклик железа, перешедшего в раствор при кислотном разрушении «сэндвича». Для проведения холостого опыта используют пробу, содержащую смывы из носоглотки здорового пациента (фиг.4). В пробе, взятой у зараженного пациента, обнаружена концентрация вируса, соответствующая 4×10 мг/мл антигена.
Предложенный способ позволяет значительно снизить материало- и трудозатраты, требуемые для проведения процесса, увеличить производительность и уменьшить себестоимость определения.
Кроме того, изобретение позволяет упростить процесс иммуноанализа, а также увеличить экспрессность и воспроизводимость, а также использовать его в различных средах.