СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ СИСТЕМНОГО АМИЛОИДОЗА И ЕГО НЕФРОПАТИЧЕСКОЙ ФОРМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD OF PREVENTING SYSTEMIC AMYLOIDOSIS AND ITS NEPHROPATIC FORM IN EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, кровообращения, минерального обмена и других показателей.
Амилоидоз - системное заболевание с поражением многих органов и различных тканевых структур, характеризующееся нарушением белкового обмена и внеклеточным отложением в них сложного белково-полисахаридного комплекса (Серов B.B. // Клин. герант. - 1995. №1. - С.3-8). Развитие амилоидоза связано с извращением белково-синтетической функции ретикуло-эндотелиальной системы, накоплением в плазме крови аномальных белков, служащих аутоантигенами. В результате взаимодействия антигена с антителом происходит осаждение грубодисперсных белков, участвующих в образовании амилоида. Амилоид является сложным гликопротеидом, в состав которого входят плазменные белки, находящиеся в тесной связи с полисахаридами Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает γ-глобулин (Dammacco F. Amyloidosis: clinical picture, immunological and biomolecular features, treatment prospects. // Ann. Ital. Med. Int. - 1991. - Jan.-Mar. - 6 (1 Pt 2). P. - 107-116) Свойственное амилоиду двойное лучепреломление в поляризованном свете при окраске конго красным определяется строением амилоида, состоящего из двух полипептидных цепей.
Откладываясь в тканях, амилоид накапливается в больших количествах и вытесняет функционально специализированные элементы органа, что приводит к атрофии, склерозу и функциональной недостаточности органов. В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов профилактики и лечения амилоидоза.
Одним из проявлений генерализованного амилоидоза является амилоидоз почек с яркой клинико-морфологической и нозологической спецификой. Микроскопически в почках амилоид обнаруживается в стенке сосудов, по ходу собирательных трубок, в капиллярных петлях и мезангии клубочков, в базальных мембранах канальцев и в строме. В интермедиальной зоне и пирамидах строма пропитывается белками плазмы.
Специфическое лечение амилоидоза не разработано, что связано с отсутствием окончательных представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания. В связи с этим возникла необходимость разработки и создания способов профилактики амилоидоза и его нефропатической формы.
Специфическое лечение амилоидоза не разработано, что связано с отсутствием окончательных представлений об этиологии и патогенезе этого заболевания.
По данным литературы (А.Ю.Николаев, Ю.С.Милованов, Е.И.Трофимова, 1998; E.F.Osserman et al., 1980) получен определенный клинический эффект при лечении диметилсульфоксидом (DMSO) больных вторичным амилоидозом. Диметилсульфоксид часто рекомендуется для лечения вторичного амилоидоза почек (Г.В.Лукина, Ю.В.Муравьев, Т.Б.Прокаева и соавт., 1996; H.J.Loffler, Н.Brass, W.Thoenes et al., 1983). Недостатком его является то, что в ряде случаев он может вызывать фатальные аритмии сердца (R.Zenhausern, A.Tobler, L.Leoncini et al., 2000). Кроме того, этот фармакологический препарат был наиболее эффективным в период быстрого отложения амилоида, но утрачивал свое действие в стадии плато.
Известен способ профилактики и лечения вторичного амилоидоза, заключающийся в применении колхицина (Г.В.Лукина, Ю.В.Муравьев, Т.Б.Прокаева и соавт., 1996; Рамеев В.В., Чегаева Т.В., Проскурнева Е.П., 1999). Однако и он обладает рядом недостатков: препарат может вызывать тошноту, рвоту, диарею, выпадение волос, лейкопению, тромбоцитопению, кожные сыпи. Колхицин назначают в постепенно нарастающей дозировке, длительно (до 5 лет и более), ориентируясь на индивидуальную переносимость. Препарат противопоказан при почечной и печеночной недостаточности, гнойных заболеваниях, беременности (Машковский М.Д., 1998). В ряде случаев развивается вакуольная рабдомиопатия и некротическая миопатия (С.Fernandez, D. Figarella-Branger, P.Alia et al., 2002; F.Himmelmann, J.M.Schroder, 1992). Колхицин применяют в случае успешного лечения и после уменьшения или исчезновения почечных симптомов амилоидоза, возможно до конца жизни больного (Sezer О., Eucker J., Jakob С, Possinger К., 2000). Кроме того, колхицин малоэффективен при выраженном амилоидозе почек (J.P.Mery, 1984).
Е.Б.Глузманом (1965) при лечении локальных форм амилоидоза успешно был применен унитиол - ингибитор развития экспериментального амилоидоза. Унитиол способен замедлять и стабилизировать течение вторичного амилоидоза почек. К побочным явлениям при его применении можно отнести тошноту, головокружение и тахикардию, поэтому увеличение дозы производят постепенно.
Известен способ профилактики и лечения системного амилоидоза и его нефропатической формы у экпериментальных животных, заключающийся в введении белкового препарата и амилоидопротектора (патент РФ на изобретение №2270672, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 27.02.2006, заявка №2004127648/14 от 15.09.2004 г., МПК А61К 31/15, А61Р 13/12), взятый нами в качестве прототипа как наиболее близкий способ. В качестве белкового препарата белым мышам вводили по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно через день в течение 30 дней, а в качестве амилоидопротектора вводили подкожно 10%-ный раствор милдроната через день из расчета 50 мг/кг в течение последних 14 дней эксперимента.
Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая, то что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров. Недостатком лекарственного препарата является то, что при длительном применении милдронат может вызвать паренхиматозную жировую дистрофию печени.
Положительные результаты исследований (Заалишвили Т.В., Брин В.Б., Козырев К.М., 2005) доказывают возможность приостановки дальнейшего накопления амилоида в тканях и даже его рассасывание, т.е. обратимость амилоидоза. Это позволяет ставить вопрос о поиске новых методов и средств воздействия, направленных на приостановку синтеза фибрилл амилоида и стимуляцию амилоидоклазии.
Сероводородные минеральные воды широко используются с профилактической, а также лечебной целью при многих патологических процессах. Из всех действующих факторов в сульфидных водах наибольшее значение по влиянию на организм придается имеющемуся в них сероводороду (Пронина Н.Н., 1971) Было доказано, что сероводород, находящийся в минеральной воде в свободном, т.е. молекулярном состоянии, обладает высокой фармакологической активностью.
SH-группы органических соединений обладают высокой и разнообразной реакционной способностью: легко окисляются с образованием дисульфидов; легко вступают и реакции алкилирования, тиол-дисульфидного обмена, образуют меркаптиды (при реакции с ионами тяжелых металлов), меркаптали, меркаптолы. SH- группы играют важную роль в биохимических процессах. В организме сероводород, даже в очень малой концентрации, вызывает изменения различных функций организма. В результате капилляры и сосуды расширяются, кровообращение в них ускоряется, приток крови к сердцу возрастает, а отток облегчается. Это способствует рассасыванию остатков воспалительных заболеваний и ускорению восстановительных процессов. Исходя из этого мы предположили, что через механизмы действия минеральная сероводородная вода может способствовать в некоторой степени торможению отдельных звеньев амилоидогенеза, в частности снижению плазматического пропитывания и деполимеризации гликозаминогликанов (компонентов, составляющих амилоид), тем самым ограничивая процесс дальнейшего накопления субстрата, т.е. стимулировать амилоидоклазию.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы, включающего введение среднеминерализованной сульфидной минеральной воды внутрижелудочно, одновременно с введением нативного яичного альбумина подкожно.
Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.
Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что нативный яичный альбумин вводят старым крысам из расчета 0,025 мл/г массы тела, а в качестве амилоидопротекторного препарата используют среднеминерализованную сульфидную минеральную воду Р-4 Редантского месторождения, вводимую им ежедневно, одновременно с нативным яичным альбумином, через зонд в желудок в дозе 10 мл/кг в течение 60 дней.
Между признаками заявляемого способа и результатом существует следующая причина - сульфидные минеральные воды содержат сероводород, находящийся в свободном, т.е. в молекулярном состоянии, обладает наибольшей фармакологической активностью. SH-группы обладают высокой и разнообразной реакционной способностью и играют важную роль в биохимических процессах. В организме сероводород, даже в очень малой концентрации, вызывает изменения различных функций организма. В результате капилляры и сосуды расширяются, кровообращение в них ускоряется, приток крови к сердцу возрастает, а отток облегчается. Это способствует рассасыванию остатков воспалительных заболеваний и ускорению восстановительных процессов. В связи с этим сульфидные минеральные воды находят широкое применение при лечении различных заболеваний
Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.
По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, неизвестна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению автора сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, включающий введение нативного яичного альбумина подкожно и амилоидопротекторного препарата в течение срока эксперимента, отличающийся тем, что нативный яичный альбумин вводят старым крысам из расчета 0,025 мл/г массы тела, а в качестве амилоидопротекторного препарата используют среднеминерализованную сульфидную минеральную воду, вводимую им ежедневно, одновременно с нативным яичным альбумином, через зонд в желудок в дозе 10 мл/кг в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, особенно при исследовании функционального состояния системы кровообращения, почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики системного амилоидоза и его нефропатической формы у экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществлялся следующим образом.
Для получения системного амилоидоза и его нефропатической формы животным (старые крысы-самцы, возраст 18-24 мес, масса тела 350-380 г) проводились через день подкожные инъекции нативного яичного альбумина 0,025 мл/г массы тела. Минеральную воду Р-4 Редантского месторождения вводили через зонд в желудок с первых суток моделирования при помощи шприца, на который надет подключичный катетер в количестве 1 мл на каждые 100 г, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.
По данным Пятигорского НИИКФ минеральная вода Р-4 Редантского месторождения является сульфидной водой средней минерализации, хлоридно-сульфидно-кальциевого состава с повышенным содержанием ионов магния, нейтральной реакцией среды, холодная, содержание общего сероводорода - 158 мг/л, свободного сероводорода - 108 мг/л.
В конце первого и второго месяца эксперимента определяли показатели электролитоводовыделителыюй функции почек.
Для гистологических исследований образцы тканей: почка, сердце, печень, селезенка, фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином и конго красным (фиг.1 - 4). Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа МИКМИД-1 под увеличением 80×200×400.
Пример 1. Двум группам старых крыс-самцов линии Вистар (№1-контроль, №2 - опыт) массой 350-380 г вводили подкожно нативный яичный альбумин из расчета 0,025 мл/г через день в течение двух месяцев.
Сероводородную минеральную воду Р-4 вводили через зонд в желудок ежедневно в дозе 10 мг/кг в группе №2. Через 1 и 2 месяца определяли некоторые показатели водоэлектролитовыделительной функции почек при спонтанном шестичасовом диурезе: уровень диуреза, клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции, уровень экскреции натрия, калия, кальция, также определяли концентрацию белка в моче.
Анализ данных показал, (табл.1) что в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения нативного яичного альбумина отмечалось увеличение диуреза через 1 месяц и его снижение через 2 месяца. Увеличение диуреза было обусловлено снижением канальцевой реабсорбции воды и увеличением скорости клубочковой фильтрации. В течение второго месяца спонтанный диурез снижался относительно значений как амилоидных, так и интактных животных, при этом скорость клубочковой фильтрации снизилась ниже фоновых значений, и канальцевая реабсорбция воды также продолжала снижаться. Экскреция натрия в условиях спонтанного диуреза была резко повышенной на протяжении всего эксперимента, особенно по истечении 2 месяца. Экскреция калия и кальция повышалась на протяжении обоих месяцев. Под влиянием введения нативного яичного альбумина отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии почти в 3 раза на протяжении 2 месяцев.
В группе №2, получавших внутрижелудочно минеральную воду Р-4 каждый день в течение двух месяцев на фоне подкожного введения нативного яичного альбумина, наблюдалась тенденция к уменьшению объема спонтанного диуреза через 1 месяц и его рост через 2 мес эксперимента относительно амилоидной группы. Рост спонтанного диуреза был обусловлен увеличением скорости клубочковой фильтрации, при этом канальцевая реабсорбция воды также увеличивалась.
Профилактическое применение сероводородной минеральной воды Р-4 Редантского месторождения обусловило снижение экскреции натрия через 1 и 2 месяца эксперимента по сравнению с группой №1, однако экскреция натрия оставалась все же выше фоновых значений. Экскреция калия на протяжении обоих месяцев эксперимента снижалась по сравнению с амилоидной группой. Снижение экскреции кальция отмечалось спустя 1 месяц эксперимента, а через 2 месяца экскреция катиона увеличилась, приближаясь к значению в группе №1. Применение минеральной воды выявило значительное снижение содержания белка в моче через 1 и 2 месяца по сравнению с амилоидными животными.
Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически:
Фиг.1. Уменьшение плазматического пропитывания стенок капилляров клубочка и интеркапиллярного отека. Уменьшение плазматического пропитывания и отека межуточного вещества. Снижение признаков конгофилии кортикальных и медуллярных сосудов. Уменьшение отложения амилоида в канальцах и клубочках почек. Снижение признаков паренхиматозной дистрофии канальцев. Очаговая периваскулярная лимфогистиоцитарная реакция элементов коркового и мозгового вещества почки. Пролиферация эндотелия капилляров и мезангиоцитов клубочка Выявлялась слабая эндотелиальная реакция капилляров клубочков и сосудов микроциркуляторного русла стромы почки, особенно коркового слоя.
Фиг.2. Уменьшение гиперемии, плазматического пропитывания сосудов системы микроциркуляции, отека межуточного вещества. Очаговая гипертрофия кардиомиоцитов и их ядер.
Фиг.3. Снижение конгофилии межуточного вещества и сосудистых стенок. Гиперемия центральных дольковых вен. Уменьшение отложения амилоида в печени в виде единичных скоплений преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. Очаговая периваскулярная гистиоцитарная реакция.
Фиг.4. Уменьшение признаков гиперемии, плазматического пропитывания стенок сосудов системы микроциркуляции (прекапилляров и капилляров), а также признаков гиперемии. Уменьшение отложения амилоида в виде единичных очаговых скоплений.
Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде в приложении.
Из вышеизложенного видно, что профилактическое введение среднеминерализованной сульфидной минеральной воды является эффективным способом коррекции проявлений генерализованного амилоидоза и его нефропатической формы.