ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ К CD22
CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TO CD22

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
По данной заявке на патент испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №61/549516, поданной 20 октября 2011 года, которая включена в этот документ в полном объеме посредством ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
В этот документ включен посредством ссылки в полном объеме машиночитаемый перечень нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, поданный одновременно с данным документом и идентифицированный следующим образом: один ASCII (текстовый) файл размером 69127 байт под названием "711021_ST25.txt" от 18 октября 2012 года.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак представляет проблему для здоровья населения. Несмотря на достижения в способах лечения, таких как химиотерапия, прогноз для многих раковых заболеваний, в том числе гематологических злокачественных опухолей, может оказаться неблагоприятным. Например, установлено, что в 2000 году в Соединенных Штатах Америки ожидалось более 45000 смертельных случаев вследствие неходжкинской лимфомы и лейкемии (Greenlee et al., CA Cancer J. Clin., 50: 7-33 (2000)). Соответственно, существует востребованность в дополнительных способах лечения рака, особенно гематологических злокачественных опухолей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложен химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий: а) антигенсвязывающий домен HA22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки или b) антигенсвязывающий домен BL22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий i) CD28 и/или ii) CD137.
В последующих вариантах осуществления изобретения предложены родственные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части и фармацевтические композиции, относящиеся к химерным антигенным рецепторам (CARs) изобретения.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения предложены способы обнаружения наличия рака у млекопитающего и способы лечения или профилактики рака у млекопитающего.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
51
На Фиг. 1 представлен график, показывающий лизис (в %) лейкозных клеток-мишеней, меченых Cr, посредством эффекторных T-клеток человека, трансдуцированны одним из следующих CARs: HA22 второго поколения, вариант 1 (; закрашенный квадрат, SEQ ID NO: 15), HA22 третьего поколения (; незакрашенный квадрат, SEQ ID NO: 16), BL22 второго поколения, вариант 1 (●; закрашенный круг, SEQ ID NO: 19), BL22 третьего поколения (○; незакрашенный круг, SEQ ID NO: 20), HA22-SH второго поколения, вариант 1 (; закрашенный треугольник, SEQ ID NO: 17), HA22-SH третьего поколения (∆; незакрашенный треугольник, SEQ ID NO: 18), мнимая трансдукция (нетрансдуцированный, X) или CD19-специфичный CAR (*) при различных соотношениях эффектора и мишени (Э:М). Соотношение Э:М показано по оси абсцисс, а лизис мишеней (в %) - по оси ординат. Фигура иллюстрирует прямой анализ клеточной линии SEM и является типичной для литического профиля, наблюдаемого и для других исследованных клеточных линий.
Фиг. 2A-2B представляют графики, показывающих лизис (в процентах) линий лейкозных клеток-мишеней KOPN8 (A) или NALM6 (B) посредством клеток-эффекторов, трансдуцированных одной из трех различных конструкций CAR к CD22 второго поколения, вариант 1: HA22-CH2CH3 (; квадраты, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3, (; треугольник, SEQ ID NO: 19) или HA22-SH (последовательность короткого константного домена иммуноглобулина; X, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М. CAR к CD19 (♦; ромб) включен в качестве контроля. По оси ординат указан лизис клеток-мишеней в процентах. На оси абсцисс указаны соотношения Э:М, которые нормализованы в соответствии с трансдукцией (в процентах) каждой отдельной конструкции CAR, как описано в Примере 4. Линии проведены с использованием функции подбора логарифмической кривой в программе Excel (Microsoft).
Фиг. 3A-3B представляют графики, показывающих лизис (в процентах) линий лейкозных клеток-мишеней REH (A) или SEM (B) посредством клеток-эффекторов, трансдуцированных одной из трех различных конструкций CAR к CD22 второго поколения, вариант 1: HA22-CH2CH3 (; квадраты, SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3 (; треугольник, SEQ ID NO: 19) или HA22-SH (последовательность короткого константного домена иммуноглобулина, X, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М. CAR к CD19 (♦; ромб) включен в качестве контроля. По оси ординат указан лизис клеток-мишеней в процентах. На оси абсцисс указаны соотношения Э:М, которые нормализованы в соответствии с трансдукцией (в процентах) каждой отдельной конструкции CAR, как описано в Примере 4. Линии проведены с использованием функции подбора логарифмической кривой в программе Excel (Microsoft).
На Фиг. 4 представлена диаграмма, отражающая лизис (в процентах) линий клеток-мишеней K562 (темно-серые), REH (черные), SEM (белые) или NALM6 (светло-серые) посредством эффекторных T-клеток, трансдуцированных ретровирусным вектором, экспрессирующим одну из различных конструкций CAR: НА 2-го (SEQ ID NO: 15); НА 3-го (SEQ ID NO: 16); HASH 2-го (SEQ ID NO: 17) или HASH 3-го поколения (SEQ ID NO: 18). Ось абсцисс описывает каждую подвергшуюся испытанию популяцию трансфицированных клеток. Мнимая трансдукция: T-клетки, активированные и культивированные как другие группы, но не подвергнутые обработке ретровирусным супернатантом (с/н), содержащим вектор CAR (нетрансдуцированные). CAR к CD19 использован в качестве контроля.
На Фиг. 5A и 5B изображены графики, отображающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (ромбы), SEM (квадраты), NALM6 (треугольники), KOPN8 (X), Daudi (круги), Raji (|) или контрольной линии CD22-отрицательных клеток-мишеней K562 (*) посредством эффекторных нетрансдуцированных T-клеток (A, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17) (B, "HASH 28z") при различных соотношениях Э:М.
На Фиг. 6A и 6B представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (A), SEM (B), NALM-6 (С) или KOPN-8 (D) посредством эффекторных нетрансдуцированных Т-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR второго поколения, вариант 1 (круги, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) или BL22 CAR второго поколения, вариант 1 (квадраты, BL22 28z, SEQ ID NO: 19) при различных соотношениях Э:М.
На Фиг. 6E и 6H представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (E), SEM (F), NALM-6 (G) или KOPN-8 (H) посредством эффекторных нетрансдуцированных T-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR третьего поколения (круги, HA22 28BBz, SEQ ID NO: 16) или BL22 CAR третьего поколения (квадраты, BL22 28BBz, SEQ ID NO: 20) при различных соотношениях Э:М.
На Фиг. 6I-6L представлены графики, показывающие лизис (в процентах) линий CD22-экспрессирующих лейкозных клеток-мишеней REH (I), SEM (J), NALM-6 (K) или KOPN-8 (L) посредством эффекторных нетрансдуцированных Т-клеток (треугольники, «мнимая трансдукция») или эффекторных клеток, трансдуцированных HA22 CAR второго поколения, вариант 1, с CH2CH3 доменом (круги, HA22 28z, SEQ ID NO: 15) или без CH2CH3 домена (квадраты, HASH22 28z, SEQ ID NO: 17) при различных соотношениях Э:М.
2
2
На Фиг. 7A представлен график, показывающий биолюминисцентные сигналы (фотоны/с/см/ср), генерированные реакцией люциферазы (трансфицированной в лейкозные клетки, которые были введены мышам) с люциферином, который был введен мышам, измеряемые в течение 30 дней. Мышей обрабатывали контрольными T-клетками («мнимая трансдукция», нетрансдуцированные, ) или T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17, закрашенные квадраты), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18, ) или HA22SH-CAR второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32, незакрашенные квадраты). Более высокие значения, выраженные в фотонах/с/см/ср, указывают на более высокую опухолевую массу.
На Фиг. 7B представлен график, показывающий выживаемость в процентах мышей, обработанных контрольными T-клетками («мнимая трансдукция», нетрансдуцированные, круги) или T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17, квадраты), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18, ∆) или HA22SH второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32, ∇), измеряемую в течение 30 дней. (Мнимая трансдукция в сравнении с HA22SH 28z, p=0,001; мнимая трансдукция в сравнении с HA22SH 28BBz, Р=0,004; мнимая трансдукция в сравнении с HA22SHBBz, р=0,001; HA22SH 28Z в сравнении с HA22SH 28 BBz, p=0,03, HA22SH 28z в сравнении с HA22SH BBz, не существенно).
На Фиг. 8A-8D представлены диаграммы, показывающие единицы лизиса, рассчитанные как описано в Примере 4 для эффекторных клеток, трансдуцированных одним из рецепторов HA22 28z (SEQ ID NO: 15), HA22 28BBz (SEQ ID NO: 16), BL22 28z (SEQ ID NO: 19), BL22 28BBz (SEQ ID NO: 20), HASH22 28z (SEQ ID NO: 17) или HASH22 28BBz (SEQ ID NO: 18) при совместном культивировании с клетками-мишенями REH (A), SEM (B), NALM-6 (C) или KOPN-8 (D).
На Фиг. 9A-9C представлены диаграммы, показывающие количество интерферона (IFN)-γ (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих CARs: рецептор к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1 (HA22SH-28Z), HASH22 второго поколения, вариант 2 (HA22SH-BBZ) или HASH22 третьего поколения (HA22SH-28BBZ) при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).
На Фиг. 9D-9F представлены диаграммы, показывающие количество интерлейкина (IL)-2 (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих CARs: рецептором к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1, HASH22 второго поколения, вариант 2, или HASH22 третьего поколения при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).
На Фиг. 9G-9I представлены диаграммы, показывающие количество фактора некроза опухоли (TNF)-α (пг/мл), секретируемого T-клетками, которые не были трансдуцированы (мнимая трансдукция) или были трансдуцированы одним из следующих рецепторов CARs: рецептором к CD19, HASH22 второго поколения, вариант 1, HASH22 второго поколения, вариант 2, или HASH22 третьего поколения при совместном культивировании с линиями лейкозных клеток NALM6-GL (CD22 низк.) (A), Raji (CD22 выс.) (B) или K562 (CD22 отрицательных) (C).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В варианте осуществления изобретения предложены химерные антигенные рецепторы (CARs), содержащие: a) антигенсвязывающий домен HA22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки или b) антигенсвязывающий домен BL22, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий i) CD28 и/или ii) CD137.
Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственно сконструированный гибридный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающие домены антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), связанные с сигнальными доменами T-клетки. К характеристикам CARs относится их способность изменять направление специфичности и реакционной способности T-клеток в сторону выбранной мишени не рестриктированным по главному комплексу гистосовместимости образом, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. Не рестриктированное по главному комплексу гистосовместимости распознавание антигена придает T-клеткам, экспрессирующим CARs, способность распознавать антиген независимо от процессирования антигена, обходя тем самым основной механизм ускользания опухоли. Более того, при экспрессии в T-клетках CARs преимущественно не димеризуются с эндогенными альфа- и бета-цепями рецептора T-клетки (TCR).
Используемые в данном документе выражения «обладают антигенной специфичностью» и «вызывают антиген-специфическую реакцию» означают, что CAR может специфически связываться с антигеном и иммунологически распознавать его, так что связывание CAR с антигеном вызывает иммунный ответ.
CARs изобретения обладают антигенной специфичностью к CD22. CD22 представляет собой линиеспецифический B-клеточный антиген, принадлежащий к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig). CD22 экспрессируется в 60-70% B-клеточных лимфом и лейкозов (например, при хроническом B-клеточном лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе, остром лимфоцитарном лейкозе (ALL) и лимфоме Беркитта) и не присутствует на клеточной поверхности на ранних стадиях развития В-клеток или на стволовых клетках. Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol., 11: 267-297 (1991); Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005).
Вне связи с какой-либо конкретной теорией или механизмом полагают, что, вызывая антиген-специфическую реакцию на CD22, изобретенные CARs обеспечивают одну или несколько из следующих возможностей: выбор в качестве мишени и разрушение CD22-экспрессирующих раковых клеток, сокращение или уничтожение раковых клеток, облегчение инфильтрации иммунных клеток в область(и) локализации опухоли и усиление/продление противораковых реакций. Поскольку CD22 не экспрессируется на ранних стадиях развития В-клеток или на стволовых клетках, предполагают, что изобретенные CARs преимущественно предотвращают главным образом выбор в качестве мишени/разрушение стволовых клеток и/или B-клеток на ранних стадиях развития.
В данном изобретении предложен CAR, содержащий антигенсвязывающий домен иммунотоксинов HA22 или BL22. Иммунотоксины BL22 и HA22 представляют собой терапевтические вещества, которые содержат scFV, специфичный к CD22, слитый с микробным токсином. Иммунотоксин связывается с поверхностью раковых клеток и убивает раковые клетки. BL22 содержит стабилизированный дисульфидом одноцепочечный вариабельный фрагмент (dsFv) антитела к CD22-RFB4, слитый с процессированной формой экзотоксина A массой 38 кДа, вырабатываемого Pseudomonas (Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005)). HA22 (CAT8015, moxetumomab pasudotox) представляет собой мутировавший вариант BL22 с повышенной аффинностью (Но et al., J. Biol. Chem., 280 (1): 607-17 (2005)).
Антигенсвязывающие домены HA22 и BL22 специфически связываются с CD22. Подходящие последовательности антигенсвязывающих доменов HA22 и BL22 раскрыты, например, в патентах США №7541034, 7355012 и 7982011, которые таким образом включены в данный документ в полном объеме путем ссылки. В связи с этим в предпочтительном варианте осуществления изобретения предложены CARs, содержащие антигенсвязывающий домен, который содержит, состоит из или состоит по существу из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антигенсвязывающего домена HA22 или BL22.
Каждый из антигенсвязывающих доменов HA22 и BL22 содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. Вариабельная область легкой цепи HA22 или BL22 может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 1 или 2 соответственно. Вариабельная область тяжелой цепи HA22 или BL22 может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 3 или 4 соответственно. Вследствие этого в варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 или 4.
В варианте осуществления изобретения вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть соединены линкером. Линкер может содержать любую подходящую аминокислотную последовательность. В варианте осуществления изобретения линкер может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 37.
В варианте осуществления антигенсвязывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. При этом антигенсвязывающие домены HA22 или BL22, каждый из которых содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, содержит, состоит из или состоит по существу из последовательности SEQ ID NO: 5 или 6 соответственно.
В варианте осуществления антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность может быть расположена при амино-конце вариабельной области легкой цепи. Лидерная последовательность может содержать любую подходящую лидерную последовательность. В варианте осуществления лидерная последовательность представляет собой последовательность рецептора гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (GM-CSF). При этом антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность, содержащую, состоящую из или состоящую по существу из последовательности SEQ ID NO: 7. В варианте осуществления изобретения, когда лидерная последовательность может способствовать экспрессии CAR на поверхности клетки, присутствие лидерной последовательности в экспрессированном CAR не является необходимым для функционирования CAR. В варианте осуществления изобретения при экспрессии CAR на клеточной поверхности лидерная последовательность может отщепляться от CAR. Соответственно, в варианте осуществления изобретения CAR не содержит лидерную последовательность.
В варианте осуществления CAR содержит иммуноглобулиновый домен. Предпочтительно иммуноглобулиновый домен представляет собой последовательность человеческого иммуноглобулина. В варианте осуществления иммуноглобулиновый домен содержит последовательность (CH2CH3) доменов CH2 и CH3 иммуноглобулина G (IgG1). При этом CAR содержит иммуноглобулиновый домен, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 8. В варианте осуществления изобретения иммуноглобулиновый домен может содержать короткую последовательность константного домена иммуноглобулина. При этом CAR содержит иммуноглобулиновый домен, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 9 или 36. Вне связи с какой-либо конкретной теорией полагают, что домен CH2CH3 продолжает связывающий мотив scFv далеко от мембраны CAR-экспрессирующих клеток и может более точно воспроизводить размер и доменную структуру нативного TCR.
В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен. В варианте осуществления изобретения трансмембранный домен содержит i) CD8 и/или ii) CD28. В предпочтительном варианте осуществления CD8 и CD28 являются человеческими доменами. CD8 или CD28 может включать не весь домен CD8 или CD28 соответственно. При этом CAR содержит а) трансмембранный домен CD8, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 10 или 33 и/или b) трансмембранный домен CD28, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из последовательности SEQ ID NO: 11.
В варианте осуществления изобретения CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий один или несколько доменов из i) CD28, ii) CD137 и iii) CD3 дзета (ζ). В предпочтительном варианте осуществления один или несколько доменов из CD28, CD137 и CD3 дзета являются человеческими. CD28 представляет собой T-клеточный маркер, имеющий важное значение в T-клеточной костимуляции. CD137, известный также под названием 4-1BB, передает мощный костимуляторный сигнал T-клеткам, способствуя дифференциации и увеличению длительной выживаемости T-лимфоцитов. CD3ζ связывается с TCR с образованием сигнала и содержит иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы (ITAM). Один или несколько доменов из CD28, CD137 и CD3 дзета может включать не полный домен CD28, CD137 или CD3 дзета соответственно. При этом внутриклеточный сигнальный домен T-клетки содержит одну или несколько последовательностей из аминокислотной последовательности CD28, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 12, аминокислотной последовательности CD137, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 13 или 34, и/или аминокислотной последовательности CD3 дзета, содержащей, состоящей из или состоящей по существу из SEQ ID NO: 14 или 35.
В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD28 и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12 и 14. Предпочтительно CAR содержит a) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 8, 11, 12 и 14; b) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 8, 11, 12 и 14; или c) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 9, 11, 12 и 14.
В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8 и внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки, содержащий CD28, CD137 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 10, 12, 13 и 14. Предпочтительно CAR содержит a) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 8, 10, 12, 13 и 14; b) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10, 12, 13 и 14; или c) каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 9, 10, 12, 13 и 14.
В варианте осуществления изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8 и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137 и CD3 дзета. При этом CAR может содержать каждую из последовательностей SEQ ID NO: 33-35. Предпочтительно CAR содержит каждую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 3 и 33-36.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения предложены CARs, содержащие, состоящие из или состоящие по существу из любых аминокислотных последовательностей, приведенных в Таблице 1.
В объем изобретения включены функциональные части изобретенных CARs, описанных в данном документе. Термин «функциональная часть» применительно к CAR относится к любой части или фрагменту CAR настоящего изобретения, которая(ый) сохраняет биологическую активность CAR, из которого она/он происходит (исходный CAR). Функциональные части охватывают, например, те части CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени или обнаруживать, лечить или предотвращать болезнь в похожей степени, в той же степени или в большей степени, чем исходный CAR. Что касается исходного CAR, функциональная часть может включать, например, приблизительно 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% или более исходного CAR.
Функциональная часть может содержать дополнительные аминокислоты на амино- или карбоксильном конце этой части или на обоих концах, причем эти дополнительные аминокислоты не обнаруживаются в аминокислотной последовательности исходного CAR. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали выполнению биологической функции функциональной части, например, распознаванию клеток-мишеней, диагностике рака, лечению или предотвращению рака и т.д. Более предпочтительно, чтобы дополнительные аминокислоты повышали биологическую активность по сравнению с биологической активностью исходного CAR.
В объем изобретения включены функциональные варианты изобретенных CARs, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин «функциональный вариант» относится к CAR, полипептиду или белку, последовательность которого по существу или в значительной степени идентична или сходна с последовательностью исходного CAR, при этом функциональный вариант сохраняет биологическую активность CAR, из которого он происходит. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, описанного в данном документе (исходного CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в похожей степени, в той же степени или в большей степени, чем исходный CAR. Что касается исходного CAR, функциональный вариант может, например, быть по своей аминокислотной последовательности идентичен исходному CAR по меньшей мере примерно на 30%, примерно на 50%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 85%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98%, примерно на 99% или более.
Функциональный вариант может, например, содержать аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной консервативной аминокислотной заменой. В качестве альтернативы или дополнения, функциональные варианты могут содержать аминокислотную последовательность исходного CAR с по меньшей мере одной неконсервативной аминокислотной заменой. В этом случае предпочтительно, чтобы неконсервативная аминокислотная замена не мешала или не ингибировала биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может усиливать биологическую активность функционального варианта, так что биологическая активность функционального варианта выше, чем у исходного CAR.
Аминокислотные замены изобретенных CARs являются предпочтительно консервативными заменами аминокислот. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области техники и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота с определенными физическими и/или химическими свойствами заменена на другую аминокислоту, которая имеет такие же или похожие химические или физические свойства. Например, консервативной аминокислотной заменой может являться кислая/отрицательно заряженная полярная аминокислота, замещенная на другую кислую/отрицательно заряженную полярную аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислота с неполярной боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val и т.д.), основная/положительно заряженная полярная аминокислота, замещенная на другую основную/положительно заряженную аминокислоту (например, Lys, His, Arg и т.д.), незаряженная аминокислота с полярной боковой цепью, замещенная на другую незаряженную аминокислоту с полярной боковой цепью (например, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr и т.д.), аминокислота с бета-разветвленной боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с бета-разветвленной боковой цепью (например, Ile, Thr и Val), аминокислота с ароматической боковой цепью, замещенная на другую аминокислоту с ароматической боковой цепью (например, His, Phe, Trp и Tyr) и т.д.
CAR по существу может состоять из заданной аминокислотной последовательности или последовательностей, описанных в данном документе, так что другие компоненты, например, другие аминокислоты, существенно не изменяют биологическую активность функционального варианта.
CARs в вариантах осуществления настоящего изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты) могут иметь любую длину, т.е. могут содержать любое количество аминокислот при условии, что CARs (или их функциональные части или функциональные варианты) сохраняют свою биологическую активность, например, способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать поврежденные клетки у млекопитающих или лечить либо предотвращать заболевания у млекопитающих и т.д. Например, CAR может быть длиной примерно от 50 до примерно 5000 аминокислот, например, 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более аминокислот.
CARs в вариантах осуществления изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты изобретения) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или нескольких природных аминокислот. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области техники и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-н-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорфенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин, β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)-карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутилглицин.
CARs в вариантах осуществления изобретения (включая функциональные части и функциональные варианты) могут быть подвергнуты гликозилированию, амидированию, карбоксилированию, фосфорилированию, этерификации, N-ацилированию, циклизации, например, посредством дисульфидного мостика, или превращены в соль присоединения кислоты и/или необязательно могут быть димеризованы или полимеризованы, либо конъюгированы.
CARs в вариантах осуществления изобретения (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть получены способами, известными в данной области техники. CARs могут быть получены любым подходящим способом получения полипептидов или белков. Подходящие способы синтеза новых полипептидов и белков описаны в ссылках, таких как Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, под ред. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, под ред. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; и патент США №5449752. Также полипептиды и белки могут быть получены в результате рекомбинации с использованием нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, по стандартным рекомбинантным методикам. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3 изд., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Кроме того, некоторые CARs изобретения (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть очищены и/или выделены из источника, такого как растение, бактерия, насекомое, млекопитающее, например, крыса, человек и т.д. Способы выделения и очистки хорошо известны в данной области техники. Альтернативно, описанные в данном документе CARs (включая их функциональные части и функциональные варианты) могут быть синтезированы на коммерческой основе компаниями, такими как Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) и Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). В связи с этим изобретенные CARs могут быть синтетическими, рекомбинантными, выделенными и/или очищенными.
В варианте осуществления изобретения дополнительно предложены антитело или его антигенсвязывающая часть, которая специфически связывается с эпитопом CARs изобретения. Антитело может представлять собой любой вид иммуноглобулина, который известен в данной области техники. Например, антитело может быть любого изотипа, например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и т.д. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антителом может быть природное антитело, например, антитело, очищенное и/или выделенное из млекопитающего, например, мыши, кролика, козы, лошади, цыпленка, хомяка, человека и т.д. В качестве альтернативы антителом может быть генно-инженерное антитело, например, гуманизированное антитело или химерное антитело. Антитело может находиться в мономерной или полимерной форме. Также антитело может обладать любым уровнем аффинности или авидности по отношению к функциональной части изобретенного CAR.
Способы испытания антител на предмет способности связываться с какой-либо функциональной частью изобретенного CAR известны в данной области техники и включают любой способ анализа связывания антитела с антигеном, например, радиоиммуноанализ (RIA), ELISA, вестерн-блоттинг, иммунная преципитация и анализы методом конкурентного ингибирования (см., например, Janeway et al. ниже и публикацию заявки на патент США №2002/0197266 A1).
Подходящие способы получения антител известны в данной области техники. Например, стандартные гибридомные способы описаны, например, в Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) и C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5 изд., Garland Publishing, New York, NY (2001). В качестве альтернативы, в данной области техники известны и другие способы, например, гибридомные способы с использованием вируса Эпштейна-Барра (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984) и Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)) и экспрессирующие векторные системы бактериофагов (см., например, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Кроме того, способы получения антител у животных, не относящихся к человеческому роду, описаны, например, в патентах США №5545806, 5569825, 5714352 и в публикации заявки на патент США №2002/0197266 A1.
Более того, для создания антитела может быть использован фаговый дисплей. При этом фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены антител, могут быть созданы с использованием стандартных методов молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше). Выбирают бактериофаги, кодирующие вариабельную область с желаемой специфичностью, для специфического связывания с желаемым антигеном, и полное или неполное антитело реконструируют с включением выбранного вариабельного домена. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие реконструированное антитело, вводят в подходящую клеточную линию, например, в миеломную клетку, используемую для получения гибридомы, так что антитела, обладающие свойствами моноклональных антител, секретируются клеткой (см., например, Janeway et al., см. выше, Huse et al., см. выше и патент США №6265150).
Антитела могут продуцироваться трансгенными мышами, которые трансгенны по специфическим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такие способы известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США №5545806, 5569825 и Janeway et al., см. выше.
Способы создания гуманизированных антител хорошо известны в данной области техники и подробно описаны в, например, Janeway et al., см. выше, патентах США №5225539, 5585089, 5693761, Европейском патенте №0239400 B1 и патенте Великобритании №2188638. Гуманизированные антитела также могут быть созданы с использованием технологии изменения поверхности антитела, описанной в патенте США №5639641 и Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).
2
В варианте осуществления изобретения также предложены антигенсвязывающие части любых антител, описанных в данном документе. Антигенсвязывающей частью может быть любая часть, у которой имеется по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например, Fab, F(ab'), dsFv, sFv, диатела и триатела.
Одноцепочечный вариабельный фрагмент (sFv) антитела, который представляет собой процессированный Fab-фрагмент, включающий вариабельный (V) домен тяжелой цепи антитела, связанный с V-доменом легкой цепи антитела через синтетический пептид, может быть создан с помощью общепринятых технологических методик рекомбинантной ДНК (см., например, Janeway et al., см. выше). Аналогично, дисульфид-стабилизированные вариабельные фрагменты (dsFv) могут быть получены по технологии рекомбинантной ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Однако фрагменты антител изобретения не ограничиваются этими примерами фрагментов антител.
Также антитело или его антигенсвязывающая часть может быть модифицирована, чтобы включать детектируемую метку, такую, например, как радиоизотоп, флуорофор (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
В варианте осуществления изобретения дополнительно предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из CARs, описанных в данном документе (включая их функциональные части и функциональные варианты). Нуклеиновые кислоты изобретения могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любые лидерные последовательности, антигенсвязывающие домены, иммуноглобулиновые домены, трансмембранные домены и/или внутриклеточные сигнальные домены Т-клетки, описанные в данном документе.
В варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен BL22 или HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи) и CH2CH3. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 21 или 22 соответственно. В другом варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи) и короткую последовательность константного домена иммуноглобулина. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 23 или 38.
Нуклеиновые кислоты изобретения могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из трансмембранных доменов и/или внутриклеточных сигнальных доменов T-клетки, описанных в данном документе. В варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 24. В еще одном варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 25. Еще в одном варианте осуществления изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из последовательности SEQ ID NO: 39.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен BL22 или HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), CH2CH3, трансмембранный домен, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из обеих последовательностей SEQ ID NO: 21 и 24 либо обеих последовательностей SEQ ID NO: 22 и 24.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), короткую последовательность константного домена иммуноглобулина, трансмембранный домен, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из обеих последовательностей SEQ ID NO: 23 и 24.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен BL22 или HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), CH2CH3, трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из обеих последовательностей SEQ ID NO: 21 и 25 либо обеих последовательностей SEQ ID NO: 22 и 25.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), короткую последовательность константного домена иммуноглобулина, трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD28, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из обеих последовательностей SEQ ID NO: 23 и 25.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен HA22 (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), короткую последовательность константного домена иммуноглобулина, трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD137, и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки, содержащий CD3ζ. При этом нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или состоять по существу из обеих последовательностей SEQ ID NO: 38 и 39.
Используемый в этом документе термин "нуклеиновая кислота" включает "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "молекулу нуклеиновой кислоты" и, как правило, означает полимер ДНК или РНК, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным, синтезированным или полученным (например, выделенным и/или очищенным) из природных источников, которые могут содержать природные, неприродные или видоизмененные нуклеотиды и которые могут содержать природную, неприродную или видоизмененную межнуклеотидную связь, например, амидофосфатную связь или тиофосфатную связь вместо фосфодиэфирной связи, находящейся между нуклеотидами немодифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота не содержит каких-либо вставок, делеций, инверсий и/или замен. Однако в некоторых примерах, рассмотренных в данном документе, нуклеиновая кислота может быть подходящей, когда она содержит одну или несколько вставок, делеций, инверсий и/или замен. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может кодировать дополнительные аминокислотные последовательности, которые не влияют на функцию CAR и которые могут или не могут транслироваться при экспрессии нуклеиновой кислоты клеткой-хозяином (например, SEQ ID NO: 31).
Нуклеиновые кислоты в варианте осуществления изобретения могут быть рекомбинантными. Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к (i) молекулам, которые сконструированы вне живых клеток объединением природных или синтетических сегментов нуклеиновых кислот с молекулами нуклеиновых кислот, которые могут реплицироваться в живой клетке, или (ii) молекулам, которые получаются в результате репликации молекул, описанных в пункте (i) выше. Для целей данного документа под репликацией может подразумеваться in vitro репликация или in vivo репликация.
6
6
6
Рекомбинантной нуклеиновой кислотой может быть нуклеиновая кислота, у которой имеется последовательность неприродного происхождения или последовательность, полученная искусственным объединением двух сегментов последовательности, разделенных иным образом. Искусственное объединение часто осуществляют путем химического синтеза или, чаще всего, искусственной манипуляции с отдельными сегментами нуклеиновых кислот, например, способами генной инженерии, такими как способы, описанные в работе Sambrook et al., упомянутой выше. Нуклеиновые кислоты могут быть сконструированы путем химического синтеза и/или на основе реакций ферментативного лигирования по методикам, известным в данной области техники. См., например, упомянутые выше работы Sambrook et al. и Ausubel et al. К примеру, нуклеиновая кислота может быть синтезирована химически с использованием природных нуклеотидов или модифицированных различным образом нуклеотидов, предназначенных для повышения биологической устойчивости молекул или для повышения физической стабильности дуплекса, образующегося при гибридизации (например, тиофосфатных производных и акридин-замещенных нуклеотидов). К примерам модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для создания нуклеиновых кислот, относятся, без ограничения, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, оксипурин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеуозин, инозин, N-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N-замещенный аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусная кислота (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил и 2,6-диаминопурин. В качестве альтернативы одна или несколько нуклеиновых кислот изобретения могут быть приобретены у компаний, таких как Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) и Synthegen (Houston, TX).
Нуклеиновая кислота может содержать любую выделенную или очищенную нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой из CARs или их функциональные части или функциональные варианты. В качестве альтернативы нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность, которая вырождается в любую из последовательностей или комбинацию вырожденных последовательностей.
В варианте осуществления изобретения также предложена выделенная или очищенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, или нуклеотидной последовательности, которая гибридизируется в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
Нуклеотидная последовательность, которая гибридизируется в строгих условиях, может гибридизироваться и в очень строгих условиях. Под выражением «очень строгие условия» подразумевается, что нуклеотидная последовательность специфически гибридизируется с целевой последовательностью (нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе) в количестве, которое сильнее поддается обнаружению, чем неспецифическая гибридизация. К очень строгим условиям относятся условия, которые позволили бы отличить полинуклеотид с точной комплементарной последовательностью или полинуклеотид, содержащий только несколько рассеянных нарушений комплементарности, от случайной последовательности, в которой случайно находятся несколько малых участков (например, 3-10 оснований), которые сопрягаются с нуклеотидной последовательностью. Такие небольшие участки комплементарности плавятся легче, чем непроцессированный комплемент из 14-17 или более оснований, а гибридизация в строгих условиях делает их легко различимыми. Относительно строгие условия могли бы включать, например, условия с низким содержанием соли и/или режим высоких температур, такие как условия, обеспечиваемые примерно 0,02-0,1 М концентрацией NaCl или эквивалентным количеством при температуре около 50-70°C. Такие строгие условия допускают небольшие (при наличии таковых) нарушения комплементарности между нуклеотидной последовательностью и матричной или целевой цепью и, в частности, подходят для обнаружения экспрессии любого из изобретенных CARs. Обычно считают, что условия можно сделать более строгими при добавлении возрастающих количеств формамида.
В изобретении также предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 70% или более, например, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99%, идентична любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
В варианте осуществления нуклеиновые кислоты изобретения могут быть введены в рекомбинантный экспрессирующий вектор. При этом в варианте осуществления изобретения предложен рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот изобретения. Для целей данного изобретения термин «рекомбинантный экспрессирующий вектор» означает генетически модифицированную олигонуклеотидную или полинуклеотидную конструкцию, которая обеспечивает экспрессию иРНК, белка, полипептида или пептида клеткой-хозяином в том случае, когда конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иРНК, белок, полипептид или пептид, а вектор приводится в контакт с клеткой в условиях, достаточных для экспрессии иРНК, белка, полипептида или пептида внутри клетки. Векторы изобретения в целом не являются природными. Однако части векторов могут быть природными. Изобретенные рекомбинантные экспрессирующие векторы могут содержать любой тип нуклеотидов, включая, без ограничения, ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, синтезированными или полученными частично из природных источников и которые могут содержать природные, неприродные или видоизмененные нуклеотиды. Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут содержать природные или неприродные межнуклеотидные связи либо оба типа связей. Предпочтительно, неприродные или видоизмененные нуклеотиды или межнуклеотидные связи не препятствуют транскрипции или репликации вектора.
В варианте осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения может представлять собой любой подходящий рекомбинантный экспрессирующий вектор и может использоваться для преобразования или трансфекции любой подходящей клетки-хозяина. К подходящим векторам относятся векторы, предназначенные для распространения и размножения либо для экспрессии, либо для того и другого, например, плазмиды и вирусы. Вектор может быть выбран из группы, состоящей из серии векторов pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), серии pBluescript (Stratagene, LaJolla, СА), серии pET (Novagen, Madison, WI), серии pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и серии pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Также могут быть использованы бактериофаговые векторы, такие как λGT10, λGT11, λZapll (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. К примерам экспрессирующих векторов растительного происхождения относятся pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). К примерам экспрессирующих векторов животного происхождения относятся pEUK-CI, рМАМ и pMAMneo (Clontech). Рекомбинантным экспрессирующим вектором может быть вирусный вектор, например, ретровирусный вектор.
Ряд способов трансфекции общеизвестен в данной области техники (см., например, Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., см. выше; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); и Chu et al., Gene, 13: 97 (1981)). К способам трансфекции относятся совместное осаждение фосфата кальция (см., например, Graham et al., см. выше), прямая микроинъекция в культивируемые клетки (см., например, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)), электропорация (см., например, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), опосредованный липосомами перенос генов (см., например, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), опосредованная липидами трансдукция (см., например, Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) и доставка нуклеиновой кислоты с помощью высокоскоростных микроснарядов (см., например, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).
В варианте осуществления рекомбинантные экспрессирующие векторы изобретения могут быть получены с помощью стандартных технологий рекомбинантной ДНК, описанные, например, в вышеупомянутых работах Sambrook et al. и Ausubel et al. Конструкции экспрессирующих векторов, которые являются кольцевыми или линейными, могут быть получены с включением репликационный системы, функционирующей в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Репликационные системы могут происходить, например, из ColEI, 2 μ плазмида, λ, SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота и т.п.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать регуляторные последовательности, такие как инициирующие и терминирующие транскрипцию и трансляцию кодоны, которые специфичны к тому виду клетки-хозяина (например, бактериальной, грибковой, растительной или животной), в которую вводится вектор в случае необходимости и с учетом того, основан ли вектор на ДНК или РНК. К примерам последовательностей, включающих терминирующие кодоны, относятся SEQ ID NO: 29 и 30. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать сайты рестрикции для облегчения клонирования. К примерам последовательностей, включающих сайты рестрикции, относятся SEQ ID NO: 26-28.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может включать один или несколько маркерных генов, которые позволяют выбирать трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева. Маркерные гены отвечают за устойчивость к биоцидам, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.д., комплементацию в аукстотрофном организме-хозяине для обеспечения прототрофии и т.п. К подходящим маркерным генам для изобретенных экспрессирующих векторов относятся, например, гены устойчивости к неомицину/G418, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к гистидинолу, гены устойчивости к тетрациклину и гены устойчивости к ампициллину.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать нативный или ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR (включая его функциональные части и функциональные варианты), или с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна или гибридизируется с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR. Выбор промоторов, например, сильных, слабых, индуцируемых, тканеспецифичных и специфичных для развития, находится в пределах компетенции среднего специалиста в данной области техники. Подобным же образом, объединение нуклеотидной последовательности с промотором также находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники. Промотором может являться невирусный промотор или вирусный промотор, например, цитомегаловирусный (CMV) промотор, промотор SV40, промотор респираторно-синцитиального вируса (RSV) или промотор, находящийся в длинном концевом повторе вируса мышиных стволовых клеток.
Изобретенные рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть предназначены либо для транзиентной экспрессии, либо для стабильной экспрессии, либо для того и другого. Кроме того, рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть приготовлены для конститутивной экспрессии или индуцируемой экспрессии.
Более того, рекомбинантные экспрессирующие векторы могут быть получены с включением суицидального гена. Используемый в данном документе термин «суицидальный ген» относится к гену, который вызывает смерть клетки, экспрессирующей суицидальный ген. Суицидальным геном может являться ген, который придает чувствительность к веществу, например, к лекарству, той клетке, в которой экспрессируется ген, и который вызывает смерть клетки при ее контакте с веществом или при воздействии на нее вещества. Суицидальные гены известны в данной области техники (см., например, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Британский центр раковых исследований по лечению раковых заболеваний при Институте исследования рака, Саттон, Суррей, Великобритания), Humana Press, 2004) и включают, например, ген тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV), цитозиндаминазу, пурин-нуклеозидфосфорилазу и нитроредуктазу.
В объем изобретения включены конъюгаты, например, биоконъюгаты, содержащие любой из изобретенных CARs (включаю любую из их функциональных частей или вариантов), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева, популяции клеток-хозяев или антитела либо их антигенсвязывающие части. Конъюгаты, а также способы синтеза конъюгатов в целом известны в данной области техники (см., например, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) и Kirin et al., Inorg Chem. 44 (15): 5405-5415 (2005)).
В варианте осуществления изобретения дополнительно предложена клетка-хозяин, содержащая любой из рекомбинантных экспрессирующих векторов, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» относится к любому виду клетки, которая может содержать изобретенный рекомбинантный экспрессирующий вектор. Клеткой-хозяином может быть эукариотическая клетка, например, из растений, животных, грибов или водорослей, либо прокариотическая клетка, например, из бактерий или простейших живых организмов. Клеткой-хозяином может быть культивируемая клетка или зародышевая клетка, т.е. выделенная непосредственно из организма, например, человеческого организма. Клеткой-хозяином может быть адгезивная клетка или суспензионная клетка, т.е. клетка, которая выращена в суспензии. Подходящие клетки-хозяева известны в данной области техники и включают, например, клетки DH5α E.coli, клетки яичника китайского хомячка, клетки Веро обезьяны, клетки COS, клетки HEK293 и т.п. Для целей амплификации или репликации рекомбинантного экспрессирующего вектора клеткой-хозяином может быть прокариотическая клетка, например, клетка DH5α. Для продуцирования рекомбинантного CAR клеткой-хозяином может быть клетка млекопитающего. Клеткой-хозяином может быть клетка человека. Несмотря на то, что клетка-хозяин может быть клеткой любого вида, может происходить из любого вида тканей и может находиться на любой стадии развития, клеткой-хозяином может быть лимфоцит периферической крови (PBL) или одноядерная клетка периферической крови (РВМС). Клеткой-хозяином может быть T-клетка.
+
+
+
+
+
+
1
2
Для целей настоящего изобретения T-клеткой может быть любая T-клетка, такая как культивируемая T-клетка, например, зародышевая T-клетка, или T-клетка из культивируемой T-клеточной линии, например, Jurkat, SupT1 и т.д., или T-клетка, полученная из млекопитающего. При получении из млекопитающего T-клетка может быть получена из многочисленных источников, включая, без ограничения, кровь, костный мозг, лимфоузел, вилочковую железу либо другие ткани или жидкости. T-клетки также могут быть обогащенными или очищенными. T-клеткой может быть человеческая T-клетка. T-клеткой может быть T-клетка, выделенная из организма человека. T-клетка может относиться к любому виду T-клеток и может находиться на любой стадии развития, включая, без ограничения, CD4/CD8 дважды положительные Т-клетки, CD4 T-хелперы, например, Th и Th-кпетки, CD8 T-клетки (например, цитотоксические T-клетки), противоопухолевые эффекторные клетки, Т-клетки памяти, необученные Т-клетки и т.п. T-клеткой может быть CD8 T-клетка или CD4 T-клетка.
В варианте осуществления изобретения также предложена популяция клеток, содержащая по меньшей мере одну клетку-хозяина, описанную в данном документе. Популяция клеток может быть неоднородной популяцией, содержащей клетку-хозяина, которая содержит любой из описанных рекомбинантных экспрессирующих векторов в дополнение по меньшей мере к одной другой клетке, например, клетке-хозяину (например, T-клетке), которая не содержит какого-либо из рекомбинантных экспрессирующих векторов, или другую клетку, помимо T-клетки, например, B-клетку, макрофаг, нейтрофил, эритроцит, гепатоцит, эндотелиальную клетку, эпителиальную клетку, мышечную клетку, клетку головного мозга и т.д. В качестве альтернативы, популяция клеток может быть по существу однородной популяцией, причем популяция содержит в основном клетки-хозяева (например, состоящие по существу из), содержащие рекомбинантный экспрессирующий вектор. Популяцией также может быть клональная популяция клеток, в которой все клетки популяции являются клонами одиночной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, так что все клетки популяции содержат рекомбинантный экспрессирующий вектор. В варианте осуществления изобретения популяция клеток является клональной популяцией, содержащей клетки-хозяева, которые содержат рекомбинантный экспрессирующий вектор, описанный в данном документе.
CARs (в том числе их функциональные части и варианты), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева (в том числе их популяции) и антитела (в том числе их антигенсвязывающие части), все из которых далее по тексту собирательно именуются «изобретенными CAR материалами», могут быть выделены и/или очищены. Используемый в данном документе термин «выделенный» означает «извлеченный из его природной среды». Термин «очищенный» или «выделенный» не означает абсолютную чистоту или выделение, скорее его надо понимать как относительный термин. Так, например, очищенный (или выделенный) препарат клетки-хозяина представляет собой препарат, в котором клетка-хозяин оказывается более чистой, чем клетки в их природной среде внутри организма. Такие клетки-хозяева могут быть получены, например, стандартными способами очистки. В некоторых вариантах осуществления препарат клетки-хозяина очищен так, что клетка-хозяин составляет по меньшей мере около 50%, например, по меньшей мере около 70% от общего содержания клеток в препарате. Например, чистота может составлять по меньшей мере примерно 50%, может быть более чем примерно 60%, примерно 70% или примерно 80% или может составлять около 100%.
Изобретенные CAR материалы могут находиться в составе композиции, например, фармацевтической композиции. В связи с этим в варианте осуществления изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая какой-либо из CARs, функциональных частей, функциональных вариантов, нуклеиновых кислот, экспрессирующих векторов, клеток-хозяев (включая их популяции) и антител (включая их антигенсвязывающие части) и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретенные фармацевтические композиции, содержащие любой из изобретенных CAR материалов, могут содержать более одного изобретенного CAR материала, например, CAR и нуклеиновую кислоту, либо два и более различных CARs. В качестве альтернативы, фармацевтическая композиция может содержать изобретенный CAR материал в сочетании с другими фармацевтически активными веществами или лекарствами, такими как химиотерапевтические вещества, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит изобретенную клетку-хозяина или популяцию таких клеток.
Изобретенные CAR материалы могут быть представлены в виде соли, например, фармацевтически приемлемой соли. К подходящим фармацевтически приемлемым солям присоединения кислоты относятся соли, которые происходят из минеральных кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, и органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислоты, например, п-толуолсульфоновая кислота.
Что касается фармацевтических композиций, фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любой из традиционно применяемых носителей и ограничен лишь физико-химическими соображениями, такими как растворимость и отсутствие реакционной способности по отношению к активному(ым) веществу(ам), и способом введения. Фармацевтически приемлемые носители, описанные в данном документе, например, основы, адъюванты, эксципиенты и разбавители, хорошо известны специалистам в данной области техники и общедоступны для неопределенного круга лиц. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый носитель представлял собой носитель, который химически инертен по отношению к активному(ым) веществу(ам) и который не имеет негативных побочных эффектов или токсичности в условиях применения.
Выбор носителя будет частично определяться конкретным изобретенным CAR материалом, а также конкретным способом, применяемым для введения изобретенного CAR материала. Соответственно, существуют разнообразные подходящие составы фармацевтической композиции изобретения. Могут быть использованы консерванты. К подходящим консервантам могут относиться, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и бензалкония хлорид. При желании может быть использована смесь двух или более консервантов. Консерванты или их смеси обычно присутствуют в количестве от примерно 0,0001% до примерно 2% от массы всей композиции.
К подходящим буферным веществам могут относиться, например, лимонная кислота, цитрат натрия, фосфорная кислота, фосфат калия и другие различные кислоты и соли. При желании может быть использована смесь двух или более буферных веществ. Буферное вещество или их смеси обычно присутствуют в количестве от примерно 0,001% до примерно 4% от массы всей композиции.
Концентрация изобретенного CAR материала в фармацевтических составах может варьироваться, например, от менее чем примерно 1 масс.%, обычно примерно 10 масс.% или по меньшей мере примерно 10 масс.%, вплоть до от примерно 20 масс.% до примерно 50 масс.% или более, и может быть подобрана главным образом в зависимости от объема жидкости и вязкости в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Способы получения вводимых (например, вводимых парентерально) композиций известны или очевидны специалистам в данной области техники и описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21-oe изд. (1 мая 2005 года).
Следующие составы для перорального, аэрозольного, парентерального (например, подкожного, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, интраперитонеального и интратекального) и местного введения являются всего лишь иллюстративными и никоим образом не ограничивающими. Для введения изобретенных CAR материалов можно применять несколько путей, и в некоторых случаях конкретный путь может обеспечить более быструю и более эффективную ответную реакцию, чем другой путь.
Составы, подходящие для перорального введения, могут содержать или состоять из (a) жидких растворов, таких как растворов эффективного количества изобретенного CAR материала в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (b) капсул, пакетов-саше, таблеток, пастилок и лепешек, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента, в виде твердых веществ или гранул; (c) порошков, (d) суспензий в подходящей жидкости; и (e) подходящих эмульсий. Жидкие составы могут включать разбавители, такие как вода и спирты, например, этанол, бензиновый спирт и полиэтиленгликоли, либо с добавлением, либо без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества. Капсульные формы могут представлять собой обычные желатиновые капсулы с твердой или мягкой оболочкой, содержащие, например, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут включать одно или несколько веществ, выбранных из лактозы, сахарозы, маннита, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, альгиновой кислоты, микрокристаллической целлюлозы, гуммиарабика, желатина, гуаровой камеди, коллоидного диоксида кремния, кроскармеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеарата кальция, стеарата цинка, стеариновой кислоты и других эксципиентов, красителей, разбавителей, буферных веществ, разрыхлителей, увлажняющих веществ, консервантов, ароматизаторов и других фармакологически совместимых эксципиентов. Формы для рассасывания могут содержать изобретенный CAR материал в корригенте, обычно в сахарозе и гуммиарабике или трагакантовой камеди, а также пастилки, содержащие изобретенный CAR материал в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и гуммиарабик, эмульсиях, гелях и других подобных основах, содержащих, кроме того, такие эксципиенты, которые известны в данной области техники.
Составы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают состав изотоническим с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Изобретенный CAR материал может быть введен в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, таком как стерильная жидкость или смесь жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водные растворы декстрозы и родственных сахаров, спирт, такой как этанол или гексадециловый спирт, гликоль, такой как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин, кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, поли(этиленгликоль) 400, масла, жирные кислоты, сложные эфиры или глицериды жирных кислот, или ацетилированные глицериды жирных кислот с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как омыляющее вещество или детергент, суспендирующего вещества, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза, эмульгирующих веществ и других фармацевтических адъювантов.
Масла, которые могут быть использованы в парентеральных составах, включают нефтяное, животное, растительное или синтетическое масло. К особым примерам масел относятся арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное масло. К жирных кислотам, подходящим для применения в парентеральных составах, относятся олеиновая кислота, стеариновая кислота и изостеариновая кислота. Этилолеат и изопропилмиристат являются примерами подходящих сложных эфиров жирных кислот.
К омыляющим веществам, подходящим для применения в парентеральных составах, относятся соли жирных кислот с щелочными металлами, аммонием и триэтаноламином, а к подходящим детергентам относятся (a) катионные детергенты, например, такие как галогениды диметилдиалкиламмония и галогениды алкилпиридиния, (b) анионные детергенты, например, такие как алкил-, арил- и олефинсульфонаты, алкил-, олефин-, эфир- и моноглицеридсульфаты и сульфосукцинаты, (c) неионные детергенты, например, такие как жирные аминоксиды, алканоламиды жирных кислот и полиоксиэтилен-полипропиленовые сополимеры, (d) амфотерные детергенты, например, такие как алкил-β-аминопропионаты и четвертичные аммониевые соли 2-алкил-имидазолина и (e) их смеси.
Парентеральные составы будут, как правило, содержать, например, от примерно 0,5 масс.% до примерно 25 масс.% изобретенного CAR материала в растворе. Могут быть использованы консерванты и буферы. С целью минимизации или устранения раздражения в месте инъекции такие композиции могут содержать одно или несколько неионных поверхностно-активных веществ, гидрофильно-липофильный баланс (HLB) которых составляет, например, от примерно 12 до примерно 17. Количество поверхностно-активного вещества в таких составах будет, как правило, колебаться в пределах, например, от примерно 5 масс.%. до примерно 15 масс.%. К подходящим поверхностно-активным веществам относятся сложные эфиры полиэтиленгликоля, сорбита и жирных кислот, такие как сорбитмоноолеат, и высокомолекулярные аддукты окиси этилена с гидрофобным основанием, образованным конденсацией окиси пропилена с пропиленгликолем. Парентеральные составы могут находиться в герметичных контейнерах для однократного или многократного приема, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в условиях сублимационной сушки (лиофилизированных условиях), при которых требуется только добавление стерильного жидкого эксципиента, например, воды, для инъекций непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии для немедленного приема могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток тех видов, которые были описаны ранее.
В соответствии с вариантом осуществления изобретения имеются инъецируемые составы. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъецируемых составов хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, под ред. Banker and Chalmers, стр. 238-250 (1982), и ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4-ое изд., стр. 622-630 (1986)).
Составы для наружного применения, в том числе составы, пригодные для трансдермального высвобождения лекарства, хорошо известны специалистам в данной области техники и являются подходящими в контексте вариантов осуществления изобретения для нанесения на кожу. Изобретенный CAR материал сам по себе или в сочетании с другими подходящими компонентами может быть внесен в аэрозольные составы, вводимые путем ингаляции. Такие аэрозольные составы можно помещать в приемлемые пропелленты, находящиеся под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Они также могут быть разработаны как лекарственные средства для препаратов, не находящихся под давлением, например, в ингаляторе или распылителе. Такие распыляемые составы также могут быть использованы для орошения слизистой.
Термины «эффективное количество» или «количество, эффективное для лечения» относятся к дозе, достаточной для профилактики или лечения рака у индивидуума. Количества, эффективные для терапевтического или профилактического применения, будут зависеть, например, от стадии и тяжести излечиваемого заболевания или расстройства, возраста, массы тела и общего состояния здоровья пациента, и от решения врача, назначающего лечение. Размер дозы будет также определяться выбранным активным веществом, способом введения, временем и частотой введения, существованием, характером и степенью каких-либо нежелательных побочных эффектов, которые могут сопровождать введение конкретного активного вещества, и желаемым физиологическим эффектом. Специалисту в данной области техники будет понятно, что для разных болезней или расстройств может потребоваться продолжительное лечение, включающее многократные введения, возможно, с применением изобретенных CAR материалов в каждом или разных циклах введения. В качестве примера и без ограничения изобретения доза изобретенного CAR материала может составлять от примерно 0,001 до примерно 1000 мг/кг массы тела подвергаемого лечению субъекта в день, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела в день, от примерно 0,01 до примерно 1 мг/кг массы тела в день. В том случае, когда изобретенным CAR материалом является клетка-хозяин, примерная доза клеток-хозяев может составить, как минимум, один миллион клеток (1 мг клеток на дозу). В том случае, когда изобретенным CAR материалом является нуклеиновая кислота, упакованная в вирусе, примерное количество вируса в дозе может составить 1 нг.
Для целей изобретения количество или доза вводимого изобретенного CAR материала должно(а) быть достаточным(ой) для вызова терапевтической или профилактической ответной реакции у субъекта или животного в течение разумного периода времени. Например, доза изобретенного CAR материала должна быть достаточной для связывания антигена или выявления, лечения или профилактики заболевания в период от примерно 2 часов или дольше, например, от примерно 12 до примерно 24 или более часов, с момента введения. В некоторых вариантах осуществления период времени может быть еще дольше. Доза будет определяться эффективностью конкретного изобретенного CAR материала и состоянием животного (например, человека), а также массой тела животного (например, человека), которого надо лечить.
В целях изобретения для определения исходной дозы, которую следует вводить млекопитающему, может быть использован анализ, который включает, например, сравнение степени, с которой клетки-мишени подвергаются лизису и/или IFN-γ секретируется T-клетками, экспрессирующими изобретенный CAR при введении заданной дозы таких T-клеток млекопитающему, среди нескольких млекопитающих, каждое из которых получает различную дозу T-клеток. Степень, с которой клетки-мишени подвергаются лизису и/или IFN-γ секретируется при введении определенной дозы, может быть оценена способами, известными в данной области техники.
В дополнение к вышеописанным фармацевтическим композициям изобретенные CAR материалы могут быть составлены в виде комплексов включения, таких как комплексы включения циклодекстрина, или в виде липосом. Липосомы могут способствовать нацеливанию изобретенных CAR материалов на конкретную ткань. Липосомы также могут применяться для увеличения периода полувыведения изобретенных CAR материалов. Существует много способов получения липосом, описанных, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) и в патентах США №4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
Системы доставки, пригодные в контексте вариантов осуществления изобретения, могут включать системы доставки с пролонгированным действием, отсроченным высвобождением и с замедленным высвобождением, так что доставка изобретенной композиции происходит до сенсибилизации и со временем, достаточным, чтобы вызвать сенсибилизацию участка, подвергаемого лечению. Изобретенная композиция может быть использована в сочетании с другими терапевтическими веществами и способами лечения. Такие системы помогают избегать повторных введений изобретенной композиции, повышая тем самым удобство для пациента и врача, и могут быть особенно подходящими для определенных вариантов осуществления изобретения.
Многие виды систем доставки с высвобождением доступны и известны обычным специалистам в данной области техники. Они включают системы на основе полимеров, таких как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащих лекарства, описаны, например, в патенте США №5075109. Системы доставки также включают неполимерные системы, которые являются липидами, включающими стероидные спирты, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты или нейтральные жиры, такие как моно, ди- и триглицериды; гидрогелевые системы высвобождения; силастиковые системы; системы на основе пептидов; восковые покрытия; прессованные таблетки с применением традиционных связующих веществ и эксципиентов; частично сплавные импланты; и т.п. К особым примерам относятся, без ограничения: (a) эрозионные системы, в которых активная композиция содержится в форме внутри матрицы, такие как системы, описанные в патентах США №4452775, 4667014, 4748034 и 5239660, и (b) диффузионные системы, в которых активный компонент проникает с контролируемой скоростью из полимера, такие как системы, описанные в патентах США №3832253 и 3854480. Кроме того, могут быть использованы системы доставки на основе насосного оборудования, некоторые из которых приспособлены для имплантации.
Обычному специалисту в данной области техники несложно будет понять, что изобретенные CAR материалы изобретения могут быть модифицированы разными способами, чтобы путем модификации повысить терапевтическую или профилактическую эффективность изобретенных CAR материалов. Например, изобретенные CAR материалы могут быть конъюгированы либо непосредственно, либо косвенно через мостик со специфической функциональной группой. Практика конъюгирования соединений, например, изобретенных CAR материалов, со специфическими функциональными группами известна в данной области техники. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) и патент США №5087616.
В качестве альтернативы, изобретенные CAR материалы могут быть модифицированы в форму депо, чтобы можно было контролировать, каким образом изобретенный CAR материал высвобождается в организме, в который он введен, по времени и расположению внутри организма (см., например, патент США №4450150). Депо-формы изобретенных CAR материалов могут представлять собой, например, имплантируемую композицию, содержащую изобретенные CAR материалы и пористый или непористый материал, такой как полимер, где изобретенные CAR материалы инкапсулированы или рассеяны по всему материалу за счет распада непористого материала. Затем депо имплантируют в желаемое место внутри организма, и изобретенные CAR материалы высвобождаются из импланта с заданной скоростью.
В том случае, когда изобретенные CAR материалы вводят вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими веществами, одно или несколько дополнительных терапевтических веществ могут быть введены млекопитающему совместно. Под «совместным введением» подразумевается введение одного или нескольких дополнительных терапевтических веществ и изобретенных CAR материалов в достаточно близкие моменты времени, так что изобретенные CAR материалы могут усиливать эффект одного или нескольких дополнительных терапевтических веществ, или наоборот. При этом изобретенные CAR материалы могут быть введены вначале, а затем могут быть введены одно или несколько дополнительных терапевтических веществ, или наоборот. В качестве альтернативы, изобретенные CAR материалы и одно или несколько терапевтических веществ могут быть введены одновременно. Примером терапевтического вещества, которое может быть введено совместно с CAR материалами, является IL-2. Полагают, что IL-2 усиливает лечебный эффект изобретенных CAR материалов. Для целей изобретенных способов, где млекопитающему вводят клетки-хозяева или популяции клеток, такие клетки могут быть клетками, которые аллогенны или аутологичны млекопитающему.
Предполагается, что изобретенные фармацевтические композиции, CARs, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева или популяции клеток могут быть использованы в способах лечения или профилактики заболевания у млекопитающего. Вне связи с какой-либо конкретной теорией или механизмом, полагают, что изобретенные CARs обладают биологической активностью, например, способностью распознавать антиген, например, CD22, так что CAR при экспрессии клеткой способен участвовать в иммунном ответе на клетку, экспрессирующую антиген, например, CD22, по отношению к которому CAR является специфичным. В связи с этим в варианте осуществления изобретения предложен способ лечения или профилактики рака у млекопитающего, включающий введение млекопитающему CARs, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессирующих векторов, клеток-хозяев, популяции клеток, антител и/или их антигенсвязывающих частей и/или фармацевтических композиций изобретения в количестве, эффективном для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
Вариант осуществления изобретения дополнительно включает лимфопению млекопитающего перед введением изобретенных CAR материалов. К примерам лимфопении относятся, без ограничения, немиелоаблативная химиотерапия, снижающая общее число лимфоцитов, миелоаблативная химиотерапия, снижающая общее число лимфоцитов, облучение всего организма и т.д.
Для целей изобретенных способов, в которых вводят клетки-хозяева или популяции клеток, такие клетки могут быть клетками, которые аллогенны или аутологичны млекопитающему. Предпочтительно, чтобы клетки были аутологичны млекопитающему.
Млекопитающим, о котором идет речь в данном документе, может быть любое млекопитающее. Используемый в данном документе термин «млекопитающее» относится к любому млекопитающему, включая, без ограничения, млекопитающих из подкласса грызунов, таких как мыши и хомяки, и млекопитающих из подкласса зайцеобразных, таких как кролики. Млекопитающие могут быть из отряда плотоядных, в том числе кошачьи (кошки) и псовые (собаки). Млекопитающие могут быть из отряда парнокопытных, в том числе подсемейство бычьих (коровы) и свиньи, или из отряда непарнокопытных, в том числе семейство лошадиных (лошади). Млекопитающие могут быть из отряда приматов, капуциновых или симоидов (обезьяны) или из отряда антропоидных (люди и человекообразные обезьяны). Предпочтительно, млекопитающим является человек.
Что касается изобретенных способов, раковым заболеванием может быть любой тип рака, в том числе острый лимфоцитарный рак, острый миелолейкоз, альвеолярная рабдомиосаркома, рак мочевого пузыря (например, карцинома мочевого пузыря), рак костей, рак головного мозга (например, медуллобластома), рак молочной железы, рак заднего прохода, анального канала или аноректальный рак, рак глаз, рак внутрипеченочных желчных протоков, рак суставов, рак шеи, желчного пузыря или плевры, рак носа, носовой полости или среднего уха, рак ротовой полости, рак вульвы, хронический лимфолейкоз, хронический миелоидный рак, рак толстой кишки, рак пищевода, рак шейки матки, фибросаркома, желудочно-кишечная карциноидная опухоль, рак головы и шеи (например, плоскоклеточный рак головы и шеи), лимфома Ходжкина, рак гортаноглотки, рак почек, рак гортани, лейкоз, жидкие опухоли, рак печени, рак легких (например, немелкоклеточная карцинома легких), лимфома, злокачественная мезотелиома, мастоцитома, меланома, множественная миелома, рак носоглотки, неходжкинская лимфома, B-хронический лимфолейкоз, лейкоз ворсистых клеток, острый лимфолейкоз (ALL) и лимфома Беркитта, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак брюшной полости, сальника и брыжейки, рак глотки, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечный рак, рак кожи, рак тонкой кишки, рак мягких тканей, солидные опухоли, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы и рак мочеточника. Предпочтительно, раковым заболеванием является гематологическая злокачественная опухоль (например, лейкоз или лимфома, включая, без ограничения, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, хронический лимфолейкоз, острый лимфоцитарный рак, острый миелолейкоз, B-хронический лимфолейкоз, лейкоз ворсистых клеток, острый лимфолейкоз (ALL) и лимфому Беркитта). Предпочтительно, раковое заболевание характеризуется экспрессией CD22.
Термины «лечить» и «предотвращать», а также производные от них слова, используемые в данном документе, необязательно подразумевают 100% или полное лечение или предотвращение. Скорее, они отражают различные степени излечения или профилактики, которые признаются специалистом в данной области техники как оказывающие возможное полезное или терапевтическое действие. В этом отношении изобретенные способы могут обеспечивать любой уровень лечения или профилактики рака у млекопитающего. Более того, лечение или профилактика, обеспечиваемые изобретенным способом, могут включать лечение или профилактику одного или нескольких состояний или симптомов заболевания, например, рака, подвергаемого лечению или профилактике. Кроме того, для целей настоящего изобретения термин «профилактика» может охватывать отсрочку начала заболевания, его симптома или состояния.
В еще одном варианте осуществления изобретения предложено применение изобретенных CARs, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессирующих векторов, клеток-хозяев, популяций клеток, антител или их антигенсвязывающих частей или фармацевтических композиций для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
В еще одном варианте осуществления изобретения предложен способ обнаружения наличия рака у млекопитающего, который включает в себя: (a) взаимодействие пробы, содержащей одну или несколько клеток из млекопитающего, с изобретенными CARs, нуклеиновыми кислотами, рекомбинантными экспрессирующими векторами, клетками-хозяевами, популяцией клеток, антителами и/или их антигенсвязывающими частями с образованием комплекса, (b) обнаружение комплекса, причем обнаружение комплекса свидетельствует о наличии рака у млекопитающего.
Проба может быть получена любым подходящим способом, например, путем биопсии или вскрытия трупа. Биопсия представляет собой удаление ткани и/или клеток из индивидуума. Такое удаление может быть предназначено для сбора ткани и/или клеток индивидуума с целью проведения экспериментов на изъятой ткани и/или клетках. Такое экспериментирование может включать проведение экспериментов для определения, страдал ли и/или страдает ли индивидуум от определенного патологического или болезненного состояния. Патологическим состоянием или заболеванием может являться, например, рак.
Что касается варианта осуществления изобретенного способа обнаружения наличия рака у млекопитающего, проба, содержащая клетки млекопитающего, может представлять собой пробу, содержащую целые клетки, их лизаты или фракцию лизатов целых клеток, например, ядерную или цитоплазматическую фракцию, фракцию цельного белка или фракцию нуклеиновой кислоты. Если проба содержит целые клетки, эти клетки могут представлять собой клетки млекопитающего, например, клетки какого-либо органа или ткани, в том числе кровяные клетки или эндотелиальные клетки.
В рамках изобретенного способа обнаружения взаимодействие может происходить in vitro или in vivo по отношению к млекопитающему. Предпочтительно, взаимодействие протекает in vitro.
Кроме того, обнаружение комплекса может проводиться разными способами, известными в данной области техники. Например, изобретенные TCRs, полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессирующие векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части, описанные в данном документе, могут быть помечены детектируемой меткой, например, такой как радиоизотоп, флуорофор (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
Способы испытания CAR на способность распознавать клетки-мишени и на специфичность к антигену известны в данной области техники. Например, в работе Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999) раскрыты способы Измерения высвобождения цитокинов (например, интерферона-γ, гранулоцитарного/моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF), фактора некроза опухоли (TNF-α) или интерлейкина 2 (IL-2)). Кроме того, функцию CAR можно оценить измерением клеточной цитотоксичности, как описано в Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, конечно, их не следует толковать каким-либо образом, ограничивающим объем изобретения.
ПРИМЕР 1
В данном примере представлен синтез рецепторов CARs к CD22, трансдукция РВМС рецепторами CARs к CD22 и анализ поверхностной экспрессии CAR на трансдуцированных PBMC.
Синтезировали последовательности, кодирующие CAR, с помощью алгоритмов оптимизации кодонов (Mr. Gene GmBH, Регенсбург, Германия) и субклонировали их в векторы «назначения», как описано в (Zhao et al., J. Immunol., 183 (9): 5563-74 (2009)), кодирующие последовательности второго поколения, вариант 1 (трансмембранный домен CD28 и внутриклеточный сигнальный домен Т-клетки CD28 и внутриклеточный сигнальный домен T-клетки CD3-дзета-цепи); второго поколения, вариант 2 (трансмембранный домен CD8, связанный с внутриклеточными сигнальными доменами T-клетки CD137 и CD3-дзета) или третьего поколения (трансмембранный домен CD8, связанный с внутриклеточными сигнальными доменами T-клетки CD28, CD137 и CD3-дзета), как показано в Таблице 1 выше.
Супернатанты ретровирусных векторов создавали трансфекцией клеток 293GP плазмидами, кодирующими ретровирусные векторы CAR и оболочечный гликопротеин RD114, собирая надосадочные жидкости культур (с/н) спустя 48-72 часа. Надосадочные жидкости культур замораживали или использовали немедленно для трансдукции активированных ОКТ3 и IL-2 человеческих РВМС, используя способ «на пластине» в течение последующих 2 дней (культура лимфоцитов на пластинах, покрытых RECTRONECTIN (Takara Bio Inc., Shiga, Япония), предварительно обработанных разбавлениями вектора, содержащего с/н), как ранее описано в Y. Zhao et al., J. Immunol., 183: 5563 (2009). В данном исследовании также использовали ретровирусный с/н, содержащий CD19 специфичный CAR из перманентной линии клеток-продуцентов (Kochenderfer et al., Blood, 116: 4099 (2010)).
2
Экспрессию CAR на трансдуцированных T-клетках определяли методом проточной цитометрии. Для обнаружения CARs, не кодирующих CH2CH3, трансдуцированные T-клетки выдерживали вместе с CD22-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN), а затем с FITC-F(ab'), специфичными к человеческому IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Для обнаружения клеток, экспрессирующих CAR, посредством домена CH2CH3 использовали козий античеловеческий IgG (H&L). HA22SH CAR экспрессирует короткую последовательность константного домена иммуноглобулина вместо CH2CH3. CD19-специфичный CAR не содержит lg участков и был обнаружен с помощью белка L. Биотинилированный белок L (50 нг/мкл, Thermo Scientific, Waltham, MA) связывали, клетки промывали, а затем обнаруживали посредством SA-FITC (4 мкг/мл, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Использовали два разбавления супернатанта, содержащего ретровирусный вектор (1:4 и 1:8). Для сравнения также оценивали с/н вектора CD19-CAR. Эксперименты по проточной цитометрии подтвердили экспрессию рецепторов CARs, приведенных в Таблице 1, на трансдуцированных Т-клетках.
ПРИМЕР 2
В данном примере показана экспрессия антигенов CD22 и CD19 на линиях лейкозных клеток.
Оценивали линии лейкозных клеток человека (REH, SEM, NALM-6, KOPN-8, Daudi, Raji и K562) на уровень экспрессии CD19 и CD22 на клеточной поверхности с использованием набора гранул QUANTI-BRITE PE (BD Biosciences) и РЕ-меченых антител к CD19 и CD22 (Таблица 2). Параметр «количество рецепторов на клетку» указывает на приблизительное абсолютное количество молекул на клетку для каждой из указанных клеточных линий. Результаты рассчитывали путем определения количества связанных антител на клетку (ABC) с помощью средств программного обеспечения CELLQUEST (BD) для анализа данных в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕР 3
В данном примере показано влияние сигнальных мотивов и CH2CH3 на активность CAR in vitro.
51
Чтобы определить, обеспечивали ли конструкции CAR второго или третьего поколения повышенную литическую активность, линии лейкозных клеток метили изотопом Cr и использовали в качестве мишеней при анализе цитолитических T-лимфоцитов (CTL). Эффекторными клетками являлись T-клетки человека, трансдуцированные одним из следующих CARs: HA22 второго поколения (SEQ ID NO: 15), HA22 третьего поколения (SEQ ID NO: 16), BL22 второго поколения (SEQ ID NO: 19), BL22 третьего поколения (SEQ ID NO: 20), HA22-SH второго поколения (SEQ ID NO: 17), HA22-SH третьего поколения (SEQ ID NO: 18), мнимая трансдукция (нетрансдуцированные клетки) и CAR, специфичный к CD19. Эффекторные клетки культивировали совместно с клетками-мишенями при различных соотношениях эффектора к мишени (Э:М). Результаты показаны на Фиг. 1 и Фиг. 6A-6L. Как показано на Фиг. 1 и Фиг. 6A-6H, CARs второго поколения демонстрировали повышенную литическую активность по сравнению с CARs третьего поколения. Более того, как показано на Фиг. 6I-6L, добавление CH2CH3 из IgG1 не оказывает влияния на функцию CAR при анализах in vitro.
ПРИМЕР 4
В данном примере показано, что единицы лизиса могут использоваться для нормализации эффективности трансдукции при анализе различных конструкций CAR.
Для нормализации эффективности трансдукции каждого CAR анализировали эффекторные T-клетки на экспрессию CAR в процентах. После этого соотношение Э:М корректировали на фактическое количество эффекторных клеток на лунку (т.е. соотношение Э:М уменьшали с 10:1 до 5:1, если процентная доля трансдукции составляла 50%). Затем строили график зависимости скорректированного соотношения Э:М от лизиса (в %). Одна единица лизиса соответствует 30% лизису клеток-мишеней при соотношении Э:М 10:1. Под определением функциональных «единиц» подразумевается величина литической активности в каждой сравниваемой популяции трансдуцированных эффекторных клеток. Единицы лизиса отражают связь нормализованных соотношений Э:М с различиями в эффективности трансдукции между конструкциями. На Фиг. 8A-8D показана литическая активность для CARs HA22 28z (SEQ ID NO: 15), HA22 28BBz (SEQ ID NO: 16), BL22 28z (SEQ ID NO: 19), BL22 28BBz (SEQ ID NO: 20), HASH22 28z (SEQ ID NO: 17) или HASH22 28BBz (SEQ ID NO: 18) по отношению к клеточным линиям REH, SEM, NALM-6 или KOPN-8.
ПРИМЕР 5
В данном примере показана литическая активность CARs на основе HA22 и BL22 к CD22.
51
Чтобы определить, приводят ли различия в аффинности к CD22 к различиям в литической активности CAR, сравнивали CARs, кодирующие последовательность scFv фрагмента HA22 и BL22, по анализу высвобождения Cr CTL с использованием четырех линий лейкозных клеток, описанных в примере 2, в качестве мишеней: KOPN8 (Фиг. 2A), NALM6 (Фиг. 2B), REH (Фиг. 3A) и SEM (Фиг. 3В). Сравнивали три различных конструкции CAR второго поколения, вариант 1, к CD22: HA22-CH2CH3 (SEQ ID NO: 15), BL22-CH2CH3 (SEQ ID NO: 19) и HA22-SH (короткая последовательность константного домена иммуноглобулина) (SEQ ID NO: 17). В качестве контроля использовали высокоактивный CAR к CD19. Соотношения Э:М нормализовали в соответствии с процентной трансдукцией каждой отдельной конструкцией CAR, как описано в Примере 4, и сравнивали таким образом непосредственно единицы лизиса. Как показано на Фиг. 2A, клеточная линия KOPN8 продемонстрировала четкое различие в литической активности в зависимости от аффинности scFv. Активность BL22 оказалась существенно ниже, чем активность HA22 (p<0,04) или HASH (p<0,005), при сравнении отдельных соотношений Э:М по критерию Стьюдента (для одной выборки, двухсторонний критерий) для всех соотношений более 1:1. В данном примере показано, что высокоаффинный scFV приводит к более эффективному лизису клеток-мишеней при использовании в конструкциях CAR в некоторых линиях лейкозных клеток и, по-видимому, это различие не связано с уровнем экспрессии CD22.
ПРИМЕР 6
В данном примере показана литическая активность CARs на основе HA22 к CD22.
51
T-лимфоциты активировали посредством OKT3 и IL-2 в течение двух дней, трансдуцировали пустым вектором (мнимая трансдукция) или ретровирусным вектором, экспрессирующим следующие конструкции CAR: HA22 (второго поколения, вариант 1) (SEQ ID NO: 15), HA22 (третьего поколения) (SEQ ID NO: 16), CAR к CD19, HASH22 (второго поколения, вариант 1, короткая последовательность константного домена иммуноглобулина) (SEQ ID NO: 17) или HASH22 (третьего поколения, короткая последовательность константного домена иммуноглобулина) (SEQ ID NO: 18). Трансдуцированные клетки затем исследовали на способность вызывать лизис CD22-экспрессирующих линий лейкозных клеток REH, SEM и NALM6 (Фиг. 4) (8-часовой анализ высвобождения Cr). Эти три клеточные линии также экспрессировали антиген CD19. Соотношение эффектора к мишени составляло 30:1. В качестве антиген-отрицательного контроля включали клеточную линию K562. Как показано на Фиг. 4, CARs к CD22 вызывали эффективный лизис линий лейкозных клеток REH, SEM и NALM6.
ПРИМЕР 7
В данном примере показана литическая активность HASH22 CAR второго поколения, вариант 1.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие HASH22 CAR второго поколения (SEQ ID NO: 17), использовали для генерации супернатанта, содержащего ретровирусный вектор. Эти супернатанты использовали для трансдукции человеческих T-лимфоцитов, а трансдуцированные T-лимфоциты исследовали на способность вызывать лизис клеточных линий, несущих антиген CD22.
T-лимфоциты активировали посредством ОКТ3 и IL-2 в течение двух дней, трансдуцировали супернатантом, содержащим ретровирусный вектор CAR, а затем исследовали на способность вызывать лизис CD22-экспрессирующих линий лейкозных клеток REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji и CD22-отрицательной контрольной клеточной линии K562. В качестве контроля (мнимая трансдукция) T-клетки активировали и культивировали таким же образом, но не подвергали обработке ретровирусным супернатантом, содержащим вектор CAR (нетрансдуцированные клетки).
Результаты показаны на Фиг. 5A и 5B. Лизис опухолевых мишеней практически не наблюдался для контрольных клеток (Фиг. 5A). Лизис клеточных линий REH, SEM и KOPN8 наблюдался в случае клеток, трансдуцированных рецептором HASH22 CAR (Фиг. 5B).
ПРИМЕР 8
В данном примере показано, что клетки, трансдуцированные CAR на основе HA22, замедляют развитие заболевания и продлевают выживаемость in vivo.
6
7
7
2
Не страдающим ожирением диабетическим мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом вводили в начальный момент инъекцию CD22-положительных человеческих лейкозных клеток, сконструированных под экспрессию люциферазы (0,5×10 NALM6-GL (NALM6, трансфицированные люциферазой)). На 3 день мышей обрабатывали контрольными T-клетками («мнимая трансдукция», нетрансдуцированные) в количестве 1×10 или T-клетками в количестве 1×10, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18) или HA22SH-CAR второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32). Измеряли опухолевую массу в течение 30 дней по биолюминесцентному изображению на приборе Xenogen IVIS. Мышам внутрибрюшинно (i.p.) вводили 3 мг D-люциферина (Caliper Life Sciences, Inc.), и через 4 минуты после инъекции проводили визуализацию анестезированных мышей при времени экспозиции 30 секунд. Для анализа биолюминесцентных сигналов, приходящихся на каждую мышь и выражаемых в фотонах/с/см/ср, использовали программное обеспечение LIVING IMAGE. График, построенный по методу Каплана-Мейера, показан на Фиг. 7A.
Как видно из Фиг. 7A, на 3 день все мыши имели одинаковое заболевание. У мышей, обработанных T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18) или HA22SH-CAR второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32), наблюдалось снижение опухолевой массы по сравнению с мышами, обработанными контрольными клетками.
Выживаемость мышей измеряли в течение 30 дней, а статистические данные по выживаемости рассчитывали, используя анализ логарифмического рангового критерия (Мантела-Кокса); результаты по выживаемости показаны на Фиг. 7B. Как видно из Фиг. 7B, у мышей, обработанных T-клетками, трансдуцированными HASH22 CAR второго поколения, вариант 1 (SEQ ID NO: 17), HASH22 CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 18) или HA22SH-CAR второго поколения, вариант 2 (SEQ ID NO: 32), наблюдалась повышенная выживаемость по сравнению с мышами, обработанными контрольными клетками.
Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитированные в данном документе, включены сюда по ссылке в такой же степени, как если бы каждая ссылка была включена по отдельности и с конкретным указанием включения по ссылке и изложена в данном документе в полном объеме.
Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «содержащий в себе» следует толковать как неограничивающие термины (т.е. подразумевающие «в том числе, без ограничения»), если не указано иное. Указание диапазонов значений в данном документе призвано служить лишь в качестве сокращенного способа индивидуально сослаться на каждое отдельное значение, попадающее в указанный диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание в такой же мере, как если бы оно было приведено в данном документе индивидуально. Все описанные в данном документе способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иное со всей очевидностью не противоречит контексту. Использование любого или всех примеров или иллюстративных выражений (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено лишь для лучшего освещения изобретения и не ставит каких-либо ограничений на объем изобретения, если не заявлено иное. Формулировки, использованные в описании, не следует толковать как указывающие на то, что какой-либо незаявленный элемент существенен для воплощения изобретения на практике.
Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения описаны в данном документе, в том числе наилучший способ, известный авторам изобретения, для осуществления этого изобретения. Вариации этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидны средним специалистам в данной области техники по прочтении вышеизложенного описания. Авторы изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты применят такие вариации при необходимости, и авторы изобретения полагают, что данное изобретение может быть воплощено на практике иным образом, отличным от описанного в конкретной форме в данном документе. Соответственно, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты объектов, перечисленных в формуле изобретения, прилагаемой к данному документу, насколько это допускается применимым законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных его вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иное со всей очевидностью не противоречит контексту.