СПОСОБ ОЦЕНКИ МИГРАЦИИ КЛЕТОК В СТРУКТУРУ МАТЕРИАЛА ИЛИ СКАФФОЛДА
METHOD OF ESTIMATING CELL MIGRATION INTO STRUCTURE OF MATERIAL OR SCAFFOLD

Предполагаемое изобретение относится к биомедицине, медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки миграции клеток в толщу материала или скаффолда.
В настоящее время благодаря развитию новых уникальных технологий во всем мире разрабатываются биосовместимые конструкции и материалы, расширяющие применение биомедицинских продуктов для замещения или восстановления поврежденных или утраченных тканей и органов. Одной из базовых характеристик, которой должны обладать материалы и скаффолды, предназначенные для заселения клетками и создания биомедицинских продуктов - это пористость («Tailoring the pore structure of PCL scaffolds for tissue engineering prepared via gas foaming of multi-phase blends» Salerno, Maio, Iannace, Netti Journal of Porous Materials volume 19, pagesl81-188 2012). Наличие системы взаимосвязанных пор позволяет клеткам заселить материал или скаффолд и нормально функционировать в дальнейшем, что, в конечном счете, обеспечивает целостность создаваемого биомедицинского клеточного продукта и его интеграцию в ткани реципиента при имплантации. Заселение материала / скаффолда происходит при высеве клеток на их поверхность in vitro либо путем рекрутинга клеток из окружающих тканей после его имплантации (Rnjak-Kovacina, J., Wise, S., Li, Z., Maitz, P., Young, C, Wang, Y., and Weiss, A. «Tailoring the porosity and pore size of electrospun synthetic human elastin scaffolds for dermal tissue engineering». Biomaterials 32, 6729, 2011; Freed LE1, Vunjak-Novakovic G, Biron RJ, Eagles DB, Lesnoy DC, Barlow SK, Langer R. «Biodegradable polymer scaffolds for tissue engineering». Biotechnology 1994 Jul; 12(7):689-93.). Клетки должны мигрировать в структуру материала / скаффолда и заселить создаваемый на их основе конструкт. В тоже время наличие пористости материала / скаффолда как таковой еще не гарантирует успешной миграции клеток в его структуру. Так, малый размер пор, отсутствие межпоровых пространств, особенности свойств поверхности внутренней структуры и т.д. могут препятствовать миграции клеток и не позволить им заселить материал / скаффолд (Takahashi, Y., and Tabata, Y. «Effect of the fiber diameterand porosity of non-woven PET fabrics on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells». J Biomater Sci Polym Ed 15, 41, 2004). В связи с этим оценка миграции клеток в структуру образцов является одним из важнейших показателей при разработке материалов / скаффолдов. Однако, новые материалы / скаффолды часто являются плотными и непрозрачными, в связи с чем они становятся недоступными для исследования обычными оптическими методами. Поэтому разработка новых способов оценки миграции клеток в структуру материала /скаффолда является актуальной задачей, решение которой позволит на этапе in vitro разработки материалов / скаффолдов спрогнозировать возможность их заселения клетками и провести отбор наиболее перспективных образцов для дальнейшей разработки биомедицинских продуктов. Прогнозирующее тестирование in vitro новых материалов / скаффолдов требует современных ревалентных способов, позволяющих проводить не только качественную, но и количественную оценку. Такой подход является неотъемлемой частью во время доклинических исследований в качестве предварительного этапа перед началом исследований in vivo. В тоже время, существующие методы оценки миграционной способности клеток не являются универсальными и часто позволяют оценить только миграционную активность самих клеток, но не их миграционную способность в структуру материала. Так, например, одними из самых распространенных методов оценки миграционной активности клеток in vitro является оценка миграции клеток с помощью камеры Брейдона или теста "раны монослоя" клеток (Э.В. Бойко, Д.С. Мальцев, В.О. Полякова Влияние рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа на клеточную культуру пигментного эпителия сетчатки человека // Вестник офтальмологии 2017, 1, С. 42-48). Данный метод оценки миграции клеток имеет ряд преимуществ, как то не требует специального оборудования или реагентов. Через несколько часов после "ранения" монослоя направленная коллективная миграция легко оценивается и определяется количественно. Однако данный способ не может использоваться с целью оценки миграции клеток в структуру материала. Он позволяет проводить оценку миграционной способности непосредственно культуры клеток и клеток под воздействием, например, тестируемых жидкостей.
В качестве прототипа выбран способ, применяемый для оценки миграционной способности фибробластов кожи человека (ФЧ), мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК-ЖТ) и эпидермальных кератиноцитов (ЭКЦ), в толщу непрозрачного 3D пластического материала в виде губки толщиной 10 мм (Рахматуллин Рамиль Рафаилевич «Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии» Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М: 2014), включающий предварительное трансфицирование ФЧ геном зеленого флуоресцирующего белка EGFP под CMV-промотором или предварительное трансфицирование геном красного флуоресцирующего белка TagRFP под CMV-промотором (МСК-ЖТ, ЭКЦ) при помощи лентовирусной конструкции, после чего клетки можно наблюдали на губке с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа Olympus IX51 (Olympus, Япония) по видеозаписи с трехсуточными циклами на протяжении периода культивирования до 26 суток.
5
6
Способ, представленный в прототипе, требует дорогостоящих, изготавливаемых только под заказ расходных материалов, в частности конструирование лентивирусного вектора, кодирующего указанную заказчиком последовательность ДНК под контролем универсального промотора цитомегаловируса человека (CMV). Еще одним недостатком является длительность и трудоемкость способа, так как наработка лентивирусных частиц с необходимым титром (с титром 10-10 TU/мл) требует затрат временного ресурса, кроме того работа с конструированием лентивирусов проводится в ограниченном количестве биотехнологических компаний, как в России, так и за рубежом, что резко ограничивает применимость метода. В предложенном способе, в качестве репортерных генов использовали сразу два цветных флуоресцентных белка: зеленый флуоресцирующий белок EGFP для фибробластов кожи человека и красный флуоресцирующий белок TagRFP для мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека (МСК-ЖТ) и эпидермальных кератиноцитов. Следовательно, все перечисленные денежные и временные затраты увеличиваются как минимум вдвое. В итоге, для реализации всего способа необходимы редкие, изготавливаемые только под заказ, лентивирусные конструкции, дорогостоящие технологии и значительные временные затраты.
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - удешевление, сокращение временных затрат, трудоемкости и повышение доступности способа для оценки миграции клеток в структуру материала /скаффолда.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем высев культуры клеток на исследуемый образец и оценку их миграции в толщу материала с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии, на образцы материала или скаффолда высевают интактные мезенхимальные стволовые клетки или фибробласты, затем последовательно через 24, 72 и 144 часа образцы с клетками окрашивают флуорохромом, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, проводят флуоресцентную микроскопию в 10 полях зрения с послойной съемкой по оси Z на глубину миграции клеток в структуру образца, с фиксацией глубины залегания ядер клеток относительно поверхности образца и последующим расчетом скорости миграции клеток в структуру материала или скаффолда по формуле: A=B/t, где А - скорость миграции клеток в структуру образца материала или скаффолда (μm/ч); В - средняя величина глубины миграции клеток в структуру образца по 10 полям зрения (μm); t - время с момента высева клеток на поверхность образца до момента исследования.
Способ оценки миграционной способности клеток в структуру материала или скаффолда осуществляют следующим образом:
2
2
2
Шаг 1. На образцы материала или скаффолда высевают культуру мезенхимальных стволовых клеток или дермальных фибробластов человека с плотностью высева 10 тыс./см. Образцы помещают в СO-инкубатор и культивируют при 37°С и 5% СO.
Шаг 2. В контрольные сроки (например, 24, 72 или 144 часа), образец материала помещают в 24-луночный планшет для флуоресцентной микроскопии с непрозрачными боковыми стенками. Затем проводят прижизненное окрашивание ядер клеток, высеянных на образец флуорохромом, обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (например, флуорохром Hoechst 33342). Для этого в лунку, содержащую образец и 2 мл культуральной среды (DMEM или α-МЕМ содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки), добавляют прижизненный краситель, который обладает высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК, согласно инструкции производителя (например, 1 мкл раствора Hoechst 33342 в концентрации 10 мкг/мл). Планшет помещают в термостат и инкубируют в течение 30 мин. при 37°С. После инкубации образец дважды отмывают фосфатным буфером. Затем к образцу добавляют 1 мл фосфатного буфера для предотвращения пересыхания образца.
Шаг 3. Планшет образцом переносят на оборудование, позволяющее проводить широкопольную флуоресцентную микроскопию (например, имиджер Cytation™ 5). В 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проводят послойную съемку по оси Z. Съемку по оси Z проводят, используя функцию Z-stack, от первой клетки (которая лежит на поверхности материала) до последней клетки (которая максимально глубоко мигрировала в толщу материала).
Шаг 4. Снимки в количестве 10 штук полученные по п. 3 обрабатываются с целью наблюдения трехмерного распределения клеток по структуре материала. Проводят анализ послойных снимков материала с клетками от верхних слоев к более глубоким, фиксируя начальный уровень поверхности образца (Н) и глубину миграции клеток в структуру материала (М) - глубину залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца). Для каждого поля зрения рассчитывают абсолютное значение глубины миграции клеток по формуле Г=М-Н. Рассчитывают среднюю величину глубины миграции клеток в структуру материала по 10 полям зрения (В) по формуле В=(Г1+Г2+…Г10)/10, где Г1 - абсолютное значение глубины миграции клеток на снимке 1, Г2 - абсолютное значение глубины миграции клеток на снимке 2. и т.д.
Шаг 5. Проводят расчет скорости миграции клеток в структуру материала по формуле: A=B/t, где А - скорость миграции клеток в структуру образца материала или скаффолда (μm/ч); В - средняя величина глубины миграции клеток в структуру образца по 10 полям зрения (μm); t - время с момента высева клеток на поверхность образца до момента исследования.
Полученные данные позволяют оценить миграцию клеток в структуру материала или скаффолда по изменению значения Z-stack в течение времени и расчитать скорость миграции клеток.
Способ оценки миграции клеток в структуру материала или скаффолда поясняется фигурами, приложенными к данному описанию.
Фиг. 1. Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Начальный уровень поверхности образца, глубина по оси Z=106 μm.
Фиг. 2 Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок, глубина по оси Z=318 μm.
Фиг. 3 Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок, глубина по оси Z=530 μm.
Фиг. 4. Пример микрофотоснимка исследуемого образца, полученного при послойной съемке по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Глубина по оси Z=689 μm, глубже ядра клеток не фиксировались.
Фиг. 5 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Начальный уровень поверхности образца - по оси Z=105 μm.
Фиг.6 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=119μm.
Фиг. 7 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=134μm.
Фиг. 8 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=148μm.
Фиг. 9 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Промежуточный микрофотоснимок - по оси Z=162μm.
Фиг. 10 Пример получаемых фотографий с образца с послойной съемкой по оси Z с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии. Финальный снимок - глубина по оси Z=177 μm.
Достижение заявленного технического результата подтверждается следующими примерами.
Пример 1.
Пример 2.
Пример 1
Для оценки миграции клеток в структуру костнозамещающего материала на основе гидроксиапатита, коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов был взят образец материала и согласно представленному способу, на его поверхность были высеяны интактные мезенхимальные стволовые клетки, как описано в шаге 1 данного способа. Далее согласно шагам 2-4 данного способа через 72 часа была проведена окраска и широкопольная флуоресцентная микроскопия с послойной съемкой по оси Z на имиджере Cytation™5. В результате в 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на глубину визуализации от поверхности образца (первой клетки на поверхности) до последней клетки в структуре материала (Фиг. 1-4) с фиксацией глубины миграции клеток в структуру материала (глубины залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца) и последующим расчетом скорости миграции клеток в структуру материала согласно шагу 5 данного способа.
Согласно полученным результатам костнозамещающии материал, в состав которого входит гидроксиапатит, коллаген и сульфатированные гликозаминогликаны, позволяет клеткам проявлять высокую миграционную способность в структуру материала. Клетки в среднем мигрировали на глубину 594 μm со 8,25 μm/ч (Табл. 1).
Пример 2
Для оценки миграционной способности клеток были взят образец скаффолда сформированного на основе олигоэфир(мет)акрилатов. На образцы скаффолда были высеяны интактные фибробласты, как описано в шаге 1 представленного способа. Далее, согласно шагам 2-4 способа через 144 часа была проведена окраска и исследование с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии с послойной съемкой по оси Z на имиджер Cytation™ 5. В результате в 10 полях зрения с использованием объектива с 4-кратным увеличением проведена послойная съемка по оси Z на глубину визуализации от первой (на поверхности) до последней (в толще материала) клетки, с фиксацией глубины миграции клеток в структуру материала (глубины залегания ядер в структуре образца относительно поверхности образца) и последующим определением скорости миграции клеток в структуру материала согласно шагу 5 данного способа (Фиг. 5-10).
Таким образом, предложенный способ позволяет оценить миграцию клеток в структуру материала или скаффолда и определить скорость и время миграции клеток.
Согласно полученным результатам образец скаффолда сформированного на основе олигоэфир(мет)акрилатов не позволял клеткам активно мигрировать в структуру материала. Клетки в среднем мигрировали на глубину 67μm со 0,47 μm/ч (Табл. 2).
Таким образом, предложенный способ позволяет получить объективные данные позволяющие оценить миграцию клеток в структуру материала / скаффолда с использованием стандартных методов высева интактных клеток на исследуемый образец и достаточно простых и распространенных методов окрашивания образцов с их исследованием методом широкопольной флуоресцентной микроскопии. Способ не требует дорогостоящих, изготавливаемых только под заказ расходных материалов, а реализуется с использованием стандартных флуорохромов, что значительно удешевляет реализацию и повышает доступность представленного способа. Несомненным преимуществом способа является то, что он не требует длительных, сложных и трудоемких подготовок (например, наработка лентивирусных частиц с необходимым титром), требующих больших временных затрат, а реализуется стандартными методами, доступными многим биотехнологическим лабораториям. Использование для оценки миграции клеток в структуру материала/скаффолда съемки по 10 полям зрения по оси Z с фиксацией залегания глубины ядер позволяет объективно и с высокой степенью точности не только качественно охарактеризовать возможность миграции клеток в структуру (толщу) исследуемых, но и дать количественную оценку процесса рассчитав скорость миграции клеток.