БОРЬБА С ЖЕСТКОКРЫЛЫМИ НАСЕКОМЫМИ-ВРЕДИТЕЛЯМИ
FIGHTING COLEOPTEROUS PESTS

ОБЛАСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение относится, в общем, к борьбе с вредителями, которые вызывают повреждение сельскохозяйственных культур при процессах питания, а конкретнее к борьбе с жесткокрылыми вредителями посредством композиции, включающей синергичные уровни активного в отношении жесткокрылых белкового токсина и активного в отношении чешуекрылых белкового токсина. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции и способам использования такой композиции, включающей белковые токсины.
ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Жесткокрылые насекомые считаются некоторыми из наиболее важных вредителей сельскохозяйственных культур. Например, виды кукурузного корневого червя являются наиболее разрушительными вредителями кукурузы, вызывая убытки, оцениваемые более чем в 1 миллиард долларов ежегодно. Важные виды вредителя - кукурузного корневого червя включают: Diabrotica virgifera virgifera, западный кукурузный корневой червь; D. longicornis barberi, северный кукурузный корневой червь, D. undecimpunctata howardi, южный кукурузный корневой червь, и D. virgifera zeae, мексиканский кукурузный корневой червь. Колорадский жук (СРВ; Leptinotarsa decemlineatd) является другим примером жесткокрылого насекомого, которое представляет собой серьезного вредителя картофеля, томата и баклажана по всему миру.
[0003] С жесткокрылых вредителей, главным образом, контролируют посредством интенсивных применений химических пестицидов, которые действуют через ингибирование роста насекомых, предотвращение питания насекомых или размножения или вызывают гибель. Можно, таким образом, достигнуть соответствующего контроля насекомых, но эти химические вещества могут иногда также влиять на других полезных насекомых. Другой проблемой, возникающей в результате широкого применения химических пестицидов, является появление резистентных видов насекомых. Ее частично уменьшили посредством различных агротехнических приемов в отношении резистентности, но существует увеличивающаяся потребность в альтернативных средствах контроля вредителей.
[0004] Cry-белки Bacillus thuringiensis (Bt) (также называемые δ-эндотоксины) представляют собой белки, которые формируют кристаллический матрикс в Bacillus, которые, как известно, обладают инсектицидной активностью при поглощении определенными насекомыми. Более 180 голотипов Cry-белков в 58 семействах были идентифицированы и названы. Различные Cry-белки были классифицированы на основе их спектра активности и гомологии последовательности. До 1990 главные классы определяли по их спектру активности (Hofte and Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255), но совсем недавно была разработана новая номенклатура, которая систематически классифицирует Cry-белки на основе гомологии аминокислотной последовательности, скорее чем на особенностях целевых насекомых (Crickmore et al. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62: 807-813).
[0005] Гены, кодирующие Cry-белки, были выделены, а их экспрессия в сельскохозяйственных культурах, как было показано, обеспечивала другой инструмент для контроля важных с экономической точки зрения насекомых-вредителей. Такие трансгенные растения, экспрессирующие Cry-белки, были коммерциализированы, давая возможность фермерам уменьшать или увеличивать применения химических средств контроля насекомых. Активные в отношении жесткокрылых Cry-белки, пригодные для трансгенных растений, включают, например, Cry3A, Cry3B и комплекс Cry34/Cry35. Примеры активных в отношении чешуекрылых Cry-белков, которые были экспрессированы в трансгенных растениях, включают, например, Cry1A (например, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac), Cry1B, Cry1F и Cry2, в числе прочих.
[0006] Другое семейство инсектицидных белков, продуцируемых видами Bacillus в течение вегетативной стадии роста (вегетативные инсектицидные белки (Vip)), были также идентифицированы. В патентах США №№5877012, 6107279 и 6137033, которые включены в данном документе посредством ссылки, описывается новый класс инсектицидных белков под названием Vip3. В других раскрытиях, включая WO 98/18932, WO 98/33991, WO 98/00546 и WO 99/57282, были также идентифицированы гомологи белков класса Vip3. Последовательности, кодирующие Vip3, кодируют приблизительно 88 кДа белки, которые обладают инсектицидной активностью в отношении широкого спектра чешуекрылых вредителей, включая, но без ограничений, совку-ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), совку травяную (FAW, Spodoptera frugiperdd), листовертку-почкоеда табака (TBW, Heliothis virescens), точильщика сахарного тростника, (SCB, Diatraea saccharalis), точильщика кукурузного стебля малого (LCB, Elasmopalpus lignosellus) и совку хлопковую (CEW, Helicoverpa zea), а при экспрессии в трансгенных растениях, например, кукурузе (Zea mays), предоставляют защиту для растения от повреждения, вызываемого при поедании насекомым.
[0007] Существует постоянная потребность в композициях и способах применения таких композиций с инсектицидной активностью, например, для применения при защите сельскохозяйственных культур или контроле болезни, опосредованной насекомыми. Необходимо, чтобы новые композиции преодолели проблему устойчивости к существующим инсектицидам или предотвратили развитие устойчивости к существующим подходам с использованием трансгенных растений. В идеале такие композиции обладают высокой токсичностью и являются эффективными при оральном поглощении целевым вредителем. Таким образом, любое изобретение, которое обеспечило композиции, в которых любые из этих свойств усилены, будет представлять шаг вперед в настоящем уровне техники.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Настоящее изобретение обеспечивает улучшенные композиции и способы контроля жесткокрылых насекомых-вредителей, которые включает нанесение на место, где жесткокрылое насекомое может поглотитьсинергетически эффективное количество по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых токсина и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых токсина. Дополнительно обеспечивается способ усиленной защиты трансгенной сельскохозяйственной культуры от повреждения, вызванного нападением и заражением жесткокрылыми насекомыми.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0009] Для ясности, определенные выражения, применяемые в настоящем описании, определяют и представляют следующим образом.
[0010] «Активность» означает, что белковые токсины и комбинации таких токсинов действуют как орально активные средства контроля насекомых, оказывают токсическое действие или способны нарушать или сдерживать питание насекомых, которые могут или не могут вызывать гибель насекомого. Если композицию настоящего изобретения доставляют насекомому, результатом является типично гибель насекомого, или насекомое не питается источником, который делает доступной композицию насекомому. Такой композицией может быть трансгенное растение, экспрессирующее комбинации токсинов настоящего изобретения. Одним примером является трансгенная кукуруза, экспрессирующая модифицированный Cry3A-белок и Cry1Ab-белок, который вызывает синергичную активность в отношении питания кукурузного корневого червя на трансгенной кукурузе.
[0011] «Контроль» или «контролирование» насекомых означает подавлять посредством токсического действия способность насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничить связанное с насекомыми повреждение или потерю сельскохозяйственных культур. «Контроль» насекомых может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя это предпочтительно означает уничтожение насекомых.
[0012] Как используется в данном документе, выражение «кукуруза» означает Zea mays или маис и включает все сорта растений, которые можно скрещивать с кукурузой, включая виды дикого маиса.
[0013] «Доставлять» или «доставка» композиции или токсина означает, что композиция или токсин контактирует с насекомым, приводя к токсическому действию и борьбе с насекомым. Данную композицию или токсин можно доставлять многими признанными способами, например, орально путем поглощения насекомым при посредстве экспрессии в трансгенном растении, составленной белковой композиции(ий), распыляемой белковой композиции(ий), матрицы с приманкой или любой другой признанной в настоящем уровне техники системы доставки токсина.
[0014] «Эффективное количество для контроля насекомых» означает ту концентрацию токсина или токсинов, которая подавляет посредством токсического действия способность насекомых выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничивает связанное с насекомыми повреждение или потерю сельскохозяйственных культур. «Эффективное количество для контроля насекомых» может означать или может не означать уничтожение насекомых, хотя оно предпочтительно означает уничтожение насекомых.
[0015] «Кассета экспрессии», как используется в данном документе, означает нуклеиновокислотную последовательность, способную к направленной экспрессии отдельной последовательности нуклеиновой кислоты в соответствующей клетке хозяина, включающую промотор, функционально связанный с представляющей интерес последовательностью нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с сигналами терминации. Она также типично, включает последовательности, необходимые для надлежащей трансляции последовательности нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии, включающая представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, может быть химерной, означая, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из ее других компонентов. Кассета экспрессии может также быть таковой, что встречается в природе, но была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Типично, однако, кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. отдельная последовательность нуклеиновой кислоты кассеты экспрессии не встречается в природе в клетке хозяина, и ее следовало вводить в клетку хозяина или предшественник клетки хозяина путем явления трансформации. Экспрессия последовательности нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию, только когда клетка хозяина подвергается воздействию определенного отдельного внешнего стимула. В случае многоклеточного организма, такого как растение, промотор может также быть специфичным к отдельной ткани, или органу или стадии развития.
[0016] «Событие MIR604», или «MIR604 событие», или «MIR604» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в патенте США №7361813 (включен в данный документ посредством ссылки), которое имеет включенный в ее геном трансген cry3A055, раскрытый в патенте США №7230167, и трансген pmi, раскрытый в патенте США №5767378. Таким образом, MIR604, включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Cry3A055 (модифицированный Cry3A или mCry3A), пригодный для контроля насекомых-вредителей кукурузных корневых червей (Diabrotica spp.), и второй трансген, кодирующий фермент фосфоманнозоизомеразу (PMI), пригодный в качестве выбираемого маркера, который дает возможность кукурузе использовать маннозу в качестве источника углерода.
[0017] «Событие MIR162», или «MIR162 событие», или «MIR162 событие» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в международной публикации WO 07/142840, в геном которого включен трансген vip3Aa20 и трансген pmi. Таким образом, MIR162 включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Vip3Aa20, пригодный для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, и второй трансген, кодирующий фермент фосфоманнозоизомеразу (PMI), пригодный в качестве выбираемого маркера, который дает возможность кукурузе использовать маннозу в качестве источника углерода.
[0018] «Событие Bt11», или «Bt11 событие», или «Bt11 событие» означает трансгенное событие кукурузы, раскрытое в патенте США №6114608 (включен в данной документ посредством ссылки), в геном которого включен трансген cry1Ab и трансген pat. Таким образом, Bt11 включает первый трансген, кодирующий инсектицидный белок Cry1Ab, пригодный для контроля чешуекрылых насекомых-вредителей, и второй трансген, кодирующий фермент PAT, пригодный в качестве выбираемого маркера, который предоставляет кукурузе устойчивость к гербицидам.
[0019] «Ген» представляет собой определенную область, которая локализована внутри генома и которая кроме вышеупомянутой кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты включает другие, в первую очередь регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты, ответственные за контроль экспрессии, иными словами транскрипции и трансляции, кодирующего участка. Ген может также, включать другие 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и последовательности терминации. Дополнительными элементами, которые могут присутствовать, являются, например, интроны.
[0020] «Ген, представляющий интерес» относится к любому гену, который при перенесении в растение, предоставляет растению необходимую особенность, такую как устойчивость к антибиотикам, устойчивость к вирусам, устойчивость к насекомым, устойчивость к болезням или устойчивость к другим вредителям, устойчивость к гербицидам, улучшенную пищевую ценность, улучшенную продуктивность в промышленном процессе или измененную репродуктивную способность. «Ген, представляющий интерес» может также являться таковым, который переносят в растения для продукции коммерчески ценных ферментов или метаболитов в растении.
[0021] Как используется в данном документе, выражение «растениевод» означает человека или субъекта, который занимается сельским хозяйством, выращивая живые организмы, такие как сельскохозяйственные культуры, для пищевых или сырьевых материалов.
[0022] «Гетерологичная» последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, по природе не связанную с клеткой хозяина, в которую ее вводят, включая не встречающиеся в природе множественные копии встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты.
[0023] «Гомологичная» последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, по природе связанную с клеткой хозяина, в которую ее вводят.
[0024] «Инсектицидная» определяется как токсичная биологическая активность, способствующая контролю насекомых, предпочтительно путем их уничтожения.
[0025] «Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты или выделенный белок представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты или белок, который благодаря человеку находится отдельно от его естественного окружения и, таким образом, не является природным продуктом. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты или белок могут находиться в очищенной форме или могут находиться в неестественном окружении, таком как, например, рекомбинантная клетка хозяина. Например, нативный Cry-белок в Bacillus thuringiensis не выделен, но тот же самый Cry-белок в трансгенном растении является выделенным.
[0026] «Модифицированный Cry3A (mCry3A)» означает ген или белок, пригодный для контроля насекомых-вредителей кукурузных корневых червей (Diabrotica spp.), раскрытый в патенте США №7030295, опубликованном 18 апреля 2006, который в данный документе включен посредством ссылки.
[0027] «Молекула нуклеиновой кислоты» или «последовательность нуклеиновой кислоты» представляет собой линейный сегмент одно- или двухцепочечной ДНК или РНК, которую можно выделить из любого источника. В контексте настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой предпочтительно сегмент ДНК.
[0028] «Растение» представляет собой любое растение на любой стадии развития, в частности семенное растение.
[0029] «Растительная клетка» представляет собой структурную и физиологическую единицу растения, включающую протопласт и клеточную стенку. Растительная клетка может находиться в форме выделенной одиночной клетки или культивируемой клетки или в качестве части более высокоорганизованной единицы такой как, например, ткань растения, орган растения или целое растение.
[0030] «Культура растительных клеток» означает культуры растительных единиц, таких как, например, протопласты, клетки в культуре клеток, клетки в тканях растения, пыльце, пыльцевых трубках, семязачатках, зародышевых мешках, зиготах и зародышах на различных стадиях развития.
[0031] «Растительный материал» относится к листьям, стеблям, корням, цветкам или частям цветков, плодам, пыльце, яйцеклеткам, зиготам, семенам, отросткам, клеточным или тканевым культурам или любым другим частям или продуктам растения.
[0032] «Орган растения» представляет собой отдельные и видимо структурированные и дифференцированные части растения, такие как корень, стебель, лист, цветочная почка или зародыш.
[0033] «Ткань растения», как используется в данном документе, означает группу растительных клеток, организованных в структурную и функциональную единицу. Любая ткань растения inplanta или в культуре включена. Данное выражение включает, но без ограничений, целые растения, органы растений, семена растений, тканевую культуру и любые группы растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Применение данного выражения в сочетании с или в отсутствие любого специфичного типа ткани растения, как перечислено выше или в в отношениином случае охвачено данным определением, не предназначено для исключения любого другого типа ткани растения.
[0034] «Трансформация» представляет собой процесс введения гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина или организм. В частности, «трансформация» означает стабильную интеграцию молекулы ДНК в геном представляющего интерес организма.
[0035] «Трансформированный/трансгенный/рекомбинантный» относится к организму хозяина, такому как бактерия или растение, в который ввели гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты может стабильно интегрироваться в геном хозяина, или молекула нуклеиновой кислоты может также присутствовать в качестве внехромосомной молекулы. Такая внехромосомная молекула может быть самореплицирующейся. Подразумевается, что трансформированные клетки, ткани или растения охватывают не только конечный продукт процесса трансформации, но также их трансгенное потомство. «Нетрансформированный», «нетрансгенный» или «нерекомбинантный» хозяин относится к организму дикого типа, например, бактерии или растению, которые не содержат гетерологичную молекулу нуклеиновой кислоты.
[0036] Класс белков «Vip3», включает, например, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba и Vip3Bb, и их гомологи. «Гомолог» означает, что обозначенный белок или полипептид имеет определенное отношение к другим членам белков класса Vip3. «Vip3Aa20» (номер доступа в GeneBank DQ539888) представляет собой Vip3 гомолог присущий только событию MIR162. Он был создан посредством спонтанных мутаций, введенных в оптимизированный для кукурузы ген vip3Aa19 (номер доступа в GeneBank DQ539887) в течение процесса трансформации растения.
[0037] Номенклатура, применяемая в данном документе для оснований ДНК и аминокислот, является такой, как изложено в 37 C.F.R. § 1.822.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] Настоящее изобретение относится к композициям и способам синергичного контроля жесткокрылых насекомых-вредителей, которое, включает нанесение на место, где жесткокрылое насекомое может питаться, синергетически эффективной композиции, содержащей по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых токсин и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых токсин. В настоящем уровне техники хорошо известно, что если два независимых белка не являются токсичными по отдельности, они не будут токсичными при комбинировании. Также хорошо известно, что, комбинируя белок без активности в отношении целевого вредителя с белком, активным в отношении этого целевого вредителя, неактивный белок не увеличит активность уже активного белка.
[0039] Согласно настоящему изобретению в данной работе было неожиданно обнаружено, что применение комбинации по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых белкового токсина и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых белкового токсина демонстрирует значительное синергичное действие (то есть конечный контроль жесткокрылых насекомых значительно больше чем тот, которую можно было предвидеть из контроля жесткокрылых насекомых активным в отношении жесткокрылых токсином, применяемым отдельно). Данное синергичное действие обеспечивает коммерчески применимый уровень контроля жесткокрылых насекомых и помогает уменьшить развитие устойчивости насекомых к отдельному токсину.
[0040] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ контроля жесткокрылого насекомого-вредителя, причем способ включает доставку жесткокрылому вредителю или в его окружающую среду композиции, содержащей по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где данная композиция контролирует жесткокрылого вредителя в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в эту композицию отдельно.
[0041] В одном аспекте данного варианта осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, а активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В еще одном варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab.
Примеры Cry1Ab-белка имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (ААА22330), Cry1Ab2 (ААА22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1AbS (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1Ab14 (AAG16877), Cry1Ab15 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления Cry1Ab-белок является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A-белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.
[0042] В еще одном аспекте данного варианта осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В другом варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.
[0043] В другом варианте осуществления охваченного способа данная композиция представляет собой трансгенное растение, экспрессирующее активный в отношении жесткокрылых белок и активный в отношении чешуекрылых белок. В одном аспекте данное трансгенное растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В еще одном аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604 и Bt11. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604, Bt11 и MIR162.
[0044] В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ контроля вредителя-кукурузного корневого червя, причем способ включает доставку вредителю-кукурузному корневому червю или в его окружающую среду композиции, содержащей модифицированный белок Cry3A (mCry3A) и белок Cry1Ab, где данная композиция контролирует вредителя-кукурузного корневого червя в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет белка mCry3A отдельно.
[0045] В другом варианте осуществления данная композиция представляет собой трансгенную кукурузу. В еще одном варианте осуществления трансгенная кукуруза, включает событие MIR604 и событие Bt11.
[0046] В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает композицию для контроля жесткокрылых, содержащую по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где данная композиция контролирует жесткокрылых вредителей в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в данную композицию отдельно.
[0047] В одном аспекте данного варианта осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, и активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В другом варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab. Примеры белка Cry1Ab имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (AAA22330), Cry1Ab2 (AAA22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1Ab8 (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1Ab14 (AAG16877), Cry1Ab15 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления белок Cry1Ab является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry1F, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист в данной области техники признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.
[0048] В еще одном аспекте данного варианта осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В другом варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.
[0049] Еще в одном варианте осуществления данная композиция представляет собой трансгенное растение, экспрессирующее активный в отношении жесткокрылых белок и активный в отношении чешуекрылых белок. В одном аспекте трансгенное растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В другом аспекте трансгенное растение представляет собой трансгенную кукурузу. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604 и Bt11. В другом аспекте трансгенная кукуруза представляет собой селекционный гибрид, включающий трансгенные события кукурузы MIR604, Bt11 и MIR162.
[0050] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ обеспечения растениевода средствами контроля популяции жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий поставку или продажу растениеводу трансгенных семян, включающих нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один активный в отношении жесткокрылых белок и по меньшей мере один активный в отношении чешуекрылых белок, где трансгенные растения, выращенные из указанных семян, контролируют жесткокрылых вредителей в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет любого отдельного активного в отношении жесткокрылых белка, включенного в него отдельно.
[0051] В другом варианте осуществления активный в отношении жесткокрылых белок представляет собой модифицированный Cry3A, а активный в отношении чешуекрылых белок представляет собой белок Cry1 или белок Vip3. В еще одном варианте осуществления Cry1-белок представляет собой Cry1Ab. Примеры белка Cry1Ab имеют следующие номера доступа в GenBank: Cry1Ab1 (AAA22330), Cry1Ab2 (AAA22613), Cry1Ab3 (AAA22561), Cry1Ab4 (BAA00071), Cry1Ab5 (CAA28405), Cry1Ab6 (AAA22420), Cry1Ab7 (CAA31620), Cry1Ab8 (AAA22551), Cry1Ab9 (CAA38701), Cry1Ab10 (A29125), Cry1Ab11 (112419), Cry1Ab12 (AAC64003), Cry1Ab13 (AAN76494), Cry1AbH (AAG16877), Cry1AM5 (AA013302), Cry1Ab16 (AAK55546), Cry1Ab17 (AAT46415), Cry1Ab18 (AAQ88259), Cry1Ab19 (AAW31761), Cry1Ab20 (ABB72460), Cry1Ab21 (ABS18384), Cry1Ab22 (ABW87320), Cry1Ab23 (HQ439777), Cry1Ab24 (HQ439778), Cry1Ab25 (HQ685122) и Cry1Ab26 (HQ847729). Еще в одном варианте осуществления белок Cry1Ab является тем белком, который включен в событие Bt11 и раскрыт в патенте США №6114608. Специалист в данной области техники признает, что другие активные в отношении жесткокрылых Cry-белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry3B, Cry8 и Cry34/Cry35. Специалист в данной области техники также признает, что другие активные в отношении чешуекрылых белки являются пригодными в настоящем изобретении, включая, но без ограничений, Cry1E, Cry IF, Cry1G, Cry1H, Cry1J, Cry2A и Cry9. Белок Vip3 можно выбрать из группы, состоящей из Vip3A, Vip3B и Vip3C. В одном варианте осуществления Vip3A белок представляет собой Vip3Aa20. Однако специалист в данной области техники признает, что другие белки Vip3 являются пригодными в настоящем изобретении.
[0052] Еще в одном варианте осуществления жесткокрылый вредитель представляет собой колорадского жука или кукурузного корневого червя. В одном варианте осуществления кукурузный корневой червь представляет собой западного кукурузного корневого червя, северного кукурузного корневого червя, южного кукурузного корневого червя или мексиканского кукурузного корневого червя.
[0053] В другом варианте осуществления семена трансгенного растения и растение выбирают из группы, состоящей из сои, хлопка, рапса, канолы, овощей, подсолнечника, табака, томата, сахарного тростника, риса, пшеницы, кукурузы, ржи, ячменя, дерна и фуражной сельскохозяйственной культуры. В другом варианте осуществления семена трансгенного растения и растение представляет собой семена и растение трансгенной кукурузы.
[0054] Коэкспрессия по меньшей мере одного активного в отношении жесткокрылых белка и по меньшей мере одного активного в отношении чешуекрылых белка в том же самом трансгенном растении может быть достигнута при помощи генной инженерии растения, чтобы оно содержало и экспрессировало все гены, необходимые в так называемом молекулярном гибриде. В качестве альтернативы растение, исходное растение 1, можно подвергать генной инженерии для экспрессии определенных генов, кодирующих инсектицидные белки настоящего изобретения. Второе растение, исходное растение 2, можно подвергать генной инженерии для экспрессии других определенных генов, кодирующих инсектицидные белки настоящего изобретения. Путем скрещивания исходного растения 1 с исходным ратстением 2 получают потомство растений, которые экспрессируют все гены, введенные исходным растениям 1 и 2, обозначенные в данном документе как "селекционный гибрид". Такой селекционный гибрид для создания композиции настоящего изобретения может быть достигнут путем скрещивания кукурузы, включающей событие MIR604, с кукурузой, включающей событие Bt11. Таким образом, потомство селекционного гибрида включает белок mCry3A и белок Cry1Ab, раскрытые в данном документе, для обеспечения синергичного контроля жесткокрылых насекомых-вредителей.
[0055] Композиции настоящего изобретения, например, семена трансгенного растения, можно также обрабатывать инсектицидным покрытием для семян, как описано в патентах США №№5849320 и 5876739, которые включены в данный документ посредством ссылки. Где как инсектицидное покрытие для семян, так и трансгенные семена настоящего изобретения являются активными в отношении того же самого целевого насекомого, причем данная комбинация является пригодной (i) в способе дополнительного усиления активности синергичной композиции настоящего изобретения в отношении целевого насекомого и (ii) в способе предотвращения развития устойчивости к композиции настоящего изобретения посредством обеспечения еще одного механизма действия в отношении целевого насекомого. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ усиления активности в отношении или предотвращения развития устойчивости целевого насекомого, например, кукурузного корневого червя, включающий нанесение инсектицидного покрытия для семян на трансгенные семена настоящего изобретения. Такие химические обработки могут включать инсектициды, фунгициды или нематоциды. Примеры таких инсектицидов включают, без ограничений, динотефуран, такой как тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, нитенпирам, нидинотефуран, хлорфенапир, тебуфенпирад, тебуфенозид, метоксифенозид, галофенозид, триазамат, авермектин, спиносад, фипринол, ацефат, фенамифос, диазинон, хлорпирифос, хлорпирифон-метил, малатион, карбарил, алдикарб, карбофуран, тиодикарб и оксамил. Даже в том случае, когда инсектицидное покрытие для семян является активным в отношении разных насекомых, инсектицидное покрытие для семян является пригодным для расширения диапазона контроля насекомых, например, посредством добавления инсектицидного покрытия для семян, которое проявляет активность в отношении чешуекрылых насекомых, на трансгенные семена настоящего изобретения, которые проявляет активность в отношении жесткокрылых насекомых, при этом полученные покрытые трансгенные семена контролируют как чешуекрылых, так и жесткокрылых насекомых-вредителей.
ПРИМЕРЫ
[0056] Настоящее изобретение будет далее описано посредством ссылки на следующие подробные примеры. Эти примеры обеспечивают только для иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Стандартные методики рекомбинантной ДНК и молекулярного клонирования, применяемые в данной работе, хорошо известны в настоящем уровне техники и описаны J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); T.J. Silhavy, M.L. Herman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) и Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), и Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).
Пример 1. Взаимодействие между токсинами в отношении колорадского жука
[0057] В данном примере влияния mCry3A на токсичность Cry1Ab и влияния Cry1Ab на токсичность mCry3A измеряют при помощи биоанализов, тестируя инсектицидные белки отдельно и в комбинации. Событие кукурузы Bt11 и событие кукурузы MIR604 экспрессируют инсектицидные белки Cry1Ab и модифицированный Cry3A (mCry3A), соответственно. Cry1Ab является активным в отношении определенных Lepidoptera, в то время как mCry3A является активным в отношении некоторых видов Coleoptera. В Соединенных Штатах (США) основное применение кукурузы Bt11 предназначено для контроля мотылька кукурузного (Ostrinia nubilalis; ECB), а главными целями кукурузы MIR604 являются западный кукурузный корневой червь (Diabrotica virgifera virgifera; WCR) и северный кукурузный корневой червь (Diabrotica longicornis barberi; NCR). Посредством обычных селекционных гибридов растений Bt11 и MIR604 были созданы гибриды маиса Bt11 х MIR604 с пакетированными генами, продуцирующие как Cry1Ab, так и mCry3A. Эти гибриды маиса обеспечивают борьбу с ECB, а также WCP и NCR.
[0058] Применяемыми индикаторными организмами являются ECB первой личиночной стадии, который является высокочувствительным к Cry1Ab и колорадский жук первой личиночной стадии (Leptinotarsa decemlineata; СРВ), который является высокочувствительным к mCry3A. ECB является нечувствительным к mCry3A, а СРВ является нечувствительным к Cry1Ab. Хотя СРВ не является целевым вредителем маиса MIR604 или Bt11 х MIR604, он является более восприимчивым к лабораторному тестированию, чем виды корневого червя, намеченные посредством mCry3A. Личинки как ECB, так и СРВ легко подвергать биоанализу с применением стандартных искусственных сред при тех же самых лабораторных условиях. Поскольку первые личиночные стадии этих видов являются высокочувствительными либо к Cry1Ab, либо к mCry3A, возможность обнаружения многих значительных изменений в токсичности любого белка максимизирована. В каждом комбинаторном биоанализе каждый чувствительный вид подвергается воздействию высокой и низкой концентрации токсина, представленного LC70 и LC30, соответственно, в комбинации с высокой концентрацией не относящегося к токсину вещества, представленного LC90, в соответствующих чувствительных видах.
[0059] Различные схемы эксперимента доступны для тестирования взаимодействий между токсинами. Схема зависит от модели, применяемой для прогнозирования влияния смесей токсинов без взаимодействия, из влияния соединений отдельно; взаимодействие обнаруживают, когда наблюдаемые влияния смеси отличаются от предположений модели. Когда токсины оказывают подобные влияния так, что одно соединение можно заменить как постоянную часть другого, нулевая модель называется подобным совместным действием. Когда эту модель применяют, в тесте на взаимодействие определяют дозозависимый ответ для фиксированного соотношения соединений (например, Tabashnik, 1992). Когда токсины действуют независимо (разные механизмы действия), самая лучшая модель представляет собой независимое совместное действие, а в тесте на взаимодействие изучают влияния варьирующих частей соединений в факторной схеме (например, Tajima et al., 2002). Обширные массивы данных для Cry1Ab и mCry3A указывают на то, что организмы, чувствительные к одному белку не будут чувствительными к другому белку; другими словами, только одно соединение является токсичным для отдельного организма, а нулевая гипотеза заключается в том, что смесь не оказывает дополнительного влияния. В таких ситуациях взаимодействие изображается разницей между токсичностью белка А отдельно и его токсичностью в присутствии белка В. Для организма, чувствительного к белку А, в сущности, не существует дозозависимого ответа на белок В и, следовательно, нет оснований ожидать, что концентрация белка В влияет на токсичность белка А. Таким образом, тестирование влияния белка В при фиксированной концентрации представляет собой простой и эффективный способ тестирования любого взаимодействия. Этот способ наиболее похож на «простой эмпирический подход», описанный Tabashnik (1992).
[0060] Взаимодействие между двумя инсектицидными белками обнаруживают как статистически значимую разницу между смертностью, наблюдаемой с отдельным токсичным белком, и смертностью, наблюдаемой, когда второй белок добавляют в комбинации с токсичным белком. ЕСВ первой личиночной стадии подвергают воздействию Cry1Ab при LC30 и LC70 отдельно и в комбинации с высокой концентрацией mCry3A, соответствующей LC90 для СРВ первой личиночной стадии. Соответственно, СРВ первой личиночной стадии подвергают воздействию mCry3A при LC30 и LC70 отдельно и в комбинации с высокой концентрацией Cry1Ab, соответствующей LC90 для ЕСВ первой личиночной стадии.
[0061] Подвергание воздействию чувствительных видов как при их LC30, так и LC70, дает возможность оценить потенциальное взаимодействие со вторым белком в двух отдельных точках на кривой зависимости «доза-ответ». Воздействие второго белка в концентрации, которая является высокотоксичной (LC90) для чувствительных видов, обеспечивает достаточно сильное воздействие, чтобы обнаружить любую биологически релевантную токсичность, если существует взаимодействие между двумя белками.
[0062] Источники Cry1Ab и mCry3A, применяемые в биоанализах, являются тестируемыми веществами, продуцируемыми путем сверхэкспрессии каждого белка в рекомбинантной Е. coli с последующей очисткой. Cry1Ab и mCry3A, которые содержатся в этих тестируемых веществах, являются в значительной степени эквивалентными инсектицидным белкам, которые экспрессированы в Bt11 и MIR604 трансгенных растениях кукурузы, соответственно. Применение очищенных белков, продуцируемых в микроорганизмах, является предпочтительным для применения полученных из растений препаратов Cry1Ab и mCry3A. Относительно более высокая чистота полученных из микроорганизмов тестируемых веществ предусматривает более точные определения токсичности без вмешательства со стороны растительных веществ. Эти растительные вещества возможно не присутствуют в равных количествах в материалах, полученных как из Bt11-, так и MIR604, а также в контрольных материалах, и могут искажать интерпретацию результатов биоанализов.
[0063] Получение тестируемого вещества Cry1Ab: тестируемое вещество Cry1Ab, как определяется, содержит приблизительно 127 мкг Cry1Ab/мл тестируемого вещества (0,0127% вес/объем). После приготовления тестируемое вещество хранят при приблизительно 4°С. Процессированный трипсином Cry1Ab в тестируемом веществе соответствует приблизительно процессированному Cry1Ab, закодированному в кукурузе Bt11. Процессированный белок Cry1Ab, закодированный в кукурузе Bt11, представляет первые 615 N-концевых аминокислот нативного белка полной длины Cry1Ab из В. thuringiensis подвида kurstaki. При сравнении преобладающая форма процессированного трипсином Cry1Ab в тестируемом веществе представляет собой белок из 587 аминокислот, представляющий тот же самый Процессированный белок Cry1Ab, присутствующий в кукурузе Bt11, минус первые 28 N-концевых аминокислот (Kramer, 2006). Трипсинизация Cry1Ab в кукурузе Bt11 удаляет эти 28 N-концевых аминокислот (которые не нужны для инсектицидной активности) и дополнительно демонстрирует существенную эквивалентность продуцированного Е. coli процессированного трипсином Cry1Ab и процессированного Cry1Ab, продуцированного в Bt11, как измерено посредством SDSPAGE, Вестерн-блоттинга, N-концевого секвенирования, пептидного картирования, биологической активности в отношении новорожденных личинок ЕСВ и отсутствия детектируемого гликозилирования. Таким образом, процессированный белок Cry1Ab, присутствующий в тестируемом веществе, можно считать в значительной степени эквивалентным процессированному белку Cry1Ab, закодированному в маисе Bt11.
[0064] Получение тестируемого вещества mCry3A: тестируемое вещество mCry3A, как определяется, содержит приблизительно 90% белка mCry3A по весу, чтобы обладать биоактивностью в отношении чувствительных видов жесткокрылых и, как показано, в значительной степени является эквивалентным mCry3A, которое продуцируется в событии кукурузы MIR604, как оценивалось посредством различных биохимических и функциональных параметров. После приготовления тестируемое вещество mCry3A хранят при приблизительно -20°С.
4
3
[0065] Оценка LC30, LC70 и LC90 в отношении дозозависимого ответа ЕСВ на Cry1Ab: биоактивность Cry1Ab оценивается в анализах питания насекомых с применением личинок ЕСВ первой личиночной стадии в соответствии со стандартными способами, известными в настоящем уровне техники. Вкратце, биоанализы проводят в 24-луночных планшетах Costar (Fisher Scientific, № по каталогу PD 10-047-05). Тестируемые растворы готовят посредством разведения жидкого тестируемого вещества Cry1Ab в 0,6 мкМ аммоний-карбонатного буфера. Сто мкл каждого разбавления добавляют к 100 мкл питательной среды для ЕСВ (General Lepidopteran Diet от BioServe, Inc.; Френчтаун, Нью-Джерси, США) и тщательно перемешивают. Питательную среду для насекомых ЕСВ готовят в соответствии со способами, известными в настоящем уровне техники. Каждая лунка содержит 200 мкл питательной среды для насекомых, содержащей концентрации Cry1Ab, находящиеся в диапазоне от 3 до 372 нг/мл питательной среды. Каждая обработка состоит из 24 лунок с повторностями, содержащих одну личинку ЕСВ/лунку. Планшеты поддерживают в лабораторных условиях окружающей среды, что касается температуры, освещения и относительной влажности. Для контроля ошибки случайной выборки личинки случайным образом помещают в группы обработки. В качестве контроля личинки подвергаются воздействию питательной среды для насекомых без тестируемого вещества (питательная среда отдельно); питательной среды для насекомых, обработанной той же самой концентрацией буфера, используемого при применении самой высокой концентрации тестируемого вещества в питательной среде (100 мкл приблизительно 0,6 мкМ 50 мМ NHHCO, pH 9,25, буфера/100 мл питательной среды); и питательной среды, обработанной раствором термоинактивированного тестируемого вещества Cry1Ab (30 минут при 100°С) в концентрации, эквивалентной самой высокой концентрации тестируемого вещества (372 нг Cry1Ab/мл питательной среды), применяемого в биоанализе. Обработка термоинактивированным белком служит в качестве контроля для потенциальных влияний добавленных белков в питательной среде для насекомых и примесей (т.е. компоненты, не относящиеся к Cry1Ab) в тестируемом веществе. Смертность оценивается через приблизительно 144 часа.
[0066] US EPA Probit Analysis Program, версия 1.5, US EPA, 1992 применяют для определения значений LC50 и LC90; к тому же, применяли уравнение углового коэффициента для регрессии логарифма дозы пробит-взамодействия для определения значений LC30 и LC70 в сочетании с пробит-таблицей с нормальным распределением (Geigy Scientific Tables, Lentner, 1982). Другие пробит-программы можно также применять.
[0067] Оценка LC30, LC70 и LC90 в отношении дозозависимого ответа СРВ на mCry3A: применяя тестируемое вещество mCry3A, LC30, LC70 и LC90 mCry3A в отношении СРВ первой личиночной стадии определяются тем же самым способом, как тот, который описывается выше для ЕСВ, применяя стандартные способы, известные в настоящем уровне техники. Тестируемые растворы готовят посредством растворения лиофилизованного тестируемого вещества в воде MilliQ. Сто мкг каждого разбавления добавляют к 100 мкг питательной среды для СРВ (BioServe, Inc., Френчтаун, Нью-Джерси, США) и тщательно перемешивают. Питательную среду для насекомых СРВ готовят с применением способов, известных в настоящем уровне техники. Каждая лунка содержит 200 мкл питательной среды для насекомых с концентрацией mCry3A, находящейся в диапазоне от 0,01 до 5 мкг/мл питательной среды. В качестве контролей личинки подвергают воздействию питательной среды для насекомых без добавленного тестируемого вещества (питательная среда отдельно), питательной среды для насекомых, обработанной тем же самым объемом воды MilliQ, используемой при применении раствора тестируемого вещества в питательной среде отдельно, и питательной среды, обработанной раствором термоинактивированного белка mCry3A из тестируемого вещества (30 минут при 100°С) в концентрации, эквивалентной самой высокой концентрации тестируемого вещества (5 мкг mCry3A/мл питательной среды), применяемого в биоанализе. Смертность оценивается через 96 часов.
[0068] Оценка влияния mCry3A на токсичность Cry1Ab: Влияние mCry3A на токсичность Cry1Ab измеряют путем подвергания воздействию ЕСВ первой личиночной стадии LC30 (эквивалентна 27 нг Cry1Ab/мл питательной среды) и LC70 (эквивалентна 70 нг Cry1Ab/мл питательной среды) Cry1Ab и путем сравнения смертности в присутствии и отсутствии mCry3A. Концентрацию mCry3A, соответствующую LC90 для СРВ (эквивалентна 2,4 мкг mCry3A/мл питательной среды), определяют, как описано выше.
[0069] Биоанализ взаимодействия осуществляют с применением тех же самых культуральных методик и условий, описанных выше, за исключением того, что 24-луночные культуральные планшеты применяют в трех повторностях для каждой обработки. Каждый планшет с обработкой содержит 24 личинки, в общей сложности 72 личинки на обработку. В качестве контролей личинки подвергают воздействию питательной среды для насекомых без тестируемого вещества (питательная среда отдельно); питательной среды для насекомых, обработанной той же самой концентрацией буфера, используемой в применении самой высокой концентрации тестируемого вещества питательной среде (100 мкл приблизительно 0,6 мкМ 50 мМ NH4HC03, рН 9,25 буфера/100 мл питательной среды); питательной среды обработанной раствором термоинактивированного Cry1Ab (30 минут при 100°C) в концентрации, эквивалентной самой высокой концентрации Cry1Ab (372 нг Cry1Ab/мл питательной среды), применяемой в биоанализе; и mCry3A в дозе 2,4 мкг/мл питательной среды, соответствующей LC90 mCry3A в отношении СРВ. Питательную среду для СРВ, обработанную LC70 (эквивалентна 1,4 jug mCry3A/мл питательной среды) mCry3A в отношении СРВ, применяют в качестве параллельного позитивного контроля, чтобы подтвердить инсектицидную активность mCry3A. Смертность оценивается через приблизительно 144 и 168 часов. Полный биоанализ взаимодействия с ЕСВ проводят дважды.
[0070] Оценка влияния Cry1Ab на токсичность mCry3A: Влияние Cry1Ab на токсичность mCry3A измеряют путем подвергания воздействию СРВ первой личиночной стадии LC30 (эквивалентна 0,62 мкг mCry3A/мл питательной среды) и LC70 (эквивалентна 1,35 p.g mCry3A/мл питательной среды) концентраций mCry3A и путем сравнения смертности в присутствии и отсутствии Cry1Ab. Концентрация Cry1Ab составляет LC90 для ЕСВ (эквивалентна 142 нг Cry1Ab/мл питательной среды). Число повторных обработок и анализа данных о смертности СРВ являются такими же самыми, как описано выше.
[0071] Биоанализы взаимодействия осуществляют с применением тех же самых культуральных методик и условий, описанных выше, за исключением того, что 24-луночные культуральные планшеты применяют в трех повторностях для каждой обработки. Каждый планшет для обработки содержит 24 личинки, в общей сложности 72 личинки на обработку. В качестве контролей личинки подвергают воздействию питательной среды для насекомых без тестируемого вещества (питательная среда отдельно), питательной среды для насекомых, обработанной тем же самым объемом воды MilliQ, используемой при применении раствора тестируемого вещества в питательной среде отдельно, питательной среды, обработанной раствором термоинактивированного Cry1Ab (30 минут при 100°C) в концентрации, эквивалентной самой высокой концентрации mCry3A (5 мкг mCry3A/мл питательной среды), применяемой в биоанализе, и Cry1Ab в дозе 142 нг/мл питательной среды соответствующей LC90 Cry1Ab в отношении ЕСВ. Питательную среду для ЕСВ, обработанную концентрацией LC70 (эквивалентна 70 нг Cry1Ab/мл питательной среды) Cry1Ab в отношении ЕСВ, применяют в качестве параллельного позитивного контроля, чтобы подтвердить инсектицидную активность Cry1Ab, применяемого в комбинаторном биоанализе. Смертность оценивается приблизительно через 72 и 96 часов. Полный биоанализ взаимодействия с ЕСВ проводят дважды.
[0072] Статистические способы: в каждом исследовании несколько критериев должны соответствовать экспериментальной схеме и анализу данных, описанных ниже, чтобы являться достоверным и эффективным тестом на взаимодействие между белками: (1) отсутствует влияние буфера, применяемого для растворения белков; (2) отсутствует влияние добавления белка per se; или (3) «не относящееся к токсину вещество» не является токсичным для нечувствительных к биоанализу видов в концентрациях, применяемых в данном эксперименте. Эти критерии соответствуют экспериментам как с ЕСВ, так и с СРВ.
[0073] Как только наблюдают смертность в биоанализах, смертность документируют каждый день до тех пор, пока смертность не составляет приблизительно 30% при обработке LC30 и 70% при обработке LC70. Данные из каждого сбора проб в пределах исследования взаимодействия с каждым белком анализируют по отдельности. При каждом сборе образцов отдельные анализы осуществляют для каждого анализа отдельно и для сводных данных от обоих анализов.
[0074] При каждом сборе образцов в каждом биоанализе проанализированный ответ представляет собой долю с преобразованием арксинуса квадратного корня мертвых личинок в каждой повторности. Влияния различных обработок тестируют посредством дисперсионного анализа. Для обоих экспериментов (с ЕСВ и СРВ) два анализа анализируют по отдельности и совместно (если применимо). Важнейшее предположение дисперсионного анализа является таковым, что существует гомогенность дисперсии между обработками, а остатки нормально распределяются. Маловероятно, что это действительно, если включены обработки негативного контроля, поскольку доля мертвых личинок равна нулю во многих повторностях. Это представляет собой отдельную проблему для дисперсионного анализа по данным с преобразованием арксинуса квадратного корня. Таким образом, данные негативного контроля исключают из анализа, поскольку их подтверждение из предположений способа является очевидным без статистического анализа. Для анализов, проанализированных по отдельности, осуществляют дисперсионный анализ с влиянием на обработку. Критерий Левена (SAS, 2002-2003) применяют, чтобы проверить предположение о гомогенности дисперсии в пределах каждой из четырех обработок, а критерий Шапиро-Уилка (SAS, 2002-2003) применяют, чтобы проверить предположение о нормально распределенных остатках. Для анализа совместных анализов осуществляют дисперсионный анализ с влиянием на анализ и обработку. Критерий Шапиро-Уилка применяют, чтобы проверить предположение о нормально распределенных остатках. Никакого формального тестирования предположения о гомогенности дисперсии не осуществляют, поскольку критерий Левена нельзя применять, если присутствует более чем одно влияние в дисперсионном анализе (SAS, 2002-2003). Однако визуальное сравнение графиков с данными по преобразованию арксинуса квадратного корня применяют, чтобы подтвердить, что гомогенность дисперсионного предположения была действительной для сводных данных.
[0075] Факторная структура обработок дает возможность исследовать три влияния: (1) основное влияние токсичного белка (Влияет ли концентрация токсина на ответ?); (2) основное влияние нетоксичного белка (Влияет ли присутствие не относящегося к токсину вещества на ответ?), и (3) взаимодействие между концентрацией токсина и присутствием не относящегося к токсину вещества (Зависит ли влияние не относящегося к токсину вещества от концентрации токсина, и зависит ли влияние концентрации токсина от присутствия не относящегося к токсину вещества?).
[0076] Влияния исследуют путем составления сравнительных комбинаций условий, что фокусируется на данном влиянии при удалении других влияний. Это достигается посредством изучения соответствующих комбинаций средних значений обработки (комбинация средних значений обработки известна в качестве сравнения). Каждое сравнение представляет собой сумму отдельных коэффициентов сравнения, умноженную на связанные с ними средние значения обработки. Статистическую значимость каждого сравнения можно оценить при соответствующей нулевой гипотезе. Нулевая гипотеза для трех пунктов состоит в следующем: (1) Но: ответ при низких и высоких концентрациях токсичного белка является тем же самым; (2) Но: ответ является тем же самым с или без нетоксичного белка; и (3) Но: любые влияния токсичных и нетоксичных белков действуют независимо друг от друга.
[0077] Каждое сравнение рассчитывают при величине ошибки первого рода 5% с применением оценки ошибки из дисперсионного анализа. При сравнении 2 комбинаций условий тестируют, присутствует ли синергизм (или антагонизм) между двумя белками. Таким образом, если нулевая гипотеза для сравнения 2 отклоняется, тогда данные обеспечивают доказательства синергизма (или антагонизма). Дополнительное изучение знака любых значительных сравнений определяет, присутствует ли синергизм или антагонизм (например, значение позитивного сравнения 2 указывает на большую смертность когда присутствует нетоксичный белок, следовательно синергизм).
[0078] Средние значения и стандартные отклонения комбинаторных биоанализов рассчитывают с применением Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ
[0079] Оценка LC30. LC70 и LC90 для Cry1Ab в отношении ЕСВ: биоактивность, оцененная для Cry1Ab в отношении личинки кукурузного мотылька, показала LC30 приблизительно 27, LC70 приблизительно 70 и LC90 приблизительно 142 нг Cry1Ab/мл питательной среды через 144 часа. Питательные среды негативного контроля показали только низкую смертность с 8% для обработки отдельно питательной средой, 4% для обработанной буфером питательной среды и 4% для питательной среды, обработанной инактивированным Cry1Ab.
[0080] Оценка LC30, LC70 и LC90 для mCry3A в отношении СРВ: биоактивность, оцененная для mCry3A в отношении личинки колорадского жука, показала LC30 приблизительно 0,6, LC70 приблизительно 1,4 и LC90 приблизительно 2,4 мкг mCry3A/мл питательной среды после 96 часов. Питательные среды негативного контроля не показали или показали только низкую смертность с 0% для обработки отдельно питательной средой, 8% для обработанной водой питательной среды и 4% для питательной среды, обработанной инактивированным mCry3A.
[0081] Оценка влияния mCry3A на токсичность Cry1Ab: присутствовала низкая средняя смертность (7% или ниже) на питательной среде отдельно, на обработанной буфером питательной среде, на обработанной термоинактивированным Cry1Ab питательной среде, и питательной среде, обработанной mCry3A при LC90 для СРВ (2,4 мкг mCry3A/мл питательной среды), через 168 часов. Дополнительно была очевидная разница между обработанными токсином питательными средами и питательными средами негативного контроля. Таким образом, несколько необходимых условий, применимых для экспериментальной схемы, были продемонстрированы.
[0082] В обоих анализах через 144 часа уровни смертности при обработках LC30 и LC70 (как с, так и без mCry3A) были статистически значимо ниже 30% и 70%, соответственно. Таким образом, анализы продолжали для достижения необходимых предельных значений токсичности в эксперименте. Через 168 часов предельные значения (т.е. соответственно 30% и 70% смертности при обработках LC30 Cry1Ab отдельно и LC70 Cry1Ab отдельно) были достигнуты. Считалось, что данные через 144 часа обладали способностью для обнаружения влияний mCry3A на Cry1Ab.
[0083] Результаты по сводным данным продемонстрировали, что влияния концентрации Cry1Ab и присутствия mCry3A были независимыми через 144 часа и 168 часов (p>0,05) в отношении кукурузного мотылька. Таким образом, влияние концентрации Cry1Ab можно протестировать посредством совместного анализа данных с и без mCry3A. Подобным образом влияние mCry3A можно протестировать посредством совместного анализа данных для LC30 и LC70.
[0084] В сводных данных присутствовало статистически значимое влияние концентрации Cry1Ab (p<0,05). Через 144 часа и через 168 часов влияние концентрации Cry1Ab было статистически значимым в сводных данных. Эти данные указывают на то, что ЕСВ отвечал, как и ожидалось, на разные концентрации Cry1Ab.
[0085] В сводных данных никакого статистически значимого влияние mCry3A на токсичность Cry1Ab обнаружено не было через 144 часа или через 16 8 часов (p>0,05). Поскольку никакого влияния mCry3A отдельно на ЕСВ обнаружено не было в данном исследовании, эти результаты не обеспечивают доказательств в отношении взаимодействия между Cry1Ab и mCry3A при уничтожении или борьбе с кукурузным мотыльком.
[0086] Оценка влияния Cry1Ab на токсичность mCry3A: в отношении СРВ анализов присутствовала низкая средняя смертность (4% или ниже) на питательной среде отдельно, на питательной среде, обработанной водой, на питательной среде, обработанной термоинактивированным Cry1Ab, и питательной среде, обработанной Cry1Ab при LC90 для ЕСВ (142 нг Cry1Ab/мл питательной среды), через 96 часов. Дополнительно присутствовала очевидная разница между питательными средами, обработанными токсином, и питательными средами негативного контроля. Таким образом, несколько необходимых условий, применимых для экспериментальной схемы, были продемонстрированы.
[0087] В обоих биоанализах СРВ наблюдали некоторую смертность через 72 часа; однако уровни смертности при обработках LC30 и LC70 были статистически значительно ниже 30% и 70%, соответственно, по меньшей мере в одном биоанализе. Таким образом, анализы продолжали для достижения необходимых предельных значений токсичности в эксперименте. Через 96 часов предельные значения (т.е. соответственно 30% и 70% смертности при LC30 mCry3A отдельно и LC70 mCry3A отдельно) были достигнуты. Считалось, что данные через72 часа обладали способностью для обнаружения влияний mCry3A на Cry1Ab. В отношении отдельных анализов и сводных данных критерии нормальности и однородности дисперсии были соответствующими как через 72 часа, так и 96 часов.
[0088] В сводных данных влияния концентрации mCry3A и присутствия Cry1Ab были независимыми через 72 часа и 96 часов (р>0,05). Таким образом, влияние концентрации mCry3A можно протестировать посредством совместного анализа данных с и без Cry1Ab. Подобным образом влияние Cry1Ab можно протестировать посредством совместного анализа данных для LC30 и LC70.
[0089] В сводных данных присутствовало статистически значимое влияние концентрации mCry3A через 72 часа и 96 часов (р<0,05). Эти данные указывают на то, что СРВ отвечал, как и ожидалось, на разные концентрации mCry3A.
[0090] В сводных данных, никакого статистически значимого влияния Cry1Ab на токсичность mCry3A обнаружено не было через 96 часов (р>0,05). Однако в сводных данных через 72 часа статистически значимое влияние Cry1Ab было обнаружено (р<0,05). Таким образом, взаимодействие между mCry3A и Cry1Ab было отмечено через 72 часа в сводных данных. Большая смертность в присутствии Cry1Ab указывает на то, что влияние представляет собой синергизм (как определено Tabashnik, 1992) или потенциация (как определено Haghdoost et al., 1997). Таким образом, Cry1Ab потенцирует или подвергает синергизму активность mCry3A,заставляя mCry3A работать быстрее в отношении целевых жесткокрылых насекомых, чем можно было бы ожидать с mCry3A отдельно. В промышленных масштабах более быстрое уничтожение обуславливает меньшее повреждение растений и меньшую возможность для развития устойчивости у жесткокрылых насекомых-вредителей.
Пример 2. Взаимодействие между токсинами в отношении кукурузного корневого червя
[0091] В данном примере исследуется, существует ли взаимодействие относительно инсектицидной активности между смесью активного в отношении чешуекрылых белка, включающей Cry1Ab и Vip3Aa20 («Lep-композиция»), и смесью активного в отношении жесткокрылых белка, включающей mCry3A («Col-композиция»).
[0092] Влияния Lep-композиции на чувствительные виды вредителя-кукурузного мотылька (Ostrinia nubilalis; ECB) исследуют в присутствии или в отсутствие Col-композиции. Личинки первой личиночной стадии применяют для проведения биоанализа поглощения питательной среды ЕСВ. Процент смертности ЕСВ оценивается через 120 часов после заражения. Сначала создают кривую зависимости «доза-ответ» для ЕСВ с восемью концентрациями Lep-композиции. Две дозы, дозу 1 для ЕСВ и дозу 2 для ЕСВ, Lep-композиции, дающие промежуточный уровень ответа, выбирают из кривой зависимости «доза-ответ» для проведения биоанализа взаимодействия активного в отношении чешуекрылых и активного в отношении жесткокрылых белков. Доза 1 для ЕСВ содержит примерно 25 нг Cry1Ab и примерно 12,5 нг Vip3Aa20 на мл питательной среды, а доза 2 для ЕСВ содержит примерно 50 нг Cry1Ab и примерно 25 нг Vip3Aa20 на мл питательной среды. Таким образом, доза 2 для ЕСВ имеет примерно 2Х количество Cry1Ab и белка Vip3Aa20 относительно дозы 1 для ЕСВ.
[0093] Результаты биоанализа для ЕСВ показаны в таблице 1. Никакого статистически значимого увеличения процента смертности для ЕСВ обнаружено не было, когда присутствует доза 2 Col-кмпозиции для WCR, указывая на то, что отсутствует взаимодействие между Col-композицией, содержащей mCry3A, и Lep-композицией, содержащей Cry1Ab+Vip3Aa20, на основе биоанализа для ЕСВ.
Таблица 1
Результаты биоанализа для ЕСВ
Обработка
Процент смертности ЕСВ
Доза 1 для ЕСВ
21
Доза 1 для ЕСВ+ доза 2 для WCR
22
Доза 2 для ЕСВ
36
Доза 2 для ЕСВ+ доза 2 для WCR
40
Доза 2 для WCR
4
Lep-буфер (негативный контроль)
1
Lep+Col-буфер (негативный контроль)
4
[0094] Влияния Col-композиции на виды чувствительного вредителя-западного кукурузного корневого червя (WCR, Diabrotica virgifera) исследуют в присутствии или в отсутствии Lep-композиции. Личинки первой личиночной стадии применяют для проведения биоанализа поглощения питательной среды WCR. Процент смертности WCR оценивается через 120 часов после заражения. Сначала создают кривую зависимости «доза-ответ» для WCR с восемью концентрациями Col-композиции. Две дозы, дозу 1 для WCR и дозу 2 для WCR, Col-композиции, дающие промежуточный уровень ответа, выбирают из кривой зависимости «доза-ответ» для проведения биоанализа взаимодействия Lep-композиции и Col-композиции. Доза 1 для WCR содержит примерно 50 мкг mCry3A на мл питательной среды, а доза 2 для WCR содержит примерно 200 мкг mCry3A на мл питательной среды. Таким образом, доза 2 для WCR имеет примерно 4Х количество белка mCry3A относительно дозы 1 для WCR.
[0095] Результаты биоанализа для WCB показаны в таблице 2. Результаты указывают на более высокий процент смертности WCR, когда присутствует доза 2 Lep-композиции, содержащей Cry1Ab+Vip3Aa20, указывая на то, что комбинация Lep-композиции и Col-композиции уничтожает WCR в большей степени, чем можно было бы ожидать за счет Col-композиции самой по себе.
Таблица 2
Результаты биоанализа для WCR
Обработка
Процент смертности WCR
Доза 1 для WCR
17
Доза 1 для WCR+ доза 2 для ЕСВ
46
Доза 2 для WCR
48
Доза 2 для WCR+ доза 2 для ЕСВ
65
Доза 2 для ЕСВ
1
Col-буфер (негативный контроль)
1
Col+Lep-буфер (негативный контроль)
1
[0096] Следует понимать, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения с учетом данного описания рекомендуются специалисту в настоящем уровне техники и должны быть включены в пределах сущности и содержания данной заявки и объема прилагаемой формулы изобретения.
[0097] Все публикации и заявки на патент, упомянутые в данном описании, являются показателем уровня компетенции специалистов в данной области техники, к которой настоящее изобретение принадлежит. Все публикации и заявки на патент включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была специфично и отдельно включена посредством ссылки.
Источники информации
1. Haghdoost, N.R., Newman, L.M. and Johnson, E.M. (1997) Multiple chemical exposures: synergism vs. individual exposure levels. Reproductive Toxicology 11: 9-27.
2. Macintosh, S.C., Stone, T.B., Sims, S.R., Hunst, P.L., Greenplate, J.T., Man-one, P.O., Perlak, FJ., Fischoff, D.A. and Fuchs, R.L. (1990) Specificity and efficacy of purified Bacillus thuringiensis proteins against agronomically important insects. Journal of Invertebrate Pathology 56: 258-266.
3. SAS Software, Version 9.1 of the SAS System for Windows. Copyright (C) 2002-2003 SAS Institute Inc. SAS and all other SAS Institute Inc. product or service names are registered trademarks of SAS Institute Inc. Cary, NC, USA.
4. Tabashnik, B. (1992) Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins. Applied and Environmental Microbiology 58: 3343-3346.
5. Tajima, 0., Schoen, E.D., Feron, VJ. and Groten, J.P. (2002) Statistically designed experiments in a tiered approach to screen mixtures of Fusarium mycotoxins for possible interactions. Food and Chemical Toxicology 40: 685-695.
6. US EPA (1992) EPA Probit Analysis Program version 1.5. Ecological Monitoring Research Division, Environmental Monitoring Systems Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, OH, USA.