Оценка изменений ядерно-ядрышкового аппарата и выживаемости клеток сперматогенного эпителия при цинковой интоксикации

УДК 581.17 Т.М. Владимцева

ОЦЕНКА ИЗМЕНЕНИЙ ЯДЕРНО-ЯДРЫШКОВОГО АППАРАТА И ВЫЖИВАЕМОСТИ КЛЕТОК СПЕРМАТОГЕННОГО ЭПИТЕЛИЯ ПРИ ЦИНКОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

В статье проведен сравнительный анализ количества всех выявляемых морфофункциональных типов ядрышек с дифференцированным подсчетом активных и малоактивных их вариантов при воздействии соли тяжелого металла на клетки сперматогенного эпителия.

Ключевые слова: ядрышки, хлорид цинка, тяжелые металлы, ядро, клетка.

T. M. Vladimtseva NUCLEAR-KERNELAPPARATUSCHANGESAND CELLS SURVIVAL RATE ASSESSMENT OF SPERMATOGENOUS EPITHELIUMIN ZINC INTOXICATION

The comparative analysis of the quantity of all kernels’morpho-functional typesbeing revealedwith theiractive and non-active variants differentiated calculation under the influence of heavy metals salts on spermatogenous epithelium cells is conducted in the article.

Key words: kernels, zinc chloride, heavy metals, kernel, cell.

Введение. Изменение уровня и направленности процессов клеточного метаболизма привлекло внимание к важнейшему звену в синтезе белков - ядрышку. Хорошо известно, что ядрышко относится к одним из наиболее пластичных клеточных органелл, его морфология и иммунореактивные свойства изменяются в ответ на разные химические и стрессовые воздействия [1, 2]. Состояние ядрышкового аппарата является адекватным показателем редоксинтетической функции клеток. В ряде клеточных популяций активность ядрышкового аппарата отражает активность пролиферативных процессов [5]. Все свойства ядрышек обусловлены спецификой функционирования генетического аппарата клеток, активность которого должна отразиться на значениях параметров их ядер и ядрышек, непосредственно связанных с синтезом нуклеиновых кислот. Изменения в параметрах ядер отражаются в степени активности ядрышек и играют немаловажную роль в клеточной патологии, отражая степень функциональной активности клеток [2, 4].

Цель исследований. Оценка изменений ядерно-ядрышкового аппарата и выживаемости клеток сперматогенного эпителия при цинковой интоксикации.

Материалы и методы исследований. Работа проведена на 40 белых беспородных мышах - самцах массой 19-21 г в двухмесячном возрасте, по 10 животных в каждой группе. В качестве модельного ксенобиотика использовался хлорид цинка в дозе 20 мг/кг массы тела. Полиморфизм ядрышек анализировали через 24 часа. Животным 2-й и 3-й групп вводили ксенобиотик в той же дозе ежедневно в течение 5 и 10 дней соответственно, с последующим аналогичным исследованием. Животным контрольной группы вводили внут-рибрюшинно физиологический раствор. Забой животных осуществлялся путем цервикальной дислокации спинного мозга в шейном отделе.

Исследование изменений активности ядрышкового аппарата клеток сперматогенного эпителия проводили путем фиксированния в течение 7 минут в метаноле мазков сперматогенного эпителия и обработки их следующим раствором: смешивали 2 г желатина, растворенного в 50 мл дистиллированной воды, и 0,5 мл 1%-й муравьиной кислоты, в эту смесь добавляли 12 г нитрата серебра (Уральский завод химреактивов). Затем заливали мазки этим раствором и помещали в термостат при температуре 37-38°С на 20 минут, после чего стекла промывали дистиллированной водой и высушивали [8]. После окраски клетки классифицировали по форме ядра (на 200 клеток сперматогенного эпителия, увеличение х 1000) по видам:

I - клетки без морфологических повреждений;

II - клетки с морфологическими признаками деградации хроматина.

В клетках определяли 2 типа ядрышек:

1 - крупные (2-4 мкм в диаметре): компактные и нуклеолонемные с высокой функциональной активностью; 2 - мелкие (до 2 мкм в диаметре): плотные фибриллярные с низкой функциональной активностью [7]. Диаметр ядрышек определяли с помощью окуляра-микрометра МОВ-1х5.

Жизнеспособность клеток сперматогенного эпителия определяли при помощи теста с витальным красителем (трипановым синим). Равные объемы (по 20 мкл) суспензии клеток сперматогенного эпителия и

0,1%-го трипанового синего («Эегоа») смешивали и помещали в камеру Горяева. Микроскопировали с помощью микроскопа «Биомед 1», увеличение х300. По морфологии цитоплазматической мембраны сперматозоиды дифференцировали на два типа:

жизнеспособные клетки (с прозрачной цитоплазмой) и нежизнеспособные клетки (с прозрачной цитоплазмой фиолетового цвета).

Клетки подсчитывали в больших квадратах. Пересчитывали клетки по стандартной формуле: х = ах5, полученной в результате преобразования: х = (ах250х2)/100, где х - общее количество клеток в 1 мкл жидкости;

2 - коэффициент разведения;

а - число клеток в подсчитанных квадратах;

100 - число сосчитанных больших квадратов;

250 - множитель, приводящий результат к объему в 1 мкл жидкости [7].

Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием ^критерия Стьюдента [3]. Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (Р<0,05).

Результаты и их обсуждение. В ходе наших экспериментов установлено, что при острой затравке животных хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг через 24 часа отмечалось достоверное увеличение числа клеток с деградацией хроматина. Количество ядрышек 1-го и 2-го типов в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 88,28+0,61 % (Р<0,001) и 81,62+0,35% (Р<0,001) по сравнению с контролем 97,98+0,27% и 94,76+0,46% соответственно. Вместе с тем в клетках сперматогенного эпителия с деградацией хроматина количество крупных и мелких ядрышек увеличилось и составило 11,72+0,6% (Р<0,001) и 18,38+0,35% (Р<0,001) по сравнению с контролем соответственно. При пятисуточном введении ксенобиотика наблюдалась тенденция к возрастанию количества клеток с деградацией хроматина в 14 раз. При этом в клетках без видимых морфологических повреждений количество ядрышек 1-го и 2-го типов снижалось до 86,40+0,27% (Р<0,001) и 67,0+0,1% (Р< 0,001) по сравнению с контролем 97,98+0,27% и 94,76+0,4% соответственно. В клетках с деградацией хроматина в ядре количество ядрышек 1-го типа возросло в 6,7 раза, а ядрышек 2-го типа - в 6,3 раза по сравнению с контрольным уровнем. Десятисуточное введение хлорида цинка привело к возрастанию количества клеток с деградацией хроматина в ядре и составило 35,02+0,34% (Р<0,001) и 1,76+0,23% в опыте и контроле соответственно и снижению количества клеток без видимых морфологических повреждений - 64,98+0,34% (Р<0,001) и 98,24+0,24% в опыте и контроле соответственно. Количество крупных и мелких ядрышек в клетках без видимых морфологических повреждений снизилось и составило 83,56+0,29% (Р< 0,001) и 61,64+0,52% (Р< 0,001) соответственно, тогда как в клетках с признаками деградации хроматина количество крупных и мелких ядрышек достоверно возросло в 8,4 и в 7,3 раза соответственно (рис. 1, 2).

%

120

100

80

60

40

20

0

контроль

24 часа

5 суток

10 суток

Рис. 1. Изменение ядерного материала в клетках сперматогенного эпителия мышей при внутрибрюшинном введении хлорида цинка в дозе 20 мг/кг

II

%

12О

1ОО

ВО

ВО

4О

2О

О

контроль

24 часа

б суток

10 суток

А

****

****

II

12О

1ОО

ВО

ВО

4О

2О

О

%

Б

****

****

****

II

Рис. 2. Относительное количество ядрышек 1 типа

Таким образом, воздействие хлорида цинка проявляется в повреждении нуклеолярного аппарата клеток сперматогенного эпителия по типу снижения транскрипционной активности в прямой зависимости «время-эффект».

При исследовании жизнеспособности клеток сперматогенного эпителия мышей установлено, что при затравке животных хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг через 24 часа и 5 суток отмечалось недостоверное снижение числа живых сперматозоидов до 89±0,57 и 83,75±2,41 соответственно по сравнению с контролем (88,25±2,56), а при 10-дневной затравке животных ксенобиотиком количество жизнеспособных половых клеток достоверно снижалось до 83,75±2,41 (Р<0,01) (рис. 3).

Живые 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

24 часа 5 суток 10 суток  контроль  опыт

Рис. 3. Динамика процессов выживаемости половых клеток мышей при действии хлорида цинка в дозе 20 мг/кг. По оси абсцисс: продолжительность воздействия хлорида цинка в днях

Выводы. Таким образом, интоксикация хлоридом цинка в дозе 20 мг/кг приводит к значительному

снижению транскрипционной активности ядрышкового аппарата клеток ткани семенников, снижая их жизнеспособность, с проявлением зависимости «время-эффект».

Литература

1. Изменения состояния ядрышка при длительном культивировании культуры клеток человека HeLa / А.А. Григорьев [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. - № 9. -С. 321-324.

2. Исследование оптических параметров ядрышек при действии ингибиторов транскрипции методом когерентной фазовой микроскопии / В.П. Тычинский [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142. - № 10 - С. 465-470.

3. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.

4. Поведение клеток лимфоидной популяции, их ядер и ядрышек при периодической болезни и лейкозе /

Ю.А. Магакян [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145. - № 2. -С. 162-166.

5. Ядерно-ядрышковый аппарат эпидермиоцитов при атоническом дерматите и красном плоском лишае / С.Г. Сапунцова [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. - № 9. -С. 352-354.

6. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Стеновая [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146. - № 12. - С. 646-650.

7. Челидзе П.В., Зацепина О.В. Морфофункциональная классификация ядрышек // Успехи соврем. био-

логии. - 1988. - Т. 105. - № 2. - С. 252-268.

8. Ploton D., Menager M., Jeannesson P. Improvement in the staining and in the visualization of the argyrophilic proteins of the nucleolar organizer region at the optical level // Histochem. J. - 1986. - V. 18. - P. 5-18.

УДК 619:636.7 С.Г. Смолин, С.Н. Донская

СОДЕРЖАНИЕ КАЛЬЦИЯ И НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФОРА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ СОБАК ПОРОДЫ

НЕМЕЦКАЯ ОВЧАРКА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ПАРААМИНОБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ В ОСЕННИЙ

И ЗИМНИЙ ПЕРИОДЫ ГОДА

Представлены результаты исследований по содержанию кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови у собак породы немецкая овчарка при применении витамина парааминобензойной кислоты.

Ключевые слова: витамин парааминобензойная кислота, кальций, неорганический фосфор, ферментативные процессы, фосфопротеиды.

S.G.Smolin, S.N.Donskaya

CALCIUM ANDINORGANIC PHOSPHORUS CONTENT INBLOOD SERUMOF GERMAN SHEPHERDBREED DOGS WHILEUSING P-AMINO-BENZOIC ACIDIN THE AUTUMN ANDWINTER PERIOD

The research results oncalcium andinorganic phosphorus contentin the blood serumof German She-pherdbreeddogswhile using paraaminobenzoic (p-amino-benzoic) acid vitamin are presented in the article.

Key words: vitamin paraaminobenzoic (p-amino-benzoic) acid, calcium, inorganic phosphorus, enzymatic processes, phosphorus proteides.

Введение. Минеральные вещества обеспечивают процессы роста, размножения, поддержания физиологического равновесия, поскольку в определенных сочетаниях участвуют во всех жизненных проявлениях организма: дыхании, работе сердца и мышц, деятельности нервной системы.

Кальций участвует в процессе свертывания крови, он необходим для нормальной деятельности сердца, функционирования иммунной системы, защищающей организм от инфекций. В организме кальций усваивается одновременно с фосфором и накапливается в основном в костной ткани, обеспечивая ее механиче-