ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ И ГЕНЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА ДЕТЕЙ

МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020

Сужаева Л.В. 1, Макарова М.А. 12, Кафтырева Л.А. 12

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ И ГЕНЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА ДЕТЕЙ

1ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора, 197101, Санкт-Петербург, Россия; 2ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава РФ, 191015, Санкт-Петербург, Россия

Вид Escherichia coli характеризуется широким внутривидовым разнообразием. Среди представителей вида присутствуют как комменсалы, так и патогены, вызывающие диареи и заболевания внекишечной локализации. Патогенные штаммы отличаются от непатогенных наличием факторов вирулентности и кодирующих их генов. Филогенетическая структура вида представлена четырьмя основными группами (А, В1, В2, D), распространенность которых отличается у жителей различных географических регионов. Патогенные представители вида давно и подробно изучаются, в то время как непатогенным штаммам не уделялось такое внимание. В статье представлены результаты исследования 511 штаммов E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей без диареи и инфекций мочевыводящих путей, в возрасте от 1 мес до 17лет, проживающих в Санкт-Петербурге. Методом ПЦР определены основные филогенетические группы, выявлены гены вирулентности E. coli, ассоциированные с диареей и заболеваниями внекишечной локализации. Результаты: Структура популяции E. coli представлена следующими группами: А - 33,3%, В1 - 6,7%, В2 - 34,0%, D - 26%. В исследуемой популяции выявлено EPEC - 2,5%, EAggEC - 4,5% штаммов. Гены вирулентности EPEC чаще выявлялись у штаммов филогруппы В1, гены вирулентности EAggEC - у изолятов филогруппы D. Распространенность генов внекишечной вирулентности была следующей: pap - 29,5%; sfa - 19,8%; afa - 3,3%; hly - 20,9%; cnf - 17,4°%; aer - 20,0%. Гены pap, sfa, hly, cnf были наиболее характерны для E. coli филогенетической группы В2. Выявлено сходство структуры исследуемой популяции E. coli по филогенетическим группам с популяциями E. coli жителей Парижа и Сиднея. Анализ распространенности генов вирулентности показал зависимость их наличия от генетического фона микроорганизма.

Ключевые слова: Escherichia coli; филогенетические группы; микробиота кишечника; гены вирулентности; EPEC; EAggEC.

Для цитирования: Сужаева Л.В., Макарова М.А., Кафтырева Л.А. Филогенетические группы и гены вирулентности штаммов Escherichia coli, выделенных из микробиоты кишечника детей. Клиническая лабораторная диагностика.2020; 65 (4): 251-257. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-4-251-257

SuzhaevaL.V.1, MakarovaM.A.12, KaftyrevaL.A.12

PHYLOGENETIC GROUPS AND VIRULENCE GENES OF ESCHERICHIA COLI STRAINS ISOLATED FROM THE CHILDREN GUT MICROBIOTA

1Saint-Petersburg Pasteur Institute, 197101, Saint-Petersburg, Russia;

2State Educational Institution of the Higher Professional Education «North-Western state medical University N.A. I.I. Mechnikov» of the Ministry of Health of the Russian Federation

Escherichia coli is characterized by a wide intraspecific diversity. The species includes both commensals and pathogens that cause diarrhea and extra-intestinal diseases. Pathogenic strains differ from non-pathogenic ones by the presence of virulence factors and their genes. The phylogenetic .structure of the species is represented by four main groups (A, B1, B2, D), which differ in their prevalence among residents of different geographical regions. Pathogenic members of the species have been studied in detail, while non-pathogenic strains have not received such attention. This report presents the results of a study of 511 E. coli strains isolated from the gut microbiota of children without diarrhea and urinary tract infections, aged from 1 month to 17 years, living in St. Petersburg. The main phylogenetic groups were determined by PCR, and E. coli virulence genes associated with diarrhea and extra-intestinal diseases were identified. Results: population structure of E. coli is represented by the following groups: A-33.3%, B1-6.7%, B2-34.0%, D-26%. In the studied population 2.5% of strains belonded to EPEC and 4.5% to EAggEC. EPEC virulence genes were more often detected in strains of phylogroup B1, and EAggEC virulence genes in isolates of phylogroup D. The prevalence of extra - intestinal virulence genes was as follows: pap - 29.5%; sfa - 19.8%; afa - 3.3%; hly - 20.9%; cnf -17.4%; aer-20.0%. The pap, sfa, hly, and cnf genes were detected mostly in the B2 phylogenetic group. Obtained data shows the similarity ofE. coli phylogenetic groups structure in St. Petersburg with E. coli populations isolated from residents of Paris and Sydney. Analysis of the virulence genes prevalence showed the dependence of their presence on the genetic background bacteria.

Keywords: Escherichia coli; phylogenetic groups; gut microbiota; virulence genes; EPEC; EAggEC.

For citation: Suzhaeva L.V., Makarova M.A., Kaftyreva L.A. Phylogenetic groups and virulence genes of Escherichia coli strains isolated from the children gut microbiota. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020; 65 (4): 251-257. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-4-251-257

For correspondence: Suzhaeva L.V, junior researcher of laboratory of enteric infections : e-mail: slv2211@yandex.ru

Information about authors:

Suzhaeva Ludmila V., https://orcid.org/0000-0001-7292-9933 Makarova Maria A., https://orcid.org/0000-0003-3600-2377 Kaftyreva Lidiya A., https://orcid.org/0000-0003-0989-1404 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship.

Received 13.02.2020 Accepted 21.02.2020

Для корреспонденции: Сужаева Людмила Валерьевна, мл. науч. сотр. лаб.кишечных инфекций; e-mail: slv2211@yandex.ru

MICROBIOLOGY

Введение. Escherichia coli - широко распространенный, неспорообразующий факультативно анаэробный микроорганизм, обитающий в дистальных отделах кишечника человека и животных [1], водах поверхностных водоемов [2] и почве [3].

E. coli - облигатный представитель микробиоты кишечника человека. Эти бактерии участвуют в усвоении и биотрансформации питательных веществ [4], поддержании колонизационной резистентности [5], синтезируют широкий спектр витаминов [6,7], жирных кислот [8], нейропептидов [9], формируют и стимулируют работу всех звеньев иммунной системы [10]. Они колонизируют кишечник новорожденного в первые часы после рождения и сохраняются в течение всей жизни [11].

Среди множества представителей вида встречаются патотипы, вызывающие диареи, характеризующиеся различными патогенетическими механизмами, и заболевания внекишечной локализации (инфекции мочевыво-дящих путей, бактериемии, менингит новорожденных). Патогенные для человека E. coli отличаются от непатогенных наличием факторов вирулентности и кодирующих их генов.

Наличие специфических генов вирулентности (инва-зинов, шигаподобных токсинов, термолабильных и термостабильных токсинов, белка интимина, пучок-форми-рующих пилей, агрегативно-адгерентных фимбрий) позволяет безошибочно выявлять патотипы диареегенных штаммов: энтероинвазивные (EIEC), энтерогеморраги-ческие (EHEC), энтеротоксигенные (ETEC), энтеропа-тогенные (EPEC), энтероагрегативные (EAggEC) E. coli [12].

Штаммы E. coli, вызывающие внекишечные заболевания (ExPEC), обладают широким спектром факторов вирулентности: адгезины, токсины, системы захвата железа, гемолизины, капсулы [13]. Эти факторы нередко обнаруживают и у штаммов E. coli - представителей микробиоты кишечника [14]. Они играют важную роль в адгезии к слизистой кишечника, повышении выживаемости, защите от поглощения простейшими. Для возникновения внекишечного заболевания необходимо наличие комплекса факторов вирулентности у штамма E. coli и предрасполагающих факторов со стороны макроорганизма [15]. Основой классификации ExPEC является локализация патологического процесса. Выделяют уропатогенные (UPEC), септицемические (SEPEC), менингитассоциированные (MNEC) E. coli.

Способность заселять различные места обитания, иметь широкий круг хозяев, вызывать заболевания различной локализации делает E. coli идеальным модельным организмом для изучения эволюции бактерий, их адаптации к различным экологическим нишам и условиям существования. В то время как патогенные представители вида имеют длительную историю изучения, подробным исследованием комменсальных штаммов занялись относительно недавно.

Вид Escherichia coli представлен семью филогенетическими группами (А, В1, В2, D, E, F, C), четыре из которых являются основными (А, В1, В2, D). Группировка основных кластеров была проведена на основании данных мультилокусного электрофореза ферментов (MLEE) 72 штаммов E. coli, выделенных от человека и животных разных континентов [16]. Анализ полных геномов E. coli показал, что средний геном содержит 4721 ген, но только 1976 из них образуют основной геном каждого штамма. Пан-геном E. coli содержит более 17000

генов, и эта цифра будет расти с увеличением количества проанализированных секвенированных штаммов. Геном E.coli представляет собой динамичную структуру вследствие происходящих в нем процессов рекомбинации. Несмотря на это, клональность структуры вида сохраняется, так как встраивание новых генов происходит только в определенных зонах, так называемых «горячих точках» интеграции [17].

Штаммы основных филогенетических групп отличаются по частоте выявления в различных экологических нишах [1,3], размеру генома [18], наличию генов вирулентности и способности вызывать заболевания [19, 20], фенотипическим характеристикам [4], профилям устойчивости к антимикробным препаратам [21], скоростью роста и способностью образовывать биопленки [22]. Таким образом, можно многое узнать о характеристиках неизвестного штамма E. coli, определив его принадлежность к филогенетической группе.

Цель исследования - определить филогенетический профиль популяции E. coli, выделенных из проб испражнений детей разных возрастных групп. Выявить генетические детерминанты факторов вирулентности и определить их распространенность в штаммах E. coli основных филогенетических групп.

Материал и методы. Материалом для исследования послужили 511 штаммов E.coli, выделенных в 20122014 гг. из испражнений детей без диареи и инфекций мочевыводящих путей в возрасте от 1 мес. до 17 лет, проживающих на территории Санкт-Петербурга.

Детекцию генов, определяющих принадлежность E. coli к филогенетической группе, проводили по методу O.Clermont [23]. Дифференциацию ДНК различных групп диареегенных E. coli (EPEC, ETEC, ElEC, EHEC, EAgEC) проводили методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией с использованием набора реагентов «АмплиСенс Эшерихиозы-FL» согласно инструкции производителя.

Методом ПЦР с электрофоретической детекцией со специфическими праймерами выявляли гены ExPEC, кодирующие продукцию: пиелонефрит-ассоциирован-ных пилей или Р-фимбрий (pap), S-фимбрий (sfa), афим-бриального адгезина (afa), a-гемолизина (hlyB), цитоне-кротического фактора (cnf), аэробактина (aer) согласно ранее опубликованным протоколам [24 - 26].

Полученные данные обработали с использованием программы SPSS 13. Достигнутый уровень значимости различий определяли с использованием критерия сопряженности х2 Пирсона. 95% доверительные интервалы долей и частот рассчитывали по методу Уилсона.

Результаты. В изученной популяции E. coli были представлены штаммы четырех основных филогрупп. Доля изолятов филогенетической группы А составляла 32,7% (95% ДИ: 28,8 - 36,9); группы В1 - 7,2% (95% ДИ: 5,3 - 9,8); группы В2 - 33,3% (95% ДИ: 29,3 - 37,5); группы D - 26,8% (95% ДИ: 23,2 - 30,8).

Анализ частоты встречаемости E. coli каждой филогенетической группы у детей разного пола (х2=1,575; df=3; р=0,665) и возраста (х2=7,080; df=9; р=0,629) свидетельствовал об отсутствии статистически значимых отличий.

При сравнении филогенетической структуры исследуемой популяций Е. coli с популяциями Е. coli жителей других географических регионов выявлена наибольшая схожесть с популяциями E. coli жителей Парижа [27] и Сиднея [27], в которых преобладали штаммы филогруп-

пы В2, были значительные и практически равные доли филогрупп А и D и незначительная доля изолятов группы В1, в отличие от популяций Е. coli жителей Фучжоу (Китай) [28] и провинции Чонам в Южной Корее [29], где доля штаммов филогруппы В1 была значительно выше (рис. 1).

При дифференциации патотипов диареегенных эше-рихий гены, характерные для энтероинвазивных, энте-рогеморрагических и энтеротоксигенных E. coli, у исследуемых штаммов выявлены не были. У 2,5% (95% ДИ:1,5 - 4,3) штаммов выявлены гены энтеропатоген-ных E. coli, у 4,5% (95% ДИ:3,0 - 6,7) - гены энтероагре-гативных E. coli.

Частота выделения EPEC у детей разных возрастных групп статистически значимо не отличалась (%2=3,216; df=1; ¿>=0,124). В группе до 1 года EPEC были обнаружены в 1,7% проб, старше 1 года - в 4,4% проб. Частота

МИКРОБИОЛОГИЯ

обнаружения EPEC среди E. coli различных филогенетических групп имела значимые различия (%2=44,472; df=3; £><0,001). Наибольшая доля штаммов EPEC была обнаружена среди представителей филогруппы В1 (18,9%), наименьшие среди представителей филогенетических групп В2 и D (0,6% и 0,6% соответственно). В группе А на долю EPEC приходилось 2,4% штаммов (рис. 2).

Частота выделения EAggEC в пробах от детей разных возрастных групп статистически значимо не отличались (х2=1,717; df=1;p=0,248). EAggEC были выявлены в 3,7% проб от детей до года и в 6,3% проб от детей старше года. Частота обнаружения EAggEC среди E. coli различных филогенетических групп была не одинакова (х2=28,612; df=3; £><0,001). Наибольшая доля штаммов EAggEC была обнаружена среди представителей филогруппы D (12,4%), наименьшие среди представителей филогенетических групп В2 и B1 (0,6% и 0% соответ-

1 2 3 4 5

D 22,9 22,2 26,8 16,9 36,2

B2 45,1 37,1 33,3 16 0

B1 12,4 11,1 7,2 23,4 34

А 19,5 29,6 32,7 43,7 29,8

Рис. 1. Доли основных филогенетических групп в структурах популяций E. coli (в %), выделенных из микробиоты кишечника жителей Сиднея (1), Парижа (2), Санкт-Петербурга (3), Фучжоу (4), провинции Чонам (5).

энтеропатогенные E.

ВЕРЕС  EAggEC

Рис. 2. Доли EPEC и EAggEC (в %) среди штаммов E. coli основных филогенетических групп. EPEC -coli; EAggEC - энтероагрегативные E. coli.

MICROBIOLOGY

ственно). В группе А к EAggEC относились только 3,0% штаммов (рис. 2).

Из множества генов, обнаруживаемых у ExPEC, для детекции были выбраны гены наиболее часто встречающиеся у UPEC, характеризующие различные этапы возможного инфекционного процесса: адгезины (pap, sfa, afa), токсины (cnf, hlyB), гены железосвязывающих систем (aer).

У 38,2% исследуемых штаммов указанные гены не обнаружены. В геноме 61,8% изолятов присутствовал как минимум один из перечисленных генов. Максимальное количество анализируемых детерминант вирулентности в одном геноме (четыре) выявлено у 2,2% штаммов. Третья часть изолятов E. coli содержали один ген, пятая часть штаммов - два гена, десятая часть штаммов - три из исследуемых генов. Наполненность геномов детерминантами вирулентности не одинакова у изолятов различных филогенетических групп. Как минимум один из исследуемых генов встречался у 9 из 10 штаммов филогенетической группы В2, у 7 из 10 - группы D, у 4 из 10 - группы А, у 2 из 10 - группы В1.

Доли штаммов, несущие единичные гены, варьировали от 18,9% (группа В1) до 31,4% (группа D) и статистически значимо не отличались между филогруппа-ми. Доли штаммов, несущих два из исследуемых генов, в филогруппах В2 и D были практически одинаковы (25,9% и 27,7%, соответственно) и значительно отличались от долей в филогруппах А и В1 (6,0% и 0% соответственно). Присутствие трех генов наиболее характерно для штаммов филогруппы В2 (25,3%), что значимо отличало их от других филогрупп, где доли таких штаммов варьировали от 2,7 до 8,8%. Четыре гена обнаружены только у штаммов групп В2 (5,9%) и А (0,6%).

Гены, кодирующие факторы адгезии, обнаружены у 38,7% E. coli. Из генов трех исследуемых адгезинов, чаще остальных выявлялись гены Р-фимбрий - 29,5%. Гены S-фимбрии обнаруживали у 19,8% штаммов, афим-бриального адгезина у 3,3% штаммов. У трети штаммов, имеющих в своем геноме детерминанты адгезинов, обнаружены две разновидности генов одновременно (в большинстве случаев P- и S-фимбрии). Сочетание генов pap+afa выявлено у 5,6% штаммов. Другие комбинации и сочетанное присутствие генов трех адгезинов обнаружено не было.

Доли штаммов, несущих в геноме детерминанты факторов адгезии, не одинаковы среди представителей различных филогрупп. Рар-гены больше представлены среди штаммов филогенетической группы В2 и D (46,7 % и 38,7 % соответственно), что значительно (%2=77,036; df=3; р<0,001) отличалось от изолятов филогруппы А и В1, где доли pap(+) штаммов составляли 9,6% и 2,7% соответственно. Sfa-гены больше представлены среди штаммов филогенетической группы В2 (45,9%), чем среди штаммов других филогрупп. Распространенность afa-генов статистически значимо не отличалась среди исследуемых штаммов (%2=4,492; df=3; р=0,213) (см.та-блицу).

Гены, кодирующие продукцию токсинов: а-гемо-лизина (hlyB) и цитонекротического фактора (cnf) присутствовали у 35,0% исследуемых штаммов. HlyB-ген обнаружен у 20,9% штаммов, cnf-ген - у 17,4% штаммов, при этом сочетанное присутствие этих генов выявлено в 3,3% случаев.

Аналогично генам адгезинов, гены токсинов имели разную распространенность среди изолятов различных филогрупп. Гены, кодирующие а-гемолизин, чаще встречались у штаммов филогруппы В2 и D (30,0% и 23,4% соответственно), чем у группы А и В1 (13,2% и 5,4% соответственно). Гены, кодирующие цитонекротический фактор, чаще обнаруживали у штаммов филогруппы В2 (37,1%). В остальных филогруппах доля cnf (+) изолятов находилась в пределах от 0% до 13,1%. (см.таблицу).

Сочетанным присутствием генетических детерминант этих токсинов отличалась группа В2 (%2=11,336; df=3; р=0,011), где доля hly (+) cnf (+) изолятов составила 7,1%, тогда как в филогруппе А - 1,8%, в группе D -1,5%, в группе В1 такие штаммы отсутствовали.

Пятая часть изучаемых штаммов содержала в составе генома ген сидерофора аэробактина. Его частота встречаемости статистически значимо не отличалась у E. coli различных филогенетических групп (%2=0,691; df=3; р=0,875) (см.таблицу). Следует отметить, что ген аэробактина значительно чаще (29,5%) обнаруживался у штаммов, в которых отсутствовали гены а-гемолизина и цитонекротического фактора (х2=54,186; df=1; р=0,000). В то время как аналогичный показатель у cnf (+ ) штаммов составлял 5,6%, у hly (+) штаммов гены аэробакти-на не обнаружены.

Гены вирулентности у штаммов E. coli основных филогенетических групп

Ген вирулентности Филогенетические группы Всего (n=511) Значение критерия х2 (df=3) Уровень значимости, р

А

абс 16 1 81 53 151

pap 77,036 <0,001

% 9,6 2,7 47,6 38,7 29,5

sfa абс 7 1 78 15 101

112,17 <0,001

% 4,2 2,7 45,9 10,9 19,8

afa абс 4 0 5 8 17

4,492 0,213

% 2,4 0 2,9 5,8 3,3

hlyB абс 22 2 51 32 107

20,391 <0,001

% 13,2 5,4 30,0 23,4 20,9

cnf абс 8 0 63 18 89

73,656 <0,001

% 4,8 0 37,1 13,1 17,4

абс 35 6 32 29 102

aer 0,691 0,875

% 21,0 16,2 18,8 21,2 20,0

Анализ распространенности комбинаций генов с различной функциональной нагрузкой (адгезинов, токсинов, факторов персистенции) показал, что у 30,5% штаммов присутствовали гены одной функциональной группы, у 30,7% изолятов выявлена комбинация генов двух функциональных групп. У трех из 511 штаммов (0,6%) обнаружены гены факторов вирулентности трех функциональных групп (адгезинов, токсинов и сидеро-фора). Эти штаммы принадлежали филогенетической группе В2.

Обсуждение. Анализ распределения долей филогенетических групп в структуре исследуемой популяции E. coli не позволяет выявить преобладающую группу, так как группы А, В2, D представлены практически в равном соотношении и суммарно составляют более 90%. Наименьшая доля штаммов относится к группе В1.

При сравнении структуры исследуемой популяции E. coli со структурами популяций, выделенных от жителей других географических регионов обращает на себя внимание сходство с популяциями E. coli жителей мегаполисов Франции [27] и Австралии [27], где также нельзя выявить ведущую филогруппу, а группа В1 представлена незначительно. Подобная структура значительно отличается от структуры популяции E. coli, выделенной от жителей Фучжоу [28] и провинции Чонам [29], где значительная доля штаммов относится к группе В1 и А, а группа В2 представлена незначительно или вообще отсутствует.

Учитывая разницу климатических условий в Санкт-Петербурге, Париже и Сиднее, одинаковое соотношение долей анализируемых показателей можно объяснить сходством условий проживания жителей мегаполисов и потребляемых ими пищевых продуктов. Отличия указанных мегаполисов от корейской провинции Чонам можно связать с различиями между сельскими жителями и горожанами (питание, санитарно-гигиенические условия, объем контакта с природной средой). Ключом к пониманию различий между Санкт-Петербургом и Фучжоу, возможно, является уклад жизни и традиции. Этим же можно объяснить и сходство между сельскими и городскими жителями Азии.

Исследования распространенности E. coli определенных филогенетических групп в кишечнике различных видов животных показали зависимость частоты обнаружения от массы тела, скорости транзита пищи, длины ЖКТ и диеты [1]. У людей разного пола варьирует длина кишечника (у мужчин длиннее чем у женщин), отличается время транзита пищи (у женщин дольше чем у мужчин) и рацион питания. Все эти характеристики также подвержены и возрастным изменениям [30, 31]. Поэтому мы проанализировали филогенетическую структуру популяции E. coli в группах детей, разделенных по возрастному и половому признаку, но значимых отличий не выявили. Вероятно, гендерные и возрастные отличия можно выявить при исследовании проб от взрослых со значительной разницей в возрасте.

В своем исследовании методом ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией мы выявили в пробах фекалий детей без признаков диареи некоторые патоти-пы диареегенных E. coli ( EPEC - 2,5%; EAggEC - 4,5%). ETEC, EIEC, EHEC патотипы выявлены не были.

Анализ литературных данных показал, что выявление EPEC у так называемых бессимптомных носителей не является редкостью. Исследование проб фекалий 5197 детей без симптомов гастроэнтерита в возрасте от

МИКРОБИОЛОГИЯ

0 до 4 лет в Нидерландах выявило EPEC в 19,9 % проб [32]. Согласно данным многоцентрового исследования причин диареи в развивающихся странах частота обнаружения энтеропатогенных E. coli в фекалиях детей в возрасте от 0 до 1 года без симптомов диареии составляет в Индии - 9,2%; Пакистане -7,5%; Бразилии -18,8%; Перу - 4,8% [33].

Находки EPEC у бессимптомных носителей можно объяснить рядом причин, как со стороны макро- так и микроорганизма. Невосприимчивость к данной инфекции связана: с отсутствием рецепторов, к которым при-креляется E. coli этого патотипа; с иммунным статусом макроорганизма, который предотвращает клинические проявления, но не препятствует колонизации; с наличием у детей раннего возраста Jg A в кишечнике (секреторного и получаемого с грудным молоком матери), который препятствует прикреплению к энтероцитам, но не убивает бактерию [34].

Кроме того, EPEC представляют собой гетерогенную группу штаммов, вирулентность которых варьирует. Некоторые штаммы вызывают диарею чаще, чем другие при одинаковой дозе заражения. В настоящее время отсутствуют тесты, позволяющие выявлять высоковирулентные штаммы.

Находки EPEC, возможно, были связаны еще и с тем, что пробы были взяты незадолго до начала заболевания, либо после стихания симптомов, когда микроорганизм уже или еще присутствовал в кишечнике. EPEC, как патогены, не имеют значения у детей старше двух лет и взрослых, однако, присутствие таких штаммов в кишечнике бессимптомных носителей не исключает риск их передачи членам семьи или воспитанникам детских учреждений, но отсутствие симптомов значительно снижает риск заражения.

В нашем исследовании методом ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией в 4,5% проб фекалий детей без признаков диареи были выявлены EAggEC. Отличительной особенностью и золотым стандартом идентификации EAggEC является характер прикрепления бактерий к клеткам HEp-2 в виде слоистого кирпичного узора при электронной микроскопии. В настоящее время применяются и молекулярно-генетические методы идентификации, основанные на выявлении aggR-гена. Однако, не все имеющие aggR -ген штаммы имеют характерный способ прикрепления, равно как и не все, прикрепляющиеся в виде кирпичной кладки, клетки имеют aggR -ген [12].

Штаммы EAggEC часто встречаются в микробиоте здоровых лиц. Распространенность изолятов с такими свойствами отличается в разных географических регионах. Результаты многоцентрового исследования показали, что в Непале, Бразилии, Индии, Перу, Танзании они встречались у 24-37% детского населения, в то время как, например, в Японии лишь в 3,5% случаев [33]. Исследования штаммов, выделенных при диарее в разных регионах, показали их генетическое разнообразие. При экспериментальном заражении добровольцев четырьмя различными штаммами EAggEC, выделенными от больных, только один штамм вызвал диарею, причем не у каждого испытуемого [35].

Методом ПЦР с электро-форетической детекцией в штаммах, выделенных из микробиоты кишечника детей без признаков инфекции мочевыводящих путей, были выявлены гены, традиционно считающиеся маркерами уропатогенных E. coli. Доли штаммов, несущих гены

MICROBIOLOGY

вирулентности, были не одинаковы среди представителей различных филогенетических групп. Группой, наиболее наполненной исследуемыми генами адгезинов и токсинов, была филогруппа В2. Далее по наполненности следует группа D. Группы А и В1 менее всего наполнены генами, часто встречающимися у уропатогенных изолятов. Эти факты позволяют предположить отличия в размере генома штаммов различных филогрупп. Подтверждением этому служат работы зарубежных исследователей, где показано, что размер генома у штаммов филогенетической группы А и В1 не превышает 5 млн. п. н. (4,78 и 4,86 соответственно) в отличие от групп В2 и D (5,09 и 5,23 соответственно). Это является результатом потери и/или приобретения генетических элементов в процессе адаптации к различным видам хозяев, экологическим нишам и условиям существования [18].

Полученные нами результаты совпадают и с результатами шведских исследователей, изучавших резидентные штаммы E. coli, выделенные из микробиоты кишечника здоровых шведских детей. Это исследование показало, что большинство (60%) резидентных штаммов принадлежало к филогенетической группе В2 и геном резидентных изолятов в отличие от транзиторных чаще содержал гены кодирующие Р-фимбрии, а-гемолизин, аэробактин, капсульные антигены К1 и К5. Эти факторы способствовали длительному сохранению E. coli в кишечнике детей. В связи с этим F. Nowrouzian и со-авт. [14] выдвинули гипотезу о том, что так называемые факторы вирулентности способствуют колонизации и персистенции штаммов E. coli в ЖКТ и являются факторами приспособляемости, а не специфическими факторами вирулентности.

Заключение. Структура популяции E. coli, выделенных из микробиоты кишечника детей без диареи и инфекций мочевыводящих путей, проживающих в Санкт-Петербурге, была представлена следующими филогенетическими группами: А - 32,7%; В1 - 7,2%; В2 - 33,3%; D - 26,8% и статистически значимо не отличалась у детей разного пола и возраста. Подобное соотношение сходно со структурами популяций E. coli жителей Парижа и Сиднея.

Штаммы E. coli различных филогенетических групп, выделенные из микробиоты кишечника детей без диареи и инфекций мочевыводящих путей, содержали гены диареегенных и уропатогенных эшерихий. Распространенность штаммов, обладающих генами вирулентности EPEC, была выше в филогенетической группе В1; генами вирулентности EAggEC - в группе D; генами вирулентности ExPEC - в группе В2. Это свидетельствует о влиянии генетического фона микроорганизма на присутствие в нем определенных генов вирулентности.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Escobar-Páramo P., Le Menac'h A., Le Gall T., Amorin C., Gou-riou S., Picard B. et al. Identification of forces shaping the commensal Escherichia coli genetic structure by comparing animal and human isolates. Environmental Microbiology. 2006; 8:1975-84. Doi: 10.1111/j.1462-2920.2006.01077.x.

2. Hansen S., Messer T., Mittelstet A., Berry E. D., Bartelt-Hunt S., Abimbola O. Escherichia coli concentrations in waters of a reservoir system impacted by cattle and migratory waterfowl. Science

of The Total Environment. 2020; 705:135607. Doi:10.1016/j.scito-tenv.2019.135607.

3. Dusek N., Hewitt A. J., Schmidt K. N., Bergholz, P. W. Landscape-Scale Factors Affecting the Prevalence of Escherichia coli in Surface Soil Include Land Cover Type, Edge Interactions, and Soil pH. Applied and environmental microbiology. 2018; 84(10): e02714-17. Doi:10.1128/AEM.02714-17.

4. Vieira G., Sabarly V., Bourguignon P. Y., Durot M., Le Fevre F., Mornico D. et al. Core and panmetabolism in Escherichia coli. Journal of bacteriology. 2011; 193(6): 1461-72. Doi:10.1128/ JB.01192-10.

5. Christofi T., Panayidou S., Dieronitou I., Michael C., Apidianakis, Y. Metabolic output defines Escherichia coli as a health-promoting microbe against intestinal Pseudomonas aeruginosa. Scientific reports. 2019; 9(1): 14463. Doi:10.1038/s41598-019-51058-3.

6. Dempsey W. B. Control of Vitamin B6 Biosynthesis in Escherichia coli. Journal of bacteriology. 1971; 108(1):415-21. https://jb.asm. org/content/jb/108/1/415.full.pdf.

7. Meganathan R., Kwon O. Biosynthesis of Menaquinone (Vitamin K 2) and Ubiquinone (Coenzyme Q). EcoSal Plus. 2009; 3(2): 10.1128/ecosalplus.3.6.3.3. Doi:10.1128/ecosalplus.3.6.3.3.

8. Zampieri M., Hörl M., Hotz F., Müller N. F., Sauer, U. Regulatory mechanisms underlying coordination of amino acid and glucose ca-tabolism in Escherichia coli. Nature communications. 2019; 10(1): 3354. doi:10.1038/s41467-019-11331-5.

9. Rieder R., Wisniewski P.J., Alderman B.L., Campbell S.C. Microbes and mental health: A review. Brain, Behavior, and Immunity. 2017; 66: 9-17. Doi: 10.1016/j.bbi.2017.01.016.

10. Brestoff J. R., Artis, D. Commensal bacteria at the interface of host metabolism and the immune system. Nature immunology. 2013; 14(7): 676-84. Doi:10.1038/ni.2640.

11. Mackie R. I., Sghir A., Gaskins H. R. Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. The American Journal of Clinical Nutrition. 1999; 69(5): 1035-45. Doi:10.1093/ ajcn/69.5.1035s.

12. Kaper J. B., Nataro J. P., Mobley H. L. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2004; 2:123-40. Doi:10.1038/nrmi-cro818.

13. Lüthje P., Brauner A. Virulence factors of uropathogenic E. coli and their interaction with the host author links open overlay panel. Advances in Microbial Physiology. 2014; 65: 337-72. Doi:10.1016/ bs.ampbs.2014.08.006.

14. Nowrouzian F., Hesselmar B., Saalman R. Strannegard I., Aberg N., Wold A. E. et al. Escherichia coli in Infants' Intestinal Microflora: Colonization Rate, Strain Turnover, and Virulence Gene Carriage. Pediatric Research. 2003; 54: 8-14. Doi:10.1203/01. PDR.0000069843.20655.EE.

15. Lefort A., Panhard X., Clermont O., Woerther P., Branger C., Men-tre F. et al. Host Factors and Portal of Entry Outweigh Bacterial Determinants To Predict the Severity of Escherichia coli Bacteremia. Journal of Clinical Microbiology. 2011; 49(3): 777-83. Doi:10.1128/JCM.01902-10.

16. Ochman H., Selander, R. K. Standard reference strains of Esche-richia coli from natural populations. Journal of bacteriology. 1984; 157(2): 690-3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC215307/pdf/jbacter00237-0354.pdf.

17. Hendrickson H. Order and disorder during Escherichia coli divergence. PLoS genetics. 2009; 5(1): e1000335. Doi:10.1371/journal. pgen.1000335.

18. Bergthorsson U., Ochman H., Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Molecular Biology and Evolution. 1998; 15(1): 6-16. Doi :10.1093/oxfordjournals. molbev.a025847.

19. Ejrn^s K., Stegger M., Reisner A., Ferry S., Monsen T., Holm S. E et al. Characteristics of Escherichia coli causing persistence or relapse of urinary tract infections: Phylogenetic groups, virulence factors and biofilm formation. Virulence. 2011; 2(6): 52837. Doi: 10.4161/viru.2.6.18189.

20. Coura F.M., Araujo D.S., Mussi J.M.S., Silva M.X., Lage A.P., Heinemann M. B. Characterization of virulence factors and phy-logenetic group determination of Escherichia coli isolated from

МИКРОБИОЛОГИЯ

diarrheic and non-diarrheic calves from Brazil. Folia Microbiologi-ca. 2017; 62(2): 139-44. Doi: 10.1007/sl2223-016-0480-9.

21. Wu H., Xia S., Bu F., Qi J., Liu Y., Xu H. Identification of integrons and phylogenetic groups of drug-resistant Escherichia coli from broiler carcasses in China. International Journal of Food Microbiology. 2015; 211: 51-6. Doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2015.07.004.

22. Nielsen D.W., Klimavicz J.S., Cavender T., Wannemuehler Y., Barbieri N.L, Nolan L.K. et al. The Impact of Media, Phylogenetic Classification, and E. coli Pathotypes on Biofilm Formation in Extraintestinal and Commensal E. coli From Humans and Animals. Frontiers in microbiology. 2018; 9: 902. Doi: 10.3389/ fmicb.2018.00902.

23. Clermont O., Bonacorsi S., Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Applied and environmental microbiology. 2000; 66: 4555-8. Doi: 10.1128/ aem.66.10.4555-4558.2000.

24. Nowrouzian F., Adlerberth I., Wold A. E. P fimbriae, capsule and aerobactin characterize colonic resident Escherichia coli. Epidemiology and infection. 2001; 126(1): 11-8. Doi:10.1017/ s0950268801005118.

25. Abe C.M., Salvador F.A., Falsetti I.N., Vieira M.A., Blanco J., Blanco J.E.et al. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains may carry virulence properties of diarrhoeagenic E. coli. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 2008; 52: 397-406. Doi:10.1111/ j.1574-695X.2008.00388.x.

26. Zhu Y., Dong W., Ma J. L., Yuan H., Hejair M.A., Pan Z. et al. Characterization and virulence clustering analysis of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. BMC Veterinary Research. 2017; 13: 94. Doi 10.1186/s12917-017-0975-x.

27. Bailey J. K., Pinyon J. L., Anantham S., Hall R. M. Distribution of Human Commensal Escherichia coli. Journal of Clinical Microbiology. 2010; 48(9): 3455-6. Doi:10.1128/JCM.00760-10.

28. Li B., Sun J. Y., Han L. Z., Huang X. H., Fu Q., Ni Y. X. Phylogenetic groups and pathogenicity island markers in fecal Escherichia

coli isolates from asymptomatic humans in China. Applied and environmental microbiology. 2010; 76(19): 6698-700. Doi: 10.1128/ AEM.00707-10.

29. Unno T., Han D., Jang J., Lee S. N., Ko G., Choi H. Y. et al. Absence of Escherichia coli phylogenetic group B2 strains in humans and domesticated animals from Jeonnam Province, Republic of Korea. Applied and environmental microbiology. 2009; 75: 565966. Doi: 10.1128/AEM.00443-09.

30. Graft J., Brinch K., Madsen, J. L. Gastrointestinal mean transit times in young and middle-aged healthy subjects. Clinical Physiology. 2001; 21: 253-9. Doi:10.1046/J.1365-2281.2001.00308.X.

31. Hounnou G., Destrieux C., Desme J., Bertrand P., Velut, S. Anatomical study of the length of the human intestine. Surgical and Radiologic Anatomy. 2002; 24: 290-4. Doi: 10.1007/s00276-002-0057-y.

32. Enserink R., Scholts R., Bruijning-Verhagen P., Duizer E., Vennema H., Boer R.et al. High detection rates of enteropathogens in asymptomatic children attending day care. PLoS One. 2014; 9(2): e89496. Doi: 10.1371/journal.pone.0089496.

33. Platts-Mills J.A., Babji S., Bodhidatta L., Gratz J., Haque R., Havt A. et al. Pathogen-specific burdens of community diarrhoea in developing countries: a multisite birth cohort study (MAL-ED). Lancet Glob Health. 2015; 3:e564-575. Doi: 10.1016/S2214-109X(15)00151-5.

34. Newburg D.S., Ruiz-Palacios G.M., Morrow A.L. Human milk glycans protect infants against enteric pathogens. Annual Review of Nutrition. 2005; 25: 37-58. Doi:10.1146/annurev.nu-tr.25.050304.092553.

35. Nataro J.P., Deng Y., Cookson S., Cravioto A., Savarino S.J., Gu-ers L.D. et al. Heterogeneity of enteroaggregative Escherichia coli virulence demonstrated in volunteers. The Journal of Infectious Diseases. 1995; 171(2): 465-8. Doi:10.1093/infdis/171.2.465.

Поступила 13.02.20 Принята к печати 21.02.20