Оценка адгезивной активности бактерий, выделенных у пациентов с инфицированными эндопротезами крупных суставов

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.72-089.28-078

Шипицына И.В., Осипова Е.В., Годовых Н.В.

ОЦЕНКА АДГЕЗИВНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ С ИНФИЦИРОВАННЫМИ ЭНДОПРОТЕЗАМИ КРУПНЫХ СУСТАВОВ

ФГБУ Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России, Курган

Изучали адгезивные свойства 67 клинических штаммов бактерий, выделенных у пациентов с инфицированными эндопро-тезами крупных суставов. Все исследованные штаммы микроорганизмов обладали адгезивными свойствами. Отмечено неодинаковое распределение по степени адгезивности для рассматриваемых групп. Способность к адгезии грамотрица-тельных микроорганизмов выше по сравнению с грамположительными. Грамотрицательные микроорганизмы активнее формируют биопленки.

Ключевые слова: адгезивные свойства бактерий; персистенция; биопленки; инфицированный эндопротез; бактериальная инфекция.

I.V. Shipitsyna, E.V. Osipova, N.V. Godovykh

THE EVALUATION OF ADHESIVE ACTIVITY OF BACTERIA EXTRACTED FROM PATIENTS WITH INFECTED ENDOPROSTHESES OF LARGE JOINTS

The G.A. Ilizarov Russian research center "Restorative traumotology and orthopedics" of Minzdrav of Russia, Kurgan, Russia

The article presents the results of study of adhesive characteristics of 67 clinical strains of bacteria extracted from patients with infected endoprotheses of large joints. All analyzed strains of microorganisms had adhesive characteristics. The unequal distribution by degree of adhesiveness for analyzed groups is marked. The capability to adhesiveness in Gram-negative microorganisms is higher in comparison with Gram-positive microorganisms. The Gram-negative microorganisms form biofilms more actively.

Keywords: adhesive characteristics; bacteria; persistence; biofilm; infected endoprothesis; bacterial infection.

Введение. От 65 до 93% инфекционных заболеваний ассоциированы со способностью их возбудителей формировать биопленки (многослойные структуры из микробных клеток) [1]. Не являются исключением и послеоперационные осложнения после эндопротезирования. Хотя инфекционные осложнения в таких случаях возникают нечасто - в 1,5-2,5% случаев от общего числа всех операций по замене суставов различной локализации [2], по своему течению они представляют состояния, трудно поддающиеся лечению. Важнейшие пути проникновения бактерий - гематогенная диссеминация или контаминация в ходе оперативного вмешательства аэрогенным путем, с кожных покровов пациента или рук хирургов при нарушении целостности перчаток [3]. Ранние проявления инфекции (в течение ближайшего года) также являются последствием контаминации, например последствия нагноения операционной раны, что в дальнейшем может привести к персистенции бактерий в мягких тканях или на поверхностях протеза. В последующем (в сроки более 12 мес) решающее значение приобретает эндогенная инфекция, распространяющаяся через кровь.

Бактерии, активно размножаясь на поверхности протеза, формируют биопленки, которые обеспечивают им более благоприятные условия существования, связанные, в частности, с противодействием механическому удалению бактерий с поверхности протеза и устойчивостью к действию бактерицидных агентов внешней среды. Определяющим звеном в ходе инфекционного процесса является установление взаимодействия между патогеном и клеткой-мишенью в результате бактериальной адгезии. Изучение факторов, влияющих на процесс адгезии in vivo и in vitro, позволит разработать профилактические меры,

Для корреспонденции:

Шипицына Ирина Владимировна, канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. микробиологии и иммунологии Адрес: 640023, Курган, п. Заозерный, 6 мкр., 1 E-mail: karina_zhezhina@mail.ru

направленные на подавление инфекционного процесса на ранних этапах, а оценка способности микроорганизмов формировать биопленки поможет в выборе правильной тактики антибактериальной терапии, необходимой для обеспечения максимальной биодоступности в очаг инфекции.

Цель работы - оценить адгезивные свойства клинических штаммов бактерий, выделенных у пациентов с инфицированными эндопротезами крупных суставов, и их способность формировать биопленки.

Материалы и методы. Материалом для исследования послужили 67 клинических штаммов бактерий, принадлежащих к 9 таксонам (Staphylococcus aureus - 6 штаммов, S. epidermidis - 38, S. haemolyticus - 6, S. hominis - 4, Streptococcus spр. - 9, Klebsiella pneumoniae - 1, Enterobacter cloacae - 1, Yersinia pseudotuberculosis - 1, Esherichia coli -1), которые были выделены у 48 пациентов с развившейся нестабильностью тазобедренного и коленного суставов. Материал (околосуставные ткани, части эндопротеза и ложе эндопротеза) отбирали во время оперативного вмешательства при ревизионном эндопротезировании. Исследуемые штаммы идентифировали на бактериологическом анализаторе WalkAway-40 Plus ("Siemens", США), используя панели РВСРС 20. Адгезивную способность микроорганизмов изучали по методике В.И. Брилиса [4]. Исследование адгезии проводили под световым микроскопом, подсчет вели учитывая в общей сложности не менее 50 эритроцитов. При оценке адгезивных свойств использовали индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) - среднее количество микробных клеток на эритроците (учитывали только участвующие в адгезивном процессе эритроциты). Микроорганизмы считали неадгезивными, если значения ИАМ не превышали 1,75, низкоадгезивными - при ИАМ в диапазоне от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными - от 2,51 до 4,0, высокоадгезивными, если ИАМ > 4,1. Для соблюдения стандартных условий в опыте использовали эритроциты только одного донора A(II).

Ряд штаммов тестировали на способность формировать биопленки на поверхности 96-луночных пластиковых план-

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 6, 2014

Рис. 1. Адгезия микроорганизмов на эритроцитах.

а - Streptococcus spp., б - K. pneumoniae, в - S. aureus, г - S. epidermidis; стрелками указаны адгезированные на поверхности эритроцитов бактерии. Окраска генциановым фиолетовым. Ув. 40.

шетов, для чего суточные бульонные культуры тестируемых штаммов инокулировали в лунки планшета по 100 мкл в 4 повторах. Для контроля на каждом планшете в 8 лунок вносили стерильный мясопептонный бульон. После инкубации в течение 24 и 48 ч при 370С содержимое лунок (бульон, содержащий планктонные бактериальные клетки) аккуратно удаляли пипеткой. Лунки 3 раза промывали фосфатным буфером. Для окрашивания пленок в лунки вносили по 180 мкл раствора ген-цианового фиолетового на 45 мин при комнатной температуре. После трехкратного промывания фосфатным буфером в лунки для экстракции краски из пленки вносили по 200 мкл 96% этанола. Через 45 мин оценивали интенсивность окрашивания спирта в лунках планшетов на фотометре ЕЬх808 ("ВюТек", США) при длине волны 630 нм. Для интерпретации полученных данных определяли критерии способности штаммов формировать биопленки в соответствии с рекомендациями S. Stepanovic и соавт. [5]. При значениях оптической плотности (ОЦ) < 0,090 считали, что штаммы не обладали способностью к образованию биопленки, при 0,090 < ОЦ < 0,180 - штаммы обладали низкой способностью к образованию биопленки, при

0,180 < OD < 0,360 - штаммы имели среднюю способность к образованию биопленки, при OD > 0,360 штаммы имели высокую способность к образованию биопленки.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения анализа данных AtteStat, версия 13.0 [6]. Значимость различий между группами проверяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксо-на и Манна-Уитни. Различия между группами наблюдения считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты и обсуждение. При микробиологическом исследовании биоматериала от пациентов с инфицированными эндопротезами коленного и тазобедреннного суставов установлено преобладание грамположительной микрофлоры (94%). Видовой состав стафилококков представлен 4 видами: S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis. Кроме стафилококков, выделено 9 штаммов стрептококков. В единичных случаях встречались грамотрицательные микроорганизмы (K. pneumoniae, E. cloacae, Y. pseudotuberculosis, E. coli).

При анализе взаимодействия исследуемых штаммов микроорганизмов с эритроцитами на поверхности последних

0,7-f 0,6-

Рис. 2. Способность к биопленкообразованию клинических штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов с инфицированными эндопротезами крупных суставов.

* - различия значимы по сравнению с контролем приp < 0,05.

выявляли как отдельные бактериальные клетки, так и группы объединенных между собой клеток. Такую картину наблюдали у среднеадгезивных штаммов (Streptococcus spp., K. pneumoniae) (рис. 1, а, б). Если культуры микроорганизмов обладали низкой адгезией (S. aureus и S. epidermidis), на поверхности эритроцитов бактерии либо не обнаруживались, либо встречались на единичных клетках (рис. 1, в, г).

Видовая принадлежность в значительной степени характеризует адгезивные свойства бактерий [7, 8]. В группе грам-положительных микроорганизмов колебания ИАМ находились в пределах от 1,71 ± 0,19 у штаммов S. hominis до 2,53 ± 0,30 у Streptococcus spp. Штаммы S.hominis не обладали адгезивными свойствами, S.aureus, S.epidermidis и S.haemolyticus имели низкоадгезивную, а Streptococcus spp. и Enterococcus spp. - среднеадгезивную способность.

Среди грамотрицательных условно-патогенных бактерий штамм E. coli обладал низкоадгезивными свойствами, а штаммы K. pneumoniae, E. cloacae и Y. pseudotuberculosis -среднеадгезивной способностью.

Исследование способности выделенных штаммов к образованию биопленок на 96-луночных планшетах показало, что штаммы, имеющие низкий адгезивный потенциал, слабо формируют биопленки. Уровень биопленкообразования в 1-е сутки эксперимента находился в пределах от 0,127 ед. опт. пл. у штаммов S. epidermidis до 0,154 ед. опт. пл. у штамма E. coli. Среднеадгезивные штаммы Streptococcus spp., E. cloacae и Y. pseudotuberculosis обладали высокой способностью формировать биопленку, о чем свидетельствовали значения OD (рис. 2). На 2-е сутки эксперимента уровень формирования биопленки был ниже по сравнению с 1-ми сутками.

Бактерии, выделенные у пациентов с инфицированными эндопротезами крупных суставов, различались адгезивными свойствами. Среднеадгезивные штаммы Streptococcus spp., E. cloacae и Y. pseudotuberculosis в отличие от низкоадгезивных (S. haemolyticus, S. aureus, S. epidermidis) активно формируют биопленки. Уровень биопленкообразования грамотрицатель-ных микроорганизмов значительно выше такового грамполо-жительных.

Штаммы S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus spp. способствуют возникновению ранней послеоперационной инфекции, которая развивается в течение первого года после эндопротезирования [9]. Поздняя инфекция может быть вызвана как грамположительной аэробной кокковой флорой, так и грамотрицательными аэробными и анаэробными бактериями [10]. В нашем случае выделенные штаммы грамотрица-тельных микроорганизмов обладали высокими адгезивными

свойствами, что в дальнейшем могло привести к прогресси-рованию инфекционного процесса и как следствие к устойчивости к применяемым антибактериальным препаратам.

Заключение. Необходимы тщательное обследование пациентов при первичном эндопротезировании для выявления микроорганизмов с выраженным персистентным потенциалом и последующие целенаправленные лечебные мероприятия. Лечение должно быть направлено не только на разрушение и удаление сформировавшихся биопленок, но и на подавление первого, наиболее важного, этапа развития биопленок - адгезии бактерий. Антибактериальные препараты следует выбирать с учетом не только данных о чувствительности выделенных монокультур возбудителей, но и их способности формировать биопленки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004; 40 (11): 1445-7.

2. Tentino J.R. Prosthetic joint infection. J. Nucl. Med. Technol. 2004; 32 (2): 47-57.

3. Charneley J. Postoperative infection after total hip replacement with special reference to air contamination in the operating room. Clin. Orthop. 1982; 87: 167-87.

4. Брилис В.И. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело. 1986; 4: 210-2.

5. Stepanovic S., Vukovi D., Hola V. et al. Quantification of biofilm in mi-crotiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by Staphylococci. APMIS. 2007; 115: 891-9.

6. Гайдышев И.П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и C/C++. СПб.: ВХВ Петербург; 2004. 512 с.

7. Balaban N.Q. et. al. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 2004; 305 (5690): 1622-5.

8. Popat R., Crusz S., Doggle S. The social behaviours of bacterial pathogens. Br. Med. Bull. 2008; 87: 63-75.

9. Horan T.C., Gaynes W.J., Jarvis W.R. CDC definition of nosocomial sursical infection. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 1992; 3 (10): 606-8.

10. Braause B. Sepsis: The rational use of anti-microbials. In: Callaghan J.J., Rosenberg A.G., Rubash H.E., eds. The adult Hip. Philadelphia: Lippincott-Raven Publeshers; 1998: 1343-9.

REFERENCES

1. Il'ina T.S., Romanova Yu.M., Gintsburg A.L. Bioplenki kak sposob sushchestvovaniia bakterii v okruzhaiushchei srede i organizme khoziaina: fenomen, geneticheskii kontrol' i sistemy reguliatsii ikh razvitiia [Biofilms as a mode of existence of bacteria in the environment and in the host organism: phenomenon, genetic control and the systems of their development regulation]. Genetika. 2004; 40

2. Tentino J.R. Prosthetic joint infection. J. Nucl. Med. Technol. 2004; 32 (2): 47-57.

3. Charneley J. Postoperative infection after total hip replacement with special reference to air contamination in the operating room. Clin. Orthop. 1982; 87: 167-87.

4. Brilis V.I. et al. Metodika izucheniia adgezivnogo protsessa mikroorga-nizmov [A technique for studying adhesive process of microorganisms]. Laboratornoy delo. 1986; 4: 210-2.

5. Stepanovic S., Vukovi D., Hola V. et al. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by Staphylococci. APMIS. 2007; 115: 891-9.

6. Gaidyshev I.P. Reshenie nauchnykh i inzhenernykh zadach sredstvami Excel, VBA i C/C++ [Solving scientific and engineering problems by means of Excel, VBA and C/C++]. St. Petesrbug: VKhV Petersburg; 2004. 512 p.

7. Balaban N.Q. et. al. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 2004; 305 (5690): 1622-5.

8. Popat R., Crusz S., Doggle S. The social behaviours of bacterial pathogens. Br. Med. Bull. 2008; 87: 63-75.

9. Horan T.C., Gaynes w.J., Jarvis w.R. CDC definition of nosocomial sursical infection. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 1992; 3 (10): 606-8.

10. Braause B. Sepsis: The rational use of anti-microbials. In: Callaghan J.J., Rosenberg A.G., Rubash H.E., eds. The adult Hip. Philadelphia: Lippincott-Raven Publeshers; 1998: 1343-9.

Поступила 02.10.13