Штамм актиномицета Streptomyces malaysiensis Ас-2175 - продуцент макбецина I и валидамицина А, обладающий фунгицидным действием
ACTINOMYCETE STRAIN STREPTOMYCES MALAYSIENSIS AC-2175 IS A PRODUCER OF MACBECIN I AND VALIDAMYCIN A, WHICH HAS A FUNGICIDAL EFFECT

Fusarium proliferatum
Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности для создания средств зашиты растений от болезней, вызванных .
Внедрение в сельское хозяйство фунгицидов на основе антагонистически активных штаммов микроорганизмов и их метаболитов является действенной альтернативой использованию химических пестицидов, позволяющей получить экологически безопасную растениеводческую продукцию [Муродова, С.С. Комплексные микробные препараты. Применение в сельскохозяйственной практике / С.С. Муродова, К.Д. Давранов // BiotechnologiaActa. - 2014. - Т. 7. - № 6. - С. 92-101; Trivedi, P. Tiny Microbes, Big Yields: enhancing food crop production with biological solutions / P.P. Trivedi, P.M. Schenk, M.D. Wallenstein, B.K. Singhet // Microbial Biotechnology. - 2017. - V. 10. - Iss. 5. - P. 999-1003]. Являясь природными соединениями, метаболиты микробов-продуцентов исключают загрязнение почвы, не аккумулируются в окружающей среде, легко подвергаются деструкции [Дятлова, К.Д. Микробные препараты в растениеводстве / К.Д. Дятлова // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7. - № 5. - С. 17-22].
Fusarium
В настоящее время значительная доля урожая многих сельскохозяйственных культур гибнет вследствие поражения посевов грибами рода [Тихомиров, А.А. Фузариоз как фактор риска при культивировании пшеницы в условиях искусственных экосистем / А.А. Тихомиров, С.В. Хижняк, С.А. Ушакова, Н.А. Тихомирова, А.М. Павлова // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2019. - Т. 53. - № 3. - C. 89-96]. Помимо экономических потерь, вызванных поражением посевов, употребление пищевых продуктов, изготовленных на основе инфицированного сырья, может вызывать у человека фузариотоксикозы [Павлюшин, В.А. Фузариоз зерновых культур и опасность микотоксинов в России / В.А. Павлюшин // АгроСнабФорум. - 2017. - № 3 (151). - С. 41-43].
Fusarium
Fusarium
Fusarium proliferatum
Fusarium head
Fusarium proliferatum
Fusarium proliferatum
Известно, что род включает большой набор видов. Для зерновых описано порядка 30 видов грибов рода , имеющих различные биоэкологические потребности, степень патогенности и токсино продуцирующую способность [Гагкаева, Т.Ю. Фузариоз зерновых культур / Т.Ю. Гагкаева, О.П. Гаврилова, М.М. Левитин, К.В. Новожилов // Приложение к журналу «Защита и карантин растений». - 2011. - № 5. - 52 с.]. способен продуцировать фумонозин [Cendoya, E. Effect of fungicides commonly used for  blight management on growth and fumonisin production by  / E. Cendoya, M. J. Nichea, M. del Pilar Monge et al. // Revista Argentina de Microbiologia. - 2021. - V. 53. - Iss. 1. - P. 64-74], проявляет определенную резистентность к ряду существующих фунгицидов [Чекмарев, В.В. Гриб  и его чувствительность к современным фунгицидам / В. В. Чекмарев // Colloquium-journal. - 2020. - № 18 (70). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/grib-fusarium-proliferatum-i-ego-chuvstvitelnost-k-sovremennym-fungitsidam (дата обращения: 20.07.2021)].
Fusarium
Fusarium wilt
Streptomyces
Потенциальными антагонистами фитопатогенных грибов могут выступать стрептомицеты за счет продукции вторичных метаболитов, в том числе летучих [Yang, M. Host and Cropping System Shape the Population: 3ADON-producers are ubiquitous in Wheat Whereas NIV-Producers are more prevalent in rice / M. Yang, H. Zhang, X. Kong et al. // Toxins. - 2018. - V. 10. - № 3. - P. 115; Cha, J.Y. Microbial and biochemical basis of a -suppressive soil / J.Y. Cha, S. Han, H.J. Hong et al. // The ISME Journal. - 2016. - V. 10. - P. 119-129]. К настоящему времени известно, что прорастание грибных спор, а также рост их гиф может быть ингибирован бактериальными летучими веществами, что достигается путем изменения морфологии грибов, активности их ферментов и экспрессии генов [Cordovez, V. Diversity and functions of volatile organic compounds produced by  from a disease-suppressive soil / V. Cordovez, V.J. Carrion, D.W. Etalo et al. // Front. Microbiol. - 2015. - V. 6. - Р. 1081].
Streptomyces lydicus
Fusarium sambucinetum
Streptomyces lydicus
Streptomyces lateritius
Fusarium
Streptomyces lateritius
Fusarium
Alternaria /
Streptomyces hygroscopicus sub. sp.
Streptomyces hygroscopicus subsp
Streptomyces chrysomallus
Streptomyces chrysomallus p-21
Известен штамм актиномицета , который ингибирует рост фитопатогенных грибов, в том числе и стимулирует рост растений [Кроуфорд Д.Л., Хунг В. С. Штамм актиномицета  для защиты растений от грибковой инфекции, композиция для защиты растений от грибковой инфекции (варианты), способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции (варианты) // Патент на изобретение RU 2127521 C1. Заявка: 96102030/13, 29.06.1994. Дата публикации: 20.03.1999]. Описан штамм  для стимуляции роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых микозов, вызванных в том числе грибами рода [Громовых Т. И., Садыкова В. С., Литовка Ю. А.Штамм актиномицета  19/97-m, используемый для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов  и Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // патент на изобретение RU 2261902 С2. Заявка 2003100579/13, 08.01.2003 Дата публикации: 27.07.04. Бюл. № 28]. , который помимо антагонистического действия на фитопатогенные грибы, оказывает инсектицидное действие [Галкина Н. Н., Бесаева С. Г., Асланян Е. М., Лиховидов В. Е. Штамм актиномицета . ЦКМ В-4561, обладающий фунгицидными, бактерицидными и инсектицидными свойствами / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. Патент на изобретение RU 2243259 С2. Заявка: 2002129235/13, 01.11.2002. Дата публикации: 27.12.2004]. Штамм обладает не только большой эффективностью и широким спектром действия в отношении фитопатогенных грибов, но дополнительно проявляет высокую антивирусную и фиторегуляторную активность [Новикова И. И., Бойкова И. В. Штамм актиномицета  для получения биопрепарата полифункционального действия / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2226214 C1. Заявка: 2002117842/13, 02.07.2002. Дата публикации: 27.03.2004].
Streptomyces resistomycificus
Streptomyces felleus
,
Fusarium
Streptomyces resistomycificus recb-31b
Streptomyces felleus
.
Наиболее близкими к предлагаемому штамму является RECB-31Bи ВИЗР N 8которые имеет широкий спектр действия против фитопатогенных грибов, в том числе рода [Сафин Р. И., Каримова Л. З., Валидов Ш. З., Александрова Н. М. Штамм бактерий для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных грибов, стимуляции их роста и повышения урожайности / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2737140 С1. Заявка: 2019141758, 13.12.2019. Дата публикации: 25.11.2020. Бюл. № 33; Новикова И. И., Литвиненко А. И., Нугманова Т. А., Калько Г. В. Штамм  для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов / Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам // Патент на изобретение RU 2052501 С1. Заявка: 5066773/13, 06.10.1992. Дата публикации: 20.01.1996]Недостаток данных штаммов актиномицетов заключается в отсутствии способности к продукции летучих веществ, обладающих фунгицидной активностью.
Streptomyces malaysiensis
Задача изобретения - получение нового штамма актиномицета  3К9, обладающего фунгицидным действием за счет продукции валидамицина и синтеза летучих веществ.
Streptomyces malaysiensis
Поставленная задача решается тем, что предложен штамм актиномицета  3К9, обладающий антагонистической активностью против фитопатогена, с которым связывают накопление фуманозина в зерне. Новый штамм выделен из почвы. Местоположение участка пробоотбора почвы - Фаленский район Кировской области (N 58 21.558 E 051 33.533).
Streptomyces malaysiensis
Штамм  3К9 депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером Ас-2175, как продуцент макбецина I, валидамицина А.
Streptomyces malaysiensis
Streptomyces resistomycificus
Streptomyces felleus
Fusarium proliferatum
Предлагаемый штамм  3К9 отличается от штаммов прототипов и тем, что он активен против и способен к продукции летучих веществ, обладающих биоконтрольным действием в отношении данного гриба.
Streptomyces malaysiensis
Streptomyces malaysiensis
Идентификацию штамма 3К9 проводили согласно определителям Гаузе и др., 1983; Bergey's Manual, 1994, а также с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов 16S рРНК, а также амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (Москва).
Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Streptomyces malaysiensis
Streptomyces malaysiensis
Штамм 3К9 формирует спиральные цепочки спор (на фиг. 1). Является аэробом, оптимальная температура для роста составляет 22 ÷ 27 °С. На плотных питательных средах штамм образует плотные колонии, на большинстве диагностических сред с умеренно обильным или скудным воздушным мицелием (ВМ). Вид ВМ зависит от среды культивирования штамма. Цвет ВМ на минеральном агаре 1 сероватый, с течением времени приобретает черный цвет за счет увлажнения воздухом; субстратный мицелий (СМ) - бесцветный, растворимых пигментов (РП) не образует (на фиг. 2 показано почернение воздушного мицелия 3К9 на минеральном агаре 1).
На среде ISP 3 и глицерин-нитратном агаре цвет ВМ - от белого до серого; СМ - бесцветный, РП отсутствуют. На органическом агаре 2 цвет ВМ - от белого до серого, СМ бесцветный, образуется пигмент желтоватого цвета. Меланоидные пигменты на среде ISP 6 не образует.
Streptomyces hygroscopicus
Streptomyces malaysiensis
На среде ISP 4, ISP 5 цвет ВМ штамма серого, бело-серого цвета; СМ - от бесцветного до слабо желтого; на среде ISP 6 - ВМ белый, скудный, РП отсутствуют. На основании культурально-морфологических признаков, штамм 3К9 наиболее близок к виду . Согласно таксономической идентификации - .
Streptomyces malaysiensis
3К9 утилизирует инозит, мальтозу и глюкозу. Слабо усваивает маннит, фруктозу, сахарозу, арабинозу, глицерин и рамнозу. Штамм способен к синтезу экзоцеллюлаз.
Streptomyces malaysiensis
Штамм 3К9 устойчив к антибиотикам ансамициновой группы - рифампицину; левомицетину; амоксициллину. 3К9 чувствителен к бацитроцину; тетрациклину и эритромицину. Рост штамма ограничивается цефазолином, канамицином (на фиг. 3 показаны зоны чувствительности штамма 3К9 к антибиотикам).
Среди антибиотиков, продуцируемых штаммом методом ВЭЖХ обнаружен макбецин I, валидамицин А (аминогликозид), известный как мощный ингибитор активности трегалазы у грибов, а также растений и насекомых, в связи, с чем широко используется как мощный противогрибковый агроантибиотик.
Fusarium proliferatum
Биологическая активность штамма в отношении доказана методом «лунок» и в двойной культуре.
Биологическая активность.
F. proliferatum
F. proliferatum
S. malaysiensis
F. proliferatum.
F. proliferatum
S. malaysiensis
Установлено ингибирующее действие экзометаболитов штамма на рост . Значение средней величины зоны ингибирования роста  составила 24 мм. Летучие вещества 3К9 также ингибируют рост Снижение скорости радиального роста  под действием летучих веществ 3К9 составило 51,6 % к контролю соответственно (фиг. 4).
Рекомендуемый способ хранения.
Для поддержания и сохранения изолята в лабораторных условиях необходим периодический пересев штамма на свежую скошенную агаризированную овсянную среду. Частота пересева штамма составляет 5 месяцев.
Хранение штамма необходимо проводить в холодильнике, при температуре 5 °С. В пересеваемой культуре нужно выделять несколько колонии, для избегания вероятности селекции мутантов.
Более подробно сущность описываемого изобретения рассказывается в приведенных ниже примерах.
Пример 1. Культивирование штамма и изучение его антагонистических свойств
Изучена динамика роста штамма при глубинном культивировании и периодическом перемешивании на качалке (220 об / мин 8/16 ч) в колбах Эрленмейера на 250 мл на модифицированной жидкой синтетической среде (100 мл), созданной на основе рекомендуемой для выращивания стрептомицетов стандартной среде Гаузе 1 (на фиг. 5 показаны колбы со следующими значениями рН питательных сред, используемых в опыте по исследованию влияния кислотности среды на накопление биомассы штаммом 3К9: 1 - значение рН = 3,5; 2 - значение рН = 4,0; 3 - значение рН = 4,5; 4 - значение рН = 5,0; 5 - значение рН = 5,5; 6 - значение рН = 6,0; 7 - значение рН = 6,5; 8 - значение рН = 7,0; 9 - значение рН = 7,5; 10 - значение рН = 8,0).
F. proliferatum
Температура культивирования - 20 °С, продолжительность - 14 суток. Модификация среды проведена путем подбора оптимальной кислотности. Выходным параметром являлась концентрация биомассы и антибиотическая активность культуральной жидкости в отношении . Исследования проведены в диапазоне pH среды, равной 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 ед. рН. Определение биомассы проводили гравиметрическим методом. В результате исследования построена кривая роста биомассы штамма 3К9 в зависимости от рН питательной среды (фиг. 6).
В условиях глубинной культуры в диапазоне рН среды от 7,0 до 8,0 наблюдалось интенсивное накопление биомассы штаммом. Замедление накопления биомассы отмечено в диапазоне рН от 4,5 до 7,5; отсутствие роста - при рН, равном 3,5 и 4,0. Анализ полученных данных позволил заключить, что глубинное культивирование штамма 3К9 на минеральной среде 1 и рН среды от 7,0 до 8,0, обеспечивает максимальный выход биомассы штамма 3К9.
F. proliferatum
F.proliferatum
Для оценки влияния рН среды на биосинтетическую активность штамма, 0,5 мл суспензии  заливали плотной питательной средой Чапека. После застывания среды вырезали блочки и заливали в лунки 0,2 мл культуральной жидкости штамма 3К9. На фиг. 7 показаны зоны ингибирования роста внеклеточными метаболитами штамма 3К9, полученными на средах разной кислотности (значения рН для позиций с 11 по 20 изменяются в диапазоне 3,5 ÷ 8,0 ед. рН с шагом 0,5).
F. proliferatum
Установлено, что штамм способен продуцировать биоактивные метаболиты антифунгального действия в широком диапазоне рН - от 4,5 до 8,0 (влияние рН среды культивирования штамма 3К9 на продукцию экзометаболитов, ингибирующих рост ,приведено на фиг. 8).
Рост штамма в широком диапазоне кислотности среды с максимумом фунгистатической активности является неоспоримым преимуществом для совместного использования биопрепарата с другими агрохимикатами, при смешивании которых в составе баковых смесей возможно резкое снижение кислотности.
На фиг. 9 показано влияние длительности культивирования штамма 3К9 на накопление биомассы. Для штамма 3К9 отмечено отсутствие выраженной лаг-фазы, установлен быстрый рост клеток сразу после инокуляции (третьи сутки).
F. proliferatum
F. proliferatum
На фиг. 10 и 11 показано влияние длительности культивирования штамма 3К9 на его способность ингибировать рост и биосинтетическую активность (позиции на фиг. 11 демонстрируют зоны ингибирования роста на: 21 - третьи сутки культивирования; 22 - пятые сутки культивирования; 23 - седьмые сутки культивирования; 24 - десятые сутки культивирования; 25 - двенадцатые сутки культивирования; 26 - четырнадцатые сутки культивирования; 27 - семнадцатые сутки культивирования).
Антагонистический эффект внеклеточных метаболитов штамма 3К9 отмечается на третьи сутки культивирования.
Пример 2. Лабораторная оценка фитотоксичности летучих веществ, продуцируемых штаммом 3К9
Оценку токсичности летучих внеклеточных метаболитов штамма 3К9 исследовали в двойной культуре, создавая физическое разделение между стрептомицетом и семенами растений. Для этого осуществляли предварительное выращивание штамма 3К9 на плотной среде Гаузе 1. Затем вырезали блочки газона (10 мм) и помещали их на крышку чашки Петри. В донце на поверхность среды Мурасиге-Скуга помещали семена клевера (30 шт.). Чашку Петри закрывали, герметизируя стык пленкой Parafilm, чтобы предотвратить утечку летучих веществ. Инкубировали чашки при 22 °С. В контроле действие летучих веществ штамма 3К9 на растения исключали, помещая на крышку чашки Петри блочек стерильной минеральной среды Гаузе 1. Повторность опыта трехкратная.
По истечению девяти суток растения извлекали из чашек считали всхожесть, измеряли длину корня и высоту побега у проростков.
Изменение морфометрических показателей роста клевера красного под действием летучих веществ штамма 3К9 показаны на фиг. 12, где 28 - корень, 29 - побег.
Достоверных отличий по всхожести семян клевера, длине корней и высоте побегов, под действием нелетучих веществ исследуемого штамма стрептомицета не выявлено.
S. malaysiensis
F. proliferatum
Пример 3. Сравнительная оценка эффективности  3К9 и коммерческих биопрепаратов против
S. malaysiensis
Trichoderma harzianum
Bacillus subtilis
F. proliferatum.
S. malaysiensis
9
5
Проведена оценка эффективности культуральной жидкости  3К9 и коммерческих биопрепаратов: глиокладин (, штамм 18 ВИЗР, титр 10 КОЕ/г), фитолавин (комплекс стрептотрициновых антибиотиков, продуцируемых почвенными грибами), фитоспорин-М () против Растворы биопрепаратов готовили согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляли 1 таб. глиокладина; 0,2 мл фитолавина; 0,15 г фитоспорина).  3К9, предварительно выращивали на жидкой питательной среде Гаузе 1 в течение 7-и суток. Численность составила 1,9×10 КОЕ/л.
F. proliferatum
5
В чашки Петри вносили 0,1 мл культуральной жидкости (6,1×10 КОЕ/л), заливали агаризированной питательной средой Чапека. После застывания среды сверлами диаметром 12 мм вырезали 3 лунки. В лунки заливали 0,1 мл культуральной жидкости стрептомицета / биопрепарата. Контролем служила вода и среда Гаузе 1.
F. proliferatum
S. malaysiensis
S. malaysiensis
В результате проведенного эксперимента выявлена чувствительность  к  3К9 и фитолавину (см. фиг. 13, где 30 - глиокладин; 31 - фитолавин; 32 - фитоспорин; 33 -  3К9).
F. proliferatum
S. malaysiensis
Зоны ингибирования роста в случае  3К9 составила 26 ± 1 мм; фитолавина 15 ± 1 мм.
Пример 4. Совместимость штамма 3К9 с биопрепаратами
S. malaysiensis
Проведено исследование совместимости  3К9 с биопрепаратами: глиокладин, фитолавин, фитоспорин-М.
S. malaysiensis
На поверхность агаризированной среды Гаузе 1 штрихом засевали  3К9. Сверлами диаметром 12 мм вырезали 3 лунки. В лунки заливали 0,1 мл раствора биопрепаратов, приготовленных согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды - 1 таб. глиокладина; 0,2 мл фитолавина; 0,15 г фитоспорина).
S. malaysiensis
В результате эксперимента установлена совместимость  3К9 с глиокладином - 30, фитолавином - 31, фитоспорином - 32 (фиг. 14).
S. malaysiensis
Пример 5. Лабораторная оценка эффективности обработки семян культуральной жидкостью  3К9
S. malaysiensis
F. proliferatum
5
В лабораторном опыте оценивали всхожесть семян, прошедших предпосевную обработку культуральной жидкостью  3К9 (1,9×105 КОЕ/л). Опыт проводили в стеклянных емкостях объемом 50 мл. Инфекционный фон создавали путем внесения в предварительно простерилизованную почву массой 30 г 0,1 мл культуральной жидкости (6,1×10 КОЕ/л). Контролем служила почва, увлажненная стерильной дистиллированной водой. Семена ячменя сорта Белгородский 100 замачивали на 1 час в 25 мл культуральной жидкости, а также ее разведениях с водой в соотношении 1:1, 1:2, 1:50. Обработанные семена высаживали в почву. Герметизировали емкости двойным слоем фольги. Проращивание семян осуществляли в лабораторный условиях, при температуре 20 ± 2 °С, без дополнительного освещения. Учет всхожести семян производили на пятые сутки.
S. malaysiensis
При испытании культуральной жидкости  3К9 без разбавления, установлено ее ингибирующее действие на всхожесть семян ячменя (доля взошедших семян составила 10 %).
S. malaysiensis
По сравнению с контрольным фоном всхожесть семян на инфекционном снизилась. При этом с увеличением разбавления культуральной жидкости, биоконтрольное действие  3К9 также снижалось. Во всех вариантах опыта, кроме варианта с предпосевной обработкой 1:1, отмечали токсическое влияние инфекционного фона на семена (снижение всхожести более, чем на 20 %) (см. таблицу).
S. malaysiensis
Рекомендуемое разбавление культуральной жидкости  3К9 (1,9×105 КОЕ/л) для предпосевной обработки семян 1:1.
Таблица - Влияние культуральной жидкости <i>S. malaysiensis</i> 3К9 на всхожесть семян ячменя в почве инфекционного фона
Разведение
Всхожесть, % от контроля
1:1
83,3
1:2
71,4
1:50
66,7