СПОСОБ СТРУКТУРНО-ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ОРГАНИЧЕСКИХ И БИООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО И КИНЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ИОНОВ ЭТИХ СОЕДИНЕНИЙ
METHOD FOR STRUCTURAL CHEMICAL ANALYSIS OF ORGANIC AND BIOORGANIC COMPOUNDS BASED ON MASS-SPECTROMETRIC AND KINETIC SEPARATION OF IONS OF SAID COMPOUNDS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к методам и технике химического анализа органических и биоорганических соединений на базе сочетания разделения ионов этих соединений по отношениям массы к заряду, подвижности, устойчивости к столкновительной фрагментации ионов и масс-спектрометрического анализа ионов-продуктов этой фрагментации. В частности, речь идет о предварительном разделении ионов при совместном действии электрических полей и газовых потоков в линейной радиочастотной ловушке по величинам зарядов и масс, сечений столкновений и устойчивости к распаду. Последующий анализ ионов-продуктов по отношениям массы к заряду может производиться с помощью времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов (орто-ВПМС) либо на каком-либо другом масс-анализаторе или на основе регистрации наведенных сигналов от вращающихся или осциллирующих ионов в том же радиочастотном квадруполе.
Распад или гибель ионов может вызываться как разогревом вращающихся ионов за счет их столкновений с атомами или молекулами газа, так и соударениями ионов с поверхностями электродов. Использование таких распадов или гибели для разделения и идентификации анализируемых соединений является одним из отличительных признаков настоящего изобретения, оно многократно увеличивает разделительную способность метода.
Регистрация наведенного сигнала от вращающихся или осциллирующих ионов перед масс-анализом ионов-продуктов подобно тому, как это сделано в масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса (ИЦР) с быстрым преобразованием Фурье, является еще одной важной особенностью настоящего изобретения. Она позволяет получать дополнительную информацию об исследуемых ионах в виде оценок сечений столкновений с атомами или молекулами буферного газа и энергий разрыва связей при столкновительной диссоциации. Сокращается также общее время, необходимое для измерений при решении структурно-аналитических задач, и расширяется динамический диапазон измеряемых интенсивностей потоков ионов, что является слабым местом орто-ВПМС, особенно при использовании времяцифрового преобразования в качестве способа регистрации.
Среди задач, для которых, кроме чувствительности, важны как разделительная способность, так и динамический диапазон измерений, может быть упомянут экспресс-анализ микропримесей в атмосферном воздухе применительно к использованию в системах безопасности, таможенного и экологического контроля. Вторая задача, где разделительная способность и «информационная производительность» являются определяющими - это исследование структуры ионов биомолекул, что может быть важным для задач протеомики, биомедицинских и биотехнологических применений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
После разработки и создания в нашем институте первых времяпролетных масс-спектрометров с ортогональным вводом ионов (орто-ВПМС) [1, 2] приборы этого типа получили широкое распространение как при решении аналитических задач, так при исследовании структуры биомолекул [3-5]. Удобство сочленения таких приборов с различными устройствами предварительного разделения ионов, производящими непрерывный или квазинепрерывный поток ионов, с импульсным времяпролетным масс-анализом, рекордным по быстродействию среди всех известных типов масс-анализаторов, обусловили высокую эффективность и привлекательность таких сочетаний для решения разнообразных аналитических и структурных задач. В то же время существуют важные структурно-аналитические проблемы, для которых разделительная способность и «информационная производительность» известных приборных комплексов, включающих в свой состав орто-ВПМС, оказывается недостаточной. Для преодоления этих ограничений естественным является стремление ввести в масс-спектрометрический эксперимент дополнительные размерности измерений, связанные с контролируемыми превращениями исследуемых ионов и регистрацией данных в процессе этих превращений. Для проведения подобных измерений желательно иметь в реакторе достаточно большое число (или достаточно интенсивный поток) исследуемых ионов и отделить эти ионы или сигнал от них от других мешающих ионов.
В последние 10-15 лет широкое распространение в масс-спектрометрии получили газонаполненные радиочастотные мультиполи, устройства, содержащие набор обычно параллельных друг другу стержней и симметрично расположенных вокруг оси устройства. Радиочастотные напряжения чаще всего в противофазе подаются на соседние стержни. Эти устройства обычно используются как средства фокусировки и эффективной транспортировки ионов или для накопления ионов (в этом случае они называются линейными радиочастотными ловушками или линейными ионными ловушками) с возможной изоляцией выбранных ионов и проведением контролируемой диссоциации и других структурных превращений [6-8]. В этих устройствах используется описанное еще в Механике Ландау и Лифшица [9] свойство высокочастотных силовых полей вызывать выталкивание частиц в таких полях в сторону уменьшения напряженности этих полей. Если говорить более точно, то усредненное движение частиц в таких (электрических) полях описывается в первом приближении эффективным потенциалом, прямо пропорциональным квадрату напряженности высокочастотного поля, умноженной на заряд частицы, и обратно пропорциональным ее массе. Для частного случая идеального радиочастотного квадруполя эффективный потенциал квадратично зависит от обеих координат (в прямоугольной системе координат), достигая минимального значения на оси квадруполя, и усредненное свободное движение ионов в таком поле - независимые гармонические колебания по обеим координатам. Как указано там же [9], идея такого воздействия высокочастотных полей принадлежит П.Л.Капице, и она была высказана им в 1951 году. Потребовалось около 40 лет, прежде чем эта идея нашла практическое применение в таких эффективных средствах манипулирования ионами, как газонаполненные радиочастотные квадруполи или мультиполи. В этих устройствах, используемых как ионные накопители и реакторы, два важных в этом случае свойства - способность к накоплению ионов и способность разделять эти ионы могут вступать в противоречие друг с другом. Для того, чтобы эффективно останавливать ионы внутри мультиполя, нужна достаточно высокая плотность газа, а для высокой селективности изоляции выбранных ионов или возбуждения резонансных осцилляций ионов и их разогрева (для проведения фрагментации и других превращений) плотность газа должна быть относительно мала.
Одной из целей настоящего изобретения является преодоление этого противоречия. Второй целью является создание эффективных способов проведения последовательных кинетических измерений превращений нескольких типов выбранных ионов, присутствующих в не полностью разделенных смесях, развитие методов анализа экспериментальных данных для дополнительного разделения на этой основе исследуемых ионов и получения количественной информации о строении, термохимии и кинетических свойствах этих ионов.
Одной из наиболее важных предпосылок для настоящего изобретения является создание нами методики резонансного возбуждения вращения выбранных ионов вокруг оси радиочастотного квадруполя и осуществление фрагментации этих ионов за счет столкновений с молекулами буферного газа [10-12]. Эта методика была новой, ранее никем не предлагавшейся. В отличие от настоящего изобретения, возбуждение вращения ионов в этом случае производится во время их движения вдоль квадруполя без предварительного накопления. Это сужает возможности для проведения кинетических измерений и обеспечивает ограниченную способность отстройки от сигналов мешающих ионов. Кроме этого, такой способ осуществления резонансного вращения накладывает очень жесткие ограничения на качество изготовления квадруполя. Небольшие отклонения в диаметре стержней или в расстояниях между ними приводит к существенным потерям в разрешающей способности метода, которая при проведении реальных измерений в нашем случае оказывалась не более 100.
В предлагаемом варианте ионы вращаются в относительно узкой зоне (несколько мм), при этом они совершают вдоль этой зоны квазихаотические колебания со средним временем прохождения этой зоны, сравнимым с периодом вращения и много меньшим времени измерения. Таким образом, неоднородности полей в значительной степени усредняются, и их влияние на ширину резонансных кривых ослабляется. В этом случае разрешающая способность резонансного возбуждения для заданных ионов и заданного буферного газа будет в основном определяться плотностью этого газа в области вращения. При разумном остаточном давлении в 0.1 мТорр для гелия ожидаемая массовая разрешающая способность на полувысоте пиков для органических ионов с массой около 1000 Д будет около или даже более 5000.
Одной из трудностей при проведении кинетических исследований в реализованном случае была некоторая неопределенность в фактической скорости вращения ионов и в связанной с этим внутренней температуре распадающихся ионов. Это было следствием того, что измерения подвижности ионов проводились при напряженностях электрического поля, меньших тех значений, при которых начинаются процессы фрагментации. Считалось при этом, что эти подвижности остаются такими же в больших полях. Это предположение не всегда соответствует действительности. В предлагаемом методе эта трудность преодолевается за счет измерения сдвига фазы наведенного сигнала от вращающихся и распадающихся ионов от вращающего поля. Этот сдвиг определяется отклонением частоты вращающего поля от резонансной частоты и временем релаксации скорости ионов, которая однозначно связана с подвижностью этих ионов.
Нами была разработана расчетная модель и проведены эксперименты по формированию сверхзвукового газового потока при относительно низких давлениях буферного газа с переносом ионов этим потоком и отражением ионов от поверхностей, покрытых тонкой заряженной диэлектрической пленкой [13-15]. Эти методы также были новыми, неизвестными в литературе.
Создан газодинамический интерфейс для имеющегося в нашем распоряжении орто-ВПМС с формирователем газового потока и секционированным радиочастотным квадруполем. Такая конфигурация интерфейса является новой. В основных чертах она описана в нашем патенте США №7547878 от 16 июня 2009 года [16]. В отличие от настоящего изобретения, в квадруполе отсутствует «запирающая» диафрагма, и вместо квазиоднородного поля внутри квадруполя создается параболическое распределение потенциала с минимумом, расположенным недалеко от начала квадруполя. Предварительные эксперименты продемонстрировали работоспособность этого оборудования, однако эффективный захват ионов примесей в буферном газе гелии в такую ловушку пока осуществить не удалось. Возбуждением нерезонансного вращения, как предлагается в настоящем изобретении, ионы выводятся из области вблизи оси радиочастотной линейной ловушки, что лишит их возможности обратного выхода через входную диафрагму ловушки. Это должно гарантированно обеспечить эффективный захват ионов в ловушку, если предприняты меры (как это сделано в настоящем изобретении), предотвращающие гибель ионов на внутренней поверхности входной диафрагмы. Возможная замена буферного газа на более тяжелый и введение запирающей диафрагмы уменьшит время термализации ионов в ловушке.
Теоретическая модель разогрева ионов, движущихся в газе под действием электрического поля, описана нами в [17]. Модель является оригинальной, ее предсказания несколько отличаются от известных моделей. В частности, она предсказывает несколько более высокую величину внутренней температуры иона по сравнению с температурой его поступательного движения. Эта модель подтверждается имеющимися экспериментальными данными, и ее использование для получения количественных термохимических данных для исследуемых ионов является возможным.
Программное обеспечение для анализа экспериментальных данных должно включать пакеты программ, реализующие в основных чертах разработанные нами оригинальные методы, описанные в [18-22, 32]. Среди этих методов наиболее важными являются следующие.
1. Метод коррекции эффектов насыщения и «мертвого» времени при использовании времяцифрового преобразования для регистрации данных ВПМС [20, 32].
2. Метод выявления экспоненциальных вкладов в затухающий наведенный сигнал от распадающихся ионов [18, стр.192] с нахождением корней характеристического полинома с помощью процедуры, описанной в [22].
3. Метод выявления экспоненциальных вкладов в совокупности кривых ионного тока, развитый ранее для анализа совокупности эффузиометрических кривых [21].
Существующие методы при реализации столкновительной диссоциации ионов или при проведении кинетических масс-спектрометрических измерений предполагают обычно предварительную изоляцию одного типа ионов при потере всех остальных, тем самым требуя использования большого объема исходного образца и больших временных затрат на проведение экспериментов. Одно из исключений представляет собой «многоотражательный» орто-ВПМС А.Н.Веренчикова [23], где из-за значительного увеличения эффективной длины дрейфа ионов и, следовательно, их времени пролета появляется возможность произвести столкновительную диссоциацию не одного, а нескольких типов выбранных ионов, достаточно далеко разнесенных по времени выхода (на время, большее времени дрейфа ионов во вторичном времяпролетном масс-спектрометре). Этот гораздо более технически сложный, чем в нашем случае, подход, конечно, исключает проведение каких-либо кинетических измерений и производит выделение первичных ионов для диссоциации только по m/z. He предусматривается также, в отличие от предлагаемого метода, возможности дальнейшего столкновительного исследования ионов-продуктов первичной диссоциации.
Возможный подход, снижающий потери первичных ионов, описан в заявке А.В.Лободы №20070120053 на патент США [24]. В этой заявке предлагается после накопления ионов в квадруполе при давлении буферного газа около 0.1 Торр осуществлять дипольное возбуждение колебаний ионов с выбранным m/z, так чтобы эти ионы в плоскости дипольного возбуждения в среднем достаточно далеко отклонялись от оси квадруполя. Во время такого возбуждения или после его окончания создается линейно изменяющееся вдоль квадруполя постоянное во времени квадрупольное поле. Потенциалы этого поля выбираются такими, чтобы в плоскости возбуждения колебаний выбранных ионов создавать в среднем электрическое поле, двигающее ионы к выходу из квадруполя (на оси квадруполя такое поле равно 0, а в перпендикулярной плоскости оно двигает ионы в противоположном направлении). В этом случае невозбужденные ионы, имеющие в среднем меньшее отклонение от оси квадруполя в этой плоскости, будут менее подвержены влиянию этого вытягивающего поля. Таким образом, интересующий пакет ионов может быть передвинут в камеру столкновений, а остальные ионы останутся в накопительном квадруполе. После завершения работы с первым пакетом аналогичным образом в камеру столкновений может быть доставлен следующий пакет. Такой подход достаточно интересен и, по-видимому, будет работать. Однако, его разрешающая способность должна быть достаточно низкой (вряд ли она будет более 10) по нескольким причинам. Главная из них - это достаточно высокая плотность буферного газа, необходимая для захвата ионов в ловушку. Таким образом, передаваемые в камеру столкновений пакеты ионов будут содержать множество ионов в достаточно широком диапазоне масс, и для проведения столкновительной диссоциации «индивидуальных» ионов все остальные ионы из этого пакета должны быть удалены. Относительно большая плотность газа в радиочастотном мультиполе при накоплении ионов в существующих системах приводит либо к невысокой избирательности ионов при их изоляции, либо требует дополнительного времени на скачивание "лишнего" газа. Другое возможное решение - это создание сложных многотамбурных систем, где функции накопления, изоляции и столкновительной диссоциации выполняются в разных частях системы с сильно различающимися плотностями буферного газа. Такая конструкция приводит к дополнительным потерям ионов и удорожанию приборного комплекса. Именно такое построение и предлагается в только что описанной заявке на патент США [24].
Динамические методы захвата ионов в квадрупольную ловушку, когда обратный выход ионов запирается включением соответствующего потенциала до момента возврата запущенного пакета ионов от точки разворота, позволяют использовать только небольшую часть исходного потока ионов, если последующие манипуляции с ионами требуют относительно большого времени. Исходный поток ионов должен быть заперт на это время, и соответствующие ионы обычно теряются.
n
n
-9
Масс-спектрометрия ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (МС ИЦР ФП) в настоящее время обеспечивает самое точное измерение отношения массы иона к заряду (m/z) с демонстрируемым разрешением свыше 100000. В МС ИЦР ФП ионы или вводятся снаружи в ячейку или создаются внутри ячейки и удерживаются в ней комбинацией статических магнитных и электрических полей (ловушка Пеннинга). Статические магнитное и электрическое поля определяют зависимую от m/z циклотронную частоту движения. Это движение возбуждается осциллирующим электрическим полем. После короткого времени приложения поле выключается. Усиление и регистрация слабых напряжений, индуцированных на пластинах ячейки движением ионов, позволяют определить частоту движения ионов и, таким образом, m/z ионов. Ионы выборочно изолируются или фрагментируются изменением величины и частоты прикладываемого поперечного радиочастотного электрического поля и остаточного давления газа. Повторные последовательности изоляции ионов и их фрагментации (MS-операции) могут быть выполнены в единственной ячейке. МС ИЦР ФП - "большой" приборный комплекс, занимающий большую площадь и также достаточно дорогой в основном из-за затрат на создание магнитного поля с помощью сверхпроводящего соленоида и сверхвысокого вакуума. Кроме того, МС ИЦР ФП демонстрирует слабое удержание ионов в MS-операции (сравнительно с трехмерной ионной ловушкой). Высокое разрешение требует чрезвычайно высокого вакуума (ниже 10 Торр).
В дополнение к масс-спектрометрии ИЦР другое применение вращения ионов предложено в ловушках постоянного электрического поля подобно инструменту Orbitrap (описанному Макаровым в 1999, Патент США 5886346 [25]). Orbitrap имеет перед методом ИЦР важное преимущество, связанное с отсутствием магнитного поля. Оба метода могут обеспечить чрезвычайно высокое разрешение для малых и средних ионов. Для больших ионов разрешение падает по двум главным причинам: меньшие частоты вращения иона (или осцилляции в Orbitrap) для больших m/z и уменьшение времени когерентного движения ионов из-за увеличенной вероятности столкновений с атомами или молекулами остаточного газа из-за больших сечений столкновения. Кроме того, Orbitrap имеет дополнительное ограничение для введения больших ионов в ловушку постоянного электрического поля, так как эти ионы могут иметь достаточно большую вероятность столкновения с атомами или молекулами остаточного газа в квадруполе накопления во время их ускорения до относительно высокой энергии (около 1 кэВ). Таким образом, в процессе введения этих больших ионов в Orbitrap, существенная часть может быть потеряна из-за диссоциации или иметь энергию меньше, чем оптимальная во время захвата иона в ловушку постоянного электрического поля. Эти приборы так же, как и приборы ИЦР, требуют достаточно большого времени измерения (до нескольких секунд) и немного больше времени для предварительного накопления ионов.
Регистрация наведенного сигнала при свободном движении ионов в радиочастотном квадруполе описана в патенте США 6784421, M.A.Park [26]. Отличие нашего варианта такой регистрации состоит в использовании в нашем случае предопределенного типа движений ионов в квадруполе в виде суперпозиции двух вращений ионов: нерезонансного, выводящего ионы из относительно плотной области газового потока, и резонансного, или собственного вращения, сигнал от которого и регистрируется. Кроме этого, в нашем случае предполагается организовать регистрацию чисто вынужденных вращений или осцилляции ионов, в том числе при наличии частот вращающего или осциллирующего поля, близких к резонансной частоте ионов. Именно в этом случае ожидается получение важной дополнительной информации об исследуемых ионах. Для уменьшения уровня наведенных сигналов от вращающего или осциллирующего поля в нашем случае предполагается использовать измерение разности потенциалов между электродами, расположенными между стержнями квадруполя так, чтобы наведенные сигналы от стержней были близки, сигнал от ионов на электродах, расположенных ближе к центру квадруполя был бы превалирующим. В рассматриваемом патенте предлагается после накопления ионов, которое производится при относительно высоком давлении буферного газа, скачивать большую часть газа. Затем собственные движения накопленных ионов в радиочастотном квадруполе возбуждаются широкополосным импульсом напряжений, приложенных в квадрупольной моде к стержням квадруполя, и после этого наведенный сигнал от их свободного движения регистрируется. Такой подход увеличивает время при проведении измерений, требует более длительного прерывания потока ионов и приведет, следовательно, к их дополнительным потерям. Кроме этого, повышенное давление буферного газа в нашем случае создало бы сложности для работы источника электронной ионизации, что потребовало бы дифференциальной откачки области источника ионов и отдельного прерываемого ввода газа в объем квадруполя. Это привело бы к дополнительным потерям анализируемых ионов, неизбежным при их введении в квадруполь против газового потока. Предлагаемый в настоящем изобретении метод накопления ионов лишен этих недостатков.
Использование резонансного вращательного движения ионов, так же как и их резонансных одномерных колебаний в радиочастотном квадруполе для устранения излишних ионов, мешающих измерению менее интенсивных аналитических ионов или вызывающих явления насыщения в измерительной системе времяпролетного масс-спектрометра, описано в патентной заявке США №20080149825 Козловского В.И. и др. [27]. В нашем случае аналогичных целей можно добиться путем соответствующей резонансной раскрутки нерезонансно вращающихся ионов в накопительной части радиочастотного квадруполя, что позволит повысить избирательность такого устранения в случае наличия заметного газового потока вдоль оси квадруполя. Использование для этих целей гибели раскрученных ионов на проводящей части выходной диафрагмы позволит избавиться не только от ионов с выбранным m/z, но и осуществить избирательное ослабление популяции накопленных ионов, существенно различающихся по подвижности или величине заряда. Периодическое возбуждение свободного дополнительного (к нерезонансному) вращения ионов и регистрация наведенных сигналов даст в нашем случае возможность проводить эти операции своевременно и не допускать нежелательных эффектов, связанных с излишним накоплением тех или иных ионов.
Использование вращательного поля для селективной диссоциации накопленных в квадрупольной линейной ловушке ионов при столкновении с атомами или молекулами буферного газа описано в патенте США №7351965 В2 [28]. Регистрацию ионов-продуктов, также удаление нежелательных ионов предлагается производить через щели вдоль вершин основных электродов гиперболической формы. Нарушения квадрупольного поля вблизи этих щелей предлагается компенсировать с помощью тонких электродов, расположенных вдоль по середине на выходе из этих щелей. При проведении диссоциации предлагается намеренно искажать квадрупольное поле заданием потенциалов на этих вспомогательных электродах, отличных от потенциалов основных электродов. Это полезно делать для смещения резонансных частот сильно раскрученных ионов для предотвращения их гибели на электродах квадруполя. В нашем случае использование круглых стержней квадруполя (что технологически много проще использования гиперболических стержней) приведет к тому же самому эффекту при диссоциации выбранных ионов. При регистрации же наведенных сигналов нет необходимости вынуждать ионы двигаться очень близко к поверхностям стержней квадруполя, так что отклонение поля от идеально квадрупольного в этом случае имеет меньшее значения по сравнению с регистрацией ионов, предлагаемой в рассматриваемом патенте. В патенте предлагается производить захват ионов в ловушку динамически, поднимая напряжение на входной диафрагме, т.к. давление буферного газа в квадруполе недостаточно, чтобы остановить ионы, отраженные от запирающего потенциала на последней секции квадруполя. В этом случае в ловушке остаются ионы, совершившие отражение от этого потенциала и не успевшие выйти назад через выходную диафрагму квадруполя до установления на ней запирающего напряжения. Для обеспечения улавливания достаточно большого числа анализируемых ионов предполагается использование относительно длинного квадруполя (1000 мм). Такая длина не только увеличивает габариты прибора, но и предъявляет более жесткие требования к параллельности стержней квадруполя и соблюдению других условий его изготовления для обеспечения однородности резонансных частот свободных движений ионов в разных местах квадруполя. Предлагаемый в настоящем изобретении метод накопления ионов, как ожидается, позволит накапливать достаточное число ионов в квадруполе, на порядок менее длинном, при сравнимом остаточном давлении буферного газа.
По-видимому, наиболее близкий по своим возможностям метод, который можно рассматривать как прототип предлагаемого изобретения, заявлен в патенте США №7507953 [29]. В основных чертах это развитие описанного в предыдущем пункте подхода, если не принимать во внимание компенсацию нарушений квадрупольного поля вблизи выходных щелей вдоль стержней линейной квадрупольной ловушки для транспорта ионов в систему регистрации. В рассматриваемом случае выбранные ионы в виде «ленточного» пучка могут попадать и в плоскую камеру столкновений, а затем транспортироваться непосредственно или после столкновительной диссоциации во времяпролетный масс-спектрометр с ортогональным вводом ионов. Возможность автономной регистрации (отдельной системой, как в предыдущем патенте) исходных ионов также предусмотрена. В этом методе в отличие от общепринятых подходов достигается использование для столкновительной диссоциации не одного, а любого желаемого числа видов родительских ионов.
n
Такая же возможность реализуется и в предлагаемом изобретении. Предусмотрено также стандартное использование линейной квадрупольной ловушки для последовательного осуществления изоляции и столкновительной диссоциации ионов для реализации MS метода, включая на последнем этапе регистрацию ионов-продуктов с помощью время-пролетного масс-спектрометра. Эта же возможность может быть реализована и в настоящем изобретении.
В перспективе предполагается использование описанного в патенте прибора в сочетании с жидкостным хроматографом для предварительного разделения сложных образцов биологического происхождения. В этом случае такой подход по сравнению с другими известными представляется наиболее эффективным с точки зрения объема получаемой информации, времени анализа и количества используемого образца.
К недостаткам описанной системы можно отнести потери разрешающей способности и чувствительности при ортогональном вводе родительских ионов в ячейку столкновений в том числе и из-за отклонений поля вблизи выходной щели от квадрупольного. Кроме этого, использование дипольного возбуждения ионов в отличие от нашего подхода, где преимущественно используются вращательные поля, приводит к более сильному влиянию объемного заряда остальных накопленных ионов на разрешающую способность выделения родительских ионов. В нашем случае эти ионы рассредоточены на различных орбитах нерезонансного вращения (в зависимости от m/z и подвижности ионов). В случае же резонансного дипольного возбуждения остальные ионы сосредоточены вблизи оси квадруполя, и при достаточно большом их числе создают заметное дополнительное поле, искажающее гармонический характер эффективного потенциала квадрупольного поля вблизи оси квадруполя.
Для достижения более эффективного использования потока исходных ионов в одном из вариантов, предлагаемых в патенте, предусмотрено разделение линейной квадрупольной ловушки на две части. В первой части, работающей при повышенном давлении, происходит накопление всех ионов предпочтительно в непрерывном режиме. Во вторую часть, осуществляющую резонансную селекцию родительских ионов при пониженном давлении (для лучшей избирательности), ионы в выбранном интервале m/z переводятся возбуждением продольных колебаний в первой части для сообщения им энергии, достаточной для преодоления потенциального барьера между первой и второй частями. В нашем случае достаточно эффективное накопление ионов, выделение родительских ионов и их фрагментацию предполагается проводить в едином квадруполе, откачиваемом одним турбомолекулярным насосом.
В рассматриваемом патенте для контроля числа накапливаемых ионов предполагается проводить предварительные эксперименты по определению скорости накопления ионов с заданными значениями m/z, используя описанные способы регистрации выбранных ионов, или путем измерения полного ионного тока скорости накопления всех ионов. Для таких измерений необходимо возбуждение колебаний соответствующих ионов в плоскости выходных щелей для транспортировки их в систему регистрации и камеру столкновений. В нашем случае измерение наведенного сигнала от вращающихся ионов позволяет осуществлять такой контроль накопления ионов в процессе самого накопления без необходимости проведения предварительных экспериментов и без заметных потерь накапливаемых ионов.
В патенте проведение кинетических измерений не предусматривается и вряд ли в описываемой конструкции возможно. С другой стороны, такие измерения, как предлагается в настоящем изобретении, при сочетании с предварительным хроматографическим разделением из-за временных ограничений возможны только для отдельных хроматографических пиков, отделенных друг от друга достаточными временными интервалами. В то же время эти измерения могут обеспечить дополнительное разделение ионов, которое может компенсировать отсутствие или даже превысить разделительные способности хроматографа при меньшем общем времени анализа. Возможно также и значительное увеличение результирующего разделения при сочетании с хроматографом, т.к. устойчивость к столкновительной диссоциации вряд ли будет сильно коррелировать с временами удерживания соединений в хроматографических колонках.
Преимуществом регистрации наведенного сигнала от вынужденно вращающихся ионов, как предлагается в настоящем изобретении и отсутствует в обсуждаемом и других аналогах, является получение дополнительных сведений об изучаемых ионах. В частности, это могут быть оценки сечений столкновений с атомами или молекулами буферного газа и энергий разрывов связей, приводящих к образованию ионов-продуктов столкновительной диссоциации.
Стандартным методом оценки сечений столкновений ионов, движущихся в газе, является та или иная разновидность измерения подвижности иона или коэффициента пропорциональности между стационарной скоростью иона и напряженностью электрического поля, вызывающего это движение. Часто это движение используется для предварительного разделения ионов. Поскольку в обычных вариантах реализации метода время движения ионов в дрейфовой трубе относительно невелико, наиболее приемлемым оказывается сочетание разделения ионов по подвижности с времяпролетным анализатором с ортогональным вводом ионов.
Серьезной проблемой такого сочетания является обеспечение высокой трансмиссии ионов через дрейфовую трубу в ВПМС. Одно из возможных решений было предложено нами в патенте США №6992284 [31], где приведен достаточно подробный обзор работ по разделению ионов по подвижности. В патенте 6992284 речь идет об использовании в дрейфовой трубе при давлении буферного газа в несколько Торр вместо однородного электрического поля последовательности чередующихся участков сильного и слабого поля. Это приводит к фокусировке ионов к оси квадруполя и позволяет несколько увеличить общее напряжение вдоль трубы, что благоприятно сказывается на разрешении пакетов ионов по подвижности. Все же во всех реализованных вариантах разделения ионов по подвижности достаточно высокого разрешения получить не удается. Даже для дрейфа ионов при атмосферном давлении не достигается разрешения более 100.
В предлагаемом изобретении подвижность ионов в их разделении выступает опосредованно. Чем больше подвижность ионов с заданным m/z, тем большую скорость движения ионы будут иметь под действием вращающего поля и, следовательно, более высокую внутреннюю температуру, пропорционально квадрату скорости. Если устойчивости к распаду рассматриваемых ионов близки, то быстрее будут распадаться ионы с большей подвижностью. При этом в нашем случае, выбором частоты вращающего поля имеется возможность выбора m/z ионов, а выбором амплитуды вращающего поля можно регулировать скорость распада. В случае классического разделения ионов по подвижности имеется довольно слабая возможность влиять на время выхода и ширину пакета интересующих ионов. Уменьшением напряженности поля вдоль трубы можно увеличить время выхода ионов, но при этом уменьшается разрешение по подвижности. В нашем случае измерение величины подвижности достигается без наличия дрейфовой трубы и без необходимости прикладывания высокого постоянного напряжения.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Особенностями одной из возможных реализаций предлагаемых методов является следующее.
При давлении буферного газа (это может быть гелий, аргон, азот или другие газы) несколько Торр на входе и менее мТорра на выходе из цилиндрического канала формируется узко направленный газовый поток. Относительно малая примесь анализируемой пробы в потоке буферного газа транспортируется в виде сфокусированного молекулярного пучка в ионный источник электронной ионизации.
Вторая возможность формирования потока исследуемых ионов - это транспортировка ионов, в том числе и многозарядных ионов биомолекул, из электроспрейного источника с их фокусировкой системой апертурных диафрагм на вход канала формирования газового потока. Для минимизации потерь ионов внутри канала производится его подогрев - это один из стандартных способов передачи ионов из электроспрейного источника в область относительно низкого давления на входе в масс-спектрометр. Вместо электроспрейного источника при таком вводе ионов может использоваться и любой другой источник ионов, работающий при атмосферном или относительно высоком давлении.
Ионизация газов в молекулярном пучке производится источником электронной ионизации с изменяемой энергией ионизации, позволяя осуществлять непосредственную ионизацию анализируемых соединений. При наличии в потоке многозарядных ионов биомолекул, например, из электроспрейного источника возможен захват медленных электронов с последующими процессами диссоциации.
Накопление, предварительное разделение, управляемая фрагментация и фокусировка ионов осуществляются в секционированном радиочастотном квадруполе, ось которого совпадает с осью газового потока. В начале квадруполя в области, ограниченной «запирающей» диафрагмой, создается относительно слабое квазиоднородное электрическое поле заданием соответствующих напряжений на секциях стержней квадруполя. Поле между входной диафрагмой и первой секцией квадруполя может иметь несколько большую напряженность для обеспечения лучшего пропускания ионов через входную диафрагму. Внутренние поверхности диафрагм покрываются тонкой (не более 1 мкм) диэлектрической пленкой, заряженной ионами буферного газа того же знака, что и анализируемые ионы. При достаточной плотности таких зарядов, как показано нами ранее [13, 14], ионы с относительно небольшой кинетической энергией (единицы эВ) будут отражаться от такой поверхности. В случае положительных ионов ионы буферного газа получаются при повышенной энергии ионизирующих электронов в ионном источнике с электронной ионизацией. Эти ионы в рассматриваемой области квадруполя раскручиваются вращающим полем, частота которого сдвинута в сторону низких частот от резонансной частоты ионов буферного газа. Сдвиг частоты от резонансной нужен, чтобы, с одной стороны, обеспечить раскрутку ионов в области относительно большой плотности газа вблизи оси квадруполя, а с другой стороны, не допустить гибели ионов на стержнях квадруполя при слишком больших радиусах вращения. Попадая на поверхность «запирающей» диафрагмы, ионы заряжают диэлектрическую пленку на ней до потенциала, который препятствует дальнейшей зарядке, вызывая отражение ионов. Часть отразившихся ионов достигает внутренней поверхности входной диафрагмы и заряжает диэлектрическую пленку на ней, формируя тем самым ловушку для вращающихся ионов с радиусами, большими радиусов отверстий выходной и входной диафрагм. При этом продольное электрическое поле и газовый поток будут обеспечивать транспорт ионов, находящихся вблизи оси квадруполя в выходную часть квадруполя и далее во времяпролетный масс-анализатор.
Обладающие большими массами, чем ионы буферного газа, анализируемые ионы эффективно фокусируются квадруполем при больших радиочастотных напряжениях, при которых ионы буферного газа могут терять устойчивость движения в квадруполе и гибнуть на его стержнях. Это может быть важным, так как иначе накопление большого объемного заряда ионов буферного газа может приводить к гибели анализируемых ионов. Альтернативно понижением энергии ионизирующих электронов образование ионов буферного газа может быть прекращено. Формированием соответствующего нерезонансного вращающего поля (с частотой, сдвинутой от минимальной резонансной частоты анализируемых ионов в сторону меньших частот) ионы заданного диапазона отношений массы к заряду начинают вращаться и удерживаются далее на устойчивых орбитах вращения по возможности внутри потока и вне отверстий входной и выходной диафрагм. При необходимости напряжение на выходной («запирающей») диафрагме может быть повышено для создания потенциального барьера для накапливаемых ионов.
Индуцированные движением ионов изменения потенциалов регистрирующих электродов внутри квадруполя регистрируются и служат для определения наличия соответствующих вращающихся ионов и грубой оценки их количества. Начало запределивания регистрируемого сигнала на основной частоте вынужденного вращения ионов будет индикацией заметной гибели накапливаемых ионов за счет расталкивания объемным зарядом, указывающей на непродуктивность дальнейшего накопления ионов. Наложением вращающих или дипольных напряжений с частотами, близкими к резонансным, можно удалять среди накапливаемых ионы, которые не представляют интереса для анализа. Это позволит несколько увеличить число «полезных» ионов, максимально удерживаемых в ловушке.
При достижении достаточного количества вращающихся ионов или после прохождения заданного времени накопления амплитуда вращающего напряжения квадруполя увеличивается до оптимального значения для удерживания и резонансной раскрутки с возможной фрагментацией анализируемых ионов. При этом напряжение входной диафрагмы увеличивается, чтобы прекратить поступление анализируемых ионов в квадруполь. Если при накоплении напряжение запирающей диафрагмы было повышено, то оно понижается для обеспечения свободного выхода ионов, движущихся вблизи оси квадруполя. Включением пакета вращающих полей для заданного диапазона m/z в течение некоторого короткого времени накопленные ионы раскручиваются на подходящие орбиты, и наведенный сигнал от них регистрируется в течение времени существования значимого сигнала на частотах в интервале задающего пакета полей. После обратного Фурье-преобразования получается масс-спектр накопленных ионов. Проведенное компьютерное моделирование показывает, что такое «свободное» вращение ионов при остаточном давлении буферного газа (гелия) около 0.1 мТорр происходит в течение около десяти миллисекунд и позволяет получить масс-спектр с разрешением около 1000 на полувысоте пиков. Для получения аналогичного разрешения для тяжелых буферных газов (более подходящих для проведения стокновительной диссоциации ионов) остаточное давление должно быть уменьшено примерно пропорционально корню квадратному из молекулярной массы этих газов. В то же время при моделировании было замечено, что явление слияния или коалесценции свободно вращающихся достаточно плотных облаков ионов с близкими m/z аналогично такому же эффекту в масс-спектрометрии ИЦР [34] существенно снижает динамический диапазон такой регистрации.
Альтернативно накопленные ионы могут быть подвергнуты масс-анализу на орто-ВПМС или других приборах. В этом случае при уменьшении вращающего напряжения или увеличении фокусирующего радиочастотного напряжения ионы с меньшими m/z и меньшей подвижностью будут постепенно входить в зону, близкую к оси квадруполя. Под действием продольного поля и газового потока они будут проходить через отверстие «запирающей» диафрагмы и в конечном итоге попадать в орто-ВПМС или другой масс-анализатор. При регистрации пиков ионов, вызывающих интерес, вращающее напряжение может быть несколько увеличено, чтобы приостановить выход этих ионов. Эти ионы могут быть подвергнуты дополнительной резонансной раскрутке, так чтобы в результате их разогрева при столкновениях с молекулами или атомами буферного газа стали происходить процессы их фрагментации. В этом случае ионы-продукты с меньшими значениями m/z, чем исходные ионы, будут менее подвержены обоим раскруткам (общей нерезонансной и резонансной для родительских ионов) и будут регистрироваться в орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах.
В стационарных условиях разогрева индивидуальных ионов (при отсутствии заметной гибели ионов за счет расталкивания объемным зарядом) должны будут наблюдаться экспоненциально затухающие сигналы ионов-продуктов, по характеристическому времени спадания сигналов и соотношениям амплитуд которых могут быть определены соответствующие константы скорости распада. При наличии нескольких типов распадающихся ионов с заданным значением m/z появляется возможность на основе анализа пиков всех продуктов выявить число таких типов и определить константы распада по каждому каналу всех этих типов ионов. Характеристические времена падения регистрируемых пиков будут определяться суммарными константами распада исходных ионов, что может позволить отделить соответствующие сигналы для разных исходных ионов, хотя их величины m/z и подвижностей могут совпадать. Возможны захваты некоторых ионов-продуктов (особенно с m/z большими, чем m/z исходных ионов) на стационарные орбиты. При включении соответствующих резонансных вращающих полей или пакета таких полей становится возможной их регистрация без использования орто-ВПМС и других масс-анализаторов. Эти ионы после их накопления могут также быть зарегистрированы и орто-ВПМС или другими масс-анализаторами, как и исходные ионы, и может быть организована их дальнейшая фрагментация, в том числе способом, описанным выше для исходных ионов.
Регистрация наведенного сигнала от вынужденно вращающихся и распадающихся ионов может также позволить определить в благоприятных случаях характеристические времена гибели нескольких типов ионов. Кроме этого, возможно также определение фазовых сдвигов (по отношению к вращающему полю) наведенных сигналов от вращения каждого типа ионов и тем самым оценка подвижности этих ионов, если известны резонансные частоты вращения этих ионов. Если же эти частоты точно неизвестны, то можно раскручивать ионы не одной, а парой близких к резонансной частот. В этом случае пара регистрируемых сдвигов фаз по этим частотам позволит найти оценки как резонансных частот, так и подвижностей ионов.
Знание подвижностей ионов, амплитуд вращающих напряжений и фаз вращения ионов позволит оценить внутренние температуры ионов. Изменение амплитуд вращающих напряжений вместе с изменением амплитуды радиочастотного поля (чтобы увеличить скорость и сохранить среднюю орбиту движения ионов) позволит проводить кинетические измерения процессов диссоциации ионов в условиях неоднородной плотности буферного газа в квадруполе и оценивать энергии активации этих процессов, которые в благоприятных случаях могут быть близки к энергиям разрываемых связей. При увеличении амплитуд вращающих напряжений также возможно включение процессов распада более устойчивых ионов и выбывание из «игры» относительно легко распадающихся ионов. Тем самым могут быть проанализированы все ионы, резонансные частоты которых близки к частотам вращающих полей.
Поскольку ионы часто довольно сильно различаются по степени устойчивости к распаду, то возможны адекватные оценки резонансных частот и подвижностей ионов даже в случаях, когда эти значения достаточно близки и не могли быть разрешены стандартными методами масс-анализа и разделения ионов по подвижностям. Эта ситуация аналогична предварительному хроматографическому разделению анализируемых соединений или разделению на основе электрофореза. Отличие состоит в том, что в предлагаемом изобретении имеется возможность выбора для кинетического исследования ионов в некотором относительно узком диапазоне m/z за счет подбора частот соответствующих вращающих полей.
Теоретические основы метода разделения экспоненциальных вкладов применительно к анализу совокупностей эффузиометрических кривых нами были разработаны ранее [21]. Суть подхода основана на полной аналогии между системами дифференциальных и конечно-разностных линейных уравнений с постоянными коэффициентами. Эта аналогия для одного уравнения, например, была использована нами при разработке методов линейного прогноза для эффективной оценки массовых чисел ионов по их временам выхода для магнитного статического масс-спектрометра [18, 33]. Определив коэффициенты такого прогноза, в частности, являющегося точным для суммы экспоненциальных кривых, факторы затухания соответствующих экспонент могут быть определены нахождением корней характеристического полинома, как и для соответствующего дифференциального уравнения с постоянными коэффициентами. В этом случае может быть использована вычислительная процедура, описанная нами в [22].
Исходя из этой аналогии, для линейной комбинации экспоненциально спадающих потоков ионов-продуктов в общем случае совокупный вектор интенсивностей этих ионов для последующих регистрации без учета ошибок измерения может быть выражен как произведение некоторой матрицы перехода на вектор таких интенсивностей для предыдущей регистрации. Матричные элементы этой матрицы перехода могут быть найдены минимизацией погрешности такой аппроксимации, что сводится к решению соответствующих систем линейных алгебраических уравнений для каждой строки этой матрицы. Собственные векторы этой матрицы описывают с точностью до нормировки вектор интенсивностей ионов-продуктов каждого типа ионов, присутствующих в анализируемой смеси. Соответствующие этим векторам собственные числа характеризуют факторы экспоненциального затухания числа таких ионов. Коэффициенты, описывающие вклады собственных векторов матрицы перехода в наблюдаемые интенсивности ионов-продуктов, находятся по методу наименьших квадратов для обеспечения в среднем минимальных погрешностей измеренных интенсивностей пиков масс-спектра для всех регистрации. Качество аппроксимации по сравнению с ошибками измерений является критерием правильности проведенного анализа. Зная число типов исходных ионов и характерные времена их экспоненциального убывания, можно решением соответствующих систем линейных уравнений найти вклады каждой из этих экспонент во все отсчеты в зарегистрированных масс-спектрах. Тем самым будут получены масс-спектры ионов-продуктов каждого типа исходных ионов, как будто они были полностью разделены перед их регистрацией. Это важно, т.к. позволит определить «точные» массы всех ионов-продуктов, если соответствующие масс-спектры были зарегистрированы на масс-анализаторе с высокой разрешающей способностью.
Альтернативно гибель и распад ионов могут быть организованы при их соударении с поверхностью электродов, не покрытых заряженной диэлектрической пленкой. В частности, для этого может быть использовано проводящее плоское кольцо, примыкающее к «запирающей» диафрагме, с внешним диаметром, совпадающим с внешним диаметром диафрагмы. В этом случае частота соударений достаточно сильно раскрученных ионов о поверхность этого кольца будет контролироваться глубиной потенциальной ямы, создаваемой задерживающим потенциалом этого кольца, и продольным полем квадруполя, двигающим ионы к запирающей диафрагме. Существенный вклад в форму потенциальной ямы для вращающихся ионов будет давать относительно большое нерезонансное вращающее поле и эффективный потенциал радиочастотного поля, напряженность которого вблизи кольца на запирающей диафрагме может быть значительно больше, чем вдали от нее.
Эффективная температура ионов, являющаяся вторым фактором для частоты столкновений, будет определяться для данных ионов и буферного газа скоростью вращения этих ионов. Малая часть ионов, зависящая от их заряда, энергия которых достаточна, чтобы преодолеть разность потенциальных энергий между дном ямы и кольцом, будет сталкиваться с кольцом и гибнуть в результате такого столкновения с вероятностью, по-видимому, близкой к 1. Если это не так, и вероятность гибели зависит от природы иона, то это еще более интересный случай, позволяющий получить дополнительное разделение ионов. Для многозарядных ионов биомолекул при захвате электрона, вышедшего из кольца возможны процессы диссоциации, приводящие к образованию ионов-продуктов с m/z, выводящими их из резонансного вращения. При этом различия в частоте всех этих процессов могут многократно превышать различия в эффективной температуре ионов (до 10 и более раз при разумных временах измерения), т.к. сталкиваться с поверхностью кольца будут ионы на краю Максвелловского распределения ионов по энергии. Если эффективности гибели ионов при столкновениях с поверхностью стержней для близких по массе и подвижности ионов близки, то характерные времена убывания числа вращающихся ионов будут определяться этими частотами столкновений с поверхностью, что в конечном итоге будет определяться подвижностью этих ионов. Если разница в 10% в частотах столкновений достаточна для уверенного разделения сигналов, то это означает, что различия в подвижности исходных ионов на уровне 1% вполне может хватить для разделения сигналов от соответствующих ионов. Возможно комбинирование обоих описанных способов организации гибели и распада ионов, когда одного из них недостаточно для уверенного разделения сигналов от близких ионов.
В случае, когда вероятность гибели иона при столкновении с кольцом близка к 1, из скорости убывания таких ионов за счет таких столкновений может быть получена оценка их эффективной температуры. Вклад гибели ионов на кольце в общую гибель при осуществлении столкновительной фрагментации может быть найден варьированием задерживающего потенциала кольца и определением характеристических времен затухания сигнала от этих ионов. Оценка эффективной температуры ионов, получаемая в данном случае не через предварительную оценку подвижности и средней скорости ионов, важна для проверки используемой модели разогрева ионов, движущихся в газе [17], и получения на этой основе адекватных количественных оценок энергий активации соответствующих процессов столкновительной фрагментации ионов. При исследовании смеси ионов описанным на предыдущей странице способом проведение такого анализа при различных амплитудах резонансного вращающего поля может дать дополнительный критерий адекватности полученных результатов. Об этом может говорить совпадающее число найденных компонент для разных вращающих полей и близкий к Аррениусовскому характер изменения констант образования соответствующих ионов-продуктов в предположении, что внутренняя температура ионов квадратично зависит от амплитуды резонансного вращающего поля [17]. После проведения исследования ионов для данного m/z дальнейшее уменьшение общего нерезонансного вращающего напряжения может быть продолжено и таким образом исследованы все интересующие ионы среди накопленных. В отличие от многих других существующих методов здесь не происходит потерь в каждом цикле измерений других накопленных ионов, кроме выбранных в этом цикле. Увеличением радиуса нерезонансного вращения исходных ионов при необходимости можно обеспечить сохранение некоторых ионов-продуктов, не сильно отличающихся по m/z от исходных ионов, на устойчивых орбитах нерезонансного вращения вокруг оси квадруполя. В этом случае после накопления достаточного количества они могут быть подвергнуты столкновительной диссоциации и исследованию кинетики этой диссоциации наряду с родительскими ионами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ
Для более полного понимания настоящего изобретения последующее описание соотнесено с соответствующими чертежами, на которых:
Фиг.1. Общая схема газодинамического интерфейса орто-ВПМС для предварительного разделения и регистрации ионов.
Фиг.2. Расчетные величины минимального потенциала отражения ионов от плоской поверхности проводника с тонкой диэлектрической пленкой (100 нм) и минимальными расстояниями между зарядами на ней (для квадратной сетки зарядов): 1-(10 нм), 2-(20 нм), 3-(30 нм).
Фиг.3. Расчетные резонансные кривые для вращающихся ионов с m/z=400 и 401 внутри и вне потока аргона для плотностей, соответствующих 30 и 0,3 мТорр при комнатной температуре.
Фиг.4. Иллюстрация к возможному механизму потерь кинетической энергии ионов, сталкивающихся с поверхностью, покрытой заряженной диэлектрической пленкой.
Фиг.5. Схема поперечного сечения (А-А, Фиг.1) области вращения ионов.
Фиг.6. Блок-схема процедуры вычисления экспоненциальных вкладов в кинетическую кривую распадающихся ионов
Фиг.7. Иллюстрация к методу разделения экспоненциально спадающих наложенных пиков ионов-продуктов столкновительной фрагментации исходных изобарных ионов.
Фиг.8. Иллюстрация к процессам гибели вращающихся ионов, при столкновениях с поверхностью проводящего кольца на краю «запирающей» диафрагмы.
Фиг.9. Копия экрана программы моделирования движения ионов в газонаполненном радиочастотном квадруполе с получением масс-спектра свободно вращающихся ионов без учета влияния объемного заряда
Фиг.10. Копия экрана программы моделирования движения ионов с учетом влияния объемного заряда, демонстрирующая явление слияния (коалесценции) ионных облаков с близкими m/z при их свободном вращении
Все эти чертежи носят поясняющий характер и не накладывают каких-либо ограничений на возможную реализацию предлагаемого изобретения.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Новый подход для транспортировки ионов из области повышенного давления на выходе из ячейки подвижности в вакуумную часть масс-спектрометра через формирование сверхзвукового газового потока описан в нашем патенте США №7482582 от 27 января 2009 года [14]. Он был развит далее для обеспечения дополнительных аналитических возможностей за счет резонансного возбуждения вращения ионов вокруг сверхзвукового потока в следующем нашем патенте США №7547878 от 16 июня 2009 года [16]. Специфическое развитие этих подходов для обеспечения эффективного количественного определения наличия примесей в газовых смесях и структурного анализа многозарядных ионов биомолекул описано в настоящем изобретении.
Особенностью предлагаемого метода в отличие от упомянутых патентов является не выделение ионов из потока гелия с ионами из ячейки подвижности, а намеренное формирование газового потока, схематически показанное на Фиг.1, из буферного газа, предпочтительно более тяжелого, чем гелий (1), поступающего внутрь цилиндрического канала (2). Поток атмосферного воздуха или другой газовой смеси, содержащий микропримеси и основные компоненты непосредственно или после обогащения, например, путем адсорбции-десорбции на подходящем носителе вводятся внутрь потока (1) из камеры смешивания (3) или альтернативно ионы органических или биоорганических соединений из электроспрейного источника или других источников вводятся внутрь канала (2) вместе с потоком (1) системой фокусирующих электродов, не показанных на Фиг.1. С целью предотвращения адсорбции ионов биомолекул на внутренней стенке канала (2) осуществляется его подогрев током через обмотку (4). Откачка газов, поступающих с потоком (1), осуществляется в основном насосом (15). Незначительная часть потока через напускную диафрагму (17) поступает в следующую ступень дифференциальной откачки орто-ВПМС или других масс-анализаторов.
6
2
Молекулярный пучок (5), содержащий (при проведении аналитических измерений) небольшую примесь атмосферного воздуха или другой газовой смеси либо ионы органических или биоорганических соединений, поступает в источник электронной ионизации (6) с изменяемой энергией ионизирующих электронов. Для уменьшения разброса по энергии электронов источник снабжен катодом (18), например, из LaB с косвенным подогревом (22). Путем выбора соответствующей энергии электронов и состава газовой смеси могут быть реализованы различные режимы ионизации, в результате которых происходит в конечном итоге либо образование положительных (или отрицательных) ионов анализируемых соединений, либо преобразование ионов, поступающих из других источников. Так, например, при энергии электронов, превышающих порог ионизации атомов или молекул буферного газа (7), основными первичными ионами будут ионы этого газа - основного компонента в пучке (5). Поскольку потенциалы ионизации органических соединений обычно меньше, чем потенциал ионизации атомов или молекул буферного газа, таких как Ar или N, то при столкновениях соответствующих молекул с ионами буферного газа будет происходить передача заряда на эти молекулы, и значительная доля этих молекул будет ионизована.
rot
До проведения аналитических измерений и далее по мере того, как в этом возникнет необходимость, производится зарядка внутренних поверхностей входной (8) и запирающей (14) диафрагм, покрытых тонкой диэлектрической пленкой (9). Для этого может использоваться поток буферного газа (5) без анализируемых примесей, проходящий через ионный источник (6) при энергии электронов, достаточной для ионизации буферного газа. Ионы буферного газа при входе в секционированный радиочастотный квадруполь (10) ускоряются продольным полем (13), создаваемым соответствующим распределением потенциалов секций квадруполя (10) и потенциалами диафрагм (8) и (14). Для обеспечения лучшего пропускания ионов через диафрагму (8) напряженность поля между ней и первой секцией квадруполя (10) несколько увеличена по сравнению с квазиоднородным полем внутри квадруполя. Сдвинутыми по фазе на π/2 высокочастотными потенциалами стержней квадруполя (10), с угловой частотой ω, многократно меньшей резонансной частоты для ионов буферного газа, которая может быть вычислена по формуле:
rot
создается вращающее поле (11). Под действием этого поля ионы (12) с отношением массы к заряду m/z (с частотами существенно большими ω) будут вращаться со средним радиусом:
rf
rot
rot
0
Для ионов буферного газа этот радиус должен быть достаточно большим для предотвращения прохода через центральное отверстие «запирающей» диафрагмы (14), но недостаточным для гибели этих ионов на стержнях квадруполя (10) и на поверхности проводящего кольца (19). В формулах (40) и (42) V, ω, V, ω - амплитуды и частоты радиочастотного и вращающего полей, e - элементарный заряд, r - радиус квадруполя - минимальное расстояние от оси квадруполя до его стержней. В этом случае ионы буферного газа будут заряжать оставшуюся доступной поверхность диафрагмы (14), которая покрыта тонкой диэлектрической пленкой (9).
-6
После того, как ионы буферного газа зарядят диэлектрическую пленку на поверхности диафрагмы (14) до достаточного уровня, они будут отражаться от этой поверхности, и по крайней мере часть из них будет достигать обратной поверхности входной диафрагмы квадруполя (8) и заряжать пленку на ее поверхности (9). Это будет происходить до тех пор, пока плотность заряда достигнет предельно возможной в данных условиях величины. После этого ионы будут отражаться и от этой диафрагмы. На Фиг.2 показаны результаты расчетов потенциалов полей, создаваемых такими зарядами. Приведены расчетные величины минимального потенциала отражения ионов от плоской поверхности проводника (35) с тонкой диэлектрической пленкой (36), толщиной 100 нм и минимальными расстояниями между зарядами на ней (для квадратной сетки зарядов): 10 нм - (31), 20 нм - (32), 30 нм - (33). Расчет произведен для достаточно большой совокупности диполей, показанных в правой верхней части чертежа. Точки расчета потенциала располагались вдоль прямой линии, начинающейся от поверхности диэлектрика (36) в показанном месте (34) в середине между зарядами и ортогональной к этой поверхности. Положительные заряды диполей с заданным шагом между ними помещались внутри квадрата с центром в показанной точке (34). Длина стороны квадрата удваивалась до тех пор, пока результат последующего расчета не совпадал с предыдущим с заданной точностью (например, 10). Поскольку вклад каждого диполя в расчетную величину потенциала положительный (положительный заряд любого из этих диполей ближе к точке расчета, чем отрицательный), рассчитанные кривые потенциалов являются оценками снизу реальных распределений потенциалов для плоских поверхностей, больших, чем расчетный квадрат с таким же распределением диполей. Для простоты расчетов диэлектрическая постоянная диэлектрика (16) полагалась равной 1, что может только занизить расчетное значение потенциала, по сравнению с ожидаемым значением при больших значениях диэлектрической постоянной.
После того, как захват ионов поверхностями обеих диафрагм (14) и (8) прекратится, ионы под действием слабого поля (13) будут накапливаться в основном перед поверхностью диафрагмы (14), образуя облако (16). Эти ионы будут вызывать появление зарядов противоположного знака на проводящей поверхности диафрагмы (14), чтобы сохранить ее потенциал, создаваемый соответствующим источником питания и делителем напряжений, не показанным на Фиг.1. Согласно известному методу «изображений», это эквивалентно, с точки зрения расчета поля слева от диафрагмы, наличию виртуального такого же как и (16) облака отрицательных зарядов (21) симметрично по другую сторону от поверхности диафрагмы. Наличие этого облака будет притягивать реальные ионы (16) к поверхности диафрагмы (14) и уменьшать расталкивающее влияние объемного заряда (16). Это должно привести к возможности накопления значительно большего числа ионов в квадруполе, чем это было бы в отсутствие диафрагмы (14).
Секционирование стержней квадруполя (10) и справа от диафрагмы (14) позволяет оптимальным образом создавать радиочастотное и продольное электрическое поле в этой части квадруполя для обеспечения эффективной регистрации анализируемых ионов (20), прошедших через диафрагму (14) в орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах. Для обеспечения оптимальных условий прохода этих ионов через диафрагму (14), к стержням квадруполя (10) могут прикладываться управляемые постоянные напряжения, сдвигающие пучок ионов в плоскости, перпендикулярной к оси квадруполя. Процесс зарядки поверхности диафрагмы (14), покрытой пленкой (9), и накопления облака ионов (16) может контролироваться измерением тока зарядов, поступающих на диафрагму (14) через соответствующую систему измерения малых медленно меняющихся токов. Прекращение такого тока будет означать конец процесса зарядки поверхности диафрагм (14) и (8) и создания стационарного вращающегося облака ионов буферного газа вблизи диафрагмы (14). Альтернативно за процессом зарядки можно следить по наведенному сигналу от вращающихся ионов (16), который после некоторого роста должен выйти на стационарный уровень. Организация такого канала измерения будет описана ниже.
После завершения зарядки поверхностей диафрагм (14) и (8) радиочастотное напряжение квадруполя (10) повышается так, чтобы убрать ионы буферного газа из зоны накопления (вызывая потерю устойчивости их движения и гибель на электродах квадруполя) и обеспечить, по возможности, близкие к оптимальным условия накопления и исследования анализируемых ионов. Для этого амплитуда радиочастотного напряжения должна быть достаточно высокой, чтобы фокусировка исследуемых ионов позволяла удерживать их на устойчивых орбитах нерезонансного вращения вокруг оси квадруполя без заметного пропускания этих ионов через диафрагму (14) и без значительной гибели этих ионов на стержнях квадруполя (10) и на поверхности проводящего кольца (19). Кроме этого, резонансные частоты вращения исследуемых ионов и возможные линейные скорости этого вращения должны вызывать при необходимости столкновительную фрагментацию исследуемых ионов с характерными временами, удобными для регистрации серий соответствующих масс-спектров на орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах (в диапазоне от секунды до десятков секунд).
Предварительная регистрация анализируемых ионов, проходящих через диафрагму (14) в отсутствие дополнительных возбуждающих полей, даст информацию о возможном наличии интересующих ионов в анализируемой смеси и диапазонах m/z ионов, подлежащих детальному исследованию. Для накопления исследуемых ионов на стержни квадруполя подается вращающее напряжение с частотой, значительно сдвинутой в сторону низких частот от резонансных частот исследуемых ионов. Амплитуда этого напряжения достаточно велика, чтобы раскрутить ионы в области относительно большой плотности газа внутри потока, так чтобы ионы практически не могли проходить через отверстия диафрагм (8) и (14). В то же время в области остаточной плотности газа влияние этого вращающего поля должно быть недостаточно, чтобы значительно раскрутить ионы и потерять их в распадах или на стержнях квадруполя.
То, что это можно сделать, проиллюстрировано на Фиг.3. Здесь показаны резонансные кривые для относительных средних радиусов раскрутки ионов, исходя из формулы (41), взятой из нашей работы [10]:
Кривые приведены для гипотетических ионов с m/z 400 и 401 для ожидаемой плотности потока в области раскрутки ионов(48), (47) и в 100 раз меньшей плотности остаточных газов (50), (49). Ширины этих кривых на полувысоте отличаются также в 100 раз, как предсказывается формулой (44):
Характерное время релаксации скорости ионов ^ было вычислено по формуле (43):
2
исходя из массы атомов буферного газа M=40 Д, средней тепловой скорости их движения V (скоростями движения ионов пренебрегли) при комнатной температуре и разумной величине сечения столкновения ионов с атомами газа σ=200 Å. Плотность газа n вычислена из уравнения состояния идеального газа при давлениях 30 и 0.3 мТорр для верхних широких (47), (48) и нижних узких (49), (50) кривых соответственно. Видно, что при достаточно большом отклонении от точки «резонанса» внутри потока средний радиус вращения ионов не сильно отклоняется от максимального значения. В то же время резонансные кривые при остаточном давлении (49), (50) спадают довольно резко, и радиус раскрутки при достаточном отклонении от резонанса даже при сравнительно больших вращающих напряжениях может быть вполне приемлемым. При больших отклонениях от резонанса радиус вращения (42) практически не зависит от времени релаксации скорости ионов (43) или от плотности газа. Изменение плотности газа приводит к изменению фазового сдвига (45) между направлением вращающего поля и направлением средней скорости вращающихся ионов.
Чем меньше плотность газа, тем ближе к π/2 этот сдвиг (если резонансная частота больше частоты вращения) и тем меньше составляющая этого поля, вращающая ионы, линейная скорость которых определяется их подвижностью:
При приближении анализируемых ионов к поверхности тонкой диэлектрической пленки на проводящей поверхности, заряженной ионами того же знака, происходит не только отражение ионов от такой поверхности, но возможна также некоторая потеря их кинетической энергии. Фиг.4 иллюстрирует эту возможность. Приближающийся к поверхности (55) ион (51) с кинетической энергией, большей тепловой, своим электрическим полем (52) сдвигает ионы (53), находящиеся вблизи углублений на поверхности (55), несколько дальше (54), чем в среднем допускается их тепловой энергией и притяжением (57) к их изображениям (56) за поверхностью проводника. Эти ионы на пленке, отдав часть своей полученной энергии атомно-молекулярным структурам пленки, уже не в состоянии вернуть иону (51) всю ту энергию, которую получили от него при его приближении к поверхности (55). Поэтому ион отразится от поверхности (55), но будет обладать меньшей энергией, чем при приближении к ней. Таким образом, даже при очень низком давлении буферного газа в зоне нерезонансного вращения анализируемых ионов будет происходить потеря их энергии, полученной в поле (13), и будет происходить их накопление подобно ионам буферного газа (16) с наибольшей плотностью вблизи диафрагмы (14) - Фиг.1.
Для контроля числа накопленных вращающихся ионов может использоваться регистрация наведенных разностей напряжений на тонких электродах, например, (113) и (114), показанных на Фиг.1 и Фиг.5. При симметричном положении этих электродов относительно ближайших стержней (101) квадруполя наведенный сигнал от вращающего поля (103) будет в значительной степени скомпенсирован и при аккуратной юстировке сведен к величине, сравнимой с сигналом от вращающихся ионов. Этот сигнал на частоте вращающего поля при приемлемой стабильности генератора вращающего поля будет почти постоянным по амплитуде. Сигнал же от накапливаемых ионов будет нарастать вначале практически линейно со временем, а при достижении значительной плотности объемного заряда сигнал начнет насыщаться за счет гибели ионов, вызываемой их расталкиванием. Наличие такого насыщения и будет сигнализировать об окончании процесса накопления. Измерение фазового сдвига регистрируемого переменного сигнала от сигнала вращающего поля будет нести качественную информацию о составе накопленных ионов - формула (45).
rf
rf
1
2
Формированием резонансного вращающего электрического поля, соответствующего выбранному m/z, начиная с интересующих ионов с наименьшим m/z из накопленных, возбуждается дополнительное вращение ионов этих соединений вокруг их положения в пакете не резонансно вращающихся ионов. На Фиг.5 схематично показано сечение квадруполя в области вращения накопленных ионов. Внутри изображения стержней (101) квадруполя даны выражения для напряжений, прикладываемых к ним. Это фокусирующее радиочастотное напряжение (102) ±V cosωt с частотой ω и амплитудой V и два вращающих напряжения (103)  и  с частотами ω, ω и амплитудами , , создающих два вращающих поля, направление первого, нерезонансного (108) в некоторый момент времени показано на чертеже. Условная граница зоны прохода ионов через диафрагму (14) показана пунктирной линией (104). Пунктирной линией с большим шагом (107) показана граница, после которой ионы начинают сталкиваться с поверхностями стержней квадруполя. Зона между двумя этими пунктирными линиями - это область возможного нерезонансного вращения ионов (105), (106), (109) без значительной вероятности их потери либо на поверхностях стержней, либо путем переноса в орто-ВПМС или в другие последующие масс-анализаторы. Усредненная траектория резонансного вращения (111) выбранных ионов вокруг центра (110), вращающегося вокруг оси квадруполя, показана точками. Эти ионы, нагреваясь за счет столкновений с атомами или молекулами буферного газа, с присущим им при заданных условиях характерным временем будут распадаться по различным каналам, давая соответствующий набор фрагментов, который при их регистрации может быть использован для идентификации известных соединений или для установления структуры новых или неизвестных соединений.
rf
Изменением общей скорости движения ионов можно изменять характерное время фрагментации ионов и соотношение интенсивностей потоков ионов-фрагментов. Скорость ионов можно менять как за счет радиусов нерезонансного и резонансного вращений, так и за счет частоты вращений, которая в случае резонансного вращения определяется фокусирующими свойствами радиочастотного поля квадруполя (формула (40)). Эти свойства можно менять подбором соответствующих амплитуды V или угловой частоты и радиочастотного напряжения. Как следует из нашей [17] и других моделей нагрева ионов в газе под действием электрического поля при сохранении среднего квадрата скорости движения ионов и при сохранении прочих условий эксперимента, внутренняя температура ионов не меняется, и не меняется скорость распада и соотношения между каналами фрагментации ионов. Если при выполнении этого условия менять радиусы нерезонансного и резонансного вращения, так чтобы траектория движения (111) ионов проходила вблизи центра квадруполя, как показано на Фиг.5, то максимальное относительное время пребывания ионов в зоне (104) возможного прохода через диафрагму (14) будет в случае достаточно большого радиуса траектории (111) тогда, когда она проходит точно через центр квадруполя. Если связать с этим максимальное значение измеряемого потока соответствующих ионов на орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах, то оказывается возможным оценить радиус резонансного вращения выбранных ионов и при известной частоте этого вращения соответствующую линейную скорость. Это связано с тем, что в этом случае радиусы резонансного (111) и нерезонансного (124) вращений совпадают, а радиус нерезонансного вращения при достаточно большом сдвиге от резонанса практически точно вычисляется независимо от подвижности иона и плотности буферного газа [10] - формула (42).
0
Двигаясь вблизи поверхности введенных электродов (112), (113), (122), (123), ионы (106), (105) и (109) вызывают появление наведенного заряда противоположного знака на этих электродах. Положение и форма этих электродов должны быть такими, чтобы, с одной стороны, обеспечивать максимально возможный уровень наведенных сигналов, с другой стороны, искажения квадрупольного поля, неизбежные при их введении не должны существенно искажать движение анализируемых ионов и приводить к значимым потерям в разрешающей способности и чувствительности. Проведенные расчеты наведенных сигналов и моделирование движения ионов с использованием пакета Simion v.7 для расчета электрических полей показали, что приемлемые характеристики имеют, цилиндрические электроды с диаметром 0.2 мм, расположенные симметрично относительно ближайших стержней квадруполя, с осями на расстоянии радиуса квадруполя r от оси квадруполя. Парные электроды (113), (114), (117), (116), расположенные симметрично относительно плоскостей, проходящих через оси стержней (101) квадруполя, подвержены существенно меньшему влиянию поля ионов, в то время как наведенные напряжения от полей круглых стержней квадруполя будут почти одинаковы для электродов соответственных пар. Это позволяет аналогично спектрометрии ИЦР организовать регистрацию вращающихся ионов, измеряя сигнал между электродами соответственных пар. Причем в данном случае такая регистрация может быть осуществлена по четырем каналам - для каждой пары электродов (112)-(115), (113)-(114), (122)-(117) и (123)-(116). Простым суммированием амплитуд сигналов по всем четырем каналам отношение сигнал/шум может быть увеличено в два раза. Более сложная обработка сигналов от свободно вращающихся ионов, включающая быстрое преобразование Фурье при учете фазовых сдвигов получающихся комплексных амплитуд может привести к четырехкратному повышению разрешения результирующего спектра. Подобная методика предложена Е.Н.Николаевым и Й.Франценом для спектров ИЦР при регистрации сигнала с помощью многоэлектродной ячейки [30]. Резонансные частоты сигналов от ионов будут существенно меньше, чем радиочастота ω фокусирующего ионы напряжения (102) и существенно больше, чем частота вынужденного вращения (108) вокруг газового потока. Использованием усилителей с соответствующей полосой пропускания, подключенных между электродами (112)-(115), (113)-(114), (122)-(117) и (123)-(116) высокочастотные и низкочастотные составляющие регистрируемого сигнала можно значительно ослабить.
Для определения значений резонансных частот и амплитуд вращающих напряжений для соответствующих целевых соединений должны быть проведены предварительные эксперименты с этими соединениями, добавленными в поток в достаточных количествах. Кроме установления условий движения соответствующих ионов на устойчивых орбитах при отсутствии их заметной убыли за счет распадов и переноса в орто-ВПМС или в другие последующие масс-анализаторы как при накоплении ионов, так и их последующем анализе должны быть найдены оптимальные амплитуды радиочастотного напряжения, частоты и амплитуды вращающих напряжений для наблюдения процессов распада вращающихся ионов за счет их разогрева при столкновениях с атомами или молекулами остаточных газов. Если убыль этих ионов будет происходить только за счет процессов мономолекулярного распада (как и любых независимых процессов гибели, описывающихся некоторой постоянной вероятностью гибели), то она будет экспоненциально затухающей во времени с характерным временем, специфичным при заданных условиях для каждого соединения. Если это время существенно больше периода вращения исходных ионов, то фазы вращения, при которых происходят распады, будут фактически равномерно распределены по всему кругу вращения. Если резонансные частоты вращения ионов-продуктов заметно отличаются от частоты вращения исходных ионов, то сигнал от этих ионов в значительной степени усреднится и будет близок к 0. Таким образом, изменение во времени сигнала на частоте вращения исходных ионов должно следовать с хорошей точностью процессу убывания числа этих ионов за счет их распадов. На этой основе возможно измерение характеристических времен распада этих ионов и их использование для идентификации целевых соединений даже при наличии других ионов, имеющих одно и то же значение m/z, но отличающихся по значениям характеристических времен распада при данных условиях вращения ионов.
k
Как известно, сумма экспоненциальных кривых удовлетворяет конечно-разностному уравнению с постоянными коэффициентами или другими словами имеет место точный линейный прогноз последующего значения таких кривых по предыдущим, измеренным с некоторым (постоянным в данном случае) временным шагом. Определив коэффициенты такого прогноза, например, по методу наименьших квадратов, факторы затухания соответствующих экспонент могут быть определены нахождением корней характеристического полинома, как и для соответствующего дифференциального уравнения с постоянными коэффициентами. В этом случае может быть использована вычислительная процедура, описанная нами в [22], модифицированная блок-схема которой приведена на Фиг.6 Исходными данными этой процедуры являются число и величины коэффициентов линейного прогноза. Для определения этого числа в данном случае можно использовать естественное разделение наблюдаемых данных на частоте вращения исходных ионов. Это, во-первых, кривые, пропорциональные синусоидальному сигналу от самого вращающего напряжения, и кривые, сдвинутые по фазе от этого сигнала на π/2, которые обусловлены только вращающимися ионами. Во-вторых, это могут быть данные, снятые для различных пар соответственных электродов, например, (112)-(115) и (113)-114). Вычислением Фурье-коэффициентов для этих двух синусоид (косинус- и синус-преобразования) для некоторой совокупности временных интервалов получаем массивы данных для прогноза. Последовательно увеличивая число коэффициентов такого прогноза, находим их по первому массиву, требуя минимума ошибки прогноза. Используя найденные коэффициенты, находим ошибку прогноза по второму массиву. Оставляем такое число коэффициентов прогноза N, которое обеспечивает минимум такой ошибки. Находим N уточненных коэффициентов по обоим совокупностям Фурье-коэффициентов {C}, требуя минимума средней ошибки прогноза по обоим массивам или по всем доступным данным, если реализуется многоканальная регистрация.
Если записать условие точного прогноза для одной экспоненты ехр(-t/τ) для равноотстоящих измерений с шагом Δt, то получится характеристическое уравнение, если ввести обозначение w=ехр(-Δt/τ):
.
Его корни (положительные числа, меньшие 1) равны факторам затухания всех экспонент, входящих в измеренные данные. На блок-схеме Фиг.6 эти искомые корни названы факторами экспонент. Именно корни полинома с ограничениями находились с помощью процедуры, описанной нами в [22]. Процедура принимает во внимание погрешности измерения или вычисления коэффициентов полинома, сводя задачу к поиску минимума функций многих переменных, описывающую сумму квадратов расхождений этих коэффициентов с вычисленными их значениями через искомые корни. Для повышения точности нахождения такого минимума производится случайный выбор начальной точки спуска к минимуму, и полученные результаты поиска затем усредняются.
Можно, по-видимому, использовать стандартные процедуры нахождения корней полинома. Однако неточности в задании коэффициентов полинома могут привести к появлению корней, выходящих за допустимый диапазон, или даже комплексных. Как поступать в таких случаях не совсем ясно. Лучше воспользоваться методом, где ограничения на искомые величины заложены с самого начала. При этом точность аппроксимации коэффициентов полинома через найденные корни при наличии оценок погрешности вычисления этих коэффициентов будет критерием адекватности полученных экспоненциальных факторов затухания.
v
Зная эти факторы или характеристические времена затухания всех экспонент, входящих в сигнал, измеренный на частоте вращения ионов, близкой к резонансной, решением соответствующей системы нормальных уравнений можно найти вклады этих экспонент и найти сдвиги фаз по отношению к вращающему полю, сигнал от которого будет представлять незатухающую «экспоненту» с фактором «затухания», равным 1. Формула (45) позволяет по измеренному фазовому сдвигу φ (пересчитанному в сдвиг фаз между направлениями вращающего поля и средней линейной скорости ионов на данной частоте) определить характерное время релаксации скорости τ. Оно однозначно связывается с подвижностью ионов κ (46).
Если же резонансная частота ионов, гибнущих с некоторым найденным характерным временем, неизвестна, то можно проводить измерения одновременно для двух близких частот вращения. В этом случае, получив соответствующие сдвиги фаз мы будем иметь два уравнения (45) с двумя неизвестными, из которых обе величины, резонансная частота и характерное время релаксации скорости данных ионов - могут быть найдены. Таким образом, если вращающиеся ионы значимо различаются по характерным временам их гибели, то их резонансные частоты и подвижности могут быть определены даже в случаях, когда соответствующие ионы не могут быть разрешены ни одним известным методом масс-анализа или разделения ионов по подвижности.
Еще одна возможность идентификация целевых соединений или разделение сигналов от ионов с одним и тем же m/z, но различающихся по характеристическим временам их фрагментации или гибели, получается на основе анализа масс-спектров ионов-продуктов, зарегистрированных на орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах. Когда высокое разрешение и чувствительность не являются критическими, достаточной может быть регистрация наведенного сигнала от свободно вращающихся ионов-продуктов в начальной части радиочастотного квадруполя. При этом сигналы от свободно вращающихся ионов, не являющихся продуктами диссоциации даже при совпадающих m/z, могут быть отделены от сигналов-ионов продуктов, т.к. сигнал от последних будет затухающим, а от первых должен быть стационарным при отсутствии их заметной гибели по каким-либо причинам.
1
2
1
2
Фиг.7 иллюстрирует идею такого анализа ионов. Здесь изображено изменение во времени t интенсивностей J трех гипотетических пиков масс-спектра. Один из них (150) с минимальным m/z, изображенный толстыми линиями, затухает относительно медленно по экспоненте (151) с характеристическим временем τ. Другой - (153) с максимальным m/z, показанный тонкими линиями, экспоненциально исчезает значительно быстрее (154) с характеристическим временем τ. Средний пик (155) является суммой двух первых пиков и составлен соответственно из двух линий - толстой и тонкой. Эти три пика соответствуют двум гипотетическим исходным ионам, исчезающим с характеристическими временами τ и τ, дающим при фрагментации по два равновероятных иона-продукта, показанные толстыми и тонкими линиями соответственно. Эти три пика в последовательные равноотстоящие моменты времени с интервалом Δt (152) могут быть выражены друг через друга с помощью линейных выражений, которые в матричной форме выписаны в (156):
kl
В более общем случае следующие по времени интенсивности пиков масс-спектра записываются в виде произведения матрицы перехода A на вектор предыдущих интенсивностей - уравнение (157):
Здесь 1 нумерует измеряемые масс-спектральные пики (полное число - n), k - задает номер исходных ионов (не больше n), распадающихся с различными характеристическими временами и дающих ионы-продукты, интенсивности которых образуют линейно независимую систему векторов. Матричные элементы матрицы перехода могут быть вычислены по методу наименьших квадратов из условия наилучшего в среднеквадратичном выполнении равенства (157) для всех моментов измерения. Для этого число зарегистрированных масс-спектров (моментов измерения) должно быть не меньше числа пиков масс-спектра (n). Решением проблемы собственных значений (158) для матрицы перехода находятся собственные векторы  и собственные числа (159):
1
2
Собственные векторы описывают распределения интенсивностей ионов-продуктов для каждого исходного иона, которому соответствует собственное число (159), являющееся экспоненциальным фактором затухания числа этих ионов. Так, например, для матрицы перехода в выражении (156) векторы с компонентами (1, 1, 0) и (0, 1, 1) являются собственными с собственными числами, равными первому ехр(-Δt/τ) и второму ехр(-Δt/τ) экспоненциальным факторам затухания. После того, как найдены число исходных ионов и экспоненциальные факторы затухания или релаксации соответствующих сигналов, могут быть вычислены вклады масс-спектров ионов-продуктов от этих исходных ионов во всех зарегистрированных отсчетах исходного масс-спектра в последовательные равноотстоящие моменты времени решением соответствующих систем линейных алгебраических уравнений, исходя из требования минимума среднеквадратичной ошибки приближения. Таким образом могут быть получены масс-спектры для каждого исходного иона, как в случае их полного разделения перед измерениями. При известных заранее m/z некоторые ионы-продукты могут быть оставлены на устойчивых орбитах нерезонансного вращения. Это позволит провести в необходимых случаях после их накопления более детальный анализ этих ионов, включая их разделение по характеристическим временам гибели.
Ионы-продукты, чтобы не помешать адекватному анализу других накопленных ионов, должны обладать m/z, отличными от других ионов, вращающихся вокруг оси квадруполя. В случае обычных однозарядных ионов это означает, что наиболее удобными являются измерения распада ионов с наименьшими m/z среди всех вращающихся ионов. Если резонансная частота вращения таких ионов достаточна, чтобы обеспечить при вращении на орбите с максимально возможным радиусом распад этих ионов с характеристическим временем, удобным для измерений, то включением соответствующего вращающего напряжения организуется режим ионной фрагментации. Если же частота вращения оказывается недостаточной, то радиочастотное напряжение квадруполя должно быть увеличено или его частота уменьшена для необходимого увеличения резонансной частоты данного типа ионов. При этом радиусы нерезонансного вращения и этого, и других ионов также изменятся, поэтому, возможно, будет необходимо изменить частоту и/или амплитуду этого вращающего поля. Через времена, пропорциональные временам релаксации скоростей соответствующих ионов, установятся вращения ионов с новой частотой и радиусами вращения. Контролировать этот процесс установления можно, регистрируя наведенные сигналы от вращающихся ионов. Дополнительное время, пропорциональное характерному времени установления внутренней температуры данных ионов, необходимо для разогрева выбранных для распада ионов до стационарного уровня внутренней температуры, при котором далее число этих ионов будет экспоненциально убывать во времени. Получающиеся ионы-продукты будут входить в зону переноса ионов в орто-ВПМС или других последующих масс-анализаторов (104) и будут попадать в эти части прибора либо при относительно малом радиусе их нерезонансного вращения либо при пересечении траекторией движения исходных ионов (111) этой зоны с последующим их распадом внутри этой зоны или без такого распада, если эта траектория проходит достаточно близко от отверстия запирающей диафрагмы (14) - Фиг.1.
Вторая возможность организации управляемой гибели или может быть фрагментации многозарядных ионов - это использовать их столкновения с поверхностью проводящего кольца (19). Этот случай проиллюстрирован на Фиг.8. Потенциальная яма (215) вблизи кольца (19) качественно показана для смещения Z в условных единицах от положения минимума. Она является результатом суперпозиции поля от потенциалов секций квадруполя (205), от задерживающего потенциала кольца (19), искривленного вблизи кольца (19) и диафрагмы (14) вращающего поля и эффективного потенциала от искаженного кольцом (19) и диафрагмой (14) радиочастотного поля. Распределение плотности вращающихся ионов в потенциальной яме (215) вблизи кольца (19) в соответствии с принципом Больцмана в стационарных условиях задается выражением (221):
eff
Два параметра этого распределения определяются природой вращающихся ионов: эффективная температура T и заряд ионов ez. При заданных m/z ионов и вращающем поле эффективная температура в первом приближении определяется в конечном счете подвижностью ионов κ - формулы (222) и (223), где коэффициент пропорциональности α в различных моделях нагрева ионов несколько по-разному зависит от свойств иона и атомов или молекул газа:
Сдвиг фазы вращающихся ионов φ возникает за счет отклонения частоты вращающего поля от резонансной частоты ионов - формула (45). На графиках (216) показаны зависимости относительной плотности трех гипотетических типов ионов для идеальной квадратичной ямы (215) от смещения вдоль оси квадруполя Z. Облако максимально раскрученных целевых ионов (210) обладает максимальным радиусом вращения и, следовательно, максимальной скоростью вращения при заданной частоте вращения и соответственно максимальной эффективной температурой. Оно максимально протяженно среди других ионов, и именно ионы из крайне правой части облака имеют шанс при столкновении со стенкой (19) рекомбинировать или погибнуть. По-видимому, вероятность такой гибели по крайней мере для однозарядных сложных органических и биоорганических ионов практически равна 1. Чтобы отскочить назад и «уйти» от стенки при соударении с проводящей поверхностью иону, который вблизи поверхности приобрел дополнительную энергию за счет притяжения к противоиону-изображению, нужно упругое соударение, а это для сложного иона при его повышенной энергии крайне маловероятно.
В конфигурации, показанной на Фиг.8, ионы (214), обладающие примерно на 10% меньшей эффективной температурой, чем ионы (210), будут иметь более чем в 2 раза меньшую частоту столкновений со стенкой (19), чем ионы (210), поскольку в этом случае «работают» правые хвосты распределений - уровни «отсечки» гибнущих ионов (218) и (220). Если вероятности гибели этих обоих типов ионов при столкновении со стенкой близки к 1, то такое различие в частоте столкновений позволит достаточно легко разделить сигналы от таких ионов с помощью известных методов и описанных, например, в нашей монографии [18]. Если скорость вращения этих ионов достаточно велика и они начинают фрагментировать с заметной эффективностью, образуя спектр ионов-фрагментов, то используя методы, описанные выше, можно разделить сигналы от различных ионов, при этом характеристические времена затухания этих сигналов будут определяться как процессами гибели исходных ионов на кольце (19), так и процессами их фрагментации. Сравнением этих характеристических времен при различных потенциалах кольца можно выделить обе составляющих и оценить на этой основе эффективную температуру (222) фрагментирующих ионов.
Замечательным свойством разделения сигналов от разных ионов при их гибели на кольце (19) является возможность практически полного разделения ионов разной зарядности в тех случаях, когда их не удается различить по m/z и устойчивости к столкновительной фрагментации. Показанное на Фиг.8 облако 4-зарядных ионов (213), совпадающих по m/z и близких по подвижности с ионами (210), сосредоточено в области, удаленной от поверхности (19), так что эти ионы практически не будут с ней сталкиваться. Это свойство отличает этот метод от других масс-спектрометричсских методик, где нет прямого разделения ионов по абсолютной величине заряда, а ионы разделяются по m/z. Наличие проводящего кольца (19) при приложении к нему потенциала, отталкивающего ионы, позволяет вывести резонансно вращающиеся ионы (210), (213) и (214) из области основной массы не резонансно вращающихся ионов (16) и тем самым ослабить влияние объемного заряда на резонансные частоты вращения и на вероятности гибели ионов на кольце (19). Ионы, участвующие только в нерезонансном вращении (16), предполагаются имеющими радиусы вращения, не выводящие их в область кольца (19), и вращающимися вблизи покрытой заряженной диэлектрической пленкой (9) диафрагмы (14). Влияние облака-изображения противоионов (21) позволит иметь существенно большую, чем обычно, ионную емкость предлагаемой квадрупольной ионной ловушки.
Измерение наведенного сигнала от вращающихся ионов возможно как в случае их стационарного вращения под действием неизменного вращающего поля, так и в случае их свободного вращения со своими собственными частотами вращения, когда исходное их движение возбуждается либо широкополосным импульсом, либо пакетом выбранных вращающих напряжений. Последний способ, например, может позволить измерять масс-спектры ионов в заданном диапазоне m/z. Фиг.9 показывает копию экрана программы моделирования движения ионов в радиочастотном квадруполе для случая, когда два типа ионов с m/z=1000 Т (304) и m/z=998 Т (305) захвачены в квадратичную потенциальную ловушку и возбуждено спонтанное вращение этих ионов на фоне их нерезонансного вращения вокруг потока гелия (303). В левом верхнем окне показано поперечное сечение квадруполя. Между стержнями квадруполя (301) показаны электроды (302), с которых может сниматься наведенный сигнал от вращающихся ионов. Они на Фиг.5 показаны под номерами (112), (113), (122), (123). Парные электроды (115), (114), (117), (116) выходят за пределы части сечения квадруполя, показанной на Фиг.9. Сигнал от одной пары электродов (113) и (114) показан в окне (308). В окне (307) показаны распределения кинетической энергии вращающих ионов. Результат обратного Фурье преобразования сигнала (308) после регистрации в течение ~10 мсек в шкале периодов вращения (пропорциональных m/z ионов) показан в окне (309). Этот результат показывает, что при характерных временах гибели исходных ионов в диапазоне секунд достаточное число масс-спектров ионов-продуктов для разделения изобарных ионов может быть в принципе получено на основе возбуждения собственных вращений ионов и регистрации наведенных сигналов. Регистрация данных на орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах может быть важной не только для случаев малых сигналов, разделения наложенных пиков и получения «точных» значений масс ионов. Она может обеспечить количественную калибровку (оценку числа вращающихся ионов) наведенных сигналов в радиочастотном квадруполе и контроль массовой шкалы масс-спектров, получаемых из наведенных сигналов с помощью обратного Фурье-преобразования, если тот же масс-спектр после возбуждения вращений и регистрации наведенных сигналов зарегистрировать на орто-ВПМС или в других последующих масс-анализаторах.
Существенный недостаток «свободного» вращения ионов в квадруполе, так же как и в магнитном поле масс-спектрометра ИЦР, - это серьезное ограничение по числу вращающихся ионов близких m/z из-за явления слияния или коалесценции ионных облаков. Копия экрана программы моделирования для случая вращения 84 50-зарядных ионов с теми же m/z, что и на Фиг.9 при учете кулоновского расталкивания ионов показана на Фиг.10. В этом случае частоты вращения этих ионов оказываются существенно более близкими, чем это диктуется разностью значений m/z (409). Показанный случай близок к пределу начала слияния ионных облаков. При вращении ионов с большим общим числом зарядов частоты вращения ионов с близкими m/z в пределах ошибки вычислений вообще перестают различаться. В масс-спектрометрии ИЦР для уменьшения влияния коалесценции используются существенно большие радиусы вращения (около 1 см и более), чем это обычно возможно в квадруполе, радиус которого в нашем случае 3,6 мм. Конечно, можно использовать квадруполь и большего радиуса, однако в этом случае для обеспечения близких к прежним частот вращения исследуемых ионов нужно было бы использовать большие напряжения радиочастотного поля (пропорционально квадрату радиуса - формула (40)). Кроме этого, пропорционально радиусу вращения вырастет линейная скорость ионов, что при частотах около 100 кГц приведет в газонаполненном квадруполе к слишком быстрому распаду ионов. По-видимому, это одна из основных причин, которая требует сверхвысокого вакуума в приборах ИЦР - любое столкновение иона при скоростях около 6 км/сек с молекулой остаточных газов (для молекулы азота энергия столкновения в этом случае около 6 эВ) приведет к выбыванию этого иона из пакета вращающихся ионов. Таким образом, чтобы сохранить возможность достаточно высоко селективных кинетических измерений столкновительно-индуцированной диссоциации ионов в радиочастотном квадруполе, радиусы вращения ионов не должны превышать 1-2 мм. При таких радиусах вращения регистрация ионов, участвующих в свободном вращении, возможна в сравнительно узком диапазоне по числу зарядов вращающихся ионов. Если это накапливающиеся ионы-продукты от достаточно большого числа распадающихся исходных ионов, то организация их гибели на проводящем кольце (19) - Фиг.8 является одним из возможных решений проблемы ограничения числа вращающихся ионов. Такую гибель можно осуществлять периодически раскруткой нужных ионов резонансным вращающим полем, а затем производить регистрацию наведенного сигнала после выключения этого поля. Альтернативно регистрацию наведенного сигнала можно производить одновременно с возбуждением стационарного квазирезонансного вращения ионов. В этом случае в регистрируемом сигнале будут присутствовать экспоненциально затухающие вклады с характерным временем распада исходных ионов и с характерным временем гибели на кольце (19). В некоторых случаях, при наличии нескольких типов ионов-продуктов с различными характерными временами гибели на кольце (19), возможно их разделение по этим временам по методу, описанному выше. Измеряя также сдвиги фаз регистрируемых сигналов по отношению к вращающему полю, возможно определение подвижностей ионов-продуктов, даже если они имеют неразличимые в данных условиях измерения величины m/z.
При проведении описанных выше измерений важным является ограничение числа накопленных ионов, хотя влияние объемного заряда и определяет естественное запределивание этого числа, обеспечивая уход «лишних» ионов на стержни квадруполя. Однако, гораздо ранее этого предела возможны нежелательные эффекты при детектировании этих ионов как при регистрации наведенных сигналов от вращающихся ионов в квадруполе, так и при регистрации масс-спектров в последующих масс-анализаторах. Намеренное освобождение от нежелательных или излишних ионов может быть важным также при накоплении ионов микропримесей, которое иначе из-за влияния объемного заряда могло бы быть невозможным или затруднительным. Периодическое возбуждение свободного вращения дополнительного к нерезонансному вращению ионов и регистрация наведенных сигналов дает в нашем случае возможность проводить эти операции своевременно и не допускать нежелательных эффектов, связанных с излишним накоплением тех или иных ионов. Соответствующая резонансная раскрутка не резонансно вращающихся ионов в накопительной части радиочастотного квадруполя позволяет получить достаточно высокую избирательность такого устранения и в случае наличия заметного газового потока вдоль оси квадруполя. Использование для этих целей гибели раскрученных ионов на проводящей части запирающей диафрагмы (19), Фиг.1, позволит избавиться не только от ионов с выбранным m/z, но и осуществить избирательное ослабление популяции накопленных ионов, существенно различающихся по подвижности или величине заряда. Такая возможность проиллюстрирована на Фиг.8, где проводящая часть запирающей диафрагмы показана под номером (19), а соответствующие вращающиеся ионные облака и соответствующие распределения плотностей ионов показаны под номерами (210), (213) и (214). Эта иллюстрация показывает, что избирательное устранение нежелательных ионов с заданным m/z при использовании статических напряжений на кольце (19) и диафрагме (16) возможно при резонансном возбуждении вращения этих ионов, если они обладают максимальной подвижностью и минимальным зарядом. Если же необходимо устранить ионы с меньшей подвижностью, то этого можно добиться сдвигом частоты раскрутки ионов в ту сторону, которая является менее опасной для потери каких- либо других ионов, представляющих интерес. Так, например, если ионы с меньшими m/z уже подвергались исследованиям, то сдвиг в сторону больших частот и, следовательно, меньших масс - формула (40) - не приведет к потере еще не исследованных ионов. В этом случае ионы разных подвижностей и совпадающих m/z будут иметь различные фазовые сдвиги относительно вращающего поля - формула (45). Отталкивающий электрический потенциал кольца (19) уменьшается на некоторое время, соответствующее прохождению нежелательных ионов мимо кольца (19), и они гибнут на его поверхности.