СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТЕАТОЗА И НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА У ЖЕНЩИН
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF STEATOSIS AND NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS IN FEMALES

Изобретение относится к области медицины, а именно гепатологии, и может использоваться для скрининга пациентов с подозрением на неалкогольную жировую болезнь печени и подлежащих дальнейшему обследованию (ультразвуковое исследование, пункционная биопсия печени, скрининг онкозаболеваний, вирусных инфекций, поиск этиологических факторов цирроза печени (аутоиммунные заболевания, лекарственно-индуцированные заболевания печени, коморбидные состояния, заболевания сердечно-сосудистой системы и т.д., согласно существующему стандарту).
В настоящее время неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) является одним из наиболее широко распространенных заболеваний печени в мире. Распространенность НАЖБП в мире варьирует от 6,3 до 33%. По результатам открытого многоцентрового рандомизированного проспективного исследования - наблюдение DIREG_L_01903 с участием 30 787 пациентов, распространенность НАЖБП в России составляет 27%, при этом у 80,3% пациентов был диагностирован стеатоз, у 16,8% - стеатогепатит, у 2,9% - цирроз печени [1]. В Российской Федерации признаки стеатоза печени встречаются примерно у трети взрослого населения [2].
Известно, что НАЖБП тесно связана с дислипидемией, ожирением, инсулинорезистентностью (ИР), артериальной гипертонией и в настоящее время рассматривается как печеночное проявление метаболического синдрома (МС) [3]. Понятие НАЖБП объединяет спектр поражений печени, включающий стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), фиброз и цирроз печени, исходом которого может стать гепатоцеллюлярная карцинома.
Современные представления о механизмах развития НАЖБП основываются на том, что НАЖБП имеет сложный многофакторный процесс развития. В качестве главного звена патогенеза рассматривают ИР и изменение профиля гормонов - регуляторов жирового обмена (лептина, адипонектина и др.) [4].
Периферическая ИР, т.е. снижение чувствительности периферических тканей, прежде всего, мышц и белой жировой ткани к инсулину сопровождается развитием гипергликемии и/или гиперинсулинемии. Гиперинсулинемия и часто наблюдающаяся при ожирении активация симпатико-адреналовой системы приводят к усилению липолиза в жировой ткани с высвобождением повышенного количества свободных жирных кислот (СЖК), в то время как в печени снижается скорость их окисления [5].
Увеличенное поступление СЖК в печень и недостаточное их окисление способствуют избыточному накоплению триглицеридов (ТГ) в гепатоцитах и секреции большого количества липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП).
Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) - монокарбоновые кислоты с длиной цепи до 6 атомов углерода (в англоязычной литературе, «short chain fatty acids» -SCFA. Первоначально КЦЖК называли «летучими жирными кислотами» из-за их специфического, нередко неприятного запаха. Наиболее важными КЦЖК являются уксусная (ацетат, С2), пропионовая (пропионат, С3), масляная (бутират, С4), валериановая (валерат, С5), капроновая (гексаноат, С6) кислоты [5, 6]. КЦЖК - основной продукт микробной ферментации углеводов, жиров и белков. Синтезируются КЦЖК, главным образом, анаэробными бактериями, которые доминируют в составе кишечной микрофлоры. Кишечные бактерии вырабатывают большое количество различных гликозидгидролаз, способных ферментировать сложные макромолекулы непереваренных в вышележащих отделах ЖКТ полисахаридов, а также пищевых и эндогенных белков (слизь, слущивающиеся эпителиальные клетки). Тип ферментируемого в толстой кишке субстрата определяет спектр и количество КЦЖК. При этом неразветвленные КЦЖК - уксусная, пропионовая и масляная - образуются при анаэробном брожении углеводов (пектинов, ксиланов, арабиногалактанов и пр.), тогда как метаболизм белков и продуктов их расщепления ведет к образованию разветвленных кислот - изомасляной (из валина) и изовалериановой (из лейцина). Ежедневно образуется около 200-1000 ммоль КЦЖК, из них лишь менее 5% экскретируется с фекалиями. Остальная часть (более 95%) быстро всасывается апикальной мембраной колоноцитов, в митохондриях которых КЦЖК (главным, образом бутират) подвергаются бета-окислению с образованием универсального источника энергии АТФ (аденозинтрифосфата). Значительная часть КЦЖК (преимущественно, уксусная и пропионовая кислота) проникает в локальные кишечные капилляры и по системе воротной вены достигает печени, где подвергается дальнейшей трансформации с образованием глюкозы (около 50% поступивших КЦЖК). Пропионат в гепатоцитах, преимущественно, участвует в глюконеогенезе, а также является регулятором метаболических процессов и липидного обмена в печени. Ацетат принимает участие в липогенезе и является важным энергетическим субстратом для сердца, мозга, почек, мышц и других периферических тканей [7].
В течение последних 30 лет КЦЖК привлекают значительный интерес физиологов, патофизиологов, диетологов, гастроэнтерологов. Физиологические эффекты КЦЖК проявляются в совокупности их локальных действий на уровне всего организма. КЦЖК выступают в роли триггера и запускают множество физиологических и клинических эффектов на разном удалении от места синтеза указанных жирных кислот [7].
Таким образом, выявление жирных кислот (метаболитов сыворотки крови) и определение их диагностической значимости позволит диагностировать НАЖБП на ранних стадиях и могут использоваться как биопрогностические тесты. В связи с этим перспективным является использование использование неинвазивной «омикс» - технологии, а в частности газовой хромато-масс-спектрометрии с определением метаболома сыворотки крови.
В настоящее время не существует единого алгоритма диагностики НАЖБП. На сегодняшний день в клинической практике при неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) используются следующие методы исследования:
1) Лабораторные тесты: биохимический анализ крови (общий белок, альбумин, ACT, АЛТ, билирубин, ГТТП, ЩФ); коагулограмма (MHO, протромбиновый индекс, АЧТВ); по показаниям - HBSAg, a-HCV, ANA; оценка липидного профиля (ХС, ЛПВП, ЛПНП, ТГ); определение уровня глюкозы натощак (по показаниям глюкозотолерантный тест), инсулин крови натощак, индекс HOMA-IR. Индекс Caro - отношение глюкозы плазмы (ммоль/л) к уровню инсулина натощак (мкед/мл). При ИР индекс менее 0,33.
2) Инструментальные методы: ультразвуковое исследование органов брюшной полости позволяет определять стеатоз при наличии жира более чем в 20% гепатоцитов [8]. При этом УЗИ является скорее качественным методом определения стеатоза, оно не дает возможности оценить его степень, а также имеет низкую чувствительность [9]. Несмотря на то, что многое зависит от опыта специалиста, УЗИ позволяет достоверно диагностировать стеатоз средней и тяжелой степени тяжести и предоставляет дополнительную информацию о гепатобилиарной системе и, следовательно, рекомендуется в качестве метода первой линии диагностики. Однако для крупномасштабного скрининга используют сывороточные биомаркеры, поскольку доступность и стоимость методов лучевой диагностики существенно влияют на целесообразность их применения. Компьютерная томография, магнитно-резонансная томография определяют гепатомегалию, признаки жировой дистрофии печени, проводится оценка степени стеатоза печени, портальной гипертензии (при наличии), но стадию НАСГ не оценивают.
3) Оценка степени фиброза печени (ФП): пункционная биопсия печени (ПБП). Биопсия печени, по-прежнему, считается золотым стандартом в диагностике и единственным надежным инструментом для верификации НАСГ и стеатоза, обеспечивая информацию о тяжести стеатоза, выраженности воспаления и степени фиброза. При этом следует отметить, что метод обладает высокой специфичностью (81-99%). К сожалению, данная методика является инвазивной, может приводить к развитию таких осложнений, как внутри-брюшное кровотечение (0,24%), внутрипеченочная гематома (2%), пневмоторакс (0,08%), желчный перитонит (0,04%), летальный исход (0,01%), местное метастазирование при прицельной биопсии злокачественных опухолей (0,0005%) [9].
Показаниями для выполнения биопсии печени являются: возраст старше 45 лет и хронический цитолитический синдром неустановленной этиологии; сочетание хронического цитолитического синдрома неустановленной этиологии, по крайней мере, с двумя проявлениями метаболического синдрома, независимо от возраста. Однако, являясь инвазивным вмешательством, биопсия печени также имеет несколько лимитирующих факторов, например, госпитализация с временной нетрудоспособностью. Кроме этого, адекватная интерпретация результатов требует патологоанатома с опытом в гепатологии, что делает данный метод исследования достаточно дорогим исследованием.
Еще одним существенным недостатком биопсии печени является одинаковая гистологическая картина, при различных заболеваниях печени, включая и НАЖБП. Так, отрицательная прогностическая ценность одной биопсии для диагностики НАСГ может составлять до 74% [10, 11].
4) Неинвазивные методы исследования и расчетные прогностические индексы в последние годы в клинической практике получили широкое распространение: шкала оценки стадии фиброза при НАЖБП (NAFLD fibrosis score), шкала BARD (0-4 балла), тест ФиброМакс включает 5 не коррелирующих между собой биохимических показателей: а2-макроглобулин, гаптоглобин, аполипопротеин А1, ГГТ и общий билирубин, которые позволяют оценить выраженность фиброза с помощью дискриминантной функции; тест ФиброМетр; эластометрия с помощью аппарата «FibroScan», FIB4, APRI. Однако данная стратегия требует дополнительной доказательной базы для пациентов с НАЖБП (А1) [10]. Следует отметить, что чувствительность и специфичность данных тестов высоки только при их комбинации (например : эластометрия + фибротест), так как только в этом случае данные методы диагностики способны обеспечить результат, по информативности аналогичный таковому при ПБП
2
В последние годы в клинической практике получили широкое распространение такие неинвазивные методы как эластометрия и фибротесты [12]. Для диагностики цирроза печени применение эластометрии и фибротестов ограничено, так, к лимитирующим факторам для выполнения эластометрии относятся индекс массы тела ≥28 кг/м, наличие асцита, холестаза, венозного застоя в системе воротной вены, а также недостаточный опыт оператора, что требует технического совершенствования метода. Ограничением к выполнению фибротестов относится острый гепатит (любой этиологии), внепеченочный холестаз. Кроме того, метод не может считаться достоверным при хронических воспалительных заболеваниях соединительной ткани (ревматизм, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия и др.), наследственных гипербилирубинемиях, например, синдроме Жильбера, гемолитической анемии. Следует отметить, что чувствительность и специфичность данных тестов высоки только при их комбинации (эластометрия + фибротест), так как только в этом случае данные методы диагностики способны обеспечить результат, по информативности аналогичный таковому при ПБП.
Наиболее близким к заявляемому методу является способ определения неалкогольного стеатогепатита при неалкогольной жировой болезни печени с помощью аппарата ФиброМакс [13].
ФиброМакс представляет собой метод неинвазивной оценки состояния печеночной ткани. Он состоит из ряда лабораторных исследований. Получаемые при этом результаты применяются для расчета нескольких наиболее важных показателей, отражающих состояние ткани печени, а именно: стадии фиброза с использованием шкалы METAVIR (или Фибро-Тест); степени выраженности некровоспалительной реакции (или Акти-Тест); степени выраженности стеатоза печени (или жирового перерождения печеночной ткани) (Стеато-Тест); распознавания неалкогольного поражения печени и определения активности его - неалкогольного стеатогепатита (или Неш-Тест); распознавания алкогольного поражения печени и определения активности его (Аш-Тест).
Расчетный алгоритм был разработан французскими исследователями с дальнейшим подтверждением во многих независимых исследованиях в разных странах с привлечением многих тысяч пациентов. В подавляющем числе клинических ситуаций была подтверждена эффективность использования Фибромакса как альтернативы для биопсии печени. Фибромакс делает возможным комплексную оценку изменений, произошедших в связи с заболеванием печени и включает 5 не коррелирующих между собой биохимических показателей: α2-макроглобулин, гаптоглобин, аполипопротеин А1, ГГТ и общий билирубин, которые позволяют оценить выраженность фиброза с помощью дискриминантной функции. Исследование обладает сравнительно высокой чувствительностью, а также специфичностью в плане фибротических изменений и стеатоза, которые вызваны токсическим или вирусным воздействием на ткань печени, а также иными причинами, неблагоприятно влияющими на печень (например, избыточная масса тела, наличие гиперлипидемии, сахарный диабет).
Для проведения ФиброМакса требуется подготовка. Рекомендуется полностью воздержаться от приема пищи за 12 часов до взятия крови. Исключить как физическое, так и эмоциональное перенапряжение, а также курение по меньшей мере за 30 минут до исследования.
Исследование с помощью системы ФиброМакс может проводиться при хронических гепатитах В и С; при стеатозе и алкогольном стеатогепатите; избыточном весе; при гиперхолистеринемии и гипертриглицеридемии; гипертонической болезни; сахарном диабете.
К недостатку способа, выбранного нами в качестве прототипа, можно отнести:
2
- ограничение контингента обследуемых пациентов, так как аппарат Фибромакс имеет ограничения по массе тела, то есть расчет проводится при индексе массы тела пациента не более 30 кг/м, в результате чего результаты пациентов с указанной массой тела будет недостоверны;
- исследование не выполняют лицам моложе 18 лет;
- исследования не проводят пациентам перенесших трансплантацию печени;
- на результаты может оказать влияние ряд факторов (т.е. исследование применяется ограниченно или же не применяется при наличии этих факторов). Среди них, например, такие: острый вирусный гепатит (типа А, В или вызванный вирусом Эпштейн-Барра); острый аутоиммунный или вызванный медикаментами гепатит; гепатонекроз; синдром Жильбера, сопровождающийся высокой гипербилирубинемией; желчнокаменная болезнь, сопровождающаяся острым холестазом; применение азатиоприна и рибавирина; хронический гемолиз (как пример - у лиц с искусственным сердечным клапаном); острое инфекционное заболевание системы дыхания, почек; наличие в полученной сыворотке гемолиза и/или липемии (исследование не выполняют);
- резкое повышение одного из биохимических показателей, не коррелирующее с клиническими данными, говорит о высокой вероятности неправильного результата;
- дороговизна исследования: (Стоимость исследования: 16 200 руб. + взятие крови из вены: 200 руб).
На сегодняшний день актуальной задачей современного здравоохранения является своевременная диагностика различных форм НАЖБП, особенно на ранних стадиях, что определяет техническую проблему - необходимость разработки более простого и точного способа дифференциальной диагностики неалкогольного стеатогепатита у женщин, лишенного вышеприведенных недостатков и обеспечивающего расширение контингента обследуемых пациентов.
Несмотря на доброкачественное и медленно-прогрессирующее течение социально-значимого заболевания, исходом могут стать такие необратимые процессы, как цирроз печени, так и гепатоцеллюлярная карцинома.
Техническим результатом изобретения является:
- повышение точности, чувствительности и специфичности диагностики различных форм неалкогольной жировой болезни печени у женщин (в частности, стеатоза и НАСГ); - обеспечение возможности проведения диагностики независимо от различных факторов воздействия.
Технический результат достигается тем, что в способе дифференциальной диагностики стеатоза и неалкогольного стеатогепатита у женщин, в ходе которого у пациента берут образец венозной крови, анализируют его биохимические показатели и определяют по нему различные формы неалкогольной жировой болезни печени, согласно изобретению анализ проводят хроматографическим методом, а в качестве анализируемых биохимических показателей являются концентрации молочной и оксаниловой кислот в образце крови, после чего определяют соотношение концентраций указанных кислот друг к другу, при этом при соотношении концентрации молочной кислоты к оксаниловой кислоте 98/1 и меньше, пациенту ставят диагноз - стеатоз; при соотношении 325/1 и больше, пациенту ставят диагноз - неалкогольный стеатогепатит, а при соотношении в диапазоне от 99/1 до 324/1 (серая зона), пациенту не ставят точный диагноз и проводят дополнительные диагностические мероприятия.
Определение содержания карбоновых кислот является наиболее объективным, менее затратным методом исследования и не имеет погрешностей в зависимости от различных факторов (масса тела, возраст, перенесенная трансплантация печени и др.), что расширяет контингент обследуемых пациентов.
Обоснование выбора диагностических маркеров осуществляли следующим образом.
Для исследования использовали газовый хромато-масс-спектрометр GCMSQP2010 Plus (Shimadzu Corporation, Япония), но для реализации заявляемого способа допускается использование других аналогичных приборов.
Забор венозной крови, получение и хранение сыворотки для целей исследований проводился в соответствии с действующими стандартами: ГОСТ Р 53079.4-2008 «Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа» (введен с 01.01.2010 г.); ГОСТ Р ИСО 6710-2009 (введен с 01.03.2010 г.; аналог международного стандарта ISO 6710, определяющий требования к контейнерам и пробиркам для сбора венозной крови) и другими нормативными документами.
Забор крови у пациентов производили утром натощак с помощью вакуумных систем для взятия венозной крови RusTech (http://www.rustech.ru/labor/vacclin.html) или аналогичных. В состав системы входят: 1) вакуумная пробирка GD080SG RusTech (8 мл, 15×100 мм) для исследования сыворотки с разделительным гелем, 2) двухсторонняя игла для вакуумной пробирки RusTech MF021G для использования с иглодержателем: размер 21G (33×0,8 мм; цвет зеленый), с заточкой обоих концов и 3) иглодержатель стандартный RusTech (GD001H).
После забора образцы крови для получения сыворотки сразу же подвергали центрифугированию в течение 15 мин. при скорости вращения 3000 оборотов.
Далее полученную сыворотку с помощью одноразовых пластмассовых пипеток (емкостью до 3 мл) распределяли в 2 стерильные пробирки с герметично закручивающимися крышками (не менее 0,5 мл сыворотки в каждую пробирку). Пробирки маркировали с указанием фамилии, инициалов, идентификационного номера пациента, номера пробы (образца) и номера пробирки (1 или 2).
Параллельно вели журнал учета проб (образцов) сыворотки с указанием даты забора крови, ФИО пациента, его идентификационного номера, номера пробы, пола, даты рождения, основного диагноза (если практически здоров, то указывается «здоровый доброволец»), номера истории болезни или др. мед. документа (карты, направления, договора), ФИО лиц, осуществивших забор крови, центрифугирование, маркировку и замораживание, а также с обязательной отметкой о наличии информированного согласия.
После маркировки пробирки сразу же помещали в специальный биомедицинский морозильник, предназначенный для хранения компонентов крови и вакцин, диагностических образцов и проб при температурах от -20°С до -35°С. Для замораживания и хранения образцов сыворотки крови использовали биомедицинский морозильник горизонтальный для хранения крови Medical Freezer MDF-236 емкостью 222 л (Sanyo, Япония. Хранение образцов сыворотки крови осуществляли при температуре -20°С.
В рамках исследования организовали хранение сывороток крови всех принимавших участие в исследовании здоровых добровольцев и больных (создается банк сывороток крови). При этом сыворотку крови из одной пробирки (2 пробирки на каждого пациента) использовали для определения метаболического профиля крови методом газовой хромато-масс-спектрометрии, а из второй пробирки - для формирования банка.
Банк сывороток крови представляет собой набор герметично закрытых пробирок с образцами полученных от пациентов сывороток крови в замороженном состоянии (не менее 0,5 мл в каждой пробирке). Пробирки находятся в биомедицинском морозильнике, обеспечивающим хранение замороженных образцов сывороток крови при температуре -20°С.
Для проведения анализа методом ГХ-МС образцы сывороток крови размораживали при комнатной температуре. Отбирали по 0,1 мл, добавляли 0,5 мл ацетонитрила, перемешивали в течение 3-х минут на вортексе медицинском вибрационном («V-3 ELMI»), прозрачную надосадочную жидкость отбирали, а осадок еще раз промывали 0,5 мл ацетонитрила. Оба раствора объединяли, переносили в виалу, и сушили в токе азота с использованием микрокомпрессора до получения сухого остатка (20-30 мин). К сухому остатку в качестве внутреннего стандарта добавляли 10 мкл растворенного в метаноле эфира тридейтерометанола и тридекановой кислоты (MW 231, С = 2 мг/мл или 8.7 мМ), вновь высушивали, добавляли 100 мкл силицирующего агента N,О-бис (триметилсилил) трифторацетамида (BSTFA, (N,О-бис (trimethylsilyl)-trifluoroacetarnid) и выдерживали 3 минуты при 50°С для получения летучих производных - силоксанов.
Газохроматографические исследования осуществляли с помощью хромато-масс-спектрометра GCMS-QP2010 Plus (Shimadzu, Япония), с программным обеспечением GCMS solution для обработки данных и базой масс-спектральной информации NIST08 (National Institute of Standarts and Technology, США). Хроматографическое разделение проводили на аналитической капиллярной колонке Agilent HP Ultra-2 (5% (фенил)-метилполисилаксон) длиной 25 м, внутренним диаметром 0,2 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.
Для хроматографирования использовали программируемый нагрев колонки от 50 до 290°С со скоростью 10°С/мин, время анализа составляло 40 мин, время при начальной температуре колонки (50°С) - 3 минуты, при конечной (290°С) - 13 минут. Объем вводимой пробы - 100 мкл, деление потока 1:50, поток газа - носителя (гелий) через колонку - 1 мл/мин, температура инжектора и детектора - 280°С.
Хроматограмма образца регистрировалась в двух режимах:
1. С 1 мин до 6,4 мин - мониторинг ионов m/z = 103,117,145 (режим SIM).
2. С 6,4 мин до 40 мин - мониторинг по полному ионному току в диапазоне масс от 35 до 550 (режим SCAN).
Выбор первого режима регистрации был обусловлен необходимостью зарегистрировать пики муравьиной, уксусной и масляных кислот на фоне силирующего агента (BSTFA), содержащегося в большом избытке.
Регистрацию хроматограммы проводили в режиме записи полного ионного тока с частотой 2,5 скана в секунду.
Полученные в результате ГХ-МС хроматограммы обрабатывали с помощью MetAlign, AIoutput, в результате чего получали матрицу данных. Затем данные загружали в пакет программ BioClassificator.py, который позволял проводить их обработку с помощью метода главных компонент (РСА), а также классификаторов- SVM (support vector machine), PLS-DA (Partial least squares Discriminant Analysis), Naive Bayes. Классификаторы SVM и PLS-DA строят разделяющую гиперплоскость в N-мерном пространстве концентраций веществ. Программы выполняют серию случайных экспериментов, которые заключаются в случайном разделении образцов каждого класса на тренировочные и тестовые, последующем построении классификатора каждым из методов по тренировочным и проверке его работы по тестовым образцам. В результате, строится ROC-кривая для каждого из методов, а также выводятся средняя точность и ее дисперсия.
В ходе исследования метаболома сыворотки крови здоровых добровольцев и пациентов с НАЖБП женского пола методом ГХ-МС были идентифицированы соединения, из них с помощью баз данных: NIST (National Institute of Standards and Technology); HMDB - (Human Metabolome Database); MassBank - (база данных с масс-спектрометрическими данными для органических соединений) и GOLM - (Golm Metabolome Database) - аннотировали 109 соединений. Среди низкомолекулярных соединений как у больных с различными формами НАЖБП так и у здоровых были выявлены индолкарбоновые и жирные кислоты, гипоксантин, гидроксикарбоновые и фенилкарбоновые кислоты. С помощью классификатора SVM (support vector machine) были выбраны соединения, разделяющих группы здоровых и пациентов с НАЖБП. Из них концентрации двух соединений, представителей карбоновых кислот достоверно значимо различались у пациентов и здоровых лиц по критерию Манна-Уитни (табл. 1).
Для визуализации различий в концентрациях этих соединений были построены графики Box-plots, в частности, на фиг. 1 представлен Box-plot для молочной кислоты и оксаниловой кислоты.
При проведении ROC анализа выявленные соединения показали высокую чувствительность - 80% и 100% специфичность. На фиг. 2 представлены ROC - кривые молочной кислоты, оксаниловой кислоты.
Данные результаты позволяют сделать вывод, что выявленные соединения могут служить в качестве диагностических маркеров НАСГ с высокой степенью надежности. Высокие значения AUC также указывают на возможность применения масс-спектрометрического анализа метаболома сыворотки крови для диагностики различных форм НАЖБП.
Концентрацию определенных карбоновых кислот в сыворотке крови с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии. При повышении концентрации молочной кислоты и снижении концентрации оксаниловой кислоты, которые показали площадь под ROC кривой (AUC) 0,90 (95% Ди = 0.62-0.99; чувствительность = 1.00, специфичность = 0.75; Р=0,02) для молочной кислоты и AUC 0,925 (95% Ди = 0.66-1.00; чувствительность = 0.80, специфичность = 1.00; Р = 0,023) для оксаниловой кислоты.
Данные показывают, что выявленные маркеры можно использовать как соединения-маркеры для диагностики различных форм неалкогольной жировой болезни печени.
В ходе экспериментальных исследований были изучены биохимические показатели двух групп пациентов: 1 группа - 10 женщин в возрасте от 18 до 65 л. с подтвержденным традиционными диагностическими методами стеотозом; 2 группа - 10 женщин в возрасте от 18 до 65 л. с подтвержденным НАСГ. У каждого пациента из обеих групп был произведен забор венозной крови, проведен хроматографический анализ, выявлены концентрации молочной и оксаниловой кислот, а также рассчитаны соотношения указанных кислот друг к другу. Результаты исследований приведены в таблице 2.
Дальнейшие экспериментальные исследования на расширенных группах пациентов (по 50 чел.) подтвердили, что у всех пациентов с соотношением концентрации молочной кислоты к концентрации оксаниловой кислоты 98/1 и меньше диагностирован стеатоз, а у всех пациентов с соотношением 324/1 и больше диагностирован НАСГ. При этом у пациентов, у которых соотношение находится в диапазоне от 99/1 до 324/1, может быть диагностирован и стеатоз, и НАСГ. Данный диапазон представляет собой серую зону и наличие значение внутри данного диапазона не позволяет поставить точный диагноз.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
У пациента забирают образец венозной крови. Затем образец крови подготавливают к хроматографии и проводят анализ, в ходе которого выявляют концентрацию молочной и оксаниловой кислот в образце. Затем выявляют соотношение молочной кислоты к оксаниловой. При соотношении концентрации молочной кислоты к оксаниловой кислоте 98/1 и меньше, пациенту ставят диагноз - стеатоз; при соотношении 325/1 и больше, пациенту ставят диагноз - неалкогольный стеатогепатит. При соотношении в диапазоне от 99/1 до 324/1 (серая зона), пациенту не ставят точный диагноз и проводят дополнительные диагностические мероприятия.
Заявляемое изобретение поясняется примерами.
Пример №1.
В 2016 г. в клинику обратилась пациентка Е., 45 лет, с жалобами на повышенную утомляемость, снижение работоспособности, периодические головные боли в затылочной и височных областях на фоне повышения артериального давления (АД), максимально до 180/105 мм рт.ст., чувство тяжести и ноющие боли в правом подреберье чаще после приема жирной и жареной пищи.
Из анамнеза заболевания: впервые подъемы АД стали беспокоить пациентку в 36 лет в период беременности, осложненной гестозом. В дальнейшем подъемы АД стали беспокоить пациентку более часто. Постоянной гипотензивной терапии не получала, самостоятельно эпизодически использовала короткодействующие препараты для купирования высокого АД.
2
2
2
Пациентка всегда имела избыточную массу тела: так, в 28 лет ее ИМТ=29 кг/м, в 33 года ИМТ=33 кг/м, на момент поступления в клинику ИМТ составлял 38 кг/м. Данную тенденцию можно связать с образом жизни и диетическими пристрастиями пациентки: она в чрезмерном количестве употребляла жирную пищу, мучное и сладкое, питалась часто в ресторанах фаст-фуда, не отрицая, что данные пищевые привычки были заложены в ее семье еще в детстве, кроме того пациентка проводит малоподвижный образ жизни, работает в офисе.
Употребление алкоголя отрицает.
Объективные данные: общее состояние удовлетворительное.
2
Тоны сердца ритмичные, приглушены. АД-180/95 мм рт.ст. Пульс - 72 ударов в минуту. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. ЧДЦ - 16 в минуту. SatO2=98%. Кожные покровы бледно-розового цвета. Периферических отеков нет. Рост -159 см, вес - 97 кг. ИМТ=38 кг/м. Антропометрические маркеры абдоминального типа ожирения: окружность талии (ОТ) - 111 см, окружность бедер (ОБ) - 118 см, соотношение ОТ/ОБ - 0,94.
Живот увеличен в объеме за счет выраженного подкожно-жирового слоя, безболезненный при пальпации во всех отделах. Печень выступает на 2 см от края реберной дуги по правой срединно-ключичной линии, край закруглен, поверхность гладкая, эластической консистенции. Абдоминальное ожирение и повышение АД свидетельствовали о наличии у пациентки МС.
По данным лабораторного обследования, были выявлены другие признаки метаболического синдрома: атерогенная дислипидемия с повышением уровня общего холестерина до 7,5 ммоль/л, гипертриглицеридемией до 2,8 ммоль/л, повышением уровня ЛПНП до 4,2 ммоль/л, снижением ЛПВП до 0,96 ммоль/л. Общее количество тромбоцитов в общеклиническом анализе крови составило 203×109/л.
Хроматографический анализ образца венозной крови пациентки согласно заявляемому способу показал наличие 3690 мкмоль/л молочной кислоты и 10 мкмоль/л оксаниловой кислоты, что соответствует соотношению 369/1. Исходя из этого, пациентке был поставлен диагноз неалкогольный стеатогепатит.
Был рассчитан индекс инсулинорезистентности: HOMA-IR рассчитывается по формуле: иммунореактивный инсулин натощак (мкМЕ/мл) × глюкоза крови натощак (ммоль/л) /22,5. У пациентки Е. значение индекса HOMA-IR=4,9 (норма - менее 2,7), что подтверждало наличие инсулинорезистентности.
Сывороточные трансаминазы составляли >2 ВГН: АЛТ - 83 ед/л, ACT - 77 ед/л, ГТТП - 51 МЕ/л, протромбиновый индекс - 89%, a-HCV, HBsAg - не обнаружены. С высокой степенью вероятности повышение ACT, АЛТ у данной пациентки указывает на неалкогольный стеатогепатит (НАСГ).
По данным УЗИ органов брюшной полости, у пациентки имелись не только проявления НАЖБП, но и поражение желчевыводящих путей: печень увеличена, паренхима гиперэхогенная, с выраженными явлениями стеатоза. Желчный пузырь: стенки не утолщены, уплотнены, в просвете густая желчь, по стенкам - единичные мелкие холестеромы.
На ЭКГ - ритм синусовый, ЧСС 68 ударов в минуту, косвенные признаки гипертрофии левого желудочка. При проведении ЭХО-КГ выявлены умеренная гипертрофия левого желудочка (толщина межжелудочковой перегородки и задней стенки левого желудочка -1,2 см), фракция выброса - 75%.
В качестве скрининга наличия стеатоза, активности воспаления и фиброза пациенту был проведен ФиброМакс. На фиг. 3 представлен результат ФиброМакса пациентки Е.
Выявлен стеатоз печени, степень стеатоза по результатам ФиброМакса составила S3 (результат: 0.91), что соответствовало выраженному стеатозу с поражением >66% гепатоцитов. По результатам оценки наличия воспалительного процесса (ActiTest), у пациента выявили А0-А1 (результат 0.22), что говорит о минимальной активности воспаления. Результаты фибротеста - 0.43, что соответствует стадии F1-F2 (по шкале METAVIR).
При оценке наличия фиброза печени по расчетным калькуляторам было выявлено: индекс APRI >1,0, что является показателем наличия фиброза; FIB-4 ->3,25 - соответствует фиброзу и NAFLD fibrosis score >0,675 - высокая вероятность выраженного фиброза (F3-4).
Пациентке была выполнена пункционная биопсия печени с последующей морфологической оценкой гепатобиоптатов (фиг. 4). Выраженность фиброза печени составила F3 (по шкале METAVIR), что соответствовало поражению зон 3 ацинусов с портальным фиброзом (фиг. 4, 5). Стеатоз составил 2 балла, что соответствует поражению 34-66% гепатоцитов. Лобулярное воспаление 2 балла, что соответствует 2-4 фокусам в поле зрения (наличие скоплений клеток воспалительного инфильтрата при увеличении х20) (фиг. 6, 7). Баллонная дистрофия при морфологической оценке составила также 2 балла, что можно расценить как умеренная или выраженная дистрофия. По результатам шкалы NAS-CRN для полуколичественной оценки тяжести и стадии НАЖБП индекс ≥5, что соответствует заключению: вероятный диагноз НАЖБП в форме стеатогепатита.
На фиг. 4 представлен снимок морфологического исследования с окраской гематоксилин-эозином х100., на котором наблюдаются следующие параметры: стеатогепатит, стеатоз 50%, гепатит умеренный, фиброз F3.
На фиг. 5 представлен снимок морфологического исследования на котором наблюдаются следующие параметры: стеатогепатит, стеатоз 90%, гепатит умеренный, фиброз F3.
На фиг. 6 представлен снимок, на котором наблюдаются следующие параметры: стеатогепатит, стеатоз, умеренный портальный и лобулярнй фиброз F3. Окраска Трихром по Массону х100.
На фиг. 7 представлен снимок морфологического исследования с ШИК-реакцией х100, на котором наблюдаются следующие параметры: стеатогепатит стеатоз 90%., умеренный фиброз.
При метаболомном исследовании сыворотки крови у пациентки было выявлено значимое снижение содержания оксаниловой кислоты - примерно в 4 раза, по сравнению с контрольной группой по нашим данным, что подтверждает диагноз НАСГ. Клинический диагноз был сформулирован следующим образом:
2
Неалкогольная жировая болезнь печени: стеатогепатит, минимальной биохимической степени активности. F1-2S3 (по данным ФиброТеста). F3S2 (по данным гепатобиопсии). Метаболический синдром. Ожирение II степени (ИМТ-38 кг/м). Инсулинорезистентность (НОМА-индекс - 4,9). Холестероз желчного пузыря. Гипертоническая болезнь II стадии, Артериальная гипертензия 2 степени, очень высокого риска ССО.
Пример 2.
В клинику с целью профилактического осмотра обратилась пациентка Ю., 54 лет. Жалоб на момент поступления не предъявляла.
Из анамнеза заболевания: пациентка длительное время не обследовалась, к врачам не обращалась. При оформлении на работу проходила плановый осмотр специалистов, где было впервые выявлено повышение печеночных проб (АЛТ, ACT, ГГГТ), по поводу чего было рекомендовано дообследование в условиях гастроэнтерологического отделения.
2
Пациентка с юного возраста страдала ожирением: на момент поступления в клинику ИМТ=33,2 кг/м. Данную тенденцию пациентка объяснила малоподвижным образом жизни, включая работу (10 лет работала на швейной фабрике), нездоровым питанием с пристрастиями употребления мучной пищи, газированные сладкие напитки, а также наследственная предрасположенность к ожирению. Употребление алкоголя отрицает.
Объективные данные: общее состояние удовлетворительное.
Тоны сердца ритмичные, ясные. АД-140/85 мм рт.ст. Пульс - 78 ударов в минуту. В легких дыхание жесткое, хрипы не выслушиваются. ЧДД - 17 в минуту. SatO2=99%. Кожные покровы физиологического цвета. Периферических отеков нет. Рост -182 см, вес - 110 кг. ИМТ=33,2 кг/м. Антропометрические маркеры абдоминального типа ожирения: окружность талии (ОТ) - 121 см, окружность бедер (ОБ) - 108 см, соотношение ОТ/ОБ 1,12.
Живот увеличен в объеме за счет выраженного подкожно-жирового слоя, безболезненный при пальпации во всех отделах. Печень по краю реберной дуги по правой срединно-ключичной линии, край закруглен, поверхность гладкая, эластической консистенции.
По данным лабораторного обследования, сывороточные трансаминазы составляли 1-2 ВГН: АЛТ-45 Ед/л, АСТ-36 Ед/л; повышение ГГТ до 314 МЕ/л, протромбиновый индекс - 89%, a-HCV, HBsAg - не обнаружены. С высокой степенью вероятности повышение ACT, АЛТ у данного пациента указывает на НАЖБП.
Хроматографический анализ образца венозной крови пациентки согласно заявляемому способу показал наличие 3689 мкмоль/л молочной кислоты и 39 мкмоль/л оксаниловой кислоты, что соответствует соотношению 96/1. Исходя из этого, пациентке был поставлен диагноз стеатоз печени.
Был рассчитан индекс инсулинорезистентности: HOMA-IR рассчитывается по формуле: иммунореактивный инсулин натощак (мкМЕ/мл) × глюкоза крови натощак (ммоль/л) /22,5. У пациентки значения индекса HOMA-IR составили 3,4 (норма - менее 2,7), что подтверждало наличие инсулинорезистентности.
По данным УЗИ органов брюшной полости, у пациента имелись проявления НАЖБП: зернистость, печень увеличена, паренхима гиперэхогенная, с выраженными явлениями стеатоза.
На ЭКГ - ритм синусовый, ЧСС 74 ударов в минуту, косвенные признаки гипертрофии левого желудочка (ЛЖ).
В качестве скрининга наличия стеатоза, активности воспаления и фиброза пациентке был выполнен ФиброМакс (фиг. 8). Выявлен стеатоз печени, степень стеатоза, по результатам ФиброМакса, составила S3 (результат: 0.91), что соответствовало выраженному стеатозу с поражением >32% гепатоцитов. По результатам оценки наличия воспалительного процесса (ActiTest) у пациента выявили А0-А1 (результат 0.20), что говорит о минимальной активности воспаления. Результаты фибротеста - 0.12, что соответствует стадии F0 - отсутствие фиброза (по шкале METAVIR).
При оценке наличия фиброза печени, по расчетным калькуляторам, было выявлено: индекс APRI<0,5, что является показателем отсутствия фиброза; FIB4<1,45 - соответствует отсутствию фиброза; значения NAFLD fibrosis score - менее -1.455, что указывает на отсутствие значительного фиброза.
Пациентке была выполнена пункционная биопсия печени с последующей морфологической оценкой гепатобиоптатов (фиг. 9-12). Стеатоз составил 2 балла, что соответствует поражению 34-66% гепатоцитов. Лобулярное воспаление - 1 балл, что соответствует поражению менее чем 2 фокусов в поле зрения (наличие скоплений клеток воспалительного инфильтрата при увеличении х20). Баллонная дистрофия при морфологической оценке у пациента отсутствовала (0 баллов). Кроме того, данных за фиброз получено не было. По результатам шкалы NAS-CRN для полуколичественной оценки тяжести и стадии НАЖБП индекс составил 2-3, что входит в «серую зону», что соответствует заключению: диагноз НАСГ маловероятен.
На фиг. 9 представлен снимок морфологического исследования с окраской гематоксилин-эозином х40. Крупнокапельный стеатоз печени 40%, без склероза.
На фиг. 10 представлен снимок морфологического исследования с окраской гематоксилин-эозином х200. Крупнокапельный стеатоз печени 40%, без склероза.
На фиг. 11 представлен снимок морфологического исследования с ШИК-реакцией с нормальным углеводным обменом и жировым гепатозом 40% (х100).
На фиг. 12 представлен снимок морфологического исследования с ШИК-реакцией с нормальным углеводным обменом и жировым гепатозом 40% (х200).
При метаболомном исследовании сыворотки крови у пациентки было выявлено значимое увеличение содержания молочной кислоты по сравнению с группой контроля, что подтверждает диагноз НАЖБП в форме стеатоза. Клинический диагноз был сформулирован следующим образом:
Неалкогольная жировая болезнь печени: стеатоз. F0A0S3 (по данным ФиброМакса). F0S2 (по данным гепатобиопсии). Ожирение I степени (ИМТ-33 кг/м2). Инсулинорезистентность (НОМА-индекс 3,4).
Заключение. Приведенные клинические случаи демонстрируют возможность применения и высокую чувствительность неинвазивных методов оценки некровоспалительной активности и стеатоза печени, в частности метаболомного профиля сыворотки крови у пациентов с НАЖБП.
Комбинированный подход позволяет повысить специфичность и чувствительность определения стеатоза, стеатогепатита и фиброза печени и возможность избежать проведения биопсии печени. Кроме того, приведенные клинические примеры доказывают высокую специфичность и чувствительность метаболомного анализа сыворотки крови для диагностики и дифферециальной диагностики различных форм НАЖБП.
Таким образом, при использовании заявляемого изобретения обеспечивается:
2
- расширение контингента обследуемых пациентов за счет пациентов с индексом массы тела более 30 кг/м, что в результате повысит достоверность исследования;
- расширение контингента пациентов за счет отсутствия ограничений пациентов по возрасту;
- расширение контингента пациентов за счет отсутствия ограничений для лиц перенесших трансплантацию печени;
- исследование может проводиться независимо от влияния различных факторов воздействия, в том числе вирусные поражения печени, аутоиммунные поражения, лекарственно-индуцированные, инфекционные заболевания, наследственные формы поражения печени;
- снижение вероятности неправильных результатов исследования, коррелирующих с клиническими данными;
- снижение стоимости исследования, что повышает комплаентность пациента к обследованию и соответственно оценки анализа в динамике на фоне терапии.
Список литературы:
1. Ивашкин, В.Т. Распространенность неалкогольной жировой болезни печени у пациентов амбулаторно-поликлинической практики в российской федерации: результаты исследования DIREG 2 / В.Т. Ивашкин, О.М. Драпкина, И.В. Маев [и др.] // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2015. - Т. 25, №6. - С. - 31-41.
2. Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Павлов Ч.С., Тихонов И.Н., Широкова Е.Н., Буеверов А.О., Драпкина О.М., Шульпекова Ю.О., Цуканов В.В., Маммаев С.Н, Маев И.В., Клинические рекомендации по диагностике и лечению неалкогольной жировой болезни печени Российского общества по изучению печени и Российской гастроэнтерологической ассоциации. // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2016; 26(2):24-42.
3. Бакулин, И.Г. Неинвазивные методы в диагностике неалкогольной жировой болезни печени / И.Г. Бакулин, М.П. Абациева // Медико-социальная экспертиза и реабилитация. - 2017. - Т. 20, №2. - С. 107-112. Doi: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9537-2017-20-2-107-112.
4. Бакулин, И.Г. Клиническое и медико-социальное значение НАЖБП через призму коморбидности / И.Г. Бакулин, М.П. Абациева, М.И. Скалинская [и др.] // Терапия. - 2019. - Т. 5, №6 (32). - С. 76-86.
5. Ардатская М.Д. Масляная кислота и инулин в клинической практике: теоретические аспекты и возможности клинического применения: [пособие] / [под ред. М.Д. Ардатской. - М.: Форте принт, 2014. - с. 64.
6. Бакулин, И.Г. Жирные кислоты сыворотки крови: возможности применения в диагностических целях при неалкогольной жировой болезни печени / И.Г. Бакулин, М.П. Абациева // Лечение и Профилактика. - 2017. - №3 (23). - С. 84-93.
7. Ардатская М.Д. Клиническое значение короткоцепочечных жирных кислот при патологии желудочно-кишечного тракта // Автореферат дисс.докт.мед.наук. - Москва. - 2003. 45 с.
8. Dasarathy S., Dasarathy J., Khiyami A., Joseph R. et al. Validity of real time ultrasound in the diagnosis of hepatic steatosis: a prospective study // J. Hepatol. 2009. Vol.51. N6. P. 1061-1067.
9. Yoneda M. Utility of contolled attenuation parameter measurement for assessing liver steatosis in Japanese patients with chronic liver disease // Hepatol. Res. 2013. Vol.43. N 11. P. 1125-1126.
10. European Association for Study of Liver; Asociacion Latinoamericana par el Estudio del Higado. EASL-ALEH Clinical Practice Guidelines: Non-invasive tests for evaluation of liver disease severity and prognosis // J. Hepatology. 2015. Vol.63. N 1. P. 237-264.
11. Бакулин, И.Г. Оценка стеатоза печени с помощью неинвазивного метода: миф или реальность? / И.Г. Бакулин, Ю.Г. Сандлер, В.А. Кейян [и др.] // Доктор.ру. - 2015. - №12(113). С. 57-64.
12. Драпкина, О.М. Современные подходы к диагностике и лечению неалкогольной жировой болезни печени / О.М. Драпкина, Т.А. Деева, Н.П. Волкова // Терапевтический архив. - 2014. - Т. 86, №10. - С. 116-123.
13. Simida, Y. Limitations of liver biopsy and non-invasive diagnostic tests for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease/ nonalcoholic steatohepatitis / 2014. - P. 475-485.