Спектроскопическое исследование комплексов Cu(II) с нативной ДНК

Спектроскопическое исследование комплексов Cu(II) с нативной ДНК

Карасев В.Е. (chemi@online.ru), Бабий А.П., Куликов А.П.

Институт химии ДВО РАН

В настоящее время уже не вызывает сомнений тот факт, что молекула ДНК является одной из главных клеточных мишеней повреждающего действия различных химических агентов и, в частности, соединений металлов.

Известно, что соединения меди (II) обладают мутагенным, канцерогенным и онкостатическим действием, которое связывают с их способностью взаимодействовать с молекулами ДНК [1]. Обнаружено, что комплексные соединения меди (II) в присутствии кислорода и восстанавливающих соединений обладают свойствами "химических" рестриктаз [2].

Несмотря на значительное количество работ посвященных исследованию взаимодействия меди (II) с нативной ДНК (нДНК), отмечается некоторая противоречивость полученных экспериментальных данных не только для комплексов меди (II) с нДНК, но даже и для комплексов меди (II) c отдельными нуклеотидами. Это является основной причиной того, что в настоящее время существуют несколько правдоподобных, но, тем не менее, противоречивых моделей строения комплексов меди (II) c ДНК [3-5]. Вместе с тем, в известной нам литературе, практически отсутствуют прямые структурные данные о строении и характере химической связи в образующихся комплексах меди (II) c нДНК [6,7].

Целью настоящей работы является изучение строения образующихся комплексов меди (II) c нДНК в растворах с различной ионной силой методами электронной, ЭПР и EXAFS спектроскопии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали следующие препараты: ДНК из морской звезды Asterias amurensis. Содержание в ДНК Г-Ц пар - 41%, белка не более 1%. Сохранность спиральной структуры подтверждена следующими показателями: Тпл = 85,30С, А Т = 11,00С, h = 39%, где Тпл - температура плавления, А Т - интервал плавления биополимера в 0,15 M NaCl, h - гипохромный эффект при термической деспирализации ДНК на длине волны 260 нм. В работе использовали соли натрия марки "ОСЧ". Полученные из карбоната меди соли CuCl2-2H2O, Cu(NO)2-3H2O и CuClO4-6H2O дважды перекристаллизовывали из

насыщенных водных растворов. Концентрацию меди (II) в растворах определяли атомно-абсорбционным методом на спектрофотометре АА-78 фирмы Nippon Jarrell Ash.

Инфракрасные спектры концентрированных водно-солевых растворов нДНК регистрировали на спектрометре Perkin-Elmer FI-IR, используя флюоритовые подложки.

Спектры ЭПР снимали на спектрометре JEX-3BC-X в трехсантиметровом диапазоне длин волн при 77K. Электронные спектры поглощения записывали на спектрометре Shimazu 3400. EXAFS спектры на пропускание K- краев поглощения атомов меди регистрировали на спектрометре, установленном на канале вывода синхротронного излучения ВЭПП-3. Обработку EXAFS - спектров выполняли согласно [8].

Комплекс I Cu(II) с нДНК получали смешиванием охлажденных растворов CuCl2 и нДНК, содержащими 0,001M NaCl. Навеску нДНК растворяли в 0,001М NaCl. Молярную концентрацию нДНК в концентрированных растворах биополимера контролировали определением фосфора в заданном объеме. К 10 мл раствора 0,042 М по фосфору нДНК приливали 10 мл 0,004 М CuCl2. Смесь осторожно перемешивали и выдерживали в течение 48 часов при 40С, затем 12 часов при 250С.

Аналогично получали комплекс II, в котором исходные растворы соли меди и биополимера содержали 0,25 М NaCl. Выбор величины ионной силы обусловлен тем, что согласно [9-10] в ~0,25 М растворе NaCl- основной формой существования иона меди (II) в растворе является ион [Cu(H2O)5 Cl]+.

Сохранность спиральной структуры в образующихся комплексах подтверждалась как ИК-спектрами в области колебаний сахарофосфатной цепи (в интервале 900-1250 см-1 наблюдались характерные для спиральной структуры биополимера полосы поглощения [11]), так и величинами Тпл которые для комплексов I и II равнялись 55,4 и 87,5 0С соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектры ЭПР всех полученных соединений Cu(II) и нДНК характерны для изолированных ионов меди (II) в кристаллических полях аксиальной симметрии (рис. 1). Они могут быть описаны спин-гамильтонианом (СГ), который для случая аксиальной симметрии имеет вид:

H = g Hz Sz + giP( Hx Sx + Hy Sy ) + A|| JzSz +A±(JxSx + JySy),

где S = 1/2; J=3/2

Строение и ближайшее координационное окружение образующегося в 0,001 M NaCl комплекса Cu

может свидетельствовать о замещении атома кислорода молекулы воды в первой координационной сфере меди (II) на атомы азота в плоскости металла (Табл.1). Сравнение спектров ЭПР комплекса I со спектрами меди (II) в фосфатном окружении свидетельствует о близости параметров СГ:

gil = 2,40 ~ 2,36; g! = 2,06 ~ 2,08; A = 132 ~ 108 э [13-15] и о возможности образования октаэдрического окружения только с донорными атомами кислорода фосфатной группы и молекул воды вокруг центрального атома в комплексе I.

А

I_I_I

0,25 0,30 0,35 Тл

Рис.1. Спектры ЭПР комплексов Cu(II)•нДНК при 77К: а) комплекс I; б) комплекс II.

Привлечение данных электронной спектроскопии (рис.2) позволяет получить дополнительные данные о строении ближайшей координационной сферы центрального атома в комплексе I. Положение максимума полосы поглощения ^макс = 722 нм d-d перехода иона С^П) в комплексе I свидетельствует об образовании вокруг центрального атома хромофорной группы (NO5) [16]. Для комплекса I проведено разложение электронного спектра на гауссовы компоненты по методике Яцимирского К.Б. и

Мальковой Т.В. [17]. Для комплекса I в электронном спектре выделили две полосы поглощения X = 722 и 936 нм.

б)

Рис.2. Электронные спектры комплексов Си(П)-нДНК:

а) комплекс I; б) комплекс II.

Анализ наблюдаемых полос поглощения проводился в соответствии со схемой уровней иона меди (II) в полях разной симметрии, в том числе и в поле вытянутой бипирамиды Б^ - наиболее стабильной конфигурации шестикоординированных комплексов меди (II) [18]. С учетом тетрагонально расщепленных для симметрии Б^ уровней 2Бё = 2Б1ё + 2 А1ё и 2Т2ё = 2Б2ё + 2Бё можно сделать следующее отнесение экспериментальных полос для комплекса I:

2А^ ^ 2Б^

22

Малая разница между энергиями Бё и Б1ё уровней комплекса I не позволила разложить полосу поглощения в области 700-850 нм на гауссовы компоненты и определить величину энергии перехода 2В2ё ^ 2Б1ё. Величина отношения частот

738 нм

поглощения в максимумах двух полос равная 1,29 говорит в пользу конфигурации тетрагональной бипирамиды.

Спектры ЭПР и параметры СГ комплексов I и II представлены на рис.1 и табл.1 и имеют значительное сходство, что может свидетельствовать об одинаковом строении ближайшей координационной сферы меди (II) - (№05). Так как при « 0,25 взаимодействие биополимера происходит с однозарядным ионом [Си(Н20)5С1]+, то не исключено образование комплекса хромофора (О5С1), имеющего весьма близкие параметры спин-гамильтониана (см. Табл. 1) [10]. В электронном спектре комплекса II наблюдается широкая полоса поглощения с ^макс 738 нм, что свидетельствует об образовании в комплексе II хромофорной группы (№05), так как ^макс для хромофорной группы (05С1) составляет 820 нм [9].

Табл.1.

Параметры СГ комплексов Си( II) с нДНК при 77 К.

комплекс I 2,360 139 2,07 0,856

комплекс II 2,359 139 2,06 0,844

комплекс П(№03-) 2,365 136 2,06 0,845

комплекс П(С104-) 2,362 140 2,06 0,850

[Си (Н20)б ]2+ 2,415 122 2,07 0,865

[Си (Н20)5 С1]+ 2,367 129 2,07 0,831

Для уточнения положения С1- иона в координационной сфере центрального атома комплекса II, нами получены комплексы II (№03-) и II (С104-), как описано ранее с использованием вместо СиС12-2Н20 и №С1 нитратов Си(№03)2 -3Н20 и №N0;? и перхлоратов Си(С104)2-6Н20 и ШС104 для комплекса П(№03-) и II (С104-) соответственно.

Электронные спектры комплексов II, П-(№03-) и П-(С104-) практически одинаковы, ^макс=738 нм. Широкая асимметричная полоса поглощения в видимой области спектра всех трех комплексов II является суммой близко лежащих полос d - d переходов, которую мы не смогли разложить на гауссовы компоненты. Это может свидетельствовать о том, что искажение октаэдрической симметрии в комплексах II невелико.

БХАББ спектры комплекса I нами были изучены ранее [12]. В табл.2 представлены данные о межатомных расстояниях в комплексах I и II.

Табл.2

Межатомные расстояния в комплексах меди (II) с нДНК

Соединение связь а, А

комплекс I Си - О 1,97

комплекс I Си - N 2,25

комплекс I Си - О акс. 2,61

комплекс II Си - О^ экв. 2,02

комплекс II Си - О акс. 2,56

комплекс II Си - Р 3,19

На рис.3 представлена кривая р(Я)| - модуль Фурье-преобразования радиальной структурной функции Х(К), описывающая радиальное распределения атомов (РРА) в комплексе II. Отсутствие существенных различий в кривых РРА для комплексов II, полученных в хлоридных, перхлоратных и нитратных растворах в интервале 1.8<Я<4 А позволяет исключить участие С1- иона в образовании как первой, так и второй координационной сферы центрального атома. Это согласуется с данными электронной и ЭПР-спектроскопии.

Несомненно, наиболее интенсивный пик РРА соответствует расстояниям медь(П) -экваториальные атомы кислорода и азота. Второй пик, расположенный на расстоянии 2,56 А соответствует расстоянию между центральным атомом и донорными атомами кислорода, находящимися в аксиальном положении. Следует отметить, что для комплекса II отмечается увеличение Яэкв и уменьшение Какс сравнительно с комплексом I. В комплексе II не обнаруживается характерное для комплекса I расстояние Кс^ = 2.25 А.

Для установления природы атомов окружающих Си(П) на расстоянии соответствующем третьему пику на |Р(Я)| при Я = 3,19 А, нами был использован методический прием, предложенный ранее [19]. Известно, что при смещении нижнего

предела интегрирования интервала радиальной структурной функции Х(К) в направлении увеличения значений волновых векторов (К) на р(Я)| быстро уменьшаются амплитуды максимумов, соответствующих расстояниям до легких атомов (в нашем случае, атомов азота и кислорода). При этом, амплитуды максимумов, соответствующих расстояниям до тяжелых атомов, изменяются незначительно. В нашем случае при увеличении нижнего предела интегрирования, амплитуды всех структурных максимумов, кроме указанного, уменьшились. Так как полученные нами данные позволяют исключить присутствие атома

Рис.3. Кривая радиального распределения атомов в комплексе II .

хлора вблизи Си(11), а соотношение Си(11): фосфат ДНК, в данном случае, равное 1:12, исключает возможность близкого расположения атомов меди, то единственно верным отнесением пика является расстояние Си-Р.

Данные БХАББ спектроскопии, полученные при исследовании комплекса Ca(II) ДНК в работе Скуратовского И.Я. и др. [20], дают близкие значения расстояния катион-фосфат Я С^Р 3,03 А.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что донорный атом кислорода фосфатной группы ДНК находится в плоскости центрального атома.

Нами проведена грубая оценка параметра ковалентности а2, характеризующего а -связь иона меди (II) с донорными атомами в х-у плоскости в комплексах Си(П) с нДНК. Величина а2 вычислена по формуле [ 21 ]:

а2 = А / Р + ( - 2,0023) + 3/7 ( ^ - 2,0023 ) + 0,04, где Р = 0,036 см-1 для комплексов меди (II).

Приведенные в Табл! данные свидетельствуют о преимущественно ионном характере связи в полученных комплексах Си(П) с нДНК. Таким образом, наши результаты дают основание полагать, что при взаимодействии иона Си(П) с нДНК в растворах с высокой ионной силой (д ~ 0,25) образуются октаэдрические комплексы только с донорными атомами азота и кислорода фосфатной группы и молекул воды. Полученные данные позволяют исключить участие С1- иона в образовании первых двух координационных сфер вокруг центрального атома в исследованных комплексах.

Ослабление связи N-Cu(II) в комплексе II, по сравнению с комплексом I, проявляется в низкочастотном сдвиге максимума поглощения в области d-d переходов комплекса II сравнительно с комплексом I.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акдокикашвили Э.Л.// Биофизика, 1987, т.23, с.782

2. Marshall L.E., Graham D.R., Reich K.A., Sigman D.S.// Biochemistry, 1981, V.20, №2, p.244-250.

3. Richard H., Scereiber J.B.// Biopolymers, 1973, V.12, №1, p.1.

4. Forster W., Bauer E., Shutz H. et. al.// Biopolymers, 1979, V.18, p.625.

5. Сорокин В. А.// Биофизика, 1994, т.39, в.6, с.393.

6. Благой Ю.П., Галкин В.Л., Гладченко Г.О. и др.// Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах. Киев: Наукова думка, 1991. 270с.

7. Sorokin V.A., Blagoi Yu.P., Valeev V.A. et. al.// J. Inorg. Biochem., 1987, v.30, №1, p.87.

8. Bauchspiess K.R.// A study of the pressure-induced mixed-valence transition in SmSe and SmS by x-ray absorption spectroscopy. Simon Fraser University, Aug. 1990, Ph.D. Thesis, 327 p.

9. Андреев С.Н., Сапожникова О.В.// Журн. неорг. химии, 1965, т.10, в.11, с.2538.

10. Вишневская Г.П., Каримова А.Ф.// сб. Радиоспектроскопия. М.:Наука, 1973, с.136.

11. Сухоруков Б.И., Козлова Л.А., Шабаргина Л.И.// Биофизика, 1974, т.19, в.6, с.963.

12. Kulikov A.P., Yuriev G.S., Babiy A.P.//Nucl. Instrum. & Meth. In Phys. Res., 1987, v.A261, p.185-186.

13. Вашман А.А., Верещагина Т.Я., Пронин Н.С.// Журн. структ. химии, 1970, т.11, №3, с.433.

14. Молочников Л.С., Ильичев С. А., Балакин С.М. и др.// Коорд. химия, 1988, т.14, в.10, с.1345.

15. Вишневская Г.П., Молочников Л.С., Сафин Р.Ш., Балакин С.М.// Высокомолекулярные соединения, 1982, т.24, №3, с.611.

16. Волченскова И.И.// Теор. и эксперим. химия, 1973, т.9, №5, с.627.

17. Спектроскопические методы в химии комплексных соединений (под ред. Вдовенко В.М.)// М.-Л., Химия, 1964.

18. Бальхаузен К.// Введение в теорию поля лигандов, М., Мир,1969.

19. Teo B.K.// EXAFS: basis principles and data analysis, Berlin, N-Y, Springer Verlag, 1986, p.349.

20. Skuratovskii I. Ya., Hasnain S.S., Alexeev D.G. et. al.// J. Inorg. Biochem., 1987, V.29, p.249.

21. Kivelson D., Neiman R.// J. Chem. Phys., 1961, V.45, p.149.