Способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями
METHOD FOR PRODUCING AND PURIFYING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE PRODUCED BY BIFIDOBACTERIA

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и биотехнологии.
Известно, что качественные и количественные изменения микрофлоры сопутствуют многим патологическим состояниям [1]. Фундаментальные и трансляционные исследования за последние два десятилетия совершили революцию в понимании роли микрофлоры кишечника в здоровье человека. Стало очевидным, что микробы-резиденты биополостей человека включаются в патофизиологию широкого диапазона заболеваний и состояний. Из этого, естественно, следует, что терапевтическая модификация микробиоты кишечника может обеспечить изменение развития и течения многих хронических заболеваний (сахарный диабет, ожирение, атеросклероз сосудов) и предупредить развитие некоторых форм рака. От состояния микробиоты зависит продолжительность жизни, репродуктивная функция человека, особенности протекания нейрофизиологических процессов, что, в конечном итоге, определяет поведение и успешность.
Известно, что онтогенез микрофлоры заканчивается формированием относительно стабильного микробиоценоза. Однако, изменение состояния окружающей среды, культуры питания, темпа жизни, появление новых технологий в пищевой промышленности, бесконтрольный прием антибиотиков – все это изменяет нашу микрофлору, что влечет за собой снижение иммунологической реактивности макроорганизма и увеличение заболеваемости населения в целом. Так же, изменение микробиоценозов является пусковым фактором старения. Существует два принципиальных подхода для сохранения эубиоза микрофлоры – это введение пробиотиков и трансплантация фекальной микробиоты – донорских или  аутоштаммов.
Предлагаемый подход в свете персонализованной медицины становится актуальным и востребованным. Возможно, человечество научится лечить еще немало заболеваний посредством управления микробиотой.
В заявляемом способе рассматривается выделение, накопление и селективная очистка веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.
В качестве источника получения бифидобактерий, могут быть использованы штаммы, выделенные от конкретного пациента и обладающие определенными биологическими свойствами и характеристиками.
Известен способ получения плазмидной ДНК микроорганизмов А.С. SU 1124033 [2]. Способ включает в себя лизис бактериальных клеток с использованием щелочного раствора додецилсульфата натрия. Использование щелочного раствора может негативно сказываться на нативных свойствах целевого компонента, а применение додецилсульфата натрия в некоторых случаях может потребовать дополнительной стадии очистки.
3
8
3
3
3
В качестве прототипа принят способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма RU 2 627 669. Для получения продуктов метаболизма по данному способу бифидобактерии выращивают во флаконах емкостью 400-500 смсо средой Блаурокка в течение 3-4 суток. Определяют концентрацию микробов со стандартизацией их количества до 1×10 КОЕ/см. Смесь бифидобактерий с продуктами их метаболизма в культуральной жидкости тщательно взбалтывают, переливают в центрифужные пробирки емкостью 50-100 см, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант декантируют, определяют содержание сухого вещества и доводят его физиологическим раствором до концентрации 10-15 мг/см, стерилизуют фильтрацией, разливают во флаконы и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С.
Однако данный способ предполагает использовать суммарный супернатант, содержащий компоненты питательной среды, и метаболиты, относящиеся к различным классам соединений. Это делает затруднительным использование веществ с разной биологической активностью, содержащихся в супернатантах бифидобактерий, а также возможность стандартизации как готового продукта, так и продукта в процессе хранения.
Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления биологически активных веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium.
Предлагаемый способ получения и очистки биологически активного вещества, продуцируемого бифидобактериями, может быть использован в фармакологических, бактериологических и биохимических исследованиях и заключается в следующем:
8
3
Вначале проводят накопление чистой культуры бифидобактерий с последующим разделением культуральной среды и бактериальной массы. Для этого выращивают культуру определенного вида бифидобактерий на жидкой Бифидум-среде (г. Оболенск). Культивирование проводят при 37 °C в течение 48 часов, что позволяет получить биомассу с содержанием бифидобактерий около 10 КОЕ/см. Затем биомассу переносят в стерильные центрифужные пробирки и осуществляют центрифугирование при 3 000-4 000 об/мин с последующим отделением бактериальной массы.
Трехкратную обработку супернатанта проводят при пониженных температурах (+4°С) избытком диметилкетона (ацетона х.ч.). Осадок отделяют, далее растворяют в буферном растворе и хроматографируют на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенная фракция олигомеров подвергается рехроматографии на аффинном сорбенте промышленного производства, например, Affi-Gel Protein A (Bio-Rad) или иные аффинные сорбенты с иммобилизоваными лектинами или гликопротеинами.
3
-1
-9
3
3
8
3
Пример 1. Выделен и идентифицирован по генетическим, морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам микроорганизм Bifidobacterium spp. штамм 74. Для накопления и выделения ДНК предварительно готовили жидкую Бифидум-среду (г. Оболенск), в которую затем помещали 1 колонию Bifidobacterium spp. Культивирование проводили при 37°C в течение 48 часов. Для определения количественного содержания бактерий в 1 см среды проводили титрование в стерильном физиологическом растворе от 10 до 10 КОЕ/см с последующим высевом по 0,1 см на плотную Бифидум-среду (г. Оболенск) и культивированием в анаэробных условиях. Количественные посевы показали, что содержание бифидобактерий в среде накопления составило около 10 КОЕ/ см. Затем биомассу переносили в стерильные центрифужные пробирки и центрифугировали при 3 000-4 000 об/мин, отделяя клеточную массу. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр. Далее к охлажденному до +4°С супернатанту, добавляли трехкратный объем диметилкетона (ацетона х.ч.) и оставляли на 24 часа в темном месте при +4°С. После чего проводили трехкратно отделение осадка с последующим растворением и переосаждением из диметилкетона. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе с рН = 7,2. В режиме колоночной хроматографии на хроматографе низкого давления BioLogic (BioRad) осуществляли эксклюзионную хроматографию на сефадексе (Sephadex) LH-20. Выделенную фракцию олигомеров обрабатывали аффинным сорбентом Affi-Gel Protein A в режиме бэтч-метода. Супернатанты подвергали лиофилизации.
3
Фармакологическое исследование проводили на 100 аутбредных крысах-самках массой 250-300 г. Все манипуляции осуществлялись в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Животных содержали в стандартных климатических условиях на стандартном рационе питания. Острый формалиновый отек вызывали субплантарным введением экзометаболитов (под подошвенный апоневроз) в заднюю правую лапу мыши 0,2 см 2% водного раствора формалина.
3
3
Все исследуемые образцы вводили принудительно через зонд в желудок. Предварительно дозу вещества разводили в 2-х см воды очищенной.  Интактному контролю животных и контролю с моделью острого иммобилизованного стресса вводили по 2 см воды очищенной.
Оценка влияния исследуемого образца на развитие острого воспаления показала выраженное уменьшение флогогенного действия формалина на животных основной группы под влиянием экзометаболита штамма № 74 Bifidobacterium spp. по сравнению с контрольной группой животных, получавших диклофенак натрия. Это говорит о высокой противовоспалительной активности данного штамма (U = 2,7; p = 0,001).
Заявленный технический результат характеризуется повышением эффективности разделения, селективной очистки, выделения и накопления веществ, продуцируемых представителями рода Bifidobacterium, который достигается за счет обработки супернатанта диметилкетоном, с последующей жидкостной хроматографией и применения сефадекса LH-20 и аффинного сорбента.
Источники информации
1. Шендеров, Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3. Пробиотики и функциональное питание / Б. А. Шендеров. – М.: Грантъ, 2001. – 288 с.
2. Пат. А.С. SU 1124033 СССР, (51) МПК. Способ получения плазмидной ДНК / Зилбере А. М., Шафранский А. Б., Хартмане Я. Я., Ансберга С. Э., Муйжниекс И. О., Камрадзе А. А.; Латвийский государственный университет им. П. Стучки. – заявка № 3555304; заявл. 16.02.1983; опубл. 15.11.1984. ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий. – [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet?DB=RUPAT&rn=283&DocNumber=1124033&TypeFile=pdf.
3. Пат. RU 2 627 669 (51) МПК А61К Способ получения продуктов метаболизма бифидобактерий для лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма и способ лечения комбинированного радиационно-термического поражения организма / Никитин А.И. (RU), Низамов Р.Н. (RU), Конюхов Г.В. (RU), Василевский Н. М. (RU), Тухфатуллов М. З. (RU), Шарифуллина Д.Т. (RU), Юнусов И.Р. (RU), Гайнутдинов  Т.Р. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») Заявка: 2016129773, 20.07.2016 Опубл.: 09.08.2017 Бюл. №22 Режим доступа: https://www.fips.ru/registers-doc-view/fips_servlet.