Диагностика бруцеллёза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Диагностика бруцеллёза методом полимеразной цепной реакции

К.Ж. Кушалиев, д.в.н., профессор, Р.Г. Зулхарнаева,

соискатель, Западно-Казахстанский АТУ; НА Сивоже-лезова, д.с.-х.н., профессор, Оренбургский ГАУ

Бруцеллёз животных широко распространён в Казахстане, наносит огромный ущерб животноводству и представляет большую угрозу здоровью людей.

Предотвращение эпизоотии позволяет поддерживать и развивать необходимые межхозяй-ственные, межрегиональные и государственные связи, а успешная борьба с болезнями животных, опасных для человека, обеспечивает охрану здоровья населения страны [1, 2].

Цель исследований — провести анализ на бруцеллёз методом ПЦР.

Объекты, методы и результаты исследований.

Работа выполнялась на базе НИИ (лаборатории биотехнологии инженерного профиля) ЗападноКазахстанского АТУ.

Использовали следующие реактивы и расходные материалы: агароза (ДиаэМ, Россия); бромид димидия (RT193993, ICN, США); бром феноловый синий (B5525, Sigma, Германия); ди-оксинуклеозидтрифосфаты — смесь dATP, dTTP, dCTP, dGTP (2 мм), R0241 (Ферментас, Литва; Сибэнзим, Россия); таq-полимераза (5 ед/мкл) (Синтол, Россия); тригидроксиметиламинометан (Трис, USB, Великобритания); этиловый спирт (Россия).

Применяли оборудование: автоматические дозаторы переменного объёма (0,1—20 м, 20—200 м,

200—1000 м); анализатор-термоциклир (ампли-фикатор) для детекции нуклеиновых кислот методом ПЦР iCycler IQ5; бокс абактериальной воздушной защиты БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2(01); бокс для проведения GWH работ UVC/T-M-AR; гельдокументирующая система Geldoc XR system PC; источник тока PowerPac basic; центрифуга Heraeus Pico 17.

Выделение ДНК проводили при помощи коммерческого набора «Амплисенс» «ДНК-сорб-Б». Вначале лизирующий раствор прогрели при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

К сыворотке крови животных добавили 300 мкл лизирующего раствора, тщательно перемешивали смесь на вортексе и прогревали 5 мин при температуре 65 °С, затем ещё раз перемешивали на вортексе. В каждую пробирку вносили 25 мкл суспензии сорбента, перемешивали и оставляли на 2 мин для осаждения сорбента. Затем повторно проводили перемешивание на вортексе и оставляли на 5 мин для осаждения сорбента. Сорбент осаждали на микроцентрифуге при 5 тыс. об./мин в течение 30 с и отбирали супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником. Вносили по 300 мкл раствора для отмывки № 1, тщательно перемешивали смесь на вортексе и вновь осаждали в прежнем режиме. Вносили по 500 мкл раствора для отмывки № 2, ресуспендировали на вортексе, осаждали микроцентрифугированием 10000 об./мин в течение 30 сек и удаляли супертанант. Повторяли процедуру отмывки раствором № 2. Элюцию проводили при помощи 50 мкл ТЕ-буфера. Качество выделения ДНК определяли при помощи метода электрофореза в агарозном геле.

При подключении к источнику тока отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от катода к аноду. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряжённость электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается плоскостными группами в молекулы ДНК [3, 4].

После окончания электрофореза, продолжающегося около 10—20 мин при напряжении тока 90—120 В, гель помещали в камеру трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254—310 нм).

Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передаётся на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм) [5].

Подбор праймеров осуществляли на основе имеющихся литературных данных по изучению

Brucella spp и данных секвенирования ДНК вакцин. В результате обработки литературных материалов были подобраны две пары праймеров для видового определения возбудителей заболевания бруцеллёза. На основе компьютерного анализа при помощи пакета программ Vector NTI проанализировали подобранные две пары праймеров. В результате анализа первая подобранная пара праймеров 24-1 (TGCAGCTCACGGATAATTTG) и 24-2 (ACACCTTGTCCACGCTCAC) строго специфична для B. abortus. Вторая пара 25-1 (ATCTGGTTCTTTCGGGTGTG) и 25-2 (CATCACCAAGAACCGTGTTG) - является маркерной для определения видов B. abortus, B. melitensis и B. suis. Праймеры были заказаны и синтезированы в компании «Бигль» (Санкт-Петербург).

Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции проведена с учётом имеющихся литературных данных по изучению Brucella spp и проведению ПЦР

Была разработана программа амплификации коллекции ДНК микроорганизмов рода Brucella, состоящая из 42 циклов. Она включает в себя несколько этапов: 1-й этап «денатурации» при 95 °С в течение 3 мин; 2-ой этап — «отжига» при 63 °С в течение 1 мин; 3-й этап — «элонгации», или «синтеза», при 72 °С в течение 1 мин.

Реакционная смесь состояла из следующих компонентов: праймеров по 0,1 мкл; буфера для проведения ПЦР реакции по 2,0 мкл; MgCl 1.5 M по 1,2 мкл; смеси дизоксинуклеотидтрифосфатов dNTP в количестве 0,4 мкл и тaq-полимераза по

0.4.мкл на реакцию.

В оптимизированную реакционную смесь мы добавляли по 1 мкл ДНК, полученной из сыворотки крови животных; по 0,1 мкл праймеров 24-1 (TGCAGCTCACGGATAATTTG) и 24-2 (ACACCTTGTCCACGCTCAC).

В результате исследования ПЦР-продуктов методом электрофореза в агарозном геле мы получили специфические отчётливые полосы, означавшие, что ДНК бруцеллы содержится в сыворотке крови животных.

Литература

1. Vierstraete Andy // Principle of the PCR. University of Ghent, March 2001.

2. Фёдоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади Мобархан А.Х. и др. Полимеразная цепная реакция (ПЦР): метод. пос. М., 1996. С. 33.

3. Сайдулдин Т.С., Уразбекова Д.С. Диагностика бруцеллеза крупного рогатого скота // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана. 2000. № 8. С. 37—39.

4. Wardeska B., Jaszczak K., Pierzchaza M., Parada R., Korczak M. Divergent selection for skeletal malformations in chickens alters polymorphism at microsatellite loci // J. Appl. Genet. 45(1). 2004. Pp. 61—71.

5. Wardeska B., Olszewski R., Jaszczak K., Zieba G., Pierzchaza M., Wicinska K. Relationship between microsatellite marker alleles on chromosomes 1-5 originating from the Rhode Island Red and Green-legged Partrigenous breeds and egg production and quality traits in F2 mapping population // J. Appl. Genet. 43(3). 2002. Pp. 319—329.