СПОСОБ ОТБОРА ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАССЧИТАННЫХ ЭНЕРГИЙ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ФЕРМЕНТАМИ ЦИКЛООКСИГЕНАЗ 1 И 2
METHOD OF SELECTING ANTI-INFLAMMATORY AGENTS USING CALCULATED ENERGIES OF INTERACTION WITH ENZYMES CYCLOOXYGENASE 1 AND 2

Изобретение относится к биологии и медицине и касается способа поиска новых противовоспалительных средств.
Известен способ отбора противовоспалительных средств из химических соединений, содержащих общий фармакофорный фрагмент: карбонил - фенильный радикал - вторичная или третичная аминогруппа, в котором все вещества разделены на четыре ряда: NH-замещенные антраниловые кислоты, ариламиды и гидразиды NH-алкенилантраниловых кислот, ариламиды N-ацетил-N-алкенилантраниловых кислот и аллиламиды NH-ацилантраниловых кислот [1]. Данный способ взят за прототип. Этот способ позволяет количественно определить уровень противовоспалительной активности на модели «каррагенинового отека» лапы крыс с помощью уравнений многопараметровой регрессии (четырех- и пятипараметровых).
эксп.
эксп.
Патентуемый способ заключается в прогнозе количественной оценки уровня экспериментального противовоспалительного действия ПВД (ПВД) с помощью многопараметровых (двух- и четырехпараметровых) уравнений зависимости ПВД от рассчитанных скоринговых функций - энергий взаимодействия с ферментами циклооксигеназ (ЦОГ) 1 и 2. Для достижения результата необходимо выполнить следующие действия:
I. Разбить 64 соединения из ряда производных антраниловой кислоты на гомологические ряды.
эксп.
II. Для данных соединений экспериментально определить ПВД (ПВД) на модели «каррагенинового отека» на крысах.
III. Рассчитать энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2 для каждого соединения.
рассч.
IV. Составить уравнения регрессии, по которым определить теоретически рассчитанную величину противовоспалительного действия (ПВД).
V. Используя полученные уравнения регрессии (табл. 7), по структурной формуле выбрать соединения, торможение отека которых превышает 30%.
рассч.
эксп.
VI. Оценить качество прогноза ПВД с ПВД.
Предлагаемая в способе последовательность действий над структурными формулами химических соединений, лабораторными животными и расчетными уравнениями позволяет получить технический результат - способ количественной прогнозной оценки уровня ПВД, который заключается в уменьшении затрат на синтез и сокращении числа химических соединений для испытания на биологическую активность.
эксп.
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ1
ЦОГ2
Патентуемый способ предусматривает изучение связи данных ПВД с рассчитанными параметрами: энергия связывания Be (Ве и Ве) и межмолекулярная энергия Ime (Ime и Ime) по ферментам ЦОГ 1 и 2. Расчет параметров проводили методом молекулярной стыковки (докинга) с помощью программы AutoDock 4, которая использует в качестве мишеней кристаллографические копии ферментов, полученные рентгеноструктурным анализом и представленные в виде pdb-файлов, взятых из базы данных Brookhaven Protein Data Bank: ЦОГ 1 (PDB ID code: 3N8X [2]) и ЦОГ 2: (PDB ID code: 1PXX [3]).
эксп.
Все исследуемые 64 соединения обладают различным уровнем противовоспалительного действия экспериментального (ПВД) (среди которых встречаются и запатентованные), разделены на три ряда:
1) N-замещенные антраниловые кислоты (табл. 1 и 2);
2) гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот (табл. 3 и 4);
3) ариламиды N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот (табл. 5 и 6).
эксп.
Исследование противовоспалительного действия ПВД выполнено на беспородных белых крысах массой 180-220 г на модели «каррагенинового отека» лапы. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 1 ч до введения каррагенина. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически по изменению объема воспаленной конечности через 4 ч после введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина [4].
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ1
ЦОГ2
Проведен расчет энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2 (Ве, Ве, Ime и Ime) для каждого соединения.
На основе полученных данных составляют уравнения многопараметровой регрессии для соединений по каждому ряду и выбирают наиболее значимое уравнение (табл. 7).
N-Замещенные антраниловые кислоты
эксп.
В таблице 1 для 22 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот приведены ПВД и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.
2
2
1
1
2
2
1
1
6
4
3
1
2
6
5
1
1
1
3
2
3
1
3
2
3
1
2
3
1
6
5
2
6
5
1
1
6
5
1
6
4
2
1
2
6
5
1
1
1
3
6
1
6
4
1
6
4
3
1
6
5
2
1
Х=Н, Y=Н, R=СНСН=СН, R=Н (1); Х=Н, Y=Н, R=Н, R=COCONHCHCH=CH (2); Х=Н, Y=Н, R=Н, R=СО (2-Фурил) (3); Х=Н, Y=Н, R=Н, R=СОСН(2-ОСН) (4); Х=Н, Y=Н, R=Н, R=СОСНСН (5); Х=Br, Y=Н, R=Н, R=CO-Ad (6); Х=Br, Y=Br, R=Н, R=CO-Ad (7); X=H, Y=H, R=H, R=COCH (8); X=H, Y=H, R=CHCH=CClCH, R=СОСН (9); X=H, Y=H, R=CHCH=CClCH, R=CO (2-Фурил) (10); X=H, Y=H, R=CHCH=CClCH, R=COCH (11); X=H, Y=H, R=CHCH, R=H (12); X=Br, Y=H, R=H, R=COCH (13); X=Br, Y=H, R=H, R=CO CH (3-NO) (14); X=Br, Y=H, R=H, R=COCHCH (15); X=Br, Y=H, R=H, R=CO (2-Фурил) (16); X=I, Y=H, R=H, R=COCH=CHCOOH (17); X=I, Y=H, R=H, R=CO(n-CHCl) (18); X=I, Y=H, R=H, R=COCH(4-Cl) (19); X=I, Y=H, R=H, R=COCH(4-CH) (20); X=I, Y=H, R=H, R=COCH(CH) (21); X=I, Y=H, R=H, R=СО(2-Фурил) (22).
ЦОГ1
ЦОГ2
LOO
2
Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено двухпараметровое уравнение 1 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД от таких параметров как энергия связывания по ферменту ЦОГ 1 (Ве)» и межмолекулярная энергия по ЦОГ 2 (Ime), имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):
рассч
ЦОГ1
ЦОГ2
ПВД = -1,315+6,661 × Ве - 9,129 × Ime
Уравнение 1 апробировано для теоретического расчета ПВД на 5 примерах соединений 23-27 из ряда N-замещенных антраниловых кислот (табл. 2).
1
6
4
2
2
3
1
2
6
5
2
3
1
6
4
2
1
6
4
1
6
5
Х=Н, Y=Н, R=Н, R=СО СН (4-NO) (23); Х=Н, Y=Н, R=СНСН=CClCH, R=СОСНСН (24); Х=Н, Y=Н, R=СНСН=CClCH, R=COCH(4-NO) (25); Х=Br, Y=Н, R=Н, R=СО СН (4-Br) (26); Х=I, Y=Н, R=Н, R=СОСН (27).
ЦОГ1
ЦОГ2
рассч.
эксп.
Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве и Ime, и на их основе было рассчитано ПВД, а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД.
рассч.
рассч.
эксп.
Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД) для 5 соединений показал, что целесообразно провести синтез 3 соединений: 24, 25 и 27, интервал ПВД которых будет лежать от 32,99% до 35,37%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД, которое составляет 46,85%, 41,90% и 37,35%, соответственно.
рассч.
эксп.
Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД):
ассч
эксп.
прогн.
ПВДр. = 0,28 × ПВД + 22,49; R = 0,948.
прогн.
рассч.
эксп.
Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R = 0,948), показывает очень высокую степень связи ПВД с ПВД.
Таким образом, уравнение 1 можно использовать для прогнозирования ПВД в ряду N-замещенных антраниловых кислот.
Гидразиды и амиды N-ацилантраниловых кислот
эксп.
В таблице 3 для 24 соединений из ряда гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот приведены ПВД и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.
1
2
5
2
2
5
1
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
5
2
1
2
5
2
2
2
1
2
2
2
2
3
3
1
3
2
2
1
3
2
3
1
3
2
2
2
1
3
2
2
2
3
2
1
3
2
2
6
5
1
2
2
2
1
2
2
2
2
1
2
2
1
2
4
2
2
1
3
2
2
2
1
2
2
6
5
1
3
2
2
1
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
6
5
2
2
6
5
Х=Н, Y=H, R-СООСН, R=NHNHCOCOOCH (1); Х=Н, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NHNH (2); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NHCHCH=CH (3); X=H, Y=H, R=COOH, R=NHCHCH=CH (4); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R = NH(CH)N(CH) (5); X=H, Y=H, R=COOCH, R=NHCHCH=CH (6); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NHCHC(CH) (7); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NHNH (8); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NHCH (9); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NHCHCHOH (10); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NH(CH)CH(CH) (11); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NHCHCH (12); X=H, Y=H, R=Ad, R=NHCHCH=CH (13); X=Br, Y=H, R=CHCHCOOH, R=NH (14); X=Br, Y=H, R=CH=CHCOOH, R=NH (15); X=Br, Y=H, R=CHCl, R=NH (16); X=Br, Y=H, R=C(CH)=CH, R=NH (17); X=Br, Y=H, R=CHCl, R=NHCH (18); X=Br, Y=H, R=CH, R=NH (19); X=Br, Y=H, R=CHCl, R=NH (20); X=Br, Y=H, R=CHCHCHCl, R=NH (21); X=Br, Y=H, R=CHCl, R=NHCHCH=CH (22); X=Br, Y=H, R=CHCHCl, R=NHCHCH=CH (23); X=I, Y=H, R=CHCH, R=NHCHCH (24).
ЦОГ1
ЦОГ2
LOO
2
Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено двухпараметровое уравнение 2 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД от таких параметров как энергия связывания по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве и Ве, имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):
рассч.
ЦОГ1
ЦОГ2
ПВД = -60,487-5,642 × Ве - 10,263 × Ве
Уравнение 2 апробировано для теоретического расчета ПВД на 7 примерах соединений 25-31 из ряда гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот (табл. 4).
1
2
5
2
6
11
1
2
2
2
2
2
3
2
1
3
2
2
2
1
2
6
5
2
6
5
1
2
2
2
2
1
2
2
2
2
2
1
2
2
2
2
6
5
Х=Н, Y=H, R=СООСН, R=NHCH (циклогексил) (25); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NH(CH)CH(CH) (26); X=Br, Y=Br, R=CH, R=NHCHCH=CH (27); X=Br, Y=H, R=CHCH, R=NHCH (28); X=H, Y=H, R=CHCl, R=NHCHCH=CH (29); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NHCHCHOH (30); X=H, Y=H, R=CONHCHCH=CH, R=NHCHCH (31).
ЦОГ1
ЦОГ2,
рассч.
эксп.
Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве и Ве и на их основе было рассчитано ПВД, а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД.
рассч.
рассч.
эксп.
Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД) для 7 соединений, показал, что экспериментально синтезировать целесообразно 6 соединений 25-30, интервал ПВД которых будет лежать от 35% до 64,20%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД, которое для соединений 25-30 составляет 32,4%, 35,60%, 33,10%, 44,45%, 39,85% и 39%, соответственно.
рассч.
эксп.
Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД):
рассч.
эксп.
прогн.
ПВД = 1,011 × ПВД + 8,788; R = 0,796.
прогн.
рассч.
эксп.
Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R = 0,796), показывает высокую степень связи ПВД с ПВД.
Таким образом, уравнение 2 можно использовать для прогнозирования ПВД ряду гидразидов и амидов N-ацилантраниловых кислот.
Ариламиды N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот
эксп.
В таблице 5 для 18 соединений из ряда ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот приведены ПВД и рассчитанные энергии взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2.
1
6
4
2
3
2
2
1
6
4
2
3
2
3
1
6
4
2
3
3
2
2
1
6
4
2
3
3
2
2
1
6
4
2
3
2
2
1
5
3
2
3
3
2
3
1
6
4
3
2
3
3
2
3
1
6
4
3
2
3
3
2
3
1
6
4
3
2
3
3
2
3
1
6
5
2
2
3
2
3
1
6
5
2
2
5
3
2
3
1
6
4
3
2
6
5
3
2
2
1
6
5
2
3
2
3
1
6
4
3
2
3
2
3
1
6
4
3
2
3
2
3
1
6
4
2
3
2
3
1
6
4
2
3
2
3
1
6
4
3
2
3
2
3
R=CH(4-Br), R=Ad, R=CHCH=CH (1); R=CH(4-Br), R=Ad, R=CHCH=CClCH (2); R=CH(4-Cl), R=CH, R=CHCH=CH (3); R=CH(4-Br), R=CH, R=CHCH=CH (4); R=CH(4-Br), R=2-фурил, R=CHCH=CH (5); R=CH(4-Br) 2-N, R=CH, R=CHCH=CClCH (6); R=CH(2-CH), R=CH, R=CHCH=CClCH (7); R=CH(4-CH), R=CH, R=CHCH=CClCH (8); R=CH(4-OCH), R=CH, R=CHCH=CClCH (9); R=CH, R=CHCl, R=CHCH=CClCH (10); R=CH, R=CH, R=CHCH=CClCH (11); R=CH(3-CH), R=CH, R=CHCH=CH (12); R=CH, R=2-фурил, R=CHCH=CClCH (13); R=CH(3-СН), R=H, R=CHCH=CClCH (14); R=CH(4-CH), R=H, R=CHCH=CClCH (15); R=CH(4-Br), R=H, R=CHCH=CClCH (16); R=CH(4-Cl), R=H, R=CHCH=CClCH (17); R=CH(4-OCH), R=H, R=CHCH=CClCH (18).
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ1
ЦОГ2
LOO
2
Затем методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, было составлено четырехпараметровое уравнение 3 (табл. 7). Установлено, что уравнение зависимости экспериментально определенного ПВД по ферментам ЦОГ 1 и 2 от таких параметров как энергия связывания (Ве и Ве) и межмолекулярная энергия (Ime и Ime), имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и критерия оценки методом перекрестного контроля исключением по одному (Q), и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S):
ассч.
ЦОГ1
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ2
ПВДр = -65,639 - 0,067 × Ве - 0,071 × Ime - 1,752 × Ве - 10,111 × Ime
Уравнение 3 апробировано для теоретического расчета ПВД на 6 примерах, соединениях 19-24 из ряда ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот (табл. 6).
1
6
4
2
6
4
3
3
2
2
1
6
4
2
3
3
2
3
1
6
5
2
3
3
2
3
1
6
4
3
2
3
3
2
3
1
6
4
3
2
3
2
3
1
6
4
3
2
2
3
2
2
R=СН(4-Br), R=СН(4-СН), R=СНСН=СН (19); R=CH(4-Br), R=СН, R=СНСН=CClCH (20); R=СН, R=СН, R=CHCH=CClCH (21); R=СН(3-СН), R=СН, R=СНСН=CClCH (22); R=СН(2-СН), R=Н, R=СНСН=CClCH (23); R=СН(3-СН), R=CHCl, R=СНСН=СН (24).
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ1
ЦОГ2
рассч.
эксп.
Вначале были проведены расчеты энергий взаимодействия по ферментам ЦОГ 1 и 2: Ве, Ве, Ime, Ime, и на их основе было рассчитано ПВД, а затем результаты расчетов были подтверждены экспериментально на лабораторных животных и определена ПВД.
рассч.
рассч.
эксп.
Расчет прогнозируемого ПВД (ПВД) для 6 соединений, показал, что экспериментально синтезировать целесообразно 5 соединений 20-24, интервал ПВД которых будет лежать от 37,10% до 52,81%. При исследовании на лабораторных животных определено ПВД, которое составляет 40,40%, 57,30%, 49,70%, 59,00% и 58,40%, соответственно.
рассч.
эксп.
Для оценки качества прогноза ПВД (ПВД) составлено линейное уравнение взаимосвязи с экспериментальными значениями ПВД (ПВД):
рассч.
эксп.
прогн.
ПВД = 0,518 × ПВД + 19,844; R = 0,865.
прогн.
рассч.
эксп.
Линейная зависимость уравнения с коэффициентом корреляции (R = 0,865), показывает высокую степень связи ПВД с ПВД.
Таким образом, уравнение 3 можно использовать для прогнозирования ПВД в ряду ариламидов N-ацил-N-алкенилантраниловых кислот.
2
LOO
Предлагаемый способ экономически выгоден и прост, так как позволяет по структурной формуле рассчитать энергии взаимодействия по ферментам циклооксигеназ 1 и 2, и с достаточно высокой достоверностью спрогнозировать уровень ПВД (по R 0,843÷0,920, F 18,01÷29,61, S 6,97÷9,84 по уравнениям 1-3 (табл. 7) и по методу перекрестной проверки исключением по одному (Q) 0,61÷0,74). В отличие от патента [1], где используются четырех- и пятипараметровые уравнения регрессии, выборки составлены на примерах от 8 до 9 соединений и апробированы по 1 соединению для каждого ряда, в данном способе предлагаются двухпараметровые уравнения 1 и 2 и четырехпараметровое уравнение 3, уравнения составлены на примере от 18 до 24 соединений в каждом ряду и апробированы на примере от 5 до 7 соединений. Описанный принцип отбора противовоспалительных средств можно использовать и для других рядов химических соединений.
Литература
1. Патент 2242754. Рос. Федерация. Способ отбора противовоспалительных средств / Коркодинова Л.М., Вахрин М.И., Данилов Ю.Л., Фешин В.П., Марданова Л.Г. №2003115080; заявл. 20.05.2003; опубл. 20.11.2004.
2. Sidhu R.S., Lee, J.Y., Yuan С.. Comparison of Cyclooxygenase-1 Crystal Structures: Cross-Talk between Monomers Comprising Cyclooxygenase-1 Homodimers. // Journal Biochemistry., 49: 7069-7079 (2010).
3. Rowlinson S.W., Kiefer J.R.. A Novel Mechanism of Cyclooxygenase-2 Inhibition Involving Interactions with Ser-530 and Tyr-385. // Journal Biol. Chem., 278: 45763-45769 (2003).
4. Тринус Ф.П., Клебанов Б.М., Кондратюк В.И. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. М., Минздрав СССР, с. 16 (1983).