Устройство для экспресс-анализа индекса биохимического потребления кислорода

Устройство для экспресс-анализа индекса биохимического потребления кислорода относится к области экологического мониторинга окружающей среды и может быть использовано для оценки состояния поверхностных вод и контроля процессов очистки сточной воды.
Так как продолжительность стандартного метода определения БПК составляет 5-10 суток [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.] интенсивно разрабатываются экспресс-анализаторы, в частности биосенсоры.
Известна модель устройства для экспресс-определения биохимического потребления кислорода, которая представляет собой кислородный электрод с иммобилизованными микроорганизмами [Арляпов В.А., Каманин С.С., Алферов С.В., Алферов В.А. Устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода. Патент РФ №106898 от 27.07.2011]. Устройство состоит из измерительной кюветы, магнитной мешалки и кислородного электрода с иммобилизованными дрожжами D. hansenii. Характерным признаком рассматриваемого устройства, совпадающими с существенными признаками заявляемого технического решения, является амперометрический способ измерения биохимического потребления кислорода с использованием клеток микроорганизмов. Существенными недостатками является использование кислородного электрода с высоким рабочим потенциалом (-0,7 В), что может стать причиной протекания побочных реакций с участием электроактивных примесей. К другим недостаткам следует отнести то, что электродная реакция зависит от рН.
5
Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода [Зайцева А.С., Юдина Н.Ю., Арляпов В.А., Пономарева О.Н., Алферов В.А. Устройство для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода. Патент РФ №164144 от 03 августа 2016]. Устройство содержит измерительную кювету с магнитной мешалкой, биосенсорную систему состоящую из двух электродов: хлорид серебряного электрода сравнения и рабочего угольно-пастового, модифицированного медиатором ферроценом, электрода с иммобилизованными дрожжевыми клетками Debaryomyces hansenii, дополнительно в измерительную кювету вводится раствор медиатора тионина. Устройство позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода (нижняя граница определяемых значений БПК составляет 4,6 мг/дм).
3
3
5
Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого устройства, является замена кислородного электрода на рабочий угольно-пастовый электрод с иммобилизованными клетками и использование медиаторов - соединений, осуществляющих перенос электронов от биоматериала на электрод. Рабочий потенциал, при котором происходит анализ индекса биохимического потребления кислорода, определяется окислительно-восстановительными свойствами используемых медиаторов. Недостатком данного устройства является высокая нижняя граница определяемых значений биохимического потребления кислорода 4,6 мг/дм, которая не позволяет исследовать воды, значение БПК которых не превышает ПДК (2-4 мг/дм), относящиеся к категории чистые [СанПиН 2.1.5.980-00. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22 июня 2000 г. - М., 2000].
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является расширение технологических возможностей, путем улучшения технических характеристик БПК-сенсора, в частности снижение нижней границы определяемых значений биохимического потребления кислорода.
Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода содержит измерительную кювету с раствором медиатора, магнитную мешалку, хлорид - серебряный электрод сравнения и рабочий угольно-пастовый электрод с иммобилизованным биоматериалом, причем в качестве иммобилизованного биоматериала взяты клетки Е. coli, а в качестве медиатора взят феррицианид калия.
5
Снижение нижней границы связано с заменой дрожжей D. hansenii на бактерии Е. coli. Клетки Е. coli являются прокариотами и в отличие от эукариотов D. hansenii характеризуются более простым строением, которое обуславливает доступность ферментативных систем для медиатора электронного транспорта, что, в свою очередь, повышает эффективность переноса электронов [Sayed Е.Т., Abdelkareem М.A. //Old Yeasts-New Questions. InTech, 2017.]. Поэтому при использовании клеток Е. coli необходим только один медиатор, вводимый в измерительную кювету, в отличие от принятого прототипа, в котором для эффективной работы биоэлектрода на основе дрожжей D. hansenii требуется дополнительная модификация рабочего электрода медиатором ферроценом, что значительно упрощает конструкцию заявляемого устройства. Кроме того, данные микроорганизмы присутствуют в природных и сточных водах, а также входят в состав инокулята в стандартном методе анализа [Galler Н. et al. //International journal of environmental research and public health. 2018. V. 15. I. 3. PP. 479.], что повышает чувствительность при определении БПК.
На фиг. изображена схема устройства определения индекса биохимического потребления кислорода. Заявляемое устройство состоит из следующих элементов: угольно-пастовый электрод (1) с иммобилизованными на поверхности клетками штамма Escherichia coli (2). Рабочий электрод и хлорид серебряный электрод сравнения (3) помещены в измерительную кювету объемом 4 мл (4). Перемешивание раствора с медиатором феррицианидом калия осуществляется с помощью магнитной мешалки (5).
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение характеристик устройства, в частности снижение нижней границы, что связано с использованием в качестве биоматериала клеток прокариот Е. coli. Кроме того, конструкция рабочего электрода упрощается, так как клетки Е. coli являются эффективными биокатализаторами и не требуют использования второго медиатора для участия в медиаторном биоэлектрокатализе.
При регистрации сигнала биосенсорной системы используют электрохимический преобразователь-потенциостат, регистрирующий зависимость силы тока от времени - IPC Micro, к которому подключаются электроды. Измерения проводят при постоянном потенциале 288 мВ.
Рабочий угольно-пастовый электрод готовят на основе графитовой пудры и минерального масла (из расчета 100 мг пудры на 40 мкл масла). Полученной пастой заполняют пластиковую трубку. Клетки микроорганизмов Е. coli наносят на поверхность рабочего электрода, для удерживания биоматериала применяют диализную мембрану, которая фиксируется с помощью пластикового кольца. Принцип работы устройства для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода заключается в следующем: измерения проводят в двухэлектродной системе, погруженной в измерительную кювету объемом 4 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буфер (рН=7,2). Рабочим электродом служит угольно-пастовый с иммобилизованными клетками бактерий Escherichia coli и электродом сравнения - насыщенный хлорид-серебряный электрод. Измерения проводят при непрерывном перемешивании раствора с медиатором феррицианидом калия, находящегося в измерительной кювете, с помощью магнитной мешалки (300 об/мин) при комнатной температуре.
3
3
2
После установления стабильного уровня тока в ячейку микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производят промывку ячейки калий-натрий-фосфатным буферным раствором. Скорость биоразложения органических субстратов рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение биохимического потребления кислорода по предварительно построенной с помощью модельного глюкозо-глутаматного раствора калибровочной кривой. В соответствии с ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97 значение биохимического потребления кислорода модельного раствора, содержащего суммарно 300 мг/дм глюкозы и глутаминовой кислоты (1:1), составляет 205 мгО/дм [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.].
2
3
Таким образом, заявляемое устройство для экспресс-анализа биохимического потребления кислорода не требует привлечения высококвалифицированного персонала и позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода за время менее 4 минут, при этом нижняя граница определяемых значений составляет 0,7 мг О/дм.
3
3
Техническим результатом заявляемого устройства заключается в улучшении технических характеристик, за счет снижения нижней границы 4,6 мг/дм (прототип) до 0,7 мг/дм(заявляемое техническое решение).