СПОСОБ И АВТОМАТИЗИРОВАННОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СЕПСИСА, ВЫЗВАННОГО БАКТЕРИЯМИ, СОДЕРЖАЩИМИ ГЕН NDM-1
METHOD AND AUTOMATIC DEVICE FOR DIAGNOSTICS OF SEPSIS, CAUSED BY BACTERIA, WHICH CONTAIN GENE NDM-1

Изобретение относится к медицинской технике и может быть использовано в люминесцентной диагностике сепсиса, вызванного или отягощенного бактериями, содержащими ген NDM-1.
Появление бактерий с геном NDM-1, способных расщеплять все существующие антибиотики и потому практически неуязвимой, вызвало тревогу медиков разных стран.
Сложность борьбы с этими микроорганизмами обусловлена активными миграционными процессами. Тесная мировая экономическая интеграция привела к увеличению интенсивности грузовых и людских перевозок, что определяет возможность быстрого распространения возбудителя на территории разных стран и континентов. Кроме того, данные гены, как правило, характеризуются большей устойчивостью к существующим средствам защиты и способностью к мутации. В 2009 г. в странах Евросоюза умерли более 25 тыс. пациентов из-за инфекций, вызванных бактериями, устойчивыми к множеству существующих лекарств. Чем совершеннее становятся антибактериальные препараты, тем более совершенные методы защиты от них вырабатывают бактерии. По оценкам экспертов, количество жертв устойчивости к антибиотикам в России существенно превосходит аналогичные показатели смертности от атипичной пневмонии, птичьего гриппа и вирусных лихорадок. В 2010 г. в Свердловской области несколько детей умерли от, казалось бы, банального гнойно-септического заболевания. Микробы оказались резистентны к антибиотикам и детей просто нечем было лечить. От сепсиса погибает людей больше, чем от ишемической болезни сердца.
Поэтому возникла проблема ранней и моментальной диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1. ВОЗ в 2010 г. сообщила, что пока у экспертов ВОЗ еще слишком мало данных о новых супербактериях (как стали называть бактерии, содержащие ген NDM-1), однако планируется проведение тщательных исследований на сей счет. В настоящее время исследования бактерий, содержащих ген NDM-1, ведутся, в основном, микробиологами Великобритании, Канады, США, России, Финляндии, Бельгии, Нидерландов, Австралии и других стран.
Ближайшим аналогом для заявленного способа и устройства для диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1, является способ и комплект средств для обнаружения ряда бактерий, в том числе NDM-1 (US 20120129180 A1, 24.05.2012), заключающийся в отборе биологических образцов и проведении ряда микробиологических исследований. Эти исследования (достаточно универсальные, так как кроме бактерии NDM-1 обнаруживают более десятка других бактерии) не автоматизированы и результаты этих исследований получаются в течение около суток. Между тем за каждые сутки сепсис, не получая должного отпора, переходит в более тяжелую фазу.
Целью настоящего изобретения является оперативное определение (в режиме реального времени) заражения бактериями, содержащими ген NDM-1, крови больного (сепсиса), резистентного хотя бы к одному антибиотику.
Поставленная цель достигается предлагаемыми способом и устройством. При этом заявляемый способ диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1, включает воздействие ультрафиолетовым зондирующим излучением на образцы с бактериями, содержащими ген NDM-1, и исследуемые образцы мазков крови больного, последующий анализ вторичного флуоресцентного свечения, причем предварительно многократно измеряют совокупности значений уровней спектральных составляющих вторичного флуоресцентного свечения от калибровочных образцов с бактериями, содержащими ген NDM-1 (патология), образцов мазков крови, не инфицированной бактериями, содержащими ген NDM-1 (норма), определяют совокупности полученных значений уровней спектральных составляющих по патологии и норме в качестве диагностических критериев, при каждом исследовании образцов мазков крови больного в режиме реального времени аналогично многократно измеряют совокупность значений уровней спектральных составляющих вторичного флуоресцентного свечения, полученную совокупность значений уровней спектральных составляющих вторичного флуоресцентного свечения в качестве спектрального образа поочередно сопоставляют с предварительно полученными диагностическими критериями нормы и патологии, находят наибольшее приближение к одному из диагностических критериев, которое и определяет диагноз.
Для осуществления предлагаемого способа автоматизированное устройство для диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1, содержит модуль фиксации исследуемых образцов двух типов с возможностью их поочередной смены, причем первый тип образцов представляет собой стандартные стеклянные пластинки с мазками достоверно не инфицированной бактериями NDM-1 крови, второй тип образцов выполнен в виде стандартных стеклянных пластинок с мазками крови обследуемого больного; две группы оптических волокон, конструктивно оформленные в виде оптоволоконного жгута, в котором уложены волокна первой и второй групп, общий для волокон обеих групп дистальный торец которого через входное окно модуля фиксации исследуемых образцов оптически связан с поверхностью установленного в модуле исследуемого образца, группу управляемых источников оптических воздействий, спектрометр, персональную ЭВМ, информационный выход которой является информационным выходом устройства, первый управляющий выход персональной ЭВМ подключен к входу запуска группы управляемых источников оптических воздействий, выходы которой оптически связаны с входами первой группы оптических волокон, выходы которых являются оптическими выходами устройства, входы второй группы оптических волокон являются оптическими входами устройства, выходы оптических волокон второй группы подключены к оптическому входу спектрометра, информационные выходы которого через USB-порт подключены к информационным входам персональной ЭВМ, второй управляющий выход которой подключен к входу запуска спектрометра, причем на внешней боковой поверхности волокон второй группы нанесены металлизированные нанопокрытия.
На фиг.1 дана схема предлагаемого устройства.
j
Автоматизированное устройство для диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1, содержит модуль 1 фиксации исследуемых образцов двух типов с возможностью их поочередной смены, две группы оптических волокон 6 и 7, конструктивно оформленные в виде оптоволоконного жгута (ОВЖ), в котором уложены волокна первой 6 и второй 7 групп, группу 2 управляемых источников оптических воздействий, спектрометр 3 и персональную ЭВМ 4. Общий для волокон 6 и 7 дистальный торец ОВЖ через входное окно модуля 1 фиксации исследуемых образцов оптически связан с поверхностью установленного в модуле 1 исследуемого образца 5. Информационный выход персональной ЭВМ 4 является информационным выходом устройства. Первый управляющий выход персональной ЭВМ 4 подключен к входу запуска группы 2 управляемых источников оптических воздействий, выходы которой оптически связаны с входами первой 6 группы оптических волокон, выходы которых являются оптическими выходами устройства, входы второй 7 группы оптических волокон являются оптическими входами устройства. Выходы оптических волокон второй 7 группы подключены к оптическому входу спектрометра 3, информационные выходы которого через USB-порт подключены к информационным входам персональной ЭВМ 4, второй управляющий выход которой подключен к входу запуска спектрометра 3. Для увеличения помехозащищенности устройства от изменения освещенности в медицинском кабинете на внешней боковой поверхности оптических волокон 7 второй группы нанесены металлизированные нанопокрытия.
1
2
1
2
Для оперативной проверки работоспособности устройства в модуль 1 можно поочередно вставлять различные исследуемые образцы 5, 5. Первый тип образцов 5 представляет собой стандартные стеклянные пластинки с мазками достоверно не инфицированной бактериями NDM-1 крови. Второй тип образцов 5 представляет собой стандартные стеклянные пластинки с мазками крови исследуемого больного. Управляемые источники 2 оптических воздействий предназначены для формирования излучения в ультрафиолетовом, видимом, инфракрасном диапазоне длин волн, а параметры излучения (например, интенсивность излучения, спектр, доза облучения, продолжительность сеанса) задаются от персональной ЭВМ 4.
В группе управляемых источников 2 оптических воздействий могут быть использованы, например, ультрафиолетовый излучатель, инфракрасные полупроводниковые диоды, светодиоды красного, синего цвета и другие управляемые серийные источники излучения. Управление интенсивностью источников производится путем изменения управляющих воздействий (для лазерных диодов, светодиодов - изменение значения тока питания, для импульсных источников с нерегулируемой амплитудой - путем изменения частоты и скважности импульсов светового излучения).
2
2
2
В режиме диагностики в модуле 1 помещается исследуемый образец 5 с мазками крови исследуемого больного. После этого дистальный торец ОВЖ (в котором уложены волокна первой 6 и второй 7 групп) вводится во входное окно модуля 1. К волокнам первой группы 6 подключен выход группы источников 2 оптических воздействий, а к волокнам 7 второй группы - волоконный вход спектрометра 3. Дистальный торец ОВЖ (с излучающими торцами первой группы волокон 6 и приемными торцами второй группы волокон 7) устанавливается в непосредственной близости от обследуемого образца 5. Зондирующее излучение от источника 2 поступает на исследуемый участок поверхности образца 5, где возникает вторичное флуоресцентное свечение.
2
Сигналы вторичного флуоресцентного свечения, возбуждаемые на обследуемой поверхности образца 5 под воздействием зондирующего излучения из волокон 6, через волокна второй группы 7 поступают на входы спектрометра 3. Распределения интенсивностей (уровней) спектральных составляющих вторичного флуоресцентного свечения от патологической (инфицированной бактериями, содержащими ген NDM-1) и не инфицированной (норма) образцов крови различаются. Коды уровней спектральных составляющих в привязке к кодам длин волн с информационных выходов спектрометра 3 поступают на информационные входы персональной ЭВМ 4.
Принцип формирования диагностических сигналов и алгоритм работы ЭВМ в этом режиме состоит в следующем.
Весь диапазон длин волн вторичного флуоресцентного свечения разбивается на дискретные участки, определяемые разрешающей способностью спектрометра 3.
Ранее в результате многократных зондирующих облучений калибровочных образцов 5 (с бактериями содержащих ген NDM-1, полученных от ВОЗ), и образцов крови, достоверно не инфицированных бактериями (норма), получают характерные устойчивые сочетания уровней сигналов вторичного флуоресцентного свечения (спектральные образы) для патологии и для нормы - диагностические критерии. Ансамбли калибровочных спектральных образов нормы патологии занесены в соответствующие базы данных персональной ЭВМ 4. При этом ансамбли калибровочных спектральных образов для бактерий, содержащих ген NDM-1, и нормы различны и соответствуют выражению:
где J - вид состояния, которому соответствует диагностический критерий (1 - здоровая кровь (не пораженная бактериями), 2 - кровь, инфицированная бактериями, содержащими гены NDM-1).
0
В результате сравнения полученных спектральных образов от обследуемой крови больного Pотн (λí) со спектральными образами диагностических критериев Pотн j (λí), например, по методу наименьших квадратов формируется оценка наиболее вероятностного состояния крови больного по соотношению:
где n - число дискретных участков длин волн (определяемое разрешающей способностью спектрометра); которая выдается на экран монитора.
2
По минимальному значению Rj принимается автоматически решение о состоянии образца исследуемой крови 5 (инфицированной бактериями, содержащими гены NDM-1, - (патология) или нет (норма)).
Соотношения (1) и (2) являются алгоритмом работы персональной ЭВМ 4, в которой есть базы данных калибровочных спектральных образов (нормы и патологии).
При помощи персональной ЭВМ 4 также осуществляется управление запуском определенного излучателя источника 2 и запуском спектрометра 3 на измерение.
Для обеспечения измерения в информативный период времени после подачи зондирующего сигнала производится запуск цикла измерений по управляющим воздействиям от персональной ЭВМ 4.
Сигналы на первом и втором управляющих выходах персональной ЭВМ 4 представляют одну и ту же последовательность импульсов, задержанных относительно другой последовательности на величину срабатывания элементов, на которые подаются сигналы предыдущей последовательности.
Первым сигналом на первом управляющем выходе ЭВМ 4 является сигнал запуска выбранного источника 2. С заданной и программируемой задержкой (определяемой задержкой появления вторичной флуоресценции) по отношению к моменту запуска источника 2 эта же последовательность поступает на вход запуска спектрометра 3 (со второго управляющего выхода персональной ЭВМ 4). Информация с выходов спектрометра 3 поступает на информационные входы персональной ЭВМ 4. Результаты диагноза по выражениям (1) и (2) выдаются на дисплей персональной ЭВМ и могут быть выведены на печать в виде диагностического заключения.
В качестве спектрометра 3 можно использовать, например, российский миниспектрометр FSD-03-08, монолитная конструкция которого включает волоконный вход, вогнутую дифракционную решетку, высокочувствительную фотодиодную линейку, 14-разрядный аналого-цифровой преобразователь. Миниспектрометр FSD-03-08 имеет спектральную разрешающую способность 10 нм (при самой высокой чувствительности) в диапазоне длин волн от 300 до 800 нм. Обмен информацией между спектрометром и персональной ЭВМ осуществляется через стандартный порт USB.
В качестве персональной ЭВМ 4 может быть использована любая IBM совместимая персональная ЭВМ (или ноутбук) отечественного или зарубежного производства. В персональной ЭВМ обеспечивается ввод идентификационных данных пациентов, автоматическая обработка и регистрация результатов обследований, ведение баз данных по результатам обследований, баз данных калибровочных спектральных образов (нормы и патологии), а также конструкторской и эксплуатационной документации устройства (с электронными подсказками обслуживающему персоналу).
1
2
В тех случаях, когда мал уровень вторичного флуоресцентного свечения от обследуемой поверхности, и есть вероятность, что имеет место дефект в оптоэлектронных трактах, поочередное помещение в модуле 1 образцов 5 и 5 и введении ОВЖ в окно модуля 1 дистального торца ОВЖ (в котором уложены приемные оптические волокна 6 второй группы и излучающие оптические волокна 7 первой группы) позволяет (при исправной работе устройства) зафиксировать поочередно диагноз «норма» и «патология». Таким образом обеспечивается оперативная проверка работоспособности устройства в широком динамическом диапазоне.
Введение спектрометра позволило повысить разрешающую способность анализа сигналов вторичного флуоресцентного свечения во всем диапазоне длин волн.
Введение металлизированных нанопокрытий на внешней поверхности волокон второй группы позволило повысить помехозащищенность устройства (устранить реагирование на изменения освещенности в медицинском кабинете). Диагностическое зондирующее ультрафиолетовое излучение угнетает бактерии, содержащие ген NDM-1, и обладает некоторым терапевтическим воздействием.
Основным техническим результатом, достигаемым при использовании заявленной группы изобретений, является оперативное определение (в режиме реального времени) заражения крови больного бактериями, содержащими ген NDM-1 и резистентными к антибиотикам. После введения ОВЖ в модуль фиксации исследуемых образцов результаты диагностики автоматически получаются в течение нескольких миллисекунд.
Полученный мультипликативный эффект не является простой суммой эффектов от вновь введенных составных частей группы изобретений, а является результатом их совместной работы по единой методике, рассмотренной ранее.
Применение предложенных способа и автоматизированного устройства для диагностики сепсиса, вызванного бактериями, содержащими ген NDM-1 позволит снизить смертность среди населения, своевременно начать лечение этой опасной разновидности заболеваний, резистентной к современным антибиотикам (например, с помощью соответствующих бактериофагов, ибо разработка и испытания новых мощных и эффективных антибиотиков для данного случая займет несколько лет и будет стоить около 1 миллиарда евро).
Литература
1. Yong D, Toleman М F Characterrisation of new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1 (fnd a novell erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsisella pneumoniae sequence type 14 from India "Antimicrob Agents Chemother. 2007 53(12): 5046-5054".
2. Queenan A M, Bush K. Carbapenemases: the versatile beta Lactamases, Clinical Microbiology Reviews, 2007 20(3), 440-458.
3. Poirel L., Pitout J D, Nordman P. Carbapenemases: molecular diversity and consequences, Future Microbiol., 2007 2(5), 501-512.
4. Giske С G, Redefining extended - spectrum {beta} - lactamases: balancing science and clinical need. J. Antimicrob. Chemother. 2009 63(1), 1-4. Epub 2008 Oct 28.