СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОГО МАРКИРОВАНИЯ, ОСНОВАННЫЙ НА МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСАХ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАСПОРТИЗАЦИИ СЕЛЕКЦИОННЫХ ДОСТИЖЕНИЙ РАСТЕНИЙ РОДА RUBUS
METHOD FOR MOLECULAR LABELLING, BASED ON MICROSATELLITE LOCI, INTENDED FOR GENETIC CERTIFICATION OF PLANT VARIETY OF RUBUS GENUS PLANTS

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики растений, в частности, к способу молекулярно-генетической паспортизации сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов на основе генетических маркеров - микросателлитных локусов. Изобретение позволяет осуществлять надежную и достоверную паспортизацию различных сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов на индивидуальном сортовом уровне и может быть использовано для широкого спектра сортов малины и ежевики и их гибридов, являясь, таким образом, универсальным.
-4
-15
Микросателлитные локусы представляют собой участки дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащие простые короткие тандемно повторяющиеся моно-, ди-, три-, тетра- или пентануклеотидные (нуклеотид - элементарная «буква» в генетическом коде организма) мотивы, которые локализованы в геномах большинства видов эукариот. Отсюда их альтернативные названия - локусы с простыми повторами последовательностей (SSR, от английского Simple Sequence Repeat) или короткие тандемные повторы (STR, от английского Short Tandem Repeats). Микросателлитные маркеры наилучшим образом подходят для паспортизации и дискриминации (различения) индивидуальных генотипов, поскольку содержат большое число аллелей (у растений до 10-20 и более на локус) и возможность использовать наборы локусов позволяет получать уникальные генетические «портреты» особей с крайне низкой вероятностью случайного повторения (от 10 до <10 в зависимости от числа локусов и аллелей) (Brown et al., In methods of genome analysis in plants, Ed. P.P. Jauhar, N.-Y., London, Tokyo, 1996, P. 147-159).
В качестве экономических преимуществ использования микросателлитных маркеров можно отметить, что их анализ, основанный на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), не требует высокого количества и качества матричной ДНК (10-100 нг на реакцию). Благодаря использованию специфических длинных ПЦР-праймеров достигается высокая воспроизводимость результатов микросателлитного анализа. При дальнейшем совершенствовании технологии возможно увеличение производительности анализа путем применения мультиплексных реакций (амплификация нескольких локусов с меченными флуоресцентными метками праймерами в одной пробирке) и автоматизации скрининга.
На данный момент для паспортизации малины и ежевики существует лишь одно запатентованное техническое решение № RU 2620967 «Паспортизация сортов малины и ежевики и изучение их филогенетических взаимоотношений методом RAPD-анализа», однако, в настоящий момент RAPD-анализ не рассматривается как точный, дающий возможность проводить паспортизацию, так как основан на использовании единичного короткого, обычно, 10-членного праймера, с произвольной нуклеотидной последовательностью (Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers» // Nucleic Acids Research, 1990, 18(22): 6531-6535). Паспортизация малины предложена с использованием фрагментов ДНК разного размера (ISSR) Соболевым В.В. с соавторами (Соболев В.В., Карлов Г.И., Соболева А.Г., Озеровский А.В., Казаков И.В., Феськов А.А. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины// Сельскохозяйственная биология, - 2006, - Т. 5, - С. 48-53), однако указанный способ основан на использовании ISSR - маркеров, относящихся к мультилокусным маркерам, которые, как правило, имеют неизвестную локализацию в хромосоме и используются для исследования генетического разнообразия, а также для филогенетических исследований (Хлесткина, Вавиловский журнал генетики и селекции, 2013, Т. 17, №4, С. 1044-1054), но для паспортизации сортов является не совсем точным и подходящим. Патенты на паспортизацию малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов с использованием молекулярного маркирования, основанного на использовании микросателлитных локусов (SSR-анализ) отсутствует. Есть работы по определению родства с использованием SSR-анализа, наиболее близкая к нашему изобретению статья Marulanda M.L., Lopez A.M., Uribe M. Genetic Diversity and Transferability of Rubus Microsatellite Markers to South American Rubus Species // The Molecular Basis of Plant Genetic Diversity, - 2012, - P. 151-164. Однако представленная система SSR-анализа Marulanda M.L. и др. используется для определения родства, а не паспортизации растений. В предложенном нами способе паспортизации в основу легло использование монолокусных SSR- маркеров, что позволяет осуществлять паспортизацию сортов на индивидуальном уровне. Кроме того нет необходимости в методе секвенирования, что делает наш способ также экономически более выгодным.
Целью предлагаемого изобретения является обеспечение достоверной и надежной генетической паспортизации сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов на основе применения высокоизменчивых микросателлитных локусов.
Поставленная цель достигается за счет использования набора эффективных и стабильных молекулярных маркеров, позволяющих выявить высокий уровень полиморфизма ДНК и получить четко воспроизводимые результаты.
Способ осуществляют следующим образом.
Отбирают образцы растительного материала исследуемого сорта, из образцов выделяют ДНК любым известным способом, амплифицируют ДНК в реакционной смеси с последовательным участием указанных нескольких праймеров по известной методике, полученные продукты амплификации разделяют на фракции методом электрофореза в разделяющем геле по стандартной методике, осуществляют визуализацию продуктов амплификации под ультрафиолетовым светом, для каждого сорта выявляют специфичные профили продуктов амплификации, которые служат маркерами данного селекционного достижения, причем в процессе амплификации обеспечивают индивидуальную температуру отжига для каждого праймера. При этом выделение ДНК осуществляют из материала, взятого от не менее десяти растений каждого сорта, выращенных в поле или защищенном грунте или не менее двадцати растений каждого сорта, выращенных в условиях in vitro.
Примеры осуществления способа
Пример 1. Отбор растительного материала
Для паспортизации сорта отбирали листья с десяти растений для каждого сорта, выращенных в полевых условиях. До начала исследований листья хранили в холодильнике при+4°С.
Пример 2. Выделение ДНК
Для выделения ДНК использовали модифицированный СТАВ-метод: Гомогенизация и экстракция. Фрагменты растительной ткани массой до 50 мг помещали в центрифужную пробирку типа "Eppendorf" объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл экстрагирующего буфера (Т=+65°С), следующего состава: 1,5% раствор бромида цетилтриметиламмония (СТАВ); 0,12 М раствор трис-HCI (рН 8,0); 1,2 М раствор хлорида натрия; 15 мМ раствор трилона Б, и гомогенизировали до однородного состояния. Далее пробирку закрывали и перемешивали содержимое на вихревом смесителе (400-600 об/мин) в течение 5 секунд. После этого пробирки помещали в твердотельный термостат и инкубировали в течение 30 мин при +65°С.
Очистка гомогенатов. После экстракции пробирку охлаждали до комнатной температуры и к образцу добавляли 500 мкл хлороформа. Содержимое перемешивали на встряхивающей ванне (200 об/мин) в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее производили центрифугирование при 13000 g в течение 10 мин. После этого пипеточным дозатором отбирали 300 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа "Eppendorf" объемом 1,5 мл и добавляли к нему 60 мкл буфера 5х СТАВ (5% р-р СТАВ; 350 мМ раствор трилона Б). Содержимое перемешивали на вихревом смесителе (400 об/мин) и инкубировали в твердотельном термостате в течение 10 мин при +65°С. После инкубации добавляли 360 мкл хлороформа. Содержимое перемешивали на встряхивающей ванне (200 об/мин) в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 13000 g в течение 10 мин (если раствор оставался мутным или была большая интерфаза, то процедуру очистки хлороформом повторяли).
Осаждение ДНК. По окончании центрифугирования пипеточным дозатором отбирали 200 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа "Eppendorf" объемом 1,5 мл и добавляли 200 мкл изопропанола. После добавления спирта содержимое пробирки перемешивали и оставляли в роторе центрифуги на 30 мин. Далее производили центрифугирование при 13000 g (Т=+4°С) в течение 10 мин.
Очистка препарата ДНК. Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 700 мкл охлажденного 70% этанола. После промывания содержимое пробирок центрифугировали при 13000 g (Т=+4°С) в течение 5 мин. Процедуру промывки повторяли два раза для удаления из осадка остатков трилона Б и изопропанола, поскольку они являются ингибиторами амплификации.
Лиофилизация препарата ДНК. После промывки этанолом, пробирки размещали в штативе и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 мин (Т=+45°С) до полного испарения этанола.
Растворение препарата ДНК. Высушенный осадок растворяли в 50 мкл деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 об/мин) при +65°С в течение 15 мин.
Пример 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Для генетической паспортизации сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов использовали 13 SSR-праймеров (таблица 1).
ПЦР проводили по следующей программе: 1 цикл - длительная денатурация (3 мин, 94°С); 40 циклов -денатурация (30 с, 94°С), отжиг (30 с, температура отжига из табл.1), элонгация (45 с, 72°С); 1 цикл - длительная элонгация (7 мин., 72°С).
Пример 4. Электрофоретическое разделение, визуализация и интерпретация результатов ПЦР.
Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в вертикальных блоках 6% полиакриламидного геля (ПААГ) в трис-ЭДТА-боратной буферной системе. После электрофореза гели окрашивают в водном растворе бромистого этидия и визуализируют в УФ-свете.
Графические изображения гелей (электрофореграммы) перехватывают с помощью фото- или видеосистемы гель-документации, и сохраняют на магнитные носители информации и обрабатывают в графических редакторах. Размер амплифицированных фрагментов определяют с помощью соответствующего программного обеспечения. В качестве стандартного маркера длины используют ДНК плазмиды pBR322 Е. coli, обработанную эндонуклеазой рестрикции Hpall, или аналогичный маркер молекулярного веса для фрагментного анализа в диапазоне 50-300 пар нуклеотидов (п.н.).
Проводят составление таблицы многолокусных генотипов по микросателлитным локусам. Длины амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов (в парах оснований) заносят в электронную таблицу MS Excel, по два столбца на локус. В случае отсутствия генотипа по какому-либо локусу (пропуск данных) указывают «0».
Примеры электрофореграмм, демонстрирующих полиморфизм длин амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов, приведены на фиг. 1, 2.
Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, включающего отбор растительного материала, является выделение ДНК из отобранного материала, генетический анализ ДНК с использованием молекулярного маркирования, основанный на микросателлитных локусах с последовательным участием нескольких SSR-праймеров, с последующим разделением продуктов амплификации путем электрофореза, их визуализацией под ультрафиолетовым светом и выявлением специфичных профилей позволит проводить паспортизацию любого сорта малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов, выращиваемых в России.
Анализ известных способов молекулярно-генетической паспортизации малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов, проведенный по патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения как «новизна». Благодаря этому можно создать генетический паспорт для различных сортов малины ежевики и малино-ежевичных гибридов, примеры генетического паспорта приведены на фиг. 3, 4, 5.
Краткое описание чертежей:
Фиг. 1. Электрофореграмма локуса Rub 13 сортов малины и ежевики. Сорта: 1 - ежевика Натчез (0/0); 2 - малина Бабье лето II (344/347); 3 - малина Атлант (344/347); 4 - ежевика Бжезина (0/0); 5 - малина Оранжевое чудо (344/345); 6 - малина Геракл (344/345); 7 - малина Атлант (262/319); 8 -маркер длин фрагментов ДНК; 9 - Ежевика Блек Сатин (0/0), М - маркер длин фрагментов ДНК.
Фиг. 2. Электрофореграмма локуса Rub 4 сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов. Сорта: 1 - ежевика Бжезина (294/295), 2 - малино-ежевичный гибрид Тайберри (314/288), 3 - малина Атлант (312/314), 4 - малина Геракл (299/314), 5 - малина Золотая осень (312/314), 6 - ежевика Блек Сатин (294/296), 7 - малино-ежевичный гибрид Тайберри Букингем (294/314), 8 - малина Пингвин (314/314), 9 - ежевика Агавам (298/ 296), 10 - вода (контроль), М - маркер длин фрагментов ДНК.
Фиг. 3. Электрофореграмма генетического паспорта ежевики сорта Бжезина с использованием микросателлитных локусов: 1 - Rub 1; 2 - Rub 2; 3 - Rub 3; 4 - Rub 4; 5 - Rub 5; 6 - Rub 6; 7 - Rub 7; 8 - Rub 8; 9 - Rub 9; 10 - Rub 10; 11 - Rub 11; 12 - Rub 12; 13 - Rub 13.
Фиг. 4. Электрофореграмма генетического паспорта малины сорта Патриция с использованием микросателлитных локусов: 1 - Rub 1; 2 - Rub 2; 3 - Rub 3; 4 - Rub 4; 5 - Rub 5; 6 - Rub 6; 7 - Rub 7; 8 - Rub 8; 9 - Rub 9; 10 - Rub 10; 11 - Rub 11; 12 - Rub 12.
Фиг. 5. Электрофореграмма генетического паспорта малино-ежевичного гибрида сорта Тайберри Букингем с использованием микросателлитных локусов: 1 - Rub 1; 2 - Rub 2; 3 - Rub 3; 4 - Rub 4; 5 - Rub 5; 6 - Rub 6; 7 - Rub 7; 8 - Rub 8; 9 - Rub 9; 10 - Rub 10; 11 - Rub 11; 12 - Rub 12.
--->
Перечень последовательностей
Seq ID No: 1. Rub1 F - праймер на локус Rub 1
5’- GTTCGATCGTCTTAGTGGCAC -3’
Seq ID No: 2. Rub1 R - праймер на локус Rub 1
5’- ATCACTTAATATTCGGACGG -3’
Seq ID No: 3. Rub2 F - праймер на локус Rub 2
5’- GCATGTCTGCTATGTGGT -3’
Seq ID No: 4. Rub2 R - праймер на локус Rub 2
5’- ATGTCTTTAGCTATACCATGTT -3’
Seq ID No: 5. Rub3 F - праймер на локус Rub 3
5’- GTCGATCGTCTATGTGAAGG -3’
Seq ID No: 6. Rub3 R - праймер на локус Rub 3
5’- CAATATGCCATCCACAGAGAAA -3’
Seq ID No: 7. Rub 4 F - праймер на локус Rub 4
5’- CAACCACCACCTCAACTAAT AA -3’
Seq ID No: 8. Rub 4 R - праймер на локус Rub 4
5’- GCAGAATCACCTGAGGCTTCTA -3’
Seq ID No: 9. Rub 5 F - праймер на локус Rub 5
5’- ATACTTGTCCAATAAACTTC -3’
Seq ID No: 10. Rub 5 R - праймер на локус Rub 5
5’- TGTTGTAAATGCAGGAACCAAC -3’
Seq ID No: 11. Rub 6 F - праймер на локус Rub 6
5’- AGTCTTCTCACATTTTGACAA -3’
Seq ID No: 12. Rub 6 R - праймер на локус Rub 6
5’- AGCAGAATCGGTTCTTACAAG -3’
Seq ID No: 13. Rub 7 F - праймер на локус Rub 7
5’- AAGACAAGGCGTCCACAACT -3’
Seq ID No: 14. Rub 7 R - праймер на локус Rub 7
5’- TATGCTTTGATTAGGCTGGGGT -3’
Seq ID No: 15. Rub 8 F - праймер на локус Rub 8
5’- CACCAATTGTACACCCAACAAC -3’
Seq ID No: 16. Rub 8 R - праймер на локус Rub 8
5’- ATCATACGGAAGGCCTTCCAT -3’
Seq ID No: 17. Rub 9 F - праймер на локус Rub 9
5’- GTCCCTTCAATAGGATCCAACG -3’
Seq ID No: 18. Rub 9 R - праймер на локус Rub 9
5’- GAACTAACCACCATCTCCTCGT -3’
Seq ID No: 19. Rub 10F - праймер на локус Rub 10
5’- ACAACGACAATTCTCACATTCG -3’
Seq ID No: 20. Rub 10 R - праймер на локус Rub 10
5’- TATCAAGCGATCCTGCAGTTGT -3’
Seq ID No: 21. Rub 11 F - праймер на локус Rub 11
5’- CCTAATGACCAATGCAAGACAA -3’
Seq ID No: 22. Rub 11 R - праймер на локус Rub 11
5’- ATCCATTCTCTTGTTGAGCAGA -3’
Seq ID No: 23. Rub 12 F - праймер на локус Rub 12
5’- ACGGTTCTAACTATGGCTGGAC -3’
Seq ID No: 24. Rub 12 R - праймер на локус Rub 12
5’- GTCGCTCCAACGAAGATTATT -3’
Seq ID No: 25. Rub 13 F - праймер на локус Rub 13
5’- TCCGATCCTTTTCTTTGGTG -3’
Seq ID No: 26. Rub 13 R - праймер на локус Rub 13
5’- CTTCTTGATCCTTGACTTGTCG -3’
<---