СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА ИЗ ПАНТОВ МАРАЛА
METHOD OF PRODUCING ACTIVE SUBSTANCE FROM MARAL ANTLERS

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и представляет собой фармакологическую композицию, содержащую очищенную и концентрированную фракцию действующих веществ из кондиционированной среды, полученной при культивировании стволовых клеток пантов марала.
Панты марала характеризуются быстрым ростом, до 2 мм в сутки, имеют трубчатую неороговевшую структуру с сетью кровеносных сосудов. Панты марала растут, получая максимальное количество питательных веществ и макро-/микроэлементов. Из 22 аминокислот в пантах содержится от 20 до 16, в зависимости от вида. Кроме того, панты содержат фосфолипиды, эфиры ненасыщенных жирных кислот, макро- и микроэлементы (Fe, Mn, Mg, Со, Zn. Cu, Са, F, I), сбалансированный набор жиро- и водорастворимых витаминов, регуляторы действия гормонов и пептидов, нормализующих реактивность иммунной системы [Шеина Н.Е. Возобновляемое биосырье Якутии: состав, свойства, биотехнологические аспекты переработки (обзор). Часть 1. Разработка на основе животного сырья, 2011].
Применение пантов в научной медицинской практике в России относится к началу XVIII в. Перечень форм лечебных препаратов, в которых используются панты, достаточно широк [И.В. Чернова. Панты и кровь в народной медицине населения саяно-алтайского региона в конце XIX-XX вв., 2009]. В России официально утверждены для лечебно-профилактического применения 4 препарата: пантов марала спиртовой экстракт «пантокрин», таблетки и водный экстракт в ампулах, «пантогематоген» (на основе крови маралов); из пантов северного оленя - «рантарин» в таблетках и спиртовой экстракт «велкорнин» [И.Н. Винокуров. Маркетинговая деятельность продвижения пантовой продукции оленеводства в России и PC (Я), 2014]. Кроме того, препараты из пантов марала также используются как наружное средство, в частности пантовые ванны.
В последние годы активно развиваются клеточные технологии, некоторые методы успешно внедрены в клиническую практику. Применение стволовых клеток пантов в чистом виде, как клеточного продукта, ограничено этическими соображениями и законодательными запретами на применение у человека ксеногенных клеток. Вместе с тем, возможно применение отдельных ростовых факторов и пептидов, продуцируемых этими клетками. Указанную фармакологическую композицию можно применять для стимуляции и регуляции регенерации органов и тканей. Состав питательной среды, используемой для культивирования стволовых клеток, включает в себя большинство незаменимых аминокислот, микроэлементы, нуклеиновые кислоты, витамины и минералы [Р.Я. Фрешни. Культура животных клеток. Практическое руководство, 2011]. В процессе культивирования клеточная культура продуцирует и секретирует в питательную среду ростовые факторы, которые функционируют как сигнальные молекулы, обеспечивая взаимодействия между клетками, за счет чего и происходит стимуляция роста и пролиферации клеток.
Известен способ консервирования пантов марала [Луницын В.Г. Способ консервирования пантов марала. Патент №2314688, 14.09.2006]. Способ консервирования включает групповую варку пантов, закрепленных на вешалах, в воде с температурой 96-98°С при 9-кратном их погружении, ветровые сушки после каждой варки и жаровой сушки при температуре 70-80°С, при этом комли пантов после срезки затирают порошком сухой глины и без сортировки их по весовым категориям производят варку два дня путем погружения пантов, закрепленных на вешалах в положении комлем вниз, в воду с длительностью погружения 1,5 минуты и остыванием между погружениями 3 минуты, при этом ветровые и жаровые сушки проводят в позиции первоначального закрепления пантов на вешалах. Недостатком данного способа является термическая обработка пантов, которая приводит к разрушению термолабильных веществ, в связи с чем из действующих веществ в конечном продукте остаются только макро- и микроэлементы.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек [Колесникова А.И. Композиция для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек. Патента №2455354, 10.07.2012]. Способ получения композиции для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек включает в себя культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (КмМСК) человека в питательной среде. Культивирование проводят в атмосфере газовой смеси, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, при 37°С.
Недостатком этого способа является низкий пролиферативный потенциал КмМСК человека по сравнению со стволовыми клетками пантов марала, и, как следствие, получение кондиционированной среды занимает больше времени, а концентрация активных веществ в ней значительно ниже по сравнению с любыми продуктами пантового производства. Кроме того, помимо факторов роста, продуцируемых клетками, в составе композиции присутствуют добавки (антибиотик/антимикотик, фетальная бычья сыворотка), которые могут повлиять на развитие нежелательных явлений в ходе лечения.
Техническим результатом предлагаемого способа получения действующего вещества из пантов марала является выделение стволовых клеток из пантов марала, получение в короткие сроки кондиционированной среды с высокой концентрацией активных биомолекул, очищение и концентрирование фракции действующего вещества.
Указанный технический результат достигается тем, что для выделения стволовых клеток мелко нарезанные панты марала обрабатывают в 0,15% коллагеназе II типа в течение 2 часов при 37°С, клетки культивируют в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. При достижении культурой 75-80% монослоя проводят смену среды и культивируют в течение 4 дней, полученную кондиционированную среду очищают и фильтруют при помощи фильтрационной системы Lab Scale через мембраны 10 и 50 кДа.
Описание способа.
Забор биоматериала (пантов марала) проводят в питомнике, имитирующем естественную среду обитания животных. При помощи одноразового скальпеля биоматериал делят на равные части, размером 2×2 см, и помещают в стерильные пробирки со средой с повышенным содержанием антибиотиков (DMEM с добавлением 2% FBS, 2 мМ L-глутамина, 200 ед./мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина, 200 ед./мл амфотерицина, 100 ед./мл гентамицина). Материал доставляют в лабораторию в течение 6 часов после забора.
5
2
При помощи одноразовых скальпелей панты мелко диспергируют. Полученный гомогенизат инкубируют в 0,15% коллагеназе II типа при 37°С в течение 2 ч. Фермент инактивируют 10 мл среды DMEM с добавлением 2% FBS, гомогенизат осаждают при 300g 7 мин, удаляют супернатант. Подсчет и оценку жизнеспособности клеток проводят на автоматическом счетчике клеток Countess (Invitrogen, США). После подсчета клетки переносят в культуральный флакон, из расчета 5×10 клеток/см, и культивируют в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Экспансию клеток проводят по стандартной методике культивирования КмМСК. Клетки культивируют до 2 пассажа со сменой среды один раз в три дня. Криоконсервирование клеточной культуры проводят по стандартной методике.
3
2
Для получения кондиционированной среды размораживают по стандартной методике необходимое количество клеток, после чего пассируют на культуральный пластик из расчета 10×10 клеток/см. Смену среды проводят при достижении культурой 75-80% монослоя. Клетки культивируют в течение 4 дней. Кондиционированную среду собирают в стерильную бутыль.
Для получения действующего вещества используют фильтрационную систему Lab Scale (Millipore, США), мембраны Pellicon XL (Millipore, США) размером 10 и 50 кДа. Фильтрацию производят в соответствии с инструкцией производителя. После фильтрации получают композицию из действующего вещества размером 10-50 кДа и аминокислот, нуклеиновых кислот, микроэлементов, витаминов, содержащихся в ростовой среде. Полученную композицию концентрируют в 2 раза.
Применение заявляемого способа позволяет получить в короткие сроки культуру стволовых клеток пантов марала, используя сравнительно небольшое количество биоматериала, и выделить фармакологическую субстанцию из кондиционированной среды, содержащую проангиогенные, противовоспалительные, иммуномодулирующие и стимулирующие регенерацию цитокины.
Разработанный способ позволяет создать композицию действующего вещества для применения с целью восстановления и повышения работоспособности лиц, работающих или проживающих на экологически загрязненных территориях, подвергающихся чрезмерным эмоционально-психическим нагрузкам на фоне снижения физических нагрузок, работающих в условиях больших физических перегрузок, больных с хроническими воспалительными заболеваниями (в том числе со скрытым течением), послеоперационных больных.
Источники информации
1. Винокуров И.Н., Алексеев Е.Д., Мандаров А.Е. Маркетинговая деятельность продвижения пантовой продукции оленеводства в России и PC (Я). Современные проблемы науки и образования. 2014. №1. С. 382.
2. Чернова И.В. Панты и кровь в народной медицине населения саяно-алтайского региона в конце XIX-XX вв. Известия Алтайского государственного университета. 2009. №4-3. С. 250-252.
3. Шеина Н.Е., Шеин А.А., Кузьмина В.Ф., Ведекинд В.Α., Кершенгольц Б.М. Возобновляемое биосырье Якутии: состав, свойства, биотехнологические аспекты переработки (обзор). Часть 1. Разработка на основе животного сырья. 2011. №4. С. 59-64.
4. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство, 2011.
5. Луницын В.Г. Способ консервирования пантов марала. Номер патента 2314688, 14.09.2006.
6. Колесникова А.И. Композиция для регенерации клеток кожи и слизистых оболочек. Номер патента 2455354, 10.07.2012.