Штамм метанолокисляющих бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М - продуцент для получения микробной белковой массы
STRAIN OF METHANOL-OXIDIZING BACTERIA ACIDOMONAS METHANOLICA BF 21-05M IS A PRODUCER FOR OBTAINING MICROBIAL PROTEIN MASS

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к штамму метилотрофных (метанолокисляющих) бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М, который может быть использован для получения белковой биомассы. Данный продукт используется как источник белка в белково-витаминных комплексах, предназначенных для балансирования кормов для сельскохозяйственных животных.
Различные виды микроорганизмов являются продуцентами полноценного белка и витаминов.
К продуцентам кормовой биомассы относятся микроорганизмы различных таксономических групп, способные расти на различных субстратах: грибы, дрожжи, бактерии, водоросли.
В качестве продуцентов белка в ряде технологий используются грибы, например, рода Candida.
Известен штамм дрожжеподобного гриба Candida famata ВКПМ Y-2207, который при выращивании на зерновой среде обеспечивает выход белка в биомассе в пределах от 31,9 до 45%. (Патент РФ № 2090610).
Известен штамм дрожжеподобного гриба Candida tropicalis ВСБ-942 - продуцент биомассы, обогащенной белком (Патент РФ № 031115). Штамм растет на н-парафинах с содержанием ароматических углеводородов 0,8%. Недостатком штамма является его недостаточно высокая продуктивность и уровень сырого протеина в биомассе не более 60-65%.
Помимо этого, необходимо отметить, что штаммы рода Candida являются условно патогенными, что при их использовании требует выполнения дополнительного процесса термолиза и сложной системы обезвреживания стоков и выбросов воздуха, что существенно повышает экономические затраты на производство белка.
Широко применяются для синтеза кормового белка также культуры дрожжей. Так, на питательных средах, включающих опилки лиственной древесины с добавлением отрубей, при выращивании микробного консорциума, включающего штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, был получен продукт с содержанием белка 20-45% (Патент РФ № 2650689). Недостатком способа является невысокий уровень синтезируемого белка в биомассе кормового продукта (не более 45%).
Известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-760 - источник белка и биологически активных веществ (а.с. СССР № 1575570). Недостатком штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-760 является способность роста при низкой концентрации субстрата в среде, что нетехнологично и снижает экономическую эффективность процесса культивирования. Другой недостаток штамма заключается в низкой продуктивности и высоком расходном коэффициенте (около 2), что снижает производственные показатели штамма. К числу недостатков штамма можно отнести способность сбраживания различных Сахаров (глюкоза, галактоза, сахароза, мальтоза и раффиноза), что может приводить к брожению в ЖКТ при скармливании животным.
В качестве источника белка в премиксах могут использоваться и грибы-базидиомицеты (шляпочные грибы (а.с. СССР № 727687)), однако, особенности выращивания таких грибов удорожают производство кормового белка.
Использование каждого типа микробного продуцента белка подбирается исходя из технических условий и экономической эффективности их применения. При этом учитывается потенциал и стабильность свойств продуцента белка.
Наряду с перечисленными выше микроорганизмами в качестве продуцентов белковой биомассы широко используют также штаммы бактерий.
Известны штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий, используемые в качестве продуцентов белка - Lactobacillus acidophilus ВГНКИ-03.04.10-ДЕП (патент РФ № 2244000), Lactobacillus plantarum ВГНКИ-03.04.09-ДЕП (патент РФ № 2244001) и Propionibacterium acnes ВГНКИ-03.04.11-ДЕП (патент РФ № 2250258). Данные штаммы обеспечивают утилизацию отходов производств, использующих природное сырье, и благотворно влияют на микрофлору кишечника животных. Однако, общим недостатком данных штаммов является недостаточно высокая концентрация биомассы, биосинтез которой подавляется образующейся молочной или пропионовой кислотой.
Тем не менее использование бактерий в качестве продуцентов белка в виде микробной биомассы является более эффективным, поскольку бактерии образуют до 75% белка по массе, в то время как дрожжи - не более 60%. В этой связи микроорганизмы, в частности, бактерии, способные обеспечивать высокое содержание белка в биомассе, представляют очевидный интерес для промышленного получения кормового белка. При этом целевой продукт получают на основе сравнительно дешевого непищевого сырья - метана или метанола.
Перспективным подходом получения полноценного белкового кормового продукта является использование метанокисляющих бактерий. Метанотрофные бактерии в подходящих условиях активно перерабатывают метан природного газа, быстро размножаются и наращивают биомассу, богатую ценным белком, витаминами и иными биологически активными соединениями.
Известен штамм Methylococcus capsulatus ВСБ-874 - продуцент кормовой биомассы. Штамм депонирован в депозитарии Института «ВНИИГенетика» под коллекционным номером ЦМПМ В-1743 (а.с. СССР № 770200). В качестве источника углерода и энергии штамм использует метан (чистый или в составе природного газа). К недостаткам данного штамма можно отнести его чувствительность к продуктам, образующимся при соокислении гомологов метана, которые неизменно, в большем или меньшем количестве, присутствуют в природном газе. Образующиеся продукты ингибируют рост штамма-продуцента.
-1
Известен штамм метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus ГБС-15, регистрационный номер ВКПМ В-12549, - продуцент микробной белковой биомассы (Патент РФ № 2613365). Штамм устойчив к гомологам метана в природном газе, обладает способностью к гетеротрофной фиксации углекислого газа и к росту при повышенном давлении. Однако скорость роста культуры в непрерывном режиме культивирования недостаточно высока (0,25 ч).
3
Альтернативно для биосинтеза микробной белковой массы могут использоваться метилотрофные микроорганизмы, использующие метанол в качестве источника углерода при получении микробной белковой биомассы. Источником дешевого метанола служит являющийся отходом попутный газ, сжигаемый при нефтедобыче (около 50 млрд м/год в РФ). При этом и сам метанол, являющийся отходом производства, также токсичен и влияет на экологическую безопасность окружающей среды. Таким образом, при использовании метилотрофных микроорганизмов в процессах получения микробной белковой биомассы может быть решена проблема безопасной утилизации вредных отходов (в данном случае метанола).
Известен штамм ацидофильных метилотрофных бактерий Acetobacter methylicum ВСБ - 867 - продуцент белково-витаминной биомассы, способный успешно развиваться на средах с метанолом и устойчивый по отношению к инфицирующей микрофлоре (а.с. № 925112, опубл. 1995). Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов Института «ВНИИГенетика» под регистрационным номером ЦМПМ В-1947 и идентифицирован как новый вид рода Acetobacter. Цель данной работы состояла в селекции нового штамма метилотрофных бактерий, способных развиваться при низких значениях рН среды с более высокой скоростью роста, высоким содержанием белка и с низкой потребностью в биостимуляторах.
Полученный в результате штамм представляет собой первую в СССР ацидофильную культуру метилотрофных (метанолокисляющих) бактерий. К положительным свойствам штамма Acetobacter methylicum ВСБ - 867 следует отнести способность расти на средах с метанолом в нестерильных условиях с высокой скоростью роста при обеспечении содержания белка до 76%. К недостаткам штамма относится нестабильность выхода конечного продукта.
Данный штамм принят в качестве наиболее близкого аналога заявленного изобретения.
Задачей предлагаемого изобретения является изыскание нового штамма метилотрофных бактерий для биосинтеза микробного белка с более высоким технологическим потенциалом, а именно с более высокими ростовыми характеристиками, а также расширение арсенала микробных культур для биосинтеза белковой биомассы.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности предлагаемого нового штамма для получения микробной белковой массы за счет оптимизации параметров роста, уменьшения расхода минеральных компонентов питания, повышение выхода микробной белковой массы, устойчивость штамма к изменению условий культивирования без снижения продуктивности. Помимо этого, преимуществом заявленного изобретения является расширение группы штаммов, способных к биосинтезу белковой биомассы, и возможность утилизировать в процессе культивирования опасный органический отход (метанол) без ущерба для окружающей среды.
Технический результат достигается при использовании штамма метанолокисляющих бактерий Acidomonas methanolica BF 21-05М, депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14051, в качестве продуцента для получения микробной белковой массы. Обозначение штамма, присвоенное депозитором BF 21-05М.
Штамм Acidomonas methanolica BF 21-05М выделен из сопутствующей микрофлоры при выращивании метилотрофных дрожжей при кислом значении рН в непрерывном процессе, селекционирован в процессе длительного (более года) пассирования на жидких и агаризованных средах с метанолом.
Штамм выделен методом накопительных культур с последующей ступенчатой автоселекцией на простой минеральной среде с добавлением дрожжевого автолизата в качестве фактора роста, при температуре 30-35°С и рН среды 4,0-4,5.
Была произведена идентификация по физиологическим и биохимическим признакам. Систематическое положение подтверждено результатами анализа гена 16S рРНК, а также расшифровкой генома. Работы проводились компанией SciBear OU (Tartu mnt 67/1-13b, Kesklinna linnaosa, Tallinn, 10115 Harju maakond, Reg. No. 16221849). Полученные последовательности были депонированы в NCBI под номерами MW695406 и JAHKKE000000000 соответственно.
Культурально-морфологические особенности штамма с указанием среды: Культура грамотрицательная, строго аэробна. Прямые короткие палочки: одиночные или соединенные попарно, иногда образуют короткие цепочки. Размер клеток 0,35-0,56 × 0,7-1,05 мкм. Спор не образует. Клеточная стенка имеет ровные контуры и плотно прилегает к цитоплазматической мембране.
На синтетической агаризованной среде с метанолом образует круглые с ровным краем, выпуклые, гладкие, от белого до светло-бежевого цвета колонии слизистой консистенции. Колонии формируются на 3-4 сутки, достигая 1-2 мм. Рост при температуре 15-38°С (оптимум 30-35°С) и рН 3,0-5,5 (оптимум 4,0-4,5).
Нитраты до нитритов не восстанавливает и способность к ассимиляционной нитратредукции не проявляет. Сероводород не образует. Тесты на оксидазу и каталазу положительные.
Факультативный метилотроф.
Кроме метанола ассимилирует:
1) спирты: этанол, глицерин, маннит, дульцит;
2) сахара: глюкозу, фруктозу, мальтозу;
3) органические кислоты: ацетат, пируват, лактат, пропионат.
Не растет на сахарозе, арабинозе, рамнозе, лактозе.
В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты.
Нуждается для роста в дрожжевом автолизате или пантотеновой кислоте.
В клетках синтезируется убихинон (преимущественно Q10).
3
Активность (продуктивность) штамма составляет до 9,3 кг×м/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде с добавлением метанола в количестве 20 мл/л.
Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при - 80°С в качестве криопротектора применяется 30% раствор глицерина.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма
Вариант 1
4
2
4
4
2
2
2
2
4
2
4
4
2
4
2
3
3
2
4
2
3
4
Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH)SO - 0,5; MgSO × 7HO - 0,2; NaCl - 0,1; CaCl × 6НО - 0,05; KHPO - 1,2; KHPO - 0,62; дрожжевой автолизат - 4. Микроэлементы (мг/л): MnSO × 5HO - 0,2; FeSO × 7HO - 1; НВО - 0,2; NaMoO × 2HO - 0,2; ΚΙ - 0,2. Метанол 20 мл/л, рН 4,2 (доводится 1М раствором HPO), температура культивирования 32°С.
Вариант 2
Оптимальные условия и состав среды для ферментации:
3
НРО4 (70%) - 40,6 мл;
KCl - 48.0 г;
4
2
MgSO × 7HO - 12,7 г;
4
2
FeSO × 7HO - 3.4 г;
4
2
CuSO × 5HO - 0,28 г;
4
2
MnSO × 5HO - 2,5 г;
4
2
ZnSO × 7HO - 2.3 г;
2
2
СоС1 × 2HO - 0,00012 г;
2
4
2
NaMoO × 2HO - 0,002 г.
Генетические особенности штамма: а) мутации, делеции, инверсии нет; б) фагоустойчив; в) плазмиды не обнаружены; г) профаги не обнаружены. Сведения о безопасности использования штамма: а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик; б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.
Для заявляемого штамма характерны:
- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;
- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;
- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность. Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Культивирование штамма Acidomonas methanolica BF 21-05Μ проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,3-0,4 в термостатируемой качалке при 32°С. Культивирование проводят в течение 24 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,2 г/л. Полученную культуру используют в качестве посевного материала для последующего выращивания бактерий в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 30 л (рабочий объем 20 л).
Пример 2
Осуществляли выращивание культуры Acidomonas methanolica BF 21-05М в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (на 1 л среды):
3
4
HPO (70%) - 40,6 мл;
KCl - 48,0 г;
4
2
MgSO × 7HO - 12,7 г;
4
2
FeSO × 7HO - 3,4 г;
4
2
CuSO × 5HO - 0,28 г;
4
2
MnSO × 5HO - 2,5 г;
4
2
ZnSO × 7HO - 2,3 г;
2
2
CoCl × 2HO - 0,00012 г;
2
4
2
NaMoO × 2HO - 0,002 г.
-1
Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 32°С до 35°С и рН 3,8-4,5. Скорость подачи метанола составляла 100 мл/ч. Дрожжевой автолизат (5% раствор) подавали в количестве 60 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч. Значение рН регулировали 5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата.
Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляли 60 л/час.
В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 13-15 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 60-68%.
Пример 3
Осуществляли выращивание культуры Acidomonas methanolica BF 21-05М в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере).
-1
Процесс выращивания осуществляли при температуре 32°С и рН среды 4.2 значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подавали воздух в количестве 120 л/ч. Коэффициент скорости протока составлял 0,25 ч.
Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяли от клеток в нестерильном режиме и возвращали в ферментационный процесс вместо воды. Доля сопутствующей микрофлоры при таком способе культивирования была неизменной и не превышала 20% от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляла 13,8 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе - 55-65%.
Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Acidomonas methanolica BF 21-05М в минеральной среде указанного состава с меньшей концентрацией солей (по сравнению с прототипом приблизительно в 10 раз) при непрерывном протоке и в широком диапазоне условий культивирования (температура, рН, содержание солей) позволяет получать стабильный выход биомассы, сопоставимый с прототипом.