НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР - ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV VESICARORIA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES TO DETECT DNA OF AGENT OF VEGETABLE DESEASE - GRAM-NEGATIVE BACTERIUM XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV VESICARORIA BY POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к области молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов.
В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Тем самым обнаруживается соответствующий возбудитель заболевания и делается вывод о его наличии в биологическом материале.
Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПНР) - высоко специфичный и высокочувствительный метод выявления бактериальной ДНК. Принцип ПНР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя.
Известно изобретение по заявке №2003121605 (опубликована 27.01.2005), представляющее набор для идентификации энтерогеморрагических Escherihia coli. Это изобретение предполагает проведение ПЦР реакции с участием реагентов, входящих в этот набор. В частности, используются следующие праймеры, специфичные искомым бактериям, которые позволяют обнаружить ДНК этой бактерии при ПЦР:
Rfb for 5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG-3'
Rfb rev 5'-GAGTACATTGGCATGGTGTGG-3'
stx2 for 5'-ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG-3'
stx2 rev 5'-CTGAGCACTTTGCAGTAACGG-3'.
В результате обнаруживаются энтерогеморрагические Escherihia coli.
Также известны аналогичные изобретения «Способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания лаймского боррелиоза - borrelia burgdorferi)) (заявка №2004105688, опубликована 10.08.2005) и «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции» (заявка №2005136997, опубликована 10.06.2007).
Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПНР-реакции (часто 2 праймера и проба).
На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответсвует требуемому расположению праймеров.
Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих организмов друг с другом, поиск уникальных для нужного микроорганизма участков, не имеющих аналогов у других микроорганизмов.
Поиск соответствия между числом мутаций и расположением праймеров означает, что мутации, возможные в данном микроогранизме (естесственно те, данные о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.
3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).
Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК фитопатогенной бактерии Xanthomonas campestris pv vesicaroria, которая вызывает черную бактериальную пятнистость - одну из самых вредоносных болезней овощных культур. Бактерия поражает томат {Lycopersicum esculentum Mill.) и перец (Capsicum annum L), вызывая значительные потери урожая.
Однако аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этой бактерии не известны.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - бактерии Xanthomonas campestris pv vesicaroria включающего в себя праймеры:
5'-Tgg gCA gCg TAT CTT TCA CC-3'
5'-ATT ggC AgA Agg gTT TgT gTA A-3'
и пробу: (BHQl)-5'-CAg ATA TCC gTC C(FdT)g gTC gAA CgT CTC g-3'Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ.
2
1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Xanthomonas campestris pv vesicaroria - гену Rhs, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ КСl, 0.8% Р40, 20 мМ MGCl), внутренний контрольный образец (ВК).
И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами, праймеры обеспечивают течение реакции, проба - проявку ее результатов.
Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.
2) Раствор фермента Taq-полимеразы.
3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 240 п.н. генома Xanthomonas campestris pv vesicaroria. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.
4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Данный набор применяется следующим образом.
1) Биологический материал (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.
2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.
3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.
4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), К+(положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.
5) В пробирку, маркированную К- вносится отрицательный контрольный образец,
6) В пробирку, маркированную К+ вносится положительный контрольный образец,
7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").
Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.
В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами.