КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ГИГИЕНЫ ПОЛОСТИ РТА
COMPOSITIONS FOR IMPROVING ORAL HYGIENE

Настоящее изобретение относится к микроорганизмам или их фрагментам в качестве сенсорно нейтральных средств гигиены полости рта, особенно для профилактики зубных камней, в качестве противокариозных средств и/или препаратов от неприятного запаха изо рта. Настоящее изобретение кроме того относится к композициям, содержащим микроорганизмы или их фрагменты для уменьшения Streptococcus mutans. Такие композиции могут быть использованы в композициях для гигиены полости рта, например, для профилактики кариеса, или для профилактики зубного камня или неприятного запаха изо рта. Они также или вместо этого могут быть использованы для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта. Так как микроорганизмы и их фрагменты, в соответствии с настоящим изобретением, имеют очень слабый, ненавязчивый запах и вкус, они особенно пригодны в качестве сенсорно нейтральных средств для предотвращения образования зубного камня, кариеса, образование биопленки во рту и/или для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта. Микроорганизмы и их фрагменты, а также композиции, содержащие такие микроорганизмы и фрагменты, таким образом, могут быть с успехом применяться в пищевых и кормовых композициях, особенно в кормах для домашних животных. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам получения таких микроорганизмов, фрагментов, композиций, пищевых продуктов и кормов.
Одна из известных проблем животных, имеющих зубы, является разрушение таких зубов. Эта проблема имеет особое значение для таких животных, которые не могут, как акулы, выталкивать зубы, постоянно заменять их новым набором. Среди наиболее важных причин разрушения зубов является кариес. Под действием микроорганизмов, колонизирующих полость рта, зубная эмаль непрерывно ослабляется и в конечном итоге растворяется, что приводит к образованию кариозных повреждений. Такие повреждения в свою очередь являются подходящими для дальнейшей колонизации микроорганизмами, что ухудшает проблему кариеса.
Проблемой, связанной с образованием кариеса, является развитие неприятного запаха изо рта. Неприятный запах изо рта считается результатом нежелательной колонизации микроорганизмами ротовой полости. Тем не менее, ни один микроорганизм до сих пор не был указан в качестве основной причины неприятного запаха изо рта. Кажется очевидным, однако, что образование кариеса и неприятного запаха изо рта являются независимыми процессами, так как неприятный запах изо рта может происходить и в отсутствие зубов и кариес может происходить в отсутствие неприятного запаха изо рта.
Другой проблемой гигиены полости рта, особенно у животных, является образование зубного камня. Кальцифицированные отложения на зубах образуются микроорганизмами, колонизирующими поверхности зубов. Как правило, в течение 7-10 дней кальцинированные отложения на зубах вырастают до такой степени, что они могут быть видимыми невооруженным глазом. Зубной камень образует очаг, который позволяет колонизировать зубы дополнительными микроорганизмами. Это, в свою очередь, может привести к развитию неприятного запаха изо рта, кариеса и воспаления ткани десен. Существует, таким образом, необходимость предотвращения развития зубного камня, например, за счет замедления образования зубного камня.
Поэтому часто необходимо попытаться, решить эти проблемы независимо. Среди наиболее заметных решений до сих пор в данной области техники являются зубные пасты и жидкости для полоскания рта. Такие зубные пасты и жидкости для полоскания рта обычно содержат антимикробные агенты, эффективные для уменьшения - количества или для ингибирования активности микроорганизмов, колонизирующих зубы, в особенности микроорганизмов, являющихся причиной кариеса и/или микроорганизмов, вызывающих неприятный запах изо рта. Однако из-за отсутствия корреляции кариеса и образования неприятного запаха изо рта, многие вещества, эффективные против кариеса, являются неэффективными для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта, и наоборот. Кроме того, эффективность против зубного камня нуждается в улучшении.
Еще одной проблемой является то, что вещества, эффективные как антимикробные агенты, часто обладают собственным сильным запахом или вкусом, который, как считается, будет отталкивать потребителей и особенно домашних животных. Таким образом, композиции для гигиены полости рта часто содержат дополнительные обонятельно активные средства для маскировки или изменения вкуса или запаха, присущего противомикробным веществам. Однако такие дополнительные агенты также нелегко принимаются потребителями из-за их еще более сильного собственного вкуса или запаха. Это приводит к нежелательно низкой приверженности потребителей к применению рекомендаций производителей таких композициях для гигиены за полостью рта.
Проблема соблюдения режима терапии особенно важна с детьми и животными. И те, и другие склонны к разработке хитрых способов избавиться от композиций гигиены полости рта или неправильного использования их, например, посредством глотании, так что эффективное антимикробное средство или средства, не могут в полной мере проявить свое предполагаемое действие. На сопротивление особенно домашних животных таких, как кошки и собаки, к любой форме лечения часто жалуются. Кроме того, такие животные, как известно, избегают лекарства, включая противомикробно эффективные композиции гигиены полости рта, которые они иначе приняли бы, даже когда они замаскированы в корме. Кроме того, некоторые способы для перорального применения композиций для гигиены не доступны для животных, так как они, например, не в состоянии полоскать горло. Кроме того, некоторые процедуры в полости рта являются особенно стрессовыми для животных и требуют анестезии. Например, такие животные, как кошки и собаки будут яростно сопротивляться удалению зубного камня.
Таким образом, гигиена полости рта считается утомительной для человека, включая детей, и для животных, включая домашних животных и т.п. По этой причине настоящее изобретение намерено облегчить вышеуказанные проблемы предшествующего уровня техники. В особенности, настоящее изобретение направлено на повышение уровня соблюдения режима терапии в соответствии с инструкциями по гигиене полости рта для человека и животных, в особенности домашних животных.
В соответствии с настоящим изобретением является важным для дополнительного соблюдения режима терапии, такого, при котором средство или средства, применяемые для профилактики зубного камня, кариеса и/или для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта имеют слабый собственный вкус и аромат. Таким образом, вместо маскировки или изменения вкуса и запаха такие агенты посредством добавления дополнительных имеющих сильный вкус или сильно пахнущих агентов, настоящее изобретение предлагает другой подход. Собственные вкус и запах агентов для гигиены полости рта до сих пор не принимали во внимание или не придавали большого значения. Кроме того, неожиданно выяснилось, что агенты, которые являются доступными, являются эффективными как для профилактики зубного камня, кариеса, так и/или профилактики или лечения неприятного запаха изо рта без того, чтобы иметь сильные собственные вкус и запах. Также неожиданно было обнаружено, что такие агенты могут быть использованы для улучшения соблюдения инструкций терапии по гигиене полости рта и, в частности для уменьшения поведения избегания гигиены полости рта у людей, включая детей, и у животных, включая домашних животных. Кроме того, настоящее изобретение позволяет получить композиции для гигиены полости рта, имеющие другие вкусы или ароматы, чем те, которые ранее требовались для маскировки или изменения вкуса или запаха агентов против зубного камня, средств против кариеса и/или средств для предотвращения неприятного запаха изо рта.
Настоящее изобретение относится к микроорганизмам или их фрагментам в качестве сенсорно нейтральных средств гигиены полости рта. Изобретение кроме того относится к композициям, содержащим микроорганизмы или их фрагменты для уменьшения mutans Streptococcus. Такие микроорганизмы и их фрагменты, а также такие композиции могут быть использованы для лечения или профилактики зубного камня. Такие микроорганизмы, фрагменты или композиции могут быть также использованы для лечения или профилактики кариеса. Они могут быть использованы также для или вместо профилактики или лечения неприятного запаха изо рта. Так как микроорганизмы и их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением имеют очень слабые, ненавязчивые запах и вкус, они особенно пригодны в качестве сенсорно нейтральных средств для профилактики кариеса, образования биопленки в ротовой полости, в том числе образования зубного камня и/или для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта. Микроорганизмы и их фрагменты, а также композиции, содержащие их, могут быть, таким образом, с успехом использованы в пищевых и кормовых композициях, особенно в кормах для домашних животных. Кроме того, изобретение относится к способам получения таких микроорганизмов, фрагментов, композиций, пищевых продуктов и кормов.
В соответствии с настоящим изобретением, микроорганизм или его фрагмент, полезные в качестве сенсорно нейтрального средства для гигиены полости рта, предпочтительно являются молочнокислой бактерией.
Как указано выше, в настоящее время неожиданно было обнаружено, что молочнокислые бактерии могут быть использованы как сенсорно нейтральное средство гигиены полости рта, особенно для лечения и профилактики зубных камней, в качестве препаратов против кариеса и/или препаратов против неприятного запаха изо рта. Этого невозможно было ожидать, так как известно, что молочнокислые бактерии, как правило, обладают сильно кислым или кислотным вкусом и/или запахом, например, в йогурте и других молочных продуктах.
В соответствии с настоящим изобретением молочнокислой бактерией является любой микроорганизм, таксономически порядка Lactobacillales и предпочтительно семейства Lactobacillaceae. Микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением, как полагают, принадлежат к указанной таксономической группе, если он больше похож на штамм пределах этой таксономической группы или меньшего таксономического ранга, чем к любому типу штамма, принадлежащему к таксономической группе, отличной от рассматриваемой группы или его меньшего ранга, где указанный анализ основывается на сравнении их генетического материала, исключая плазмиды и неинтегрированные вирусы. Таким образом, микроорганизм считается принадлежащей к семейству Lactobacillaceae, если он, как определено в предыдущем предложении, генетически более похож на типичный штамм видов или родов в семействе Lactobacillaceae по сравнению с типичными штаммами видов или родов, принадлежащих к другому семейству в порядке Lactobacillales.
Сходство в соответствии с настоящим изобретением оценивали с помощью алгоритма глобального выравнивания Needleman-Wunsch. Этот алгоритм является стандартным алгоритмом для нахождения оптимального выравнивания, включая разрывы двух последовательностей нуклеиновых кислот по всей их длине. Алгоритм Needleman и Wunsch был опубликован в 1970 J. Mol. Biol. 48, 443-453, в котором штраф за разрыв в n позициях вычисляется по формуле
штраф за внесение делеции в выравнивание + (n-1) × штраф за продолжение делеции.
Не существует штрафа для свисающих концов.
Штраф за внесение делеции в выравнивание в контексте настоящего изобретения равняется 10,0. Штраф за продолжение делеции в контексте настоящего изобретения составляет 0,5. Матрица замен для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот в контексте настоящего изобретения представляет собой унитарную матрицу тождественного преобразования ДНК, которая присваивает 1 балл для каждого идентичного «замещения» основания, и -10000 для всех других замещений оснований. Выравнивание последовательностей может быть осуществлено с этими параметрами, например, с помощью общедоступных инструментов, предлагаемых EBI.
Особым преимуществом, присущим микроорганизмам семейства Lactobacillaceae, является то, что они в целом, как может считаться, являются безопасными для потребления человеком и животными. Например, молочнокислые бактерии используются в течение длительного времени в производстве пищевых продуктов, например, посредством обработки молока. Кроме того, они просты в обращении из-за их низкой опасности для здоровья человека или животных, и они легко выращиваются в больших количествах, например, партиями по 500 л культуральной среды. Особенно предпочтительные методы культивирования будут описаны ниже.
Среди членов семейства Lactobacillaceae такие молочнокислые бактерии являются особенно предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением, которые принадлежат к роду Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus или Sharpea, среди которых микроорганизмы рода Lactobacillus являются наиболее предпочтительными. Такие микроорганизмы были широко использованы при получении пищевых продуктов и кормов, они просты в обращении и могут быть получены в больших количествах. Кроме того, в семействе Lactobacillaceae особенно среди рода Lactobacillus, могут быть получены микроорганизмы, которые являются как сенсорно нейтральными, так и эффективными в качестве средств гигиены полости рта, в частности, средства против зубного камня, средства против кариеса и/или препаратов от неприятного запаха изо рта.
Молочнокислые бактерии в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно являются палочковидными или сферическими, изменяясь от длинных и тонких до коротких изогнутых стержней, причем предпочтительно являются неподвижными и/или неспорообразующими и производят молочную кислоту в качестве основного или единственного продукта ферментативного метаболизма. Род Lactobacillus, к которому принадлежит микроорганизм настоящего изобретения в предпочтительном варианте делится по следующим характеристикам на три основные подгруппы, при этом предполагается, что виды Lactobacillus настоящего изобретения могут принадлежать к каждой из трех основных подгрупп:
(а) гомоферментативные лактобактерии
(i) продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно L-, D- или DL-изомер(ы) молочной кислоты в количестве по меньшей мере 85% из глюкозы через путь Эмбдена-Мейергофа;
(ii) растущие при температуре 45°С, но не при температуре 15°С;
(iii) имеющие палочкообразную форму, и
(iv) имеющие глицерин-тейхоевые кислоты в клеточной стенке;
(b) гомоферментативные лактобактерии
(i) продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно L- или DL-изомер(ы) молочной кислоты через путь Эмбдена-Мейергофа;
(ii) растущие при температуре 15°С, показывающие вариабельный рост при температуре 45°С;
(iii) имеющие форму коротких стержней или коринеформа и
(iv) имеющие рибит- и/или глицерин-тейхоевые кислоты в клеточной стенке;
(c) гетероферментативные лактобактерии
(i) продуцирующие молочную кислоту, предпочтительно DL-изомер молочной кислоты в количестве по меньшей мере 50% из глюкозы через пентозо-фосфатный путь;
(ii) продуцирующие диоксид углерода и этанол;
(iii) показывающие вариабельный рост при температуре 15°С или 45°С;
(iv) имеющие форму длинных или коротких стержней, и
(v) имеющие глицерин-тейхоевые кислоты в клеточной стенке.
На основании вышеописанных характеристик, микроорганизмами, предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением, могут быть идентифицированы как принадлежащие к группе молочнокислых бактерий, в частности к роду Lactobacillus.
В предпочтительном варианте выполнения изобретения микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением имеет метаболические отпечатки пальцев, выбранные из группы, состоящей из:
(i) он метаболизирует D-лактозу, но не L-сорбозу и/или D-сахарозу и/или D-инулин,
(ii) он метаболизирует инулин,
(iii) он метаболизирует L-сорбозу, но не D-лактозу и/или D-сахарозу и/или инулин, и
(iv) он метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу и инулин.
Предпочтительно, микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением имеет метаболические отпечатки пальцев, выбранные из группы, состоящей из:
(i) он метаболизирует D-лактозу, но не L-сорбозу, D-сахарозе и инулин,
(ii) он метаболизирует L-сорбозу, D-лактозе и инулин, но не D-сахарозу,
(iii) он метаболизирует L-сорбозу, но не D-лактоуа, D-сахарозу и инулин, и
(iv) он метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу, D-сахарозу, но не инулин.
Конечно, микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением не ограничивается метаболизмом вышеупомянутых Сахаров образцов метаболических отпечатков пальцев, но может быть способен метаболизировать дополнительные сахара.
В рамках настоящего изобретения термин «микроорганизм» относится не только к таким микроорганизмами, которые при помещении в соответствующие условия культивирования, можно размножить (жизнеспособные микроорганизмы). Особым преимуществом настоящего изобретения является то, что вместо таких жизнеспособных микроорганизмов могут быть использованы также соответствующие термически инактивированные или лиофилизированные микроорганизмы. Это особенно полезно, поскольку некоторые потребители могут возражают против идеи потребления жизнеспособных микроорганизмов, или против введения таких жизнеспособных микроорганизмов детям или домашним животным, даже если они уверены, что такие жизнеспособные микроорганизмы являются полезными для их здоровья. Поскольку настоящее изобретение относится к увеличению соответствия с инструкции по уходу за ротовой полостью, это является особым преимуществом, что даже такие необоснованные возражения могут быть предметом заботы. Таким образом, если явно не указано в этом описании и прилагаемых примерах, рисунках и формуле изобретения, не различают жизнеспособные, термически инактивированные или лиофилизированные микроорганизмы.
В соответствии с настоящим изобретением, термически инактивированные клетки предпочтительно получают посредством автоклавирования жизнеспособных клеток микроорганизмов при температуре 121°С в течение по меньшей мере 20 минут в присутствии насыщенного водяного пара при атмосферном давлении 2 бар. Такое получение термически инактивированных микроорганизмов может быть достигнуто с помощью стандартного лабораторного оборудования, так как процесс автоклавирования является стандартным методом, известным в области микробиологии и соответствующего биотехнологического инжиниринга. Это очень быстрая методика, и доказана инактивация микроорганизмов семейства Lactobacillaceae и, в частности рода Lactobacillus.
Альтернативно, термическая инактивация микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением может быть достигнута посредством замораживания таких клеток до температуры -20°С. Такое замораживание также легко выполнить с помощью стандартного лабораторного оборудования.
Независимо от режима термической инактивации, т.е. посредством автоклавирования или посредством замораживания, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, чтобы концентрация жизнеспособных микроорганизмов уменьшалась бы при обработке по меньшей мере на 85%, 90% или 95%, а особенно предпочтительно по меньшей мере на 97%, 98%, 99% и особенно предпочтительно на 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99, 8% или 99,9%. Особенно предпочтительным является такое автоклавирование или замораживание, которые приводят к уменьшению концентрации жизнеспособных микроорганизмов по меньшей мере на 3 порядка (то есть в 1000 раз), еще более предпочтительно по меньшей мере на 4 порядка и еще более предпочтительно по меньшей мере на 5 порядков.
Особым преимуществом микроорганизмов настоящего изобретения является то, что они сохраняют свою полезность в качестве сенсорно нейтрального средства гигиены полости рта, предпочтительно препарата против зубного камня, средства против кариеса и/или препарата от неприятного запаха изо рта даже после такого инактивации в автоклаве или замораживания. В такой термически инактивированной форме микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением особенно легко хранить даже при 20°С в стандартной атмосфере с относительной влажностью 80% при этой температуре. Эта стабильность при хранении имеет особое значение, так как инактивированные микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением позволяет производить продукты питания или корма, содержащие такие инактивированные формы без компрометирующей даты "срок годности".
Те же преимущества могут быть получены в соответствии с настоящим изобретением с использованием лиофилизированных микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением, т.е. лиофилизированных микроорганизмов семейства Lactobacillaceae и особенно лиофилизированные молочнокислые микроорганизмы рода Lactobacillus. Лиофилизацию в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно проводить в течение по меньшей мере 2 часов при комнатной температуре, т.е. при температуре от 16°С до 25°С.
В дополнение к или в качестве альтернативы к микроорганизмам в соответствии с настоящим изобретением, например, в жизнеспособной, термически инактивированные или в лиофилизированной форме, могут быть использованы их фрагменты. Фрагментация микроорганизмов может быть легко осуществлена с использованием стандартных способов, известных в данной области техники, в частности посредством лизиса клеток и/или пастеризации. Способ, используемый для лизиса или фрагментации микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением, в том числе термически инактивированных и/или их лиофилизированных форм, не имеет особого значения. Соответствующие способы могут быть выбраны, например, из химических методов, включая ферментативную обработку, предпочтительно одной или несколькими протеазами, к примеру протеиназой К, липазами или гликозидазами; не ограничивающими примерами для других химических веществ являются: ионофоры, детергенты, например, додецилсульфат натрия, кислоты или щелочи, не ограничивающими примерами для средств физического воздействия являются: высокое давление, наподобие Френч-пресса, осмолярности и перемалывания, например с использованием стеклянных или стальных бусин. Особенно предпочтительные способы получения термически инактивированных и/или лиофилизированных микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением и их фрагментов описаны в WO 2006/027265 А1, страницы 25-28 и WO 2009/149816 А1, страницы 28-34. "Фрагмент микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением" охватывает любую часть клетки микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно, указанный фрагмент является мембранной фракцией, полученной посредством приготовления мембранного препарата. Препараты мембран связывающих микроорганизмов, принадлежащих к семейству Lactobacillaceae, предпочтительно к роду Lactobacillus, могут быть получены способами, известными в данной области техники, например, с использованием метода, описанного в Rollan et al. Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-307, Matsuquchi et al, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 или в Stentz et al. Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 или в Varmanen et al. J. Bacteriology 182 (2000), 146-154. Кроме того, препараты цельных клеток также предусмотрены. Предпочтительно, чтобы описанный в настоящем изобретении фрагмент связывающего микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением сохранял бы способность специфически связываться с mutans Streptococcus и более предпочтительно Streptococcus mutans, которая описана в настоящем изобретении подробно.
Микроорганизмы, используемые в настоящем изобретении, т.е. молочнокислые бактерии предпочтительно семейства Lactobacillaceae или рода Lactobacillus, включая соответствующие термически инактивированные или лиофилизированные формы и их фрагменты, предпочтительно используются в качестве противокариозных средств. В соответствии с настоящим изобретением, термин "противокариозное средство" определяется как любое средство, которое своим присутствием в полости рта человека или животного, включая домашних животных, таких как собаки, кошки, крысы, мыши, хомяки, морские свинки или обезьяны, снижает риск развития новых кариозных повреждений. Особое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что микроорганизм, используемый в качестве противокариозного средства, не должен быть эффективным антимикробным сам по себе. Таким образом, нет необходимости в соответствии с настоящим изобретением, чтобы микроорганизмы или их фрагменты, используемые в качестве противокариозных средств, уменьшали при совместном культивировании количество микроорганизмов, генерирующих кариес, в частности микроорганизмов, принадлежащих к группе mutans Streptococci.
Следовательно, еще одним преимуществом в соответствии с настоящим изобретением является то, что микроорганизмы, используемые в качестве противокариозных средств, имеют очень ограниченное воздействие на нормальную микрофлору полости рта человека или из животных, особенно домашнего животного. Подходящие микроорганизмы будут описаны ниже.
Микроорганизм, используемый в настоящем изобретении, т.е. молочнокислые бактерии предпочтительно семейства Lactobacillaceae или рода lactobacillus, включая соответствующие термически инактивированные или лиофилизированные формы и их фрагменты, предпочтительно используются в качестве средств против зубных камней. В соответствии с настоящим изобретением, термин "средств против зубных камней" определяется как любое средство, которое своим присутствием в полости рта человека или животного, включая домашних животных, снижает риск развития зубного камня, или которое замедляет дальнейшее развитие зубного камня. Не требуется, чтобы средств против зубных камней в соответствии с настоящим изобретением фактически устраняло бы зубной камень, уже сформированный на зубе.
Кроме того, микроорганизмы, используемые в настоящем изобретении, т.е. молочнокислые бактерии предпочтительно семейства Lactobacillaceae или рода lactobacillus, включая соответствующие термически инактивированные или лиофилизированные формы и их фрагменты, предпочтительно использовать в качестве препаратов против неприятного запаха изо рта. В соответствии с настоящим изобретением, термин "неприятный запах изо рта" означает любой неприятный запах исходящим из полости рта. Таким образом, термин используется в соответствии с настоящим изобретением, как для слабых форм неприятного запаха, также называемого «зловонного дыхания», которое не является болезнью, а также для таких форм неприятного запаха, которые, например, вследствие его интенсивности или аромата, считаются симптомами заболевания; такие последние формы неприятного запаха изо рта также называют галитозом. Клинически значимые формы неприятного запах изо рта, то есть галитоза, могут иметь различные причины. Наиболее заметным для всех форм дурного запаха изо рта являются инфекции, вызванные микроорганизмами колонизирующими полость рта, где такой микроорганизм переваривает органический материал, например мертвые эпителиальные клетки, другие микроорганизмы или остатки продуктов питания или кормов. Предпочтительно, настоящее изобретение устанавливает задержку начала неприятного запаха изо рта и/или уменьшает интенсивность или изменяет аромат неприятного запаха изо рта, будь то клинически не соответствующие зловонному дыханию или клинически значимому галитозу. Тем не менее, если явно не упомянуто в настоящем изобретении, термин "неприятный запах изо рта" не распространяется на неприятные запахи, происходящие за пределами полости рта, например, в пищеводе или желудке. Такие неприятные запахи, например, могут стать заметным во время отрыжки.
В рамках настоящего изобретения термин "полость рта" означает, такую полость, которая распространяется от губ и зубов до язычка, но не включая его.
Рот определяет полость рта млекопитающих, предпочтительно людей или животных, таких как домашние животные, состоящий из слизистой оболочки полости рта (десны, губы, щеки, небо и дно полости рта), языка и зубов (в том числе искусственных структур).
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, термин "сенсорно нейтральный" определяется как такой агент, который может заменить до 2 мас. % муки грубого помола пшеницы так, что не более 5 из 10 обученных экспертов при рассмотрении вкуса и аромата такой смеси муки грубого помола пшеницы и микроорганизмов и/или фрагментов в соответствии с настоящим изобретением отметят значительные изменения, если судить на основе шкалы от «нет никакой разницы», «слегка изменен», «заметно изменен» до «значительно изменен». Предпочтительно до 5 мас. % муки грубого помола пшеницы может быть заменено микроорганизмами и/или их фрагментами, так, что не более 5 из 10 экспертов сочтут вкус и/или запах такой смеси значительно измененными.
В соответствии с настоящим изобретением, таким образом, также обеспечивается композиция, содержащая
- связывающий микроорганизм или его фрагмент в количестве в качестве (а) сенсорно нейтральном, так и (b) эффективном для уменьшения mutans Streptococci в полости рта человека или животного, и/или эффективном для снижения неприятного запаха изо рта, причем микроорганизм представляет собой молочнокислые бактерии.
В настоящее время неожиданно было обнаружено, что для проявления противокариозного эффекта сенсорно нейтрального средства достаточно использовать связывающие молочнокислые бактерии для уменьшения mutans Streptococci в полости рта. Как описано выше, такие связывающие молочнокислые бактерии, термически инактивированные или лиофилизированные формы, а также фрагменты таких связывающих молочнокислых бактерий могут быть использованы в качестве противокариозного средства без антимикробного эффекта, т.е. не убивая самих кариесогенных микроорганизмов или подавляя их рост. Вместо этого достаточно, чтобы связывающий микроорганизм или его фрагмент связывался с одним или несколькими видами mutans Streptococci. Такое связывание может привести к агглютинации связанных mutans Streptococci, которые в свою очередь удаляются из полости рта посредством нормального глотания слюны и во время еды и питья. Как описано в WO 2008/074473 А2 удаление mutans Streptococci из полости рта значительно снижает риск образования биопленки в полости рта и на зубах, тем самым косвенно снижает риск развития кариеса. Это особенно справедливо и для таких связывающих микроорганизмов, которое связывается с Streptococcus mutans, как описано в WO 2006/027265 A1. Однако, не было до сих пор известно, что такие связывающие микроорганизмы можно использовать в качестве сенсорно нейтральных средств, то есть в концентрации сенсорно нейтральной, как описано выше, и подробно описанном ниже. Кроме того, не было до сих пор известно, что такое связывание с mutans Streptococci и особенно с Streptococcus mutans может снизить риск развития неприятного запаха изо рта.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением таким образом предпочтительно содержит микроорганизм или его фрагмент, способный специфически связываться с бактерии, принадлежащей к группе mutans Streptococci, где специфическое связывание представляет собой
(i) устойчивое к термической обработке, и/или
(ii) устойчивое к протеазной обработке и/или
(iii) кальций-зависимое и/или
(iv) формирующееся в диапазоне рН между 4,5 и 8,5 и/или;
(v) формирующееся в присутствии слюны.
Термин «специфически связывающийся» в контексте настоящего изобретения означает, что связывающий микроорганизм или его фрагмент, предпочтительно микроорганизм (или соответствующий фрагмент), принадлежащий к семейству Lactobacillaceae и более предпочтительно роду Lactobacillus, связывается с одним или несколькими штаммами, принадлежащих к mutans Streptococci, предпочтительно Streptococcus mutans, но не связывается с большинством других, предпочтительно никаким другим видам, принадлежащим к роду Streptococcus. В частности, связывающий микроорганизм или его фрагмент предпочтительно не связываются с бактериями, принадлежащими к видам Streptococcus oralis и/или Streptococcus mitis и/или Streptococcus salivarius. Еще более предпочтительно, связывающий микроорганизм также не связывается с бактериями, принадлежащим к виду Streptococcus salivarius, более предпочтительно принадлежащих к подвиду thermophilus. Более предпочтительно, чтобы связывающий микроорганизм или его фрагмент не связывались с Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и/или Streptococcus salivarius DSMZ 20567. И даже более предпочтительно, чтобы связывающий микроорганизм или его фрагмент также не связывался бы с Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus.
Специфической реакция связывания включает в себя связывание и, предпочтительно, агрегирование Streptococcus mutans или других клеток mutans Streptococci, как описано в настоящем изобретении, в качестве связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением в том числе его фрагмента в полости рта. Это специфическое связывание приводит, как следствие, к смыванию связанных клеток, например, посредством слюны или полоскания рта или ополаскивания рта и тому подобное, как описано в настоящем изобретении. Предпочтительно реакции специфического связывания связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением и их фрагментов с Streptococcus mutans и/или другими mutans Streptococci предохраняет такие клетки Streptococcus от прикрепления к поверхности зуба или зубов, или, не будучи связаны такой теорией, может привести к отрыву клеток Streptococcus от поверхности зуба или зубов. В результате реакция специфического связывания приводит к смыванию связанных клеток Streptococcus изо рта, тем самым уменьшая этиологический агент биопленки и, таким образом, предотвращая и/или вылечивая кариес.
Считается, что связывающий микроорганизм или его фрагмент может специфически связываться с стрептококковым антигеном I/II, который также известен как антиген В, IF, P1, SR, MSL-1 или PAc. Однако, связывающий микроорганизм или его фрагмент может связываться с любым другим белком или структурой поверхности S. mutans, тем самым агрегирую S. mutans и смывая его из полости рта, как описано в настоящем изобретении. Известно, что Streptococcus mutans связывается через указанный стрептококковый антиген I/II с зубным налетом. Соответственно, когда связывающий микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением может связаться, например, с указанным стрептококковым антигеном I/II, Streptococcus mutans или другой соответствующий mutans Streptococcus затрудняется связаться с поверхностью зубов, что таким образом помогает предотвратить и/или лечить кариес.
10
Пелликула представляет собой прозрачное тонкое покрытие, содержащее белки и липиды, находящиеся в слюне. Она образуется в течение нескольких секунд после очистки поверхности зуба. Образование пелликулы является первым шагом в образовании зубных бляшек. Зубная бляшка представляет собой мягкие отложения, которые накапливаются на зубах. Бляшка может быть определена как комплекс микробного сообщества, с более чем 10 бактериями на миллиграмм. По оценкам специалистов, до 400 различных видов бактерий могут быть найдены в бляшке. В дополнение к бактериальным клеткам бляшка содержит небольшое количество эпителиальных клеток, лейкоцитов и макрофагов. Клетки содержатся во внеклеточном матриксе, который формируется из бактериальных продуктов и слюны. Внеклеточный матрикс содержит белки, полисахариды и липиды. Один из белков, присутствующих в слюне является агглютинином, который, с одной стороны, как предполагают, приводит к частичному удалению mutans Streptococci из полости рта, однако, с другой стороны, предполагают, облегчает адгезию mutans Streptococci к поверхности зубов, облегчая тем самым начальное прикрепление клеток Streptococcus к зубам и, таким образом, начало кариеса.
Предпочтительно, указанное выше связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий - или его фрагмент - способны специфически связываться с Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523) и/или серотипа е (NCTC 10923), и/или серотипа f (NCTC 11060) и/или Streptococcus sobrinus DSMZ 20742 и/или Streptococcus ratti DSMZ 20564 и/или Streptococcus cricetus DSMZ 20562 и/или Streptococcus feras DSMZ 20646 и/или Streptococcus macacae DSMZ 20714.
Это означает, что вышеупомянутый связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, или его фрагмент предпочтительно связывается по меньшей мере с одним микроорганизмом, выбранным из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523), серотипа е (NCTC 10923) серотипа f (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus DSMZ 20742, Streptococcus ratti DSMZ 20564, Streptococcus cricetus DSMZ 20562, Streptococcus ferus DSMZ 20646 и Streptococcus macacae DSMZ 20714. Более предпочтительно, чтобы указанный выше связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, или его фрагмент связывался бы с любой комбинацией, группировкой или подгруппой вышеуказанных бактерий. Еще более предпочтительно, чтобы указанный выше связывающий микроорганизм или его фрагмент, принадлежащие к группе молочнокислых бактерий связывался бы со всеми вышеуказанными бактериями. В соответствии с настоящим изобретением "серотип" представляет собой антигенные свойства бактериальной клетки, предпочтительно клетки Streptococcus mutans или Streptococcus sobrinus, которые были определены серологическими методы, известными в данной области техники.
Как описано выше, специфическое связывание связывающего микроорганизма или его фрагмента к mutans Streptococci и предпочтительно к Streptococcus mutans является предпочтительно устойчивыми к термической обработке. Соответственно, связывание не отменяется, если связывающий микроорганизм настоящего изобретения обрабатывается нагреванием, например, при температуре выше 55°С, еще более предпочтительно более чем 65°С, особенно предпочтительно более чем 95°С и наиболее предпочтительно при 121°С. После охлаждения способность связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или его фрагмента к специфическому связыванию с mutans Streptococci определяется, как описано в настоящем изобретение.
Соответствующая температура может зависеть от конкретных видов связывающего микроорганизма, но она может быть легко определена специалистом в данной области техники посредством рутинного экспериментирования, например, посредством инкубации соответствующих клеток при различных температурах и определения количества связывающих клеток или их фрагментов, которые по-прежнему способны специфически связываться с mutans Streptococci и/или Streptococcus mutans с помощью способов, продемонстрированных в настоящем изобретении. Как правило, термической обработка продолжается в течение некоторого периода времени по меньшей мере 1 минуты. Предпочтительно термическая обработка продолжается в течение периода времени по меньшей мере n минут, в котором n представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 60, причем n=20 являются особенно предпочтительными. Тем не менее, не существует в принципе никакого верхнего предела времени инкубации. Тем не менее, предпочтительно не более 4, 3, 2 или 1 часа(ов). Наиболее предпочтительной является термическая обработка по меньшей мере 20 минут при температуре 121°С в насыщенном водяном пару, имеющим атмосферное давление 2 бара. Таким образом, термически инактивированная форма связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением, получаемая в автоклаве, является особенно предпочтительной. Наиболее предпочтительная термической обработка рассматривается как отмена любой функции белка и любой жизнеспособности клеток, что таким образом отличает микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением от других микроорганизмов тем, что он по-прежнему способен специфически связываться с S. mutans. Таким образом, это очень полезно для любой пищи, кормов, напитков или композиций в соответствии с настоящим изобретением в том случае, если желательно, чтобы микроорганизм не должен быть живым.
Специфическое связывание связывающего микроорганизма или его фрагмента дополнительно предпочтительно характеризуются его устойчивостью к протеазной обработке. Предпочтительно, чтобы связывание являлось бы устойчивым к обработке одной или несколькими протеазами, выбранными из группы, состоящей из проназы Е, протеиназы К, трипсина и химотрипсина. Эти протеазы не проявляют специфичности и, таким образом, рассматриваются как деградирующие любой белок, находящийся на поверхности клеток микроорганизма. Другие протеазы, которые, как известно, имеют предпочтения для определенных последовательностей аминокислотных остатков, представляют собой эластазу, тромбин, аминопептидазу I, карбоксипептидазу, дострипаин, эндопротеиназу, папаин, катепсин В, пепсин, гастриксин, химозин, катепсин D. Последние протеазы могут также быть использованы для тестирования того, будет ли специфическое связывание связывающего микроорганизма или его фрагмента с S. mutans или другой mutans Streptococcus устойчиво к последним более специфичным протеазам. Таким образом, после обработки протеазой, которое описано в примерах WO 2008/074473 А2 или WO 2006/027265 А1, которые включены в настоящее описание, связывающий микроорганизм или его фрагмент по-прежнему способны специфически связываться с Streptococcus mutans/mutans Streptococci.
Кроме того, специфическое связывание связывающего микроорганизма или фрагмента дополнительно предпочтительно характеризуется посредством его зависимости от кальция. Предпочтительно, чтобы специфическое связывание происходило бы в присутствии концентрации ионов кальция в диапазоне от 0,05 мМ до 500 мМ, предпочтительно между 1 мМ и 100 мМ. Особенно предпочтительные концентрации кальция составляет между 2 и 30 мМ. Зависимость специфического связывания от кальций может быть исследована, как описано в примерах WO 2008/074473 А2 или WO 2006/027265 А1, которые включены в настоящее описание. Кроме того, специфическое связывание со связывающим микроорганизмом или фрагментом предпочтительно поддерживается в интервале рН от 4,0 до 9,0, предпочтительно от 4,0 до 7,0, в частности, значение рН, при котором специфическое связывание имеет место, до сих пор предпочтительно составляет 4,5. Количественная оценка поддержания специфического связывания вне интервала рН, описанного выше, показано в вышеупомянутых примерах.
Специфическое связывание предпочтительно является независимым от магния. Таким образом, нет необходимости, чтобы присутствовали ионы магния или соли магния.
Другой предпочтительной характеристикой специфического связывания является его наличие в присутствии слюны. Слюна является экзогенным секретом, который синтезируется в слюнных железах. Она является сложной жидкостью, содержащей, помимо около 99% воды множество органических и неорганических соединений. Физиологическими ингредиентами слюны являются, в частности, ферменты, например, амилазы, карбоангидразы, лизоцим, пероксидазы или белки, например, муцин, лактоферрин, белки, богатые пролином, цистатины, гистатины или статерины или растворимые IgA. Таким образом, хотя различные потенциально мешающие вещества присутствуют в слюне, специфическое связывание микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением не нарушается или затрудняется. Для исследования специфического связывания в присутствии слюны, предпочтительно используется слюна, которая содержит предпочтительно виды Streptococcus, описанные выше. Если, однако виды Lactobacillus rhamnosus исследуются на специфическое связывание с S. mutans в присутствии слюны, предпочтительно, чтобы Streptococcus salivarius ssp. thermophilus были пропущены. Специфическое связывание анализировали, как описано в настоящем изобретении. Вышеуказанные характеристики связывающего микроорганизма или его фрагмента, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий делает его надежным и эффективным средством для профилактики и/или лечения кариеса, так как они, главным образом, вводятся в различных формах в рот, включая полость рта и зубы, где, в частности, присутствует слюна, включающая некоторые протеазы и низкие значения рН после приема углевод-содержащих продуктов питания. Кроме того, устойчивость к нагреванию оказывает благотворное действие при добавлении микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением в качестве добавки в пищевой продукт или в корм во время получения указанного пищевого продукта или корма. А именно, пищевые продукты или корма часто подвергаются термической стерилизации, предварительной кулинарной обработке, пастеризации и т.п., что негативно сказывается на жизнеспособности микроорганизмов.
Связывающий микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением и/или его соответствующий фрагмент, способен специфически связываться с одним или несколькими mutans Streptococci и предпочтительно с Streptococcus mutans, где специфическое связывание представляет собой
(i) устойчивое к термической обработке, и
(ii) устойчивое к протеазной обработке, а также
(v) формирующееся в присутствии слюны.
Такие связывающие микроорганизмы и их фрагменты сочетают вышеупомянутые преимущества. В частности, так как их специфическое связывание устойчиво к термической обработке, они могут быть включены в продукт, который подвергается термической обработке для стерилизации, тем самым продлевая срок хранения продукта без повреждения свойств гигиены ротовой полости, обеспечиваемые продукту микроорганизмами или их фрагментами, предпочтительно без ухудшения эффективности против зубного камня, эффективности против кариеса или эффективности против неприятного запаха из-за рта продукта. Кроме того, вследствие протеазной устойчивости связывающие микроорганизмы и их фрагменты могут быть включены в различные продукты различного состава еще до того, как такие продукты подвергнутся термической обработке для денатурации белка. И важно, что формирование специфического связывания в присутствии слюны позволяет использовать связывающие микроорганизмы и их фрагменты и в таких продуктах, которые не удаляют слюну из ротовой полости. Эта способность, в свою очередь увеличивает соблюдение режима терапии, особенно у детей и животных, в том числе и домашних животных, так как такие потребители, как правило, не желают использовать продукт, который привел бы к сухости в полости рта.
По этим причинам, связывающий микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением, и/или соответствующий фрагмент еще более предпочтительно способны специфически связываться с одним или несколькими mutans Streptococci и предпочтительно с Streptococcus mutans, где специфическое связывание представляет собой
(i) устойчивое к термической обработке в течение 20 минут при температуре 121°С в насыщенном водяном пару, имеющим атмосферное давление 2 бар, и
(ii) устойчивое к обработке одним или несколькими ферментами, выбранными из проназы Е, протеиназы К, трипсина и химотрипсина, а также
(v) формирующимися в присутствии слюны.
Предпочтительно, специфическое связывание связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением и/или соответствующего фрагмента является также
(iii) кальций-зависимым и
(iv) формируется в диапазоне рН от 4,5 до 8,5.
Метод определения связывания связывающих микроорганизмов и их фрагментов к mutans Streptococci описано в Lang et al (2010) Journal of Dental Research 89(2) 175-179, которая включена в настоящее изобретение.
Предпочтительно, чтобы специфическое связывание микроорганизма или его фрагмента могло бы быть проанализировано следующим образом:
(а) выращивание указанного связывающего микроорганизма до стационарной фазы, или, в случае, если должен быть протестирован фрагмент, получение такого фрагмента,
(b) смешивание указанного связывающего микроорганизма или фрагмента с mutans Streptococcus, выращенным до стационарной фазы,
(c) инкубирование смеси, полученной на стадии (b), при условиях, позволяющих образование агрегатов из указанного микроорганизма и указанного Streptococcus, а также
(d) детектирование агрегатов по возникновению осадка.
В предпочтительном варианте бактерии, принадлежащие к группе mutans Streptococci, используемые в таком анализе, являются Streptococcus mutans. Для специфического связывания с mutans Streptococci предпочтительно никакое связывание не может быть обнаружено по меньшей мере к одному, предпочтительно по крайней мере двум и более, предпочтительно по крайней мере к трем и еще более предпочтительно ко всем микроорганизмам, выбранным из группы, состоящей из Streptococcus salivarius spp. thermophilus, Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и Streptococcus sanguinis DSMZ 20567.
600
600
8
9
В частности, связывающие микроорганизмы, принадлежащие к группе молочнокислых бактерий, предпочтительно семейства Lactobacillaceae и еще более предпочтительно рода Lactobacillus, или соответствующие фрагменты, предпочтительно смешивают с mutans Streptococci в соотношении клетка-клетка от 3:1 до 60:1 (mutans Streptococci : связывающий микроорганизм). Как молочнокислые бактерии связывающие бактерии, так и mutans Streptococci выращивают в культуральной жидкости до стационарной фазы. Предпочтительно, измеряют оптическую плотность фотометрически при длине волны 600 нм. Указанные соотношения соответствуют отношению колониеобразующих единиц от 1:50 до 1:2,5. Предпочтительно OD=1 в 1 мл соответствует 3×10 колониеобразующих единиц mutans Streptococci. Предпочтительно OD=1 в 1 мл соответствует 7×10 колониеобразующих единиц молочнокислых бактерий. Предпочтительно для анализа реакции агрегации посредством осаждения, бактерии находятся в объеме 2 мл в 15-мл пробирках фирмы Falcon. В случае необходимости культуральную суспензию разбавляли PBS-буфером для получения объемных соотношений, упомянутых выше, при сохранении конечного объема в 2 мл.
Предпочтительно, смесь Streptococcus и связывающих молочнокислых бактерий или их фрагментов перемешивали в течение около 15 секунд, а затем оставляли в покое по меньшей мере 5, 10, 15 минут и более предпочтительно в течение 20 минут при комнатной температуре, т.е. любой температуре между 16°С до 25°С. Агрегацию наблюдали как немедленное помутнение суспензии, а через по меньшей мере 20 минут агрегация видна в виде агрегатов, которые оседали как видимый осадок, в то время как агрегирующие смеси не mutans Streptococci оставались в суспензии. В качестве контроля аутоагрегации соответствующих связывающих бактерии или их фрагментов и штамма mutans Streptococcus могут быть проанализированы посредством исключения либо mutans Streptococcus, либо связывающих микроорганизмов/фрагментов.
Агрегация связывающего микроорганизма и mutans Streptococcus в соответствии с описанным выше анализом может быть количественно охарактеризована посредством выделения образованных агрегатов, как описано в Lang et al (2010) Journal of Dental Research 89(2) 175-179, или центрифугированием, например, при 500×g в течение 30 секунд. Впоследствии количество агрегации может быть определено посредством измерения количества неагрегированных клеток, которые остаются в надосадочной жидкости. Определение может быть выполнено любым подходящим способом, известным специалисту в данной области техники. Предпочтительно, определение осуществляется посредством удаления определенного объема надосадочной жидкости, например, 1 мл. Впоследствии, оптическая плотность удаленного супернатанта может быть измерена на любой подходящей длине волны, известной специалистам в данной области техники, например, при 600 нм. Измеренное значение после вычитания значения соответствующего контрольного образца без лактобактерий представляет количество клеток, которые еще не были агрегированы.
Способ определения специфического связывания в соответствии с настоящим изобретением описывается в примере 4 в WO 2008/74473 А2, с соответствующими инструкциями для выращивания соответствующих микроорганизмов, описанных в примере 1 этой публикации. Оба примера приводятся в настоящем изобретении с целью раскрытия способа определения специфического связывания в соответствии с настоящим изобретением.
Кроме того, для решения проблемы возможной аутоагрегации может быть использован краситель, предпочтительно флуоресцентный краситель. Таким образом, в более предпочтительном варианте специфическое связывание может быть проанализировано следующим образом:
(a) выращивание указанного микроорганизма до стационарной фазы;
(b) смешивание указанного микроорганизма с бактериями, принадлежащими к группе mutans Streptococci, выращенными до стационарной фазы и которые были окрашены с использованием подходящего красителя, предпочтительно флуоресцентного красителя;
(c) инкубирование смеси, полученной на стадии (b), в условиях, позволяющих образование агрегатов из указанного микроорганизма и бактерии группы mutans Streptococci, а также
(d) детектирование агрегатов посредством обнаружения красителя, предпочтительно флуоресцентного красителя.
Кроме того, в предпочтительном варианте бактерии, принадлежащие к группе mutans Streptococci, используемые в таком анализе являются Streptococcus mutans.
600
600
8
9
Предпочтительно агрегационный анализ может быть осуществлен таким образом, что сначала связывающий микроорганизм и mutans Streptococci выращивают до стационарной фазы, как описано выше. Предпочтительно, измеряют оптическую плотность фотометрически при длине волны 600 нм. Предпочтительно OD=1 в 1 мл соответствует 3×10 колониеобразующих единиц соответствующего mutans Streptococcus. Предпочтительно OD=1 в 1 мл соответствует 7×10 колониеобразующих единиц связывающих микроорганизмов, в особенности семейства lactobacillaceae и еще более предпочтительно рода lactobacillus, как описано в настоящем изобретении.
600
Впоследствии mutans Streptococci окрашивается. В еще одном предпочтительном варианте окрашиваются связывающие микроорганизмы, в то время как Streptococci не окрашиваются. Так как может быть использован любой подходящий краситель, предпочтительно могут быть использованы флуоресцентные красители, известные специалистам в данной области техники. Предпочтительно быть использован специфичный или неспецифичный флуоресцентный краситель может, например, CFDA-SE для окрашивания интактных клеток, другие полезные красители включают диацетат карбоксифлуоресцеина ацетоксиметиловый эфир, BCECF AM и кальцеин AM. В частности, клетки собирают, например посредством центрифугирования, предпочтительно при 3200×g в течение 5 мин. После этого полученный осадок может быть ресуспендирован в любом пригодном буфере, известном специалисту в данной области техники, предпочтительно в PBS-буфере. Объем буфера может быть рассчитан таким образом, чтобы в результате суспензии имела бы OD, например, 4,2/мл. После этого суспензия может быть смешана с подходящим красителем, например, флуоресцентным красителем, предпочтительно с 5,6-карбоксифлуоресцеином диацетатом, сукцинимидным эфиром (CFDA-SE), более предпочтительно с 2 мкл раствора CFDA-SE (Invitrogen). Затем клетки можно инкубировать в течение подходящего периода времени, как известно это специалистам в данной области техники, например, течение 2 часов, при подходящей температуре, как известно специалистам в данной области техники, например, при 37°С. На следующем этапе, окрашенные клетки могут быть собраны, например, центрифугированием. Предпочтительно, центрифугирование проводят при 3200×g в течение 5 мин. Эти клетки могут быть затем вновь суспендированы в подходящем буфере, как известно специалистам в данной области техники, например, в 2 мл PBS-буфера.
Для агрегации связывающие микроорганизмы предпочтительно смешивают с mutans Streptococci в объемных соотношениях от 3:1 до 1:3 (mutans Streptococci : связывающие микроорганизмы). Более предпочтительно, чтобы объемное соотношение смеси было 1:1. Указанные соотношения соответствуют соотношению колониеобразующих единиц от 1:50 до 1:150. Для анализа реакции агрегации посредством измерения окрашивания, предпочтительно флуоресценции, связывающий микроорганизм и mutans Streptococci используются в любом подходящем объеме, известном специалистам в данной области техники, Предпочтительно, в объеме 50 мкл. Предпочтительно, смешивание осуществляется в планшете для микротитрования, например, в 96-луночном планшете для микротитрования. Впоследствии, смесь может встряхиваться, предпочтительно в течение 12 мин на полной скорости. После этого смесь может быть отцентрифугирована, например, в течение 10 секунд при 500×g. Супернатант затем может быть удален, и осадок может быть ресуспендирован в любом подходящем буфере, известном специалисту в данной области техники, предпочтительно в PBS-буфере в любом подходящем объеме, например, в 100 мкл. Окрашивание суспензии может быть измерено в смеси с помощью любых подходящих средств, известных в данной области техники. Предпочтительно, в случае флуоресценции флуоресценция может быть детектирована в флуоресцентном ридере, например, на длине волны возбуждения 495 нм и для эмиссии 525 нм. В качестве контроля связывающий микроорганизм сам по себе и окрашенные mutans Streptococci сами по себе могут быть проанализированы. Любое фоновое окрашивание, например флуоресценция, может быть измерено для тестируемых mutans Streptococci самих по себе и, предпочтительно, может быть вычтена из значения для агрегации с соответствующим связывающим микроорганизмом. Агрегационный эффект присутствует, если фоновое окрашивание, например флуоресценция, измеренное, как указано в настоящем изобретении выше, вычитается из измеренного окрашивания, например, флуоресценции в образце, содержащем связывающий микроорганизм, как описано в настоящем изобретении выше, и исследуемого mutans Streptococcus, как описано в настоящем изобретении выше, и полученное значение по меньшей мере выше нуля. Более предпочтительно, агрегационный эффект присутствует, если полученное значение воспроизводимо выше нуля в серии испытаний, проведенных, как описано выше. "Серии экспериментов" означает по меньшей мере два, предпочтительно три, более предпочтительно 4, и наиболее предпочтительно 5 испытаний.
Альтернативный способ тестирования связывания может быть выполнен, как описано в примере 5 в WO 2008/074473 А2, который включен в настоящее изобретение посредством ссылки.
Для фрагментов связывающих микроорганизмов связывание в основном определяется как для жизнеспособных, так и инактивированных связывающих микроорганизмов, как описано выше. Количество фрагментов, которые будут использоваться для определения связывания или для приготовления пищевой или кормовой композиции в соответствии с настоящим изобретением вместо клеток связывающего микроорганизма, предпочтительно такое же как количество материала клеточной стенки жизнеспособного или термически инактивированного связывающего микроорганизма. Например, содержание пептидогликана связывающего микроорганизма может быть измерено с использованием соответствующих красителей и такое же количество фрагментов на основе измерения таких красителей может быть использовано.
Указанные связывающие микроорганизмы предпочтительно представляют собой молочнокислые бактерии, принадлежащие к роду Lactobacillus, более предпочтительно вида Lactobacillus, как описано в настоящем изобретении. Еще более предпочтительно, указанные Lactobacillus принадлежит видам Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus. Тем не менее, виды Lactobacillus не ограничиваются ими. Указанные связывающие микроорганизмы могут быть предпочтительно "выделенными" или "очищенными". Термин "выделенный" означает, что материал удаляется из своей первоначальной среды, например, природной среды, если они природного происхождения. Например, встречающиеся в природе микроорганизмы, предпочтительно виды Lactobacillus, отделенные от некоторых или всех из сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такой микроорганизм может быть частью композиции, и может рассматриваться все еще как выделенный, поскольку в этой композиции он не является частью его природного окружения. Таким образом, микроорганизм, выращенный в чистой культуре по прежнему считается выделенным микроорганизмом. Кроме того, фрагмент микроорганизма считается "выделенным" в соответствии с настоящим изобретением, если он отделен от по меньшей мере от части материала соответствующего микроорганизма.
Термин "очищенный" не требует абсолютной чистоты, а скорее, он предназначен как относительное определение. Индивидуальные микроорганизмы, выделенные из библиотеки обычно очищают до микробиологической однородности, т.е. они растут в виде отдельных колоний при штриховом нанесении на чашки с агаром при помощи способов, известных в данной области техники. Предпочтительно, чашки с агаром, которые используются для этой цели, являются селективными в отношении молочнокислых бактерий, и особенно предпочтительно для видов Lactobacillus. Такие селективные чашки с агаром известны в данной области техники.
Для получения фрагментов предпочтительно разрушить жизнеспособные или термически инактивированные клетки связывающих микроорганизмов способами, известными в данной области техники, например обработкой ультразвуком, Френч-прессом или в шаровой мельнице, и отделить фрагменты от других остатков клеток с помощью центрифугирования. Осадок фрагментов затем можно промыть и снова центрифугировать, чтобы получить осадок фрагментов.
Более предпочтительно, чтобы указанный выше связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, выбирался из группы, состоящей из Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus, соответственно, имеющие DSMZ номер доступа 16667 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-KI), DSMZ номер доступа DSMZ 16668 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K2), DSMZ номер доступа DSMZ 16669 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K3), DSMZ номер доступа DSMZ 16670 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K4), DSMZ номер доступа DSMZ 16671 (L. paracasei ssp. paracasei Lb-Ob-K5), DSMZ номер доступа DSMZ 16672 (L. rhamnosus Lb-Ob-K6) и DSMZ номер доступа DSMZ 16673 (L. rhamnosus Lb-Ob-K7) или их мутант или их производные, в которых указанный мутант или производное сохраняет способность специфически связываться с mutans Streptococci. Термин "Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus, имеющие DSMZ номер доступа" относится к клеткам микроорганизма, принадлежащего к виду Lactobacillus paracasei или Latobacillus rhamnosus, депонированного в Deutsche Sammlung  Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ("DSMZ") на 26 августа 2004, и обладающие следующими номерами депонирования DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 или 16673. DSMZ находится в Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany. Вышеупомянутые номера депонирования DSMZ были сделаны в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей процедуры выдачи патентов.
"Мутант или производное" указанного выше связывающего микроорганизма, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий, предпочтительно клетки депонированных Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus, предпочтительно имеют те же характеристики, как соответствующие депонированные штаммы, т.е. они сохраняют способность специфически связываться с mutans Streptococci, предпочтительно с характеристиками связывания, как описано в настоящем изобретении. Например, указанное производное может быть получено с помощью генетической инженерии. В контексте настоящего изобретения термин «получены с помощью генетической инженерии» используется в самом широком смысле для способов, известных специалисту в данной области техники, чтобы изменить желаемые нуклеиновые кислоты in vitro и in vivo таким образом, чтобы генетические модификации оказали эффект, и гены были изменены с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Соответственно, предпочтительно, чтобы указанные способы включали клонирование, секвенирование и трансформацию рекомбинантных нуклеиновых кислот. Для этой цели соответствующие векторы, включая экспрессирующие векторы для видов Lactobacillus, какие, например, описаны в ЕР 0506789 В1, ЕР 0316677 В1, ЕР 0251064 В1, ЕР 0218230 В1, ЕР 0133046 В1 и WO 89/01970.
Праймеры, ферменты, дополнительные клетки-хозяева для клонирования промежуточных конструкций и тому подобное могут быть использованы, и они известны специалистам в данной области техники. Предпочтительно, генетически модифицированные мутанты включают клетки связывающего микроорганизма, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий, предпочтительно семейства lactobacteriaceae, еще более предпочтительно рода lactobacillus и наиболее предпочтительно одному из депонированных видов Lactobacillus, несущих рекомбинантную нуклеиновую кислоту, либо содержащуюся в бактериальной хромосоме, либо на одной или нескольких плазмидах, или содержащуюся в бактериальной хромосоме, и/или на одной или нескольких плазмидах. Указанные рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно являются чужеродным по отношению к указанному выше связывающему микроорганизму, принадлежащему к группе молочнокислых бактерий. Термин "чужеродный" означает, что полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты являются либо гетерологичными по отношению к клетке-хозяину, что означает полученную из клетки или организма с отличным генетическим окружением, либо является гомологичной по отношению к клетке-хозяине, но локализованной в отличном генетическом окружении, чем естественный аналог указанной молекулы нуклеиновой кислоты. В этом случае гетерологичный полинуклеотид может находиться под контролем своего собственного промотора или под контролем гетерологичного промотора. Вышеописанный вектор или молекула нуклеиновой кислоты, присутствующие в клетке-хозяине, могут быть либо интегрированы в геном клетки-хозяина, либо они могут быть сохранены в той или иной форме вне хромосомы. В этой связи следует также понимать, что вышеописанная молекула нуклеиновой кислоты может быть использована для восстановления или создания мутантного гена с помощью гомологичной рекомбинации. Плазмида может быть иметь низкое, среднее или высокое число плазмидных копий. Указанные мутанты, сконструированные с помощью генетической инженерии, могут нести нуклеиновые кислоты, кодирующих глюканазу или мутаназу, которые способны разрушать mutan-специфические 1,3-гликозидные связи сахарозных субъединиц. Грибковые глюканазы, например, описаны в Fuglsang et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 2009-2018. Предполагается также, что генетически модифицированные мутанты содержат клетки несущие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, которые предпочтительно секретируются или заякорены на клеточной стенки бактерий. Термин "антитело" включает интактные антитела, а также антитела, их фрагменты, такие как разделенные легкие и тяжелые цепи, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. Термин «антитело» также включает гуманизированные антитела, бифункциональные антитела и конструкции антител, такие как одноцепочечные Fv, (scFv), или антитела-гибридные белки. Предполагается также в контексте настоящего изобретения, что термин "антитело" включает конструкции антител, которые могут быть экспрессированы в клетках производных от указанных выше депонированных микроорганизмов, например, конструкции антител, которые могут быть трансформированы с помощью, в частности, векторов с помощью способов, известных в данной области техники. В частности, предполагается, что такие конструкции антител, специфически распознают, например, стрептококковый антиген ML Такой подход, например, описан в Krueger et al., Nat. Biotechnol. 20 (2002), 702-706 или в Shiroza, Biochim Biophys Acta 1626 (2003), 57-64.
Секреция экспрессированного антитела предпочтительно достигается посредством функционального связывания нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, с секреторной сигнальной последовательностью. Заякоривание на клеточной стенке бактерий может быть достигнуто за счет использования механизма фермента сортазы. А именно, поверхностные белки грамположительных бактерий связаны с клеточной стенкой бактерий с помощью механизма, который включает расщепление консервативного Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG) мотива, который осуществляется во время сборки пептидогликановой клеточной стенки. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, может быть слита с последовательностью, кодирующей вышеупомянутый консервативный мотив, который используется сортазой для закрепления белков на клеточной стенке бактерий.
Кроме того, предполагается, что вышеупомянутый связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, которые генетически модифицированы таким образом, чтобы нести молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие реутерин, который является антимикробной субстанцией, эффективной в частности, против Streptococcus mutans. Реутерин, например, описан в Talarico et al., Chemother. 33 (1989), 674-679.
Мутант связывающего микроорганизма, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, предпочтительно мутант депонированных штаммов Lactobacillus, предпочтительно получается с помощью искусственной мутации. В соответствии с настоящим изобретением термин "мутированный" означает одну или несколько постоянных модификаций генетического материала, т.е. нуклеиновой кислоты, вызванные, например, природными или физическими средствами или химическими соединениями/веществами/агентами, такими как EMS или ENU. Указанные модификации включают точечные мутации, такие как транзикции или трансверсии, делеция/инсерция/вставка одного или нескольких оснований в нуклеиновой кислоте/гене/хромосоме, тем самым модифицируя нуклеиновую кислоту/ген/хромосому, что может привести, в частности, аберрантной генной экспрессии/транскрипции/трансляции или неактивным генным продуктам, конститутивно активным/неактивным генным продуктам, ведущим, например, к доминантно-негативным эффектам. Предпочтительно, мутация приводит к увеличению способности к специфическому связыванию mutans Streptococci. Таким образом, предпочтительно также, чтобы мутантные клетки микроорганизма, которые несут одну или несколько мутаций в одном или нескольких желаемых генах, или в котором одна или несколько мутаций в одном или нескольких желаемых генов индуцировались способами, известными специалисту в данной области техники. Также известно в данной области техники, что мутированные или генетически модифицированные бактериальные клетки могут быть отобраны с помощью любого подходящего способа/фенотипа.
В контексте настоящего изобретения мутант, имеющий повышенную способность специфически связываться с mutans Streptococci, может быть исследован в соответствии со способами, описанными выше. Термин "мутант", однако, также включает клетки упомянутого выше связывающего микроорганизма, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий, предпочтительно клетки депонированного микроорганизма, которые несут природные, спонтанные мутации в своем геноме, то есть в бактериальной хромосоме. "Спонтанные мутации" представляют собой мутации, которые возникают естественным образом, т.е. без непосредственной генетической манипуляции человеком, или под воздействием мутагенов. Селекция спонтанных мутантов может быть достигнута посредством культивирования штамма и отбора нужного варианта, например, на способность варианта бактерии демонстрировать улучшенное связывание с mutans Streptococci. Способы селекции спонтанных мутантов хорошо известны в данной области техники (см., например, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Например, такие мутации могут возникнуть в процессе культивирования, например, во время нормального процесса деления клеток в сочетании с репликацией ДНК или во время пассирования и/или сохранения мутанта вышеупомянутого связывающего микроорганизм, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий.
Однако, даже при том, что генетическая манипуляция микроорганизмов может придавать полезные или даже весьма полезные свойства микроорганизмам, альтернативно, предпочтительно, чтобы связывающий микроорганизм и предпочтительно все микроорганизмы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, не были генетически модифицированными микроорганизмами, как это определено в Article 2(2) Directive 2001/18/ЕС в соответствующей версии, действующей на день подачи настоящей заявки. Тем не менее, микроорганизмы, полученные посредством методик генетической модификации, перечисленных в Annex 1В указанной Directive 2001/18/ЕС в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно не считаются генетически модифицированными микроорганизмами, как это определено в Article 2(2) Directive 2001/18/ЕС. Исключив генетически модифицированные микроорганизмы, можно избежать рациональные и иррациональные страхи потребителей, тем самым увеличивая соблюдение режима терапии потребителей гигиены полости рта.
В соответствии с настоящим изобретением связывающий микроорганизм, предпочтительно семейства Lactobacillaceae и еще более предпочтительно рода lactobacilli, наиболее предпочтительно один из указанных вышеупомянутых особенно предпочтительных штаммов, не содержит генетический материал, который был бы изменен таким образом, который не происходит естественно в результате скрещивания и/или естественной рекомбинации. Такие способы включают
(1) методики рекомбинантных нуклеиновых кислот, включающих образование новых комбинаций генетического материала посредством введения молекулы нуклеиновой кислоты, произведенной любыми средствами вне организма, в любой вирус, бактериальные плазмиды или другие векторные системы и их инкорпорацию в организм-хозяина, в котором они в природе не встречаются, но в котором они способны продолжать свое размножение;
(2) методики, предусматривающие прямую интродукцию в организм наследуемого материала, полученного вне организма, включая микроинъекции, макро-инъекции и микро-инкапсуляцию;
(3) слияние клеток, включая слияние протопластов, или методики гибридизации, где жизнь клетки с новыми комбинациями наследуемого материала формируются посредством слияния двух или более клеток в ходе процессов, которые не встречаются в природе.
Естественные процессы, такие как конъюгация, трансдукция и трансформация, однако, являются предпочтительно не исключаемыми в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, предпочтительно не исключаемыми методиками в соответствии с настоящим изобретением являются, при условии, что они не включают использование молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты или генетически модифицированных организмов, отличных от тех, которые получаются одним или несколькими методиками/способами, описанными в настоящем документе:
(1) мутагенез посредством спонтанной или индуцированной спонтанной мутации, а также
(2) слияние клеток в том числе слияние протопластов микроорганизмов, способных обмениваться генетическим материалом в рамках традиционных методов селекции.
В соответствии с настоящим изобретением, таким образом, предпочтительно, чтобы связывающий микроорганизм и предпочтительно также любой другой микроорганизм, используемый в соответствии с настоящим изобретением, не содержал бы генетического материала организма надцарства архебактерий или эукариот, конечно, за исключением такого генетического материала, который естественным образом может быть найден в штаммах того же вида или менее предпочтительно по меньшей мере той же рода, что и микроорганизм, используемый в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, предпочтительно, чтобы микроорганизм, используемый в соответствии с настоящим изобретением, не содержал бы генетический материал микроорганизма, найденного только в филюме, отличном от фирмикутов, и еще более предпочтительно не содержал бы генетический материал, найденный только в, или полученный из микроорганизмов из класса, отличного от бацилл, еще более предпочтительно не содержал бы генетический материал, который можно найти только в, или полученный из микроорганизмов порядка, отличного от Lactobacillales.
Если микроорганизм, используемый в соответствии с настоящим изобретением, и в частности связывающий микроорганизм принадлежит семейству Lactobacillaceae, то предпочтительно, чтобы соответствующий микроорганизм не содержал бы генетический материал, найденный только в, или полученный из микроорганизмов семейства, отличного от Lactobacillaceae. Еще более предпочтительно, если микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением и в частности связывающий микроорганизм принадлежал бы роду лактобактерий, то соответствующий микроорганизм не содержал бы генетический материал, найденный только в, или полученный из микроорганизмов рода, отличного от молочнокислых бактерий.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является предпочтительно композицией антикариесогенной пищи или кормов или антикариесогенной фармацевтической композицией. Таким образом, изобретение относится к применению вышеуказанного связывающего микроорганизма или его фрагмента для получения антикариесогенной композиции, предпочтительно фармацевтической или косметической композиции для лечения или профилактики кариеса, вызванного mutans Streptococci и/или Streptococcus mutans.
Термин «композиция», используемый в соответствии с настоящим изобретением, указывает композиции, которые содержат по меньшей мере один связывающий микроорганизм - возможно в термически инактивированной или лиофилизированной форме или его фрагмент, предпочтительно депонированный микроорганизм, как описано выше - возможно, в термически инактивированной или лиофилизированной форме - или фрагмент указанного микроорганизма. Предполагается, что композиции, используемые в соответствии с настоящим изобретением, содержат вышеуказанные ингредиенты в любой комбинации. Они могут, при необходимости, содержать по меньшей мере один дополнительный ингредиент, подходящий для предотвращения и/или лечения кариеса. Соответственно, они могут при необходимости содержать любую комбинацию из описанных ниже дополнительных ингредиентов. Термин "ингредиенты, подходящие для профилактики и/или лечения кариеса" охватывает соединения или композиции и/или комбинаций из них, которые либо ингибируют связывание mutans Streptococci с поверхностью зубов, с зубным налетом и/или которые инактивируют mutans Streptococci. Более предпочтительно указанный термин охватывает соединения или композиции, и/или их комбинации, которые могут ингибировать адгезию mutans Streptococci на поверхность зубов, ингибировать активность гликозилтрансфераз из mutans Streptococci, ингибировать или инактивировать mutans Streptococci, ингибировать агглютинин-зависимое связывания mutans Streptococci и/или ингибировать сахароза-зависимое связывание mutans Streptococci, как будет описано ниже.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой композицию для гигиены полости рта у домашнего животного и еще более предпочтительно представляет собой композицию для предотвращения или уменьшения зубного камня. Такие композиции известны, например, из ЕР 0141645 А2, WO 0150882 А2, WO 2001/070043 А2, WO 02/078462 A1, WO 2004/082518 А2, WO 2005/092087 А2 и WO 2010/052467 А2. Продукты питания и корма, описанные в этих документах, в частности в примерах, приведенных в этих документах, включены в данное описание в качестве примеров предпочтительных базовых композиций. Эти базовые композиции в соответствии с настоящим изобретением являются дополнительными внесенными посредством инкорпорации связывающего микроорганизма в соответствии с настоящим изобретением или его фрагмента.
Особое преимущество настоящего изобретения состоит в том, что под действием связывающего микроорганизма или его фрагмента, т.е. специфического связывания с mutans Streptococcus и наиболее предпочтительно посредством специфического связывания mutans Streptococcus, накопление зубного камня может быть задержано или замедлено без необходимости полагаться на действие бактерицидных средств или других химических веществ, которые убивают микроорганизмы в полости рта. Есть подозрение, что нормальная микрофлора полости рта полезна для человека и животных, например, в качестве таких микроорганизмов нормальной микрофлоры будут конкурировать с болезнетворными микроорганизмами за пищу, тем самым ограничивая рост патогенных микроорганизмов, что позволяет избежать инфекций. Настоящее изобретение позволяет нормальной микрофлоре полости рта в основном оставаться непотревоженной и по-прежнему наделяет свойствами гигиены полости рта, предпочтительно предотвращения или замедления образования зубного камня.
Еще одно преимущество настоящего изобретения в профилактике и лечении зубного камня является то, что настоящее изобретение не требует присутствия агентов для удаления солей кальция, таких как сульфат цинка, растворимых пирофосфатов, триполифосфата натрия и растворимых дифосфонатов. Такие агенты удаляют кальций из полости рта, тем самым удаляя ключевой компонент зубного камня. Однако зубная эмаль в основном состоит из гидроксиапатита, который представляет собой минерал с высоким содержанием кальция. Таким образом, удаление кальция из полости рта приводит к дальнейшему ослаблению зубов, что является нежелательным. Настоящее изобретение, с другой стороны, позволяет лечить или предотвращать образование зубного камня без удаления кальция, что является необходимым для поддержания здоровой зубной эмали.
Для достижения наилучших результатов в профилактике образования зубного камня композиции настоящего изобретения поэтому включают связывающий микроорганизм или его фрагмент, в котором связывающий микроорганизм принадлежит предпочтительно семейству Lactobacillaceae, более предпочтительно роду Lactobacillus и наиболее предпочтительно одному из вышеуказанных депонированных штаммов связывающих микроорганизмов, и дополнительно содержит средства для удаления солей кальция в такой концентрации, что связывание связывающих микроорганизмов или их фрагментов к mutans Streptococci снижается не более чем на 10%, как определяется с помощью нефелометрии, и предпочтительно, не содержит таких агентов. В таких предпочтительных композициях агенты для удаления солей кальция предпочтительно выбирают из группы: сульфата цинка, хлорид цинка, растворимых пирофосфатов, триполифосфата натрия и растворимых дифосфонатов.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение связывающего микроорганизма или его фрагмента, как описано выше, для получения лекарственного средства для профилактики или лечения зубных камней, предпочтительно у ребенка или у домашнего животного. Как указывалось выше, связывающий микроорганизм может также быть в термически инактивированной форме, в частности в форме автоклавированной форме или в лиофилизированной форме. Связывающий микроорганизм предпочтительно принадлежит семейству Lactobacillaceae, еще более предпочтительно роду Lactobacillus, еще более предпочтительно виду Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus. В частности, связывающий микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран из указанных выше штаммов L. paracasei или L. rhamnosus, соответственно, имеющей любой номер доступа DSMZ от 16667 до 16673, или их мутант или производное.
Наиболее предпочтительно, чтобы композиции в соответствии с настоящим изобретением представляла бы собой композиции пищевого продукта или корма, особенно для детей или домашних животных. Такие композиции пищевого продукта или корма для гигиены ротовой полости иногда называют функциональной пищей или функциональным кормом. Термины «пища» и «корм» используются в соответствии с настоящим изобретением независимо от питательной ценности соответствующих композиций и, таким образом, не ограничиваются конкретными питательными целями, хотя пищевые и кормовые композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть приспособлены для таких конкретных целей. Термины "пища" и "корма", тем самым показывают, что соответствующие композиции подходят для размещения в полости рта и для приема внутрь.
Особое значение в соответствии с настоящим изобретением имеют пищевые или кормовые композиции для животных, предпочтительно для домашних животных, и наиболее предпочтительно для кошек, собак, крыс, хомяков и морских свинок. У таких животных формирование кариеса является особенно печально известным и также трудно излечимым, поскольку любое лечение зубов, как например, удаление зубного камня требует анестезии домашнего животного. Настоящее изобретение является особенно подходящим для предотвращения потребности такого стрессового лечения.
Кормовая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является кормом для домашних животных, т.е. композиция для питания животных, разводимых или содержащихся, но обычно не использующихся для потребления человеком в Европейском союзе. Предпочтительно "домашнее животное" в соответствии с настоящим изобретением представляет собой млекопитающее отряда плотоядных, еще более предпочтительно подотряда Псообразных или подотряда Кошкообразных и наиболее предпочтительно семейств собачьи или кошачьи. Кроме того, предпочтительными являются домашние животные порядка Грызуны, причем особенно предпочтительными животными являются мыши, кролики, хомяки и морские свинки.
Для кормов для домашних животных предпочтительным является такая композиция в соответствии с настоящим изобретением, которая представляет собой комбикорма, полноценные корма, дополнительный корм или корма с минеральными добавками. В соответствии с настоящим изобретением, термин "комбикорма" означает смесь по меньшей мере двух исходных материалов, содержащих или не содержащих кормовые добавки для перорального кормления животных в виде полноценного или дополнительного корма. Термин "полноценные корма" означает комбикорма, которые в силу своей композиции, являются достаточными для ежедневного рациона. Термин "дополнительные корма" в соответствии с настоящим изобретением означает комбикорма, которые имеет высокое содержание определенных веществ, но которые, по причине его состава, является достаточными для ежедневного рациона, только если они используются в комбинации с другими кормами. Термин "корма с минеральными добавками" означает дополнительное питание, содержащее не менее 40% минеральных веществ. Наконец, термин "кормовое вещество" в соответствии с настоящим изобретением означает продукты растительного или животного происхождения, чья главная цель является удовлетворения питательных потребностей животного в их естественном состоянии, свежем или консервированном состоянии и продуктах, полученных посредством промышленной их обработки, а также органические или неорганические вещества, содержащие или не содержащие кормовые добавки, которые предназначены для использования в перорального кормления животных либо непосредственно как таковые, либо после обработки, или в получении комбикорма, или в качестве носителя премиксов. Термин «пероральное кормление животного» означает введение корма в желудочно-кишечном тракт животного через рот с целью удовлетворения потребностей в питании животного и/или поддержания продуктивности обычно здоровых животных.
В соответствии с настоящим изобретением композиция, содержащая связывающий микроорганизм, может быть также композицией для ухода за полостью рта. Предпочтительные примеры композиций для ухода за полостью рта в соответствии с настоящим изобретением представляют собой: зубную пасту, средства для чистки зубов, зубные порошки, гели для ротовой полости, средства для полоскания рта, вещество зубного протеза, спреи для рта, пастилки, пероральные таблетки, жевательные резинки, зубную нить или зубную лента и, в частности для животных, жевательные продукты.
Предпочтительная лекарственная композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит не только связывающий микроорганизм или его фрагмент, но также перорально приемлемый носитель, такой носитель может представлять собой любую подходящую основу, которая может быть применена к ротовой полости безопасным и эффективным образом, так что связывающий микроорганизм настоящего изобретения и/или его фрагмент может связываться с одним или несколькими штаммами mutans Streptococci и предпочтительно с одним или несколькими штаммами Streptococcus mutans, оказывая тем самым эффект против зубного камня и/или антикариесогенный эффект и/или эффект против неприятного запаха. Лекарственная композиция может представлять собой композицию с одной или несколькими фазами.
В частности, средство ухода за полостью рта в соответствии с настоящим изобретением может быть пастой, гелем или жидкой композицией, если не указано иное. Композиция для чистки зубов может быть в любой желаемой форме, такой как объемно полосатая, поверхностно полосатая, многослойная, паста, имеющая гелевое обрамление, или любой их комбинацией. Композиция для чистки зубов может содержаться в физически разделенных отсеках дозатора и высвобождаться параллельно. Композиции для ухода за зубами, например, описаны в ЕР 0617608 В1.
Предпочтительные композиции для чистки зубов, описаны в примерах с 21 по 24 из WO 2008/074473 А2. В дополнение к описанным выше компонентам композиции для чистки зубов в соответствии с настоящим изобретением могут содержать разнообразные необязательные ингредиенты чистки зубов, некоторые из которых описаны ниже. Необязательные ингредиенты включают, например, но не ограничиваясь ими, клеи, пенообразующие агенты, ароматизаторы, подсластители, дополнительные агенты против зубного камня, дополнительные абразивные материалы и красители. Эти и другие необязательные компоненты дополнительно описаны, например, в патентах США 5004597, США 4885155, США 3959458 и США 3937807.
Например, зубная паста может включать в себя одно или несколько поверхностно-активных веществ, хелатирующие агенты, источники фтора, активные вещества для отбеливания зубов и вещества, модифицирующие цвет зубов, загустители, смачивающие вещества, ароматизаторы и подсластители, бикарбонат щелочного металла, разнообразные носители и/или других активные агенты.
Одним из предпочтительных необязательных агентов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, является поверхностно-активное вещество, предпочтительно выбранное из группы, состоящей из саркозинатных поверхностно-активных веществ, изетионатных поверхностно-активных веществ и тауратных поверхностно-активных веществ. Предпочтительными для использования в настоящем изобретении являются соли щелочных металлов или аммонийные соли этих поверхностно-активных веществ. Наиболее предпочтительными в настоящем изобретении являются соли натрия и калия из следующих: лауроилсаркозинат, миристоилсаркозинат, пальмитоилсаркозинат, стеароилсаркозинат и олеоилсаркозинат.
Другой предпочтительный дополнительный агент представляет собой хелатирующий агент, такой как винная кислота и ее фармацевтически приемлемые соли, лимонная кислота и цитраты щелочных металлов и их смеси. Хелатирующие агенты способны образовывать комплекс с кальцием, обнаруженным в клеточных стенках бактерий. Хелатирующие агенты могут также разрушать бляшки посредством удаления кальция из кальциевых мостиков, которые помогают удерживать эту биомассу интактной. Однако, как указано выше, существует предпочтительная максимальная концентрация таких агентов или такие композиции, которые предназначены для особенно бережного лечения зубов.
Как правило, имеется дополнительное водорастворимое соединение фтора, присутствующее в средствах для чистки зубов и других пероральных композициях, в количестве, достаточном для получения концентрации фторид-иона в композиции при 25°С, и/или когда он используется от около 0,0025% до около 5,0% по массе, предпочтительно от около 0,005% до около 2,0% по массе, для обеспечения дополнительной противокариозной эффективности. Широкое разнообразие материалов, содержащих фторид-ионы, может быть использовано в качестве источников растворимого фторида в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Примеры подходящих материалов, дающих фторид-ионы, находятся в патенте США 3535421 и патенте США 3678154. Репрезентативные источники фторид-ионов включают фторид олова, фторид натрия, фторид калия, монофторфосфат натрия и многие другие. Фторид олова и фторид натрия являются особенно предпочтительными, также как их смеси.
Композиции для гигиены полости рта в соответствии с настоящим изобретением могут также включать активные вещества для отбеливания зубов, включая отбеливающие или окисляющие агенты, такие как пероксиды, пербораты, перкарбонаты, пероксикислоты, персульфаты, хлориты металлов и их комбинации. Подходящие соединения включают перекись водорода, пероксид мочевины, пероксид кальция и их смеси. Предпочтительным перкарбонатом является перкарбонат натрия. Другие подходящие отбеливающие агенты включают калиевые, аммониевые, натриевые и литиевые персульфаты и моно- и тетрагидраты пербората, и пероксигидрат пирофосфата натрия. Пригодные хлориты металлов включают хлорит кальция, хлорит бария, хлорит магния, хлорит лития, хлорит натрия и хлорит калия. Предпочтительным хлоритом является хлорит натрия. Дополнительными отбеливающими активными веществами могут быть гипохлорит и диоксид хлора.
В дополнение к агентам для отбеливания зубов в качестве отбеливающих агентов вещества, модифицирующие цвет зубов, могут рассматриваться среди активных веществ для ухода за полостью рта, полезных в настоящем изобретении. Эти вещества являются подходящими для изменения цвета зубов, чтобы удовлетворить потребителя. Эти вещества включают частицы, которые при нанесении на поверхность зубов модифицируют эту поверхность через поглощение и, или отражение света. Такие частицы обеспечивают улучшение внешнего вида, когда пленку, содержащую такие частицы наносят на поверхности зуба или зубов.

При получении зубных паст или гелей необходимо добавлять некоторые загущающие вещества для получения желательной консистенции композиции, чтобы обеспечить желательные характеристики активного высвобождения при использовании, чтобы обеспечить стабильность при хранении и чтобы обеспечить стабильность композиции и т.д. Предпочтительными загущающими агентами являются карбоксивиниловые полимеры, каррагенан, гидроксиэтилцеллюлоза, ЛАПОНИТ (изготовлен компанией Роквуд Аддитивс Лимитед) и водорастворимые соли эфиров целлюлозы, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза и натрий карбоксиметилгидроксиэтил целлюлоза. Природные камеди, такие как камедь карайи, ксантановая камедь, аравийская камедь и трагакантовая камедь также могут быть использованы. Коллоидный алюмосиликат магния или высокодисперсный диоксид кремния могут быть использованы как часть загустителя для дополнительного улучшения текстуры.
Другим необязательным компонентом перорального носителя композиции для местного применения в соответствии с настоящим изобретением является увлажнитель. Увлажнитель служит для предохранения композиции зубных паст от затвердевания при воздействии воздуха, придавая композиции ощущение влажности во рту, и для особых увлажнителей, придавая желательный сладкий вкус композиции зубной пасты. Увлажнитель на чистой увлажняющей основе, как правило, составляет от около 0% до около 70%, предпочтительно от около 5% до около 25% от массы композиции в соответствии с настоящим изобретением. Подходящие увлажнители для использования в композициях в соответствии с настоящим изобретением, включают пищевые многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, ксилит, бутиленгликоль, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль, особенно сорбит и глицерин.
Ароматизаторы и подслащивающие агенты также могут быть добавлены в композиции. Подходящие ароматизаторы включают масло грушанки, масло перечной мяты, масло кудрявой мяты, масло из цветов гвоздичного дерева, ментол, анетол, метилсалицилат, эвкалиптол, кассию, 1-ментилацетат, шалфей, эвгенол, масло петрушки, оксанон, альфа-иризон, майоран, лимон, апельсин, пропенил гуаетол, корицу, ванилин, тимол, линалоол, глицериновый ацеталь коричного альдегида, известный как CGA, а также их смеси. Ароматизаторы обычно используются в композициях в количестве от около 0,001% до около 5% от массы композиции.
Подсластители, которые могут быть использованы, включают сахарозу, глюкозу, сахарин, глюкозу, левулезу, лактозу, как описано выше, маннит, сорбит, фруктозу, мальтозу, ксилит, соли сахарина, тауматин, аспартам, D-триптофан, дигидрохальконы, соли ацесульфама и цикламата, особенно цикламат натрия и сахарин натрия и их смеси. Композиция детского питания предпочтительно содержит от около 0,1% до около 10% этих агентов, предпочтительно от около 0,1% до около 1% от массы композиции. Предпочтительно корм для домашних животных в соответствии с настоящим изобретением имеет только низкое содержание указанных Сахаров, которые могут метаболизироваться mutans Streptococci и, предпочтительно, Streptococcus mutans, чтобы избежать кариесогенную активность mutans Streptococci. Таким образом, содержание сахарозы, тростникового сахара, карамели, кукурузного сиропа, кукурузной патоки, глюкозы, фруктозы и сорбита предпочтительно поддерживать на низком уровне, с максимальным содержанием 20 мас. % от общей массы пищи младенца или предпочитаемого корма домашнего животного; максимальное содержание 5 мас. % является еще более предпочтительным, и максимальное содержание 2 мас. % является наиболее предпочтительным. Также предпочтительно, чтобы содержание каждого из сахарина, глюкозы, левулозы, лактозы, маннита, мальтозы и ксилита составляло бы менее 20 мас. %, более предпочтительно менее 5 мас. % и наиболее предпочтительно менее 2 мас. %, причем предпочтительно, без ксилита в корме для домашних животных вообще.
Лекарственная композиция для гигиены полости рта в соответствии с настоящим изобретением может также включать бикарбонатную соль щелочного металла. Бикарбонатные соли щелочных металлов растворимы в воде и, если не стабилизированы, имеют тенденцию к выделению диоксида углерода в водной системе. Бикарбонат натрия, также известный как питьевая сода, является предпочтительной бикарбонатной солью щелочного металла. Композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать от около 0,5% до около 30%, предпочтительно от около 0,5% до около 15% и наиболее предпочтительно от около 0,5% до около 5% бикарбонатной соли щелочного металла. Вода, используемая при получении коммерчески приемлемых композиций для полости рта, предпочтительно должна иметь низкое содержание ионов и свободной от органических примесей. Вода обычно составляет от около 10% до около 50% и предпочтительно от около 20% до около 40% от массы водной композиции зубной пасты в соответствии с настоящим изобретением. Эти количества воды включают свободную воду, которую добавляют, плюс вводимую с другими материалами, такими как сорбит. Диоксид титана также может быть добавлен в композиции в соответствии с настоящим изобретением. Диоксид титана представляет собой белый порошок, который придает непрозрачность композиций. Диоксид титана обычно содержится от около 0,25% до около 5% от массы композиции для чистки зубов.
рН композиций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно регулируют посредством использования буферных агентов. Буферные агенты, используемые в настоящем изобретении, относятся к агентам, которые могут быть использованы для регулировки рН композиций в диапазоне от около 4,5 до около 9,5, предпочтительно от 4,5 до 8,5. Буферные агенты включают монофосфат натрия, тринатрийфосфат, гидроксид натрия, карбонат натрия, кислый пирофосфат натрия, лимонную кислоту и цитрат натрия. Буферные агенты можно вводить в количестве от около 0,5% до около 10% от массы композиций в соответствии с настоящим изобретением. Значение рН композиции для чистки зубов измеряется из водной суспензии средства для чистки зубов 3:1, например, 3 части воды на 1 часть зубной пасты.
Другие необязательные агенты, которые могут быть использованы в композициях в соответствии с настоящим изобретением, включают диметиконсополиолы, выбранные из алкил- и алкокси-диметиконсополиолов, такие как от С12 до -С20 алкил диметиконсополиолы и их смеси. Высоко предпочтительным является цетилдиметиконсополиол, который продается под торговым названием Abil ЕМ90. Диметиконсополиол обычно присутствует в количестве от около 0,01% до около 25%, предпочтительно от около 0,1% до около 5%, более предпочтительно от около 0,5% до около 1,5% по массе. Диметиконсополиолы помогают в обеспечении положительных эффектов ощущения зуба. Другие полезные носители включают двухфазные рецептуры для чистки зубов, такие как раскрытые в патентах США 5213790, 5145666, 5281410,4849213 и 4528180.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать другие активные агенты, такие как антимикробные агенты. Среди таких агентов представлены нерастворимые в воде некатионные антимикробные агенты, такие как галогенированные дифениловые эфиры, фенольные соединения, включая фенол и его гомологи, моно- и полиалкиловые и ароматические галоидфенолы, резорцин и его производные, бисфенольные соединения и галогенированные салициланилиды, эфиры бензойной кислоты и галогенированные карбанилиды. Водорастворимые противомикробные препараты включают четвертичные аммониевые соли и бис-бигуанидные соли, среди прочих. Триклозан монофосфат является дополнительным водорастворимым антимикробным агентом. Четвертичные аммониевые агенты включают такие, в которых один или два из заместителей у четвертичного азота имеют углеродную цепь длиной (обычно алкильная группа) от около 8 до около 20, обычно от около 10 до около 18 атомов углерода, а остальные заменители (обычно алкильная или бензильная группа) имеют меньшее количество атомов углерода, например, от около 1 до около 7 атомов углерода, обычно метальные или этильные группы. Додецилтриметиламмоний бромид, тетрадецилпиридиний хлорид, домифен бромид, N-тетрадецил-4-этилпиридиний хлорид, додецилдиметил-(2-феноксиэтил)аммоний бромид, бензиддиметилстеариламмоний хлорид, цетилпиридиний хлорид, кватернизованный 5-амино-1,3-бис (2-этилгексил)-5-метил-гексагидропиримидин, хлорид бензалкония, хлорид бензетония и метилбензетоний хлорид являются примерами типичных четвертичных аммониевых антибактериальных агентов. Другими соединениями являются бис[4-(11-амино)-1-пиридиний]алканы, описанные в патенте США 4206215. Другие антимикробные агенты, такие как бисглицинат меди, глицинат меди, цитрат цинка и лактат цинка также могут быть включены. Ферменты являются другим типом активного вещества, которые могут быть использованы в композициях в соответствии с настоящим изобретением. Полезные ферменты включают такие, которые принадлежат к категории протеаз, литических ферментов, ингибиторов матрицы зубного налета и оксидаз: протеазы включают папаин, пепсин, трипсин, фицин, бромелин; литические ферменты клеточной стенки включают лизоцим, ингибиторы матрицы зубного налета включают декстраназы, мутаназы, и оксидазы включают лактатоксидазу, галатозооксидазу, оксидазу мочевой кислоты, пероксидазы включающие в себя пероксидазу хрена, миелопероксидазу, лактопероксидазу, хлоропероксидазу. Оксидазы также обладают отбеливающей/чистящей активностью, в дополнение к противомикробным свойствам. Такие агенты описаны в патенте США 2946725 и в патенте США 4051234. Другие антимикробные агенты включают хлоргексидин, триклозан, триклозанмонофосфат и ароматические масла, такие как тимол. Триклозан и другие агенты этого типа описаны в патентах США 5015466 и США 4894220. Эти агенты, которые обеспечивают эффект против зубного налета, могут присутствовать в количестве от около 0,01% до около 5,0% от массы композиции для ухода за зубами.
Термин «жевательная резинка», как определено в настоящем изобретении, означает кондитерскую композицию, которая подходит для жевания и которая содержит в себе какое-либо подходящее количество эластомера, известного специалистам в данной области техники, предпочтительно в количестве 2% или более от массы композиции. Подходящие компоненты пастилок и жевательной резинки описаны, например, в патенте США 4,083,955; в патенте США US 6,770,264 или в патенте США US 6,270,781. Предпочтительные пастилки описаны в примерах 19 и 20 WO 2008/074473 А2. Предпочтительная композиция жевательной резинки описана в примере 25 из WO 2008/074473 А2.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, содержат эластомер или смесь нескольких различных эластомеров. Эластомерные материалы, как правило, известны в данной области техники, но иллюстративные примеры включают бутадиен-стирольный каучук (SBR); синтетические камеди, полиизобутилен и сополимеры изобутилена и изопрена; природные камеди, чикл, натуральный каучук, желутонг, балату, гуттаперчу; лечикаспи; сорву и их смеси. Композиции, используемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно содержат от около 2% до около 30%, более предпочтительно от около 5% до около 25% по массе эластомера. Эти концентрации определяются желаемой конечной текстурой жевательной резинки, так как когда общий уровень эластомера ниже около 2%, базовая композиция теряет упругость, жевательную текстуру и свойство сцепления, в то время как на уровне, превышающем около 30% рецептура становится твердой, резиновой и делает жевание затрудненным. Растворители эластомеров также предпочтительно присутствует в композиции, используемых в соответствии с настоящим изобретением, поскольку они способствуют размягчению эластомерного компонента. Предпочтительные примеры растворителей эластомеров для использования в настоящем изобретении включают сложный эфир пентаэритрита частично гидрогенизированную канифоль, сложный эфир пентаэритрита и канифоли, глицериновый эфир частично димеризованной канифоли, глицериновый эфир полимеризованной канифоли, глицериновый эфир таллового масла, древесная канифоль или живичная канифоль, сложный эфир глицерина частично гидрогенизированной канифоли, сложный метиловый эфир частично гидрогенизированной канифоли и их смеси. Композиции, используемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно содержат от около 2% до около 50%, более предпочтительно от около 10% до около 35% по массе растворителя эластомера.
Пастилки в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены, например, с помощью известных в данной области техники способов для формирования прессованных таблеток, где дисахарид диспергирован по прессованному твердому носителю, при необходимости в сочетании с каким-либо соответствующим таблетирующим агентом, таким как лубриканты (например, стеарат магния) и спрессован в таблетки. Твердым носителем для таких таблетированных рецептур может быть твердое вещество, растворимое в слюне, такое как растворимый в холодной воде крахмал, или моносахарид, так что пастилка будет легко растворяться в полости рта с высвобождением содержащегося в ней дисахаридной кислоты в растворе слюны для контакта и абсорбции через слизистую оболочку полости рта/носоглотки, при помещении пастилки в рот. рН Вышеописанных рецептур может лежать в интервале приблизительно от 4 до приблизительно 8,5. Пастилки в соответствии с настоящим изобретением также могут быть получены с использованием других известных в данной области техники методик получения твердых рецептур единичной дозировки.
Промывание для ротовой полости или полоскание для ротовой полости в соответствии с настоящим изобретением может содержать EtOH или может быть свободно от EtOH, и может содержать другие активные ингредиенты, как например, противомикробные средства, такие как хлоргексидин. Предпочтительным промыванием для ротовой полости или полосканием для ротовой полости в соответствии с настоящим изобретением может быть следующим:
А Масло перечной мяты 1,2 части.
Настойка арники 3,0 части
Настойка мирры 3,0 части
Tween 5,0 частей
В Спирт 90% 50,0 частей
С Бензоат натрия 0,2 части
Подсластитель (например, аспартам) 0,02 части
Дистиллированная вода до 100,0
А должна быть хорошо перемешана, В добавляется при перемешивании и С добавляется позднее. Полученная прозрачная жидкость должна быть профильтрована в течение 48 часов после приготовления. Другое предпочтительное полоскание полости рта описывается в примере 26 WO 2008074473 А2.
Вне зависимости от лекарственной формы, жидкой или твердой, в одном из предпочтительных вариантов выполнения настоящего изобретения лекарственная форма удерживается в полости рта потребителя, предпочтительно полости рта животного в течение периода времени достаточного, чтобы способствовать контакту микроорганизма или аналога или фрагмента вышеупомянутого микроорганизма, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий, с ротовой полостью пациента.
Термины "зубная нить" и "зубная ленты", как используется в настоящем изобретении, относятся к материалу, для вытеснения и удаления разлагающихся частиц пищи, которые накапливаются в межзубные и поддесневых поверхностях, и для вытеснения и удаления бактерий, зубного налета и/или зубного камня, которые накапливается в ротовой полости. Зубная нить или зубная лента могут дополнительно содержать, в дополнение к микроорганизмам в соответствии с настоящим изобретением, как описано в настоящем изобретении, чистящие агенты, абразивные материалы, ингредиенты для контроля винного камня, отбеливатели, поверхностно-активные вещества и/или активные ингредиенты, такие как фториды, противомикробные препараты, химиотерапевтические агенты или антибиотики. Другие дополнительные агенты представляют собой агенты против зубного налета, ароматизаторы и красители. Зубная нить или зубная лента может быть в любой подходящей форме, известной специалисту в данной области техники, например, в виде PTFE (тефлоновой) зубной нити, как описано, например, в патенте США 3664915, патенте США 3953566, патенте США 3962153 патенте США 4096227, патенте США 4187390, патенте США 4256806, патенте США 4385093, патенте США 4478665, патенте США 4776358, патенте США 5033488, патенте США 5209251, патенте США 5220932, патенте США 5518012, патенте США 5718251, патенте США 5765576 или патенте США 5911228, в виде приспособления межзубной хирургической мононитью описаны, например, в патенте США 3800812, патенте США 4974615, патенте США 5760117, патенте США 5433226, патенте США 5479952, патенте США 5503842, патенте США 5755243, патенте США 5884639, патенте США 6003525 или патенте США 6027592, или в виде лент из биокомпонентов. Предпочтительно, чтобы зубная нить или зубная лента были в форме хирургической мононити с эластомерным покрытием, как описано, например, в патенте США 20050226820, или в форме зубной ленты на основе ориентированного термопластика, как описано, например, в патенте США 20020144704.
Косметические композиции для ухода за полостью рта, как описано в настоящем изобретении, в частности, композиции против зубного камня, композиции против кариеса и композиции против неприятного запаха могут быть использованы в диапазоне перорального введения человеку, а также в диапазоне перорального введения в ветеринарии, предпочтительно млекопитающих, не относящихся к человеку, более предпочтительно, для домашних животных. Если композиция используется для перорального введения в диапазоне ветеринарии, композиция может содержать другие ингредиенты, пригодные для такого введения, как известно специалисту в данной области техники.
Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
Фармацевтические композиции содержат терапевтически эффективное количество вышеуказанных микроорганизмов или их фрагментов, и могут быть приготовлены в различных формах, например, в твердой, жидкой, порошкообразной, водной, лиофилизированной формах.
Фармацевтическую композицию можно вводить с фармацевтически приемлемым носителем пациенту, предпочтительно человека или животному, а наиболее предпочтительно ребенку или домашнему животному. Термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим агентством или другими общепризнанно фармакопеями для применения для животных и, в частности для людей. Предпочтительная фармацевтическая композиция, используемая в соответствии с настоящим изобретением, не содержит лактозу в диапазоне от 1% (масс./масс.) и 6% (масс./масс.). Кроме того, предпочтительно, чтобы фармацевтическая композиция содержала бы не более 1% (масс./масс.) лактозы, например, содержала бы менее 1%, предпочтительно менее 0,9% (масс./масс.), 0,8% (масс./масс.) лактозы и т.д., или, чтобы фармацевтическая композиция содержала бы более 6%, 7%, 8% и т.д. (масс./масс.) лактозы. Альтернативно, но также предпочтительным является, чтобы фармацевтическая композиция не содержала бы лактозу.
Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или носителю, с которым вводят лекарственное средство. Такой носитель является фармацевтически приемлемыми, т.е. является не токсичным для реципиента, при используемых дозировке и концентрации. Предпочтительным являются изотонический, гипотонический или слабо гипертонический носитель и имеющий относительно низкую ионную силу, такой как это обеспечивается посредством раствора сахарозы. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Солевые растворы и водные растворы глюкозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, ион натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Вспомогательное вещество может содержать лактозу, как описано выше, но наиболее предпочтительно оно не содержит лактозы. Композиция, при необходимости, может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих агентов или агентов, буферизующих рН. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов длительного высвобождения и тому подобное. Пероральные композиции может включать стандартные носители, такие как фармацевтической степени чистоты мальтодекстрин, маннит, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington Pharmaceutical Sciences», E.W. Martin. Обезжиренное молоко, сухое обезжиренное молоко, продукты, не содержащие молоко или лактозу, также могут быть использованы. Сухое обезжиренное молоко обычно суспендируется в фосфатном солевом буфере (PBS), автоклавируется или фильтруется для удаления белковых и живых контаминантов, а затем высушивается сублимацией, высушивается при нагревании, высушивается в вакууме или лиофилизацией. Некоторые другие примеры веществ, которые могут служить фармацевтическими носителями являются сахара, такие как глюкоза и сахароза, крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал, целлюлоза и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетаты целлюлозы, порошкообразная трагакантовая камедь, солод, желатин; тальк, стеариновая кислота; стеарат магния, сульфат кальция, карбонат кальция, растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; агар, альгиновая кислота; апирогенная вода, изотонический солевой раствор, клюквенные экстракты и фосфатный буферный раствор, сухое обезжиренное молоко, а также другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических препаратах, такие как витамин С, эстроген и эхинацея, например. Смачивающие агенты и лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия, а также красители, вкусовые агенты, лубриканты, вспомогательные вещества, вещества, используемые в производстве таблеток, стабилизаторы, антиоксиданты и консерванты могут также присутствовать.
Предпочтительно, пероральная рецептура содержит лактозу, как описано в настоящем изобретении, и наиболее предпочтительно не содержит лактозу. Различные носители и/или вспомогательные вещества, пригодные для перорального введения, которые хорошо известны в данной области техники, могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Некариесогенная композиция может, при необходимости, также содержать различные известные добавки, такие как, например, консерванты, отвердители, лубриканты, эмульгаторы, стабилизаторы, эссенции и тому подобное. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество вышеуказанных соединений, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя так, чтобы обеспечить надлежащую форму для введения пациенту. Рецептура должна соответствовать способу введения.
Предпочтительная композиция в соответствии с настоящим изобретением не содержит лактозу в диапазоне от 1% (масс./масс.) до 6% (масс./масс.). Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция содержала бы не более 1% (масс./масс.) лактозы, например, она содержала бы менее 1%, предпочтительно менее 0,9% (масс./масс.), 0,8% (масс./масс.) лактозы и т.д., или, чтобы композиция содержала бы более 6%, 7%, 8% и т.д. (масс./масс.) лактозы. Альтернативно, но предпочтительным является то, чтобы композиция не содержала бы лактозу.
В дополнительном аспекте композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть получена посредством включения стадии составления связывающего микроорганизма, его фрагмента с косметически, перорально или фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. Предпочтительно, чтобы этот микроорганизм являлся бы депонированным микроорганизмом, как описано в настоящем изобретении выше, или его мутантом, производным, аналогом или его фрагментом. Предпочтительная композиция в соответствии с настоящим изобретением не содержит лактозу в диапазоне от 1% (масс./масс.) до 6% (масс./масс.). Кроме того, предпочтительно, чтобы композиция содержала бы не более 1% (масс./масс.) лактозы, например, она содержала бы менее 1%, предпочтительно менее 0,9% (масс./масс.), 0,8% (масс./масс.) лактозы и т.д., или чтобы композиция содержала бы более 6%, 7%, 8% и т.д. (масс./масс.) лактозы. Альтернативно, но предпочтительным является то, чтобы композиция не содержала бы лактозы.
2
12
3
8
2
13
Композиция в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно пищевая или кормовая композиции, включая фармацевтические композиции, содержит связывающий микроорганизм, как описано выше, возможно в термически инактивированной или лиофилизированной форме, в количестве от 10 до 10 клеток предпочтительно от 10 до 10 клеток на мг в твердой форме композиции. В случае жидкой формы композиции, количество микроорганизмов составляет от 10 до 10 клеток на мл. Однако для конкретной композиции количества микроорганизмов могут быть различным, как это описано в настоящем изобретении.
Предпочтительно, чтобы концентрация связывающих микроорганизмов в композиции в соответствии с настоящим изобретением составляла бы от 0,01 мас. % до 10 мас. % по отношению к общей массе композиции. Еще более предпочтительно, чтобы концентрация связывающих микроорганизмов в композиции в соответствии с настоящим изобретением составляла бы от 0,025 мас. % до 2 мас. % Как описано выше, когда используются фрагменты вместо связывающих клеток, концентрация фрагментов выбирается так, чтобы содержание пептидогликана связывающих клеток было бы таким же.
В соответствии с настоящим изобретением, термин пища включает в себя все годные в пищу и пригодные для питья продукты питания и напитки. Соответственно, микроорганизм или его фрагмент могут быть включены в пищу или питье. Таковы, например, камедь, спрей, напитки, конфеты, детское питание, мороженое, замороженный десерт, сладкая заправка для салата, молочные препараты, сыр, творог, йогурт без лактозы, сквашенное молоко, сливки или взбитые сливки и тому подобное.
Продукты на основе молока предусмотрены в рамках настоящего изобретения. Молоко, однако, понимается в значении продуктов животного происхождения, таких как коровы, козы, овцы, буйволы, зебры, лошади, обезьяны, или верблюды, и тому подобное. Молоко может быть в нативном состоянии, восстановленным молоком, обезжиренным молоком или молочной добавкой с соединениями, необходимыми для роста бактерий или для последующей обработки ферментированного молока, такие как жиры, белки дрожжевого экстракта, пептон и/или поверхностно-активное вещество, например. Термин молоко также применяется к тому, что обычно называют растительным молоком, то есть экстрактам растительного материала, которые были обработаны или не обработаны, такие как, бобовые растения (соя, нут, чечевица и т.п.), или масличные (рапс, соя, фасоль, кунжут, хлопок и тому подобное), экстракт которых содержит белки в растворе или в коллоидной суспензии, которые коагулируются посредством химического воздействия, посредством кислотной ферментации и/или нагревания. Наконец, слово молоко и означает смеси молока животных и растительного молока.
5
7
Там, где связывающий микроорганизм настоящего изобретения или его фрагмент добавляют в йогурт и тому подобное, имеющие аналогичное содержимое, достаточно добавить микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением в концентрации от около 10-10 клеток/мл, или эквивалентное количества его фрагмента. В таком случае, можно полностью предотвратить или ингибировать образование биопленки посредством mutans Streptococci, предпочтительно Streptococcus mutans, и таким образом, предотвратить или замедлить развитие зубного камня, неприятного запаха изо рта или кариеса индуцированного кариесогенными штаммами, без существенных побочных эффектов на качество напитка такового.
Такой пищевой напиток или корм могут быть получены общим способом для производства пищевых продуктов и напитков или кормов, включая добавление активного ингредиента в сырой или приготовленный материал пищи, напитка или корма. Пищу, напиток или корм в соответствии с настоящим изобретением можно формовать и гранулировать таким же образом, как обычно используется для пищевых продуктов, напитков и кормов. Формование и гранулирование включает методы гранулирования, такие как гранулирование в псевдоожиженном слое, гранулирование перемешиванием, экструзионное гранулирование, валковое гранулирование, гранулирование в потоке газа, гранулирование формовкой под давлением, горячее гранулирование, гранулирование распылением, и инжекционное гранулирование, методы покрытия, такие как дражирование, покрытие в псевдоожиженном слое и сухое покрытие, сухой губкой, способом избыточного пара, методом матированием пеной, расширительными методами, такими как метод микроволновой инкубации и экструзионными методами с помощью машин экструзионного гранулирования и экструдеров.
Пища, напитки или корма в соответствии с настоящим изобретением включают в себя любую пищу, напитки или корма, которые содержат связывающий микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением или его фрагмент в качестве активного ингредиента. Активный ингредиент в пище, напитке или корме специально не ограничивается какой-либо концентрацией тех пор, пока в получающихся пище, напитке или корме может оказывать свою активность специфически связываться с mutans Streptococci. Концентрация активного ингредиента составляет предпочтительно от 0,001 до 100% по массе, более предпочтительно от 0,01 до 100% по массе и наиболее предпочтительно от 0,1 до 100% по массе от пищи, напитка или корма, содержащие такой активный ингредиент или по отношению к числу клеток тех, которые описаны в настоящем изобретении.
Конкретные пищевые продукты или напитки, в которых активный ингредиент добавляется, включают, например, соки, прохладительные напитки, супы, чаи, кисломолочные напитки, молочные продукты, такие как кисломолочные продукты, мороженое, сливочное масло, сыр, переработанное молоко и обезжиренное молоко, мясные продукты, такие как ветчина, колбаса, и гамбургер, продукты типа рыбного пирога, яичные продукты, такие как приправленные яичные рулеты и яичный творог, кондитерские изделия такие как печенье, желе, закуски, и жевательную резинку, хлеб, макаронные изделия, соленые огурцы, копченые продукты, сушеную рыбу и приправы. Форма пищевого продукта или напитка включает, например, порошковые пищевые продукты, листовые пищевые продукты, бутилированные продукты, консервированные продукты, автоклавированные продукты, капсулированные пищевые продукты, таблетки пищевые продукты и жидкие пищевые продукты.
Пищевой продукт или напиток в соответствии с настоящим изобретением, которые предназначены для проглатывания младенцами, т.е. содержащие связывающий микроорганизм или его фрагмент с активностью специфически связываться с mutans Streptococci, предпочтительно представляют собой питательную смесь для грудных детей. Такая питательная композиция для младенцев включает модифицированное молоко, приготовленное для младенцев, молоко с гидролизованными белками, модифицированное молоко для специфического питания или детского питания и блюда, приготовленные для малышей. Форма питательной смеси для младенцев включает, но не ограничивается этим специальное порошковое молоко, высушенное и распыленное и детское питание, а также включают в себя обычные продукты, такие как мороженое, сквашенное молоко, и желе для проглатывания младенцами.
Питательная композиция для младенцев, а также питательные продукты или кормовые композиции для животного и особенно домашних животных в соответствии с настоящим изобретением в основном состоят из белка, липидов, сахаридов, витаминов и/или минеральных веществ. В питательную композицию активный ингредиент вмешивается с этими компонентами. Белок включает молочные белки, такие как обезжиренное молоко, казеин, сырная сыворотка, концентрат сывороточного белка и изоляты сывороточного белка и их фракции, такие как альфа-s-казеин, бета-казеин, альфа-лактоальбулин и бета-лактоглобулин. Дополнительно яичный белок, такой как белок яичного желтка, белок яичного белка и яичный альбумин, или соевый белок, такой как обезжиренный соевый белок, выделенный соевый белок и концентрированный соевый белок могут быть использованы. Помимо этих белков, такие как клейковина пшеницы, белки мяса рыбы, белки мяса крупного рогатого скота и коллаген могут быть также использованы удовлетворительно. Дополнительно фракции этих белков, пептиды из кислотной или ферментативной их обработки или свободные аминокислоты могут также удовлетворительно использоваться. Свободные аминокислоты могут служить в качестве источников азота и могут дополнительно быть использованы для конкретных физиологических активностей. Такие свободные аминокислоты включают, например, таурин, аргинин, цистеин, цистин и глутамин. Для собак аминокислоты включают аргинин, метионин, гистидин, фенилаланин, изолейцин, треонин, лейцин, триптофан, лизин и валин. Для кошек таурин также имеет важное значение. Липиды включают животные жиры и масла, такие как молочный жир, лярд, мясной жир и рыбий жир, растительные масла, такие как соевое масло, рапсовое масло, кукурузное масло, кокосовое масло, пальмовое масло, пальмоядровое масло, сафлоровое масло, перилловое масло, льняное масло, масло энотеры, триглицериды с жирными кислотами средней длины и хлопковое масло, жиры и масла, производимые бактериями, и фракционированные масла вышеперечисленного, их гидрогенизированные масла и их переэтерифицированные масла. Количество липидов, которое должно быть смешано, варьируется в зависимости от применения.
Кроме того, предпочтительными ингредиентами пищевых продуктов и кормов, особенно кормов для домашних животных являются омега-6 жирные кислоты и омега-3 жирные кислоты. Особенно предпочтительными являются линолевая кислота, предпочтительно в виде кукурузы, сои, рапса, сафлоровое и подсолнечное масло, цельное зерно и/или жиры домашней птицы; арахидоновая кислота, предпочтительно в виде птичьего жира, мясо, яичный желток и/или рыбий жир; гамма-линолевая кислота, предпочтительно в виде масла семян черной смородины, масло бурачника и/или масло энотеры; дигомогаммалиноленовая кислота, предпочтительно в форме селезенки, почек, надпочечников и/или метаболизированной из gla (гамма-линоленовая кислота); альфа-линоленовая кислота, предпочтительно в виде льняного масла, масла канолы, соевого и/или орехового масла; эйкозапентаеновая кислота, предпочтительно в форме холодолюбивых рыб и их масла, докозагексаеновая кислота, предпочтительно в виде холодолюбивых рыб и их масла.
Сахариды включают, например, один или несколько крахмалов, растворимые полисахариды, декстрины, моносахариды, такие как сахароза, лактоза, как описано в настоящем изобретении, мальтоза, глюкоза и фруктоза и других олигосахариды. Предпочтительные сахариды включают глюкозу, фруктозу, мед, галактозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, декстрины, гликоген и крахмал. Однако, как описано выше, максимальное содержание глюкозы, фруктозы, меда, галактозы, лактозы, сахарозы и мальтозы предпочтительно составляет 20 мас. % от общей массы композиции, более предпочтительно 5 мас. % от общей композиции и наиболее предпочтительно 2 мас. % от общей массы композиции. Еще более предпочтительно, вышеупомянутый максимум содержания 20 мас. %, более предпочтительно 5 мас. % и наиболее предпочтительно 2 мас. % относится к общему количеству всех веществ группы: тростниковый сахар, карамель, кукурузная меласса, кукурузный сироп, глюкоза, фруктоза, галактоза, глюкоза, мед, лактоза, левулоза, мальтоза, маннит, сахарин, сорбит, ксилит и сахароза, и наиболее предпочтительно, к общему числу моно- и дисахаридов.
Также предпочтительными являются пищевые волокна, предпочтительно выбранные из целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина, растительных камедей и смеси растворов камедей, мякоти свеклы, гуаровой камеди, гуммиарабика, ксантановой камеди и камеди рожкового дерева. Общее количество таких сахаридов предпочтительно составляет от 40 до 80% по массе от общего количества твердых веществ в питательной композиции. Кроме того, искусственные подсластители, такие как аспартам, могут быть использованы удовлетворительно. Количество искусственного подсластителя составляет соответствующим от 0,05 до 1,0% на общую массу твердых веществ в питательной композиции.
Витамины включают, но не ограничиваются этим: ликопин в качестве основного компонента и дополнительно включают в себя, например, витамины, такие как витамин А, витамин группы В, витамины С, D, Е и витамин группы К, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, никотинамид, карнитин, холин, инозит и биотин до тех пор, пока такие витамины могут быть введены детям или домашним животным. Такие витамины предпочтительно составляют от 10 мг до 5 г % на общую массу твердых веществ в питательной композиции для младенцев. Предпочтительные витамины для питательной композиции для младенцев и/или животных, предпочтительно домашних животных, включают:
Витамин А (ретинол) и/или бета-каротин в качестве предшественника. Витамин предпочтительно присутствует в виде печени, рыбьего жира, моркови, зеленых листовых овощей, яичных желтков и/или желтых фруктов или в виде синтетической формы витамина А и/или бета-каротина.
Витамин D (кальциферол). Витамин предпочтительно присутствует в виде палтуса и/или масла печени трески, морской рыбы, сыра, йогурта и/или яйца или в виде синтетической формы витамина D.
Витамин Е (токоферол). Витамин предпочтительно присутствует в виде зародышей, кукурузы, орехов, семян, шпината и/или других зеленых листовых овощей, спаржи, растительных масел или в виде синтетической формы витамина Е.
Витамин K (нафтохинон). Витамин предпочтительно присутствует в виде капусты, цветной капусты, шпината и/или других зеленых листовых овощей, зерновых, сои и/или других овощей или в виде синтетической формы витамина K. Предпочтительно, пищевые продукты или корма не содержат менадион.
Витамин B1 (тиамин). Витамин предпочтительно присутствует в виде зародышей пшеницы, риса и/или других цельных зерен, нежирного мяса (особенно свинины), печени, рыбы, дрожжей, сушеных бобов, гороха и/или соевых бобов или в виде синтетических форм витамина B1.
Витамин B2 (рибофлавин). Витамин предпочтительно присутствует в виде постного мяса, печени, рыбы, яиц, дрожжей, сыра, бобовых, орехов и/или зеленых листовых овощей или в виде синтетической формы витамина B2.
Витамин B3 (ниацин). Витамин предпочтительно присутствует в виде печени, постного мяса, птицы, рыбы, орехов, дрожжей, бобовых, спаржи, семян и/или зеленых листовых овощей или в виде синтетических форм витамина B3.
Витамин B5 (пантотеновая кислота). Витамин предпочтительно присутствует в виде яиц, рыбы, постной говядины, бобовых, дрожжей, брокколи и/или других овощей семейства капустных, белого и/или сладкого картофеля или в виде синтетических форм витамина B5.
Витамин B6 (пиридоксин). Витамин предпочтительно присутствует в виде мяса, рыбы, яиц, бананов и/или цельного зерна или в виде синтетических форм витамина B6.
Витамин B8 (биотин). Витамин предпочтительно присутствует в виде сырого яичного желтка, печени и/или овощей или в виде синтетических форм витамина B8.
Витамин B9 (фолиевая кислота, фолат). Витамин предпочтительно присутствует в виде моркови, дрожжей, печени, яичного желтка, дыни, абрикосов, тыквы, фасоли, ржи, цельной пшеницы и/или зеленых листовых овощей или в виде синтетических форм витамина B9.
Витамин B12 (кобаламин). Витамин предпочтительно присутствует в виде рыбы, печени, мяса, птицы, яиц и/или сыра или в виде синтетических форм витамина B12.
Витамин С (аскорбиновая кислота). Витамин предпочтительно присутствует в виде лимонного фруктового сока или мякоти, ягод, помидор, цветной капусты, картофеля, зеленых листовых овощей и/или зеленого перца или в виде синтетических форм витамина С. Добавки в соответствующей форме, предпочтительно в виде аскорбата кальция, являются предпочтительным из-за их благотворного воздействия на собак, страдающих от хронических расстройств суставов и опорно-двигательного аппарата. У щенков они помогают предотвратить развитие таких расстройств.
Кроме того, минеральные вещества включают кальций, магний, калий, натрий, железо, медь, цинк, фосфор, хлор, марганец, селен и йод. Такие минеральные вещества предпочтительно составляют от 1 мг до 5 г на общую массу твердых веществ в питательной композиции для младенцев.
Помимо этих компонентов, описанных выше, питательная композиция для младенцев, а также пищевая или кормовая композиции для животных, предпочтительно домашних животных, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть смешаны с любым компонентом, желательно смешаны с питательными композициями, например, с пищевыми волокнами, нуклеотидами, нуклеиновыми кислотами, ароматизаторами и красителями.
Пищевой продукт или напиток, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть использован в качестве лечебного питания или напитка или функционального пищевого продукта или напитка для предотвращения и/или лечения кариеса и/или для предотвращения или лечения неприятного запаха изо рта и/или для предотвращения образования или лечения зубного камня.
Когда пищевой продукт или напиток в соответствии с настоящим изобретением принимают внутрь, количество, подлежащее приему не ограничено каким-либо специфическим образом. Количество, которое должно поступать в организм, как правило, находится в пределах от 0,1 до 50 г, предпочтительно от 0,5 г до 20 г в день, в расчете на общее количество активного ингредиента.
Пищевой продукт или напиток постоянно поглощается в этом количестве на срок от одного дня до 5 лет, предпочтительно от 2 недель до одного года. В настоящем патенте потребляемое количество можно регулировать к соответствующему диапазону в зависимости от тяжести симптомов индивидуума, принимающего пищевой продукт или напиток, возраста и массы его тела, и тому подобное.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать в дополнение к связывающему микроорганизму или его фрагменту, крупы, отруби, жмыховую муку, кормовое сырье животного происхождения, другое пищевое сырье и очищенные продукты. Зерновые могут включать в себя, сельдерей пахучий, пшеницу, ячмень, овес, рожь, коричневый рис, гречку, просо итальянское, просо китайское, Deccan grass, кукурузу и сою. Отруби могут включать в себя, рисовые отруби, обезжиренные рисовые отруби, отруби из низкосортной муки, проростки пшеницы, ячменные отруби, отборные кормовые гранулы, кукурузные отруби и проростки кукурузы. Жмыховая мука включает, например, соевую муку, соевый порошок, льняную муку, хлопковую муку, арахисовую муку, подсолнечную муку, кокосовую муку, пальмовую муку, кунжутную муку, муку из подсолнечника, рапсовую муку, жмыховую муку из капока и муку из горчицы. Сырьевые продукты для корма животного происхождения включает, например, рыбную муку, импортируемые продукты, цельные продукты, продукты с побережья, рыбный гидролизат, мясной порошок, мясокостную муку, кровяную муку, гидролизованные волосы, костную муку, побочные продукты скотобойни, перьевую муку, куколки тутового шелкопряда, обезжиренное молоко, казеин, сухую сыворотку и криль. Другое сырьевые продукты для корма включают в себя, например, стебли растений и листья, таких как люцерна, hey cube, продукты из листьев люцерны, порошка листьев рожкового дерева, побочные продукты промышленности переработки кукурузы, такие как мука из кукурузного глютена, кормовой кукурузный плотен и жидкий кукурузный экстракт, крахмал, сахар, дрожжи, побочные продукты бродильного производства, такие как пивной отстой, солодовый корень, ликерный отстой и отстой соевого соуса и сельскохозяйственные побочные продукты, такие как остатки переработки цитрусовых, остаток соевого творога, кофейная гуща и остаток какао, маниока, конские бобы, гуаровая мука, морские водоросли, спирулина и хлорелла. Очищенные продукты включают, например, белки, такие как казеин и альбумин, аминокислоты, крахмал, целлюлозу, сахариды, такие как сахароза и глюкоза, минеральные вещества и витамины.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать одну или несколько добавок. Такие добавки для пищевых продуктов могут быть получены посредством общего способа получения добавки для пищевых продуктов, напитков и кормов. При необходимости, добавки для общего использования в пищевых продуктах, напитках или корма, например, добавки, описанные в Food Additive Handbook (The Japan Food Additives Association; issued on January 6, 1997) могут быть добавлены удовлетворительным образом, в том числе подсластители, красители, консерванты, загустители и стабилизаторы, антиоксиданты, закрепители окраски, отбеливатели, антисептики, гуммиоснову, горечи, ферменты, отбеливатели, подкислитель, приправы, эмульгаторы, усилители, агенты для производства, ароматизаторы и экстракт из пряностей. Кроме того, обычные сахариды, крахмал, неорганические вещества, растительные порошки, вспомогательные вещества, дезинтеграторы, лубриканты, связывающие агенты, поверхностно-активные вещества, пластификаторы и агенты, упоминаемые ранее для фармацевтических таблеток могут быть добавлены удовлетворительным образом.
Подсластители включают браззеин; куркулин; эритрит; глицирризин; глицерин, Е422; гидрогенизированный гидролизат крахмала; инулин; изомальту, Е953; лактитол, Е966; архат; мабинлин; мальтит, Е965; мальтоолигосахариды; маннитол, Е421; миракулин; монатин; монеллин; пентадин; сорбит, Е420; экстракты стевии или стевиогликозиды, особенно стевиозид, ребаудиозид А, ребаудиозид С, дулькозид А, рубузозид, стевиолбиозид Н и ребаудиозид В; тагатоза; тауматин, Е957; ксилит, Е967, ацесульфам калия, Е950; элитам; аспартам, Е951, соль аспартама-ацесульфам, Е962; цикламат, Е952; дульцин; глуцин; неогесперидин дигидрохалкон, Е959; неотам, Р-4000, сахарин, Е954; сукралоза, Е955; солодка; ксилоза и раканка (фрукт Momordica grosvenori).
Красители включают каротиноиды и живицу куркумы, флаваноид, карамельный краситель, краситель спирулины, хлорофилл, краситель пурпурной сладкой картошки, краситель пурпурного ямса, перилловый краситель и краситель из голубики.
Консерванты включают, например, сульфит натрия, бензоаты, бензоиновый экстракт, сорбаты и пропионаты.
Загустители и стабилизаторы включают, например, камеди, такие как аравийскую камедь и ксантановую камедь, альгинаты, хитин, хитозан, экстракт алоэ, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, казеин натрия, кукурузный крахмал, карбоксиметилцеллюлозу, желатин, агар, декстрин, метилцеллюлозу, поливиниловый спирт, микроволокнистую целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, целлюлозу морских водорослей, полиакрилат натрия, полифосфат натрия, каррагенан или стенки дрожжевых клеток.
Антиоксиданты включают, например, витамин группы С, этилендиаминтетраацетат натрия, эталендиаминтетраацетат кальция, эриторбиновую кислоту, оризанол, катехин, кверцетин, экстракт гвоздики, обработанный ферментом рутин, яблочный экстракт, экстракт семян кунжута, дибутилгидрокситолуол, экстракт фенхеля, экстракт хрена, водный экстракт сельдерея, экстракт чая, токоферолы, рапс, экстракт кофейных зерен, экстракт семян подсолнечника, феруловую кислоту, бутилгидроксианизол, экстракт листьев черники, экстракт прополиса, экстракт перца, экстракт бальзамина садового, галловую кислоту, экстракт эвкалипта, и экстракт розмарина.
Агенты для закрепления окраски включают, например, нитрит натрия. Отбеливатели включают, например, сульфит натрия.
Антисептики включают, например, о-фенилфенол. Гуммиоснова включает, например, метил ацетилрицинолеат, воск urushi, этерифицированную канифоль, смолу элеми, воск урукури, смолу каури, воск карнауба, эфир глицерина и жирной кислоты, спермацетовый воск, копайский бальзам, копаловую смолу, каучук, воск из рисовых отрубей, тростниковый воск, шеллак, джелутонг, эфир сахарозы и жирной кислоты, деполимеризации натуральный каучук, парафиновый воск, пихтовый бальзам, эфиры жирных кислот и пропиленгликоля, порошкообразную целлюлозу, порошкообразную рисовой шелухи, масло жожоба, полиизобутилен, полибутен, микрокристаллический воск, мастику, пчелиный воск и фосфат кальция. Горечи включают, например, изо-альфа-горькую кислоту, кофеин, экстракт каваратаке (Coriolus versicolor), экстракт хинина из красной перуанской коры, экстракт коры филодендрона, экстракт корня горечавки, экстракты из пряностей, ферментативно модифицированный нарингин, экстракт ямайской кассии, теабромин, нарингин, экстракт кассии, экстракт Польши, экстракт изодониса, оливковый чай, горький апельсин (Citrus aurantium), экстракт хмеля и полыни. Ферменты включают, например, амилазу, трипсин или сычужный фермент. Отбеливателей включают, например, воск уруши и японский воск. Подкислитель, включает, например, адипиновую кислоту, итаконовую кислоту, лимонную кислоту, янтарную кислоту, ацетат натрия, винную кислоту, диоксид углерода, молочную кислоту, фитиновую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту и фосфорную кислоту. Приправы включают, например, аминокислоты, такие как аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, глютамин, аланин, изолейцин, глицин, серии, цистеин, тирозин, лейцин и пролин, нуклеиновые кислоты, такие как инозинат натрий уридинат натрия, гуанилат натрия, цитидилат натрий, рибонуклеотид кальция и рибонуклеотид натрия, органические кислоты, такие как лимонная кислота и янтарная кислота, хлорид калия, разбавленный рассол хлорида натрия, технический хлорид калия, сывороточная соль, трикалий фосфат, дикалий гидрофосфат, калий дигидрофосфат, динатрий гидрофосфат, натрий дигидрофосфат, тринатрийфосфат и экстракт хлореллы.
Усилители включают, например, соли цинка, витамин группы С, различные аминокислоты, 5-адениловую кислоту, хлорид железа, гесперидин, различный кальцинированный кальций, различный некальцинированный кальций, дибензоилтриамин, гидроксид кальция, карбонат кальция, гидрохлорид тиамина, каротин из Дуналиелла, токоферол, никотиновая кислота, каротин моркови, каротин пальмового масла, пантотенат кальция, витамин А, гидроксипролин, пирофосфат кальция дигидрофосфат железа, пирофосфат железа, ферритин, гемовое железо, менахиноном, фолиевую кислоту и рибофлавин.
Агенты для производства включает, например, технологические вспомогательные вещества, такие как ацетон и ионообменные смолы.
Ароматизаторы включают, например, ванильную эссенцию и экстракты пряностей, включают, например, экстракт стручкового перца.
Эти различные добавки могут быть добавлены к активному ингредиенту, с учетом способа введения, в соответствии с настоящим изобретением.
9
Предполагается, что композиция в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно композиция пищевого продукта или корма или фармацевтическая композиция, включает в себя вышеупомянутый связывающий микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий в виде пробиотического микроорганизма. А именно, в дополнение к пробиотическому эффекту, указанный выше пробиотический микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, можно использовать для лечения и/или предотвращения образования биопленки, вызванной mutans Streptococci. Количество указанного пробиотического микроорганизма достаточно высокое, чтобы существенно положительно модифицировать состояние, подлежащее лечению, предпочтительно кариес, зубной камень и/или неприятный запах изо рта, но достаточно низкое, чтобы избежать серьезных побочных эффектов (при разумном соотношении польза/риск) в рамках здравого медицинского суждения. Эффективное количество указанного пробиотического микроорганизма будет зависеть от конкретной цели, которая должна быть достигнута, возраста и физического состояния пациента, подвергаемого лечению, тяжести основного заболевания, продолжительности лечения, характера сопутствующей терапии, конкретного используемого микроорганизма. Эффективное количество указанного пробиотического микроорганизма будет, таким образом минимальным количеством, которое обеспечит желаемое специфическое связывание с mutans Streptococci. Присутствие, например, 1×10 бактерий, как жизнеспособных, так и нежизнеспособных целых клеток в 0,05 мл раствора фосфатно-солевого буфера, или в 0,05 мл суспензии агара или сухой эквивалентной массе фрагментов клеточной стенки, эффективно при введении в количествах от около 0,05 мл до около 20 мл. Несомненные практические успехи состоят в том, что пробиотические организмы могут быть введены в удобной форме, такой как пероральный путь, в зависимости от способа введения, может потребоваться покрыть активные ингредиенты, которые содержат указанные пробиотические организмы, материалом, чтобы защитить указанные организмы от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать указанные организмы. Для того чтобы ввести пробиотические организмы способом, отличным от парентерального введения, они должны быть покрыты, или вводиться с материалом для предотвращения инактивации. Например, пробиотические организмы могут вводиться совместно с ингибиторами ферментов или в липосомах. Ингибиторы ферментов поджелудочной железы включают ингибитор трипсина, диизопропилфторфосфат (DFP) и тразилол. Липосомы включают эмульсии вода-в-масле-в-воде Р40, а также обычные и специально разработанные липосомы, которые транспортируют молочнокислые бактерии или их побочные продукты к мочеполовым поверхностям. Дисперсии также могут быть получены, например, в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. Обычно дисперсии получают включением различных стерилизованных пробиотических организмов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и методики сублимационной сушки, которые приводят к порошку активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из предварительно стерилизованного фильтрованием их раствора. Дополнительные предпочтительные методы приготовления включают, но не ограничиваются лиофилизации и термической сушки.
Композиция настоящего изобретения включает также продукты, предназначенные для перорального или трансбуккального введения, которые содержат приемлемый фармацевтический носитель, как описано в настоящем изобретении, в котором или на котором, клетки вышеупомянутого микроорганизма, принадлежащего к группе молочнокислых бактерий, добавляют в свежей, концентрированной или высушенной форме, например. Эти продукты могут быть обеспечиваться в виде суспензии для приема внутрь, геля, распылителя, капсулы, твердой желатиновой капсулы, сиропа, или в любом другой галеновой форме, известной специалистам в данной области техники.
9
9
Когда пробиотические организмы подходящим образом защищены, как описано выше, активное соединение можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или с усваиваемым съедобным носителем, или оно может быть заключено в твердые или мягкие желатиновые капсулы, или оно может быть спрессовано в таблетки, предназначенные для того, чтобы пройти через желудок (т.е. с кишечнорастворимым), или оно может быть включено непосредственно в пищевой рацион. Для перорального терапевтического введения пробиотические микроорганизмы могут быть инкорпорированы в вспомогательные вещества и использоваться в виде таблеток для приема внутрь, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобное. Композиции и препараты в соответствии с настоящим изобретением получают таким образом, что пероральная стандартная лекарственная форма содержит, например, приблизительно 1×10 жизнеспособных и нежизнеспособных клеток на мл, например, лактобактерий на мл. Пробиотический организм составляется для удобного и эффективного введения в эффективных количествах с подходящим приемлемым носителем для фармацевтических или пищевых целей в стандартной лекарственной форме, как раскрыто выше. Стандартная лекарственная форма может, например, содержать основное активное соединение в количестве приблизительно 10 жизнеспособных или нежизнеспособных, например, лактобактерий на мл. В случае композиций, содержащих дополнительные ингредиенты, такие как пребиотики, дозировки определяются на основе обычной дозы и способа введения указанных ингредиентов.
Предпочтительными ингредиентами в составе пищевых продуктов и кормов в соответствии с настоящим изобретением являются: люцерна, порошковый концентрат люцерны, дегидратированая мука люцерны, питательный концентрат люцерны, альфа-липоевая кислота, животный гидролизат, животный жир, аргинин, искусственные ароматизаторы, аскорбиновая кислота, спаржа, Bacillus subtilis, бекон, беконовая ароматическая добавка, ячмень, зелень ячменя, ячменный солод, базилик, бобы, говядина, мясо-костная мука, бульон из говядины, говяжьи субпродукты, говяжья приправа, говяжья печень, говяжье мясо, говяжий жир, свекольный жом, мякоть свеклы (с удаленным сахаром), свекла, бета-каротин, ВНА, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophilum, биотин, blue 2, blue 2 и других красители, черника, костная мука, масло бурачника, сухие пивные дрожжи, пивные дрожжи, экстракт пивных дрожжей (ферментируемые остатки Saccharomyces cerevisiae), пивоваренная рисовая крупка, брокколи, неочищенный рис, мука из коричневого риса, кальций, аскорбат кальция, карбонат кальция, хлорид кальция, йодат кальция, пантотенат кальция, фосфат кальция, пропионат кальция, сульфат кальция, меласса тростникового сахара, мука из канолы, каноловое масло, кантаксантин, карамель, карамельный колер, кармин, каррагинан, каррагенановая камедь, морковный порошок, морковь, казеин, зубатка, блюда из зубатки, сельдерей, целлюлоза, целлюлозный порошок, сырный порошок, хелатированный кобальт, хелатированная медь, хелатированное железо, хелатированный калий, курица, куриный бульон, куриные субпродукты - только органы, куриные субпродукты, блюда из куриных субпродуктов, куриные субпродукты - только мясо органов, куриные натуральные хрящи, куриный жир, натуральный куриный жир, куриная ароматическая добавка, куриные потроха, куриная печень, гидролизат куриной печени, ароматическая добавка с запахом куриной печени, куриная мука, курица а-ля натюрель, куриный бульон, экстракт цикория, холин хлорид, хондроитин сульфат, корица, лимонная кислота, лимонная кислота и розмарин, лимонная кислота и экстракт розмарина, цитрусовый пектин, масло из цветов гвоздичного дерева, аминокислотный хелат кобальта, карбонат кобальта, протеинат кобальта, треска, медь, аминокислотный хелат меди, медный аминокислотный комплекс, оксид меди, протеинат меди, сульфат меди, кукуруза, кукурузные отруби, кукурузная мука, мука из зародышей кукурузы, кукурузная клейковина, кукурузная глютеновая мука, кукурузная крупа, кукурузная мука, кукурузное масло, кукурузный крахмал, кукурузный крахмал модифицированный, кукурузный сироп,
дробленный ячмень, дробленая перловая крупа, клюква, порошок клюквы, куриные обвалки, обвалки ягненка, обвалки индейки, дегидратированная люцерна, дегидратированная люцерновая мука, дегидратированная морковь, дегидратированный картофель, глюкоза, DHA, дикальций фосфат, DL-альфа-токоферол ацетат, DL-метионин, высушенный животный гидролизат, сушеные яблоки, сухой экстракт ферментации Bacillus lichemformis, сухой экстракт ферментации Bacillus subtilis, сушеная мякоть свеклы, сушеная мякоть свеклы ((с удаленным сахаром), сушеные ягоды черники, сухие пивные дрожжи, сушеная пахта, сушеный стручковый перец, сушеная морковь, целлюлоза, сушеный сыр чеддер, сушеный сыр, высушенный сырный порошок, сушеные куриные хрящи, сушеная куриная печень, высушенный куриный бульон, высушенный корень цикория, сушеная мякоть цитрусовых, высушенная приготовленная индейка, сушеная клюква, сушеные яйца, сухой яичный порошок, сухой яичный продукт, яичный порошок, сушеный чеснок, сушеный имбирь, сушеные выжимки винограда, сушеная зеленая фасоль, сушеная ламинария, высушенная мука из ламинарии, сухие гидролизаты печени, высушенные мясные побочные продукты, сушеная паприка, сушеные хлопья петрушки, сушеный горох, сушеный жом простой свеклы, сушеный картофель, сушеный шпинат, сушеный сладкий картофель, сушеные томатный выжимки, сушеные растительные волокна моркови, сухая сыворотка, сушеный ямс, утка, твердая мука, манная крупа, обогащенная мононитратом тиамина, яичная лапша, яичные обломки, яичные продукты, яйца, Enterococcus faecium, этоксиквин, эвкалиптовое масло, сульфат железа, клетчатка, рыба, рыбные бульоны, рыбная мука, натуральная рыбная мука, рыбий жир, льняная мука, семена льна, мука из льняного семени, фолиевая кислота, фолиевая кислота пиридоксина гидрохлорида, пищевой крахмал, свежевыжатый сок, свежая курица, свежие куриные субпродукты, фруктоолигосахариды, фумаровая кислота, чеснок, чесночный экстракт, чесночная отдушка, чесночное масло, чесночный порошок, желатин, имбирь, экстракт имбиря, глюкозамин, глюкозамин гидрохлорид, глицерин, глицерин, моностеарат глицерина, глицин, зеленая фасоль, зеленый чай, дробленная кукуруза, дробленные семена льна, дробленные семена подорожника, дробленный рис, дробленная пшеница, дробленная пшеничная мука, дробленный цельного зерна ячмень, дробленный цельного зерна кукурузы, дробленный цельного зерна сорго, дробленный цельного зерна пшеницы, дробленый горох, дробленная цельного зерна пшеница, дробленная желтозерная кукуруза, гуаровая камедь, гуммиарабик, палтус, селедочная мука, селедочное масло, соляная кислота, инозит, йод, йодированная соль, аминокислотный хелат железа, железный комплекс аминокислоты, оксид железа, протеинат железа, сульфат железа, L-аланин, L-аргинин, L-аскорбил-2-полифосфат, L-аскорбил-2-полифосфат a, L-карнитин, L-лизин, L-лизина моногидрохлорид, L-триптофан, Lactobacillus acidophilus, баранина, бараний бульон, субпродукты баранины, гидролизат баранины, бараний жир, баранья печень, баранья мука, бараний бульон, бараний рубец, лецитин, чечевица, салат-латук, печень, камедь рожкового дерева, лютеин, ликопен, лизин, макрель, оксид магния, солодовый экстракт, осоложенная ячменная мука, сульфат марганца, аминокислотный хелат марганца, оксид марганца, протеинат марганца, сульфат марганца, оксид марганца, оксид марганца, йодат кальция, протеинат марганца, сульфат марганца, кленовый сироп, экстракт календулы, мука календулы, натуральная мясо-костная мука, мясо-печеночная мука, мясные субпродукты, менадион диметилпиримидинол бисульфит, комплекс менадиона бисульфита натрия, менадион витамин K3, рыбная мука из менхаден, рыбий жир из менхаден, молоко, токоферолы, смешанные морковные растительные волокна, модифицированный пищевой крахмал, модифицированный крахмал, меласса, монокальций фосфат, мононатрий фосфат, натуральные и искусственные куриные ароматические добавки, натуральные и искусственные ароматизаторы, натуральные куриные ароматические добавки, естественный краситель, натуральный ароматизатор, натуральная ароматическая добавка птицы, природный аромат дыма, ниацин, никотиновая кислота и сульфат железа, обезжиренный йогурт, овсяные отруби, овсяная клетчатка, овсяная крупа, овсяная мука, овес, океаническая рыба, мясо океанической рыбы, океаническая рыба с белым мясом, омега жирные кислоты, экстракт лука, луковый порошок, пантотенат, маслосмола паприки, петрушка, хлопья из петрушки, масло петрушки, порошок петрушки, частично гидригенизированное соевое масло, макаронные изделия, гороховые волокна, гороховый белок, скорлупа арахиса 10,8%, перловая крупа, горох, перец, вазелин, филлохинон витамин K1, фосфорная кислота, свиной бульон, свиные субпродукты, свиная печень, сорбат калия, аминокислотный комплекс калия, хлорид калия, цитрат калия, йодид калия, йодид калия, сорбат калия, картофель, картофельные волокна, картофельный крахмал, птица, мука из субпродуктов птицы, субпродукты птицы, птичий жир, птичьи потроха, печень домашней птицы, порошкообразная целлюлоза, порошкообразная целлюлоза 11,1%, пропионовая кислота, пропилгаллат и лимонная кислота, пропиленгликоль, пиридоксин гидрохлорид, псиллиум, кролик, кроличьи субпродукты, кроличий бульон, red 3, red 40 и другие красители, красный перец, рибофлавин, рис, рисовые отруби, рисовая мука, рисовая клейковина, рисовая шелуха, концентрат рисового белка, розмарин, экстракт розмарина, экстракт розмарина и лимонная кислота, рожь, шалфей, лосось, бульон лосося, лососевая мука, лососевое масло, соль, морская соль, селен, креветки, аромат дыма, альгинат натрия, аскорбат натрия, бисульфат натрия, карбонат натрия, казеинат натрия, хлорид натрия, гексаметафосфат натрия, метабисульфат натрия, нитрит натрия для сохранения цвета, фосфат натрия, пропионат натрия, селенит натрия, алюминат натрия, кремний, триполифосфат натрия, триполифосфат натрия, сорбиновая кислота, сорбит, соевая мука, соевая шелуха, соевый лецитин, соевый белковый концентрат, изолят соевого белка, соевое масло, соевая шелуха, соевая мука, соевые высевки, соевое масло, мята, шпинат, спирулина, крахмал, обезжиренная костяная мука, сахароза, достаточное количество воды для обработки, сахар, высушенная на солнце люцерновая мука, шрот, подсолнечное масло, порошок из сладкого картофеля, сладкий картофель, сало, крахмал тапиоки, таурин, тетрапирофосфат натрия, текстурированный растительный белок, тиамин, тиамин гидрохлорид, мононитрат тиамина, тимьян, диоксид титана, пигмент диоксид титана, хлопья помидоров, томатная паста, мякоть томатов, помидоры, микроэлементы (сульфат кальция), микроэлементы (сульфат меди), микроэлементы (хлористый калий), микроэлементы (триполифосфат натрия), микроэлементы (оксид цинка), микроэлементы (протеинат цинка), микроэлементы (сульфат цинка), трикальций фосфат, тунец, тунцовая мука, индюшка, индюшачий бульон, мука из субпродуктов индейки, натуральная индейка, индюшачий бульон, куркума, телятина, бульон из телятины, растительное масло, оленина, субпродукты из оленины, печень оленины, мука из оленины, мясо оленины, бульон из оленины, витамин А, витамин D3 и витамин А ацетат, витамин B1, витамин B12, витамин B12 и D3, витамин B2, витамин B6, витамин С, витамин D3, витамин D3 и Е, витамин Е, витамин K, вода, кресс-салат, воды, достаточное количество для обработки, кресс-салат и шпинат, пшеница, пшеничные отруби, пшеничная мука, проростки пшеницы, клейковина пшеницы, пшеничная крупка, пшеничные высевки, пшеничный крахмал, сыворотка, рыба с белым мясом, рыба с белым мясом, мука из рыбы с белым мясом, цельный коричневый рис, цельная морковь, цельная клюква, цельные яйца, цельный чеснок, цельные зерна кукурузы, цельное зерно пшеницы, дробленный цельный ячмень, дробленный цельный коричневый рис, дробленный овес, дробленная цельная пшеница, цельный рис, цельный сладкий картофель, цельная пшеница, мука из цельной пшеницы, дикий рис, ксантановая камедь, дрожжевая культура, желтый yellow 5, yellow 6, желтый сквош, желтый цуккини, юкка шидигера, экстракт юкки шидигера, аминокислотный хелат цинка, аминокислотный комплекс цинка, оксид цинка, протеинат цинка, протеинат цинка и сульфат цинка.
Наиболее предпочтительными компонентами являются: альфа-липоевая кислота, предпочтительно в количестве, достаточном, чтобы способствовать формированию здоровой кожи и/или шерстяному покрову; для антибиотических целей предпочтительными ингредиентами являются альфа-липоевая кислота, сушеный чеснок, экстракта чеснока, чесночное масло и чесночный порошок, лецитин, предпочтительно в качестве антиоксидантов; дробленный ячмень, дробленый круглый ячмень, дробленые цельные зерна кукурузы, дробленые цельные зерна сорго, селедочное масло, скумбрия, рыбий жир из менхадена, океаническая рыба, цельный коричневый рис и цельный сладкий картофель являются предпочтительными в качестве источников энергии; предпочтительными источниками клетчатки являются дегидратированная морковь, сушеные яблоки, дробленые цельные зерна ячменя, овсяные отруби, овсяная крупа, овсяная мука, дробленый цельный ячмень, дробленый цельный овес; протеинат кобальта (источник хелатированного кобальта), протеинат меди, протеинат железа, протеинат марганца, протеинат марганца, микроэлементы и протеинат цинка являются предпочтительными источниками минеральных веществ; предпочтительными источниками омега-3 жирных кислот являются масло огуречника, масло канолы, масло канолы (с консервантами в виде смеси токоферолов) и семена льна; экстракт розмарина и лимонная кислот являются предпочтительными консервантами; предпочтительными источниками белка являются мука из говядина, куриная мука, сушеный горох, палтус, мука из баранины, рыбная мука из менхадена, океаническая рыба, горох, мука из оленины, цельный коричневый рис и дробленная цельная пшеница; предпочтительными источниками витаминов являются аскорбат кальция, морковь, сушеная морковь, смешанные токоферолы, цельная морковь: предпочтительными для замены обычной водой, а также предпочтительными ароматизаторами являются говяжий бульон, куриный бульон, бульон из баранины, бульон из баранины и бульон из индейки.
Ингредиентами не наиболее, но также весьма предпочтительными являются: порошок концентрата люцерны, мука из дегидратированной люцерны, куриный жир, куриная печень, свежевыжатый сок, мясо океанической рыбы и перловая крупа в качестве источников энергии; зеленая фасоль, дробленый цельный горох, овес и гороховые волокна в качестве источников волокна; аминокислотный хелат кобальта, аминокислотный хелат меди, аминокислотный комплекс меди, мука из сушеных водорослей, аминокислотный хелат железа, аминокислотный хелат марганца, сульфат марганца, комплекс аминокислот калия, аминокислотный хелат цинка в качестве источника минеральных веществ; экстракт цикория, экстракт имбиря и экстракт юкки шидигера как пребиотики; пищевыми консервантами являются чеснок, розмарин и шалфей, пищевой концентрат люцерны, зубатка, мука из зубатки, треска, утка, яйца, дробленная цельная пшеница, сельдь, гороховый белок, кролики, креветки, тунец, оленина, мясо оленины, рыба с белым мясом, рыба с белым мясом, мука из рыбы с белым мясом, цельная пшеница являются предпочтительными в качестве источников белка, бета-каротина и фолиевой кислоты являются предпочтительными источниками витаминов, куриный бульон, кроличий бульон, бульон из индейки, бульон из телятины и бульон из оленины являются предпочтительными заменами для обычной воды, а также предпочтительными ароматизаторами.
Стандартная пища кормовой композиции в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, корм для домашних животных, предпочтительно содержит один или более ингредиентов из группы, состоящей из витамина В-12, биотина, карбоната кальция, пантотената кальция, хлорида холина, карбоната кобальта, сульфата меди, с добавками витамина D3 и Е, DL-метионина, сушеных водорослей, сульфата железа, фолиевой кислоты, инозита, оксида марганца, оксида марганца, сульфата марганца, комплекса менадиона и бисульфита натрия, минеральных добавок, в том числе сульфата цинка, натурального ароматизатора, никотиновой кислоты и сульфата железа, ниацина в качестве добавки, хлорида калия, йодида калия, пиридоксина гидрохлорида, рибофлавина, селенита натрия, таурина, тиамина, мононитрата тиамина, мононитрата тиамина, витамина А, витамина А и D3, витамина А ацетата, витамина B12, витамина D3, воды, оксида цинка и сульфата цинка.
Корм, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может быть любым кормом, содержащим связывающий микроорганизм или его фрагмент в качестве активного ингредиента. Корм включает, например, корм для домашних животных для собак, кошек и крыс и корм для крупного рогатого скота для коров и свиней.
Корм может быть получен посредством соответствующего смешивания активного ингредиента, как описано в настоящем изобретении выше, с сырьем для корма, включая, например, крупы, отруби, жмыховую муку, сырье для корма животного происхождения, другое сырье для корма и очищенные продукты, как указано выше. Предпочтительными кормами в соответствии с настоящим изобретением являются жевательные продукты. Предпочтительные продукты представляют собой свиные уши, бычьи сухожилия, хвосты рогатого скота, пищеводы, сушеное мясо мышц, свиные ноги и сушеная прессованная коровья кожа, шкура буйвола или композитные жевательные продукты, содержащие растительные материалы, как например, волокна, отруби и т.д. Другие жевательные продукты известны в данной области техники, и также являются предпочтительными, например жевательные продукты патента США 2988045, WO 01/50882 А2, ЕР 1151674 А1, ЕР 1006789 А1 и СН 676200 А5. Жевательный продукт предпочтительно используется в форме кости, рулета, пончика, скобы, кренделя, восьмерки, или чипсов.
В случае обеспечения животных кормами в соответствии с настоящим изобретением количество корма для потребления конкретно не ограничено, но предпочтительно составляет, например, от 0,1 мг до 50 г на 1 кг массы тела в день, предпочтительно от 0,5 мг до 20 г на 1 кг массы тела в день, в зависимости от количества активного ингредиента. Корм постоянно принимается в этом количестве на срок от одного дня до 5 лет, предпочтительно от 2 недель до одного года. Опять же, принимаемое количество можно регулировать к соответствующему диапазону в зависимости от вида, возраста и массы тела животного потребляющего корм, и тому подобное.
Также предпочтительно, чтобы композиция в соответствии с настоящим изобретением включала бы один или несколько пробиотических микроорганизмов или продукты, полученные из них, независимо от связывающего микроорганизма и его фрагмента. Предпочтительными пробиотическими микроорганизмами и их соответствующими продуктами являются Bacillus subtilis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium thermophilum, высушенный ферментативный экстракт Bacillus licheniformis, высушенный ферментативный экстракт Bacillus subtilis, Enterococcus faecium и Lactobacillus acidophilus.
Особенно предпочтительными являются пищевые и кормовые композиции, дополнительно содержащие в дополнение к связывающему микроорганизму или его фрагменту, дополнительные микроорганизмы для профилактики и/или лечения неприятного запаха изо рта. Наиболее предпочтительными являются пищевые и кормовые композиции, дополнительно содержащие такие микроорганизмы, как раскрыто в WO 2009/149816 А1, которая включена в настоящем изобретении в полном объеме, из которых дополнительный микроорганизм предпочтительно выбирается из группы, состоящей из Lactobacillus acidophilus имеющий DSMZ номер доступа DSMZ 19825 DSMZ, DSMZ 19826, DSMZ 19827.
Далее изобретение будет дополнительно описано с помощью избранных примеров и вариантов. Эти варианты выполнения и примеры предназначены для представления конкретных предпочтительных отличительных признаков настоящего изобретения без ограничения объема настоящего описания или объема формулы изобретения. Следует понимать, что специалист в данной области техники может разработать дополнительные рабочие примеры и варианты выполнения с помощью своего общего знания и инструкций и разъяснений, приведенных в настоящем описании и документов, включенных в настоящее изобретение посредством ссылки.
Пример 1: Хранение и культивирование связывающих микроорганизмов
Хранение и культивирование штаммов может осуществляться в соответствии с обычными процедурами. В соответствии с этим настоящим примером штаммы хранили в виде низкотемпературного хранения при -80°С. 1 мл культуры выращивали до стационарной фазы (OD600: 4-8) в MRS-среде и смешивали с 500 мкл стерильного 50% глицеринового раствора и замораживали. Культуры mutans Streptococci выращивали в TSY-среде до стационарной фазы (OD600 1-2) и обрабатывали, как указано выше для хранения в замороженном состоянии.
Культивирование mutans Streptococci (S. mutans, S. sobrinus, S. ratti, S. cricetus, S. ferus или S. macacae), а также культивирование лактобактерий может осуществляться в 5 мл в закрытых пробирках Falcon при 37°С без встряхивания в течение ночи.
В частности, штаммы, используемые в настоящей заявке, хранили в виде низкотемпературного хранения при -80°С. 1 мл культуры, выращенной до стационарной фазы (OD600/мл 4-8) в MRS-бульоне, смешивали с 500 мкл стерильного 50%-ного раствора глицерина и замораживали.
В частности, культуры mutans Streptococci выращивали в TSY-бульоне в стационарной фазы (OD600/мл 1-2) и обрабатывали как описано выше.
Выращивание mutans Streptococci (S. mutans (DSMZ 20523, серотип С; NCTC 10923, серотип E; NCTC 11060, серотип F), S. sobrinus DSMZ 20742, S. ratti DSMZ 20564, S. cricetus DSMZ 20562, S. ferus DSMZ 20646 или S. macacae DSMZ 20714) и культивирование лактобактерий осуществляли в 5 мл в закрытых пробирках Falcon при 37°С без встряхивания в течение ночи. Для флуоресцентного анализа, как описано в примере 5, использовали S. mutans DSMZ 20523.
Для анализа агрегации лактобактерий выращивали в MRS-среде. В 5 мл MRS-среды, инокулировали 10 мкл сток-раствора и инкубировали в течение 3 дней при 37°С в аэробных условиях. Измеряли оптическую плотность культуры при 600 нм (OD600). Затем культуру разбавляли до OD600 равной 2 с помощью PBS-буфера. mutans Streptococci выращивали в 7 мл TSY-среде. 7 мл TSY-среды инокулировали 10 мкл сток-раствора и инкубировали при 37°С в анаэробных условиях.
MRS-бульон:
MRS-смесь (Difco, США) 55 г/л, рН: 6,5
TSY-бульон:
TSY-смесь (Difco, США) 30 г/л
Дрожжевой экстракт (Deutsche Hefewerke, Germany) 3 г/л
Буфер:
PBS-буфер:
2
4
2
NaHPO 2HO 1,5 г/л
2
4
KHPO 0,2 г/л
NaCl 8,8 г/л
рН доводили с помощью HCl
Пример 2: Таксономическая классификация связывающего штамма и штаммов Streptococcus
Таксономическую классификацию штаммов осуществляли в соответствии с их схемой брожения углеводов. Ее определяли с использованием системы API 50 СН (bioMerieux, France) и проанализировали с использованием программного обеспечения APILAB PLUS версии 3.3.3 (bioMerieux, France).
Пример 3: Окрашивание клеток
После того как выращивали лактобактерии и mutans Streptococci, как описано в примере 1, mutans Streptococci окрашивали с помощью флуоресцентного штамма. Для этого измеряли OD600 культуры. Культуру собирали центрифугированием при 3200×g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в PBS-буфере. Количество буфера рассчитывали таким образом, чтобы в полученная суспензия при смешивании имела OD600 равное 4. 2 мл этой суспензии с 2 мкл раствора CFDA-SE (Invitrogen, USA), который получали в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание клеток проводили посредством инкубации смеси в течение 2 ч при 37°С. Окрашенные клетки собирали центрифугированием при 3200×g в течение 5 мин. Затем клетки ресуспендировали в 2 мл PBS-буфера.
Пример 4: Агрегационный анализ осаждения mutans Streptococci
Для анализа смешивание лактобактерий и mutans Streptococci осуществляли в объемном соотношении от 3:1 до 60:1 (mutans Streptococci : лактобактерии), это соответствует соотношению колониеобразующих единиц от 1: 50 до 1:2,5.
8
9
Оптическая плотность, измеренная при длине волны 600 нм в 1 мл, составляла предпочтительно для mutans Streptococci 3×10 колониеобразующих единиц и для лактобактерий предпочтительно 7×10 колониеобразующих единиц. Перемешивание осуществляли в объеме 2 мл в 15 мл пробирках Falcon. Культуральные суспензии разбавляли PBS-буфером, чтобы получить объемное соотношение, упоминаемое выше, сохраняя при этом конечный объем в 2 мл. Смесь встряхивали в течение 15 секунд. Агрегацию наблюдали как немедленное помутнение суспензии. Пробирки оставляли в покое в течение 20 мин, после этого периода времени агрегаты осаждаются в виде заметного осадка, тогда как не агрегирующие смеси остаются в суспензии. Образованные агрегаты отделяли центрифугированием при 500×g в течение 30 секунд. Сразу после этого количество агрегатов оценивали посредством измерения количества неагрегированных клеток, которые оставались в супернатанте. Для этого 1 мл супернатанта осторожно удаляли для измерения оптической плотности. Оптическую плотность измеряли при 600 нм. Значение после вычитания соответствующего контрольного эксперимента без лактобактерий представляет собой количество клеток, которые не агрегировали.
В качестве контроля всегда исследовали аутоагрегацию соответствующего штамма Lactobacillus и штаммов mutans Streptococcus посредством проведения теста, когда в пробирку добавляли только Lactobacillus или штаммы Streptococcus mutans. Агрегация S. mutans с помощью Lactobacillus показана на Фиг. 1 (левая пробирка) и 2.
Штаммы лактобактерий, как описано выше в настоящем изобретении, в частности, тех, которые депонированы в DSMZ, демонстрировали агрегацию всех серотипов S. mutans, не показывая аутоагрегационное поведение.
Пример 5: Флуоресцентный анализ агрегации mutans Streptococci
Для анализа суспензию соответствующих лактобактерий и соответствующих окрашенных mutans Streptococcus (S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. mutans DSMZ 20523 с Lb-OB-K7 (DSMZ 16673); S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-KI (DSMZ 16667), S. sobrinus DSMZ с 20 742 Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. sobrinus DSMZ 20742 с Lb-OB-K7 (DSMZ 16673); S. cricetus DSMZ с 20562 Lb-OB-KI (DSMZ 16667), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. cricetus DSMZ 20562 с Lb-OB-K7 (DSMZ 16673);
S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. ratti DSMZ 20564 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. ratti DSMZ с 20 564 Lb-OB-K7 (DSMZ 16673);
S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. ferus DSMZ 20646 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672), S. ferus DSMZ с 20 646 Lb-OB-K7 (DSMZ 16673);
S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K1 (DSMZ 16667), S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), S. macacae DSMZ 20724 с Lb-OB-K6 (DSMZ 16672) и S. macacae DSMZ с 20 724 Lb-OB-K7 (DSMZ 16673)) смешивали. 50 мкл суспензии лактобактерий добавляли к 50 мкл окрашенного mutans Streptococci в 96-луночном планшете для микротитрования. Планшет встряхивали на полной скорости в течение 12 минут. Затем планшет центрифугировали при 500×g в течение 10 секунд. Супернатант осторожно удаляли и отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS-буфера. Флуоресценцию суспензии измеряли с помощью ридера флуоресценции планшетов для микротитрования на длине волны возбуждения 495 нм и эмиссии 525 нм. В качестве контроля одни лактобактерии, так же как и окрашенные mutans Streptococci обрабатывали и измеряли, как описано. Фоновую флуоресценцию, измеренную только для соответствующих mutans Streptococci, вычитали из величины, измеренной для агрегации с соответствующим Lactobacillus. Все измерения проводили трижды, mutans Streptococci агрегировали посредством всех протестированных лактобактерий (см. Фиг. 3).
Пример 6: Специфичность агрегации к типичным представителем флоры полости рта
Культуры Lactobacillus выращивали, как описано в примере 1. Бактерии полости рта - а именно: Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (выделенные с помощью OrganoBalance, идентифицированные с помощью API 50 СН (Biomerieux, France) в соответствии с инструкциями производителя); Streptococcus oralis (DSMZ 20066); Streptococcus oralis (DSMZ 20395); Streptococcus oralis (DSMZ 20627); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 1798); Staphylococcus epidermidis (DSMZ 20044); Streptococcus mitis (DSMZ 12643), Streptococcus sanguinis (DSMZ 20567) - выращивали в 5 мл среды BHI в закрытых пробирках Falcon на 15 мл при 37°С в течение ночи. Каждую из вышеуказанных бактерий ротовой полости предпочтительно смешивали в объемном соотношении 3:1 с культурой Lactobacillus, и агрегацию оценивали, как в примере 4. Для каждого испытания «агрегирует/не агрегирует» только одну из вышеупомянутых бактерий предпочтительно использовали для немедленного определения исхода тестирования.
В качестве контроля всегда исследовали аутоагрегацию соответствующего штамма Lactobacillus и штаммов mutans Streptococcus посредством проведения теста, когда в пробирку добавляли только Lactobacillus или штаммы флоры полости рта.
L. paracasei ssp. штаммы paracasei Lb-OB-K1 (DSMZ 16667), Lb-OB-K2 (DSMZ 16668), Lb-OB-K3 (DSMZ 16669), Lb-OB-K4 (DSMZ 16670), Lb-OB-K5 (DSMZ 16671), не агрегировали бактерии полости рта, упомянутые выше. Таким образом, они являются "специфически связывающимися с mutans Streptococci" в соответствии с приведенным выше определением. L. rhamnosus штаммы Lb-OB-K6 (DSMZ 16672) и Lb-ОВ-K7 (DSMZ 16673) агрегировали Streptococcus salivarius thermophilus ssp.Они, тем не менее считаются "специфически связывающимися с mutans Streptococci" в соответствии с вышеуказанными менее предпочтительным определением
BHI-бульон:
BHI смесь (Difco, США) 37 г/л рН: 7,2
Пример 7: Температурная устойчивость агрегационной способности молочнокислых бактерий
Бактерии выращивали, как в примере 1. Выращенные культуры молочнокислых бактерий автоклавировали при 121°С при давлении 2 бар в насыщенном водяном пару в течение 20 мин. После охлаждения автоклавированных культур до комнатной температуры, лактобактерии смешивали в объемном соотношении 1:3 с выращенными культурами S. mutans, и агрегацию оценивали, как в примере 4, в том числе в контрольных экспериментах. Агрегацию также анализировали с использованием бактерий полости рта, как описано в примере 6.
Было обнаружено, что агрегационное поведение лактобактерий не изменялось процедурой автоклавирования по отношению к тестируемым серотипам S. mutans или к бактериям полости рта.
Пример 8: Агрегация с помощью инактивированных нагреванием лактобактерий
Молочнокислые бактерии выращивали, как описано в примере 1. mutans Streptococci выращивали и окрашивали, как описано в примерах 1 и 3. Выращенные культуры молочнокислых бактерий доводили до OD600 равное 2, как описано в примере 1. 1 мл этой суспензии автоклавировали при 121°С при давлении 2 бар в течение 20 мин, как описано выше. После охлаждения автоклавированных культур до комнатной температуры измеряли агрегацию, как описано в примере 5, включая контрольные эксперименты. Инактивированные нагреванием лактобактерии все еще агрегировали все mutans Streptococci.
Пример 9: Зависимость агрегации от значения рН
Бактерии выращивали, как в примере 1. 0,5 мл лактобактерий и 1,5 мл S. mutans собирали центрифугированием при 3200×g в течение 10 мин, и надосадочную жидкость сливали. Клетки ресуспендировали до их первоначального объема (0,5 мл и 1,5 мл, соответственно) в различных PBS-буферах доводили до различных значений рН. Значения рН буфера доводили до значения от 7,0 до 3,0 с шагом 0,5 единицы рН. Культуры ресуспендировали в буфере соответствующего значения рН, который должен был быть использован для анализа поведения агрегации.
После этого лактобактерии смешивали в объемном соотношении 1:3 с культурой S. mutans и оценивали агрегацию, как в примере 4, включая контрольные эксперименты. Никакой заметной агрегации S. mutans посредством лактобактерий не произходило при значениях рН ниже 4,5.
Пример 10: Зависимость агрегации от значения рН
Молочнокислые бактерии выращивали, как описано в примере 1. mutans Streptococci выращивали и окрашивали, как описано в примерах 1 и 3. Сразу после этого агрегацию анализировали при различных значениях рН. Для этой цели молочнокислые бактерии, а также стрептококки ресуспендировали в ацетатном буфере, доведенном до соответствующего рН. Исследования проводили при рН 4,0, 4,5 и 5,0. Агрегацию анализировали, как описано в примере 5. Никакой агрегации mutans Streptococci не происходило при значениях рН ниже 4,5.
Пример 11: Чувствительность агрегационного поведения к лиофилизации
Бактерии выращивали, как в примере 1. Аликвоты по 1 мл культуры молочнокислых бактерий собирали центрифугированием при 3200×g в течение 10 минут. Супернатант отбрасывали и осадок лиофилизировали при комнатной температуре в вакууме в течение двух часов. Полученный сухой осадок каждого исследуемого штамма Lactobacillus хранили при комнатной температуре и при 4°С, соответственно в течение 1 дня, 1 недели, 2 недель, 3 недель и 4 недель. После периода хранения, лиофилизованный осадок ресуспендировали в 1 мл PBS-буфера, рН 7,0. Ресуспендированные лактобактерии смешивали в объемном соотношении 1:3 с свежевыращенными культурами S. mutans, и агрегацию оценивали, как в примере 4, включая контрольные опыты.
Агрегационное поведение указанных молочнокислых бактерий к S. mutans не изменялось вследствие лиофилизации или процедурами хранения.
Пример 12: Чувствительность агрегационного поведения к лиофилизации
Молочнокислые бактерии выращивали, как описано в примере 1. mutans Streptococci выращивали и окрашивали, как описано в примерах 1 и 3. Выращенные культуры молочнокислых бактерий доводили до OD 600 равное 2, как описано в примере 1. 1 мл этой суспензии лиофилизировали при комнатной температуре в вакууме в течение двух часов. Сразу после этого лиофилизированный осадок ресуспендировали в 1 мл PBS-буфера. Агрегации измеряли, как описано в примере, включая контрольные эксперименты.
Агрегационное поведение указанных молочнокислых бактерий по отношению к mutans Streptococci не изменялось после лиофилизации.
Пример 13: Тест на устойчивость к протеазам
Бактерии выращивали, как в примере 1. Использовали протеазы: проназу Е, протеиназу К, трипсин, химотрипсин (все получены от Sigma, Germany). Аликвоты по 1 мл лактобактерий промывали в PBS-буфере посредством сбора клеток центрифугированием при 3200×g в течение 10 минут и ресуспендированием осадка в 1 мл PBS-буфера (рН 7,0). Затем клетки собирали снова, как описано выше, и ресуспендировали в PBS-буфере (рН 7,0), содержащем соответствующие протеазы в конечной концентрации 2,5 мг/мл. Суспензию инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Сразу после этого клетки промывали и ресуспендировали в PBS-буфере (рН 7,0), как описано выше.
Агрегацию анализировали, как описано в примере 3, включая контрольные эксперименты. Агрегационное поведение указанных молочнокислых бактерий по отношению к S. mutans не изменялось вследствие обработки любой из указанных протеаз.
Пример 14: Протеазная чувствительность агрегационного поведения лактобактерий
Молочнокислые бактерии выращивали, как описано в примере 1. mutans Streptococci выращивали и окрашивали, как описано в примерах 1 и 3. Использовали протеазы: проназу Е, протеиназу К, трипсин, химотрипсин (все получены от Sigma, Germany). Аликвоты по 1 мл лактобактерий промывали в PBS-буфере путем сбора клеток посредством центрифугирования при 3200×g в течение 10 мин и ресуспендирования осадка в 1 мл PBS-буфера (рН 7,0). Сразу после этого клетки собирали снова, как описано выше и ресуспендировали в PBS-буфере (рН 7,0), содержащем соответствующие протеазы в конечной концентрации 2,5 мг л/мл. Суспензию инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки промывали и ресуспендировали в PBS-буфере (рН 7,0), как описано выше. Агрегацию оценивали, как описано в примере 5, включая контрольные эксперименты. Агрегационное поведение лактобактерий по отношению к mutans Streptococci не изменилось вследствие обработки любой из указанных протеаз.
Пример 15: Ионная зависимость агрегационного поведения
Бактерии выращивали, как в примере 1. Аликвоты по 1 мл лактобактерий промывали в 1 мл 200 мМ растворе ЭДТА дважды, как описано выше. Сразу после этого клетки собирали и ресуспендировали в 1 мл PBS-буфера (рН 7,0).
Агрегацию анализировали как описано в Примере 4, и наблюдали полную потерю способности к агрегации. Ресуспендирование молочнокислых бактерий в 1 мл 2 мМ раствора кальция после двукратной промывки 200 мМ раствором ЭДТА восстанавливало способность к агрегации S. mutans. Ресуспендирование промытых ЭДТА клеток в растворе магния вплоть до концентрации 100 мМ не восстанавливало способность к агрегации S. mutans.
Пример 16: Ионная зависимость агрегационного поведения
Молочнокислые бактерии выращивали, как описано в примере 1. mutans Streptococci выращивали и окрашивали, как описано в примерах 1 и 3. Аликвоты по 1 мл лактобактерий промывали дважды в 1 мл 200 мМ растворе ЭДТА, как описано выше. Сразу после этого клетки собирали и ресуспендировали в 1 мл PBS-буфера (рН 7,0). Агрегацию оценивали, как описано в примере 5, и наблюдали полную потерю способности к агрегации. Ресуспендирование молочнокислых бактерий в 1 мл 2 мМ раствора кальция после двукратной промывки 200 мМ раствором ЭДТА восстанавливало способность к агрегации S. mutans. Ресуспендирование промытых ЭДТА клеток в растворе магния вплоть до концентрации 100 мМ не восстанавливало способность к агрегации mutans Streptococci.
Пример 17: Исследование агрегации в присутствии слюны
Бактерии выращивали, как в примере 1. 2 мл аликвоты культуры S. mutans собирали, как описано выше, и ресуспендировали в 2 мл слюны. Слюна обеспечивалась двумя добровольцами и использовалась сразу после забора. Агрегацию анализировали как описано в Примере 4.
Агрегационное поведение указанных молочнокислых бактерий по отношению к S. mutans не изменилась в присутствии слюны.
Пример 18: Агрегация mutans Streptococci в присутствии слюны
Свежую слюну забирали у добровольцев. Слюнотечение индуцировали посредством жевании жевательной резинки без сахара. Волонтеры собрали по 15 мл слюны для каждого образца. Свежесобранную слюну разводили 1:2 в PBS-буфере для исследовательской процедуры. Лактобактерии и mutans Streptococci культивировали, как описано в примере 1. mutans Streptococci окрашивали, как описано в примере 3, за исключением того, что после процедуры окрашивания окрашенные клетки ресуспендировали в слюне вместо PBS-буфера. Агрегацию оценивали, как описано в примере 5, включая контрольные эксперименты. Присутствие слюны не ингибировало агрегацию.
Пример выделения 1: Получение дополнительных лактобактерий
Лактобактерии могут быть получены из любого источника, например, посредством мазка из полости рта добровольцев с низким количеством кариеса и/или зубного камня. Кроме того, лактобактерии могут быть получены из коллекции клеточных культур, таких как DSMZ и АТСС, или из других известных источников молочнокислых бактерий, например, растений, продуктов питания и кормов. Полученные штаммы затем очищали стандартными микробиологическими методиками. Селективные среды для лактобактерий описаны, например, посредством Rogosa et al. 1951. Селективная среда для выделения лактобактерий из полости рта и фекалий, J. Bacteriol. 62: 132-133.
Изолированные штаммы выращивали, как описано в примере 1. Отбор на связывание проводили, как описано в примере выделения 2.
Пример выделения 2:
Окрашенные mutans Streptococcus (DSMZ 20523) получали и распределяли в 96-луночных микротитрационных планшетах, как описано выше в примере 5. Кроме того, как описано в примере 5, по 50 мкл штаммов отбираемых для скрининга связывающего роста в соответствии с примером 1, добавляли в каждую лунку планшета для микротитрования и встряхивали на полной скорости в течение 12 минут. Сразу после этого планшет центрифугировали при 500×g в течение 10 секунд, и супернатант осторожно удаляли. Осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS и измеряли флуоресценцию суспензии, как описано в примере 5.
Штаммы, предназначенные для скрининга, затем исследовали, как описано выше в примере 5, на связывание с S. mutans DSMZ 20523, S. sobrinus DSMZ 20742, S. cricetus DSMZ 20562, С. ratti DSMZ 20564, S. ferus DSMZ 20646 и S. macacae DSMZ 20724. Были найдены положительные связывающие для получения агрегатов.
Пища и корм в соответствии с примером 1: Корм для щенка собаки
Основные ингредиенты: говядина, коричневый рис, семена рапса, льняной шрот, семена подсолнечника, семена гречихи (соба), ячмень, просо.
Минорные ингредиенты: морковь, свекла, брокколи, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, рапсовое масло, морская соль, орегано, чеснок, аскорбиновая кислота, прополис, витамины (витамины А, B12, D3, С, Е, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, фолиевая кислота, пантотенат, ниацин), минеральные вещества (хром, селенит натрия, железо, медь, цитрат цинка, сульфат кобальта).
К 1 кг базовой композиции, имеющей вышеуказанные основные и минорные ингредиенты, добавляли 3 г высушенных автоклавированных связывающих микроорганизмов и их фрагментов. Микроорганизменный материал получали посредством выращивания связывающих микроорганизмов, как описано в примере 1. То есть, лактобактерии выращивали на MRS-среде. 5 мл MRS-среды инокулировали с 10 мкл сток-раствора и инкубировали в течение 3 дней при 37°С в аэробных условиях. Микроорганизмы осаждали центрифугированием и промывали один раз PBS. Ресуспендированные микроорганизмы автоклавировали, как описано в примере 8. Автоклавированные микроорганизмы сушили в сушильном шкафу при 75°С в течение ночи с получением высушенных инактивированных нагреванием связывающих микроорганизмов и их фрагментов. Корм для щенков собак получали с каждым из депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673 по отдельности для получения 7 отдельных образцов корма для щенков.
Общее содержание следующих частей было следующим (по массовым % от общей загрузки).
Белки (минимально) 26,0
Жир (минимально) 14,0
Волокна (макс.) 5,0
Влажность (макс.) 10,5
Корм для взрослых собак
Основной ингредиент: говядина, коричневый рис, семена рапса, льняной шрот, семена подсолнечника, семена гречихи (соба), ячмень, просо.
Минорные ингредиенты: морковь, свекла, брокколи, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, рапсовое масло, морская соль, орегано, чеснок, аскорбиновая кислота, прополис, витамины (витамины А, B12, D3, С, Е, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, фолиевая кислота, пантотенат, ниацин), минеральные вещества (хром, селенит натрия, железо, медь, цитрат цинка, сульфат кобальта).
Как описано для корма для щенков собак, 7 образцов препаратов корма для взрослых собак получали с использованием депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673 по отдельности.
Общее содержание нижеперечисленных частей было следующим (по массовым % от общей загрузки).
Белки (минимально) 20,0
Жир (минимально) 12,0
Волокна (макс.) 5,0
Влажность (макс.) 10,5
Вегетарианский корм для собаки.
Основные ингредиенты: соевый шрот, коричневый рис, семена рапса, льняной шрот, семена подсолнечника, семена гречихи, ячмень, просо.
Минорные ингредиенты: морковь, брокколи, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, рапсовое масло, морская соль, орегано, чеснок, аскорбиновая кислота, прополис, витамины (витамины А, B12, D3, С, Е, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, фолиевая кислота, пантотенат, ниацин), минеральные вещества (хром, селенит натрия, железо, медь, цитрат цинка, сульфат кобальта).
Как описано для корма для щенков собак, 7 образцов вегетарианских препаратов корма получали с использованием депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673 по отдельности.
Общее содержание нижеперечисленных частей было следующим (по массовым % от общей загрузки).
Белки (минимально) 20,0
Жир (минимально) 12,0
Волокна (макс.) 9,0
Влажность (макс.) 10,5.
Все пищевые продукты подавали в отдельную группу из 5 собак соответствующего возраста (1-8 месяцев, 2-4 года и 2-4 года соответственно) один раз в день. Как это требуется для собак, другим стандартным кормом обеспечивались в другое время дня. Однако, за исключением выше перечисленных пищевых продуктов в соответствии с настоящим изобретением никаким другим кормом не обеспечивались из тех, которые рекламировались соответствующим производителем в качестве специального для гигиены полости рта. Через 6 месяцев, ни у одой из собак не образовались зубные камни. Кроме того, неприятный запах изо рта у собак, измеряемый 10 добровольцами через 3 часа после последнего кормления, принимался как допустимый.
Пища и корм в соответствии с примером 2: Жевательный продукт для собаки
Полоску из сыромятной кожи коровы окунали в культуру штаммов связывающих микроорганизмов DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673, соответственно. Связывающие микроорганизма выращивали, как описано в разделе «пища и корм в соответствии с примером 1». Полоски сыромятной кожи затем формовали в костеподобную форму и автоклавировали, как описано в разделе «пища и корм в соответствии с примером 1».
Автоклавированные полоски высушивали на воздухе. Высушенные костеподобные полоски давали 5 собакам 5-8 лет, у которых только что был удален зубной камень. Новые высушенные костеподобные полоски затем давали дважды в неделю. За исключением высушенных костеподобных полосок собак кормили, как перед удалением зубного камня. В течение 8 месяцев, ни у одной из собак не образовались зубные камни снова. Кроме того, неприятный запах изо рта у собак, измеряемый 10 добровольцами через 3 часа после последнего кормления, принимался как допустимый.
Пища и корм в соответствии с примером 3: Дополнительные корма для собаки
Корм для щенков:
Основные ингредиенты: курица, куриная мука, ячмень, горох, коричневый рис, измельченная экструдированная цельная соя, куриный жир (с консервантами в виде смеси токоферолов).
Минорные ингредиенты: мука из мяса лосося, натуральный ароматизатор куриной печени, сухие пивные дрожжи, льняная мука, яичный порошок, яблоки, морковь, хлорид калия, дикальций фосфат, минеральные вещества (например, протеинат цинка, протеинат железа, протеинат меди, протеинат марганца, селенит натрия, протеинат кобальта, йодат кальция), соль, хлорид холина, витамины (например, витамин Е, L-аскорбил-2-полифосфат, витамин B12, d-пантотенат кальция, витамин А, ниацин, рибофлавин, фолиевая кислота, биотин, пиридоксина гидрохлорид, тиамина мононитрат, витаминная добавка D3, карбонат кальция), дрожжевые культуры (Saccharomyces cerevisiae), высушенный продукт ферментации Enterococcus faecium, высушенный продукт ферментации Lactobacillus acidophilus, высушенный экстракт продукта ферментации Aspergillus niger, экстракта ферментации Trichoderma longibrachiatum, высушенный экстракт продукта ферментации и ферментируемые остатки Bacillus subtilis.
Общее содержание нижеперечисленных частей было следующим (по массовым % от общей загрузки).
Белки мас. % (минимально): 28,0
Жиры мас. % (минимально): 15,0
Волокна мас. % (макс): 3,5.
Влажность мас. % (макс): 10,0.
Корм для взрослой собаки:
Основные ингредиенты: курица, куриная мука, ячмень, горох, овес, коричневый рис, куриный жир (с консервантами в виде смеси токоферолов).
Минорные ингредиенты: натуральный ароматизатор куриной печени, сухие пивные дрожжи, мука из мяса лосося, яичный порошок, яблоки, цельные семена льна, морковь, дикальций фосфат, хлорид калия, соль, минеральные вещества (т.е. протеинат цинка, протеинат железа, протеинат меди, протеинат марганца, селенит натрия, протеинат кобальта, йодат кальция), хлорид холина, витамины (например, витамин Е, L-аскорбил-2-полифосфат, витамин B12, d-пантотенат кальция, витамин А, ниацин, рибофлавин, фолиевая кислота, биотин, пиридоксин гидрохлорид, мононитрат тиамина, витаминная добавка D3), гидрохлорид глюкозамина, сульфат хондроитина, дрожжевые культуры (Saccharomyces cerevisiae), высушенный продукт ферментации Enterococcus faecium, высушенный продукт ферментации Lactobacillus acidophilus, высушенный экстракт продукта ферментации Aspergillus niger, экстракта ферментации Trichoderma longibrachiatum, высушенный экстракт продукта ферментации и ферментируемые остатки Bacillus subtilis.
Общее содержание нижеперечисленных частей было следующим (по массовым % от общей загрузки).
Белки мас. % (минимально): 26,0
Жира мас. % (минимально): 13,0
Волокна мас. % (макс): 3,5.
Влажность мас. % (макс): 10,0.
Весовой контроль кормления собаки:
Основные ингредиенты: коричневый рис, куриная мука, ячмень, овес, горох, курица, куриный жир (с консервантами в виде смеси токоферолов).
Минорные ингредиенты: натуральный ароматизатор куриной печени, сухие пивные дрожжи, мука из мяса лосося, яичный порошок, яблоки, цельные семена льна, морковь, дикальций фосфат, хлорид калия, соль, минеральные вещества (т.е. протеинат цинка, протеинат железа, протеинат меди, протеинат марганца, селенит натрия, протеинат кобальт, йодат кальция), хлорид холина, витамины (например, витамин Е, L-аскорбил-2-полифосфат, витамин B12, d-пантотенат кальция, витамин А, ниацин, рибофлавин, фолиевая кислота, биотин, пиридоксин гидрохлорид, мононитрат тиамина, витаминная добавка D3), гидрохлорид глюкозамина, сульфат хондроитина, дрожжевые культуры (Saccharomyces cerevisiae), высушенный продукт ферментации Enterococcus faecium, высушенный продукт ферментации Lactobacillus acidophilus, высушенный экстракт ферментации Aspergillus Niger, высушенный экстракт ферментации Trichoderma longibrachiatum, высушенный экстракт продукта ферментации и ферментируемые остатки Bacillus subtilis.
Общее содержание следующих частей (по массовым % от общей загрузки).
Белки мас. % (минимально): 24,0
Жира мас. % (минимально): 10,0
Волокна мас. % (макс): 3,5.
Влажность мас. % (макс): 10,0.
Как описано для корма для щенка в разделе «пища и корм в соответствии с примером 1», 7 соответствующих образцов препаратов корма для щенка, для взрослых собак и для контроля веса получали с использованием депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673 по отдельности.
Корм для взрослой собаки с высоким содержанием белка:
Основные ингредиенты: мясо курицы, отделенное от костей, куриная мука, мука из мяса индейки, розовый картофель, сельдевидный сиг, куриный жир (с консервантами в виде смеси токоферолов).
Минорные ингредиенты: сладкий картофель, цельные яйца, индейка, мука из мяса лосося, масло лосося и анчоуса, лосось, натуральный куриный ароматизатор, подсолнечное масло, вяленая на солнце люцерна, сушеные коричневые водоросли, морковь, шпинат, горох, помидоры, яблоки, подорожник, темнокрасная съедобная водоросль, корень цикория, корень солодки, корень куркумы, пажитник, глюкозамин HCl, клюква, черная смородина, цветы календулы, L-карнитин, сладкий укроп, кукуруза обыкновенная, листья мяты перечной, цветы ромашки, одуванчик, чабер садовый, экстракт розмарина, хондраитин-сульфат, шиповник, витамины (например, витамин Е, хлорид холина, витамин А, витамин D3, тиамина мононитрат, витамин B12, фолиевая кислота, биотин), морская соль, минеральные вещества (например, протеинат железа, протеинат цинка, протеинат марганца, протеинат меди), высушенный продукт ферментации Lactobacillus acidophilus, высушенный продукт ферментации Enterococcus faecium.
Общее содержание следующих частей (по массовым % от общей загрузки).
Белки минимально: 42 мас. %
Жир минимально: 16 мас. %
Волокна макс. 3 мас. %
Влажность не более: 10 мас. %
Минеральных вещества макс: 7 мас. %
Как описано для корма щенка в разделе «пища и корм в соответствии с примером 1», 7 соответствующих препаратов корма для собаки получали с использованием депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672 и 16673 по отдельности.
Вегетарианский корм для собаки:
Основные ингредиенты: коричневый рис, семена рапса, льняной шрот, семена подсолнечника, семена гречихи (соба), ячмень, просо, морковь, свекла, брокколи, подсолнечное масло с высоким содержанием олеиновой кислоты.
Минорные ингредиенты: рапсовое масло, морская соль, орегано, чеснок, аскорбиновая кислота, прополис, витамины (например, витамины А, B12, D3, С, Е, K3, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, биотин, фолиевая кислота, пантотенат, ниацин) минеральные вещества (например, хром, селенит натрия, железо, цитрат меди, сульфат цинка, кобальт).
Общее содержание следующих частей составляло (в массовых % от общей загрузки.)
Белки минимально: 20 мас. %
Жир минимально: 12 мас. %
Волокна макс: 9 мас. %
Влажность макс: 10,5 мас. %
Как описано для корма для щенка в разделе «пища и корм в соответствии с примером 1», 7 соответствующих препаратов корма собаки получали с использованием депонированных штаммов Lactobacillus DSMZ 16667, 16668, 16669, 16670,16671,16672 и 16673 по отдельности.
Дополнительные варианты выполнения:
1. Связывающий микроорганизм или его фрагмент, где микроорганизм или его фрагмент, способный связываться по меньшей мере с одним, предпочтительно по меньшей мере с двумя, а более предпочтительно по меньшей мере с тремя штаммами Streptococcus группы mutans Streptococcus, и где связывание проявляет устойчивость к термической обработке и/или устойчивость к протеазной обработке и/или является кальций зависимым и/или формируется в пределах рН выше 4,0 и/или является не зависимым от магния и/или образуются в присутствии слюны в качестве перорального средства для ухода за ротовой полостью.
2. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке при температуре ≥55°С, предпочтительно при ≥65°С, более предпочтительно при 95-121°С и наиболее предпочтительно при температуре 121°С.
3. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке в течение ≥15 мин, предпочтительно 15-120 мин, предпочтительно 15-30 мин, наиболее предпочтительно 20 мин.
4. Связывающий микроорганизм или его фрагмент, в соответствии с вариантом выполнения 3, где связывание является устойчивым к термической обработке в насыщенном водяном паре при давлении 1-5 бар, предпочтительно 1-3 бар, более предпочтительно 2 бар.
5. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке в насыщенном водяном паре при давлении 1-5 бар, предпочтительно 1-3 бар, более предпочтительно 2 бар, при температуре 95-121°С, более предпочтительно при 121°С, в течение ≥15 мин, предпочтительно 15-120 мин, предпочтительно 15-30 мин, наиболее предпочтительно 20 мин.
6. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка проводится в насыщенном водяном паре при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
7. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином и, предпочтительно, также является устойчивым к протеазной обработке эластазой, тромбином, амнопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаином, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастрисцином, химозином и/или катепсином D.
8. Связывающий микроорганизм или его фрагмент, в соответствии с вариантом выполнения 7, где связывание является устойчивым к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и химотрипсином.
9. Связывающий микроорганизм или его фрагмент, в соответствии с вариантом выполнения 7, где связывание является устойчивым к протеазной обработке эластазой, тромбином, аминопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаином, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастриксином, химозином и катепсином D.
10. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке в насыщенном водяном пару при давлении 1-5 бар, предпочтительно 1-3 бар, более предпочтительно 2 бар, при температуре 95-121°С, более предпочтительно при 121°С, в течение ≥15 мин, предпочтительно 15-120 мин, предпочтительно 15-30 мин, наиболее предпочтительно 20 мин, а также устойчивы к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином, и, предпочтительно, также устойчивы к протеазной обработке эластазой, тромбином, аминопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаиномом, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастриксином, химозином и/или катепсином D.
11. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 6, где связывание является устойчивым к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином и, предпочтительно, также устойчивы к протеазной обработке эластазой, тромбином, аминопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаиномом, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастриксином, химозином и/или катепсином D.
12. Связывающий микроорганизм или его фрагмент соответствии с вариантом выполнения 8, где связывание является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка проводится в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
2+
13. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, в котором связывание зависит от присутствия ионов Са в концентрации по меньшей мере 2 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 1 мМ, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,05 мМ.
2+
14. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, в котором связывание зависит от присутствия ионов Са в концентрации 0,05-500 мМ, более предпочтительно 1-100 мМ, наиболее предпочтительно 2-30 мМ.
15. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 12 или 13, где связывание является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка проводится в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
16. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 12 или 13, где связывание является устойчивым к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином и, предпочтительно, также устойчивы к протеазной обработке эластазой, тромбином, аминопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаиномом, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастриксином, химозином и/или катепсином D.
17. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание происходит при рН равном 4,0-9,0, предпочтительно 4,0-7,0, более предпочтительно 4,2-5,0 и наиболее предпочтительно 4,5.
18. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 16, в котором связывание является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка проводится в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
19. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 16, где связывание является устойчивым к протеазной обработке проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином и, предпочтительно, также устойчивы к протеазной обработке эластазой, тромбином, аминопептидазой I, карбоксипептидазой, домтрипаиномом, эндопротеиназой, папаином, катепсином В, пепсином, гастриксином, химозином и/или катепсином D.
2+
20. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 16, где связывание зависит от присутствия ионов Са в концентрации по меньшей мере 2 мМ, более предпочтительно по меньшей мере 1 мМ, наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,05 мМ.
21. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание не зависит от присутствия ионов магния, предпочтительно является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка проводится в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
22. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, в котором связывание происходит в присутствии слюны, а предпочтительно является устойчивым к термической обработке, где термическая обработка происходит в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
23. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по п. 1, где связывание является устойчивым к термической обработке, является устойчивым к протеазной обработке и происходит в присутствии слюны.
24. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из предыдущих вариантов выполнения, в котором штамм mutans Streptococcus выбирается из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523), Streptococcus mutans серотипа е (NCTC 10923), Streptococcus mutans серотипа f (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus DSMZ 20742, Streptococcus ratti DSMZ 20564, Streptococcus cricetus DSMZ 20562, Streptococci ferus DSMZ 20646 и Streptococcus macacae DSMZ 20714, и предпочтительно, где специфическое связывание связывающего микроорганизма или его фрагмента может быть исследовано следующим образом:
(a) выращивание указанного связывающего микроорганизма до стационарной фазы, или, в случае если фрагмент должен быть проверен, получение такого фрагмента,
(b) смешивание указанного связывающего микроорганизма или фрагмента с mutans Streptococcus, выращенного до стационарной фазы,
(c) инкубирование смеси, полученной на стадии (b), в условиях, позволяющих образование агрегатов из указанного микроорганизма и указанных Streptococcus, а также
(d) детектирование агрегатов по возникновению осадка.
25. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1-22, где микроорганизм или его фрагмент, способные связываться с каждым из штаммов, выбранных из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523), Streptococcus mutans серотипа е (NCTC 10923) и Streptococcus mutans серотипа f (NCTC 11060).
26. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24, где указанный микроорганизм или его фрагмент не способен связываться по меньшей мере с одним, предпочтительно по меньшей мере с двумя и более предпочтительно по меньшей мере с тремя и даже более предпочтительно со всеми микроорганизмы, выбранными из группы, состоящей из Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и Streptococcus salivarius DSMZ 20567.
27. Связывающий микроорганизм или его фрагмент соответствии с вариантом выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, где связывающий микроорганизм принадлежит семейству Lactobacillaceae, предпочтительно роду Lactobacillus, роду Paralactobacillus, роду Pediococcus или роду Sharpea, более предпочтительно виду Lactobacillus paracasei, виду Lactobacillus rhamnosus, виду Lactobacillus casei, виду Lactobacillus zeae и наиболее предпочтительно представляет собой любой из штаммов DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 или DSMZ 16673 или их мутант или производное.
28. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 26, в котором микроорганизм или его фрагмент, способный связываться с каждым из штаммов, выбранных из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа С (DSMZ 20523), Streptococcus mutans серотипа е (NCTC 10923) и Streptococcus mutans серотипа f (NCTC 11060), и не способный связываться с микроорганизмом, выбранным из группы, состоящей из Streptococci Salivarius ssp. thermophilus, Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и Streptococcus salivarius DSMZ 20567.
29. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 26 или 27, в котором указанный микроорганизм или его фрагмент, после термической обработки в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин, сохраняет способность связывать mutans Streptococcus, выбранных из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523), Streptococcus mutans серотипа е (NCTC 10923), Streptococcus mutans серотипа f (NCTC 11060), Streptococcus sobrinus DSMZ 20742, Streptococcus ratti DSMZ 20564, Streptococcus cricetus DSMZ 20562, Streptococcus ferus DSMZ 20646 и Streptococcus macacae DSMZ 20714 в присутствии по меньшей мере 0,05 мМ ионов кальция и в присутствии слюны и независимо от обработки проназой Е, протеиназой К, трипсином и/или химотрипсином, где при этих условиях термически обработанный микроорганизм или его фрагмент не способны связываться с микроорганизмом, выбранным из группы, состоящей из Streptococcus salivarius ssp.thermophilus, Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и Streptococcus salivarius DSMZ 20567.
30. Связывающий микроорганизм по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, где связывающий микроорганизм находится в инактивированной форме, получаемой или полученной в результате термической инактивации, лиофилизации или распылительной сушки, где термическая инактивация предпочтительно достигается посредством
- автоклавирования клеток указанного связывающего микроорганизма при температуре 121°С в течение 20 мин в присутствии насыщенного пара при атмосферном давлении 2 бара, или
- замораживания этих клеток в течение по меньшей мере 1 ч при -20°С.
31. Инактивированный связывающий микроорганизм соответствии с вариантом выполнения 29, получаемый или полученный посредством термической инактивации при температуре ≥55°С, предпочтительно при температуре ≥65°С, еще более предпочтительно при температуре 95-121°С и наиболее предпочтительно при температуре 121°С
32. Инактивированный связывающий микроорганизм в соответствии с вариантом выполнения 30, получаемый или полученный посредством термической инактивации в течение ≥15 мин, предпочтительно 15-120 мин, предпочтительно 15-30 мин, наиболее предпочтительно 20 мин.
33. Инактивированный связывающий микроорганизм в соответствии с вариантом выполнения 29, 30 или 31, получаемый или полученный посредством термической инактивации в насыщенном водяном пару при давлении 1-5 бар, предпочтительно 1-3 бар, более предпочтительно 2 бар, а наиболее предпочтительно при термической инактивации в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
34. Фрагмент связывающего микроорганизма по любому из предыдущих вариантов выполнения, в котором фрагмент является лизатом или мембранным фрагментом связывающего микроорганизма.
35. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 в качестве сенсорно нейтрального средства для гигиены полости рта.
36. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или 33 в качестве средства против зубного камня, сенсорно нейтрального средства против кариеса и/или в качестве средства против неприятного запаха изо рта.
37. Связывающий микроорганизм или его фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 35 в качестве сенсорно нейтрального средства против зубного камня, сенсорно нейтрального средства против кариеса и/или сенсорно нейтрального средства против неприятного запаха изо рта агента.
38. Связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 34, 35 или 36, где указанный связывающий микроорганизм или его фрагмент является выделенным и очищенным связывающим микроорганизмом или его фрагментом.
39. Композиция, содержащая связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37, в качестве перорального средства для ухода за полостью рта, предпочтительно в качестве средства против зубного камня, средства против кариеса и/или средства против неприятного запаха изо рта агента.
40. Композиция, содержащая связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37, в качестве сенсорно нейтрального средства для гигиены полости рта, предпочтительно в виде в качестве сенсорно нейтрального средства против зубного камня, сенсорно нейтрального средства против кариеса и/или сенсорно нейтрального средства против неприятного запаха изо рта.
41. Композиция, содержащая связывающий микроорганизм или его фрагмент по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37, в количестве
- достаточном для предотвращения или уменьшения интенсивности неприятного запаха изо рта и/или
- достаточном для предотвращения кариеса или замедления образования кариеса и/или
- достаточном для предотвращения образования зубного камня или замедления образования зубного камня.
42. Композиция, содержащая связывающий микроорганизм по любому из вариантов выполнения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36 или 37, в концентрации
2
13
2
12
2
8
- 10-10 клеток/мг, предпочтительно 10-10 клеток/мг, еще более предпочтительно 10-10 клеток/мг или
2
13
- 10-10 клеток/мл, или
- ≥0,01 мас. % относительно общей массы композиции, предпочтительно 0,01-10 мас. % и более предпочтительно 0,025-2 мас. % или
- ≥0,01 мг сухого веса/г общей композиции, предпочтительно 0,01-100 мг сухого веса/г общей композиции и более предпочтительно 0.025-2 мг сухого веса/г общей композиции.
43. Композиция, содержащая фрагмент связывающего микроорганизма по любому из вариантов выполнения 32, 33, 34, 35, 36 или 37, в концентрации
- ≥0,01 мас. % относительно общей композиции, предпочтительно 0,01-10 мас. % и более предпочтительно 0,025-2 мас. % или
- ≥0,01 мг сухого веса/г общей композиции, предпочтительно 0,01-100 мг сухого веса/г общей композиции и более предпочтительно 0,025-2 мг сухого веса/г общей композиции.
44. Композиция по любому из вариантов выполнения 38, 39, 40, 41 или 42, содержащая дополнительный микроорганизм в жизнеспособной, термически инактивированной или лиофилизированной форме, где термически инактивированная форма получаема или получена посредством обработки в насыщенном водяном пару при давлении равном 1-5 бар, предпочтительно 1-3 бар, более предпочтительно 2 бар, и наиболее предпочтительно посредством термоинактивации в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин.
45. Композиция по варианту выполнения 43, в котором дополнительный микроорганизм является микроорганизмом против неприятного запаха изо рта в концентрации, достаточной для предотвращения, модификации или уменьшения неприятного запаха изо рта, предпочтительно способного стимулировать рост Streptococcus salivar, но не стимулировать рост Streptococcus mutans и/или Porphyromonas gingivalis.
46. Композиция в соответствии с вариантом выполнения 44, в котором микроорганизм против неприятного запаха изо рта представляет собой вид Lactobacillus acidophilus, и предпочтительно представляет собой любой из штаммов Lactobacillus DSMZ 19825, DSMZ 19826 или DSMZ 19827.
47. Композиция по любому из вариантов выполнения 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45,
- где композиция предназначена для использования у человека или животного, и представляет собой зубную пасту, средство для чистки зубов, зубной порошок, гель для перорального применения, полоскание рта, материал зубных протезов, средство для ароматизации рта в аэрозольной упаковке, пастилку, пероральные таблетки, жевательную резинку, полоскание рта, зубную нить, жевательный продукт или добавки к пище, корму или напиткам, или
- где композиция находится в форме порошка, таблетки, препарата в виде пленки, раствора, аэрозоля, гранулы, таблетки, суспензии, эмульсии, капсулы, сиропа, жидкости, эликсира, экстракта, настойки или жидкого экстракта, листового пищевого продукта, бутилированного продукта питания, консервов, автоклавированного продукта питания или жидкого продукта питания или
- где композиция представляет собой пищевой продукт или напиток, выбранные из группы, состоящей из жевательной резинки, спрея, напитка, конфеты, детского питания, мороженого, замороженного десерта, сладкой заправки для салата, молочного препарата, сыра, творога, йогурта, подкисленного молока, сливок для кофе, взбитых сливок, сливочного масла, сыра, переработанного молока и обезжиренного молока, мясного продукта - предпочтительно ветчины, колбасы, и гамбургера, мяса рыбы, мучных изделия, яичных продуктов - предпочтительно яичные рулеты и яичный творог, кондитерских изделий - предпочтительно печенье, желе, закуски и жевательная резинка, хлеб, макаронные изделия, маринованные, копченые продукты, сушеная рыба, приправы.
48. Композиция по любому из вариантов выполнения 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45, где композиция представляет собой пищевую или кормовую композицию.
49. Пищевая или кормовая композиция в соответствии с вариантом выполнения 47, где композиция предназначена для младенцев или для домашнего животного, предпочтительно собаки, кошки, крысы, мыши, хомяка, морской свинки или обезьяны.
50. Пищевая или кормовая композиции для домашних животных в соответствии с вариантом выполнения 48, где композиция представляет собой жевательный продукт для домашнего животного, и предпочтительно в форме кости, рулета, пончика, скобы, кренделя, цифры восемь, или чипса.
51. Композиция по любому из вариантов выполнения 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48, где композиция представляет собой косметическую, фармацевтическую или ветеринарную композицию.
52. Пищевая или кормовая композиция для домашних животных,
содержащая инактивированный связывающий микроорганизм в термически инактивированной или лиофилизированной форме, где инактивированный микроорганизм способен связываться со штаммом Streptococcus группы mutans Streptococcus, и где связывание происходит в присутствии слюны и является устойчивым к термической обработке, зависимой от кальция, где термическая обработка происходит в насыщенном водяном пару при давлении 2 бар при температуре 121°С в течение 20 мин,
и где штамм mutans Streptococcus выбирается из группы, состоящей из Streptococcus mutans серотипа с (DSMZ 20523), Streptococcus mutans серотипа е (NCTC 10923) и Streptococcus mutans серотипа f (NCTC 11060),
и где инактивированный их связывающий микроорганизм не способен связываться с микроорганизмом, выбранным из группы, состоящей из Streptococcus salivarius ssp. thermophilus, Streptococcus oralis DSMZ 20066, Streptococcus oralis DSMZ 20395, Streptococcus oralis DSMZ 20627, Streptococcus mitis DSMZ 12643 и Streptococcus salivarius DSMZ 20567,
и где связывающий микроорганизм присутствует в сенсорно нейтральном количестве
- достаточном для предотвращения или уменьшения интенсивности неприятного запаха изо рта и/или
- достаточном для предотвращения кариеса или замедления образования кариеса и/или
- достаточном для предотвращения образования зубного камня или замедления образования зубного камня.
53. Пищевая композиция для домашних животных в соответствии с вариантом выполнения 51, где концентрация инактивированных связывающих микроорганизмов составляет
2
13
2
12
3
8
- 10-10 клеток/мг, предпочтительно 10-10 клеток/мг, еще более предпочтительно 10-10 клеток/мг или
2
13
- 10-10 клеток/мл, либо
- ≥0,01 мас. % относительно общей композиции, предпочтительно 0,01-10 мас. % и более предпочтительно 0,025-2 мас. % или
- ≥0,01 мг сухого веса/г общей композиции, предпочтительно 0,01-100 мг сухого веса/г общей композиции и более предпочтительно 0,025-2 мг сухого веса/г общей композиции
54. Пищевая или кормовая композиция для домашних животных, содержащая фрагмент в соответствии с вариантом выполнения 33, в концентрации
- ≥0,01 мас. % относительно общей композиции, предпочтительно 0,01-10 мас. % и более предпочтительно 0,025-2 мас. % или
- ≥0,01 мг сухого веса/г общей композиции, предпочтительно 0,01-100 мг сухого веса/г общей композиции и более предпочтительно 0,025-2 мг сухого веса/г общей композиции.
55. Применение связывающего микроорганизма или его фрагмента по любому из вариантов выполнения 1-37, в качестве сенсорно нейтрального средства для гигиены полости рта, предпочтительно в виде сенсорно нейтрального средства против зубного камня и/или сенсорно нейтрального средства против кариеса и/или сенсорно нейтрального средства против неприятного запаха изо рта.
56. Применение связывающего микроорганизма или его фрагмента по любому из вариантов выполнения 1-37 для производства любого
- лекарственного средства для профилактики или лечения образования зубного камня,
- лекарственного средства для профилактики или лечения образования кариеса,
- лекарственного средства для профилактики или лечения неприятного запаха изо рта,
где связывающий микроорганизм и/или его фрагмент находится в сенсорно нейтральном количестве.