СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ КОПЕЕЧНИКА ЧАЙНОГО (HEDYSARUM THEINUM KRASNOB.)
METHOD OF REPRODUCTION OF TEA TICK TREFOIL (HEDYSARUM THEINUM KRASNOB)

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала лекарственного растения копеечника чайного.
Известны методы культивирования тканей in vitro (аналог) двух видов копеечника - копеечника забытого и копеечника альпийского (Ляпкова Н.С., Хадеева Н.В., Шаин С.С., Майсурян А.Н. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro. Биотехнология, 1999, 1, С.55-61). Авторам удалось получить каллусные ткани листового, стеблевого и корневого происхождения, а также изолированные корни этих растений.
Культивирование недифференцированно растущих клеток растений не всегда гарантирует сохранение биосинтеза видоспецифичных соединений в условиях in vitro. Кроме того, выращивание клеточных культур, а также культивирование изолированных корней на питательной среде, содержащей фитогормоны, существенно ограничивает вероятность дальнейшего использования получаемой растительной массы и тем самым снижает ценность метода.
Наиболее близким к предлагаемому способу является «Культура корня Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - продуцент изофлавонов» (Патент РФ №2360964 от 10.07.2009, Бюл. №19). Задача изобретения - получение культуры корня Hed.th., интенсивно растущей в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющей способность к синтезу изофлавонов, характерных для корней целого растения, и обладающей генетической и биохимической стабильностью, для контролируемого выращивания лекарственного сырья в любое время года.
Поставленная задача решалась созданием новой культуры корня Hedysarum theinum Krasnob., депонированной в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Институте физиологии растений РАН - под обозначением Hed.th. - продуцента изофлавонов: ононина, гликозида тексазина, малонилононина, формононетина.
Недостатком данного метода является культивирование только корней, а наземная часть при этом отсутствует. Вегетативные органы также представляют лекарственную ценность и могут быть использованы.
Заявляемый способ размножения копеечника чайного методом культуры in vitro позволяет получить активно растущие растения-регенеранты с полноценными вегетативными органами и корневой системой.
Сущность способа размножения копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.) заключается в том, что используются вызревшие простерилизованные семена копеечника чайного, которые высаживают на питательные среды Мурасиге-Скуга (MS), не содержащие гормоны, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают на среды размножения MS с добавлением 5 мкМ БАП (6-бензиламинопурина), 2,5 мкМ кинетина и 5 мкМ ГК, затем образовавшиеся конгломераты микропобегов делят и пересаживают на среды, содержащие 1,0 БАП+L-глютамин и аденин сульфат 100 мг/л. Микропобеги размножают и укореняют в последующих пассажах. После адаптации к нестерильным условиям получают стандартные саженцы копеечника чайного.
Способ реализуют следующим образом.
Перед стерилизацией семена копеечника чайного промывают под проточной водой в течение 15-25 минут. Стерилизацию проводят в условиях ламинар-бокса 0,1% раствором сулемы 10 минут. Затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Этот способ стерилизации позволяет получить 70% эксплантов «стерильными» и жизнеспособными. Питательные среды для этапа введения в культуру ткани готовят по прописи Мурасиге-Скуга (MS), они не содержат гормоны, на них высаживают простерилизованные семена (Фиг.1. Побеги копеечника чайного на этапе введения в культуру ткани).
Через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают на среды размножения MS с добавлением 5 мкМ БАП (6-бензиламинопурина), 2,5 мкМ кинетина и 5 мкМ ГК (гибберелловой кислоты) (табл.1) для микроразмножения (Фиг.2. Микроразмножение копеечника чайного). Образовавшиеся конгломераты микропобегов легко делятся на одиночные, которые пересаживают на среды, содержащие 1,0 мкМ БАП+L-глютамин и аденин сульфат (100 мг/л). Для длительного получения активно пролиферирующей культуры необходимо использовать схему чередования сред с высоким и низким содержанием БАП через один пассаж. В результате чего получают стерильную культуру копеечника со стабильным коэффициентом размножения 3,3±0,4. Число побегов на один эксплант за один пассаж составляет от 2 до 15 штук. Укореняют побеги на среде Мурасиге-Скуга дополненной 3 мкМ НУК (α-нафтилуксусная кислота). Адаптацию растений-регенерантов копеечника чайного к нестерильным условиям проводят на гидропонной установке, используя ¼ минерального состава среды MS (Фиг.3.) Через 25-30 суток адаптации получают стандартные саженцы (Фиг.4. Растение-регенерант копеечника чайного после адаптации на гидропонной установке).
(n-1)
На основании теоретического расчета по формуле Bn=B1×G (где n - количество месяцев культивирования, B1 - количество микропобегов, G - коэффициент размножения) от одного растения при данном способе культивирования можно получить за 12 месяцев до 159432 саженцев копеечника чайного, если коэффициент размножения равен 3,0.
Высокая эффективность процесса, тиражируемость, адаптация в условиях гидропоники определяют промышленную применимость предлагаемого способа.
Таблица 1.
Влияние гормонального состава питательных сред и схемы культивирования на побегообразование у копеечника чайного
Гормональный состав питательной среды, мкМ, (№ среды)
Высота растений, мм
Коэффициент размножения
Примечание
1,0 БАП+L-глютамин и аденин сульфат 100 мг/л (78)
30,1±0,1
1,0
рост в длину, гибель побегов 40%
2,5 БАП (98)
20,3±0,2
1,8±0,1
гибель побегов 20%
5 БАП+2,5 кинетина +5 ГК (204)
30,7±0,2
2,5±0,5
гибель побегов 20%
5 БАП+1 НУК
30±0,7
2,0±0,2
гибели побегов 30%
Чередование сред 204 и 78
40,5±0,1
3,3±0,4.
стабильный рост и размножение