Способность к формированию биопленки возбудителем дифтерии

3. Обнаружен параллелизм между увеличением содержания в крови ГЪ-4, ТОТа, нарушением клеточного состава периферической крови и усугублением тяжести патологии: уровень указанных цитокинов в крови возрастает уже на I стадии ХЛЛ, достигая максимальных величин на IV стадии. Мониторинг показателей содержания в крови ГЪ-4 и ТОТа может быть использован в качестве объективных прогностических критериев прогрессирующего течения В-ХЛЛ, оценки эффективности комплексной терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кадагидзе З. Г. Цитокины. Практическая онкология. 2003; 4 (3): 131-9.

2. Канцерогенез: патофизиологические и клинические аспекты. Саратов: Изд-во СГМУ; 2011.

3. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. СПб: Фолиант; 2008.

4. ВолковаМ. А., ред. Клиническая онкогематология: Руководство для врачей. 2-е изд. М.: Медицина; 2007.

5. Воробьев А. И., ред. Руководство по гематологии. 4-е изд. М.: Ньюдиамед; 2007.

6. Телетаева Г. М. Цитокины и противоопухолевый иммунитет. Практическая онкология. 2007; 8 (1): 211-8.

7. Bloomfield C. D., Foon K. A., Lemine E. G. Basic principles and clinical management of cancer. New York; 1993: 459-68.

8. Brown M., Hural J. Functions of IL-4 and control of its expression. Crit. Rev. Immunol. 1997; 17: 1-32.

9. Kishimoto Т. Interleukin-6: discovery of a pleiotropic cytokine. Ar-thr. Res. Ther. 2006; 8 (suppl. 2): 2-14.

10. Moore K., de Waal Malefyt R., Coffman R. L. Interleukine-10 and interleukine-10 receptor. Ann. Rev. Immunol. 2001; 19: 683-765.

Поступила 11.05.12

микробиология

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.871.1:579.22].083.1

Г. Г. харсеева1, А. Ю. миронов2, Я. Н. Фролова1, А. В. Лабушкина1

способность к формированию биопленки возбудителем дифтерии

1ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону, 2ГБОУ ВПО Первый московский государственный медицинский университет им. И. м. Сеченова

Цель исследования - изучение способности возбудителя дифтерии к формированию биопленки как одному из механизмов персистенции в организме человека. Объектом исследования послужил штамм С. diphtheriae gravis tox+, выделенный в МУЗ городская больница № 1 г. Гуково Ростовской области в 2011 г. из ротоглотки больного 19 лет с диагнозом «дифтерия ротоглотки, типичная пленчатая локализованная, средней тяжести, гладкое течение». В качестве контроля использовали музейный штамм С. diphtheriae gravis tox+ № 665, полученный из ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Установлено, что возбудитель дифтерии обладает способностью к образованию биопленки, причем интенсивность процесса образования экзополисахарида выше на стеклянных, чем на пластиковых, поверхностях. Выявлены различия в степени интенсивности образования биопленки циркулирующим в популяции и музейным штаммами С. diphtheriae gravis tox+. Жизнеспособность формирующих ее микроорганизмов связана с адаптационными возможностями штаммов.

Ключевые слова: возбудитель дифтерии, биопленка

G.G. Kharseyeva, A.Yu. Mironov, Ya.N. Frolova, A.V. Labushkina The article deals with results of studying diphtheria causative agent capacities to form biofilm as one of mechanisms of persistence in human organism. The study object was strain of C.diphtheriae gravis tox+ obtained from nasopharynx of patient aged 19 in municipal hospital №1 of town of Gukovo of Rostov oblast in 2011. The patient had diagnosis of "diphtheria of nasopharynx, typical filmy, localized, mild severity, even course". The control was implemented using the museum strain C.diphtheriae gravis tox+ № 665 from the L.A. Tarasevitch state research institute of standardization and biologic preparations control. It is established that diphtheria causative agent as an ability to form biofilm. The intensity of process of formation of exopolysaccharide is higher on glass that on plastic surfaces. The differences in degree of intensity of formation of biofilm are revealed between the strain circulation in population and museum strains C.diphtheriae gravis tox+. The vital capacity of biofilm forming microorganisms is related with adaptation possibilities of strains.

Key words: diphtheria agent, biofilm

Несмотря на проводимую вакцинацию, эпидемии дифтерии периодически повторяются [8]. Поэтому решение проблемы снижения заболеваемости дифтерией не может быть

Для корреспонденции:

Харсеева Галина Георгиевна, д-р мед. наук, проф., зав. каф. микробиологии и вирусологии № 2

Адрес: 344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер,, 29 Телефон: (8863)250-41-09 E-mail: galinagh@bk.ru

ограничено лишь проведением профилактических прививок населения. Известно, что формирование бактерионосительства при дифтерии происходит у лиц с высоким уровнем противодифтерийных антитоксических антител [9]. Для расшифровки механизмов длительной персистенции штаммов дифтерийных бактерий в организме необходимо учитывать и особенности биологических свойств возбудителя, в частности его способность образовывать биопленки.

Микробные биопленки ответственны за этиологию и патогенез многих острых и особенно хронических бактериальных инфекций человека [2]. К таким инфекционным за-

МИКРОБИОЛОГИЯ

болеваниям, этиологическими агентами которых являются микроорганизмы в составе биопленки, относят тонзиллиты, бронхиты, пневмонии, пародонтиты, муковисцидоз, бактериальные простатиты, инфекционные эндокардиты и др. [3]. Свыше 60% всех внутрибольничных инфекций развивается в результате действия микроорганизмов, находящихся в составе биопленки [7].

В течение всего времени существования полимикробные фиксированные сообщества микроорганизмов синтезируют полимерный матрикс, состоящий из экзополисахарида [5]. Внедренные в матрикс микроорганизмы изменяют свои биологические свойства, что в значительной степени защищает их от воздействия факторов врожденного иммунитета, клеточных и гуморальных факторов адаптивного иммунитета [4, 6]. Исследование способности возбудителя дифтерии формировать биопленки приобретает в настоящее время особую актуальность в связи с продолжающейся циркуляцией штаммов токсигенных Corynebacterium diphtheriae в постэпидемический период [10].

Цель исследования - изучение способности возбудителя дифтерии к формированию биопленки как одному из механизмов персистенции в организме человека.

Материалы и методы. Объектом исследования послужил штамм С. diphtheriae gravis tox+, выделенный в МУЗ городская больница № 1 г. Гуково Ростовской области в 2011 г из ротоглотки больного 19 лет с диагнозом: «дифтерия ротоглотки, типичная пленчатая, локализованная, средней тяжести, гладкое течение». В качестве контроля использовали музейный штамм С. diphtheriae gravis tox+ № 665, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ Государственный научно-медицинский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.

Культивирование штаммов дифтерийных бактерий осуществляли в пластиковых (гидрофобных) и стеклянных (гидрофильных) микробиологических пробирках, содержащих по 3 мл 20% сывороточного бульона. Тестирование штаммов на способность формировать биопленки проводили по методике Р. L. Watnick и соавт. (1999). Предварительно по стандарту Мак-Фарланда готовили микробную взвесь дифтерийных микробов густотой 1 млрд м.т/мл. Полученную микробную взвесь в разведении 1:100 вносили в объеме 0,1 мл в пробирки с 20% сывороточным бульоном и инкубировали в термостате при 370С в течение 168 ч. Интенсивность биопленкообразова-ния определяли через 48, 72, 120, 144 и 168 ч.

Жидкую фракцию суспензии удаляли, двукратно промывали дистиллированной водой и вносили в пробирки по 4 мл 1% раствора кристалл-виолета, выдерживая при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого содержимое пробирок трижды промывали дистиллированной водой, добавляли по 4 мл 99% раствора димексида и выдерживали при комнатной температуре 15 мин.

Интенсивность биопленкообразования штаммами возбудителя дифтерии оценивали, измеряя оптическую плотность (ОП) на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм.

Жизнеспособность дифтерийных бактерий в биопленке определяли по уровню высеваемости биопленочной культуры на кровяно-теллуритовом агаре через 48, 72, 120, 144 и 168 ч культивирования. Для получения биопленочной культуры из флакона удаляли жидкую фракцию, двукратно промывали дистиллированной водой. Затем при помощи урологического зонда вертикальными обратнопоступательными движениями снимали с поверхности стекла адгезированную биопленочную культуру исследуемого микроорганизма. Полученное содержимое помещали в эпендорф и центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин, убирали надосадочную жидкость и при помощи физиологического раствора доводили до объема 1 мл. Проводили 10-кратные разведения биопленочной культуры, после чего в объеме 0,05 мл из разведений 10-6-10-10 делали высев на кровяно-теллуритовый агар. Подсчет выросших ко-

лоний осуществляли через 24 ч, приводили показатели к 1 мл и рассчитывали среднее арифметическое в КОЕ/мл.

Результаты и обсуждение. При сравнительном исследовании интенсивности биопленкообразования штаммами С. diphtheriae gravis tox+ выявляли различия при культивировании их в пластиковых и стеклянных пробирках (рис. 1). Изучение интенсивности образования экзополисахарида на пластике показано, что диапазон колебаний ОП биопленки штамма, выделенного от больного, и музейного штамма колебался в пределах от 0,06 до 0,133, тогда как на стекле был выше и составил 0,062-0,395. Максимальных значений процесс биопленкообразования у штаммов С. diphtheriae gravis tox+ достигал на 120-й и 144-й час культивирования.

В ходе сравнительного анализа процесса образования эк-зополисахарида циркулирующим и музейным штаммами С. diphtheriae gravis tox+ отмечено отсутствие каких-либо различий при их культивировании на гидрофобных поверхностях (пластик). На гидрофильной поверхности (стекло) процесс биопленкообразования более интенсивно протекал у штамма С. diphtheriae gravis tox+ № 665 (диапазон колебаний ОП составил 0,233-0,395) по сравнению с циркулирующим штаммом С. diphtheriae gravis tox+, выделенным от больного с токсической формой дифтерии (ОП 0,062-0,209). Пик интенсивности биопленкообразования у исследованных штаммов приходился на 120-й час культивирования за исключением штамма С. diphtheriae gravis tox+ № 665 (144-й час культивирования на пластике).

Возможно, повышенная степень колонизации дифтерийными микробами поверхности стекла связана с его адгезивными свойствами. Стекло в отличие от пластика гидрофильно и биологически инертно [1], что обеспечивает более интенсивное прикрепление микробных клеток. Из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения, а для стекла данный процесс не характерен [1].

При изучении динамики роста планктонной культуры дифтерийных бактерий при культивировании в стеклянных и пластиковых пробирках получены аналогичные результаты. Максимальных значений процесс размножения планктонной культуры циркулирующего и музейного штаммов С. diphtheriae gravis tox+ как в пластиковых, так и в стеклянных пробирках достигал на 168-й час культивирования.

Жизнеспособность дифтерийных микробов, входящих в состав биопленки, оценивали по уровню высеваемости на кровяно-теллуритовом агаре (рис. 2). При культивировании в пластиковых пробирках у циркулирующего и музейного

0,7

0,6

I 0,5 В

Ё 0,4

I 0,3

а>

I 0,2

0,1

48

72

144

168

96 120 Часы

—О— С. diphtheriae gravis tox+ № 665

Рис. 1. Показатели оптической плотности экзополисахарида штаммов С. diphtheriae gravis tox+ при культивировании в стеклянных и пластиковых пробирках.

Часы

—О— С. diphtheriae gravis tox+ № 665

m С. diphtheriae gravis tox+ циркулирующий

Рис. 2. Высеваемость биопленочной культуры штаммов С. diphtheriae gravis tox+ при культивировании в стеклянных и пластиковых пробирках.

штаммов уровень высеваемости колебался в пределах от 0,12 • 106 до 3,0 • 106 КОЕ/мл, тогда как в стеклянных пробир-кахрыл несколько выше (от 0,14 • 106 до 3,31 • 106 КОЕ/мл). Максимальных значений уровень высеваемости двух токси-генных штаммов С. diphtheriae при росте в пластиковых и в стеклянных пробирках достигал к 120-му часу.

У циркулирующего штамма возбудителя дифтерии по сравнению с музейным количество экзополисахарида, образуемого на 120-й час, было ниже (см. рис. 1), но при высеве из него (см. рис. 2) наблюдалось наибольшее количество клеток бактерий (3,31 • 106 КОЕ/мл). Для музейного штамма характерна обратная зависимость: высокое содержание экзополисахарида совпадало с низкой высеваемостью клеток бактерий (2,9 • 106 КОЕ/мл). Возможно, этот факт связан с более высокой способностью циркулирующего в популяции штамма возбудителя дифтерии адаптироваться к условиям окружающей среды.

Заключение. Возбудитель дифтерии обладает способностью к образованию биопленки, что повышает колонизацию этим

микроорганизмом эпителия верхних дыхательных путей и защиту возбудителя от воздействия факторов иммунной системы. Данные характеристики патогенных бактерий делают их более конкурентоспособными в борьбе за сайты адгезии при образовании биопленок на эпителии верхних дыхательных путей, способствуя формированию бактерионосительства. Выявленные различия в степени интенсивности образования биопленки циркулирующим в популяции и музейным штаммами С. diphtheriae gravis tox+ и жизнеспособности формирующих ее микроорганизмов связаны с их адаптационными возможностями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Блажевич О. В. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004; 40 (11): 1445-56.

2. Червинец Ю. В., Ботина С. Г., Глазова А. А., Коробан Н. В., Чер-винец В. М., Самоукина А. M. и др. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактоба-циллами, выделенными из полости рта здоровых людей. Клиническая лабораторная диагностика. 2011; 2: 44-6.

3. Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284: 1318-22.

4. Cook G., Costerton J. W., Darouiche R. O. Direct confocal microscopy studies of the bacterial colonization in vitro of a silver-coated heart valve sewing cuff. Int. J. Antimicrob. Agents. 2000; 13: 169-73.

5. DaveyM. E., O'Toole G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64 (4): 847-67.

6. El-AziziM., Rao S., Kanchanapoom Т., KhardoriN. Molecular basis of bacterial adhesion. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2005; 7; 29-41.

7. Froeliger E. H., Fives-Taylor P. Streptococcus parasanguis fimbria-associated adhesin fapl is required for biofilm formation. Infect. Immun. 2001; 69: 2512-9.

8. Gristina A. G., Dobbins J. J., Giammara В., Lewis J. C., DeVreies W. C. Biomaterial-centered sepsis and the total artificial heart. J.A.M.A. 1988; 259: 870-4.

9. Galazka A. Implications of the diphtheria epidemic in the Former Soviet Union for immunization programs. J. Infect. Dis. 2000; 181 (suppl. 1): 244-8.

10. Golaz A. Epidemic diphtheria in the Newly Independent States of the Former Soviet union: implications for diphtheria control in the United States. J. Infect. Dis. 2000; 181: 237-43.

Поступила 26.06.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.843.1:579.254].083.1

О. А. Рыковская, О. А. Шалу, Е. В. Монахова, Л. М. Смоликова, О. С. Чемисова, Е. Н. Голенищева, Е. М. Санамянц, Г. В. Гальцева, А. В. Алленов, Г. П. Мурначев, Т. В. Хоменко

разработка комплексного метода оценки вирулентности парагемолитических вибрионов

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ФКУЗ Приморская противочумная станция Роспотребнадзора, Уссурийск, ФКУЗ Причерноморская противочумная станция Роспотребнадзора, Новороссийск, ФКУ3 Владивостокское противочумное отделение ФКУЗ Приморская противочумная станция Роспотребнадзора

Парагемолитические вибрионы, выделенные из разных источников, изучены по фено- и генотипическим признакам, ассоциированным с вирулентностью. Выявлено несовпадение в некоторых случаях результатов теста Канагава и ПЦР-тестирования гена tdh. Обоснована необходимость комплексной оценки вирулентности, включающей определение гемолитической активности в тесте Канагава, уреазной на среде Кристенсена и ПЦР-детекцию генов tdh и trh. Описан разработанный комплексный метод, определена формула патогенных штаммов, приведены 3 варианта вирулентных парагемолитических вибрионов. Предложены в качестве контрольных тест-штаммы Vibrio parahaemolyticus для фено- и генотипического тестирования штаммов по признакам вирулентности.

Ключевые слова: парагемолитические вибрионы, феномен Канагава, уреазная активность, гены термостабильного прямого гемолизина