Питательная среда плотная для культивирования и выращивания туляремийного микроба
DENSE NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION AND GROWING OF TULAREMIC MICROBE

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования и выращивания туляремийного микроба.
Известна свернутая желточная среда МакКоя, способ приготовления которой следующий: смешивают желток свежих куриных яиц с 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 3:2, смесь разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и в скошенном положении свертывают в течение 1 ч при 80°С. При обильном засеве рост туляремийного микроба появляется уже через 24-48 ч в виде сплошного газона с шероховатой поверхностью, однако при скудном посеве разрозненные беловатые колонии становятся заметными к 3-5-му дню. Поэтому посевы при температуре 37°С следует выдерживать до 10 суток (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководства. Москва: Медицина, Шико. 2009. С. 159).
Недостатком данной среды является незначительная чувствительность.
Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба сухая (FT-агар), содержащая, г/л: сернокислотный гидролизат рыбной муки марки ФКС 17.0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 5.0; дрожжевой экстракт 2,3; магний сернокислый 0,5; натрия сульфит 0,7; агар 10±2.0. 34,0 г основы размешать в 970 мл дистиллированной воды, автоклавировать при 121°С в течение 15 мин. Охладить до температуры 50-45°С. Затем глюкозо-витаминной добавки (ГВД) в количестве 6,02 г растворить в 20 мл воды, автоклавировать при 110°С в течение 30 мин. В охлажденный раствор основы асептически внести раствор (ГВД), тщательно перемешать и разлить в чашки Петри (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. ФБУН государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. ГОСТ Р ИКО 9001-2015. Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба, сухая». (FT-агар). ТУ 9398-028-78095326-2007. Г. Оболенск., Московская обл., Серпуховской район. ФБУН ГНЦ ПМБ.
Данный качественный и количественный состав компонентов питательной среды максимально приближен по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению.
Целью настоящего изобретения является получение качественной питательной среды плотной для культивирования туляремийного микроба на водных настоях мозга теленка, мясного крупного рогатого скота и питательного бульона для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) и стимулирующей добавки эмульсии желтка куриного яйца.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит настои мозга теленка, мясного из мяса крупного рогатого скота и питательного бульона для культивирования микроорганизмов сухого (СПБ), среда также включает: дрожжевой экстракт, глюкозу, магний сернокислый, натрий сернистокислый, агар микробиологический, L-цистеин, дистиллированную воду, с добавлением в среду стимулирующей добавки, в качестве которой используют эмульсию желтка куриного яйца; при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Настой мозга теленка
200,0-300,0
Мясной настой из мяса КРС
200,0-300,0
Питательный бульон для культивирования
микроорганизмов сухой (СПБ)
10,-20,0
Дрожжевой экстракт
1,5-3,5
Глюкоза
0,5-1,5
L-цистеин
0,3-0,7
Магний сернокислый
0,5-0,9
Натрий сернистокислый
0,5-0,9
Агар микробиологический
9,0-15,0
Эмульсия желтка куриного яйца
5,0-15,0
Дистиллированная вода
до 1 л
Для приготовления питательной основы настоя мозгов теленка в качестве исходного сырья используют мозги теленка, содержащие, мг в 100 г субпродукта: глютаминовой кислоты 1426; оксипролина 32; пролина 732; серина 555; тирозина 375; общее количестве аминокислот составляет 11546; нуклеиновые кислоты 258. В 100 г субпродукта %: воды 77,6; белка 11,8. Незаменимые аминокислоты составляют 4464, в том числе: валина 602; изолейцина 546; лейцина 970; лизина 841; метионина 232; треонин 540; триптофана 164; фенилаланина 569. Заменимые аминокислоты, в том числе: аланина 772; аргинина 574; аспарагиновой кислоты 1138; гистидина 623; глицина 610. Приготовление желатина проводят из костной ткани, хрящей и соединительной ткани животных. Особенно много эластинов в связках и сухожилиях, содержащие много моноаминокислот, глицина, однако почти нет серосодержащих аминокислот и триптофана (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва: Пищевая промышленность. 1979. 247 с.).
Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) производства Махачкала, ул. Леваневского, д. 24. Состав, г/л: панкреатический гидролизат из кильки 10,0 натрия хлорида 4,95, рН 7,2±0,2. Порошок рассыпчатый, без комков готовый к применению. МИКРОГЕН ФГУН «НПО» Микроген МЗ РФ, РОССИЯ, г. Москва, ул. 1-я Дубровская, д. 15.
Дрожжевой экстракт, производство Франция, партия №071105630, дата изготовления 10.2015 г., годен до 10.2018 г. Дрожжевой экстракт используется в качестве полноценного и дешевого источника факторов роста микроорганизмов, что повышает ростовые свойства предлагаемой питательной среды (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1986). По химическому составу дрожжевые среды представляют высокоценный питательный субстрат, весьма близкий к мясу, содержит до 53% белка. Богатство дрожжей белками и витаминами позволяет получать из них высококачественные питательные среды (Козлов М.Ю., 1950).
Глюкоза безводная, ГОСТ6938-79, производство Нева-реактив, партия 6, дата изготовления 11.06.15 г., - источник углерода для обеспечения роста туляремийного микроба.
Натрий сернистокислый, импорт, партия №03 от 14.02.16 г., срок хранения 6 мес. Регулятор окислительно-восстановительного потенциала среды является серосодержащим веществом. Снижение окислительно-восстановительного потенциала можно достигнуть искусственным путем - введением в среду натрия сернистокислого. Концентрация натрия сернистокислого в пределах от 0,1 до 0,7% оказалась наиболее благоприятной. Указанные концентрации натрия сернистокислого создают оптимальный уровень окислительно-восстановительного потенциала (рН 7,0±0,2) для начала роста.
Агар микробиологический (европейский тип). Производитель: Испания. Партия LF15110173.
Приготовление водного настоя мозга теленка
Мелкий помол через мясорубку, на 1 килограмм продукта 1,5 литра воды питьевой, затем настаивают 6 дней при комнатной температуре. Полученный настой хранится под 2% хлороформом 6 суток, затем используется. Содержание сухого остатка составляет 2,5%.
Приготовление мясного настоя
Мясной настой приготавливают аналогично приготовления мозга теленка. Используют мясо крупного рогатого скота 1 сорт.
Приготовление эмульсии из желтка куриного яйца
Используют куриные яйца сорт 1, для снятия различных загрязнений их моют под проточной водой хозяйственным мылом щеткой, затем каждое яйцо обтирают спиртом и складывают в кристаллизатор, застланный марлей, смоченной 70°С спиртом, затем в стерильном боксе аккуратно вскрывают стерильным пинцетом - пробивают скорлупу, постепенно убирая полностью белок, не поранив желток, затем желток над факелом спиртовки опускают в стерильную колбу, добавляя на каждый желток половину скорлупки забуференного физиологического раствора, аккуратно взболтать до получения эмульсии.
Приготовление питательной среды для культивирования и выращивания туляремийного микроба заключается в следующем.
Берут по 250,0 г настоев мозга теленка и мясного, добавляют питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 15,0, а также добавляют следующие ингредиенты в соотношении, г/л: дрожжевой экстракт 2,5; глюкозу 1,0; магний сернокислый 0,7; натрий сернистокислый 0,7; агар микробиологический - 12,0; L-цистеин 0,5; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 0,5 мл до рН 7,0±0,1. Приготовленную питательную среду (основу) разливают в 5 градуированные флаконы объемом 200 мл по 198 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный в кипящей водяной бане и остуженный до 56°С агар, добавляют эмульсию желтка куриного яйца в количестве 2,0 мл в каждый флакон, затем тщательно перемешивают разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.
-6
-7
Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования туляремийного микроба проводят путем подсчета количества выросших колоний при посеве из 10 и 10 разведений.
9
9
-6
3
-7
2
Эффективность полученной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-07) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием в качестве тест-культуры F. Tularensis 15 НИИЭГ. Испытуемую культуру выращивают на поверхности скошенного FT агара рН 7,0±0,1 при температуре 37°С в течение 48±2 ч. Из двухсуточной культуры тест-штамма туляремийного микроба готовят взвесь в 0,9% растворе натрия хлористого, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85П ГИСК им. Л.А. Тарасевича, эквивалентную 5×10 м.к./мл, полученную микробную взвесь культуры разводят в 5 раз (к 1 мл взвеси добавляют 4,0 мл раствора натрия хлористого). Полученное разведение эквивалентно 1×10 м.к./мл. Из исходной стандартной взвеси делают десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл культуры в 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлористого, тщательно перемешивают, меняют стерильную пипетку после каждого разведения. Для контроля качества сред применяют разведения 10(1×10 м.к./мл) и 10 (1×10 м.к./мл).
6
7
Контроль плотных питательных сред. По 0,1 мл взвеси тест-штамма F. tularensis из разведений 10 (100 м.к./мл) и 10 (10 м.к./мл) высевают на 3 чашки Петри с испытуемой средой и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Контролем служит заранее проверенный агар высокого качества FT-агар. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С. Учитывали результат подсчета выросших колоний через каждые 24-48-72-120 ч.
Эффективность исследуемых сред оценивают в соответствии с методическими рекомендациями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителя чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза», Москва, 2008.
Пример 1. Тест-штаммы выращивали на плотной питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 200,0; мясной настой 200,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 10,0; дрожжевой экстракт 1,5; глюкозу 0,5; L-цистеин 0,3; магний сернистокислый 0,5; натрий сернистокислый 0,5; агар микробиологический 9,0; эмульсию желтка куриного яйца 5,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило 35% колоний соответственно диаметром 1,2 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.
Пример 2. Тест-штаммы выращивали на плотной питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 250,0; мясной настой 250,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 15,0; дрожжевой экстракт 2,5; глюкозу 1,0; L-цистеин 0,5; магний сернистокислый 0,7; натрий сернистокислый 0,7; агар микробиологический 12,0; эмульсию желтка куриного яйца 10,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило более 60% колоний соответственно диаметром 1,8 и 2,0 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.
Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: настой мозга теленка 300,0; мясной настой 300,0; питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (СПБ) 20,0; дрожжевой экстракт 3,5; глюкозу 1,5; L-цистеин 0,7; магний сернистокислый 0,9; натрий сернистокислый 0,9; агар микробиологический 15,0; эмульсию желтка куриного яйца 15,0; воду дистиллированную до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество колоний, выросших на плотных пластинках агара, для туляремийного микроба тест-штамма F. tularensis 15 НИИЭГ при посевной дозе 100 м.к. и 10 м.к. составило 30% колоний соответственно диаметром 1,5 мм, тогда как на контрольной среде FT-агаре вырастало более 40% колоний соответственно диаметром 1,5 мм.
Таким образом, пример 2 питательной среды является оптимальным по количеству подобранных ингредиентов питательной среды плотной для выращивания и культивирования туляремийного микроба, что позволяет получить достаточное количество колоний туляремийного микроба на 3 сутки.