СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВСТУПЛЕНИЯ ЯДЕР СИМПЛАСТА ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ В АПОПТОЗ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ГОМОГЕНАТЕ ПЛАЦЕНТЫ СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМА С У БЕРЕМЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕРПЕС-ВИРУСНУЮ ИНФЕКЦИЮ
METHOD OF DIAGNOSING APOPTOSIS INITIATION IN PLACENTAL STEM SYMPLAST NUCLEI BY DEFINITION OF CYTOCHROME C CONTENT IN PLACENTAL HOMOGENATE FOR PREGNANT WITH HERPESVIRUS INFECTION IN THIRD TRIMESTER

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на формирование апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты путем установления в гомогенате плаценты содержания цитохрома С при различных титрах антител к вирусу герпеса.
В доступной литературе мы обнаружили высказывания, что повреждение наружной мембраны митохондрий приводит к нарушению энергетического процесса в межмембранном пространстве митохондрий, приводящее к появлению активных форм кислорода (АФК), ведущих к образованию пор во внутренней мембране митохондрий и выбросу в цитозоль клетки цитохрома С [1, 2, 4, 5, 6]. Цитохром С, накапливающийся в большом количестве в цитозоле, принимает участие в формировании апоптосом, инициирующих процесс цикла формирования каспаз от 8-9 до каспазы 3, являющейся причиной начала процесса апоптоза в ядрах [2, 7, 8].
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
У родильниц, перенесших в третьем триместре беременности вспышку герпес-вирусной инфекции различной агрессивности, что устанавливалось по титру антител к вирусу герпеса, забирались кусочки плаценты, из которых приготовляли гомогенат для определения цитохрома С. В другом кусочке плаценты после фиксации в формалине и заливки в парафин приготовлялись гистологические срезы для определения иммуногистохимическим методом числа ядер в симпласте ворсинок, вступающих в апоптоз.
Цель достигается тем, что оценка содержания в гомогенате плаценты цитохрома С при различных титрах к вирусу герпеса позволяет прогнозировать развитие апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
1. Исследовались плаценты после родов у 20 беременных, перенесших вспышку герпес-вирусной инфекции в третьем триместре с титром антител к вирусу простого герпеса 1:6400 (герпесная инфекция средней тяжести), и у 20 беременных, перенесших вспышку герпес-вирусной инфекции в третьем триместре с титром антител к вирусу герпеса 1:12800 (герпесная инфекция тяжелой формы).
Морфологическая классификация апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке, повреждающихся концов фрагментов ДНК in situ end-labeling (ISEL - метод) [3]. Срезы после дегидратации в дистиллированной воде в течение 30 мин инкубируют в 3% растворе перекиси водорода и отмывают 0,15 М забуференным солевым раствором (PBS) (0,15 M NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5). Затем срезы инкубируют в смеси 0,3 М NaCl и 30 мМ цитрата натрия (pH 7,0; 80°С, 20 мин) и отмывают в 0,15 М PBS. После чего срезы инкубируют в растворе проназы при комнатной температуре в течение 30 мин (Calbiochem; 1 мг/мл на 0,15 М PBS). Отмывают в 0,15 М PBS и буфером А (50 мМ Трис-гидрохлорид, 5 мМ хлорид магния, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 0,005% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,5).
Последовательно инкубируют (18°С, 2 ч) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF; "Promega Madison WI", 0,001 мМ biotin-II-dUTP, "Sigma") и ДНК полимеразе-1 E coli (20 ед/мл; "Promega"), приготовленной на буфере А. Затем отмывают буфером А, а вслед за ним 0,5 М PBS (0,5 М NaCl на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5).
Окончательно срезы инкубируют с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit-Vector, Burliname, СА), разведенным 1:25 0,5 М PBS, в который введены 1% БСА (бычьего сывороточного альбумина) и 0,5% твин-20, и в течение 10 мин окрашивают 0,04% раствором ДАБ (3,3-диаминобензидин тетрахлорид) на 0,05 М трис - буфере pH 7,5 и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015% из 30% раствора. Промывают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в бальзам.
Метод обладает высокой чувствительностью даже для ядер, которые только начинают запрограммированную гибель. С помощью этого метода можно увидеть конденсацию хроматина, плотно прилегающего к ядерной оболочке. Титр антител к вирусу герпеса определялся методом иммуноферментного анализа на спектрофотометре "Stat-Fax2100" (USA). Подсчет ядер, находившихся в состоянии апоптоза, проводился на 100 концевых ворсинках плаценты в каждом отдельно взятом случае. В подсчет на 100 ворсинок отбиралось 2000 ядер. Подсчет показал, что при легкой степени тяжести герпес-вирусной инфекции число ядер, находящихся в состоянии апоптоза, насчитывалось от 1,5±0,002% (титр антител - 1:6400), а при тяжелой форме - 3,0±0,03% (титр антител - 1:12800).
2. Для оценки содержания цитохрома С приготовляли гомогенат из тех же плацент. Поверхность плаценты, полученной в течение 10-15 мин после родов, отмывали большим количеством физиологического раствора (ФР). Плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью до 2-3 см, причем толщина срезаемого слоя не превышала 1 мм. Кусочки ткани помещались в химические стаканы, содержащие 200 мл ФР, отмывались от клеток крови и перемешивались на магнитной мешалке в течение 15 мин. Для получения экстрактов отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге и взвешивали. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенезировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г-1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надасадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения ИФА. Размноженный супернатант использовали для количественного определения цитохрома С иммуноферментным методом на ридере "Stat-Fax-2100" (USA) с использованием наборов "Bender Medsystems" (Austria).
Исследования показали, что по мере нарастания титра антител к вирусу герпеса в гомогенате плаценты нарастает содержание цитохрома С: при титре антител 1:6400 определяется 13,9±0,06 пг/мл. При титре 1:12800-18,8±0,08 пг/мл (контроль - 10,7±0,04 пг/мл). При подсчете числа ядер симпласта ворсинок плаценты, находившихся в состоянии апоптоза, установлено, если количество цитохрома С в гомогенате определяется в пределах 13,9±0,06 пг/мл, в симпласте содержится 1,5±0,002% ядер в состоянии апоптоза. При увеличении содержания цитохрома С до 18,8±0,08 пг/мл количество ядер в состоянии апоптоза увеличивается до 3,0±0,03% (контроль 0-1,0±0,002%).
Литература
1. Владимиров Ю.А Свободные радикалы в живых системах / Ю.А.Владимиров, О.А.Азизова, А.И.Деев и др. // Итоги науки и техники Сер. Биофизика. - 1991. - т.29.
2. Князькин И.В. Апоптоз в онкоурологии / И.В.Князькин, В.Н.Цыган - Спб.: наука. - 2007. - 240 с.
3. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе / В.М.Погорелов, Г.И.Козинец // Гематология и трансфузиология. - 1995. - т.43. - №5. - С.21-24.
4. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран /В.П. Скулачев. - М.: Наука. - 1989. - 564 с.
5. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П.Скулачев // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №3. - С.4-16.
6. Скулачев В.П. Феноптоз; запрограммированная смерть организма / В.П.Скулачев // Биохимия. - 1999. - т.64. - Вып.12. - С.1679-1688.
7. Mathiasen I.S. Triggering caspase-independent cell death to combat cancer / I.S. Mathiasen, М. Jaattela // Trends. Mol. Med. - 2002 (8). - P.212-220.
8. Pan G. Caspase-9, BCL-XL and Apaf-1 form a ternaly complex / G. Pan, K. O'Rourke, V.M.Dixit // J. Biol. Chem. - 1998. - vol.273. - P.5841-5845.