ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГАСТРОЭНТЕРИТА У ПОРОСЯТ-ОТЪЕМЫШЕЙ, И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГАСТРОЭНТЕРИТА У ПОРОСЯТ-ОТЪЕМЫШЕЙ
PROBIOTIC PREPARATION INTENDED FOR TREATMENT AND PREVENTION OF GASTROENTERITIS IN GUMMERS AND METHOD OF TREATMENT AND PREVENTION OF GASTROENTERITIS IN GUMMERS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ветеринарии.
Желудочно-кишечные болезни поросят различной этиологии по частоте, массовости и величине наносимого экономического ущерба занимают одно из первых мест в нозологическом профиле болезней свиней.
Широко применяемые для лечения поросят антибиотики наряду с положительным воздействием на течение и форму болезни вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистентности у патогенных бактерий, дисбактериозы, аллергические реакции и др.
В последние годы все большее значение в качестве альтернативы антибиотиков приобретают пробиотические препараты, применение которых в свиноводстве является принципом решения проблемы получения экологически чистых продуктов питания.
Однако при производстве пробиотиков в состав препарата включается, как правило, только биомасса живых, антагонистически активных микроорганизмов, а ценные продукты микробного синтеза (ферменты и бактериоцины) не используются, т.к. процесс их выделения и концентрирования является технологически сложным и трудоемким.
Известен способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний поросят, включающий интраперитонеальное введение поросятам живой культуры Bacillus subtilis штамма №44 (SU 1563699 A, 20.07.1987). Недостатком известного способа является трудность введения препарата и недостаточно высокая эффективность его применения.
Известен способ профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят, включающий введение поросятам с кормом взвеси живой культуры штамма Bacillus subtilis 534, BKM B-1666D в 0,9%-ном растворе натрия хлорида (SU 1824194 A1, 30.06.1993). Недостатками известного способа являются достаточно высокий процент падежа и случаев заболеваний поросят, необходимость продолжительного введения препарата.
Наиболее близким является способ профилактики желудочно-кишечных болезней поросят-отъемышей, включающий введение с кормом клеточной суспензии штаммов Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП (RU 2218924 C2, 20.12.2003). Недостатком способа является необходимость введения препарата сразу после рождения, что не всегда осуществимо на производстве, а также недостаточно высокая его эффективность.
Техническим результатом, на который направлено заявленное изобретение, является повышение эффективности лечения и профилактики гастроэнтерита поросят-отъемышей за счет использования нового пробиотического препарата на основе штаммов Bacillus subtilis ТПИ 13 и Bacillus licheniformis ТПИ 11 и продуктов их метаболизма.
3
Заявленный технический результат достигается за счет нового пробиотического препарата для лечения гастроэнтерита поросят-отъемышей, полученного на основе штамма Bacillus subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и штамма Bacillus licheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ВГНКИ, депонированных во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ), который представляет собой смесь их культуральных жидкостей, содержащих продукты микробного синтеза данных штаммов с концентрацией микробных клеток 5 млрд м.к./см в объемном соотношении указанных штаммов 1:1, в которую внесено равное по массе количество смеси отрубей и дикальцийфосфата, взятых в соотношении 4:1, высушенный до влажности (5±1)%.
Данный технический результат обеспечивается также описываемым способом лечения и профилактики гастроэнтерита у поросят-отъемышей, включающим введение в рацион указанного выше пробиотического препарата для лечения в дозе 7,5 г на голову 1 раз в день в течение 10 дней, а для профилактики в дозе 5 г на голову 1 раз в день 7 дней подряд.
Для приготовления пробиотического препарата использовали известные штаммы Bacillus subtilis ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ и Bacillus licheniformis ТПИ 11-07.06.22-ДЕП/ВГНКИ, депонированные во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ) (А.П.Лиморенко, П.Г.Васильев, А.В.Вишняков, Т.Н.Грязнева. Изучение влияния посевной дозы на основные показатели нативной культуры при глубинном выращивании В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11 в питательных средах на основе солянокислого гидролизата соевой муки. Журнал "Ветеринарная медицина", 2007, №1, с.9).
В. subtilis ТПИ 13 - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На МПА и сусло-агаре с добавлением 5 мкг/мл канамицина образуют матовые колонии телесного или сероватого цвета. В мазках из колоний, выросших через 24-48 часов на картофельном агаре, обнаруживаются палочки размером 2,6×0,7 мкм, содержащие центрально расположенные споры овальной формы. Колонии старых культур могут приобретать черную окраску. Имеет плазмидную и хромосомную устойчивость к канамицину (50 мкг/мл). На МПБ культура образует пленку. Мочевину не гидролизует. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Растет в присутствии 7% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Не нуждается для роста в аминокислотах и витаминах. Не патогенен. Чувствителен к видоспецифическим бактериофагам. Коагулазной и лецитиназной активностью не обладает. Антагонистическая активность (зоны угнетения роста тест-культур) составляет в отношении S. sonnet - 13±1 мм; S. typhimurimn - 14±2 мм; S. aureus - 23±2 мм; C. albicans - 20±2 мм.
Bacillus licheniformis ТПИ 11 - грамположительные спорообразующие факультативные аэробные палочки. Подвижны. На МПА, сусло-агаре образуют матовые колонии бежевого цвета с грубой поверхностью. В мазках из колоний, выросших на МПА, через 18 часов обнаруживаются палочки размером 2,5×0,6 мкм, содержащие споры овальной формы, которые располагаются центрально. На МПБ культура образует каталазу. Мочевину не гидролизует. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Растет в присутствии 7% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, медленно разжижает желатину. Ферментирует глюкозу, лактозу и маннит с образованием кислоты, редуцирует нитраты, в анаэробных условиях образуя из них газ. Обладает коагулазной и летициназной активностью. Чувствителен к видоспецифическим бактериофагам. Не патогенен. Угнетает рост тест-штаммов S. sonnet - 16±2 мм; S. typhimurimn - 12±2 мм; S. aureus - 26±2 мм; C. albicans - 25±2 мм.
Пробиотический препарат на основе указанных штаммов получают следующим образом.
3
Первой технологической стадией приготовления является выращивание исходных культур бацилл В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11 в пробирках на скошенном агаре. Далее посевной материал выращивают на плотной питательной среде Гаузе, в биологических матрацах объемом 20 дм при температуре (37±1)°С в течение 5-7 суток. Ежедневно, начиная с 3 суток культивирования, определяют типичность (гетерогенность) роста и уровень спорообразования бацилл путем микроскопического анализа мазков из биомассы бацилл, окрашенных по Цилю-Нильсену. Через 6-7 суток культивирования В. subtilis ТПИ 13 и В. licheniformis ТПИ 11 оценивают завершенность спорообразования.
Второй технологической стадией приготовления является перенос культур бацилл в биореактор КМ-0,1, где происходит приготовление посевного материала в жидких средах ПС-№4 для В. subtilis ТПИ 13 и ПС-№7 для В. licheniformis ТПИ 11 (таблица 1).
Таблица 1
Состав питательных сред, используемых для промышленного культивирования изучаемых бацилл
Компоненты питательной среды
ПС №4
ПС №7
КУК, см<sup>3</sup>/дм<sup>3</sup>
60
21
ГК, см<sup>3</sup>/дм<sup>3</sup>
8
70
Глюкоза, г/дм<sup>3</sup>
11
12
MnSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O, г/дм<sup>3</sup>
0,3
0,3
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O, г/дм<sup>3</sup>
0,25
0,25
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O, г/дм<sup>3</sup>
0,01
0,01
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O, г/дм<sup>3</sup>
0,046
0,046
NaCl, г/дм<sup>3</sup>
10,0
1,0
3
3
Принятые для КМ-0,1 параметры культивирования (коэффициент аэрации 0,7 дм/мин, продолжительность культивирования 24 ч - для В. subtilis ТПИ 13 и 0,4 дм/мин и 26 ч - для В. licheniformis ТПИ 11 соответственно, а также число оборотов мешалки - 500 об/мин) являются достаточными для обеспечения полноценного роста и спорообразования бацилл.
Приготовленные посевные культуры В. subtilis ТПИ 13 и B. lichemiformis ТПИ 11 должны иметь следующие показатели:
3
- содержание клеток по счету в камере Горяева - не менее 15 млрд/см;
3
- содержание живых клеток по методу БК - не менее 10 млрд/см;
- содержание зрелых спор - не менее 80%.
3
Посевной материал вносят в биореактор из расчета 1 млн живых спор на 1,0 см питательной среды.
Следующая стадия технологического процесса - культивирование бацилл в биореакторах БИОР - 0,1.
Параметры и режимы глубинного культивирования бацилл представлены в таблице 2.
Таблица 2
Параметры и режимы глубинного культивирования бацилл
Параметры и режимы
B. subtilis ТПИ 13
B. lichemiformis ТПИ 11
Тип биореактора
БИОР-0,1
БИОР-0,1
ПС
№4
№7
Коэффициент заполнения биореактора
0,6
0,6
Температура, °С
37±1
37±1
Давление, МПа
0,10±0,05
0,10±0,05
Коэффициент аэрации, дм<sup>3</sup>/мин
0,7±0,1
0,4±0,1
Частота вращения мешалки, об/мин
530
320
Продолжительность культивирования, ч
24
28
Пеногаситель Э-1, дм<sup>3</sup>
0,8
0,5
3
Основанием для окончания культивирования является накопление биомассы в культуральной жидкости не менее 5 млрд м.к./см.
Следующая стадия производства - приготовление в гомогенизаторе смеси культуральных жидкостей B. subtilis ТПИ 13 и B. lichemiformis ТПИ 11, содержащих продукты микробного синтеза бацилл и биомассу бацилл в объемном соотношении 1:1. Затем в гомогенизатор вносится равная по массе смесь пшеничных отрубей (ГОСТ 7169-66) и дикальцийфосфата при их соотношении 4:1.
Применение дикальцийфосфата в составе описываемого пробиотического препарата позволяет не только оптимизировать кальциевый и минеральный состав препарата, но и способствует снижению тяжести заболевания за счет высоких адсорбирующих свойств кальцийфосфатной соли.
Перемешивание проводится при частоте вращения мешалки 1000 об/мин.
Полученная масса высушивается контактно-сорбционным методом в сушильной установке ЭВЗ с кипящим слоем в течение 3 часов при температуре 40°С и 3 часов - при температуре 60°С до влажности (5±1)%.
Фасовка пробиотика осуществляется в пакеты из полимерных материалов по 50 г.
Пробиотик дают поросятам-отъемышам в профилактических целях и дозе 5 г на голову 1 раз в день 7 дней подряд, а в терапевтических целях в дозе 7,5 г на голову 1 раз в день в течение 10 дней.
Техническим результатом заявленного способа являются сокращение сроков и повышение эффективности лечения и профилактики гастроэнтерита поросят в период отъема за счет применения нового эффективного пробиотика.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение пробиотика.
1. Выращивание культур B. subtilis ТЛИ 13 и B. licheniformis ТПИ 11 в пробирках на скошенном агаре.
3
2. Выращивание посевного материала на плотной питательной среде Гаузе в биологических матрацах объемом 20 дм при температуре (37±1)°С в течение 5-7 суток.
3
3
3. Выращивание посевного материала в биореакторе КМ-0,1 в жидких средах ПС-№4 для В. subtilis ТПИ 13 и ПС-№7 для В. licheniformis ТПИ 11 (коэффициент аэрации 0,7 дм/мин, продолжительность культивирования 24 ч - для В. subtilis ТПИ 13 и 0,4 дм/мин и 26 ч - для В. licheniformis ТПИ 11 соответственно, число оборотов мешалки - 500 об/мин).
3
3
3
4. Культивирование бацилл в биореакторах БИОР - 0,1 (коэффициент аэрации 0,7 дм/мин, продолжительность культивирования 24 ч - для В. subtilis ТПИ 13 и 0,4 дм/мин и 28 ч - для В. licheniformis ТПИ 11 соответственно, число оборотов мешалки - 530 об/мин для В. subtilis ТПИ 13 и 320 об/мин для В. licheniformis ТПИ 11). Посевной материал вносят в биореактор из расчета 1 млн живых спор на 1,0 см питательной среды.
5. Приготовление в гомогенизаторе смеси культуральных жидкостей B. subtilis ТПИ 13 и B. lichemiformis ТПИ 11, содержащих продукты микробного синтеза бацилл и биомассу бацилл, в объемном соотношении 1:1. Затем в гомогенизатор вносится равная по массе смесь пшеничных отрубей (ГОСТ 7169-66) и дикальцийфосфата, взятых в соотношении 4:1.
Перемешивание проводится при частоте вращения мешалки 1000 об/мин.
6. Высушивание полученной массы контактно-сорбционным методом и сушильной установке ЭВЗ с кипящим слоем в течение 3 часов при температуре 40°С и 3 часов - при температуре 60°С до влажности (5±1)%.
Пример 2.
Лечебно-профилактическую эффективность препарата оценивали на базе свинокомплексов хозяйств СПК «Новое Литвиново» и ЗАО «Медвежьи озера» Щелковского района Московской области. Учитывали данные клинических исследований поросят-отъемышей опытных и контрольных групп, определяли микрофлору кишечника, оценивали воздействие препарата на организм поросят-отъемышей, биохимический состав крови и основные экономические показатели производственных испытаний препарата.
Препарат поросятам давали с кормом:
- I опытная группа (профилактическая) - пробиотик давали 1 раз в день в течение 7 дней в дозе 5 г (7,5 млрд микробных клеток на одного поросенка);
- I контрольная группа - с профилактической целью скармливали кормовой антибиотик биовит-80 по общепринятой в хозяйстве схеме;
- II опытная группа (терапевтическая) - поросята с признаками гастроэнтерита, которым пробиотик давали с кормом в дозе 7,5 г в течение 10 дней (11,25 млрд микробных клеток на одного поросенка);
- II контрольная группа - поросята с признаками гастроэнтерита, которых лечили антибиотиками: дизпаркол внутримышечно в дозе 1 мл на 10 кг веса, биовит-80 с кормом в дозе 4 г на одного поросенка в течение 10 дней.
На фиг.1 представлены данные о клинических наблюдениях за поросятами I опытной группы (20 животных), получавшими препарат с профилактической целью в дозе 5 г (7,5 млрд микробных клеток на одного поросенка) 1 раз в день 7 дней подряд.
В I опытной группе на 2 сут с начала постановки опыта заболело 2 поросенка. Болезнь проявлялась расстройством пищеварения, сопровождалась диареей и длилась 5 сут. Все поросята выздоровели. Заболеваемость поросят гастроэнтеритом была на 15,8% ниже, чем в контрольной группе.
На фиг.2 представлена заболеваемость поросят I контрольной группы.
У поросят I контрольной группы на 2 сутки признаки гастроэнтерита наблюдали у 6 голов, на 3 сутки - у 7 голов. На 7 сутки с начала постановки опыта 2 поросенка пали. Летальность составила 10%.
Таким образом, профилактическая эффективность пробиотика составила 90%.
Эффективность лечения гастроэнтерита у поросят-отъемышей показана на фиг.3, на котором представлены данные о течении болезни у поросят II опытной группы (больные животные), получавших препарат в терапевтической дозе - 7,5 г (11,25 млрд микробных клеток на 1 поросенка) 1 раз в день 10 дней подряд. У поросят на 3 день с начала постановки опыта наблюдалось улучшение общего состояния, возросла двигательная активность, появился аппетит. Все поросята выздоравливали на 5 день с начала постановки опыта.
В опытной группе ни один поросенок не пал.
Во II контрольной группе (фиг.4) на 5-6 сутки исчезновение клинических признаков гастроэнтерита наблюдалось у 4 голов, на 8 сутки - у 15 голов. На 7 сутки с начала постановки опыта пало 2 поросенка, на 9 сутки пало 5 голов. Летальность составила 25%.
Терапевтическая эффективность применения препарата с терапевтической целью при гастроэнтерите поросят-отъемышей составила 100%.
При лечении пробиотиком выздоровление в среднем наступало на 3-5 день, в контроле - на 6-7 день с начала постановки опыта (фиг.3 и 4).
Таким образом, профилактическая эффективность пробиотика при гастроэнтерите поросят-отъемышей составила 90% при даче препарата в дозе 5 г на голову 1 раз в день 7 дней подряд, терапевтическая - 100% при даче препарата в дозе 7,5 г на голову 1 раз в день в течение 10 дней.