МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА B (HBV)
MODULATION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) EXPRESSION

Перечень последовательностей
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла, озаглавленного BIOL0175WOSEQ.txt, который был создан 18 апреля 2012 года и имеет размер около 256 кБ. Информация о перечне последовательностей в электронном формате включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.
Область изобретения
В некоторых аспектах реализации данного изобретения представлены способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии мРНК и белка вируса гепатита В (HBV) у животного. Такие способы, соединения и композиции применимы для лечения, предупреждения или улучшения связанных с HBV заболеваний и расстройств.
Уровень техники
Гепатит В представляет собой вирусное заболевание, которое передается парентерально через зараженный материал, такой как кровь и продукты крови, зараженные иглы, половым путем, а также вертикально от инфицированных матерей к их потомству. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, во всем мире инфицировано более 2 миллиардов людей, каждый год возникает около 4 миллионов острых случаев, происходит 1 миллион смертей в год и появляется 350-400 миллионов хронических носителей (Всемирная организация здравоохранения: Geographic Prevalence of Hepatitis B Prevalence, 2004. http://www.who.int/vaccines-surveillance/graphics/htmls/hepbprev.htm).
Вирус HBV представляет собой двухцепочечный гепатотропный вирус, который инфицирует только людей и приматов, не являющихся человеком. Репликация вируса происходит преимущественно в печени и, в меньшей степени, в почках, поджелудочной железе, костном мозге и селезенке (Hepatitis В virus biology. Microbiol Mol Biol Rev. 64: 2000; 51-68.). Вирусные и иммунные маркеры могут быть обнаружены в крови, и они характеризуют развивающиеся со временем структуры антигенов-антител. Первый обнаруживаемый вирусный маркер представляет собой HBsAg, за ним следует е-антиген гепатита В (HBeAg) и ДНК HBV. В инкубационный период титры могут быть высокими, однако уровни ДНК и HBeAg HBV падают при возникновении заболевания и могут быть не обнаруживаемыми во время пика клинической болезни (Hepatitis В virus infection-natural history and clinical consequences. N Engl J Med.. 350: 2004; 1118-1129). HBeAg представляет собой вирусный маркер, обнаруживаемый в крови, который коррелирует с активной вирусной репликацией и, следовательно, высокой вирусной нагрузкой и инфективностью (Hepatitis В е antigen-the dangerous end game of hepatitis B. N Engl J Med. 347: 2002; 208-210). Присутствие анти-HBsAb и анти-HBcAb (IgG) указывает на выздоровление и иммунитет у ранее инфицированного субъекта.
В настоящее время терапии для хронической инфекции HBV, которые рекомендованы Американской ассоциацией по изучению болезней печени (AASLD) и Европейской ассоциацией по изучению печени (EASL), включают интерферон альфа (INFα), пегилированный интерферон альфа-2а (Peg-IFN2a), энтекавир и тенофовир. Нуклеозидные и нуклеотидные терапии, энтекавир и тенофовир, являются успешными для снижения вирусной нагрузки, однако скорости снижения сероконверсии HBeAg и HBeAg даже ниже, чем эти показатели, полученные при терапии с IFNα. Также используют другие аналогичные терапии, включая ламивудин (ЗТС), телбивудин (LdT) и адефовир, однако для нуклеозидной/нуклеотидной терапии в целом, возникновение резистентности ограничивает терапевтическую эффективность.
Следовательно, в данной области техники существует необходимость открытия и разработки новых противовирусных терапий. Кроме того, существует необходимость в новых анти-HBV терапиях, способных увеличивать скорости сероконверсии HBeAg и HBsAg. В недавнем клиническом исследовании была обнаружена корреляция между, сероконверсией и снижением HBeAg (Fried et аl. (2008) Hepatology 47:428) и снижением HBsAg (Moucari et al. (2009) Hepatology 49:1151). Снижение уровней антигенов может обеспечивать возможность иммунологического контроля инфекции HBV, поскольку высокие уровни антигенов, предположительно, вызывают иммунологическую толерантность. Существующие нуклеозидные терапии для HBV способны существенно снижать уровни HBV, однако они слабо влияют на уровни HBeAg и HBsAg.
Антисмысловая технология развивается как эффективное средство снижения экспрессии специфических генных продуктов, и, следовательно, может быть подтверждена ее уникальная полезность в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования экспрессии HBV (смотри публикации патентов США №№2008/0039418 и 2007/0299027). Антисмысловая терапия отличается от нуклеозидной терапии тем, что она может напрямую влиять на транскрипты для антигенов HBV и, посредством этого, снижать уровни HBeAg и HBsAg в сыворотке. Из-за большого количества перекрывающихся транскриптов, вырабатываемых при инфекции HBV, существует также возможность снижения ДНК HBV, помимо HBeAg и HBsAg, одним антисмысловым олигомером. Следовательно, антисмысловая технология развивается как эффективное средство снижения экспрессии определенных генных продуктов, и, следовательно, может быть подтверждена ее уникальная полезность в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования HBV.
Краткое описание изобретения
В настоящем документе представлены способы, соединения и композиции для модулирования экспрессии мРНК и белка HBV. В некоторых аспектах реализации данного изобретения, соединения, применимые для модулирования экспрессии мРНК и белка HBV, представляют собой антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды.
В некоторых вариантах реализации, модулирование может происходить в клетке или ткани. В некоторых вариантах реализации клетка или ткань находится в организме животного. В некоторых вариантах реализации животное представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации снижаются уровни мРНК HBV. В некоторых вариантах реализации снижаются уровни ДНК HBV. В некоторых вариантах реализации снижаются уровни белка HBV. В некоторых вариантах реализации снижаются уровни антигена HBV. В некоторых вариантах реализации снижаются уровни s-антигена HBV (HBsAg). В некоторых вариантах реализации снижаются уровни е-антигена HBV (HBeAg). Такое снижение может происходить в зависимости от времени или в зависимости от дозы.
Также представлены способы, соединения и композиции, применимые для предупреждения, лечения и улучшения заболеваний, расстройств и состояний. В некоторых вариантах реализации, такие связанные с HBV заболевания, расстройства и состояния представляют собой болезни печени. В некоторых вариантах реализации, такие заболевания, расстройства и состояния печени включают желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, воспаление, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV и заболевание печени, связанное с трансплантацией. В некоторых вариантах реализации, такие связанные с HBV заболевания, расстройства и состояния представляют собой гиперпролиферативные заболевания, расстройства и состояния. В некоторых вариантах реализации такие гиперпролиферативные заболевания, расстройства и состояния включают рак, а также связанные злокачественные образования и метастазы. В некоторых вариантах реализации, такие виды рака включают рак печени и гепатоцеллюлярный рак (НСС).
Такие заболевания, расстройства и состояния могут в совокупности иметь один или несколько факторов риска, причин или последствий. Некоторые факторы риска и причины развития заболевания печени или гиперпролиферативного заболевания включают возраст; табакокурение; воздействие солнечного света и ионизирующей радиации; контакт с некоторыми химическими веществами; инфекцию некоторыми вирусами и бактериями; некоторые гормональные терапии; семейный анамнез рака; употребление алкоголя; и некоторые особенности образа жизни, включая плохое питание, недостаток физической активности и/или избыток веса. Некоторые симптомы и последствия, связанные с развитием заболевания печени или гиперпролиферативного заболевания, включают, но не ограничиваясь этим: болезнь, похожую на грипп, слабость, боли, головную боль, жар, потерю аппетита, диарею, желтуху, тошноту и рвоту, боль в области печени, стул земляного или серого цвета, зуд по всему телу и мочу темного цвета.
В некоторых вариантах реализации, способы лечения включают введение антисмыслового соединения HBV пациенту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах реализации, способы лечения включают введение антисмыслового олигонуклеотида HBV пациенту, нуждающемуся в этом.
Подробное описание
Следует понимать, что изложенное выше общее описание и следующее подробное описание являются лишь примерными и пояснительными, и не являются ограничивающими заявленное изобретение. В настоящем документе применение единственного числа включает множественное число, если специально не оговорено иное. При использовании в настоящем документе, применение «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включая», а также других форм, таких как «включает» и «включен», не является ограничивающим. Также, такие термины как «элемент» или «компонент» охватывают элементы и компоненты, составляющие одно целое, а также элементы и компоненты, которые составляют более одной субъединицы, если специально не указано иное.
Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены только для организационных целей, и их не следует толковать как ограничения описываемого предмета обсуждения. Все документы или части документов, которые упомянуты в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь этим, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, в явной форме включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме.
Определения
Если не даны конкретные определения, то номенклатура, используемая в связи с методиками и приемами, а также сами методики и приемы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, представляют собой те, которые хорошо известны и общеприняты в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методики. Где это допустимо, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, номера доступа GENBANK и связанная информация о последовательностях, которую можно получить из таких баз данных как Национальный центр биотехнологической информации (NCBI), а также другие данные, упомянутые в тексте настоящего описания, включены в настоящий документ путем ссылки в отношении фрагментов указанных документов, рассматриваемых в настоящем документе, а также в полном объеме.
Если не указано иное, то следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
«2'-O-метоксиэтил» (также 2'-МОЕ и 2'-O(СН)-ОСН) относится к O-метокси-этиловой модификации в 2'-положении фуранозного кольца. Сахар с 2'-O-метоксиэтиловой модификацией представляет собой модифицированный сахар.
«2'-МОЕ нуклеозид» (также 2'-O-метоксиэтиловый нуклеозид) обозначает нуклеозид, содержащий 2'-МОЕ модифицированный сахарный фрагмент.
«2'-замещенный нуклеозид» обозначает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении фуранозильного кольца, отличный от Н или ОН. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды содержат нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями.
«3'-сайт-мишень» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен к 3'-основному нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
«5'-сайт-мишень» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен к 5'-основному нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
«5-метилцитозин» обозначает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5-положении. 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеооснование.
«Около» обозначает в пределах ±7% от значения. Например, если указано «соединения, по меньшей мере примерно на 70% ингибирующие HBV», подразумевается, что уровни HBV ингибированы в диапазоне от 63% до 77%.
«Приемлемый профиль безопасности» обозначает характеристику побочных эффектов, которая находится в пределах клинически допустимых пределов.
«Активное фармацевтическое средство» обозначает вещество или вещества в фармацевтической композиции, которые обеспечивают терапевтическое преимущество при введении пациенту. Например, в некоторых вариантах реализации, антисмысловый олигонуклеотид, направленный на HBV, представляет собой активное фармацевтическое средство.
«Активная область мишени» обозначает область мишени, на которую направлено одно или несколько активных антисмысловых соединений. «Активные антисмысловые соединения» обозначают антисмысловые соединения, которые снижают уровни целевой нуклеиновой кислоты или уровни белка.
«Острая инфекция гепатита В» возникает, если у пациента, на которого воздействовал вирус гепатита В, начали развиваться признаки и симптомы вирусного гепатита. Этот период времени, называемый инкубационным периодом, составляет около 90 дней, но может быть коротким, лишь 45 дней, или более продолжительным, до 6 месяцев. Для большинства людей эта инфекция вызывает слабый или умеренный дискомфорт, и проходит самостоятельно благодаря иммунной реакции организма, борющейся с вирусом. Однако у некоторых людей, особенно у людей с ослабленной иммунной системой, таких как пациенты, страдающие СПИДом, проходящие химиотерапию, принимающие иммуноподавляющие лекарства или принимающие стероиды, из-за острой инфекции HBV существуют серьезные проблемы, которые перерастают в более тяжелые состояния, такие как скоротечная печеночная недостаточность.
«Введенные одновременно» относится к совместному введению двух средств любым способом, при котором фармакологическое действие обоих средств проявляется у пациента одновременно. При одновременном введении не требуется, чтобы оба агенты были введены в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним способом введения. Действие обоих средств не обязательно должно проявляться одновременно. Их действие должно лишь перекрываться в течение определенного периода времени, и оно не обязательно должно иметь одинаковую протяженность по времени.
«Введение» обозначает предоставление фармацевтического средства пациенту, и включает, но не ограничиваясь этим, введение медицинским специалистом или самостоятельное введение.
«Средство» обозначает активное вещество, которое может обеспечивать терапевтическое преимущество при введении животному. «Первое средство» обозначает терапевтическое соединение, описанное в настоящем документе. Например, первое средство может быть антисмысловым олигонуклеотид ом, направленным на HBV. «Второе средство» обозначает второе терапевтическое соединение, описанное в настоящем документе (например, второй антисмысловый олигонуклеотид, направленный на HBV) и/или не-HBV терапевтическое соединение.
«Улучшение» относится к уменьшению по меньшей мере одного показателя тяжести состояния или заболевания. Тяжесть показателей может быть определена субъективными или объективными оценками, известными специалистам в данной области.
«Животное» относится к человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, мышей, крыс, кроликов, собак, котов, свиней и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь этим, обезьян и шимпанзе.
«Антитело» относится к молекуле, которая характеризуется каким-либо специфическим взаимодействием с антителом, причем каждое антитело и антиген определены в отношении друг друга. Антитело может относиться к полной молекуле антигена или его фрагменту или области, такой как тяжелая цепь, легкая цепь, область Fab и область Fc.
«Антисмысловая активность» обозначает любую обнаруживаемую или измеримую активность, которая относится к гибридизации антисмыслового соединения с его целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации, антисмысловая активность представляет собой снижение количества или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого такой целевой нуклеиновой кислотой.
«Антисмысловое соединение» обозначает олигомерное соединение, способное подвергаться гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой при помощи водородной связи. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, шкРНК, мноРНК, микроРНК и сателлитные повторы.
«Антисмысловое ингибирование» обозначает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного к целевой нуклеиновой кислоте по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты в отсутствие антисмыслового соединения.
«Антисмысловые механизмы» представляют собой все механизмы, включающие гибридизацию соединения с целевой нуклеиновой кислотой, причем результат или эффект гибридизации заключается в целевом разрушении или целевой оккупации с сопутствующей остановкой клеточного механизма, включающего, например, транскрипцию или сплайсинг.
«Антисмысловый олигонуклеотид» обозначает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеооснований, которая допускает гибридизацию с соответствующей областью или сегментом целевой нуклеиновой кислоты.
«Основная комплементарность» относится к способности точного спаривания нуклеооснований антисмыслового олигонуклеотида с соответствующими нуклеооснованиями в целевой нуклеиновой кислоте (то есть гибридизации), и она опосредована водородным связыванием Уотсона-Крика, Хугстина или обратным водородным связыванием Хугстина между соответствующими нуклеооснованиями.
«Бициклический сахар» обозначает фуранозное кольцо, модифицированное мостиковым присоединением двух не геминальных атомов углерода. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.
«Вес тела» относится к полному весу тела животного, включая все ткани, в том числе жировую ткань.
«Кэп-структура» или «концевой кэп-фрагмент» обозначает химические модификации, которые были внедрены в любой конец антисмыслового соединения.
3
«cEt» или «затрудненный этил» обозначает бициклический сахарный фрагмент, включающий мостик, соединяющий 4'-углерод и 2'-углерод, причем указанный мостик имеет формулу: 4'-СН(СН)-O-2'.
3
«Затрудненный этилнуклеозид» (также cEt нуклеозид) обозначает нуклеозид, включающий бициклический сахарный фрагмент, содержащий мостик 4'-СН(СН)-O-2'.
«Химически отличная область» относится к области антисмыслового соединения, которая каким-либо образом химически отличается от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, имеющая 2'-O-метоксиэтил нуклеотиды является химически отличной от области, имеющей нуклеотиды с 2'-O-метоксиэтиловыми модификациями.
«Химерные антисмысловые соединения» обозначает антисмысловые соединения, которые имеют по меньшей мере 2 химически отличных области, каждое положение имеет множество субъединиц.
«Хроническая инфекция гепатита В» возникает, если субъект, который изначально страдал острой инфекцией, впоследствии не поборол эту инфекцию. Станет ли заболевание хроническим или будет полностью излечено, - зависит, в основном, от возраста инфицированного субъекта. Хроническое заболевание развивается примерно у 90% детей, инфицированных при рождении. Однако, по мере взросления субъекта, риск хронической инфекции снижается, и острая инфекция перерастает в хроническую у 20%-50% детей и менее 10% подростков и взрослых. Хронические инфекции HBV представляют собой основную лечебную цель для вариантов реализации настоящего изобретения, хотя композиции антисмысловых нуклеотидов (ASO) настоящего изобретения также могут лечить связанные с HBV состояния, такие как воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, серозный гепатит и другие.
«Совместное введение» обозначает введение пациенту двух или более фармацевтических средств. Два или более фармацевтических средств могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более фармацевтических средств может вводиться таким же или другим способом введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.
«Комплементарность» обозначает способность спаривания между нуклеооснованиями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
«Выполнение» обозначает соблюдение пациентом рекомендованного лечения.
«Включают», «включает» и «включающий» следует понимать как предполагающие включение указанной стадии или элемента, или группы стадий или элементов, но не как исключение какой-либо другой стадии или элемента, или группы стадий или элементов.
«Смежные нуклеооснования» обозначает нуклеооснования, расположенные непосредственно рядом друг с другом.
«Курс лечения» обозначает способ или курс, который восстанавливает здоровье или представляет собой предписанное лечение определенной болезни.
«Дезоксирибонуклеотид» обозначает нуклеотид, имеющий водород в 2' положении сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
«Разработан» или «разработан для» относится к процессу разработки олигомерного соединения, которое специфически гибридизуется с определенной молекулой нуклеиновой кислоты.
«Разбавитель» обозначает ингредиент в композиции, которые не обладает фармакологической активностью, но является фармацевтически необходимым или желательным. Например, в лекарствах для инъекций разбавитель может быть жидкостью, например, солевым раствором.
«Лекарственная форма» обозначает форму, в которой представлено фармацевтическое средство, например, пилюля, таблетка или другая лекарственная форма, известная в данной облатти техники.
«Доза» обозначает определенное количество фармацевтического средства, которое обеспечивается при разовом введении или в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах реализации, доза может быть введена двумя или более болюсами, таблетками или инъекциями. Например, в некоторых вариантах реализации, если необходимо подкожное введение, то для заданной дозы необходим объем, который не может быть обеспечен одной инъекцией. В таких вариантах реализации для достижения заданной дозы может быть использовано две или более инъекций. В некоторых вариантах реализации доза может быть введена двумя или более инъекциями для минимизации реакции пациента в точке инъекции. В других вариантах реализации, фармацевтическое средство вводят инфузией в течение продолжительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть определены как количество фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц.
«Режим дозирования» представляет собой комбинацию доз, предназначенную для достижения одного или нескольких заданных эффектов.
«Продолжительность» обозначает период времени, в течение которого продолжается определенная активность или событие. В некоторых вариантах реализации продолжительность лечения представляет собой период времени, в течение которого вводят дозы фармацевтического средства.
«Эффективное количество» в контексте модулирования активности или лечения, или предупреждения состояния, обозначает введение такого количества активного ингредиента пациенту, нуждающемуся в таком модулировании, лечении или профилактике, как в однократной дозе, так и в составе серии доз, которое является эффективным для модулирования указанного эффекта, или для лечения, или для профилактики, или для улучшения указанного состояния. Эффективное количество может варьироваться в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, подлежащего лечению, таксономической группы пациентов, подлежащих лечению, состава композиции, оценки медико-санитарной обстановки и других релевантных факторов.
«Эффективность» обозначает способность вызывать заданный эффект.
«Экспрессия» включает все функции, при помощи которых кодированная геном информация превращается в структуры, существующие и функционирующие в клетке. Такие структуры включают, но не ограничиваясь этим, продукты транскрипции и трансляции.
«Полная комплементарность» или «100% комплементаность» обозначает, что каждое нуклеооснование первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеооснование во второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации, первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а целевая нуклеиновая кислота представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
«Полностью модифицированный мотив» относится к антисмысловому соединению, включающему смежную последовательность нуклеозидов, причем практически каждый нуклеозид представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром, имеющий однообразную модификацию.
«Химерный олигонуклеотид» обозначает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают Н расщепление РНазы, расположена между внешними областями, имеющими один или несколько нуклеозидов, причем нуклеозиды, включающие внутреннюю область, являются химически отличными от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может быть упомянута как «гэп», а внешние области могут быть упомянуты как «крылья».
«С увеличенным гэп» обозначает антисмысловое соединение, имеющее сегмент гэп из 12 или более смежных 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между 5' и 3' сегментами крыльев, имеющими от одного до шести нуклеотидов с фрагментами модифицированного сахара.
«HBV» обозначает вирус гепатита В млекопитающих, включая вирус гепатита В человека. Этот термин охватывает географические генотипы вируса гепатита В, в частности, вирус гепатита В человека, а также различные штаммы географических генотипов вируса гепатита В.
«Антиген HBV» обозначает любой антиген или белок вируса гепатита В, включая ядерный белок, такой как «ядерный антиген гепатита В» или «HBcAG» и «антиген Е гепатита В», или «HBeAG» и белки оболочки, такие как «поверхностный антиген HBV» или «HBsAg», или «HBsAG».
«Антиген Е гепатита В» или «HBeAg», или «HBeAG» представляет собой секретируемую, нечастичную форму ядерного белка HBV. Антигены HBV HBeAg и HBeAg имеют общие первичные аминокислотные последовательности, поэтому демонстрируют перекрестную активность на Т-клеточном уровне. HBeAg не является необходимым для вирусной сборки или репликации, хотя исследования позволяют предположить, что они могут быть необходимы для создания хронической инфекции. Неонатальное инфицирование HBeAg-негативным мутантом зачастую приводит к моментальному возникновению острой, а не хронической инфекции HBV (Terezawa et al. (1991) Pediatr. Res. 29:5), тогда как инфицирование молодых североамериканских лесных сурков WHeAg-негативным мутантом приводит к гораздо более низкому уровню хронической инфекции WHV (Cote et al. (2000) Hepatology 31:190). HBeAg может потенциально действовать как толераген путем инактивации сердцевинных специфических Т-клеток за счет удаления или клональной анэргии (Milich et al. (1998) J. Immunol. 160:8102). Существует положительная корреляция между снижением вирусной нагрузки и антигенов HBV и снижением экспрессии Т-клетками ингибирующего рецептора, программирующего гибель, 1 (PD-1, известного также как PDCD1), отрицательного регулятора активированных Т-клеток, при противовирусной терапии и сероконверсии HbeAg(Evans et al. (2008) Hepatology 48:759).
«мРНК HBV» обозначает любую матричную РНК, экспрессируемую вирусом гепатита В.
«Нуклеиновая кислота HBV» или «ДНК HBV» обозначает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую HBV. Например, в некоторых вариантах реализации, нуклеиновая кислота HBV включает, без ограничения, любую последовательность ДНК вируса, кодирующую геном HBV или его часть, любую последовательность РНК, транскрибируемую из вирусной ДНК, включая любую последовательность мРНК, кодирующую белок HBV.
«Белок HBV» обозначает любой белок, секретируемый вирусом гепатита В. Этот термин охватыват различные антигены HBV, включая ядерные белки, такие как «антиген Е гепатита», «HBeAg», или «HBeAG» и оболочечные белки, такие как «поверхностный антиген HBV» или «HBsAg».
th
½
«Поверхностный антиген HBV» или «HBsAg», или «HBsAG» представляет собой оболочечный белок инфекционных вирусных частиц HBV, но он также секретируется как неинфекционная частица с содержанием в сыворотке в 1000 раз выше, чем вирусные частицы HBV. Уровни HBsAg в сыворотке инфицированного человека или животного могут достигать 1000 мкг/мл (Kann and Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 9 ed. 745). При острых инфекциях HBV, период полувыведения HBsAg из сыворотки, или t, составляет 8,3 дня (Chulanov et al. (2003) J. Med. Virol. 69: 313). Интернализация HBsAg миелоидными дендритными клетками ингибирует повышующую регуляцию со-стимулирующих молекул (то есть В7) и ингибирует стимулирующую способность Т-клеток (den Brouw et al. (2008) Immunology 126:280), и дендритные клетки хронически инфицированных пациентов также демонстрируют недостаток экспрессии со-стимулирующих молекул, секреции IL-12 и стимуляции Т-клеток в присутствии HBsAg (Zheng et al. (2004) J. Viral Hepatitis 11:217). HBsAg-специфичные клетки CD8 пациентов с СНВ демонстрируют измененное тетрамерное связывание. Эти клетки CD8 не являются анэргическими, но они могут обладать топологией TCR, которая обусловливает частичную переносимость или невосприимчивость (Reignat et al. (2002) J. Exp. Med. 195:1089). Более того, снижение HBsAg в сыворотке >1 log на 24 неделе имеет высокое предиктивное значение (92%) для устойчивой вирологической реакции (SVR - определяется как не обнаруживаемая ДНК HBV по ПЦР через 1 год после лечения) в ходе Peg-IFNα2a терапии (Moucari et al. (2009) Hepatology 49:1151).
«Состояние, связанное с гепатитом В» или «HBV-связанное состояние» обозначает любое заболевание, биологическое состояние, медицинское состояние или событие, которое обострено, обусловлено, связано, имеет отношение или приписано к инфекции, воздействию или болезни гепатита В. Термин «состояние, связанное с гепатитом В» включает хроническую инфекцию HBV, воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, серозный гепатит, желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюляное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV, заболевание печени, связанное с трансплантацией, и состояния, имеющие симптомы, которые могут включать любой или все из следующих: болезнь, похожую на грипп, слабость, боли, головную боль, жар, потерю аппетита, диарею, тошноту и рвоту, боль в области печени, стул земляного или серого цвета, зуд по всему телу и мочу темного цвета, в сочетании с положительным тестом на присутствие вируса гепатита В, вирусного антигена гепатита В или положительным тестом на присутствие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита В.
«Гибридизация» обозначает гибридизацию молекул комплементарных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации, молекулы комплементарных нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловое соединение и целевую нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации, молекулы комплементарных нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловый олигонуклеотид и целевую нуклеиновую кислоту.
«Идентификация животного, имеющего инфекцию HBV» обозначает определение животного, у которого диагностирован HBV; или определение животного, имеющего любой симптом инфекции HBV, включая, но не ограничиваясь этим, хроническую инфекцию HBV, воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, серозный гепатит, желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV, заболевание печени, связанное с трансплантацией, и состояния, имеющие симптомы, которые могут включать любой или все из следующих: болезнь, похожую на грипп, слабость, боли, головную боль, жар, потерю аппетита, диарею, тошноту и рвоту, боль в области печени, стул земляного или серого цвета, зуд по всему телу и мочу темного цвета, в сочетании с положительным тестом на присутствие вируса гепатита В, вирусного антигена гепатита В или положительным тестом на присутствие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита В, в сочетании с положительным тестом на присутствие вируса гепатита В, вирусного антигена гепатита В или положительным тестом на присутствие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита В.
«Непосредственно смежные» обозначает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно смежными элементами.
«Пациент» обозначает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.
«Выполнение пациентом» обозначает соблюдение пациентом рекомендованного или предписанного лечения.
«Вызывает», «ингибирует», «потенцирует», «повышает», «увеличивает», «снижает» и тому подобные, обычно обозначают количественные различия между двумя состояниями. Такие термины могут относиться к статистически значимому различию между двумя состояниями. Например, «количество, эффективное для ингибирования активности или экспрессии HBV», обозначает, что уровень активности или экспрессии HBV в обработанном образце количественно отличается, и может быть статистически значимым, от уровня активности или экспрессии HBV в необработанных клетках. Такие термины применяют, например, к уровням экспрессии и уровням активности.
«Ингибирование HBV» обозначает снижение уровня экспрессии мРНК, ДНК и/или белка HBV. В некоторых вариантах реализации, HBV ингибируют в присутствии антисмыслового соединения, направленного на HBV, включая антисмысловый олигонуклеотид, направленный на HBV, по сравнению с уровнями экспрессии мРНК, ДНК и/или белка HBV в отсутствие HBV антисмыслового соединения, такого как антисмысловый олигонуклеотид.
«Ингибирование экспрессии или активности» относится к снижению, блокированию экспрессии или активности и не обязательно обозначает полное исключение экспрессии или активности.
«Реакция в точке инъекции» обозначает воспаление или аномальное покраснение кожи пациента в месте инъекции.
«Межнуклеозидная связь» относится к химической связи между нуклеозидами.
«Внутрибрюшинное введение» обозначает введение в брюшину инфузией или инъекцией.
«Внутривенное введение» обозначает введение в вену.
«Удлиненные» антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой те, которые имеют один или несколько дополнительных нуклеозидов по сравнению с антисмысловым олигонуклеотидом, описанным в настоящем документе.
«Связанный дезоксинуклеозид» обозначает основание нуклеиновой кислоты (A, G, С, Т, U), замещенное дезоксирибозой, связанной фосфатным эфиром с образованием нуклеотида.
«Связанные нуклеозиды» обозначает соседние нуклеозиды, связанные вместе межнуклеозидной связью.
2
2
2
2
2
2
«Блокированная нуклеиновая кислота» или «БНК», или «БЫК нуклеозиды» обозначает мономеры нуклеиновых кислот, имеющие мостиковое соединение двух атомов углеродов между положением 4' и 2' нуклеозидного сахарного звена, с образованием посредством этого бициклического сахара. Примеры такого бициклического сахара включают, но не ограничиваясь этим, А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(СН)-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2') БНК и (Е) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2') БНК, как показано ниже.
1
2
n
1
2
1
1
1
2
x
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
i
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
При использовании в настоящем документе, БНК соединения включают, но не ограничиваясь этим, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между положением 4' и 2' сахара, причем каждый из мостиков независимо включает 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-; причем: х равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный C-С алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C арил, замещенный C-C арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, Cs-C-j алициклический радикал, замещенный C-C алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J), или сульфоксил (S(=O)-J); и каждый J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, С-С арил, замещенный C-C арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C-C аминоалкил, замещенный C-С аминоалкил или защитную группу.
1
2
n
1
2
n
1
2
1
1
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
1
2
1
1
2
1
12
Примеры 4'-2' мостиковых групп, входящих в определение БНК, включают, но не ограничиваясь этим, группы формул: -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. Более того, другие группы, входящие в определение БНК, представляют собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'- мостики, причем каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу или С-С алкил.
2
2
2
2
2
2
2
Также в определение БНК по настоящему изобретению включены БНК, в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного сахарного кольца связана с 4' углеродным атомом сахарного кольца с образованием посредством этого метиленокси (4'-СН-O-2') мостика для получения бициклического сахарного фрагмента. Мостик также может быть метиленовой (-СН-) группой, соединяющей 2' кислородный атом и 4' углеродный атом, для которой используют термин метиленокси (4'-СН-O-2') БНК. Более того, в случае бициклического сахарного фрагмента, имеющего этиленовую мостиковую группу в этом положении, используют термин этиленокси (4'-СНСН-O-2') БНК. a-L-метиленокси (4'-СН-O-2'), изомер метиленокси (4'-СН-O-2') БНК, также входит в определение БНК, используемое в настоящем документе.
«Не совпадающий» или «не комплементарный нуклеозид» относится к случаю, когда нуклеооснование первой нуклеиновой кислоты не может спариваться с соответствующим нуклеооснованием второй или целевой нуклеиновой кислоты.
«Модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замещению или любому изменению природной межнуклеозидной связи (то есть фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).
«Модифицированное нуклеооснование» обозначает нуклеооснование, отличное от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. «Не модифицированное нуклеооснование» обозначает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Модифицированный нуклеозид» обозначает нуклеозид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное нуклеооснование.
«Модифицированный нуклеотид» обозначает нуклеотид, имеющий, независимо, модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеооснование.
«Модифицированный олигонуклеотид» обозначает олигонуклеотид, включающий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеооснование.
«Модифицированный сахар» обозначает замещение и/или любое изменение природного сахарного фрагмента.
«Мономер» относится к одному звену олигомера. Мономеры включают, но не ограничиваясь этим, нуклеозиды и нуклеотиды, будь то природные или модифицированные.
«Мотив» обозначает схему не модифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении.
«Природный сахарный фрагмент» обозначает сахарный фрагмент, который находится в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
«Природная межнуклеозидная связь» обозначает 3'-5' фосфодиэфирную связь.
«Некомплементарное нуклеооснование» относится к паре нуклеооснований, которые не образуют водородные связи друг с другом или иным образом не поддерживают гибридизацию.
«Нуклеиновая кислота» относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает, но не ограничиваясь этим, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК (микроРНК).
«Нуклеооснование» обозначает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
«Комплементарность нуклеооснования» относится к нуклеооснованию, которое способно к спариванию с другим нуклеооснованием. Например, аденин (А) в ДНК комплементарен тимину (Т). Например, аденин (А) в РНК комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации комплементарное нуклеооснование относится к нуклеооснованию антисмыслового соединения, которое способно к спариванию с нуклеооснованием его целевой нуклеиновой кислоты. Например, если нуклеооснование в определенном положении антисмыслового соединения способно к водородному связыванию с нуклеооснованием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, то это положение водородного связывания между указанным олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислоты считают комплементарным по этой паре нуклеооснований.
«Последовательность нуклеооснований» обозначает порядок смежных нуклеооснований, независимый от какого-либо сахара, связи и/или модификации нуклеооснования.
«Нуклеозид» обозначает нуклеооснование, связанное с сахаром.
«Нуклеозид-миметик» включает такие структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания, и необязательно связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, как, например, нуклеозид-миметики, имеющие морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бицикло или трицикло-сахарные заменители, например, не фуранозные сахарные звенья. Нуклеотид-миметик включает такие структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, как, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолиновые соединения (морфолиновые соединения, связанные при помощи -N(H)-C(=O)-O- или другой не фосфодиэфирной связи). Заменитель сахара пересекается с несколько более широким термином нуклеозид-миметика, но он предназначен для указания замены только сахарного звена (фуранозного кольца). Тетрагидропираниловые кольца, представленные в настоящем документе, являются иллюстративными для примера заменителя сахара, в котором группа фуранозного сахара заменена тетрагидропираниловой кольцевой системой. «Миметик» относится к группам, которые являются заменой для сахара, нуклеооснования и/или межнуклеозидной связи. Как правило, миметик используют вместо сахара или комбинации сахара и межнуклеозидной связи, а нуклеооснование сохраняется для гибридизации с выбранной мишенью.
«Нуклеотид» обозначает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
«Нецелевое действие» относится к нежелательному или пагубному биологическому действию, связанному с модулированием экспрессии РНК или белка гена, отличного от целевой нуклеиновой кислоты.
«Олигомерное соединение» обозначает полимер связанных мономерных субъединиц, который способен гибридизоваться по меньшей мере с какой-либо областью молекулы нуклеиновой кислоты.
«Олигонуклеозид» обозначает олигонуклеотид, в котором межнуклеозидные связи не содержат атом фосфора.
«Олигонуклеотид» обозначает полимер связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или не модифицированным, не зависимо друг от друга.
«Парентеральное введение» обозначает введение инъекцией (например, болюсной инъекцией) или инфузией. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
«Пептид» обозначает молекулу, образованную связыванием по меньшей мере двух аминокислот амидными связями. Без ограничения, при использовании в настоящем документе, «пептид» относится к полипептидам и белкам.
«Фармацевтически приемлемый носитель» обозначает среду или разбавитель, который не взаимодействует со структурой олигонуклеотида. Некоторые такие носители обеспечивают возможность составления фармацевтических композиций, таких как, например, таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и пастилки для перорального приема пациентом.
«Фармацевтически приемлемое производное» охватывает фармацевтически приемлемые соли, конъюгаты, пролекарства или изомеры соединений, описанных в настоящем документе.
«Фармацевтически приемлемые соли» обозначает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть соли, которые сохраняют заданную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не наделяют его нежелательным токсикологическим действием.
«Фармацевтическое средство» обозначает вещество, которое обеспечивает терапевтическое преимущество при введении пациенту. Например, в некоторых вариантах реализации, антисмысловый олигонуклеотид, направленный на HBV, представляет собой фармацевтическое средство.
«Фармацевтическая композиция» обозначает смесь веществ, пригодную для введения субъекту. Например, фармацевтическая композиция может включать антисмысловый олигонуклеотид и стерильный водный раствор. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция демонстрирует активность в анализе свободного поглощения в некоторых клеточных линиях.
«Фосфотиоатная связь» обозначает связь между нуклеозидами, где фосфодиэфирная связь модифицирована заменой одного из не мостиковых атомов кислорода атомом серы. Фосфотиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
«Часть» обозначает определенное количество смежных (то есть связанных) нуклеооснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации, часть является определенным количеством смежных нуклеооснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации, часть является определенным количеством смежных нуклеооснований антисмыслового соединения.
«Предупреждение» или «профилактика» относится к отсрочке или предотвращению возникновения или развития состояния или заболевания в течение периода времени от часов до дней, предпочтительно от недель до месяцев.
«Пролекарство» обозначает терапевтическое средство, которое готовят в неактивной форме, которая превращается в активную форму (то есть лекарство) внутри организма или его клеток под действием эндогенных ферментов или других химических веществ и/или условий.
«Профилактически эффективное количество» относится к количеству фармацевтического средства, которое обеспечивает профилактическое или превентивное преимущество для животного.
«Рекомендованная терапия» обозначает лечебную схему, рекомендованную медицинским специалистом для лечения, улучшения или предупреждения заболевания.
«Область» определяют как часть целевой нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
«Рибонуклеотид» обозначает нуклеотид, имеющий гидрокси-группу в 2' положении сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
«Соли» обозначают физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть соли, которые сохраняют заданную биологическую активность исходного олигонуклеотида и не наделяют его нежелательным токсикологическим действием.
«Сегменты» определяют как более мелкие или субфрагменты областей целевой нуклеиновой кислоты.
«Сероконверсию» определяют как отсутствие HBeAg в сыворотке плюс присутствие HBeAb в сыворотке, в случае мониторинга HBeAg как определителя сероконверсии, или определяют как отсутствие HBsAg в сыворотке, в случае мониторинга HBsAg как определителя сероконверсии, по результатам определения доступных в настоящее время пределов обнаружения коммерческих систем иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA).
«Укороченные» или «усеченные» версии антисмысловых олигонуклеотидов, представленных в настоящем документе, имеют один, два или более удаленных нуклеозидов.
«Побочные эффекты» обозначает физиологические реакции, приписываемые лечению, которые отличны от заданного действия. В некоторых вариантах реализации, побочные эффекты включают, без ограничения, реакции в точке инъекции, аномалии при испытании функции печени, аномалии функции почек, печеночную токсичность, почечную токсичность, аномалии центральной нервной системы и миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на печеночную токсичность или аномалию функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на печеночную токсичность или аномалию функции печени.
«Существенный», при использовании в настоящем документе, обозначает измеримый или наблюдаемый, например, существенный результат, такой как существенное улучшение или существенное снижение, как правило, относится к измеримому или наблюдаемому результату, такому как измеримое или наблюдаемое улучшение или снижение.
«Сайты», при использовании в настоящем документе, определяют как уникальные положения нуклеооснований в целевой нуклеиновой кислоте.
«Замедляет прогрессирование» обозначает уменьшение развития указанного заболевания.
«Может специфически гибридизоваться» относится к антисмысловому соединению, имеющему достаточную степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой для инициации заданного эффекта, одновременно демонстрирующему минимальное влияние или отсутствие влияния на нецелевые нуклеиновые кислоты в условиях, в которых необходимо специфическое связывание, то есть при физиологических условиях в случае анализов in vivo и при терапевтическом лечении. «Строгие условия гибридизации» или «строгие условия» относятся к условиям, в которых олигомерное соединение гибридизуется с его целевой последовательностью, но с минимальным количеством других последовательностей.
«Статистически значимый», при использовании в настоящем документе, обозначает измеримый или наблюдаемый параметр, который маловероятно является случайным результатом.
«Подкожное введение» обозначает введение непосредственно под кожу.
«Субъект» обозначает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.
«Мишень» относится к белку, модулирование которого задано. «Целевой ген» относится к гену, кодирующему мишень.
«Таргетинг» обозначает процесс разработки и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать заданный эффект.
«Целевая нуклеиновая кислота», «целевая РНК», «целевой РНК транскрипт» и «мишень нуклеиновой кислоты», все эти термины обозначают нуклеиновую кислоту, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.
«Целевая область» обозначает часть целевой нуклеиновой кислоты, на которую направлено одно или несколько антисмысловых соединений.
«Целевой сегмент» обозначает последовательность нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, на которую направлено антисмысловое соединение. «Сайт-мишень 5'» относится к 5'-основному нуклеотиду целевого сегмента. «Сайт-мишень 3'» относится к 3'-основному нуклеотиду целевого сегмента.
«Терапевтически эффективное количество» обозначает количество фармацевтического средства, которое обеспечивает пациенту терапевтическое преимущество.
«Лечение» относится к введению композиции для изменения или улучшения заболевания или состояния.
«Не модифицированные» нуклеооснования обозначают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
«Не модифицированный нуклеотид» обозначает нуклеотид, состоящий из природных нуклеооснований, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации не модифицированный нуклеотид представляет собой нуклеотид РНК (то есть β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотид ДНК (то есть β-D-дезоксирибонуклеозид).
«Валидированный целевой сегмент» определяют как часть целевой области, состоящую по меньшей мере из 8 нуклеооснований (то есть 8 смежных нуклеооснований), на которую направлено активное олигомерное соединение.
«Сегмент крыла» обозначает множество нуклеозидов, модифицированных для влияния на свойства олигонуклеотида, такие как усиленная ингибирующая активность, повышенная связывающая аффиность к целевой нуклеиновой кислоте или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.
Некоторые варианты реализации
В некоторых вариантах реализации представлены способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии мРНК HBV.
В некоторых вариантах реализации представлены антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту HBV. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота HBV является последовательностями, представленными далее под номером доступа GENBANK U95551.1 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO:1).
В некоторых вариантах реализации, соединения, представленные в настоящем документе, представляют собой или включают модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации эти соединения включают модифицированный олигонуклеотид и конъюгат, описанный в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид представляет собой фармацевтически приемлемое производное.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеооснований, нацеленный на HBV. Мишень HBV может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO:1, или ее часть, или ее вариант.
В некоторых вариантах реализации, соединения или модифицированные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, имеют длину от 10 до 30 связанных нуклеооснований, и нацелены на HBV. В некоторых вариантах реализации, мишень HBV имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды нацелены на одну из следующих нуклеотидных областей HBV: CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC (SEQ ID NO:1273); AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA (SEQ ID NO:1354); CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT (SEQ ID NO:1276); CAAGGTATGTTGCCCGT (SEQ ID NO:1277); CCTATGGGAGTGGGCCTCAG (SEQ ID NO:1279; TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCG (SEQ ID NO:1287); TATATGGATGATGTGGT (SEQ ID NO:1359); TGCCAAGTGTTTGCTGA (SEQ ID NO:1360); TGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (SEQ ID NO:1361); CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGT (SEQ ID NO:1352); GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGT (SEQ ID NO:1353); CTTTTTCACCTCTGCCTA (SEQ ID NO:1362); TTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGG (SEQ ID NO:1363); AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG (SEQ ID NO:1274); TGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCAT (SEQ ID NO:1275); TGTATTCCCATCCCATC (SEQ ID NO:1278); TGGCTCAGTTTACTAGTGC (SEQ ID NO:1280); GGGCTTTCCCCCACTGT (SEQ ID NO:1281); TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (SEQ ID NO:1282); CGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID NO:1283); GGAGTGTGGATTCGCAC (SEQ ID NO:1284); или GAAGAAGAACTCCCTCGCCT (SEQ ID NO:1285). В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 9, 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид БНК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозид ы с бициклическими сахарными модификациями. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой затрудненный этилнуклеозид (cEt).
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированные олигонуклеотиды, состоящие из 10-30 связанных нуклеозидов, и имеющие последовательность нуклеооснований, содержащую часть, содержащую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации, такие олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 9, 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид БНК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды содержат нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой затрудненный этилнуклеозид (cEt). В некоторых вариантах реализации, каждый модифицированный нуклеозид в каждом сегменте крыла независимо представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид или нуклеозид с бициклической сахарной модификацией, такой как затрудненный этилнуклеозид (cEt) или нуклеозид БЫК.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 или 1379. В некоторых вариантах реализации, такие олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 9, 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1-5, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4 или 2-3 связанных модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид БЫК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой затрудненный этилнуклеозид (cEt).
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, каждый нуклеозид с модифицированным сахаром независимо представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид или нуклеозид с бициклическим сахарным фрагментом, такой как затрудненный этилнуклеозид (cEt) или нуклеозид БНК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, каждый нуклеозид с модифицированным сахаром независимо представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид или бициклический нуклеозид, такой как затрудненный этилнуклеозид (cEt) или нуклеозид БНК.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 или 1379. В некоторых вариантах реализации, такие олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1-5, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4 или 2-3 связанных модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связанных модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид БНК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:5, 15, 16, 33, 39-95, 123-135, 163-175, 180-310, 321-406, 413-455, 461-802 или 804-1272. В некоторых вариантах реализации, такие олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1-5, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4 или 2-3 связанных модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид БЫК. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с бициклическими сахарными модификациями. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:6-14, 17-32, 34-38, 96-122, 136-162, 176-179, 407-412, 456-462, 523-538. В некоторых вариантах реализации, такие олигонуклеотиды имеют сегмент гэп из 10 или более связанных дезоксинуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, такой сегмент гэп находится между двумя сегментами крыльев, которые независимо имеют 1-5, 1-4, 1-3, 2-5, 2-4 или 2-3 связанных модифицированных нуклеозида. В некоторых вариантах реализации, один или несколько модифицированных нуклеозидов в сегменте крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-замещенный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, модифицированный нуклеозид представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 14 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-3 или 2 нуклеозида с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром, как нуклеозиды 2'-МОЕ.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3-4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеозидов с модифицированным сахаром, как нуклеозиды 2'-МОЕ.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 18 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 3-5 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 22, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов с модифицированным сахаром, как нуклеозиды 2'-МОЕ.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат соль модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В некоторых вариантах реализации, последовательность нуклеооснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% комплементарна последовательности SEQ ID NO:1, по результатам измерения целостности модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации, последовательность нуклеооснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% комплементарна любой из последовательностей SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, по результатам измерения целостности модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации, соединение или модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере одна межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
2
2
3
3
В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтиловую группу (2'-O(СН)-ОСН). В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахар содержит группу 2'-O-СН.
2
n
2
3
В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один модифицированный сахар, бициклический сахар содержит мостик 4'-(СН)O-2', причем n равен 1 или 2. В некоторых вариантах реализации, бициклический сахар содержит мостик 4'-CH-O-2'. В некоторых вариантах реализации, бициклический сахар содержит мостик 4'-СН(СН)-O-2'.
В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один нуклеозид указанного модифицированного олигонуклеотида содержит модифицированное нуклеооснование. В некоторых вариантах реализации, модифицированнле нуклеооснование представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из связанных нуклеозидов. Сегмент гэп расположен между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', и каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 10 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из трех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар и/или затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых аспектах, каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой затрудненный этиловый (cEt) сахар. В других аспектах, три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а три связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'. В других аспектах, три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а три связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 10 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из двух связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых аспектах, два связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 9 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из двух связанных нуклеозидов; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; два связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 8 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов; три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из пяти связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 8 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляет собой затрудненный этиловый (cEt) сахар; каждый из пяти связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 9 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых аспектах, четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 9 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 9 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 8 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 8 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 7 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 7 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из шести связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; шесть связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 7 связанных дезоксинуклеозидов, и сегмент крыла 5' состоит из шести связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов; шесть связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 10 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из 10 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, причем пять связанных нуклеозидов крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', и каждый из пяти связанных нуклеозидов крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из трех связанных нуклеозидов. В некоторых аспектах, сегмент гэп расположен между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3'; каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой затрудненный этиловый (cEt) сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин. В других аспектах, сегмент гэп расположен между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3'; три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; три связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин. В других аспектах, три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а три связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из двух связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. В некоторых аспектах, сегмент гэп расположен между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3'; два связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 9 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоязий из двух связанных нуклеозидов, причем пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; два связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 8 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем три связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из пяти связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 8 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем каждый из трех связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляет собой затрудненный этиловый (cEt) сахар; каждый из пяти связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 9 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых аспектах, четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', а четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар в направлении от 5' к 3'.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 9 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 9 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем четыре связанных нуклеозида сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ Ю NO: 1, и причем модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 8 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 8 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 7 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; пять связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар и 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь преставляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 7 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из шести связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем шесть связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 7 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из шести связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов, причем шесть связанных нуклеозидов сегмента крыла 5' представляют собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-O-метоксиэтиловый сахар, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3'; каждый из четырех связанных нуклеозидов сегмента крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар; каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает затрудненный этиловый (cEt) сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1, 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, причем пять связанных нуклеозидов крыла 5' представляют собой затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид, затрудненный этиловый (cEt) сахар, 2'-дезоксинуклеозид и затрудненный этиловый (cEt) сахар в направлении от 5' к 3', и каждый из пяти связанных нуклеозидов крыла 3' представляет собой 2'-O-метоксиэтиловый сахар.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из двух связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из восьми связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из восьми связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из двух связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из семи связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из семи связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из трех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из шести связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из шести связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нулеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из двух связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из шести связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из шести связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из двух связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из трех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из трех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из пяти связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из двух связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из двух связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из пяти связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из четырех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из трех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из девяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из трех связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из четырех связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов, сегмент гэп состоит из десяти связанных дезоксинуклеозидов, сегмент крыла 5' состоит из двух связанных нуклеозидов, сегмент крыла 3' состоит из двух связанных нуклеозидов, каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из двух связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из восьми связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из восьми связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из двух связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из семи связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из семи связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из трех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из шести связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из шести связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 18 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из двух связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из шести связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из шести связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из двух связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из трех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 17 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из трех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO: 1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из двух связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из двух связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из пяти связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из четырех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из трех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из девяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из трех связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из четырех связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции содержат модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеооснований, содержащую часть, состоящую по меньшей мере из 8 смежных нуклеооснований, комплементарную равной по длине части любого из нуклеооснований, представленных далее в последовательностях SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, причем указанная последовательность нуклеооснований комплементарна к SEQ ID NO:1, и при этом модифицированный олигонуклеотид содержит: а) сегмент гэп, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; b) сегмент крыла 5', состоящий из двух связанных нуклеозидов; и с) сегмент крыла 3', состоящий из двух связанных нуклеозидов. Сегмент гэп располагается между сегментом крыла 5' и сегментом крыла 3', каждый нуклеозид каждого сегмента крыла включает 2'-O-метоксиэтиловый сахар, каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную связь, и каждый цитозиновый остаток представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации, представленные способы, соединения и композиции ингибируют уровни экспрессии мРНК и/или ДНК HBV и/или уровни белка, и/или уровни антигена.
В другом варианте реализации представлен способ лечения HBV-связанных заболеваний, расстройств и состояний у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества любой фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для лечения HBV-связанных заболеваний, расстройств и состояний. В родственных вариантах реализации млекопитающим является человек, а HBV-состояние заболевание, расстройство и состояние представляет собой инфекцию вируса гепатита В от вируса гепатита В человека. Более конкретно, вирус гепатита В человека может быть любым из человеческих географических генотипов: А (Северо-Западная Европа, Северная Америка, Центральная Америка); В (Индонезия, Китай, Вьетнам); С (Восточная Азия, Корея, Китай, Япония, Полинезия, Вьетнам); D (Средиземноморский регион, Ближний восток, Индия); Е (Африка); F (коренные американцы, Полинезия); G (Соединенные Штаты, Франция); или Н (Центральная Америка).
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, комплементарен в пределах следующих нуклеотидных областей последовательности SEQ ID NO:1: 1-20, 10-29, 10-56, 13-38, 13-35, 19-38, 25-47, 25-50, 25-56, 43-68, 43-63, 55-74, 58-73, 58-74, 58-77, 58-79, 58-80, 58-84, 59-74, 59-75, 59-80, 60-75, 60-76, 60-79, 61-76, 61-77, 61-80, 62-77, 63-84, 68-114, 101-123, 98-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 158-177, 167-186, 191-215, 196-224, 196-215, 196-218, 199-228, 199-218, 199-224, 200-224, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-274; 245-260, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-266, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-265, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-270, 252-267, 253-268, 253-269, 253-272, 253-274, 254-269, 254-270, 254-274, 255-270, 255-271, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 256-271, 256-275, 255-276, 256-272, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 258-273, 259-274, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 292-311, 290-312, 293-312, 293-315, 293-321, 296-321, 302-321, 324-343, 339-361, 339-367, 348-367, 342-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-383, 360-388, 360-385, 362-381, 366-388, 369-388, 366-385, 366-392, 370-389, 370-392, 380-399, 382-401, 384-433, 384-400, 384-401, 385-401, 405-424, 409-428, 405-428, 411-426, 411-427, 411-430, 411-431, 411-437, 412-431, 411-426, 411-427, 412-428, 412-431, 412-427, 413-433, 413-432, 413-428, 413-429, 413-432, 413-433, 414-427, 415-427, 414-429, 414-430, 414-433, 415-428, 415-429, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-429, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-435, 418-434, 418-437, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 421-436, 422-437, 422-441, 423-436, 425-465, 454-473, 454-472, 457-476, 457-472, 457-473, 454-476, 455-472, 457-485, 458-485, 458-483, 458-477, 458-473, 459-485, 460-485, 463-498, 463-485, 466-485, 463-482, 457-491, 458-491, 459-491, 460-491, 463-491, 466-491, 472-491, 472-493, 473-492, 475-491, 459-494, 460-494, 463-494, 466-494, 467-498, 472-494, 475-494, 457-473, 457-472, 458-494, 454-494, 457-494, 457-473, 485-513, 470-493, 476-519, 485-519, 500-519, 512-534, 512-550, 524-546, 536-559, 548-567, 548-570, 550-570, 548-594, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 639-754, 639-658, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 642-754, 653-672, 662-685, 665-685,665-689, 668-687, 670-754, 670-706, 670-685, 670-686, 670-689, 671-690, 671-691, 671-686, 671-687, 672-693, 672-697, 672-707, 672-687, 672-688, 673-688, 674-693, 678-693, 679-694, 679-707, 679-698, 679-701, 679-702, 679-707, 680-695, 680-699, 679-699, 681-706, 681-696, 682-697, 682-706, 682-707, 682-702, 682-701, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-754, 688-704, 689-709, 689-710, 690-705, 679-705, 679-710, 679-706, 690-710, 691-710, 690-754, 690-706, 684-703, 687-705, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 688-705, 689-704, 689-705, 689-708, 690-705, 690-706, 690-709, 691-706, 692-711, 693-716, 693-712, 695-715, 697-716, 697-716, 690-716, 724-746, 724-752, 724-754, 724-758, 733-752, 738-754, 738-753, 739-758, 739-754, 739-775, 739-754, 740-754, 742-785, 742-773, 757-776, 757-785, 790-815, 793-812, 811-833, 811-844, 814-833, 811-906, 820-839, 822-844, 822-867, 823-842, 845-864, 845-867, 854-906, 845-909, 845-906, 854-876, 863-882, 863-885, 878-900, 887-906, 899-918, 899-933, 899-958, 905-927, 905-933, 914-933, 936-958, 936-955, 945-964, 951-970, 951-985, 951-1044, 951-1024, 951-1056, 951-997, 960-985, 963-1044, 963-1024, 963-997, 972-1015, 1025-1044, 1031-1056, 1037-1056, 1046-1083, 1049-1068, 1070-1089, 1070-1095, 1082-1101, 1081-1134, 1081-1143, 1082-1101, 1088-1107, 1088-1134, 1094-1119, 1097-1119, 1112-1134, 1118-1143, 1118-1146, 1088-1146, 1121-1140, 1127-1146, 1127-1193, 1150-1193, 1156-1187, 1165-1187, 1170-1192, 1171-1191, 1172-1191, 1176-1192, 1176-1285, 1177-1192, 1176-1191, 1203-1297, 1206-1228, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1255, 1245-1265, 1251-1280, 1262-1285, 1251-1285, 1259-1296, 1259-1290, 1259-1287, 1261-1296, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1296, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1264-1297, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1296, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1271-1290, 1271-1296, 1277-1296, 1261-1290, 1262-1290, 1268-1290, 1263-1305, 1259-1305, 1259-1305, 1266-1305, 1259-1302, 1275-1294, 1281-1306, 1281-1324, 1281-1336, 1282-1301, 1286-1306, 1290-1324, 1293-1318, 1290-1324, 1293-1315, 1296-1315, 1311-1336, 1311-1333, 1326-1345, 1353-1381, 1359-1378, 1395-1414, 1498-1532, 1498-1523, 1498-1535, 1510-1529, 1515-1535, 1515-1563, 1515-1596, 1515-1605, 1515-1602, 1515-1540, 1515-1535, 1518-1605, 1518-1602, 1518-1537, 1521-1563, 1521-1540, 1550-1655, 1550-1563, 1550-1569, 1553-1578, 1553-1599, 1553-1590, 1565-1584, 1571-1595, 1577-1605, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1578-1598, 1571-1598, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1580-1605, 1580-1602, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1553-1655, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1586-1652, 1642-1664, 1651-1720, 1651-1673, 1655-1679, 1695-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1743-1768, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1796, 1777-1800, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1798, 1779-1797, 1779-1796, 1779-1795, 1779-1794, 1780-1799, 1780-1796, 1780-1795, 1781-1797, 1781-1796, 1781-1796, 1781-1800, 1781-1797, 1782-1799, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1800, 1784-1799, 1779-1799, 1778-1889, 1778-1794, 1779-1795, 1780-1799, 1785-1800, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1828, 1806-1825, 1809-1828, 1812-1843, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1843, 1815-1844, 1815-1840, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1840, 1821-1844, 1821-1837, 1822-1843, 1822-1839, 1822-1837, 1823-1843, 1823-1838, 1824-1839, 1827-1846, 1861-1884, 1861-1880, 1865-1885, 1866-1881, 1867-1882, 1867-1886, 1868-1883, 1869-1885, 1869-1884, 1870-1885, 1871-1886, 1872-1887, 1874-1889, 1876-1895, 1888-1914, 1888-1908, 1891-1910, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1913-1935, 1898-1920, 1907-1929, 1913-1935, 1918-1934, 1919-1938, 1919-1934, 1921-1934, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2368-2393, 2381-2397, 2368-2394, 2379-2394, 2381-2396, 2368-2397, 2368-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2459-2478, 2819-2838, 2818-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, направлен на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 1-20, 10-29, 10-56, 13-38, 13-35, 19-38, 25-47, 25-50, 25-56, 43-68, 43-63, 55-74, 58-73, 58-74, 58-77, 58-79, 58-80, 58-84, 59-74, 59-75, 59-80, 60-75, 60-76, 60-79, 61-76, 61-77, 61-80, 62-77, 63-84, 68-114, 101-123, 98-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 158-177, 167-186, 191-215, 196-224, 196-215, 196-218, 199-228, 199-218, 199-224, 200-224, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-274; 245-260, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-266, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-265, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-270, 252-267, 253-268, 253-269, 253-272, 253-274, 254-269, 254-270, 254-274, 255-270, 255-271, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 256-271, 256-275, 255-276, 256-272, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 258-273, 259-274, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 292-311, 290-312, 293-312, 293-315, 293-321, 296-321, 302-321, 324-343, 339-361, 339-367, 348-367, 342-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-383, 360-388, 360-385, 362-381, 366-388, 369-388, 366-385, 366-392, 370-389, 370-392, 380-399, 382-401, 384-433, 384-400, 384-401, 385-401, 405-424, 409-428, 405-428, 411-426, 411-427, 411-430, 411-431, 411-437, 412-431, 411-426, 411-427, 412-428, 412-431, 412-427, 413-433, 413-432, 413-428, 413-429, 413-432, 413-433, 414-427, 415-427, 414-429, 414-430, 414-433, 415-428, 415-429, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-429, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-435, 418-434, 418-437, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 421-436, 422-437, 422-441, 423-436, 425-465, 454-473, 454-472, 457-476, 457-472, 457-473, 454-476, 455-472, 457-485, 458-485, 458-483, 458-477, 458-473, 459-485, 460-485, 463-498, 463-485, 466-485, 463-482, 457-491, 458-491, 459-491, 460-491, 463-491, 466-491, 472-491, 472-493, 473-492, 475-491, 459-494, 460-494, 463-494, 466-494, 467-498, 472-494, 475-494, 457-473, 457-472, 458-494, 454-494, 457-494, 457-473, 485-513, 470-493, 476-519, 485-519, 500-519, 512-534, 512-550, 524-546, 536-559, 548-567, 548-570, 550-570, 548-594, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 639-754, 639-658, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 642-754, 653-672, 662-685, 665-685,665-689, 668-687, 670-754, 670-706, 670-685, 670-686, 670-689, 671-690, 671-691, 671-686, 671-687, 672-693, 672-697, 672-707, 672-687, 672-688, 673-688, 674-693, 678-693, 679-694, 679-707, 679-698, 679-701, 679-702, 679-707, 680-695, 680-699, 679-699, 681-706, 681-696, 682-697, 682-706, 682-707, 682-702, 682-701, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-754, 688-704, 689-709, 689-710, 690-705, 679-705, 679-710, 679-706, 690-710, 691-710, 690-754, 690-706, 684-703, 687-705, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 688-705, 689-704, 689-705, 689-708, 690-705, 690-706, 690-709, 691-706, 692-711, 693-716, 693-712, 695-715, 697-716, 697-716, 690-716, 724-746, 724-752, 724-754, 724-758, 733-752, 738-754, 738-753, 739-758, 739-754, 739-775, 739-754, 740-754, 742-785, 742-773, 757-776, 757-785, 790-815, 793-812, 811-833, 811-844, 814-833, 811-906, 820-839, 822-844, 822-867, 823-842, 845-864, 845-867, 854-906, 845-909, 845-906, 854-876, 863-882, 863-885, 878-900, 887-906, 899-918, 899-933, 899-958, 905-927, 905-933, 914-933, 936-958, 936-955, 945-964, 951-970, 951-985, 951-1044, 951-1024, 951-1056, 951-997, 960-985, 963-1044, 963-1024, 963-997, 972-1015, 1025-1044, 1031-1056, 1037-1056, 1046-1083, 1049-1068, 1070-1089, 1070-1095, 1082-1101, 1081-1134, 1081-1143, 1082-1101, 1088-1107, 1088-1134, 1094-1119, 1097-1119, 1112-1134,1118-1143, 1118-1146, 1088-1146, 1121-1140, 1127-1146, 1127-1193, 1150-1193, 1156-1187, 1165-1187, 1170-1192, 1171-1191, 1172-1191, 1176-1192, 1176-1285, 1177-1192, 1176-1191, 1203-1297, 1206-1228, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1255, 1245-1265, 1251-1280, 1262-1285, 1251-1285, 1259-1296, 1259-1290, 1259-1287, 1261-1296, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1296, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1264-1297, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1296, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1271-1290, 1271-1296, 1277-1296, 1261-1290, 1262-1290, 1268-1290, 1263-1305, 1259-1305, 1259-1305, 1266-1305, 1259-1302, 1275-1294, 1281-1306, 1281-1324, 1281-1336, 1282-1301, 1286-1306, 1290-1324, 1293-1318, 1290-1324, 1293-1315, 1296-1315, 1311-1336, 1311-1333, 1326-1345, 1353-1381, 1359-1378, 1395-1414, 1498-1532, 1498-1523, 1498-1535, 1510-1529, 1515-1535, 1515-1563, 1515-1596, 1515-1605, 1515-1602, 1515-1540, 1515-1535, 1518-1605, 1518-1602,1518-1537, 1521-1563, 1521-1540, 1550-1655, 1550-1563, 1550-1569, 1553-1578, 1553-1599, 1553-1590, 1565-1584, 1571-1595, 1577-1605, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1578-1598, 1571-1598, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1580-1605, 1580-1602, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1553-1655, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1586-1652, 1642-1664, 1651-1720, 1651-1673, 1655-1679, 1695-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1743-1768, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1796, 1777-1800, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1798, 1779-1797, 1779-1796, 1779-1795, 1779-1794, 1780-1799, 1780-1796, 1780-1795, 1781-1797, 1781-1796, 1781-1796, 1781-1800, 1781-1797, 1782-1799, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1800, 1784-1799, 1779-1799, 1778-1889, 1778-1794, 1779-1795, 1780-1799, 1785-1800, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1828, 1806-1825, 1809-1828, 1812-1843, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1843, 1815-1844, 1815-1840, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1840, 1821-1844, 1821-1837, 1822-1843, 1822-1839, 1822-1837, 1823-1843, 1823-1838, 1824-1839, 1827-1846, 1861-1884, 1861-1880, 1865-1885, 1866-1881, 1867-1882, 1867-1886, 1868-1883, 1869-1885, 1869-1884, 1870-1885, 1871-1886, 1872-1887, 1874-1889, 1876-1895, 1888-1914, 1888-1908, 1891-1910, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1913-1935, 1898-1920, 1907-1929, 1913-1935, 1918-1934, 1919-1938, 1919-1934, 1921-1934, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2368-2393, 2381-2397, 2368-2394, 2379-2394, 2381-2396, 2368-2397, 2368-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2459-2478, 2819-2838, 2818-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, комплементарен в пределах генной области второй части pre-Sl HBV, соответствующей нуклеотидной области 1-1932 последовательности SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, комплементарен в пределах генной области первой части pre-Sl HBV, соответствующей нуклеотидной области 2831-3182 последовательности SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, нацелен на генную область второй части pre-S I HBV, соответствующую нуклеотидной области 1-1932 последовательности SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, нацелен на генную область первой части pre-Sl HBV, соответствующую нуклеотидной области 2831-3182 последовательности SEQ ID NO:1.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV, имеющую часть смежных нуклеооснований, которая комплементарна равной по длине части нуклеооснований указанной области. Например, эта часть может быть частью, содержащей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований, комплементарной равной по длине части области, упомянутой в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды направлены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 1-20, 10-29, 10-56, 13-38, 13-35, 19-38, 25-47, 25-50, 25-56, 43-68, 43-63, 55-74, 58-73, 58-74, 58-77, 58-79, 58-80, 58-84, 59-74, 59-75, 59-80, 60-75, 60-76, 60-79, 61-76, 61-77, 61-80, 62-77, 63-84, 68-114, 101-123, 98-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 158-177, 167-186, 191-215, 196-224, 196-215, 196-218, 199-228, 199-218, 199-224, 200-224, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-274; 245-260, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-266, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-265, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-270, 252-267, 253-268, 253-269, 253-272, 253-274, 254-269, 254-270, 254-274, 255-270, 255-271, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 256-271, 256-275, 255-276, 256-272, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 258-273, 259-274, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 292-311, 290-312, 293-312, 293-315, 293-321, 296-321, 302-321, 324-343, 339-361, 339-367, 348-367, 342-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-383, 360-388, 360-385, 362-381, 366-388, 369-388, 366-385, 366-392, 370-389, 370-392, 380-399, 382-401, 384-433, 384-400, 384-401, 385-401, 405-424, 409-428, 405-428, 411-426, 411-427, 411-430, 411-431, 411-437, 412-431, 411-426, 411-427, 412-428, 412-431, 412-427, 413-433, 413-432, 413-428, 413-429, 413-432, 413-433, 414-427, 415-427, 414-429, 414-430, 414-433, 415-428, 415-429, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-429, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-435, 418-434, 418-437, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 421-436, 422-437, 422-441, 423-436, 425-465, 454-473, 454-472, 457-476, 457-472, 457-473, 454-476, 455-472, 457-485, 458-485, 458-483, 458-477, 458-473, 459-485, 460-485, 463-498, 463-485, 466-485, 463-482, 457-491, 458-491, 459-491, 460-491, 463-491, 466-491, 472-491, 472-493, 473-492, 475-491, 459-494, 460-494, 463-494, 466-494, 467-498, 472-494, 475-494, 457-473, 457-472, 458-494, 454-494, 457-494, 457-473, 485-513, 470-493, 476-519, 485-519, 500-519, 512-534, 512-550, 524-546, 536-559, 548-567, 548-570, 550-570, 548-594, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 639-754, 639-658, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 642-754, 653-672, 662-685, 665-685,665-689, 668-687, 670-754, 670-706, 670-685, 670-686, 670-689, 671-690, 671-691, 671-686, 671-687, 672-693, 672-697, 672-707, 672-687, 672-688, 673-688, 674-693, 678-693, 679-694, 679-707, 679-698, 679-701, 679-702, 679-707, 680-695, 680-699, 679-699, 681-706, 681-696, 682-697, 682-706, 682-707, 682-702, 682-701, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-754, 688-704, 689-709, 689-710, 690-705, 679-705, 679-710, 679-706, 690-710, 691-710, 690-754, 690-706, 684-703, 687-705, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 688-705, 689-704, 689-705, 689-708, 690-705, 690-706, 690-709, 691-706, 692-711, 693-716, 693-712, 695-715, 697-716, 697-716, 690-716, 724-746, 724-752, 724-754, 724-758, 733-752, 738-754, 738-753, 739-758, 739-754, 739-775, 739-754, 740-754, 742-785, 742-773, 757-776, 757-785, 790-815, 793-812, 811-833, 811-844, 814-833, 811-906, 820-839, 822-844, 822-867, 823-842, 845-864, 845-867, 854-906, 845-909, 845-906, 854-876, 863-882, 863-885, 878-900, 887-906, 899-918, 899-933, 899-958, 905-927, 905-933, 914-933, 936-958, 936-955, 945-964, 951-970, 951-985, 951-1044, 951-1024, 951-1056, 951-997, 960-985, 963-1044, 963-1024, 963-997, 972-1015, 1025-1044, 1031-1056, 1037-1056, 1046-1083, 1049-1068, 1070-1089, 1070-1095, 1082-1101, 1081-1134, 1081-1143, 1082-1101, 1088-1107, 1088-1134, 1094-1119, 1097-1119, 1112-1134, 1118-1143, 1118-1146, 1088-1146, 1121-1140, 1127-1146, 1127-1193, 1150-1193, 1156-1187, 1165-1187, 1170-1192, 1171-1191, 1172-1191, 1176-1192, 1176-1285, 1177-1192, 1176-1191, 1203-1297, 1206-1228, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1255, 1245-1265, 1251-1280, 1262-1285, 1251-1285, 1259-1296, 1259-1290, 1259-1287, 1261-1296, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1296, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1264-1297, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1296, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1271-1290, 1271-1296, 1277-1296, 1261-1290, 1262-1290, 1268-1290, 1263-1305, 1259-1305, 1259-1305, 1266-1305, 1259-1302, 1275-1294, 1281-1306, 1281-1324, 1281-1336, 1282-1301, 1286-1306, 1290-1324, 1293-1318, 1290-1324, 1293-1315, 1296-1315, 1311-1336, 1311-1333, 1326-1345, 1353-1381, 1359-1378, 1395-1414, 1498-1532, 1498-1523, 1498-1535, 1510-1529, 1515-1535, 1515-1563, 1515-1596, 1515-1605, 1515-1602, 1515-1540, 1515-1535, 1518-1605, 1518-1602, 1518-1537, 1521-1563, 1521-1540, 1550-1655, 1550-1563, 1550-1569, 1553-1578, 1553-1599, 1553-1590, 1565-1584, 1571-1595, 1577-1605, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1578-1598, 1571-1598, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1580-1605, 1580-1602, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1553-1655, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1586-1652, 1642-1664, 1651-1720, 1651-1673, 1655-1679, 1695-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1743-1768, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1796, 1777-1800, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1798, 1779-1797, 1779-1796, 1779-1795, 1779-1794, 1780-1799, 1780-1796, 1780-1795, 1781-1797, 1781-1796, 1781-1796, 1781-1800, 1781-1797, 1782-1799, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1800, 1784-1799, 1779-1799, 1778-1889, 1778-1794, 1779-1795, 1780-1799, 1785-1800, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1828, 1806-1825, 1809-1828, 1812-1843, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1843, 1815-1844, 1815-1840, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1840, 1821-1844, 1821-1837, 1822-1843, 1822-1839, 1822-1837, 1823-1843, 1823-1838, 1824-1839, 1827-1846, 1861-1884, 1861-1880, 1865-1885, 1866-1881, 1867-1882, 1867-1886, 1868-1883, 1869-1885, 1869-1884, 1870-1885, 1871-1886, 1872-1887, 1874-1889, 1876-1895, 1888-1914, 1888-1908, 1891-1910, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1913-1935, 1898-1920, 1907-1929, 1913-1935, 1918-1934, 1919-1938, 1919-1934, 1921-1934, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2368-2393, 2381-2397, 2368-2394, 2379-2394, 2381-2396, 2368-2397, 2368-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2459-2478, 2819-2838, 2818-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV, имеющую часть смежных нуклеооснований, которая комплементарна равной по длине части нуклеооснований указанной области. Например, эта часть может быть частью, содержащей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований, комплементарной равной по длине части области, упомянутой в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды направлены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 58-73, 58-74, 58-77, 59-74, 60-75, 61-76, 62-77, 245-274; 245-260, 250-265, 251-266, 252-267, 253-268, 254-269, 255-270, 256-271, 256-272, 258-273, 259-274, 380-399, 382-401, 411-437, 411-427, 411-426, 412-427, 413-428, 413-432, 414-429, 415-430, 416-431, 417-432, 418-433, 419-434, 420-435, 421-436, 422-437, 457-472, 458-473, 639-754, 639-658, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 670-754, 670-706, 670-685, 671-686, 672-687, 673-688, 678-693, 679-694, 680-695, 681-706, 681-696, 682-697, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-702, 688-703, 689-704, 690-705, 691-706, 738-754, 738-753, 739-754, 1176-1285, 1176-1191, 1177-1192, 1261-1285, 1261-1276, 1262-1277, 1263-1278, 1264-1279, 1265-1280, 1266-1281, 1267-1282, 1268-1283, 1269-1284, 1270-1285, 1577-1606, 1577-1592, 1578-1593, 1579-1594, 1580-1595, 1581-1596, 1582-1597, 1583-1598, 1584-1599, 1585-1600, 1586-1601, 1587-1602, 1588-1603, 1589-1604, 1590-1605, 1591-1606, 1778-1889, 1778-1800, 1778-1793, 1779-1794, 1780-1799, 1780-1796, 1780-1795, 1781-1796, 1782-1797, 1783-1798, 1784-1799, 1785-1800, 1822-1839, 1822-1837, 1823-1838, 1824-1839, 1866-1881, 1867-1882, 1868-1883, 1869-1884, 1870-1885, 1871-1886, 1872-1887 или 1874-1889, и причем по меньшей мере один нуклеозид соединения или модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый или затрудненный этиловый (cEt) сахар.
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, комплементарен в пределах следующих нуклеотидных областей последовательности SEQ ID NO:1: 58-73, 58-74, 58-77, 59-74, 59-75, 60-75, 60-76, 61-76, 61-77, 62-77, 253-272, 253-269, 254-270, 255-271, 256-272, 411-437, 411-426, 411-427, 411-430, 412-427, 412-428, 412-431, 413-428, 413-429, 413-432, 414-429, 414-430, 414-433, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-434, 418-437, 457-472, 457-473, 458-473, 670-706, 670-685, 670-686, 671-686, 671-687, 672-687, 672-688, 673-688, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 689-704, 689-705, 690-705, 690-706, 691-706, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1794, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1796, 1781-1797, 1781-1800, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1799 и 1784-1800.
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение или олигонуклеотид, направленный на нуклеиновую кислоту HBV, направлен на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 58-73, 58-74, 58-77, 59-74, 59-75, 60-75, 60-76, 61-76, 61-77, 62-77, 253-272, 253-269, 254-270, 255-271, 256-272, 411-437, 411-426, 411-427, 411-430, 412-427, 412-428, 412-431, 413-428, 413-429, 413-432, 414-429, 414-430, 414-433, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-434, 418-437, 457-472, 457-473, 458-473, 670-706, 670-685, 670-686, 671-686, 671-687, 672-687, 672-688, 673-688, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 689-704, 689-705, 690-705, 690-706, 691-706, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1794, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1796, 1781-1797, 1781-1800, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1799 и 1784-1800.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV, имеющую часть смежных нуклеооснований, которая комплементарна равной по длине части нуклеооснований указанной области. Например, эта часть может быть частью, содержащей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований, комплементарной равной по длине части области, упомянутой в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды направлены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 1-20, 10-29, 10-56, 13-38, 13-35, 19-38, 25-47, 25-50, 25-56, 43-68, 43-63, 55-74, 58-73, 58-74, 58-77, 58-79, 58-80, 58-84, 59-74, 59-75, 59-80, 60-75, 60-76, 60-79, 61-76, 61-77, 61-80, 62-77, 63-84, 68-114, 101-123, 98-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 158-177, 167-186, 191-215, 196-224, 196-215, 196-218, 199-228, 199-218, 199-224, 200-224, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-270, 253-269, 253-272, 253-274, 254-270, 254-274, 255-271, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 256-275, 255-276, 256-272, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 292-311, 290-312, 293-312, 293-315, 293-321, 296-321, 302-321, 324-343, 339-361, 339-367, 348-367, 342-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-383, 360-388, 360-385, 362-381, 366-388, 369-388, 366-385, 366-392, 370-389, 370-392, 384-433, 384-400, 384-401, 385-401, 405-424, 409-428, 405-428, 411-426, 411-427, 411-430, 411-431, 411-437, 412-431, 411-426, 411-427, 412-428, 412-431, 412-427, 413-433, 413-432, 413-428, 413-429, 413-432, 413-433, 414-427, 415-427, 414-429, 414-430, 414-433, 415-428, 415-429, 415-430, 415-431, 415-434, 416-431, 416-432, 416-429, 416-435, 417-432, 417-433, 417-436, 418-433, 418-435, 418-434, 418-437, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 422-441, 423-436, 425-465, 454-473, 454-472, 457-476, 457-472, 457-473, 454-476, 455-472, 457-485, 458-485, 458-483, 458-477, 458-473, 459-485, 460-485, 463-498, 463-485, 466-485, 463-482, 457-491, 458-491, 459-491, 460-491, 463-491, 466-491, 472-491, 472-493, 473-492, 475-491, 459-494, 460-494, 463-494, 466-494, 467-498, 472-494, 475-494, 457-473, 457-472, 458-494, 454-494, 457-494, 457-473, 485-513, 470-493, 476-519, 485-519, 500-519, 512-534, 512-550, 524-546, 536-559, 548-567, 548-570, 550-570, 548-594, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 642-754, 653-672, 662-685, 665-685, 665-689, 668-687, 670-706, 670-685, 670-686, 670-689, 671-690, 671-691, 671-686, 671-687, 672-693, 672-697, 672-707, 672-687, 672-688, 673-688, 674-693, 679-707, 679-698, 679-701, 679-702, 679-707, 680-699, 679-699, 682-706, 682-707, 682-702, 682-701, 687-754, 688-704, 689-709, 689-710, 690-705, 679-705, 679-710, 679-706, 690-710, 691-710, 690-754, 690-706, 684-703, 687-705, 687-702, 687-703, 687-706, 688-703, 688-704, 688-705, 689-704, 689-705, 689-708, 690-705, 690-706, 690-709, 691-706, 692-711, 693-716, 693-712, 695-715, 697-716, 697-716, 690-716, 724-746, 724-752, 724-754, 724-758, 733-752, 738-754, 739-758, 739-754, 739-775, 739-754, 740-754, 742-785, 742-773, 757-776, 757-785, 790-815, 793-812, 811-833, 811-844, 814-833, 811-906, 820-839, 822-844, 822-867, 823-842, 845-864, 845-867, 854-906, 845-909, 845-906, 854-876, 863-882, 863-885, 878-900, 887-906, 899-918, 899-933, 899-958, 905-927, 905-933, 914-933, 936-958, 936-955, 945-964, 951-970, 951-985, 951-1044, 951-1024, 951-1056, 951-997, 960-985, 963-1044, 963-1024, 963-997, 972-1015, 1025-1044, 1031-1056, 1037-1056, 1046-1083, 1049-1068, 1070-1089, 1070-1095, 1082-1101, 1081-1134, 1081-1143, 1082-1101, 1088-1107, 1088-1134, 1094-1119, 1097-1119, 1112-1134, 1118-1143, 1118-1146, 1088-1146, 1121-1140, 1127-1146, 1127-1193,1150-1193, 1156-1187, 1165-1187, 1170-1192, 1171-1191, 1172-1191, 1176-1192, 1177-1192, 1176-1191, 1203-1297, 1206-1228, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1255, 1245-1265, 1251-1280, 1262-1285, 1251-1285, 1259-1296, 1259-1290, 1259-1287, 1261-1296, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1296, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1264-1297, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1296, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1271-1290, 1271-1296, 1277-1296, 1261-1290, 1262-1290, 1268-1290, 1263-1305, 1259-1305, 1259-1305, 1266-1305, 1259-1302, 1275-1294, 1281-1306, 1281-1324, 1281-1336, 1282-1301, 1286-1306, 1290-1324, 1293-1318, 1290-1324, 1293-1315, 1296-1315, 1311-1336, 1311-1333, 1326-1345, 1353-1381, 1359-1378, 1395-1414, 1498-1532, 1498-1523, 1498-1535, 1510-1529, 1515-1535, 1515-1563, 1515-1596, 1515-1605, 1515-1602, 1515-1540, 1515-1535, 1518-1605, 1518-1602, 1518-1537, 1521-1563, 1521-1540, 1550-1655, 1550-1563, 1550-1569, 1553-1578, 1553-1599, 1553-1590, 1565-1584, 1571-1595, 1577-1605, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1578-1598, 1571-1598, 1579-1594, 1579-1594, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1580-1605, 1580-1602, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1553-1655, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1586-1652, 1642-1664, 1651-1720, 1651-1673, 1655-1679, 1695-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1743-1768, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1796, 1777-1800, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1798, 1779-1797, 1779-1796, 1779-1795, 1779-1794, 1780-1799, 1780-1796, 1780-1795, 1781-1797, 1781-1796, 1781-1796, 1781-1800, 1781-1797, 1782-1799, 1782-1797, 1782-1798, 1783-1798, 1783-1799, 1784-1800, 1784-1799, 1779-1799, 1778-1794, 1779-1795, 1780-1799, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1828, 1806-1825, 1809-1828, 1812-1843, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1843, 1815-1844, 1815-1840, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1840, 1821-1844, 1821-1837, 1822-1843, 1822-1839, 1823-1843, 1827-1846, 1861-1884, 1861-1880, 1865-1885, 1867-1886, 1869-1885, 1876-1895, 1888-1914, 1888-1908, 1891-1910, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1913-1935, 1898-1920, 1907-1929, 1913-1935, 1918-1934, 1919-1938, 1919-1934, 1921-1934, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2368-2393, 2381-2397, 2368-2394, 2379-2394, 2381-2396, 2368-2397, 2368-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2459-2478, 2819-2838, 2818-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или олигонуклеотиды направлены на область нуклеиновой кислоты HBV, имеющую часть смежных нуклеооснований, которая комплементарна равной по длине части нуклеооснований указанной области. Например, эта часть может быть частью, содержащей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных нуклеооснований, комплементарной равной по длине части области, упомянутой в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды направлены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1: 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-270, 253-272, 253-274, 254-274, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 256-275, 255-276, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 405-424, 409-428, 405-428, 411-430, 411-431, 411-431, 412-431, 411-426, 411-427, 412-428, 412-431, 412-427, 413-433, 413-432, 413-428, 413-433, 411-427, 414-427, 415-427, 415-428, 415-429, 416-432, 416-429, 418-435, 418-434, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 422-441, 423-436, 425-465, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 642-754, 653-672, и причем по меньшей мере один нуклеозид соединения или модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 50% ингибирование: 1-20, 10-29, 10-56, 13-38, 13-35, 19-38, 25-47, 25-50, 25-56, 43-68, 43-63, 55-74, 58-77, 58-74, 58-73, 58-79, 58-80, 58-84, 59-74, 59-75, 59-80, 60-79, 60-75, 60-76, 61-80, 61-76, 61-77, 62-77, 63-84, 68-114, 101-123, 98-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 158-177, 167-186, 191-215, 196-224, 196-215, 196-218, 199-228, 199-218, 199-224,200-224, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-264, 242-263, 243-262, 244-263, 245-264, 246-266, 247-266, 247-269, 247-270, 245-267, 251-267, 245-266, 250-269, 251-268, 251-269, 245-269, 245-266, 245-261, 250-265, 250-266, 250-267, 250-268, 250-269, 251-266, 251-270, 252-267, 253-268, 253-269, 253-272, 253-274, 254-269, 254-270, 254-274, 255-274, 255-401, 255-400, 255-274, 255-273, 255-272, 255-271, 255-270, 256-271, 256-272, 256-275, 255-276, 256-276, 253-275, 256-279, 257-276, 258-273, 259-274, 260-279, 262-281, 262-321, 262-315, 262-312, 265-312, 266-288, 266-291, 266-285, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 292-311, 290-312, 293-312, 293-315, 293-321, 296-321, 302-321, 324-343, 339-361, 339-367, 348-367, 342-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-383, 360-388, 360-385, 362-381, 366-388, 369-388, 366-385, 366-392, 370-389, 370-392, 380-399, 382-401, 384-433, 384-400, 384-401, 385-401, 405-424, 409-428, 405-428, 411-430, 411-431, 411-431, 412-431, 411-426, 411-427, 411-430, 411-437, 412-428, 412-431, 412-427, 413-432, 413-428, 413-429, 413-433, 411-427, 414-427, 414-429, 414-430, 414-433, 415-427, 415-428, 415-429, 415-430, 415-431, 415-434, 416-435, 416-432, 416-431, 416-429, 417-432, 417-433, 417-436, 418-437, 418-435, 418-434, 418-433, 419-435, 419-434, 420-435, 419-432, 419-434, 421-436, 422-441, 422-437, 423-436, 425-465, 454-473, 454-472, 457-476, 454-476, 455-472, 457-485, 457-473, 457-472, 458-485, 458-483, 458-477, 458-473, 459-485, 460-485, 463-498, 463-485, 466-485, 463-482, 457-491, 458-491, 459-491, 460-491, 463-491, 466-491, 472-491, 472-493, 473-492, 475-491, 459-494, 460-494, 463-494, 466-494, 467-498, 472-494, 475-494, 457-473, 457-472, 458-494, 454-494, 457-494, 457-473, 485-513, 470-493, 476-519, 485-519, 500-519, 512-534, 512-550, 524-546, 536-559, 548-567, 548-570, 550-570, 548-594, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 611-645, 617-363, 623-642, 617-645, 639-654, 641-656, 642-657, 642-754, 643-658, 653-672, 662-685, 665-685,665-689, 668-687, 670-689, 670-706, 670-685, 670-686, 671-686, 671-687, 671-690, 671-691, 672-687, 672-688, 672-693, 672-697, 672-707, 673-688, 674-693, 678-693, 679-707, 679-694, 679-698, 679-701, 679-702, 679-707, 680-699, 679-699, 680-695, 681-696, 682-706, 682-707, 682-702, 682-701, 682-697, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-702, 687-703, 687-706, 687-754, 688-703, 688-704, 689-704, 689-705, 689-709, 689-710, 690-705, 690-706, 691-706, 679-705, 679-710, 679-706, 690-710, 691-710, 690-754, 690-706, 684-703, 687-705, 687-703, 687-706, 688-705, 689-708, 690-709, 692-711, 693-716, 693-712, 695-715, 697-716, 697-716, 690-716, 724-746, 724-752, 724-754, 724-758, 733-752, 738-753, 738-754, 739-758, 739-754, 739-775, 739-754, 740-754, 742-785, 742-773, 757-776, 757-785, 790-815, 793-812, 811-833, 811-844, 814-833, 811-906, 820-839, 822-844, 822-867, 823-842, 845-864, 845-867, 854-906, 845-909, 845-906, 854-876, 854-873, 863-882, 863-885, 878-900, 878-897, 887-906, 899-918, 899-933, 899-958, 905-927, 905-933, 914-933, 936-958, 936-955, 945-964, 951-970, 951-985, 951-1044, 951-1024, 951-1056, 951-997, 960-985, 963-1044, 963-1024, 963-997, 966-985, 972-1015, 978-997, 1025-1044, 1031-1056, 1037-1056, 1046-1083, 1049-1068, 1070-1089, 1070-1095, 1082-1101, 1081-1134, 1081-1143, 1082-1101, 1088-1107, 1088-1134, 1094-1119, 1097-1119, 1112-1134, 1118-1143, 1118-1146, 1088-1146, 1121-1140, 1127-1146, 1127-1193, 1150-1193, 1156-1187, 1165-1187, 1170-1192, 1171-1191, 1172-1191, 1176-1192, 1177-1192, 1176-1191, 1203-1297, 1206-1228, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1255, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1245-1265, 1251-1280, 1251-1285, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1296, 1259-1290, 1259-1287, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1261-1296, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1262-1285, 1262-1296, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1264-1297, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1296, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1271-1290, 1271-1296, 1277-1296, 1261-1290, 1262-1290, 1268-1290, 1263-1305, 1259-1305, 1259-1305, 1266-1305, 1259-1302, 1275-1294, 1281-1306, 1281-1324, 1281-1336, 1782-1797, 1282-1301, 1286-1306, 1290-1324, 1293-1318, 1290-1324, 1293-1315, 1296-1315, 1311-1336, 1311-1333, 1326-1345, 1353-1381, 1359-1378, 1395-1414, 1498-1532, 1498-1523, 1498-1535, 1510-1529, 1515-1535, 1515-1563, 1515-1596, 1515-1605, 1515-1602, 1515-1540, 1515-1535, 1518-1605, 1518-1602, 1518-1537, 1521-1563, 1521-1540, 1550-1655, 1550-1563, 1550-1569, 1553-1578, 1553-1599, 1553-1590, 1565-1584, 1571-1595, 1577-1606, 1577-1605, 1577-1596, 1577-1592, 1577-1593, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1578-1598, 1579-1594, 1579-1595, 1579-1598, 1571-1598, 1580-1605, 1580-1602, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1553-1655, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1586-1652, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1642-1664, 1651-1720, 1651-1673, 1655-1679, 1695-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1743-1768, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1796, 1777-1800, 1778-1800, 1778-1793, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1798, 1779-1797, 1779-1796, 1779-1795, 1779-1794, 1780-1796, 1781-1797, 1781-1796, 1781-1800, 1781-1797, 1782-1799, 1784-1800, 1779-1799, 1778-1794, 1779-1795, 1780-1799, 1794-1813, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1796, 1781-1797, 1781-1800, 1782-1798, 1783-1799, 1784-1799, 1784-1800, 1785-1800, 1806-1837, 1806-1828, 1806-1825, 1809-1828, 1812-1843, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1843, 1815-1844, 1815-1840, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1840, 1821-1844, 1821-1837, 1822-1843, 1822-1839, 1823-1843, 1827-1846, 1861-1884, 1861-1880, 1865-1885, 1867-1886, 1869-1885, 1876-1895, 1888-1914, 1888-1908, 1891-1910, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1913-1935, 1898-1920, 1907-1929, 1913-1935, 1918-1934, 1919-1938, 1919-1934, 1921-1934, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2278-2297, 2281-2300, 2284-2303, 2368-2393, 2381-2397, 2368-2394, 2379-2394, 2381-2396, 2368-2397, 2368-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2459-2478, 2819-2838, 2818-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 60% ингибирование: 1-20, 10-29, 10-53, 13-38, 25-50, 43-68, 55-74, 58-84, 58-77, 58-74, 58-73, 58-79, 59-80, 59-74, 59-75, 60-75, 60-76, 61-77, 61-76, 61-80, 62-77, 68-114, 98-123, 101-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 191-215, 196-224, 196-215, 199-228, 199-218, 200-223, 199-218, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-263, 244-263, 245-264, 247-266, 250-265, 251-266, 252-267, 253-272, 253-269, 251-267, 253-274, 254-270, 255-276, 256-279, 256-276, 256-274, 256-272, 256-271, 258-273, 259-274, 265-388, 265-284, 266-291, 266-288, 260-279, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 293-312, 296-315, 302-321, 324-343, 339-367, 339-361, 342-367, 348-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-379, 366-392, 366-385, 369-388, 370-392, 382-401, 405-428, 405-424, 409-428, 411-436, 411-433, 411-431, 411-426, 411-430, 411-427, 412-431, 412-428, 412-427, 413-428, 413-429, 413-433, 414-433, 414-430, 414-429, 414-433, 415-430, 415-431, 415-434, 415-435, 415-436, 416-429, 416-434, 416-431, 416-432, 416-436, 416-435, 417-436, 417-433, 417-432, 418-434, 418-433, 418-437, 419-434, 420-435, 421-436, 422-437, 423-436, 425-465, 454-472, 455-472, 457-476, 457-472, 457-473, 458-485, 458-473, 458-483, 463-498, 467-498, 463-482, 470-493, 472-491, 485-519, 485-513, 500-519, 512-534, 524-546, 536-558, 548-567, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 608-648, 639-654, 640-656, 641-656, 642-657, 642-658, 643-658, 653-672, 662-685, 665-685, 670-706, 670-689, 670-685, 670-686, 671-690, 671-686, 671-687, 672-707, 672-697, 672-693, 672-687, 672-688, 673-688, 679-707, 679-698, 679-694, 680-695, 681-696, 682-697, 682-701, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-754, 687-702, 687-705, 687-703, 687-706, 688-704, 688-703, 688-704, 688-705, 688-707, 689-710, 689-709, 689-705, 689-704, 690-754, 690-705, 690-706, 691-706, 691-710, 692-711, 697-716, 724-758, 724-754, 724-752, 724-746, 738-754, 738-753, 739-754, 742-785, 757-785, 790-815, 811-906, 811-844, 811-833, 822-867, 822-844, 823-842, 845-867, 854-906, 854-873, 878-897, 899-958, 899-933, 936-958, 945-964, 951-1044, 951-1024, 951-985, 951-997, 963-1044, 963-1024, 963-997, 966-985, 978-997, 1031-1056, 1046-1083, 1070-1095, 1081-1143, 1081-1134, 1082-1101, 1088-1146, 1088-1134, 1118-1146, 1118-1143, 1127-1193, 1170-1189, 1176-1192, 1176-1191, 1177-1192, 1203-1297, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1251-1270, 1251-1285, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1276, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1281, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1297, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1287, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1281-1336, 1281-1324, 1281-1306, 1286-1305, 1290-1324, 1311-1336, 1326-1345, 1353-1381, 1395-1414, 1498-1535, 1498-1532, 1515-1535, 1515-1534, 1521-1540, 1550-1655, 1553-1599, 1553-1590, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1595, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1642-1664, 1651-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1800, 1777-1797, 1655-1674, 1778-1794, 1778-1800, 1781-1800, 1781-1797, 1784-1800, 1779-1799, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1796, 1781-1797, 1781-1800, 1782-1797, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1825, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1844, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1837, 1822-1838, 1827-1846, 1861-1884, 1821-1840, 1866-1885, 1867-1886, 1888-1914, 1888-1907, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1919-1938, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2278-2297, 2281-2300, 2284-2303, 2368-2397, 2368-2396, 2368-2394, 2368-2393, 2379-2394, 2381-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2819-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 65% ингибирование: 1-20, 10-29, 10-53, 13-38, 25-50, 43-68, 55-74, 58-84, 58-79, 58-74, 58-73, 58-77, 59-75, 59-80, 58-77, 60-75, 60-76, 61-77, 61-76, 61-80, 62-77, 68-114, 98-123, 101-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 191-215, 196-215, 199-228, 199-218, 200-223,199-218, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-263, 244-263, 245-264, 250-265, 251-266, 253-269, 253-274, 255-276, 256-279, 256-276, 256-274, 256-272, 256-271, 247-266, 253-272, 258-273, 266-291, 266-288, 260-279, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 296-315, 293-312, 302-321, 324-343, 339-367, 339-361, 342-367, 348-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-379, 366-392, 366-385, 369-388, 370-392, 382-401, 405-428, 405-424, 409-428, 411-433, 411-431, 411-430, 411-427, 411-426, 412-431, 412-428, 412-427, 413-433, 413-428, 413-429, 413-432, 414-433, 414-430, 414-429, 415-430, 415-431, 415-434, 415-435, 415-436, 416-434, 416-436, 416-435, 416-432, 416-431, 417-436, 417-433, 417-432, 418-433, 418-434, 418-437, 420-435, 422-437, 423-436, 425-465, 454-472, 455-472, 457-472, 458-485, 458-483, 458-473, 463-498, 467-498, 457-476, 470-493, 472-491, 485-519, 485-513, 500-519, 512-534, 524-546, 536-558, 548-567, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 608-648, 639-654, 640-656, 641-656, 642-657, 642-658, 643-658, 653-672, 662-685, 665-685, 670-685, 670-706, 670-689, 670-686, 670-685, 671-686, 671-687, 671-690, 672-688, 672-687, 672-707, 672-697, 672-693, 673-688, 679-698, 680-695, 681-696, 682-697, 682-701, 683-698, 684-699, 685-700, 686-701, 687-702, 688-703, 688-707, 687-754, 690-754, 690-706, 690-705, 687-705, 687-703, 687-706, 687-702, 688-705, 688-703, 688-704, 689-705, 691-706, 692-711, 697-716, 724-758, 724-754, 724-752, 724-746, 738-754, 739-754, 742-785, 757-785, 790-815, 811-906, 811-844, 811-833, 822-867, 822-844, 823-842, 845-867, 854-906, 854-873, 878-897, 899-958, 899-933, 936-958, 945-964, 951-1044, 951-1024, 951-985, 951-997, 963-1044, 963-1024, 963-997, 966-985, 978-997, 1031-1056, 1046-1083, 1070-1095, 1081-1143, 1081-1134, 1082-1101, 1088-1146, 1088-1134, 1118-1146, 1118-1143, 1127-1193, 1170-1189, 1176-1192, 1177-1192, 1203-1297, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1251-1270, 1251-1285, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1281, 1262-1277, 1262-1278, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1297, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1280, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1287, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1281-1336, 1281-1324, 1281-1306, 1290-1324, 1311-1336, 1326-1345, 1353-1381, 1395-1414, 1498-1535, 1498-1532, 1515-1535, 1515-1534, 1550-1655, 1553-1599, 1553-1590, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1595, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1642-1664, 1651-1720, 1655-1674, 1716-1738, 1743-1763, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1800, 1777-1797, 1778-1800, 1778-1797, 1779-1799, 1778-1794, 1779-1794, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1796, 1780-1799, 1780-1795, 1781-1796, 1781-1797, 1781-1800, 1782-1797, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1825, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1844, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1837, 1822-1838, 1827-1846, 1861-1884, 1866-1885, 1867-1886, 1888-1914, 1888-1907, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1919-1938, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2278-2297, 2281-2300, 2284-2303, 2368-2397, 2368-2396, 2368-2394, 2368-2393, 2379-2394, 2381-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2819-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 70% ингибирование: 1-20, 10-29, 10-53, 13-38, 25-50, 43-68, 55-74, 58-84, 58-79, 58-74, 59-75, 59-80, 58-77, 60-75, 60-76, 61-77, 68-114, 98-123, 101-123, 113-138, 116-138, 131-150, 137-162, 152-186, 191-215, 199-228, 199-218, 200-223, 205-224, 206-228, 218-237, 224-243, 233-263, 244-263, 245-264, 253-269, 253-274, 255-276, 256-279, 256-276, 256-274, 256-272, 247-266, 250-265, 251-266, 253-272, 256-271, 266-291, 266-288, 260-279, 281-321, 281-303, 290-321, 290-312, 293-312, 302-321, 324-343, 339-367, 339-361, 342-367, 348-367, 358-392, 358-378, 360-392, 360-379, 366-392, 366-385, 370-392, 382-401, 405-428, 405-424, 409-428, 411-433, 411-431, 411-430, 411-427, 411-426, 412-431, 412-428, 412-427, 413-428, 413-429, 413-432, 414-433, 414-430, 414-429, 415-430, 414-433, 415-434, 415-435, 415-436, 416-431, 416-434, 416-436, 416-435, 416-432, 417-436, 417-433, 418-433, 418-437, 423-436, 425-465, 454-472, 455-472, 457-472, 457-476, 458-473, 458-485, 458-483, 463-498, 467-498, 457-476, 470-493, 470-493, 472-491, 485-519, 485-513, 485-519, 485-513, 500-519, 512-534, 524-546, 536-558, 548-567, 554-573, 548-576, 560-594, 584-606, 608-648, 639-654, 640-656, 641-656, 642-657, 642-658, 643-658, 653-672, 662-685, 665-685, 670-706, 670-689, 670-685, 670-686, 671-690, 671-686, 671-687, 672-687, 672-688, 672-707, 672-697, 672-693, 673-688, 679-698, 681-696, 682-697, 682-701, 683-698, 684-699, 686-701, 687-702, 687-754, 687-702, 688-703, 690-754, 690-706, 687-705, 687-703, 687-706, 692-711, 697-716, 724-758, 724-754, 724-752, 724-746, 738-754, 739-754, 738-754, 742-785, 757-785, 790-815, 811-906, 811-844, 811-833, 822-867, 822-844, 845-867, 854-906, 854-873, 878-897, 899-958, 899-933, 936-958, 945-964, 951-1044, 951-1024, 951-985, 951-997, 963-1044, 963-1024, 963-997, 966-985, 978-997, 1031-1056, 1046-1083, 1070-1095, 1081-1143, 1081-1134, 1082-1101, 1088-1146, 1088-1134, 1118-1146, 1118-1143, 1127-1193, 1170-1189, 1176-1192, 1177-1192, 1203-1297, 1206-1255, 1209-1228, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1251-1285, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1281, 1262-1277, 1262-1278, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1297, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1287, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1281-1336, 1281-1324, 1281-1306, 1290-1324, 1311-1336, 1326-1345, 1353-1381, 1395-1414, 1498-1535, 1498-1532, 1515-1535, 1550-1655, 1553-1599, 1553-1590, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1595, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1602, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1642-1664, 1651-1720, 1716-1738, 1743-1763, 1764-1783, 1773-1792, 1777-1800, 1777-1797, 1778-1800, 1778-1797, 1779-1799, 1778-1794, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1800, 1782-1797, 1794-1813, 1806-1837, 1806-1825, 1812-1837, 1812-1831, 1815-1844, 1815-1834, 1818-1837, 1821-1837, 1822-1838, 1827-1846, 1861-1884, 1866-1885, 1867-1886, 1888-1914, 1888-1907, 1891-1914, 1895-1938, 1895-1935, 1919-1938, 1928-1956, 1957-1976, 2035-2057, 2083-2141, 2230-2261, 2278-2297, 2281-2300, 2284-2303, 2368-2397, 2368-2396, 2368-2394, 2368-2393, 2379-2394, 2381-2396, 2420-2439, 2458-2476, 2819-2838, 2873-2892 и 3161-3182.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 75% ингибирование: 13-32, 16-35, 19-38, 25-44, 28-47, 31-50, 43-62, 46-65, 49-68, 55-74, 58-82, 58-74, 58-77, 59-75, 60-75, 60-76, 61-77, 65-84, 98-117, 101-120, 104-123, 116-135, 119-138, 131-150, 137-156, 140-159, 143-162, 158-177, 161-180, 164-183, 167-186,200-219,203-226, 209-228, 218-237, 233-252, 236-255, 239-258, 242-264, 247-266, 251-266, 253-272, 255-276, 266-285, 269-288, 281-300, 284-303, 290-313, 298-317, 302-321, 324-343, 339-358, 342-361, 348-367, 358-381, 364-383, 366-386, 370-389, 373-392, 382-401, 405-424, 409-428, 411-430, 411-426, 411-427, 412-427, 412-431, 413-428, 413-429, 413-432, 414-436, 414-430, 414-429, 415-430, 416-431, 416-432, 417-433, 418-437, 422-441, 425-444, 428-447, 434-453, 440-459, 443-462, 446-465, 456-477, 458-473, 464-483, 470-493, 476-495, 479-498, 488-507, 491-510, 494-513, 500-519, 512-531, 515-534, 524-543, 527-546, 536-555, 539-558, 560-579, 566-585, 569-588, 572-591, 575-594, 584-603, 587-606, 608-627, 614-633, 617-636, 620-639, 623-642, 626-645, 629-648, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 653-672, 665-684, 668-688, 670-706, 670-686, 670-685, 671-691, 671-687, 671-686, 672-688, 673-688, 679-703, 681-696, 682-697, 686-701, 686-706, 687-702, 687-703, 688-703, 689-708, 693-712, 695-714, 696-715, 697-716, 727-746, 739-754, 742-761, 748-767, 751-770, 754-773, 757-776, 760-779, 763-782, 766-785, 790-809, 793-812, 796-815, 811-830, 814-833, 817-836, 820-839, 822-844, 845-864, 854-873, 857-876, 863-882, 866-885, 872-891, 875-894, 878-897, 881-900, 884-903, 887-906, 899-918, 902-921, 905-924, 908-927, 911-930, 914-933, 936-955, 939-958, 951-970, 954-973, 957-976, 960-979, 963-982, 966-985, 969-988, 972-991, 975-994, 978-997, 996-1015, 1002-1021, 1025-1044, 1031-1050, 1034-1053, 1037-1056, 1046-1065, 1049-1068, 1052-1071, 1055-1074, 1058-1077, 1061-1080, 1064-1083, 1070-1089, 1073-1092, 1076-1095, 1082-1101, 1088-1107, 1094-1113, 1097-1116, 1100-1119, 1103-1122, 1106-1125, 1109-1128, 1112-1131, 1115-1134, 1121-1140, 1127-1146, 1153-1172, 1156-1175, 1159-1178, 1162-1181, 1165-1184, 1168-1191, 1174-1193, 1206-1225, 1209-1228, 1212-1231, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1239-1258, 1242-1261, 1245-1264, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1283, 1257-1276, 1258-1277, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1277, 1262-1278, 1263-1278, 1263-1279, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1280, 1264-1283, 1265-1281, 1265-1284, 1266-1281, 1266-1282, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1268-1287, 1269-1284, 1269-1285, 1270-1285, 1272-1291, 1275-1294, 1282-1303, 1286-1306, 1290-1309, 1293-1312, 1296-1315, 1299-1318, 1305-1324, 1311-1330, 1314-1333, 1317-1336, 1353-1381, 1356-1375, 1359-1378, 1498-1517, 1501-1520, 1504-1523, 1510-1529, 1553-1572, 1556-1575, 1559-1578, 1562-1581, 1565-1584, 1571-1590, 1574-1599, 1577-1606, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1594, 1579-1595, 1579-1598, 1580-1595, 1580-1596, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1598, 1582-1601, 1582-1602, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1600, 1584-1603, 1585-1600, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1601, 1586-1605, 1586-1602, 1587-1602, 1587-1603, 1587-1606, 1588-1603, 1588-1604, 1589-1604, 1589-1605, 1590-1605, 1590-1606, 1591-1606, 1604-1623, 1607-1626, 1630-1649, 1633-1652, 1645-1664, 1651-1670, 1654-1674, 1657-1676, 1660-1679, 1663-1682, 1666-1685, 1689-1708, 1695-1714, 1698-1717, 1701-1720, 1716-1735, 1778-1797, 1778-1794, 1778-1797, 1779-1795, 1779-1798, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1781-1800, 1794-1813, 1895-1914, 1898-1917, 1901-1920, 1907-1926, 1910-1929, 1913-1932, 1916-1935, 1919-1938, 2278-2297, 2281-2300 и 2284-2303.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 80% ингибирование: 13-32, 16-35, 19-38, 25-44, 28-47, 46-65, 49-68, 58-77, 59-80, 63-82, 98-120, 116-135, 137-159, 158-177, 167-186, 203-224, 205-224, 209-228, 218-237, 233-252, 236-263, 245-264, 253-272, 256-275, 257-276, 266-288, 281-300, 290-312, 293-312, 324-343, 339-358, 348-367, 358-378, 360-379, 361-383, 366-385, 373-392, 382-401, 405-424, 411-431, 411-426, 411-427, 411-430, 413-428, 414-433, 414-434, 415-430, 415-434, 416-431, 416-435, 417-436, 418-437, 422-441, 425-444, 434-453, 456-476, 458-473, 458-477, 464-483, 471-493, 488-507, 494-513, 512-531, 524-543, 527-546, 536-558, 560-579, 566-585, 572-591, 575-594, 584-603, 587-606, 608-627, 614-633, 617-636, 620-639, 623-642, 626-645, 629-648, 639-654, 641-656, 642-657, 643-658, 665-688, 670-687, 670-686, 671-686, 671-687, 671-691, 673-688, 679-699, 682-697, 682-706, 686-701, 687-702, 687-706, 687-703, 693-715, 727-746, 742-761, 748-767, 757-776, 766-785, 790-815, 814-833, 820-839, 822-844, 845-864, 854-873, 854-876, 863-885, 872-906, 878-897, 899-918, 905-933, 936-955, 951-979, 963-985, 966-985, 972-1015, 978-997, 1002-1021, 1025-1044, 1031-1056, 1049-1074, 1061-1083, 1070-1089, 1082-1101, 1088-11107, 1094-1119, 1109-1134, 1121-1140, 1127-1146, 1159-1187, 1171-1191, 1206-1228, 1209-1228, 1215-1255, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1245-1264, 1251-1279, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1283, 1265-1284, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1283, 1268-1284, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1275-1294, 1282-1301, 1286-1306, 1293-1318, 1311-1333, 1326-1345, 1359-1378, 1553-1578, 1565-1584, 1571-1590, 1574-1599, 1577-1592, 1577-1596, 1577-1593, 1577-1596, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1595, 1579-1598, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1596, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1597, 1582-1601, 1582-1602, 1583-1598, 1583-1599, 1583-1602, 1584-1599, 1584-1603, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1605, 1587-1602, 1587-1606, 1588-1603, 1589-1604, 1589-1605, 1657-1679, 1780-1795, 1780-1796, 1780-1799, 1913-1935, 2278-2297, 2281-2300 и 2284-2303.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 85% ингибирование: 13-32, 16-35, 19-38, 25-44, 46-65, 59-80, 101-120, 140-159, 158-177, 167-186, 200-219, 205-224, 209-228, 233-252, 242-263, 253-272, 266-285, 281-300, 290-311, 293-312, 359-379, 361-381, 370-389, 382-401, 411-426, 411-430, 411-427, 413-428, 414-433, 415-430, 416-435, 417-436, 422-441, 456-476, 458-473, 470-493, 512-531, 524-543, 536-558, 566-585, 575-594, 587-606, 608-627, 614-636, 623-645, 639-654, 665-687, 671-686, 671-687, 680-699, 682-703, 687-706, 687-703, 727-746, 742-761, 757-776, 793-812, 822-843, 854-876, 854-873, 863-885, 878-900, 878-897, 887-906, 899-918, 905-927, 914-933, 936-955, 951-985, 966-985, 972-1015, 978-997, 1002-1021, 1025-1044, 1037-1056, 1049-1074, 1064-1083, 1070-1089, 1088-1107, 1094-1119, 1109-1128, 1121-1140, 1156-1175, 1162-1187, 1172-1191, 1206-1228, 1209-1228, 1215-1255, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1245-1264, 1251-1279, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1276, 1261-1277, 1261-1280, 1262-1277, 1262-1278, 1262-1281, 1263-1278, 1263-1282, 1264-1279, 1264-1283, 1265-1284, 1266-1285, 1267-1282, 1267-1283, 1268-1284, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1270-1285, 1275-1294, 1282-1301, 1293-1315, 1311-1330, 1359-1378, 1574-1593, 1577-1592, 1577-1593, 1577-1596, 1577-1606, 1578-1593, 1578-1594, 1578-1597, 1579-1598, 1580-1596, 1580-1599, 1581-1597, 1581-1600, 1582-1601, 1583-1598, 1583-1602, 1584-1603, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1605, 1587-1602, 1588-1603, 1780-1799, 1780-1796 и 2278-2297,2281-2300 и 2284-2303.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 90% ингибирование: 13-32, 16-35, 60-80, 140-159, 158-177, 167-186, 242-261, 292-311, 362-381, 370-389, 382-401, 411-427, 411-426, 413-428, 415-430, 416-435, 422-441, 473-492, 617-636, 623-642, 639-654, 668-687, 680-699, 682-701, 684-703, 687-706, 727-746, 757-776, 824-843, 854-873, 854-876, 863-882, 878-897, 878-900, 887-906, 899-918, 905-927, 914-933, 936-955, 951-970, 960-985, 966-985, 972-1015, 978-997, 1025-1044, 1037-1056, 1070-1089, 1097-1119, 1109-1128, 1121-1140, 1165-1187, 1172-1191, 1206-1228, 1209-1228, 1215-1234, 1215-1234, 1215-1255, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1245-1264, 1251-1279, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1280, 1262-1278, 1261-1276, 1262-1281, 1262-1277, 1263-1282, 1263-1278, 1264-1283, 1265-1284, 1266-1285, 1268-1284, 1269-1284, 1269-1285, 1269-1288, 1296-1315, 1577-1605, 1577-1596, 1577-1593, 1577-1592, 1578-1597, 1581-1600, 1582-1601, 1583-1602, 1583-1598, 1585-1601, 1585-1604, 1586-1605, 1588-1603, 1780-1799, 1780-1796, 2278-2297, 2281-2300 и 2284-2303.
В некоторых вариантах реализации, следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO:1, при направленном действии антисмысловых соединений или олигонуклеотидов, демонстрируют по меньшей мере 95% ингибирование: 411-426, 411-427, 413-428, 617-636, 623-642, 668-687, 680-699, 682-701, 854-873, 878-897, 887-906, 914-933, 966-985, 978-997, 1209-1228, 1215-1234, 1218-1237, 1221-1240, 1224-1243, 1227-1246, 1230-1249, 1233-1252, 1236-1255, 1245-1264, 1251-1270, 1254-1273, 1254-1279, 1257-1276, 1258-1277, 1259-1278, 1260-1279, 1261-1285, 1261-1280, 1262-1281, 1263-1282, 1263-1278, 1264-1283, 1265-1284, 1266-1285, 1268-1284, 1269-1288, 1577-1592, 1577-1596, 1577-1601, 1583-1598, 1585-1601, 1588-1603, 1780-1799, 2278-2297, 2281-2300 и 2284-2303.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 50% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 510088, 510089, 510090, 510092, 510096, 510097, 510098, 510099, 510100, 510101, 510102, 505330, 509928, 510104, 509929, 510105, 509930, 510106, 510107, 510108, 510111, 510115, 509931, 510116, 510117, 510118, 510119, 510120, 510121, 509932, 510122, 509933, 510123, 509934, 510124, 509935, 510125, 510126, 510127, 510128, 510140, 146779, 505314, 505315, 505316, 505317, 146821, 505318, 509922, 505319, 509925, 505320, 509952, 505321, 505322, 505323, 505324, 505325, 505326, 505327, 505328, 505329, 509956, 509957, 509927, 509958, 510038, 505330, 509959, 510039, 509960, 510040, 509961, 510041, 509962, 509963, 505331, 505332, 509968, 509969, 510050, 510052, 505333, 505334, 505335, 505336, 509972, 146823, 509974, 505338, 505339, 509975, 505340, 509978, 505341, 509979, 510058, 505342, 509981, 510061, 505344, 505345, 509983, 505346, 509984, 505347, 505348, 505350, 505352, 505353, 505354, 505355, 505356, 146786, 505357, 505358, 505359, 505360, 509985, 509986, 509987, 509988, 505363, 505364, 505365, 505366, 146787, 510079, 524410, 524411, 524413, 524414, 524415, 524416, 524417, 524418, 524419, 524420, 524421, 524422, 524424, 524425, 524426, 524427, 524428, 524429, 524431, 524432, 524433, 524434, 524435, 524436, 524439, 524440, 524442, 524444, 524446, 524447, 524448, 524450, 524451, 524452, 524453, 524454, 524455, 524456, 524457, 524458, 524459, 524460, 524461, 524462, 524464, 524466, 524467, 524468, 524469, 524470, 524471, 524472, 524473, 524474, 524475, 524477, 524478, 524479, 524480, 524481, 524482, 524483, 524484, 524485, 524486, 524487, 524489, 524490, 524491, 524492, 524493, 524494, 524495, 524496, 524498, 524499, 524500, 524501, 524502, 524503, 524504, 524506, 524507, 524508, 524509, 524510, 524511, 524512, 524513, 524514, 524515, 524516, 524517, 524518, 524519, 524520, 524521, 524522, 524523, 524524, 524525, 524526, 524527, 524528, 524529, 524530, 524531, 524532, 524533, 524534, 524535, 524536, 524537, 524538, 524539, 524540, 524541, 524543, 524544, 524546, 524547, 524548, 524549, 524550, 524551, 524552, 524553, 524554, 524555, 524556, 524557, 524558, 524559, 524560, 524561, 524562, 524563, 524564, 524565, 524568, 524569, 524570, 524571, 524572, 524573, 524574, 524575, 524576, 524577, 524578, 524579, 524580, 524581, 524582, 524584, 524585, 524586, 524587, 524588, 524589, 524590, 524591, 524592, 524593, 524594, 524595, 524598, 524599, 524600, 524601, 524602, 524603, 524604, 524605, 524606, 524607, 524608, 524609, 524610, 524611, 524614, 524615, 524616, 524617, 524618, 524619, 524620, 524621, 524622, 524623, 524624, 524625, 524626, 524627, 524629, 524632, 524633, 524634, 524635, 524636, 524637, 524638, 524639, 524640, 524641, 524642, 524643, 524644, 524646, 524647, 524648, 524649, 524650, 524651, 524652, 524654, 524656, 524657, 524658, 524659, 524660, 524661, 524662, 524663, 524664, 524665, 524666, 524667, 524668, 524669, 524670, 524672, 524673, 524675, 524676, 524678, 524679, 524680, 524682, 524683, 524684, 524685, 524686, 524687, 524688, 524689, 524690, 524691, 524692, 524693, 524694, 524695, 524696, 524697, 524698, 524699, 524700, 524701, 524702, 524703, 524704, 524705, 524706, 524707, 524708, 524709, 524710, 524712, 524713, 524714, 524715, 524716, 524717, 524718, 524719, 524721, 524722, 524723, 524724, 524726, 524727, 524728, 524729, 524730, 524731, 524732, 524733, 524734, 524735, 524736, 524737, 524738, 524739, 524740, 524741, 524742, 524743, 524744, 524745, 524746, 524747, 524748, 524749, 524750, 524751, 524752, 524753, 524754, 524755, 524756, 524757, 524758, 524759, 524760, 524761, 524762, 524763, 524764, 524765, 524766, 524767, 524768, 524769, 524770, 524771, 524772, 524773, 524774, 524775, 524776, 524777, 524778, 524779, 524780, 524781, 524782, 524783, 524784, 524785, 524786, 524787, 524788, 524789, 524790, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524799, 524800, 524801, 524802, 524803, 524804, 524805, 524806, 524807, 524808, 524809, 524810, 524811, 524812, 524813, 524814, 524815, 524816, 524817, 524818, 524819, 524820, 524821, 524822, 524823, 524824, 524825, 524826, 524827, 524828, 524829, 524830, 524831, 524632, 524833, 524834, 524835, 524842, 524843, 524844, 524845, 524847, 524848, 524856, 524857, 524861, 524866, 524867, 524868, 524869, 524870, 524871, 524872, 524873, 524875, 524876, 524877, 524878, 524879, 524880, 524881, 524882, 524883, 524884, 524885, 524886, 524887, 524888, 524889, 524890, 524891, 524892, 524893, 524894, 524895, 524896, 524897, 524898, 524899, 524900, 524901, 524902, 524903, 524904, 524905, 524906, 524907, 524908, 524909, 524910, 524911, 524912, 524913, 524914, 524915, 524916, 524917, 524918, 524919, 524921, 524922, 524923, 524924, 524925, 524926, 524927, 524928, 524929, 524930, 524931, 524932, 524933, 524934, 524935, 524936, 524937, 524938, 524939, 524940, 524941, 524942, 524943, 524944, 524945, 524946, 524947, 524948, 524949, 524950, 524951, 524952, 524953, 524954, 524955, 524956, 524957, 524958, 524959, 524960, 524961, 524962, 524964, 524965, 524976, 524977, 524978, 524979, 524980, 524981, 524982, 524983, 524984, 524985, 524986, 524987, 524988, 524989, 524991, 524992, 524993, 524994, 524997, 524998, 525021, 525022, 525037, 525039, 525043, 525050, 525052, 525086, 525090, 525100, 551909, 551910, 551911, 551912, 551913, 551916, 551917, 551918, 551919, 551920, 551921, 551922, 551923, 551924, 551925, 551926, 551927, 551928, 551929, 551930, 551932, 551933, 551934, 551935, 551936, 551937, 551939, 551940, 551941, 551942, 551943, 551944, 551945, 551946, 551947, 551948, 551949, 551950, 551951, 551952, 551953, 551954, 551955, 551956, 551957, 551958, 551959, 551960, 551962, 551963, 551964, 551965, 551966, 551967, 551968, 551971, 551972, 551973, 551974, 551975, 551976, 551977, 551978, 551979, 551980, 551981, 551982, 551983, 551984, 551985, 551986, 551987, 551988, 551989, 551990, 551992, 551993, 551994, 551995, 551996, 551997, 551998, 551999, 552000, 552001, 552002, 552003, 552004, 552005, 552006, 552007, 552009, 552010, 552011, 552012, 552013, 552014, 552015, 552016, 552017, 552018, 552019, 552020, 552021, 552022, 552023, 552024, 552025, 552026, 552027, 552028, 552029, 552030, 552031, 552032, 552033, 552034, 552035, 552036, 552037, 552038, 552039, 552040, 552041, 552042, 552043, 552044, 552045, 552046, 552047, 552048, 552049, 552050, 552051, 552052, 552053, 552054, 552055, 552056, 552057, 552058, 552059, 552060, 552061, 552062, 552063, 552064, 552065, 552067, 552068, 552069, 552070, 552071, 552072, 552073, 552074, 552075, 552076, 552077, 552078, 552079, 552080, 552081, 552082, 552083, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552089, 552090, 552091, 552092, 552093, 552094, 552095, 552096, 552097, 552098, 552099, 552100, 552101, 552102, 552114, 552115, 552116, 552117, 552118, 552119, 552122, 552123, 552124, 552125, 552126, 552127, 552128, 552129, 552131, 552132, 552133, 552134, 552135, 552136, 552137, 552138, 552139, 552140, 552141, 552142, 552143, 552144, 552145, 552146, 552147, 552148, 552149, 552150, 552151, 552152, 552153, 552154, 552155, 552158, 552159, 552160, 552161, 552162, 552163, 552164, 552165, 552167, 552168, 552169, 552170, 552171, 552175, 552176, 552177, 552178, 552179, 552180, 552181, 552182, 552183, 552185, 552186, 552187, 552188, 552189, 552191, 552192, 552193, 552194, 552195, 552196, 552197, 552198, 552199, 552200, 552201, 552202, 552203, 552204, 552205, 552206, 552207, 552208, 552209, 552210, 552211, 552212, 552213, 552214, 552215, 552216, 552217, 552218, 552220, 552222, 552224, 552225, 552230, 552239, 552240, 552241, 552242, 552243, 552246, 552247, 552248, 552249, 552250, 552251, 552252, 552253, 552254, 552255, 552256, 552257, 552258, 552259, 552260, 552261, 552262, 552263, 552264, 552265, 552266, 552267, 552268, 552269, 552270, 552271, 552279, 552285, 552288, 552293, 552294, 552295, 552296, 552297, 552300, 552301, 552302, 552303, 552304, 552305, 552306, 552307, 552308, 552309, 552310, 552312, 552313, 552314, 552315, 552316, 552317, 552318, 552319, 552320, 552321, 552322, 552323, 552325, 552326, 552330, 552331, 552332, 552333, 552337, 552338, 552339, 552340, 552341, 552342, 552343, 552344, 552345, 552347, 552348, 552349, 552350, 552351, 552352, 552354, 552355, 552356, 552357, 552358, 552359, 552360, 552361, 552362, 552363, 552364, 552365, 552366, 552367, 552368, 552369, 552370, 552371, 552372, 552373, 552374, 552375, 552376, 552377, 552378, 552379, 552380, 552385, 552386, 552390, 552391, 552393, 552394, 552395, 552396, 552397, 552398, 552399, 552400, 552401, 552402, 552403, 552408, 552409, 552410, 552411, 552412, 552413, 552414, 552415, 552416, 552417, 552418, 552419, 552420, 552421, 552422, 552423, 552424, 552425, 552428, 552430, 552431, 552432, 552433, 552440, 552442, 552443, 552444, 552445, 552446, 552447, 552448, 552449, 552450, 552452, 552453, 552455, 552456, 552458, 552459, 552464, 552465, 552466, 552467, 552468, 552469, 552470, 552471, 552472, 552473, 552474, 552475, 552476, 552477, 552478, 552479, 552480, 552481, 552482, 552484, 552485, 552486, 552487, 552488, 552490, 552491, 552493, 552497, 552499, 552500, 552501, 552502, 552503, 552504, 552505, 552506, 552508, 552509, 552510, 552511, 552512, 552513, 552514, 552515, 552516, 552517, 552520, 552521, 552522, 552523, 552525, 552526, 552527, 552528, 552529, 552530, 552531, 552532, 552533, 552534, 552535, 552538, 552539, 552540, 552541, 552542, 552544, 552547, 552548, 552553, 552554, 552555, 552557, 552558, 552559, 552561, 552562, 552565, 552566, 552567, 552568, 552569, 552570, 552571, 552572, 552576, 552577, 552578, 552579, 552580, 552581, 552582, 552583, 552584, 552585, 552586, 552587, 552588, 552589, 552590, 552591, 552592, 552594, 552595, 552596, 552597, 552598, 552600, 552606, 552608, 552787, 552788, 552789, 552790, 552791, 552794, 552795, 552796, 552797, 552798, 552799, 552800, 552801, 552802, 552803, 552804, 552805, 552806, 552807, 552808, 552809, 552810, 552811, 552812, 552813, 552814, 552815, 552816, 552817, 552818, 552819, 552820, 552821, 552822, 552823, 552824, 552825, 552826, 552827, 552828, 552829, 552830, 552831, 552832, 552833, 552834, 552835, 552836, 552837, 552838, 552839, 552840, 552841, 552842, 552843, 552844, 552845, 552846, 552847, 552848, 552849, 552850, 552851, 552852, 552853, 552854, 552855, 552856, 552857, 552858, 552859, 552860, 552861, 552862, 552863, 552864, 552865, 552866, 552868, 552870, 552871, 552872, 552876, 552889, 552890, 552891, 552892, 552893, 552894, 552895, 552896, 552898, 552899, 552901, 552902, 552903, 552904, 552905, 552907, 552908, 552909, 552910, 552911, 552912, 552913, 552914, 552915, 552916, 552917, 552918, 552919, 552922, 552923, 552925, 552926, 552927, 552928, 552929, 552930, 552931, 552932, 552933, 552934, 552935, 552936, 552937, 552938, 552939, 552940, 552941, 552942, 552943, 552944, 552945, 552946, 552947, 552948, 552950, 552951, 552953, 552954, 552955, 552956, 552957, 552958, 552959, 552960, 552961, 552965, 552966, 552969, 552970, 552971, 552972, 552973, 552974, 552975, 552976, 552977, 552979, 552980, 552981, 552982, 552983, 552984, 552987, 552988, 552989, 552990, 552991, 552992, 552993, 552994, 552995, 552996, 552997, 552998, 552999, 553000, 553001, 553002, 553003, 553004, 553005, 553006, 553007, 553008, 553009, 553010, 553011, 553012, 553014, 553015, 553016, 566828, 566829, 566830, 566831, 566832, 577120, 577121, 577122, 577123, 577124, 577125, 577126, 577127, 577128, 577129, 577130, 577131, 577132, 577133, 577134, 577135, 577136, 582665 и 582666.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 50% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 33, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 74, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 106, 108, 109, 111, 112, 115, 117,121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 197, 198, 199, 201, 203, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 217, 218, 220, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 240, 241, 242, 243, 244, 250, 283, 321, 322, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 350, 351, 353, 355, 357, 358, 359, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 416, 417, 418, 419, 420 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 453, 454, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 475, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 539, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 564, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 582, 583, 585, 586, 588, 589, 590, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 631, 632, 633, 634, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 754, 755, 756, 757, 759, 760, 768, 769, 773, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 876, 877, 888, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 901, 903, 904, 905, 906, 909, 910, 933, 934, 949, 951, 955, 962, 964, 998, 1002, 1013, 1052, 1267, 1271, 1272, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311, 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1345, 1346, 1347, 1348, 1349, 1350, 1364, 1365, 1366, 1367, 1368, 1369, 1370, 1371, 1372, 1375 и 1376.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 60% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 510090, 510100, 510102, 505330, 509928, 510104, 509929, 510105, 509930, 510106, 510107, 510111, 509931, 510116, 510117, 510118, 510119, 510120, 510121, 509932, 510122, 509933, 510123, 509934, 510124, 509935, 510125, 510128, 146779, 505314, 505315, 505316, 505317, 146821, 505318, 505319, 505322, 505323, 505324, 505325, 505326, 505327, 505328, 505329, 509956, 509957, 509958, 505330, 509959, 510041, 505332, 509968, 505333, 505335, 146823, 509974, 505338, 505339, 509975, 505340, 505341, 509979, 505342, 509981, 505344, 505345, 509983, 505346, 509984, 505347, 505348, 505353, 505354, 505356, 146786, 505357, 505358, 505359, 505360, 509985, 509986, 505363, 505366, 524410, 524413, 524414, 524415, 524416, 524417, 524418, 524419, 524420, 524421, 524422, 524424, 524425, 524426, 524428, 524431, 524432, 524433, 524434, 524435, 524439, 524440, 524446, 524447, 524448, 524451, 524452, 524453, 524454, 524455, 524456, 524457, 524459, 524460, 524461, 524464, 524466, 524467, 524468, 524469, 524471, 524472, 524473, 524474, 524475, 524477, 524478, 524479, 524480, 524481, 524482, 524485, 524486, 524487, 524489, 524490, 524491, 524492, 524493, 524494, 524495, 524496, 524499, 524500, 524501, 524502, 524503, 524504, 524506, 524507, 524508, 524509, 524510, 524511, 524512, 524513, 524514, 524515, 524516, 524517, 524519, 524520, 524521, 524523, 524525, 524526, 524527, 524528, 524529, 524532, 524533, 524534, 524535, 524536, 524537, 524538, 524539, 524540, 524541, 524543, 524546, 524547, 524549, 524550, 524552, 524553, 524554, 524555, 524556, 524557, 524558, 524559, 524560, 524561, 524562, 524563, 524564, 524565, 524568, 524569, 524570, 524571, 524572, 524573, 524574, 524575, 524576, 524577, 524578, 524579, 524580, 524581, 524582, 524585, 524586, 524587, 524588, 524589, 524590, 524591, 524593, 524594, 524595, 524598, 524599, 524600, 524602, 524603, 524604, 524605, 524606, 524607, 524610, 524611, 524614, 524615, 524616, 524617, 524618, 524619, 524620, 524621, 524622, 524623, 524625, 524627, 524629, 524632, 524633, 524634, 524635, 524636, 524637, 524638, 524639, 524640, 524641, 524642, 524643, 524644, 524646, 524647, 524648, 524649, 524650, 524651, 524654, 524656, 524657, 524658, 524659, 524661, 524662, 524663, 524664, 524665, 524666, 524667, 524668, 524669, 524670, 524673, 524675, 524676, 524678, 524679, 524680, 524683, 524684, 524685, 524686, 524687, 524688, 524689, 524690, 524691, 524692, 524694, 524695, 524696, 524697, 524698, 524699, 524700, 524701, 524702, 524703, 524704, 524705, 524706, 524707, 524708, 524709, 524710, 524713, 524714, 524715, 524716, 524717, 524718, 524719, 524721, 524722, 524724, 524726, 524727, 524728, 524729, 524730, 524731, 524732, 524733, 524734, 524735, 524736, 524737, 524738, 524739, 524741, 524742, 524743, 524744, 524746, 524747, 524748, 524749, 524750, 524751, 524752, 524753, 524754, 524755, 524756, 524757, 524758, 524759, 524760, 524761, 524762, 524763, 524764, 524765, 524766, 524767, 524768, 524769, 524770, 524771, 524772, 524773, 524774, 524775, 524776, 524777, 524778, 524779, 524780, 524781, 524782, 524783, 524784, 524785, 524787, 524788, 524789, 524790, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524799, 524800, 524801, 524802, 524803, 524804, 524805, 524806, 524807, 524808, 524809, 524810, 524811, 524812, 524813, 524814, 524815, 524816, 524817, 524818, 524819, 524820, 524821, 524822, 524823, 524824, 524825, 524826, 524827, 524828, 524829, 524830, 524632, 524833, 524842, 524843, 524844, 524845, 524847, 524856, 524866, 524867, 524868, 524869, 524870, 524871, 524872, 524873, 524876, 524878, 524879, 524880, 524881, 524882, 524883, 524884, 524885, 524886, 524887, 524888, 524889, 524890, 524891, 524892, 524893, 524894, 524895, 524896, 524897, 524898, 524899, 524900, 524901, 524902, 524903, 524904, 524905, 524906, 524907, 524908, 524909, 524910, 524911, 524912, 524913, 524914, 524915, 524916, 524921, 524922, 524923, 524924, 524925, 524926, 524928, 524929, 524930, 524931, 524932, 524933, 524936, 524937, 524938, 524939, 524940, 524941, 524942, 524944, 524946, 524947, 524948, 524949, 524950, 524952, 524953, 524954, 524955, 524961, 524977, 524978, 524979, 524980, 524981, 524982, 524983, 524984, 524985, 524986, 524987, 524988, 524991, 524992, 524993, 524994, 525037, 525052, 551909, 551911, 551919, 551920, 551921, 551922, 551924, 551925, 551926, 551927, 551928, 551932, 551933, 551934, 551935, 551936, 551941, 551943, 551944, 551948, 551949, 551950, 551951, 551952, 551953, 551954, 551955, 551956, 551957, 551958, 551959, 551960, 551962, 551963, 551965, 551966, 551967, 551968, 551973, 551975, 551979, 551981, 551982, 551983, 551984, 551985, 551986, 551987, 551989, 551990, 551992, 551993, 551994, 551995, 551996, 551997, 551998, 551999, 552000, 552001, 552002, 552003, 552005, 552006, 552007, 552009, 552010, 552012, 552013, 552014, 552015, 552016, 552017, 552018, 552019, 552020, 552021, 552022, 552023, 552024, 552025, 552026, 552027, 552028, 552029, 552030, 552031, 552032, 552033, 552034, 552035, 552036, 552038, 552039, 552041, 552042, 552044, 552045, 552046, 552047, 552048, 552049, 552050, 552051, 552052, 552053, 552054, 552055, 552056, 552057, 552058, 552059, 552060, 552061, 552062, 552063, 552064, 552065, 552068, 552069, 552070, 552071, 552073, 552074, 552075, 552076, 552077, 552078, 552079, 552080, 552081, 552082, 552083, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552089, 552090, 552091, 552092, 552093, 552094, 552095, 552096, 552097, 552098, 552099, 552100, 552101, 552102, 552114, 552115, 552116, 552117, 552118, 552119, 552123, 552124, 552125, 552126, 552127, 552128, 552129, 552131, 552132, 552133, 552134, 552135, 552136, 552138, 552139, 552140, 552141, 552143, 552144, 552145, 552146, 552147, 552148, 552149, 552150, 552151, 552152, 552153, 552155, 552158, 552159, 552160, 552162, 552163, 552168, 552169, 552170, 552171, 552176, 552178, 552179, 552180, 552182, 552183, 552185, 552187, 552188, 552191, 552192, 552193, 552194, 552195, 552196, 552197, 552198, 552199, 552200, 552201, 552202, 552203, 552204, 552205, 552206, 552207, 552208, 552209, 552210, 552211, 552212, 552213, 552214, 552215, 552216, 552222, 552224, 552225, 552239, 552240, 552242, 552246, 552247, 552248, 552252, 552253, 552254, 552255, 552256, 552257, 552258, 552259, 552261, 552263, 552265, 552266, 552268, 552285, 552293, 552294, 552295, 552296, 552301, 552302, 552303, 552306, 552307, 552308, 552309, 552310, 552312, 552313, 552314, 552315, 552316, 552317, 552318, 552320, 552321, 552322, 552323, 552325, 552326, 552331, 552332, 552337, 552338, 552339, 552340, 552343, 552345, 552347, 552348, 552349, 552351, 552354, 552355, 552356, 552358, 552359, 552360, 552361, 552362, 552363, 552364, 552365, 552366, 552367, 552368, 552369, 552370, 552371, 552372, 552373, 552374, 552375, 552376, 552377, 552378, 552379, 552396, 552397, 552398, 552403, 552408, 552409, 552410, 552411, 552412, 552414, 552416, 552418, 552419, 552420, 552421, 552422, 552423, 552424, 552431, 552442, 552445, 552449, 552455, 552456, 552459, 552464, 552465, 552466, 552467, 552469, 552472, 552473, 552474, 552475, 552477, 552478, 552479, 552480, 552484, 552487, 552497, 552508, 552509, 552511, 552512, 552515, 552516, 552520, 552521, 552522, 552523, 552526, 552527, 552528, 552529, 552530, 552531, 552534, 552540, 552541, 552542, 552559, 552567, 552568, 552569, 552570, 552572, 552576, 552577, 552578, 552579, 552582, 552583, 552584, 552585, 552586, 552587, 552588, 552590, 552595, 552596, 552597, 552788, 552789, 552790, 552791, 552796, 552800, 552801, 552803, 552804, 552805, 552806, 552807, 552808, 552809, 552811, 552812, 552813, 552814, 552815, 552816, 552817, 552818, 552819, 552820, 552821, 552822, 552823, 552824, 552826, 552827, 552828, 552829, 552830, 552831, 552832, 552833, 552834, 552835, 552836, 552837, 552838, 552839, 552841, 552842, 552843, 552844, 552845, 552846, 552847, 552848, 552849, 552850, 552851, 552852, 552853, 552854, 552855, 552856, 552857, 552858, 552859, 552860, 552861, 552862, 552863, 552864, 552865, 552866, 552872, 552891, 552892, 552893, 552894, 552902, 552903, 552904, 552905, 552907, 552908, 552909, 552910, 552911, 552912, 552913, 552914, 552915, 552916, 552917, 552918, 552922, 552923, 552925, 552927, 552928, 552929, 552930, 552931, 552932, 552933, 552934, 552935, 552936, 552937, 552938, 552939, 552940, 552941, 552942, 552943, 552944, 552945, 552946, 552951, 552955, 552956, 552957, 552958, 552960, 552961, 552966, 552969, 552971, 552972, 552973, 552974, 552975, 552976, 552977, 552979, 552980, 552981, 552982, 552983, 552984, 552988, 552989, 552990, 552991, 552992, 552993, 552994, 552995, 552996, 552998, 552999, 553000, 553001, 553002, 553003, 553004, 553005, 553006, 553007, 553008, 553009, 553010, 553011, 553012, 553016, 566828, 566829, 566830, 566831, 566832, 577120, 577121, 577122, 577123, 577124, 577125, 577126, 577127, 577128, 577129, 577130, 577131, 577132, 577133, 577134, 577135, 577136 и 582666.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 60% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:7, 9, 10, 12, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 33, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 56, 83, 85, 86, 87, 88, 89, 92, 96, 98, 100, 102, 103, 112, 115, 117, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 166, 167, 168, 172, 174, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 198, 199, 201, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 218, 220, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 240, 243, 321, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 342, 343, 344, 345, 346, 350, 351, 357, 358, 359, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 370, 371, 372, 375, 376, 377, 378, 379, 381, 382, 383, 384, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 416, 417, 418, 419, 420 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 429, 430, 431, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 453, 456, 457, 459, 460, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 475, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 535, 537, 539, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 564, 566, 567, 568, 569, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 583, 585, 586, 588, 589, 590, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 631, 632, 634, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 652, 653, 654, 655, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719,  720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 740, 741, 742, 744, 745, 754, 755, 756, 757, 759, 768, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 787, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 848, 849, 850, 851, 852, 853, 854, 856, 858, 859, 860, 861, 862, 864, 865, 866, 867, 873, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 903, 904, 905, 906, 949, 964, 1271, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311, 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1339, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1345, 1346, 1347, 1348, 1349, 1350, 1365, 1366, 1367, 1368, 1369, 1370, 1371, 1372 и 1376.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 70% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 510100, 505330, 509928, 509929, 509930, 510106, 509931, 510116, 510119, 510120, 510121, 509932, 510122, 509933, 510123, 509934, 510124, 509935, 146779, 505317, 146821, 505318, 505319, 505323, 505325, 505326, 505327, 509957, 505330, 505332, 505335, 509974, 505338, 505339, 509975, 505342, 509981, 505345, 505346, 505347, 505348, 146786, 505357, 505358, 505359, 505363, 524410, 524413, 524414, 524415, 524416, 524418, 524419, 524420, 524421, 524424, 524425, 524426, 524428, 524431, 524432, 524433, 524434, 524435, 524446, 524447, 524448, 524452, 524453, 524457, 524459, 524460, 524461, 524464, 524466, 524467, 524468, 524469, 524472, 524473, 524474, 524475, 524477, 524478, 524479, 524480, 524481, 524482, 524485, 524487, 524490, 524491, 524492, 524493, 524494, 524495, 524499, 524500, 524502, 524503, 524507, 524508, 524510, 524511, 524512, 524513, 524514, 524515, 524516, 524517, 524520, 524525, 524526, 524528, 524532, 524533, 524534, 524535, 524536, 524537, 524538, 524539, 524540, 524541, 524547, 524549, 524552, 524553, 524554, 524555, 524556, 524557, 524558, 524559, 524560, 524561, 524563, 524564, 524565, 524568, 524569, 524570, 524571, 524572, 524573, 524574, 524575, 524577, 524578, 524579, 524580, 524582, 524586, 524587, 524590, 524591, 524594, 524595, 524598, 524600, 524602, 524603, 524604, 524605, 524606, 524607, 524610, 524611, 524614, 524615, 524616, 524617, 524618, 524619, 524620, 524621, 524629, 524633, 524634, 524635, 524636, 524637, 524638, 524641, 524642, 524643, 524644, 524646, 524647, 524648, 524649, 524650, 524651, 524656, 524657, 524659, 524661, 524662, 524663, 524664, 524665, 524666, 524667, 524668, 524669, 524670, 524678, 524679, 524680, 524685, 524686, 524687, 524688, 524689, 524690, 524691, 524692, 524695, 524696, 524698, 524699, 524700, 524701, 524702, 524703, 524704, 524705, 524706, 524707, 524708, 524709, 524713, 524714, 524715, 524716, 524717, 524718, 524721, 524722, 524724, 524726, 524727, 524728, 524729, 524730, 524731, 524732, 524733, 524734, 524735, 524736, 524737, 524738, 524739, 524741, 524742, 524743, 524746, 524747, 524748, 524749, 524750, 524751, 524752, 524754, 524755, 524756, 524758, 524760, 524761, 524762, 524763, 524764, 524765, 524766, 524767, 524768, 524769, 524771, 524773, 524775, 524776, 524777, 524778, 524779, 524780, 524781, 524782, 524783, 524784, 524785, 524787, 524788, 524789, 524790, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524799, 524800, 524801, 524802, 524803, 524804, 524805, 524806, 524807, 524808, 524809, 524810, 524811, 524812, 524813, 524814, 524815, 524816, 524817, 524818, 524819, 524821, 524822, 524823, 524824, 524825, 524826, 524827, 524828, 524829, 524830, 524833, 524842, 524843, 524844, 524845, 524856, 524866, 524867, 524868, 524869, 524870, 524871, 524873, 524879, 524880, 524881, 524882, 524883, 524884, 524885, 524886, 524887, 524888, 524889, 524890, 524891, 524892, 524893, 524894, 524895, 524896, 524897, 524898, 524899, 524900, 524902, 524903, 524905, 524906, 524907, 524908, 524909, 524910, 524911, 524912, 524913, 524914, 524915, 524916, 524921, 524922, 524930, 524931, 524932, 524937, 524940, 524942, 524948, 524980, 524981, 524982, 524983, 524984, 524985, 524986, 524987, 524988, 551919, 551921, 551922, 551924, 551925, 551926, 551933, 551941, 551950, 551951, 551952, 551953, 551955, 551956, 551957, 551958, 551966, 551983, 551984, 551985, 551986, 551987, 551989, 551990, 551992, 551993, 551994, 551995, 551996, 551997, 551998, 551999, 552000, 552005, 552006, 552009, 552012, 552013, 552014, 552015, 552017, 552018, 552019, 552020, 552021, 552022, 552023, 552024, 552025, 552026, 552027, 552028, 552029, 552030, 552031, 552032, 552033, 552034, 552038, 552039, 552041, 552044, 552046, 552047, 552049, 552050, 552051, 552052, 552053, 552054, 552055, 552056, 552057, 552058, 552059, 552060, 552061, 552062, 552063, 552064, 552065, 552068, 552069, 552070, 552071, 552073, 552074, 552075, 552076, 552077, 552078, 552079, 552080, 552081, 552082, 552083, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552089, 552090, 552091, 552092, 552093, 552094, 552095, 552096, 552097, 552098, 552099, 552100, 552101, 552115, 552117, 552123, 552125, 552127, 552128, 552129, 552132, 552133, 552138, 552139, 552140, 552141, 552143, 552144, 552145, 552146, 552147, 552148, 552149, 552150, 552151, 552152, 552158, 552159, 552160, 552163, 552168, 552179, 552187, 552188, 552192, 552193, 552195, 552199, 552200, 552201, 552202, 552203, 552204, 552205, 552206, 552207, 552208, 552210, 552211, 552213, 552214, 552222, 552246, 552247, 552248, 552253, 552254, 552255, 552258, 552294, 552301, 552302, 552306, 552307, 552308, 552309, 552310, 552312, 552314, 552315, 552317, 552318, 552321, 552322, 552323, 552325, 552332, 552337, 552339, 552347, 552348, 552349, 552354, 552355, 552358, 552359, 552360, 552361, 552362, 552363, 552364, 552365, 552366, 552367, 552368, 552369, 552371, 552373, 552374, 552375, 552376, 552377, 552378, 552379, 552403, 552408, 552409, 552411, 552418, 552419, 552420, 552424, 552442, 552464, 552465, 552466, 552467, 552472, 552474, 552475, 552477, 552478, 552521, 552522, 552523, 552527, 552528, 552529, 552530, 552534, 552567, 552578, 552579, 552584, 552586, 552587, 552588, 552590, 552789, 552803, 552804, 552805, 552808, 552816, 552817, 552818, 552819, 552820, 552821, 552822, 552823, 552824, 552828, 552829, 552830, 552833, 552834, 552835, 552842, 552843, 552844, 552846, 552848, 552849, 552850, 552851, 552852, 552853, 552854, 552855, 552856, 552857, 552858, 552859, 552860, 552861, 552863, 552864, 552865, 552872, 552894, 552903, 552904, 552907, 552909, 552910, 552911, 552913, 552914, 552915, 552916, 552917, 552918, 552922, 552923, 552925, 552927, 552928, 552929, 552930, 552931, 552932, 552933, 552934, 552935, 552936, 552937, 552938, 552939, 552940, 552941, 552942, 552943, 552944, 552945, 552946, 552957, 552961, 552966, 552969, 552971, 552972, 552974, 552976, 552979, 552980, 552981, 552983, 552984, 552988, 552989, 552990, 552991, 552995, 552996, 552998, 552999, 553001, 553002, 553003, 553004, 553006, 553008, 553009, 553010, 553011, 553012, 566828, 566829, 566830, 566831, 566832, 577120, 577121, 577122, 577123, 577124, 577125, 577126, 577127, 577128, 577129, 577130, 577131, 577132, 577133, 577134, 577135, 577136 и 582666.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 70% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:12, 17, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 39, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 83, 89, 92, 96, 98, 100, 103, 112, 123, 125, 126, 127, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 166, 167, 168, 174, 176, 177, 178, 179, 181, 186, 187, 188, 190, 198, 201, 207, 209, 210, 211, 212, 213, 224, 225, 226, 227, 232, 234, 240, 321, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 335, 336, 337, 339, 342, 343, 344, 345, 346, 357, 358, 359, 363, 364, 368, 370, 371, 372, 375, 376, 377, 378, 379, 382, 383, 384, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 395, 397, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 409, 410, 412, 413, 417, 418, 420 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 430, 435, 436, 438, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 457, 459, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 473, 474, 475, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 487, 488, 489, 490, 492, 496, 497, 500, 501, 504, 505, 508, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 520, 521, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 539, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 566, 567, 569, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 588, 589, 590, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 605, 606, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 631, 632, 634, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 652, 653, 654, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 665, 666, 667, 669, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 682, 684, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695, 696, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 740, 741, 742, 745, 754, 755, 756, 757, 768, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 784, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807, 808, 809, 810, 811, 812, 814, 815, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 833, 834, 842, 843, 844, 849, 852, 854, 860, 892, 893, 894, 895, 896, 897, 898, 899, 900, 1288, 1289, 1290, 1291, 1292, 1293, 1294, 1295, 1296, 1297, 1298, 1299, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1309, 1310, 1311, 1312, 1313, 1314, 1315, 1316, 1317, 1320, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336, 1337, 1338, 1340, 1341, 1342, 1343, 1344, 1345, 1346, 1347, 1348, 1349 и 1350, 1367, 1368, 1369, 1370, 1372 и 1376.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 80% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 510100, 509931, 510116, 505317, 505319, 505323, 505326, 505327, 505330, 505339, 505346, 505347, 505358, 509934, 146786, 524414, 524415, 524416, 524418, 524419, 524425, 524426, 524431, 524432, 524434, 524446, 524447, 524452, 524459, 524460, 524466, 524469, 524475, 524477, 524478, 524479, 524482, 524485, 524490, 524491, 524492, 524493, 524494, 524495, 524499, 524502, 524503, 524507, 524510, 524511, 524512, 524520, 524525, 524528, 524532, 524533, 524534, 524535, 524536, 524540, 524541, 524547, 524552, 524553, 524556, 524561, 524564, 524565, 524568, 524570, 524571, 524572, 524573, 524578, 524580, 524586, 524590, 524591, 524594, 524595, 524602, 524604, 524606, 524607, 524610, 524611, 524614, 524616, 524617, 524618, 524619, 524620, 524621, 524633, 524634, 524635, 524636, 524637, 524641, 524643, 524644, 524646, 524649, 524650, 524651, 524657, 524662, 524664, 524667, 524670, 524678, 524679, 524680, 524686, 524688, 524690, 524691, 524692, 524695, 524698, 524699, 524701, 524702, 524704, 524705, 524706, 524707, 524708, 524709, 524713, 524715, 524716, 524717, 524718, 524721, 524726, 524727, 524728, 524729, 524730, 524731, 524733, 524734, 524735, 524737, 524739, 524741, 524742, 524743, 524747, 524748, 524749, 524751, 524752, 524754, 524758, 524760, 524762, 524763, 524764, 524767, 524768, 524769, 524771, 524773, 524777, 524778, 524779, 524780, 524781, 524783, 524784, 524788, 524789, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524801, 524803, 524804, 524805, 524806, 524807, 524808, 524809, 524810, 524811, 524813, 524816, 524819, 524822, 524823, 524824, 524827, 524828, 524829, 524833, 524842, 524844, 524880, 524881, 524882, 524884, 524886, 524887, 524888, 524889, 524890, 524891, 524893, 524907, 524908, 524980, 524986, 524987, 551921, 551924, 551925, 551953, 551956, 551957, 551984, 551986, 551987, 551989, 551990, 551993, 551994, 551995, 551996, 551997, 551998, 551999, 552000, 552005, 552006, 552018, 552019, 552020, 552021, 552022, 552023, 552024, 552025, 552026, 552027, 552028, 552029, 552030, 552031, 552032, 552033, 552034, 552039, 552044, 552046, 552050, 552051, 552052, 552053, 552054, 552055, 552056, 552057, 552058, 552059, 552060, 552061, 552062, 552063, 552064, 552065, 552073, 552077, 552078, 552079, 552080, 552082, 552083, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552089, 552090, 552091, 552092, 552093, 552094, 552095, 552096, 552097, 552098, 552138, 552139, 552145, 552146, 552147, 552149, 552192, 552193, 552199, 552200, 552201, 552207, 552246, 552247, 552253, 552301, 552307, 552308, 552310, 552317, 552347, 552348, 552354, 552355, 552360, 552361, 552362, 552363, 552364, 552365, 552366, 552367, 552371, 552375, 552464, 552465, 552521, 552808, 552816, 552817, 552818, 552819, 552820, 552822, 552824, 552834, 552844, 552849, 552850, 552851, 552852, 552853, 552854, 552916, 552922, 552923, 552925, 552930, 552931, 552932, 552933, 552936, 552937, 552938, 552939, 552942, 552943, 552944, 552980, 552988, 552989, 552996, 552998, 553002, 553003, 566828, 566829, 566830, 566831, 566832, 577120, 577121, 577122, 577123, 577124, 577125, 577126, 577127, 577128, 577130, 577131, 577132, 577133, 577134, 577135, 577136 и 582666.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 80% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:17, 20, 22, 24, 26, 28, 39, 40, 50, 51, 83, 89, 103, 123, 126, 127, 136, 137, 143, 147, 149, 168, 176, 177, 178, 179, 187, 188, 210, 211, 212, 224, 225, 226, 227, 232, 325, 326, 327, 329, 330, 336, 337, 342, 343, 345, 357, 358, 363, 370, 371, 376, 379, 387, 388, 389, 392, 395, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 409, 412, 413, 417, 420 421, 422, 430, 435, 438, 442, 443, 444, 445, 446, 450, 451, 457, 462, 463, 466, 474, 475, 478, 480, 481, 482, 483, 488, 490, 496, 500, 501, 504, 505, 512, 514, 516, 517, 520, 521, 524, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 543, 544, 545, 546, 547, 551, 553, 554, 555, 559, 560, 561, 567, 572, 574, 577, 580, 588, 589, 590, 596, 598, 600, 601, 602, 605, 608, 609, 611, 612, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 623, 625, 626, 627, 628, 631, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 643, 644, 645, 646, 648, 650, 652, 653, 654, 658, 659, 660, 662, 663, 665, 669, 671, 673, 674, 675, 678, 679, 680, 682, 684, 688, 689, 690, 691, 692, 694, 695, 699, 700, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 712, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 725, 728, 731, 734, 735, 736, 740, 741, 745, 756, 791, 792, 793, 795, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 804, 805, 806, 807, 819, 820, 892, 898, 899, 1292, 1293, 1295, 1296, 1301, 1302, 1303, 1304, 1305, 1306, 1307, 1308, 1310, 1312, 1316, 1322, 1324, 1325, 1326, 1327, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1338, 1339, 1340, 1341, 1344, 1345, 1349, 1350, 1368, 1372 и 1376.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 90% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 524414, 524415, 524432, 524460, 524466, 524469, 524475, 524477, 524493, 524512, 524535, 524540, 524552, 524561, 524572, 524617, 524619, 524634, 524641, 524644, 524657, 524667, 524691, 524698, 524699, 524701, 524706, 524707, 524709, 524713, 524715, 524716, 524718, 524721, 524726, 524729, 524730, 524731, 524733, 524734, 524735, 524739, 524743, 524754, 524763, 524764, 524767, 524771, 524780, 524781, 524784, 524788, 524789, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524801, 524803, 524804, 524805, 524806, 524807, 524808, 524809, 524810, 524811, 524822, 524827, 524842, 551986, 551987, 551989, 552005, 552018, 552019, 552020, 552021, 552022, 552023, 552025, 552046, 552050, 552051, 552052, 552053, 552054, 552055, 552057, 552082, 552083, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552089, 552092, 552093, 552096, 552097, 552307, 552317, 552355, 552361, 552362, 552363, 552817, 552851, 552922, 552923, 566828, 566829, 566830, 566831, 566832, 577120, 577121, 577122, 577123, 577124, 577125, 577126, 577127, 577128, 577130, 577131, 577132, 577134, 577135, 577136 и 582666.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 90% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:17, 24, 50, 51, 137, 143, 147, 176, 211, 212, 224, 226, 227, 325, 326, 343, 371, 376, 379, 403, 422, 445, 450, 462, 482, 527, 529, 544, 551, 554, 567, 577, 601, 608, 609, 611, 616, 617, 619, 623, 625, 626, 628, 631, 636, 639, 640, 641, 643, 644, 645, 646, 650, 654, 665, 674, 675, 678, 682, 691, 692, 695, 699, 700, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 712, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 735, 801, 804, 805, 807, 1296, 1302, 1303, 1304, 1312, 1325, 1326, 1332, 1334, 1340, 1345, 1349 и 1376.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 95% ингибирование мРНК HBV, ISIS ID: 524619, 524634, 524641, 505339, 524698, 524709, 524718, 524731, 524734, 524789, 524791, 524792, 524793, 524794, 524795, 524796, 524797, 524798, 524801, 524803, 524804, 524805, 524806, 505346, 146785, 524807, 505347, 524808, 524809, 524810, 524811, 146786, 525101, 525102, 525103, 525107, 525108, 525109, 525110, 525111, 525112, 525113, 525114, 525115, 525116, 525117, 525118, 525119, 525120, 552018, 552050, 552019, 552051, 552020, 552052, 551987, 552021, 552053, 552005, 552022, 552054, 551989, 552023, 552055, 552084, 552085, 552086, 552087, 552088, 552361, 552317, 566831, 577123, 577124, 566830, 566828, 566829, 577127, 577135, 577132, 577136, 566832 и 577122.
В некоторых вариантах реализации, следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды направлены на определенную область нуклеиновой кислоты HBV и вызывают по меньшей мере 95% ингибирование мРНК HBV, SEQ ID NO:17, 50, 137, 143, 187, 210, 212, 224, 529, 544, 551, 608, 619, 628, 641, 645, 700, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 712, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 1014, 1015, 1016, 1020, 1021, 1022, 1023, 1024, 1025, 1026, 1027, 1028, 1029, 1030, 1031, 1032, 1033, 1236, 1302, 1312, 1334, 1340, 1345, 1349.
В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающие введение животному, нуждающемуся в этом, соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 и 1379.
В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающие введение животному, нуждающемуся в этом, соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:17, 51, 86, 93, 95, 98, 100, 102, 104, 106, 109, 112, 115, 117, 137, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 167, 168, 176, 177-179, 181, 188, 190-192, 194, 199, 201, 208, 209, 211, 226, 230-237, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 271, 1318-1347, 1364-1372, 1375, 1376 и 1379, при чем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонукеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар и/или затрудненный этиловый (cEt) сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272, 1288-1350, 1364-1372, 1375, 1376 и 1379.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:17, 51, 86, 93, 95, 98, 100, 102, 104, 106, 109, 112, 115, 117, 137, 140, 143, 145, 147, 149,151, 153, 155, 157, 159, 161, 167, 168, 176, 177-179, 181, 188, 190-192, 194, 199, 201, 208, 209, 211, 226, 230-237, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 271, 1318-1347, 1364-1372, 1375 и 1376, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар и/или затрудненный этиловый (cEt) сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлен способ предотвращения, улучшения или лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:17, 51, 86, 93, 95, 98, 100, 102, 104, 106, 109, 112, 115, 117, 137, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 167, 168, 176, 177-179,181, 188, 190-192, 194, 199, 201, 208, 209, 211, 226, 230-237, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 271, 1318-1347, 1364-1372, 1375 и 1376, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар и/или затрудненный этиловый (cEt) сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающие введение животному, нуждающемуся в этом, соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5, 15, 16, 33, 39-95, 123-135, 163-175, 180-310, 321-406, 413-455, 461-802 или 804-1272.
В некоторых вариантах реализации представлены способы лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающие введение животному, нуждающемуся в этом, соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:6-14, 17-32, 34-38, 96-122, 136-162, 176-179, 407-412, 456-462, 523-538, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 14 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-3 или 2 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3-4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 18 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 3-5 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272 или 1288-1350.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5, 15, 16, 33, 39-95, 123-135, 163-175, 180-310, 321-406, 413-455, 461-802 или 804-1272.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:6-14, 17-32, 34-38, 96-122, 136-162, 176-179, 407-412, 456-462, 523-538, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар.
В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 14 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-3 или 2 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3-4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 18 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 3-5 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлен способ предотвращения, улучшения или лечения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 10-30 связанных нуклеозидов, направленный на HBV и имеющий последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5-310, 321-802, 804-1272 или 1288-1350, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:5-310, 321-802 или 804-1272. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, включающую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ Ю NO: 5, 15, 16, 33, 39-95, 123-135, 163-175, 180-310, 321-406, 413-455, 461-802 или 804-1272. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:6-14, 17-32, 34-38, 96-122, 136-162, 176-179, 407-412, 456-462, 523-538, причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 14 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-3 или 2 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 9 или 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3-4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 18 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 3-5 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
Примеры HBV-связанных заболеваний, расстройств или состояний включают, но не ограничиваясь этим, хроническую инфекцию HBV, желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV и состояния, имеющие симптомы, которые могут включать любой или все из следующих: болезнь, похожую на грипп, слабость, боли, головную боль, жар, потерю аппетита, диарею, тошноту и рвоту, боль в области печени, стул земляного или серого цвета, зуд по всему телу и мочу темного цвета, в сочетании с положительным тестом на присутствие вируса гепатита В, вирусного антигена гепатита В или положительным тестом на присутствие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита В.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения экспрессии мРНК HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации снижение экспрессии мРНК HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние. В некоторых вариантах реализации снижение экспрессии мРНК HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит заболевание печени. В некоторых вариантах реализации экспрессия мРНК HBV снижается по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения уровня белка HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации снижение уровня белка HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние. В некоторых вариантах реализации снижение уровня белка HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит заболевание печени. В некоторых вариантах реализации уровень белка HBV снижается по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения уровня ДНК HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации снижение уровня ДНК HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние. В некоторых вариантах реализации млекопитающим может быть человек, а вирусом гепатита В может быть вирус гепатита В человека. Более конкретно, вирус гепатита В человека может быть любым из человеческих географических генотипов: А (Северо-Западная Европа, Северная Америка, Центральная Америка); В (Индонезия, Китай, Вьетнам); С (Восточная Азия, Корея, Китай, Япония, Полинезия, Вьетнам); D (Средиземноморский регион, Ближний восток, Индия); Е (Африка); F (коренные американцы, Полинезия); G (Соединенные Штаты, Франция); или Н (Центральная Америка). В некоторых вариантах реализации снижение уровня ДНК HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит заболевание печени. В некоторых вариантах реализации уровень ДНК HBV снижается по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения уровня антигена HBV у животного, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой HBsAG или HBeAG. В некоторых вариантах реализации снижение уровня антигена HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние. В некоторых вариантах реализации снижение уровня антигена HBV у животного предупреждает, улучшает или лечит заболевание печени. В некоторых вариантах реализации уровень антигена HBV снижается по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения уровня ДНК HBV и антигена HBV у животного, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение этому животному соединения или композиции, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой HBsAG или HBeAG. В некоторых вариантах реализации количество антигена HBV может быть снижено достаточно для сероконверсии, которую определяют как отсутствие HBeAg в сыворотке плюс присутствие HBeAb в сыворотке, в случае мониторинга HBeAg как определителя сероконверсии, или которую определяют как отсутствие HBsAg в сыворотке, в случае мониторинга HBsAg как определителя сероконверсии, по результатам определения доступных в настоящее время пределов обнаружения коммерческих систем иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA).
В некоторых вариантах реализации представлен способ лечения животного с HBV-связанным заболеванием, расстройством или состоянием, включающий: а) идентификацию указанного животного с HBV-связанным заболеванием, расстройством или состоянием, и b) введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований по меньшей мере на 90% комплементарную любой из последовательностей SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363, по результатам измерения целостности указанного модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество соединения или композиции, введенной животному, лечит или уменьшает HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние, или его симптом, у животного. В некоторых вариантах реализации HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние представляет собой заболевание печени. В некоторых вариантах реализации, связанное заболевание, расстройство или состояние представляет собой хроническую инфекцию HBV, желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV или заболевание печени, связанное с трансплантацией.
В некоторых вариантах реализации представлен способ лечения животного с HBV-связанным заболеванием, расстройством или состоянием, включающий: а) идентификацию указанного животного с HBV-связанным заболеванием, расстройством или состоянием, и b) введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеооснований по меньшей мере на 90% комплементарную последовательности SEQ Ю NO:1, по результатам измерения целостности указанного модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации терапевтически эффективное количество соединения или композиции, введенной животному, лечит или уменьшает HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние, или его симптом, у животного. В некоторых вариантах реализации HBV-связанное заболевание, расстройство или состояние представляет собой заболевание печени. В некоторых вариантах реализации, связанное заболевание, расстройство или состояние представляет собой хроническую инфекцию HBV, желтуху, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночную недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гемофагоцитарный синдром, серозный гепатит, виремию HBV или заболевание печени, связанное с трансплантацией.
В некоторых вариантах реализации HBV имеет последовательность, представленную далее под номером доступа GenBank U95551.1 (включена в настоящий документ как SEQ ID NO:1) или любой ее вариант или фрагмент. В некоторых вариантах реализации HBV имеет усеченные части человеческой последовательности, как представлено далее в SEQ ID NO:1273, 1274, 1275, 1276, 1277, 1278, 1279, 1280, 1281, 1282, 1283, 1284, 1285, 1287, 1352, 1353, 1354, 1359, 1360, 1361, 1362 и 1363.
В некоторых вариантах реализации животное представляет собой человека.
В некоторых вариантах реализации соединения или композиции разработаны в качестве первого средства. В некоторых вариантах реализации способы включают введение первого средства и одного или нескольких вторых средств. В некоторых вариантах реализации способы включают введение первого средства и одного или нескольких вторых средств. В некоторых вариантах реализации первое средство и одно или несколько вторых средство вводят совместно. В некоторых вариантах реализации первое средство и одно или несколько вторых средств вводят совместно последовательно или параллельно.
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых средств также представляют собой соединение или композицию, описанную в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых средств являются отличными от соединения или композиции, описанной в настоящем документе. Примеры одного или нескольких вторых средств включают, но не ограничиваясь этим, противовоспалительное средство, химиотерапевтическое средство или противоинфекционное средство.
В других родственных вариантах реализации, дополнительное терапевтическое средство может быть агентом HBV, агентом HCV, химиотерапевтическим средством, антибиотиком, анальгетиком, нестероидным противовоспалительным средством (NSAID), противогрибковым средством, антипаразитарным средством, средством против тошноты, средством против диареи или иммуноподавляющим средством.
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых агентов представляют собой агент HBV. В некоторых вариантах реализации агент HBV может включать, но не ограничиваясь этим, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2а и интерферон альфакон-1 (пегилированный и не пегилированный), рибавирин; ингибитор репликации РНК HBV; второй антисмысловый олигомер; терапевтическую вакцину HBV; профилактическую вакцину HBV; ламивудин (3ТС); энтекавир (ETV); тенофовир диизопроксил-фумарат (TDF); телбивудин (LdT); адефовир; или любую терапию HBV антителами (моноклональными или поликлональными).
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых агентов представляют собой агент HCV. В некоторых вариантах реализации агент HBV может включать, но не ограничиваясь этим, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-2а и интерферон альфакон-1 (пегилированный и не пегилированный); рибавирин; ингибитор репликации РНК HCV (например, серии VP50406 производства ViroPharma); антисмысловый агент HCV; терапевтическую вакцину HCV; ингибитор протеазы HCV; ингибитор геликазы HCV; или терапию HCV моноклональными или поликлональными антителами.
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых средств представляют собой противовоспалительное средство (то есть терапию, снижающую воспаление). В некоторых вариантах реализации терапия, снижающая воспаление, может включать, но не ограничиваясь этим, терапевтическое изменение образа жизни, стероид, NSAID или DMARD. Стероид может быть кортикостероидом. NSAID может быть аспирином, ацетаминофеном, ибупрофеном, напроксеном, ингибиторами СОХ, индометацином и тому подобными. DMARD может быть ингибитором TNF, ингибитором синтеза пурина, ингибитором кальциневрина, ингибитором синтеза пиримидина, сульфасалазином, метотрексатом и тому подобными.
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых средств представляют собой химиотерапевтическое средство (то есть средство лечения рака). Химиотерапевтические средства могут включать, но не ограничиваясь этим, даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозин арабинозид, бис-хлорэтилнитрозомочевину, бусульфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевину, азотные иприты, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин (СА), 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксициклофосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид, триметрексат, тенипозид, цисплатин, гемцитабин и диэтилстильбэстрол (DES).
В некоторых вариантах реализации одно или несколько вторых агентов представляют собой противоинфекционное средство. Примеры противомикробных средств включают, но не ограничиваясь этим, антибиотики, противогрибковые лекарства и противовирусные лекарства.
В некоторых вариантах реализации, введение включает парентеральное введение.
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения. В некоторых вариантах реализации млекопитающим может быть человек, а вирусом гепатита В может быть вирус гепатита В человека. Более конкретно, вирус гепатита В человека может быть любым из человеческих географических генотипов: А (Северо-Западная Европа, Северная Америка, Центральная Америка); В (Индонезия, Китай, Вьетнам); С (Восточная Азия, Корея, Китай, Япония, Полинезия, Вьетнам); D (Средиземноморский регион, Ближний восток, Индия); Е (Африка); F (коренные американцы, Полинезия); G (Соединенные Штаты, Франция); или Н (Центральная Америка).
В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 70% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 75% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 80% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 85% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 90% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации представлен способ снижения количества мРНК, ДНК, белка HBV и/или антигена HBV у млекопитающего, инфицированного вирусом гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, нуждающемуся в этом, для снижения инфекции вируса гепатита В и антигена гепатита В, по сравнению с количеством мРНК, белка HBV и количеством антигена HBV у млекопитающего до лечения, причем количество мРНК снижается по меньшей мере на 95% по сравнению с количеством до введения модифицированного анисмыслового олигонуклеотида. В родственных способах антигеном HBV может быть HBsAg или может быть HBeAg, и более конкретно, количество антигена HBV может быть существенно снижено для сероконверсии, которую определяют как отсутствие HBeAg в сыворотке плюс присутствие HBeAb в сыворотке, в случае мониторинга HBeAg как определителя сероконверсии, или которую определяют как отсутствие HBsAg в сыворотке, в случае мониторинга HBsAg как определителя сероконверсии, по результатам определения доступных в настоящее время пределов обнаружения коммерческих систем иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA).
В некоторых вариантах реализации представлен способ ускорения сероконверсии вируса гепатита В у млекопитающего, инфицированного HBV, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше, млекопитающему, инфицированному гепатитом В; мониторинг присутствия HBeAg плюс HBeAb в образце сыворотки млекопитающего, или мониторинг присутствия HBsAg в образце сыворотки млекопитающего, как отсутствие HBeAg в сыворотке плюс присутствие HBeAb в образце сыворотки, в случае мониторинга HBeAg как определителя сероконверсии, или отсутствие HBsAg в образце сыворотки, в случае мониторинга HBsAg как определителя сероконверсии, по результатам определения доступных в настоящее время пределов обнаружения коммерческих систем иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA), представляет собой показатель сероконверсии у млекопитающего.
В некоторых вариантах реализации представлено применение соединения или композиции, описанной в настоящем документе, для предупреждения, улучшения или лечения заболевания печени или его симптома у млекопитающего. В некоторых вариантах реализации, соединение или композиция содержит модифицированный олигонуклеотид длиной от 10 до 30 связанных нуклеозидов, нацеленный на HBV. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, включающую по меньшей мере 10 смежных нуклеооснований любой из последовательностей нуклеооснований SEQ ID NO:17, 51, 86, 93, 95, 98, 100, 102, 104, 106, 109, 112, 115, 117, 137, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153,155, 157, 159, 161, 167, 168, 176, 177-179, 181, 188, 190-192, 194, 199, 201, 208, 209, 211, 226, 230-237, 244, 245, 247, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 271, 1318-1347, 1364- 1372, 1375, 1376 и 1379.
50
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются эффективными на основании того, что они имеют значение in vitro IC менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 65 нМ, менее 60 нМ, менее 55 нМ, менее 50 нМ, менее 49 нМ, менее 47 нМ, менее 46 нМ, при доставке в клетки HepG2.2.1. В некоторых вариантах реализации, ингибирование измеряют при помощи набора затравочных зондов RTS3370, описанного в настоящем документе.
50
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются эффективными на основании того, что они имеют значение in vitro IC менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 60 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 35 нМ, менее 34 нМ, менее 33 нМ, менее 32 нМ, менее 31 нМ, при доставке в клетки HepG2.2.1. В некоторых вариантах реализации, ингибирование измеряют при помощи набора затравочных зондов RTS3371, описанного в настоящем документе.
50
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются эффективными на основании того, что они имеют значение in vitro IC менее 20 мкМ, менее 10 мкМ, менее 9, 5 мкМ, менее 9,0 мкМ, менее 8, 5 мкМ, менее 8,0 мкМ, менее 7, 5 мкМ, менее 7,0 мкМ, менее 6, 5 мкМ, менее 6,0 мкМ, менее 5, 5 мкМ, менее 5,0 мкМ, менее 4, 5 мкМ, менее 4,0 мкМ, менее 3, 5 мкМ мегее 3,0 мкМ, менее 2, 5 мкМ, при доставке в клетки HepG2.2.1, как описано в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются высоко переносимыми, что демонстрируется тем, что они увеличивают по меньшей мере одно из значений ALT или AST не более чем в 4 раза, 3 раза или 2 раза по сравнению с животными, обработанными солевым раствором, или увеличивают вес печени, селезенки или почек не более чем на 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% или 2%. В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются высоко переносимыми, что демонстрируется тем, что они не увеличивают ALT или AST по сравнению с животными, обработанными солевым раствором. В некоторых вариантах реализации, соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются высоко переносимыми, что демонстрируется тем, что они не увеличивают вес печени, селезенки или почек по сравнению с животными, обработанными солевым раствором. В некоторых вариантах реализации, эти соединения или композиции содержат ISIS 146779, ISIS 146786, ISIS 505317, ISIS 505329, ISIS 505332, ISIS 505346, ISIS 505347, ISIS 505358, ISIS 509926, ISIS 509927, ISIS 509932, ISIS 509934, ISIS 509960, ISIS 509974, ISIS 510038, ISIS 510039, ISIS 510040, ISIS 510041, ISIS 510050 ISIS 509975, ISIS 510100, ISIS 510106 и ISIS 510116. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или композиции содержат соединения, содержащие последовательность нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:5-310, 321-802 или 804-1272. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или композиции содержат соединения, содержащие последовательность нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:5, 15, 16, 33, 39-95, 123-135, 163-175, 180-310, 321-406, 413-455, 461-802 или 804-1272. В некоторых вариантах реализации, такие соединения или композици содержат последовательность нуклеооснований любой из последовательностей SEQ ID NO:6-14, 17-32, 34-38, 96-122, 136-162, 176-179, 407-412, 456-462, 523-538 (обновленные SEQ ID NO), причем по меньшей мере один нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один 2'-O-метоксиэтиловый сахар. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 14 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-3 или 2 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 16 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 17 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 2-4 или 3-4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 18 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5, 3-5 или 4 нуклеозида с модифицированным сахаром. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет 20 нуклеозидов в длину и имеет сегмент гэп из 10 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, модифицированный олигонуклеотид имеет сегмент крыла на конце 5' и конце 3' сегмента гэп, каждый независимо имеет 1-5 или 5 нуклеозидов с модифицированным сахаром.
В некоторых вариантах реализации представлено применение соединения или композиции, описанной в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для лечения, улучшения, отсрочки или предупреждения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния у животного.
В некоторых вариантах реализации представлено применение соединения или композиции, описанной в настоящем документе, в производстве лекарственного средства для лечения, улучшения, отсрочки или предупреждения заболевания печени у животного.
В некоторых вариантах реализации представлен набор для лечения, предупреждения или улучшения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния, или его симптома, как описано в настоящем документе, причем указанный набор включает: а) соединение или композиции, описанные в настоящем документе; и необязательно b) дополнительное средство или терапию, описанную в настоящем документе. Набор может дополнительно включать инструкции или этикетку по применнию набора для лечения, предупреждения или улучшения HBV-связанного заболевания, расстройства или состояния.
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, но не ограничиваясь этим, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, олигонуклеотидные аналоги, олигонуклеотид-миметики, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть «антисмысловым» для целевой нуклеиновой кислоты, что означает, что оно способно подвергаться гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой посредством водородного связывания.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение имеет последовательность нуклеооснований, которая, при прочтении в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент целевого сегмента целевой нуклеиновой кислоты, на который он направлен. В некоторых таких вариантах реализации, антисмысловый олигонуклеотид имеет последовательность нуклеооснований, которая, при прочтении в направлении от 5' к 3', содержит обратный комплемент целевого сегмента целевой нуклеиновой кислоты, на который он направлен.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 10-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 12-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 12-22 субъединицы. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 14-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 14-20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 15-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 15-20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 16-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 16-20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 17-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 17-20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 18-30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 18-21 субъединицы. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 18-20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 20-30 субъединиц. Другими словами, такие антисмысловые соединения имеют от 12 до 30 связанных субъединиц, от 14 до 30 связанных субъединиц, от 14 до 20 связанных субъединиц, от 15 до 30 связанных субъединиц, от 15 до 20 связанных субъединиц, от 16 до 30 связанных субъединиц, от 16 до 20 связанных субъединиц, от 17 до 30 связанных субъединиц, от 17 до 20 связанных субъединиц, от 18 до 30 связанных субъединиц, от 18 до 20 связанных субъединиц, от 18 до 21 связанных субъединиц, от 20 до 30 связанных субъединиц или от 12 до 22 связанных субъединиц, соответственно. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 14 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 16 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 17 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 18 субъединиц. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет длину 20 субъединиц. В других вариантах реализации, антисмысловое соединение имеет 8-80, 12-50, 13-30, 13-50, 14-30, 14-50, 15-30, 15-50, 16-30, 16-50, 17-30, 17-50, 18-22, 18-24, 18-30, 18-50, 19-22, 19-30, 19-50 или 20-30 связанных субъединиц. В некоторых таких вариантах реализации, антисмысловые соединения имеют длину 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц, или диапазон, определяемый любыми двумя из представленных выше значений. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид, а связанные субъединицы являются нуклеотидами.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на нуклеиновую кислоту HBV, могут быть укорочены или усечены. Например, одна субъединица может быть удалена с конца 5' (усечение 5'), или, альтернативно, с конца 3' (усечение 3'). Укороченное или усеченное антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, может иметь две субъединицы, удаленные с конца 5', или, альтернативно, может иметь две субъединицы, удаленные с конца 3' антисмыслового соединения. Альтернативно, удаленные нуклеозиды могут быть рассредоточены в антисмысловом соединении, например, в антисмысловом соединении, имеющем один нуклеозид, удаленный с конца 5', и один нуклеозид, удаленный с конца 3'.
При наличии одной дополнительной субъединицы в удлиненном антисмысловом соединении, эта дополнительная субъединица может быть расположена на конце 5' или 3' антисмыслового соединения. При наличии двух или более дополнительных субъединиц, добавленные субъединицы могут быть соседними относительно друг друга, например, в антисмысловом соединении, имеющем две субъединицы, добавленные в конце 5' (присоединение 5'), или, альтернативно, в конце 3' (присоединение 3') антисмыслового соединения. Альтернативно,добавленные субъединицы могут быть рассредоточены в антисмысловом соединении, например, в антисмысловом соединении, имеющем одну субъединицу, присоединенную к концу 5', и одну субъединицу, присоединенную к концу 3'.
Можно увеличивать или уменьшать длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловый олигонуклеотид, и/или внедрять несовпадающие основания без аннулирования активности. Например, в публикации Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), были испытаны серии антисмысловых олигонуклеотидов из 13-25 нуклеооснований на их способность вызывать расщепление целевой РНК в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеооснований с 8 или 11 не совпадающими основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфическое расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие несовпадений. Точно так же, целевое специфическое расщепление было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов из 13 нуклеооснований, включая олигонуклеотиды с 1 или 3 несовпадениями.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, имеющего 100% комплементарность с мРНК bcl-2 и имеющего 3 несовпадения с мРНК bcl-xL, снижать экспрессию bcl-2 и bcl-xL in vitro и in vivo. Более того, этот олигонуклеотид показал потенциальную противоопухолевую активность т vivo.
Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) исследовали серию последовательных антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеооснований, а также антисмысловые олигонуклеотиды из 28 и 42 нуклеооснований, включающих последовательность из двух или трех последовательных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность блокировать трансляцию DHFR человека в анализе ретикулоцитов кроликов. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеооснований по отдельности был способен ингибировать трансляцию, хотя и на более слабом уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды из 28 или 42 нуклеооснований.
Мотивы антисмысловых соединений
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту HBV, содержали химически модифицированные субъединицы, расположенные в таких последовательностях, или мотивах, чтобы придавать антисмысловым соединениям такие свойства, как усиленная ингибирующая активность, повышенная связывающая аффиность к целевой нуклеиновой кислоте или устойчивость к разрушению под действием нуклеаз in vivo.
Химерные антисмысловые соединения обычно содержат по меньшей мере одну область, модифицированную так, чтобы придавать повышенную устойчивость к нуклеазному расщеплению, повышенное клеточное поглощение, повышенную связывающую аффинность к целевой нуклеиновой кислоте и/или повышенную ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения может необязательно служить в качестве субстрата для клеточной эндонкулеазы РНазы Н, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК: ДНК.
3
Антисмысловые соединения, имеющие мотив химерного олигонуклеотида, считают химерными антисмысловыми соединениями. В химерном олигонуклеотиде, внутренняя область, содержащая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНазы Н, расположена между внешними областями, содержащими множество нуклеотидов, которые являются химически отличными от нуклеозидов внутренней области. В случае если антисмысловый олигонуклеотид имеет мотив химерного олигонуклеотида, то сегмент гэп обычно служит в качестве субстрата для эндонуклеазного расщепления, тогда как сегменты крыльев включают модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации, области химерного олигонуклеотида дифференцируются по типу сахарных фрагментов, составляющих кажду отдельную область. Типы сахарных фрагментов, которые используют для дифференциации областей химерного олигонуклеотида, могут, в некоторых вариантах реализации, включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать 2'-МОЕ и 2'-O-СН, среди прочих) и модифицированные нуклеозиды с бициклическим сахаром (такие модифицированные нуклеозиды с бициклическим сахаром могут включать нуклеозиды, содержащие затрудненный этил). В некоторых вариантах реализации, нуклеозиды в крыльях могут включать несколько модифицированных сахарных фрагментов, включая, например, 2'-МОЕ и бициклические сахарные фрагменты, такие как затрудненный этил или БНК. В некоторых вариантах реализации, крылья могут включать несколько модифицированных и не модифицированных сахарных фрагментов. В некоторых вариантах реализации, крылья могут включать различные комбинации нуклеозидов 2'-МОЕ, бициклических сахарных фрагментов, таких как затрудненные этилнуклеозиды или БНК-нуклеозиды, и 2'-дезоксинуклеозидов.
Каждая отдельная область может включать одинаковые сахарные фрагменты, вариантные или измененные сахарные фрагменты. Мотив крыло-гэп-крыло зачастую описывают как «X-Y-Z», где «X» представляет собой длину 5'-крыла, «Y» представляет собой длину гэп, и «Z» представляет собой длину 3'-крыла. «X» и «Z» могут содержать одинаковые, вариантные или измененные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации, «X» и «Y» могут включать один или несколько 2'-дезоксинуклеозидов. «Y» может включать 2'-дезоксинуклеозиды. При использовании в настоящем документе, химерный олигонуклеотид, описанный как «X-Y-Z», имеет такую конфигурацию, что гэп расположен сразу возле каждого из 5'-крыла и 3'-крыла. Следовательно, между 5'-крылом и гэп, или между гэп и 3'-крылом нет промежуточных нуклеотидов. Любые антисмысловые соединения, описанные в настоящем документе, могут иметь мотив химерного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации, «X» и «Z» являются одинаковыми; в других вариантах реализации они различные. В некоторых вариантах реализации, «Y» содержит от 8 до 15 нуклеозидов. X, Y или Z могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 11-меры, имеющие мотив 1-9-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 12-меры, имеющие мотив 1-9-2, 2-9-1 или 1-10-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 13-меры, имеющие мотив 1-9-3, 2-9-2, 3-9-1, 1-10-2 или 2-10-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 14-меры, имеющие мотив 1-9-4, 2-9-3, 3-9-2, 4-9-1, 1-10-3, 2-10-2 или 3-10-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 15-меры, имеющие мотив 1-9-5, 2-9-4, 3-9-3, 4-9-2, 5-9-1, 1-10-4, 2-10-3, 3-10-2 или 4-10-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 16-меры, имеющие мотив 4-8-4, 2-9-5, 3-9-4, 4-9-3, 5-9-2, 1-10-5, 2-10-4, 3-10-3, 4-10-2, 3-8-5 или 5-10-1.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 17-меры, имеющие мотив 3-9-5, 3-10-4, 4-9-4, 5-9-3, 2-10-5, 3-10-4, 4-10-3, 5-10-2, 2-9-6, 5-8-4, 5-7-5, 6-7-4 или 6-9-2.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 18-меры, имеющие мотив 4-9-5, 5-9-4, 3-10-5, 4-10-4 или 5-10-3.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 19-меры, имеющие мотив 5-9-5, 4-10-5 или 5-10-4.
В некоторых вариантах реализации, химерные олигонуклеотиды, представленные в настоящем документе, содержат, например, 20-меры, имеющие мотив 5-10-5, 2-10-8, 8-10-2, 3-10-7, 7-10-3, 4-10-6 или 6-10-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение содержит мотив «олигомера крыла», имеющий конфигурацию крыло-гэп или гэп-крыло, то есть конфигурацию X-Y или Y-Z, как описано выше для конфигурации химерного олигонуклеотида. Следовательно, конфигурации олигомера крыла, представленные в настоящем документе, включают, но не ограничиваясь этим, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 или 6-8.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 2-10-2.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 3-10-3.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 4-10-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 5-10-5.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 3-10-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 2-10-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 2-10-8.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 8-10-2.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 3-10-7.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 7-10-3.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 4-10-6.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 6-10-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 2-9-6.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 6-9-2.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 4-9-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 5-9-3.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 3-9-5.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 5-9-2.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 2-9-5.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 4-9-3.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида 3-9-4.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет гэп-расширенный мотив.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, имеет мотив химерного олигонуклеотида, в котором гэп состоит из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту HBV, содержат любой из следующих сахарных мотивов:
k-d(10)-k
e-d(10)-k
k-d(10)-e
k-k-d(10)-k-k
k-k-d(10)-e-e
e-e-d(10)-k-k
k-k-k-d(10)-k-k-k
e-e-e-d(10)-k-k-k
k-k-k-d(10)-e-e-e
k-k-k-d(10)-k-k-k
e-k-k-d(10)-k-k-e
e-e-k-d(10)-k-k-e
e-d-k-d(10)-k-k-e
e-k-d(10)-k-e-k-e
k-d(10)-k-e-k-e-e
e-e-k-d(10)-k-e-k-e
e-d-d-k-d(9)-k-k-e
e-e-e-e-d(9)-k-k-e
e-e-e-e-e-d(10)-e-e-e-e-e
k-d-k-d-k-d(9)-e-e
e-e-k-k-d(9)-e-k-e-e
k-d-k-d-k-d(10)-e-e-e-e-e
k-e-k-d(10)-k-e-k
e-e-e-k-k-d(8)-e-e-e-e
e-e-e-k-k-d(7)-k-k-e-e-e
e-e-e-k-d(9)-k-e-e-e
e-e-e-k-k-d(7)-k-k-e-e-e
e-e-e-e-k-k-d(7)-e-e-e-e
e-k-e-k-d(9)-e-e-e-e
e-k-e-k-d-k-d(7)-e-e-e-e
e-e-e-k-k-d(7)-k-k-e-e-e
k-d-k-d-k-d(8)-e-e-e-e-e
причем k представляет собой затруденный этилнуклеозид, е представляет собой 2'-МОЕ замещенный нуклеозид, и d представляет собой 2'-дезоксинуклеозид.
m
n
p
r
t
g
v
w
x
y
z
В некоторых вариантах реализации, антисмысловый олигонуклеотид имеет сахарный мотив, описанный Формулой А, представленной ниже: (J)-(B)-(J)-(B)-(A)-(D)-(A)-(B)-(J)-(B)-(J)
причем:
каждый А независимо представляет собой 2'-замещенный нуклеозид;
каждый В независимо представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый J независимо представляет собой 2'-замещенный нуклеозид или 2'-дезоксинуклеозид;
каждый D представляет собой 2'-дезоксинуклеозид;
m равен O-4; n равен O-2; р равен O-2; r равен O-2; t равен O-2; v равен O-2; w равен O-4; х равен O-2; y равен O-2; z равен O-4; g равен 6-14;
при условии, что:
по меньшей мере, один из m, n и r является отличным от 0;
по меньшей мере, один из w и y является отличным от 0;
сумма m, n, р, r и t составляет от 2 до 5; и сумма v, w, х, y и z составляет от 2 до 5.
Целевые нуклеиновые кислоты, целевые области и нуклеотидные последовательности
Нуклеотидная последовательность, кодирующая HBV, включает, без ограничения, следующую: номер доступа GENBANK U95551.1 (в настоящий документ включена как SEQ ID NO:1).
Следует понимать, что последовательность, представленная далее в каждом SEQ ID NO в Примерах, содержащихся в настоящем документе, является не зависимой от любых модификаций сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеооснования. Поэтому антисмысловые соединения, определенные номером SEQ ID NO, могут включать, независимо, одну или несколько модификаций сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеооснования. Антисмысловые соединения, описанные этим номером Isis (Isis №), указывают комбинацию последовательности нуклеооснования и мотива.
В некоторых вариантах реализации, целевая область является структурно определенной областью целевой нуклеиновой кислоты. Например, целевая область может охватывать 3' не транслируемую область (UTR), 5' не транслируемую область, экзон, интрон, экзон-интронное сочленение, кодирующую область, область инициации трансляции, область обрыва трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для HBV могут быть получены по номеру доступа из базы данных последовательностей, такой как NCBI, и такая информация включена в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах реализации, целевая область может охватывать последовательность от 5' целевого сайта любого целевого сегмента в пределах целевой области от 3' целевого сайта другого целевого сегмента в пределах той же целевой области.
Таргетинг включает определение по меньшей мере одного целевого сегмента, с которым гибридизуется антисмысловое соединение с возникновением заданного эффекта. В некоторых вариантах реализации заданный эффект представляет собой снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты мРНК. В некоторых вариантах реализации, заданный эффект представляет собой снижение уровней белка, кодирующего целевую нуклеиновую кислоту или фенотипическое изменение, связанное с целевой нуклеиновой кислотой.
Целевая область може содержать один или несколько целевых сегментов. Несколько целевых сегментов в пределах целевой области могут перекрываться. Альтернативно, они могут не перекрываться. В некоторых вариантах реализации, целевые сегменты в пределах целевой области разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах реализации, целевые сегменты в пределах целевой области разделены количеством нуклеотидов, которое составляет, или примерно равно, или не превышает, или примерно не превышает 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, или находится в диапазоне, определенном любыми из двух предшествующих значений. В некоторых вариантах реализации, целевые сегменты в пределах целевой области разделены не более чем или примерно не более чем 5 нуклеотидами целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации, целевые сегменты являются смежными. Подразумевается целевые области, определенные диапазоном, имеющим исходную нуклеиновую кислоту, то есть любой из 5' целевых сайтов или 3' целевых сайтов, перечисленных в настоящем документе.
Соответствующие целевые сегменты могут находиться в 5' не транслируемой области, кодирующей области, 3' не транслируемой области, интроне, экзоне или экзон-интронном сочленении. Целевые сегменты, содержащие инициирующий кодон или стоп-кодон, также являются пригодными целевыми сегментами. Соответствующий целевой сегмент может специально исключать некоторую структурно определенную область, такую как инициирующий кодон или стоп-кодон.
Определение соответствующих целевых сегментов может включать сравнение последовательности целевой нуклеиновой кислоты с другими последовательностями генома. Например, для определения областей сходства среди различных нуклеиновых кислот может быть использован алгоритм BLAST. Это сравнение может предотвращать выбор последовательностей антисмысловых соединений, которые могут гибридизоваться неспецифическим образом с последовательностями, отличными от выбранной целевой нуклеиновой кислоты (то есть нецелевыми последовательностями).
В пределах активной целевой области может наблюдаться изменение активности (например, по результатам определения процентного снижения уровней целевой нуклеиновой кислоты) антисмысловых соединений. В некоторых вариантах реализации, снижение уровней мРНК HBV является показателем ингибирования экспрессии HBV. Снижение уровней белка HBV также является показателем ингибирования экспрессии целевой мРНК. Кроме того, показателем ингибирования экспрессии HBV являются фенотипические изменения. В некоторых вариантах реализации, показателем ингибирования экспрессии HBV может быть уменьшение усталости, уменьшение симптомов, похожих на грипп, улучшение аппетита, снижение тошноты, уменьшение боли в суставах, уменьшение желтухи, уменьшение боли в животе, снижение слабости, снижение потери веса, уменьшение роста молочной железы у мужчин, уменьшение сыпи на пальцах, уменьшение проблем свертываемости крови, уменьшение цирроза, уменьшение пауковидных кровеносных сосудов на коже, повышение абсорбции витаминов А и D, снижение роста опухоли, снижение объема опухоли, уменьшение головной боли, уменьшение жара, уменьшение диареии, уменьшение боли в области печени организма, уменьшение стула земляного или серого цвета, уменьшение зуда, уменьшение мочи темного цвета и уменьшение тошноты и рвоты. В некоторых вариантах реализации, показателем ингибирования экспрессии HBV может быть улучшение симптомов, обусловленных HBV-связанными состояниями, заболеваниями и расстройствами. В некоторых вариантах реализации, показателем ингибирования экспрессии HBV является уменьшение цирроза. В некоторых вариантах реализации, показателем ингибирования экспрессии HBV является уменьшение маркеров рака печени.
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации, гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в настоящем документе, и нуклеиновой кислотой HBV. Наиболее общий механизм гибридизации включает водородное связывание (например, Уотсона-Крика, Хугстина или обратное водородное связывание Хугстина) между комплементарными нуклеооснованиями молекул нуклеиновых кислот.
Гибридизация может происходить при различных условиях. Обязательным условием является зависимость от последовательностей, и она определяется природой и составом молекул нуклеиновых кислот, подлежащих гибридизации.
Способы определения того, может ли определенная последовательность специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, могут специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой HBV.
Комплементарностъ
Антисмысловое соединение и целевая нуклеиновая кислоты комплементарны друг другу, если достаточное количество нуклеооснований антисмыслового соединения может быть связано водородной связью с соответствующими нуклеооснованиями целевой нуклеиновой кислоты, так что возникает заданный эффект (например, антисмысловое ингибирование целевой нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота HBV).
Не комплементарные нуклеооснования между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой HBV могут быть допустимы при условии, что антисмысловое соединение остается способным специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой. Более того, антисмысловое соединение может гибридизоваться в одном или нескольких сегментах нуклеиновой кислоты HBV, так что промежуточные или соседние сегменты не участвуют в гибридизации (например, петлевая структура, не совпадающая или шпилечная структура).
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, представленное в настоящем документе, или его определенная часть комплементарны или по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарны нуклеиновой кислоте HBV, целевой области, целевому сегменту или определенной их части. Процент комплементарности антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой может быть определен стандартными способами.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеооснований указанного антисмыслового соединения комплементарны целевой области и, следовательно, будут специфически гибридизоваться, представляет 90 процентнов комплементарности. В этом примере оставшиеся не комплементарные нуклеооснования могут быть сгруппированы или перемежаться с комплементарными нуклеооснованиями, и не обязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеооснованиями. Поэтому антисмысловое соединение длиной 18 нуклеооснований, имеющее четыре не комплементарных нуклеооснования, к которым примыкают две области полной комплементарности с целевой нуклеиновой кислотой, имеет общую комплементарность с целевой нуклеиновой кислотой 77,8%, и, следовательно, входит в рамки настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью целевой нуклеиновой кислоты может быть определен обычным способом с использованием программ BLAST (программ для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания) и программ Power BLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологичности, идентичности или комплементарности последовательности может быть определен, например, программой Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Мэдисон, штат Висконсин), с использованием настроек по умолчанию, в которых используется алогритм Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение, представленное в настоящем документе, или определенная его часть полностью комплементарны (то есть на 100% комплементарны) целевой нуклеиновой кислоте или определенной ее части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементерно к нуклеиновой кислоте HBV, или ее целевой области, или целевому сегменту, или целевой последовательности. При использовании в настоящем документе, «полностью комплементарен» обозначает, что каждое нуклеооснование антисмыслового соединения может участвовать в точном спаривании оснований с соответствующими нуклеооснованиями целевой нуклеиновой кислоты. Например, антисмысловое соединение из 20 нуклеооснований полностью комплементарно целевой последовательности длиной 400 нуклеооснований, если существует соответствующая часть из 20 нуклеооснований целевой нуклеиновой кислоты, которая полностью комплементарна указанному антисмысловому соединению. Термин «полностью комплементарен» может быть использован также в отношении определенной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть из 20 нуклеооснований антисмыслового соединения, состоящего из 30 нуклеооснований, может быть «полностью комплементарна» целевой последовательности длиной 400 нуклеооснований. Часть из 20 нулеооснований олигонуклеотида, состоящего из 30 нуклеооснований, полностью комплементерна целевой последовательности, если целевая последовательность имеет соответствующую часть из 20 нуклеооснований, в которой каждое нуклеооснование комплементарно части из 20 нуклеооснований указанного антисмыслового соединения. В то же время целое антисмысловое соединение из 30 нуклеооснований может быть или может не быть полностью комплементарным к целевой последовательности, в зависимости от того, являются ли оставшиеся 10 нуклеооснований антисмыслового соединения также комплементарными целевой последовательности.
Не комплементарное нуклеооснование может быть расположено у конца 5' или конца 3' антисмыслового соединения Альтернативно, не комплементарное нуклеооснование или нуклеооснования могут быть во внутреннем положении антисмыслового соединения. В случае наличия двух или более не комплементарных нуклеооснований, они могут быть смежными (то есть связанными) или не смежными. В одном варианте реализации, не комплементарное нуклеооснование расположено в сегменте крыла химерного антисмыслового олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, которые имеют длину или которые содержат до 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеооснований, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не комплементарного нуклеооснования(ий) относительно целевой нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота HBV, или ее определенная часть.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, которые имеют длину или которые содержат до 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеооснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не комплементарного нуклеооснования(ий) относительно целевой нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота HBV, или ее определенная часть.
Представленные антисмысловые соединения включают также те, которые комплементарны части целевой нуклеиновой кислоты. При использовании в настоящем документе, «часть» относится к определенному количеству смежных (то есть связанных) нуклеооснований в пределах области или сегмента целевой нуклеиновой кислоты. «Часть» может также относиться к определенному количеству смежных нуклеооснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 8 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 9 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 10 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 11 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 12 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 13 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 14 нуклеооснований. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 15 нуклеооснований. Также подразумеваются антисмысловые соединения, которые комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеооснований, или в диапазоне между любыми из двух этих значений.
Идентичность
Антисмыловые соединения, представленные в настоящем документе, также могут иметь определенный процент идентичности с определенной нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO или соединением, представленным номером Isis, или их частью. При использовании в настоящем документе, антисмысловое соединение является идентичным к последовательности, описанной в настоящем документе, если оно имеет такую же способность к спариванию нуклеооснований. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, считается идентичной к этой последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Подразумеваются также укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанных в настоящем документе, а также соединения, имеющие не идентичные основания по сравнению с антисмысловыми соединениями, представленными в настоящем документе. Не идентичные основания могут быть соседними друг к другу или рассредоточены в антисмысловом соединении. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают по количеству оснований, имеющих идентичное спаривание оснований, по сравнению с последовательностью, с которой его сравнивают.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения или их части являются по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными к одному или нескольким антисмысловым соединениями или последовательностям SEQ ID NO, или их частям, описанным в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации, часть антисмыслового соединения сравнивают с частью целевой нуклеиновой кислоты такой же длины. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеооснований с равной по длине частью целевой нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах реализации, часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с частью целевой нуклеиновой кислоты такой же длины. В некоторых вариантах реализации сравнивают часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеооснований с равной по длине частью целевой нуклеиновой кислоты.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основания и сахара. Часть нуклеооснования (известная также как основание) нуклеозида, как правило, представляет собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно включают фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые включают пентафуранозный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильным фрагментом сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентного связывания соседних нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах олигонуклеотидной структуры, фосфатные группы обычно упоминают как образующие межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замещения или изменения межнуклеозидных связей, сахарных фрагментов или нуклеооснований. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую являются предпочтительными по сравнению с нативными формами за счет желательных свойств, таких как, например, усиленное клеточное поглощение, усиленная аффинность к целевой нуклеиновой кислоте, увеличенная устойчивость в присутствии нуклеаз или увеличенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для увеличения связывающей аффинности укороченного или усеченного антисмыслового соединения к его целевой нуклеиновой кислоте. Следовательно, зачастую могут быть получены сравнимые результаты с укороченными антисмысловыми соединениями, которые имеют такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой фосфодиэфирную связь 3' с 5'. Антисмысловые соединения, имеющие одну или несколько модифицированных, то есть неприродных, межнуклеозидных связей, зачастую выбирают вместо антисмысловых соединений, имеющих природные межнуклеозидные связи из-за желательных свойств, таких как, например, усиленное клеточное полощение, усиленная аффиность к целевым нуклеиновым кислотам и увеличенная устойчивость в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Иллюстративные межнуклеозидные связи, содержащие фосфор, включают, но не ограничиваясь этим, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидаты и фосфотиоаты. Хорошо известны способы получения фосфоросодержащих и не фосфоросодержащих связей.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту HBV, содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации, модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфотиоатные связи. В некоторых вариантах реализации, каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
Модифицированные сахарные фрагменты
1
12
Антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, могут необязательно содержать один или несколько нуклеозидов, в которых модифицирована сахарная группа. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать улучшенную устойчивость к действию нуклеаз, увеличенную связывающую аффинность или какое-либо другое преимущественное биологическое свойство антисмысловым соединениям. В некоторых вариантах реализации, нуклеозиды включают химически модифицированный рибофуранозный кольцевой фрагмент.Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничения, добавление групп заместителей (включая 5' и 2' группы заместителей); связывание мостиком не геминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БцНК); замену рибозильного кольцевого кислородного атома на S, N(R) или C(R1)(R)2 (R=Н, С-С алкил или защитная группа); и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (смотри Международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны другие 5', 2'-бис-замещенные нуклеозиды), замену рибозильного кольцевого кислородного атома на S с дополнительным замещением в 2'-положении (смотри опубликованную заявку на патент США US2005/0130923, опубликованную 16 июня 2005 года), или, альтернативно, 5'-замещение БцНК (смотри Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой БНК замещена, например, 5'-метиловой или 5'-виниловой группой).
3
2
2
3
1
10
3
2
3
2
2
1
10
Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты включают, без ограничения, нуклеозиды, включающие 5'-винил, 5'-метил (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН и 2'-O(СН)OCH группы заместителей. Заместитель в 2' положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C-С алкила, OCF, O(СН)2SCH, O(CH)2-O-N(Rm)(Rn) и O-CH-C(=0)-N(Rm)(Rn), причем каждый Rm и Rn независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил.
2
2
2
2
3
2
3
3
2
3
2
3
2
1
12
2
3
2
2
При использовании в настоящем документе, «бициклические нуклеозиды» относятся к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический сахарный фрагмент. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие мостик между 4' и 2' рибозильными кольцевыми атомами. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения, представленные в настоящем документе, содержат один или несколько бициклических нуклеозидов, причем мостик содержит бициклический нуклеозид 4'-2'. Примеры таких бициклических нуклеозидов 4'-2' включают, но не ограничиваясь этим, нуклеозиды формул: 4'-(CH)-O-2' (БНК); 4'-(CH)-S-2'; 4'-(CH)-O-2' (ENA); 4'-СН(СН)-O-2' (cEt) и 4'-СН(СН0СНз)-O-2', и их аналоги (смотри патент США 7399845, опубликованный 15 июля 2008 года; 4'-С(СН)(СН)-O-2', и его аналоги (смотри опубликованную Международную заявку РСТ W02009/006478, опубликованную 8 января 2009 года); 4'-СН-N(ОСН)-2', и его аналоги (смотри опубликованную Международную заявку РСТ WO 2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 года); 4'-СН-O-N(СН)-2' (смотри опубликованную заявку на патент США US 2004/0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-CH-N(R)-O-2', причем R представляет собой Н, С-С алкил или защитную группу (смотри патент США 7427672, опубликованный 23 сентября 2008 года); 4'-СН-С(Н)(СН)-2' (смотри публикацию Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН-С(=СН)-2', и его аналоги (смотри опубликованную Международную заявку РСТ WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 года). Также смотри, например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№ U.S. 6670461, 7053207, 6268490, 6770748, 6794499, 7034133, 6525191, 7399845; опубликованный Международные заявки РСТ WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570 и WO 2007/134181; публикации патентов США №№US 2004/0171570, US 2007/0287831 и US 2008/0039618; и патенты США серийных №№12/129154, 60/989574, 61/026995, 61/026998, 61/056564, 61/086231, 61/097787 и 61/099844; а также Международный заявки РСТ №№PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154 и PCT/US2008/068922. Каждый из представленных выше бициклических нуклеозидов может быть получен с одним или несколькими стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (смотри Международную заявку РСТ PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
В некоторых вариантах реализации, бициклические сахарные фрагменты БцНК нуклеозидов включают, но не ограничиваясь этим, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между положением 4' и 2' пентафуранозного сахарного фрагмента, причем такие мостики независимо содержат 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[С(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-;
причем:
x равен 0, 1 или 2;
n равен 1, 2, 3 или 4;
a
b
2
12
1
12
2
12
1
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
2
1
каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный C-С алкил, C-C алкенил, замещенный C-С алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, С-С арил, замещенный С-С арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, C-C алициклический радикал, замещенный C-C алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и
1
2
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый J и J независимо представляет собой, Н, С-С алкил, замещенный C-С алкил, С-C алкенил, замещенный С-С алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C арил, замещенный С-С арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C-С аминоалкил, замещенный C-C аминоалкил или защитную группу.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
3
2
2
2
2
2
1
12
В некоторых вариантах реализации, мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации, мостик представляет собой 4'-СН-2', 4'-(СН)2-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'-, причем каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
В некоторых вариантах реализации, бициклические нуклеозиды дополнительно определены по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий 4'-2' метиленокси-мостик, может быть в α-L конфигурации или β-D конфигурации. Ранее в антисмысловые олигонуклеотиды, демонстрирующие антисмысловую активность, были внедрены a-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В некоторых вариантах реализации, бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваясь этим, (А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК, (С) этиленокси (4'-(СН)-O-2') БцНК, (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2') БцНК, (Е) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2') БцНК, (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') БцНК, (G) метилен-тио (4'-СН-S-2') БцНК, (Н) метилен-амино (4'-CH-N(R)-2') БцНК, (I) метил-карбоциклические (4'-СН-СН(СН)-2') БцНК и (J) пропилен-карбоциклические (4'-(СН)-2') БцНК, изображенные ниже.
1
12
причем Вх представляет собой фрагмент основания, a R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу I:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -CH-N(R)-CH-, -C(=O)-N(R)-CH-, -CH-O-N(R)-, -СН-N(R)-O- или -N(R)-O-CH;
c
1
12
R представляет собой C-C алкил или амино-защитную группу; и
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное связывание со стабилизирующей средой.
В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу II:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
a
1
6
2
6
2
6
1
6
3
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, C-С алкинил, замещенный C-С алкил, замещенный С-С алкенил, замещенный С-С алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тио.
c
c
d
c
3
c
c
c
d
c
d
c
1
6
1
6
c
В одном варианте реализации, каждая из замещенных групп независимо представляет собой моно- или полизамещенную группу с группами заместителей, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J и NJC(=X)NJJ, причем каждый J, J и J независимо представляют собой Н, C-С алкил ил изамещенный C-С алкил, и Х представляет собой О или NJ.
В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу III:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
1
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, С-С алкинил, замещенный C-С алкил, 5 замещенный C-С алкенил, замещенный С-С алкинил или замещенный ацил (С(=O)-). В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу IV:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
a
b
T и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
d
1
6
1
6
2
6
1
6
2
6
2
6
R представляет собой C-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный C-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, замещенный С-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил, C-С алкоксил, замещенный C-С алкоксил, ацил, замещенный ацил, C-С аминоалкил или замещенный C-С аминоалкил;
В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу V:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
a
b
e
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
q, q, q и q, каждый независимо, представляют собой водород, галоген, С-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
q и q, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C-С алкил или замещенный C-C алкил.
2
Были описаны синтез и получение метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК мономеров аденина, цитозина, гуанина, 5-метил-цитозина, тимина и урацила, а также их олигомеризация и свойства распознавания нуклеиновых кислот (смотри, например, Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). БцНК и их получение описаны также в WO 98/39352 и WO 99/14226.
2
2
Также были получены аналоги метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК, метиленокси (4'-СН-O-2') БцНК и 2'-тио-БцНК (смотри, например, Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Было описано также получение блокированных нуклеозидных аналогов, включающих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (смотри, например, Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники описан синтез 2'-амино-БцНК, нового конформационно ограниченного олигонуклеотидного аналога с высокой аффинностью (смотри, например, Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были описаны 2'-амино- и 2'-метиламино-БцНк, а также термическая устойчивость их дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК.
В некоторых вариантах реализации, бициклический нуклеозид имеет Формулу VI:
причем:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
Т и T, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, сопряженную группу, химически активную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
i
j
k
j
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
j
j
k
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый q, q, q и q независимо, представляет собой Н, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C алкоксил, замещенный C-C алкоксил, OJ, SJ, SOJ, SO2J, NJJ, N3, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=0)NJJ или N(Н)С(=S)NJJ; и
i
j
i
k
g
h
g
h
1
12
1
12
q и q иди q и q вместе представляют собой =C(q)(q), причем q и q, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил.
2
3
2
Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий мостик 4'-(СН)-2', и алкениловый аналог, мостик 4'-СН=СН-СН-2' (смотри, например, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Также был описан синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов, их олигомеризация и биохимические исследования (смотри, например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
При использовании в настоящем документе, «бициклический нуклеозид» относится к нуклеозиду, содержащему мостиковое соединение двух атомов углерода сахарного кольца, с образованием посредством этого бициклического сахарного фрагмента. В некоторых вариантах реализации, мостик соединяет 2' углерод и другой углерод сахарного кольца.
При использовании в настоящем документе, «4'-2' бициклический нуклеозид» или «4'-2' бициклический нуклеозид» относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостиковое соединение 2' углеродного атома и 4' углеродного атома.
При использовании в настоящем документе, «моноциклические нуклеозиды» относятся к нуклеозидам, содержащим модифицированные сахарные фрагменты, которые не являются бициклическими сахарными фрагментами. В некоторых вариантах реализации, сахарный фрагмент или аналог сахарного фрагмента нуклеозида может быть модифицированным или замещенным в любом положении.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
При использовании в настоящем документе, «2'-модифицированный сахар» обозначает фуранозный сахар, модифицированный в 2'-положении. В некоторых вариантах реализации, такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенида, включая, но не ограничиваясь этим, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил, и замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах реализации, 2'-модификации выбраны из заместителей, включающих, но не ограничиваясь этим: O[(СН)O]CH, O(CH)NH, O(СН)CH, O(CH)ONH, ОСНС(=O)(Н)СН и O(СН)O|N[(СН)CH], причем пит равны от 1 до около 10. Другие группы 2'-заместителей также могут быть выбраны из: C-C алкила; замещенного алкила; алкенила; алкинила; алкарила; аралкила; O-алкарила или O-аралкила; SH; SCH; OCN; Cl; Br; CN; CF; OCF; SOCH; SOCH; ONO; NO; N; NH; гетероциклоалкила; гетероциклоалкарила; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенного силила; РНК-расщепляющей группы; репортерной группы; интеркалятора; групп для улучшения фармакокинетических свойств; и групп для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, а также других заместителей, имеющих аналогичные свойства. В некоторых вариантах реализации, модифицированные нуклеозиды включают боковую цепь 2'-МОЕ (смотри, например. Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такое 2'-МОЕ замещение может быть описано как обладающее улучшенной связывающей аффинностью по сравнению с не модифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Было также показано, что олигонуклеотиды, имеющие заместитель 2'-МОЕ, являются антисмысловыми ингибиторами генной экспрессии с многообещающими характеристиками для применения in vivo (смотри, например, Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
При использовании в настоящем документе, «модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид» или «модифицированный ТГП нуклеозид» обозначает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый «сахар», замещающий пентафуранозный остаток в нормальных нуклеозидах (заменитель сахара). Модифицированные ТГП нуклеозиды включают, но не ограничиваясь этим, так называемые гекситоловые нуклеиновые кислоты (ГНК), анитоловые нуклеиновые кислоты (АНК), маннитоловые нуклеиновые кислоты (МНК) (смотри Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), фтор-ГНК (F-ГНК) или соединения, имеющие Формулу X:
Формула X:
причем независимо для каждого из упомянутого по меньшей мере одного тетрагидропиранового нуклеозидного аналога Формулы X:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
3
4
3
4
3
4
Т и Т, каждый независимо, межнуклеозидная связывающая группа, связывающая тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением или одним из Т и Т, представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т и Т представляет собой Н, гидрокси-защитную группу, связанную сопряженную группу или 5' или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
q, q, q, q, q, qи q, каждый независимо, представляет собой, Н, C-С алкил, замещенный C-С алкил, С-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный С-С алкинил; и
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
один из R и R представляет собой водород, а другой выбран из галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, ОС(=Х)NJJ, NJC(=X)NJJ и CN, причем X представляет собой О, S или NJ, и каждый J, J и J независимо представляет собой Н или C-С алкил.
m
n
p
r
s
t
u
m
n
p
r
s
t
u
m
n
p
r
s
t
u
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах реализации, представлены модифицированные ТГП нуклеозиды Формулы X, в которых каждый q, q, q, q, q, q и q представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q является отличным от Н. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации представлены ТГП нуклеозиды Формулы X, в которых один из R и R представляет собой F. В некоторых вариантах реализации R представляет собой фтор, a R представляет собой Н, R представляет собой метокси, а R представляет собой Н, и R представляет собой метоксиэтокси, а R представляет собой Н.
1
10
3
2
2
3
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
При использовании в настоящем документе, «2'-модифицированный нуклеозид» или «2'-замещенный нуклеозид» относится к нуклеозиду, включающему сахар, содержащий заместитель в 2'-положении фуранозного кольца, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваясь этим, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два углеродных атома сахароного кольца, соединяет 2' углерода и другой углерод сахарного кольца, а также нуклеозиды с немостиковыми 2' заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, O-аллил, O-C-C алкил, -OCF, O-(СН)-O-СН, 2'-O(СН)2SCH, O-(CH)-O-N(R)(R) или O-СН-С(=O)-N(R)(R), причем каждый R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, в других положениях сахара и/или в нуклеоосновании.
При использовании в настоящем документе, «2'-F» относится к сахару, содержащему фтор-группу в 2'-положении.
3
3
При использовании в настоящем документе, «2'-ОМе» или «2'-ОСН», или «2'-O-метил», каждый относится к нуклеозиду, включающему сахар, содержащий группу -ОСН в 2'-положении сахарного кольца.
При использовании в настоящем документе, «олигонуклеотид» относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации, один или несколько из множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации, олигонуклеотид содержит один или несколько рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
В данной области техники известны многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы, заменяющие сахар, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в антисмысловые соединения (смотри, например, обзорную статью: Leumann, J.С, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут подвергаться различным дополнительным замещениям для усиления активности.
Специалистам в данной области хорошо известны способы получения модифицированных сахаров.
В нуклеотидах, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, фрагменты нуклеооснования (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняются для гибридизации с соответствующей мишенью нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах реализации, антисмысловые соединения содержат один или несколько нуклеотидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахарный фрагмент представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации, 2'-МОЕ модифицированные нуклеотиды расположены в мотиве химерного олигонуклеотида. В некоторых вариантах реализации, модифицированный сахарный фрагмент представляет собой cEt. В некоторых вариантах реализации cEt модифицированные нуклеотиды расположены в крыльях мотива химерного олигонуклеотида.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или рецептур. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, включая, но не ограничиваясь этим, способ введения, степень заболевания или дозу, подлежащую введению.
Антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, может быть использовано в фармацевтических композициях путем смешивания указанного антисмыслового соединения с соответствующим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). PBS представляет собой разбавитель, пригодный для применения в композициях, доставляемых парентерально. Соответственно, в одном варианте реализации, используемом в способах, описанных в настоящем документе, представлена фармацевтическая композиция, включающая антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту HBV, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах реализации, фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS. В некоторых вариантах реализации, антисмысловое соединение представляет собой антисмысловый олигонуклеотид.
Фармацевтические композиции, включающие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любые другие олигонуклеотиды, которые, при введении животному, включая человека, могут обеспечивать (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и другим биоэквивалентам. Применимые фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваясь этим, соли натрия и калия.
Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов с одного или с обоих концов антисмыслового соединения, которые расщепляются под действием эндогенных нуклеаз в организме, с образованием активного антисмыслового соединения.
Сопряженные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или несколькими фрагментами или конъюгатами, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение образующихся антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные сопряженные группы включают холестериновые фрагменты и жировые фрагменты. Дополнительные сопряженные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Антисмысловые соединения могут быть также модифицированы для получения одной или нескольких стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или к обоим концам антисмысловых соединений для усиления свойств, таких как, например, устойчивость к действию нуклеаз. В стабилизирующие группы включены кэп-структуры. Эти концевые модификации защищают антисмысловое соединение, имеющее концевую нуклеиновую кислоту, от экзонуклеазного расщепления, и могут способствовать доставке и/или локализации в клетке. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области и включают, например, инвертированные дезокси-кэпы с удаленными азотистыми основаниями. Дополнительные 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы для закрывания одного или обоих концов антисмыслового соединения, чтобы обеспечить устойчивость к действию нуклеаз, включают группы, описанные в WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 года.
Клеточная культура и обработка антисмысловыми соединениями
Влияние антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот HBV может быть испытана in vitro в различных типах клеток. Клеточные, используемые для таких анализов, доступны в продаже у коммерческих поставщиков (например, American Type Culture Collection, Manassus, штат Вирджиния; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, штат Северная Калифорния; Clonetics Corporation, Walkersville, штат Мэриленд), и их выращивают в соответствии с инструкциями поставщика с использованием имеющихся в продаже реактивов (например, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, штат Калифорния). Иллюстративные клеточные типы включают, но не ограничиваясь этим, клетки HuVEC, клетки b.END, клетки HepG2, клетки Нер3В и первичные гепатоциты.
In vitro испытание антисмысловых олигонуклеотидов
В настоящем документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обаботки другими антисмысловыми соединениями.
Клетки могут быть обработаны антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают примерно 60-80% слияния в культуре.
Один реагент, которые обычно используют для введения антисмысловых олигонуклеотидов в выращенные клетки, включает катионный липидный реагент трансфекции LIPOFECTIN (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с LIPOFECTIN в среде OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) для достижения заданной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая может находиться в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в выращенные клетки, включает LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Антисмысловый олигонуклеотид может быть смешан с LIPOFECTAMINE в среде OPTI-MEM 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) для достижения заданной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая может находиться в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другие методики, используемые для введения антисмысловых олигонуклеотидов в выращенные клетки, включают электропорацию.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами стандартами способами. Клетки могут быть собраны через 16-24 часа после обработки антисмысловым олигонуклеотидов, и в это время измеряют уровни РНК или белка целевых нуклеиновых кислот по способам, известным в данной области техники и описанным в настоящем документе. Как правило, при выполнении обработки в нескольких экземплярах, данные представляют как среднее значение повторных обработок.
Используемая концентрация антисмыслового олигонуклеотида варьируется от одной клеточной линии к другой. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной клеточной линии хорошо известны в данной области. Антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ, при трансфекции с LIPOFECTAMINE. Антисмысловые олигонуклеотиды использую в более высоких концентрациях, от 625 до 20000 нМ, при трансфекции при помощи электропорации.
Выделение РНК
Анализ РНК может быть выполнен на общей клеточной РНК или поли(А)+мРНК. В данной области техники известны способы выделения РНК. РНК готовят с использованием способов, хорошо известных в данной области, например, используя реагент TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния) по методикам, рекомендованным производителем.
Анализ ингибированш уровней или экспрессии мишени
Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты HBV может быть анализировано различными способами, известными в данной области. Нарпимер, уровни целевой нуклеиновой кислоты могут быть количественно определены, например, нозерн-блоттингом, сравнительной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть выполнен на общей клеточной РНК или поли(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области. Анализ нозерн-блоттинга также является стандартным в данной области. Количественная ПЦР в реальном времени может быть легко осуществлена с использованием имеющейся в продаже системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 производства PE-Applied Biosystems, Фостер-сити, штат Калифорния, которую используют в соответствии с инструкциями производителя.
Количественный анализ ПЦР в реальном времени уровней целевой РНК
Количественное определение уровней целевой РНК может быть осуществлено количественной ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Фостер-сити, штат Калифорния) по инструкциям производителя. Способы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.
Перед ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (RT), в результате чего образуется комплементарная ДНК (кДНК), которую затем используют как субстрат для амплификации ПЦР в реальном времени. Реакции RT и ПЦР в реальном времени выполняют последовательно в одной и той же лунке с образцом. Реактивы для RT и ПЦР в реальном времени можно приобрести у компании Invitrogen (Карлсбад, штат Калифорния). Реакции RT и ПЦР в реальном времени выполняют по способам, хорошо известным специалистам в данной области.
Количества целевого гена (или РНК), полученные по ПЦР в реальном времени, нормализуют с использованием уровня экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклофилин А, или количественным определением общей РНК, используя RIBOGREEN (Invitrogen Inc., Карлсбад, штат Калифорния). Экспрессию циклофилина А количественно определяют по ПЦР в реальном времени, которую осуществляют одновременно с мишенью, поочередно или отдельно. Общую РНК количественно определяют с использованием реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invetrogen Inc., Юджин, штат Орегон). Способы количественного определения РНК при помощи RIBOGREEN описаны в публикации Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN используют прибор CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).
Образцы и праймеры предназначены для гибридизации с нуклеиновой кислотой HBV. Способы разработки образцов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области, и могут включать применение программного обеспечения, такого как программа PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Фостер-сити, штат Калифорния).
Количественный анализ ПЦР в реальном времени уровней целевой ДНК
Количественное определение уровней целевой ДНК может быть осуществлено количественной ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательностей ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Фостер-сити, штат Калифорния) по инструкциям производителя. Способы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.
Количества целевого гена (или ДНК), полученные по ПЦР в реальном времени, нормализуют с использованием уровня экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклофилин А, или количественным определением общей ДНК, используя RIBOGREEN (Invitrogen Inc., Карлсбад, штат Калифорния). Экспрессию циклофилина А количественно определяют по ПЦР в реальном времени, которую осуществляют одновременно с мишенью, поочередно или отдельно. Общую ДНК количественно определяют с использованием реагента для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invetrogen Inc., Юджин, штат Орегон). Способы количественного определения ДНК при помощи RIBOGREEN описаны в публикации Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Для измерения флуоресценции RIBOGREEN используют прибор CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).
Образцы и праймеры предназначены для гибридизации с нуклеиновой кислотой HBV. Способы разработки образцов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области, и могут включать применение программного обеспечения, такого как программа PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Фостер-сити, штат Калифорния).
Анализ уровней белка
Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот HBV может быть определено измерением уровней белка HBV. Уровни белка HBV могут быть оценены или количественно определены различными способами, хорошо известными в данной области, такими как иммунопреципитация, анализ вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг), иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), количественные анализы белка, анализы активности белка (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Антитела, направленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Бирмингем, штат Мичиган), или могут быть получены стандартными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известными в данной области.
In vivo исследование антисмысловых соединений
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигониклеотиды, испытывают на животных для оценки их способности ингибировать экспрессию HBV и вызывать фенотипические изменения. Испытание может быть выполнено на здоровых животных или в экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным, антисмысловые олигонуклеотиды составляют в композицию в фармацевтически приемлемом разбавителе, таком как фосфатно-солевой буферный раствор. Введение включает парентеральные пути введения, такие как внутрибрюшинное, внутривенное, подкожное, интратекальное и интрацеребровентрикулярное. Расчет дозы антисмыслового олигонуклеотида и частоты доз находится в рамках возможностей специалистов в данной области и зависит от таких факторов, как способ введения и вес тела животного. После периода обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, РНК выделяют из печеночной ткани и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты HBV. Измеряют также изменения уровней ДНК HBV. Измеряют также изменения уровней белка HBV. Измеряют также изменения уровней HBeAg HBV. Измеряют также изменения уровней HBsAg HBV.
Некоторые показания
В некоторых вариантах реализации, в настоящем документе представлены способы, соединения и композиции для лечения пациента, включающие введение одной или нескольких фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, пациент страдает HBV-связанным состоянием. В некоторых вариантах реализации, хроническая инфекция HBV, воспаление, фиброз, цирроз, рак печени, серозный гепатит, желтуха, рак печени, воспаление печени, фиброз печени, цирроз печени, печеночная недостаточность, диффузное гепатоцеллюлярное воспалительное заболевание, гепофагоцитарный синдром, серозный гепатит и виремия HBV. В некоторых вариантах реализации, HBV-связанное состояние может включать любое или все из следующих: болезнь, похожую на грипп, слабость, боли, головную боль, жар, потерю аппетита, диарею, желтуху, тошноту и рвоту, боль в области печени, стул земляного или серого цвета, зуд по всему телу и мочу темного цвета, в сочетании с положительным тестом на присутствие вируса гепатита В, вирусного антигена гепатита В или положительным тестом на присутствие антитела, специфичного к вирусному антигену гепатита В. В некоторых вариантах реализации, пациент имеет риск HBV-связанного состояния. Сюда входят пациенты, имеющие один или несколько факторов риска для развития HBV-связанного состояния, включая половые отношения с пациентом, инфицированным вирусом гепатита В, проживание в одном доме с пациентом с хронической инфекцией вируса гепатита В, воздействие крови человека, инфицированного вирусом гепатита В, инъекция запрещенных лекарств, заболевание гемофилией и посещение мест распространения гепатита В. В некоторых вариантах реализации, пациента определяют как нуждающегося в лечении HBV-связанного состояния. В некоторых вариантах реализации, в настоящем документе представлены способы профилактического снижения экспрессии HBV у пациента. Некоторые варианты реализации включают лечение пациента, нуждающегося в этом, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV.
За счет пересечения путей передачи, многие люди подвергаются воздействию вируса гепатита В (HBV) и вируса гепатита С (HCV), и меньшая часть является хронически инфицированной обоими вирусами, особенно в таких регионах, как Азия, где HBV является эндемичным. По оценкам, до 10% людей с HCV могут также страдать HBV, тогда как, вероятно, 20% людей с HBV инфицированы также HCV. Однако лечение гепатита В или гепатита В у пациентов, инфицированных одновременно HBV-HCV, не было хорошо изучено. Лечение усложняется тем фактом, что HCV и HBV ингибируют репликацию друг друга (хотя это взаимодействие наблюдалось не во всех исследованиях). Следовательно, лечение, которое полностью подавляет HBV, может потенциально снижать рецидив HCV или наоборот. Поэтому соединения и композиции, описанные в настоящем документе, могут быть преимущественно использованы для лечения пациентов, инфицированных одновременно HBV и HCV. Примеры возможностей лечения гепатита С (HCV) включают интерфероны, например, интерферон-альфа-2b, интерферон альфа-2а и интерферон альфакон-1. Более редкая частота дозирования интерферона может быть достигнута при использовании пегилированного интерферона (интерферона, присоединенного к полиэтиленгликольному фрагменту, что улучшает его фармакокинетический профиль). Было также показано, что комплексная терапия с интерфероном альфа-2b (пегилированным и не пегилированным) и рибавирином является преимущественной для некоторых групп пациентов. Другие средства, разработанные в настоящее время, включают ингибиторы репликации РНК HCV (например, серии VP50406 производства ViroPharma), антисмысловые агенты HCV, терапевтические вакцины HCV, ингибиторы протеазы HCV, ингибиторы геликазы HCV и терапию антителами HCV (моноклональными или поликлональными).
В некоторых вариантах реализации, лечение способами, соединениями и композициями, описанными в настоящем документе, применимо для предупреждения HBV-связанного состояния, обусловленного наличием вируса гепатита В. В некоторых вариантах реализации, лечение способами, соединениями и композициями, описанными в настоящем документе, применимо для предупреждения HBV-связанного состояния.
В одном варианте реализации, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, сопровождается контролированием уровней мРНК HBV в сыворотке пациента для определения реакции пациента на введение антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, сопровождается контролированием уровней ДНК HBV в сыворотке пациента для определения реакции пациента на введение антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, сопровождается контролированием уровней белка HBV в сыворотке пациента для определения реакции пациента на введение антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, сопровождается контролированием уровней антигена S HBV (HbsAg) в сыворотке пациента для определения реакции пациента на введение антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, сопровождается контролированием уровней антигена Е HBV (HBeAg) в сыворотке пациента для определения реакции пациента на введение антисмыслового соединения. Реакцию пациента на введение антисмыслового соединения врач использует для определения количества и продолжительности терапевтического вмешательства.
В некоторых вариантах реализации, введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, приводит к снижению экспрессии HBV по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном двумя из этих значений. В некоторых вариантах реализации, введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту HBV, приводит к уменьшению симптомов, связанных с HBV-связанным состоянием, и к снижению HBV-связанных маркеров в крови. В некоторых вариантах реализации, введение антисмыслового соединения HBV снижает уровни РНК HBV, уровни ДНК HBV, уровни белка HBV, уровни HBsAg или уровни HBeAg по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном двумя из этих значений.
В некоторых вариантах реализации, фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, направленное на HBV, используют для получения лекарственных средств для лечения пациента, страдающего или восприимчивого к HBV-связанному состоянию.
Некоторые комплексные терапии
В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, вводят совместно с одним или несколькими другими фармацевтическими средствами. В некоторых вариантах реализации, такое одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для лечения того же заболевания, расстройства или состояния, что и одна или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, такое одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для лечения другого заболевания, расстройства или состояния, чем одна или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, такое одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для лечения нежелательного побочного действия одной или нескольких фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим средством для лечения нежелательного действия этого другого фармацевтического средства. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим средством для получения комбинационного эффекта. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, вводят совместно с другим фармацевтическим средством для получения синергетического эффекта.
В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, и один или несколько других фармацевтических средств вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, и один или несколько других фармацевтических средств вводят в разное время. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, и один или несколько других фармацевтических средств готовят вместе в одной композиции. В некоторых вариантах реализации, одну или несколько фармацевтических композиций, представленных в настоящем документе, и один или несколько других фармацевтических средств готовят по отдельности. В некоторых вариантах реализации, описанные антисмысловые олигонуклеотиды вводят в комбинации с HCV агентом. В следующих вариантах реализации, HCV соединение вводят одновременно с антисмысловым соединением; в других вариантах реализации, HCV соединение вводят отдельно; так, чтобы дозы HCV агента и антисмыслового соединения перекрывались, по времени, в организме пациента. В родственных вариантах реализации, агент HCV может быть выбран из интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2а и интерферона альфакон-1 (пегилированного и не пегилированного); рибавирина; ингибитора репликации РНК HCV (например, серии VP50406 производства ViroPharma); антисмыслового агента HCV; терапевтической вакцины HCV; ингибитора протеазы HCV; ингибитора геликазы HCV; и терапии HCV антителами (моноклональными или поликлональными антителами).
В других вариантах реализации, антисмысловое соединение HBV настоящего изобретения может быть введено пациенту, инфицированному HBV, в комбинации с одним или несколькими HBV терапевтическими средствами, причем одно или несколько HBV терапевтических средств могут быть введены в той же лекарственной композиции, что и соединение антисмыслового олигонуклеотида HBV, или могут быть введены в отдельной композиции. Одно или несколько HBV терапевтических средств могут быть введены одновременно с соединением антисмыслового олигонуклеотида HBV, или могут быть введены отдельно, так, чтобы дозы соединения антисмыслового олигонуклеотида HBV и терапевтического агента HBV перекрывались, по времени, в организме пациента. В родственных вариантах реализации, одно или несколько HBV терапевтических средств могут быть выбраны из интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2а и интерферона альфакон-1 (пегилированного и не пегилированного), рибавирина; ингибитора репликации РНК HBV; второго антисмыслового соединения HBV; терапевтической вакцины HBV; профилактической вакцины HBV; ламивудина (3ТС); энтекавира (ETV); тенофовира; телбивудина (LdT); адефовира; и терапии HBV антителами (моноклональными или поликлональными).
ПРИМЕРЫ
Исключение ограничения настоящего описания и включение путем ссылки
Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были описаны с особенностями в соответствии с некоторыми вариантами реализации, следующие примеры служат лишь для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и не предназначены для их ограничения. Каждая ссылка, цитируемая в настоящей заявке, включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме.
Пример 1: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. Культивированные клетки HepG2.2.15 при плотности 25000 клеток на лунку трансфицировали при помощи электропорации 15000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Набор вирусных затравочных зондов RTS3370 (прямая последовательность CTTGGTCATGGGCCATCAG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:2; обратная последовательность CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:3; последовательность зонда TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:4) использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 1 разработали как 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды или 3-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды. 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. 3-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие три и 4 нуклеозида, соответственно. Каждый нуклеозид в 5' сегменте крыла, и каждый нуклеозид в 3' сегменте крыла имеет МОЕ модификацию сахара. Каждый нуклеозид в центральном сегменте гэп имеет дезокси-сахарную модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Колонка «мотив» указывает структуру гэп и крыльев каждого химерного олигонуклеотида. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 1, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1).
Таблица 1
Ингибирование уровней мРНК HBV действием МОЕ химерных олигонуклеотидов, направленных на SEQ ID NO:1
Вирусный сайт инициации
Вирусный терминирующий сайт
ISIS №
Последовательность
Мотив
% ингибирование
SEQ ID NO
245
261
510088
CCACGAGTCTAGACTCT
3-10-4
55
5
250
266
510089
GTCCACCACGAGTCTAG
3-10-4
59
6
251
267
510090
AGTCCACCACGAGTCTA
3-10-4
60
7
252
268
510091
AAGTCCACCACGAGTCT
3-10-4
47
8
253
269
510092
GAAGTCCACCACGAGTC
3-10-4
59
9
254
270
510093
AGAAGTCCACCACGAGT
3-10-4
32
10
255
271
510094
GAGAAGTCCACCACGAG
3-10-4
41
11
256
272
510095
AGAGAAGTCCACCACGA
3-10-4
44
12
257
273
510096
GAGAGAAGTCCACCACG
3-10-4
54
13
258
274
510097
TGAGAGAAGTCCACCAC
3-10-4
57
14
384
400
510098
TGATAAAACGCCGCAGA
3-10-4
55
15
385
401
510099
ATGATAAAACGCCGCAG
3-10-4
59
16
411
427
510100
GGCATAGCAGCAGGATG
3-10-4
85
17
412
428
510101
AGGCATAGCAGCAGGAT
3-10-4
51
18
413
429
510102
GAGGCATAGCAGCAGGA
3-10-4
69
19
414
433
505330
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
5-10-5
74
20
414
430
510103
TGAGGCATAGCAGCAGG
3-10-4
12
21
415
434
509928
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
5-10-5
71
22
415
431
510104
ATGAGGCATAGCAGCAG
3-10-4
69
23
416
435
509929
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
5-10-5
78
24
416
432
510105
GATGAGGCATAGCAGCA
3-10-4
69
25
417
436
509930
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
5-10-5
72
26
417
433
510106
AGATGAGGCATAGCAGC
3-10-4
77
27
418
437
146783
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
5-10-5
15
28
418
434
510107
AAGATGAGGCATAGCAG
3-10-4
69
29
419
435
510108
GAAGATGAGGCATAGCA
3-10-4
59
30
420
436
510109
AGAAGATGAGGCATAGC
3-10-4
0
31
421
437
510110
AAGAAGATGAGGCATAG
3-10-4
38
32
457
473
510111
ACGGGCAACATACCTTG
3-10-4
62
33
639
658
146784
CTGAGGCCCACTCCCATAGG
5-10-5
5
34
639
655
510112
AGGCCCACTCCCATAGG
3-10-4
44
35
640
656
510113
GAGGCCCACTCCCATAG
3-10-4
27
36
641
657
510114
TGAGGCCCACTCCCATA
3-10-4
44
37
642
658
510115
CTGAGGCCCACTCCCAT
3-10-4
52
38
687
706
509931
CGAACCACTGAACAAATGGC
5-10-5
89
39
687
703
510116
ACCACTGAACAAATGGC
3-10-4
89
40
688
704
510117
AACCACTGAACAAATGG
3-10-4
69
41
689
705
510118
GAACCACTGAACAAATG
3-10-4
63
42
690
706
510119
CGAACCACTGAACAAAT
3-10-4
74
43
738
754
510120
АССАСАТСАТССАТАТА
3-10-4
71
44
1176
1192
510121
TCAGCAAACACTTGGCA
3-10-4
73
45
1778
1797
509932
AATTTATGCCTACAGCCTCC
5-10-5
76
46
1778
1794
510122
TTATGCCTACAGCCTCC
3-10-4
76
47
1779
1798
509933
CAATTTATGCCTACAGCCTC
5-10-5
72
48
1779
1795
510123
TTTATGCCTACAGCCTC
3-10-4
75
49
1780
1799
509934
CCAATTTATGCCTACAGCCT
5-10-5
75
50
1780
1796
510124
ATTTATGCCTACAGCCT
3-10-4
73
51
1781
1800
509935
ACCAATTTATGCCTACAGCC
5-10-5
72
52
1781
1797
510125
AATTTATGCCTACAGCC
3-10-4
69
53
1782
1798
510126
CAATTTATGCCTACAGC
3-10-4
59
54
1783
1799
510127
CCAATTTATGCCTACAG
3-10-4
58
55
1784
1800
510128
ACCAATTTATGCCTACA
3-10-4
60
56
1822
1838
510129
AGGCAGAGGTGAAAAAG
3-10-4
47
57
1823
1839
510130
TAGGCAGAGGTGAAAAA
3-10-4
30
58
1865
1884
509936
GCACAGCTTGGAGGCTTGAA
5-10-5
39
59
1865
1881
510131
CAGCTTGGAGGCTTGAA
3-10-4
4
60
1866
1885
509937
GGCACAGCTTGGAGGCTTGA
5-10-5
35
61
1866
1882
510132
ACAGCTTGGAGGCTTGA
3-10-4
0
62
1867
1886
505370
AGGCACAGCTTGGAGGCTTG
5-10-5
36
63
1867
1883
510133
CACAGCTTGGAGGCTTG
3-10-4
12
64
1868
1887
509938
AAGGCACAGCTTGGAGGCTT
5-10-5
7
65
1868
1884
510134
GCACAGCTTGGAGGCTT
3-10-4
20
66
1869
1888
509939
CAAGGCACAGCTTGGAGGCT
5-10-5
36
67
1869
1885
510135
GGCACAGCTTGGAGGCT
3-10-4
22
68
1870
1889
505371
CCAAGGCACAGCTTGGAGGC
5-10-5
35
69
1870
1886
510136
AGGCACAGCTTGGAGGC
3-10-4
14
70
1871
1887
510137
AAGGCACAGCTTGGAGG
3-10-4
0
71
1872
1888
510138
CAAGGCACAGCTTGGAG
3-10-4
6
72
1873
1889
510139
CCAAGGCACAGCTTGGA
3-10-4
17
73
1918
1934
510140
GCTCCAAATTCTTTATA
3-10-4
59
74
2378
2397
509940
TCTGCGAGGCGAGGGAGTTC
3-10-4
10
75
2378
2394
510141
GCGAGGCGAGGGAGTTC
3-10-4
5
76
2379
2395
510142
TGCGAGGCGAGGGAGTT
3-10-4
0
77
2380
2396
510143
CTGCGAGGCGAGGGAGT
3-10-4
8
78
2381
2397
510144
TCTGCGAGGCGAGGGAG
3-10-4
17
79
2820
2836
510145
TTCCCAAGAATATGGTG
3-10-4
22
80
2821
2837
510146
GTTCCCAAGAATATGGT
3-10-4
11
81
2822
2838
510147
TGTTCCCAAGAATATGG
3-10-4
21
82
Пример 2: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК ИВУ в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. Культивированные клетки HepG2.2.15 при плотности 25000 клеток на лунку трансфицировали при помощи электропорации 15000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. RTS3370 обнаружил первичную мРНК и вторичные части транскриптов мРНК pre-S1, pre-S2 и pre-C. Химерные олигонуклеотиды испытали также с дополнительными наборами затравочных зондов. Набор вирусных затравочных зондов RTS3371 (прямая последовательность CCAAACCTTCGGACGGAAA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:311; обратная последовательность TGAGGCCCACTCCCATAGG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO: 312; последовательность зонда CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:313) также использовали для измерения уровней мРНК. RTS3371 обнаружил первичную мРНК и вторичные части транскриптов мРНК pre-S1, pre-S2 и pre-C, аналогичные RTS3370, но в других областях. Набор вирусных затравочных зондов RTS3372 (прямая последовательность ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:314; обратная последовательность CGACGCGGCGATTGAG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:315; последовательность зонда AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:316) использовали для измерения уровней мРНК. RTS3372 обнарружил первичную геномную последовательность. Набор вирусных затравочных зондов RTS3373MGB (прямая последовательность CCGACCTTGAGGCATACTTCA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:317; обратная последовательность AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:318; последовательность зонда TTAAAGACTGGGAGGAGTTG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:319) использовали для измерения уровней мРНК. RTS3373MGB обнаружил первичную мРНК и вторичные части транскриптов мРНК pre-S 1, pre-S2, pre-C и pre-Х.
Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 2 разработали как 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды или 3-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды, или 2-10-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды. 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. 3-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по три нуклеозида. 2-10-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 14 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по два нуклеозида. Каждый нуклеозид в 5' сегменте крыла, и каждый нуклеозид в 3' сегменте крыла имеет МОЕ модификацию сахара. Каждый нуклеозид в центральном сегменте гэп имеет дезокси-сахарную модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Колонка «мотив» указывает структуру гэп и крыльев каждого химерного олигонуклеотида. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 2, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1).
Таблица 2
Ингибирование уровней мРНК HBV действием МОЕ химерных олигонуклеотидов, направленных на SEQ ID NO:1 (обнаружено по RTS3370, RTS3371, RTS3372 и RTS3373MGB)
Сайт инициации
Терминирующий сайт
№ ISIS
Последовательность
RTS3370% ингибирование
RTS3371% ингибирование
RTS3372% ингибирование
RTS3373 MGB % ингибирование
Мотив
SEQ ID NO
58
77
146779
GAACTGGACCACCAGCAGG
76
80
82
81
5-10-5
83
58
71
510019
GAGCCACCAGCAGG
38
32
45
31
2-10-2
84
61
80
505314
CCTGAACTGGAGCCACCAGC
68
71
67
66
5-10-5
85
62
77
509941
GAACTGGAGCCACCAG
36
32
71
53
3-10-3
86
196
215
505315
AAAAACCCCGCCTGTAACAC
69
74
80
88
5-10-5
87
199
218
505316
AAGAAAAACCCCGCCTGTAA
60
60
64
64
5-10-5
88
205
224
505317
GTCAACAAGAAAAACCCCGC
85
83
79
85
5-10-5
89
228
241
510020
GTATTGTGAGGATT
28
18
0
16
2-10-2
90
229
242
510021
GGTATTGTGAGGAT
40
37
19
34
2-10-2
91
244
263
146821
CACCACGAGTCTAGACTCTG
74
73
62
75
5-10-5
92
245
260
509942
CACGAGTCTAGACTCT
18
15
45
46
3-10-3
93
245
258
510022
CGAGTCTAGACTCT
32
26
23
19
2-10-2
94
246
261
509943
CCACGAGTCTAGACTC
34
35
63
60
3-10-3
95
247
266
505318
GTCCACCACGAGTCTAGACT
75
77
64
75
5-10-5
96
250
269
509921
GAAGTCCACCACGAGTCTAG
46
46
39
40
5-10-5
97
250
265
509944
TCCACCACGAGTCTAG
38
39
65
59
3-10-3
98
251
270
509922
AGAAGTCCACCACGAGTCTA
55
56
17
38
5-10-5
99
251
266
509945
GTCCACCACGAGTCTA
34
35
64
51
3-10-3
100
252
271
509923
GAGAAGTCCACCACGAGTCT
39
38
39
33
5-10-5
101
252
267
509946
AGTCCACCACGAGTCT
47
51
50
45
3-10-3
102
253
272
505319
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
88
83
80
78
5-10-5
103
253
268
509947
AAGTCCACCACGAGTC
46
50
56
46
3-10-3
104
254
273
509924
GAGAGAAGTCCACCACGAGT
43
40
49
44
5-10-5
105
254
269
509948
GAAGTCCACCACGAGT
41
46
51
44
3-10-3
106
254
267
510023
AGTCCACCACGAGT
41
32
47
48
2-10-2
107
255
274
509925
TGAGAGAAGTCCACCACGAG
50
57
55
55
5-10-5
108
255
270
509949
AGAAGTCCACCACGAG
40
41
52
34
3-10-3
109
255
268
510024
AAGTCCACCACGAG
26
29
19
23
2-10-2
110
256
275
505320
TTGAGAGAAGTCCACCACGA
51
57
55
66
5-10-5
111
256
271
509950
GAGAAGTCCACCACGA
30
31
43
33
3-10-3
112
256
269
510025
GAAGTCCACCACGA
44
38
53
54
2-10-2
113
257
270
510026
AGAAGTCCACCACG
39
42
32
25
2-10-2
114
258
273
509952
GAGAGAAGTCCACCAC
54
52
60
48
3-10-3
115
258
271
510027
GAGAAGTCCACCAC
29
30
25
19
2-10-2
116
259
274
509953
TGAGAGAAGTCCACCA
39
44
47
38
3-10-3
117
259
272
510028
AGAGAAGTCCACCA
31
29
3
15
2-10-2
118
260
273
510029
GAGAGAAGTCCACC
21
19
23
18
2-10-2
119
261
274
510030
TGAGAGAAGTCCAC
16
22
21
20
2-10-2
120
262
281
505321
AGAAAATTGAGAGAAGTCCA
53
58
52
56
5-10-5
121
265
284
505322
CCTAGAAAATTGAGAGAAGT
62
65
69
67
5-10-5
122
293
312
505323
ATTTTGGCCAAGACACACGG
86
84
81
85
5-10-5
123
296
315
505324
CGAATTTTGGCCAAGACACA
67
67
69
64
5-10-5
124
302
321
505325
GGACTGCGAATTTTGGCCAA
77
75
73
76
5-10-5
125
360
379
505326
TCCAGCGATAACCAGGACAA
89
90
77
91
5-10-5
126
366
385
505327
GACACATCCAGCGATAACCA
83
85
75
86
5-10-5
127
369
388
505328
GCAGACACATCCAGCGATAA
65
68
49
57
5-10-5
128
384
399
509954
GATAAAACGCCGCAGA
37
46
53
35
3-10-3
129
384
397
510031
TAAAACGCCGCAGA
36
36
33
33
2-10-2
130
385
398
510032
ATAAAACGCCGCAG
12
7
19
15
2-10-2
131
386
401
509955
ATGATAAAACGCCGCA
49
55
57
53
3-10-3
132
386
399
510033
GATAAAACGCCGCA
39
39
45
37
2-10-2
133
387
400
510034
TGATAAAACGCCGC
40
37
29
39
2-10-2
134
388
401
510035
ATGATAAAACGCCG
22
24
9
22
2-10-2
135
411
430
505329
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
60
64
47
55
5-10-5
136
411
426
509956
GCATAGCAGCAGGATG
62
64
71
60
3-10-3
137
411
424
510036
ATAGCAGCAGGATG
44
34
30
48
2-10-2
138
412
431
509926
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
45
54
71
62
5-10-5
139
412
427
509957
GGCATAGCAGCAGGAT
72
75
80
71
3-10-3
140
412
425
510037
CATAGCAGCAGGAT
29
24
24
20
2-10-2
141
413
432
509927
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
54
58
54
49
5-10-5
142
413
428
509958
AGGCATAGCAGCAGGA
63
66
68
64
3-10-3
143
413
426
510038
GCATAGCAGCAGGA
55
54
37
46
2-10-2
144
414
433
505330
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
85
87
74
82
5-10-5
20
414
429
509959
GAGGCATAGCAGCAGG
64
64
80
68
3-10-3
145
414
427
510039
GGCATAGCAGCAGG
58
54
41
45
2-10-2
146
415
430
509960
TGAGGCATAGCAGCAG
59
59
66
64
3-10-3
147
415
428
510040
AGGCATAGCAGCAG
58
55
38
41
2-10-2
148
416
431
509961
ATGAGGCATAGCAGCA
56
54
65
56
3-10-3
149
416
429
510041
GAGGCATAGCAGCA
64
62
64
57
2-10-2
150
417
432
509962
GATGAGGCATAGCAGC
57
52
58
49
3-10-3
151
417
430
510042
TGAGGCATAGCAGC
48
50
55
48
2-10-2
152
418
433
509963
AGATGAGGCATAGCAG
50
52
64
51
3-10-3
153
418
431
510043
ATGAGGCATAGCAG
36
31
36
26
2-10-2
154
419
434
509964
AAGATGAGGCATAGCA
48
47
72
65
3-10-3
155
419
432
510044
GATGAGGCATAGCA
44
28
0
14
2-10-2
156
420
435
509965
GAAGATGAGGCATAGC
45
41
65
62
3-10-3
157
420
433
510045
AGATGAGGCATAGC
41
43
37
29
2-10-2
158
421
436
509966
AGAAGATGAGGCATAG
32
29
64
51
3-10-3
159
421
434
510046
AAGATGAGGCATAG
21
18
26
27
2-10-2
160
422
437
509967
AAGAAGATGAGGCATA
21
17
55
46
3-10-3
161
422
435
510047
GAAGATGAGGCATA
25
24
23
25
2-10-2
162
423
436
510048
AGAAGATGAGGCAT
21
17
25
19
2-10-2
163
424
437
510049
AAGAAGATGAGGCA
17
11
38
27
2-10-2
164
454
473
505331
ACGGGCAACATACCTTGATA
55
57
65
60
5-10-5
165
457
476
505332
CAAACGGGCAACATACCTTG
73
77
77
74
5-10-5
166
457
472
509968
CGGGCAACATACCTTG
60
61
73
70
3-10-3
167
458
473
509969
ACGGGCAACATACCTT
58
63
64
58
3-10-3
168
458
471
510050
GGGCAACATACCTT
58
56
57
46
2-10-2
169
459
472
510051
CGGGCAACATACCT
49
43
47
37
2-10-2
170
460
473
510052
ACGGGCAACATACC
50
50
54
51
2-10-2
171
463
482
505333
AGAGGACAAACGGGCAACAT
64
68
64
71
5-10-5
172
466
485
505334
ATTAGAGGACAAACGGGCAA
59
62
42
69
5-10-5
173
472
491
505335
CCTGGAATTAGAGGACAAAC
78
81
73
86
5-10-5
174
475
494
505336
GATCCTGGAATTAGAGGACA
56
65
61
72
5-10-5
175
639
654
509970
GGCCCACTCCCATAGG
38
55
74
48
3-10-3
176
641
656
509971
GAGGCCCACTCCCATA
30
46
77
54
3-10-3
177
642
657
509972
TGAGGCCCACTCCCAT
58
57
84
66
3-10-3
178
643
658
509973
CTGAGGCCCACTCCCA
38
53
70
66
3-10-3
179
670
689
146823
GGCACTAGTAAACTGAGCCA
61
64
63
63
5-10-5
180
670
685
509974
CTAGTAAACTGAGCCA
71
71
78
80
3-10-3
181
670
683
510053
AGTAAACTGAGCCA
49
48
52
53
2-10-2
182
671
684
510054
TAGTAAACTGAGCC
41
38
19
30
2-10-2
183
672
685
510055
CTAGTAAACTGAGC
25
27
42
47
2-10-2
184
673
692
505337
AATGGCACTAGTAAACTGAG
34
46
49
52
5-10-5
185
679
698
505338
TGAACAAATGGCACTAGTAA
74
77
71
80
5-10-5
186
682
701
505339
CACTGAACAAATGGCACTAG
82
83
71
82
5-10-5
187
687
702
509975
CCACTGAACAAATGGC
72
73
76
80
3-10-3
188
688
707
505340
ACGAACCACTGAACAAATGG
69
69
78
76
5-10-5
189
688
703
509976
ACCACTGAACAAATGG
47
48
67
65
3-10-3
190
689
704
509977
AACCACTGAACAAATG
33
33
39
41
3-10-3
191
690
705
509978
GAACCACTGAACAAAT
50
49
63
48
3-10-3
192
691
710
505341
CCTACGAACCACTGAACAAA
64
70
70
72
5-10-5
193
691
706
509979
CGAACCACTGAACAAA
67
66
78
77
3-10-3
194
691
704
510056
AACCACTGAACAAA
36
36
23
32
2-10-2
195
692
705
510057
GAACCACTGAACAA
45
44
51
43
2-10-2
196
693
706
510058
CGAACCACTGAACA
59
52
48
49
2-10-2
197
697
716
505342
GAAAGCCCTACGAACCACTG
76
80
73
83
5-10-5
198
738
753
509980
ССАСАТСАТССАТАТА
40
33
62
54
3-10-3
199
738
751
510059
АСАТСАТССАТАТА
19
9
30
27
2-10-2
200
739
754
509981
АССАСАТСАТССАТАТ
76
78
93
85
3-10-3
201
739
752
510060
САСАТСАТССАТАТ
45
35
24
17
2-10-2
202
740
753
510061
ССАСАТСАТССАТА
52
49
43
40
2-10-2
203
741
754
510062
АССАСАТСАТССАТ
44
45
48
47
2-10-2
204
756
775
505343
TGTACAGACTTGGCCCCCAA
47
56
55
68
5-10-5
205
823
842
505344
AGGGTTTAAATGTATACCCA
66
71
64
72
5-10-5
206
1170
1189
505345
GCAAACACTTGGCACAGACC
76
80
35
70
5-10-5
207
1176
1191
509982
CAGCAAACACTTGGCA
42
44
56
54
3-10-3
208
1177
1192
509983
TCAGCAAACACTTGGC
60
54
74
70
3-10-3
209
1259
1278
505346
CCGCAGTATGGATCGGCAGA
88
82
57
80
5-10-5
210
1261
1276
509984
GCAGTATGGATCGGCA
61
58
65
72
3-10-3
211
1262
1281
505347
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
84
81
71
83
5-10-5
212
1268
1287
505348
CTAGGAGTTCCGCAGTATGG
78
68
70
79
5-10-5
213
1271
1290
505349
CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA
47
54
59
61
5-10-5
214
1277
1296
505350
AACAAGCGGCTAGGAGTTCC
55
62
69
69
5-10-5
215
1280
1299
505351
CAAAACAAGCGGCTAGGAGT
20
49
49
54
5-10-5
216
1283
1302
505352
GAGCAAAACAAGCGGCTAGG
53
83
73
87
5-10-5
217
1286
1305
505353
TGCGAGCAAAACAAGCGGCT
64
73
68
78
5-10-5
218
1413
1426
510063
ACAAAGGACGTCCC
14
8
0
0
2-10-2
219
1515
1534
505354
GAGGTGCGCCCCGTGGTCGG
68
81
61
80
5-10-5
220
1518
1537
505355
AGAGAGGTGCGCCCCGTGGT
59
75
75
84
5-10-5
221
1521
1540
505356
TAAAGAGAGGTGCGCCCCGT
63
76
83
78
5-10-5
222
1550
1563
510064
AAGGCACAGACGGG
35
38
25
32
2-10-2
223
1577
1596
146786
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
88
91
84
93
5-10-5
224
1580
1599
505357
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
70
75
71
82
5-10-5
225
1583
1602
505358
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
77
82
72
84
5-10-5
226
1586
1605
505359
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
72
73
67
80
5-10-5
227
1655
1674
505360
AGTCCAAGAGTCCTCTTATG
66
68
54
68
5-10-5
228
1706
1719
510065
CAGTCTTTGAAGTA
19
19
26
17
2-10-2
229
1778
1793
509985
TATGCCTACAGCCTCC
64
60
64
63
3-10-3
230
1779
1794
509986
TTATGCCTACAGCCTC
66
66
77
73
3-10-3
231
1780
1795
509987
TTTATGCCTACAGCCT
56
55
68
67
3-10-3
232
1781
1796
509988
ATTTATGCCTACAGCC
52
52
68
63
3-10-3
233
1782
1797
509989
AATTTATGCCTACAGC
48
44
70
59
3-10-3
234
1783
1798
509990
CAATTTATGCCTACAG
24
18
39
40
3-10-3
235
1784
1799
509991
CCAATTTATGCCTACA
37
37
55
55
3-10-3
236
1785
1800
509992
ACCAATTTATGCCTAC
35
36
60
55
3-10-3
237
1806
1825
505361
AAAGTTGCATGGTGCTGGTG
42
55
75
61
5-10-5
238
1809
1828
505362
GAAAAAGTTGCATGGTGCTG
45
56
64
53
5-10-5
239
1812
1831
505363
GGTGAAAAAGTTGCATGGTG
71
70
80
72
5-10-5
240
1815
1834
505364
AGAGGTGAAAAAGTTGCATG
51
57
77
82
5-10-5
241
1818
1837
505365
GGCAGAGGTGAAAAAGTTGC
54
63
76
78
5-10-5
242
1821
1840
505366
TTAGGCAGAGGTGAAAAAGT
61
65
80
66
5-10-5
243
1822
1837
509993
GGCAGAGGTGAAAAAG
47
51
74
54
3-10-3
244
1823
1838
509994
AGGCAGAGGTGAAAAA
47
40
76
54
3-10-3
245
1824
1843
505367
TGATTAGGCAGAGGTGAAAA
41
39
62
29
5-10-5
246
1824
1839
509995
TAGGCAGAGGTGAAAA
46
42
79
59
3-10-3
247
1826
1839
510066
TAGGCAGAGGTGAA
40
33
44
31
2-10-2
248
1827
1846
505368
AGATGATTAGGCAGAGGTGA
27
46
62
51
5-10-5
249
1861
1880
146787
AGCTTGGAGGCTTGAACAGT
59
61
65
72
5-10-5
250
1864
1883
505369
CACAGCTTGGAGGCTTGAAC
11
21
48
31
5-10-5
251
1865
1880
509996
AGCTTGGAGGCTTGAA
13
1
45
40
3-10-3
252
1865
1878
510067
CTTGGAGGCTTGAA
22
17
20
14
2-10-2
253
1866
1881
509997
CAGCTTGGAGGCTTGA
29
19
51
45
3-10-3
254
1866
1879
510068
GCTTGGAGGCTTGA
24
25
37
32
2-10-2
255
1867
1886
505370
AGGCACAGCTTGGAGGCTTG
32
36
58
33
5-10-5
63
1867
1882
509998
ACAGCTTGGAGGCTTG
1
4
23
12
3-10-3
256
1867
1880
510069
AGCTTGGAGGCTTG
23
24
17
23
2-10-2
257
1868
1883
509999
CACAGCTTGGAGGCTT
5
1
48
41
3-10-3
258
1868
1881
510070
CAGCTTGGAGGCTT
21
20
0
18
2-10-2
259
1869
1884
510000
GCACAGCTTGGAGGCT
14
10
50
37
3-10-3
260
1869
1882
510071
ACAGCTTGGAGGCT
19
22
24
27
2-10-2
261
1870
1889
505371
CCAAGGCACAGCTTGGAGGC
27
40
68
38
5-10-5
69
1870
1885
510001
GGCACAGCTTGGAGGC
10
12
43
16
3-10-3
262
1870
1883
510072
CACAGCTTGGAGGC
28
31
33
30
2-10-2
263
1871
1886
510002
AGGCACAGCTTGGAGG
24
20
46
25
3-10-3
264
1871
1884
510073
GCACAGCTTGGAGG
20
18
22
15
2-10-2
265
1872
1887
510003
AAGGCACAGCTTGGAG
6
0
45
24
3-10-3
266
1872
1885
510074
GGCACAGCTTGGAG
18
18
32
23
2-10-2
267
1873
1892
505372
CACCCAAGGCACAGCTTGGA
18
8
55
16
5-10-5
268
1873
1888
510004
CAAGGCACAGCTTGGA
9
0
31
15
3-10-3
269
1873
1886
510075
AGGCACAGCTTGGA
23
9
27
10
2-10-2
270
1874
1889
510005
CCAAGGCACAGCTTGG
0
0
39
25
3-10-3
271
1876
1895
505373
AGCCACCCAAGGCACAGCTT
47
50
69
56
5-10-5
272
1879
1898
505374
CAAAGCCACCCAAGGCACAG
27
27
55
30
5-10-5
273
1882
1901
505375
CCCCAAAGCCACCCAAGGCA
34
40
54
39
5-10-5
274
1885
1904
505376
ATGCCCCAAAGCCACCCAAG
41
43
54
52
5-10-5
275
1888
1907
505377
TCCATGCCCCAAAGCCACCC
40
42
72
40
5-10-5
276
1891
1910
505378
ATGTCCATGCCCCAAAGCCA
35
33
70
40
5-10-5
277
1918
1933
510006
СТССАААТТСТТТАТА
9
2
53
41
3-10-3
278
1918
1931
510076
ССАААТТСТТТАТА
28
22
7
22
2-10-2
279
1919
1934
510007
GCTCCAAATTCTTTAT
43
39
72
57
3-10-3
280
1919
1932
510077
ТССАААТТСТТТАТ
19
11
0
2
2-10-2
281
1920
1933
510078
СТССАААТТСТТТА
19
11
0
0
2-10-2
282
1921
1934
510079
GCTCCAAATTCTTT
50
48
61
55
2-10-2
283
1957
1976
505379
GGAAAGAAGTCAGAAGGCAA
17
14
81
39
5-10-5
284
2270
2285
510008
GTGCGAATCCACACTC
21
4
36
11
3-10-3
285
2270
2283
510080
GCGAATCCACACTC
32
29
41
33
2-10-2
286
2271
2284
510081
TGCGAATCCACACT
28
20
25
11
2-10-2
287
2272
2285
510082
GTGCGAATCCACAC
28
20
32
22
2-10-2
288
2368
2387
505380
GAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
24
22
90
48
5-10-5
289
2378
2393
510009
CGAGGCGAGGGAGTTC
12
1
65
10
3-10-3
290
2378
2391
510083
AGGCGAGGGAGTTC
17
18
29
25
2-10-2
291
2379
2394
510010
GCGAGGCGAGGGAGTT
18
13
82
37
3-10-3
292
2379
2392
510084
GAGGCGAGGGAGTT
29
22
54
30
2-10-2
293
2380
2395
510011
TGCGAGGCGAGGGAGT
13
11
69
44
3-10-3
294
2380
2393
510085
CGAGGCGAGGGAGT
25
20
53
42
2-10-2
295
2381
2396
510012
CTGCGAGGCGAGGGAG
17
14
79
53
3-10-3
296
2381
2394
510086
GCGAGGCGAGGGAG
33
29
66
48
2-10-2
297
2382
2397
510013
TCTGCGAGGCGAGGGA
18
4
77
47
3-10-3
298
2420
2439
505381
CCGAGATTGAGATCTTCTGC
12
18
83
28
5-10-5
299
2459
2478
505382
CCCACCTTATGAGTCCAAGG
14
19
80
36
5-10-5
300
2819
2838
505383
TGTTCCCAAGAATATGGTGA
29
32
78
44
5-10-5
301
2820
2835
510014
TCCCAAGAATATGGTG
10
10
68
40
3-10-3
302
2821
2836
510015
TTCCCAAGAATATGGT
5
0
62
24
3-10-3
303
2822
2837
510016
GTTCCCAAGAATATGG
6
2
42
16
3-10-3
304
2823
2838
510017
TGTTCCCAAGAATATG
18
18
47
18
3-10-3
305
2824
2839
510018
TTGTTCCCAAGAATAT
7
5
57
19
3-10-3
306
2825
2838
510087
TGTTCCCAAGAATA
25
20
44
25
2-10-2
307
2873
2892
505384
GAAAGAATCCCAGAGGATTG
8
4
61
22
5-10-5
308
3161
3180
146833
ACTGCATGGCCTGAGGATGA
47
46
82
54
5-10-5
309
3163
3182
505385
CCACTGCATGGCCTGAGGAT
25
34
69
19
5-10-5
310
Пример 3: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepAD38 (Tet-HBV) химерными олигонуклеотидами МОЕ
Некоторые антисмысловые олигонуклеотиды, выбранные из исследования, описанного в Примере 2, испытали на их влияние на мРНК HBV в другой клеточной линии, клетках гепатомы человека HepAD38, в которых выработка HBV контролируется тетрациклин-регулируемым промотором. Культивированные клетки HepAD38 (Tet-HBV) при плотности 45000 клеток на лунку трансфицировали при помощи электропорации 15000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПНР в реальном времени. Наборы вирусных затравочных зондов RTS3372 и RTS3373MGB использовали по отдельности для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены в Таблице 3 как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Таблица 3
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV МОЕ химерными олигонуклеотидами в клетках HepAD38 (Tet-HBV) (обнаружено по RTS3372 и RTS3373MGB)
Сайт инициации
Терминирующий сайт
№ ISIS
Мотив
RTS3373MGB % ингибирование
RTS3372% ингибирование
SEQ ID NO
58
77
146779
5-10-5
76
82
83
58
71
510019
5-10-5
0
9
84
61
80
505314
5-10-5
65
75
85
196
215
505315
5-10-5
46
65
87
199
218
505316
5-10-5
57
71
88
205
224
505317
5-10-5
83
87
89
228
241
510020
2-10-2
6
0
90
229
242
510021
2-10-2
19
24
91
244
263
146821
5-10-5
72
71
92
245
258
510022
2-10-2
6
24
94
247
266
505318
5-10-5
68
77
96
250
269
509921
5-10-5
25
47
97
251
270
509922
5-10-5
28
46
99
252
271
509923
5-10-5
19
40
101
253
272
505319
5-10-5
69
66
103
254
273
509924
5-10-5
9
39
105
254
267
510023
2-10-2
19
15
107
255
274
509925
5-10-5
26
55
108
255
268
510024
2-10-2
0
5
110
256
275
505320
5-10-5
62
68
111
256
269
510025
2-10-2
0
8
113
257
270
510026
2-10-2
7
21
114
258
271
510027
2-10-2
0
0
116
259
272
510028
2-10-2
0
0
118
260
273
510029
2-10-2
0
9
119
261
274
510030
2-10-2
0
0
120
262
281
505321
5-10-5
53
54
121
265
284
505322
5-10-5
59
60
122
293
312
505323
5-10-5
65
77
123
296
315
505324
5-10-5
78
83
124
302
321
505325
5-10-5
71
80
125
360
379
505326
5-10-5
76
84
126
366
385
505327
5-10-5
77
83
127
369
388
505328
5-10-5
65
78
128
384
397
510031
2-10-2
0
16
130
385
398
510032
2-10-2
0
0
131
386
399
510033
2-10-2
1
21
133
387
400
510034
2-10-2
8
28
134
388
401
510035
2-10-2
0
0
135
411
430
505329
5-10-5
58
72
136
411
424
510036
2-10-2
6
11
138
412
431
509926
5-10-5
20
54
139
412
425
510037
2-10-2
0
10
141
413
432
509927
5-10-5
56
76
142
413
426
510038
2-10-2
54
68
144
414
433
505330
5-10-5
66
81
20
414
427
510039
2-10-2
60
74
146
415
428
510040
2-10-2
33
39
148
416
429
510041
2-10-2
30
58
150
417
430
510042
2-10-2
34
57
152
418
431
510043
2-10-2
0
2
154
419
432
510044
2-10-2
0
29
156
420
433
510045
2-10-2
3
31
158
421
434
510046
2-10-2
0
0
160
422
435
510047
2-10-2
0
0
162
423
436
510048
2-10-2
0
0
163
424
437
510049
2-10-2
0
0
164
454
473
505331
5-10-5
60
77
165
457
476
505332
5-10-5
55
74
166
458
471
510050
2-10-2
47
47
169
459
472
510051
2-10-2
35
55
170
460
473
510052
2-10-2
27
41
171
463
482
505333
5-10-5
66
78
172
466
485
505334
5-10-5
53
63
173
472
491
505335
5-10-5
70
76
174
475
494
505336
5-10-5
64
77
175
670
689
146823
5-10-5
74
79
180
670
683
510053
2-10-2
18
20
182
671
684
510054
2-10-2
13
21
183
672
685
510055
2-10-2
4
2
184
673
692
505337
5-10-5
60
72
185
679
698
505338
5-10-5
62
75
186
682
701
505339
5-10-5
81
90
187
688
707
505340
5-10-5
67
81
189
691
710
505341
5-10-5
68
80
193
691
704
510056
2-10-2
0
0
195
692
705
510057
2-10-2
37
48
196
693
706
510058
2-10-2
44
59
197
697
716
505342
5-10-5
80
87
198
738
751
510059
2-10-2
0
0
200
739
752
510060
2-10-2
0
0
202
740
753
510061
2-10-2
23
19
203
741
754
510062
2-10-2
25
30
204
756
775
505343
5-10-5
62
71
205
823
842
505344
5-10-5
52
66
206
1170
1189
505345
5-10-5
83
81
207
1259
1278
505346
5-10-5
84
81
210
1262
1281
505347
5-10-5
89
84
212
1268
1287
505348
5-10-5
78
78
213
1271
1290
505349
5-10-5
74
77
214
1277
1296
505350
5-10-5
75
77
215
1280
1299
505351
5-10-5
49
62
216
1283
1302
505352
5-10-5
70
66
217
1286
1305
505353
5-10-5
62
60
218
1413
1426
510063
2-10-2
0
0
219
1515
1534
505354
5-10-5
85
75
220
1518
1537
505355
5-10-5
81
74
221
1521
1540
505356
5-10-5
57
52
222
1550
1563
510064
2-10-2
0
0
223
1577
1596
146786
5-10-5
94
85
224
1580
1599
505357
5-10-5
86
79
225
1583
1602
505358
5-10-5
89
79
226
1586
1605
505359
5-10-5
82
68
227
1655
1674
505360
5-10-5
84
74
228
1706
1719
510065
2-10-2
0
0
229
1806
1825
505361
5-10-5
66
66
238
1809
1828
505362
5-10-5
52
59
239
1812
1831
505363
5-10-5
72
75
240
1815
1834
505364
5-10-5
73
80
241
1818
1837
505365
5-10-5
68
82
242
1821
1840
505366
5-10-5
50
76
243
1824
1843
505367
5-10-5
58
76
246
1826
1839
510066
2-10-2
0
31
248
1827
1846
505368
5-10-5
71
84
249
1861
1880
146787
5-10-5
25
35
250
1864
1883
505369
5-10-5
29
65
251
1865
1878
510067
2-10-2
0
0
253
1866
1879
510068
2-10-2
0
20
255
1867
1886
505370
5-10-5
45
70
63
1867
1880
510069
2-10-2
0
0
257
1868
1881
510070
2-10-2
0
0
259
1869
1882
510071
2-10-2
0
0
261
1870
1889
505371
5-10-5
48
66
69
1870
1883
510072
2-10-2
0
0
263
1871
1884
510073
2-10-2
0
0
265
1872
1885
510074
2-10-2
0
2
267
1873
1892
505372
5-10-5
48
67
268
1873
1886
510075
2-10-2
0
0
270
1876
1895
505373
5-10-5
23
48
272
1879
1898
505374
5-10-5
0
34
273
1882
1901
505375
5-10-5
39
66
274
1885
1904
505376
5-10-5
0
40
275
1888
1907
505377
5-10-5
4
47
276
1891
1910
505378
5-10-5
65
77
277
1918
1931
510076
2-10-2
0
0
279
1919
1932
510077
2-10-2
0
0
281
1920
1933
510078
2-10-2
0
0
282
1921
1934
510079
2-10-2
18
50
283
1957
1976
505379
5-10-5
42
84
284
2270
2283
510080
2-10-2
0
0
286
2271
2284
510081
2-10-2
0
0
287
2272
2285
510082
2-10-2
0
10
288
2368
2387
505380
5-10-5
29
79
289
2378
2391
510083
2-10-2
0
0
291
2379
2392
510084
2-10-2
31
17
293
2380
2393
510085
2-10-2
0
8
295
2381
2394
510086
2-10-2
10
2
297
2420
2439
505381
5-10-5
30
86
299
2459
2478
505382
5-10-5
16
87
300
2819
2838
505383
5-10-5
26
81
301
2825
2838
510087
2-10-2
0
0
307
2873
2892
505384
5-10-5
31
59
308
3161
3180
146833
5-10-5
55
76
309
3163
3182
505385
5-10-5
58
83
310
Пример 4: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepAD38 (Tet-HBV) химерными олигонуклеотидами МОЕ
Некоторые антисмысловые олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примерах 1 и 2, испытали на их влияние на мРНК HBV in vitro. Культивированные клетки HepAD38 (Tet-HBV) при плотности 45000 клеток на лунку трансфицировали при помощи электропорации 15000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПНР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3372. При помощи набора затравочных зондов RTS3373MGB измерили также уровни мРНК. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены в Таблице 4 как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Таблица 4
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV МОЕ химерными олигонуклеотидами (RTS3372 и RTS3373MGB)
Сайт инициации
Терминирующий сайт
№ ISIS
Мотив
RTS3372% ингибирование
RTS3373MGB % ингибирование
SEQ ID NO
62
77
509941
3-10-3
36
5
86
245
260
509942
3-10-3
3
0
93
245
261
510088
3-10-4
24
10
5
246
261
509943
3-10-3
27
13
95
250
265
509944
3-10-3
46
34
98
250
266
510089
3-10-4
61
33
6
251
266
509945
3-10-3
54
43
100
251
267
510090
3-10-4
58
32
7
252
267
509946
3-10-3
50
28
102
252
268
510091
3-10-4
60
42
8
253
268
509947
3-10-3
49
40
104
253
269
510092
3-10-4
40
9
9
254
269
509948
3-10-3
13
22
106
254
270
510093
3-10-4
39
2
10
255
270
509949
3-10-3
33
24
109
255
271
510094
3-10-4
40
16
11
256
271
509950
3-10-3
31
23
112
256
272
510095
3-10-4
24
6
12
257
273
510096
3-10-4
62
44
13
258
273
509952
3-10-3
42
40
115
258
274
510097
3-10-4
65
48
14
259
274
509953
3-10-3
35
29
117
384
399
509954
3-10-3
35
18
129
384
400
510098
3-10-4
62
43
15
385
401
510099
3-10-4
67
50
16
386
401
509955
3-10-3
44
37
132
411
426
509956
3-10-3
67
53
137
411
427
510100
3-10-4
88
69
17
412
427
509957
3-10-3
86
76
140
412
428
510101
3-10-4
71
46
18
413
428
509958
3-10-3
78
74
143
413
429
510102
3-10-4
77
52
19
414
433
505330
5-10-5
81
60
20
414
429
509959
3-10-3
62
49
145
414
430
510103
3-10-4
9
5
21
415
434
509928
5-10-5
81
66
22
415
430
509960
3-10-3
67
57
147
415
431
510104
3-10-4
71
57
23
416
435
509929
5-10-5
82
69
24
416
431
509961
3-10-3
62
43
149
416
432
510105
3-10-4
81
64
25
417
436
509930
5-10-5
74
45
26
417
432
509962
3-10-3
59
48
151
417
433
510106
3-10-4
86
70
27
418
437
146783
5-10-5
19
3
28
418
433
509963
3-10-3
48
28
153
418
434
510107
3-10-4
74
51
29
419
434
509964
3-10-3
50
39
155
419
435
510108
3-10-4
67
50
30
420
435
509965
3-10-3
49
38
157
420
436
510109
3-10-4
12
13
31
421
436
509966
3-10-3
23
22
159
421
437
510110
3-10-4
34
16
32
422
437
509967
3-10-3
3
12
161
457
472
509968
3-10-3
56
38
167
457
473
510111
3-10-4
68
51
33
458
473
509969
3-10-3
53
39
168
639
658
146784
5-10-5
0
0
34
639
654
509970
3-10-3
51
15
176
639
655
510112
3-10-4
66
32
35
640
656
510113
3-10-4
70
31
36
641
656
509971
3-10-3
54
31
177
641
657
510114
3-10-4
67
45
37
642
657
509972
3-10-3
51
25
178
642
658
510115
3-10-4
73
50
38
643
658
509973
3-10-3
49
32
179
670
685
509974
3-10-3
74
67
181
687
706
509931
5-10-5
92
83
39
687
702
509975
3-10-3
72
71
188
687
703
510116
3-10-4
83
74
40
688
703
509976
3-10-3
46
52
190
688
704
510117
3-10-4
71
57
41
689
704
509977
3-10-3
18
22
191
689
705
510118
3-10-4
71
50
42
690
705
509978
3-10-3
57
37
192
690
706
510119
3-10-4
80
64
43
691
706
509979
3-10-3
65
55
194
738
753
509980
3-10-3
48
44
199
738
754
510120
3-10-4
70
54
44
739
754
509981
3-10-3
54
45
201
1176
1191
509982
3-10-3
44
36
208
1176
1192
510121
3-10-4
74
69
45
1177
1192
509983
3-10-3
57
53
209
1261
1276
509984
3-10-3
57
50
211
1778
1797
509932
5-10-5
30
76
46
1778
1793
509985
3-10-3
0
46
230
1778
1794
510122
3-10-4
0
60
47
1779
1798
509933
5-10-5
54
78
48
1779
1794
509986
3-10-3
56
81
231
1779
1795
510123
3-10-4
74
85
49
1780
1799
509934
5-10-5
69
84
50
1780
1795
509987
3-10-3
52
78
232
1780
1796
510124
3-10-4
75
84
51
1781
1800
509935
5-10-5
72
85
52
1781
1796
509988
3-10-3
57
68
232
1781
1797
510125
3-10-4
68
72
53
1782
1797
509989
3-10-3
46
41
234
1782
1798
510126
3-10-4
56
51
54
1783
1798
509990
3-10-3
16
25
234
1783
1799
510127
3-10-4
61
69
55
1784
1799
509991
3-10-3
41
41
236
1784
1800
510128
3-10-4
61
68
56
1785
1800
509992
3-10-3
43
43
237
1822
1837
509993
3-10-3
72
44
244
1822
1838
510129
3-10-4
66
33
57
1823
1838
509994
3-10-3
79
32
245
1823
1839
510130
3-10-4
49
31
58
1824
1839
509995
3-10-3
63
30
247
1865
1884
509936
5-10-5
74
59
59
1865
1880
509996
3-10-3
36
0
252
1865
1881
510131
3-10-4
26
0
60
1866
1885
509937
5-10-5
78
63
61
1866
1881
509997
3-10-3
5
0
254
1866
1882
510132
3-10-4
37
4
62
1867
1886
505370
5-10-5
54
17
63
1867
1882
509998
3-10-3
13
0
256
1867
1883
510133
3-10-4
42
25
64
1868
1887
509938
5-10-5
9
6
65
1868
1883
509999
3-10-3
47
6
258
1868
1884
510134
3-10-4
56
27
66
1869
1888
509939
5-10-5
64
29
67
1869
1884
510000
3-10-3
24
1
260
1869
1885
510135
3-10-4
70
43
68
1870
1889
505371
5-10-5
63
46
69
1870
1885
510001
3-10-3
39
12
262
1870
1886
510136
3-10-4
52
23
70
1871
1886
510002
3-10-3
10
0
264
1871
1887
510137
3-10-4
28
0
71
1872
1887
510003
3-10-3
21
0
266
1872
1888
510138
3-10-4
25
7
72
1873
1888
510004
3-10-3
21
38
269
1873
1889
510139
3-10-4
18
0
73
1874
1889
510005
3-10-3
8
0
271
1918
1933
510006
3-10-3
0
0
278
1918
1934
510140
3-10-4
81
67
74
1919
1934
510007
3-10-3
69
66
280
2270
2285
510008
3-10-3
23
0
285
2378
2397
509940
3-10-4
66
7
75
2378
2393
510009
3-10-3
23
0
290
2378
2394
510141
3-10-4
10
11
76
2379
2394
510010
3-10-3
39
6
292
2379
2395
510142
3-10-4
46
24
77
2380
2395
510011
3-10-3
33
23
294
2380
2396
510143
3-10-4
59
36
78
2381
2396
510012
3-10-3
38
22
296
2381
2397
510144
3-10-4
54
20
79
2382
2397
510013
3-10-3
42
0
298
2820
2835
510014
3-10-3
51
9
302
2820
2836
510145
3-10-4
68
19
80
2821
2836
510015
3-10-3
35
2
303
2821
2837
510146
3-10-4
65
15
81
2822
2837
510016
3-10-3
9
0
304
2822
2838
510147
3-10-4
30
0
85
2823
2838
510017
3-10-3
18
0
305
2824
2839
510018
3-10-3
24
5
306
Пример 5: Зависимое от дозы ингибирование вирусной РНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Некоторые химерные олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примерах 3 и 4, испытали при различных дозах в клетках HepG2.2.15 человека. Клетки поместили на планшет при плотности 25000 клеток на лунку и трансфицировали электропорацией антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 2, 5 мкМ, 5,0 мкМ, 10,0 мкМ и 20,0 мкМ, как показано в Таблице 5. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
50
Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC) каждого олигонуклеотида также представлены в Таблице 5. Как показано в Таблице 5, в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, существенно снизились уровни мРНК HBV зависимым от дозы образом.
Таблица 5
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3370
№ ISIS
2, 5 мкМ
5,0 мкМ
10,0 мкМ
20,0 мкМ
IC<sub>50</sub> (мкМ)
146786
33
50
54
81
5,7
505317
35
40
63
67
6,6
505323
16
33
48
63
11,1
505326
27
44
64
67
6,9
509929
21
44
60
62
8,4
509931
51
63
75
75
<2, 5
509957
37
53
57
70
5,4
509974
25
35
54
63
9, 5
509975
36
55
62
81
4,7
509981
7
23
35
52
18,8
510039
27
46
60
69
6,9
510040
10
28
43
59
13,4
510041
29
41
53
66
8,3
510058
9
34
42
63
11,9
Пример б: Зависимое от дозы ингибирование вирусной РНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Дополнительные химерные олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примерах 3 и 4, дополнительно испытали при различных дозах в клетках HepG2.2.15 человека. Клетки поместили на планшет при плотности 28000 клеток на лунку и трансфицировали при помощи реагента LipofectAMINE 2000 антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 15,625 нМ, 31,25 нМ, 62, 5 нМ, 125,0 нМ и 250,0 нМ, как показано в Таблице 6. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК
HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
50
Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC) каждого олигонуклеотида также представлены в Таблице 6. Как показано в Таблице 6, в некоторых клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, существенно снизились уровни мРНК HBV зависимым от дозы образом.
Таблица 6
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3370
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125,0 нМ
250,0 нМ
IC<sub>50</sub> (нМ)
146779
14
25
44
70
78
73,1
146786
10
35
64
85
93
49,4
146833
12
16
32
62
72
99,8
505317
19
31
44
69
83
65,2
505319
5
11
24
39
69
152,8
505323
2
11
26
68
90
85,4
505326
1
15
45
72
89
73,7
505327
0
4
12
56
74
128, 5
505329
3
16
33
51
64
130,4
505339
26
32
59
82
92
46,0
505342
10
4
34
69
74
95,7
505347
20
26
41
70
92
63,0
505356
0
0
0
38
69
182,0
505358
8
28
47
71
84
67,9
505382
5
0
3
26
19
>250,0
509926
0
6
18
42
67
159,3
509927
3
17
33
55
76
103,2
509929
7
19
36
60
69
102,9
509931
18
28
52
76
87
57,4
509934
14
14
40
61
76
89,3
509957
20
28
51
71
79
63,1
509958
12
17
37
56
76
96,4
509959
12
11
18
59
70
121,7
509960
9
19
30
57
74
103,4
509972
15
6
17
27
45
>250,0
509974
25
35
57
83
92
45,3
509975
33
44
45
61
80
53,1
509981
0
15
11
35
60
224,4
510007
0
0
15
31
45
>250,0
510038
12
19
48
73
84
68,9
510039
17
25
44
69
72
77,3
510040
17
20
23
59
72
108,6
510041
11
21
43
64
79
80, 5
510050
3
21
16
51
70
132,4
510058
7
9
16
22
46
>250,0
510079
0
6
11
29
32
>250,0
510100
18
34
50
79
83
56,1
510106
23
25
35
69
74
78,4
510116
20
44
65
79
91
42,6
510140
7
28
30
55
58
136, 5
При помощи набора затравочных зондов RTS3371 измерили также уровни мРНК. Результаты представлены в Таблице 7.
Таблица 7
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3371
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125,0 нМ
250,0 нМ
IC<sub>50</sub> (нМ)
146779
16
7
38
69
68
96,9
146786
28
39
65
86
93
35
146833
26
22
52
61
65
82,3
505317
18
33
40
77
84
61,4
505319
0
0
0
15
55
>250,0
505323
0
0
33
66
87
100, 5
505326
0
21
7
57
85
114,6
505327
0
0
40
50
63
132,3
505329
11
22
35
66
77
90,7
505342
15
0
1
40
59
190,1
505347
3
35
44
65
90
68,4
505356
0
0
3
42
76
153,2
505358
20
11
39
71
78
79,7
505382
0
0
0
0
0
>250,0
509926
0
4
14
55
72
130,6
509927
11
25
31
61
78
88,4
509929
11
26
41
70
77
75,8
509931
25
39
55
79
85
46,6
509934
0
25
32
54
65
119,9
509957
25
44
48
74
80
50,6
509958
24
18
20
57
72
114, 5
509959
2
9
31
52
65
132,3
509960
16
28
22
57
75
101,8
509972
3
5
1
39
60
236,3
509974
38
46
65
83
94
31,2
509975
30
7
24
49
67
148,2
509981
22
22
23
46
58
194,7
510007
3
0
15
33
39
>250,0
510038
16
22
50
76
84
62,9
510039
23
36
32
70
68
79,7
510040
18
15
41
59
67
101,9
510041
0
27
38
62
81
84, 5
510050
1
16
17
52
63
149
510058
20
19
40
44
51
214,1
510079
0
2
5
41
49
>250,0
510100
35
52
61
86
90
30,7
510106
27
23
5
75
81
87,9
510116
11
44
70
72
94
46, 5
510140
0
18
26
45
41
>250,0
Пример 7: Переносимость МОЕ химерных олигонуклеотидов, направленных на HBV, у мышей BALB/c
Мыши BALB/c mice (Charles River, штат Массачусетс) представляют собой многоцелевую модель мышей, которую часто использвют для испытаний безопасности и эффективности. Мышей обработали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из исследований, описанных выше, и оценили изменения уровней различных метаболических маркеров.
Испытание 1
Каждой мыши из группы четырех мышей BALB/c дважды в неделю, в течение 3 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 146779, ISIS 146786, ISIS 505317, ISIS 505319, ISIS 505330, ISIS 505332, ISIS 505339, ISIS 505346, ISIS 505347, ISIS 505358, ISIS 509929, ISIS 509931, ISIS 509932, ISIS 509934, ISIS 509957, ISIS 510100, ISIS 510106, ISIS 510116 и ISIS 510140. Группе из четырех мышей BALB/c дважды в неделю, в течение 3 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC (SEQ ID NO:320)), МОЕ химерного олигонуклеотида 5-10-5 без известной гомологии с какой-либо генной последовательностью человека или мыши. Другой группе из 4 мышей BALB/c дважды в неделю, в течение 3 недель, подкожно вводили PBS. Эта группа мышей служила в качестве контрольной группы. Через три дня после последней дозы в каждой временной точке измерили вес тела, мышей умертвили и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Вес тела и органов
Вес тела мышей измерили перед введением дозы и в конце каждого периода обработки. Вес тела представлен в Таблице 8 и выражен как процентное изменение от веса, измеренного перед началом обработки. В конце исследования измерили вес печени, селезенки и почек, значения представлены в Таблице 9 как процентная разница от веса соответствующего органа контрольного образца с PBS. Результаты показывают, что большинство олигонуклеотидов ISIS не приводят к каким-либо неблагоприятным эффектам на вес тела или органов.
Таблица 8
Изменение веса тела мышей BALB/c после обработки антисмысловым олигонуклеотидом (%)
Вес тела
PBS
9
ISIS 141923
9
ISIS 146779
11
ISIS 146786
9
ISIS 505317
10
ISIS 505319
14
ISIS 505330
11
ISIS 505332
10
ISIS 505339
14
ISIS 505346
12
ISIS 505347
16
ISIS 505358
12
ISIS 509929
8
ISIS 509931
9
ISIS 509932
21
ISIS 509934
14
ISIS 509957
10
ISIS 510100
10
ISIS 510106
15
ISIS 510116
16
ISIS 510140
19
Таблица 9
Изменение веса органов мышей BALB/c после обработки антисмысловым олигонуклеотидом (%)
Печень
Почки
Селезенка
PBS
-
-
-
ISIS 141923
3
-3
-9
ISIS 146779
10
1
13
ISIS 146786
19
-3
4
ISIS 505317
-4
-7
9
ISIS 505319
1
-16
23
ISIS 505330
12
-4
9
ISIS 505332
7
-2
14
ISIS 505339
5
-6
7
ISIS 505346
7
-6
0
ISIS 505347
12
-7
5
ISIS 505358
8
0
3
ISIS 509929
17
14
200
ISIS 509931
-4
-9
3
ISIS 509932
18
-9
79
ISIS 509934
6
-6
2
ISIS 509957
0
-2
15
ISIS 510100
2
1
8
ISIS 510106
5
-2
58
ISIS 510116
12
-8
7
ISIS 510140
20
-8
49
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на печеночную функцию, измерили концентрации трансаминаз в плазме при помощи автоматического клинического анализатора химического состава (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Измерили концентрации ALT (аланин-трансаминазы) и AST (аспартат-трансаминазы) в плазме и представили результаты, выраженные в МЕ/л, в Таблице 10. Измерили также уровни холестерина и триглицеридов в плазме, используя тот же клинический анализатор химического состава, и также представили результаты в Таблице 10.
Таблица 10
Влияние обработки антисмысловым олигонуклеотидом на метаболические маркеры в печени мышей BALB/c
ALT (МЕ/л)
AST (МЕ/л)
Холестерин (мг/дл)
Триглицериды (мг/дл)
PBS
37
58
114
238
ISIS 141923
36
57
114
234
ISIS 146779
43
56
121
221
ISIS 146786
53
76
118
327
ISIS 505317
68
103
117
206
ISIS 505319
136
152
144
168
ISIS 505330
281
194
119
188
ISIS 505332
67
70
123
226
ISIS 505339
113
111
135
249
ISIS 505346
56
63
128
234
ISIS 505347
79
83
122
347
ISIS 505358
78
175
112
214
ISIS 509929
111
166
61
175
ISIS 509931
635
508
110
179
ISIS 509932
92
113
118
131
ISIS 509934
38
89
97
176
ISIS 509957
159
229
85
173
ISIS 510100
90
87
86
222
ISIS 510106
61
88
79
239
ISIS 510116
70
95
124
214
ISIS 510140
1247
996
161
167
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на почечную функцию, измерили концентрации азота мочевины крови (BUN) при помощи автоматического клинического анализатора химического состава (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в Таблице 11.
Таблица 11
Влияние обработки антисмысловым олигонуклеотидом на почечные маркеры мышей BALB/c
BUN (мг/дл)
PBS
29
ISIS 141923
29
ISIS 146779
28
ISIS 146786
30
ISIS 505317
30
ISIS 505319
30
ISIS 505330
29
ISIS 505332
28
ISIS 505339
29
ISIS 505346
27
ISIS 505347
26
ISIS 505358
26
ISIS 509929
25
ISIS 509931
23
ISIS 509932
28
ISIS 509934
25
ISIS 509957
24
ISIS 510100
27
ISIS 510106
27
ISIS 510116
25
ISIS 510140
22
Испытание 2
Каждой мыши из группы четырех мышей BALB/c дважды в неделю, в течение 3 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 505329, ISIS 509926, ISIS 509927, ISIS 509958, ISIS 509959, ISIS 509960, ISIS 509974, ISIS 509975, ISIS 510038, ISIS 510039, ISIS 510040, ISIS 510041 и ISIS 510050. Группе из 4 мышей BALB/c дважды в неделю, в течение 3 недель, подкожно вводили PBS. Эта группа мышей служила в качестве контрольной группы. Через три дня после последней дозы в каждой временной точке измерили вес тела, мышей умертвили и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Вес органов
В конце исследования измерили вес печени, селезенки и почек, и значения также представлены в Таблице 12 как процентное изменение от веса соответствующего органа контрольного образца с PBS.
Таблица 12
Изменение веса органов мышей BALB/c после обработки антисмысловым олигонуклеотидом (%)
№ ISIS
Печень
Почки
Селезенка
505329
12
2
12
509926
23
3
30
509927
8
-4
27
509958
1
-4
9
509959
7
0
26
509960
16
6
30
509974
5
8
7
509975
1
-1
7
510038
6
4
23
510039
0
15
9
510040
3
1
2
510041
6
6
10
510050
5
5
18
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на печеночную функцию, измерили концентрации трансаминаз в плазме при помощи автоматического клинического анализатора химического состава (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Измерили концентрации ALT (аланин-трансаминазы) и AST (аспартат-трансаминазы) в плазме и представили результаты, выраженные в МЕ/л, в Таблице 13.
Таблица 13
Влияние обработки антисмысловым олигонуклеотидом на трансаминазы (МЕ/л) в печени мышей BALB/c
ALT
AST
PBS
37
78
ISIS 505329
48
65
ISIS 509926
77
120
ISIS 509927
71
92
ISIS 509958
106
105
ISIS 509959
119
122
ISIS 509960
40
66
ISIS 509974
38
43
ISIS 509975
33
45
ISIS 510038
69
66
ISIS 510039
32
61
ISIS 510040
83
113
ISIS 510041
32
45
ISIS 510050
26
47
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на почечную функцию, измерили концентрации азота мочевины крови (BUN) при помощи автоматического клинического анализатора химического состава (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в Таблице 14.
Таблица 14
Влияние обработки антисмысловым олигонуклеотидом на почечные маркеры мышей BALB/c
BUN
PBS
21
ISIS 505329
22
ISIS 509926
20
ISIS 509927
20
ISIS 509958
22
ISIS 509959
21
ISIS 509960
20
ISIS 509974
19
ISIS 509975
19
ISIS 510038
19
ISIS 510039
19
ISIS 510040
22
ISIS 510041
18
ISIS 510050
22
Пример 8: Завимое от дозы подтверждение направленного действия МОЕ химерных олигонуклеотидов на HBV в клетках HepG2.2.15
Химерные олигонуклеотиды выбрали на основании сохранения последовательности, активности и переносимости, по результатам измерения в исследовании, описанном в Примерах 7 и 8, и испытали в различных дозах на клетках HepG2.2.15. Клетки поместили на планшет при плотности 28000 клеток на лунку и трансфицировали при помощи реагента LipofectAMINE 2000 антисмысловым олигонуклеотидом в концентрациях 15,625 нМ, 31,25 нМ, 62, 5 нМ, 125,0 нМ и 250,0 нМ. Через два дня после трансфекции среду заменили свежей средой. Образцы собрали через 4 дня после трансфекции. В надосадочной жидкости измерили уровни ДНК, РНК, HBsAg и HBeAg.

Уровни мРНК HBV измерили количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками. Как показано в Таблице 15, уровни мРНК HBV снизились зависимым от дозы образом в большинстве клеток, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Антигены HBV в надосадочных жидкостях обнаружили при помощи иммуноферментого анализа твердофазного (ELISA). Уровни антигена HBs (HBsAg) обнаружили иммуноферментным твердофазным анализом компании Abazyme LLC, штат Массачусетс. Как показано в Таблице 16, обработка олигонуклеотидами ISIS 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 и 510116 вызвала существенное снижение уровней HBsAg. Уровни антигена НВе (HBeAg) обнаружили иммуноферментным твердофазным анализом компании International Immune-diagnostics, штат Калифорния. Как показано в Таблице 17, обработка олигонуклеотидами ISIS 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 и 510116 вызвала существенное снижение уровней HBeAg. Уровни ДНК HBV измерили при помощи набора затравочных зондов RTS3370. Как показано в Таблице 18, обработка олигонуклеотидами ISIS 146779, 146786, 505329, 505330, 505339, 505347, 505358, 509927, 509934, 509958, 509959, 509960, 509974, 5100038, 510039, 510040, 510041, 510100, 510106 и 510116 вызвала существенное снижение уровней ДНК HBV. Общее содержание белка в надосадочных жидкостях измерили DC анализом белка (BioRad), как показано в Таблице 19.
Таблица 15
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125 нМ
250 нМ
146779
10
25
42
64
95
146786
23
59
78
84
90
505329
45
49
57
69
83
505330
31
61
65
80
93
505339
31
56
78
89
97
505347
30
50
72
87
96
505358
28
52
75
86
95
509927
41
61
67
61
76
509934
38
61
64
82
58
509958
50
67
72
79
89
509959
50
63
73
80
86
509960
63
61
72
82
74
509974
29
44
75
91
96
510038
29
40
85
89
93
510039
32
34
63
84
84
510040
18
0
51
71
77
510041
34
53
67
76
71
510100
29
64
70
89
93
510106
28
65
64
81
85
510116
13
34
78
89
95
Таблица 16
Зависимое от дозы снижение антигена S в надосадочной жидкости клеток HepG2.2.15
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125 нМ
146779
40
58
80
92
146786
47
75
92
98
505329
37
58
71
89
505330
45
66
84
95
505339
62
79
93
96
505347
68
71
89
97
505358
69
83
92
96
509927
54
74
88
94
509934
40
59
78
89
509958
57
77
91
93
509959
54
72
84
100
509960
44
72
91
91
509974
58
77
92
95
510038
58
78
94
98
510039
53
74
89
95
510040
39
70
80
90
510041
47
65
82
92
510100
74
83
95
96
510106
54
75
86
92
510116
61
74
91
94
Таблица 17
Зависимое от дозы снижение антигена Е в надосадочной жидкости клеток HepG2.2.15
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125 нМ
146779
14
45
66
76
146786
26
58
75
80
505329
19
26
60
73
505330
28
70
69
80
505339
31
57
77
82
505347
24
33
64
77
505358
26
45
72
81
509927
34
54
72
79
509934
21
42
59
73
509958
29
45
72
77
509959
60
64
77
80
509960
19
36
67
77
509974
16
48
72
80
510038
20
35
79
80
510039
14
41
64
78
510040
0
8
37
69
510041
9
34
63
76
510100
26
52
73
81
510106
7
42
62
76
510116
27
56
76
81
Таблица 18
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование ДНК HBV в клетках HepG2.2.15
№ ISIS
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125 нМ
146779
71
71
84
85
146786
67
81
82
75
505329
53
65
72
67
505330
72
76
86
90
505339
83
85
89
88
505347
76
78
81
87
505358
79
82
90
87
509927
51
75
78
69
509934
61
60
64
75
509958
57
73
69
71
509959
59
54
73
73
509960
48
66
63
54
509974
76
90
84
85
510038
69
76
90
87
510039
70
79
81
86
510040
40
67
68
68
510041
53
71
62
68
510100
76
81
87
87
510106
46
74
73
76
510116
79
84
89
86
Таблица 19
Общие уровни белка в надосадочной жидкости клеток HepG2.2.15
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125 нМ
PBS
5601
5601
5601
5601
146779
6491
6631
6027
5067
146786
5408
5328
4839
3518
505329
5719
5285
5384
4994
505330
7514
7262
6627
5179
505339
6572
6343
5349
4550
505347
7315
6602
6378
5908
505358
6357
6871
5798
5720
509927
5581
5487
5145
3601
509934
5476
5610
5394
4127
509958
5193
5492
5071
3957
509959
5051
5312
5144
3893
509960
4726
5160
5071
3305
509974
6913
7624
5798
5389
510038
5707
6381
5772
6733
510039
5981
7629
4802
6156
510040
4302
5209
5049
4188
510041
5565
5607
5205
3757
510100
8466
8378
7985
6402
510106
5703
5940
5231
4005
510116
5880
5380
4797
4757
Пример 9: In vivo ингибирование мРНК HBV МОЕ химерными олигонуклеотиды у HBV-трансгенных мышей
ISIS 146786, МОЕ химерный олигонуклеотид 5-10-5, и ISIS 510100, МОЕ химерный олигонуклеотид 3-10-4 МОЕ, демонстрирующие существенное ингибирование мРНК HBV, испытали на трансгенных мышах, содержащих ген HBV (линия Chisari 1.3.32) (Guidotti, L.G. et al., J. Virol. 1995, 69, 6158-6169) и оценили эффективность указанных химерных олигонуклеотидов.
Обработка
Двум группам по десять-одиннадцать HBV-трансгенных самцов и самок мышей дважды в неделю, в течение четырех недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786 или ISIS 510100. Другой группе из 14 самцов и самок HBV-трансгенных мышей вводили энтекавир, пероральное противовирусное лекарство, которое используют для лечения инфекции гепатита В, в дозе 1 мг/кг, ежедневно в течение двух недель. Другой группе из 10 самцов и самок HBV-трансгенных самок мышей подкожно вводили PBS дважны в неделю, в течение четырех недель. Мышей, которым делали инъекции PBS, использовали в качестве контрольной группы. Измерили уровни мРНК и ДНК HBV, ALT в плазме и вес тела и органов.
Анализ РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР HBV в реальном времени, используя наборы затравочных зондов RTS3370, RTS3371 и RTS3372. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК HBV, по сравнению с контрольным образцом с PBS. Как показано в Таблице 20, обработка антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS привела к существенному снижению мРНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом, независимо от набора затравочных зондов, использованного для измерения. Энтекавир не снижает экспрессию мРНК HBV.
Таблица 20
Ингибирование мРНК HBV в печени HBV-трансгенных мышей по сравнению с PBS контролем
№ ISIS
RTS3370
RTS3371
RTS3372
146786
82
75
81
510100
93
83
89
Анализ ДНК
ДНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР HBV в реальном времени, используя наборы затравочных зондов RTS3370 и RTS3371. Уровни нормализовали к RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом с PBS. Как показано в Таблице 21, обработка антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS привела к существенному снижению ДНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом, независимо от набора затравочных зондов, использованного для измерения. Обработка энтекавиром, как и ожидалось, также снижает уровни ДНК.
Таблица 21
Ингибирование ДНК HBV в печени HBV-трансгенных мышей по сравнению с PBS контролем
№ ISIS
RTS3370
RTS3371
146786
65
69
510100
67
73
Энтекавир
75
96
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на печеночную функцию, измерили концентрации трансаминазы в плазме с использованием ручного клинического анализатора химическогосостава (Тесо Diagnostics, Анахайм, штат Калифорния). Измерили концентрации ALT (аланин-трансаминазы) и представили результаты, выраженные в МЕ/л, в Таблице 22. Эти результаты показывают, что антисмысловое ингибирование HBV не вызывает неблагоприятного действия на функцию печени мышей.
Таблица 22
Влияние обработки антисмысловым олигонуклеотидом на ALT в печени трансгенных мышей
МЕ/мл
PBS
12,7
ISIS 146786
24,1
ISIS 510100
25,8
Энтекавир
23,7
Данные этого исследования показывают, что ISIS 146786 and ISIS 510100 вызывают устойчивое снижение РНК и ДНК HBV в печени, и обработка этими олигонуклеотидами хорошо переносится трансгенными мышами.
Пример 10: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. В этот анализ включили также несколько антисмысловых олигонуклеотидов из исследований, описанных выше. Культивированные клетки HepG2.2.15 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице 23 были разработаны как 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды. Эти химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5' сегменте крыла, и каждый нуклеозид в 3' сегменте крыла имеет МОЕ модификацию сахара. Каждый нуклеозид в центральном сегменте гэп имеет дезокси-сахарную модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 23, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1).
Таблица 23
Ингибирование уровней мРНК HBV действием химерных антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на SEQ ID NO:1 (RTS3370)
Вирусный сайт инициации
Вирусный терминирующий сайт
№ ISIS
Последовательность
% ингибирования
SEQ ID NO
1
20
524410
TGGTGAAAGGTTGTGGAATT
70
321
4
23
524411
GTTTGGTGAAAGGTTGTGGA
51
322
7
26
524412
AGAGTTTGGTGAAAGGTTGT
47
323
10
29
524413
TGCAGAGTTTGGTGAAAGGT
74
324
13
32
524414
TCTTGCAGAGTTTGGTGAAA
91
325
16
35
524415
GGATCTTGCAGAGTTTGGTG
93
326
19
38
524416
CTGGGATCTTGCAGAGTTTG
85
327
22
41
524417
ACTCTGGGATCTTGCAGAGT
66
328
25
44
524418
CTCACTCTGGGATCTTGCAG
86
329
28
47
524419
CCTCTCACTCTGGGATCTTG
81
330
31
50
524420
AGGCCTCTCACTCTGGGATC
77
331
34
53
524421
TACAGGCCTCTCACTCTGGG
71
332
37
56
524422
AAATACAGGCCTCTCACTCT
68
333
40
59
524423
GGGAAATACAGGCCTCTCAC
43
334
43
62
524424
GCAGGGAAATACAGGCCTCT
76
335
46
65
524425
CCAGCAGGGAAATACAGGCC
89
336
49
68
524426
CCACCAGCAGGGAAATACAG
82
337
52
71
524427
GAGCCACCAGCAGGGAAATA
53
338
55
74
524428
CTGGAGCCACCAGCAGGGAA
76
339
56
75
524429
ACTGGAGCCACCAGCAGGGA
55
340
57
76
524430
AACTGGAGCCACCAGCAGGG
45
341
58
77
146779
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
57
83
59
78
524431
TGAACTGGAGCCACCAGCAG
85
342
60
79
524432
CTGAACTGGAGCCACCAGCA
90
343
61
80
505314
CCTGAACTGGAGCCACCAGC
93
85
62
81
524433
TCCTGAACTGGAGCCACCAG
79
344
63
82
524434
CTCCTGAACTGGAGCCACCA
82
345
65
84
524435
TGCTCCTGAACTGGAGCCAC
78
346
68
87
524436
TACTGCTCCTGAACTGGAGC
58
347
71
90
524437
GTTTACTGCTCCTGAACTGG
40
348
74
93
524438
AGGGTTTACTGCTCCTGAAC
45
349
77
96
524439
AACAGGGTTTACTGCTCCTG
69
350
80
99
524440
CGGAACAGGGTTTACTGCTC
67
351
83
102
524441
AGTCGGAACAGGGTTTACTG
47
352
86
105
524442
AGTAGTCGGAACAGGGTTTA
59
353
89
108
524443
GGCAGTAGTCGGAACAGGGT
47
354
92
111
524444
AGAGGCAGTAGTCGGAACAG
54
355
95
114
524445
GGGAGAGGCAGTAGTCGGAA
49
356
98
117
524446
TAAGGGAGAGGCAGTAGTCG
81
357
101
120
524447
CGATAAGGGAGAGGCAGTAG
86
358
104
123
524448
TGACGATAAGGGAGAGGCAG
79
359
107
126
524449
GATTGACGATAAGGGAGAGG
27
360
110
129
524450
GAAGATTGACGATAAGGGAG
53
361
113
132
524451
CGAGAAGATTGACGATAAGG
67
362
116
135
524452
CCTCGAGAAGATTGACGATA
84
363
119
138
524453
AATCCTCGAGAAGATTGACG
79
364
122
141
524454
CCCAATCCTCGAGAAGATTG
65
365
125
144
524455
GTCCCCAATCCTCGAGAAGA
66
366
128
147
524456
AGGGTCCCCAATCCTCGAGA
67
367
131
150
524457
CGCAGGGTCCCCAATCCTCG
76
368
134
153
524458
CAGCGCAGGGTCCCCAATCC
59
369
137
156
524459
GTTCAGCGCAGGGTCCCCAA
80
370
140
159
524460
CATGTTCAGCGCAGGGTCCC
90
371
143
162
524461
CTCCATGTTCAGCGCAGGGT
75
372
146
165
524462
GTTCTCCATGTTCAGCGCAG
54
373
149
168
524463
GATGTTCTCCATGTTCAGCG
27
374
152
171
524464
TGTGATGTTCTCCATGTTCA
72
375
158
177
524466
TCCTGATGTGATGTTCTCCA
91
376
161
180
524467
GAATCCTGATGTGATGTTCT
77
377
164
183
524468
TAGGAATCCTGATGTGATGT
77
378
167
186
524469
TCCTAGGAATCCTGATGTGA
94
379
170
189
524470
GGGTCCTAGGAATCCTGATG
56
380
188
207
524471
CGCCTGTAACACGAGAAGGG
65
381
191
210
524472
CCCCGCCTGTAACACGAGAA
71
382
194
213
524473
AAACCCCGCCTGTAACACGA
74
383
195
214
524474
AAAACCCCGCCTGTAACACG
72
384
196
215
505315
AAAAACCCCGCCTGTAACAC
52
87
197
216
524475
GAAAAACCCCGCCTGTAACA
38
385
198
217
524476
AGAAAAACCCCGCCTGTAAC
18
386
200
219
524477
CAAGAAAAACCCCGCCTGTA
86
387
203
222
524478
CAACAAGAAAAACCCCGCCT
84
388
204
223
524479
TCAACAAGAAAAACCCCGCC
80
389
205
224
505317
GTCAACAAGAAAAACCCCGC
84
89
206
225
524480
TGTCAACAAGAAAAACCCCG
79
390
207
226
524481
TTGTCAACAAGAAAAACCCC
76
391
209
228
524482
TCTTGTCAACAAGAAAAACC
86
392
212
231
524483
GATTCTTGTCAACAAGAAAA
57
393
215
234
524484
GAGGATTCTTGTCAACAAGA
51
394
218
237
524485
TGTGAGGATTCTTGTCAACA
83
395
221
240
524486
TATTGTGAGGATTCTTGTCA
61
396
224
243
524487
CGGTATTGTGAGGATTCTTG
74
397
227
246
524488
CTGCGGTATTGTGAGGATTC
49
398
230
249
524489
ACTCTGCGGTATTGTGAGGA
67
399
233
252
524490
TAGACTCTGCGGTATTGTGA
88
400
236
255
524491
GTCTAGACTCTGCGGTATTG
84
401
239
258
524492
CGAGTCTAGACTCTGCGGTA
82
402
242
261
524493
CCACGAGTCTAGACTCTGCG
94
403
243
262
524494
ACCACGAGTCTAGACTCTGC
87
404
244
263
146821
CACCACGAGTCTAGACTCTG
87
92
245
264
524495
CCACCACGAGTCTAGACTCT
80
405
246
265
524496
TCCACCACGAGTCTAGACTC
65
406
247
266
505318
GTCCACCACGAGTCTAGACT
65
96
248
267
524497
AGTCCACCACGAGTCTAGAC
46
407
249
268
524498
AAGTCCACCACGAGTCTAGA
54
408
250
269
509921
GAAGTCCACCACGAGTCTAG
35
97
251
270
509922
AGAAGTCCACCACGAGTCTA
51
99
252
271
509923
GAGAAGTCCACCACGAGTCT
49
101
253
272
505319
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
60
103
254
273
509924
GAGAGAAGTCCACCACGAGT
46
105
255
274
509925
TGAGAGAAGTCCACCACGAG
79
108
256
275
505320
TTGAGAGAAGTCCACCACGA
84
111
257
276
524499
ATTGAGAGAAGTCCACCACG
83
409
260
279
524500
AAAATTGAGAGAAGTCCACC
71
410
263
282
524501
TAGAAAATTGAGAGAAGTCC
67
411
266
285
524502
CCCTAGAAAATTGAGAGAAG
88
412
269
288
524503
TCCCCCTAGAAAATTGAGAG
82
413
272
291
524504
AGTTCCCCCTAGAAAATTGA
66
414
275
294
524505
GGTAGTTCCCCCTAGAAAAT
0
415
278
297
524506
CACGGTAGTTCCCCCTAGAA
65
416
281
300
524507
ACACACGGTAGTTCCCCCTA
87
417
284
303
524508
AAGACACACGGTAGTTCCCC
76
418
287
306
524509
GCCAAGACACACGGTAGTTC
61
419
290
309
524510
TTGGCCAAGACACACGGTAG
87
420
291
310
524511
TTTGGCCAAGACACACGGTA
87
421
292
311
524512
TTTTGGCCAAGACACACGGT
93
422
293
312
505323
ATTTTGGCCAAGACACACGG
83
123
294
313
524513
AATTTTGGCCAAGACACACG
79
423
295
314
524514
GAATTTTGGCCAAGACACAC
74
424
298
317
524515
TGCGAATTTTGGCCAAGACA
78
425
300
319
524516
ACTGCGAATTTTGGCCAAGA
71
426
301
320
524517
GACTGCGAATTTTGGCCAAG
71
427
302
321
505325
GGACTGCGAATTTTGGCCAA
50
125
303
322
524518
GGGACTGCGAATTTTGGCCA
55
428
321
340
524519
GTGAGTGATTGGAGGTTGGG
68
429
324
343
524520
TTGGTGAGTGATTGGAGGTT
84
430
327
346
524521
AGGTTGGTGAGTGATTGGAG
64
431
330
349
524522
AGGAGGTTGGTGAGTGATTG
58
432
333
352
524523
GACAGGAGGTTGGTGAGTGA
62
433
336
355
524524
GAGGACAGGAGGTTGGTGAG
56
434
339
358
524525
TTGGAGGACAGGAGGTTGGT
81
435
342
361
524526
AAGTTGGAGGACAGGAGGTT
77
436
345
364
524527
GACAAGTTGGAGGACAGGAG
69
437
348
367
524528
CAGGACAAGTTGGAGGACAG
82
438
351
370
524529
AACCAGGACAAGTTGGAGGA
67
439
354
373
524530
GATAACCAGGACAAGTTGGA
53
440
357
376
524531
AGCGATAACCAGGACAAGTT
55
441
358
377
524532
CAGCGATAACCAGGACAAGT
84
442
359
378
524533
CCAGCGATAACCAGGACAAG
86
443
360
379
505326
TCCAGCGATAACCAGGACAA
79
126
361
380
524534
ATCCAGCGATAACCAGGACA
85
444
362
381
524535
CATCCAGCGATAACCAGGAC
90
445
364
383
524536
CACATCCAGCGATAACCAGG
82
446
365
384
524537
ACACATCCAGCGATAACCAG
72
447
366
385
505327
GACACATCCAGCGATAACCA
61
127
367
386
524538
AGACACATCCAGCGATAACC
79
448
368
387
524539
CAGACACATCCAGCGATAAC
73
449
370
389
524540
CGCAGACACATCCAGCGATA
94
450
373
392
524541
CGCCGCAGACACATCCAGCG
84
451
390
409
524542
AGAGGAAGATGATAAAACGC
45
452
393
412
524543
TGAAGAGGAAGATGATAAAA
62
453
396
415
524544
GGATGAAGAGGAAGATGATA
58
454
399
418
524545
GCAGGATGAAGAGGAAGAT G
48
455
402
421
524546
GCAGCAGGATGAAGAGGAA G
60
456
405
424
524547
ATAGCAGCAGGATGAAGAGG
84
457
408
427
524548
GGCATAGCAGCAGGATGAAG
56
458
409
428
524549
AGGCATAGCAGCAGGATGAA
78
459
410
429
524550
GAGGCATAGCAGCAGGATGA
67
460
411
430
505329
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
85
136
412
431
509926
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
84
139
413
432
509927
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
68
142
414
433
505330
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
82
20
415
434
509928
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
83
22
416
435
509929
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
80
24
417
436
509930
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
78
26
418
437
146783
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
80
28
419
438
524551
CAAGAAGATGAGGCATAGCA
55
461
422
441
524552
CAACAAGAAGATGAGGCATA
90
462
425
444
524553
AACCAACAAGAAGATGAGGC
82
463
428
447
524554
AAGAACCAACAAGAAGATG А
79
464
431
450
524555
CAGAAGAACCAACAAGAAG А
72
465
434
453
524556
GTCCAGAAGAACCAACAAGA
87
466
437
456
524557
ATAGTCCAGAAGAACCAACA
72
467
440
459
524558
TTGATAGTCCAGAAGAACCA
76
468
443
462
524559
ACCTTGATAGTCCAGAAGAA
78
469
446
465
524560
CATACCTTGATAGTCCAGAA
77
470
449
468
524561
CAACATACCTTGATAGTCCA
69
471
452
471
524562
GGGCAACATACCTTGATAGT
39
472
455
474
524563
AACGGGCAACATACCTTGAT
72
473
456
475
524564
AAACGGGCAACATACCTTGA
86
474
457
476
505332
CAAACGGGCAACATACCTTG
85
166
458
477
524565
ACAAACGGGCAACATACCTT
80
475
459
478
524566
GACAAACGGGCAACATACCT
42
476
461
480
524567
AGGACAAACGGGCAACATAC
47
477
464
483
524568
TAGAGGACAAACGGGCAACA
81
478
467
486
524569
AATTAGAGGACAAACGGGCA
72
479
470
489
524570
TGGAATTAGAGGACAAACGG
84
480
471
490
524571
CTGGAATTAGAGGACAAACG
86
481
472
491
505335
CCTGGAATTAGAGGACAAAC
89
174
473
492
524572
TCCTGGAATTAGAGGACAAA
92
482
474
493
524573
ATCCTGGAATTAGAGGACAA
86
483
476
495
524574
GGATCCTGGAATTAGAGGAC
76
484
479
498
524575
TGAGGATCCTGGAATTAGAG
77
485
482
501
524576
GGTTGAGGATCCTGGAATTA
62
486
485
504
524577
GGTGGTTGAGGATCCTGGAA
73
487
488
507
524578
GCTGGTGGTTGAGGATCCTG
84
488
491
510
524579
CGTGCTGGTGGTTGAGGATC
79
489
494
513
524580
TCCCGTGCTGGTGGTTGAGG
83
490
497
516
524581
TGGTCCCGTGCTGGTGGTTG
66
491
500
519
524582
GCATGGTCCCGTGCTGGTGG
77
492
503
522
524583
TCGGCATGGTCCCGTGCTGG
0
493
506
525
524584
GGTTCGGCATGGTCCCGTGC
56
494
509
528
524585
GCAGGTTCGGCATGGTCCCG
61
495
512
531
524586
CATGCAGGTTCGGCATGGTC
87
496
515
534
524587
AGTCATGCAGGTTCGGCATG
77
497
518
537
524588
AGTAGTCATGCAGGTTCGGC
64
498
521
540
524589
AGCAGTAGTCATGCAGGTTC
61
499
524
543
524590
TTGAGCAGTAGTCATGCAGG
86
500
527
546
524591
TCCTTGAGCAGTAGTCATGC
80
501
530
549
524592
GGTTCCTTGAGCAGTAGTCA
50
502
533
552
524593
AGAGGTTCCTTGAGCAGTAG
61
503
536
555
524594
CATAGAGGTTCCTTGAGCAG
89
504
539
558
524595
ATACATAGAGGTTCCTTGAG
87
505
542
561
524596
GGGATACATAGAGGTTCCTT
0
506
545
564
524597
GGAGGGATACATAGAGGTTC
38
507
548
567
524598
ACAGGAGGGATACATAGAGG
73
508
551
570
524599
GCAACAGGAGGGATACATAG
67
509
554
573
524600
ACAGCAACAGGAGGGATACA
72
510
557
576
524601
GGTACAGCAACAGGAGGGAT
59
511
560
579
524602
TTTGGTACAGCAACAGGAGG
81
512
563
582
524603
AGGTTTGGTACAGCAACAGG
74
513
566
585
524604
CGAAGGTTTGGTACAGCAAC
85
514
569
588
524605
GTCCGAAGGTTTGGTACAGC
76
515
572
591
524606
TCCGTCCGAAGGTTTGGTAC
80
516
575
594
524607
ATTTCCGTCCGAAGGTTTGG
88
517
578
597
524608
GCAATTTCCGTCCGAAGGTT
50
518
581
600
524609
GGTGCAATTTCCGTCCGAAG
55
519
584
603
524610
ACAGGTGCAATTTCCGTCCG
81
520
587
606
524611
AATACAGGTGCAATTTCCGT
88
521
590
609
524612
GGGAATACAGGTGCAATTTC
32
522
593
612
524613
GATGGGAATACAGGTGCAAT
49
523
608
627
524614
AGCCCAGGATGATGGGATGG
89
524
611
630
524615
GAAAGCCCAGGATGATGGGA
71
525
614
633
524616
TCCGAAAGCCCAGGATGATG
86
526
617
636
524617
TTTTCCGAAAGCCCAGGATG
97
527
620
639
524618
GAATTTTCCGAAAGCCCAGG
80
528
623
642
524619
TAGGAATTTTCCGAAAGCCC
95
529
626
645
524620
CCATAGGAATTTTCCGAAAG
88
530
629
648
524621
CTCCCATAGGAATTTTCCGA
83
531
632
651
524622
CCACTCCCATAGGAATTTTC
68
532
635
654
524623
GGCCCACTCCCATAGGAATT
60
533
638
657
524624
TGAGGCCCACTCCCATAGGA
57
534
641
660
524625
GGCTGAGGCCCACTCCCATA
62
535
644
663
524626
ACGGGCTGAGGCCCACTCCC
57
536
647
666
524627
GAAACGGGCTGAGGCCCACT
62
537
650
669
524628
GGAGAAACGGGCTGAGGCCC
31
538
653
672
524629
CCAGGAGAAACGGGCTGAGG
77
539
656
675
524630
GAGCCAGGAGAAACGGGCTG
48
540
659
678
524631
ACTGAGCCAGGAGAAACGGG
43
541
662
681
524632
TAAACTGAGCCAGGAGAAAC
67
542
665
684
524633
TAGTAAACTGAGCCAGGAGA
86
543
668
687
524634
CACTAGTAAACTGAGCCAGG
96
544
669
688
524635
GCACTAGTAAACTGAGCCAG
83
545
671
690
524636
TGGCACTAGTAAACTGAGCC
84
546
672
691
524637
ATGGCACTAGTAAACTGAGC
82
547
674
693
524638
AAATGGCACTAGTAAACTGA
74
548
677
696
524639
AACAAATGGCACTAGTAAAC
63
549
678
697
524640
GAACAAATGGCACTAGTAAA
67
550
679
698
505338
TGAACAAATGGCACTAGTAA
84
186
680
699
524641
CTGAACAAATGGCACTAGTA
95
551
681
700
524642
ACTGAACAAATGGCACTAGT
77
552
682
701
505339
CACTGAACAAATGGCACTAG
95
187
683
702
524643
CCACTGAACAAATGGCACTA
89
553
684
703
524644
ACCACTGAACAAATGGCACT
90
554
686
705
524646
GAACCACTGAACAAATGGCA
82
555
687
706
509931
CGAACCACTGAACAAATGGC
90
39
689
708
524647
TACGAACCACTGAACAAATG
79
556
690
709
146824
CTACGAACCACTGAACAAAT
72
557
692
711
524648
CCCTACGAACCACTGAACAA
73
558
693
712
524649
GCCCTACGAACCACTGAACA
83
559
695
714
524650
AAGCCCTACGAACCACTGAA
82
560
696
715
524651
AAAGCCCTACGAACCACTGA
81
561
697
716
505342
GAAAGCCCTACGAACCACTG
66
198
698
717
524652
GGAAAGCCCTACGAACCACT
59
562
699
718
524653
GGGAAAGCCCTACGAACCAC
46
563
718
737
524654
ACTGAAAGCCAAACAGTGGG
64
564
721
740
524655
ATAACTGAAAGCCAAACAGT
0
565
724
743
524656
CATATAACTGAAAGCCAAAC
70
566
727
746
524657
ATCCATATAACTGAAAGCCA
91
567
730
749
524658
ATCATCCATATAACTGAAAG
69
568
733
752
524659
CACATCATCCATATAACTGA
70
569
736
755
524660
ТАССАСАТСАТССАТАТААС
57
570
739
758
524661
СААТАССАСАТСАТССАТАТ
70
571
742
761
524662
ССССААТАССАСАТСАТССА
85
572
745
764
524663
GGCCCCCAATACCACATCAT
70
573
748
767
524664
CTTGGCCCCCAATACCACAT
82
574
751
770
524665
AGACTTGGCCCCCAATACCA
77
575
754
773
524666
TACAGACTTGGCCCCCAATA
77
576
757
776
524667
CTGTACAGACTTGGCCCCCA
90
577
760
779
524668
ATGCTGTACAGACTTGGCCC
79
578
763
782
524669
AAGATGCTGTACAGACTTGG
79
579
766
785
524670
CTCAAGATGCTGTACAGACT
84
580
769
788
524671
GGACTCAAGATGCTGTACAG
24
581
772
791
524672
AAGGGACTCAAGATGCTGTA
57
582
775
794
524673
AAAAAGGGACTCAAGATGCT
66
583
778
797
524674
GGTAAAAAGGGACTCAAGAT
30
584
781
800
524675
AGCGGTAAAAAGGGACTCAA
68
585
784
803
524676
AACAGCGGTAAAAAGGGACT
67
586
787
806
524677
GGTAACAGCGGTAAAAAGGG
48
587
790
809
524678
ATTGGTAACAGCGGTAAAAA
81
588
793
812
524679
AAAATTGGTAACAGCGGTAA
89
589
796
815
524680
AAGAAAATTGGTAACAGCGG
84
590
799
818
524681
CAAAAGAAAATTGGTAACAG
41
591
802
821
524682
AGACAAAAGAAAATTGGTAA
51
592
805
824
524683
CAAAGACAAAAGAAAATTGG
66
593
808
827
524684
ACCCAAAGACAAAAGAAAAT
61
594
811
830
524685
TATACCCAAAGACAAAAGAA
79
595
814
833
524686
ATGTATACCCAAAGACAAAA
84
596
817
836
524687
TAAATGTATACCCAAAGACA
77
597
820
839
524688
GTTTAAATGTATACCCAAAG
80
598
821
840
524689
GGTTTAAATGTATACCCAAA
71
599
822
841
524690
GGGTTTAAATGTATACCCAA
85
600
823
842
505344
AGGGTTTAAATGTATACCCA
85
206
824
843
524691
TAGGGTTTAAATGTATACCC
90
601
825
844
524692
TTAGGGTTTAAATGTATACC
83
602
827
846
524693
TGTTAGGGTTTAAATGTATA
53
603
830
849
524694
TTTTGTTAGGGTTTAAATGT
67
604
845
864
524695
AACCCCATCTCTTTGTTTTG
81
605
848
867
524696
AGTAACCCCATCTCTTTGTT
71
606
851
870
524697
GAGAGTAACCCCATCTCTTT
65
607
854
873
524698
TCAGAGAGTAACCCCATCTC
96
608
857
876
524699
AATTCAGAGAGTAACCCCAT
94
609
860
879
524700
TAAAATTCAGAGAGTAACCC
71
610
863
882
524701
CCATAAAATTCAGAGAGTAA
90
611
866
885
524702
AACCCATAAAATTCAGAGAG
86
612
869
888
524703
CATAACCCATAAAATTCAGA
72
613
872
891
524704
TGACATAACCCATAAAATTC
81
614
875
894
524705
CAATGACATAACCCATAAAA
81
615
878
897
524706
TTCCAATGACATAACCCATA
95
616
881
900
524707
AACTTCCAATGACATAACCC
91
617
884
903
524708
CATAACTTCCAATGACATAA
83
618
887
906
524709
ACCCATAACTTCCAATGACA
95
619
890
909
524710
AGGACCCATAACTTCCAATG
66
620
893
912
524711
GCAAGGACCCATAACTTCCA
41
621
896
915
524712
GTGGCAAGGACCCATAACTT
53
622
899
918
524713
CTTGTGGCAAGGACCCATAA
91
623
902
921
524714
GTTCTTGTGGCAAGGACCCA
77
624
905
924
524715
TGTGTTCTTGTGGCAAGGAC
90
625
908
927
524716
TGATGTGTTCTTGTGGCAAG
90
626
911
930
524717
GTATGATGTGTTCTTGTGGC
82
627
914
933
524718
TTTGTATGATGTGTTCTTGT
95
628
930
949
524719
AAACATTCTTTGATTTTTTG
61
629
933
952
524720
CTAAAACATTCTTTGATTTT
43
630
936
955
524721
TTTCTAAAACATTCTTTGAT
90
631
939
958
524722
AGTTTTCTAAAACATTCTTT
75
632
942
961
524723
GGAAGTTTTCTAAAACATTC
52
633
945
964
524724
ATAGGAAGTTTTCTAAAACA
74
634
948
967
524725
TTAATAGGAAGTTTTCTAAA
40
635
951
970
524726
CTGTTAATAGGAAGTTTTCT
93
636
954
973
524727
GGCCTGTTAATAGGAAGTTT
87
637
957
976
524728
ATAGGCCTGTTAATAGGAAG
85
638
960
979
524729
TCAATAGGCCTGTTAATAGG
92
639
963
982
524730
CAATCAATAGGCCTGTTAAT
90
640
966
985
524731
TTCCAATCAATAGGCCTGTT
96
641
969
988
524732
ACTTTCCAATCAATAGGCCT
77
642
972
991
146826
CATACTTTCCAATCAATAGG
92
643
975
994
524733
TGACATACTTTCCAATCAAT
91
644
978
997
524734
CGTTGACATACTTTCCAATC
95
645
996
1015
524735
CCCAAAAGACCCACAATTCG
92
646
999
1018
524736
AAACCCAAAAGACCCACAAT
74
647
1002
1021
524737
GCAAAACCCAAAAGACCCAC
85
648
1005
1024
524738
GCAGCAAAACCCAAAAGACC
70
649
1025
1044
524739
AACCACATTGTGTAAATGGG
90
650
1028
1047
524740
GATAACCACATTGTGTAAAT
58
651
1031
1050
524741
CAGGATAACCACATTGTGTA
83
652
1034
1053
524742
ACGCAGGATAACCACATTGT
84
653
1037
1056
524743
TTAACGCAGGATAACCACAT
93
654
1040
1059
524744
GCATTAACGCAGGATAACCA
60
655
1043
1062
524745
AGGGCATTAACGCAGGATAA
58
656
1046
1065
524746
ACAAGGGCATTAACGCAGGA
75
657
1049
1068
524747
CATACAAGGGCATTAACGCA
89
658
1052
1071
524748
ATGCATACAAGGGCATTAAC
87
659
1055
1074
524749
TACATGCATACAAGGGCATT
86
660
1058
1077
524750
GAATACATGCATACAAGGGC
75
661
1061
1080
524751
ATTGAATACATGCATACAAG
81
662
1064
1083
524752
TAGATTGAATACATGCATAC
85
663
1067
1086
524753
GCTTAGATTGAATACATGCA
69
664
1070
1089
524754
CCTGCTTAGATTGAATACAT
90
665
1073
1092
524755
AAGCCTGCTTAGATTGAATA
76
666
1076
1095
524756
TGAAAGCCTGCTTAGATTGA
76
667
1079
1098
524757
AAGTGAAAGCCTGCTTAGAT
68
668
1082
1101
524758
AGAAAGTGAAAGCCTGCTTA
81
669
1085
1104
524759
GCGAGAAAGTGAAAGCCTGC
61
670
1088
1107
524760
TTGGCGAGAAAGTGAAAGCC
89
671
1091
1110
524761
AAGTTGGCGAGAAAGTGAAA
74
672
1094
1113
524762
TGTAAGTTGGCGAGAAAGTG
85
673
1097
1116
524763
CCTTGTAAGTTGGCGAGAAA
90
674
1100
1119
524764
AGGCCTTGTAAGTTGGCGAG
93
675
1103
1122
524765
GAAAGGCCTTGTAAGTTGGC
78
676
1106
1125
524766
ACAGAAAGGCCTTGTAAGTT
76
677
1109
1128
524767
TACACAGAAAGGCCTTGTAA
94
678
1112
1131
524768
GTTTACACAGAAAGGCCTTG
80
679
1115
1134
524769
ATTGTTTACACAGAAAGGCC
83
680
1118
1137
524770
GGTATTGTTTACACAGAAAG
63
681
1121
1140
524771
TCAGGTATTGTTTACACAGA
93
682
1124
1143
524772
GGTTCAGGTATTGTTTACAC
68
683
1127
1146
524773
AAAGGTTCAGGTATTGTTTA
82
684
1130
1149
524774
GGTAAAGGTTCAGGTATTGT
68
685
1150
1169
524775
TGGCCGTTGCCGGGCAACGG
74
686
1153
1172
524776
ACCTGGCCGTTGCCGGGCAA
77
687
1156
1175
524777
CAGACCTGGCCGTTGCCGGG
88
688
1159
1178
524778
GCACAGACCTGGCCGTTGCC
80
689
1162
1181
524779
TTGGCACAGACCTGGCCGTT
85
690
1165
184
524780
CACTTGGCACAGACCTGGCC
93
691
1168
187
524781
AAACACTTGGCACAGACCTG
90
692
1169
188
524782
CAAACACTTGGCACAGACCT
75
693
1170
189
505345
GCAAACACTTGGCACAGACC
78
207
1171
190
524783
AGCAAACACTTGGCACAGAC
84
694
1172
1191
524784
CAGCAAACACTTGGCACAGA
90
695
1174
1193
524785
GTCAGCAAACACTTGGCACA
79
696
1200
1219
524786
ACCAAGCCCCAGCCAGTGGG
57
697
1203
1222
524787
ATGACCAAGCCCCAGCCAGT
74
698
1206
1225
524788
CCCATGACCAAGCCCCAGCC
90
699
1209
1228
524789
TGGCCCATGACCAAGCCCCA
96
700
1212
1231
524790
TGATGGCCCATGACCAAGCC
79
701
1215
1234
524791
CGCTGATGGCCCATGACCAA
97
702
1218
1237
524792
ACGCGCTGATGGCCCATGAC
98
703
1221
1240
524793
CGCACGCGCTGATGGCCCAT
98
704
1224
1243
524794
CCACGCACGCGCTGATGGCC
98
705
1227
1246
524795
GTTCCACGCACGCGCTGATG
98
706
1230
1249
524796
AAGGTTCCACGCACGCGCTG
99
707
1233
1252
524797
GAAAAGGTTCCACGCACGCG
97
708
1236
1255
524798
GCCGAAAAGGTTCCACGCAC
98
709
1239
1258
524799
GGAGCCGAAAAGGTTCCACG
75
710
1242
1261
524800
AGAGGAGCCGAAAAGGTTCC
79
711
1245
1264
524801
GGCAGAGGAGCCGAAAAGGT
98
712
1248
1267
524802
ATCGGCAGAGGAGCCGAAAA
73
713
1251
1270
524803
TGGATCGGCAGAGGAGCCGA
91
714
1254
1273
524804
GTATGGATCGGCAGAGGAGC
98
715
1257
1276
524805
GCAGTATGGATCGGCAGAGG
98
716
1258
1277
524806
CGCAGTATGGATCGGCAGAG
98
717
1259
1278
505346
CCGCAGTATGGATCGGCAGA
98
210
1260
1279
146785
TCCGCAGTATGGATCGGCAG
98
718
1261
1280
524807
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
98
719
1262
1281
505347
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
98
212
1263
1282
524808
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
96
720
1264
1283
524809
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
97
721
1266
1285
524810
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
96
722
1269
1288
524811
GCTAGGAGTTCCGCAGTATG
96
723
1272
1291
524812
GCGGCTAGGAGTTCCGCAGT
75
724
1275
1294
524813
CAAGCGGCTAGGAGTTCCGC
86
725
1278
1297
524814
AAACAAGCGGCTAGGAGTTC
73
726
1281
1300
524815
GCAAAACAAGCGGCTAGGAG
71
727
1282
1301
524816
AGCAAAACAAGCGGCTAGGA
89
728
1283
1302
505352
GAGCAAAACAAGCGGCTAGG
76
217
1284
1303
524817
CGAGCAAAACAAGCGGCTAG
78
729
1285
1304
524818
GCGAGCAAAACAAGCGGCTA
71
730
1286
1305
505353
TGCGAGCAAAACAAGCGGCT
82
218
1287
1306
524819
CTGCGAGCAAAACAAGCGGC
82
731
1288
1307
524820
GCTGCGAGCAAAACAAGCGG
67
732
1290
1309
524821
CTGCTGCGAGCAAAACAAGC
79
733
1293
1312
524822
GACCTGCTGCGAGCAAAACA
87
734
1296
1315
524823
CCAGACCTGCTGCGAGCAAA
94
735
1299
1318
524824
GCTCCAGACCTGCTGCGAGC
80
736
1302
1321
524825
TTTGCTCCAGACCTGCTGCG
70
737
1305
1324
524826
ATGTTTGCTCCAGACCTGCT
75
738
1308
1327
524827
ATAATGTTTGCTCCAGACCT
55
739
1311
1330
524828
CCGATAATGTTTGCTCCAGA
87
740
1314
1333
524829
GTCCCGATAATGTTTGCTCC
80
741
1317
1336
524830
TCAGTCCCGATAATGTTTGC
76
742
1320
1339
524831
TTATCAGTCCCGATAATGTT
53
743
1577
1596
146786
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
96
224
Пример 11: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК ИВУ в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. В этот анализ включили также несколько антисмысловых олигонуклеотидов из исследований, описанных выше. Культивированные клетки HepG2.2.15 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 70 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК некоторых химерных олигонуклеотидов также измерили при помощи RTS3372. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах 24 и 25 были разработаны как 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды. Эти химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5' сегменте крыла, и каждый нуклеозид в 3' сегменте крыла имеет МОЕ модификацию сахара. Каждый нуклеозид в центральном сегменте гэп имеет дезокси-сахарную модификацию. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 24, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1). Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 25, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1286 (переставленная версия доступа GENBANK №U95551.1). «Н/и» указывает, что данные ингибирования для этого конкретного химерного олигонуклеотида не были измерены конкретным набором затравочных зондов.
Таблица 24
Ингибирование уровней мРНК HBV действием химерных антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на SEQ ID NO:1 (RTS3370 и RTS3372)
Сайт инициации
Терминирующий сайт
№ ISIS
Последовательность
RTS3370% ингибирование
RTS3372% ингибирование
SEQ ID NO
1323
1342
524832
GAGTTATCAGTCCCGATAAT
63
н/и
744
1326
1345
524833
ACAGAGTTATCAGTCCCGAT
82
н/и
745
1329
1348
524834
ACAACAGAGTTATCAGTCCC
52
н/и
746
1332
1351
524835
AGGACAACAGAGTTATCAGT
57
н/и
747
1335
1354
524836
GAGAGGACAACAGAGTTATC
49
н/и
748
1338
1357
524837
CGGGAGAGGACAACAGAGTT
0
н/и
749
1341
1360
524838
TTGCGGGAGAGGACAACAGA
17
н/и
750
1344
1363
524839
TATTTGCGGGAGAGGACAAC
30
н/и
751
1347
1366
524840
GTATATTTGCGGGAGAGGAC
22
н/и
752
1350
1369
524841
GATGTATATTTGCGGGAGAG
32
н/и
753
1353
1372
524842
TACGATGTATATTTGCGGGA
76
н/и
754
1356
1375
524843
GGATACGATGTATATTTGCG
76
н/и
755
1359
1378
524844
CATGGATACGATGTATATTT
87
н/и
756
1362
1381
524845
AGCCATGGATACGATGTATA
70
н/и
757
1365
1384
524846
AGCAGCCATGGATACGATGT
22
н/и
758
1368
1387
524847
CCTAGCAGCCATGGATACGA
67
н/и
759
1371
1390
524848
CAGCCTAGCAGCCATGGATA
56
н/и
760
1374
1393
524849
GCACAGCCTAGCAGCCATGG
38
н/и
761
1377
1396
524850
GCAGCACAGCCTAGCAGCCA
11
н/и
762
1380
1399
524851
TTGGCAGCACAGCCTAGCAG
34
н/и
763
1383
1402
524852
CAGTTGGCAGCACAGCCTAG
47
н/и
764
1386
1405
524853
ATCCAGTTGGCAGCACAGCC
45
н/и
765
1389
1408
524854
AGGATCCAGTTGGCAGCACA
36
н/и
766
1392
1411
524855
CGCAGGATCCAGTTGGCAGC
41
н/и
767
1395
1414
524856
CCGCGCAGGATCCAGTTGGC
72
н/и
768
1398
1417
524857
GTCCCGCGCAGGATCCAGTT
55
н/и
769
1457
1476
524858
AGCGACCCCGAGAAGGGTCG
17
н/и
770
1460
1479
524859
CCAAGCGACCCCGAGAAGGG
45
н/и
771
1463
1482
524860
GTCCCAAGCGACCCCGAGAA
8
н/и
772
1466
1485
524861
AGAGTCCCAAGCGACCCCGA
51
н/и
773
1469
1488
524862
GAGAGAGTCCCAAGCGACCC
28
н/и
774
1472
1491
524863
GACGAGAGAGTCCCAAGCGA
37
н/и
775
1492
1511
524864
GAACGGCAGACGGAGAAGGG
27
н/и
776
1498
1517
524866
CGGTCGGAACGGCAGACGGA
78
н/и
777
1501
1520
524867
GGTCGGTCGGAACGGCAGAC
78
н/и
778
1504
1523
524868
CGTGGTCGGTCGGAACGGCA
79
н/и
779
1507
1526
524869
CCCCGTGGTCGGTCGGAACG
70
н/и
780
1510
1529
524870
GCGCCCCGTGGTCGGTCGGA
78
н/и
781
1513
1532
524871
GGTGCGCCCCGTGGTCGGTC
74
н/и
782
1514
1533
524872
AGGTGCGCCCCGTGGTCGGT
63
н/и
783
1515
1534
505354
GAGGTGCGCCCCGTGGTCGG
70
н/и
220
1516
1535
524873
AGAGGTGCGCCCCGTGGTCG
72
н/и
784
1517
1536
524874
GAGAGGTGCGCCCCGTGGTC
49
н/и
785
1518
1537
505355
AGAGAGGTGCGCCCCGTGGT
64
н/и
221
1519
1538
524875
AAGAGAGGTGCGCCCCGTGG
57
н/и
786
1520
1539
524876
AAAGAGAGGTGCGCCCCGTG
63
н/и
787
1521
1540
505356
TAAAGAGAGGTGCGCCCCGT
68
н/и
222
1522
1541
524877
GTAAAGAGAGGTGCGCCCCG
50
н/и
788
1523
1542
524878
CGTAAAGAGAGGTGCGCCCC
64
н/и
789
1550
1569
524879
GATGAGAAGGCACAGACGGG
70
н/и
790
1553
1572
524880
GCAGATGAGAAGGCACAGAC
81
н/и
791
1556
1575
524881
CCGGCAGATGAGAAGGCACA
80
н/и
792
1559
1578
524882
GGTCCGGCAGATGAGAAGGC
84
н/и
793
1562
1581
524883
CACGGTCCGGCAGATGAGAA
79
н/и
794
1565
1584
524884
GCACACGGTCCGGCAGATGA
83
н/и
795
1568
1587
524885
AGTGCACACGGTCCGGCAGA
77
н/и
796
1571
1590
524886
CGAAGTGCACACGGTCCGGC
89
н/и
797
1574
1593
524887
AAGCGAAGTGCACACGGTCC
85
н/и
798
1575
1594
524888
GAAGCGAAGTGCACACGGTC
83
н/и
799
1576
1595
524889
TGAAGCGAAGTGCACACGGT
83
н/и
800
1577
1596
146786
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
88
85
224
1578
1597
524890
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
83
н/и
801
1579
1598
524891
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
82
н/и
802
1580
1599
505357
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
79
н/и
803
1581
1600
524892
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
73
н/и
804
1582
1601
524893
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
80
н/и
805
1583
1602
505358
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
84
н/и
226
1584
1603
524894
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
74
н/и
806
1585
1604
524895
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
72
н/и
807
1586
1605
505359
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
78
н/и
227
1604
1623
524896
ACGGTGGTCTCCATGCGACG
79
н/и
808
1607
1626
524897
TTCACGGTGGTCTCCATGCG
75
н/и
809
1630
1649
524898
CCTTGGGCAACATTCGGTGG
77
н/и
810
1633
1652
524899
AGACCTTGGGCAACATTCGG
76
н/и
811
1636
1655
524900
GTAAGACCTTGGGCAACATT
73
н/и
812
1639
1658
524901
TATGTAAGACCTTGGGCAAC
60
н/и
813
1642
1661
524902
TCTTATGTAAGACCTTGGGC
72
н/и
814
1645
1664
524903
TCCTCTTATGTAAGACCTTG
75
н/и
815
1648
1667
524904
GAGTCCTCTTATGTAAGACC
65
н/и
816
1651
1670
524905
CAAGAGTCCTCTTATGTAAG
76
н/и
817
1654
1673
524906
GTCCAAGAGTCCTCTTATGT
78
н/и
818
1657
1676
524907
AGAGTCCAAGAGTCCTCTTA
82
н/и
819
1660
1679
524908
CAGAGAGTCCAAGAGTCCTC
82
н/и
820
1663
1682
524909
TTGCAGAGAGTCCAAGAGTC
76
н/и
821
1666
1685
524910
ACATTGCAGAGAGTCCAAGA
76
н/и
822
1669
1688
524911
TTGACATTGCAGAGAGTCCA
74
н/и
823
1689
1708
524912
GTATGCCTCAAGGTCGGTCG
76
н/и
824
1692
1711
524913
GAAGTATGCCTCAAGGTCGG
73
н/и
825
1695
1714
524914
TTTGAAGTATGCCTCAAGGT
76
н/и
826
1698
1717
524915
GTCTTTGAAGTATGCCTCAA
75
н/и
827
1701
1720
524916
ACAGTCTTTGAAGTATGCCT
77
н/и
828
1704
1723
524917
CAAACAGTCTTTGAAGTATG
55
н/и
829
1707
1726
524918
AAACAAACAGTCTTTGAAGT
59
н/и
830
1710
1729
524919
TTTAAACAAACAGTCTTTGA
53
н/и
831
1713
1732
524920
GTCTTTAAACAAACAGTCTT
3
н/и
832
1716
1735
524921
CCAGTCTTTAAACAAACAGT
75
н/и
833
1719
1738
524922
CTCCCAGTCTTTAAACAAAC
70
н/и
834
1722
1741
524923
CTCCTCCCAGTCTTTAAACA
68
н/и
835
1725
1744
524924
CAACTCCTCCCAGTCTTTAA
62
н/и
836
1728
1747
524925
CCCCAACTCCTCCCAGTCTT
63
н/и
837
1731
1750
524926
CTCCCCCAACTCCTCCCAGT
62
н/и
838
1734
1753
524927
СТССТСССССААСТССТССС
55
н/и
839
1737
1756
524928
ААТСТССТСССССААСТССТ
61
н/и
840
1740
1759
524929
ТСТААТСТССТСССССААСТ
61
н/и
841
1743
1762
524930
ТААТСТААТСТССТСССССА
70
н/и
842
1746
1765
524931
СТТТААТСТААТСТССТССС
74
н/и
843
1749
1768
524932
GACCTTTAATCTAATCTCCT
74
н/и
844
1752
1771
524933
AAAGACCTTTAATCTAATCT
60
н/и
845
1755
1774
524934
TACAAAGACCTTTAATCTAA
55
н/и
846
1758
1777
524935
TAGTACAAAGACCTTTAATC
54
н/и
847
1761
1780
524936
TCCTAGTACAAAGACCTTTA
69
н/и
848
1764
1783
524937
GCCTCCTAGTACAAAGACCT
72
н/и
849
1767
1786
524938
ACAGCCTCCTAGTACAAAGA
60
н/и
850
1770
1789
524939
CCTACAGCCTCCTAGTACAA
66
н/и
851
1773
1792
524940
ATGCCTACAGCCTCCTAGTA
70
н/и
852
1776
1795
524941
TTTATGCCTACAGCCTCCTA
63
н/и
853
1777
1796
524942
ATTTATGCCTACAGCCTCCT
70
н/и
854
1778
1797
509932
AATTTATGCCTACAGCCTCC
68
н/и
46
1779
1798
509933
CAATTTATGCCTACAGCCTC
68
н/и
48
1780
1799
509934
CCAATTTATGCCTACAGCCT
65
н/и
50
1781
1800
509935
ACCAATTTATGCCTACAGCC
64
н/и
52
1782
1801
524943
GACCAATTTATGCCTACAGC
57
н/и
855
1783
1802
524944
AGACCAATTTATGCCTACAG
60
н/и
856
1785
1804
524945
GCAGACCAATTTATGCCTAC
54
н/и
857
1788
1807
524946
TGCGCAGACCAATTTATGCC
68
н/и
858
1791
1810
524947
TGGTGCGCAGACCAATTTAT
64
н/и
859
1794
1813
524948
TGCTGGTGCGCAGACCAATT
75
н/и
860
1797
1816
524949
TGGTGCTGGTGCGCAGACCA
68
н/и
861
1800
1819
524950
GCATGGTGCTGGTGCGCAGA
69
н/и
862
1803
1822
524951
GTTGCATGGTGCTGGTGCGC
59
н/и
863
1807
1826
524952
AAAAGTTGCATGGTGCTGGT
61
н/и
864
1810
1829
524953
TGAAAAAGTTGCATGGTGCT
60
н/и
865
1813
1832
524954
AGGTGAAAAAGTTGCATGGT
61
н/и
866
1816
1835
524955
CAGAGGTGAAAAAGTTGCAT
63
н/и
867
1819
1838
524956
AGGCAGAGGTGAAAAAGTTG
57
н/и
868
1822
1841
524957
ATTAGGCAGAGGTGAAAAAG
50
н/и
869
1823
1842
524958
GATTAGGCAGAGGTGAAAAA
57
н/и
870
1825
1844
524959
ATGATTAGGCAGAGGTGAAA
54
н/и
871
1828
1847
524960
GAGATGATTAGGCAGAGGTG
59
н/и
872
1831
1850
524961
CAAGAGATGATTAGGCAGAG
61
н/и
873
1834
1853
524962
GAACAAGAGATGATTAGGCA
56
н/и
874
1837
1856
524963
CATGAACAAGAGATGATTAG
24
н/и
875
1840
1859
524964
GGACATGAACAAGAGATGAT
54
н/и
876
1843
1862
524965
GTAGGACATGAACAAGAGAT
52
н/и
877
1846
1865
524966
ACAGTAGGACATGAACAAGA
47
н/и
878
1849
1868
524967
TGAACAGTAGGACATGAACA
33
н/и
879
1852
1871
524968
GCTTGAACAGTAGGACATGA
44
н/и
880
1855
1874
524969
GAGGCTTGAACAGTAGGACA
43
н/и
881
1858
1877
524970
TTGGAGGCTTGAACAGTAGG
28
н/и
882
1862
1881
524971
CAGCTTGGAGGCTTGAACAG
30
н/и
883
1871
1890
524972
CCCAAGGCACAGCTTGGAGG
38
н/и
884
1874
1893
524973
CCACCCAAGGCACAGCTTGG
47
н/и
885
1877
1896
524974
AAGCCACCCAAGGCACAGCT
49
н/и
886
1880
1899
524975
CCAAAGCCACCCAAGGCACA
32
н/и
887
1883
1902
524976
GCCCCAAAGCCACCCAAGGC
56
н/и
888
1886
1905
524977
CATGCCCCAAAGCCACCCAA
63
н/и
889
1889
1908
524978
GTCCATGCCCCAAAGCCACC
64
н/и
890
1892
1911
524979
GATGTCCATGCCCCAAAGCC
65
н/и
891
1895
1914
524980
GTCGATGTCCATGCCCCAAA
80
н/и
892
1898
1917
524981
AGGGTCGATGTCCATGCCCC
79
н/и
893
1901
1920
524982
ATAAGGGTCGATGTCCATGC
79
н/и
894
1904
1923
524983
TTTATAAGGGTCGATGTCCA
71
н/и
895
1907
1926
524984
TTCTTTATAAGGGTCGATGT
77
н/и
896
1910
1929
524985
AAATTCTTTATAAGGGTCGA
79
н/и
897
1913
1932
524986
TCCAAATTCTTTATAAGGGT
80
н/и
898
1916
1935
524987
AGCTCCAAATTCTTTATAAG
80
н/и
899
1919
1938
524988
AGTAGCTCCAAATTCTTTAT
76
н/и
900
1922
1941
524989
CACAGTAGCTCCAAATTCTT
59
н/и
901
1925
1944
524990
CTCCACAGTAGCTCCAAATT
46
н/и
902
1928
1947
524991
TAACTCCACAGTAGCTCCAA
63
н/и
903
1931
1950
524992
GAGTAACTCCACAGTAGCTC
65
н/и
904
1934
1953
524993
CGAGAGTAACTCCACAGTAG
69
н/и
905
1937
1956
524994
AAACGAGAGTAACTCCACAG
61
н/и
906
1940
1959
524995
CAAAAACGAGAGTAACTCCA
46
н/и
907
1943
1962
524996
AGGCAAAAACGAGAGTAACT
39
н/и
908
1946
1965
524997
AGAAGGCAAAAACGAGAGTA
53
н/и
909
1949
1968
524998
GTCAGAAGGCAAAAACGAGA
56
н/и
910
1952
1971
524999
GAAGTCAGAAGGCAAAAACG
49
н/и
911
1955
1974
525000
AAAGAAGTCAGAAGGCAAAA
29
н/и
912
1958
1977
525001
AGGAAAGAAGTCAGAAGGCA
41
н/и
913
1961
1980
525002
TGAAGGAAAGAAGTCAGAAG
34
н/и
914
1964
1983
525003
TACTGAAGGAAAGAAGTCAG
26
н/и
915
1984
2003
525004
GCGGTATCTAGAAGATCTCG
24
н/и
916
1987
2006
525005
GAGGCGGTATCTAGAAGATC
29
н/и
917
1990
2009
525006
GCTGAGGCGGTATCTAGAAG
29
н/и
918
1993
2012
525007
AGAGCTGAGGCGGTATCTAG
13
н/и
919
1996
2015
525008
TACAGAGCTGAGGCGGTATC
6
н/и
920
1999
2018
525009
CGATACAGAGCTGAGGCGGT
3
н/и
921
2002
2021
525010
TCCCGATACAGAGCTGAGGC
27
н/и
922
2005
2024
525011
GCTTCCCGATACAGAGCTGA
43
н/и
923
2008
2027
525012
AAGGCTTCCCGATACAGAGC
33
н/и
924
2011
2030
525013
TCTAAGGCTTCCCGATACAG
34
н/и
925
2014
2033
525014
GACTCTAAGGCTTCCCGATA
38
н/и
926
2017
2036
525015
GGAGACTCTAAGGCTTCCCG
16
н/и
927
2020
2039
525016
TCAGGAGACTCTAAGGCTTC
16
н/и
928
2023
2042
525017
TGCTCAGGAGACTCTAAGGC
14
н/и
929
2026
2045
525018
CAATGCTCAGGAGACTCTAA
34
н/и
930
2029
2048
525019
GAACAATGCTCAGGAGACTC
32
н/и
931
2032
2051
525020
GGTGAACAATGCTCAGGAGA
9
н/и
932
2035
2054
525021
TGAGGTGAACAATGCTCAGG
50
н/и
933
2038
2057
525022
TGGTGAGGTGAACAATGCTC
54
н/и
934
2041
2060
525023
GTATGGTGAGGTGAACAATG
47
н/и
935
2044
2063
525024
GCAGTATGGTGAGGTGAACA
40
н/и
936
2047
2066
525025
AGTGCAGTATGGTGAGGTGA
35
н/и
937
2050
2069
525026
CTGAGTGCAGTATGGTGAGG
43
н/и
938
2053
2072
525027
TGCCTGAGTGCAGTATGGTG
45
н/и
939
2056
2075
525028
GCTTGCCTGAGTGCAGTATG
42
н/и
940
2059
2078
525029
ATTGCTTGCCTGAGTGCAGT
39
н/и
941
2062
2081
525030
AGAATTGCTTGCCTGAGTGC
27
н/и
942
2065
2084
525031
CAAAGAATTGCTTGCCTGAG
42
н/и
943
2068
2087
525032
CAGCAAAGAATTGCTTGCCT
49
н/и
944
2071
2090
525033
CCCCAGCAAAGAATTGCTTG
41
н/и
945
2074
2093
525034
TCCCCCCAGCAAAGAATTGC
39
н/и
946
2077
2096
525035
AGTTCCCCCCAGCAAAGAAT
39
н/и
947
2080
2099
525036
ATTAGTTCCCCCCAGCAAAG
43
н/и
948
2083
2102
525037
GTCATTAGTTCCCCCCAGCA
64
н/и
949
2086
2105
525038
AGAGTCATTAGTTCCCCCCA
45
н/и
950
2089
2108
525039
GCTAGAGTCATTAGTTCCCC
58
н/и
951
2092
2111
525040
GTAGCTAGAGTCATTAGTTC
45
н/и
952
2095
2114
525041
CAGGTAGCTAGAGTCATTAG
44
н/и
953
2098
2117
525042
ACCCAGGTAGCTAGAGTCAT
39
н/и
954
2101
2120
525043
CCCACCCAGGTAGCTAGAGT
51
н/и
955
2104
2123
525044
ACACCCACCCAGGTAGCTAG
27
н/и
956
2107
2126
525045
TTAACACCCACCCAGGTAGC
41
н/и
957
2110
2129
525046
AAATTAACACCCACCCAGGT
44
н/и
958
2113
2132
525047
ТССАААТТААСАСССАСССА
29
н/и
959
2116
2135
525048
TCTTCCAAATTAACACCCAC
31
н/и
960
2119
2138
525049
GGATCTTCCAAATTAACACC
42
н/и
961
2122
2141
525050
GCTGGATCTTCCAAATTAAC
53
н/и
962
2125
2144
525051
GATGCTGGATCTTCCAAATT
41
н/и
963
2128
2147
525052
CTAGATGCTGGATCTTCCAA
62
н/и
964
2131
2150
525053
TCTCTAGATGCTGGATCTTC
41
83
965
2134
2153
525054
AGGTCTCTAGATGCTGGATC
26
73
966
2137
2156
525055
ACTAGGTCTCTAGATGCTGG
36
74
967
2140
2159
525056
ACTACTAGGTCTCTAGATGC
22
63
968
2143
2162
525057
CTGACTACTAGGTCTCTAGA
28
80
969
2146
2165
525058
TAACTGACTACTAGGTCTCT
47
83
970
2149
2168
525059
ACATAACTGACTACTAGGTC
31
77
971
2152
2171
525060
TTGACATAACTGACTACTAG
34
75
972
2155
2174
525061
GTGTTGACATAACTGACTAC
42
75
973
2158
2177
525062
TTAGTGTTGACATAACTGAC
48
81
974
2161
2180
525063
ATATTAGTGTTGACATAACT
33
73
975
2164
2183
525064
CCCATATTAGTGTTGACATA
41
82
976
2167
2186
525065
AGGCCCATATTAGTGTTGAC
39
77
977
2170
2189
525066
TTTAGGCCCATATTAGTGTT
46
83
978
2173
2192
525067
AACTTTAGGCCCATATTAGT
38
69
979
2176
2195
525068
CTGAACTTTAGGCCCATATT
41
85
980
2179
2198
525069
TGCCTGAACTTTAGGCCCAT
38
81
981
2182
2201
525070
AGTTGCCTGAACTTTAGGCC
17
67
982
2185
2204
525071
AAGAGTTGCCTGAACTTTAG
27
62
983
2188
2207
525072
CACAAGAGTTGCCTGAACTT
27
64
984
2191
2210
525073
AACCACAAGAGTTGCCTGAA
41
80
985
2194
2213
525074
TGAAACCACAAGAGTTGCCT
32
75
986
2197
2216
525075
ATGTGAAACCACAAGAGTTG
43
67
987
2200
2219
525076
GAAATGTGAAACCACAAGAG
34
74
988
2203
2222
525077
CAAGAAATGTGAAACCACAA
22
65
989
2206
2225
525078
AGACAAGAAATGTGAAACCA
39
70
990
2209
2228
525079
GTGAGACAAGAAATGTGAAA
32
74
991
2212
2231
525080
AAAGTGAGACAAGAAATGTG
30
63
992
2215
2234
525081
CCAAAAGTGAGACAAGAAAT
25
58
993
2218
2237
525082
CTTCCAAAAGTGAGACAAGA
36
74
994
2221
2240
525083
TCTCTTCCAAAAGTGAGACA
42
84
995
2224
2243
525084
GTTTCTCTTCCAAAAGTGAG
33
75
996
2227
2246
525085
ACGGTTTCTCTTCCAAAAGT
32
68
997
2230
2249
525086
ATAACGGTTTCTCTTCCAAA
51
80
998
2233
2252
525087
TCTATAACGGTTTCTCTTCC
36
77
999
2236
2255
525088
TACTCTATAACGGTTTCTCT
23
69
1000
2239
2258
525089
AAATACTCTATAACGGTTTC
45
77
1001
2242
2261
525090
ACCAAATACTCTATAACGGT
57
82
1002
2245
2264
525091
GACACCAAATACTCTATAAC
36
77
1003
2248
2267
525092
AAAGACACCAAATACTCTAT
42
80
1004
2251
2270
525093
CCGAAAGACACCAAATACTC
41
89
1005
2254
2273
525094
ACTCCGAAAGACACCAAATA
29
73
1006
2257
2276
525095
CACACTCCGAAAGACACCAA
33
92
1007
2260
2279
525096
ATCCACACTCCGAAAGACAC
18
74
1008
2263
2282
525097
CGAATCCACACTCCGAAAGA
30
57
1009
2266
2285
525098
GTGCGAATCCACACTCCGAA
28
67
1010
2269
2288
146789
GGAGTGCGAATCCACACTCC
37
72
1011
2272
2291
525099
GGAGGAGTGCGAATCCACAC
36
64
1012
2275
2294
525100
GCTGGAGGAGTGCGAATCCA
52
90
1013
2278
2297
525101
TAAGCTGGAGGAGTGCGAAT
49
96
1014
2281
2300
525102
CTATAAGCTGGAGGAGTGCG
37
96
1015
2284
2303
525103
GGTCTATAAGCTGGAGGAGT
30
97
1016
2287
2306
525104
GGTGGTCTATAAGCTGGAGG
22
77
1017
2290
2309
525105
TTTGGTGGTCTATAAGCTGG
41
76
1018
2293
2312
525106
GCATTTGGTGGTCTATAAGC
39
76
1019
2313
2332
525107
GAAGTGTTGATAGGATAGGG
27
97
1020
2316
2335
525108
CCGGAAGTGTTGATAGGATA
42
97
1021
2319
2338
525109
TTTCCGGAAGTGTTGATAGG
48
99
1022
2322
2341
525110
TAGTTTCCGGAAGTGTTGAT
18
98
1023
2325
2344
525111
CAGTAGTTTCCGGAAGTGTT
19
98
1024
2328
2347
525112
CAACAGTAGTTTCCGGAAGT
29
96
1025
2331
2350
525113
TAACAACAGTAGTTTCCGGA
39
95
1026
2334
2353
525114
GTCTAACAACAGTAGTTTCC
40
99
1027
2369
2388
525115
CGAGGGAGTTCTTCTTCTAG
42
98
1028
2372
2391
525116
AGGCGAGGGAGTTCTTCTTC
31
97
1029
2375
2394
525117
GCGAGGCGAGGGAGTTCTTC
22
98
1030
2379
2398
525118
GTCTGCGAGGCGAGGGAGTT
20
99
1031
2398
2417
525119
CGCGGCGATTGAGACCTTCG
26
97
1032
2401
2420
525120
CGACGCGGCGATTGAGACCT
23
97
1033
2404
2423
525121
CTGCGACGCGGCGATTGAGA
47
92
1034
2407
2426
525122
CTTCTGCGACGCGGCGATTG
27
74
1035
2410
2429
525123
GATCTTCTGCGACGCGGCGA
36
87
1036
2413
2432
146790
TGAGATCTTCTGCGACGCGG
25
85
1037
2416
2435
525124
GATTGAGATCTTCTGCGACG
17
84
1038
2419
2438
525125
CGAGATTGAGATCTTCTGCG
24
82
1039
2422
2441
525126
TCCCGAGATTGAGATCTTCT
29
74
1040
2425
2444
525127
GGTTCCCGAGATTGAGATCT
14
79
1041
2428
2447
525128
TGAGGTTCCCGAGATTGAGA
41
76
1042
2431
2450
525129
CATTGAGGTTCCCGAGATTG
39
72
1043
2434
2453
525130
TAACATTGAGGTTCCCGAGA
37
71
1044
2437
2456
525131
TACTAACATTGAGGTTCCCG
42
76
1045
2440
2459
525132
GAATACTAACATTGAGGTTC
21
75
1046
2443
2462
525133
AAGGAATACTAACATTGAGG
36
75
1047
2446
2465
525134
TCCAAGGAATACTAACATTG
29
77
1048
2449
2468
525135
GAGTCCAAGGAATACTAACA
32
76
1049
2452
2471
525136
TATGAGTCCAAGGAATACTA
23
62
1050
2455
2474
525137
CCTTATGAGTCCAAGGAATA
27
57
1051
2458
2477
525138
CCACCTTATGAGTCCAAGGA
52
82
1052
2461
2480
525139
TCCCCACCTTATGAGTCCAA
46
80
1053
2464
2483
525140
AGTTCCCCACCTTATGAGTC
14
59
1054
2467
2486
525141
TAAAGTTCCCCACCTTATGA
20
45
1055
2470
2489
525142
CAGTAAAGTTCCCCACCTTA
14
72
1056
2473
2492
525143
GACCAGTAAAGTTCCCCACC
30
77
1057
2476
2495
525144
AAAGACCAGTAAAGTTCCCC
19
72
1058
2479
2498
525145
AATAAAGACCAGTAAAGTTC
18
55
1059
2482
2501
525146
AAGAATAAAGACCAGTAAAG
16
51
1060
2485
2504
525147
TAGAAGAATAAAGACCAGTA
22
68
1061
2488
2507
525148
CAGTAGAAGAATAAAGACCA
13
59
1062
2491
2510
525149
GTACAGTAGAAGAATAAAGA
0
45
1063
2494
2513
525150
CAGGTACAGTAGAAGAATAA
31
62
1064
2497
2516
525151
AGACAGGTACAGTAGAAGAA
8
62
1065
2500
2519
525152
TAAAGACAGGTACAGTAGAA
29
61
1066
2503
2522
525153
GATTAAAGACAGGTACAGTA
28
67
1067
2506
2525
525154
GAGGATTAAAGACAGGTACA
38
76
1068
2509
2528
525155
AATGAGGATTAAAGACAGGT
30
72
1069
2512
2531
525156
TCCAATGAGGATTAAAGACA
24
67
1070
2515
2534
525157
TTTTCCAATGAGGATTAAAG
0
44
1071
2518
2537
525158
GTGTTTTCCAATGAGGATTA
20
74
1072
2521
2540
525159
ATGGTGTTTTCCAATGAGGA
30
71
1073
2524
2543
525160
AAGATGGTGTTTTCCAATGA
22
68
1074
2527
2546
525161
GAAAAGATGGTGTTTTCCAA
19
61
1075
2530
2549
525162
TAGGAAAAGATGGTGTTTTC
14
52
1076
2533
2552
525163
TATTAGGAAAAGATGGTGTT
1
47
1077
2536
2555
525164
GTATATTAGGAAAAGATGGT
0
60
1078
2539
2558
525165
AATGTATATTAGGAAAAGAT
0
30
1079
2542
2561
525166
GTAAATGTATATTAGGAAAA
1
18
1080
2545
2564
525167
GGTGTAAATGTATATTAGGA
23
72
1081
2548
2567
525168
CTTGGTGTAAATGTATATTA
32
75
1082
2551
2570
525169
TGTCTTGGTGTAAATGTATA
12
65
1083
2554
2573
525170
TAATGTCTTGGTGTAAATGT
3
51
1084
2557
2576
525171
TGATAATGTCTTGGTGTAAA
24
62
1085
2560
2579
525172
TTTTGATAATGTCTTGGTGT
18
66
1086
2563
2582
525173
ATTTTTTGATAATGTCTTGG
11
63
1087
2566
2585
525174
CACATTTTTTGATAATGTCT
20
68
1088
2569
2588
525175
GTTCACATTTTTTGATAATG
38
68
1089
2572
2591
525176
ACTGTTCACATTTTTTGATA
12
61
1090
2575
2594
525177
CAAACTGTTCACATTTTTTG
25
56
1091
2578
2597
525178
CTACAAACTGTTCACATTTT
21
47
1092
2581
2600
525179
GGCCTACAAACTGTTCACAT
28
83
1093
2584
2603
525180
GTGGGCCTACAAACTGTTCA
7
72
1094
2587
2606
525181
TAAGTGGGCCTACAAACTGT
26
75
1095
2590
2609
525182
CTGTAAGTGGGCCTACAAAC
35
78
1096
2593
2612
525183
TAACTGTAAGTGGGCCTACA
29
69
1097
2596
2615
525184
CATTAACTGTAAGTGGGCCT
22
73
1098
2599
2618
525185
TCTCATTAACTGTAAGTGGG
31
81
1099
2602
2621
525186
TTTTCTCATTAACTGTAAGT
15
58
1100
2605
2624
525187
TTCTTTTCTCATTAACTGTA
14
71
1101
2608
2627
525188
ATCTTCTTTTCTCATTAACT
19
71
1102
2611
2630
525189
GCAATCTTCTTTTCTCATTA
36
79
1103
2614
2633
525190
ATTGCAATCTTCTTTTCTCA
38
82
1104
2617
2636
525191
TCAATTGCAATCTTCTTTTC
23
61
1105
2620
2639
525192
TAATCAATTGCAATCTTCTT
10
67
1106
2623
2642
525193
GCATAATCAATTGCAATCTT
27
71
1107
2626
2645
525194
CAGGCATAATCAATTGCAAT
23
71
1108
2629
2648
525195
TAGCAGGCATAATCAATTGC
30
77
1109
2632
2651
525196
ACCTAGCAGGCATAATCAAT
7
70
1110
2635
2654
525197
AAAACCTAGCAGGCATAATC
47
70
1111
2638
2657
525198
GATAAAACCTAGCAGGCATA
41
81
1112
2641
2660
525199
TTGGATAAAACCTAGCAGGC
30
78
1113
2644
2663
525200
CCTTTGGATAAAACCTAGCA
31
76
1114
2647
2666
525201
TAACCTTTGGATAAAACCTA
25
63
1115
2650
2669
525202
TGGTAACCTTTGGATAAAAC
24
76
1116
2653
2672
525203
ATTTGGTAACCTTTGGATAA
20
64
1117
2656
2675
525204
AATATTTGGTAACCTTTGGA
16
77
1118
2659
2678
525205
GTAAATATTTGGTAACCTTT
39
80
1119
2662
2681
525206
ATGGTAAATATTTGGTAACC
40
75
1120
2665
2684
525207
CCAATGGTAAATATTTGGTA
38
75
1121
2668
2687
525208
TATCCAATGGTAAATATTTG
0
0
1122
2671
2690
525209
CCTTATCCAATGGTAAATAT
28
57
1123
2674
2693
525210
TACCCTTATCCAATGGTAAA
18
71
1124
2677
2696
525211
TAATACCCTTATCCAATGGT
35
76
1125
2680
2699
525212
GTTTAATACCCTTATCCAAT
41
77
1126
2683
2702
525213
AAGGTTTAATACCCTTATCC
11
79
1127
2686
2705
525214
AATAAGGTTTAATACCCTTA
35
75
1128
2689
2708
525215
GATAATAAGGTTTAATACCC
22
54
1129
2692
2711
525216
CTGGATAATAAGGTTTAATA
19
35
1130
2695
2714
525217
GTTCTGGATAATAAGGTTTA
24
58
1131
2698
2717
525218
GATGTTCTGGATAATAAGGT
20
73
1132
2701
2720
525219
CTAGATGTTCTGGATAATAA
26
66
1133
2704
2723
525220
TAACTAGATGTTCTGGATAA
21
66
1134
2707
2726
525221
GATTAACTAGATGTTCTGGA
30
78
1135
2710
2729
525222
AATGATTAACTAGATGTTCT
30
61
1136
2713
2732
525223
AGTAATGATTAACTAGATGT
9
57
1137
2716
2735
525224
GGAAGTAATGATTAACTAGA
18
72
1138
2719
2738
525225
TTTGGAAGTAATGATTAACT
7
67
1139
2722
2741
525226
TAGTTTGGAAGTAATGATTA
2
30
1140
2725
2744
525227
GTCTAGTTTGGAAGTAATGA
27
78
1141
2728
2747
525228
AGTGTCTAGTTTGGAAGTAA
27
75
1142
2731
2750
525229
AATAGTGTCTAGTTTGGAAG
34
73
1143
2734
2753
525230
GTAAATAGTGTCTAGTTTGG
28
68
1144
2737
2756
525231
TGTGTAAATAGTGTCTAGTT
27
79
1145
2740
2759
525232
GAGTGTGTAAATAGTGTCTA
27
71
1146
2743
2762
525233
ATAGAGTGTGTAAATAGTGT
17
75
1147
2746
2765
525234
TCCATAGAGTGTGTAAATAG
18
75
1148
2749
2768
525235
CCTTCCATAGAGTGTGTAAA
23
80
1149
2752
2771
525236
CCGCCTTCCATAGAGTGTGT
26
82
1150
2755
2774
525237
TACCCGCCTTCCATAGAGTG
19
80
1151
2758
2777
525238
ATATACCCGCCTTCCATAGA
0
67
1152
2761
2780
525239
ATAATATACCCGCCTTCCAT
19
70
1153
2764
2783
525240
TATATAATATACCCGCCTTC
9
73
1154
2767
2786
525241
TCTTATATAATATACCCGCC
20
80
1155
2770
2789
525242
CTCTCTTATATAATATACCC
29
76
1156
2773
2792
525243
TTTCTCTCTTATATAATATA
16
58
1157
2776
2795
525244
TTGTTTCTCTCTTATATAAT
26
57
1158
2779
2798
525245
GTGTTGTTTCTCTCTTATAT
35
85
1159
2782
2801
525246
TATGTGTTGTTTCTCTCTTA
34
82
1160
2785
2804
525247
CGCTATGTGTTGTTTCTCTC
34
86
1161
2802
2821
525248
TGACCCACAAAATGAGGCGC
17
71
1162
2805
2824
525249
TGGTGACCCACAAAATGAGG
31
67
1163
2808
2827
525250
ATATGGTGACCCACAAAATG
38
69
1164
2811
2830
525251
AGAATATGGTGACCCACAAA
37
77
1165
2814
2833
525252
CCAAGAATATGGTGACCCAC
35
79
1166
2817
2836
146831
TTCCCAAGAATATGGTGACC
27
75
1167
2820
2839
525253
TTGTTCCCAAGAATATGGTG
33
69
1168
2823
2842
525254
ATCTTGTTCCCAAGAATATG
27
65
1169
2826
2845
525255
TAGATCTTGTTCCCAAGAAT
31
70
1170
2829
2848
525256
CTGTAGATCTTGTTCCCAAG
42
81
1171
2832
2851
525257
ATGCTGTAGATCTTGTTCCC
34
80
1172
2835
2854
525258
CCCATGCTGTAGATCTTGTT
38
80
1173
2838
2857
525259
TGCCCCATGCTGTAGATCTT
36
80
1174
2841
2860
525260
TTCTGCCCCATGCTGTAGAT
32
74
1175
2844
2863
525261
AGATTCTGCCCCATGCTGTA
27
75
1176
2847
2866
525262
GAAAGATTCTGCCCCATGCT
34
70
1177
2850
2869
525263
GTGGAAAGATTCTGCCCCAT
22
76
1178
2853
2872
525264
CTGGTGGAAAGATTCTGCCC
36
72
1179
2856
2875
525265
TTGCTGGTGGAAAGATTCTG
32
71
1180
2859
2878
525266
GGATTGCTGGTGGAAAGATT
20
74
1181
2862
2881
525267
AGAGGATTGCTGGTGGAAAG
25
73
1182
2865
2884
525268
CCCAGAGGATTGCTGGTGGA
40
82
1183
2868
2887
525269
AATCCCAGAGGATTGCTGGT
32
79
1184
2871
2890
525270
AAGAATCCCAGAGGATTGCT
23
69
1185
2874
2893
525271
GGAAAGAATCCCAGAGGATT
10
66
1186
2877
2896
525272
TCGGGAAAGAATCCCAGAGG
29
73
1187
2880
2899
525273
TGGTCGGGAAAGAATCCCAG
31
77
1188
2883
2902
525274
TGGTGGTCGGGAAAGAATCC
38
71
1189
2886
2905
525275
AACTGGTGGTCGGGAAAGAA
33
78
1190
2889
2908
525276
TCCAACTGGTGGTCGGGAAA
29
76
1191
2892
2911
525277
GGATCCAACTGGTGGTCGGG
19
81
1192
2895
2914
525278
GCTGGATCCAACTGGTGGTC
24
74
1193
2898
2917
525279
AAGGCTGGATCCAACTGGTG
33
83
1194
2901
2920
525280
CTGAAGGCTGGATCCAACTG
18
81
1195
2904
2923
525286
GCTCTGAAGGCTGGATCCAA
40
79
1196
2907
2926
525287
TTTGCTCTGAAGGCTGGATC
34
69
1197
2910
2929
525288
GTGTTTGCTCTGAAGGCTGG
38
72
1198
2913
2932
525289
GCTGTGTTTGCTCTGAAGGC
40
82
1199
2916
2935
525290
TTTGCTGTGTTTGCTCTGAA
44
78
1200
2919
2938
525291
GGATTTGCTGTGTTTGCTCT
38
76
1201
2922
2941
525292
TCTGGATTTGCTGTGTTTGC
28
79
1202
2925
2944
525293
CAATCTGGATTTGCTGTGTT
26
61
1203
2928
2947
525294
TCCCAATCTGGATTTGCTGT
32
68
1204
2931
2950
525295
AAGTCCCAATCTGGATTTGC
33
59
1205
2934
2953
146832
TTGAAGTCCCAATCTGGATT
17
35
1206
2937
2956
525296
GGATTGAAGTCCCAATCTGG
35
62
1207
2940
2959
525297
TTGGGATTGAAGTCCCAATC
10
36
1208
2943
2962
525298
TTGTTGGGATTGAAGTCCCA
24
49
1209
2946
2965
525299
TCCTTGTTGGGATTGAAGTC
16
52
1210
2949
2968
525300
GTGTCCTTGTTGGGATTGAA
18
71
1211
2952
2971
525301
CAGGTGTCCTTGTTGGGATT
25
73
1212
2955
2974
525302
GGCCAGGTGTCCTTGTTGGG
31
70
1213
2958
2977
525303
TCTGGCCAGGTGTCCTTGTT
29
75
1214
2978
2997
525304
CAGCTCCTACCTTGTTGGCG
29
71
1215
2981
3000
525305
CTCCAGCTCCTACCTTGTTG
19
63
1216
2984
3003
525306
ATGCTCCAGCTCCTACCTTG
35
75
1217
2987
3006
525307
CGAATGCTCCAGCTCCTACC
13
77
1218
2990
3009
525308
GCCCGAATGCTCCAGCTCCT
28
72
1219
2993
3012
525309
CCAGCCCGAATGCTCCAGCT
32
77
1220
2996
3015
525310
AACCCAGCCCGAATGCTCCA
34
72
1221
2999
3018
525311
TGAAACCCAGCCCGAATGCT
28
69
1222
3002
3021
525312
GGGTGAAACCCAGCCCGAAT
18
68
1223
3020
3039
525313
AAAGGCCTCCGTGCGGTGGG
36
77
1224
3023
3042
525314
CCAAAAGGCCTCCGTGCGGT
34
83
1225
3026
3045
525315
ACCCCAAAAGGCCTCCGTGC
28
70
1226
3029
3048
525316
TCCACCCCAAAAGGCCTCCG
26
65
1227
3032
3051
525317
GGCTCCACCCCAAAAGGCCT
19
36
1228
3035
3054
525318
GAGGGCTCCACCCCAAAAGG
14
36
1229
3038
3057
525319
CCTGAGGGCTCCACCCCAAA
32
71
1230
3041
3060
525320
GAGCCTGAGGGCTCCACCCC
37
61
1231
3044
3063
525321
CCTGAGCCTGAGGGCTCCAC
42
70
1232
3047
3066
525322
TGCCCTGAGCCTGAGGGCTC
24
56
1233
3050
3069
525323
GTATGCCCTGAGCCTGAGGG
14
75
1234
3053
3072
525324
GTAGTATGCCCTGAGCCTGA
29
83
1235
3056
3075
525325
TTTGTAGTATGCCCTGAGCC
32
61
1236
3059
3078
525326
AAGTTTGTAGTATGCCCTGA
35
70
1237
3062
3081
525327
GCAAAGTTTGTAGTATGCCC
37
61
1238
3065
3084
525328
CTGGCAAAGTTTGTAGTATG
26
63
1239
3068
3087
525329
TTGCTGGCAAAGTTTGTAGT
37
74
1240
3071
3090
525330
GATTTGCTGGCAAAGTTTGT
20
56
1241
3074
3093
525331
GCGGATTTGCTGGCAAAGTT
28
80
1242
3077
3096
525332
GAGGCGGATTTGCTGGCAAA
38
74
1243
3080
3099
525333
CAGGAGGCGGATTTGCTGGC
41
66
1244
3083
3102
525334
AGGCAGGAGGCGGATTTGCT
27
55
1245
3086
3105
525335
TGGAGGCAGGAGGCGGATTT
13
17
1246
3089
3108
525336
TGGTGGAGGCAGGAGGCGGA
7
21
1247
3092
3111
525337
GATTGGTGGAGGCAGGAGGC
21
44
1248
3095
3114
525338
GGCGATTGGTGGAGGCAGGA
31
65
1249
3098
3117
525339
TCTGGCGATTGGTGGAGGCA
15
76
1250
3101
3120
525340
CTGTCTGGCGATTGGTGGAG
35
73
1251
3104
3123
525341
TTCCTGTCTGGCGATTGGTG
32
72
1252
3107
3126
525342
GCCTTCCTGTCTGGCGATTG
28
64
1253
3110
3129
525343
GCTGCCTTCCTGTCTGGCGA
25
69
1254
3113
3132
525344
TAGGCTGCCTTCCTGTCTGG
32
79
1255
3116
3135
525345
GGGTAGGCTGCCTTCCTGTC
35
80
1256
3134
3153
525346
TCAAAGGTGGAGACAGCGGG
4
57
1257
3137
3156
525347
TTCTCAAAGGTGGAGACAGC
32
72
1258
3140
3159
525348
TGTTTCTCAAAGGTGGAGAC
32
66
1259
3143
3162
525349
GAGTGTTTCTCAAAGGTGGA
34
63
1260
3146
3165
525350
GATGAGTGTTTCTCAAAGGT
35
68
1261
3149
3168
525351
GAGGATGAGTGTTTCTCAAA
36
84
1262
3152
3171
525352
CCTGAGGATGAGTGTTTCTC
44
77
1263
3155
3174
52535
TGGCCTGAGGATGAGTGTTT
32
72
1264
3158
3177
525354
GCATGGCCTGAGGATGAGTG
27
73
1265
3162
3181
525355
CACTGCATGGCCTGAGGATG
40
69
1266
Таблица 25
Ингибирование уровней мРНК HBV действием химерных антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на SEQ ID NO:1286 (RTS3370 и RTS3372)
Вирусный сайт инициации
Вирусный терминирующий сайт
№ ISIS
Последовательность
RTS3370% ингибирование
RTS3372% ингибирование
SEQ ID NO
85
104
525356
TTCCACTGCATGGCCTGAGG
53
78
1267
88
107
525357
GAATTCCACTGCATGGCCTG
44
68
1268
91
110
525358
GTGGAATTCCACTGCATGGC
42
80
1269
94
113
525359
GTTGTGGAATTCCACTGCAT
45
77
1270
97
116
525360
AAGGTTGTGGAATTCCACTG
65
67
1271
100
119
525361
TGAAAGGTTGTGGAATTCCA
56
61
1272
Пример 12: Зависимое от дозы ингибирование вирусной РНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ

Некоторые химерные олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примерах 11 и 12, испытали при различных дозах в клетках HepG2.2.15 человека. Клетки поместили на планшет при плотности 28 ООО клеток на лунку и трансфицировали при помощи реагента LipofectAMINE 2000 антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 5, 56 нМ, 16,67 нМ, 50,0 нМ и 150,0 нМ, как показано в Таблице 26. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
50
Полумаксимальные ингибирующие концентрации (IC) каждого олигонуклеотида также представлены в Таблице 26. Как показано в Таблице 26, в клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, уровни мРНК HBV снизились зависимым от дозы образом.
Таблица 26
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3370
№ ISIS
5, 5556 нМ
16,6667 нМ
50,0 нМ
150,0 нМ
IC<sub>50</sub> (нМ)
146785
0
0
14
66
120,8
146786
40
64
78
88
8, 5
505314
23
35
58
84
28,8
505339
28
42
62
84
23,2
505347
9
21
45
75
53, 5
514469
11
22
69
79
35,4
524493
13
39
56
81
32,8
524540
15
38
54
80
34,0
524617
14
32
78
83
27,1
524619
33
42
60
84
21,3
524634
20
45
63
80
26,3
524641
39
49
62
86
14,9
524698
34
34
49
64
47,4
524699
25
31
44
63
66,1
524706
29
20
36
58
128,8
524709
32
26
48
56
89,1
524718
46
41
61
79
15,8
524731
49
53
68
83
8,1
524734
42
31
35
64
87,2
524767
19
38
62
84
27,8
524768
35
38
62
75
23, 5
524769
16
26
61
75
38,1
524806
0
0
0
35
>150,0
524807
3
22
39
74
60,2
524907
22
35
63
80
29,1
524908
25
45
67
78
22,9
524976
7
3
0
16
>150,0
524978
6
0
0
27
>150,0
524979
3
0
11
34
>150,0
524980
18
51
48
59
51, 5
524981
16
27
49
61
65,8
524982
21
19
29
54
>150,0
524983
23
40
50
60
53,2
524984
19
25
45
74
50,0
524985
13
19
40
56
107,2
524986
29
48
46
64
39,3
524987
17
0
43
61
102,8
524988
22
39
52
63
47,6
524991
0
7
19
20
>150,0
524997
17
0
1
9
>150,0
524998
1
5
8
34
>150,0
525095
5
0
0
18
>150,0
525100
14
5
14
26
>150,0
525101
0
0
15
19
>150,0
525102
0
0
18
23
>150,0
525103
0
0
3
15
>150,0
525179
18
7
9
18
>150,0
525245
0
0
8
8
>150,0
525247
12
15
16
23
>150,0
525289
1
1
15
30
>150,0
525314
17
0
18
25
>150,0
525324
0
6
13
16
>150,0
525351
28
13
22
30
>150,0
Некоторые ISIS-олигонуклеотиды испытали также с использованием набора затравочных зондов RTS3372. Результаты представлены в Таблице 27.
Таблица 27
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3372
№ ISIS
5, 5556 нМ
16,6667 нМ
50,0 нМ
150,0 нМ
IC<sub>50</sub> (нМ)
146785
0
0
0
51
>150,0
146786
41
68
81
91
7,9
505347
0
13
44
75
59,7
524103
0
0
1
9
>150,0
524245
0
0
6
10
>150,0
524767
18
46
60
85
25,8
524768
34
41
66
79
20, 5
524769
12
38
60
77
34, 5
524806
0
0
0
0
>150,0
524807
0
9
34
70
78,6
524907
20
41
62
84
26,4
524908
27
45
66
82
21,3
524976
0
0
0
16
>150,0
524978
3
0
0
22
>150,0
524979
0
0
0
33
>150,0
524980
28
51
52
67
30,1
524981
7
29
51
66
55,8
524982
22
29
37
63
83, 5
524983
20
51
43
62
50,9
524984
20
30
38
75
51,7
524985
30
33
40
60
83,6
524986
25
51
51
66
33,8
524987
19
0
24
65
157,6
524988
12
41
45
62
59,2
524991
0
0
4
8
>150,0
524997
19
0
0
15
>150,0
524998
0
0
1
42
>150,0
525095
0
0
0
17
>150,0
525100
10
0
4
19
>150,0
525101
10
0
21
25
>150,0
525102
0
0
10
15
>150,0
525247
11
12
15
28
>150,0
525289
0
9
11
33
>150,0
525314
1
0
18
24
>150,0
525324
9
8
15
10
>150,0
Пример 13: Зависимое от дозы ингибирование вирусной РНК HBV в клетках HepG2.2.15 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Некоторые химерные олигонуклеотиды из исследований, описанных выше, испытали при различных дозах на клетках HepG2.2.15 человека. Клетки поместили на планшет при плотности 30000 клеток на лунку и трансфицировали при помощи реагента LipofectAMINE 2000 антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 7,8125 нМ, 15,625 нМ, 31,25 нМ, 62, 5 нМ, 125,0 нМ и 250,0 нМ, как показано в Таблице 28. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3370. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Полумаксимальные ингибирующие концентрации (ICso) каждого олигонуклеотида также представлены в Таблице 28. Как показано в Таблице 28, в некоторых клетках, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами, уровни мРНК HBV снизились зависимым от дозы образом.
Таблица 28
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2.2.15 с использованием RTS3370
№ ISIS
7,8125 нМ
15,625 нМ
31,25 нМ
62, 5 нМ
125,0 нМ
250,0 нМ
IC<sub>50</sub> (нМ)
146786
0
0
14
49
33
50
161,2
510100
0
17
30
28
44
53
177,8
510106
0
4
0
0
29
0
>250,0
509934
0
0
0
7
16
0
>250,0
510116
0
0
8
21
27
25
>250,0
505347
31
3
30
63
80
81
48,7
Пример 14: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepG2 химерными олигонуклеотидами МОЕ
Антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды испытали в серии экспериментов, имеющих такие же культуральные условия. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах. Включили также ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 и ISIS 510100 из исследований, описанных выше. Культивированные клетки HepG2 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 70 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПНР в реальном времени. Набор вирусных затравочных зондов RTS3370 (прямая последовательность CTTGGTCATGGGCCATCAG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:2; обратная последовательность CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO: 3; последовательность зонда TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:4) использовали для измерения уровней мРНК. Уровни измерили также с использованием набора затравочных зондов RTS3371 (прямая последовательность CCAAACCTTCGGACGGAAA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:311; обратная последовательность TGAGGCCCACTCCCATAGG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO: 312; последовательность зонда CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, в настоящем документе обозначена как SEQ Ю NO: 313). Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками. В некоторых анализах, показанных в Таблицах 32, 35, 42, 45 и 46, эффективность ISIS 146786 измерили в двух лунках на одном планшете. В этих случаях представлены значения уровней ингибирования в обеих лунках.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были разработаны как 2-9-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 2-9-6 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 2-10-8 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 3-9-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 3-9-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 3-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 3-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 3-10-7 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 4-9-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 4-9-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 4-10-6 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 5-9-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 5-9-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 6-9-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 6-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды, 7-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды или 8-10-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды. 2-9-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие два и пять нуклеозидов, соответственно. 2-9-6 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие два и шесть нуклеозидов, соответственно. 2-10-8 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие два и восемь нуклеозидов, соответственно. 3-9-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие три и четыре нуклеозида, соответственно. 3-9-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие три и пять нуклеозидов, соответственно. 3-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по три нуклеозида. 3-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие три и четыре нуклеозида, соответственно. 3-10-7 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие три и семь нуклеозидов, соответственно. 4-9-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие четыре и три нуклеозида, соответственно. 4-9-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по четыре нуклеозидов. 4-10-6 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие четыре и шесть нуклеозидов, соответственно. 5-9-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие пять и два нуклеозида, соответственно. 5-9-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие пять и три нуклеозида, соответственно. 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. 6-9-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 17 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит девять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие шесть и два нуклеозида, соответственно. 6-10-4 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие шесть и четыре нуклеозида, соответственно. 7-10-3 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие семь и три нуклеозида, соответственно. 8-10-2 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие восемь и два нуклеозида, соответственно. Каждый нуклеозид в 5' сегменте крыла, и каждый нуклеозид в 3' сегменте крыла имеет МОЕ модификацию сахара. Колонка «мотив» указывает мотивы с количеством нуклеозидов в крыльях и сегменте гэп каждого олигонуклеотида. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Колонка «мотив» указывает структуру гэп и крыльев каждого химерного олигонуклеотида. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблицах, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №LJ95551.1). Эффективность новых разработанных олигонуклеотидов сравнили с ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 и 510100, информация для которых помещена в верхнюю часть каждой таблице.
Таблица 29
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
50
224
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
62
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552276
5-9-3
42
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552277
5-9-3
46
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552278
5-9-3
31
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552279
5-9-3
41
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552280
5-9-3
5
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552281
5-9-3
11
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552282
5-9-3
20
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552283
5-9-3
28
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552230
4-9-4
57
17
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552284
5-9-3
0
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552231
4-9-4
29
18
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552285
5-9-3
61
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552232
4-9-4
35
19
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552286
5-9-3
47
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552233
4-9-4
38
21
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552287
5-9-3
45
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552234
4-9-4
0
23
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552288
5-9-3
50
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552235
4-9-4
0
25
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552289
5-9-3
46
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552236
4-9-4
45
27
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552290
5-9-3
41
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552237
4-9-4
44
29
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552291
5-9-3
26
29
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552239
4-9-4
62
1292
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552293
5-9-3
67
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552240
4-9-4
61
1293
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552294
5-9-3
71
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552241
4-9-4
55
1294
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552295
5-9-3
58
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552242
4-9-4
60
40
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552296
5-9-3
59
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552243
4-9-4
57
41
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552297
5-9-3
55
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552244
4-9-4
33
42
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552298
5-9-3
48
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552245
4-9-4
48
43
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552299
5-9-3
34
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552246
4-9-4
81
1295
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552300
5-9-3
56
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552247
4-9-4
87
1296
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552301
5-9-3
86
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552248
4-9-4
72
1297
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552302
5-9-3
77
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552249
4-9-4
56
1298
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552303
5-9-3
65
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552250
4-9-4
52
1299
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552304
5-9-3
57
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552251
4-9-4
43
1300
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552305
5-9-3
56
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552252
4-9-4
62
1301
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552306
5-9-3
75
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552253
4-9-4
82
1302
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552307
5-9-3
90
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552254
4-9-4
74
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552255
4-9-4
78
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552256
4-9-4
65
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552257
4-9-4
62
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552258
4-9-4
72
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552259
4-9-4
63
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552260
4-9-4
58
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552261
4-9-4
63
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552262
4-9-4
50
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552263
4-9-4
60
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552264
4-9-4
52
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552265
4-9-4
68
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552266
4-9-4
62
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552267
4-9-4
58
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552268
4-9-4
62
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552269
4-9-4
52
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552270
4-9-4
54
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552271
4-9-4
58
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552272
4-9-4
40
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552273
4-9-4
34
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552274
4-9-4
34
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552275
4-9-4
39
56
Таблица 30
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA CGG
146786
5-10-5
49
224
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
43
145
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
54
17
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552384
2-9-5
29
1318
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552440
3-9-4
58
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552385
2-9-5
57
1319
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552441
3-9-4
42
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552386
2-9-5
53
1320
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552442
3-9-4
53
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552387
2-9-5
48
1321
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552443
3-9-4
59
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552388
2-9-5
40
86
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552444
3-9-4
51
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552389
2-9-5
39
137
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552445
3-9-4
60
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552390
2-9-5
52
140
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552446
3-9-4
54
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552391
2-9-5
57
143
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552447
3-9-4
54
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552392
2-9-5
0
145
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552448
3-9-4
58
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552393
2-9-5
59
147
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552449
3-9-4
60
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552394
2-9-5
53
149
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552450
3-9-4
53
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552395
2-9-5
57
151
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552451
3-9-4
39
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552396
2-9-5
62
153
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552452
3-9-4
57
153
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552238
4-9-4
38
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552292
5-9-3
48
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552346
6-9-2
0
33
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552397
2-9-5
63
167
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552453
3-9-4
56
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552398
2-9-5
61
168
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552454
3-9-4
48
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552399
2-9-5
52
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552400
2-9-5
57
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552401
2-9-5
52
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552402
2-9-5
54
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552403
2-9-5
74
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552404
2-9-5
43
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552405
2-9-5
15
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552406
2-9-5
37
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552407
2-9-5
37
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552408
2-9-5
76
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552409
2-9-5
76
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552410
2-9-5
63
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552411
2-9-5
70
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552412
2-9-5
62
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552413
2-9-5
56
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552414
2-9-5
63
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552415
2-9-5
52
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552416
2-9-5
67
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552417
2-9-5
50
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552418
2-9-5
79
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552419
2-9-5
70
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552420
2-9-5
71
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552421
2-9-5
69
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552422
2-9-5
68
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552423
2-9-5
65
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552424
2-9-5
70
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552425
2-9-5
51
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552426
2-9-5
40
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552427
2-9-5
35
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552428
2-9-5
58
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552429
2-9-5
46
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552430
2-9-5
53
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552431
2-9-5
51
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552432
2-9-5
57
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552433
2-9-5
54
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552434
2-9-5
44
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552435
2-9-5
46
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552436
2-9-5
36
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552437
2-9-5
27
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552438
2-9-5
27
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552439
2-9-5
13
236
Таблица 31
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
35
224
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
52
145
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552496
4-9-3
47
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552497
4-9-3
57
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552498
4-9-3
45
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552499
4-9-3
52
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552500
4-9-3
46
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552501
4-9-3
44
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552502
4-9-3
57
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552503
4-9-3
52
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552504
4-9-3
45
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552505
4-9-3
56
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552506
4-9-3
54
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552507
4-9-3
34
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552508
4-9-3
34
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552509
4-9-3
48
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552510
4-9-3
50
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552455
3-9-4
66
181
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552511
4-9-3
66
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552456
3-9-4
64
1322
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552512
4-9-3
62
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552457
3-9-4
14
1323
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552513
4-9-3
56
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552458
3-9-4
59
1324
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552514
4-9-3
52
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552459
3-9-4
69
188
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552515
4-9-3
57
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552460
3-9-4
0
190
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552516
4-9-3
54
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552461
3-9-4
20
191
689
704
AACCACTGAACAAATG
552517
4-9-3
52
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552462
3-9-4
46
192
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552518
4-9-3
34
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552463
3-9-4
48
194
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552519
4-9-3
44
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552464
3-9-4
81
211
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552520
4-9-3
69
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552465
3-9-4
84
1325
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552521
4-9-3
80
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552466
3-9-4
75
1326
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552522
4-9-3
76
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552467
3-9-4
65
1327
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552523
4-9-3
71
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552468
3-9-4
53
1328
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552524
4-9-3
43
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552469
3-9-4
51
1329
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552525
4-9-3
57
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552470
3-9-4
46
1330
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552526
4-9-3
60
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552471
3-9-4
54
1331
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552527
4-9-3
72
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552472
3-9-4
78
1332
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552528
4-9-3
78
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552473
3-9-4
67
1333
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552529
4-9-3
77
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552474
3-9-4
79
1334
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552530
4-9-3
78
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552475
3-9-4
74
1335
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552531
4-9-3
68
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552476
3-9-4
52
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552477
3-9-4
76
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552478
3-9-4
70
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552479
3-9-4
67
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552480
3-9-4
68
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552481
3-9-4
57
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552482
3-9-4
51
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552483
3-9-4
48
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552484
3-9-4
58
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552485
3-9-4
51
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552486
3-9-4
55
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552487
3-9-4
62
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552488
3-9-4
51
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552489
3-9-4
49
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552490
3-9-4
51
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552491
3-9-4
51
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552492
3-9-4
38
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552493
3-9-4
52
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552494
3-9-4
17
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552495
3-9-4
49
236
Таблица 32
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
43
224
52
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
38
145
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552552
5-9-2
33
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552553
5-9-2
46
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552554
5-9-2
54
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552555
5-9-2
50
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552556
5-9-2
46
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552557
5-9-2
57
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552558
5-9-2
55
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552559
5-9-2
66
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552560
5-9-2
44
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552561
5-9-2
48
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552562
5-9-2
52
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552563
5-9-2
45
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552564
5-9-2
41
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552565
5-9-2
54
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552566
5-9-2
56
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552567
5-9-2
71
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552568
5-9-2
64
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552569
5-9-2
59
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552570
5-9-2
60
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552571
5-9-2
55
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552572
5-9-2
60
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552573
5-9-2
24
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552574
5-9-2
34
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552575
5-9-2
36
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552576
5-9-2
67
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552577
5-9-2
64
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552578
5-9-2
75
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552579
5-9-2
75
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552580
5-9-2
59
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552581
5-9-2
54
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552582
5-9-2
61
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552583
5-9-2
69
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552584
5-9-2
74
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552585
5-9-2
62
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552586
5-9-2
79
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552587
5-9-2
71
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552532
4-9-3
48
1336
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552588
5-9-2
70
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552533
4-9-3
43
1337
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552589
5-9-2
59
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552534
4-9-3
62
1338
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552590
5-9-2
70
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552535
4-9-3
55
1339
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552591
5-9-2
51
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552536
4-9-3
3
1340
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552592
5-9-2
50
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552537
4-9-3
14
1341
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552593
5-9-2
46
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552538
4-9-3
52
1342
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552594
5-9-2
55
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552539
4-9-3
47
1343
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552595
5-9-2
60
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552540
4-9-3
60
1344
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552596
5-9-2
63
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552541
4-9-3
60
1345
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552597
5-9-2
61
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552542
4-9-3
64
1346
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552598
5-9-2
57
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552543
4-9-3
46
1347
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552600
5-9-2
59
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552544
4-9-3
53
1348
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552602
5-9-2
6
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552545
4-9-3
33
230
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552604
5-9-2
47
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552546
4-9-3
42
231
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552606
5-9-2
53
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552547
4-9-3
51
232
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552608
5-9-2
53
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552548
4-9-3
52
233
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552610
5-9-2
47
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552549
4-9-3
38
234
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552612
5-9-2
39
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552550
4-9-3
19
235
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552614
5-9-2
24
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552551
4-9-3
24
236
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552616
5-9-2
15
236
Таблица 33
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
51
224
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
76
50
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552007
6-10-4
61
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552039
7-10-3
84
83
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552008
6-10-4
48
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552040
7-10-3
48
103
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552009
6-10-4
77
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552041
7-10-3
73
136
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552010
6-10-4
63
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552042
7-10-3
66
139
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552011
6-10-4
52
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552043
7-10-3
54
142
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552012
6-10-4
73
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552044
7-10-3
86
20
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552013
6-10-4
73
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552045
7-10-3
65
22
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552014
6-10-4
76
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552046
7-10-3
93
24
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552015
6-10-4
70
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552047
7-10-3
77
26
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552016
6-10-4
61
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552048
7-10-3
66
28
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552017
6-10-4
73
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552049
7-10-3
73
39
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552018
6-10-4
98
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552050
7-10-3
98
719
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552019
6-10-4
98
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552051
7-10-3
99
212
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551986
4-10-6
92
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552020
6-10-4
97
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552052
7-10-3
98
720
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551987
4-10-6
95
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552021
6-10-4
97
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552053
7-10-3
98
721
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551988
4-10-6
50
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552005
5-10-5
99
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552022
6-10-4
99
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552054
7-10-3
99
1349
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551989
4-10-6
96
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552023
6-10-4
99
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552055
7-10-3
98
722
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551990
4-10-6
86
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552024
6-10-4
89
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552056
7-10-3
88
224
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551991
4-10-6
0
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552025
6-10-4
90
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552057
7-10-3
92
801
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551992
4-10-6
72
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552026
6-10-4
88
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552058
7-10-3
86
802
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551993
4-10-6
82
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552027
6-10-4
87
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552059
7-10-3
88
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551994
4-10-6
85
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552028
6-10-4
83
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552060
7-10-3
82
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551995
4-10-6
84
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552029
6-10-4
88
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552061
7-10-3
85
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551996
4-10-6
87
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552030
6-10-4
88
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552062
7-10-3
85
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551997
4-10-6
83
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552031
6-10-4
82
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551998
4-10-6
85
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552032
6-10-4
87
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551999
4-10-6
82
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552033
6-10-4
87
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552000
4-10-6
83
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552006
5-10-5
88
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552034
6-10-4
89
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552001
4-10-6
65
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552035
6-10-4
60
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552002
4-10-6
63
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552036
6-10-4
65
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552003
4-10-6
65
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552037
6-10-4
58
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552004
4-10-6
58
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552038
6-10-4
70
52
Таблица 34
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
64
224
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
62
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552168
3-9-5
79
1288
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552222
4-9-4
79
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552169
3-9-5
67
1289
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552223
4-9-4
40
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552170
3-9-5
69
1290
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552224
4-9-4
64
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552171
3-9-5
65
1291
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552225
4-9-4
69
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552172
3-9-5
33
9
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552226
4-9-4
48
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552173
3-9-5
41
10
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552227
4-9-4
32
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552174
3-9-5
31
11
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552228
4-9-4
42
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552175
3-9-5
59
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552176
3-9-5
68
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552177
3-9-5
55
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552178
3-9-5
66
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552179
3-9-5
70
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552180
3-9-5
66
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552181
3-9-5
51
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552182
3-9-5
69
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552183
3-9-5
69
29
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552184
3-9-5
43
33
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552185
3-9-5
66
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552186
3-9-5
54
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552187
3-9-5
74
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552188
3-9-5
78
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552189
3-9-5
57
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552190
3-9-5
39
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552191
3-9-5
60
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552192
3-9-5
85
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552193
3-9-5
86
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552194
3-9-5
68
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552195
3-9-5
73
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552196
3-9-5
60
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552197
3-9-5
60
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552198
3-9-5
61
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552199
3-9-5
89
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552200
3-9-5
85
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552201
3-9-5
81
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552202
3-9-5
76
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552203
3-9-5
74
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552204
3-9-5
71
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552151
2-9-6
77
1308
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552205
3-9-5
78
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552152
2-9-6
72
1309
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552206
3-9-5
77
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552153
2-9-6
67
1310
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552207
3-9-5
81
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552154
2-9-6
56
1311
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552208
3-9-5
70
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552155
2-9-6
61
1312
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552209
3-9-5
63
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552156
2-9-6
20
1313
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552210
3-9-5
75
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552157
2-9-6
39
1314
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552211
3-9-5
75
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552158
2-9-6
70
1315
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552212
3-9-5
67
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552159
2-9-6
74
1316
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552213
3-9-5
70
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552160
2-9-6
78
1317
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552214
3-9-5
79
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552161
2-9-6
56
47
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552215
3-9-5
61
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552162
2-9-6
64
49
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552216
3-9-5
62
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552163
2-9-6
71
51
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552217
3-9-5
58
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552164
2-9-6
52
53
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552218
3-9-5
56
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552165
2-9-6
53
54
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552219
3-9-5
33
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552166
2-9-6
41
55
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552220
3-9-5
53
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552167
2-9-6
54
56
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552221
3-9-5
31
56
Таблица 35
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
60
224
85
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
76
50
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
73
17
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552071
8-10-2
79
83
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552114
2-9-6
66
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552115
2-9-6
70
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552116
2-9-6
68
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552117
2-9-6
70
1291
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552072
8-10-2
50
103
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552118
2-9-6
66
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552119
2-9-6
62
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552120
2-9-6
35
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552121
2-9-6
39
12
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552073
8-10-2
80
136
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552122
2-9-6
55
17
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552074
8-10-2
73
139
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552123
2-9-6
75
18
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552075
8-10-2
78
142
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552124
2-9-6
64
19
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552076
8-10-2
70
20
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552125
2-9-6
73
21
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552077
8-10-2
83
22
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552126
2-9-6
64
23
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552078
8-10-2
80
24
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552127
2-9-6
72
25
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552079
8-10-2
86
26
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552128
2-9-6
76
27
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552080
8-10-2
83
28
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552129
2-9-6
72
29
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552131
2-9-6
61
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552132
2-9-6
73
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552133
2-9-6
75
1294
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552081
8-10-2
76
39
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552134
2-9-6
58
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552135
2-9-6
67
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552136
2-9-6
65
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552137
2-9-6
55
43
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552082
8-10-2
98
719
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552138
2-9-6
82
1295
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552083
8-10-2
99
212
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552139
2-9-6
86
1296
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552084
8-10-2
99
720
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552140
2-9-6
74
1297
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552085
8-10-2
100
721
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552141
2-9-6
67
1298
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552086
8-10-2
100
1349
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552142
2-9-6
45
1299
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552087
8-10-2
100
722
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552143
2-9-6
68
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552144
2-9-6
78
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552145
2-9-6
88
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552146
2-9-6
81
1303
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552088
8-10-2
95
224
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552147
2-9-6
88
1304
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552089
8-10-2
93
801
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552148
2-9-6
79
1305
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552090
8-10-2
87
802
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552149
2-9-6
81
1306
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552091
8-10-2
88
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552092
8-10-2
90
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552093
8-10-2
91
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552094
8-10-2
88
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552063
7-10-3
81
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552095
8-10-2
89
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552064
7-10-3
85
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552096
8-10-2
92
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552065
7-10-3
86
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552097
8-10-2
93
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552066
7-10-3
33
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552098
8-10-2
88
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552067
7-10-3
50
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552099
8-10-2
70
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552068
7-10-3
73
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552100
8-10-2
70
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552069
7-10-3
73
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552101
8-10-2
76
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552070
7-10-3
71
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552102
8-10-2
64
52
Таблица 36
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
84
224
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
76
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552330
6-9-2
54
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552331
6-9-2
66
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552332
6-9-2
70
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552333
6-9-2
55
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552334
6-9-2
42
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552335
6-9-2
39
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552336
6-9-2
27
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552337
6-9-2
74
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552338
6-9-2
68
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552339
6-9-2
71
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552340
6-9-2
61
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552341
6-9-2
58
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552342
6-9-2
55
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552343
6-9-2
63
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552344
6-9-2
51
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552345
6-9-2
65
29
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552346
6-9-2
0
33
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552347
6-9-2
84
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552348
6-9-2
87
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552349
6-9-2
74
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552350
6-9-2
59
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552351
6-9-2
60
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552352
6-9-2
53
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552353
6-9-2
0
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552354
6-9-2
83
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552355
6-9-2
90
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552356
6-9-2
0
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552357
6-9-2
45
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552358
6-9-2
74
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552359
6-9-2
72
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552360
6-9-2
87
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552361
6-9-2
96
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552308
5-9-3
81
1303
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552362
6-9-2
92
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552309
5-9-3
77
1304
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552363
6-9-2
92
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552310
5-9-3
80
1305
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552364
6-9-2
87
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552311
5-9-3
13
1306
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552365
6-9-2
84
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552150
2-9-6
73
1307
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552312
5-9-3
77
1307
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552366
6-9-2
87
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552313
5-9-3
64
1308
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552367
6-9-2
85
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552314
5-9-3
73
1309
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552368
6-9-2
77
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552315
5-9-3
75
1310
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552369
6-9-2
75
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552316
5-9-3
64
1311
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552370
6-9-2
63
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552317
5-9-3
99
1312
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552371
6-9-2
81
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552318
5-9-3
76
1313
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552372
6-9-2
65
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552319
5-9-3
55
1314
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552373
6-9-2
74
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552320
5-9-3
68
1315
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552374
6-9-2
78
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552321
5-9-3
74
1316
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552375
6-9-2
81
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552322
5-9-3
73
1317
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552376
6-9-2
78
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552323
5-9-3
75
47
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552377
6-9-2
70
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552324
5-9-3
0
49
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552378
6-9-2
72
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552325
5-9-3
70
51
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552379
6-9-2
74
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552326
5-9-3
63
53
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552380
6-9-2
53
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552327
5-9-3
30
54
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552381
6-9-2
26
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552328
5-9-3
25
55
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552382
6-9-2
13
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552329
5-9-3
33
56
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552383
6-9-2
5
56
Таблица 37
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
30
50
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551909
2-10-8
62
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551941
3-10-7
74
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551973
4-10-6
64
83
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551910
2-10-8
52
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551942
3-10-7
54
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551974
4-10-6
51
103
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551911
2-10-8
58
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551943
3-10-7
64
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551975
4-10-6
57
136
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551912
2-10-8
59
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551944
3-10-7
66
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551976
4-10-6
57
139
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551913
2-10-8
58
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551945
3-10-7
56
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551977
4-10-6
56
142
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551914
2-10-8
0
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551946
3-10-7
48
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551978
4-10-6
53
20
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551915
2-10-8
44
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551947
3-10-7
53
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551979
4-10-6
64
22
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551916
2-10-8
57
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551948
3-10-7
68
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551980
4-10-6
56
24
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551917
2-10-8
58
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551949
3-10-7
64
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551981
4-10-6
63
26
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551918
2-10-8
59
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551950
3-10-7
71
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551982
4-10-6
63
28
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551919
2-10-8
76
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551951
3-10-7
71
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551983
4-10-6
73
39
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551920
2-10-8
68
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551952
3-10-7
76
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551984
4-10-6
81
719
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551921
2-10-8
83
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551953
3-10-7
82
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551985
4-10-6
76
212
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551922
2-10-8
73
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551954
3-10-7
68
720
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551923
2-10-8
59
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551955
3-10-7
71
721
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551924
2-10-8
80
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551956
3-10-7
80
1349
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551925
2-10-8
82
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551957
3-10-7
88
722
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551926
2-10-8
71
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551958
3-10-7
74
224
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551927
2-10-8
68
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551959
3-10-7
69
801
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551928
2-10-8
69
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551960
3-10-7
62
802
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551929
2-10-8
54
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551961
3-10-7
20
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551930
2-10-8
53
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551962
3-10-7
60
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551931
2-10-8
47
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551963
3-10-7
63
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551932
2-10-8
68
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551964
3-10-7
56
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551933
2-10-8
72
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551965
3-10-7
67
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551934
2-10-8
64
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551966
3-10-7
73
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551935
2-10-8
68
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551967
3-10-7
60
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
551936
2-10-8
67
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
551968
3-10-7
63
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
551937
2-10-8
47
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
551969
3-10-7
36
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
551938
2-10-8
41
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
551970
3-10-7
43
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
551939
2-10-8
53
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
551971
3-10-7
55
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
551940
2-10-8
50
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
551972
3-10-7
58
52
Таблица 38
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
21
50
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551909
2-10-8
52
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551941
3-10-7
62
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
551973
4-10-6
58
83
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551910
2-10-8
48
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551942
3-10-7
36
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
551974
4-10-6
45
103
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551911
2-10-8
61
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551943
3-10-7
56
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
551975
4-10-6
60
136
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551912
2-10-8
53
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551944
3-10-7
48
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
551976
4-10-6
48
139
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551913
2-10-8
53
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551945
3-10-7
54
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
551977
4-10-6
48
142
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551914
2-10-8
0
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551946
3-10-7
56
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
551978
4-10-6
36
20
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551915
2-10-8
47
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551947
3-10-7
45
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
551979
4-10-6
54
22
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551916
2-10-8
44
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551948
3-10-7
59
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
551980
4-10-6
49
24
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551917
2-10-8
48
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551949
3-10-7
60
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
551981
4-10-6
57
26
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551918
2-10-8
53
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551950
3-10-7
57
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
551982
4-10-6
57
28
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551919
2-10-8
65
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551951
3-10-7
57
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
551983
4-10-6
53
39
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551920
2-10-8
57
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551952
3-10-7
67
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
551984
4-10-6
62
719
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551921
2-10-8
60
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551953
3-10-7
57
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
551985
4-10-6
58
212
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551922
2-10-8
63
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551954
3-10-7
61
720
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551923
2-10-8
50
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551955
3-10-7
44
721
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551924
2-10-8
52
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551956
3-10-7
46
1349
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551925
2-10-8
54
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551957
3-10-7
51
722
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551926
2-10-8
70
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551958
3-10-7
72
224
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551927
2-10-8
60
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551959
3-10-7
61
801
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551928
2-10-8
57
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551960
3-10-7
58
802
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551929
2-10-8
49
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551961
3-10-7
26
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551930
2-10-8
54
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551962
3-10-7
57
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551931
2-10-8
46
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551963
3-10-7
56
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551932
2-10-8
57
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551964
3-10-7
53
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551933
2-10-8
65
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551965
3-10-7
54
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551934
2-10-8
58
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551966
3-10-7
69
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551935
2-10-8
63
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551967
3-10-7
53
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
551936
2-10-8
67
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
551968
3-10-7
60
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
551937
2-10-8
51
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
551969
3-10-7
42
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
551938
2-10-8
40
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
551970
3-10-7
38
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
551939
2-10-8
32
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
551971
3-10-7
46
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
551940
2-10-8
39
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
551972
3-10-7
51
52
Таблица 39
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
40
224
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
60
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552276
5-9-3
44
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552277
5-9-3
39
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552278
5-9-3
37
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552279
5-9-3
50
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552280
5-9-3
2
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552281
5-9-3
0
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552282
5-9-3
13
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552229
4-9-4
17
12
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552283
5-9-3
27
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552230
4-9-4
53
17
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552284
5-9-3
0
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552231
4-9-4
31
18
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552285
5-9-3
56
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552232
4-9-4
35
19
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552286
5-9-3
43
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552233
4-9-4
40
21
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552287
5-9-3
44
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552234
4-9-4
0
23
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552288
5-9-3
44
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552235
4-9-4
13
25
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552289
5-9-3
21
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552236
4-9-4
40
27
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552290
5-9-3
34
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552237
4-9-4
37
29
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552291
5-9-3
34
29
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552239
4-9-4
58
1292
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552293
5-9-3
61
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552240
4-9-4
54
1293
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552294
5-9-3
62
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552241
4-9-4
47
1294
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552295
5-9-3
63
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552242
4-9-4
61
40
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552296
5-9-3
61
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552243
4-9-4
55
41
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552297
5-9-3
52
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552244
4-9-4
45
42
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552298
5-9-3
27
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552245
4-9-4
41
43
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552299
5-9-3
32
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552246
4-9-4
67
1295
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552300
5-9-3
57
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552247
4-9-4
74
1296
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552301
5-9-3
76
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552248
4-9-4
65
1297
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552302
5-9-3
68
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552249
4-9-4
38
1298
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552303
5-9-3
59
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552250
4-9-4
43
1299
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552304
5-9-3
30
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552251
4-9-4
52
1300
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552305
5-9-3
49
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552252
4-9-4
51
1301
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552306
5-9-3
56
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552253
4-9-4
47
1302
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552307
5-9-3
49
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552254
4-9-4
50
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552255
4-9-4
64
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552256
4-9-4
57
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552257
4-9-4
51
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552258
4-9-4
62
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552259
4-9-4
59
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552260
4-9-4
56
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552261
4-9-4
54
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552262
4-9-4
47
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552263
4-9-4
45
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552264
4-9-4
52
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552265
4-9-4
58
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552266
4-9-4
54
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552267
4-9-4
43
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552268
4-9-4
57
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552269
4-9-4
34
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552270
4-9-4
37
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552271
4-9-4
42
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552272
4-9-4
36
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552273
4-9-4
25
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552274
4-9-4
11
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552275
4-9-4
38
56
Таблица 40
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
38
1354
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
49
145
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
55
17
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552384
2-9-5
41
1318
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552440
3-9-4
57
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552385
2-9-5
53
1319
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552441
3-9-4
38
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552386
2-9-5
42
1320
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552442
3-9-4
72
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552387
2-9-5
43
1321
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552443
3-9-4
56
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552388
2-9-5
18
86
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552444
3-9-4
39
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552389
2-9-5
24
137
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552445
3-9-4
53
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552390
2-9-5
40
140
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552446
3-9-4
57
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552391
2-9-5
51
143
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552447
3-9-4
53
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552392
2-9-5
0
145
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552448
3-9-4
57
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552393
2-9-5
52
147
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552449
3-9-4
49
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552394
2-9-5
32
149
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552450
3-9-4
44
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552395
2-9-5
33
151
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552451
3-9-4
38
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552396
2-9-5
46
153
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552452
3-9-4
30
153
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552130
2-9-6
46
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552184
3-9-5
34
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552238
4-9-4
41
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552292
5-9-3
45
33
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552346
6-9-2
0
33
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552397
2-9-5
37
167
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552453
3-9-4
45
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552398
2-9-5
42
168
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552454
3-9-4
39
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552399
2-9-5
34
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552400
2-9-5
47
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552401
2-9-5
53
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552402
2-9-5
47
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552403
2-9-5
70
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552404
2-9-5
44
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552405
2-9-5
0
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552406
2-9-5
25
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552407
2-9-5
23
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552408
2-9-5
73
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552409
2-9-5
71
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552410
2-9-5
52
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552411
2-9-5
62
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552412
2-9-5
50
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552413
2-9-5
55
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552414
2-9-5
64
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552415
2-9-5
45
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552416
2-9-5
45
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552417
2-9-5
37
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552418
2-9-5
73
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552419
2-9-5
68
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552420
2-9-5
64
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552421
2-9-5
54
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552422
2-9-5
60
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552423
2-9-5
62
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552424
2-9-5
60
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552425
2-9-5
46
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552426
2-9-5
48
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552427
2-9-5
36
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552428
2-9-5
57
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552429
2-9-5
36
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552430
2-9-5
42
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552431
2-9-5
60
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552432
2-9-5
44
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552433
2-9-5
55
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552434
2-9-5
46
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552435
2-9-5
47
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552436
2-9-5
25
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552437
2-9-5
19
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552438
2-9-5
25
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552439
2-9-5
22
236
Таблица 41
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
49
145
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552496
4-9-3
35
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552497
4-9-3
60
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552498
4-9-3
20
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552499
4-9-3
45
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552500
4-9-3
53
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552501
4-9-3
56
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552502
4-9-3
50
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552503
4-9-3
36
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552504
4-9-3
50
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552505
4-9-3
53
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552506
4-9-3
49
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552507
4-9-3
35
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552508
4-9-3
62
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552509
4-9-3
65
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552510
4-9-3
54
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552455
3-9-4
60
181
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552511
4-9-3
65
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552456
3-9-4
69
1322
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552512
4-9-3
63
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552457
3-9-4
4
1323
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552513
4-9-3
50
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552458
3-9-4
59
1324
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552514
4-9-3
53
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552459
3-9-4
69
188
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552515
4-9-3
68
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552460
3-9-4
3
190
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552516
4-9-3
65
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552461
3-9-4
37
191
689
704
AACCACTGAACAAATG
552517
4-9-3
54
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552462
3-9-4
42
192
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552518
4-9-3
23
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552463
3-9-4
28
194
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552519
4-9-3
32
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552464
3-9-4
72
211
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552520
4-9-3
61
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552465
3-9-4
68
1325
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552521
4-9-3
68
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552466
3-9-4
76
1326
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552522
4-9-3
71
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552467
3-9-4
72
1327
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552523
4-9-3
73
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552468
3-9-4
50
1328
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552524
4-9-3
49
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552469
3-9-4
65
1329
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552525
4-9-3
45
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552470
3-9-4
58
1330
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552526
4-9-3
39
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552471
3-9-4
30
1331
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552527
4-9-3
39
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552472
3-9-4
43
1332
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552528
4-9-3
43
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552473
3-9-4
25
1333
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552529
4-9-3
50
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552474
3-9-4
70
1334
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552530
4-9-3
73
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552475
3-9-4
64
1335
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552531
4-9-3
62
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552476
3-9-4
50
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552477
3-9-4
66
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552478
3-9-4
68
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552479
3-9-4
60
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552480
3-9-4
58
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552481
3-9-4
54
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552482
3-9-4
44
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552483
3-9-4
17
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552484
3-9-4
64
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552485
3-9-4
56
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552486
3-9-4
26
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552487
3-9-4
42
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552488
3-9-4
35
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552489
3-9-4
46
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552490
3-9-4
41
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552491
3-9-4
38
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552492
3-9-4
47
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552493
3-9-4
49
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552494
3-9-4
22
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552495
3-9-4
0
236
Таблица 42
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
56
224
55
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
509959
3-10-3
54
145
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552552
5-9-2
32
1355
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552553
5-9-2
53
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552554
5-9-2
48
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552555
5-9-2
39
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552556
5-9-2
39
86
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552557
5-9-2
54
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552558
5-9-2
41
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552559
5-9-2
56
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552560
5-9-2
39
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552561
5-9-2
51
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552562
5-9-2
56
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552563
5-9-2
31
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552564
5-9-2
31
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552565
5-9-2
53
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552566
5-9-2
46
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552567
5-9-2
63
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552568
5-9-2
66
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552569
5-9-2
60
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552570
5-9-2
60
1324
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552571
5-9-2
44
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552572
5-9-2
52
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552573
5-9-2
20
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552574
5-9-2
36
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552575
5-9-2
19
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552576
5-9-2
61
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552577
5-9-2
57
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552578
5-9-2
71
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552579
5-9-2
59
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552580
5-9-2
58
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552581
5-9-2
51
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552582
5-9-2
40
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552583
5-9-2
35
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552584
5-9-2
50
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552585
5-9-2
48
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552586
5-9-2
74
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552587
5-9-2
68
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552532
4-9-3
59
1336
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552588
5-9-2
67
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552533
4-9-3
52
1337
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552589
5-9-2
47
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552534
4-9-3
71
1338
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552590
5-9-2
58
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552535
4-9-3
59
1339
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552591
5-9-2
46
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552536
4-9-3
19
1340
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552592
5-9-2
44
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552537
4-9-3
26
1341
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552593
5-9-2
39
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552538
4-9-3
54
1342
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552594
5-9-2
52
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552539
4-9-3
50
1343
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552595
5-9-2
57
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552540
4-9-3
60
1344
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552596
5-9-2
58
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552541
4-9-3
68
1345
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552597
5-9-2
52
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552542
4-9-3
63
1346
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552598
5-9-2
51
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552543
4-9-3
44
1347
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552600
5-9-2
51
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552544
4-9-3
45
1348
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552602
5-9-2
13
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552545
4-9-3
42
230
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552604
5-9-2
42
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552546
4-9-3
46
231
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552606
5-9-2
42
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552547
4-9-3
38
232
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552608
5-9-2
37
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552548
4-9-3
49
233
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552610
5-9-2
41
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552549
4-9-3
34
234
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552612
5-9-2
23
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552550
4-9-3
13
235
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552614
5-9-2
11
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552551
4-9-3
8
236
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552616
5-9-2
6
236
Таблица 43
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
47
224
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
67
50
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552007
6-10-4
53
83
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552039
7-10-3
74
83
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552008
6-10-4
47
103
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552040
7-10-3
57
103
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552009
6-10-4
70
136
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552041
7-10-3
65
136
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552010
6-10-4
51
139
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552042
7-10-3
59
139
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552011
6-10-4
47
142
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552043
7-10-3
36
142
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552012
6-10-4
62
20
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552044
7-10-3
82
20
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552013
6-10-4
72
22
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552045
7-10-3
62
22
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552014
6-10-4
73
24
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552046
7-10-3
74
24
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552015
6-10-4
66
26
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552047
7-10-3
60
26
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552016
6-10-4
67
28
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552048
7-10-3
60
28
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552017
6-10-4
72
39
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552049
7-10-3
68
39
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552018
6-10-4
89
719
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552050
7-10-3
86
719
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552019
6-10-4
87
212
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552051
7-10-3
86
212
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
551986
4-10-6
64
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552020
6-10-4
86
720
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552052
7-10-3
87
720
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
551987
4-10-6
76
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552021
6-10-4
84
721
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552053
7-10-3
75
721
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
551988
4-10-6
5
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552005
5-10-5
72
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552022
6-10-4
80
1349
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552054
7-10-3
83
1349
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
551989
4-10-6
64
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552023
6-10-4
78
722
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552055
7-10-3
57
722
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
551990
4-10-6
83
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552024
6-10-4
89
224
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552056
7-10-3
82
224
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
551991
4-10-6
0
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552025
6-10-4
89
801
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552057
7-10-3
89
801
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
551992
4-10-6
67
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552026
6-10-4
84
802
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552058
7-10-3
82
802
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
551993
4-10-6
78
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552027
6-10-4
85
225
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552059
7-10-3
85
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
551994
4-10-6
82
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552028
6-10-4
82
804
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552060
7-10-3
74
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
551995
4-10-6
81
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552029
6-10-4
81
805
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552061
7-10-3
81
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
551996
4-10-6
79
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552030
6-10-4
86
226
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552062
7-10-3
85
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
551997
4-10-6
80
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552031
6-10-4
86
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
551998
4-10-6
74
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552032
6-10-4
78
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
551999
4-10-6
79
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552033
6-10-4
80
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552000
4-10-6
84
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552006
5-10-5
86
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552034
6-10-4
81
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552001
4-10-6
66
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552035
6-10-4
55
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552002
4-10-6
54
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552036
6-10-4
58
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552003
4-10-6
50
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552037
6-10-4
43
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552004
4-10-6
56
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552038
6-10-4
66
52
Таблица 44
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
61
224
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
66
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552168
3-9-5
64
1288
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552222
4-9-4
76
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552169
3-9-5
65
1289
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552223
4-9-4
41
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552170
3-9-5
58
1290
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552224
4-9-4
58
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552171
3-9-5
51
1291
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552225
4-9-4
49
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552172
3-9-5
23
9
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552226
4-9-4
36
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552173
3-9-5
44
10
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552227
4-9-4
20
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552174
3-9-5
28
11
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552228
4-9-4
29
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552175
3-9-5
56
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552176
3-9-5
66
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552177
3-9-5
53
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552178
3-9-5
57
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552179
3-9-5
56
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552180
3-9-5
51
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552181
3-9-5
51
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552182
3-9-5
63
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552183
3-9-5
60
29
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552185
3-9-5
67
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552186
3-9-5
37
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552187
3-9-5
68
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552188
3-9-5
71
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552189
3-9-5
51
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552190
3-9-5
47
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552191
3-9-5
50
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552192
3-9-5
80
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552193
3-9-5
73
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552194
3-9-5
58
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552195
3-9-5
60
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552196
3-9-5
54
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552197
3-9-5
64
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552198
3-9-5
62
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552199
3-9-5
57
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552200
3-9-5
52
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552201
3-9-5
73
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552202
3-9-5
60
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552203
3-9-5
60
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552204
3-9-5
63
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552151
2-9-6
71
1308
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552205
3-9-5
64
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552152
2-9-6
69
1309
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552206
3-9-5
71
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552153
2-9-6
63
1310
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552207
3-9-5
71
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552154
2-9-6
56
1311
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552208
3-9-5
52
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552155
2-9-6
61
1312
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552209
3-9-5
50
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552156
2-9-6
40
1313
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552210
3-9-5
66
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552157
2-9-6
45
1314
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552211
3-9-5
63
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552158
2-9-6
66
1315
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552212
3-9-5
62
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552159
2-9-6
68
1316
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552213
3-9-5
64
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552160
2-9-6
78
1317
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552214
3-9-5
72
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552161
2-9-6
57
47
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552215
3-9-5
54
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552162
2-9-6
54
49
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552216
3-9-5
49
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552163
2-9-6
65
51
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552217
3-9-5
50
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552164
2-9-6
48
53
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552218
3-9-5
39
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552165
2-9-6
46
54
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552219
3-9-5
41
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552166
2-9-6
42
55
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552220
3-9-5
32
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552167
2-9-6
47
56
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552221
3-9-5
33
56
Таблица 45
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
87
224
56
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
5-10-5
56
50
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
69
17
58
77
GAACTGGAGCCACCAGCAGG
552071
8-10-2
73
83
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552114
2-9-6
64
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552115
2-9-6
61
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552116
2-9-6
53
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552117
2-9-6
69
1291
253
272
AGAGAAGTCCACCACGAGTC
552072
8-10-2
39
103
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552118
2-9-6
49
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552119
2-9-6
49
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552120
2-9-6
21
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552121
2-9-6
27
12
411
430
TGAGGCATAGCAGCAGGATG
552073
8-10-2
73
136
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552122
2-9-6
48
17
412
431
ATGAGGCATAGCAGCAGGAT
552074
8-10-2
69
139
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552123
2-9-6
68
18
413
432
GATGAGGCATAGCAGCAGGA
552075
8-10-2
78
142
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552124
2-9-6
47
19
414
433
AGATGAGGCATAGCAGCAGG
552076
8-10-2
63
20
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552125
2-9-6
72
21
415
434
AAGATGAGGCATAGCAGCAG
552077
8-10-2
62
22
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552126
2-9-6
64
23
416
435
GAAGATGAGGCATAGCAGCA
552078
8-10-2
59
24
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552127
2-9-6
65
25
417
436
AGAAGATGAGGCATAGCAGC
552079
8-10-2
80
26
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552128
2-9-6
78
27
418
437
AAGAAGATGAGGCATAGCAG
552080
8-10-2
74
28
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552129
2-9-6
68
29
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552130
2-9-6
46
33
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552131
2-9-6
61
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552132
2-9-6
66
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552133
2-9-6
78
1294
687
706
CGAACCACTGAACAAATGGC
552081
8-10-2
69
39
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552134
2-9-6
68
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552135
2-9-6
59
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552136
2-9-6
39
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552137
2-9-6
36
43
1261
1280
TTCCGCAGTATGGATCGGCA
552082
8-10-2
86
719
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552138
2-9-6
80
1295
1262
1281
GTTCCGCAGTATGGATCGGC
552083
8-10-2
85
212
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552139
2-9-6
80
1296
1263
1282
AGTTCCGCAGTATGGATCGG
552084
8-10-2
86
720
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552140
2-9-6
70
1297
1264
1283
GAGTTCCGCAGTATGGATCG
552085
8-10-2
83
721
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552141
2-9-6
72
1298
1265
1284
GGAGTTCCGCAGTATGGATC
552086
8-10-2
83
1349
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552142
2-9-6
58
1299
1266
1285
AGGAGTTCCGCAGTATGGAT
552087
8-10-2
77
722
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552143
2-9-6
70
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552144
2-9-6
66
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552145
2-9-6
78
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552146
2-9-6
63
1303
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
552088
8-10-2
90
224
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552147
2-9-6
80
1304
1578
1597
GGTGAAGCGAAGTGCACACG
552089
8-10-2
87
801
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552148
2-9-6
74
1305
1579
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCACAC
552090
8-10-2
85
802
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552149
2-9-6
79
1306
1580
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGCACA
552091
8-10-2
84
225
1581
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTGCAC
552092
8-10-2
86
804
1582
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGTGCA
552093
8-10-2
82
805
1583
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
552094
8-10-2
84
226
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552063
7-10-3
79
806
1584
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAAGTG
552095
8-10-2
85
806
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552064
7-10-3
83
807
1585
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGAAGT
552096
8-10-2
88
807
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552065
7-10-3
86
227
1586
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCGAAG
552097
8-10-2
90
227
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552066
7-10-3
35
1350
1587
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGCGAA
552098
8-10-2
86
1350
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552067
7-10-3
53
46
1778
1797
AATTTATGCCTACAGCCTCC
552099
8-10-2
66
46
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552068
7-10-3
70
48
1779
1798
CAATTTATGCCTACAGCCTC
552100
8-10-2
67
48
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552069
7-10-3
68
50
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
552101
8-10-2
65
50
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552070
7-10-3
64
52
1781
1800
ACCAATTTATGCCTACAGCC
552102
8-10-2
54
52
Таблица 46
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
5-10-5
69
224
57
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
510100
3-10-4
59
17
58
74
CTGGAGCCACCAGCAGG
552330
6-9-2
50
1288
59
75
ACTGGAGCCACCAGCAG
552331
6-9-2
46
1289
60
76
AACTGGAGCCACCAGCA
552332
6-9-2
50
1290
61
77
GAACTGGAGCCACCAGC
552333
6-9-2
48
1291
253
269
GAAGTCCACCACGAGTC
552334
6-9-2
42
9
254
270
AGAAGTCCACCACGAGT
552335
6-9-2
30
10
255
271
GAGAAGTCCACCACGAG
552336
6-9-2
23
11
256
272
AGAGAAGTCCACCACGA
552337
6-9-2
42
12
411
427
GGCATAGCAGCAGGATG
552338
6-9-2
40
17
412
428
AGGCATAGCAGCAGGAT
552339
6-9-2
50
18
413
429
GAGGCATAGCAGCAGGA
552340
6-9-2
45
19
414
430
TGAGGCATAGCAGCAGG
552341
6-9-2
44
21
415
431
ATGAGGCATAGCAGCAG
552342
6-9-2
51
23
416
432
GATGAGGCATAGCAGCA
552343
6-9-2
44
25
417
433
AGATGAGGCATAGCAGC
552344
6-9-2
24
27
418
434
AAGATGAGGCATAGCAG
552345
6-9-2
41
29
457
473
ACGGGCAACATACCTTG
552346
6-9-2
0
33
670
686
ACTAGTAAACTGAGCCA
552347
6-9-2
75
1292
671
687
CACTAGTAAACTGAGCC
552348
6-9-2
72
1293
672
688
GCACTAGTAAACTGAGC
552349
6-9-2
65
1294
687
703
ACCACTGAACAAATGGC
552350
6-9-2
42
40
688
704
AACCACTGAACAAATGG
552351
6-9-2
45
41
689
705
GAACCACTGAACAAATG
552352
6-9-2
43
42
690
706
CGAACCACTGAACAAAT
552353
6-9-2
20
43
1261
1277
CGCAGTATGGATCGGCA
552354
6-9-2
70
1295
1262
1278
CCGCAGTATGGATCGGC
552355
6-9-2
66
1296
1263
1279
TCCGCAGTATGGATCGG
552356
6-9-2
62
1297
1264
1280
TTCCGCAGTATGGATCG
552357
6-9-2
53
1298
1265
1281
GTTCCGCAGTATGGATC
552358
6-9-2
57
1299
1266
1282
AGTTCCGCAGTATGGAT
552359
6-9-2
46
1300
1267
1283
GAGTTCCGCAGTATGGA
552360
6-9-2
45
1301
1268
1284
GGAGTTCCGCAGTATGG
552361
6-9-2
44
1302
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552308
5-9-3
38
1303
1269
1285
AGGAGTTCCGCAGTATG
552362
6-9-2
51
1303
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552309
5-9-3
76
1304
1577
1593
AAGCGAAGTGCACACGG
552363
6-9-2
73
1304
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552310
5-9-3
58
1305
1578
1594
GAAGCGAAGTGCACACG
552364
6-9-2
66
1305
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552311
5-9-3
38
1306
1579
1595
TGAAGCGAAGTGCACAC
552365
6-9-2
64
1306
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552150
2-9-6
68
1307
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552312
5-9-3
75
1307
1580
1596
GTGAAGCGAAGTGCACA
552366
6-9-2
55
1307
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552313
5-9-3
66
1308
1581
1597
GGTGAAGCGAAGTGCAC
552367
6-9-2
67
1308
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552314
5-9-3
56
1309
1582
1598
AGGTGAAGCGAAGTGCA
552368
6-9-2
41
1309
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552315
5-9-3
46
1310
1583
1599
GAGGTGAAGCGAAGTGC
552369
6-9-2
52
1310
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552316
5-9-3
55
1311
1584
1600
AGAGGTGAAGCGAAGTG
552370
6-9-2
35
1311
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552317
5-9-3
53
1312
1585
1601
CAGAGGTGAAGCGAAGT
552371
6-9-2
58
1312
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552318
5-9-3
59
1313
1586
1602
GCAGAGGTGAAGCGAAG
552372
6-9-2
68
1313
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552319
5-9-3
56
1314
1587
1603
TGCAGAGGTGAAGCGAA
552373
6-9-2
63
1314
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552320
5-9-3
62
1315
1588
1604
GTGCAGAGGTGAAGCGA
552374
6-9-2
70
1315
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552321
5-9-3
63
1316
1589
1605
CGTGCAGAGGTGAAGCG
552375
6-9-2
64
1316
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552322
5-9-3
52
1317
1590
1606
ACGTGCAGAGGTGAAGC
552376
6-9-2
58
1317
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552323
5-9-3
45
47
1778
1794
TTATGCCTACAGCCTCC
552377
6-9-2
42
47
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552324
5-9-3
49
49
1779
1795
TTTATGCCTACAGCCTC
552378
6-9-2
37
49
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552325
5-9-3
48
51
1780
1796
ATTTATGCCTACAGCCT
552379
6-9-2
57
51
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552326
5-9-3
50
53
1781
1797
AATTTATGCCTACAGCC
552380
6-9-2
48
53
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552327
5-9-3
13
54
1782
1798
CAATTTATGCCTACAGC
552381
6-9-2
22
54
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552328
5-9-3
9
55
1783
1799
CCAATTTATGCCTACAG
552382
6-9-2
20
55
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552329
5-9-3
18
56
1784
1800
ACCAATTTATGCCTACA
552383
6-9-2
18
56
Пример 15: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepG2 дезокси-, МОЕ и (S)-cEt-химерными олигонуклеотидами
Антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды испытали в серии экспериментов, имеющих такие же культуральные условия. Результаты каждого эксперимента показаны в отдельных таблицах, представленных ниже. ISIS 146786 и ISIS 509934, которые были описаны в более ранней заявке (предварительная заявка на патент США №61/478040, поданная 21 апреля 2011 года), также включили в эти исследования для сравнения. Культивированные клетки HepG2 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 70 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Набор вирусных затравочных зондов RTS3370 (прямая последовательность CTTGGTCATGGGCCATCAG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:1; обратная последовательность CGGCTAGGAGTTCCGCAGTA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:2; последовательность зонда TGCGTGGAACCTTTTCGGCTCC, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:3) использовали для измерения уровней мРНК. Уровни измерили также с использованием набора затравочных зондов RTS3371 (прямая последовательность CCAAACCTTCGGACGGAAA, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:311; обратная последовательность TGAGGCCCACTCCCATAGG, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:312; последовательность зонда CCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAT, в настоящем документе обозначена как SEQ ID NO:313). Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были разработаны как дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химерные олигонуклеотиды. Эти химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем нуклеозид имеет или МОЕ сахарную модификацию, или (S)-cEt сахарную модификацию, или дезокси-модификацию. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; и «е» обозначает модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблицах, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1). Эффективность новых разработанных олигонуклеотидов сравнили с ISIS 146786, 509934, ISIS 509959 и ISIS 510100.
Таблица 47
30 Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1780
1799
CCAATTTATGCCTACAGCCT
509934
еееее-10-еееее
30
50
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552787
ekk-10-kke
57
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552788
ekk-10-kke
60
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552789
ekk-10-kke
67
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552790
ekk-10-kke
67
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552791
ekk-10-kke
65
86
245
260
CACGAGTCTAGACTCT
552792
ekk-10-kke
44
93
246
261
CCACGAGTCTAGACTC
552793
ekk-10-kke
0
95
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552794
ekk-10-kke
54
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552795
ekk-10-kke
55
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552796
ekk-10-kke
62
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552797
ekk-10-kke
59
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552798
ekk-10-kke
59
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552799
ekk-10-kke
58
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552800
ekk-10-kke
62
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552801
ekk-10-kke
65
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552802
ekk-10-kke
53
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552803
ekk-10-kke
67
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552804
ekk-10-kke
75
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552805
ekk-10-kke
72
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552806
ekk-10-kke
64
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552807
ekk-10-kke
68
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552808
ekk-10-kke
65
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552809
ekk-10-kke
60
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552810
ekk-10-kke
59
153
419
434
AAGATGAGGCATAGCA
552811
ekk-10-kke
64
155
420
435
GAAGATGAGGCATAGC
552812
ekk-10-kke
69
157
421
436
AGAAGATGAGGCATAG
552813
ekk-10-kke
64
159
422
437
AAGAAGATGAGGCATA
552814
ekk-10-kke
62
161
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552815
ekk-10-kke
61
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552816
ekk-10-kke
63
168
639
654
GGCCCACTCCCATAGG
552817
ekk-10-kke
42
176
641
656
GAGGCCCACTCCCATA
552818
ekk-10-kke
44
177
642
657
TGAGGCCCACTCCCAT
552819
ekk-10-kke
56
178
643
658
CTGAGGCCCACTCCCA
552820
ekk-10-kke
59
179
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552821
ekk-10-kke
76
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552822
ekk-10-kke
77
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552823
ekk-10-kke
73
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552824
ekk-10-kke
73
1324
678
693
AAATGGCACTAGTAAA
552825
ekk-10-kke
51
1364
679
694
CAAATGGCACTAGTAA
552826
ekk-10-kke
55
1365
680
695
ACAAATGGCACTAGTA
552827
ekk-10-kke
67
1366
681
696
AACAAATGGCACTAGT
552828
ekk-10-kke
78
1367
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552829
ekk-10-kke
72
1368
683
698
TGAACAAATGGCACTA
552830
ekk-10-kke
71
1369
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552831
ekk-10-kke
69
1370
685
700
ACTGAACAAATGGCAC
552832
ekk-10-kke
67
1371
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552833
ekk-10-kke
65
1372
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552834
ekk-10-kke
78
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552835
ekk-10-kke
70
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552836
ekk-10-kke
64
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552837
ekk-10-kke
65
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552838
ekk-10-kke
64
194
738
753
ССАСАТСАТССАТАТА
552839
ekk-10-kke
60
199
739
754
АССАСАТСАТССАТАТ
552840
ekk-10-kke
35
201
1176
1191
CAGCAAACACTTGGCA
552841
ekk-10-kke
62
208
1177
1192
TCAGCAAACACTTGGC
552842
ekk-10-kke
67
209
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552843
ekk-10-kke
77
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552844
ekk-10-kke
81
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552845
ekk-10-kke
63
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552846
ekk-10-kke
79
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552847
ekk-10-kke
47
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552848
ekk-10-kke
69
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552849
ekk-10-kke
59
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552850
ekk-10-kke
83
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552851
ekk-10-kke
90
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552852
ekk-10-kke
89
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552853
ekk-10-kke
83
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552854
ekk-10-kke
80
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552855
ekk-10-kke
75
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552856
ekk-10-kke
69
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552857
ekk-10-kke
68
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552858
ekk-10-kke
79
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552859
ekk-10-kke
79
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552860
ekk-10-kke
71
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552861
ekk-10-kke
68
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552862
ekk-10-kke
65
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552863
ekk-10-kke
70
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552864
ekk-10-kke
71
1345
Таблица 48
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552787
ekk-10-kke
53
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552788
ekk-10-kke
45
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552789
ekk-10-kke
75
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552790
ekk-10-kke
68
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552791
ekk-10-kke
51
86
245
260
CACGAGTCTAGACTCT
552792
ekk-10-kke
38
93
246
261
CCACGAGTCTAGACTC
552793
ekk-10-kke
0
95
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552794
ekk-10-kke
44
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552795
ekk-10-kke
56
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552796
ekk-10-kke
45
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552797
ekk-10-kke
46
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552798
ekk-10-kke
53
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552799
ekk-10-kke
48
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552800
ekk-10-kke
54
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552801
ekk-10-kke
63
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552802
ekk-10-kke
49
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552803
ekk-10-kke
71
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552804
ekk-10-kke
64
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552805
ekk-10-kke
70
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552806
ekk-10-kke
67
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552807
ekk-10-kke
61
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552808
ekk-10-kke
83
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552809
ekk-10-kke
59
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552810
ekk-10-kke
56
153
419
434
AAGATGAGGCATAGCA
552811
ekk-10-kke
62
155
420
435
GAAGATGAGGCATAGC
552812
ekk-10-kke
66
157
421
436
AGAAGATGAGGCATAG
552813
ekk-10-kke
63
159
422
437
AAGAAGATGAGGCATA
552814
ekk-10-kke
65
161
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552815
ekk-10-kke
63
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552816
ekk-10-kke
88
168
639
654
GGCCCACTCCCATAGG
552817
ekk-10-kke
94
176
641
656
GAGGCCCACTCCCATA
552818
ekk-10-kke
82
177
642
657
TGAGGCCCACTCCCAT
552819
ekk-10-kke
80
178
643
658
CTGAGGCCCACTCCCA
552820
ekk-10-kke
84
179
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552821
ekk-10-kke
71
181
671
686
ACTAGTAAACTGAGCC
552822
ekk-10-kke
85
1322
672
687
CACTAGTAAACTGAGC
552823
ekk-10-kke
71
1323
673
688
GCACTAGTAAACTGAG
552824
ekk-10-kke
81
1324
678
693
AAATGGCACTAGTAAA
552825
ekk-10-kke
51
1364
679
694
CAAATGGCACTAGTAA
552826
ekk-10-kke
64
1365
680
695
ACAAATGGCACTAGTA
552827
ekk-10-kke
61
1366
681
696
AACAAATGGCACTAGT
552828
ekk-10-kke
76
1367
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552829
ekk-10-kke
61
1368
683
698
TGAACAAATGGCACTA
552830
ekk-10-kke
59
1369
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552831
ekk-10-kke
58
1370
685
700
ACTGAACAAATGGCAC
552832
ekk-10-kke
64
1371
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552833
ekk-10-kke
75
1372
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552834
ekk-10-kke
84
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552835
ekk-10-kke
57
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552836
ekk-10-kke
51
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552837
ekk-10-kke
53
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552838
ekk-10-kke
48
194
738
753
ССАСАТСАТССАТАТА
552839
ekk-10-kke
50
199
739
754
АССАСАТСАТССАТАТ
552840
ekk-10-kke
54
201
1176
1191
CAGCAAACACTTGGCA
552841
ekk-10-kke
61
208
1177
1192
TCAGCAAACACTTGGC
552842
ekk-10-kke
71
209
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552843
ekk-10-kke
75
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552844
ekk-10-kke
78
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552845
ekk-10-kke
52
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552846
ekk-10-kke
76
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552847
ekk-10-kke
61
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552848
ekk-10-kke
72
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552849
ekk-10-kke
87
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552850
ekk-10-kke
76
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552851
ekk-10-kke
76
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552852
ekk-10-kke
79
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552853
ekk-10-kke
82
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552854
ekk-10-kke
85
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552855
ekk-10-kke
78
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552856
ekk-10-kke
77
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552857
ekk-10-kke
75
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552858
ekk-10-kke
75
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552859
ekk-10-kke
79
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552860
ekk-10-kke
71
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552861
ekk-10-kke
74
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552862
ekk-10-kke
66
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552863
ekk-10-kke
70
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552864
ekk-10-kke
73
1345
Таблица 49
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
еееее-10-еееее
60
224
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552889
ek-10-keke
59
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552890
ek-10-keke
56
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552891
ek-10-keke
67
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552892
ek-10-keke
65
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552893
ek-10-keke
68
86
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552894
ek-10-keke
71
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552895
ek-10-keke
51
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552896
ek-10-keke
51
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552897
ek-10-keke
43
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552898
ek-10-keke
43
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552899
ek-10-keke
55
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552900
ek-10-keke
34
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552901
ek-10-keke
42
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552902
ek-10-keke
60
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552903
ek-10-keke
76
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552904
ek-10-keke
74
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552905
ek-10-keke
66
143
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552907
ek-10-keke
69
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552908
ek-10-keke
63
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552909
ek-10-keke
70
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552910
ek-10-keke
72
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552911
ek-10-keke
72
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552912
ek-10-keke
67
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552913
ek-10-keke
74
181
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552914
ek-10-keke
75
1368
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552915
ek-10-keke
58
1370
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552916
ek-10-keke
74
1372
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552917
ek-10-keke
76
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552918
ek-10-keke
75
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552919
ek-10-keke
55
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552920
ek-10-keke
49
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552921
ek-10-keke
45
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552922
ek-10-keke
83
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552923
ek-10-keke
83
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552924
ek-10-keke
0
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552925
ek-10-keke
85
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552926
ek-10-keke
50
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552927
ek-10-keke
76
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552928
ek-10-keke
78
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552929
ek-10-keke
75
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552930
ek-10-keke
78
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552931
ek-10-keke
74
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552932
ek-10-keke
86
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552933
ek-10-keke
82
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552934
ek-10-keke
74
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552935
ek-10-keke
76
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552936
ek-10-keke
81
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552937
ek-10-keke
80
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552938
ek-10-keke
78
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552939
ek-10-keke
75
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552940
ek-10-keke
63
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552941
ekk-10-kke
78
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552942
ek-10-keke
80
1344
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552865
ekk-10-kke
67
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552866
ekk-10-kke
68
1347
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552868
ekk-10-kke
55
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552869
ekk-10-kke
48
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552870
ekk-10-kke
55
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552871
ekk-10-kke
57
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552872
ekk-10-kke
70
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552873
ekk-10-kke
49
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552874
ekk-10-kke
42
236
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
552875
ekk-10-kke
41
237
1822
1837
GGCAGAGGTGAAAAAG
552876
ekk-10-kke
50
244
1823
1838
AGGCAGAGGTGAAAAA
552877
ek-10-keke
39
245
1824
1839
TAGGCAGAGGTGAAAA
552878
ekk-10-kke
31
247
1865
1880
AGCTTGGAGGCTTGAA
552879
ekk-10-kke
5
252
1866
1881
CAGCTTGGAGGCTTGA
552880
ekk-10-kke
5
254
1867
1882
ACAGCTTGGAGGCTTG
552881
ekk-10-kke
10
256
1868
1883
CACAGCTTGGAGGCTT
552882
ekk-10-kke
11
258
1869
1884
GCACAGCTTGGAGGCT
552883
ekk-10-kke
27
260
1870
1885
GGCACAGCTTGGAGGC
552884
ekk-10-kke
36
262
1871
1886
AGGCACAGCTTGGAGG
552885
ekk-10-kke
12
264
1872
1887
AAGGCACAGCTTGGAG
552886
ekk-10-kke
32
266
1874
1889
CCAAGGCACAGCTTGG
552888
ekk-10-kke
1
271
Таблица 50
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
1577
1596
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
146786
еееее-10-еееее
59
224
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552955
eee-10-kkk
60
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552956
eee-10-kkk
60
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552957
eee-10-kkk
64
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552958
eee-10-kkk
56
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552959
eee-10-kkk
59
86
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552960
eee-10-kkk
42
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552961
eee-10-kkk
41
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552962
eee-10-kkk
35
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552963
eee-10-kkk
19
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552964
eee-10-kkk
34
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552965
eee-10-kkk
42
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552966
eee-10-kkk
60
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552967
eee-10-kkk
38
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552968
eee-10-kkk
35
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552969
eee-10-kkk
67
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552970
eee-10-kkk
56
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552971
eee-10-kkk
69
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552972
eee-10-kkk
75
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552973
eee-10-kkk
59
145
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552974
eee-10-kkk
71
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552975
eee-10-kkk
56
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552976
eee-10-kkk
50
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552977
eee-10-kkk
56
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552978
eee-10-kkk
43
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552979
eee-10-kkk
71
181
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552980
eee-10-kkk
80
1368
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552981
eee-10-kkk
64
1370
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552982
ek-10-keke
61
1372
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552983
eee-10-kkk
77
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552984
eee-10-kkk
65
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552985
eee-10-kkk
41
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552986
eee-10-kkk
30
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552987
eee-10-kkk
41
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552988
eee-10-kkk
74
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552989
eee-10-kkk
85
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552990
eee-10-kkk
72
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552991
eee-10-kkk
73
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552992
eee-10-kkk
60
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552993
eee-10-kkk
52
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552994
eee-10-kkk
58
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552995
eee-10-kkk
70
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552996
eee-10-kkk
74
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552997
eee-10-kkk
59
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552998
eee-10-kkk
82
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552999
eee-10-kkk
70
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
553000
eee-10-kkk
67
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
553001
eee-10-kkk
67
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
553002
eee-10-kkk
74
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
553003
eee-10-kkk
72
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
553004
eee-10-kkk
73
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
553005
eee-10-kkk
67
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
553006
eee-10-kkk
69
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
553007
eee-10-kkk
60
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
553008
eee-10-kkk
71
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552943
ek-10-keke
77
1345
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
553009
eee-10-kkk
78
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552944
ek-10-keke
74
1346
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
553010
eee-10-kkk
78
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552945
ek-10-keke
76
1347
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
553011
eee-10-kkk
72
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552946
ek-10-keke
71
1348
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
553012
eee-10-kkk
74
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552947
ek-10-keke
54
230
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
553013
eee-10-kkk
39
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552948
ek-10-keke
50
231
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
553014
eee-10-kkk
37
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552949
ek-10-keke
8
232
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
553015
eee-10-kkk
45
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552950
ek-10-keke
44
233
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
553016
eee-10-kkk
47
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552951
ek-10-keke
60
234
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
553017
eee-10-kkk
47
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552952
ek-10-keke
35
235
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
553018
eee-10-kkk
30
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552953
ek-10-keke
37
236
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
553019
eee-10-kkk
37
236
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
552954
ek-10-keke
40
237
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
553020
eee-10-kkk
24
237
Таблица 51
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552889
ek-10-keke
42
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552890
ek-10-keke
56
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552891
ek-10-keke
55
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552892
ek-10-keke
53
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552893
ek-10-keke
56
86
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552894
ek-10-keke
53
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552895
ek-10-keke
38
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552896
ek-10-keke
43
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552897
ek-10-keke
40
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552898
ek-10-keke
50
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552899
ek-10-keke
37
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552900
ek-10-keke
43
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552901
ek-10-keke
56
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552902
ek-10-keke
43
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552903
ek-10-keke
78
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552904
ek-10-keke
75
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552905
ek-10-keke
52
143
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552907
ek-10-keke
75
147
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552908
ek-10-keke
57
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552909
ek-10-keke
66
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552910
ek-10-keke
60
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552911
ek-10-keke
65
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552912
ek-10-keke
37
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552913
ek-10-keke
76
181
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552914
ek-10-keke
79
1368
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552915
ek-10-keke
71
1370
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552916
ek-10-keke
82
1372
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552917
ek-10-keke
78
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552918
ek-10-keke
64
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552919
ek-10-keke
38
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552920
ek-10-keke
43
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552921
ek-10-keke
49
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552922
ek-10-keke
90
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552923
ek-10-keke
92
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552924
ek-10-keke
30
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552925
ek-10-keke
81
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552926
ek-10-keke
39
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552927
ek-10-keke
53
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552928
ek-10- keke
48
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552929
ek-10-keke
68
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552930
ek-10-keke
87
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552931
ek-10-keke
87
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552932
ek-10-keke
88
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552933
ek-10-keke
75
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
552934
ek-10-keke
76
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
552935
ek-10-keke
71
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
552936
ek-10-keke
80
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
552937
ek-10-keke
81
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
552938
ek-10-keke
85
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
552939
ek-10-keke
82
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
552940
ek-10-keke
76
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
552941
ekk-10-kke
72
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
552942
ek-10-keke
85
1344
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552865
ekk-10-kke
70
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552866
ekk-10-kke
65
1347
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552868
ekk-10-kke
36
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552869
ekk-10-kke
23
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552870
ekk-10-kke
49
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552871
ekk-10-kke
46
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552872
ekk-10-kke
73
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552873
ekk-10-kke
41
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552874
ekk-10-kke
18
236
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
552875
ekk-10-kke
0
237
1822
1837
GGCAGAGGTGAAAAAG
552876
ekk-10-kke
49
244
1823
1838
AGGCAGAGGTGAAAAA
552877
ek-10-keke
37
245
1824
1839
TAGGCAGAGGTGAAAA
552878
ekk-10-kke
28
247
1865
1880
AGCTTGGAGGCTTGAA
552879
ekk-10-kke
0
252
1866
1881
CAGCTTGGAGGCTTGA
552880
ekk-10-kke
12
254
1867
1882
ACAGCTTGGAGGCTTG
552881
ekk-10-kke
0
256
1868
1883
CACAGCTTGGAGGCTT
552882
ekk-10-kke
0
258
1869
1884
GCACAGCTTGGAGGCT
552883
ekk-10-kke
12
260
1870
1885
GGCACAGCTTGGAGGC
552884
ekk-10-kke
39
262
1871
1886
AGGCACAGCTTGGAGG
552885
ekk-10-kke
37
264
1872
1887
AAGGCACAGCTTGGAG
552886
ekk-10-kke
15
266
1874
1889
CCAAGGCACAGCTTGG
552888
ekk-10-kke
0
271
Таблица 52
Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
Последовательность
№ ISIS
Мотив
% ингибирования
SEQ ID NO
58
73
TGGAGCCACCAGCAGG
552955
eee-10-kkk
67
1318
59
74
CTGGAGCCACCAGCAG
552956
eee-10-kkk
60
1319
60
75
ACTGGAGCCACCAGCA
552957
eee-10-kkk
73
1320
61
76
AACTGGAGCCACCAGC
552958
eee-10-kkk
63
1321
62
77
GAACTGGAGCCACCAG
552959
eee-10-kkk
58
86
250
265
TCCACCACGAGTCTAG
552960
eee-10-kkk
67
98
251
266
GTCCACCACGAGTCTA
552961
eee-10-kkk
78
100
252
267
AGTCCACCACGAGTCT
552962
eee-10-kkk
29
102
253
268
AAGTCCACCACGAGTC
552963
eee-10-kkk
25
104
254
269
GAAGTCCACCACGAGT
552964
eee-10-kkk
33
106
255
270
AGAAGTCCACCACGAG
552965
eee-10-kkk
55
109
256
271
GAGAAGTCCACCACGA
552966
eee-10-kkk
71
112
258
273
GAGAGAAGTCCACCAC
552967
eee-10-kkk
23
115
259
274
TGAGAGAAGTCCACCA
552968
eee-10-kkk
41
117
411
426
GCATAGCAGCAGGATG
552969
eee-10-kkk
76
137
412
427
GGCATAGCAGCAGGAT
552970
eee-10-kkk
44
140
413
428
AGGCATAGCAGCAGGA
552971
eee-10-kkk
77
143
414
429
GAGGCATAGCAGCAGG
552972
eee-10-kkk
74
145
415
430
TGAGGCATAGCAGCAG
552973
eee-10-kkk
61
145
416
431
ATGAGGCATAGCAGCA
552974
eee-10-kkk
73
149
417
432
GATGAGGCATAGCAGC
552975
eee-10-kkk
66
151
418
433
AGATGAGGCATAGCAG
552976
eee-10-kkk
70
153
457
472
CGGGCAACATACCTTG
552977
eee-10-kkk
65
167
458
473
ACGGGCAACATACCTT
552978
eee-10-kkk
40
168
670
685
CTAGTAAACTGAGCCA
552979
eee-10-kkk
79
181
682
697
GAACAAATGGCACTAG
552980
eee-10-kkk
81
64
684
699
CTGAACAAATGGCACT
552981
eee-10-kkk
74
66
686
701
CACTGAACAAATGGCA
552982
ek-10-keke
52
68
687
702
CCACTGAACAAATGGC
552983
eee-10-kkk
78
188
688
703
ACCACTGAACAAATGG
552984
eee-10-kkk
71
190
689
704
AACCACTGAACAAATG
552985
eee-10-kkk
38
191
690
705
GAACCACTGAACAAAT
552986
eee-10-kkk
48
192
691
706
CGAACCACTGAACAAA
552987
eee-10-kkk
54
194
1261
1276
GCAGTATGGATCGGCA
552988
eee-10-kkk
85
211
1262
1277
CGCAGTATGGATCGGC
552989
eee-10-kkk
84
1325
1263
1278
CCGCAGTATGGATCGG
552990
eee-10-kkk
79
1326
1264
1279
TCCGCAGTATGGATCG
552991
eee-10-kkk
53
1327
1265
1280
TTCCGCAGTATGGATC
552992
eee-10-kkk
68
1328
1266
1281
GTTCCGCAGTATGGAT
552993
eee-10-kkk
67
1329
1267
1282
AGTTCCGCAGTATGGA
552994
eee-10-kkk
69
1330
1268
1283
GAGTTCCGCAGTATGG
552995
eee-10-kkk
62
1331
1269
1284
GGAGTTCCGCAGTATG
552996
eee-10-kkk
82
1332
1270
1285
AGGAGTTCCGCAGTAT
552997
eee-10-kkk
58
1333
1577
1592
AGCGAAGTGCACACGG
552998
eee-10-kkk
86
1334
1578
1593
AAGCGAAGTGCACACG
552999
eee-10-kkk
63
1335
1579
1594
GAAGCGAAGTGCACAC
553000
eee-10-kkk
67
1336
1580
1595
TGAAGCGAAGTGCACA
553001
eee-10-kkk
70
1337
1581
1596
GTGAAGCGAAGTGCAC
553002
eee-10-kkk
84
1338
1582
1597
GGTGAAGCGAAGTGCA
553003
eee-10-kkk
83
1339
1583
1598
AGGTGAAGCGAAGTGC
553004
eee-10-kkk
68
1340
1584
1599
GAGGTGAAGCGAAGTG
553005
eee-10-kkk
57
1341
1585
1600
AGAGGTGAAGCGAAGT
553006
eee-10-kkk
74
1342
1586
1601
CAGAGGTGAAGCGAAG
553007
eee-10-kkk
62
1343
1587
1602
GCAGAGGTGAAGCGAA
553008
eee-10-kkk
50
1344
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
552943
ek-10-keke
86
1345
1588
1603
TGCAGAGGTGAAGCGA
553009
eee-10-kkk
79
1345
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
552944
ek-10-keke
83
1346
1589
1604
GTGCAGAGGTGAAGCG
553010
eee-10-kkk
74
1346
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
552945
ek-10-keke
79
1347
1590
1605
CGTGCAGAGGTGAAGC
553011
eee-10-kkk
60
1347
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
552946
ek-10-keke
68
1348
1591
1606
ACGTGCAGAGGTGAAG
553012
eee-10-kkk
78
1348
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
552947
ek-10-keke
51
230
1778
1793
TATGCCTACAGCCTCC
553013
eee-10-kkk
45
230
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
552948
ek-10-keke
56
231
1779
1794
TTATGCCTACAGCCTC
553014
eee-10-kkk
53
231
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
552949
ek-10-keke
1
232
1780
1795
TTTATGCCTACAGCCT
553015
eee-10-kkk
55
232
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
552950
ek-10-keke
52
233
1781
1796
ATTTATGCCTACAGCC
553016
eee-10-kkk
65
233
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
552951
ek-10-keke
59
234
1782
1797
AATTTATGCCTACAGC
553017
eee-10-kkk
36
234
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
552952
ek-10-keke
34
235
1783
1798
CAATTTATGCCTACAG
553018
eee-10-kkk
20
235
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
552953
ek-10-keke
55
236
1784
1799
CCAATTTATGCCTACA
553019
eee-10-kkk
34
236
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
552954
ek-10-keke
51
237
1785
1800
ACCAATTTATGCCTAC
553020
eee-10-kkk
28
237
Пример 16: Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование РНК HBV в клетках HepG2 химерными олигонуклеотидами МОЕ

Антисмысловые олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примере 14, демонстрирующие т vitro ингибирование мРНК HBV, отобрали и испытали при различных дозах в клетках HepG2. Клетки поместили на планшет при плотности 28000 клеток на лунку и трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 9,26 нМ, 27,78 нМ, 83,33 нМ и 250,00 нМ, как показано в Таблице 53. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор затравочных зондов HBV RTS3371. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Как показано в Таблице 53, уровни мРНК HBV снизились зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом. «н/д» показывает, что для указанной дозы нет данных.
Таблица 53
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование HBV человека в клетках HepG2
№ ISIS
9,2593 нМ
27,7778 нМ
83,3333 нМ
250,0 нМ
146786
10
43
74
89
509934
12
31
52
79
509959
4
24
49
67
510100
11
28
60
77
510124
3
11
13
41
551926
1
26
51
76
551958
15
17
56
82
551987
4
40
65
81
551990
7
55
78
91
551993
15
30
70
80
551994
0
30
39
58
551995
6
41
73
85
551996
13
47
71
85
551997
16
38
68
89
551998
4
36
69
85
551999
10
31
67
86
552000
0
17
61
78
552006
6
37
74
89
552009
1
5
39
60
552013
0
28
3
72
552014
0
26
32
77
552018
6
27
63
81
552019
15
34
65
90
552020
2
35
65
91
552021
4
11
53
82
552022
6
35
57
79
552023
11
33
59
81
552024
15
43
69
91
552025
17
35
69
87
552026
14
26
66
86
552027
3
46
62
88
552028
9
43
58
78
552029
8
40
72
89
552030
18
48
77
92
552031
0
38
66
89
552032
42
48
80
88
552033
2
40
64
84
552034
6
40
70
81
552039
2
33
56
83
552044
19
30
63
84
552046
4
21
47
77
552050
15
44
70
92
552051
8
33
69
90
552052
17
38
71
91
552053
0
40
59
86
552054
7
15
58
75
552056
19
62
86
92
552057
11
33
69
86
552058
30
55
79
90
552059
11
25
69
90
552060
9
32
61
86
552061
6
40
69
88
552062
22
48
75
89
552064
23
49
69
90
552065
10
8
69
86
552069
11
4
28
60
552073
9
31
62
78
552075
21
18
33
65
552077
0
17
40
72
552079
1
12
44
70
552080
3
12
34
69
552082
13
29
66
87
552083
24
54
69
88
552084
10
25
48
82
552085
28
35
64
85
552086
0
24
65
84
552088
33
53
77
93
552089
0
41
69
92
552090
17
35
70
87
552091
13
31
69
89
552092
6
23
66
89
552093
0
17
61
89
552094
12
38
65
88
552095
20
42
73
88
552096
Н/Д
39
66
91
552097
24
43
67
88
552098
0
24
56
85
552101
3
13
28
61
552147
11
27
58
80
552160
20
25
69
89
552163
0
21
22
53
552176
16
11
40
66
552192
7
38
78
89
552222
0
24
65
79
552247
0
38
69
86
552255
5
27
69
81
552301
5
38
65
86
552309
8
26
62
85
552312
0
4
32
62
552347
2
15
38
75
552348
12
40
42
65
552354
10
35
44
76
552361
2
25
55
74
552363
20
36
54
76
552374
7
4
38
76
552379
0
12
24
46
552403
8
27
54
76
552408
2
25
44
77
552409
6
31
56
80
552418
0
30
72
84
552420
9
34
53
81
552442
4
23
46
56
552466
0
23
56
79
552474
11
34
66
87
552477
11
22
44
64
552530
25
37
73
87
552559
9
13
29
51
Пример 17: Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование мРНК ИВУ в клетках HepG2 дезокси-, МОЕ и (S)-cEt-химерными олигонуклеотидами
Антисмысловые олигонуклеотиды из исследования, описанного в Примере 15, демонстрирующие in vitro ингибирование мРНК HBV, отобрали и испытали при различных дозах в клетках HepG2. Клетки поместили на планшет при плотности 28 ООО клеток на лунку и трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 9,26 нМ, 27,78 нМ, 83,33 нМ и 250,00 нМ, как показано в Таблице 54. Примерно через 16 часов обработки, РНК выделили из клеток, и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор затравочных зондов HBV RTS3371. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN*. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Как показано в Таблице 54, уровни мРНК HBV снизились зависимым от дозы образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Таблица 54
Зависимое от дозы антисмысловое ингибирование HBV человека в клетках HepG2
№ ISIS
9,2593 нМ
27,7778 нМ
83,3333 нМ
250,0 нМ
146786
10
43
74
89
552808
13
14
55
70
552816
38
73
87
92
552818
29
63
87
85
552820
58
83
90
90
552821
33
49
71
88
552822
24
55
74
88
552824
8
24
65
87
552834
11
28
68
89
552849
12
25
73
84
552851
13
42
74
89
552852
4
35
70
87
552853
19
52
86
93
552854
28
57
80
89
552916
5
26
64
82
552922
25
44
77
89
552923
22
49
82
91
552925
33
56
80
92
552930
12
49
79
89
552931
12
40
62
82
552932
24
62
84
91
552933
20
40
75
89
552936
18
36
75
88
552937
22
51
82
88
552938
12
36
67
80
552939
17
40
65
79
552942
21
48
74
88
552943
5
39
70
85
552944
14
33
70
77
552980
15
40
69
86
552988
4
36
58
84
552989
0
50
74
81
552996
0
25
53
72
552998
17
49
79
90
553002
0
32
68
86
553003
15
42
67
88
Пример 18: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК ИВУ в клетках HepG2 дезокси-, МОЕ и (S)-cEt-химерными олигонуклеотидами
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. ISIS 5808 и ISIS 9591, описанные в US 5985662, а также ISIS 146781, ISIS 146786, 524518, ISIS 552859 и ISIS 552870 также включили в эти исследования для сравнения и обозначили звездочкой. Культивированные клетки HepG2 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE 2000 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Наборы вирусных затравочных зондов RTS3370 и RTS3371 использовали для измерения уровней мРНК по отдельности. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблице ниже были разработаны как МОЕ химерные олигонуклеотиды или дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химерные олигонуклеотиды. 5-10-5 МОЕ химерные олигонуклеотиды имеют 20 нуклеозидов в длину, причем центральный сегмент гэп содержит десять 2'-дезоксинуклеозидов, к которому с обоеих сторон (в направлениях 5' и 3') присоединены крылья, содержащие по пять нуклеозидов. Дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химерные олигонуклеотиды имеют 16 нуклеозидов в длину, причем нуклеозид имеет или МОЕ сахарную модификацию, или (S)-cEt сахарную модификацию, или дезокси-модификацию. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 55, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1).
Таблица 55
5 Ингибирование уровней вирусной мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами, измеренное с RTS3370 или RTS3371
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
№1818
Мотив
% ингибирование (RTS3370)
% ингибирование (RTS3371)
Последовательность
SEQ ID NO
156
176
5808*
Равномерно дезокси
57
64
CCTGATGTGATGTTCTCCATG
1373
303
322
524518*
еееее-10-еееее
62
72
GGGACTGCGAATTTTGGCCA
428
376
395
146781*
еееее-10-еееее
72
93
AAACGCCGCAGACACATCCA
1374
380
399
582665
еееее-10-еееее
57
59
GATAAAACGCCGCAGACACA
1375
382
401
582666
еееее-10-еееее
49
92
ATGATAAAACGCCGCAGACA
1376
411
426
566831
kdkdk-9-ee
96
73
GCATAGCAGCAGGATG
137
411
427
577123
eekk-9-ekee
84
96
GGCATAGCAGCAGGATG
17
411
427
577124
kdkdk-8-eeee
92
96
GGCATAGCAGCAGGATG
17
411
426
577126
kkk-8-eeeee
87
90
GCATAGCAGCAGGATG
137
413
428
566830
kdkdk-9-ee
93
95
AGGCATAGCAGCAGGA
143
415
430
577130
eek-10-kke
87
94
TGAGGCATAGCAGCAG
147
415
430
577131
kdkdk-9-ee
83
93
TGAGGCATAGCAGCAG
147
1263
1278
566828
kdkdk-9-ee
97
90
CCGCAGTATGGATCGG
1236
1577
1596
146786*
еееее-10-еееее
93
71
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
224
1577
1592
566829
kdkdk-9-ee
98
84
AGCGAAGTGCACACGG
1334
1577
1596
577120
kdkdk-10-eeeee
94
93
GTGAAGCGAAGTGCACACGG
224
1577
1592
577127
kkk-8-eeeee
95
70
AGCGAAGTGCACACGG
1334
1577
1592
577134
kek-8-eeeee
94
89
AGCGAAGTGCACACGG
1334
1577
1592
577135
kek-10-kek
96
94
AGCGAAGTGCACACGG
1334
1583
1598
552859*
ekk-10-kke
92
91
AGGTGAAGCGAAGTGC
1340
1583
1602
577121
kdkdk-10-eeeee
91
74
GCAGAGGTGAAGCGAAGTGC
226
1583
1598
577128
kkk-8-eeeee
92
85
AGGTGAAGCGAAGTGC
1340
1583
1598
577132
kdkdk-9-ee
97
81
AGGTGAAGCGAAGTGC
1340
1583
1598
577136
kek-10-kek
95
95
AGGTGAAGCGAAGTGC
1340
1588
1603
566832
kdkdk-9-ee
95
78
TGCAGAGGTGAAGCGA
1345
1780
1795
552870*
ekk-10-kke
71
93
TTTATGCCTACAGCCT
232
1780
1799
577122
kdkdk-10-eeeee
70
96
CCAATTTATGCCTACAGCCT
50
1780
1796
577125
kdkdk-8-eeee
70
94
ATTTATGCCTACAGCCT
51
1780
1795
577129
kkk-8-eeeee
76
51
TTTATGCCTACAGCCT
232
1780
1795
577133
kdkdk-9-ee
80
52
TTTATGCCTACAGCCT
232
1873
1892
9591*
Равномерно дезокси
30
14
CACCCAAGGCACAGCTTGG
1377
Пример 19: Эффективность химерных олигонуклеотидов, направленных на HBV, у трансгенных мышей
В нескольких исследованиях трансгенных мышей обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS для оценки эффективности химерных олигонуклеотидов. Оценили уровни ДНК и РНК HBV.
Испытание 1
Каждой мыши в группе из 12 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 510106, ISIS 510116, ISIS 505347 или ISIS 509934. Контрольной группе из 12 мышей подкожно вводили PBS два раза в неделю, в течение 4 недель. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали печени для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя наборы затравочных зондов RTS3370, RTS3371 и RTS3372. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с наборами затравочных зондов RTS3370 и RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные, выраженные как процентное ингибирование по сравнению с контрольной группой, представлены в Таблице 56. Как показано в Таблице 56, большинство антисмысловых олигонуклеотидов привело к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 56
Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV в печени трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование ДНК (RTS3370)
% ингибирование ДНК (RTS3371)
% ингибирование ДНК (RTS3372)
% ингибирование РНК (RTS3370)
% ингибирование РНК (RTS3371)
% ингибирование РНК (RTS3372)
505347
5-10-5 МОЕ
72
79
75
54
28
30
509934
5-10-5 МОЕ
93
95
94
72
75
92
510106
3-10-4 МОЕ
0
0
51
0
0
12
510116
3-10-4 МОЕ
68
79
68
49
54
66
Испытание 2
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 146779, ISIS 505358, ISIS 146786, ISIS 509974, ISIS 509958 или ISIS 509959. Контрольной группе из 10 мышей подкожно вводили PBS два раза в неделю, в течение 4 недель. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали печени для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3370. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3370 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные, выраженные как процентное ингибирование по сравнению с контрольной группой, представлены в Таблице 57. Как показано в Таблице 57, большинство антисмысловых олигонуклеотидов привело к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 57
Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV в печени трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование ДНК
% ингибирование РНК
146779
5-10-5 МОЕ
39
5
146786
5-10-5 МОЕ
83
73
505358
5-10-5 МОЕ
84
77
509958
3-10-3 МОЕ
82
29
509959
3-10-3 МОЕ
54
30
509974
3-10-3 МОЕ
56
28
Испытание 3
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 50 мг/кг ISIS 509960, ISIS 505329, ISIS 146786, ISIS 505339 или ISIS 509927. Другой группе из 6 мышей вводили энтекавир, пероральное противовирусное лекарство, используемое для лечения инфекции гепатита В, в дозе 1 мг/кг, ежедневно, в течение двух недель. Контрольной группе из 10 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили PBS. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали печени для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные, выраженные как процентное ингибирование по сравнению с контрольной группой, представлены в Таблице 58. Как показано в Таблице 58, большинство антисмысловых олигонуклеотидов привело к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 58
Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV в печени трансгенных мышей
Химия олигонуклеотида
% ингибирование ДНК
% ингибирование РНК
энтекавир
-
94
0
ISIS 146786
5-10-5 МОЕ
97
92
ISIS 505329
5-10-5 МОЕ
70
63
ISIS 505339
5-10-5 МОЕ
74
63
ISIS 509927
5-10-5 МОЕ
80
57
ISIS 509960
3-10-3 МОЕ
86
60
Испытание 4
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786, ISIS 552176 и ISIS 552073. Одной группе из 10 мышей подкожно вводили PBS два раза в неделю, в течение 4 недель. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные представлены в Таблице 59. Как показано в Таблице 59, антисмысловые олигонуклеотиды вызывают снижение ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 59
Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV у трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование РНК
% ингибированиеДНК
146786
5-10-5 МОЕ
81
91
552073
8-10-2 МОЕ
39
22
552176
3-9-5 МОЕ
55
56
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на печеночную функцию, измерили концентрации ALT в плазме при помощи автоматического клинического анализатора химического состава (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, штат Нью-Йорк) (Nyblom, H. et al., Alcohol & Alcoholism 39: 336-339, 2004; Tietz NW (Ed): Clinical Guide to Laboratory Tests, 3е изд. W.B. Saunders, Филадельфия, штат Пенсильвания, 1995). Результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в Таблице 60. Оба ISIS олигонуклеотида считаются переносимыми мышами, что демонстрируется их профилем трансаминазы в печени.
Таблица 60
Уровни ALT (МЕ/л) трансгеных мышей
ALT
PBS
77
ISIS 146786
21
ISIS 552073
19
ISIS 552176
27
Испытание 5
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786, ISIS 552056, ISIS 552088 и ISIS 552309. Одной группе из 10 мышей подкожно вводили PBS два раза в неделю, в течение 4 недель. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Как показано в Таблице 61, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 61
Процентное ингибирование ДНК и РНК HBV у трансгенных мышей
Химия
% ингибирование (РНК)
% ингибирование(ДНК)
ISIS 146786
5-10-5 МОЕ
60
90
ISIS 552056
7-10-3 МОЕ
25
58
ISIS 552088
8-10-2 МОЕ
8
0
ISIS 552309
5-9-3 МОЕ
35
84
Испытание 6
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786, ISIS 505330, ISIS 509932, ISIS 552032, ISIS 552057, ISIS 552075, ISIS 552092 и ISIS 552255. Одной группе из 10 мышей подкожно вводили PBS два раза в неделю, в течение 4 недель. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Как показано в Таблице 62, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» показывает мотив гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 62
Процентное ингибирование ДНК и РНК HBV у трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование (РНК)
% ингибирование(ДНК)
146786
5-10-5 МОЕ
52
95
505330
5-10-5 МОЕ
7
61
509932
5-10-5 МОЕ
83
98
552032
6-10-4 МОЕ
54
97
552057
7-10-3 МОЕ
19
62
552075
8-10-2 МОЕ
12
18
552092
8-10-2 МОЕ
25
74
552255
4-9-4 МОЕ
41
89
Испытание 7
Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 20 мг/кг ISIS 552859, ISIS 577121, ISIS 577122, ISIS 577123, ISIS 577132, ISIS 577133 и ISIS 577134. Эти химерные олигонуклеотиды имеют дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химию. Одной группе из 10 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили PBS. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Как показано в Таблице 63, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ.
Таблица 63
Процентное ингибирование ДНК и РНК HBV у трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование (РНК)
% ингибирование (ДНК)
552859
ekk-10-kke
60
86
577121
kdkdk-10-eeeee
59
93
577122
kdkdk-10-eeeee
42
68
577123
eekk-9-ekee
0
77
577132
kdkdk-9-ee
4
24
577133
kdkdk-9-ee
46
64
577134
kek-8-eeeee
0
17
Испытание 8
Группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786, химерного олигонуклеотида 5-10-5 МОЕ. Каждой мыши в группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 10 мг/кг ISIS 552803, ISIS 552903, ISIS 552817, ISIS 552822 и ISIS 552907. Эти химерные олигонуклеотиды имеют дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химию. Одной группе из 10 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили PBS. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные представлены в Таблице 64. Как показано в Таблице 64, антисмысловые олигонуклеотиды вызывают снижение ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ; в случае МОЕ химерных олигонуклеотидов, колонка «химия» указывает структуру гэп-крыла.
Таблица 64
Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV у трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
Доза (мг/кг в неделю)
% ингибирование РНК
% ингибирование ДНК
146786
5-10-5 МОЕ
50
81
91
552803
ekk-10-kke
20
71
95
552817
ekk-10-kke
20
86
51
552822
ekk-10-kke
20
90
89
552903
ek-10-keke
20
56
82
552907
ek-10-keke
20
41
45
Испытание 9
Группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786. Группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 10 мг/кг ISIS 552853, ISIS 552854, ISIS 552932 и ISIS 552938. Одной группе из 10 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили PBS. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Как показано в Таблице 65, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ; в случае МОЕ химерных олигонуклеотидов, колонка «химия» указывает структуру гэп-крыла.
Таблица 65
Процентное ингибирование ДНК и РНК HBV у трансгенных мышей
Химия
Доза (мг/кг в неделю)
% ингибирование (ДНК)
% ингибирование (РНК)
ISIS 146786
5-10-5 МОЕ
50
90
60
ISIS 552853
ekk-10-kke
20
94
60
ISIS 552854
ekk-10-kke
20
61
23
ISIS 552932
ek-10-keke
20
75
70
ISIS 552938
ek-10-keke
20
67
56
Испытание 10
Группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 25 мг/кг ISIS 146786. Группе из 6 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили 10 мг/кг ISIS 552922, ISIS 552923, ISIS 552942, ISIS 552872, ISIS 552925, ISIS 552937 и ISIS 552939. Одной группе из 10 мышей дважды в неделю, в течение 4 недель, подкожно вводили PBS. Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя набор затравочных зондов RTS3371. Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с набором затравочных зондов RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Как показано в Таблице 66, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ; в случае МОЕ химерных олигонуклеотидов, колонка «химия» указывает структуру гэп-крыла.
Таблица 66
Процентное ингибирование ДНК и РНК HBV у трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
Доза (мг/кг в неделю)
% ингибирование(ДНК)
% ингибирование (РНК)
146786
5-10-5 МОЕ
50
52
57
552922
ekk-10-kke
20
61
50
552923
ek-10-keke
20
89
76
552942
ek-10-keke
20
58
52
552872
ek-10-keke
20
77
46
552925
ek-10-keke
20
89
65
552937
ek-10-keke
20
59
35
552939
ek-10-keke
20
57
19
Пример 20: Эффективность химерных олигонуклеотидов, направленных на HBV, у трансгенных мышей
Использовали мышей с фрагментом гена HBV (Guidotti, L.G. et al., J. Virol. 1995, 69, 6158-6169) Мышей обрабатывали ISIS антисмысловыми олигонуклеотидами, выбранными из исследований, описанных выше, и оценили их эффективность в этой модели. Оценили уровни ДНК, РНК и антигена HBV.
Каждой мыши из группы 10 мышей дважды в неделю подкожно вводили сначала 50 мг/кг, а затем, дважды в неделю, в течение следующих 3 недель, 25 мг/кг ISIS 146786 или ISIS 510100. Каждую мышь в контрольной группе из 10 мышей обрабатывали таким же образом при помощи ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, SEQ ID NO:320; 5-10-5 МОЕ химерный олигонуклеотид без известной мишени у мышей) или ISIS 459024 (CGGTCCTTGGAGGATGC, SEQ ID NO:1351; 3-10-4 МОЕ химерный олигонуклеотид без известной мишени у мышей). Мышей умертвили через 48 часов после последней дозы, и собрали органы и сыворотку для дальнейшего анализа.
Анализ ДНК и РНК
РНК экстрагировали из печеночной ткани для анализа ПЦР ДНК HBV в реальном времени, используя наборы затравочных зондов RTS3370, RTS3371 или RTS3372 (прямая последовательность ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT, обозначенная SEQ ID NO: 314; обратная последовательность CGACGCGGCGATTGAG, обозначенная SEQ ID NO:315; последовательность зонда AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG, обозначенная SEQ ID NO:316). Уровни ДНК нормализовали к Picogreen. Образцы РНК HBV также анализировали с наборами затравочных зондов RTS3370 и RTS3371 после анализа ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК нормализовали к RIBOGREEN. Данные представлены в Таблице 67. Образцы ДНК в сыворотке анализировали после испытательного периода. Данные, выраженные относительно уровней, измеренных в контрольной группе, представлены в Таблице 68. Как показано в Таблицах 67 и 68, антисмысловые олигонуклеотиды приводят к снижению ДНК и РНК HBV по сравнению с PBS контрольным образцом. Результаты представлены как процентное ингибирование мРНК или ДНК HBV, по сравнению с контрольным образцом. Колонка «химия» указывает структуру гэп-крыла каждого химерного олигонуклеотида.
Таблица 67
10 Процентное ингибирование РНК и ДНК HBV в печени трансгенных мышей
№ ISIS
Химия
% ингибирование ДНК (RTS3370)
% ингибирование ДНК (RTS3371)
% ингибирование ДНК (RTS3372)
% ингибирование РНК (RTS3370)
% ингибирование РНК (RTS3371)
% ингибировании РНК (RTS3372)
146786
5-10-5 МОЕ
97
97
95
86
85
89
510100
3-10-4 МОЕ
95
94
94
56
64
77
141923
5-10-5 МОЕ
2
0
13
0
7
31
459024
3-10-4 МОЕ
19
0
8
0
0
0
Таблица 68
Процентное ингибирование ДНК HBV в сыворотке трансгенных мышей
№ ISIS
% ингибирование (RTS3370)
% ингибирование (RTS3371)
146786
98
98
510100
99
98
141923
0
0
459024
0
0
Анализ антигена HBV
Антигены HBV в надосадочных жидкостях обнаружили при помощи иммуноферментого анализа твердофазного (ELISA). Уровни антигена HBs (HBsAg) обнаружили иммуноферментным твердофазным анализом компании Abazyme LLC, штат Массачусетс. Как показано в Таблице 57, обработка олигонуклеотидами ISIS 146786 или 510100 вызывает снижение уровней HBsAg. Уровни антигена НВе (HBeAg) обнаружили иммуноферментным твердофазным анализом компании International Immune-diagnostics, штат Калифорния. Как показано в Таблице 69, обработка олигонуклеотидами ISIS 146786 или 510100 вызывает также снижение уровней HBeAg.
Таблица 69
Уровни антигенов HBV (Единицы Института Пауля-Эрлиха/мл) у трансгенных мышей
HBsAg
HBeAg
PBS
40
80
146786
3
15
510100
15
22
141923
32
80
459024
44
51
Пример 21: Антисмысловое ингибирование вирусной мРНК HBV в клетках HepG2 дезокси-, МОЕ и (S)-cEt-химерными олигонуклеотидами
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны для направленного действия на вирусную нуклеиновую кислоту HBV, и были испытаны на их действие на мРНК HBV in vitro. В этот анализ включили также ISIS 146786, ISIS 505358, ISIS 509932 и ISIS 510100, описанные в предварительной заявке на патент США №61/478040, поданной 21 апреля 2011 года; ISIS 552859, описанный в предварительной заявке на патент США №61/596692, поданной 8 февраля 2012 года; ISIS 577121, ISIS 577122, ISIS 577123, ISIS 577132, ISIS 577133 и ISIS 577134, описанные в исследовании, раскрытом выше. Культивированные клетки HepG2 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи Cytofectin 9,375 нМ, 18,75 нМ, 37, 50 нМ, 75,00 нМ, 15,00 нМ или 300,00 нМ антисмыслового олигонуклеотида После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3371. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Результаты представлены как процентное ингибирование HBV, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Новые разработанные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были разработаны как дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химерные олигонуклеотиды. Дезокси-, МОЕ и (S)-cEt химерные олигонуклеотиды имеют 16, 17 или 18 нуклеозидов в длину, причем нуклеозиды имеют или МОЕ сахарную модификацию, или (S)-cEt сахарную модификацию, или дезокси-модификацию. Колонка «химия» описывает модификации сахара каждого олигонуклеотида. «k» обозначает (S)-cEt модификацию сахара; число обозначает количество дезоксинуклеозидов; в противном случае, «d» обозначает дезоксинуклеозид; и «е» обозначает модификацию МОЕ. Межнуклеозидные связи в каждом химерном олигонуклеотиде представляют собой фосфотиоатные (P=S) связи. Все цитозиновые остатки в каждом олигонуклеотиде представляют собой 5-метилцитозины.
«Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен химерный олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый химерный олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 70, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1).
Таблица 70
Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, направленные на SEQ ID NO:1
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
№ ISIS
Мотив
Последовательность
SEQ ID NO
411
427
585163
eeekk-8-eeee
GGCATAGCAGCAGGATG
17
414
430
585164
eeekk-7-kkeee
TGAGGCATAGCAGCAGG
21
414
430
585165
eeek-9-keee
TGAGGCATAGCAGCAGG
21
1577
1593
585170
eeekk-7-kkeee
AAGCGAAGTGCACACGG
1304
1577
1593
585171
eeek-9-keee
AAGCGAAGTGCACACGG
1304
1577
1593
585172
eeeekk-7-eeee
AAGCGAAGTGCACACGG
1304
1577
1593
585173
ekek-9-eeee
AAGCGAAGTGCACACGG
1304
1577
1593
585174
ekekdk-7-eeee
AAGCGAAGTGCACACGG
1304
1583
1599
585166
eeekk-7-kkeee
GAGGTGAAGCGAAGTGC
1310
1583
1599
585167
eeek-9-keee
GAGGTGAAGCGAAGTGC
1310
1780
1797
577119
kdkdk-8-eeeee
AATTTATGCCTACAGCCT
1379
1780
1796
585168
eeekk-7-kkeee
ATTTATGCCTACAGCCT
51
1780
1796
585169
eeek-9-keee
ATTTATGCCTACAGCCT
51
Таблица 71
Зависимое от дозы ингибирование уровней мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами
№ ISIS
9,375 нМ
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
300,0 нМ
146786
37
37
58
70
81
93
505358
30
26
28
57
74
85
510100
42
30
43
61
77
91
552859
21
30
39
61
79
91
577119
42
43
46
66
74
75
577121
10
15
42
64
82
89
577122
21
30
53
66
78
84
577123
27
29
45
56
78
84
577132
14
21
42
61
80
92
577133
12
14
32
47
62
77
577134
37
39
59
72
86
90
585174
31
28
48
61
80
90
Таблица 72
Зависимое от дозы ингибирование уровней мРНК HBV химерными антисмысловыми олигонуклеотидами
№ ISIS
9,375 нМ
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
300,0 нМ
146786
25
34
57
71
85
92
509932
9
28
59
62
70
74
585163
17
32
52
68
77
81
585164
23
4
29
31
36
56
585165
6
31
42
58
66
82
585166
19
27
35
48
50
63
585167
22
25
50
69
76
88
585168
4
30
44
52
67
76
585169
32
32
42
62
76
80
585170
23
19
39
49
66
75
585171
28
27
42
59
81
88
585172
26
29
30
64
80
91
585173
29
30
41
71
86
88
Пример 22: Анализ эффективности однообразных дезоксиолигонуклеотидов при ингибровании мРНК HBV в клетках HepG2
Дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды были испытаны на их влияние на мРНК HBV in vitro. В этот анализ включили также ISIS 5808 и ISIS 9591, описанные в US 5985662. В этот анализ включили ISIS 146786 в качестве эталона. Культивированные клетки HepG2 при плотности 28000 клеток на лунку трансфицировали при помощи LipofectAMINE2000 18,75 нМ, 37, 50 нМ, 75,00 нМ, 150,00 нМ или 300,00 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После примерно 24 часов обработки, РНК выделили из клеток и измерили уровни мРНК HBV количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК и ДНК использовали набор вирусных затравочных зондов RTS3371. Уровни мРНК HBV скорректировали в соответствии с общим содержанием РНК, по результатам измерения с RIBOGREEN. Уровни антигена S и антигена Е также измерили при помощи иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Результаты представлены как процентное ингибирование, по сравнению с не обработанными контрольными клетками.
Исследованные антисмысловые олигонуклеотиды, ISIS 582699, ISIS 582700 и ISIS 582701, были разработаны в соответствии с последовательностями и химическими структурами, описанными в публикации Korba and Germ, Antiviral Research, 1995, Vol.28, 225-242; соответствующие названия олигонуклеотидов в представленной ссылке - S1, C1 и L2c, соответственно. Антисмысловые олигонуклеотиды в Таблицах ниже были разработаны как однообразные дезокси-олигонуклеотиды длиной 16 или 21 нуклеозида, причем эти нуклеозиды имеют дезокси-модификации. «Вирусный целевой сайт инициации» указывает 5'-основной нуклеотид, на который направлен олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. «Вирусный целевой терминирующий сайт» указывает 3'-основной нуклеотид, на который направлен олигонуклеотид в последовательности вирусного гена. Каждый олигонуклеотид, перечисленный в Таблице 73, направлен на вирусную геномную последовательность, обозначенную в настоящем документе как SEQ ID NO:1 (доступ GENBANK №U95551.1). Результаты показывают, что дезокси-олигонуклеотиды имеют незначительное влияние на уровни экспрессии мРНК HBV, уровни ДНК и уровни антигена HBV.
Таблица 73
Однообразные дезокси-олигонуклеотиды, направленные на SEQ ID NO:1
Вирусный целевой сайт инициации
Вирусный целевой терминирующий сайт
№ ISIS
Последовательность
SEQ ID NO
160
180
582699
GAATCCTGATGTGATGTTCTC
1378
1884
1899
582701
CCAAAGCCACCCAAGG
1380
1910
1930
582700
CAAATTCTTTATAAGGGTCGA
1381
Таблица 74
Зависимое от дозы ингибирование уровней мРНК HBV после обработки олигонуклеотидами
№ ISIS
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
300,0 нМ
5808
38
23
29
40
54
9591
35
20
32
26
40
146786
11
5
45
66
92
582699
32
28
27
39
52
582700
18
12
20
16
23
582701
4
0
0
3
13
Таблица 75
Зависимое от дозы ингибирование уровней ДНК HBV в клетках HepG2 после обработки олигонуклеотидами
№ ISIS
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
5808
20
17
0
0
9591
0
0
0
0
146786
32
50
77
83
582699
0
44
0
17
582700
0
0
0
0
582701
0
0
0
0
Таблица 76
Уровни антигена S HBV после обработки олигонуклеотидами (произвольные единицы)
№ ISIS
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
5808
9254
8228
4168
2540
9591
10924
8683
9334
12142
146786
12501
7265
3408
1 017
582699
9340
9325
7589
4712
582700
9697
8350
11 168
10703
582701
15283
18209
14632
15299
Таблица 77
Уровни антигена Е HBV после обработки олигонуклеотидами (произвольные единицы)
ISIS No
18,75 нМ
37, 5 нМ
75,0 нМ
150,0 нМ
5808
8075
8587
5036
3286
9591
9242
8093
8257
6944
146786
8532
4034
2301
449
582699
7815
7191
7026
5278
582700
8690
9304
7941
6315
582701
8847
8257
8211
6276