СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА РЫБНОГО КОЛЛАГЕНА
METHOD FOR PRODUCING FISH COLLAGEN HYDROLYZATE

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, касается способа получения гидролизата морского коллагена (молекулярная масса ниже 15кДа), который может быть использован в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности для получения медицинских и косметических препаратов, а также некоторых продуктов питания.
Коллаген с широким спектром молекулярных масс (ММ) получил широкое распространение. Его активно используют в пищевой промышленности для самых различных целей: как источник белка, желирующий, влагосвязывающий компонент и эмульгатор, для пищевых оболочек (Пустыльник Я.И. Кожевенные отходы - золотое дно / Я.И. Пустыльник //В мире оборудования. - 2002. - №2 (19), Чернецова Е.Н. Использование коллагена в колбасном производстве // Мясные технологии. 2007. №11), при производстве молочных продуктов, кондитерских изделий, соусов (http://www.cpt.in.ua/Kollagen-Pro/syrki.html, Пащенко В.Л. Коллагеновый гидролизат в технологии заварных пряников / Всероссийская научно-практическая конференция студентов, аспирантов и молодых ученых с Международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности», Бийск, 2011. - С. 351-354, TW 200744459), биологически активных добавок (http://kollagen-ultra.ru/, http://asteriskcz.com/products) и т.п. Коллагенсодержащие препараты находят самое широкое применение в медицине и фармакологии в качестве «подложек» для выращивания новых тканей, адресной доставки лекарств, получения инплантов, о чем свидетельствуют данные научных публикаций (Николаева Т.И., Шеховцов П.В. Гидролизаты коллагена в профилактике и лечении заболеваний суставов // Фундаментальные исследования. - 2014. - №12-3. - С. 524-528; Кулакова К.В., Алейник Д.Я., Чарыкова И.Н. Совместное использование разработанных коллагенсодержащих комплексов и культуры клеток для создания новых тканевых эквивалентов. Бюллетень сибирской медицины. 2016; 15(5):75-82. DOI: 10.20538/1682-0363-2016-5-75-82 и др.) и патентов (РФ 2360690, US 2015343026, AU 2015296246, AU 2015287696, US 2017044220, US 2017043023, US 2017043021, СА 2951346, WO 2009140573 и т.д). Препараты на основе коллагена используются в лечебной косметологии (http://www.grandplastica.ru/, http://www.mc-algyda.ru/, http://absolutmed.ru/).
В последнее время коллаген, выделенный из гидробионтов, чаще всего из отходов переработки морских рыб («морской коллаген»), вытесняет таковой, выделенный из тканей животных. Это объясняется преимуществами морского коллагена: большее структурное сходство с коллагеном человека, обеспечивающее биосовместимость (уровень усвоения организмом коллагена из рыбы в 1,5 раза выше коллагена, получаемого из шкуры свиньи), а также антигенность, способность к биодеградации (http://camucamu.ru).
Гидролизат коллагена с ММ менее 15-20 кДа представляет значительный интерес, т.к. имеет способность проникать в клетки при адресной доставке лекарственных ингредиентов (Басинский С.Н. Способ адресной доставки лекарственных препаратов в лечении дистрофических состояний глаз // РМЖ «Клиническая Офтальмология». 2004. Т. 12, №1. С. 5-8 и др.), более эффективно поглощаться как в пищеварительном тракте, так и органами покровной системы человека: кожей, волосами, ногтями (http://japanvitamins.ru/print_product_info.php/products_id/).
Для выделения гидролизата коллагена используют методы ферментативного гидролиза и химического (щелочного, щелочно-солевого, кислотного). В первом случае используют протеолитические ферментные препараты, а также комплексные добавки, содержащие несколько ферментов (RU 2094999, RU 2375385, RU 2409216, RU 2272808, RU 2272808, RU 2360693, RU 2501812). В плане практического использования гидролизата коллагена, выделенного ферментативным способом, следует обратить внимание на следующее. Ферменты, используемые в качестве агентов гидролиза белка-коллагена, сами являются белками, имеющими ММ в диапазоне 20- 60 кДа (http://www.chemport.ru/data/chemipedia/article_4009.html), и отделить их от коллагена после гидролиза достаточно проблематично. Оставаясь в растворе или порошке коллагена, они могут проявить свою активность как ферменты, в любое время, и тем самым изменить эффект, ожидаемый от коллагена. Это обстоятельство позволяет считать более приемлемым в данной ситуации химический, а именно щелочной гидролиз, который позволяет получать низкомолекулярный и олигомерный коллаген.
Известен способ получения гидролизата коллагена из отходов шкур животных, предусматривающий водно-термическую обработку в присутствии щелочи. Смешивают отходы, воду и щелочь в соотношении 1:(1,8-2,0):(0,09-0,46), приготовленную смесь подвергают водно-термической обработке при 120-180°С в течение 25-90 мин (RU №2291164). Недостатком данного способа являются жесткий температурный режим и высокая концентрация щелочи в растворе.
Известен способ, связанный с термообработкой коллагенсодержащих отходов в течение 2-3 ч при температуре 90-110°С в водном растворе гидроксида натрия, взятом в количестве 3-5% от массы отходов, при жидкостном коэффициенте, равном 1 (см. RU 2375385).
Недостатками методов являются отсутствие как входного контроля для сырья, так и параметров выделяемого коллагена: ММ, зольность и т.п.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ обработки коллагенсодержащего сырья, защищенный патентом RU 2501812 С2, кл. С08В 37/08, А61K 35/60, А61K 38/39, А61K 31/728, C12N 9/14, принятый за ближайший аналог (прототип). В способе по прототипу сырье, костную крошку размером 700-2000 мкм, гидролизуют в течение 24-48 ч в смеси раствора 0,4 Н гидроксида натрия и этанола в соотношении 1:1, нейтрализуют до рН 6,8-7,8, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 20-40 мин, надосадок сливают, а осадок обрабатывают 0,125%-ным раствором папаина при 37°С, затем повторно гидролизуют смесью раствора 0,4 Н гидроксида натрия и этанола в соотношении 1:1, диализуют против воды, замораживают и лиофилизируют. Технический результат - повышение качества конечного продукта.
Преимуществом и общим признаком с предлагаемым изобретением является использование для получения низкомолекулярного гидролизата коллагена слабого раствора гидроксида натрия, удаление соли диализом и испарение воды для получения конечного продукта.
Недостатком способа по прототипу является многостадийность процесса и отсутствие контроля качества входного для сырья и конечного для гидролизата: ММ, зольность и.т.п.
Задачей изобретения является создание нового способа получения гидролизата рыбного коллагена, пригодного для получения жидких субстанций, порошков, пленок для самого широкого использования в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности с применением слабого раствора гидроксида натрия.
Техническим результатом от использования предлагаемого изобретения является получение гидролизата коллагена с со значением среднечисленной ММ<15 кДа, с преимущественным содержанием коллагена со среднечисленной ММ ≤ 7 кДА и параметрами:
влажность (макс, %) - 7,0,
зольность (макс, %) - 2,0,
жиры (макс, %) - 0,3,
РН (10% раствор) - 5,5-6,5,
растворимость в воде - полная,
просеивание - очень быстрое,
энзиматическая активность - отсутствие,
вид раствора - незначительная замутненность,
цвет порошка - цвет слоновой кости,
запах и вкус - нейтральные.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения гидролизата рыбного коллагена включает подготовку и анализ сырья, в качестве которого используют шкуры промысловых рыб, химическое выделение гидролизата коллагена с помощью слабого раствора гидроксида натрия, при этом подготовку сырья осуществляют путем очистки рыбьих шкур, промывки их водой, замораживания, измельчения и перемешивания, анализ сырья осуществляют путем контроля содержания в сырье влаги, золы и жира, причем используют гомогенизированный продукт, содержащий не более 55% воды, не более 3% золы и менее 1% жира, химическое выделение гидролизата коллагена осуществляют путем промывки подготовленного гомогенизированного продукта водой, заливки 2-3% раствором гидроксида натрия при гидромодуле 1:2-1:5, выдерживании в течение 20-24 ч, нейтрализации раствором уксусной кислоты, фильтрации продукта от примесей; получение кислой дисперсии осуществляют путем подкисления раствора раствором уксусной кислоты до 3%; формирование сухой формы осуществляют путем испарения воды из фильтрата без нагрева при температуре выше 50°С; испарение воды осуществляют лиофильно или распылительной сушкой, в зависимости от назначения сухой формы.
Температура денатурации коллагена шкур рыб заметно ниже, чем у млекопитающих; он легче подвергается воздействию агентов гидролиза. Поэтому режимы технологических процессов выделения коллагена из шкур рыб могут быть более щадящие - пониженные температуры, невысокие концентрации реагентов, меньшая продолжительность обработки.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Способ получения гидролизата коллагена включает следующие этапы:
1) подготовку и анализ сырья;
2) ферментативное выделение гидролизата коллагена;
3) получение кислой дисперсии гидролизата коллагена;
4) формирование «сухой» формы продукта.
Сначала осуществляют подготовку и анализ сырья. В качестве сырья используют шкуры промысловых рыб. Их очищают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт анализируют на содержание влаги, золы и жира по общепринятым методикам. Для дальнейших манипуляций используют гомогенизированный продукт, содержащий не более 55% воды, не более 3% золы и менее 1% жира.
Предварительно взвешенный гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 мин, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 2-3%-ным раствором гидроксида натрия, при гидромодуле от 1:2 до 1:5 в зависимости от необходимой концентрации коллагена в растворе и выдерживают в течение 20-24 ч. Гидромодуль выбирают в зависимости от задачи: при небольшом гидромодуле концентрация коллагена в растворе большая, увеличение гидромодуля приводит к уменьшению концентрации коллагена в растворе, но росту выхода коллагена на единицу массы сырья.
Для получения жидкой субстанции раствор нейтрализуют раствором уксусной кислоты до рН 6,5-7,0, при необходимости хранения субстанции подкисляют до рН 5,5-6,5. Для получения сухих форм воду из фильтрата испаряют любым способом без нагрева выше 50°С (лиофильная, распылительная сушка) в зависимости от назначения сухой формы (порошок, пленка).
Выделенный предлагаемым способом гидролизат коллагена имеет значения среднечисленной молекулярной массой ММ<15 кДа с преимущественным содержанием коллагена со среднечисленной молекулярной массой ММ ≤ 7 кДа.
Параметры выделенного коллагена:
влажность (макс., %) - 7,0,
зольность (макс., %) - 2,0,
жиры (макс., %) - 0,3,
РН (10% раствор) - 5,5-6,5,
растворимость в воде – полная.
просеивание - очень быстрое
энзиматическая активность - отсутствие
вид раствора незначительная замутненность
цвет порошка: цвет слоновой кости
запах и вкус нейтральные.
Ниже приведены примеры конкретного осуществления предлагаемого изобретения.
Пример 1
Шкуру промысловых рыб (например, трески) очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,0%), золы (1,1%) и жира (1,1%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 мин, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 2%-ным раствором гидроксида натрия при гидромодуле 1:2. Обработку проводят в течение 20 ч. Для получения и хранения жидкой субстанции раствор нейтрализуют и подкисляют раствором уксусной кислоты до рН 5,5-6,5. Для анализа параметров коллагена из раствора испаряют воду лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ ≤ 15кДа), ~80% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.
Параметры выделенного коллагена:
влажность - 2,0%,
зольность - 0,9%,
жиры - 0,2%,
РН (10% раствор) - 5,5,
растворимость в воде - полная
энзиматическая активность – отсутствие,
вид раствора - незначительная замутненность,
цвет - цвет слоновой кости,
запах и вкус - нейтральные.
Пример 2
Шкуру промысловых рыб (например, горбуши) очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит влаги (61,5%), золы (1,1%) и жира (1,1%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 мин, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 3%-ным раствором гидроксида натрия при гидромодуле 1:2 и выдерживают в течение 20 ч. Затем продукт фильтруют от примесей, нейтрализуют раствором уксусной кислоты до рН 6,5-7,0, воду испаряют лиофильно. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ ≤ 15кДа), ~90% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.
Параметры выделенного коллагена:
влажность - 2,1%,
зольность - 1,1%,
жиры - 0,2%,
РН (10% раствор) - 5,5,
Цвет - цвет слоновой кости,
запах и вкус – нейтральные,
растворимость в воде - полная.
Пример 3
Шкуру промысловых рыб (например, трески) очищают, взвешивают, промывают водопроводной водой, замораживают, измельчают, перемешивают. Полученный таким образом гомогенизированный продукт содержит: влаги (64,0%), золы (1,0%) и жира (1,4%). Гомогенизированный продукт три раза промывают водопроводной и один раз дистиллированной водой. Каждый раз выдерживают в течение 40 мин, воду сливают. Гомогенизированный продукт заливают 3%-ным раствором гидроксида натрия при гидромодуле 1:5 и выдерживают в течение 24 ч. Затем продукт фильтруют от примесей, нейтрализуют раствором уксусной кислоты до рН 6,5-7,0, воду испаряют распылительной сушкой. Выделен гидролизат коллагена (среднечисленная ММ ≤ 15кДа), более 90% которого имеют среднечисленную ММ≤7 кДа.
Параметры выделенного коллагена:
влажность - 2,1%,
зольность - 1,1%,
жиры - 0,2%
РН (10% раствор) - 7,0
растворимость в воде - полная
запах и вкус нейтральные
просеивание - очень быстрое.