ЕВРОПИЕВЫЙ КОМПЛЕКС МОНОНАТРИЕВОЙ СОЛИ 2,2',2'',2'''-(2,2'-((4-(4-АМИНОФЕНИЛ)-2,2'-БИПИРИДИН-6-ИЛ)МЕТИЛАЗАДИИЛ)БИС-(ЭТАН-2,1-ДИИЛ))-БИС(АЗАТРИИЛ)ТЕТРАУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
EUROPIUM COMPLEX OF MONOSODIUM SALT OF 2,2',2",2'"-(2,2'-((4-(4-AMINOPHENYL)-2,2'-BIPYRIDINE-6-YL)METHYLAZADIYL)BIS-(ETHANE-2,1-DIYL))-BIS(AZATRIYL)TETRAACETIC ACID

1. Область техники, к которой относится изобретение.
1
Изобретение относится к области люминесцентных комплексных соединений европия с гетероциклическим 2,2′-бипиридиновым лигандом  с хелатирующим фрагментом на основе диэтилендиаминотетрауксусной кислоты (DTTA) и аминогруппой, пригодной для создания мостика пептидной биоконъюгации (Фиг. 1). Изобретение может быть использовано в качестве люминесцентной метки для иммуноанализа и может найти применение в медицине, а также в научно-исследовательских лабораториях.
2. Уровень техники.
3+
3+
3+
3+
3+
3+
3+
Производные пиридина и их аннелированные аналоги являются достаточно известными лигандами для комплексообразования с различными катионами металлов. Наибольшее практическое значение приобрели их комплексы с лантаноидами, такими, как Sm, Dy, Pr, Ho, Yb, Nd, Er. Такие соединения демонстрируют интересные магнитные свойства (G.M. Davies, S.J.A. Pope, H. Adams, S. Faulkner, M.D. Ward, Inorg. Chem. 44 (2005) 4656. DOI:10.1021/ic050512k), а также способны к люминесценции в ИК-диапазоне (S. Quici, M. Cavazzini, G. Marzanni, G. Accorsi, N. Armaroli, B. Ventura, F. Barigelletti, Inorg. Chem. 44 (2005) 529. DOI:10.1021/ic0486466) и в видимой части спектра (L. Armelao, S. Quici, F. Barigelletti, G. Accorsi, G. Bottaro, M. Cavazzini, E. Tondello, Coord. Chem. Rev. 254 (2009) 487. DOI:10.1016/j.ccr.2009.07.025), что делает возможным их применение в магнитно-резонансной терапии (S. Aime, S.G. Crich, E. Gianolio, G.B. Giovenzana, L. Tei, E. Terreno, Coord. Chem. Rev. 250 (2006) 1562. DOI:10.1016/S1002-0721(13)60022-8), а также в области телекоммуникаций (Y. Oshishi, T. Kanamori, T. Kitagawa, S. Takashashi, E. Snitzer, G. H. Jr. Sigel, Opt. Lett. 16 (1991) 1747. DOI:10.1364/OL.16.001747) и в качестве меток для иммуноанализа (J. Yan, G. Wang, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 490. DOI:10.1016/j.trac.2005.11.013). В последнем случае для успешного применения необходимо наличие в составе таких соединений линкера для связывания с биологическими молекулами организма, в качестве которого могут выступать такие функциональные группы, как карбоксильная (S. P. Martsev, V. A. Preygerzon, Y. I. Mel’nikova, Z. I. Kravchuk, G. V. Ponomarev, V. E. Lunev, A. P. Savitsky, J. Immunol. Methods. 186 (1995) 293. DOI:10.1016/0022-1759(95)00154-3 ), альдегидная (S. Poupart, C. Boudon, P. Peixoto, M. Massonneau, P.-Y. Renard, A. Romieu, Org. Biomol. Chem. 4 (2006) 4165. DOI:10.1039/B612805J), сульфохлоридная (A. Chan, E. P. Diamandis, M. Krajden, Anal. Chem. 2 (1993) 158. DOI:10.1021/ac00050a012), и некоторые другие, например, аминогруппа (N. Meltola, P. Jauria, P. Saviranta, H. Mikola, Bioconjugate Chem. 10 (1999) 325. DOI:10.1021/bc980013q). В случае наличия в составе лиганда последней, возможно, как её непосредственное связывание с карбоксильной группой биомолекулы, так и трансформация в изотиоцианатную посредством реакции с тиофосгеном, что позволяет получить более удобный в использовании линкер, обычно гладко и селективно реагирующий с первичными аминогруппами биологических молекул с образованием производных тиомочевины (H. Takalo, V. M. Mukkala, H. Mikola, P. Liitti, I. Hemmila, Bioconjugate Chem. 5 (1994) 278. DOI:10.1021/bc00027a015).
Кроме того, во избежание рассеяния энергии возбуждённого состояния лантанида посредством передачи её молекулам растворителя необходимо насыщение его координационной сферы. Так как координационное число лантанидов равно девяти, лиганд должен быть девятидентантен. Это достигается посредством введения в его структуру дополнительных хелатирующих групп, в качестве которых используются остатки полиаминоуксусных кислот, таких как IDA, DO3A и DTTA (A. M. Prokhorov, V. N. Kozhevnikov, D. S. Kopchuk, H. Bernard, N. Le Bris, R. Tripier, H. Handel, B. Koenig, D. N. Kozhevnikov, Tetrahedron 67 (2011) 597. DOI:10.1016/j.tet.2010.11.058).
Представленные в литературе лиганды, отвечающие всем указанным требованиям, основаны на использовании в качестве хромофора 2,2′:6′,2′′-терпиридинов (Z. Wang, J. Yan, K. Matsumoto, Luminescence 20 (2005) 347. DOI:10.1002/bio.843), а также пиридина, функционализированного по С4 положению (H. Takalo, P. Pasanen, J. Kankare, Acta Chem. Scand. B 42 (1988) 373. DOI:10.3891/acta.chem.scand.42b-0373), либо сопряжённого с пятичленными азотсодержащими гетероциклами (J. Yuan, G. Wang, K. Majima, K. Matsumoto, Anal. Chem. 73 (2001) 1869. DOI:10.1021/ac0013305).
2
3
2
2
Значительно реже встречаются лиганды, основанные на использовании в качестве хромофора 2,2′-бипиридинов. К настоящему моменту в литературе представлены всего два примера подобных лигандов (лиганды  и , Фиг. 2), подходящих для биоконьюгации с белком (A. M. Prokhorov, V. N. Kozhevnikov, D. S. Kopchuk, H. Bernard, N. Le Bris, R. Tripier, H. Handel, B. Koenig, D. N. Kozhevnikov, Tetrahedron 67 (2011) 597. DOI:10.1016/j.tet.2010.11.058). При этом структура лишь одного из них, лиганда ,обеспечивает насыщение координационной сферы европия, что обеспечивается наличием в α-положении к атому азота остатка DTTA. Его европиевый комплекс показал достаточно высокое время жизни возбуждённого состояния (0.60 мс) с невысоким квантовый выходом фотолюминесценции (0.6%). Лиганд  (Фиг. 2), как соединение с наиболее совпадающими признаками был выбран нами в качестве прототипа.
3. Сущность изобретения.
1
4
пара
мета
Сущность изобретения составляет водорастворимый европиевый комплекс  лиганда 2,2′-бипиридинового ряда (Фиг. 1), структура которого обеспечивает насыщение координационной сферы европия и может быть пригодна для биоконьюгации с белком (H. Takalo, V. M. Mukkala, H. Mikola, P. Liitti, I. Hemmila, Bioconjugate Chem. 5 (1994) 278. DOI:10.1021/bc00027a015), отличающийся увеличенным в два раза квантовым выходом, положением аминогруппы в аминофенильном заместителе (- вместо -), положением аминофенильного заместителя (находится не в 5′, а в 4 положении 2,2′-бипиридина), увеличенным временем жизни возбуждённого состояния.
Представляемое изобретение демонстрирует улучшенные фотофизические свойства по сравнению с прототипом, а именно: двукратное увеличение квантового выхода (с 0.6% до 1.2%) при одновременном увеличении времени жизни возбуждённого состояния (с 0.6 мс до 1.06 мс), что делает его более пригодным для практического применения.
4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
4.1. Для подтверждения возможности осуществления изобретения приводится способ получения соединения 1
Графически схема синтеза представлена на Фиг. 3.
Синтез тетраэфира
5.
6
Растворили тетраэфир (255 мг, 0.3 ммоль), синтезированный по описанной методике(A. P. Krinochkin, D. S. Kopchuk, G. A. Kim, I. N. Ganebnykh, I. S. Kovalev, S. Santra, G. V. Zyryanov, A. Majee, V. L. Rusinov, O. N. Chupakhin, ChemistrySelect 4 (2019) 6377)в метаноле (50 мл), каталитический палладий (10%) на углероде (25 мг), восстановили водородом, в течение 8 часов при комнатной температуре. Реакционную массу упарили в вакууме. Полученный остаток очищен колоночной хроматографией, элюент - хлористый метилен, затем – этилацетат. Элюаты, содержащие продукт, были упарены в вакууме.
Тетра-
трет
-бутил 2,2′,2′′,2′′′-(((((4-(4-аминофенил)-[2,2′-бипиридин]-6-ил)ме-тил)азадиил)бис(этан-2,1-диил))бис(азатриил))тетраацетат
5
ЯМР
Н
ESI-MS
1
t
t
3
4
3
4
3
+
3
2
2
2
2
аром
аром
аром
аром
H
H
H
J
J
J
J
J
m/z
(«тетраэфир »). Тёмно-жёлтое масло. Выход 146 мг (0.18 моль, 59%).  (CDCl, δ, м.д.): 1.39 (c, 36H, Bu), 3.31-3.50 (м, 12H, NC,CCOOBu), 3.70-3.83 (м, 4H, NCH), 5.17 (с, 2H, PyC), 6.78 (м, 2H, CH), 7.34 (м, 1H, H-5′(Py)), 7.70 (м, 2H, CH), 7.81 (т, 1H,  7.6 Гц, H-4′(Py)), 7.89 (д, 1H,  1.2 Гц, CH(Py)), 8.58 (д, 1H,  7.2 Гц, H-3′(Py)), 8. 67 (д, 1H,  1.2 Гц, CH(Py)), 8.70 (д, 1H, 4.8 Гц, Н-6′(Py))., : найдено 819.51, вычислено 819.50 (М+Н).
Получение лиганда
4.
5
Тетраэфир (164 мг, 0.2 ммоль) был растворён в смеси 5 мл 11Н соляной кислоты и 5 мл воды и выдержан при комнатной температуре в течение 8 часов. Реакционную массу упарили в вакууме, к остатку добавили 10 мл 11Н соляной кислоты, смесь выдержали при комнатной температуре в течение 2 часов, упарили в вакууме, остаток обработали сухим ацетонитрилом (25 мл), выдержали полученную смесь при комнатной температуре в течение 8 часов. Осадок отфильтровали, высушили в вакууме.
Гидрохлорид (2,2′,2′′,2′′′-(2,2′-((4-(4-Аминофенил)-2,2′-бипиридин-6-ил)метил-азадиил)бис-(этан-2,1-диил))бис(азатриил)тетрауксусной кислоты
4
29
34
6
8
2
(«лиганд »).Выход 134 мг (0.16 ммоль, 78%). Найдено, %: C 40.57, H 5.20, N 9.73, Cl 22.95. Вычислено для CHNO•11/2HCl•7/2HO: C 40.59, H 5.46, N 9.79, Cl 22.72.
Получение европиевого комплекса
1.
4
3
2
Лиганд (43 мг, 0.05 ммоль) растворили в 10 мл воды, к раствору прибавили расчетное количество гидроксида натрия (19 мг, 0.48 ммоль). Затем к раствору добавляют EuCl•6HO (18 мг, 0.05 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток экстрагировали горячим метанолом (3×20 мл), экстракт упарили в вакууме.
1
ESI-MS
29
30
6
8
m/z
--
(«комплекс»). Выход 26 мг (0.030 ммоль, 61%). Найдено, %: С 40.60, Н 4.79, N 9.94. Вычислено для CHEuNNaO•5H2O: С 40.71, Н 4.71, N 9.82. , : найдено 743.13, вычислено 743.12 [M-Na].
Заявленное соединение представляет собой бесцветное порошкообразное вещество, растворимое в метаноле и воде, нерастворимое в хлороформе, 1,2-дихлорэтане и толуоле.
4.2. Подтверждение насыщенности координационной сферы европия.
1
Таблица 1. Координационные свойства европиевого комплекса .
τ<sub>H2O</sub>, мс
τ<sub>D2O</sub>, мс
q
1.06
1.0
-0.29
τ –
q
q
H2O
D2O
время жизни возбуждённого состояния;  – параметр, соответствующий количеству молекул воды в координационной сфере европия,  =1.2*(1/τ – 1/τ – 0.25)
2
2
Для измерения времени жизни европиевой фотолюминесценции использовался спектрофлюориметр Varian Cary Eclipse с ксеноновой импульсной лампой, время вспышки лампы 0,001 мс. Было получено 5 параллелей по 50 измерений, результаты усреднены. Измерения в HO и DO проводились в одинаковых условиях.
4
Как следует из результатов измерения времён жизни возбуждённого состояния европия в воде и тяжёлой воде, приведённых в табл. 1, и соответствующих расчётов, выполненных в соответствие с формулой (A. Beeby, I.M. Clarkson, R.S. Dickins, S. Faulkner, D. Parker, L. Royle, A.S. De Sousa, J.A.G. Williams, M. Woods, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 3 (1999) 493. DOI:10.1039/A808692C) в координационной сфере европия, хелатированного лигандом , отсутствуют молекулы воды (дентатность лиганда равна 9), то есть структура последнего исключает безызлучательную релаксацию энергии возбуждённого состояния европия.
4.3. Измерение относительного квантового выхода.
1
Таблица 2. Фотофизические свойства европиевого комплекса .
Поглощение, λ<sub>max</sub>, нм (ε, 10<sup>-3</sup>М<sup>-1</sup>см<sup>-1</sup>)
Φ<sub><i>EM</i></sub>
245, 314 (8.70)
1.2
Ф
– квантовый выход фотолюминесценции
Электронные спектры поглощения регистрировали с использованием стандартной программы Shimadzu Scan на двулучевом спектрофотометре UV-2600 (“Shimadzu”, Япония) в диапазоне 190 – 700 нм с точностью установки длины волны ± 0,1 нм.
Спектры люминесценции записаны на спектрофлюориметре Varian Cary Eclipse с взаимно перпендикулярными лучами, точность установки длины волны 0.5 нм. Измерения проводились в диапазонах от 190 до 800 нм в кварцевых кюветах SUPRASIL 111-QS 10 (“Hellma”, Германия), ширина зоны вокруг стационарной точки возбуждения/испускания составляет 10 нм. Длина волны стационарной точки возбуждения задавалась каждый раз максимуму в спектрах поглощения и испускания, длина волны стационарной точки испускания – максимуму в спектрах возбуждения. Напряжение на ФЭУ выбиралось исходя из люминесцентного отклика во время тестовой регистрации. В спектрах учитывалась люминесценция растворителей.
3
2
2
2
Относительные квантовые выходы растворов соединений  измерялись при 22+1 °С по методике, доступной на www.jyhoriba.co.uk (Jobin Yvon Ltd. 2 Dalston Gardens, Stanmore, Middlesex HA7 1BQ UK). Образцом сравнения выступал водный раствор рутениевого комплекса [Ru(bpy)]Cl·3HO. Для измерения квантового выхода использовалось не менее 4-х параллелей с усреднением результатов, R ≥0,99. Абсорбция в точке возбуждения не превышала 0,05 Abs для исключения реабсорбции.
Как следует из приведённых данных (Фиг. 4 и Табл. 2), максимум поглощения европиевого комплекса находится в области 314 нм, соединение демонстрирует характерную европиевую фотолюминесценцию с максимумом длины волны испускаемого излучения 613 нм (красный цвет). Квантовый выход европиевой фотолюминесценции составляет 1.2 %.