ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
ANTIVIRAL MEDICATION AND METHOD OF PREVENTION AND TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS

Заявляемое изобретение относится к медицине и фармации, в частности к лечению, предупреждению и профилактике вирусных заболеваний, преимущественно вызванных преимущественно вирусом Хантаан или восточного энцефаломиелита лошадей (далее - ВсЭЛ).
Анализ меняющихся экологических условий циркуляции вируса в природе, эволюция противовирусных препаратов все более убедительно свидетельствуют о том, что одним из основополагающих подходов к проблеме профилактики и лечения вирусных инфекций должен быть анализ вирусной патологии как сложного динамического процесса, требующего постоянной корректировки стратегии и тактики борьбы с вирусными инфекциями.
В силу определенных социально-политических причин возрастает эпидемическая опасность заноса возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций и распространение их на территории нашей страны (см., например, Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Я. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней // Эпидемиол. и инф. болезни. - 2000. - №1. - С.4-8).
Одной из серьезных проблем здравоохранения являются природно-очаговые вирусные инфекции, среди которых лидируют вирусные геморрагические лихорадки (см., например, Chu J.-K., Jennings G.B., Schmaljohn C.S. A vaccinia virus-vectored Hantaan virus vaccine protects hamsters from challenge with Hantaan and Seoul virus but not Puumala virus // J.Virol. - 1995. - Vol.69, №10. - P.6417-6423; Деконенко А.Е., Ткаченко Е.А., Липская Г.Ю. и др. Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимеразной реакции и секвенирования // Вопр. вирусол. - 1996. - №1. - С.24).
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - острая вирусная природно-очаговая инфекция человека, характеризующаяся полиморфизмом клинических проявлений с вовлечением в патологический процесс практически всех органов и систем, тяжелым течением и развитием серьезных осложнений. Заболевание протекает с выраженными инфекционно-токсическими и геморрагическим проявлениями, поражением почек и развитием острой почечной недостаточности. В последнее время ГЛПС приобретает все большее значение в патологии человека и выходит на одно из ведущих мест среди других природно-очаговых инфекций.
ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозных вирусных инфекций и одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека. На территории Российской Федерации расположен один из самых крупных и активных мировых очагов ГЛПС. В РФ эндемичны по ГЛПС 61 из 89 административных территорий. Причем 97% случаев выявлено в Европейской части РФ и 3% - в Азиатской части, главным образом, на Дальнем Востоке (см., например, Ткаченко Е.А., Дроздов С.Г., Федоров Ю.М. Хантавирусы и хантавирусные инфекции // Сб. тез. докл. науч. конф. ИПВЭ «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», г.Москва, 23-25 ноября 1999 г. - М., 1999. - Т.2. - С.88).
Ежегодно в мире регистрируют приблизительно 200 тысяч случаев заболевания ГЛПС, выделено более 500 штаммов хантавирусов - из них на территории бывшего Советского Союза - 120 (см., например, Щербакова С.А., Попов Н.В., Добло А.Д. и др. Некоторые результаты и перспективы изучения циркуляции вируса ГЛПС на территории Саратовской области // Сб. науч. трудов «Проблема особо опасных инфекций». - Саратов, 2000. - Вып.№80. - С.48-52).
Все вышесказанное определяет актуальность изучения новых антивирусных препаратов для профилактики и терапии актуальных вирусных инфекций. Отсутствие эффективных неспецифических противовирусных препаратов в отношении природно-очаговых вирусных инфекций РФ стимулирует активизацию работ по синтезу новых соединений различной химической структуры.
Химиопрепараты имеют гораздо меньше противопоказаний к применению, чем вакцины. Для хранения не требуются передвижные холодильники (рефрижераторы) и нет необходимости проведения биопроб перед непосредственным применением. При этом показано применение неспецифических препаратов для людей с нарушенным иммунитетом. Таким образом, химиопрепараты являются альтернативным средством лечения и профилактики опасных и особо опасных вирусных инфекций, особенно инфекций, в отношении которых не разработаны специфические средства защиты.
Многолетние исследования показали, что лучшие из противовирусных веществ либо селективно ингибируют отдельные этапы вирусной репродукции, либо опосредованно действуют через клетку-хозяина. Весьма перспективной группой противовирусных препаратов являются аномальные нуклеозиды и их производные (см., например, Ершов Ф.И. Лекарства против вирусов // Materia Medica (бюл. Для врачей и фармацевтов). - 1996. - №2(10). - С.5-13).
К настоящему времени тактика изучения эффективности химиопрепаратов для ряда вирусных инфекций описана в литературе (см., например. Вотяков В.И., Боренко Е.И. Подход к оценке активности химических соединений против вирусов, размножающихся в тканевых культурах // Методические вопросы научной разработки противовирусных веществ. - Минск, 1977. - С.10-14; Чижов Н.П. Экспериментальные методы и критерии оценки ингибирующей активности противовирусных веществ. - Минск, 1977. - C.36-41).
Доклиническое изучение препарата складывается из нескольких этапов: изучение эффективности препаратов в культуре клеток и на лабораторной модели, воспроизводящей ведущий синдром заболевания и имеющей сходство клиники, патогенеза инфекции, протекающей у человека.
Отмечается сложность изучения хантавирусных инфекций, так как это сопряжено с поиском экспериментальной формы инфекции у животных. Анализ данных литературы свидетельствует, что эта проблема до настоящего времени не имела положительного решения.
Одним из перспективных противовирусных лекарственных соединений для лечения вируса Хантаан или ВсЭЛ является натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат (далее - Средство).
Из уровня техники известно биологически активное соединение, защищающее от инфекций, вызываемых вирусами лихорадки долины Рифт, а также активного в отношении вируса ЗЭЛ, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, инфекционного ляринготрахеита птиц, всего 10 РНК и ДНК, содержащих вирусов (см. патент на изобретение №2294936 «Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат, обладающая противовирусной активностью», дата подачи 29.06.2005 г., опубликовано 10.03.2007 г.).
К настоящему времени стратегия отбора эффективных неспецифических медицинских средств защиты для ряда вирусных инфекций описана в Руководствах по доклинической оценки лекарственных средств (см. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., Минздрав РФ, 2005).
Техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является расширение ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения, предупреждения и экстренной профилактики вируса Хантаан или ВсЭЛ.
Указанный технический результат достигается тем, что для лечения, предупреждения и экстренной профилактики инфекционных заболеваний и состояний вирусной этиологии, вызываемых вирусами Хантаан или ВсЭЛ, применяют противовирусное лекарственное Средство - натриевую соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат.
При этом заболевание или состояние представляет собой геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (вызываемую вирусом Хантаан) или ВсЭЛ. Лекарственное Средство предназначается для системного введения с использованием дозированного количества, например в количестве 50 мг/кг - для предупреждения заболевания и экстренной профилактики.
Лекарственное Средство, выполненное в виде раствора, таблеток или капсул, предназначено для введения человеку, домашним или сельскохозяйственным животным перорально или в виде инъекций.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «новизна».
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного выполнения.
Исследования для оценки эффективности лекарственного Средства в отношении вирусов Хантаан или ВсЭЛ в сопоставлении с контролем в культуре клеток и на лабораторных животных проводили по следующим направлениям:
- оценка величины максимально переносимой дозы (МПД);
- оценка противовирусной эффективности Средства в отношении возбудителей ГЛПС в монослое культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) по подавлению уровня репродукции вирусов;
- выбор лабораторной модели для изучения эффективности Средства в отношении экспериментальных форм ГЛПС;
- оценка эффективности Средства на лабораторных животных, инфицированных возбудителями ГЛПС и восточного энцефаломиелита лошадей, при использовании схем экстренной профилактики и лечения.
Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами (см. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: «Высшая школа». - 1990).
В работе использовали вирус Хантаан (возбудитель ГЛПС) и вирус восточного энцефаломиелита лошадей.
Для моделирования летальной формы ГЛПС использовали двухнедельных белых мышей-сосунков, для моделирования экспериментальной форм ВсЭЛ - белых мышей массой 8-10 г.
Наблюдение за инфицированными животными проводили в течение 21 суток, при этом контролировали гибель животных дважды в течение дня.
Токсичность Средства оценивали на неинфицированных двух- и четырехнедельных мышах.
Основным критерием оценки эффективности являлся показатель защиты животных от гибели (процент) при проведении испытаний in vivo и подавление репродукции вируса при проведении испытаний in vitro. В качестве дополнительных критериев служили: среднее время жизни (дни) и уровень подавления репродукции вируса в тканях головного мозга (Δ, lg).
Пример 1.
Оценку эффективности Средства в отношении вируса Хантаан проводили в культуре клеток СПЭВ по подавлению репродукции исследуемых возбудителей в присутствии химиопрепаратов. Уровень накопления вируса в культуре клеток оценивали титрованием методом формирования негативных колоний.
Двухсуточный монослой культуры клеток СПЭВ заражали вирусом в дозе 0,02 БОЕ/кл при температуре (37±0,5)°С. Для вируса Хантаан время адсорбции составляло 90 мин. После адсорбции монослой клеток отмывали 3 объемами среды поддержания, в пробирки вносили свежую среду с различными концентрациями Средства (от 1 до 100 мкг/мл). На каждую дозу Средства использовали 4 пробирки с монослоем клеток. Инкубацию проводили при (37±0,5)°С для вируса Хантаан в течение 7 суток. По окончании срока инкубации проводили криодеструкцию клеток и определяли уровень накопления вируса по формированию негативных колоний в культуре клеток GMK-АН-1(Д) для вируса Хантаан. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1
Оценка противовирусной эффективности Средства in vitro в отношении вируса Хантаан (возбудителя ГЛПС)
Концентрация препарата, мкг/мл
Средство
титр вируса, lgБOE/мл
снижение титра, Δ, lg
100
3,0
2,0
50
3,5
1,5
20
3,8
1,2
10
3,8
1,2
5
3,9
1,1
1
4,8
0,2
Контроль (без препарата)
5,0
-
Из данных, представленных в таблице 1, видно, что только Средство в достаточно большой концентрации значимо подавляет репродукцию вируса Хантаан (наблюдали 100-кратное снижение репродукции вируса).
Пример 2. Изучение ингибирующего действия Средства на возбудитель ГЛПС проводили на белых мышах-сосунках 12-суточного возраста, инфицированных подкожно вирусом Хантаан, в дозе 6 lgБOE.
Эффективность Средства оценивали по клиническим проявлениям и гибели животных, титр вируса определяли по методу И.П.Ашмарина и соавт. (см. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбролов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. - Л., 1975. - 103 с.).
С учетом величины острой токсической дозы была выбрана рабочая доза Средства - 50 мг/кг массы животного.
Оценку эффективности Средства проводили по следующим схемам:
1. Схема экстренной профилактики - животным вводили вируссодержащую суспензию в объеме 0,1 мл подкожно. Средство вводили через 2 ч после инфицирования перорально и далее раз в сутки в течение 5 дней в рабочей дозе.
2. Схема лечения - животным вводили вируссодержащую суспензию в объеме 0,1 мл подкожно, через 24 ч после инфицирования вводили Средство перорально и далее раз в сутки в течение 4 дней в испытуемой дозе.
Результаты оценки противовирусной эффективности Средства при пероральном введении беспородным белым мышам-сосункам, инфицированным подкожно вирусом Хантаан, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Противовирусная эффективность Средства в отношении экспериментальной формы хантавирусной инфекции
Препарат
Схема введения препарата
Количество погибших мышей
Среднее время жизни, сутки
Защита от гибели, процент
Снижение уровня накопления вируса в мозгу, Δ, lg
Средство
+2, +24, 48, 72, 96, 120
18/22
11,7
16,7
5,0 1,8
Контроль (без препарата)
-
32/32
8,5
-
6,8 -
Контроль стада
-
0/20
21,0
-
-
Следует отметить, что в опытной группе наблюдали значительное удлинение срока жизни.
Из данных, представленных в таблице 2, видно, что применение Средства в целях экстренной профилактики более эффективно подавляет размножение вируса в тканях головного мозга. Для Средства кратность подавления составила почти 100.
Таким образом, удлинение срока жизни животных в опытной группе и снижение уровня накопления вируса в головном мозгу свидетельствуют о положительном влиянии исследуемого Средства на динамику инфекционного процесса при использовании препаратов для экстренной профилактики экспериментальной хантавирусной инфекции.
Пример 3.
50
Для изучения противовирусного действия Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей (доза инфицирования 10 ЛД) использовали схему введения 1 и 2.
Схема 1. Средство вводили мышам перорально в дозе 50 мг/кг через 2 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 5 дней один раз в сутки.
Схема 2. Средство вводили мышам перорально в дозе 50 мг/кг через 24 ч после инфицирования и далее ежедневно в течение 4 дней один раз в сутки.
В таблице 3 представлены данные изучения эффективности Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при парентеральном инфицировании.
Защитная эффективность Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при введении его животным по схеме экстренной профилактики составила 50,0%; удлинение среднего времени жизни в группе животных составило 7,2 дня.
Таблица 3
Оценка противовирусной активности Средства в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ
Препарат
Схема
Количество животных в опыте, шт
Количество павших животных, шт
Защита от гибели, процент
Средняя продолжительность жизни, день
Подавление репродукции вируса в головном мозгу, Δ, lg
Средство
№1
30
8
73,3
16,9
7,1
1,3
№2
30
9
70,0
15,7
7,2
1,2
Контроль дозы
36
36
-
3,9
8,3
-
Контроль стада
30
0
-
-
-
Контроль плацебо
30
0
-
-
-
Средство проявило высокую защитную эффективность в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ у белых мышей при введении его животным по схеме экстренной профилактики, защита от гибели составила 73,3%; удлинение среднего времени жизни в группе животных составило 13,0 дней.
В группе леченых животных значительно увеличился показатель среднего времени жизни. Средство проявило высокую защитную эффективность (73,3%) в отношении экспериментальной формы ВсЭЛ.
Таким образом, лекарственное Средство - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2-4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она дигидрат в ходе исследования умеренно эффективно в отношении вируса Хантаан в дозе 50 мг/кг. При применении Средства по схемам экстренной профилактики и лечения обладает высокой защитной эффективностью против возбудителей ВсЭЛ при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.
Заявляемое изобретение способствует расширению ассортимента лекарственных средств, обладающих широким спектром действия и предназначенных для лечения, предупреждения и экстренной профилактики вирусных инфекций, в частности, вызванных вирусом Хантаан или восточного энцефаломиелита лошадей (далее - ВсЭЛ).