о
Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80С с раствором Гемжел
METHOD FOR UNREGULATED FREEZING OF PERIPHERAL BLOOD PRECURSOR CELLS AT TEMPERATURE OF MINUS 80 °C WITH GEMGEL SOLUTION

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии низкотемпературного (минус 80°С) замораживания клеток-предшественников периферической крови с комбинированным криоконсервантом Гемжел(Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - с. 55-56.) на основе глицерина и поливинилпирролидона для замораживания гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения различного происхождения.
Криоконсервант Гемжел включает следующие компоненты:
Высокоочищенный глицерин с м.м. 92.1-66 мл
Поливинилпирролидон с м.м. 12600±2700 - 70 г
Раствор желатина медицинского 10% для инъекций со средне молекулярной массой в границах 110000-450000 - 200 мл
Натрий цитрат трехзамещенный - 10 г
Динатриевая соль ЭДТА - 1 г
рН раствора до 7,0-7,4
Гемодез с м.м. 8000±2000 - до 1000 мл.
А
А
А
А
А
Предлагаемый способ замораживания клеток-предшественников периферической крови (КППК) включает заготовку клеточной взвеси из КППК с стволовыми клетками, смешивание криконсерванта Гемжел с клеточной взвесью в соотношении 1:1 в пластикатном криоконтейнере (ПК), его герметизацию, эквилибрацию клеточной взвеси с криоконсервантом при комнатной температуре в течение 30 мин, маркировку, размещение ПК в металлическом пенале-холдере, поэтапное охлаждение клеточной взвеси с криоконсервантом в электроморозильниках с регулируемой установкой температуры (Т) по многоступенчатой программе, причем на первом этапе ПК размещают на 10 мин в электрический холодильник с Т плюс 4±1°С, на втором этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 9±1°С, на третьем этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 22±1°С, на четвертом - на 25 мин в морозильную камеру с Т минус 28±1°С, после чего ПК помещают в хранилище - холодильник с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания. ПК с КППК размораживают энергичным покачиванием в водяной бане емкостью 20 л с температурой плюс 43°С до температуры плюс 2÷ плюс 4°С в клеточной взвеси. Предлагаемый способ обеспечивает сохранение жизнеспособными до 70% ядерных клеток и до 78% клеток-предшественников грануломоноцитопоэза.
Присутствие в растворе Гемжел двух разных по механизму действия на ГСК и организм человека криопротекторов в низких концентрациях минимизирует токсичность криоконсерванта Гемжел, не требует его отмывания перед переливанием тому же больному, у которого была произведена заготовка костномозговой взвеси, и способствует сохранению необходимого для лечебных целей количества клеток-предшественников периферической крови.
Способ замораживания КППК с раствором Гемжел относится к медицине, в частности трансфузиологии и применяется в лечении больных с депрессий кроветворения полихимио- или лучевой терапии.
В Российской Федерации и за рубежом все активнее разрабатываются новые и совершенствуются известные технологии замораживания и длительного хранения клеток-предшественников периферической крови с ГСК при отрицательных температурах для клинических целей. Достигнуты значительные успехи в лечении гипо- и апластических расстройств в системе кроветворения у людей с использованием замороженных КППК. Несмотря на то, что со времени исторического обнаружения криозащитных свойств у многоатомного спирта глицерина прошло свыше ста лет, до сих пор криобиологическим сообществом не снят вопрос о поиске и разработке высокоэффективного криоконсерванта и способа замораживания КППК на его основе.
Аналог: «Комбинированный эндоцеллюлярно-экзоцеллюлярный криоконсервант «Гемжел» на основе глицерина и поливинилпирролидона для замораживания ГСК костного мозга при -196°С» см. Сведенцов Е.П. Криоконсерванты для живых клеток. - Сыктывкар, 2010. - с. 55-56 (Коми научный центр УрО РАН).
В основе способа замораживания КППК лежит охлаждение смеси свежезаготовленной костномозговой взвеси с криоконсервантом Гемжел в жидкоазотном программном замораживателе клеточных суспензий типа УОП 7000000 по двухступенчатой программе: на первом этапе - со скоростью 1°С/мин до минус 9°С, на втором - 10°С/мин до минус 185°С, после чего контейнер с замороженными ядерными клетками перекладывают в хранилище с жидким азотом (минус 196°С) для окончательного замораживания. Способ обеспечивает сохранность жизнеспособными 71,4% ядерных клеток и 78,3% аутологичных гемопоэтических стволовых клеток.
Недостатки способа:
- потребность в дефицитном и токсичном хладоагенте - жидком азоте;
- способ требует использования сложной в обращении электронной автоматики, например, для заправки биохранилищ жидким азотом, программного замораживателя клеточных суспензий УОП 7000000;
- негативное влияние человеческого фактора;
- риски инфекционных заболеваний.
В качестве прототипа заявляемого изобретения взято техническое решение, указанное в Методических рекомендациях 2000,224, утвержденных МЗ РФ 23.03.20001. Киров, 2000 г., с. 1-18 с.
В основе метода консервирования костного мозга, изложенного в Методических рекомендациях, лежит замораживание свежезаготовленной костномозговой взвеси с криоконсервантом Гемжел в два этапа: на первом этапе криоконтейнер со взвесью ГСК погружают на 15-25 мин в резервуар с 96° этиловым спиртом, предварительно охлажденным до минус 26÷ минус 30°С. Замороженные таким образом ГСК на втором этапе переносят в хранилище-морозильник с температурой минус 40 ÷ минус 50°С для окончательного замораживания. Размораживание ГСК производят в водяной бане емкостью 20 л с температурой плюс 43°С путем энергичного покачивания в течение 65-75 с, обеспечивающим сохранность 70,3±3,5% ядерных клеток и 70,7±37% аутологичных ГСК.
Главный недостаток прототипа - использование в качестве клеточного хладоагента высокотоксичного 96° этилового спирта, а также обеспечение сохранности недостаточного для трансплантации количества консервированных КППК с ГСК.
Перед авторами была поставлена задача: во-первых, повысить эффективность технологии замораживания КППК за счет повышения устойчивости к факторам криоповреждения на этапах замораживания клеточной взвеси с криоконсервантом Гемжел, во-вторых, одновременно повысить безопасность медико-технической процедуры за счет исключения из методики замораживания КППК высокотоксичных для обслуживающего персонала жидкого азота и этилового спирта.
Цель изобретения - повышение сохранности и выхода жизнеспособных деконсервированных КППК безопасным способом.
А
А
А
А
А
Поставленная цель достигается за счет заготовки костномозговой взвеси из КППК с стволовыми клетками, смешивания криконсерванта Гемжел с клеточной взвесью в соотношении 1:1 в пластикатном криоконтейнере (ПК), его герметизации, эквилибрации клеточной взвеси с криоконсервантом при комнатной температуре в течение 30 мин, маркировки, размещения ПК в металлическом пенале-холдере, поэтапного охлаждения клеточной взвеси с криоконсервантом в электроморозильниках с регулируемой установкой температуры (Т) по многоступенчатой программе, причем на первом этапе ПК размещают на 10 мин в электрический холодильник с Т плюс 4±1°С, на втором этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 9±1°С, на третьем этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 22±1°С, на четвертом этапе - на 25 мин в морозильную камеру с Т минус 28±1°С, после чего ПК помещают в хранилище - холодильник с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания. ПК с КППК размораживают энергичным покачиванием в водяной бане емкостью 20 л с температурой плюс 43°С до температуры плюс 2÷ плюс 4°С в клеточной взвеси. После отогревания в водяной бане количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 92,20±6,81%, жизнеспособных (устойчивых к витальному красителю) - 77,27±5,90% клеток; ГСК - 82,2%; CD34+ стволовых клеток - 64,90±17,30%.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
А
Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - заготовка костномозговой взвеси у больных с сохраненным костномозговым кроветворением; Б - смешивание криконсерванта Гемжел со свежезаготовленной костномозговой взвесью в соотношении 1:1 в ПК; В - герметизация ПК; Г - эквилибрация клеточной взвеси с криоконсервантом при комнатной температуре в течение 30 мин; Д - маркировка, размещение ПК в металлическом пенале-холдере; Е - поэтапное охлаждение КППК в электроморозильниках с заданной температурой (Т) клеток до минус 80±2°С; Ж - размораживание клеток путем энергичного покачивания в водяной бане емкостью 20 л с температурой плюс 43°С до температуры плюс 2÷ плюс 4°С в клеточной взвеси.
А
А
А
А
А
Существенными отличительными признаками заявляемого способа замораживания КППК с криоконсервантом Гемжел до минус 80°С являются: З - в известном способе в качестве жидкого хладоагента при замораживании клеток использовали 96° этиловый спирт, предварительно охлажденный до Т (по тексту); И - используется 4 этапный режим: на первом этапе пластикатный криоконтейнер, размещенный со взвесью клеток в пенале-холдере, помещают на 10 мин в электрический холодильник с Т плюс 4±1°С, на втором этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 9±1°С, на третьем этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 22±1°С, на четвертом - на 25 мин в морозильную камеру с Т минус 28±1°С, после чего ПК помещают в хранилище - холодильник с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и последующего изъятия из хранилища-холодильника для размораживания по требованию клиники (максимальный срок наблюдения 7 месяцев).
Способ замораживания КППК) с криоконсервантом Гемжел заключается в следующем (пример выполнения):
- производят заготовку костномозговой взвеси с гемопоэтическими стволовыми клетками у больных с сохраненным костномозговым кроветворением методами центрифугирования, седиментации эритроцитов с применением желатина или сепарации на аппаратах Amicus или Spectra в объеме от 40,0 до 80,0 (в среднем 60,0) мл в стандартный пластикатный криоконтейнер («Гемакон» 500, «Гемакон» 500/300, «Компопласт» и т.п.);
- производят подготовку свежезаготовленной костномозговой взвеси к замораживанию. Для этого к клеточной взвеси в пластикатном криоконтейнере закрытым способом капельно приливают криоконсервант Гемжел в соотношении 1:1 при непрерывном ручном помешивании смеси, криоконтейнер с клеточной взвесью герметизируют, затем клеточную взвесь с криоконсервантом подвергают эквилибрации при температуре окружающей среды в течение 30 мин, далее криоконтейнер с клеточной взвесью маркируют и размещают в металлическом пенале-холдере.
A
- производят настройку Т в электроморозильниках согласно выбранной программы ступенчатого замораживания клеток: например, модель Sanyo MDF-U5411 - на минус 9±1°С, Sanyo MDF-U333 - на минус 22±1°С, Sanyo MDF-U333 - на минус 28±1°С, Sanyo MDF-U53 - на минус 80±2°С.
A
A
A
A
- производят 4 этапное замораживание костномозговой взвеси: на первом этапе пластикатный криоконтейнер, размещенный со взвесью клеток в пенале-холдере, помещают на 10 мин в электрический холодильник с Т плюс 4±1°С, на втором этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 9±1°С, на третьем этапе - на 10 мин в морозильную камеру с Т минус 22±1°С, на четвертом - на 25 мин в морозильную камеру с Т минус 28±1°С, после чего криоконтейнер в пенеле-хлдере переносят в хранилище-холодильник модели Sanyo MDF-U53 с температурой минус 80±2°С для окончательного замораживания и последующего изъятия по требованию клиники. Процесс замораживания продолжается 75 минут. Криоконсервированные с раствором Гемжел костномозговые клетки сохраняют биологическую полноценность в течение 7 лет (срок наблюдения).
- производят размораживание криоконсервированных клеток-предшественников периферической крови. Для этого пластикатный криоконтейнер со взвесью клеток в пенале-холдере в перчатках извлекают из морозильной камеры хранилища-холодильника, затем помещают в водяную баню емкостью 20 л с температурой плюс 43°С и подвергают энергичным покачиваниям до регистрации температуры плюс 2÷ плюс 4°С в клеточной взвеси.
Сравнительный анализ результатов замораживания клеток-предшественников периферической крови известным и заявляемым способами представлен в табл. 1.
Использование технического решения по заявляемому способу замораживания клеток - предшественников периферической крови по сравнению с прототипом позволяет снизить риски для здоровья персонала и повысить процент пригодных для аутологичной трансплантации ГСК.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну заявляемого способа замораживания клеток - предшественников периферической крови.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную преемственность.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории клеточных технологий ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».