ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ КОСТНЫХ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ
THERAPEUTIC APPLICATION OF BONE MORPHOGENETIC PROTEINS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В настоящем изобретении предложен полипептид, выбранный из костного морфогенетического белка 10 (BMP10) или варианта костного морфогенетического белка 9 (ВМР9), у которого отсутствует остеогенная активность, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания. В настоящем изобретении также предложены новые варианты ВМР9 и фармацевтические композиции, содержащим указанные полипептиды.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Заболевание сосудов представляет собой патологическое состояние артерий мышечного типа крупного и среднего размера, вызванное дисфункцией клеток эндотелия. Вследствие воздействия таких факторов, как патогены, окисленные частицы ЛПНП и другие воспалительные стимулы происходит активация клеток эндотелия. Это приводит к изменению характеристик указанных клеток: клетки эндотелия начинают выделять цитокины и хемокины и экспрессировать молекулы адгезии на своей поверхности. В свою очередь это приводит к привлечению лейкоцитов (моноцитов и лимфоцитов), которые могут проникать в стенки кровеносных сосудов. Стимуляция слоя гладкомышечных клеток цитокинами, которые продуцируются эндотелиальными клетками и рекрутированными лейкоцитами, вызывает пролиферацию гладкомышечных клеток и миграцию в направлении просвета кровеносного сосуда. Данный процесс вызывает утолщение стенки сосуда, образуя бляшку, состоящую из пролиферирующих гладкомышечных клеток, макрофагов и различных типов лимфоцитов. Данная бляшка вызывает нарушение кровообращения, приводящее к пониженному количеству кислорода и питательных веществ, которые достигают целевого органа. На заключительных стадиях указанная бляшка может разрушаться, вызывая образование сгустков, и как результат, инсультов.
Заболевание органов дыхания - это медицинский термин, который охватывает патологические состояния, воздействующие на органы и ткани, благодаря которым у высших организмов возможен газообмен, и включает состояния верхних дыхательных путей, трахеи, бронхов, бронхиол, альвеол, плевры и плевральной полости, а также нервов и мышц, участвующих в дыхании. Заболевания органов дыхания варьируют от легких и локальных заболеваний, таких как обычная простуда, до угрожающих жизни заболеваний наподобие бактериальной пневмонии, легочной эмболии и рака легких.
Легочная артериальная гипертензия (ЛАГ, pulmonary arterial hypertension) представляет собой редкое заболевание сосудов, лечения для которого в настоящее время не существует. Наследственная и идиопатическая легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) характеризуются сужением и облитерацией прекапиллярных легочных артерий, на фоне пролиферации и устойчивости к апоптозу гладкомышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток (Morrell и др. (2009) J. Am. Coll. Cardiol. 54, S20-31). Возникающее в результате увеличение сопротивления в сосудах легких вызывает сильное повышение давления в легочной артерии, приводящее к гипертрофии правого желудочка и, в конечном итоге, смерти по причине правожелудочковой недостаточности (Gaine и Rubin (1998) Lancet 352, 719-725).
Идентификация гетерозиготных герминативных мутаций в гене, кодирующем рецептор костного морфогенетического белка II типа (BMPR-II) в 2000 году (Lane и др. Nat. Genet. 26, 81-84 (2000); Deng и др. (2000) Am. J. Hum. Genet. 67, 737-744), обеспечила основное понимание патобиологии наследственной ЛАГ. В результате последующих исследований были также идентифицированы мутации BMPR-II в 15-40% случаев идиопатической ЛАГ (Thomson и др. (2000) J. Med. Genet. 37, 741-745), также установлено, что негенетические формы ЛАГ характеризуются пониженной экспрессией BMPR-II в организме человека (Atkinson и др. (2002) Circulation 105, 1672-1678) и на моделях у животных (Long и др. (2009) Circulation 119, 566-576).
По результатам генетических данных эндотелиальные клетки явным образом также рассматриваются в качестве основного типа инициирующих клеток при ЛАГ. Предыдущие исследования показали, что делеции BMPR-II при определенных условиях в эндотелии достаточно для того, чтобы индуцировать ЛАГ у части мышей (Hong и др. (2008) Circulation 118, 722-730), и что восстановление передачи сигнала BMPR-II в эндотелии на моделях у грызунов предотвращает или инвертирует течение экспериментальной легочной гипертензии (Reynolds и др. (2012) Eur. J. Respir. 39, 329-343; Reynolds и др. (2007) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 292, L1182-1192; Spiekerkoetter и др. (2013) J. Clin. Invest. 123, 3600-3613). Совсем недавно было показано, что селективное улучшение эндотелиального BMPR-II при помощи ВМР9 инвертирует течение легочной артериальной гипертензии (Long и др. (2015) Nature Medicine 21, 777-785). Кроме того, в настоящее время сообщают о мутациях в рецепторе I типа, ALK-1 (Trembath и др. (2001) N. Engl. J. Med. 345, 325-334), и вспомогательном белке рецептора III типа, эндоглине (Harrison и др. (2003) J. Med. Genet. 40, 865-871), у пациентов с ЛАГ, оба из которых почти исключительно экспрессируются в эндотелии. Несмотря на эти данные, конкретный характер эндотелиальной дисфункции при патобиологии ЛАГ и участие передачи сигнала BMP в данном процессе остаются предметами спора. Хотя устойчивая ЛАГ характеризуется чрезмерной клональной пролиферацией эндотелиальных клеток легких (Yeager и др. (2001) Circ. Res. 88, Е2-Е11) как элементом обструктивных клеточных повреждений, инициирование патологии заболевания как в организме человека (Teichert-Kuliszewska и др. (2006) Circ. Res. 98,209-217), так и на моделях заболевания у животных (Wilson и др. (1992) Crit. Rev. Toxicol. 22, 307-325; Taraseviciene-Stewart и др. (2001) Faseb. J. 15, 427-438) связывают с парадоксальным увеличением степени апоптоза эндотелиальных клеток. В результате дополнительных исследований была идентифицирована роль потери эндотелиального BMPR-II при обострении проницаемости сосудов и измененной транслокации лейкоцитов через стенку сосудов (Burton и др. (2011) Blood 117, 333-341; Burton и др. (2011) Blood 118, 4750-4758; Kim и др. (2013) Arterioscler Thromb. Vase. Biol. 33, 1350-1359).
in vitro
in vivo
В то время как исследования  с применением гладкомышечных клеток легочной артерии (PASMC) показали, что увеличение концентрации лиганда BMP может устранить потерю функции, связанную с мутациями в сигнальном пути BMP (Yang и др. (2008) Circ. Res. 102, 1212-1221), до настоящего времени ни в одном из исследований  не удалось терапевтически доставить лиганд BMP таким образом, чтобы обеспечить доказательство правильности концепции такого подхода для лечения ЛАГ. Сложность сигнального семейства BMP, которое состоит из четырех рецепторов II типа, пяти рецепторов I типа и более двадцати лигандов BMP (Miyazono и др. (2005) Cytokine Growth Factor Rev. 16, 251-263), может объяснять отсутствие таких исследований. Идентификация соответствующего лиганда для селективного нацеливания на эндотелий легких представляет собой сложную задачу. В последнее время было обнаружено, что BMPR-II образует сигнальный комплекс с ALK-1 и специфично передает сигнал в ответ на ВМР9 и 10 в клетках эндотелия микрососудов (David и др. (2007) Blood 109, 1953-1961).
de novo
В публикации WO 2005/113590 описано применение антагонистов BMP10 для лечения заболеваний сердца. В публикации WO 2013/152213 описано применение полипептидов ВМР9 и/или BMP10 для увеличения уровней эритроцитов и/или гемоглобина у позвоночных. В публикации WO 2006/130022 описан агонист или антагонист BMPR-II, который является подходящим при модуляции фолликулогенеза и скорости овуляции у самок млекопитающих. В публикации WO 2010/114833 описаны фармацевтические композиции для лечения заболеваний сердца, которые содержат костный морфогенетический белок. В публикации WO 94/26893 описаны белки BMP-10, способы их получения и применения для лечения дефектов кости и хряща и для заживления ран и восстановления смежных тканей. В публикациях WO 95/24474 и WO 96/39431 описан полипептид BMP10 человека и ДНК (РНК), кодирующая такой полипептид, которые заявляются как подходящие для индуцирования образования костной ткани . В публикациях WO 93/00432 и WO 95/33830 описаны белки ВМР9, способы их получения и применения для лечения дефектов кости и хряща, заживления ран и восстановления смежных тканей и для роста и функционирования печени. В публикации WO 2010/115874 описываются способы лечения легочной артериальной гипертензии путем введения нацеливающихся на апелин/APJ лекарственных средств. В публикациях WO 2009/114180 и WO 2014/160203 описаны низкомолекулярные ингибиторы передачи сигнала через BMP, которые заявляются как подходящие для модуляции роста клеток, их дифференциации, пролиферации и апоптоза, и, таким образом, они могут быть подходящими для лечения заболеваний или состояний, связанных с передачей сигнала через BMP, включая воспаление, сердечно-сосудистые заболевания, гематологические заболевания, рак и расстройства кости, а также для модуляции клеточной дифференцировки и/или пролиферации. Указанные заявленные низкомолекулярные ингибиторы также являются подходящими для снижения уровней АроВ-100 или липопротеина низкой плотности в циркуляции и для лечения или предотвращения приобретенной или врожденной гиперхолестеринемии или гиперлипопротеинемии; заболеваний, расстройств или синдромов, связанных с дефектами всасывания или обмена липидов; или заболеваний, расстройств или синдромов, вызванные гиперлипидемией.
Таким образом, существует необходимость в обеспечении эффективного лечения заболеваний сосудов и заболеваний органов дыхания, в частности, легочной артериальной гипертензии (ЛАГ).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен полипептид, выбранный из костного морфогенетического белка 10 (BMP10) или варианта костного морфогенетического белка 9 (ВМР9), у которого отсутствует остеогенная активность, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полипептида, выбранного из костного морфогенетического белка 10 (BMP10) или варианта костного морфогенетического белка 9 (ВМР9), у которого отсутствует остеогенная активность.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая BMP10 или вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен вариант ВМР9, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №5.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен вариант ВМР9, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №6.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанные варианты ВМР9, описанные в настоящем описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1.
Вектор и система экспрессии для про.ВМР9 и про.ВМР10.
Фигура 2.
Образование неостеогенных вариантов ВМР9. А. Схематическое изображение синтеза ВМР9 и посттрансляционного процессинга. B-D. Два варианта ВМР9 (D366A и D408A) обладают сигнальной активностью, сопоставимой с активностью дикого типа в эндотелиальных клетках при индуцировании экспрессии ID1 и ID2 (В и С), однако в С2С12 клетках у них отсутствует остеогенная сигнальная активность (D).
Фигура 3.
3
3
Сравнение сигнальной активности эндотелиальных клеток и остеогенной активности С2С12 клеток между ВМР9 и ВМР10. А-С: ВМР9 и ВМР10 обладают схожей с НМЕС-1 сигнальной активностью. После сывороточного голодания клетки НМЕС-1 обрабатывали ВМР9 или BMP10 в указанных концентрациях. Через 8 часов после обработки экстрагировали мРНК, и уровни экспрессии ID1, ID2 или BMPR-II измеряли при помощи количественной ПЦР. В качестве контроля применяли β2-микроглобулин и на графике отмечали кратные изменения по сравнению с необработанными образцами. Представлено среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM), N=2; D. Подобно ВМР9, BMP10 может также защищать hPAEC от апоптоза, индуцированного ФНО-α/циклогексимидом (ЦГМ). Способы представлены на Фигуре 3А, N=1; Е: ВМР9 и BMP10 ингибируют пролиферацию эндотелиальных клеток в равных пределах. hPAEC обрабатывали ВМР9 или BMP10 (оба от R&D Systems) в ЕВМ2/2% фетальной бычьей сыворотке в течение 24 часов. Клетки инкубировали с 0,5 мкКи на лунку Н-тимидином в течение заключительных 6 часов. Далее клетки лизировали, и поглощение Н-тимидина измеряли при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. Число экспериментов N=1, среднее значение ± SEM по 4-м лункам. F: В отличие от ВМР9 ВМР10 не обладает определяемой остеогенной активностью, измеренной как активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в С2С12 клетках. С2С12 клетки обрабатывали ВМР9 или BMP10 при указанных концентрациях в течение 64 часов. Клетки лизировали в 1% Тритон Х-100/ФСБ, и активность ЩФ в клеточном лизате измеряли, применяя хромогенный субстрат фосфатазы двунатриевую соль 4-нитрофенилфосфата (Sigma, S0942), и указанный растворимый продукт измеряли при 405 нм на планшете-ридере. Во всех анализах как ВМР9, так и ВМР10 приобретали у R&D Systems. Про.ВМР9 получали своими силами и его концентрацию (зрелый лиганд) определяли при помощи ИФА, применяя ВМР9, полученный от R&D Systems в качестве стандарта.
Фигура 4.
Полученный своими силами про.ВМР10 является полностью активным. А. Схематическое изображение синтеза BMP10 и посттрансляционного процессинга. В. Кондиционированная среда для экспрессии BMP10, меченная антителом по отношению к BMP10 (R&D Systems). С. Невосстанавливающий ДСН-ПААГ-электрофорез, показывающий очистку про.ВМР10 на гель-фильтрационной колонке S200. Идентичность продомена и BMP10 подтверждали при помощи вестерн-блоттинга и масс-спектрометрических пептидных карт. D и Е. Сравнение сигнальной емкости про.ВМР10 с ВМР9 и BMP10 (полученных от R&D Systems) в НМЕС-1 путем отслеживания фосфорилирования Smad1/5/8 и экспрессии генов ID1/2/3. Способы представлены на Фигурах 3А-С. Концентрации BMP на Фигуре 3D составляют 0,05, 0,1, 1,5 нг/мл и время обработки составляет 1 час. Представлено среднее значение ± SEM, N=2.
Фигура 5.
Итоги аланин-сканирующего мутагенеза ВМР9. Двадцать четыре варианта ВМР9 получили и исследовали как в НМЕС-1 клетках на индукцию гена ID1, так и в С2С12 клетках на активность щелочной фосфатазы. Нормализацию всех результатов проводили по ВМР9 дикого типа (WT), и представлено среднее значение трех экспериментов. '-' обозначает необработанные клетки.
Фигура 6.
Варианты BMP могут индуцировать экспрессию гена BMPR2 в hPAEC.
Фигура 7.
Вариант BMP D408A может предотвратить ранний апоптоз hPAEC, индуцированный ФНО-α/ЦГМ.
Фигура 8.
ВМР9 и BMP10 ингибируют образование трубки разрастающихся эндотелиальных клеток крови (ВОЕС) в матрице коллаген:фибронектин. (А) Примеры изображений ВОЕС трубок в гелях с содержанием коллагена, окрашенных при помощи 4',6-диамидин-2-фенилиндола (DAPI) и FITC-ULEX. Сети формируются при нахождении только в среде (2% ВВМ2 = ЕВМ2, содержащая 2% ФСБ). Добавление возрастающих концентраций ВМР9 ингибирует образование сетей ВОЕС.(В) Количественное определение параметров сети ВОЕС, определенных для 3 независимых экспериментов, показывает, что ВМР9 ингибирует длину и число трубок, образование ответвлений и петель в зависимости от концентрации. (С) ВМР9 и BMP10, у которых оба лиганда ингибируют образование трубки ВОЕС.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен полипептид, выбранный из костного морфогенетического белка 10 (BMP10) или варианта костного морфогенетического белка 9 (ВМР9), у которого отсутствует остеогенная активность, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания дыхательных органов.
Настоящее изобретение направлено на терапевтическое применение костных морфогенетических белков, которые поддерживают сигнальную активность эндотелиальных клеток (например, которую можно засвидетельствовать при помощи индукции экспрессии генов ID1, ID2 и/или BMPR-II), однако у которых отсутствует остеогенная активность (например, которую можно измерить при помощи активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в клеточной линии миобластов мыши С2С12). К примеру, BMP10 и варианты ВМР9, раскрытые в настоящем описании, не только поддерживают сигнальную активность эндотелиальных клеток, но и синергетически лишены остеогенной активности. Таким образом, нативный BMP10 и варианты ВМР9, раскрытые в настоящем описании, представляют собой более предпочтительные агонисты, нежели чем нативный ВМР9, для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания, в частности ЛАГ, в силу отсутствия способности к стимулированию образования костной ткани.
BMP10
Приведенные в настоящем описании упоминания «ВМР10» и «костный морфогенетический белок 10» относятся к полипептиду человека, принадлежащему к суперсемейству белков TGF-β, который кодируется геном  (содержащим последовательность, представленную в SEQ ID №1) и который содержит последовательность из 424 аминокислот, представленную в SEQ ID №2, в которой аминокислотные остатки с 1 по 21 содержат сигнальный пептид, аминокислотные остатки с 22 по 316 содержат пропептид, и аминокислотные остатки с 317 по 424 содержат зрелый BMP10.
ВМР9
Приведенные в настоящем описании упоминания «вариант ВМР9» и «вариант костного морфогенетического белка 9» относятся к полипептиду человека, принадлежащему к суперсемейству белков TGF-β, который кодируется геном  (содержащим последовательность, представленную в SEQ ID №3) и который содержит вариант последовательности из 429 аминокислот, представленной в SEQ ID №4, в которой аминокислотные остатки с 1 по 22 содержат сигнальный пептид, аминокислотные остатки с 23 по 319 содержат пропептид, и аминокислотные остатки с 320 по 429 содержат зрелый BMP19. Во избежание недоразумений следует подчеркнуть, что такой вариант ВМР9 должен поддерживать сигнальную активность эндотелиальных клеток, однако у него отсутствует остеогенная активность.
Упоминания термина «вариант» включают генетические вариации в нативной не мутантной последовательности ВМР9 или ее дикого типа. Примеры таких генетических вариаций включают мутации, выбранные из: замен, делеций, вставок и им подобных.
В контексте настоящего описания упоминания «отсутствие остеогенной активности» или «остеогенная активность отсутствует» относятся к варианту ВМР9, содержащему одну или несколько мутаций в последовательности, соответствующей SEQ ID №4, которые приводят к устранению, минимизации и/или подавлению остеогенной активности (например, которую можно измерить при помощи активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в клеточной линии миобластов мыши С2С12). Преимущественными вариантами ВМР9 будут являться те, которые сохраняют способность к специфичной передаче сигнала в эндотелии (т.е. те, которые обладают по меньшей мере 0,75-кратной индукцией ID1 по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи экспрессии гена ID1 в НМЕС-1 клетках) и которые обладают более низким значением остеогенной активности (т.е. менее чем 0,5-кратной по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи активности ЩФ в клеточной линии миобластов мыши С2С12).
Более предпочтительными вариантами ВМР9 будут являться те, которые сохраняют способность к специфичной передаче сигнала в эндотелии (т.е. те, которые обладают по меньшей мере 0,75-кратной индукцией ID1 по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи экспрессии гена ID1 в НМЕС-1 клетках) и обладают незначительной остеогенной активностью (т.е. менее чем 0,1-кратной по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи активности ЩФ в клеточной линии миобластов мыши С2С12).
Самыми предпочтительными вариантами ВМР9 будут являться те, которые обладают увеличенной способностью к специфичной передаче сигнала в отношении эндотелия (т.е. те, которые обладают более высокими уровнями индукции ID1 по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи экспрессии гена ID1 в НМЕС-1 клетках) и незначительной остеогенной активностью (т.е. менее чем 0,1-кратной по сравнению с диким типом ВМР9, измеренной при помощи активности ЩФ в клеточной линии миобластов мыши С2С12).
В одном варианте реализации указанное заболевание сосудов выбрано из: легочной гипертензии; легочной артериальной гипертензии; врожденной геморрагической телеангиэктазии; атеросклероза и гепатопульмонального синдрома.
В еще одном варианте реализации указанное заболевание сосудов выбрано из: легочной гипертензии; легочной артериальной гипертензии; врожденной геморрагической телеангиэктазии и гепатопульмонального синдрома.
В еще одном варианте реализации указанное заболевание сосудов выбрано из легочной артериальной гипертензии.
В одном варианте реализации указанное заболевание органов дыхания выбрано из: обструктивных легочных заболеваний, таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), хронический бронхит и эмфизема; заболеваний сосудов легких, таких как отек легких и легочное кровотечение; дыхательной недостаточности и респираторного дистресс-синдрома, например острого повреждения легких и острого респираторного дистресс-синдрома, и интерстициальных заболеваний легких, таких как идиопатический легочный фиброз.
В одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой BMP10. Таким образом согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен BMP10 для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания. Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что BMP10 является таким же эффективным, как и ВМР9 при индуцировании экспрессии гена ID1, ID2 и BMPR-II (см. Фигуры 3А-3С). Кроме того, в настоящем описании было показано, что BMP10 демонстрирует одинаковую с ВМР9 антиапоптозную активностью при защите hPAEC от апоптоза, индуцированного ФНО-α-ЦГМ (см. Фигуру 3D). Тем не менее важно отметить то, что в отличие от ВМР9 BMP10 при самой высокой исследуемой концентрации не индуцирует какую-либо активность ЩФ (см. Фигуру 3F).
В еще одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой BMP10, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID №2.
В еще одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой BMP10, кодируемый нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID №1.
В еще одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой продомен-связанную форму BMP10 (про.ВМР10). Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что указанный комплекс про.ВМР10 является очень стабильным (см. Фигуры 4В и 4С) и вероятнее всего он будет являться предпочтительной формой для лечения заболеваний сосудов и заболеваний органов дыхания, таких как ЛАГ.
В еще одном варианте реализации про.ВМР10 содержит последовательность пропептида, имеющую последовательность аминокислотных остатков с 22 по 216 последовательности SEQ ID №2, нековалентно связанную с последовательностью зрелого BMP10, имеющей последовательность аминокислотных остатков с 317 по 424 последовательности SEQ ID №2.
В еще одном варианте реализации про.ВМР10 содержит тетрамер, содержащий две указанные пропептидные последовательности и две указанные последовательности зрелого BMP10.
В одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность. Таким образом согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания.
В еще одном варианте реализации указанный полипептид представляет собой вариант продомен-связанной формы ВМР9 (про.ВМР9).
В еще одном варианте реализации указанный вариант про.ВМР9 содержит вариант последовательности пропептида, имеющей последовательность аминокислотных остатков с 23 по 319 последовательности SEQ ID №4, нековалентно связанную с последовательностью зрелого ВМР9, имеющего последовательность аминокислотных остатков с 320 по 429 последовательности SEQ ID №4.
В еще одном варианте реализации указанный вариант про.ВМР9 содержит тетрамер, содержащий две указанные пропептидные последовательности и две указанные последовательности зрелого ВМР9.
В одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, содержит мутантную аминокислотную последовательность SEQ ID №4 с заменой, делецией или вставкой.
В еще одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, содержит мутантную аминокислотную последовательность SEQ ID №4 с заменой, соответствующую.
В еще одном варианте реализации указанная мутантная аминокислотная последовательность SEQ ID №4 с заменой, содержит одну или несколько (т.е. единичных, двойных, тройных замен и т.д.) следующих замен: Н326А, D342A, S343A, W344A, I346A, К349А, F362A, D366A, К372А, I375A, L379A, Н381А, L382A, К383А, К390А, S402A, L404A, К406А, D408A, V411A, T413A, L414A, Y416A и Y418A.
В еще одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из одного из следующих вариантов последовательности ВМР9 SEQ ID №4: Н326А, D342A, S343A, W344A, I346A, К349А, F362A, D366A, К372А, I375A, L379A, Н381А, L382A, К383А, К390А, S402A, L404A, К406А, D408A, V411A, Т413А, L414A, Y416A и Y418A.
В еще одном варианте реализации указанная мутантная аминокислотная последовательность SEQ ID №4 с заменой, содержит одну или несколько (т.е. единичных, двойных, тройных замен и т.д.) следующих замен: Н326А, S343A, К349А, F362A, D366A, I375A, L379A, L382A, К390А, S402A, D408A, Y416A и Y418A.
В еще одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из одного из следующих вариантов последовательности ВМР9 SEQ ID №4: Н326А, S343A, К349А, F362A, D366A, I375A, L379A, L382A, К390А, S402A, D408A, Y416A и Y418A. Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что эти мутантные последовательности сохраняют предпочтительное действие специфичной передачи сигнала в отношении эндотелия и обладают значительно пониженным остеогенным сигналингом (о чем свидетельствует по меньшей мере 0,75-кратная индукция ID1 и менее чем 0,5-кратная активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9 на Фигуре 5).
В еще одном варианте реализации указанная мутантная аминокислотная последовательность SEQ ID №4 с заменой, содержит одну или несколько (т.е. единичных, двойных, тройных замен и т.д.) следующих замен: F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416AH Y418A.
В еще одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из одного из следующих вариантов последовательности ВМР9 SEQ ID №4: F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A и Y418A. Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что эти мутантные последовательности сохраняют предпочтительное действие специфичной передачи сигнала в отношении эндотелия, однако остеогенный сигналинг у них отсутствует (о чем свидетельствует по меньшей мере 0,75-кратная индукция ID1 и незначительная (т.е. менее чем 0,1-кратная) активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9 на Фигуре 5).
В еще одном варианте реализации указанная мутантная аминокислотная последовательность SEQ ID №4 с заменой, содержит одну или обе (т.е. единичную или двойную замену) из следующих замен: D366A или D408A.
in vivo
В еще одном реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из одного из следующих вариантов последовательности BMP9SEQ ID №4: D366A или D408A. Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что эти мутантные последовательности поддерживают благоприятное воздействие ВМР9, однако они не в состоянии инициировать остеогенный сигналинг и, следовательно, устраняют потенциальный риск образования костной ткани путем введения ВМР9  (см. результаты, представленные на Фигуре 2). Данные, представленные в настоящем описании, также показывают, что эти мутантные последовательности обладают повышенным специфичным в отношении эндотелия сигналингом, однако остеогенный сигналинг у них отсутствует (о чем свидетельствует более чем 1-кратная индукция ID1 и незначительная (т.е. менее чем 0,1-кратная) активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9 на Фигуре 5).
В еще одном варианте реализации указанный вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из варианта последовательности ВМР9 SEQ ID №4D408A. Данные, представленные в настоящем описании, показывают, что эта мутантная последовательность продемонстрировала способность к защите от раннего апоптоза РАЕС, индуцированного фактором некроза опухоли α (ФНО-α) и циклогексимидом (ЦГМ) (см. результаты, представленные на Фигуре 7).
В еще одном варианте реализации вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенная активность, выбран из варианта ВМР9 D366A, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID №5, или варианта ВМР9 D408A, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID №6.
Следует отметить то, что раскрытые в настоящем описании варианты ВМР9 представляют собой ранее неизвестные полипептиды, которые, следовательно, образуют новые аспекты настоящего изобретения. Таким образом согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен вариант ВМР9, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №5. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен вариант ВМР9, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №6.
В то время как возможно введение активного монокомпонентного полипептида, предпочтительно, чтобы он был представлен в виде фармацевтической композиции (например, состава). В одном варианте реализации это стерильная фармацевтическая композиция.
В настоящем изобретении также предложены определенные выше фармацевтические композиции и способы получения фармацевтической композиции, содержащей (например, с добавлением) по меньшей мере один полипептид согласно настоящему изобретению совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами и необязательно другими терапевтическими или профилактическими агентами.
Таким образом согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая BMP10 или вариант ВМР9, у которого отсутствует остеогенной активностью, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая варианты ВМР9, определенные в настоящем описании, такие как вариант ВМР9 D366A, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №5, или вариант ВМР9 D408A, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №6.
Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество (-а) можно выбрать из, например, носителей (например, твердого, жидкого или полутвердого носителя), адъювантов, разбавителей, наполнителей или объемообразующих агентов, гранулирующих агентов, покрывающих агентов, агентов, контролирующих высвобождение, связывающих агентов, разрыхлителей, смазывающих агентов, консервантов, антиоксидантов, буферных агентов, суспендирующих агентов, загустителей, ароматизаторов, подсластителей, агентов, маскирующих вкус, стабилизаторов или любых других вспомогательных веществ, обычно применяемых в фармацевтических композициях. Примеры вспомогательных веществ для различных типов фармацевтических композиций более подробно изложены ниже.
В контексте настоящего описания термин «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в пределах медицинских показаний являются подходящими для применения при контакте с тканями субъекта (например, человека) без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или иной проблемы, или осложнения, которые сопоставимы с приемлемым соотношением польза/риск. Каждый носитель, вспомогательное вещество и т.д. также должны быть «приемлемыми» в смысле совместимости с другими ингредиентами указанного состава.
Фармацевтические композиции, содержащие указанные согласно настоящему изобретению полипептиды можно приготавливать согласно известных методик, см., к примеру, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Истон, штат Пенсильвания, США.
Фармацевтические композиции могут быть в любой форме, подходящей для перорального, парентерального, местного, интраназального, сублингвального, офтальмологического, ушного, ректального, интравагинального или трансдермального введения. Если композиции предназначены для парентерального введения, их можно приготавливать для внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного введения или для непосредственной доставки в целевой орган или ткань путем инъекции, инфузии или других средств доставки. Указанную доставку можно осуществить при помощи болюсной инъекции, краткосрочной инфузии или долгосрочной инфузии, а также можно осуществить посредством пассивной доставки или за счет использования подходящей инфузионной помпы или шприцевой помпы.
Адаптированные для парентерального введения фармацевтические составы включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики, сорастворители, поверхностно-активные вещества, смеси органических растворителей, агенты, образующие комплекс с циклодекстрином, эмульгаторы (для образования и стабилизации эмульсии составов), липосомные компоненты для образования липосом, гелеобразующие полимеры для образования полимерных гелей, криопротекторы и комбинации агентов в частности для того, чтобы стабилизировать указанный активный ингредиент в растворимой форме и сделать состав изотоничным крови предполагаемого реципиента. Фармацевтические составы для парентерального введения также могут быть в форме водных и неводных стерильных суспензий, которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители (R.G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, Vol. 21(2) 2004, p 201-230).
Следует принимать во внимание то, что генная терапия, включающая BMP10 или вариант ВМР9 согласно настоящему изобретению, входит в объем настоящего изобретения. Например, вектор, кодирующий нуклеотидную последовательность BMP10 или варианта ВМР9, вводят субъекту человека-хозяина, что приводит к эндогенной экспрессии (например, эндогенной экспрессии в печени) полипептида BMP10 или варианта ВМР9 для высвобождения в кровоток. Таким образом согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую BMP10 или вариант ВМР9, для применения для лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания. В еще одном варианте реализации указанный вектор содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID №1.
В одном варианте реализации указанный вектор представляет собой вирусный вектор. В еще одном варианте реализации указанный вирусный вектор выбран из: ретровируса, аденовируса, лентивируса, вируса простого герпеса, вируса коровьей оспы и аденоассоциированного вируса. В еще одном варианте реализации указанный вектор представляет собой вирусный вектор, который является аденоассоциированным вирусом.
В альтернативном варианте реализации указанный вектор не является вирусным вектором. Применение векторов, не являющихся вирусными, обладает рядом преимуществ по сравнению с применением вирусных векторов, такими как легкость крупномасштабного производства и низкая иммуногенность в хозяине. Примеры методов невирусной генной терапии включают: инъекцию голой ДНК, электропорацию, генную пушку, сонопорацию, магнитофекцию и применение олигонуклеотидов, липоплексов, дендримеров и неорганических наночастиц.
Указанные составы могут быть представлены в упаковках с единичной или многократной дозой, например, запаянных ампулах, флаконах и предварительно заполненных шприцов, и их можно хранить в высушенном при сублимации (лиофилизованном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением.
Фармацевтический состав можно получить путем лиофилизации полипептида согласно настоящему изобретению. Лиофилизация относится к процедуре сублимационной сушки композиции. Таким образом сублимационная сушка и лиофилизация в настоящем описании используются как синонимы.
Приготовляемые для немедленного использования растворы и суспензии для инъекций можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению для проведения парентеральной инъекции могут также содержать фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для разведения в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях непосредственно перед применением.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или переносящих сред включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и им подобные), карбоксиметилцеллюлозу и их подходящие смеси, растительные масла (такие как подсолнечное масло, сафлоровое масло, кукурузное масло или оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, путем применения способствующих загущению или покрывающих материалов, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и применения поверхностно-активных веществ.
Указанные композиции согласно настоящему изобретению могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено путем включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и им подобных. Кроме того, может быть желательным включение агентов для регулирования тоничности, таких как сахаров, хлорида натрия и им подобных. Продолжительное всасывание инъецируемой фармацевтической формы можно обеспечить путем добавления агентов, которые замедляют всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.
В одном конкретном варианте реализации настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для в.в. введения, например, путем инъекции или инфузии. Для внутривенного введения указанный раствор можно дозировать в неизменном виде или можно проводить его инъекцию в инфузионный пакет (содержащий фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, такое как 0,9% физиологический раствор или 5% декстроза) перед введением.
В другом конкретном варианте реализации указанная фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для подкожного (п.к.) введения.
Фармацевтические лекарственные формы, подходящие для перорального введения, включают таблетки (с покрытием или без покрытия), капсулы (твердые или мягкие), каплеты, пилюли, пастилки, сиропы, растворы, порошки, гранулы, эликсиры и суспензии, подъязычные таблетки, капсулы-имплантанты или пластыри, такие как буккальные пластыри.
Таким образом композиции в виде таблеток могут содержать единичную дозировку активного полипептида совместно с инертным разбавителем или носителем, таким как сахар или сахарный спирт, например, лактоза, сахароза, сорбит или маннит; и/или полученный не из сахара разбавитель, такой как карбонат натрия, фосфат кальция, карбонат кальция или целлюлоза или ее производные, такие как микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, и крахмалы, такие как кукурузный крахмал. Таблетки также могут содержать такие стандартные ингредиенты, как связующие и гранулирующие агенты, такие как поливинилпирролидон, разрыхлители (например, разбухающие перекрестно-сшитые полимеры, такие как перекрестно-сшитая карбоксиметилцеллюлоза), смазывающие агенты (например, стеараты), консерванты (например, парабены), антиоксиданты (например, бутилгидрокситолуол (ВНТ)), буферные агенты (например, фосфатные или цитратные буферы) и шипучие агенты, такие как цитратные/бикарбонатные смеси. Такие вспомогательные вещества хорошо известны и здесь нет необходимости в их подробном обсуждении.
Таблетки можно разрабатывать для того, чтобы высвобождение лекарственного средства происходило либо при контакте с жидкостями желудка (таблетки с быстрым высвобождением), либо чтобы высвобождение осуществлялось контролируемым образом (таблетки с контролируемым высвобождением) в течение продолжительного периода времени или в определенной области желудочно-кишечного тракта.
Составы в виде капсул могут представлять собой разновидности твердого желатина или мягкого желатина и могут содержать активный компонент в твердой, полутвердой или жидкой форме. Желатиновые капсулы можно получить из животного желатина или его синтетических или полученных из растений эквивалентов.
Твердые лекарственные формы (например, таблетки, капсулы и т.п.) могут быть с покрытием или без. Покрытия могут выступать либо в качестве защитной пленки (например, полимер, воск или лак), либо как механизм для контроля высвобождения лекарственного средства или для эстетических целей или целей идентификации. Указанное покрытие (например, полимер типа Eudragit™) может быть разработано так, чтобы высвобождение активного компонента происходило в желаемом участке желудочно-кишечного тракта. Таким образом указанное покрытие можно выбрать так, чтобы его разложение происходило при определенных значениях рН в желудочно-кишечном тракте, что тем самым селективно высвобождает полипептид в желудке или в подвздошной кишке, двенадцатиперстной кишке, тощей или толстой кишке.
Вместо покрытия или в дополнение к нему лекарственное средство может быть представлено в твердой матрице, содержащей агент, контролирующий высвобождение, например, агент, задерживающий высвобождение, с возможностью высвобождения указанного полипептида в желудочно-кишечном тракте контролируемым образом. В качестве альтернативы указанное лекарственное средство может быть представлено в полимерном покрытии, например, полимерном покрытии из полиметакрилата, с возможностью избирательного высвобождения указанного полипептида в условиях различной кислотности или щелочности в желудочно-кишечном тракте. В качестве альтернативы материал указанной матрицы или тормозящего высвобождение покрытия может быть в форме расщепляемого полимера (например, полимер малеинового ангидрида), который по существу подвергается непрерывному расщеплению по мере того, как лекарственная форма проходит через желудочно-кишечный тракт. В другом альтернативном варианте указанное покрытие можно разработать так, чтобы его разрушение происходило под действием микробов в кишечнике. В качестве дополнительного альтернативного варианта указанный активный полипептид можно вводить в состав системы для доставки, которая обеспечивает осмотический контроль высвобождения указанного полипептида. Составы для осмотического высвобождения и другие составы для задерживающего высвобождения или продолжительного высвобождения (например, составы на основе ионообменных смол) можно получить согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области техники.
Указанные полипептиды согласно настоящему изобретению можно приготавливать с носителем и вводить в форме наночастиц, при этом увеличенная площадь поверхности наночастиц способствует их всасыванию. Кроме того, наночастицы обеспечивают возможность непосредственного проникновения в клетку. Системы для доставки лекарственных средств в виде наночастиц описаны в «Технологии с применением наночастиц для доставки лекарственных средств» ("Nanoparticle Technology for Drug Delivery") под редакцией Ram В Gupta и Uday В. Kompella, Informa Healthcare, ISBN 9781574448573, опубликованной 13 марта 2006 г. Наночастицы для доставки лекарственных средств также описаны в J. Control. Release, 2003, 91 (1-2), 167-172 и в Sinha и др., Mol. Cancer Ther. August 1, (2006) 5, 1909.
Фармацевтические композиции обычно содержат от приблизительно 1% (масс/масс) до приблизительно 95% (масс/масс) активного ингредиента и от 99% (масс/масс) до 5% (масс/масс) фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества или комбинации вспомогательных веществ. В частности, указанные композиции содержат от приблизительно 20% (масс/масс) до приблизительно 90% (масс/масс) активного ингредиента и от 80% (масс/масс) до 10% фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества или комбинации вспомогательных веществ. Указанные фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1% до приблизительно 95%, в частности от приблизительно 20% до приблизительно 90%, активного ингредиента. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть, например, в виде единичной лекарственной формы, например, в виде ампул, флаконов, суппозиториев, предварительно заполненных шприцов, драже, таблеток или капсул.
Указанное фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество (-а) можно выбрать в соответствии с желаемой физической формой состава и можно, например, выбрать из разбавителей (например, твердых разбавителей, таких как наполнители или объемообразующие агенты, а также жидких разбавителей, таких как растворители и сорастворители), разрыхлителей, буферных агентов, лубрикантов, агентов для повышения текучести, агентов, контролирующих высвобождение (например, полимеров, задерживающих или замедляющих высвобождение, или восков), связующих веществ, гранулирующих агентов, пигментов, пластификаторов, антиоксидантов, консервантов, ароматизирующих агентов, агентов, маскирующих вкус, агентов, регулирующих тоничность, и покрывающих агентов.
Специалист в данной области техники должен обладать опытом для того, чтобы выбрать соответствующие количества ингредиентов для применения в указанных составах. К примеру таблетки и капсулы обычно содержат от 0 до 20% разрыхлителей, от 0 до 5% лубрикантов, от 0 до 5% агентов для повышения текучести и/или от 0 до 99% (масс/масс) наполнителей/или объемообразующих агентов (в зависимости от дозы лекарственного средства). Они также могут содержать от 0 до 10% (масс/масс) полимерных связующих, от 0 до 5% (масс/масс) антиоксидантов, от 0 до 5% (масс/масс) пигментов. Таблетки с замедленным высвобождением будут дополнительно содержать от 0 до 99% (масс/масс) контролирующих высвобождение (например, задерживающих) полимеров (в зависимости от дозы). Пленочные оболочки таблеток или капсул обычно содержат от 0 до 10% (масс/масс) полимеров, от 0 до 3% (масс/масс) пигментов и/или от 0 до 2% (масс/масс) пластификаторов.
Составы для парентерального введения обычно содержат от 0 до 20% (масс/масс) буферов, от 0 до 50% (масс/масс) сорастворителей и/или от 0 до 99% (масс/масс) воды для инъекций (ВДИ) (в зависимости от дозы и был ли лиофилизирован состав). Составы для внутримышечного депонирования также могут содержать от 0 до 99% (масс/масс) масла.
Фармацевтические композиции для перорального введения можно получить путем комбинирования активного ингредиента с твердыми носителями, при желании гранулированием полученной смеси, и обработки указанной смеси, при желании или необходимости после добавления соответствующих вспомогательных веществ, в таблетках, драже или капсулах. Также возможно их включение в полимерные или воскообразные матрицы, которые позволяют активным ингредиентам диффундировать или высвобождаться в отмеряемых количествах.
Указанные полипептиды согласно настоящему изобретению можно также приготовить в виде твердых дисперсий. Твердые дисперсии представляют собой однородные чрезвычайно высоко дисперсные фазы двух или более твердых веществ. Твердые растворы (молекулярно-дисперсные системы), один тип твердой дисперсии, хорошо известны для применения в фармацевтической технологии (см. (Chiou и Riegelman, J. Pharm. Sci., 60, 1281-1300 (1971)), и они являются подходящими для увеличения скорости растворения и увеличения биодоступности лекарственных средств, которые плохо растворимы в воде.
В настоящем изобретении также предложены твердые лекарственные формы, содержащие указанный твердый раствор, описанный выше. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, жевательные таблетки и диспергируемые или шипучие таблетки. Можно смешивать известные вспомогательные вещества с указанным твердым раствором, чтобы получить желаемую лекарственную форму. Например, капсула может содержать указанный твердый раствор, смешанный с (а) разрыхлителем и лубрикантом или (б) разрыхлителем, лубрикантом и поверхностно-активным веществом. Кроме того, капсула может содержать объемообразующий агент, такой как лактоза или микрокристаллическая целлюлоза. Таблетка может содержать указанный твердый раствор, смешанный с по меньшей мере одним разрыхлителем, лубрикантом, поверхностно-активным веществом, объемообразующим агентом и веществом, способствующим скольжению. Жевательная таблетка может содержать указанный твердый раствор, смешанный с объемообразующим агентом, лубрикантом и при желании дополнительным подсластителем (таким как искусственный подсластитель) и подходящими ароматизаторами. Твердые растворы можно также получить путем распыления растворов лекарственного средства и подходящего полимера на поверхность инертных носителей, таких как сахарные гранулы («нонпарели»). Данные гранулы затем можно помещать в капсулы или прессовать в таблетки.
Указанные фармацевтические составы могут быть представлены пациенту в виде «упаковок для пациента», содержащих полный курс лечения в одной упаковке, обычно упаковке в виде блистера. Упаковки для пациента обладают преимуществом по сравнению с традиционными рецептами, в которых фармацевт предоставляемое пациенту фармацевтическое средство отбирает из крупной партии, в том, что пациент всегда имеет доступ к листовке-вкладышу в упаковке, содержащемуся в упаковке для пациента, который как правило отсутствует в рецептах для пациента. Было показано, что вложение листовки-вкладыша улучшает соблюдение пациентом указаний врача.
Композиции для местного применения и назальной доставки включают мази, крема, спреи, пластыри, гели, жидкие капли и вкладыши (например, внутриглазные вкладыши). Такие композиции можно приготовить согласно известным способам.
Примеры составов для ректального или интравагинального введения включают пессарии и суппозитории, которые могут быть, например, образованы из пластичного по форме или воскообразного материала, содержащего указанный активный полипептид. Растворы указанного активного полипептида можно также применять для ректального введения.
Композиции для введения путем ингаляции могут быть в форме ингаляционных порошковых композиций или жидких или порошкообразных спреев, и их можно вводить в стандартной форме с применением порошковых ингаляторов или аэрозольных распыляющих устройств. Такие устройства хорошо известны. Для введения путем ингаляции порошкообразные составы обычно содержат активный полипептид совместно с инертным твердым порошкообразным разбавителем, таким как лактоза.
Указанные полипептиды согласно настоящему изобретению в целом будут представлены в единичной лекарственной форме и как таковые будут как правило содержать достаточное количество полипептида, чтобы обеспечить желаемый уровень биологической активности. Например, состав может содержать от 1 нг до 2 г активного ингредиента, например, от 1 нг до 2 мг активного ингредиента. В пределах этих диапазонов конкретные поддиапазоны полипептида составляют от 0,1 мг до 2 г активного ингредиента (более часто от 10 мг до 1 г, например, от 50 мг до 500 мг) или от 1 мкг до 20 мг (например, от 1 мкг до 10 мг, например, от 0,1 мг до 2 мг активного ингредиента).
Для композиций для перорального введения единичная лекарственная форма может содержать от 1 мг до 2 г, более часто от 10 мг до 1 г, например, от 50 мг до 1 г, например, от 100 мг до 1 г активного полипептида.
Указанный активный полипептид вводят пациенту, нуждающемуся в этом (например, пациенту-человеку или пациенту-животному) в количестве, достаточном для достижения желаемого терапевтического эффекта.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания сосудов или заболевания органов дыхания, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полипептида, выбранного из костного морфогенетического белка 10 (BMP10) или варианта костного морфогенетического белка 9 (ВМР9), у которого отсутствует остеогенная активность.
Следующие исследования иллюстрируют настоящее изобретение:
Сокращения
Материалы и способы
Получение рекомбинантного про.ВМР9 и про.ВМР10
Полноразмерную кДНК, содержащую открытую рамку считывания пре-про-ВМР9 человека, клонировали в вектор экспрессии рСЕР4 между сайтами HindIII и XhoI (см. Фигуру 1). Аналогичным образом полноразмерную кДНК пре-про-ВМР10 человека клонировали в вектор экспрессии рСЕР4 между сайтами XhoI и BamHI (см. Фигуру 1). Верификацию вставок проводили при помощи секвенирования ДНК. Варианты про.ВМР9 получали с применением набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange (Stratagene), и подтверждение наличия всех мутаций проводили при помощи секвенирования ДНК.
Плазмиды, содержащие пре-про-ВМР9 (или пре-про-ВМР10), трансфицировали в HEK-EBNA клетки (эмбриональные клетки почек человека, содержащие ядерный антиген вируса Эпштейна-Барра), применяя полиэтиленимин в DMEM-среде, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Для облегчения обработки про.ВМР9 и про.ВМР10 осуществляли совместную трансфекцию плазмид, экспрессирующих фурин человека. На следующий день клетки перемещали в среду CDCHO без сыворотки, и сбор кондиционированной среды проводили через 3-4 дня. Идентичность про.ВМР9 и про.ВМР10 в кондиционированной среде подтверждали при помощи вестерн-блоттинга с применением антител против ВМР9 (МАВ3209, R&D Systems), против продомена ВМР9 (AF3879, R&D Systems) или BMP10 (МАВ2926, R&D Systems) соответственно.
Для того чтобы произвести очистку про.ВМР10 1-5 литров кондиционированной среды загружали в колонку с Q-сефарозой, предварительно уравновешенной в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ NaCl. Связанные белки элюировали градиентом NaCl (50-2000 мМ). Фракции анализировали при помощи невосстанавливающего ДСН-ПААГ-электрофореза, и те фракции, которые содержали про.ВМР10, объединяли и концентрировали перед загрузкой в колонку для гель-фильтрации S200. Чистота про.ВМР10 из колонки S200 составляла более 90%, и идентичность продомена BMP10 и зрелого BMP10 дополнительно подтверждали при помощи способов идентификации с применением расщепления в геле и масс-спектрометрии.
Анализы на наличие передачи сигнала при помощи количественной ПЦР (кПЦР) и фосфорилирования Smadl/5/8 в эндотелиальных клетках
Для проведения анализов на наличие передачи сигнала концентрацию про.ВМР9 определяли при помощи ИФА, применяя ВМР9 от R&D в качестве стандартов; и концентрацию про.ВМР10 количественно оценивали при помощи вестерн-блоттинга и Image J, применяя BMP10 от R&D в качестве стандартов.
После сывороточного голодания НМЕС-1 клетки обрабатывали лигандами для BMP в указанных концентрациях. Через 8 часов после обработки осуществляли экстракцию мРНК, и уровни экспрессии ID1, ID2 или BMPR-II измеряли при помощи количественной ПЦР. В качестве контроля применяли β2-микроглобулин и на графике отмечали кратные изменения по сравнению с необработанными образцами. Представлено среднее значение ± SEM, N=2. Для анализа фосфорилирования Smad1/5/8 НМЕС-1 клетки после сывороточного голодания обрабатывали лигандами BMP в указанных концентрациях в течение 1 часа, и передачу сигнала останавливали путем размещения планшетов на сухом льду. Добавляли буфер для лизиса (125 мМ Трис-HCl, рН 6,8,2% ДСН и 10% глицерина), и устанавливали концентрацию белка в общем лизате клеток, применяя анализ для определения концентрации белка с последующим растворением при помощи детергента (DC™ protein assay (Bio-Rad)). От 25 до 35 мкг общего белка клеток использовали для иммуноблоттинга, и фосфорилирование Smad1/5/8 отслеживали при помощи антител против pSmad1/5/8 (Передача сигнала в клетке, № по каталогу 9516). α-тубулин применяли в качестве контроля нагрузки.
Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в клеточной линии миобластов мыши С2С12
С2С12 клетки высевали в количестве 20000 клеток на лунку в 24-луночные планшеты в DMEM-среду с добавлением 10% FBS. После 48 часов клетки фиксировали с DMEM, содержащей 0,25% FBS, в течение 16 ч и обрабатывали лигандами для BMP в указанных концентрациях в течение 64 часов. Клетки лизировали в 1% Тритон Х-100/ФСБ, и общую концентрацию белка в указанном лизате клеток устанавливали, применяя анализ для определения концентрации белка с последующим растворением при помощи детергента (DC™ protein assay (Bio-Rad)). Активность ЩФ в указанном лизате клеток измеряли, применяя хромогенный субстрат фосфатазы 4-нитрофенилфосфат динатриевую соль (Sigma, S0942), и указанный растворимый продукт измеряли при 405 нм на планшете-ридере. Во всех анализах ВМР9 и BMP10, которые представляли собой контроль, приобретали у R&D Systems.
Результаты
ВМР9 передача сигнала и данные, подтверждающие ее терапевтический эффект при ЛАГ
in vitro
ВМР9 и BMP10 были идентифицированы как лиганды для орфанного рецептора ALK 1 (David и др. (2007) Blood 109 (5): 1953-1961 гг). В эндотелиальных клетках они индуцируют аналогичный набор генов, включая ID1, ID2 и BMPRII. ВМР9 синтезируется в печени (Miller и др. (2000) J. Biol. Chem. 275 (24): 17937-17945; Bidart и др. (2012) Cell Mol. Life. Sci. 69 (2):313-324), циркулирует в концентрации от 2 до 10 нг/мл и является единственным BMP, у которого подтверждается циркуляция в активных концентрациях (Herrera и Inmam (2009) ВМС Cell Biol. 10:20, David и др. (2008) Circ. Res. 102 (8):914-922). ВМР9 является фактором устойчивости сосудов, подавляющим миграцию, пролиферацию и ангиогенез эндотелиальных клеток , что тем самым способствует стабильности сосудов (David и др. (2008), выше).
Конструирование вариантов ВМР9, у которых сохранены защитные свойства в отношении эндотелия, но у которых отсутствует активность в отношении образования костной ткани
in vitro
in vivo
Несмотря на возможность лечения сердечно-сосудистых заболеваний путем селективной активации эндотелиальных рецепторов, ВМР9 может также передавать сигнал в мезенхимальных стволовых клетках (МСК) и С2С12 миобластов. Среди 14 исследованных BMP было обнаружено, что ВМР9 обладает самым высоким остеогенным сигналингом  и активностью в отношении образования костной ткани  (Kang и др. (2004) Gene Ther. 11 (17): 1312-1320; Luther и др. (2011) Curr. Gene Ther. 11 (3):229-240). Оба ALK1 и ALK2 необходимы для остеогенной активности ВМР9 (Lou и др. (2010) J. Biol. Chem. 285 (38):29588-29598), однако характер взаимодействия ВМР9 с ALK1 и ALK2 в контексте остеогенной активности неизвестен. Хотя эндотелиальные клетки сосудов также экспрессируют ALK2 (Upton и др. (2008) Mol. Pharmacol. 73 (2):539-552), ALK1 представляет собой основной рецептор I типа, опосредующий ответы ВМР9 в данных клетках (Upton и др. (2009) J. Biol. Chem. 284 (23):15794-15804; Scharpfenecker и др. (2007) J. Cell Sci. 120 (Pt6):964-972). Необходимость рецептора II типа для остеогенной активности ВМР9 исследовали на МСК. Было показано, что экспрессия доминантных негативных мутантов всех трех рецепторов BMP II типа, BMPR-II, ActR-IIA и ActR-IIB, может ингибировать индуцированную ВМР9 остеогенную активность, при этом доминантный негативный мутант ActR-IIA является наиболее эффективным (Wu и др. (2010) Acta biochimica и biophysica Sinica 42 (10):699-708).
in vivo
in vivo
Авторы настоящего изобретения предположили, что посредством мутирования сайта связывания рецептора I типа и II типа на ВМР9, можно сконструировать варианты ВМР9, которые сохраняют связывание с ALK1, но теряют связывание с ALK2. Вероятнее всего то, что такие варианты ВМР9 могут сохранить защитную функцию в отношении эндотелия, однако у них отсутствует остеогенная активность. Авторы настоящего изобретения уже идентифицировали два таких варианта ВМР9, которые поддерживают сигнальную активность эндотелиальных клеток, о чем свидетельствует индукция экспрессии генов ID1 и ID2, однако у которых отсутствует остеогенная сигнальная активность, оцениваемая при помощи анализа на активность щелочной фосфатазы в С2С12 клетках (Фигура 2). Вероятнее всего то, что данные варианты ВМР9 (D366A и D408A) поддерживают благоприятное воздействие , так как они обладают нормальной сигнальной активностью в эндотелиальных клетках, однако они не способны вызывать остеогенный сигналинг и, следовательно, устраняют потенциальный риск образования костной ткани путем введения ВМР9 .
Аланин-сканирующий мутагенез ВМР9
Двадцать четыре варианта ВМР9 с заменами на аланин (Н326А, D342A, S343A, W344A, I346A, К349А, F362A, D366A, К372А, I375A, L379A, Н381А, L382A, К383А, К390А, S402A, L404A, К406А, D408A, V411A, Т413А, L414A, Y416A и Y418A) получили и исследовали как в НМЕС-1 клетках на индукцию гена ID1, так и в С2С12 клетках на активность щелочной фосфатазы. Результаты данного исследования представлены на Фигуре 5, где можно увидеть, что тринадцать вариантов ВМР9 (Н326А, S343A, К349А, F362A, D366A, I375A, L379A, L382A, К390А, S402A, D408A, Y416A и Y418A) идентифицировали как варианты, поддерживающие благоприятное воздействие специфичного в отношении эндотелия сигналинга и обладающие значительно пониженным остеогенным сигналингом (о чем свидетельствует по меньшей мере 0,75-кратная индукция ID1 и менее чем 0,5-кратная активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9). Кроме того, результаты, представленные на Фигуре 5, показывают, что восемь вариантов ВМР9 (F362A, D366A, I375A, L379A, S402A, D408A, Y416A и Y418A) были идентифицированы как варианты, поддерживающие специфичный в отношении эндотелия сигналинг, у которых однако отсутствует остеогенный сигналинг (о чем свидетельствует по меньшей мере 0,75-кратная индукция ID1 и незначительная (то есть менее чем 0,1-кратная) активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9). Более того результаты, представленные на Фигуре 5, показывают, что два варианта ВМР9 (D366A или D408A) увеличивали специфичный в отношении эндотелия сигналинг, однако остеогенный сигналинг у них отсутствовал (о чем свидетельствует более чем 1-кратная индукция ID1 и незначительная (т.е. менее чем 0,1-кратная) активность ЩФ по сравнению с диким типом ВМР9).
Валидация вариантов ВМР9 в первичных эндотелиальных клетках
Восемь вариантов ВМР9 (F362A, D366A, 1375A, L379A, S402A, D408A, Y416A и Y418A), которые были определены выше как поддерживающие специфичный в отношении эндотелия сигналинг с отсутствием остеогенного сигналинга, дополнительно подвергали процессу валидации в первичных эндотелиальных клетках. Было обнаружено, что все мутанты индуцируют экспрессию гена BMPR2 в эндотелиальных клетках легочной артерии человека (hPAEC, Фигура 6). Было показано, что по меньшей мере один вариант, D408A, способен защищать РАЕС от раннего апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли α (ФНО-α) и циклогексимидом (ЦГМ) (Фигура 7).
ВМР10 сигналинг в эндотелии
BMP10 незаменим для развития сердца (Neuhaus и др. (1999) Mech. Dev. 80 (2):181-184). У мышей, у которых отсутствует BMP10, летальный исход наблюдается на эмбриональном уровне вследствие тяжелых нарушений в развитии сердца (Chen Н и др. (2004) Development 131 (9):2219-2231). ВМР10 регулирует развитие стенки желудочка сердца через фактор транскрипции Tbx20 (Zhang и др. (2011) J. Biol. Chem. 286 (42):36820-36829), и гиперэкспрессия BMP10 в миокарде приводит к нарушению послеродового гипертрофического роста сердца (Chen и др. (2006.), J. Biol. Chem. 281 (37):27481-27491). У взрослых особей BMP10 экспрессируется только в правом предсердии (Chen и др. (2004), выше). Было показано, что BMP10 в циркуляции опосредует зависимую от потока устойчивость артерий (Laux и др. (2013) Development 140(16):3403-3412).
in vitro
in vivo
Уровень BMP10 в циркуляции является спорным. В то время как белок BMP10 был обнаружен в сыворотке крови человека с применением протеомических подходов (Souza и др. (2008) Mol. Endocrinol. 22(12):2689-2702), и его можно было измерить при помощи ИФА (Ricard и др. (2012) Blood 119 (25):6162-6171), другие исследования с применением анализов на активность не смогли обнаружить циркулирующий BMP10 (Bidart и др. (2012) и Herrera и Inman (2009), выше). Тем не менее в недавнем докладе была продемонстрирована активность BMP10 в кровотоке (Chen и др. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (29): 11887-11892). Такое противоречие может быть связано с нахождением BMP10 в циркуляции в активных/неактивных состояниях, неполной обработкой, ингибированием посредством фактора в сыворотке или различными анализами на активность, которые применяются в опубликованных отчетах. Продомен BMP10 может играть в этом роль. Например, сообщалось, что продомен BMP10, в отличие от других BMP, может ингибировать индуцированную BMP10 экспрессию генов в С2С12 клетках (Sengle и др. (2011) J. Biol. Chem. 286 (7):5087-5099). Кроме того, измерения Biacore показали, что ВМР10 обладает более высоким сродством по отношению к ALK1/BMPR-II, нежели чем ВМР9 (Townson и др. (2012), J. Biol. Chem. 287(33):27313-27325), и потеря белка BMPR-II во время начала ЛАГ будет явным образом оказывать воздействие на BMP10 сигналинг. Важно отметить то, что в исследованиях  и  BMP10 лишен остеогенной активности. Таким образом нативный BMP10 представляет собой более предпочтительного агониста, нежели чем нативный ВМР9 для лечения ЛАГ.
Сравнение активности ВМР9 и ВМР10
3
Анализ на определение сигналинга в зависимости от концентрации в эндотелиальных клетках микрососудов человека (НМЕС-1) показал, что BMP10 при индуцировании экспрессии генов ID1, ID2 и BMPR-II является таким же эффективным, как и ВМР9 (Фигуры 3А-3С). Важно отметить то, что BMP10 демонстрирует такую же антиапоптозную активностью, что и ВМР9 при защите hPAEC от индуцированного ФНО-α-ЦГМ апоптоза (Фигура 3D). Сообщалось, что ВМР9 поддерживает стабильность сосудистой системы посредством подавления пролиферации эндотелиальных клеток (David и др. (2008), выше). Как ВМР9, так и BMP10 в равной степени репрессируют синтез ДНК, измеряемый как поглощение Н-тимидина, в hPAEC (Фигура 3Е). Щелочная фосфатаза (ЩФ) является ключевым ферментом в остеогенном пути, и индуцированную ВМР9 активность ЩФ можно определить в С2С12 клетках при концентрации ВМР9 в 5 нг/мл. Тем не менее в одинаковых условиях BMP10 не индуцировал какую-либо активность ЩФ при наивысшей исследуемой концентрации (20 нг/мл, Фигура 3F), что согласуется с предыдущим исследованием с применением BMP, экспрессированных аденовирусом, в С2С12 клетках (Kang и др. (2004), выше).
Эффективность введения ВМР10 и продомен-связанного ВМР10 для лечения ЛАГ и других сердечно-сосудистых заболеваний
in vivo
BMP синтезируются в виде пре-про-белков, и продомен расщепляется после секреции (Фигура 4А). В предыдущем докладе было показано, что указанный продомен BMP10 может ингибировать активность BMP10, и вероятнее всего то, что BMP10 циркулирует в неактивной форме. Авторы настоящего изобретения получили большое количество продомен-связанного BMP10 (про.ВМР10). В отличие от предыдущего доклада было обнаружено, что указанный продомен остается связанными с BMP10, когда BMP10 получают из клеток млекопитающих, и что указанный комплекс про.ВМР10 является очень стабильным (Фигуры 4В и 4С). Это указывает на то, что вероятнее всего про.ВМР10 будет представлять собой циркулирующую форму. Более того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали в НМЕС-1 клетках (Фигуры 4D и 4Е) и НРАЕС клетках то, что проВМР10 обладает сопоставимой с ВМР9 активностью, и BMP10 были приобретены из коммерческих источников (R&D Systems). Поскольку указанный продомен защищает гидрофобную поверхность BMP10 и, следовательно, стабилизирует указанную циркулирующую форму BMP10, вероятнее всего то, что про.ВМР10 будет являться предпочтительной формой для введения  для лечения ЛАГ и других сердечнососудистых заболеваний.
ВМР9 и ВМР10 ингибируют образование трубок разрастающихся эндотелиальных клеток крови (ВОЕС) в гелях с содержанием коллагена
Разрастающиеся эндотелиальные клетки крови могут быть выделены из периферической крови большинства индивидуумов и представляют собой высоко пролиферативный тип клеток, которые являются весьма характерными эндотелиальными клетками человека. Было показано, что как и эндотелиальные клетки ВОЕС образуют вакуолизованные капиллярно-подобные структуры в 3-мерной матрице коллаген:фибронектин. Результаты данного анализа представлены на Фигуре 8, которые не только демонстрируют антиангиогенную роль ВМР9 и BMP10, но и также показывают, что ВМР9, также будучи антипролиферативным для эндотелиальных клеток, защищает эндотелиальные клетки от апоптоза, а также защищает эндотелиальные клетки от повышенной проницаемости. Ингибирование при помощи ВМР9 проявляется даже при низких концентрациях.