МАЛЫЕ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК С МИШЕНЬ-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЗАТРАВОЧНЫМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ

1. Способ получения библиотеки малых интерферирующих РНК (siRNA), который включает синтез множества молекул РНК, где каждая молекула РНК содержит
(a) затравочную последовательность, содержащую случайные нуклеотиды, и незатравочную последовательность, содержащую обозначенные нуклеотиды; или
(b) затравочную последовательность, содержащую нуклеотиды, характерные для одной или нескольких затравочных последовательностей микроРНК организма-мишени или организма, родственного организму-мишени, и незатравочную последовательность, содержащую обозначенные нуклеотиды.
2. Способ по п.1, где синтез включает разработку in silico.
3. Способ по п.1 или 2, где каждая молекула РНК из множества молекул РНК содержит по меньшей мере приблизительно 17-19 нуклеотидов, и где затравочная последовательность содержит 6-8 нуклеотидов.
4. Способ по п.3, где каждая молекула РНК из множества молекул РНК содержит 21 нуклеотид, где затравочная последовательность содержит нуклеотиды, занимающие положения 2-8 молекулы РНК, и где незатравочная последовательность содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-21 молекулы РНК.
5. Способ по пп.1, 2 и 4, где незатравочная последовательность содержит
(a) консенсусную последовательность микроРНК; или
(b) консенсусную последовательность микроРНК от вредителя или патогена растения, или от организма, родственного вредителю или патогену растения.
6. Способ по п.5, где вредителем растения является нематода или насекомое.
7. Способ по п.6, где нематода является соевой цистообразующей нематодой (Heterodera glycines), или насекомое является западным кукурузным жуком (Diabrotica virgifera).
8. Способ по п.7, где незатравочная последовательность
(a) является консенсусной последовательностью на основании последовательностей микроРНК Caenorhabditis elelgans; или
(b) содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-21 SEQ ID NO:47; или
(c) является консенсусной последовательностью на основании последовательностей микроРНК Tribolium castaneum; или
(d) содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-21 SEQ ID NO:50.
9. Способ по пп.1, 2, 4 и 6-8, где незатравочная последовательность дополнительно содержит одну или несколько нуклеотидных замен для улучшения стабильности микроРНК.
10. Способ по пп.1, 2, 4 и 6-8, дополнительно включающий этапы:
(a) исключения молекул РНК, содержащих один или несколько нуклеотидов в пределах затравочной последовательности, которые встречаются с низкой частотой в соответствующих положениях последовательностей микроРНК организма-мишени или организма, родственного организму-мишени;
(b) исключения молекул РНК, содержащих гомонуклеотидный квадруплет в пределах затравочной последовательности; и/или
(c) исключения молекул РНК, содержащих затравочную последовательность с большим содержанием GC в положениях 1-9, чем содержание GC в положениях 11-19.
11. Способ по пп.1, 2, 4 и 6-8, дополнительно включающий этап исключения молекул РНК, комплементарных нуклеиновой кислоте растения-хозяина.
12. Способ по п.11, где растением-хозяином является Glycine max (соя) или Zea mays (кукуруза).
13. Способ по пп.1, 2, 4, 6-8 и 12, где множество молекул РНК содержит молекулы РНК с затравочной последовательностью из остатков 2-8 SEQ ID NO:49 или остатков 2-8 SEQ ID NO:51.
14. Библиотека siRNA, полученная с помощью способа по любому из пп.1-13.
15. Молекула siRNA из библиотеки по п.14.
16. Молекула siRNA, содержащая
(a) затравочную последовательность, содержащую нуклеотиды, характерные для одной или нескольких затравочных последовательностей микроРНК организма-мишени или организма, родственного организму-мишени, и
(b) незатравочную последовательность.
17. Молекула siRNA по п.16, которая содержит по меньшей мере приблизительно 19 нуклеотидов, и где затравочная последовательность содержит 6-8 нуклеотидов.
18. Молекула siRNA по п.17, которая содержит 21 нуклеотид, где затравочная последовательность содержит нуклеотиды, занимающие положения 2-8 молекулы РНК, и где незатравочная последовательность содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-21 молекулы РНК.
19. Молекула siRNA по любому из пп.16-18, где незатравочная последовательность содержит
(a) консенсусную последовательность микроРНК; или
(b) консенсусную последовательность микроРНК от вредителя или патогена растения, или от организма, родственного вредителю или патогену растения.
20. Молекула siRNA по п.19, где вредителем растения является нематода или насекомое.
21. Молекула siRNA по п.20, где нематода является Heterodera glycines, или насекомое является Diabrotica virgifera.
22. Молекула siRNA по пп.16-18, 20 и 21, где незатравочная последовательность
(a) является консенсусной последовательностью на основании последовательностей микроРНК Caenorhabditis elegans; или
(b) содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-19 SEQ ID NO:47; или
(c) является консенсусной последовательностью на основании последовательностей микроРНК Tribolium castaneum; или
(d) содержит нуклеотиды, занимающие положения 1 и 9-19 SEQ ID NO:50.
23. Молекула siRNA по пп.16-18, 20 и 21, которая содержит затравочную последовательность из остатков 2-8 SEQ ID NO:48, остатков 2-8 SEQ ID NO:49 или остатков 2-8 SEQ ID NO:51.
24. Молекула siRNA по п.23, которая содержит затравочную последовательность из остатков 2-8 любой из SEQ ID NO:1-14.
25. Молекула siRNA по п.24, которая содержит нуклеотидную последовательность из любой из SEQ ID NO:1-14.
26. Искусственная молекула РНК, содержащая молекулу siRNA по любому из пп.15-25.
27. Искусственная молекула РНК по п.26, которая содержит нуклеотидную последовательность из любой из SEQ ID NO:16-29.
28. Вектор, содержащий молекулу siRNA по любому из пп.15-25.
29. Вектор по п.28, который содержит нуклеотидную последовательность из любой из SEQ ID NO:31-44.
30. Нуклеиновая кислота, содержащая молекулу siRNA по любому из пп.15-25.
31. Трансгенное растение или его часть, содержащие молекулу siRNA по любому из пп.15-25, искусственную молекулу РНК по п.26 или 27, вектор по п.28 или 29 или нуклеиновую кислоту по п.30.
32. Трансгенное растение по п.31, которое является Glycine max или Zea mays.
33. Продукт растительного происхождения, полученный из трансгенного растения по п.п.31 или 32, где продукт растительного происхождения содержит молекулу siRNA, искусственную молекулу РНК, вектор или нуклеиновую кислоту.
34. Продукт растительного происхождения по п.33, где продукт растительного происхождения выбран из группы, состоящей из цветков, пыльцы, листьев, вьющихся стеблей, стеблей, плодов, овощей, тыкв, корней, клубней, шишек, стручков, семян, бобов и их частей.
35. Биологический образец, полученный из продукта растительного происхождения или его части по п.33 или 34.
36. Товарный продукт, содержащий siRNA по любому из пп.15-25.
37. Товарный продукт по п.36, где товарный продукт выбран из группы, состоящей из цельных или переработанных семян, бобов, зерен, косточек, оболочек, муки грубого помола, круп, муки, Сахаров, крахмалов, белковых концентратов, белковых изолятов, восков, масел, экстрактов, соков, концентратов, жидкостей, сиропов, корма, силоса, волокон, бумаги или других пищевых продуктов или продуктов, получаемых из растений.
38. Биологический образец, полученный из товарного продукта по п.36 или 37.
39. Способ придания растению устойчивости к нематоде, включающий осуществление в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащей siRNA по п.24 или 25, в результате чего растение становится устойчивым к нематоде.
40. Способ по п.39, который включает осуществление в растении экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащей искусственную miRNA по п.26.
41. Способ по п.п.39 или 40, где нематода является соевой цистообразующей нематодой.
42. Молекула siRNA, которая целенаправленно воздействует как на ген нематоды, так и на эндогенный ген растения, связанный с фенотипом устойчивости растения к нематоде.
43. Молекула siRNA по п.42, где молекула siRNA способна подавлять экспрессию гена нематоды и эндогенного гена растения.
44. Молекула siRNA по п.43, где экспрессия молекулы siRNA в трансгенном растении или его части придает растению или его части больший уровень устойчивости к заражению нематодой, чем можно было бы ожидать от супрессии либо гена нематоды, либо эндогенного гена растения по отдельности.
45. Молекула siRNA по любому из п.п.42-44, где эндогенным геном растения является ген ответа на этилен.
46. Молекула siRNA по п.45, где геном ответа на этилен является ETR1.
47. Молекула siRNA по п.46, где геном ETR1 является ETR1 сои.
48. Молекула siRNA по п.47, где ген ETR1 сои содержит SEQ ID NO:52, или комплементарную ей последовательность.
49. Молекула siRNA по п.п.42-44, 45-48, где нематода является соевой цистообразующей нематодой.
50. Молекула siRNA по п.49, где молекула siRNA содержит SEQ ID NO:3 (siRNA0097), SEQ ID NO:4 (siRNA00145), SEQ ID NO:55 (siRNA0097*) или SEQ ID NO:56 (siRNA0145*).
51. Трансгенное растение или его часть с пониженным уровнем экспрессии гена ответа на этилен по сравнению с нетрансгенным растением или его частью того же вида где трансгенное растение или его часть содержит siRNA, которая подавляет экспрессию гена нематоды-вредителя, и где трансгенное растение или его часть обладают большей толерантностью к заражению нематодным вредителем, чем можно было бы ожидать либо от пониженного уровня экспрессии гена ответа на этилен, либо от супрессии гена нематоды по отдельности.
52. Трансгенное растение или его часть по п.51, где трансгенное растение или его часть является растением сои или его частью.
53. Трансгенное растение или его часть по п.52, где нематода является соевой цистообразующей нематодой.
54. Трансгенное растение или его часть по любому из п.п.51-53, где ген ответа на этилен является геном ETR1 сои.
55. Трансгенное растение или его часть по п.54, где молекула siRNA выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:3 (siRNA0097), SEQ ID NO:4 (siRNA0145), SEQ ID NO:55 (siRNA0097*) и SEQ ID NO:56 (siRNA0145*).
56. Трансгенное растение или его часть по п.55, где уровень экспрессии гена ETR1 в трансгенном растении снижен по меньшей мере на приблизительно 30%.
57. Трансгенное растение или его часть по п.56, где большая толерантность к заражению соевой цистообразующей нематодой измеряется числом цист на корнях сои.
58. Трансгенное растение или его часть по п.57, где число цист на корнях уменьшено по меньшей мере на приблизительно 52%.
59. Способ повышения устойчивости растения или его части к заражению нематодным вредителем, включающий введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу siRNA, которая подавляет экспрессию гена нематоды, тем самым снижая способность нематоды заражать растение или его часть, где растение или его часть дополнительно обладает пониженным уровнем экспрессии гена ответа на этилен по сравнению с растением или его частью того же вида без молекулы siRNA, в результате чего растение или его часть, содержащие siRNA, обладают большей устойчивостью к заражению нематодой, чем можно было бы ожидать от супрессии гена нематоды или супрессии гена ответа на этилен по отдельности.
60. Способ по п.59, где растение или его часть является растением сои или его частью.
61. Способ по п.60, где нематода является соевой цистообразующей нематодой.
62. Способ по любому из пп.59-61, где ген ответа на этилен является геном ETR1 сои.
63. Способ по п.62, где молекулу siRNA выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:3 (siRNA0097), SEQ ID NO:4 (siRNA0145), SEQ ID NO:55 (siRNA0097*) и SEQ ID NO:56 (siRNA0145*).
64. Способ по п.63, где уровень экспрессии гена ETR1 в растении снижен по меньшей мере на приблизительно 30%.
65. Способ по п.64, где большую устойчивость к заражению соевой цистообразующей нематодой измеряют числом цист на корнях сои.
66. Способ по п.65, где число цист на корнях уменьшено по меньшей мере на приблизительно 52%.
67. Способ придания растению или его части устойчивости к нематоде, включающий осуществление в растении или его части экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу siRNA, которая подавляет экспрессию гена нематоды, и где растение или его часть являются нечувствительными к этилену, в результате чего растение или его часть становятся устойчивыми к нематоде в большей степени, чем можно было бы ожидать либо от siRNA, либо от нечувствительности к этилену по отдельности.
68. Способ снижения развития нематодных цист на корнях растения, восприимчивого к заражению нематодой, включающий введение в клетки растения или его части молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу siRNA, которая при обеспечении контакта с нематодой заставляет нематоду образовывать уменьшенное число цист на корнях растения, и где растение или его часть обладают сниженным уровнем гена ответа на этилен, в результате чего развитие цист на корнях растения понижено в большей степени, чем можно было бы ожидать либо от обеспечения контакта молекулы siRNA с нематодой, либо от пониженного уровня экспрессии растительного гена ответа на этилен по отдельности.