НАБОР СПЕЦИФИЧЕСКИХ ГИБРИДИЗАЦИОННЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНЕ ЛИЗОСОМА-АССОЦИИРОВАННОГО ПРОТЕИНА-2 (LAMP2) У ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ MLPA ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ДАНОНА
SET OF SPECIFIC HYBRIDIZATION PROBES FOR DETERMINATION OF CHANGES IN HUMAN LYSOSOME-ASSOCIATED PROTEIN-2 (LAMP2) GENE BY MLPA METHOD FOR DIAGNOSTICS OF DANONE'S DISEASE

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики, в частности, к способам определения изменений структуры гена LAMP2 и диагностике болезни Данона. Предложен набор специфических гибридизационных зондов для определения изменений в гене лизосома-ассоциированного протеина-2 (LAMP2) у человека методом MLPA. Изобретение может быть использовано:
1. Для диагностики болезни Данона при подозрении по клиническим признакам;
2. При поиске причин развития дилатационной кардиомиопатии у лиц женского пола и гипертрофической кардиомиопатии у лиц мужского пола при наличии синдрома Вольфа-Паркинсона-Уайта (PWP-синдром).
3. В научно-исследовательских целях при изучении структуры гена LAMP2 человека.
Болезнь Данона - это Х-сцепленное заболевание, характеризующееся триадой клинических признаков у мужчин: гипертрофической кардиомиопатией, скелетной миопатией и умственной отсталостью. Впервые болезнь была описана Морисом Даноном в 1981 г. у двух неродственных мальчиков [1]. Жизнеугрожающим признаком у таких пациентов является гипертрофическая кардиомиопатия, которая развивается в раннем возрасте (13,3±8,0 года) и характеризуется тяжелым течением. Признаки миопатии, поражения сердца и умственной отсталости сильно варьируют, что затрудняет диагностику по клиническим признакам [2].
У женщин, вследствие гетерозиготности мутаций в LAMP2, это заболевание характеризуется более поздней (28,9±14,2 лет) и мягкой клинической симптоматикой. Скелетная миопатия и умственная отсталость встречаются редко или выражены слабо [2]. Основным, и часто единственным, проявлением у них является дилатационная кардиомиопатия.
По современным представлениям болезнь Данона является следствием мутаций в гене LAMP2, кодирующем лизосома-ассоциированный мембранный протеин 2. У больных наблюдается дефицит этого белка и нарушение функций лизосом. Как следствие, в клетках скелетной и сердечной мускулатуры, головного мозга накапливаются вакуоли, в которых содержится большое количество гликогена [3, 4]. Это приводит к увеличению размеров клеток и их гибели. В миокарде это проявляется гипертрофией и фиброзными изменениями [3, 4, 5].
Распространенность болезни Данона до настоящего времени подробно не изучена. Это связано с тем, что причина гипертрофии миокарда из-за отложений гликогена в кардиомицитах вследствие мутации в гене LAMP2 часто остается нераспознанной. По некоторым литературным данным, изменения в LAMP2 гене встречаются у 1-5% больных с ГКМП. А частота таких кардиомиопатий составляет 2 случая на 1000 молодого взрослого населения [2]. В группе белорусских женщин, страдающих дилатационной кардиомиопатией, на долю носительниц патогенных мутаций в LAMP2 приходится 10% [9].
В клинико-генетической базе данных ClinVar NCBI в гене LAMP2 зарегистрировано 50 патогенных мутаций и 21 вероятно патогенный вариант, ассоциированных с болезнью Данона. Из них 24 делеции и 8 дупликаций, большинство (45.5%) которых имеет относительно небольшой размер - до 50 bp. На долю крупных перестроек от 50 bp до 50kb приходится 4 случая в ClinVar, что составляет 5.6%. Приведенные данные относятся только к изменениям гена LAMP2, и не касаются крупных перестроек, затрагивающих сразу несколько генов, так как они могут иметь иное фенотипическое проявление у человека.
В связи с большой долей делеций и дупликаций в этом гене и тяжести патологии целесообразно проводить поиск мутаций в нем у пациентов с подозрением на болезнь Данона. Высокочувствительным методом для выявления делеций/дупликаций является метод мультиплексной пробозависимой лигазной реакции с амплификацией (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) [6, 7, 8]. Метод MLPA основан на использовании термостабильной лигазы для лигирования олигонуклеотидных зондов, которые полностью комплементарны последовательности геномной ДНК.
MLPA включает в себя следующие этапы: денатурация геномной ДНК (или РНК), гибридизация зондов на таргетные участки, лигирование зонда, амплификация с помощью праймеров, комплементарных зондам (Фиг. 1). На фигуре 1 представлены этапы мультиплексной пробозависимой лигазной реакции с амплификацией (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA). Полученные продукты амплификации анализируют с использованием капиллярного гель-электрофореза. Детектируемый при этом уровень флуоресценции пропорционален количеству специфического продукта реакции. В случае отсутствия комплементарности (при делециях) или частичного несовпадения зондов и последовательности таргетного участка (при точечных мутациях), эффективность лигазной реакции снижается, количество амплифицированного продукта падает пропорционально, что детектируется низким уровнем флуоресценции. В случае дупликации таргетного участка, количество продукта амплификации, а, значит, и уровень флуоресценции, возрастает. Данная методика является сравнительной, для анализа ее результатов необходимы референсные зонды и образцы.
Бесспорным достоинством этого метода является возможность регистрировать различные типы изменений генов: делеции, дупликации, точечные мутации. Крупные делеции/дупликации могут захватывать протяженные мультиэкзонные области и даже целые гены. В таких случаях речь идет о копийности гена, которую трудно выявить другими методами (ПЦР, ПЦР в реальном времени, секвенированием и др.). Метод MLPA принято считать золотым стандартом в определении копийности ДНК, так называемой, Copy Number Variation - CNV. Немаловажным преимуществом метода также является его относительно низкая стоимость и высокая воспроизводимость. Метод MLPA ограничен использованием 60-ти зондов в одной реакции (в одной пробирке) и вместимостью ПНР-машины. Преимущества MLPA по сравнению с другими методами приведены в таблице 1.
Основным производителем реактивов для выполнения MLPA является компания MRC-Holland (Amsterdam, the Netherlands). Она разработала более 350 наборов для MLPA анализа самых разных генов, мутации в которых приводят к развитию генетических заболеваний человека. Они широко используются в лабораториях всего мира. Однако в списке наборов/генов не представлен ген LAMP2 и болезнь Данона.
В связи с тем, что на рынке доступны качественные реактивы для проведения MLPA от компании MRC-Holland (Amsterdam, the Netherlands), прошедшие валидацию во многих лабораториях мира, зонды для LAMP2 были сконструированы таким образом, чтобы они были совместимы с реактивами от MRC-Holland:
1) в состав LAMP2-зондов включены последовательности для связывания ПЦР-праймеров, рекомендуемых MRC-Holland. Меченые праймеры входят в состав набора SALSA MLPA EK1.
2) размеры зондов для LAMP2 подобраны таким образом, чтобы они не перекрывались с референсными зондами из набора SALSA MLPA Р200-В1 Reference-1 probemix (MRC-Holland). Референсные зонды абсолютно необходимы для контроля реакции MLPA, а именно:
- контроль количества input ДНК осуществляется по Q-фрагментам размером 64, 70, 76, 82 нуклеотидов. Они видны на гель-электрофорезе в случае, если был использован ДНК-образец в слишком малом количестве (менее 100 нг).
- контроль денатурации ДНК осуществляется по GC-богатому фрагменту JPH3up (DD) (19q24, размер 251 нуклеотид). Низкий уровень флуоресценции этого фрагмента указывает на неполную денатурацию ДНК образца, что недопустимо при анализе результатов MLPA.
- контрольные зонды для Х- и Y-хромосом, размером 208 и 239 нуклеотидов соответственно. Женский и мужской образцы имеют разную копийность этих хромосом, поэтому их уровень флуоресценции будет различаться у мужчин и женщин.
- контроль прохождения MLPA осуществляется также по референсным зондам, подобранным к разным хромосомам человека (размер фрагментов от 172 до 246 нуклеотидов). Они необходимы для нормализации результатов опытных и контрольных образцов, а также образцов из разных раундов MLPA.
Таким образом, преимуществом сконструированных ТАМР2-зондов является еще и то, что они полностью подходят под систему реактивов MRC-Holland (Amsterdam, the Netherlands) - https://www.mrcholland.com/. Это в свою очередь, дает возможность оценивать успешность MLPA гена LAMP2 одновременно по нескольким критериям.
Задача изобретения состоит в разработке высокочувствительных гибридизационных зондов к гену LAMP2 для выявления в нем делеций, дупликаций, изменения копийности методом MLPA для диагностики болезни Данона.
Поставленная задача решается путем создания зондов ко всем кодирующим экзонам гена LAMP2 на основе его референсной последовательности RefSeqGene NG_007995.1 и принципов конструирования гибридизационных зондов для MLPA, согласно которым зонды соответствуют следующим критериям:
- Каждый зонд состоит из двух олигонуклеотидов: левого и правого (Фиг. 2). На фигуре 2 представлено схематическое строение зонда с соблюдением направленности 5'->3'. Зонды и олигонуклеотиды не перекрываются. Для LAMP2 подобрано 9 таких зондов.
- Левый олигонуклеотид содержит на 5'-конце последовательность, комплементарную прямому (forward) ПЦР-праймеру, и на 3'-конце гибридизационную последовательность, комплементарную таргетному участку, которым является экзон гена LAMP2.
- Правый олигонуклеотид содержит на 3'-конце последовательность, комплементарную обратному (reverse) ПЦР-праймеру, и на 5'-конце гибридизационную последовательность, комплементарную целевому участку. Важно: последний 5'-нуклеотид правого олигонуклеотида фосфорилирован.
- Гибридизационные последовательности должны быть абсолютно комплементарны целевым участкам гена. В случае LAMP2 подобрано девять целевых участков; по одному в каждом экзоне этого гена.
- Целевые участки должны быть уникальными: не иметь псевдогенов и не содержать полиморфные локусы. Они не должны образовывать термостабильных вторичных структур типа шпилек и петель, не должны содержать большое число GC-пар. Вторичные структуры значительно снижают эффективность гибридизации, что приводит к ложным результатам. Все эти требования были учтены при подборе таргетных участков в экзонах LAMP2.
- Гибридизационные последовательности левого и правого олигонуклеотидов (в составе одного зонда) должны быть подобраны встык друг другу и не перекрываться.
- Длина гибридизационной последовательности должна быть не меньше 21 нуклеотида, предпочтительно 26-30 нуклеотидов. В случае LAMP2 их длина варьирует от 25 до 53 нуклеотидов.
- Каждый зонд имеет свой уникальный размер. Он складывается из длины двух гибридизационных последовательностей (левой и правой) и длин участков для ПЦР-праймеров (прямого и обратного). Разница между длинами разных зондов должна быть не менее 4-х нуклеотидов для успешного разделения их в капиллярном гель-электрофорезе. Идеальной считается длина от 100 до 140 нуклеотидов. В случае LAMP2 зондов подобрана следующая линейка размеров для девяти экзонов: 104, 108, 113, 119, 124, 128, 132, 138, 146.
- Tm каждой гибридизационной последовательности в отдельности ≥68°С, содержание GC ~50%, ΔG≥0.
- В левой гибридизационной последовательности допустимо присутствие не более 2-х G/C в составе последних пяти нуклеотидов на 3'-конце, который непосредственно прилегает к сайту лигирования.
- В левой и правой гибридизационных последовательностях не допустимо присутствие более 3-х G/C подряд в области, которая примыкает к участку связывания праймеров.
- Первый нуклеотид на 5'-конце левой гибридизационной последовательности влияет на силу сигнала зонда. Предпочтительно, чтобы в этой позиции находился С или G.
- Правые гибридизационные последовательности должны быть 5'-фосфорилированы.
- Олигонуклеотиды, входящие в состав зонда, не должны содержать никакой флуоресцентной метки. Только ПЦР-праймеры должны быть мечены.
Таким образом, зонды для гена LAMP2 размером 104-146 нуклеотидов сконструированы с учетом перечисленных требований. Их последовательности представлены в таблице 1.
19 первых нуклеотидов в составе всех LPO - это последовательность связывания прямого ПЦР-праймера, входящего в состав набора SALSA MLPA EK1 (MRC-Holland). 23 последних нуклеотида в составе RPO - это последовательность связывания обратного ПЦР-праймера из того же набора. В случае использования реактивов для MLPA другого производителя, эти последовательности должны быть заменены, согласно инструкции производителя.
Проведение MLPA с использованием специфических гибридизационных зондов для LAMP2 гена человека
Выделение и очистка геномной ДНК из образцов буккального эпителия проводили стандартным фенол-хлороформным методом с использованием протеиназы К для депротеинизации. Экстракция ДНК может быть произведена любым доступным методом и коммерческим набором, которые не оставляют высокие концентрации солей в растворе ДНК. Спектрофотометрические характеристики ДНК должны соответствовать принятым стандартам: 260/280 - не менее 1.8, 230/260 - не менее 1.7.
Для MLPA необходимо 50-250 нг геномной ДНК в 5 мкл реакционной смеси (оптимально 50-100 нг). ДНК-образцы должны быть растворены в ТЕ-буфере (10 mM Tris-HCl рН 8.0+0.1 mM EDTA), чтобы предотвратить депуринизацию ДНК. Метод экстракции, тип ткани, концентрация ДНК контрольных и опытных образцов должны быть одинаковыми, так как анализ результатов MLPA проводится путем их сравнения. Хранить аликвоты ДНК рекомендовано при -20°С.
Подбор образцов.
1. По меньшей мере, три разных контрольных образца должны быть включены в MLPA эксперимент. Если тестируется более 20 образцов сразу, следует увеличить количество контрольных образцов.
Подбор контрольных образцов проводили на основании отсутствия клинических признаков болезни Данона у индивидуумов. Отсутствие точечных мутаций, делеций и дупликаций в гене LAMP2 у них было предварительно определено с помощью секвенирования гена LAMP2.
2. Контрольный образец без ДНК был использован для оценки контаминации образцов.
3. Положительный контроль (образец с установленной мутацией в гене LAMP2) должен быть включен в MLPA эксперимент по возможности.
4. Исследуемыми образцами являлись мужчины и женщины с кардиомиопатиями, ЭКГ-признаками PWP-синдрома (10 человек). Требования к качеству геномной ДНК были соблюдены. Опытные и контрольные образцы были выделены одинаковым способом из буккального эпителия.
Приготовление смеси зондов
Олигонуклеотиды были синтезированы в ООО «АртБиоТех» (Минск, Беларусь), растворены в ТЕ до концентрации 1 μM каждый. Смесь зондов создавали путем смешения 0,8 мкл 1 μМ растворов олигонуклеотидов и доведением общего объема смеси до 200 мкл ТЕ-буфером.
Выполнение MLPA
MLPA выполняли в амплификаторе Bio-Rad С1000 Thermal Cycler (США) по многостадийной программе:
День 1 - денатурация и гибридизация.
Денатурацию ДНК проводили путем нагревания ДНК-образцов объемом 5 мкл (50-250 нг) в 0.2ml-пробирках (ПЦР-пробирках). Использовали следующий температурный режим: 98°С - 5 минут, 25°С - пауза. Перед изъятием образцов из амплификатора важно, чтобы они имели температуру 25°С.
Гибридизация зондов на ДНК длится не менее 16 часов. Гибридизацию выполняли с помощью набора реактивов EK-1FAM SALSA MLPA Kit (MRC-Holland, the Netherlands).
Реакционная смесь для каждой реакции (образца) состояла из:
1. MLPA буфер - 1.5 мкл
2. Смесь зондов - 0.5 мкл.
3. Смесь контрольных зондов из набора SALSA MLPA Р200-В1 Reference-1 probemix - 1.0 мкл
Эту смесь в объеме 3 мкл добавляли к каждому денатурированному образцу ДНК (объемом 5 мкл), аккуратно и медленно пипетируя. Гибридизацию проводили на амплификаторе по программе: 95°С - 1 минута, 60°С - 18 часов.
Удобно ставить гибридизацию во второй половине дня, например, в 17 часов, тогда 18-часовой период истечет в 11 часов следующего дня.
День 2 - лигазная реакция и ПЦР
Лигазную реакцию проводили с помощью лигазы и буферов к ней, входящих в состав набора SALSA MLPA EK1-FAM (MRC-Holland, the Netherlands).
Состав реакционной смеси для лигазной реакции одного образца:
1. Вода деионизированная - 25 мкл
2. Буффер А - 3 мкл
3. Буффер В - 3 мкл
4. Лигаза - 1 мкл
Смесь аккуратно и медленно перемешивали. В это время образцы должны находиться в амплификаторе и быть нагреты до 54°С. К каждому образцу добавляли 32 мкл свежеприготовленной смеси, аккуратно пипетируя. Дальнейший температурный режим: 54°С - 15 мин, 98°С - 5 мин, 20°С - пауза.
ПЦР проводили в реакционной смеси:
1. Вода деионизированная - 7.5 мкл
2. SALSA ПЦР-праймеры - 2 мкл
3. ДНК-полимераза SALSA - 0.5 мкл
Смесь аккуратно и медленно перемешивали. К каждому образцу добавляли по 10 мкл смеси для ПЦР. Температурные режим: (95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 60 с)*35 циклов, 72°С - 20 мин, 15°С - пауза.
После амплификации ПЦР-продукты могут храниться при 4°С в течение недели. При необходимости хранить дальше, рекомендуется поместить их на -25°С.
Разделение фрагментов в капиллярном электрофорезе и их анализ
Разделение фрагментов проводили на приборе ABI 3500XL (Applied Biosystems) с использованием полимера РОР-7.
Смесь для загрузки капилляра: 0.7 мкл ПЦР-продукта+0.2 мкл маркера длин LIZ GS500+9 мкл HiDi формамида. Смесь нагревали в течение 3 минут при 86°С, затем охлаждали 2 минуты при 4°С.
Результаты были проанализированы в программе Cofallyser.Net, которая находится в свободном доступе на сайте https://support.mrcholland.com/kb/articles/using-coffalyser-net и доступна для скачивания после регистрации.
Примеры промышленного применения.
Специфические гибридизационные зонды гена LAMP2 были применены для поиска изменений в этом гене у 10 пациентов с идиопатической кардиомиопатией. В результате у одного из них была обнаружена делеция в LAMP2.
Изобретение подтверждается примерами 1-4, показанными на Фигурах 3-4:
- Пример 1 - MLPA анализ отрицательного контроля (без ДНК);
- Пример 2 - MLPA анализ образца женщины без признаков болезни Данона;
- Пример 3 - MLPA анализ образца мужчины без признаков болезни Данона;
- Пример 4 - MLPA анализ образца мужчины с подозрением на болезнь Данона.
Пример 1. На фигуре 3 представлен профиль фрагментов, полученных в MLPA реакции без ДНК. Отрицательный контроль без ДНК используется в анализе для оценки контаминации опытных образцов.
Отсутствие референсных и LAMP2 фрагментов на фигуре 3 свидетельствует о чистоте проведенной реакции и отсутствии контаминации. Контрольные фрагменты 64, 70, 76, 82 нуклеотидов видны на гель-электрофорезе в случае, если в реакции использован ДНК-образец в количестве менее 100 нг.
Пример 2. Проведен MLPA-анализ контрольного ДНК-образца женщины без каких-либо признаков кардиомиопатии. Получен профиль фрагментов гена LAMP2 и референсных фрагментов. На фигуре 4 этот образец (А) представлен в сравнении с мужским образцом (Б).
Анализ полученного профиля ДНК-образца женщины:
- референсные фрагменты 64, 70, 76, 82 имеют низкие пики, что свидетельствует о подходящем количестве ДНК, использованном в анализе.
- Пол образца подтверждается высоким пиком референсного фрагмента X-хромосомы АМОТ-4(ХС) размером 208 оснований, а также отсутствием фрагмента Y-хромосомы UTY-15(YC) размером 239 н.
- Фрагмент 251 н. - JPH3up (DD) - имеет высокую интенсивность свечения, что указывает на полную денатурацию ДНК даже в GC-богатых регионах.
- Целевые фрагменты представлены 9-тью пиками, что свидетельствует об успешной гибридизации, лигировании и амплификации по всем девяти целевым последовательностям (экзонам 1-9) гена LAMP2. Фрагменты имеют интенсивность свечения RFU 10000-28000, которая будет считаться референсной в дальнейшем анализе опытных образцов.
Таким образом, MLPA-анализ продемонстрировал отсутствие перестроек (делеций, дупликаций) в гене LAMP2 в исследованном образце женщины. Никаких симптомов, указывающих на болезнь Данона или кардиомиопатию, у нее нет.
Пример 3. Проведен MLPA анализ ДНК-образца мужчины без каких-либо признаков болезни Данона. Получен профиль фрагментов этого гена и референсных фрагментов (Фиг. 4Б).
Анализ полученного профиля:
- референсные фрагменты 64, 70, 76, 82 имеют низкие пики, что свидетельствует о подходящем количестве ДНК, использованном в анализе.
- На пол образца указывает наличие пика фрагмента Y-хромосомы UTY-15(YC) размером 239 н. (высотой  относительно референсных фрагментов аутосом) и невысокий пик фрагмента Х-хромосомы АМОТ-4(ХС) размером 208 н. (относительно женского образца на фигуре 4).
- Фрагмент 251 н. - JPH3up (DD) - имеет высокую интенсивность свечения, что указывает на полную денатурацию ДНК даже в GC-богатых регионах.
- Целевые LAMP2-фрагменты имеют сниженную интенсивность свечения почти в 2 раза (RFU 6000-18000) по сравнению с женским образцом (RFU 10000-28000). Это связано с тем, что ген LAMP2 расположен в Х-хромосоме, представленной у мужчин одной копией. В случае делеции какого-либо участка гена, целевой(ые) фрагмент(ы) будет отсутствовать полностью.
Таким образом, MLPA-анализ продемонстрировал отсутствие перестроек (делеций, дупликаций) в гене LAMP2 в исследованном образце мужчины. Никаких симптомов, указывающих на болезнь Данона, у него нет. Сниженная интенсивность флуоресценции девяти LAMP2-фрагментов связана с наличием у мужчин одной копии Х-хромосомы.
Пример 4. Проведен MLPA анализ образца мужчины с подозрением на болезнь Данона. Получен профиль фрагментов гена LAMP2 и референсных фрагментов. На фигуре 5 показан результат в сравнении с контрольным образцом мужского пола (Фиг. 5).
Анализ полученного профиля:
- референсные фрагменты 64, 70, 76, 82 имеют низкие пики, что свидетельствует о подходящем количестве ДНК, использованном в анализе.
- На пол указывает наличие пика фрагмента Y-хромосомы UTY-15(YC) (высотой  относительно референсных фрагментов аутосом) и пониженный пик фрагмента X-хромосомы АМОТ-4(ХС) размером 208 нуклеотидов.
- Фрагмент 251 н. - JPH3up (DD) - имеет высокую интенсивность свечения, что указывает на полную денатурацию ДНК даже в GC-богатых регионах.
- Целевые LAMP2-фрагменты представлены 8 пиками, что соответствует только восьми экзонам гена. Полностью отсутствует пик для экзона 6 (Фиг. 5). Это указывает на делецию экзона или его части, затрагивающей область гибридизации с зондом.
Таким образом, MLPA-анализ выявил перестройку гена LAMP2 в области экзона 6 в исследованном образце мужчины. В 30 лет у данного пациента была выявлена дилатационная кардиомиопатия. Сопутствующими клиническими проявлениями были периферические мышечные нарушения и умеренная деменция. На основе клинических симптомов и результатов MLPA-анализа гена LAMP2 у мужчины была диагностирована болезнь Данона.
Изменения в районе экзона 6 гена LAMP2 были верифицированы с помощью секвенирования по Сэнгеру. В результате была выявлена делеция 4 п.н. c.864+3_864+6delGAGT, запрещающая гибридизацию зонда LP06+RP06, что отражалось в отсутствии пика флуоресценции для экзона 6. На фигуре 6 представлены результаты секвенирования района 6 экзона, демонстрирующие делецию 4 пн, где «норма» - электрофореграмма контрольного образца без каких-либо изменений в гене LAMP2, «делеция 4 пн» - электрофореграмма пациента с делецией c.864+3_864+6delGAGT.
Предложенный набор специфических гибридизационных зондов для гена LAMP2 позволяет выявлять изменения в этом гене. Он может быть использованы для диагностики болезни Данона при подозрении по клиническим признакам, а также в научно-исследовательских целях при изучении изменений структуры гена LAMP2 человека. Представленные зонды покрывают все кодирующие экзоны гена LAMP2. Их дополнительным преимуществом является то, что они совместимы с референсными зондами из коммерческого набора SALSA MLPA Р200-В1 Reference-1 probemix (MRC-Holland), что позволяет контролировать качество выполнения MLPA по нескольким параметрам. На данный момент не известно о коммерчески доступных зондах для гена LAMP2.
Источники информации:
1. Danon М.J., Oh S.J., DiMauro S., Manaligod J.R., Eastwood A., Naidu S., Schliselfeld L.H. Lysosomal glycogen storage disease with normal acid maltase. Neurology, 1981, vol. 31, no. 1, pp. 51-57. doi.org/10.1212/wnl.31.1.51
2. Charron P., Villard E., Sebillon P., Laforet P., Maisonobe Т., Duboscq-Bidot L., Romero N., Drouin-Garraud V., Richard P., Eymard В., Komajda M.  disease as a cause of hypertrophic cardiomyopathy: a systematic survey. Heart, 2004, vol. 90, no. 8, pp. 842-846. doi.org/10.1136/hrt.2003.029504
3. Tanaka Y., Guhde G., Suter A., Eskelinen E.-L., Hartmann D., Lullmann-Rauch R., Janssen P.M.L., Blanz J., von Figura K., Saftig P. Accumulation of autophagic vacuoles and cardiomyopathy in LAMP-2-deficient mice. Nature, 2000, vol. 406, no. 6798, pp. 902-906. doi.org/10.1038/35022595
4. Sugie K., Yamamoto A., Murayama K., Oh S.J., Takahashi M., Mora M., Riggs J.E., Colomer J., Iturriaga C., Meloni A., Lamperti C., Saitoh S., Byrne E., DiMauro S., Nonaka I., Hirano M., Nishino I. Clinicopathological features of genetically confirmed Danon disease. Neurology, 2002, vol. 58, no. 12, pp. 1773-1778. doi.org/10.1212/wnl.58.12.1773
5. Boucek D., Jirikowic J., Taylor M. Natural history of Danon disease. Genetics in Medicine, 2011, vol. 13, no. 6, pp. 563-568. doi.org/10.1097/gim.0b013e31820ad795
6. Yau SC, Bobrow M, Mathew CG, Abbs SJ. Accurate diagnosis of carriers of deletions and duplications in Duchenne/Becker muscular dystrophy by fluorescent dosage analysis. J Med Genet. 1996 Jul; 33(7):550-8. doi: 10.1136/jmg.33.7.550. PMID: 8818939; PMCID: PMC1050661.
7. Jan P. Schouten, Cathal J. McElgunn, Raymond Waaijer, Danny Zwijnenburg, Filip Diepvens, Gerard Pals, Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acids Research, Volume 30, Issue 12, 15 June 2002, Page e57, https://doi.org/10.1093/nar/gnf056
8. Bunyan DJ, Eccles DM, Sillibourne J, Wilkins E, Thomas NS, Shea-Simonds J, Duncan PJ, Curtis CE, Robinson DO, Harvey JF, Cross NC. Dosage analysis of cancer predisposition genes by multiplex ligation-dependent probe amplification. Br J Cancer. 2004 Sep 13; 91(6):1155-9. doi:10.1038/sj.bjc.6602121. PMID: 15475941; PMCID: PMC2747696.
9. Sivitskaya L., Vaikhanskaya Т., Danilenko N., Davydenko O., Zhelev N. LAMP2 mutations causing dilatedcardiomyopathy in women. (2021) Poster Abstracts, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 35: sup1, S120, DOI: 10.1080/13102818.2020.1871545