СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА ХОЛЕСТЕРИНА В ОРГАНИЗМЕ
METHOD FOR DETECTION OF DISTURBED CHOLESTEROL METABOLISM IN BODY

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения нарушения обмена холестерина у больных с патологией сердечно-сосудистой системы, эндокринной и других систем организма человека.
В современной медицинской литературе уделяется большое внимание изучению содержания холестерина в крови при ряде заболеваний (например, при атеросклерозе, ишемической болезни сердца, сахарном диабете, метаболическом синдроме и др.), что связано с диагностической и прогностической значимостью данного лабораторного теста. Однако на сегодняшний день имеются расхождения по принятым в практике значениям уровней общего холестерина.
В книге Климова А.Н., Никульчевой Н.Г. «Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения» (СПб.: Питер, 1999. С.129. Таблица 7) указывается, что в плазме крови здоровых взрослых людей концентрация общего холестерина составляет 3,88-6,46 ммоль/л. В справочнике для врачей (Чиркин А.А., Доценко Э.А., Юпатов Г.И. Липидный обмен. - М.: Медицинская литература, 2003. - 128 с.) на с.34 в таблице 3.4 описано, что нормальное содержание общего холестерина в крови составляет 3,65-5,20 ммоль/л. В монографии под редакцией профессора Белевитина А.Б. и профессора Щербака С.Г. «Клиническая интерпретация лабораторных исследований» (СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2006. С.122. Таблица 5.17) приводится следующая классификация уровней общего холестерина в сыворотке крови: желательный - <5,17 ммоль/л; погранично повышенный - 5,17-6,18 ммоль/л; высокий - >6,2. В тексте монографии на с.122 подчеркивается, что содержание общего холестерина в норме у взрослых <5,17 ммоль/л. В книге «Карманный справочник по диагностическим тестам» под редакцией В.С.Камышникова (М.: МЕДпресс-информ, 2004. С.76) указывается, что содержание общего холестерина в плазме крови составляет: желательные значения <5,2 ммоль/л; пограничный интервал - 5,2-6,1 ммоль/л; высокий риск развития атеросклероза - >6,2 ммоль/л. В монографии А.А.Кишкуна «Руководство по лабораторным методам диагностики» (М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. С.207. Таблица 4-25) приведены значения основных липидных показателей для взрослых людей и их взаимосвязь с риском возникновения заболеваний. Для общего холестерина сыворотки крови приводятся следующие значения в ммоль/л: референтные значения - <5,2; пограничные значения высокого риска ишемической болезни сердца (ИБС) - 5,2-6,2; высокий риск ИБС - ≥6,2.
Таким образом, в литературе по лабораторным методам исследования в клинике указывается, что содержание общего холестерина в плазме или сыворотке крови здоровых взрослых людей должно быть <5,2 ммоль/л, что принимается за норму, более высокое содержание общего холестерина является фактором риска развития атеросклероза и ИБС.
Немаловажное значение для диагностики нарушения обмена холестерина в организме имеет определение содержание его этерифицированной (ЭХС) и неэтерифицированной (НЭХС) форм.
Известен способ определения содержания ЭХС и НЭХС в сыворотке или плазме крови с использованием реакции Калиани-Златкиса-Зака (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике.- М.: МВД-пресс информ, 2004. С.521-523). Принцип способа состоит в том, что ЭХС и НЭХС экстрагируют из сыворотки или плазмы крови изопропиловым спиртом, после чего в полученном экстракте предварительно определяют содержание общего холестерина (ОХС), а перешедший в экстракт НЭХС осаждают раствором дигитонина в этиловом спирте. Концентрацию ОХС в экстракте и НЭХС в осадке определяют по реакции Калиани-Златкиса-Зака. Сущность реакции состоит в последовательном формировании в молекуле холестерина двух, трех и четырех двойных сопряженных связей в присутствии ионов трехвалентного железа, при этом максимум поглощения образовавшихся соединений сдвигается от 420 нм до 563 нм. Содержание ЭХС в пробе находят по разности уровней ОХС и НЭХС.
Недостатками данного способа являются образование сходных по молярной экстинции цветных комплексов ЭХС и НЭХС, что снижает достоверность полученных результатов; использование большого объема образца сыворотки или плазмы крови; использование для проведения анализа токсических соединений (изопропанол, ледяная уксусная кислота, концентрированные серная и ортофосфорная кислоты, ацетон), вредных для здоровья исследователя; длительность выполнения анализа; большие объемы реактивов; недостоверность получаемых результатов.
Другим способом, принятым за ближайший аналог, определения концентрации НЭХС и ЭХС в сыворотке или плазме крови является прямой метод, основанный на реакции Либермана-Бурхардта (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: «МЕД-пресс информ», 2004. С.523-525). В данном способе также предварительно измеряют содержание ОХС в сыворотке или плазме крови, после чего НЭХС осаждают раствором дигитонина в изопропаноле. Предварительное определение концентрации ОХС в сыворотке или плазме крови и НЭХС в осадке осуществляют с помощью реакции Либермана-Бурхардта: холестерин в присутствии уксусного ангидрида, смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна содержанию определяемого продукта. Содержание ЭХС в пробе находят по разности уровней ОХС и НЭХС.
К недостаткам данного способа относится неспецифичность реакции холестерина со смесью Либермана-Бурхардта. Это связано с тем, что в «жестких» условиях протекания реакции вследствие значительного выделения эндогенного тепла в химический процесс вступают многие другие компоненты сыворотки крови, кроме того НЭХС и ЭХС формируют цветные комплексы с разным коэффициентом молярной экстинции, в случае взаимодействия реагента с ЭХС оптическая плотность раствора оказывается более высокой. Это изначально вносит ошибку в исследование, исключает достоверность получаемого результата, поскольку неизвестно соотношение НЭХС/ЭХС в каждой из проб. К другим недостаткам относятся использование большого объема образца сыворотки или плазмы крови, использование для проведения анализа токсических соединений (изопропанол, ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота), длительность выполнения анализа, большие объемы реактивов.
Таким образом, известные способы определения содержания этерифицированного и неэтерифицированного холестерина в сыворотке или плазме крови с использованием реакции Калиани-Златкиса-Зака или реакции Либермана-Бурхардта (Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: «МЕД-пресс информ», 2004) обладают рядом недостатков перед предлагаемым способом, например использование для проведения анализа токсических соединений, вредных для здоровья исследователя; использование большого объема образца сыворотки или плазмы крови; длительность выполнения анализа; большие объемы реактивов. Тогда как предлагаемый способ лишен этих недостатков.
Задачами настоящего изобретения являются определение содержания этерифицированной и неэтерифицированной формы холестерина в крови (сыворотке или плазме), сокращение времени анализа, снижение стоимости определения ЭХС и НЭХС, повышение достоверности результатов.
НЭХС
ОХС
ЭХС
Сущность изобретения состоит в том, что определяют содержание неэтерифицированного холестерина (С), общего холестерина (С) и эфиров холестерина (С) в пробе сыворотки или плазмы крови.
Концентрацию эфиров холестерина определяют по формуле:
ЭХС
ОП
К
С=Е/Е* 2,585, ммоль/л,
где
ОП
Е - экстинция опытной пробы;
К
Е - экстинция калибровочной пробы;
2,585 - коэффициент.
Концентрацию неэтерифицированного холестерина определяют по формуле:
НЭХС
ОХС
ЭХС
С=С-С, ммоль/л.
ЭХС
НЭХС
За норму принимают отношение С/С=1,70-2,33 усл.ед., и чем меньше значение данного отношения, тем выше степень нарушения обмена холестерина.
ЭХС
НЭХС
ЭХС
ОХС
При значении коэффициента С/С=1,70-2,33 усл.ед. значение коэффициента эстерификации холестерина (т.е. отношение содержания эфиросвязанного холестерина к общему, С/С) составляет 0,63-0,70, что не противоречит значению коэффициента эстерификации, приводимому в книге Камышникова B.C. «Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике» (М.: МЕДпресс-информ, 2004. С.526), равному 0,6-0,8, а использование более современных методов анализа уточняет известные данные.
Техническим результатом изобретения является обеспечение достоверности определения содержания этерифицированной и неэтерифицированной формы холестерина благодаря тому, что способ выполним инструментально, оперативно, обеспечивает точность определения параметров, исключает погрешность в связи с неприменением ряда реагентов, используемых в аналогах.
Способ прост в исполнении относительно аналогов, трудозатраты сокращаются на 40-60%, снижается стоимость определения нарушения обмена холестерина в организме с использованием доступных реагентов.
Способ осуществляют следующим образом. Предварительно готовят раствор дигитонина (1 г дигитонина растворяют при нагревании в 100 мл 100 ммоль/л фосфатного буфера с pH 7,4) и рабочий раствор для определения концентрации холестерина, содержащий холестеролэстеразу (400 U/л), холестеролоксидазу (250 U/л), пероксидазу (500 U/л), хромоген (р-аминоантипирин). Далее образец сыворотки или плазмы крови разделяют на две части. В одной части энзиматическим колориметрическим способом определяют содержание ОХС. А другую часть обрабатывают следующим образом: в пробирку (опытную) вносят 0,1 мл сыворотки или плазмы крови и 0,2 мл раствора дигитонина, оставляют при температуре 20-25°С на 10 минут для полного осаждения НЭХС. Затем опытную пробирку центрифугируют в течение 5 минут при 3000 оборотов/минуту. После центрифугирования отбирают прозрачную надосадочную жидкость и проводят анализ по схеме, указанной в таблице:
Наименование проб в пробирках
Опытная проба, мл
Калибровочная проба, мл
Контрольная проба, мл
Надосадочная жидкость
0,2
-
-
Стандартный раствор холестерина
-
0,2
-
Дистиллированная вода
-
-
0,2
Рабочий раствор холестерина
2,0
2,0
2,0
Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 20-25°С в течение 5 минут. Далее измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной пробы против контрольной на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм.
ЭХС
ОП
К
ОП
К
НЭХС
НЭХС
ОХС
ЭХС
ОХС
ЭХС
НЭХС
Расчет концентрации ЭХС и НЭХС производят следующим образом: С=Е/Е*2,585, ммоль/л, где Е - экстинция опытной пробы; Е - экстинция калибровочной пробы; 2,585 - коэффициент, соответствующий концентрации холестерина в калибровочной пробе, а концентрацию НЭХС (С) определяют по формуле: С=С-С, ммоль/л, где С - концентрация общего холестерина. Далее рассчитывают коэффициент С/С. Если найденный по приведенной формуле показатель ниже 1,70 условных единиц (норма 1,70-2,33 условных единиц), то у обследуемого пациента диагностируют нарушение обмена холестерина в организме.
ЭХС
НЭХС
Для подтверждения возможности промышленной применимости описанного способа были проведены биохимические исследования плазмы крови больных, наблюдавшихся у терапевта в МУЗ Городская поликлиника №19 (г.Краснодар, ул.Офицерская, 33) с диагнозом ишемическая болезнь сердца, и клинически здорового добровольца. Биохимическое исследование крови людей включало определение уровня общего холестерина (ОХС), этерифицированного (ЭХС) и неэтерифицированного (НЭХС) холестерина с последующим расчетом коэффициента С/С по описанной методике. Анализ проводился параллельно на базе клинико-диагностической лаборатории МУЗ Городская поликлиника №19 и лаборатории клинической биохимии кафедры фундаментальной и клинической биохимии Кубанского государственного медицинского университета (заключения прилагаются) (см. приложение 1-16).
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 1. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Акопян Т.А., 56 лет. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 6,40 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,273 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,273/0,202*2,585=3,49 ммоль/л; С=6,40-3,49=2,91 ммоль/л; С/С=1,20 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 2. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Черевко Л.С., 63 года. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 5,60 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,261 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,261/0,202*2,585=3,34 ммоль/л; С=5,60-3,34=2,26 ммоль/л; С/С=1,48 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 3. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Попова В.В., 72 года. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 5,30 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,249 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,249/0,202*2,585=3,19 ммоль/л; С=5,30-3,19=2,11 ммоль/л; С/С=1,51 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 4. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Бойко Л. Д., 62 года. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 5,50 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,256 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,256/0,202*2,585=3,27 ммоль/л; С=5,50-3,27=2,23 ммоль/л; С/С=1,47 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 5. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Рыбкина И.В., 32 года. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 5,60 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,266 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,266/0,202*2,585=3,41 ммоль/л; С=5,60-3,41=2,19 ммоль/л; С/С=1,56 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 6. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Роменская Г.В., 54 года. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 5,00 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,242 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,242/0,202*2,585=3,10 ммоль/л; С=5,00-3,10=1,90 ммоль/л; С/С=1,63 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 7. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови больной, страдающей ишемической болезнью сердца (ИБС). Больная Ряузова Н.П., 87 лет. Диагноз: ИБС. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 4,00 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,183 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,183/0,202*2,585=2,34 ммоль/л; С=4,00-2,34=1,66 ммоль/л; С/С=1,41 условных единиц, что ниже нормы (норма: 1,70-2,33 усл.ед.), следовательно, у больной имеется выраженное нарушение обмена холестерина.
ОП
К
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Пример 8. Определение содержания ЭХС и НЭХС в крови здоровой женщины. Ладутько Е.А., 28 лет. Диагноз: обследование. Из локтевой вены пациентки взяли 2,0 мл крови, в качестве антикоагулянта использовали гепарин. С помощью центрифугирования отделили плазму от форменных элементов. В плазме определили содержание ОХС, что составило 4.40 ммоль/л. 1) К 0,1 мл плазмы прилили 0,2 мл раствора дигитонина в фосфатном буфере (pH 7,4) для осаждения НЭХС - опытная проба. 2) В другую пробирку внесли 0,1 мл стандартного раствора холестерола (2,585 ммоль/л) и 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,4) - калибровочная проба. 3) Опытную пробу инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего центрифугировали 5 минут при 3000 оборотах/минуту. 4) К прозрачному супернатанту, полученному после центрифугирования опытной пробы, объемом 0,2 мл прилили 2,0 мл рабочего реагента. 5) Из калибровочного раствора отобрали 0,2 мл и прилили к 2,0 мл рабочего раствора. 6) Приготовили контрольный раствор путем добавления 0,2 мл дистиллированной воды к 2,0 мл рабочего раствора. 7) После 5 минут инкубации опытной и калибровочной пробы измерили оптическую плотность опытного и калибровочного растворов против контрольного на фотоколориметре КФК-2МП в кювете с толщиной поглощающего слоя 0,5 см при длине волны 490 нм. Получили следующие результаты: Е=0,227 е.о.п.; Е=0,202 е.о.п.; С=0,227/0,202*2,585=2,90 ммоль/л; С=4,40-2,90=1.50 ммоль/л; С/С=1,93 условных единиц, что соответствует норме (норма: 1,70-2,33 усл.ед.).
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
ЭХС
НЭХС
Как показали исследования, у всех обследованных больных ИБС значение коэффициента С/С было ниже 1,70 усл.ед., тогда как концентрация общего холестерина в плазме крови превышала значение 5,17 ммоль/л только у пяти из семи больных (см. примеры 1-5). Причем значение коэффициента С/С было тем ниже, чем выше был уровень общего холестерина. Например, при концентрации ОХС=5,50 ммоль/л значение С/С составило 1,47 усл.ед (см. пример 3); тогда как при уровне ОХС=6,40 ммоль/л значение С/С=1,20 усл.ед (см. пример 1). У двух больных ИБС значение ОХС составило 4,00 и 5,00 ммоль/л (см. примеры 6 и 7), что соответствует общепринятой норме, на основании чего можно было бы сделать ложное заключение об отсутствии нарушения в обмене холестерина в организме, тогда как данные клинического обследования свидетельствовали о прогрессировании течения заболевания. Значения коэффициента С/С у описанных больных были ниже нормального (норма 1,70-2,33 усл.ед.) и составили 1,41 и 1,63 усл.ед. соответственно, на основании чего был сделан вывод о нарушении в обмене холестерина в организме. У клинически здорового добровольца (см. пример 8) содержание общего холестерина в плазме крови составило 4,40 ммоль/л, а значение коэффициента С/С=1,93 усл.ед., что соответствовало нормальным значениям.
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой диагностической ценностью, легко выполним, не наносит значительного вреда для организма лаборанта, обеспечивает повышение достоверности определения наличия нарушений в обмене холестерина в организме и может быть использован в повседневной работе клинико-диагностических лабораторий лечебно-профилактических учреждений.
Приложение №1
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент РОМЕНСКАЯ Г.В.
Пол Жен Возраст 54 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №69417
Направление №2470
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,00
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,10
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,90
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,63
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №2
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент ЛАДУТЬКО ЕЛИЗАВЕТА АЛЕКСЕЕВНА
Пол Жен Возраст 28 год/лет
Диагноз обследование
Дата поступления образца: 24.04.2009 г.
Дата исследования: 24.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
4,40
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
2,90
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,50
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,93
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №3
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент РЫБКИНА ИРИНА ВАСИЛЬЕВНА
Пол Жен Возраст 32 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 31.03.2009 г.
Дата исследования: 31.03.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,60
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,41
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,19
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,56
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №4
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент РЯУЗОВА Н.П.
Пол Жен Возраст 87 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
4,00
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
2,34
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,66
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,41
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №5
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент БОЙКО Л.Д.
Пол Жен Возраст 62 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,50
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,27
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,23
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,47
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №6
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент ПОПОВА В.В.
Пол Жен Возраст 72 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,30
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,19
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,11
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,51
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №7
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент ЧЕРЕВКО Л.С.
Пол Жен Возраст 63 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,60
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,34
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,26
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,48
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №8
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент АКОПЯН Т.А.
Пол Жен Возраст 56 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
6,40
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,49
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,91
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,20
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №9
КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра фундаментальной и клинической биохимии
Лаборатория клинической биохимии
Пациент РОМЕНСКАЯ Г.В.
Пол Жен Возраст 54 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,00
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,10
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,90
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,63
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №10
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент ЛАДУТЬКО ЕЛИЗАВЕТА АЛЕКСЕЕВНА
Пол Жен Возраст 28 год/лет
Диагноз обследование
Страховой полис СН 4304 №10639
Дата поступления образца: 24.04.2009 г.
Дата исследования: 24.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
4,40
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
2,90
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,50
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,93
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №11
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент РЫБКИНА ИРИНА ВАСИЛЬЕВНА
Пол Жен Возраст 32 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №492993
Направление №2949
Дата поступления образца: 31.03.2009 г.
Дата исследования: 31.03.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,60
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,41
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,19
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,56
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №12
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент РЯУЗОВА Н.П.
Пол Жен Возраст 87 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №48508
Направление №2458
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
4,00
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
2,34
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
1,66
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,41
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №13
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент БОЙКО Л.Д.
Пол Жен Возраст 62 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №501565
Направление №2417
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,50
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,27
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,23
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,47
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №14
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент ПОПОВА В.В.
Пол Жен Возраст 72 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 1807 №1599091
Направление №2440
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,3
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,19
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,11
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,51
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №15
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент ЧЕРЕВКО Л.С.
Пол Жен Возраст 63 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №246112
Направление №2469
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
5,60
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,34
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,26
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,48
Усл.ед.
1,70-2,33
Приложение №16
МУЗ Городская поликлиника №19
г.Краснодар, ул. Офицерская, 33.
Клинико-диагностическая лаборатория
Пациент АКОПЯН Т.А.
Пол Жен Возраст 56 год/лет
Диагноз Ишемическая болезнь сердца
Страховой полис СН 4307 №249195
Направление №2466
Дата поступления образца: 22.04.2009 г.
Дата исследования: 22.04.2009 г.
Наименование теста
Результат
Единицы измерения
Референсный интервал
Биохимия крови
Общий холестерин (ОХС)
6,40
ммоль/л
Уровень
Желательный:
<5,17
Погранично повышенный:
5,17-6,18
Высокий:
>6,2
Эфиры холестерина (ЭХС)
3,49
ммоль/л
Неэтерифицированный холестерин (НЭХС)
2,91
ммоль/л
Коэффициент ЭХС/НЭХС
1,20
Усл.ед.
1,70-2,33