СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОЗОНО-КИСЛОРОДНОЙ СМЕСИ, ВВОДИМОЙ В БРЮШНУЮ ПОЛОСТЬ, В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR SIMULATING ACTION OF DIFFERENT CONCENTRATIONS OF OZONE-OXYGEN MIXTURE INTRODUCED IN ABDOMINAL CAVITY IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной хирургии, и может быть использовано для наиболее точного и полного изучения контактного и резорбтивного воздействия озоно-кислородной смеси на тканевые и органные структуры при введении ее в брюшную полость животных в условиях нормокомпрессии, а также для нахождения безопасного и токсического диапазонов концентраций озоно-кислородной смеси.
L
L
L(min)
L
L(min)
α
α
Известен способ / Патент №2256910, G01N 33/00, G01N 33/18, БИПМ №20, 20.07.2005 / определения параметров чувствительности экспериментальных животных к токсическому действию водорастворимых химических веществ, включающий регистрацию гибели животных под действием ксенобиотика, при этом регистрируют изменение среднего времени гибели (Т) гидробионтов в зависимости от концентрации токсиканта (С), с последующим графическим определением константы летальности (К), минимального времени наступления гибели (Т) и расчетом показателя чувствительности биообъекта к токсическому действию ксенобиотика (tg) по формуле tg=K×Т. Однако данный способ рассматривает чувствительность экспериментальных животных только с позиции показателей летальности, не учитывая токсическое воздействие на внутренние органы и ткани.
3
Известен способ / Патент РФ №2341828, G09B 23/28, БИПМ №35, 20.12.2008 / моделирования отдаленной токсической энцефалопатии. Животным в течение 7 недель ежедневно по четыре часа 5 раз в неделю ингаляционным путем вводят пары металлической ртути со средней концентрацией 0,362 мг/м. При этом регистрацию полученных результатов проводят дважды в динамике постконтактного периода: 1-й срок - сразу после окончания ингаляционного воздействия нейтротоксикантом; 2-й срок - через 9 недель после окончания ингаляционного воздействия нейротоксикантом. Однако данный способ экспериментально не поясняет выбора предложенной концентрации металлической ртути, для сравнения не используют другие ее концентрации.
Наиболее близким к предлагаемому является способ / Заявка №98103686/14, А61В 17/00, А61K 33/00, БИ №34, 10.12.1999 /профилактики спаечной болезни при перитоните, заключающийся в интраперитонеальном введении протеолитических ферментов, где после купирования перитонита в послеоперационном периоде, перед введением протеолитических ферментов, проводят газацию брюшной полости озоно-кислородной смесью с концентрацией 1000-1500 мкг/л в объеме 2,5-3 л с экспозицией 15-20 мин, после чего брюшную полость через дренажи заполняют нормотермическим физиологическим раствором, насыщенным озоном в концентрации 700-1000 мкг/л в, содержащим 30-40 мг трипсина или химотрипсина в сочетании с 20000-30000 фибринолизина, в объеме 2-2,5 л, который оставляют в брюшной полости, после чего приступают к выполнению интестинального компонента терапии, заключающегося в раздувании петель тонкого кишечника путем введения озонкислородной смеси с концентрацией 500-700 мкг/л в объеме 4-4,5 л, а после экспозиции 10-15 мин кишечник освобождают от введенного газа посредством вакуум-отсоса с созданием разряжения, при этом данную процедуру повторяют каждые 15-20 мин 3-4 раза, после чего в кишечник вводят 2-2,5 л озонированного гипертермического (40-45°С) физиологического раствора с концентрацией озона 400-500 мкг/л на 30-35 мин, при этом указанный комплекс мероприятий повторяют 1-2 раза в сутки в течение 3-7 суток в зависимости от степени тяжести перитонита и предрасположенности организма к спайкообразованию. Однако данный способ не позволяет обеспечить индивидуальный подбор и контроль вводимого объема озоно-кислородной смеси, необходимого для полного ее распределения в брюшной полости без нанесения баротравмы, и не имеет экспериментального обоснования использования применяемых концентраций веществ, а также контроля эффективности профилактических мероприятий.
Задачей предлагаемого способа является оценка влияния действия различных концентраций озоно-кислородной смеси при введении ее в брюшную полость животных.
Поставленную задачу решают за счет того, что газацию брюшной полости животных проводят озоно-кислородной смесью в концентрации 40,60,80 и 100 мг/л после предварительного анестезиологического пособия и пункции брюшной полости с герметичной установкой в нее перекрытого зажимом катетера, к которому через тройник посредством двух коротких трубок с зажимами подключают механический или электронный манометр с ртутной шкалой и шприц Жане, наполненный озоно-кислородной смесью, и измеряют внутриполостное давление манометром, открывая зажимы на катетере и на трубке, ведущей к манометру, затем открывают зажим трубки, ведущей к шприцу Жане, и осуществляют медленное внутриполостное введение озоно-кислородной смеси, контролируя изменение цифр давления на манометре, при этом давление в брюшной полости доводят до величины, превышающей исходный уровень ровно на 1 мм рт.ст., после чего введение прекращают и дополнительно контролируют точность показаний манометра при закрытом зажиме трубки шприца Жане, при необходимости вводя в брюшную полость дополнительный объем озоно-кислородной смеси либо возвращая избыточный объем обратно в шприц Жане, после чего катетер герметично выводят из брюшной полости, оставляя озоно-кислородную смесь в ней, и выводят животных из эксперимента через 4 часа, на 1,3,7 и 30 сутки для каждой из исследуемых концентраций с последующим изучением внутри- и внеполостных тканевых и органных структур на макро- и микроскопическом уровне и решением вопроса о безопасности или токсичности исследуемых концентраций озоно-кислородной смеси.
Исследование можно проводить с использованием других газообразных веществ, а введение их можно осуществлять в другие полости тела с положительным давлением.
Способ проводят на лабораторных животных путем контролируемого введения различных концентраций озоно-кислородной смеси в брюшную полость с индивидуальным подбором объема вводимого газа в соответствии с объемом брюшной полости без значимого повышения давления в ней (ровно на 1 мм рт.ст.). Манипуляцию проводят для оценки действия отдельных концентраций озоно-кислородной смеси против контроля с решением вопроса об их безопасности или токсичности, однократно герметично заполняя брюшную полость животных озоно-кислородной смесью в концентрациях 40, 60, 80 и 100 мг/л, после чего газовую смесь оставляют в брюшной полости и выводят животных из эксперимента, используя для каждой концентрации несколько сроков выведения (4 часа, 1, 3, 7 и 30 суток), с последующей оценкой контактного и резорбтивного действия отдельных концентраций озоно-кислородной смеси на основании исследования внутри- и внеполостных тканевых и органных структур на макро- и микроскопическом уровне. Перед введением газовой смеси брюшную полость пунктируют с последующей герметичной установкой в нее перекрытого зажимом катетера, к которому через тройник посредством двух коротких трубок с зажимами подключают механический или электронный манометр с ртутной шкалой и нагнетающее устройство в виде шприца Жане, наполненного озоно-кислородной смесью в выбранной концентрации. Далее последовательно открывают зажимы на катетере и на трубке, ведущей к манометру, и проводят измерение внутрибрюшного давления манометром, фиксируя его показания, после чего открывают зажим трубки нагнетающего устройства и осуществляют медленное внутриполостное введение озоно-кислородной смеси, контролируя изменение цифр давления на манометре, при этом давление в брюшной полости доводят до величины, превышающей исходный уровень ровно на 1 мм рт.ст., после чего введение прекращают и дополнительно контролируют точность показаний прибора при закрытом зажиме трубки нагнетающего устройства, при необходимости посылая в полость дополнительный объем газа. В случае создания в брюшной полости давления, превышающего исходный уровень более чем на 1 мм рт.ст., избыточный объем возвращают обратно в шприц Жане. После заполнения брюшной полости озоно-кислородной смесью катетер перекрывают зажимом и выводят его из брюшной полости, сохраняя ее герметичность. Проведение всех перечисленных манипуляций осуществляют после предварительного анестезиологического пособия. Таким образом, подбирают оптимальный вводимый объем озоно-кислородной смеси с максимальным распределением ее в брюшной полости без создания избыточной компрессии на ткани и органы. При этом увеличивается чистота эксперимента, так как озон в равной мере действует на все перитонеальные образования, не искажая результаты исследования дополнительным влиянием фактора давления. Данный способ может быть использован для определения безопасности или токсичности различных концентраций и других газообразных веществ. Кроме того, исследование можно проводить и в других полостях тела с положительным давлением. Однако предлагаемый способ не применим для полостей с отрицательным давлением (плевральная полость) ввиду резкого изменения давления в них даже очень малыми объемами газов.
Моделирование действия различных концентраций озоно-кислородной смеси осуществляли на 63 здоровых кроликах породы шиншилла обоего пола, которых содержали в одинаковых условиях на стандартном пищевом и питьевом режиме. Животных готовили к эксперименту, сбривая шерсть на передней брюшной стенке и обрабатывая кожу в месте пункции растворами антисептиков, после чего область пункции ограничивали марлевыми салфетками. При проведении пункции и введении газа в брюшную полость животным давали кратковременный эфирный наркоз. Пункцию проводили при положении животного на спине по срединной линии передней брюшной стенки в нижних этажах брюшной полости между двумя продольными швами-держалками либо цапками, поднимающими брюшную стенку для исключения ранения внутренних органов пункционной иглой, предварительно рассекая кожу, подкожную клетчатку и апоневроз прямой мышцы живота до брюшины небольшим разрезом для облегчения точного проведения иглы в месте пункции. Животных распределили на 5 групп: 4 опытных группы (60 животных) и 1 контрольная группа (3 животных). По 15 особей в каждой из опытных групп получали озон в концентрации соответственно 40 мг/л, 60 мг/л, 80 мг/л и 100 мг/л, кролики контрольной группы озона не получали. После прекращения действия газообразного озона лабораторных животных выводили из эксперимента передозировкой эфира через разные сроки для оценки динамики морфологических и гистологических изменений, используя в качестве объектов образцы большого сальника, тонкого кишечника с брыжейкой, париетальной и висцеральной брюшины и спаек при их наличии. После введения оптимального объема озона перекрытый зажимом катетер убирали из брюшной полости с герметичным ушиванием разреза передней брюшной стенки, после чего по 3 кролика каждой группы были выведены из эксперимента соответственно через 4 часа, на 1, 3, 7 и на 30 сутки. При этом у животных контрольной группы на всех сроках не было выявлено каких-либо изменений в образцах как на макро-, так и на микроскопическом уровнях.
При введении кроликам озона в концентрации 40 мг/л на всех сроках исследования макроскопически не было отмечено никаких изменений органов брюшной полости, выпота в брюшной полости выявлено не было, брюшина была чистой, блестящей, петли кишечника, сальник лежали свободно, брыжейка не была изменена, спаек не обнаружено.
Микроскопически лишь через 4 часа было выявлено незначительное расширение сосудов микроциркуляторного русла тонкой кишки и сальника, что говорит об умеренной активизации местных метаболических процессов и может расцениваться как положительное влияние озона, а на всех остальных сроках образцы тканей не отличались от образцов контрольной группы животных: отека, полнокровия сосудов, тромбозов и клеточной инфильтрации не выявлено, мезотелиальный слой поврежден не был, признаков фиброза не отмечено.
При концентрации озона 60 мг/л макроскопическая картина через 4 часа включала незначительное полнокровие сосудов брыжейки и сальника без кровоизлияний в интерстиций, на 1 сутки признаки полнокровия практически не были заметны, при ревизии органов брюшной полости поверхности брюшины, серозной оболочки кишечника были влажными с выступлением небольшого количества каплей серозного экссудата, скоплений жидкости в отлогих местах обнаружено не было, на 3 сутки полнокровие сосудов, экссудация отсутствовали, поверхности органов имели физиологическую окраску, на поверхности тонкой кишки в нескольких местах обнаружен фибринозный налет без слипания петель кишки, на 7 сутки у одного животного имели место 1-2 тонких, мягких спайки петель тонкой кишки на фоне интактных органов брюшной полости, спайки легко разрывались без нарушения целостности кишечной стенки и не деформировали кишечник, на 30 сутки макроскопическая картина не отличалась от таковой у контрольных животных.
Микроскопически через 4 часа в образцах тканей имело место умеренное полнокровие сосудов микоцеркуляторного русла с образованием незначительной периваскулярной инфильтрации без наличия тромбозов, целостность мезотелиального покрова брюшины у всех животных нарушена не была. На 1 сутки сосудистая сеть оставалась расширенной и полнокровной, возникали несущественный отек и инфильтрация интерстиция клеточными элементами, преимущественно лимфоцитами и макрофагами, в большей степени проявляясь в поверхностных слоях и уменьшаясь вглубь тканей, в местах расхождения мезотелиоцитов наблюдали скопление клеточных элементов и нестойкого фибрина. На 3 сутки отек и инфильтрация интерстиция значительно уменьшились, мезотелиальные поверхности имели небольшие, редкие скопления фибрина, часть из которых в виде длинных тончайших нитей связывала листки париетальной и висцеральной брюшины, изредка обнаруживали единичные молодые фибробласты. На 7 сутки гистоструктура тканей не отличалась от интактной, при исследовании спайки петли тонкой кишки у одного кролика отмечено малое количество рыхло расположенных пучков коллагеновых волокон и фибробластов в ее составе, сосудистая сеть отсутствовала. На 30 сутки все образцы тканей не содержали каких-либо патологических изменений, явления фиброза отсутствовали как внутри срезов, так и за их пределами.
Применение озона в концентрации 80 мг/л макроскопически через 4 часа дало картину умеренного полнокровия сосудов сальника, брыжейки и стенки тонкой кишки без кровоизлияний в ткани. На 1 сутки в брюшной полости был заметен серозный выпот объемом 2-4 мл, сохранялось полнокровие сосудов брыжейки и сальника. На 3 сутки экссудация значительно уменьшилась, гиперемия исчезла, на поверхностях органов имелись фибринозные наложения, однако слипания их стенок практически не происходило. На 7 сутки экссудат в брюшной полости отсутствовал, у 2-х кроликов было выявлено несколько рыхлых, тонких висцеро-висцеральных спаек, которые хорошо разъединялись тупым путем без травмирования поверхностей органов. На 30 сутки лишь у одного кролика были диагностированы 2 висцеро-висцеральных спайки, более плотные по консистенции, которые были неплотно припаяны к стенкам кишки и не наносили серьезной травмы органам при тупом разделении.
Микроскопический анализ показал, что через 4 часа в тканях органов брюшной полости возникла выраженная сеть сосудов микроциркуляторного русла с появлением тромбов в просвете и пропотеванием плазмы в интерстиций. На 1 сутки наблюдались поверхностные дефекты мезотелиальной выстилки в виде расхождения мезотелиоцитов ввиду нарастающего интерстициального отека и отслойка погибшего мезотелия, на месте дефектов мезотелия и в окружающем интерстиции отмечены скопления лимфоцитов, макрофагов, полиморфно-ядерных нейтрофилов, нестойкий фибринозный налет на поврежденных поверхностях в виде тончайших нитей распространялся на контактирующие краевые дефекты соседних образований. На 3 сутки явления отека и клеточной инфильтрации частично стихали, фибринозные тяжи становились более прочными, уплотнялись и утолщались за счет скопления вокруг них молодых фибробластов, продуцирующих коллаген, фибриллы которого рыхло переплетали соприкасающиеся поверхности органов. На 7 сутки инфильтрация исчезала, фибриновые скопления на месте дефектов поверхностей практически полностью замещались на рыхлые, тонкие тяжи из коллагена и фибробластов с новообразованием небольшого количества капилляров и артериол и незначительным количеством лейомиоцитов. На 30 сутки количество рыхлых тяжей значительно уменьшилось, целостность мезотелиальной выстилки на всем протяжении восстанавливалась, лишь у одного животного было отмечено 2 плотных сращения из волокнистой соединительной ткани с небольшим количеством капилляров и наличием дифференцированных сосудов и незначительного количества гладкомышечных клеток, растущих из гладкомышечного слоя, спайки были равномерно покрыты слоем мезотелиоцитов, у 2-х других кроликов мезотелиальный покров регенерировал полностью, каких-либо патологических изменений в срезах диагностировано не было.
Для концентрации озона 100 мг/л макроскопически через 4 часа были характерны резкая гиперемия и полнокровие сосудов кишечника, брыжейки и сальника с расширением мелких артерий. На 1 сутки в отлогих местах брюшной полости обнаружили умеренное количество серозно-геморрагического выпота в объеме 7-10 мл на фоне неуменьшающейся гиперемии тканей и нарастающего отека. На 3 сутки экссудация уменьшалась, пастозность тканей сохранялась, поврежденные области брюшины были покрыты фибрином, местами склеены между собой. На 7 сутки экссудат в брюшной полости практически отсутствовал, у всех животных имели место рыхлые висцеро-висцеральные и висцеро-париетальные спайки, которые хорошо разъединялись тупым путем без ранения стенок органов. На 30 сутки спайки имели плотную консистенцию, при их тупом разделении травмировались припаянные органы.
На микроскопическом уровне через 4 часа в срезах было отмечено резкое полнокровие капилляров, артериол и мелких артерий с тромбозом части из них, пропотеванием плазмы и клеточных элементов и кровоизлияниями в интерстиций. На 1 сутки зафиксированы обширные и глубокие дефекты мезотелиального покрова, покрытые клетками перитонеального экссудата (макрофаги, лимфоциты, нейтрофилы), эритроцитами, нитями фибрина с полнокровием сосудов микроциркуляторного русла, отеком интерстиция, инфильтрацией его макрофагами, единичными полиморфно-ядерными нейтрофилами, лимфоидными клетками вокруг зоны дефекта. На 3 сутки имели место явные признаки начинающегося фиброза, как в отношении фибриновых мостиков, на которые садились молодые фибробласты, так и в отношении интерстиция органов, отмечалось значительное усиление васкуляризации сальника, появление молодых фибробластов. На 7 сутки значительно активизировались процессы продукции и структурирования коллагена, новообразования капилляров, артериол, мышечных клеток. На 30 сутки плотные пучки коллагеновых волокон спаек сочетались с небольшим количеством эластиновых волокон, поверхность сращений была покрыта мезотелием, фиброз от спаек уходил вглубь тканей, и их клеточный состав был более дифференцированным. Таким образом, при полном заполнении брюшной полости кролика газообразным озоном нормального давления абсолютно безопасными являются концентрации до 40 мг/л, относительно безопасными - концентрации от 40 до 60 мг/л, поверхностно повреждающими - концентрации от 60 до 80 мг/л, глубоко повреждающими - концентрации от 80 до 100 мг/л.
Предлагаемый способ позволяет полноценно оценить влияние озоно-кислородной смеси на тканевые и органные структуры внутри брюшной полости животных и за ее пределами, существенно не изменяя исходного давления в ней, и точно определить безопасные и токсические концентрации озоно-кислородной смеси.
Преимущество предлагаемого способа по сравнению с известными заключается в обеспечении индивидуального подбора и контроля вводимого объема озоно-кислородной смеси, в исключении возможности нанесения баротравмы избыточным объемом озоно-кислородной смеси либо неполного, неравномерного заполнения пространства брюшной полости при введении недостаточного объема озоно-кислородной смеси, а также в возможности эмпирически оценить характер влияния различных концентраций озоно-кислородной смеси. Кроме того, исследование можно проводить с использованием других газообразных веществ, а введение их можно осуществлять в другие полости тела с положительным давлением.