Фосфолипидная композиция доксорубицина для лечения больных раком молочной железы
PHOSPHOLIPID COMPOSITION OF DOXORUBICIN FOR TREATING PATIENTS WITH BREAST CANCER

Область техники.
Изобретение относится к области фармацевтики и представляет собой фосфолипидную композицию на основе доксорубицина в фосфолипидной матрице следующего состава, % масс: доксорубицина гидрохлорид - 0,9-1,1, фосфатидилхолин - 18-22, мальтозы моногидрат - 76,9-81,1, для лечения больных раком молочной железы, а также опухолями другой локализации. Композиция представляет собой лиофильно высушенный порошок для получения раствора для внутривенного введения, который при регидратации образует коллоидный раствор фосфолипидных наночастиц, содержащих доксорубицин, размером 10-20 нм.
Уровень техники.
Химиотерапия, наряду с хирургическим и радиотерапевтическим методами, является одним из основных методов лечения больных раком молочной железы, а также злокачественными новообразованиями другой локализации. Химиотерапия используется для снижения вероятности рецидива на ранних стадиях заболевания в схемах комбинированного лечения (адъювантная и неоадъювантная терапия) и в качестве монотерапии при лечении запущенных форм онкологических заболеваний с отдаленными метастазами и без них.
Рак молочной железы (РМЖ) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний в популяции в целом (11,5%), занимая второе место после злокачественных поражений кожи [1]. У женского населения России РМЖ является ведущей онкологической патологией (21,1%). Пик заболеваемости - 32,38-32,52% приходится на самый активный трудоспособный возраст - 40-49 лет. При этом заболеваемость РМЖ растет: в России с 2007 по 2017 год прирост заболеваемости РМЖ составил 33,38%, а риск умереть от рака молочной железы у женщин - 1,7% в 2017 г. Метастатическое поражение жизненно важных органов является основной причиной смертности при раке молочной железы.
Анализ результатов адъювантной химиотерапии, проведенный Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group, продемонстрировал ее эффективность [2], что свидетельствует о крайней актуальности дальнейшего развития химиотерапевтических методов лечения больных РМЖ, повышения их эффективности и снижения токсичности.
Арсенал химиотерапевтических препаратов для лечения больных РМЖ обширен, включает препараты различного механизма действия. Однако в результате углубленных исследований у широкого контингента больных был сделан вывод о том, что наиболее эффективными являются схемы химиотерапии, содержащие антрациклиновые антибиотики [3-5]. Механизм их действия основан на интеркаляции лекарственного средства между азотистыми основаниями двухцепочечной молекулы ДНК с образованием прочных комплексов. При этом изменяются процессы транскрипции и трансляции, то есть повреждается синтез ДНК и РНК. Результатом становится нарушение процессов жизнедеятельности клеток вплоть до ее гибели.
Доксорубицин является одним из наиболее востребованных антрациклиновых антибиотиков. Он высокоэффективен не только в лечении больных РМЖ, но и многими другими распространенными онкологическими заболеваниями: раком щитовидной железы, печени, легкого, предстательной железы, желудка, саркомами костей и мягких тканей, онкогематологическими заболеваниями [3]. Однако серьезным недостатком доксорубицина является отсутствие селективности распределения его в организме, специфичности в отношении опухоли и, как следствие, развитие серьезных побочных реакций при его применении в отношении многих органов и тканей: сердца, почек, костного мозга и других, причем именно кардиотоксичность является лимитирующим фактором, препятствующим эскалации дозы цитостатика, и, соответственно, достижению особенно высокой эффективности.
3+
Кардиомиопатия развивается в результате свободнорадикального повреждения миокарда. Свободные радикалы способны поражать многие внутриклеточные органеллы и компартменты клетки, включая клеточную мембрану, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, ДНК. В присутствии ионов железа образуются хелатные комплексы Fe- доксорубицина. Эти комплексы ускоряют реакции образования свободных радикалов и тем самым вызывают еще большее повреждение ткани миокарда [4]. Совокупность высокой эффективности и выраженной токсичности стимулирует современные исследования в направлении создания новых лекарственных форм этого антибиотика.
Одним из наиболее активно разрабатываемых подходов к созданию модифицированных лекарственных форм цитостатиков является нанофармацевтика, то есть иммобилизация терапевтически активного вещества в наночастицы.
Цель создания наноразмерных систем доставки лекарственных средств - улучшить баланс между эффективностью и токсичностью системно введенных химиопрепаратов.
В последнее десятилетие целый ряд исследований был посвящен включению доксорубицина в наночастицы на основе полимеров, липидов или их комбинаций [5].
Наиболее перспективными для транспорта лекарств являются наносистемы на основе липидов вследствие их биосовместимости и биодеградируемости. Липидная, преимущественно фосфолипидная, поверхность транспортных частиц обладает свойством афинности по отношению к фосфолипидной поверхности мембран клеток-мишеней, способствуя проникновению частиц в клетку, что было показано в работе Mussi с соавт. для твердых липидных наночастиц [6].
В настоящее время в мировой фармакопее на основе доксорубицина существует несколько официальных нанопрепаратов, разработанных с целью снижения токсического действия и повышения эффективности терапии за счет изменения фармакокинетики [7, 8].
Например, инкапсулирование доксорубицина в липосомы с присоединенным к поверхности метоксиполиэтиленгликолем (Келикс (Caelyx, Schering-Plough, США) действительно привело к снижению кардио- и нефротоксичности, однако усилились токсические реакции в виде ладонно-подошвенного синдрома [9, 10] и иммунотоксических побочных эффектов [11]
Другой препарат - инкапсулированный в липосомы доксорубицин-цитратный комплекс (Миоцет (TLC D-99, The Lyposome Company, США) оказывает менее выраженное кардиотоксическое действие, чем несвязанный доксорубицин, однако существенно сильнее подавляет костный мозг [12]. То есть, изменение фармакокинетики цитостатика за счет включения его в липосомальный контейнер приводит к снижению общей токсичности, но в отношении отдельных органов и тканей токсические реакции усиливаются.
Имеется ряд патентов на аналогичные разработки.
В патентном документе КНР CN103622912 описан способ получения липосом доксорубицина гидрохлорида и доцетаксела (или паклитаксела). Согласно технической схеме, принятой в соответствии с изобретением, растворимое в воде лекарственное средство (доксорубицина гидрохлорид) и растворимое в липидах лекарственное средство (доцетаксел или паклитаксел) инкапсулируются в липосому одновременно, в результате в образовавшейся композиции водорастворимая фракция находится во внутреннем объеме липосомы, а жирорастворимая - между двумя слоями фосфолипидных мембран липосомы.
В патентном документе КНР CN102078317 изобретение раскрывает комплекс дигидроартемизинин-фосфолипид, липосомальный препарат, его способ получения и применение. При включении в комплекс дигидроартемизинин-фосфолипид доксорубицина цитотоксичность доксорубицина возрастает.
В Европейском патентном документе ЕР1435231 раскрыты липосомы, которые образуются из раствора липидов, содержащего фосфолипид, стирол и растворитель. Липосомы могут быть нагружены терапевтическим или диагностическим агентом, в частности, доксорубицина гидрохлоридом.
Патент RU42953 раскрывает способ получения липосомальной формы доксорубицина с увеличенным временем циркуляции в крови. Липосомальная нанокапсула с доксорубицином представляет собой полую сферу, образованную двухслойной липидной оболочкой из фосфатидилхолина и димиристоилфосфатидилглицерина.
Помимо Келикса и Миоцета еще некоторые липосомальные препараты на основе доксорубицина прошли клинические испытания: Липодокс (ЗАО "Биолек", Харьков, Украина), Доксил (Doxil, Sequus Pharmaceutical, США).
Однако необходимо отметить, что присутствующие на рынке липосомальные формы доксорубицина обладают определенными недостатками, к которым относятся:
- низкая стабильность, связанная с формой выпуска в виде раствора;
- многокомпонентный состав, усложняющий технологию получения и влияющий на стоимость препарата;
- размер липосом (от 100 до 400 нм), что увеличивает вероятность «захвата» препарата ретикулоэндотелиальной системой;
- побочные реакции организма на введение препарата, связанные с присутствием ПЭГ и др.
Таким образом, актуальным является дальнейший поиск оптимального состава препарата на основе «защищенного» доксорубицина, который позволит при сохранении уровня терапевтической эффективности снизить выраженность токсических реакций и сдвинуть тем самым баланс «польза/риск» в сторону «пользы».
В этой связи особый интерес представляют фосфолипиды сои с высоким содержанием фосфатидилхолина (не менее 95%). Поскольку фосфатидилхолин - основной структурный компонент биологических мембран, попадая в организм, эффективно способствует восстановлению структуры и функции поврежденных мембран клеток, нормализации белкового, липидного и жирового обменов при различных патологических состояниях. Фосфолипиды в составе лекарственной композиции в качестве системы транспорта способствуют снижению токсичности, повышению биодоступности лекарственных соединений улучшению фармакокинетики транспортируемого лекарственного соединения.
Известна фармацевтическая композиции доксорубицина следующего состава, % масс: фосфатидилхолин растительного происхождения - 20-43%, мальтоза - 55-78% и доксорубицин - 2-8%. (патент RU2411935) Способ ее получения заключается в том, что в водном растворе мальтозы смешивают доксорубицин и фосфолипид, затем полученную грубую эмульсию пропускают через гомогенизатор (MiniLab 7.3 VH, Rannie, Дания) при давлении 800 бар, фильтруют через фильтр 0,22 мкм, разливают во флаконы вместимостью 10 мл и лиофильно высушивают. После регидратации полученной таким образом лиофильно высушенной композиции более 90% частиц в растворе имеют размер 20 нм. Доксорубицин при внутрибрюшинном введении мышам с карциномой легкого Льюис LLC в составе такой композиции активнее накапливается в ткани опухоли и эффективнее тормозит рост опухоли у мышей в сравнении со свободной субстанцией.
В настоящем изобретении для получения композиции Доксорубицина-НФ использован похожий способ и аналогичные компоненты. Однако состав (% масс.) в ней подобран таким образом, чтобы снизить содержание доксорубицина гидрохлорида, и, следовательно, уменьшить токсичность композиции в целом при сохранении ее терапевтической эффективности:
Доксорубицина гидрохлорид
0,9-1,1
Фосфатидилхолин
18-22
Мальтозы моногидрат
76,9-81,1
Композиция доксорубицина (композиция доксорубицин-НФ) представляет собой лиофилизат коллоидного раствора фосфолипидных наночастиц со встроенным в них доксорубицином размером менее 20 нм, полученного при гомогенизации в жестких условиях. При регидратации лиофилизата непосредственно используемый коллоидный раствор восстанавливает свои свойства.
При оценке терапевтической эффективности композицию Доксорубицин-НФ сравнивали с препаратом-аналогом Келикс, в котором доксорубицин инкапсулирован в пэгилированные (ПЭГ) липосомы и препаратом Доксорубицин-Тева, в котором доксорубицин находится в свободном, незащищенном состоянии. По сравнению со свободным доксорубицином преимущества композиции Доксорубицин-НФ очевидны: токсичность намного ниже, эффективность (широта терапевтического интервала) выше. Результаты экспериментов показали сопоставимую эффективность композиции Доксорубицин-НФ с препаратом Келикс. Вместе с тем, композиция Доксорубицин-НФ разработана на основе растительных фосфолипидов - нетоксичных и биосовместимых компонентов из-за своей молекулярной идентичности с собственными фосфолипидами мембран клеток организма. Отсутствие в составе разработанного препарата ПЭГа снижает токсичность, которая проявляется у людей в виде ладонно-подошвенного синдрома. Учитывая, что стоимость одного курса лечения препаратом Келикс составляет около 200000 руб, снижение этого экономического показателя лечения крайне актуально. Разработка лекарственного средства на основе предложенной в изобретении композиции Доксорубицин-НФ, по предварительной оценке, позволит снизить стоимость курса лечения до 18000-20000 руб., то есть, более, чем в 10 раз. Не менее важное преимущество разработанного отечественного препарата на основе доксорубицина, встроенного в фосфолипидные наночастицы, помимо уменьшения стоимости препарата - это возможность импортзамещения.
Включение доксорубицина в фосфолипидную матрицу и получение ультратонкой суспензии изменяет фармакокинетику цитостатика, способствует перераспределению его по компонентам крови, что обусловливает большее накопление доксорубицина в тканях опухолей у мышей и кроликов по сравнению со свободной субстанцией и, соответственно, увеличение эффективности при экспериментальной терапии опухолей. Терапевтический интервал при однократном введении композиции мышам с различными перевиваемыми опухолями, в том числе, аденокарциномой молочной железы, а также терапевтическая и антиметастатическая эффективность композиции при многократном (трехкратном) введении мышам с карциномой легкого Льюис сопоставимы с таковыми для препарата Келикс (пэгилированный липосомальный препарат - аналог) и значительно превышают эффекты препарата Доксорубицин-Тева (свободный доксорубицин, препарат сравнения). Токсические реакции и переносимость однократного и многократного введения композиции интактными лабораторными животными (мышами и крысами) сопоставимы с таковыми для препарата Келикс.
Приведенные ниже примеры демонстрируют сравнительное изучение специфической фармакологической активности на различных моделях опухолей и острого токсического действия разработанного фосфолипидного препарата Доксорубицин-НФ, пегилированного препарата Келикс и незащищенного препарата Доксорубицин-Тева.
Материалы и методы исследований
Материалы:
1. Соевый фосфолипид Lipoid S100 с содержанием фосфатидилхолина 94-96% (Lipoid GmbH, Германия);
2. Субстанция доксорубицина гидрохлорид (Омутнинская фабрика, Россия);
3. Мальтозы моногидрат (Merck, Германия);
4. Вода Milli-Q.
Исследованные лекарственные средства:
В исследовании использованы препараты сравнения на основе доксорубицина: Келикс - концентрат для приготовления раствора доксорубицина липосомального пэгилированного для внутривенного введения 2 мг/мл (ТТИ Биофарм Компани Лимитед, Китай) (табл.2) и Доксорубицин-Тева - лиофилизат для приготовления раствора доксорубицина для внутрисосудистого и внутрипузырного введения, 50 мг (Фармахеми Б.В., Нидерланды) (табл.3).
В качестве контрольного вещества (отрицательный контроль) использован изотонический (0,9%) раствор хлористого натрия в ампулах по 10 мл (ЗАО «Renewal», Россия).
Оборудование:
1. Весы Explorer Ohaus Е1В120 (OHAUS Europe, Швейцария);
2. Система очистки воды Milli-Q Biocel 230V/50HZ (Millipore, Франция);
3. Верхнеприводная мешалка RW 16 basic Package (IKA, Германия);
4. Термостат водяной GFL-1013 (Германия);
5. Микрофлюидайзер M110EH30K (Microfluidics, США);
6. Установка для фильтрации YY30 090 00, предфильтры из стекловолокна и мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore, США);
7. Бутылочный диспенсер для розлива во флаконы Vitlab genius (Vitlab, Германия);
8. Лиофильная сушка Virtis Advantage XL (Virtis, США);
9. рН-метр Mettler Toledo Seven Easy (Mettler Toledo, Швейцария);
10. Лазерный корреляционный спектрометр Zetasizer Nano series Nano-ZS (Malvern, Великобритания);
11. Патрон для ультрафильтрации Vivaspin 500 с порогом отсечения 5 кДа (Sartorius, Германия);
12. Центрифуга Eppendorf 5810 R (Eppendorf, Германия);
13. ВЭЖХ хроматограф Agilent серии 1100 с диодно-матричным детектором, колонка Eclipse XDB-C18 размером 4,6×150 мм, с дисперсностью сорбента 3,5 мкм (Agilent Technologies, США).
Лабораторные животные:
1
1. мыши-гибриды BDF [DBA/2 х C57BL/6j], самки, 6-8 недель, массой 18-20 г., получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал НЦБТ «Андреевка»);
57
6
2. мыши CBl, самки, 6-8 недель, массой 18-20 г., получены из НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Пущино).
Экспериментальные модели перевиваемых опухолей, процедура инокуляции опухоли:
1
6
1. лимфолейкоз Р388 прививали мышам BDF [DBA/2 х C57BL/6j], самкам, подкожно на боковую поверхность тела в количестве 1x10 клеток в объеме 0,1 мл среды 199; для прививки животным использовали клетки 6-8 пассажа;
57
6
2. карциному молочной железы Са755 прививали мышам линии CBl, самкам, подкожно по 50 мг опухолевой ткани на боковую поверхность тела в объеме 0,1 мл 0,9% натрия хлорида; для прививки животным использовали опухоль 6-8 генерации;
57
6
3. карциному легкого Льюис LLC прививали внутримышечно по 15 мг/мышь опухолевой ткани мышам CBl, самкам, в объеме 0,1 мл 0,9% натрия хлорида; для прививки животным использовали опухоль 6-8 генерации.
Оценка противоопухолевой эффективности воздействия
Оценку противоопухолевой эффективности лекарственного средства проводили, используя общепринятые в экспериментальной онкологии критерии для цитостатических и цитотоксических препаратов:
к
оп
к
- торможение роста опухоли по формуле: ТРО = [(V - V) / V ⋅ 100%,
оп
к
где V - объем опухоли в опытной группе; V - объем опухоли в контрольной группах.
оп
к
к
- увеличение продолжительности жизни по формуле: УПЖ = [(СПЖ - СПЖ) / СПЖ] ⋅ 100%, где СПЖоп - средняя продолжительность жизни в опытной группе; СПЖк - средняя продолжительность жизни в контрольной группах.
1
2
3
1
2
3
Объем опухоли рассчитывали по формуле: V = d ⋅ d ⋅ d ⋅ 0,52, где d, d и d - три взаимно перпендикулярных диаметра опухоли.
Критериями эффективности противоопухолевых свойств лекарственных средств, в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств, являются: ТРО ≥ 75%, УПЖ ≥ 35%.
легких
mts
Антиметастатическое действие лекарственных средств оценивали в группах с многократным введением цитостатиков с использованием критериев: частота метастазирования в легкие, величина средней массы легких с метастазами (m), величина средней массы метастазов (m), уровень торможения метастазирования (ТМ).
mts
Среднюю массу метастазов (m, мг) вычисляли по формуле:
легких оп/к
легких инт.
легких оп/к
легких инт
m - m, где m - масса легких в опытной или контрольной группах, m - масса легких интактных животных.
Торможение метастазирования (ТМ,%) вычисляли по формуле:
mts к
mts оп
mts к
mts к
mts оп
ТМ = [m - m] / m × 100%, где m - масса легких с метастазами в контрольной группе, m - масса легких с метастазами в контрольной группе.
Критерием эффективности антиметастатического действия лекарственных средств, в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть 1. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с., является: ТМ ≥ 35%.
Статистический анализ
Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m).
Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica ver. 7.0. Достоверность отличий между группами данных оценивали с применением t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни, в зависимости от числа наблюдений и характера распределения величин параметров в группе. Различия считали достоверными при р<0,05.
Пример 1. Получение и характеристика композиции Доксорубицина-НФ
118,5 г мальтозы моногидрата растворяли в 400 мл воды, 1,5 г доксорубицина растворяли в 100 мл воды. К раствору мальтозы при перемешивании добавляли сначала 30 г фосфолипида, затем приливали водный раствор доксорубицина. Доводили объем полученной первичной эмульсии до 600 мл водой и перемешивали. Первичную эмульсию подвергали 7 циклам гомогенизации на микрофлюидайзере при давлении 1000-1500 атм и температуре продукта на выходе 45-55°С. В полученной наноэмульсии доводили рН 0,1н. раствором NaOH до попадания в интервал значений от 5,5 до 7,2. Затем наноэмульсию фильтровали, фильтрат разливали во флаконы и лиофильно удаляли воду.
Содержимое флакона разводили до конечного объема 10 мл и в восстановленной наноэмульсии определяли размер частиц, содержание и процент включения доксорубицина в наночастицы, содержание фосфатидилхолина, рН. Для определения содержания доксорубицина аликвоту наноэмульсии разбавляли в 10 раз метанолом, 10 мкл полученного раствора вносили на колонку и элюировали в течение 10 мин со скоростью 0,5 мл/мин смесью 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты (А) и ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислоты (В) в режиме линейного градиента, мин (% В): 0(30)-10(90). Сигнал детектировали по поглощению при длине волны 254 нм. Время удерживания доксорубицина 6,3 мин. Количественный расчет содержания доксорубицина производили методом внешнего стандарта с использованием калибровочной зависимости концентрации лекарства от площади пика его сигнала на хроматограмме. Для определения процента включения доксорубицина в наночастицы наноэмульсию помещали в патрон для ультрафильтрации и центрифугировали. В фильтрате определяли содержание доксорубицина - оно соответствует количеству несвязавшегося с наночастицами лекарства.
Содержание фосфатидилхолина определяли с помощью ферментного набора фирмы Sentinel Diagnistics (Италия) колориметрическим методом. Результаты приведены в таблице 4.
Пример 2. Распределение доксорубицина по компонентам плазмы крови.
На рисунке 1 представлено распределение доксорубицина по компонентам плазмы крови после ее инкубации с субстанцией доксорубицина (ДОКС) и препаратом Доксорубицин-НФ (ДОКС-НФ).
Из представленных данных следует, что при инкубации плазмы в присутствии доксорубицина-субстанции большая часть лекарственного средства обнаруживается в белковой фракции (ДЛП), что, вероятно, отражает его связывание с альбумином. Для исследуемого препарата Доксорубицин-НФ доля доксорубицина в белковой фракции резко снижается (более чем в 3 раза). При этом достоверно повышается его содержание во фракциях липопротеинов. Наибольшее включение доксорубицина из препарата наблюдается во фракцию ЛВП. Небольшое количество обнаружено также во фракции ЛНП. Известно, что экспрессия ЛНП-рецепторов на клетках опухолей повышена, также имеются данные о транспорте в опухоль лекарственных средств, связанных с ЛВП [13].
Таким образом, при введении в кровь/плазму Доксорубицина-НФ и доксорубицина-субстанции за счет различного сродства к липопротеинам и белкам происходит их перераспределение по компонентам плазмы (липопротеины, белки): при введении в кровь/плазму препарата Доксорубицин-НФ доксорубицин преимущественно находится во фракции ЛВП, содержание его в этой фракции в три раз выше, чем при введении в виде доксорубицина-субстанции. Такое трехкратное увеличение содержания доксорубицина, введенного в кровь/плазму в составе фосфолипидных наночастиц, во фракции ЛВП повышает вероятность накопления лекарственного вещества в ткани опухоли.
Пример 3. Накопление доксорубицина в тканях опухоли аденокарциномы молочной железы Са755
57
6
Мышам-самкам линии CBl прививали аденокарциному молочной железы Са755, кроликам породы Шиншилла - карциному VX-2. После образования опухоли животных делили на две группы (мышей - по 9 особей в группе, кроликов - по 3) и внутривенно однократно вводили одной группе свободный доксорубицин, другой - композицию доксорубицина. Доза для мышей - 15 мг/кг, доза для кроликов - 3 мг/кг. Через 4 часа животных подвергали эвтаназии, вырезали опухоль и печень и анализировали образцы на содержание доксорубицина.
В таблице 5 приведены результаты определения доксорубицина в ткани печени и опухоли экспериментальных животных - носителей опухолей.
Приведенные данные свидетельствовали об увеличении накопления в ткани опухоли доксорубицина при его введении в составе композиции по сравнению со свободной субстанцией: для мышей - в 4,5 раза, для кроликов - в 2,5 раза (достоверность различий Р ≤ 0,05). При этом наблюдалось повышенное содержание доксорубицина в тканях опухоли по отношению к его содержанию в печени.
Пример 3. Противоопухолевая активность композиции Доксорубицин-НФ при однократном введении
При исследовании специфической - противоопухолевой - активности композиции Доксорубицин-НФ использовали образец, состав и физико-химические свойства которого представлены в таблице 1. Изучение проводили в сравнении с препаратами Келикс (табл.2) и Доксорубицин-Тева (табл.3).
Модель лимфолейкоза Р388
На модели лимфолейкоза Р388 при изучении противоопухолевого действия композиции Доксорубицина в сравнении с препаратами Келикс и Доксорубицин-Тева лекарственные средства вводили внутривенно (в/в) однократно в разовых дозах - 5 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг. Доксорубицин-Тева вводили с использованием промежуточной дозы - 12 мг/кг. Лечение начинали через 48 часов после инокуляции лимфолейкоза Р388.
Объем введения лекарственных средств в дозе X мг/кг рассчитывали следующим образом:
количество субстанции в мг для введения одной мыши: 0,00Х ⋅ m (мг/мышь);
количество субстанции в мл для введения одной мыши: (0,00Х ⋅ m)/[С] (мл/мышь);
где m - масса мыши, [С] - концентрация препарата.
Контрольное вещество вводили в объеме, соответствующем максимальной дозе лекарственного средства.
Данные по динамике роста опухолей у животных в опытной и контрольных группах представлены на рисунках 2 и 3.
Терапевтическое действие всех лекарственных форм Доксорубицина дозозависимо: композиция Доксорубицина и Доксорубицин-Тева в низкой дозе - 5 мг/кг не оказывали терапевтического противоопухолевого действия, препарат Келикс проявлял эффективность, хотя показатели его действия - ТРО и УПЖ находились почти на нижней границе эффективности, по современным критериям: ТРО=79,4% на 23 сутки наблюдения, УПЖ=35%.
Увеличение дозы лекарственных средств приводило к более выраженным терапевтическим эффектам. При дозе 10 мг/кг начинало проявляться преимущество композиции Доксорубицин-НФ по сравнению с Доксорубицином-Тева: ТРО сохранялось на одном уровне 80,0-81,2 (эффективном, по современным критериям) на протяжении всего срока наблюдения, тогда как в группе Доксорубицин-Тева колебания этого показателя значительные (83,0-65,5-76,0-50,9%) и конечное значение свидетельствовало об отсутствии противоопухолевого действия на 23 сутки наблюдения. Однако значения показателя УПЖ в этих двух группах животных были сходны и не соответствовали критерию эффективности по УПЖ (22,9 и 28,8%, соответственно, что < 35%). Келикс в дозе 10 мг/кг оказывал противоопухолевое действие, как по показателю ТРО (95,0-100% на все сроки наблюдения), так и по УПЖ (111,9%).
При дальнейшем повышении дозы лекарственных средств до 15 мг/кг эффективность композиции Доксорубицина продолжала возрастать, достигая биологически значимых значений по обоим показателям: на ранние сроки наблюдения (8-14 сутки) 93% ТРО с сохранением показателя на уровне 82,6% до конца наблюдения, УПЖ - 43,8%. Противоопухолевая эффективность Келикса продолжала оставаться на высоком уровне: ТРО≈100% и УПЖ - 145,1%.
Принципиально иная картина наблюдалась в группе животных, которым вводили препарат Доксорубицин-Тева. Несмотря на то, что ТРО сохранялось весь срок наблюдения на высоком уровне ≈90%, продолжительность жизни животных резко сократилась: УПЖ составило -6%, что свидетельствует о выраженной токсичности лечения. Уменьшение дозы Доксорубицина-Тева до 12 мг/кг привело к снижению, как терапевтического эффекта, так и токсичности: ТРО колебалось в пределах 85,2-75,5%, а УПЖ составило 23,3%.
Таким образом, сравнение биологических эффектов композиции Доксорубицина-НФ и препарата Доксорубицин-Тева свидетельствует о несомненном преимуществе композиции Доксорубицина-НФ. Как видно из графиков «доза-эффект (по ТРО)» на различные сроки наблюдения (6, 12 и 16 сутки), эффективные дозы обоих препаратов практически совпадают и находятся в пределах 10-15 мг/кг (рис. 4 и 6). Однако графики «доза - эффект (по СПЖ)» существенно различаются (рис. 5 и 7). Из данных, представленных на рисунке 5, можно заключить, что токсическая доза для композиции Доксорубицина не достигнута (>15 мг/кг), поскольку кривая не вышла на плато, а продолжает возрастать в интервале доз 10-15 мг/кг, тогда как аналогичная кривая для препарата Доксорубицин-Тева имеет максимум, соответствующий дозе 10,0 мг/кг, а дозы, выше 13,9 мг/кг являются токсическими.
Для препарата Келикс на основании графика «доза-эффект» (по ТРО) в сроки наблюдения 6,12 и 18 дней эффективные дозы находятся в интервале 5,1-15 мг/кг (рис. 8). На основании графиков «доза-эффект» (по СПЖ) токсическая доза для препарата Келикс при 15 мг/кг еще не достигнута (рис. 9).
При оценке эффекта на 6 сутки после окончания лечения широта терапевтического действия для композиции Доксорубицина составила - 9,8-15,0 мг/кг, для Доксорубицина-Тева - 8,8-10,0 мг/кг; препарат Келикс имеет самую большую широту терапевтического действия - 5,0-15,0 мг/кг. Полученные результаты коррелируют с данными литературы о терапевтической эффективности Келикса и его токсичности [14].
Модель карциномы молочной железы Са755
При исследованиях на модели карциномы молочной железы мыши Са577 композицию Доксорубицин-НФ и препараты сравнения Доксорубицин-Тева и Келикс вводили в/в однократно в разовых дозах - 8 мг/кг, 12 мг/кг и 18 мг/кг по основному действующему веществу - доксорубицину. Лечение начинали через 48 часов после инокуляции опухоли Са755.
Объем введения лекарственных средств в дозе X мг/кг и количество контрольного препарата рассчитывали, как описано в модели лимфолейкоза Р388.
57
6
На этой модели все препараты показали высокую терапевтическую эффективность ≈100% по ТРО и 90,6 - 114,3% по УПЖ (табл.6). Это, с одной стороны, характеризует Са755 как модель, высокочувствительную к доксорубицину, а с другой стороны, свидетельствует об устойчивости мышей линии С/Bl к токсическому действию доксорубицина.
Таким образом, на модели Са755 проявилась высокая противоопухолевая активность композиции Доксорубицин-НФ, но эта модель не позволила выявить преимущества или недостатки изучаемого препарата Доксорубицин-НФ.
Модель карциномы легкого Льюис
На модели карциномы легкого Льюис LLC исследуемый диапазон доз охватывал как нетоксические (6-10 мг/кг), так и токсические (12-18 мг/кг) дозы. В диапазоне нетоксических доз только композиция Доксорубицин-НФ проявила эффективность по обоим показателям (ТРО и УПЖ) при дозе 8 мг/кг (табл.6). Хотя при этой дозе значение ТРО для препарата Келикс было выше (88,2% против 62,7% для композиции доксорубицина), отмечалось УПЖ на 36,1%, что по современным критериям является показателем терапевтической эффективности лечения (УПЖ > 35%). Повышение дозы приводило к увеличению противоопухолевого действия для всех препаратов. Однако при этом за счет развития токсических реакций уменьшалась продолжительность жизни экспериментальных животных. В диапазоне токсических доз были особенно заметны различия между композицией доксорубицина и препаратом Доксорубицин-Тева. Гибель животных при введении Доксорубицина-НФ в токсических дозах (12-18 мг/кг) составляла 10-20%, тогда как при введении препарата Доксорубицин-Тева - 20-40%; УПЖ в этих группах животных различалось в 2-3 раза: 223% против 62%, 136,5% против 84,5% и 95,2% против 59,4% для доз 12, 15 и 18 мг/кг доксорубицина в композиции доксорубицина и препарате Доксорубицин-Тева соответственно. На основании выявленных различий между токсическими проявлениями с учетом их терапевтической эффективности по ТРО было установлено, что широта терапевтического интервала композиции Доксорубицин-НФ оказалась большей по сравнению с таковой для препарата Доксорубицин-Тева (10,0-12,8 мг/кг против 9,3-10,1 мг/кг) и меньшей по сравнению с препаратом Келикс (10,0-12,8 мг/кг против 8,2-12,2 мг/кг).
Пример 4. Противоопухолевая и антиметастатическая активность композиции доксорубицина при многократном введении
57
6
Мышам-самкам линии CBl, начиная с 48 ч после инокуляции опухоли карциномы легкого Льюис LLC, вводили внутривенно композицию Доксорубицин-НФ и препараты сравнения Доксорубицин-Тева и Келикс с интервалами 3, 5 и 7 суток дней в разовых дозах 6 и 8 мг/кг (курсовые дозы 18 мг/кг и 24 мг/кг соответственно). Оценивали терапевтическое (показатели ТРО и УПЖ) и антиметастатическое действие (показатель уровень торможения метастазирования (ТМ) и др.) (табл.6, 7).
Введение композиции доксорубицина в курсовой дозе 18 мг/кг было наиболее эффективным при трехдневном интервале по всем показателям: ТРО (75%), УПЖ (179%) и ТМ (51%). При этом при повышении курсовой дозы до 24 мг/кг наблюдали увеличение эффективности по ТРО (89%) и ТМ (63%). Такая же закономерность наблюдалась для препарата Келикс (ТРО - 81% и 100%; ТМ - 45% и 73% для доз 18 и 24 мг/кг соответственно). Однако в группах животных, которым вводили препарат Доксорубицин-Тева, наблюдали проявление токсичности для обеих доз.
Кроме того, согласно полученным данным, наименьшее количество метастазов наблюдали при введении трех разовых доз композиции доксорубицина 6 и 8 мг/кг с интервалом 3 суток. Количество метастазов прогрессивно нарастало при увеличении интервала до 5 и 7 суток. Такая же тенденция наблюдалась при введении препарата Келикс. При введении препарата Доксорубицин-Тева наименьшее количество метастазов отмечено при интервале между инфузиями 7 суток.
Пример 5. Острая токсичность композиции доксорубицина
1
50
Исследование проводили на мышах-гибридах F (СБА х C57Bl/6j) и аутбредных крысах обоих полов. Найденные значения LD (мг/кг) приведены в таблице 8.
Из представленных в таблице 8 данных следует, что выраженность токсических проявлений при введении композиции Доксорубицин-НФ мышам зависит от пола животного: самцы оказались более чувствительны к токсическому действию композиции, чем самки.
50
50
50
50
Сравнительное исследование острой токсичности на мышах - самках доказало, что защищенные формы доксорубицина являются менее токсичными, чем свободный доксорубицин: композиция доксорубицина (LD=31 мг/кг) характеризовалась сопоставимым токсическим потенциалом с препаратом Келикс (LD=27 мг/кг) и оказывала умеренное токсическое действие на организм животных, которое по количественному критерию (LD) было практически в 2 раза ниже чем у препарата Доксорубицин-Тева (LD=16 мг/кг).
Таким образом, композиция доксорубицина в экспериментах in vivo на животных проявила себя как эффективное средство для терапии опухолевых заболеваний, прежде всего рака молочной железы. Установлено, что доксорубицин в большей степени накапливается в ткани опухоли аденокарциномы молочной железы у мышей и кроликов по сравнению со свободной субстанцией и эффективен при терапии этой опухоли у мышей. На модели карциномы легкого Льюис показано, что терапевтический интервал при однократном введении композиции Доксорубицина-НФ шире, чем для препарата Доксорубицин-Тева, но несколько уже в области низких доз (но не высоких), чем для препарата Келикс. Выявлено также что при многократном (трехкратном) введении композиция Доксорубицин-НФ демонстрировала аналогичные по противоопухолевой и антиметастатической эффективности результаты, что и препарат Келикс, которые значимо превышали терапевтическую активность препарата Доксорубицин-Тева. Острое токсическое действие, которое оказывали композиция Доксорубицин-НФ и препарат Келикс, было сопоставимо и существенно менее выражено, чем у препарата Доксорубицин-Тева.
Включение доксорубицина в фосфолипидную матрицу и получение ультратонкой суспензии изменяет фармакокинетику цитостатика, способствует перераспределению его по компонентам крови, что обусловливает большее накопление доксорубицина в тканях опухолей у мышей и кроликов по сравнению со свободной субстанцией и, соответственно, увеличение эффективности при экспериментальной терапии опухолей. Терапевтический интервал при однократном введении композиции мышам с различными перевиваемыми опухолями, в том числе, аденокарциномой молочной железы, а также терапевтическая и антиметастатическая эффективность композиции при многократном (трехкратном) введении мышам с карциномой легкого Льюис сопоставимы с таковыми для препарата Келикс (пэгилированный липосомальный препарат - аналог) и значительно превышают эффекты препарата Доксорубицин-Тева (свободный доксорубицин, препарат сравнения). Токсические реакции и переносимость однократного и многократного введения композиции интактными лабораторными животными (мышами и крысами) сопоставимы с таковыми для препарата Келикс.
Технический результат. Разработка лекарственного препарата на основе композиции Доксорубицин-НФ существенно улучшит результаты лечения больных раком молочной железы, а также опухолями другой локализации, за счет снижения интенсивности токсических реакций на лечение (в том числе, кардиотоксичности), повышения накопления активного вещества в опухоли и увеличения терапевтического интервала доксорубицина. Отсутствие полиэтиленгликоля в составе композиции (в отличие от препарата Келикс) должно снизить выраженность ладонно-подошвенного синдрома, что значительно улучшит качество жизни больных, получающих химиотерапевтическое лечение. Внедрение отечественного препарата на основе композиции липосомального доксорубицина окажет принципиальное влияние на стоимость курса химиотерапевтического лечения, снизив его почти в 10 раз по сравнению с курсом лечения с применением Келикса.
ЛИТЕРАТУРА
1. Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность). Ред. А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. 250 с. ISBN 978-5-85502-243-8.
2. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Long-term outcomes for neoadjuvant versus adjuvant chemotherapy in early breast cancer: meta-analysis of individual patient data from ten randomised trials. Lancet Oncol 2018; 19: 27-39. http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(17)30777-5.
3. Артамонова E.В. Место пегилированного липосомального доксорубицина в терапии метастатического рака молочной железы // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2016. - Т. 12. - №. 2. - С. 35-45.
4. Rehammar JC, Jensen MB, McGale P, Lorenzen EL, Taylor C, Darby SC,  L, Wang Z, Ewertz M. Risk of heart disease in relation to radiotherapy and chemotherapy with anthracyclines among 19,464 breast cancer patients in Denmark, 1977-2005 // Radiotherapy and Oncology. - 2017. - V. 123. - №. 2. - P. 299-305. doi: 10.1016/j.radonc.2017.03.012.
5. Rao W, Wang H, Han J, Zhao S, Dumbleton J, Agarwal P, Zhang W, Zhao G, Yu J, Zynger DL, Lu X, He X. Chitosan-decorated Doxorubicin-encapsulated nanoparticle targets and eliminates tumor reinitiating cancer stem-like cells. ACS Nano. 2015; 9(6): 5725-5740. doi: 10.1021/nn506928p.
6. Mussi SV, Silva RC, Oliveira MC, Lucci CM, Azevedo RB, Ferreira LA. New approach to improve encapsulation and antitumor activity of doxorubicin loaded in solid lipid nanoparticles // European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2013. - V. 48. - №. 1.
7. Brand W, Noorlander CW, Giannakou C, Kooi MW, Park MVDZ, Vandebriel RJ, Bosselaers IEM, Scholl JHG, Geertsma RE. Nanomedicinal products: a survey on specific toxicity and side effects. Intern J Nanomed. 2017; 12: 6107-6129.
8. Vail DM, Amantea MA, Colbem GT, Martin FJ, Hilger RA, Working PK. Pegilated liposomal doxorubicin: proof of principle using preclinical animal models and pharmacokinetic studies. Semin Oncol. 2004; 31(6 suppl 13): 16-35.
9. Patil RR, Guhagarkar SA, Devarajan PV. Engineered nanocarrier of doxorubicin: a current update. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2008; 25(1): 1-61.
10. Yokomichi N, Nagasawa T, Coler-Reilly A, et al. Pathogenesis of Hand-Foot syndrome induced by PEG-modified liposomal doxorubicin. Hum Cell. 2013; 26(1): 8-18.
11. Verhoef JJ, Carpenter JF, Anchordoquy TJ, Schellekens H. Potential induction of anti-PEG antibodies and complement activation toward PEGylated therapeutics. Drug Discov Today. 2014; 19(12): 1945-1952.
12. Alphandery E, Grand-Dewyse P, Lefevre R, Mandawala C, Durand-Dubief M. Cancer therapy using nanoformulated substances: scientific, regulatory and financial aspects. Expert Rev Anticancer Ther. 2015; 15(10): 1233-1255.
13. Тертов В.В. Множественно-модифицированные липопротеиды низкой плотности, циркулирующие в крови человека // Ангиология и сосудистая хирургия. - 1999. - №5 (прил.). - С. 218-239.
14. Rafiyath SM, Rasul М, Lee В, Wei G, Lamba G, Liu D. Comparison of safety and toxicity of liposomal doxorubicin vs conventional anthracyclines: a meta-analysis. Exp Hematol Oncol. 2012; 1(1): 10.
ТАБЛИЦЫ
Мыши:С57/Bl6, самки (в группах n=10) с перевиваемой карциномой легкого Льюис LLC
Композицию Доксорубицина, Доксорубицин-Тева, Келикс вводили внутривенно через 48 часов после перевивки LLC трехкратно с интервалом 3, 5 или 7 дней в разовых дозах 6 мг/кг и 8 мг/кг (курсовые дозы 18 мг/кг и 24 мг/кг, соответственно)
Мыши:С57/Bl6, самки (в группах n=10) с перевиваемой карциномой легкого Льюис LLC
Композицию Доксорубицина и препараты Доксорубицин-Тева, Келикс вводили внутривенно через 48 часов после перевивки LLC трехкратно с интервалом 3, 5 или 7 дней в разовых дозах 6 мг/кг и 8 мг/кг (курсовые дозы 18 мг/кг и 24 мг/кг, соответственно)