Экспрессия Thy-1 (cd9o) антигена на периферических стволовых (CD34+) гемопоэтических клетках

 I I I I I I I I   тп

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспрессия Thy-1 (CD90) антигена на периферических стволовых (CD34+) гемопоэтических клетках

Л.Ю. Гоивцова, H.H. Тупицын Лаборатория иммунологии гемопоэза, отдел клинической иммунологии НИИ клинической онкологии, ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, Москва

Ключевые слова: стволовые гемопоэтические клетки, CD34, субпопуляции, Thy-1.

Резюме

Целью данного исследования явилась характеристика популяции ранних стволовых кроветворных клеток на основании экспрессии Thy-1 антигена на мобилизованных CD34+ клетках. Методом проточной цитофлуориметрии, с применением прямых флуорохромных конъюгатов моноклональных антител и с использованием двойной и тройной флуоресцентной метки охарактеризованы субпопуляции стволовой кроветворной клетки. Оценено 40 образцов продуктов афереза, полученных у 35 онкологических больных в ходе стимуляции кроветворения и сбора трансплантируемой кроветворной ткани. В большинстве случаев стволовые кроветворные клетки экспрессировали CD90 слабо и только в отдельных образцах это была отчетливая дискретная клеточная популяция. В целом пул стволовых кроветворных клеток в образцах, изученных нами, был мономорфен по экспрессии антигенов HLA-DR, CD38, CD45, преобладали миелоидно-коммитированные предшественники (CD13+, CD33+).

Средние уровни экспрессии Thy-1 антигена в исследовании составили 18,5±3,3% в пределах CD34+ клеток. Отдельные образцы демонстрировали значительную пропорцию Thy-1+CD34+ клеток (более 50,0%). Значимых корреляций количества CD90+CD34+клеток с числом стволовых клеток, экспрессирующих антигены HLA-DR, CD38, CD117, нами не получено. Установлена связь между процентным содержанием стволовых клеток, экспрессирующих Thy-1, и следующими субпопуляциями клеток CD34+CD33+(р=0,037), CD34+CD71+ (р=0,009), CD34+CD19+ (р=0,029). Данные указывают на гетерогенность иммунологического фенотипа Thy-1 + мобилизованных стволовых кроветворных клеток и возможность присутствия выраженной пропорции CD34+CD90+ клеток в трансплантируемой ткани.

Введение

В настоящее время взгляды мирового научного сообщества все чаще обращаются к тканевым негемопоэтическим аспектам трансплантации стволовых клеток. На основании широкого спектра молекулярно-биологических методов исследования проводятся попытки получить детальную характеристику различных типов стволовых клеток и установить последовательность стадий дифференцировки на ранних этапах развития клетки.

Вместе с тем, не ослабевает интерес к детальному изучению стволовой кроветворной клетки, что продиктовано возрастающими потребностями клиники. Открытие антигена, экспрессируемого на поверхности стволовой клетки и клеток-предшественниц гемопоэза [1], позволило изучать суммарный пул стволовых [С034+] клеток с использованием методов проточной цитофлуориметрии. В настоящее время методы количественного подсчета стволовых клеток в гемопоэтической ткани [костный мозг, периферическая кровь, пуповинная кровь) по числу С034+ клеток четко стандартизированы. Отработаны протоколы ауто- и алло-трансплантации кроветворной ткани, позволяющие восстанавливать кроветворение в полном объеме после введения сверхвысоких доз цитостатиков.

Вместе с открытием антигена стволовых клеток и возможностью быстрого подсчета С034+ клеток методами проточной цитофлуориметрии клиника получила четкие критерии сбора материала для полноценной трансплантации [2-8]. Однако для детальной характеристики пула стволовых кроветворных клеток данные проточной цитофлуориметрии с применением одноцветного анализа [выявление только одного антигена на мембране клеточной поверхности) оказались недостаточными.

Введение многопараметровой проточной цитофлуори-метрии [оценка экспрессии на мембране одной клетки нескольких маркеров одновременно) дало возможность качественной характеристики стволовых кроветворных клеток. В настоящее время субпопуляции стволовых кроветворных клеток охарактеризованы достаточно детально на основании экспрессии на клеточной мембране антигенов, определяющих степень зрелости клетки, направление её дальнейшей дифференцировки, а также антигенов, ассоциированных с некоторыми функциональными особенностями клеток пула стволовых кроветворных [9-12].

Прослежена связь количества различно коммитирован-ных клеток-предшественниц в трансплантируемой ткани со скоростью восстановления определенных кроветворных ростков [13-16]. Подобные данные позволяют надеяться на детальный прогноз в отношении течения посттранспланта-ционного периода восстановления кроветворения для каждого пациента.

I I I I I I

Особенно важным с этой точки зрения представляется выявление и детальная характеристика минорной фракции [менее 5%) стволовых кроветворных клеток с минимальными признаками дифференцировки, так называемой фракции ранних полипотентных стволовых клеток крови [17]. Данные стволовые клетки обеспечивают не столько быстрое, сколько устойчивое, длительное восстановление кроветворения [18, 19]. Вопрос полноты восстановления кроветворения чрезвычайно актуален в практике, поскольку, несмотря на успехи современной трансплантологии, у 10% пациентов после трансплантации наблюдается возникновение повторных отсроченных цитопений, даже при трансплантации полноценной с точки зрения количества CD34+ клеток кроветворной ткани.

Одной из наиболее легко выявляемых иммунофеноти-пических характеристик минимальной по количеству фракции ранних CD34+ стволовых клеток является экспрессия антигена Thy-1 [молекула CD90) [20, 21, 22].

Именно стволовые гемопоэтические клетки, составляющие фракцию Thy-1 позитивных клеток, способны поддерживать рост долгосрочных культур костного мозга. Данная фракция включает клетки, формирующие так называемую «область булыжника» и клетки, репопулирующие кроветворные органы при трансплантации у SCID-hu мышей [19, 23, 24]. Кроме того, большинство Thy-1 + стволовых клеток накапливают значительные количества родамина (Rh123). Указанные данные подтверждают экспрессию Thy-1 во фракции наиболее ранних стволовых кроветворных клеток.

Выраженное присутствие подобных стволовых клеток [CD34+CD90+) в трансплантируемом материале является теоретической основой полноценности восстановления всех кроветворных ростков после трансплантации CD34+ клеток. Соответственно, детальное изучение стволовой клетки с точки зрения экспрессии Thy-1 антигена представляется чрезвычайно важным.

Материалы и методы

Нами проведена оценка экспрессии антигена Thy-1 [CD90) на стволовых CD34+ клетках у 35 онкогематологи-ческих больных [детского и взрослого возраста).

Периферические стволовые гемопоэтические клетки (ПСГК) были получены методом афереза в процессе мобилизации стволовых клеток с помощью ростовых факторов [в основном, нейпоген) в сочетании с цитостатической химиотерапией. Схемы мобилизации были достаточно однотипными.

Методом проточной цитофлуориметрии с использованием двойной и тройной флуоресцентной окраски исследовано 40 образцов аферезного продукта.

При изучении субпопуляций ПСГК использованы коммерческие прямые флуорохромные конъюгаты моноклональных антител фирм Becton Dickinson (США) и Immunotech [Coulter, Франция) к следующим антигенам: CD71, CD90, HLA-DR, CD38, CD117, CD50, CD45, CD56, CD7, CD10, CD19, CD33, CD13, CD34.

Клетки цитоконцентрата освобождали от эритроцитов стандартным методом лизиса [раствор FACS Lysing solution -Becton Dickinson). Окрашивали прямыми конъюгатами моноклональных антител [МКА) к антигену CD34 [клон HPCA-2) и на втором этапе докрашивали антителами к дифференци-ровочным антигенам лейкоцитов человека, связанных в той или иной степени со стволовой кроветворной клеткой [панель указана выше).

Сбор и учет данных проводили на проточном цитометре FACSсan [Beckton Dickinson) с использованием программы Lysis II. При анализе данных учитывалось пять параметров: прямое светорассеяние - FSC [forward scatter), боковое светорассеяние - SSC [900 light/side scatter) и 3 канала

флуоресцентного сигнала. При исследовании субпопуляций стволовой клетки накапливали не менее 50 000 событий с тем, чтобы, в зависимости от процента С034+ клеток, их общее количество было не менее 200. Субпопуляции стволовых клеток изучали в узкой области анализа [в терминологии цитометрии - гейт), включающей только С034+ клетки. Уровни неспецифического связывания определялись по изотипи-ческим контролям [рис. 1).

Рис. 1. Цитограммы, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии. Выбор анализируемого гейта при характеристике субпопуляций стволовых клеток.

А - Изотипический контроль, определяющий уровни неспецифического связывания. По оси X - экспрессия !дЭ1, по оси У - гранулярность клеток; В - отражает правильность выбора гейта для сбора Сй34+ клеток. По оси X - уровни экспрессии Сй34 антигена, по оси У- гранулярность клеток. Все Сй34+ клетки включены в гейт я1; С - окончательный образец сбора стволовых клеток. Параметры те же, что и в цитограмме В, только набор клеточных событий осуществлен в гейте Й1, включающем стволовые клетки (гейт Я2) и незначительную примесь гранулоцитов (фон). Дальнейший анализ субпопуляций выполняется исключительно в гейте Я2, то есть среди Сй34+ клеток

Обработка данных осуществлялась с использованием программы WinMDI. Статистический анализ включал сравнение средних величин и корреляционный анализ.

Результаты и обсуждение

Следует сказать, что спектр экспрессии Thy-1 антигена или молекулы CD90 достаточно широк, и молекула не является специфичной только для гемопоэтических клеток-пред-шественниц. Коэкспрессия антигена вместе с CD34 обнаруживается как на фракции незрелых предшественников, так и на стромальных клетках костного мозга [22-24 ].

Антиген Thy-1 относится к иммуноглобулиновому суперсемейству и вместе с интегринами, селектинами, кадгери-нами и группой гликопротеиновых молекул CD44 составляет семейство адгезионных молекул [так называемых CAM -cellular adhesion molecule). Данные молекулы вовлекаются во взаимодействия клетка-клетка и клетка-строма и, возможно,

lililí

I I I

опосредуют феномен мобилизации стволовых кроветворных клеток в периферическую кровь [21, 25, 26].

Функции антигена Thy-1 в настоящее время не ясны, однако, высказываются предположения о вовлечении данной молекулы в регуляцию процессов пролиферации - опосредование отрицательного сигнала, приводящего к ингибиции пролиферации ранних гемопоэтических клеток-предше-ственниц [23, 24].

Данный тезис подтверждается работами, демонстрирующими, что большинство клеток, составляющих фракцию CD34+ Thy-1 +, способно обеспечивать поддержание долгосрочных культур клеток костного мозга [LTC-IC) [19, 23, 24]. Кроме того, имеются сведения о преобладании среди фракции ранних стволовых клеток [CD34+CD38-HLA-DR), таких стволовых клеток, которые экспрессируют молекулу CD90 [21]. Эти данные подтверждают факт экспрессии антигена Thy-1 на ранних этапах дифференцировки стволовой клетки и позволяют отнести CD34+CD90+ клетки к истинно стволовым, способным обеспечить устойчивое и полноценное восстановление кроветворения в случае их значительного содержания в трансплантированной ткани.

Популяция стволовых клеток, экспрессирующих Thy-1 антиген, очень незначительна, и, по данным различных исследований, составляет от 1% до 10% от всех CD34+ мобилизованных периферических стволовых гемопоэтических клеток. Интересно, что пропорция данных клеток в костном мозге и в пуповинной крови может быть более выраженной [от 3% до 25% среди всех CD34+ клеток) [24].

Иммунофенотипически фракция CD34+Thy-1 + стволовых клеток не является гомогенной, что подтверждено исследованиями изолированных CD34+ клеток. Большинство CD34+CD90+ клеток экспрессируют молекулы HLA-DR, CD38, CD33, CD45, CD54. И лишь очень незначительная часть данных клеток коэкспрессировала молекулы CD56 и CD71 [21].

Скорее всего, данная субпопуляция стволовых клеток является транзиторной для периферической крови и проявляется на достаточно ранних этапах мобилизации, поскольку пик количества CD34+ Thy-1+ клеток не совпадает по времени с пиком мобилизации CD34+ клеток [27,28].

В нашем исследовании суммарный пул ПСКГ был достаточно гетерогенен по иммунологическому фенотипу. Большинство CD34+ клеток были позитивны в отношении экспрессии антигенов CD38, HLA-DR, CD117, CD50. Преобладающее количество стволовых клеток коэкспрессировали миелоид-ные антигены CD33 и CD13, уровни экспрессии антигенов лимфоцитов были невысокими.

Средний процент CD90+ клеток среди всех CD34+ клеток в нашем исследовании составил 18,5±3,3%, что в целом соотносится с данными зарубежных исследований. Однако уровни CD90+ CD34+ клеточной фракции значительно варьировали - от 0,1 до 70,6 %. Следует сказать, что случаи высокого содержания Thy-1+ стволовых клеток в аферез-ном продукте и стимулированной периферической крови -нечастая ситуация. Так, только в 8 исследованных из 40 содержание CD34+CD90+ клеток превысило 30,0% от общего количества стволовых кроветворных клеток, и лишь в 4 случаях количество CD34+CD90+ клеток было более 50,0% среди всех клеток пула стволовых кроветворных

В отношении характера экспрессии Thy-1+ на стволовых клетках можно сказать, что большинство CD34+ клеток в нашем исследовании экспрессируют Thy-1 антиген достаточно слабо, и процентное их содержание является невысоким. Только в редких случаях они представляют собой отчетливую отдельную фракцию антиген-позитивных клеток [рис. 2А). Данный факт может быть объяснен, во-первых, спецификой применяемых мобилизационных протоколов, то

есть использованием в клинике ростовых факторов, действующих на уровне ранних миелоидных предшественников. Вместе с тем, по данным зарубежных исследователей, включение Г-КСФ в схемы стимуляции значительно повышает количество С034+С090+ клеток среди мобилизованных стволовых кроветворных клеток [15, 21]

CD 90 PE

FL2-Height

В

Рис. 2. Экспрессия CD90 на стволовых кроветворных (CD34+) клетках.

А - Присутствие дискретной фракции CD90+CD34+ клеток в цитаферезном продукте. Анализ осуществлен в пределах только CD34+ клеток. По оси ординат - CD34+ клетки, по оси абсцисс - экспрессия CD90 на стволовых CD34+ клетках

Кроме того, как уже отмечалось, возможна разница во времени стимуляции общего количества стволовых С034+клеток и фракции ранних стволовых клеток с фенотипом CD34+CD90+ [23, 27, 28].

На рис. 2А продемонстрировано присутствие отчетливой фракции CD34+ Thy-1+ клеток [область R1 - CD34+CD90+ клетки, которые составили 26,9% от общего количества CD34+ клеток). На рис. 2В показано присутствие в трансплантированной ткани значительной пропорции CD34+ клеток, слабо экспрессирующих молекулу CD90 [59,6%).

В пределах субпопуляции CD90+ стволовых клеток интенсивность экспрессии антигена стволовых клеток CD34 в большинстве случаев не была более высокой, чем для суммарного пула CD34+ клеток.

Нами отмечены также некоторые особенности характеристик светорассеяния Thy-1 + стволовых кроветворных клеток. Во всех случаях данные клетки представляли достаточно гомогенную популяцию [рис. 3, клетки, выделенные зеленым цветом) и имели низкие показатели SSC [SSC low), так же, как и большинство CD34+ клеток. Тогда как достаточно гетерогенный для пула стволовых CD34+ клеток показатель FSC [характеризует размер клетки), был более низким для Thy-1 позитивных стволовых клеток. Таким образом, популяция стволовых клеток, экспрессирующих Thy-1 антиген, представлена более мелкими клетками.

С целью детальной характеристики фракции CD34+CD90+ клеток мы сопоставили экспрессию Thy-1 антигена и экспрессию ряда дифференцировочных антигенов лейкоцитов

I I I I I I

[ЖИШ

человека на стволовых кроветворных CD34+ клетках. При этом не выявлено достоверно значимых корреляций экспрессии Thy-1 с антигенами CD38 и HLA-DR. Вместе с тем, в ряде случаев мы отмечали присутствие одновременно выраженного количества Thy-1+ и HLA-DR+ стволовых [CD34+] клеток в кроветворной ткани, так же, как и присутствие выраженной фракции стволовых CD34+ кроветворных клеток, одновременно экспрессирующих антиген Thy-1 и молекулу CD38.

Рис. 3. Параметры светорассеяния Thy-1 -позитивных стволовых клеток.

По оси ординат - параметр SSC, определяющий гранулярность клеток. По оси абсцисс - параметр FSC, определяющий размер клеток. На рисунке представлены только Сй34+клетки, зеленым цветом выделена субпопуляция CD90+CD34+, для большинства клеток которой показатель FSC имеет более низкие уровни по сравнению с остальными стволовыми кроветворными клетками (выделены красным цветом). В данном цитаферезном продукте количество CD34+CD90+ клеток составило 27,0%

Все вышесказанное подтверждает большую гетерогенность иммунологического фенотипа CD34+CD90+ клеток, а также возможность присутствия популяций CD34+HLA-DR- и CD34+CD38- в пределах фракции Thy-1+стволовых клеток, что вполне соответствует данным зарубежных исследований [20, 21]. Кроме того, значительную роль может играть и факт несоответствия времени мобилизации данных субпопуляций, однако для подтверждения этого необходимо накопление большего количества данных.

Высокодостоверные корреляции получены в отношении количества стволовых клеток, экспрессирующих Thy-1 антиген и CD34+ клеток, экспрессирующих трансферриновый рецептор CD71. Данный факт говорит о возможности одновременного присутствия в трансплантированной ткани CD34+ клеток, экспрессирующих как Thy-1 антиген, так и трансфер-риновый рецептор, молекулу CD71 [p=0,009, n=30).

Также достоверные значимые корреляции получены в отношении экспрессии ТИу-1 и одного из пан-миелоидных антигенов, молекулы С033 [р=0,037) на стволовых С034+ кроветворных клетках.

В отношении экспрессии на стволовых клетках с-кГС рецептора [С0117) и ТИу-1 антигена значимых корреляций не получено [р=0,7). Однако средние уровни С0117+ стволовых клеток составили 82,1±4,1% и в ряде образцов [где оценивалась одновременно экспрессия и С0117, и С090) содержание ТИу-1+ стволовых клеток было больше 50,0%. Данные зарубежных исследований относительно экспрессии о-к^ рецептора на С034+ ТИу-1+ клетках противоречивы. Отдельные исследования [21 ] описывают минимальное количество [не более 1,0%) С034+ ТИу-1 + клеток, коэксп-рессирующих С0117. Большинство исследований подтверждает факт одновременной экспрессии С090 и С0117 [о-к^-рецептора) на С034+ клетках [15, 19, 29].

Дальнейший набор материала, возможно, выявит более высокую частоту встречаемости субпопуляции С0117+С090+ среди мобилизованных стволовых кроветворных клеток и подтвердит факт коэкспрессии обеих молекул в пределах одной стволовой кроветворной клетки.

Нами установлен факт возможности одновременного присутствия среди мобилизованных стволовых кроветворных клеток субпопуляций С034+ клеток, экспрессирующих ТИу-1 антиген и В-клеточный антиген С019 [р=0,029). Возможность коэкспрессии В-клеточного антигена С019 и ТИу-1 антигена описана ранее в зарубежной работе [30]. Однако для подтверждения факта сосуществования двух данных антигенов на уровне одной кроветворной клетки, как и в случае с С0117, необходимы дополнительные углубленные исследования.

Заключение

Таким образом, продемонстрирована возможность присутствия среди мобилизованных стволовых клеток крови выраженного количества С034+, экспрессирующих молекулу С090, то есть популяции ранних стволовых кроветворных клеток

На основании иммунологического фенотипа ПСКГ установлена значительная гетерогенность субпопуляций стволовых клеток, экспрессирующих ТИу-1 антиген [С090) в отношении молекул Н1_А-0К С038 и с-кй: рецептора, молекулы С0117.

Факт присутствия в трансплантируемой ткани выраженного количества стволовых клеток, экспрессирующих ТИу-1 антиген, позволяет надеяться на обеспечение как быстрого, так и устойчивого восстановления кроветворения и избежать случаев повторных отсроченных цитопений при трансплантации кроветворной ткани.

Дальнейшее детальное изучение динамики поступления ТИу-1 + С034+ клеток в периферическое русло позволит выработать более оптимальные протоколы стимуляции и сбора трансплантируемой ткани, обогащенной фракцией ранних стволовых кроветворных клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Civin C.I., Strauss L.C., Brovall C. et al. Antigenic analysis of haematopoiesis III. A haematopoietic progenitor cell surface antigen defined by monoclonal antibody reside against KG-1 cells. J. Immunol. 1984; 133: 157-65.

2. Siena S., Bregni M., Brando B. et.al. Flow cytometry for clinical estimation of circulating hematopoietic progenitors for autologous transplantation in cancer patients. Blood 1991 ; 77: 400-9.

3. Zimmerman T.M., Lee W.J., Bender J.G. et al. Quantitative CD34+ analysis may be used to guide peripheral blood stem cell harvest. Bone Marrow Transplant. 1995; 9: 439-44.

4. Bender J.G., To L.B., Williams S. et al. Defining a therapeutic dose of peripheral blood stem cells. J. Hematother. 1992; 1:329-41.

5. Sutherland D.R., Anderson L., Keeney M. et al. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometryJ. Haematother. 1996; 5: 213-26.

6. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I. CD34: structure, biology and clinical utility. Blood 1996; 87: 1-13.

7. Brecher M.E., Sims L., Schmitz J. et al. North American Multicenter study on flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic cells. J. Hematother. 1996; 5:227-36.

8. Baech J., Johnsen N.E. Technical aspects and clinical impact of hematopoietic progenitor subset quantification. Stem cells, 2000; 18:76-86.

9. Bender J.G., Unverzagt K.L., Walker D.E. et al. Identification and comprasion of CD34-positive cells and thier subpopulation from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry. Blood 1991; 77: 2122-6.

10. Andreeva L.Yu., Tupitsyn N.N. Tissue Antigen, the 7-th Workshop and Conference on HLDA-7; 2000: 55(1): 96.

11. Pierelli L., Teofili L., Menichella G. et al. Further investigations on the expression on HLA-DR, CD33 and CD13 surface antigens in purified bone marrow and peripheral blood CD34+ haematopoietic progenitor cells. Br. J. Haematol. 1994; 84: 24-30.

12. Андреева Л.Ю., Тупицын H.H. Субпопуляции периферических стволовых гемопоэтических клеток (ПСГК): Проточно-цитофлуориметрическая

тттт

идентификация ПСГК на основании светорассеяния и экспрессии CD34, CD45, AC1 33. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2002; 1: 60-5.

13. Stewart D.A., Guo D., Luider J. Factors predicting engraftment of autologous blood stem cells: CD34+ subset inferior to the total CD34+ cell dose. Bone Marrow translpant. 1999; 23:1237-40.

14. Knudsen L.M., Jensen L., Jarlbaek L. et. al. Subset of CD34+ haematopoietic progenitor and plateled recovery after high dose chemotherapy and peripheral blood stem cell transplantation., Haematologyca 1999; 84: 517-24.

15. To L.B., Haylock D.N., Dowse P.J. A comparative study of phenotype and proliferative capacity of peripheral blood (PB) CD34+ cells mobilized by four different protocols and those of steady -phase PB and bone marrow CD34+ cells. Blood 1994; 84: 2930-9.

16. Derksen M.W., Rodenhuis S., Dirkson M.K.A. Subset of CD34+ cells and rapid haematopoietic recovery after peripheral-blood stem cell transplantation. J. Clin. Oncol. 1995; 13:1922-32.

1 7. Udomsakdi C., Landsdorp P.M., Hogge D.E. et.al. Characterization of primitive haematopoietic cells in normal human peripheral blood. Blood 1992; 80:2513-7.

1 8. Lanza F., Companioni A., Moretti S. et al. CD34 cell subset and longterm culture colony-forming cells evaluated on both autologous and normal bone marrow stroma predict long-term haematopoietic engraftment in patients undergoing autologous peripheral blood stem cell transplantation. Exp. Haematol. 2001; 29: 1484-93.

19. Mayani H., Lansdorp P.M. Thy-1 expression is linked to functional properties of primitive haematopoietic progenitor cells from human umbilical cord blood. Blood 1994; 83:2410-5.

20. Terstappen L.W.M.M., Huang S., Safford M., Lansdorp P.M. Sequential generation of haematopoietic colonies derived from single non- lineage-commited

CD34+CD38- progenitor cells. Blood 1991; 76: 1218.

21. Humeau L., Bardini L., Maroc C. Phenotypic, molecular and functional characterisation of human peripheral blood CD34+/Thy-1+ cells. Blood 1996; 87: 949-55.

22. Murrey L., Chen B., Galy A. et.al. Enrichment of human haematopoietic stem cell activity in the CD34+Thy-1 + lin- subpopulation from mobilized peripheral blood. Blood 1995; 85: 368-78.

23. Graig W., Kay R., Cutler R.L. Expression of Thy-1 antigen on human haematopoietic progenitor cells. J. Exp. Med. 1 993; 177:1 331 -42.

24. Lansdorp P.M. CD90 claster workshop report. Leukocyte Typing V. Oxford: University Press; 1995; 976-8.

25. Simmons P.J., Zannettino A., Gronthos S., Potential adhesion mechanisms for localisation of haematopoietic progenitors to bone marrow stroma. Leuk. Lymphoma. 1994; 1 2: 353-63.

26. Murrey L., Testa N., Swindell R. et al. Enrichment of human hematopoietic stem cell activity in the CD34+Thy- 1 +Lin- subpopulation from mobilized peripheral blood. Blood 1995; 85: 368-378.

27. Haas R., Mohle R., Murea S. et al. Characterisation of peripheral blood progenitor cells mobilised by cytotoxic chemotherapy and recombinant granulocyte colony-stimulatig factor. J. Haematother. 1 994; 3: 323-30.

28. Stewart A.K., Kreating I.A., Anania S. et.al. Optimising the CD34+ and Thy-1+ stem cells content of peripheral blood collections. Exp. Haematol. 1995; 23:1619-27.

29. D'Arena G., Musto P., Cascavilla N. et al. Thy-1 (CD90) and c-kit receptor (CD11 7) expression on CD34+ haematopoietic progenitor cell: a five dimension flow cytometry study. Haematologyca 1998; 83: 587-92.

30. Tong J., Hoffnam R., Siena S. et al. Characterization and quantitation of primitive haematopoietic progenitor cells present in peripheral blood autografts. Exp. Haematol., 1994, 22: 101 6-21.

A