Способ получения водного экстракта листьев кипрея узколистного Epilobium angustifolium L., проявляющего ингибирующую активность против коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2-го типа in vitro
METHOD FOR OBTAINING AN AQUEOUS EXTRACT OF FIREWEED LEAVES EPILOBIUM ANGUSTIFOLIUM L., WHICH EXHIBITS INHIBITORY ACTIVITY AGAINST SARS-CoV-2 CORONAVIRUS AND HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 2 IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и медицине, в частности к способу получения водного экстракта ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.), который эффективно ингибирует in vitro репликацию коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа.
В связи с непрекращающимися волнами коронавирусной инфекции в дополнение к разработкам вакцин против SARS-CoV-2 по-прежнему существует острая потребность в безопасных и эффективных средствах профилактики и лечения этой новой болезни, а также ее осложнений. Применение таких препаратов как дексаметазон, хлорохин, гидроксихлорохин, ремдесивир, фавипиравир, лопинавир/ритонавир, ивермектин и тоцилизумаб, вызывает побочные эффекты различной степени тяжести, а также нарушения функций сердечно-сосудистой системы и печени [Chiu M.N., Bhardwaj М., Sah S.P. Safety profile of COVID-19 drugs in a real clinical setting. Eur J Clin Pharmacol. 2022 Jan 28; 1-21. doi: 10.1007/s00228-021-03270-2]. Кроме того, на фоне глобального распространения вновь появляющихся новых генетических вариантов SARS-CoV-2 появились сообщения о том, что иммуносупрессивная терапия с использованием кортикостероидов и блокаторов цитокинов для контроля синдрома «цитокинового шторма» в тяжелых случаях коронавирусной болезни повышает риск проявления оппортунистических инфекций, вызванных различными микроорганизмами, включая герпесвирусы (Herpes Viruses, HSVs) разных видов, например, цитомегаловирус (Cytomegalovirus, CMV) или вирусы простого герпеса (Herpes Simplex Virus, HSV) [Abdoli A., Falahi S., Kenarkoohi A. COVID-19-associated opportunistic infections: a snapshot on the current reports. Clin Exp Med. 2021 Aug 23; 1-20. doi: 10.1007/s10238-021-00751-7; Franceschini E., Cozzi-Lepri A., Santoro A., Bacca E., Lancellotti G., Menozzi M., Gennari W., Meschiari M., Bedim A., Orlando G. et al. Herpes Simplex Virus Re-Activation in Patients with SARS-CoV-2 Pneumonia: A Prospective, Observational Study. Microorganisms. 2021 Sep 7; 9 (9): 1896. doi: 10.3390/microorganisms9091896].
Вирус простого герпеса 2 типа (далее - HSV-2) вызывает рецидивирующие болезненные поражения гениталий, [Treml J.,  М.,  K.,  М., Kubatka P., Hassan Sherif T.S. Natural Products-Derived Chemicals: Breaking Barriers to Novel Anti-HSV Drug Development Viruses. 2020 Jan 29; 12 (2): 154. doi: 10.3390/v12020154], может передаваться при родах от матери к младенцу с тяжелыми последствиями для него [Egan K.Р., Wu S., Wigdahl В., Jennings S.R. Immunological control of herpes simplex virus infections. J. Neurovirol. 2013; 19: 328-345. doi: 10.1007/s13365-013-0189-3], в значительной степени связан с повышенным риском приобретения и передачи вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV). Появление устойчивых к лекарственным препаратам штаммов HSV-2 определяет острую необходимость в разработке новых противогерпетических препаратов с различными механизмами действия. Известные противовирусные препараты (ацикловир и родственные ему синтетические нуклеозидные аналоги, а также ингибиторы ДНК-полимеразы) обычно используются для предотвращения, сокращения или уменьшения тяжести реактивации латентных герпесвирусов. В последнее время сообщается о некоторых ограничениях использования этих препаратов, в основном связанных как с их долгосрочной токсичностью, так и вирусной резистентностью [Whitley R., Baines J. Clinical management of herpes simplex virus infections: Past, present, and future. F1000 Res. 2018 doi: 10.12688/f1000research.l6157.1.; Garber A., Barnard L., Pickrell C. Review of Whole Plant Extracts With Activity Against Herpes Simplex Viruses In Vitro and In Vivo. J Evid Based Integr Med. Jan-Dec 2021; 26: 2515690X20978394. doi: 10.1177/2515690X20978394]. Идет постоянный поиск альтернативной или дополнительной стратегии в лечении герпесвирусной инфекции. Исследуются вещества, способные ингибировать репликацию HSV-2 in vitro с эффективностью, сравнимой с эффективностью референтного антигерпетического препарата ацикловира [Luganini А., Sibille G., Mognetti В., Sainas S., Pippione A.C., Giorgis M., Boschi D., Lolli M.L., Gribaudo G. Effective deploying of a novel DHODH inhibitor against herpes simplex type 1 and type 2 replication. Antiviral Res. 2021 Mar 11; 189: 105057. doi: 10.1016/j.antiviral.2021.105057].
Исследование вирус-ингибирующих (противовирусных) свойств природных веществ растительного происхождения может стать прогрессом в поиске эффективных средств альтернативного или дополнительного лечения как при COVID-19 [Mhatre S., Srivastava Т., Naik S., Patravale V. Antiviral activity of green tea and black tea polyphenols in prophylaxis and treatment of COVID-19: A review. Phytomedicine. Phytomedicine. 2021 May; 85: 153286. Doi: 10.1016/j.phymed.2020.153286. Epub 2020 Jul 17], так и герпесвирусных инфекциях, в том числе вызываемых HSV-2, против которых на сегодняшний день не существует эффективной вакцины [Aschner С.В., Herold B.C. Alphaherpesvirus Vaccines. Curr Issues Mol Biol. 2021; 41: 469-508. doi: 10.21775/cimb.041.469].
Известны средства растительного происхождения, блокирующие развитие инфекции COVID-19. Так, китайскими учеными обнаружено, что некоторые природные вещества, например, полифенольные соединения катехина (Catechins) листьев или корней некоторых растений проявляют высокое сродство к связыванию с рекомбинантной вирусной протеазой PLpro SARS-CoV-2, что предполагает потенциальную полезность этих соединений в лечении при COVID-19 [Wu С., Liu Y., Yang Y., Zhang P., Zhong W., Wang Y., Wang Q., Xu Y., Li M., Li X., Zheng M., Chen L., Li H. Analysis of therapeutic targets for SARS-CoV-2 and discovery of potential drugs by computational methods. Acta Pharm Sin B. 2020 May; 10 (5): 766-788. Doi: 10.1016/j.apsb.2020.02.008; Mhatre S., Naik S., Patravale V. A molecular docking study of EGCG and theaflavin digallate with the druggable targets of SARS-CoV-2. Comput Biol Med. 2021 Feb; 129: 104137. Doi: 10.1016/j.compbiomed.2020.104137]. В доклиническом исследовании in vivo на трансгенных мышах, имеющих клеточные рецепторы hACE2 для проникновения SARS-CoV-2, было показано, что гликозид байкалин (Baicalin) из корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis, Lamiaceae) при пероральном введении значительно ингибировал репликацию вируса, спасал от потери массы тела и снижал степень поражения легочной ткани у этих животных [Song J., Zhang L., Xu Y., Yang D., Zhang L., Yang S., Zhang W., Wang J., Tian S., Yang S., Yuan Т., Liu A., Lv Q., Li F., Liu H., Hou В., Peng X., Lu Y., Du G. The comprehensive study on the therapeutic effects of baicalein for the treatment of COVID-19 in vivo and in vitro. Biochem Pharmacol. 2021 Jan; 183: 114302. Doi: 10.1016/j.bcp.2020.114302].
50
50
Известен способ получения водного экстракта корня куркумы Curcuma longa, обладающего противовирусным действием против SARS-CoV-2, включающий измельчение через терку корня куркумы, проведение водной экстракции (режим неизвестен), удаление из экстракта твердых компонентов путем центрифугирования в течение 10 мин, при 3985 RCF (относительная центробежная сила), дополнительную очистку супернатанта путем ультрацентрифугирования при 50 624 RCF и 4°С в течение двух часов. Противовирусное действие водного экстракта куркумы показано в различных концентрациях (разведения с 1:8 до 1:1024) путем предварительной инкубации 100 ТЦПД/100 мкл SARS-CoV-2 в среде для культивирования клеток, последующего нанесения данной смеси на монослой клеток линии VeroE6. Было показано, что в разведении 1:128, соответствующего 15,6 мкг/мл куркумина (полифенола), было достаточно для полной прямой нейтрализации (инактивации) SARS-CoV-2. При этом ЕС составила 7,9 мкг/мл. Клиническое применение куркумина затруднено из-за его плохой биодоступности. Только 1% куркумина усваивается организмом, и после периода полувыведения примерно 8 часов он распадается на несколько неэффективных продуктов [Bormann М., Alt М., Schipper L., van de Sand L., Khanh Le-Trilling V.T., Rink L., Heinen N.. Madel R.J., Otte M., Wuensch K., Heilingloh C.S., Mueller Т., Dittmer U., Eisner C., Pfaender S., Trilling M., Witzke O., Krawczyk A. Turmeric Root and Its Bioactive Ingredient Curcumin Effectively Neutralize SARS-CoV-2 In Vitro Viruses. 2021 Sep 23; 13 (10): 1914. doi: 10.3390/v13101914]. Отсутствует информация о том, что водный экстракт куркумы, полученный по указанному способу одновременно обладает противовирусным действием против HSV-2. Кроме того, куркума произрастает только в Индии, и производство на ее основе средства против SARS-CoV-2 в России зависит от импортных поставок.
Экспериментально показано, что тритерпеновый гликозид глицирризин (или глицирризиновая кислота), производственным способом выделенный из корня солодки, с высокой аффинностью взаимодействует с рецепторно-связывающим доменом RBD (receptor-binding domain) S белка SARS-CoV-2, т.е. блокирует возможность для «входа» вируса в клетку [Li J., Xu D., Wang L., Zhang M., Zhang G., Li E., He S. Glycyrrhizic Acid Inhibits SARS-CoV-2 Infection by Blocking Spike Protein-Mediated Cell Attachment. Molecules. 2021 Oct 9; 26 (20): 6090. doi: 10.3390/molecules26206090].
Известна ингибирующая активность in vitro свежеприготовленного водного экстракта корня солодки вида Glycyrrhiza. glabra L. (лакрица или солодка голая), фильтрованного через фильтр 0,2 нм против SARS-CoV-2, продемонстированная на моделях имитационного лечения вирусной инфекции при одновременном или последовательном нанесении на монослой клеток линии Vero Е6 экстракта корня солодки и SARS-CoV-2 в прямой и обратной последовательности [Tolah A.M., Altayeb Lamya M,. Alandijany T.A., Dwivedi V.D., El-Kafrawy S.A., Azhar E.I. Computational and In Vitro Experimental Investigations Reveal Anti-Viral Activity of Licorice and Glycyrrhizin against Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Pharmaceuticals (Basel). 2021 Nov 24; 14 (12): 1216. doi: 10.3390/ph14121216.]. Данное растение представляет интерес для отечественной фармацевтической промышленности ввиду его широкого произрастания на территории России в южных районах европейской части, Западной Сибири и Северного Кавказа. Однако способ получения указанного экстракта в источнике не указан. Кроме того, отсутствует информация о противовирусном действии экстракта корня солодки при HSV-2.
4
Метанольный экстракт семян гармалы обыкновенной (Peganum harmala L.) эффективен против 10 БОЕ/мл HSV-2 при концентрации 3,2 мкг/мл как во время проникновения вируса в клетки, так и при «выходе» новообразованных вирионов [Benzekri R., Bouslama L., Papetti A., Hammami M., Smaoui A., Limam F. Anti HSV-2 activity of Peganum harmala (L.) and isolation of the active compound Microb Pathog. 2018 Jan; 114: 291-298. doi: 10.1016/j.micpath.2017.12.017]. Отсутствует информация о противовирусном действии экстракта гармалы при SARS-CoV-2. Хотя ареал ее произрастания распространен от Средиземноморья до Центральной Азии, включая территорию России (Дагестан, Ставропольский край), однако растение является ядовитым, что создает определенные проблемы при подготовке растительного сырья для его использования в фармацевтической промышленности.
Известно, что хлороформный, метанольный и водный экстракты свежей коры акации нильской (Vachellia nilotica) проявляют противовирусную активность против инфекции HSV-2, при этом метанольный экстракт показал наилучшие результаты, частично инактивируя вирус и препятствуя его прикреплению к клеткам [Donalisio М., Cagno V., Civra A., Gibellini D., Musumeci G., M., Ghosh M., Lembo D. The traditional use of Vachellia nilotica for sexually transmitted diseases is substantiated by the antiviral activity of its bark extract against sexually transmitted viruses J Ethnopharmacol. 2018 Mar 1; 213: 403-408. doi: 10.1016/j.jep.2017.11.039]. Отсутствует информация о противовирусной активности экстракта коры акации нильской против SARS-CoV-2. Кроме того, для отечественного производства лекарственного препарата на основе акации нильской растительное сырье необходимо завозить в Россию из-за рубежа, т.к. растение произрастает в тропической и субтропической Африке от Египта до ЮАР, в Афганистане, Ливии, Малой Азии, на Индостане, в Шри-Ланке, выращивается в Иране, Вьетнаме, Австралии и на Карибских островах.
Известно, что метанольный экстракт листьев кустарникового молочая (Pedilanthus tithymaloides), собранных в Западной Бенгалии, ингибирует репликацию HSV-2 дикого типа и клинических изолятов. Способ получения экстракта включает промывку листьев в проточной воде, высушивание в тени, измельчение в механической шлифовальной машине до порошка, экстракцию метанольным спиртом в течение 72 час путем холодной мацерации [Ojha D., Das R., Sobia P., Dwivedi V., Ghosh S., Samanta A., Chattopadhyay D. Pedilanthus tithymaloides Inhibits HSV Infection by Modulating NF-κВ Signaling PLoS One. 2015 Sep 25; 10 (9): e0139338. doi: 10.1371/journal.pone.0139338. eCollection 2015.]. Отсутствует информация о противовирусной активности экстракта листьев кустарникового молочая против SARS-CoV-2. Доступность данного растительного сырья для его применения в фармацевтической промышленности России ограничена, т.к. растение произрастает в тропических областях Южной Америки, Африки, Южной и Юго-Восточной Азии, а информация о его выращивании для фармацевтических целей в промышленных масштабах не обнаружена.
2
50
Известно, что водно-спиртовый экстракт корня и стеблей хвоща ветвистого (Equisetum giganteum) эффективен на культуре клеток in vitro против 10 БОЕ/мл HSV-2 с ЕС=18 мкг/мл, а 100%-ное ингибирование вирусной репликации наблюдалось при 100 мкг/мл на стадии прикрепления вируса и его «входа» в клетки. Далее в экспериментах in vivo на мышах показано, что у животных при одновременном введении им вируса и экстракта хвоща ветвистого, не было отмечено клинических проявлений заболевания и репликации HSV-2 в половых путях и спинном мозге [Churqui М.Р., Lind L.,  K., Svensson A., Savolainen О., Aranda K.Т., Kristina E. Extracts of Equisetum giganteum L and Copaifera reticulate Ducke show strong antiviral activity against the sexually transmitted pathogen herpes simplex virus type 2. J Ethnopharmacol. 2018 Jan 10; 210: 192-197. doi: 10.1016/j.jep.2017.08.010]. Однако описание технологии получения экстракта, как и информация об его эффективности против SARS-CoV-2 отсутствует. Несмотря на то, что хвощ ветвистый произрастает на территории юга России, включая Крым, Кавказ, юг Западной Сибири, в 10 регионах России (Брянская область, Калмыкия, Курганская область, Липецкая область, Республика Мордовия, Новосибирская область, Омская область, Самарская область, Республика Татарстан, Ульяновская область) он включен в Красную книгу, что может ограничить перспективы его использования в фармацевтической промышленности.
В настоящее время установлена одновременная ингибирующая активность некоторыми растительными экстрактами репликации нового коронавируса и герпесвируса. Например, показано, что метанольный экстракт листьев виноградной лозы (Vitis vinifera, Vitaceae) был способен ингибировать репликацию как SARS-CoV-2, так и HSV-1 in vitro на ранних стадиях инфекции путем прямой инактивации вирионов при очень низкой концентрации - 10 мкг/мл [Zannella С., Giugliano R., Chianese A., Buonocore С., Vitale G.A., Sanna G., Sarno F., Manzin A., Nebbioso A., Termolino P., Altucci L., Massimiliano G., de Pascale D., Franci G. Antiviral Activity of Vitis vinifera Leaf Extract against SARS-CoV-2 and HSV-1 Viruses. 2021 Jun 29; 13 (7): 1263. doi: 10.3390/v13071263]. Данные о способности указанного средства подавлять репликацию вируса HSV-2 отсутствуют. Растительное сырье в России доступно, т.к. виноградная лоза Vitis vinifera культивируется на Кавказе и в Крыму. Однако неизвестно, в какой мере противовирусные свойства культивируемого растения в регионах России совпадают с описанными выше противовирусными свойствами листьев V. vinifera сорта Paulsen 1103, собранных в Италии.
Известен способ получения водного экстракта Черноголовки обыкновенной Prunella vulgaris, обладающего противовирусным действием против SARS-CoV-2, включающий замачивание на ночь высушенных семян растения в деионизированной воде при комнатной температуре, а затем кипячение в течение часа, после чего охлажденную надосадочную жидкость центрифугируют при 3000 g в течение 30 мин, фильтруют через мембрану из ацетата целлюлозы 0,45 мкм и лиофилизируют. Полученный темно-коричневый остаток растворяют в деионизированной воде и хранят при -20°С. Показано, что при концентрации 50 до 125 мкг/мл указанный экстракт частично или полностью снижает на клетках Vero развитие цитопатического эффекта, индуцированного при их инфицировании SARS-CoV-2 [Ао Z., Chan M., Ouyang M.J., Olukitibi Т.А., Mahmoudi M., Kobasa D., Yao X. Identification and evaluation of the inhibitory effect of Prunella vulgaris extract on SARS-coronavirus 2 virus entry. PLoS One. 2021 Jun 9; 16 (6): e0251649. doi: 10.1371/journal.pone.0251649. eCollection 2021]. Информация об эффективности водного экстракта Черноголовки обыкновенной, полученного по описанному способу, против HSV-2 отсутствует.
Известен способ получения вещества, обладающего противовирусным действием против вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов, включающий получение водного экстракта из китайской травы Черноголовки обыкновенной Prunella vulgaris горячей водой, осаждение этанолом и колоночную гель-проникающую хроматографию. Химические испытания показали, что активное вещество представляет собой анионный полисахарид. С помощью теста на уменьшение бляшек этот полисахарид в концентрации 100 мкг/мл был активен против вирусов простого герпеса типов 1 и 2 [Xu НХ, Lee SH, Lee SF, White RL, Blay J (1999) Isolation and characterization of an anti-HSV polysaccharide from Prunella vulgaris. Antiviral Res 44: 43-54. doi: 10.1016/s0166-3542(99)00053-4]. Как видно из описания аналога, противовирусное действие против вируса простого герпеса HSV-2 водного экстракта Черноголовки обыкновенной, не подвергнутого осаждению этанолом и колоночной гель-проникающей хроматографии, не показано. Следовательно, отсутствует единая технология получения экстракта этого растения, эффективного как против SARS-CoV-2, так и HSV-2. Хотя Черноголовка - обычный представитель Европейской России, повсеместно произрастает в Карелии, на Кавказе, Западной и Северной Сибири, ограничением для ее применения в официальной медицине является то, что это ядовитое растение, она не является фармакопейным растением в России.
Известен способ получения экстракта корней или надземной части манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L., обладающего противовирусным действием в отношении HSV-2. Способ включает экстракцию корней 50-кратным объемом этилацетата в три приема при нагревании на водяной бане с обратным холодильником по 20 минут, объединение этилацетатного экстракта, концентрирование его упариванием и осаждение концентрата в хлороформе или экстракцию надземной части манжетки обыкновенной, собранной в начале цветения, 90-96° этиловым спиртом в соотношении 1:10 при комнатной температуре в течение 24 часов с повторением 3-4 раза с последующим объединением и упариванием экстракта, разведение его дистиллированной водой, очистку водного экстракта хлороформом, экстракцию очищенного водного остатка этилацетатом, упаривание полученного экстракта и осаждения продукта хлороформом [патент на изобретение РФ №2580304 Противовирусное средство на основе суммы флавоноидов из Alchemilla vulgaris L., опубл. 10.04.2016 Бюл. №10. МПК A61K 36/73, B01D 11/02, А61Р 31/12, А61Р 31/14, А61Р 31/16, А61Р 31/20, А61Р 31/22].
Известен способ получения экстракта базидиального гриба чаги Inonotus obliquus, обладающего ингибирующей активностью на репликацию коронавируса SARS-CoV-2. Способ включает водную экстракцию измельченного природного сырья при температуре 50-95°С в течение от 1,0 до 72 часов, фильтруют экстракт через капроновую ткань. Показана дозазависимая активность экстракта против SARS-CoV-2 в тестах на клеточных культурах Vero Е6 и Vero [патент на изобретение РФ №2741714 Ингибитор репликации коронавируса SARS-CoV-2 на основе водного экстракта гриба Inonotus obliquus, опубл. 28.01.2021. МПК A61K 36/06, B01D 11/02, А61Р 31/14]. Отсутствует информация о противовирусном действии водного экстракта чаги, полученного по указанному способу, против HSV-2.
Известно, что водорастворимый меланин, полученный из водного экстракта чаги I. obliquus обладает противовирусной активностью in vitro на культуре клеток Vero против HSV-2. Способ получение водного экстракта чаги включает измельчение грибной массы известным способом с последующим извлечением целевого продукта посредством гидролиза при рН 12-14 под давлением 0,5-07 атм в течение 30 мин или при 50°С в течение 1-2-суток; подкисление фугата после центрифугирования до рН 2,0-3,0, осаждение осадка меланина центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин, промывание и высушивание продукта при температуре 50°С. Полученный меланин не растворяется в воде, но хорошо растворяется в щелочах. Водорастворимый меланин получают из указанного препарата тщательным растворением полученного пигмента в 10% растворе аммиака с последующим мягким выпариванием остаточного аммиака и воды. Полученный меланин полностью растворим в воде [патент на изобретение РФ №2480227 Противовирусное средство на основе меланина. Опубл. 10.01.2013, Бюл. №1. МПК A61K 36/06, A61K 31/785, А61Р 31/22, А61Р 31/12, А61Р 31/16, А61Р 31/18]. Отсутствует информация о противовирусном действии водного экстракта чаги, полученного по указанному способу, против SARS-CoV-2. Таким образом, отсутствует единая технология получения водного экстракта чаги, обладающего противовирусным свойством одновременно против SARS-CoV-2 и HSV-2. Вместе с тем, базидиальный гриб Inonotus obliquus (чага) имеет широкий ареал распространения. В Российской Федерации, включая лесную зону юга Западной Сибири, этот гриб развивается на березе бородавчатой и березе белой (Betula pendula Roth и Betula alba L.). Препараты гриба Inonotus obliquus нашли широкое применение в медицине. Однако, по литературным данным, широкая биологическая активность I. obliquus связана с полисахаридами, но механизмы их действия пока находятся на стадии изучения. При этом отмечается низкая цитотоксичность препаратов этого гриба из семейства Basidiomycota и факт, что из-за различий в среде обитания и методах экстракции состав и концентрации полученных полисахаридов не одинаковы [Lu Y., Jia Y., Xue Z., Li N., Liu J., Chen H. Recent Developments in Inonotus obliquus (Chaga mushroom) Polysaccharides: Isolation, Structural Characteristics, Biological Activities and Application. Polymers (Basel). 2021 Apr 29; 13 (9): 1441. Doi: 10.3390/polym13091441].
Сотрудниками Научно-исследовательского института вирусологии Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины (г. Новосибирск) показано, что ингибирующей активностью против репликации коронавируса SARS-COV-2 и HSV-2 in vitro обладает водный экстракт листьев кипрея узколистного Epilobium angustifolium L. [Казачинская Е.И., Чепурнов А.А., Кононова Ю.В., Романюк В.В., Шестопалов A.M. Активность водных экстрактов растительного сырья на репликацию вируса герпеса типа 2 // Материалы VIII Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания», сборник трудов, издательство «Новация», Сочи, 2021. С. 74-76; Казачинская Е.И., Чепурнов А.А., Кононова Ю.В., Романюк В.В., Шестопалов A.M. Ингибирующая активность чайных композиций и их составляющих ингредиентов на репликацию SARS-COV-2 // Материалы VIII Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции с международным участием «Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания», сборник трудов, издательство «Новация», Сочи, 2021. С. 73-74]. Однако указанные свойства водного экстракта кипрея узколистного определяются способом его получения.
Кипрей узколистный Epilobium angustifolium L. (Иван-чай) - это один из 200 видов растений рода Epilobium семейства Кипрейные (Onagraceae), повсеместно произрастающий во многих регионах мира и наиболее распространенный в географических зонах с умеренным климатом [Корсун В.Ф., Журавлев Д.В., Корсун Е.В. Русский чай по имени Иван. Изд. Концептуал, 2017 г. С. 224. ISBN: 978-5-906867-35-3; Kalle R., Belichenko О., Kuznetsova N., Kolosova V., Prakofjewa J., Stryamets N., Mattalia G.,  P., Simanova A., Priise В., et al. Gaining Momentum: Popularization of Epilobium angustifolium as Food and Recreational Tea on the Eastern Edge of Europe. Appetite. 2020; 150: 104638. doi: 10.1016/j.appet.2020.104638]. E. angustifolium L. является одним из наиболее известных лекарственных растений и издавна используется в народной медицине разных стран в виде чая или настоя листьев для лечения мигреней, бессонницы, анемии, белой горячки, а также против различных инфекций (т.е. при простуде) и при желудочно-кишечных расстройствах (таких как дизентерия и диарея), в лечении язвы желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, гастрита, колита, а также при проблемах с предстательной железой или мочеиспусканием, связанных с воспалением уретры, аденомой предстательной железы и доброкачественной гиперплазии предстательной железы [Schepetkin I.A., Andrew G. Ramstead, Liliya N. Kirpotina, Jovanka M. Voyich, Mark A. Jutila, and Mark T. Quinn Therapeutic Potential of Polyphenols from Epilobium angustifolium (Fireweed) Phytother Res. 2016 Aug; 30 (8): 1287-1297. doi: 10.1002/ptr.5648; Vogl S., Picker P., Mihaly-Bison J., Fakhrudin N., Atanasov A.G., Heiss E. H., Wawrosch C., Reznicek G., Dirsch V.M., Saukel J., Kopp B. Ethnopharmacological in vitro studies on Austria's folk medicine-an unexplored lore in vitro anti-inflammatory activities of 71 Austrian traditional herbal drugs. J Ethnopharmacol. 2013 Oct 7; 149 (3): 750-71. doi: 10.1016/j.jep.2013.06.007], а также наружно для снятия отеков, заживления ран и кожных язв [Karakaya S.,  I., Yakinci O.F., Sytar О., Ceribasi S., Dursunoglu В., Ozbek H., Guvenalp Z. In vivo bioactivity assessment on Epilobium species: A particular focus on Epilobium angustifolium and its components on enzymes connected with the healing process. J. Ethnopharmacol. 2020; 262: 113207. doi: 10.1016/j.jep.2020.113207].
E. angustifolium L. содержит белки (16,4% содержание в сухом препарате), минеральные вещества (16 мг марганца; 6 мг бора; по 2,3 мг железа и меди; по 1,3 мг никеля и титана; 0,44 мг молибдена), витамины (от 200 до 388 мг витамина С; от 3,64 до 7,59 мг витамина РР; витамины А и В1, В2, В6 и В9 от 0,1 до 0,6 мг), флавоноиды до 0,1% (кверцетин, кемферол, рутин), антоцианы (1,0-1,81%), хлорофилл (5,1-13,5%), таниды - дубильные вещества пирогалловой группы (7-20%), слизи/мукополисахариды (8,8-19,3%), пищевые волокна (10,6%), лигнин (8,67-13,8%) и др. [Иринина О.И., Елисеева С.А. Изучение биохимического состава и лечебных свойств растения кипрей узколистный (Иван-чай). Ползуновский вестник. 2021. №2. С. 44-54. DOI: 10.25712/ASTU.2072-8921.2021.02.006].
С уникальным биохимическим составом препаратов кипрея узкослистного Е. angustifolium L. связывают многообразие его биологической активности - это антиоксидантные, противовоспалительные, антипролиферативные (противоопухолевые) и антибактериальные свойства [Schepetkin I.A., Andrew G. Ramstead, Liliya N. Kirpotina, Jovanka M. Voyich, Mark A. Jutila, and Mark T. Quinn Therapeutic Potential of Polyphenols from Epilobium angustifolium (Fireweed) Phytother Res. 2016 Aug; 30 (8): 1287-1297. doi: 10.1002/ptr.5648], а также антифунгальную активность [Nowak A.,  M., Ossowicz-Rupniewska P., Makuch E., Duchnik W., Kucharski Adamiak-Giera U., Prowans P., Czapla N., Bargiel P., Petriczko J., Markowska M., Klimowicz A. Epilobium angustifolium L. Extracts as Valuable Ingredients in Cosmetic and Dermatological Products. Molecules. 2021 Jun 7; 26 (11): 3456. doi: 10.3390/molecules26113456.], а также обезболивающий эффект [Tita В., Abdel-Haq H., Vitalone A., Mazzanti G., Saso L. Analgesic properties of Epilobium angustifolium, evaluated by the hot plate test and the writhing test. Farmaco. May-Jul 2001; 56 (5-7): 341-3. doi: 10.1016/s0014-827x(01)01046-1].
Кипрей узколистный произрастает по всему Северному полушарию, на территории России преимущественно в нечерноземной полосе. Огромные площади занимает на Урале Алтае, юге Западной Сибири, что делает данный вид растительного сырья перспективным для применения в отечественной фармацевтической промышленности.
Как указано выше, биологические свойства экстрактов кипрея узколистного в значительной мере зависят от способов их получения.
Известен способ получения водно-этанольного экстракта кипрея Е. angustifolium L., включающий экстракцию 75% этиловым спиртом в соотношении растительного сырья в спирте 1:10 в гидромодуле и обработку ультразвуковым излучением с частотой колебаний 35 кГц при t=40±5°C в течение 90±10 мин, позволяющую идентифицировать процесс массопередачи, тем самым увеличивая выход экстракта. Данный экстракт обладает повышенной антиоксидантной и антиканцерогенной активностью [патент на изобретение РФ №2714765 Способ получения экстракта Иван-чая. МПК A23F 3/34. Опубл.: 19.02.2020. Бюл. №5].
Показано, что водно-спиртовый экстракт кипрея Е. angustifolium L., содержащий энотеин В, влияет на 50%-ное ингибирование репликации штаммов вируса гриппа А, что сопоставимо с активностью коммерческих препаратов ремантадин и тамифлю [Бабенко А. Турмагамбетова А.С. Алексюк М.С. Зайцева И.А. Соколова Н.С. Богоявленский А.П. Березин В.Э. Противовирусная активность Chamerion angustifolium или Epilobium angustifolium. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2014. №6. С. 81-82].
Известно, что водные экстракты кипрея Е. angustifolium, полученные на водяной бане при соотношении растительного сырья в воде 1:10 при 40°С в течение часа с последующим выпариванием жидкости и лиофилизацией экстракта, обладают ингибирующей активностью на нейтральную эндопептидазу, играющую роль в прогрессировании рака предстательной железы [Kiss A., Kowalski J., Melzig M.F. Induction of neutral endopeptidase activity in PC-3 cells by an aqueous extract of Epilobium angustifolium L. and oenothein B. Phytomedicine. 2006 Mar; 13 (4): 284-9. doi: 10.1016/j.phymed.2004.08.002].
Наиболее близким по назначению аналогом, выбранным в качестве прототипа, является способ получения водного экстракта ферментированных листьев камелии китайской (Camellia sinensis L., Theaceae), обладающего противовирусным действием против SARS-CoV-2. Способ включает экстракцию коммерческого сырья зеленого и черного чая, полученного на основе ферментированных листьев камелии китайской, в горячей очищенной воде в течение 15 мин и фильтрацию через нитроцеллюлозные фильтры (Merck Millipore) с диаметром пор 0,2 нм. Противовирусная активность показана на основе предварительного смешивания экстракта с препаратом инфекционного SARS-CoV-2 (штамм JPN/TY/WK-521), выдерживания смеси при комнатной температуре в течение разного времени с последующим нанесением смеси на культуру клеток линии VeroE6. Показано снижение вирусного титра SARS-CoV-2 в культуре клеток в сравнении с контролем [Ishimoto K., Hatanaka N., Otani S., Maeda S., Xu В., Yasugi M., Moore J.E., Suzuki M., Nakagawa S., Yamasaki S. Tea crude extracts effectively inactivate severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Lett Appl Microbiol. 2022 Jan; 74 (1): 2-7. Doi: 10.1111/lam.13591]. Информация об эффективности водного экстракта ферментированных листьев камелии китайской против HSV-2 отсутствует. Для получения растительного сырья в России для отечественной фармацевтической промышленности единственным регионом, где возможно выращивание камелии китайской в промышленных масштабах, являются влажные субтропики Черноморского побережья России. Это самый северный регион распространения этой культуры, и выращивание его лимитируется климатическими условиями в большей степени, чем в основных чаепроизводящих странах (Китае, Индии, Шри-Ланка и др.), что объясняет низкую урожайность данной культуры [Лошкарева С.В. Биологические и хозяйственные свойства гибридов F1 от свободного опыления чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) во влажных субтропиках России // Автореф дис на соиск уч степ канд сельхоз наук. по спец 06.01.05. ФГБНУ Всероссийский НИИ цветоводства и тропических культур. Сочи. 2019. 24 с.].
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка единой технологии получения водного экстракта растения, проявляющего ингибирующую активность как против коронавируса SARS-CoV-2, так и вируса простого герпеса 2-го типа HSV-2 in vitro при условии произрастания растения, отвечающего указанным требованиям, на территории России для обеспечения фармацевтической промышленности отечественным растительным сырьем.
Техническим результатом изобретения является разработка единой технологии получения водного экстракта листьев кипрея узколистного Epilobium angustifolium L., обеспечивающей подавление репликации коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2 типа HSV-2 in vitro.
Указанный технический результат достигается тем, что листья кипрея узколистного Epilobium angustifolium L. до ферментации гранулируют; ферментацию останавливают путем помещения гранул в конвекционную сушилку на 20 мин при 110°С, затем при 80°С проводят окончательное высушивание гранул до остаточной влажности 4%; для приготовления экстракта гранулы заливают дистиллированной водой, доведенной до кипения, в соотношении 1:10 массы сухого сырья/объем воды, выдерживают 15 мин при комнатной температуре в режиме покачивания, затем - в течение 2 часов при 37°С в покое.
Раскрытие сущности изобретения
Способ получения водного экстракта листьев кипрея узколистного Epilobium angustifolium L., проявляющего ингибирующую активность против коронавируса SARS-CoV-2 и вируса простого герпеса 2-го типа in vitro, включает завяливание листьев, их гранулирование, ферментацию гранул, которую останавливают путем помещения гранул в конвекционную сушилку на 20 мин при 110°С, затем при 80°С проводят окончательное высушивание гранул до остаточной влажности 4%. Для приготовления экстракта гранулы заливают дистиллированной водой, доведенной до кипения, в соотношении 1:10 массы сухого сырья/объем воды, выдерживают 15 мин при комнатной температуре в режиме покачивания, затем - в течение 2 часов при 37°С в покое, после чего экстракт фильтруют.
Завяливание листьев осуществляют в проветриваемом, затемненном помещении при температуре 20-22°С в течение 24 ч при толщине слоя 5-10 см и периодическом перемешивании.
Для получения гранул из завяленных листьев может быть использована промышленная мясорубка, позволяющая получить гранулы размером 5-10 мм.
Ферментацию гранул осуществляют при толщине слоя 5-10 мм при температуре 30-32°С в течение 4 ч.
Покачивание экстракта может быть автоматизировано, например, с помощью механической качалки со скоростью движения 15 об/мин.
Для фильтрации экстракта используют стерильную (кипячением в воде) капроновую ткань.
Осуществление изобретения
Осуществление способа проводили одновременно со сравнительным анализом противовирусной активности против SARS-CoV-2 и HSV-2 водного экстракта кипрея узколистного, полученного по заявленному способу, с контрольными образцами водных экстрактов ферментированных листьев камелии китайской, плодового тела наги, травы манжетки обыкновенной, корня солодки, антивирусные свойства которых описаны в уровне техники по данной заявке.
Водный экстракт кипрея узколистного получали по заявленному способу. Сырье листьев кипрея узколистного было заготовлено в 2020 г. на Салаирском кряже в Новосибирской области 54°54' с. ш. 83°39' в. д.
Контрольные образцы водных экстрактов против SARS-CoV-2.
Водный экстракт ферментированных листьев камелии китайской - сырья черного чая из Непала получен на основе сырья, предоставленного НПФ «Золотая долина», г. Новосибирск.
Водный экстракт измельченного плодового тела чаги (Inonotus obliquus, Basidiomycota), получен на основе чаги, собранной на Салаирском кряже в Новосибирской области (54°54' с. ш. 83°39' в. д.).
Водный экстракт корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra L., Fabaceae) получен на основе солодки, выращенной на Южном Урале.
Контрольные образцы водных экстрактов против HSV-2.
Водный экстракт измельченного плодового тела чаги I. obliquus (Inonotus) получен на основе сырья, указанного выше.
Водный экстракт травы манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L., Rosaceae), получен на основе растения, собранного в горном Алтае (Чемальский район Республики Алтай, в урочище Манас у подножия горы Кабарга (51°5'22ʺN 86°32'1ʺЕ), т.к. ранее Мазурковой с соавт. была описана противогерпетическая активность экстрактов разных частей этого растения, собранного также в горном Алтае, но на Семинском перевале (51°2'43ʺN 85°36'13ʺЕ) [Мазуркова Н.А., Кукушкина Т.А., Высочина Г.И., Ибрагимова Ж.Б., Лобанова И.Е., Филиппова Е.И., Мазуркова О.Ю., Макаревич Е.В., Шишкина Л.Н., Агафонов А.П. Изучение противогерпетической активности экстрактов манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.). Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016. 1 (14): 118-127. eLIBRARY ID: 26209552].
2
50
Коронавирус SARS-CoV-2. Вирусный изолят был выделен в 2020 г. на культуре клеток Vero из образца мазка носоглотки больного человека, позитивного на наличие вирусной РНК SARS-CoV-2 при анализе в лаборатории по диагностике COVID-19 при ФИЦ ФТМ. Лабораторный вирусный штамм депонирован в коллекции вирусов 48 ЦНИИ МО РФ под наименованием SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 [Чепурнов А.А., Шаршов К.А., Казачинская Е.И., Кононова Ю.В., Казачкова Е.А., и др. Антигенные свойства изолята коронавируса SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020, выделенного от пациента в Новосибирске. Журнал инфектологии. 2020; 12 (3): 42-50. Doi: 10.22625/2072-6732-2020-12-3-42-50]. Титр инфекционного SARS-CoV-2 в супернатанте питательной среды (с 2% прогретой сыворотки крови КРС от «слепого пассажа» на инфицированных клетках Vero, выращенных в культуральных флаконах объемом 175 см (Corning, США), выражали в ТЦПД/мл (тканевых цитопатических дозах вируса, вызывающего цитопатическое действие на инфицированные клетки в 50% лунок) (фиг. 1). Для этого проводили фиксацию инфицированных клеток, заранее выращенных в 96-луночных стерильных культуральных планшетах (Corning, США), в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [Case J.B., Bailey A.L., Kim A.S., Chen R.E., Diamond M.S. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology. 2020 Sep; 548: 39-48. Doi: 10.1016/j.virol.2020.05.015].
2
Вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2). Штамм MS HSV-2, полученный из Американской коллекции и описанный в работе [Суслопаров М.А., Глотов А.Г., Глотова Т.И. Изучение эффективности лечебно-профилактического действия сверхмалых доз антител к гамма интерферону на экспериментальной мышиной модели герпес-вирусной инфекции. Антибиотики и химиотерапия. 2004. 49 (10): 3-6. eLIBRARY ID: 21668149], ранее был любезно предоставлен авторам д.-ром М.А. Суслопаровым для исследования ингибирующей активности растительных и химически синтезированных препаратов. HSV-2 хранился в виде мозговой суспензии инфицированных мышей-сосунков линии Balb/c при минус 80°С. Вирусный препарат нарабатывали «слепым» пассажем на перевиваемой культуре клеток Vero (фиг. 2а), выращенных до монослоя в полистироловых культуральных флаконах объемом 175 см на питательной среде с 2% прогретой эмбриональной сыворотки крови (КРС). «Урожай» HSV-2 от «слепого пассажа» собирали при 100%-ном цитопатическом действии вируса на чувствительные клетки, когда они округляются и/или сливаются в синцитии (фиг. 2b), но еще прикреплены к поверхности ростового флакона или лунки планшета. Инфекционный титр HSV-2 в супернатанте питательной среды от разрушенных 3-х кратным замораживанием/оттаиванием инфицированных клеток Vero выражали в бляшко-образующих единицах (БОЕ)/мл, т.к. цитопатическое действие этого вируса легко идентифицируется на монослое инфицированных клеток до одной БОЕ, состоящей из нескольких инфицированных клеток (фиг. 2с). Работы проведены с использованием оборудования ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение №075-15-2021-691).
Статистическую обработку результатов по определению инфекционных титров вирусов, а также по цитотоксичности и эффективным концентрациям проводили с применением метода Спирмена-Кербера в программе Excel при 95%-ном уровне надежности (р≤0.05).
Перечень графических материалов
Фиг. 1. Цитопатическое действие SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 на культуру клеток Vero.
Примечание: а - монослой культуры клеток Vero; b - цитопатическое действие SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 на культуру клеток Vero.
Фиг. 2. Цитопатическое действие вируса простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2) на культуру клеток Vero.
Примечание: а - монослой культуры клеток Vero; b - 100%-ный цитопатический эффект HSV-2; с - одна БОЕ в лунке 96-луночного культурального планшета.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами
Пример 1. Завяливание и ферментация листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.)
Заявяливание и ферментацию осуществляли согласно заявленному способу. Для завяливания листья раскладывали толщиной 5-10 см в затемненном, проветриваемом помещении при температуре 20-22°С и выдерживали при периодическом перемешивании в течение 24 ч. Для получения гранул из завяленных листьев использовали промышленную мясорубку. Гранулированную массу, разложенную в один слой толщиной 5-10 мм подвергали ферментации при температуре 30-32°С в течение 4 ч и далее помещали в конвекционную сушилку для остановки процессов ферментации на 20 мин при 110°С и затем при 80°С проводили окончательное высушивание гранул.
Пример 2. Получение водного экстракта из гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Е. angustifolium L.) и контрольных образцов
Растительное сырье кипрея узколистного в виде высушенных согласно заявленному способу гранул ферментированных листьев (2 г), а также контрольные образцы сырья - измельченное плодовое тело чаги, порошок корня солодки голой, сырье черного чая (камелии китайской) из Непала и измельченная трава манжетки обыкновенной в соотношении 1:10 (1 г/10 мл) заливали доведенной до кипения свежей кипяченной дистиллированной водой в стеклянной колбе, выдерживали 15 мин на механической качалке при комнатной температуре и 15 об/мин, а затем 2 часа при 37°С в покое. Экстракты фильтровали через капроновую ткань и использовали в свежем виде для анализа ингибирующей активности.
Пример 3. Анализ цитотоксичности водного экстракта из измельченных гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Е. angustifolium L.) и контрольных образцов
50
50
Цитотоксичность растительных экстрактов определяли по 50%-ной токсичной концентрации в мл при нанесении препаратов на клеточную культуру Vero с разведения  в объеме 200 мкл/лунка двойным шагом, т.е. с 100 мг/мл или 100000 мкг/мл) в лунки 96-луночного планшета в четырех повторах в двух независимых экспериментах и выдерживали в течение 1 часа при 37°С. Затем, в первом варианте, монослой клеток отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде, содержащей 2% прогретой сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) или, во втором варианте, монослой клеток не отмывали, а оставляли экстракты. Цитотоксическое действие растительных препаратов оценивали каждые сутки, срок наблюдения 5 суток. Контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero 1:1 по объему. По результатам, представленным в таблице 1 видно, что показатели CC/мл по средним значениям с доверительными интервалами при 95%-ном уровне надежности (р≤0,05) исследуемых экстрактов в основном, оказались невысокие при обработке ими клеток в течение одного часа с последующей отмывкой - в диапазоне концентраций от 62500,0±16038,37 - 85700,0±16038,72 мкг/мл, что указывает на отсутствие токсичности для клеток линии Vero. Экстракт черного чая (камелии китайской) из Непала проявил более заметную цитотоксичность - 10675,0±1950,0 мкг/мл. При более длительном воздействии экстрактов на монослой клеток (до 5 суток) повышалась и цитотоксичность - для чаги, кипрея узколистного и корня солодки приблизительно в 10 раз (в диапазоне концентраций от 8593,75±71,71 до 10937,5±64,14 мкг/мл), а для черного чая из Непала в 2 раза (до 5467,5±32,12 мкг/мл). Тем не менее, при сравнении с литературными данными [Trujillo-Correa A.I., Quintero-Gil D.C., Diaz-Castillo F.,  W., Robledo S.M., Martinez-Gutierrez M. In vitro and in silico anti-dengue activity of compounds obtained from Psidium guajava through bioprospecting BMC Complement Altern Med. 2019 Nov 6; 19 (1): 298. Doi: 10.1186/s12906-019-2695-1.], эти значения CC не являются токсичными.
Пример 4. Анализ ингибирующей активности водного экстракта измельченных гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) и контрольных образцов на репликацию SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-l/2020 при прямой нейтрализации (инактивации) вирионов перед инфицированием клеток линии Vero
3
4
5
3
4
5
50
50
50
50
50
50
50
Анализ ингибирующей активности водного экстракта высушенных согласно заявленному способу гранул ферментированных листьев кипрея узколистного и контрольных образцов водных экстрактов измельченного плодового тела чаги, порошка корня солодки голой и сырья черного чая из Непала проводили методом классической реакции нейтрализации (инактивации) вируса в четырех повторах в двух независимых экспериментах по классической схеме нейтрализации (инактивации) вируса, как нами описано недавно для исследования антител пациентов, переболевших COVID-19 [Kazachinskaia E.I., Chepurnov А.А., Shcherbakov D.N, Kononova Yu.V., Shanshin D.V., Romanova V.D., Khripko O.P., Saroyan T.A., Gulyaeva M.A., Voevoda M.I., Shestopalov A.M. IgG Study of Blood Sera of Patients with COVID-19. Patogens 2021, Nov 2. 10, 1421. Doi: 10.3390/patogens10111421]. Перед нанесением на монослой клеток Vero, выращенных в 96-луночных планшетах, растительные экстракты с исходной концентрацией по сухому веществу в объеме 100 мкл/лунка с разведения от 1:2 двойным шагом (т.е. с 50 мг/мл) предварительно инкубировали с инфекционным SARS-CoV-2 в трех возрастающих титрах - 10, 10 и 10 ТЦПД/мл в течение 1 часа при 37°С. После инкубации смеси растительных экстрактов с вирусным препаратом на клетках течение 1 часа при 37°С, монослой клеток отмывали и оставляли в поддерживающей питательной среде, содержащей 2% прогретой сыворотки крови КРС, до проявления ЦПД вируса в контрольных лунках, содержащих инфицированные клетки (фиг. 1). Отрицательный контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero (1:1 по объему). Учет результатов по ингибированию вирусной репликации сначала проводили визуально при наблюдении в инвертированный микроскоп (Микромед, Россия) при 10-кратном увеличении, а затем после фиксации клеток в течение 30 мин раствором формальдегидом и 0,05%-ным раствором кристаллического фиалетового с 20% спирта, как описано [Case J.B., Bailey A.L., Kim A.S., Chen R.E., Diamond M.S. Growth, detection, quantification, and inactivation of SARS-CoV-2. Virology. 2020 Sep; 548: 39-48. Doi: 10.1016/j.virol.2020.05.015]. Результат оценивали в соответствии с «Руководством…» [Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Минздрав РФ, ЗАО «ИИА «Ремедиум, Москва. 2000. 398 с]. По результатам, представленным в таблице 2, видно, что ингибирующая активность для 10 ТЦПД/мл SARS-COV-2 экстракта кипрея узколистного (с ЕС=33,56±8,75 мкг/мл) оказалась сопоставима с активностью контрольных образцов экстракта чаги (с EC=13,72±2,99 мкг/мл), экстракта корня солодки (с ЕС=30,51±7.82 мкг/мл) и экстракта сырья черного чая из Непала (с EC=11,43±1,48 мкг/мл). Кроме того, экстракт кипрея узколистного, также как и экстракты контрольных образцов, ингибировал SARS-COV-2 и с более высокими инфекционными дозами - 10 и 10 ТЦПД/мл.
Пример 5. Анализ ингибирующей активности водного экстракта измельченных гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) и контрольных образцов на репликацию SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 при профилактической схеме (нанесение разведений экстрактов на монослой клеток перед их инфицированием)
3
3
50
50
50
50
50
Анализ ингибирующей активности водного экстракта высушенных гранул ферментированных листьев кипрея узколистного и контрольных образцов водных экстрактов измельченного плодового тела чаги, порошка корня солодки голой и сырья черного чая из Непала проводили в четырех повторах в двух независимых экспериментах при профилактической схеме, т.е. нанесение экстрактов в объеме 100 мкл/лунка с разведения от 1:2 двойным шагом, т.е. с 50 мг/мл с исходной концентрацией по сухому веществу. Через час экспозиции экстрактов с клетками в лунки вносили вирусный препарат в разведении, соответствующем инфекционной дозе в титре - 10 ТЦПД/мл SARS-CoV-2 и оставляли в покое. Отрицательный контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero (1:1 по объему). Учет результатов проводили при сравнении с контрольными рядами инфицированных и неинфицированных клеток линии Vero, аналогично описанию (см. пример 4). Результат оценивали в соответствии с указанным в примере 4 руководством Фисенко, 2000. По результатам, представленным в таблице 3, видно, что ингибирующая активность для 10 ТЦПД/мл SARS-COV-2 экстракта кипрея узколистного (с ЕС=1367,19±8,02 мкг/мл) сопоставима с активностью экстракта сырья черного чая из Непала (с ЕС=1171,87±9,25 мкг/мл), но ниже, чем активность экстракта чаги (с EC=292,95±2,00 мкг/мл).
Пример 6. Анализ ингибирующей активности водного экстракта гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) и контрольных образцов на репликацию SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 по схеме «лечения» клеток (при предварительном инфицирование клеток)
3
3
50
50
50
50
50
Анализ ингибирующей активности водного экстракта высушенных по заявленному способу гранул ферментированных листьев кипрея узколистного и контрольных образцов водных экстрактов измельченного плодового тела чаги, порошка корня солодки голой и сырья черного чая из Непала проводили в четырех повторах в двух независимых экспериментах по схеме «лечения» клеток. Для этого монослой клеток Vero инфицировали вирусным препаратом в разведении, соответствующем титру 10ТЦПД/мл SARS-CoV-2, в течение 1 часа при 37°С. Затем после отмывки, на монослой клеток в лунки вносили разведения экстрактов и оставляли в покое для «лечения» клеток. Отрицательный контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero (1:1 по объему). Учет результатов проводили при сравнении с контрольными рядами инфицированных и неинфицированных клеток линии Vero, аналогично описанию (см. пример 4). Результат оценивали в соответствии с руководством Фисенко, 2000, указанным в примере 4. По результатам, представленным в таблице 3, видно, что ингибирующая активность для 10 ТЦПД/мл SARS-COV-2 экстракта кипрея узколистного по схеме «лечения» клеток (при предварительном инфицирование клеток) с ЕС=341,78±2,01 мкг/мл превосходит активность экстракта чаги (с ЕС=683,58±4,00 мкг/мл) и экстракта сырья черного чая из Непала (с EC=1269,53±8,964,00 мкг/мл).
Пример 7. Анализ ингибирующей активности водного экстракта гранул ферментированных листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) и контрольных образцов на репликацию вируса простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2)
50
50
100
50
100
50
100
3
Анализ ингибирующей активности водного экстракта высушенных по заявленному способу гранул ферментированных листьев кипрея узколистного и контрольных образцов водных экстрактов измельченного плодового тела чаги и травы манжетки обыкновенной проводили методом классической реакции нейтрализации (инактивации) вируса как описано выше в примере 4. Учет результатов по ингибированию вирусной репликации проводили визуально при наблюдении в инвертированный микроскоп (Микромед, Россия) при 10-кратном увеличении. Отрицательный контроль: кипяченая дистиллированная вода и ростовая среда для клеток Vero (1:1 по объему). Результат оценивали в соответствии с руководством Фисенко, 2020, указанным в примере 4. Оценивали как общепринятую 50%-ную ингибирующую (эффективную) концентрацию (ЕС в мкг/мл), так и 100%-ный антивирусный эффект, т.к. этот показатель также встречается в научной литературе при описании подходов к поиску растительных препаратов, подавляющих инфекционность HSV-2 [Churqui М.Р., Lind L.,  K., Svensson A., Savolainen О., Aranda K.Т., Kristina E. Extracts of Equisetum giganteum L and Copaifera reticulate Ducke show strong antiviral activity against the sexually transmitted pathogen herpes simplex virus type 2. J Ethnopharmacol. 2018 Jan 10; 210: 192-197. doi: 10.1016/j.jep.2017.08.010]. По результатам, представленным в таблице 4, видно, что экстракт кипрея узколистного проявил более высокую 50% и 100%-ную ингибирующую активность против вируса простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2) с ЕС=10,68±1,96 мкг/мл и ЕС=183,10±23,93 мкг/мл против 10 БОЕ/мл HSV-2, чем экстракты контрольных образцов чаги (ЕС=21,36±3,92 мкг/мл, ЕС=683,59±125,30 мкг/мл) и манжетки обыкновенной (ЕС=39,67±8,75 мкг/мл, ЕС=366,20±47,85 мкг/мл).
Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет простыми методами и без использования сложного оборудования проводить процедуру подготовки к экстрагированию листьев кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) и получать из высушенных гранул ферментированных листьев этого растения водный экстракт, биологически активные вещества которого способствуют ингибированию in vitro репликации коронавируса (штамм SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020) и вируса простого герпеса 2 типа (штамм MS HSV-2) при прямой инактивации вирионов (в течение 1 ч при 37°С) перед инфицированием клеток линии Vero.
Использование дополнительных схем экспериментов по ингибированию in vitro репликации SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 - по профилактической схеме путем нанесения разведений экстрактов на монослой клеток перед их инфицированием и схеме «лечения» клеток при предварительном инфицировании клеток, позволило получить предварительные экспериментальные данные о возможном влиянии водного экстракта кипрея узколистного на разные этапы «жизненного»цикла SARS-CoV-2 - на его «входе» в инфицируемые клетки и «выходе» из инфицированных клеток.
Выявленные свойства водного экстракта кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) могут быть полезны для разработки эффективных лекарственных препаратов как против инфекции COVID-19, в том числе при наличии у пациентов риска проявления оппортунистической инфекции, вызванной вирусом герпеса 2-го типа, так и для лечения каждой из этих инфекций в отдельности. Открываются перспективы использования кипрея узколистного как в виде чайных напитков, так и в виде отдельных веществ, выделенных из его экстрактов. Для снижения рецидивов хронического HSV-2 такой экстракт также может быть основой в виде чайных напитков и/или составов для местного применения в виде мазей.
Учитывая огромные площади, занимаемые узколистным кипреем на Урале Алтае, юге Западной Сибири, а также возможности его культивирования в промышленных масштабах, это делает данный вид растительного сырья перспективным для применения в отечественной фармацевтической промышленности.