АНАЛИЗ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ОТХОДАХ
ANALYSIS FOR DETERMINING ANTIBIOTICS IN WASTES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к простому и удобному в применении способу быстрого определения присутствия антибиотика в отходах, таких как, например, потоки жидких или твердых отходов заводов. Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему систему для анализа и руководство по быстрому определению присутствия антибиотика в отходах.
Предпосылки изобретения
Устойчивость к противомикробным препаратам является одной из основных глобальных проблем, которая больше не является прогнозом на будущее, а имеет место именно сейчас в каждом регионе мира и имеет потенциал воздействия на кого бы то ни было любого возраста, в любой стране. Устойчивость к противомикробным препаратам, при которой бактерии изменяются так, что антибиотики больше не действуют в организмах людей, которые нуждаются в них для лечения инфекций, в настоящее время является главной угрозой для общественного здравоохранения. Возрастает количество публичных призывов к глобальным коллективным действиям для решения проблемы этой угрозы, в том числе предложение по подготовке международного договора относительно устойчивости к противомикробным препаратам. Устойчивость к антибиотикам не является должным образом картированной во всем мире, однако страны, подверженные воздействию в наибольшей степени, являются более бедными странами с более слабыми системами здравоохранения. Существует три основных пути, посредством которых может появиться устойчивость к противомикробным препаратам: естественная устойчивость к определенным типам бактерий, генетическая мутация или приобретение устойчивости от другой бактерии.
Устойчивость к противомикробным препаратам может возникать самопроизвольно вследствие мутаций самих микроорганизмов, формирования устойчивости с течением времени или неправильного применения антибиотиков. Лечение, направленное на устойчивые микроорганизмы, становится все более трудно проводить, что требует применения альтернативных лекарственных препаратов или более высоких доз, и оба из этих вариантов могут быть более затратными или более токсичными для индивидуума. Некоторые инфекции уже становятся неизлечимыми в связи с устойчивостью к противомикробным препаратам.
Устойчивость к противомикробным препаратам является все более проблематичным вопросом, ежегодно приводящим к миллионам смертей. Тенденция к возрастанию устойчивости к лекарственным средствам может объясняться четырьмя основными направлениями: применением антибиотиков в популяции людей, применением антибиотиков в популяции животных, распространением устойчивых штаммов между источниками-людьми и/или источниками, отличными от людей, и выбросом антибиотиков в окружающую среду.
Последняя причина устойчивости к противомикробным препаратам, выброс антибиотиков в окружающую среду, является возрастающей проблемой в различных сегментах сельского хозяйства и промышленности. В этом отношении распространение и загрязнение окружающей среды, в особенности через "горячие точки", такие как больничные и промышленные сточные воды и необработанные городские сточные воды, представляют возрастающую проблему общественного здравоохранения. После того, как начали использовать антибиотики, последние загрязняли окружающую среду посредством нескольких источников, таких как отходы деятельности человека (применения лекарственных препаратов, ведения сельского хозяйства), лечения животных и фармацевтической промышленности. Отходы с антибиотиками могут содержать устойчивые бактерии или могут быть источником для их развития. В результате этого отходы с антибиотиками могут обуславливать внесение в окружающую среду бактерий, устойчивых к антибиотикам. Поскольку бактерии размножаются быстро, устойчивые бактерии, попадающие в окружающую среду, реплицируют свои гены устойчивости, так как они продолжают делиться. В дополнение, бактерии, несущие гены устойчивости (т.е. устойчивые бактерии), обладают способностью к распространению своих генов в другие виды путем горизонтального переноса генов. Таким образом, даже если конкретный антибиотик больше не вносится в окружающую среду, гены устойчивости к антибиотику будут сохраняться благодаря бактериям, которые с тех пор размножаются без непрерывного воздействия.
В качестве одного из последствий производители антибиотиков должны будут гарантировать, что для сведения к минимуму влияния производства жизненно важных лекарственных препаратов на окружающую среду применяются наиболее чистые, наиболее строгие и надежные способы, и первым шагом в этом направлении является измерение содержания антибиотиков в потоках (промышленных) отходов.
С технической точки зрения при применении аналитических способов из существующего уровня техники это возможно. Количество антибиотиков в водных потоках можно измерять с помощью нескольких способов, в том числе фотометрирования, электрохимического анализа, газовой хроматографии и нормально-фазовой жидкостной хроматографии (Pettas and Karayannis (2004), Anal. Chim. Acta 522, 275-280). Недостаток. Недостатком является то, что эти методики являются трудоемкими и времязатратными, и для них зачастую требуются дорогостоящие устройства и высококвалифицированные специалисты. Вследствие этого эти способы трудно, если вообще возможно, реализовать с высокой регулярностью и/или во многих местах специалистам, не имеющим особенно высоких технических навыков.
Таким образом, существует потребность в простых, недорогих и удобных в применении способах для определения присутствия и/или концентрации антибиотиков в потоках отходов. В настоящем изобретении обеспечивается такой способ.
Микробиологические анализы для определения антибиотиков известны в течение некоторого времени. Примеры таких анализов описаны в СА 2056581, DE 3613794, ЕР 0005891, ЕР 0285792, ЕР 2226389, GB 1467439, WO 94/18343 и WO 2005/118837. В большинстве случаев эти анализы предназначены для применения в молочной промышленности, в частности, для анализа молока. Эти микробиологические анализы включают в себя готовый к применению анализ, в котором используется микроорганизм и который дает результат по изменению, указываемому индикатором, таким как индикаторная молекула, которая может давать индикаторный сигнал, при добавлении в аналитическую среду. Его принцип заключается в том, что если антибиотик присутствует в образце в концентрации, достаточной для подавления роста микроорганизма, то цвет индикатора будет оставаться тем же самым, тогда как если подавление не происходит, то рост микроорганизма сопровождается образованием кислых и/или восстановленных метаболитов или другими явлениями, индуцирующими изменение индикаторного сигнала индикатора.
К сожалению, если такие анализы применяются в отношении субстратов, более сложных, чем молоко, таких как потоки сточных вод, содержащие многие другие компоненты, или даже (полу)твердые отходы, такие как осадки на фильтре, мицелии или концентрированные остатки процессов брожения, результаты трудно интерпретировать, и, следовательно, они являются недостоверными. Если изменением индикатора является изменение цвета индикаторной молекулы, то такое изменение часто трудно наблюдать или интерпретировать. Другим возможным недостатком является то, что дополнительные компоненты в сложных образцах, не обладающие противомикробной активностью, влияют на надлежащее функционирование аналитического микроорганизма.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу определения присутствия или отсутствия антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы, включающему стадии:
(a) приведения указанного безлактозного образца в контакт с аналитической средой, содержащей микроорганизм, гелеобразователь и индикатор, способный к выявлению роста или подавления микроорганизма, с получением совокупности из безлактозного образца и аналитической среды;
(b) инкубирования совокупности, полученной на стадии (а), в течение периода времени, достаточного для роста микроорганизма в случае отсутствия антибиотика в указанном безлактозном образце; и (с) выявления роста или подавления роста микроорганизма с помощью индикатора,
отличающемуся тем, что на стадии (а) добавляют молоко и/или молочный порошок. Настоящее изобретение дополнительно относится к набору, содержащему:
(a) контейнер с аналитической средой, содержащей микроорганизм, гелеобразователь и индикатор, способный к выявлению роста или подавления микроорганизма, для получения смеси;
(b) руководство, содержащее инструкции по определению концентрации антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению
бромкрезолового пурпурного или бромтимолового синего для определения концентрации антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению соединения, разрушающего р-лактамы, для определения концентрации антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы.
Подробное описание изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение простого, недорогого и удобного в применении способа определения антибиотиков в отходах. Также обеспечивается набор из частей, содержащий удобную в применении систему для микробиологического анализа и инструкции по применению в отношении отходов, в том числе сложных матриц, таких как потоки сточных вод, содержащие многие другие компоненты, или даже (полу)твердые отходы, такие как осадки на фильтре, мицелии или концентрированные остатки процессов брожения.
В настоящем изобретении обеспечивается уникальный, надежный и простой универсальный протокол тестирования.
В контексте настоящего изобретения термины и сокращения определяются следующим образом.
Термин "антибиотик" относится к таким соединениям, как, например, β-лактамы, тетрациклины, аминогликозиды, хинолоны и сульфонамиды и их производные; а также к любой их комбинации. Примерами антибиотиков, присутствие которых можно выявлять с помощью способа или набора согласно настоящему изобретению, являются, без ограничения, аминогликозиды (такие как амикацин, дибекацин, гентамицин, канамицин А, неомицины В, С и Е, нетилмицин, сизомицин, стрептомицин, тобрамицин и т.п.), цефалоспорины (такие как 7-аминоцефалоспорановая кислота, 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота, цефаклор, цефадроксил, цефамандол, цефатризин, цефазолин, цефбуперазон, цефкапен, цефдинир, цефдиторен, цефепим, цефетамет, цефиксим, цефменоксим, цефметазол, цефминокс, цефодизим, цефоницид, цефоперазон, цефоранид, цефоселис, цефотаксим, цефотиам, цефотетан, цефовецин, цефокситин, цефозопран, цефпирамид, цефпиром, цефподоксим, цефпрозил, цефкином, цефроксадин, цефсулодин, цефтаролин, цефтазидим, цефтерам, цефтибутен, цефтиофур, цефтизоксим, цефтобипрол, цефтолозан, цефтриаксон, цефуроксим, цефалексин, цефалоспорин С, цефрадин и т.п.), пенициллины (такие как 6-аминопенициллановая кислота, амоксициллин, ампициллин, клоксациллин, флуклоксациллин, оксациллин, пенициллин G, пенициллин V и т.п.), хинолоны первого поколения (такие как циноксацин, налидиксовая кислота, оксолиновая кислота, пипемидовая кислота, пиромидовая кислота, розоксацин), хинолоны второго поколения (такие как ципрофлоксацин, эноксацин, флероксацин, ломефлоксацин, надифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, пефлоксацин, руфлоксацин), хинолоны третьего поколения (такие как балофлоксацин, грепафлоксацин, левофлоксацин, пазуфлоксацин, спарфлоксацин, темафлоксацин, тозуфлоксацин), хинолоны четвертого поколения (такие как клинафлоксацин, гатифлоксацин, гемифлоксацин, моксифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин, прулифлоксацин), сульфонамиды и тетрациклины (такие как хлортетрациклин, демеклоциклин, лимецикпин, меклоциклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, ролитетрациклин, тетрациклин и т.п.). Что важно, также включены продукты распада и/или перегруппированные производные вышеуказанных соединений, которые при этом все еще обладают противомикробной активностью.
-1
-1
-1
-1
Термин "аналитическая среда" относится к композиции в форме раствора, твердого вещества или, предпочтительно, в форме гелеобразной матрицы, такой как золь или гель. Если аналитическая среда имеет форму гелеобразной матрицы, то она может содержать гелеобразователь. Специалисту в данной области будет понятно, что в основе твердых аналитических сред могут лежать материалы-носители, такие как керамические материалы, хлопок, стекло, металлические частицы, бумага, полимеры любой конфигурации или формы, силикаты, губчатые вещества, шерсть и т.п. Аналитическая среда обычно содержит один или несколько индикаторов. Аналитическая среда может содержать один или несколько типов микроорганизмов или ферментов в качестве средств выявления и по меньшей мере одно питательное вещество. Аналитическая среда может иметь форму таблетки, диска или бумажного фильтра, содержащих микроорганизм, индикатор и питательное вещество. Эти три составляющие могут присутствовать в одной таблетке, но также и в двух или более таблетках. Разумеется, также можно применять анализы с комбинацией аналитических сред в твердой, жидкой и/или гелеобразной форме. В одном варианте осуществления микроорганизм, индикатор и питательное вещество вносят в раствор агара. Раствору агара дают затвердеть с образованием аналитической среды таким образом, чтобы микроорганизм оставался живым, но не мог размножаться вследствие, например, низкой температуры. В одном варианте осуществления количество гелеобразователя в аналитической среде составляет 2-100 г⋅л, предпочтительно 5-50 г⋅л, более предпочтительно 10-20 г⋅л, наиболее предпочтительно 12-15 г⋅л. В предпочтительном варианте осуществления гелеобразователь представляет собой агар. Аналитическая среда необязательно также может содержать один или несколько буферов, стабилизаторов, поверхностно-активных веществ, солей, веществ, изменяющих чувствительность к определенным противомикробным соединениям в положительную (улучшение чувствительности) или отрицательную (снижение чувствительности) сторону, средств, повышающих вязкость, или любую их комбинацию. Если в среде присутствует буфер, то его можно добавлять в ходе смешивания компонентов среды, или компоненты можно растворять и/или суспендировать в буфере. Подходящие буферные средства включают в себя без ограничения апанин, фосфат калия и фосфат натрия. Примерами веществ, изменяющих чувствительность к определенным противомикробным соединениям, являются антифолаты, такие как орметоприм, тетроксоприм и триметоприм, которые улучшают чувствительность микроорганизма к сульфаниламидным соединениям, или соли щавелевой кислоты или фтористоводородной кислоты или хелатообразователи для кальция, которые улучшают чувствительность к тетрациклину. Цистеин и пенициллинсвязывающий белок являются соединениями, которые, как известно, снижают чувствительность к определенным противомикробным соединениям. Примеры средств, повышающих вязкость, включают без ограничения аскорбилметилсиланолпектинат, карбомер, карбоксиметилцеллюлозу, цетеариловый спирт, цетиловый спирт, цетиловые сложные эфиры, кокамид DEA, эмульгирующий воск, глюкозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, лаурамид DEA, линолеамид DEA, алюмосиликат магния, мальтодекстрины, дистеарат PEG-8, полиакриламид, поливиниловый спирт, сополимер PVP/гексадецена, хлорид натрия, сульфат натрия, амидопропилбетаин соевого масла, ксантановую камедь и т.п. Подходящий стабилизатор представляет собой, например, коллоидный кремнезем. В качестве альтернативы, необязательные ингредиенты аналитической среды, упомянутые выше, также можно добавлять экзогенным путем. Аналитическая среда может содержаться в любом типе контейнера; часто используемыми контейнерами являются пробирки, титрационные микропланшеты и чашки Петри. Контейнеры могут иметь любую форму и размер и могут быть изготовлены из любого доступного материала, при условии, что возможно наблюдение изменений индикатора. Наблюдение изменений индикатора можно осуществлять визуально, но также можно осуществлять с использованием считывающего устройства для образцов, такого как сканер. Частью аналитической системы необязательно являются средства для запечатывания указанных контейнеров, заполненных аналитической средой, на период инкубирования и/или вкладыш с инструкциями по применению, и/или средства для установки времени, необходимого для инкубирования. Аналитическая среда необязательно является стерилизованной. Обычно рН доводят до требуемого значения. Способ согласно настоящему изобретению может включать смешивание образцов {например, с другими образцами, но также, например, с солями, буферными соединениями, стабилизаторами, изотопно мечеными соединениями, флуоресцентно мечеными соединениями и т.п.), концентрирование и/или дополнительное разведение (например, жидкостями для разведения, такими как вода) образцов перед добавлением в аналитическую среду.
-1
5
12
-1
6
10
-1
6
9
-1
6
8
-1
6
7
-1
Термин "CFU" является акронимом понятия "колониеобразующие единицы" и относится к количеству микроорганизмов, спор микроорганизмов, частично проросших спор микроорганизмов и/или вегетативных клеток, способных образовывать колонии микроорганизмов. Концентрация указанных CFU выражена в виде числа колониеобразующих единиц на мл аналитической среды (CFU⋅мл) и обычно находится в диапазоне от 1×10 до 1×10 CFU⋅мл, предпочтительно от 1×10 до 1×10 CFU⋅мл, более предпочтительно от 2×10 до 1×10 CFU⋅мл, наиболее предпочтительно от 5×10 до 1×10 CFU⋅мл или еще более предпочтительно от 5×10 до 2×10 CFU⋅мл.
Термин "гелеобразователь" относится к соединению или веществу, которое способствует превращению смеси в гель или принятию ею формы геля. Подходящими примерами гелеобразователей являются агар, альгиновая кислота и ее соли, каррагинан, желатин, гидроксипропилгуар и его производные, камедь рожкового дерева (смола рожкового дерева), переработанная морская водоросль эухеума и т.п.
-1
-1
-1
-1
В контексте настоящего изобретения термин "индикатор" относится к веществу, применяемому для измерения (например, по изменению цвета или флуоресценции) состояния аналитической среды в отношении присутствия конкретного компонента (например, кислоты, основания, окислителей или восстановителей). Индикатор при изменении одного состояния на другое обеспечивает выявляемый сигнал, такой как изменение цвета или флуоресценция. Индикатор может представлять собой индикатор рН, окислительно-восстановительный индикатор или их комбинацию. Термин "индикатор" в данном документе также может относиться к двум или более индикаторам. Примеры подходящих индикаторов хорошо известны специалисту в данной области (см. справочник H.J.  Biological Stains, R.D. Lillie ed., Baltimore, 1969). Особенно применимыми являются индикаторы, которые при изменении одного состояния на другое обеспечивают визуально выявляемый сигнал, такой как изменение цвета или флуоресценция. Количество индикатора в аналитической среде составляет 0,01-50 г⋅л аналитической среды, предпочтительно 0,1-10 г⋅л, более предпочтительно 0,5-5 г⋅л, наиболее предпочтительно 1-3 г⋅л. Такие индикаторы можно легко выбрать из справочников, таких как `H.J.  Biological Stains`, R.D. Lillie ed., Baltimore, 1969. Предпочтительными индикаторами являются индикаторы рН и/или окислительно-восстановительные индикаторы. Примерами подходящих индикаторов являются кислотный синий 120, кислотный оранжевый 51, кислотный желтый 38, ализариновая кислота, ализариновый синий, азур А, азур В, основный синий 3, бриллиантовый черный, бриллиантовый крезиловый синий, кроцеиновый бриллиантовый МОО, бриллиантовый желтый, бромкрезоловый зеленый, бромкрезоловый пурпурный, бромфеноловый синий, бромфеноловый красный, бромтимоловый синий, хлоркрезоловый зеленый, конго красный, м-крезоловый пурпурный, галлоцианин, индигокармин, янус зеленый В, лакмус, метиленовый синий, метиловый красный, нильский синий А, нитразол желтый (также называемый нитразиновым желтым), о-нитрофенол, п-нитрофенол, 1-10-фенантролин, фенолфталеин, феноловый красный, сафранин О, тионин, тимоловый синий, толуидиновый синий и ксиленоловый синий. Предпочтительными индикаторами являются индикаторы, изменяющие цвет в диапазоне рН от 4,5 до 8,0, предпочтительно от 5,0 до 7,5, более предпочтительно от 5,5 до 7,0, предпочтительно ими являются бромкрезоловый зеленый, бромкрезоловый пурпурный, бромтимоловый синий, метиловый красный или феноловый красный, наиболее предпочтительно бромкрезоловый пурпурный или бромтимоловый синий.
Термин "безлактозный образец" относится к образцу, отличному от молока или других молочных продуктов, содержащих лактозу. Безлактозный образец относится к образцу, в котором необходимо определить присутствие или отсутствие антибиотиков и который следует отличать от образцов молока, для которых широко применяются и известны анализы содержания антибиотиков из предшествующего уровня техники. "Безлактозный" также охватывает "практически безлактозный". Как правило, безлактозный образец содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы, например, от 0,0001% (вес/вес) до 0,01% (вес/вес) лактозы, предпочтительно от 0,00001% (вес/вес) до 0,005% (вес/вес) лактозы. Содержание лактозы можно определить согласно способам, известным специалисту в данной области. Содержание лактозы предпочтительно определяют согласно ISO 22662:2007. Примеры безлактозных образцов в контексте настоящего изобретения включают образцы из потоков промышленных отходов заводов, в том числе как водных, так и твердых потоков отходов, образцы из стоков и поверхностных вод, таких как реки, озера, ручьи и т.п., и образцы из мочи или навоза в ветеринарии. Безлактозные образцы для применения в настоящем изобретении могут быть получены из текучей среды, такой как вода, сточные воды, технологическая вода, канализационная вода, питьевая вода, вода, применяемая, например, в бассейнах, саунах и оранжереях, а также охлаждающая вода. Она может представлять собой воду из сельскохозяйственных источников, рыбных хозяйств, балластную воду кораблей, воду из градирен, станций очистки сточных вод, электростанций, отраслей химической промышленности, таких как текстильная промышленность, целлюлозно-бумажная промышленность, полиграфическая промышленность, черная металлургия, коксовая промышленность, нефтяная промышленность, промышленное производство пестицидов, лакокрасочная промышленность, медицинская и стоматологическая промышленность, промышленное производство растворителей, фармацевтическая промышленность, промышленное производство химических веществ для консервирования древесины, а также пищевой промышленности. Жидкость может представлять собой входящий сток и/или поток, выходящий сток и/или поток или промежуточный сток и/или поток из любого из вышеупомянутых источников.
Термин "микроорганизм" относится к микроорганизму, чувствительному к антибиотику, присутствие или отсутствие которого надлежит определить по его росту.
Термин "питательное вещество", используемый в данном документе, относится к питательному веществу или ингредиенту, которые содействуют росту микроорганизма и/или требуются для него. Подходящие питательные вещества зависят от микроорганизма, используемого в аналитической среде. Аналитическая среда может содержать два или более различных питательных веществ. Они включают в себя без ограничения источники усвояемого углерода, такие как углеводы, такие как, например, глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза и декстроза; источники усвояемого азота, такие как аминокислоты, такие как, например, пептон или триптон; источники витаминов и факторов роста, такие как говяжий или дрожжевой экстракт; и источники минеральных веществ, такие как соли щелочноземельных металлов, такие как соли, например, бария или кальция.
Термины "молочный порошок" или "сухое молоко" относятся к изготовленному молочному продукту, полученному путем выпаривания молока до сухого состояния. Одной целью высушивания молока является его консервирование; молочный порошок имеет намного более длительный срок годности при хранении, чем жидкое молоко, и не нуждается в охлаждении ввиду низкого содержания влаги в нем. Другой целью является уменьшение его объема для экономии при транспортировке. Молочный порошок и молочные продукты включают в себя такие объекты, как сухое цельное молоко, обезжиренное (снятое) сухое молоко, сухая пахта, сухие продукты из молочной сыворотки и сухие молочные смеси.
В контексте настоящего изобретения термин "спора" относится к примитивной, обычно одноклеточной, часто устойчивой к воздействию окружающей среды покоящейся или репродуктивной структуре, образуемой микроорганизмами и способной к развитию в новый отдельный микроорганизм.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу определения присутствия или отсутствия антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы, включающему стадии:
(a) приведения указанного безлактозного образца в контакт с аналитической средой, содержащей микроорганизм, гелеобразователь и индикатор, способный к выявлению роста или подавления микроорганизма, с получением совокупности из безлактозного образца и аналитической среды;
(b) инкубирования совокупности, полученной на стадии (а), в течение периода времени, достаточного для роста микроорганизма в случае отсутствия антибиотика в указанном безлактозном образце; и
(с) выявления роста или подавления роста микроорганизма с помощью индикатора,
отличающемуся тем, что на стадии (а) добавляют молоко и/или молочный порошок.
Неожиданно было обнаружено, что добавление молока или молочного порошка к безлактозному образцу, который подлежит тестированию в отношении присутствия или отсутствия антибиотика, приводит к улучшению точности и облегчению выявления по сравнению с осуществлением аналогичного анализа в отсутствие молока (молочного порошка). Выполнение микробиологических анализов для определения антибиотиков в молоке является, как описано в разделе "Предпосылки изобретения", хорошо известным. Также сообщалось о применении микробиологических анализов для определения антибиотиков в образцах, не связанных с молочной промышленностью; они обычно представляют собой водные безлактозные текучие среды. Тем не менее, в предшествующем уровне техники отсутствует предложение по выполнению, не говоря уже об улучшении, определения антибиотиков в безлактозных образцах путем добавления молока (молочного порошка) к указанным безлактозным образцам. Механизм, лежащий в основе этого наблюдения, пока еще не вполне понятен. Независимо от того, связан ли он с механизмами влияния молока на аналитическую среду, микроорганизм (рост микроорганизма), эффект окрашивания индикаторов или химическое или физическое взаимодействие с безлактозным образцом, подлежащим анализу, в настоящее время этот эффект является предположительным и не подкрепляется сведениями из предшествующего уровня техники.
В первом варианте осуществления микроорганизм относится к штамму Bacillus, Escherichia coli или Streptococcus. В дополнительном варианте осуществления микроорганизм представляет собой термофильный микроорганизм, такой как Bacillus stearothermophilus или Streptococcus thermophilus. Аналитическая среда может содержать один или несколько типов микроорганизмов в качестве средств выявления. Микроорганизм может быть внесен в аналитическую среду в виде единиц, способных образовывать колонии, или CFU. Рост микроорганизма на стадии (b) инкубирования должен происходить в течение предварительно установленного периода, предпочтительно в рамках временного интервала 0,5-4 часов, более предпочтительно 1-3,5 часов, наиболее предпочтительно 2,0-3,25 часов. Рост микроорганизма предпочтительно осуществляется при предварительно установленной температуре, предпочтительно при оптимальной температуре роста микроорганизма. Если, например, используются термофильные микроорганизмы, указанная температура предпочтительно составляет 40-70°С, более предпочтительно 50-65°С, наиболее предпочтительно 60-64°С. Указанную реакцию необязательно можно выполнять с помощью термостатического устройства. С помощью термостатического устройства образцы можно выдерживать при предварительно установленной температуре, такой как температура, при которой микроорганизм демонстрирует достаточный рост. Указанное термостатическое устройство предпочтительно сконструировано таким образом, что оно может вмещать в себя контейнеры, заполненные аналитической средой. Термостатическое устройство необязательно соединено со средством для установки времени, необходимого для инкубирования, таким образом, чтобы нагревание и/или охлаждение прекращалось по истечении предварительно установленного периода. В качестве альтернативы, время, требуемое для роста микроорганизма, равно времени, требуемому для индуцирования изменения индикатора калибровочным образцом без какого-либо дезинфицирующего средства.
Во втором варианте осуществления твердые вещества удаляют из указанного безлактозного образца перед стадией (а). Такое удаление можно осуществлять с использованием операций, доступных специалисту в данной области, таких как центрифугирование, декантация, фильтрация и т.п. При необходимости, если указанный безлактозный образец содержит много твердых веществ или даже представляет собой твердое вещество, то образец вначале предпочтительно смешивают с водным раствором перед удалением твердых веществ. Указанный водный раствор может представлять собой молоко или молочный порошок, смешанные с водой.
В третьем варианте осуществления количество лактозы, присутствующее в безлактозном образце, объединенном с добавленным молоком или молочным порошком, составляет 1-10% (вес/вес), предпочтительно 2-5% (вес/вес).
В четвертом варианте осуществления выполняют контрольный тест, согласно которому на стадии (а) добавляют известное количество антибиотика. Указанный антибиотик может быть любым антибиотиком и предпочтительно представляет собой пенициллин G K.
В пятом варианте осуществления выполняют контрольный тест, согласно которому на стадии (а) добавляют известное количество соединения, разрушающего β-лактамы. Указанное соединение, разрушающее β-лактамы, может представлять собой любое соединение, разрушающее β-лактамы, и предпочтительно представляет собой β-лактамазу.
Хотя контрольные тесты не являются обязательными для надлежащего функционирования способа согласно настоящему изобретению, специалисту в данной области понятно, что надежность результатов улучшается при выполнении обоих контрольных тестов из четвертого и пятого вариантов осуществления вместе со способом по первому аспекту.
В шестом варианте осуществления в настоящем изобретении обеспечивается способ определения концентрации антибиотика в безлактозном образце, включающий стадии:
(a) получения диапазона разведений указанного безлактозного образца путем добавления молока;
(b) приведения каждого образца разведения, полученного на стадии (а), в контакт с аналитической средой, содержащей микроорганизм, питательное вещество и индикатор;
(c) инкубирования каждой смеси, полученной на стадии (b), в течение периода времени для обеспечения роста микроорганизма в случае отсутствия антибиотика в образце;
(d) выявления роста или подавления роста микроорганизма с помощью индикатора;
(e) определения образца разведения с наивысшим коэффициентом разведения, способного подавлять рост микроорганизма;
(f) определения концентрации антибиотика в образце разведения, определенном на стадии (е), и
(g) определения концентрации антибиотика в указанном безлактозном образце путем умножения концентрации, определенной на стадии (f), на коэффициент разведения, определенный на стадии (е), используемый для получения образца разведения.
Рост или подавление роста микроорганизма выявляют путем наблюдения присутствия или отсутствия изменения индикатора. Это предпочтительно выполняют для каждого образца разведения в диапазоне разведения. Если, например, изменение индикатора представляет собой изменение цвета, то изменение цвета можно наблюдать визуально. Тем не менее, в одном варианте осуществления настоящего изобретения изменение цвета определяют с помощью прибора, генерирующего цифровые данные изображений, или прибора, генерирующего аналоговые данные изображений и преобразующего указанные аналоговые данные изображений в цифровые данные изображений с последующей интерпретацией указанных цифровых данных изображений процессором компьютера. Такой прибор, который может, например, представлять собой считывающее устройство для образцов, такое как сканер, соединенное с персональным компьютером, описан в WO 03/033728. При использовании такого прибора возможно сканировать нижнюю сторону каждого из образцов в тестовом планшете. Цвет и яркость отраженного света регистрируют с помощью трех переменных, каждая из которых описывает один компонент цвета, например, в так называемой модели L*a*b*. В модели L*a*b* цветовой спектр разделяется в двухмерной матрице. Положение цвета в данной матрице регистрируют с помощью двух переменных "а" и "b". Переменная L указывает на интенсивность (например, от светло-синего до темно-синего). Можно создать критерий, содержащий а-значение, b-значение и L-значение, с получением следующей сложной функции:
L
b
Z=W⋅L+wa⋅a+w⋅b,
где wu, wa и wb представляют собой весовые коэффициенты для L-значения, а-значения и b-значения соответственно. Значения данных весовых коэффициентов можно рассчитать с помощью "дискриминантного анализа" таким образом, чтобы в отношении разброса групповые средние значения характеризовались максимальным расстоянием. Путем комбинирования двух или более компонентов цвета в модели L*a*b* предварительно определенным образом в зависимости от типа дезинфицирующего средства и образца возможно произвести точное выявление. На практике определенное значение Z, при котором в анализе должно произойти переключение между положительным и отрицательным результатом, предварительно определяют путем эксперимента для каждого дезинфицирующего средства. При желании считывающее и компьютерное оборудование, описанное выше, можно объединить с нагревательным оборудованием, например, термостатическим устройством, описанным в WO 2007/090683.
Во втором аспекте настоящего изобретения предусматривается набор для выполнения способа согласно первому аспекту настоящего изобретения, при этом указанный набор содержит (а) контейнер с аналитической средой, которая содержит микроорганизм, гелеобразователь и индикатор, способный к выявлению роста или подавления микроорганизма, для получения смеси, и (b) руководство по выполнению способа согласно первому аспекту настоящего изобретения, такое как руководство, содержащее инструкции по определению концентрации антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы. Такой набор содержит один или несколько контейнеров, содержащих аналитическую среду, описанную выше. Контейнеры могут представлять собой пробирки любой формы и размера и могут быть изготовлены из любого доступного материала, при условии, что возможно наблюдение изменений индикатора. Контейнеры также могут представлять собой лунки, такие как входящие в состав титрационных микропланшетов.
Руководство по выполнению способа согласно первому аспекту настоящего изобретения должно содержать по меньшей мере инструкции по обработке образца, включающей необязательное удаление твердых веществ посредством фильтрации или центрифугирования и добавление молока или молочного порошка, описанное в первом аспекте настоящего изобретения.
В первом варианте осуществления набор содержит один или несколько контейнеров, содержащих молочный порошок.
Во втором варианте осуществления набор содержит устройство для отбора образцов, которое представляет собой устройство, с помощью которого в указанную аналитическую среду можно добавлять текучую среду. Такое устройство предпочтительно представляет собой контейнер, необязательно с отметками объема. Такое устройство более предпочтительно представляет собой шприц, пипетку или автоматическую систему пипетирования. Такие шприц или пипетка могут быть сконструированы таким образом, что при использовании только одного режима функционирования из текучей среды, подлежащей анализу, можно извлечь предварительно определенный объем. Необязательно можно применять системы, известные из уровня техники, в которых при использовании одного способа эксплуатации могут функционировать более одного шприца или пипетки. Целью второго аспекта настоящего изобретения является обеспечение набора, позволяющего осуществлять простое добавление определенных количеств текучей среды, подлежащей добавлению согласно первому аспекту настоящего изобретения.
В третьем варианте осуществления набор содержит средства для запечатывания указанных контейнеров, содержащих аналитическую среду, на период инкубирования.
В четвертом варианте осуществления набор содержит один или несколько контейнеров с известными количествами антибиотика, подлежащего использованию для выполнения контрольного теста. Указанный антибиотик может быть любым антибиотиком и предпочтительно представляет собой пенициллин G K.
В пятом варианте осуществления набор содержит один или несколько контейнеров с известными количествами соединения, разрушающего β-лактамы, подлежащего использованию для выполнения контрольного теста. Указанное соединение, разрушающее β-лактамы, может представлять собой любое соединение, разрушающее β-лактамы, и предпочтительно представляет собой β-лактамазу.
В шестом варианте осуществления второго аспекта настоящего изобретения набор содержит термостатическое устройство, с помощью которого образцы можно выдерживать при предварительно установленной температуре, такой как температура, при которой микроорганизм демонстрирует достаточный рост. Указанное термостатическое устройство предпочтительно сконструировано таким образом, что оно может вмещать в себя указанные контейнеры, заполненные аналитической средой. Термостатическое устройство необязательно соединено со средствами для установки времени, необходимого для инкубирования, таким образом, чтобы нагревание и/или охлаждение прекращалось по истечении предварительно установленного периода.
В седьмом варианте осуществления набор содержит носитель данных, на который загружена компьютерная программа, подходящая для предоставления компьютеру инструкций по анализу цифровых данных, получаемых со считывающего устройства для образцов. Указанный носитель данных может представлять собой любой носитель, подходящий для хранения цифровой информации, такой как CD-ROM, дискета, DVD, флэш-накопитель, магнитная лента и т.п. Указанный носитель данных, на который загружена компьютерная программа, преимущественно обеспечивает легкий доступ к последним доступным компьютерным программам, подходящим для применения в способе согласно настоящему изобретению.
В третьем аспекте настоящего изобретения предусматривается композиция, содержащая безлактозный образец, содержащий менее 0,01% вес/вес лактозы, микроорганизм, гелеобразователь, индикатор и одно из молока и молочного порошка. Такая композиция получается в том случае, когда способ согласно первому аспекту настоящего изобретения применяют в отношении безлактозного образца, такого как образцы из потоков промышленных отходов заводов, в том числе как водных, так и твердых потоков отходов, образцы из стоков и поверхностных вод, таких как реки, озера, ручьи и т.п., и образцы из мочи или навоза в ветеринарии.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предусматривается применение бромкрезолового пурпурного или бромтимолового синего, или соединения, разрушающего β-лактамы, для определения концентрации антибиотика в безлактозном образце, который является практически безлактозным и/или содержит менее 0,01% (вес/вес) лактозы.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Руководство по определению антибиотиков в сточных водах
Ниже приведен неограничивающий пример того, что может быть включено в качестве руководства в набор по настоящему изобретению.
Окружающая среда
Следует убедиться, что окружающая среда, в которой будет выполняться определение антибиотиков, не содержит р-лактамы. Если этого нельзя гарантировать в самом помещении, то можно использовать вытяжной шкаф с ламинарным потоком воздуха в качестве альтернативы.
Оборудование/вспомогательные приспособления
- Центрифуга для центрифужных пробирок на 2 мл (скорость вращения 15000 об./мин.).
- Водяная баня, в которой можно установить температуры 37°С и 65°С.
- рН-метр.
- Морозильная камера с отдельным отсеком для хранения образцов; в качестве альтернативы можно использовать закрытый ящик в морозильной камере.
- Пипетка Eppendorf на 10-100 мкл и 100-1000 мкл.
- Наконечники пипеток Eppendorf на 100 мкл и 1000 мкл.
- Центрифужные пробирки на 2,0 мл.
- Центрифужные пробирки на 10 мл с завинчивающимися крышками.
- Центрифужные пробирки Greiner на 50 мл с завинчивающимися крышками.
- Система очистки воды Milli-Q.
- Ампулы Delvotest SP NT (или сопоставимые системы для микробиологического анализа содержания антибиотиков).
- Мерные колбы (100 мл и 200 мл, стерилизованные и промытые 4 раза водой Millipore).
Химические вещества
- 1 н. гидроксид натрия (не содержащий β-лактамов).
- 1 н. хлористоводородная кислота (не содержащая β-лактамов).
- β-лактамаза BS (например, от поставщика AG Scientific, номер продукта L-2467).
- Цельное молоко (не содержащее β-лактамов); в качестве альтернативы можно использовать молочный порошок, 1 грамм молочного порошка в 10 мл воды Milli-Q. Молоко можно хранить в морозильной камере (срок годности при хранении 3 месяца). Перед использованием следует медленно разморозить замороженное молоко до комнатной температуры.
Для всех источников молока важно убедиться в том, что молоко не дает положительную реакцию в анализе.
- Пенициллин G K.
Получение раствора
- Вода для разведения: добавляют 40 мл воды Milli-Q в новую центрифужную пробирку Greiner на 50 мл.
- Раствор β-лактамазы: взвешивают 50 мг в центрифужной пробирке на 2 мл и добавляют 2 мл воды Milli-Q. Корректируют количество, если при проведении анализа необходимо меньше или больше.
- 1 н. гидроксид натрия: взвешивают 1 грамм NaOH в новой центрифужной пробирке Greiner на 50 мл, растворяют в 25 мл воды Milli-Q и перемешивают.
- 1 н. хлористоводородная кислота: добавляют 24 грамма воды Milli-Q в новую центрифужную пробирку Greiner на 50 мл, добавляют 0,9 мл концентрированной HCl и перемешивают.
- Исходный раствор 4 ppb пенициллина G K: взвешивают точно 44 мг пенициллина G K (90% чистоты) в мерной колбе на 100 мл, растворяют, наполняют водой Milli-Q и перемешивают (раствор А). Добавляют 1,0 мл раствора А в мерную колбу на 100 мл, наполняют водой Milli-Q и перемешивают (раствор В). Добавляют 1,0 мл раствора В в мерную колбу на 100 мл, наполняют водой Milli-Q и перемешивают (раствор С). Взвешивают 5,0 грамма раствора С в центрифужной пробирке Greiner на 50 мл, добавляют 45,0 грамма молока и перемешивают (исходный раствор 4 ppb). Разделяют этот раствор на несколько центрифужных пробирок по 10 мл, отмечают каждую пробирку и замораживают при -18°С (4 мл на пробирку и срок годности при хранении 3 месяца). - Тестовый раствор 2 ppb пенициллина G K: Вынимают пробирку с исходным раствором пенициллина G K из морозильной камеры и медленно размораживают до комнатной температуры. Смешивают 600 мкл исходного раствора пенициллина G K с 600 мкл цельного молока и перемешивают.
Процесс отбора образцов
В ходе отбора, хранения и транспортировки образцов критически важно удостовериться в том, что β-лактамы не вносятся. Для сведения к минимуму вероятности загрязнения необходимы следующие стадии.
1. Надевают перчатки и чистый лабораторный халат во избежание загрязнения.
2. Заполняют две центрифужные пробирки Greiner на 50 мл 40 мл образца и закрывают их завинчивающимися крышками непосредственно после добавления.
3. Маркируют пробирки с образцами и убеждаются в том, что текст на маркировке легко читается.
4. Помещают две пробирки непосредственно в ранее никогда не использовавшийся пластиковый пакет и закрывают его кабельной стяжкой.
5. Также маркируют пластиковый пакет с той же информацией, которая указана на самих пробирках с образцами.
6. Хранят две пробирки с образцами в пластиковом пакете при -18°С, если анализ не выполняется сразу же. Хранение при -18°С следует произвести в пределах периода 15 минут после отбора образцов.
Предварительная обработка
Если образцы заморожены, то образец размораживают путем помещения образца за день до выполнения анализов в холодильник (3-10°С).
1. Взвешивают 2 грамма в центрифужной пробирке Greiner на 50 мл, добавляют 25 мл воды Milli-Q и перемешивают до образования однородной суспензии; убеждаются, что обе фазы тщательно перемешаны, в особенности в случае с сухими или высушенными образцами.
2. Встряхивают образцы по меньшей мере в течение 10 минут при комнатной температуре
3. Доводят рН до 6,2-6,8 с помощью 1 н. NaOH или 1 н. HCl.
4. Заполняют две центрифужные пробирки на 2 мл.
5. Центрифугируют в течение 10 мин. при 14000 об./мин.
Прозрачный верхний слой будет использоваться для дальнейших анализов.
Предварительные манипуляции для анализов
Существует три различных вида предварительных манипуляций с образцами для трех различных анализов; в зависимости от требований можно осуществлять любой или все из этих анализов:
1. Нормальный анализ.
2. Анализ с добавлением стандарта.
3. Анализ ферментативного разрушения.
При планировании выполнения этих различных видов деятельности по предварительным манипуляциям следует учитывать, что предварительные манипуляции с использованием фермента занимают по меньшей мере 2 часа времени подготовки.
1. Предварительные манипуляции для нормального анализа
Добавляют 600 мкл прозрачного раствора образца в центрифужную пробирку на 2,0 мл, добавляют 600 мкл молока, сразу же закрывают крышку и перемешивают; эту смесь можно анализировать непосредственно.
2. Предварительные манипуляции для анализа с добавлением стандарта Добавляют 600 мкл раствора образца в центрифужную пробирку на 2 мл и добавляют 600 мкл тестового раствора 2 ppb пенициллина G K, закрывают крышку и перемешивают; эту смесь можно анализировать непосредственно.
3. Предварительные манипуляции для анализа Ферментативного разрушения Добавляют 700 мкл прозрачного раствора образца в центрифужную пробирку на 2,0 мл, добавляют 100 мкл раствора β-лактамазы, сразу же закрывают крышку и перемешивают. Помещают центрифужную пробирку на 2 часа в водяную баню при 37°С, охлаждают через два часа, добавляют 700 мкл молока и перемешивают; эту смесь можно анализировать непосредственно.
Выполнение определения антибиотиков
Изучают общее описание, включенное вместе с ампулами Delvotest SP NT (или сопоставимой системой). Таблица ниже приведена в качестве примера гипотетической заполняемой таблицы для образцов. В первый ряд добавляют пустой образец (молоко) и тестовый раствор 2 ppb пенициллина G K. В этом примере применяются следующие коды для различных анализов: N для нормального анализа; S для анализа с добавлением стандарта; Е для анализа ферментативного разрушения.
100 мкл из всех растворов образцов отбирают в ампулу Delvotest SP NT с помощью пипетки Eppendorf на 100 мкл. С помощью наконечника пипетки пронизывают крышку на верхней части ампулы и добавляют 100 мкл в ампулу. Ампулы помещают на 2,5 ч. на водяную баню при 65°С. Ампулу запечатывают лентой. Через 2,5 ч. ампулы вынимают из водяной бани. Проверяют, имеют ли пустые образцы желтый цвет, и если нет, то продлевают время нахождения в водяной бане на 30 мин.
Интерпретация результатов
Желтый цвет означает отрицательный результат, а пурпурный цвет означает положительный результат. Положительный результат означает, что в образце имеет место противомикробная активность, превышающая 2 ppb (в пересчете на пенициллин G K).
Результаты нормального анализа
- Пурпурный цвет означает противомикробную активность > 2 ppb, а желтый - < 2 ppb.
Результаты анализа с добавлением стандарта
- Если образец имеет желтый цвет в нормальном анализе и пурпурный в анализе с добавлением стандарта: уровень противомикробной активности составляет < 2 ppb.
- Если образец имеет желтый цвет в нормальном анализе и желтый в анализе с добавлением стандарта: наблюдается матричный эффект, результаты не могут быть достоверными. Необходимо разведение образца.
- Если образец имеет пурпурный цвет в нормальном анализе, то анализ с добавлением стандарта нельзя применять.
Анализ ферментативного разрушения
- Если образец имеет пурпурный цвет в нормальном анализе и пурпурный в анализе ферментативного разрушения: результаты не могут быть достоверными. Образец необходимо повторно проанализировать с большим количеством фермента.
- Если образец имеет пурпурный цвет в нормальном анализе и желтый в анализе ферментативного разрушения: уровень противомикробной активности составляет > 2 ppb.
- Если образец имеет желтый цвет в нормальном анализе, то анализ ферментативного разрушения не даст никакой дополнительной информации для применения.
Расчет противомикробной активности
-1
Результаты можно рассчитать следующим образом (предел обнаружения способа составляет 2 ppb, 2 ppb соответствует 2 мкг⋅л):
-1
-1
- Образец: 2 г⋅25 мл, что соответствует 80 г⋅л.
-1
- Разведение в 2 раза молоком => 40 г⋅л.
- Если образец окрашивается в пурпурный цвет, это означает присутствие противомикробной активности > 2 мкг в 40 граммах.
-1
-1
- 2 мкг⋅40 г => 50 мкг⋅кг => противомикробная активность > 50 ppb.
- Если в желтый - противомикробная активность < 50 ppb.
Пример 2
Определение антибиотика в образце с добавлением и без добавления молока
Два образца, пустой образец (воду) и тестовый раствор 2 ppb пенициллина G K, анализировали с помощью коммерчески доступных (DSM Food Specialties B.V., Делфт, Нидерланды) Delvotest SP NT аналогично описанному в руководстве поставщика. Две ампулы заполняли пустым образцом. В одну добавляли молоко (в данном примере использовали нормализованное молоко пониженной жирности из нидерландского супермаркета) согласно инструкции, изложенной в общих чертах в примере 1, а в другую добавляли такое же количество воды. Две ампулы также заполняли тестовым раствором 2 ppb пенициллина G K, и вновь в одну добавляли молоко согласно инструкции, изложенной в общих чертах в примере 1, а в другую добавляли такое же количество воды. Ампулы, заполненные образцами, инкубировали при 64°С +/- 2°С, и цвет агара в ампулах регистрировали визуально в несколько моментов времени. Вышеописанный эксперимент осуществляли в пяти повторностях, и средние наблюдаемые значения были обобщены в таблице ниже.
Как можно видеть из таблицы, отсутствие антибиотика в пустых образцах приводит к росту микроорганизма в слое агара, что, в свою очередь, приводит к изменению рН и изменению цвета индикатора с пурпурного на желтый (символы --+, -++ и +++ в таблице означают соответственно изменение цвета с пурпурного на желтый от частичного до полного). При том, что образцы с тестовым раствором пенициллина G K не демонстрируют какое-либо изменение цвета вследствие эффекта подавления, оказываемого пенициллином G K на рост микроорганизма, в пустом образце начало изменения цвета можно наблюдать уже через 120 мин. в присутствии молока, тогда как в отсутствие добавленного молока данное наблюдение можно сделать только через 180 мин. Кроме того, полное изменение цвета также происходит быстрее в присутствии молока.
Пример 3
Определение антибиотика в образце с добавлением и без добавления молока
Пример 2 повторяли с различными другими образцами, такими как потоки технологических отходов и экстракты мицелиальных осадков на фильтре после брожения, и в тех случаях, когда в образце отсутствовал антибиотик, подтверждали эффект, соответствующий наблюдаемому в примере 2 (более быстрое изменение цвета индикатора в слое агара в тестовых ампулах Delvotest SP NT в присутствии молока по сравнению с тем же в отсутствие молока).