Изменчивость плюсовых деревьев сосны обыкновенной на архиве клонов по ISSR-маркерам

УДК 630*232.311.3

П. С. Новиков, О. В. Шейкина, Т. Н. Милютина

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПЛЮСОВЫХ ДЕРЕВЬЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА АРХИВЕ КЛОНОВ ПО ISSR-МАРКЕРАМ

Приведены данные исследования генетической изменчивости по ISSR-маркерам плюсовых деревьев сосны обыкновенной на архиве клонов, позволивших выделить 144 полиморфных локуса. Основные параметры генетической изменчивости деревьев составили: индекс Шеннона - 0,407, генетическое разнообразие по Нею - 0,257, эффективное число аллелей - 1,405.

Ключевые слова: ISSR-маркеры, сосна обыкновенная, плюсовые деревья, генетическая изменчивость.

Введение. Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) широко распространена на территории нашей страны и играет важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем. Немаловажной задачей научных исследований является оценка степени использования генетического потенциала сосны при организации постоянной лесосеменной базы. Эта задача вытекает из самого содержания работ по организации лесного семеноводства в Российской Федерации. Для создания лесосеменных плантаций используются только плюсовые деревья. Как показывает практика, количество таких деревьев в различных субъектах РФ достаточно ограничено, поэтому есть определенный риск снижения генетического разнообразия искусственно создаваемых лесов при использовании в лесном семеноводстве ограниченного количества плюсовых деревьев. В связи с этим исследования, связанные с изучением индивидуальной изменчивости плюсовых деревьев и оценкой доли генетической изменчивости вида, приходящейся на плюсовые деревья, являются актуальными и необходимыми.

ДНК-маркеры доказали свою значимость в исследованиях генетического разнообразия. Часто в исследованиях применяются ПЦР-системы, основанные на RAPD, AFLP и SSR ДНК-маркерах [1, 2]. Основные недостатки этих методов - низкая воспроизводимость RAPD-анализа, высокая стоимость AFLP и необходимость знания фланговых последовательностей праймеров для SSR-анализа. ISSR-анализ не имеет большинства из этих ограничений [3-6]. Он широко используется научным сообществом в различных областях исследований растений [7]. При этом методе анализа амплифицируются участки между короткими тандемными микросателлитными повторами из 1-4 оснований ДНК, которые повсеместно присутствуют в геномах эукариот [8]. Они рассеяны по всему геному и различаются по числу повторяющихся единиц.

ISSR-анализ был успешно использован для оценки степени генетического разнообразия на меж- и внутривидовом уровне в широком диапазоне видов сельскохозяйственных культур, которые включают рис [9], пшеницу [10], просо [11], виноград [12], картофель [13] и подорожник [14]. Также он применялся при оценке генетического разнообразия какао [15], ели Дугласа и суджи [16] и даже грибов [17]. В то же время анализ литературы показал, что в России до сих пор исследования, посвященные изучению генетического разнообразия сосны обыкновенной по ISSR-маркерам, не проводились.

Цель работы заключалась в изучении генетической изменчивости плюсовых деревьев сосны обыкновенной на архиве клонов на основе проведения полимеразной цепной реакции с 7 ISSR-праймерами.

© Новиков П. С., Шейкина О. В., Милютина Т. Н., 2011.

Достижение поставленной цели предусматривает решение следующих задач:

1) сбор образцов хвои для выполнения генетического анализа;

2) выделение ДНК и проверка его качества;

3) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с ISSR-праймерами;

4) выполнение электрофоретического разделения продуктов ПЦР;

5) обработка полученных гелей и расчет основных параметров, характеризующих уровень генетической изменчивости совокупности изучаемых плюсовых деревьев сосны обыкновенной.

Материалы и методы. Объектом исследований являлись клоны плюсовых деревьев сосны обыкновенной, растущие на архиве клонов в Учебно-опытном лесхозе Республики Марий Эл. Всего проанализировано 41 плюсовое дерево.

В качестве исходного материала для экстракции геномной ДНК использовали хвою, которую хранили после сбора при -20°С. За основу бралась стандартная методика с применением 2хСТАВ-буфера [18].

Для экспериментальной работы были взяты 7 ISSR-праймеров, характеризующихся высокой индивидуальной изменчивостью и обеспечивающих простоту интерпретации результатов анализа (табл.1).

Т а б л и ц а 1

Характеристика используемых ISSR-праймеров

Праймер (Sequence 5'-3') Оптимальная температура отжига (Tm<„ °С) Количество циклов амплификации Концентрация Taq-полимеразы,

(CA)6AGG 60

(CA)6GT 60

(CA)6AC 60

(GA)8T 65 45 0,2

(AG)8GCT 65

(AG)8GCA 60

(AG)8C 60

Полимеразную цепную реакцию проводили в следующих условиях: реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 1 мкл ПЦР-буфера; 0,2 мкл 10 Мм dNTPs; 0,1 мкл 100 мкМ праймера; 1 мкл образца ДНК; 0,1 мкл Taq-полимеразы (2 ед/мкл); 7,6 мкл воды. Для проведения реакции использовали набор реактивов «Encyclo PCR kit» (Evrogen). Режим амплификации: 5 мин денатурация при 94°С, 0,5 мин денатурация при 94°С, 45 сек отжиг (45-60°С), элонгация 2 мин при 72°С, 7 мин достройка при 72°С, 45 циклов амплификации. Реакции проводили в тонкостенных пробирках, объемом 200 мкл на амплификаторе MJ Mini™ Gradient Thermal Cycler (BIO-RAD).

Электрофорез ДНК проводили в агарозных гелях с концентрацией агарозы 1,5 %. Разделение проводили в электрофорезной камере PowerPacTM Universal (BIO-RAD) в ТВЕ буфере с добавлением бромистого этидия в течение 2-2,5 часов при напряжении электрического поля 70 mV.

Визуализацию ДНК, обработку и анализ полученных изображений проводили с помощью системы гель-документации GelDoc 2000 (BIO-RAD) с использованием программного пакета Quantity One Version 4.6.3. Математическую обработку данных проводили в среде POPGENE Version 1.32 [19]. ISSR- профили анализировались по наличию (1) или отсутствию (0) полос на геле, соответствующих определенным в табл. 2 фрагментам, и математически обрабатывались в среде POPGEN [19]. На основании полученных данных рассчитывались относительные частоты фрагментов. Полученные частоты ISSR-фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости плюсовых деревьев сосны. Для этого были рассчитаны следующие параметры оценки генетической

изменчивости: наблюдаемое число аллелей - эффективное число аллелей - N6, общее генетическое разнообразие - Н (индекс Нея) и индекс Шеннона - I.

Результаты и обсуждение. По результатом ISSR-анализа ДНК, выделенной из хвои клонов плюсовых деревьев сосны, было установлено, что 7 ISSR-праймеров позволяют определить 144 амплифицируемых фрагмента, из которых 29 фрагментов приходится на (СA)6AGG, 13 - на (СА^Т, 20 - на (СА)бАС, 21 - на (ОА^Т, 29 - на (А^Ь GCT, 19 - на (AG)8GCА и 13 - на (АО)8С (табл. 2.). Все обнаруженные локусы можно считать полиморфными, так как фрагмент ДНК, который бы встречался абсолютно у всех плюсовых деревьев независимо от происхождения, выявлен не был. Длина амплифицированных фрагментов ДНК у разных праймеров варьировала от 1900 до 130 пар нуклеотидов. Пример электрофореграммы продуктов ПЦР с праймером (СА)6АОО приведен на рис. 1.

Т а б л и ц а 2

Результаты ПЦР ДНК клонов плюсовых деревьев сосны

Праймер Количество полиморфных фрагментов Размеры амплифицируемых фрагментов, Ьр

(CA)6AGG 29 1900, 1750, 1550, 1400, 1300, 1000, 850, 830, 800, 750, 700, 680, 650, 630, 570, 530, 500, 470, 450, 420, 400, 360, 320, 300, 270, 220, 180, 150, 130

(CA)6GT 13 950, 830, 700, 560, 500, 430, 380, 370, 330, 280, 250, 230, 200

(СА)бАС 20 1700, 1400, 1100, 950, 900, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 370, 350, 300, 290, 210, 200

(GA)8T 21 1570, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 970, 900, 820, 770, 730, 670, 650, 620, 580, 530, 500, 480, 440, 400, 360

(AG)8GCT 29 1800, 1700, 1500, 1300, 1200, 1100, 1000, 970, 800, 750, 730, 700, 680, 630, 590, 570, 550, 520, 500, 480, 430, 370, 350, 300, 270, 210, 180, 150,130

(AG)8GCA 19 1380, 1250, 1150, 950, 850, 780, 700, 670, 650, 630, 600, 560, 520, 470, 450, 430, 350, 330, 280

(AG)8C 13 1100, 1000, 910, 750, 700, 650, 600, 500, 450, 400, 350, 250, 200

На основе анализа полученных электрофореграмм были рассчитаны частоты встречаемости аллелей обнаруженных локусов для анализируемой совокупности плюсовых деревьев. Полученные частоты ^БЯ-фрагментов использовались для оценки основных параметров генетической изменчивости плюсовых деревьев сосны. Расчеты показали, что в исследуемой группе плюсовых деревьев эффективное число аллелей (№е) составило - 1,405, индекс Шеннона (I) - 0,407, общее генетическое разнообразие (Н) - 0,257.

Для оценки уровня генетической изменчивости плюсовых деревьев по 188Я-маркерам необходим сравнительный анализ с показателями, присущими виду в данном географическом районе в целом. Однако, как уже отмечалось выше, в России исследования популяций сосны обыкновенной по ^БЯ-маркерам пока не проводились, и выполнить сравнительный анализ нет возможности. В то же время имеются работы по изучению сосны обыкновенной с использованием ^БЯ-маркеров за рубежом, в частности в Китае [20]. Как показывает анализ табл. 3, в целом уровень генетической изменчивости изученых плюсовых деревьев не уступает уровню генетической изменчивости на видовом уровне, выявленному в Китае: эффективное число аллелей 1,405 против 1,2652; генетическое разнообразие по Нею 0,257 против 0,2393 и индекс Шеннона 0,407 против 0,1581.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1718 М

— ____ —^ «—• Г" г: — й Я

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов ДНК сосны с праймером

Т а б л и ц а 3

Сравнительный анализ уровня генетической изменчивости сосны обыкновенной

по ISSR-маркерам

Показатели генетической изменчивости Плюсовые деревья сосны обыкновенной Данные Li Hui-yu, Jing Jing, Liu Gui-fmg и др. [20].

варьирование показателей в разных популяциях в среднем по виду

Эффективное число аллелей (N6) 1,405 1,1339-1,3349 1,2652

Генетическое разнообразие по Нею (Н) 0,257 0,1340-0,3025 0,2393

Индекс Шеннона (I) 0,407 0,0857-0,2006 0,1581

Таким образом, проведенные исследования показали, что совокупность клонов плюсовых деревьев, представленных на архиве клонов в Республике Марий Эл, характеризуется достаточно высоким уровнем генетической изменчивости по ISSR-маркерам. Выполненная работа позволит внести определенный задел в исследования биоразнообразия сосны обыкновенной в Среднем Поволжье.

Выводы.

1. Исследования показали, что ISSR-анализ является хорошим инструментом для изучения и оценки уровня генетической изменчивости сосны обыкновенной, так как взятые для эксперимента ISSR-праймеры показали высокую индивидуальную изменчивость.

2. С использованием 7 ISSR-праймеров было выявлено 144 полиморфных фрагмента ДНК. Количество фрагментов у разных праймеров варьировало от 13 до 29 и в среднем на праймер составило 21. Длина амплифицированных фрагментов ДНК у разных праймеров варьировала от 1900 до 130 пар нуклеотидов.

3. Изученная группа плюсовых деревьев характеризуется следующими показателями генетической изменчивости: эффективное число аллелей (N6) - 1,405, индекс Шеннона (I) - 0,407, общее генетическое разнообразие (Н) - 0,257. Данные показатели позволяют говорить о достаточно высоком уровне генетической изменчивости плюсовых деревьев сосны обыкновенной, потомство которых представлено на архиве клонов в Республике Марий Эл.

Список литературы

1. Staub, J.E. Genetic markers, map construction, and their application in plant breeding / J.E. Staub, F.C. Serquen & M. Gupta // HortScience. - 1996. - Vol. 31(5). - Р. 729-739.

2. Gupta, P.K. The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat / P.K. Gupta, & R.K. Varshney // Euphytica. - 2000. - Vol. 113. - Р. 163-185.

3. Zietkiewicz, E. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) - anchored polymerase chain reaction amplification / E. Zietkiewicz, A. Rafalski & D. Labuda // Genomics. - 1994. - Vol. 20. - Р. 176-183.

4. Gupta, M. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats / M. Gupta, Y-S. Chyi, J. Romero-Severson & J.L. Owen // Theor Appl Genet. - 1994. -Vol. 89. - Р. 998-1006.

5. Wu, K. Detection of microsatellite polymorphisms without cloning / K. Wu, R. Jones, L. Dannaeberger & P.A. Scolnik // Nucleic Acids Res. - 1994. - Vol. 22. - Р. 3257-3258.

6. Meyer, W. Hybridization probes for conventional DNA fingerprinting used as single primers in the polymerase chain reaction to distinguish strains of Cryptococcus neoformans / W. Meyer, T.G. Mitchell, E.Z. Freedman & R. Vilgays // J Clin Microbiol. - 1993. - Vol. 31. - Р. 2274-2280.

7. Godwin, I.D. Application of inter-simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics / I.D. Godwin,

E.A.B. Aitken & L.W. Smith // Electrophoresis. - 1997. - Vol. 18. - Р. 1524-1528.

8. Tautz, D. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes / D. Tautz, & M. Renz // Nucleic Acids Res. - 1984. - Vol. 12. - Р. 4127-4138.

9. Joshi, S.P. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza / S.P. Joshi, V.S. Gupta, R.K. Aggarwal, P.K. Ranjekar & D.S. Brar // Theor Appl Genet. - 2000. - Vol. 100. - Р. 1311-1320.

10. Nagaoka, T. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers / T. Nagaoka, & Y. Ogihara // Theor Appl Genet. - 1997. - Vol. 94.

- Р. 597-602.

11. Salimath, S.S. Assessment of genome origins and genetic diversity in the genus Eleusine with DNA markers / S.S. Salimath, A.C. de Oliveira, I.D. Godwin & J.L. Bennetzen // Genome. - 1995. - Vol. 38: - P. 757-763.

12. Ajibade, S.R. Inter-simple sequence repeat analysis of genetic relationships in the genus Vigna / S.R. Ajib-ade, N.F. Weeden & S.M. Chite // Euphytica. - 2000. - Vol. 111. - Р. 47-55.

13. Huang, J. Genetic diversity and relationships of sweet potato and its wild relatives in Ipomoea series Batatas (Convolvulaceae) as revealed by inter-simple sequence repeat (ISSR) and restriction analysis of chloroplast DNA / J. Huang, & S.M. Sun // Theor Appl Genet. - 2000. - Vol. 100. - Р. 1050-1060.

14. Wolff, K. PCR markers distinguish Plantago major subspecies / K. Wolff, & M. Morgan-Richards // Theor Appl Genet. - 1998. - Vol. 96. - Р. 282-286.

15. Charters, Y.M. The use of self-pollinated progenies as 'in-groups' for the genetic characterization of cocoa germplasm / Y.M. Charters, & M.J. Wilkinson // Theor Appl Genet. - 2000. - Vol. 100. - Р. 160-166.

16. Tsumura, Y. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglasfir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica) / Y. Tsumura, K. Ohba & S.H. Strauss // Theor Appl Genet. - 1996. - Vol. 92. - Р. 40-45.

17. Hantula, J. Random amplified microsatellites (RAMS)- a novel method for characterizing genetic variation within fungi / J. Hantula, M. Dusabenyagasani & R.C. Hamelin // Eur J for Path. - 1996. - Vol. 26. - Р. 159-166.

18. Rogers, S.O. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fimgi / S.O. Rogers, A.J. Benedich // S.B. Gelvin, R.A. Schilperoort (eds.) Plan Molecular Biology Manual. - Dordrecht: Kluwer Academic Press, 1994.

- P. D 1-8.

19. Yeh, F.C. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits /

F.C. Yeh, and T.J.B. Boyle // Belgian Journal of Botany. - 1997.- Vol. 129. - P. 157.

20. Hui-yu, Li. Genetic variation and division of Pinus sylvestris provenances by ISSR markers / Li Hui-yu, Jing Jing, Liu Gui-frng, Ma Xu-jun, Dong Jing-xiang, Lin Shi-jie// Journal of Forest Research.- 2005.- Vol. 16(3).- P. 216-218.

Статья поступила в редакцию 05.09.11.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 16.552.11.7050 от 29 июля 2011 г.) с использованием оборудования ЦКП «ЭБЭЭ» ФГБОУ ВПО «МарГТУ».

P. S. Novikov, O. V. Sheikina, T. N. Milutina

VARIATION OF PINUS SYLVESTRIS PLUS TREES ON THE CLONE ARCHIVE IN ACCORDANCE WITH ISSR MARKERS

Genetic variation researches data of plus trees of pinus sylvestris on the clone archive in accordance with ISSR-markers are given. The data allowed to sort out 144 polymorphic locus. Basic parameters of the trees genetic variation were: Shannon index - 0,407, Nei's genetic diversity - 0,257 and effective number of alleles - 1,405.

Key words: ISSR markers, Pinus Sylvestris, plus trees, genetic variation

НОВИКОВ Петр Сергеевич - аспирант кафедры лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии МарГТУ. Область научных интересов - лесное семеноводство, молекулярная генетика древесных видов. Автор 19 публикаций.

E-mail: novikov-petr@mail.ru

ШЕЙКИНА Ольга Викторовна - кандидат сельскохозяйтвенных наук, доцент кафедры лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии МарГТУ. Область научных интересов -лесное семеноводство, молекулярная генетика древесных видов. Автор 30 публикаций.

E-mail: ShejkinaOV@marstu.net

МИЛЮТИНА Татьяна Николаевна - аспирант кафедры лесной селекции, недревесных ресурсов и биотехнологии МарГТУ. Область научных интересов - лесное семеноводство, молекулярная генетика древесных видов. Автор 18 публикаций.

E-mail: Milutina_Tanja@mail.ru