ЛЕЧЕНИЕ СВЯЗАННЫХ С ЭРИТРОПОЭТИНОМ (ЕРО) ЗАБОЛЕВАНИЙ ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К ЕРО
TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH ERYTHROPOIETIN (EPO) BY NATURAL EPO ANTISENSE TRANSCRIPT INHIBITION

ЗАЯВЛЕННЫЙ ПРИОРИТЕТ
В настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой Соединенных Штатов Америки с регистрационным номером № 61/119961, поданной 4 декабря 2008 г., под названием "RNA Molecules Targeting Erythropoietin and Related Molecules", в полном объеме включенной в настоящее описание в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Воплощения настоящего изобретения включают в себя олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию EPO и ассоциированных с ним молекул.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
(TM)
ДНК-РНК- и РНК-РНК-гибридизация важны для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию, транскрипцию и трансляцию ДНК. Гибридизация является также центральным процессом для множества технологий, в которых производится либо детектирование конкретной нуклеиновой кислоты, либо изменение ее экспрессии. Антисмысловые нуклеотиды, например, прерывают экспрессию гена путем гибридизации с РНК-мишенью, мешая таким образом сплайсингу, транскрипции, трансляции и репликации РНК. Антисмысловая ДНК имеет еще и то дополнительное свойство, что ДНК-РНК-гибриды служат в качестве субстрата для расщепления под действием рибонуклеазы H - активность, которая имеет место в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как это происходит в случае олигодезоксинуклеотидов (ODN), или же они могут быть экспрессированы на основе эндогенных генов, таких как молекулы РНК. В настоящее время комиссией FDA принято антисмысловое лекарственное средство, VITRAVENE (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что свидетельствует о терапевтической применимости антисмысловых средств.
Physiological Rev.
Повышенная продукция эритроцитов, опосредованная гормоном эритропоэтином (EPO), является хорошо известным адаптивным ответом человека на гипоксию (Bunn et al. (1996),  76, 839-845). Обычно продуцируемый почками взрослого человека и эмбриональной печенью, EPO стимулирует развитие в костном мозге предшественников эритроцитов, экспрессирующих рецептор EPO (EpoR).
EPO является гликопротеиновым гормоном (46 кДа), продуцируемым внутри почек почечными интерстициальными клетками, которые регулируют продукцию эритроцитов в костном мозге. Указанные клетки чувствительны к низкой концентрации артериального кислорода и при низких уровнях кислорода (гипоксия) выделяют эритропоэтин. Эритропоэтин стимулирует костный мозг к продуцированию большего количества эритроцитов, повышая таким образом способность переноса кислорода кровью. EPO осуществляет свое действие путем связывания с EpoR на поверхности предшественников эритроцитов в костном мозге. Однако экспрессия EPO обнаружена и на других клетках из других нормальных тканей, помимо почечных интерстициальных клеток, включая энтероциты, трофобласты и нейроны.
Измерение уровня EPO в кровотоке может способствовать выявлению расстройств костного мозга или почечного заболевания. Нормальные уровни эритропоэтина составляют от 0 до 19 мЕд./мл (миллиединиц на миллилитр). Повышенные уровни могут наблюдаться при истинной стойкой красной полицитемии, состоянии, характеризующемся увеличением селезенки и повышенной продукцией эритроцитов костным мозгом. Значения ниже нормальных являются показателем хронической почечной недостаточности, ведущей к анемии. Хроническая почечная недостаточность приводит к анемии отчасти в силу прогрессирующего отсутствия адекватной продукции EPO, необходимой для поддержания эритропоэза.
Гипоксия является доминирующим признаком солидных опухолей, охватывающим приблизительно девяносто процентов всех злокачественных опухолей человека. Адаптивные ответы на гипоксию при солидных опухолях коррелировали с повышенной агрессивностью, с пониженной степенью гибели опухолевых клеток и пониженной реакцией опухоли как на действие радиации, так и на химиотерапевтическое воздействие. Экспрессия EPO наблюдалась при различных гематопоэтических и негематопоэтических злокачественных новообразованиях, и, как было показано, этим был опосредован автономный рост клеток эритроцитарной лейкемии, экспрессирующих EpoR.
Многие распространенные виды злокачественных опухолей человека в повышенных количествах экспрессируют индуцируемый гипоксией фактор транскрипции, HIF-1, который регулирует экспрессию EPO, а также и нескольких генов, необходимых для повышения выживаемости клеток злокачественной опухоли в условиях гипоксии, включая гены, кодирующие гликолитические ферменты, переносчики глюкозы и фактор роста сосудистого эндотелия (Semenza (1999) Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15, 551-578). Опухолевая гипоксия признана основным фактором в резистентности опухолей к химиотерапии и радиационной терапии, хотя и лежащие в основе этого механизмы неизвестны. Гипоксия индуцирует адаптивные ответы в клетках в большей степени за счет активации экспрессии нескольких генов под регуляторным воздействием индуцируемого гипоксией фактора транскрипции-1 (HIF-1), гетеродимерного фактора транскрипции, состоящего из субъединиц HIF-1α и HIF-1β.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие представлено с целью резюмирования данного изобретения, с кратким указанием природы и предмета изобретения. Оно представлено с расчетом на понимание, что его не следует использовать для интерпретации или ограничения объема защиты изобретения или содержания формулы изобретения.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложены способы ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, что приводит к повышенной регуляции соответствующего смыслового гена. Здесь также предполагается, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто посредством siРНК, рибозимов и малых молекул, которые считаются входящими в объем защиты настоящего изобретения.
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Одно из воплощений связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO или другого продукта гена в клетках или тканях пациентов  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 следующих друг за другом нуклеотидов от 1 до 156 в последовательности SEQ ID NO:2 (фигура 3), таким образом модулируя функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента  или .
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов EPO, например, нуклеотидов, указанных в последовательности SEQ ID NO:2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов, и на комплементарные им последовательности. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов приведены в последовательностях SEQ ID NO: 3-5 (фигура 4).
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности обратного комплемента антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента  или .
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт с антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового полинуклеотида EPO; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию полинуклеотида EPO в клетках или тканях пациента  или .
В предпочтительном воплощении композиция содержит один или более антисмысловых полинуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами EPO.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.
Еще в одном предпочтительном воплощении модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, содержащие фосфоротиоат, метилфосфонат, пептид-нуклеиновую кислоту, 2’-O-метил, фторо- или углерод, метилен или другие закрытые молекулы нуклеиновой кислоты (LNA). Предпочтительно, чтобы модифицированные нуклеотиды были закрытыми молекулами нуклеиновой кислоты, включая α-L-LNA.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает в себя введение пациенту антисмысловых соединений по меньшей мере однократно, однако такое лечение может быть модифицировано, с тем, чтобы со временем оно включало в себя введение многократных доз. Такое лечение можно комбинировать с одним или несколькими другими видами терапии.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды инкапсулированы в липосомы или прикреплены к молекуле-носителю (например, холестерину, пептиду TAT).
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, насчитывающим от 5 до 30 нуклеотидов в длину, при этом указанный олигонуклеотид по меньшей мере на 50% идентичен последовательности антисмыслового олигонуклеотида по отношению к эритропоэтиновому (EPO) полинуклеотиду; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента  или .
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и таким образом модулирующим функцию и/или экспрессию эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида в клетках или тканях пациента  или .
in vivo
in vitro
В одном из воплощений экспрессия и/или функция эритропоэтина (EPO)  или  повышена по сравнению с контролем.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность олигонуклеотида эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую и/или некодирующую последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид нацелен на перекрывающиеся и/или неперекрывающиеся последовательности эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В одном из воплощений по меньшей мере один антисмысловой олигонуклеотид содержит одну или несколько модификаций, выбранных из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида, а также их сочетаний.
В связанном с этим воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.
В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из следующего: фосфоротиоата, 2’-O-метоксиэтила (МОЭ), 2’-фторо, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
В другом относящемся к этому воплощении одна или несколько модификаций включают в себя по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты (PNA), закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), арабино-нуклеиновой кислоты (FANA), их аналогов, производных и их сочетаний.
В другом воплощении по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну олигонуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательностей SEQ ID NO: 3-5.
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции функции и/или экспрессии эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним олигонуклеотидом короткой интерферирующей РНК (siРНК) длиной в 5-30 нуклеотидов, где последовательность указанного по меньшей мере одного олигонуклеотида siРНК по меньшей мере на 50% идентична комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти следующих друг за другом нуклеотидов антисмысловой и/или смысловой молекулы нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего  или .
В одном из воплощений последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% идентична последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновым кислотам, которые комплементарны антисмысловой и/или смысловой молекуле нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
Другое воплощение связано со способом модуляции экспрессии и/или функции эритропоэтинового (EPO) гена в клетках или тканях млекопитающего  или , предусматривающим приведение указанных клеток или тканей в контакт по меньшей мере с одним антисмысловым олигонуклеотидом длиной приблизительно в 5 - 30 нуклеотидов, специфичных в отношении некодирующей и/или кодирующей последовательностей смысловой и/или природной антисмысловой цепи полинуклеотида, кодирующего молекулу эритропоэтина (EPO), при этом последовательность по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в виде последовательностей SEQ ID NO:1 и 2; и модуляцию экспрессии и/или функции гена эритропоэтина (EPO) в клетках или тканях млекопитающего  или .
in vivo
in vitro
Другое воплощение настоящего изобретения связано с синтетическим, модифицированным олигонуклеотидом, содержащим по меньшей мере одну модификацию, причем по меньшей мере одна модификация выбрана из следующего: по меньшей мере одного модифицированного сахарного фрагмента; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида; и их сочетаний; при этом указанный олигонуклеотид является антисмысловым соединением, которое гибридизуется с геном эритропоэтина (EPO) и модулирует экспрессию и/или функцию гена эритропоэтина (EPO)  или  по сравнению с нормальным контролем.
В одном из воплощений по меньшей мере одна модификация содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из следующего: фосфоротиоата, алкилфосфоната, фосфородитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, сложного фосфатного триэфира, ацетамидата, сложного карбоксиметилового эфира и их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну межнуклеотидную фосфоротиоатную связь.
В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит остов межнуклеотидных фосфоротиоатных связей.
В одном из воплощений указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из следующего: пептид-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), их аналога, производного, а также их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид содержит модифицированный сахарный фрагмент, выбранный из следующего: 2’-O-метоксиэтил-модифицированного сахарного фрагмента, 2’- метокси-модифицированного сахарного фрагмента, 2’-O-алкил-модифицированного сахарного фрагмента, бициклического сахарного фрагмента и их сочетаний.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид составляет в длину по меньшей мере приблизительно от 5 до 30 нуклеотидов и гибридизуется с антисмысловой и/или смысловой цепью эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида, и при этом указанное антисмысловое соединение имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 20% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежных нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой последовательности нуклеиновой кислоты эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
В другом воплощении указанный олигонуклеотид имеет последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную комплементарной последовательности по меньшей мере приблизительно пяти смежным нуклеиновых кислот антисмысловой и/или смысловой кодирующей и/или некодирующей последовательностям эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида.
in vivo
in vitro,
В другом воплощении указанный олигонуклеотид гибридизуется с эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и модулирует экспрессию и/или функцию по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида  или  по сравнению с нормальным контролем.
В связанном с этим воплощении указанный олигонуклеотид содержит одну из последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
Одно из воплощений настоящего изобретения связано с композицией, содержащей один или несколько олигонуклеотидов, специфичных в отношении одного или более эритропоэтиновых (EPO) полинуклеотидов, причем указанные полинуклеотиды содержат антисмысловые последовательности, комплементарные последовательности, аллели, гомологи, изоформы, варианты, производные, мутанты, фрагменты или их сочетания.
В связанном с этим воплощении указанные олигонуклеотиды имеют последовательности, по меньшей мере приблизительно на 40% идентичные любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
В определенном воплощении указанные олигонуклеотиды содержат любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде SEQ ID NO: 3-5.
В одном из воплощений указанные олигонуклеотиды, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, содержат одну или несколько модификаций или нуклеотидных замен.
В другом воплощении одна или несколько модификаций или нуклеотидных замен выбраны из следующего: фосфоротиоата, метилфосфоната, пептид-нуклеиновой кислоты, молекул закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) и их сочетаний.
Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом профилактики или лечения заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом, где указанный способ предусматривает следующее:
введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида и модулирует экспрессию указанного по меньшей мере одного эритропоэтинового (EPO) полинуклеотида; в результате чего осуществляется профилактика или лечение заболевания или расстройства, ассоциированного по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом и/или по меньшей мере с одним кодируемым им продуктом.
В одном из воплощений заболевание или расстройство, ассоциированное по меньшей мере с одним эритропоэтиновым (EPO) полинуклеотидом, выбрано из следующего: заболевания, расстройства или состояния гематологического нарушения, заболевания крови, характеризующегося низкой или дефективной продукцией эритроцитов, анемии, серповидноклеточной анемии, бета-талассемии, аномального эритропоэза, беременности или нарушения менструального цикла, ранней анемии недоношенных, почечной недостаточности, хронической почечной недостаточности, гипертонии, заболевания или расстройства, ассоциированного с хирургическим вмешательством, заболевания или расстройства у педиатрического пациента при диализе, заболевания или состояния, ассоциированного с низким гематокритным числом, СПИДа, расстройства, связанного с химиотерапевтическими воздействиями, кистозного фиброза, злокачественной опухоли или опухоли, инфекционного заболевания, венерического заболевания, иммунологически зависимого заболевания и/или аутоиммунного заболевания или расстройства, сердечно-сосудистого заболевания, например, инсульта, гипотонии, задержки сердечных сокращений, ишемии, в частности, ишемически-реперфузионного повреждения, инфаркта миокарда, такого как острый инфаркт миокарда, хронической сердечной недостаточности, стенокардии, гипертрофии сердца, заболевания сердца и легких, искусственного кровообращения, респираторного заболевания, почечного заболевания, заболевания мочевого пузыря/репродуктивной системы, эндокринных расстройств/расстройств метаболизма, желудочно-кишечного заболевания, болезни центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы, при которой прежде всего имеют место неврологические или психиатрические симптомы, связанной с возрастом потери когнитивной функции, детского церебрального паралича, нейродегенертивного заболевания, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Ли, деменции, потери памяти, амиотрофического бокового склероза, алкоголизма, расстройства настроения, тревожного расстройства, болезни дефицита внимания, гиперактивности, аутизма, шизофрении, депрессии, травмы или ишемии головного или спинного мозга, болезни Крейтцфельда-Якоба, офтальмологических заболеваний, эпилепсии, множественного склероза, воспаления, радиационного поражения, дегенерации желтого пятна, диабетической нейропатии, диабетической ретинопатии, глаукомы, ишемии сетчатки и травмы сетчатки, повреждения спинного мозга, состояния в связи с космическим полетом, острой потери крови, старения и состояний при неопластических заболеваниях.
in vivo
in vivo
Одно из воплощений настоящего изобретения связано со способом идентификации и селекции по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения , предусматривающим выбор полинуклеотида-мишени, ассоциированного с состоянием болезни; идентификацию олигонуклеотидов, содержащих по меньшей мере пять смежных нуклеотидов, которые комплементарны, в смысловой или в антисмысловой ориентации, выбранному полинуклеотиду-мишени; и измерение температурной точки плавления гибрида антисмыслового олигонуклеотида и полинуклеотида-мишени при жестких условиях гибридизации; и, на основе полученной информации, выбор по меньшей мере одного олигонуклеотида для введения .
Другие аспекты описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
Фигура 1 представляет собой графические результаты ПЦР в режиме реального времени, показывающие кратность различий уровней мРНК EPO после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, вводимыми с помощью полифектамина-2000, по сравнению с контролем. Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК EPO в клетках HepG2 значительно увеличиваются через 48 ч. после обработки двумя из siРНК, обозначаемыми как epoas (epoas_1, P=0,02, и epoas_2, P=0,04, Фиг. 1A). В тех же самых примерах уровни РНК epoas были значительно уменьшены после обработки siРНК к epoas (Фиг. 1B). Столбцы, обозначенные как epoas_1, epoas_2, epoas_3, соответствуют образцам, обработанным, соответственно, последовательностями SEQ ID NO. 3, 4 и 5.
На фигуре 2 приведена последовательность SEQ ID NO: 1: мРНК эритропоэтина (EPO), Homo sapiens (Номер доступа в NCBI No.: NM_000799.2), и последовательность SEQ ID NO: 1a означает геномную последовательность EPO (экзоны показаны заглавными буквами, а интроны маленькими).
На фигуре 3 приведена последовательность SEQ ID NO:2: природная антисмысловая последовательность EPO-AS (Номер доступа в NCBI No.: AW798641.1).
На фигуре 4 приведены антисмысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO: 3-5. «r» означает РНК.
На фигуре 5 приведены смысловые олигонуклеотиды, SEQ ID NO:6-8. «r» означает РНК. Это обратные комплементы последовательностей SEQ ID NO: 3-5.
На фигуре 6 показан прямой праймер (SEQ ID NO: 9), обратный праймер (SEQ ID NO: 10) и репортерная последовательность (SEQ ID NO: 11) для специальных анализов, разработанных компанией Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00171267_ml).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже описано несколько аспектов настоящего изобретения, со ссылкой на примеры его приложений, приведенные для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные специфические подробности, взаимосвязи и методы приведены для более полного понимания изобретения. Однако рядовому специалисту в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение может быть реализовано без какой-либо одной или нескольких из специфических подробностей, или же другими способами. Настоящее изобретение не ограничено порядком действий или процессов, поскольку некоторые действия могут быть выполнены в различном порядке и/или одновременно с другими действиями или процессами. Более того, не все проиллюстрированные действия или процессы являются необходимыми для осуществления методологии согласно настоящему изобретению.
Подразумевается, что все описанные здесь гены, названия генов и продукты генов соответствуют гомологам из любого биологического вида, к которому применимы описанные здесь композиции и способы. Таким образом, указанные термины включают в себя, но не ограничены генами и генными продуктами, полученными из организмов человека и мыши. Подразумевается, что если описан ген или генный продукт из конкретного вида, такое описание предусмотрено только в качестве примера и ни в коем случае не должно быть расценено как ограничение изобретения, если в контексте специально не оговорено иначе. Таким образом, например, в случае описанных здесь генов, которые в некоторых воплощениях связаны с последовательностями нуклеиновых кислот и аминокислотными последовательностями млекопитающих, подразумевается, что они охватывают гомологичные и/или ортологичные генные продукты и продукты генов из других животных, включая рыб, амфибий, рептилий и птиц, и не ограничиваясь остальными млекопитающими. В предпочтительных воплощениях указанные гены или последовательности нуклеиновых кислот относятся к человеку.
Определения
Используемая здесь терминология предназначена лишь для описания конкретных воплощений, а не для ограничения настоящего изобретения. Подразумевается, что использование формы единственного числа включает в себя также и форму множественного числа, если в контексте специально не оговорено иначе. Кроме того, в случае, если термины "включающий" "включает", "имеющий", "имеет" или их варианты используются в подробном описании и/или в формуле изобретения, подразумевается, что такие термины используются в значении "содержащий".
Термин "примерно" или "приблизительно" означает в рамках приемлемого разброса ошибки для конкретной величины, что определяется специалистом в данной области и что отчасти будет зависеть от того, как указанная конкретная величина измеряется или определяется, то есть имеются в виду ограничения измерительной системы. Например, "примерно" может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартное отклонение, в соответствии с практикой, принятой в данной области. Альтернативно, "примерно" может означать область вплоть до 20%, предпочтительно, вплоть до 10%, более предпочтительно, вплоть до 5%, и наиболее предпочтительно, вплоть до 1% от данной величины. Альтернативно, в частности, в отношении биологических систем или процессов, указанный термин может означать в пределах порядка величин, предпочтительно, в пределах 5-кратной, и более предпочтительно, в пределах 2-кратной величины. При употреблении конкретных величин в настоящей заявке и в формуле изобретения, если специально не указано иное, должно подразумеваться, что термин "примерно" означает в пределах приемлемого разброса ошибки для конкретной величины.
Используемый здесь термин "мРНК" означает известный в настоящее время мРНК-транскрипт(транскрипты) гена-мишени, а также любые дополнительные транскрипты, которые могут быть выявлены.
Под "антисмысловыми олигонуклеотидами" или "антисмысловым соединением" подразумевается молекула РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-мишень, ДНК-мишень). Например, если это олигонуклеотид РНК, он связывается с другой РНК-мишенью путем РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени (Eguchi et al, (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Антисмысловой олигонуклеотид может усиливать или ослаблять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Данное определение означает включение любой чужеродной молекулы РНК или ДНК, которая используется с терапевтической, диагностической или других точек зрения. Такие молекулы включают в себя, например, антисмысловые молекулы РНК или ДНК, РНК-интерференцию (РНКi), микро-РНК, молекулы РНК-ловушек, siРНК, энзиматическую РНК, терапевтическую корректирующую РНК и агонистическую РНК и антагонистическую РНК, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS, external guide sequence), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, указанные соединения могут быть введены в виде одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" включает в себя также линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или сочленений, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептид-нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), фосфоротиоат, метилфосфонат и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью по регулярной схеме взаимодействий мономера с мономером, такой, какая имеет место при спаривании оснований Уотсона-Крика, спаривании хугстеновских и обратных хугстеновских пар оснований или прочего.
Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть состоящим из разных областей. В контексте настоящего изобретения "химерные" соединения являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химических областей, например, область(области) ДНК, область(области) РНК, область(области) PNA и т.д. Каждая химическая область составлена по меньшей мере одной мономерной единицей, то есть нуклеотидом в случае олигонуклеотидного соединения. Такие олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область, в которой указанный олигонуклеотид модифицирован, с тем, чтобы он проявлял одно или более желательных свойств. Желательные свойства олигонуклеотида включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, например, повышенную резистентность к деградации под действием нуклеаз, повышенное поглощение клетками и/или повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, следовательно, обладать различными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению, как описано выше, могут быть организованы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или олигонуклеотидных аналогов.
Олигонуклеотид может состоять из областей, которые могут быть связаны в "регистр", то есть когда указанные мономеры связаны последовательно, как в нативной ДНК, или связаны посредством спейсеров. Подразумевается, что спейсеры образуют ковалентный "мостик" между указанными областями и в предпочтительных случаях имеет длину, не превышающую приблизительно 100 атомов углерода. Такие спейсеры могут быть наделены различными функциями, например, они могут нести положительный или отрицательный заряд, могут обладать специфическими свойствами связывания нуклеиновой кислоты (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с канавкой, токсины, флюорофоры и т.д.), будучи липофильными, индуцировать образование специальных вторичных структур, например, наподобие аланин-содержащих пептидов, которые индуцируют образование альфа-спиралей.
Здесь термины "EPO" и "эритропоэтин" включают в себя все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.
Здесь, в настоящей заявке, слова эритропоэтин, эпоэтин, EPO и hEPO (человеческий эритропоэтин) используются в качестве взаимозаменяемых понятий.
in vitro
Здесь термин "олигонуклеотид, специфичный в отношении..." или "олигонуклеотид, который нацелен...", относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную к образованию стабильного комплекса с частью гена-мишени, или (ii) способную к образованию стабильного дуплекса с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена путем теоретических расчетов и/или в результате анализов . Примеры анализов для определения стабильности гибридизации комплексов и дуплексов описаны ниже в Примерах.
Здесь термин "нуклеиновая кислота-мишень" включает в себя ДНК, РНК (включая пре-мРНК и мРНК), транскрибируемые с такой ДНК, а также кДНК, полученную с такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию нуклеиновой кислоты. Такая модуляция функции нуклеиновой кислоты-мишени соединениями, которые специфически с ней гибридизуются, обычно называется "антисмысловой". Такие функции ДНК, которым можно препятствовать, включают в себя, например, репликацию и транскрипцию. Функции РНК, которым можно препятствовать, включают в себя все жизненные функции, такие, например, как транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляцию белка с РНК, сплайсинг РНК, с получением одного или более видов мРНК, а также каталитическую активность, которая может быть блокирована или облегчена посредством РНК. Совокупным эффектом такой интерференции функции нуклеиновой кислоты-мишени является модуляция экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.
Интерференция РНК, "РНКi", опосредована двухцепочечными молекулами РНК (дцРНК), которые имеют специфическую гомологию последовательностей с последовательностями своих нуклеиновых кислот-"мишеней" (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747). В определенных воплощениях настоящего изобретения такими медиаторами являются "малые интерферирующие" РНК-дуплексы из 5-25 нуклеотидов (siРНК). siРНК получены в результате процессинга siРНК под действием фермента РНКазы, известного как «Dicer» (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366). siРНК-дуплексные продукты собираются в мультибелковый комплекс siРНК, называемый RISC (RNA Induced Silencing Complex). Чтобы не связывать себя какой-либо конкретной теорией, будем считать, что RISC сориентирован на нуклеиновую кислоту-мишень (соответствующую мРНК), где siРНК-дуплекс взаимодействует специальным образом, обусловленным специфичностью последовательности, опосредуя каталитическое расщепление (Bernstein, E., et al. (2001) Nature 409: 363-366; Boutla, A., et al. (2001) Curr. Biol. 11: 1776-1780). Малые интерферирующие РНК, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы и использованы соглано методикам, которые хорошо известны в данной области и которые знакомы рядовым специалистам. Малые интерферирующие РНК для применения в способах согласно изобретению, соответственно, содержат приблизительно от 1 примерно до 50 нуклеотидов (нтд.). В примерах неограничивающих воплощений siРНК могут содержать приблизительно от 5 примерно до 40 нтд., приблизительно от 5 примерно до 30 нтд., приблизительно от 10 примерно до 30 нтд., приблизительно от 15 примерно до 25 нтд., приблизительно 20-25 нуклеотидов.
Выбор подходящих олигонуклеотидов облегчается применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и выделяют области идентичности или гомологии. Такие программы используются для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, в результате поиска в базах данных, таких как GenBank, или путем секвенирования продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот из совокупности видов позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, в которых обнаруживается подходящая степень идентичности между видами. В случае генов, которые еще не секвенированы, для определения степени идентичности между генами искомых видов и других видов предпринимают саузерн-блоттинг. Предпринимая саузерн-блоттинг в условиях разной жесткости, можно получить, как это хорошо известно в данной области, приблизительную степень идентичности. Указанные процедуры позволяют выбрать олигонуклеотиды, которые проявляют высокую степень комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней у субъекта, который нуждается в осуществлении контроля, и низкую степень комплементарности в отношении соответствующих последовательностей нуклеиновых кислот у других видов. Специалисту должно быть очевидно, что есть определенная свобода в выборе соответствующих областей генов для применения в настоящем изобретении.
Под "ферментативной РНК" подразумевается молекула РНК с ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) действуют прежде всего путем связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит на участке-мишени для связывания ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в непосредственной близости от ферментативной части молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота прежде всего распознает, а потом связывается с РНК-мишенью путем спаривания оснований, и при образовании связей с правильным участком проявляет свое энзиматическое действие, расщепляя РНК-мишень.
Под "ловушкой РНК" подразумевается молекула РНК, которая имитирует природный домен для связывания лиганда. Следовательно, ловушка РНК конкурирует с природной мишенью за связывание специфического лиганда. Например, показано, что повышенная экспрессия РНК в результате ее транс-активации (TAR, trans-activation response) в ответ на ВИЧ может действовать в качестве "ловушки" и эффективно связывать tat-белок ВИЧ, таким образом предотвращая связывание его с последовательностями TAR, кодирующими РНК ВИЧ (Sullenger et al. (1990) Cell, 63, 601-608). Это конкретный специфический пример. Специалистам должно быть очевидно, что это является всего лишь одним из примеров, и с использованием технологий, в целом известных в данной области, могут быть реализованы также и другие воплощения.
Здесь термин "мономеры" обычно относится к мономерам, связанным фосфодиэфирными связями, или их аналогам, образующим олигонуклеотиды, размер которых варьирует от нескольких мономерных единиц, например, приблизительно от 3-4, примерно до нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают в себя фосфоротиоат, фосфородитиоат, метилфосфонаты, фосфороселеноат, фосфорамидат и т.п., что более полно описано ниже.
Термин "нуклеотид" охватывает нуклеотиды, образующиеся природным образом, а также неприродным путем образующиеся нуклеотиды. Специалистам должно быть очевидно, что ряд нуклеотидов, которые первоначально считались образующимися "неприродным путем", впоследствии были обнаружены в природе. Таким образом, "нуклеотиды" включают в себя не только известные пуриновые и пиримидиновые молекулы, содержащие гетероцикл, но и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративными примерами других типов нуклеотидов являются молекулы, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этаноцитозин, N6,N6-этано-2,6- диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(C3-C6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолопиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и "неприродным путем образующиеся" нуклеотиды, описанные Benner с соавт., патент США № 5432272. Подразумевается, что термин "нуклеотид" охватывает каждый из приведенных примеров, также как и все эти примеры, а также их аналоги и таутомеры. Представляющими особый интерес нуклеотидами являются те из них, которые содержат гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые считаются природным путем образующимися нуклеотидами, в связи с их терапевтическим и диагностическим применениями в отношении человека. Нуклеотиды включают в себя 2’-дезокси- и 2’-гидроксильные сахара, например, как описано у Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), а также их аналоги.
Nucl. Acid. Res.
Nature Biotechnology
Biochemica et Biophysica Acta
Nucleic Acid Research
Drug Discovery & Development
Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.
J. Am. Chem. Soc.
Curr Top Med Chem
Annual Review of Analytical Chemistry
"Аналоги" в случае нуклеотидов включают в себя синтетические нуклеотиды, имеющие модифицрованные фрагменты оснований и/или модифицрованные сахарные фрагменты (см., например, общее описание у Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) , 25(22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001)  19: 17-18; Manoharan M., (1999)  1489: 117-139; Freier S. M., (1997) , 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) , 3: 203-213, Herdewin P., (2000) , 10: 297-310); 2’-O, 3’-C-связанные [3.2.0] бициклоарабинонуклеозиды (см., например, N. K. Christiensen., et al., (1998) , 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) . 7(7): 641-9; Cho EJ, et al. (2009) , 2, 241-264). Такие аналоги включают в себя синтетические нуклеотиды, созданные для повышения связывающих свойств, например, стабильности дуплекса или триплекса, специфичности и т.п.
Здесь под "гибридизацией" подразумевается спаривание по существу комплементарных цепей олигомерных соединений. Один из механизмов спаривания включает в себя образование водородных связей, которое может быть образованием водородных связей по Уотсону-Крику, по Хугстену и образованием обратных хугстеновских пар между комплементарными нуклеозидами или нуклеотидными основаниями (нуклеотиды) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые спариваются с образованием водородных связей. Гибридизация может возникать при различных обстоятельствах.
in vivo
in vitro
Антисмысловое соединение является "специфически гибридизующимся", если связывание этого соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью мешает реализации нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая модуляцию функции и/или активности, и если имеется существенная степень комплементарности, во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот в условиях, при которых требуется специфическое связывание, то есть при физиологических условиях в случае испытаний  или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых анализы предпринимаются .
Здесь фраза "жесткие условия гибридизации", или "жесткие условия", относится к условиям, при которых соединение согласно изобретению будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но при этом с минимальным количеством других последовательностей. Жесткие условия являются зависимыми от конкретной последовательности и будут разными при различных обстоятельствах, и в контексте настоящего изобретения "жесткие условия", при которых олигомерные соединения гибридизуются с последовательностью-мишенью, определяются природой и составом олигомерных соединений, а также анализами, посредством которых они будут изучаться. Обычно жесткие условия гибридизации включают в себя низкие концентрации (<0,15 M) солей с неорганическими катионами, такими как Na++ или K++ (то есть низкую ионную силу), температуру выше 20°C-25°C, ниже Tm комплекса олигомерное соединение:последовательность-мишень, и присутствие денатурирующих средств, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид, или детергента додецилсульфата натрия (ДСН). Например, каждый 1% формамида снижает степень гибридизации на 1,1%. Примером условий высокой жесткости гибридизации является 0,1X буфер хлорида и цитрата натрия (SSC)/0,1% (вес./об.) ДСН при 60°C в течение 30 минут.
Используемый здесь термин "комплементарность" относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами одной или двух олигомерных цепей. Например, если основание нуклеиновой кислоты в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородную связь с основанием нуклеиновой кислоты в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, будь указанная нуклеиновая кислота-мишень молекулой ДНК, РНК или олигонуклеотида, тогда положение водородной связи между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью считается комплементарным положением. Олигомерное соединение и молекула ДНК, РНК или олигонуклеотида являются комплементарными друг другу, если достаточное количество комплементарных положений в каждой молекуле занято нуклеотидами, которые могут образовывать друг с другом водородные связи. Таким образом, "специфически гибридизующийся" и "комплементарный" являются терминами, которые используются для обозначения достаточной степени точного спаривания или комплементарности на протяжении участка с достаточным количеством нуклеотидов, так, чтобы между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой-мишенью осуществлялось стабильное и специфическое связывание.
В данной области считается очевидным, что для того, чтобы осуществлялась специфическая гибридизация, последовательность олигомерного соединения необязательно должна быть на 100% комплементарна таковой ее нуклеиновой кислоты-мишени. Более того, олигонуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментами так, чтобы случайные или соседние сегменты не были вовлечены в процесс гибридизации (например, структура петли, некомплементарность или структура шпильки). Последовательность олигомерных соединений согласно изобретению по меньшей мере приблизительно на 70% или по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 85%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере приблизительно на 95%, или по меньшей мере приблизительно на 99% комплементарны области-мишени внутри целевой последовательности нуклеиновой кислоты, на которую они нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и, следовательно, будут с ним специфически гибридизоваться, будет иметь 90-процентную комплементарность. В данном примере оставшиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть кластеризованы или разбросаны между комплементарными нуклеотидами и необязательно должны быть смежными между собой или с комплементарными нуклеотидами. Как таковое, антисмысловое соединение, которое составляет в длину 18 нуклеотидов и имеет 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, будет в целом на 77,8% комплементарно нуклеиновой кислоте-мишени и может, таким образом, входить в объем, охватываемый настоящим изобретением. Процент комплементарности антисмыслового соединения области нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен рутинным способом с использованием программ BLAST (основной поисковой инструмент при локальном выравнивании) и программ PowerBLAST, известных в данной области (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang and Madden, (1997) Genome Res., 1, 649-656). Процент гомологии, идентичности или комплементарности последовательности может быть определен, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием параметров по умолчанию, где используется алгоритм Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489).
Здесь термин "температурная точка плавления (Tm)" относится к температуре, при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных последовательности-мишени, при равновесии гибридизуется с последовательностью-мишенью. Как правило, жесткими условиями являются такие, при которых концентрация соли составляет по меньшей мере приблизительно от 0,01 до 1,0 M концентрации иона Na (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, от 10 до 50 нуклеотидов). Жесткие условия могут быть достигнуты также путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
Здесь термин "модуляция" означает либо увеличение (стимуляция), либо уменьшение (ингибирование) экспрессии гена.
Термин "вариант", при его использовании в контексте полинуклеотидной последовательности, может охватывать полинуклеотидную последовательность, связанную с геном дикого типа. Данное определение может включать в себя также, например, "аллельные", "слитые", "видовые" или "полиморфные" варианты. Слитый вариант может иметь значительную степень идентичности со ссылочной молекулой, но обычно он будет иметь большее или меньшее число полинуклеотидов в силу альтернативного сплайсинга экзонов в ходе процессинга мРНК. Соответствующий полипептид может иметь дополнительные функциональные домены, или же такие домены могут отсутствовать. Видовыми вариантами являются полинуклеотидные последовательности, которые варьируют от одного вида к другому. Особенно применимыми в настоящем изобретении являются варианты продуктов генов дикого типа. Варианты могут быть результатом по меньшей мере одной мутации в последовательности нуклеиновой кислоты и могут приводить к образованию измененных мРНК или полипептидов, структура или функции которых могут быть или могут не быть изменены. Любой конкретный природный или рекомбинантный ген может не иметь ни одной, иметь одну или много аллельных форм. Общие мутационные изменения, которые вызывают появление вариантов, обычно приписывают природным делециям, добавлениям или заменам нуклеотидов. Каждое из таких типов изменений может возникать в данной последовательности отдельно или в сочетании с другими один или более раз.
Полученные в результате полипептиды будут, как правило, иметь значительный уровень идентичности аминокислотных остатков по отношению друг к другу. Полиморфный вариант соответствует вариации в полинуклеотидной последовательности конкретного гена между индивидами данного вида. Полиморфные варианты могут также охватывать "однонуклеотидные полиморфизмы" (SNP), или мутации одного основания, при которых полинуклеотидная последовательность варьирует по одному основанию. Наличие полиморфизмов SNP может быть показательным, например, для определенной популяции с предрасположенностью к болезненному состоянию, которая является не чем иным как восприимчивостью к нему вместо резистентности.
Производные полинуклеотиды включают в себя нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, замене водорода на алкил, ацил или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотиды, могут содержать неприродным образом возникшие участки, такие как измененные фрагменты сахара или связи между сахарами. Такими примерами могут служить фосфоротиоат и другие известные в данной области серосодержащие вещества. Производные нуклеиновые кислоты могут содержать также метки, включая радиоактивные нуклеотиды, ферменты, флуоресцирующие агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные вещества, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и пр.
"Производным" полипептида или пептида является таковой, который модифицирован, например, путем гликозилирования, пэгилирования, фосфорилирования, сульфатации, восстановления/алкилирования, ацилирования, химического спаривания или мягкой обработки формалином. Производное может быть модифицировано также таким образом, чтобы оно, либо непосредственно, либо косвенно, содержало детектируемую метку, включая, но не ограничиваясь перечисленным, радиоактивный изотоп, флуоресцентную или ферментативную метку.
Здесь подразумевается, что термин "животное" или "пациент" включает в себя, например, людей, овец, лосей, оленей, чернохвостого оленя, норку, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, цыплят, рептилий, рыб, насекомых и паукообразных.
Термин "млекопитающее" распространяется на теплокровных млекопитающих, в связи с которыми обычно обращаются за медицинской помощью (например, люди и одомашненные животные). Примеры включают в себя домашних кошек, собак, лошадей, жвачных животных и человека, а также только человека.
Термин "лечение" распространяется на лечение болезненного состояния у млекопитающего и включает в себя (a) предотвращение проявления болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к указанному болезненному состоянию, но наличие которого у млекопитающего еще не диагностировано; (b) ингибирование указанного болезненного состояния, например, задержку его развития; и/или (c) облегчение указанного болезненного состояния, например, путем регрессии указанного болезненного состояния до достижения определенного уровня. Лечение также включает в себя облегчение симптома заболевания (например, ослабление боли или уменьшение дискомфорта), при этом такое облегчение может воздействовать, а может напрямую и не воздействовать на заболевание (например, на причину, трансмиссию, экспрессию и т.д.).
Полинуклеотидные и олигонуклеотидные композиции и молекулы
Мишени
: В одном из воплощений мишени включают в себя последовательности нуклеиновых кислот эритропоэтина (EPO), включая, без ограничения, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, ассоциированные с EPO.
Эритропоэтин (EPO) является членом семейства гематопоэтических факторов роста, которые действуют в качестве гормона. EPO регулирует продукцию красных клеток крови (эритроцитов) (эритропоэз) и поддерживает общую массу эритроцитов в организме на оптимальном уровне. Продукция EPO стимулируется снижением содержания кислорода в ренальном артериальном кровообращении, опосредованным фактором транскрипции, который чувствителен к уровню кислорода. EPO продуцируется прежде всего клетками перитубулярного эндотелия почечных капилляров. Секретируемый EPO связывается с рецепторами EPO на поверхности костномозговых предшественников эритроцитов и вызывает их быструю репликацию и созревание до уровня функциональных красных клеток крови. Такая стимуляция приводит к быстрому подъему численности эритроцитов и в результате к увеличению гематокритного числа (% эритроцитов в крови) (D'Andrea et al. (1989) Cell 57: 277-285; Lodish et al. (1995) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60: 93-104).
Эритропоэтин стимулирует костный мозг к продуцированию большего количества эритроцитов. В результате увеличение количества эритроцитов повышает способность переноса кислорода кровью. Являясь первичным регулятором продукции красных клеток крови, эритропоэтин выполняет следующие основные функции: стимулирует развитие эритроцитов; инициирует синтез гемоглобина, молекулы, находящейся в красных клетках крови и переносящей кислород.
EPO стимулирует митотическое деление и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов и, таким образом, обеспечивает продуцирование эритроцитов. Он вырабатывается в почке в условиях гипоксии. В процессе индуцируемой EPO дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов происходит индукция синтеза глобулинов и повышение синтеза комплекса гема и количества ферритиновых рецепторов. Это дает возможность клетке присоединять больше ионов и синтезировать функциональный гемоглобин. Гемоглобин в зрелых эритроцитах связывает кислород. Таким образом, эритроциты и содержащийся в них гемоглобин играют ключевую роль в снабжении организма кислородом. Сложные процессы, которые описаны, инициированы взаимодействием EPO с соответствующим рецептором на клеточной поверхности предшественников эритроцитов.
В здоровом состоянии организма, когда ткани получают достаточное количество кислорода от существующего в нем количества эритроцитов, EPO присутствует в плазме в очень малых концентрациях. Этой низкой в норме концентрации достаточно для стимуляции возмещения эритроцитов, которые с возрастом обычно убывают.
Количество EPO в кровообращении повышается в условиях гипоксии, когда в циркуляции уменьшается перенос кислорода клетками крови. Гипоксия может быть вызвана потерей большого количества крови в результате кровотечения, деструкцией красных кровяных клеток в результате радиационного воздействия, уменьшения поглощения кислорода, вызванного условиями высокогорья или длительным пребыванием в бессознательном состоянии, или же различными формами анемии. В ответ на то, что ткани подвергаются гипоксическому стрессу, EPO будет способствовать повышению продукции эритроцитов путем стимуляции пролиферации эритроидных клеток-предшественников. Когда количество эритроцитов в циркуляции становится выше уровня, необходимого для потребностей нормальных тканей в кислороде, уровень EPO в крови снижается.
Поскольку EPO играет основополагающую роль в процессе образования эритроцитов, этот гормон имеет потенциально полезные применения как в диагностике, так и в лечении болезней крови, характеризующихся низким уровнем продуцирования эритроцитов или их дефективной продукцией. Примеры опосредованных эритропоэтином заболеваний и расстройств, которые можно лечить с помощью клеток/тканей, регенерировавших из стволовых клеток, полученных с применением антисмысловых соединений, включают в себя заболевания или состояния, при которых используется защитная активность полипептида EPO для защиты от повреждения или для восстановления функции после повреждения реактивных клеток, тканей или органов. Примеры таких заболеваний или состояний включают в себя, но не ограничиваются болезненными состояниями, расстройствами и состояниями гематологических нарушений, болезней крови, характеризующихся низким уровнем продуцирования эритроцитов или их дефективной продукцией, анемией, серповидноклеточной анемией, бета-талассемией, аномальным эритропоэзом, нарушениями беременности и менструального цикла, ранней анемией недоношенных, почечной недостаточностью, хронической почечной недостаточностью, гипертонией, заболеванием или расстройством, ассоциированным с хирургическим вмешательством, заболеванием или расстройством у педиатрического пациента при диализе, заболеванием или расстройством, ассоциированным с низким гематокритным числом, СПИДом, расстройствами, связанными с химиотерапевтическими воздействиями, кистозным фиброзом, злокачественной опухолью или опухолью, инфекционными заболеваниями, венерическими заболеваниями, иммунологически зависимыми заболеваниями и/или аутоиммунными заболеваниями или расстройствами, сердечно-сосудистыми заболеваниями, например, инсультом, гипотонией, задержкой сердечных сокращений, ишемией, в частности, ишемически-реперфузионным повреждением, инфарктом миокарда, таким как острый инфаркт миокарда, хронической сердечной недостаточностью, стенокардией, гипертрофией сердца, заболеваниями сердца и легких, искусственным кровообращением, респираторными заболеваниями, почечными заболеваниями, заболеваниями мочеполовой и репродуктивной системы, эндокринными расстройствами/расстройствами метаболизма, желудочно-кишечными заболеваниями, болезнями центральной нервной системы (ЦНС) или периферической нервной системы, при которых прежде всего имеют место неврологические или психиатрические симптомы, связанной с возрастом потерей когнитивной функции, детским церебральным параличом, нейродегенертивным заболеванием, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Ли, деменцией, потерей памяти, амиотрофическим боковым склерозом, алкоголизмом, расстройством настроения, тревожным расстройством, болезнью дефицита внимания, гиперактивностью, аутизмом, шизофренией, депрессией, травмой или ишемией головного или спинного мозга, болезнью Крейтцфельда-Якоба, офтальмологическими заболеваниями, эпилепсией, множественным склерозом, воспалением, радиационным поражением, дегенерацией желтого пятна, диабетической нейропатией, диабетической ретинопатией, глаукомой, ишемией сетчатки и травмой сетчатки, повреждением спинного мозга, состоянием в связи с космическим полетом, острой потерей крови, старением и состоянием при неопластических заболеваниях.
in vitro
5
В одном из воплощений способы и композиции согласно изобретению используются для модуляции любой из функций эритропоэтина. Анализы для определения модуляции функций эритропоэтина известны в данной области и описаны в литературе. Например, в патенте США № 5688679, "Human erythropoietin gene; high level expression in stably transfected mammalian cells", включенном в настоящее описание в виде ссылки, сообщается об использовании  анализа биологической активности эритропоэтина, который основан на образовании эритроидных колоний (из CFU-E; эритроидных колониеобразующих клеток) в культурах мышиных костномозговых клеток в сгустке плазмы (Blood Cells 4: 89-103, 1978). Согласно литературным данным, чувствительность такого анализа оценивается приблизительно в 5 миллиединиц/мл. Эритропоэтин, используемый в качестве стандарта для такого анализа, представлял собой частично очищенный препарат из плазмы анемичных овец. Производили оценку супернатантов из пересеваемых клеточных линий, растущих в течение 24 часов в свежей среде без добавления метотрексата. Такой супернатант разбавляли 1:200 средой, и в количестве от 1 до 10 микролитров добавляли на миллилитр анализируемой культуры, содержащей 2×10 клеток костного мозга, 10% бычьей цитратной плазмы, 20% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 1,6% бычьего эмбрионального экстракта (Gibco). После инкубации в течение 36-48 часов сгустки плазмы фиксировали на предметном стекле микроскопа, окрашивали бензидином для выявления гемоглобина и подсчитывали эритроидные колонии.
В патенте США № 5688679, включенном в настоящее описание в виде ссылки, также сообщается о применении супернатантов из выбранных клеточных линий для количественного определения иммунологически реактивного эритропоэтина с помощью конкурентного радиоиммуноанализа с использованием поливалентной антисыворотки, полученной у кролика против эритропоэтина человека (J. Cell. Physiol. 118: 87-96, 1984). Эритропоэтин может определяться также и с помощью других иммунологических методов, например, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции.
Более того, в этом же самом патенте описан количественный анализ эритропоэтина, секретируемого в клеточный супернатант и оказывающего воздействие на пролиферацию других костномозговых клеток-предшественников. Может быть изучено влияние эритропоэтина на различные предшественники из костного мозга мыши и человека, включая эритроидные колониеобразующие клетки (CFU-E), эритроидные бурст-образующие клетки (BFU-E), предшественники гранулоцитов-макрофагов (CFU-GM) и колониеобразующие клетки в смеси клеток (CFU-Mix) (J. Cell. Physiol. Suppl. 1: 79-85, 1982; J. Cell. Physiol. 118: 87-96, 1984); указанные ссылки также включены в настоящее описание.
in vivo
in vitro
Сообщалось также, что эритропоэтин воздействует и на другие типы клеток, отличные от клеток эритроидного ряда. Например, в публикации Lifshitz, et al., 2009, "Non-erythroid activities of erythropoietin: Functional effects on murine dendritic cells", Mol. Immunol. 46(4): 713-21, включенной в настоящее описание в виде ссылки, сообщается об экспериментах  на мышах, которым инъецировали EPO, и на трансгенных мышах, в повышенном количестве экспрессирующих человеческий EPO, у которых обнаруживали повышенное содержание популяции дендритных клеток (ДК) в селезенке с повышенной экспрессией CD80 и CD86 на клеточной поверхности. Prutchi с соавт., 2008, "Erythropoietin effects on dendritic cells: potential mediators in its function as an immunomodulator?" Exp Hematol. 36(12): 1682-90, сообщают о том, что при воздействии , EPO способствовал повышению содержания ДК в периферической крови и полученных из моноцитов дендритных клеток (MoДК), экспрессирующих костимуляторные молекулы CD80 и CD86.
В предпочтительном воплощении указанные олигонуклеотиды специфичны в отношении полинуклеотидов EPO, которые включают в себя, без ограничения, некодирующие области. EPO-мишени содержат варианты EPO; мутанты EPO, включая SNP; некодирующие последовательности EPO; аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, чтобы указанный олигонуклеотид представлял собой антисмысловую молекулу РНК.
В соответствии с воплощениями настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты-мишени не ограничена только лишь полинуклеотидами EPO, но распространяется также и на любую из изоформ EPO, его рецепторов, гомологов, некодирующих областей и т.п.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид направлен на природную антисмысловую последовательность (природную последовательность, антисмысловую по отношению к кодирующим и некодирующим областям) EPO-мишеней, включая, без ограничения, их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, чтобы указанный олигонуклеотид представлял собой антисмысловую молекулу РНК или ДНК.
В другом предпочтительном воплощении олигомерные соединения согласно изобретению включают в себя также варианты, в которых отличающиеся основания встречаются в одном или нескольких положениях нуклеотидов в указанном соединении. Например, если первым нуклеотидом является аденин, могут быть получены варианты, которые содержат в этом положении тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или неприродные нуклеотиды. Это может быть произведено в любых положениях антисмыслового соединения. Затем эти соединения тестируют, с использованием описанных здесь способов, с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность между антисмысловым соединением и мишенью составляет приблизительно от 50% примерно до 60%. В некоторых воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 60% примерно до 70%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 70% примерно до 80%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно от 80% примерно до 90%. В определенных воплощениях гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
in vivo
in vitro
Антисмысловое соединение является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальному функционированию нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая потерю ее активности, и при этом оно должно обладать достаточной степенью комплементарности, чтобы было исключено неспецифическое связывание антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, благоприятных для специфического связывания. Такие условия включают в себя, например, физиологические условия в случае анализов  или терапевтического воздействия, и условия, при которых предпринимаются анализы в случае количественных оценок .
in vivo
in vitro
Антисмысловое соединение, будь то ДНК, РНК, химерное, замещенное соединение и т.д., является специфически гибридизуемым, если связывание указанного соединения с молекулой ДНК-мишени или РНК-мишени препятствует нормальному функционированию ДНК-мишени или РНК-мишени, вызывая потерю ее функциональности, и при этом должна иметь место достаточная степень комплементарности, чтобы было исключено неспецифическое связывание антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, благоприятных для специфического связывания, то есть в физиологических условиях в случае анализов  или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых предпринимаются анализы в случае количественных оценок .
В другом предпочтительном воплощении нацеливание на EPO, включая, без ограничения, антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д., где одна или более из указанных последовательностей представлены в виде SEQ ID NO: 2 и пр., модулирует экспрессию или функцию EPO. В одном из воплощений экспрессия или функция повышается по сравнению с контролем. В другом предпочтительном воплощении экспрессия или функция понижается по сравнению с контролем.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды содержат последовательности нуклеиновых кислот, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, включая антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных соединений включают в себя фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и пр. В другом предпочтительном воплощении нуклеотиды содержат фосфорное производное. Фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к сахару или к фрагменту сахарного аналога в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может быть монофосфатом, дифосфатом, трифосфатом, алкилфосфатом, алканфосфатом, фосфоротиоатом и пр. Приемы получения указанных выше фосфатных аналогов и их включения в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, как таковые, известны, и нет необходимости их здесь описывать.
Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используется специалистами в данной области для терапевтических применений. Антисмысловые олигонуклеотиды используются в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды безопасно и эффективно вводят человеку, и в настоящее время проводится целый ряд клинических испытаний. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут быть полезными терапевтическими средствами, которые можно скомпоновать таким образом, чтобы они использовались в лечебных схемах для обработки клеток, тканей и для лечения животных, в частности, человека.
В воплощениях согласно изобретению олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с молекулами нуклеиновых кислот-мишеней и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Функции ДНК, которым предполагается противостоять, включают в себя, например, репликацию и транскрипцию. Функции РНК, которым предполагается противостоять, включают в себя все жизненные функции, такие, например, как транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белка с РНК, сплайсинг РНК, с получением одного или более видов мРНК, а также каталитическая активность, которая может быть блокирована или облегчена посредством РНК. Указанные функции могут быть усилены или могут ингибироваться, в зависимости от потребностей.
Антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), альтернативные сплайсеры, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени. Как таковые, указанные соединения могут быть введены в виде одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
Нацеливание антисмысловых соединений на конкретную молекулу нуклеиновой кислоты, в контексте настоящего изобретения, может быть многоступенчатым процессом. Указанный процесс обычно начинается с идентификации нуклеиновой кислоты-мишени, функция которой подлежит модуляции. Указанной нуклеиновой кислотой-мишенью может быть, например, клеточный ген (или мРНК, транскрибируемая с указанного гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или же молекула нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. В настоящем изобретении нуклеиновая кислота-мишень кодирует эритропоэтин (EPO).
Процесс нацеливания обычно включает в себя также определение по меньшей мере одной области-, сегмента- или участка-мишени внутри целевой нуклеиновой кислоты для взаимодействия с антисмысловым соединением, осуществляемого таким образом, чтобы в результате был получен требуемый эффект, например, модуляция экспрессии. В контексте настоящего изобретения термин "область" определяется как часть нуклеиновой кислоты-мишени, имеющая по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику. Внутри областей нуклеиновых кислот-мишеней находятся сегменты. "Сегменты" определяются как менее крупные или как суб-части областей внутри нуклеиновой кислоты-мишени. Используемый в настоящем изобретении термин "участки" определяется как положения внутри нуклеиновой кислоты-мишени.
В предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями эритропоэтина (EPO) и модулируют экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO) (SEQ ID NO: 1). Примеры антисмысловых последовательностей включают в себя последовательности SEQ ID NO: 2-5.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментами полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) и модулируют экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO). Указанные сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды являются специфичными в отношении природных антисмысловых последовательностей эритропоэтина (EPO), при этом связывание олигонуклеотидов с природными антисмысловыми последовательностями эритропоэтина (EPO) модулирует экспрессию и/или функцию эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5, антисмысловые последовательности, которые идентифицированы и объем которых увеличен, например, с помощью ПЦР, гибридизации и т.д. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных соединений включают в себя фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и пр. В другом предпочтительном воплощении нуклеотиды содержат фосфорное производное. Фосфорное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к сахару или к фрагменту сахарного аналога в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может быть монофосфатом, дифосфатом, трифосфатом, алкилфосфатом, алканфосфатом, фосфоротиоатом и пр. Приемы получения указанных выше фосфатных аналогов и их включения в нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и олигонуклеотиды, как таковые, известны, и нет необходимости их здесь описывать.
in vivo
in vivo
Поскольку, как известно в данной области, кодоном инициации трансляции обычно является 5’-AUG (в молекулах транскрибированной мРНК; 5’-ATG в соответствующей молекуле ДНК), кодон инициации трансляции обозначается также как "кодон AUG", "старт-кодон" или "старт-кодон AUG". Меньшая часть генов имеет кодон инициации трансляции, имеющий РНК-последовательность 5’-GUG, 5’-UUG или 5’-CUG; а 5’-AUA, 5’-ACG и 5’-CUG, как было показано, функционируют . Таким образом, термины "кодон инициации трансляции" и "старт-кодон" могут охватывать многие последовательности кодонов, несмотря даже на то, что инициирующей аминокислотой в каждом случае обычно является метионин (у эукариот) или формилметионин (у прокариот). Гены эукариот могут иметь два или более альтернативных старт-кодонов, любой из которых может быть предпочтительно использован для инициации трансляции в конкретный тип клеток или ткани или при особом наборе условий. В контексте настоящего изобретения, "старт-кодон" и "кодон инициации трансляции" относятся к кодону или кодонам, которые используются  для инициации трансляции мРНК, транскрибированной с гена, кодирующего эритропоэтин (EPO), независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. Кодон терминации трансляции (или "стоп-кодон") гена может иметь от одной до трех последовательностей, то есть 5’-UAA, 5’-UAG и 5’-UGA (соответствующими ДНК-последовательностями являются, соответственно, 5’-TAA, 5’- TAG и 5’-TGA).
Термины "область старт-кодона" и "область кодона инициации трансляции" относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает приблизительно от 25 примерно до 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5’- или 3’-) от кодона инициации трансляции. Сходным образом, термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает приблизительно от 25 примерно до 50 смежных нуклеотидов в любом направлении (то есть 5’- или 3’-) от кодона терминации трансляции. Следовательно, все эти области, и "область старт-кодона" (или "область кодона инициации трансляции"), и "область стоп-кодона" (или "область кодона терминации трансляции"), являются областями, на которые могут быть эффективно нацелены антисмысловые соединения согласно изобретению.
Открытая рамка считывания (ORF), или "кодирующая область", которая известна специалистам как область между кодоном инициации трансляции и кодоном терминации трансляции, также является областью, которая может быть эффективной целевой областью. В контексте настоящего изобретения, целевой областью (или областью-мишенью) является внутригенная область, охватывающая кодон инициации трансляции или кодон терминации трансляции открытой рамки считывания (ORF) гена.
Другая целевая область включает в себя 5’-нетранслируемую область (5’UTR), известную специалистам как часть мРНК в 5’-направлении от кодона инициации трансляции и, таким образом, включающую в себя нуклеотиды между 5’-сайтом кэпирования и кодоном инициации трансляции мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). Еще одна целевая область включает в себя 3’-нетранслируемую область (3’UTR), известную специалистам как часть мРНК в 3’-направлении от кодона терминации трансляции и, таким образом, включающую в себя нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3’-концом мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). 5’-сайт кэпирования мРНК содержит N7-метилированный остаток гуанозина, соединенный с крайним 5’-остатком мРНК посредством 5’-5’-трифосфатного звена. Считается, что 5’-сайт кэпирования мРНК включает в себя структуру 5’-сайта как таковую, а также первые 50 нуклеотидов, примыкающих к 5’-сайту. Другой целевой областью в настоящем изобретении является 5’-сайт кэпирования.
Хотя некоторые мРНК-транскрипты эукариот транслируются в прямом направлении, многие содержат одну или более областей, известных как "интроны", которые вырезаются из транскрипта перед его трансляцией. Остальные (и, следовательно, транслируемые) области известны как "экзоны", они соединяются вместе посредством сплайсинга, образуя непрерывную последовательность мРНК. В одном из воплощений нацеливание на участки сплайсинга, то есть интрон-экзонные соединения или экзон-интронные соединения, является особенно полезным в ситуации, когда при том или ином заболевании происходит аберрантный сплайсинг или когда имеет место сверхпродуцирование конкретного продукта сплайсинга. Образование аберрантных соединений при сплайсинге в результате реаранжировки является еще одним воплощением целевого участка. мРНК-транскрипты, продуцируемые посредством процесса сплайсинга двух (или более) мРНК из разных генов, известны как "слитые транскрипты." Нацеливание на интроны может быть эффективно осуществлено с помощью антисмысловых соединений, нацеленных, например, на ДНК или на пре-мРНК.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующей и/или некодирующей областями полинуклеотида-мишени и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды связываются со смысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены из одной и той же области геномной ДНК. Указанные альтернативные транскрипты обычно известны как "варианты". Более конкретно, "варианты пре-мРНК" являются транскриптами, продуцируемыми из одной и той же геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, продуцируемых из той же самой геномной ДНК, либо своим старт-положением, либо стоп-положением, и содержат как интронную, так и экзонную последовательности.
При вырезании одной или более экзонных или интронных областей или их частей в процессе сплайсинга, варианты пре-мРНК продуцируют более короткие "варианты мРНК". Следовательно, варианты мРНК являются прошедшими стадию процессинга вариантами пре-мРНК, и каждый уникальный вариант пре-мРНК должен в результате сплайсинга всегда продуцировать уникальный вариант мРНК. Указанные варианты мРНК известны также как "варианты альтернативного сплайсинга". Если вариант сплайсинга пре-мРНК не образуется, тогда вариант пре-мРНК идентичен варианту мРНК.
Варианты могут быть получены с использованием альтернативных сигналов запуска и остановки транскрипции. Транскрипты пре-мРНК и мРНК могут иметь более одного старт-кодона или стоп-кодона. Варианты, которые происходят из пре-мРНК или мРНК, в которых используются альтернативные старт-кодоны, известны как "альтернативные старт-варианты" указанных пре-мРНК или мРНК. Те транскрипты, в которых используется альтернативный стоп-кодон, известны как "альтернативные стоп-варианты" указанных пре-мРНК или мРНК. Одним специфическим типом альтернативного стоп-варианта является "вариант поли-A", при котором аппаратом транскрипции продуцируются множественные транскрипты, являющиеся результатом альтернативной селекции одного из "стоп-сигналов поли-A", и таким образом продуцируются транскрипты, которые заканчиваются уникальными участками поли-А. В контексте настоящего изобретения описанные здесь типы вариантов также являются воплощениями нуклеиновых кислот-мишеней.
Локализации участков на нуклеиновой кислоте-мишени, с которыми гибридизуются антисмысловые соединения, определяются как участки длиной по меньшей мере в 5 нуклеотидов области-мишени, на которую нацелено активное антисмысловое соединение.
Хотя здесь для примера и приведены специфические последовательности определенных сегментов-мишеней, специалисту в данной области должно быть очевидно, что они служат лишь для иллюстративных целей и описывают конкретные воплощения, входящие в объем, охватываемый настоящим изобретением. Дополнительные сегменты-мишени с легкостью могут быть идентифицированы рядовым специалистом в данной области на основании приведенного здесь описания.
Сегменты-мишени длиной в 5-100 нуклеотидов, содержащие отрезки по меньшей мере в пять (5) смежных нуклеотидов, выбранных среди предпочтительных иллюстративных сегментов-мишеней, также считаются подходящими для осуществления нацеливания.
Сегменты-мишени могут включать в себя последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов от 5’-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды образуют отрезок из следующих друг за другом нуклеотидов той же самой ДНК или РНК, начиная непосредственно выше 5’-конца сегмента-мишени и продолжая вдоль ДНК или РНК приблизительно на расстояние от 5 примерно до 100 нуклеотидов). Сходным образом, предпочтительные сегменты-мишени представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов от 3’-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды образуют отрезок из следующих друг за другом нуклеотидов той же самой ДНК или РНК, начиная непосредственно ниже 3’-конца сегмента-мишени и продолжая вдоль ДНК или РНК приблизительно на расстояние от 5 примерно до 100 нуклеотидов). Специалисты в данной области на основании проиллюстрированных здесь сегментов-мишеней смогут без излишнего экспериментирования идентифицировать дальнейшие предпочтительные сегменты-мишени.
Как только будут идентифицированы одна или более областей-мишеней, сегментов или участков, выбирают антисмысловые соединения, которые имеют достаточную комплементарность в отношении мишени, то есть будут достаточно хорошо гибридизоваться и с достаточной специфичностью, чтобы можно было ожидать требуемого эффекта.
В воплощениях настоящего изобретения олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Такие олигонуклеотиды имеют по меньшей мере 5 нуклеотидов в длину и могут быть синтезированы таким образом, чтобы каждый олигонуклеотид был нацелен на перекрывающиеся последовательности, так, чтобы в результате синтезированные олигонуклеотиды покрывали полную длину полинуклеотида-мишени. Мишени также включают в себя как кодирующие, так и некодирующие области.
В одном из воплощений предпочтительно на специфические нуклеиновые кислоты нацеливать антисмысловые олигонуклеотиды. Нацеливание антисмысловых соединений на конкретную нуклеиновую кислоту является многоступенчатым процессом. Обычно такой процесс начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой подлежит модуляции. Это может, например, быть клеточным геном (или мРНК, транскрибированной с такого гена), экспрессия которого ассоциирована с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или некодирующим полинуклеотидом, таким, например, как некодирующая РНК (нкРНК).
Science
Genome Res
РНК могут быть классифицированы на (1) матричные РНК (мРНК), которые транслируются в белки, и (2) некодирующие белок РНК (нкРНК). нкРНК содержат микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие транскрипционные единицы (TU), содержащие высокую плотность стоп-кодонов и лишенные сколько-нибудь обширной "открытой рамки считывания". По-видимому, многие нкРНК начинаются с участков инициации 3’-нетранслируемых областей (3’UTR) кодирующего белок локуса. Обычно нкРНК являются редкими, и по меньшей мере половина нкРНК, которые секвенированы ассоциацией FANTOM, по-видимому, не полиаденилированы. Большинство исследователей с полным основанием сосредоточены на полиаденилированных мРНК, которые проходят стадию процессинга и экспортируются в цитоплазму. В настоящее время показано, что набор неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень обширным, и что многие такие транскрипты происходят из так называемых межгенных областей (Cheng, J. et al. (2005)  308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. et al (2005).  15 (7), 987-997). Механизмом, посредством которого нкРНК могут регулировать экспрессию генов, является спаривание оснований с транскриптами-мишенями. РНК, которые функционируют путем спаривания оснований, могут быть сгруппированы в (1) цис-кодируемые РНК, которые кодируются на одном и том же участке генетической локализации, но на противоположной цепи РНК, на которую они воздействуют, и, следовательно, они полностью комплементарны своей мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, кодирование которых имеет иную хромосомную локализацию, нежели РНК, на которую они воздействуют, и обычно проявляемый ими потенциал спаривания оснований со своими мишенями не так высок.
Не желая связывать себя какой бы то ни было теорией, можно, тем не менее, утверждать, что описанное здесь нарушение на уровне антисмыслового полинуклеотида, вызываемое антисмысловыми олигонуклеотидами, может изменять экспрессию соответствующих смысловых матричных РНК. Однако такая регуляция может быть либо дискордантной (нарушение антисмысловой цепи приводит к повышению уровней матричной РНК), либо конкордантной (нарушение антисмысловой цепи одновременно приводит к снижению уровней матричной РНК). В этих случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части антисмыслового транскрипта, приводя к его разрушению или удалению. Кодирующие, также как и некодирующие, соединения могут быть нацелены идентичным образом, и при этом каждая из категорий способна регулировать соответствующие смысловые транскрипты - либо конкордантным, либо дискордантным образом. Стратегии, которые используются при идентификации новых олигонуклеотидов для их использования против мишени, могут быть основаны на разрушении антисмысловых РНК-транскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или любым другим способом модуляции представляющей интерес мишени.
Стратегия 1: В случае дискордантной регуляции выведение из строя антисмыслового транскрипта повышает экспрессию типового (смыслового) гена. Если бы этот последний ген кодировал известную или мнимую мишень лекарственного средства, тогда удаление его антисмыслового эквивалента предположительно могло бы имитировать действие агониста рецептора или ферментативного стимулятора.
Стратегия 2: В случае конкордантной регуляции можно одновременно подавить оба транскрипта, антисмысловой и смысловой, и таким образом добиться синергического уменьшения экспрессии типового (смыслового) гена. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид используется для достижения нокдауна, тогда такая стратегия может быть использована таким образом, чтобы один антисмысловой олигонуклеотид был нацелен на смысловой транскрипт, а другой антисмысловой олигонуклеотид был нацелен на соответствующий антисмысловой транскрипт, или чтобы единственный энергетически симметричный антисмысловой олигонуклеотид одновременно был нацелен на область перекрывания смыслового и антисмыслового транскриптов.
Согласно настоящему изобретению, антисмысловые соединения включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), соединения siРНК, одно- или двухцепочечные соединения [системы] интерференции РНК (РНКi), такие как соединения siРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют их функции. Как таковые, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут быть миметиками одного или нескольких из указанных соединений. Такие соединения могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми или U-образными олигомерными соединениями и могут содержать такие структурные элементы как внутренние или концевые выпячивания, ошибочные спаривания или петли. Антисмысловые соединения обычно получают линейно, но они могут быть соединены или получены иным способом, с получением кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать в себя конструкции, такие, например, как две цепи, гибридизованные таким образом, чтобы получилось полностью или частично двухцепочечное соединение или одноцепочечное соединение с достаточной само-комплементарностью для обеспечения гибридизации и образования полного или частичного двухцепочечного соединения. Двухцепочечные соединения могут быть соединены внутренними участками, оставляя свободными 3’- или 5’-концы, или же они могут быть соединены, образуя непрерывную структуру шпильки или петли. Структура шпильки может содержать нависающий край либо с 5’-, либо с 3’-конца, продуцируя удлинение одноцепочечного характера. Двухцепочечные соединения необязательно могут включают в себя нависающие края на обоих концах. Дополнительные модификации могут включать в себя конъюгатные группы, присоединенные к одному из концов, к избранным нуклеотидным положениям, положениям сахара или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, такие две цепи могут быть соединены через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании только из одной цепи дцРНК могут принимать форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа (U-образной), которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса. Таким образом, такие дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфической модуляции экспрессии гена можно достичь путем стабильной экспрессии шпилечной (U-образной) дцРНК в трансгенных клеточных линиях, однако в некоторых воплощениях экспрессия или функция гена повышается. При образовании из двух цепей или одной цепи, которая принимает форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа (U-образной), которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса, две указанные цепи (или дуплекс-образующие области одной цепи) являются комплементарными цепями РНК, между которыми спаривание оснований происходит по схеме Уотсона-Крика.
Сразу же после введения в систему, соединения согласно изобретению могут выявить действие одного или более ферментов или структурных белков, вызывая расщепление или другую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, или же могут действовать на основе механизмов заселения (связывания). Обычно нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНК-подобные" (то есть в целом имеющие один или более 2’-дезокси-сахаров и обычно содержащие, вместо оснований U, основания T) или "РНК-подобные" (то есть в общем имеющие один или более 2’-гидроксила или 2’-модифицированных сахаров и обычно содержащие, вместо оснований T, основания U). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать структуру более чем одного типа, наиболее часто, A- и B-формы. Обычно считается, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру наподобие B-формы, являются "ДНК-подобными", тогда как имеющие A-подобную структуру являются "РНК-подобными. В некоторых воплощениях (в случаях химер) антисмысловое соединение может содержать области как в A-, так и в B-форме.
В другом предпочтительном воплощении требуемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из нижеуказанного: антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, химерные антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, РНК-интерференцию (РНКi), короткую интерферирующую РНК (siРНК); микро-интерферирующую РНК (miРНК); малую временную РНК (stРНК); или короткую шпилечную (U-образную) РНК (shРНК); короткие РНК, способствующие активации экспрессии генов (РНКa); малые активирующие РНК (saРНК) или их сочетания.
дцРНК также могут активировать экспрессию генов - механизм, который был назван "процессом активации экспрессии генов короткими РНК ", или РНКa. дцРНК, нацеленные на генные промоторы, вызывают сильную активацию транскрипции ассоциированных генов. РНКa в клетках человека была обнаружена с помощью искусственных дцРНК, названных "малыми активирующими РНК" (saРНК). В настоящее время неизвестно, сохранились ли РНКa в других организмах.
Обнаружено, что малая двухцепочечная РНК (дцРНК), такая как короткая интерферирующая РНК (siРНК) и микро-РНК (miРНК), запускает эволюционно консервативный механизм, известный как РНК-интерференция (РНКi). РНКi неизменно приводит к молчанию (сайленсингу) гена путем ремоделирования хроматина, с последующей супрессией транскрипции, деградацией комплементарной мРНК или блокированием трансляции белка. Однако в случаях, подробно описываемых в нижеследующем разделе примеров, показано, что олигонуклеотиды повышают экспрессию и/или функцию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) и кодируемых ими продуктов. дцРНК могут действовать также как малые активирующие РНК (saРНК). Не желая связывать себя какой бы то ни было теорией, отметим лишь, что путем нацеливания последовательностей на генные промоторы, saРНК будут вызывать экспрессию гена - явление, названное процессом дцРНК-индуцированной активации транскрипции" (РНКa).
Еще в одном воплощении идентифицированные здесь "предпочтительные сегменты-мишени" могут быть использованы в скрининге дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO). "Модуляторами" являются такие соединения, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эритропоэтин (EPO), и которые содержат участок по меньшей мере из 5 нуклеотидов, который является комплементарным предпочтительному сегменту-мишени. Способ скрининга включает в себя стадии приведения в контакт предпочтительного сегмента-мишени молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды эритропоэтина (EPO) с одним или более модуляторами-кандидатами, и выбора одного или более модуляторов-кандидатов, которые уменьшают или увеличивают экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), например, SEQ ID NO: 3-5. Сразу после обнаружения того, что модулятор- или модуляторы-кандидаты способны модулировать (например, либо уменьшать, либо увеличивать) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), указанный модулятор может быть использован в дальнейших исследованиях функции полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) или для применения в качестве экспериментального, диагностического или терапевтического средства согласно настоящему изобретению.
Нацеливание природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени, например, гена EPO (например, с номером доступа NM 000799.2, Фиг. 2). В предпочтительном воплощении мишенью является антисмысловой полинуклеотид эритропоэтинового гена. В предпочтительном воплощении антисмысловой олигонуклеотид нацелен на смысловую и/или природную антисмысловую последовательности полинуклеотидов эритропоэтина (EPO) (например, с номером доступа NM 000799.2, Фиг. 2), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные им последовательности. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой, а мишени включали в себя кодирующую и некодирующую области антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов EPO.
Природные антисмысловые полинуклеотиды могут быть идентифицированы, как описано, например, в международной заявке WO 2007/087113 и патентной заявке США № 2009/0258925, обе они называются "Natural Antisense and Non-coding RNA Transcripts as Drug Targets" и в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылок.
Предпочтительные сегменты-мишени согласно настоящему изобретению можно также комбинировать с соответствующими им комплементарными антисмысловыми соединениями согласно изобретению, с образованием стабилизированных двухцепочечных (сдвоенных) олигонуклеотидов.
Nature
Nature
Gene
Science
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Genes Dev.,
Genes Dev.
Science
В данной области было показано, что такие двухцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишени и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК посредством антисмыслового механизма. Кроме того, такие двухцепочечные фрагменты могут быть подвергнуты химическим модификациям (Fire et al, (1998) , 391, 806-811; Timmons and Fire, (1998) , 395, 854; Timmons et al, (2001) , 263, 103-112; Tabara et al, (1998) , 282, 430-431; Montgomery et al, (1998) , 95, 15502-15507; Tuschl et al, (1999)  13, 3191-3197; Elbashir et al, (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir et al, (2001)  15, 188-200). Например, было показано, что такие двухцепочечные фрагменты ингибируют мишень путем классической гибридизации антисмысловой цепи дуплекса с мишенью, таким образом запуская процесс ферментативной деградации мишени (Tijsterman et al., (2002) , 295, 694-697).
В предпочтительном воплощении антисмысловой олигонуклеотид направляют на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO) (например, с номером доступа NM 000799.2), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные им последовательности. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой.
В соответствии с воплощениями настоящего изобретения, нуклеиновая кислота-мишень не ограничена только эритропоэтином (EPO), но распространяется также и на любые изоформы, рецепторы, гомологи и пр. молекул эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов EPO, например, полинуклеотидов, представленных в виде SEQ ID NO: 2, а также любых ее вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных ей последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены в виде SEQ ID NO: 3-5.
В одном из воплощений указанные олигонуклеотиды комплементарны или связаны с последовательностями нуклеиновых кислот антисмыслового эритропоэтина (EPO), включая, без ограничения, некодирующие смысловую и/или антисмысловую последовательности, ассоциированные с полинуклеотидами эритропоэтина (EPO), и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
В другом предпочтительном воплощении указанные олигонуклеотиды комплементарны или связаны с последовательностями нуклеиновых кислот природного антисмыслового EPO, представленными в виде SEQ ID NO: 2, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
В предпочтительном воплощении олигонуклеотиды включают в себя последовательности по меньшей мере из 5 смежных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO: 3-5 и модулируют экспрессию и/или функцию молекул эритропоэтина (EPO).
Мишени указанного полинуклеотида включают в себя EPO, включая членов его семейства, варианты EPO; мутанты EPO, включая SNP; некодирующие последовательности EPO; аллели EPO; видовые варианты, фрагменты и т.п. Предпочтительно, чтобы олигонуклеотид был антисмысловой молекулой.
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотид, нацеленный на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), включают в себя антисмысловую РНК, РНК-интерференцию (РНКi), короткую интерферирующую РНК (siРНК); микро-интерферирующую РНК (miРНК); малую временную РНК (stРНК); или короткую шпилечную (U-образную) РНК (shРНК); короткие РНК, способствующие активации экспрессии генов (РНКa); или малые активирующие РНК (saРНК).
В другом предпочтительном воплощении нацеливание на полинуклеотиды эритропоэтина (EPO), например, SEQ ID NO: 2, модулирует экспрессию или функцию указанных мишеней. В одном из воплощений экспрессия или функция повышается по сравнению с контролем. В другом предпочтительном воплощении экспрессия или функция понижается по сравнению с контролем.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые соединения содержат последовательности, представленные в виде SEQ ID NO: 3-5. Указанные олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более коротких или более длинных фрагментов, модифицированных связей и пр.
В другом предпочтительном воплощении SEQ ID NO: 3-5 включают в себя один или более нуклеотидов LNA.
Nature
Nucleic Acids Research
Модуляция требуемой нуклеиновой кислоты-мишени может быть достигнута несколькими путями, известными в данной области. Например, с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, siРНК и т.д. Молекулы ферментативных нуклеиновых кислот (например, рибозимы) являются молекулами нуклеиновых кислот, способными катализировать одну или более различных реакций, включая способность неоднократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновых кислот способом, который специфичен в отношении последовательности нуклеотидных оснований. Такие ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы, например, для нацеливания виртуально на любой РНК-транскрипт (Zaug et al, 324,  429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; и Jefferies et al, 17  1371, 1989).
Ann. Rep. Med. Chem
J. Med. Chem
В силу того, что они специфичны в отношении последовательности, транс-расщепляющие ферментативные молекулы нуклеиновых кислот являются перспективными в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний человека (Usman & McSwiggen, (1995) . 30, 285-294; Christoffersen and Marr, (1995) . 38, 2023-2037). Ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть сконструированы таким образом, чтобы расщеплять специфические РНК-мишени среди основных клеточных РНК. Явление такого расщепления делает мРНК нефункциональной и нарушает экспрессию белка с указанной РНК. Таким образом можно селективно ингибировать синтез белка, ассоциированного с болезненным состоянием.
Обычно ферментативные нуклеиновые кислоты с расщепляющей РНК активностью действуют прежде всего путем связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит на участке-мишени для связывания ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в непосредственной близости от ферментативной части молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота прежде всего распознает, а потом связывается с РНК-мишенью путем образования комплементарных пар оснований, и при образовании связей с правильным участком, проявляет свое ферментативное действие, расщепляя указанную РНК-мишень. Стратегическое расщепление такой РНК-мишени нарушит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того как ферментативная нуклеиновая кислота свяжется и расщепит свою РНК-мишень, она избавляется от связи с данной РНК, в поисках другой мишени, и может многократно связываться и расщеплять новые мишени.
Science
Scientific American
TIBTECH
Science
TIBS
FASEB J.
Curr. Op. Biotech.
in vitro
Proc. R. Soc. London
Для разработки новых нуклеиновых кислот-катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигирование фосфодиэфирных связей и амидных связей (Joyce, (1989) Gene, 82, 83-87; Beaudry et al, (1992)  257, 635-641; Joyce, (1992)  267, 90-97; Breaker et al, (1994)  12, 268; Bartel et al, (1993)  261: 1411-1418; Szostak, (1993)  17, 89-93; Kumar et al, (1995) , 9, 1183; Breaker, (1996) , 1, 442), было использовано несколько подходов, таких как стратегии селекции (эволюции)  (Orgel, (1979) , B 205, 435).
-1
2+
-1
-1
in vitro
Разработка рибозимов, которые являются оптимальными для каталитической активности, была бы существенным вкладом в любую стратегию, в которой используются РНК-расщепляющие рибозимы в целях регуляции экспрессии генов. Рибозим в виде «головки молотка», например, функционирует со скоростью катализа (kcat), приблизительно составляющей 1 мин в присутствии насыщающих (10 мМ) концентраций кофактора Mg. Было показано, что искусственный рибозим "РНК-лигаза" катализирует соответствующую реакцию самомодификации со скоростью, приблизительно составляющей 100 мин. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы в виде «головки молотка», которые имеют субстрат-связывающие «лапки», сделанные из ДНК, катализирующей расщепление РНК со скоростями многократной оборачиваемости, приближающимися к 100 мин. Наконец, при замене специфического остатка внутри каталитического ядра «головки молотка» определенными нуклеотидными аналогами образуются модифицированные рибозимы, которые приобретают 10-кратно увеличенную скорость катализа. Такие достижения показывают, что рибозимы могут вызывать химические трансформации, со скоростями катализа, которые значительно выше, чем скорости, присущие  большей части природных саморасщепляющихся рибозимов. В таком случае возможно, что структуры определенных саморасщепляющихся рибозимов могут быть оптимизированы для получения максимальной каталитической активности, или что могут быть получены полностью новые РНК-мотивы, которые развивают значительно более высокие скорости расщепления фосфодиэфирной связи РНК.
Межмолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК-катализатором, который соответствует модели «головки молотка», было впервые показано в 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). РНК-катализатор был получен и введен в реакцию со множеством молекул РНК, и в результате было продемонстрировано то, что он является истинным каталитзатором.
Nature
Nature
Nature
FEBS Lett.
in vivo
Nature
Nature
Nature
Каталитические РНК, сконструированные на основе мотива «головки молотка», используются для расщепления специфических последовательностей-мишеней путем подходящих замен оснований в каталитической РНК, с сохранением необходимого спаривания оснований с последовательностями-мишенями (Haseloff and Gerlach, (1988) , 334, 585; Walbot and Bruening, (1988) , 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) , 328: 596-600; Koizumi, M., et al. (1988) , 228: 228-230). Это позволяет использовать каталитическую РНК для расщепления специфических последовательностей-мишеней и указывает на то, что каталитические РНК, сконструированные в соответствии с моделью «головки молотка», возможно, смогут расщепить специфические субстраты РНК  (см. Haseloff and Gerlach, (1988) , 334, 585; Walbot and Bruening, (1988) , 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) , 328: 596-600).
РНК-интерференция (РНКi) стала исключительным инструментом для модуляции экспрессии генов у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Такой подход требует доставки малых интерферирующих РНК (siРНК) либо в виде РНК как таковой, либо в виде ДНК, с использованием экспрессирующей плазмиды или вируса и кодирующей последовательности для малых шпилечных (U-образных) РНК, которые в результате процессинга превращаются в siРНК. Такая система способствует эффективному транспорту пре-siРНК в цитоплазму, где они являются активными, и позволяет использовать регулируемые и тканеспецифические промоторы для экспрессии генов.
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Указанный термин включает в себя олигонуклеотиды, состоящие из образующихся природным путем нуклеотидов, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (остов) связей, а также олигонуклеотиды, имеющие участки, которые образуются неприродным путем и которые функционируют сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто бывают востребованы в большей степени, чем нативные формы, поскольку они обладают желательными свойствами, такими, например, как усиленное поглощение клетками, повышенная аффинность в отношении нуклеиновой кислоты-мишени и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Nat. Rev. Genet
Curr. Opin. Genet. Dev.
Genes Dev.
Согласно настоящему изобретению, олигонуклеотиды или "антисмысловые соединения" включают в себя антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешней вспомогательной последовательности (EGS), соединения siРНК, соединения одно- или двухцепочечной интерферирующей РНК (РНКi), такие соединения как siРНК, saРНК, aРНК и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют ее функцию. Как таковые, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные, РНК-подобные соединения или их смеси, или же могут быть миметиками одного или нескольких из них. Указанные соединения могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми или олигомерными соединениями шпилечного типа и могут содержать такие структурные элементы как внутренние или концевые выпячивания, ошибочные спаривания или петли. Антисмысловые соединения обычно получают линейно, но они могут быть соединены или получены и иным способом, с получением кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать в себя конструкции, такие, например, как две цепи, гибридизованные таким образом, чтобы получилось полностью или частично двухцепочечное соединение или одноцепочечное соединение с достаточной само-комплементарностью для обеспечения гибридизации и образования полного или частичного двухцепочечного соединения. Двухцепочечные соединения могут быть соединены внутренними участками, оставляя свободными 3’- или 5’-концы, или же они могут быть соединены, образуя непрерывную структуру шпильки или петли. Структура шпильки может содержать нависающий край либо с 5’-, либо с 3’-конца, продуцируя удлинение одноцепочечного характера. Двухцепочечные соединения необязательно могут включать в себя нависающие края на обоих концах. Дополнительные модификации могут включать в себя конъюгатные группы, присоединенные к одному из концов, к избранным нуклеотидным положениям, положениям сахара или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, такие две цепи могут быть соединены через фрагмент ненуклеиновой кислоты или линкерную группу. При образовании только из одной цепи дцРНК могут принимать форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа, которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса. Таким образом, такие дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфической модуляции экспрессии гена можно достичь путем стабильной экспрессии дцРНК шпилек в трансгенных клеточных линиях (Hammond et al., (1991) , 2, 110-119; Matzke et al., (2001) , 11, 221-227; Sharp, (2001) , 15, 485-490). При образовании из двух цепей или одной цепи, которая принимает форму само-комплементарной молекулы шпилечного типа, которая дуплицируется сама с собой в обратном направлении с образованием дуплекса, две указанные цепи (или дуплекс-образующие области одной цепи) являются комплементарными цепями РНК, между которыми спаривание оснований происходит по схеме Уотсона-Крика.
Сразу же после введения в систему, соединения согласно изобретению могут выявить действие одного или более ферментов или структурных белков, вызывая расщепление или другую модификацию нуклеиновой кислоты-мишени, или же могут действовать на основе механизмов заселения (связывания). Обычно нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНК-подобные" (то есть в целом имеющие один или более 2’-дезокси-сахаров и обычно содержащие, вместо оснований U, основания T) или "РНК-подобные" (то есть в общем имеющие один или более 2’-гидроксила или 2’-модифицированных сахаров и обычно содержащие, вместо оснований T, основания U). Спирали нуклеиновых кислот могут принимать структуру более чем одного типа, чаще всего, A- и B-формы. Обычно считается, что олигонуклеотиды, которые имеют структуру наподобие B-формы, являются "ДНК-подобными", в то время как имеющие A-подобную структуру являются "РНК-подобными. В некоторых воплощениях (в случаях химер) антисмысловое соединение может содержать области как в A-, так и в B-форме.
Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловую часть длиной приблизительно от 5 примерно до 80 нуклеотидов (то есть приблизительно от 5 примерно до 80 связанных друг с другом нуклеозидов). Это соотносится с длиной антисмысловой цепи или части антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению содержит от 5 приблизительно до 80 нуклеотидов, а двухцепочечное антисмысловое соединение согласно изобретению (такое, например, как дцРНК) содержит смысловую и антисмысловую цепь или ее часть длиной от 5 приблизительно до 80 нуклеотидов. Специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин.
В одном из воплощений антисмысловые соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 10 до 50 нуклеотидов. Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин. В некоторых воплощениях указанные олигонуклеотиды составляют 15 нуклеотидов в длину.
В одном из воплощений антисмысловые или олигонуклеотидные соединения согласно изобретению имеют антисмысловые участки длиной от 12 или 13 до 30 нуклеотидов. Рядовому специалисту в данной области должно быть понятно, что под этим подразумеваются антисмысловые участки длиной в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов или в некотором диапазоне указанных длин.
В другом предпочтительном воплощении олигомерные соединения согласно изобретению включают в себя также варианты, в которых в одном или нескольких нуклеотидных положениях в таких соединениях встречаются разные основания. Например, если первым нуклеотидом является аденозин, могут быть получены варианты, которые в указанном положении содержат тимидин, гуанозин или цитидин. Указанное относится к любому из положений в антисмысловых соединениях или в соединениях дцРНК. Затем указанные соединения тестируют с помощью описанных здесь способов с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между антисмысловым соединением и мишенью составляет приблизительно от 40% примерно до 60%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 60% примерно до 70%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 70% примерно до 80%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляет приблизительно от 80% примерно до 90%. В определенных воплощениях степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности приблизительно составляет 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
В другом предпочтительном воплощении антисмысловые олигонуклеотиды, такие, например, как молекулы нуклеиновых кислот, представленные последовательностями SEQ ID NO: 2-5, содержат одну или более замен или модификаций. В одном из воплощений нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (LNA).
В другом предпочтительном воплощении олигонуклеотиды направлены на одну или несколько областей молекул нуклеиновой кислоты, их смысловые и/или антисмысловые последовательности кодирующих и/или некодирующих последовательностей, ассоциированных с EPO и с последовательностями, представленными как SEQ ID NO: 1, 2. Указанные олигонуклеотиды направлены также на перекрывающиеся области последовательностей SEQ ID NO: 1, 2.
Определенные предпочтительные олигонуклеотиды согласно изобретению являются химерными олигонуклеотидами. "Химерные олигонуклеотиды", или "химеры", в контексте настоящего изобретения, являются олигонуклеотидами, которые содержат две или более химически различных областей, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Указанные олигонуклеотиды обычно содержат по меньшей мере одну область модифицированных нуклеотидов, которые наделены одним или несколькими благоприятными свойствами (такими, например, как повышенная резистентность к действию нуклеаз, улучшенное поглощение клетками, повышенная аффинность связывания с мишенью), и область, которая является субстратом для ферментов, способных к расщеплению гибридов РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера, РНКаза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, таким образом сильно увеличивая эффективность антисмысловой модуляции экспрессии генов. И, следовательно, сравнимые результаты могут быть часто получены с более короткими олигонуклеотидами при использовании химерных олигонуклеотидов, по сравнению с фосфоротиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующимися с той же самой областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени может, как обычно, определяться методом гель-электрофореза, а в случае необходимости, с помощью известных в данной области ассоциированных технологий гибридизации нуклеиновых кислот. В одном из предпочтительных воплощений химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы увеличить аффинность связывания с мишенью, и, как правило, область, которая действует в качестве субстрата для РНКазы H. Аффинность олигонуклеотида в отношении его мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоты, кодирующей ras) обычно определяют путем измерения Tm олигонуклеотида/пары-мишени, которая является температурой, при которой происходит диссоциация олигонуклеотида с мишенью; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше Tm, тем больше аффинность олигонуклеотида в отношении мишени.
Химерные антисмысловые соединения согласно изобретению могут быть образованы в виде композитной структуры двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеотидов и/или миметиков олигонуклеотидов, как описано выше. В данной области такие соединения еще называются гибридами или гапмерами. Примеры патентов Соединенных Штатов, в которых описано получение таких гибридных структур, включают в себя, не ограничиваясь перечисленными, патенты США № 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356 и 5700922, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Acc. Chem. Res.
В другом предпочтительном воплощении область олигонуклеотида, которая модифицирована, включает в себя по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный в 2’-положении сахара, наиболее предпочтительно, 2’-O-алкила, 2’-O-алкил-O-алкила или 2’-фтор-модифицированный нуклеотид. В других предпочтительных воплощениях, модификации РНК включают в себя 2’-фтор-, 2’-амино- и 2’-O-метил-модификации на рибозе пиримидинов, остатки рибозы, лишенные азотистого основания, или инвертированное основание на 3’-конце РНК. Обычно такие модификации стандартными методами вносят в олигонуклеотиды, и показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокое значение Tm (то есть более высокую аффинность в отношении мишени), чем 2’-дезоксиолигонуклеотиды против данной мишени. Эффектом такой повышенной аффинности является еще более усиленное ингибирование РНКi-олигонуклеотидом экспрессии генов. РНКаза H является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет цепь РНК в РНК:ДНК-дуплексах; следовательно, активация РНКазы H приводит к расщеплению РНК-мишени, таким образом сильно увеличивая эффективность РНКi-ингибирования. Расщепление РНК-мишени может определяться, как обычно, методом гель-электрофореза. В другом предпочтительном воплощении химерный олигонуклеотид модифицируют также с целью повышения резистентности в отношении действия нуклеаз. Клетки содержат различные экзо- и эндонуклеазы, которые могут вызывать деградацию нуклеиновых кислот. Было показано, что целый ряд нуклеотидных и нуклеозидных модификаций придают олигонуклеотиду, в который они встроены, дополнительную резистентность к расщеплению под действием нуклеаз по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Резистентность к нуклеазам обычно измеряют путем инкубации олигонуклеотидов с клеточными экстрактами или изолированными растворами нуклеаз, а затем через некоторое время определяют количество оставшегося интактным олигонуклеотида, обычно используя метод гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, которые модифицируют для повышения их резистентности к действию нуклеаз, остаются интактными в течение более продолжительного времени, чем немодифицированные олигонуклеотиды. Как было показано, к усилению или приданию резистентности к действию нуклеаз приводят разные модификации олигонуклеотидов. В настоящее время более предпочтительными являются олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, которые повышают аффинность их связывания с мишенью, способны также независимо повышать их резистентность к действию нуклеаз. Некоторые полезные модификации можно найти у De Mesmaeker с соавт. (1995) , 28: 366-374.
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
2
3
3
3
3
2
n
3
2
n
2
2
n
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
Специфические примеры некоторых предпочтительных олигонуклеотидов, предусмотренных в настоящем изобретении, включают в себя олигонуклеотиды, содержащие модифицированный остов, например, фосфоротиоатные связи между сахарами, связи из сложного фосфатного триэфира, метилфосфонатов, из алкила или циклоалкила с короткой цепью, или гетероатомные или гетероциклические связи с короткой цепью между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатным остовом и таковые с гетероатомным остовом, в частности, CH-NH-O-CH, CH,-N(CH)-O-CH [известным как (метилимино) или MMI-остов], CH-O-N (CH)-CH, CH-N(CH)-N (CH)-CH и остов O-N(CH)-CH-CH, в которых природный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P-O-CH). Амидные остовы, описанные De Mesmaeker с соавт., (1995) Ace. Chem. Res. 28: 366-374, также являются предпочтительными. Предпочтительными являются также олигонуклеотиды, имеющие морфолино-структуры остова (Summerton and Weller, патент США No. 5,034,506). В других предпочтительных воплощениях, таких как остов пептид-нуклеиновая кислота (PNA), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, с нуклеотидами, прямо или косвенно соединенными с аза-атомами азота полиамидного остова (Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497). Олигонуклеотиды могут содержать также один или более замещенных сахарных фрагментов. Предпочтительные олигонуклеотиды включают в себя одно из следующего в 2’-положении: OH, SH, SCH, F, OCN, OCH OCH, OCH O(CH) CH, O(CH) NH или O(CH) CH, где n принимает значения от 1 приблизительно до 10; низший C1-C10-алкил, алкоксиалкокси, замещенный низший алкил, алкарил или аралкил; Cl; Br; CN; CF; OCF; O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; SOCH; SO CH; ONO; NO; N; NH; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенный силил; РНК-расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида; или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами.
2
2
3
3
2
2
3
Helv. Chim. Acta
Предпочтительная модификация включает в себя 2’-метоксиэтокси [2’-O-CH CH OCH, известную также как 2’-O-(2-метоксиэтил)] (Martin et al, (1995) , 78, 486). Другие предпочтительные модификации включают в себя 2’-метокси (2’-O-CH), 2’-пропокси (2’-OCH CHCH) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть произведены также и в других положениях олигонуклеотида, в частности, в 3’-положении сахара на 3’-концевом нуклеотиде и в 5’-положении 5’-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут содержать также сахарные миметики, такие как циклобутилы вместо пентофуранозильной группы.
Nucl. Acids Res
Олигонуклеотиды могут также включать в себя, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области просто "основанием"). Здесь "немодифицированные" или "природные" нуклеотиды включают в себя аденин (A), гуанин (G), тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают в себя нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах только в редких случаях или транзитно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-метилпиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2’-дезоксицитозином и часто обозначаемый в данной области как 5-Me-C), 5-гидроксиметилцитозин (hMeC), гликозил-hMeC и гентобиозил-hMeC, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-аминоаденин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6(6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp. 75-77; Gebeyehu, G., (1987) et al. . 15: 4513). Может быть включено "универсальное" основание, известное в данной области, например, инозин. Было показано, что замещения 5-Me-C повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными замещениями.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Bioorg. Med. Chem. Let
Bioorg. Med. Chem. Let
Nucl. Acids Res.
EMBO J.
FEBS Lett
Biochimie
Tetrahedron Lett
Nucl. Acids Res
Nucleosides & Nucleotides
Tetrahedron Lett
Другие модификации олигонуклеотидов согласно изобретению включают в себя химически связанные с олигонуклеотидом один или несколько фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность или клеточное поглощение олигонуклеотидов. Такие фрагменты включают в себя, но не ограничены липидными фрагментами, такими как фрагмент холестерина (Letsinger et al, (1989)  86, 6553), холевую кислоту (Manoharan et al. (1994) . 4, 1053), тиоэфира, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al. (1992) Ann. KY. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) . 3, 2765), тиохолестерин (Oberhauser et al, (1992)  20, 533), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Saison-Behmoaras et al.  1991, 10, 111; Kabanov et al. (1990) . 259, 327; Svinarchuk et al. (1993)  75, 49), фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний-1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфат (Manoharan et al. (1995) . 36, 3651; Shea et al. (1990) . 18, 3777), цепи полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al. (1995) , 14, 969) или адамантануксусной кислоты (Manoharan et al. (1995) . 36, 3651). Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области, например, см. патенты США № 5138045, 5218105 и 5459255.
Необязательно, чтобы все положения в данном олигонуклеотиде были модифицированы одинаковым образом, и на самом деле в отдельный олигонуклеотид или даже в отдельный нуклеозид внутри олигонуклеотида можно встроить более одной из указанных выше модификаций. Настоящее изобретение включает в себя также олигонуклеотиды, которые, как указано выше, являются химерными олигонуклеотидами.
В другом воплощении молекула нуклеиновой кислоты конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленным, лишенные азотистого основания остатки дезоксирибозы или рибозы, простой полиэфир, полиамин, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или соединения полиуглеводорода. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или несколькими нуклеотидами, содержащимися в указанной молекуле нуклеиновой кислоты в нескольких положениях на группе сахара, группе основания или фосфатной группе.
Олигонуклеотиды, используемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены с помощью стандартной и удобной технологии твердофазного синтеза, хорошо известной в данной области. Оборудование для такого синтеза продается несколькими торговыми организациями, включая Applied Biosystems. Могут быть использованы также любые другие способы такого синтеза; современный синтез олигонуклеотидов без каких-либо трудностей может быть осуществлен рядовым специалистом в данной области. Хорошо известно также применение сходных технологий для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные алкилированные производные. Хорошо известно также применение сходных технологий и коммерчески доступных продуктов модифицированных амидитов и стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотин, флуоресцеин, акридин или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные от компании Glen Research, Sterling VA), для синтезирования флуоресцентно меченных, биотинилированных или иным образом модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.
Current Opinions in Drug Discovery & Development
В соответствии с настоящим изобретением, использование модификаций, например, применение мономеров LNA, приводит к усилению, повышению специфичности и продолжительности действия и расширению возможностей введения олигонуклеотидов, содержащихся в используемых в настоящее время химических составах, таких как MOE, ANA, FANA, PS и т.д. (Uhlman, et al. (2000)  Vol. 3 No 2). Этого можно достичь путем замены некоторых из мономеров в современных олигонуклеотидах мономерами LNA. LNA-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, сходный с таковым родительского соединения, или может иметь больший или, предпочтительно, меньший размер. Предпочтительно, чтобы такие LNA-модифицированные олигонуклеотиды содержали менее чем приблизительно 70%, более предпочтительно, менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно, менее чем приблизительно 50% мономеров LNA, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно, приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов.
Предпочтительным образом модифицированные олигонуклеотидные остовы включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфатные триэфиры, сложные фосфатные аминоалкилтриэфиры, метильные и другие алкилфосфонаты, содержащие 3’-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, содержащие 3’-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные фосфатные тионоалкилтриэфиры и боранофосфаты, имеющие в норме 3’-5’-связи, их 2’-5’-связанные аналоги, а также имеющие обратную полярность, при этом соседние пары нуклеозидных элементов связаны в направлении от 3’-5’ к 5’-3’ или от 2’-5’ к 5’-2’. Включены также различные соли, смеси солей и свободные формы кислот.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше фосфор-содержащих связей, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
2
Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, которые не включают в себя атом фосфора, имеют остовы, которые образованы межнуклеозидными алкильными или циклоалкильными связями с короткой цепью, межнуклеозидными смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными связями, или одной или несколькими межнуклеозидными гетероатомными или гетероциклическими связями с короткой цепью. Они содержат таковые, имеющие связи морфолино (частично образованные из сахарного фрагмента нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетиловые и тиоформацетиловые остовы; метиленформацетиловые и тиоформацетиловые остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; остовы метиленимино и метиленгидразино; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, имеющие смешанные части из компонентов N, O, S и CH.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше олигонуклеозидов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264 562; 5 264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596 086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623 070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Science
В других предпочтительных олигонуклеотидных миметиках как сахарная, так и межнуклеозидная связь, то есть остов, нуклеотидных элементов заменены новыми группами. Элементы оснований поддерживаются для гибридизации с соответствующим соединением нуклеиновой кислоты-мишени. Одно из таких олигомерных соединений, миметик олигонуклеотида, который, как было показано, обладает исключительными гибридизационными свойствами, называется пептидом-нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA сахарный остов олигонуклеотида заменен амид-содержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеиновые основания сохранены и прямо или косвенно соединены с аза-атомами азота амидной части остова. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение соединений PNA, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки. Дополнительные сведения о соединениях PNA можно найти у Nielsen с соавт., (1991)  254, 1497-1500.
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
3
2
2
2
Ace. Chem. Res
В другом воплощении настоящего изобретения предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеотиды с гетероатомными остовами, и, в частности, CH-NH-O-CH-N(CH)-O-CH, известным как (метилимино), или MMI-остов, CH-O-N(CH)-CH, CHN(CH)-N(CH)CH и O-N(CH)-CH-CH, где природный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P-O-CH- в указанном выше патенте США № 5489677, и амидные остовы, описанные у De Mesmaeker с соавт., (1995) . 28: 366-374. Предпочтительными являются также олигонуклеотиды, имеющие структуры остова морфолино приведенного выше патента США № 5034506.
2
2
n
3
2
n
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
2
n
2
n
3
2
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
Helv. Chim. Acta
Модифицированные олигонуклеотиды могут содержать также один или несколько замещенных сахарных фрагментов. Предпочтительные олигонуклеотиды включают в себя одно из следующего в 2’-положении: OH, F, O-, S- или N-алкил; O-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или O-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещены или не замещены С-СО-алкилом или С-СО-алкенилом и алкинилом. Особенно предпочтительными являются O(CH)OmCH,O(CH), OmCH, O(CH)NH, O(CH)CH, O(CH)ONHиO(CH)ONCH)CH), где n и m принимают значения от 1 приблизительно до 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат одно из следующего в 2’-положении: С-СО, (низший алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил), SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств олигонуклеотида или группу для улучшения фармакодинамических свойств олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает в себя 2’-метоксиэтокси (2’-O-CHCHOCH, известную также как 2’-O-(2-метоксиэтил), или 2’-MOE) (Martin et al., (1995) , 78, 486-504), то есть алкокси-алкокси-группу. Дополнительная предпочтительная модификация содержит 2’-диметиламинооксиэтокси, то есть группу O(CH)ON(CH), известную также как 2’-DMAOE, как здесь описано ниже в примерах, и 2’-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области как 2’-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2’-DMAEOE), то есть 2'-O-CH-O-CH-N(CH).
3
2
2
2
2
Другие предпочтительные модификации включают в себя 2’-метокси (2’-O-CH), 2’-аминопропокси (2’-OCHCHCHNH) и 2’-фтор (2’-F). Сходные модификации могут быть произведены также и в других положениях олигонуклеотида, в частности, в 3’-положении сахара на 3’-концевом нуклеотиде или в 2’-5’-связанных олигонуклеотидах и в 5’-положении 5’-концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут содержать также миметики сахаров, такие как циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильной группы. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких модифицированных структур сахара, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Олигонуклеотиды могут также включать в себя модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области просто "основанием"). Здесь "немодифицированные" или "природные" нуклеотиды включают в себя пуриновые основания аденин (A) и гуанин (G), а также пиримидиновые основания тимин (T), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают в себя также и другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-Me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азо-урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Кроме того, нуклеотиды содержат также и материал, описанный в патенте Соединенных Штатов № 3687808, описанный в издании 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering' на страницах 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанный у Englisch с соавт., Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, страница 613, а также описанный у Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications', на страницах 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Определенные из указанных нуклеотидов являются особенно полезными для повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6-замещенные пурины, содержащие 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозина повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и в настоящее время являются предпочтительными замещениями, даже еще конкретнее, в сочетании с модификациями 2’-O-метоксиэтилсахара.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение указанных выше модифицированных нуклеотидов, также как и других модифицированных нуклеотидов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175 273; 5 367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Другая модификация олигонуклеотидов согласно изобретению включает в себя химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение такого олигонуклеотида.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Bioorg. Med. Chem. Let.
Ann. N. Y. Acad. Sci.
Bioorg. Med. Chem. Let
Nucl. Acids Res.
FEBS Lett.
Biochimie
Tetrahedron Lett.
Nucl. Acids Res.
Nucleosides & Nucleotides
Tetrahedron Lett.
Biochim. Biophys. Acta
J. Pharmacol. Exp. Ther.
Такие фрагменты включают в себя, но не ограничены перечисленным, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al, (1989) , 86, 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al, (1994) , 4, 1053-1060), тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al, (1992) , 660, 306-309; Manoharan et al., (1993) ., 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al, (1992) , 20, 533-538), алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила (Kabanov et al, (1990) , 259, 327-330; Svinarchuk et al, (1993)  75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфонат (Manoharan et al, (1995) , 36, 3651-3654; Shea et al., (1990) , 18, 3777-3783), цепь полиамина или цепь полиэтиленгликоля (Mancharan et al, (1995) , 14, 969-973), или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al, (1995) , 36, 3651-3654), фрагмент пальмитила (Mishra et al, (1995) , 1264, 229-237), или октадециламин или фрагмент гексиламинокарбонил-т-оксихолестерина (Crooke et al, (1996) , 277, 923-937).
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486 603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Поиск новых лекарственных средств: Соединения согласно настоящему изобретению могут найти применение в областях, связанных с поиском и целевой направленностью новых лекарственных средств. Настоящее изобретение включает в себя применение соединений и предпочтительных сегментов-мишеней, идентифицированных здесь при попытках поиска новых лекарственных средств для выяснения взаимоотношений, которые существуют между полинуклеотидами эритропоэтина (EPO) и состоянием, фенотипом или условиями болезни. Такие способы включают в себя детектирование или модуляцию полинуклеотидов эритропоэтина (EPO), включая приведение образца, ткани, клетки или организма в контакт с соединениями согласно изобретению, количественное определение нуклеиновой кислоты или белкового уровня эритропоэтина (EPO), и/или связанный с этим фенотипический или химический конечный результат в определенной временнóй точке после введения, и, необязательно, сравнение полученного значения с таковым в необработанном образце или в образце, обработанном дополнительным соединением согласно изобретению. Такие способы могут быть предприняты также параллельно или в сочетании с другими экспериментами для определения функции неизвестных генов в подтверждение их целевой направленности или для определения валидности продукта конкретного гена в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа.
Оценка стимуляции или ингибирования экспрессии гена
:
Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку или организм хозяина может быть установлен путем прямого детектирования присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанной клетке или организме. Такое детектирование может быть достигнуто несколькими способами, хорошо известными в данной области. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть установлено путем саузерн-блоттинга или с помощью технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, которые способствуют специфической амплификации нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия экзогенных нуклеиновых кислот может быть количественно оценена также и с помощью обычных методов, включая анализ экспрессии гена. Например, мРНК, продуцируемая на основе экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть определена и количественно оценена с помощью нозерн-блоттинга или ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Экспрессия РНК с экзогенной нуклеиновой кислоты может быть детектирована также путем количественного определения ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, модулирующую активность антисмыслового соединения можно измерить непрямым путем по снижению или повышению экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в качестве показателя того, что экзогенная нуклеиновая кислота является продуцентом эффекторной РНК. На основе консервативности последовательности могут быть созданы праймеры, которые можно использовать для амплификации кодирующих областей генов-мишеней. Прежде всего, для построения модели контроля гена можно использовать наиболее сильно экспрессируемую кодирующую область из каждого гена, хотя можно использовать и любую кодирующую или некодирующую область. Каждый контролируемый ген комплектуют путем встраивания каждой кодирующей области между репортерной кодирующей областью и ее поли(A)-сигналом. Такие плазмиды будут продуцировать мРНК с репортерным геном в вышерасположенной части указанного гена и потенциальную РНКi-мишень в 3’-некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть оценена по модуляции репортерного гена. Репортерные гены, используемые в способах согласно настоящему изобретению, включают в себя синтазу ацетогидроксикислот (AHAS), щелочную фосфатазу (ЩФ), бета-галактозидазу (LacZ), бета-глюкуронидазу (GUS), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), зеленый флуоресцирующий белок (GFP), красный флуоресцирующий белок (RFP), желтый флуоресцирующий белок (YFP), голубой флуоресцирующий белок (CFP), пероксидазу хрена (HRP), люциферазу (Luc), нопалинсинтазу (NOS), октопинсинтазу (OCS) и их производные. Доступно множество селективных маркеров, которые придают резистентность к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гигромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модуляции репортерного гена хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничены перечисленным, флуориметрические методы (например, метод флуоресцентной спектроскопии, метод сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS), метод флуоресцентной микроскопии), методы определения резистентности к антибиотикам.
Наборы, реагенты для научных исследований, диагностика и терапия
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы для диагностики, терапии и профилактики, а также в качестве реагентов для научных исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, которые способны ингибировать экспрессию генов с исключительной специфичностью, часто используются специалистами в данной области для выявления функции конкретных генов или для выявления различий между функциями разных членов биологического пути обмена.
Для применения в наборах и в диагностике и в различных биологических системах, соединения согласно настоящему изобретению, либо отдельно, либо в сочетании с другими соединениями или терапиями, используются в качестве инструментария в дифференциальных и/или комбинаторных анализах для выявления характера экспрессии части или полного набора генов, экспрессируемых внутри клеток и тканей.
Здесь термин "биологическая система", или "система", определяется как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, которая экспрессирует или становится компетентной в отношении экспрессии продуктов эритропоэтиновых (EPO) генов. Таковые включают в себя, но не ограничены указанным, человека, трансгенных животных, клетки, клеточные культуры, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их сочетания.
В качестве одного неограничивающего примера, характер экспрессии внутри клеток и тканей, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и полученную картину анализируют на разных уровнях экспрессии генов, которые связаны, например, с ассоциацией с заболеванием, с сигнальным путем, клеточной локализацией, уровнем экспрессии, с размером, структурой или функцией исследуемых генов. Такие анализы могут быть предприняты на стимулированных или нестимулированных клетках и в присутствии или в отсутствие других соединений, которые действуют на характер экспрессии.
FEBS Lett.
FEBS Lett.
Drug Discov. Today
Methods Enzymol.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
FEBS Lett
FEBS Lett.
J. Biotechnol
Anal. Biochem.
Cytometry
Curr. Opin. Microbiol
J. Cell Biochem. Suppl.,
in situ
Eur. J. Cancer
Chem. High Throughput Screen
Примеры известных в данной области способов анализа экспрессии генов включают в себя массив ДНК-матриц или микрочипов (Brazma and Vilo, (2000) , 480, 17-24; Celis, et al., (2000) , 480, 2-16), SAGE (серийный анализ экспрессии генов) (Madden, et al., (2000) , 5, 415-425), READS (амплификация ферментов рестрикции расщепленных кДНК) (Prashar and Weissman, (1999) , 303, 258-72), TOGA (анализ полной экспрессии гена) (Sutcliffe, et al, (2000) , 97, 1976-81), белковые чипы и протеомику (Celis, et al., (2000) ., 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), секвенирование экспрессируемой последовательности tag (EST) (Celis, et al., , 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., ., 2000, 80, 143-57), субстрактивный фингерпринтинг РНК (SuRF) (Fuchs, et al., (2000)  286, 91-98; Larson, et al., (2000)  41, 203-208), субстрактивное клонирование, дифференциальный дисплей (DD) (Jurecic and Belmont, (2000) . 3, 316-21), сравнительную геномную гибридизацию (Carulli, et al., (1998)  31, 286-96), технологии FISH (флуоресцентная  гибридизация) (Going and Gusterson, (1999) , 35, 1895-904) и методы масс-спектрометрии (To, Comb. (2000) , 3, 235-41).
Соединения согласно изобретению полезны для научных исследований и диагностики, поскольку эти соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими эритропоэтин (EPO). Например, олигонуклеотиды, которые гибридизуются с такой же эффективностью и в тех же условиях, что и соединения, описанные здесь в качестве эффективных модуляторов эритропоэтина (EPO), являются эффективными праймерами или зондами в условиях, способствующих, соответственно, амплификации или детектированию. Такие праймеры и зонды используются в способах, требующих специфического детектирования молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих эритропоэтин (EPO), и при амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для детектирования или для применения в дальнейших исследованиях эритропоэтина (EPO). Гибридизацию антисмысловых олигонуклеотидов согласно изобретению, в частности, праймеров и зондов, с нуклеиновой кислотой, кодирующей эритропоэтин (EPO), можно обнаружить способами, известными в данной области. Такие способы могут включать в себя конъюгацию фермента с олигонуклеотидом, радиоактивное мечение олигонуклеотида или любые иные подходящие для детектирования средства. Могут быть получены также наборы, в которых используются такие средства для детектирования уровня эритропоэтина (EPO) в образце.
Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений используются специалистами в данной области также и в терапевтических целях. Антисмысловые соединения используются в качестве терапевтических составляющих при лечении болезненных состояний у животных, включая человека. Антисмысловые олигонуклеотидные лекарственные средства безопасно и эффективно вводили человеку, и в настоящее время производится целый ряд клинических испытаний. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут служить полезными способами воздействия, которые можно отработать для применения в схемах лечения клеток, тканей и животных, в частности, человека.
В терапевтических целях животное, предпочтительно, человека, у которого предполагается наличие заболевания или расстройства, которые можно лечить путем модуляции экспрессии полинуклеотидов эритропоэтина (EPO), лечат путем введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, в одном неограничивающем воплощении указанные способы включают в себя стадию введения животному, в случае необходимости лечения, терапевтически эффективное количество модулятора эритропоэтина (EPO). Модуляторы эритропоэтина (EPO) согласно настоящему изобретению эффективно регулируют активность (EPO) или изменяют экспрессию эритропоэтинового (EPO) белка. В одном из воплощений активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибируется приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, чтобы активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибировалась приблизительно на 30%. Более предпочтительно, чтобы активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного ингибировалась приблизительно на 50% или более. Таким образом, олигомерные соединения модулируют экспрессию мРНК эритропоэтина (EPO) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% по сравнению с контролем.
В одном из воплощений активность и/или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, если активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена приблизительно на 30%. Более предпочтительно, если активность или экспрессия эритропоэтина (EPO) у животного повышена на 50% или более. Таким образом, олигомерные соединения модулируют экспрессию мРНК эритропоэтина (EPO) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% по сравнению с контролем.
Например, снижение экспрессии эритропоэтина (EPO) может быть измерено в сыворотке, в крови, в жировой ткани, в печени или в любой другой жидкости, ткани или органе животного с использованием методов, описанных в литературе и известных специалистам в данной области. Предпочтительно, чтобы подвергаемые анализу клетки, содержащиеся внутри указанных жидкостей, тканей или органов, содержали молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды эритропоэтина (EPO) и/или как таковой эритропоэтиновый (EPO) белок.
Соединения согласно изобретению могут быть использованы в фармацевтических композициях путем добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов согласно изобретению может быть использовано также и в профилактических целях.
Конъюгаты
Другая модификация олигонуклеотидов согласно изобретению включает в себя химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать в себя конъюгатные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгатные группы согласно изобретению включают в себя интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, которые усиливают фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, которые усиливают фармакокинетические свойства олигомеров. Типичные конъюгатные группы включают в себя холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеин, родамины, кумарины и красители. Группы, которые усиливают фармакодинамические свойства олигомеров, в контексте данного изобретения, включают в себя группы, которые улучшают поглощение, повышают резистентность к деградации и/или усиливают специфичную в отношении последовательности гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Группы, которые усиливают фармакокинетические свойства, в контексте данного изобретения, включают в себя группы, которые улучшают поглощение, распределение, метаболизм или выведение из организма соединений согласно изобретению. Репрезентативные конъюгатные группы описаны в международной патентной заявке № PCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992 г., и в патенте США № 6287860, "Antisense inhibition of MEKK2 expression", при этом оба указанных документа включены в настоящее описание в виде ссылок. Конъюгатные фрагменты включают в себя, но не ограничены перечисленным, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, трихолестерин, алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила, фосфолипид, например, ди-гексадецил-rac-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-O-гексадецил-rac-глицеро-3-H-фосфат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантануксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть конъюгированы также с активными лекарственными средствами, например, с аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлоротиазидом, диазепином, индометацином, барбитуратом, цефалоспорином, лекарственным сульфамидным препаратом, противодиабетическим препаратом, антибактериальным средством или антибиотиком.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают в себя, но не ограничены ими, патенты США № 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723; 5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.
Композиции
Соединения согласно изобретению могут быть также смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным способом ассоциированы с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, как, например, липосомы, направленные на рецептор молекулы, пероральные, ректальные, местные или другие композиции, способствующие поглощению, распределению и/или абсорбции. Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции композиций, включают в себя, но не ограничены перечисленными, патенты США № 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543165; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящее описание в виде ссылки.
Хотя для модуляции целевой экспрессии и/или функции нет необходимости вводить указанные здесь антисмысловые олигонуклеотиды в формате вектора, воплощения настоящего изобретения связаны с экспрессией векторных конструкций для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих промоторы, гибридные промоторные геномные последовательности и обладающих высокой активностью конститутивного промотора или промоторной активностью, которая может быть индуцирована в случае необходимости.
В одном из воплощений осуществление изобретения включает в себя введение по меньшей мере одного из указанных выше антисмысловых олигонуклеотидов с помощью соответствующей системы доставки нуклеиновых кислот. В одном из воплощений такая система включает в себя невирусный вектор, оперативно связанный с полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают в себя олигонуклеотид как таковой (например, любую одну или более из последовательностей SEQ ID NO: 3-5) или в сочетании с соответствующей белковой, полисахаридной или липидной композицией.
Дополнительные подходящие системы доставки нуклеиновых кислот включают в себя вирусный вектор, типичную последовательность по меньшей мере одного из аденовирусов, аденовирус-ассоциированных вирусов (AAV), хелпер-зависимых аденовирусов, ретровирусов или японских гемагглютинирующих вирусов (HVJ) липосомного комплекса. Предпочтительно, чтобы вирусный вектор содержал сильный эукариотический промотор, оперативно связанный с полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (CMV).
J. Neurochem
Proc Natl. Acad. Sci.
Proc Natl. Acad. Sci USA
Science
Nat. Genet
J. Virol
Nat. Genet
Дополнительно предпочтительные векторы включают в себя вирусные векторы, слитые белки и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают в себя вирус мышиного лейкоза Молони и вирусы на основе ВИЧ. Один из предпочтительных вирусов на основе ВИЧ включает в себя по меньшей мере два вектора, в которых гены gag и pol происходят из генома ВИЧ, а ген env происходит из другого вируса. Векторы ДНК-вирусов являются предпочтительными. Такие векторы включают в себя векторы pox, такие как векторы orthopox или avipox, герпес-вирусные векторы, такие как вектор вируса простого герпеса I (HSV) [Geller, A.I. et al., (1995) , 64: 487; Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., (1993) : U.S.A.: 90 7603; Geller, A.I., et al., (1990) : 87: 1149], аденовирусные векторы (LeGal LaSalle et al., , 259: 988 (1993); Davidson, et al., (1993) . 3: 219; Yang, et al., (1995) . 69: 2004) и адено-ассоциированные вирусные векторы (Kaplitt, M.G., et al., (1994) . 8: 148).
Антисмысловые соединения согласно изобретению охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое, при его введении животному, включая человека, способно его обеспечить (прямо или косвенно) их биологически активным метаболитом или остатком.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений согласно изобретению: то есть солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родительского соединения и не придают ему нежелательных токсикологических эффектов. Для олигонуклеотидов предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей и их применений дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Настоящее изобретение включает в себя также фармацевтические композиции и составы, которые содержат антисмысловые соединения согласно изобретению. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены разными путями, в зависимости от того, требуется ли локальное или системное лечение, и от той области, которая должна быть подвергнута лечению. Введение может быть местным (включая офтальмическое, а также слизистые мембраны, включая вагинальную и ректальную доставку), пульмональным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение с помощью небулайзера; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение. Олигонуклеотиды по меньшей мере с одной 2’-O-метоксиэтил-модификацией считаются особенно эффективными для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного введения могут включать в себя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимы или желательны подходящие фармацевтически приемлемые носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и пр. Могут быть использованы также снабженные покрытием презервативы, перчатки и пр.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, которые могут быть представлены в удобной дозированной лекарственной форме, можно получить в соответствии с общепринятой технологией, хорошо известной в фармацевтической индустрии. Такие технологии включают в себя стадию приведения в соприкосновение активных ингредиентов с фармацевтически приемлемым носителем (носителями) или наполнителем (наполнителями). Обычно указанные композиции получают путем равномерного приведения в тесный контакт активных ингредиентов с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями, или же и с тем, и с другим, а затем, если это необходимо, придания полученному продукту формы.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены в любую из возможных дозированных лекарственных форм, включая, но ими не ограничиваясь, таблетки, капсулы, мягкие капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и спринцовки. Композиции согласно настоящему изобретению могут быть составлены также в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, включая, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может содержать также стабилизаторы.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы согласно настоящему изобретению могут содержать одно или более веществ, способствующих проникновению, носителей, наполнителей или других активных или неактивных ингредиентов.
Эмульсии обычно представляют собой гетерогенные системы одной жидкости, диспергированной в другой в виде капель, обычно превышающих 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии, помимо диспергированных фаз, могут содержать дополнительные компоненты и активное начало, которое может быть представлено в виде раствора в водной фазе, в масляной фазе либо самостоятельно в отдельной фазе. Микроэмульсии составляют отдельное воплощение настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны специалистам в данной области и дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
Составы согласно настоящему изобретению включают в себя липосомные композиции. В настоящем изобретении термин "липосома" означает частицу, составленную из амфифильных липидов, окруженных сферическим бислоем или бислоями. Липосомы представляют собой униламеллярные или мультиламеллярные везикулы, имеющие мембрану, образованную липофильным материалом, и водное содержимое, которое включает в себя композицию, предназначенную для доставки. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые, как считается, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК, с образованием стабильного комплекса. Считается, что чувствительные к pH или отрицательно заряженные липосомы захватывают ДНК, не образуя с ней комплекс. Как катионные, так и некатионные липосомы используются для доставки ДНК к клеткам.
Липосомы включают в себя также "стерически стабилизированные" липосомы, термин, который используется здесь в отношении липосом, содержащих один или более специализированных липидов. При включении их в состав липосом такие специализированные липиды способствуют повышению времени жизни липосом в циркуляции по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются такие липосомы, в которых часть образующего везикулы липидного компонента липосом содержит один или более гликолипидов или дериватизирована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как фрагмент полиэтиленгликоля (PEG). Липосомы и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
Терапевтические составы и композиции согласно изобретению могут также включать в себя поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в производстве лекарственных средств, композиций и в эмульсиях хорошо известно в данной области. Поверхностно-активные вещества и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
В одном из воплощений в настоящем изобретении используются различные вещества, способствующие проникновению, для повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Помимо усиления диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, вещества, способствующие проникновению, усиливают также проникающую способность липофильных лекарственных средств. Вещества, способствующие проникновению, могут быть классифицированы и отнесены к одной из пяти обширных категорий, то есть к поверхностно-активным веществам, жирным кислотам, солям желчных кислот, хелатообразующим агентам и к веществам, не являющимся ни хелатообразующими, ни поверхностно-активными. Вещества, способствующие проникновению, и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что обычно композиции составляют в соответствии с их предполагаемым применением, то есть со способом введения.
Предпочтительные композиции для местного введения включают в себя композиции, в которых олигонуклеотиды согласно изобретению смешивают со средствами для местной доставки, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительными липидами и липосомами являются нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристиоилфосфатидилхолин DMPC, дистеаролифосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристиоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA).
Для местного или других путей введения олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать с ними комплексы, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, олигонуклеотиды могут образовывать комплекс с липидами, в частности, с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и эфиры жирных кислот, их фармацевтически приемлемые соли, а также их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860.
In vivo
Композиции и составы для перорального введения включают в себя порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водной или неводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Могут быть желательны также загустители, вкусовые добавки, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие агенты или связующие вещества. Предпочтительными пероральными композициями являются такие композиции, в которые олигонуклеотиды согласно изобретению вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, и хелатообразующими веществами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают в себя жирные кислоты и/или их эфиры и соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки. Предпочтительными являются также комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли в сочетании с желчными кислотами/солями. Особенно предпочтительной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA. Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают в себя полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут быть доставлены перорально, в виде гранул, включая распыляемые высушенные частицы, или в виде комплексов, с образованием микро- или наночастиц. Вещества, способствующие образованию олигонуклеотидных комплексов, и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860, который включен в настоящее описание в виде ссылки.  введение интерферирующих РНК описано, например, в патенте США № 7528118, "RNAi modulation of ApoB and uses thereof", включенном в настоящее описание в виде ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут содержать также буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие, например, но ими не ограничиваясь, как вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Определенные воплощения настоящего изобретения связаны с фармацевтическими композициями, содержащими одно или несколько олигомерных соединений и одно или несколько других химиотерапевтических агентов, функционирование которых основано не на антисмысловом механизме. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают в себя, но не ограничены противоопухолевыми химиотерапевтическими агентами, такими как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозин-арабинозид, бисхлорэтил-нитрозомочевина, бусульфан, митомицин C, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексил-нитрозомочевина, азотистый иприт, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевину, дезоксикоформицин, 4-гидроксиперокси-циклофосфамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (MTX), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстилбестрол (DES). При использовании с соединениями согласно изобретению такие химиотерапевтические агенты можно использовать индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение определенного периода, после которого вводят MTX и олигонуклеотид), или в сочетании с одним или несколькими другими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, MTX и олигонуклеотидом, или 5-FU, рентгенотерапией и олигонуклеотидом). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и антивирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь ими, рибивирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, также можно объединять в композиции согласно изобретению. Комбинации антисмысловых соединений и других неантисмысловых лекарственных средств также входят в объем, охватываемый настоящим изобретением. Сочетания из двух или нескольких соединений могут быть использованы вместе или последовательно.
В другом относящемся к этому воплощении, композиции согласно изобретению могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту-мишень. Например, первой мишенью может быть антисмысловая последовательность эритропоэтина (EPO), а второй мишенью может быть область из другой нуклеотидной последовательности. Альтернативно, композиции согласно изобретению могут содержать два или более антисмысловых соединений, нацеленных на разные области одной и той же эритропоэтиновой (EPO) нуклеиновой кислоты-мишени. Здесь проиллюстрирован целый ряд примеров антисмысловых соединений, а другие могут быть выбраны среди подходящих из известных в данной области соединений. Сочетания из двух или нескольких соединений могут быть использованы вместе или последовательно.
Дозирование
50
in vitro
in vivo
Clin. Cancer Research
Считается, что состав фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) входят в компетенцию специалистов в данной области. Дозирование зависит от тяжести и реактивности болезненного состояния, подвергаемого лечению, при этом курс лечения длится от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не наступит выздоровление, или же до тех пор, когда будет достигнуто облегчение состояния болезни. Оптимальные схемы дозирования можно вывести из расчетов, связанных с накоплением лекарственного средства в организме пациента. Рядовой специалист может с легкостью определить оптимальные дозы, способы введения дозировок и частоту введения. Оптимальные дозировки могут варьировать, в зависимости от относительной эффективности индивидуальных олигонуклеотидов, и в целом могут быть оценены на основе показателей EC, которые были признаны эффективными как , так и на животных моделях . Обычно дозировка составляет от 0,01 мкг до 100 г/кг веса тела, и ее можно вводить один или более раз в день, в неделю, в месяц или в год, или даже один раз каждые 2-20 лет. Рядовые специалисты в данной области могут с легкостью оценить частоту введения дозировок на основе измеряемых времени удерживания и концентраций лекарственного средства в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть уместно подвергнуть пациента поддерживающей терапии для предупреждения рецидива болезненного состояния, при этом олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, которые варьируют от 0,01 мкг до 100 г/кг веса тела, от одного или более раз в день до одного раза в каждые 20 лет. Введение антисмыслового олигонуклеотида рибонуклеотидредуктазы пациентам с острым миелолейкозом при изучении действия возрастающих доз было описано в публикации Klisovic с соавт., 2008, "Phase I study of GTI-2040, an antisense to ribonucleotide reductase, in combination with high-dose cytarabine in patients with acute myeloid leukemia," : 14(12): 3889-95, включенной в настоящее описание в виде ссылки.
Хоть здесь и описаны различные воплощения настоящего изобретения, следует, однако, понимать, что они приведены лишь в качестве примера и ни в коей мере не являются ограничительными. В соответствии с описанием настоящей заявки, можно осуществить целый ряд изменений в отношении описанных здесь воплощений, не выходя за рамки объема или концепции настоящего изобретения. Таким образом, ширина охвата и объем настоящего изобретения не должны быть ограничены ни одним из описанных выше воплощений.
Все указанные здесь документы включены в настоящее описание в виде ссылки. Все цитируемые в настоящей заявке публикации и патентные документы включены в одинаковой степени в виде ссылок, для всех возможных применений, как если бы каждая индивидуальная публикация или патентный документ были указаны отдельно. Цитируя в настоящем документе различные публикации, Заявитель не имеет в виду, что та или иная конкретная ссылка относится к "предшествующему уровню техники" по отношению к настоящему изобретению. Воплощение композиций и способов согласно изобретению проиллюстрировано в приводимых ниже примерах.
ПРИМЕРЫ
Следующие неограничивающие примеры служат для иллюстрации отдельных воплощений настоящего изобретения. Следует понимать, что варианты в соотношениях и альтернативы в элементах приведенных компонентов будут считаться очевидными для специалистов в данной области и входящими в объем воплощений, охватываемых настоящим изобретением.
Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфичных в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, являющейся антисмысловой и/или смысловой цепью полинуклеотида эритропоэтина (EPO)
Указанный выше термин "олигонуклеотид, специфичный в отношении" или "нацеленный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность (i) способную образовывать стабильный комплекс с частью гена-мишени, или (ii) способную образовывать стабильный комплекс с частью мРНК-транскрипта гена-мишени.
Выбор соответствующих олигонуклеотидов облегчается использованием компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и выявляют идентичные или гомологичные области. Такие программы используются для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, путем изучения баз данных, таких как GenBank, или путем секвенирования продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот из разных видов позволяет выбрать последовательности нуклеиновых кислот, имеющие подходящую степень межвидовой идентичности. В случае генов, которые не секвенированы, предпринимают саузерн-блоттинг, позволяющий определить степень идентичности между генами у вида, являющегося мишенью, и у других видов. Как известно в данной области, предпринимая саузерн-блоттинг разных степеней жесткости, можно получить приближенную оценку степени идентичности. Такие процедуры позволяют выбрать олигонуклеотиды, которые обладают высокой степенью комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот-мишеней у субъекта, который нуждается в терапевтическом вмешательстве, и более низкой степенью комплементарности в отношении последовательностей нуклеиновых кислот у других видов. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что существует определенный разброс при выборе соответствующих областей генов для применения в настоящем изобретении.
in vivo
in vitro
Антисмысловое соединение является "специфически гибридизующимся", если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью мешает осуществлению нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая модуляцию функции и/или активности, и имеется степень комплементарности, достаточная для того, чтобы избежать неспецифического связывания антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновых кислот в условиях, при которых желательно осуществление специфического связывания, то есть при физиологических условиях в случаях осуществления анализов  или терапевтического воздействия, и в тех условиях, когда предпринимаются анализы .
in vitro
Как известно в данной области, гибридизационные свойства описанных здесь олигонуклеотидов могут определяться посредством одного или более анализов . Например, указанные свойства описанных здесь олигонуклеотидов могут быть получены путем определения прочности связывания между природной антисмысловой последовательностью-мишенью и потенциальными лекарственными молекулами путем изучения кривых плавления.
Сила связывания между природной антисмысловой последовательностью-мишенью и потенциальной лекарственной молекулой (Молекула) может быть установлена с помощью любого из способов, используемых для оценки силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.
Путем анализа кривых плавления определяют температуру, при которой происходит быстрый переход из двухцепочечной в одноцепочечную конформацию в случае комплекса между природной антисмысловой последовательностью и Молекулой. Такая температура является широко распространенным критерием надежной оценки силы взаимодействия между двумя такими молекулами.
Анализ кривых плавления может быть предпринят с использованием кДНК-копии природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического ДНК- или РНК-нуклеотида, соответствующего участку связывания Молекулы. Доступно множество наборов (например, Applied Biosystems Inc. MeltDoctor kit), содержащих все необходимые реагенты для реализации указанного анализа. Такие наборы включают в себя подходящий буферный раствор, содержащий один из красителей, связывающихся с двухцепочечной ДНК (дцДНК) (такой как красители ABI HRM, SYBR Green, SYTO и т.д.). Свойства красителей дцДНК таковы, что они в свободной форме почти не флуоресцируют, но при связывании с дцДНК продуцируют высокий уровень флуоресценции.
Для выполнения указанного анализа, кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрации, определяемой в соответствии с инструкциями конкретного производителя. Полученную смесь нагревают до 95°C, чтобы произошла диссоциация всех образовавшихся ранее комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой, более низкой, температуры, определяемой производителем такого набора, позволяя молекулам ДНК ренатурировать. Затем вновь образованные комплексы медленно нагревают до 95°C, одновременно регистрируя в непрерывном режиме данные по уровню флуоресценции, продуцируемой в результате такой реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующей в реакционной смеси дцДНК. Указанные данные можно получать, используя инструментарий ПЦР в реальном масштабе времени, совместимый с таким набором (например, ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System или LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK).
Пики плавления выстраивают путем нанесения отрицательной производной значения флуоресценции от температуры (-d(флуоресценции)/dT) по оси Y) против температуры (ось Х), используя для этого соответствующую компьютерную программу (например, LightTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Полученные данные анализируют на предмет определения температуры быстрого перехода из состояния комплексной дцДНК в одноцепочечные молекулы. Эту температуру обозначают Tm, и она обратно пропорциональна силе взаимодействия между двумя указанными молекулами. Обычно Tm превышает 40°C.
Пример 2: Модуляция полинуклеотидов EPO
2
2
2
5
Клетки HepG2 из ATCC (cat# HB-8065) выращивали в ростовой среде (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, или Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-OH-CV)+ пенициллин/стрептомицин (Mediatech cat# MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO. За день до эксперимента клетки пересевали при плотности 1,5×10/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°C и 5% CO. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах заменяли свежей ростовой средой. Все антисмысловые олигонуклеотиды разбавляли до концентрации 20 мкМ. Два мкл указанного раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM media (Gibco cat#31985-070) и 4 мкл липофектамина-2000 (Invitrogen cat# 11668019) при комнатной температуре в течение 20 мин и добавляли к каждой лунке 6-луночных планшетов, содержащей клетки HepG2. Сходную смесь, которая содержала 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, использовали для mock-трансфицированных контролей. Через 3-18 ч инкубации при 37°C и 5% COсреду заменяли свежей ростовой средой. Через 48 час после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли, и из клеток выделяли РНК, используя систему SV Total РНК Isolation System компании Promega (cat#Z3105) или же набор RNeasy Total РНК Isolation kit компании Qiagen (cat#74181), в соответствии с инструкциями производителя. 600 нг РНК добавляли к реакции обратной транскрипции, проводимой с использованием набора Verso кДНК от компании Thermo Scientific (cat#AB1453B) или же набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat#4368813), как описано в протоколе производителя. кДНК из указанной реакции обратной транскрипции использовали для мониторинга экспрессии гена в методе ПЦР в реальном масштабе времени с использованием смеси ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) для анализа экспрессии гена и праймеры/зонды от компании ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00171267_ml by Applied Biosystems Inc., Foster City CA). В следующем цикле ПЦР использовали условия: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) с использованием инструментария ПЦР в реальном масштабе времени, StepOne Plus (Applied Biosystems).
Кратность изменений генной экспрессии после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основе различий в 18S-нормализованных значениях dCt между обработанными и mock-трансфицированными образцами.
Праймеры и зонды для специально разработанного Taqman-анализа для EPOAS, антисмысловые в отношении природного EPO, (SEQ ID NO: 2): Последовательность прямого праймера Seq. ACCACCCCGGTGTCAAG (SEQ ID NO: 9)
Последовательность обратного праймера Seq. TTTACCTGTTTTCGCACCTACCAT (SEQ ID NO: 10)
Репортерная последовательность Seq. CAAGCTGTGACTTCTC (SEQ ID NO: 11) Краситель репортера 1: FAM
Результаты
Результаты ПЦР в реальном масштабе времени показали, что уровни мРНК EPO в клетках HepG2 значительно повышаются через 48 час после обработки двумя siРНК, созданными для epoas (epoas_1, P=0,02, и epoas_2, P=0,04, Фиг. 1A). В тех же самых образцах уровни РНК epoas были, возможно, снижены после обработки указанными siРНК для epoas (Фиг. 1B).
Пример 3: Модуляция белкового продукта EPO in vitro
Клетки HepG2, обработанные антисмысловыми олигонуклеотидами EPO, как описано в примере 2, изучали на предмет экспрессии белка EPO. Концентрацию и уровни секреции человеческого белка EPO, присутствующего в клеточных супернатантах, изучали с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (например, коммерчески доступного человеческого эритропоэтина производства компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN), в соответствии с инструкциями производителя, и сравнивали с уровнями в нетрансфицированных контрольных областях.
Пример 4: Модуляция полинуклеотида и белкового продукта EPO у мышей ICGN
J. Vet. Med. Sci
Антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные в отношении EPO-AS, вводили мышам ICGN (мыши с гломерулонефритом, полученные из линии мышей ICR), являющимся генетической моделью анемии у мышей, и осуществляли мониторинг улучшения состояния анемии. См., например, публикацию Nagasaki, et al., 2009, "Amelioration of Anemia in the ICGN Mouse, a Renal Anemia Model, with a Subcutaneous Bolus Injection of Erythropoietin Adsorbed to Hydroxyapatite Matrix," . 71(10): 1365-1371, включенную в настоящее описание в виде ссылки. Олигонуклеотиды вводят в хвостовую вену путем инъекции иглой 27G. Болюсную дозу антисмысловых олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 3, 4 и 5) растворяли в PBS до концентрации, предусматривающей доставку предполагаемой дозы в 8 мкл/г веса тела. Мышей держали под инфракрасной лампой приблизительно в течение 3 мин перед введением дозы для облегчения проведения инъекции. Контрольным мышам вводили такой же объем чистого PBS.
Предварительно, в течение нескольких дней до начала введения указанных дозировок, из хвостовой вены собирали по 4-7 капель образцов крови.
2
Образцы крови брали из нижней полой вены под CO-анестезией или эфирным наркозом и использовали для генетических анализов. Уровни мРНК EPO измеряли методом ОТ-ПЦР, как было описано ранее. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) был предпринят с помощью набора Human EPO ELISA Kit (например, человеческого эритропоэтина, доступного от компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, или Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada) для определения концентрации rhEPO в плазме. Гематологические анализы предпринимали с помощью автоматического счетчика (KX-21NV; Sysmex, Kobe, Japan), в соответствии с прилагаемым руководством. Ретикулоциты считали на предметных стеклах в мазках крови, окрашенных раствором метиленового синего (Brecher's New Methylene Blue Solution), и вычисляли процент ретикулоцитов. Количество эритроцитов, концентрацию гемоглобина, гематокритное число и степень удерживания (sustaining rate), которая представляет собой отношение значения на день 21 к таковому на день 0, оценивают как удерживание эффективности гематопоэза. Мышей умерщвляли под эфирным наркозом, и изъятые из них печень, почки и селезенку взвешивали. Печень, селезенку и подкожную ткань фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, и, после окрашивания гематоксилином и эозином, проводили гистопатологический анализ.
Пример 5: Модуляция экспрессии полинуклеотида и белкового продукта EPO у пациентов с анемией
Пациентов с анемией лечили антисмысловыми олигонуклеотидами EPO. Пациентам вводили антисмысловые олигонуклеотиды (SEQ ID NO: 3, 4 и 5) путем в/в инфузии из расчета 5 мг/кг, от одного до пяти раз в неделю. Гемоглобин определяли регулярно, например, раз в неделю, стандартным спектрофотометрическим методом. Лечение корректировали, соответственно, в зависимости от относительного изменения от недели к неделе наблюдаемого уровня гемоглобина. Дозировку снижали, когда уровень гемоглобина приближался к 12 г/дл или повышался более чем на 1 г/дл за какой-нибудь из 2-недельных периодов. (См., например, руководство по введению эритропоэтина на вкладыше в упаковке для Epogen, доступном по адресу в Интернете http://www.epogen.com/pdf/epogen_pi.pdf, включенному в настоящее описание в виде ссылки.)
Изучали экспрессию белка и мРНК EPO. Концентрацию и уровни секреции белка EPO определяли с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (например, человеческого эритропоэтина, коммерчески доступного от компании Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN), в соответствии с инструкциями производителя. мРНК изучали с помощью ОТ-ПЦР, как описано в другой части настоящего описания.
Хоть изобретение проиллюстрировано и описано применительно к одному или нескольким воплощениям, у специалистов в данной области, при ознакомлении с настоящим описанием и прилагаемым графическим материалом и их осмыслении, могут возникнуть определенные эквивалентные идеи и модификации. Кроме того, даже если какой-нибудь конкретный признак настоящего изобретения описан здесь со ссылкой только на одно из целого ряда возможных применений, такой признак может быть сочетан с одним или несколькими другими признаками, связанными с другими применениями, поскольку это может оказаться востребованным и эффективным для любого какого-нибудь или для конкретного практического применения.
Реферат, прилагаемый к описанию, позволит читателю быстро установить сущность данного технического описания. Он представлен с учетом того, что не будет использован для интерпретации или ограничения объема или значения нижеследующей формулы изобретения.