ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PHOTOSENSIBILISER AND METHOD OF OBTAINING THEREOF

Изобретение относится к получению новой фармацевтически приемлемой светочувствительной композиции, содержащей 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин.
Фотосенсибилизаторы - класс веществ, производных порфиринов и родственных им гетероароматических структур, применяемых для методов фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностики злокачественных опухолей, трофических язв и некоторых других патологий. При активации лазерным излучением фотосенсибилизатора, накопившегося в опухоли, в ее клетках развиваются фотохимические процессы, при которых молекула фотосенсибилизатора, поглотив квант света, переходит в возбужденное триплетное состояние, энергия которого способствует образованию молекулярного синглетного кислорода. Являясь мощным окислителем в клетке и околоклеточном пространстве, он выступает универсальным поражающим фактором как внутри патологической клетки, так и вне ее.
Основные требования к оптимальному фотосенсибилизатору:
1) низкая темновая и световая токсичность;
2) высокая селективность накопления в злокачественных тканях;
3) сильное поглощение в спектральном диапазоне, где биологические ткани имеют наибольшее пропускание (красный и ближний ИК-диапазоны);
4) высокий квантовый выход образования синглетного кислорода в условиях in vivo;
5) доступность получения или синтеза, а также однородный воспроизводимый химический состав;
6) растворимость в воде или разрешенных для внутривенного введения жидкостях и кровезаменителях;
7) стабильность при световом воздействии и хранении.
6
Известны различные фотосенсибилизаторы - производные хлорина e, например РАДАХЛОРИН (патент РФ 2183956 от 27.06.2002 г.). Однако степень его чистоты недостаточна, что приводит к размыванию четкой границы между раковой опухолью и близкорасположенной здоровой тканью, снижая эффективность фотодинамической терапии.
Известны также ФОТОДИТАЗИН (патент РФ 2144538 от 20.01.1998 г.) и фотосенсибилизатор по патенту РФ 2276976, опубл. 2006 г. Однако их водные растворы неустойчивы из-за протекания радикальных процессов, приводящих к частичной деструкции и трансформации тетрапиррольного макроцикла, и обладают ограниченным сроком хранения даже при температуре 4-8°C.
Известны фотосенсибилизаторы - производные бактериохлорина, поглощающие свет в наиболее оптимальном диапазоне 740-820 нм, например фотосенсибилизаторы по Евразийскому патенту №002910, опубл. 2002 г., патенту РФ 2382787, опубл. 2010 г. Однако эти фотосенсибилизаторы тоже содержат лишь одно активное вещество.
6
Фотосенсибилизаторы на основе производных либо хлорина e, либо бактериохлорина вводят внутривенно, устанавливают по меньшей мере один пластиковый катетер в опухоль и проводят лазерное облучение через стенки катетера.
Однако при этом имеет место травматичность, предполагающая проведение общего анестезиологического пособия, а также недостаточная эффективность фотосенсибилизаторов, поскольку достигается лишь торможение роста опухоли.
Наиболее перспективными для практического использования считаются производные бактериохлорина.
Существуют два подхода к получению производных бактериохлорина:
1) направленная модификация природных бактериохлорофиллов. Однако наиболее доступный природный тетрагидропорфирин - бактериохлорофилл «а» склонен к окислению до соответствующих хлоринов и порфиринов, что существенно ограничивает их внедрение в клиническую практику. Высокая гидрофобность и связанная с ней низкая растворимость в полярных растворителях также осложняют практическое использование известных бактериохлоринов;
2) синтетический, включающий восстановление в различных порфиринах двойных связей в пиррольных кольцах. Так, известен способ получения 5,10,15,20-тетракис(1”-алкил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-n-толуолсульфоната алкилированием 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина метил-п-толуолсульфонатом в нитрометане (Евразийский патент №002910 от 1998 г.).
Наиболее близким к изобретению является способ получения 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-n-толуолсульфоната (Дудкин С.В. «Синтез и некоторые свойства гидрированных производных тетраазапорфина и мезо-тетра(3-пиридил)порфина», канд. дисс. М.: 2012 г., с.129-131). Он заключается в последовательном проведении следующих операций:
- восстановление 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-порфина п-толуолсульфонилгидразидом в присутствии 30-35-кратного избытка поташа в пиридине при T=110°C;
- хроматографическое выделение 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина, который может быть также назван тетракис-мезо-(3'-пиридил)бактериохлорин;
- N-метилирование тетракис-мезо-(3'-пиридил)бактериохлорина метил-п-толуолсульфонатом в нитрометане при кипении в течение 1 ч;
- охлаждение реакционной массы до комнатной температуры, разбавление бензолом до соотношения 1:1;
- фильтрование;
- промывка бензолом;
- сушка.
Целевой продукт - 5,10,15,20-тетракис-(N-метил-3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирин-тетра-п-толуолсульфонат. Это соединение может быть также названо 5,10,15,20-тетракис-(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин.
Однако выход целевого продукта невысок - 29%, и его эффективность при использовании в качестве фотосенсибилизатора невысока, так как он не обеспечивает снижение агрессии роста и метастазирования опухолей, не препятствует некротизации опухолевой ткани, не позволяет полностью и равномерно насыщать опухолевый объем и регионарные метастазы, не позволяет одновременно с лечением проводить и диагностику распространенности регионарного метастазирования.
Задачей изобретения является поиск способа получения фотосенсибилизатора с более высоким выходом, который был бы лишен вышеназванных недостатков.
Поставленная задача решена способом получения фотосенсибилизатора, который заключается в том, что 3-пиридилкарбоксальдегид конденсируют с пирролом в смеси пропионовая кислота - пропионовый ангидрид при их соотношении от 3-4 до 1-2 при кипении в течение 80-100 мин, продукт конденсации восстанавливают п-толуолсульфонилгидразидом в среде пиридина в присутствии карбоната калия при его 30-35-кратном избытке и 5-10% хинолина при T=85-95°C, в течение 4-5 часов, полученный продукт N-метилируют в диметилформамиде при кипении в течение 50-65 мин, осаждают бензолом, фильтруют и сушат.
Эта задача решена также фотосенсибилизатором, полученным этим способом.
При этом фотосенсибилизатор, полученный по заявленному способу, содержит 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорин в количестве 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорин в количестве 75-85%.
Структура этих соединений доказана электронным спектром поглощения в воде.
max
-3
ЭСП λ, нм (ε.10): 761(46,4); 655(7,1); 516(27,3); 417(118,9); 374(64,0).
Технический результат изобретения заключается в том, что:
- значительно повышается выход целевого продукта до 90-92%;
- полученный по этому способу фотосенсибилизатор позволяет:
- снизить темп роста и метастазирования опухолей;
на фиг. показан рост первичного узла опухоли карциномы легких Льюис у мышей BDF;
- препятствовать некротизации опухолевой ткани;
- поскольку фотосенсибилизатор хорошо растворим в воде, он может быть введен непосредственно в опухолевый объем и доступные метастатические очаги, поэтому появляется возможность создания концентрации препарата непосредственно в опухолевой ткани ~ в 1000 раз выше, чем при внутривенном введении, что безусловно повышает эффект лечения. Это контролируется оптическим прибором за счет добавления небольшого (5-7%) количества флуоресцирующих примесей;
- проводить одновременно с лечением и диагностику регионарного метастазирования.
К тому же получаемый фотосенсибилизатор работает в самом оптимальном диапазоне 760-762 нм, т.к. не рассеивается естественно окрашенными тканями (гемоглобин, миоглобин и др.), что безусловно повышает КПД излучения. У продукта отсутствует световая токсичность. Высокий процент выхода синглетного кислорода определяет ускорение начала реактивного изменения опухолевой ткани уже через несколько часов. Выход синглетного кислорода определяли, главным образом, путем сравнения со стандартом -тетракис-(п-сульфофенил)порфирином. В качестве источника возбуждающего света применяли осветительную часть флуориметра Perkin-Elmer MPF-44B. Ширина щели - 5 нм. Заявленный фотосенсибилизатор имеет квантовый выход ~ в 1,5 раза выше, что подтверждает, что он является более эффективным фотогенератором синглетного кислорода.
Сведения, подтверждающие возможность воспроизведения изобретения
Для реализации способа используют следующие вещества:
- 3-пиридилкарбоксальдегид - коммерческий продукт TCI EUROPE N.V.;
- пиррол - ТУ 6-09-07-242-84;
- пропионовая кислота - ТУТ CP 1150Н-63, хч;
- пропионовый ангидрид - ТУ 6-09-08-1176-77;
- оксид алюминия - ТУ 6-09-426-75;
- хлороформ - ТУ 263-44493179-01 с изм. №1, 2;
- метанол - ГОСТ 2222-95;
- п-толуолсульфонилгидразид - ТУ 6-09-10-541-76;
- пиридин - ГОСТ 13647-78 с изм. №1;
- поташ (карбонат калия) - ГОСТ 4221-76;
- оксид алюминия - ТУ 6-09-426-75;
- хлористый метилен - ТУ 2631-44493179-98 с изм. №1, 2, 3;
- гексан - ТУ 6-09-06-4521-77;
- метилтозилат (метиловый эфир п-толуолсульфокислоты) - ТУ 6-09-86-75;
- диметилформамид - ГОСТ 20289-74 с изм. №1, 2;
- бензол - ГОСТ 5955-75 с изм. №1, 2;
- аргон - ГОСТ 10157-79 с изм. №1, 2, 3, 4.
Пример 1.
а) получение 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)21H,23H-порфина.
При кипении к смеси 500 мл уксусной кислоты, 150 мл нитробензола и 27 мл (0,286 моль) уксусного ангидрида постепенно добавляют смесь 10 мл (0,144 моль) пиррола и 13,7 мл (0,144 моль) 3-пиридилкарбоксальдегида. Смесь кипятят 1,5 ч, затем охлаждают, отгоняют уксусную кислоту, разбавляют остаток водой, нитробензол отгоняют с водяным паром. Остаток отфильтровывают, осадок промывают водой и высушивают на воздухе. Затем остаток при перемешивании кипятят с метанолом, осадок отфильтровывают, промывают метанолом и высушивают. Выход 16,2 г. Осадок экстрагируют хлороформом в аппарате Сокслета до бесцветного вытека. Экстракт упаривают до 200 мл и отфильтровывают выпавший осадок. Раствор хроматографируют на оксиде алюминия II степени активности по Брокману. Элюат упаривают до минимального объема, осаждают метанолом, отфильтровывают порфирин, промывают метанолом и высушивают при 70°C. Выход - 5,6 г (25,1%).
Продукт идентифицирован по данным ЭСП и ЯМР-спектра.
5,10,15,20-тетракис-(3'-пиридил)21H,23H-порфин
Rf (силуфол): 0,92 (хл-ме, 5:1); 0,40 (бз-ме, 10:1)
max
-3
ЭСП λ, нм. (е.10): 647(3,4); 590(6,1); 550(7,6); 516(18,3); 419(439,3) хлороформ.
1
1
2
1
1
3
H ЯМР (вн.ст. ТМС) δ, м.д.: 9,50s (4H, 2'-H); 9,10dd (4H, 6'-H, J=5,6Hz, J=1,4Hz); 8,56 d (4H, 4'-H, J=5,6Hz); 7,81t (4н, 5'-H, J=5,6Hz); -2,80bs (CDCl)
б) восстановление 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)21H,23H-порфина с получением смеси 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорина и 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорина.
При нагревании и перемешивании к смеси 0,5 г (0,808 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)порфина (Мм - 618,704) и 3,7 г (26,8 ммоль) карбоната калия в 30 мл пиридина постепенно прибавляют раствор 5,0 г (26,8 ммоль) п-толуолсульфонилгидразида (Мм - 186,23) в 20 мл пиридина, затем реакционную массу выдерживают при Т=85-95°C, в течение 4-5 часов. Смесь выливают в 300 мл воды, центрифугируют, промывают водой и высушивают на воздухе при комнатной температуре.
Состав смеси идентифицировали по данным ЭСП, количественный состав определяли по соотношению интенсивности полос в ЭСП.
max
-3
ЭСП λ, нм, (ε.10): 746(52,9); 654(7,5); 520(33,3); 418(78,0); 379(76,8); 356(62,1) (хлороформ).
5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорин - 15-25% и 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорин - 75-85%.
в) N-метилирование для получения смеси 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)хлорина и 5,10,15,20-тетракис(N-метил-3'-пиридил)бактериохлорина.
408 мг (0,43 ммоль) 5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)-21H,23H-7,8,17,18-тетрагидропорфирина растворяют в 20 мл ДМФА, добавляют 1,0 г (5,37 ммоль) метилтозилата (Мм - 186,23), нагревают до 110°C при перемешивании под аргоном 1 ч, охлаждают, добавляют 20 мл бензола, выдерживают 2 ч, осадок отфильтровывают, промывают бензолом и высушивают на воздухе. Выход 1,0 г (90,63%).
Полученный целевой продукт идентифицирован по данным ЭСП.
Пример использования заявленного фотосенсибилизатора при фотодинамической терапии.
Пациент О., 1951 г.р. В течение нескольких лет установлен диагноз: папиллярный рак (высоко дифференцированная форма опухоли) щитовидной железы с MTS в регионарный л/у шеи. От хирургического лечения отказался.
При первом сеансе фотодинамической терапии в опухолевую ткань размерами 3,2×3,5×3,7 см введено 50 мг (из расчета 1,2 мг на 1 г опухоли) заявленного фотосенсибилизатора и в регионарный метастаз в развилке сонной артерии размерами 3,0×1,7 см введено 30 мг препарата (из расчета 5 мг на 1 г опухоли) - исходя из понимания метастаза как более агрессивной ткани, т.е. аналогично признакам снижения дифференцировки. После 20 минут экспозиции проведен сеанс облучения в опухоли и метастазе ИК лазерным излучением длиной волны 760 нм в низкоинтенсивном режиме в течение 20 и 15 минут соответственно.
Через 7 дней проведен цитологический контроль. В опухолевой ткани имеются выраженные признаки реактивных клеточных изменений, резко снизился пул клеток с повышенной митотической активностью, определяются единичные комплексы первоначального строения опухоли. В цитологическом материале из метастаза в л/у - картина папиллярного рака. Проведен повторный сеанс ФДТ. Результат положительный.
В последующем цитологическом мониторинге нарастали явления апоптоза, реактивных изменений. В динамике клеточный состав из метастаза характеризовался как клетки кубического эпителия без признаков атипии, вплоть до полного отсутствия данных за патологическую ткань. При УЗИ в развилке сонной артерии имеется фрагмент банального л/у плоской формы размерами не более 0,5×0,3 см.
Таблица
№
Параметры способа
Выход, %
*Состав Хл/БХл, %
Конденсация
Восстановление
N-метилирование
*Соотношение ПК-ПА
Время, τ, мин
Избыток поташа, кратность
Хинолин, %
Температура, °C
Время, τ, ч
Время, τ, мин
1
3
80
30
5
85
4
50
91
15/85
2
4
90
35
7
85
4,5
50
90
20/80
3
3
100
33
7
90
4
60
90,63
17/83
4
3
90
30
10
95
5
65
92
25/75
5
4
90
35
10
95
5
65
92
21/79
*Примечание:Пропионовая кислота - ПКПропионовый ангидрид - ПА5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)хлорин - Хл5,10,15,20-тетракис(3'-пиридил)бактериохлорин - БХл