СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНАЗЫ, ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ПОЛИСАХАРИДОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ВИНИЛОВЫМИ МОНОМЕРАМИ
METHOD FOR PRODUCING IMMOBILIZED ENZYME PREPARATION BASED ON COLLAGENASE, HYALURONIC ACID AND POLYSACCHARIDES MODIFIED WITH VINYL MONOMERS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу стабилизации коллагеназы растворами гиалуроновой кислоты и графт-сополимерами с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Изобретение может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии.
Коллагеназа (КФ 3.4.4.19) - фермент, обладающий протеолитической активностью с узко специфической направленностью к гидролизу коллагена с выделением свободной аминокислоты - оксипролина. Коллагеназа расщепляет крайне устойчивые к действию других протеаз коллагеновые волокна с образованием высокомолекулярных фрагментов, выполняет в организме человека и животных важнейшие функции: участвует в превращениях соединительной ткани при росте и морфогенезе, а также в устранении некоторых патологических процессов при артритах, опухолевых метастазах и т.д.
Коллагеназа содержится в составе безводной композиции для обработки ран [Патент RU 2585373 С2, МПК A61K 38/48, A61K 9/10, A61K 47/30, A61K 47/44, А61Р 17/02, C12N 9/00, опубл. 27.05.2016, Бюл. №15]. Описана мазь для заживления ожоговых и инфицированных ран, которая содержит коллагеназу Clostridium histolyticum в качестве протеолитического фермента, в качестве антибиотика - гентамицина сульфат, а в качестве мазевой основы - полиэтиленоксиды с молекулярными массами 400 и 1500 Да и глицерин. Изобретение обеспечивает щадящее, бескровное энзиматическое очищение ран, стимулирует развитие здоровых грануляций и не препятствует процессам эпителизации [Патент RU 2174389 С2, МПК A61K 9/06, A61K 38/43, А61Р 17/02, опубл. 10.10.2001, Бюл. №28]. Известна высокоэффективная нетоксичная, неаллергенная фармацевтическая композиция для заживления и очищения раневых, ожоговых и других повреждений кожи на основе коллагеназы микробного происхождения [Патент RU 2166950 С1, МПК A61K 35/74, C12Q 1/37, опубл. 20.05.2001, Бюл. №14]. Коллагеназу используют для лечения нерубцовой алопеции [Патент RU 2695364 С1, МПК A61K 35/50, A61K 35/28, A61K 35/51, А61Р 17/04, опубл. 23.07.2019, Бюл. №21]. Коллагеназа содержится в повязке, которая представляет собой комплекс из трех лейкопластырей или раневых покрытий с разными составами хитозановых прокладок для последовательного лечения инфицированных раневых повреждений [Патент RU 2014113441 А, МПК A61K 9/70, В82 В 1/00, опубл. 27.10.2015, Бюл. №30].
Гиалуроновая кислота является природным линейным несульфатированным гликозаминогликаном, состоящим из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, соединенных между собой β-1,3 и β-1,4-гликозидными связями. Гиалуроновая кислота - амфифильное соединение, проявляет гидрофильные (благодаря наличию групп -СООН и -ОН) и гидрофобные свойства (участки из 8 СН-единиц).
Описана активная против акне добавка к парфюмерно-косметическим продуктам, содержащая гиалуроновую кислоту [Патент RU 2678307 С1, МПК A61K 8/00, A61K 8/18, A61K 8/34, A61K 8/36, A61K 8/42, A61K 8/67, A61K 8/64, А61Р 17/10, A61Q 19/00, опубл. 25.01.2019, Бюл. №3]. Известен препарат для коррекции дефектов кожи, включающий гиалуроновую кислоту, который обеспечивает выработку ее собственных компонентов, а именно гиалуроновой кислоты, коллагена и эластина, при этом обладает сильными антиоксидантными свойствами и выраженным длительным эффектом коррекции кожных дефектов кожи [Патент RU 2659959 С1, МПК A61K 8/73, A61K 8/34, A61K 8/64, A61K 8/96, A61Q 19/08, опубл. 04.07.2018, Бюл. №19]. Гиалуроновая кислота входит в состав композиций для омоложения кожи [Патент RU 2629593 С1, МПК A61K 8/98, A61K 8/73, A61Q 19/08, опубл. 30.08.2017, Бюл. №25]. Гиалуроновая кислота с молекулярной массой менее 40 кДа представляет собой трансдермальный переносчик в составе косметического крема для ухода за кожей [Патент RU 2666602 С1, МПК A61K 8/04, A61K 8/34, A61K 8/73, A61K 8/92, A61K 8/97, A61K 8/9767, A61Q 19/08, опубл. 11.09.2018, Бюл. №26].
Графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из N-винилимидазола или N,N-диметиламиноэтилметакрилата за счет наличия основной цепи из модифицированного природного полисахарида с молекулярной массой в интервале 10-600 кДа могут образовывать растворы с различной вязкостью, зависящей как от массы исходного полисахарида, так и от количества вносимого графт-сополимера [A. Benchabane, K. Bekkour. Rheological properties of carboxymethyl cellulose (CMC) solutions. 2008. Colloid and Polymer Science. Vol. 286. P. 1173-1180.]. Кроме того, такие полимеры могут использоваться в биомедицинских целях, например, в качестве носителя для цитостатического антибиотика широкого спектра действия «Паклитаксела» при пероральном и/или инфузионном введении [V. А. Kuznetsov, А. V. Sorokin, М. S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949; V. A. Kuznetsov, A. V. Sorokin, M. S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
На данный момент нет сведений о комплексах коллагеназы с гиалуроновой кислотой и полисахаридами, модифицированными виниловыми мономерами, такими как графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА).
Известен способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана [Патент RU 2678435 С2, МПК A61K 31/722, A61K 38/43, А61Р 17/02, C12N 11/10, опубл. 29.01.2019, Бюл. №4]. Данный способ включает иммобилизацию коллагеназы в буферном растворе на матрицу кислоторастворимого среднемолекулярного или высокомолекулярного хитозана в соотношении 20 мл буферного раствора коллагеназы в концентрации 1 мг/мл на 1 г указанной матрицы, при этом в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М глициновый буфер с рН 8.6 для среднемолекулярного и с рН 10.5 для высокомолекулярного хитозана; далее проводят инкубирование в течение 5 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; затем промывают образовавшийся осадок 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7.5 до отсутствия в промывных водах коллагеназы.
Недостатком способа является получение ферментного препарата в твердой фазе, не позволяющей проникать молекулам коллагеназы в глубокие слои кожи.
Запатентован способ стабилизации ферментов - пепсина, химотрипсина, трипсина, панкреатина, папаина и других протеаз, путем добавления в их растворы полисахаридов - гуаровой камеди, ксантановой камеди, камеди бобов рожкового дерева, крахмала, декстрана, пуллулана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, каррагинана, пектина, хитозана и прочих полисахаридов, а также производных целлюлозы: карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, этилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы [JPH034791A].
Известен способ получения препарата коллагеназы в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана, включающий иммобилизацию коллагеназы в буферном растворе на матрицу хитозана, инкубирование при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером, отличающегося тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана, в качестве буфера используют 0.05 М ацетатный буфер с рН 5.8 или 0.05 М глициновый буфер с рН 9.0, инкубация проводится в течение 2 часов [Патент RU 2712528, МПК C12N 11/10, А61K 31/722, опубл. 29.01.2020 Бюл. №4].
В отличие от этих двух способов предложенное нами использование полисахаридов (карбоксиметилцеллюлозы и хитозана), модифицированных виниловыми мономерами (N-винилимидазолом или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом) обеспечивает большее количество связей между полисахаридом и ферментом в ходе иммобилизации, что увеличивает прочность образуемого комплекса и пролонгирует процесс высвобождения фермента в область поврежденных тканей. Кроме того, добавление в препарат гиалуроновой кислоты будет способствовать его более глубокому проникновению в различные слои кожи.
Известно, что полимеры на основе поли-β-гликозидов (целлюлозы и ее производных, хитозана, гиалуроновой кислоты и т.д.) склонны к образованию пленок, которые могут защитить кожу от пересыхания или обеспечить дополнительную защиту на поверхности раневого повреждения. Однако способность образовывать конъюгаты у таких полимеров несколько ограничена рядом факторов: поверхностным зарядом, типом функциональной группы и т.д. Поэтому для придания ряда новых свойств целесообразно проводить химическую модификацию природных полисахаридов. Так, например, введение азольных заместителей повышает комплексообразующую способность полисахаридов и снижает поверхностный отрицательный заряд карбоксиметилцеллюлозы [V.А. Kuznetsov, А.V. Sorokin, М. S. Lavlinskaya et al. Graft copolymers of carboxymethyl cellulose with N-vinylimidazole: synthesis and application for drug delivery. 2019. Polymer Bulletin. Vol. 76. P. 4929-4949], а введение звеньев N,N-диметиаминоэтилметакрилата не только снижает поверхностный заряд, но придает водному раствору модифицированного полисахарида стимулочувствительные свойства [V.A. Kuznetsov, А.V. Sorokin, М.S. Lavlinskaya. Synthesis of graft copolymers of carboxymethyl cellulose and N,N-dimethylaminoethyl methacrylate and their study as Paclitaxel carriers. 2020. Polymer Bulletin. DOI: 10.1007/s00289-020-03250-z].
В качестве прототипа служила топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК A61K 38/08, А61K 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, А61K 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.
В отличие от прототипа в качестве действующего вещества мы используем не противомикробный пептид, а фермент коллагеназу, которая способна избирательно гидролизовать коллаген, входящий в состав соединительной ткани живого организма, расщепляя крайне устойчивые к действию других протеаз коллагеновые волокна, выполняет в организме человека и животных важнейшие функции, участвует в превращениях соединительной ткани при росте и морфогенезе, а также в устранении некоторых патологических процессов при артритах, опухолевых метастазах и т.д., при гнойных ранах коллагеназа способствует быстрому удалению нежизнеспособных тканей и эксудата, раннему появлению грануляционной ткани, эпителизации, применение коллагеназы предупреждает развитие грубых рубцов, при этом сохраняется подвижность кожи и мягких тканей.
Кроме того, добавление нами в раствор графт-сополимеров карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) позволяет путем включения в полисахаридный гель (один из способов физической иммобилизации ферментов) дополнительно стабилизировать коллагеназу и обеспечить ей пролонгированное действие.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения иммобилизованного жидкого или гелеобразного ферментного препарата на основе коллагеназы, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) или высокомолекулярной (800 кДа), благодаря чему растворы коллагеназы можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а фермент при этом становится более стабильным в сравнении с нативным и способен проникать в глубокие слои кожи, при этом внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение коллагеназы, поддерживая ее необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.
Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного ферментного препарата на основе коллагеназы, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты, включающем растворение коллагеназы в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг коллагеназы на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, перемешивание осуществляют до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию коллагеназы путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана 50-100 кДа (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Фиг. 1. Диаграмма значений каталитической активности (А) коллагеназы в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 4°С.
Фиг. 2. Диаграмма значений каталитической активности (А) коллагеназы в присутствии гиалуроновой кислоты различной молекулярной массы после его хранения при 25°С.
Фиг. 3. Таблица 1. Вязкость препаратов, содержащих коллагеназу, гиалуроновую кислоту и полисахариды, модифицированные виниловыми мономерами.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования была выбрана коллагеназа из Clostridium histolyticum фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве стабилизирующих агентов применяли три вида гиалуроновой кислоты (ООО «Лаборатория Гиалика») с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) и 800 (ВМГК) кДа. В качестве матрицы для иммобилизации коллагеназы применяли графт-сополимеры карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) с молекулярной массой 50-100 к Да.
Стабилизацию коллагеназы осуществляли путем растворения ее навески массой 10 мг в 2 мл водного раствора гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 300 (НМГК), 500 (СМГК) или 800 (ВМГК) кДа в концентрации 1.5% с последующим перемешиванием при комнатной температуре до полного растворения. Затем к полученной смеси добавляли для иммобилизации коллагеназы графт-сополимер карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) (при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля (табл. 1).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах коллагеназы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -V.193. - P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине [Garcia-Carreno, F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition //Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 200 мкл образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера (рН 7.5), 800 мкл азоказеина (0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при минус 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13 000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 200 мкл трис-HCl буфера и 200 мкл образца, который вносили после инкубации смеси в течение 2 часов при 37°С. За единицу каталитической активности коллагеназы принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность коллагеназы рассчитывали по формуле:
ПА = D*1000/120/200/C,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Были проведены исследования стабильности коллагеназы в растворах гиалуроновой кислоты (300, 500 и 800 кДа) по сравнению с нативным энзимом. Препараты инкубировали при 4 и 25°С в течение 0, 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток с дальнейшим измерением протеолитической активности. Полученные результаты отражены на фиг. 1, 2.
В ходе наших экспериментов было выявлено, что гиалуроновая кислота не ингибирует коллагеназу.
На фиг. 1 представлена диаграмма зависимости каталитической активности энзима от времени его хранения при 4°С. Установлено, что нативная коллагеназа сохраняет 52-53% своей активности после 7-14 суток инкубации при 4°С, а после 3 недель хранения активна на 40% от исходного препарата. Коллагеназа в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) на 14 день хранения сохраняет более 90% каталитической способности от неинкубированного образца. После 21 дня инкубации активность коллагеназы в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты составляет 69% от начальной. Раствор коллагеназы со среднемолекулярной гиалуроновой кислотой (500 кДа) незначительно теряет свою активность в течение всего периода инкубации и сохраняет 91% своей ферментативной способности на 21 сутки хранения. Коллагеназа в растворе высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) постепенно инактивируется: на 3 сутки активность энзима снижается на 10%, на 7 сутки - на 14%, а после 21 дня хранения каталитическая способность фермента составляет 72% от исходной.
На фиг. 2 изображена диаграмма изменения каталитической активности коллагеназы после ее хранения при 25°С. На 7 сутки хранения при температуре 25°С свободный энзим сохраняет 51% активности, препарат коллагеназы в растворе среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) - 87%, раствор коллагеназы в высокомолекулярной гиалуроновой кислоте (800 кДа) - 86%, коллагеназа в растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) - 76%. Нативная коллагеназа на 14 и 21 сутки эксперимента активна соответственно на 45 и 36%, комплексы фермента со среднемолекулярной гиалуроновой кислотой - на 71 и 63%, с высокомолекулярной гиалуроновой кислотой - на 65 и 50%, с низкомолекулярной гиалуроновой кислотой - 74 и 40%.
Выявлено, что раствор коллагеназы в среднемолекулярной гиалуроновой кислоте (500 кДа) после инкубации при температурах 4 и 25°С оказался наиболее стабильным по сравнению с другими препаратами.
Таким образом, был разработан способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе коллагеназы, низкомолекулярной (300 кДа), среднемолекулярной (500 кДа) и высокомолекулярной (800 кДа) гиалуроновой кислоты с последующим добавлением графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) для иммобилизации коллагеназы.
При этом полученный предложенным способом препарат можно хранить при температурах от 4 до 25°С в течение 21 суток, а коллагеназа при этом становится более стабильной в сравнении с нативной и способна проникать в глубокие слои кожи. Внесение в состав препарата модифицированных полисахаридов позволяет не только варьировать вязкость и консистенцию образцов (от жидкого состояния до геля с различной текучестью), но также способствует образованию конъюгатов с ферментом с большим количеством связей и взаимодействий между полисахаридом и ферментом, по сравнению с немодифицированными карбоксиметилцеллюлозой и хитозаном, что дополнительно повышает стабильность препарата и концентрацию активного вещества в пораженном участке кожи, а также обеспечивает контролируемое (порционное) высвобождение коллагеназы, поддерживая ее необходимую концентрацию в течение длительного времени. Кроме того, способность модифицированных полисахаридов образовывать устойчивые пленки защищает фермент и обрабатываемый участок кожи от пересыхания, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.