Секретируемая металлопротеиназа Bacillus intermedius: получение гомогенного препарата фермента и исследование физико-химических свойств

Том 152, кн. 2

Естественные науки

2010

УДК 577.151

СЕКРЕТИРУЕМАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА

BACILLUSINTERMEDIUS: ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННОГО ПРЕПАРАТА ФЕРМЕНТА И ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Н.Л. Рудакова, А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, А.М. Марданова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова

Аннотация

Исследованы динамика роста и накопления протеолитической активности реком-бинантного штамма Bacillus subtilis BG 2036, несущего на плазмиде рСМ4 ген секрети-руемой металлопротеиназы Bacillus intermedius. Разработан эффективный метод получения гомогенного препарата фермента из культуральной жидкости с применением гидрофобных сорбентов бацитрацин-силохрома и бутил-сефарозы. Изучены чувствительность металлопротеиназы к различным ингибиторам, влияние ионов двухвалентных металлов на активность фермента, а также некоторые физико-химические свойства.

Ключевые слова: металлопротеиназа, гомогенный белок, гидрофобный сорбент, Bacillus subtilis.

Введение

Секретируемые металлопротеиназы - особая группа протеолитических ферментов, выполняющих в клетке широкий спектр функций: от общих трофических до специфических регуляторных. Большой интерес для исследования представляют минорные металлопротеиназы, доля которых в общем пуле протеолитической активности не превышает 10%. Низкий уровень активности фермента может свидетельствовать о том, что белок выполняет специфическую функцию в клетках бактерий. В связи с этим представляет интерес исследование его физико-химических свойств и субстратной специфичности. Для решения этих задач необходимо разработать эффективный способ выделения белка и его очистки до гомогенного состояния.

При разработке метода выделения и очистки фермента перспективным является использование генно-инженерных штаммов, содержащих на плазмиде ген индивидуального фермента, что позволяет избежать контаминации белковых примесей при получении гомогенного препарата фермента.

Рекомбинантный штамм B. subtilis был получен путем трансформации плаз-миды pCM4, несущей ген секретируемой металлопротеиназы B. intermedius, в лабораторный протеазодефицитный штамм B. subtilis BG 2036, дефектный по собственным внеклеточным протеиназам. Использование модельного штамма позволило избежать наложения пула контаминирующих белков при получении гомогенного препарата фермента.

Целью работы явилось создание эффективного метода получения гомогенного препарата секретируемой металлопротеиназы Bacillus intermedius 3-19 из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis BG 2036 и изучение некоторых свойств гомогенного белка.

1. Материалы и методы

1.1 Бактериальный штамм и условия культивирования. В работе использовали рекомбинантный штамм B. subtilis BG 2036, несущий на мультикопий-ной плазмиде рСМ4 ген секретируемой металлопротеиназы B. Intermedius 3-19. Штаммом-реципиентом служил штамм B. subtilis BG 2036, из хромосомной ДНК которого были делетированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. E. Феррарри, Genencor Int. Inc. USA). В работе использовали плазмиду рСМ4, несущую 6 kb фрагмент геномной ДНК B. Intermedius 3-19 с геном металлопротеиназы под собственным промотором.

Культивирование рекомбинантного штамма проводили на среде, описанной ранее [1], на вибростенде («B. Braun», Германия) при 200 об/мин в течение 30 ч. Соотношение объема среды к объему колбы составляло 1 : 7. Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 20 мин при 8 тыс. об/мин.

1.2. Реагенты для выделения фермента. Для выделения фермента использовали бацитрацин-силохром, синтезированный на химическом факультете МГУ (г. Москва) [2], ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу («Sigma», США), бутил-сефарозу HiTrap («Pharmacia», США).

1.3. Выделение фермента. Выделение металлопротеиназы B. intermedius из 1 л культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis проводили с помощью дробного фракционирования сульфатом аммония с разными интервалами насыщения: 0.3-0.8; 0.2-0.8; 0.3-0.7 и 0.2-0.7. Сульфатаммонийную фракцию диализовали против 0.05 М трис-HCl буфера рН 7.3 до исчезновения следов сульфата аммония (контроль - 5% BaCl2). Очистку диализата сульфа-таммонийной фракции проводили на колонке (1 см х 13 см) с бацитрацин-сило-хромом, уравновешенным 0.05 М трис-HCl буфером рН 7.3, содержащим 5 мМ Са Элюцию проводили тем же буфером, содержащим 1 М NaCl и 7% изопро-панола. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяли и диализовали против 0.05 М трис-HCl буфера рН 7.3 с 5 мМ Са2+. Для получения гомогенного фермента использовали два способа очистки с целью выбора наилучшего варианта.

1.3.1. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозе. Фракцию фермента после очистки на бацитрацин-силохроме и диализа помещали на колонку (1 см х 7 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0.01 М трис-HCl буфером рН 8.0 с 5 мМ Са . Элюцию проводили тем же буфером, содержащим 0.6 М NaCl. Активные фракции белка объединяли, диализовали против 0.02 М Na-ацетатного буфера рН 6.8 с 5 мМ Са2+ и помещали на колонку (1 см х 7 см) с КМ-целлюлозой, уравновешенной 0.02 М Na-ацетатным буфером с рН 6.8, содержащим 5 мМ Са2+.

1.3.2. Очистка фермента на гидрофобном носителе бутил-сефарозе.

На колонку с бутил-сефарозой объемом 1 мл, уравновешенной 0.05 М трис-HCl буфером рН 7.3 с 5 мМ Са , содержащим 35% сульфата аммония, помещали фермент, полученный после очистки на бацитрацин-силохроме и диализа против 0.05 М трис-HCl буфера рН 7.3 с 5 мМ Са2+. Элюцию проводили тем же буфером с понижением концентрации сульфата аммония до 20-15%.

Полученные после каждого способа очистки фракции собирали и диализо-вывали против 0.05 М трис-HCl буфера рН 7.3 с 5 мМ Са2+.

Степень чистоты полученных препаратов и молекулярную массу определяли методом электрофореза в 12.5%-ном ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [3]. Окраску проводили двумя красителями: Coomassie Brilliant Blue (SERVA) и раствором ZnCl2. Было установлено, что точность определения молекулярной массы белка при использовании раствора ZnCl2 составляет 30 нг белка [4]. Перед окрашиванием гель выдерживали в течение 10 мин в 0.2 М растворе имидазола, а затем переносили в 0.3 М раствор ZnCl2. В результате наблюдалось негативное окрашивание белковых полос. Для приготовления растворов использовали деионизированную воду.

Молекулярную массу фермента определяли электрофоретически, используя маркерные белки («Sigma»).

Протеолитическую активность металлопротеазы определяли по расщеплению азоказеина [5]. К 100 мкл субстрата (раствор азоказеина («Sigma», США) в концентрации 10 мг/мл в 0.05 М трис-HCl буфере рН 7.3 с 5 мМ Са2) добавляли 50 мкл белка и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч, затем реакционную смесь осаждали 10%-ной трихлоруксусной кислотой и выдерживали 10 мин на ледяной бане. Далее пробы центрифугировали 7 мин при 13 тыс. об/мин, отбирали 250 мкл супернатанта и добавляли 50 мкл 4 н NaOH. Контрольным являлся образец, в котором изначально к субстрату добавляли ТХУ, выдерживали вместе с опытными пробами в течение 1 ч при 37 °С, а затем добавляли 50 мкл фермента. Против данного контроля проводили измерение на спектрофотометре (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин. Удельную активность определяли как отношение единицы активности к единице белка по А280 и выражали в ед/мг белка.

Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует поглощению А280, равному единице в кювете толщиной 1 см.

Для выяснения влияния различных ингибиторов на активность металло-протеиназы гомогенный препарат белка выдерживали в присутствии ингибитора в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего определяли остаточную активность по гидролизу азоказеина по описанной выше методике. Остаточную активность выражали в процентах относительно контроля, активность которого в отсутствие ингибиторов принимали за 100%. Использованные в работе ингибиторы («Sigma», Германия) - EDTA (неспецифический ингибитор металло-протеиназ), 1,10-фенантролин (специфический ингибитор металлопротеиназ), PMSF (специфический ингибитор сериновых протеиназ), парахлормеркурий-

бензоат и HgCl2 - добавляли к ферменту в соотношениях фермент : ингибитор, составляющих 1 : 10 и 1 : 100.

При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на активность метал-лопротеиназы использовали хлориды кальция, магния, кобальта, меди и никеля в конечной концентрации от 1 до 20 мМ, а хлорид цинка - от 0.01 до 20 мМ. К ферментным растворам добавляли указанные растворы двухвалентных металлов и выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем по описанной ранее методике определяли активность фермента и выражали ее в процентах относительно контроля. Контролем (100%) служил уровень активности фермента в отсутствие ионов металлов.

рН-Оптимум активности фермента определяли по гидролизу азоказеина в 0.05 М трис-HCl буфере рН 7.3 с 5 мМ Са2+ в интервале рН от 7.2 до 9.5.

Для анализа экспериментальных данных использовали программу Microsoft Excel. Для описания и сравнения признаков использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних.

2. Результаты и их обсуждение

Исследование динамики роста и накопления протеолитической активности металлопротеазы рекомбинантного штамма B. subtilis показало, что активность фермента появляется в культуральной жидкости на 20-й час роста, ее уровень достигает максимума на 29-31-й ч роста, что соответствует стационарной фазе роста культуры. Протеолитическая активность контрольного безпротеазного штамма B. Subtilis BG 2036 обнаруживается в следовых количествах по сравнению с уровнем активности рекомбинантного штамма (рис. 1).

Для получения гомогенного белка дальнейшая работа была направлена на разработку эффективного метода очистки металлопротеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis.

Первым этапом выделения фермента было проведение дробного фракционирования сульфатом аммония. При исследовании 4 интервалов насыщения куль-туральной жидкости сульфатом аммония было установлено, что оптимальным является интервал насыщения 0.2-0.7. В этом случае достигался максимальный выход белка (около 50%), степень очистки составляла 20 (табл. 1). В дальнейшей работе использовали фракцию фермента, полученную при насыщении сульфатом аммония в интервале 0.2-0.7.

Диализат сульфатаммонийной фракции подвергали хроматографической очистке на гидрофобном носителе бацитрацин-силохроме, с помощью которого удалось повысить степень очистки фермента в 2 раза по сравнению с предыдущей стадией, выход составил 19% (табл. 2).

SDS-электрофорез показал наличие 4 белковых полос (рис. 2, дорожка 3).

Для получения гомогенного фермента использовали два способа, описанных в разделе «Материалы и методы».

1-й способ - сочетание методов ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-и КМ-целлюлозе. Полученный после обработки на бацитрацин-силохроме и диализа ферментный раствор подвергали хроматографической очистке на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, что позволило увеличить степень очистки в 2.2 раза по сравнению со степенью очистки фермента на бацитрацин-силохроме (табл. 3).

часы

Рис. 1. Динамика роста и накопления протеолитической активности: 1 - рост безпроте-азного штамма, 2 - рост рекомбинантного штамма, 3 - протеолитическая активность рекомбинантного штамма, 4 - протеолитическая активность беспротеазного штамма

Табл. 1

Дробное фракционирование сульфатом аммония металлопротеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis

Интервал насыщения сульфатом аммония Степень очистки Выход, %

0.3-0.8 9.5 10.2

0.2-0.8 10 40.5

0.3-0.7 9.1 16.8

0.2-0.7 20 47.5

Табл. 2

Выделение металлопротеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма B. subtilis

Стадии V, А^съ Активность, Удельная Степень Выход,

очистки мл общ., мг общ., активность, очистки %

ед. акт. ед./мг

Культуральная

жидкость 760 11400 595 0.05 1 100

Диализат сульфа-

таммонийной

фракции 24 312 322 1.03 20.6 54

Хроматография

на бацитрацин-

силохроме 149 47.5 114.3 2.41 48.2 19.2

кДа 66

45 21

14.4

19 кДа

1

2

3

4

5

Рис. 2. SDS-электрофорез в ПААГ: 1 - маркеры: BSA (66 кДа), альбумин (45 кДа), па-паин (21 кДа), лизоцим (14.4 кДа), 2 - фракция белка после осаждения сульфатом аммония, 3 - фракция белка после очистки на бацитрацин-силохроме, 4 - фракция белка после ионообменной хроматографии (ДЭАЭ-целлюлоза), 5 - фракция белка после очистки на бутил-сефарозе

Табл. 3

Очистка металлопротеиназы методом ионообменной хроматографии

Стадии очистки V, А280, Активность, Удельная Степень Выход,

мл общ., общ., активность, очистки %

мг ед. акт. ед./мг

Хроматография на

бацитрацин-

силохроме 7 2.23 5.37 2.41 1 100

Хроматография

на ДЭАЭ-целлюлозе 4 0.156 2.38 5.31 2.2 44.3

Хроматография

на КМ-целлюлозе 5 0.135 1.74 2.9 1.2 32.4

8Б8-электрофорез показал наличие 3 полос белка (рис. 2, дорожка 4).

Следующий этап очистки фермента на КМ-целлюлозе не привел к увеличению степени очистки, так как белок не сорбировался на катионообменнике, а в собранной после прохождения через КМ-целлюлозу белковой фракции терялась значительная часть активности (табл. 3). Таким образом, ионообменная хроматография на ДЭАЭ- и КМ-целлюлозе не позволила получить гомогенный фермент.

2-й способ - хроматография на гидрофобном носителе бутил-сефарозе. Для работы с носителем предварительно следует подобрать концентрацию сульфата аммония, максимально близкую к той, при которой протеолитическая активность белка начинает резко снижаться, свидетельствуя о начале осаждения белка сульфатом аммония. Нами было установлено, что концентрация сульфата аммония в растворе фермента, при которой его активность резко снижается, составляет 35%. Фракцию фермента, полученную после хроматографии на бацитрацин-

силохроме, помещали на колонку с бутил-сефарозой и проводили хроматогра-фическую очистку так, как описано в разделе «Материалы и методы». Удельная активность фермента повысилась в 4 раза по сравнению с предыдущей стадией, выход составил около 14% (табл. 4).

8Б8-электрофорез показал наличие одной белковой полосы после хроматографии на бутил-сефарозе. Окраску геля проводили раствором Кумасси и раствором 2иС12. В обоих случаях наблюдали наличие только одной белковой полосы, свидетельствующей о гомогенности препарата (рис. 2, дорожка 5).

Таким образом, разработан способ получения гомогенного препарата ме-таллопротеиназы из рекомбинантного штамма В. subtilis ВО 2036 рСМ4.

Молекулярная масса металлопротеиназы, определенная электрофоретиче-ски, составляет 19 кДа (рис. 2).

Табл. 4

Очистка на бутил-сефарозе фермента, полученного после очистки на бацитрацин-сило-хроме

Стадии очистки V, А28СЪ Актив- Удельная Сте- Вы-

мл общ., ность, актив- пень ход,

мг общ., ность, очист- %

ед. акт. ед./мг ки

Диализат сульфатаммо-

нийной фракции 24 312 322 1.С3 1 1СС

Хроматография

на бацитрацин-

силохроме 149 47.5 114.3 2.41 2.07 35.5

Хроматография

на бутил-сефарозе 44.7 5.14 43.8 8.52 8.27 13.6

Исследование влияния различных ингибиторов на активность металлопро-теиназы показало практически полное ингибирование активности белка в присутствии 1,10-фенантролина, а также высоких концентраций ББТА; белок не ингибируется РМ8Б. Эти результаты подтверждают, что белок относится к классу металлопротеиназ. Высокие концентрации парахлормеркурийбензоата ингибируют активность фермента, что позволяет предположить наличие цис-теина в молекуле фермента (табл. 5).

Табл. 5

Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназы B. intermedius

Ингибитор Остаточная активность, % фермент : ингибитор

1 : 1С 1 : 1СС

EDTA 96 5.7

1,10-фенантролин 5.8 С

PMSF 93.9 91.2

парахлормеркурийбензоат 94.2 1.9

HgCl2 51.1 39.7

.0 140 -

1-

о о 120 -

X

ш 100 -

1-

т Л 80 -

К

л X 60

у

о 1- 40

я

н о 20

о

0

0,01

0,1

1 2 3 4 5 6 Я

I

i

I

1

5

10

20

мМ

Рис. 3. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность металлопротеиназы: 1 -

ги2+; 2 - Са2+; 3 - Мя2+ интервалов для долей)

2и2+; 2 - Са2+; 3 - Mg2+; 4 - Со2+; 5 - Си2+; 6 - №2+ (представлено в виде доверительных

0,6

0,55

с 0,5

|_ 2 0,45

.0 н 0,4

о

I 0,35

н 0,3

0,25

0,2

Й.

7,2

7,4

7,6

7,8 8 рН

8,5

9,5

Рис. 4. рН-оптимум металлопротеиназы: представлены 95%-ные доверительные интервалы для истинной медианы

9

Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность металлопротеиназы показало, что Са и Mg в концентрации 10 мМ повышают активность фермента на 30% и 20% соответственно. Со , Си и N1 в концентрациях от 1 до 20 мМ снижают активность металлопротеиназы, причем с увеличением концентрации это снижение более значительно. Низкие концентрации 2п (0.01 мМ) практически не влияют на активность фермента, увеличение его концентрации приводит к резкому снижению активности металлопротеиназы (рис. 3). Это согласуется с данными литературы. Так, при исследовании нейтральной протеиназы В. сегеш было показано, что добавление в раствор апофер-мента 10 мкМ ионов 2п полностью восстанавливало его активность [6]. Для цинковой эндопептидазы термолизина установлено, что внесение в раствор фермента ионов 2п в концентрации более 10 мкМ ингибирует его активность [7].

Исследовали рН-оптимум гомогенного белка (рис. 4). Установлено, что рН-оптимум фермента в 0.05 М трис-НС1 буфере с 5 мМ Са2+ соответствует 8.0, что дает основание называть фермент щелочной эндопептидазой.

Таким образом, нами разработан эффективный способ получения гомогенного препарата металлопротеиназы рекомбинантного штамма Bacillus subtilis BG 2036pCM4 и определены некоторые свойства этого фермента.

Авторы выражают благодарность профессору С.В. Кострову за предоставленную плазмиду рСМ4, профессору E. Феррарри за предоставленный протеа-зодефицитный штамм Bacillus subtilis BG 2036, а также доктору Г. Лохнит за помощь в определении N-концевой последовательности зрелого белка методом Эдмана.

Работа поддержана грантами РФФИ (проект № С9-С4-99С44 р-офи), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг. (ГК № П4С6 от 12.С5.2С1С) и Аналитической ведомственной целевой федеральной программы (РНП 2.11.1005).

Summary

N.L. Rudakova, A.R. Sabirova, A.R. Kayumov, A.M. Mardanova, N.P. Balaban, M.R. Sha-ripova. Bacillus intermedius Secreted Metalloproteinase: Homogeneous Enzyme Receiving and Physicochemical Properties Investigation.

Growth dynamics and proteolytic activity of recombinant stain Bacillus subtilis BG 2036 carrying Bacillus intermedius secreted metalloproteinase gene on the plasmid pCM4 were investigated. The efficient method for homogeneous enzyme isolation from culture broth using hydrophobic sorbents bacitracin-sylochrom and butyl-sepharose was created. Inhibitor analysis, bivalent metal ions influence and some physicochemical properties of metalloproteinase were studied.

Key words: metalloproteinase, homogeneous enzyme, hydrophobic sorbent, Bacillus subtilis.

Сокращения

SDS - sodium dodecyl sulfate

PMSF - phenylmethanesulfonyl fluoride

BSA - bovine serum albumin

ПААГ - полиакриламидный гель

ТХУ - трихлоруксусная кислота

EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid

ДЭАЭ-целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза

КМ-целлюлоза - карбоксиметил-целлюлоза

Литература

1. Габдрахманова Л.А., Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Токмакова Ю.С., Соколова Е.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Оптимизация среды культивирования для продукции глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 3-19 // Микробиол. - 2002. - T. 71, № 3. - С. 323-329.

2. Stepanov V.M., Rudenskaya G.N. Proteinase affinity chromatography on bacitracin-Sepharose // J. Appl. Biochem. - 1983. - V. 5, No 6. - P. 420-428.

3. Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R250. - URL: http://www.molbiol.ru/protocol/17_02.html, свободный.

4. Окрашивание белковых SDS PAAG с помощью Imidazol/Zn. - URL: http://www.molbiol.ru/protocol/17_03.html, свободный.

5. Charney J., Tomarelli R.M. A colorimetric method for the determination of the proteolytic activity of duodenal juice // J. Biochem. - 1947. - V. 177. - P. 501-505.

6. Feder J., Keay L., Garrett L.R., Cirulis N., Moseley M.N., Wild B.S. Bacillus cereus neutral protease // Biochim. Biophys. Acta. - 1971. - V. 251, No 1. - P. 74-78.

7. Roche R.S., Voordouw G. The structural and functional roles of metal ions in thermolysin // CRC Crit. Rev. Biochem. - 1978. - V. 5. - P. 1-23.

Поступила в редакцию 18.09.09

Рудакова Наталья Леонидовна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: puphen@rambler.ru

Сабирова Альбина Рушановна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: albina12@mail.ru

Каюмов Айрат Рашитович - кандидат биологических наук, младший научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: airat_kayumov@rambler.ru

Марданова Айслу Миркасимовна - кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: Ayslu.Mardanova@ksu.ru

Балабан Нэлли Павловна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: NellyBalaban@yandex.ru

Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.

E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru