МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ЗЕЛЕНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
MODIFIED GREEN FLUORESCENT PROTEINS AND METHODS OF THEIR APPLICATION

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США, серийный номер 60/733429, поданной 4 ноября 2005 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в основном к области биологии и химии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к флуоресцентным белкам.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Aequorea victoria
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из водной медузы (синоним А.А.), описанный Джонсон с соавт. в J. Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, был обнаружен как часть биолюминесцентной системы медузы, в которой GFP играет роль вторичного эмиттера, трансформирующего синий свет фотопротеинового экворина в зеленый свет.
A.victoria
кДНК, кодирующая GFP , была клонирована Прашером с соавт. (Prasher et al., Gene, 1992, V. 111(2), pp. 229-233). Выяснилось, что этот ген может гетерологично экспрессироваться практически в любом организме за счет уникальной способности GFP образовывать флуорофор (Chalfie et al., Gene (1992), 111(2): 229-233). Данный факт открывает широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологии в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки.
A.victoria
Были проведены обширные исследования с целью улучшения свойств GFP и получения на основе GFP реактивов, полезных и оптимизированных для множества исследовательских целей. Были разработаны новые варианты GFP, такие как «гуманизированная» ДНК GFP, белковый продукт которой характеризуется повышенным синтезом в клетках млекопитающих (Haas, et al., Current Biology 1996, V. 6, pp. 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research 1996, V. 24, pp. 4592-4593). Один такой гуманизированный белок представляет собой «улучшенный зеленый флуоресцентный белок» (EGFP). Другие мутации GFP приводят к получению вариантов, испускающих синий, голубой и желто-зеленый свет. Кроме того, были получены варианты GFP с улучшенной укладкой и также была достигнута клеточная флуоресценция в условиях инкубации при температуре 37°С. Используемые мутанты GFP  подробно описаны в патентах США 5491084, 5625048, 5777079, 5804387, 6090919, 5874304, 5968750, 6020192, 6027881, 6046925, 6054321, 6066476, 6096865, 6146826, 6414119, 6638732, 6699687, 6803188, 6077707, 6124128, 6172188, 6818443, 6194548, 6265548, 6319669, 6403374, 6593135, 6800733, 6780975, 6852849 и 6919186.
A.victoria
Aequorea A
macrodactyla
A. coerulescens
Были выделены гомологи GFP разных видов, включая Anthozoa и Arthropoda (Matz et al., Nature Biotechnol. 1999, V. 17, pp. 969-973; Shagin et al., Mol. Biol. Evol. 2004, V. 21(5), pp. 841-850). Множество биологических и биомедицинских применений, таких белков было подробно описано Lippincott-Schwartz и Patterson в Science, 2003, V. 300(5616), pp. 87-91). Кроме того, были выделены гомологи, близкие к GFP , из других медуз рода , включая зеленый флуоресцентный белок А. GFPxm (Xia et al., Mar Biotechnol 2002, V. 4(2), pp. 155-62) и GFP-подобный белок , AcGFPL (Gurskaya et al., Biochem J. 373(Pt2): 403-408).
macrodactyla
A.victoria
GFPxm А. характеризуется 83% идентичностью с GFP. GFPxm дикого типа не используется в качестве флуоресцентного маркера в клеточных тестах из-за низкой скорости его созревания при температуре 37°С. Модификация GFPxm для оптимизации скорости его созревания при температурах 35-39°С представляет собой способ выявления репортера в клетках млекопитающих с низкими уровнями экспрессии и/или с повышенной чувствительностью относительно GFPxm дикого типа. Указанные свойства в значительной мере повышают возможности использования GFPxm при исследовании клеточных функций живых клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
macrodactyla
macrodactyla
Настоящее изобретение относится к функциональным сконструированным флуоресцентным белкам с повышенной скоростью созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с зеленым флуоресцентным белком дикого типа А. (GFPxm), где указанные функциональные сконструированные флуоресцентные белки по существу идентичны по аминокислотной последовательности зеленому флуоресцентному белку А. (GFPxm) (SEQ ID NO: 2) и включают аминокислотное замещение F220L.
macrodactyla
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный флуоресцентный белок, аминокислотная последовательность которого по существу подобна аминокислотной последовательности зеленого флуоресцентного белка А.  (GFPxm) (SEQ ID NO: 2) и отличается от SEQ ID NO: 2 по меньшей мере аминокислотным замещением F220L. Указанный функциональный флуоресцентный белок имеет повышенную скорость созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm.
macrodactyla
В предпочтительном варианте молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует флуоресцентный белок, который также включает дополнительные замещения аминокислот, выбранные из группы, состоящей из K3G, E6D, T9A, P58T, F99L, F99H, M128K, M128E, I136M, Y151H, N144S, K162E, K156M, T214A, G228C, G228S и K238R, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет повышенную скорость созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm А. дикого типа.
В предпочтительных вариантах молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует флуоресцентный белок, который по существу подобен по аминокислотной последовательности GFPxm и включает дополнительно одно или несколько замещений аминокислот, которые изменяют его флуоресцентные свойства и/или способствуют оптимизации укладки, как было показано, например, в SEQ ID No: 18-24.
macrodactyla
В другом предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к функциональному мутантному флуоресцентному белку, аминокислотная последовательность которого по существу подобна аминокислотной последовательности GFPxm А. (SEQ ID NO: 2) и который отличается от SEQ ID No: 2 по меньшей мере аминокислотным замещением F220L. Указанный функциональный мутантный флуоресцентный белок обладает повышенной скоростью созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm. Рассматриваются также примеры мутантных флуоресцентных белков, имеющих аминокислотный состав, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID No: 4-24, где указанный мутантный флуоресцентный белок имеет повышенную скорость созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются векторы, включающие нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к кассете экспрессии, включающей нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке.
Дополнительно, предлагаются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или кассеты экспрессии согласно настоящему изобретению.
Дополнительно, предлагаются наборы, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или кассеты экспрессии, которые содержат указанные нуклеиновые кислоты или белки согласно настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 приведена иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) флуоресцентного белка GFPxm.
На фиг.2 приведена иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) флуоресцентного белка Mut2.
На фиг.3 приведена иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) флуоресцентного белка Mut-g9.
На фиг.4 показана относительная яркость колоний E. coli, экспрессирующих флуоресцентный белок GFPxm, Mut2 или Mut-g9 после роста при разных температурах. Температурные условия и время инкубации указаны под гистограммой. Все данные нормализованы относительно яркости колоний, экспрессирующих Mut-g9, после роста в течение 36 часов при температуре 20°С.
На фиг.5 показаны кривые, отображающие флуоресценцию растущих колоний E. coli, экспрессирующих GFPxm (линия 1), Mut2 (линия 2) или Mut-g9 (линия 3) в течение 6 часов после индукции.
На фиг.6 показана иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) tagGFP.
На фиг.7А приведена иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) tagGFP.
На фиг.7B приведена иллюстрация нормализованных спектров возбуждения (линия 1) и эмиссии (линия 2) YFP1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Как использовано в настоящем описании, термин «флуоресцентный белок» относится к белку, который флуоресцирует, то есть он может демонстрировать низкую, умеренную или интенсивную флуоресценцию при облучении светом соответствующей длины волны возбуждения. Флуоресценция, характерная для такого флуоресцентного белка, представляет собой свойство, определяемое флуорофором, где указанный флуорофор возникает при аутокаталитической циклизации двух или более аминокислотных остатков в полипептидном скелете. При этом флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению не включают белки, которые демонстрируют флуоресценцию только за счет тех остатков, которые действуют сами по себе в качестве внутренних флуорофоров, например, за счет триптофана, тирозина и фенилаланина.
Как используется в настоящем описании, термин «флуоресцентное свойство» относится к коэффициенту молярной экстинкции при соответствующей длине волны возбуждения, к квантовой эффективности флуоресценции, к форме спектра возбуждения или спектра эмиссии, к максимуму длины волны возбуждения и максимуму длины волны эмиссии, отношению амплитуд возбуждения при двух разных длинах волн, к соотношению амплитуд эмиссии при двух разных волнах, к длительности возбужденного состояния или к анизотропии флуоресценции. Для оценки используются определяемые различия по любому одному из указанных свойств между GFPxm дикого типа и мутантной формой. Измеряемое различие может быть определено как уровень любого количественно определяемого свойства флуоресценции, например уровень флуоресценции при определенной длине волны или интегральный показатель флуоресценции в спектре эмиссии.
(-2)
(-1)
(-4)
(-1)
Как используется в настоящем описании, термин «уровень созревания» или «скорость созревания» относится к скорости образования зрелого флуоресцентного белка (т.е. флуоресцентного белка, способного создавать флуоресценцию) после трансляции. Уровень созревания может быть охарактеризован периодом созревания. Было обнаружено, что созревание флуоресцентного белка включает две стадии: (i) образование укладки белка, что означает формирование бета-цилиндрической структуры белка с центральной альфа-спиралью, содержащей аминокислоты, которые будут далее образовывать хромофор. Данная стадия в целом характеризуется константой скорости примерно 10с или полупериодом, равным от нескольких секунд до десятков секунд; (ii) созревание хромофора, где указанная стадия включает циклизацию белкового скелета и дегидратацию. Данная стадия обычно характеризуется константой примерно в 10с или полупериодом, равным примерно нескольким секундам. Таким образом, указанная стадия со сниженной скоростью представляет собой ограничивающую стадию в созревании зеленого флуоресцентного белка (Reid BG, Flynn GC, Biochemistry. 1997 V. 36(22), pp. 6786-6791).
A. victoria
Как используется в настоящем описании, термин «GFP» относится к зеленому флуоресцентному белку , включающему ранее известные версии GFP, сконструированные с целью достижения более высокой флуоресценции или флуоресценции в различных цветах. Последовательность GFP дикого типа была описана в Prasher et al., Gene 111 (1992), 229-33.
A. Macrodactyla
Как используется в настоящем описании, термин «GFPxm» относится к зеленому флуоресцентному белку дикого типа.
Как используется в настоящем описании, термин «выделенный» означает молекулу или клетку, которая находится в среде, отличной от среды, в которой существует данная молекула или данная клетка в природе.
Ссылка на нуклеотидную последовательность, «кодирующую» полипептид, означает, что указанная последовательность, при транскрипции и трансляции мРНК, образует полипептид. Данный термин включает как кодирующую цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична мРНК, так и последовательность которая в перечне последовательностей обозначается как комплиментарная цепь, которую используют в качестве матрицы для транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области, указанный термин также включает вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Как используется в настоящем описании, термин «мутант» относится к белку согласно настоящему изобретению, в котором одна или несколько добавленных и/или замещенных, и/или делетированных, и/или вставленных аминокислот на N-конце, и/или на С-конце, и/или внутри нативных аминокислотных последовательностей белков согласно настоящему изобретению. Как используется в настоящем описании, термин «мутант» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант» относится к любому более короткому или более длинному варианту соответствующего белка или соответствующей нуклеиновой кислоты.
Как используется в настоящем описании, термин «гомолог или гомология» представляет собой термин, который широко используется в данной области для описания родства одной нуклеотидной или пептидной последовательности другой нуклеотидной или пептидной последовательности, которое определяется степенью идентичности и/или близости между указанными сравниваемыми последовательностями.
Как используется в настоящем описании, аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность «по существу идентичны» эталонной последовательности, если данная аминокислотная последовательность или данная нуклеотидная последовательность обладает по меньшей мере 90% идентичностью по последовательности (например, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью по последовательности) с эталонной последовательностью в данном окне сравнения. Как используется в настоящем описании, аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность «по существу подобны» эталонной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность или указанная нуклеотидная последовательность характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью по последовательности (например, 80%, 85% 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью по последовательности) с эталонной последовательностью в данном окне сравнения. Идентичность по последовательности рассчитывают относительно эталонной последовательности. Алгоритмы анализа последовательностей известны в данной области и включают такие как программа BLAST, описанная Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, pp. 403-10 (1990).
A. macrodactyla
Как было описано ранее, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантные флуоресцентные белки, а также относится к белкам, кодируемым указанными нуклеиновыми кислотами. Белки, представляющие интерес, по существу идентичны зеленому флуоресцентному белку дикого типа  GFPxm (SEQ ID No 2) и включают по меньшей мере аминокислотное замещение F220L. Указанные мутанты представляют собой функциональные флуоресцентные белки, обладающие повышенной скоростью созревания при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm.
A. macrodactyla
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный мутант включает только замещение F220L. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что замещение F220L приводит к измеримому повышению скорости созревания GFPxm при температуре 20°С или выше в сравнении с GFPxm дикого типа. Авторы настоящего изобретения также показали, что замещение F220L изменяет флуоресцентные свойства белка в сравнении с GFPxm .
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный мутант также включает дополнительные аминокислотные замещения, которые дополнительно повышают скорость созревания белка при температуре 20°С, например данный вариант относится к мутанту, имеющему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No: 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18.
Указанные выше мутации в GFPxm могут быть объединены с мутациями, которые дополнительно повышают способность к образованию укладки, снижают уровень олигомеризации или влияют на спектральные свойства GFPxm и его мутантов, показанных, например, в SEQ ID No: 18-24.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются вектора, включающие нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к кассете экспрессии, включающей нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке.
Представляют также интерес белки и нуклеиновые кислоты, которые по существу подобны указанным выше эталонным специфическим белкам и нуклеиновым кислотам, или к производным или гомологам, или мутантам указанных эталонных специфических белков и нуклеиновых кислот. Дополнительно, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, стабильным клеточным линиям и трансгенным организмам, включающим указанные выше эталонные молекулы нуклеиновой кислоты. Белки и нуклеиновые кислоты рассматриваемого состава могут найти применение во множестве различных направлений и способов и конкретно для мечения клетки и белка. И наконец, в настоящем изобретении предлагаются наборы для применения таких способов и приложений.
Молекулы нуклеиновой кислоты
crodactyla
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидные последовательности, которые кодируют мутантные флуоресцентные белки, которые по существу идентичны зеленому флуоресцентному белку GFPxm A. Ma дикого типа (SEQ ID No: 2) и включают по меньшей мере аминокислотное замещение F220L.
Молекула нуклеиновой кислоты, используемая в настоящем изобретении, представляет собой молекулу ДНК, такую как молекулы геномной ДНК, молекулы кДНК или молекулы РНК, такие как молекулы мРНК.
in vitro
crodactyla
В частности, указанные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы ДНК, включающие открытую рамку считывания, кодирующую флуоресцентный белок согласно настоящему изобретению. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты присутствуют в среде, отличной от их природного окружения; т.е., они являются выделенными, присутствуют в обогащенных количествах или присутствуют, или экспрессируются , или в клетке или в организме, отличающихся от их природного окружения. В предпочтительном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению получают генно-инженерными методами, то есть получают из природного белка, например зеленого флуоресцентного белка GFPxm A. Ma дикого типа путем модификаций.
Модификации, а также добавки или делеции, могут быть встроены любым методом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1992) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 11-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539), Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая ошибочно-направленную ПЦР, перестановку, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, мутагенез с использованием ПЦР на основе спаренных молекул, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный согласованный мутагенез, экспоненциальный согласованный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, случайный мутагенез, генную повторную сборку, генный сайт-насыщенный мутагенез (GSSM), повторную сборку при проведении синтеза лигированием (SLR), или их сочетание. Указанные модификации, добавления или делеции могут быть также встроены способом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательности, мутагенез ДНК путем фосфотиоатной модификации, мутагенез на основе включения матрицы, содержащей урацил, мутагенез на основе дуплекса, содержащего бреши, репарационный мутагенез с точечными ошибочными спариваниями, мутагенез с использованием штамма-хозяина, дефицитного по репарации, химический мутагенез, радиогенный мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с использованием ограничения по селекции, мутагенез с использованием ограничения по очистке, искусственный синтез гена, согласованный мутагенез, создание химерного мультимера нуклеиновой кислоты или их сочетание.
Конкретные молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают нуклеотидные последовательности, кодирующие следующие флуоресцентные белки: Mut 2 (SEQ ID No: 4); Mut 235 (SEQ ID No: 6); Mut 235-1 (SEQ ID No: 8); Mut 235-2 (SEQ ID No: 10); Mut 235-4 (SEQ ID No: 12); Mut-g9 (SEQ ID No: 14); Mut 235-4G6 (SEQ ID No: 16). Кроме того, представляют интерес молекулы нуклеиновой кислоты, включающие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие мутанты Mut-g9, tagGFP (также называемые как macGFP, SEQ ID No: 18), tagCFP (SEQ ID No: 20), tagYFP1 (SEQ ID No: 22) и tagYFP2 (SEQ ID No: 24)), где флуоресцентные свойства указанных мутантов сравнивают с белком Mut-g9.
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные выше белки, приведены в виде SEQ ID No: 3-23.
Каждый из указанных конкретных типов молекул интересующих нуклеиновых кислот описывается более подробно отдельно в разделе «Примеры», приведенном ниже.
Кроме того, в настоящем описании рассматриваются нуклеиновые кислоты, которые гибридизируются с указанными выше нуклеиновыми кислотами в жестких условиях, предпочтительно в условиях высокой жесткости (например, комплементы описанных выше нуклеиновых кислот). Пример соответствующих условий жесткости включает гибридизацию при температуре 50°С или выше и в среде, содержащей 0,1×SSC (15 мМ хлорид натрия/1,5 мМ цитрат натрия). Другой пример условий гибридизации высокой жесткости включает инкубацию в течение ночи при температуре 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат тринатрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 7,6), 5×раствор Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 мкг/мл денатурированной обработанной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой в 0,1×SSC при температуре 65°С. Другие варианты гибридизации в условиях высокой жесткости известны в данной области и могут быть также использованы для идентификации нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению.
Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, кодирующих белки согласно настоящему изобретению. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замещения кодонов нуклеиновой кислоты, которые отличаются от кодонов, кодирующих те же самые аминокислоты. В частности, получают вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые повышают экспрессию в клетке-хозяине. В указанном варианте осуществления изобретения кодоны нуклеиновой кислоты, которые являются не предпочтительными или менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, замещают кодонами, которые представлены в повышенных количествах в кодирующих последовательностях в генах клетки-хозяина, где указанные замещенные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем нуклеиновые кислоты являются гуманизированными. В контексте настоящего описания термин «гуманизированный» относится к изменениям, вводимым в последовательность нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов с целью экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также патент США No. 5795737, в котором описывается процесс гуманизации белков.
nd
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, соответствующие кДНК, гены полной длины и конструкции могут быть получены путем синтеза с использованием множества различных процедур, известных в данной области. Соответствующие конструкции нуклеиновой кислоты очищают с использованием стандартных методик рекомбинантных ДНК, описанных, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), и нормативов, описанных в руководстве Национального Института здоровья США (United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research).
Было показано, что флуоресцентные белки могут быть генетически слиты с другими целевыми белками и использованы в качестве маркеров для идентификации локализации и количества получаемого целевого белка. Соответственно настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим белки слияния, которые включают флуоресцентный белок и дополнительные аминокислотные последовательности. Такие последовательности могут достигать, в частности, примерно до 15, примерно до 100, примерно до 200 или примерно до 1000 аминокислот в длину. Указанные белки слияния обладают способностью флуоресцировать, что определяется частью флуоресцентного белка.
in vivo
В настоящем изобретении также предлагается вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, включающие рассматриваемые нуклеиновые кислоты. Соответствующие векторы включают вирусные векторы и векторы невирусной природы, плазмиды, космиды, фаги и т.п., предпочтительно плазмиды, используемые для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.п. последовательности нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в соответствующей клетке-хозяине. Выбор подходящего вектора может сделать любой специалист со средним уровнем знаний в данной области, и многие такие векторы коммерчески доступны. Для получения конструкций частичную нуклеиновую кислоту или полноразмерную нуклеиновую кислоту встраивают в вектор, в типичном случае за счет присоединения с помощью ДНК-лигазы к сайту расщепления рестрикционным ферментом в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть встроена путем гомологичной рекомбинации , в типичном случае за счет присоединения участков гомологии к вектору на границах желательной нуклеотидной последовательности. Участки гомологии добавляют путем лигирования олигонуклеотидов или по процедуре полимеразно-цепьевой реакции с использованием праймеров, включающих как участок гомологии, так и, например, часть желательной нуклеотидной последовательности.
В настоящем изобретении также рассматриваются кассеты или системы экспрессии, используемые, в том числе, для получения целевых флуоресцентных белков или их белков слияния, или для репликации целевых молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать в виде внехромосомного элемента или может быть интегрирована в геном клетки в результате встраивания такой кассеты экспрессии в клетку. В процессе экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению, экспрессируется в любой подходящей системе экспрессии, включающей, например, бактериальную систему, дрожжевую систему, системы экспрессии в насекомых, амфибиях или млекопитающих. В векторе экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.
Клеточные линии, стабильно экспрессирующие белки согласно настоящему изобретению, могут быть выбраны в соответствии с известными в данной области методиками (например, путем совместной трансфекции с использованием селектируемого маркера, такого как dhfr, gpt, неомицин или гигромицин, который позволяет идентифицировать и выделить трансфицированные, которые содержат ген, интегрированный в геном).
E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae,
Xenopus oocytes
Указанные выше системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как клетки клетки насекомых в сочетании с векторами на основе бакуловируса или могут использоваться клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, HEK 293, CHO,  и т.п.
В том случае, когда любые указанные выше клетки-хозяева или другие подходящие клетки-хозяева или организмы используют для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид входят в область настоящего изобретения в качестве продукта клетки-хозяина или организма-хозяина. Указанный продукт может быть выделен известными в данной области процедурами.
Белки
crodactyla
Настоящее изобретение также относится к функциональным флуоресцентным мутантным белкам, аминокислотная последовательность которых по существу идентична аминокислотной последовательности GFPxm A. Ma (SEQ ID No: 2) и которые отличаются от SEQ ID No: 2 по меньшей мере аминокислотным замещением F220L. Указанные функциональные флуоресцентные мутантные белки имеют повышенную скорость созревания при температуре 20°C или выше в сравнении с GFPxm.
macrodactyla
crodactyla.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемый в нем флуоресцентный белок включает только одно замещение F220L в сравнении с SEQ ID NO: 2 и имеет повышенный уровень созревания, в сравнении с GFPxm А. . В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный флуоресцентный белок может обладать измененными флуоресцентными свойствами в сравнении с GFPxm A. Ma
В другом предпочтительном варианте замещение F220L объединено с другими мутациями, введенными для улучшения свойств белка. Например, разные сочетания аминокислотных замещений, выбранные из группы, состоящей из K3G, E6D, T9A, P58T, F99L, F99H, M128K, M128E, I136M, Y151H, N144S, K162E, K156M, T214A, G228C, G228S и K238R, дополнительно повышают скорость созревания белка при температуре 20°С или выше, как показано в разделе «Примеры».
Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения целевые белки обладают максимумом поглощения в диапазоне примерно от 300 до 700 нм, обычно в диапазоне примерно от 350 до 650 нм и чаще в диапазоне примерно от 400 до 600 нм. Целевые белки представляют собой флуоресцентные белки, где указанный термин означает, что они могут возбуждаться при одной длине волны света, после чего они испускают свет другой длины волны. Спектры возбуждения целевых белков варьируют в типичном случае в диапазоне примерно от 300 до 700 нм. Целевые белки в основном имеют максимальный коэффициент экстинкции примерно от 25000 до 150000 и обычно в диапазоне примерно от 45000 до 129000. Целевые белки в типичном случае имеют длину примерно от 150 до 300 аминокислот и обычно примерно от 200 до 300 аминокислотных остатков и в основном имеют молекулярный вес в диапазоне примерно от 15 до 35 кДа, обычно в диапазоне примерно от 17,5 до 32,5 кДа.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения целевые белки представляют собой яркосветящиеся белки, где яркость в данном случае означает, что флуоресценция белка может быть выявлена обычными методами (например, при визуальном скрининге, спектрофотометрией, спектрофлуориметрией, с использованием флуоресцентного микроскопа, флуоресцентного сортировщика (FACS) и т.п.). Флуоресцентная яркость конкретных флуоресцентных белков определяется по их квантовому выходу, умноженному на коэффициент максимальной экстинкции.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения целевые белки характеризуются повышенной скоростью созревания при температуре 20°C или выше, в сравнении с GFPxm. Скорость созревания может быть определена как время, необходимое для того, чтобы белки достигли своей третичной структуры, которая определяет их флуоресцирующие качества в определенный период времени. Иными словами, скорость созревания флуоресцентного белка может быть оценена по интенсивности флуоресценции клеток-хозяев, экспрессирующих целевой белок, после определенного периода времени, прошедшего после трансфекции клетки-хозяина конструкцией экспрессии, способной экспрессировать указанный флуоресцентный белок.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения целевые белки имеют повышенную скорость созревания при температуре 20°C или выше, предпочтительно при температуре 30°C или выше и наиболее предпочтительно при температуре в диапазоне от 35°C до 39°C, например, при температуре 37°C. Хорошо известно, что многие клетки, включая клетки млекопитающих, инкубируют при температуре примерно 37°C, с тем чтобы сохранить оптимальный и/или физиологический приемлемый рост. Клеточные линии, происходящие из разных организмов или тканей, могут иметь различные релевантные температуры, варьирующие от примерно 35°C для фибробластов, до примерно 38°C-39°C для бета-клеток мышей.
E. coli
E. coli
Так, например, для сравнения скоростей созревания флуоресцентных белков при разных температурах может быть использован следующий подход: клетки-хозяева (например, бактериальные клетки, предпочтительно клетки ) трансфицируют вектором экспрессии, кодирующим флуоресцентный белок, под контролем подходящего промотора. В определенном варианте экспрессия флуоресцентного белка начинается сразу же после трансфекции (в том случае, когда используют конститутивный промотор, или в связи с проникновением индуцибельного промотора). В другом варианте экспрессию флуоресцентного белка индуцируют по методу, известному в данной области. Клетки-хозяева растят на чашках Петри при температуре 20°C, 30°C или 37°C в течение определенных периодов времени (например, в течение 36, 24 и 12 часов после начала экспрессии флуоресцентного белка), определяют флуоресценцию колоний , обычными методами (например, при визуальном скрининге, спектрофотометрией, спектрофлуориметрией, с использованием флуоресцентного микроскопа, флуоресцентного сортировщика (FACS) и т.п.) и рассчитывают яркость флуоресценции.
Конкретные белки, представляющие интерес в контексте настоящего изобретения, включают мутантные зеленые флуоресцентные белки: Mut 2 (SEQ ID No: 4); Mut 235 (SEQ ID No: 6); Mut 235-1 (SEQ ID No: 8); Mut 235-2 (SEQ ID No: 10); Mut 235-4 (SEQ ID No: 12); Mut-g9 (SEQ ID No: 14) и Mut 235-4G6 (SEQ ID No: 16). Конкретные белки, представляющие интерес, имеют большую скорость созревания при температуре 20°С или выше, чем белок GFPxm.
Конкретные интересующие белки обсуждаются более подробно в разделе «Примеры», приведенном ниже.
Белки, которые по существу подобны или по существу идентичны специфическим аминокислотным последовательностям согласно настоящему изобретению, то есть SEQ ID No:4-16, также рассматриваются в настоящем изобретении. Идентичность по последовательности вычисляют на основе эталонной последовательности по методике, включающей использованием алгоритма MegAlign, DNAstar clustal, описанного в соответствующей работе Хиггинса и Шарпа «Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer», CABIOS, 5 pp. 151-3 (1989)) (с использованием параметров: ktuple 1, штраф за наличие бреши 3, окно 5 и сохраненные диагонали 5). Во многих вариантах осуществления настоящего изобретения представляющие интерес аминокислотные последовательности характеризуются значительной идентичностью по последовательности, которая составляет, например, 93%, 95%, 97%, 99%, 100%, в особенности это относится к последовательности аминокислот, которые обеспечивают функциональные участки белка.
in vivo
in vitro
Белки, представляющие собой мутанты указанных выше белков, также рассматриваются в настоящем изобретении. Мутанты могут сохранять биологические свойства белков из того источника, из которого они были получены, или могут обладать биологическим свойствами, которые отличаются от белков дикого типа. Термин «биологическое свойство» белков согласно настоящему изобретению относится, без ограничения, к флуоресцентным свойствам; биохимическим свойствам, таким как стабильность  и/или  (например, период полувыведения); скорость созревания; тенденция к агрегации или олигомеризации, а также другие подобные свойства. Мутации включают изменения одной аминокислоты, делеции или вставки одной или нескольких аминокислот; N-концевые усечения или расширения, С-концевые усечения или расширения и т.п.
Мутанты могут быть получены с использованием стандартных методик молекулярной биологии, таких как подробно описанные выше в разделе «Молекулы нуклеиновой кислоты». Приведенные в настоящем описании мутанты включают следующие:
(1) Мутант Mut-g9 с усиленными флуоресцентными свойствами, включающий замещения I167T, F223S, S65C и F64L относительно Mut-g9 (SEQ ID No: 14). Указанный мутант также имеет повышенную скорость созревания в сравнении с белками GFPxm и Mut-9. Аминокислотная последовательность указанного мутанта, названного как tagGFP (также macGFP), также показана в SEQ ID No: 18.
(2) Мутант tagGFP со сдвигом голубой области в спектре флуоресценции, который включает замещения C65A, Y66W, L99H, I123V, K128E, D129G, F145A, N146I, H148D, V163A, T167I, T203C, T205S, C227Y, в сравнении с tagGFP. Аминокислотная последовательность указанного мутанта, названная как tagCFP, приведена в SEQ ID No: 20.
(3) Мутант tagGFP со сдвигом желтой части в спектре флуоресценции, который включает замещения C65T, I68V, E76K, M153T, F224V, C228S и T203Y в сравнении с tagGFP. Аминокислотная последовательность указанного мутанта, названная как tagYFP, приведена в SEQ ID No: 22.
На основе руководства, приведенного в примерах и с использованием стандартных методик, любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может легко создать большое множество дополнительных мутантов и исследовать их на наличие изменения биологического свойства (например, биохимического, спектрального и т.п.). Например, может быть измерена интенсивность флуоресценции с использованием спектрофотометра при разных длинах волн возбуждения.
Белки согласно настоящему изобретению находятся в изолированной форме, то есть это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагмента и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу. В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную по меньшей мере 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.
В предпочтительном варианте целевые белки получают методом синтеза, например путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, которая кодирует представляющий интерес белок в подходящей клетке-хозяине, как было указано выше. Может использоваться любая удобная процедура очистки белка, где подходящие методики очистки белка описаны в соответствующем руководстве Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Например, может быть получен лизат из исходного источника и далее подвергнут очистке с использованием методики ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п.
В настоящем изобретении также описываются белки слияния, включающие белок согласно настоящему изобретению или его функциональные фрагменты, слитые, например, с последовательностью, полученной после деградации, с последовательностью субклеточной локализации (например, такой как сигнал ядерной локализации, сигнал пероксимального нацеливания, последовательность, направленная на аппарат Гольджи, последовательность, направленная на митохондрии, и т.п.), с сигнальным пептидом, или любым белком, или полипептидом, представляющим интерес. Белки слияния могут включать, например, флуоресцентный белок согласно настоящему изобретению и второй полипептид («партнер слияния»), слитые в рамке считывания с N-концом и/или С-концом флуоресцентного белка. Партнеры слияния включают, без ограничения, полипептиды, которые могут связываться с антителами, специфичными к партнеру слияния (например, эпитопными метками), с антителами или их связывающими фрагментами, с полипептидами, которые обеспечивают каталитическую функцию или индуцируют клеточный ответ, лигандами, или рецепторами, или их миметиками и т.п.
rd
2
В настоящем изобретении также рассматриваются антитела, которые специфически связываются с флуоресцентными белками согласно настоящему изобретению. Подходящие антитела могут быть получены с использованием методик, известных в данной области. Например, поликлональные антитела могут быть получены по методике, описанной в приведенной ниже работе (Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), а моноклональные антитела могут быть получены по методике, описанной в приведенной ниже работе (Goding Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3 edition, (1996) Academic Press). Химерные антитела, включающие гуманизированные антитела, а также одноцепочечные антитела и фрагменты антител, такие как Fv, F(ab') и FAb, также представляют интерес.
Трансгенные организмы
Escherichia coli, Streptomyces
Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут использоваться для создания трансгенных организмов или для сайт-специфических генных модификаций клеточных линий. Трансгенные клетки согласно настоящему изобретению включают одну или несколько нуклеиновых кислот, рассматриваемых в настоящем изобретении, которые присутствуют в качестве трансгена. Для целей настоящего изобретения может использоваться любая подходящая клетка-хозяин, включающая прокариотические (например, sp.,  и т.п.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенные организмы согласно настоящему изобретению могут представлять прокариотические или эукариотические организмы, включающие бактерии, цианобактерии, грибы, растения и животные, в которые вводится одна или большее число клеток организма, содержащего гетерологичную нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, путем встраивания ее за счет манипуляции человеком, например, в рамках трансгенных методик, известных в данной области.
nd
Выделенная нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может быть встроена в организм-хозяин с использованием методик, известных в данной области, например, путем инфекции, трансфекции, трансформации или трансконъюгации. Методики переноса молекул нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в такие организмы хорошо известны и описаны в стандартных руководствах, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
nd
В одном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенный организм может представлять собой прокариотический организм. Способы трансформации прокариотических хозяйских клеток хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный трансгенный организм может представлять собой гриб, например дрожжи. Дрожжи широко используются в качестве носителя для гетерологичной генной экспрессии (см., например, Goodey et al., Yeast biotechnology, D.R. Berry et al., eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp. 401-429, и Kong et al., Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton and G. T. Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp. 107-133). Доступно несколько типов дрожжевых векторов, включающих интегрирующиеся векторы, которые требуют рекомбинации с геномом-хозяином для своего поддержания, а также автономно реплицирующиеся плазмидные векторы.
nd
rd
nd
nd
Другим организмом-хозяином является организм животного. Трансгенные животные могут быть получены с использованием трансгенных методик, известных в данной области и описанных в стандартных руководствах (таких как: Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, 2 edition (2003) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vinterstein, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3 ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2 Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Ptactical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2 edition (2000)). Например, трансгенные животные могут быть получены посредством гомологичной рекомбинации, в рамках которой меняется эндогенный локус. Альтернативно, конструкцию нуклеиновой кислоты интегрируют в случайном режиме в геном. Векторы для стабильной интеграции включают плазмиды, ретровирусы и другие вирусы животных, YAC и т.п.
in vitro
Нуклеиновая кислота может быть введена в клетку, непосредственно или опосредованно, за счет введения в предшественник клетки, с помощью осторожной генетической манипуляции, такой как микроинъекция, или с помощью инфекции рекомбинантным вирусом или с использованием рекомбинантного вирусного вектора и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классический кроссбридинг или оплодотворение , но, скорее, обозначает введение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК.
Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации включают по меньшей мере часть нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, где указанный ген содержит желательную одну или несколько генетических модификаций и включает участки гомологии к целевому локусу. В конструкции ДНК для проведения случайной интеграции нет необходимости включать участки гомологии для облегчения рекомбинации. Могут быть также включены маркеры позитивной и негативной селекции. Способы получения клеток, содержащих целевые генные модификации, посредством гомологической рекомбинации, известны в данной области. Различные методики трансфекции клеток млекопитающих описаны, например, в работе Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537).
В случае эмбриональных стволовых клеток (ES) может быть использована клеточная линия ES или эмбриональные клетки могут быть получены в свежем виде от организма-хозяина, такого как мышь, крыса, морская свинка и т.п. Такие клетки выращивают на соответствующем питательном слое для фибробластов или выращивают в присутствии фактора ингибирования лейкозных клеток (LIF). Трансформированные ES или эмбриональные клетки могут быть использованы для создания трансгенных животных с использованием соответствующей методики, известной в данной области.
Трансгенные животные могут представлять собой любых животных, отличных от человека, включая млекопитающее, отличное от человека (например, мышь, крыса), птицу или земноводное и т.п., и используются в функциональных исследованиях, при скрининге лекарственных препаратов и т.п. Репрезентативные примеры использования трансгенных животных включают следующие описанные ниже варианты.
Могут быть также получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах № 5767367, 5750870, 5739409, 5689049, 5689045, 5674731, 5656466, 5633155, 5629470, 5595896, 5576198, 5538879 и 5484956, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылок. Способы получения трансгенных растения обобщены также в следующих обзорах: Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons (1993) pp. 275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz) (2002) 719 p.
Для получения трансгенного организма-хозяина могут использоваться, например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки. После сбора клеток или тканей интересующую экзогенную ДНК вводят в растительные клетки, и для такого введения доступно множество различных методик. При наличии выделенных протопластов возникает возможность введения с использованием ДНК-опосредованных протоколов генного переноса, включающих инкубирование протопластов с оголенной ДНК, такой как плазмида, включающей экзогенную кодирующую последовательность, представляющую интерес, в присутствии поливалентных катионов (например, ПЭГ или PLO); или по методу электропорации протопластов в присутствии оголенной ДНК, включающей интересующую экзогенную последовательность. Далее отбирают протопласты, которые успешно захватили экзогенную ДНК, растят их до образования калюса и в итоге получают трансгенные растения посредством контакта с соответствующими количествами и взятыми в соответствующих соотношениях стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокинины.
Могут использоваться другие подходящие методы получения растений, такие как подход, основанный на использовании «генной пушки», или трансформация, опосредованная использованием Agrobacterium, известные специалистам в данной области.
Способы использования
Флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению (а также другие компоненты согласно настоящему изобретению, описанные выше) нашли использование во множестве различных приложений. Репрезентативные направления применения каждого из указанных типов белков будут описаны ниже, где дано описание конкретных видов использования с соответствующими примерами, которые никоим образом не следует трактовать в качестве ограничивающих возможности использования белков согласно настоящему изобретению.
in vivo
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, относящемся к способам мечения белка, клетки или клеточной органеллы целевые белки могут найти применение в качестве меток  (или репортерных молекул) в клеточных тестах и других тестах молекулярной биологии. Представляющие интерес тесты включают, без ограничения, тесты для выявления генной экспрессии, локализации белка и совместной локализации белка, белок-белковых взаимодействий, взаимодействий по типу белок-нуклеиновая кислота, взаимодействий по типу нуклеиновая кислота-нуклеиновая кислота, локализации клетки и клеточной органеллы и их взаимодействия и т.п. Флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению могут найти применение в качестве белковых меток или меток для клеточных органелл в живых и фиксированных клетках, в качестве маркеров слияния клеток или органелл, в качестве маркеров целостности клетки или органеллы, в качестве маркеров трансфекции (например, в качестве меток для селекции трансфицированных клеток, содержащих вектор экспрессии, кодирующий по меньшей мере один флуоресцентный белок согласно настоящему изобретению) и в качестве зондов в масштабе реального времени, действующих в концентрациях, близких к физиологическим, и т.п.
Например, целевые белки нашли применение для идентификации и/или измерения уровней экспрессии, представляющих интерес белка или полипептидов в биологическом материале. Указанный способ включает: i) введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует флуоресцентный белок согласно настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты оперативно связана и находится под контролем последовательности экспрессии, которая регулирует экспрессию белка или полипептида. представляющих интерес; ii) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в соответствующих условиях; и iii) обнаружение флуоресцентной эмиссии флуоресцентного белка как средства измерения уровня экспрессии белка, представляющего интерес.
Рассматриваемые в настоящем изобретении белки также нашли применение для выявления локализации интересующего белка или полипептида в биологическом материале. Указанный способ включает: i) введение в клетку молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует флуоресцентный белок согласно настоящему изобретению, где указанная молекула нуклеиновой кислоты слита с последовательностью, кодирующей интересующий белок или полипептид, оперативно связана с ним и находится под контролем соответствующей последовательности контроля экспрессии; ii) культивирование клетки в условиях, подходящих для экспрессии интересующего белка; и iii) выявление наличия флуоресцентной эмиссии флуоресцентного белка как средства определения локализации интересующего белка.
Представляющие интерес варианты применения включают использование целевых белков в методах резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В процедурах данных методик целевые белки служат в качестве донора и/или акцепторов в сочетании со вторым флуоресцентным белком или красителем, например флуоресцентным белком, описанным в работе Матца с соавт. (Matz et al., Nature Biotechnology 17: 969-973 (1999)); другими флуоресцентными красителями, такими как кумарин и его производные, 7-амино-4-метилкумарин и аминокумарин; bodipy красителями; каскадным синим; или флуоресцеином и его производными, такими как изотиоцианат флуоресцина и орегоновый зеленый; родаминовыми красителями, такими как техасский красный, тетраметилродамин, эозины и эритроцины; цианиновыми красителями, такими как Cy3 и Cy5; макроциклическими хелатами лентанинда ионов, такими как квантовый краситель; а также хемилюминесцентными красителями, такими как люциферазы, включая люциферазы, описанные в патентах США № 5843746, 5700673, 5674713, 5618722, 5418155, 5330906, 5229285, 5221623 и 5182202, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Конкретные примеры направлений применения, в которых могут использоваться методы FRET анализа, использующие целевые флуоресцентные белки, включают, без ограничения, варианты применения, описанные в патентах США No. 6008373, 5998146, 5981200, 5945526, 5945283, 5911952, 5869255, 5866336, 5863727, 5728528, 5707804, 5688648 и 5439797, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению нашли использование в способе выявления эффектов исследуемого вещества на регуляцию экспрессии и/или транслокации одного или нескольких белков, представляющих определенный интерес, в клетке. Альтернативно, они могут найти применение в способе выявления экспрессии интересующего белка и сопутствующей активности контрольной последовательности экспрессии в ответ на введение исследуемого вещества. Указанные флуоресцентные белки также могут найти применение в способе сравнения активности двух или более контрольных последовательностей экспрессии в клетке в ответ на введение исследуемого вещества. Такие способы могут быть осуществлены в присутствии, и также в отсутствие исследуемого вещества, эффект которого на данный процесс подлежит измерению.
Флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению нашли также использование в вариантах применения, включающих автоматизированный скрининг чипов, содержащих клетки, которые экспрессируют флуоресцентные репортерные группы, в рамках методов микроскопии и электронного анализа. Указанный скрининг может быть использован для обнаружения нужного лекарственного средства, а также в области функциональных геномных исследований, где указанные целевые белки используются в качестве маркеров целых клеток для выявления изменений многоклеточной реорганизации и миграции, например, при образовании многоклеточных трубочек (при образовании кровеносных сосудов) эндотелиальными клетками, для исследования миграции клеток через систему Fluoroblok (Becton Dickinson Co.), для заживлении ран или в процессах прорастания нейритов. Скрининг может также проводиться в тех случаях, когда белки согласно настоящему изобретению используются в качестве маркеров, слитых с пептидами (такими как направленные последовательности) или с белками, которые позволяют выявить изменения во внутриклеточной локализации, в качестве индикатора клеточной активности, например, в процессе сигнальной трансдукции, такой как транслокация киназы и фактора транскрипции при воздействии определенных стимулов. Соответствующие примеры включают белок киназы С, белок киназы А, факторы транскрипции NFkB и NFAT; белки, участвующие в клеточном цикле, такие как циклин A, циклин B1, циклин E; процесс протеазного расщепления с последующим перемещением расщепленного субстрата; фосфолипиды с маркерами для внутриклеточных структур, таких как эндоплазматический ретикулюм, аппарат Гольджи, митохондрии, пероксисомы, ядро, ядрышки, плазматическая мембрана, гистоны, эндосомы, лизосомы или микротрубочки.
Белки согласно настоящему изобретению могут также использоваться в масштабном скрининге для выявления совместной локализации других флуоресцентных белков слияния с маркерами локализации, как индикаторы движения внутриклеточных флуоресцентных белков и/или пептидов или только как маркеры. Примеры соответствующих приложений, которые включают автоматический скрининг чипов с клетками, в которых содержатся целевые флуоресцентные белки, включают описание их применения в патенте США № 5989835, а также в документах WO 0017624, WO 00/26408, WO 00/17643 и WO 00/03246, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Флуоресцентные белки согласно настоящему изобретению также находят применение в крупномасштабных скрининг-тестах. Целевые флуоресцентные белки представляют собой стабильные белки с периодами полувыведения более чем 24 часа. В настоящем описании также предлагаются дестабилизированные варианты целевых флуоресцентных белков со сниженным периодом полувыведения, которые могут использоваться в качестве репортеров транскрипции для выявления лекарственного средства. Например, белок согласно настоящему изобретению может быть слит с предполагаемой протеолитической сигнальной последовательностью, полученной из белка с более коротким периодом полувыведения, таким как последовательность PEST из мышиного гена орнитиндекарбоксилазы, вариант деструкции мышиного циклина В1 или убихитин и т.п. Описание дестабилизированных белков и векторов, которые могут использоваться для их получения, приведено в патенте США № 6130313, описание которого включено в настоящее изобретение в качестве ссылки. Промоторы для пути сигнальной трансдукции могут быть выявлены с использованием дестабилизированных вариантов целевых флуоресцентных белков, применяемых для скрининга лекарственных средств, таких как, например, AP1, NFAT, NFkB, Smad, STAT, p53, E2F, Rb, myc, CRE, ER, GR и TRE и т.п.
Целевые белки могут использоваться в качестве детекторов вторичных мессенджеров путем слияния целевых белков со специфическими доменами, такими как PKCgamma домен связывания кальция, PKCgamma домен связывания DAG, домен SH2 или домен SH3 и т.п.
Секретируемые формы целевых белков, которые, в свою очередь, могут использоваться во многих различных приложениях, могут быть получены путем слияния секретируемых лидерных последовательностей с целевыми белками.
Целевые белки также нашли применение в приложениях, связанных с сортировкой активированных клеток по флуоресценции (FACS). В таких вариантах применения целевой флуоресцентный белок использует как метку для маркирования популяции клеток и полученную меченую популяцию клеток затем сортируют с использованием флуоресцентного устройства для сортировки флуоресцентных активированных клеток, как это известно в данной области. Методы FACS описаны в патентах США № 5968738 и 5804387, описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
in vivo
Целевые белки также находят применение в качестве меток  для трансгенных животных. Так, например, экспрессия целевого белка может быть осуществлена с использованием тканеспецифических промоторов, и такие методы находят использование при исследовании в области генной терапии, таких как оценка эффективности трансгенной экспрессии, в числе других применений. Репрезентативное применение флуоресцентных белков с использованием трансгенных животных, которое иллюстрирует такой вариант применения, описано в WO 00/02997, описание которого включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Дополнительное направление применения белков согласно настоящему изобретению включает использование в качестве маркеров после их инъекции в клетки или животным и при калибровке для проведения количественных измерений, в качестве маркеров или репортеров в биосенсорных устройствах, функционирующих на основе кислорода, для мониторинга жизнеспособности клеток и в качестве маркеров или меток в случае животных, домашних питомцев, игрушек, пищи и т.п.
+2
Целевые флуоресцентные белки также находят применение в качестве биосенсоров в прокариотических и эукариотческих клетках, таких как индикатор иона Ca, индикатора величины рН, индикатор фосфорилирования или индикатор других ионов, таких как ионы магния, натрия, калия, хлорида и галогенидов. Методы использования флуоресцентных белков в качестве сенсоров также включают соответствующие методы, описанные в патентах США № 5972638, 5824485 и 5650135 (а также содержащиеся в них ссылки), описание которых включено в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Целевые флуоресцентные белки также находят применение в качестве источника перестроенных в системе кровотока флуоресцентных белков и их биосенсеров. Методы получения и использования флуоресцентных белков, перестроенных в кровотоке, описаны в литературе Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, V. 98(6), pp. 3197-3202, Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2004, V. 101(29), pp. 10554-10559, Filippin et al., J. Biol. Chem., 2003, V. 278(40), pp. 39224-34; и патенты США № 6469154 и 6699687, полное описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Антитела согласно настоящему изобретению, описанные выше, также находят использование во множестве применений, включающих дифференциацию целевых белков от других флуоресцентных белков.
Наборы
В настоящем изобретении также рассматриваются наборы в практике осуществления одного или нескольких направлений их применения. В предпочтительных вариантах наборы могут использоваться для мечения белков. Указанные наборы в типичном случае включают белок согласно настоящему изобретению в качестве такового или нуклеиновую кислоту, кодирующую данный белок, предпочтительно с элементами экспрессии целевых белков, например, включая конструкцию, такую как вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую целевой белок. Указанные компоненты набора в типичном случае присутствуют в подходящей для хранения среде, такой как забуференный раствор, в типичном случае в подходящем контейнере. Также в наборе могут содержаться антитела, специфичные для предлагаемого белка. В некоторых вариантах указанный набор включает множество различных векторов, каждый из которых кодирует целевой белок, где указанные векторы разработаны для целей экспрессии в разных средах и/или в разных условиях, таких как, например, конститутивная экспрессия, где указанный вектор включает сильный промотор для экспрессии в клетках млекопитающих, или беспромоторный вектор с сайтом множественного клонирования для обычного встраивания промотора и пролонгированной экспрессии и т.п.
Кроме указанных выше компонентов целевые наборы также включают инструкции для осуществления предлагаемых методов. Инструкции могут присутствовать в целевых наборах в разных формах, где в каждом наборе может присутствовать одна или несколько таких форм.
Приведенный ниже пример дан для целей иллюстрации и не должен быть интерпретирован в плане ограничения.
Примеры
Пример 1
Получение нуклеиновых кислот, кодирующих мутантные флуоресцентные белки GFPxm
A. macrodactyla
Получают методом синтеза нуклеиновую кислоту, кодирующую GFPxm  дикого типа. Для повышения выхода белка в системах эукариотической экспрессии проводят однократную гуманизацию гена GFPxm. Нуклеотидный и аминокислотный состав гуманизированного GFPxm показан в виде SEQ ID No: 1, 2.
E. coli
E. coli
Проводят дальнейший случайный мутагенез с получением библиотеки случайно мутированных вариантов GFPxm с использованием набора для случайного мутагенеза на основе ПЦР Diversity PCR Random Mutagenesis (CLONTECH) в условиях, оптимальных для достижения 3-4 мутаций на 1000 п.н. Продукты ПЦР клонируют в векторе pQE30 (Qiagen) и трансформируют в клетки  (штамм XL1-blue). Колонии , экспрессирующие мутантные белки, растят при температуре 37°С и подвергают визуальному скринингу с использованием флуоресцентного стереомикроскопа SZX-12 (Olympus) после 12-24 часов роста.
При первом пассаже отбирают клон, обладающий наиболее яркой флуоресценцией после 18 часов роста клеток. Последовательность вставки нуклеиновой кислоты из данного клона указывает на то, что она включает замещение F220L в сравнении с белком GFPxm. Нуклеотидный и аминокислотный состав указанного белка, названного Mut2, показаны в виде SEQ ID No: 3,4.
Нуклеиновую кислоту Mut 2 подвергают нескольким дополнительным раундам случайного мутагенеза, в результате которого получают следующие мутанты: (i) второй раунд: Mut 235 (SEQ ID No: 5, 6); (ii) третий раунд: Mut 235-1 (SEQ ID No: 7, 8); Mut 235-2 (SEQ ID No: 9, 10); Mut 235-4 (SEQ ID No: 11, 12); (iii) четвертый раунд Mut-g9 (SEQ ID No: 13, 14) и Mut 235-4G6 (SEQ ID No: 15, 16). На основании визуального скрининга делается вывод, что мутант Mut-g9, включающий аминокислотные замещения F220L/K3G/T9A/F99L/M128K/N144S/K162E/T214A/G228C/K238R (в сравнении с GFPxm), созревает быстрее при температуре 37°С, чем другие исследованные мутанты.
Пример 2
Характеристика мутантных флуоресцентных белков
E. coli
Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки GFPxm, Mut 2 и Mut-g9, получают по процедуре примера 1. Как было описано выше, указанные нуклеиновые кислоты клонируют в векторе экспрессии pQE30 (Qiagen) с получением рекомбинантного белка, содержащего шестигистидиновую метку на N-конце. После экспрессии в белки очищают с помощью аффинной хроматографии на смоле, содержащей TALON (Clontech). Получают спектр возбуждения-эмиссии с использованием спектрофотометра Varian Cary Eclipse Fluorescence. Спектры возбуждения-эмиссии для данных белков приведены на фиг.1-3. Было показано, что мутация F220L изменяет флуоресцентные свойства флуоресцентного белка.
in vivo
E. coli
Были охарактеризованы скорости созревания указанных белков в двух системах . В рамках первого эксперимента клетки  (штамм XL1-blue) трансформируют плазмидой pQE30 (Qiagen), кодирующей соответствующие флуоресцентные белки под контролем промотора Т5, и растят в чашках Петри при температурах 20, 30 или 37°С в течение 36, 24 и 12 часов соответственно. В рамках использованной системы флуоресцентный белок постоянно экспрессируется и созревает в процессе роста E. coli за счет проникновения промотора. После завершения роста в указанных условиях флуоресцирующие колонии фотографируют с использованием флуоресцентного стереомикроскопа Olympus US SZX12, снабженного камерой Olympus DP50. Вычисляют яркость колоний с использованием программного обеспечения ImageJ. Результаты измерения показаны на видеогистограмме на фиг.4.
E. coli
В другом эксперименте отдельные колонии , содержащие векторы, которые кодируют флуоресцентный белок, растят на среде LB с добавкой 2% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина в течение 5 часов, центрифугируют и помещают в ТрисHCl буфер, pH 7,5, содержащий 100 мМ NaCl. Индуцируют экспрессию интенсивно флуоресцирующего белка при температуре 37°С за счет добавления IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Проводят мониторинг нарастания флуоресцентного сигнала при температуре 37°С, определяемого экспрессией и мутацией синтезированного флуоресцентного белка, с использованием флуоресцентного спектрофотометра Varian Cary Eclipse Fluorescence и программного обеспечения Kinetics в течение 6 часов (фиг.5.).
В обеих экспериментальных системах скорость созревания белков повышается в указанном порядке: GFPxm<Mut 2<Mut-g9 (фиг.4, 5).
Пример 3
Мутагенез Mut-g9
По процедуре примера 1 получают нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Mut-g9 и подвергают сайт-направленному мутагенезу с получением вариантов, характеризующихся измененными флуоресцентными свойствами и сниженной способностью образовывать димеры. В результате получают белок tagGFP (SEQ ID No: 17,18), содержащий следующие аминокислотные замещения (в сравнении с Mut-g9): I167T, F223S, S65C, F64L. Спектры возбуждения-эмиссии данного белка показаны на фиг.6. Скорость созревания указанного белка была выше, чем соответствующий показатель для белков GFPxm, Mut2 и Mut-g9. Скорость созревания определяют по процедуре, описанной в примере 2.
E. coli
Дополнительно варианты tagGFP, характеризующиеся измененными спектрами флуоресценции, получают путем сайт-направленного мутагенеза в положениях T203 и Y66, что приводит к образованию варианта со сдвигом в желтой части спектра (пик возбуждения/эмиссии при 502/521 нм), включающего замещения T203Y и F224V, и варианта со сдвигом в голубой части спектра (пик возбуждения/эмиссии при 430/470 нм), включающего замещение Y66W. Нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные спектральные варианты, используют для случайного мутагенеза с целью улучшения укладки белка (как показано при экспрессии , штамм XL1-Blue). Указанная процедура приводит к образованию белка tagCFP с флуоресценцией в голубой части спектра, для которого соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности показаны в SEQ ID No: 19, 20, и к белку tagYFP с флуоресценцией в желтой части спектра, для которого соответствующие нуклеотидная и аминокислотная последовательности показаны в SEQ ID No: 21, 22.
В сравнении с tagGFP tagCFP включает замещение Y66W в сочетании с C65A, L99H, I123V, K128E, D129G, F145A, N146I, H148D, V163A, T167I, T203C, T205S и C227Y, где метка tagYFP1 включает замещения T203Y, F224V в сочетании с замещениями C65T, I68V, E76K, M153T и C228S. Спектры возбуждения-эмиссии для данных белков показаны на фиг.7A и 7B.
Дополнительно, за счет сайт-направленного мутагенеза A206 остатка был получен мутант tagYFP со сниженной тенденцией к олигомеризации, названной как tagYFP2 (SEQ ID No: 23, 24). Указанный белок существует в виде мономера даже при высоких (5 мг/мл) концентрациях, как было показано по результатам гель-фильтрации.
Пример 4
Мечение клеток млекопитающих с использованием tagGFP, tagCFP и tagYFP1
Для проведения флуоресцентного мечения эукариотических клеток получают нуклеиновые кислоты, кодирующие tagGFP, tagCFP и tagYFP1, по процедуре примера 3 и клонируют их по отдельности в векторе pEGFP-C1 (CLONTECH) между сайтами рестрикции Agel и Bg/ll (на участке кодирования EGFP). Используют следующие клеточные линии: клеточную линию эпителиальных клеток почки человека 293Т, клеточную линию эмбриональных фибробластов мышей 3Т3, клеточную линию подкожных фибробластов мышей L929, клеточную линию эпителиальных клеток почки африканской зеленой обезьяны Vero и фибробласты почки африканской зеленой обезьяны COS1. Клетки трансфицируют с использованием реагента LipofectAMINE (Invitrogen) и тестируют через 20 часов после трансфекции. Для получения снимков клеток используют флуоресцентный микроскоп Olympus CK40, снабженный камерой CCD (DP-50, Olympus). Экспрессия указанных белков в разных клеточных линиях приводит к ярким сигналам флуоресценции без агрегации. Флуоресценция четко выявляется в течение 24 часов после трансфекции. Не наблюдается токсичности для клеток.
Пример 5
Мечение белка и органелл с использованием tagGFP и tagCFP
Нуклеиновые кислоты, кодирующие tagGFP и tagCFP, полученные по описанной выше методике примера 3, оперативно связывают с нуклеиновыми кислотами, кодирующими человеческий цитоплазматический бета-актин, альфа-тубулин, фибрилларин или направленную на митохондрии последовательность из предшественника субъединицы VIII цитохром С оксидазы человека. Трансфекция человеческих клеток 293Т и HeLa указанными выше плазмидами, экспрессирующими белки слияния на основе флуоресцентных белков и хозяйских клеточных белков и/или сигналов локализации, приводит к яркой флуоресценции, которая характеризуется картиной, близкой к картине, наблюдаемой для белков слияния с EGFP.
Пример 6
Варианты белка tagCFP (SEQ ID NO: 19, 20)
Нуклеиновая кислота, кодирующая белок tagCFP, была получена, как описано в примере 3. На ее основе за счет сайт-направленного мутагенеза А206 остатка был получен мутант tagCFP со сниженной тенденцией к олигомеризации, содержащий замену A206D. Полученный мутант обладал яркой циановой флуоресценцией со спектрами поглощения и эмиссии, идентичными спектрам, полученным для белка tagCFP. Указанный белок существует в виде мономера даже при высоких (10 мг/мл) концентрациях, как было показано по результатам гель-фильтрации.
Однако наблюдалось некоторое снижение скорости созревания этого белка по сравнению с tagCFP. Скорость созревания определяли по процедуре, описанной в примере 2.
Также из коллекции мутантных белков, полученных при получении tagCFP на основе tagGFP, был секвенирован вариант tagCFP, обладающий сходными с tagCFP спектрами поглощения и эмиссии флуоресценции, но несколько меньшей яркостью. Полученный вариант имел 97% идентичности аминокислотной последовательности с tagCFP и содержал следующие замены (по сравнению с tagGFP): А65Т, А145Н, I146S, D148A, A163V, Y227C.
Все публикации, патентные заявки, процитированные в данном описании, включены в качестве ссылки в той мере, в какой каждая отдельная публикация или отдельная патентная заявка специфически и индивидуально соответствует включению в качестве ссылки. Цитирование каждой публикации приводится для целей иллюстрации текста и лучшего понимания настоящего изобретения, и не должно рассматриваться как допущение, что каждая такая публикация соответствует достигнутому уровню в данной области.