СПОСОБ НОРМАЛИЗАЦИИ ИЗМЕНЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НИТРИТОВ В КРОВИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR NORMALISING ABNORMAL BLOOD NITRITE CONCENTRATION

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для восстановления пониженной продукции нитритов в крови у кардиологических больных.
В настоящее время в высокоразвитых странах характерно увеличение продолжительности жизни человека, улучшение питания, снижение доли физического труда в профессиональной деятельности. Одновременно с этим возникают новые социальные и медицинские проблемы, связанные с ростом темпа жизни, необходимостью усваивать больший объем информации, быстро решать сложные задачи, овладевать новыми профессиями, осваивать труднодоступные регионы земного шара.
В связи с этим проблема стресса, адаптации и профилактики стрессорных повреждений выдвинулась в число наиболее актуальных проблем современной биологии и медицины (Судаков К.В. Стресс: постулаты, анализ с позиций общей теории функциональных систем // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 1992. - №4. - С.86-93).
Одним из важнейших факторов, приводящих к развитию заболеваний сердечно-сосудистой системы, является острый или хронический стресс (Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981. - 425 с.).
Начальным этапом в патогенезе различных заболеваний сердечно-сосудистой системы является эндотелиальная дисфункция (Stokes K.Y., Granger D.N. The microcirculation: a motor for the systemic inflammatory response and large vessel disease induced by hypercholestcrolaemia? // J Physiol. - 2004. - V.562 - №3. - P.647-653). Дисфункция эндотелия сопровождается снижением продукции вазодилататорных, антитромбогенных агентов и преобладанием вазоконстрикторных и прокоагулянтных факторов, что приводит к повышению тонуса сосудов и провоцирует развитие тромбозов.
Одним из важнейших факторов, синтезируемых эндотелием, является оксид азота (Ignarro L.G., Murad F. Nitric oxide: biochemistry, molecular biology and therapeutic implication //Adv. Pharmacol. - 1995. - V.34. - P.1-516). Оксид азота представляет собой уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. Он участвует в реализации многих важных физиологических функций, таких как вазодилатация, нейротрансмиссия, агрегация тромбоцитов, регуляция продукции биологически активных веществ, в частности простациклина, регуляция тонуса гладких мышц, реакциях иммунной системы, состояние памяти и др. (Anggard E. Nitric oxide: mediator, murderer and medicine // Lancet. 1994. №343, p.1199-1206).
Эндогенный оксид азота существует и непрерывно синтезируется в органах, тканях и клетках ферментативным путем при участии NO-синтаз - семейства цитохром Р-450-подобных ферментов, использующих в качестве субстрата аминокислоту L-аргинин. Образующийся в организме оксид азота, окисляясь, переходит в нитриты, а затем в нитраты (Карпюк В.Б., Черняк Ю.С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг нитроксидергической вазорелаксации при субарахноидальном кровоизлиянии // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.16-19).
Доказано, что у больных уже на начальных стадиях развития заболеваний сердечно-сосудистой системы происходит снижение синтеза оксида азота эндотелием, что проявляется снижением концентрации в крови его стабильных метаболитов - нитритов и нитратов (Манухина Е.Б., Лямина Н.П., Долотовская П.В., Лямина С. В. Роль оксида азота и кислородных свободных радикалов в патогенезе артериальной гипертензии // Кардиология. - 2002. - №11. - C.34-7).
Исследование и разработка методов регулирования и поддержания физиологического уровня концентраций эндогенного оксида азота в клетках, органах и в организме в целом представляет несомненный научный и практический интерес.
Существующие в настоящее время медикаментозные методы коррекции функционального состояния системы оксида азота нередко оказываются недостаточно эффективными, требуют тщательный лабораторный и клинический контроль во время применения, имеют широкий спектр противопоказаний и побочных эффектов. Многие авторы отмечают высокую стоимость медикаментозного лечения (Усенко В.А. Фармацевтический маркетинг, ценовая политика фармацевтических фирм // Провизор. - 1999. - №21. - С.34-35) Более того, использование в клинической практике органических нитратов в качестве донаторов оксида азота сопровождается развитием толерантности и перекрестной толерантности, что может усугублять эндотелиальную дисфункцию, еще больше снижая продукцию оксида азота эндотелием (Münzel Т., Daiber A., Mülsch A. Explaining the Phenomenon of Nitrate Tolerance //AHA Circulation Research. - 2005. - V.97. - P.618-645).
Таким образом, очевидна необходимость совершенствования методов регуляции синтеза оксида азота и поиска новых альтернативных терапевтических и экспериментальных подходов.
2
2
Новым перспективным и доступным методом лечения широкого круга заболеваний является терагерцовая терапия. Терагерцовый диапазон частот (100 ГГц - 10 ТГц) интересен тем, что именно в нем, в основном, сосредоточены частотные спектры поглощения и излучения важнейших клеточных метаболитов - NO, O, СО, СО, ОН- и др. (Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2003. - №12. - С.3-6). Фундаментальной основой функционирования сложных биологических систем являются молекулы-метаболиты, стабильные и строго воспроизводимые молекулярные структуры биосреды. Поэтому детерминированное управление их реакционной способностью излучением, совпадающим со спектрами их излучения и поглощения, делает возможным регуляцию их процесса метаболизма в биосреде. Анализ биомедицинских эффектов электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров атмосферных газов-метаболитов показывает прямую связь спектров заданного метаболита и его свойств в биосреде. Это соответствует представлениям о веществе и поле как о единой системе (Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - 2003. - №12. - С.3-6). Так, показано благоприятное влияние электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах клеточных метаболитов на динамику показателей микрбциркуляции, гемостаза и фибринолиза, что может играть важную роль в профилактике нарушений функционального состояния тромбоцитов и гиперкоагуляции у больных инфарктом миокарда, стенокардией, сосудистыми заболеваниями головного и спинного мозга (Паршина С.С., Киричук В.Ф., Головачева Т.В. и др. Первый опыт клинического применения электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра оксида азота // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2004, №11, с.44-54; Паршина С.С. Клинические особенности использования ТГЧ - терапии - NO у больных стенокардией // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2006, №1-2, с.4-11; Бецкий О.В., Креницкий А.П. Биофизические эффекты волн терагерцового диапазона и перспективы развития нового направления в биомедицинской технологии: «Терагерцовая терапия» и «Терагерцовая диагностика» // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника, 2003, №12, с.3-6). Обнаружено выраженное антистрессорное действие электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц (Киричук В.Ф., Цымбал А.А. и др. Изменения концентрации кортикостерона - маркера стресс-реакции под влиянием терагерцового излучения на частотах оксида азота 150,176-150,664 ГГц // Рос. Физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2008. - №11. - С.85-90).
2
Прототипом настоящего исследования является способ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОНИЖЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ НИТРИТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ В УСЛОВИЯХ СТРЕССА, заключающийся в том, что область мечевидного отростка грудины белых крыс, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, облучают электромагнитными волнами терагерцового диапазона, при этом используют частоты молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц плотностью мощности 0,2 мВт/см. Облучение проводят в течение 30 минут.
Недостатком данного метода является то, что для нормализации концентрации нитритов у животных требуется очень длительное время облучения - 30 минут терагерцовыми волнами на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота 150,176-150,664 ГГц.
2
Авторами впервые предложен способ нормализации измененной концентрации нитритов в крови в эксперименте путем воздействия на организм животного терагерцовыми волнами на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мкВт/см в течение 15 минут.
Также следует отметить, что, с одной стороны, авторами впервые установлено, что именно терагерцовые волны на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц способны нормализовывать измененную концентрацию нитритов в крови, а с другой, благодаря указанному излучению значительно сокращено (в 2 и более раз) время терапевтического воздействия на организм животного, что, несомненно, является инновационным (восстановление концентрации нитритов начинается уже при 5 минутах воздействия и своего максимума (физиологически оптимального) достигает при 15 минутах воздействия). Предлагаемый способ позволяет нормализовать продукцию оксида азота, а также функцию эндотелия при постстрессорных состояниях.
В отличие от заявленного прототипа наш метод основан на определении концентрации нитритов именно в сыворотке крови, а не плазме, как указано в прототипе. Метод определения концентрации нитритов в сыворотке крови является более точным, физиологичным и химически чистым экспериментом, так как плазма крови содержит белки (именно фибриноген), которые оказывают существенное влияние на показатели концентрации нитритов и в большинстве случаев нитриты в плазме вообще не определяют.
Изучали образцы крови 60 белых беспородных крыс-самцов массой 180-220 г. В качестве модели, имитирующей нарушения продукции оксида азота, применяли острый иммобилизационный стресс - фиксация крыс в положении на спине в течение 3 часов (Киричук В.Ф., Антипова О.Н., Креницкий А.П., Тупикин В.Д., Майбородин А.В., Бецкий О.В., Иванов А.Н., Цымбал А.А., Помошникова О.И. Способ профилактики и коррекции стрессорных повреждений организма. Патент РФ №2284827 от 10 октября 2006 года).
Исследование проводилось в 5 группах животных по 12 особей в каждой: 1 группа - контрольная - интактные животные; 2 группа - группа сравнения, животные в состоянии острого иммобилизационного стресса; 3, 4 и 5 группы - опытные, в которых животные подвергались однократному облучению в течение 5, 15 и 30 минут соответственно на фоне иммобилизации. Для устранения влияния сезонной и циркадной зависимости на продукцию оксида азота эксперименты проводились в зимний период календарного года в первой половине дня, в одно и то же время. Все животные при проведении эксперимента находились в одинаковых условиях.
2
2
Однократное облучение области мечевидного отростка грудины животных, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, проводилось электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см, заданной генератором «КВЧ-О», разработанным впервые в ОАО «Центральный научно-исследовательский институт измерительной аппаратуры» (г.Саратов) совместно с ФГУП «НПП-Исток» г.Фрязино и Медико-технической ассоциацией КВЧ г.Москва (Патент на полезную модель №66961 «Аппарат для воздействия электромагнитными волнами крайне высокой частоты» 10 октября 2007 г.). Структура молекулярного терагерцового спектра электромагнитного излучения атмосферного кислорода формируется в нем в соответствии с методами, предложенными и реализованными в квазиоптическом КВЧ генераторном комплексе моделирования детерминированных шумов для биофизических исследований, разработанным в ОАО «Центральный научно-исследовательский институт измерительной аппаратуры» (г.Саратов) (Патент на полезную модель №66961 «Аппарат для воздействия электромагнитными волнами крайне высокой частоты» от 10 октября 2007 г.).
Забор крови для исследования концентрации нитритов осуществляли в пластиковые пробирки путем пункции сердца.
Определение концентрации нитритов в сыворотке крови проводилось с использованием реактива Грисса по методу Карпюка В.Б. и соавторов (Карпюк В.Б., Черняк Ю.С., Шубич М.Г. Лабораторный мониторинг нитроксидергической вазорелаксации при субарахноидальном кровоизлиянии // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2000. - №5. - С.16-19).
При анализе результатов исследования показано, что у крыс, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, наблюдалось статистически достоверное по сравнению с группой интактных животных снижение нитритов в сыворотке крови, что свидетельствует об угнетении продукции оксида азота (таблица).
Таким образом, при остром иммобилизационном стрессе происходит нарушение продукции оксида азота, что требует, несомненно, коррекции (таблица).
2
Воздействие терагерцовым излучением на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см в течение 5 минут на животных, находящихся в состоянии острого иммобилизационного стресса, приводило к частичному увеличению концентрации нитритов в сыворотке крови.
2
Следовательно, представленные данные свидетельствуют о том, что терагерцовое излучение на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности -100 мкВт/см уже в течение 5 минут способствует незначительному (частичному), но восстановлению нарушенной продукции оксида азота.
2
Применение электромагнитных волн терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см в течение 15 минут вызывает полную статистически достоверную нормализацию концентрации нитритов в сыворотке крови у экспериментальных животных (таблица).
При воздействии на животных на фоне острого иммобилизационного стресса электромагнитными волнами терагерцового диапазона на указанной частоте в течение 30 минут также наблюдается полное статистически достоверное восстановление нарушенной продукции оксида азота (таблица). Следует отметить, что диапазон вариабельности концентраций нитритов в сыворотке крови у животных, подвергнутых облучению в течение 30 минут терагерцовыми волнами на частоте атмосферного кислорода 129,0 ГГц на фоне острого иммобилизационного стресса, значительно шире вариабельности данного показателя у животных группы контроля (таблица). В некоторых случаях установлено также увеличение концентрации нитритов в сыворотке крови по сравнению с группой интактных животных.
2
Следовательно, 30-минутное воздействие терагерцовыми волнами на частоте молекулярного спектра атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мкВт/см обладает свойством не только восстанавливать измененную концентрацию нитритов в сыворотке крови, но даже и в некоторых случаях незначительно увеличивать ее относительно контрольной группы животных - 0,82 (0,61-0,90) мкг/мл.
2
Таким образом, терагерцовое излучение на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см в течение 15 минут является оптимальным режимом для восстановления измененной концентрации нитритов в сыворотке крови в эксперименте, так как при минимально возможном времени экспозиции терагерцового излучения (15 минут) достигается максимальный физиологический эффект, не превышающий оптимальных физиологических показателей, зафиксированных у животных контрольной группы.
Пример 1.
У интактной крысы 1 была определена концентрация нитритов в сыворотке крови, она составила 0,75 мкг/мл.
Затем животное было подвергнуто трехчасовому острому иммобилизационному стрессу. В ходе развития стресс-реакции зарегистрировано угнетение продукции оксида азота, что выражается в снижении концентрации стабильных метаболитов оксида азота - нитритов в сыворотке крови до уровня 0,22 мкг/мл.
2
Далее животное облучалось электромагнитными волнами терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см в течение 15 минут. В образце крови крысы, подвергнутой облучению, обнаружена статистически достоверная нормализация концентрации нитритов до уровня интактных животных, и она составила 0,71 мкг/мл.
Указанные факты свидетельствуют о восстановлении продукции оксида азота.
2
Таким образом, способ нормализации измененной концентрации нитритов в крови в эксперименте под влиянием электромагнитного излучения терагерцового диапазона на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц при плотности мощности - 100 мВт/см в течение 15 минут может быть использован в экспериментальной и клинической кардиологии как новый метод эффективной коррекции и нормализации продукции оксида азота и как один из методов, нормализующих функции эндотелия сосудов.
ТаблицаКонцентрация нитритов в сыворотке крови у животных в состоянии иммобилизационного стресса и подвергнутых терагерцовому облучению на частоте молекулярного спектра излучения и поглощения атмосферного кислорода 129,0 ГГц
Показатели
Интактные животные (n=12)
Стресс (n=12)
Облучение на фоне стресса в течение
5 минут (n=12)
15 минут (n=12)
30 минут (n=12)
Концентрация нитритов, мкг/мл
0,76 (0,66; 0,81)
0,21 (0,20; 0,24) P<sub>1</sub><0,01
0,35 (0,25; 0,45) P<sub>1</sub><0,05; P<sub>2</sub><0,05
0,62 (0,50; 0,72) P<sub>2</sub>>0,05; P<sub>2</sub><0,01 P<sub>3</sub><0,05
0,82 (0,61; 0,90) P<sub>1</sub>>0,05; P<sub>2</sub><0,01; P<sub>3</sub><0,05; P<sub>4</sub>>0,05
Примечание:
В каждом случае приведены средняя величина (медиана), нижний и верхний квартили (25%,75%) из соответствующего числа измерений.
P<sub>1</sub> - по сравнению с группой интактных животных;
Р<sub>2</sub> - по сравнению с группой животных, подвергнутых острому иммобилизационному стрессу;
P<sub>3</sub> - по сравнению с группой животных, подвергнутых 5-минутному облучению на фоне стресса;
P<sub>4</sub>- по сравнению с группой животных, подвергнутых 15-минутному облучению на фоне стресса.