Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и апоптоза лимфоцитов человека при беременности

Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и апоптоза лимфоцитов человека при беременности

К.б.н., с.н.с. Е.Г. ОРЛОВА1, д.м.н., проф., зав. лаб. С.В. ШИРШЕВ

Regulation of expression of membrane molecules and apoptosis of human lymphocyte by leptin and ghrelin during pregnancy

E.G. ORLOVA, S.V. SHIRSHEV

Лаборатория иммунорегуляции Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь

Изучено влияние лептина и грелина, а также их совместное действие в сочетаниях, характерных для разных триместров беременности, на экспрессию мембранных молекул и апоптоз лимфоцитов периферической крови женщин. Лептин в дозах, характерных для беременности, снижает процент активированных Т^клеток и апоптоз лимфоцитов, а также оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на содержание клеток CD16+CD56+NK и CD16+CD56+NKT, не влияя на количество T-лимфоцитов CD4+CD25bright. Грелин, напротив, дозозависимо повышает процент активированных Т^клеток и апоптоз лимфоцитов, не влияя на уровень клеток CD16+CD56+NK, CD16+CD56+NKT и T-лимфоцитов CD4+CD25bright. При одновременном внесении гормонов в сочетаниях, соответствующих I—II триместру беременности, не влияют на процент активированных Т^клеток, клеток CD16+CD56+NK и CD16+CD56+NKT, а также апоптоз лимфоцитов. При этом в комбинации, характерной для II—III триместра, стимулируют экспрессию CD25 на ^-клетках и CD16 на NK-клетках.

Ключевые слова: лептин, грелин, Th-клетки, NK-клетки, NKT-клетки, Treg, апоптоз.

This work was designed to study effects of leptin and/or ghrelin in combinations characteristic of different trimesters of pregnancy on the expression of membrane molecules and apoptosis of lymphocyte in the peripheral blood of women. Leptin was shown to decrease the relative number of activated Th-cells and apoptosis of lymphocytes. Moreover, it either increased or decreased the number of CD16+CD56+NK and CD16+CD56+NKT cells depending on the dose but did not change the number of T-lymphocytes CD4+CD25bright. In contrast, ghrelin caused a dose-dependent increase in the number of activated Th-cells and enhanced lymphocyte apoptosis but did not influence the number of CD16+CD56+NK, CD16+CD56+NKT cells, and T-lymphocytes CD4+CD25bright. Simultaneous administration of both hormones in combinations known to occur in the first and second trimesters of pregnancy did not change percentage of activated Th-cells, the relative number of CD16+CD56+NK and CD16+CD56+NKT cells or apoptosis of lymphocytes. However, they stimulated expression of CD25 on Th-cells and CD16 on NK-cells.

Key words: leptin, ghrelin, Th-cells, NK-cells, NKT-cells, Treg, apoptosis.

Исследование иммуномодулирующих эффектов гормонов, принимающих активное участие в процессах гестации, необходимо для понимания механизмов, определяющих изменение иммунитета при беременности. Лептин и грелин являются пептидными гормонами, разнонаправленно регулирующими энергетический обмен. Помимо этого, оба гормона обладают иммуномодулирующей активностью и необходимы для реализации репродуктивной функции [1]. Лептин синтезируется адипоцитами и ограничивает избыточное накопление жировой ткани [2]. Грелин вырабатывается тканью желудка и угнетает секрецию лептина, усиливая чувство голода и аппетит [1]. При беременности уровень лептина значительно нарастает, особенно во И—Ш триместрах [3]. Гормон необходим для успешной имплантации и активно вырабатывается плацентой [1]. Участие грелина в регуляции репродуктивных процессов обусловлено экспрессией рецепторов к

нему клетками эндометрия, плаценты и эмбриона. В противоположность лептину уровень грелина нарастает на ранних этапах беременности и снижается в поздние сроки [4]. Грелин препятствует развитию бластоцисты и процессу имплантации [1]. Участие гормонов в регуляции иммунитета определяется их непосредственным влиянием на клетки иммунной системы, которые экспрессируют специфические мембранные рецепторы к лептину и грелину [5—9]. Основные исследования [1, 2, 5—9] иммуномодули-рующих эффектов лептина и грелина проводились на моделях ожирения и воспаления, при которых концентрации гормонов значительно превышают физиологические. В работах ряда авторов [1, 2, 10] показано, что лептин является провоспалительным гормоном и способствует преобладанию клеточно-опосредованного иммунного ответа. Грелин оказывает противовоспалительные эффекты и антагонистическое действие по отношению к лептину, бло-

© Е.Г. Орлова, С.В. Ширшев, 2010 26

'e-mail: orlova_katy@mail.ru

кируя, например, индуцированную лептином продукцию провоспалительных цитокинов [1, 6, 7, 11]. Лептин в свою очередь усиливает экспрессию рецепторов к грелину на иммунокомпетентных клетках [6, 11]. Беременность смещает центр иммунных реакций на T-хелперы (Th) — 2-й тип иммунного реагирования [12], поэтому изучение роли лептина и грелина в контроле функциональной активности лимфоцитов при беременности приобретает особую значимость.

Цель работы — исследовать влияние лептина и грелина, а также их совместные эффекты, в сочетаниях, характерных для разных триместров беременности, на экспрессию мембранных молекул и апоп-тоз лимфоцитов периферической крови женщин.

Материал и методы

В работе использовали суспензию мононукле-арных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин (от 23 до 35 лет), находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла (5—11-й день). Мононуклеарные клетки получали с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл—верографин (1,077 г/см3). Полученную суспензию (1 • 106 мл) после двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 мМ HEPES; 2 мМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с гормонами в течение суток при температуре 37°С в условиях 5% СО2. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во II—III триместрах беременности соответственно [3]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1,25 и 0,83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I—II и III триместрах беременности [4]. Для изучения совместных эффектов лептин и грелин вносили в культуры одномоментно в сочетаниях, характерных для I—II (лептин 10 нг/мл + грелин 1,2 нг/мл) и II—III (лептин 35 нг/мл + грелин 0,87 нг/мл) триместров беременности. В контрольные пробы вместо гормонов добавляли равное количество их растворителя (хлорида натрия).

Фенотип лейкоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлюориметре EPICS XL («Beckman Coulter», США). После инкубации с гормонами клетки отмывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали моноклональными антителами, меченными флуорохромами: флюоресцеини-зотиоционатом (FITC) и фикоэритрином (PE), согласно методике производителя («Beckman Coulter», США). Лимфоцитарный гейт выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток, подсчитывая не менее 10 000 клеток. Для контроля неспецифического связывания

и выделения негативного по флюоресценции лим-фоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.

Определяли следующие субпопуляции лимфоцитов: активированные Th-клетки CD3+CD4+CD25dim (CD4-FITC/CD25-PE), Т-клетки CD4+ с высокой экспрессией CD25 (CD3+CD4+CD25bright), так называемые естественные T-регуляторные лимфоциты, или Treg. Основным маркером Treg является экспрессия в клетке транскрипционного фактора Foxp3, которая коррелирует с интенсивностью экспрессии мембранной молекулы CD25 [13, 14]. Таким образом, к Treg (CD3+CD4+CD25+Foxp3+) относятся именно лимфоциты CD3+CD4+CD25bright, а активированные Th-клетки составляют пул CD3+CD4+CD25dim [5, 14—16]. Кроме того, определяли содержание натуральных киллеров (NK-клеток) с фенотипом CD3-CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE) и Т-клеток с функциями естественных киллеров (NKT-клетки) CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE).

Апоптоз лимфоцитов оценивали путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC) и йодистым пропидием (PI). Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в ранней (AnV+/ PI) и поздней стадии (AnV+/PI+ ) апоптоза [17]. Для индукции апоптоза использовали анти-CD3 моно-клональные антитела (5 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия), которые вносили в культуры вместе с гормонами [18]. Контролем служили пробы, в которые добавляли только индуктор апоптоза.

Достоверность полученных результатов оценивали с помощью парного и непарного t-критериев Стьюдента.

Результаты и обсуждение

С учетом того, что активация Т-клеток играет ключевую роль в поляризации иммунного ответа, а интерлейкин-2 является основным аутокринным регулятором дифференцировки и пролиферации лимфоцитов, исследование гормональной регуляции Т-клеточного звена иммунитета включало анализ экспрессии CD25 (высокоаффинного рецептора к интерлейкину-2) на Т^клетках. Установлено, что грелин в дозах, характерных для беременности, до-зозависимо регулирует экспрессию молекулы CD25 ^-клетками. Высокая доза гормона увеличивает, а низкая не влияет на процент активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25dim. Лептин в исследуемых дозах, напротив, снижает количество CD4+CD25dim Т-клеток. Одновременное внесение гормонов в комбинации, характерной для I—II триместра беременности, нивелирует самостоятельное влияние как лептина, так и грелина на экспрессию CD25 Т^клетками. Однако в сочетаниях, сопоставимых с таковыми в II—III триместре беременности, гормоны увеличивают процент Т-клеток

Таблица 1. Модуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул лимфоцитами периферической крови женщин in vitro

Показатель n Активированные Th-клетки

Контроль 22 6,25+1,80 0,63+0,47

Грелин (1,2 нг/мл) 10 9,61 + 1,77 0,62+0,16

p=0,001*

Грелин (0,87 нг/мл) 10 5,99+2,01 0,46+0,26

p=0,0001A

Лептин (10 нг/мл) 13 4,86+2,14 0,78+0,31

p=0,022*

Лептин (35 нг/мл) 13 4,33+1,31 0,72+0,26

p=0,007*

Лептин (10 нг/мл) + грелин (1,2 нг/мл) 10 5,15+6,43 0,36+0,14

Лептин (35 нг/мл) + грелин (0,87 нг/мл) 10 10,02+2,35 1,32+0,69

p=0,002* p=0,00004"

Примечание. Все данные в таблицах представлены в виде М±т. Здесь и в табл. 2, 3: п — число исследований в группе, значение р представлены только для достоверных отличий. Здесь и в табл. 3:* — р <0,05 по непарному ^критерию Стьюдента при сравнении с контролем; А — р <0,05 по парному ^критерию Стьюдента при сравнении с пробой с внесением того же гормона в концентрации, характерной для I триместра беременности; * — р <0,05 по непарному ^критерию Стьюдента при сравнении с пробой с внесением лептина в концентрации 35 нг/мл.

Таблица 2. Модуляция грелином и лептином апоптоза лимфоцитов периферической крови женщин in vitro

Показатель n Число лимфоцитов, находящихся в ранней стадии апоптоза (AnV+/PI-), % Число лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза (AnV+/ PI+), %

Контроль 7 24,55+4,26 62,88+5,62

Грелин (1,2 нг/мл) 7 19,78+2,59 71,06+3,97

p=0,038*

Грелин (0,87 нг/мл) 7 22,2+4,03 68,71+4,46

Лептин (10 нг/мл) 7 26,38+6,78 49,92+11,28

p=0,023*

Лептин (35 нг/мл) 7 25,13+5,93 48,94+11,79

p=0,021*

Лептин (10 нг/мл) + грелин (1,2 7 26,97+9,06 59,39+12,54

нг/мл)

Лептин (35 нг/мл) + грелин (0,87 7 21,83+5,68 59,44+15,95

нг/мл)

Примечание.* — p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента при сравнении с контролем.

CD4+CD25dim, что свидетельствует о доминирующем влиянии грелина (табл. 1).

При исследовании регуляторного влияния лептина и грелина, а также их сочетаний на количество Т-клеток CD4+CD25bright (Treg) статистически значимых эффектов не выявлено (см. табл. 1).

Альтернативным исходом Т-клеточной активации является инициация апоптоза. При беременности апоптоз является одним из факторов контроля активации Т-лимфоцитов и индукции периферической толерантности к полуаллогенному трофобла-сту [12]. Установлено, что грелин в концентрации, характерной для I—II триместра беременности, увеличивает процент лимфоцитов, находящихся в поздней стадии апоптоза (AnV+/PI+). Лептин, напротив, в исследуемых дозах проявляет антиапоп-тотическое действие, снижая количество AnV+/PI+ лимфоцитов. Результатом совместного действия

лептина и грелина в сочетаниях, характерных для разных триместров беременности, является отмена модулирующих влияний гормонов на апоптоз лимфоцитов (табл. 2).

Таким образом, в дозах, характерных для беременности, грелин и лептин меняют направленность регуляторных эффектов на противоположную. Так, грелин, оказывая, по данным литературы, противовоспалительное действие, в концентрациях, отражающих его уровень в разные триместры беременности, проявляет провоспалительную активность, стимулируя активацию и апоптоз лимфоцитов. Лептин в свою очередь, являясь провоспалительным гормоном, оказывает противовоспалительное действие, снижая количество активированных Th-клеток и апоптоз лимфоцитов. Сочетанное действие грелина и лептина на уровне лимфоцитов нивелирует самостоятельные эффекты каждого гормона и приводит

Таблица 3. Модуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул NK- и NKI-клетками периферической крови женщин in vitro

Показатель

NK-клетки CD3-CD16+CD56+

NKT-клетки CD3+CD16+CD56+

Контроль Грелин

Лептин

Лептин

12 10 10 7

10 10

7,73+1,43 9,52+2,04 9,65+1,19 9,03+0,90 p=0,04* 5,42+1,34 p=0,018* p=0,0005A 10,09+1,97 11,98+1,34 p=0,0001* p=0,00005#

1,61+0,76 2,79+1,74 3,29+0,95 2,19+1,08

2,83+0,53 p=0,006*

2,34+1,12 3,17+1,03

n

7

к формированию новых кооперативных эффектов в зависимости от триместра беременности, что, возможно, обусловлено антагонизмом внутриклеточных эффекторных молекул различных сигнальных путей, активируемых при связывании гормонов с рецепторами. Помимо этого, грелин, по-видимому, способен блокировать эффекты лептина путем модуляции экспрессии его рецепторов и/или увеличения продукции эндогенного грелина [6].

Учитывая важную роль NK- и NKr-клеток при беременности как эффекторов неспецифической резистентности организма, мы посчитали необходимым оценить регуляцию гормонами их фенотипа [12, 16]. Следует отметить, что NK- и NKT-клетки периферической крови конститутивно экспонируют на мембране CD56, тогда как экспрессия CD16 ассоциирована с терминальной стадией их дифферен-цировки и приобретением наибольшей цитолитиче-ской активности [19, 20]. Установлено, что грелин в дозах, характерных для беременности, не влияет на процент NK- и NKT-клеток, экспрессирующих CD16. Лептин, напротив, оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на экспрессию молекулы CD16 на NK- и NKT-клетках. Так, в дозе, характерной для I триместра беременности, гормон повышает процент CD 16+NK-клеток и не влияет на количество CD 16+NKT-лимфоцитов. Однако в концентрации, сопоставимой с таковой в II—III триместре, лептин снижает содержание CD16+NK-клеток и увеличивает процент CD16+NKT-клеток. При одновременном внесении с лептином грелин меняет направленность его эффектов. Так, в комбинации, характерной для I—II триместра беременности, гормоны не влияют на процент CD16+NK- и CD16+NKT-клеток. Однако в дозах, сопоставимых с таковым II—III триместре, гормоны повышают содержание NK-клеток и не влияют на процент NKT-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD16 (табл. 3). Несмотря на то что прямых данных литературы [6—8], касающихся экспрессии рецепторов к грелину на NK- и NKr-клетках нет, выявленные

нами эффекты свидетельствуют о возможной модуляции грелином их фенотипа как непосредственно, так и опосредованно, возможно, путем регуляции количества рецепторов к лептину, как это показано для других субпопуляций лимфоцитов.

В целом полученные данные свидетельствуют о том, при беременности грелин и лептин проявляют реципрокные регуляторные эффекты на активацию и апоптоз лимфоцитов, а также фенотип NK- и NKT-клеток, не влияя на уровень Treg. Изменение направленности эффектов лептина и грелина в дозах, характерных для беременности, по-видимому, обусловлено особенностью взаимодействия низких физиологических доз гормонов с клеткой, поскольку основные регуляторные эффекты лептина и грелина исследованы в патофизиологических концентрациях, значительно превышающих содержание гормонов в крови при беременности. Сочетанное влияние лептина и грелина на уровне лимфоцитов в дозах, соответствующих таковым в I—II триместре беременности, нивелирует самостоятельное действие каждого гормона, что важно для сохранения баланса про- и противовоспалительных иммунных реакций на ранних этапах беременности, когда риск развития реакций иммунного отторжения против полуаллогенного плода особенно велик [12]. В то же время преобладание модулирующих эффектов грелина при одновременном внесении гормонов в дозах, характерных для II—III триместра беременности, по-видимому, может стимулировать провоспалительные реакции, что в этот период необходимо для поддержания резистентности организма матери и способствует родам.

Выводы

1. Лептин в дозах, характерных для беременности, снижает процент Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, а также оказывает разнонаправленное дозозависимое действие на содержание CD16+56+NK- и CD16+56+NKT-клеток, не влияя на количество T-лимфоцитов CD4 +CD25bright.

2. Грелин в исследуемых концентрациях дозоза-висимо повышает уровень Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, не оказывая действия на количество CD16+56+NK-, CD16+56+NKT-клеток и Т-лимфоцитов CD4+CD25bright.

3. При одновременном внесении лептин и гре-лин в комбинации, характерной для 1—11 триместра беременности, не влияют на процент Т-клеток CD4+CD25dim и апоптоз лимфоцитов, а также на ко-

личество CD16+56+NK- и CD16+56+NKT-KneTOK, а в сочетании, сопоставимом с таковым в II—III триместре беременности, стимулируют экспрессию молекулы CD25 на Th-клетках и CD16 на NK-клетках.

Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

ЛИТЕРАТУРА

1. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: Краткое методическое руководство. Екатеринбург 2008;60.

2. Ширшев С.В. Механизмы иммунного контроля процессов репродукции. Екатеринбург 1999;381.

3. Ширшев С.В., Орлова Е.Г. Молекулярные механизмы регуляции лептином функциональной активности мононуклеар-ных фагоцитов. Биохимия 2005;70:8:1021 —1029.

4. Baecher-Allan C., Brown J.A., Freeman G.J., Hafler D.A. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol 2001;167:1245—1253.

5. Bijl M., Horst G., Limburg P.C., Kallenberg C.G. Anti-CD3-induced and anti-Fas-induced apoptosis in systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol 2001;123:127—132.

6. De Rosa V., Procaccini C., Cali G. et al. A key role of leptin in the control of regulatory T-cell proliferation. Immunity 2007;26:143— 145.

7. Dixit V.D., Schaffer E.M., Pyle R.S. et al. Ghrelin inhibits leptin-and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T-cells. J Clin Inv 2004;114:57—66.

8. Dixit V.D., Taub D.D. Ghrelin and immunity: a young player in an old field. Exp Gerontol 2005;40:900—910.

9. Fantuzzi G. Adipose tissue, adipokines, and inflammation. J Allergy Clin Immunol 2005;115:911—919.

10. Fuglsang J., Skjxrbxk C., Espelund U. et al. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy. Clin Endocrinol 2005;62:554-559.

11. Hardie L., Trayhurn P., Abramovich D., Fowler P. Circulating leptin in women: a longitudinal study in the menstrual cycle and during pregnancy. Clin Endocrinol 1997;47:101 —106.

12. Hattori N., Saito T., Yagyu T. et al. GH, GH receptor, GH secretagogue receptor, and ghrelin expression in human

T-cells, B-cells, and neutrophils. J Clin Endocrinol Metabol 2001;86:4284-4291.

13. MittagA., LenzD, GerstnerA.O. etal. Polychromatic (eight-color) slide-based cytometry for the phenotyping of leukocyte, NK, and NKT subsets. Cytometry 2005;65:103-115.

14. Ou D., Metzger D.L., Wang X. et al. Beta-cell antigen-specific CD56(+) NKT cells from type 1 diabetic patients: autoaggressive effector T cells damage human CD56(+) beta cells by HLA-restricted and non-HLA-restricted pathways. Hum Immunol 2002;63:256-270.

15. Papathanassoglou E., El-Haschimi K., Li X.C. et al. Leptin receptor expression and signaling in lymphocytes: kinetics during lymphocyte activation, role in lymphocyte survival, and response to high fat diet in mice. J Immunol 2006;176:7745-7752.

16. Roncador G., Brown P.J., Maestre L. et al. Analysis of FOXP3 protein expression in human CD4+CD25+ regulatory T-cells at the single-cell level. Eur J Immunol 2005;35:1681-1691.

17. Sasaki Y., Sakai M., Miyazaki S. et al. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T-cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases. Mol Hum Reprod 2004;10:347-353.

18. Tena-Sempere M. Roles of ghrelin and leptin in the control of reproductive function. Neuroendocrinol 2007;86:229-241.

19. Waseem T., Duxbury M., Ito H. et al. Exogenous ghrelin modulates release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-stimulated macrophages through distinct signaling pathways Surgery 2008;143:334-342.

20. Yi H., Zhen Y., Jiang L. et al. The phenotypic characterization of naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T-cells. Cell Mol Immunol 2006;3:189-195.