ДИСПЛЕЙ ИНТЕРАЛЬНОГО МЕМБРАННОГО БЕЛКА НА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРИОНАХ ПОКСВИРУСА

1. Выделенный полинуклеотид, содержащий:
(a) фрагмент первой нуклеиновой кислоты, кодирующей интегральный мембранный белок (IMP) или его фрагмент, где IMP или его фрагмент содержит по меньшей мере одну внемембранную область, по меньшей мере один трансмембранный домен и по меньшей мере одну внутримембранную область, и где участок фрагмента первой нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну внутримембранную область, располагается на 5'- или 3'-конце фрагмента первой нуклеиновой кислоты; и
(b) фрагмент второй нуклеиновой кислоты, кодирующий белок F13L вируса осповакцины или его функциональный фрагмент, где фрагмент второй нуклеиновой кислоты является слитым в рамке считывания с участком фрагмента первой нуклеиновой кислоты, кодирующей внутримембранную область IMP;
где инфицированная поксвирусом клетка, содержащая полинуклеотид, может экспрессировать слитый белок IMP-F13L в виде части внешней мембраны оболочки внеклеточного оболочечного вириона (EEV).
2. Полинуклеотид по п. 1, где белок F13L или его функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или его функциональный фрагмент.
3. Полинуклеотид по п. 1 или п. 2, где IMP представляет собой пронизывающий несколько раз мембрану белок, содержащий по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь трансмембранных доменов.
4. Полинуклеотид по п. 3, где IMP содержит нечетное число трансмембранных доменов, где 5'-конец фрагмента первой нуклеиновой кислоты кодирует внемембранную область, где 3'-конец фрагмента первой нуклеиновой кислоты кодирует внутримембранную область, и где 5'-конец второго полинуклеотида является слитым с 3'-концом фрагмента первой нуклеиновой кислоты.
5. Полинуклеотид по п. 4, где IMP содержит сопряженный с G-белком рецептор (GPCR).
6. Полинуклеотид по п. 5, где IMP представляет собой белок Фрайзлед 4 человека (FZD4) или его фрагмент.
7. Полинуклеотид по п. 6, который кодирует полипептид, содержащий аминокислоты от 20 до 892 SEQ ID NO:2.
8. Полинуклеотид по п. 7, дополнительно содержащий сигнальный пептид.
9. Полинуклеотид по п. 8, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:2.
10. Полинуклеотид по п. 5, где IMP представляет собой рецептор хемокинов CXC.
11. Полинуклеотид по п. 10, где рецептор хемокинов CXC представляет собой CXCR4 или его фрагмент.
12. Полинуклеотид по п. 11, который кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
13. Полинуклеотид по п. 3, где IMP содержит четное число трансмембранных доменов, и где 5'- и 3'-конец фрагмента первой нуклеиновой кислоты кодируют внутримембранные области.
14. Полинуклеотид по п. 13, где фрагмент второй нуклеиновой кислоты является слитым с 3'-концом фрагмента первой нуклеиновой кислоты.
15. Полинуклеотид по п. 14, где IMP представляет собой белок CD20 человека или его фрагмент.
16. Полинуклеотид по п. 15, который кодирует белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
17. Полинуклеотид по любому из пп. 1-16, где первый и второй фрагменты нуклеиновой кислоты являются непосредственно слитыми.
18. Полинуклеотид по любому из пп. 1-17, дополнительно содержащий третий фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий гетерологичный пептид.
19. Полинуклеотид по п. 18, где гетерологичный пептид содержит линкерную последовательность, аминокислотную метку или пептидную или полипептидную последовательность, которая облегчает очистку.
20. Полинуклеотид по п. 19, где гетерологичный пептид содержит гистидиновую метку.
21. Полинуклеотид по любому из пп. 1-20, который является функционально связанным с промотором поксвируса.
22. Полинуклеотид по п. 21, где промотор поксвируса представляет собой p7.5 или H5, или T7.
23. Слитый белок F13L, кодируемый полинуклеотидом по любому из пп. 1-22.
24. Геном поксвируса, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-22.
25. Геном поксвируса по п. 24, который представляет собой геном вируса осповакцины.
26. Рекомбинантный EEV вируса осповакцины, содержащий геном поксвируса по п. 25.
27. Способ получения рекомбинантного EEV вируса осповакцины по п. 26, включающий:
(a) инфицирование клетки-хозяина, чувствительной к инфекции вирусом осповакцины, вирусом осповакцины, содержащим геном поксвируса по п. 24, и
(b) выделение EEV, высвобождаемого клеткой-хозяином.
28. Способ дисплея интегрального мембранного белка (IMP) или его фрагмента в нативной конформации, включающий:
(a) инфицирование клетки-хозяина, чувствительной к инфекции поксвирусом, рекомбинантным поксвирусом, который экспресисрует IMP или его фрагмент в виде слитого белка с характерный для EEV поксвируса белком или его мембраносвязанным фрагментом, где EEV продуцируемый инфицированной клеткой-хозяином содержит слитый белок IMP в виде части внешней мембраны оболочки EEV;
(b) выделение EEV, высвобождаемого клеткой-хозяином
где IMP или его фрагмент предоставлены на поверхность EEV в нативной конформации.
29. Способ по п. 28, где характерный для EEV белок представляет собой белок A33R, белок A34R, белок A56R, белок B5R, белок A36R, белок F13L вируса осповакцины, любой его мембраносвязанный фрагмент или любое их сочетание.
30. Способ по п. 29, где характерный для EEV белок представляет собой F13L (SEQ ID NO:1) или его функциональный фрагмент.
31. Способ по п. 30, где IMP представляет собой пронизывающий несколько раз мембрану белок, содержащий по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь трансмембранных доменов.
32. Способ по п. 31, где IMP содержит сопряженный с G-белком рецептор (GPCR), содержащий семь трансмембранных доменов, и где F13L является слитым с C-концом IMP.
33. Способ по п. 32, где IMP представляет собой белок фрайзлед 4 человека (FZD4) или его фрагмент.
34. Способ по п. 33, где слитый белок содержит аминокислоты от 20 до 892 SEQ ID NO:2.
35. Способ по п. 34, где слитый белок дополнительно содержит сигнальный пептид.
36. Способ по п. 35, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:2.
37. Способ по п. 32, где IMP представляет собой рецептор хемокинов CXC.
38. Способ по п. 37, где рецептор хемокинов CXC представляет собой CXCR4 или его фрагмент.
39. Способ по п. 38, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
40. Способ по п. 31, где IMP или его фрагмент содержит четное число трансмембранных доменов, и где N-конец и C-конец IMP или его фрагмента являются внутримембранными.
41. Способ по п. 40, где F13L является слитым с C-концом IMP.
42. Способ по п. 41, где IMP представляет собой CD20 человека или его фрагмент.
43. Способ по п. 42, где слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.
44. Способ по п. 29, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент содержит стебель, трансмембранный и внутримембранный домены белка A56R вируса осповакцины.
45. Способ по п. 30, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент состоит по существу из аминокислот от 108 до 314 SEQ ID NO:5.
46. Способ по п. 45, где IMP содержит внеклеточный домен FZD4 человека.
47. Способ по п. 46, где слитый белок содержит аминокислоты от 20 до 370 SEQ ID NO:6.
48. Способ по п. 46, где слитый белок дополнительно содержит сигнальный пептид.
49. Способ по п. 48, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:6.
50. Способ по п. 45, где IMP содержит внеклеточный домен ErbB2 (Her2) человека.
51. Способ по п. 50, где слитый белок содержит аминокислоты от 20 до 855 SEQ ID NO:7.
52. Способ по п. 51, где слитый белок дополнительно содержит сигнальный пептид.
53. Способ по п. 52, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:7.
54. Способ по п. 45, где IMP содержит внеклеточный домен CD100 человека (семафорин 4D).
55. Способ по п. 54, где слитый белок содержит аминокислоты от 20 до 935 SEQ ID NO:8.
56. Способ по п. 55, где слитый белок дополнительно содержит сигнальный пептид.
57. Способ по п. 56, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:8.
58. Способ по п. 29, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент содержит трансмембранный и внутримембранный домены белка B5R вируса осповакцины.
59. Способ по п. 58, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент состоит по существу из аминокислот от 276 до 317 SEQ ID NO:9.
60. Способ по п. 58, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент содержит стебель, трансмембранный домен и внутримембранный домен белка B5R вируса осповакцины.
61. Способ по п. 30, где мембраносвязанный характерный для EEV белковый фрагмент состоит по существу из аминокислот от 238 до 317 SEQ ID NO:9.
62. Способ по п. 59 или п. 61, где IMP содержит внеклеточный домен FZD4 человека.
63. Способ по п. 62, где слитый белок содержит аминокислоты от 20 до 243 SEQ ID NO:10 или аминокислоты от 20 до 281 SEQ ID NO:11.
64. Способ по п. 63, где слитый белок дополнительно содержит сигнальный пептид.
65. Способ по п. 64, где сигнальный пептид содержит аминокислоты от 1 до 19 SEQ ID NO:10.
66. Слитый белок, содержащий:
(a) аминокислоты от 20 до 892 SEQ ID NO:2;
(b) SEQ ID NO:3;
(c) SEQ ID NO:4;
(d) аминокислоты от 20 до 370 SEQ ID NO:6;
(e) аминокислоты от 20 до 855 SEQ ID NO:7;
(f) аминокислоты от 20 до 935 SEQ ID NO:8;
(g) аминокислоты от 20 до 243 SEQ ID NO:10; или
(h) аминокислоты от 20 до 281 SEQ ID NO:11;
где слитый белок при экспрессии рекомбинантным поксвирусом появляется на поверхности внеклеточного оболочечного вирионп (EEV) поксвируса в нативной конформации.
67. Рекомбинантный EEV поксвируса, содержащий слитый белок по п. 66.
68. Рекомбинантный EEV поксвируса, содержащий гетерологичный IMP или его фрагмент, слитый с характерным для EEV поксвируса белком или его мембраносвязанным фрагментом, где слитый белок находится во внешней мембране оболочки EEV, где IMP или его фрагмент предоставлены на поверхности EEV в своей нативной конформации.
69. Рекомбинантный EEV поксвируса по п. 67 или п. 68, где EEV поксвируса представляет собой EEV вируса осповакцины.
70. Способ селекции антител, которые связываются с пронизывающим несколько раз мембрану белком, включающий:
(a) связывание рекомбинантного EEV по любому из пп. 26 или 67-69 с твердой подложкой;
(b) получение библиотеки дисплея антител, где библиотека содержит пакеты дисплея, предоставляющие совокупность антигенасвязывающих доменов;
(c) приведение библиотеки дисплея в контакт с EEV, таким образом, что пакеты дисплея, предоставляющий антигенсвязывающие домены, которые специфически связывается с IMP, экспрессируемым на EEV, могут его связывать;
(d) удаление несвязанных пакетов дисплея; и
(e) выделение пакетов дисплея, которые предоставляют антигенсвязывающий домен, специфический к IMP, экспрессируемому на EEV.
71. Способ по п. 70, где рекомбинантный EEV инактивируют перед связыванием с твердой подложкой.
72. Способ по п. 71, где EEV инактивируют инкубацией с просаленом (триоксаленом, 4'-аминометилгидрохлоридом) в присутствии УФ-облучения.
73. Способ по любому из пп. 70-72, где EEV связывают с твердой поверхностью с помощью реакции с тозильными группами, связанными с поверхностью.
74. Способ по п. 73, где твердая поверхность представляет собой активированные тозилом магнитные гранулы.
75. Способ по любому из пп. 70-72, где EEV подвергают битионилированию и связывают с покрытой стрептавидином твердой поверхностью.
76. Способ по п. 75, где твердая поверхность представляет собой покрытые стрептавидином магнитные гранулы.