Недостаточность репрограммирования ядра гемопоэтическои стволовой клетки при его переносе

мм

Новости клеточных технологий

КЛОНИРОВАНИЕ

^нтп

Недостаточность репрограммирования ядра гемопоэтической стволовой клетки при его переносе

Эксперименты по переносу ядра в энуклеированный ово-цит показали, что генетические и эпигенетические изменения, приобретаемые клеткой в процессе дифференцировки, могут быть полностью «репрограммированы». При переносе ядра соматическая клетка может вернуться в плюрипотен-тное состояние и дать начало новому эмбриону из которого могут быть изолированы совместимые эмбриональные стволовые клетки [embryonic stem cells, ESC) [1]. Однако, частота выделения линии ESC из бластоцисты, полученной переносом ядра крайне низка и составляет в среднем 1 линия из 200-300 переносов. Считается, что частоту удачных попыток переноса может увеличить использование ядер от незрелых стволовых клеток дефинитивных тканей [2]. Так, если донором ядра является ESC, процент рожденных клонированных животных может достигать 20. Если же донор - соматическая дифференцированная клетка, число рожденных плодов значительно снижается. Поэтому, существует предположение, что в дифференцированных соматических клетках генетические и эпигенетические модификации труднее изменить и перепрограммировать в цитоплазме овоцита [1, 2].

В настоящее время, достаточно хорошо охарактеризованы гемопоэтические стволовые клетки [hematopoietic stem cells, HSC). Одна такая клетка способна восстановить гемопоэз летально облученной мыши [3]. Пластичность генома HSC позволяет получить из них клетки не только гемопоэтической линии [4]. Таким образом, HSC могли бы стать хорошим альтернативным донорским источником для переноса ядра и теоретически повысить частоту создания жизнеспособных клонов. Основываясь на этих данных, ученые из RIKEN Bioresource Center [Tsukuba, Japan) проверили гипотезу о том, что эти клетки могут быть «выгодными» донорами ядер для клонирования, так как у них относительно пластичный геном. Авторы протестировали способность к репрограммированию и клонированию HSC, выделенные из самок и самцов мышей разных линий, в сравнении с фиб-робластами, кумулюсными и клетками Сертоли, стандартно применяющимися для клонирования.

Основная часть реконструированных эмбрионов культивировалась в течение 48 часов, а затем переносилась в организм самки. Во всех экспериментальных группах около 90% клонированных зигот делились в первые 24 часа, однако в течение следующих суток только 34% HSC-образованных эмбрионов давали 4 клетки, тогда как в других группах большинство клонов достигло 4клеточной стадии. Частота развития HSC-эмбрионов в бластоцисту оказалась неожиданно низкой [5,9%), тогда как почти половина [45,8%) клонов из кумулюсных клеток развивалась нормально. Четырехкле-точные эмбрионы были перенесены в организм самок-реципиентов. Всего два мышонка родилось из HSC-клонов и только из клеток одной линии. Клонированное потомство родилось во всех контрольных группах: из клеток Сертоли - 6, из кумулюсных - 8 и из фибробластов - 5 мышат. Таким образом, клоны, полученные из HSC, показали самый низкий потенциал развития, как на ранних стадиях развития так и на более поздних.

Считается, что геном донорского ядра «перепрограммируется» при его переносе в цитоплазму овоцита в определенное время, когда происходит переключение активности материнского генома на эмбриональный геном. Это так называемая эмбриональная активация генов [embryonic gene activation, EGA). У мышей эта активация начинается еще на стадии зиготы, но в основном она происходит на двуклеточной стадии [5-7]. Поэтому, скорее всего, остановка в развитии клонированных эмбрионов происходит при нарушении эмбриональной активации генов. Для выяснения молекулярно-генетических причин этого процесса Kimiko Inoue с коллегами исследовали эмбрионы при переходе из 2 в 4-клеточную стадию [точка появления разницы в развитии HSC-эмбри-онов). Для сравнения были изучены нормальные эмбрионы, эмбрионы, полученные искусственным оплодотворением и клонированные из HSC и кумулюсных клеток. Авторы выявили, что в эмбрионах, полученных от разных клеток, уровень экспрессии 6-ти основных генов, активных в основной стадии EGA [3-5], различен. Например, уровень транскрипции гена Hdacl (histone deacetylase 1) был высок во всех трех группах, кроме HSC-эмбрионов. Известно, что этот ген слабо экспрессируется на одноклеточной стадии развития эмбриона и сильнее - на дву- четырехклеточной. Hdacl взаимодействует с обширной генной сетью и считается ключевым геном деацетилаз, активируемым в эмбрионе сразу после оплодотворения. Возможно, он играет одну из важнейших ролей в регуляции экспрессии генов раннего развития, так как при его подавлении гиперацетилирование гистонов приводит к полной блокировке дальнейшего развития на двуклеточной стадии [8, 9]. Анализ с использованием антител на ацетилированные гистоны в HSC-эмбрионах подтвердил повышенный уровень ацетилирования, то есть пониженная активность Hdacl ведет к изменениям на хроматиновом уровне. В то же время, гены Endomucin, CD45 и c-kit, которые, как известно, активны в HSC, в клонированных HSC-эмбрионах не транскрибировались.

Авторы работы впервые показали возможность рождения клонированных мышей переносом ядра от донорской HSC. В то же время, ожидалось, что эффективность клонирования будет выше, чем при использовании других соматических клеток, так как геном HSC проявляет большую пластичность. Однако, частота развития клонированных эмбрионов с ядрами HSC оказалось неожиданно низкой, значительно хуже на всех стадиях, начиная с четырехкле-точной, сравнительно с клонами, полученными от ядер других клеток-доноров. На основании анализа экспрессии генов было показано нарушение активации эмбрионального генома.

Низкий уровень развития HSC-клонов даже по сравнению с клонами из лимфоцитов [10], говорит о том, что «ство-ловость» донорского ядра не всегда улучшает эффективность клонирования. Одной из основных причин может быть низкая активность гена Hdad в HSC, что приводит к гипе-рацетилированию гистонов. Вероятно, что разница в экспрессии проанализированных генов зависит от доступности гиперацетилированной ДНК к транскрипционным факторам.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 3 (5), 2006

мм

ш

Новости клеточных технологий

Дальнейшие исследования помогут проверить эту гипотезу. Несмотря на многочисленные вновь возникшие вопросы, Ютлко 1поие и его коллеги получили важный результат, заключающийся не только в клонировании мышей с использованием ИБС, но и в сравнительном анализе,

показывающем низкий уровень перепрограммирования ядра ИБС. Возможно, что аналогичная недостаточность перепрограммирования будет наблюдаться и с ядрами взрослых стволовых клеток человека. Вопрос выбора оптимальной клетки-донора ядра клонирования остается актуальным.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Rideout W.M. 3rd, Eggan K., Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001; 293: 1093-8.

2. Blelloch R. Progress for nuclear transfer technology. 7th Int Congress Cell Transplant Society. Nov. 17-20, Boston, USA. Oral presentation.

3. Osawa M., Hanada K., Hamada H. et al. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science 1996; 273(5272): 242-5.

4. Krause D.S., Theise N.D., Collector M.I. et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell 2001; 105(3): 369-77.

5. De Sousa P.A., Watson A.J., Schultz RM. Transient expression of a translation initiation factor is conservatively associated with embryonic gene activation in murine and bovine embryos. Biol. Reprod. 1998; 59(4): 969-77.

6. Hamatani T., Carter M.G., Sharov A.A. et al. Dynamics of global gene expression changes during mouse preimplantation development. Dev. Cell. 2004; 6(1): 117-31.

7. Evsikov A.V., de Vries W.N., Peaston A.E. et al. Systems biology of the 2-cell mouse embryo. Cytogenet. Genome Res. 2004; 105(2-4): 240-50.

8. Schultz R.M., Davis W. Jr., Stein P. et al. Reprogramming of gene expression during preimplantation development. J. Exp. Zool. 1999; 285(3): 276-82.

9. Ma J., Svoboda P., Schultz R.M. et al. Regulation of zygotic gene activation in the preimplantation mouse embryo: global activation and repression of gene expression. Biol. Reprod. 2001; 64(6): 1713-21.

10. Inoue K., Wakao H., Ogonuki N. et al. Generation of cloned mice by direct nuclear transfer from natural killer T cells. Curr. Biol. 2005; 15(12): 1114-8.

Подготовила T.B. Лопатина по материалам J. Cell Sci. 2006; 119: 1985-91

Изучение иммунологической совместимости клона и клетки - донора ядра

Считается, что создание индивидуальных для каждого пациента линий эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] с помощью метода переноса ядра соматической клетки в энуклеированный овоцит позволит избежать проблемы иммунного отторжения. Действительно, клонированные ЭСК имеют идентичный реципиенту генетический материал ядра и, следовательно, идентичные антигены главного/минорного комплекса гистосовместимости ядерного происхождения. Полная совместимость по антигенам MHC I-II классов исключает прямое распознавание Т-лимфоцитами и, следовательно, реакции острого отторжения.

С другой стороны, митохондриальная ДНК клонированных ЭСК и клеток реципиента не идентичны. Митохондриальный геном человека содержит гены не менее 13 белков [1 ]. Для этих генов характерен выраженный полиморфизм [2], что, по-видимому, обусловлено несовершенством механизмов репарации, отсутствием гистонов и присутствием свободных радикалов кислорода - побочных продуктов аэробного дыхания. Таким образом, митохондриальные белки клонированных ЭСК и клеток реципиента могут иметь значительные структурные различия. Подобные структурные различия, в свою очередь, могут обуславливать реакцию отторжения по механизму непрямого распознавания. Представления о роли антигенов митохондриального происхождения в реакциях отторжения в настоящий момент имеют преимущественно теоретический характер и требуют тщательного изучения.

Первые исследования, проведенные группой R. Lanza et al. [3], показали, что трансплантация клонированных гемопо-этических стволовых клеток не сопровождается какой-либо видимой реакцией иммунного отторжения. Исследованию иммунологической совместимости пары клонированное животное/линия клеток, являющихся источником ядра,

посвящена недавно опубликованная в Biochemical and Biophysical Research Communications работа японской группы A. Shimada.

В исследовании использовались преадипоцитарные клеточные линии преадипо-1 и преадипо-2, полученные из ади-поцитов жировой ткани разных [аллогенных по отношению друг к другу) свиней путем дедифференцировки [3, 4]. Ранее ядра клеток этих линий использовали для клонирования 2 свиней - клон-РА1 и клон-РА2, соответственно [3]. Пре-адипоциты обеих линий маркировали витальным красителем. крашенные клетки пересаживали в кожу клонированных животных в количестве 1,0-1,4 млрд [сингенная и аллоген-ная трансплантация). Через 3 недели фрагменты кожи в местах введения резецировали, подвергали всестороннему гистологическому исследованию [схема эксперимента для сингенной трансплантации показана на рисунке).

Гистологический анализ показал, что клетки сингенных трансплантатов располагались в виде скоплений, в составе которых обнаружено незначительное количество некротического дебриса. Большинство меченых клеток имело первоначальную фибробластоподобную морфологию. Эта клеточная популяция была представлена адипоцитами [жировые включения в цитоплазме). днако, меченые адипоциты не были обнаружены в 35-40% сингенных трансплантатов. Клетки аллогенных трансплантатов также располагались в виде скоплений, среди которых не было обнаружено некротического дебриса. Во всех фрагментах кожи меченые клетки имели только однотипную фибробластоподобную морфологию.

Таким образом, авторы не наблюдали реакции острого отторжения не только для сингенных, но и для аллогенных преадипоцитов. тсутствовала и лимфоидная инфильтрация трансплантатов. С другой стороны, исследуемые клетки дифференцировались в адипоциты только при введении

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 3 (5), 2006