ДЕЙСТВИЕ ЭМИ НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ С ЧАСТОТОЙ 2-8 ГГЦ НА рН ВОДЫ И НА СКОРОСТЬ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН

УДК 577.3

З.Х-М. Хашасв, А.Ф. Кожокару, Э.М. Шекшеев Действие ЭМИ низкой интенсивности с частотой 2-8 ГГц на pH воды и на

скорость прорастания семян

В предыдущих исследованиях нами [Кожокару и др., 1997] экспериментально было показано, что дистиллированная вода, облученная в течение 30 минут ЭМИ мм и см диапазонов низкой интенсивности , сохраняет в памяти изменения , полученные при облучении и стимулирует скорость прорастания семян без облучения семян.

Было показано, что при действии облученной ЭМИ дистиллированной воды на семена увеличивается количество связанной воды, удерживаемой семенами.

Было также показано, что после воздействия ЭМИ в дистиллированной воде происходит изменение pH на сотые доли единиц в кислую сторону, а pH среды прорастания семян смещался на 0,5 единиц в щелочную сторону, в то время как в контроле в первые часы он не изменялся. Особенное выраженное изменение свойств облученной ЭМИ дистиллированной воды было показано спектрофотометрическим методом по увеличению в 2 раза выхода из семян в среду прорастания белков, ферментов, стимуляторов роста и метаболитов по сравнению с контролем. В настоящем отчете приводятся более подробные данные этих исследований.

Было предположено, что облученная ЭМИ вода может оказывать стимулирующее действие на прорастание семян за счет изменения при облучении ее структуры и физикохимических свойств, степени ее связанности с «примесями» ионами и биомолекулами, с последними вода может связываться как на поверхности (гидратированная вода), так и внутри в виде мостиков, поддерживая их конформацию даже при относительно низком содержании воды. Возможно, в растениях при действии ЭМИ увеличивается связанность воды со структурными элементами клетки(микротрубочками и микрофиламентами цитоскелета), участвующими в прорастании семян.

Для проверки первого из предположений в данном разделе работы было исследовано влияние облученной ЭМИ воды (бидистиллированной, дистиллированной водопроводной) с различным содержанием примесей, влияющих на структуру воды, от которой зависит эффективность воздействия ЭМИ, а также влияющих на каталитическую активность ферментов и, соответственно, на скорость прорастания семян.

Материалы и методы

Опыты проводились с бидистиллированной, дистиллированной водопроводной водой, облученной ЭМИ низкой интенсивности с ППМ 5 и 25 мкВт/см2 и частотой 2-8ГГц. Во второй серии опытов воду облучали радиочастотным генератором 4-141 с частотой42.25 ГГц и ППМ 2 мВт/см2 [Fesenko et al., 1995], как в предыдущем отчете. В отдельной серии опытов использовали ЭМИ высокой интенсивности ППМ 1-13 Вт/см2 (генератор Луч 3). Облучение проводили в чашках Петри с диаметром 6 см, толщина слоя в чашке 1,8 см, объем раствора 5 мл или в пластмассовых бюксах марки ТУ 64-2-279-79. Экспозиция при облучении ЗОмин при 22°С. С помощью цифрового рН-метра фирмы «Mettler Delta 320» с электродом марки «Orion» проводили измерения pH воды до и после облучения ЭМИ, а также pH среды прорастания семян через считанные часы, через одни и двое суток. В отчете приводятся значения pH через

15-20 минутный интервал времени после начала измерения, в течение которого устанавливалось постоянное значение pH.

Спектрофотометрическим методом на «Specord М 40» с программным управлением по изменению оптической плотности суспензии определяли суммарное количество вышедших в среду из семян ферментов, белков и других компонентов. Результаты исследований прямого действия облучения ЭМИ на воду, водные растворы и семена, замоченные в воде, представлены в виде разницы между величинами ряда физиологических и биофизических показателей для контрольных и опытных образцов.

Результаты исследований

В таблице 1 представлены результаты по изменению скорости прорастания и веса семян при добавлении к ним облученной ЭМИ (ППМ 25 мкВт/см2, частота 2-8 ГГц) воды из разных источников (бидистиллированной, дистиллированной водопроводной) и при одновременном облучении воды и семян. В первом варианте постановки опытов, когда облученная ЭМИ вода добавлялась через 10-30 минут после облучения к замоченным в необлученной воды в течение

16-19 часов семенам, готовых к прорастанию (условия опыта такие же, как в первом отчете), скорость прорастания, вес семян и проростков на первые и последующие сутки измерения в опытных образцах с облученной ЭМИ водой были выше, чем в контрольных образцах. Для водопроводной воды эффект ЭМИ проявлялся в большой степени (на 10-15%), а для дистиллированной и бистиллированной воды был менее значительным. Из полученных данных можно предположить, что облучение ЭМИ действует не только на воду, ее дипольные молекулы, на водородные связи, но и па присутствующие в ней примеси, ионы, газы и частицы Особенно существенной для эффекта ЭМИ, на наш взгляд, является концентрация примесных Са-карбонатных и других частиц размером 0,2-2,0 мкм, которая в бидистиллированной воде составляет 1 тыс./см3 и выше. Эти частицы обрастают адсорбционной «шубой» и поглощают большое количество энергии ЭМИ, которую они передают биомолекулам; при действии ЭМИ или магнитного поля «шубы» сбрасываются, частицы оголяются и возрастает их катапизаторная роль. В большой мере этот эффект, по-видимому, проявляется для дистиллированной и водопроводной воды.

Таблица 1.

Изменение скорости прорастания и веса семян пшеницы при добавлении к семенам облученной низко интенсивным ЭМИ воды и при облучении семян в воде

Время регистрации

№ № Вариант опыта 1 сутки Зсутки 5 сутки

% % прор астан ия Вес (мг) семя н %% прораст ания Вес (мг) семян %% прорастания Вес (мг) семян

1 Бидист.вода без облучения 70 675 70 730 80 950

2 Бидист.вода облученная 80 700 80 870 80 1000

3 Облучение семян в бидист.воде. 80 680 85 830 85 1050

4 Диет, вода без облучения 70 700 80 715 80 1000

5 Бидист.вода облученная 80 750 80 780 80 1050

6 Облучение семян в бидист.воде 85 700 85 840 95 1150

7 Водопров.вода без облучения 75 730 85 745 90 1050

8 Водопров.вода облученная 85 745 100 815 100 1100

9 Облучение семян в водопров.воде 90 750 90 880 100 1300

В другой серии опытов при исследовании эффекта воды, облученной ЭМИ с частотой 42,25 ГГц и ППМ 2 мВт/см2при добавлении её к замоченным семенам в бюксах через 10-30 минут после облучения было показано, что степень прорастания и вес семян были немного выше для каждого вида воды, чем в первой серии опытов, когда облучение воды проводилось ЭМИ меньшей интенсивности. Так, для облученной ЭМИ водопроводной воды увеличение указанных параметров происходило на 15-20% по отношению к контрольным образцам, для дистиллированной воды на 10-15% и для бидистиллированной воды на 8-12%. Следовательно, при увеличении количества примесей в воде и при этом виде облучения эффект воды выше.

Мы предположили, что полученный эффект ЭМИ на прорастание семян может быть связан с изменением структуры воды и степени связывания воды со структурами клеток и

биомолекул. Для доказательства последнего предположения была поставлена следующая серия опытов, в которой мы исследовали возможность связывания с семенами воды из различных источников. Опыты проводились в чашках Петри, в каждой чашке проращивали по 30 семян.

На вторые сутки наблюдения вес семян в опыте с добавлением облученной водопроводной воды оказался на 3% больше, чем в контроле (число проросших семян в опыте составляло 95%, а в контроле - 75%), а в случае замачивания семян по обычной методике в течение 16-19 часов, когда семена были готовы к прорастанию. Если же семена замачивались в течение меньшего промежутка времени 10 часов, то вес семян, к которым добавлялась облученная водопроводная вода, через 24 часа был на 5-8% выше, чем в контрольном образце. Для облученной дистиллированной и бидистиллированной воды вес семян при такой постановке опытов был на 3-5% выше, чем в контроле. Нам показалось возможным, что в этом случае семена содержат больше связанной воды. Для выявления связанной с семенами воды избыток воды с увлажненных семян отбирался фильтровальной бумагой, а затем семена выдерживались в течение 10 часов на кальке и вновь взвешивались, такая процедура не сказывалась на эффективности и скорости дальнейшего прорастания семян. В этом случае вес семян, к которым добавлялась облученная водопроводная вода, через 24 часа был больше, чем контрольных семян не на 5-8%, а на 0,5-0,6%, что указывало на то, что облучение воды способствует увеличению количества связанной со структурами клеток семян воды, составляющей по данным нашего опыта десятую часть от общего количества воды, проникающей в семена под влиянием ЭМИ (в данном случае водопроводной, как наиболее эффективной). Вес сухой массы проростков, полученных на седьмые сутки проращивания семян и высушенных при 22° С в течение 3-х суток, был на 18% больше в опыте, чем в контроле, а при высушивании в течение суток в сушильном шкафу ’при 55° С на 3,5% (исходно, до высушивания биомасса проростков различалась на 18%). Мы предположили, что наибольшая часть этой разницы в весе при последнем высушивании проростков относится к связанной воде. Полученные в этой серии опытов данные по увеличению проницаемости семян для воды, количеством связанной с семенами и проростками воды возможно, на наш взгляд, объяснить изменением физико-химической структуры воды под действием ЭМИ низкой интенсивности (разрушением кластеров). Семена, содержащие большее количество связанной воды и в большей степени набухшие, имеют более высокую активность ферментов (эстераз), клеточного метаболизма и более высокую скорость прорастания.

На рисунке 1 показаны результаты спектрофотометрических исследований количества вышедших из семян в среду белков, ферментов и других метаболитов в ходе набухания и прорастания замоченных семян пшеницы (через сутки) при добавлении к ним необлученной (А-контроль) и облученной ЭМИ с ППМ 25мкВт/см2 и частотой 2-8 ГГц(Б-контроль) воды из разных источников. Было выяснено, что при добавлении воды через 30 минут после облучения ЭМИ бидистиллированной, дистиллированной и водопроводной воды максимумы оптической плотности спектров (при 256,6 нм) выше в 1,5 раза по сравнению с контролем (кривые 1-3). Наибольший эффект наблюдался для дистиллированной и водопроводной воды (кривые 2-3, рис.1Б). Для семян, облученных в водопроводной воде, получена кривая 4 (рис. 1Б), которая также располагалась выше, чем в контроле (кривая 4 на рис.1А). Облучение семян в бидистиллированной воде существенно не изменяло оптическую плотность максимумов спектра по сравнению с контролем (необлученные семена в воде) (на рисунке не показано). Измеряемые эффекты зависели от количества взятых в образец семян, от их состояния (сухие, увлажненные, замоченные), от времени и дозы облучения ЭМИ, а также от качества воды (степени очистки от ионов, газов, солей и различных примесей).

Облучение дистиллированной воды ЭМИ высокой интенсивности генератором Луч-3 в течение 1,5-2 часов с повышением температуры раствора до 35 °С и добавление ее к воздушносухим семенам (рис.2) приводило к 100% ингибированию роста и к существенному выходу из семян белков и метаболитов.

В таблице 2 представлены экспериментальные данные по исследованию pH воды, полученной из разных источников: бидистиллированной, дистиллированной и водопроводной. Из таблицы видно, что у каждого вида воды свой исходный pH, облучение ЭМИ низкой интенсивности

сдвигает pH в кислую сторону, а прорастание семян в облученной воде любой степени очистки независимо от первоначального pH сдвигает pH в щелочную сторону. Облученная бидистиллированная вода, добавленная через 10 и 30 минут после облучения , в первые 3-5 часов не изменяла pH среды, эффект был такой же, как в контроле с необлученной водой. В тех же условиях дистиллированная и водопроводная вода через такой же интервал времени проращивания изменяли pH среды на 0,5-).7 ед.рН. Существенный эффект в изменении pH среды при добавлении к семенам облученной и необлученной воды проявлялся через 1-2 суток. Разница между pH исходно взятой в опыт бидистиллированной необлученной воды и такой же воды, в которой проращивались семена, через сутки наблюдения составляла 1,35 ед.рН и 1,71 ед.рН через двое суток, при облучении этой воды указанная разница была 1,58 и 1,88 ед.рН, соответственно. Аналогично, разница pH исходной дистиллированной воды и той же воды, использованной для проращивания семян, на 1 и 2 сутки 1,40 и 1,47ед., при облучении воды она существенно выше 2,43 и 2,20, соответственно. Для водопроводной воды эти изменения были менее значительными без облучения воды - 0,53 и 0,67 уд., с облучением -лишь на 0,13 ед. выше, чем без облучения.

Таблица 2.

Изменение pH водной среды проращивания семян пшеницы при ее облучении

№№ Вариант опыта Исходный pH воды pH воды через сутки pH воды через двое суток

1. Бидист. вода без облучения 5,50-5,45 6,86-6,88 7,20-7,22

2. Бидист. вода облученная 5,48-5,43 7,02-7,06 7,23-7,25

3. Облучение семян в бидист.воде 5,50-5,55 6,65-6,68 6,83-6,89

4. Дистилл. вода без облучения 5,00-4,95 6,88-6,92 6,96-6,98

5. Дистилл. вода облученная 4,98-4,89 7,35-7,37 7,15-7,20

6. Облучение семян в дистилл.воде 5,50-5,05 7,22-7,25 7,30-7,35

7 Водопров. вода без облучения 7,30-7,35 7,85-7,8 7 7,95-7,98

8. Водопров. вода облученная 7,30-7,28 7,95-7,98 7,68-7,72

9. Облучение семян в водопров. воде 7,30-7,35 7,90-7,95 7,98-7,99

Для выявления воздействия облучения воды на pH среды сравнивались контрольные и опытные значения pH. Оказалось, что через 1-2 суток после проращивания семян в облученной бидистиллированной и дистиллированной воде pH защелачивался, причем в большей степени для дистиллированной воды (на 0,45 и 0,2ед.на 1 и 2 сутки) (таблица 2).

При добавлении облученной водопроводной воды к семенам или при облучении семян в этой воде pH существенно не изменялся, вероятно, из-за исходно высокого щелочного pH, не создающего градиента ионов водорода на цитоплазматической мембране семян. Это предположение подтвердилось в опытах с водопроводной водой, в которой pH был исходно доведен до 3,0. При проращивании в ней семян pH также защелачивался через двое суток до 5,75 (этот pH был 6,65 и 6,3 для бидистиллированной и дистиллированной воды с исходным pH 3,0).

Таким образом, были получены данные, свидетельствующие о том, что при добавлении к семенам облученной ЭМИ низкой интенсивности воды с различным содержанием примесей и исходным pH в кислой области, ЭМИ индуцирует некоторое защелачивание водной среды проращивания семян. Эти данные подтверждают высказанное в предыдущем отчете предположение о том, что защелачивание среды может приводить к закислению матрикса растительных клеток, которое, в свою очередь, может способствовать транспорту протонов

внутрь хлоропластов и увеличивать градиент pH на тилакоидной мембране и, следовательно, активировать синтез АТФ, метаболические процессы и скорость прорастания семян. Возможно, что на цитоплазматической мембране клеток в результате изменения градиента pH могут активироваться Н+, К+ и другие ионные каналы. Не исключено, что для стимуляции прорастания семян и роста проростков значение этих процессов, происходящих под влиянием изменений pH облученной водной среды прорастания семян, не столь велико, как изменение структуры воды и степень ее связанности со структурами и биомолекулами растительных клеток, как описано выше.

Обсуждение результатов

Полученные нами данные показывают, что облучение ЭМИ низкой интенсивности из разных источников, с разным количеством примесей (1тыс./см3- в бидистиллированной воде, 10тыс./см3 - в дистиллированной воде, 1 млн./см3 - в водопроводной) по-разному влияет на степень прорастания, вес семян и проростков пшеницы, семена при этом не облучаются. Наиболее эффективной оказалась водопроводная вода, она увеличивала указанные параметры на 1-2 сутки наблюдения на 10-15% при воздействии на воду ЭМИ с ППМ 25 мкВт/см2 и на 15-20% при воздействии ЭМИ с ППМ 2 мВт/см2 Дистиллированная и бидистиллированная вода стимулировала прорастание семян несколько в меньшей степени , в частности, на 10-15% и 8-12% при облучении ЭМИ с ППМ 2 мВт/см2, соответственно.

В отдельной серии опытов было показано, что облученная ЭМИ вода способствует увеличению проницаемости семян для воды. При высушивании семян в течение 10 часов через 24 часа после добавления к ним облученной водопроводной воды на воздухе они содержали на 0Ю5-0,6% больше воды, чем в контроле, а при высушивании проростков на 7-ые сутки наблюдения при 55°С в течение суток они содержали на 3-5% больше воды, чем в контрольных образцах. Эти опыты свидетельствовали на наш взгляд, о способности воды, облученной ЭМИ, индуцировать связывание молекул воды с клеточными структурами и биомолекулами семян и проростков. Содержание воды в опытных образцах семян и проростков без высушивания был также больше, чем в контрольных, что свидетельствовало об увеличении проницаемости клеток данного растительного объекта для воды. Количество связанной воды составляло часть от количества воды, поступившей в клетки под действием ЭМИ. По литературным данным (Хохлова и др., 1996) при использовании ингибиторов синтеза белков цитоскелета (колхицина и цитохалазина) при проращивании семян имело место обратное перераспределение свободной и связанной воды в сторону большего содержания свободной фракции. К такому эффекту может привести и торможение активности клеточного метаболизма в результате нарушения связей ферментных белков с цитоскелетом (Хохлова и др., 1996).

Спектрофотометрическим методом по изменению оптической плотности суммарного количества вышедших из семян белков, ферментов (эстераз) и других компонентов было показано, что водопроводная вода, облученная слабоинтенсивным ЭМИ и добавленная к замоченным предварительно семенам, также индуцирует наибольший эффект по сравнению с дистиллированной и бидистиллированной водой. При облучении дистиллированной воды ЭМИ высокой интенсивности наблюдалось полное подавление скорости прорастания семян, сопровождающееся достаточно высоким выходом метаболитов из семян; такая среда роста, добавленная к новой порции семян без облучения полностью подавляла прорастание семян.

Измерение pH водной среды прорастания семян показало, что значение этого показателя смещалось в щелочную сторону для дистиллированной и бидистиллированной воды в первые часы после добавления облученной воды на 0,5-0,7 ед., в 1-2 сутки наблюдения - на 1,5-2,20 уд., (для дистиллированной защелачивание было больше). В контрольных образцах также происходило увеличение pH, но в меньшей степени, что свидетельствовало о том, что облучение воды ЭМИ индуцирует изменение pH среды в щелочную сторону, обусловленное , вероятно, усилением откачки протонов из среды в матрикс клеток семян. Это может приводить к усилению транспорта протонов в хлоропласты и усилению синтеза АТФ, и, следовательно, ускорению синтеза метаболитов и прорастания семян. Мы допускаем, что значение изменений

pH среды для ускорения прорастания семян под действием облучения воды может быть не столь значительным , как других рассматриваемых нами процессов.

Основные выводы

1. Слабоинтенсивное воздействие ЭМИ на воду различной степени очистки, которую впоследствии, через 10-30 минут после облучения, добавляли к семенам пшеницы, стимулировало скорость прорастания семян, увеличивало вес семян и проростков, выход из семян белков, ферментов (эстераз) и других метаболитов. Степень эффективности воздействия убывала в следующем порядке: водопроводная, дистиллированная и бидистиллированная вода. Эти данные свидетельствовали о наличии у воды «памяти».

2. Полученную биологическую активность облученной ЭМИ воды мы объясняем увеличением количества связанной со структурами и биомолекулами растительных клеток молекул воды, что следует из полученных нами экспериментальных данных по высушиванию семян и проростков. Эти данные могут являться доказательством того факта, что ЭМИ изменяет физико-химическую структуру воды (разрушают кластеры) таким образом, что образуются новые водородные связи молекул воды, которые используются для связи с биомолекулами. Наблюдаемое нами увеличение проницаемости семян для воды, усиление набухания семян при действии облученной воды также способствовало увеличению степени и скорости прорастания семян.

3. Другим объяснением биологической активности облученной воды может являться возможность ускорения синтеза АТФ при увеличении откачки протонов из среды в матрикс растительных клеток, это предположение основано на факте подщелачивания среды проращивания семян при добавлении облученной ЭМИ воды.

4. Наличие в облученной водной среде проращивания семян примесей увеличивало ее эффективность. Этот факт можно объяснить тем, что ЭМИ, как и магнитное поле, может способствовать разрушению не только кластеров, но и может освобождать частицы примесей от адсорбционной «шубы», что увеличивает их катализаторную активность.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кожокару А.Ф., Кожокару H.JJ., Акаев И.Г Отчет «Диполь», 1-ый этап, 1997, стр.116-124.

2. Хохлова J1.П., Швалева А.Л., Волобуева О.В. Исследование состояния воды при действии модификаторов цитоскелета. Биофизика, 1966, т.41, N 3, с.590-595.

3. Fesenko Е.Е., Geletyuk V.J., Kazsachenko V.N., Chemeris N.K. Preliminary microwave irradiation of water solutions changes their channel-modifying activity. FEBS Letters, 1995, v.366, N 1, p.49-52