КЛЕТОЧНО-РЕАКТИВНЫЕ АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА, АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ИЛИ АНАЛОГИ КОМПСТАТИНА НАЦЕЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CELL-REACTIVE COMPSTATIN ANALOGS, LONG-ACTING COMPSTATIN ANALOGS, OR TARGETED COMPSTATIN ANALOGS AND USES THEREOF

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/484836, поданной 11 мая 2011 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Перечень последовательностей
[0001.1] Настоящая заявка включает Перечень последовательностей, поданный электронно в формате ASCII и включенный в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 15 января -2014, названа 2008575-0035 SL. txt и ее размер составляет 356444 байта.
Уровень техники
[0002] Система комплемента представляет собой состоящую более чем из 30 белков плазмы и клеточно-связанных белков систему, играющую важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете. Белки системы комплемента функционируют в виде серий ферментативных каскадов за счет разнообразных белковых взаимодействий и процессов расщепления. Активация комплемента происходит тремя основными путями: через антителозависимый классический путь, альтернативный путь и манноза-связывающий лектиновый (MBL) путь. Ненадлежащая или избыточная активация комплемента является основной причиной или фактором, способствующим развитию ряда серьезных заболеваний и состояний, и на протяжении последних нескольких десятилетий на изучение различных ингибиторов комплемента для применения в качестве терапевтических агентов были направлены значительные усилия. Тем не менее, по-прежнему имеется потребность в инновационных подходах к ингибированию активации комплемента для различных терапевтических целей.
Краткое описание изобретения
[0003] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина. Например, в настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина, композиции, содержащие клеточно-реактивные аналоги компстатина, и способы получения, идентификации, описания и/или применения клеточно-реактивных аналогов компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина.
[0004] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия. Например, в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия, композиции, содержащие аналоги компстатина длительного действия, и способы получения, идентификации, описания и/или применения аналогов компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая аналог компстатина длительного действия.
[0005] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия. Например, в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, композиции, содержащие аналоги компстатина нацеленного действия, и способы получения, идентификации, описания и/или применения аналогов компстатина нацеленного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая аналог компстатина нацеленного действия. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая аналог компстатина нацеленного действия.
[0006] В настоящем изобретении также предложены способы защиты клетки от комплемент-опосредованного повреждения. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают приведение указанной клетки в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Указанная клетка может относиться к любому типу клеток согласно различным вариантам реализации. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка представляет собой клетку крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка крови представляет собой красную клетку крови (RBC/кКК), также называемую эритроцитом. Согласно некоторым вариантам реализации в указанной клетке наблюдается аномально низкий уровень экспрессии, поверхностной плотности и/или активности одного или более регуляторного белка комплемента. Например, указанная клетка может содержать мутацию в гене, кодирующем такой белок, отличающуюся тем, что указанная мутация приводит к снижению или отсутствию экспрессии и/или снижению активности кодируемого белка. Указанная клетка может относиться к любому типу клеток животных или любых видов согласно различным вариантам реализации. Например, указанная клетка может представлять собой клетку млекопитающего, например, примата (человека или не являющегося человеком примата), грызуна (например, мыши, крысы, кролика), копытного (например, свиньи, овцы, коровы), собачьих или кошачьих. Согласно многим вариантам реализации указанная защита представляет собой защиту от комплемента приматов, например, комплемента человека. Согласно некоторым вариантам реализации контакт с указанной клеткой происходит ex vivo (вне организма субъекта). Согласно некоторым вариантам реализации контакт с указанной клеткой происходит in vivo (у субъекта, например, у человека). Согласно некоторым вариантам реализации указанная клетка предназначена для трансплантации субъекту или была трансплантирована субъекту. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена выделенная клетка, к которой ковалентно присоединен аналог компстатина. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложен(а) выделенная(ый) ткань или орган, по меньшей мере к некоторым из клеток которой(ого) присоединен аналог компстатина.
[0007] В настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта, нуждающегося в лечении комплемент-опосредованного расстройства. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает введение клеточно-реактивного аналога компстатина указанному субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации указанный способ включает введение аналога компстатина длительного действия указанному субъекту. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия представляет собой клеточно-реактивный аналог компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанное комплемент-опосредованное расстройство представляет собой пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС) или другое расстройство, связанное с комплемент-опосредованным гемолизом. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение (например, в результате инфаркта миокарда, тромбоэмболического инсульта или хирургического вмешательства). Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой травму. Согласно некоторым вариантам реализации указанное расстройство представляет собой отторжение трансплантата.
[0008] Все статьи, издания, патентные заявки, патенты, другие публикации, веб-сайты и базы данных, упоминаемые в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылок. В случае противоречия между настоящим описанием и любой из включенных ссылок настоящее описание (включая любые поправки к нему) будет иметь решающее значение. Если не указано иное, в настоящей заявке используются принятые в соответствующих областях техники значения терминов и сокращения.
Краткое описание чертежей
[0009] На Фиг. 1 представлен график, отражающий процент подавляющей активацию комплемента активности аналога компстатина CA28 (SEQ ID NO: 28) и трех аналогов компстатина длительного действия (CA28-1, CA28-2, CA28-3) как функции от концентрации пептида (мкМ). Подавление активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа подавления классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов двух серий измерений. CA28 (круги; красный цвет), CA28-1 (кресты (х); голубой цвет); CA28-2 (треугольники, зеленый цвет), CA28-3 (квадраты (фиолетовый цвет).
[0010] На Фиг. 2 представлен график, отражающий процент подавляющей активацию комплемента активности CA28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-2 и CA28-3 как функции от концентрации соединения (мкМ). CA28 (квадраты, светло-серый), CA28-2 (ромбы, черный цвет), CA28-3 (круги, темно-серый цвет). CA28-3 представляет собой соединение, которое содержит несколько пептидных фрагментов. Хотя активность, приходящаяся на пептидный фрагмент, меньше активности отдельной молекулы CA28, общая активность CA28-3 в пересчете на моли выше активности CA28.
[0011] На Фиг. 3 представлен график концентраций CA28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-2 и CA28-3 в плазме от времени у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. CA28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из CA28-2 и CA28-3 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества CA28-2 и CA28-3 содержат 80% активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100% активного соединения в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. Таким образом, значения Cmax выше реальных Cmax. CA28 (квадраты, светло-серый), CA28-2 (треугольники, черный), CA28-3 (круги, темно-серый).
[0012] На Фиг. 4 представлен график, отражающий процент подавляющей активацию комплемента активности CA28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-4 как функции от концентрации соединения (мкМ). Подавление активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа подавления классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов четырех серий измерений CA28-4. CA28 (квадраты, светло-серый цвет), CA28-4 (кресты, черный цвет).
[0013] На Фиг. 5 приведен график, отражающий зависимость концентраций от времени для CA28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-2, CA28-3 и CA28-4 у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. CA28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из CA28-2, CA28-3 и CA28-4 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества CA28-2 и CA28-3 содержат 80% активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100% активного соединения в пересчете на сухую массу. Таким образом, значения Сmax превосходят значения Cmax, которые были бы получены при введении указанных соединений в означенных дозах в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. CA28 (квадраты, светло-серый), CA28-2 (треугольники, черный), CA28-3 (круги, темно-серый), CA28-4 (перевернутые треугольники, черный).
Подробное описание некоторых вариантов реализации изобретения
[0014] I. Определения
[0015] Термины «приблизительно» или «примерно» в отношении числа обычно включают числа, попадающие в диапазон ±10%, согласно некоторым вариантам реализации ±5%, согласно некоторым вариантам реализации ±1%, согласно некоторым вариантам реализации ±0,5% от числа, если не указано или иным образом очевидно из контекста иное (за исключением случаев, когда такое число недопустимым образом превышает 100% от возможного значения).
[0016] «Компонент комплемента» или «белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в активацию системы комплемента или принимающий участие в одной или более комплемент-опосредованной активности. Компоненты классического пути комплемента включают, например, C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 и C5b-9-комплекс, также называемый мембраноатакующим комплексом (МАК), и активные фрагменты или продукты ферментативного расщепления каких-либо из вышеперечисленных компонентов (например, C3a, C3b, C4a, C4b, C5a и т.п.). Компоненты альтернативного пути включают, например, факторы B, D и пропердин. Компоненты лектинового пути включают, например, MBL2, MASP-1 и MASP-2. Компоненты комплемента также включают клеточно-связанные рецепторы растворимых компонентов комплемента, отличающиеся тем, что указанный рецептор опосредует одну или более биологическую активность такого растворимого компонента комплемента после связывания указанного растворимого компонента комплемента. Такие рецепторы включают, например, рецептор C5a (C5aR), рецептор C3a (C3aR), рецептор комплемента 1 (CR1), рецептор комплемента 2 (CR2), рецептор комплемента 3 (CR3, также известный как CD45) и т.п. Следует иметь в виду, что термин «компонент комплемента» не подразумевает включение таких молекул и молекулярных структур, которые служат в качестве «триггеров» для активации комплемента, например, комплексов антиген-антитело, чужеродных структур, обнаруживаемых на поверхностях микроорганизмов или искусственных поверхностях, и т.п.
[0017] «Комплемент-опосредованное расстройство» представляет собой любое расстройство, для которого, согласно имеющимся данным или предположениям, по меньшей мере у некоторых субъектов, страдающих от указанного расстройства, активация комплемента является способствующим и/или по меньшей мере отчасти причинным фактором; например, расстройства, при которых активация комплемента приводит к повреждению тканей. Неограничивающие примеры комплемент-опосредованных расстройств включают, не ограничиваясь перечисленными, (i) различные расстройства, характеризующиеся гемолизом или гемолитической анемией, такие как атипичный гемолитико-уремический синдром, болезнь холодовых агглютининов, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, трансфузионные реакции; (ii) отторжение трансплантата (например, сверхострое или острое отторжение трансплантата) или дисфункция трансплантата; (iii) расстройства, включающие ишемическое/реперфузионное повреждение, такие как травма, хирургическое вмешательство (например, реконструкция при аневризме), инфаркт миокарда, ишемический инсульт; (iv) расстройства дыхательной системы, такие как астма и хроническое обструктивное заболевание легких (ХОБЛ); (v) артрит, например, ревматоидный артрит; (vi) глазные расстройства, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома и увеит. Термин «расстройство» в настоящей заявке применяют взаимозаменяемо с терминами «заболевание», «состояние» и аналогичными терминами, для обозначения любого нарушения здоровья или состояния анормального функционирования организма, например, любого состояния, при котором показана организация медицинского ухода и/или хирургического вмешательства, или в связи с которым субъект обращается за надлежащей медицинской и/или хирургической помощью. Следует также понимать, что конкретные расстройства перечислены в конкретных категориях для удобства и это не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Следует понимать, что определенные расстройства могут быть перечислены в нескольких подходящих категориях.
[0018] «Регуляторный белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в регуляцию активности комплемента. Регуляторный белок комплемента может понижающе регулировать активность комплемента, например, подавляя активацию комплемента или инактивируя или ускоряя разрушение одного или более активированного белка комплемента. Примеры регуляторных белков комплемента включают ингибитор C1, связывающий C4 белок, кластерин, витронектин, CFH, фактор I и клеточно-связанные белки CD46, CD55, CD59, CR1, CR2 и CR3.
[0019] «Связанный» в настоящей заявке в отношении двух или более фрагментов означает, что указанные фрагменты физически связаны или соединены друг с другом с образованием достаточно стабильной молекулярной структуры, так что указанные фрагменты остаются связанными в условиях, при которых образуется указанная связь, и, предпочтительно, в условиях, при которых применяют указанную новую молекулярную структуру, например, в физиологических условиях. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанная связь представляет собой ковалентную связь. Согласно другим вариантам реализации указанная связь является нековалентной. Фрагменты могут быть связаны либо прямо, либо непрямо. Если два фрагмента прямо связаны, они либо ковалентно связаны друг с другом, либо находятся на достаточно близком расстоянии, так что их связь поддерживается за счет межмолекулярных сил между указанными двумя фрагментами. Если два фрагмента связаны непрямо, каждый из них связан либо ковалентно, либо нековалентно с третьим фрагментом, за счет которого поддерживается связь между указанными двумя фрагментами. В целом, если говорится, что два фрагмента связаны «соединяющим фрагментом» или «соединяющей частью», связь между указанными двумя связанными фрагментами является непрямой, и, как правило, каждый из связанных фрагментов ковалентно связан с соединяющим фрагментом. Два фрагмента могут быть связаны с помощью «линкера». Линкер может представлять собой любой подходящий фрагмент, который вступает в реакцию с указанными соединениями, связывая их за разумный период времени, в условиях, соответствующих стабильности указанных соединений (участки которых могут быть защищены в надлежащих случаях, в зависимости от условий), в достаточном количестве, с удовлетворительным выходом. Как правило, линкер содержит по меньшей мере две функциональные группы, одна из которых вступает в реакцию с первым соединением, а другая вступает в реакцию с вторым соединением. Следует иметь в виду, что после того, как линкер прореагировал со связываемыми соединениями, термин «линкер» может относиться к части полученной структуры, которая происходит из указанного линкера, или, по меньшей мере, к части, которая не включает прореагировавшие функциональные группы. Соединяющий фрагмент может содержать часть, не участвующую в образовании связи с соединяемыми соединениями, основное назначение которой может состоять в пространственном разделении указанных соединений. Такая часть может называться «спейсером».
[0020] «Полипептид» в настоящей заявке относится к аминокислотному полимеру, необязательно включающему один или более аналог аминокислоты. Белок представляет собой молекулу, состоящую из одного или более полипептида. Пептид представляет собой относительно короткий полипептид, длина которого, как правило, составляет примерно от 2 до 60 аминокислот, например, от 8 до 40 аминокислот. Термины «белок», «полипептид» и «пептид» могут применяться взаимозаменяемо. Полипептиды в настоящей заявке могут включать аминокислоты, такие как встречающиеся в белках в природе, аминокислоты, не встречающиеся в белках в природе и/или аналоги аминокислот, которые не являются аминокислотами. В настоящей заявке «аналог» аминокислоты может представлять собой другую аминокислоту, структурно сходную с указанной аминокислотой, или соединение, не являющееся аминокислотой, структурно сходное с указанной аминокислотой. Существует значительное число известных в данной области техники аналогов 20 аминокислот, обычно обнаруживаемых в белках («стандартных» аминокислот). Одна или более из аминокислот полипептида может быть модифицирована, например, добавлением химического соединения, такого как углеводная группа, фосфатная группа, фарнезильная группа, изофарнезильная группа, жирнокислотная группа, линкер для конъюгирования, функционализирования или другой модификации, и т.п. Определенные подходящие неограничивающие аналоги и модификации описаны в WO 2004026328 и/или ниже. Указанный полипептид может быть ацетилирован, например, на N-конце и/или амидирован, например, на C-конце.
nd
[0021] Термин «реактивные функциональные группы» в настоящей заявке относится к группам, включающим, не ограничиваясь перечисленными, олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галиды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазогруппы, диазоний, нитрогруппы, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, изонитрилы сульфеновой кислоты, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, ортоэфиры, сульфиты, енамины, инамины, мочевины, псевдомочевины, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азиды, азосоединения, азоксисоединения и нитрозосоединения, сложные эфиры н-гидроксисукцинимида, малеимиды, сульфгидрилы и т.п. Способы получения каждой из указанных функциональных групп общеизвестны в данной области техники, и их применение или модификация для конкретной цели находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники (см., например, Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989, и Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, 2 ed., Academic Press, San Diego, 2008).
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
[0022] «Специфическое связывание» обычно относится к физической связи между целевым полипептидом (или, в более общем случае, целевой молекулой) и связывающей молекулой, такой как антитело или лиганд. Связывание, как правило, зависит от наличия конкретной структурной особенности мишени, такой как антигенная детерминанта, эпитоп, связывающий карман или углубление, распознаваемой связывающей молекулой. Например, если антитело специфично в отношении эпитопа А, присутствие полипептида, содержащего эпитоп А, или присутствие свободного немеченого А в реакции, включающей и свободный меченый А, и связывающую молекулу, присоединяющуюся к нему, снизит количество меченого А, который связывается с указанной связывающей молекулой. Следует понимать, что специфичность не обязательно должна быть абсолютной, и обычно относится к контексту, в котором происходит связывание. Например, в данной области техники общеизвестно, что многие антитела перекрестно реагируют с другими эпитопами, помимо имеющихся в целевой молекуле. Такая перекрестная реакционная способность может быть приемлемой, это зависит от предполагаемого применения антитела. Специалист в данной области техники сможет отобрать антитела или лиганды с достаточной степенью специфичности, подходящие для любого конкретного применения (например, для обнаружения целевой молекулы, для терапевтических целей и т.п.). Следует также понимать, что специфичность может оцениваться в контексте дополнительных факторов, таких как аффинность связывающей молекулы в отношении мишени относительно аффинности указанной связывающей молекулы в отношении других мишеней, например, конкурентных. Если связывающая молекула проявляет высокую аффинность в отношении целевой молекулы, которую необходимо обнаруживать с ее помощью, и низкую аффинность в отношении нецелевых молекул, указанное антитело, вероятно, является приемлемым реагентом. После того как специфичность связывающей молекулы в одном или более контексте установлена, она может применяться в других, предпочтительно сходных, контекстах без необходимости повторных проверок ее специфичности. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) двух молекул, демонстрирующих специфическое связывание, составляет 10 M или менее, например, 10 M или менее, например, 10 M или менее, например, 10 М или менее, 10 М или менее, 10 M или менее, или 10 M или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.
[0023] «Субъект», лечение которого проводят в соответствии с настоящим изобретением, как правило, представляет собой человека, не являющегося человеком примата или низшее животное (например, мышь или крысу), у которого экспрессируется или присутствует по меньшей мере какой-либо компонент комплемента C3 примата (например, человека) и, необязательно, один или более дополнительный компонент комплемента примата. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью мужского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью женского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является взрослым, например, человеком в возрасте по меньшей мере 18 лет, например, от 18 до 100 лет.
[0024] «Лечение» в настоящей заявке в отношении лечения субъекта относится к обеспечению лечения, т.е. обеспечению любого типа организации медицинского ухода или хирургического лечения субъекта. Указанное лечение может предоставляться для того, чтобы обратить, облегчить, подавить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность наступления заболевания, или для того, чтобы обратить, облегчить, подавлять или предотвратить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность появления одного или более симптома или проявления заболевания. «Предотвращать» относится к предотвращению наступления заболевания, появления симптома или проявления заболевания в течение по меньшей мере некоторого периода времени по меньшей мере у некоторых индивидуумов. Лечение может включать введение соединения или композиции указанному субъекту после развития одного или более симптома или проявления, свидетельствующего о заболевании, например, для того, чтобы обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить или предотвратить прогрессирование указанного заболевания и/или обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить один или более симптом или проявление указанного заболевания. Соединение или композиция может вводиться субъекту, у которого развилось заболевание или имеется повышенный риск развития указанного заболевания по сравнению с представителем общей популяции. Соединение или композиция может вводиться субъекту, у которого развилось заболевание и имеется повышенный риск развития одного или более конкретного симптома, проявления указанного заболевания или обострения указанного заболевания по сравнению с другими индивидуумами, у которых диагностировано указанное заболевание, либо по сравнению с типичным или средним риском возникновения такого симптома, проявления или обострения у указанного субъекта. Например, на указанного субъекта мог воздействовать «триггер», который обуславливает возникновение повышенного риска (в частности, временно повышенного риска) развития обострения у указанного субъекта. Соединение или композиция может вводиться профилактически, т.е. до развития какого-либо симптома или проявления указанного заболевания. Как правило, в этом случае у субъекта имеется риск развития указанного заболевания, например, относительно представителя общей популяции, необязательно имеющего совпадающие возраст, пол и/или другой(ие) демографический(ие) показатель(и).
[0025] В настоящей заявке термин «алифатический» обозначает фрагмент углеводорода, который может представлять собой прямую цепь (т.е. быть неразветвленным), быть разветвленным или циклическим (в том числе конденсированным, мостиковым и спиро-конденсированным полициклическим) и может быть полностью насыщенным, либо содержать одну или более единицу ненасыщенности, но не является ароматическим. Если не указано иное, алифатические группы содержат 1-30 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам реализации алифатические группы содержат 1-10 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-8 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-6 атомов углерода, и согласно дальнейшим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-4 атома углерода. Подходящие алифатические группы включают, но не ограничены перечисленными, линейные или разветвленные, алкильные, алкенильные и алкинильные группы, и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил.
[0026] В настоящей заявке, «алкил» относится к насыщенному неразветвленному, разветвленному или циклическому углеводороду, содержащему примерно от 1 до примерно 22 атомов углерода (и всем комбинациям и субкомбинациям диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения - предпочтительно примерно от 1 до примерно 12, или примерно от 1 до примерно 7 атомов углерода. Алкильные группы включают, но не ограничены перечисленными, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, т-бутил, н-пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, циклогексил, циклооктил, адамантил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, и 2,3-диметилбутил.
[0027] В настоящей заявке «галоген» относится к F, Cl, Br или I.
[0028] В настоящей заявке «алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему примерно 1-10 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), например, примерно от 1 до 7 атомов углерода, который, как подразумевается, присоединен к концевой C=O группе одинарной связью (и может также называться «ацильной группой»). Алканоильные группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил, 2-метил-бутирил, 2,2-диметоксипропионил, гексаноил, гептаноил, октаноил и т.п.; для целей настоящего изобретения формильную группу считают алканоильной группой. «Низший алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему примерно от 1 до примерно 5 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода). Такие группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил и т.п.
[0029] В настоящей заявке «арил» относится к необязательно замещенной, моно- или бициклической ароматической кольцевой системе, содержащей от примерно 5 до примерно 14 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), предпочтительно от примерно 6 до примерно 10 атомов углерода. Неограничивающие примеры включают, например, фенил и нафтил.
[0030] В настоящей заявке «аралкил» относится к алкильным радикалам, несущим арильный заместитель и содержащим от примерно 6 до примерно 22 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), согласно определенным вариантам реализации - предпочтительно примерно от 6 до примерно 12 атомов углерода. Аралкильные группы необязательно могут быть замещенными. Неограничивающие примеры включают, например, бензил, нафтилметил, дифенилметил, трифенилметил, фенил этил и дифенилэтил.
[0031] В настоящей заявке термины «алкокси» и «алкоксил» относятся к необязательно замещенной группе алкил-O-, где алкил соответствует приведенному выше определению. Типовые алкоксигруппы и алкоксильные группы включают метокси, этокси, н-пропокси, и-пропокси, н-бутокси и гептокси.
[0032] В настоящей заявке «карбокси» относится к группе -C(=O)OH.
[0033] В настоящей заявке «алкоксикарбонил» относится к -C(=O)O-алкильной группе, где алкил соответствует приведенному выше определению.
[0034] В настоящей заявке «ароил» относится к -C(=O)-арильной группе, где арил соответствует приведенному выше определению. Типовые ароильные группы включают бензоил и нафтоил.
[0035] Термин «циклическая кольцевая система» относится к ароматической или неароматической частично ненасыщенной или полностью насыщенной 3-10-членной кольцевой системе, которая включает одиночные кольца с 3-8 атомами, и би- и три-циклические кольцевые системы, которые могут включать ароматические 5- или 6-членные арильные или ароматические гетероциклические группы, конденсированные с неароматическим кольцом. Указанные гетероциклические кольца включают содержащие от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно определенным вариантам реализации термин «гетероциклический» относится к неароматическому 5-, 6- или 7-членному кольцу или полициклической группе, в которой по меньшей мере один кольцевой атом представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из O, S и N, включая, но не ограничиваясь перечисленными, би- или трициклическую группу, содержащую конденсированные шестичленные кольца с одним-тремя гетероатомами, независимо выбранными из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкильной группе, которая согласно настоящей заявке относится к группам с 3-10, например, 4-7 атомами углерода. Циклоалкилы включают, но не ограничены перечисленными, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и т.п., которые являются необязательно замещенными. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкенильному или циклоалкинильному фрагменту, который является необязательно замещенным.
2
3
2
3
[0036] Как правило, замещенные химические фрагменты содержат один или более заместитель, замещающий водород. Типовые заместители включают, например, галоген, алкил, циклоалкил, аралкил, арил, сульфгидрил, гидроксил (-OH), алкоксил, циано (-CN), карбоксил (-COOH), -C(=O)O-алкил, аминокарбонил (-C(=O)NH), -N-замещенный аминокарбонил (-C(=O)NHR''), CF, CFCF и т.п. Применительно к вышеперечисленным заместителям каждый фрагмент R'' может независимо представлять собой, например, любой из H, алкила, циклоалкила, арила или аралкила.
[0037] В настоящей заявке «L-аминокислота» относится к любой из встречающихся в природе левовращающих альфа-аминокислот, обычно присутствующих в белках или сложных алкильных эфирах указанных альфа-аминокислот. Термин «D-аминокислота» относится к правовращающим альфа-аминокислотам. Если не указано иное, все упоминаемые в настоящей заявке аминокислоты представляют собой L-аминокислоты.
[0038] В настоящей заявке «ароматическая аминокислота» представляет собой аминокислоту, содержащую по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.
[0039] В настоящей заявке «ароматический аналог аминокислоты» представляет собой аналог аминокислоты, содержащий по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.
[0040] II. Краткое описание
2
[0041] В настоящем изобретении предложены клеточно-реактивные аналоги компстатина и имеющие к ним отношение способы, например, способы их применения. Клеточно-реактивные аналоги компстатина представляют собой соединения, включающие фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, способную вступать в реакцию с функциональной группой, экспонируемой на поверхности клетки, например, в физиологических условиях, с образованием ковалентной связи. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, соответственно, ковалентно присоединяется к указанной клетке. Без связи с какой-либо конкретной теорией соединенный с клеткой аналог компстатина защищает указанную клетку от комплемент-опосредованного повреждения за счет, например, связывания с C3 (который может находиться в форме C3(HO)) на поверхности клетки и/или поблизости от указанной клетки, подавления расщепления и активации C3 и/или связывания с C3b и подавления его отложения на указанной клетке, либо участия в каскаде активации комплемента. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения выделенные клетки приводят в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина ex vivo (вне организма). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения указанные клетки присутствуют в выделенной(ом) ткани или органе, например, в ткани или органе для трансплантации субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки приводят в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина in vivo, посредством введения указанного клеточно-реактивного аналога компстатина субъекту. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина ковалентно присоединяется к клеткам in vivo. Согласно некоторым аспектам способы согласно настоящему изобретению защищают клетки, ткани и/или органы от разрушительных эффектов активации комплемента на протяжении по меньшей мере двух недель, без необходимости повторного лечения в течение указанного времени.
[0042] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина, содержащие нацеливающий фрагмент, который нековалентно связывается с целевой молекулой, присутствующей на поверхности клеток или тканей, или с внеклеточным веществом, не присоединенным к клеткам или ткани. Такие аналоги компстатина в настоящей заявке называются «аналогами компстатина нацеленного действия». Часто целевая молекула представляет собой белок или углевод, присоединенный к клеточной мембране и экспонируемый на поверхности клетки. Нацеливающий фрагмент нацеливает аналог компстатина в клетку, ткань или область, чувствительную к активации комплемента. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения выделенные клетки приводят в контакт с аналогом компстатина нацеленного действия ex vivo (вне организма). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения указанные клетки присутствуют в выделенной(ом) ткани или органе, например, в ткани или органе для трансплантации субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения аналог компстатина нацеленного действия вводят субъекту и он нековалентно присоединяется к клетке, ткани или внеклеточному веществу in vivo. Согласно некоторым аспектам предложенный в изобретении способ защищает клетки, ткани и/или органы от разрушительных эффектов активации комплемента на протяжении по меньшей мере двух недель, без необходимости повторения лечения в течение указанного времени. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит и нацеливающий фрагмент, и клеточно-реактивный фрагмент. Указанный нацеливающий фрагмент нацеливает аналог компстатина, например, в конкретный тип клеток, нековалентно связываясь с молекулой на таких клетках. Клеточно-реактивный фрагмент затем ковалентно связывается с указанной клеткой или внеклеточным веществом. Согласно другим вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия не включает клеточно-реактивный фрагмент.
[0043] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина длительного действия, отличающиеся тем, что указанные аналоги компстатина длительного действия содержат такой фрагмент, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), увеличивающий время жизни указанного соединения в организме (например, понижая его выведение из крови). Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия не включает нацеливающий фрагмент или клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия содержит нацеливающий фрагмент и/или клеточно-реактивный фрагмент.
[0044] III. Система комплемента
th
th
[0045] Для облегчения понимания настоящего изобретения и без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящем разделе приведено краткое описание комплемента и путей его активации. Более подробную информацию можно найти, например, в Kuby Immunology, 6 ed., 2006; Paul, W.E., Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6 ed., 2008; и Walport MJ., Complement. First of two parts. N Engl J Med., 344(14):1058-66, 2001.
[0046] Комплемент представляет собой часть системы врожденного иммунитета, играющую важную роль в защите организма от инфекционных агентов. Система комплемента включает более чем 30 сывороточных и клеточных белков, вовлеченных в три главных пути, известных как классический, альтернативный и лектиновый пути. Классический путь обычно запускается связыванием комплекса антигена и IgM- либо IgG-антитела с C1 (хотя некоторые другие активаторы могут также инициировать указанный путь). Активированный C1 расщепляет C4 и C2 с получением C4a и C4b, наряду с C2a и C2b. C4b и c2a объединяются с образованием C3-конвертазы, которая расщепляет C3 с образованием C3a и C3b. При связывании C3b с C3-конвертазой образуется С5-конвертаза, которая расщепляет C5 на C5a и C5b. C3a, C4a и C5a являются анафилатоксинами и опосредуют различные реакции при остром воспалительном ответе. C3a и C5a являются также хемотаксическими факторами, привлекающими клетки иммунной системы, такие как нейтрофилы.
[0047] Альтернативный путь инициируется и амплифицируется, например, на поверхности микроорганизмов и различных комплексных полисахаридов. В указанном пути гидролиз C3 до C3(H2O), который происходит спонтанно на низком уровне, приводит к связыванию фактора B, который расщепляется фактором D с образованием жидкофазной C3-конвертазы, которая активирует комплемент расщеплением C3 на C3a и C3b. C3b связывается с мишенями, такими как клеточная поверхность, и образует комплекс с фактором B, который позднее расщепляется фактором D с образованием C3-конвертазы. Поверхностно-связанные C3-конвертазы расщепляют и активируют дополнительные молекулы C3, что приводит к быстрому отложению C3b непосредственно рядом с участком активации, а также к дополнительному образованию C3-конвертазы, которая, в свою очередь, синтезирует дополнительный C3b. Указанный процесс приводит к запуску цикла расщепления C3 и образования C3-конвертазы, существенно усиливающего ответ. Расщепление C3 и связывание следующей молекулы C3b с C3-конвертазой приводит к образованию C5-конвертазы. C3- и C5-конвертазы указанного пути контролируются молекулами клетки-хозяина CR1, DAF, МСР, CD59 и fH. Механизм действия указанных белков включает либо ускоряющую распад активность (т.е. способность к разложению конвертаз), либо способность функционировать в качестве кофакторов при разрушении C3b или C4b фактором I, или обе способности. В норме присутствие регуляторных белков комплемента на поверхностях клеток-хозяев предотвращает значительную активацию комплемента на них.
[0048] C5-конвертазы, синтезируемые в обоих путях, расщепляют C5 с образованием C5a и C5b. C5b затем связывается с C6, C7 и C8 с образованием C5b-8, который катализирует полимеризацию C9 с образованием мембраноатакующего комплекса (МАК) C5b-9. Указанный МАК встраивается в мембраны целевых клеток и вызывает лизис клеток. Присутствие небольших количеств МАК на мембране клеток может приводить к разнообразным последствиям помимо гибели клетки.
[0049] Пектиновый путь комплемента инициируется связыванием связывающего маннозу лектина (MBL) и MBL-связанной серин-протеазы (MASP) с углеводами. Ген MB1-1 (известный как LMAN-1 у человека) кодирует интегральный мембранный белок I типа, локализованный в промежуточной области между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи. Ген MBL-2 кодирует растворимый связывающий маннозу белок, обнаруживаемый в сыворотке. В лектиновом пути человека MASP-1 и MASP-2 вовлечены в протеолиз C4 и C2, приводящий к описанному выше образованию C3-конвертазы.
[0050] Активность комплемента регулируется различными белками млекопитающих, называемыми белками контроля комплемента (ССР/БКК) или регуляторными белками активации комплемента (RCA) (патент США №6897290). Указанные белки различаются в отношении специфичности лигандов и механизма(ов)подавления комплемента. Они могут ускорять нормальный распад конвертаз и/или функционировать в качестве кофакторов фактора I, ферментативно расщепляя C3b и/или C4b на более маленькие фрагменты. БКК характеризуются присутствием нескольких (как правило, 4-56) гомологичных мотивов, известных как короткие консенсусные повторы (SCR/ΚΚΠ), белковых модулей контроля комплемента (БКК) или доменов SUSHI примерно 50-70 аминокислот длиной, которые содержат консервативный мотив, включающий четыре связанных дисульфидными связями цистеина (две дисульфидные связи), пролин, триптофан и множество гидрофобных остатков. Семейство БКК включает рецептор комплемента типа 1 (CR1; C3b:C4b рецептор), рецептор комплемента типа 2 (CR2), мембранный кофакторный белок (MCP; CD46), ускоряющий распад фактор (DAF), фактор комплемента H (fH) и C4b-связывающий белок (C4bp). CD59 представляет собой мембраносвязанный регуляторный белок комплемента, структурно не родственный указанным БКК. Регуляторные белки комплемента обычно служат для ограничения активации комплемента, которая в ином случае могла бы происходить на клетках и в тканях указанного млекопитающего, например, хозяина-человека. Таким образом, «собственные» клетки обычно защищены от разрушительных эффектов, которые возникали бы в случае активации комплемента на указанных клетках. Недостаточность или дефекты регуляторного(ых) белка(ов) комплемента вовлечена(ы) в патогенез разнообразных комплемент-опосредованных расстройств, например, описываемых в настоящей заявке.
[0051] IV. Аналоги компстатина
[0052] Компстатин представляет собой циклический пептид, который связывается с C3 и подавляет активацию комплемента. В патенте США №6319897 описан пептид с последовательностью Ile- [Cys-Val-Val-Gln-Asp-Tip-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr (SEQ ID NO: 1), с дисульфидной связью между двумя цистеинами, выделенными скобками. Следует понимать, что название «компстатин» не было использовано в патенте США №6319897, но затем стало применяться в научной и патентной литературе (см., например, Morikis, et al., Protein Sci., 7(3):619-27, 1998) для обозначения пептида, имеющего такую же последовательность, что и SEQ ID NO: 2, описанная в патенте США №6319897, но амидированного на С-конце, как показано в Таблице 1 (SEQ ID NO: 8). Термин «компстатин» применяют в настоящей заявке в соответствии с таким использованием (т.е. для обозначения последовательности SEQ ID NO: 8). Были разработаны аналоги компстатина, имеющие более высокую комплемент-подавляющую активность по сравнению с компстатином. См., например, WO 2004/026328 (PCT/US2003/029653), Morikis, D., et al., Biochem Soc Trans. 32(Pt l): 28-32, 2004, Mallik, В., et al., J. Med. Chem., 274-286, 2005; Katragadda, M., et al. J. Med. Chem., 49: 4616-4622, 2006; WO 2007062249 (PCT/US2006/045539); WO 2007044668 (PCT/US2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345) и описание ниже.
[0053] Аналоги компстатина могут быть ацетилированы или амидированы, например, на N-конце и/или С-конце. Например, аналоги компстатина могут быть ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце. В соответствии с принятым в данной области техники значением в настоящей заявке термин «компстатин» и описанные в настоящей заявке активности аналогов компстатина относительно активности компстатина относятся к компстатину, амидированному на С-конце (Mallik, 2005, выше).
[0054] Конкатемеры или мультимеры компстатина или его комплемент-подавляющего аналога также подходят для настоящего изобретения.
[0055] В настоящей заявке термин «аналог компстатина» включает компстатин и любой его комплемент-подавляющий аналог. Термин «аналог компстатина» охватывает компстатин и другие соединения, разработанные или идентифицированные на основе компстатина, комплемент-подавляющая активность которых составляет по меньшей мере 50% от такой активности компстатина по оценке, например, с применением любого анализа активации комплемента из общепринятых в данной области техники, или по существу аналогичных или эквивалентных анализов. Определенные подходящие анализы описаны в патенте США №6319897, WO 2004/026328, Morikis, выше, Mallik, выше, Katragadda 2006, выше, WО 2007062249 (PCT/US2006/045539); WO 2007044668 (PCT7US2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US2008/078593); и/или WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345). В указанном анализе может быть измерен, например, опосредованный альтернативным или классическим путем лизис эритроцитов, или он может представлять собой ИФА-анализ ELISA. Согласно некоторым вариантам реализации применяют анализ, описанный в WO/2010/135717 (PCT/US2010/035871).
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
[0056] Активность аналога компстатина может быть выражена через IC (концентрация соединения, которое подавляет активацию комплемента на 50%), где более низкий IC, как известно в данной области техники, указывает на более высокую активность. Активность предпочтительного аналога компстатина для применения согласно настоящему изобретению по меньшей мере равна активности компстатина. Заметим, что определенные модификации, которые, как известно, снижают или полностью подавляют комплемент-подавляющую активность, могут быть прямо исключены из любого варианта реализации настоящего изобретения. С помощью анализа опосредованного альтернативным путем лизиса эритроцитов было установлено, что ICдля компстатина составляет 12 мкМ (WO 2004/026328). Следует иметь в виду, что точное значение IC50 для конкретного аналога компстатина при измерении будет варьировать в зависимости от условий эксперимента (например, от концентрации в сыворотке, применяемой для анализа). Используются сравнительные значения, например, полученные в экспериментах, в которых IC определяют для нескольких разных соединений в идентичных по существу условиях. Согласно одному из вариантов реализации IC аналога компстатина не превышает IC компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 2-99 раз выше активности компстатина (т.е. значение IC указанного аналога в 2-99 раз меньше значения IC компстатина). Например, указанная активность может быть в 10-50 раз выше активности компстатина или в 50-99 выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 99-264 выше активности компстатина. Например, указанная активность может быть в 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260 или 264 раза выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанная активность в 250-300, в 300-350, в 350-400 или в 400-500 раз выше активности компстатина. Настоящее изобретение также охватывает аналоги компстатина с активностью, превышающей активность компстатина в 500-1000 или более раз. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,2 мкМ до примерно 0,5 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,1 мкМ до примерно 0,2 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,05 мкМ до примерно 0,1 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от примерно 0,001 мкМ до примерно 0,05 мкМ.
d
d
d
[0057] K связывания компстатина с C3 может быть измерена с применением изотермической титрационной калориметрии (Katragadda, et al., J. Biol. Chem., 279(53), 54987-54995, 2004). Было установлено, что связывающая способность различных аналогов компстатина в отношении C3 коррелирует с их активностью, при этом более низкая K, как известно в данной области техники, указывает на более высокую связывающую способность. Линейная корреляция между связывающей способностью и активностью была показана для некоторых протестированных аналогов (Katragadda, 2004, выше; Katragadda 2006, выше). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина связывается с C3 с K, значение которой составляет от 0,1 мкМ до 1,0 мкМ, от 0,05 мкМ до 0,1 мкМ, от 0,025 мкМ до 0,05 мкМ, от 0,015 мкМ до 0,025 мкМ, от 0,01 мкМ до 0,015 мкМ или от 0,001 мкМ до 0,01мкМ.
[0058] Соединения, «разработанные или идентифицированные на основе компстатина», включают, но не ограничены перечисленными, соединения, содержащие аминокислотную цепь, последовательность которой получают: (i) модифицируя последовательность компстатина (например, заменой одной или более аминокислоты указанной последовательности компстатина другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, встраиванием одной или более аминокислоты или аналога аминокислоты в указанную последовательность компстатина или удалением одной или более аминокислоты из указанной последовательности компстатина); (ii) отбором из фаг-дисплейной пептидной библиотеки, в которой одна или более аминокислота компстатина рандомизирована и необязательно затем модифицирована в соответствии со способом (i); или (iii) идентификацией при скрининге на соединения, конкурирующие за связывание с C3 или его фрагментом с компстатином или любым его аналогом, полученным с помощью способов (i) или (ii). Многие подходящие аналоги компстатина включают гидрофобный кластер, бета-изгиб и дисульфидный мостик.
[0059] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность или состоит по существу из последовательности, получаемой осуществлением 1, 2, 3, или 4 замещений в последовательности компстатина, т.е. заменой 1, 2, 3 или 4 аминокислот в последовательности компстатина другой стандартной аминокислотой или нестандартной аминокислотой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены только аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4 или 9; или, согласно определенным вариантам реализации, изменены обе аминокислоты 4 и 9, и дополнительно изменено до 2-х аминокислот в положениях, выбранных из 1, 7, 10, 11 и 13. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4, 7 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положении 2 или 12, либо в обоих положениях, при условии, что при указанном изменении сохраняется способность указанного соединения к циклизации. Такое(ие) изменение(ия) в положениях 2 и/или 12 может(гут) осуществляться наряду с к изменением(ями) в положениях 1, 4, 7, 9, 10, 11 и/или 13. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или более аминокислоты в последовательности компстатина, необязательно также включает до 1, 2 или 3 дополнительных аминокислот на С-конце. Согласно одному из вариантов реализации указанная дополнительная аминокислота представляет собой Gly. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или более аминокислоты в последовательности компстатина, необязательно также включает до 5 или до 10 дополнительных аминокислот на С-конце. Следует понимать, что аналоги компстатина могут обладать любой одной или более характеристикой или свойством из различных вариантов реализации, описанных в настоящей заявке, и характеристики или свойства любого варианта реализации могут дополнительно характеризовать любой другой описанный в настоящей заявке вариант реализации, если не указано или не очевидно из контекста иное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность, идентичную последовательности компстатина, за исключением положений, соответствующих положениям 4 и 9 в последовательности компстатина, или состоит по существу из такой последовательности.
[0060] Компстатин и определенные аналоги компстатина, активность которых выше активности компстатина, содержат исключительно стандартные аминокислоты («стандартными аминокислотами» являются глицин, лейцин, изолейцин, валин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, цистеин, метионин, аргинин, лизин, пролин, серии, треонин и гистидин). Определенные аналоги компстатина, обладающие повышенной активностью, содержат одну или более нестандартную аминокислоту. Подходящие нестандартные аминокислоты включают моно- и мультигалогенированные (например, фторированные) аминокислоты, D-аминокислоты, гомо-аминокислоты, н-алкил-аминокислоты, дегидроаминокислоты, ароматические аминокислоты (отличные от фенилаланина, тирозина и триптофана), орто-, мета- или пара-аминобензойную кислоту, фосфоаминокислоты, метоксилированные аминокислоты и α,α-дизамещенные аминокислоты. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина получают заменой одной или более L-аминокислоты в аналоге компстатина, описываемом где-либо в настоящей заявке, соответствующей D-аминокислотой. Такие соединения и способы их применения представляют собой аспекты настоящего изобретения. Типовые подходящие нестандартные аминокислоты включают 2-нафтилаланин (2-NaI), 1-нафтилаланин (1-NaI), 2-инданилглицинкарбоновую кислоту (2Ig1), дигидротриптофан (Dht), 4-бензоил-L-фенилаланин (Bpa), 2-α-аминомасляную кислоту (2-Abu), 3-α-аминомасляную кислоту (3-Abu), 4-α-аминомасляную кислоту (4-Abu), циклогексилаланин (Cha), гомоциклогексилаланин (hCha), 4-фтор-L-триптофан (4fW), 5-фтор-L-триптофан (5fW), 6-фтор-L-триптофан (6fW), 4-гидрокси-L-триптофан (4OH-W), 5-гидрокси-L-триптофан (5OH-W), 6-гидрокси-L-триптофан (6OH-W), 1-метил-L-триптофан (1MeW), 4-метил-L-триптофан (4MeW), 5-метил-L-триптофан (5MeW), 7-аза-L-триптофан (7aW), α-метил-L-триптофан (αMeW), β-метил-L-триптофан (βMeW), N-метил-L-триптофан (NMeW), орнитин (orn), цитруллин, норлейцин, γ-глутаминовую кислоту и т.п.
1
5
1
5
[0061] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналог Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина). Типовые аналоги Trp приведены выше. См. также Beene, et. al. Biochemistry 41: 10262-10269, 2002 (где описаны, в том числе, моно- и мультигалогенированные аналоги Trp); Babitzke & Yanofsky, J. Biol. Chem. 270: 12452-12456, 1995 (где описаны, в том числе, метилированные и галогенированные Trp, и другие Trp- и индольные аналоги); и патенты США 6214790, 6169057, 5776970, 4870097, 4576750 и 4299838. Другие аналоги Trp включают варианты, замещенные (например, метальной группой) по α- или β-углероду, и, необязательно, также в одном или более положении на индольном кольце. Аминокислоты, содержащие два или более ароматических кольца, включая замещенные, незамещенные или альтернативно замещенные варианты, представляют интерес в качестве аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, например, в положении 4, представляет собой 5-метокси, 5-метил-, 1-метил-, или 1-формил-триптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют аналог Trp (например, в положении 4), содержащий 1-алкильный заместитель, например, низший алкильный (например, С-С) заместитель. Согласно определенным вариантам реализации применяют Ν(α) метилтриптофан или 5-метилтриптофан. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог, содержащий 1-алканоильный заместитель, например, низший алканоил (например, С-С). Примеры включают 1-ацетил-L-триптофан и L-β-триптофан.
[0062] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную гидрофобность по сравнению с Trp. Например, индольное кольцо может быть замещено одной или более алкильной (например, метильной) группой. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp принимает участие в гидрофобных взаимодействиях с С3. Такой аналог Trp может находиться, например, в положении 4 относительно последовательности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или более замещенных или незамещенных компонента моноциклического ароматического кольца.
[0063] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную склонность к образованию водородных связей с С3 по сравнению с Trp, но не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Указанный аналог Trp может иметь повышенную полярность по сравнению с Trp и/или повышенную способность к участию в электростатическом взаимодействии с донором водородной связи на С3. Определенные типовые аналоги Trp, которым свойственна повышенная способность к образованию водородных связей, содержат электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Такой аналог Trp может быть расположен, например, в положении 7 относительно последовательности компстатина.
2
[0064] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналог Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина), например, аналоги Ala, идентичные Ala, за исключением того, что они содержат одну или более CH-группу в боковой цепи. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Ala представляет собой неразветвленную аминокислоту с одной метильной группой, такую как 2-Abu. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналог Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина) и аналог Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина).
n
m
[0065] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность (X'aa)-Gln-Asp-Хаа-Gly-(X''aa), (SEQ ID NO: 2), где каждый X'aa и каждый Х''aа представляет собой независимо выбранную аминокислоту или аналог аминокислоты, причем Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, и при этом n>1 и m>1 и значение n+m составляет от 5 до 21. Указанный пептид имеет коровую последовательность Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 70), где Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, например, аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с донором H-связи по сравнению с Trp, однако согласно определенным вариантам реализации не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог может быть таким, в котором индольное кольцо Trp замещено электроотрицательным фрагментом, например, галогеном, таким как фтор. Согласно одному варианту реализации Хаа представляет собой 5-фтортриптофан. Специалисту в данной области техники будет ясно, что, при отсутствии указывающих на обратное данных, любой не встречающийся в природе пептид, последовательность которого содержит указанную коровую последовательность, и который подавляет активацию комплемента и/или связывается с С3, будет получен на основе последовательности компстатина. Согласно альтернативному варианту реализации Хаа представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты, не являющийся аналогом Trp, допускающий образование бета-изгиба пептидом Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 70).
[0066] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 3), где X'aa и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly (SEQ ID NO: 3), где X'aa и Хаа выбраны из Trp, аналогов Trp и других аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанная коровая последовательность образует бета-изгиб в контексте пептида. Указанный β-изгиб может быть гибким, позволяя пептиду существовать в двух или более конформациях, по оценке, например, с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или более замещенных или незамещенных компонента моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданилглицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, Х'аа может представлять собой 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, но, согласно определенным вариантам реализации, не обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом H в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан.
[0067] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp и аналогов Trp, а Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, такой как 1-метилтриптофан или другой аналог Trp с алкильным заместителем на индольном кольце (например, в положении 1, 4, 5, или 6). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или более замещенных или незамещенных компонента моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданилглицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с C3 по сравнению с Trp, но, согласно определенным вариантам реализации, не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом H в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа представляет собой Ala или аналог Ala, такой как Abu, или другую неразветвленную аминокислоту с одной метильной группой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln-Asp-Хаа-Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp, аналогов Trp и аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одну ароматическую боковую цепь, и Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа выбран из аналогов Trp, ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот.
n
m
[0068] Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид является циклическим. Указанный пептид может быть циклизован с помощью связи между любыми двумя аминокислотами, одна из которых представляет собой (X'aa), а другая расположена в (Х''аа). Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет от 9 до 15 аминокислот, например, 10-12 аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет 11 аминокислот, со связью (например, дисульфидной связью) между аминокислотами в положениях 2 и 12. Например, длина пептида может составлять 13 аминокислот, со связью между аминокислотами в положениях 2 и 12, которая обеспечивает образование циклической части длиной 11 аминокислот.
2
2
n
2
2
2
[0069] Согласно определенным вариантам реализации указанный пептид содержит последовательность или состоит из последовательности X'aa1-Х'аа2-Х'аа3-Х'аа4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aa1-Х''аа2-Х''аа3-Х''аа4-Х''аа5 (SEQ ID NO: 5). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp, и X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, Х''аа1, Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 и Х''аа5 независимо выбраны из аминокислот и аналогов аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот. Любой один или более из X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, X''aa1, Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 и Х''аа5 может быть идентичен аминокислоте в соответствующем положении компстатина. Согласно одному из вариантов реализации Х''аа1 представляет собой Ala или неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой. Указанный пептид может быть циклизован посредством ковалентной связи между (i) X'aa1, Х'аа2 или Х'аа3; и (ii) Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 или Х''аа5. Согласно одному варианту реализации указанный пептид циклизован посредством ковалентной связи между Х'аа2 и Х''аа4. Согласно одному варианту реализации каждая из указанных ковалентно связанных аминокислот представляет собой Cys, и указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную (S-S) связь. Согласно другим вариантам реализации указанная ковалентная связь представляет собой С-С, С-О, C-S, или C-N связь. Согласно определенным вариантам реализации один из указанных ковалентно связанных остатков представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, другой ковалентно связанный остаток представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, и указанная ковалентная связь представляет собой амидную связь. Аминокислоты или аналоги аминокислот с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH(CH)CH(NH)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (orn), соответственно. Примеры аминокислот с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, включают дикарбоксильные аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота. Могут также применяться аналоги, такие как бета-гидрокси-L-глутаминовая кислота. Согласно некоторым вариантам реализации пептид циклизован тиоэфирной связью, например, согласно описанию в PCT/US2011/052442 (WO/2012/040259). Например, согласно некоторым вариантам реализации дисульфидная связь в любом из указанных пептидов заменена тиоэфирной связью. Согласно некоторым вариантам реализации образуется цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин или гамма-цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации модификация включает замену дисульфидной связи Cys-Cys между цистеинами на Х'аа2 и Х''аа4 в SEQ ID NO: 5 (или в соответствующих положениях в других последовательностях) с добавлением СН, с образованием гомоцистеина на Х'аа2 или Х''аа4, и введение тиоэфирной связи с образованием цистатионина. Согласно одному из вариантов реализации указанный цистатионин представляет собой гамма-цистатионин. Согласно другому варианту реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин. Другая модификация в соответствии с настоящим изобретением включает замену дисульфидной связи тиоэфирной связью без добавления СН, с образованием таким образом лантитионина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина, содержащий тиоэфир вместо дисульфидной связи, имеет повышенную стабильность, по меньшей мере в некоторых условиях, по сравнению с аналогом компстатина, содержащим дисульфидную связь.
[0070] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:
1
1
1
1
1
2
2
[0071] Xaa1-Cys-Val-Хаа2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Хаа3-His-Arg-Cys- Xaa4 (SEQ ID NO: 6); где: Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, B-Ile, B-Val, B-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или B-Gly-Ile, и В представляет собой первый блокирующий фрагмент; Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp; Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp; Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Аlа и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В ; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.
1
[0072] Согласно другим вариантам реализации Xaal отсутствует или представляет собой любую аминокислоту или аналог аминокислоты, и Хаа2, Хаа2*, Хаа3, и Хаа4 соответствуют определению, данному выше. Если Xaa1 отсутствует, к N-концевому остатку Cys может быть присоединен блокирующий фрагмент В.
2
[0073] Согласно другому варианту реализации Хаа4 представляет собой любую(ой) аминокислоту или аналог аминокислоты, а Xaa1, Хаа2, Хаа2*, и Хаа3 соответствуют определению, данному выше. Согласно еще одному варианту реализации Хаа4 представляет собой дипептид, выбранный из группы, состоящей из: Thr-Ala и Thr-Asn, где карбоксиконцевой -ОН, или Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В.
[0074] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой Trp.
[0075] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp, cодержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или более замещенных или незамещенных компонента моноциклического ароматического кольца. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 2-нафтилаланина (2-NaI), 1-нафтилаланина (1-NaI), 2-инданилглицин-карбоновой кислоты (Ig1), дигидротриптофана (Dht) и 4-бензоил-L-фенилаланина.
[0076] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог Trp представляет собой 1-метилтриптофан. Согласно одному из вариантов реализации Хаа2 представляет собой 1-метилтриптофан, Хаа2* представляет собой Trp, Xaa3 представляет собой Ala, а другие аминокислоты идентичны соответствующим аминокислотам компстатина.
[0077] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2* может представлять собой аналог Trp, такой как аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 5-фтортриптофана и 6-фтортриптофана.
[0078] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа2 представляет собой Trp, а Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6, Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной по сравнению с Trp гидрофобностью, такой как аналог Trp, выбранный из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана, и Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно определенным вариантам реализации, не свойственна повышенная гидрофобность по сравнению с Trp. Например, согласно одному варианту реализации Хаа2 представляет собой метилтриптофан, а Хаа2* представляет собой 5-фтортриптофан.
[0079] Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой Ala. Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой, например, Abu.
[0080] В настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp, и других аминокислот или аналогов аминокислот, которые содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо, и Xaa3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp, либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.
1
2
1
1
1
[0081] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент, присутствующий на N- или С-конце любого из описанных в настоящей заявке аналогов компстатина, представляет собой любой фрагмент, Стабилизирующий пептид, предотвращая его разрушение, которое иначе произошло бы в крови или интерстициальной жидкости млекопитающего (например, человека или не являющегося человеком примата). Например, блокирующий фрагмент В может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру N-конца пептида так, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между N-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Блокирующий фрагмент В может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру С-конца пептида так, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между С-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Могут применяться любые подходящие блокирующие фрагменты, известные в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В содержит ацильную группу (т.е. часть карбоновой кислоты, остающуюся после удаления -ОН-группы). Указанная ацильная группа, как правило, содержит от 1 до 12 атомов углерода, например, от 1 до 6 атомов углерода. Например, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В выбран из группы, состоящей, из: формила, ацетила, проприонила, бутирила, изобутирила, валерила, изовалерила и т.п. Согласно одному из вариантов реализации блокирующий фрагмент В представляет собой ацетильную группу, т.е. Xaa1 представляет собой Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu или Ac-Gly-Ile.
2
2
1
[0082] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой первичный или вторичный амин (-NHили -NHR, где R представляет собой органический фрагмент, такой как алкильная группа).
1
2
[0083] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий отрицательный заряд, который в ином случае может присутствовать на N-конце при физиологических уровнях рН. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий отрицательный заряд, который в ином случае может присутствовать на С-конце при физиологических уровнях рН.
[0084] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина ацетилирован или амидирован на N-конце и/или С-конце, соответственно. Аналог компстатина может быть ацетилирован на N-конце, амидирован на С-конце и/или и ацетилирован на N-конце, и амидирован на С-конце. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит алкильную или арильную группу на N-конце, а не ацетильную группу.
[0085] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:
[0086] Хаа1-Cys-Val-Хаа2-Gln-Asp-Хаа2*-Gly-Xaa3-His-Arg-Cys-Xaa4 (SEQ ID NO: 7); где: Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, Ас-Ile, Ac-Val, Ас-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или Ac-Gly-Ile;
2
Xaa2 и Xaa2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp; Xaa3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp; Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой -ОН любого из L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на -NH; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Аlа и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен вторым блокирующим фрагментом В2; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.
[0087] Согласно некоторым вариантам реализации Xaa1, Хаа2, Хаа2*, Xaa3 и Хаа4 соответствуют приведенному выше описанию для различных вариантов реализации последовательности SEQ ID NO: 6. Например, согласно определенным вариантам реализации Хаа2* представляет собой Trp. Согласно определенным вариантам реализации Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, например, 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Xaa3 представляет собой Ala. Согласно определенным вариантам реализации Xaa3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метильной группой.
[0088] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile и Хаа4 представляет собой L-Thr.
[0089] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile, Хаа2* представляет собой Trp и Хаа4 представляет собой L-Thr.
[0090] В настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 7, согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp, других аминокислот или аналогов ароматических аминокислот, и Xaa3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp, либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.
[0091] Согласно определенным вариантам реализации любого из указанных аналогов компстатина, описанных в настоящей заявке, применяют аналог Phe, но не Phe.
[0092] В Таблице 1 приведен неограничивающий список аналогов компстатина, подходящих для настоящего изобретения. В левой колонке приведены сокращенные обозначения указанных аналогов с отмеченными конкретными модификациями в означенных положениях (1-13) относительно исходного пептида, компстатина. В соответствии с использованием в данной области техники термин «компстатин» в настоящей заявке, как и сравнительные активности описанных в настоящей заявке аналогов компстатина по сравнению с компстатином, относятся к пептиду компстатину, амидированному на С-конце. Если не указано иное, пептиды в Таблице 1 амидированы на С-конце. Выделение жирным шрифтом применяют для обозначения определенных модификаций. Активность относительно активности компстатина приведена на основании данных из опубликованных источников и описываемых в них анализов (WO 2004/026328, WO 2007044668, Mallik, 2005; Katragadda, 2006). В случаях обращения к нескольким публикациям, где указывается активность, используют значение, опубликованное позже; следует понимать, что значения могут корректироваться в случае расхождений между данными анализов. Следует также иметь в виду, что согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептиды, перечисленные в Таблице 1, при применении в терапевтических композициях и способах согласно настоящему изобретению циклизованы посредством дисульфидной связи между двумя остатками Суs. Варианты способов циклизации указанных пептидов также входят в объем настоящего изобретения. Как уже отмечалось, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения одна или более аминокислота аналога компстатина (например, любого из аналогов компстатина, описанных в настоящей заявке) может представлять собой N-алкил-аминокислоту (например, N-метил-аминокислоту). Например, без ограничения, по меньшей мере один аминокислота в составе циклической части указанного пептида, по меньшей мере одна аминокислота в направлении N-конца относительно циклической части и/или по меньшей мере одна аминокислота в направлении С-конца относительно циклической части может представлять собой N-алкил-аминокислоту, например, N-метил-аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит, например, N-метилглицин, к примеру, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации один или более из аналогов компстатина в Таблице 1 содержит по меньшей мере один N-метилглицин, например, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина.
[0094] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей 9-36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 и 36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и/или способов согласно настоящему изобретению указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 30 и 31. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 28. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 32. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 34. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 36.
1
2
2
[0095] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, соответствующую приведенной в Таблице 1, но Ac-группа в ней заменена на вариант блокирующего фрагмента В, соответствующий приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации-NH группа заменена на вариант блокирующего фрагмента В , соответствующий приведенному выше описанию.
[0096] Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина связывается с по существу с той же областью β-цепи С3 человека, что и компстатин. Согласно одному варианту реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с фрагментом С-концевой части β-цепи С3 человека с молекулярной массой, составляющей примерно 40 кДа, с которым связывается компстатин (Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol, 35:160, 1998; Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol. 43(12):2023-9, 2006). Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатина-С3, например, кристаллической структурой или установленной с применением ЯМР трехмерной структурой. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-С3 и формирует по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида с последовательностью, приведенной в Таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36 в структуре пептид-С3, например, кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 30 или 31, в структуре пептид-С3, например, в кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 9-36, например, соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, в структуре пептид-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 30 или 31 в структуре пептид-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и указанный пептид.
[0097] Специалист в данной области техники легко сможет определить, связывается ли аналог компстатина с фрагментом С-концевой части β-цепи С3, с применением рутинных экспериментальных методов. Например, специалист в данной области техники может синтезировать фотосшиваемый вариант указанного аналога компстатина включением фотосшивающей аминокислоты, такой как p-бензоил-L-фенилаланин (Вра) в указанное соединение, например, на С-конце указанной последовательности (Soulika, A.M., et al, выше). Необязательно могут быть включены дополнительные аминокислоты, например, эпитопная метка, такая как метка FLAG или НА-метка, для облегчения обнаружения указанного соединения, например, с применением вестерн-блоттинга. Аналог компстатина инкубируют с указанным фрагментом и инициируют сшивание. Колокализация указанного аналога компстатина и С3 фрагмента указывает на связывание. Поверхностный плазмонный резонанс может также применяться для определения того, связывается ли аналог компстатина с участком связывания компстатина на С3 или его фрагменте. Специалист в данной области техники может использовать программное обеспечение для молекулярного моделирования, чтобы предсказать, образует ли соединение по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин или пептид с последовательностью любого из указанных в Таблице 1 пептидов, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно некоторым вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31.
rd
[0098] Аналоги компстатина могут быть получены с помощью различных известных в данной области техники способов искусственного синтеза пептидов, посредством конденсирования остатков аминокислот, например, в соответствии со стандартными способами пептидного синтеза, могут быть получены экспрессированием, in vitro или в живых клетках, подходящих кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот с помощью известных в данной области техники способов. Например, пептиды могут быть синтезированы с применением стандартных твердофазных методик согласно описанию у Malik, выше, Katragadda, выше, WO 2004026328 и/или WO 2007062249. Может быть проведена, а затем снята защита потенциально реакционноспособных фрагментов, таких как аминогруппы и карбоксильные группы, реактивные функциональные группы и т.п., с применением различных защитных групп и методик, известных в данной области техники. См., например, «Protective Groups in Organic Synthesis» («Защитные группы в органическом синтезе»), 3 ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999. Пептиды могут быть очищены с применением стандартных методов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. Разделение диастереомеров пептидов, при необходимости, может быть выполнено с применением известных способов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. При необходимости составы могут быть лиофилизированы и затем растворены в подходящем растворителе, например, в воде. pH полученного раствора может быть скорректирован, например, до физиологических значений pH, с применением основания, такого как NaOH. Пептидные составы при необходимости могут быть охарактеризованы с помощью масс-спектроскопии, например, для подтверждения массы и/или образования дисульфидной связи. См., например, Mallik, 2005, и Katragadda, 2006.
[0099] Аналог компстатина, необязательно связанный с клеточно-реактивным фрагментом или нацеливающим фрагментом, может быть модифицирован добавлением такой молекулы, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), либо сходных молекул, для стабилизации соединения, снижения его иммуногенности, увеличения времени жизни в организме, повышения или понижения растворимости и/или повышения устойчивости к разложению. Способы пегилирования общеизвестны в данной области техники (V Veronese, F.M. & Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456, 2002; Davis, F.F., Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 457-458, 2002); Hinds, K.D. & Kim, S.W. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 505-530 (2002; Roberts, M.J., Bentley, M.D. & Harris, J.M. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459-476; 2002); Wang, Y.S. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 547-570, 2002). Широкий ряд полимеров, таких как ПЭГ и модифицированные ПЭГ, в том числе дериватизированные ПЭГ, к которым можно удобным образом присоединить полипептиды, описан в каталоге Nektar (Nektar Advanced Pegylation 2005-2006 Product Catalog, Nektar Therapeutics, Сан-Карлос, Калифорния), где также приведены подробные описания подходящих процедур конъюгации. Согласно еще одному варианту реализации аналог компстатина конденсирован с Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Согласно некоторым другим вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом альбумина или со связывающим альбумин пептидом. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина модифицируют с помощью одного или более полипептидного или неполипептидного компонента, например, указанный аналог компстатина пегилируют, либо конъюгируют с другим фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный компонент не является Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Аналог компстатина может быть представлен мультимером или частью супермолекулярного комплекса, который может включать либо один вид молекулярных соединений, либо несколько разных видов (например, несколько разных аналогов).
[00100] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина представляет собой многовалентное соединение, содержащее множество фрагментов аналога компстатина, ковалентно или нековалентно связанных с полимерным скелетом или скаффолдом. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть идентичными или разными. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит несколько экземпляров, или копий, одного фрагмента аналога компстатина. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит один или более экземпляр каждого из двух или более неидентичных фрагментов аналога компстатина, например, 3, 4, 5 или более разных фрагментов аналога компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения число фрагментов аналога компстатина («n») составляет от 2 до 6. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 7 до 20. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 20 до 100. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100 до 1000. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 1000 до 10000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 10000 до 50000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 50000 до 100000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100000 до 1000000.
[00101] Фрагменты аналога компстатина могут быть присоединены непосредственно к полимерному скаффолду или могут быть присоединены соединяющим фрагментом, который связывает указанный фрагмент аналога компстатина и полимерный скаффолд. Указанный соединяющий фрагмент может быть присоединен к одному фрагменту аналога компстатина и к полимерному скаффолду. Как вариант, к соединяющему фрагменту может быть присоединено несколько фрагментов аналога компстатина таким образом, что указанный соединяющий фрагмент прикрепляет к полимерному скаффолду несколько фрагментов аналога компстатина.
[00102] Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащую первичный или вторичный амин, например, остаток Lys. Например, остаток Lys, или последовательность, содержащую остаток Lys, добавляют на N-конце и/или С-конец указанного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys отделен от циклической части указанного аналога компстатина жестким или гибким спейсером. Указанный спейсер может, например, включать замещенную или незамещенную, насыщенную или ненасыщенную алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или другие фрагменты, например, согласно описанию в Разделе VI применительно к линкерам. Длина указанной цепи может составлять, например, от 2 до 20 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации указанный спейсер представляет собой пептид. Длина указанного пептидного спейсера может составлять, например, от 1 и 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот. Подходящие спейсеры могут включать или состоять, например, из нескольких остатков Gly, нескольких остатков Ser, либо и тех, и других остатков. Аминокислота с боковой цепью, содержащая первичный или вторичный амин и/или по меньшей мере одна аминокислота в спейсере необязательно представляет собой D-аминокислоту. Может использоваться любой из разнообразных полимерных скелетов или скаффолдов. Например, полимерный скелет или скаффолд может представлять собой полиамид, полисахарид, полиангидрид, полиакриламид, полиметакрилат, полипептид, полиэтилен оксид или дендример. Подходящие способы и полимерные скелеты описаны, например, в WO 98/46270 (PCT/US98/07171) или WO 98/47002 (PCT/US98/06963). Согласно одному из вариантов реализации указанный полимерный скелет или скаффолд содержит несколько реактивных функциональных групп, таких как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы. Проводят реакцию указанного полимерного скелета или скаффолда с аналогами компстатина. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина содержит любую из множества различных реакционноспособных функциональных групп, такую как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы, с которыми проводят реакцию подходящих групп на полимерном скелете. Как вариант, сначала проводят реакцию мономерных единиц, которые могут быть соединены друг с другом с образованием полимерного скелета или скаффолда, с аналогами компстатина, и полученные мономеры полимеризуют. Согласно другому варианту реализации короткие цепи предварительно полимеризуют, функционализируют, а затем из смеси коротких цепей разных композиций собирают более длинные полимеры.
[00103] V. Миметики компстатина
[00104] Структура компстатина известна в данной области техники, а также известны ЯМР-структуры для ряда аналогов компстатина с более высокой активностью, чем у компстатина (Malik, выше). Структурная информация может применяться для разработки миметиков компстатина.
[00105] Согласно одному из вариантов реализации миметик компстатина представляет собой любое соединение, которое конкурирует с компстатином или любым аналогом компстатина (например, аналогом компстатина, последовательность которого приведена в Таблице 1) за связывание с С3 или его фрагментом (таким как 40 кДа фрагмент β-цепи, с которым связывается компстатин). Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина обладает активностью, равной или превышающей активность компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина более стабилен, перорально доступен или обладает лучшей биодоступностью, чем компстатин. Указанный миметик компстатина может представлять собой пептид, нуклеиновую кислоту или малую молекулу. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатин-С3, например, кристаллической структурой или трехмерной структурой, установленной в ходе ЯМР-экспериментов. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-С3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность, приведенную в Таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно определенным вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, в структуре пептид-С3. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью, приведенной в Таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно определенным вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, в структуре пептид-C3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина имеет непептидный остов, но содержит боковые цепи, расположенные соответственно последовательности, полученной на основе последовательности компстатина.
[00106] Специалисту в данной области техники будет понятно, что после того как конкретная нужная конформация короткого пептида подтверждена, для получения пептида или пептидомиметика, соответствующего указанной конформации, могут применяться общеизвестные способы. См., например, G.R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547-3558; Hruby and Nikiforovich (1991), Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram & S. Ramasehan, eds., Indian Acad, of Sci., Bangalore, PP. 429-455), Eguchi M, Kahn M., Mini Rev Med Chem., 2(5):447-62, 2002. Особое значение для настоящего изобретения имеет то, что структура пептидных аналогов может быть дополнительно скорректирована с учетом влияния остатков аминокислот различных боковых цепей, например, на эффекты функциональных групп или пространственные ограничения, согласно имеющимся в соответствующей области техники данным относительно компстатина и его аналогов, в том числе.
[00107] Специалистам в данной области техники будет понятно, что для получения конкретной конформации остова и функциональных групп боковых цепей, необходимых для связывания с C3 и подавления активации комплемента, пептидный миметик может подходить так же хорошо, как и пептид. Соответственно, предполагается, что в объем настоящего изобретения входит получение и применение C3-связывающего подавляющего комплемент соединения с использованием либо встречающихся в природе аминокислот, производных аминокислот, аналогов аминокислот, либо не являющихся аминокислотами молекул, способных соединяться с образованием остова в подходящей конформации. Непептидный аналог или аналог, содержащий пептидные и непептидные компоненты, в настоящей заявке иногда называется «пептидомиметиком» или «изостерическим миметиком» для обозначения замещений или разновидностей пептида, обладающих в общем аналогичными конформационными особенностями остова и/или других функциональных групп, таким образом, достаточно сходные с приводимыми в качестве примеров пептидами для подавления активации комплемента. В более общем случае миметиком компстатина является любое соединение, в котором фармакофоры размещаются аналогично их положению в компстатине, даже если остов отличается.
[00108] Применение пептидомиметиков при разработке высокоаффинных аналогов пептидов общеизвестно в данной области техники. Принимая во внимание ротационные ограничения, сходные с ограничениями, свойственными остаткам аминокислот в составе пептида, можно провести анализ аналогов, содержащих не-аминокислотные фрагменты, иуточнить их конформационные мотивы при помощи диаграммы Рамачандрана (Hruby & Nikiforovich 1991), наряду с другими известными методами.
[00109] Специалист в данной области техники легко сможет подобрать подходящие методы скрининга для идентификации дополнительных миметиков компстатина и отбора обладающих требуемой ингибирующей активностью. Например, компстатин или его аналог может быть помечен (например, радиоактивной или флуоресцентной меткой) и приведен в контакт с C3 в присутствии разных концентраций тестируемого соединения. Оценивают способность указанного тестируемого соединения уменьшать связывание аналога компстатина с C3. Тестируемое соединение, которое значительно уменьшает связывание указанного аналога компстатина с C3, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Например, тестируемое соединение, которое уменьшает концентрацию в равновесном состоянии комплекса аналога компстатина с C3, или которое уменьшает скорость образования комплекса аналога компстатина с C3 по меньшей мере на 25% или по меньшей мере на 50%, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Специалисту в данной области техники будет ясно, что может применяться несколько вариантов скрининга. Соединения для скрининга включают природные продукты, библиотеки аптамеров, фаг-дисплейные библиотеки, библиотеки соединений, синтезированных с применением комбинаторной химии и т.п. Настоящее изобретение охватывает синтезирование комбинаторной библиотеки соединений на основе описанной выше коровой последовательности и скрининг указанной библиотеки для идентификации миметиков компстатина. Любой из указанных способов может также применяться для идентификации новых аналогов компстатина, имеющих более высокую ингибирующую активность, чем аналоги компстатина, протестированные к настоящему времени. Следует иметь в виду, что миметики компстатина могут применяться в клеточно-реактивных соединениях согласно настоящему изобретению, и в настоящем изобретении предложены такие клеточно-реактивные миметики компстатина.
[00110] VI. Клеточно-реактивные аналоги компстатина или аналоги компстатина длительного действия
2
2
1
1-
[00111] В настоящем изобретении предложены разнообразные клеточно-реактивные аналоги компстатина. Согласно некоторым аспектам клеточно-реактивный аналог компстатина содержит соединение с формулой A-L-M, где А представляет собой фрагмент, содержащий клеточно-реактивную функциональную группу J, L представляет собой необязательно присутствующую соединяющую часть, и M содержит фрагмент аналога компстатина. Указанный фрагмент аналога компстатина может, согласно различным вариантам реализации, включать любой аналог компстатина, например, любой из описанных выше аналогом компстатина. Формула A-L-M охватывает варианты реализации, в которых A-L присутствует на N-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присутствует на С-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присоединен к S боковой цепи аминокислоты указанного фрагмента аналога компстатина, и варианты реализации, в которых одинаковые или разные A-L присутствуют на обоих концах М. Следует иметь в виду, что в тех случаях, когда определенный(ые) аналог(и) компстатина присутствует(ют) в качестве фрагмента аналога компстатина в соединении с формулой А-L-M, функциональная группа указанного аналога компстатина будет вступать в реакцию с функциональной группой L с образованием ковалентной связи с А или L. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина, где фрагмент аналога компстатина включает аналог компстатина с аминокислотой с боковой цепью, содержащей первичную аминогруппу (NH) (такой аналог компстатина, который может быть представлен формулой R-(NH)), может иметь формулу RNH-L-А, где образовалась новая ковалентная связь с L (например, N-С) и утрачен водород. Соответственно, термин «фрагмент аналога компстатина» включает молекулярные структуры, в которых по меньшей мере один атом аналога компстатина принимает участие в образовании ковалентной связи со вторым фрагментом, например, модификации боковой цепи. Сходный принцип применим к фрагментам аналога компстатина, присутствующим в описанном выше многовалентном соединении. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент на N-конце или С-конце аналога компстатина, например, аналога компстатина, описанного выше в Разделе IV, заменен на A-L в структуре клеточно-реактивного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации А или L содержит блокирующий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или более блокирующий фрагмент), но не содержащего клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что клеточно-реактивный аналог компстатина содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного клеточно-реактивного аналога компстатина составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина.
[00112] Клеточно-реактивный фрагмент А согласно различным вариантам реализации может включать любую из разнообразных клеточно-реактивных функциональных групп J. В целом, клеточно-реактивная функциональная группа может быть выбрана по меньшей мере частично на основании таких факторов, как (а) конкретная функциональная группа, на которую необходимо нацеленно воздействовать; (b) способность указанной реактивной функциональной группы вступать в реакцию с целевой функциональной группой в физиологически приемлемых ex vivo условиях (например, при физиологически приемлемых значениях pH и осмолярности) и/или in vivo условиях (например, в крови); (с) специфичность реакции между указанной реактивной функциональной группой и целевой функциональной группой в физиологически приемлемых ex vivo условиях и/или in vivo; (d) стабильность (например, в in vivo условиях) ковалентной связи, образующейся при реакции указанной реактивной функциональной группы с целевой функциональной группой; (е) простота синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина, содержащего указанную реактивную функциональную группу и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с целевой химической группой без высвобождения замещаемой группы. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая приводит к высвобождению замещаемой группы при реакции с мишенью. Соединения, содержащие такие группы, могут подходить, например, для мониторинга прогресса и/или степени реакции. Согласно некоторым вариантам реализации замещаемая группа является физиологически приемлемой для клеток, тканей или органов в синтезируемом количестве (например, в отношении концентрации и/или синтезируемого абсолютного количества) и/или медицински приемлемой для субъекта в синтезируемом in vivo количестве (например, в отношении концентрации в соответствующей физиологической жидкости, такой как кровь, и/или в отношении абсолютного синтезируемого количества). Согласно некоторым вариантам реализации синтезированную ex vivo замещаемую группу по меньшей мере частично удаляют, например, промыванием клеток, либо промыванием или перфузированием ткани или органа, например, солевым раствором.
2
[00113] Согласно многим вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа, подходящая для настоящего изобретения, вступает в реакцию с боковой цепью остатка аминокислоты и/или с N-концевой аминогруппой или С-концевой карбоксильной группой белка. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточно-реактивная функциональная группа реакционноспособна в отношении сульфгидрильных (-SH) групп, которые присутствуют в боковых цепях остатков цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации применяют малеимидную группу. Малеимидные группы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами остатков цистеина в белках при физиологических pH и образуют стабильную тиоэфирную связь. Согласно некоторым вариантам реализации применяют галогенацетильную группу, такую как йодоацетильная или бромацетильная группа. Галогенацетилы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами при физиологических pH. Реакция йодоацетильной группы протекает с нуклеофильным замещением йода атомом серы из сульфгидрильной группы с образованием в результате стабильной тиоэфирной связи. Согласно другим вариантам реализации используют йодацетамидную группу. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с аминогруппами (-NH), которые присутствуют на N-концах белков и в боковых цепях остатков лизина (ε-аминогруппа). Согласно некоторым вариантам реализации применяют активированный сложный эфир, например, сукцинимидиловый сложный эфир (т.е. сложный NHS-эфир). Например, при синтезе может применяться н-гидроксисукцинимид (NHS) или его водорастворимый аналог (сульфо-NHS), таким образом, полученный клеточно-реактивный аналог компстатина содержит сложный NHS-эфир. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с карбоксильными (-СООН) группами, которые присутствуют на С-концах белков и в боковых цепях различных аминокислотные остатки. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина реакционноспособен в отношении гидроксильных (-ОН) групп, которые присутствуют в боковых цепях различных аминокислот и в углеводных фрагментах гликозилированных белков.
2
n
[00114] В целом, соединяющая часть L может включать любой один или более алифатический и/или ароматический фрагмент, допускающий образование стабильного соединения, объединяющего связанные фрагменты. Термин «стабильный» в настоящей заявке предпочтительно относится к соединениям, обладающим достаточной стабильностью, чтобы позволять получение и сохранение целостности указанного соединения на протяжении достаточного периода времени, например, подходящего для одной или более из описанных в настоящей заявке целей. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит насыщенную или ненасыщенную замещенную или незамещенную разветвленную или неразветвленную алифатическую цепь длиной от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 6, или 5 или менее атомов углерода, где под длиной имеется в виде число атомов С в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанная алифатическая цепь содержит один или более гетероатом (О, N, S), который может быть выбран независимо. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере 50% атомов главной цепи L являются атомами углерода. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент насыщенного алкила (СН), где n составляет от 1 до 30.
2
2
n
[00115] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит один или более гетероатом и имеет длину в общей сложности от 1 до 1000, от 1 до 800, от 1 до 600, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 30, или от 1 до 10 атомов углерода в цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) (-(О-СН-СН-)), где значение n составляет от 1 до 500, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 10 до 200, от 200 до 300, от 100 до 200, от 40 до 500, от 30 до 500, от 20 до 500, от 10 до 500, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10.
2
[00116] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит ненасыщенный фрагмент, такой как -СН=СН- или -СН-СН=СН-; фрагмент, содержащий неароматическую циклическую кольцевую систему (например, циклогексильный фрагмент), ароматический фрагмент (например, ароматическую циклическую кольцевую систему, такую как фенильный фрагмент); фрагмент простого эфира (-C-O-C-); амидный фрагмент (-C(=O)-N-); фрагмент сложного эфира (-СО-O-); карбонильный фрагмент (-С(=O)-); фрагмент имина (-C=N-); фрагмент тиоэфира (-C-S-C-); аминокислотный остаток; и/или любой фрагмент, который может быть образован в ходе реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно определенным вариантам реализации в одном или более фрагменте соединяющей части либо в клеточно-реактивном фрагменте один или более атом водорода (или другой атом) независимо замещен одним или более фрагментом, например, но не ограничиваясь перечисленными, алифатическим; ароматическим, арилом; алкилом, аралкилом, алканоилом, ароилом, алкокси; тио; F; Cl; Br; I; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHC12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; - или -GRG1 где G представляет собой -O-, -S-, -NRG2-, -C(=O)-, -S(=O)-, -SO2-, -C(=O)O-, -C(=O)NRG2-, -OC(=O)-, -NRG2C(=O)-, -OC(=O)O-, -OC(=O)NRG2-, -NRG2C(=O)O-, -NRG2C(=O)NRG2-, -C(=S)-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)S-, -C(=NRG2)-, -C(=NRG2)O-, -C(=NRG2)NRG3-, -OC(=NRG2)-, -NRG2C(=NRG3)-, -NRG2SO2-, -NRG2SO2NRG3-, или -SO2NRG2-, где каждый из RG1, RG2 и RG3 независимо включает, не ограничиваясь перечисленными, водород, галоген или необязательно замещенный алифатический, ароматический или арильный фрагмент. Следует иметь в виду, что циклические кольцевые системы, в случае присутствия в качестве заместителей, могут необязательно быть присоединены посредством линейного фрагмента. Применяют предпочтительно такие комбинации заместителей и переменных параметров, предусмотренных настоящим изобретением, которые обеспечивают образование стабильных соединений, подходящих для любого одного или более из описанных в настоящей заявке способов, например, подходящих для лечения одного или более расстройства и/или для контакта с клеткой, тканью или органом согласно описанию в настоящей заявке, и/или подходящих в качестве промежуточных соединений при получении одного или более из таких соединений.
Pj
Pj
2
2
2
2
m
2
2
n
2
p
2
m
2
p
2
2
n
2
2
[00117] L, согласно различным вариантам реализации, может включать любой один или более фрагмент из описанных в предыдущем параграфе. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или более разных фрагмента, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, длиной от 1 до примерно 60 атомов, от 1 до примерно 50 атомов, например, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, или от 1 до 6 атомов, где под длиной подразумевается число атомов в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или более разных фрагмента, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, содержащей от 1 до примерно 40, например, от 1 до 30, например, от 1 до 20, от 1 до 10, или от 1 до 6 атомов углерода в главной (наиболее длинной) цепи. В целом, структура такого клеточно-реактивного аналога компстатина может быть представлена формулой A-(L)j-M, где значение j составляет, как правило, от 1 до 10, и каждый L независимо выбран из фрагментов, описанных в предыдущем параграфе. Согласно многим вариантам реализации L содержит одну или более углеродсодержащую цепь, такую как -(СН)n- и/или -(O-СН-СН-)n, которая(ые) соединена(ы) ковалентно друг с другом и/или с клеточно-реактивной функциональной группой или аналогом компстатина, например, посредством фрагментов (например, амидных фрагментов, фрагментов сложных эфиров или простых эфиров), образующихся при реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит -(CH)-C(=O)-NH-(CHCHO)(CH)C(=O)- или -(CH)-C(=O)-NH-(CH)(OCHCH)C(=O)-. Согласно некоторым вариантам реализации m, n, и p подобраны таким образом, что число атомов углерода в указанной цепи составляет от 1 до 500, например, от 2 до 400, от 2 до 300, от 2 до 200, от 2 до 100, от 2 до 50, от 4 до 40, от 6 до 30, или от 8 до 20. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 500 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 400 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 300 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 200 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 100 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 50 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 25 и/или значение p составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 8 и/или значение p составляет от 2 до 10. Необязательно по меньшей мере один -СН-заменен на CH-R, где R может представлять собой любой заместитель. Необязательно по меньшей мере один -СН- заменен на гетероатом, циклическую кольцевую систему, фрагмент амида, сложного эфира или простого эфира. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 3 атома углерода в наиболее длинной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 атомов углерода в наиболее длинной цепи.
1
P1
2
P2
3
P3
p
1
2
3
P
[00118] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А содержит клеточно-реактивную функциональную группу J и линкер L, содержащий соединяющую часть L и реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с аналогом компстатина с образованием А-М. Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер L, содержащий две реактивные функциональные группы и соединяющую часть L. Реактивные функциональные группы из L вступают в реакцию с подходящими реактивными функциональными группами из А и M с образованием клеточно-реактивного аналога компстатина A-L-M. Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит линкер L, содержащий соединяющую часть L. Например, согласно приведенному ниже описанию, линкер, содержащий реактивную функциональную группу, может присутствовать на N-или С-конце, либо фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может быть присоединен к N- или С-концу посредством линкера. Соответственно, L может содержать несколько соединяющих частей L, привнесенных, например, А, линкером(ами), применяемым(и) для объединения А и М, и/или аналогом компстатина. Следует понимать, что в случае присутствия в структуре A-L-M определенная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) групп(ы), присутствующая(ие) до реакции в L , L , L и т.п., пройдет(ут) через реакцию, так что только часть(и) указанной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) будет(ут) присутствовать в конечной структуре A-L-M, и указанное соединение будет содержать фрагменты, образованные в ходе реакции указанных функциональных групп. В общем случае, если соединение содержит две или более соединяющие части, указанные соединяющие части могут быть одинаковыми либо разными, и могут быть независимо выбраны согласно различным вариантам реализации. Несколько соединяющих частей L могут быть соединены друг с другом с образованием большей соединяющей части L, и по меньшей мере к некоторым из таких соединяющих частей может быть присоединен один или более аналог компстатина и/или одна или более клеточно-реактивная функциональная группа. В молекулах, содержащих несколько аналогов компстатина, указанные аналоги компстатина могут быть одинаковыми либо разными, и в том случае, если они разные, могут быть независимо выбраны. То же относится и к соединяющим частям, и к реактивным функциональным группам. Настоящее изобретение охватывает применение многовалентных аналогов компстатина, содержащих одну или более клеточно-реактивную функциональную группу, и применение конкатемеров аналогов компстатина, содержащих одну или более клеточно-реактивную функциональную группу. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна связь представляет собой стабильную нековалентную связь, такую как биотин/(стрепт)авидиновая связь, или другую нековалентную связь приблизительно эквивалентной силы.
2
2
n
2
[00119] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит аналог компстатина, в котором любая из последовательностей SEQ ID NO: 3-36 удлинена посредством одной или более аминокислоты на N-конце, С-конца, или на обоих концах, причем по меньшей мере одна из указанных аминокислот имеет боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильная группа, карбоксильная группа (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппа, фенольная группа, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо. Согласно некоторым вариантам реализации указанная(ые) аминокислота(ы) представляет(ют) собой L-аминокислоту(ы). Согласно некоторым вариантам реализации любая одна или более из указанных аминокислот представляет собой D-аминокислоту. Если добавлено несколько аминокислот, указанные аминокислоты могут быть независимо выбраны. Согласно некоторым вариантам реализации указанную реактивную функциональную группу (например, первичный или вторичный амин) используют в качестве мишени для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин (Lys) и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH(CH)CH(NH)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (orn), соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна аминокислота представляет собой цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин, тирозин, триптофан, метионин или гистидин. Цистеин содержит боковую цепь, содержащую сульфгидрильную группу. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота содержат боковую цепь, содержащую карбоксильную группу (способную к ионизации до карбоксилатной группы). Аргинин содержит боковую цепь, содержащую гуанидиногруппу. Тирозин содержит боковую цепь, содержащую фенольную группу (способную к ионизации до фенолатной группы). Триптофан содержит боковую цепь, содержащую индольное кольцо. Метионин содержит боковую цепь, содержащую тиоэфирную группу. Гистидин содержит боковую цепь, содержащую имидазольное кольцо. Доступен широкий ряд нестандартных аминокислот, содержащих боковые цепи, включающие одну или более такую реактивную функциональную группу, в том числе встречающиеся в природе аминокислоты и аминокислоты, отсутствующие в природе. См., например, Hughes, В. (ed.), Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, Volumes 1-4, Wiley-VCH (2009-2011); Blaskovich, M., Handbook on Syntheses of Amino Acids General Routes to Amino Acids, Oxford University Press, 2010. Настоящее изобретение охватывает варианты реализации, в которых одну или более нестандартную аминокислоту применяют для добавления к основе фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Любая одна или более из указанных аминокислот может быть защищена подходящим образом во время синтеза указанного соединения. Так, одна или более аминокислота может быть защищена во время реакции(й), вовлекающей(их) боковую цепь целевой аминокислоты (мишени). Согласно некоторым вариантам реализации, которые отличаются тем, что в качестве основы для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, применяют содержащую сульфгидрил аминокислоту, указанный сульфгидрил защищают во время циклизации указанного соединения за счет образования внутримолекулярной дисульфидной связи между другими аминокислотами, например, цистеинами.
1
1
1
2
2
2
2
1
1
P3
p3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
[00120] В содержащемся в данном параграфе описании аминокислота с боковой цепью, содержащей аминогруппу, приводится в качестве примера. Настоящее изобретение охватывает аналогичные варианты реализации, когда применяется аминокислота сбоковой цепью, содержащей другие реактивные функциональные группы. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют непосредственно к N-концу или С-концу любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36 посредством пептидной связи. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют к N- или С-концу любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36 посредством соединяющей части, которая может содержать любой один или более соединяющий фрагмент из описанных выше. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере две аминокислоты добавляют на одном либо на обоих концах. Указанные две или более добавленные аминокислоты могут быть соединены друг с другом пептидными связями, или по меньшей мере некоторые из указанных добавленных аминокислот могут быть соединены друг с другом посредством соединяющей части, которая может содержать любой один или более соединяющий фрагмент из описанных в настоящей заявке. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит фрагмент аналога компстатина M с формулой B1-R1- M -R2-B2, где Μ представляет любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, либо R1 или R2 может отсутствовать; по меньшей мере один R1 и R2 содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин; и В1 и В2 представляют собой необязательно присутствующие блокирующие фрагменты. R1 и/или R2 может/могут быть присоединен(ы) к Μ посредством пептидной связи или не-пептидной связи. R1 и/или R2 может/могут содержать соединяющую часть L. Например, R1 может иметь формулу М-L и/или R2 может иметь формулу L-М, где L представляет собой соединяющую часть, и М содержит по меньшей мере одну аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин. Например, М может представлять собой Lys или аминокислотную цепь, содержащую Lys. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит одну или более аминокислоту или состоит из одной или более аминокислоты. Например, длина L может составлять от 1 до примерно 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот длиной. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит несколько остатков Gly, Ser и/или Ala, либо состоит из нескольких остатков Gly, Ser и/или Ala. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает аминокислоты, содержащие реакционноспособную SH-группу, такие как Cys. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L присоединен к N-концевой аминокислоте Μ амидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Lприсоединен к С-концевой аминокислоте Μ посредством амидной связи. Указанное соединение может быть затем удлинено на любом либо на обоих концах добавлением следующей(их) соединяющей(их) части(ей) и/или аминокислот(ы). Указанные аминокислоты могут быть одинаковыми либо разными; в том случае, если аминокислоты разные, они могут быть выбраны независимо. Согласно некоторым вариантам реализации применяют две или более аминокислоты с боковыми цепями, содержащие реактивные функциональные группы, отличающиеся тем, что указанные реактивные функциональные группы могут одинаковыми либо разными. Указанные две или более реактивные функциональные группы могут применяться в качестве основы для добавления двух или более фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют два или более клеточно-реактивных фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют клеточно-реактивный фрагмент и нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации после включения указанной аминокислоты в пептидную цепь к боковой цепи аминокислоты присоединяют линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент уже присоединен к боковой цепи аминокислоты до применения указанной аминокислоты при синтезе клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может применяться производное Lys, содержащее присоединенный к его боковой цепи линкер. Указанный линкер может содержать клеточно-реактивную функциональную группу или может позже быть модифицирован таким образом, чтобы включать клеточно-реактивную функциональную группу.
n
2
2
n
2
[00121] Более подробное описание определенных клеточно-реактивных аналогов компстатина приводится ниже. В приведенном ниже описании пептид с последовательностью аминокислот Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr (SEQ ID NO: 37) (соответствующий аналогу компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 28, где звездочками в SEQ ID NO: 37 обозначены цистеины в активном соединении, соединенные дисульфидной связью, и (1Me)Trp означает 1-метил-триптофан)), применяют в качестве типового фрагмента аналога компстатина; малеимид (сокращенно Mal) применяют в качестве примера клеточно-реактивной функциональной группы; (СН2) и (O-СН-СН) применяют в качестве примеров соединяющих частей; лизин применяют в качестве примера аминокислоты, содержащей реактивную функциональную группу (в некоторых соединениях), и ацетилирование и амидирование N- и С-концов, соответственно, применяют в качестве необязательно присутствующих типовых блокирующих фрагментов в некоторых соединениях и выделяют курсивом, т.е. Ас и NH, соответственно. Следует иметь в виду, что указанные соединения могут быть получены с применением разнообразных методов синтеза и с использованием разнообразных предшественников. Обсуждение различных методов синтеза и предшественников ниже не подразумевает ограничения настоящего изобретения. В общем случае, любое свойство любого из описанных ниже соединений может быть без ограничений скомбинировано со свойством(ами) других описанных ниже или где-либо в настоящей заявке соединений, и настоящее изобретение охватывает такие варианты реализации.
2
5
[00122] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивает клеточно-реактивной соединение, содержащее малеимидную группу (в качестве клеточно-реактивной функциональной группы) и алкановую кислоту (RCOOH), где R представляет собой алкильную группу. Например, может применяться 6-малеимидокапроновая кислота (Маl-(СН)-СООН), изображенная ниже.
[00123] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивает производное алкановой кислоты, которое содержит активированный фрагмент карбоновой кислоты, например, фрагмент ОН которой был преобразован в лучшую замещаемую группу. Например, может быть проведена реакция карбоксильной группы соединения I с ЭДК, с последующей реакцией с NHS (который может необязательно быть представлен водорастворимым сульфо-NHS), с получением сложноэфирного производного N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты, т.е. сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) 6-малеимидогексановой кислоты (изображенного ниже).
[00124] Соединение с последовательностью SEQ ID NO: 37 может быть модифицировано на N- и/или C-конце для получения клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, соединение II может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина посредством реакции с N-концевой аминогруппой Ile.
2
5
2
[00125] Малеимид-(CH)-C(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 38). Следует иметь в виду, что в последовательности SEQ ID NO: 38 фрагмент -C(=O) присоединен к непосредственно С-концевой аминокислоте (Ile) посредством связи C-H, где N является частью указанной аминокислоты и не показан.
[00126] Согласно другим вариантам реализации малеимидная группа соединена с Thr на C-конце с получением следующего клеточно-реактивного аналога компстатина:
2
[00127] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(C=O)-(CH)-малеимид (SEQ ID NO: 39)
2
2
n
2
m
[00128] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением бифункционального линкера (например, гетеробифункционального линкера). Типовой гетеробифункциональный линкер, содержащий фрагменты (CH-CH-O) и (CH) (где m=2), приведен ниже:
[00129] Соединение III содержит малеимидную группу в качестве клеточно-реактивной функциональной группы и фрагмент сложного NHS-эфира, который легко вступает в реакцию с аминогруппой (например, N-концевой аминогруппой или аминогруппой боковой цепи аминокислоты).
[00130] Вариант реализации соединения III, где n=2, может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина с применением аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 37:
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00131] Малеимид-(CH)-C(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 40).
2
2
[00132] Следует иметь в виду, что в соединении с последовательностью SEQ ID NO: 40 фрагмент -C(=O) присоединен к N-концевой аминокислоте (остаток Ile) посредством связи C-N, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Согласно некоторым вариантам реализации линкер имеет формулу Соединения III, где n≥1. Типовые значения n для фрагмента (СН-СН-O)n приведены в настоящей заявке.
[00133] Согласно некоторым вариантам реализации алкильная цепь, соединяющая фрагмент малеимида с остальной частью молекулы, содержит большее или меньшее число метиленовых единиц, фрагмент олиго(этиленгликоля) содержит большее или меньшее число единиц этиленгликоля и/или указанный фрагмент олиго(этиленгликоля) фланкирован большим или меньшим количеством метиленовых единиц с любой или с обеих сторон, по сравнению с соединением с последовательностью SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40. Типовые клеточно-реактивные аналоги компстатина, иллюстрирующие некоторые из таких вариантов, приведены ниже (SEQ ID NO: 41-46):
2
2
2
2
2
2
2
[00134] Малеимид-(CH)-C(=O)-NH-CHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 41)
2
3
2
2
2
2
2
2
[00135] Малеимид-(CH)-C(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp -Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 42)
2
5
2
2
2
2
2
[00136] Малеимид-(СН)-С(=O)-NН-СН2СНОСНСНОСНС(=O)-Ilе-Суs*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 43)
2
4
2
2
2
2
2
2
2
[00137] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-СНСНOСНСНОСНСНС(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp -Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 44)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00138] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-СНСНОСНСНOСНСНС(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 45)
2
5
2
2
2
2
2
2
[00139] Малеимид-(СН)-С(=O)-NН-СНСНОСНСНОСНС(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 46)
[00140] Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 37 удлинен включением остатка Lys на Ν- или С-конце указанного пептида, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:
2
[00141] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 47).
[00142] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N- или С- концу последовательности SEQ ID NO: 37 посредством пептидного линкера, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:
5
2
[00143] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)-Lys-NH (SEQ ID NO: 48).
2
2
2
2
[00144] Согласно некоторым вариантам реализации к N- или С-концу аналога компстатина добавляют линкер, содержащий первичный или вторичный амин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер содержит алкильную цепь и/или фрагмент олиго(этиленгликоля). Например, может применяться NH(CHCHO)nCHC(=O)OH (например, 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота (АЕЕАс) или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановая кислота) или ее сложный NHS-эфир (например, сложный NHS-эфир 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановой кислоты). Согласно некоторым вариантам реализации полученное соединение представлено следующим (часть, соответствующая линкеру, выделена жирным шрифтом):
2
2
5
2
[00145] NH(CH)C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 49)
2
2
2
2
2
2
[00146] NН(СНСНO)СНС(=O)-Ilе-Суs-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 50)
[00147] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N- или С-концу SEQ ID NO: 37 посредством линкера, включающего непептидную часть. Например, указанный линкер может включать алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или циклическую кольцевую систему. Согласно некоторым вариантам реализации применяют 8-АЕЕАс или ее сложный NHS-эфир, получая (в случае присоединения Lys на С-конце) следующее соединение (часть, относящаяся к 8-АЕЕАс, выделена жирным шрифтом):
2
2
2
2
2
2
[00148] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCHC(=O)-Lys-NH (SEQ ID NO: 51).
[00149] Следует иметь в виду, что в последовательностях SEQ ID NO: 49 и 50 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Ile посредством C-N связи, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Сходным образом, в SEQ ID NO: 51 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Lys посредством C-N связи, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Следует также иметь в виду, что в SEQ ID NO: 51 фрагмент NH присоединен к непосредственно N-концевой аминокислоте (Thr) посредством C-N связи, где С представляет собой атом углерода карбонила указанной аминокислоты и не показан.
[00150] Соединения с последовательностями SEQ ID NO: 47-51, могут легко быть модифицированы по первичной аминогруппе с получением клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может быть проведена реакция соединений с последовательностями SEQ ID NO: 47-51 (или других соединений, содержащих первичный или вторичный амин и фрагмент аналога компстатина) со сложным эфиром N- сукцинимидила 6-малеимидокапроновой кислоты с получением следующих клеточно-реактивных аналогов компстатина:
2
5
2
[00151] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-(CH)-(Mal)-NH(SEQ ID NO: 52)
5
2
5
2
[00152] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-(Gly)-Lys-C(=O)-(CH)-(Mal)-NH(SEQ ID NO: 53).
2
5
2
5
2
[00153] Mal-(CH)-(C(=O)-NH(CH)C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 54)
2
5
2
2
2
2
2
[00154] Mal-(CH)-(C(=O)NH(CHCHO)CHC(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 55)
2
2
2
2
2
2
5
2
[00155] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 56)
2
2
2
2
2
5
2
[00156] Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-CH(OCHCH)NH(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 57).
[00157] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 38-57, где -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 71) заменен на последовательность аминокислот, содержащую последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, согласно любой из последовательностей SEQ ID NO 3-27 или 29-36, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N- и/или С-концах аналога компстатина, могут отсутствовать, быть заменены на линкер (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединены к другой N- или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем(их) варианте(ах).
[00158] Другие бифункциональные кросс-линкеры, содержащие малеимид в качестве клеточно-реактивного фрагмента и сложный NHS-эфир в качестве амино-реакционноспособного фрагмента, подходящего для различных вариантов реализации настоящего изобретения, включают, например, сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (SMPB); сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); сложный эфир Ν-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимида (GMBS). Добавление сульфоната к кольцу NHS дает водорастворимые аналоги, такие как сульфосукцинимидил(4-йодоацетил)-аминобензоат (сульфо-SIAB), сульфо-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфо-сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB), сульфо-Ν-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимид сложный эфир (сульфо-GMBS) и т.п., которые могут позволить избежать необходимости использования органического растворителя. Согласно некоторым вариантам реализации применяют длинноцепочечный вариант любого из вышеназванных аналогов, содержащий спейсерный отрезок между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью указанной молекулы. Указанный спейсер может включать, например, алкильную цепь. Примером является сукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбокси-[6-амидокапроат].
[00159] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и йодоацетильную группу (реакционноспособную в отношении сульфгидрильных групп). Такие линкеры включают, например, н-сукцинимидил (4-йодоацетил)-аминобензоат (SIAB); сукцинимидил 6-[(йодоацетил)-амино]гексаноат (SIAX); сукцинимидил 6-[6-(((йодоацетил)амино)-гексаноил)амино]гексаноат (SIAXX); сукцинимидил 4-((йодоацетил)амино)метил)-циклогексан-1-карбоксилат (SIАС); сукцинимидил 6-((((4-(йодоацетил)амино)метил-циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (SIACX).
[00160] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и пиридил-дисульфидную группу (в качестве клеточно-реактивного фрагмента, реакционноспособного в отношении сульфгидрильных групп). Примеры включают N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP); сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT) и варианты, содержащие сульфонат на кольце NHS и/или спейсер, содержащий алкильную цепь между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью молекулы (например, сукцинимидил 6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат) (LC-SPDP). Могут применяться варианты таких линкеров, включающие дополнительные или другие фрагменты. Например, для спейсера может быть использована более длинная или более короткая алкильная цепь, либо вместо алкильной цепи может быть использован фрагмент олиго(этиленгликоля).
[00161] В общем случае клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением разнообразных методов. Клеточно-реактивные соединения, включающие клеточно-реактивную функциональную группу и линкер, часто доступны для приобретения в виде готовых составляющих. Например, 6-малеимидокапроновую кислоту и сложный эфир N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты можно приобрести у различных поставщиков. Как вариант, такие соединения могут быть синтезированы с применением известных в данной области техники способов. См., например, Keller О, Rudinger J. Helv Chim Acta. 58(2):531-41, 1975 и Hashida S, et al., J Appl Biochem., 6(l-2):56-63, 1984. См. также Hermanson, G. выше, и ссылки в указанном источнике, для ознакомления с описаниями способов и реагентов, подходящих для синтеза конъюгатов. В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, и полученные соединения.
[00162] Согласно некоторым вариантам реализации при синтезе линейного пептида применяют аминокислоту, содержащую линкер, присоединенный к боковой цепи. Указанный линейный пептид может быть синтезирован с применением стандартных методов пептидного синтеза, известных в данной области техники, например, с помощью стандартного твердофазного синтеза пептидов. Линейный пептид затем циклизуют (например, окислением остатков Cys с образованием внутримолекулярного дисульфида). Затем может быть проведена реакция указанного циклического соединения с линкером, содержащим клеточно-реактивную функциональную группу. Согласно другим вариантам реализации проводят реакцию фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, с линейным соединением, перед его циклизацией. В общем случае реактивные функциональные группы могут быть подходящим образом защищены, чтобы избежать ненужной реакции между ними во время синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина. Клеточно-реактивная функциональная группа, любая из боковых цепей аминокислот и/или любой или оба конца указанного пептида могут быть защищены во время указанной реакции, а затем защита может быть снята. Например, SH-группы остатков Cys и/или SH-реакционноспособные фрагменты, такие как малеимиды, могут быть защищены до окончания циклизации, чтобы избежать реакции между ними. Условия реакции подбирают по меньшей мере частично с учетом необходимых для конкретной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) условий получения удовлетворительного выхода за приемлемый период времени. Температура, pH и концентрация реагентов могут быть скорректированы для обеспечения нужной степени или скорости реакции. См., например, Hermanson, выше. Требуемый продукт может быть очищен, например, с удалением непрореагировавшего соединения, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, непрореагировавшего аналога компстатина, линкера(ов), продуктов, отличных от требуемого клеточно-реактивного аналога компстатина, которые могли образоваться в ходе реакции, других веществ, присутствующих в реакционной смеси и т.п. Композиции и способы получения клеточно-реактивных аналогов компстатина и промежуточные материалы при их синтезе, представляют собой аспекты настоящего изобретения.
[00163] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вышеописанный(ые) линкер(ы) применяют при получении аналогов компстатина, содержащих такой фрагмент, как цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другой(ие) полимер(ы), например, стабилизирующий указанное соединение, увеличивающий время его жизни в организме, повышающий его растворимость, уменьшающий иммуногенность и/или повышающий его устойчивость к разрушению. Без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящей заявке такой фрагмент может называться «снижающим клиренс фрагментом» (CRM/СКФ), а аналог компстатина, содержащий такой фрагмент, может называться «аналогом компстатина длительного действия». Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия имеет среднее время полужизни в плазме, составляющее по меньшей мере 1 день, например, 1-3 дня, 3-7 дней, 7-14 дней или 14-28 дней, при введении в/в в дозе 10 мг/кг людям или не являющимся людьми приматам. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия после введения в/в в дозе 10 мг/кг людям или не являющимся людьми приматам увеличивается по меньшей мере в 2 раза, например, в 2-5, 5-10, 10-50 или 50-100 раз по сравнению с соответствующим аналогом компстатина, имеющим такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, содержащим один или более блокирующий фрагмент), но не содержащим указанный СКФ. Как уже отмечалось, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-36 удлинен посредством одной или более аминокислоты на N-конце, С-конце или на обоих концах, при этом по меньшей мере одна из указанных аминокислот содержит боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильную группу, карбоксильную группу (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппу, фенольную группу, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо, что облегчает конъюгирование с реактивной функциональной группой с присоединением СКФ к указанному аналогу компстатина. Следует понимать, что в соответствующем аналоге компстатина, не содержащем СКФ, может также отсутствовать одна или более такая аминокислота из присутствующих в аналоге компстатина длительного действия, которому он соответствует. Таким образом, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий любой из SEQ ID NO: 3-36 и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и последовательности SEQ ID NO: 3-36, соответственно. Например, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36 и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после введения одной в/в дозы. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после достижения равновесного состояния после введения нескольких в/в доз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Cmax аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, по меньшей мере в 5 раз, например, в 5-50 раз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Cmax аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, в 10-20 раз. Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой не являющегося человеком примата, например, обезьяну, такую как яванский макак или макак-резус. Согласно некоторым вариантам реализации почечный клиренс аналога компстатина длительного действия в течение первых 24 часов после введения в/в в дозе 10 мг/кг людям или не являющимся людьми приматам ниже по меньшей мере в 2 раза, например, в 2-5, 5-10, 10-50 или 50-100 раз, чем почечный клиренс соответствующего аналога компстатина. Концентрация аналога компстатина в образцах крови и/или мочи может быть измерена с применением, например, УФ, ВЭЖХ, масс-спектроскопии (МС) или антител к СКФ, или комбинации таких способов, как ЖХ/МС или ЖХ/МС/МС. Параметры фармакокинетики, такие как время полужизни и клиренс, могут быть определены с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Фармакокинетический анализ может быть выполнен, например, с применением программного обеспечения WinNonlin v 5.2 (Pharsight Corporation, Сент-Луис, Миссури).
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[00164] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия обладает молярной активностью, составляющей по меньшей мере примерно 10%, 20%, 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30%) до 90% или более, от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, содержащего один или более блокирующий фрагмент), но не содержащего СКФ. В некоторых вариантах реализации, согласно которым аналог компстатина длительного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%), от 30% до 90% или более, от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации полиэтиленгликоль (ПЭГ) содержит фрагмент (СНСНСО) с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации описанный выше линкер содержит фрагмент (СНСНО), со средней молекулярной массой от примерно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; до 100000 дальтон. «Средняя молекулярная масса» относится к среднему значению молекулярной массы. Согласно некоторым вариантам реализации полидисперсность D фрагмента (СНСНO) составляет от 1,0005 до 1,50, например, от 1,005 до 1,10; 1,15;1,20; 1,25; 1,30; 1,40 или 1,50; или принимает любое значение от 1,0005 до 1,50.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[00165] Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент (СНСНСО) является монодисперсным, и значение полидисперсности фрагмента (СНСНO) составляет 1,0. Такие монодисперсные фрагменты (СНСНO) известны в данной области техники, коммерчески доступны у Quanta BioDesign (Пауэлл, Огайо) и включают, в качестве неограничивающего примера, монодисперсные фрагменты, значение n для которых составляет 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 или 24.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[00166] Согласно некоторым вариантам реализации соединение содержит несколько фрагментов (СНСНO), отличающихся тем, что общая молекулярная масса указанных (СНСНO) фрагментов составляет примерно от 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит несколько фрагментов (СНСНO) определенной длины, например, n=4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит достаточное число фрагментов (СНСНO) определенной длины, чтобы общая молекулярная масса указанных фрагментов (СНСНO) составляла от примерно 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации значение n составляет от примерно 30 до примерно 3000. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом из концов линейного ПЭГ. Бифункциональный ПЭГ, содержащий реактивную функциональную группу на каждом конце указанной цепи, может применяться, например, согласно приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации указанные реактивные функциональные группы идентичны, тогда как согласно некоторым вариантам реализации на каждом конце присутствуют разные реактивные функциональные группы. Согласно некоторым вариантам реализации несколько фрагментов (СНСНO) представлено в виде разветвленных структур. Ветви могут быть присоединены к линейному полимерному остову (например, в виде гребенчатой структуры) или могут отходить от одной или более группы центрального ядра, например, в виде звездообразной структуры. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 3 до 10 цепей (СНСНO). Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 4 до 8 цепей (СНСНO). Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 цепи (СНСНO). Согласно некоторым вариантам реализации звездообразная молекула содержит 10-100, 10-50, 10-30 или 10-20 цепей (СНСНO), отходящих от группы центрального ядра. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, таким образом, может содержать, например, 3-10 фрагментов аналога компстатина, например, 4-8 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (СНСНO) посредством функциональной группы на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия может содержать, например, 10-100 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (СНСНO) посредством функциональной группы на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации ветви (иногда называемые «ответвлениями») разветвленных или звездообразных ПЭГ содержат примерно одинаковое количество фрагментов (СНСНO). Согласно некоторым вариантам реализации длины по меньшей мере некоторых ветвей могут отличаться. Следует понимать, что согласно некоторым вариантам реализации одна или более цепь (СНСНO) не содержит присоединенного фрагмента аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере примерно к 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%), или 100% указанных цепей присоединен фрагмент аналога компстатина.
2
2
n
2
2
n
[00167] В показанных в настоящей заявке классах и соединениях фрагмент полиэтиленгликоля изображен с атомом кислорода с правой стороны повторяющегося звена или с левой стороны повторяющегося звена. В тех случаях, когда изображен только один вариант ориентации, настоящее изобретение охватывает обе ориентации (т.е. (СНСНO) и (ОСНСН)) фрагментов полиэтиленгликоля для конкретного соединения или класса; либо, в тех случаях, когда соединение или класс содержит несколько фрагментов полиэтиленгликоля, настоящим изобретением охвачены все комбинации ориентаций.
2
2
n
3
2
2
n
[00168] Формулы некоторых типовых монофункциональных ПЭГ, содержащих реактивную функциональную группу, приведены ниже. С иллюстративной целью показаны формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включает(ют) сложный NHS-эфир, но могут применяться и другие реактивные функциональные группы, например, соответствующие приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации показан (СНСНО) с метоксигруппой (ОСН) на левом конце, однако следует понимать, что изображенные ниже и в других местах в настоящей заявке цепи могут оканчиваться другим OR-фрагментом (например, алифатической группой, алкильной группой, низшей алкильной группой или любой другой подходящей концевой группой ПЭГ) или ОН-группой. Следует также иметь в виду, что, согласно различным вариантам реализации, фрагмент (СНСНО) с NHS-группой могут соединять фрагменты, отличные от изображенных.
[00169] Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет формулу А:
где «Реактивная функциональная группа» и n соответствуют определению, данному выше и описанию классов и подклассов в настоящей заявке;
1
R представляет собой водород, алифатическую группу или любую подходящую концевую группу; и
1-12
2
2
2
x
x
x
x
x
Т представляет собой ковалентную связь или прямую или разветвленную углеводородную цепь С, где одна или более углеродная единица Т необязательно и независимо заменена на -О-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, -С(O)O-, -ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)-, -N(R)SO- или -SON(R)-; и
x
1-6
каждый R независимо представляет собой водород или алифатический С.
[00170] Типовые монофункциональные ПЭГ с формулой А включают:
2
m
[00171] В Формуле I фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH)-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле I, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Например, согласно некоторым вариантам реализации m равен 3, как показано ниже:
2
m
[00172] В Формуле II фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет обитую структуру -(CH)-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле II, где значение m составляет от 1 до 10 (например, где m равен 5, как показано в Формуле III, приведенной ниже), или где m равен 0 (как показано ниже в Формуле IIIа).
2
2
n
[00173] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ включает фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на каждом из концов. Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми (гомобифункциональными) или разными (гетеробифункциональными). Согласно некоторым вариантам реализации структура бифункционального ПЭГ может быть симметричной, при этом для соединения реактивной функциональной группы с кислородными атомами на каждом конце цепи -(СНСНО) применяют одинаковые фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации для соединения указанных двух реактивных функциональных групп с ПЭГ-частью указанной молекулы применяют разные фрагменты. Структуры типовых бифункциональных ПЭГ изображены ниже. Для иллюстративных целей приведены формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включают сложный NHS-эфир, но могут использоваться и другие реактивные функциональные группы.
[00174] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ имеет формулу В:
где каждый Т и «Реактивная функциональная группа» независимо соответствуют приведенным выше определениям и описаны в классах и подклассах в настоящей заявке, и n соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящей заявке.
[00175] Типовые бифункциональные ПЭГ, имеющие формулу В, включают:
2
m
[00176] В Формуле IV фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -(CH)-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональные ПЭГ имеют структуру, соответствующую формуле IV, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5.
2
m
[00177] В Формуле V фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH)-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональные ПЭГ имеют структуру, соответствующую формуле V, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5.
[00178] Согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты аналога компстатина и ПЭГ-содержащих соединений и классов, показанные в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации для синтеза таких конъюгатов проводят реакцию функциональной группы (например, амина, гидроксила или тиольной группы) на аналоге компстатина с ПЭГ-содержащим соединением, имеющим «реактивную функциональную группу» согласно описанию в настоящей заявке. К примеру, Формулы III и IV, соответственно, могут образовывать конъюгаты аналога компстатина со структурой:
где  представляет собой точку присоединения аминогруппы на аналоге компстатина. Согласно определенным вариантам реализации аминогруппа представляет собой группу боковой цепи лизина. Следует иметь в виду, что могут быть получены соответствующие конъюгаты с любым из описанных в настоящей заявке ПЭГ-содержащих соединений и классов, в зависимости от выбора реактивной функциональной группы и/или функциональной группы компстатина.
2
2
n
[00179] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ содержит фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на конце каждой из нескольких цепей -(СНСНО).Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми, либо по меньшей мере две группы могут быть разными. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ имеет формулу, выбранную из следующих:
2
1
[00180] где каждый R независимо представляет собой «реактивную функциональную группу», или R, и каждый из Т, n и «реактивных функциональных групп» независимо соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящей заявке. Структура типовых разветвленных ПЭГ (с 8 ответвлениями, или ветвями), содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:
[00181] Структура типовых разветвленных ПЭГ (с 4 ответвлениями или ветвями) содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:
2
2
2
2
[00182] Число ветвей, отходящих от остова, может варьировать. Например, число 4 в приведенных выше формулах VI и VII может быть изменено на любое другое целое число от 0 до 10 согласно различным вариантам реализации. Согласно определенным вариантам реализации одна или более ветвь не содержит реакционноспособной функциональной группы; указанная ветвь оканчивается группой -СНСНОН или -CHCHOR согласно приведенному выше описанию.
[00183] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой
[00184] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой
[00185] .
2
2
m
[00186] Разумеется, метиленовая (СН) группа в приведенном выше фрагменте х может, как вариант, включать более длинную алкильную цепь (СН), где m принимает значения до 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 или 30, или может содержать один или более другой фрагмент из описанных в настоящей заявке.
[00187] Согласно некоторым вариантам реализации типовые разветвленные ПЭГ, содержащие NHS или малеимидные реакционноспособные группы, изображены ниже:
[00188] Согласно некоторым вариантам реализации применяют вариант с формулой X или XI, где 3 или каждая из 4 ветвей включает реактивную функциональную группу.
[00189] Также могут быть приведены следующие примеры ПЭГ:
[00190]
2
2
n
Как уже отмечалось, следует иметь в виду, что, согласно описанию в настоящей заявке, в различных вариантах реализации между пептидным компонентом и фрагментом (СНСНО)-R аналога компстатина длительного действия может быть введен любой из разнообразных фрагментов, такой как линейный алкил, сложный эфир, амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил), замещенная или незамещенная циклоалкильная структура, или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации такой(ие) фрагмент(ы) может(гут) придавать соединению большую чувствительность к гидролизу, который может отсоединять пептидную часть указанного соединения от СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации такое высвобождение может увеличивать проникновение в ткани in vivo и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой общий (например, кислотно-щелочной) гидролиз. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой катализируемый ферментами, например, катализируемый эстеразой. Разумеется, могут происходить оба типа гидролиза. Примеры ПЭГ, содержащих один или более такой фрагмент и сложный NHS-эфир в качестве реактивной функциональной группы, приведены ниже:
[00191]
[00192]
[00193]
[00194] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный (с несколькими ветвями) ПЭГ или звездообразный ПЭГ содержит пентаэритритное ядро, гексаглицериновое ядро или трипентаэритритное ядро. Следует понимать, что согласно определенным вариантам реализации ветви не обязательно отходят от одной точки.
[00195] Монофункциональные, бифункциональные, разветвленные и другие ПЭГ, содержащие одну или более реактивную функциональную группу, могут, согласно некоторым вариантам реализации, быть получены, например, от NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк или от ВОС Sciences, 45-16 Рэмси Роад, Ширли, Нью-Йорк 11967, США, в том числе, или могут быть получены с применением способов, известных в данной области техники.
2
2
n
[00196] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и клеточно-реактивную функциональную группу, и СКФ. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены варианты молекул любого из вышеупомянутых клеточно-реактивных аналогов компстатина, в которых клеточно-реактивная функциональная группа или фрагмент заменен на фрагмент (СНСНО) с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 дальтон, например, по меньшей мере 1500 дальтон - примерно 100000 дальтон (например, со средней молекулярной массой, составляющей примерно 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; или 100000 дальтон).
[00197] Ниже приведены типовые аналоги компстатина длительного действия, отличающиеся тем, что значение п достаточно для обеспечения средней молекулярной массы, составляющей от примерно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000 и 100000 дальтон.
2
2
n
2
[00198] (СНСНO)С(=O)-Ile-Суs-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH) (SEQ ID NO: 58)
2
2
2
2
2
2
n
2
[00199] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-C(=O)-(CH2CHO)-NH (SEQ ID NO: 59)
2
2
2
[00200] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O))-(CHCHO)n-NH (SEQ ID NO: 60)
5
2
2
n
2
[00201] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)-Lys-C(=O)-(CHCHO)-NH (SEQ ID NO: 61)
2
2
n
2
[00202] Ac-(CHCHO)C(=O)Lys-(Gly)5-Ile-Cys*-Val-(lMen)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH) (SEQ ID NO: 62)
2
2
n
2
[00203] Ac-(CHCHO)C(=O)Lys-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH) (SEQ ID NO: 63)
2
2
n
2
2
n
2
2
2
n
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
n
2
3
2
2
2
2
2
2
m
2
2
n
2
O
O
О
О
[00204] В последовательности SEQ ID NO: 58 (CHCHO) соединен амидной связью с N-концевой аминокислотой. В последовательностях SEQ ID NO: 59-63 указанный фрагмент (СНСНO) соединен амидной связью с боковой цепью Lys; соответственно, следует понимать, что NH на С-конце в последовательностях SEQ ID NO: 59, 60 и 61 указывает на амидирование С-конца указанного пептида, а в последовательностях SEQ ID NO: 62 и 63 Ас на N-конце указывает на ацетилирование N-конца указанного пептида, согласно приведенному выше описанию. Специалистам в данной области техники также будет понятно, что свободный конец фрагмента (СНСНO), как правило, оканчивается (R), где подчеркнутым О обозначен атом О на концевой (СНСНO) группе. Часто (R) представляет собой такой фрагмент, как гидроксильная (Н) или метоксигруппа (-СН), хотя могут использоваться и другие группы (например, другие алкоксигруппы). Соответственно, последовательность SEQ ID NO: 59, например, может быть представлена последовательностью Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CHCHO)-R)-NH (SEQ ID NO: 64), где R представляет собой, например, либо Н, либо СН, в случае линейного ПЭГ. В случае бифункционального, разветвленного или звездообразного ПЭГ R представляет собой остальную часть указанной молекулы. Далее, следует понимать, что фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может варьировать, согласно описанию в настоящей заявке (например, соответствуя любой из формул, приведенных в настоящей заявке). Например, аналоги компстатина длительного действия, содержащие ту же пептидную последовательность, что и SEQ ID NO: 64, в которых фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, содержит сложный эфир и/или алкильную цепь, могут быть представлены следующими Ac-Ile-Cys*-Val(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)-(CHCHO)-R)-NH (SEQ ID NO: 65);
2
2
2
2
2
2
m-
2
2
n
2
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)C(=O)-(CHCHO)-R)-NH (SEQ ID NO: 66);
2
2
2
2
2
2
m-
2
2
2
n
2
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)C(=O)-(CH)j (CHCHO)-R)-NH (SEQ ID NO: 67).
В последовательностях SEQ ID NO: 65-67 m, согласно различным вариантам реализации, может варьировать от 1 до примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30. В последовательностях SEQ ID NO: 67 j, согласно различным вариантам реализации, может варьировать от 1 и до примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30.
2
2
n
Следует также иметь в виду, что, согласно описанию в настоящей заявке, в различных вариантах реализации между Lys-(C(=O)- и (CHCHO)-R могут быть введены другие фрагменты, такие как амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил) или замещенная или незамещенная циклоалкильная структура.
[00205] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 58-67, в которых -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trρ-Gln-Asρ-Tφ-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 71) заменен последовательностью аминокислот, содержащей последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, любой из последовательностей SEQ ID NO 3-27 или 29-36, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N- и/или С-концах аналога компстатина, может(могут) отсутствовать, быть заменен линкером (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединен к другой N- или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем варианте(вариантах).
[00206] Любой аналог компстатина, например, любое соединение, содержащее любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-37, может, согласно различным вариантам реализации, быть присоединено через N-конец или С-конец, или рядом с N-концом или С-концом (например, через боковую цепь аминокислоты на N-концевой или С-концевой аминокислоте или рядом с ней), прямо или непрямо, к любому фрагменту, содержащему реактивную функциональную группу, например, любому соединению с Формулой I-XVI или Формулой А-Н.
[00207] Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит полипептид, который присутствует в сыворотке человека, или его фрагмент, или по существу аналогичный вариант указанного полипептида или его фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид, фрагмент или вариант имеет молекулярную массу, составляющую от 5 кДа до 150 кДа, например, по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 кДа или более, например, от 100 до 120, или от 120 до 150 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу с одной или более аминокислотной боковой цепью указанного полипептида, отличающуюся тем, что указанная боковая цепь содержит совместимую функциональную группу. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу, с N-концевым амином и/или С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего амино-реактивную функциональную группу, с аминокислотами с боковой цепью, содержащими первичный амин (например, с лизином), и/или с N-концевым амином указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего карбоксил-реактивную функциональную группу, с С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом конце указанного полипептида и, необязательно, к боковой цепи одной или более внутренней аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего сульфгидрил-реактивную функциональную группу, с одной или более сульфгидрильной группой указанного полипептида.
2
5
2
[00208] Согласно некоторым вариантам реализации в указанный полипептид вводят по меньшей мере одну реактивную функциональную группу. Например, согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одну боковую цепь указанного полипептида модифицируют, преобразуя первую реактивную функциональную группу в другую реактивную функциональную группу перед проведением реакции с указанным аналогом компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят тиол. Доступно несколько способов введения тиолов в биомолекулы, в том числе восстановление внутренних дисульфидов, а также преобразование аминов, альдегидов или групп карбоновых кислот в тиольные группы. Дисульфидные поперечные связи цистинов в белках могут быть восстановлены до остатков цистеина с применением дитиотреитола (DTT/ДТТ), трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР/ТКЭФ), или трис-(2-цианоэтил)фосфина. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатом (SPDP) с последующим восстановлением конъюгата 3-(2-пиридилдитио)пропионила с применением ДТТ или ТКЭФ. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидилацетилтиоацетатом, с последующим удалением ацетильной группы 50 мМ гидроксиламином или гидразином при близких к нейтральным значениях pH. Амины могут быть прямо тиолированы с помощью реакции с 2-иминотиоланом, при которой сохраняется общий заряд указанной молекулы и вводится свободный тиол. Остатки триптофана в не содержащих тиолов белках могут быть окислены до остатков меркаптотриптофана, которые могут затем быть модифицированы йодоацетамидами или малеимидами. Может быть проведена реакция полипептида, содержащего один или более тиол, с аналогом компстатина, содержащим малеимидную группу, такую как Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 68), для синтеза аналога компстатина длительного действия.
[00209] Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид получают рекомбинантным способом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид по меньшей мере частично получают рекомбинантным способом (например, в бактериальных или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки грибов, насекомых, растений или позвоночных животных) и/или по меньшей мере частично получают с применением химического синтеза. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид представляет собой puf. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид не гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид представляет собой сывороточный альбумин человека (HSA). Согласно некоторым вариантам реализации по существу аналогичный вариант указанного полипептида обладает достаточным сходством с полипептидом, вариантом которого он является, чтобы не распознаваться как чужеродный нормальной иммунной системой субъекта, например, субъекта-человека. Согласно некоторым вариантам реализации изменения в последовательностях по существу аналогичного варианта по сравнению с полипептидом, вариантом которого она является, подбирают таким образом, чтобы избежать образования эпитопов МНС класса I. Для предсказания наличия эпитопа МНС класса I в последовательности могут применяться различные известные в данной области техники способы.
[00210] В настоящем изобретении также предложены мультимеры, например, конкатемеры, содержащие два или более (например, от 2 до 10) аналога компстатина, содержащих СКФ, отличающиеся тем, что средняя молекулярная масса полученной молекулы (или ее СКФ-компонентов) составляет от 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанные аналоги компстатина, содержащие СКФ, могут быть связаны с помощью любых из вышеописанных соединяющих фрагментов.
[00211] VII. Аналоги компстатина нацеленного действия
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
[00212] В настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, включающие нацеливающий фрагмент и фрагмент аналога компстатина, отличающийся тем, что указанный нацеливающий фрагмент нековалентно связывается с целевой молекулой. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина нацеленного действия, аналогичные клеточно-реактивным аналогам компстатина, описанным в Разделе VI, отличающиеся тем, что указанные соединения включают нацеливающий фрагмент помимо или вместо клеточно-реактивного фрагмента. Указанный нацеливающий фрагмент может включать, например, антитело, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, аптамер), углевод, малую молекулу или супрамолекулярный комплекс, который(ая) специфически связывается с целевой молекулой. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) нацеливающего фрагмента в отношении целевой молекулы (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) составляет 10 M или менее, например, 10 M или менее, например, 10 M или менее, например, 10М или менее, 10 М или менее, 10 М или менее, или 10 M или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.
[00213] В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых нацеливающий фрагмент представляет собой антитело, указанное антитело может представлять собой любой иммуноглобулин или его производное, сохраняющее связывающую способность, или любой белок, содержащий связывающий домен, гомологичный или в основном гомологичный связывающему домену иммуноглобулина. Такие белки могут быть получены из природных источников, либо частично или полностью получены синтетически (например, с применением технологий рекомбинантной ДНК, химического синтеза и т.п.). Указанное антитело может принадлежать любому виду, например человеку, грызуну, кролику, козе, курице и т.п. Указанное антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, в том числе к любому классу иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело может представлять собой такой фрагмент антитела, как Fab', F(ab').sub.2, scFv (одноцепочечный вариабельный), или другой фрагмент, сохраняющий участок связывания антигена, или полученный рекомбинантным способом scFv фрагмент, включая полученные рекомбинантным способом фрагменты. См., например, Allen, Т., Nature Reviews Cancer, Vol. 2, 750-765, 2002 и включенные туда ссылки. Могут применяться моновалентные, бивалентные или многовалентные антитела. Указанное антитело может представлять собой гибридное антитело, например, такое, в котором вариабельный домен, полученный от грызуна, конденсирован с константным доменом, полученным от человека, соответственно, сохраняющее специфичность антитела грызуна. Согласно некоторым вариантам реализации антитело человека или его часть синтезируют, например, у грызунов, геном которых включает гены иммуноглобулинов человека, с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации гуманизированное антитело синтезируют прививкой одной или более определяющей комплементарность области от не являющегося человеком вида (например, мыши) к последовательности антитела человека. Указанное антитело может быть частично или полностью гуманизировано. См., например, Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Front Biosci. 13:1619-33 (2008) для ознакомления с обзором различных способов получения гуманизированных антител, которые могут применяться для получения нацеливающего фрагмента, подходящего для настоящего изобретения. Антитело может быть поликлональным или моноклональным, хотя для целей настоящего изобретения моноклональные антитела, как правило, предпочтительнее. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют F(ab')2 или F(ab') фрагмент, тогда как согласно другим вариантам реализации применяют антитела, содержащие Fc-домен. В данной области техники известны способы получения специфически связывающихся антител практически для любой нужной молекулы. Так, моноклональные или поликлональные антитела могут быть очищены из природных источников, например, из крови или асцитной жидкости животного, у которого синтезируется указанное антитело (например, после иммунизации указанной молекулой или ее антигенным фрагментом) или могут быть получены рекомбинантным путем, в культуре клеток. В данной области техники известны способы получения фрагментов антител, например, с помощью расщепления, дисульфидного восстановления или синтеза.
[00214] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент может представлять собой любую молекулу, специфически связывающуюся с целевой молекулой посредством механизма, отличного от взаимодействия антиген-антитело. Такой нацеливающий фрагмент называют «лигандом». Например, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения лиганд может представлять собой полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, ДНК или РНК), углевод, липид или фосфолипид, либо малую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации малая молекула представляет собой органическое соединение, либо встречающееся в природе, либо полученное искусственным путем, которое имеет относительно низкую молекулярную массу и не является белком, полипептидом, нуклеиновой кислотой или липидом, как правило, с молекулярной массой, составляющей менее чем примерно 1500 г/моль, и, как правило, содержащее несколько углерод-углеродных связей. В общем случае аптамер представляет собой олигонуклеотид (например, РНК или ДНК, необязательно содержащий один или более модифицированный нуклеозид (например, основания или сахара, отличные от 5 стандартных оснований (A, G, С, T, U) или сахаров (рибозы и дезоксирибозы), присутствующих в РНК и ДНК чаще всего), или модифицированные межнуклеозидные связи (например, не-фосфодиэфирные связи), которые, например, стабилизируют указанную молекулу, например, придавая ей большую устойчивость к разложению нуклеазами), который связывается с конкретным белком. Согласно некоторым вариантам реализации длина олигонуклеотида составляет до примерно 100 нуклеозидов, например, от 12 до 100 нуклеозидов. Аптамеры могут быть получены с помощью процесса in vitro эволюции, называемого SELEX, и в данной области техники известны способы получения аптамеров, специфичных в отношении представляющего интерес белка. См., например, Brody Ε Ν, Gold L. J Biotechnol. 2000 March; 74(1): 5-13. Согласно некоторым вариантам реализации применяют нуклеиновую кислоту или блокированную нуклеиновую кислоту пептида.
[00215] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент содержит пептид. Согласно некоторым вариантам реализации пептид, который связывается с представляющей интерес целевой молекулой, идентифицируют с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей и т.п.
[00216] В качестве лигандов могут применяться малые молекулы. Способы идентификации таких лигандов известны в данной области техники. Например, можно идентифицировать малые молекулы-лиганды для многочисленных представляющих интерес белков с помощью in vitro скрининга библиотек малых молекул, в том числе комбинаторных библиотек, и компьютерного скрининга, например, для идентификации малых органических соединений, которые связываются с углублениями на поверхности белков (карманами) (Huang, Ζ., Pharm. & Ther. 86: 201-215, 2000).
[00217] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающие фрагменты не являются белками или молекулами, которые обычно применяют в качестве носителей и конъюгируют с антигенами для стимуляции синтеза антител. Примерами являются белки-переносчики или такие молекулы, как бычий сывороточный альбумин, гемоцианин фиссуреллы, бычий гамма-глобулин и дифтерийный токсин. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный нацеливающий фрагмент не является Fc частью молекулы иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации нацеливающий фрагмент представляет собой часть комплекса, содержащего один или более дополнительный фрагмент, к которому он ковалентно или нековалентно присоединен.
[00218] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула может представлять собой любую молекулу, синтезируемую клеткой (включая любые формы, экспрессируемые на поверхности указанной клетки, или их модифицированные формы, по меньшей мере отчасти формирующиеся в результате экстраклеточной модификации). Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой внеклеточное вещество, присутствующее в ткани или на ткани. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула характерна для конкретного заболевания или физиологического состояния или характерна для одного или более типа клеток или тканей. Целевая молекула часто представляет собой молекулу, по меньшей мере частично присутствующую на поверхности клетки, (например, трансмембранный или иным образом соединенный к мембраной белок) так что по меньшей мере часть указанной молекулы доступна для связывания с экстраклеточным связывающим агентом, таким как антитело. Целевая молекула может быть, но не обязательно, специфичной для какого-либо типа клеток. Например, специфичная для определенного типа клеток целевая молекула часто представляет собой белок, пептид, мРНК, липид или углевод, который присутствует на клетках или в клетках конкретного типа (типов) в большем количестве, чем на клетках или в клетках многих других типов. В некоторых случаях специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в детектируемых количествах только в клетках или на клетках конкретного представляющего интерес типа. В то же время следует иметь в виду, что подходящая специфичная для определенного типа клеток целевая молекула не обязательно должна быть абсолютно специфичной для представляющего интерес типа клеток, чтобы считаться специфичной для указанного типа клеток. Согласно некоторым вариантам реализации уровни экспрессии специфичной для конкретного типа клеток целевой молекулы по меньшей мере в 3 раза выше в клетках данного типа, чем в клетках эталонной популяции, которая может представлять собой, например, смесь, содержащую приблизительно равные количества клеток нескольких (например, 5-10 или более) разных тканей или органов. Согласно некоторым вариантам реализации специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в количествах, по меньшей мере в 4-5 раз, 5-10 раз или более чем в 10 раз больших по сравнению со средней экспрессией в эталонной популяции. Согласно некоторым вариантам реализации обнаружение или измерение специфичной для типа клеток целевой молекулы позволяет специалисту в данной области техники отличить тип или типы клеток, представляющий(ие) интерес, от клеток многих, большинства или всех других типов. В целом, присутствие и/или высокое содержание большинства целевых молекул может быть определено с применением одной или более стандартной техники, такой как нозерн-блоттинг, in situ гибридизация, ОТ-ПЦР, секвенирование, иммунологических способов, таких как иммуноблоттинг, иммунодетекция (например, иммуногистохимическая), или обнаружение с помощью флуоресценции после окрашивания флуоресцентно мечеными антителами (например, с применением FACS), олигонуклеотидных или кДНК микрочипов или мембранных чипов, белкового анализа на микрочипах, масс-спектроскопии и т.п.
[00219] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой канал, переносчик, рецептор или другую молекулу, по меньшей мере частично экспонируемую на поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой переносчик анионов или водный канал (например, белок аквапорин).
[00220] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эритроцитов, такой как гликофорин (например, гликофорин А, В, С или D) или белок полосы 3.
[00221] Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности нормальных здоровых сосудов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток, но не на поверхности неактивированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой молекулу экспрессия или экспонирование которой индуцируется таким стимулом, как повреждение или воспаление. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула будет распознана как «несобственная» реципиентом при получении трансплантата, содержащего клетки, экспрессирующие указанную целевую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой углеводный ксеноантиген, антитела к которому, как правило, обнаруживаются у человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает антиген группы крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает ксеноантиген, например, эпитоп альфа-Gal (Galalpha1-3Galbeta1-(3)4GlcNAc-R) (см., например, Macher ΒΑ and Galili U. The Galalpha1, 3Galbeta1, 4GlcNAc-R (alpha-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim Biophys Acta. 1780(2):75-88 (2008).
[00222] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и нацеливающий фрагмент, и СКФ.
[00223] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько нацеливающих фрагментов, которые могут быть одинаковыми или разными. Разные нацеливающие фрагменты могут связываться с одной и той же целевой молекулой или с разными целевыми молекулами. В настоящем изобретении предложен аналог компстатина нацеленного действия, являющий многовалентным в отношении нацеливающего фрагмента, аналога компстатина, или обоих.
[00224] В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и нацеливающий фрагмент, и полученные соединения. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия может быть получен с применением способов, в целом аналогичных описанным в Разделе VI, отличающихся тем, что нацеливающий фрагмент применяют вместо клеточно-реактивного фрагмента или наряду с ним. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия, содержащий пептид в качестве нацеливающего фрагмента, синтезируют в виде полипептидной цепи, содержащей фрагмент аналога компстатина и пептидный нацеливающий фрагмент. Указанная полипептидная цепь необязательно содержит один или более спейсерный пептид между фрагментом аналога компстатина и нацеливающим фрагментом.
[00225] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере примерно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или более блокирующий фрагмент), но не содержащего нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина нацеленного действия составляет по меньшей мере примерно 10%, 20%, или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина.
[00226] VIII. Применение
[00227] Клеточно-реактивные аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия имеют широкий ряд применений. В настоящей заявке, без какого-либо ограничения настоящего изобретения, описаны определенные варианты применения клеточно-реактивных аналогов компстатина длительного действия или нацеленного действия и связанные с ними аспекты настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от комплемент-опосредованного повреждения или имеющему риск возникновения комплемент-опосредованного повреждения органа, ткани или клетки. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина приводят в контакт с органом, тканью или клетками ex vivo, и он ковалентно связывается с ними. Указанный орган, ткань или клетки вводят субъекту, и они защищены от повреждения, которое в иных обстоятельствах происходило бы под действием системы комплемента реципиента.
[00228] Для целей, описанных в настоящей заявке, могут применяться аналоги компстатина, которые не связываются ковалентно с клетками. Например, может применяться аналог компстатина, модифицированный фрагментом, увеличивающим время жизни указанного соединения в организме и/или аналог компстатина, содержащий фрагмент, нацеливающий указанный аналог компстатина по отношению к типу клеток или к области, чувствительному(ой) к активации комплемента; настоящее изобретение охватывает такие варианты применения. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий как фрагмент, увеличивающий время жизни указанного соединения в организме, так и нацеливающий фрагмент. В тех случаях, когда ниже идет речь о клеточно-реактивном аналоге компстатина, в настоящем изобретении предложены аналогичные композиции и способы, относящиеся к аналогам компстатина нацеленного действия, а также (по крайней мере в аспектах, подразумевающих введение аналога компстатина субъекту) варианты реализации, отличающиеся тем, что аналог компстатина, не включающий нацеливающий фрагмент или клеточно-реактивный фрагмент, необязательно аналог компстатина длительного действия, применяют вместо клеточно-реактивного аналога компстатина или наряду с ним.
[00229] Определенные представляющие интерес варианты применения включают: (1) защиту эритроцитов (кКК) от опосредованного комплементом повреждения у индивидуумов с такими расстройствами, как пароксизмальная ночная гемоглобинурия или атипичный гемолитико-уремический синдром, или другими расстройствами, характеризующимися комплемент-опосредованным лизисом кКК; (2) защиту трансплантированных органов, тканей и клеток от комплемент-опосредованного повреждения; (3) уменьшение ишемического/реперфузионного (И/Р) повреждения (например, у индивидуумов, страдающих от травмы, обструкции сосудов, инфаркта миокарда, или в других ситуациях, при которых может происходить И/Р повреждение); и (4) защиту различных структур организма (например, сетчатки) или мембран (например, синовиальной мембраны), которые могут подвергаться действию компонентов комплемента, от комплемент-опосредованного повреждения при любом из разнообразных комплемент-опосредованных расстройств. Благоприятные эффекты подавления активации комплемента на поверхности клеток или других структур организма не ограничены обусловленными непосредственно защитой собственно указанных клеток или структур от прямого комплемент-опосредованного повреждения (например, предотвращением лизиса клеток). Так, подавление активации комплемента с применением клеточно-реактивного аналога компстатина может снижать синтез анафилатоксинов и в результате приток/активацию нейтрофилов и другие провоспалительные проявления, и/или снижать потенциально разрушительное высвобождение внутриклеточного содержимого, потенциально оказывая, таким образом, благоприятное действие на отдаленные системы органов или на весь организм.
[00230] А. Защита клеток крови
[00231] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина нацеленного действия на клетки и/или аналог компстатина ненацеленного действия (например, ненацеленный аналог компстатина длительного действия) применяют для защиты клеток крови от комплемент-опосредованного повреждения. Указанные клетки крови могут представлять собой любой клеточный компонент крови, например, эритроциты (красные клетки крови, кКК), лейкоциты (белые клетки крови, бКК) и/или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина клеточно-нацеленного действия нацелен на целевую молекулу, экспонируемую на поверхности клеток кКК, такую как гликофорин или белок полосы 3. С комплемент-опосредованным повреждением клеток крови связаны разнообразные расстройства. Такие расстройства могут развиваться в результате, например, дефицита или дефектов одного или более клеточного или растворимого СРБ у индивидуума, например, из-за (а) мутации(й) гена(ов), кодирующего(их) такие белки; (b) мутации(ий) в генах, необходимых для синтеза или нормального функционирования одного или более СРБ, и/или (с) присутствия аутоантител к одному или более СРБ. Комплемент-опосредованный лизис кКК может происходить в результате присутствия аутоантител к антигенам кКК, которые могут появляться в связи с разнообразными причинами (часто идиопатическими). У индивидуумов с такой(ими) мутацией(ями) в генах, кодирующих СРБ, и/или антителами против СРБ или против собственных кКК имеется повышенный риск расстройств, включающих комплемент-опосредованное повреждение кКК. У индивидуумов, перенесших один или более характерный для расстройства эпизод, имеется повышенный риск рецидива.
[00232] Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) представляет собой относительно редкое расстройство, включающее приобретенную гемолитическую анемию, характеризующуюся комплемент-опосредованным интраваскулярным гемолизом, гемоглобинурией, недостаточностью костного мозга и тромбофилией (склонностью к формированию тромбов). Она поражает примерно 16 индивидуумов на миллион по всему миру, встречается у представителей обоих полов и может возникнуть в любом возрасте, часто поражая молодых людей (Bessler, M. & Hiken, J., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 104-110 (2008); Hillmen, P. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 116-123 (2008)). ПНГ представляет собой хроническое истощающее заболевание с периодическими эпизодами острого гемолиза, приводящее к тяжелым клиническим проявлениям и сокращению продолжительности жизни. Помимо анемии, многие пациенты испытывают боли в животе, страдают от дисфагии, эректильной дисфункции и лёгочной гипертензии, у них имеется повышенный риск почечной недостаточности и тромбоэмболических осложнений.
[00233] ПНГ впервые была описана как отдельное явление в первом десятилетии XIX века, но только в 1950-х годах, после открытия альтернативного пути активации комплемента, была точно установлена причина гемолиза при ПНГ (Parker СJ. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an historical overview. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 93-103 (2008)). В норме CD55 и CD59 присоединены к клеточной мембране гликозилфосфатидилинозитольными (ГФИ) якорями (гликолипидными структурами, заякоривающими определенные белки на плазматической мембране). ПНГ возникает как последствие незлокачественной клональной экспансии гемопоэтической стволовой клетки(клеток), которая(ые) приобрела(и) соматическую мутацию в гене PIGA, кодирующем белок, вовлеченный в синтез ГФИ-якорей (Takeda J, et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-Α gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 73:703-711 (1993)). Потомки таких стволовых клеток дефицитны по ГФИ-заякоренным белкам, в том числе CD55 и CD59. Указанный дефект делает клетки чувствительными к комплемент-опосредованному лизису кКК. Для постановки диагноза часто применяют проточно-цитометрический анализ с применением антител к ГФИ-заякоренным белкам. Он позволяет обнаружить дефицит ГФИ-заякоренных белков на поверхности клетки, определить степень дефицита и долю пораженных клеток (Brodsky RA. Advances in the diagnosis and therapy of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood Rev. 22(2):65-74 (2008). Клетки кКК при ПНГ III типа полностью дефицитны по ГФИ-связанным белкам и высокочувствительны к комплементу, тогда как кКК при ПНГ II типа частично дефицитны и менее чувствительны. FLAER представляет собой флуоресцентно меченый неактивный вариант проаэролизина (бактериального токсина, который связывает ГФИ-якоря), и его все чаще используют вместе с проточной цитометрией для диагностики ПНГ. Отсутствие связывания Flaer с гранулоцитами является достаточным для диагностирования ПНГ. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина защищает кКК при ПНГ от отложения C3b.
[00234] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от атипичного гемолитического синдрома (аГУС). аГУС представляет собой хроническое расстройство, характеризующееся микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью, и обусловленное неадекватной активацией комплемента, часто по причине наличия мутаций в генах, кодирующих регуляторные белки комплемента (Warwicker, P., et al.. Kidney Int 53, 836-844 (1998); Kavanagh, D. & Goodship, T. Pediatr Nephrol 25, 2431-2442 (2010). Мутации в гене фактора комплемента H (CFH) являются наиболее частой генетической аномалией среди пациентов с аГУС, и 60-70% указанных пациентов умирает или достигает терминальной стадии почечной недостаточности в течение одного года после начала заболевания (Kavanagh & Goodship, выше.) Также описаны мутации фактора I, фактора В, C3, связанных с фактором H белков 1-5 и тромбомодулина. Другие причины аГУС включают наличие аутоантител против регуляторных белков комплемента, таких как CFH. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, у которого, как было установлено, имеется мутация фактора I, фактора В, C3, связанных с фактором H белков 1-5 или тромбомодулина, либо, как было установлено, присутствуют антитела против регуляторного белка комплемента, например, CFH.
[00235] Комплемент-опосредованный гемолиз наблюдается в разнородной группе других состояний, включающей аутоиммунные гемолитические анемии, вовлекающие антитела, которые связываются с кКК, и приводящие к комплемент-опосредованному гемолизу. Например, такой гемолиз может происходить при первичной хронической болезни Холодовых агглютининов и в ходе определенных реакций на лекарственные препараты и другие чужеродные вещества (Berentsen, S., et al., Hematology 12, 361-370 (2007); Rosse, W.F., Hillmen, P. & Schreiber, A.D. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 48-62 (2004)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина вводят субъекту, страдающему от хронической болезни холодовых агглютининов или субъекту, у которого имеется риск возникновения хронической болезни холодовых агглютининов. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина применяют для лечения субъекта, страдающего от HELLP-синдрома, или субъекта, у которого имеется риск возникновения HELLP-синдрома, который диагностируют по наличию гемолиза, повышенных уровней печеночных ферментов и низкому содержанию тромбоцитов, и который по меньшей мере у некоторых субъектов связан с мутациями регуляторного(ых) белка(ов) комплемента (Fakhouri, F., et al., 112: 4542-4545 (2008)).
2
2
[00236] Согласно другим вариантам реализации клеточно-реактивные аналоги компстатина применяют для защиты кКК или других клеточных компонентов крови, предназначенных для переливания субъекту. Некоторые примеры таких применений подробнее описаны ниже. Как уже отмечалось, аналоги компстатина нацеленного действия и/или длительного действия могут применяться в описанных выше способах подавления комплемент-опосредованного гемолиза и/или повреждения кКК. Согласно некоторым вариантам реализации для лечения ПНГ или аГУС применяют аналог компстатина длительного действия, содержащий фрагмент (СНСНO).
[00237] В. Трансплантация
[00238] Трансплантация представляет собой приобретающий все большее значение метод лечения, который обеспечивает способы замещения органов и тканей, поврежденных при травме, заболевании или других состояниях. Почки, печень, легкие, поджелудочная железа и сердце относятся к органам, которые могут быть успешно трансплантированы. Часто трансплантируемые ткани включают кости, хрящи, сухожилия, роговицу, кожу, клапаны сердца и кровеносные сосуды. Трансплантация панкреатического островка или островковых клеток представляет собой перспективный подход для лечения диабета, например, диабета I типа. Для целей настоящего изобретения орган, ткань или клетка (или популяция клеток), который(ая) предназначен(а) для трансплантации, трансплантируется или был(а) трансплантирован(а), может быть называться «трансплантат». Для целей настоящего изобретения переливание крови считается «трансплантацией».
[00239] При трансплантации трансплантат подвергается разнообразным разрушительным воздействиям и стимулам, которые могут вносить вклад в развитие дисфункции трансплантата и, потенциально, недостаточности трансплантата. Например, ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой распространенную и весомую причину заболеваемости и смертности для многих трансплантатов (в частности, солидных органов) и может быть главным фактором, определяющим вероятность выживания трансплантата. Отторжение трансплантата представляет собой один из основных рисков, связанных с трансплантацией между генетически отличными индивидуумами, и может приводить к недостаточности трансплантата и необходимости извлечения указанного трансплантата из тела реципиента.
[00240] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина с нацеленным действием на клетки и/или аналог компстатина длительного действия применяют для защиты трансплантата от комплемент-опосредованного повреждения. Аналог компстатина с нацеленным действием на клетки вступает в реакцию с клетками трансплантата, ковалентно присоединяется к нему и подавляет активацию комплемента. Аналог компстатина с нацеленным действием на клетки связывается с целевой молекулой в трансплантате (например, экспрессируемой эндотелиальными клетками или другими клетками трансплантата) и подавляет активацию комплемента. Целевая молекула может, например, представлять собой молекулу, экспрессия которой индуцируется или стимулируется таким стимулом, как повреждение или воспаление, молекулу, которая распознается как «несобственная» реципиентом, углеводный ксеноантиген, антитела против которого обычно имеются у людей, например, антиген группы крови, или ксеноантиген, например, молекулу, содержащую эпитоп альфа-Gal. Согласно некоторым вариантам реализации снижение активации комплемента может проявляться в виде снижения средних показателей отложения C4d в кровеносных сосудах трансплантатов, которые были приведены в контакт с аналогом компстатина, например, с клеточно-реактивным аналогом компстатина, по сравнению со средним уровнем отложения C4d в трансплантатах, которые не были приведены в контакт с аналогом компстатина (например, у субъектов с аналогичными трансплантатами, получающих другую аналогичную терапию).
[00241] Трансплантат может быть приведен в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия до, во время и/или после трансплантирования, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения. Например, перед трансплантацией трансплантат, извлеченный из тела донора, может быть приведен в контакт с жидкостью, содержащей клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Например, указанный трансплантат может быть погружен в указанный раствор и/или перфузирован указанным раствором. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят донору перед извлечением трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят реципиенту во время и/или после введения трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный компстатин, аналог длительного действия или нацеленного действия вводят местно в трансплантированный трансплантат. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина вводят системно, например, внутривенно.

[00242] В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) выделенный трансплантат и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция дополнительно содержит жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт (например, подходящий для ополаскивания, промывания, погружения, перфузии, поддержания или хранения) с трансплантатом (например, органом), в частности, выделенным трансплантатом, извлеченным из тела донора и предназначенным для трансплантирования реципиенту. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт с трансплантатом (например, органом); и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанный жидкий раствор может представлять собой любой жидкий раствор, физиологически приемлемый для данного трансплантата (например, подходящий осмотический состав, не цитотоксичный), медицински приемлемый с учетом последующего введения трансплантата реципиенту (например, предпочтительно стерильный или по меньшей мере не содержащий неприемлемых количеств микроорганизмов или других загрязняющих примесей) и совместимый с клеточно-реактивным аналогом компстатина (т.е. не устраняющий реакционную способность указанного аналога компстатина), или совместимый с аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации раствор представляет собой любой известный в данной области техники раствор, предназначенный для любых таких целей. Согласно некоторым вариантам реализации жидкий раствор представляет собой раствор Маршалла, или гиперосмолярный цитратный раствор (Soltran, Baxter Healthcare), раствор Университета Висконсина в Мэдисоне (UW) (ViaSpan™, Bristol Myers Squibb), раствор гистидин-триптофан-кетоглутарат (НТК) (Custodial, Kohler Medical Limited), EuroCollins (Fresenius) и Celsior (Sangstat Medical), Polysol, IGL-1 или AQIX RS-1. Разумеется, могут применяться другие растворы, относящиеся к физиологически приемлемым композициям, например, содержащие эквивалентные или сходные ингредиенты в тех же или в других концентрациях. Согласно некоторым вариантам реализации раствор не содержит ингредиента(ов), с которым(и) указанный клеточно-реактивный аналог компстатина предположительно будет активно вступать в реакцию, и любой раствор может быть модифицирован так, чтобы не содержать таких ингредиентов, или может быть получен без таких ингредиентов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный клеточно-реактивный аналог компстатина присутствует в трансплантат-совместимом растворе в концентрации, например, от 0,01 мг/мл до 100 мг/мл, или может быть добавлен к указанному раствору для получения такой концентрации.
[00243] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен набор, содержащий: (а) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия; и (b) трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может быть представлен твердой формой (например, порошком) или раствором, в по меньшей мере частично растворенной форме. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и/или трансплантат-совместимый раствор представлены в заранее установленных количествах, таким образом, что при их сочетании образуется раствор, содержащий указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, с подходящей концентрацией для приведения в контакт с трансплантатом. Во многих вариантах реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты находятся в отдельных емкостях, входящих в набор. Согласно некоторым вариантам реализации и клеточно-реактивный аналог компстатина, и компоненты трансплантат-совместимого раствора представлены твердой формой (например, порошком), в отдельных емкостях или в виде смеси. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор содержит инструкции по применению, например, инструкции по добавлению клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в трансплантат-совместимый раствор и/или инструкции по приведению трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Указанный набор необязательно содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль продуктов, применяемых для трансплантации, клеточной терапии и/или переливания крови.
[00244] В настоящем изобретении также предложен способ ковалентного связывания аналога компстатина с выделенным трансплантатом, включающий контакт указанного выделенного трансплантата с клеточно-реактивным аналогом компстатина. В настоящем изобретении также предложен выделенный трансплантат, к которому ковалентно присоединен аналог компстатина. Как правило, к указанному выделенному трансплантату присоединено множество молекул аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит солидный орган, такой как почка, печень, легкое, поджелудочная железа или сердце. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит кость, хрящ, фасцию, сухожилие, связки, роговицу, склеру, перикард, кожу, сердечный клапан, кровеносный сосуд, амниотическую мембрану или твердую мозговую оболочку. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит несколько органов, например, трансплантат сердца-легкого или поджелудочной железы-почки. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат включает орган или ткань не полностью. В частности, трансплантат может содержать часть органа или ткани, например, долю печени, участок кровеносного сосуда, лоскут кожи или сердечный клапан. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит препарат, содержащий выделенные клетки или фрагменты ткани, извлеченные из исходной ткани, но сохраняющие по меньшей мере отчасти архитектуру ткани, например, панкреатические островки. Согласно некоторым вариантам реализации препарат содержит выделенные клетки, не связанные друг с другом соединительной тканью, например, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные из периферической и/или пуповинной крови, либо цельную кровь или любой содержащий клетки продукт крови, например, эритроциты (кКК) или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат получен от скончавшегося донора (например, после смерти мозга (DBD-донор) или после сердечной смерти). Согласно некоторым вариантам реализации, в зависимости от конкретного типа трансплантата, трансплантат получают от живого донора. Например, почки, участки печени, клетки крови относятся к типам трансплантатов, которые часто получают от живого донора без чрезмерного риска для указанного донора и в соответствии с разумной медицинской практикой.
[00245] Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой ксенотрансплантат (т.е. донор и реципиент принадлежат к разным видам). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой аутотрансплантат (т.е. трансплантат, переносимый из одной части тела в другую часть тела одного и того же индивидуума). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой изотрансплантат (т.е. донор и реципиент генетически идентичны). Согласно большинству вариантов реализации указанный трансплантат представляет собой аллотрансплантат (т.е. донор и реципиент являются генетически неидентичными представителями одного вида). В случае аллотрансплантата донор и реципиент могут либо быть, либо не быть генетически связаны (например, они могут быть членами одной семьи). Как правило, донор и реципиент совместимы по группе крови (по меньшей мере совместимы в системе ABO и необязательно - в системах Rh, Kell и/или в других системах антигенной совместимости клеток крови). Кровь реципиента может подвергаться скринингу на аллогенные антитела к трансплантату и/или реципиенту и донору, так как присутствие таких антител может приводить к сверхострому отторжению (т.е. отторжению, начинающемуся практически немедленно, например, в течение нескольких минут после начала контакта трансплантата с кровью реципиента). Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) может применяться для скрининга сыворотки субъекта на анти-HLA антитела. Сыворотку инкубируют с панелью лимфоцитов с известным HLA-фенотипом. Если сыворотка содержит антитела против молекул HLA на клетках-мишенях, происходит гибель клетки в результате комплемент-опосредованного лизиса. Использование отобранной панели клеток-мишени позволяет определить специфичность обнаруженного антитела. Другие техники, подходящие для определения присутствия или отсутствия анти-HLA антител и, необязательно, определения их HLA-специфичности, включают ИФА ELISA, проточно-цитометрический анализ, технологии на основе микрогранул (например, технологию Luminex). Методология проведения указанных анализов общеизвестна, и существуют разнообразные коммерчески доступные наборы для их проведения.
[00246] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия подавляет комплемент-опосредованное отторжение. Например, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия подавляет сверхострое отторжение. Сверхострое отторжение обусловлено по меньшей мере частично антитело-опосредованной активацией системы комплемента у реципиента через классический путь и, в результате, отложением МАК на трансплантате. Это, как правило, происходит из-за уже присутствующих у реципиента антител, которые вступают в реакцию с трансплантатом. Хотя и желательно попытаться избежать сверхострого отторжения до трансплантации, обеспечив подбор совместимого трансплантата, это не всегда возможно, например, ввиду ограниченности времени и/или ресурсов. Кроме того, у некоторых реципиентов (например, у индивидуумов после неоднократного переливания, у индивидуумов, ранее получавших трансплантаты, у женщин после нескольких беременностей) может уже существовать такое значительное количество антител, в том числе, потенциально, антител к антигенам, проверку на которые обычно не проводят, что своевременно подобрать гарантированно совместимый трансплантат может быть трудно или даже практически невозможно. У таких индивидуумов имеется повышенный риск сверхострого отторжения.
[00247] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия подавляет острое отторжение или недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «острое отторжение» относится к отторжению, возникающему по меньшей мере через 24 часа, обычно по меньшей мере через несколько дней - неделю после трансплантации, и до 6 месяцев после трансплантации. Острое антитело-опосредованное отторжение (АОО) часто включает резкое повышение уровня донор-специфических аллоантител (ДСА) в течение нескольких первых недель после трансплантации. Без связи с конкретной теорией, возможно, что уже существующие клетки плазмы и/или конверсия В-клеток памяти в новые клетки плазмы играют определенную роль в повышении синтеза ДСА. Такие антитела могут вызывать комплемент-опосредованное повреждение трансплантата, которое может быть подавлено путем приведения указанного трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Без связи с конкретной теорией, подавление активации комплемента в трансплантате может уменьшать лейкоцитарную инфильтрацию (например, нейтрофилами), также вносящую вклад в острую недостаточность трансплантата.
[00248] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия подавляет комплемент-опосредованное И/Р повреждение трансплантата. Согласно более подробному описанию, приведенному ниже, И/Р повреждение может происходить при реперфузии ткани, поступление крови в которую временно прерывалось, как это происходит в трансплантируемых органах. Уменьшение И/Р повреждения снижает вероятность наступления острой дисфункции трансплантата или снижает ее тяжесть, и уменьшает вероятность развития острой недостаточности трансплантата.
[00249] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия подавляет хроническое отторжение и/или хроническую недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «хроническое отторжение или недостаточность трансплантата» относится к отторжению или недостаточности, наступающему(ей) по меньшей мере через 6 месяцев после трансплантации, например, через 6 месяцев - 1, 2, 3, 4, 5 лет, или более, после трансплантации, часто через месяцы или годы нормального функционирования трансплантата. Это обусловлено хроническим воспалительным и иммунным ответом против указанного трансплантата. Для целей настоящего изобретения хроническое отторжение может включать хроническую васкулопатию аллотрансплантата - этот термин применяют для обозначения фиброза внутренних кровеносных сосудов трансплантированной ткани. Так как за счет программ иммуносупрессивной терапии частота развития острого отторжения была снижена, все более значимым в качестве причины дисфункции и недостаточности трансплантатов становится хроническое отторжение. Появляется все больше доказательств того, что синтез аллоантител В-клетками является важным элементом возникновения хронического отторжения и недостаточности трансплантатов (Kwun J. and Knechtle S J, Transplantation, 88(8):955-61 (2009). Более ранее повреждение трансплантата может представлять собой способствующий фактор, приводящий к хроническим процессам, таким как фиброз, которые могут приводить, в конечном счете, к хроническому отторжению. Таким образом, подавление такого раннего повреждения с помощью применения клеточно-реактивного аналога компстатина может задерживать и/или снижать вероятность наступления или тяжесть хронического отторжения трансплантата.
[00250] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия вводят реципиенту трансплантата для подавления отторжения трансплантата и/или недостаточности трансплантата.
[00251] С. Ишемическое/реперфузионное повреждение
[00252] Ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой важную причину повреждения тканей после травм и при других условиях, связанных с временным прекращением кровотока, например, при инфаркте миокарда, инсульте, тяжелой инфекции, заболевании сосудов, реконструкции при аневризме, сердечно-легочном шунтировании и трансплантации.
[00253] При травме системная гипоксемия, гипотензия и локальное прерывание кровоснабжения в результате ушибов, синдрома сдавливания и повреждения сосудов приводят к ишемии, повреждающей метаболически активные ткани. Восстановление кровоснабжения запускает интенсивную системную воспалительную реакцию, часто более пагубную, чем собственно ишемия. После реперфузии области ишемии синтезируемые и высвобождающиеся местно факторы попадают в систему кровообращения и достигают отдаленных областей, иногда вызывая значительные повреждения органов, не затронутых изначальным ишемическим инсультом, например, легких и кишечника, приводя к дисфункции одного органа и к мультиорганной дисфункции. Активация комплемента происходит вскоре после реперфузии и представляет собой ключевой посредник пост-ишемического повреждения, действующий как прямо, так и опосредованно через хемоаттрактивные и стимулирующие эффекты на нейтрофилы. Все три основных пути комплемента активируются и, функционируя совместно или независимо, включаются в связанные с И/Р нежелательные явления, затрагивающие многие системы органов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, незадолго до этого (например, на протяжении предшествующих 2, 4, 8, 12, 24 или 48 часов) перенесшему травму, например, травму, приводящую к возникновению риска И/Р повреждения у указанного субъекта, например, из-за системной гипоксемии, гипотензии и/или локального прерывания кровоснабжения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может вводиться интраваскулярно, необязательно в кровеносный сосуд, через который кровь поступает в поврежденную часть тела, либо непосредственно в указанную часть тела. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от повреждения спинного мозга, травматического повреждения головного мозга, ожога и/или геморрагического шока.
[00254] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту до, во время или после хирургической процедуры, например, хирургической процедуры, которая, как ожидается, временно приостановит поступление крови в ткань, орган или часть тела. Примеры таких процедур включают сердечно-легочное шунтирование, ангиопластику, восстановление/замену клапана сердца, реконструкцию при аневризме или другие хирургические операции на сосудах. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может вводиться до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с хирургической процедурой.
[00255] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, перенесшему ИМ, тромбоэмболический инсульт, тромбоз глубоких вен или эмболию легких. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может вводиться в комбинации с трохмболитическим агентом, таким как тканевый активатор плазминогена (tPA) (например, альтеплазой (активазой), ретеплазой (ретавазой), тенектеплазой (TNK-азой)), анистреплазой (эминазой), стрептокиназой (кабикиназой, стрептазой) или урокиназой (аббокиназой). Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может вводиться до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с периодом введения тромболитического агента.
[00256] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту для лечения И/Р повреждения.
[00257] D. Другие комплемент-опосредованные расстройства
[00258] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в глаз для лечения глазного расстройства, такого как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома или увеит. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен в стекловидную полость (например, посредством интравитреальной инъекции) для лечения субъекта, страдающего от ВМД, или субъекта, у которого имеется риск возникновения ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в переднюю камеру, например, для лечения переднего увеита.
[00259] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от аутоиммунного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения аутоиммунного заболевания, например, аутоиммунного заболевания, опосредованного по меньшей мере частично антителами против одного или более собственного антигена.
[00260] Клеточно-реактивные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или аналоги компстатина нацеленного действия могут вводиться в синовиальную полость, например, субъекту, страдающему от артрита (например, ревматоидный артрит). Разумеется, они могут вводиться системно дополнительно или
[00261] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от внутримозгового кровоизлияния, или субъекта, у которого имеется риск возникновения внутримозгового кровоизлияния.
[00262] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от миастении гравис, или субъекта, у которого имеется риск возникновения миастении гравис.
[00263] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейромиелита зрительного нерва (NMO/НЗН), или субъекта, у которого имеется риск возникновения НЗН.
[00264] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита (МПГН), или субъекта, у которого имеется риск возникновения МПГН, например, МПГН I типа, МПГН II типа или МПГН III типа.
[00265] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейродегенеративного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения нейродегенеративного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейропатической боли, или субъекта, у которого имеется риск развития нейропатической боли. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от риносинусита или назального полипоза или субъекта, у которого имеется риск возникновения риносинусита или назального полипоза. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от рака, или субъекта, у которого имеется риск возникновения рака. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от сепсиса, или субъекта, у которого имеется риск возникновения сепсиса. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от респираторного дистресс-синдрома взрослых, или субъекта, у которого имеется риск возникновения респираторного дистресс-синдрома взрослых.
[00266] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от анафилаксии или инфузионной реакции, или субъекта, у которого имеется риск возникновения анафилаксии или инфузионной реакции. Например, согласно некоторым вариантам реализации субъект может получать предварительное лечение до, во время или после получения лекарственного средства или основы, которые могут вызывать анафилаксию или инфузионную реакцию. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, у которого имеется риск возникновения анафилаксии, или субъект, страдающий от анафилактической реакции на пищевой продукт (например, арахис, моллюски или другие пищевые аллергены), укус насекомого (например, пчелы, осы), получает лечение клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия.
[00267] Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения, быть введен местно или системно.
[00268] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения респираторного заболевания, например, астмы или хронического обструктивного заболевания легких (ХОБЛ). Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может вводиться в дыхательные пути ингаляционным путем, например, в виде сухого порошка или распылением, или может вводиться путем инъецирования, например, внутривенно, согласно различным вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения тяжелой астмы, например, астмы, которая недостаточно контролируется бронходилататорами и /или ингаляционными кортикостероидами.
[00269] IX. Композиции и введение
[00270] В настоящем изобретении предложены разнообразные композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно различным вариантам реализации композиция может обладать любым свойством или комбинацией свойств, описанных в настоящей заявке, при условии, что они не являются взаимоисключающими. В настоящем изобретении предложены варианты реализации таких композиций и способы их применения, отличающиеся тем, что указанный аналог компстатина представляет собой любой аналог компстатина.
[00271] Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит очищенный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Очистка может осуществляться с применением разнообразных способов, которые специалист в данной области техники может выбрать, опираясь на требуемую степень чистоты различных компонентов, присутствующих в указанной композиции перед очисткой. Например, может применяться фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматография и/или другие способы и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%), 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция состоит или по существу состоит из клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия.
[00272] Согласно некоторым вариантам реализации композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, и соединение, содержащее клеточно-реактивную функциональную группу, характеризуются тем, что отношение клеточно-реактивного аналога компстатина к соединению, содержащему клеточно-реактивную функциональную группу, в пересчете на моли составляет по меньшей мере 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1,000:1 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина длительного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации масса представляет собой сухую массу.
[00273] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанной композиции фармацевтического класса согласно различным вариантам реализации может быть свойственна любая из вышеперечисленных характеристик в отношении чистоты. Указанная композиция фармацевтического класса в достаточной степени свободна от эндотоксинов, тяжелых металлов и неидентифицированных и/или охарактеризованных веществ, чтобы быть приемлемой, без дополнительной очистки, для применения в качестве фармацевтической композиции, подходящей для введения субъекту-человеку или для получения фармацевтической композиции для введения субъекту-человеку. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция фармацевтического класса является стерильной.
[00274] Подходящие составы, например, по существу чистые составы клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или аналога компстатина нацеленного действия или другого активного агента, могут быть скомбинированы с фармацевтически приемлемыми носителями или основами и т.п. для получения подходящей фармацевтической композиции. Термин «фармацевтически приемлемый носитель или основа» относится к нетоксичному(ой) носителю или основу, не устраняющему(ей) фармакологическую активность указанного соединения, вместе с которым он(а) входит в состав. Специалисту в данной области техники будет понятно, что носитель или основа «нетоксичен/нетоксична», если он(а) совместим(а) с введением субъекту в количестве, подходящем для доставки соединения, без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители или носители, которые могут применяться в композициях согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены перечисленными, воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор ацетата натрия или ацетата калия, 5% декстрозу и т.п. Указанная композиция может включать другие компоненты, подходящие для нужного состава, например, соответствующие описанию в настоящей заявке. Дополнительные активные соединения, например, соединения, независимо подходящие для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного расстройства, могут также быть включены в указанные композиции. В настоящем изобретении предложены такие фармацевтические композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и, необязательно, второй активный агент, подходящий для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного расстройства.
[00275] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтически приемлемая композиция, подходящая для введения человеку, упаковка которой содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль фармацевтических агентов, например, Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA). Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен(а) фармацевтический(ая) набор или упаковка, содержащий(ая): (а) фармацевтически приемлемый клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия в твердой форме; (b) фармацевтически приемлемый носитель или основу. Указанный(ая) набор или упаковка необязательно содержит инструкции относительно растворения в носителе клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации предложен фармацевтический набор или упаковка. Указанная(ый) упаковка или набор содержит количество фармацевтической композиции, достаточное по меньшей мере для однократного дозирования, например, содержит от 1 до 200 доз, либо любое промежуточное количество или субдиапазон доз. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая(ий) упаковка или набор содержит одну или более иглу и, необязательно, один или более шприц. Согласно некоторым вариантам реализации предложен по меньшей мере один предварительно заправленный шприц. Согласно некоторым вариантам реализации предложена(ы) одна или более единичная лекарственная форма или заранее отмеренные аликвоты. Согласно некоторым вариантам реализации предложены инструкции по введению, которые, согласно некоторым вариантам реализации, включают инструкции для самостоятельного введения.
[00276] Фармацевтическая композиция может вводиться субъекту любым подходящим путем, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, внутривенно, внутримышечно, подкожно, ингаляционным путем, назально, интратекально, интракраниально, интраартериально, перорально, ректально, трансдермально, внутрикожно, подкожно и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят интраартериально. Указанная композиция может вводиться местно, либо в сосудистую систему, снабжающую орган или ткань, либо экстраваскулярно поблизости от органа или ткани. Следует понимать, что термин «введение» охватывает непосредственно введение соединения или композиции субъекту, инструктирование третьих лиц для введения соединения или композиции субъекту, назначение или предложение соединения или композиции субъекту (например, для самостоятельного введения), самостоятельное введение и, в соответствующих случаях, другие способы предоставления соединения или композиции субъекту.
[00277] Фармацевтические композиции, подходящие для инъецирования (например, для внутривенного введения) или введения через помпу или катетер, как правило, включают стерильные водные растворы (для водорастворимых композиций) или дисперсии, и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Стерильные растворы могут быть получены введением указанного соединения в нужном количестве в подходящий растворитель, необязательно с одним ингредиентом или с комбинацией ингредиентов, таких как буферы, например, ацетаты, цитраты, лактаты или фосфаты; агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и другие подходящие ингредиенты и т.п., по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Специалистам в данной области техники известны многие физиологически приемлемые соединения, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию. Другие подходящие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза; декстраны; аминокислоты, такие как глицин; полиолы, например, маннит. Указанные соединения могут, например, служить в качестве наполнителей и/или стабилизаторов, например, для порошка, и/или если в процесс получения или хранения входит лиофилизация. Поверхностно-активное(ые) вещество(а), например, Tween-80, Pluronic-F108/F68, дезоксихолевая кислота, фосфатидилхолин и т.п., может(гут) быть включены в композицию, например, для улучшения растворимости или получения микроэмульсии для доставки гидрофобных лекарственных средств. Значение pH при необходимости может быть скорректировано с помощью кислот или оснований, например, соляной кислоты или гидроксида натрия. Состав для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или инфузионные мешки, либо в многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительно растворы для инъекций являются стерильными и не содержат неприемлемых количеств эндотоксина.
[00278] Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие подходящие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способы получения могут включать вакуумную и сублимационную сушку, позволяющие получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный нужный ингредиент, например, из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.
[00279] Согласно определенным вариантам реализации может применяться пероральное введение. Композиции для перорального введения обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть введено в состав со вспомогательными веществами и применяться в форме таблеток, пастилок или капсул, например, желатиновых капсул. В состав композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы. Указанные таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов, либо соединения сходной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, агент для улучшения распадаемости, такой как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматический агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Перорально может также вводиться жидкая композиция. Составы для пероральной доставки могут содержать агенты для повышения стабильности в желудочно-кишечном тракте и/или для усиления абсорбции.
[00280] При введении ингаляционным путем аналог компстатина может вводиться в форме спрей-аэрозоля из емкости под давлением или диспенсера, содержащего подходящее распыляющее вещество, например, газ, такой как углекислый газ. Может применяться дозирующий ингалятор или распылитель. Аэрозоль может содержать жидкие частицы или сухой аэрозоль (например, сухие порошки, крупные пористые частицы и т.п.).
[00281] Для местного нанесения аналог компстатина может быть получен в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспензированный или растворенный в одном или более носителе. Носители для местного нанесения включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. Как вариант, фармацевтически приемлемые композиции могут быть получены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего аналог компстатина, суспензированный или растворенный в одном или более фармацевтически приемлемом носителе. Подходящие носители включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, сорбитмоностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.
[00282] Системное введение может также осуществляться трансмукозально или трансдермально. Для трансмукозального или трансдермального введения в указанном составе могут применяться пенетранты, подходящие для проникновения через такой барьер. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники и включают, например, для трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли жёлчных кислот и производные фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может осуществляться, например, посредством применения назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения, как правило, вводят в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, общеизвестных в данной области техники.
[00283] Указанные соединения могут также быть получены в форме суппозиториев (например, на стандартных основах для суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.
[00284] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина или другое активное соединение вводят в состав с носителями, которые защищают указанное соединение от быстрого выведения из организма, например, в составы с контролируемым высвобождением, такие как имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Например, аналог компстатина может быть включен в состав или инкапсулирован в составе с микрочастицами или наночастицами. Могут применяться биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, полимеры простых эфиров, полимолочная кислота, ПМГК и т.п. Липосомы или другие частицы на основе липидов могут применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии с известными специалистам в данной области техники способам, например, согласно описанию в патенте США №4522811 и/или других источников, ссылки на которые приведены в настоящей заявке. Могут применяться составы-депо, содержащие аналог компстатина. Указанный аналог компстатина высвобождается из депо на протяжении периода времени, например, так, чтобы обеспечить терапевтическую концентрацию на протяжении более длительного периода времени, чем при внутривенном введении соединения. Специалисту в данной области техники будет понятно, что для получения состава с контролируемым высвобождением, имплантата и т.п. необходимо выбирать материалы и способы, позволяющие сохранить активность указанного соединения.
[00285] Следует иметь в виду, что аналог компстатина и/или дополнительный(ые) активный(ые) агент(ы) могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислых солей включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гликолат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Также фармацевтически приемлемые соли могут быть при необходимости получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, в зависимости от свойств активного агента.
[00286] Следует понимать, что упоминаемые в настоящей заявке фармацевтически приемлемые носители, соединения и способы получения приводятся в качестве примеров и являются неограничивающими. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21st Edition. Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005 для ознакомления с дополнительным описанием фармацевтически приемлемых соединений и способов получения фармацевтических композиций различных видов.
[00287] Фармацевтическая композиция может вводиться в количестве, эффективном для достижения требуемого благоприятного эффекта. Согласно некоторым вариантам реализации эффективного количества достаточно для обеспечения одного или более из следующих полезных свойств:
[00288] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят парентерально. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят посредством внутривенной инъекции. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса или в/в инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в капельного вливания. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса с последующей в/в инфузией или в/в капельным вливанием. Согласно некоторым вариантам реализации в/в инфузию проводят на протяжении примерно 1, 2, 3, 4, 5, 15, 20, 30, 60 или 120 минут. Согласно некоторым вариантам реализации в/в капельное вливание проводят на протяжении более чем примерно 60 минут, например, на протяжении примерно 1, 2, 3 или более часов. Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 2,000 мг/кг/день, например, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 1,000 мг/кг/день, например, от примерно 5 мг/кг/день до примерно 500 мг/кг/день. Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от примерно 10 мг/кг/день до примерно 100 мг/кг/день, например, от примерно 10 мг/кг/день до примерно 50 мг/кг/день например, от примерно 10 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день. Следует иметь в виду, что введение нужного общего суточного количества может осуществляться реализацией разнообразных режимов дозирования. Например, нужное количество аналога компстатина может быть введено при однократном введении или при многократном введении, например, в течение 24-часового периода. Например, субъект может получать две или более дозы на протяжении 24-часового периода, и указанные дозы могут вводиться за одинаковые периоды времени или за разные периоды времени. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят с интервалами более 24 часов. Например, согласно различным вариантам реализации дозы могут вводиться в среднем через день, каждые 3-4 дней, еженедельно, раз в две недели и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации ковалентно присоединенные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия защищают клетки, ткани, органы, на протяжении периода недель или месяцев без необходимости повторения лечения. Например, субъекты могут получать поддерживающее повторное лечение с интервалами 1-2 недели, 2-4 недели, 4-6 недель, 6-8 недель или даже реже. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере некоторые дозы вводят подкожно. Например, согласно некоторым вариантам реализации предусматривается введение приблизительно 0,1-5 мг/кг/день, например, примерно 0,5-2 мг/кг/день; например, в объеме, равном приблизительно 0,25 мл - 2 мл, например, в объеме, составляющем примерно 1 мл. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация составляет примерно 50 мг/мл - примерно 300 мг/мл, например, примерно 50 мг/мл - примерно 100 мг/мл или примерно 100 мг/мл - примерно 200 мг/мл. Согласно некоторым вариантам реализации введение осуществляется ежедневно. Согласно некоторым вариантам реализации для доставки аналогичных количеств соединения применяют внутримышечное введение. Следует понимать, что может присутствовать начальная стадия лечения, на протяжении которой лечение проводят чаще и/или вводят более высокие дозы. Например, субъекту с ПНГ или аГУС может потребоваться введение нескольких доз для обеспечения защиты существенной части кКК указанного субъекта. После этого могут вводиться более низкие дозы и/или дозирование может быть менее частым, например, для защиты вновь образующихся кКК и/или для поддержания защиты существующих кКК. Разумеется, сходные методы могут в подходящих случаях применяться для лечения любого заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации лечение начинают с в/в введения, а затем переходят к подкожному, внутримышечному или внутрикожному введению для поддерживающей терапии. В зависимости от заболевания лечение может продолжаться с интервалами, например, на протяжении месяцев, лет или неограниченного периода времени. Подходящие дозы и режим дозирования зависят по меньшей мере частично от эффективности и времени полужизни указанного аналога компстатина (или другого активного агента), и могут необязательно корректироваться для конкретного реципиента, например, посредством введения повышающихся доз до достижения нужного заранее известного отклика, например, требуемой степени подавления комплемента и/или защиты клеток. При необходимости, конкретный уровень дозы для любого конкретного субъекта может быть по крайней мере отчасти выбран на основании разнообразных факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, конкретное состояние, лечение которого проводится, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, маршрут введения, скорость выведения, комбинирование с любым лекарственным средством и/или выраженность экспрессии или активности белка комплемента, измеренная в одном или более образце, полученном от указанного субъекта.
[00289] Настоящее изобретение охватывает введение аналога компстатина в комбинации с дополнительной терапией. Такая дополнительные терапия может включать введение любого(ых) агента(ов) из используемых данной области техники или потенциально подходящих для лечения субъекта, страдающего от указанного заболевания.
[00290] Если два или более терапевтических средства (например, соединения или композиции) применяют или вводят «в комбинации» друг с другом, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения они могут вводиться в одно время, на протяжении частично совпадающих периодов времени или последовательно (например, могут быть разделены во времени периодом протяженностью до 2 недель). Они могут вводиться одним и тем же путем либо разными путями. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят с интервалом не более 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина может вводиться до или после введения дополнительного(ых) соединения(ий), например, достаточно близко во времени, так что указанный аналог компстатина и дополнительное(ые) соединение(ия) присутствует(ют) в подходящих количествах в организме по меньшей мере однажды. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят достаточно близко во времени, так что не более чем 90% ранее введенной композиции метаболизируется до неактивных метаболитов или устраняется, например, выведением из организма, к моменту введения второго соединения или композиции.
[00291] Согласно некоторым вариантам реализации вводят композицию, включающую и клеточно-реактивный аналог компстатина, и дополнительные соединение(ия).
[00292] Пример 1: Получение пегилированных аналогов компстатина, по существу сохраняющих комплемент-подавляющую активность
[00293] Аналог компстатина с последовательностью аминокислот аналога компстатина SEQ ID NO: 28, но содержащий фрагмент AEEAc-Lys, расположенный в направлении С-конца от остатка Thr последовательности SEQ ID NO: 28 для последующего конъюгирования активированным сложным NHS-эфиром ПЭГ с аминогруппой боковой цепи Lys. Указанное соединение синтезировали с применением стандартных способов. Вкратце, аминокислоты (включая АЕЕАс) получали в виде Fmoc-защищенных аминокислот, отличающихся тем, что α-аминогруппу каждой аминокислоты защищают с помощью Fmoc. Функциональные группы боковых цепей также блокировали различными подходящими защитными группами. Синтез осуществляли твердофазным методом, описанным у Merrifield (J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)). Цепи собирали на твердой фазе, по завершении которой N-конец ацетилировали; затем пептид отщепляли от твердой фазы, одновременно снимали защиту ацидолизом с применением TFA, и амидировали. Линейный пептид затем окисляли и очищали. Полученный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 51), сокращенно CA28-AEEАс-Lys. Отметим, что для краткости N-концевая ацетильная группа и С-концевые аминогруппы в аббревиатуре не указаны. Монофункциональный линейный активированный сложный NHS-эфир ПЭГ с молекулярными массами 30 кДа и 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. № SUNBRIGHT ME-400GS), соответственно, соединяли с боковыми цепями лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующих аналогов компстатина длительного действия: CA28-AEEAc-Lys-(ПЭГ30k) и CA28-AEEAc-Lys-(ПЭГ40k), и очищали. Отметим, что число после термина «ПЭГ» и перед буквой «k» представляет собой молекулярную массу указанного фрагмент ПЭГ в килодальтонах, и «k» представляет собой сокращение от «кДа»). CA28-AEEAc-Lys-(ПЭГ30k) также называют CA28-1. CA28-AEEAc-Lys-ПЭГ40k) также называют CA28-2.
[00294] Ингибирующую активность синтезированных соединений оценивали посредством изменения эффекта указанных соединений на активацию комплемента классическим путем с применением стандартного анализа подавления комплемента. В указанном протоколе измеряют отложение C3b в формате ELISA. Отложение C3b, мониторинг которого проводят указанным способом, опосредовано активированным классическим путем комплементом. Вкратце, 96-луночные планшеты покрывают БСА. Добавляют плазму человека, куриный овальбумин (OVA), поликлональные анти-OVA антитела и тестируемое соединение (называемое «лекарственным средством»), инкубируют, а затем добавляют HRP-конъюгированное антитело против C3 человека. После дополнительного инкубирования добавляют субстрат и регистрируют сигнал. Детальная информация о протоколе приведена ниже.
[00295] Протокол анализа подавления классического пути комплемента
Материалы:
- 96-луночный планшет (полистироловый планшет, Thermo Scientific, 9205)
- Куриный овальбумин (Sigma A5503-5G)
- Антитело кролика против куриного овальбумина (Abeam ab 1221)
- Блокирующий буфер (буфер Startingblock, Thermo Scientific 37538)
- Вероналовый буфер (концентрация 5Х, Lonza 12-624Е)
- Плазма человека (собранная с добавлением лепирудина с конечной концентрацией 50 мкг/мл)
- HRP-конъюгированное козье антитело против C3 человека, (MP Biomedicals, 55237)
- Отмывочный буфер Tween-20 (0,05% Tween 20-ФСБ буфер)
- ТМБ (Субстрат пероксидазы, BD 555214) - 1:1 смесь BD 51-2607КС и 51-2606КС.
2
4
- 1M HSO
Протокол:
1. Добавить 100 мкл/лунку 1% куриного овальбумина (в ФСБ)
2. Инкубировать в течение ночи при 4°C или комнатной температуре в течение 1-2 ч.
3. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету.
4. Блокировать добавлением 200 мкл блокирующего буфера
5. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре
6. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету
7. Добавить 100 мкл поликлонального антитела против куриного овальбумина в разведении 1:1000 в блокирующем буфере
8. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре
9. Дважды промыть отмывочным буфером
++
10. Добавить по 50 мкл VB в лунки №2-12
++
11. Добавить 100 мкл лекарственного средства в начальном разведении (2Х в VB) в лунку 1.
12. Приготовить серийные разведения (1:2) указанного лекарственного средства из лунок 1-10 следующим образом:
a. Взять 50 мкл раствора из исходной лунки
b. Добавить указанный раствор в следующую лунку
c. Перемешать многократным пипетированием
d. Повторять до лунки №10
Примечание: из лунки №10 удалить 50 мкл и утилизировать.
13. Добавить 50 мкл плазмы в разведении 2Х (разведение 1:37,5 исходной плазмы) в лунки 1-11
14. Инкубировать в течение 1 часа
15. Промыть отмывочным буфером
16. Добавить 100 мкл HRP-антитела против C3 в разведении 1/1000 в блокирующем буфере
17. Инкубировать в течение 1 часа
18. Промыть отмывочным буфером
19. Добавить по 100 мкл ТМБ во все лунки
20. Инкубировать в течение 5-10 мин в темноте
2
4
21. Добавить 50 мкл 1M HSO
22. Произвести считывание планшета на 450 нм
++
VB
Формула:
Барбитал
5 мМ
NaCl
72,5 мМ
MgCl<sub>2</sub>
0,5 мМ
CaСl<sub>2</sub>
0,15 мМ
PH
7,4
Исходные растворы:
Для получения 50 мл рабочего буфера:
- Взвесить 210 мг NaCl
- Добавить 10мл 5Х VB
2
- Добавить 100 мкл CaСl (500Х)
- Добавить 250 мкл MgCl (200Х)
2
- Довести объем до 50 мл добавлением НO
- Довести pH до 7,4
50
[00296] Данные анализировали с применением программного обеспечения GraphPad Prism5. Наборы данных для каждого эксперимента нормализовали по проценту активации по сравнению с контролем со 100% активацией, соответствующим лунке, в которую не добавляют соединение. Значения концентраций лекарственного средства (значения X) логарифмически преобразовывали, и процент активации (Pa) (Y значения) переводили в процент подавления (Pi), используя следующую формулу: Pi=100-Pa (Yi=100-Ya). Строили график зависимости процента подавления от концентрации лекарственного средства; для аппроксимации полученного набора данных использовали сигмоидальную функцию зависимости доза-ответ [Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10((Log ЕС-Х)))]. Значения IC получали, используя параметры аппроксимирующей функции.
50
[00297] Результаты приведены на Фиг. 1, значения IC приведены в Таблице 2 (в Примере 2). Согласно приведенным данным, CA28-1 и CA28-2 проявляли активность, составляющую примерно 30% от активности CA28 в пересчете на моли.
[00298] Пример 2: Получение аналогов компстатина длительного действия, демонстрирующих повышенную молярную активность
8
[00299] Активированный сложный NHS-эфир ПЭГ с 8 ответвлениями с молекулярной массой 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. № SUNBRIGHT HGEO-400GS; химическая формула: гексаглицерин окта(сукцинимидилоксиглутарил) полиоксиэтилен) присоединяли к боковой цепи лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующего аналога компстатина длительного действия: (CA28-АЕЕАс)-ПЭГ40k, также называемого CA28-3.
-1
-1
[00300] Комплемент-подавляющую активность CA28-3 исследовали с применением описанного в Примере 1 анализа. Результаты приведены на графике на Фиг. 1, а значение IC50 приведено в Таблице 2, и то, и другое - как функция от концентрации CA28. Концентрацию CA28 рассчитывали с применением коэффициента экстинкции CA28 на 283 нм (10208,14 л⋅моль⋅см). На основании другого анализа (поглощение УФ в зависимости от массы материала, и элементного CHN-анализа) было сделано заключение, что на молекулу CA28-3 приходится 7,5 фрагмента CA28. Таким образом, активность CA28-3 в пересчете на моли в 7,5 раз выше показанной на Фиг. 1 и приведенной в Таблице 2. Таким образом, значение IC50 в Таблице 2 в 7,5 раз выше реального значения IC50 CA28-3 в пересчете на моли. При подсчете значение IC50 CA28-3 в пересчете на моли составляет примерно 0,26 (меньше, чем у исходного соединения CA28). На Фиг. 2 представлен процент подавляющей активацию комплемента активности CA28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-2 и CA28-3, как функция от концентрации CA28-3 (мкМ), т.е. активность CA28-3 была скорректирована с учетом того, что указанное соединение включает 7,5 фрагментов CA28. В пересчете на моли комплемент-подавляющая активность CA28-3 выше, чем у CA28.
[00301] Растворимость СА28-1, CD28-2 и СА28-3 в воде в присутствии или в отсутствие разнообразных буферных веществ и/или вспомогательных веществ была, согласно наблюдениям, выше растворимости исходного соединения СА28.
[00302] Пример 3: Аналоги компстатина длительного действия, демонстрирующих существенное увеличение времени полужизни в плазме и Cmax
[00303] В данном Примере описывается определение параметров фармакокинетики аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 после введения яванским макакам.
[00304] Дозирование и получение образцов
[00305] СА28-2 и СА28-3 вводили в момент времени 0 посредством внутривенной инъекций самкам яванского макака (три на группу, возраст 2-5 лет, 2,9-3,5 кг). Соединения вводили в количестве 50 мг/кг в 5% растворе декстрозы в воде в концентрации 25 мг/мл. Образцы крови (объемом ~1 мл каждый) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: до дозирования, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч (4 дня) и 192 ч (8 дней) после дозирования. Образцы собирали посредством прямой венепункции, помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°C на 3000×g в течение 5 минут. На протяжении всего процесса обработки образцы поддерживали в охлажденном состоянии. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной камере, настроенной на поддержание температур от -60°C до -80°C. Все животные демонстрировали нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не было отмечено связанных с соединением нарушений на протяжении исследования.
4
4
4
[00306] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно приведенному выше описанию, анализировали с помощью ЖХ/МС/МС с применением следующих способов определения концентрации соединения: 50 мкл образца смешивали с внутренним стандартом (CA28-AEEAc-Arg), затем добавляли 100 мкл 1М NHOAc, pH 3,5 с НОАс и перемешивали. Затем добавляли 250 мкл ацетонитрила и перемешивали. Образец центрифугировали, супернатант переливали в другую пробирку и высушивали. Образец повторно растворяли и инжектировали в систему ЖХ/МС/МС. Подвижная фаза А была представлена 5 мМ NHОАс 0,1% FА, Подвижная фаза В была представлена (АCN: 50 мМ NHОАс) в пропорции 90:10 с 0,1% FА. Использовали ЖХ колонку Intrada WP-RР 2×150мм, 3 мкм. Количественное определение проводили на тройном квадрупольном масс-спектрометре Applied Biosystems API-4000 в режиме положительных ионов. Для фрагментирования соединения в источнике масс-спектрометра применяли индуцированную столкновениями диссоциацию (ДИС), ионы с m/z 144 отбирали по массе в Q1, фрагментировали, ионы с m/z 77 отбирали по массе в Q3 и детектировали. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Analyst 1.4.2.
[00307] Результаты. Концентрации в мкг/мл CA28-2 и CA28-3 в сыворотке в каждый момент времени приведены в Таблице 3 ниже. Представлены данные для каждой из 3-х обезьян, получавших указанное соединение. Средние значения и стандартные отклонения легко рассчитать. Данные для всех животных хорошо согласуются. Для CA28 приведены уже имевшиеся данные, полученные в предыдущем исследовании, в котором CA28 внутривенно вводили яванским макакам. В данном исследовании CA28 определяли в образцах с применением ВЭЖХ.
[00308] Результаты для каждого соединения усредняли, полученный график представлен на Фиг. 3. Значительное увеличение времени полужизни и Cmax по сравнению с CA28 наблюдалось и для CA28-2, и для CA28-3. Конечное время полужизни и для CA28-2, и для CA28-3 составляло приблизительно 4-4,5 дня. Исходя из указанных данных, внутривенное введение с интервалами приблизительно 1-2 недели предположительно будет обеспечивать постоянные уровни соединения и эффективно подавлять активацию комплемента у субъектов-людей, хотя интервалы дозирования могут быть и более короткими, и более длинными.
Пример 4: Аналог компстатина длительного действия, содержащий HSA в качестве снижающего клиренс фрагмента
2
5
2
[00309] Лизины боковых цепей сывороточного альбумина человека (HSA) преобразовывали в тиолы с применением 2-иминотиолана и проводили их реакцию с аналогом компстатина, содержащим малеимид в качестве реактивной функциональной группы: Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 68). Комплемент-подавляющую активность (Фиг. 4) полученного аналога компстатина длительного действия (CA28-4) исследовали in vitro согласно описанию в Примере 1, а фармакокинетические свойства исследовали in vivo согласно описанию в Примере 3. Параметры фармакокинетики CA28-4 после введения яванским макакам определяли согласно описанию в предыдущем примере. Результаты приведены на Фиг. 5 (вместе с результатами для CA28, CA28-1, CA28-2 и CA28-3). Данные ФК для CA28-4 представлены в Таблице 4.
[00310] Пример 5: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ
[00311] Когорту субъектов, у которых диагностировано ПНГ, делят на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получают лечение внутривенным введением CA28-2 или CA28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг и 20 мг/кг, с интервалами от 1 и 2 недель. Лечение необязательно начинают с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижают. Субъекты в Группе 3 получают лечение Экулизумабом в соответствии с рекомендованным режимом дозирования. Проводят мониторинг изменений от времени интраваскулярного гемолиза (на основе измерений ЛДГ и/или мечения кКК (51)Cr), ретикулоцитоза (индикатора анемии), гематокрита, концентрации гемоглобина в крови, опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации C3, таких как C3b, на эритроцитах, которое может быть обнаружено с применением проточной цитометрии), симптомов ПНГ, необходимости переливания, случаев тромбоэмболии, качества жизни и выживаемости. Сравнивают результаты между группами и более ранние данные для контрольных ПНГ-пациентов, полученные при клинических испытаниях Экулизумаба. Уменьшение персистентной анемии (о котором, например, свидетельствует снижение ретикулоцитоза, уменьшение признаков гемолиза, повышение гематокрита, повышение уровня гемоглобина), улучшение качества жизни, уменьшение симптомов ПНГ, снижение потребности в переливании, снижение частоты случаев тромбоэмболии, повышение качества жизни и/или повышение выживаемости, у субъектов, получающих CA28-2 (Группа 1) или CA28-3 (Группа 2), по сравнению с субъектами в группе 4, свидетельствует об эффективности.
[00312] Пример 6: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ
[00313] Повторяют Пример 4 с той разницей, что субъектами являются индивидуумы с ПНГ, остающиеся зависимыми от переливаний, и/или содержание гемоглобина у которых продолжает оставаться ниже предельного значения (например, 9,0 г/дл), несмотря на лечение Экулизумабом. Сравнивают результаты между группами.
[00314] Пример 7: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с аГУС
[00315] Когорту субъектов, у которых диагностировано аГУС, разделяли на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получают лечение внутривенным введением CA28-2 или CA28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг до 20 мг/кг, с интервалами времени от 1 до 2 недель. Лечение необязательно начинают с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижают. Субъекты в Группе 3 получают лечение Экулизумабом в соответствии с рекомендованным режимом дозирования. Проводят мониторинг изменений от времени интраваскулярного гемолиза (на основе измерений ЛДГ), опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации C3, таких как C3b, на эритроцитах), симптомов аГУС, почечной функции, необходимость плазмообмена или диализа, качества жизни и выживаемости. Сравнивают результаты между группами и более ранние данные для контрольных аГУС-пациентов, полученные при клинических испытаниях Экулизумаба. Уменьшение признаков гемолиза, улучшение качества жизни, уменьшение симптомов аГУС, уменьшение потребности в плазмообмене или диализе, повышение качества жизни и/или повышения выживаемости у субъектов, получающих CA28-2 или CA28-3, по сравнению с субъектами в группе 4 эффективности.
[00316] Пример 8: Примеры 5-7 повторяют с применением дополнительных аналогов компстатина длительного действия.
[00317] Пример 9: Примеры 5-7 повторяют с применением клеточно-реактивных аналогов компстатина.
*****
[00318] Специалистам в данной области техники известны многие эквиваленты конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке, либо такие эквиваленты могут быть выявлены с применением не более чем рутинных экспериментов. Предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен приведенным выше описанием и отражен в прилагаемой формуле изобретения. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение никоим образом не зависит от конкретных результатов, полученных в любом конкретном примере или в любом конкретном варианте реализации. Употребление существительных в единственном числе и термина «указанный/ые» может подразумевать «один/одна или более чем один/одна», если иное не указано или не очевидно из контекста. Подразумевается, что пункты формулы изобретения или описание, включающие союз «или» между одним или более представителями группы, удовлетворены, если присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом один, более чем один или все представители указанной группы, если иное не указано или не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых присутствует, используется или иным образом связан с определенным продуктом или процессом ровно один представитель указанной группы. Например, без ограничения, следует понимать, что в тех случаях, когда в формуле изобретения или в описании указано, что остаток в конкретном положении может быть выбран из конкретной группы аминокислот или аналогов аминокислот, настоящее изобретение включает индивидуальные варианты реализации, в которых остаток в указанном положении представляет собой любую(ой) из перечисленных аминокислот или аналогов аминокислот. Настоящее изобретение также включает варианты реализации, в которых присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом более чем один либо все представители указанной группы. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и пермутации, в которых одно или более ограничение, элемент, условие, описательный термин и т.п., из одного или более из приведенных пунктов формулы или приведенного выше описания введен в другой пункт формулы. Например, любой пункт формулы, зависимый от другого пункта формулы, может быть модифицирован так, чтобы включать один или более элемент, ограничение, условие или описательный термин, присутствующий в любом другом пункте формулы, зависимом от того же основного пункта. Кроме того, в тех случаях, когда в формуле изобретения упоминается композиция, следует понимать, что в объем настоящего изобретения включены способы введения указанной композиции, соответствующие любому из описанных в настоящей заявке способов, и способы применения указанной композиции для любой из описанных в настоящей заявке целей; в объем настоящего изобретения включены и способы получения композиции в соответствии с любым из способов получения, описанных в настоящей заявке, если не указано иное, или если специалисту в данной области техники не очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Способы лечения субъекта могут включать этап обеспечения субъекта, нуждающегося в таком лечении (например, субъекта, который перенес заболевание, либо субъекта, у которого имеется повышенный риск заболевания), этап диагностирования заболевания у субъекта и/или этап выбора субъекта для лечения клеточно-реактивным аналогом компстатина.
[00319] В тех случаях, когда элементы представлены в виде списков, следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа указанных элементов, и что из указанной группы может(могут) быть удален(ы) любой(ые) элемент(ы). Для краткости только некоторые из указанных вариантов реализации конкретно представлены в настоящей заявке, однако настоящее изобретение включает все подобные варианты реализации. Следует также понимать, что, в общем случае, если сказано, что настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения, включает(ют) конкретные элементы, свойства и т.п., определенные варианты реализации настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения состоят, либо состоят по существу, из таких элементов, свойств и т.п. Описания различных заболеваний, расстройств и состояний в различных разделах настоящей заявки приведены для удобства и не подразумевают ограничения настоящего изобретения.
[00320] При указании диапазонов предельные значения включены. Кроме того, следует понимать, что если иное не указано или не очевидно из контекста и для специалиста в данной области техники, под значениями, выраженными через диапазоны, может, согласно разным вариантам реализации настоящего изобретения, подразумеваться любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов, до десятых долей единиц нижней границы указанного диапазона, если из контекста явно не следует иное. Любой конкретный вариант реализации, аспект, элемент, признак и т.п., настоящего изобретения может быть явным образом исключен(а) из формулы изобретения, даже если такое исключение не приведено в настоящей заявке явным образом. Например, любой аналог компстатина, функциональная группа, соединяющая часть, заболевание или показание могут быть явным образом исключены.