СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ОБРАЗЦА ФЛАВИВИРУСА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛАЗЕРА НА СВОБОДНЫХ ЭЛЕКТРОНАХ
METHOD OF ASSESSING THE QUALITY OF A FLAVIVIRUS SAMPLE TO OBTAIN A THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE USING A FREE ELECTRON LASER

Область техники
Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в качестве дополнительной процедуры для характеризации образцов флавивирусов с целью определения их трехмерной структуры методом анализа единичной молекулы в растворе с использованием лазера на свободных электронах. Способ основан на сочетании прямой визуализации биологических объектов с помощью просвечивающей электронной микроскопии с последующей качественной оценкой гомогенности и определения статистического распределения частиц разных размеров в растворе при комнатной температуре в нативных условиях методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР).
Уровень техники
Флавивирусы широко распространены в субтропическом, тропическом и экваториальном регионе мира. Хотя вакцины доступны, по-прежнему тысячи случаев инфицирования регистрируются каждый год в развивающихся странах. Необходимы новые вакцины и лекарственные препараты на основе малых молекул с доступными условиями хранения и более низкой ценой. Для их разработки эффективным является дизайн, основанный на структуре мишени.
Флавивирусы, частицы 50-60 нм - сложные объекты для структурных исследований, т.к. относятся к т.н. оболочечным вирусам у которых нуклеакапсид окружен липидная оболочка, в которую встроены белки, они обладают природной гетерогенностью, популяция состоит из зрелых частиц полностью покрытых растворимым белком оболочки, полузрелых, незрелых и деформированных. В растворе в разных соотношениях присутствуют частицы разной стадии созревания. Наиболее компактным является зрелый вирус. Из-за липидной оболочки частицы могут существенно деформироваться (ломаться) в процессе выделения и очистки. Качество препарата варьируется в зависимости от процедуры выделения и очистки.
Для разработки лекарств необходима структура зрелых частиц, полностью покрытых оболочечным белком. Наиболее оптимальным для получения структур флавивирусов в растворе, особенно в динамике, является использование лазера на свободных электронах, методика «визуализации единичной молекулы», которая не требует получения кристаллов вирусов или замораживания раствора как при криоэлектронной микроскопии. Метод основан на получении дифракции от единичных частиц в растворе, который инжектируется (впрыскивается) под сверхинтенсивный пучок электронов. Инжектирование является ключевым этапом эксперимента (J. Bielecki, Hantke M.F., B.J. Daurer et al., Electrospray sample injection for single-particie imaging with x-ray lasers, Science advances, 2019, 5eaav8801). Успешность инжекции напрямую зависит от гомогенности, чистоты, концентрации и отсутствия агрегатов в образце. При требуемой высокой концентрации частиц есть риск образования большого количества агрегатов, которые мешают процессу инжекции раствора вируса как и значительное количество деформированных («сломанных») частиц. Неспособность потока частиц проходить через инжектор делает невозможным весь дорогостоящий эксперимент. Поэтому необходимо проводить отбор качественных образцов до эксперимента.
Для оценки качества вакцин на основе инактивированных вирусов используют метод сканирующей зондовой микроскопии (патент RU 2339036 С2). Но этот метод не позволяет напрямую визуализировать вирусные частицы и не применялся для высококонцентрированных образцов.
Способ характеризации на основе просвечивающей электронной микроскопии методом негативного контрастирования известен и используется в основном для оценки качества вакцин (S. Goldsmith and S. Miller, Modem Uses of Electron Microscopy for Detection of Viruses, Clin Microbiol Rev. 2009. V. 22 №2. P. 552). Методика помогает качественно оценить наличие деформированных частиц и гетерогенность, наличие\отсутствие примесных клеточных белков и фрагментов вирусных частиц. Однако, характеризация только таким способом даже при низких концентрациях часто демонстрирует артифактную агрегацию из-за взаимодействия с контрастным веществом.
Криогенная электронная просвечивающая микроскопия используется для определения структур биологических молекул (D. Lyumkis, Challenges and Opportunities in Cryo-EM Single-Particle Analysis// JBC. 2019. 294, 5181.) Приготовление образцов не требует использования контрастирующего агента, позволяет независимо проверить чистоту и качество биологических образцов, но эффект псевдоагрегации может присутствовать из-за скопления частиц вследствие неравномерной толщины льда и расположения частиц в разных слоях льда. Также возможна механическая деформация частиц флавивирусов на поверхности толщи льда из-за относительно крупного размера частиц. При получении структур методом криоэлектронной микроскопии наличие деформированных частиц не играет существенной роли, так как проводится классификация частиц на всех изображениях в программном обеспечении и частицы с искаженной симметрией отбраковываются. Но большое количество деформированных частиц мешает инжекции в инжекторах, применяемых в экспериментах с использованием лазера на свободных электронах.
Для детекции и оценки статистического распределения биологических молекул разных размеров в растворах используется метод светодинамического рассеяния (B.J. Berne and R. Pecora// Dynamic Light Scattering: with applications to Chemistry, Biology, and Physics, Courier Corporation,2013, p. 384), но несмотря на то что этот метод возможно использовать в том же диапазоне концентраций по белку 0,5-1,0 мг/мл для флавивирусов, для гидродинамического радиуса молекул определенного светодинамическим расеянием его точность приблизительно в 4 раза хуже чем для радиуса инерции, определенного рентгеновским малоугловым рассеянием с использованием синхротронного излучения (Werner A., Konarev P.V., Svergun D.I., Ulrich Н.// Characterization of a fluorophore binding RNA aptamer by fluorescence correlation spectroscopy and small angle X-ray scattering. Analytical Biochemistry, 2009. 389, 52).
Для оценки количества биомолекул разных размеров в растворах используется метод диференциальной мобильности частиц. Однако концентрация 1 мг\мл по белку является для этого метода предельно низкой, на его результаты могут влиять такие факторы как проводимость буфера, наличие агрегатов (S.L. Kaufman, J.W. Skogen, F.D. Dorman, F. Zarrin, K.C. Lewis // Macromolecule analysis based on electrophoretic mobility in air: Globular proteins. Anal. Chem. 1996. 68, 1895-1904).
6
9
11
9
Для оценки количества биомолекул разных размеров в растворах используется технология анализа траектории наночастиц. В ней используется свойства рассеивания света и броуновского движения, что позволяет получать распределение частиц по размерам и измерять концентрацию частиц в суспензиях. Однако метод технически сложен, зависит от качества фильтрации буфера, микропримесей в буфере, диапозон концентраций наночастиц в котором результаты наиболее достоверны 10-10, тогда как для экспериментов по определению структуры вирусов с использованием ЛСЭ требуется концентрация 10-10. (Gerritzen М.J.Н., Martens D.E., Wijffels R.Н., Stork М.// High throughput nanoparticle tracking analysis for monitoring outer membrane vesicle production. Journal of Extracellular Vesicles. 2017. 6, 1333883).
Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является создание эффективного комплексного трехступенчатого способа предварительной оценки качества образца флавивируса, предназначенного для определения трехмерной структуры в растворе методом единичной молекулы с использованием лазера на свободных электронах, взаимодополняющими методами.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является отбор образца флавивируса, соответствующего необходимым критериям для дальнейшего проведения экспериментов по определению трехмерной структуры в растворе.
Для достижения технического результата предложен способ оценки качества образца флавивируса для получения трехмерной структуры с использованием лазера на свободных электронах, включающий разделение буферного раствора, содержащего частицы флавивируса на три порции, нанесение первой порции исследуемого образца флавивируса на поверхность поддерживающей медной сетки и нанесение на нее контрастирующего вещества с последующим сканированием в режиме просвечивающего электронного микроскопа, при этом, визуально оценивают чистоту образца и количество зрелых вирусных частиц, нанесение второй порции образца флавивируса в вакууме на поддерживающую медную сетку с углеродным покрытием и витрифицирование в специализированной камере при влажности 95-100% и температуре -180°С в жидком этане, с последующим сканированием образца флавивируса в режиме просвечивающего криоэлектронного микроскопа, при этом, визуально оценивают наличие зрелых и деформированных частиц, присутствие клеточных белков и фрагментов разрушения вируса, помещение третьей порции образца флавивируса в рентгеновский кварцевый капилляр с последующим определением статистического распределения частиц по размерам методом малоуглового рентгеновского рассеяния, при этом, определяют форму и распределение различных олигомеров в растворе по размеру, а качество образца флавивируса определяют по количеству деформированных и зрелых вирусных частиц и отсутствию посторонних примесей в виде клеточного дебриса, примесных белков, фрагментов вирусов и проценту агрегатов.
Кроме того, подготовительное центрифугирование образца флавивируса проводят в режиме 1000g в течение 5 минут.
Кроме того, поддерживающую медную сетку, покрытую пленкой аморфного углерода обрабатывают в тлеющем разряде для придания сетке гидрофильности.
Кроме того, первую порцию образца флавивируса контрастируют с использованием 1% раствора ацетата уранила.
Кроме того, получение экспериментальных данных криоэлектронной микроскопии производится с использованием криогенного электронного микроскопа Titan Krios 60-300 при помощи программного обеспечения EPU (FEI).
Кроме того, при применении метода малоуглового рентгеновского рассеяния используют синхротронное излучение.
Кроме того, при применении метода малоуглового рентгеновского рассеяния для обработки кривых малоуглового рассеяния используют пакет программ ATSAS.
Кроме того, распределение вирусных частиц по размерам в приближении полидисперсных сфер получают с помощью программы MIXTURE.
Осуществление изобретения
В рамках изобретения предлагается использовать взаимодополняющую информацию полученную тремя разными методиками. Использование негативного контрастирования позволяет отбраковать образцы с большим количеством примесей имеющие гетерогенный состав, криоэлектронная микроскопия позволяет получить изображения более высокой четкости и разрешения и позволяет определить количество деформированных частиц и проверить образование агрегатов. Применение метода МУРР позволяет определить форму и статистическое распределение различных олигомеров в растворе, этот метод является одним из наиболее эффективных дифракционных методов исследования биологических молекул в растворах. Метод основан на рассеянии под углами меньше 30° от частиц различных размеров.
При исследовании биологических молекул малой концентрации источником рентгеновского излучения служит синхротронное излучение с длиной волны 0,03-0,35 нм. Используется монохроматичный пучок, который проходя через образец регистрируется детектором. Форма и размер частиц определяется при помощи математического аппарата на основе зависимости интенсивности рассеяния от угла рассеяния (Konarev P.V., Petoukhov M.V., Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277).
Способ оценки качества образца флавивируа включает центрифугирование раствора флавивируса, подготовку поверхности медной сетки и разделение раствора на три порции. Первую порцию сорбируют на поддерживающую медную сетку с последующим контрастированием контрастирующим агентом и исследуют под просвечивающим электронным микроскопом, вторую порцию раствора с вирусными частицами сорбируют на поддерживающую сетку в вакууме и верифицируют при -180°С в жидком этане, исследуют в просвечивающем криоэлектронным микроскопом, полученные изображения анализируют. Анализ полученного изображения происходит следующим образом: визуально оценивают наличие зрелых частиц, деформированных частиц, агрегатов, присутствие клеточных белков и фрагментов разрушения вирусов. Третью часть образца помещают в рентгеновский капилляр и определяют статистическое распределение частиц по размером методом малоуглового рентгеновского рассеяния, который позволяет определить форму и распределение различных олигомеров в растворе по размеру, качество образца определяется по количеству деформированных вирусных частиц, количеству зрелых частиц, отсутствию посторонних примесей в виде клеточного дебриса, примесных белков, фрагментов вирусов и проценту агрегатов.
Существует вариант, при которым образец центрифугируется в режиме 1000g. Существует вариант при котором используют медные сетки диаметром 3 мм со сплошным покрытием углеродом на который сорбируется образец, при котором образец после сорбции контрастируют 1% ацетат уранилом с последующим высушиванием на воздухе. После этого устанавливают сетку с биологическими объектами в просвечивающий электронный микроскоп и, проводят исследование поверхности по известной методике (Maliuchenko N.V., Agapov Tonevitskii A.G., Moisenovich M.M., Savvateev M.N., Tonevitskii E.A., Bykov V.A., Kirpichnikov M.P. // Detection of immune complexes using atomic force microscopy. // Bioiizika. 2004 Nov-Dec; 49(6): 1008-14. Russian). Существует вариант, при которым используется витрификация образца в жидком этане при температуре -180°С, образец исследуют в криоэлектронном микроскопе Titan Krios собирая набор изображений с помощью программного обеспечения EPU (FEI). Существует вариант, при котором исследуется несколько концентраций образца методом малоуглового рентгеновского рассеяния.
Для анализа изображений полученных с использованием негативного контрастирования под просвечивающим электронным микроскопом визуально оценивают наличие примесей, агрегатов, приблизительное количество незрелых и зрелых частиц, изображения полученные при использовании криоэлектронной микроскопии оценивают приблизительное количество деформированных, зрелых и незрелых частиц. При этом оптимальным является отсутствие фрагментов вирусов и клеточных белков, присутствие деформированных частиц не более 10±2%, >90±5% зрелых частиц. При анализе малоугловых рентгеновских данных при помощи математического аппарата определяют статистическое распределение частиц и\или их агрегатов по размеру в растворе, оптимальным является наличие в растворе >90±5% частиц с диаметром 50-60 нм. Соответствующий критериям образец пригоден для получения набора дифракционных картин на инструменте ЛСЭ с использованием инжектора-электроспрея.
Пример реализации предложенного способа.
Использование способа позволяет увеличить эффективность проведения эксперимента по сбору данных. С его помощью был собран набор дифракционных данных с частиц вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в растворе на инструменте SPB/SFX Европейского лазера на свободных электронах (XFEL).
Используется образец инактивированного вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) максимально возможной концентрации без видимой опалесценции, приготовленный методом культивирования штамма вируса клещевого энцефалита штамм Софьин на первичной культуре эмбрионов куриных яиц с последующей инактивацией (Патент на изобретение РФ RU 2678431 C2).
2
Первую порцию образца непосредственно наносят на медную сетку диаметром 3 мм, объемом 3 мкл и проводят кратковременную инкубацию в течение 5 минут при комнатной температуре. При кратковременной инкубации образца происходит сорбция частиц на сетку. Для удаления не связавшихся с сеткой частиц и остатков солей, затрудняющих последующий анализ, используют отмывку деоионизованной водой. Наиболее общий случай исследований заключается в последующем анализе образца на поверхности сетки с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Исследуют серию из 10-15 изображений полученных с участков располагающихся случайным образом, каждый площадью 1000×1000 нм. Количество примесей должно составлять не более 5%, крупных агрегатов, состоящих из 3 и более частиц не более 10-15%, количество зрелых частиц более 85±5%. При удовлетворительном качестве образца переходят к анализу второй порции образца.
Вторую порцию образца в объеме 2 мкл сорбируют на сетку в вакууме в установке для нанесения и витрификации образца, например Vitrobot Mark IV, при температуре 4°С и влажности 95-100%, излишек образца удаляется при помощи блоттинга с последующей витрификацией в жидком этане, подготовленные сетки запресовываются в картирджи в жидком азоте при температуре 77 К, набор экспериментальных данных производится с использованием криогенного электронного микроскопа, например Titan Krios 60-300, с использованием программного обеспечения EPU (FEI). Изображения анализируются в программе RELION (Nakane, Т. et al. // New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 2018. 7, 1-38). Процент зрелых частиц должен составлять >85±5%, процент деформированных частиц не более 10%. При удовлетворительном качестве второй порции образца протестированного данной методикой переходят к анализу третьей порции образца.
Третья порция образца в объеме 50 мкл помещается в кварцевый капилляр, запаивается и исследуется методом малоуглового рассеяния при комнатной температуре, полученные кривые малоуглового рассеяния анализируются, используя стандартные алгоритмы программ, например, OLIGOMER (Konarev P.V., Petoukhov M.V., Volkov V.V. et al. // J. Appl. Cryst. 2006. V. 39. №2. P. 277) с вычислением размера отдельной частицы, их групп и распределению частиц по размерам с вычислением объемной доли каждой фракции, например, по программе MIXTURE. Процент индивидуальных вирусных частиц должен быть не менее 85±5%.
Образец ВКЭ, проанализированный по приведенному выше способу, был успешно проинжектирован с использованием инжектора-электроспрея на инструменте SPB/SFX Европейского лазера на свободных электронах (XFEL), впервые получена дифракция с частиц ВКЭ в растворе, собран набор дифракционных данных.
Таким образом, заявляемый способ позволяет проводить отбор образцов флавивирусов, соответствующих необходимым критериям для дальнейшего проведения экспериментов по определению трехмерной структуры в растворе.