СПОСОБ СКРИНИНГА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ У ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR SCREENING MALIGNANT NEOPLASMS IN HUMANS

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и эпигенетике, и касается способа скрининга злокачественных новообразований у человека.
В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика онкологических заболеваний на основе биологических маркеров на уровне клеток, субклеточных структур и генома. Нормальное клеточное деление требует, чтобы геном реплицировался правильно, гарантируя тем самым, что геномная информация в неизмененном виде перешла из одного клеточного поколения в другое. Процесс ДНК репликации является жестко регулируемым и синхронизирован по всему геному. Нарушение времени репликации является важным компонентом в развитии опухоли и ранним эпигенетическим событием при канцерогенезе [Genome Research. 2012; 22(10): 1833-1844, Science. 2017; 355(6331): 1330-1334]. В немногочисленных зарубежных работах показано, что частота лимфоцитов с асинхронной репликацией (ЛАР) изученных генов у онкологических больных достоверно повышена по сравнению со здоровыми лицами [Genes, Chromosomes and Cancer. 1998; 22(3): 225-231, Genes, Chromosomes and Cancer. 2000; 27(3): 270-277, Cancer Genetics and Cytogenetics. 2003; 143(2): 133-139, Neoplasia. 2010; 12(8): 668-674] и увеличивается в процессе малигнизации заболеваний [Experimental Hematology. 2000; 28(2): 156-160, Journal of Cellular Biochemistry. 2013; 114(5): 1074-1083].
В России подобные работы не проводились.
Известен способ выявления рака и риска развития рака, основанный на определении уровня синхронности репликации аллелей генов в клетках, изолированных из жидкостей тела человека («Facile detection of cancer and cancer risk based on level of coordination between alleles» патент US 6803195 B1, 1999 г.).
Недостатком данного способа является применение его только для рака простаты и рака молочной железы.
Известен «Способ диагностики онкологических заболеваний» по патенту RU 2384845, в котором проводят исследование образца, взятого у пациента, на выявление онкологического маркера мРНК гена Т (Brachyury). Онкологическое заболевание диагностируют при обнаружении сильного генспецифического сигнала мРНК гена Т (Brachyury). Недостатком данного способа является отбор материала для анализа непосредственно из различных органов для выявления в них онкологического заболевания.
Известен «Способ дифференциальной диагностики заболеваний онкологического и неонкологического генеза» по патенту RU 2593015. Сущность способа состоит в том, что исследуют электрофоретическую подвижность эритроцитов и при ее снижении менее, чем на 49% от физиологической нормы, диагностируют заболевание неонкологического генеза. При снижении электрофоретической подвижности эритроцитов более чем на 50% от физиологической нормы диагностируют заболевание онкологического генеза, при физиологической норме, равной 1,75±0,04 мкм⋅см/В⋅с.
К недостаткам способа можно отнести диагностику злокачественных новообразований происходящих только из эпителиальных тканей.
Известен «Способ скрининга и мониторинга онкологических заболеваний» по патенту RU 2537263. Он включает забор образца ткани, выделение из образца ткани РНК, синтез кДНК, амплификацию посредством множественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакцией с последующим анализом амплифицированных продуктов.
Недостатком способа является сложность интерпретации результатов, а также возможность загрязнения образцов посторонней ДНК и, как результат, ложноположительный ответ.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения выбран способ дифференциальной диагностики больных раком простаты, изложенный в статье Cytron S. et al. [Cytron S., Stepnov E., Bounkin I., Mashevich M, Dotan A., Avivi L. Epigenetic analyses in blood cells of men suspected of prostate cancer predict the outcome of biopsy better than serum PSA levels. // Clinical Epigenetics. 2011; 2(2): 383-388. DOI: 10.1007/s 13148-011-0029-3]. Диагностика рака простаты с применением рассматриваемого способа основана на анализе количества стимулированных фитогемагглютининином (ФГА) лимфоцитов периферической крови с асинхронной репликацией генов RB1 и AML1, выявляемых при помощи флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Способ реализуют в следующей последовательности:
1. У каждого пациента берут 5 мл периферической крови, из которой готовят клеточную культуру ФГА-стимулированных лимфоцитов.
2. Культуру инкубируют при +37°С в течение 72 ч, затем проводят гипотонизацию и фиксацию лимфоцитов. Полученную клеточную суспензию хранят при -20°С до приготовления препаратов для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
3. Используют два коммерческих молекулярных зонда фирмы Vysis (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) на гены RBI и AML1. In situ гибридизацию и пост-гибридизационную отмывку проводят согласно стандартному протоколу, рекомендованному фирмой-производителем. Готовые предметные стекла хранят при -20°С до момента анализа.
4. Препараты анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus ВН2, оснащенного тройным линейным фильтром (Chroma Technology, Brattleboro, VT, USA). Для каждого образца анализируют не менее 200 клеток, имеющих 2 отчетливых, хорошо определяемых флуоресцентных сигнала. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК. Таким образом, часть клеток отражает одинаковый статус репликации: клетки с нереплицированными аллелями (SS - клетки) и клетки с реплицированными аллелями (DD - клетки); другая часть клеток отражает асинхронную репликацию - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (SD - клетки). Для каждого гена рассчитывают частоту SD клеток, по отношению ко всей клеточной популяции, содержащей два сигнала (общее число SD, SS, и DD клеток). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента (t-тест (Microsoft Excel)).
Недостатки способа.
1. Зависимость пролиферативной кинетики (митотического индекса и скорости пролиферации) от марки компонентов культуральной среды, времени культивирования и индивидуальных особенностей донора/больного может вносить ошибку в результаты.
2. Материалом для FISH-исследования является 72-часовая культура ФГА-стимулированных лимфоцитов, что увеличивает продолжительность исследования до 6 рабочих дней.
Технический результат предлагаемого решения заключается в создании возможности проведения скрининга злокачественных новообразований у человека, упрощение способа, сокращение времени исследования и его стоимости.
Сущность способа, включает забор периферической крови, получение образцов суспензий содержащих нестимулированные лимфоциты и анализ в них асинхронной репликации гена AURKA с помощью флуоресцентной in situ гибридизации - FISH. Если частота лимфоцитов с асинхронной репликацией - ЛАР гена AURKA превышает 28,0%, то это свидетельствует о наличии у человека злокачественного новообразования.
Перечень фигур.
Фиг. 1. Лимфоцит с нереплицированными аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентные сигналы, показывающие нереплицированные аллели гена;
Фиг. 2. Лимфоцит с асинхронно реплицированными (ЛАР) аллелями гена AURKA: 1 - ядро клетки, 2 - флуоресцентный сигнал, показывающий нереплицированный аллель гена; 3 - флуоресцентный сигнал, показывающий реплицированный аллель гена.
Порядок реализации способа.
2
2
1. Образцы венозной крови (3 мл) забирают при помощи вакуумной системы, содержащей Li-гепарин в концентрации 12-30 ME на 1 мл крови. В центрифужную пробирку переносят 1 мл цельной крови, добавляют 9 мл теплого(+37°С) гипотонического раствора KCl (550 мг/110 мл) и помещают в термостат (+37°С) на 30 мин. После окончания гипотонизации пробирки центрифугируют (1000 об/мин) в течение 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив в пробирке около 0,3-0,5 мл. Осадок ресуспендируют и заливают (до 10 мл) свежеприготовленным фиксатором Карноя (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), непрерывно перемешивая на шейкере. Далее центрифугируют (1000 об/мин) в течение 15 минут. Смену фиксатора с последующим центрифугированием и удалением супернатанта до 0,5 мл производят трижды. Пробирку с суспензией клеток в последнем фиксаторе заклеивают парафилмом и помещают в морозильную камеру (-20°С) для хранения и/или дальнейшего использования. Перед приготовлением препаратов пробирку вынимают из морозильной камеры, хорошо встряхивают и центрифугируют (1000 об/мин) 10 минут. Затем удаляют супернатант, оставив 0,3-0,5 мл, и непрерывно перемешивая на шейкере добавляют 2-9 капель свежеприготовленного фиксатора Карноя. Клеточную суспензию раскапывают по 15-30 мкл на охлажденные в морозильной камере (-20°С), предварительно очищенные предметные стекла на теплом термостолике (+30°С). Готовые препараты помещают в термостат (+37°С) на ночь для досушивания. На следующий день на предметное стекло наносят 100-150 мкл раствора РНК-азы (10 мкл раствора RNAse (10 мг/мл), 100 мкл 20×SSC (стандартный цитратный буфер) (рН 5.3) и 890 мкл бидистиллированной воды), закрывают покровным стеклом (22×50 мм) и, поместив во влажную камеру, убирают на 60 мин в термостат (+37°С). Затем стряхивают покровное стекло и отмывают препарат при комнатной температуре в фосфатном буфере (PBS) (рН 7.0-7.2) в течение 5 мин, далее - в растворе пепсина (85 мкл 37% (12N) HCl, 50 мкл рабочего 10% раствора пепсина, доведенного до 100 мл дистиллированной водой) в течение 12 мин на водяной бане при +37°С. Переносят препарат в стакан с PBS (рН 7.0-7.2) комнатной температуры на 5 мин. Далее отмывают в растворе MgCl (5 мл 1М MgCl, 3 мл 37% формальдегида, доведенные до 100 мл PBS (рН 7.0-7.2)) при комнатной температуре в течение 10 мин. После чего отмывают в PBS (рН 7.0-7.2) 5 мин. Затем проводят дегидратацию препарата в серии спиртов (этанол) разной концентрации (70%, 85% и 96%) по 3 мин в каждом.
2. Препарат высушивают при комнатной температуре и используют коммерческий молекулярный зонд на ген AURKA согласно протоколу фирмы-производителя (Kreatech, Нидерланды).
3. Анализ препаратов проводят на флуоресцентном микроскопе Axiolmager А-2 (Carl Zeiss, Германия) с набором фильтров DAPI, Orange/Green, Gold (Vysis, США). Для каждого образца анализируют не менее 300 клеток, имеющих отчетливые хорошо определяемые флуоресцентные сигналы. Анализируемые флуоресцентные сигналы в клетках (фиг 1, фиг. 2) подразделяют на 2 категории: "S" - единичный сигнал, представляющий собой участок еще нереплицированной ДНК (фиг. 1 п. 2, фиг.2 п. 2) и "D" - двойной сигнал от реплицированного участка ДНК (фиг 2 п. 3). Таким образом, одна часть клеток имеет нереплицированные аллели гена AURKA (фиг. 1), другая часть клеток отражает асинхронную репликацию аллелей гена AURKA - когда в клетке виден один сигнал одинарный, а второй двойной (фиг. 2). Статистическую достоверность различия между двумя клеточными популяциями определяют с помощью критерия Стьюдента.
Примеры конкретного применения.
Пример №1. Больной А. 1941 год рождения. Находился на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом первично-множественный метахронный рак: рак прямой кишки cT2N0M0 IB, рак желудка pT3N0M0 IIA. Образец периферической крови взят перед операцией по поводу второй опухоли. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 38,3%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.
Пример №2. Больная Б. 1968 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка cT4aN0M0. Образец периферической крови взят перед диагностической лапароскопией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 34,3%, что свидетельствует о наличии у нее злокачественного новообразования.
Пример №3. Больной В. 1961 года рождения. Находился на лечении в отделении лучевой и лекарственной терапии гемобластозов с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз, подтвержденный имммунофенотипированием лимфоцитов. Образец периферической крови взят при постановке диагноза. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 47,7%, что свидетельствует о наличии у него злокачественного новообразования.
Пример №4. Больной Д. 1948 года рождения. Находился в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом рак желудка T4N0M0. Впоследствии, по результатам морфологического исследования операционного материала диагноз был пересмотрен: язва желудка. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР гена AURKA составила 26%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.
Пример №5. Больная Г. 1986 года рождения. Находилась на лечении в отделении лучевого и хирургического лечения заболеваний абдоминальной области с диагнозом желчекаменная болезнь: хронический калькулезный холецистит. Образец периферической крови взят перед операцией. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA до начала лечения. Частота ЛАР теш. AURKA составила 21,2%, что свидетельствует об отсутствии у нее злокачественного новообразования.
Пример №6. Донор Е. 1977 года рождения. Клинически здоров. Проведен анализ частоты ЛАР гена AURKA. Частота ЛАР гена AURKA составила 13,9%, что свидетельствует об отсутствии у него злокачественного новообразования.
Подтверждение достижения технического результата.
Всего обследовано 220 человек. В первую группу - 188 человек были включены больные хроническим лимфоцитарным лейкозом, больные лимфомой Ходжкина, больные раком желудка и больные с первично-множественными злокачественными новообразованиями различных локализаций (молочная железа, предстательная железа, щитовидная железа, легкие, желудочно-кишечный тракт, гортань, мочевой пузырь, почки, матка). Во вторую группу вошло 32 человека без злокачественных новообразований.
Среднегрупповые частоты ЛАР теш. AURKA составили 20,6±0,7% в группе лиц без злокачественных новообразований и 36,4±0,4% в группе онкологических больных. Проведенный анализ показал, что у 95% онкологических больных частота ЛАР превышала верхнюю границу 95% доверительного интервала 27,9% для группы лиц без злокачественных новообразований. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа составила 95%., специфичность - 100%.
Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект:
- возможность проведения скрининг-диагностики злокачественных новообразований;
- по сравнению с прототипом предложенное изобретение снижает в 2 раза время для осуществления диагностического исследования и его трудоемкость;
- устраняет зависимость результата анализа от условий культивирования лимфоцитов;
- снижает в 4 раза экономические затраты на проведение исследования, так как для осуществления его по прототипу требуется наличие дополнительных реактивов и больший расход дорогостоящих ДНК-зондов;
- обеспечивает высокую чувствительность исследования - 95% и специфичность - 100%;
Статистическую обработку данных проводят с помощью стандартных методов статистического анализа с использованием компьютерной программы Microsoft Excel (2007). Оценку достоверности различий между двумя клеточными популяциями проводят по t-критерию. При сравнении межгрупповых показателей используют критерий Хи-квадрат.- Различия считаются статистически достоверными при t≥1,96 и χ2≥3,84, что соответствует р<0,05.