СПОСОБ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ФЕКАЛИЙ ПЕРЕД ВЫДЕЛЕНИЕМ ДНК ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ОПИСТОРХОЗА МЕТОДОМ ПЦР
METHOD FOR FECES PREPARATION FOR DNA RECOVERY FOR PCR DIAGNOSING OF OPISTHORCHIASIS

Изобретение относится к области медицины, к паразитологии, и может быть использовано в лабораторных исследованиях проб фекалий для диагностики описторхозного поражения печени и желудочно-кишечного тракта.
Описторхоз является одним из значимых природно-очаговых заболеваний.
В настоящее время известен ряд различных способов диагностики, например способ диагностики описторхозного поражения печени с помощью ультразвукового сканирования (RU, патент №2136216, МПК А61В 8/00, опубл. 10.09.1999 г.).
Известен также способ диагностики описторхоза с применением микроскопии (RU, патент №2257152, МПК A61B 10/00, G01N 33/48, опубл. 27.03.2005 г.). Во время эзофагогастродуоденоскопии оценивают степень поражения слизистой оболочки желудка. Точность диагностики данных методов недостаточно высока.
Стандартным методом клинической диагностики описторхоза является копроовоскопия.
Чувствительность копроовоскопии составляет около 60%, причем процент идентификации и предел детекции описторхид зависят от паразитологического метода и квалификации специалиста (Огородова Л.М., Петрова И.В. и др. Метод генетической диагностики описторхоза. - ж. Клиническая лабораторная диагностика, 2009, №7, с.37-39).
В настоящее время особо актуальным становится подход к диагностике описторхид с применением методов идентификации ДНК паразитов. На сегодняшний день известна диагностическая тест-система с применением методов идентификации ДНК описторхид в виде мультиплексного ПЦР-анализа (полимеразно-цепной реакции) (Брусенцов И.И., Катохин А.В. и др. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПНР. - ж. Медицинская паразитология и паразитарные болезни, Москва, «С-ИНФО», 2010, №2, с.10-13).
Известен метод предварительной обработки фекалий перед выделением ДНК описторхид формалин-эфирным обогащением образцов фекалий, включающий разведение 100 мг фекалий в 1 мл стерильной дистиллированной воды (являющейся одновременно и растворителем и отмывочным раствором) с добавлением для последующего фракционирования в качестве экстрагента 200 мкл эфира, а центрифугирование проводят в течение 2 мин при 6500 об/мин (S.Wongratanacheewin, W. Pumidonming. R.W.Sermswan, V.Pipitgool, W.Maleewong / Выявление О.viverrini в клинических образцах стула методом ПЦР.- J. Of Clinical Microbiology. 2002. Vol.40. N.10. P.3879-3880).
Данный способ не достаточно эффективен, т.к. вероятность обнаружения яиц описторхид невысока, кроме того, данный метод является энергоемким.
Наиболее близким является метод предварительной обработки фекалий перед выделением ДНК для диагностики описторхоза методом ПЦР этилацетатной техникой, включающий растворение 500 мг фекалий в 4 мл стерильного физиологического раствора (отмывочного раствора) с добавлением для последующего фракционирования в качестве экстрагента 400 мкл этилацетата, последующее центрифугирование при 4000 об/мин в течение 10 мин (Duenngai K., Sithithaworn P., Rudrappa U.K., Iddya K., Laha Т., Stensvold С., Strandgaard Н., Johansen M.V - Улучшение ПЦР детекции ДНК О.viverrini в клинических образцах стула / J. Of Clinical Microbiology. - 2008. V.46: P.366-368).
Данный способ позволяет производить диагностику описторхоза методом ПЦР, однако он достаточно энергоемок, а вероятность обнаружения яиц описторхид невысока, т.к. количество взятого в предварительную обработку образца фекалий для дальнейшей ПЦР-диагностики невысоко, что не позволяет с высокой точностью выявлять наличие описторхид.
Сложность диагностики описторхид определяется неравномерностью распределения объектов исследования в фекальных массах, в отличие от бактерий и вирусов. Важно, чтобы объект исследования (яйца описторхид) попал в анализируемую часть образца. В связи с этим предварительная обработка достаточного количества клинического образца (1 г фекалий), включающая одновременную концентрацию, очистку от детрита и ингибиторов (обогащение 1 г фекалий в 100 мкл очищенного концентрированного осадка) является необходимым этапом в диагностике описторхид.
Задачей изобретения является повышение эффективности способа диагностики описторхид.
Технический результат, который будет достигнут от использования изобретения, заключается в повышении вероятности обнаружения яиц описторхид даже при незначительном их содержании в клиническом образце фекалий и снижении энергоемкости.
Технический результат достигается тем, что в способе предварительной обработки фекалий перед выделением ДНК для диагностики описторхид методом ПЦР, включающем растворение (отмывку) фекалий, гомогенизирование и фильтрацию, фракционирование этилацетатным экстрагентом, последующее центрифугирование и удаление фекальной пробки, отличающемся тем, что фекалии берут в количестве 1000 мг, а в качестве растворителя используют 0,1-1%-ную кислоту в количестве 7 мл, а для фракционирования используют этилацетат в количестве 2 мл, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 1 минуты.
Сущность изобретения заключается в увеличении вероятности попадания яиц описторхид в анализируемую аликвоту образца фекалий за счет предварительной очистки и концентрации достаточного количества (1 г) клинического образца (фекалий) перед выделением ДНК и последующей детекции методом ПЦР.
Использование фекалий в количестве 1000 мг позволяет увеличить вероятность попадания яиц описторхид в исследуемый образец, что особенно важно при неравномерном и незначительном их содержании в образце.
Использование в качестве растворителя (отмывочного раствора) 0,1-1%-ной уксусной кислоты в количестве 7 мл обеспечивает наилучшее очищение осадка от детрита. Фракционирование диэтилацетатом в количестве 2 мл необходимо и достаточно для качественного разделения фекальной пробки и очищенного осадка.
Центрифугирование при 1500 об/мин в течение 1 минуты достаточно для осаждения яиц описторхид из разведенных в 0,1-1% уксусной кислоте фекалий.
Заявляемый способ предварительной подготовки позволяет сократить энергоемкость за счет сокращения времени образования фекальной пробки и времени центрифугирования, а также значительного снижения количества оборотов центрифугирования в минуту.
Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности приемов предварительной обработки фекалий, приводящей к значительному повышению вероятности обнаружения яиц описторхид даже при незначительном их содержании в клиническом образце фекалий и снижении энергоемкости за счет увеличения концентрации исследуемого осадка, позволяющего значительно увеличить качество диагностики, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
В мерной (на 10 мл) одноразовой пробирке взвешивают 1000 мг фекалий, добавляют до 8 мл (т.е. 7 мл) 0,1-1%-ную уксусную кислоту и гомогенизируют с помощью одноразовой палочки. После чего фильтруют через капроновый фильтр и воронку в одноразовую мерную центрифужную пробирку. Доводят фильтрат до 8 мл 0,1-1%-ной уксусной кислотой, добавляют в эту пробирку в качестве экстрагента 2 мл диэтилацетата, закрывают резиновой крышкой и встряхивают. После поднятия вверх фекальной пробки пробирку центрифугируют в течение 1 минуты со скоростью 1500 об/мин. Одноразовой палочкой отслаивают от стенок пробирки фекальную пробку (пробку удаляют переворачиванием пробирки и протиранием стенок пробирки ватным тампоном). Полученный очищенный осадок, содержащий яйца (объем примерно 100 мкл), используют для выделения ДНК описторхид ПЦР-диагностикой.
Сравнительные данные показателей по заявляемому способу и способу по прототипу приведены в таблице 1.
Таблица 1
№№ п./п.
Показатели
Прототип
Заявляемый способ
1.
Время образования фекальной пробки, мин
5
0,5-1
2.
Чистота осадка, от 0 до 10 баллов
при растворителе (физиологический раствор) - осадок мутный, содержит элементы детрита, 2 балла
при растворителе 0,1-1% уксусной кислоты - осадок прозрачный, 7 баллов
3.
Вероятность ложноотрицательного ответа, вызванного ингибированием ПЦР
есть
практически отсутствует
4.
Чувствительность диагностики, %
80-85
95-99
5.
Вероятность наличия яиц в образце, %
48-50
99-100
6.
Необходимое количество исследований образца с низкой концентрацией яиц (1 я/г) для получения истинного положительного результата, разы
2-3
1
7.
Время центрифугирования, мин
10
1
8.
Скорость центрифугирования, об/мин
4000
1500
Как видно из таблицы 1, заявляемый способ по сравнению со способом по прототипу является менее энергоемким, т.к. позволяет сократить в 5-10 раз время образования фекальной пробки, в 10 раз время центрифугирования и более чем в 2,5 раза скорость центрифугирования.
Заявляемый способ позволяет получить в 3,5 раза более чистый осадок, на 15-20% повысить чувствительность диагностики при проведении однократного исследования. Вероятность ложноотрицательного ответа, вызванного ингибированием ПЦР, практически отсутствует.
Таким образом, данный способ является менее энергоемким и способствует двукратному повышению эффективности выявления описторхозной инвазии методом ПЦР.