РЕГУЛИРУЕМЫЙ ЭНДОГЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ КАК ВАЖНЫЙ ФАКТОР ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ТРИПТОФАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ ОТ КАНОНИЧЕСКОЙ АМИНОАЦИЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ К НЕКАНОНИЧЕСКИМ РЕГУЛЯТОРНЫМ ФУНКЦИЯМ

Оригинальные исследования

223

РЕГУЛИРУЕМЫЙ ЭНДОГЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ КАК ВАЖНЫЙ ФАКТОР ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ТРИПТОФАНИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ ОТ КАНОНИЧЕСКОЙ АМИНОАЦИЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ К НЕКАНОНИЧЕСКИМ РЕГУЛЯТОРНЫМ ФУНКЦИЯМ

М.К. Нурбеков 1, А.А. Елов 1, Р.И. Жданов 12

1 Московский государственный гуманитарный университет им. М.А. Шолохова, Москва, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Controllable endogenic proteolysis as a major factor of switching tryptophanyl-tRNA synthetase from canonical aminoacylation activity to non-canonical regulatory functions

M.K. Nurbekov1, AA. Elov1, R.I. Zhdanov12

1MA. Sholokhov Moscow State University for the Humanities, Moscow, Russia 2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

Триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСаза) обладает уникальным комплексом дополнительных неканонических активностей в дополнение к основному аминоацилирующему действию, в частности, по контролю ангиогенеза. Представляется важным изучение роли ограниченного регулируемого эндогенного протеолиза как возможного молекулярного механизма переключения от канонической аминоацилиру-ющей активности исходного нативного фермента к неканонической антиангиогенной активности. В работе разработан оригинальный подход к выявлению роли эндогенного протеолиза индуцируемыми внутриклеточными протеазами в модификации фермента, а также роли эндогенного связанного на ферменте триптофана и варьирования содержания в триптофанил-тРНК-синтетазе существенного для активности иона цинка как важных факторов сложного процесса активации неканонической цитокинной функции фермента. Нами изучены роли ограниченного протеолиза индуцируемыми внутриклеточными протеазами ТРСазы, модификации фермента эндогенным, связанным на ферменте Трп, а также содержания в ТРСазе важного для активности иона цинка, как необходимых факторов комплексного процесса переключения ТРСазы от канонической аминоацилирую-щей активности к неканонической цитокинной. Путем модификации стандартной процедуры выделения фермента ТРСазы, изменением содержания эндогенного триптофана и снижением содержания иона цинка в ферменте, смоделированы важные для поддержания гомеостаза клетки и тканей процессы перехода между основной формой исходной нат-ТРСазы и ее модифицированной цитокинной активной формами. Переход нат-ТРСазы в модифицированную форму в результате указанных модификаций фермента, и стимулируемого ими отщепления N-концевого фрагмента в 20 кД, продемонстрирован хроматографическими и иммунохимическими методами и подтвержден методами электрофореза и иммуноблоттинга.

Ключевые слова: каскады протеолитических реакций, аутофагия, апоптосомы, инфламмасомы, важные для активности ион цинка, триптофанил-тРНК-синтетаза, канонические и неканонические функции, гель-фильтрационная хроматография, иммунохимический анализ, иммуноблоттинг.

Классические молекулярно генетические подходы, обеспечивая базовый уровень знаний о закономерностях структуры и функций генов, не дают полной картины сложнейшей сети обменных процессов на различных уровнях [1]. Огромную роль в реализации таких фундаментальных функций организма как дифференциация, гомеостаз, адаптация, комплекс защитных реакций к меняющимся факторам внешней и внутренней среды играют взаимодействия белковых комплексов друг с другом и с низкомолекулярными лигандами [2]. Кроме того, универсальным механизмом осуществления защитных функций

е-mail: mlkn47@mail.ru

Tryptophanyl-tRNA synthetase has a unique set of additional non-canonical activities in addition main aminoacylation activity, in particular for the control of angiogenesis [7]. It is important to study the role of endogenous limited controlled proteolysis as a possible molecular mechanism of switching from the canonical source aminoacylation activity of the native enzyme to non-canonical anti-angiogenic activity. We consider important data on the possible role of the significant for the activity zinc ion discovered earlier in the tryptophanyl-tRNA synthetase [8], and endogenous tryptophan in the activation of the regulatory functions of the enzyme. We have developed a novel approach to the identification of the role of endogenous proteolysis induced by intracellular proteases in the modification of the enzyme, as well as the role of the endogenous enzyme bound tryptophan and varying content of zinc ion essential for tryptophanyl-tRNA synthetase activity, as important factors in the complex process of activation of the non-canonical cytokine functions of the enzyme. Proteolytic transition of native tryptophanyl-tRNA synthetase as a result of above modifications of the enzyme and resulting cleavage of N-terminal fragment of 20 kDa have been shown with chromatographic, immunochemical methods, and confirmed by electrophoresis and immunoblotting.

Key words: cascades of proteolytic reactions, autophagy, apoptosome, inflammasome, important for the activity zinc ion, Trp-tRNA synthetase, canonical and non-canonical functions, DEAE chromatography, gel filtration chromatography, immunoassay, immunoblotting.

клетки и организма являются каскады регулируемых протеолитических процессов. Строгая регуляция этих процессов обеспечивается сформировавшимися в ходе длительной эволюции реакциями аутофа-гии при участии убиквитин-протеасомной системы, индуцируемыми металлопротеиназами. Далее строгая избирательность и специфичность защитных реакций, обеспечивающих адекватный ответ на повреждающие внутриклеточные и внешние факторы, обеспечивается системой внутриклеточных и внеклеточных рецепторов, других сигнальных молекул с последующим образованием высокомолекулярных

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

224

Оригинальные исследования

комплексов — апоптосом и инфламмасом [3, 4]. Эти комплексы затем активируют специфические виды каспаз, приводящих к процессам апоптоза и воспалительным и противовоспалительным реакциям природного иммунитета [4].

Ярким примером активации защитных функций клетки и организма является активация неканонических регуляторных функций одного фермента из класса аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСазы) — триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРСаза). Этот фермент осуществляет реакцию специфического аминоацилирования тРНК гомологичной аминокислотой, тем самым обеспечивая «расшифровку» генетического кода и необходимый уровень точности его трансляции [5]. В свете отмеченных выше базовых механизмов защиты организма, включая комплекс реакций природного иммунитета, представляется важным открытие в последнее время неканонических регуляторных функций ТРСазы [6]. Эти неканонические функции достигаются в результате протеолитической модификации фермента путем отщепления N-концевого фрагмента в 150 остатков, причем оставшийся фрагмент приобретает выраженную активность, подавляющую ангиогенез (формы мини-ТРСазы и Т2-ТРСазы, соответственно) [7]. Таким образом, в нашем исследовании особый интерес представляло изучение молекулярного механизма перехода от канонической аминоацилирующей активности исходной нативной ТРСазы (нат-ТРСазы) к неканонической антиангиогенной активности. Значительный вклад в понимание процессов регуляции и взаимосвязи канонических и неканонических функций ТРСазы внесло открытие необходимости иона цинка для реализации активности ТРСазы [8]. Хотя выявленные закономерности регуляторных функций цинка близки у высших млекопитающих, включая участие в организации структуры и функций защитных систем организмов — апоптосом и инфламмасом [4], наблюдаются также и определенные различия. Вклад альтернативного сплайсинга (АС) в инициацию и регуляцию процессов активации цитокинной функции ТРСазы безусловно важен [7]. Однако длительные структурно-функциональные исследования ТРСазы, ее дополнительных неканонических активностей, в частности, в синтезе вторичного мессенджера АрррА, а также исследование функций важного для активности иона цинка [8], позволили нам выдвинуть концепцию, формулирующую их роль в активации неканонических функций ТРСазы на посттрансляционном уровне [9]. Предварительные наблюдения показывали, что состояние «насыщенности» апофермента ТРСазы ионом цинка и эндогенным триптофаном (Трп), выполняющим важные аллостерические эффекторные функции, а также строго регулируемые процессы эндогенного ограниченного протеолиза индуцибельными протеазами, важны для активации регуляторных функций ТРСазы.

В данной работе изучены роли ограниченного протеолиза индуцируемыми внутриклеточными протеазами ТРСазы, модификации фермента эндогенным связанным на ферменте Трп, а также содержания в ТРСазе важного для активности иона цинка, как необходимых факторов комплексного процесса переключения ТРСазы от канонической аминоаци-лирующей активности к неканонической цитокинной. Путем модификации стандартной процедуры выделения фермента ТРСазы, изменением содержания эндогенного триптофана и снижением содержания

иона цинка в ферменте, смоделированы важные для поддержания гомеостаза клетки и тканей процессы перехода между основной формой исходной нат-ТРСазы и ее модифицированной цитокинно активной формами. Переход нат-ТРСазы в модифицированную форму в результате указанных модификаций фермента, и стимулируемого ими отщепления N-концевого фрагмента в 20 кД, продемонстрирован хроматографическими и иммунохимическими методами и подтвержден методами электрофореза и иммуноблоттинга.

Материал и методы

Все используемые в работе реагенты были чистые для анализа или химически чистые. В работе использовали [3H]-L-Tryptophan, 30 Ки/ммоль (Amersham, Великобритания); L-триптофан, трис-гидрохлорид (натриевая соль), динатриевую соль АТФ, ЭДТА, бромид цетилтриметиламмония (цетавлон), 2-меркап-тоэтанол, бычий сывороточный альбумин (фракция V) (БСА), акриламид, N^'-Метилен-бис-акриламид, додецилсульфат натрия (ДДС-Na), фенилметил-сульфонилфторид (PMSF), о-фенантролин, Кумас-си бриллиантовый голубой R-250, сефадексы G-75 и G-100 fine (Sigma, США); нитроцеллюлозные фильтры BA 85 (Schleicher and Schuel); фильтры 3 ММ (Whatman) США; аффинные колонки HiTrapTM Streptavidin HP (GE Healthcare, Швеция); активированный уголь Norit(r), 250 г (Fluka, ФРГ); набор для иммуноблоттинга (Thermo Sci., США); деионизированную воду получали с помощью системы «Milli Q» (Millipore, США).

Выделение и характеристика препарата

фермента ТРСазы

Исходную нат-ТРСазу выделяли из бычьей поджелудочной железы и охарактеризовывали как описано в [10]. Реакционная смесь в объеме 60 мкл, содержала 20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ MgCl2, 0,05 мг/мл БСА, 0,1 мМ [14C] L-триптофан или [3H] L-триптофан (54 мКи/моль, «Amersham»), 50 мМ Kcl, 1,0 мМ ЭДТА, 2,5 мМ АТФ, 7 мг/мл суммарной дрожжевой тРНК (при использовании частично очищенных препаратов тРНКТрп их концентрация в смеси составляла 0,2 мкМ) и, в среднем, по 10 мкг белка из фракций. Инкубировали смесь 1—2 мин при 37°С. Включенную в тРНКТрп радиоактивную метку измеряли в сцинтилляторе на счетчике как описано [10]. Хроматографическое разделение различных форм ТРСазы осуществляли на колонках ДЭАЭ-целлюлозы ДЕ-52 (5x15 см), уравновешенной 20 мМ трис-HCl, рН 7.5, 0,2 мМ L-триптофан, 1,0 мМ Mg-АТФ, и элюировали фракции ступенчатым градиентом NH4Cl (0,09 М, 0,14 М, 0,2 М) в буфере А (25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,2 мМ L-триптофана, 1 мМ Mg-АТФ). Фракцию, отобранную при 0,14 М соли, подвергали повторной хроматографии на колонке ДЭАЭ-целлюлозы ДЕ-52 при линейном градиенте NH4Cl 0,1-0,16 М в буфере А.

Получение моноспецифических антител к ТРСазе. Иммунизацию кроликов, получение поликлональных и моноспецифических антител осуществляли по протоколам иммунизации и методикам, описанным в работе [11]. Получения моноспецифических антител к различным к N-концевым и C-концевым частям молекулы ТРСазы проводили в соответствии с методи-

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

225

ками, описанными в работе [12] c использованием стандартных фирменных аффинных колонок HiTrapTM Streptavidin HP (GE Healthcare, Швеция) объемом в 1 мл с адсорбированным очищенным исходным препаратом нат-ТРСазы и усеченной модиф-ТРСазы в концентрации 10мг/мл в объеме 1 мл как описано в работе [11]. Все элюированные препараты моноспецифических антител диализовали против фосфатно-солевого буфера (PBS) и концентрировали ультрафильтрацией до 1—2 мг/мл. Наличие различных форм ТРСазы в элюатах с колонок определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) как описано в [12].

ДСН-ПААГ электрофорез аликвот белка осуществляли в системе Лэммли. Аликвоты из фракций центральных областей пиков профиля элюции с ДЕАЕ-колонок и колонок с сефадексом G-100, нормализованные по белку (до 1 ое/мл) в объеме 5—10 мкл обрабатывали 1/10 объема денатурирующего раствора с 10% ДДС-Na, 1,0 М 2-мер-капто-этанола и 0,05% бромфенолового синего, после прогревания в кипящей водяной бане 2 мин наносили на 10% ПААГ гель. Электрофорез проводили при 80 V и токе 30 mA. Гели прокрашивали Coomassie brilliant blue R-250 (Serva) и отмывали в 7% CH3COOH ночь. В качестве маркеров молекулярной массы белков взят набор маркеров фирмы «Fermentas» (Литва). Для иммуноблоттинга картину разделения в ПААГ геле переносили на мембраны BA 85 (Schleicher and Schuell) с величиной пор 0,45 мкм, как указано в работе [13]. Фильтры проявляли c использованием набора для иммуноблоттинга (Thermo Sci., США) в растворе 0,05% 4-СИ-нафтол в 50 мМ трис-HCl, рН 7,5 и 0,05% перекиси водорода. При необходимости, второй фильтр, использованный в иммуноблоттинге, прокрашивали Кумасси бриллиантовым голубым R-250 (Sigma) и промывали 5% уксусной кислотой.

Удаление эндогенного триптофана

Для удаления эндогенного триптофана из исходной ТРСазы препарат фермента пропускали в буфере, содержащем 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола через колонку с активированным углем, как указано в работе [14]. Полученный препарат после концентрирования ультрафильтрацией до концентрации ~ 5 ое/мл далее пропускали через колонку 2,5x50 см (BioRad 7372551), уравновешенную буфером А: 25 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ 2-меркапто-этанол, содержащим 0,1 М NH4Cl. После этой процедуры, содержание эндогенного триптофана снижалось на 20—30%. Оценку эндогенного триптофана осуществляли, как описано в [14], путем пропускания препарата фермента через колонки с активированным углем. В среднем концентрация белка ТРСа-зы в элюате достигала 2,0 оптических ед/мл. Затем проводили диализ ТРСазы в течение ночи при 4°С против буфера А, очищенного от следовых примесей цинка или против 5 мМ раствора о-фенантролина как описано в работе [6]. Очищенный препарат фермента концентрировали ультрафильтрацией до 8 ое/ мл и хроматографировали на колонках с сефадек-сом G-100.

Содержание Zn2+ устанавливали в буферных растворах фермента в деионизированой воде как описано в работе [7]. Следовые примеси тяжелых

металлов, включая Zn, удаляли из буферов и растворов обработкой дитизоном [7] и последующим пропусканием через колонку со смолой Челекс-100. Содержание иона цинка в препаратах ТРСазы определяли методом атомно-абсорбционного анализа, как указано в работе [8]. Препарат фермента разводили до концентрации 1—5 мкМ 0,01 М буфером трис-HCl, рН 7,5, который не мешает определению Zn2+ методом атомной абсорбции. Содержание Zn2+ определяли по градуировочному графику (0,02—0,2 мкг/мл). Точность метода составляла ± 5% [8].

Для анализа форм ТРСазы (содержащей, либо лишенной Zn2+) использовали метод иммуноферментного анализа с использованием специфичных к N- и С-концевым фрагментам ТРСазы моноспецифических антител, как описано выше. Для этого брали 100 мкл раствора препарата исходной ТРСазы, обедненного по Zn2+ препарата ТРСазы, либо из фракций элюата с колонок и наносили в лунки 96-луночной ИФА-планшеты. Сорбцию на поверхности лунок ИФА-планшета из раствора с концентрацией в пределах 1—5 мкг/мл проводили в течение 10 ч при 4°С. По окончании инкубации планшет промывали фосфатно-солевым раствором с 0,1% твин-20 (PBST). Свободные центры связывания блокировали 2% обезжиренным молоком, инкубируя планшет в течение 1 ч при 37°С. Затем планшет промывали PBST, в лунки вносили моноспецифические антитела (1—5 мкг/мл) к N-концевым участкам ТРСазы, и инкубировали 1 ч при 37°С. После промывания, в лунки планшета вносили конъюгат пероксидазы хрена и кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали PBST. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора субстрата пероксидазы хрена (1 мг/мл в 1% цитратном буфере, содержащем 0,05% Н2О2 при рН 4,5). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2М Н^04. Интенсивность окраски регистрировали спектрофотометрически [12].

Результаты и обсуждение

Альтернативный сплайсинг (АС), являясь одним из важных элементов регуляции действия генов и обеспечивая процессы развития тканей и организма, находится под строгим генетическим контролем цис- и транс-действующих факторов, а также эпигенетическим контролем [15]. Несмотря на важный вклад АС в процессы обеспечения структурного и функционального разнообразия продуктов генов, он является лишь вспомогательным инструментом сложнейшего комплекса процессов пострансляцион-ного процессинга и модификации белков защитных систем организма, таких как апоптоз, убиквитин-протеасомная система, каскады протеолитической регуляции реакций природного иммунитета, часто являясь отражением патологических состояний организма [2]. Вопросы тканеспецифической регуляции сплайсинга ТРСазы недостаточно изучены, а сложность регуляции сплайсинга на транскрипционном и пост-транскрипционном уровнях может быть излишней, не позволяющей обеспечивать быстрый ответ на изменения внешней и внутренней среды организма. Следовательно, описанный для ТРСазы весь комплекс структурных и регуляторных аспектов обеспечения АС [7], скорее всего, не мог объяснить все аспекты регуляции неканонических функций фермента. С другой стороны, процессы эндоген-

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

226

Оригинальные исследования

ного ограниченного протеолиза важны для множества процессов жизнедеятельности клеток и тканей, включая процессы дифференцировки и развития тканей, транспорт белков, презентации антигенов, заживление ран, процессы ангиогенеза и антиангиогенеза [16].

Хотя известна важная антиинфекционная роль снижения уровня доступного триптофана во внеклеточной среде в результате параллельной стимуляции (при действии интерферона-у) экспрессии индо-ламиноксидазы (IDO), метаболизирующей данную аминокислоту и ТРСазы, сохраняющей ее для клетки в форме аминоацилированной тРНКТрп, остаются нераскрытыми механизмы повышенной экспрессии ТРСазы в поджелудочной железе (ПЖ), соотношение и роль канонических и защитных неканонических активностей ТРСазы, а также механизмы переключения указанных активностей ТРСазы.

Большое значение имеют как механизмы тканеспецифической регуляции экспрессии и функций ТРСазы, так и видовые особенности этих процессов. Особенно ярко эта специфика проявлялась, по данным различных авторов, в связи с функциями существенного для активности иона Zn2+ в ферменте [17]. Сравнительный анализ показал большую устойчивость к потере цинка бычьего фермента, что подтвердило ранние наши наблюдения [8]. Следую-

щим аспектом проблемы может быть меньший эффект стимуляции экспрессии ТРСазы при действии интерферона гамма в случае бычьего фермента и фермента из других млекопитающих [17]. Все это показывало актуальность изучения взаимосвязи процессов эндогенного протеолиза, связанного на ферменте эндогенного Трп и цинка в процессах переключения функций ТРСазы, через изменения соотношения форм фермента в клетке и тканях.

Нами, путем модификации стандартной процедуры выделения ТРСазы [10] смоделированы процессы перехода ТРСазы из исходной канонической формы (нат-ТРСаза) в неканоническую форму (мо-диф-ТРСаза). Путем тщательного подбора качества исходного сырья (поджелудочной железы быков осеннего забоя), при проведении стандартной оригинальной методики очистки нат-ТРСазы содержание исходной формы нат-ТРСазы достигало более 90% от суммарного белка, элюируемого 0,14 М NH4Cl с ДЭАЭ-колонки. Авторами в ходе многократных процедур выделения фермента удавалось стабильно воспроизводить этот результат. Эксперимент по модификации процедуры очистки ТРСазы воспроизводил условия эндогенного протеолитического перехода нат-ТРСАаза ^ модиф-ТРСаза в условиях защитного действия эндогенных, связанных на ферменте субстратов (L-Trp и АТФ) (рис. 1А, Б).

А

Рис. 1.

Профили элюции различных форм ТРСазы:

А — фермента с анионообменной колонки ДЕ-52 (1 — пик белка при ионной силе, соответствующей 0,09 М NH4CI; 2 — пик белка при ионной силе, соответствующей 0,14 М NH4CI или 0,16 М NH4CI);

Б — модифицированной формы ТРСазы со второй колонки ДЕАЕ-целлюлозы ДЕ-52.

А280 — оптическая плотность элюата при 280 нм

Объем элюата, мл

Б

Моделирование превращения нат-ТРСАаза ^ модиф-ТРСаза ^

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

х

0_

X

о

о

о

ОчГ

о

Номер фракций

♦ Профиль элюции с колонки

Л Активность различных форм ТРС-азы в реакции аминоацилирования тРНКТрп

[] интенсивность иммунной реакции антиген-антитело в % к максимальным значениям сигнала во фракциях

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

227

Модификация исходной методики выделения нат-ТРСазы [10] заключалась в исключении стадии добавления сильного ингибитора протеаз диозопропил-фторфосфата (ДФФ) на ранних этапах получения экстракта измельченной ПЖ. Умеренный ингибитор протеаз — фенилметилсульфонилфторид (PMSF) вносили в буфер на колоночных стадиях фракционирования фермента. Кроме этого, из стандартной процедуры выделения нат-ТРСазы убрали стадию гель-хроматографии на сефадексе G-100 и заменили ее второй колонкой с ДЭАЭ-целлюлозой ДЕ-52 с использованием линейного градиента соли NH4Cl в буфере А. Профиль хроматографии состоял из двух пиков с приблизительно равными количествами (в соответствии с площадями пиков) форм нат-ТРСазы и модиф-ТРСазы. Фракции соответствующих пиков подвергали иммуноферментному анализу c использованием моноспецифических антител к модиф-ТРСазе и к N-концевой части нат-ТРСазы. Параллельно фракции из области пика, соответствующие наибольшей гомогенности форм ТРСазы, подвергали процедурам электрофореза в денатурирующих условиях в ПААГ в системе Лэммли и далее, для подтверждения результатов иммуноферментного анализа, проводили процедуры иммуноблоттинга гелей (рис. 2А, Б). Из приведенных графиков видно, что первый пик соответствует гомогенному препарату нат-ТРСазы, причем пики иммуноферментного реагирования строго соответствуют наличию соответствующих эпитопов в элюируемых формах ТРСазы (см. рис. 1Б). Результаты иммунохимического анализа, адекватность выбранного подхода к изучению механизма перехода форм ТРСазы в ходе эндогенного протеолиза и методики разделения и очистки форм ТРСазы, четко и однозначно подтверждаются проведенным электрофоретическим (ЭФ) анализом фракций элюата в области пиков.

Рис. 2. Молекулярно-массовый состав аликвот фракций хроматографического разделения различных форм ТРСазы на колонке ДЕАЕ-целлюлозы ДЕ-52:

А — ДСН-ПААГ электрофорез в области пиков градиентного фракционирования; дорожка 5 — маркеры молекулярной массы (сверху вниз: фосфорилаза B, БСА, овальбумин, карбоангидраза, fi-лактоглобулин, лизоцим);

Б — иммуноблоттинг результатов ДСН-ПААГ электрофореза с использованием моноспецифических антител к различным формам ТРСазы

Видно, что отобранные фракции области пиков содержат практически гомогенные формы 60x60 кД и 40x40 кД, соответственно (рис. 2А, дорожки №1—4 и 6—9, соответствующие фракциям № 18, 20, 22, 24 и 64, 66, 68, 70 элюата с колонок ДЕАЕ-цел-люлозы; рис. 1Б). Окончательным доказательством идентичности полученных белковых форм с белком ТРСазы, а также наличия (или отсутствия) важного для проявления основных канонических функций и деблокирования при удалении неканонических функций фермента N-концевого фрагмента, служит иммуноблоттинг картины ЭФ разделения с использованием моноспецифических антител к N-концевой части ТРСазы. Видно наличие мощного сигнала к исходной полноразмерной нат-ТРСазе (рис. 2Б, дорожки № 1—4), и их практическое отсутствие на усеченную модиф-ТРСазу (дорожки № 6—9).

Была проведена серия экспериментов по частичному удалению эндогенного Трп и существенному снижению уровня содержания Zn2 + в препаратах ТРСазы. Ранее нами уже наблюдалась существенная лабилизация эндогенного протеолиза при удалении эндогенного Трп. Мы изучили, как на этот процесс повлияет удаление Zn2 + . В ранних работах мы наблюдали снижение активности лишенного Zn2+ фермента [8]. Это несколько не согласовывалось с данными [17]. Мы ранее [8] не проверяли влияние удаления Zn2+ с препарата ТРСазы на процессы возможного эндогенного протеолиза фермента. В опыте, иллюстрированном на рисунке 3, препарат фермента исходный и подвергнутый процедурам удаления эндогенного Трп и Zn2+, подвергали хроматографическому анализу на колонках c сефадексом G-100. Видно, что пики активностей ТРСазы, содержание Zn2+, и иммунный ответ на соответствующие моноспецифические антитела строго совпадают с пиком белка ТРСазы, причем расположение пика профиля элюции с колонки соответствует выходу нат-ТРСазы с молекулярной массой 60x60 кД. После удаления Zn2+ (рис. 3Б), наблюдалось существенное изменение профиля с появлением основного пика, соответствующего модиф-ТРСазе с массой 40x40 кД, с сохранившимся плечом, соответствующим исходной нат-ТРСазе, с содержанием, приблизительно 20% по площади пиков. Причем наблюдалась потеря активности препарата в основном пике (рис. 3Б), отсутствие Zn2+ и реакции на N-концевые моноспецифические антитела. Полученные результаты также объясняют отсутствие полной инактивации в препаратах бычьей ТРСазы при удалении Zn2+. Скорее всего, остаточная активность представляла собой процент исходной, не подвергнутой эндогенному протеолизу нат-ТРСазы в обедненных по Zn2+ препаратах. Получает при этом объяснение и важность наличия значительного количества лишенного Zn2+ апофермента ТРСазы в ПЖ и роль эндогенного Трп. Известно из данных других авторов, что Ap3A существенно стимулирует секрецию инсулина в бета клетках ПЖ [18]. Из наших данных, полученных ранее, следовало, что удаление цинка с фермента активизирует синтез Ар3А. Все это, вместе с выявленной в ходе серии процедур получения гомогенных препаратов ТРСазы суперэкспрессией фермента в ПЖ, позволяет сформулировать стройную гипотезу о важной тканеспецифической роли ТРСазы в ПЖ. Она заключается в том, что связанный эндогенный Трп на ферменте способствовал выполнению тканеспецифической регуляторной

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

228

Оригинальные исследования

функции ТРСазы, через частичное блокирование, вместе с другими субстратами процессов эндогенного протеолиза ТРСазы, способствуя сохранению повышенного уровня нат-ТРСазы, которая на фоне частичной обедненности в содержании иона цинка на ферменте стимулировала синтез вторичного мессенджера Ар3А и секреции инсулина бета клетками ПЖ.

Проведенный цикл экспериментов позволяет утверждать, что в случае ТРСазы, существенный вклад в регулируемые переходы между формами фермента вносят, именно, пост-трансляционные механизмы,

включающие ковалентные или нековалентные модификации фермента, действие кофакторов и резкую активацию экспрессии (или деблокирование активности) эндогенных, индуцируемых интерфероном-у протеаз [19]. Однако в работе [7], несмотря на подробное изучение механизма стимуляции экспрессии ТРСазы интерфероном-у и выявлением основных «мотивов», возможно, участвующих в АС, не было выявлено наличие специфических цис-регуляторных последовательностей АС, а выявленные множественные формы пре-мРНК могли быть отражением стресса, испытываемого клетками в культуре.

Хроматография исходной нат-ТРСАазы на колонке с сефадексом G-100

Номер фракции

Ряд 2  Ряд 1 Ряд 3  . Ряд 4

Б

Роль Zn2+ в переходе нат-ТРСАаза ^ модиф-ТРСаза

Номер фракции I Ряд 2 * Ряд 1 * Ряд 3

Ряд 4

Рис. 3. Профиль элюции ферментов с колонки с сефадексом G-100:

А — исходного фермента ТРСазы; Б — обедненного по Zn2+ и содержанию эндогенного Трп препарата ТРСазы. Ряд 1 — содержание Zn2+ в препаратах фермента во фракциях; ряд 2 — иммунный ответ в реакции ИФА,

-% от максимального значения; ряд 3 — активность ТРСазы в реакции аминоацилирования тРНКТрп; ряд 4 — профиль оптической плотности

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

229

С помощью серии простых экспериментов, явившихся результатом многолетних наблюдений, мы показали наличие альтернативного, а, возможно, и основного механизма переключения от канонических к неканоническим функциям ТРСазы. Вероятно, в определенных стрессовых условиях не исключена и реализация механизма АС. Однако, известно, что АС находится под строгим контролем цис-регуляторных последовательностей и транс-действующих белковых факторов, связывающихся с этими последовательностями и позволяющих сплайсесомам «распознать» участки и приступить к процессу сплайсинга. Следовательно, можно говорить о наличии, так называемого, «кода сплайсинга», отвечающего за тканеспецифическую, зависимую от стадии развития или конкретного физиологического состояния организма, регуляцию сплайсинга. Таким образом, на данном этапе познания механизма регуляции образования различных форм ТРСазы, мы можем утверждать об активном участии посттрансляционных механизмов в данном процессе, что подтверждается рядом наблюдений аналогичных механизмов другими авторами [16]. Полученные в работе данные указывают на значительную роль, именно, посттрансляционных механизмов в регуляции переключения от канонических к неканоническим функциям

ЛИТЕРАТУРА:

1. Grigorenko EL, Dozier M. Introduction to the special section on genomics. Child Dev. 2013; 84(1): 6-16.

2. Wang Y., Qin Z. Coordination of autophagy with other cellular activities Acta Pharmacologica Sinica 2013; 34: 585-94.

3. Rahimi N. The Ubiquitin-proteasome system meets angiogenesis. Mol. Cancer Ther. 2012; 11: 538-48

4. McIlwain D.R., Berger T., Mak T.W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5(4): 1-29.

5. Yao P., Fox P.L. Aminoacyl-tRNA synthetases in medicine and disease. EMBO Mol. Med., 2013; 5: 332-43.

6. Kim S., You S., Hwang D. Aminoacyl-tRNA synthetases and tumorigenesis: more than housekeeping. Nat. Rev. Cancer. 2011; 11(10): 708-18

7. Liu J., Shue E., Ewalt K.L. et al. A new g-interferon-inducible promoter and splice variants of an anti-angiogenic human tRNA synthetase. NAR 2004; 32 (2): 719-27.

8. Nurbekov M.K., Kisselev L.L., Favorova O.O. et al. Bovine tryptophanyl-tRNA synthetase — a Zinc metalloenzyme. Eur. J. Doklady Biochem. 1981; 120 (3): 511-17.

9. Nurbekov M.K., Rasulov M.M., Voronkov M.G. et. al. The complex of zinc bis-(2-methylphenoxyacetate) with tris-2(hydroxyethyl) amine as an activator of synthesis of total tryptophanyl-tRNA synthetase. Biochem. Biophys. 2012; 444: 147-8.

10. Kisselev L.L., Favorova O.O., Kovaleva G.K. Tryptophanyl-tRNA synthetase from beef pancreas. Methods Enzymol. 1979; 59: 234-57.

ТРСазы, что не исключает, в определенной степени, вклад и АС, конкретные механизмы которого не ясны, в отличие от комплекса изученных, в том числе, в данной работе, посттрансляционных механизмов регуляции.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доцентам М.Я. Ибрагимовой и Т.А. Невзоровой (кафедра биохимии Казанского федерального университета) за методическую и консультативную помощь при получении препаратов моноспецифических антител и получении исходных препаратов фермента, А.Б. Ильина и Л.Г. Морозову — за помощь в экспериментах и участие в обсуждении работы. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа финансировалась из средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности, а также поддержана грантом 2013 года Института перспективных гуманитарных исследований и технологий и ректората МГГУ имени М.А. Шолохова (М.К.Н. и Р.И.Ж.).

11. Hjelm B., Forsstrom B., Igel U. et al. Generation of monospecific antibodies based on affinity capture of polyclonal antibodies. Protein Sci. 2011; 20(11): 1824-35.

12. KPL Technical Guide for ELISA. http://www.kpl.com/docs/ techdocs/KPL%20ELISA%20Technical%20Guide.pdf.

13. Favorova O.O., Zargarova T.A., Rukosuyev V.S. et al. Molecular and cellular studies of tryptophanyl-tRNA synthetases using monoclonal antibodies. Remarkable variations in the content of tryptophanyl-tRNA synthetase in the pancreas of different mammals. Eur. J. Biochem., 1989; 184: 583-88.

14. Iborra F., Dorizzi M., Labuesse J. Aminoacylation of tRNA Trp from beef liver, yeast and E. coli by beef pancrease tryptophan-tRNA ligase. Stoichiometry of tRNATrp binding. Eur. J. Biochem. 1973; 39: 275-82.

15. Gomez Acuna L., Fiszbein A., Allo M. et al. Connections between chromatin signatures and splicing. WIREs RNA 2013; 4: 77-91.

16. Min Guo M., Schimmel P. Essential nontranslational functions of tRNA synthetases. Nature Chemical Biology 2013; 9: 145-53.

17. Wakasugi K. Human tryptophanyl-tRNA synthetase binds with heme to enhance its aminoacylation activity. FEBS Lett. 2010; 584: 229-32.

18. Silvestre R.A., Rodriguez-Gallardo J., Egido E.M. et al. Stimulatory effect of exogenous diadenosine tetraphosphate on insulin and glucagon secretion in the perfused rat pancreas. Br. J. Pharmacol., 1999; 128(3): 795-01.

19. Sharony R., Yu P.J., Park J. et al. Protein targets of inflammatory serine proteases and cardiovascular disease. Inflammation 2010; 7 (45): 1-17.

Поступила: 22.08.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014