СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННОГО ТЕХНЕЦИЕМ-99м ДОКСОРУБИЦИНА
METHOD OF PREPARING REAGENT FOR PRODUCING TECHNETIUM-99m LABELLED DOXORUBICIN

Изобретение относится к области фармацевтической химии, в частности, к способам получения реагентов для приготовления радиофармпрепаратов (РФП), применяемых для диагностики в онкологии.
99m
Введение изотопной метки технеция-99 м (Тс) в структуру противоопухолевого антибиотика доксорубицина гидрохлорида (ДОКС) явилось новым подходом к проблеме визуализации злокачественных новообразований (ЗНО) и прогноза эффективности противоопухолевой терапии. Обосновывается это тем, что антибиотик антрациклинового ряда доксорубицин подавляет синтез ДНК и РНК в раковых клетках и имеет высокое противоопухолевое и противолейкозное действие, обусловленное изменением клеточных функций. Эти свойства обеспечивают высокую специфичность РФП на их основе к очагам ЗНО.
99m
Противоопухолевая химиотерапия доксорубицином прочно вошла в практику лечения большинства онкологических заболеваний и проведение предварительных исследований с меченным Тс доксорубицином помогло бы определить чувствительность ЗНО к данному препарату и проведение эффективной противоопухолевой терапии.
Первые исследования показали, что меченный Тс доксорубицин избирательно накапливается в опухолевой ткани.
В настоящее время известно несколько лабораторных методик приготовления доксорубицина, меченного технецием-99 м.
99m
Так, например, известен способ приготовления [Liang Shan, PhD, 99mTc-Labeled doxorubicin // Created: December 3, 2012; Last Update: January 2, 2013, PubMed. Chemical name: 99mTc-Labeled doxorubicin] путем смешивания во флаконе водного раствора доксорубицина с переменными концентрациями (20, 50, 100, 200, 400 и 1000 мкг) хлорида олова. Затем к смеси добавляли раствор пертехнетата натрия, Тс (40,0 МБк) и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Радиохимическая чистота (РХЧ) полученного препарата составляла 95%.
99m
99m
В методике [Faheem A. Rizvi, Tanveer Н. Bokhari, S. Roohi, A. Mushtaq. Direct labeling of doxorubicin with technetium-99m: its optimization, characterization and quality control // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry - 2012. - V 293. - p. 303-307] доксорубицин меченый Tc был подготовлен смешиванием во флаконе, 200 мкг доксорубицина, 12 мкг олова хлорида дигидрата и 370 МБк раствора натрия пертехнетата, Тс, pH в диапазоне 6-7 доводили с помощью 0,5 М NaOH. Полученную смесь инкубировали 15 минут при комнатной температуре и в темноте, т.к. лиганд светочувствительный. РХЧ препарата была равной 92% и оставалась стабильной в течение 5 часов.
99m
По способу, предложенному в работе [Andras Polyak, Elena Alina Palade, Lajos Balogh et al. In vitro and biodistribution examinations of Tc-99m-labelled doxorubicin-loaded nanoparticles //. Nuclear Medicine Review. - 2011. - V. 14. - No.2. - p. 55-62], меченый Tc доксорубицин был приготовлен путем предварительного смешивания во флаконе 200 мкг хлорида олова с 2 мл Doxo-HSA-Коллоид. Инкубировали при комнатной температуре 2 ч. После в полученный раствор вводили 1 мл (500 МБк) элюата натрия пертехнетата и проводили инкубацию в тех же условиях еще в течение часа. РХЧ - 95%.
99m
99m
2
2
Наиболее близким к заявляемому является способ, приведенный в работе [Pardeep Kumar, Baljinder Singh, Shalini Chopra, et al. Indigenous development of a single vial kit preparation of Tc-doxorubicin and its preclinical evaluation // Journal of Nuclear Medicine - 2013. - V.54. - No. 2. - p. 1126], в соответствии с которым меченный Tc доксорубицин был подготовлен путем предварительного смешивания во флаконе 1,0 мл раствора ДОКС с концентрацией 2 мг/мл, 0,05 мл раствора хлорида олова, содержащего 2 мг SnCl·2HO в 1 мл уксусной кислоты. pH доводили до 5,5 с помощью 0,1 N NaOH. Составляющие реагента лиофилизировали в течение 24 ч. В полученный реагент вводили 4 мл элюата технеция-99 м (0,5-1,1 ГБк) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Препарат имеет РХЧ более 95%.
99m
Главным недостатком способа, как и всех приведенных методик введения изотопной метки Тс в структуру доксорубицина, является то, что все они недостаточно удобны для прямого получения радиофармпрепарата в условиях клиник, поскольку субстанция доксорубицина нестабильна при изменении кислотности, к тому же применение уксусной кислоты для приготовления раствора олова требует проведения дополнительных анализов при определении качества радиофармпрепарата.
99
99m
99m
99m
Таким образом, до настоящего времени остается нерешенной задача приготовления реагента в виде стандартного набора для Мо/Тс-генератора, при взаимодействии которого с элюатом Тс из генератора, будет получаться РФП «Доксорубицин, Тс» с заданными свойствами и требуемыми показателями качества.
99m
Технический результат заключается в повышении стабильности реагента для получения радиофармпрепарата "Доксорубицин, Тс".
Указанный технический результат достигается тем, что в способе приготовления реагента для получения меченного технецием-99 м доксорубицина, включающем приготовление раствора олова (II) хлорида дигидрата, его смешивание с порошком доксорубицина гидрохлорида и лиофильную сушку смеси, согласно изобретению, раствор олова (II) хлорида дигидрата готовят путем разведения в соляной кислоте, а в смесь добавляют 1 мл буферного раствора pH 4,01, замораживают при температуре жидкого азота и затем подвергают лиофильной сушке при температуре Т=-50°C в вакууме - 0,0015 Торр в течение не менее 20,5 часов, с последующим досушиванием в течение не менее 5,5 часов при температуре +16±2°C.
На фиг.1 изображена сцинтиграмма тела мыши через 1 ч после внутривенного введения радиофармпрепарата на основе меченного технецием-99м доксорубицина, который был получен из реагента, приготовленного по предлагаемому способу.
2
2
Осуществление способа рассмотрим на примере конкретного выполнения. В мерную пробирку вносят навеску олова (II) хлорида дигидрата (SnCl·2HO) массой 0,07 г, осторожно приливают 0,2 мл 1М соляной кислоты (НСl). По окончании растворения доводят объем кипяченой дистиллированной водой до 10 мл. Полученный раствор имеет концентрацию олова 7 мг/мл. Использовали только свежеприготовленный раствор. Преимущество данной методики приготовления раствора олова состоит в том, что в водных растворах соляная кислота диссоциирует практически полностью на водородные и хлорид ионы. В дальнейшем при проведении анализа качества полученного РФП это избавляет от сложного анализа по определению концентрации уксусной кислоты в составе РФП.
Во флакон вместимостью 10 мл вносят 3-4 мг порошка доксорубицина гидрохлорида, 0,25-0,30 мг приготовленного раствора олова и 1 мл буферного раствора pH 4,01, например фталатного.
Содержимое флакона замораживают, погружая его в контейнер с жидким азотом. После этого флакон помещают в камеру сублиматора и подвергают лиофильной сушке в течение не менее 26 часов. На первом этапе лиофилизацию проводят при заданных параметрах лиофилизатора: Т=-50°C в вакууме - 0,0015 Торр в течение не менее 20,5 часов. На втором этапе флакон перемещают в верхнюю лиофильую камеру и проводят досушивание в течение не менее 5,5 ч при +16±2°C.
Предварительная глубокая и быстрая заморозка важна для получения качественного продукта, т.к. размеры кристаллов льда получаются меньше и они быстрее испаряются на следующем этапе.
В ходе лиофилизации лед удаляется из замороженного образца в процессе возгонки. Процесс осуществляется за счет работы коллектора и вакуумного насоса. Для обеспечения этого процесса в рабочей камере создается высокий вакуум (0,0015 Торр). Температура коллектора, в котором конденсируется пары воды и растворителя, должна быть минимум на 15-20°C ниже, чем температура плавления образца.
Такие параметры процесса, как температура сушки, величина вакуума, температура конденсации, взаимозависимы и изменения одного из них неизбежно ведет за собой изменение других параметров.
Процесс досушивания при температуре ниже 16±2°C протекает более длительное время, при температуре выше +20°C происходит агломерация частиц.
В работе использовали лиофильную сушилку FreeZone (Labconco).
99m
Из приготовленного реагента получили радиофармпрепарат, путем внесения во флакон с реагентом 5 мл раствора натрия пертехнетата, Тс с активностью 110-1480 МБк/мл с последующим инкубированием в течение 20 мин до полного растворения. Радиохимическая чистота полученного радиофармпрепарата составила 98,2% на момент приготовления и 96,7% через 8 часов после приготовления. Испытания, проведенные на экспериментальных животных, показали, что после внутривенного введения радиофармпрепарат активно накапливается в перевитых злокачественных новообразованиях мышей более чем в 2 раза по сравнению с контралатеральной стороной (фиг. 1), что соответствует должному и свидетельствует о сохранении качества радиофармпрепарата.
Описанный выше способ по сравнению с известными ранее имеет преимущество, заключающееся в стабилизации pH радиофармпрепарата на основе меченного технецием-99м доксорубицина.