Способ получения бетулина
METHOD OF OBTAINING BETULIN

Изобретение относится к фармацевтической, парфюмерной, пищевой и химической отраслям промышленности, а именно к способу выделения бетулина формулы I из бересты белоствольных берез. Фармакологическая и фармацевтическая активность бетулина высока, достаточно хорошо исследована и в настоящее время интерес к его свойствам только возрастает. На его основе синтезируют перспективные фармацевтические препараты, обладающие гастро-, гепатопротекторными, антивирусными свойствами и противоопухолевой активностью; он используется в качестве компонента пищевых биологически активных добавок антиоксидантного действия. Эфиры бетулина используют в качестве эмульгаторов в парфюмерно-косметической промышленности. Получаемый различными способами бетулин может быть использован для приготовления фармацевтических препаратов и в качестве компонента пищевых биологически активных добавок оздоравливающего и профилактического действия.
пл
Бетулин представляет собой белый кристаллический порошок с Т=261-262°C, относится к тритерпеноидам лупанового ряда, а его содержание в бересте может достигать 35% по массе. Бетулин растворим в толуоле, этилацетате, низших спиртах и нерастворим в воде.
Во многих российских и зарубежных научных центрах ведутся работы по извлечению и химической модификации бетулина, сопутствующих веществ и их производных, проявляющих биологическую активность и представляющих интерес для фармацевтической, парфюмерной, пищевой и химической промышленности. Такие исследования проводятся, например, в институте химии и институте биологии Уфимского НЦ РАН, Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, институте химии и химической технологии СО РАН, Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, НИИ эпидемиологии и микробиологии Республики Беларусь, University of Minnesota-Duluth, USA; University of South Bohemia, Czech Republic; Kyoto Pharmaceutical University, Japan и др.
Известные в настоящее время способы получения бетулина имеют недостатки, приводящие к невысокой степени извлечения продукта высокого качества, многостадийности и значительной продолжительности процесса выделения и очистки.
Для интенсификации процессов выделения бетулина из внешнего слоя коры березы в настоящее время используют различные способы предварительной обработки растительного сырья, направленные на обеспечение последующего ускоренного доступа экстрагента к экстрагируемой клетке.
Известен способ интенсификации процесса экстракции бересты путем взрывного автогидролиза или неизобарного парокрекинга [1]. Бересту сначала подвергают активации при обработке паром в условиях неизобарного парокрекинга при температуре 180-260°C и давлении 2-5 МПа в течение 1-6 минут, затем щелочному гидролизу в водно-спирто-щелочной среде с последующим извлечением бетулина экстракцией спиртами. Выход бетулина составляет 25-37% от веса абсолютно сухой бересты. Недостатком данного способа является его технологическая сложность, так как способ включает три стадии: активация в условиях неизобарного парокрекинга при высокой температуре и повышенном давлении, щелочной гидролиз в водно-спирто-щелочной среде и экстракцию бетулина спиртом.
Близкий к описанному способ получения бетулина [2] предусматривает активацию бересты в условиях неизобарного парокрекинга при температуре 180-260°C, давлении 2-5 МПа и продолжительности активации 1-5 мин в присутствии щелочи (щелочной гидролиз), взятой в количестве 5-20% от веса абсолютно сухой бересты с последующей экстракцией бетулина спиртом. При реализации этого способа совмещаются стадии активации бересты и щелочного гидролиза, но экстракция бетулина спиртом является отдельной стадией.
Недостатком способа является сложность процесса активации бересты неизобарным парокрекингом, требующим использования повышенного давления и высоких температур для получения перегретого водяного пара. Это усложняет технологию и повышает энергоемкость процесса получения бетулина. Кроме того, при реализации способа возникает необходимость использования достаточно длительной стадии экстракции бетулина, поскольку она протекает в естественных условиях без какой либо интенсификации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения бетулина [3, прототип]. Принятый за прототип способ получения бетулина, включает предварительную активацию бересты и экстракцию бетулина 86%-ным раствором этилового спирта.
Процесс заключается в предварительной активации бересты и экстракции бетулина 86%-ным раствором этилового спирта. Активацию бересты осуществляют путем ударно-акустического воздействия при температуре 70°C. Ударно-акустическая активация (реализуемая, например, ударными воздействиями на дно технологического объема, выполненное в виде мембраны из упругого материала) интенсифицирует гидролиз бересты, которая превращается в гомогенную массу коричневого цвета. Предварительная активация ускоряет переход бетулина в раствор и способствует повышению его выхода. Далее бетулин осаждают из упаренного раствора при разбавлении его водой и отделяют фильтрованием. Выход бетулина составляет 43% от массы абсолютно сухой бересты.
Но существенный недостаток этого способа состоит в том, что бетулин получается низкого качества, загрязненный трудноотделяемой щелочью. Поэтому получение чистого продукта требует дополнительной очистки от щелочи и сопутствующих окрашенных веществ, извлекаемых наряду с целевым продуктом.
Кроме того, в результате ударно-акустического воздействия происходит дополнительное разрушение растительного сырья до сметаноподобной массы с размерами частиц до 1 мкм, что затрудняет последующий процесс фильтрации. Причиной этого является механическое измельчение коры до минимального размера для обеспечения ускоренного доступа экстрагента к поверхности экстрагируемого материала клеток.
Задача, на решение которой направлено предлагаемое техническое решение, - улучшение качества целевого продукта. Основной стадией процесса является проникновение экстрагента к поверхности экстрагируемых клеток путем предварительной активации бересты ультразвуковыми колебаниями с параметрами, обеспечивающими формирование на поверхности частиц бересты взрывающихся кавитационных пузырьков. Воздействия колебаний ультразвуковой частоты с интенсивностью, достаточной для формирования на поверхности обрабатываемых образцов бересты березы, взрывающихся за каждый период колебаний кавитационных пузырьков, - создают потоки экстрагента, проникающие в капилляры частиц сырья, подготавливая сырье к экстракции и ускоряя, затем, процесс извлечения бетулина.
2
2
Сущность предлагаемого технического решения заключается в том, что в заявляемом способе получения бетулина из бересты березы, включающем предварительную активацию бересты и экстракцию бетулина 86%-ным раствором этилового спирта, предварительную активацию осуществляют при помощи ультразвукового воздействия, обеспечивающего на поверхности частиц бересты колебания с интенсивностью в диапазоне 10-15 Вт/см на частоте не менее 20-22 кГц при температуре 40°C в течение 5-25 мин, а последующую экстракцию интенсифицируют ультразвуковым воздействием с уменьшенной до 5 Вт/см интенсивностью колебаний при температуре не менее 40°C в течение времени, определяемого исходным размером частиц бересты березы.
Поскольку структура коры представляет собой капиллярно-пористое тело, в капиллярах и порах (в исходном и высушенном сырье) присутствует большое количество воздуха. Этот воздух создает пробки, препятствующие проникновению экстрагента внутрь сырья. Кавитационные пузырьки, формируемые за счет ультразвуковых колебаний определенной интенсивности, обеспечивают эффективное перемещение экстрагента по капиллярам и удаление путем растворения воздушных пробок за счет звукокапиллярного эффекта [4]. Таким образом, происходит пропитка бересты экстрагентом, который свободно перемещается вдоль капилляров и по их внешней поверхности, что обеспечивает возможность экстракции большинства клеток используемого сырья.
Кроме того, после заполнения капилляров экстрагентом, формируемые на поверхности кавитационные пузырьки продолжают взрываться и вдоль капилляров по экстрагенту начинают распространяться ударные волны, разрушающие структуру сырья и клеточные стенки, создавая трещины и обеспечивая доступ экстрагента к клеткам, подготавливая сырье (бересту березы) к процессу ускоренной экстракции.
При реализации последующей экстракции сниженные по интенсивности колебания уже не способны разрушать механически частички коры и стенки клеток (т.е. не будет происходить разрушение и измельчение частиц), но будет эффективно осуществляться за счет кавитационных потоков интенсивное вымывание экстрагентом целевого продукта. При этом под действием ультразвуковых колебаний происходит более быстрое и активное вымывание бетулина из внутриклеточных тканей бересты березы. Таким образом, интенсификация процесса экстракции ультразвуковыми колебаниями с указанными параметрами и дает возможность увеличить выход бетулина. Активированная по предлагаемому способу береста быстрее экстрагируется этиловым спиртом под действием ультразвука, а при охлаждении в полученном экстракте легче осаждается бетулин, и выпавший, впоследствии, осадок отфильтровывается и высушивается.
Определяющее значение при реализации предлагаемого способа имеют параметры ультразвукового воздействия, при которых способ получения бетулина реализуется с максимальной эффективностью.
2
Предварительно помещенные в раствор этилового спирта частицы бересты необходимо активировать ультразвуковыми колебаниями в режиме развитой кавитации, когда взрывающиеся пузырьки запасают и передают в капилляры максимальную энергию. Это обеспечивается при создании на поверхности сырья колебаний с интенсивностью в диапазоне 10-15 Вт/см на частоте не менее 20-22 кГц при температуре 40°C в течение 5-25 мин [5].
Такой эффект создается при амплитуде колебаний излучающей поверхности УЗ преобразователя 20-30 мкм и легко реализуется на частицах сырья, перемещающихся в экстрагенте на расстояниях, не превышающих 5-15 мм от излучающей поверхности. Продолжительности воздействия в интервале от 5 до 25 минут будет достаточно, чтобы все частицы сырья, находящиеся в замкнутом объеме на расстояниях, превышающих указанное, за счет механического перемешивания были подвергнуты необходимому УЗ воздействию. (Береста березы имеет размеры частиц от минимального в 1 мм до максимального - 15 мм, что обусловлено применением для получения бетулина отходов различных производств, использующих и перерабатывающих березу).
2
Последующую экстракцию интенсифицируют ультразвуковым воздействием с уменьшенной до 5 Вт/см интенсивностью колебаний и амплитуде колебаний излучающей поверхности менее 15 мкм при температуре не менее 40°C при продолжительности процесса, определяемой исходным размером частиц бересты березы. Очевидно, что меньшие по размерам частицы сырья будут проэкстрагированы быстрее. Так, из результатов исследований известно, что полное истощение сырья происходит при указанных режимах ультразвукового воздействия за время, не превышающее 5 мин, при размере экстрагируемых частиц в 1 мм, и может достигать 3 часов при размере частиц коры березы в 10-15 мм [4].
Полученный после реализации процесса экстракт, имеющий температуру ниже температуры кипения растворителя, сливают из реактора через фильтрующий материал, частично упаривают, отгоняя органический растворитель - две трети от первоначального объема. При охлаждении осаждается чистый бетулин, его отделяют фильтрованием и высушивают при температуре 60°C. Сухой остаток представляет собой светло-бежевый порошок, без посторонних включений.
Процесс ультразвукового воздействия на бересту, помещенную в реакторе в раствор спирта (для извлечения бетулина выбран малотоксичный растворитель - этиловый спирт), осуществляется в течение интервала от 5 до 25 мин (табл. 1). Прохождение ультразвуковых колебаний в жидкой среде сопровождается явлением кавитации, способствующим увеличению проницаемости клеточных стенок сырья, ускорению процессов гидролиза бересты и диффузии бетулина в раствор, повышая его выход. Указанного времени достаточно для практически полного истощения сырья.
Предложенный способ реализован при помощи ультразвукового технологического аппарата «Волна» (фиг. 1), модель УЗТА-0,4/22-ОМ (производство ООО «Центр ультразвуковых технологий», г. Бийск, Алтайский край) [5].
Предлагаемое техническое решение подтверждается конкретными примерами.
2
2
Пример 1. Измельченную бересту с содержанием бетулина 29,5% в количестве 150 г кипятят 20 мин в воде, отфильтровывают и высушивают. Подготовленную таким образом бересту загружают в реактор ультразвукового технологического аппарата «Волна», добавляют 1050 мл 86%-ного раствора этилового спирта и подвергают ультразвуковому воздействию на частоте 22±1,65 кГц интенсивностью 10-15 Вт/см при температуре 30-48°C в течение 5-25 мин. Затем из полученной массы бетулин экстрагируют при ультразвуковом воздействии интенсивностью 5 Вт/см при температуре от 40 до 70°C, продолжительность процесса зависит от размера частиц и составляет от 5 мин (частицы минимального размера 1 мм) до 3 часов (частицы размером 15 мм). Реакционную смесь выгружают из реактора, отделяют твердый остаток фильтрованием на воронке Бюхнера, из фильтрата отгоняют этиловый спирт до объема 350 мл и охлаждают при температуре не выше 8°C. Выпавший осадок бетулина отфильтровывают, промывают на фильтре горячей водой до нейтральной реакции и высушивают при температуре 60°C. Выход бетулина составляет 26,8% от веса абсолютно сухой бересты (Табл. 1).
Пример 2. Выполнение операций способа осуществляется аналогично примеру 1, но без использования предварительной обработки бересты методом ультразвукового воздействия. Получение бетулина с выходом 25,3% достигается кипячением бересты в 86%-ном этиловом спирте в течение 15 часов.
2
пл
31
50
2
Сопоставительный анализ результатов представленных данных (табл. 1) явно свидетельствует о преимуществе предложенного способа с предварительной обработкой бересты ультразвуковым воздействием интенсивностью 15 Вт/см на частоте 22±1,65 кГц, температура реакционной массы 40°C, продолжительность предварительной активации бересты 15 мин. При этом выход бетулина-сырца максимальный и достигает 26,8% от веса абсолютно сухой бересты с наилучшим качеством конечного продукта, о чем свидетельствуют данные по температуре плавления полученного образца 250-251°C. После перекристаллизации из этилового спирта Т бетулина составила 259-260°C. Найдено: С, % 81.2; Н, % 11.5; CHO. Вычислено: С, % 81.4; Н, % 11.3.
Таким образом, заявляемый способ получения бетулина из коры березы (бересты) позволяет сократить продолжительность процесса до 200 мин (вместо 15 часов), снизить его энергоемкость и повысить выход бетулина на 1,5%.
Упрощение технологии заключается также в использовании оборудования, в котором отсутствуют движущиеся детали (или подвижные соединения), а пьезолектрический источник ультразвукового воздействия позволяет создавать излучение различной интенсивности на заданной частоте воздействия.
В настоящее время в лаборатории синтеза и выделения природных и биологически активных веществ Бийского технологического института успешно прошли испытания по реализации предложенного способа выделения бетулина из бересты березы, а также проведена успешная предварительная апробация предлагаемого способа получения бетулина в условиях действующего предприятия ООО «Биофит» (г. Барнаул), профилем которого является получение полуфабрикатов из растительного сырья.
Источники информации
1. Пат. РФ 2074867. Способ получения бетулина. Опубл. 10.03.97. Бюл. №7.
2. Пат. РФ 2131882. Способ получения бетулина. Опубл. 20.06.99. Бюл. №17.
3. Пат. РФ 2264411. Способ получения бетулина. Опубл. 20.11.05. Бюл. №27 - прототип.
4. Хмелев, В.Н. Ультразвуковые многофункциональные и специализированные аппараты для интенсификации технологических процессов в промышленности, сельском и домашнем хозяйстве: монография [Текст] / В.Н. Хмелев, Г.В. Леонов, Р.В. Барсуков, С.Н. Цыганок, А.В. Шалунов. Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2007. - 400 с.
5. Хмелев, В.Н. Ультразвук. Аппараты и технологии: монография [Текст] / В.Н. Хмелев, А.В. Шалунов, С.С. Хмелев, С.Н. Цыганок. - Бийск: Изд-во Алтайского гос. технич. ун-та, 2015. - 688 с.
6. Молчанов, Г.И. Фармацевтические технологии: современные электрофизические биотехнологии в фармации: учебное пособие / Г.И. Молчанов, А.Л. Молчанов, Ю.Л. Морозов. - М.: Альфа-М: ИНФРА-М, 2009. - 336 с.