Возможность сохранения коллекции редких и ценных растении в генетических банках in vitro

УДК 573.6:58.08523 Н.А. Мамаева, О.И. Коротков, О.И. Молчанова

ВОЗМОЖНОСТЬ СОХРАНЕНИЯ КОЛЛЕКЦИЙ РЕДКИХ И ЦЕННЫХ РАСТЕНИЙ В ГЕНЕТИЧЕСКИХ БАНКАХ IN VITRO

В статье показана возможность и перспективность применения новейших методов биотехнологии для сохранения генетических ресурсов природной и культурной флоры. Представлена информация о таксономическом составе растений двух наиболее крупных в России банках растений in vitro: Гпавного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН и Волгоградского регионального ботанического сада. Подобраны оптимальные условия для длительного сохранения асептических растений. Отмечено, что при формировании банка in vitro особое внимание должно уделяться репрезентативности и поддержанию генетической чистоты таксонов.

Сохранение коллекций in vitro рассматривается как важнейший дополнительный метод в комплексе мер сохранения растений ex situ.

В последнее время ботанические сады и дендрарии приобретают все большее значение в области охраны растительного мира: они превратились в важные центры сохранения биоразнообразия растений.

Сохранение растений ex situ в коллекциях живых растений несет в себе ряд недостатков, обусловле-ных следующими причинами: 1) небольшим количеством особей, выживающих в культуре; 2) методически неверным отбором для переноса в растений культуру, не обеспечивающим достаточную репрезентативность охраняемого фонда; 3) увеличением вероятности аутокроссинга, ведущего к гомозиготности и, в ряде случаев, понижению или полной потере фертильности; 4) ограниченным генотипическим разнообразием материала, полученного при вегетативном размножении; 5) неспособностью к выживанию многих растений в культуре, особенно в искусственно созданных условиях среды (например, в оранжереях) [1].

Основной задачей ботанических садов в сохранении биологического разнообразия является изучение и сохранение генетических ресурсов природной флоры путем обогащения коллекций живых растений, а также разработка оптимальных режимов долговременного хранения семян и меристем, обеспечивающих их жизнеспособность и стабильность. Особый интерес представляет изучение возможностей сохранения в генетических банках видов, естественное возобновление которых в природе ослаблено или затруднено. Для таких видов от устойчивости воспроизводства ex situ зависит сохранность их генофонда в целом.

Эффективность сохранения генофонда растений ex situ может быть резко повышена путем создания генетических банков. По классификации Международного центра генетических ресурсов различают следующие их виды: 1) генетические банки семян; 2) банки растительного материала, сохраняемого in vitro (культуры меристем, тканей сеянцев в условиях замедленного роста); 3) полевые генные банки (специальные, обычно клоновые посадки плодовых и лесных пород, корневых и клубневых культур).

Использование системы in vitro имеет целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами поддержания коллекций растений. Среди них экономия площадей и затрат труда, независимость от климатических условий, возможность использования минимального количества эксплантов для получения стерильных культур без нарушения природных популяций, репродукция материала, трудноразмножаемого традиционными методами и возможность его длительного хранения в асептических условиях. Многие авторы указывают на важнейшее значение этого метода, как дополнительного варианта, для сохранения видов ex situ, выступающего в качестве их страхового фонда [2-3].

В настоящей работе представлена информация о двух наиболее крупных банках растений in vitro в России, в которых сохраняются представители, как культурных, так и дикорастущих видов.

Работа по созданию банка асептических культур Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (ГБС РАН) ведется с 1995 г. В настоящее время он является наиболее представительным в России и содержит на данный момент более 800 наименований растений: 214 видов и 622 культивара из 35 семейств (табл.). При этом в банке in vitro наиболее полно представлены следующие семейства: Actinidiaceae Hutch., Asteraceae Dumotr., Oleaceae Hoffmgg.&Link, Ericaceae Juss., Liliaceae Juss., Orchidaceae Juss. и Rosaceae Juss. Подобный банк, насчитывающий более 250 наименований (34 вида и около 200 культиваров из 24 семейств), существует в Волгоградском региональном ботаническом саду.

Таксономический состав генетического банка асептических культур ГБС РАН

Семейство Число

видов культиваров

Aceraceae з -

Actinidiaceae 7 12

Agavaceae з 20

Amaryllidaceae з -

Araceae 12 15

Araliaceae з -

Aristolochiaceae 2 -

Aspidiaceae 5 16

Asteraceae 9 5з

Begoniaceae - 15

Betulaceae 5 -

Berberidaceae 6 -

Caprifoliaceae 2 16

Celastraceae 1 -

Davalliaceae 2 4

Dioscoreaceae 2 -

Ericaceae 12 46

Fabaceae 5 -

Geraniaceae - 15

Gesneriaceae - з5

Glossulariaceae 4 11

Hydrangeaceae 2 -

Iridaceae 2 з

Lamiaceae 2 5

Liliaceae 12 62

Loganiaceae - 4

Magnoliaceae 1 -

Moraceae 12 15

Oleaceae 20 75

Orchidaceae 4з -

Paeoniaceae 10 -

Ranunculaceae 5 42

Rosaceae 17 157

Schizandraceae 1 1

Thymelaeaceae 1 -

7з

На базе коллекционных фондов ГБС РАН проведено комплексное изучение культурных форм садовых бородатых ирисов. Показано, что сорта из разных садовых групп четко дифференцируются, как по морфобиологическим, так и по цитогенетических признакам.

Изучение цитогенетических характеристик позволило определить вероятные пути формирования существующего сортимента культуры [4]. Также установлено, что биоморфологические особенности современных сортов садовых бородатых ирисов несмотря на действие длительного селекционного отбора в целом отражают экологию основных видов-родоначальников [5]. Это в значительной степени определяет особенности культивирования сортов садовых Бородатых ирисов из разных групп в условиях ex situ (in vivo и in vitro).

В Волгоградском региональном ботаническом саду находится одна из наиболее крупных в мире коллекций представителей рода Clematis L. В настоящее время коллекционный фонд клематисов сада представлен 38 видами и 246 сортами из 14 сортовых групп согласно Международной садовой классификации. Среди них 69 сортов выведено селекционерами Советского союза, что составляет около 20% от общего числа отечественных сортов, занесенных в Международный регистр [6]. При этом по декоративным качествам коллекционный фонд наиболее полно отражает современные достижения основных селекционных центров Японии, Великобритании, Франции, Канады, Америки и т. д. По видовому и сортовому разнообразию наиболее широко представлены садовые следующие группы: группа ранних крупноцветковых, группа поздних крупноцветковых, Atragene, Viticella и Integrifolia [7]. При этом для более 100 генотипов разработаны технологии клонального микроразмножения.

В Волгоградском региональном ботаническом саду начата работа по изучению пластичности генома рода Clematis L. с помощью RAPD-метода. В качестве модельных объектов для RAPD-анализа были использованы представители рода Clematis из разных садовых групп.

В результате проведенных исследований отработан метод выделения высокоочищенной геномной ДНК из листьев Clematis, подобраны эффективные праймеры и оптимизированы условия проведения RAPD-анализа. На основе результатов молекулярного генотипирования продолжится работа по созданию генетических паспортов данной культуры.

Несомненно, данная коллекция будет использоваться для научно-просветительских и образовательных целей.

Цели, которые ставились при создании банка in vitro, в целом не отличаются от задач, возникающих при создании любой коллекции, однако имеют и некоторые специфические особенности, такие, как: 1) сбор, идентификация, описание и номенклатура образцов, комплексное изучение материала с использованием анатомо-морфологических, биотехнологических и молекулярных методов, хранение и репродуцирование; 2) создание базы данных, включающей информацию по каждому конкретному образцу, с возможностью удаленного доступа посредством сети Internet. Такая система позволяет управлять базами данных в ботанических учреждениях, расположенных на разных территориях.

Особое внимание уделяется репрезентативности и поддержанию генетической чистоты таксонов, сохраняемых in vitro.

Виды растений природной флоры должны быть представлены образцами из как можно большего числа популяций из естественных мест произрастания. Так, в нашей коллекции, например, Iris ensata Thunb., представлен популяциями из трех точек ареала, Syringa josikaea Jacq. - из семи. Это позволяет обеспечивать наиболее полную репрезентативность их генофонда.

Для подтверждения генетической идентичности растений, размноженных в условиях in vitro (микроклонов), с исходными растениями нами используются молекулярные методы.

Исходным материалом для включения таксонов в генетический банк служили семена и вегетативные фрагменты органов растений. Материал получали из двух источников: ботанических учреждений, которые любезно предоставляли вегетативный материал и семена, и по обмену семенами через делектусы.

Методика исследований основана на общепринятых классических приемах работы с культурами изолированных тканей и органов растений [8].

Основной метод, используемый нами при размножении большинства таксонов in vitro, - это активация уже существующих в растениях пазушных меристем. По мнению большинства исследователей, он считается наиболее надежным с точки зрения генетической стабильности размножаемых форм [1; 3; 8]. Эта модель, основанная на снятии апикального доминирования, положена в основу промышленного размножения большинства видов растений.

Считается, что все таксоны растений потенциально могут быть размножены через культуру тканей, но далеко не для всех видов эти методики разработаны. Основные приемы сохранения генофонда in vitro могут

быть применимы только к тем видам растений, для которых разработаны легковоспроизводимые методы размножения [3].

Было установлено, что особенности клонального микроразмножения, а также выбор оптимального приема культивирования, тесно связаны с особенностями биологии и размножения вида в природе.

Среди факторов, оказывающих наибольшее влияние на морфогенетические процессы в культуре тканей и органов, в первую очередь, необходимо выделить таксономическую принадлежность, генетические особенности растений-регенерантов, физиологическое состояние маточных растений, инициального экс-планта, состав питательной среды, условия культивирования.

Основная часть коллекции растений in vitro хранится при температуре 3-50С. При этих условиях обеспечивается только минимальный рост побегов, полученных из меристем [9]. Периодическое субкультивирование трудоемко и значительно удорожает содержание коллекций. Поэтому сейчас достаточно интенсивно изучаются различные способы депонирования коллекций, т.е. возможности увеличения интервала между пересадками объектов путем минимализации их ростовых процессов. При разработке подходов и методов сохранения отдельных видов растений должен быть использован дифференцированный подход с учетом биологических особенностей растений в конкретных условиях.

В последнее время в своей работе мы особое внимание уделяем редким и исчезающим видам растений флоры России, коллекция которых в условиях in vitro содержит более 70 видов из 28 семейств.

В настоящее время создание банков стерильных культур редких растений является одним из перспективных направлений сохранения биоразнообразия растений. Они служат сохранению природного наследия и могут быть использованы для обмена между ботаническими учреждениями разных стран. Создание коллекций растений in vitro можно рассматривать как одну из форм охраны растений природной флоры и как эффективный метод сохранения биоразнообразия ex situ, что составляет часть общей стратегии охраны растений.

За последнее время активность исследований, направленных на консервацию растительных ресурсов in vitro, возросла во всем мире. В то же время для большинства дикорастущих видов растений не разработаны методы сохранения in vitro. Мы рассматриваем созданные коллекции как основу для проведения широкого спектра биологических исследований. Среди них, прежде всего, разработка надежной методологии сохранения in vitro редких и исчезающих видов растений с возможной последующей их реинтродукцией. Несомненно, данный коллекционный фонд может иметь большое значение для образовательных целей, в частности, на его основе могут создаваться экспозиции редких и полезных растений.

На наш взгляд, необходимо рассматривать сохранение коллекций in vitro как важнейший дополнительный метод в комплексе мер сохранения растений ex situ.

В дальнейшем на национальном и международном уровнях потребуется создание новых и укрепление существующих банков хранения коллекций растений in vitro, а также расширение на их основе исследований в области оценки, изучения и сохранения растительных ресурсов.

Литература

1. Андреев, Л.Н. Сохранение редких и исчезающих растений ex situ: достижения и проблемы / Л.Н. Андреев, Ю.Н. Горбунов // Изучение и охрана разнообразия фауны, флоры и основных экосистем Евразии: мат-лы Междунар. конф. - М., 2000. - С. 19-23.

2. Использование методов биотехнологии растений для сохранения и изучения биоразнообразия мировой флоры / В.Б. Белокурова, Е.В. Листван, П.Д. Майстров [и др.] // Цитология и генетика. - 2005. - № 1. -С. 41-51.

3. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала плодово-ягодных культур: автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук / В.А. Высоцкий. - М., 1998. - 44 с.

4. Матвеева, Т.С. Полиплоидные декоративные растения / Т.С. Матвеева. - Л.: Наука, 1980. - 300 с.

5. Родионенко, Г.И. Род Ирис - Iris L. (Вопросы морфологии, биологии, эволюции и систематики) / Г.И. Ро-дионенко. - М.-Л.: Изд-во академии наук СССР, 1961. - 215 с.

6. Clematis Register and Checklist. The Royal Horticultural Society, 80 vincent Square. - London, 2002. - P. 367.

7. Бескарaвайная, М.А. Клематисы лианы будущего / М.А. Бескарaвайная. - Воронеж: Кварта, 1998. - 171 с.

8. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р.Г. Бутенко. -М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

9. Morel, L. Meristem culture techniques for the long storage of cultivated plants / L. Morel // International biological program 2: Crop genetic resources for today and tomorrow. - New York, 1975. - P. 327-333.

--------♦-----------

УДК 633.494:54 Т.И. Аникиенко

ХИМИЧЕСКИЙ И МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ КЛУБНЕЙ И ЗЕЛЕНОЙ МАССЫ ТОПИНАМБУРА

В статье приводится химический и микроэлементный состав клубней и зеленой массы топинамбура, выращенного в Шушенском и Сухобузимском районах Красноярского края.

Перспективным направлением в совершенствовании кормовой базы для молочного животноводства, особенно в условиях Восточной Сибири, является использование для производства кормов такой высокоурожайной и неприхотливой к почвенно-климатическим условиям культуры, как топинамбур. Топинамбур, или земляная груша, выращивается в ряде стран как кормовая или продовольственная культура.

Ценность топинамбура, как кормовой, овощной, технической и лечебной культуры, обусловлена прежде всего химическим составом растения.

Исследования проводились на образцах, отобранных в Шушенском и Сухобузимском районах Красноярского края, в 1993-2004 гг.

Полный химический анализ кормов массовой доли (м.д.) был проведен в химической лаборатории КрасНИПТИЖа и в аккредитованной лаборатории Красноярского государственного аграрного университета (аттестат аккредитации № РОСС RU. 000121 ПО11 от 23 мая 2001 года). Химический состав кормов определяли по гостированным и актуализированным методикам.

В табл. 1 представлен химический состав клубней топинамбура.

Таблица 1

Химический состав клубней топинамбура и других корнеплодов

Показатель Клубни топинамбура Картофель Морковь

М.д. влаги 74,93 76,30 86,80

М.д. сырой золы, % 6,18 1,1 1,0

М.д. сахара, % 8,99 8,2 3,5

М.д. белка, % 10,63 1,5 0,8

М.д. сырой клетчатки, % 3,93 0,6 1,3

Кормовые единицы 0,97 0,30 0,14

Из данных табл. 1 видно, что клубни топинамбура значительно превосходят картофель по м.д. сырой золы в 5,6 раза, морковь - в 6,2 раза; м.д. белка - в 7 и 13,3 раза; м.д. клетчатки в 6,5 и 3 раза соответственно. По кормовым единицам клубни топинамбура превосходят в 3,2 раза, чем картофель, и в 6,9 раза, чем морковь.

По содержанию витаминов В1, В2, С топинамбур богаче картофеля, моркови и свеклы в 2,5 раза. Значительно больше в нем железа, кремния и цинка, а соотношения калия и натрия наиболее сбалансировано, чем у картофеля и моркови (Головин, 1991).

Предельно допустимая концентрация нитратов для топинамбура в литературе отсутствует, но для моркови, например, она составляет 300 мг/кг, свеклы - 140, капусты - 300, картофеля - 80, огурцов -150 мг/кг (Рыбальский, Жакетов, Ульянов, Шепелев, 1989), т.е. значительно больше тех величин, что установлены в топинамбуре.