Способ получения сополимеров хитозана с акриламидом как рН-чувствительного средства доставки биологически активных веществ
METHOD FOR OBTAINING CHITOSAN COPOLYMERS WITH ACRYLAMIDE AS A pH-SENSITIVE MEANS OF DELIVERING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES

Изобретение относится к области химии полимеров и может найти применение в областях пищевой, фармацевтической, биотехнологической, медицинской промышленности, в частности, к получению со-полимеров как средств доставки биологически активных веществ. Более конкретно изобретение относится к способу получения привитых сополимеров хитозана с акриламидом методом обработки раствора реагентов ионизирующим излучением.
Хитозан - биополимер, получающийся частичным или полным деацетилированием хитина, одного из самых распространенных природных полисахаридов. В последнее время хитозан и его производные вызывают все больший интерес благодаря уникальным свойствам хитозана, связанным с его экологической чистотой, высокой биологической активностью, реакционной способностью, биосовместимостью и биоразлагаемостью (1. Khajavian M., Vatanpour V., Castro-Munoz R., Boczkaj G. Chitin and derivative chitosan-based structures-Preparation strategies aided by deep eutectic solvents: A review. Carbohydrate Polymers. 2022. Vol. 275, Art. 118702. DOI 10.1016/j.carbpol.2021.118702.)
Хитозан и его производные используются для разработки систем доставки лекарственных веществ (2. Pari R. Drug delivery applications of chitin and chitosan: a review. Environmental Chemistry Letters. 2020. Vol. 18. Iss. 3. P. 577-594. DOI 10.1007/s10311-020-00963-5).
Основным препятствием для щирокого использования хитозана является его низкая растворимость в воде, неустойчивость в кислых растворах и низкая механическая прочность и плохая пластичность при его использовании в виде пленок.
Одним из самых эффективных методов для улучшения физико-химических свойств хитозана является получение его сополимеров (3. Desnelli D., Eliza E., Mara A., Rachmat A. Synthesis of copolymer of chitosan with acrylamide as an adsorbent for heavy metal waste treatment. IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering. 2020. Vol. 833. Art. 012064).
Известны различные методы сшивки полимерных цепей. Сополимеры хитозана с акриламидом могут быть получены микроволновым синтезом [3]. В работе (4. Мочалова А.Е., Заборщикова Н.В., Князев А.А., Смирнова Л.А., Извозчикова В.А., Медведева В.В., Семчиков Ю.Д. Привитая полимеризация акриламида на хитозан: структура и свойства сополимеров. Высокомолекулярные соединения. 2006. Т. 48. № 9. С. 1588-1594.) привитые сополимеры хитозана с акриламидом получены в уксуснокислых растворах хитозана с использованием в качестве инициатора персульфата аммония (ПСА). Недостатком данного метода является разрушение цепей полисахарида под влиянием ПСА (5. Татаринов П.В., Мочалова А.Е., Белышева Е.В., Смирнова Л.А., Бодриков И.В. Индуцированная деградация хитозана, сопряженная с блок-сополимеризацией с акриламидом. Журнал прикладной химии. 2010. Т. 83. Вып. 7. С. 1188-1192.)
Также известны способы получения привитых сополимеров хитозана с акриламидом с использованием других инициаторов радикальной полимеризации окислительной природы, в том числе ионов тяжелых металлов, например, ионов церия (6. Jigar M., Joshi Vijay, Kumar Sinha. Ceric ammonium nitrate induced grafting of polyacrylamide onto carboxymethyl chitosan // Carbohydrate Polymers. 2007. Vol .67, Issue 3, p. 427-435). Эти методы, в свою очередь, являются нежелательными для получения полимеров биологического назначения. Известен способ получения привитых сополимеров хитозана с использованием ионизирующего излучения. Недостатком предложенных способов является использование изотопного источника и длительность процесса ввиду малой скорости накопления дозы (7. Saleh Alaaeldine Sh., Ibrahim Ahmed G., Elsharma Emad M., Metwally Essam, Siyam Tharwat. Radiation grafting of acrylamide and maleic acid on chitosan and effective application for removal of Co(II) from aqueous solutions // Radiation Physics and Chemistry. 2018. Vol. 144. P. 116-124. Doi 10.1016/j.radphyschem.2017.11.018., 8. Jian-Ping Wang, Yong-Zhen Chen, Shu-Juan Zhang, Han-Qing Yu A chitosan-based flocculant prepared with gamma-irradiation-induced grafting // Bioresour Technol. 2008. Vol. 99(9). P. 3397-402. doi: 10.1016/j.biortech.2007.08.014).
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения сополимеров хитина или хитозана с синтетическими полимерами, включающий получение сополимеров хитозана с акриламидом (9. Пат. РФ № 2292354, опубл. БИ № 3, 27.01.2007 г.) Процесс сополимеризации осуществляют методом реакционной экструзии при температуре ниже температуры плавления синтетического реагента. Недостатком данного способа является неоднородность получаемых продуктов вследствие затрудненной диффузии при протекании химической реакции взаимодействия в твердом агрегатном состоянии.
Задачей настоящего изобретения является достижение нового технического результата: разработка способа получения сополимеров хитозана с акриламидом путем равномерной обработки реакционных смесей без их нагрева.
Поставленная задача решается тем, что для получения сополимеров хитозана с акриламидом используется обработка раствора хитозана с акриламидом в растворе уксусной кислоты ускоренными электронами. Использование воздействия ускоренными электронами позволяет избежать применения химических агентов для проведения процесса прививочной полимеризации.
Преимуществами данного способа является то, что образование сополимера происходит равномерно по объему вещества, с высокой скоростью, без использования химических инициаторов и без необходимости нагревания.
Для получения привитых сополимеров необходимо в макромолекуле создать реакционные центры, на которых в дальнейшем происходит прививка. Поскольку главные цепи полимеров содержат слабо полярные С-Н связи, для их разрыва лучше всего подходит высокоэнергетическое облучение как инициатор радикальных процессов. Частным случаем такого способа получения привитого сополимера является радиационный метод синтеза, который предполагает облучение полимера в присутствии мономера или предварительное облучение полимера с последующей обработкой его мономером. Скорость радиационной привитой сополимеризации определяется дозой и интенсивностью облучения, температурой, природой полимера, средой, наличием ингибиторов, кислорода и т.д. В результате облучения полимера возникают свободнорадикальные центры в результате распада С-Н или других связей. Эти центры инициируют свободнорадикальную полимеризацию добавленного мономера. Таким образом, использование ионизирующего излучения позволяет избежать применения химических агентов для проведения процесса прививочной полимеризации.
В предлагаемом способе получение привитых сополимеров хитозана с акриламидом осуществляют путем обработки раствора хитозана с акриламидом в 2%-растворе уксусной кислоты ионизирующим излучением при толщине слоя не более 1 см посредством перемещения раствора со скоростью 2 см/сек под выпускным окном импульсного ускорителя электронов ИЛУ-6 (ИЯФ СО РАН, Россия). Дозы обработки составляют 20, 40, 80 и 160 кГр (Дж/г). Привитый сополимер выделяют из раствора, промывают и сушат. После сушки образцы представляют собой твердые конгломераты. Для последующего использования конгломераты разрушают обработкой в вибрационной мельнице в течение 5 минут.
Эффективность сополимера как pH-чувствительного средства доставки биологически активных веществ доказана получением новой композиции биологически активного вещества бетулина с синтезированным сополимером хитозана с акриламидом.
Композиты бетулина с сополимером хитозана с акриламидом в соотношении 1:9 (по массе) получали с помощью механохимического синтеза путем обработки в мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Inc., США). Методом ИК-спектроскопии доказано образование водородных связей с участием гидроксильной группы бетулина и амино-группы сополимера. Вместо бетулина могут быть использованы другие биологически-активные вещества.
Растворение механокомпозитов бетулина исследовали с помощью тестера растворимости Varian 705 DS (США). Наибольшая скорость выделения бетулина в раствор наблюдалась в щелочной среде с pH 8,46. В случае композитов с сополимером хитозана высокая концентрация в растворе сохранялась длительное время, что связано, по-видимому, с наличием межмолекулярных комплексов в растворе.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1. 4 г хитозана растворяли в 200 мл 2%-ного раствора уксусной кислоты при перемешивании до получения однородного прозрачного раствора. Затем при перемешивании раствора порциями добавляли 3,5 г акриламида (мольное соотношение компонентов 1 : 2). Перемешивание проводили в течение 30 минут. Обработку полученного раствора ионизирующим излучением проводили при толщине слоя не более 1 см посредством перемещения раствора со скоростью 2 см/сек под выпускным окном ускорителя. Электронно-лучевую обработку осуществляли с использованием импульсного ускорителя электронов ИЛУ-6 (ИЯФ СО РАН, Россия). Энергия электронов - 2,4 МэВ, импульсный ток пучка - 328 мА, частота следования импульсов - 2,5 Гц. Доза облучения составляла 20 кГр (Дж/г). Для выделения привитого сополимера к 1 объему раствора добавляли 3 объема ацетона, что приводило к образованию творожистого осадка. Отделение осадка от раствора производили с использованием центрифуги ОПН-8 (Дастан, Киргизия) в течение 15 мин со скоростью 8000 об/мин (g~6400). После отделения осадок сушили при комнатной температуре и пониженном давлении в течение 24 часов. Очистку сополимера проводили промывкой осадка смесью ацетон - вода 60 : 40 (об.) с последующим центрифугированием. Процедуру повторяли 3 раза. Окончательную сушку проводили при 60°С при пониженном давлении в течение 24 часов. Выход продукта, степень и эффективность прививки представлены в табл. 1.
Пример 2. Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него, доза облучения составляла 40 кГр (Дж/г).
Пример 3. Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него, доза облучения составляла 80 кГр (Дж/г).
Пример 4. Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него, доза облучения составляла 160 кГр (Дж/г).
2
4
Пример 5. Выполнен аналогично примеру 4, однако, в отличие от него, полученный продукт использовали для получения композита с бетулином. Композит получали методом совместной механохимической активации смеси продукта сополимеризации по примеру 4 и бетулина, соотношение компонентов 9 : 1 (масс.). Механическую активацию осуществляли с использованием мельницы SPEX-8000 (CertiPrep, USA). Смесь массой 2 г помещали в стальной реактор объемом 60 мл, в качестве мелющих тел использовали стальные шары диаметром 6 мм, масса мелющих тел составляла 60 г, длительность обработки 15 мин. Тестирование высвобождения и растворимости бетулина производили с использованием тестера растворимости Varian 705 DS (США). Навеску образца с размерами частиц 125-315 мкм (процесс классификации проводили с использованием соответствующих сит), содержащую избыток бетулина по отношению к его растворимости, помещали в термостатированный при 37±0.5°C стеклянный стакан, в котором находилась механическая мешалка. Стакан заполняли буферным раствором в объеме 200 мл. Через определенные промежутки времени отбирали раствор, объем которого составлял 20 мл (объем раствора при этом не компенсировали). Раствор фильтровали через фильтровальную бумагу (синяя лента). Смесь экстрагировали гексаном три раза, фильтраты собирали и сушили над безводным сульфатом натрия NaSO. После выпаривания остаток растворяли в этаноле. Содержание бетулина в этанольных растворах определяли с помощью ВЭЖХ. В качестве элюента использовали градиент ацетонитрила (от 80 до 100%) в фосфатном буфере при рН = 6,5.
0
0
0
Проведено исследование растворимости полученного композита в зависимости от рН. Растворение проводили в буферных растворах с рН кислой среды (рН = 4,7), щелочной (рН = 8,51), а также с рН, близкой к среде желудка (рН = 1,98). Кривые изменения содержания бетулина в растворе представлены на фиг. 1. Данные показывают, что в щелочной среде выделение бетулина из композита происходит с большей скоростью с образованием растворов с повышенной концентрацией бетулина.
Таблица 1 - Выход продукта, степень и эффективность прививки при различных дозах электронно-лучевой обработки.
№ примера
Доза, кГр
Степень прививки, %
Эффективность прививки, %
Выход продукта, %
1
20
69
79
90
2
40
73
85
92
3
80
77
88
95
4
160
43
66
77