Влияние фетальных изолированных гепатоцитов на показатели иммунитета у животных с фульминантной печеночной недостаточностью

Экспериментальное исследование

УДК: 612.359: 612.351.6:618.393:616.08 ВЛИЯНИЕ ФЕТАЛЬНЫХ ИЗОЛИРОВАННЫХ ГЕПАТОЦИТОВ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА У ЖИВОТНЫХ С ФУЛЬМИНАНТНОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

А.М.ХАДЖИБАЕВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, А.А.МАДАМИНОВ, Р.К.АХМЕДОВА

INFLUENCE FETAL OF THE ISOLATED HEPATOCYTES ON INDICATORS OF IMMUNITY AT ANIMALS WITH FULMINANT HEPATIC FAILURE

A.M.KHADJIBAEV, M.D.URAZMETOVA, A.A.MADAMINOV, R.K.AHMEDOVA

Республиканской научный центр экстренной медицинской помощи

Проведен сравнительный анализ иммунологических показателей при трансплантации ксеногенных фетальных гепатоцитов человека (ФГЧ) и аллогенных крыс (ИГКр), применяемых на фоне острого поражения печени в эксперименте. В эксперименте использовали 100 половозрелых беспородных крыс-самцов массой 250—300 г. Острое поражение печени получали путем однократного вну-трибрюшинного введения неразведенного гепатотропного токсина CCl4 половозрелым беспородным крысам-самцам в дозе 1 мл/кг. Животные с фульминантной печеночной недостаточностью (ФПН) были разделены на 3 группы: 1-я — ФПН без трансплантации гепатоцитов и две опытных группы: 2-я — ФПН с трансплантацией изолированных гепатоцитов плодов человека (ФГЧ) и 3-я — ФПН с трансплантацией ИГКр, которую проводили внутриселезеночным введением взвеси клеток. Контролем служили интактные животные 4-й группы. Для получения изолированных гепатоцитов (ИГ) использовали печень плодов человека и крыс. Изучение основных параметров иммунного статуса (CD3+, CD4+, CD8+, CD16 и CD19, ФАН и ЦИК) показало, что ксеногенные ФГЧ оказывали стимулирующее действие на показатели. При сопоставлении влияния ксено- и аллогенных ИГ установлена возможность применения ксенотрансплантации изолированных гепатоцитов в качестве временной меры при остром поражении печени.

Ключевые слова: иммунный статус, фетальные гепатоциты человека, фульминантная печеночная недостаточность, четыреххлористый углерод, трансплантация гепатоцитов.

Objective of this research was the comparative analysis of change of immunologic indicators at transplantation xenogenic FHH and isolated allogenic hepatocytes rats (IGrats), applied against an acute lesion of a liver in experiment. In experiment used 100 puberal not purebred rats of males in weight from 250 till 300 g. In experiment an acute lesion of a liver received by unitary intraperitoneal introduction of not divorced hepatotropic toxin carbon tetrachloride to puberal not purebred rats to males in a dose of 1 ml/kg. Animals with FHF have been parted on 4 groups: 1 group — FHF without transplantation of hepatocytes) and two skilled groups: 2 group — FHF with transplantation of the isolated hepatocytes of FHH and 3 group - FHF with transplantation of the isolated hepatocytes of IGrats which spent hypodermic introduction of a suspension of cells. As the control intact animals (4 group) served. For reception of the isolated hepatocytes (IG) used a liver of fetal of the human and a liver of fetal of rats. By researches of key parametres of the immune status (CD3+, CD4+, CD8+, CD16 and CD19, the phagocytic activity of neutrophils and the Circulating Immune Complexes it is taped, that xenogenic FHH had stimulating an effect on normalisation of the changed indicators. By influence comparison xeno- and the allogenic cultivated IG possibility of application of a xenotransplantation of the isolated hepatocytes as a provisional measure is established at an acute injury of a liver.

Keywords: immune status, fetal hepatocytes of the human, fulminant hepatic failure, carbon tetrachloride, transplantation of hepatocytes.

В настоящее время поражения печени токсической и вирусной природы имеют тенденцию к увеличению. По данным A.Habib (2001), ежегодно около 26 тысяч из трех миллионов больных с хроническими заболеваниями печени умирают от недостаточности и цирроза. Единственным методом радикальной терапии этой категории больных является трансплантация печени, которая, однако, требует проведения экспериментальных разработок как по получению материала, так и по его применению.

Одним из подходов к решению проблемы на

современном уровне является использование клеточных технологий, в частности трансплантации культур изолированных фетальных гепатоцитов животных, что является наиболее эффективным и доступным. Так, известны положительные результаты исследований по пересадке островковых клеток поджелудочной железы новорожденных ягнят собакам с аллоксановым диабетом и людям с сахарным диабетом [2,4,6], которые были взяты нами за основу. Таким материалом могут служить изолированные гепатоциты плодов человека. Однако процесс восстановления утраченных

функций печени в качестве временной меры под воздействием ауто- и ксенотрансплантации клеточных не изучен [5].

Цель. Сравнительный анализ иммунологических показателей при трансплантации ксеноген-ных фетальных гепатоцитов человека (ФГЧ) и аллогенных крыс (ИГКр), применяемых на фоне острого поражения печени в эксперименте.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В эксперименте использовано 100 половозрелых беспородных крыс-самцов массой 250-300 г. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986), на стандартной лабораторной диете по 5-7 голов в клетке. В эксперименте фульминантную (молниеносную) печеночную недостаточность (ФПН) получали путем однократного внутрибрюшинного введения животным неразведенного гепатотропно-го токсина СС14 в дозе 1 мл/кг.

Животные с ФПН были разделены на 4 группы: 1-я группа - ФПН без трансплантации гепатоцитов, 2-я - ФПН с трансплантацией изолированных гепатоцитов плодов человека (ФГЧ), 3-я

- ФПН с трансплантацией изолированных гепатоцитов плодов крыс (ИГКр), которую проводили подкожным введением взвеси клеток. Контролем служили интактные животные 4-й группы. Для получения изолированных гепатоцитов (ИГ) использовали печень плодов человека и крыс. Ге-патоциты выделяли по методу P.Seglen (1976) c применением вместо коллагеназы химического реагента блокатора кальциевых каналов - ЭДТА. Жизнеспособность гепатоцитов оценивали по их окрашиванию 0,2% раствором трипанового синего с подсчетом клеток в камере Горяева. Клетки трансплантировались при жизнеспособности более 85%. Полученные гепатоциты разводили до концентрации 20 млн клеток/мл и хранили в пенициллино-вых флаконах при +40оС до использования.

Трансплантацию ИГ животным производили в период между 30 и 34 часами после моделирования острого поражения печени. Пятьдесят миллионов (0,5х108) ресуспендированных гепатоцитов вводили внутриселезеночно, иммуносупрессия при этом не применялась. После процедуры трансплантации животных помещали в теплое помещение со свободным доступом к воде и пище.

Для оценки клинического состояния применялась унифицированная методика с учетом пятибалльной степени печеночной энцефалопатии [9]. О функции печени судили по биохимическим показателям сыворотки крови животных (общий билирубин, альбумин, активность аланинамино-трансферазы - АЛТ и аспартатаминотрансферазы

- АСТ и аммиака) унифицированными методами, принятыми в клинической практике (Колб В.Г., Камышников В.С., 1982). Оценка иммунного статуса включала определение относитель-

ного содержания Т- и В- лимфоцитов (CD3+, CD20+ клеток), иммунорегуляторных лимфоцитов Т-хелперов/индукторов (CD4+) и Т- цито-токсических/супрессоров (CD8+), натуральных киллеров (CD16+) и клеток апоптоза (CD95+) методом непрямого розеткообразования [3] с применением моноклональных антител серии ИКО (МедБиоСпектр, Россия). Фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) определяли с помощью латекса диаметром 2,3 мк.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У животных с ФПН (1-я гр.) наблюдалось достоверное снижение относительных и абсолютных показателей иммунного статуса (табл. 1). Так, наряду с достоверным дефицитом абсолютного количества общих лимфоцитов, Т-лимфоцитов у животных с экспериментальной ФПН наблюдалось снижение регуляторных субпопуляций Т-хелперов и менее выраженное - Т-цитотоксических/супрессо-ров с уменьшением ИРИ на 30% (до 1,26±0,07 против 1,79±0,94 в контроле). Со стороны естественных факторов защиты с повышением количества натуральных киллеров (СD16+) выявлено снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и вместе с тем повышение процента СD95+клеток, что свидетельствует об активации процесса апоптоза. Абсолютное содержание В-лимфоцитов было сниженным при небольшом их относительном повышении.

Влияние трансплантации ФГЧ крысам с ФПН на иммунологические показатели оценивали на 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки (табл. 1).

Так, абсолютное количество Т-лимфоцитов (CD3+клеток) при трансплантации ФГЧ по сравнению с моделью ФПН на 7-е, 14-е и 21-е сутки увеличилось на 27, 30 и 30%, Т-хелперов - на 24, 25 и 41%, ИРИ - на 11, 12 и 10%. Эти изменения показателей иммунного статуса свидетельствуют о положительном влиянии трансплантации ФГЧ на фоне ФПН с тенденцией к нормализации. Повышение ФАН до нормальных значений со снижением количества натуральных киллеров с нормализацией абсолютного количества В-лимфоцитов также отражали положительную динамику иммунного статуса. При этом отмечалось незначительное изменение процесса апоптоза.

В таблице 2 проведены данные о влиянии трансплантации ФГЧ и ИГ крыс при ФПН. Как видно из таблицы, различия между 2-й и 3-й группами выражаются в изменении параметров иммунного статуса на 14-10%. Расхождение выявлено в содержании В-лимфоцитов и процесса апоптоза, которые были несколько увеличены в 3-й группе (СС14+ИГКр).

На рисунке показано различие действия ксе-ногенных и аллогенных ИГ на уровень основных параметров иммунного статуса у животных 2-й (ФГЧ) и 3-й групп (ИГКр), что определяет аналогичные изменения, происходящие в процессе их трансплантации.

А.М.ХАДЖИБАЕВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, А.А.МАДАМИНОВ, Р.КАХМЕДОВА

Таблица 1. Показатели иммунного статуса крыс с ФПН, индуцированной ^^ после трансплантации ксеногенных ФГЧ

Показатель Контроль Модель CCl4 Модель СС14+ИГчеловека, сут.

3-и 7-и 14-и 21-и

Лимф.,% 30,8±0,94 42±0,85* 38±1,21* 29,3±1,68 30,5±0,96 28,3±1,45

Лим.,абс. 2024±60 1532±69* 1495±74* 1637±122* 1599±83 1578±39

CD3,% 55,8±0,63 45,5±1,18* 36,7±0,88* 52±1,12 53,8±1,51 53,3±1,05

CD3, абс. 1127±26 696±31* 550±37* 847±58* 855±27* 840±17

CD4,% 35,8±0,49 25,3±0,8* 21,8±0,40* 30,8±0,95 31,7±0,84* 31,3±0,71

CD4, абс. 723±19 386±12* 327±19* 503±36* 504±17* 493±8*

CD8,% 20±0,33 20,2±0,75 15±0,44* 21,2±0,4 22,2±0,7 22±0,63

CD8, абс. 404±10 310±20* 225±17* 345±24* 352±10 347±12

ИРИ 1,79±0,04 1,26±0,07* 1,46±0,03* 1,46±0,05* 1,43±0,02* 1,43±0,04*

CD20,% 18,3±0,52 20±0,58 24,2±0,83* 22,7±0,84* 23,5±0,88* 22,5±0,85*

СD20,абс. 368±9 306±13 358±8 369±28 374±19 354±15

CD16,% 10,3±0,63 15,5±0,99* 15±0,58* 11,2±0,31 16,7±1,05* 13±0,58*

CD16^6c 207±14 238±21 224±13 182±11 284±31* 206±12

CD95,% 18,1±0,43 24,5±1,18* 26,5±0,43* 26,8±0,6* 24,5±1,56* 24±0,82*

СD95,абс. 366±13 375±24 397±23 437±30* 394±39 378±15*

ФАН,% 55,4±1,88 39±1,06* 34,7±1,02* 45,2±2,37* 45±1,41* 47,5±1,34

Примечание. * - р< 0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 2. Показатели иммунного статуса крыс с ФПН, индуцированной CCI4, под влиянием трансплантации ксенеогенных

7-е сут. эксперимента

Показатель Контроль Модель CCl4 Транспл. ФГЧ Транспл. ИГКр

Лимф.,% 30,8±0,94 42±0,85* 29,3±1,68 29,7±0,88

Лим.,абс. 2024±60 1532±69* 1637±122* 2142±105

CD3,% 55,8±0,63 45,5±1,18* 52±1,12 44,2±0,6*

CD3, абс. 1127±26 696±31* 847±58* 946±48

CD4,% 35,8±0,49 25,3±0,8* 30,8±0,95* 25,7±0,33*

CD4, абс. 723±19 386±12* 503±36* 549±26*

CD8,% 20±0,33 20,2±0,75 21,2±0,4 18,5±0,56

CD8, абс. 404±10 310±20* 345±24* 397±24

ИРИ 1,79±0,04 1,26±0,06* 1,46±0,05* 1,4±0,05*

CD20,% 18,3±0,52 20±0,58 22,7±0,84* 23,3±0,76*

СD20,абс. 368±9 306±13* 369±28 503±36*

CD16,% 10,3±0,63 15,5±0,99* 11,2±0,31 14,3±0,71*

CD16,% 207±14 238±21* 182±11 306±26*

CD95,% 18,1±0,43 24,5±1,18* 26,8±0,6* 27,8±0,7*

СD95,абс. 366±13 375±24 437±30* 599±40*

ФАН,% 55,4±1,88 39±1,06* 45,2±2,37* 57,2±1,01

Примечание. * - р< 0,05 по сравнению с контролем.

Рисунок. Относительные показатели иммунного статуса у животных с ФПН при трансплантации ФГЧ (2-я гр.), ИГКр (3-я гр.) на 7-е сутки эксперимента, % к контролю.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было показано, что степень печеночной энцефалопатии явилась основной причиной гибели животных от ФПН [1]. Установлено, что у животных с СС14 печеночная энцефалопатия (ПЭ) V степени составила 50%. Тяжесть степени ПЭ коррелировала с биохимическими показателями животных, отражающих нарушение метаболизма в печени: повышение общего билирубина, АЛТ, АСТ, аммиака.

Иммунологические исследования при ФПН, индуцированной СС14, выявили неспецифические изменения основных параметров иммунного статуса, определяющие количественный Т-клеточный дефицит с нарушением процесса иммуноре-гуляциии (снижение Т-хелперов/индукторов (СБ4+лимфоцитов), изменение естественных факторов защиты с подавлением фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и увеличением количества натуральных киллеров (СБ16+клеток), а также усилением процесса апоптоза в лимфоцитах. Аналогичные данные были получены ранее [7].

Трансплантация ФГЧ на фоне индуцирования ФПН, вызывала изменение иммунологических показателей с тенденцией к нормализации, что являлось одной из главных причин стабилизации достигнутых результатов. В результате трансплантации ФГЧ улучшение иммунного статуса животных коррелировало с клинико-биохимическим состоянием [8].

Положительные иммунологические изменения показали, что трансплантация изолированных ге-патоцитов является эффективной, оказывает им-мунокорригирующее действие при ФПН. При сравнении влияния трансплантации аллогенных и ксеногенных гепатоцитов (ИГкр и ИГчел) на иммунный статус выявлена недостоверная разница

между ними, что объясняется менее выраженными антигенными свойствами эмбриональных клеток, в отличие от клеток взрослого организма. Все вышесказанное определяет возможность использования в качестве донорского материала при ФПН и ксеногенных ИГ.

Эффективность лечения определяется не столько детоксикационными свойствами гепатоци-тов, но и поступлением в кровь реципиента факторов регенерации печени из трансплантируемых клеток - HGF-фактора роста гепатоцитов, TGF-трансформирующего фактора рости, фактора некроза опухоли (ФНО), ИЛ-6 и др. [11]. Кроме того, фетальные клетки животных проявляют высокую пролиферативную активность, обладают меньшей чувствительностью к факторам роста [10,12], что позволяет использовать изолированные гепатоциты для улучшения биологической функции печени при остром поражении печени.

Наши данные совпадают с результатами эксперимента с использованием печеночных клеток свиньи в опытах при их трансплантации крысам с ФПН. Так, учеными было установдено, что ксенотрансплантация культуры клеток на фоне ФПН является эффективным методом снижения летальности и ограничения цитолитического и хо-лестатического синдромов, системной воспалительной реакции, расстройств белково-синтетической функции. КТ неонатальных гепатоцитов оказывается методом коррекции печеночной недостаточности за счет протективной функции пересаженных клеток. Автор считает, что особенностью саногенеза ФПН в условиях ксенотрансплантации криоконсервированной культуры клеток печени является пролонгированный эффект повышенной концентрации HGF, вырабатываемого перенесенным материалом [5].

А.М.ХАДЖИБАЕВ, М.Д.УРАЗМЕТОВА, А.А.МАДАМИНОВ, Р.К.АХМЕДОВА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ксенотрансплантация ФГЧ крысам с ФПН оказывала четко выраженное нормализирующее действие на уровень основных показателей иммунного статуса. По влиянию на иммунологические показатели животных с ФПН не выявлено достоверных различий между трансплантацией ксеногенных фетальных ИГ человека и аллоген-ных фетальных ИГ крыс.

ЛИТЕРАТУРА

1. Акзамов А.А. Влияние трансплантации изолиро-

ванных гепатоцитов на клинико-иммунологи-ческие изменения при печеночной недостаточности в эксперименте. «Актуальные проблемы организации экстренной медицинской помощи: критические состояния в клинике внутренних болезней и педиатрии» 4-я Респ. науч.-практ. конф. Ташкент 2004;474-476.

2. Арипов УА. Пересадка островковых клеток Лан-

герганса поджелудочной железы в лечении ин-сулинзависимого (1-го типа) сахарного диабета. Актуальные проблемы хирургии и трансплантологии. Ташкент 1997;14-17.

3. Гариб Ф.Ю., Гариб В.Ф., Ризопулу А.П. Способ определения субпопуляций лимфоцитов. ПП № 2426 РУз. Расмий ахборотнома Ташкент 1995;1:90.

4. Исламов Б.Ф. Хирургическое лечение инсулинзави-симого сахарного диабета пересадкой островко-вых клеток поджелудочной железы (эксп.-клин. иссл.). Автореф. дис.... д-ра мед. наук. Ташкент 1998;36.

5. Лепехова С.А. Саногенез печеночной недостаточ-

ности под влиянием ксенотрансплантации клеток печени и селезенки (эксп. исследование). Автореф. дис.... д-ра мед наук. М; 40.

6. Уразметов К.Г., Мамадалиев Ш.Х., Исламов Б.Ф.,

Елецкая Н.В. Влияние пересадки аллогенных островковых клеток поджелудочной железы у крыс с аллоксановым диабетом. Докл АН РУз 1995;2:51-54.

7. Хаджибаев А.М., Акзамов А.А., Уразметова М.Д

Иммунная система при тяжелой печеночной недостаточности. Мед журн Узбекистана 2004;1-2: 216-219.

8. Хаджибаев А.М., Акзамов А.А., Уразметова М.Д. и др.

Особенности иммунного статуса крыс в динамике печеночной недостаточности при трансплантации изолированных гепатоцитов. Тез. докл.. 2-го Всемир. конгресса по иммунопатологии и аллергологии. Аллергол и иммунол 2004;5(1):172.

9. Bures J., Buresoya O., Huston JP Innate and motivated behavior. Techniques and basic experiments for the study of brain and behavior. New York Elsevier 1976; 37.

10. Habib A., Wendy M.B., Douglas M.H. Long-Term management of cirrhosis Appropriate supportive care is both critical and difficult. Postgraduate Medicine 2001.

11. Fausto N. Hepatocyte replication and liver regeneration. Acute liver Failure. Cambridge 1997; 1-9.

12. Мari Z.H. Experimental studies on the effects of hepatocyte-based liver support (Transforming growth factor, fetal hepatocytes, and epidermal growth factor). Uppsala Universitet (Sweden) 1998;48.

ФУЛЬМИНАНТ ЖИГАР ЕТИШМОВЧИЛИГИ БУЛГАН ЖОНИВОРЛАРГА ИММУНИТЕТ КУРСАТКИЧЛАРИГА АЖРАТИЛГАН ЭМБРИОНАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРНИНГ ТАЪСИРИ

А.М.Хаджибаев, М.Д.Уразметова, А.АМадаминов, Р.К.Ахмедова Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази

Тажрибадаги жигарнинг уткир шикастланиши фонида одам ва каламушларнинг фетал гепатоцитлари (ОФГ ва КФГ)нинг мутаносиб равишда ксено- ва аллотрансплантациясининг иммунологик курсаткичларга таъсири °иёсий тахлил °илинган. Тажрибада вазни 250-300 г. булган, жинсий балогатга етган наслсиз 100 нафар ка-ламуш °улланилган. Жигарнинг уткир шикастланишига ушбу жониворларнинг °орин бушлигига CCl4 гепато-троп токсинни 1 мл/кг дозада эритмасдан юбориш йули билан эришилган. Фульминант жигар етишмовчили-ги (ФЖЕ) булган жониворлар 3 гурухга ажратилди: 1-гурухга гепатоцитлар трансплантацияси бажарилмаган, 2-гурухга ОФГ ва 3-гурухга КФГ тало° ичига хужайралар суспензиясини юбориш йули билан трансплантация °илинган. 4-гурухдаги соглом жониворлар назорат сифатида кузатилган. Ажратилган гепатоцитларни (АГ) олиш учун одам ва каламуш эмбрионларининг жигари °улланилган. Иммун холатнинг асосий курсаткичлари (CD3+, CD4+, CD8+, CD16 и CD19, ФАН и ЦИК)ни урганиш натижасида ксеноген ОФГ стимулловчи таъсирга эга эканлиги ани°ланди. Ксено- ва аллоген АГнинг таъсирини °иёслаш жигарнинг уткир шикастланишларида ажратилган ксеноген хужайраларни ва°тинчалик даво чораси сифатида куллаш мумкинлиги курсатилган.

Контакт: Уразметова Маиса Дмитриевна.

100117, Ташкент, Фархадская, 2.

Тел.: +99871-1504384, Факс: +99871-1504605,

E-mail: urazmetovr@gmail.com