Средство, обладающее антиагрегантной активностью
AGENT POSSESSING ANTIAGGREGANT ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих антиагрегантной активностью.
Известны средства, обладающие антиагрегантной активностью, способные угнетать агрегацию тромбоцитов путем различных механизмов действия: ингибиторы метаболизма арахидоновой кислоты: неселективные ингибиторы циклооксигеназы (ацетилсалициловая кислота, индобуфен, трифлузал) и блокаторы тромбоксана (пикотамид, ридогрел); препараты, увеличивающие содержание циклического аденозинмонофосфата в тромбоцитах - ингибиторы фосфодиэстеразы тромбоцитов (дипиридамол, трифлузал) и стимуляторы аденилатциклазы (илопрост); блокаторы аденозиндифосфат-рецепторов - тиенопиридины (тиклопидин, клопидогрел, прасугрел, тикагрелор); антагонисты IIb/IIIa гликопротеиновых рецепторов тромбоцитов (абциксимаб, эптифибатид, тирофибан, ламифибан, фрамон) [1, 2, 3, 4, 5, 6]. В последние годы на первый план выходит проблема резистентности больных к действию антиагрегантных средств [7, 8, 9, 10, 11, 12]. Так, число пациентов, у которых может наблюдаться резистентность к ацетилсалициловой кислоте и клопидогрелю, по данным разных авторов, составляет 24-35% и 15-40%, соответственно [7, 8, 13, 14, 15, 16].
Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств, обладающих антиагрегантной активностью.
Поставленная задача решается использованием натриевой соли 11H-индено[1,2-b]хиноксалин-11-он оксима (IQ-1S) в качестве антиагрегантного средства.
Известно, что IQ-1S имеет высокое сродство к с-Jun N-терминальным киназам (JNK) и проявляет свойства ингибитора данных киназ [17]. В литературе имеются данные о наличии у IQ-1S противовоспалительных свойств: на модели коллаген-индуцированного артрита у мышей введение IO-1S уменьшало воспаление [18]. Также имеются данные о том, что IQ-1S улучшает исход инсульта в условиях модели фокальной ишемии головного мозга с реперфузией у мышей и может быть донатором NO в ходе ферментативного метаболизма в микросомах печени [19]. Кроме того, у соединения IQ-1S выявлен антирадикальный эффект [20].
Использование IQ-1S в качестве антиагрегантного средства в литературе не описано.
Принципиально новым в предполагаемом изобретении является то, что в качестве антиагрегантного средства используется IQ-1S. Данный вид активности соединения явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники.
IQ-1S можно использовать для лечения больных с сердечнососудистыми и другими заболеваниями для снижения агрегационной способности тромбоцитов.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".
Новое свойство IQ-1S было обнаружено благодаря экспериментальным исследованиям.
Эксперименты по изучению антиагрегантной активности IQ-1S в опытах in vitro и in vivo проводили на 39 крысах-самцах сток Вистар массой 250-280 г. Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Крысы находились в стандартных пластиковых клетках фирмы VELAZ на подстилке из мелкой древесной стружки по пять особей в клетке в открытом режиме. Температура воздуха в виварии 20-23°С, влажность - не более 50%, объем воздухообмена (вытяжка : приток) - 8:10, световой режим (день : ночь) - 1:1. Кормление животных осуществлялось в соответствии с регламентирующими документами на содержание животных [21].
Для проведения экспериментов у крыс под эфирным наркозом проводили забор образцов крови из общей сонной артерии. В качестве стабилизатора образцов крови использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9.
Агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме (БТП) определяли нефелометрическим методом по Born [22]. Получение БТП и бедной тромбоцитами плазмы (БеТП) и подсчет числа тромбоцитов проводили по стандартному методу [23]. Из проб крови получали БТП и БеТП методом центрифугирования при 400 g и 1800 g соответственно на центрифуге РС-6. В полученной БТП подсчитывали количество тромбоцитов микроскопическим методом при фазовом контрасте в камере Горяева.
3
3
Так как в норме число тромбоцитов в крови у крысы колеблется в широких пределах - от 430000 до 1 млн в 1 мм - после определения числа тромбоцитов в БТП проводили стандартизацию числа тромбоцитов, для чего БПТ разводили необходимым количеством БеТП до 400±30 тыс.тромбоцитов в 1 мм в пробе [24, 25].
Агрегацию тромбоцитов оценивали в стандартизованной БТП на приборе АТ-02, агрегатограммы регистрировали с помощью самописца Recorder 2210.
После добавления индуктора агрегации регистрировали изменение уровня оптической плотности БТП. В качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов использовали показатель степени агрегации (в %), характеризуемый изменением оптической плотности БТП после добавления в кювету индуктора агрегации. При этом за 100% принимали величину оптической плотности БеТП, а за 0% - величину оптической плотности БТП.
-6
В качестве индуктора агрегации использовали АДФ в конечной концентрации 4⋅10 М.
-6
В опытах in vitro использовали плазму, полученную от 10 интактных крыс-доноров. IQ-1S добавляли в 1 мл подготовленной БТП в конечной концентрации 50 нг/мл и 100 нг/мл. В качестве растворителя IQ-1S использовали раствор, содержащий диметилсульфоксид (ДМСО), спирт этиловый 95% и натрия хлорид 0,9% в соотношении 1:1:1 по объему. Раствор IQ-1S оставался стабильным в условиях термостатирования при 37°С в течение 4 часов. Стандитизированную БТП инкубировали с растворами IQ-1S или растворителем при 37°С в течение 10 мин перед внесением индуктора агрегации тромбоцитов АДФ в конечной концентрации 4⋅10 М.
Исследования влияния IQ-1S на агрегацию тромбоцитов in vivo были проведены в двух сериях опытов: на интактных крысах и на крысах в условиях модели фокальной ишемии головного мозга.
Интактным животным IQ-1S вводили внутрижелудочно однократно в дозе 50 мг/кг (n=5). Контролем (n=5) служили интактные животные, которым внутрижелудочно однократно вводили эквиобъемные количества 1% крахмальной слизи. Забор проб крови проводили через 3 ч после внутрижелудочных введений.
В серии опытов по исследованию IQ-1S в условиях модели фокальной ишемии головного мозга (ФИГМ) с реперфузией крыс использовалось 3 группы крыс: ложнооперированные (n=5), контрольные (n=7) и опытные (n=7). Модель ФИГМ воспроизводили у крыс контрольной и опытной групп по методу, описанному Zea Longa et al. [26]. Хирургические вмешательства проводили в асептических условиях. Животных наркотизировали пропофолом (10 мг/кг/час). В течение операционного периода осуществляли поддержание ректальной температуры на уровне 37±0,5°С при помощи коврика Homeothermic Blanket Control Unit (Harvard Apparatus, USA). ФИГМ создавали с использованием интралюминальной нити (Doccol Corp., Redlands, СА, USA). Для создания модели ФИГМ у животного в области шеи срезали кожный лоскут диаметром 10-15 мм и методом тупого раздвижения тканей отпрепаровывали левую общую, внутреннюю и внешнюю сонные артерии. Через наружную сонную артерию во внутреннюю сонную артерию вводили нейлоновый монофиламент с силиконовым наконечником длиной 18 мм для прекращения кровотока к левой среднемозговой артерии. Нить оставляли на 1 ч, затем вынимали, зашивали разрез и оставляли животных на 48 часов при свободном доступе к воде и пище. В группе ложнооперированных животных проводилось аналогичное оперативное вмешательство, но без окклюзии средней мозговой артерии.
Животные опытной группы получили внутрижелудочно IQ-1S в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 1% крахмальной слизи, ложнооперированные животные и контрольные животные получили внутрижелудочно эквиобъемное количество 1% крахмальной слизи. Введения IQ-1S осуществляли через 30 минут после начала реперфузии и один раз в сутки в течение 2-х дней после оперативного вмешательства. Последнее введение соединения и эквибъемного количества крахмальной слизи (1 мл) животным проводили за 3 часа до забора крови.
Статистическую обработку проводили с помощью пакета программного обеспечения "Statistica 6.0". Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку, для выявления межгрупповых различий использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследований антиагрегантной активности IQ-1S представлены в примерах 1-9.
Пример 1. В контрольной группе (БТП интактных животных-доноров) амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 35±2% (табл. 1: контроль).
#
Примечание:  - р<0,05 по сравнению с группой контроля.
Пример 2. После 10-минутной инкубации БТП с растворителем амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 33±1%, что не отличалось от контрольного значения (табл. 1: Растворитель).
Пример 3. После 10-минутной инкубации БТП с IQ-1S в конечной концентрации 50 нг/мл амплитуда АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 23±1 (табл. 1: IQ-1S 50 нг/мл) и была на 34% ниже по сравнению с контрольной группой.
Пример 4. После 10-минутной инкубации БТП с IQ-1S в конечной концентрации 100 нг/мл амплитуды АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 15±1 (табл. 1: IQ-1S 100 нг/мл) и была на 57% ниже по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, IQ-1S в условиях in vitro при инкубировнии в стандартизированной БТП крыс в течение 10 минут в конечных концентрациях 50 нг/мл и 100 нг/мл проявляет выраженный антиагрегантный эффект, снижая амплитуду агрегации тромбоцитов на 34% и 57% соответственно.
Результаты исследований антиагрегантной активности IQ-1S у интактных крыс после однократного введения представлены в примерах 5-6.
Пример 5. У контрольных крыс амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 32±1% (табл. 2: Контроль).
#
Примечание:  - р<0,05 по сравнению с группой контроля.
Пример 6. У крыс опытной группы после однократного внутрижелудочного введения IQ-1S в дозе 50 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 20±2% (табл. 2: Опыт) и была ниже на 37% по сравнению с контрольной группой.
Таким образом, однократное внутрижелудочном введение IQ-1S в дозе 50 мг/кг интактным крысам снижает агрегацию тромбоцитов.
Результаты исследований антиагрегантной активности IQ-1S у крыс после фокальной ишемии головного мозга представлены в примерах 7-9.
Пример 7. У ложнооперованных крыс амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 29±1% (табл. 3: Ложнооперованные).
#
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с группой ложнооперированных животных;  - р<0,05 по сравнению с группой контроля.
Пример 8. У крыс контрольной группы на третьи сутки после фокальной ишемии головного мозга наблюдалось повышение агрегации тромбоцитов. Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов составила 45±4%, что было на 55% выше показателя ложнооперированных животных (табл. 3: Контроль).
Пример 9. К третьим суткам после ФИГМ у крыс опытной группы после курсового внутрижелудочного введения IQ-1S в дозе 50 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 33±3% (табл. 3: Опыт). Этот показатель был на 27% ниже, чем в контроле и был близок к значению у ложнооперированных животных.
Таким образом, IQ-1S при курсовом трехкратном внутрижелудочном введение в дозе 50 мг/кг крысам после ФИГМ способен ограничивать гиперагрегацию тромбоцитов.
Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих антиагрегантной активностью.
Источники литературы, принятые во внимание:
1. Носаль Р. Современное состояние и перспективы антитромбоцитарной терапии // Словакофарма ревю. - 2000. - №1-2. - С. 14-19.
2. Сычев Д.А., Зятенков А.В., Кукес В.Г. Клиническая фармакогенетика антиагрегантов: взгляд клинического фармаколога // Российский кардиологический журнал. - 2007. - Т. 66, №4. - С. 92-100.
3. Косарев В.В., Бабанов С.А. Клиническая фармакология современных антиагрегантов и их место в фармакотерапии ишемической болезни сердца и ассоциированных состояний // Русский медицинский журнал. Кардиология. - 2013. - №27. - С. 1378-1383.
4. Нечаева Г.И., Дрокина О.В., Фисун Н.И. Современная антиагрегантная терапия: место тикагрелора в клинических рекомендациях // Лечащий врач. - 2015. - №3. - С. 72-75.
5. Hamilton J.R., Kaplan Z., Jackson S.P., Opat S. Antiplatelet therapy: present status andfuture prospects // Expert Opin. Drug Discov. - 2007. - Vol. 2, №8 - P. 1035-1040.
6. Gurbel P.A., Myat A., Kubica J., Tantry U.S. State of the art: Oral antiplatelet therapy // Journal of the Royal Society of Medicine Cardiovascular Disease - 2016. - №5. - P. 1-10.
7. Сироткина O.B., Вавилова T.B. Фармакогенетика антитромботических препаратов // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2007. - №2. - С. 3-15.
8. Марцевич С.Ю. Предупреждение американской ассоциации кардиологов о возможной неэффективности клопидогрела. Какой должна быть современная терапия антиагрегантами? // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. - 2010. - Т. 6, №4. - С. 607-609.
9. Кропачева Е.С. Фармакогенетика антитромботических препаратов: современное состояние проблемы // Атеротромбоз. - 2018. - №2. - С. 115-129.
10. Kumar А, Kao J. Platelet resistance to antiplatelet drugs // Recent. Pat. Cardiovasc. Drug Discov. - 2009. - Vol. 4, №2. - P. 98-108.
11. Cattaneo M. Resistance to antiplatelet drugs: molecular mechanisms and laboratory detection // J. Thromb. Haemost. - 2007. - Vol. 5, Suppl. 1. - P. 230-237.
12. Cattaneo M. Resistance to anti-platelet agents // Thrombosis Research. - 2011. - Vol. 127, Suppl. 3. - S61-S63.
13. Каражанова Л.К., Жукушева Ш.Т., Чиныбаева А.А. Молекулярно-генетические основы диагностики и лечения ишемической болезни сердца (обзор литературы) // Наука и здравоохранение. - 2014. - №3. - С. 4-11.
14. Papathanasiou A., Goudevenos J., Tselepis A.D. Resistance to fspirin and clopidogrel: possible mechanisms, laboratory investigation, and clinical significance // Hellenic J. Cardil. - 2007. - Vol. 48. - P. 352-363.
15. Pusch G., Koltai K., Tibold A. et al. Clinical importance of aspirin and clopidogrel resistance // World J. Cardiol. - 2010. - Vol. 2, №7. - P. 171-186.
16. Lev E.I., Patel R.T., Maresh K.J. et al. Aspirin and clopidogrel drug response in patients undergoing percutaneous coronary intervention the role of dual drug resistance // J. Am. Coll. of Cardiol. - 2006. - Vol. 47, №1. - P. 27-33.
17. Schepetkin I.A., Kirpotina L.N., Khlebnikov A.I. et al. Identification and characterization of a novel class of c-Jun N-terminal kinase inhibitors // Mol. Pharmacol. - 2012. - Vol. 81, №6. - P. 832-845.
18. Schepetkin I.A., Kirpotina L.N., Hammaker D. et al. Antiinflammatory effects and joint protection in collagen-induced arthritis after treatment with IQ-1S, a selective c-Jun N-terminal kinase inhibitor // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2015. - Vol. 353, №3. - P. 505-516.
19. Atochin D.N., Schepetkin I.A., Khlebnikov A.I. et al. A Novel dual NO-donating oxime and c-Jun N-terminal kinase inhibitor protects against cerebral ischemia-reperfusion injury in mice // Neurosci. Lett. - 2016. - Vol. 618. - P. 45-49.
20. Хлебников А.И., Аточин Д.Н., Щепеткин И.А. и др. Поиск нейропротекторов с мультитаргетными свойствами в ряду производных инденохиноксалина // Сборник тезисов докладов Третьего Междисциплинарного Симпозиума по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике 2017 / под редакцией К.В. Кудрявцева и Е.М. Паниной. - М.: «Перо», 2017. - С. 55.
21. Каркищенко Н.Н. Лабораторные животные - М., 2003. - 220 с.
22. Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. - 1962. - Vol. 194, №4832. - P. 927-929.
23. Баркаган З.C., Момот А.П. Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза. - Барнаул, 1998. - С. 10-11.
24. Закревская А.Л. Тромбоциты крыс как модель исследования ингибиторов агрегации // Патологическое функционирование системы гемостаза. - Л., 1990. - С. 46-54.
25. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. - Киев, 1974. - С. 200.
26. Zea Longa E.L., Weinstein P.R., Carlson S., Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without cranirctomy in rats // Stroke. - 1989. -Vol. 20. - P. 84-91.