Молекулярное типирование штаммов Vibrio parahaemolyticus на основе INDEL-маркеров

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Молекулярное типирование штаммов Vibrio parahaemolyticus на основе INDEL-маркеров

Чемисова О.С., ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт»

Водопьянов А.С., роспотребнадзора

Рыковская О.А.,

Водопьянов С.О.,

Голенищева Е.Н.

Разработан метод генотипирования штаммов Vibrio parahaemolyticus на основе определения деле-ций-вставок (INDEL-маркеров). Типирование штаммов V. parahaemolyticus, выделенных из морской воды, от гидробионтов и людей в регионах Черного, Азовского, Каспийского, Японского морей с 1972 по 2015 г. проводили по 6 INDEL-локусам. Метод INDEL-типирования позволил выявить 25 генотипов, которые распределились по 5 кластерам. Выявлена корреляция распределения штаммов V. parahaemolyticus на кластеры в зависимости от наличия генов основных факторов патогенности и принадлежности к пандемичному клону.

Ключевые слова:

Vibrio parahaemolyticus, INDEL-типирование, вибрионы, генотип, термостабильный прямой гемолизин TDH, TDH-родственный гемолизин TRH

Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2018. Т. 7, № 3. С. 26-30.

doi: 10.24411/2305-3496-2018-13004 Статья поступила в редакцию: 05.02.2018. Принята в печать: 13.07.2018.

Molecular typing of the Vibrio parahaemolyticus strains by INDEL markers

Chemisova O.S., Vodopyanov A.S., Rostov-on-Don Research Institute for Plague Control Rykovskaya O.A., Vodopyanov S^., Golenishcheva E.N.

A method of genotyping Vibrio parahaemolyticus strains based on the definition of "deletions-inserts" (INDEL-markers) was developed. The typing of V. parahaemolyticus strains isolated from sea water, from hydrobionts and people in the regions of the Black, Azov, Caspian and Japanese Seas was carried out by 6 INDEL-loci from 1972 to 2015. INDEL-typing method allowed to identify 25 genotypes, which were distributed between 5 clusters. The correlation of distribution of V. parahaemolyticus strains on clusters depending on the presence of genes of the main factors of pathogenicity and belonging to the "pandemic" clone was revealed.

Keywords:

Vibrio parahaemolyticus, INDEL-typing, vibrios, genotype, thermostable direct hemolysin TDH, TDH-related hemolysin TRH

Infectious Diseases: News, Opinions, Training. 2018; 7 (3): 26-30.

doi: 10.24411/2305-3496-2018-13004 Received: 05.02.2018. Accepted: 13.07.2018.

Чемисова О.С., Водопьянов А.С., Рыковская О.А., Водопьянов С.О., Голенищева Е.Н. МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS НА ОСНОВЕ INDEL-МАРКЕРОВ

Вибрионы широко распространены на земном шаре, они являются естественными обитателями пресных и соленых водоемов, а также гидробионтов, обитающих в них. В настоящее время известно около 91 вида вибрионов, 12 из них отнесены к патогенным для человека [1]. Среди галофильных вибрионов по частоте и тяжести вызываемых ими острых кишечных заболеваний особое место занимают парагемолитические вибрионы. Vibrio parahaemolyticus - основная причина пищевых ток-сикоинфекций, особенно в Японии, Юго-Восточной Азии и Приморском крае [2-4]. Опасность заражения парагемо-литическими вибрионами существует везде, где население использует в питании продукты моря. Вспышки заболеваний возникают в теплое время года в основном в прибрежных районах, но могут встречаться и в местах, удаленных от побережья, что связано с завозом инфицированных продуктов.

В организм человека вибрионы попадают при употреблении в пищу сырых или недостаточно обработанных морепродуктов. Вызываемый ими острый гастроэнтерит протекает по типу пищевой токсикоинфекции (ПТИ). Основными факторами патогенности V. parahaemolyticus являются гемолизины - термостабильный прямой (TDH-thermostabLe direct hemolysin) и TDH-родственный (TDH-reLated hemolysin), а также 2 контакт-зависимые системы секреции третьего типа (T3SS), особенно T3SS2, ответственная за энтероток-сичность [5-7]. Заболевания, вызываемые парагемолити-ческими вибрионами, могут протекать в виде одной из трех клинических форм: гастроэнтеритической, дизентерие-и холероподобной [8].

Для быстрой и точной диагностики заболеваний, вызываемых V. parahaemolyticus представляется важным совершенствование схемы изучения биологических свойств вибрионов, в том числе при использовании методов молекулярной биологии. Фундаментальные исследования в области генетики микроорганизмов в последнее десятилетие позволили расширить возможности идентификации микроорганизмов и изучения генетического разнообразия популяций. Применение молекулярных методов внутривидового типирования бактерий позволяет проводить анализ и прогнозировать распространение клонов с повышенной вирулентностью, устойчивостью к внешним факторам и антибактериальным препаратам. Одним из новых молекулярных методов является INDEL-типирование, в основе которого лежит поиск спонтанных вставок/делеций (insertion/deletion) нескольких нуклеотидов, отличающихся по длине у различных организмов. INDEL-метод с успехом применяют для генотипирования как микроорганизмов [9], так и человека [10]. А.С. Водопьяновым с соавт. разработана система INDEL-типирования Vibrio cholerae, включающая 4 гена и систему специфических прай-меров [11]. Сведения об использовании INDEL-типиро-вания для парагемолитических вибрионов в литературе не найдены.

Цель исследования - изучение с помощью метода INDEL-типирования коллекционных штаммов V. parahaemolyticus, выделенных на территории РФ.

Материал и методы

В работе использовали 100 штаммов V. рогоЬоето^сив, выделенных из морской воды, от гидробионтов и людей в регионах Черного, Азовского, Каспийского, Японского морей с 1972 по 2015 г. Штаммы хранились в лиофилизирован-ном состоянии в коллекции музея живых культур с центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора.

Штаммы были представлены 4 вариантами: tdh+trh+, tdh+trh-, tdh-trh+, tdh-trh-. ПЦР со сконструированными праймерами к 6 INDEL-локусам вибрионов (см. табл.) проводили по уже описанной ранее методике [12]. Кластерный анализ и построение дендрограммы выполнены с помощью программы GeneExpert (ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора).

Результаты и обсуждение

Проведенный INDEL-анализ 100 штаммов V. рагаЬаето-1уИсиз позволил выявить 25 уникальных генотипов, которые распределились между 5 кластерами, обозначенными буквами латинского алфавита от А до F (рис. 1). В целом для штаммов была характерна низкая клональность - большинство генотипов было представлено одним или двумя изоля-тами, из 25 генотипов лишь 11 включали от 3 до 13 штаммов. Наибольшее число генотипов было характерно для штаммов, выделенных от больных людей и из морской воды. Сопоставление генотипов парагемолотических вибрионов и места их выделения не выявило четкой географической привязанности, что можно объяснить широким распространением разных штаммов по путям транспорта рыбной продукции, а также с балластными водами судов.

Рис. 1. Дендрограмма, построенная на основании кластерного распределения и !МРЕ1_-аллелей у штаммов V. рагаЬае-тдуУсиэ, выделенных на территории РФ

Праймеры, использованные в работе

№ INDEL-локус Праймер Размер ампликона, п.о.

I прямой 1 обратный I

1 Vp967 acaaaagagcgagcactgaaac gatccaagatgagctggaaaac 112/94

2 Vp08 tgaaaaactgggttaaggttgc agacatgcccaccttgacttc 104/89

3 Vp619 acctgtgactgaaccagaacc cccactgaatgaagctacctgt 114/92

4 Vp2256 aaaaagcggcagataatgcac ccttatcaatggcttcttgtcc 111/99

5 VpA472 cgtgaactggcaagactgga ccaatgcgatttggtaagtgtc 95/77

6 Vp506 aagcaccacagtcatcctgtaa gcggtctgtagtcgtgtgaa 85/79

tdh+trh- B2 B3 B8 С2 С5 С7 С8 С9 D1

tdh+trh+ B3 С1 С9

tdh-trh- A4 B1 B2 B3 B4 B6 B7 С1 С10 С2 С3 С4 С6 С7 С8 D1 F1 F2

tdh-trh+Д A3 B5 С6

Рис. 2. Связь между наличием генов tdh и trh и INDEL-генотипом

1971 A3 B3 С5

1972 B3

1973 B2 B3 B4 С10 С3 С6 С7

1974 B2 B7 С6 С7

1975 B2 B8 С2 С6

1976 B2 С1 С4 С8

1978 A4 B5 С2

1979 С2

1980 С8

1984 A 3 С9

1985 |A 3 B2 B3 B6 С6 С9

1986 С9

1987 С9

19881 A2 С1 С9

19971 A4 С6 D1

2008 D1

20091 A 3 A4 B1 B3 С1 С2

20101 A 3 С1

20121 A 3 A4 B2 B3

2013 2015

B2 B3 С6 С7 С8 D1

Рис. 3. Связь между годом выделения штаммов V. рагаЬав-тдуУсиэ и генотипом

Патогенность возбудителя V. parahemolyticus связывают с продукцией токсинов-гемолизинов: термостабильного прямого гемолизина (Thermostable Direct Hemolysin, TDH) и TDH-родственного гемолизина (TDH-related hemolysin,

Т1^Н), кодируемых соответственно генами tdh и Ы. Штаммы, содержащие ген tdh, входили в кластеры В, С и D, большинство из них относились к генотипам С9 и D1. Штаммы вошли в кластеры А, В, С. Отдельный кластер F составили штаммы, не несущие генов основных факторов патогенности, кроме того, авирулентные парагемолитические вибрионы относились к А, В и С кластерам, преимущественно к генотипам А3 и А4 (рис. 2).

Начиная с 1996 г. было выявлено, что доминирующее значение в этиологии пищевых токсикоинфекций имеют штаммы V. parahaemolyticus серогруппы О3:К6, получившие в зарубежной литературе название пандемичных [13]. Панде-мичные штаммы V. parahaemolyticus, взятые в проведенное исследование отнесены к геноварианту D1, только один штамм -к варианту С6. Полученные данные подтверждают имеющееся в зарубежной литературе мнение о клональном происхождении пандемичных штаммов [13].

Анализ выделения генотипов с 1972 по 2015 г. продемонстрировал сохранение и циркуляцию некоторых из них в течение нескольких лет (рис. 3). Так, штаммы генотипа А3 выделены из морской воды на побережье Приморского края с 2009 по 2015 г. Штаммы V. para-haemolyticus генотипа В2 стали причиной заболевания в Новороссийске в 1973-1976 гг., штаммы генотипа С9 выделены из клинического материала больных в Бердянске в 1985-1988 гг., а клон D1 зарегистрирован во Владивостоке в 1997 и 2008 гг.

Также выявленные маркеры легли в основу созданной и зарегистрированной базы данных «Гены V. parahaemo-lyticus, содержащие INDEL-маркеры» [14].

Таким образом, на основании анализа указанных выше генов V. parahaemolyticus разработана система INDEL-типирования, включающая сконструированные праймеры к 6 INDEL-локусам. Использование предложенного варианта INDEL-типирования не требует внедрения особых лабораторных приемов и может быть самостоятельным методом с большой дискриминирующей способностью.

Чемисова О.С., Водопьянов А.С., Рыковская О.А., Водопьянов С.О., Голенищева Е.Н. МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS НА ОСНОВЕ INDEL-МАРКЕРОВ

На основании исследования методом INDEL-типирова-ния можно заключить, что штаммы парагемолитических вибрионов, выделенные из объектов окружающей среды и клинических проб на территории РФ с 1972 по 2015 г. могут быть ти-пированы в зависимости от наличия генов основных факторов

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

патогенности и принадлежности к пандемичному клону. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о циркуляции различных по генотипу штаммов парагемолитических вибрионов на территории Приморского края и в прибрежных районах Черного моря в течение длительного времени.

ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора:

Чемисова Ольга Сергеевна - кандидат биологических наук, временно исполняющая обязанности заместителя директора

по научной работе

Е-таН: chemisova@inbox.ru

Водопьянов Алексей Сергеевич - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, руководитель группы вирусологии лаборатории диагностики особо опасных инфекций Е-таН: aLexvod@gmaiL.com

Рыковская Оксана Алексеевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник Е-таН: rykowskaya.oxana@yandex.ru

Водопьянов Сергей Олегович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией биохимии микробов

E-maiL: vodopyanov_as@antipLague.ru

Голенищева Елена Николаевна - научный сотрудник

E-maiL: GoLenisheva111@g.maiL.com

ЛИТЕРАТУРА

1. Fournier J.M., Quiliei M.L. Infections a vibrions non choleriques // Maladies Infectieuses. 2002. 8026-F-15. 7.

2. Беленева И.А., Масленникова Э.Ф., Магарламов Т.Ю. Физиолого-биохимические свойства галофильных вибрионов Vibrio parahaemolyticus и Vibrio alginolyticus, изолированных из гидробионтов залива Петра Великого Японского моря // Биология моря. 2004. Т. 30, № 2. С. 114-119.

3. Ristori C.A., Iaria S.T., Gelli D.S., Rivera I.N. Pathogenic bacteria associated with oysters and estuarine water along the south coast of Brazil // Int. J. Environ. Health Res. 2007. Vol. 17, N 4. P. 259-269.

4. Смоликова Л.М., Воронежская Л.Г., Подосинникова Л.С., Голенищева Е.Н. Парагемолитические вибрионы - возбудители пищевых ток-сикоинфекций // Холера : сборник статей. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». Ростов н/Д, 2003. С. 93.

5. Nitshibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium // Infect. Immun. 1995. Vol. 63. P. 2093-2099.

6. Park K.-S., Iida T., Yamaichi Y. et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus // Infect. Immun. 2000. Vol. 68, N 10. P. 5742-5748.

7. Park K.-S., Ono T., Rokuda M. et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahatmolyticus // Infect. Immun. 2004. Vol. 72, N 11. P. 6659-6665.

8. МУК 4.2.1793-03. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека

вибрионами : методические указания. М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2003.

9. Oka K., Asari M., Omura T., Yoshida M. et al. Genotyping of 38 insertion/deletion polymorphisms for human identification using universal fluorescent PCR // Mol. Cell Probes. 2014. Vol. 28, N 1. P. 13-18.

10. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D. et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis // Emerg. Infect. Dis. 2007. Vol. 13, N 11. P. 1725-1732.

11. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишань-кин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации // Здоровье населения и среда обитания. 2015. № 5 (266). С. 41-44.

12. Мишанькин Б.Н., Водопьянов А.С., Ломов Ю.М. Мультилокусное VNTR-типирование культур холерных вибрионов, выделенных в г. Казань во время вспышки холеры летом 2001 года // Журн. микробиол. 2003. № 6. С. 11-15.

13. Nair G. B., Ramamurthy T., Bhattacharya S. K. et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serova-riants // din. Microbiol. Rev. 2007. Vol. 20, N 1. P. 39-48.

14. Свидетельство о государственной регистрации базы данных. Гены Vibrio parahaemolyticus, содержащие INDEL-маркеры / Водопьянов С.О., Чемисова О.С., Водопьянов А.С., Олейников И.П.; правообладатель ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. № 2016620699 от 26.05.2016.

REFERENCES

1. Fournier J.M., Quiliei M.L. Infections a vibrions non choleriques. In: Maladies infectieuses. 2002; 8026-F-15: 7.

2. Beleneva I.A., Maslennikova E.F., Magarlamov T.Yu. Physiological and biochemical characteristics of halophilic bacteria Vibrio parahaemolyticus and V. alginolyticus isolated from marine invertebrates of Peter the

Great Bay, Sea of Japan. Biologiya moray [Marine Biology]. 2004; 30

3. Ristori C.A., Iaria S.T., Gelli D.S., Rivera I.N. Pathogenic bacteria associated with oysters and estuarine water along the south coast of Brazil. Int J Environ Health Res. 2007; 17 (4): 259-69.

4. Smolikova L.M., Voronezhskaya L.G., Podosinnikova L.S., Golenish-cheva E.N. Paragemolytic vibrios are the causative agents of food toxic infections. In: Cholera: collection of articles. Materials of the VIII Russian scientific-practical conference on the problem of "Cholera". Rostov-on-Don; 2003: 93.

5. Nitshibuchi M., Kaper J.B. Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium. Infect Immun. 1995; 63: 2093-9.

6. Park K.-S., Iida T., Yamaichi Y., et al. Genetic characterization of DNA region containing the trh and ure genes of Vibrio parahaemolyticus Infect Immun. 2000; 68 (10): 5742-8.

7. Park K.-S., Ono T., Rokuda M., et al. Functional characterization of two type III secretion systems of Vibrio parahatmolyticus. Infect Immun. 2004; 72 (11): 6659-65.

8. MG 4.2.1793-03. Laboratory diagnostics of diseases caused by paragemolytic and other pathogenic for human vibrios: Methodological guidelines. Moscow: Federal Center for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2003.

9. Oka K., Asari M., Omura T., Yoshida M., et al. Genotyping of 38 insertion/deletion polymorphisms for human identification using universal fluorescent PCR. Mol Cell Probes. 2014; 28 (1): 13-8.

10. Larsson P., Svensson K., Karlsson L., Guala D., et al. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg Infect Dis. 2007; 13 (11): 1725-32.

11. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Mishan'-kin B.N., et al. INDEL- и VNTR-typing Vibrio cholerae strains, isolated in 2013 from the environment objects in the Russian Federation. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya [Public Health and Life Environment]. 2015; 5

12. Mishan'kin B.N., Vodop'yanov A.S., Lomov Yu.M. Multilocus VNTR-genotyping of the cultures of Vibrio cholerae isolated in Kazan the outbreak of cholera in summer of 2001. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunology]. 2003; 6: 11-5.

13. Nair G.B., Ramamurthy T., Bhattacharya S.K., et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants. Clin Microbiol Rev. 2007; 20 (1): 39-48.

14. Certificate of state registration of the database. Vibrio parahaemolyticus genes containing INDEL-markers / Vodop'yanov S.O., Chemi-sova O.S., Vodop'yanov A.S., Oleynikov I.P .; rights holder FKUZ Rostov-on-Don anti-plague institute Rospotrebnadzor. No. 2016620699 of 05/26/2016.