СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ЛЕТАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА in vitro
METHOD FOR REDUCING LETHAL ACTION OF BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDE in vitro

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано при поиске путей уменьшения патогенных свойств бактериального липополисахарида.
Бактериальный липополисахарид (ЛПС, эндотоксин) представляет собой амфифильный биополимер, содержащий гидрофильные (О-специфические цепи, олигосахарид кора) и гидрофобный (липид А) фрагменты. Он является важнейшим фактором патогенности грам-отрицательных микроорганизмов, ответственным за развитие бактериального эндотоксикоза и его наиболее тяжелой формы - бактериально-токсического шока. Влияние ЛПС на макроорганизм проявляется в стимуляции лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток, усилении продукции интерлейкинов, фактора некроза опухолей-альфа и ряда других медиаторов, в активации системы комплемента и факторов свертывания крови, что может заканчиваться развитием диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, эндотоксинового шока и острой полиорганной недостаточности (Ильина А.Я. Патогенетические механизмы и клинические аспекты действия термостабильного эндотоксина кишечной микрофлоры / Ильина А.Я., Лазарева С.И., Лиходед В.Г. и др. // Рус. мед. журн. - 2003. - Т. 11. - С.126-129; Dauphinee S.M. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells/Dauphinee S.M., Karsan A. // Laboratory Invest. -2006. - Vol.86. - P. 9-22).
Чрезвычайно актуальным в настоящее время является поиск способов уменьшения летальных эффектов ЛПС, что может открыть новые перспективы в детоксикации организма. В литературе описаны разнообразные способы изменения патогенных свойств молекулы эндотоксина. Обычно для снижения токсичности ЛПС применяются различные химические вещества (катионные амфифильные молекулы, синтетические пептиды, полиамины, нетоксичный полисахарид хитозан), уменьшающие патогенное действие ЛПС в результате образования с ним макромолекулярных комплексов (Давыдова В.Н. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексообразования / Давыдова В.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - С.1278-128; Ермак И.М. Модификация биологических свойств липополисахарида при образовании им комплекса с хитозаном / Ермак И.М., Давыдова В.Н., Горбач В.И. // Бюл. эксперим. биол. мед. - 2004. - Т. 137. - С.430-434; Ермак И.М. Взаимодействие бактериальных липополисахаридов с растворимыми белками макроорганизма и поликатионами / Ермак И.М., Давыдова В.Н. // Биологические мембраны. - 2008. - Т. 25. - С.323-342; Kaconis Y. Biophysical mechanisms of endotoxin neutralization by cationic amphiphilic peptides / Kaconis Y., Kowalski I., Howe J. et al. // Biophys J. - 2011. - Vol.100(11). - P. 2652-2661; Sil D. Biophysical mechanisms of the neutralization of endotoxins by lipopolyamines / Sil D., Heinbockel L., Kaconis Y. et al. // Open Biochem J. - 2013. Vol.7. - P.82-93).
Новым направлением является создание олигонуклеотидных аптамеров, специфически связывающихся с ЛПС и снижающих его патогенную активность (Wen A.A novel lipopolysaccharide-antagonizing aptamer protects mice against endotoxemia / Wen A., Yang Q., Li J. et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. - Vol.382. - P. 140-144; Bruno J.G. In vitro antibacterial effects of antilipopolysaccharide DNA aptamer-C1qrs complexes / Bruno J.G., Carrillo M.P., Phillips T. et al. // Folia Microbiol. - 2008. - Vol.53 (4). - P. 295-302).
Однако химическая модификация молекулы ЛПС не всегда оказывается доступной, удобной и приемлемой, в силу дороговизны и малой доступности применяемых для этой цели веществ. Кроме того, вещества, использующиеся для модификации токсической молекулы, сами могут обладать биологической активностью и оказывать влияние на исследуемые функции.
Более приемлемым и доступным способом изменения токсических свойств бактериального ЛПС является воздействие на него физических факторов, а именно электромагнитного излучения (Lin С.Т. Long-term continuous exposure to static magnetic field reduces popolysaccharide-induced cytotoxicity of fibroblasts / Lin СТ., Lee S.Y., Chen C.Y. et al. // Int. J. Radiat. Biol. - 2008. - Vol.84(3). - P. 219-226).
Наиболее близким аналогом данного патента может рассматриваться модифицирующее влияние на патогенные свойства бактериального ЛПС излучения низкоинтенсивного красного лазера (Брилль Г.Е. Лазерное облучение бактериального липополисахарида модифицирует его влияние на микроциркуляцию / Брилль Г.Е., Агаджанова К.В., Гаспарян Л.В., Макела A.M. // Лазерная медицина. - 2009. - Т. 13, вып.4. - С.46-49). Предварительное облучение ЛПС светом красного лазера (длина волны 660 нм) существенно ослабляет патогенное влияние эндотоксина на систему микроциркуляции, уменьшая количество лейкоцитов, участвующих в ролинге, а также препятствует развитию дилатации венозных сосудов, ослабляет процесс коагрегации тромбоцитов и лейкоцитов, ингибирует адгезию тромбоцитов на мультимерной молекуле фактора фон Виллебранда. Однако в данном исследовании не изучалось изменение летальных свойств бактериального ЛПС при лазерном воздействии.
Нами предлагается новый простой и доступный способ уменьшения летального действия ЛПС путем облучения его суспензии in vitro низкоинтенсивным электромагнитным излучением с частотой 1 ГГц.
2
Способ реализуется следующим образом. В работе используется ЛПС кишечной палочки 055:В5 (Sigma, США). Предварительно 25 мг ЛПС разводится в 25 мл дистиллированной воды (концентрация ЛПС=1000 мкг/мл). Затем раствор ЛПС делится на 2 пробы: 10 мл - для контроля, 15 мл - для облучения. Облучение раствора ЛПС производится в малой чашке Петри аппаратом «Акватон-02» (производитель - фирма «Телемак», Саратов), генерирующим низкоинтенсивное электромагнитное излучение с частотой 1 ГГц. Плотность мощности излучения на поверхности раствора - 0,0001 мВт/см, время облучения - 10 мин. Физические параметры излучения задаются используемым прибором. Выбор времени облучения обоснован тем, что в течение 10 мин происходят изменения процесса спонтанного структурообразования молекул ЛПС, обнаруженные нами в предварительных экспериментах с использованием метода клиновидной дегидратации (Брилль Г.Е. Влияние электромагнитного излучения УВЧ-диапазона на структурообразовательные свойства бактериального липополисахарида / Брилль Г.Е., Егорова А.В., Бугаева И.О., Дубовицкий С.А., Власкин С.В. // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2013. - Т.9, №4. - С.637-640), что позволяет предположить изменение при этом летальных свойств ЛПС.
Летальные дозы (ЛД) эндотоксина определяются на 2 группах мышей-самцов. Масса каждого животного - 20 г. Мышам первой группы (контроль) внутрибрюшинно вводится нативный (необлученный) ЛПС в дозах 100, 200, 300 и 400 мкг/мышь (соответственно 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 мл ЛПС). Число животных для каждой дозы - 8. Мыши второй (опытной) группы получают внутрибрюшинные инъекции предварительно облученного ЛПС в тех же дозах (объемах). Число животных для каждой дозы - 13. Наблюдение за животными проводится в течение 24 часов после введения ЛПС. Расчет летальных доз ЛПС производится методом пробит-анализа.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.
Расчетные параметры ЛД для группы контроля составили:
16
ЛД- 124,7 мкг/мышь
50
ЛД- 212,2 мкг/мышь
84
ЛД- 299,7 мкг/мышь
100
ДД- 343,4 мкг/мышь
Расчетные параметры ЛД для опытной группы составили:
16
ЛД- 188,2 мкг/мышь
50
ЛД- 287,1 мкг/мышь
84
ЛД- 386,0 мкг/мышь
100
ЛД- 435,4 мкг/мышь
50
Для группы контроля М±m ЛД составило - 212,2±25,2
50
Для опытной группы М±m ЛД составило - 287,1±22,3
Достоверность разницы между группой контроля и опытной группой: р<0,02
2
Следовательно, облучение ЛПС электромагнитным излучением с частотой 1 ГГц, при плотности мощности 0,0001 мВт/см, в течение 10 мин достоверно снижает летальный эффект бактериального ЛПС на 26% (р<0,02).
Способ прост в реализации, не требует дорогостоящего оборудования и высокоэффективен.