РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Rhodococcus rhodochrous, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АЦИЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ СИНТЕЗА N-ЗАМЕЩЕННЫХ АКРИЛАМИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА
RECOMBINANT BACTERIUM STRAIN Rhodococcus rhodochrous HAVING CONSTITUTIVE ACYLATING ACTIVITY, AND METHOD OF SYNTHESIS OF N-REPLACED ACRYLAMIDES USING THIS STRAIN AS BIOCATALYST

Заявляемая группа изобретений относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Rhodococcus rhodochrous, а также способа синтеза N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида с использованием клеток этого штамма в качестве биокатализатора.
N-замещенные алифатические акриламиды являются производными акриламида - мономера для синтеза широкой гаммы полимеров, которые применяются практически во всех областях промышленности. Развитие технологии производства полимеров в последние годы привело к разработке новых видов полимеров, в состав которых наряду с основным мономером - акриламидом - входят также различные производные, в том числе N-замещенные акриламиды. Эти мономеры выполняют роль модификаторов физико-химических свойств полимеров, существенно расширяя круг их применения. Одной из значительных областей применения N-замещенных акриламидов является синтез водорастворимых полимеров, применяемых в качестве адсорбентов, флокулянтов и структурообразователей во многих отраслях промышленности и сельского хозяйства (Полиакриламид. - М., 1992).
На сегодняшний день промышленным путем N-замещенные акриламиды получают традиционным способом - путем химического синтеза, основанного на ацилировании алифатических аминов хлорангидридами акриловой и метакриловой кислот (MacWilliams D.S. Functional monomers. Their preparation, polymerization, and application. New York: M. Decker, 1973). Реагенты, используемые для такого синтеза, крайне ядовиты, и, с учетом возрастающих потребностей в N-замещенных акриламидах, производство по традиционной технологии становится все более опасным для окружающей среды и персонала.
Принципиально другим способом получения N-замещенных акриламидов является биокаталитический синтез, проводимый в водной среде.
Известен способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с помощью биокатализатора - клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, обладающих ацилирующей активностью (RU2399672), обусловленной наличием в них фермента ациламидазы.
Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) рассмотрим в качестве ближайшего аналога заявляемого штамма, а способ биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 (RU2399672) - в качестве ближайшего аналога заявляемого способа.
Недостатком штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 является то, что его ацилирующая активность является индуцибельной, то есть требует наличия в среде культивирования дорогостоящего индуктора - ацетанилида. Это повышает стоимость и снижает конкурентоспособность способа - ближайшего аналога, основанного на использовании штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 в качестве биокатализатора.
Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала способов биокаталитического синтеза N-замещенных акриламидов.
Задача решена путем:
- конструирования рекомбинантного штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, обладающего конститутивной ацилирующей активностью и полученного путем замещения в хромосоме штамма Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д (RU 2053300) гена, кодирующего структурную часть фермента нитрилгидратазы на ген, кодирующий структурную часть фермента ациламидазы из штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793 при сохранении промотора гена нитрилгидратазы в качестве промотора гена ациламидазы у заявляемого штамма;
- разработки способа синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.
Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960, в хромосому которого интегрирован ген ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, приобретает конститутивную ацилирующую активность и способность синтезировать N-замещенные алифатические акриламиды. При смешивании водных растворов акриламида и аминов в присутствии клеток Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 (используемого в качестве биокатализатора) происходит синтез N-замещенных акриламидов, в частности, N-изопропилакриламида (или N-диметиламинопропилакриламида).
Характеристика заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960
Морфологические свойства. Клетки штамма неподвижны и окрашиваются по Граму. Спор не образуют, некислотоустойчивы. В возрасте 18-20 ч клетки образуют длинные (до 20 мкм) слабо ветвящиеся нити, которые через 48-72 ч распадаются на палочковидные и кокковидные элементы. В старых культурах наблюдаются плеоморфные клетки в виде колб, груш, булав. Деление клеток происходит по раскалывающемуся и сгибающему типам.
Культуральные свойства. На плотных питательных средах (МПА, Хоттингер) через 48 ч роста штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм, окрашенные от палево-розового до розово-оранжевого цвета. При росте на мясо-пептонном бульоне образуются пленка и осадок. Лакмусовое молоко не изменяется.
Физиологические свойства. Облигатный аэроб. Редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра отрицательные. Образует сероводород. Штамм оксидазоотрицательный, каталазо- и фосфатазаположительный. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и 80 гидролизует. Аденин не утилизирует. Клетки не выдерживают нагревания в снятом молоке при 72°C в течение 15 мин. Штамм растет при pH 6-9, температуре 5-45°C. Кислоту образует из следующих сахаров и спиртов: глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, сорбита, манита и глицерина. Газообразования ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника азота используют соединения аммония, нитраты и мочевину. В качестве единственного источника углерода использует мальтозу, манит, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, бензоат, n- и m-гидроксибензоат, тирозин; не использует рамнозу, галактозу, инозит, a-кетоглутарат. В клеточной стенке штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 содержатся мезо-диаминопимелиновая кислота, арабиноза и галактоза, что характерно для коринеподобных бактерий с IV типом клеточной стенки. Клетки также содержат липид A(LCN), характерный для родококков.
Отличительная особенность заявляемого штамма состоит в высоком уровне стабильности ацилирующей активности в неселективных условиях, т.е. в отсутствии в среде антибиотиков. Уровень утраты гена ациламидазы после роста в неселективных условиях для штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас-1960 составляет менее 0.1%.
Получение биокатализатора.
Для получения клеток заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960 в больших количествах и с высокой активностью ациламидазы штамм выращивают при 25-30°C в течение 48-72 часов на синтетических средах, содержащих в качестве источника углерода сахара или спирты в концентрациях 0.1-4%, а в качестве источника азота соединения аммония, нитраты или мочевину в концентрациях 0.4-2%. Полученные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5-16 тыс.об/мин, ресуспендируют в 10 мМ фосфатном буфере pH 7,0-8,0 до концентрации 20-40 г по сухой массе/л и хранят в таком виде при 4°C.
Ацилирующую активность штаммов определяют по скорости синтеза N-изопропилакриламида по следующей методике.
Смешивают 300 мкл 10% водного раствора акриламида, 250 мкл 10% водного раствора изопропиламина (pH 10), 450 мкл культуры. Инкубируют при 37°C 2 часа, отделяют клетки центрифугированием в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин, определяют содержание N-изопропилакриламида с помощью газовой хроматографии.
Активность культуры выражают в мМ ИПАА, синтезированного за 1 час на л культуры.
Способ синтеза N-замещенных акриламидов в общем виде
Синтез N-замещенных акриламидов, в частности N-изопропилакриламида или N-диметиламинопропилакриламида, осуществляют смешиванием водных растворов акриламида и алифатических первичных аминов, в частности изопропиламина и диметиламинопропиламина в концентрациях от 1% до 10% с суспензией биокатализатора (от 1 до 10 г клеток по сухой массе на 1 л реакционной смеси) в термостатируемом сосуде (при температуре от 20 до 40°C, предпочтительнее от 25 до 30°C) и последующим перемешиванием (от 100 до 250 об/мин) в течение 1-48 час. Значение pH варьирует от 8,5 до 11, предпочтительнее от 9 до 11.
Содержание конечного продукта - N-замещенного акриламида определяют с помощью газовой хроматографии
Заявляемый способ позволяет получать растворы, содержащие от 1 до 30 г/л N-замещенных акриламидов.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.
Фигура 1. Структура плазмиды pRY1-H1-aam-H2. H1 - фрагмент промоторной области кластера генов нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; aam - ген, кодирующий ациламидазу из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793; H2 - фрагмент ДНК с геном nhmG из Rhodococcus rhodochrous ВКМ АС-1515Д; bla - ген, кодирующий бета-лактамазу (маркер устойчивости к ампициллину); tsr - ген, кодирующий 23 S рРНК метилтрансферазу (маркер устойчивости к тиострептону); oriR E. coli - область, ответственная за репликацию плазмиды pUC19 в E. coli; oriT - область, ответственная за конъюгативный перенос плазмиды.
Пример 1. Конструирование интеграционной касеты для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д на ген ациламидазы Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793
Интеграционная кассета состоит из гена ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1793, фланкированного фрагментами хромосомы из штамма Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д, обозначенными H1 и Н2. Фрагмент H1 содержит участок ДНК, гомологичный регуляторной области нитрилгидратазы в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Фрагмент Н2 содержит участок ДНК, гомологичный гену nhmG в хромосоме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. Рекомбинантная плазмида для замещения генов нитрилгидратазы в хромосоме состоит из интеграционной кассеты, клонированной на плазмиде pRY1 (Рябченко Л.Е., Полякова И.Н., Яненко А.С. Мобилизуемые плазмидные векторы, способные к конъюгативному переносу между клетками Е. coli и Rhodococcus, и их использование для конструирования штаммов Rhodococcus. Биотехнология, 2005, N5, с.6-13). Эта плазмида не способна автономно поддерживаться в штамме Rhodococcus rhodochrous BKM АС-1515Д. При наличии в составе плазмиды участка, гомологичного хромосоме хозяина, плазмида способна интегрировать в хромосому по гомологичным участкам.
Ген ациламидазы и фрагменты H1 и Н2 наработаны с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием соответствующих праймеров и ДНК-матриц, перечисленных в таблице 1.
Таблица 1
Список праймеров и ДНК-матриц, использованных для наработки фрагментов интеграционной кассеты H1, aam и Н2.
Фрагмент
Название праймера
Последовательность праймера
ДНК-матрица
H1
Прямой
5'-GGGGGATCCCCGGAGTCTTCATCCTGTTTTGGGATGCG-3'
Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д
Обратный
5'-GATCCATGGCCTCATTCCTTTCATCGGAGC
aam
Прямой
5'-GTCCCATGGCCGAACAGAATCTGC
Хромосомная ДНК из R. erythropolis ВКПМ Ас-1793
Обратный
5'-GGGGAGCTCGATTCAGACGTCATCACAC
CAATCTAGCC-3'
Н2
Прямой
5'-GGGGAGCTCGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG-3'
Хромосомная ДНК из R. rhodochrous BKM АС-1515Д
Обратный
5'-GGGGAATTCAGTACCCACCGAGCCGAATTAGGAACCACCG-3'
В последовательности праймеров внесены сайты рестриктаз BamHI, Ncol, Sad, EcoRI, необходимые для соединения фрагментов друг с другом и введения кассеты в плазмиду pRY1. Схема плазмиды, содержащей интеграционную кассету, представлена на фиг.1.
Пример 2. Конструирование заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960
Для конструирования заявляемого штамма плазмиду с интеграционной кассетой вводят в штамм R. rhodochrous BKM AC-1515 Ac помощью конъюгации. Для передачи плазмиды в R. rhodochrous BKM АС-1515Д используют вспомогательный штамм Е. coli S17-1, способный обеспечивать конъюгативный перенос производных плазмиды pRY1 в реципиентные штаммы Rhodococcus. Для осуществления конъюгативного переноса плазмиду pRY1-H1-aam-H2 вводят в штамм Е. coli S17-1 путем химической трансформации ДНК. Конъюгационные скрещивания между Е. coli S17-1 и R. rhodochrous BKM АС-1515Д проводят путем смешивания экспоненциально растущих культур обоих штаммов, инкубации их на твердой среде в отсутствие селектирующих агентов в течение ночи, а затем инкубации в течение 4 суток в присутствии антибиотиков тиострептона (селекция против клеток R. rhodochrous BKM АС-1515Д, не получивших плазмиду) и налидиксовой кислоты (селекция против клеток Е. coli S17-1). Устойчивые к тиострептону клоны R. rhodochrous BKM АС-1515Д содержат плазмиду pRY1-H1-aam-H2, интегрированную в хромосому. Исключение плазмиды из хромосомы в некоторых случаях приводит к замещению гена нитрилгидратазы на ген ациламидазы. При этом клетка приобретает чувствительность к тиострептону, но сохраняет ацилирующую активность. Так, получен штамм, содержащий в хромосоме ген ациламидазы, который депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» как Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac-1960.
Пример 3. Получение биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960
4
2
4
9
В колбу Эрленмейера (объемом 750 мл), содержащую 50 мл синтетической питательной среды MS следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,5; мочевина - 0,06; MgSO - 0.05; CoCl - 0.004; FeSO - 0,0005; вода - остальное, добавляют 0,5 мл культуры (10 кл/мл) заявляемого штамма, предварительно выращенного на той же среде. Затем колбу инкубируют с перемешиванием (200 об/мин) при 30°C в течение 72 час. Полученная таким образом культура обладает ацилирующей активностью 25 мМ ИПАА/л*ч. Полученную биомассу штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960 отделяют центрифугированием при 5 тыс. об/мин и хранят при +4°C.
Пример 4. Синтез N-изопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960
Водные растворы акриламида и изопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и изопропиламина в смеси составляют 6% и 3%, соответственно. Концентрация биокатализатора в смеси составляет 8 г по сухой массе/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 7 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин). Концентрацию N-изопропилакриламида в реакционной смеси определяют с помощью газовой хроматографии. Концентрация N-изопропилакриламида в полученном образце составляет 32 г/л.
Пример 5. Синтез N-диметиламинопропилакриламида с использованием биокатализатора на основе заявляемого штамма Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ас1960
Водные растворы акриламида и диметиламинопропиламина (рН 10) смешивают, затем к реакционной смеси в качестве биокатализатора добавляют суспензию клеток штамма Rhodococcus rhodochrous Ac1960, полученную как в примере 3. Концентрации акриламида и диметиламинопропиламина в смеси составляют 6% и 2.5%, соответственно. Концентрация клеток в смеси составляет 8 г сухого веса/л. Реакционную смесь инкубируют при 37°C в течение 24 часов. Затем клетки отделяют центрифугированием (5 тыс. об/мин) и количество конечного продукта определяют методом газовой хроматографии. Концентрация полученного раствора N-диметиламинопропилакриламида составляет 8 г/л.
Таким образом,
- сконструирован штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМ Ac1960, обладающий конститутивной ацилирующей активностью и, в отличие от штамма ближайшего аналога, не нуждающийся в индукторе ацилирующей активности и способный расти на минеральной синтетической среде;
- заявляемый способ синтеза N-замещенных акриламидов с использованием в качестве биокатализатора заявляемого штамма позволяет получать концентрированные (8-30 г/л) растворы N-замещенных акриламидов, что превосходит способ - ближайший аналог в 1,5 раза.