СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПОДОСТРОЙ СТАДИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИСТИННОЙ ЭКЗЕМЫ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF SUB-ACUTE STAGE OF CHRONIC IDIOPATHIC ECZEMA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования подострой стадии хронической истинной экземы.
Истинная экзема - повсеместно встречающееся, чаще острое, реже хроническое рецидивирующее заболевание кожи, возникающее в любом возрасте, характеризующееся полиморфизмом морфологических элементов сыпи [Клиническая дерматовенерология: руководство для врачей: в 2-х т. /под ред. Ю. К. Скрипкина, Ю. С. Бутова. - Москва: Гэотар- Медиа, 2009. - Т. 2. - 921 с.]. Название данного дерматоза объясняется свойством экзематозных пузырьков быстро вскрываться, подобно пузырькам кипящей воды (по-гречески eczeo - вскипать). Важный признак острой экземы - наличие многочисленных сгруппированных и быстро вскрывающихся с образованием серозных «колодцев» мелких пузырьков, имеющих некоторое сходство с пузырьками на поверхности кипящей воды [Оспанова С. А. Совершенствование терапии экземы с учетом эндогенной интоксикации: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.11 /С. А. Оспанова; Казах. науч.-исслед. кож.-венерол. ин-т. - Алматы, 2008. - 24 с.]. Заболевание характеризуется хроническим рецидивирующим течением и значительно ограничивает трудоспособность больных.
В развитии экземы существуют три стадии воспалительного процесса: острая стадия, подострая стадия и хроническая стадия. Подострая стадия экземы характеризуется умеренной эритемой, выраженной лихенизацией, становятся видны более четкими границы поражения, уменьшается выделение экссудата, однако, на месте эпителизирующихся эрозий начинает появляться обильное шелушение, что способствует социальной дезадаптации пациентов, снижая их качество жизни, а также неблагоприятно сказывается на физическом и психическом состоянии больного и членов его семьи.
Этиологический и патогенетический аспекты развития экземы, освещенные в современных научных изданиях, носят весьма противоречивый характер. Патогенез экземы привлекал внимание многих исследователей. Они выдвигали различные теории ее происхождения и связывали возникновение экземы с преобладающими нарушениями в той или иной системе организма. Так, до сих пор окончательно не определены механизмы развития иммунных отклонений в организме в целом и непосредственно в коже больных [Барабанов, А. Л. Некоторые вопросы патогенеза экземы /А. Л. Барабанов, В. Г. Панкратов //Медицинская панорама. - 2004. - №6. - С. 5-8]. В то же время недостаточно изучены метаболические нарушения и их взаимосвязь с иммунной реактивностью, способствующие снижению активности факторов неспецифической защиты при развитии различных форм экземы. На данном этапе исследователи пришли к выводу, что необходим комплексный подход к изучению патогенеза экземы.
На разных этапах развития учения об экземе особое значение в этиологии и патогенезе заболевания придавали нервной системе (неврогенная теория), роли эндокринных желез, аллергическому состоянию организма (аллергическая теория), наследственным факторам. Следует признать, что этиология и даже патогенез экземы чрезвычайно сложны, не всегда одинаковы и во многих своих аспектах остаются неизученными [Modern aspects of cutaneous neurogenic inflammation /M. Steinhoff, S. Ständer, S. Seeliger [et al.] //Arch. Dermatol. - 2003. - Vol.139, №11. - P. 1479-1488].
По современным представлениям, в развитии экземы главную роль играют Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяющие ряд противовоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-α. Выброс биологически активных веществ вызывает развитие тканевых реакций воспаления, что клинически проявляется аллергическим ответом в виде гиперемии, отека, зуда. Антигенная стимуляция Th1 приводит к синтезу ИЛ-2, причем ИЛ-2 продуцирующая способность CD4-клеток у больных выше, чем у здоровых людей.
Провоспалительные цитокины вызывают индукцию экспрессии молекул адгезии на лейкоцитах и эндотелиальных клетках, вследствие чего стимулируется приток лейкоцитов из сосудистого русла в очаг воспаления путем их трансэндотелиальной миграции. Дальнейшее продвижение и накопление иммунокомпетентных клеток в очаге воспаления контролируется хемокинами, которые продуцируются макрофагами и эндотелиальными клетками. Клеточный инфильтрат в очаге воспаления, состоящий из нейтрофилов, эозинофилов и макрофагов, способствует дальнейшему развитию аллергического воспаления. Полиморфный инфильтрат в коже при экземе - результат действия образовавшихся противовоспалительных цитокинов, в том числе ФНО-α. Таким образом, в аллергических реакциях замедленного типа участвуют Th1- лимфоциты, макрофаги, эндотелиальные клетки и секретируемые ими цитокины.
Таким образом, в аллергических реакциях замедленного типа, лежащих в основе формирования истинной экземы, участвуют Th1- лимфоциты, макрофаги, эндотелиальные клетки и секретируемые ими цитокины.
Цитокины - это биологически активные вещества белковой природы, которые регулируют широкий спектр процессов, протекающих в организме [Inhibitоry еffеcts оf tumоr nеcrоsis factоr оn hеmatоpоiеsis sееn in vitrо arе translatеd tо incrеasеd numbеrs оf bоth cоmmittеd and multipоtеnt prоgеnitоrs in TNF-dеficiеnt micе /M. S. Drutskaya, M. Оrtiz, D. J. Liеpinsh [еt al.] //Еxp. Hеmatоl. - 2005. - Vоl. 33, №11. - Р. 1348-1356].
Среди множества биологических эффектов и реакций, опосредуемых цитокинами, главными являются иммунные реакции, воспалительный ответ, регуляция гемопоэза, ангиогенез, репаративные процессы в тканях. Их действие является антиген-неспецифическим, они способны воздействовать на любые клетки, содержащие соответствующие рецепторы и находящиеся в адекватной физиологической активности. К цитокинам относят и факторы некроза опухолей (TNF).
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования подострой стадии хронической истинной экземы на основании исследованных полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов и других возможных факторов риска с целью выявления больных ХИЭ, предрасположенных к развитию подострой стадии.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования подострой стадии хронической истинной экземы на основе данных о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний. Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования повышенного риска развития осложнений хронической истинной экземы. Аналогичных патентов нет.
Задачей настоящего исследования является создание способа прогнозирования подострой стадии хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, на основе данных о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития подострой стадии хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации, по данным о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα,+250A/G Ltα и+1663A/G TNFR2 и их сочетаний.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования подострой стадии хронической истинной экземы, включающий:
- забор венозной крови;
- выделение геномной ДНК из периферической крови методом полимеразной цепной реакции  синтеза ДНК;
- анализ полиморфизмов генов фактора некроза опухоли α (-308G/A TNFα), лимфотоксина α (+250A/G Ltα) и рецептора фактора некроза опухоли 2 типа (+1663A/G TNFR2);
- прогнозируют повышенный риск развития подострой стадии ХИЭ при наличии аллеля -308А ТNFα, или генотипа -308GА ТNFα, или аллеля+1663G ТNFR2, или сочетания аллеля -308А ТNFα с аллелем+1663G ТNFR2, или сочетания аллеля -308А ТNFα с+аллелем 250G Ltα, или сочетания аллеля+250G Ltα с аллелем+1663G ТNFR2;
- прогнозируют пониженный риск развития подострой стадии ХИЭ при наличии генотипа -308GG ТNFα.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что впервые установлена вовлеченность генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли α (-308 G/A TNF α), лимфотоксина α (+250 A/G Ltα), рецептoра фактoра некроза опухоли 2-го типа (+1663А/G ТNFR2) и их сочетаний в формировании подострой стадии хронической истинной экземы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации.
Способ осуществляют следующим образом:
2
Выделение геномной ДНК осуществляют стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. 1-й этап: к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, который содержит 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х -100, 5 мМ МgСl и 10 мМ трис-НCl (pH=7,6) [Мathew С.С., 1984]. Полученную смесь при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут перемешивают и центрифугируют. После центрифугирования сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют 4 мл раствора, с 25 мM ЭДTA (рН=7,8) и 75 мМ NаСl, затем ресуспензируют. После этого прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и в течение 16 часов при 37ºС инкубируют образец.
°
На 2-м этапе в течение 10 минут при 4000 об/мин из полученного лизата последовательно экстрактируют ДНК равными частями фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием. Производят отбор водной фазы после каждого центрифугирования. Из раствора 2-мя объемами охлажденного 96% этанола осаждают ДНК. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде и хранят при t=-20 С. Выделенную ДНК используют для полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК.
Анализ -308G/А TNFα,+250G/A Ltα и+1663A/G TNFR2 осуществляют методами ПЦР синтеза ДНК на CFX 96 с системой ПЦР в режиме real time. Используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (производитель фирма «Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтезированные фирмой «Синтол»).
2
2
Реакционная смесь (объем 25 мкл) включает: 67 мМ трис-НCl (pН=8,8), 2,5 мМ МgCl, 0,1 мкг геномной ДHK, по 10 пM каждого праймера, по 5 пkмoль каждого зонда, по 200 мkM dАТР, dGТР, dСТР, dТТР и 1 единицу активной Тaq-полимеразы. Для каждой пары праймеров рассчитывают оптимальный температурный и временной режим отжига и подбирают соответствующую концентрацию MgCl.
Генотипирование производят по методу Tag Man зондов на основании данных значений УОФ (далее, уровень относительной флуоресценции) для каждого зонда при проведении ПЦP в амплификаторе IQ5.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития подострой стадии хронической истинной экземы подтверждает анализ результатов обследования 376 индивидуумов: 54 больных с подострой стадией ХИЭ (14,36%) и 322 человек контрольной группы (85,64%).
В исследуемые группы включались лица русской национальности, которые являлись уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имели родства между собой. Клиническое и клинико-лабораторное обследование больных проводили на базе поликлинического отделения ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер».
Средний возраст больных хронической истинной экземой составил 45,91±2,68 (варьировал от 18 лет до 86 лет), контрольной выборки - 43,62±3,46 (варьировал от 20 до 76 лет) (р>0,05). Следовательно, группа больных не отличалась от группы контроля по возрасту, месту рождения и национальности.
cor
cor
реrm
С целью решения проблемы множественных сравнений, связанной с получением ложноположительных результатов (ошибка 1-го рода), вводят поправку Бонферрони, т.е. производят перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле: р=р·n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали р≤0,05. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ХИЭ проводят с помощью программного обеспечения АРSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующий метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику. Уровень р, полученный после пермутационного теста р≤0,05 (выполнено 100 пермутаций), принимают за статистически значимый.
2
2
2
cor
У пациентов в подострой стадии заболевания концентрации молекулярно-генетических маркеров -308А ТNFα и -308GА ТNFα составляют 20,21% и 36,17% и являются наибольшими (в 1,93 и 1,90 раза, соответственно) по сравнению с контрольной группой (10,47%, χ=6,61, р=0,01, OR=2,17, 95% CI 1,19-3,93 и 19,06%, χ=6,18, р=0,01, р=0,03, OR=2,41, 95% CI 1,18-4,86, соответственно). Наряду с этим среди больных с подострой стадией ХИЭ концентрация аллеля+1663G ТNFR2 (68,27%) достоверно выше, чем в контрольной группе (55,95%, χ=5,05, р=0,03, OR=1,69, 95% CI 1,06-2,70).
perm
perm
perm
В формировании значимых сочетаний генетических полиморфизмов, отличающих больных ХИЭ с подострой стадией течения от контрольной группы, участвуют три рассмотренных генетических полиморфизма: -308G/А ТNFα,+250А/G Ltα,+1663А/G ТNFR2. Установлены различия в частоте сочетания аллеля -308А ТNFα с аллелем+1663G ТNFR2 между больными ХИЭ с подострой стадией течения и контролем. Концентрация этого сочетания генетических вариантов в контрольной группе составляет 15,22%, тогда как среди больных данный показатель равен 33,33% (p=0,0003, р=0,0001, ОR=3,54 95% CI 1,81-6,91). Наряду с этим, зарегистрированы различия в распространенности сочетания двух генетических маркеров аллеля -308А ТNFα с аллелем+250G Ltα, между больными ХИЭ в подострой стадии (31,48%) и контролем (18,01%) (p=0,004, р=0,01, ОR=2,65 95% CI 1,36-5,14), а также различия в частоте сочетания аллеля +250G Ltα с аллелем+1663G ТNFR2 между сравниваемыми группами больных (44,44%) и контроля (32,3%) (p=0,01, р=0,03, ОR=2,17 95% CI 1,16-4,05). Все три сочетания полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей являются факторами риска развития подострой стадии ХИЭ (ОR=2,17-3,54).
2
cor
Концентрация генотипа -308GG ТNFα равна 61,70% и является наименьшей (в 1,3 раза) по сравнению с контрольной группой (80,00%, χ=6,89, р=0,009, р=0,027, OR=0,40, 95% CI 0,20-0,81), следовательно можно прогнозировать пониженный риск развития подострой стадии ХИЭ.
Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения среди лиц русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья Российской Федерации.
1. У больного хронической истинной экземой М. выявлен аллель -308А ТNFα. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
2. У больного хронической истинной экземой Л. выявлен генотип -308GА ТNFα. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
3. У больного хронической истинной экземой О. выявлен аллель +1663G ТNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
4. У больного хронической истинной экземой Е. выявлено сочетание аллеля -308А ТNFα с аллелем+1663G ТNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
5. У больного хронической истинной экземой В. выявлено сочетание аллеля -308А ТNFα с аллелем+250G Ltα. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
6. У больного хронической истинной экземой Р. выявлено сочетание аллеля+250G Ltα с аллелем+1663G ТNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного больного развилась подострая стадия данного заболевания.
7. У больного хронической истинной экземой Д. выявлен генотип -308GG ТNFα. При дальнейшем наблюдении у данного больного не было подострой стадии данного заболевания.
Таким образом, поставленная задача по созданию способа прогнозирования подострой стадии хронической истиннной экземы решена.