CПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИНТЕРФЕРОН-СТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING LOW-MOLECULAR PEPTIDES SHOWING INTERFERON STIMULATING ACTIVITY

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской, фармацевтической промышленности, а именно получению иммуномодулирующих низкомолекулярных пептидов из отходов производства лактоглобулинов.
Среди низкомолекулярных пептидов молозива наиболее известен иммуномодулятор фактор переноса. По данным У.Дж.Хэннен самым лучшим источником фактора переноса является коровье молозиво (Доктор Уильям Дж.Хэннен «Трансфер Фактор-плюс. Идеальная комбинация биологически активных веществ для оптимального иммунитета» / Под ред. Ю.П.Гичева и Э.Огановой. - Новосибирск, 2001. - 73 с.) Известно, что фактор переноса обладает универсальной иммуномодулирующей эффективностью независимо от биологического вида донора и реципиента (Лыкова С.Г. с соавт. «Опыт применения Трансфер Фактора в дерматологии» // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2002, №3, - с.34-35). Поэтому антигенспецифичные низкомолекулярные пептиды, выделенные из иммунного молозива коров, могут обеспечить иммунитет против соответствующих заболеваний и значительно облегчить их течение.
Существует способ получения низкомолекулярных пептидов - биологически активной добавки «Милканг» (RU №2183935. 2002.06.07). Указанный способ получения низкомолекулярных пептидов, выбранный в качестве прототипа, позволяет получить малые пептиды весом более 50 кДа путем использования неиммунного сырья (молока, обезжиренного молока, молозива, стародойного молока, подсырной или творожной сыворотки, ультрафильтратов обезжиренного или цельного молока). Сам процесс получения низкомолекулярных пептидов включает ряд этапов: центрифугирование, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое разделение, диализ и стабилизацию микрофильтрацией.
В Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии развернуто производство медицинского иммунобиологического препарата для лечения и профилактики острых кишечных инфекций «Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл коровий сухой для перорального применения» (регистрационное удостоверение №ЛСР-002636/08 от 09.04.2008; Промышленный регламент №ПР 01898776-02-06). Сырьем для производства лактоглобулина служит иммунное молозиво коров. Согласно способу получения иммунного лактоглобулина (RU 2298409 10.05.2007) в производственный процесс внесены изменения (дополнение №1 ПР 01898776-02-06), согласно которому в технологическом процессе разделения лактосыворотки путем ультрафильтрации на мембранном кассетном модуле получают 2 фракции: высокомолекулярные лактоглобулины и низкомолекулярную фракцию, содержащую пептиды молекулярной массой менее 5 кДа, являющуюся отходом производства лактоглобулина.
Целью изобретения является разработка способа получения низкомолекулярных пептидов, обладающих выраженной интерферон-стимулирующей активностью, из отходов производства лактоглобулина иммунного (против условнопатогенных энтеробактерий и сальмонелл).
Цель достигается тем, что ультрафильтрат, содержащий низкомолекулярные пептиды, многократно диализуют против дистиллированной воды на полисульфидных мембранах с диаметром пор 1 кДа. Полученный раствор концентрируют с помощью ионообменной гельхроматографии. Элюацию проводят 0,5 М водным раствором хлорида натрия. Данный способ позволяет получить концентрированный раствор низкомолекулярных пептидов с общим содержанием белков 3 мг/мл.
Исходным сырьем для получения низкомолекулярных пептидов (НМП) служит отход производства лактоглобулина против условно патогенных бактерий и сальмонелл (RU 2298409, 2007), в соответствии с которым иммунное молозиво коров подвергают сбраживанию пепсином, удаляют творожную массу. Из полученной иммунной сыворотки молозива коров методом ультрафильтрации удаляют денатурированные белки и жир, получая очищенную лактосыворотку. Полученную лактосыворотку разделяют на ультрафильтрационной установке на две фракции: высокомолекулярную фракцию (лактоглобулин) и содержащий низкомолекулярные пептиды фильтрат в качестве отхода производства, который и используют для получения НМП.
Пример 1. Получение исходного сырья для выделения НМП в процессе производства лактоглобулина.
20 л иммунного молозива коров подвергают сбраживанию путем добавления 20 г пепсина и выдерживания при температуре 37°С в течение 18-20 ч. Творожную массу удаляют.
2
Полученные 10 л лактосыворотки очищают от остатков жировой эмульсии и казеина на кассетной фильтрационной установке с общей площадью мембран 2 ми диаметром пор 0,2 мкм.
2
Очищенную лактосыворотку подвергают разделению по молекулярным параметрам на ультрафильтрационной установке с общей фильтрующей поверхностью 1 м с диаметром пор 15 кДа. В результате разделения получают две фракции: высокомолекулярную - концентрат (свыше 15 кДа) и низкомолекулярную - фильтрат (менее 15 кДа). Высокомолекулярная фракция используется для получения специфических лактоглобулинов, а фильтрат - для выделения низкомолекулярных пептидов. Выход фильтрата с молекулярными параметрами менее 15 кДа - 7 л.
Пример 2. Получение низкомолекулярных пептидов.
2
Фильтрат подвергают диализу на полисульфидных полых волокнах с общей фильтрующей поверхностью 1 м с диаметром пор 1 кДа в течение 4 ч против 50,0 л дистиллированной воды. Скорость потока составляет 10-15 л/ч. В результате получают 5 л исходного раствора, содержащего НМП с концентрацией белка (по Лоури) 3 мг/мл.
Раствор, содержащий НМП, концентрируют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЕ - целлюлозе на колонке диаметром 100 мм и длиной 250 мм. Скорость потока 50 мл/мин. Элюцию НМП производят 0,5 М водным раствором хлорида натрия. Выход НМП - 0,5 л с концентрацией общего содержания белка (по Лоури) 3 мг/мл.
Пример 3. Контроль НМП на специфичность.
В качестве контроля НМП на специфичность была использована реакция преципитации в геле. Двух кроликов породы шиншилла весом 2,5 кг иммунизировали коммерческим препаратом «Трансфер Фактор» (США), содержащим низкомолекулярные пептиды молозива коров, и двух кроликов - полученными НМП. Оба препарата были стандартизованы по белку до концентрации 10 мкг/мл. Иммунизацию проводили по общепринятой схеме (Фримель 1985). Через месяц сыворотки крови иммунизированных животных разводили 0,15 М раствором хлорида натрия 1:1 и ставили реакцию преципитации в геле (1% агар «Дифко») против двух тестируемых антигенов: «Трансфер Фактора» (США) и НМП. Методом радиальной иммунодиффузии были выявлены общие зоны преципитации, что свидетельствует о подлинности полученного препарата.
Контроль НМП на специфичность осуществляли также с помощью иммунно-ферментного анализа (ИФА).
«Трансфер Фактор» (США) и НМП, полученные предлагаемым способом, были стандартизированы в 0,015 М фосфатном буфере рН 7,2 - 7,4 по количеству общего белка 20 мкг/мл. Препараты разводили до концентрации: 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,6; 0,3; 0,15; 0,08 мкг/мл. Далее ИФА проводили с использованием кроличьих сывороток, полученных в результате иммунизации кроликов двумя тестируемыми антигенами: «Трансфер Фактором» (США) и выделенными НМП, описанной выше.
Исследование 6 различных серий антигенов показало, что низкомолекулярные пептиды в 100% проб показывали полную выявляемость с 6 вариантами сывороток с чистотой препарата 96 - 100%. «Трансфер Фактор» (США) также давал 100% выявляемость низкомолекулярных пептидов, однако чистота препарата варьировала от 100% при использовании сывороток кроликов, иммунизированных собственно «Трансфер Фактором» (США), и 40% при использовании антисывороток к низкомолекулярным пептидам (таблица 1).
Таблица 1
Выявляемость низкомолекулярных пептидов разными сериями кроличьих сывороток
Серии препаратов
Антисыворотки к «Трансфер Фактору» США (1-я серия иммунизации)
Антисыворотки к низкомолекулярным пептидам (2-я серия иммунизации)
количество препарата, мкг/мл
выявляемость в ИФА, %
количество препарата, мкг/мл
выявляемость в ИФА, %
Серия низкомолекулярных пептидов №1
9,6
96
10
100
Серия низкомолекулярных пептидов №2
9,8
98
10
100
Серия низкомолекулярных пептидов №3
10
100
10
100
Серия низкомолекулярных пептидов №4
9,8
98
98
98
Серия низкомолекулярных пептидов №5
9,8
98
10
100
Серия низкомолекулярных пептидов №6
10
100
10
100
Трансфер Фактор (США)
10
100
4
40
Пример 4. Стимуляция выработки интерферона-гамма под действием низкомолекулярных пептидов.
Для изучения возможности стимуляции выработки интерферона-гамма была использована экспериментальная модель на белых беспородных лабораторных мышах весом 12-14 г. В эксперименте участвовали 4 группы мышей по 10 штук в каждой:
1-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды перорально по 0,2 мл (общее содержание белка 3 мг/мл);
2-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней парентерально (внутрибрюшинно) гентамицин в суточной лечебной дозе;
3-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды перорально по 0,2 мл (общее содержание белка 3 мг/мл) и парентерально (внутрибрюшинно) гентамицин в суточной лечебной дозе в течение 5 дней;
4-я группа - интактные мыши (контрольная группа).
Через 3 дня после отмены препаратов у опытных и контрольных животных изучали содержание интерферона-гамма в копрофильтратах с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа (Pro Con IFgamma Санкт-Петербург).
Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Количество интерферона-гамма в копрофильтратах экспериментальных животных
Опытная группа. Вводимые препараты
Количество интерферона-гамма в копрофильтратах, нг/мл
Достоверная разница от показателей в контрольной группе
Достоверная разница от показателей в группе с гентамицином
1-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды
400
3,3:1
2:1
2-я группа - мыши, получавшие гентамицин
200
1,6:1
1:1
3-я группа - мыши, получавшие низкомолекулярные пептиды и гентамицин
350
2,9:1
1,75:1
4-я группа - интактные мыши (контрольная группа)
120
1:1
1:1,6
Как представлено в таблице 2, при применении низкомолекулярных пептидов отмечено достоверное повышение содержания интерферона-гамма в копрофильтратах опытных групп по сравнению с контрольной группой: в 1-й группе - в 3,3 раза; 2-й группе - в 1,6 раза; 3-й группе - в 2,9 раза. Кроме того, как в группе животных, получавших только низкомолекулярные пептиды, так и в группе мышей, получавших сочетание низкомолекулярных пептидов и антибиотиков, происходило достоверное увеличение интерферона-гамма по сравнению с группой животных, получавших только гентамицин (в 2 раза и в 1,7 раза соответственно).