ВАКЦИНА ПРОТИВ КЛЕЩЕЙ РОДА RHIPICEPHALUS
VACCINE AGAINST RHIPICEPHALUS TICKS

Настоящее изобретение в целом относится к области паразитологии и иммунологии и, в частности, к вакцине против клещей рода Rhipicephalus. В частности изобретение относится к композиции, содержащей первый и второй белок, к применению такой композиции в качестве вакцины против клещей рода Rhipicephalus и к применению первого и второго выделенных белков для вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus.
В настоящее время заражение эктопаразитами является важной проблемой для здоровья человека и здоровья животных, т.к. оно оказывает значительные последствия на благосостояние и экономику. Эктопаразиты являются очень разнообразными, но наиболее значимыми вредителями являются членистоногие, например: насекомые, такие как мухи и комары, или паукообразные, такие как клещи и зудни. Эктопаразит на одной или нескольких стадиях своего развития контактирует с человеком- или животным-хозяином, чтобы кормиться на хозяине, и этот контакт может быть коротким, длительным и/или повторяющимся. Многие эктопаразиты на одной или нескольких стадиях своего развития питаются кровью хозяина; таким образом, их называют гематофорами или кровососущими. Этот тип паразитизма имеет ряд отрицательных эффектов, которые могут изменяться от простого раздражения до причины гибели. Это обусловлено тем, что контактирование паразит-хозяин включает ряд механических и биологических взаимодействий: прокалывание кожи эктопаразитами может вызывать высыпания или воспаление; паразит во время укуса может впрыскивать со своей слюной ряд биологических соединений для поддержания тока крови, подавления иммунного ответа и подавления чувствительности, эти вещества могут вызывать реакцию гиперчувствительности; повторные потребления крови тысячами эктопаразитов в течение длительного периода времени могут приводить к тому, что хозяин начинает страдать анемией, а также паразит может являться переносчиком микроскопического патогена, который может инфицировать хозяина через части ротового аппарата, слюну паразита или его фекалии. Передаваемый патоген может вызывать так называемое (арбо-) заболевание, передаваемое через членистоногих переносчиков хозяину.
Последствиями для хозяина могут являться: длительный стресс, токсичность, индуцированная фактором, относящимся к паразиту, физическое повреждение шкуры или кожи в результате укусов или вторичных инфекций, анемия и/или инфекция с широким спектром заболеваний, передаваемых, например, бактериями или риккетсиями, такими как, Borrelia, Ehrlichia или Anaplasma; вирусами, такими как флавивирус, буньявирус или реовирус, вызывающие: лихорадку денге, желтую лихорадку, энцефалит, "синий язык" овец и т.д., или простейшими и паразитическими червями, такими как, плазмодий, бабезия, трипаносомы, лейшмания, ленточные черви, плоские черви, круглые черви, и т.д. Также существует реальная опасность зоонозного распространения таких заболеваний от животного людям.
Таким образом, заражение эктопаразитами влияет на общее состояние человека или животного-хозяина. Для животных-хозяев сельскохозяйственного значения это серьезно влияет на их экономические показатели, такие как их трансформация корма и скорость роста, и количество и качество их производства мяса, яиц, молока, шерсти, шкур и число потомства.
Членистоногие эктопаразиты значимой ветеринарной и зоонозной значимости представляет собой клещей рода Rhipicephalus. Они представляют собой клещей с жестким спинным щитком (семейство Ixodidae), которые питаются на различных млекопитающих, как диких животных, таких как олень, антилопа, и некоторых видах грызунов, а также на домашнем скоте, таком как крупный рогатый скот, лошади, ослы, козы, овца, свиньи и собаки. Некоторые клещи рода Rhipicephalus предпочитают конкретные виды хозяина, например, предпочтение собак Rhipicephalus sanguineus (коричневый собачий клещ или клещ, обитающий в собачьей конуре). Более важными с экономической точки зрения являются клещи рода Rhipicephalus, которые питаются на крупном рогатом скоте, например: R. appendiculatus (коричневый аргасовый клещ), и клещи из подрода Boophilus, например: R. (Boophilus) microplus (южный кольчатый клещ, который также известен под старым названием: Boophilus microplus) и R. (Boophilus) annulatus (североамериканский клещ).
Клещи рода Rhipicephalus распространены во всем мире, но в основном встречаются в (суб-) тропических зонах. Они могут являться носителями широкого спектра заболеваний, некоторые из которых являются зоонозными, например, Babesia, Theileria, Anaplasma, Coxiella, Borrelia, Rickettsia, наировирус и т.д.
Клещи подвергаются изменчивости в зависимости от сезонных или региональных условий и имеют определенные стадии жизненного цикла: яйцо, личинка, нимфа и взрослое насекомое. Полный цикл в среднем занимает 2-4 недели, и каждая стадия обладает конкретными морфологическими признаками тела клеща, такими как грызло и спинной щиток. Характерной также является подвижность клещей, которая отражает количество времени, в течение которого клещ прикрепляется и открепляется от своего хозяина. Для обзора см. Barker and Murrell (2002, Exp. and Appl. Acarol., vol. 28, p. 55).
В попытке снижения заражения клещами и его последствий в течение длительного периода времени применяли ряд мер, некоторые более успешные, чем другие. Наиболее эффективным является использование химических лекарственных средств, которые отпугивают, уничтожают или повреждают клещей, например, акарицидов. Их можно наносить на поверхность хозяина, например, в виде спрея, поливания, или применять пероральным или парентеральным путем, и они могут действовать на организме хозяина или в нем. За последнее столетие был разработан широкий спектр акарицидных лекарственных средств для этой цели.
Основным недостатком использования таких химических антипаразитарных средств является развитие устойчивости у клещей, что делает эти соединения менее эффективными с течением времени. В результате в некоторых случаях возникает необходимость обрабатывать домашний скот каждые несколько недель, что является трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, существуют другие проблемы, такие как: опасение токсичности для пользователя, побочные эффекты для хозяина, остаточные количества в продуктах животного (мясо, молоко, шкуры), а также проблемы окружающей среды. Обзор по этому описан Otranto and Wall (2008, Med. and Vet. Entomol., vol. 22, p. 291).
В качестве альтернативы химическим антипаразитарным средствам в течение многих лет тестировали вакцинацию, однако, с умеренным успехом. Вакцина против эктопаразитов должна обеспечивать снижение числа клещей или периода времени, в течение которого они прикрепляются или питаются на хозяине. Это также должно приводить к снижению побочных эффектов, которые может вызывать заражение эктопаразитами хозяина, таких как: поражение шкуры, анемия, токсичность или инфекция трансмиссивными болезнями. Также это снизит плодовитость клещей в отношении числа, массы и жизнеспособности яиц, которые может продуцировать самка клеща, что снижает общую нагрузку заражения стада и/или в географическом районе.
Эффективность вакцины против клещей можно выражать в ее "нокдаун эффекте", означающем визуальное снижение уровня заражения, как правило, путем наблюдения меньшего количества взрослых насекомых. Наиболее вероятно, это обусловлено смертельным действием на личинки и нимфы.
Механизм действия вакцины против питающегося кровью эктопаразита является непрямым механизмом: хозяин эктопаразита является мишенью для вакцинации антигеном от эктопаразита, таким образом, что образуются специфические антитела в крови у объекта. Затем эктопаразит питается кровью вакцинированного хозяина, таким образом, получает эти антитела. Когда вакцинный антиген получали от основной биомолекулы паразита, такие антитела нарушают основные биологические процессы у паразита, что нарушает его рост и размножение (Willadsen, 2004, Parasitology, vol. 129, p. S367).
Вследствие того что требуется некоторый период времени, чтобы антитела из высасываемой паразитом крови оказывали свое действие на эктопаразита, такая вакцина не может предотвращать первичный контакт между вакцинированным хозяином и эктопаразитом, как некоторые химические репелленты. Однако такой тип вакцины может являться эффективным против эктопаразитов, которые остаются на одном и том же хозяине в течение длительного периода времени (часы, сутки, недели), такого как, в течение которого остаются клещи рода Rhipicephalus.
Первые вакцины против эктопаразитов представляли собой грубые гомогенаты целых паразитов или конкретных частей тела. Затем тестировали более специфические белковые антигены. Преимущественно эти вакцины использовали в виде эмульсий вода-в-масле с добавлением адъювантов. В этих вакцинах использовали доступный или замаскированный антиген; где доступный антиген представляет собой антиген, который является "видимым" для иммунной системы хозяина, когда эктопаразит контактирует, такой как антиген из его частей ротового аппарата или слюны. Замаскированный антиген, являющийся антигеном, который является более скрытым в эктопаразите и, таким образом, как правило, не презентируется иммунной системе хозяина. Таким образом, принимая во внимание, что иммунитет против доступного антигена паразита регулярно усиливается в результате контактирования с эктопаразитом; для иммунитета против замаскированного антигена паразита необходимым является искусственная повторная стимуляция.
В вакцинах против клещей рода Rhipicephalus ранее тестировали замаскированные ассоциированные с кишечником белки. Это привело к разработке вакцин только против эктопаразитов, которые являются коммерчески доступными для применения в ветеринарии с 1990-х гг.: TickGARD™ (Intervet, Bendigo, Australia) и Gavac™ (Heber Biotec, Havana, Cuba; Revetmex, Mexico). Эти вакцины представляют собой эмульсии вода-в-масле с добавлением адъювантов для применения у мишеней, являющихся крупным рогатым скотом. В этих вакцинах применяют замаскированный антиген из средней кишки R. (Boophilus) microplus: Bm86 или его гомолог: Bm95, который продуцируют в рекомбинантной системе экспрессии (Escherichia coli, соответственно Pichia pastoris). Обе вакцины снижают жизнеспособность и размножение клещей R. (Boophilus) microplus до некоторой степени. Таким образом, эти вакцины в основном используют в географических областях, где заражение устойчивыми к акарицидам клещами рода Rhipicephalus является высоким. Для обзора см. De la Fuente et al. (2007, Anim. Health Res. Rev., vol. 8, p. 23).
w
Bm86 представляет собой гликопротеин, который располагается на внутренней стороне эпителия средней кишки клещей R. (Boophilus) microplus. Bm86 впервые был описан в WO 88/03929. Полноразмерный Bm86 содержит приблизительно 650 аминокислот и имеет кажущуюся M приблизительно 89 кДа. Белок содержит N-концевую сигнальную последовательность, C-концевую трансмембранную область, и ряд EGF-подобных доменов (Lee and Opdebeeck, 1994, Int. J. of Paras., vol. 25, p. 241; Kamau et al., 2011, Insect Mol. Biol., vol. 20, p. 105). Его функция в биологии клеще не известна.
Полагают, что специфические к Bm86 антитела в высасываемой паразитом крови и, возможно, факторы комплемента, связываются с белком Bm86 на клетках кишечника клеща и инициируют процесс, который повреждает кишечник (Kemp et al., 1989, Exp. Appl. Acarol., vol. 7, p. 43).
Многие аминокислотные последовательности Bm86 и его гомологов являются общедоступными, например, из GenBank, хотя используемое наименование является не очень подходящим: гомологичный белок, получаемый из других видов Rhipicephalus, а не от вида microplus можно обозначать как белок Bm86 или как Bm86-подобный белок, или обозначают с его собственным кодом вида, такой как Rs86 из гомологичного белка Bm86, получаемого из клеща R. sanguineus. В литературе гомологичные белки от других видов в некоторых случаях называют "ортологами".
Гомологи Bm86 были найдены во всех группах семейства Ixodidae, и их аминокислотные последовательности являются достаточно консервативными; в роде Rhipicephalus уровень идентичности аминокислотных последовательностей среди гомологов Bm86 составляет по меньшей мере приблизительно 71% (Nijhof et al., 2010, Int. J. for Parasit., vol. 40, p. 1587). Для гомологов Bm86, выделяемых из клещей вида R. (Boophilus) microplus, собранных по всему миру (Австралии, Африки, Мексики, Южной Америки) уровень идентичности аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере приблизительно 82% (Canales et al., 2008, BMC Biotech., vol. 8, doi: 10,1186/1472-6750-8-14). Вследствие такого высокого уровня консервативности вакцинация гомологом Bm86 из одного вида клеща рода Rhipicephalus также защищает от других клещей рода Rhipicephalus.
Были описаны консервативные протективные эпитопы из белка Bm86 (Odongo et al., 2007, Vaccine, vol. 25, p. 1287; Kopp et al., 2010, Vaccine, vol. 28, p. 261).
Для улучшения эффективности вакцин на основе Bm86 против эктопаразитов рассматривали несколько возможностей, только некоторые тестировали.
Один из вариантов представлял собой улучшение состава существующей вакцины. Это применяли в TickGARD Plus™ (Intervet, Bendigo, Australia) (Anonymous, 2002, Aust. Vet. J., vol. 80, p. 394).
Другой вариант заключался в использовании альтернативного вакцинного антигена, например, из другой части клеща, такой как части ротового аппарата или гемолимфа. Было опубликовано несколько списков потенциальных антигенов-кандидатов, например, Almazan et al. (2003, Vaccine, vol. 21, p. 1492-1501); Willadsen (2004, выше); De la Fuente and Kocan (2006, Paras. Immunol., vol. 28, p. 275); Parizi et al. (2009, Rev. Bras. Parasitol. Vet., vol. 18, p. 1) и Almazan et al. (2010, Paras. Res., vol. 106, p. 471).
В других предлагали применять комбинации; комбинацию химиотерапии и вакцинации в комплексной стратегии борьбы с клещами (Otranto and Wall, 2008, выше) или комбинации антигенов в многокомпонентных вакцинах.
Тем не менее были протестированы несколько комбинаций двух замаскированных антигенов; несмотря на то что в некоторых случаях выявляли положительный эффект, не наблюдали общего улучшения эффекта вакцинации в отношении какой-либо добавляемой защиты. Примеры тестируемых комбинаций представляют собой: Bm86 и Bm91 (карбоксипептидаза из R. (Boophilus) microplus) (Willadsen et al., 1996, Paras. Immunol., vol. 18, p. 241); Bm86 и BMA7 (муциноподобный гликопротеин) (McKenna et al., 1998, Paras. Immunol., vol. 20, p. 325) и Bm86 и 5'-нуклеотидазу (Hope et al., 2010, Paras. Immunol., vol. 32, p. 135). В одном из исследований тестировали сайленсинг мРНК из Rs86 (гомолога Bm86) и суболезин (Subolesin) с использованием подхода РНКи (de la Fuente et al., 2006, Paras. Res., vol. 99, p. 108).
w
Суболезин, также известный как 4D8, представляет собой белок с кажущейся M приблизительно 20 кДа, и у рода Rhipicephalus суболезин содержит приблизительно 161 аминокислоту. Точная роль этого белка не известна, но он встречается в различных тканях клеща: слюнные железы, кишечник и ткани репродуктивной системы. В качестве замаскированного антигена его характеризуют даже меньше, чем Bm86, даже несмотря на то, что он, по-видимому, широко распространен среди членистоногих (De la Fuente et al., 2006, Vaccine, vol. 24, p. 4082). Суболезин преимущественно локализуется в ядре в клетке; это согласуется с тем фактом, что ортологи суболезина, встречающиеся у насекомых, происходят из семейства белков Акиринов (Akirin), которые являются факторами транскрипции (Galindo et al., 2009, Dev. Comp. Immunol., vol. 33, p. 612).
Большое число аминокислотных последовательностей гомологичных белков суболезина являются доступными в GenBank. Главным образов их обозначают как суболезин или белок 4D8, независимо от каких клещей их выделяют. Анализ белков суболезинов из различных видов Rhipicephalus и из различных географических областей выявил, что эти белки являются высококонсервативными и характеризуются уровнем идентичности аминокислотных последовательностей по меньшей мере приблизительно 85% (De la Fuente et al., 2006, Vaccine, выше).
Функцию суболезина у клеща рода Rhipicephalus подавляли экспериментально специфическими антителами от вакцинированного суболезином хозяина или сайленсингом генов подходом РНКи. Это значительно нарушало рост и развитие клещей, такое как переваривание высасываемой крови, откладку яиц, линьку и выживаемость. Суболезин использовали в качестве вакцинного антигена и рассматривали возможность применения в комбинированных вакцинах с один или более из большого количества потенциальных вакцинных кандидатов. Для обзора: De la Fuente et al. (2011, Vet. Path., vol. 181, p. 17). Картировали протективные эпитопы суболезина (Prudencio et al., 2010, Vaccine, vol. 28, p. 5398).
Однако до настоящего времени не описано эффективной комбинированной вакцины против клещей с использованием суболезина. Следует отметить последнее достижения в этой области: De la Fuente и коллеги отказались от тестирования комбинированных вакцин и вернулись к применению единичных вакцин суболезина или белка Bm86 и рекомендуют комбинировать такую единичную вакцину с другими средствами борьбы с клещами, такими как использование акарицидов (Carreon et al., 2012, Vaccine, vol. 30, p. 273).
Следует отметить, что, несмотря на все попытки и предположения в отношении использования различных антигенов и комбинаций, результаты трех десятилетий исследований в области вакцин против клещей являются в лучшем случае посредственными. Это привело доктора P. Willadsen, который являлся создателем TickGARD™ и одним из ведущих ученых в этой области, к заключению, что вакцины против клещей на основе смесей антигенов являются наиболее "обоснованной гипотезой" (хотя недоказанной), но в большинстве случаев являются "безосновательной надеждой". Исходя из предположения, что "такие смеси облают повышенной эффективностью", он высказывал замечание, что "однако экспериментальные данные для этого являются крайне скудными и противоречивыми". (Willadsen, 2008, Trends in Paras., vol. 24, p. 164-167).
Таким образом, в данной области существует острая потребность в более эффективной вакцине против клещей рода Rhipicephalus. Таким образом, задачей настоящего изобретения является устранение недостатков в известном уровне техники и решение этой потребности в данной области путем предоставления улучшенной вакцины против клещей рода Rhipicephalus.
Неожиданно было выявлено, что эту задачу можно решить и, таким образом, можно устранить недостатки известного уровня техники путем использования двух белковых антигенов от клещей рода Rhipicephalus Bm86 и суболезина или их гомологов или иммуногенных фрагментов, но только когда два белка презентируют раздельно иммунной системе хозяина. Когда два белка комбинировали в простой смеси, только умеренные уровни антител образовывались и в основном против Bm86. Такая вакцинация только частично защищала от клещей рода Rhipicephalus, помещаемых на являющегося крупным рогатым скотом хозяина при экспериментальном заражении.
Однако когда Bm86 и суболезин презентировали иммунной системе хозяина одновременно, но физически раздельно друг от друга, авторы изобретения обнаружили, что у объекта образовывались высокие уровни антител против каждого из двух белков. Эти антитела оказывали неожиданно благоприятное комбинированное действие, приводящее к сильной иммунной защите вакцинированного хозяина от экспериментального заражения клещами рода Rhipicephalus. В некоторых случаях наблюдали практически полный эффект подавления.
В настоящее время это открытие можно применять для предпочтительного использования в вакцине против клещей рода Rhipicephalus, в частности двумя путями: а именно путем однократного или двойного введения этих двух белков.
Когда два белка применяют при однократном введении, их необходимо формулировать таким образом, чтобы они оставались физически разделенными друг от друга в конечной вакцинной композиции.
Альтернативно, когда два белка применяют при двойном введении, их необходимо вводить одновременно, но в различные участки организма различными путями или различными способами.
Неизвестно, почему два белка Bm86 и суболезин или их гомологи или иммуногенные фрагменты должны быть презентированы иммунной системе-объекту раздельно для обеспечения достаточной стимуляции гуморальной иммунной системы для борьбы с заражением клещами. Хотя авторы изобретения не желают быть связанными какой-либо теорией или моделью, которая может объяснять эти наблюдения, они предполагают, что причина может заключаться в определенной форме взаимодействия между этими двумя белками, в результате которого один маскирует другой для иммунной системы-объекта.
Таким образом, до настоящего изобретения специалист применяет простую комбинацию двух белков, которая не может обеспечивать эффективной иммунной защиты. Авторы изобретения считают, что это является причиной того, почему не существует известного уровня техники, в котором описывают использование комбинации антигенов Bm86 и суболезина в вакцине против клещей, не говоря уже об успешной результате вакцинации при таком применении.
Касательно применения двух белковых антигенов в виде однократного введения.
В первом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей первый и второй выделенный белок, где первый выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 71% с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 1, и где второй выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 96% с аминокислотной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 2, и где два белки физически отделены друг от друга.
Первый и второй выделенные белки композиции в соответствии с белками по изобретению представляют собой антигены и способны индуцировать иммунный ответ. Таким образом, композиция по изобретению представляет собой антигенную композицию. Композицию по изобретению можно преимущественно использовать для получения вакцины против клещей рода Rhipicephalus.
Как используют в настоящем описании, термин "содержащий" (а также варианты, такие как "содержат", "содержит" и "содержал") относится ко всем элементам и в любой возможной комбинации, допустимой по изобретению, которые входят или включены в раздел, абзац текста, пункт формулы изобретения и т.д., в которых этот термин используют, даже если такие элементы или комбинации явно не описывают; и не относится к исключению какого-либо из такого элемента(ов) или комбинаций. Таким образом, любой такой раздел, абзац текста, пункта формулу изобретения и т.д. также может относиться к одному или более вариантов осуществления, где термин "содержащий" (или его варианты) заменяют терминами, такими как "состоит из", "состоящий из" или "по существу состоит из".
По изобретению указатели "первый" и "второй" используют только для простоты обозначения, и не указывают на какой-либо числовой порядок или зависимость.
Термин "выделенный" следует интерпретировать как выделенный из своего естественного окружения в результате преднамеренного действия или вмешательства человека, например, процедурой in vitro для биохимической очистки.
По изобретению "белок" относится к молекулярной цепи аминокислот. Белок не обладает конкретной длиной, структурой или формой, и при необходимости его можно модифицировать in vivo или in vitro, например, гликозилированием, амидированием, карбоксилированием, фосфорилированием, пегилированием или изменениями пространственного сворачивания. Белок может представлять собой нативный или зрелый белок, белок-предшественник или пробелок, или часть белка. Белок может быть биологического или синтетического происхождения. В числе прочего, полипептиды и пептиды входят в определение белка.
"Идентичность аминокислотных последовательностей" представляет собой хорошо известный способ обозначения эволюционного родства двух белков. Его обозначают посредством процента аминокислот, которые являются идентичными при сравнении соответствующих положений двух аминокислотных последовательностей. Такое выравнивание подходящим способом проводят с использованием компьютерной программы, такой как общедоступные программы Blast™ или ClustalW™, с использованием параметров по умолчанию. Эти программы, как правило, оптимизируют способ выравнивания двух последовательностей и демонстрируют область перекрытия с числом и процентом идентичных совпадений между аминокислотами. Таким образом, выявляемая область перекрытия может являться такой же длины как SEQ ID NO: 1 или 2 или меньше в зависимости от размера белковой последовательности, которую сравнивают с SEQ ID NO: 1 или 2. По изобретению указываемый процент идентичности аминокислотных последовательностей основан на сравнении всей длины SEQ ID NO: 1 или 2.
Согласно настоящему изобретению SEQ ID NO: 1 представляет собой неполную аминокислотную последовательность из белка Bm86, идентифицированного у клеща R. (Boophilus) microplus из Мексики. Полная аминокислотная последовательность из этого белка Bm86 является идентичной последовательности, которая предоставлена в GenBank под номером доступа: ADQ19685 для изолята из Техаса (США). SEQ ID NO: 1 содержит только 608 аминокислот, т.к. не содержит 20 N-концевых аминокислот нативной сигнальной последовательности белка, а также 22 C-концевые аминокислоты его трансмембранной области. Эта усеченная форма белка Bm86 является иммунопротективной, и ее можно подходящим способом получать in vitro, например, в рекомбинантной системе экспрессии.
Согласно настоящему изобретению, белок Bm86 SEQ ID NO: 1 служит в качестве эталона для гомологов белка Bm86, которые можно в равной степени использовать по изобретению. Эти белки можно идентифицировать по их проценту идентичности аминокислотных последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Таким образом, гомологи Bm86 представляют собой белки, основанные или получаемые из белков от различных видов Rhipicephalus и имеют уровень гомологии аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 71% в области перекрывания. Это можно определять выравниванием аминокислотных последовательностей по всей длине SEQ ID NO: 1, например, с белками в общедоступных базах данных, длина которых составляет по меньшей мере 608 аминокислот. Например, выравниванием SEQ ID NO: 1 и "поверхностного гликопротеина клеток кишечника" R. appendiculatus, доступного под номером доступа GenBank ADA55445.
В большей степени близкородственные гомологи белков Bm86 представляют собой белки от клещей подрода Boophilus. Как правило, они обладают идентичностью аминокислотных последовательностей с полноразмерной SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 82%, например, при выравнивании SEQ ID NO: 1 с "BD86-подобным белком" от R. decoloratus, доступным под номером доступа GenBank ABY58970.
Также близкородственные гомологи Bm86 представляют собой белки с аминокислотными последовательностями, основанными или получаемыми от клещей вида R. (Boophilus) microplus. Как правило, они обладают идентичностью аминокислотных последовательностей с полноразмерной SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 95%, например, при выравнивании SEQ ID NO: 1 с "гликопротеином Bm86" R. microplus, доступным под номером доступа GenBank ADQ19687.
Таким образом, согласно изобретению первый выделенный белок представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 71%.
В предпочтительном варианте осуществления первый выделенный белок по изобретению представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 82%.
В более предпочтительном варианте осуществления первый выделенный белок по изобретению представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 95%.
В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению первый выделенный белок обладает идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 71, 73, 75, 80, 82, 85, 87, 90, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99 или даже 100% в этом порядке предпочтения.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления первый выделенный белок композиции по изобретению представляет собой белок Bm86 или его гомолог.
Аналогичным образом SEQ ID NO: 2 представляет собой неполную аминокислотную последовательность из белка суболезина (4D8), идентифицированного у клеща R. (Boophilus) microplus из Мексики. SEQ ID NO: 2 является доступной в GenBank под номером доступа: ABA62327. SEQ ID NO: 2 содержит 147 аминокислот, т.к. она не содержит C-концевой участок нативного белка суболезина, который являлся нерелевантным для его иммуногенности. Эта усеченная форма белка суболезина является иммунопротективной, и ее можно подходящим способом получать in vitro, например, в рекомбинантной системе экспрессии.
Согласно настоящему изобретению белок суболезин SEQ ID NO: 2 служит в качестве эталона для гомологов белка суболезина, которые можно в равной степени использовать по изобретению. Эти белки можно идентифицировать по их проценту идентичности аминокислотных последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
Выявлено, что белки суболезины являются более консервативными, чем белки Bm86 и, в частности, часть суболезина, которая находится в SEQ ID NO: 2, является высококонсервативной. Таким образом, гомологи суболезина представляют собой белки, основанные или получаемые из белков от различных видов Rhipicephalus, и обладают уровнем гомологии аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 96% в области перекрывания. Это можно определять выравниванием аминокислотных последовательностей по всей длине SEQ ID NO: 2, например, с белками в общедоступных базах данных, длина которых составляет по меньшей мере 147 аминокислот. Например, выравнивание SEQ ID NO: 2 и "защитного антигена 4D82" из R. sanguineus, доступное под номером доступа GenBank ABA62332.
Даже близкородственные гомологи суболезина представляют собой белки с аминокислотными последовательностями, основанными на или получаемыми из белков, происходящих из клещей подрода Boophilus из Rhipicephalus, или даже из клещей вида R. (Boophilus) microplus. Обе эти последовательности, как правило, обладают идентичностью аминокислотных последовательностей с полноразмерной SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 99%, например, приравнивании SEQ ID NO: 2 с суболезином от R. microplus, который является доступным под номером доступа GenBank AFH57342.
Таким образом, по изобретению второй выделенный белок представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 96%.
В предпочтительном варианте осуществления второй выделенный белок по изобретению представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 99%.
В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению второй выделенный белок обладает идентичностью аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или даже 100% в этом порядке предпочтения.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления второй выделенный белок композиции по изобретению представляет собой белок суболезин или его гомолог.
По изобретению клещи рода "Rhipicephalus", подрода "Boophilus" или вида "microplus" относятся к клещам, которых в настоящее время относят к таксономическим группам с такими названиями. Они также включают клещей, которых дополнительно классифицируют каким-либо образом, например, как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант или подтип, и т.п. Такие клещи обладают общими характерологическими признаками представителей своей таксономической группы, такими как их морфологические, генетические и биохимические характеристики, а также их биологические характеристики, такие как физиологические, иммунологические или паразитарное поведение. Как правило, классификация клещей основана на (электронной) микроскопии и секвенировании выбранных нуклеотидов или ПЦР молекулярных маркеров, как известно в данной области.
Специалисту будет очевидно, что, несмотря на то, что клещи, которые являются объектом настоящего изобретения, в настоящее время относят к этому роду, подроду или виду, это является таксономической классификацией, которая может являться объектом изменения по мере того, как новые сведения приводят к переклассификации в новую или другую таксономическую группу. Такая возможность уже является очевидной из последней филогенетической переклассификации рода Boophilus в подрод ниже Rhipicephalus (Barker and Murrell, 2002, Exp. Appl. Acarol., vol. 28, p. 55). Однако вследствие того, что это не приводит к изменению вовлеченного эктопаразита или его набора белков, а только его научного названия или классификации, такие подвергшиеся переклассификации клещи остаются в объеме изобретения.
Предпочтительные клещи рода Rhipicephalus для обеспечения (по меньшей мере одного из) первого и второго выделенных белков композиции по изобретению представляют собой вид клещей Rhipicephalus, которые заражают животных значимых с ветеринарной точки зрения, таких как домашний скот, животных-компаньонов. Более предпочтительными являются виды клещей рода Rhipicephalus, в частности виды: sanguineus, evertsi, appendiculatus, annulatus, australis, decoloratus, geigyi, kohlsi и microplus.
Более предпочтительными являются виды клещей подрода Boophilus из Rhipicephalus, например, выбранные из видов R. (Boophilus): annulatus, australis, decoloratus, geigyi, kohlsi и microplus.
Наиболее предпочтительными являются клещи вида R. (Boophilus) microplus.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления первые и второй выделенные белки композиции по изобретению получают из, или они являются основанными на белке из вида клещей подрода Boophilus из Rhipicephalus.
В одном из вариантов осуществления каждый из первого и второго выделенных белков композиции по изобретению получают из отличного вида клещей Rhipicephalus.
Например, первый белок, белок Bm86 или его гомолог, можно получать из R. (Boophilus) microplus, а второй белок, суболезин или его гомолог, можно получать из R. sanguineus. Такая комбинация антигенов может обеспечивать получаемой на их основе вакцине широкий спектр защиты от клещей ряда видов Rhipicephalus.
Аналогично, каждый из двух белков можно получать из различного изолята клеща R. (Boophilus) microplus.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления каждый из первого и второго выделенных белков композиции по изобретению получают из, или они основаны на различном изоляте клеща R. (Boophilus) microplus.
В предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению первый выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 82% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и/или второй выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 96% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
В более предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению первый выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 95% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и/или второй выделенный белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью аминокислотной последовательности по меньшей мере 99% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
Как будет понятно специалисту, первый и второй выделенные белки, как описано в соответствии с изобретением, не должны представлять собой полный нативный белок Bm86, соответственно суболезина или их гомологов. Наоборот эти белки можно использовать в виде укороченного варианта или в виде фрагмента, при условии, что эти фрагменты все еще обладают соответствующей иммуногенной эффективностью для обеспечения полезных эффектов изобретения. Фактически SEQ ID NO: 1 и 2 уже представляют собой усеченные формы своих нативных исходных белков. Также эффективным может являться дополнительные уменьшения длины, и специалист способен идентифицировать такие фрагменты, которые все еще обеспечивают иммунную защиту. Однако для того, чтобы являться иммуногенным, минимальная длина белкового фрагмента должна составлять: 8-11 аминокислот для связывания рецептора MHC I и 11–15 аминокислот для связывания рецептора MHC II (описано, например, Germain and Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403).
Предпочтительные примеры иммуногенных фрагментов первого и второго выделенных белков композиции по изобретению, включая их гомологи, представляют собой фрагменты, содержащие по меньшей мере один из протективных эпитопов. Специалист способен идентифицировать такие протективные эпитопы общепринятыми способами, например, такими как хорошо известный способ Pepscan (Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, vol. 81, p. 3998), или с использованием компьютерного прогнозирования (Margalit et al., 1987, J. of Immunol., vol. 138, p. 2213).
Примеры таких защитных эпитопов описаны, например, для Bm86 Odongo et al. (2007, выше), которые описывают линейные протективные эпитопы, дающие перекрестную реакцию, соответствующие фрагментам аминокислот: 8-38 и 512-542 SEQ ID NO: 1; также Kopp et al. (2010, выше) описывают протективные эпитопы, соответствующие фрагментам аминокислот: 1-22 и 372-396 SEQ ID NO: 1.
Аналогично, Prudencio et al. (2010, выше) идентифицировали фрагмент аминокислот 98-123 SEQ ID NO: 2 как протективный эпитоп для суболезина.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления композиция по изобретению содержит иммуногенный фрагмент из первого или второго выделенного белка по изобретению.
Иммуногенный фрагмент можно получать из Bm86 или суболезина, или из гомолога любого из этих белков. Иммуногенный фрагмент можно использовать вместо или в дополнение к белку или гомологу, из которого его получают.
Для усиления иммунного ответа иммуногенного фрагмента его можно комбинировать или связывать с молекулой носителя. Хорошо известные носители представляют собой бактериальные токсоиды, такие как столбнячный токсин или дифтерийный анатоксин; альтернативно можно использовать KLH, BSA, или компоненты бактериальных клеточных стенок (получаемый из) липид A, и т.д.
Предпочтительный иммуногенный фрагмент по изобретению представляет собой фрагмент из Bm86 или из его гомолога, который содержит по меньшей мере один фрагмент аминокислот SEQ ID NO: 1, выбранный из: 1-22, 8-38, 372-396 и 512-542.
Дополнительный предпочтительный иммуногенный фрагмент по изобретению представляет собой фрагмент суболезина или его гомолога, который содержит фрагмент аминокислот 98-123 SEQ ID NO: 2.
По тем же причинам первый и второй выделенный белок композиции по изобретению также может являться длиннее аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 2, или длиннее их нативных белков. Такое удлинение может являться искусственным или не предусматриваемым и в равной степени является приемлемым по изобретению при условии, что удлинение аминокислот не нарушает иммунопротективной способности белка. Искусственное удлинение белков можно, например, использовать для улучшения уровня экспрессии для целей очистки или детекции белка после экспрессии или для получения более иммуногенного белка. Удлинение можно проводить различными способами, например, биохимическим слиянием аминокислот. Наиболее подходящим образом это получают модификацией кодирующей нуклеиновой кислоты, которую используют в системе экспрессии. Такие слитые или удлиненные варианты первого и/или второго выделенного белка композиции по изобретению также входят в объем изобретения.
По изобретению "физически раздельный" означает состоящий из отдельных физических соединений. Для первого и второго выделенного белка композиции по изобретению это означает, что они могут содержаться в отдельных растворах и/или содержаться в отдельных фармацевтических носителях или на них.
В вариантах осуществления отдельных растворов раствор является предпочтительно жидким, и отдельные растворы могут содержаться в одном или более контейнерах. Например, композиция по изобретению может представлять собой эмульсию, содержащую отдельные растворы в виде раздельных водных фаз.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению представляет собой эмульсию, отличающуюся тем, что первый и второй белок, как описано по изобретению, содержатся в раздельных водных фазах.
"Эмульсия" по изобретению представляет собой жидкую коллоидную систему, содержащую две или более фаз, одна из которых является непрерывной, и одна из которых является диспергированной в непрерывной фазе; как правило, размер везикул дисперсии находится в диапазоне микрометров или даже нанометров.
Существует несколько предпочтительных вариантов осуществления, содержащих два белка в раздельных водных фазах, например: в эмульсии вода-в-масле, где два белка содержатся в раздельных водных фазах, которые являются диспергированными в одной окружающей масляной фазе, или в эмульсии "вода-в-масле-в-воде", где каждая из внешней и внутренней водных фаз содержит один из двух белков, и они являются разделенными масляной фазой.
Альтернативно, два белки можно разделять с использованием микровезикул, таких как ISCOM, мицеллы или липосомы, содержащих один из белков и диспергированных в непрерывной водной фазе, содержащей другой белок.
Для вариантов осуществления, связанных с отдельными фармацевтическими носителями, доступными являются различные соединения и макромолекулярные структуры, которые можно использовать для захвата одного или другого из двух белков, и, таким образом, отдельно презентировать их иммунной системе объекта при вакцинации.
Все эти варианты осуществления хорошо понятны специалисту в данной области, и их все можно осуществлять на практике с использованием только общепринятых способов и стандартных веществ. Например, способы и вещества для получения таких эмульсий хорошо известны в данной области и описаны, например, в государственных регулирующих документах, таких как фармакопея, и в хорошо известных руководствах, таких как "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al., ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681) и "Remington: the science и practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472). Подробные описания и демонстрационные примеры приведены в разделе "Примеры".
Такие эмульсии, как правило, получают и стабилизируют путем использования одного или более выбранных поверхностно-активных соединений или поверхностно-активных вещества, таких как эмульгаторы, солюбилизаторы, амфифильные вещества и детергенты, или соединение, содержащее коллоидные частицы. Хорошо известные примеры поверхностно-активных веществ представляют собой соединения из семейств: Span™, Tween™ и Arlacel™. Посредством выбора поверхностно-активного вещества с желаемое величиной гидрофильно-липофильного баланса (HLB) можно получать различные фазы эмульсии, и они остаются стабильными, таким образом, что эмульсия не "распадается" даже при хранении в течение длительного периода времени и при переменных температурах.
Водная фаза может быть основана на очищенной воде, такой как вода для инъекции, и может содержать соли и/или буферы. Масляная фаза может быть основана на любом фармацевтически приемлемом масле, например, минеральных маслах, таких как Bayol™, Markol™, Montanide™, или на легком парафиновом масле; животных жирах, таких как рыбий жир, жир печени трески, пристан, сквален или сквалан; растительных маслах, таких как соевое масло, арахисов масло, кукурузное масло, хлопковое масло или подсолнечное масло, или полусинтетических маслах, таких как масло миглиол, цетиол или миритол.
Также коммерчески доступными являются готовые к применению смеси масляной фазы с эмульгатором, для них требуется только смешивание с антигеном в водной фазе. Примеры представляют собой Montanide ISA 50V2 и Montanide ISA 206V (Seppic); они содержат инъецируемое минеральное масло высокой степени чистоты и эмульгатор, получаемый из маннита и очищенной олеиновой кислоты растительного происхождения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению композиция представляет собой эмульсию вода-в-масле, содержащую непрерывную масляную фазу и по меньшей мере две отдельные водные фазы, где одна из водных фаз содержит первый выделенный белок, как описано по изобретения, а другая водная фаза содержит второй выделенный белок, как описано по изобретению.
"Эмульсия вода-в-масле (в/м)" хорошо известна в данной области и относится к композиции, содержащей две жидкие фазы, одну диспергированную в другой; где водная фаза является диспергированной в масляной фазе. Известно несколько способов получения такой эмульсии. Для изобретения не является критичным, как используют способ, при условии, что в получаемой эмульсии первый и второй выделенные белки композиции по изобретению остаются в стабильном физически раздельном состоянии. Например, можно получать две отдельные эмульсии в/м, где одна содержит первый, а другая содержит второй белок, которые затем можно аккуратно объединять, таким образом, что образуется одна непрерывная масляная фаза, которая содержит две различные и раздельные водные фазы.
В другом предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению композиция представляет собой эмульсию "вода-в-масле-в-воде", содержащую непрерывную внешнюю водную фазу, содержащую масляную фазу, где масляная фаза содержит по меньшей мере одну внутреннюю водную фазу, и где один белок, выбранный из первого и второго выделенного белка, как описано по изобретению, содержится во внешней водной фазе, а другой белок из первого и второго выделенного белка, как описано по изобретению, содержится во внутренней водной фазе.
"Эмульсия вода-в-масле-в-воде (в/м/в)" хорошо известны в данной области и относится к композиции, содержащей три жидкие фазы, диспергированные одна в другой; где водная фаза является диспергированной в масляной фазе, где масляная фаза в свою очередь является диспергированной в водной фазе.
Также существует несколько способов получения такой эмульсии. Применяемый способ не является критичным при условии, что в получаемой эмульсии обе водные фазы, содержащие один из двух белков композиции по изобретению, остаются раздельными. Например, эмульсия в/м можно получать с использованием водной фазы, содержащей один из двух белков. Затем их можно аккуратно смешивать с водным раствором, содержащим другой из двух белков. При правильных условиях образуется эмульсия в/м/в, где два белки содержатся в раздельных водных фазах, которые разделены масляной фазой. В этом случае также специалист способен выбирать необходимые соединения и условия для получения достаточной стабильной эмульсии.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению отдельные фармацевтические носители содержат каждый из первого и второго выделенных белков, как описано по изобретению.
Согласно настоящему изобретению "отдельные фармацевтические носители содержат" относится к ситуации, где каждый из первого и второго выделенных белков композиции по изобретению присоединен к носителю; присоединение необходимо проводить таким образом, что белок легко не откреплялся, так чтобы не нарушать их раздельное презентирование иммунной системе-объекту.
Термин "содержащийся" означает, что белок может являться связанным в фармацевтическом носителе или на нем в различных конформациях, таких как на поверхности носителя, или в большей степени внутри, таким образом, как захваченный в решетке или гелеобразной структуре, или в крупнопористых полостях носителя. Присоединение является нековалентным и, как правило, приводит к образованию комбинации атомных и ионных взаимодействий, таких как электростатические и ванн-дер-ваальсовы силы, гидрофобных взаимодействий и образованию водородных связей.
Термин "раздельный" предназначен указывать на то, что один тип, партия или молекула носителя должна содержать только один из двух белков для того, чтобы обеспечивать возможность раздельного презентирования белков иммунной системе-объекту. Тем не менее носитель, который используют для каждого из белков, может являться одним и тем же или различным, и нагруженный носитель(и) могут находиться в одной и той же водной фазе. Это проиллюстрировано ниже.
Известно несколько кандидатов для фармацевтического носителя для применения в изобретении. Примеры представляют собой фармацевтически приемлемые гели, например, из соединения алюминия, такие как гель гидроокиси алюминия или алюминий-фосфатный гель, или гель на основе метилцеллюлозы, например, метоцел (Dow). Природный ионный углеводный полимер, который способен образовывать гель при контакте с жидкостями организма, представляет собой, например, полимер GelSite™.
Альтернативно, носитель может представлять собой макромолекулярную структуру: "макромолекулярная структура" для применения в изобретение относится к относительно крупным молекулярным структурам, таким как структуры полимеров или частиц, размер которых являются значительным, например, более 1000 Да, или более 100 нм. Хорошо известные примеры представляют собой ISCOM™, хитозан, дендромер, альгинат, латексную частицу, частицу коллоидного золота или частицу синтетического полимера, все хорошо известные в данной области.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления композиции по изобретению по меньшей мере один из фармацевтических носителей представляет собой соединение алюминия или макромолекулярную структуру.
Пример композиции по изобретению, где "отдельные фармацевтические носители содержат" первый и второй выделенные белки, получают, когда макромолекулярный носитель добавляют в каждый из двух контейнеров, где каждый контейнер содержит раствор с одним из двух белков. После подходящей инкубации белки удерживаются в носителе или на нем. "Нагруженные" носители, например, можно промывать для удаления несвязанного белка и можно объединять в один раствор, который затем представляет собой композицию по изобретению. Таким образом, два белка, даже когда находится в одной и той же водной фазе, все еще презентируются раздельно иммунной системе-объекту при вакцинации. В этом примере носитель является одним и тем же для двух белков, но, альтернативно, для каждого из белков можно использовать различный носитель. Специалист в данной области способен получать и тестировать варианты на основании этой идеи для дополнительной оптимизации результата такой композиции.
Дополнительный вариант, который входит в объем изобретения, представляет собой комбинацию эмульсии и фармацевтического носителя. Например, ее можно применять в одном из вариантов осуществления, где один из первого или второго выделенного белка по изобретению, содержится фармацевтическим носителем, например, гель на основе алюминия, и нагруженный белком гель на основе алюминия, эмульгируют в водной фазе в эмульсии в/м.
Преимущественно это может обеспечивать дополнительную стимуляцию иммунной реакции объекта на белки.
Как описано, композиция по изобретению может находиться в нескольких формах, и ее можно получать несколькими способами.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения композиции по изобретению, включающему этапы:
- получения растворов или фармацевтических носителей, содержащих первый или второй выделенный белок, как описано по изобретению, и
- объединения этих растворов и/или фармацевтических носителей в одну композицию, таким образом, что такая композиция содержит первый и второй выделенный белок, как описано по изобретению.
В соответствии со способом по изобретению этап объединения растворов или носителей в одну композицию можно проводить различными путями. Например, это можно проводить (задолго) до введения в лаборатории или на фармацевтическом производстве. Такой способ объединения обеспечивает оптимальный контроль качества и безопасности получаемой комбинации.
Альтернативно, объединение можно проводить непосредственно перед введением путем смешивания раствора(ов) и/или носителя(ей) или ранее подготовленных эмульсий, содержащих раствор(ы) и/или носитель(и). Это может подходящим способом проводить специалист, проводящий введение вакцины, со стороны человека- или животного-объекта, которых необходимо вакцинировать; так называемое смешивание "на месте". Например, это включает смешивание вручную равных объемов двух эмульсий в/м, где каждая содержит отличный антиген в своей водной фазе. Это приводит к эмульсии в/м с непрерывной масляной фазой и диспергированной водной фазой, содержащей капельки водной фазы, которые содержат различные и отдельные антигены, например, Bm86 и суболезин, их гомологи или иммуногенные фрагменты. Такой способ обеспечивает оптимальную гибкость для отбора растворов, которые необходимо объединять.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления способа по изобретению способ включает этапы:
- получения отдельных эмульсий, содержащих первый или второй выделенный белок, как описано по изобретению, и
- смешивания этих отдельных эмульсий в объединенную эмульсию.
"Смешивание" проводят низкоинтенсивным смешиванием, таким образом, чтобы не разрушать эмульсии, которые необходимо смешивать. Например, это можно проводить низкоскоростным смешиванием, например, при менее 1000 об/мин, или смешиванием или встряхиванием вручную.
В предпочтительном варианте осуществления эмульсии представляют собой эмульсии в/м, т.к. такие эмульсии являются наиболее подходящими для смешивания на месте.
В качестве дополнительной альтернативы этапа объединения растворов или носителей в одну композицию объединение можно проводить в момент введения путем применения устройства для инъекции в один участок, которое обеспечивает смешивание при инокуляции.
В этом варианте осуществления устройство для инъекции в один участок содержит первый и второй выделенный белок, как описано по изобретению, в отдельных растворах в отдельных камерах или контейнерах. Такие устройства для инъекции в один участок хорошо известны в данной области и могут представлять собой, например, электро-механический инъектор с одной иглой, в которую подаются растворы из различных контейнеров, или могут представлять собой комбинированный или двойной шприц с отдельными камерами, которые сходятся через соединительную трубки в одноканальное сопло, к которому можно присоединять иглу. В результате объединения отдельных растворов в соединительной трубке происходит смешивание во время инъекции в один участок. Таким образом, это относится к однократному введению композиции или вакцины по изобретению и включает способ по изобретению.
В дополнительном аспекте изобретение относится к композиции, получаемой способом по изобретению, где композиция содержит первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, в физически разделенном друг от друга состоянии.
Получение растворов для применения в способе по изобретению можно проводить различными способами, которые все хорошо известны специалисту. Точный способ получения также не является критическим при условии, что получаемая композиция обеспечивает полезные эффекты изобретения.
Например, раствор по изобретению может представлять собой водную фазу, содержащую один из первого или второго выделенного белка, как описано по изобретению, как правило, с подходящим буфером и/или стабилизатором.
Также раствор по изобретению может представлять собой эмульсию, содержащую такую водную фазу, содержащую один из первого или второго выделенного белка, как описано по изобретению, и масляную фазу, например, легкое минеральное масло.
Стандартное эмульгирование эмульсии в/м на основе легкого минерального масла, как правило, проводят путем эмульгирования водной фазы, содержащей антиген в масляной фазе с использованием условий высокоскоростного сдвига. Подходящим способом можно использовать высокоскоростной смеситель, например, от Silverson, для смешивания воды в масле, например, при 4000 об/мин в течение 3 минут при комнатной температуре. Скорость смешивания двух жидких фаз и настройки мощности и об/мин смесителя регулируют и оптимизируют для объема и типа эмульсии, которую необходимо получать. Во время смешивания наблюдают за температурой, таким образом, чтобы она не превышала максимального значения, например, 40°C. Подходящим образом такие эмульсии могут быть основаны на коммерческих ингредиентах, таких как Montanide™ (Seppic), и их можно получать по инструкциям поставщика.
Для эмульгацию и стабилизации раздельных фаз используют подходящие поверхностно-активные вещества, например, соединения из семейств Span™, Tween™ или Arlacel™ для регуляции размера и стабильности капель. Как правило, используют поверхностно-активные вещества от 0,1 до 10% масс./об. Как правило, к масляной фазе добавляют поверхностно-активное вещество с низким значением HLB (например, Span™) и к водной фазе добавляют поверхностно-активное вещество с высоким значением HLB (например, Tween™). Для получения инъецируемой эмульсии с приемлемой вязкостью общее отношение воды к маслу предпочтительно находится в диапазоне от 30:70 до 70:30 и более предпочтительно приблизительно 50:50.
Также можно получать более сложные эмульсии, например, эмульсию в/м/в можно получать, например, сначала эмульгированием водной фазы (с антигеном) в масляной фазе с использованием большой скорости сдвига, а затем эмульгированием этой эмульсии в/м в водной фазе, содержащей (другой) антиген, с использованием низкой-средней скорости сдвига. Подходящим образом для этой цели можно использовать эмульсию на основе Montanide™ ISA 206.
Кроме того, водную фазу, содержащую нагруженный антигеном гель на основе алюминия, можно смешивать с масляным адъювантом с получением эмульсии в/м или в/м/в с повышенной стимуляцией иммунного ответа и т.д.
Аналогично, получение фармацевтических носителей для применения в способе по изобретению можно проводить различными способами, которые все хорошо известны специалисту. Например, можно получать различные гели, содержащие антиген: гель на основе метилцеллюлозы можно получать по инструкциям поставщика, например, Methocel™ (Dow). Альтернативно, его можно диспергировать в неводном растворителе, а затем можно добавлять воду и антиген и смешивать.
2
Кроме того, альгинатные микросферы можно получать в соответствии с хорошо известными протоколами: сначала альгинат смешивают с антигеном в воде, затем получают микросферы, например, сушкой распылением, и стабилизируют микросферы в 1% растворе CaCl, pH 5 с использованием условий высокоскоростного сдвига.
Также по инструкциям производителя можно получать гель на основе хитозана: 0,5% масс./масс. гель можно получать с использованием хитозана в воде с уксусной кислотой, эту смесь можно смешивать с 10% раствором сульфата натрия и обрабатывать ультразвуком для диспергирования с последующей нейтрализацией. После стерилизации его инкубируют с антигеном в водной фазе.
Гели на основе алюминия, такие как из гидроокиси алюминия или фосфат алюминия, можно приобретать у различных поставщиков в виде 2% или 3% исходного раствора (например, Brenntag, Reheis). Вещество в массе можно разделять на подходящие для обработки количества и стерилизовать автоклавированием. Гели можно смешивать с антигеном путем их совместного перемешивания в течение 15 минут при комнатной температуре в воде с буфером, таким как Tris (10 мМ) или PBS. Характерная конечная концентрация геля на основе алюминия в конечной вакцине может составлять приблизительно 0,1% масс./об.
Первый и второй выделенные белки композиции по изобретению можно продуцировать или получать различными способами, но предпочтительно их продуцируют системой экспрессии in vitro.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления способа по изобретению первый этап включает этапы:
- экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей первый или второй выделенный белок в экспрессирующей системе, и
- сбора и выделения экспрессируемого белка.
Подходящие экспрессирующие системы хорошо известны и, как правило, являются доступными. Примеры представляют собой рекомбинантные системы экспрессии бактериального происхождения, из дрожжей, насекомых, растений или млекопитающих, например: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. или Caulobacter crescentus; Sacharomyces cereviseae, Pichia pastoris; бакуловирус, дрозофила; табак или клетки Hela или CHO.
Альтернативно, экспрессию также можно проводить в так называемых бесклеточных системах экспрессии, например: система лизата E. coli (Roche) или система лизата ретикулоцитов кролика (Promega corp.).
Как хорошо известно в данной области, в системе экспрессии белка используют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющей интерес белок. Такая нуклеотидная последовательность может представлять собой ген (т.е. открытую рамку считывания, кодирующую полный белок) или ген-фрагмент. Она может являться природного или синтетического происхождения.
Для управления экспрессией из нуклеотидной последовательности она должна находиться под контролем (являться функционально связанной с) промоторной последовательности, которая является функциональной в выбранной системе экспрессии. Подходящим образов широкий спектр молекулярно-биологических средств и наборов являются доступными для каждой из основных систем экспрессии, которые обеспечивают обработку нуклеиновой кислоты, чтобы она экспрессировалась.
Адаптация нуклеотидной последовательности, кодирующей желаемый антиген, к используемой системе экспрессии, является общепринятой практикой. Например, встраиваемая последовательность гена предпочтительно не содержит N-концевую сигнальную последовательность и какие-либо трансмембранные области. Их можно заменять выбираемой сигнальной последовательностью, которая подходит к системе экспрессии. Аналогично, частоту использования кодона встраиваемого гена можно адаптировать для соответствия частоте использования кодона выбранной системы экспрессии, например, частоте использования кодона E. coli или клеток насекомых. Как правило, это проводят только посредством "молчащими" мутациями, таким образом, что кодированные аминокислоты не изменяют.
В предпочтительном варианте осуществления первый и второй выделенные белки композиции по изобретению получают в различных системах экспрессии.
Это обеспечивает отдельную оптимизацию их условий экспрессирования.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антиген Bm86 получают посредством рекомбинантной системой экспрессии на основе бакуловируса/клетки насекомого, а антиген суболезин рекомбинантной системой экспрессии E. coli.
Применяя эти конкретные системы экспрессии, подходящим образом получают антигены Rhipicephalus для применения в качестве выделенных антигенов по изобретению, и они обладают повышенной эффективностью при применении в вакцине по изобретению.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие первый или второй выделенный белок, как описано по изобретению, можно получать несколькими путями, например, выделением из клеща или синтезом in vitro, например, на основе обратной трансляции определенной аминокислотной последовательности. Более подходящим способом белки можно синтезировать на основании опубликованных нуклеотидных последовательностей, доступных в общедоступных базах данных, таких как GenBank.
rd
Необходимые молекулярно-биологические способы, включая клонирование, трансфекцию, рекомбинацию, отбор и амплификацию, хорошо известны в данной области и подробно описаны в руководствах, таких как: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989); Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986); and: Sambrook & Russell, 2001, в "Molecular cloning: a laboratory manual", 3 ed. New York, USA: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Альтернативно, первый и второй выделенные белки композиции по изобретению можно получать посредством живого рекомбинантного микроорганизма-носителя(LRC). Это включает, например, варианты осуществления рекомбинантного паразита, бактерии или вируса, которые можно вводить человеку- или животному-объекту. Затем микроорганизм LRC продолжает существовать в объекте без видимого вреда и экспрессирует и доставляет иммунной системе объекта первый и второй выделенные белки композиции по изобретению. Таким образом, варианты осуществления таких микроорганизмов LRC входят в объем изобретения.
При "сборе и выделении" экспрессируемого белка также используют стандартные способы, подходящие для типа системы экспрессии, которую использовали. В частности, в случае, когда экспрессируемый белок секретируется клетками системы экспрессии, культуральный супернатант можно собирать центрифугированием, необязательно с последующим концентрированием. Альтернативно, в случае, когда экспрессируемый белок остается в клетках системы экспрессии, можно собирать эти клетки и получать белок в виде экстракта, обрабатывать ультразвуком или лизировать эти клетки. Все эти способы хорошо известны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению композиция сама по себе может являться пригодной для использования в качестве вакцины против клещей рода Rhipicephalus. Например, когда масляное соединение, которое использовали для получения эмульсии по изобретению, уже действует как подходящий адъювант. Также композиция по изобретению может сама по себе являться достаточно безопасной, стабильной и эффективной, чтобы соответствовать фармацевтическим требованиям к коммерческой вакцине.
Однако для композиции по изобретению необходимыми могут являться некоторые добавки или дополнительная обработка, чтобы преобразовать ее в приемлемую и эффективную вакцину.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к композиции по изобретению для применения в качестве вакцины против клещей рода Rhipicephalus.
В дополнительном аспекте изобретение относится к композиции по изобретению для вакцинации против клещей рода Rhipicephalus.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению композиции по изобретению для получения вакцины против клещей рода Rhipicephalus.
В дополнительном аспекте изобретение относится к вакцине против клещей рода Rhipicephalus, содержащей композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый компонент.
"Вакцина против клещей рода Rhipicephalus" по изобретению представляет собой иммуногенную композицию для введения подходящему человеку- или животному-объекту, которое может являться хозяином для клеща Rhipicephalus. Вакцина индуцирует у объекта иммунный ответ, который опосредованно негативно воздействует на клещей рода Rhipicephalus, которые заразили хозяина, снижая число, ухудшая состояние здоровья и способность к размножению этих клещей. Вакцина по изобретению также может снижать число или тяжесть поражений и побочных эффектов, вызываемых заражением клещами, или реакции объекта на это.
Термин "вакцина" предполагает использование иммунологически эффективного количества одного или более антигенных соединений и фармацевтически приемлемого компонента. Антигенные соединения по изобретению представляют собой первый и второй выделенные белки композиции по изобретению.
Что составляет "иммунологически эффективное количество" для вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению зависит от желаемого действия и от конкретных характеристик используемой вакцины. Определение эффективного количества входит в компетенцию обычного практикующего врача, например, путем мониторинга иммунного ответа объекта после вакцинации или после экспериментального заражения, например, путем мониторинга клинических признаков и серологических параметров у объекта, а также путем наблюдения или выделения клещей на вакцинированном хозяине, и сравнения их с ответами, наблюдаемыми у невакцинированных хозяев.
Независимо от того является ли человеком или животным хозяин фактически страдает от заражения клещами рода Rhipicephalus, и насколько серьезно может устанавливать квалифицированный специалист, такой как опытный скотовод или ветеринар. Вследствие того, что размер взрослых и насосавшихся кровью клещей рода Rhipicephalus составляет приблизительно от 0,5 приблизительно до 3 см, их можно, таким образом, легко наблюдать на хозяине. Для определения какого-либо заражения на стадиях нимфы клещами рода Rhipicephalus необходимым может являться микроскопическое исследование образца, получаемого от хозяина. Специалист может проводить определение наблюдаемого клеща, как принадлежащего к роду Rhipicephalus.
Таким образом, способы оценки эффективности вакцины по изобретению являются легкодоступными и включают наблюдение разницы степени и последствий заражения клещами рода Rhipicephalus, которую вызывает вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению, между вакцинированными и невакцинированными хозяевами.
Дополнительный полезный эффект вакцины по изобретению представляет собой профилактику или снижение распространения клещей рода Rhipicephalus в географической области или в популяции; это включает горизонтальное распространение или заражение окружающей среды. Таким образом, использование вакцины по изобретению приводит к снижению распространенности клещей рода Rhipicephalus.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению способна снижать распространенность клещей рода Rhipicephalus в географической области.
"Фармацевтически приемлемый компонент" способствует эффективному введению вакцины, не вызывая (тяжелых) неблагоприятных воздействий на здоровье объекта, которому ее вводят. Такой раствор может, например, представлять собой стерильную воду или стерильный физиологический раствор. В более сложной форме раствор может, например, представлять собой буфер, который может содержать дополнительные добавки, такие как стабилизатор, консервант или адъювант. Подробное описание и примеры описаны в хорошо известных руководствах.
Вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению может содержать стабилизатор, например, для защиты подверженных разрушению компонентов или для увеличения срока хранения вакцины. Как правило, стабилизаторы представляют собой большие молекулы высокой молекулярной массы, такие как липиды, углеводы или белки; например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов. Предпочтительно стабилизатор не содержит соединения животного происхождения.
Вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению может содержать консервант, такой как тимеросал, мертиолат, соединения фенольной смолы и/или гентамицин.
Очевидно, что смешивание других добавок, которые являются необходимыми или благоприятными для фармацевтической стабильности или эффективности вакцины по изобретению, также входят в объем изобретения.
В случае, когда вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению находится не в форме эмульсии, она может представлять собой водный раствор, например, в одном из вариантов осуществления, где отдельные фармацевтические носители содержат первый и второй выделенные белки композиции по изобретению. В этом случае вакцину можно лиофилизировать для повышения enhance ее стабильности и обеспечения длительного хранения при температурах выше нуля.
Способы лиофилизации известны специалистам в данной области, и оборудование для лиофилизации в различных масштабах является коммерчески доступным.
Таким образом, в более предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению отличается тем, что вакцина находится в лиофилизированной форме.
Для восстановления лиофилизированной вакцинной композиции ее суспендируют в физиологически приемлемом разбавителе. Общепринято это проводит непосредственно перед введением для того, чтобы гарантировать наилучшее качество вакцины. Разбавитель может представлять собой, например, стерильную воду или физиологический раствор. Разбавитель, используемый для восстановления вакцины, может сам по себе содержать дополнительные соединения, такие как адъювант. В другом варианте осуществления лиофилизированную вакцину можно суспендировать в эмульсии, как описано в EP 382271.
В дополнительном варианте осуществления лиофилизированной вакцины по изобретению разбавитель для вакцины поставляют отдельно от лиофилизированного осадка, содержащего активную вакцинную композицию. В этом случае лиофилизированная вакцина и композиция разбавителя образуют набор частей, которые совместно воплощают настоящее изобретение.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления лиофилизированной вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению вакцина содержится в наборе частей по меньшей мере с двумя типами контейнеров, где один контейнер содержит лиофилизированную вакцину, и один контейнер содержит водный разбавитель.
Очевидно, что объект вакцинации против клещей рода Rhipicephalus по изобретению представляет собой являющихся человеком или животными хозяев, подверженные заражению клещами рода Rhipicephalus, как описано выше. Однако возраст, масса, пол, иммунологический статус и другие параметры объекта, подлежащей вакцинации, не являются критическими, хотя очевидно, что предпочтительно вакцинировать здоровых объектов и вакцинировать как можно раньше для профилактики заражения. Вследствие того, что заражение клещами рода Rhipicephalus можно устанавливать уже в молодом возрасте, таким образом, вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно применять в течение первых 2 недель после рождения.
Предпочтительные объекты для вакцинации по изобретению представляют собой любых хозяев, являющихся животным-компаньоном или домашним скотом, которые подвержены заражению клещами рода Rhipicephalus. Более предпочтительно животное-мишень представляет собой собаку, крупный рогатый скот, лошадь, свинью, козу, овцу или оленя. Даже более предпочтительно животное-мишень представляет собой крупный рогатый скот, и наиболее предпочтительно животное-мишень представляет собой крупный рогатый скот коровы (Bos taurus), крупный рогатый скот зебу (Bos indicus), буйвола, бизона, яка или зубра.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно в равной степени использовать в качестве профилактического или в качестве терапевтического лечения, и она может препятствовать возникновению и прогрессированию заражения клещами рода Rhipicephalus и его последствиям.
Вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению может эффективно служить в качестве первичной вакцинации, за которой в дальнейшем может следовать и усиливать ее эффект одна или более повторных вакцинаций одной и той же или другой вакциной против клещей рода Rhipicephalus.
Схему введения вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению предпочтительно включают в существующие схемы вакцинации для других вакцин для этого объекта.
Предпочтительно вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению применяют в виде годовой дозы. Однако в областях, где уровень заражения клещами рода Rhipicephalus является высоким, необходимой может являться повторная вакцинация в более короткие интервалы, например, через 6 месяцев.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно вводить в дозах, содержащих от 1 до 1000 мкг каждого из первого и второго выделенного белка композиции по изобретению. По существу можно использовать большие или меньшие дозы; предпочтительно одна доза вакцины содержит от 10 до 1000 мкг каждого из двух белков.
В серии экспериментов сероконверсии in vivo тестировали различные отношения антигенов Bm86 и суболезина. Выявлено, что количества двух антигенов необязательно является одинаковым; фактически было выявлено, что благоприятным является содержание в дозе для животного больше антигена суболезина на дозу чем белка Bm86.
По сравнению с конкретным составом, содержащим равные количества антигенов Bm86 и суболезина в дозе, получаемый у телят титр антител против суболезина можно было повышать при использовании аналогичного состава, который содержал количество антигена суболезина выше, чем количество Bm86; это не оказывало влияния на титр антител против Bm86.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению содержит первый и второй выделенные белки, таким образом, что количество каждого из белков в микрограммах в дозе отличается более чем на 5%.
В предпочтительном варианте осуществления вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению количество одного из двух белков в микрограммах в дозе является приблизительно в два раза больше, чем другого белка.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению содержит приблизительно 25 мкг/дозе Bm86 и приблизительно 50 мкг/дозе суболезина.
Для вакцины по изобретению с такой разницей отношения белков демонстрировали повышенную эффективность по сравнению с вакциной, содержащей равные количества в микрограммах в дозе обоих белков.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению вводят в объеме, который является приемлемым для объекта. Например, объем одной дозы вакцины может составлять от 0,1 до 10 мл. Предпочтительно объем одной дозы составляет от 0,25 до 5 мл.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно вводить объекту известными в данной области способами. Предпочтительное применение является парентеральным путем, таким как через какой-либо путь инъекции в кожу или через кожу, например, внутримышечный, внутривенный, интраперитонеальный, внутрикожный, подслизистый или подкожный.
Предпочтительный путь введения вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению является посредством внутримышечной или подкожной инъекции.
Очевидно, что оптимальный путь введения зависит от конкретного вакцинного состава, который используют, и от конкретных характеристик объекта.
Специалист способен дополнительно оптимизировать вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению. Как правило, это включает точную регуляцию эффективности вакцины, таким образом, что она обеспечивает достаточную иммунную защиту. Это можно проводить адаптацией дозы, объема или содержания антигена вакцины; путем использования вакцины в другой форме или составе; путем адаптации других компонентов вакцины (например, стабилизатора или адъюванта) или путем введения другим путем или способом.
Вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению может дополнительно содержать другие соединения, такие как адъювант, дополнительный антиген, цитокин и т.д. Альтернативно, вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно преимущественно объединять с фармацевтическим компонентом, таким как антибиотик, гормон или противовоспалительное лекарственное средство.
В предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению отличается тем, что она содержит адъювант.
"Адъювант" представляет собой хорошо известный ингредиент вакцин, который стимулирует иммунный ответ объекта неспецифическим образом. Многие различные адъюванты известны в данной области. Примеры адъювантов представляют собой полный и неполный адъювант Фрейнда, витамин E, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как декстрансульфат, карбопол и пиран, соединения алюминий, такие как фосфат алюминия или гидроксид алюминия, сапонин и т.д.
Кроме того, пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, тафтсин, часто используют в качестве адъюванта, и преимущественно можно использовать минеральное масло, например, Bayol™ или Markol™, Montanide™ или легкое парафиновое масло, растительные масла или комбинированные продукты, такие как ISA™ от Seppic или DiluvacForte™.
Одним из руководств по адъювантам и видам их использования и эффектам является "Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN-10: 0896037355).
Наряду с возможным адъювантным эффектом, который может уже быть обеспечен компонентами композиции по изобретению, вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению предпочтительно содержит адъювант сапонин.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению содержит сапонин.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению вакцина представляет собой эмульсию, где сапонин содержится по меньшей мере в одной из водных фаз.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению представляет собой эмульсию вода-в-масле, где Montanide ISA 50V2 содержится в масляной фазе, и сапонин Quil A содержится по меньшей мере в одной из водных фаз.
Было выявлено, что комбинированное использование адъюванта на основе Montanide и сапонина индуцирует более эффективный иммунный ответ по сравнению с тем, когда используется только один из них.
"Сапонин" является хорошо известным поверхностно-активным гликозидным соединением. Коммерческие продукты представляют собой Quil A™ (Brenntag), Q-vac™ (Biolang), VaxSap™ (Desert King) и Abisco100™ (Isconova). Вследствие того, что сапонин является гидрофильным, он может легко переходить в одну или более водных фаз вакцины по изобретению. Адъювант сапонин предпочтительно содержится в вакцине по изобретению на уровне от 10 до 10,000 мкг/мл, более предпочтительно от 50 до 5000 мкг/мл, даже более предпочтительно от 100 до 1000 мкг/мл.
Было выявлено, что введение сапонина в качестве (дополнительного) адъюванта обеспечивает значительное повышение уровней антител, которые можно индуцировать вакциной по изобретению. Частично это объясняли повышением антител типа IgG2a, которые образуются наряду с антителами типа IgG1, получали без сапонина. В отношении вакцины против клещей рода Rhipicephalus образование антител типа IgG2a является наиболее благоприятным, т.к. полагают, что эти антитела в меньшей степени зависят от факторов комплемента для их повреждающих клетки эффектов по сравнению с антителами типа IgG1.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно преимущественно комбинировать с другим антигеном, например, получаемым из другого патогена или иммунологически активного соединения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению содержит дополнительный иммуноактивный компонент.
"Дополнительный иммуноактивный компонент" может представлять собой антиген и/или иммуностимулирующее вещество; любой из них может содержать адъювант.
Дополнительный иммуноактивный компонент, когда находится в форме антигена, может состоять из любого антигенного компонента важного с точки зрения ветеринарии. Например, он может содержать биологическую или синтетическую молекулу, такую как белок, углевод, липополисахарид, или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей белков антиген. Также клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту, или микроорганизм LRC, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты, может представлять собой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты или дополнительного иммуноактивного компонента. Альтернативно он может содержать фракционированный или убитый микроорганизм, такой как паразит, бактерия или вирус.
Дополнительный иммуноактивный компонент(ы) могут находиться в форме иммуностимулирующего вещества, например, хемокина, или иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, содержащей неметилированный мотив CpG. Альтернативно, вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно саму добавлять к вакцине.
В предпочтительном варианте осуществления дополнительный иммуноактивный компонент представляет собой или его получают из микроорганизма, инфекционного для человека или животного, которое также являются мишенью для вакцинации вакциной против клещей рода Rhipicephalus по изобретению.
Преимущество такой комбинированной вакцины заключается в том, что она не только индуцирует иммунный ответ против клещей рода Rhipicephalus, а также против других патогенов, при этом необходимой является только однократная обработка объекта для вакцинации, таким образом, снижая вызываемый вакцинацией стресс объекта, а также затраты времени и трудовые затраты.
Примеры таких дополнительных иммуноактивных компонентов в основном представляют собой все вирусные, бактериальные и паразитарные патогены или получаемые из них антигены, которые можно применять для вакцинации человека или животного, которое также является мишенью для вакцинации вакциной против клещей рода Rhipicephalus по изобретению.
Например, для свиней: цирковирус свиней, вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вирус псевдобешенства, парвовирус свиней, вирус классической чумы свиней, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, E. coli, Streptococcus, Salmonella, Clostridia, Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella, Haemophilus, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora, Trichinella и т.д.
Для крупного рогатого скота: Neospora, Dictyocaulus, Cryptosporidium, Ostertagia, Babesia, Theileria, Anaplasma, Trypanosoma, Cowdria, Toxoplasma, ротавирус крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, коронавирус крупного рогатого скота, вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (вирус герпеса крупного рогатого скота), парамиксовирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус бешенства, вирус "синего языка", Pasteurella haemolytica, E. coli, Salmonella, Staphylococcus, Mycobacterium, Brucella, Clostridia, Mannheimia, Haemophilus, Fusobacterium и т.д.
Для овец или коз: Toxoplasma, Neospora, Cowdria, Babesia, Theileria, Anaplasma, Eimeria, Trypanosoma, вирус чумы мелких жвачных животных, вирус "синего языка", вирус Шмалленберга, Mycobacterium, Brucella, Clostridia, Coxiella, E. coli, Chlamydia, Clostridia, Pasteurella, Mannheimia и т.д.
Для собак: Ehrlichia, Leishmania donovani-complex, Neospora, Anaplasma, Dirofilaria, Dypilidium, парвовирус собак, вирус чумы собак, аденовирус 1 или 2 типов собак, вирус гепатита собак, коронавирус собак, вирус парагриппа собак, вирус бешенства, калицивирус кошек, вирус герпеса кошек, вирус панлейкопении кошек, Clostridium, Hepatozoon, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica, Chlamydia, Babesia, Theileria и т.д.
Вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению получают средствами хорошо известными специалисту.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения вакцины против клещей рода Rhipicephalus, включающему смешивание композиции по изобретению и фармацевтически приемлемого компонента.
Вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно получать способами, как описано в настоящем описании, которые может легко применять специалист в данной области. Например, первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, можно получать в промышленном масштабе в меньших или больших объемах в системе экспрессии. Белок собирают из культуры экспрессирующих клеток или культурального супернатанта. При необходимости по соображениям биологической безопасности собираемый белковый продукт можно сначала подвергать биологической инактивации.
Это можно проводить несколькими способами общепринятой химической инактивации, такой как формалином, бета-пропиолактоном, бинарным этиленимином или бета-этаноламином.
Лизат можно получать физическими (френч-пресс, ультразвуковой дезинтегратор) или химическими (детергенты, средства, вызывающие диссоциацию комплексов) средствами. Суспензию можно дополнительно очищать или концентрировать, например, центрифугированием или фильтрованием. Получаемый препарат антигена затем объединяют с фармацевтически приемлемыми компонентами, формулируют в вакцину и заполняют контейнеры соответствующего размера. На различных стадиях процесса производства проводят мониторинг соответствующими тестами, например, посредством иммунологических тестов на качество и контроль антигенов; посредством микробиологических тестов на инактивацию, стерильность и отсутствие посторонних веществ, и в заключение посредством исследований на животных для подтверждения эффективности и безопасности вакцины. Они все хорошо известны специалисту. После завершения тестирования на качество, количество и стерильность, такие вакцинные продукты разрешают для продажи.
Общие способы и факторы, которые необходимо учитывать, которые применяют при получении вакцины, хорошо известны в данной области и описаны, например, в государственных регулирующих документах (фармакопеи) и в хорошо известных руководствах.
Предпочтительно вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению формулируют в форме, которая является подходящей для парентеральной инъекции, т.е. инъецируемой жидкости, такой как суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия. Общепринято такие вакцины получают стерильными и с физиологическим pH.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления вакцина против клещей рода Rhipicephalus по изобретению содержит в качестве первого выделенного белка 25 мкг/дозе Bm86, экспрессируемого бакуловирусом/клеткой насекомого, и в качестве второго выделенного белка 50 мкг/дозе экспрессируемого E. coli суболезина, где каждый выделенный белок содержится в отдельной водной фазе эмульсии вода-в-масле, таким образом каждая водная фаза также содержит Quil A сапонин, а масляная фаза содержит Montanide ISA 50V2.
Как описано, вакцину против клещей рода Rhipicephalus по изобретению можно преимущественно применять к являющемуся человеком или животным объекту, который представляет собой хозяина, подверженного заражению клещами рода Rhipicephalus.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus, включающему введение объекту вакцины против клещей рода Rhipicephalus по изобретению.
В настоящее время это открытие можно предпочтительно использовать для вакцины против клещей рода Rhipicephalus, в частности двумя путями: в частности, путем однократного или двукратного введения.
Когда два белка применяют при однократном введении, их необходимо формулировать таким образом, чтобы они оставались в раздельном друг от друга состоянии в конченой вакцинной композиции, как описано выше.
Альтернативно, два белка можно применять при двукратном введении для отдельной презентации иммунной системе объекта для индукции иммунной реакции против заражения клещами рода Rhipicephalus. Это можно преимущественно получать введением объекту в различные участки на теле, различными путями или различными способами.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к первому выделенному белку, как описано по изобретению, для вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus, отличающейся тем, что белок вводят одновременно со вторым выделенным белком, как описано по изобретению, но в другие участки на теле, различными путями или различными способами.
Кроме того, в дополнительном аспекте изобретение относится ко второму выделенному белку, как описано по изобретению, для вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus, отличающемуся тем, что белок вводят одновременно с первым выделенным белком, как описано по изобретению, но в другие участки на теле, различными путями, или различными способами.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению первого и второго выделенных белков, как описано по изобретению, для вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus, отличающемуся тем, что белки вводят одновременно, но в различные участки на теле, различными путями или различными способами.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу вакцинации объекта против клещей рода Rhipicephalus, включающему введение объекту первого и второго выделенных белков, как описано по изобретению, отличающемуся тем, что введение белков является одновременным, но в различные участки на теле, различными путями или различными способами.
Термин "одновременно" означает, что существует определенный период времени, в течение которого первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, необходимо вводить объекту. Целью такого одновременного (но раздельного) введения по отношению к иммунной системе хозяина является индукция сильных гуморальных иммунных ответов против каждого из белков. Вследствие того, что развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающего может занимать до 14 суток, таким образом, оба белка необходимо вводить объекту в течение периода приблизительно 14 суток. Таким образом, по изобретению "одновременно" означает в течение периода приблизительно 14 суток.
Предпочтительно период для одновременного введения является более коротким, таким образом, в предпочтительном варианте осуществления "одновременно" означает в течение периода продолжительностью 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 суток в этом порядке предпочтения. Наиболее предпочтительно одновременно означает в течение 1 суток.
Согласно настоящему изобретению введение объекту первого и второго выделенных белков, как описано по изобретению, необходимо проводить "в различные участки на теле, различными путями, или различными способами". Это служит для обеспечения раздельной презентации двух белков иммунной системе объекта.
По изобретению "различные участки на теле" означает, что участки обработки для введения (вакцины, содержащей) первого и второго выделенных белков, как описано по изобретению, в организм объекта являются физически раздельными. В одном из вариантов осуществления это относится к применению отдельных шприцов, где каждый содержит любой белок, и их затем используют для проведения отдельных инъекций в различные участки на теле объекта, как правило, на расстоянии друг от друга более 1 см, предпочтительно по меньшей мере 5, 8, 10, 15, 20, или по меньшей мере 30 см, в этом порядке предпочтения.
В альтернативном варианте осуществления это может относиться к применению устройства для инъекции в несколько точек; где устройство содержит более одной точки инъекции, где каждая точка соединена с отдельной камерой или контейнером, содержащим (вакцину, содержащую comprising) любой из первого или второго выделенного белка, как описано по изобретению. Такие устройства для инъекции в несколько точек хорошо известны в данной области. Например, в одном из вариантов осуществления это относится к комбинированному или двойному шприцу с отдельными камерами, где каждая камера соответствует отдельной игле; где иглы находятся на некотором расстоянии друг от друга, например, приблизительно 0,1-2 см.
Хотя использование устройства для инъекции в несколько точек предусматривает только однократное действие введения, однако такое введение вакцины по изобретению представляет собой двойное введение по изобретению. Это обусловлено тем, что первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, вводят в различные участки на теле объекта.
Этот вариант осуществления отличается от использования устройства для инъекции ив одну точку, как описано выше.
По изобретению "различными путями" означает использование двух различных способов введения, выбранных из путей, известных в данной области, и подходящих для конкретного объекта, например:
- посредством инъекции: внутримышечной, внутривенной, интраперитонеальной, внутрикожной, подслизистой, или подкожной;
- посредством местного нанесения в виде капли, спрея, геля или мази на эпителий слизистой оболочки глаза, носа, полости рта, ануса или влагалища, или на эпидермис наружного слоя кожи;
- посредством распыления в виде аэрозоля или порошка;
- через алиментарный путь посредством объединения с пищей, кормом или питьевой водой, например, в виде порошка, жидкости или таблетки, или
- посредством введения непосредственно в полость рта в виде жидкости, геля, таблетки или капсулы, или в анус в виде суппозитория.
В предпочтительном варианте осуществления различные пути включают подкожное и внутримышечное введение.
Кроме того, "различными способами" относится к различным путям, которыми первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, можно формулировать. Многие из таких способов уже перечислены в вариантах различных путей, например, жидкость, гель, мазь, порошок, таблетка или капсула. В этом отношении жидкость может представлять собой суспензию, раствор, дисперсию или эмульсию.
В предпочтительном варианте осуществления различные способы выбраны из эмульсии, суспензии и дисперсии.
Как будет понятно специалисту, различные пути применения (участок, путь и способ) можно преимущественно комбинировать. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, вводят объекту путем сочетания различных путей их введения.
Для вариантов осуществления изобретения, относящихся к двойному введению, первый и второй выделенные белки, как описано по изобретению, можно подходящим способом выставлять на продажу в форме, где оба белка предоставляют в отдельных контейнерах в их конкретных фармацевтических препаратах. Для простоты использования два контейнера можно предоставлять в одной упаковке необязательно с разбавителем и/или набором инструкций по их введению.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к набору частей, содержащих по меньшей мере два контейнера, где один контейнер содержит первый выделенный белок, как описано по изобретению, и другой контейнер содержит второй выделенный белок, как описано по изобретению.
Ниже изобретение дополнительно описано с ссылкой на следующие ниже неограничивающие примеры.
Примеры
1. Общие способы и вещества
1.1. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ Bm86 И СУБОЛЕЗИНА
Для различных исследований in vivo и in vitro, проводимых с антигенами Bm86 и суболезин, использовали ряд различных рекомбинантных систем экспрессии. Во всех случаях экспрессия белка являлась детектируемой без необходимости специальной модификации. Также все антигены, продуцируемые прокариотическими или эукариотическими системами, а также системами на основе высших или низких эукариот, всегда распознавались специфической бычьей антисывороткой и являлись иммунологически активными, например, в анализах искусственного кормления клещей. Это свидетельствует о том, что для используемых белковых антигенов Bm86 и суболезин не требуется сложная посттрансляционная модификация для того, чтобы они являлись иммунопротективными. Некоторые комбинации антигена и системы экспрессии более подробно описаны ниже.
1.1.1. Экспрессия суболезина системой экспрессии E. coli
Для экспрессии бактериями Escherichia coli использовали плазмиду для переноса/клонирования, которая была основана на коммерческой плазмиде pET14.b. Ген суболезина, который экспрессировали в E. coli, получали из клеща R. (Boophilus) microplus из Мексики, и его полная последовательность представлена в GenBank с номером доступа: ABA62327. Экспрессируемый белок представлял собой вариант длиной 147 аминокислот с усеченным C-концом, в частности, как проиллюстрировано в SEQ ID NO: 2.
Конструировали ДНК-праймеры для подходящего субклонирования гена суболезина в плазмиду pET и для обеспечения ее пептидом слияния 6xHis на N-конце для облегчения очистки и детекции. Для экспрессии использовали стандартные коммерческие клетки E. coli BL21 (DE3)™ (Invitrogen) с использованием стандартной коммерческой петельной среды LB с ампициллином. Культивирование проводили в течение ночи при 37°C и 200 об/мин.
W
W
Вследствие того, что плазмиды типа pET обеспечивают сверхэкспрессию, антиген суболезин выявили внутриклеточно как тельца включения. Их собирали центрифугированием клеток с последующей обработкой ультразвуком. Затем тельца включения с суболезином подвергали денатурации с использованием 6 M мочевинного буфера. Затем белок очищали с использованием колонки His-Trap, например, картриджа Profinia™ IMAC (BioRad Bio Scale). Элюированный антиген суболезин концентрировали через 5,0 MCO фильтр PES (Vivaspin) центрифугированием, и подвергали диализу для ренатурации против 50 мМ буфера MES (морфолиноэтансульфоновая кислота) при pH 5,8, через MCO 3,5 кДа диализную мембрану (SpectraPore).
Такой очищенный антиген суболезин дополнительно характеризуют с использованием нескольких техник. После SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим для очищенного суболезина демонстрировали одну основную полосу 20 кДа и некоторые минорные полосы, вероятно, мультимеры при 40, 60 и 80 кДа. В вестерн-блоттинге с использованием поликлональной бычьей антисыворотки против суболезина специфически распознавали полосы 20, 40 и 60 кДа.
В анализе антигена Elisa специфическое связывание с этим суболезином можно было снижать титрованием антигена. После очистки на колонке His-trap антиген суболезин являлся такой степени чистоты, что его количество можно было определять в стандартном анализе белка BCA (Pierce), который указывал на то, что можно стандартно получать концентрацию суболезина приблизительно 100 мг/л. Выделенный белок хранили замороженным при -70°C до момента использования.
1.1.2. Экспрессия суболезина или Bm86 системой экспрессии на основе Pichia
Экспрессию суболезина или антигена Bm86 в Pichia проводили по существу как описано (Almazan et al. 2010 и Canales et al., 2008, выше). В кратком изложении, кодирующие гены экспрессировали с использованием коммерческой плазмиды pPICZα (Invitrogen) в качестве вектора для переноса. Его конструировали и амплифицировали в E. coli, а затем использовали для трансформации компетентных клеток X-33 P. pastoris. Этот вектор для переноса обеспечивает стабильную интеграцию в хромосому Pichia под контролем промотора AOX1. В зависимости от числа вставок гена конкретная клетка-клон может обладать более высокой или более низкой способностью к экспрессии. Экспрессию проводили с использованием стандартных условий; сначала клетки размножали на основной среде с дрожжевым экстрактом и экстрактом из соевых бобов и глицерином. После амплификации культуру индуцировали для экспрессии под промотором AOX заменой среды на среду с 2% метанолом и продолжали инкубировать еще в течение 48 часов.
Оба антигена экспрессировали с использованием специфической сигнальной последовательности Pichia (MAT альфа-prepro), и Bm86 не содержал трансмембранной последовательности. Таким образом, белки продуцировались в культуральный супернатант, из которого их концентрировали и использовали для характеризации и получения вакцины.
1.1.3. Экспрессия Bm86 системой экспрессии на основе бакуловируса
Для экспрессии белка Bm86 в системе экспрессии на основе бакуловируса-клетки насекомого получали ген Bm86 из клеща R. (Boophilus) microplus из Мексики, его последовательность является такой же, как последовательность в GenBank с номером доступа ADQ19685. Кодирующую нуклеотидную последовательность оптимизировали для соответствия частоте использования кодона бакуловируса без изменения кодируемого белка, т.к. все вводимые мутации являлись молчащими. Ген, который экспрессировали бакуловирусом, содержал сигнальную последовательность Bm86, но не трансмембранную область; таким путем секретировался из клеток насекомых и не оставался связанным с клеточной мембраной. Получаемый зрелый экспрессируемый бакуловирусом белок Bm86 содержал аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Векторная плазмида для переноса, используемая для клонирования и экспрессии, представляла собой коммерческую плазмиду pVL1393, которая обеспечивает экспрессию под контролем промотора гена полиэдрина. После трансфекции отбирали рекомбинантные бакуловирусы в несколько этапов клонированием способом бляшкообразования. Выбирали один рекомбинант, являющийся стабильным и продуктивным, его использовали для увеличения масштаба и продукции белка. Как правило, клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в коммерческой среде SF900, инфицированной приблизительно 0,1 m.o.i., и собирали белок через 4-5 суток инкубации при 28°C. Белок Bm86, полученный из супернатанта культуры клеток насекомых, собирали центрифугированием, инактивировали рекомбинантный бакуловирус и концентрировали через мембраны Vivaspin™.
Затем очищенный антиген Bm86 характеризовали с использованием специфической антисыворотки против Bm86 от кролика или крупного рогатого скота несколькими способами: сэндвич-ELISA, и SDS-PAGE/вестерн-блоттинг для полосы приблизительно 80 кДа. Измерение количества белка Bm86 до некоторой степени вызывало затруднение в результате высокого содержания цистеина в таком белке, таким образом, стандартный анализ BCA или по Лоури давал неправильные количества. Однако стандартные анализы Брэдфорд или CBB демонстрировали измерения с достоверными результатами, указывая на то, что приблизительно 400 мкг/мл белка антигена Bm86 можно стандартно продуцировать в системе экспрессии на основе бакуловируса.
1.1.4. Характеризация белка
Для подтверждения идентичности белков Bm86 и суболезина, продуцируемых системой экспрессии, их подвергали анализу белковой последовательности их триптических фрагментов с использованием хроматографии и масс-спектрометрии (Radboud University Proteomics Centre, Nijmegen, NL). В кратком изложении, вырезали гелевые полоски, содержащие белок из препаративного SDS-PAGE. Белки расщепляли трипсином в геле, элюировали и анализировали на колонке для жидкостной хроматографии, которая была соединена с масс-спектрометр циклотронного резонанса. Выявляемые белковые последовательности анализировали на известный уровень фона и контаминации и собирали последовательности белков Bm86 и суболезина. Bm86 и суболезин выявляли как один преобладающий белок в их соответствующих образцах. Покрытие для последовательности белка суболезина составляло 88%, для Bm86 68%. Тем не менее выявленные результаты точно совпадали с аминокислотными последовательностями, которые предназначены для экспрессии.
1.2. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗЫ
Для различных серологических анализов, используемых во время экспериментов, использовали твердофазные иммуноферментные анализы (Elisa). Их проводили в виде стандартного Elisa (захват) в формате сэндвич и настраивали для анализа содержащих антитело или антиген образцов. Их основная схема всегда являлась одинаковой, в кратком изложении, стенки планшета для титрования покрывали иммобилизованным антителом посредством инкубации в течение ночи. Затем планшет отмывали и инкубировали с антигеном, который специфически распознает иммобилизованное антитело. После инкубации и промывания добавляли второе отличающееся антитело, которое также может распознавать антиген. После инкубации и промывания добавляли третье антитело, которое являлось специфическим для типа IgG второго антитела. Третье антитело являлось конъюгированным с ферментом пероксидазой хрена (HRP), который обеспечивает реакцию с изменением цвета для выявления, если какой-либо антиген связывался, путем считывания показаний в подходящем фотоспектрометрическом ридере Elisa.
Для детекции белка Bm86 или его антител в Elisa применяли анти-Bm86 IgG кролика (Pichia) для захвата, второе антитело анти-Bm86 коровы (бакуловирус) и конъюгат антитела коза против бычьего IgG-HRP.
Для детекции белка суболезин или его антитела в Elisa применяли коммерческое антитело к His-метке для захвата, второе антитело анти-суболезин коровы и в качестве конъюгата антитело козы против бычьего IgG-HRP.
Все используемые процедуры являлись общепринятыми или такими, как рекомендует поставщик; аналогично, все используемые вещества являлись общепринятыми, такими как планшеты, буферы, используемые для покрытия, инкубация, промывание или блокирование, окрашивающий субстрат и т.д. При возможности промывание планшетов Elisa, считывание показаний с планшетов и результат вычислений проводили посредством автоматического способа и оборудования.
Когда Elisa являлся предназначенным для детекции и количественного определения антител в образце (активность Elisa), таком как сыворотка животных в исследовании вакцинации, то используемый антиген являлась эталонным антигеном, и тестируемую сыворотку титровали как второе антитело параллельно с эталонным вторым антителом. В противоположность этому, когда Elisa являлся предназначенным для детекции и количественного определения антигенного вещества в образце (антигенная масса Elisa), таком как получаемом из системы экспрессии, то тестируемый антиген титровали в планшеты, затем к эталонному образцу антигена, и второе антитело представляло собой эталонное антитело.
Когда дело касалось определения, является ли антитело типа IgG1 или IgG2, то использовали селективное конъюгированное антитело, например, коммерческое антитело овцы против IgG1 коровы, или антитело овцы против IgG2a коровы.
Результаты этих анализов Elisa представляют собой значения титра, которые являются относительными, что означает, что их числовые значения зависят от конкретных эталонных образцов и способа разбавления, который использовали. Таким образом, их точные значения не являются релевантными, т.к. другие способы проведения такого Elisa с использованием другого эталонного образца приведут к другому значению. Однако вследствие того, что все образцы в этих экспериментах тестировали одинаковым способом, их относительное значение является релевантным, и позволят проводить сравнение титров антигена или антитела между образцами, которые анализировали с использованием одного и того же анализа.
1.3. ФОРМУЛИРОВАНИЕ ВАКЦИН
Эмульсии и гели получали в основном по инструкциям поставщика с незначительными адаптациями для приведения в соответствие с конкретными требованиями со стороны оборудования или объема. В кратком изложении:
- Эмульсии Montanide™ ISA50V2 получали полностью согласно инструкциям поставщика (Seppic). Montanide смешивали 50:50 с водной фазой белка в PBS посредством высокоскоростного сдвигового перемешивания при комнатной температуре в течение приблизительно 10 минут. Наблюдали, чтобы температура не превышала приблизительно 35°C. Montanide подвергали стерильному фильтрованию перед использованием. Эмульсии проверяли визуально и с использованием микроскопа (увеличение 1000x) на окраску и однородность.
- Эмульсии Montanide ISA50V2 + сапонин получали, как указано выше, за исключением того, что сапонин QuilA™ добавляли к содержащей белок водной фазе перед эмульгированием. Сначала QuilA растворяли PBS до 10% раствора и подвергали стерильному фильтрованию. Его смешивали 1:10 с водной фазой антигена в PBS и эмульгировали 50:50 с Montanide. Конечная эмульсия содержала 500 мкг/мл сапонина.
- Эмульсии светлого минерального масла с использованием Marcol™ или Drakeol™ в качестве масла получали в виде эмульсий 40:60 в/м с белками в PBS при стандартных условиях высокоскоростного сдвига. Используемые поверхностно-активные вещества представляли собой 5% Span80™ и 1% Tween80™ (в конечной эмульсии).
- Гели на основе алюминия получали с (конечным) 0,15% гелем гидроксида алюминия или 0,1% гелем фосфата алюминия и белка в PBS.
- Комбинированные эмульсии на основе алюминия-масла получали в виде объединения в/м композиций, описанных выше, содержащих гель гидроксида алюминия или фосфата алюминия с антигеном в водной фазе и Montanide ISA50V2 в масляной фазе.
2. Исследование вакцинация-экспериментальное заражение с использованием антигенов Bm86 и суболезина в схеме двойного введения
2.1. ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование представляло собой рандомизированное испытание с использованием молодых бычков (в возрасте 4-6 месяцев) смешанной породы Herford/Holstein, получаемых из области, в которой клещи не встречаются, которых случайным образом распределяли на различные группы обработки по 5 животных/группа. За исключением контрольной группы одна доза тестируемого препарата содержала 100 мкг рекомбинантного антигена в объеме 1 мл эмульсии в/м. Инъекции вводили подкожно путем инъекции в область шеи. Животные, которых вакцинировали более чем одним белком, получали инъекции в разные участки. После первичной вакцинации проводили повторную вакцинацию 2 раза с интервалами в три недели.
Через три недели после последней повторной вакцинации животные переводили из общего загона на содержания в индивидуальных загонах, и они получали экспериментальное заражение на разных участках бока 2 видами клещей рода Rhipicephalus, каждый с противоположных сторон. Каждые сутки участки заражения проверяли и собирали всех насосавшихся кровью самок, которые отпадали. Репрезентативное число собранных клещей инкубировали для обеспечения откладки яиц. Массы яиц клещей затем инкубировали для измерения выхода личинок в качестве меры жизнеспособности.
2.2. СПОСОБЫ
2.2.1. Тестируемые препараты
Адъювант, используемый для этого испытания, представлял собой Montanide ISA50V2 (Seppic, France), который эмульгировали в эмульсии в/м 50:50 с водной фазой в стандартных условиях. В контрольной группе водная фаза состояла из стандартного стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS). Вакцины содержали водные фазы с:
- 100 мкг белка Bm86,получаемого с использованием система экспрессии Pichia. Встраиваемый ген Bm86 получали из мексиканского клеща R. (Boophilus) microplus без его нативной сигнальной последовательности или трансмембранной области.
- 100 мкг белка суболезина, получаемого с использованием системы экспрессии E. coli. Встраиваемый ген суболезина получали из мексиканского клеща R. (Boophilus) microplus (147 аминокислот) и присоединяли N-концевой пептид слияния 6xHis.
Вакцины-эмульсии получали стерильными и хранили в стеклянных флаконах при 2-8°C до момента использования.
2.2.2. Животные
Используемые телята являлись здоровыми животными, не зараженными Anaplasma и Babesia, и перед вакцинацией животные проходили акклиматизацию в течение периода 4 недель. Животные имели метку на ухе с уникальным номером для идентификации. Обеспечение кормом и водой являлось стандартным. За всеми животными ежесуточно наблюдал ветеринар в отношении каких-либо отклонений.
2.2.3. Виды обработки
Все вакцинации проводили подкожно в область шеи 1 мл дозы с использованием 3 мл шприца с иглой 16-калибра. Перед инъекцией участок инъекции брили. Последующие инъекции проводили попеременно с левой и правой стороны шеи. Двойную вакцину вводили с левой и правой стороны шеи на одни и те же сутки.
Отбор образцов крови проводили на каждые сутки вакцинации, но перед введением вакцины и перед экспериментальным заражением, собирали 10 мл крови из яремной вены для получения сыворотки. Образцы хранили при -20°C до момента использования.
Как правило, наблюдали временный локальный отек на участке инъекции вакцины приблизительно до 72 часов после инъекции.
2.2.4. Заражение клещами
Заражение клещами проводилось изолятом R. (Boophilus) microplus из Мексики и изолятом R. (Boophilus) annulatus из Техаса. Клещей поддерживали в виде лабораторных колоний путем кормления на молодых телятах. Насосавшихся крови клещей собирали и инкубировали для откладки яиц и выведения в камерах с изменяемой влажностью воздуха при 12-12 час. цикле день-ночь, 22-25°C и 80% относительной влажности.
Для экспериментального заражения клещами крупный рогатый скот в исследовании брили с обоих боков для крепления клетки хлопка с клеем, в которых могли бы размещаться личинки. Для обеспечения заражения на участке вокруг участка инокуляции прикрепляли защитную сетку из хлопка. На следующие сутки животных заражали 250 мг (приблизительно 5000) личинок R. (Boophilus) microplus на правом боку и таким же количеством личинок R. (Boophilus) annulatus еа левом боку. Затем сетки держали закрытыми. Через двое суток после заражения удаляли неприкрепившиеся личинки. Затем инфицированные участки ежесуточно исследовали на развитие клещей. Всех насосавшихся крови, которые отпадали, собирали, подсчитывали, взвешивали и инкубировали в увлажненной (80%) атмосфере при 27°C для обеспечения откладки яиц, развития и выхода личинок.
2.2.5. Оценка результатов
Титры антител
Определение серологических показателей животных проводили посредством сэндвич-ELISA с использованием антител, как описано.
Паразитологические параметры
Определяли общее число клещей, насосавшихся крови, собираемых с каждого отдельного теленка (и участка заражения) во время периода заражения. Эти количества подвергали логарифмическому преобразованию с получением массивов данных с нормальным распределением, для которых модно было проводить статистический анализ с использованием параметрических анализов. На группу рассчитывали средний log (число насосавшихся крови самок) и усредненный log среднего значения для группы. Статистическую значимость различий в группах рассчитывали с использованием ANOVA и попарного сравнения по критерию Дункана. Защиту рассчитывали как снижение числа клещей по сравнению с контрольным значением, выражаемого в процентах.
Определяли массу каждого собранного клеща и выражали в граммах. Определяли массу яиц, продуцируемую собранным клещом (откладку яиц) и выражали в миллиграммах. Жизнеспособность яиц (фертильность) определяли путем взвешивания массы собранных личинок. Фертильность выражали в виде массы личинок относительно массы яиц и выражали в виде отношения.
Конечный и комбинированный эффект вакцинации на заражения клещами и их потомство, называемый "общей эффективностью", рассчитывали на основании комбинации снижения числа насосавшихся кровью клещей, снижения массы яиц и снижения фертильности и выражали в виде процента уменьшения жизнеспособного потомства.
2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ
2.3.1. Серология
Гуморальный иммунный ответ на вводимые с вакциной антигены оказался значительным и антигенспецифическим, т.к. для результатов выявляли повышение в течение длительного периода времени. В таблице 1 представлены значения титра сразу после заражения.
2.3.2. Реакции на экспериментальное заражение клещами
Для экспериментальных заражений клещами R. (Boophilus) microplus, а также для R. (Boophilus) annulatus наблюдали четкое видимое невооруженным глазом различие в количествах насосавшихся кровью клещей в экспериментальных группах со значительным снижением количества насосавшихся крови клещей в вакцинированных группах. У нескольких вакцинированных животных даже совсем не наблюдали насосавшихся кровью клещей, тогда как на невакцинированных телятах число насосавшихся кровью клещей достигало более 600. Для иллюстрации степени этого различия фигура 1 представляет собой фотографии бока телят из этого исследования через 23 суток после заращения, у одного проводили имитацию вакцинации с использованием адъюванта с PBS, и другого вакцинировали Bm86 и суболезином в режиме двойного введения.
На основании числа насосавшихся кровью клещей, которых можно было получать из экспериментальных групп, выявляемые различия являлись статистически значимыми (p=0,0164, соответственно p=0,0354, для логарифмически преобразованных данных).
Общий средний % снижения числа клещей обоих видов экспериментального заражения по сравнению с вакцинированными в режиме имитации телятами составлял приблизительно 79% у крупного рогатого скота, который вакцинировали только Bm86, при этом для групп, которых вакцинировали Bm86 и суболезином, снижение заражения составляло приблизительно 97%.
Такая достаточно убедительная защита от контрольного заражения, включая снижение процента снижения жизнеспособности потомства, являлась в основном обусловленной снижением числа насосавшихся кровью клещей: в результате предотвращения созревания клещей до стадии взрослого насекомого, это оказывает значительное влияние на способности размножения клещей.
Таблица 1Результаты исследования вакцинация-экспериментальное заражение
Серология (титра Ab в 2Log)
Защ. от эксп. зараж. (% снижения)
Вакцинный Ag
Ведение
α Bm86
α суболезин
Bm86
Суболезин
Pichia
--
одно
10,2
<7
79
Pichia
E. coli
двойное
10,6
10,0
97
--
--
контроль
<7
<7
--
Ag=антиген; Ab=антитело; защ. от эксп. зараж. = защита от экспериментального заражения;% снижения = среднее снижение числа насосавшихся кровью клещей (обоих видов экспериментального заражения).
2.4. ОБСУЖДЕНИЕ И ВЫВОДЫ
Результаты этого исследования вакцинации-экспериментального заражения in vivo демонстрируют, что можно улучшать защитный эффект вакцинации крупного рогатого скота против заражения клещами с использованием только антигена Bm86. В этом исследовании защитный эффект антигена Bm86 выражается в снижении числа сосущих кровь клещей на 79%. Эта часть исследования представляла собой сравнительный эксперимент и воспроизводила эффект, который был известен в течение длительного периода времени для коммерческих вакцин на основе одного антигена Bm86, таких как TickGARD. Однако в этом случае защита являлась выше уровня, как правило, наблюдаемого в известном уровне техники (50-70% снижение), наиболее вероятно, вследствие того, что использовали большую дозу (100 вместо 50 мкг) и более частую схему вакцинации (3 вместо 2 вакцинаций в целом).
Однако в настоящее время можно значительно улучшать защитный эффект такой одной вакцинации до 97% снижения числа клещей, когда крупный рогатый скот также вакцинируют антигеном суболезином в режиме двойного введения. Эти результаты получали с использованием только стандартного дозирования и состава.
Наблюдаемая защита от экспериментального заращения коррелировала с уровнем образования антител против антигенов Bm86 и суболезина. Общий защитный эффект (снижение жизнеспособного потомства) от двух различных видов клещей экспериментального заражения приближался к 100%, сто превышает уровень видов клещей. На практике это означает эффективное снижение нагрузки заражения на стадо.
3. Исследование вакцинации-серологических параметров с использованием антигенов Bm86 и суболезина в режиме одного введения
3.1. Краткое описание
Проводили исследование вакцинации in vivo по большей части сходное по схеме с исследованием, описанным выше, но теперь проводили мониторинг серологических показателей телят в качестве меры их иммунного ответа и возможности выздоровления после экспериментального заражения. Используемые вакцинные антигены представляли собой белки, Bm86 и суболезин, которые получали из различных систем экспрессии и эмульгировали в различных конформациях.
Каждую группу по пять телят вакцинировали три раза (подкожно) с интервалами в один месяц. Все препараты вакцины формулировали с адъювантом Montanide ISA 50V2 в эмульсии в/м 50:50. Одну группу (T1) вакцинировали Bm86, экспрессируемым в Pichia pastoris, и суболезином, экспрессируемым в E. coli, сформулированными в виде отдельных вакцин, которые инъецировали слева и справа в область шеи. Вторую группу (T2) обрабатывали аналогично, но антигены получали из систем экспрессии на основе бакуловируса. Третью группу (T3) вакцинировали экспрессируемыми бакуловирусом антигенами Bm86 и суболезином, которые смешивали в одной водной фазе перед формулированием с адъювантом. Вакцину разделяли на две равные аликвоты, которые инъецировали слева и справа в область шеи. Четвертую группу (T4) вакцинировали экспрессируемыми бакуловирусом белками Bm86 и суболезином, каждый в раздельных водных фазах эмульсии в/м. Вакцину разделяли на две равные аликвоты, которые инъецировали слева и справа в область шеи. В качестве контроля одну группу (C) вакцинировали только адъювантом.
3.2. СПОСОБЫ
3.2.1. Тестируемые препараты
Тестируемая группа 1
Двойное введение антигенов Bm86 и суболезина в различные участки. Для этого используют 50 мкг на дозу (1 мл) Bm86, продуцируемого в P. pastoris, и 50 мкг на дозу (1 мл) суболезина, продуцируемого в Escherichia coli, инъецируемые в различные участки на животном. Последовательность Bm86 получали из изолята австралийского клеща R. (Boophilus) microplus.
Тестируемая группа 2
Двойное введение антигенов Bm86 и суболезина в различные участки с использованием 50 мкг на дозу (1 мл) Bm86, продуцируемого в бакуловирусе, и 50 мкг на дозу (1 мл) суболезина, продуцируемого в бакуловирусе, инъецировали в различные участки на животном.
Тестируемая группа 3
Одно введение антигенов Bm86 и суболезина в тот же участок с использованием 50 мкг Bm86 и 50 мкг суболезина на дозу 2 мл. Каждый антиген продуцировали бакуловирусом, а затем антигены объединяли в одной водной фазе, эмульгировали, а затем разделяли на две равного объема инъекции в различные участки on животное.
Тестируемая группа 4
Одно введение антигенов Bm86 и суболезина в тот же участок с использованием 50 мкг Bm86 и 50 мкг суболезина на дозу 2 мл. Каждый антиген продуцировали отдельно бакуловирусом, а затем эмульгировали в отдельных эмульсиях в/м. Фактически используемые эмульсии в/м представляли собой эмульсии, также используемые для группы T2, и равные части этих эмульсий в/м смешивали вручную непосредственно перед вакцинацией. Это обеспечивало два антигена в одной и той же эмульсии в/м, но каждый в отдельной водной фазе. Затем объем вакцины разделяли на две равного размера инъекции в различные участки на животном.
Контрольная группа
Группа с имитацией вакцинации получала инъекции только адъюванта. Вакцинацию проводили в виде 2×1 мл в различные участки on животное для исключения влияния участка инъекции самого по себе.
3.2.2. Животные
Использовали телят эрширской породы и обоих полов. Возраст телят составлял приблизительно 3 месяца, и они являлись клинически здоровыми. Животных взвешивали во время периода акклиматизации и распределяли по группам обработки случайным отбором из распределенных по массе групп. Конечным результатом являлась случайное распределение животных по группам обработки схожих средних масс (приблизительно 80 килограмм).
Для всех вакцин и для контроля введение проводили путем подкожной инъекции в средней нижней боковой части шеи, с противоположных сторон и в объеме дозы 1 мл на участок инъекции.
3.2.3. Статистика
Все данные по титру антител подвергали логарифмическому преобразованию для обеспечения большей степени нормального распределения массива данных. Это позволяло использовать параметрический статистический анализ значений группы. В результате все рассчитываемые средние значения представляли собой средние геометрические значения, если не указано иначе.
3.2.4. Сбор и обработка крови
Образцы крови всех групп собирали еженедельно в течение периода до 18 недель. Приблизительно 10 мл кровь собирали в пробирки для сыворотки из левой или правой яремной вены. После образования тромбов образцы крови центрифугировали и сливали сыворотку из каждой пробирки или пипетировали в меченые криопробирки. Затем образцы сыворотки хранили приблизительно при -40°C, транспортировали на сухом льду для анализа Elisa на титры специфических к Bm86 и суболезину антител.
3.3. РЕЗУЛЬТАТЫ
С использованием Elisa с иммобилизованными антителами измеряли образование антител телят против белков, которые использовали для иммунизации. В зависимости от состава вакцины выявляли образование различных антител против каждого из антигенов. Титры антител против Bm86 через 2 недели после второй повторной вакцинации, как правило, являлись низкими во всех группах вакцинированных животных в диапазоне от 7,2 до 10,8 (в относительных единицах титра Log2 Elisa). Более высокие титры антител выявляли у телят группы T3 далее в группе T4, T1 и T2 в порядке уменьшения (таблица 2)
Наиболее высокие титры антител против суболезина выявляли в группе T1, далее в группе T4, T2 и T3 в порядке уменьшения. Следует отметить, что вследствие того, что каждый из антигенов Bm86 и суболезина, используемых для вакцинации животных из групп T2, T3 и T4, получали из одной партии, различия в титрах антител в этих группах относятся к составу вакцины. Когда антигены смешивали в водной фазе перед эмульгированием в масляном адъюванте (группа T3), образование антител против суболезина являлось незначительным, хотя образование антител против Bm86 повышалось. Такое подавление реактивности против этих антигенов не выявляли, когда каждый из антигенов формулировали в его собственной водной фазе (группа T4); образование антител в этой группы являлось очень сходным с образованием антител у крупного рогатого скота, который вакцинировали этими антигенами в виде вакцин с двойным введением (группа T2).
Образование антител против Bm86, продуцируемого в Pichia (группа T1), у крупного рогатого скота являлось аналогичным образованию антител у крупного рогатого скота, который получал Bm86, продуцируемый бакуловирусом (группа T2). Однако образование антител против антигена суболезина, продуцируемого E. coli, у крупного рогатого скота являлась намного выше, чем образование антител у крупного рогатого скота, который вакцинировали суболезином, продуцируемым бакуловирусом (группа T2; p=0,05, однофакторный дисперсионный анализ/критерий Дункана).
Таблица 2Результаты исследования вакцинации-серологии
Серология
Вакцинный Ag
(Титр Ab в 2Log)
Группа
Bm86
Суболезин
Введение
α Bm86
α суболезин
Т1
Pichia
E. coli
двойное
8,6
12,3
Т2
бакуловирус
бакуловирус
двойное
8,2
9,8
Е3
бакуловирус
бакуловирус
одно-комбинированное
9,7
8,2
Т4
бакуловирус
бакуловирус
одно-раздельное
8,9
9,6
K
--
--
контроль
7,2
7,3
3.4. ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЯ
В этом серологическом исследовании in vivo тестировали некоторые аспекты комбинированной вакцины Bm86-суболезин.
Сначала исследовали эффект комбинации двух антигенов Bm86 и суболезина в одной лекарственной форме. Результаты демонстрируют, что, когда Bm86 и суболезин объединяют в одной водной фазе (T3), то суболезин не распознавался хорошо, и иммунный ответ сдвигался в сторону образования антител против Bm86. В этой группе образование антител против Bm86 являлось статистически значимо выше, чем образование антител у крупного рогатого скота, который вакцинировали каждым из антигенов, формулируемых в виде отдельного введения (T1, T2). В противоположность этому, образование антител против антигена суболезина являлось ниже, чем образование антител у крупного рогатого скота, который вакцинировали двумя антигенами раздельно. Этот эффект является неблагоприятным: хотя он может являться положительным, что обусловлено более высоким образованием антител против Bm86, это обеспечивает частичную защиту от экспериментального заражения. Как видно из исследований вакцинации-экспериментального заражения (пример 2), для сильной защитной реакции необходимы высокие уровни антител против Bm86 и суболезина. Таким образом, при снижении титра суболезина, являющегося результатом непосредственного смешивания двух антигенов, невозможно получать эффективной иммунной защиты.
Однако следует отметить что, когда эти каждый из этих антигенов содержался в отдельной водной фазе (T4), не выявляли подавления или смещения образования антитело, и Bm86 и суболезин индуцировали совпадающий титр специфических антител. Это является очень сходным с образованием антител, наблюдаемым после двойного введения (T2). Таким образом, это демонстрирует, что в основном можно индуцировать образование антител против каждого из двух антигенов с использованием схемы только с однократным введением вакцины, но необходимо уделять особое внимание их презентации в виде отдельных соединений иммунной системе объекта.
Второй целью являлась оценка эффекта системы экспрессии. Таким образом, рекомбинантный белок Bm86 продуцировали посредством экспрессии Pichia или бакуловирусом, и суболезин продуцировали E. coli или бакуловирусом. Обнадеживающим являлось открытие, что все используемые системы экспрессии обеспечивали достаточные количества антигена без особых требований. С использованием стандартного Elisa антигенных масс оценивали относительные количества продуцируемого антигена, и количество отбираемого Bm86 составляло приблизительно 50 мкг, что являлось равным дозе, используемой в исследовании примера 2.
Для вакцинации антигеном суболезином использовали 50 мкг на дозу, что составляло приблизительно половину количества, используемого в более ранних исследованиях. Серологический ответ против суболезина, продуцируемого E. coli, являлся лучше, чем против суболезина, продуцируемого бакуловирусом. Образование антитела против Bm86 также являлось до некоторой степени менее выраженным, чем в предшествующем испытании. Было не сразу понятно почему, но это не было связано с выбранной системой экспрессии, т.к. образование антител против Bm86, получаемого с использованием антигена, продуцируемого бакуловирусом, являлось сравним с образованием антител после иммунизации антигеном, продуцируемым Pichia.
Был сделан вывод, что система экспрессии не является критической, но что существует возможность для улучшения уровней получаемых титров защитных антител, на основе, например, исследований оптимизации дозы антигена и типа адъюванта.
4. Анализы кормления клещей in vitro
Анализы искусственного кормления проводили для клещей рода Rhipicephalus, кормление на тестируемых образцах бычьей крови, как способ облегчения оценки защитной способности против экспериментального заражения уровней антитела против Bm86 и/или антитела против суболезина в образцах крови. Целью анализов являлись детекция различия числа клещей, которые насасывались кровью, от общего числа клещей, помещаемых для кормления на конкретный образец крови, и проведение корреляции числа клещей с титром антигена в тестируемом образце крови.
Применение этих анализов способствовало снижению числа необходимых экспериментальных животных. Кроме того, подтверждали, что анализы in vitro являются быстрым и надежным способом оценки защиты от экспериментального заражения клещами, т.к. она непосредственно связана с уровнями антител против Bm86 и суболезина в крови.
4.1. СПОСОБЫ
2
2
Анализы проводили с использованием устройств, изготовляемых в лаборатории проведения исследования, на основе описания Kröber and Guerin (2007, Trends in Paras., vol. 23, p. 445) с использованием установки из 24-луночных планшетов. Личинки клещей рода Rhipicephalus получали инкубацией яиц от взрослых самок, которых содержали в лабораторной колонии в стандартных условиях. При достижении возраста приблизительно 3 недель приблизительно 0,3 грамма личинок в 50 мкл жидкости-носителя помещали в лунку, это соответствовало 50-100 личинкам, и каждый образец тестировали в 6 лунках. Тестируемые камеры накрывали с одной стороны сеткой, чтобы предотвратить побег, а с другой стороны мембраной для кормления, которая обеспечивает доступ к образцу крови или сыворотки. Затем личинки проникают через мембрану с помощью своего ротового аппарата и питаются кровью, аналогично ситуации в природе. Тестируемый образец смешивали с антибиотиком и противогрибковым соединением для консервации. Затем тестируемые устройства помещали в стандартные инкубационные камеры CO при 37°C, 5% CO и 80% относительной влажности.
После инкубации в течение приблизительно 72 часов камеры помещали при -20°C, чтобы вызвать гибель личинок, а затем исследовали посредством микроскопии. Оценку проводили путем определения, явно ли клещ насосался крови или не насосался, и подчитывали количества этих двух групп для каждой тестируемой камеры. Следует отметить, что специалист, проводивший оценку, не располагал исходной информацией об образцах крови или сыворотки, которые тестировали. Эти подсчеты давали конечное значение процента клещей, которые насасывались кровью после кормления на конкретном образце.
4.2. РЕЗУЛЬТАТЫ
Выявляли, что результаты анализов искусственного кормления клещей, любого снижения числа насосавшихся кровью клещей для конкретного тестируемого образца крови или сыворотки хорошо коррелируют с титром антител против Bm86 или суболезина тестируемых образцов. На фигуре 2 представлены результаты тестирования бычьей сыворотки при искусственном кормлении клещей на сыворотке. Быков иммунизировали антигеном Bm86 или суболезином в исследованиях определения дозы и оптимизации адъюванта, как описано ниже. В конкретном тесте, представленном на фигуре 2, сыворотку получали после 2 вакцинаций.
Для тестирования одновременного действия на клеща антитела против Bm86 и против суболезина образцы сыворотки, содержащие эти антитела, индивидуально смешивали 1:1. Для точного сравнения тестируемые образцы только с антителами против Bm86 или только с антителами против суболезина также разбавляли 1:1 с использованием телячьей сыворотки на сутки 0 (отбираемой перед вакцинацией). Число насосавшихся кровью клещей, выявляемых на образце сыворотки сутки 0, принимали как отражающее 0% ингибирования.
Результаты указывают на значительное повышение ингибирования насасывания кровью клещей при объединении антисыворотки против Bm86 и суболезина. Разница между ингибированиями, индуцируемыми антисывороткой только против Bm86 и антисывороткой только против суболезина, не являлась статистически значимой.
Эти результаты еще раз отражают кумулятивный эффект, который можно получать в отношении насасывания кровью клещей, когда достаточно высокие уровни антител против Bm86 и суболезина содержатся в высасываемой клещом крови.
5. Исследования оптимизации вакцины
Проводили ряд исследований вакцинации in vivo для тестирования различных доз антигена и для оптимизации используемых эмульсий и адъювантов. Исследования оценивали посредством серологических анализов и тестирования в анализах искусственного кормления клещей. Результатом исследований являлись составы, которые индуцировали очень высокие уровни антител.
Один из подходов заключался в тестировании использования сапонина в качестве адъюванта, вводимого в водную фазу вакцинных эмульсий. Затем сапонин действует в дополнение к адъювантному эффекту, который уже индуцирован стандартной масляной фазой, используемой для получения эмульсий по изобретению. В этих исследованиях белки использовали на субоптимальных уровнях, таким образом, чтобы любой дополнительный адъювантный эффект выделялся в большей степени.
Параллельно проводили исследования поиска дозы для тестирования эффекта различных количеств антигена.
Для всех этих исследований тестировали основные схемы в группах по 5 телят (в возрасте 6-8 месяцев, породы Frysian/Holstein, смешанного пола), которых вакцинировали, а затем повторно вакцинировали через 6 недель. Сыворотку тестировали каждую неделю.
Для Bm86: использовали количества антигена 25, 50, 100 и 200 мкг/дозе. Различные составы тестировали с 50 мкг Bm86/дозе. Различные тестируемые составы в/м получали с Montanide ISA 50V2; Montanide ISA 50V2 + сапонин; белым минеральным маслом; гелем гидроокиси алюминия или гелем фосфата алюминия. Антиген Bm86 экспрессировали системой экспрессии на основе бакуловируса, как описано.
Для суболезина: использовали количества антигена 12,5, 25, 50 и 100 мкг/дозе. Различные составы (таких же типов, как использовали для Bm86) тестировали с 25 мкг антигена суболезина. Антиген суболезин экспрессировали системой экспрессии на основе E. coli с N-концевой His-меткой, как описано.
Группы имитации вакцинации не требовались, т.к. уже было установлено, что у них не образуются релевантные антитела.
Для обоих антигенов наиболее высокие гуморальные иммунные ответы выявляли с использованием адъювантов Montanide ISA 50V2 + сапонин или геля фосфата алюминия. Это можно было объяснять путем исследования профилей IgG, которые демонстрировали, что посредством этих адъювантов получают образование антител IgG2a в дополнение к образованию антител IgG1, таким образом, повышая общий уровень образующихся специфических антител.
Наиболее высокие уровни антитела из исследований поиска дозы антигена являлись для Bm86 при 50 мкг/дозе и для суболезина при 100 мкг/дозе.
С использованием стандартных анализов с антителами Elisa определяли максимальные титры антител, получаемые в этих исследований по оптимизации, которые составляли для Bm86: 19 Log2 и для суболезина: 18 Log2 единиц Elisa.
Принимая по внимание эти данные, эти уровни антител у вакцинированных мишеней являлись значительно выше уровней приблизительно 10 единиц Log2 Elisa (как применяют в этих экспериментах), которые обеспечивали защиту в исследовании вакцинация-экспериментальное заражение, считали, что такие вакцинированные животные являются эффективно защищенными.
Сыворотку из этих исследований использовали для анализов кормления клещей in vitro, описанных выше.
6. Продолжающееся исследование вакцинации in vivo с использованием оптимизированных вакцин
В настоящее время проводят исследование вакцинации in vivo, в котором вакцинные составы с оптимальным адъювантом тестируют в комбинации с оптимальными дозами антигенов. С использованием по существу туже схему как в исследования оптимизации 6 групп по 5 телят иммунизируют различными вакцинами и проводят мониторинг их серологических иммунных ответов. Тестируемые группы представляют собой:
- только Bm86:
50 мкг/дозе антигена Bm86, экспрессируемого бакуловирусом, формулируемого в Montanide ISA 50 V2 с сапонином.
- только суболезин:
50 мкг/дозе антигена суболезина, экспрессируемого E. coli, формулируемого в Montanide ISA 50 V2 с сапонином.
- двойная Bm86 + суболезин:
50 мкг/дозе антигена Bm86, экспрессируемого бакуловирусом, формулируемого в Montanide ISA 50 V2 с сапонином, вводимого с одной стороны, и одновременно вводимого с другой стороны: 50 мкг/дозе антигена суболезина, экспрессируемого E. coli, формулируемого в Montanide ISA 50 V2 с сапонином.
- одно введение Bm86 + суболезин, раздельные водные фазы, 3 группы:
антиген Bm86, экспрессируемый бакуловирусом, совместно с сапонином в одной водной фазе эмульсии в/м на основе Montanide ISA 50 V2, и в другой водной фазе этой же эмульсии в/м: антиген суболезина, экспрессируемый E. coli, совместно с сапонином. Этот состав тестируются с тремя комбинациями количеств каждого из антигенов: 25, 50 или 100 мкг/мл каждого из Bm86 или суболезина.
Вакцину для однократного введения, содержащую оба антигена, но в раздельных водных фазах, получают смешиванием непосредственно перед вакцинацией равных объемов вакцин в/м для однократного введения Bm86 и суболезина.
7. Планируемое исследование вакцинации in vivo с использованием оптимизированных вакцин
В целях разработки продукта планируют дополнительные исследования вакцинации in vivo. Они имеют по существу такую же схему, но будут включать заражение клещами in vivo. В применяемых вакцинах будут использовать оптимизированные дозы и состав антигенов Bm86 и суболезина, как определяют в предшествующих исследованиях. Также они будут подтверждать необходимость раздельного презентирования белков Bm86 и суболезина иммунной системе объекта.
Подписи к чертежам
Фигура 1
Эффект вакцинации антигенами Bm86 и суболезином на число насосавшихся крови клещей R. (Boophilus) microplus.
Фотографии получены из центральной части бока коров, которых подвергали экспериментальному заражению личинками R. (Boophilus) microplus, через 23 суток после экспериментального заражения.
Верхний кадр: Контрольная вакцинация адъювантом
Нижний кадр: вакцинированный теленок, получающий антигены Bm86 и суболезина при двойном введении. У этого животного наблюдали полное подавление.
Сетка, которую можно видеть, предназначена для сохранения экспериментального заражения, локализованного в виде пятна.
Фигура 2
Результаты анализа искусственного кормления клещей, представляющие уровень ингибирования насасывания крови клещом, который получали с использованием образца сыворотки, получаемого от быков после двух вакцинаций антигеном Bm86 или суболезином.
Образцы:
сутки 0: сыворотка до вакцинации;
Bm86: сыворотка после вакцинации и повторной вакцинации антигеном Bm86, смешиваемая с сывороткой сутки 0 1:1;
суболезин: то же, вакцинированные и повторно вакцинированные антигеном суболезином, с сывороткой сутки 0 также 1:1;
Bm86+суболезин: комбинация 1:1 сыворотки Bm86 и суболезина.