ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ T-КЛЕТОК

1. Способ идентификации антигенспецифического T-клеточного рецептора (TCR), включающий:
магнитное обогащение и экспансирование гетерогенной популяции T-клеток при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на поверхности наночастиц,
сортировку указанных экспансированных T-клеток при помощи лиганда ГКГС-пептид, с получением популяции T-клеток с требуемой антигенной специфичностью; и
секвенирование генов TCR или их участков в популяции T-клеток.
2. Способ по п.1, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
3. Способ по п.1 или 2, в котором гетерогенная популяция T-клеток содержит образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), T-клетку памяти, наивные T-клетки, ранее активированные T-клетки и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль.
4. Способ по п.3, в котором гетерогенная популяция T-клеток происходит из костного мозга, ткани лимфатического узла, ткани селезенки или опухоли.
5. Способ по п.3, в котором гетерогенную популяцию T-клеток выделяют при помощи лейкафереза.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором гетерогенную популяцию T-клеток обогащают CD8+ клетками, CD4+ клетками или регуляторными T-клетками.
6
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором гетерогенная популяция T-клеток содержит по меньшей мере 10 CD8+ клеток, CD4+ клеток или регуляторных T-клеток.
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 2 дней до приблизительно 9 недель, и, необязательно, в течение по меньшей мере приблизительно 1 недели.
9. Способ по п. 8, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 2 недель.
10. Способ по п.9, в котором сортировку клеток проводят при помощи антигенпрезентирующего комплекса ГКГС-пептид.
11. Способ скрининга популяции T-клеток на предмет реактивности по отношению к библиотеке антигенных пептидов, включающий:
магнитное обогащение и экспансирование антигенспецифических T-клеток в популяции при помощи коктейля парамагнитных частиц, каждая из которых имеет конъюгированный на поверхности антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид, который презентирует антигенный пептид, представляющий интерес,
и фенотипическую оценку экспансированных T-клеток.
12. Способ по п.11, в котором T-клетки и указанные парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
13. Способ по п.12, в котором популяция T-клеток происходит из костного мозга, ткани лимфатического узла, ткани селезенки или опухоли.
14. Способ по п.13, в котором популяцию T-клеток выделяют при помощи лейкафереза.
15. Способ по любому из пп.11-14, в котором популяцию T-клеток обогащают CD8+ клетками или CD4+ клетками.
6
16. Способ по любому из пп.11-15, в котором популяция T-клеток содержит по меньшей мере 10 CD8+ клеток, CD4+ клеток.
17. Способ по любому из пп.11-16, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение приблизительно 2 дней.
18. Способ по любому из пп. 11-17, в котором экспансированные T-клетки оценивают на предмет экспрессии цитокинов.
19. Способ по любому из пп.11-18, в котором последовательное обогащение и экспансию выполняют с применением проточной фракции (flow-through fraction), при этом в каждом последовательном обогащении и экспансии тестируют другой антигенный пептид, представляющий интерес.
20. Способ по п.19, в котором выполняют по меньшей мере шесть стадий последовательного обогащения и экспансии, и, необязательно, по меньшей мере десять стадий последовательного обогащения и экспансии.
21. Способ по п.20, в котором каждая стадия последовательного обогащения и экспансии включает от пяти до приблизительно 20 антигенных пептидов, представляющих интерес.
22. Способ по п.20 или 21, в котором тестируют по меньшей мере 75 антигенов, или, необязательно, в котором тестируют по меньшей мере 100 антигенов.
23. Способ по любому из пп.11-22, в котором популяция T-клеток происходит от пациента, больного раком, пациента, имеющего аутоиммунное нарушение, или пациента, имеющего инфекционное заболевание.
24. Способ экспансии T-клеток, содержащих гетерологичный или сконструированный T-клеточный рецептор (TCR), включающий:
магнитное обогащение и экспансирование популяции T-клеток, содержащей T-клетки, экспрессирующие гетерологичный или сконструированный T-клеточный рецептор (TCR), при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на своей поверхности, который распознается гетерологичным или сконструированным T-клеточным рецептором (TCR).
25. Способ по п. 24, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
26. Способ по п. 25, в котором исходная частота гетерологичного или сконструированного T-клеточного рецептора в популяции T-клеток составляет по меньшей мере приблизительно 20%.
27. Способ по п. 25 или 26, в котором сконструированные T-клетки экспансируют в культуре в течение по меньшей мере 10 дней, и необязательно от 10 до 20 дней, и необязательно от 10 до 14 дней.
28. Способ получения популяции антигенспецифических T-клеток, включающий:
предоставление образца, содержащего T-клетки от пациента или подходящего донора;
приведение указанного образца в контакт с первыми наночастицами, которые являются парамагнитными и содержат на своей поверхности антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид, при этом комплекс ГКГС-пептид получают при помощи пассивной нагрузки наночастиц, конъюгированных с ГКГС;
размещение магнитного поля вблизи парамагнитных наночастиц,
извлечение антигенспецифических T-клеток, ассоциированных с парамагнитными частицами, и
необязательное экспансирование извлеченных T-клеток в присутствии магнитного поля.
29. Способ по п.28, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
30. Способ по п.29, в котором наночастицы, конъюгированные с ГКГС, пассивно нагружают в течение по меньшей мере приблизительно 2 дней при помощи инкубации с избытком пептидного антигена.
31. Способ по п.29 или 30, в котором вторую наночастицу, имеющую лимфоцитарный костимулирующий лиганд на своей поверхности, добавляют во время обогащения или экспансии извлеченных T-клеток.
32. Способ по п.31, в котором указанная вторая наночастица является парамагнитной и указанную вторую наночастицу добавляют во время экспансии извлеченных T-клеток.
33. Способ по п.31, в котором указанная вторая наночастица не является парамагнитной и ее добавляют во время магнитного обогащения антигенспецифических T-клеток.
34. Способ по п.33, в котором указанная вторая наночастица является полимерной и необязательно содержит PLGA, PLGA-PEG, PLA или PLA-PEG.
35. Способ по любому из пп.28-34, в котором популяция T-клеток содержит образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), T-клетку памяти, наивные T-клетки, ранее активированные T-клетки и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль.
36. Способ по п.35, в котором указанная популяция T-клеток происходит из костного мозга, ткани лимфатического узла, ткани селезенки или опухоли.
37. Способ по п.35, в котором указанную популяцию T-клеток выделяют при помощи лейкафереза.
38. Способ по любому из пп.28-37, в котором популяцию T-клеток обогащают CD8+ клетками, CD4+ клетками или регуляторными T-клетками.
6
39. Способ по любому из пп.28-37, в котором популяция T-клеток содержит по меньшей мере 10 CD8+ клеток, CD4+ клеток или регуляторных T-клеток.
40. Способ по любому из пп.28-39, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 2 дней до приблизительно 9 недель.
41. Способ по п.40, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 4 недель.
42. Способ по п.41, в котором выполняют по меньшей мере один дополнительный цикл магнитного обогащения и экспансии.
43. Способ по любому из пп. 28-42, в котором пациент представляет собой пациента, больного раком.
44. Способ по любому из пп. 28-43, дополнительно включающий адаптивный перенос указанных экспансированных антигенспецифических T-клеток пациенту.
45. Способ по п.44, дополнительно включающий поддержку/усиление при помощи фармацевтической композиции, содержащей искусственную антигенпрезентирующую клетку (иАПК), презентирующую антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид и лимфоцитарный костимулирующий лиганд.
46. Способ генерации T-клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), включающий:
магнитное обогащение и экспансирование популяции Т-клеток при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на своей поверхности, с получением тем самым обогащенной и экпансированной популяции антигенспецифических Т-клеток; и
трансформацию популяции Т-клеток химерным антигенным рецептором (CAR).
47. Способ по п.46, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
48. Способ по п.47, в котором наночастицы, конъюгированные с ГКГС, пассивно нагружают в течение по меньшей мере приблизительно 2 дней при помощи инкубации с избытком пептидного антигена.
49. Способ по п.47 или 48, в котором вторую частицу, имеющую лимфоцитарный костимулирующий лиганд, конъюгированный с ее поверхностью, добавляют во время обогащения или экспансии извлеченных T-клеток.
50. Способ по п.49, в котором указанная вторая наночастица является парамагнитной и указанную вторую наночастицу добавляют во время экспансии извлеченных T-клеток.
51. Способ по п. 50, в котором вторая наночастица не является парамагнитной и ее добавляют во время магнитного обогащения антигенспецифических T-клеток.
52. Способ по п.51, в котором вторая наночастица является полимерной и, необязательно, содержит PLGA, PLGA-PEG, PLA или PLA-PEG.
53. Способ по любому из пп.46-52, в котором популяция T-клеток содержит образец мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), T-клетку памяти, наивные T-клетки, ранее активированные T-клетки и лимфоциты, инфильтрирующие опухоль.
54. Способ по п.53, в котором популяция T-клеток происходит из костного мозга, ткани лимфатического узла, ткани селезенки или опухоли.
55. Способ по п.54, в котором популяцию T-клеток выделяют при помощи лейкафереза.
56. Способ по любому из пп.46-55, в котором популяцию T-клеток обогащают CD8+ клетками.
6
57. Способ по любому из пп.46-56, в котором популяция T-клеток содержит по меньшей мере 10 CD8+ клеток.
58. Способ по любому из пп.46-57, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 9 недель.
59. Способ по п.58, в котором магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 5 дней до приблизительно 4 недель.
60. Способ по п. 59, в котором выполняют по меньшей мере один дополнительный цикл магнитного обогащения и экспансии.
61. Способ по любому из пп.46-60, в котором пациент представляет собой пациента, больного раком.
62. Способ по любому из пп. 46-61, дополнительно включающий адаптивный перенос указанной популяции Т-клеток, экспрессирующих указанный CAR, пациенту.
63. Способ по п.62, дополнительно включающий поддержку/усиление при помощи фармацевтической композиции, содержащей искусственную антигенпрезентирующую клетку (иАПК), презентирующую антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид и лимфоцитарный костимулирующий лиганд.
64. Способ экспансии T-клетки, экспрессирующей CAR, включающий:
предоставление популяции Т-клеток, экспрессирующих CAR, по п. 46, и
магнитное экспансирование указанной популяции Т-клеток в присутствии парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на своей поверхности.
65. Способ по п.64, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
66. Способ лечения пациента, имеющего рак, включающий:
введение CAR-T-клеток в соответствии со способом по п. 46 или 61, и
введение искусственной антигенпрезентирующей клетки пациенту, презентирующей антиген, представляющий интерес, в комплексе с ГКГС и лимфоцитарный костимулирующий лиганд.
67. Способ лечения пациента, имеющего гематологический рак, который имеет рецидив после аллогенной трансплантации стволовых клеток, включающий:
предоставление образца, содержащего T-клетки от подходящего донора;
приведение указанного образца в контакт с наночастицами, которые являются парамагнитными и содержат на своей поверхности: (1) антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид, при этом указанный комплекс ГКГС-пептид получают при помощи пассивной нагрузки наночастиц, конъюгированных с ГКГС (сигнал 1); и (2) анти-CD28 костимулирующий лиганд (сигнал 2);
размещение магнитного поля вблизи парамагнитных наночастиц,
извлечение антигенспецифических T-клеток, ассоциированных с парамагнитными частицами,
экспансирование извлеченных Т-клеток; и
введение экспансированных T-клеток пациенту.
68. Способ по п.67, в котором пациент имеет острый миелогенный лейкоз (AML) или миелодиспластический синдром.
69. Способ по п.67, в котором ГКГС представляет собой ГКГС-Ig.
70. Способ по любому из пп.67-69, в котором антигенспецифические T-клетки магнитно обогащают и активируют при помощи магнитной колонки и парамагнитных нано-иАПК, презентирующих от 2 до 5 опухоль-ассоциированных пептидных антигенов.
71. Способ по п.70, в котором один или несколько пептидных антигенов выбирают из сурвивина, WT-1, PRAME, RHAMM и PR3.
72. Способ по п.70 или 71, в котором указанные пептидные антигены пассивно нагружают на полученные нано-иАПК, которые презентируют сигнал 1 и сигнал 2 на одних и тех же или разных популяциях частиц, посредством сайт-направленной конъюгации.
73. Способ по любому из пп. 67-72, в котором T-клетки и парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля в течение по меньшей мере 5 минут.
74. Способ по п.73, в котором указанные T-клетки и указанные парамагнитные наночастицы инкубируют в присутствии магнитного поля от 5 минут до 5 часов.
75. Способ по п.74, в котором T-клетки экспансируют в культуре в течение по меньшей мере приблизительно 5 дней.
76. Способ по любому из пп.67-75, в котором экспансированные T-клетки вводят пациенту от 1 до приблизительно 4 раз.