СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ПОЛИПЕПТИДА НЕЙРОТОКСИНА И ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКОЙ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЕЙ
AGENTS AND METHODS FOR MEASURING POLYPEPTIDE NEUROTOXIN AND ITS CATALYTIC AND PROTEOLYTIC ACTIVITIES

Настоящее изобретение относится к области средств для обеспечения получения полипептидов и контроля качества. В особенности, это касается способа определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный или непроцессированный полипептид нейротоксин. Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для определения вышеуказанного количества и набору, подходящему для выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением.
Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют весьма мощные нейротоксины, то есть ботулинические токсины (BoNTs) и токсин столбняка (TeNT), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины (CNTs) специфически связываются с нейрональными клетками и нарушают высвобождение нейромедиатора. Каждый токсин синтезируется как неактивный, непроцессированный одноцепочечный белок с молекулярной массой около 150 кДа. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (одноцепочечный разрыв) посредством бактериальной протеаз(ы). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи массой около 50 кДа и тяжелой цепи массой около 100 кДа, связанных дисульфидной связью. CNTs структурно и функционально состоят из трех доменов, то есть каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей транслокационный домен (N-концевая половина) и рецептор-связывающего домена (С-концевая половина), смотрите Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются как молекулярные комплексы, содержащие белок нейротоксин массой 150 кДа и ассоциированные нетоксичные белки. Размеры комплекса различаются в зависимости от штамма Clostridial и различных серотипов нейротоксина в пределах от 300 кДа, более чем 500 кДа и 900 кДа. Нетоксичные белки в этих комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от деградации, смотрите Sil-berstein 2004, Pain Practice 4, S19-S26.
2+
Clostridium botulinum секретирует семь антигенно отличающихся серотипов, обозначаемые как ботулинические нейротоксины от А до G (BoNT). Все серотипы вместе с родственным столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, являются Zn-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз путем расщепления SNARE белков, смотрите Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. CNTs cause the flaccid muscular paralysis seen in botulism and tetanus, see Fischer 2007, PNAS 104, 10447.
Несмотря на его токсические эффекты, комплекс ботулинического токсина применялся в качестве терапевтического агента для большого количества болезней. Серотип ботулинического токсина А был одобрен в Соединенных Штатах в 1989 г. для использования на людях для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств. Он коммерчески доступен как белковый препарат Ботулинический токсин А, например, под торговым наименованием ВОТОХ (Allergan Inc) или под товарным знаком DYSPORT (Ipsen Ltd). Улучшенный, свободный от комплексов препарат Ботулинический токсин А, коммерчески доступен под товарным знаком XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). Для терапевтических применений препарат вводится непосредственно в мышцу, которая подлежит лечению. При физиологических значениях рН токсин высвобождается из белкового комплекса и достигается желаемый фармакологический эффект. Эффект ботулинического токсина является только временным, что служит причиной того, что повторное введение ботулинического токсина необходимо для поддержания терапевтического эффекта.
Клостридиальные нейротоксины ослабляют силу произвольно сокращающихся мышц и являются эффективной терапией для косоглазия, фокусной дистонии, включая цервикальную дистонию и доброкачественный эссенциальный блефароспазм. Кроме того, для них было показано облегчение гемифациального спазма и фокальной спастичности, и, более того, была показана способность быть эффективными при широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные расстройства, чрезмерное потоотделение и косметическая коррекция морщин, смотрите Jost 2007, Drugs 67, 669.
В ходе процесса получения клостридиальных нейротоксинов количественное определение также как и контроль качества активного полипептида нейротоксина имеет особенно важное значение. Доступные в настоящее время препараты нейротоксинов содержат в дополнение к требуемому активному (процессированному или зрелому) нейротоксину протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипептид нейротоксин. Протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированный полипептид нейротоксин отличаются от зрелого (активного, процессированного) нейротоксического полипептида в последовательности только несколькими аминокислотами. Поэтому они с трудом могут быть количественно различимы на основании их химических и физических свойств. С другой стороны, часть протеолитически непроцессированного предшественника и/или частично процессированный полипептид нейротоксин полного белка все еще может иметь существенное значение в таких препаратах. Эта часть зависит от биологической системы, применяемой для получения, и следует из биосинтеза и условий процесса ферментации. Таким образом, количество требуемого зрелого, биологически активного полипептида нейротоксина в нейротоксических препаратах предопределено и в настоящее время довольно трудно для определения.
Средства и способы надежной качественной и количественной системы обнаружения зрелого (активного) полипептида нейротоксина весьма желательны, но еще недоступны.
Таким образом, техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, может рассматриваться как предоставление средств и способов, обеспечивающих вышеупомянутые потребности. Техническая задача решается посредством примеров осуществления, охарактеризованных в формуле изобретения и приведенных ниже.
Настоящее изобретение относится к способу определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащему стадии:
a) контактирование первой части названного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с легкими цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание упомянутого антитела с вышеназванным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с тяжелой цепью вышеназванного зрелого нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии а), посредством чего образуется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй части вышеназванного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами упомянутого частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые позволяют связывание упомянутого антитела с упомянутым частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего образуется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадиях b) и d),
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии е).
Вышеупомянутый способ может, в общем, содержать дополнительные стадии, включающие стадии для приготовления раствора, или стадии, касающиеся дополнительной оценки результатов, полученных на стадии f). Кроме того, стадии а) и b), также как и стадии с) и d), могут быть выполнены одновременно или последовательно. В последнем случае стадии а) и b) могут быть выполнены до или после стадий с) и d). Дальнейшее определение, упомянутое для стадии е), может быть проведено в названном случае после того, как обе серии стадий были проведены, или определение на стадии е), поскольку будет затронут первый комплекс обнаружения, проводится после стадий а) и b), в то время как определение, касающееся второго комплекса обнаружения, проводится после стадий с) и d). Способ может быть частично или полностью автоматизирован. Инкубация и стадии измерений могут быть выполнены, например, роботом. Анализ данных и интерпретация могут быть выполнены на компьютере, снабженным вычислительным алгоритмом.
Термин "полипептид нейротоксин", применяемый в настоящем изобретении, относится к семи отдельным серотипам ботулинических нейротоксинов, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, и к столбнячному нейротоксину (TeNT), смотрите Таблицу 1, и вариантам вышеупомянутого.
Таблица 1
Ботулинические и столбнячные нейротоксины
SEQ ID NO:
Ссылка
Номер доступа:
Нейротоксин (полной длины)/бактериальный штамм
17
Beecher 1997, J Protein Chem 16, 701-712; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49-57.
ABD65472.1 GI:89258592
BoNT/A (Hall/62A)
18
Antharavally 1998, J Protein Chem 17, 417-428
BAE48264.1 GI:81230332
BoNT/B (Okra)
19
Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892
BAA89713.1 GI:6729213
BoNT/CI (C-6814)
20
Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892
BAA90661.1 GI:6939795
BoNT/D (CB16)
21
Antharavally 1997, J Protein Chem 16, 787-799
CAA43999.1 GI:40394
BoNT/E (Beluga)
22
Sagane 1999, J Protein Chem 18,885-892
CAA73972.1 GI:3805790
BoNT/F (NCTC10281)
23
Campbell 1993, Biochim. Biophys. Acta 1216 (3), 487-491
CAA52275.1 GI:441276
BoNT/G
24
Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202,41-51; Krieglstein et al. 1990, Eur J Biochem 188, 39-45
P04958.2 GI:135624
TeNT
50
Нейротоксины, упомянутые в настоящем изобретении, в принципе, содержат N-концевую легкую цепь и С-концевую тяжелую цепь. Нейротоксины продуцируются в виде одноцепочечных молекул-предшественников, называемых в настоящем изобретении как «непроцессированные полипептиды нейротоксины». Последовательности N-концевой легкой цепи и С-концевой тяжелой цепи разделены в непроцессированных нейротоксинах по меньшей мере одним сайтом протеолитического расщепления. Эти нейротоксины содержат линкерную последовательность между последовательностями легкой и тяжелой цепи, где легкая цепь локализована у N-конца, начиная от первого сайта расщепления, и тяжелая цепь локализована у С-конца, начиная от второго сайта расщепления. В аспекте настоящего изобретения названный линкер имеет аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NOs:1-16. Во время процессинга нейротоксинов последовательность линкера будет вырезана. Эти нейротоксины содержат два сайта протеолитического расщепления, один на N-концевом и один на С-концевом краях линкерной последовательности. В ходе процессинга таких нейротоксинов могут возникнуть интермедиаты, которые расщепляются по тому или другому сайту расщепления, то есть линкерная последовательность еще не вырезана, но остается либо на N-концевой легкой цепи, либо на С-концевой тяжелой цепи. Такие интермедиаты упоминаются в настоящем описании как "частично процессированные полипептиды нейротоксины". Другие нейротоксины содержат только один сайт расщепления. Понятно, что для таких нейротоксинов не может быть вырезана никакая линкерная последовательность. Тем не менее, непроцессированный нейротоксин может быть распознан иммунологически благодаря присутствию интактного сайта протеолитического расщепления и фланкирующих последовательностей. Эти фланкирующие последовательности и сайт расщепления также рассматриваются как линкер в целях настоящего изобретения. Таким образом, термин "линкер", применяемый в настоящем изобретении и определенный выше, относится либо к последовательности между последовательностями легких и тяжелых цепей полипептидов нейротоксинов, имеющих два сайта расщепления, либо к сайту расщепления и фланкирующим последовательностей для полипептидов нейротоксинов, имеющих только единственный сайт расщепления. В результате процессинга получается "процессированный полипептид нейротоксин". Названный нейротоксический полипептид нейротоксин показывает биологические свойства, характерные для нейротоксина, а именно, (а) связывание с рецептором, (b) интернализация, (с) транслокация через эндосомальную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, вовлеченных в слияние мембраны синаптического пузырька. Поэтому процессированный полипептид нейротоксин иногда упоминается в настоящем изобретении как активный или зрелый нейротоксический полипептид. Биологическая активность полипептидов нейротоксинов, в некотором аспекте, является результатом всех вышеупомянутых биологических свойств. Исследования in vivo для оценки биологической активности включают определение LD50 для мышей и анализ ех vivo одного из куполов диафрагмы мыши, как описано Реагсе et al. и Dressier et al. (Pearce 1994, Toxicol AppI Pharmacol 128:69-77 and Dressier 2005, Mov Disord 20:1617-1619). Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах (ME). При использовании в настоящем изобретении, 1 ME - количество нейротоксического компонента, который убивает 50% обработанной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, то есть LD для мышей при внутрибрюшинном введении.
В аспекте способа настоящего изобретения названый полипептид нейротоксин выбирается из группы, состоящей из: а) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ:17-24, и b) полипептида нейротоксина, имеющего аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40% идентичной аминокислотной последовательности полипептида нейротоксина, как показано любой из последовательностей SEQ:17-24. Вышеупомянутые аминокислотные последовательности показывают непроцессированные полипептиды нейротоксины. Последовательности соответствующих частично процессированных или процессированных полипептидов нейротоксинов могут быть выведены из названных последовательностей с помощью информации о сайтах расщепления, представленных ниже в Таблице 3. В другом варианте выполнения настоящего изобретения, полипептид нейротоксин имеет аминокислотную последовательность, являющуюся по меньшей мере на 40%, на 50%, на 60%, на 70%, на 75%, на 80%, на 85%, на 90%, на 95%, на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной аминокислотной последовательности, как показано SEQ:17-24. Термин «идентичная», при использовании в настоящем изобретении, относится к идентичности последовательностей аминокислотных последовательностей, где последовательности выровнены таким образом, что достигается наиболее высокая степень соответствия. Это может быть достигнуто при использовании опубликованных методик или способов, кодифицируемых в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403. Величины процента идентичности, в одном варианте, вычисляются относительно полной аминокислотной последовательности. Ряд программ, основанных на различных алгоритмах, доступен квалифицированному специалисту в данной области техники для того, чтобы сравнивать различные последовательности. В этом контексте алгоритмы Нидлмана и Вунша или Смита и Ватермана дают особенно надежные результаты. Для проведения выравнивания последовательностей следует использовать программу PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith and Waterman 1981, Adv AppI Math 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Величины идентичности последовательностей, приведенные выше в процентах, должны быть определены, в одном варианте настоящего изобретения, с помощью программы GAP в районе полной последовательности со следующими параметрами настройки: вес гэпа: 50, вес длины: 3, среднее совпадение: 10.000 и среднее несовпадение: 0.000, которые, если иначе не определено, должны всегда использоваться в качестве стандартных параметров настройки для выравниваний последовательностей. Следует иметь ввиду, что вышеупомянутые варианты, в аспекте настоящего изобретения, должны сохранить по меньшей мере одно из биологических свойств нейротоксинов и, в некотором варианте настоящего изобретения, все биологические свойства полипептида нейротоксина, рассматриваемого в настоящем изобретении. В следующем варианте выполнения настоящего изобретения, варианты могут быть нейротоксинами, имеющими улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для узнавания ферментом или для связывания с рецептором, или любое другое свойство, указанное выше. Понятно, что концепция настоящего изобретения основывается на присутствии двух или более сайтов расщепления между легкой и тяжелой цепями полипептида нейротоксина, в то время как природа сайтов расщепления и особенности аминокислотной последовательности между ними не имеет значения, пока агент является специфичным для частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина. Соответственно, другим вариантом является замена сайтов узнавания протеазы и пептидного линкера между тяжелой и легкой цепью полипептида нейротоксина.
В другом варианте полипептид нейротоксин в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть химерной молекулой. Так называемая химерная молекула в одном варианте может иметь одиночные замещенные домены. Соответственно, в другом варианте, часть тяжелой цепи нейротоксина замещается FC-фрагментом антитела.
Термин "количество", при применении в способе по настоящему изобретению, охватывает абсолютное количество полипептида, относительное количество или концентрацию названного полипептида, так же, как и любое значение или параметр, который коррелирует с ними или может быть выведен их них.
Термин "раствор", при применении в настоящем изобретении, относится к любой растворяющей системе, содержащей зрелый полипептид нейротоксин и его частично процессированные и/или непроцессированные предшественники полипептида нейротоксина. Растворяющая система, кроме того, содержит растворитель. Возможными растворителями в различных вариантах изобретения являются вода, водные буферные системы, органические растворители и ионные жидкости. В одном варианте настоящего изобретения растворяющей системой является система водного растворителя. Кроме того, растворяющая система в дополнение к зрелому полипептиду нейротоксину и частично процессированному или непроцессированному предшественнику полипептида нейротоксина и растворителю может также содержать дополнительно молекулы, включая дополнительные бактериальные полипептиды. В некотором варианте, раствором, который должен применяться в способе в соответствии с настоящим изобретением, будет культура бактериальных клеток или частично очищенный или очищенный препарат, полученный из такой бактериальной клеточной культуры.
Термин «порция», используемый в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к образцу или к аликвоте раствора. В варианте способа настоящего изобретения первая порция и вторая порция, упоминаемые в настоящем изобретении, полностью эквиваленты по их объемам и содержанию. Это может быть достигнуто, например, измерением содержания общего белка первой и второй порции, в соответствии с чем, практически полная идентичность содержания общего белка показательна для первой и второй порции, имеющих практически идентичное содержание. Однако в следующем варианте, порция, которая будет применяться в качестве первой или второй порции, может быть разбавлением образца или аликвоты раствора. Следует понимать, что в зависимости от количества подлежащего определению полипептида нейротоксина (то есть частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина или общего нейротоксина) разбавление может быть необходимым, чтобы обеспечить оптимальное качественное и количественное определение. Как делать такие разбавления, хорошо известно специалистам в данной области техники.
Термин "контактирование", использующийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к (i) обеспечению вышеупомянутых антител захвата и раствора, содержащего нейротоксины, или (ii) обеспечению антитело-содержащих комплексов и антител обнаружения в физической близости, чтобы позволить физическое и/или химическое взаимодействие. Подходящие условия, которые обеспечивают специфическое взаимодействие, известны квалифицированному специалисту в данной области техники. Названные условия будут зависеть от антител и раствора, которые будут применяться в способе по настоящему изобретению, и могут быть адаптированы специалистом в данной области техники. Помимо этого, время, достаточное для осуществления взаимодействия, также может быть определено квалифицированным специалистом в данной области техники. Кроме того, нужно понимать, что между отдельными стадиями контактирования, изложенными в способе по настоящему изобретению, могут выполняться стадии промывки для обеспечения подходящих условий для контактирования. Например, после формирования первого антитело-содержащего комплекса на стадии а), оставшийся раствор должен быть удален до применения антитела обнаружения к указанному антитело-содержащему комплексу. Кроме того, после того как первый комплекс обнаружения сформирован на стадии b), возможно будет необходимо удалить оставшееся (несвязавшееся) антитело обнаружения до определения количества первого комплекса обнаружения на стадии с). То же самое применяется, конечно, для стадий от а) до f), соответственно.
Термин "антитело", используемый в настоящем изобретении, охватывает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, синтетическое антитело или фрагмент любого из перечисленных антител. Фрагменты названных антител включают Fab, Fv или scFv фрагменты, или химически модифицированные производные любого из этих фрагментов. Антитела могут быть изготовлены с использованием способов, которые описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик, первоначально описанными в Kóhler 1975, Nature 256, 495, и Galfre 1981, Meth Enzymol 73, 3. Названные методики содержат слияние клеток миеломы мыши с клетками селезенки, полученными из иммунизированных млекопитающих. Антитела могут быть далее улучшены с помощью методик, известных специалистам этой области техники. Например, поверхностный плазменный резонанс, использующийся в системе в BIACORE(R), может быть использован для повышения эффективности фаговых антител, которые связываются с эпитопом, смотрите Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7. Антитела, используемые в настоящем изобретении, также содержат функциональные эквиваленты антител, то есть агентов, которые способны к специфическому связыванию с желательными эпитопами или частями полипептидов нейротоксинов. В некотором варианте такие функциональные эквиваленты содержат рецептор или связывающие белки, упомянутые в других указанны как специфическое связывание.
Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением, "первое антитело захвата" специфически связывается с эпитопами, содержащимися в легкой цепи зрелого полипептида нейротоксина и содержащимися в частично процессированном и/или непроцессированном полипептиде нейротоксине. Термин «специфическое связывание», при использовании в настоящем изобретении, в общем, означает, что антитело не реагирует перекрестно в существенной степени с другими эпитопами на тяжелой цепи или линкере нейротоксического полипептида, подлежащего определению, или на других полипептидах. Специфическое связывание, как упоминается в настоящем изобретении, может быть исследовано различными хорошо известными методиками, включая, например, эксперименты по конкуренции и Вестерн-блоты. Термин «эпитоп», при использовании в соответствии с настоящим изобретением, касается антигенной детерминанты, которая узнается антителом.
В другом варианте, различные антитела захвата могут использоваться, чтобы заменить первое антитело захвата. С этой целью может применяться по меньшей мере одно антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи непроцессированного полипептида нейротоксина, по меньшей мере еще одно антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи частично процессированного полипептида нейротоксина, и еще по меньшей мере одно антитело захвата, которое специфично связывается с эпитопами легкой цепи процессированного полипептида нейротоксина. Следует иметь в виду, что эти три типа антител имеют функциональное сходство с первым антителом захвата в целях способа по настоящему изобретению. Похожим образом, антитело захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, может применяться в комбинации с антителом захвата, которое специфически связывается с эпитопами легкой цепи процессированного полипептида нейротоксина.
Указанное первое антитело захвата в некотором варианте должно быть иммобилизовано. Названная иммобилизация антитела, в принципе, может достигаться, в некотором варианте, обратимым или необратимым, прямым или непрямым (через линкерные молекулы) связыванием антитела с твердой подложкой. В некотором варианте изобретения, первое антитело захвата иммобилизуется до выполнения способа. В другом варианте, первое антитело захвата иммобилизуется после того, как был сформирован первый антитело-содержащий комплекс, но до контактирования комплекса с антителом обнаружения. Материалы для твердых подложек известны специалистам в данной области техники и включают, среди прочего, коммерчески доступные полисахаридные матрицы, выбранные из группы, состоящей из: сефарозы, сефадекса; агарозы, сефацела, микроцеллюлозы и альгинатных гранул, полипептидных матриц, гранул полистирола, латексных гранул, магнитных гранул, коллоидных металлических частиц, стеклянных, пластмассовых и/или кремниевых крошек и поверхностей, нитроцеллюлозных полосок, мембран, листов, стабилизированных эритроцитов, лунки и стенки реакционных плашек, пластиковых пробирок. В некотором варианте настоящего изобретения, названная твердая подложка изготовлена из полистирола, подвергнутого гамма-облучению.
Термин "первый антитело-содержащий комплекс" относится к комплексу, содержащему первое антитело захвата, специфически связанное с процессированными, частично процессированными, или формируется в результате контактирования первого антитела захвата с раствором, содержащим названные процессированные, частично процессированные или непроцессированные полипептиды нейротоксины, как указано выше.
Согласно способу по настоящему изобретению, "второе антитело захвата" специфически связывается с эпитопом, который содержит линкер непроцессированного и/или частично процессированного полипептида нейротоксина или его частей. В случаях, где линкерная последовательность отсутствует, предусматривается, что названное второе антитело захвата специфически связывается с эпитопом, содержащим нерасщепленный сайт протеолитического расщепления или его части. В некотором аспекте изобретения, второе антитело захвата не реагирует перекрестно с процессированным полипептидом нейротоксином в существенной степени. В некотором варианте настоящего изобретения, названное второе иммобилизованное антитело захвата специфически связывается с эпитопом, по существу состоящим из аминокислотной последовательности, как показано SEQ ID NO:1-16, содержащим ее или содержащимся ей, смотрите Таблицы 2 или 3, приведенные ниже.
Таблица 2
Аминокислотная последовательность сайтов расщепления различных полипептидов нейротоксинов и фланкирующих последовательностей
SEQ
Последовательность эпитопа, включающая сайты расщепления (выделено)
Нейротоксин (бактериальный штамм)
1
KLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALN…DLCIKV
BoNT/A (Hall/62A)
2
IQMCKSVKAPG…ICIDV
BoNT/B (Okra)
3
TKFCHKAIDGRSL…YNKTL…DCRELLV
BoNT/CI (C-6814)
4
TKVCLRLTK…NSRD…DSTCIKV
BoNT/D
5
IRFCKNIVSVKG…IRK…SICIEI
BoNT/E (Beluga)
6
VKFCKSVIPRKG…TKAP…PRLCIRV
BoNT/F(NCTC10281)
7
IAMCKPVMYKNT…GKS…EQCIIV
BoNT/G
8
IGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKI
TeNT
Таблица 3
Аминокислотные последовательности линкерных участков
SEQ ID NO:
Последовательность эпитопов
Сайты расщепления
Нейротоксин/бактериальный штамм
9
TKSLDKGYNK
K438/Т439 K448/А449
BoNT/A (Hall/62A)
10
CKSVKAPGIC
K441/А442
BoNT/B (Okra)
11
SLYNK
R444/S445 K449/Т450
BoNT/CI (C-6814)
12
NSR
K442/N443
BoNT/D (CB16)
R445/D446
13
GIR
K419/G420 R422/K423
BoNT/E (Beluga)
14
KGTK
R435/K436 K439/А440
BoNT/F(NCTC 10281)
15
NGTK
BoNT/G
16
ENLYNR
R449 (альтернативно R455)
TeNT
Благодаря присутствию вышеупомянутого эпитопа, непроцессированные или частично процессированные полипептиды нейротоксины могут специфически связываться вторым антителом захвата и, таким образом, формировать второй антитело-содержащий комплекс. Названное второе антитело захвата является иммобилизованным, как подробно объяснено выше.
Соответственно, термин "второй антитело-содержащий комплекс" относится к комплексу, содержащему второе антитело захвата, специфически связанное с частично процессированным или непроцессированным полипептидом нейротоксином. Названный второй антитело-содержащий комплекс, однако, не должен содержать процессированный полипептид нейротоксин.
Согласно способу по настоящему изобретению "антитело обнаружения" специфически связывается с первым и/или вторым антитело-содержащим комплексом. В некотором варианте изобретения, антитело обнаружения идентично для первого и второго антитело-содержащего комплекса. Однако в другом варианте, для первого и второго антитело-содержащего комплекса могут использоваться различные антитела обнаружения. В некотором варианте, антитело обнаружения специфически связывается с эпитопами на тяжелой цепи процессированного, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина. Вследствие присутствия одного и того же эпитопа в обоих комплексах, первый антитело-содержащий комплекс или второй антитело-содержащий комплекс могут быть специфически связаны и, таким образом, обнаружены с помощью антитела обнаружения в указанном варианте настоящего изобретения.
В результате специфического связывания антитела обнаружения, формируются первый комплекс обнаружения или второй комплекс обнаружения, соответственно.
Поэтому термин "первый комплекс обнаружения" относится к комплексу, содержащему первый антитело-содержащий комплекс и антитело обнаружения. Аналогично, термин "второй комплекс обнаружения" относится к комплексу, содержащему второй антитело-содержащий комплекс и антитело обнаружения.
35
125
32
33
В аспекте способа по настоящему изобретению, указанное антитело обнаружения, содержащееся в первом или втором комплексе обнаружения, соединено с детектируемой меткой, позволяющей измерять количество антитела обнаружения, которое связано с комплексом обнаружения. С помощью измерения количества названного связанного антитела обнаружения может быть определено количество первых или вторых антитело-содержащих комплексов, так как количество связанного антитела обнаружения в комплексе обнаружения коррелирует с количеством антитело-содержащего комплекса, содержащимся в комплексе обнаружения. Мечение может быть проведено прямыми или непрямыми методами. Прямое мечение включает в себя непосредственное присоединении метки (ковалентно или нековалентно) к первому антителу обнаружения. Косвенное мечение включает в себя связывание (ковалентно или нековалентно) агента, который специфически связывается с антителом обнаружения и который несет детектируемую метку. Таким агентом может быть, например, вторичное (более высокого порядка) антитело, которое специфически связывается с антителом обнаружения. Вторичное антитело в таком случае будет соединено с детектируемой меткой. Следует иметь в виду, что дополнительные антитела более высокого порядка часто используются также для детектирования комплекса обнаружения. Антитела более высокого порядка часто используются для усиления сигнала. Подходящие антитела более высокого порядка могут также включать хорошо известную систему стрептавидин-биотин (Vector Laboratories, Inc.) и хорошо известный Dako LSAB™2 и LSAB™+ (меченый стрептавидин-биотин), или Dako PAP (пероксидаза антипероксидаза). В следующем варианте указанная метка первого антитела обнаружения выбирается из группы, состоящей из: флуоресцентных красителей, хемолюминисцентных молекул, радиоактивных меток и ферментов, способных генерировать детектируемый сигнал. Типичные флуоресцентные метки включают флуоресцентные белки (такие как GFP и его производные), Cy3, Cy5, Texas Red, флуоресцеин и Texas Red (например, Alexa 568). Типичные радиоактивные метки включают S, I, P, P и т.п. Альтернативно, детектируемая метка, соединенная с названным первым антителом обнаружения, может также быть ферментом, который способен к генерированию детектируемого сигнала, например, путем конверсии субстрата. В некотором варианте, такой фермент может быть пероксидазой (например, пероксидазой хрена) или щелочной фосфатазой.
Термин "определение количества", используемый в настоящем изобретении, касается измерения абсолютного количества, относительного количества или концентрации количественным или полуколичественным способом. Измерение будет осуществляться на основе химических, физических или биологических свойств детектируемой метки, соединенной с первым антителом обнаружения. Подходящие единицы измерения для обнаружения хорошо известны специалистам в данной области техники и зависят от природы детектируемой метки, как указывалось выше. Однако необходимо понимать, что количество детектируемой метки, которое может быть измерено, прямо коррелирует с количеством комплекса обнаружения, которое в свою очередь коррелирует с количеством антитело-содержащего комплекса и, таким образом, с количеством подлежащих определению видов нейротоксина, которые должны быть определены, то есть либо общего (процессированного, непроцессированного и частично процессированного нейротоксина), либо непроцессированного и частично процессированного нейротоксина. Следует понимать, что определение количества полипептидов нейротоксинов, в некотором варианте, также требует калибровки способа путем применения стандартных растворов с предопределенным количеством полипептидов нейротоксинов. То, как выполнять такую калибровку, хорошо известно специалистам в данной области техники.
Термин «вычисление», используемый в соответствии со способом по настоящему изобретению, касается математических операций, которые позволяют определить количество процессированного нейротоксина на основании количеств общего нейротоксина (то есть процессированного, непроцессированного и частично процессированного нейротоксина) и количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина. В отношении способа по настоящему изобретению, вышеуказанные вычисления включают вычитание количества частично процессированного и непроцессированного нейротоксина из количества общего нейротоксина.
Способ в соответствии с настоящим изобретением преимущественно позволяет надежно определять количество процессированного нейротоксина в данном препарате. Соответственно, качество препаратов на основе нейротоксина может быть повышено, так как препараты могут быть проверены на постоянное содержание требующегося процессированного полипептида нейротоксина.
В принципе, способ по настоящему изобретению может быть выполнен присоединением первого антитела захвата к твердой подложке, такой как реакционная пробирка. Точно так же, второе антитело захвата должно быть соединено с другой физически отдельной твердой подложкой (например, с дополнительной реакционной пробиркой). Оба антитела захвата, присоединенные к твердыми подложкам, будут последовательно вовлечены в контакт с названными порциями раствора, содержащими процессированный, непроцессированный и/или частично процессированный нейротоксин, подлежащий определению. Таким раствором может быть, например, очищенная бактериальная клеточная культура Clostridum sp. Следует иметь в виду, что первая порция будет вовлечена в контакт с первым антителом захвата на первой твердой подложке, а вторая порция будет вовлечена в контакт со вторым антителом захвата на второй твердой подложке. Порции обычно имеют равный объем и нормализованы относительно их содержимого, например, содержания общего белка. Контактирование будет выполнено в течение времени, достаточного для специфического связывания первых и вторых антител захвата с их соответствующими антигенами. Например, контактирование может быть выполнено при комнатной температуре в течение около одного часа. Впоследствии первая и вторая порции раствора удаляются, и твердые подложки (например, реакционные пробирки) будут промыты один или два раза буфером, при условиях, которые не влияют на первый и второй антитело-содержащие комплексы, которые были к тому времени сформированы с антителами захвата на твердых подложках. После того как стадии промывки были выполнены, (первое) антитело обнаружения должно быть добавлено к твердым подложкам, при условиях, которые позволяют специфическое связывание антитела обнаружения. Избыток антитела обнаружения должен быть удален дальнейшими стадиями промывки с использованием подходящего буфера. Впоследствии, количество первого и второго комплексов обнаружения может быть определено определением количества специфически связанного антитела обнаружения. Это достигается в зависимости от природы метки антитела обнаружения, например, измерением оптической плотности или интенсивности флюоресценции. Измеренное количество для детектируемой метки может сравниваться со стандартами калибровки, чтобы определить количество видов нейротоксина, то есть либо общий (процессированный, непроцессированный и частично процессированный нейротоксин), либо непроцессированный и частично процессированный нейротоксин в первом или во втором комплексе обнаружения. Следует иметь в виду, что первый комплекс обнаружения представляет количество общего нейротоксина, в то время как второй комплекс обнаружения представляет количество только частично процессированных и непроцессированных полипептидов нейротоксина. Соответственно, количество процессированного полипептида нейротоксина может быть вычислено вышеупомянутым способом, вычитанием количества частично процессированного или непроцессированного полипептида нейротоксина из общего количества полипептида нейротоксина.
Следует понимать, что вышеприведенные определения и объяснения терминов применяются с изменениями и оговорками в отношении всех вариантов, описанных в этом описании, если не указано иное.
Настоящее изобретение также касается способа определения количества процессированного (активного) полипептида нейротоксина в растворе, содержащем процессированный полипептид нейротоксин и частично процессированный и/или непроцессированный полипептид нейротоксин, содержащего стадии:
a) контактирование первой порции указанного раствора с первым антителом захвата, которое специфически связывается с тяжелыми цепями зрелого полипептида нейротоксина, частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание названного антитела с указанным зрелым нейротоксином, частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, первого антитело-содержащего комплекса,
b) контактирование первого антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, которое специфически связывается с легкой цепью указанного зрелого нейротоксина, частично процессрованного и непроцессированного полипептида нейротоксина в антитело-содержащем комплексе, сформированном на стадии а), посредством чего формируется первый комплекс обнаружения,
c) контактирование второй порции указанного раствора со вторым антителом захвата, которое специфически связывается с линкерами указанных частично процессированного и непроцессированного полипептида нейротоксина, при условиях, которые обеспечивают связывание указанного антитела с названным частично процессированным и непроцессированным полипептидом нейротоксином, с формированием, таким образом, второго антитело-содержащего комплекса,
d) контактирование второго антитело-содержащего комплекса с антителом обнаружения, посредством чего формируется второй комплекс обнаружения,
e) определение количества первого и второго комплексов обнаружения, сформированных на стадии b) и стадии d), и
f) вычисление количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных на стадии е).
В другом варианте способов в соответствии с настоящим изобретением, названные способы дополнительно содержат определение связывающей активности полипептида нейротоксина.
Термин "связывающая активность", применяющийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, относится к способности процессированного полипептида нейротоксина связываться с поверхностным рецепторным белком, который присутствует, например, на периферийных холинергических нервных окончаниях. Рецепторные белки включают SV2 для BoNT/A, синап-тотагмины I и II для ВоМТ/В и BoNT/G, и ганглиозидный (GT1B) корецептор. В отношении способа в соответствии с настоящим изобретением, названная связывающая активность может быть определена методом ex vivo с использованием модельного субстрата, который заменяет поверхностный белковый рецептор путем имитации его связывающего домена. Названный модельный субстрат является, в некотором варианте, меченым пептидом, полученным из вышеупомянутых рецепторных белков. В другом варианте, подходящие метки включают те, которые упомянуты в другой части описания настоящего изобретения, и, в частности, биотин.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения связывающей активности полипептида нейротоксина, содержащему стадии
a) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с меченым пептидом, посредством чего формируется комплекс, и
b) определение указанного комплекса, сформированного на стадии (а), основанное на метке, посредством которой присутствие или отсутствие комплекса, или его количество свидетельствуют о связывающей активности полипептида нейротоксина в указанном растворе.
Комплекс может быть определен на основе природы метки, которая использовалась для мечения пептида. В некотором варианте, например, биотинилированный пептид, содержащийся в комплексе, может быть определен с помощью стрептавидинового конъюгата, способного генерировать детектируемый сигнал. Присутствие, отсутствие или интенсивность будут свидетельствовать о связывающей активности полипептидов нейротоксинов в растворе или их силы.
В другом варианте способа в соответствии с настоящим изобретением, указанный способ дополнительно содержит определение протеолитической активности полипептида нейротоксина.
Термин "протеолитическая активность", применяющийся в соответствии со способом по настоящему изобретению, касается способности процессированного нейротоксина протеолитически расщеплять чувствительный к N-этилмалеимиду фактор, обеспечивающий прикрепление белков (SNARE), вовлеченных в слияние мембраны синаптического пузырька. В некотором варианте указанное расщепление является цинк-независимым. Названная протеолитическая активность может быть определена с использованием модельного субстрата, который заменяет природный SNARE-белок. Более того, при расщеплении детектируемая метка, такая как краситель, должна высвобождаться из названного модельного субстрата. В одном варианте, модельным субстратом является соединение, имеющее общую формулу Х-пара-нитроанилид, где Х - это аргинин или пептид, имеющий последовательность аргинин-Y, в которой Y представляет собой одну или более аминокислот, и в другом варианте, соединением является аргинин-пара-нитроанилид.
Таким образом, настоящее изобретение, кроме того, относится к способу определения протеолитической активности нейротоксина, включающему стадии
а) контактирование порции раствора, содержащего полипептид нейротоксин, с соединением, имеющим общую формулу: Х-пара-нитроанилид, где Х является аргинином или пептидом, имеющим последовательность аргинин-Y, где Y представляет собой одну или более аминокислот, и
b) определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе на основе количества высвободившегося пара-нитроанилина на стадии b), которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
В этом варианте Y представляет остаток пептида, имеющего аминокислотную последовательность, как показано любой из последовательностей SEQ ID NOs:25 или 26.
Процессированный полипептид нейротоксин, содержащийся указанной порцией раствора, может расщепляться и, таким образом, высвобождать пара-нитроанилин из оставшегося пептида. Пара-нитроанилин является красителем, хорошо известным специалистам в данной области техники. Определение протеолитической активности полипептида нейротоксина в указанном растворе основано на количестве высвобождающегося пара-нитроанилина, которое коррелирует с количеством полипептида нейротоксина.
Настоящее изобретение также относится к устройству для определения количества процессированного полипептида нейротоксина в растворе, содержащему:
а) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проводить стадии a)-е) вышеупомянутых способов; и
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с а).
Термин "устройство", применяющийся в настоящем изобретении, касается системы, содержащей по меньшей мере вышеуказанную установку и средства, операционно связанные друг с другом, чтобы делать возможным определение. В некотором варианте, система может представлять собой твердую подложку с иммобилизованными антителами захвата, как упомянуто выше, которые могут находиться в физически разделенных пробирках, чтобы позволить отдельное контактирование с первой и второй порцией раствора. Более того, устройство может содержать, в некотором варианте, блок для определения количества комплексов обнаружения. В зависимости от вида используемых антител обнаружения, такой блок будет содержать детектор для сигналов, генерируемых антителом обнаружения. Кроме того, блок может также содержать, в некотором варианте, средства для калибровки, например, алгоритм, основанный на компьютере, для сравнения измеряемых сигналов с калибровочными стандартами, чтобы определять количество полипептидов нейротоксинов, присутствующих в растворе или в его порциях. Устройство будет также содержать средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количества первого и второго комплексов обнаружения, например, компьютерный алгоритм для проведения вычисления.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, подходящему для проведения вышеуказанных способов, причем указанный набор содержит:
a) систему первого антитела захвата, второго антитела захвата и антитела обнаружения, где указанная система позволяет проведение стадий от а) до е) вышеупомянутых способов;
b) средства для вычисления количества зрелого полипептида нейротоксина на основании количеств первого и второго комплексов обнаружения, определенных с помощью системы в соответствии с а); и
с) инструкции для проведения указанного способа.
Термин "набор", используемый в настоящем изобретении, относится к набору вышеупомянутых средств или реактивов в соответствии с настоящим изобретением, которые могут быть упакованы вместе или по отдельности. Компоненты набора могут содержать отдельные ампулы (то есть как набор отдельных частей) или поставляться в виде единственной ампулы. Кроме того, следует понимать, что набор в соответствии с настоящим изобретением предназначен для осуществления способов, упомянутых в описании настоящего изобретения, приведенном выше. В одном варианте предусматривается, что все компоненты поставляются в состоянии, готовом для осуществления вышеупомянутых способов. В другом варианте, набор содержит инструкции для того, чтобы выполнить указанные способы. Инструкции могут быть представлены в виде руководства для пользователя в бумажной или электронной форме. Например, руководство может содержать инструкции для интерпретации результатов, полученных при выполнении вышеупомянутых способов с использованием набора в соответствии с настоящим изобретением.
Все ссылки, процитированные в настоящем описании, таким образом включены посредством, как в отношении их полного содержания, так и в отношении их конкретно упомянутой части.
Чертежи
Фиг.1: Схема связывания по меньшей мере одного (или более) антитела обнаружения.
Фиг.2: Схема специфического связывания второго антитела захвата с частично процессированным или непроцессированным предшественником полипептида нейротоксина и последующего связывания по меньшей мере одного (или более) антитела обнаружения.
Фиг.3: Схема определения связывающей активности полипептида нейротоксина.
Фиг.4: Схема определения протеолитической активности полипептида нейротоксина.