Способ определения генотоксичности наночастиц
METHOD OF DETERMINING GENOTOXICITY OF NANOPARTICLES

Предлагаемое изобретение относится к области биомедицинских исследований и нанотехнологий, в частности к разработке универсального и надежного способа определения генетической чувствительности ДНК клеток к наноматериалам медицинского и фармацевтического назначения в условиях in vitro. Способ определения генетической чувствительности ДНК клеток к наноматериалам осуществляют путем оценки степени их генотоксичности наночастиц золота на ядерный аппарат эритроцитов в условиях in vitro. Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в токсикологических исследованиях, а именно, при выявлении степени чувствительности ядерного аппарата клеток организма, в условиях эксперимента, к действию наночастиц.
В настоящее время для оценки генотоксичности наночастиц применяются: анализ LDH (Marquis, В.J., Love, S.A., Braun, K.L., & Haynes, С.L. (2009). Analyticalmethodstoassessnanoparticletoxicity. Analyst, 134(3), 425-439), метод ДНК-комет (Дурнев А.Д. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет invitro // Методические рекомендации. / А.Д. Дурнев [и др.] - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. -2010.), анализ метафазных пластинок (AshaRani P.V., LowKahMun G., Hande M.P. et al. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells // ACS Nano. - 2009. - Vol.3, №2. - P. 279-290.), тест Эймса (Li Y. et al. Genotoxicity of silver nanoparticles evaluated using the Ames test and in vitro micronucleus assay // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. - 2012. - T. 745. - №. 1. - C. 4-10.), который заключается в индукции обратных мутаций в бактериальных генах канцерогенами, Allium test (FISKESJÖ G. The Allium test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. - 1985. - T. 102. - №. 1. - C. 99-112).
Указанные способы оценки генотоксичности наряду с очевидными достоинствами имеют ряд недостатков, которые вынуждают вести поиск новыхоптимальных методов определения генотоксичности наночастиц используемых в медицине.
Известен так же способ определения генотоксичности НЧ/НМ-методом анализа метафазных пластинок (AshaRani P.V., LowKahMun G., Hande M.P. et al. Cytotoxicityandgenotoxicityofsilvernanoparticlesinhumancells // ACSNano. -2009. - Vol.3, №2. - P. 279-290.), основанном на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей in vitro или in vivo, который требует наличие уже идентифицированных хромосом и высокой квалификации исследователя, что значительно удорожает исследование и, следовательно, плохо поддается автоматизации.
Наиболее близким по технической сущности является способ определения генотоксичности методом анализа метафазных пластинок (Asha Rani P.V., Low Kah Mun G., Hande M.P. et al. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells // ACS Nano. - 2009. - Vol.3, №2. - P. 279-290.). Данный метод является более точным в сравнении с ана-телофазным методом, однако пригоден только для объектов, для которых уже идентифицированы все хромосомы.
Суть метода-прототипа заключается в регистрации видимых структурных нарушений хромосом в клетках in vitro на стадии метафазы. Исследования по оценке хромосомных аберраций in vitro проводят на перевиваемых клеточных линиях или первичных культурах клеток. Используемые клетки отбирают на основе способности к росту в культуре, стабильности кариотипа, числа и разнообразия хромосом и спонтанного уровня хромосомных аберраций. После экспозиции исследуемым соединением в культуры выделенных клеток вносят вещество, блокирующее клеточный цикл на стадии метафазы (например, колцемид или колхицин). Затем клетки фиксируют, красят и анализируют под микроскопом для обнаружения хромосомных аберраций.
Основным недостатком прототипа является то, что данный метод применим для культуры клеток, обладающих только высокой пролиферативной и митотической активностью. Для успешного анализа хромосомных препаратов необходимо достаточное число метафазных пластинок с хорошей морфологией.
Задача изобретения - создание надежного эффективного высокочувствительного быстрого способа оценки генотоксичности наночастиц на наследственный материал эритроцитов периферической крови в условиях in vitro. Данный способ основан на учете хромосомных аберраций (микроядер), позволяющий учитывать нарушения, как в интерфазе, так и в процессе деления клетки. Достоинство этого метода состоит в том, что он, в отличие от своих аналогов позволяет проводить оценку уровня хромосомных нарушений по анализу интерфазного ядра, т.е. не требует наличия клеток в митозе.
Достижение технического результата настоящего изобретения связано со сокращением времени оценки генотоксического эффекта воздействия наночастиц и уменьшением стоимости проведения цитогенетического анализа. Данный способ экспресс-оценки потенциальной генотоксической активности наночастиц по наличию микроядер в исследуемых образцах, образовавшихся в результате присутствия изучаемого вещества позволит в экспериментальных условиях вести подбор наиболее оптимальных физико-химических параметров синтезируемых наночастиц медицинского и фармацевтического назначения.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем: осуществляется стерильный забор крови из вены, приготовление цитогенетических препаратов на предметных стеклах, фиксация смесью 70%-ного этилового спирта, гидролиз 1 н. HCl с последующей окраской препаратов реактивом Шиффа; полученные препараты подвергаются цитогенетическому анализу для определения степени генетических нарушений: ведется подсчет исследуемых клеток, содержащих микроядра и ядерный материал, не оформленный в четкое микроядро, причисленное к общему количеству просмотренных клеток. Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фиг. 1 изображен препарат периферической крови контрольных образцов, а на фиг. 2 представлены патоморфологические изменения ядер в опытных образцах, где элементы 1 - эритроцит в норме; 2 - эритроцит с МЯ; 3 - микроядро, 4 - амитоз в клетке эритроцита; 5 - конгломерат разрушенного эритроцита.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:
2
2
5
2 мкл цельной венозной крови исследуемого объекта, подвергшемуся воздействию наночастиц наносят на сухие, предварительно тщательно обезжиренные предметные стекла и фиксируются 70% раствором этанола. Затем готовятся цитогенетические препараты, которые гидролизуются и окрашиваются реактивом Шиффа. Реактив Шиффа готовится следующим образом: 1 г парарозанилина гидрохлорида растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. Встряхивают в течение 5 мин и охлаждают точно до 56°С. Профильтровывают и добавляют к фильтрату 4 мл 5 н HCl, охлаждают до 25°С и добавляют 1 г метабисульфита калия (KSO). Свежий раствор имеет малиново-розовый цвет. Через несколько часов жидкость начинает обесцвечиваться, а затем становиться чуть желтоватой. Препараты периферической крови окрашивают следующим образом: полученные предметные стекла помещают в 1 н. HCI для гидролиза при 60°С в течение 11 мин. Затем споласкивают в дистиллированной воде и окрашивают реактивом Шиффа в течение 1 часа. Окрашенные предметные стекла осушают и споласкивают в трех порция раствора свежеприготовленной сернистой воды (к 100 мл проточной воды добавляют 5 мл 10% метабисульфита и 5 мл 1 н. HCl) по 2-3 мин в каждой. Затем споласкивают в дистиллированной воде в течение 5 минут и обезвоживают в спиртах (60%, 70%, 96%) по 2-3 мин в каждом. Обезвоженные препараты просветляют в двух порциях ксилола и заключают в бальзам.
Окрашенные таким образом препараты подвергаются цитогенетическому анализу. Мазки просматривают под микроскопом (увеличение 1000×, микроскоп «Оптон»), от 200 до 1000 клеток в каждом препарате. На препаратах ведется подсчет исследуемых клеток, содержащих микроядра и ядерный материал, не оформленный в четкое микроядро, причисленное к общему количеству просмотренных клеток. Для определения степени генетических нарушений используется суммарное количество аномальных клеток.
Полученные значения соответствующих параметров статистически обрабатываются (по t-критерию Стьюдента). В случае обнаружения статистически значимых различий между опытными и контрольными образцами (уровень значимости р≤0,05), исследуемое вещество (наночастицы) признается обладающим потенциальной генотоксической активностью.
Пример конкретного осуществления способа:
На основании вышеописанного метода авторами было исследовано генотоксическое воздействие наночастиц золота (Au) на ядерный материал эритроцитов периферической крови рыб.
Целью исследования являлось изучение генотоксичности наночастиц А и эритроциты периферической крови рыб (далее - объект) в условиях эксперимента. Выборка в контрольной и опытной группах обследуемых объектов составила 28 особей.
В качестве метода при изучении генотоксичности периферической крови был выбран микроядерный тест. Показано, что этот тест является достаточно чувствительным, более простым и мало-затратным (экономически выгодным) по сравнению с общепризнанным цитогенетическим методом исследования аберраций хромосом в метафазе митоза. Применение микроядерного теста дает возможность проведения автоматизации исследований.
В результате изучения генотоксичности эритроцитов периферической крови исследуемых объектов (клетки, содержащие ядерный материал) проведен цитогенетический скрининг, результаты которого приведены в таблице 1.
В контрольной группе уровень эритроцитов с микроядрами (ЭМ) варьирует от 0,8 до 2,5%о. У опытных образцах наблюдается статистически достоверное снижение ЭМ (от по сравнению с контрольной группой, показания которых варьировали от 0.5 до 1.3%о. Ни у одной из групп исследуемого образца, как в контроле, так и в опыте не отмечается значения ЭМ менее 0,14%о. (Таблица 1) Статистически достоверные различия получены при сравнении значений уровня ЭМ в контрольных и опытных образцах (р<0,05). Канцерогены помимо генотоксических эффектов могут вызывать преждевременную эллиминацию большого числа поврежденных клеток, связанную с запуском к клетке свободно-радикальных процессов. О чем, возможно, свидетельствуют полученные показатели крови в опыте животных подвергшихся действию наночастиц Au.
Таким образом, полученные данные позволили сделать заключение о том, что обнаруженное достоверное повышение уровня цитогенетических нарушений в эритроцитах исследуемых образцов, индуцированных действием наночастиц Au, является свидетельством развития процессов генотоксического действия.
При исследовании периферической крови опытных образцов исследуемых объектов, был обнаружен ряд деструктивных изменений клеток красного ряда, отличающихся степенью проявления патоморфологических нарушений.
Регистрировалось высокое содержание ядер эритроцитов с рыхлым дисперсным хроматином. Хроматин - это нуклеопротеидные нити, из которых состоят хромосомы клеток эукариот. Встречались двуядерные клетки, свидетельствующие о протекающих патологических процессах, вследствие отрицательного воздействия канцерогенных факторов в природных условиях.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемый способ имеет следующие преимущества: менее трудоемок, прост и доступен в применении, не требует высокой квалификации исследователя и идентификации хромосом, что значительно сокращает время проведения анализа; менее затратный, нет необходимости в применении дорогостоящих реактивов.
Предлагаемый надежный эффективный высокочувствительный способ экспресс-оценки генотоксичности наночастиц по живому образцу ткани, содержащим наследственный материал на основе микроядерного теста, является удобным объектом для исследования генетической активности периферической крови, что открывает возможность ранней диагностики генотоксикации НЧ/НМ, и осуществлять их контроль и коррекцию.