АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА ДЛЯ УСКОРЕНИЯ ЭЛИМИНАЦИИ АНТИГЕНОВ
ANTIGEN-BINDING MOLECULE FOR ACCELERATING ANTIGEN LOSS

Область техники
Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам с усиленным внутриклеточным захватом связанного антигена, антигенсвязывающим молекулам, в которых количество антигенов, которое может связываться на одну молекулу, увеличено, антигенсвязывающим молекулам с улучшенной фармакокинетикой, антигенсвязывающим молекулам с усиленной внутриклеточной диссоциацией внутриклеточно связанного антигена, антигенсвязывающим молекулам с усиленным внеклеточным высвобождением в не связанном с антигеном состоянии, антигенсвязывающим молекулам, имеющим функцию снижения общей концентрации антигена или свободной концентрации антигена в плазме, фармацевтическим композициям, содержащим такие антигенсвязывающие молекулы, и способам их получения.
Уровень техники
Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств, так как они обладают высокой стабильностью в плазме и обладают малым количеством побочных эффектов. В настоящее время ряд подобных фармацевтических средств IgG-типа являются коммерчески доступными, и на сегодняшний день разрабатываются многие лекарственные средства на основе антител (непатентные документы 1 и 2). Между тем, описаны различные способы, применимые для второго поколения лекарственных средств на основе антител, включающие способы, которые усиливают эффекторную функцию, антигенсвязывающую способность, фармакокинетику и стабильность, и способы, которые снижают риск развития иммуногенности (непатентный документ 3). Как правило, требуемая доза лекарственного средства на основе антитела является очень высокой. Это, в свою очередь, привело к возникновению проблем, таких как высокая стоимость производства, а также к трудностям при получении подкожных составов. В теории, доза фармацевтического средства на основе антитела может быть снижена путем улучшения фармакокинетики антитела или повышения аффинности между антителами и антигенами.
В литературе описаны способы улучшения фармакокинетики антител с использованием искусственных замен аминокислот в константных областях (непатентные документы 4 и 5). Аналогично описано созревание аффинности в качестве способа улучшения антигенсвязывающей способности или активности нейтрализации антигена (непатентный документ б). Этот способ дает возможность увеличения антигенсвязывающей способности посредством внесения аминокислотной мутации в CDR вариабельной области и т.п. Повышение антигенсвязывающей способности обеспечивает улучшение биологической активности in vitro или обеспечивает возможность снижения дозы и дополнительно обеспечивает повышенную эффективность in vivo (непатентный документ 7).
Способность одной молекулы антитела нейтрализовать антиген зависит от ее аффинности. Путем увеличения аффинности антиген можно нейтрализовать меньшим количеством антитела. Для увеличения аффинности антитела можно использовать различные способы (непатентный документ б). Далее, если бы аффинность можно было сделать бесконечной посредством ковалентного связывания антитела с антигеном, одна молекула антитела могла бы нейтрализовать одну молекулу антигена (двухвалентное антитело могло бы нейтрализовать две молекулы антигена). Однако, стехиометрия нейтрализации одного антитела против одного антигена (одного двухвалентного антитела против двух антигенов) является лимитирующим фактором для предшествующих способов, и, таким образом, невозможно полностью нейтрализовать антиген количеством антитела, меньшим, чем количество антигена. Другими словами, эффект, усиливающий аффинность, имеет лимитирующее значение (непатентный документ 9). Для увеличения периода действия нейтрализующего эффекта нейтрализующего антитела в течение определенного периода антитело должно быть введено в дозе, более высокой, чем количество антигена, продуцируемое в организме в течение такого же периода. Таким образом, в случае улучшения только фармакокинетики антител или технологии созревания аффинности, как описано выше, существует ограничение в отношении снижения требуемой дозы антитела. Таким образом, для поддержания эффекта антител в отношении нейтрализации антигена в течение заданного периода времени с помощью антител в количестве, меньшем, чем количество антигена, одно антитело должно нейтрализовать множество антигенов. Недавно было описано антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, в качестве нового способа для достижения описанной выше задачи (патентный документ 1). Антитела с рН-зависимым связыванием антигена, которые прочно связываются с антигеном при нейтральных условиях в плазме и диссоциируют от антигена при кислых условиях в энодосоме, могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Когда антитело с рН-зависимым связыванием антигена диссоциирует от антигена и рециркулирует в плазму посредством FcRn, оно может повторно связываться с другим антителом. Таким образом, антитело с рН-зависимым связыванием антигена может многократно связываться с несколькими антигенами.
Кроме того, время удержания антигена в плазме является очень коротким по сравнению со временем удержания антител, рециркулирующих в плазму путем связывания с FcRn. Если антитело с таким продолжительным временем удержания в плазме связывает антиген, время удержания в плазме комплекса антиген-антитело увеличивается до того же времени удержания, что и у антитела. Таким образом, вследствие связывания с антителом повышается время удержания антигена, и, таким образом, концентрация антигена в плазме увеличивается.
Таким образом, антитела с рН-зависимым связыванием антигена обладают эффектами, которые не могут быть осуществлены с помощью нормальных антител, поскольку они могут ускорять элиминацию антигенов из плазмы по сравнению с нормальными антигенами, посредством связывания одного антитела с множеством антигенов. Однако способы инженерии антител для улучшения эффектов антител с рН-зависимым связыванием антигена, которые могут многократно связываться с антигенами и которые ускоряют элиминацию антигенов из плазмы, до настоящего времени не были описаны.
IgG-антитела имеют длительное время удержания в плазме вследствие их связывания с FcRn. Связывание между IgG и FcRn наблюдают только в кислых условиях (рН 6,0), и связывание практически не наблюдается в нейтральных условиях (рН 7,4). IgG антитела захватываются в клетки неспецифически, но посредством связывания с FcRn в эндосоме в кислых условиях внутри эндосомы, они возвращаются на клеточную поверхность и диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях в плазме. Когда в Fc-область IgG вносят мутации так, что связывание с FcRn в диапазоне кислых значений рН утрачивается, рециклирование антитела из эндосомы в плазму не происходит и время удержания антител в плазме значительно снижается. Способ повышения связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН описан в качестве способа увеличения времени удержания в плазме IgG-антитела. Повышение связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН посредством внесения аминокислотных замен в Fc-область IgG-антитела приводит к увеличенной эффективности рециклирования антитела из эндосомы в плазму и, в результате, увеличивается время удержания в плазме.
До настоящего времени было проведено множество исследований антителозависимой клеточной цитотоксичности (далее обозначаемой как ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (далее обозначаемой как CDC), которые являются эффекторными функциями антител класса IgG. Было описано, что в классе IgG человека, антитела полкласса IgG1 обладают наиболее высокой активностью ADCC и активностью CDC (непатентный документ 13). Более того, также полагают, что одной из эффекторных функций антител является антителозависимый клеточно-опосредуемый фагоцитоз (ADCP), который представляет собой фагоцитоз клеток-мишеней, опосредуемый антителами класса IgG (непатентные документы 14 и 15). Поскольку антитела подкласса IgG1 могут индуцировать эти эффекторные функции против опухолей, антитела подкласса IgG1 используют для большинства фармацевтических средств против антигенов злокачественной опухоли.
Для того, чтобы IgG-антитела опосредовали активность ADCC и ADCP, Fc-область IgG-антитела должна связываться с рецепторами антител (далее обозначаемыми как Fcγ-рецептор или FcγR), которые присутствуют на поверхности эффекторных клеток, таких как киллерные клетки, натуральные киллерные клетки и активированные макрофаги. У человека описаны изоформы FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и FcγRIIIb в качестве представителей семейства Fcγ-рецепторов, и также описаны их соответствующие аллотипы (непатентный документ 16).
Усиление цитотоксических эффекторных функций, таких как ADCC и ADCP, привлекло внимание в качестве перспективных средств для усиления противоопухолевых эффектов антител против
злокачественной опухоли. Важность опосредуемых Fcγ-рецептором эффекторных функций, являющихся целью противоопухолевых эффектов антител, описана с использованием моделей на мышах (непатентные документы 17 и 18). Более того, было выявлено, что клинические эффекты у человека коррелировали с высокоаффинным полиморфным аллотипом (VI58) и низкоаффинным полиморфным аллотипом (F158) FcγRIIIa (непатентный документ 19). В этих сообщениях указано, что антитела с Fc-областью, оптимизированной для связывания с конкретными Fcγ-рецепторами, опосредуют более мощные эффекторные функции, и, тем самым, проявляют более эффективные противоопухолевые эффекты. Баланс между аффинностью антител против активирующих рецепторов, включая FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb, и ингибирующих рецепторов, включающих FcγRIIb, является важным фактором при оптимизации эффекторных функций антител. Повышение аффинности к активирующим рецепторам может обеспечить антитела со свойством опосредования более мощных эффекторных функций (непатентный документ 20), и, таким образом, описано в различных сообщениях до настоящего времени в качестве способа модификации с помощью инженерии антител для повышения или усиления противоопухолевой активности фармацевтических средств на основе антител против антигенов злокачественной опухоли.
Что касается связывания между Fc-областью и Fcγ-рецептором, было показано, что несколько остатков в шарнирной области антитела и СН2-домене антитела и цепь сахаров, связанная с Asn в положении 297 (нумерация EU) в СН2-домене, являются важными (непатентные документы 13, 21 и 22). Фокусируясь на этих участках связывания, до настоящего времени проводили исследования на мутантах Fc-области, имеющих различные свойства связывания Fcγ-рецептора, и были получены мутанты Fc-области с более высокой аффинностью в отношении активирующего Fcγ-рецептора (патентные документы 2 и 3). Например, Lazar et al. успешно увеличили связывание IgG1 человека с FcγRIIIa человека (V158) приблизительно в 370 раз посредством замены Ser в положении 239, Ala в положении 330 и Не в положении 332 (нумерация EU) IgG1 человека на Asp, Leu и Glu, соответственно (непатентный документ 19 и патентный документ 2). Соотношение связывания FcγRIIIa и FcγRIIb (соотношение А/1) для этого мутанта было приблизительно в 9 раз выше, чем для дикого типа. Более того, Shinkawa et al. успешно увеличили связывание с FcγRIIIa вплоть до приблизительно 100 раз посредством удаления фукозы из цепи сахара, связанной с Asn в положении 297 (нумерация EU) (непатентный документ 24). Эти способы могут значительно повысить активность IgG1 человека в отношении ADCC по сравнению со встречающимся в природе IgG1 человека.
Таким образом, поскольку активность связывания Fcγ-рецептора играет важную роль в цитотоксической активности в антителах, нацеленных на антигены мембранного типа, изотип IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR используют, когда требуется цитотоксическая активность. Увеличение цитотоксической
активности посредством усиления активности связывания Fcγ-рецептора также является широко используемым способом. С другой стороны, роль, которую играет активность связывания Fcγ-рецептора в антителах, нацеленных на растворимые антигены, неизвестна, и полагают, что отсутствуют отличия между IgG1 человека с высокой активностью связывания Fcγ-рецептора и IgG2 человека и IgG4 человека с низкой активностью связывания FcγR. Таким образом, до настоящего времени не предпринимали попыток усиления активности связывания Fcγ-рецептора для антител, нацеленных на растворимые антигены, и их эффекты не описаны.
[Документы уровня техники]
Патентные документы
[Патентный документ 1] WO 2009/125825
[Патентный документ 2] WO 2000/042072
[Патентный документ 3] WO 2006/019447
Непатентные документы
[Непатентный документ 1] Janice М Reichert, Clark J Rosensweig, Laura В Faden & Matthew С Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078
[Непатентный документ 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396
[Непатентный документ 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. (2005) 20 (1), 17-29
[Непатентный документ 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J. Immunol. (2006) 176 (1), 346-356
[Непатентный документ 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637-640
[Непатентный документ 6] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2005) 102 (24), 8466-8471
[Непатентный документ 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652-665
[Непатентный документ 8] Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S., Catalytic antibodies and their applications., Curr Opin Biotechnol. (2005) 16 (6), 631-636
[Непатентный документ 9] Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J., Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2005) 334 (4), 1004-1013
[Непатентный документ 10] Dall'Acqua WF, Woods RM, Ward ES, Palaszynski SR, Patel NK, Brewah YA, Wu H, Kiener PA, Langermann S., Increasing the affinity of a human IgG1 for the neonatal Fc receptor: biological consequences., J. Immunol. (2002) 169 (9), 5171-5180
[Непатентный документ 11] Yeung YA, Leabman MK, Marvin JS, Qiu J, Adams CW, Lien S, Starovasnik MA, Lowman HB., Engineering human IgG1 affinity to human neonatal Fc receptor: impact of affinity improvement on pharmacokinetics in primates., J. Immunol. (2009) 182 (12), 7663-7671
[Непатентный документ 12] Datta-Mannan A, Witcher DR, Tang Y, Watkins J, Wroblewski VJ., Monoclonal antibody clearance. Impact of modulating the interaction of IgG with the neonatal Fc receptor., J. Biol. Chem. (2007) 282 (3), 1709-1717
[Непатентный документ 13] Clark, M., Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms., Chemical Immunology (1997) 65, 88-110
[Непатентный документ 14] Horton НМ, Bernett MJ, Pong E, Peipp M, Karki S, Chu SY, Richards JO, Vostiar I, Joyce PF, Repp R, Desjarlais JR, Zhukovsky EA., Potent in vitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19 monoclonal antibody against lymphoma and leukemia., Cancer Res. (2008) 68, 8049-8057
[Непатентный документ 15] Zalevsky J, Leung IW, Karki S, Chu SY, Zhukovsky EA, Desjarlais JR, Carmichael DF, Lawrence CE., The impact of Fc engineering on an anti-CD19 antibody: increased Fey receptor affinity enhances B-cell clearing in nonhuman primates., Blood (2009) 113, 3735-3743
[Непатентный документ 16] Jefferis R, Lund J., Interaction sites on human IgG-Fc for FcgammaR: current models., Immunol. Lett. (2002) 82, 57-65
[Непатентный документ 17] Clynes, R., Yoshizumi, Т., Moroi, Y., Houghton, A.N., and Ravetch, J.V., Fc Receptors are required for passive and active immunity to melanoma., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998) 95, 652-656
[Непатентный документ 18] Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets., Nat. Med. (2000) 6, 443-446
[Непатентный документ 19] Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H., Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene., Blood (2002) 99, 754-758
[Непатентный документ 20] Nimmerjahn F, Ravetch JV., Divergent immunoglobulin g subclass activity through selective Fc receptor binding., Science (2005) 310, 1510-1512
[Непатентный документ 21] Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions., Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1098-1104
[Непатентный документ 22] Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for Clq, Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding., Immunology (1995) 86, 319-324
[Непатентный документ 23] Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa 0, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, Vielmetter J, Carmichael DF, Hayes RJ, Dahiyat BI., Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. (2006) 103, 4005-4010
[Непатентный документ 24] Shinkawa T, Nakamura K, Yamane N, Shoji-Hosaka E, Kanda Y, Sakurada M, Uchida K, Anazawa H, Satoh M, Yamasaki M, Hanai N, Shitara K., The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity., J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473
Сущность изобретения
[Проблемы, решаемые с помощью изобретения]
Настоящее изобретение было осуществлено ввиду описанных выше обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом связанного антигена, антигенсвязывающих молекул, в которых количество антигенов, которое может связаться на одну молекулу, увеличено, антигенсвязывающих молекул с улучшенной фармакокинетикой, антигенсвязывающих молекул с усиленной внутриклеточной диссоциацией внеклеточно связанного антигена, антигенсвязывающих молекул с усиленным внеклеточным высвобождением в не связанном с антигеном состоянии, антигенсвязывающих молекул, имеющих функцию снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, фармацевтических композиций, содержащих такие антигенсвязывающие молекулы, и способов их получения.
[Средства для решения проблем]
В результате проведения тщательного исследования для достижения упомянутых выше задач, авторы настоящего изобретения создали антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы изменяется в зависимости от концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, более высокой, чем у связывающего Fcγ-рецептор домена Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, присоединенная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Более того, авторы настоящего изобретения разработали способ усиления внутриклеточного захвата связанных антигенов, способ увеличения количества антигенов, которые могут связываться с одной антигенсвязывающей молекулой, способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена, который внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, от антигенсвязывающей молекулы, способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном, и способ снижения общей концентрации антигена и концентрации свободного антигена в плазме, где способы включают контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или in vitro. Более того, авторы изобретения разработали способы получения антигенсвязывающих молекул, обладающих упомянутыми выше свойствами, и также открыли применение фармацевтических композиций, содержащих в качестве активного ингредиента, такую антигенсвязывающую молекулу или антигенсвязывающую молекулу, полученную способом получения по настоящему изобретению, и, тем самым, осуществили настоящее изобретение.
Иными словами, более конкретно, настоящее изобретение относится к [1]-[46] ниже:
[1] Фармацевтическая композиция, которая содержит антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, и где антигенсвязывающий домен обладает антигенсвязывающей активностью, которая изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью в отношении Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
[2] Фармацевтическая композиция согласно [1], где антиген представляет собой растворимый антиген.
[3] Фармацевтическая композиция согласно [1] или [2], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.
[4] Фармацевтическая композиция согласно [3], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.
[5] Фармацевтическая композиция согласно [1] или [2], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.
[6] Фармацевтическая композиция согласно [5], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.
[7] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[6], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.
[8] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[7], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.
[9] Фармацевтическая композиция согласно [8], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот выбраны из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.
[10] Фармацевтическая композиция согласно [9], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;
любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 203;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;
любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;
любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 2 32;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 23 6;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;
любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;
любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;
His в положении аминокислоты 244;
Ala в положении аминокислоты 245;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246; любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;
любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249; либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250; Phe в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254; любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255; любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256; любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260; любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;
любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;
любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;
либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;
либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;
Ala в положении аминокислоты 279;
любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;
любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;
любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;
любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;
любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;
любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;
любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;
любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;
любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;
любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;
любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;
Phe в положении аминокислоты 313; Leu в положении аминокислоты 315;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;
любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;
Не в положении аминокислоты 32 3;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;
любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;
любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;
любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;
любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;
любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 33 9;
либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;
либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;
Asp в положении аминокислоты 378;
Asn в положении аминокислоты 379;
любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;
либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;
Glu в положении аминокислоты 385;
Thr в положении аминокислоты 392;
]Leu в положении аминокислоты 396;
Lys в положении аминокислоты 421;
Asn в положении аминокислоты 427;
либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;
Met в положении аминокислоты 429;
Trp в положении аминокислоты 434;
Не в положении аминокислоты 436; и
любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[11] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[10], где Fc-область нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область любого из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
[12] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[11], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).
[13] Фармацевтическая композиция согласно любому из [1]-[11], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.
[14] Фармацевтическая композиция согласно любому из [8]-[13], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из
Asp в положении аминокислоты 238 и
Glu в положении аминокислоты 328
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[15] Способ, включающий стадию контактирования антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с Fc-областью нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, который представляет собой способ согласно любому из:
(i) способа увеличения количества антигенов, которое может связать единичная антигенсвязывающая молекула;
(ii) способа элиминации антигенов плазмы;
(iii) способа улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;
(iv) способа ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;
(v) способа ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном; и
(vi) способа снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме.
[16] Способ согласно [15], где антиген представляет собой растворимый антиген.
[17] Способ согласно [15] или [16], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.
[18] Способ согласно [17], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.
[19] Способ согласно [15] или [16], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.
[20] Способ согласно [19], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.
[21] Способ согласно любому из [15]-[20], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.
[22] Способ согласно любому из [15]-[21], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.
[23] Способ согласно [22], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.
[24] Способ согласно [23], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;
любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 22 3;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;
любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;
любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232; любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233; любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;
любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;
любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;
His в положении аминокислоты 244;
Ala в положении аминокислоты 245;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;
любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;
любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;
Phe в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;
любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;
любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;
любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;
любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;
любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;
либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;
либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;
Ala в положении аминокислоты 279;
любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;
любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;
любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;
любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;
любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;
любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;
любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;
любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;
любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;
любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;
любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;
Phe в положении аминокислоты 313;
Leu в положении аминокислоты 315;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;
любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;
Не в положении аминокислоты 323;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;
любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;
любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;
любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;
любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;
любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 339;
либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;
либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;
Asp в положении аминокислоты 378;
Asn в положении аминокислоты 379;
любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;
либо Ala, либо Не в положении аминокислоты 382;
Glu в положении аминокислоты 385;
Thr в положении аминокислоты 392;
Leu в положении аминокислоты 396;
Lys в положении аминокислоты 421;
Asn в положении аминокислоты 427;
либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;
Met в положении аминокислоты 429;
Trp в положении аминокислоты 434;
Ile в положении аминокислоты 436; и
любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[25] Способ согласно любому из [15]-[24], где Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область согласно любому из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
[26] Способ согласно любому из [15]-[25], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).
[27] Способ согласно любому из [15]-[25], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.
[28] Способ согласно любому из [22]-[27], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из
Asp в положении аминокислоты 238 и
Glu в положении аминокислоты 328
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[29] Способ, включающий стадию усиления активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативной Fc-областью IgG-человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, который представляет собой способ согласно любому из:
(i) способа изменения антигенсвязывающей молекулы, где внутриклеточный захват антигена, с которым она связывается, усиливается;
(ii) способа увеличения количества антигенов, которые могут связываться одной молекулой антигенсвязывающей молекулы;
(iii) способа повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы;
(iv) способа улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;
(v) способа ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;
(vi) способа ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигеном, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме; и
(vii) способа изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме.
[30] Способ согласно [29], где антиген представляет собой растворимый антиген.
[31] Способ согласно [29] или [30], где концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция.
[32] Способ согласно [31], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях высокой концентрации ионов кальция является более высокой, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция.
[33] Способ согласно [29] или [30], где условия концентрации ионов представляют собой условия рН.
[34] Способ согласно [33], где антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, в котором активность связывания с антигеном в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем в условиях диапазона кислых значений рН.
[35] Способ согласно любому из [29]-[34], где антигенсвязывающая молекула обладает нейтрализующей активностью против антигена.
[36] Способ согласно любому из [29]-[35], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.
[37] Способ согласно [36], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот выбраны из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличается от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.
[38] Способ согласно [33], где Fc-область представляет собой Fc-область, содержащую по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Lys или Tyr в положении аминокислоты 221;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;
любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 22 3;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;
любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;
любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,
Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;
любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;
любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;
His в положении аминокислоты 244;
Ala в положении аминокислоты 245;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246; любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;
любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;
либо Glu, либо Gin в положении аминокислоты 250;
Phe в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254; любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255; любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256; любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260; любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;
любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;
любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;
либо Phe, либо Не в положении аминокислоты 273;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;
либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;
Ala в положении аминокислоты 27 9;
любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;
любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281; любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;
любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;
любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;
любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;
любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;
любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;
любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300; любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301; Не в положении аминокислоты 302;
любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;
любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;
любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;
Phe в положении аминокислоты 313;
Leu в положении аминокислоты 315;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;
любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 32 0;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;
Ile в положении аминокислоты 32 3;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329; любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn,
Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;
любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;
любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;
любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;
любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 33 9;
либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;
либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;
Asp в положении аминокислоты 378;
Asn в положении аминокислоты 379;
любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;
либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;
Glu в положении аминокислоты 385;
Thr в положении аминокислоты 392;
Leu в положении аминокислоты 396;
Lys в положении аминокислоты 421;
Asn в положении аминокислоты 427;
либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;
Met в положении аминокислоты 429;
Trp в положении аминокислоты 434;
Ile в положении аминокислоты 436; и
любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[39] Способ согласно любому из [29]-[38], где Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, представляет собой Fc-область согласно любому из нативного IgGl человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
[40] Способ согласно любому из [29]-[39], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa (R), FcγRIIa (H), FcγRIIb, FcγRIIIa (V) или FcγRIIIa (F).
[41] Способ согласно любому из [29]-[39], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.
[42] Способ согласно любому из [36]-[41], где Fc-область представляет собой Fc-область, которая содержит по меньшей мере одно или несколько из:
Asp в положении аминокислоты 238 и
Glu в положении аминокислоты 328
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[43] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который содержит стадии:
(a) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов кальция;
(b) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях низкой концентрации ионов кальция;
(c) выбора антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбора антигенсвязывающих молекул из культуры согласно (е).
[44] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:
(a) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях высокой концентрации ионов кальция;
(b) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях низкой концентрации ионов кальция;
(c) выбора антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с) с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и (f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).
[45] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:
(a) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона нейтральных значений рН;
(b) определения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона кислых значений рН;
(c) выбора антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).
[46] Способ получения антигенсвязывающей молекулы, который включает стадии:
(a) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона нейтральных значений рН;
(b) определения антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона кислых значений рН;
(c) выбора антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывания полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, в котором активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирования клеток, в которые введен вектор, в котором полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбора антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).
[47] Способ получения согласно любому из [43]-[46], где антиген представляет собой растворимый антиген.
[48] Способ получения согласно любому из [43]-[47], где связывающий Fcγ-рецептор домен содержит Fc-область антитела.
[49] Способ получения согласно [48], где Fc-область представляет собой Fc-область, в которой по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области.
[50] Способ получения согласно [49], где Fc-область содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;
любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 223;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;
любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;
любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;
любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;
любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;
His в положении аминокислоты 244;
Ala в положении аминокислоты 245;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;
любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;
любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;
Phe в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;
любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;
любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;
любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;
любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;
любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;
либо Phe, либо Ile в положении аминокислоты 273;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;
либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;
Ala в положении аминокислоты 279;
любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;
любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;
любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;
любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;
любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;
любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;
любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;
любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301;
Ile в положении аминокислоты 302;
любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;
любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;
любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;
Phe в положении аминокислоты 313;
Leu в положении аминокислоты 315;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;
любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;
Ile в положении аминокислоты 323;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;
любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;
любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;
любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;
любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;
любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 339;
либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;
либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;
Asp в положении аминокислоты 378;
Asn в положении аминокислоты 379;
любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;
либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;
Glu в положении аминокислоты 385;
Thr в положении аминокислоты 392;
Leu в положении аминокислоты 396;
Lys в положении аминокислоты 421;
Asn в положении аминокислоты 427;
либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;
Met в положении аминокислоты 429;
Trp в положении аминокислоты 434;
Ile в положении аминокислоты 436; и
любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440,
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
[51] Способ получения согласно любому из [43]-[50], где связывающий Fcγ-рецептор домен представляет собой Fc-область любого из нативного IgG1 человека, нативного IgG2 человека, нативного IgG3 человека и нативного IgG4 человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 в соответствии с нумерацией EU, представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
[52] Способ получения согласно любому из [43]-[51], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIa, FcγRIIa (R), FcγRIIa (H), FcγRIIb, FcγRIIIa (V) или FcγRIIIa (F).
[53] Способ получения согласно любому из [43]-[51], где Fcγ-рецептор человека представляет собой FcγRIIb.
[54] Способ получения согласно любому из [48]-[53], где Fc-область содержит по меньшей мере одну или несколько аминокислот из:
Asp в положении аминокислоты 238 и
Glu в положении аминокислоты 328
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен неограниченный механизм действия для элиминации растворимого антигена из плазмы посредством введения антитела, которое связывается с антигеном зависимым от концентрации ионов образом и связывание которого с Fcγ-рецептором усилено при нейтральных значениях рН по сравнению с существующими нейтрализующими антителами.
На фиг. 2 представлена концентрация рецептора IL-6 человека с течением времени в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, или H54/L28-IgG1.
На фиг. 3 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, Fv4-IgG1-F760, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1, который лишен связывания FcγR мыши, Fv4-IgG1-F1022, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR мыши, или Fv4-IgG1-Fuc, которое представляет собой антитело Fv4-IgG1 с низким содержанием фукозы.
На фиг. 4 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, или антигенсвязывающие молекулы, содержащие в качестве тяжелой цепи Fv4-IgGl-F1022 или Fv4-IgG1-F1093, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1022 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 5 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, или антигенсвязывающие молекулы, содержащие в качестве тяжелой цепи Fv4-IgG1-F1022 или Fv4-IgG1-F1093, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1-F1022 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 6 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087, которое является вариантом Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR мыши (в частности, усиленным связыванием мыши FcγRIIb и связыванием FcγRIII мыши) и Fv4-IgG1-F1182, которое представляет собой вариант Fv4-IgG1 с усиленным связыванием FcγR (в частности, усиленным связыванием FcγRI и связыванием FcγRIV).
На фиг. 7 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, которые представляют собой варианты Fv4-IgG1-F1087 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 8 представлена концентрация с течением времени введенных антигенсвязывающих молекул в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 и Fv4-IgG1-F1181, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1182 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 9 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, которые являются вариантами Fv4-IgG1-F1087 с повышенным связыванием FcRn в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 10 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1182 и Fv4-IgG1-F1181, которое является вариантом Fv4-IgG1-F1182 с повышенным связыванием FcRn, в диапазоне кислых значений рН.
На фиг. 11 представлены результаты изменения концентрации в плазме Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087 у трансгенной мыши с FcRn человека, когда мыши вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087.
На фиг. 12 представлены результаты изменения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека у трансгенной мыши с FcRn человека, когда мыши вводили Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F1782 или Fv4-IgG1-F1087.
На фиг. 13 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме нормальных мышей, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.
На фиг. 14 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом FcγRIII, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.
На фиг. 15 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.
На фиг. 16 представлена концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей с дефицитом FcγRIIb, которым вводили Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши, и Fv4-mIgG1-mF46, которое является вариантом Fv4-mIgG1 с дополнительно усиленным связыванием FcγRIIb мыши и связыванием FcγRIII мыши.
На фиг. 17 представлен результат оценки способности к агрегации тромбоцитов иммунокомплекса омализумаб-G1d-v3/IgE с помощью анализа агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из доноров с аллотипом FcγRIIa (R/H).
На фиг. 18 представлен результат оценки способности к агрегации тромбоцитов иммунокомплекса омализумаб-G1d-v3/IgE с помощью анализа агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из доноров с аллотипом FcγRIIa (Н/Н).
На фиг. 19 представлен результат оценки экспрессии CD62p на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенная черным цветом область на графике указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с PBS. Область, которая не закрашена на графике, указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с иммунокомплексом.
На фиг. 20 представлен результат оценки экспрессии активного интегрина на поверхности мембраны тромбоцитов. Закрашенная черным цветом область на графике указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с PBS. Область, которая не закрашена на графике, указывает на результат стимуляции посредством ADP после реакции с иммунокомплексом.
На фиг. 21 представлены результаты оценки активности агрегации тромбоцитов, индуцируемой иммунокомплексом омализумаб-BP230/IgE и иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE в анализе агрегации тромбоцитов с использованием тромбоцитов, происходящих из донора с полиморфизмом FcγRIIa (R/H).
На фиг. 22 представлены результаты оценки экспрессии CD62p на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенный серым цветом график указывает на результат, когда стимуляцию посредством добавления ADP проводили после реакции с PBS, сплошная линия и пунктирная линия указывают на результаты, когда стимуляцию посредством ADP проводили после реакции с иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE и иммунокомплексом омализумаб-ВР230/IgE, соответственно.
На фиг. 23 представлены результаты оценки активации экспрессии интегринов на поверхности мембраны промытых тромбоцитов. Закрашенный серым цветом график указывает на результат, когда стимуляцию посредством добавления ADP проводили после реакции с PBS, сплошная линия и пунктирная линия указывают на результаты, когда стимуляцию посредством ADP проводили после реакции с иммунокомплексом омализумаб-G1d-v3/IgE и иммунокомплексом омализумаб-ВР230/IgE, соответственно.
На фиг. 24 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта PD, а на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта PD. Значение величины связывания каждого варианта PD с каждым FcγR делили на значение величины связывания IL6R-F652/IL6R-L, которое представляет собой контрольное антитело до внесения изменения (IL6R-F652, соответствующая SEQ ID NO: 142, представляет собой тяжелую цепь антитела, содержащую измененную Fc с заменой Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp), с каждым FcγR; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве относительной величины активности связывания для каждого варианта PD с каждым FcγR. На графике F652 на фигуре показана величина для IL6R-F652/IL6R-L.
На фиг. 25 показан график, на котором на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в GpH7-B3 (SEQ ID NO: 159)/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 160), которое не имеет изменения P238D, и на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для вариантов, полученных путем внесения каждого изменения в IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142)/IL6R-L, имеющего изменение P238D. Значение величины связывания FcγRIIb каждого варианта делили на значение величины связывания FcγRIIb предварительно измененного антитела; а затем полученную величину умножали на 100 и использовали в качестве величины относительной активности связывания. В этом случае, область А содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb в обоих случаях, когда изменение вносят в GpH7-B3/GpL16-k0, которое не имеет P238D, и когда изменение вносят в IL6R-F652/IL6R-L, которое имеет P238D. Область В содержит изменения, которые проявляют эффект усиления связывания FcγRIIb при внесении в GpH7-B3/GpL16-k0, которое не имеет P238D, но не проявляют эффекта усиления связывания FcγRIIb при внесении в IL6R-F652/IL6R-L, которое имеет P238D.
На фиг. 26 показана кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг. 27 представлено изображение наложения кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена А Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Сα.
На фиг. 28 показано сравнение детальной структуры в области P238D после наложения кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, в отношении только СН2-домена A Fc или только СН2-домена В Fc путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основании расстояний между парами атомов Сα.
На фиг. 29 показано, что водородная связь может находиться между основной цепью Gly в положении 237 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене A Fc, и Tyr в положении 160 в FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc (P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг. 30 показано, что между Asp в положении 270 (указанном согласно нумерации EU) в СН2-домене В Fc, и Arg в положении 131 FcγRIIb может быть выявлено электростатическое взаимодействие в кристаллической структуре комплекса внеклеточной области Fc(P238D)/FcγRIIb.
На фиг. 31 представлен график, на котором на горизонтальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIb для каждого варианта 2В, и на вертикальной оси показана относительная величина активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта 2В. Значение величины связывания каждого варианта 2В с каждым FcγR делили на значение величины связывания контрольного антитела перед изменением (измененная Fc с заменой Pro в положении 238 (указанном согласно нумерации EU) на Asp) для каждого FcγR; а затем полученную величину умножали на 100, и использовали в качестве величины относительной активности связывания каждого варианта 2В в отношении каждого FcγR.
На фиг. 32 показан Glu в положении 233 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг. 33 показан Ala в положении 330 (указанном согласно нумерации EU) в цепи A Fc и окружающие остатки во внеклеточной области FcγRIIb в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
На фиг. 34 показаны структуры Pro в положении 271 (указанном согласно нумерации EU) цепи В Fc после наложения кристаллических структур комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa путем аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα, в отношении В-цепи Fc.
На фиг. 35 представлено изображение комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенное посредством рентгеноструктурного анализа. Для каждого из доменов СН2 и СН3 в Fc-области, домены слева обозначены как домен А и домены справа обозначены как домен В.
На фиг. 36 представлено сравнение после наложения структур комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa (код PDB: 3RY6), определенных с помощью рентгеноструктурного анализа, в отношении СН2-домена А Fc-области посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα. На этой диаграмме структура, изображенная с помощью жирной линии, демонстрирует комплекс Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, в то время как структура, изображенная тонкой линией, указывает на структуру Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa. Только СН2-домен А Fc-области изображен для комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIa.
На фиг. 37 представлена рентгеновская кристаллическая структура комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, детальная структура в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области, который образует водородную связь с Tyr в положении 160 в FcγRIIb в структуре основной цепи.
На фиг. 38 представлена рентгеновская кристаллическая структура комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, структура аминокислотных остатков в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области, который образует водородную связь с Tyr в положении 160 в FcγRIIb в структуре основной цепи.
На фиг. 39 представлено сравнение в области петли в положениях 266-271 (нумерация EU) после наложения рентгеновских кристаллических структур комплекса Fc (P238D)/внеклеточный домен FcγRIIb, представленного в примере 10, и комплекса Fc (Р208)/внеклеточный домен FcγRIIb в отношении СН2-домена В Fc-области посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα. По сравнению с Fc (P238D), Fc (Р208) имеет изменение H268D в положении 268 (нумерация EU) и изменение P271G в положении 271 (нумерация EU) в петле.
На фиг. 40 представлена диаграмма, на которой показана структура в области Ser239 в СН2-домене В Fc-области в рентгеновской кристаллической структуре комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.
На фиг. 41 представлено сравнение после наложения трехмерных структур комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, определенных с помощью рентгеноструктурного анализа посредством аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Сα.
На фиг. 42 представлено сравнение в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области между рентгеновскими кристаллическими структурами комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.
На фиг. 43 представлено сравнение в области Asp в положении 237 (нумерация EU) в СН2-домене В Fc-области между рентгеновскими кристаллическими структурами комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, вместе с электронной плотностью, определенной с помощью рентгеноструктурного анализа с использованием коэффициента 2Fo-Fc.
На фиг. 44 представлено сравнение между последовательностями константной области G1d и G4d. На диаграмме аминокислоты, заключенные в жирную рамку, указывают на положения с отличающимися аминокислотными остатками между G1d и G4d.
На фиг. 45 представлено изменение концентрации в плазме антитела GA2-IgG1 и GA2-F1087 у нормальных мышей.
На фиг. 46 представлено изменение концентрации в плазме hIgA у нормальных мышей, которым вводили GA2-IgG1 и GA2-F1087.
На фиг. 47 представлено изменение концентрации в плазме антител 278-IgG1 и 278-F1087 у мышей C57BL/6J.
На фиг. 48 представлено изменение концентрации в плазме hIgE (Asp6) у мышей C57BL/6J, которым вводили 278-IgG1 и 278-F1087.
На фиг. 49 представлена структура CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа. На (i) представлена кристаллическая структура CDR3 тяжелой цепи, полученная в условиях кристаллизации в присутствии ионов кальция. На (ii) представлена кристаллическая структура CDR3 тяжелой цепи, полученная в условиях кристаллизации в отсутствие ионов кальция.
На фиг. 50 представлена концентрация в плазме с течением времени каждого антитела у нормальных мышей, которым вводили антитело H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1.
На фиг. 51 представлена концентрация в плазме с течением времени растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R) у нормальных мышей, которым вводили антитело H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1.
На фиг. 52 представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность Vk5-2 человека, и антитела, имеющего последовательность hVk5-2_L65, которая имеет измененную последовательность гликозилирования в последовательности Vk5-2 человека. Сплошная линия показывает хроматограмму для антитела, имеющего последовательность Vk5-2 человека (тяжелая цепь: CIM_H (SEQ ID NO: 67); легкая цепь: hVk5-2 (SEQ ID NO: 4)); пунктирная линия показывает хроматограмму для антитела, имеющего последовательность hVk5-2_L65 (тяжелая цепь: CIM_H (SEQ ID NO: 67); легкая цепь: hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 70)).
На фиг. 53А представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) и антитела, имеющего последовательность, в которой Asp (D) в последовательности LfVk1_Ca заменен на Ala, (А) после хранения при 5°С (сплошная линия) или 50°С (пунктирная линия). После хранения при 5°С, наиболее высокий пик в хроматограмме для каждого антитела определяется как основной пик и ось у каждой ионообменной хроматографии нормализовывали к главному пику. На графике представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) в качестве легкой цепи.
На фиг. 53В представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Cal (SEQ ID NO: 85) в качестве легкой цепи.
На фиг. 53С представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca2 (SEQ ID NO: 86) в качестве легкой цепи.
На фиг. 53D представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca3 (SEQ ID NO: 87) в качестве легкой цепи.
На фиг. 54А представлены ионообменные хроматограммы для антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83)) и антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca6 (тяжелая цепь: GC_H (SEQ ID NO: 51); легкая цепь: LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88)), в котором Asp (D) в положении 30 (нумерация Kabat) в последовательности LfVk1_Ca заменен на Ser (S), после хранения при 5°С (сплошная линия) или 50°С (пунктирная линия). После хранения при 5°С наиболее высокий пик на хроматограмме для каждого антитела определяется как основной пик и ось у каждой ионообменной хроматограммы нормализовывали к основному пику. На графике представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) в качестве легкой цепи.
На фиг. 54В представлена хроматограмма для антитела, имеющего LfVk1_Ca6 (SEQ ID NO: 88) в качестве легкой цепи.
На фиг. 55 представлена взаимосвязь между модельным распределением аминокислот (указанным как "Модель") и распределением аминокислот для информации о последовательности из 290 клонов, выделенных из Е. coli, в которые была введена библиотека генов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом (указанным как "Библиотека"). На горизонтальной оси указано положение аминокислот (нумерация Kabat). На вертикальной оси указан процент распределения аминокислот.
На фиг. 56 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RC1IgG_010, антитела 6RC1IgG_012 и антитела 6RC1IgG_019 в условиях высокой концентрации ионов кальция (1,2 мМ). На горизонтальной оси представлено время и на вертикальной оси представлена величина RU.
На фиг. 57 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RC1IgG_010, антитела 6RC1IgG_012 и антитела 6RC1IgG_019 в условиях низкой концентрации ионов кальция (3 мкМ). На горизонтальной оси показано время и на вертикальной оси представлена величина RU.
На фиг. 58 представлена взаимосвязь между модельным распределением аминокислот (указанным как "Модель") и распределением аминокислот для информации о последовательности из 132 клонов, выделенных из Е. coli, в которые введена библиотека генов антител, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом (указанным как "Библиотека"). На горизонтальной оси представлено положение аминокислот (нумерация Kabat). На вертикальной оси представлен процент распределения аминокислот.
На фиг. 59 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RpH#01, антитела 6RpH#02 и антитела 6RpH#03 при рН 7,4. На горизонтальной оси представлено время и на вертикальной оси представлена величина RU.
На фиг. 60 представлены сенсограммы для антитела против IL-6R (тоцилизумаб), антитела 6RpH#01, антитела 6RpH#02 и антитела 6RpH#03 при рН 6,0. На горизонтальной оси показано время и на вертикальной оси представлена величина RU.
На фиг. 61А представлена график ответов ECL на нативную Fc и измененную Fc из сывороток, полученных от 15-30 независимых пациентов с ревматизмом. На графиках ответов ECL на нативную Fc (фиг. 61А), представлены Fv4-YTE (фиг. 61В), Fv4-F1166 (=YTE+Q438R/S440E) (фиг. 61С), Fv4-F1167 (=YTE+S424N) (фиг. 61D), Fv4-LS (фиг. 61Е), Fv4-F1170 (=LS+Q438R/S440E) (фиг. 61F), Fv4-F1171 (=LS+S424N) (фиг. 61G, Fv4-N434H (фиг. 61Н), Fv4-F1172 (=N434H+Q438R/S440E) (фиг. 61I), Fv4-F1173 (=N434H+S424N) (фиг. 61J), соответственно.
Фиг. 61В является продолжением фиг. 61А.
Фиг. 61С является продолжением фиг. 61В.
Фиг. 61D является продолжением фиг. 61С.
Фиг. 61Е является продолжением фиг. 61D.
Фиг. 61Е является продолжением фиг. 61Е.
Фиг. 61G является продолжением фиг. 61F.
Фиг. 61Н является продолжением фиг. 61G.
Фиг. 61I является продолжением фиг. 61Н.
Фиг. 61J является продолжением фиг. 61I.
На фиг. 62А представлен график ответов ECL на измененную Fc из сывороток, полученных от 30 независимых пациентов с ревматизмом. На графиках ответов ECL на Fv4-LS (фиг. 62А), представлены Fv4-F1380 (фиг. 62В), Fv4-F1384 (фиг. 62С), Fv4-F1385 (фиг. 62D), Fv4-F1386 (фиг. 62Е), Fv4-F1388 (фиг. 62F) и Fv4-F1389 (фиг. 62G), соответственно.
Фиг. 62В является продолжением фиг. 62А.
Фиг. 62С является продолжением фиг. 62В.
Фиг. 62D является продолжением фиг. 62С.
Фиг. 62Е является продолжением фиг. 62D.
Фиг. 62F является продолжением фиг. 62Е.
Фиг. 62G является продолжением фиг. 62F.
[Способы осуществления изобретения]
Ниже предоставлены определения и подробное описание, чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, проиллюстрированного в настоящем описании.
Аминокислоты
В рамках настоящего изобретения аминокислоты описаны с помощью однобуквенного или трехбуквенного кодов или обоих из них, например, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V.
Изменение аминокислот
Для изменений аминокислот в аминокислотной последовательности антигенсвязывающей молекулы, можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как способы сайт-направленного мутагенеза (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Вставки, делеции и/или замены аминокислот вносят соответствующим образом с помощью этих известных способов. Замена аминокислотных остатков означает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком для цели изменения аспектов, таких как следующие:
(a) структура основной цепи полипептида в области спиральной структуры или области структуры слоя;
(b) заряд или гидрофобность заданного участка; или
(c) длина боковой цепи.
Аминокислотные остатки подразделяют на следующие группы, исходя из свойств боковых цепей, включенных в их структуры:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu и Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn и Gln;
(3) кислые: Asp и Glu;
(4) основные: His, Lys и Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly и Pro; и
(6) ароматические: Trp, Tyr и Phe.
Замену между аминокислотными остатками в каждой из этих групп называют консервативной заменой. С другой стороны, замену между аминокислотными остатками из различных групп аминокислот называют неконсервативной заменой. Замены в рамках настоящего изобретения могут представлять собой консервативные замены или неконсервативные замены или комбинацию консервативных и неконсервативных замен. Более того, в качестве способов изменения аминокислот для замены на ненативные аминокислоты можно использовать множество известных способов (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; и Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, которая имеет ненативную аминокислоту, связанную с комплементарной амбер-супрессорной тРНК кодона UAG (амбер-кодон), который является одним из стоп-кодонов.
Более того, в качестве обозначения аминокислотного изменения можно использовать обозначение, в котором используются однобуквенные коды аминокислот для аминокислоты до лигирования и аминокислоты после изменения, перед и после номера, указывающего на конкретное положение, соответственно. Например, изменение P238D, которое используют при замене аминокислоты Fc-области, включенной в константную область антитела, обозначает замену Pro в положении 238 (в соответствии с нумерацией EU) на Asp. Иными словами, номер указывает на положение аминокислоты в соответствии с нумерацией EU, однобуквенный код аминокислоты, находящийся перед номером, указывает на аминокислоту до замены и однобуквенный код аминокислоты, находящийся после номера, указывает на аминокислоту после замены.
И/или
Как используют в рамках изобретения, термин "и/или" означает комбинацию терминов до и после выражения "и/или" и включает каждую комбинацию, где "и" и "или" пригодным образом комбинируются. В частности, например, выражение "аминокислоты в положениях 326, 328 и/или 428 являются замещенными" включает следующие варианты изменений аминокислот:
аминокислота(ы) в (а) положении 326, (b) положении 328, (с) положении 428, (d) положениях 326 и 328, (е) положениях 326 и 428, (f) положениях 328 и 428 и (g) положениях 326, 328 и 428.
Антигены
Как используют в рамках изобретения, структура "антигена", в частности, не ограничивается конкретной структурой при условии, что она включает эпитоп, который связывается антигенсвязывающим доменом. В другом значении антиген может представлять собой неорганический материал или органический материал и предпочтительно он представляет собой растворимый антиген, который присутствует в жидкости организма и который в одном варианте осуществления может связываться антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению. Примерами антигенов являются следующие молекулы:
17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозиновый рецептор A1, A33, ACE, ACE-2, активны, активны A, активны AB, активны В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/ТАСЕ, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический пептид, интегрин av/b3, Ax1, b2M, В7-1, В7-2, В7-Н, В-лимфоцитарный стимулирующий фактор (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, ВАK, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bcl, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 остеогенин, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, костный нейротрофический фактор, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактор комплемента 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, кальцитонин, сАМР, карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированный со злокачественной опухолью, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсин Botulinum, токсин Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератиновый ассоциированный с опухолью антиген, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, регулирующий фактор комплемента (фактор, ускоряющий распад), дез-(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, ДНКМ-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептор эндотелина, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, фактор активации фибробластов (FAP), Fas, FcRI, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1, GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp 130, gp72, GRO, рилизинг-фактор гормона роста, гаптен (NP-cap или NIP-cap), НВ-EGF, НСС, гликопротеин оболочки gB HCMV, гликопротеин оболочки дН HCMV, UL HCMV, гемопоэтический фактор роста (HGF), НерВ gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеин gD HSV, HGFA, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), gp120 HIV, петля V3 gp 120 IIIB HIV, HLA, HLA-DR, HM1,24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, сердечный миозин человека, цитомегаловирус человека (HCMV), гормон роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептор IgA, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа-2, интегрин альфа-3, интегрин альфа-4, интегрин альфа4/бета1, интегрин альфа4/бета7, интегрин альфа5 (альфа V), интегрин альфа5/бета1, интегрин альфа5/бета3, интегрин альфа6, интегрин бета1, интегрин бета2, интерферон-гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин LI, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, КС, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bpl, LBP, LDGF, LECT2, lefty, антиген Lewis-Y, ассоциированный с Lewis-Y антиген, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, белок поверхности легких, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина-бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, МАР2, MARC, МСАМ, МСАМ, МСК-2, МСР, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептор MGDF, MGMT, МНС (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, МК, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Мро, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, мюллерово ингибиторное вещество, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, адгерин N-C, NCA90, NCAM, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нервов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGGI, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pl50, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадгерин, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, простат-специфический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, А-цепь релаксина, В-цепь релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеин-72), TARC, ТСА-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, ТЕСК, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, панспецифический TGF-бета, TGF-бета RI (ALK-5), TGF-бета RII, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевой фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа-бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 R5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD 120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD 120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (0X40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (лиганд ODF TRANCE/RANK, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд Apo-3 TWEAK, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд IVEM LIGHT I, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганд AITR лиганда GITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a коннектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD154 CD40, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганд Apo-1 Fas-лиганда, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD70 CD27), TNFSF8 (лиганд CD153 CD30), TNFSF9 (лиганд CD137 лиганда 4-1ВВ), TP-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, ассоциированный с опухолью CA125, ассоциированный с опухолью антиген, экспрессирующий ассоциированные с Lewis-Y углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VE-кадгерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный анотиген, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрин VNR, фактор Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, αβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный LDL, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, Clr, Cls, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, С6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевой фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор IXa, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор Xlla, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA, SIP; рецептор ацетилхолина, AdipoRl, AdipoR2, ADP рибозилциклазу-1, альфа-4/бета-7 интегрин, альфа-5/бета-1 интегрин, альфа-v/бета-6 интегрин, альфа-v/бета-1 интегрин, лиганд ангиопоэтина-2, Angptl2, Anthrax, кадгерин, карбоангидразу-IX, CD105, CD155, CD158a, CD37, CD49b, CD51, CD70, CD72, клаудин 18, токсин Clostridium difficile, CS1, лиганд Delta-подобного белка 4, оксидазу DHICA, лиганд Dickkopf-1, дипептидилпептидазу IV, EPOR, F-белок RSV, фактор Ia, FasL, рецептор фолатов альфа, рецептор глюкагона, рецептор глюкагон-подобного пептида 1, глутаматкарбоксипептидаза II, GMCSFR, гликопротеин Е2 вируса гепатита С, гепцидин, рецептор IL-17, рецептор IL-22, рецептор IL-23, рецептор IL-3, тирозинкиназу Kit, лейцин-блогатый альфа-2-гликопротеин 1 (LRG1), рецептор лизосфинголипидов, мембранный гликопротеин OX2, мезотелин, МЕТ, MICA, MUC-16, ассоциированный с миелином гликопротеин, нейропилин-1, нейропилин-2, рецептор Nogo, PLXNA1, PLXNA2, PLXNA3, PLXNA4A, PLXNA4B, PLXNB1, PLXNB2, PLXNB3, PLXNC1, PLXND1, лиганд запрограммированной гибели клеток 1, конвертазу пробелков РС9, лиганд 1 гликопротеина Р-селектина, RAGE, ретикулон 4, RF, RON-8, SEMA3A, SEMA3B, SEMA3C, SEMA3D, SEMA3E, SEMA3F, SEMA3G, SEMA4A, SEMA4B, SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F, SEMA4G, SEMA5A, SEMA5B, SEMA6A, SEMA6B, SEMA6C, SEMA6D, SEMA7A, шига-подобный токсин II, рецептор 1 сфингозин-1-фосфата, ST2, стафилококковую липотейхоевую кислоту, тенасцин, TG2, тимический стромальный рецептор лимфопротеинов, рецептор 12А суперсемейства TNF, трансмембранный гликопротеин NMB, TREM-1, TREM-2, трофобластный гликопротеин, рецептор TSH, TTR, тубулин и ULBP2; и рецепторы для факторов роста и гормонов, молекулы, которые существуют в их растворимой форме и не заякорены на клетках в жидкостях организма. Например, среди рецепторов растворимые антигены, присутствующие в жидкости организма вследствие некоторого механизма, включающего опосредуемое протеазой расщепление рецепторов и т.п., экспрессируемых на клеточной поверхности, также являются пригодными примерами растворимых антигенов по настоящему изобретению. Примеры таких молекул могут включать растворимую молекулу IL-6R (J. Immunol. (1994) 152, 4958-4968) и CD20, а также CD52 (Br. J. Haematol. (2003) 123 (5), 850-857), описанные в настоящем описании. Более того, также примерами растворимых антигенов по настоящему изобретению являются не только молекулы, по своей природе экспрессируемые в живом организме, но также растворимые антигены, существующие в жидкости организма, которые являются инфекционными молекулами, такими как или антигены, представляемые инфекционными организмами, такими как вирусы, или представляемые на таких организмах. Пригодные примеры жидкости организма включают кровь, плазму, сыворотку, мочу, лимфу, слюну и слезную жидкость.
Эпитоп
"Эпитоп" означает антигенную детерминанту в антигене и относится к антигенному центру, с которым связывается антигенсвязывающий домен антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем описании. Таким образом, например, эпитоп может быть определен в соответствии с его структурой. Альтернативно эпитоп может быть определен в соответствии с антигенсвязывающей активностью антигенсвязывающей молекулы, которая распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, эпитоп может быть указан с помощью аминокислотных остатков, образующих эпитоп. Альтернативно, когда эпитоп представляет собой цепь сахаров, эпитоп может быть указан с помощью его определенной структуры цепи сахаров.
Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, в котором распознается его первичная аминокислотная последовательность. Такой линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере три и наиболее часто по меньшей мере пять, например, от приблизительно 8 до приблизительно 10 или 6-20 аминокислот в его конкретной последовательности.
В противоположность линейному эпитопу, "конформационный эпитоп" представляет собой эпитоп, в котором первичная аминокислотная последовательность, содержащая эпитоп, не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, первичная аминокислотная последовательность конформационного эпитопа не обязательно распознается определяющим эпитоп антителом). Конформационные эпитопы могут содержать большее количество аминокислот по сравнению с линейными эпитопами. Антитело, распознающее конформационный эпитоп, распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда молекула белка сворачивается и формирует трехмерную структуру, аминокислоты и/или основные цепи полипептида, которые образуют коноформационный эпитоп, располагаются рядом друг с другом, и эпитоп становится распознаваемым для антитела. Способы определения конформаций эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию, двумерный ядерный магнитный резонанс, сайт-специфическое спиновое мечение и электронный парамагнитный резонанс, он они не ограничиваются ими. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).
Активность связывания
Примеры способа оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, описаны ниже. В соответствии с примерами ниже, также можно соответствующим образом проводить способы оценки связывания эпитопа исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен, с антигеном, отличным от IL-6R.
Например, то, что исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, распознает линейный эпитоп в молекуле IL-6R, можно подтвердить, например, как описано ниже. Для указанной выше цели синтезируют линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. Пептид можно синтезировать химически или его можно получать способами генетической инженерии с использованием области, кодирующей аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену в кДНК IL-6R. Затем исследуемую антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен для IL-6R, оценивают в отношении ее активности связывания с линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен. Например, иммобилизованный линейный пептид можно использовать в качестве антигена в ELISA для оценки активности связывания антигенсвязывающей молекулы с пептидом. Альтернативно активность связывания с линейным пептидом можно оценивать, исходя из уровня, на котором линейный пептид ингибирует связывание антигенсвязывающей молекулы с клетками, экспрессирующими IL-6R. Эти исследования могут продемонстрировать активность связывания антигенсвязывающей молекулы с линейным пептидом.
Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, конформационного эпитопа можно оценивать следующим образом. Для указанной выше цели получают экспрессирующие IL-6R клетки. Наличие распознавания исследуемой антигенсвязывающей молекулой, содержащей антигенсвязывающий домен IL-6R, конформационного эпитопа, можно определять, когда она прочно связывается с экспрессирующими IL-6R клетками при контакте, но по существу не связывается с иммобилизованным линейным пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. В рамках настоящего изобретения "по существу не связывает" означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее, и особенно предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессрующими IL-6R человека.
Способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками, включают, например, способы, описанные в Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). В частности, оценку можно проводить на основе принципа ELISA или активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS) с использованием в качестве антигена экспрессирующих IL-6R клеток.
В формате ELISA активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигнала, генерируемого ферментативной реакцией. В частности, исследуемую антигенсвязывающую молекулу комплекс добавляют в планшет для ELISA, на котором иммобилизованы эксперессирующие IL-6R клетки. Затем антигенсвязывающую молекулу, связанную с клетками, выявляют с использованием меченного ферментом антитела, которое распознает исследуемую антигенсвязывающую молекулу. Альтернативно, когда используют FACS, приготавливают серии разведении исследуемой антигенсвязывающей молекулы и можно определять титр связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками для сравнения активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующими IL-6R клетками.
Связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы с антигеном, экспрессируемым на поверхности клеток, суспендированных в буфере или сходных с ним, можно выявлять с использованием проточного цитометра. Известные проточные цитометры включают, например, следующие устройства:
FACSCanto™ II
FACSAria™
FACSArray™
FACSVantage™ SE
FACSCalibur™ (все являются торговыми названиями BD Biosciences)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все являются торговыми названиями Beckman Coulter).
Предпочтительные способы оценки активности связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, с антигеном, включают, например, следующий способ. Сначала экспрессирующие IL-6R клетки подвергают реакции с исследуемой антигенсвязывающей молекулой, а затем их окрашивают меченным FITC вторичным антителом, которое распознает антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу надлежащим образом разбавляют подходящим буфером с получением молекулы с желаемой концентрацией. Например, молекулу можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с использованием FACSCalibur (BD). Интенсивность флуоресценции, полученную с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. среднее геометрическое значение, отражает количество антитела, связанного с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы, которую отражает количество связанной исследуемой антигенсвязывающей молекулы, можно определять путем определения геометрического среднего значения.
То, обладает ли исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, общим эпитопом с другой антигенсвязывающей молекулой, можно оценивать на основе конкуренции между двумя молекулами за один и тот же эпитоп. Конкуренцию между антигенсвязывающими молекулами можно выявлять с помощью анализа перекрестного блокирования и т.п. Например, предпочтительным анализом перекрестного блокирования является конкурентный анализ ELISA.
В частности, в анализе перекрестного блокирования белок IL-6R, иммобилизованный на лунках микропланшета для титрования, предварительно инкубируют в присутствии или в отсутствие являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, а затем к ним добавляют антигенсвязывающую молекулу. Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с белком IL-6R в лунках, непрямо коррелирует со связывающей способностью являющейся кандидатом конкурентной антигенсвязывающей молекулы, которая конкурирует за связывание с тем же эпитопом. Следовательно, чем более высокой является аффинность конкурентной антигенсвязывающей молекулы к тому же эпитопу, тем более низкой является активность связывания исследуемой антигенсвязывающей молекулы с покрытыми белком IL-6R лунками.
Количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с лунками через IL-6R, можно без труда определить путем предварительного мечения антигенсвязывающей молекулы. Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу определяют с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестного блокирования, в котором используются ферментные метки, такие пероксидаза, называют "конкурентным анализом ELISA". Антигенсвязывающую молекулу также можно метить другими агентами для мечения, которые обеспечивают выявление или измерение. В частности, известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.
Когда являющаяся кандидатом конкурентная антигенсвязывающая молекула может блокировать связывание исследуемой антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен для IL-6R, по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50%, и более предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению с активностью связывания в контрольном эксперименте, проведенном в отсутствие конкурентной антигенсвязывающей молекулы, то определяют, что исследуемая антигенсвязывающая молекула по существу связывается с тем же эпитопом, с которым связывается конкурентная антигенсвязывающая молекула, или конкурирует за связывание с тем же эпитопом.
Когда структура эпитопа, с которым связывается исследуемая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен для IL-6R, уже идентифицирована, тогда то, имеют ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общий эпитоп, можно оценивать путем сравнения активности связывания двух антигенсвязывающих молекул с пептидом, полученным путем внесения аминокислотных мутаций в пептид, формирующий эпитоп.
Для измерения указанной выше активности связывания, например, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул в отношении линейного пептида, в который внесена мутация, сравнивают в описанном выше формате ELISA. Помимо способов ELISA, активность связывания с мутантным пептидом, связанным с колонкой, можно определять путем пропускания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул через колонку, а затем количественного определения антигенсвязывающей молекулы, элюированной в элюирующем растворе. Способы адсорбции мутантного пептида на колонку, например, в форме слитого пептида с GST, известны.
Альтернативно, когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, тогда то, обладают ли исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы общим эпитопом, можно оценивать следующим способом. Сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки и клетки, экспрессирующие IL-6R с мутацией, внесенной в эпитоп. Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы добавляют в суспензию клеток, полученную суспендированием этих клеток в соответствующем буфере, таком как PBS. Затем клеточные суспензии надлежащим образом промывают буфером, и к ним добавляют меченное FITC антитело, которое распознает исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы. Интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, определяют с использованием FACSCalibur (BD). Исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы надлежащим образом разбавляют с использованием подходящего буфера и используют в желаемых концентрациях. Например, их можно использовать в концентрации в диапазоне от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализа с использованием программного обеспечения CELL QUEST (BD), т.е. геометрическое среднее значение, отражает количество меченного антитела, связавшегося с клетками. Следовательно, активность связывания исследуемых и контрольных антигенсвязывающих молекул, которую отражает количество связавшегося меченого антитела, можно определять путем измерения геометрического среднего значения.
В описанном выше способе то, что антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R," можно оценивать, например, следующим способом. Сначала исследуемые и контрольные антигенсвязывающие молекулы, связанные с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции клеток. Когда используют FACSCalibur для выявления флуоресценции проточной цитометрией, определенную интенсивность флуоресцении можно анализировать с использованием программного обеспечения CELL QUEST. Из геометрических средних значений в присутствии и в отсутствие антигенсвязывающей молекулы можно вычислять сравнительное значение (ΔGeo-Mean) по следующей формуле для определения соотношения увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания антигенсвязывающей молекулой.
ΔGeo-Mean = Geo-Mean (в присутствии антигенсвязывающей молекулы)/Geo-Mean (в отсутствие антигенсвязывающей молекулы)
Геометрическое среднее сравнительное значение (значение ΔGeo-Mean для мутантной молекулы IL-6R), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R, сравнивают со сравнительным значением ΔGeo-Mean, которое отражает количество исследуемой антигенсвязывающей молекулы, связавшейся с экспрессирующими IL-6R клетками. В этом случае, особенно предпочтительно, чтобы концентрации исследуемой антигенсвязывающей молекулы, используемой для определения сравнительных значений ΔGeo-Mean для экспрессирующих IL-6R клеток и клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, были скорректированы так, чтобы они были равными или по существу равными. В качестве контрольной антигенсвязывающей молекулы используют антигенсвязывающую молекулу, для которой подтверждено, что она распознает эпитоп в IL-6R.
Если сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, меньше чем сравнительное значение ΔGeo-Mean исследуемой антигенсвязывающей молекулы для экспрессирующих IL-6R клеток по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30%, и особенно предпочтительно на 15%, тогда исследуемая антигенсвязывающая молекула "по существу не связывается с клетками, экспрессирующими мутантный IL-6R". Формула для определения значения Geo-Mean (геометрического среднего значения) описана в руководстве пользователя программного обеспечения CELL QUEST (BD biosciences). Если сравнение показывает, что сравнительные величины по существу эквивалентны, то может быть определено, что эпитоп для исследуемой и контрольной антигенсвязывающих молекул является одним и тем же.
Антигенсвязывающий домен
В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающий домен" может представлять собой любую структуру при условии, что она связывается с представляющим интерес антигеном. Такие домены предпочтительно включают, например:
вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител;
модуль приблизительно из 35 аминокислот, называемый А-доменом, который содержится в мембранном белке клеток авимере in vivo (WO 2004/044011, WO 2005/040229);
аднектин, содержащий домен 10Fn3, который связывается с белковой частью фибронектина - гликопротеина, экспрессирующегося на клеточной мембране (WO 2002/032925);
аффитело, которое состоит из трехспирального пучка из 58-аминокислот на основе каркаса связывающего IgG домена белка А (WO 1995/001937);
Смоделированные белки анкиринового повтора (DARPin), которые представляют собой область, экспонированную на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), имеющих структуру, в которой субъединица, состоящая из поворота, содержащего 33 аминокислотных остатка, две антипараллельных спирали и петли многократно сложены в стопку (WO 2002/020565);
антикалины и т.п., которые представляют собой домены, состоящие из четырех петель, которые поддерживают одну сторону структуры бочки, состоящей из восьми расположенных по кругу антипараллельных нитей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокалина, таких как ассоциированный с желатином липокалин нейтрофилов (NGAL) (WO 2003/029462); и
вогнутая область, образованная структурой параллельных слоев внутри структуры в форме подковы, образованной уложенными в стопку повторами модуля лейцин-богатого повтора (LRR) вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулине вой структуры и используется в системе приобретенного иммунитета у бесчелюстных позвоночных, таких как минога и миксина (WO 2008/016854). Предпочтительные антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению включают, например, антигенсвязывающие домены, имеющие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей антител. Предпочтительные примеры антигенсвязывающих доменов включают "одноцепочечный Fv (scFv)", "одноцепочечное антитело", "Fv", "одноцепочечный Fv2 (scFv2)", "Fab" и "F(ab')2".
Антигенсвязывающие домены антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению могут связываться с идентичным эпитопом. Такой эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Альтернативно, каждый из антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению может связываться с отличающимся эпитопом. В рамках настоящего изобретения, отличающийся эпитоп может присутствовать, например, в белке, содержащем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Альтернативно, эпитоп может присутствовать в белке, содержащем аминокислоты в положениях 20-365 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Специфичность
"Специфичный" означает, что одна из молекул, которая специфически связывается, не проявляет никакого существенного связывания с молекулами, отличными от одной или нескольких молекул-партнеров по связыванию. Более того, "специфичный" также используют, когда антигенсвязывающий домен является специфичным к конкретному эпитопу среди множества эпитопов в антигене. Когда эпитоп, связываемый антигенсвязывающим доменом, содержится в нескольких различных антигенах, антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающий домен, могут связываться с различными антигенами, которые имеют этот эпитоп.
Антитела
В рамках настоящего изобретения "антитело" относится к природному иммуноглобулину или иммуноглобулину, полученному частичным или полным синтезом. Антитела можно выделять из природных источников, таких как природная плазма и сыворотка, или из культуральных супернатантов продуцирующих антитела гибридом. Альтернативно антитела можно частично или полностью синтезировать с использованием способов, таких как генетическая рекомбинация. Предпочтительные антитела включают, например, антитела изотипа иммуноглобулине в или принадлежащего ему подкласса. Известные иммуноглобулины человека включают антитела следующих девяти классов (изотипов): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM. Из этих изотипов антитела по настоящему изобретению включают IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные области IgG включают мутантов, образованных из них естественным образом. Ряд аллотипических последовательности вследствие генетического полиморфизма описан в "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No. 91-3242, для константных областей антител IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека и любую из них можно использовать в рамках настоящего изобретения. В частности, для последовательности IgG1 человека, аминокислотная последовательность положений 356-358 (нумерация EU) может быть либо DEL, либо ЕЕМ.
Способы получения антитела с желаемой активностью связывания известны специалистам в данной области. Ниже приведен пример, в котором описан способ получения антитела, которое связывается с IL-6R (антитело против IL-6R). Антитела, которые связываются с антигеном, отличным от IL-6R, также можно получать в соответствии с примером, описанным ниже.
Антитела против IL-6R можно получать в качестве поликлональных или моноклональных антител с использованием известных способов. Продуцируемые антитела против IL-6R предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, происходящие из млекопитающих. Такие происходящие из млекопитающих моноклональные антитела включают антитела, продуцируемые гибридомами или клетками-хозяевами, трансформированными экспрессирующим вектором, несущим ген антитела, способами генетической инженерии. Моноклональные антитела по настоящему изобретению включают "гуманизированные антитела" или "химерные антитела".
Продуцирующие моноклональные антитела гибридомы можно получать с использованием известных способов, например, как описано ниже. В частности, млекопитающих иммунизируют общепринятыми способами иммунизации с использованием белка IL-6R в качестве сенсибилизирующего антигена. Полученные иммунные клетки подвергают слиянию с известными родительскими клетками общепринятыми способами слияния клеток. Затем гибридомы, продуцирующие антитело против IL-6R, можно отбирать путем скрининга продуцирующих моноклональное антитело клеток с использованием общепринятых способов скрининга.
В частности, моноклональные антитела получают так, как описано ниже. Сначала можно экспрессировать ген IL-6R, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, для получения белка IL-6R, представленного в SEQ ID NO: 1, который будет использован в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела. Для этого последовательность гена, кодирующего IL-6R, встраивают в известный экспрессирующий вектор, и подходящие клетки-хозяева трансформируют этим вектором. Желаемый белок IL-6R человека очищают из клеток-хозяев или их культуральных супернатантов известными способами. Для получения растворимого IL-6R из культуральных супернатантов, например, белок, состоящий из аминокислот в положениях 1-357 в полипептидной последовательности IL-6R SEQ ID NO: 1, такой как описан в Mullberg et al. (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), экспрессируют в качестве растворимого IL-6R вместо белка IL-6R SEQ ID NO: 1. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать очищенный природный белок IL-6R.
Очищенный белок IL-6R можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для иммунизации млекопитающих. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать неполный пептид IL-6R. В этом случае, неполный пептид можно получать путем химического синтеза на основе аминокислотной последовательности IL-6R человека, или путем встраивания неполного гена IL-6R в экспрессирующий вектор для экспрессии. Альтернативно неполный пептид можно получать путем деградации белка IL-6R протеазой. Длина и область неполного пептида IL-6R не ограничены конкретными вариантами осуществления. Предпочтительная область может быть произвольным образом выбрана из аминокислотной последовательности в положениях аминокислот 20-357 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Количество аминокислот, образующих пептид, подлежащий применению в качестве сенсибилизирующего антигена, предпочтительно составляет по меньшей мере пять или более, шесть или более, или семь или более. Более конкретно, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать пептид из 8-50 остатков, более предпочтительно, из 10-30 остатков.
Альтернативно, для сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, полученный путем слияния желаемого неполного полипептида или пептида белка IL-6R с отличающимся полипептидом. Например, предпочтительно в качестве сенсибилизирующих антигенов используют Fc-фрагменты антител и пептидные метки. Векторы для экспрессии таких слитых белков можно конструировать путем слияния в рамке считывания генов, кодирующих два или более желаемых полипептидных фрагментов, и встраивания слитого гена в экспрессирующий вектор, как описано выше. Способы получения слитых белков описаны в Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Способы получения IL-6R для применения в качестве сенсибилизирующего антигена и способы иммунизации с использованием IL-6R конкретно описаны в WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693 и т.п.
Отсутствуют конкретное ограничение на млекопитающих, подлежащих иммунизации сенсибилизирующим антигеном. Однако предпочтительно выбирать млекопитающих, учитывая их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Как правило, предпочтительно используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомячки, кроликов и обезьян.
Указанных выше животных иммунизируют сенсибилизирующим антигеном известными способами. Как правило, выполняемые способы иммунизации включают, например, внутрибрюшинную или подкожную инъекцию сенсибилизирующего антигена млекопитающим. В частности, сенсибилизирующий антиген соответствующим образом разбавляют PBS (фосфатно-солевой буфер), физиологическим солевым раствором или сходными с ними. Если желательно, общепринятый адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда, смешивают с антигеном и смесь эмульгируют. Затем сенсибилизирующий антиген вводят млекопитающем несколько раз с интервалами 4-21 суток. При иммунизации сенсибилизирующим антигеном можно использовать подходящие носители. В частности, когда в качестве сенсибилизирующего антигена используют низкомолекулярный неполный пептид, иногда желательно связывать сенсибилизирующий антигенный пептид с белком-носителем, таким как альбумин или гемоцианин лимфы улитки, для иммунизации.
Альтернативно гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, можно получать с использованием способов иммунизации ДНК, как описано ниже. Иммунизация ДНК представляет собой способ иммунизации, который обеспечивает стимуляцию иммунной системы путем экспрессии сенсибилизирующего антигена у животного, имунизированного в результате введения векторной ДНК, сконструированной для обеспечения экспрессии гена, кодирующего антигенный белок, у животного. По сравнению с общепринятыми способами иммунизации, в которых белковый антиген вводят животным, подлежащим иммунизации, иммунизация ДНК является лучшей в том, что:
- может быть обеспечена стимуляция иммунной системы при сохранении структуры мембранного белка, такого как IL-6R; и
- отсутствует необходимость в очистке антигена для иммунизации.
Для получения моноклонального антитела по настоящему изобретению с использованием иммунизации ДНК, сначала ДНК, экспрессирующую белок IL-6R, вводят животному, подлежащему иммунизации. ДНК, кодирующую IL-6R, можно синтезировать известными способами, такими как ПЦР. Полученную ДНК встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор, а затем его вводят животному, подлежащему иммунизации. Предпочтительно используемые экспрессирующие векторы включают, например, коммерчески доступные экспрессирующие векторы, такие как pcDNA3.1. Векторы можно вводить в организм с использованием общепринятых способов. Например, иммунизацию ДНК проводят с использованием генной пушки для введения покрытых экспрессирующим вектором частиц золота в клетки организма животного, подлежащего иммунизации. Антитела, которые распознают IL-6R. также можно получать способами, описанными в WO 2003/104453.
После иммунизации млекопитающего, как описано выше, подтверждают увеличение титра связывающего IL-6R антитела в сыворотке. Затем иммунные клетки собирают от млекопитающего, а затем подвергают слиянию клеток. В частности, предпочтительно в качестве иммунных клеток используют спленоциты.
В качестве клетки, подлежащей слиянию с упомянутыми выше иммунными клетками, используют клетки миеломы млекопитающих. Клетки миеломы предпочтительно содержат подходящий селективный маркер для скрининга. Селективный маркер придает клеткам характеристики для их выживания (или гибели) в конкретных условиях культивирования. В качестве селективных маркеров известны дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит HGPRT) и дефицит тимидинкиназы (далее сокращенно обозначаемый как дефицит TK). Клетки с дефицитом HGPRT или TK обладают чувствительностью к гипоксантину-аминоптерину-тимидину (далее сокращенно обозначаемой чувствительностью HAT). Чувствительные к HAT клетки не могут синтезировать ДНК в селективной среде HAT, и, таким образом, погибают. Однако, когда клетки слиты с нормальными клетками, они могут продолжать синтезировать ДНК с использованием пути спасения нормальных клеток, и, таким образом, они могут расти в селективной среде HAT.
Селекцию клеток с дефицитом HGPRT и TK можно проводить в среде, содержащей 6-тиогуанин, 8-азагуанин (далее сокращенно обозначаемый как 8AG) или 5'-бромдезоксиуридин, соответственно. Нормальные клетки погибают, поскольку они включают аналоги пиримидина в их ДНК. Между тем, клетки, которые являются дефицитными по этим ферментам, могут выживать в селективной среде, поскольку они не могут включать эти аналоги пиримидина. Кроме того, селективный маркер, называемый устойчивостью к G418, обеспечиваемый геном устойчивости к неомицину, обеспечивает устойчивость к 2-дезоксистрептаминовым антибиотикам (аналоги гентамицина). Известны различные типы миеломных клеток, которые пригодны для слияния клеток.
Например, предпочтительно можно использовать миеломные клетки, включающие следующие клетки:
Р3(P3x63Ag8, 653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);
P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology и Immunology (1978) 81, 1-7);
NS-1 (С. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519);
MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);
SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);
FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);
3194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);
R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), и т.д.
Слияние клеток между иммуноцитами и клетками миеломы по существу проводят с использованием известных способов, например, способа Kohler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).
Более конкретно, слияние клеток можно проводить, например, в общепринятой культуральной среде в присутствии агента, обеспечивающего слияние клеток. Агенты, обеспечивающие слияние клеток, включают, например, полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендай (HVJ). Если необходимо, также можно добавлять вспомогательное вещество, такое как диметилсульфоксид, для повышения эффективности слияния.
Соотношение иммунных клеток и клеток миеломы можно определять самостоятельно, предпочтительно, например, оно составляет одну клетку миеломы на каждые от одного до десяти иммуноцитов. Культуральные среды, используемые для слияния клеток, включают, например, среды, которые пригодны для выращивания клеточных линий, такие как среда RPMI1640 и среда MEM, и другие общепринятые культуральные среды, используемые для этого типа клеточной культуры. Кроме того, предпочтительно в культуральную среду можно добавлять сывороточные добавки, такие как эмбриональная телячья сыворотка (FCS).
Для слияния клеток заданные количества указанных выше иммунных клеток и миеломных клеток смешивают в описанной выше культуральной среде. Затем добавляют раствор PEG (например, средняя молекулярная масса составляет приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретый до приблизительно 37°С, в концентрации, как правило, от 30% до 60% (масс./об.). Затем эту смесь осторожно перемешивают для получения желаемых слитых клеток (гибридом). Затем к клеткам постепенно добавляют подходящую культуральную среду, упомянутую выше, и смесь многократно центрифугируют для удаления супернатанта. Таким образом, можно удалить агенты слияния клеток и т.п., которые являются неблагоприятными для роста гибридомы.
Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить путем культивирования с использованием общепринятой селективной среды, например, среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки) можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. Как правило, период составляет от нескольких суток до нескольких недель. Затем, гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и клонируют по отдельности общепринятыми способами лимитирующих разведении.
Селекцию полученных таким образом гибридом можно проводить с использованием селективной среды на основе селективного маркера, которым обладает миелома, используемая для слияния клеток. Например, селекцию клеток с дефицитом HGPRT или ТК можно проводить путем культивирования с использованием среды HAT (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). В частности, когда для слияния клеток используют чувствительные к HAT миеломные клетки, клетки, успешно слитые с нормальными клетками, могут селективно пролиферировать в среде HAT. Клетки, отличные от желаемых гибридом (неслитые клетки), можно уничтожать путем продолжения культивирования в описанной выше среде HAT в течение достаточного периода времени. В частности, селекцию желаемых гибридом можно проводить путем культивирования, как правило, в течение от нескольких суток до нескольких недель. Затем гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, подвергают скринингу и по отдельности клонируют общепринятыми способами лимитирующих разведении.
Желаемые антитела можно предпочтительно отбирать и по отдельности клонировать способами скрининга на основе известной реакции антиген/антитело. Например, связывающее IL-6R моноклональное антитело может связываться с IL-6R, экспрессированным на поверхности клетки. Такое моноклональное антитело можно подвергать скринингу с помощью активированной флуоресценцией сортировки клеток (FACS). FACS представляет собой систему, которая оценивает связывание антитела с клеточной поверхностью путем анализа клеток, контактирующих с флуоресцентным антителом, с использованием лазерного луча и измерения флуоресценции, испускаемой индивидуальными клетками.
Для скрининга гибридом, которые продуцируют моноклональные антитело по настоящему изобретению, с помощью FACS, сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки. Клетки, предпочтительно используемые для скрининга, представляют собой клетки млекопитающих, в которых IL-6R экспрессируется неестественным образом. В качестве контроля можно проводить селективное выявление активности антитела, которое связывается с IL-6R клеточной поверхности, с использованием в качестве клеток-хозяев нетрансформированных клеток млекопитающих. В частности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против IL-6R, можно выделять путем селекции гибридом, которые продуцируют антитело, которое связывается с клетками, в которых экспрессируется IL-6R неестественным образом, но не с клетками-хозяевами.
Альтернативно активность связывания антитела с иммобилизованными экспрессирующими IL-6R клетками можно оценивать на основе принципа ELISA. Например, экспрессирующие IL-6R клетки иммобилизуют на лунках планшета для ELISA. Культуральные супернатанты гибридом контактируют с иммобилизованными клетками в лунках и выявляют антитела, которые связываются с иммобилизованными клетками. Когда моноклональные антитела происходят из мыши, антитела, связанные с клетками, можно выявлять с использованием антитела против иммуноглобулина мыши. Селекцию гибридом, продуцирующих желаемое антитело, обладающее антигенсвязывающей способностью, проводят с помощью описанного выше скрининга, и их можно клонировать способом лимитирующих разведении и т.п.
Продуцирующие моноклональное антитело гибридомы, полученные таким образом, можно пассировать в общепринятой культуральной среде и хранить в жидком азоте в течение длительного периода времени.
Описанные выше гибридомы культивируют общепринятым способом, и желаемые моноклональные антитела можно получать из культуральных супернатантов. Альтернативно гибридомы вводят совместимым млекопитающим и выращивают в них, и моноклональные антитела получают из асцитной жидкости. Первый из этих способов пригоден для получения антител с высокой чистотой.
Предпочтительно также можно использовать антитела, кодируемые генами антител, которые клонированы из антителопродуцирующих клеток, таких как описанные выше гибридомы. Клонированный ген антитела встраивают в подходящий вектор, и его вводят в клетку-хозяина для экспрессии антитела, кодируемого геном. Способы выделения генов антител, встраивания генов в векторы и трансформации клеток-хозяев, уже разработаны, например, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767-775). Способы продуцирования рекомбинантных антител также известны, как описано ниже.
Например, кДНК, кодирующую вариабельную область (V-область) антитела против IL-6R, получают из клеток гибридомы, экспрессирующих антитело против IL-6R. Для этой цели сначала из гибридом экстрагируют тотальную РНК. Способы, используемые для экстракции мРНК из клеток, включают, например:
- способ ультрацентрифугирования с гуанидином (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299), и
- способ AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
Экстрагированные мРНК можно очищать с использованием набора для очистки мРНК mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience) и т.п. Альтернативно также коммерчески доступны наборы для экстракции тотальной мРНК непосредственно из клеток, такие как набор для очистки мРНК QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience). мРНК можно получать из гибридом с использованием таких наборов. кДНК, кодирующие V-область антитела, можно синтезировать из полученных мРНК с использованием обратной транскриптазы. кДНК можно синтезировать с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК с обратной транскриптазой AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.) и т.п. Более того, для синтеза и амплификации кДНК можно соответствующим образом использовать набор для амплификации кДНК SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) и способ 5'-RACE на основе ПЦР (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932). В таком способе синтеза кДНК на оба конца кДНК можно вносить подходящие участки для ферментов рестрикции, описанные ниже.
Представляющий интерес фрагмент кДНК очищают из полученного продукта ПЦР, а затем его лигируют в векторную ДНК. Таким образом, конструируют рекомбинантный вектор и вводят в Е. coli и т.п. После селекции колоний из образующих колонии Е. coli можно получать желаемый рекомбинантный вектор. Затем исследуют, имеет ли рекомбинантный вектор представляющую интерес нуклеотидную последовательность кДНК, известным способом, таким как способ с терминацией цепи дидезоксинуклеотидами.
Способ 5'-RACE, в котором используются праймеры для амплификации гена вариабельной области, удобно использовать для выделения гена, кодирующего вариабельную область. Сначала конструируют библиотеку кДНК 5'-RACE с помощью синтеза кДНК с использованием РНК, экстрагированных из клеток гибридом в качестве матрицы. Для синтеза библиотеки кДНК 5'-RACE соответствующим образом используют коммерчески доступный набор, такой как набор для амплификации кДНК SMART RACE.
Ген антитела амплифицируют способом ПЦР с использованием полученной библиотеки кДНК 5'-RACE в качестве матрицы. Праймеры для амплификации гена антитела мыши можно конструировать на основе известных последовательностей генов антител. Нуклеотидные последовательности праймеров варьируют, в зависимости от подкласса иммуноглобулине в. Таким образом, предпочтительно, чтобы подкласс был определен заранее с использованием коммерчески доступного набора, такого как набор для изотипирования моноклональных антител мыши Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).
В частности, например, праймеры, которые обеспечивают амплификацию генов, кодирующих тяжелые цепи γ1, γ2а, γ2b и γ3 и легкие цепи κ и λ, используют для выделения генов, кодирующих IgG мыши. Как правило, для амплификации гена вариабельной области gG используют праймер, который гибридизуется с областью константной области вблизи вариабельной области, в качестве 3'-праймера. Между тем, в качестве 5'-праймера используют праймер, прилагаемый к набору для конструирования библиотеки кДНК 5'-RACE.
Продукты ПЦР, амплифицированные таким образом, используют для переформировывания иммуноглобулине в, состоящих из комбинации тяжелых и легких цепей. Селекцию желаемого антитела можно проводить с использованием активности связывания IL-6R переформированного иммуноглобулина в качестве индикатора. Например, когда задачей является выделение антитела против IL-6R, более предпочтительно, чтобы связывание антитела с IL-6R было специфическим. Скрининг связывающего IL-6R антитела можно проводить, например, с помощью следующих стадий:
(1) контактирование экспрессирующей IL-6R клетки с антителом, содержащим V-область, кодируемую кДНК, выделенной из гибридомы;
(2) выявление связывания антитела с эксперессирующей IL-6R клеткой; и
(3) селекция антитела, которое связывается с экспрессирующей IL-6R клеткой.
Способы выявления связывания антитела с экспрессирующими IL-6R клетками известны. В частности, связывание антитела с экспрессирующими IL-6R клетками можно выявлять с помощью описанных выше способов, таких как FACS. Для оценки активности связывания антитела соответствующим образом используют иммобилизованные образцы экспрессирующих IL-6R клеток.
Предпочтительные способы скрининга антител, в которых в качестве индикатора используется активность связывания, также включают способы пэннинга с использованием фаговых векторов. Способы скрининга с использованием фаговых векторов являются преимущественными, когда гены антител выделяют из библиотек подклассов тяжелых цепей и легких цепей из популяции клеток, экспрессирующей поликлональное антитело. Гены, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей и легких цепей, можно связывать соответствующей линкерной последовательностью с получением одноцепочечного Fv (scFv). Фаги, представляющие scFv на их поверхности, можно получать встраиванием гена, кодирующего scFv, в фаговый вектор. Фаги контактируют с представляющим интерес антигеном. Затем ДНК, кодирующую scFv, обладающие представляющей интерес активностью связывания, можно выделять путем сбора фагов, связанных с антигеном. Этот процесс можно повторять при необходимости для увеличения содержания scFv, обладающих представляющий интерес активностью связывания.
После выделения кДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела против IL-6R, кДНК расщепляют ферментами рестрикции, которые распознают участки рестрикции, встроенные на обоих концах кДНК. Предпочтительные ферменты рестрикции распознают и расщепляют нуклеотидную последовательность, которая встречается в нуклеотидной последовательности гена антитела с низкой частотой. Более того, предпочтительно в представляющий интерес вектор вводят участок рестрикции для фермента, который образует липкий конец, для встраивания одной копии расщепленного фрагмента в правильной ориентации. Кодирующую кДНК V-область антитела против IL-6R расщепляют, как описано выше, и ее встраивают в соответствующий экспрессирующий вектор для конструирования экспрессирующего вектора для антитела. В этом случае, если ген, кодирующий константную область антитела (С-область) и ген, кодирующий описанную выше V-область, слить в рамке считывания, то получится химерное антитело. В рамках настоящего изобретения "химерное антитело" означает, что происхождение константной области отличается от вариабельной области. Таким образом, в дополнение к гетерохимерным антителам мыши/человека, химерные антитела по настоящему изобретению включают аллохимерные антитела человека/человека. Экспрессирующий вектор для химерного антитела можно конструировать путем встраивания гена V-области в экспрессирующий вектор, который уже имеет константную область. В частности, например, последовательность, распознаваемая первым ферментом рестрикции, который расщепляет выше гена V-области, можно соответствующим образом помещать на 5'-конец экспрессирующего вектора, содержащего ДНК, кодирующую желаемую константную область (С-область) антитела. Экспрессирующий вектор для химерного антитела конструируют путем слияния в рамке считывания двух генов, расщепленных одной и той же комбинацией ферментов рестрикции.
Для получения моноклонального антитела против IL-6R, гены антител встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы гены экспрессировались под контролем регулирующей экспрессию области. Регулирующая экспрессию область для экспрессии антитела включает, например, энхансеры и промоторы. Более того, на N-конец можно присоединять подходящую сигнальную последовательность, так чтобы экспрессируемое антитело секретировалось наружу клеток. В примерах, описанных ниже, в качестве сигнальной последовательности используют пептид, имеющий аминокислотную последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3). Между тем, можно присоединять другие подходящие сигнальные последовательности. Экспрессированный полипептид расщепляется на С-конце описанной выше последовательности, и полученный полипептид секретируется из клеток в качестве зрелого полипептида. Затем подходящие клетки-хозяева трансформируют экспрессирующим вектором и получают рекомбинантные клетки, экспрессирущие ДНК, кодирующую антитело IL-6R.
ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела по отдельности встраивают в различные экспрессирующие векторы для экспрессии гена антитела. Молекулу антитела, имеющую Н- и L-цепи, можно экспрессировать путем котрансфекции одной и той же клетки-хозяина векторами, в которые соответственно встроены гены Н-цепи и L-цепи. Альтернативно клетки-хозяева можно трансформировать одним эрепрессирующим вектором, в который встроены ДНК, кодирующие Н- и L-цепи (см. WO 1994/011523).
Существуют различные известные комбинации клетка-хозяин/экспрессирующий вектор для получения антител путем введения выделенных генов антител в соответствующих хозяев. Все из этих экспрессирующих систем пригодны для выделения антигенсвязывающих доменов по настоящему изобретению. Подходящие эукариотические клетки, используемые в качестве клеток-хозяев, включают клетки животных, клетки растений и клетки грибов. В частности, клетки животных включают, например, следующие клетки.
(1) клетки млекопитающих: СНО, COS, клетки миеломы, клетки почки китайского хомячка (BHK), HeLa, Vero клетки почки эмбриона человека (HEK) 293, Freestyle™293 и т.п.;
(2) клетки земноводных: ооциты Xenopus и т.п.; и
(3) клетки насекомых: sf9, sf21, Tn5 и т.п.
Кроме того, в качестве клетки растений известна экспрессирующая система для генов антител с использованием клеток, происходящих из рода Nicotiana, таких как Nicotiana tabacum. Для трансформации клеток растений можно соответствующим образом использовать культивированные клетки каллуса.
Более того, в качестве клеток грибов можно использовать следующие клетки:
- дрожжи: род Saccharomyces, как например, Saccharomyces serevisiae, и род Pichia, как например, Pichia pastoris; и
- нитчатые грибы: род Aspergillus, как например, Aspergillus niger.
Более того, также известны экспрессирующие системы для генов антител, в которых используются прокариотические клетки. Например, при использовании бактериальных клеток, в рамках настоящего изобретения можно подходящим образом использовать клетки Е. coli, клетки Bacillus subtilis и т.п. Экспрессирующие векторы, несущие представляющие интерес гены антитела, вводят в клетки путем трансфекции. Трансфицированные клетки культивируют in vitro, и из культуры трансформированных клеток можно получать желаемое антитело.
В дополнение к описанным выше клеткам-хозяевам, также для получения рекомбинантного антитела можно использовать трансгенных животных. Следовательно, антитело можно получать из животного, которому введен ген, кодирующий представляющее интерес антитело. Например, ген антитела можно конструировать в качестве слитого гена путем встраивания в рамке считывания в ген, который кодирует белок, специфически продуцируемый в молоке. В качестве белка, секретируемого в молоке, можно использовать, например, β-казеин козы и т.п. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в который встроен ген антитела, инъецируют в эмбрион козы, а затем этот эмбрион имплантируют самке козы. Желаемые антитела можно получать в качестве белка, слитого с белком молока, из молока, продуцируемого трансгенной козой, родившейся от козы, являющейся реципиентом эмбриона (или ее потомства). Кроме того, для увеличения объема молока, содержащего желаемое антитело, продуцируемого трансгенной козой, трансгенной козе при необходимости можно вводить гормоны, Ebert, K.М. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).
Когда антигенсвязывающую молекулу, описанную в настоящем описании, вводят человеку, антигенсвязывающий домен, происходящий из генетически рекомбинантного антитела, которое является искусственно модифицированным для снижения гетерологической антигенности против человека и т.п., можно соответствующим образом использовать в качестве антигенсвязывающего домена молекулы. Такие генетически рекомбинантные антитела включают, например, гуманизированные антитела. Эти модифицированные антитела получают соответствующим образом известными способами.
Вариабельная область антитела, используемая для получения антигенсвязывающего домена антигенсвязывающей молекулы, описанной в настоящем описании, как правило, образована тремя определяющими комплементарность областями (CDR) которые разделены четырьмя каркасными областями (FR). CDR представляет собой область, которая по существу определяет специфичность связывания антитела. Аминокислотные последовательности CDR являются в высокой степени разнообразными. С другой стороны, образующие FR аминокислотные последовательности часто обладают высокой идентичностью, даже среди антител с отличающейся специфичностью связывания. Таким образом, как правило, специфичность связывания определенного антитела можно вносить в другое антитело путем пересадки CDR.
Гуманизированное антитело также называют переформированным антителом человека. В частности, известны гуманизированные антитела, полученные пересадкой CDR антитела не являющегося человеком животного, такого как антитело мыши, в антитело человека и т.п. Также известны стандартные способы генной инженерии для получения гуманизированных антител. В частности, например, в качестве способа пересадки CDR антитела мыши в FR человека известна перекрывающаяся ПЦР с удлинением. В перекрывающейся ПЦР с удлинением нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR антитела мыши, подлежащую пересадке, добавляют к праймерам для синтеза FR антитела человека. Праймеры получают для каждой из четырех FR. Является общепризнанным, что при пересадке CDR мыши в FR человека, выбор FR человека, который имеет высокую идентичность FR мыши, является преимущественным для сохранения функции CDR. Таким образом, как правило, предпочтительно использовать FR человека, содержащую аминокислотную последовательность, которая обладает высокой идентичностью с аминокислотной последовательностью FR, соседней с CDR мыши, подлежащей пересадке.
Нуклеотидные последовательности, подлежащие лигированию, конструируют так, чтобы они были соединены друг с другом в рамке считывания. FR человека синтезируют по отдельности с использованием соответствующих праймеров. В результате получают продукты, в которых ДНК, кодирующая CDR мыши, связана с индивидуальными ДНК, кодирующими FR. Нуклеотидные последовательности, кодирующие CDR мыши, каждого продукта конструируют так, чтобы они перекрывались друг с другом. Затем проводят синтез комплементарной цепи для гибридизации перекрывающихся CDR продуктов, синтезированных с использованием гена антитела человека в качестве матрицы. С помощью этой реакции FR человека лигируют через последовательности CDR мыши.
Полноразмерный ген V-области, в котором в конечном итоге лигированы три CDR и четыре FR, амплифицируют с использованием праймеров, которые гибридизуются с его 5'- или 3'-концом, в которые добавлены подходящие последовательности, распознаваемые ферментом рестрикции. Экспрессирующий вектор для гуманизированного антитела можно получать путем встраивания ДНК, полученной, как описано выше, и ДНК, которая кодирует С-область антитела человека, в экспрессирующий вектор, так чтобы они лигировались в рамке считывания. После трансфекции рекомбинантным вектором хозяина для получения рекомбинантных клеток, рекомбинантные клетки культивируют и ДНК, кодирующую гуманизированное антитело, экспрессируют с получением гуманизированного антитела в клеточной культуре (см., публикацию патента Европы № ЕР 239400 и международную публикацию патента № WO 1996/002576).
Путем качественного или количественного определения и оценки антигенсвязывающей активности гуманизированного антитела, полученного, как описано выше, можно пригодным образом отобрать FR антитела человека, которые позволяют CDR образовывать подходящий антигенсвязывающий центр при лигировании через CDR. Аминокислотные остатки в FR можно заменять при необходимости, так чтобы CDR переформированного анитетела человека образовывали соответствующий антигенсвязывающий центр. Например, мутации аминокислотной последовательности можно вносить в FR с использованием способа ПЦР, который используется для пересадки CDR мыши в FR человека. Более конкретно, в праймеры, которые гибридизуются с FR, можно вносить частичные мутации нуклеотидной последовательности. Мутации нуклеотидной последовательности вносятся в FR, синтезированные с использованием таких праймеров. Мутантные последовательности FR, имеющие желаемые характеристики, можно отбирать путем измерения и оценки активности мутанта антитела с замененной аминокислотой в отношении связывания с антигеном с помощью упомянутого выше способа (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).
Альтернативно желаемые антитела человека можно получать путем иммунизации трансгенных животных, имеющих полный набор генов антител человека (см. WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) путем иммунизации ДНК.
Более того, также известны способы получения антител человека путем пэннинга с использованием библиотек антител человека. Например, V-область антитела человека экспрессируют в качестве одноцепочечного антитела (scFv) на поверхности фага способом фагового дисплея. Можно отбирать фаги, экспрессирующие scFv, которые связываются с антигеном. Последовательность ДНК, кодирующую V-область антитела человека, которая связывается с антигеном, можно определять путем анализа генов выбранных фагов. Определяют последовательность ДНК scFv, которая связывается с антигеном. Получают экспрессирующий вектор путем слияния последовательности V-области в рамке считывания с последовательностью С-области желаемого антитела человека, и встраивания ее в соответствующий экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вводят в клетки, пригодные для экспрессии, такие как клетки, описанные выше. Антитело человека можно получать путем экспрессии гена, кодирующего антитело человека, в клетках. Эти способы уже известны (см. WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).
В дополнение к способам, описанным выше, для выделения генов антител можно соответствующим образом использовать способы клонирования В-клеток (идентификация каждой кодирующей антитело последовательности, ее клонирование и выделение; использование при конструировании экспрессирующего вектора для получения каждого антитела (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности); и т.п.), как описано, например Bernasconi et al. (Science (2002) 298: 2199-2202) или в WO 2008/081008.
Система нумерации EU и система нумерации Kabat
В соответствии со способами, используемыми в рамках настоящего изобретения, положения аминокислот, приписываемые CDR и FR антитела, указаны в соответствии с нумерацией по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, аминокислоты вариабельной области указаны в соответствии с нумерацией по системе Kabat, в то время как аминокислоты константной области указаны в соответствии с системой нумерации EU на основе положений аминокислот по Kabat.
Условия концентрации ионов
Условия концентрации ионов металлов
В одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация ионов относится к концентрации ионов металлов.
"Ионы металлов" относятся к ионам элементов группы I, за исключением водорода, таких как щелочные металлы и элементы группы меди, ионам элементов группы II, таких как щелочноземельные металлы и элементы группы цинка, ионам элементов группы III, за исключением бора, ионам элементов группы IV, за исключением углерода и кремния, ионам элементов группы VIII, таких как элементы группы железа и элементы группы платины, ионам элементов, принадлежащих подгруппе А групп V, VI и VII, и элементов металлов, таких как сурьма, висмут и полоний. Атомы металлов обладают свойством высвобождения валентных электронов так, что они становятся катионами. Это называют тенденцией к ионизации. Металлы с высокой тенденцией к ионизации считаются химически активными.
В рамках настоящего изобретения предпочтительные ионы металлов включают, например, ион кальция. Ион кальция вовлечен в модулирование множества биологических явлений, включая сокращение мышц, таких как скелетные, гладкие и сердечная мышцы; активацию движения, фагоцитоза и т.п. лейкоцитов; активацию изменения формы, секреции и т.п. тромбоцитов; активацию лимфоцитов; активацию тучных клеток, включая секрецию гистамина; клеточные ответы, опосредуемые рецептором катехоламина а или рецептором ацетилхолина; экзоцитоз; высвобождение веществ-передатчиков из окончаний нейронов; и поток аксоплазмы в нейронах. Известные внутриклеточные рецепторы ионов кальция включают тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкую цепь миозина, которые имеют несколько участков связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции. Также существует множество известных кальций-связывающих мотивов. Такие хорошо известные мотивы включают, например, домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексии, домен тромбоспондина 3 типа и EGF-подобные домены.
В рамках настоящего изобретения, когда ион металла представляет собой ион кальция, условия концентрации ионов кальция включают низкие концентрации ионов кальция и высокие концентрации ионов кальция. "Активность связывания варьирует, в зависимости от концентраций ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий между условиями низкой и высокой концентрации ионов кальция. Например, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция. Альтернативно антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы может быть более высокой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция.
В рамках настоящего изобретения высокая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 200 мкМ до 2 мМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в переделах от 400 мкМ до 1,5 мМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ, которая является близкой к концентрации ионов кальция в плазме (крови) in vivo.
В рамках настоящего изобретения низкая концентрация ионов кальция, в частности, не ограничена конкретной величиной; однако концентрация предпочтительно может быть выбрана из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,2 мкМ до 20 мкМ. В другом варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ. В альтернативном варианте осуществления концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ. Более того, концентрация может быть выбрана из величин в пределах от 2 мкМ до 4 мкМ. В частности, предпочтительной является концентрация, выбранная из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, которая является близкой к концентрации ионизированного кальция в ранних эндосомах in vivo.
В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,1 мкМ до 30 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 100 мкМ до 10 мМ. Предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 0,5 мкМ до 10 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 200 мкМ до 5 мМ. Особенно предпочтительно, это означает, что антигенсвязывающая активность при концентрации ионов кальция в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем при концентрации ионов кальция в плазме in vivo; и, в частности, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более слабой при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 1 мкМ до 5 мкМ, чем при концентрации ионов кальция, выбранной из величин в пределах от 500 мкМ до 2,5 мМ.
То, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов металлов, можно определять, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. Например, для подтверждения того, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы становится более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция, сравнивают антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы при низкой и высокой концентрациях ионов кальция.
В рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой при высокой концентрации ионов кальция, чем при низкой концентрации ионов кальция". В настоящем описании "антигенсвязывающая активность является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция" иногда представлено как "антигенсвязывающая способность является более слабой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция". Также "антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов кальция снижена так, чтобы она была ниже, чем антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов кальция" может быть представлено как "антигенсвязывающую способность при низкой концентрации ионов кальция ослабили по сравнению с антигенсвязывающей способностью при высокой концентрации ионов кальция".
При определении антигенсвязывающей активности, условия, отличные от концентрации ионов кальция, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области, и они конкретно не ограничены. Например, активность можно определять при 37°С в буфере HEPES. Например, для определения можно использовать Biacore (GE Healthcare) и т.п. Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем пропускания антигена в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном мембраны можно оценивать путем пропускания антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения над чипом, на котором иммобилизован антиген.
При условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при низкой концентрации ионов кальция является более слабой, чем при высокой концентрации ионов кальция, соотношение антигенсвязывающей активности между антигенсвязывающей активностью между низкой концентрацией ионов кальция и высокой концентрацией ионов кальция конкретно не ограничено; и величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ), которая представляет собой соотношение константы диссоциации (KD) в отношении антигена при низкой концентрации ионов кальция и KD при высокой концентрация ионов кальция, предпочтительно составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 2 мМ) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 4 00, 1000 или 10000, при условии что молекула может быть получена способами, известными специалистам в данной области. Альтернативно указывается величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ). Следовательно, величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (Са 3 мкМ)/KD (Са 1,2 мМ) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.
Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать KD (константа диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения активности можно использовать кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации). KD (константа диссоциации) и кажущуюся KD (кажущаяся константа диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или проточного цитометра.
Альтернативно, например, также в качестве показателя для отображения соотношения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при низкой и высокой концентрациях кальция предпочтительно можно использовать константу скорости диссоциации (kd). Когда константу скорости диссоциации (kd) используют вместо константы диссоциации (KD) в качестве показателя для отображения соотношение активностей связывания, соотношение констант скорости диссоциации (kd) при низкой и высокой концентрациях кальция, т.е. величина kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокой концентрация кальция), предпочтительно равна 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более, и еще более предпочтительно 30 или более. Верхний предел величины Kd (низкая концентрация кальция)/kd (высокая концентрация кальция) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии что можно получить молекулу способами, известными специалистам в данной области.
Когда антиген представляет собой растворимый антиген, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать kd (константа скорости диссоциации). Между тем, когда антиген представляет собой антиген мембраны, для отображения антигенсвязывающей активности можно использовать кажущуюся kd (кажущуюся константу скорости диссоциации). kd (константа скорости диссоциации) и кажущуюся kd (кажущаяся константа скорости диссоциации) можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare) или проточного цитометра. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы определяют при различных концентрациях ионов кальция, предпочтительно использовать одни и те же условия, за исключением концентраций кальция.
Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего стадии:
(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция;
(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция; и
(c) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которого является более низкой при низкой концентрации кальция, чем при высокой концентрации кальция.
Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, или их библиотеки, включающего стадии:
(a) контактирование антигена с антигенсвязывающим доменом или антителом или их библиотекой при высокой концентрации кальция;
(b) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (а); и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).
Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего стадии:
(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция;
(b) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связались с антигеном на стадии (а);
(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, выбранным на стадии (b), связываться с антигеном при высокой концентрации кальция; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).
Кроме того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:
(a) контактирование при высокой концентрации кальция библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;
(b) элюирование антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с колонкой на стадии (а), из колонки при низкой концентрации кальция; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).
Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:
(a) позволение библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител при низкой концентрации кальция пройти через колонку, на которой иммобилизован антиген;
(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые элюировались без связывания с колонкой на стадии (а);
(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связаться с антигеном при высокой концентрации кальция; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, которые связались с антигеном на стадии (с).
Более того, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые являются одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, можно получать путем скрининга, включающего стадии:
(a) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител при высокой концентрации кальция;
(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела,  которые связались с антигеном на стадии (а);
(c) инкубация при низкой концентрации кальция антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b); и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем критерий для выбора на стадии (b).
Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам или антителам, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрации ионов кальция, чем при высокой концентрации ионов кальция, которые получают способами скрининга, которые дополнительно включают стадию повторения два или более раз стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество циклов стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено, однако обычно составляет 10 или менее.
В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,1 мкМ до 30 мкМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 0,5 мкМ до 10 мкМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в ранней эндосоме in vivo, в частности, от 1 мкМ до 5 мкМ. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации кальция конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 100 мкМ до 10 мМ, но предпочтительно она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция от 200 мкМ до 5 мМ. Более предпочтительно, она представляет собой антигенсвязывающую активность при концентрации ионизированного кальция в плазме in vivo, в частности, от 0,5 мМ до 2,5 мМ.
Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Условия, отличные от концентрации ионизированного кальция, могут быть определены специалистами в данной области. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать в качестве константы диссоциации (KD), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся KD), константы скорости диссоциации (kd), кажущейся константы диссоциации (кажущаяся kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.
В рамках настоящего изобретения стадия выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, является тождественной стадии выбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых является более низкой при низкой концентрация кальция, чем при высокой концентрации кальция.
При условии, что антигенсвязывающая активность является более высокой при высокой концентрации кальция, чем при низкой концентрации кальция, различие в антигенсвязывающей активности между высокой и низкой концентрациями концентрация конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при высокой концентрации кальция предпочтительно в два раза или более, более предпочтительно в 10 раз или более, и еще более предпочтительно в 40 раз или более превышает низкую концентрацию кальция.
Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любые антигенсвязывающие домены и антитела. Например, можно проводить скрининг описанных выше антигенсвязывающих доменов или антител. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающих доменов или антител, имеющих природные последовательности или последовательности с замещенными аминокислотами.
Библиотеки
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, которая в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены которых имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов. Концентрации ионов предпочтительно включают, например, концентрацию ионов металлов и концентрацию ионов водорода.
В рамках настоящего изобретения "библиотека" относится к множеству антигенсвязывающих молекул или множеству слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, или нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, кодирующих их последовательности. Последовательности множества антигенсвязывающих молекул или множества слитых полипептидов, содержащих антигенсвязывающие молекулы, в библиотеке не идентичны, а отличаются друг от друга.
6
12
14
6
14
7
12
8
11
8
12
В рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" в выражении "множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга", означает, что последовательности антигенсвязывающих молекул в библиотеке отличаются друг от друга. В частности, в библиотеке количество последовательностей, отличающихся друг от друга, отражает количество независимых клонов с различными последовательностями, и также может называться "размером библиотеки". Размер библиотеки для обычной библиотеки фагового дисплея находится в диапазоне от 10 до 10. Размер библиотеки может быть увеличен вплоть до 10 с использованием известных способов, таких как рибосомный дисплей. Однако истинное количество фаговых частиц, используемых в селекции способом пэннинга фаговой библиотеки, как правило, в 10-10000 раз превышает размер библиотеки. Эту избыточную множественность также называют "количеством эквивалентов библиотеки", и она означает, что существует от 10 до 10000 индивидуальных клонов, которые обладают одной и той же аминокислотной последовательностью. Таким образом, в рамках настоящего изобретения выражение "последовательности отличаются друг от друга" означает, что последовательности независимых антигенсвязывающих молекул в библиотеке, исключая эквиваленты библиотеки, отличаются друг от друга. Более конкретно, указанное выше означает, что существует от 10 до 10 антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, предпочтительно от 10 до 10 молекул, более предпочтительно от 10 до 10 молекул, и особенно предпочтительно от 10 до 10 молекул, последовательности которых отличаются друг от друга.
В рамках настоящего изобретения выражение "множество" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" в случае, например, антигенсвязывающих молекул, слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул, векторов или вирусов по настоящему изобретению, главным образом, относится к группе из двух или более типов вещества. Например, когда два или более вещества отличаются друг от друга конкретной характеристикой, это означает, что существует два или более типов вещества. Такие примеры могут включать, например, мутантные аминокислоты, наблюдаемые в конкретных аминокислотных положениях аминокислотной последовательности. Например, когда существует две или более антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нестрогих остатков или за исключением конкретных мутантных аминокислот в гипервариабельных положениях, экспонированных на поверхности, существует множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В другом примере, когда существует две или более полинуклеотидных молекулы, последовательности которых являются по существу одинаковыми или предпочтительно одинаковыми, за исключением нуклеотидов, кодирующих нестрогие остатки, или нуклеотидов, кодирующих мутантные аминокислоты гипервариабельных положений, экспонированных на поверхности, существует множество полинуклеотидных молекул по настоящему изобретению.
4
5
6
7
8
Кроме того, в рамках настоящего изобретения выражение "в основном состоит из" в выражении "библиотека в основном состоит из множества антигенсвязывающих молекул" отражает количество антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, среди независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. Особенно предпочтительно, чтобы в библиотеке существовало по меньшей мере 10 антигенсвязывающих молекул, имеющих такую активность связывания. Более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Особенно предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Еще более предпочтительно, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей по меньшей мере 10 антигенсвязывающих молекул, обладающих такой активностью связывания. Альтернативно это также предпочтительно может быть выражено как соотношение количества антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых варьирует, в зависимости от концентрации ионов, и количества независимых клонов, имеющих различные последовательности, в библиотеке. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в которой антигенсвязывающие молекулы, имеющие такую активность связывания, составляют от 0,1% до 80%, предпочтительно от 0,5% до 60%, более предпочтительно от 1% до 40%, еще более предпочтительно от 2% до 20%, и особенно предпочтительно от 4% до 10% независимых клонов с отличающимися последовательностями в библиотеке. В случае слитых полипептидов, полинуклеотидных молекул или векторов, могут быть возможными сходные выражения, в которых используются количества молекул или отношение к общему количеству молекул. В случае вирусов, также могут быть возможными сходные выражения, в которых используется количество вирионов или отношение к общему количеству вирионов.
Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих доменов в зависимости от концентрации ионов кальция
Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым путем. Например, когда ион металла представляет собой ион кальция, можно использовать заранее существующие антитела, заранее существующие библиотеки (фаговая библиотека, и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из гибридом, полученных путем иммунизации животных или из В-клеток иммунизированных животных, антитела или библиотеки, полученные внесением аминокислот, способных хелатировать кальций (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки (хелатирующие кальций аминокислоты (такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), библиотеки с увеличенным содержанием неприродных аминокислот, библиотеки полученные путем внесения хелатирующих кальций аминокислот (таких как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в конкретные положения, и т.п.
Примеры аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, как описано выше, могут представлять собой любые типы аминокислот, при условии что аминокислоты формируют кальций-связывающий мотив. Кальций-связывающие мотивы хорошо известны специалистам в данной области и подробно описаны (например, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki и Kretsinger (Белок Prof. (1995) 2, 305-490); Moncrief et al. (J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562); Chauvaux et al. (Biochem. J. (1990) 265, 261-265); Bairoch и Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454-456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410-419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638-643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349-354); Wurzburg et al. (Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). В частности, любые известные кальций-связывающие мотивы, включая лектины С-типа, такие как ASGPR, CD23, MBR и DC-SIGN, могут быть включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Предпочтительные примеры таких предпочтительных кальций-связывающих мотивов также включают, в дополнение к кальций-связывающим мотивам, описанным выше, например, кальций-связывающий мотив в антигенсвязывающем домене SEQ ID NO: 62.
Более того, в качестве аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция, например, предпочтительно можно использовать аминокислоты, имеющие активность хелатирования металлов. Примеры таких хелатирующих металлы аминокислот включают, например, серии (Ser(S)), треонин (Thr(T)), аспарагин (Asn(N)), глутамин (Gln(Q)), аспарагиновую кислоту (Asp(D)) и глутаминовую кислоту (Glu(E)).
Положения в антигенсвязывающих доменах, в которых содержатся описанные выше аминокислоты, конкретно не ограничены конкретными положениями, и они могут представлять собой любые положения в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которые образуют антигенсвязывающий домен, при условии, что они изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В частности, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены тяжелых цепей которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекулы в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты. В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены тяжелых цепей которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.
Между тем, в неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и антигенсвязывающие домены легкой цепи которых содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов кальция. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислот. В другом варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR1-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислоты в положениях 30, 31 и/или 32, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.
В другом неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к библиотекам, в основном состоящим из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR2-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 50, как указано в соответствии с системой нумерации Kabat.
В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. В альтернативном варианте осуществления антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и CDR3-домены легкой цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в положении 92, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.
Более того, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и в которых две или три CDR, выбранных из описанных выше CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержат упомянутые выше аминокислотные остатки. Более того, антигенсвязывающие домены по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, в основном состоящей из антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга и легкие цепи которых содержат упомянутые выше аминокислотные остатки в любом одном или нескольких из положений 30, 31, 32, 50 и/или 92, как указано в соответствии с системной нумерации Kabat.
В особенно предпочтительном варианте осуществления каркасные последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы предпочтительно содержат каркасные последовательности человека эмбрионального типа. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, когда каркасные последовательности представляют собой полностью человеческие последовательности, ожидается, что при введении такой антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению человеку (например, для лечения заболеваний), она индуцирует небольшой иммуногенный ответ или не индуцирует иммуногенного ответа. В указанном выше контексте выражение "содержащий последовательность эмбрионального типа" в рамках настоящего изобретения означает, что часть каркасных последовательностей по настоящему изобретению идентична части любых каркасных последовательностей человека эмбрионального типа. Например, когда последовательность FR2 тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению представляет собой комбинацию последовательностей FR2 тяжелой цепи различных каркасных последовательностей человека эмбрионального типа, такая молекула также представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, "содержащую последовательность эмбрионального типа".
Предпочтительные примеры каркасных областей включают, например, последовательности полностью человеческих каркасных областей человека, известные в настоящее время, которые включены в web-сайт V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) или другие. Эти последовательности каркасных областей можно соответствующим образом использовать в качестве последовательности эмбрионального типа, содержащейся в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению. Последовательности эмбрионального типа могут быть подразделены на категории в соответствии с их сходством (Tomlinson et al. (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams и Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Соответствующие последовательности эмбрионального типа могут быть выбраны из Vκ, которые подразделяются на семь подгрупп; Vλ, которые подразделяются на десять подгрупп; и VH, которые подразделяются на семь подгрупп.
Полностью человеческие последовательности VH предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например, последовательности VH:
подгруппы VH1 (например, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 и VH1-69);
подгруппы VH2 (например, VH2-5, VH2-26 и VH2-70);
подгруппы VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 и VH3-74);
подгруппы VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 и VH4-61);
подгруппы VH5 (VH5-51);
подгруппы VH6 (VH6-1); и
подгруппы VH7 (VH7-4 и VH7-81).
Они также описаны в известных документах (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) и т.п., и, таким образом, специалисты в данной области могут соответствующим образом моделировать антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, исходя из информации об этих последовательностях. Также предпочтительно использовать другие полностью человеческие каркасные области или каркасные субобласти.
Полностью человеческие последовательности VK предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:
А20, А30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 и O18, выделенные в подгруппу Vk1;
A1, А2, A3, А5, А7, А17, А18, А19, А23, O1 и O11, выделенные в подгруппу Vk2;
A11, А27, L2, L6, L10, L16, L20 и L25, выделенные в подгруппу Vk3;
В3, выделенная в подгруппу Vk4;
В2 (также обозначаемая как Vk5-2), выделенная в подгруппу Vk5; и
А10, А14 и А26, выделенные в подгруппу VK6.
(Kawasaki et al. (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173-181)).
Полностью человеческие последовательности VL предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, например:
V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 и V1-22, выделенные в подгруппу VL1;
V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 и V2-19, выделенные в подгруппу VL1;
V3-2, V3-3 и V3-4, выделенные в подгруппу VL3;
V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 и V4-6, выделенные в подгруппу VL4; и
V5-1, V5-2, V5-4 и V5-6, выделенные в подгруппу VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).
Обычно эти каркасные последовательности отличаются друг от друга одним или несколькими аминокислотными остатками. Эти каркасные последовательности можно использовать в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению. Другие примеры полностью человеческих каркасных областей, используемых в комбинации с "по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов" по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, например, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ (например, Kabat et al. (1991), выше, Wu et al. (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
Без связи с конкретной теорией полагают, что одна из причин для того, чтобы ожидать, что использование последовательностей эмбрионального типа предотвратит неблагоприятные иммунные ответы у большинства индивидуумов, состоит в следующем. В результате процесса созревания аффинности в ходе нормальных иммунных ответов, часто в вариабельных областях иммуноглобулинов происходят соматические мутации. Такие мутации чаще всего происходят в области CDR, последовательности которых являются гипервариабельными, но также затрагивают остатки каркасных областей. Такие мутации каркасной области не существуют в генах эмбрионального типа, но также с меньшей вероятностью будут иммуногенными у пациентов. Это является следствием того, что в нормальной человеческой популяции присутствует большинство каркасных последовательностей, экспрессируемых с генов эмбрионального типа и в результате иммунной толерантности, ожидается, что эти каркасные области эмбрионального типа будут иметь низкую иммуногенность у пациентов или не иметь иммуногенности у пациентов. Для максимизации возможности иммунной толерантности можно выбирать гены, кодирующие вариабельную область, из группы часто встречающихся функциональных генов эмбрионального типа.
Для получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, в которых описанные выше каркасные последовательности содержат аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентрации ионов кальция, можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР.
Например, библиотеку, которая содержит множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, где вариабельную область легкой цепи выбирают в качестве каркасной последовательности, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. В качестве неограничивающего примера, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, сконструированные посредством комбинирования последовательности вариабельной области легкой цепи, принадлежащая семейству Vk5-2, соответствующая SEQ ID NO: 62 (Vk5-2), и вариабельной области тяжелой цепи, полученными в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области.
Альтернативно последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную в качестве каркасной области, первоначально содержащей по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы, как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала различные аминокислотные остатки, отличные от упомянутых выше аминокислотных остатков. В настоящем описании такие остатки называют нестрогими остатками. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, подлежащих внесению в последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 62 (Vk5-2), включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 или 2.
В настоящем описании нестрогие остатки относятся к варьированию аминокислотных остатков, имеющемуся в гипервариабельных положениях, в которых присутствует несколько различных аминокислот, в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи, когда сравнивают аминокислотные последовательности известных и/или нативных антител или антигенсвязывающих доменов. Гипервариабельные положения, как правило, расположены в CDR. В одном варианте осуществления для определения гипервариабельных положений в известных и/или нативных антителах пригодны данные, предоставленные Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 и 1991). Более того, в базах данных в Интернете (http://vbase.mrc-сре.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) предоставлены собранные последовательности многих легких цепей и тяжелых цепей человека и их положения. Информация о последовательностях и положениях пригодна для определения гипервариабельных положений в рамках настоящего изобретения. В соответствии с настоящим изобретением, когда определенное положение аминокислоты имеет предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 20 возможных вариантов аминокислотных остатков, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 19, предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 18, предпочтительно от 5 до 17, предпочтительно от 6 до 16, предпочтительно от 7 до 15, предпочтительно от 8 до 14, предпочтительно от 9 до 13, и предпочтительно от 10 до 12 возможных вариантов аминокислотных остатков, это положение является гипервариабельным. В некоторых вариантах осуществления определенное положение аминокислоты может иметь предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 8, предпочтительно приблизительно 10 и предпочтительно приблизительно 12 вариантов аминокислотных остатков.
Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающих молекул в зависимости от концентраций ионов, как упоминалось выше. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают, например, библиотеки, в которых вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с последовательностями вариабельной области легкой цепи, в которых конкретный остаток(и) в последовательности эмбрионального типа, такой как SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) или SEQ ID NO: 8 (Vk4) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR1 легкой цепи. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки в CDR2 легкой цепи. Кроме того, другие неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи.
Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR1 легкой цепи, включают остатки в положениях 30, 31 и/или 32 в CDR1 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR2 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 50 в CDR2 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков, содержащихся в CDR3 легкой цепи, включают аминокислотный остаток в положении 92 в CDR3 вариабельной области легкой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует, в зависимости от концентрации ионов кальция. Между тем, поскольку известны тропонин С, кальмодулин, парвальбумин и легкая цепь миозина, которые обладают несколькими участками связывания ионов кальция и, как полагают, имеют общее происхождение с точки зрения молекулярной эволюции, можно конструировать CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи так, чтобы они имели их связывающие мотивы. Например, можно использовать домены кадгерина, EF-hand кальмодулина, С2-домен протеинкиназы С, Gla-домен белка фактора свертывания крови IX, лектины С-типа рецептора ациарогликопротеинов и манноза-связывающего рецептора, А-домены рецепторов LDL, аннексин, домена тромбоспондина 3 типа, и EGF-подобные домены соответствующим образом для описанных выше целей.
Когда вариабельные области тяжелой цепи, полученные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, и вариабельные области легкой цепи, в которые внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, комбинируют, как описано выше, последовательности вариабельных областей легкой цепи можно конструировать так, чтобы они содержали нестрогие остатки аналогично тому, как описано выше. Количество и положение таких нестрогих остатков конкретно не ограничивается конкретными вариантами осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или последовательности FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области легкой цепи, включают аминокислотные остатки, приведенные в таблицах 1 и 2.
Предпочтительные вариабельные области тяжелой цепи, подлежащие комбинированию, включают, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Для получения рандомизированной библиотеки вариабельной области известные способы комбинируют соответствующим образом. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области предпочтительно можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из лимфоцитов животных, иммунизированных конкретным антигеном, пациентов с инфекциями, индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или пациентов с аутоиммунным заболеванием.
В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также предпочтительно можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Критерием возникновения разнообразия аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является то, что разнообразие возникает у аминокислотных остатков в экспонированных на поверхности положениях антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы. Как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка, и информации о трехмерной структуре, полученной для антитела. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Главным образом или предпочтительно, когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, равный приблизительно 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для персональных компьютеров описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно предпочтительно можно использовать наивную библиотеку, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). В настоящем описании, аминокислотная последовательность, содержащая наивную последовательность, относится к аминокислотной последовательности, полученной из такой наивной библиотеки.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен по настоящему изобретению можно получать из библиотеки, содержащей множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, полученных путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области, где вариабельная область тяжелой цепи, выбрана в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, сконструированные путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1). Альтернативно такую библиотеку можно конструировать путем выбора соответствующих вариабельных областей легкой цепи из вариабельных областей легкой цепи, которые имеют последовательности эмбрионального типа, вместо вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области. Такие предпочтительные библиотеки включают, например, библиотеки, в которых последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1) или SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1) комбинируют с вариабельными областями легкой цепи, имеющими последовательность эмбрионального типа.
Альтернативно последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную в качестве каркасной последовательности, которая первоначально содержит "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы", как упоминалось выше, можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 (6RL#9-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях 95, 96 и/или 100а. Альтернативно неограничивающие примеры нестрогих остатков, вносимых в последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 (6KC4-1#85-IgG1), включают все аминокислотные остатки CDR1 и CDR2 тяжелой цепи и аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи, за исключением остатков в положениях аминокислоты 95 и/или 101.
Альтернативно библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул, последовательности которых отличаются друг от друга, можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей легкой цепи, сконструированных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельных областей легкой цепи, имеющих последовательности эмбрионального типа, с вариабельными областями тяжелой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, ответственный за зависимое от концентрации ионов изменение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы". Когда концентрация ионов представляет собой концентрацию ионов кальция, неограничивающие примеры таких библиотек предпочтительно включают библиотеки, в которых вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательности эмбрионального типа, комбинируют с последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, в которой конкретный остаток(остатки) заменен по меньшей мере одним аминокислотным остатком, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов кальция. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR1 тяжелой цепи. Следующие неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков включают аминокислотные остатки CDR2 тяжелой цепи. Кроме того, неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков также включают аминокислотные остатки CDR3 тяжелой цепи. Неограничивающие примеры таких аминокислотных остатков CDR3 тяжелой цепи включают аминокислоты в положениях 95, 96, 100а и/или 101 в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, как указано согласно нумерации Kabat. Более того, эти аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или в комбинации, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив и/или антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует в зависимости от концентрации ионов кальция.
Когда вариабельные области легкой цепи, сконструированные в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, или вариабельные области легкой цепи, имеющие последовательность эмбрионального типа, комбинируют с вариабельной областью тяжелой цепи, в которую внесен по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов, как упоминалось выше, последовательность вариабельной области тяжелой цепи также можно конструировать так, чтобы она содержала нестрогие остатки, аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению варьирует, в зависимости от концентраций ионов. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Более того, рандомизированные библиотеки вариабельной области можно предпочтительно использовать в качестве аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, отличных от аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы. Когда в качестве вариабельных областей легкой цепи используют последовательности эмбрионального типа, неограничивающие примеры таких последовательностей включают последовательности SEQ ID NO: 5 (Vk1), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3) и SEQ ID NO: 8 (Vk4).
Предпочтительно можно использовать любую из описанных выше аминокислот, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентраций ионов кальция, при условии что они образуют кальций-связывающий мотив. В частности, такие аминокислоты включают электронодонорные аминокислоты. Предпочтительные примеры таких электронодонорных аминокислот включают серин, треонин, аспарагин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.
Условия концентраций ионов водорода
-3
-14
-7
В одном варианте осуществления настоящего изобретения условия концентраций ионов относятся к условиям концентраций ионов водорода или условиям рН. В рамках настоящего изобретения концентрация протона, т.е. ядра атома водорода, используется в качестве синонима водородного показателя (рН). Когда активность ионов водорода в водном растворе отображают как аН+, рН определяется как -log10aH+. Когда ионная сила водного раствора является низкой (например, ниже 10), аН+ практически равна ионной силе водорода. Например, ионное произведение воды при 25°С и 1 атмосфере составляет Kw=aH+aOH=10, и, таким образом, в чистой воде аН+=аОН=10. В этом случае, рН=7 является нейтральным; водный раствор, рН которого ниже 7, является кислым, или рН которого больше 7, является щелочным.
В рамках настоящего изобретения, когда условия рН используют в качестве условий концентрации ионов, условия рН включают высокие концентрации ионов водорода или низкие значения рН, т.е. диапазон кислых значений рН, и низкие концентрации ионов водорода или высокие значения рН, т.е. диапазон нейтральных значений рН. "Активность связывания варьирует в зависимости от условий рН" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы варьирует вследствие различий в условиях высокой концентрации ионов водорода или низких значений рН (диапазон кислых значений рН) и низкой концентрации ионов водорода или высоких значений рН (диапазон нейтральных значений рН). Это включает, например, случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне нейтральных значений рН, чем в диапазоне кислых значений рН, и случай, когда антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы является более высокой в диапазоне кислых значений рН, чем в диапазоне нейтральных значений рН.
В настоящем описании диапазон нейтральных значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН6,7 до рН10,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН6,7 до рН 9,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН7,0 до рН9,0. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН7,0 до рН8,0. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 7,4, которое является близким к рН плазмы (крови) in vivo.
В настоящем описании диапазон кислых значений рН не ограничивается конкретной величиной и предпочтительно выбран из диапазона от рН4,0 до рН6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН4,5 до рН6,5. В другом варианте осуществления значение рН может быть выбрано из диапазона от рН5,0 до рН6,5. В другом варианте осуществления рН может быть выбрано из диапазона от рН5,5 до рН6,5. Особенно предпочтительное значение рН включает рН 5,8, что является близким к концентрации ионизированного кальция в ранней эндосоме in vivo.
В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН (диапазон кислых значений рН) является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН (диапазон нейтральных значений рН)" означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН4,0 до рН6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН6,7 до рН10,0; предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН4,5 до рН6,5, является более слабой, чем при рН, выбранном из диапазона от рН6,7 до рН9,5; более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН5,0 до рН6,5, является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН7,0 до рН9,0; еще более предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при значении рН, выбранном из диапазона от рН5,5 до рН6,5 является более слабой, чем при значении рН, выбранном из диапазона от рН7,0 до рН8,0; особенно предпочтительно это означает, что антигенсвязывающая активность при значении рН в ранней эндосоме in vivo является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при значении рН в плазме in vivo; и, конкретно, это означает, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при рН5,8 является более слабой, чем антигенсвязывающая активность при рН 7,4.
Определение того, изменяется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий рН можно проводить, например, с использованием известных способов измерения, таких как способы, описанные в разделе "Активность связывания" выше. В частности, активность связывания измеряют в различных условиях рН с использованием способов измерения, описанных выше. Например, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы сравнивают в условиях диапазона кислых значений рН и диапазона нейтральных значений рН, чтобы подтвердить, что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы изменяется так, что она является более высокой в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем в условиях диапазона кислых значений рН.
Более того, в рамках настоящего изобретения выражение "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или при высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" также может быть выражено как "антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН". В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН". Альтернативно "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН" может быть описана как "антигенсвязывающая активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, снижена так, чтобы она была слабее, чем антигенсвязывающая способность при низкой концентрации ионов водорода или высоких значениях рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН".
Условия, отличные от концентрации ионов водорода или рН для измерения и антигенсвязывающей активности, могут быть соответствующим образом выбраны специалистами в данной области и они конкретно не ограничены. Измерение можно проводить, например, при 37°С с использованием буфера HEPES. Измерение можно проводить, например, с использованием Biacore (GE Healthcare). Когда антиген представляет собой растворимый антиген, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы можно определять путем оценки активности связывания с растворимым антигеном путем нанесения антигена в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизована антигенсвязывающая молекула. Когда антиген представляет собой антиген мембраны, активность связывания с антигеном мембраны можно оценивать путем нанесения антигенсвязывающей молекулы в качестве анализируемого соединения на чип, на который иммобилизован антиген.
При условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более слабой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, соотношение антигенсвязывающей активности между антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН конкретно не ограничено, и величина KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4), которая представляет собой соотношение константы диссоциации (KD) для антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и KD при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более; более предпочтительно величина KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) составляет 10 или более; и еще более предпочтительно величина KD (pH 5,8)/KD (рН 7,4) составляет 40 или более. Верхний предел величины KD (pH 5,8)/KD (pH 7,4) конкретно не ограничен и он может представлять собой любую величину, такую как 400, 1000 или 10000, при условии что молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.
Когда антиген представляет собой растворимый антиген, константу диссоциации (KD) можно использовать в качестве величины антигенсвязывающей активности. Между тем, когда антиген представляет собой мембранный антиген, можно использовать кажущуюся константу диссоциации (KD). Константу диссоциации (KD) и кажущуюся константу диссоциации (KD) можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда, проточный цитометр и т.п.
Альтернативно, например, константу скорости диссоциации (kd) можно соответствующим образом использовать в качестве показателя, указывающего на соотношение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению между активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, и при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН. Когда kd (константа скорости диссоциации) используют в качестве показателя, указывающего на соотношение активностей связывания вместо KD (константа диссоциации), величина kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН), которая представляет собой соотношение kd (константа скорости диссоциации) в отношении антигена при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений, рН и kd (константа скорости диссоциации) при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно составляет 2 или более, более предпочтительно 5 или более, еще более предпочтительно 10 или более и еще более предпочтительно 30 или более. Верхний предел величины kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) конкретно не ограничен, и он может представлять собой любую величину, такую как 50, 100 или 200, при условии, что можно молекулу можно получать способами, известными специалистам в данной области.
Когда антиген представляет собой растворимый антиген, в качестве величины антигенсвязывающей активности можно использовать константу скорости диссоциации (kd), и когда антиген представляет собой антиген мембраны, можно использовать кажущуюся константу скорости диссоциации (kd). Константу скорости диссоциации (kd) и кажущуюся константу скорости диссоциации (kd) можно определять способами, известными специалистам в данной области, и можно использовать Biacore (GE healthcare), проточный цитометр и т.п. В рамках настоящего изобретения, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы измеряют при различных концентрациях ионов водорода, т.е. рН, условия, отличные от концентрации ионов водорода, т.е. рН, предпочтительно являются одинаковыми.
Например, антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител, включающего следующие стадии (а)-(с):
(a) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне кислых значений рН;
(b) получение значения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена или антитела в диапазоне нейтральных значений рН; и
(c) выбор антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН.
Альтернативно антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются одним из вариантов осуществления, предусматриваемых настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов или антител или их библиотеки, включающего следующие стадии (а)-(с):
(a) контактирование антигенсвязывающего домена, или антитела, или их библиотеки, в диапазоне нейтральных значений рН с антигеном;
(b) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а), в диапазон кислых значений рН; и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, диссоциировавших на стадии (b).
Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать путем скрининга антигенсвязывающих доменов, или антител, или их библиотеки, включающего следующие стадии (a)-(d):
(a) контактирование в диапазоне кислых значений рН антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител;
(b) отбор антигенсвязывающего домена или антитела, которые не связываются с антигеном на стадии (а);
(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, отобранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).
Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (а)-(с):
(a) контактирование в диапазоне нейтральных значений рН библиотеки антигенсвязывающих доменов или антител с колонкой, на которой иммобилизован антиген;
(b) элюирование в диапазоне кислых значений рН из колонки антигенсвязывающего домена или антитела, связавшегося с колонкой на стадии (а); и
(c) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных на стадии (b).
Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):
(a) позволение в диапазоне кислых значений рН библиотеке антигенсвязывающих доменов или антител проходить через колонку, на которую иммобилизован антиген;
(b) сбор антигенсвязывающего домена или антитела, элюированных без связывания с колонкой на стадии (а);
(c) позволение антигенсвязывающему домену или антителу, собранным на стадии (b), связываться с антигеном в диапазоне нейтральных значений рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (с).
Антигенсвязывающий домен или антитело, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, которые являются другим вариантом осуществления, предусматриваемым настоящим изобретением, можно получать способом скрининга, включающим следующие стадии (a)-(d):
(а) контактирование антигена с библиотекой антигенсвязывающих доменов или антител в диапазоне нейтральных значений рН;
(b) получение антигенсвязывающего домена или антитела, связавшихся с антигеном на стадии (а);
(c) помещение антигенсвязывающего домена или антитела, полученных на стадии (b), в диапазон кислых значений рН; и
(d) выделение антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых на стадии (с) является более слабой, чем стандарт, выбранный на стадии (b).
Описанные выше стадии можно повторять два или более раз. Таким образом, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим доменам и антителам, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, которые получают способом скрининга, который дополнительно включает стадии повторения два или более раз стадий (а)-(с) или (a)-(d) в описанных выше способах скрининга. Количество повторений стадий (а)-(с) или (a)-(d) конкретно не ограничено; однако обычно количество составляет 10 или менее.
В способах скрининга по настоящему изобретению антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничена, при условии что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 4,0 до 6,5, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 4,5 до 6,6 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 5,0 до 6,5, и антигенсвязывающую активность при рН от 5,5 до 6,5 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН в ранней эндосоме in vivo в качестве более предпочтительного значения рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 5,8. Между тем, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена или антитела при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 10, и включает антигенсвязывающую активность при рН от 6,7 до 9,5 в качестве предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН от 7,0 до 9,5 и антиген связывающую активность при рН от 7,0 до 8,0 в качестве других предпочтительных значений рН. Антигенсвязывающая активность также включает антигенсвязывающую активность при рН плазмы in vivo в качестве более предпочтительных значений рН, и, в частности, антигенсвязывающую активность при рН 7,4.
Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от концентрации ионизированного кальция. Антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена или антитела можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием Biacore (GE healthcare), графика Скэтчарда или FACS.
В рамках настоящего изобретения стадия отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является синонимичной стадии отбора антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, является более низкой, чем при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН.
При условии, что антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, отличие между антигенсвязывающей активностью при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, и антигенсвязывающей активностью при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, конкретно не ограничено; однако антигенсвязывающая активность при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, предпочтительно в два или более раз, более предпочтительно в 10 или более раз, и еще более предпочтительно в 40 или более раз превышает антигенсвязывающую активность при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН.
Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подвергаемые скринингу способами скрининга, описанными выше, могут представлять собой любой антигенсвязывающий домен или антитело, и можно проводить скрининг упомянутого выше антигенсвязывающего домена или антитела. Например, можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, имеющих нативную последовательность, и можно проводить скрининг антигенсвязывающего домена или антитела, в которых их аминокислотные последовательности были заменены.
Антигенсвязывающий домен или антитело по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных путем иммунизации животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислотные мутации в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислотных мутаций в описанные выше антитела или библиотеки.
Способы получения антигенсвязывающего домена или антитела, антигенсвязывающая активность которых при низкой концентрации ионов водорода или высоком значении рН, т.е. в диапазоне нейтральных значений рН, является более высокой, чем при высокой концентрации ионов водорода или низком значении рН, т.е. в диапазоне кислых значений рН, из антигенсвязывающих доменов или антител, полученных из гибридом, полученных иммунизацией животных или из В-клеток иммунизированных животных, предпочтительно включают, например, антигенсвязывающую молекулу или антитело, в которых по меньшей мере одна из аминокислот антигенсвязывающего домена или антитела заменена аминокислотой с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или мутацией на неприродную аминокислоту, или антигенсвязывающий домен или антитело, в которые встроена аминокислота с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродная аминокислота, такая как описана в WO 2009/125825.
Участки внесения мутаций на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты конкретно не ограничены, и они могут представлять собой любое положение, при условии что антигенсвязывающая активность в диапазоне кислых значений рН становится более слабой, чем в диапазоне нейтральных значений рН (величина KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) увеличивается) по сравнению с величиной до замены или вставки. Например, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, являются пригодными вариабельная область и CDR антитела. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить количество аминокислот, подлежащих замене, или количество аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, подлежащих встраиванию. Можно осуществить замену на одну аминокислоту, имеющую pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одну неприродную аминокислоту; можно осуществить встраивание одной аминокислоты, имеющей pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или одной неприродной аминокислоты; можно осуществить замену на две или более аминокислоты, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или на две или более неприродных аминокислоты; и можно осуществить встраивание двух или более аминокислот, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или двух или более неприродных аминокислот. Альтернативно другие аминокислоты можно параллельно удалять, добавлять, встраивать и/или заменять, помимо замены на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, или встраивания аминокислот, имеющих pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот. Замену на или встраивание аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот можно проводить случайным образом способами, такими как сканирование гистидином, в которых аланин в способе сканирования аланином, известном специалистам в данной области, заменяют на гистидин. Антигенсвязывающие молекулы, проявляющие более высокую величину KD (в диапазоне кислых значений рН)/KD (в диапазоне нейтральных значений рН) или kd (в диапазоне кислых значений рН)/kd (в диапазоне нейтральных значений рН) по сравнению с величиной до внесения мутации можно выбирать из антигенсвязывающих доменов или антител, в которые внесены случайные инсерции или мутации с заменой на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты.
Предпочтительные примеры антигенсвязывающих молекул, содержащих мутацию на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, как описано выше, и антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают антигенсвязывающие молекулы, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне нейтральных значений рН после мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты сравнима с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты. В рамках настоящего изобретения "антигенсвязывающая молекула после мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты имеет антигенсвязывающую активность, сравнимую с антигенсвязывающей активностью до мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты" означает, что, при принятии антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы до мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты, как 100%, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы после мутации на аминокислоты, имеющие pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота), или неприродные аминокислоты составляет по меньшей мере 10% или более, предпочтительно 50% или более, более предпочтительно 80% или более, и еще более предпочтительно 90% или более. Антигенсвязывающая активность после мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4 может быть более высокой, чем до мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты при рН 7,4. Если антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы снижается вследствие встраивания или замены на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, антигенсвязывающую активность можно сделать сравнимой с антигенсвязывающей активностью до встраивания или замены на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты, путем внесения замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающей молекулы. Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания которых скорректирована так, чтобы она была сравнимой, путем замены, делеции, вставки и/или инсерции одной или нескольких аминокислот после замены на или вставки аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродной аминокислоты.
Между тем, когда антигенсвязывающая молекула представляет собой вещество, содержащее константную область антитела, предпочтительные варианты осуществления антигенсвязывающих молекул, антигенсвязывающая активность которых в диапазоне кислых значений рН является более низкой, чем в диапазоне нейтральных значений рН, включают способы, в которых константные области антитела, содержащиеся в антигенсвязывающих молекулах, модифицированы. Конкретные примеры модифицированных константных областей антител предпочтительно включают константные области SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 14.
Аминокислоты, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена в зависимости от условий концентрации ионов водорода
Антигенсвязывающие домены или антитела по настоящему изобретению, подлежащие скринингу описанными выше способами скрининга, можно получать любым способом. Например, когда условия концентрации ионов представляют собой условия концентрации ионов водорода или условия рН, можно использовать общепринятые антитела, общепринятые библиотеки (фаговая библиотека и т.д.), антитела или библиотеки, полученные из В-клеток иммунизированных животных или из гибридом, полученных иммунизацией животных, антитела или библиотеки (библиотеки с увеличенным содержанием аминокислот с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродных аминокислот, библиотеки, в которые внесены мутации на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в конкретных положениях и т.д.), полученные путем внесения мутаций на аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0 (например, гистидин и глутаминовая кислота) или неприродные аминокислоты в описанные выше антитела или библиотеки.
В одном неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения библиотеку, содержащую множество антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, последовательности которых отличаются друг от друга, также можно конструировать путем комбинирования вариабельных областей тяжелой цепи, полученных в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, с вариабельными областями легкой цепи, в которые внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода".
Такие аминокислотные остатки включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи. Аминокислотные остатки также включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR3 легкой цепи.
Описанные выше аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR1 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 24, 27, 28, 31, 32 и/или 34 согласно нумерации Kabat в CDR1 вариабельной области легкой цепи. Между тем, аминокислотные остатки, содержащиеся в CDR2 легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 50, 51, 52, 53, 54, 55 и/или 56 согласно нумерации Kabat в CDR2 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки в CDR3 легкой цепи включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки в положениях 89, 90, 91, 92, 93, 94 и/или 95А согласно нумерации Kabat, в CDR3 вариабельной области легкой цепи. Более того, аминокислотные остатки могут содержаться отдельно или они могут содержаться в комбинации из двух или более аминокислот, при условии, что они позволяют изменять антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от концентрации ионов водорода.
Даже когда вариабельную область тяжелой цепи, полученную в качестве рандомизированной библиотеки последовательностей вариабельной области, комбинируют с описанной выше вариабельной областью легкой цепи, в которую внесен "по меньшей мере один аминокислотный остаток, который изменяет антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода", ее можно конструировать так, чтобы нестрогие остатки содержались в последовательности вариабельной области легкой цепи аналогично тому, как описано выше. Количество и положение нестрогих остатков конкретно не ограничено конкретным вариантом осуществления, при условии что антигенсвязывающая активность антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению изменяется в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, последовательности CDR и/или FR тяжелой цепи и/или легкой цепи могут содержать один или несколько нестрогих остатков. Например, нестрогие остатки, подлежащие внесению в последовательности вариабельных областей легкой цепи, включают, но не ограничиваются ими, например, аминокислотные остатки, приведенные в таблице 3 и 4. Между тем, аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи, отличные от нестрогих остатков, и аминокислотные остатки, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода, соответственно включают, но не ограничиваются ими, последовательности эмбрионального типа, такие как Vk1 (SEQ ID NO: 5), Vk2 (SEQ ID NO: 6), Vk3 (SEQ ID NO: 7) и Vk4 (SEQ ID NO: 8).
(положение указано согласно нумерации Kabat)
(положение указано согласно нумерации Kabat)
Любой аминокислотный остаток можно соответствующим образом использовать в качестве описанных выше аминокислотных остатков, которые изменяют антигенсвязывающую активность антигенсвязывающей молекулы в зависимости от условий концентрации ионов водорода. В частности, такие аминокислотные остатки включают аминокислоты с pKa боковой цепи 4,0-8,0. Такие электроноотдающие аминокислоты предпочтительно включают, например, встречающиеся в природе аминокислоты, такие как гистидин и глутаминовая кислота, а также неприродные аминокислоты, такие как аналоги гистидина (US 20090035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3.5-Br2-Tyr (pKa 7,21) и 3.5-I2-Tyr (pKa 7,38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-2768). Особенно предпочтительные аминокислотные остатки включают, например, аминокислоты с pKa боковой цепи 6,0-7,0. Такие электроноотдающие аминокислотные остатки предпочтительно включают, например, гистидин.
Для модификации аминокислот антигенсвязывающих доменов можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Более того, различные известные способы также можно использовать в качестве способа модификации аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно соответствующим образом использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которых амбер-супрессорная тРНК, которая комплементарна кодону UAG (амбер-кодон), который является стоп-кодоном, связана с неприродной аминокислотой.
Предпочтительная вариабельная область тяжелой цепи, которую используют в комбинации, включает, например, рандомизированные библиотеки вариабельной области. Известные способы соответствующим образом комбинируют в качестве способа получения рандомизированной библиотеки вариабельной области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области можно использовать иммунную библиотеку, сконструированную на основе генов антител, происходящих из животных, иммунизированных конкретными антигенами, пациентов с инфекцией или индивидуумов с повышенным титром антител в крови в результате вакцинации, пациентов со злокачественной опухолью или лимфоцитов от пациентов с иммунными заболеваниями.
В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения, аналогично тому, как описано выше, в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также пригодным образом можно использовать синтетическую библиотеку, полученную путем замены последовательностей CDR V-генов в геномной ДНК или функциональных реконструированных V-генов набором синтетических олигонуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие наборы кодонов соответствующей длины. В этом случае, поскольку в последовательности CDR3 тяжелой цепи наблюдают разнообразие, также можно заменять только последовательность CDR3. Основанием для получения вариантов аминокислот в вариабельной области антигенсвязывающей молекулы является получение вариантов аминокислотных остатков экспонированных на поверхности положений антигенсвязывающей молекулы. Экспонированное на поверхности положение относится к положению, которое считается способным экспонироваться на поверхности и/или контактировать с антигеном, исходя из структуры, группы структур и/или смоделированной структуры антигенсвязывающей молекулы, и, как правило, такие положения представляют собой CDR. Предпочтительно, экспонированные на поверхности положения определяют с использованием координат из трехмерной модели антигенсвязывающей молекулы с использованием компьютерной программы, такой как программа InsightII (Accelrys). Экспонированные на поверхности положения можно определять с использованием алгоритмов, известных в данной области (например. Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Определение экспонированных на поверхности положений можно проводить на основе информации о трехмерной структуре с использованием программного обеспечения, пригодного для моделирования белка. Программное обеспечение, которое можно использовать для этих целей, предпочтительно включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Когда алгоритм требует введения пользователем параметра размера, "размер" образца, который используют в вычислении, устанавливают как радиус, приблизительно равный 1,4 Ангстрем или менее. Более того, способы определения экспонированных на поверхности областей и участков с использованием программного обеспечения для персонального компьютера описаны Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
В другом неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения в качестве рандомизированной библиотеки вариабельной области также особенно пригодным является использование наивной библиотеки, которая сконструирована из генов антител, происходящих из лимфоцитов здоровых индивидуумов, и набор генов которой состоит из наивных последовательностей, которые представляют собой последовательности антител без предпочтений (Gejima et al. (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).
Нейтрализующая активность
Неограничивающий вариант осуществления настоящего изобретения относится к антигенсвязывающей молекуле, обладающей активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, включающей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, и имеющей нейтрализующую активность против антигена, где антигенсвязывающий домен обладает антигенсвязывающей активностью, которая изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем Fc-область нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров; и фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающую молекулу. Главным образом, нейтрализующая активность относится к активности ингибирования биологической активности лиганда, такого как вирусы и токсины, обладающие биологической активностью в отношении клеток. Таким образом, вещества, обладающие нейтрализующей активностью, относятся к веществам, которые связываются с лигандом или рецептором, с которым связывается лиганд, и ингибируют связывание между лигандом и рецептором. Рецепторы, связывание которых с лигандом блокировано вследствие нейтрализующей активности, не способны проявлять биологическую активность через этот рецептор. Когда антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, такое антитело, обладающее нейтрализующей активностью, обычно называют нейтрализующим антителом. Нейтрализующую активность исследуемого вещества можно измерять путем сравнения биологической активности в присутствии лиганда между ситуациями, когда исследуемое вещество присутствует и отсутствует.
Например, основные возможные лиганды для рецептора IL-6 предпочтительно включают IL-6, как показано в SEQ ID NO: 15. Рецептор IL-6, который представляет собой мембранный белок типа I, N-конец которого образует внеклеточный домен, образует гетеротетрамер с рецептором gp130, который индуцируется к димеризации посредством IL-6 (Heinrich et al. (Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). Образование гетеротетрамера активирует Jak, которая ассоциирована с рецептором gp130. Jak претерпевает аутофосфорилирование и фосфорилирует рецептор. Участок фосфорилирования рецептора и Jak служит в качестве участка связывания для содержащих SH2 молекул, принадлежащих семейству Stat, таких как Stat3; МАР-киназа; PI3/Akt; и другие содержащие SH2 белки и адаптеры. Далее, Stat, связанный с рецептором gp130, фосфорилируется посредством Jak. Фосфорилированный Stat димеризуется и перемещается в ядро, и регулирует транскрипцию генов-мишеней. Jak или Stat также могут быть вовлечены в каскады передачи сигнала через рецепторы других классов. Нарушенную регуляцию каскадов передачи сигнала IL-6 наблюдают при воспалительных и патологических состояниях аутоиммунных заболеваний и злокачественных опухолей, таких как рак предстательной железы и множественная миелома. Stat3, который может действовать в качестве онкогена, конститутивно активируется во многих злокачественных опухолях. При раке предстательной железы и множественной миеломе существует перекрестная связь между каскадом передачи сигнала через рецептор IL-6 и каскадом передачи сигнала через представителей семейства рецептора эпителиального фактора роста (EGFR) (Ishikawa et al. (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).
Такие внутриклеточные каскады передачи сигнала различаются для каждого типа клеток; таким образом, соответствующие молекулы-мишени можно определять для каждой представляющей интерес клетки-мишени, и они не ограничиваются упомянутыми выше факторами. Активность нейтрализации можно оценивать путем измерения активации передачи сигнала in vivo. Более того, активацию передачи сигнала in vivo можно выявлять с использованием в качестве показателя действия индукции транскрипции гена-мишени, который располагается ниже каскада передачи сигнала in vivo. Изменение активности транскрипции гена-мишени можно выявлять по принципу репортерных анализов. В частности, репортерный ген, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или люцифераза, помещают ниже промоторной области или фактора транскрипции гена-мишени, его репортерную активность измеряют, и, тем самым, можно измерять изменение активности транскрипции в качестве активности репортера. Можно соответствующим образом использовать коммерчески доступные наборы для измерения активации передачи сигнала in vivo (например. Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clontech)).
3
Более того, для способов измерения активности нейтрализации рецепторов/лигандов семейства рецепторов EGF и т.п., которая обычно воздействует на каскады передачи сигнала, которые действуют в направлении стимуляции пролиферации клеток, активность нейтрализации нейтрализующих антител можно оценивать путем измерения активности пролиферации клеток-мишеней. Например, когда пролиферация клеток стимулируется факторами роста семейства EGF, такими как HB-EGF, ингибиторный эффект на пролиферацию таких клеток, основанный на нейтрализующей активности антитела против HB-EGF, можно пригодным образом оценивать или измерять следующими способами: для оценки или измерения активности ингибирования пролиферации клеток in vitro используют способ измерения включения [Н]-меченного тимидина, добавленного в среду, жизнеспособными клетками в качестве показателя способности к репликации ДНК. В качестве более удобных способов используют способ исключения красителя, в котором измеряют способность клеток исключать краситель, такой как трипановый синий, из клетки под микроскопом, и способ с МТТ. В последнем из этих способов используется способность живых клеток преобразовывать МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия), который представляет собой соль тетразолия, в синий продукт формазан. Более конкретно, исследуемое антитело добавляют вместе с лигандом в культуральный раствор исследуемых клеток, и после определенного периода времени в культуральный раствор добавляют МТТ и его оставляют стоять в течение некоторого периода времени для включения МТТ в клетку. В результате, МТТ, который представляет собой желтое соединение, преобразуется в синее соединение под действием сукцинатдегидрогеназы в митохондриях клеток. После растворения этого синего продукта для окрашивания, его поглощение измеряют и используют в качестве показателя количества живых клеток. В дополнение к МТТ, также являются коммерчески доступными реагенты, такие как MTS, XTT, WST-1 и WST-8 (Nacalai Tesque и т.п.) и их можно пригодным образом использовать. Для измерения активности связывающее антитело, которое представляет собой антитело того же изотипа, что и антитело против HB-EGF, но не обладает активностью ингибирования пролиферации клеток, можно использовать в качестве контрольного антитела аналогично тому, как и антитело против HB-EGF, и активность можно определять, когда антитело против HB-EGF демонстрирует более высокую активность ингибирования пролиферации клеток, чем контрольное антитело.
Клетки, которые предпочтительно можно использовать для оценки активности, включают, например, клетки, пролиферация которых стимулируется посредством HB-EGF, такие как клеточная линия рака яичника RMG-1 и клетки мыши Ba/F3, трансформированные вектором для экспрессии гена, кодирующего hEGFR/mG-CSFR, который представляет собой слитый белок, в котором внеклеточный домен EGFR человека слит в рамке считывания с внутриклеточным доменом рецептора GCSF мыши. Таким образом, специалисты в данной области могут соответствующим образом выбрать клетки для применения для оценки активности и использовать их для измерения активности пролиферации клеток, как упоминалось выше.
Поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая настоящим изобретением, может элиминировать антигены из плазмы, антигенсвязывающая молекула сама по себе не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако является более удобным блокирование функции антигена, присутствующего в плазме, посредством осуществления нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.
Более того, поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая настоящим изобретением, может ускорять внутриклеточную диссоциацию антигена, который может быть внеклеточно связанным с антигенсвязывающей молекулой, от антигенсвязывающей молекулы, антиген, который диссоциировал от антигенсвязывающей молекулы внутри клетки деградируется в лизосоме. Таким образом, сама по себе антигенсвязывающая молекула не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако более удобно блокировать функцию антигена, присутствующего в плазме, посредством нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в клетки, экспрессирующие Fcγ-рецептор посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.
Более того, поскольку антигенсвязывающая молекула, предусматриваемая в рамках настоящего изобретения, может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме, антигенсвязывающая молекула сама по себе не обязательно должна обладать нейтрализующей активностью. Однако более удобно блокировать функцию антигена, присутствующего в плазме, посредством нейтрализующей активности против антигена до тех пор, пока антиген не будет захвачен с антигенсвязывающей молекулой в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки посредством опосредуемого Fcγ-рецептором эндоцитоза.
Fcγ-рецептор
Fcγ-рецептор относится к рецептору, способному связываться с Fc-областью моноклональных антител IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, и включает всех представителей, принадлежащих семейству белков, по существу кодируемых геном Fcγ-рецептора. У человека это семейство включает FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc; FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотип Н131 и R131), FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2), и FcγRIIc; и FcγRIII (CD16) включая изоформу FcγRIIIa (включая аллотип V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотип FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2); a также неидентифицированные FcγR человека, изоформы FcγR и их аллотипы. Однако Fcγ-рецептор не ограничивается этими примерами. Не ограничиваясь этим, FcγR включает FcγR человека, мыши, крысы, кролика и обезьяны. FcγR может происходить из любых организмов. FcγR мыши включает, но не ограничивается ими, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (FcγRIV, CD16-2), а также неидентифицированные FcγR мыши, изоформы FcγR и их аллотипы. Такие предпочтительные Fcγ-рецепторы включают, например, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16) и/или FcγRIIIb (CD16) человека. Полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRI представлены в SEQ ID NO: 16 (NM_00056.3) и 17 (NP_000557.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIa (аллотип Н131) представлены в SEQ ID NO: 18 (ВС020823.1) и 19 (ААН20823.1) (аллотип R131 представляет собой последовательность, в которой аминокислота в положении 166 SEQ ID NO: 19 заменена на Arg), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγIIB представлены в SEQ ID NO: 20 (ВС146678.1) и 21 (AAI46679.1), соответственно; полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIa представлены в SEQ ID NO: 22 (ВС033678.1) и 23 (ААН33678.1), соответственно; и полинуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность FcγRIIIb представлены в SEQ ID NO: 24 (ВС128562.1) и 25 (AAI28563.1), соответственно (номер доступа RefSeq представлен в каждом случае в скобках). То, обладает ли Fcγ-рецептор активностью связывания с Fc-областью моноклонального антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, можно оценивать с помощью скрининга ALPHA (анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), способа BIACORE на основе поверхностного плазменного резонанса (SPR) и другие (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), в дополнение к описанным выше форматам FACS и ELISA.
Между тем, "Fc-лиганд" или "эффекторный лиганд" относится к молекуле и предпочтительно полипептиду, которые связываются с Fc-областью антитела, образуя комплекс Fc/Fc-лиганд. Молекула может происходить из любых организмов. Связывание Fc-лиганда с Fc предпочтительно индуцирует одну или несколько эффекторных функций. Такие Fc-лиганды включают, но не ограничиваются ими, Fc-рецепторы, FcγR, FcγR, FcγR, FcRn, C1q и С3, маннан-связывающий лектин, рецептор маннозы, белок A Staphylococcus, белок G Staphylococcus и вирусные FcγR. Fc-лиганды также включают гомологи Fc-рецептора (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136), которые являются семейством Fc-рецепторов, гомологичных FcγR. Fc-лиганды также включают неидентифицированные молекулы, которые связываются с Fc.
В FcγRI (CD64), включая FcγRIa, FcγRIb, и FcγRIc, и FcγRIII (CD16), включающий изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2), α-цепь, которая связывается с Fc-частью IgG, ассоциирована с общей γ-цепью, имеющей ITAM, ответственный за передачу внутриклеточного активирующего сигнала. Между тем, цитоплазматический домен FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa (включая аллотипы H131 и R131) и FcγRIIc содержит ITAM. Эти рецепторы экспрессируются на многих клетках, таких как макрофаги, тучные клетки и антигенпредставляющие клетки. Активирующий сигнал, передаваемый при связывании этих рецепторов с Fc-частью IgG, приводит к усилению фагоцитарной активности макрофагов, продукции воспалительных цитокинов, дегрануляции тучных клеток и усилению функции антигенпредставляющих клеток. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать активирующий сигнал, как описано выше, также называют активирующими Fcγ-рецепторами.
Между тем, внутрицитоплазматический домен FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) содержит ITIM, ответственный за передачу ингибиторных сигналов. Связывание между FcγRIIb и В-клеточным рецептором (BCR) на В-клетках подавляет активирующий сигнал от BCR, что приводит к подавлению продукции антитела через BCR. Связывание FcγRIII и FcγRIIb на макрофагах подавляет фагоцитарную активность и продукцию воспалительных цитокинов. Fcγ-рецепторы, обладающие способностью передавать ингибирующий сигнал, как описано выше, также называют ингибиторным Fcγ-рецептором.
Активность связывания с Fcγ-рецептором
Активность связывания FcγR-связывающего домена, который включен в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, с любым из Fcγ-рецепторов человека, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb, может быт подтверждена с помощью описанного выше формата FACS и ELISA, а также скрининга ALPHA (анализ усиленной за счет эффекта близости люминесценции), способа BIACORE, который основан на явлении поверхностного плазменного резонанса (SPR) и т.п. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010). Внеклеточный домен Fcγ-рецептора человека можно использовать в качестве растворимого антигена в этих анализах.
Скрининг ALPHA проводят с помощью технологии ALPHA на основе принципа, описанного ниже, где используется два типа гранул: донорные и акцепторные. Люминесцентный сигнал выявляется только когда молекулы, связанные с донорными гранулами, биологически взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, и эти два типа гранул находятся вблизи друг друга. Возбуждаемый лазерным пучком фотосенсибилизатор в донорных гранулах преобразует кислород вокруг гранулы в возбужденный синглетный кислород. Когда синглетный кислород распространяется среди донорных гранул и достигает акцепторных гранул, расположенных близко, в акцепторных гранулах индуцируется хемилюминесцентная реакция. Это в конечном итоге приводит к испусканию света. Когда молекулы, связанные с донорными гранулами, не взаимодействуют с молекулами, связанными с акцепторными гранулами, синглетный кислород, продуцируемый донорными гранулами, не достигает акцепторных гранул и хемилюминесцентная реакция не происходит.
Например, меченную биотином антигенсвязывающую молекулу, содержащую Fc-область, иммобилизуют на донорных гранулах, и Fcγ-рецептор, меченный глутатион-S-трансферазой (GST) иммобилизуют на акцепторных гранулах. В отсутствие антигенсвязывающей молекулы, содержащей конкурирующий вариант Fc-области, Fcγ-рецептор взаимодействует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативную Fc-область, что приводит к индукции сигнала в области 520-620 нм. Антигенсвязывающая молекула, имеющая немеченый вариант Fc-области, конкурирует с антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативную Fc-область, для взаимодействия с Fcγ-рецептором. Относительную аффинность связывания можно определять путем количественного определения снижения флуоресценции в результате конкуренции. Способы биотинилирования антигенсвязывающих молекул, таких как антитела, с использованием сульфо-NHS-биотина и т.п., известны. Соответствующие способы добавления GST-метки к Fcγ-рецептору включают способы, которые вовлекают слияние полипептидов, кодирующих Fcγ и GST в рамке считывания, экспрессию слитого гена с использованием клеток, в которые введен вектор, с которым ген функционально связан, а затем очистку с использованием колонки с глутатионом. Индуцированный сигнал предпочтительно можно анализировать, например, путем аппроксимации его к односторонней модели конкуренции на основе нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения, такого как GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
Одно из веществ при наблюдении их взаимодействия иммобилизуют в качестве лиганда на тонкую золотую пленку на сенсорном чипе. Когда свет падает на заднюю поверхность сенсорного чипа, так чтобы общее отражение происходило на поверхности контакта между тонкой золотой пленкой и стеклом, интенсивность отраженного света частично снижается в определенной области (сигнал SPR). Другое из веществ при выявлении взаимодействия инжектируют в качестве анализируемого соединения на поверхность сенсорного чипа. Когда анализируемое соединение связывается с лигандом, масса иммобилизованной молекулы лиганда возрастает. Изменение индекса рефракции вызывает сдвиг положения сигнала SPR (с другой стороны, диссоциация вызывает сдвиг сигнала обратно в исходное положение). В системе Biacore величину сдвига, упомянутую выше (т.е. изменение массы на поверхности сенсорного чипа) наносят на график по вертикальной оси, и, таким образом, изменение массы с течением времени показывают в качестве данных измерения (сенсограмма). Параметры кинетики (константа скорости ассоциации (ka) и константу скорости диссоциации (kd)), определяют из кривых сенсограммы, и аффинность (KD) определяют из соотношения этих двух констант. В способе BIACORE, предпочтительно используют анализ ингибирования. Примеры такого анализа ингибирования описаны в Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11): 4005-4010.
Связывающий Fcγ-рецептор домен
Связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий более высокой активностью связывания Fcγ-рецептора, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, можно получать посредством изменения аминокислоты нативной Fc-области IgG человека. Более того, для связывающего Fcγ-рецептор домена можно использовать любую структуру антигенсвязывающего домена, описанную ранее, которая характеризуется тем, что она связывается с Fcγ-рецептором. В таком случае связывающий Fcγ-рецептор домен можно получать без необходимости во внесении аминокислотных изменений, или аффинность в отношении Fcγ-рецептора можно увеличивать путем внесения дополнительных изменений. Примеры такого связывающего Fcγ-рецептор домена включают Fab-фрагмент антитела, который связывается с FcγRIIIa, который описан в Protein Eng Des Sel. 2009 Mar; 22(3):175-88, Protein Eng Des Sel. 2008 Jan; 21(1):1-10 и J Immunol. 2002 Jul 1; 169(1):137-44, происходящее из верблюда однодоменное антитело и одноцепочечное Fv-антитело и связывающий FcγRI циклический пептид, описанный в FASEB J. 2009 Feb; 23(2):575-85. То, является ли активность связывания FcγR связывающего Fcγ-рецептор домена более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, можно определять соответствующим образом с использованием способа, описанного в упомянутом выше разделе об активности связывания.
В рамках настоящего изобретения Fc-область IgG человека является пригодным примером связывающего Fcγ-рецептор домена, являющегося исходным материалом. В рамках настоящего изобретение "изменение аминокислоты" или "аминокислотное изменение" Fc-области включает изменение аминокислотной последовательности Fc-области, являющейся исходным материалом, на отличающуюся аминокислотную последовательность. При условии, что модифицированный вариант Fc-области, являющейся исходным материалом, может связываться с Fcγ-рецептором человека в диапазоне нейтральных значений рН, любую Fc-область можно использовать в качестве Fc-области, являющейся исходным материалом. Более того, Fc-область, полученная путем дальнейших изменений уже измененной Fc-области, используемой в качестве исходной Fc-области, также можно предпочтительно использовать в качестве Fc-области по настоящему изобретению. "Исходная Fc-область" может относиться к самому полипептиду, композиции, содержащей исходную Fc-область, или аминокислотной последовательности, кодирующей исходную Fc-область. Исходные Fc-области могут содержать Fc-область известного IgG-антитела, полученную путем рекомбинации, кратко описанной в разделе "Антитела". Источник исходных Fc-областей не ограничен, и их можно получать от человека или любых не являющихся человеком организмов. Такие организмы предпочтительно включают мышей, крыс, морских свинок, хомячков, песчанок, кошек, кроликов, собак, коз, овец, животных семейства бычьих, лошадей, верблюдов и организмов, выбранных из не являющихся человеком приматов. В другом варианте осуществления исходные связывающие Fcγ-рецептор домены также можно получать из яванских макаков, мартышек, макаков-резус, шимпанзе или людей. Исходные Fc-области можно предпочтительно получать из IgG1 человека; однако они не ограничиваются каким-либо конкретным классом IgG. Это означает, что в качестве исходной Fc-области можно соответствующим образом использовать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, и в рамках настоящего изобретения это также означает, что предпочтительно в качестве исходной Fc-области можно использовать Fc-область произвольного класса или подкласса IgG, происходящую из любых организмов, описанных выше. Примеры встречающихся в природе вариантов или модифицированных форм IgG описаны в опубликованных документах (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; WO 2009/086320; WO 2008/092117; WO 2007/041635 и WO 2006/105338); однако они не ограничиваются этими примерами.
Примеры изменений включают изменения с одной или несколькими мутациями, например, мутациями путем замены другими аминокислотными остатками аминокислот исходных Fc-областей, путем встраивания одного или нескольких аминокислотных остатков в исходные Fc-области, или путем делеции одной или нескольких аминокислот из исходной Fc-области. Предпочтительно, аминокислотные последовательности измененных Fc-областей включают по меньшей мере часть аминокислотной последовательности ненативной Fc-области. Такие варианты обязательно обладают идентичностью или сходством последовательности с их исходной Fc-областью, меньшим чем 100%. В предпочтительном варианте осуществления варианты обладают идентичностью или сходством аминокислотной последовательности приблизительно от 75% до менее чем 100%, более предпочтительно приблизительно от 80% до менее чем 100%, еще более предпочтительно приблизительно от 85% до менее чем 100%, еще более предпочтительно, приблизительно от 90% до менее чем 100%, и еще более предпочтительно приблизительно от 95% до менее чем 100% с аминокислотной последовательностью их исходной Fc-области. В неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере одна аминокислота отличается между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью. Аминокислотное отличие между модифицированной Fc-областью по настоящему изобретению и ее исходной Fc-областью также может быть предпочтительно указано на основе аминокислотных отличий в описанных выше конкретных положениях аминокислот в соответствии с системой нумерации EU.
Для модификации аминокислот Fc-областей можно соответствующим образом использовать известные способы, такие как сайт-направленный мутагенез (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) и перекрывающаяся ПЦР. Более того, различные известные способы также можно использовать в качестве способа модификации аминокислот для замены аминокислот на аминокислоты, отличные от природных аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Например, можно соответствующим образом использовать бесклеточную систему трансляции (Clover Direct (Protein Express)), содержащую тРНК, в которых амбер-супрессорная тРНК, которая комплементарна кодону UAG (амбер-кодон), который является стоп-кодоном, связана с неприродной аминокислотой.
Fc-область, обладающую активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, которая содержится в антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению, можно получать любым способом, однако, в частности, Fc-область, обладающая активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, можно получать путем изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов, подлежащие изменению, включают, например, Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 и их варианты). Fc-области IgG включают мутантов, естественным образом образованных из них. Ряд аллотипических последовательностей вследствие генетического полиморфизма описан в "Sequences of proteins of immunological interest", NIH Publication No.91-3242, для Fc-областей антител IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека и IgG4 человека и любую из них можно использовать в рамках настоящего изобретения. В частности, для последовательности IgG1 человека, аминокислотной последовательностью в положениях 356-358 (нумерация EU) может быть либо DEL, либо ЕЕМ.
Аминокислоты в любых положениях можно изменять на другие аминокислоты при условии, что Fc-область обладает активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, или ее активность связывания Fcγ-рецептора в нейтральном диапазоне может быть усилена. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека, предпочтительно вносить изменения, которые приводят к усилению связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Аминокислотные изменения для усиления активности связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН описаны, например, в WO 2007/024249, WO 2007/021841, WO 2006/031370, WO 2000/042072, WO 2004/029207, WO 2004/099249, WO 2006/105338, WO 2007/041635, WO 2008/092117, WO 2005/070963, WO 2006/020114, WO 2006/116260 и WO 2006/023403.
Примеры таких аминокислот, которые могут быть изменены, включают по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в соответствии с нумерацией EU. Изменение этих аминокислот усиливает связывание Fcγ-рецептора Fc-области IgG-иммуноглобулина диапазоне нейтральных значений рН.
Особенно предпочтительные изменения для применения в рамках настоящего изобретения включают следующие изменения:
аминокислота в положении 221 либо на Lys, либо на Tyr;
аминокислота в положении 222 на любой из Phe, Trp, Glu и Tyr;
аминокислота в положении 223 на любой из Phe, Trp, Glu и Lys;
аминокислота в положении 224 на любой из Phe, Trp, Glu и Tyr;
аминокислота в положении 225 на любой из Glu, Lys и Trp;
аминокислота в положении 227 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;
аминокислота в положении 228 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;
аминокислота в положении 230 на любой из Ala, Glu, Gly и Tyr;
аминокислота в положении 231 на любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr;
аминокислота в положении 232 на любой из Glu, Gly, Lys и Tyr;
аминокислота в положении 233 на любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 234 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 235 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 236 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 237 на любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 238 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 239 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 240 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;
аминокислота в положении 241 на любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 243 на любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 244 на His;
аминокислота в положении 245 на Ala;
аминокислота в положении 246 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;
аминокислота в положении 247 на любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr;
аминокислота в положении 249 на любой из Glu, His, Gln и Tyr;
аминокислота в положении 250 либо на Glu, либо на Gln;
аминокислота в положении 251 на Phe;
аминокислота в положении 254 на любой из Phe, Met и Tyr;
аминокислота в положении 255 на любой из Glu, Leu и Tyr;
аминокислота в положении 256 на любой из Ala, Met и Pro;
аминокислота в положении 258 на любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr;
аминокислота в положении 260 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;
аминокислота в положении 262 на любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr;
аминокислота в положении 263 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;
аминокислота в положении 264 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 265 на любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 266 на любой из Ala, Ile, Met и Thr;
аминокислота в положении 267 на любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 268 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp;
аминокислота в положении 269 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 270 на любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 271 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 272 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 273 либо на Phe, либо на Ile;
аминокислота в положении 274 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 275 либо на Leu, либо на Trp;
аминокислота в положении 276 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 278 на любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp;
аминокислота в положении 279 на Ala;
аминокислота в положении 280 на любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 281 на любой из Asp, Lys, Pro и Tyr;
аминокислота в положении 282 на любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr;
аминокислота в положении 283 на любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr;
аминокислота в положении 284 на любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr;
аминокислота в положении 285 на любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 286 на любой из Glu, Gly, Pro и Tyr;
аминокислота в положении 288 на любой из Asn, Asp, Glu и Tyr;
аминокислота в положении 290 на любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 291 на любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr;
аминокислота в положении 292 на любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr;
аминокислота в положении 293 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 294 на любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 295 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 296 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val;
аминокислота в положении 297 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 298 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 299 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 300 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp;
аминокислота в положении 301 на любой из Asp, Glu, His и Tyr;
аминокислота в положении 302 на Ile;
аминокислота в положении 303 на любой из Asp, Gly и Tyr;
аминокислота в положении 304 на любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr;
аминокислота в положении 305 на любой из Glu, Ile, Thr и Tyr;
аминокислота в положении 311 на любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr;
аминокислота в положении 313 на Phe;
аминокислота в положении 315 на Leu;
аминокислота в положении 317 либо на Glu, либо на Gln;
аминокислота в положении 318 на любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr;
аминокислота в положении 320 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 322 на любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 323 на Ile;
аминокислота в положении 324 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 325 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 326 на любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 327 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 328 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 329 на любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 330 на любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 331 на любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 332 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 333 на любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr;
аминокислота в положении 334 на любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr;
аминокислота в положении 335 на любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr;
аминокислота в положении 336 на любой из Glu, Lys и Tyr;
аминокислота в положении 337 на любой из Glu, His и Asn;
аминокислота в положении 339 на любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr;
аминокислота в положении 376 либо на Ala, либо на Val;
аминокислота в положении 377 либо на Gly, либо на Lys;
аминокислота в положении 378 на Asp;
аминокислота в положении 379 на Asn;
аминокислота в положении 380 на любой из Ala, Asn и Ser;
аминокислота в положении 382 либо на Ala, либо на Ile;
аминокислота в положении 385 на Glu;
аминокислота в положении 392 на Thr;
аминокислота в положении 396 на Leu;
аминокислота в положении 421 на Lys;
аминокислота в положении 427 на Asn;
аминокислота в положении 428 либо на Phe, либо на Leu;
аминокислота в положении 429 на Met;
аминокислота в положении 434 на Trp;
аминокислота в положении 436 на Ile; и
аминокислота в положении 440 на любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr,
в соответствии с нумерацией EU в Fc-области.
Количество аминокислот, которые изменены, конкретно не ограничено. Может быть изменена аминокислота только в одном положении или могут быть изменены аминокислоты в двух или более положениях. Примеры комбинаций изменений аминокислот в двух или более положениях включают комбинации, представленные в таблице 5 (таблицы с 5-1 по 5-3).
Для условий рН для измерения активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, можно пригодным образом использовать условия в диапазоне кислых значений рН или в диапазоне нейтральных значений рН. Диапазон нейтральных значений рН в качестве условий для измерения активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, как правило, указывают как от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, он представляет собой диапазон, указываемый произвольными величинами рН от рН 7,0 до рН 8,0; и предпочтительно он выбран из рН 7,0, рН 7,1, рН 7,2, рН 7,3, рН 7,4, рН 7,5, рН 7,6, рН 7,7, рН 7,8, рН 7,9 и рН 8,0; и особенно предпочтительно он представляет собой значение рН 7,4, которое является близким к рН плазмы (крови) in vivo. В рамках настоящего изобретения диапазон кислых значений рН в качестве условий наличия активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена, содержащегося в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, и Fcγ-рецептора, как правило, указывают как с рН 4,0 по рН 6,5. Предпочтительно, его указывают как с рН 5,5 по рН 6,5 и особенно предпочтительно его указывают как с рН 5,8 по рН 6,0, что является близким к значению рН в ранней эндосоме in vivo. Что касается температуры, используемой в качестве условий измерения, аффинность связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом и Fcγ-рецептором человека можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, для определения аффинности связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом человека и Fcγ-рецептором используют температуру от 15°С до 40°С. Более предпочтительно, для определения аффинности связывания между связывающим Fcγ-рецептор доменом и Fcγ-рецептором можно сходным образом использовать любую температуру от 20°С до 35°С, такую как любая из 20°С, 21°С, 22°С, 23°С, 24°С, 25°С, 26°С, 27°С, 28°С, 29°С, 30°С, 31°С, 32°С, 33°С, 34°С или 35°С. Температура 25°С является неограничивающим примером в одном варианте осуществления настоящего изобретения.
В рамках настоящего изобретения, "активность связывания связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении Fcγ-рецептора является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области в отношении активирующего Fcγ-рецептора" означает, что активность связывания связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении любого из рецепторов Fc(человека из FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и/или FcγRIIIb является более высокой, чем активность связывания нативного связывающего Fcγ-рецептор домена в отношении этих Fcγ-рецепторов человека.
Например, она относится к активности связывания антигенсвязывающей молекулы, включающей связывающий Fcγ-рецептор домен, которая составляет 105% или более, предпочтительно 110% или более, 115% или более, 120% или более, 125% или более, особенно предпочтительно 130% или более, 135% или более, 140% или более, 145% или более, 150% или более, 155% или более, 160% или более, 165% или более, 170% или более, 175% или более, 180% или более, 185% или более, 190% или более, 195% или более, превышает в два раза или более, в 2,5 раза или более, в три раза или более, в 3,5 раза или более, в четыре раза или более, в 4,5 раз или более, в пять раз или более, в 7,5 раз или более, в десять раз или более, в 20 раз или более, в 30 раз или более, в 40 раз или более, в 50 раз или более, в 60 раз или более, в 70 раз или более, в 80 раз или более, в 90 раз или более или в 100 раз или более активность связывания антигенсвязывающей молекулы, включающей Fc-область нативного IgG человека, который используют в качестве контроля, исходя из упомянутого выше способа анализа. Для нативного связывающего Fcγ-рецептор домена можно использовать связывающий Fcγ-рецептор домен, являющийся исходным материалом, и также можно использовать связывающий Fcγ-рецептор домен нативного антитела, принадлежащий тому же подклассу.
В рамках настоящего изобретения, в частности, Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, пригодным образом используют в качестве Fc-области нативного IgG человека, подлежащей применению в качестве контроля. То, является ли цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) содержащей фукозу цепью сахаров, можно определять с использованием способа, описанного в непатентном документе 24. Например, такой способ, как указано ниже, обеспечивает определение того, является ли цепь сахаров, связанная с нативной Fc-областью IgG человека, содержащей фукозу цепью сахаров. Посредством реакции N-гликозидазы F (Roche diagnostics) с нативным IgG человека, подлежащим исследованию, цепь сахаров диссоциирует от нативного IgG человека, подлежащего исследованию (Weitzhandler et al. (J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675)). Далее концентрированный сгущенный материал реакционного раствора, из которого были удалены белки посредством реакции с этанолом (Schenk et al. (J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)), метят флуоресцентной меткой 2-аминопиридином (Bigge et al. (Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)). Флуоресцентно меченную модифицированную посредством 2-АВ цепь сахаров, полученную посредством удаления реагента твердофазной экстракцией с использованием целлюлозной кассеты, анализируют с помощью нормально-фазовой хроматографии. Наблюдение обнаруживаемого пика хроматограммы обеспечивает определение того, является ли цепь сахаров, связанная с нативной Fc-областью IgG человека, содержащей фукозу цепью сахаров. Неограничивающие примеры такой Fc-области нативного IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная с аминокислотой в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, включают Fc-области, включенные в антитела, полученные посредством экспрессии в клетках СНО, таких как СНО-K1 (American Туре Culture Collection, АТСС №CRL-61) или DXB11 (American Туре Culture Collection, АТСС №CRL-11397), генов, кодирующих антитела, содержащие нативную Fc-область IgG человека. С использованием активности связывания Fc-областей, включенных в таких антитела в качестве контролей, в отношении Fcγ-рецептора, сравнивали активность Fc-областей по настоящему изобретению в отношении связывания Fcγ-рецептора. Это обеспечивает определение того, имеет ли связывающий Fcγ-рецептор домен по настоящему изобретению более высокую активность связывания Fcγ-рецептора, чем Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Более того, количество фукозы, связанной с цепью сахаров, включенной по сравнению с Fc-областями, можно сравнивать посредством определения количества фукозы в цепи, связанной с Fc-областью, включенной в эти антитела, и количества фукозы в цепи сахаров, связанной с Fc-областями по настоящему изобретению с использованием таких способов, как упоминались выше.
В качестве антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область нативного антитела того же подкласса, которое используют в качестве контроля, можно пригодным образом использовать антигенсвязывающие молекулы, имеющие Fc-область моноклонального IgG-антитела. Структуры таких Fc-областей представлены в SEQ ID NO: 11 (А добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААС82527.1), SEQ ID NO: 12 (А добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААВ59393.1), SEQ ID NO: 13 (номер доступа RefSeq САА27268.1) и SEQ ID NO: 14 (A добавлен на N-конец последовательности с номером доступа RefSeq ААВ59394.1). Более того, при использовании в качестве исследуемого вещества антигенсвязывающей молекулы, обладающей Fc-областью, полученной путем изменения антитела определенного изотипа, используемого в качестве исходной Fc-области, антигенсвязывающую молекулу, обладающую Fc-областью моноклонального IgG-антитела этого изотипа используют в качестве контроля для подтверждения эффектов на активность связывания с Fcγ-рецепторами антигенсвязывающей молекулы, имеющей измененную Fc-область. Таким образом, антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область, для которой подтверждено, что она обладает высокой активностью связывания Fcγ-рецептора, как описано выше, отбирают соответствующим образом.
Примеры связывающих Fcγ-рецептор доменов, пригодных для применения в рамках настоящего изобретения, включают связывающие Fcγ-рецептор домены со свойством наличия более высокой активности связывания с определенными Fcγ-рецепторами, чем с другими Fcγ-рецепторами (связывающие Fcγ-рецептор домены с селективной активностью связывания Fcγ-рецептора). Когда антитело используют в качестве антигенсвязывающей молекулы (когда Fc-область используют в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена), поскольку одна молекула антитела может связываться только с одним Fcγ-рецептором, одна антигенсвязывающая молекула, которая связалась с ингибиторным Fcγ-рецептором, не может связаться с другим активирующим FcγR, и одна антигенсвязывающая молекула, которая связалась с активирующим Fcγ-рецептором, не может связываться ни с другим активирующим Fcγ-рецептором ни с ингибиторным Fcγ-рецептором.
Как описано выше, пригодными примерами активирующего Fcγ-рецептора являются FcγRI (CD64), включая FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2). FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2) является пригодным примером ингибиторного Fcγ-рецептора.
FcγR-связывающий домен, обладающий селективной активностью связывания с Fcγ-рецептором
То, обладает ли FcγR-связывающий домен по настоящему изобретению селективной активностью связывания, может быть подтверждено посредством сравнения активности связывания с соответствующими Fcγ-рецепторами, определенной способом, описанным в представленном выше разделе об активности связывания Fcγ-рецепторов. Связывающий FcγR домен с более высокой активностью связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами, чем с активирующими Fcγ-рецепторами, можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. В одном неограничивающем варианте FcγR-связывающий домен с более высокой активностью связывания с FcγRIIb (включая FcγRIIb-1 и FcγRIIb-2), чем с активирующим Fcγ-рецептором, выбранным из группы, состоящей из FcγRI(CD64), включая FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIII(CD16), включая изоформы FcγRIIIa (включая аллотипы V158 и F158) и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIIb-NA1 и FcγRIIIb-NA2) и FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIa и FcγRIIc (включая аллотипы H131 и R131), можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. Более того, в неограничивающем варианте осуществления настоящего изобретения FcγR-связывающий домен с более высокой активностью связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb и FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc, можно использовать в качестве селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, предусматриваемую в рамках настоящего изобретения. То, обладает ли FcγR-связывающий домен, подлежащий исследованию, селективной активностью связывания с Fcγ-рецепторами, можно определять посредством сравнения величины (соотношения), полученной делением величин KD FcγR-связывающего домена в отношении FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc, на величины KD для FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, где величины KD определяют способом, описанным в упомянутом выше разделе об активности связывания с Fcγ-рецепторами или, более конкретно, посредством сравнения показателей селективности FcγR, представленных в уравнении 1.
[Уравнение 1]
Показатель селективности FcγR = величина KD для активирующего FcγR/величина KD для ингибиторного FcγR
В уравнении 1, упомянутом выше, "активирующий FcγR" относится к FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc и ингибиторный FcγR относится к FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2. Хотя активирующий FcγR и ингибиторный FcγR, используемые для измерений величины KD, могут быть выбраны из любой комбинации, в неограничивающем варианте осуществления можно использовать величину (соотношение), полученную делением величины KD для FcγRIIa, включая аллотип Н131, на величину KD для FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2.
Например, показатели селективности FcγR имеют величины 1,2 или более, 1,3 или более, 1,4 или более, 1,5 или более, 1,6 или более, 1,7 или более, 1,8 или более, 1,9 или более, 2 или более, 3 или более, 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более, 25 или более, 30 или более, 35 или более, 40 или более, 45 или более, 50 или более, 55 или более, 60 или более, 65 или более, 70 или более, 75 или более, 80 или более, 85 или более, 90 или более, 95 или более, 100 или более, 110 или более, 120 или более, 130 или более, 140 или более, 150 или более, 160 или более, 170 или более, 180 или более, 190 или более, 200 или более, 210 или более, 220 или более, 230 или более, 240 или более, 250 или более, 260 или более, 270 или более, 280 или более, 290 или более, 300 или более, 310 или более, 320 или более, 330 или более, 340 или более, 350 или более, 360 или более, 370 или более, 380 или более, 390 или более, 400 или более, 410 или более, 420 или более, 430 или более, 440 или более, 450 или более, 460 или более, 470 или более, 480 или более, 490 или более, 500 или более, 520 или более, 540 или более, 560 или более, 580 или более, 600 или более, 620 или более, 640 или более, 660 или более, 680 или более, 700 или более, 720 или более, 740 или более, 760 или более, 780 или более, 800 или более, 820 или более, 840 или более, 860 или более, 880 или более, 900 или более, 920 или более, 940 или более, 960 или более, 980 или более, 1000 или более, 1500 или более, 2000 или более, 2500 или более, 3000 или более, 3500 или более, 4000 или более, 4500 или более, 5000 или более, 5500 или более, 6000 или более, 6500 или более, 7000 или более, 7500 или более, 8000 или более, 8500 или более, 9000 или более, 9500 или более, 10000 или более или 100000 или более.
Неограничивающий вариант осуществления селективного FcγR-связывающего домена в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению включает, например, Fc-области, полученные посредством модификации FcγR-связывающего домена, включенного в Fc-область (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющую часть константной области представленной в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека. Пример способа получения модифицированных Fc-областей включает способ, описанный в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. Примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, или Fc-область, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, или Fc-область, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, демонстрируют более высокую активность связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc.
Константные области, содержащие селективный FcγR-связывающий домен, которые включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую константную область, также могут представлять собой Fc-области и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, которая сохраняет или демонстрирует сниженную активность связывания с активирующим FcγR (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb, включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa, включая аллотип H131, FcγRIIa, включая аллотип R131 и/или FcγRIIc) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа) и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область дикого типа.
По сравнению с Fc-областью дикого типа и антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, степень упомянутого выше уменьшения активности связывания с активирующим FcγR Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающей молекулы, содержащей такую Fc-область, составляет, например, 99% или менее, 98% или менее, 97% или менее, 96% или менее, 95% или менее, 94% или менее, 93% или менее, 92% или менее, 91% или менее, 90% или менее, 8 8% или менее, 86% или менее, 84% или менее, 82% или менее, 80% или менее, 78% или менее, 76% или менее, 74% или менее, 72% или менее, 70% или менее, 68% или менее, 66% или менее, 64% или менее, 62% или менее, 60% или менее, 58% или менее, 56% или менее, 54% или менее, 52% или менее, 50% или менее, 45% или менее, 40% или менее, 35% или менее, 30% или менее, 25% или менее, 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 4% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее, 0,5% или менее, 0,4% или менее, 0,3% или менее, 0,2% или менее, 0,1% или менее, 0,05% или менее, 0,01% или менее или 0,005% или менее.
Fc-области, содержащие селективный FcγR-связывающий домен, и константные области, содержащие такую Fc-область, и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую константную область, которые включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, также могут представлять собой Fc-области и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, которые демонстрируют усиленную активностью связывания с ингибиторным FcγR (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область дикого типа.
По сравнению с Fc-областью дикого типа и антигенсвязывающей молекулой, содержащей Fc-область дикого типа, степень упомянутого выше усиления активности связывания с ингибиторным FcγR Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающей молекулы, содержащей такую Fc-область, составляет, например, 101% или более, 102% или более, 103% или более, 104% или более, 105% или более, 106% или более, 107% или более, 108% или более, 109% или более, 110% или более, 112% или более, 114% или более, 116% или более, 118% или более, 120% или более, 122% или более, 124% или более, 126% или более, 128% или более, 130% или более, 132% или более, 134% или более, 136% или более, 138% или более, 140% или более, 142% или более, 144% или более, 146% или более, 148% или более, 150% или более, 155% или более, 160% или более, 165% или более, 170% или более, 175% или более, 180% или более, 185% или более, 190% или более, 195% или более, превышает в 2 раза или более, в 3 раза или более, в 4 раза или более, в 5 раз или более, в 6 раз или более, в 7 раз или более, в 8 раз или более, в 9 раз или более, в 10 раз или более, в 20 раз или более, в 30 раз или более, в 40 раз или более, в 50 раз или более, в 60 раз или более, в 70 раз или более, в 80 раз или более, в 90 раз или более, в 100 раз или более, в 200 раз или более, в 300 раз или более, в 400 раз или более, в 500 раз или более, в 600 раз или более, в 700 раз или более, в 800 раз или более, в 900 раз или более, в 1000 раз или более, в 10000 раз или более или в 100000 раз или более.
Более того, Fc-область, содержащая селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающая молекула, содержащая такую Fc-область, могут представлять собой Fc-область и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую Fc-область, которая сохраняет или демонстрирует сниженную активность связывания с активирующим FcγR (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa, включая аллотип V158, FcγRIIIa, включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131 и/или FcγRIIc) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа; и демонстрирует усиленную активность связывания с ингибиторным FcγR (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющей часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа), и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа.
Более того, Fc-область, содержащая селективный FcγR-связывающий домен, включенный в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, и антигенсвязывающая молекула, содержащая такую Fc-область, могут представлять собой Fc-область и антигенсвязывающую молекулу, содержащую такую как Fc-область с более высокой степенью усиления активности связывания с ингибиторным Fcγ-рецептором (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2), чем с активирующим Fcγ-рецептором (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131), по сравнению с Fc-областью (Fc-область класса IgG относится, например, к области от цистеина в положении 226 (нумерация EU) до С-конца или от пролина в положении 230 (нумерация EU) до С-конца, но не ограничивается ими), составляющую часть константной области, присутствующей в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека (далее обозначаемой как Fc-область дикого типа) и антигенсвязывающей молекулой, содержащей такую Fc-область дикого типа.
В рамках настоящего изобретения по меньшей мере одно другое изменение Fc-области можно добавлять к Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp, и Fc-области, в которой аминокислота в положении 328 (нумерация EU) представляет собой Glu, согласно вариантам осуществления и т.п., описанным в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. В дополнение к этим изменениям также можно добавлять дополнительные изменения. Дополнительные изменения можно выбирать из любых замен, делеций и модификаций аминокислот и их комбинаций. Например, можно добавлять изменения, которые усиливают активность связывания с FcγRIIb при сохранении или снижении активности связывания с FcγRIIa (Н-тип) и FcγRIIa (R-тип). Добавление таких изменений повышает селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa.
Среди них, изменения, которые повышают селективность в отношении FcγRIIb относительно FcγRIIa (R-тип) являются благоприятными, и изменения, которые повышают селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa (Н-тип), являются более благоприятными. Примеры предпочтительных аминокислотных замен для таких изменений включают: изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Asn в положении 325 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 236 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Asn в положении 325 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 235 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Pro в положении 331 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ala в положении 327 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Leu в положении 328 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Ser в положении 324 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Ile в положении 332 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 324 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Glu в положении 333 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 337 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Thr в положении 335 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на His; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Val в положении 266 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Tyr в положении 300 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на His; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Pro; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Gln в положении 295 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 334 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Lys; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены Glu в положении 233 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Tyr в положении 296 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asn; и изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Met.
Благоприятными аминокислотными заменами среди этих изменений являются, например, изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Phe; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Val; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Gln; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asn; изменение посредством замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Gly; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Gin; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Ser в положении 239 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Ser в положении 267 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Trp; изменение посредством замены Leu в положении 234 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Gly в положении 237 (нумерация EU) на Tyr; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Lys; изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Arg; изменение посредством замены Glu в положении 233 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены His в положении 268 (нумерация EU) на Glu; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ser; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Thr; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Ile; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Leu; изменение посредством замены Val в положении 323 (нумерация EU) на Met; изменение посредством замены Tyr в положении 296 (нумерация EU) на Asp; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Ala; изменение посредством замены Lys в положении 326 (нумерация EU) на Asn; и изменение посредством замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Met.
Упомянутое выше изменение может представлять собой изменение в одном положении, или можно комбинировать изменения в двух или более положениях. Подходящие примеры таких изменений представляют собой изменения, описанные в таблицах 14-15, таблицах 17-24 и таблицах 26-28.
Fc-область, полученная путем изменения FcγR-связывающего домена, включенного в Fc-область, представленную в качестве IgG1 (SEQ ID NO: 14), IgG2 (SEQ ID NO: 15), IgG3 (SEQ ID NO: 16) или IgG4 (SEQ ID NO: 17) человека, может быть приведена в качестве примера другого неограничивающего варианта осуществления селективного FcγR-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. Способ получения модифицированных Fc-областей представляет собой, например, способ, описанный в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. Примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Fc-область, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и антигенсвязывающие молекулы, содержащие такую Fc-область, демонстрируют более высокую активность связывания с FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2, чем с FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NAl, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип Н131, FcγRIIa включая аллотип R131 и/или FcγRIIc.
В рамках настоящего изобретения по меньшей мере одно другое изменение Fc-области можно добавлять к Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly, посредством вариантов осуществления и т.п., описанных в упомянутом выше разделе об аминокислотных изменениях. В дополнение к этим изменениям также можно добавлять дополнительные изменения. Дополнительные изменения могут быть выбраны из любых из замен, делеций и модификаций аминокислот и их комбинаций. Например, можно добавлять изменения, которые сохраняют или снижают активность связывания с активирующими Fcγ-рецепторами (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NAl, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131). Можно добавлять изменения, которые усиливают активность связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) при сохранении или снижении активности связывания с FcγRIIa (Н-тип) и FcγRIIa (R-тип). Более того, также можно добавлять изменения, где степень усиления активности связывания с ингибиторными Fcγ-рецепторами (FcγRIIb-1 и/или FcγRIIb-2) является более высокой, чем степень усиления активности связывания с активирующими Fcγ-рецепторами (FcγRIa, FcγRIb, FcγRIc, FcγRIIIa включая аллотип V158, FcγRIIIa включая аллотип F158, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA1, FcγRIIIb включая аллотип FcγRIIIb-NA2, FcγRIIa включая аллотип H131, FcγRIIa включая аллотип R131). Добавление таких изменения повышает селективность связывания с FcγRIIb относительно FcγRIIa.
Пример неограничивающего варианта осуществления измененной Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, включает измененную Fc-область, в которой одно или несколько из положений 233, 234, 237, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 272, 296, 326, 327, 330, 331, 332, 333 и 396 (нумерация EU) заменены в Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 (нумерация EU) представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).
Кроме того, примером неограничивающего варианта осуществления измененной Fc-области, содержащей селективный FcγR-связывающий домен, является измененная Fc-область, содержащая любой один или несколько из
Asp в положении аминокислоты 233,
Tyr в положении аминокислоты 234,
Asp в положении аминокислоты 237,
Ile в положении аминокислоты 264,
Glu в положении аминокислоты 265,
любой из Phe, Met и Leu в положении аминокислоты 266,
любой из Ala, Glu, Gly и Gln в положении аминокислоты 267,
Asp или Glu в положении аминокислоты 268,
Asp в положении аминокислоты 269,
любой из Asp, Phe, Ile, Met, Asn и Gln в положении аминокислоты 272,
Asp в положении аминокислоты 296,
Ala или Asp в положении аминокислоты 326,
Gly в положении аминокислоты 327,
Lys или Arg в положении аминокислоты 330,
Ser в положении аминокислоты 331,
Thr в положении аминокислоты 332,
любой из Thr, Lys и Arg в положении аминокислоты 333,
любой из Asp, Glu, Phe, Ile, Lys, Leu, Met, Gln, Arg и Tyr в положении аминокислоты 396,
показанные с помощью нумерации EU, в Fc-области, в которой аминокислота в положении 238 представляет собой Asp и аминокислота в положении 271 (нумерация EU) представляет собой Gly в IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).
Примеры неограничивающего варианта осуществления Fc-области, которая дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное изменение Fc-области, и дополнительно содержит дополнительные изменения, упомянутые выше, включает Fc-области, представленные в таблицах с 6-1 по 6-7.
(Таблица 6-2 является продолжением Таблицы 6-1.)
(Таблица 6-3 является продолжением Таблицы 6-2.)
(Таблица 6-4 является продолжением Таблицы 6-3.)
(Таблица 6-5 является продолжением Таблицы 6-4.)
(Таблица 6-6 является продолжением Таблицы 6-5.)
(Таблица 6-7 является продолжением Таблицы 6-6.)
У мышей было идентифицировано четыре типа FcγR: FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV. У человека также в качестве соответствующих FcγR были идентифицированы FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb. FcγRIIb, который считается только ингибиторным типом среди этих FcγR, является консервативным как у человека, так и у мышей. Другие FcγR, за исключением FcγRIIIb, передают сигналы активации через иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), в то время как FcγRIIb передает ингибиторные сигналы через иммунорецепторный тирозиновый ингибиторный мотив (ITIM), присутствующий внутри клеток (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).
FcγRIIb1 и FcγRIIb2 описаны в качестве вариантов по сплайсингу FcγRIIb. Как у человека, так и у мышей, FcγRIIb1 имеет более длинный внутриклеточный домен, чем FcγRIIb2. Было подтверждено, что FcγRIIb1 экспрессируется в В-клетках, и было подтверждено, что FcγRIIb2 экспрессируется в макрофагах, тучных клетках, дендритных клетках, базофилах, нейтрофилах и эозинофилах (J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18).
До настоящего времени было описано, что у человека, дисфункция и сниженная экспрессия FcγRIIb коррелирует с возникновением аутоиммунных заболеваний. Например, было описано, что у некоторых пациентов с SLE, связывание активаторов транскрипции ослаблено вследствие полиморфизма в области промотора экспрессии FcγRIIb, что приводит к сниженной экспрессии FcγRIIb (Hum. Genet. (2005) 117, 220-227; J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199; и J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). Более того, среди пациентов с SLE описано два типа аллотипов, где аминокислота в положении 233 представляет собой Ile или Thr в FcγRIIb. Это положение находится в трансмембранной области FcγRIIb и, согласно сообщением, FcγRIIb менее вероятно существует в липидном рафте, когда аминокислота в положении 233 представляет собой Thr по сравнению с тем, когда аминокислота представляет собой Ile и в результате, функция передачи сигнала FcγRIIb снижается (Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). Равным образом у мышей, сообщалось, что у мышей с нокаутом, полученных путем нарушения гена FcγRIIb у мышей C57BL/6, присутствуют SLE-подобные симптомы, такие как продукция аутоантител и гломерулонефрит (Immunity 13 (2000) 277-285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). Более того, до настоящего времени был описан сниженный уровень экспрессии FcγRIIb и т.п. у мышей, которых считают моделями с естественным возникновением SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429-435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227-230; J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). Из этих сообщений считается, что FcγRIIb регулирует гуморальный иммунитет у мышей, как и у человека.
Когда антитело, содержащее Fc по настоящему изобретению, элиминирует антигены через FcγRIIb, считается, что функция эндоцитоза FcγRIIb вносит наиболее важный вклад среди функций FcγRIIb. Как описано выше, FcγRIIb1 и FcγRIIb2 существуют в качестве вариантов по сплайсингу FcγRIIb, однако описано, что последний в основном вовлечен в эндоцитоз иммунокомплекса антитела и антигена (J. Immunol. (1994), 152 574-585; Science (1992) 256, 1808-1812; Cell (1989) 58, 317-327). До настоящего времени сообщалось, что FcγRIIb2 мыши включен в покрытое клатрином углубление и подвергается эндоцитозу (Cell (1989) 58, 317-327). Более того, сообщалось, что дилейциновый мотив является необходимым для опосредуемого FcγRIIb2 эндоцитоза, и дилейциновый мотив является консервативным как у человека, так и у мышей (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963-2969). Исходя из этого, FcγRIIb2 может обладать активностью эндоцитоза у человека, как и у мышей.
С другой стороны, в отличие от FcγRIIb2, сообщалось, что FcγRIIb1 не вызывает эндоцитоза. FcγRIIb1 обладает встроенной последовательностью в его внутриклеточном домене, который не встречается в FcγRIIb2. Считается, что эта последовательность ингибирует захват FcγRIIb1 в покрытое клатрином углубление и в результате ингибируется эндоцитоз (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888; J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302). Равным образом у человека FcγRIIb1 обладает последовательностью вставки в участке, сходном с участком FcγRIIb2, как и у мышей; таким образом, предположительно, отличие в способности к эндоцитозу между FcγRIIb1 и FcγRIIb2 обеспечивается сходным механизмом. Более того, сообщалось, что как у человека, так и у мышей, приблизительно 40% иммунокомплексов на поверхности клеток захватываются в клетку в течение 20 минут (Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337; Science (1992) 256, 1808-1812). Таким образом, равным образом у человека FcγRIIb2 предположительно захватывает иммунокомплексы в клетки на уровнях, сходных с мышами.
Поскольку FcγRIIb является единственным, который имеет ITIM внутри клетки как у человека, так и у мышей, среди семейства FcγR и распределение экспрессирующих клеток является одинаковым, предположительно, их функция в иммунном контроле является сходной. Более того, учитывая тот факт, что иммунокомплексы захватывается в клетки на сходных уровнях у человека и у мышей, эффекты антител в отношении элиминации антигена, опосредуемые FcγRIIb, у человека могут быть предсказуемыми с использованием мышей. Антигенсвязывающие молекулы mF44 и mF46 обладают свойствами связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом и обладает усиленной аффинностью в отношении FcγRIIb и FcγRIII мыши по сравнению с mIgG1, который является антигенсвязывающей молекулой, обладающей свойством связывания растворимого антигена рН-зависимым образом. Действительно, в примере 5 показано, что выведение антигена возрастало, когда mF44 или mF46 вводили нормальным мышам по сравнению с тем, когда вводили mIgG1.
Более того, в описанном ниже примере 6 сходный эксперимент проводили с использованием мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора. Сообщалось, что FcγR, отличные от FcγRIIb, экспрессируются только в совместном присутствии гамма-цепи у мышей. Таким образом, только FcγRIIb экспрессируется у мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора. Введение mF44 или mF46, которые являются антигенсвязывающими молекулами, обладающими свойством связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом, мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора позволяет оценку эффектов ускорения элиминации антигена, когда связывание FcγRIIb селективно усиливалось. Из результатов примера 6, когда mF44 или mF46 (которые являются антигенсвязывающими молекулами, обладающими свойством связывания растворимых антигенов рН-зависимым образом) вводили мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, было показано, что выведение антигена было увеличено по сравнению с тем, когда мышам вводили mIgG1 (который является антигенсвязывающей молекулой, обладающей свойством связывания с растворимыми антигенами рН-зависимым образом). Более того, результаты примера 6 демонстрируют, что при введении мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора mF44 или mF46 вызывают сходную степень элиминации антигена по сравнению с нормальными мышами.
В примере 6 проводили сходный эксперимент с использованием мышей с дефицитом FcγRIII. Поскольку mIgG1, mF44 и mF46 связываются только с FcγRIIb и FcγRIII среди mFcγR, введение антител мышам с дефицитом FcγRIII позволяет оценку эффектов ускорения элиминации антигена, когда связывание FcγRIIb селективно усилено. Результаты примера 6 указывают на то, что, когда mF44 или mF46 вводили мышам с FcγRIII, выведение антигена увеличивалось по сравнению с тем выведением антигена у мышей, когда им вводили mIgG1. Более того, результаты примера 6 показали, что при введении мышам с дефицитом FcγRIII, mF44 и mF46 обеспечивают сходные степени элиминации антигена по сравнению с тем, когда их вводили мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора и при введении нормальным мышам.
Эти результаты показали, что элиминация антигена может быть ускорена посредством усиления селективного связывания с FcγRIIb отдельно без усиления связывания с активными FcγR.
В дополнение к сообщенным документам, рассмотренным до настоящего времени, на основе упомянутых выше результатов оценки с использованием мышей, считается, что захват иммунокомплексов в клетки через FcγRIIb происходит in vivo у человека, как и у мышей, и в результате антитела, которые обладают Fc с селективно усиленным связыванием с FcγRIIb человека, могут ускорять элиминацию его антигенов. Более того, как рассмотрено выше, поскольку считается, что захват иммунокомплексов в клетки через FcγRIIb происходит при сходных скоростях у мышей и человека, эффекты ускорения элиминации антигена по сравнению с эффектами антител, имеющих Fc с усиленной аффинностью в отношении FcγRIIb мыши, могут быть достигнуты in vivo у человека с использованием Fc, в которой аффинность в отношении FcγRIIb человека усилена до сходной степени.
Как описано в WO 2009/125825, Fv4-IgG1 представляет собой антитело, которое является результатом сообщения гуманизированному антителу против рецептора IL-6 H54/L28-IgG1 активности связывания с антигеном рН-зависимым образом, т.е. изменения вариабельной области так, чтобы сообщить ей свойство связывания с антигеном при рН 7,4 и диссоциации от антигена при рН 5,8. В WO 2009/125825 показано, что элиминация растворимого рецептора IL-6 человека значительно ускорена у мышей, которым совместно вводили IgG1 Fv4 и растворимый рецептор IL-6 человека в качестве антигена по сравнению с мышами, которым вводили совместно H54/L28-IgG1 и антиген. В этом случае, тяжелая цепь H54-IgG1 и легкая цепь L28-CK, включенные в H54/L28-IgG1, представлены в SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, соответственно; и тяжелая цепь VH3-IgG1 и легкая цепь VL3-CK, включенные в Fv4-IgG1, представлены в SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 39, соответственно.
Растворимый рецептор IL-6 человека, связанный с антителом H54/L28-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека, рециклирует в плазму вместе с антителом через FcRn. Между тем, антитело Fv4-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом диссоциирует от растворимого рецептора IL-6 человека, который связался с антителом в кислых условиях в эндосоме. Поскольку диссоциированный растворимый рецептор IL-6 человека деградируется в лизосоме, элиминация растворимого рецептора IL-6 человека может быть значительно ускорена и антитело Fv4-IgG1, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН зависимым образом, рециклирует в плазму после связывания с FcRn в эндосоме. Поскольку рециклированное антитело может вновь связываться с растворимым рецептором IL-6 человека, связывание с антигеном (растворимый рецептор IL-6 человека) и рециклирование в плазму через FcRn повторяется. В результате одна молекула антитела может многократно связываться с растворимым рецептором IL-6 человека множество раз (WO 2009/125825).
С другой стороны, как описано в рамках настоящего изобретения, было обнаружено, что концентрация в плазме растворимого антигена может быть значительно снижена посредством введения антигенсвязывающей молекулы с усиленной активностью связывания FcγR связывающего Fcγ-рецептор домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу, которая содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, такой как рН, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, и связывающий Fcγ-рецептор домен.
Не ограничиваясь конкретной теорией, неожиданное снижение концентрации растворимого антигена в плазме, наблюдаемое при введении антигенсвязывающей молекулы с усиленным связыванием с FcγR, которая содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, и FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН может быть объяснено следующим образом.
Как описано выше, антигенсвязывающая молекула, такая как Fv4-IgG1, содержащая антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, может быть способна неоднократно связываться с антигеном множество раз, однако эффект диссоциации растворимого антигена в эндосоме в отношении ускорения элиминации антигена из плазмы может зависеть от скорости захвата комплекса антигена и антигенсвязывающей молекулы в эндосому. Антигенсвязывающие молекулы с усиленной активностью связывания с различными FcγR, которые содержат антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, активно захватываются в клетки посредством связывания с различными FcγR, экспрессируемыми на клеточной мембране, и могут вновь циркулировать в плазме посредством рециклирования через связывание между FcRn и FcRn-связывающим доменом в молекуле, обладающей активностью связывания с FcRn, в условиях диапазона кислых значений рН. Более конкретно, поскольку упомянутые выше антигенсвязывающие молекулы, которые образовали комплексы с растворимыми антигенами в плазме, активно захватываются в клетки через FcγR, экспрессируемые на клеточной мембране, эффект ускорения элиминации растворимых антигенов в плазме может быть более выраженным, чем у антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых с различными FcγR не усилена.
FcγR-связывающая активность антител, которые связываются с мембранными антигенами, играет важную роль в цитотоксической активности антител. Таким образом, когда цитотоксическая активность необходима для антитела, подлежащего применению в качестве фармацевтического средства, используют IgG1-изотип человека, который обладает высокой активностью связывания FcγR, и широко используют способ усиления активности связывания FcγR антител для усиления цитотоксической активности антитела. С другой стороны, роль FcγR-связывающей активности антител, которые связываются с растворимыми антигенами и которые используют в качестве фармацевтических средств, не известна и отличия в физиологических эффектах на организмы, которым вводили IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR и IgG2 человека и IgG4 человека с низкой активностью связывания FcγR, вследствие их отличий в активности связывания FcγR, до настоящего времени полностью не исследовались. Как описано ниже в разделе "Примеры", было в действительности подтверждено, что в плазме индивидуумов, которым вводили антитела, активность связывания которых с FcγR была утрачена, не было влияния на изменения концентрации растворимого антигена. С другой стороны, в рамках настоящего изобретения было обнаружено, что концентрация растворимых антигенов в плазме значительно снижена у индивидуумов, которым вводили антигенсвязывающие молекулы, обладающие усиленной активностью связывания FcγR и содержащие антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с растворимыми антигенами изменяется в зависимости от условий концентрации ионов. Более конкретно, посредством комбинирования FcRn-связывающего домена, обладающего активностью связывания FcRn в условия диапазона кислых значений рН и антигенсвязывающим доменом, связывание которого с растворимыми антигенами изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, которые представляют собой домены, включенные в антигенсвязывающие молекулы, нацеленные на растворимые антигены, впервые было выявлено преимущество усиления связывания с FcγR.
Антигенсвязывающая молекула
В рамках настоящего изобретения, термин "антигенсвязывающая молекула" используют в наиболее широком значении для обозначения молекулы, обладающей активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и содержащей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен. В частности, антигенсвязывающие молекулы включают различные типы молекул, при условии, что они проявляют антигенсвязывающую активность. Молекулы, в которых антигенсвязывающий домен связан с Fc-областью, включают, например, антитела. Антитела могут включать единичные моноклональные антитела (включая антитела-агонисты и антитела-антагонисты), антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела и т.п. Альтернативно при использовании в качестве фрагментов антител, они предпочтительно включают антигенсвязывающие домены и антигенсвязывающие фрагменты (например, Fab, F(ab')2, scFv и Fv). Каркасные молекулы, где трехмерные структуры, такие как уже известная стабильная белковая структура α/β-бочонок, используются в качестве каркаса (основы) и только некоторые части структур преобразованы в библиотеки для конструирования антигенсвязывающих доменов, также включены в антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению.
Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может содержать по меньшей мере некоторые части Fc-области, которые опосредуют связывание с FcRn и Fcγ-рецептором. В неограничивающем варианте осуществления антигенсвязывающая молекула включает, например, антитела и слитые белки Fc. Слитый белок относится к химерному полипептиду, содержащему полипептид, имеющий первую аминокислотную последовательность, который связан с полипептидом, имеющим вторую аминокислотную последовательность, которые не связаны в природе. Например, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность по меньшей мере части Fc-области (например, часть Fc-области, ответственная за связывание с FcRn, или часть Fc-области, ответственная за связывание с Fcγ-рецептором) и не являющегося иммуноглобулином полипептида, содержащего, например, аминокислотную последовательность лиганд-связывающего домена рецептора или рецептор-связывающего домена лиганда. Аминокислотные последовательности могут находиться в отдельных белках, которые переносят вместе в слитый белок, или, как правило, они могут находиться в одном белке, но они включены в слитый полипептид в новом порядке. Слитые белки можно получать, например, посредством химического синтеза или способами генетической рекомбинации для экспрессии полинуклеотида, кодирующего области пептидов в желаемом порядке.
Соответствующие домены по настоящему изобретению могут быть связаны вместе через линкеры или прямо через связывание полипептида.
Линкеры включают произвольные пептидные линкеры, которые можно вносить способами генетической инженерии, синтетические линкеры и линкеры, описанные, например, в Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. Однако пептидные линкеры являются предпочтительными в рамках настоящего изобретения. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и ее могут надлежащим образом выбирать специалисты в данной области в зависимости от назначения. Длина предпочтительно составляет пять аминокислот или более (без конкретных ограничений, верхний предел обычно составляет 30 аминокислоты или менее, предпочтительно 20 аминокислоты или менее), и особенно предпочтительно 15 аминокислот.
Например, такие пептидные линкеры предпочтительно включают:
Ser
Gly⋅Ser
Gly⋅Gly⋅Ser
Ser⋅Gly⋅Gly
Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 26)
Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 27)
Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 28)
Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 29)
Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 30)
Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 31)
Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 32)
Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 33)
(Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Ser (SEQ ID NO: 28))n
(Ser⋅Gly⋅Gly⋅Gly⋅Gly (SEQ ID NO: 29))n
где n представляет собой целое число, равное 1 или более. Длину или последовательности пептидных линкеров могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области, в зависимости от назначения.
Обычно для сшивания пептидов используют синтетические линкеры (химические сшивающие агенты), и например:
N-гидроксисукцинимид (NHS),
дисукцинимидилсуберат (DSS),
3
бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS),
дитиобис(сукцинимидил пропионат) (DSP),
дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP),
этиленгликоль бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS),
этиленгликоль бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (сульфо-EGS),
дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST),
бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES),
и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Эти сшивающие агенты являются коммерчески доступными.
Когда используют множество линкеров для связывания соответствующих доменов, все они могут быть одного типа или они могут быть различных типов.
В дополнение к линкерам, проиллюстрированным выше, также можно соответствующим образом использовать линкеры с пептидными метками, такими как His-метка, НА-метка, myc-метка и FLAG-метка. Более того, также можно соответствующим образом использовать образование водородных связей, образование дисульфидных связей, образование ковалентных связей, ионное взаимодействие и свойства связывания друг с другом в результате их комбинации. Например, можно использовать аффинность между СН1 и CL антитела, и также можно использовать Fc-области, происходящие из описанных выше биспецифических антител для гетероассоциации Fc-областей. Более того, также можно соответствующим образом использовать дисульфидные связи, образующиеся между доменами.
Для связывания соответствующих доменов пептидной связью, полинуклеотиды, кодирующие домены, связывают вместе в рамке считывания. Известные способы связывания полинуклеотидов в рамке считывания включают способы, такие как лигирование фрагментов рестрикции, ПЦР со слиянием и перекрывающаяся ПЦР. Такие способы можно соответствующим образом использовать отдельно или в комбинации для конструирования антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения термины "связанный" и "слитый", или "связывание" и "слияние" используют взаимозаменяемо. Эти термины означают, что два или более элементов или компонентов, таких как полипептиды, слиты вместе с образованием единой структуры любыми способами, включая описанные выше способы химического связывания и способы генетической рекомбинации. Слияние в рамке считывания означает, когда два или более элементов или компонентов представляют собой полипептиды, связывание двух или более элементов рамок считывания с образованием непрерывной более длинной рамки считывания при сохранении правильных рамок считывания полипептидов. Когда две молекулы Fab используют в качестве антигенсвязывающего домена, в качестве предпочтительной антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно использовать антитело, которое представляет собой антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, где антигенсвязывающий домен связан в рамке считывания с Fc-областью через пептидную связь без линкера.
FcRn
В отличие от Fcγ-рецептора, принадлежащего семейству иммуноглобулинов, FcRn, в частности, FcRn человека, структурно сходен с полипептидами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, проявляя 22%-29% идентичность последовательности с молекулами МНС класса I (Ghetie el al., Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn экспрессируется в качестве гетеродимера, состоящего из растворимой β- или легкой цепи (β2-микроглобулин) в комплексе с трансмембранной α- или тяжелой цепью. Подобно МНС, α-цепь FcRn содержит три внеклеточных домена (α1, α2 и α3) и ее короткий цитоплазматический домен заякоривает белок на клеточной поверхности, α1- и α2-домены взаимодействуют с FcRn-связывающим доменом Fc-области антитела (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315).
FcRn экспрессируется в материнской плаценте и желточном мешке млекопитающих, и он вовлечен в перенос IgG от матери к плоду. Кроме того, в тонком кишечнике новорожденных грызунов, где FcRn экспрессируется, FcRn вовлечен в перенос материнских IgG через эпителий щеточной каемки из проглоченного молозива или молока. FcRn экспрессируется во множестве других тканей и системах эндотелиальных клеток различных видов. FcRn также экспрессируется у взрослого человека в эндотелии, кровеносных сосудах мышц и синусоидных капиллярах печени. Полагают, что FcRn участвует в поддержании концентрации IgG в плазме путем опосредования рециклирования IgG в сыворотку при связывании с IgG. Как правило, связывание FcRn с молекулами IgG строго зависит от рН. Оптимальное связывание наблюдают при кислом диапазоне рН ниже 7,0.
FcRn человека, предшественником которого является полипептид, имеющий сигнальную последовательность SEQ ID NO: 34 (полипептид с сигнальной последовательностью представлен в SEQ ID NO: 35), образует комплекс с β2-микроглобулином человека in vivo. Как показано в справочных примерах, описанных ниже, растворимый FcRn человека в комплексе с β2-микроглобулином получают с использованием общепринятых способов рекомбинантной экспрессии. FcRn-связывающий домен по настоящему изобретению можно оценивать в отношении его активности связывания с таким растворимым FcRn человека в комплексе с β2-микро глобулином. В рамках настоящего изобретения, если нет иных указаний, FcRn человека относится к форме, способной связываться с FcRn-связывающим доменом по настоящему изобретению. Примеры включают комплекс между FcRn человека и β2-микроглобулином человека.
Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают FcRn-связывающим доменом. FcRn-связывающий домен конкретно не ограничен при условии, что антигенсвязывающие молекулы обладают активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН, и он может представлять собой домен, который обладает прямой или непрямой активностью связывания с FcRn. Предпочтительные примеры такого домена включают Fc-область IgG-иммуноглобулина, альбумин, домен 3 альбумина, антитело против FcRn, пептид против FcRn, каркасную молекулу против FcRn и т.п., которые обладают активностью прямого связывания с FcRn, или молекулы, которые связываются с IgG или альбумином, которые обладают активностью непрямого связывания с FcRn. В рамках настоящего изобретения предпочтительным является домен, обладающий активностью связывания с FcRn в диапазоне кислых значений рН и в диапазоне нейтральных значений рН. Когда домен уже обладает активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН, его предпочтительно можно использовать как есть. Когда домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно модифицировать для сообщения активности связывания FcRn. Альтернативно аминокислоты можно изменять в домене, уже обладающем активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН для увеличения активности связывания FcRn. Для изменения аминокислот в FcRn-связывающем домене, представляющее интерес изменение можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН до и после изменения аминокислот.
Предпочтительным FcRn-связывающим доменом человека является область, которая прямо связывается с FcRn. Такие предпочтительные FcRn-связывающие домены включают, например, Fc-области антител. Между тем, области, способные связываться с полипептидом, таким как альбумин или IgG, который обладает активностью связывания FcRn, могут непрямо связываться с FcRn через альбумин, IgG и т.п. Таким образом, для FcRn-связывающей области по настоящему изобретению, предпочтительно можно использовать область, которая связывается с полипептидом, обладающим активностью связывания FcRn. Fc-область содержит аминокислотную последовательность, происходящую из константной области тяжелой цепи антитела. Fc-область является частью константной области тяжелой цепи антитела, начинающейся с N-конца шарнирной области в участке расщепления папаином, который расположен приблизительно в положении аминокислоты 216 в соответствии с нумерацией EU, и включающей шарнирную область, СН2- и СН3-домены.
Активность связывания FcRn-связывающего домена с FcRn, в частности FcRn человека, или антигенсвязывающей молекулы, содержащей домен
Активность связывания FcRn-связывающего домена по настоящему изобретению с FcRn, в частности FcRn человека, можно измерять способами, известными специалистам в данной области, как описано в разделе "Активность связывания" выше. Специалисты в данной области могут соответствующим образом определить условия, отличные от рН. Антигенсвязывающую активность и активность связывания с FcRn человека антигенсвязывающей молекулы можно оценивать, основываясь на константе диссоциации (KD), кажущейся константе диссоциации (KD), константе скорости диссоциации (kd), кажущейся константе скорости диссоциации (kd) и т.п. Их можно измерять способами, известными специалистам в данной области. Например, можно использовать Biacore (GE healthcare), график Скэтчарда или проточный цитометр.
Когда измеряют активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению, условия, отличные от рН, конкретно не ограничены, и их могут соответствующим образом выбирать специалисты в данной области. Измерения можно проводить, например, при 37°C с использованием буфера MES, как описано в WO 2009/125825. Альтернативно активность связывания FcRn человека Fc-области по настоящему изобретению можно измерять способами, известными специалистам в данной области, и ее можно измерять с использованием, например, Biacore (GE Healthcare) и т.п. Активность FcRn-связывающего домена в отношении связывания с FcRn человека можно оценивать путем нанесения в качестве анализируемого соединения FcRn человека, FcRn-связывающего домена или антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, содержащей FcRn-связывающий домен, на чип, на который иммобилизован FcRn-связывающий домен, антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, содержащая FcRn-связывающий домен, или FcRn человека.
Диапазон кислых значений рН, указываемый в качестве условий для наличия активности связывания между FcRn и FcRn-связывающим доменом в антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, как правило, относится к рН 4,0-рН 6,5. Предпочтительно он относится к рН 5,5-рН 6,5 и особенно предпочтительно он относится к рН 5,8-рН 6,0, что является близким к рН в ранней эндосоме in vivo. Диапазон нейтральных значений рН, указываемый в качестве условий для наличия активности связывания между FcRn и антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению или FcRn-связывающим доменом, включенным в такую молекулу, как правило, относится к от рН 6,7 до рН 10,0. Предпочтительно, диапазон нейтральных значений рН представляет собой диапазон, указанный с помощью произвольных величин рН от рН 7,0 до рН 8,0, и предпочтительно он выбран из рН 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 и 8,0, и особенно предпочтительно рН 7,4, что близко к значению рН плазмы (крови) in vivo. Когда оценка аффинности связывания между FcRn человека и FcRn-связывающим доменом человека или антигенсвязывающей молекулой, содержащей этот домен при рН 7,4, затруднена вследствие низкой аффинности связывания, вместо рН 7,4 можно использовать рН 7,0. В качестве температуры, подлежащей применению в условиях анализа, аффинность связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Предпочтительно, температуру от 15°С до 40°С используют для определения аффинности связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn человека. Более предпочтительно, также для определения аффинности связывания между FcRn-связывающим доменом и FcRn в равной степени можно использовать любую температуру от 20°С до 35°С, такую как любая из 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35°С. Неограничивающим примером варианта осуществления настоящего изобретения является температура 25°С.
Согласно Yeung et al. (J. Immunol. (2009) 182, 7663-7671), активность связывания природного IgG1 человека с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН (рН 6,0) составляет KD 1,7 мкМ, в то время как эта активность практически не поддается выявлению в диапазоне нейтральных значений рН. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, обладающую активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, которая включает антигенсвязывающие молекулы, активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона кислых значений рН составляет KD 20 мкМ или сильнее и активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона нейтральных значений рН эквивалентна активности связывания FcRn человека у IgG человека. В более предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, включающую антигенсвязывающие молекулы, активность связывания с FcRn человека которых в условиях диапазона кислых значений рН составляет KD 2,0 мкМ или сильнее. В еще более предпочтительном варианте осуществления можно использовать антигенсвязывающие молекулы, активность связывания FcRn человека которых в диапазоне диапазона кислых значений рН равна KD 0,5 мкМ или сильнее. Упомянутые выше величины KD определяют способом, описанным в The Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (посредством иммобилизации антигенсвязывающей молекулы на чип и загрузки FcRn человека в качестве анализируемого образца).
В рамках настоящего изобретения предпочтительной является Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Если домен представляет собой Fc-область, уже обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, ее можно использовать как есть. Если домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно изменять для получения Fc-области, обладающей желаемой активностью связывания FcRn. Fc-область, обладающую желаемой активностью связывания FcRn или усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, также можно предпочтительно получать посредством изменения аминокислот в Fc-области. Изменение аминокислот в Fc-области, которое сообщает такую желаемую активность связывания, можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН до и после изменения аминокислот. Специалисты в данной области могут внести соответствующие аминокислотные изменения с использованием хорошо известного способа, сходного с упомянутым выше способом, используемым для изменения активности связывания Fcγ-рецептора.
Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, которая включена в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, можно получать любым способом; но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания FcRn или обладающий усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменения на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоты в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН или что активность связывания с FcRn человека в условиях кислого диапазона может увеличиваться. Когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обладает эффектом усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447 (нумерация EU), как описано в WO 2000/042072. Аналогично, предпочтительные примеры аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2002/060919. Более того, такие аминокислоты, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 250, 314 и 428 (нумерация EU), как описано в WO 2004/092219. Такие аминокислоты, которые можно изменять, дополнительно включают аминокислоты в положениях 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2010/045193. Эти аминокислотные изменения усиливают связывание FcRn в условиях диапазона кислых значений рН Fc-области IgG-иммуноглобулина.
В рамках настоящего изобретения предпочтительной является Fc-область, которая обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Если домен представляет собой Fc-область, уже обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, его можно использовать как есть. Если домен не обладает или обладает слабой активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, аминокислоты в антигенсвязывающей молекуле можно изменять с получением Fc-области, обладающей желаемой активностью связывания FcRn. Fc-область, обладающую желаемой активностью связывания FcRn или усиленной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, предпочтительно можно получать посредством изменения аминокислот в Fc-области. Изменения аминокислот Fc-области, которые сообщают такую желаемую активность связывания, можно идентифицировать посредством сравнения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН до и после изменения аминокислот. Специалисты в данной области могут вносить соответствующие аминокислотные изменения с использованием хорошо известного способа, сходного с упомянутым выше способом, используемым для изменения активности связывания Fcγ-рецептора.
Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, которая включена в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, можно получать любым способом; но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания или обладающий усиленной активностью связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные примеры Fc-областей IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменений на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоты в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, или активность связывания с FcRn человека в условиях кислого диапазона кислых значений может повышаться. Когда антигенсвязывающая молекула содержит Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обеспечивает усиление связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433 и/или 434, а также аминокислоты, которые можно комбинировать с ними, которые представляют собой аминокислоты в положениях 253, 310, 435 и/или 426 (нумерация EU), как описано в WO 1997/034631. Предпочтительные аминокислоты представляют собой аминокислоты в положениях 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447 (нумерация EU), как описано в WO 2000/042072. Аналогично, предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2002/060919. Более того, такие аминокислоты, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 250, 314 и 428 (нумерация EU), как описано в WO 2004/092219. Кроме того, предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 и/или 442, как описано в WO 2006/020114. Другие предпочтительные примеры таких аминокислот, которые можно изменять, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2010/045193. Эти аминокислотные изменения усиливают связывание FcRn в условиях диапазона кислых значений рН Fc-области IgG-иммуноглобулина.
В неограничивающем варианте осуществления изменений, которые вызывают эффект усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, когда Fc-область IgG1 человека включена в качестве Fc-области, примеры включают по меньшей мере одно или несколько аминокислотных изменений, выбранных из группы, состоящей из:
либо Arg, либо Leu в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Ser, Thr и Tyr в положении аминокислоты 252;
либо Ser, либо Thr в положении аминокислоты 254;
любой из Arg, Gly, Ile и Leu в положении аминокислоты 255;
любой из Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu и Thr в положении аминокислоты 256;
либо Ile, либо Thr в положении аминокислоты 308;
Pro в положении аминокислоты 309;
любой из Glu, Leu и Ser в положении аминокислоты 311;
либо Ala, либо Asp в положении аминокислоты 312;
либо Ala, либо Leu в положении аминокислоты 314;
любой из Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser и Thr в положении аминокислоты 385;
любой из Arg, Asp, ILe, Lys, Met, Pro, Ser и Thr в положении аминокислоты 386;
любой из Ala, Arg, His, Pro, Ser и Thr в положении аминокислоты 387;
любой из Asn, Pro и Ser в положении аминокислоты 389;
любой из Leu, Met, Phe, Ser и Thr в положении аминокислоты 428;
любой из Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro и Ser в положении аминокислоты 433;
любой из His, Phe и Tyr в положении аминокислоты 434; и
любой из Arg, Asn, His, Lys, Met и Thr в положении аминокислоты 436
в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в одном положении или в двух или более положениях.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Ile в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309 и/или Glu в положении аминокислоты 311 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Thr в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309, Leu в положении аминокислоты 311, Ala в положении аминокислоты 312 и/или Ala в положении аминокислоты 314. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Ile или Thr в положении аминокислоты 308; Pro в положении аминокислоты 309; Glu, Leu или Ser в положении аминокислоты 311; Ala в положении аминокислоты 312; и/или Ala или Leu в положении аминокислоты 314. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой Thr в положении аминокислоты 308, Pro в положении аминокислоты 309, Ser в положении аминокислоты 311, Asp в положении аминокислоты 312 и/или Leu в положении аминокислоты 314.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Leu в положении аминокислоты 251, Tyr в положении аминокислоты 252, Ser или Thr в положении аминокислоты 254, Arg в положении аминокислоты 255 и/или Glu в положении аминокислоты 256 в соответствии с нумерацией EU.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее любой из Leu, Met, Phe, Ser и Thr в положении аминокислоты 428; любой из Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro и Ser в положении аминокислоты 433; любой из His, Phe и Tyr в положении аминокислоты 434; и/или любой из Arg, Asn, His, Lys, Met и Thr в положении аминокислоты 436, указанные в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменения(ий), изменение(я) может включать His или Met в положении аминокислоты 428 и/или His или Met в положении аминокислоты 434.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Arg в положении аминокислоты 385, Thr в положении аминокислоты 386, Arg в положении аминокислоты 387 и/или Pro в положении аминокислоты 389 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменение(я) может представлять собой Asp в положении аминокислоты 385, Pro в положении аминокислоты 386 и/или Ser в положении аминокислоты 389.
Более того, когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, включают изменения по меньшей мере одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Gln, либо Glu в положении аминокислоты 250; и
либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428
в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащее изменению, конкретно не ограничено, и аминокислота может быть изменена только в одном положении или в двух или более положениях.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 250 и/или либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут представлять собой изменения, включающие Glu в положении аминокислоты 250 и/или либо Leu, либо Phe в положении аминокислоты 428.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, примеры включают изменения по меньшей мере двух или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Asp, либо Glu в положении аминокислоты 251;
Tyr в положении аминокислоты 252;
Gln в положении аминокислоты 307;
Pro в положении аминокислоты 308;
Val в положении аминокислоты 378;
Ala в положении аминокислоты 380;
Leu в положении аминокислоты 428;
либо Ala, либо Lys в положении аминокислоты 430;
любой из Ala, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 434; и
Ile в положении аминокислоты 436
в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в двух положениях или в трех или более положениях.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 307 и либо Ala, либо Ser в положении аминокислоты 434 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Pro в положении аминокислоты 308 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Tyr в положении аминокислоты 252 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Val в положении аминокислоты 378 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Leu в положении аминокислоты 428 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Ala в положении аминокислоты 434 и Ile в положении аминокислоты 436. Более того, в другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Pro в положении аминокислоты 308 и Tyr в положении аминокислоты 434. Более того, в другом отличающемся неограничивающем варианте осуществления изменений, изменения могут включать Gln в положении аминокислоты 307 и Ile в положении аминокислоты 436.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменение(я), включающее Gln в положении аминокислоты 307, Ala в положении аминокислоты 380 и Ser в положении аминокислоты 434 as в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Gln в положении аминокислоты 307, Ala в положении аминокислоты 380 и Ala в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Tyr в положении аминокислоты 252, Pro в положении аминокислоты 308 и Tyr в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Asp в положении аминокислоты 251, Gln в положении аминокислоты 307 и His в положении аминокислоты 434.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, примеры неограничивающего варианта осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, включают изменения по меньшей мере два или более аминокислоты выбранный из группы, состоящей из:
Leu в положении аминокислоты 238;
Leu в положении аминокислоты 244;
Arg в положении аминокислоты 245;
Pro в положении аминокислоты 249;
Tyr в положении аминокислоты 252;
Pro в положении аминокислоты 256;
любой из Ala, Ile, Met, Asn, Ser и Val в положении аминокислоты 257;
Asp в положении аминокислоты 258;
Ser в положении аминокислоты 260;
Leu в положении аминокислоты 262;
Lys в положении аминокислоты 270;
либо Leu, либо Arg в положении аминокислоты 272;
любой из Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 279;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 283;
Asn в положении аминокислоты 285;
Phe в положении аминокислоты 286;
либо Asn, либо Pro в положении аминокислоты 288;
Val в положении аминокислоты 293;
любой из Ala, Glu и Met в положении аминокислоты 307;
любой из Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val и Trp в положении аминокислоты 311;
Pro в положении аминокислоты 312;
Lys в положении аминокислоты 316;
Pro в положении аминокислоты 317;
либо Asn, либо Thr в положении аминокислоты 318;
любой из Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser и Trp в положении аминокислоты 332;
любой из Asn, Thr и Trp в положении аминокислоты 339;
Pro в положении аминокислоты 341;
любой из Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr и Tyr в положении аминокислоты 343;
Arg в положении аминокислоты 375;
любой из Gly, Ile, Met, Pro, Thr и Val в положении аминокислоты 376;
Lys в положении аминокислоты 377;
либо Asp, либо Asn в положении аминокислоты 378;
любой из Asn, Ser и Thr в положении аминокислоты 380;
любой из Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 382;
Asn в положении аминокислоты 423;
Asn в положении аминокислоты 427;
любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 430;
либо His, либо Asn в положении аминокислоты 431;
любой из Phe, Gly, His, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434;
любой из Ile. Leu и Thr в положении аминокислоты 436;
любой из Lys, Leu, Thr и Trp в положении аминокислоты 438;
Lys в положении аминокислоты 440; и
Lys в положении аминокислоты 442;
в соответствии с нумерацией EU. Количество аминокислот, подлежащих изменению, конкретно не ограничено и аминокислоту можно изменять только в двух положениях или в трех или более положениях.
Когда в качестве Fc-области включена Fc-область IgG1 человека, неограничивающий вариант осуществления изменений, которые вызывают эффекты усиления связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека, может представлять собой изменения, включающие Ile в положении аминокислоты 257 и Ile в положении аминокислоты 311 в соответствии с нумерацией EU. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Ile в положении аминокислоты 257 и His в положении аминокислоты 434. В другом неограничивающем варианте осуществления изменений изменения могут включать Val в положении аминокислоты 376 и His в положении аминокислоты 434.
Более того, как описано ниже, для FcRn-связывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, также предпочтительно можно использовать Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН. Такую Fc-область можно получать любым способом в соответствии с упомянутым выше способом получения Fc-областей, обладающих активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, но, в частности, FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания или обладающий усиленной активностью связывания с FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН, можно получать посредством изменения аминокислот IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве исходной Fc-области. Предпочтительные Fc-области IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для изменений на другие аминокислоты, можно изменять аминокислоту в любом положении при условии, что Fc-область обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН или активность связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН может увеличиваться. Когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое обладает эффектами усиления связывания с FcRn в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания исходной Fc-области IgG1 человека. Предпочтительные примеры таких измененных Fc-областей включают FcRn-связывающие домены человека, в которых по меньшей мере одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 в участке исходной Fc-области в соответствии с нумерацией EU, отличаются от соответствующих аминокислот в нативной Fc-области.
Предпочтительные примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-области, содержащие по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
Met в положении аминокислоты 237;
Ala в положении аминокислоты 238;
Lys в положении аминокислоты 239;
Ile в положении аминокислоты 248;
любой из Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 250;
любой из Phe, Trp и Tyr в положении аминокислоты 252;
Thr в положении аминокислоты 254;
Glu в положении аминокислоты 255;
любой из Asp, Glu и Gln в положении аминокислоты 256;
любой из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 257;
His в положении аминокислоты 258;
Ala в положении аминокислоты 265;
Phe в положении аминокислоты 270;
либо Ala, либо Glu в положении аминокислоты 286;
His в положении аминокислоты 289;
Ala в положении аминокислоты 297;
Gly в положении аминокислоты 298;
Ala в положении аминокислоты 303;
Ala в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 307;
любой из Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln и Thr в положении аминокислоты 308;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro и Arg в положении аминокислоты 309;
любой из Ala, His и Ile в положении аминокислоты 311;
либо Ala, либо His в положении аминокислоты 312;
либо Lys, либо Arg в положении аминокислоты 314;
либо Ala, либо His в положении аминокислоты 315;
Ala в положении аминокислоты 317;
Gly в положении аминокислоты 325;
Val в положении аминокислоты 332;
Leu в положении аминокислоты 334;
His в положении аминокислоты 360;
Ala в положении аминокислоты 376;
Ala в положении аминокислоты 380;
Ala в положении аминокислоты 382;
Ala в положении аминокислоты 384;
либо Asp, либо His в положении аминокислоты 385;
Pro в положении аминокислоты 386;
Glu в положении аминокислоты 387;
либо Ala, либо Ser в положении аминокислоты 389;
Ala в положении аминокислоты 424;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 428;
Lys в положении аминокислоты 433;
любой из Ala, Phe, His, Ser, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434; и
His в положении аминокислоты 436;
в Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
Например, с использованием этих аминокислотных изменений отдельно или множества изменений в комбинации, связывание Fc-области IgG с FcRn в диапазоне кислых значений рН и/или в диапазоне нейтральных значений рН может быть усилено; однако аминокислотные изменения, подлежащие внесению, конкретно не ограничены, и при условии, что сообщается эффект увеличения времени удержания в плазме, можно вносить любое аминокислотное изменение.
Фармацевтические композиции
Когда вводят общепринятое нейтрализующее антитело против растворимого антигена, ожидается, что удержание антигена в плазме будет пролонгированным вследствие связывания с антителом. Как правило, антитела имеют длительное время полужизни (от одной недели до трех недель), в то время как время полужизни антигена обычно является коротким (одни сутки или менее). Между тем связанные с антителом антигены имеют значительно более длительное время полужизни в плазме по сравнению с тем, когда антигены присутствуют отдельно. По этой причине введение существующего нейтрализующего антитела приводит к увеличению концентрации антигена в плазме. Такие случаи описаны для различных нейтрализующих антител, которые нацелены на растворимые антигены, включая, например, IL-6 (J. Immunotoxicol. (2005) 3, 131-139), амилоид-бета (mAbs (2010) 2 (5), 1-13), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM (2006) 54, 2387-2392), гепцидин (AAPS J. (2010) 4, 646-657) и рецептор sIL-6 (Blood (2008) 112 (10), 3959-64). Описано, что введение существующих нейтрализующих антител увеличивает общую концентрацию антигена в плазме приблизительно в 10-1000 раз (уровень увеличения варьирует, в зависимости от антигена) от исходного уровня. В рамках настоящего изобретения общая концентрация антигена в плазме относится к концентрации в качестве общего количества антигена в плазме, т.е. сумме концентраций связанного с антителом и не связанного с антителом антигена. Увеличение общей концентрации антигена в плазме является нежелательным для таких фармацевтических средств на основе антител, которые нацелены на растворимый антиген. Причина этого состоит в том, что концентрация антитела должна быть более высокой, чем по меньшей мере общая концентрация антигена в плазме, для нейтрализации растворимого антигена. В частности, "общая концентрация антигена в плазме увеличивается в 10-1000 раз" означает, что для нейтрализации антигена концентрация антитела в плазме (т.е. доза антитела) должна быть в 10-1000 раз более высокой по сравнению с тем, когда увеличение общей концентрации антигена в плазме не происходит. Напротив, если общая концентрация антигена в плазме может быть снижена в 10-1000 раз по сравнению с существующим нейтрализующим антителом, дозу антитела также можно снижать в аналогичной степени. Таким образом, антитела, способные снижать общую концентрацию антигена в плазме путем элиминации растворимого антигена из плазмы, в высокой степени пригодны по сравнению с существующими нейтрализующими антителами.
Хотя настоящее изобретение не ограничено конкретной теорией, причина увеличения количества антигенов, которые могут связываться с одной антигенсвязывающей молекулой, и причина усиленного снижения концентрации антигена в плазме, когда антигенсвязывающую молекулу вводят в живой организм, что приводит к увеличению захвата антигенсвязывающей молекулы в клетки in vivo, где антигенсвязывающая молекула содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, так что антигенсвязывающая активность является более низкой в условиях диапазона кислых значений рН, чем в условиях диапазона нейтральных значений рН, и FcRn-связывающий домен, такой как константная область антитела, обладающая активностью связывания Fcγ-рецептора человека в условиях диапазона нейтральных значений рН, может быть объяснена следующим образом.
Например, когда антитело, которое связывается с антигеном мембраны, вводят in vivo, после связывания с антигеном антитело в связанном с антигеном состоянии включается в эндосому путем внутриклеточной интернализации. Затем антитело переносится в лизосому, оставаясь связанным с антигеном, и деградируется там вместе с антигеном. Опосредуемую интернализацией элиминацию из плазмы называют антиген-зависимой элиминацией, и она была описана для многих молекул антител (Drug Discov Today (2006) 11(1-2), 81-88). Когда одна молекула IgG-антитела связывается с антигенами двухвалентным образом, одна молекула антитела интернализуется, оставаясь связанной с двумя антигенами, и деградируется в лизосоме. В случае типичных антител, таким образом, одна молекула IgG-антитела не может связываться с тремя молекулами антигена или более. Например, одна молекула IgG-антитела, обладающая нейтрализующей активностью, не может нейтрализовать три или более молекулы антигена.
Время удержания молекулы IgG в плазме является относительно длительным (элиминация является медленной), поскольку функционирует FcRn, который известен как рецептор спасения для молекулы IgG. Молекулы IgG, включенные в эндосомы путем пиноцитоза, связываются в кислых условиях эндосом с FcRn, экспрессируемым в эндосомах. Молекулы IgG, которые не могут связываться с FcRn, переносятся в лизосомы и деградируются в них. Между тем, молекулы IgG, связанные с FcRn, переносятся на клеточную поверхность. Молекулы IgG диссоциируют от FcRn человека в нейтральных условиях в плазме и, таким образом, рециклируют обратно в плазму.
Альтернативно, когда антигенсвязывающие молекулы представляют собой антитела, которые связываются с растворимым антигеном, вводимые in vivo антитела связываются с антигенами, а затем антитела включаются в клетки, оставаясь связанными с антигенами. Большинство антител, включенных в клетки, связываются с FcRn в эндосоме, а затем переносятся на клеточную поверхность. Антитела диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях плазмы и высвобождаются во внешнюю среду клеток. Однако антитела, имеющие типичные антигенсвязывающие домены, антигенсвязывающая активность которых не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, высвобождаются во внешнюю среду клеток, оставаясь связанными с молекулами и, таким образом, они не могут связываться вновь с антигеном. Таким образом, подобно антителам, которые связываются с антигенами мембраны, единичная типичная молекула IgG-антитела, антигенсвязывающая активность которой не варьирует, в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, не может связываться с тремя молекулами антигенов или более.
Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антитела, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция) могут диссоциировать от антигена в эндосоме. Антитела, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, когда рециклируют в плазму посредством FcRn, после диссоциации от антигенов могут вновь связываться с антигеном. Таким образом, такая единичная молекула антитела может многократно связываться с несколькими молекулами антигена. Между тем, антиген, связанный с антигенсвязывающими молекулами, диссоциируют от антитела в эндососме и деградируют в лизосоме без рециклирования в плазму. Путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo, захват антигена в клетки ускоряется и является возможным снижение концентрации антигена в плазме.
Захват антигенов, связанных антигенсвязывающими молекулами, в клетки далее усиливается путем сообщения или усиления активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН (рН 7,4) антителам, связывающимся с антигенами рН-зависимым образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях диапазона кислых значений рН в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциируют в условиях диапазона кислых значений рН), и антителам, которые связываются с антигенами зависимым от концентрации ионов кальция образом, которые прочно связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция в плазме и диссоциируют от антигенов в условиях низкой концентрации ионов кальция в эндосоме (антитела, которые связываются с антигенами в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциируют в условиях низкой концентрации ионов кальция). В частности, путем введения таких антигенсвязывающих молекул in vivo ускоряется элиминация антигена, и является возможным снижение концентрации антигена в плазме. Типичные антитела, которые не обладают способностью связываться с антигенами рН-зависимым образом или зависимым от концентрации ионов кальция образом, и комплексы антиген-антитело таких антител включаются в клетки посредством неспецифического эндоцитоза и транспортируются на клеточную поверхность путем связывания с FcRn в кислых условиях эндосом. Они диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях на клеточной поверхности и рециклируют в плазму. Таким образом, когда антитело, которое связывается с антигеном полностью рН-зависимым образом (которое связывается в условиях диапазона нейтральных значений рН и диссоциирует в условиях диапазона кислых значений рН) или полностью зависимым от концентрации ионов кальция образом (которое связывается в условиях высокой концентрации ионов кальция и диссоциирует в условиях низкой концентрации ионов кальция) связывается с антигеном в плазме и диссоциирует от антигена в эндосоме, скорость элиминации антигена считается равной скорости захвата в клетки антитела или комплекса антиген-антитело посредством неспецифического эндоцитоза. Когда зависимость от рН или концентрации ионов кальция связывания антиген-антитело является недостаточной, антигены, которые не диссоциировали от антител в эндосоме, рециклируют в плазму вместе с антителами. С другой стороны, когда зависимость от рН является достаточно высокой, скорость-лимитирующей стадией элиминации антигена является клеточный захват посредством неспецифического эндоцитоза. Между тем, FcRn транспортирует антитела из эндосомы на клеточную поверхность и ожидается, что часть FcRn также распределена на клеточной поверхности.
Авторы настоящего изобретения сделали заключение, что IgG-иммуноглобулины, обладающие активностью связывания или обладающие усиленной активностью связывания с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, могут связываться с Fcγ-рецепторами, присутствующими на поверхности клетки, и что IgG-иммуноглобулины захватываются в клетки зависимым от Fcγ-рецептора образом посредством связывания с Fcγ-рецепторами, присутствующими на клеточной поверхности. Скорость захвата в клетки через Fcγ-рецепторы является более высокой, чем скорость захвата в клетки посредством неспецифического эндоцитоза. Таким образом, полагают, что скорость элиминации антигена антигенсвязывающими молекулами можно далее увеличить посредством усиления способности связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН. Следовательно, антигенсвязывающие молекулы, обладающие способностью связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, захватывают антигены в клетки быстрее, чем обычные (нативные человеческие) IgG-иммуноглобулины и после связывания с FcRn в эндосоме и диссоциации антигенов они рециклируют вновь в плазму и они вновь связываются с антигенами и захватываются в клетки через Fcγ-рецепторы. Поскольку оборачиваемость этого цикла может быть увеличена посредством увеличения способности связываться с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН, скорость элиминации антигена из плазмы увеличится. Более того, посредством получения антигенсвязывающих молекул, которые обладают сниженной антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона нейтральных значений рН, скорость элиминации антигена из плазмы может быть далее увеличена. Посредством увеличения количества циклов в результате увеличения оборачиваемости этого цикла может увеличиваться количество молекул антигенов, которые могут связываться одной антигенсвязывающей молекулой. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению включают антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен и, поскольку связывающий Fcγ-рецептор домен не влияет на связывание антигена и основываясь на упомянутом выше механизме, считается, что, независимо от типа антигенов, захват антигена в клетки антигенсвязывающими молекулами может быть усилен и скорость элиминации антигена может быть увеличена посредством снижения активности связывания (связывающей способности) антигенсвязывающей молекулы с антигенами в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или условия низкой концентрации ионов кальция, по сравнению с активностью связывания (связывающей способностью) с антигенами в условиях концентрации ионов кальция, таких как диапазон нейтральных значений рН, или условия высокой концентрации ионов кальция и/или усиление активности связывания с Fcγ-рецепторами при рН в плазме. Таким образом, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут проявлять лучшие эффекты, чем общепринятые терапевтические антитела, с точки зрения снижения побочных эффектов, вызываемых антигенами, увеличения дозы антитела и улучшения кинетики антител in vivo.
На фиг. 1 представлен вариант осуществления механизма элиминации растворимых антигенов из плазмы путем введения антител с зависимым от концентрации ионов связыванием антигена, обладающих усиленным связыванием с Fcγ-рецепторами при нейтральных значениях рН, по сравнению с общепринятыми нейтрализующими антителами. Далее в настоящем описании описаны антитела с зависимым от концентрации ионов водорода (т.е. рН) связыванием антигена в качестве примера антител с зависимым от концентрации ионов связыванием антигена, однако механизмы не ограничиваются концентрацией ионов водорода. Существующие нейтрализующие антитела, которые не обладают способностью к рН-зависимому связыванию антигена, могут постепенно захватываться, главным образом, посредством неспецифических взаимодействий с клетками после связывания с растворимыми антигенами в плазме. Комплексы нейтрализующих антител и растворимых антигенов, которые захватились в клетки, перемещаются в кислые эндосомы и рециклируют в плазму посредством FcRn. С другой стороны, антитело с рН-зависимым связыванием антигена с усиленным связыванием с Fcγ-рецепторами в нейтральных условиях, связывается с растворимым антигеном в плазме и после этого оно может быстро захватываться в клетки, экспрессирующие Fcγ-рецепторы на поверхности клеток посредством взаимодействия с Fcγ-рецептором помимо неспецифического взаимодействия. В этом случае растворимые антигены, связанные с антителом с рН-зависимым связыванием антигена, диссоциируют от антитела вследствие способности к рН-зависимому связыванию в кислых эндосомах. Растворимые антигены, которые диссоциировали от антитела, затем перемещаются в лизосомы и деградируются посредством протеолиза. Между тем, антитела, которые высвободили растворимые антигены, связываются с FcRn в кислой эндосоме, а затем рециклируют на мембрану клетки посредством FcRn, и вновь высвобождаются в плазму. Таким образом, свободные антитела, которые рециклируют, могут вновь связываться с другими растворимыми антигенами. Такие антитела с рН-зависимым связыванием антигена, связывание которых с Fcγ-рецепторами в нейтральных условиях может перемещать большое количество растворимых антигенов в лизосомы, снижают общую концентрацию антигена в плазме посредством повторяющегося цикла из: захвата в клетки через Fcγ-рецепторы; диссоциации и деградации растворимых антигенов; и рециклирования антитела.
В частности, настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, антигенсвязывающим молекулам, полученным способами изменения по настоящему изобретению, или антигенсвязывающим молекулам, полученным способами получения по настоящему изобретению.
Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или антигенсвязывающие молекулы, полученные способами получения по настоящему изобретению, пригодны в качестве фармацевтических композиций, поскольку они при введении обладают мощным эффектом снижения концентрации антигена в плазме по сравнению с типичными антигенсвязывающими молекулами, и проявляют улучшенный иммунный ответ in vivo, фармакокинетику и т.п. у животных, которым вводят молекулы. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые носители.
В рамках настоящего изобретения фармацевтические композиции, как правило, относятся к средствам для лечения или профилактики или исследования и диагностики заболеваний.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть составлены способами, известными специалистам в данной области. Например, их можно использовать парентерально в форме инъекций стерильных растворов или суспензий, включающих воду или другую фармацевтически приемлемую жидкость. Например, такие композиции могут быть составлены путем смешения в форме единичной дозы, требуемой повсеместно одобренной практикой производства лекарственных средств, путем комбинирования надлежащим образом с фармакологически приемлемыми носителями или средами, в частности, со стерильной водой, физиологическим раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспензией, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, вкусовой добавкой, эксципиентом, носителем, консервантом, связующим веществом и т.п. В таких составах количество активного ингредиента корректируют так, чтобы получить соответствующее количество в заданном диапазоне.
Стерильные композиции для инъекций могут быть составлены с использованием носителей, таких как дистиллированная вода для инъекций, в соответствии со стандартной практикой составления.
Водные растворы для инъекций включают, например, физиологический солевой раствор и изотонические растворы, содержащие декстрозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Также их можно использовать в комбинации с соответствующими солюбилизаторами, например, спиртами (этанол и т.п.), полиспиртами (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), неионными поверхностно-активными веществами (полисорбат 80(ТМ), НСО-50 и т.п.).
Масла включают кунжутное масло и соевые масла. В комбинации с солюбилизаторами можно использовать бензилбензоат и/или бензиловый спирт. Также можно комбинировать буферы (например, фосфатный буфер натрий-ацетатный буфер), успокаивающие средства (например, прокаина гидрохлорид), стабилизаторы (например, бензиловый спирт и фенол) и/или антиоксиданты. Полученными инъекционными препаратами заполняют подходящие ампулы.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению предпочтительно вводят парентерально. Например, вводят композиции в дозированной форме для инъекций, трансназального введения, введения через легкие или чрескожного введения. Например, их можно вводить системно или локально путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции и т.п.
Способы введения можно надлежащим образом выбирать, учитывая возраст и симптомы пациента. Доза фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающую молекулу, может составлять, например, от 0,0001 до 1,000 мг/кг для каждого введения. Альтернативно доза может составлять, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не ограничивается числовыми величинами, описанными выше. Дозы и способы введения варьируют, в зависимости от массы тела пациента, возраста, симптомов и т.п. Специалисты в данной области могут установить подходящие дозы и способы введения, учитывая факторы, описанные выше.
Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, могут быть посттрансляционно модифицированными (например, модификация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования хорошо известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению.
Способы, в которых используются антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению
Настоящее изобретение также относится к способу, включающему контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где способ представляет собой любой из следующих:
(i) способ увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула;
(ii) способ элиминации антигенов плазмы;
(iii) способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;
(iv) способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;
(v) способ ускорения высвобождения наружу клетки антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме; и
(vi) способ снижения концентрации свободного антигена или общей концентрации антигена в плазме.
Более того, настоящее изобретение относится к способу, включающему усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, где способ представляет собой любой из следующих:
(i) способ изменения антигенсвязывающей молекулы, в которой внутриклеточный захват антигена, подлежащего связыванию, усилен;
(ii) способ увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула;
(iii) способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы;
(iv) способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы;
(v) способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой;
(vi) способ ускорения высвобождения антигенсвязывающей молекулы наружу клетки в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме; и
(vii) способ изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме.
Примеры способов контактирования антигенсвязывающей молекулы с экспрессиирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo включают (1) так называемый способ ex vivo, где плазму, содержащую антигенсвязывающие молекулы и антигены, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, временно извлекают из живого организма; подвергают контактированию с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы; а затем, после определенного периода времени, плазму, содержащую внеклеточные рециклированные (или также обозначаемые ресекретированные и рециркулированные) антигенсвязывающие молекулы без связанных антигенов возвращают в живой организм, и (2) способ введения антигенсвязывающих молекул в живой организм. В способе (1), также можно использовать способ: временного извлечения из живого организма плазмы, содержащей антигены, с которыми связываются антигенсвязывающие молекулы; контактирования с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и антигенсвязывающие молекулы; и, после определенного периода времени, возвращения плазмы в живой организм.
В рамках настоящего изобретения экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки не ограничиваются конкретными клетками и можно использовать клетки любого типа при условии, что они представляют собой клетки, которые экспрессируют желаемый Fcγ-рецептор(ы). Для идентификации клеток, которые экспрессируют желаемый Fcγ-рецептор(ы), можно использовать общеизвестные базы данных, такие как Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/). Более того, то, экспрессируются ли рецепторы в клетках, используемых для контактирования антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, можно подтверждать способом, которые подтверждают экспрессию гена, кодирующего желаемый Fcγ-рецептор(ы), или иммунологическим способом, в котором используются антитела, которые связываются с желаемым Fcγ-рецептором(ами). Эти способы также являются общеизвестными. Поскольку контакт экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток с антигенсвязывающими молекулами и антигенами, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, осуществляют также in vivo, контактирование экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток с антигенсвязывающими молекулами в рамках настоящего изобретения включает введение антигенсвязывающих молекул в живые организмы. Длительность контакта представляет собой, например, подходящую длительность от одной минуты до нескольких недель, от 30 минут до одной недели, от одного часа до трех суток и от двух часов до одних суток. Более конкретно, длительность, необходимую для захвата антигенсвязывающих молекул или антигенов, связавшихся с антигенсвязывающими молекулами, в клетки посредством эндоцитоза, опосредуемого Fcγ-рецепторами, соответствующим образом используют в качестве длительности контакта. Например, различные иммунные клетки можно использовать для экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток.
Способ усиления активности связывания связывающего Fcγ-рецептор домена с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, относительно нативного связывающего Fcγ-рецептор домена, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, описан в представленном ниже разделе в отношении способа получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению.
Способ изменения антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом антигенов, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой
Настоящее изобретение относится к способам изменения антигенсвязывающей молекулы с усиленным внутриклеточным захватом антигенов, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает усиление, в условиях диапазона нейтральных значений рН, активности связывания Fcγ-рецептора связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
В рамках настоящего изобретения "внутриклеточный захват антигенов" посредством антигенсвязывающей молекулы означает, что антигены захватываются в клетки опосредуемым Fcγ-рецептором эндоцитозом и интернализацией. В рамках настоящего изобретения "усиление захвата в клетки" означает, что скорость захвата в клетки антигенсвязывающих молекул, связанных с антигенами в плазме, увеличивается и/или количество захваченных антигенов, которые рециклировали в плазму, снижается и только необходимо, чтобы скорость захвата в клетки увеличивалась по сравнению с антигенсвязывающей молекулой перед снижением антигенсвязывающей активности (связывающей способности) антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания антигенсвязывающей молекулы с Fcγ-рецептором в диапазоне нейтральных значений рН, и предпочтительно, чтобы скорость увеличивалась по сравнению с нативным IgG человека, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU) представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, и особенно предпочтительно, чтобы скорость увеличивалась по сравнению с любым из нативных IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. Таким образом, в рамках настоящего изобретения то, усиливается ли захват антигенов антигенсвязывающими молекулами, можно определять посредством наблюдения того, увеличивается ли скорость захвата антигенов в клетки. Скорость захвата антигенов в клетки можно вычислять, например, добавлением антигенсвязывающей молекулы и антигена в культуральную среду, содержащую экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки, и измерением снижения концентрации антигена в культуральной среде с течением времени или измерением количества антигенов, захваченных в экспрессирующие Fcγ-рецептор клетки с течением времени. С использованием способа увеличения скорости захвата антигенов в клетки антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению, например, посредством введения антигенсвязывающей молекулы, может быть увеличена скорость элиминации антигена из плазмы. Таким образом, то, усиливается ли захват антигена в клетки антигенсвязывающей молекулой, также можно подтверждать, например, посредством оценки того, увеличивается ли скорость элиминации антигена из плазмы и того, снижает ли введение антигенсвязывающей молекулы общую концентрацию антигена в плазме.
В рамках настоящего изобретения "общая концентрация антигена в плазме" означает сумму концентраций антигенов, связанных с антигенсвязывающими молекулами и не связанных антигенов или "концентраций свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигенов, не связанных с антигенсвязывающими молекулами. Различные способы измерения "общей концентрации антигена в плазме" или "концентраций свободного антигена в плазме" хорошо известны в данной области, как описано в настоящем описании ниже.
В рамках настоящего изобретения "нативный IgG человека" означает немодифицированный IgG человека и он не ограничивается конкретным классом IgG. Более того, в "нативном IgG человека" желательно, чтобы цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляла собой содержащую фукозу цепь сахаров. Это означает, что при условии, что IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека может связываться с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, их можно использовать в качестве "нативного IgG человека". Предпочтительно, "нативный IgG человека" может представлять собой IgG1 человека.
Способ увеличения количества антигенов, которые могут связываться одной антигенсвязывающей молекулой
Настоящее изобретение относится к способу увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Более того, настоящее изобретение относится к способу увеличения количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
Выражение "количество антигенов, с которым может связываться одна антигенсвязывающая молекула" в рамках настоящего изобретения означает количество антигенов, с которым может связываться антигенсвязывающая молекула до тех пор, пока молекула не деградирует или не элиминируется. Выражение "увеличение количества антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула" в рамках настоящего изобретения относится к увеличению количества раз диссоциации молекулы антигена, связанной с антигенсвязывающей молекулой, и связывания антигенсвязывающей молекулы вновь с молекулой антигена. Молекулы антигена, которые связываются с антигенсвязывающей молекулой, могут представлять собой одну и ту же молекулу антигена или различные молекулы, существующие в реакционной системе, где присутствуют обе молекулы. Иными словами, оно относится к общему количеству раз связывания антигенсвязывающей молекулы с антигеном в реакционной системе. В другом выражении, когда принимают, что один цикл представляет собой внутриклеточный захват антигенсвязывающей молекулы, связанной с антигеном, диссоциацию антигена в эндосоме, а затем возвращение антигенсвязывающей молекулы наружу клетки, выражение относится к увеличению количества раз, когда этот цикл может повторяться до тех пор, пока антигенсвязывающая молекула не деградирует или не элиминируется. После связывания с Fcγ-рецептором, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, обладающие активностью связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН, захватываются в клетку, экспрессирующую этот Fcγ-рецептор, посредством эндоцитоза. Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, которая диссоциировала от Fcγ-рецептора в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, вновь рециклирует наружу клетки посредством связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, которая рециклирует наружу клетки после диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, может вновь связываться с антигеном. Таким образом, то, увеличивается ли количество циклов, можно оценивать посредством определения того, происходит ли вышеупомянутое "усиление внутриклеточного захвата" или происходит ли описанное ниже "улучшение фармакокинетики".
Способ элиминации антигенов плазмы или способ повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы
Настоящее изобретение относится к способу элиминации антигенов из плазмы, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором активность связывания антигена антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Более того, настоящее изобретение относится к способу повышения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен, и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
В рамках настоящего изобретения выражение "способ повышения способности элиминировать антигены плазмы" имеет то же значение, что и "способ увеличения способности антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены из плазмы".
В рамках настоящего изобретения "способность элиминировать антигены плазмы" относится к способности элиминировать из плазмы антигены, присутствующие в плазме, когда антигенсвязывающие молекулы вводят in vivo или антигенсвязывающие молекулы секретируются in vivo. Таким образом, в рамках настоящего изобретения все это выражение "способность антигенсвязывающей молекулы элиминировать антигены плазмы повышается" означает, что, когда вводят антигенсвязывающую молекулу, скорость элиминации антигена из плазмы увеличивается по сравнению со скоростью до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, по сравнению с антигенсвязывающей активностью в диапазоне нейтральных значений рН или при высокой концентрации ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания антигенсвязывающей молекулы с Fcγ-рецептором в диапазоне нейтральных значений рН. То, увеличивается ли способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены плазмы, можно определять, например, путем введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул в живой организм и измерения концентрации в плазме растворимых антигенов после введения. Когда концентрация растворимых антигенов в плазме снижается после введения растворимых антигенов и антигенсвязывающих молекул посредством усиления активности связывания антигенсвязывающих молекул с Fcγ-рецепторами в условиях диапазона нейтральных значений рН или посредством снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающей молекулы в условиях концентрации ионов, такой как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, по сравнению с антигенсвязывающей активностью в условиях концентрации ионов, такой как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, в дополнение к усилению активности связывания Fcγ-рецептора, может быть определено, что способность антигенсвязывающих молекул элиминировать антигены плазмы усиливается. Растворимые антигены могут представлять собой антигены, с которыми антигенсвязывающие молекулы фактически связываются (антигены в форме комплекса антиген/антигенсвязывающая молекула), или антигены, с которыми антигенсвязывающие молекулы не связываются, и их концентрации могут быть определены как "концентрация связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов в плазме" и "концентрация не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов в плазме", соответственно (последняя обладает тем же значением, что и "концентрация свободного антигена в плазме"). Поскольку "общая концентрация антигена в плазме" означает сумму концентраций связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов и не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов или "концентрацию свободных антигенов в плазме", которая представляет собой концентрацию не связанных с антигенсвязывающей молекулой антигенов, растворимый антиген концентрация может быть определен как "общая концентрация антигена в плазме". Различные способы измерения "общей концентрации антигена в плазме" или "концентрации свободного антигена в плазме" хорошо известны в данной области, как описано в настоящем описании ниже.
Способ улучшения фармакокинетики антигенсвязывающих молекул
Настоящее изобретение относится к способу улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с клеткой, экспрессирующей Fcγ-рецептор, in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Более того, настоящее изобретение относится к способу улучшения фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула, обладающая активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
В настоящем описании "усиление фармакокинетики", "улучшение фармакокинетики" и "превосходящая фармакокинетика" можно переформулировать как "усиление удержание в плазме (крови)", "улучшение удержания в плазме (крови)", "превосходящее удержание в плазме (крови)", и "пролонгированное удержание в плазме (крови)". Эти термины являются синонимами.
В настоящем описании "улучшение фармакокинетики" означает не только пролонгирование периода времени до элиминации из плазмы (например, пока антигенсвязывающая молекула не деградирует внутреклеточно и т.п. и может вернуться в плазму) после введения антигенсвязывающей молекулы человеку или не являющимся человеком животным, таким как мыши, крысы, обезьяны, кролики и собаки, но также пролонгирование удержания в плазме антигенсвязывающих молекул в форме, которая обеспечивает связывание антигена (например, в свободной от антигена форме антигенсвязывающей молекулы) в ходе периода введения до элиминации вследствие деградации. Нативный IgG может связываться с FcRn из не являющихся человеком животных. Например, мышь можно предпочтительно использовать для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, поскольку нативный IgG может связываться с FcRn мыши прочнее, чем с FcRn человека (Int Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). В качестве другого примера, также в качестве индивидуума для введения в целях подтверждения свойства антигенсвязывающей молекулы по изобретению, описанного далее, предпочтительно можно использовать мышь с дефицитом ее нативных генов FcRn и с трансгеном гена FcRn человека (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104). В частности, "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода времени до элиминации вследствие деградации антигенсвязывающей молекулы, не связанной с антигенами (свободная от антигена форма антигенсвязывающей молекулы). Антигенсвязывающая молекула в плазме не может связываться с новым антигеном, если антигенсвязывающая молекула уже связана с антигеном. Таким образом, чем более длительным является период времени, когда антигенсвязывающая молекула не связана с антигеном, тем более длительным является период времени, когда она может связываться с новым антигеном (более высокая вероятность связывания с другим антигеном). Это обеспечивает уменьшение периода времени, когда антиген свободен от антигенсвязывающей молекулы in vivo, и продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой. Концентрация в плазме свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы может увеличиваться и период времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, может продлеваться путем ускорения элиминации антигена из плазмы посредством введения антигенсвязывающей молекулы. В частности, в настоящем описании "улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы" включает улучшение фармакокинетического параметра свободной от антигена формы антигенсвязывающей молекулы (любое из продления времени полужизни в плазме, продления среднего времени удержания в плазме и снижения клиренса из плазмы), продление периода времени, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы, и ускорение опосредуемой антигенсвязывающей молекулой элиминации из плазмы. Улучшение фармакокинетики антигенсвязывающей молекулы можно оценивать путем определения любого из параметров: время полужизни в плазме, среднее время удержания в плазме и клиренс из плазмы, для антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы ("Pharmacokinetics: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Например, концентрацию в плазме антигенсвязывающей молекулы или ее свободной от антигена формы определяют после введения антигенсвязывающей молекулы мышам, крысам, обезьянам, кроликам, собакам или человеку. Затем, определяют каждый параметр. Когда время полужизни в плазме или среднее время удержания в плазме пролонгируются, можно считать, что фармакокинетика антигенсвязывающей молекулы в плазме повышается. Параметры можно определять способами, известными специалистам в данной области. Параметры можно оценивать соответствующим образом, например, с помощью некомпартментного анализа с использованием программного обеспечения для фармакокинетического анализа WinNonlin (Pharsight) в соответствии с инструкцией по применению. Концентрацию в плазме свободной от антигена антигенсвязывающей молекулы можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, с использованием известного способа анализа (Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48(4): 406-417).
В рамках настоящего изобретения "улучшение фармакокинетики" также включает пролонгирование периода, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой, после введения антигенсвязывающей молекулы. Оценку того, пролонгируется ли период, когда антиген связан с антигенсвязывающей молекулой после введения антигенсвязывающей молекулы, можно проводить путем определения концентрации в плазме свободного антигена. Заключение о пролонгировании можно делать, исходя из определенной концентрации в плазме свободного антигена или периода времени, требуемого для увеличения соотношения концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена.
Концентрацию свободного антигена, не связанного с антигенсвязывающей молекулой, или соотношение концентрации свободного антигена и концентрации общего антигена можно определять способами, известными специалистам в данной области, например, можно использовать способ определения, представленный в Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103. Альтернативно, когда антиген проявляет конкретную функцию in vivo, определение того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая нейтрализует функцию антигена (антагонистическая молекула), можно проводить путем исследования того, нейтрализуется ли функция антигена. Оценку того, нейтрализуется ли функция антигена, можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена. Оценку того, связан ли антиген с антигенсвязывающей молекулой, которая активирует функцию антигена (молекула-агонист), можно проводить путем анализа маркера in vivo, который отражает функцию антигена.
Определение концентрации в плазме свободного антигена и соотношения количества свободного антигена в плазме и количества общего антигена в плазме, анализ маркеров in vivo и сходные способы определения конкретно не ограничены; однако анализы предпочтительно проводят после того, как проходит определенный период времени после введения антигенсвязывающей молекулы. В рамках настоящего изобретения период после введения антигенсвязывающей молекулы конкретно не ограничен; специалисты в данной области могут определить соответствующий период, в зависимости от свойств и т.п. вводимой антигенсвязывающей молекулы. Такие периоды включают, например, одни сутки после введения антигенсвязывающей молекулы, трое суток после введения антигенсвязывающей молекулы, семь суток после введения антигенсвязывающей молекулы, 14 суток после введения антигенсвязывающей молекулы и 28 суток после введения антигенсвязывающей молекулы. В настоящем описании "концентрация антигена в плазме" относится либо к "общей концентрации антигена в плазме", которая представляет собой сумму концентрации антигена, связанного и не связанного антигенсвязывающей молекулой, либо к "концентрации свободного антигена в плазме", которая представляет собой концентрацию антигена, не связанного антигенсвязывающей молекулой.
Путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению общую концентрацию антигена в плазме можно снижать в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже больше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область нативного IgG человека, в которой цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой цепь сахаров, имеющую фукозу, в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена или по сравнению с тем, когда молекулу с антигенсвязывающим доменом, содержащую антигенсвязывающий домен, по настоящему изобретению не вводят.
Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как показано ниже;
величина А: Молярная концентрация антигена в каждый момент времени
величина В: Молярная концентрация антигенсвязывающей молекулы в каждый момент времени
величина С: Молярная концентрация антигена на молярную концентрацию антигенсвязывающей молекулы (молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула) в каждый момент времени
С=А/В.
Меньшая величина С указывает на более высокую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу, в то время как более высокая величина С указывает на более низкую эффективность элиминации антигена на антигенсвязывающую молекулу.
Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно вычислять, как описано выше.
Молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно снижать путем введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению в 2 раз, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или даже выше по сравнению с введением эталонной антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-область IgG человека дикого типа в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена человека.
В рамках настоящего изобретения нативный IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 предпочтительно используют в качестве нативного IgG человека, который используют в качестве эталонного нативного IgG человека, подвергаемого сравнению с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания Fcγ-рецептора или активности in vivo. Предпочтительно, можно соответствующим образом использовать эталонную антигенсвязывающую молекулу, содержащую тот же антигенсвязывающий домен, что и представляющая интерес антигенсвязывающая молекула, и Fc-область нативного IgG человека в качестве связывающего Fcγ-рецептор домена. Более предпочтительно, нативный IgG1 человека используют в качестве эталонного нативного IgG человека, подлежащего сравнению с антигенсвязывающими молекулами в отношении их активности связывания Fcγ рецептора или активности in vivo. Более того, в рамках настоящего изобретения, в качестве эталонной антигенсвязывающей молекулы, подвергаемой сравнению с антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению, также можно соответствующим образом использовать антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого не изменяется в зависимости от концентрации ионов, антигенсвязывающую молекулу, содержащую FcRn-связывающий домен, активность связывания FcRn которого в условиях диапазона кислых значений рН не усилена, антигенсвязывающую молекулу, содержащую связывающий Fcγ-рецептор домен, который не обладает активностью селективного связывания с Fcγ-рецепторами и т.п.в зависимости от цели.
Снижение общей концентрации в плазме или молярного соотношения антиген/антитело можно оценивать, как описано в примерах 6, 8 и 13. Более конкретно, с использованием трансгенной линии мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104), их можно оценивать либо с помощью модели совместного введения антиген-антитело, либо стационарной инфузионной модели, когда антигенсвязывающая молекула не реагирует перекрестие с антигеном-аналогом мыши. Когда антигенсвязывающая молекула перекрестие реагирует с аналогом мыши, их можно оценивать путем простого введения антигенсвязывающей молекулы мышам линии трансгенных мышей с FcRn человека 32 или 276 (Jackson Laboratories). В модели совместного введения мыши вводят смесь антигенсвязывающей молекулы и антигена. В стационарной инфузионной модели, мыши имплантируют инфузионный насос, содержащий раствор антигена, для достижения постоянной концентрации антигена в плазме, а затем мыши вводят антигенсвязывающую молекулу. Исследуемую антигенсвязывающую молекулу вводят в той же дозировке. Общую концентрацию антигена в плазме, концентрацию свободного антигена в плазме и концентрацию антигенсвязывающей молекулы в плазме измеряют в соответствующий момент времени с использованием способа, известного специалистам в данной области.
Для оценки эффектов связывающего Fcγ-рецептор домена, обладающего селективной активностью связывания с Fcγ-рецепторами, когда антигенсвязывающая молекула не реагирует перекрестно с аналогичным антигеном мыши, общую концентрацию антигена в плазме или снижение молярного соотношения антиген/антитело можно оценивать либо посредством модели одновременной инъекции антиген-антитело, либо посредством модели инъекции антигена в стационарном состоянии с использованием традиционно используемых мышей C57BL/6J (Charles River Japan). Когда антигенсвязывающая молекула перекрестно реагирует с аналогом мыши, антигенсвязывающую молекулу можно просто инъецировать традиционно используемым мышам C57BL/6J (Charles River Japan) для проведения оценки.
Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения для оценки долговременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, долговременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 2, 4, 7, 14, 28, 56 или 84 суток после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойств антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению. То, достигается ли с помощью антигенсвязывающей молекулы, описанной в рамках настоящего изобретения, снижение концентрации антигена в плазме или молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула, можно определять путем оценки снижения в любой один или несколько из моментов времени, описанных выше.
Концентрацию общего или свободного антигена в плазме и молярное соотношение антиген/антигенсвязывающая молекула можно измерять через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 24 часов после введения для оценки кратковременного эффекта настоящего изобретения. Иными словами, кратковременную концентрацию антигена в плазме определяют путем измерения концентрации общего или свободного антигена в плазме и молярного соотношения антиген/антигенсвязывающая молекула через 15 мин, 1, 2, 4, 8, 12 или 2 4 часов после введения антигенсвязывающей молекулы для оценки свойства антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению.
Путь введения антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению можно выбирать из внутрикожной, внутривенной, проводимой в стекловидное тело, подкожной, внутрибрюшинной, парентеральной и внутримышечной инъекции.
В рамках настоящего изобретение улучшение фармакокинетики у человека является предпочтительным. Когда удержание в плазме у человека трудно определить, его можно предсказать, исходя из удержания в плазме у мышей (например, здоровых мышей, трансгенных мышей, экспрессирующих антиген человека, трансгенных мышей, экспрессирующих FcRn человека) или обезьян (например, яванские макаки).
Способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой
Настоящее изобретение относится к способу ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен имеет более высокую активность связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Настоящее изобретение относится к способу ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внутриклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
В рамках настоящего изобретения место, где антиген диссоциирует от антигенсвязывающей молекулы, может быть любым при условии, что он находится в клетке, однако предпочтительно он находится в ранней эндосоме. В рамках настоящего изобретения "внутриклеточная диссоциация антигена от антигенсвязывающей молекулы, где антиген внеклеточно связался с антигенсвязывающей молекулой," не означает, что все антигены, захваченные в клетки после связывания с антигенсвязывающими молекулами, внутриклеточно диссоциируют от антигенсвязывающих молекул, и соотношение внутриклеточной диссоциации антигенов от антигенсвязывающих молекул только должно быть более высоким по сравнению с соотношением до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающих молекул в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, чем в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, и происходит увеличение активности связывания Fcγ-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН. Более того, способ ускорения внутриклеточной диссоциации антигена от антигенсвязывающей молекулы может быть указан как способ, который усиливает внутриклеточный захват связанных с антигеном антигенсвязывающих молекул и сообщает антигенсвязывающим молекулам свойство облегчения ускорения внутриклеточной диссоциации антигенов от антигенсвязывающих молекул.
Способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме
Настоящее изобретение относится к способу ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где способ включает контактирование антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Более того, настоящее изобретение относится к способу ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
В рамках настоящего изобретения выражение "внеклеточное высвобождение антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме" не должно означать, что все антигенсвязывающие молекулы, которые были захвачены в клетку в связанной с антигеном форме, внеклеточно высвобождаются в не связанной с антигеном форме и соотношение антигенсвязывающих молекул, внеклеточно высвободившихся в не связанной с антигеном форме, только должно быть более высоким по сравнению с соотношением до снижения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающих молекул в условиях концентрации ионов, таких как диапазон кислых значений рН или низкая концентрация ионов кальция, чем в условиях концентрации ионов, таких как диапазон нейтральных значений рН или высокая концентрация ионов кальция, и происходит увеличение активности Fc-рецептора в диапазоне нейтральных значений рН. Внеклеточно высвобожденные антигенсвязывающие молекулы предпочтительно сохраняют антигенсвязывающую активность. Более того, способ ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме, где антигенсвязывающая молекула была захвачена в клетку в связанной с антигеном форме, может быть указан как способ, который усиливает захват связанных с антигеном антигенсвязывающих молекул в клетки и сообщает антигенсвязывающим молекулам свойство облегчения ускорения внеклеточного высвобождения антигенсвязывающей молекулы в не связанной с антигеном форме.
Способ снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме или способ изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме
Настоящее изобретение относится к способу снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме, где способ включает контактирвоание антигенсвязывающей молекулы с экспрессирующей Fcγ-рецептор клеткой in vivo или ex vivo, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
Более того, настоящее изобретение относится к способу изменения антигенсвязывающей молекулы, который может снижать общую концентрацию антигена или концентрацию свободного антигена в плазме, где способ включает усиление активности связывания Fcγ-рецептора в условиях диапазона нейтральных значений рН связывающего Fcγ-рецептор домена в антигенсвязывающей молекуле по сравнению с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров, где антигенсвязывающая молекула обладает активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и содержит связывающий Fcγ-рецептор домен и антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов.
Способ оценки снижения общей концентрации антигена или концентрации свободного антигена в плазме описан в упомянутом выше разделе о способе улучшения фармакокинктики антигенсвязывающих молекул.
Способ элиминации антигенов из плазмы ex vivo
Пример неограничивающего варианта осуществления применения антигенсвязывающей молекулы для способа элиминации антигенов из плазмы, который предусматривается настоящим изобретением, включает применение антигенсвязывающей молекулы для так называемого способа элиминации антигенов из плазмы ex vivo, который включает контактирование антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению с плазмой, выделенной от индивидуумов, чтобы позволить образование иммунокомплексов и позволить иммунокомплексам контактировать с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и FcRn. Скорость элиминации антигенов плазмы может быть увеличена посредством замены/комбинирования способа введения антигенсвязывающих молекул in vivo с так называемым способом ex vivo, где плазму, содержащую антигенсвязывающие молекулы и антигены, которые связываются с антигенсвязывающими молекулами, временно извлекают из живого организма, а затем контактируют с клетками, экспрессирующими Fcγ-рецепторы и FcRn, и плазму, содержащую внеклеточно рециклированные (или также называемые ресекретированными или рециркулированными) антигенсвязывающие молекулы без связанного антигена после определенного периода времени, возвращают в живой организм.
Более того, примером неограничивающего варианта осуществления применения антигенсвязывающей молекулы для способа элиминации антигенов из плазмы, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, включат применение антигенсвязывающей молекулы для так называемого способа элиминации антигенов из плазмы ex vivo, который включает контактирование иммунокомплексов, присутствующих в плазме, выделенной от индивидуумов, которым вводили антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, с клетками, экспрессирующими FcRn и Fcγ-рецепторы.
Подтверждение того, элиминируются ли антигены из плазмы можно проводить, например, посредством оценки того, ускоряется ли скорость элиминации из плазмы антигенов, упомянутых выше, когда вместо антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, в качестве контроля для сравнения используют антигенсвязывающую молекулу, содержащую антигенсвязывающий домен, в котором антигенсвязывающая активность не изменяется в зависимости от концентрации ионов, антигенсвязывающую молекулу, содержащую FcRn-связывающий домен, активность связывания FcRn которого в условиях диапазона кислых значений рН не усиливается, или антигенсвязывающую молекулу, содержащую связывающий Fcγ-рецептор домен, который не обладает активностью селективного связывания с Fcγ-рецепторами.
Способ получения антигенсвязывающих молекул
Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, содержащей антигенсвязывающий домен и связывающий Fcγ-рецептор домен и обладающей активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, где антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена изменяется в зависимости от условий концентрации ионов и связывающий Fcγ-рецептор домен обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров.
В частности, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):
(a) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях высокой концентрации ионов кальция;
(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях низкой концентрации ионов кальция;
(c) выбор антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с) с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбор антигенсвязывающих молекул из культуры клеток согласно (е).
Настоящее изобретение также относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):
(a) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях высокой концентрации ионов кальция;
(b) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях низкой концентрации ионов кальция;
(c) выбор антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбор антигенсвязывающих молекул из культуры клеток согласно (е).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):
(а) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона нейтральных значений рН;
(b) определение антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в условиях диапазона кислых значений рН;
(c) выбор антигенсвязывающего домена, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, выбранный согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, который обладает более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбор антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения антигенсвязывающей молекулы, который включает следующие стадии (a)-(f):
(a) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона нейтральных значений рН;
(b) определение антигенсвязывающей активности антитела в условиях диапазона кислых значений рН;
(c) выбор антитела, для которого антигенсвязывающая активность, определенная согласно (а), является более высокой, чем антигенсвязывающая активность, определенная согласно (b);
(d) связывание полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен антитела, выбранного согласно (с), с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров;
(e) культивирование клеток, в которые введен вектор, с которым полинуклеотид, полученный согласно (d), функционально связан; и
(f) сбор антигенсвязывающих молекул из клеточной культуры согласно (е).
Термины "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют в настоящем описании синонимично и такие обозначения могут включать любого потомка клетки или клеточной линии. Таким образом, например, термины "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичные рассматриваемые клетки и культуры, происходящие из них, не зависимо количества переносов. Также понятно, что все потомки могут не быть точно идентичными по содержанию ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Также могут быть включены мутантные потомки, которые обладают по существу теми и же функциями или биологической активностью, в отношении которых проводили скрининг первоначально трансформированных клеток. Если подразумевается другое обозначение, это будет очевидно из контекста описания.
При указании на экспрессию кодирующей последовательности, термин "последовательность контроля" относится к нуклеотидным последовательностям ДНК, которые необходимы для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Последовательности контроля, пригодные, например, для прокариот, включают промотор, необязательную последовательность оператора, участок связывания рибосом и, возможно, другие последовательности, которые все еще предстоит изучить. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры для экспрессии кодирующей последовательности.
Для нуклеиновой кислоты термин "функционально связанный" означает, что нуклеиновая кислота имеет функциональную взаимосвязь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК препоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в качестве белка-предшественника, который участвует в секреции полипептида. Промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Участок связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы способствовать трансляции. Обычно выражение "функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидера, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в подходящих участках рестрикции. Если такие участки не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой. Более того, связанные нуклеиновые кислоты можно получать с помощью упомянутой выше технологии перекрывающейся ПЦР.
"Лигирование" относится к способу формирования фосфодиэфирной связи между двумя фрагментами нуклеиновой кислоты. Для лигирования двух фрагментов концы этих фрагментов должны быть совместимыми друг с другом. В некоторых случаях эти концы обладают совместимостью сразу после расщепления эндонуклеазой. Однако может быть необходимо, чтобы сначала липкие концы, обычно образующиеся при расщеплении эндонуклеазой, были преобразованы в тупые концы, чтобы они стали совместимыми для лигирования. Для преобразования в тупые концы ДНК обрабатывают в подходящем буфере в течение по меньшей мере 15 минут при 15°С приблизительно 10 единицами фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I или ДНК-полимеразой Т4 в присутствии четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в соответствующем буферном растворе. Далее ДНК очищают экстракцией фенолом-хлороформом и преципитацией этанолом, или очисткой на диоксиде кремния. Фрагменты ДНК, подлежащие слиянию, добавляют в эквимолярных количествах к раствору. Этот раствор содержит АТР и буфер лигазы, а также приблизительно 10 единиц лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4 на 0,5 мкг ДНК. Если ДНК подлежит лигированию с вектором, вектор сначала линеаризуют посредством расщепления соответствующей эндонуклеазами рестрикции. Затем линеаризованный фрагмент обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой или фосфатазой кишечника теленка, тем самым препятствуя самолигированию фрагмента на стадии лигирования.
В способах получения по настоящему изобретению, антигенсвязывающие домены или антитела, обладающие более высокой антигенсвязывающей активностью в условиях высокой концентрации ионов кальция, чем в условиях низкой концентрации ионов кальция, которые выбраны способом, описанным в упомянутом выше разделе "условия концентрации ионов", являются выделенными. Более того, антигенсвязывающие домены или антитела, обладающие более высокой антигенсвязывающей активностью в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем в условиях диапазона кислых значений рН, которые выбраны способом, описанным в упомянутом выше разделе "условия концентрации ионов", являются выделенными. Например, когда антигенсвязывающие домены, выделенные таким образом, выбирают из библиотеки, как описано ниже в примерах, полинуклеотиды, кодирующие антигенсвязывающие домены, выбирают посредством общепринятой амплификации генов из вирусов, таких как фаги. Альтернативно, когда антигенсвязывающие домены или антитела, выделенные таким образом, представляют собой антитела, выбранные из культур клеток, таких как гибридомы, как указано в упомянутом выше разделе об антителах, гены антител и т.п. выделяют посредством общепринятой амплификации генов из этих клеток.
Далее, полинуклеотид, кодирующий антигенсвязывающий домен, выделенный как описано выше, связывают в рамке считывания с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем нативный связывающий Fcγ-рецептор домен, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Пригодный пример связывающего Fcγ-рецептор домена включает Fc-область антитела, как описано в упомянутом выше разделе о связывающем Fcγ-рецептор домене. Более того, примеры Fcγ-рецептора включают FcγRIa, FcγRIIa(R), FcγRIIa(H), FcγRIIb, FcγRIIIa(V) или FcγRIIIa(F).
Пригодные примеры Fc-области антитела включают Fc-области, имеющие по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот в положениях 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 и 440 в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU, которые отличаются от аминокислот в соответствующих участках в нативной Fc-области. Пригодным примером нативной Fc-области является Fc-область согласно любому из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
В неограничивающем варианте осуществления пригодным примером Fc-области антитела является Fc-область, содержащая по меньшей мере одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
либо Lys, либо Tyr в положении аминокислоты 221;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 222;
любой из Phe, Trp, Glu и Lys в положении аминокислоты 223;
любой из Phe, Trp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 224;
любой из Glu, Lys и Trp в положении аминокислоты 225;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 227;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 228;
любой из Ala, Glu, Gly и Tyr в положении аминокислоты 230;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 231;
любой из Glu, Gly, Lys и Tyr в положении аминокислоты 232;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 233;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 234;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 235;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 236;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 237;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 238;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 239;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 240;
любой из Asp, Glu, Leu, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 241;
любой из Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp и Tyr в положении аминокислоты 243;
His в положении аминокислоты 244;
Ala в положении аминокислоты 245;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 246;
любой из Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 247;
любой из Glu, His, Gln и Tyr в положении аминокислоты 249;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 250;
Phe в положении аминокислоты 251;
любой из Phe, Met и Tyr в положении аминокислоты 254;
любой из Glu, Leu и Tyr в положении аминокислоты 255;
любой из Ala, Met и Pro в положении аминокислоты 256;
любой из Asp, Glu, His, Ser и Tyr в положении аминокислоты 258;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 260;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile и Thr в положении аминокислоты 262;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 263;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 264;
любой из Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 265;
любой из Ala, Ile, Met и Thr в положении аминокислоты 266;
любой из Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 267;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 268;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 269;
любой из Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 270;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 271;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 272;
либо Phe, либо Ile в положении аминокислоты 273;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 274;
либо Leu, либо Trp в положении аминокислоты 275;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 276;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 278;
Ala в положении аминокислоты 279;
любой из Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 280;
любой из Asp, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 281;
любой из Glu, Gly, Lys, Pro и Tyr в положении аминокислоты 282;
любой из Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg и Tyr в положении аминокислоты 283;
любой из Asp, Glu, Leu, Asn, Thr и Tyr в положении аминокислоты 284;
любой из Asp, Glu, Lys, Gln, Trp и Tyr в положении аминокислоты 285;
любой из Glu, Gly, Pro и Tyr в положении аминокислоты 286;
любой из Asn, Asp, Glu и Tyr в положении аминокислоты 288;
любой из Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp и Tyr в положении аминокислоты 290;
любой из Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln и Thr в положении аминокислоты 291;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro, Thr и Tyr в положении аминокислоты 292;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 293;
любой из Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 294;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 295;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 296;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 297;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 298;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 299;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val и Trp в положении аминокислоты 300;
любой из Asp, Glu, His и Tyr в положении аминокислоты 301;
Ile в положении аминокислоты 302;
любой из Asp, Gly и Tyr в положении аминокислоты 303;
любой из Asp, His, Leu, Asn и Thr в положении аминокислоты 304;
любой из Glu, Ile, Thr и Tyr в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Asn, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 311;
Phe в положении аминокислоты 313;
Leu в положении аминокислоты 315;
либо Glu, либо Gln в положении аминокислоты 317;
любой из His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 318;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 320;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 322;
Ile в положении аминокислоты 323;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 324;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 325;
любой из Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 326;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 327;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 328;
любой из Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 329;
любой из Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 330;
любой из Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 331;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 332;
любой из Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val и Tyr в положении аминокислоты 333;
любой из Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro и Thr в положении аминокислоты 334;
любой из Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 335;
любой из Glu, Lys и Tyr в положении аминокислоты 336;
любой из Glu, His и Asn в положении аминокислоты 337;
любой из Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser и Thr в положении аминокислоты 339;
либо Ala, либо Val в положении аминокислоты 376;
либо Gly, либо Lys в положении аминокислоты 377;
Asp в положении аминокислоты 378;
Asn в положении аминокислоты 379;
любой из Ala, Asn и Ser в положении аминокислоты 380;
либо Ala, либо Ile в положении аминокислоты 382;
Glu в положении аминокислоты 385;
Thr в положении аминокислоты 392;
Leu в положении аминокислоты 396;
Lys в положении аминокислоты 421;
Asn в положении аминокислоты 427;
либо Phe, либо Leu в положении аминокислоты 428;
Met в положении аминокислоты 429;
Trp в положении аминокислоты 434;
Ile в положении аминокислоты 436; и
любой из Gly, His, Ile, Leu и Tyr в положении аминокислоты 440;
в участке Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
Более того, для Fc-областей по настоящему изобретению, можно пригодным образом использовать Fc-области, которые обладают активностью связывания или усиленной активностью связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Примеры таких Fc-областей включают Fc-области иммуноглобулинов IgG-типа, такие как Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для вариантов, имеющих изменения других аминокислот, можно использовать Fc-области с аминокислотными изменениями в любом положении при условии, что существует активность связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН или активность связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН может быть увеличена и, когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое усиливает связывание с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН по сравнению с активностью связывания Fc-области, являющейся исходным материалом, IgG1 человека. Пригодные примеры аминокислот, которые можно изменять, включают аминокислоты в положениях 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447 (нумерация EU), как описано в WO 2000/042072. Аналогично, пригодные примеры аминокислот, которые могут быть изменены, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2002/060919. Более того, примеры аминокислот, которые могут быть изменены, также включают аминокислоты в положениях 250, 314 и 428 (нумерация EU), как описано в WO 2004/092219. Другие пригодные примеры аминокислот, которые могут быть изменены, также включают аминокислоты в положениях 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 и/или 436 (нумерация EU), как описано в WO 2010/045193. Fc-области, полученные путем усиления связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН Fc-области IgG-иммуноглобулинов посредством изменений аминокислот, можно использовать в способах получения по настоящему изобретению.
Более того, как описано далее, для Fc-области, включенной в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, можно пригодным образом использовать Fc-область, обладающую активностью связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН. Такую Fc-область можно получать любым способом в соответствии с упомянутым выше способом получения Fc-областей, обладающих активностью связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН. В частности, можно получать Fc-область, содержащую FcRn-связывающий домен, обладающий активностью связывания или обладающий усиленной активностью связывания с FcRn в диапазоне нейтральных значений рН вследствие изменения аминокислот Fc-области IgG-иммуноглобулина человека, используемого в качестве Fc-области, являющейся исходным материалом. Благоприятные Fc-области IgG-иммуноглобулинов для изменения включают Fc-области IgG человека (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и их варианты). Для вариантов, имеющих изменения других аминокислот, можно использовать Fc-области с аминокислотными изменениями в любом положении при условии, что существует активность связывания FcRn в диапазоне нейтральных значений рН или активность связывания с FcRn человека в диапазоне нейтральных значений рН может быть увеличена. Когда антигенсвязывающая молекула включает Fc-область IgG1 человека в качестве Fc-области, она предпочтительно включает изменение, которое усиливает связывание с FcRn в диапазоне нейтральных значений рН по сравнению с активностью связывания Fc-области, являющейся исходным материалом, IgG1 человека. Пригодные примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-области человека, обладающие по меньшей мере одной или несколькими аминокислотами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот в положениях 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436 в участке Fc-области, являющейся исходным материалом, в соответствии с нумерацией EU, которые отличаются от соответствующих аминокислот в нативной Fc-области.
Пригодные примеры таких измененных Fc-областей включают Fc-области, содержащие по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из:
Met в положении аминокислоты 237;
Ala в положении аминокислоты 238;
Lys в положении аминокислоты 239;
Ile в положении аминокислоты 248;
любой из Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 250;
любой из Phe, Trp и Tyr в положении аминокислоты 252;
Thr в положении аминокислоты 254;
Glu в положении аминокислоты 255;
любой из Asp, Glu и Gln в положении аминокислоты 256;
любой из Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr и Val в положении аминокислоты 257;
His в положении аминокислоты 258;
Ala в положении аминокислоты 265;
Phe в положении аминокислоты 270;
либо Ala, либо Glu в положении аминокислоты 286;
His в положении аминокислоты 289;
Ala в положении аминокислоты 297;
Gly в положении аминокислоты 298;
Ala в положении аминокислоты 303;
Ala в положении аминокислоты 305;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 307;
любой из Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln и Thr в положении аминокислоты 308;
любой из Ala, Asp, Glu, Pro и Arg в положении аминокислоты 309;
любой из Ala, His и Ile в положении аминокислоты 311;
либо Ala, либо His в положении аминокислоты 312;
либо Lys, либо Arg в положении аминокислоты 314;
либо Ala, либо His в положении аминокислоты 315;
Ala в положении аминокислоты 317;
Gly в положении аминокислоты 325;
Val в положении аминокислоты 332;
Leu в положении аминокислоты 334;
His в положении аминокислоты 360;
Ala в положении аминокислоты 376;
Ala в положении аминокислоты 380;
Ala в положении аминокислоты 382;
Ala в положении аминокислоты 384;
либо Asp, либо His в положении аминокислоты 385;
Pro в положении аминокислоты 386;
Glu в положении аминокислоты 387;
либо Ala, либо Ser в положении аминокислоты 389;
Ala в положении аминокислоты 424;
любой из Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp и Tyr в положении аминокислоты 428;
Lys в положении аминокислоты 433;
любой из Ala, Phe, His, Ser, Trp и Tyr в положении аминокислоты 434; и
His в положении аминокислоты 436;
в Fc-области в соответствии с нумерацией EU.
Например, с использованием аминокислотных изменений по отдельности или с использованием более одного из них в комбинации, связывание FcRn Fc-области IgG в диапазоне кислых и/или нейтральных значений рН может быть усилено, и аминокислотные изменения, которые внесены, конкретно не ограничиваются, и при условии, что время удержания в плазме повышается, можно вносить любое аминокислотное изменение.
Антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению выделяют из культуры клеток, трансформированных желаемым экспрессирующим вектором, содержащим функционально связанный полинуклеотид, полученный посредством связывания, как описано выше, полинуклеотида, кодирующего антигенсвязывающий домен, с полинуклеотидом, кодирующим связывающий Fcγ-рецептор домен, обладающий активностью связывания FcRn человека в диапазоне кислых значений рН и обладающий более высокой активностью связывания с Fcγ-рецептором в условиях диапазона нейтральных значений рН, чем с нативным связывающим Fcγ-рецептор доменом, в котором цепь сахаров, связанная в положении 297 (нумерация EU), представляет собой содержащую фукозу цепь сахаров. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению получают с использованием способа в соответствии со способом получения антител, описанных в упомянутом выше разделе об антителах.
Все цитированные в описании документы уровня техники включены в настоящее описание в качестве ссылок. Ниже настоящее изобретение конкретно описано с помощью примеров, однако его не следует считать ограниченным ими.
[Примеры]
[Пример 1] Получение антигенсвязывающих молекул, активность связывания FcγR мыши которых в условиях диапазона нейтральных значений рН является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области IgG человека
(1-1) антитела с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека
H54/L28-IgG1, которое содержит H54-IgG1 (SEQ ID NO: 36) и L28-CK (SEQ ID NO: 37), описанное в WO 2009/125825, представляет собой гуманизированное антитело против рецептора IL-6. Между тем, Fv4-IgG1, которое содержит VH3-IgG1 (SEQ ID NO: 38) и VL3-CK (SEQ ID NO: 39), представляет собой гуманизированное антитело против рецептора IL-6, которое получили путем сообщения H54/L28-IgG1 свойства связывания с растворимым рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом (который связывается при рН 7,4 и диссоциирует при рН 5,8). Исследование на мышах in vivo, описанное в WO 2009/125825, продемонстрировало, что, в группе, в которой вводили смесь Fv4-IgG1 и растворимого рецептора IL-6 человека в качестве антигена, элиминация растворимого рецептора IL-6 человека из плазмы была значительно ускорена по сравнению с группой, в которой вводили смесь H54/L28-IgG1 и растворимого рецептора IL-6 человека в качестве антигена.
Растворимый рецептор IL-6 человека, связанный с H54/L28-IgG1, который представляет собой антитело, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека, вместе с другим антителом рециклирует в плазму посредством FcRn. Между тем, Fv4-IgG1, которое представляет собой антитело, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, диссоциирует от растворимого рецептора IL-6 человека в кислых условиях в эндосоме. Диссоциировавший растворимый рецептор IL-6 человека деградируется в лизосомах, и, таким образом, это обеспечивает значительное ускорение элиминации растворимого рецептора IL-6 человека. Более того, после связывания с FcRn в эндосоме, Fv4-IgG1, которое представляет собой антитело, которое связывается с растворимым рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, рециклирует в плазму. Поскольку рециклированное антитело может вновь связываться с растворимым рецептором IL-6 человека, антитело многократно связывается с антигеном (растворимый рецептор IL-6 человека) и рециклирует посредством FcRn в плазму. Полагают, что, в результате единичная молекула антитела может повторно связываться несколько раз с растворимым рецептором IL-6 человека (WO 2009/125825).
(1-2) Получение антитела против рецептора IL-6 человека с усиленным связыванием FcγR мыши и антитела против рецептора IL-6 без связывания FcγR мыши
VH3-IgG1-F1022 (SEQ ID NO: 40), антигенсвязывающую молекулу с усиленным связыванием FcγR мыши, получали путем замены Lys на Asp в положении 326 (нумерация EU) и Leu на Tyr в положении 328 (нумерация EU) в VH3-IgG1. Fv4-IgG1-F1022, содержащее VH3-IgG1-F1022 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
Между тем, VH3-IgG1-F760 (SEQ ID NO: 41), антигенсвязывающую молекулу без связывания FcγR мыши, получали путем замены Leu на Arg в положении 235 и Ser на Lys в положении 239 (нумерация EU) в VH3-IgG1. Fv4-IgG1-F760, содержащее VH3-IgG1-F760 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
(1-3) Оценка связывания FcγR мыши
VH3/L(WT)-IgG1, VH3/L(WT)-IgG1-F1022 и VH3/L(WT)-IgG1-F760, которые содержал VH3-IgG1, VH3-IgG1-F1022 и VH3-IgG1-F760 в качестве тяжелой цепи и L(WT)-CK (SEQ ID NO: 42) в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Эти антитела подвергали кинетическому анализу в отношении их связывания FcγR мыши, как описано ниже.
(1-4) Кинетический анализ связывания FcγR мыши
D
Проводили кинетический анализ связывания антител с FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV мыши (далее обозначаемыми как FcγR мыши) (полученными согласно примеру 26) с использованием Biacore Т100 и Т200 (GE Healthcare). Соответствующее количество белка L (ACTIGEN) иммобилизовывали на сенсорный чип СМ4 (GE Healthcare) способом присоединения аминов и представляющие интерес антитела улавливали на него. Затем, инжектировали разбавленные растворы FcγR мыши и подвижный буфер в качестве пустого образца и FcγR мыши позволяли взаимодействовать с антителами, уловленными на сенсорный чип. Использованный подвижный буфер представлял собой 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, 0,05% (масс./об.) Tween20, рН 7,4. Этот буфер также использовали для разбавления FcγR мыши. Сенсорный чип регенерировали с использованием 10 ммоль/л глицин-HCl, рН 1,5. Все измерения проводили при 25°С. Константу скорости связывания ka (1/М с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), которые являются параметрами кинетики, вычисляли из сенсограмм, полученных посредством измерения. На основе этих величин вычисляли K (М) каждого антитела в отношении FcγR человека. Каждый параметр вычисляли с использованием программного обеспечения Biacore Т100 или Т200 Evaluation Software (GE Healthcare).
Посредством измерения был получен результат, представленный в таблице 7. Было продемонстрировано, что VH3/L (WT)-IgG1-F1022 обладает увеличенной активностью связывания с mFcγRI, mFcγRIIb и mFcγRIII по сравнению с VH3/L (WT)-IgG1. Что касается VH3/L (WT)-IgG1-F760, связывание с различными FcγR мыши не поддавалось обнаружению, что демонстрирует, что VH3/L (WT)-IgG1-F760 лишено активности связывания с различными FcγR мыши.
(1-5) Получение антител с содержанием низкого содержания фукозы
Известные способы увеличения активности связывания FcγR антител включают способы преобразования цепей сахаров, связанных с антителом, в цепи сахаров с низким содержанием фукозы (J. Biol. Chem. (2003) 278, 3466-3473), в дополнение к способам внесения изменения аминокислот в Fc-область антитела. Fv4-IgG1 с низким содержанием фукозы (далее, сокращенно обозначаемое как Fv4-IgG1-Fuc) приобретали посредством экспрессии Fv4-IgG1 с использованием клеток СНО с дефицитом гена переносчика фукозы (WO 2006067913) в качестве клеток-хозяев в соответствии со способом, описанным в справочном примере 4. Сообщалось, что, среди mFcγR (Fcγ-рецепторы мыши), антитела с низким содержанием фукозы обладают селективно увеличенной активностью связывания FcγRIV (Science, 2005, 310 (5753) 1510-1512).
[Пример 2] Эффект элиминации антигенов из плазмы посредством антигенсвязывающих молекул, активность связывания с FcγR которых является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области IgG человека
(2-1) Эффект H54/L28-IgG1 и Fv4-IgG1 в отношении элиминации антигенов из плазмы
H54/L28-IgG1, которое представляет собой антитело против рецептора IL-6 человека, и Fv4-IgG1, обладающее свойством связывания с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, получали способом, описанным в справочном примере 1. Исследования инфузии in vivo проводили с использованием полученных H54/L28-IgG1 и Fv4-IgG1 способом, описанным ниже.
(2-1-1) Инфузионные исследования in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека
Модель на животных, в которой концентрация растворимого рецептора IL-6 человека поддерживается постоянной в плазме, создавали посредством имплантации инфузионного насоса (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet), содержащего растворимый рецептор IL-6 человека, под кожу спины трансгенных мышей с FcRn человека (В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32 +/+ мышь, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104). В модели на животных оценивали динамику in vivo после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Для подавления продукции нейтрализующих антител против растворимого рецептора IL-6 человека, моноклональное антитело против CD4 мыши (полученное известным способом) вводили один раз в количестве 20 мг/кг в хвостовую вену. Затем в область спины мышей имплантировали инфузионный насос, содержащий 92,8 мкг/мл растворимого рецептора IL-6 человека. Через трое суток после имплантации инфузионного насоса вводили антитело против рецептора IL-6 человека один раз в сутки в дозе 1 мг/кг в хвостовую вену. Взятие крови от мышей проводили через 15 минут, семь часов, одни сутки, двое суток, четверо суток и семь суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Сразу после этого собранную кровь центрифугировали при 15000 об./мин. и 4°С в течение 15 минут с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже до применения.
(2-1-2) Определение концентрации рецептора IL-6 человека (hsIL-6R) в плазме способом электрохемилюминесценции
Концентрации рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли способом электролюминесценции. Образцы для кривой стандарта hsIL-6R, полученные в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 и 31,25 пг/мл и образцы для анализа плазмы мыши, разбавленные в 50 раз или более, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), тоцилизумабом, рутенированным посредством SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery). Смеси инкубировали при 37°С в течение ночи. Тоцилизумаб приготавливали в конечной концентрации 333 мкг/мл. Затем реакционные смеси разделяли на аликвоты в планшете со стрептавидином МА400 PR (Meso Scale Discovery). Раствор, подвергаемый реакции при комнатной температуре в течение одного часа, смывали, а затем распределяли аликвотами буфер для считывания Т (х4) (Meso Scale Discovery). Сразу после этого проводили измерение с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 Reader (Meso Scale Discovery). Концентрацию рецептора IL-6 человека определяли на основе ответа по стандартной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Мониторинг концентрации рецептора IL-6 человека с течением времени представлен на фиг. 2. По сравнению с H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, могло снизить концентрацию рецептора IL-6 человека, но не могло снизить ее ниже исходного уровня без введения антитела. Следовательно, введенное антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, не могло снижать концентрацию антигена концентрация ниже уровня до введения антитела.
(2-2) Эффект элиминации антигена из плазмы посредством антитела с увеличенной или сниженной активностью связывания FcγR
То, влияет ли на концентрацию рецептора IL-6 человека с течением времени увеличение или снижение активности Fv4-IgG1, которое представляет собой антитело с рН-зависимым связыванием рецептора IL-6 человека, в отношении связывания FcγR, оценивали способом, описанным ниже. С использованием Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-F760, Fv4-IgG1-F1022 и Fv4-IgG1-Fuc, полученных, как описано в примере 1, проводили испытания с инфузией in vivo способом, описанным ниже.
(2-2-1) Испытания с инфузией in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека
Модель на животных, в которой концентрация растворимого рецептора IL-6 человека поддерживается постоянной в плазме, создавали посредством имплантации инфузионного насоса (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet), содержащего растворимый рецептор IL-6 человека, под кожу спины трансгенных мышей с FcRn человека (В6.mFcRn-/-.hFcRn Tg линия 32 +/+ мышь, Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. (2010) 602, 93-104). В модели на животных антитело против рецептора IL-6 человека вводили одновременно с Sanglopor (CSL Behring), который представляет собой препарат иммуноглобулинов, для оценки динамики in vivo растворимого рецептора IL-6 человека после введения антитела. Для подавления продукции нейтрализующих антител против растворимого рецептора IL-6 человека, моноклональное антитело против CD4 мыши (полученное известным способом) вводили один раз в количестве 20 мг/кг в хвостовую вену. Затем в область спины мышей имплантировали инфузионный насос, содержащий 92,8 мкг/мл растворимого рецептора IL-6 человека. Через трое суток после имплантации инфузионного насоса вводили антитело против рецептора IL-6 человека и Sanglopor один раз в дозе 1 мг/кг и 1000 мг/кг, соответственно, в хвостовую вену. Взятие крови от мышей проводили через 15 минут, семь часов, одни сутки, двое суток, четверо суток и семь суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Взятие крови от мышей проводили через 15 минут, семь часов, одни сутки, двое суток, трое суток и семь суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Сразу после этого собранную кровь центрифугировали при 15000 об./мин. и 4°С в течение 15 минут с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже до применения.
(2-2-2) Определение концентрации растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R) в плазме способом электрохемилюминесценции
Концентрации hsIL-6R человека в плазме мыши определяли способом электролюминесценции, как описано в (2-1-2).
Результат представлен на фиг. 3. Было продемонстрировано, что концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мыши с течением времени, которым вводили Fv4-IgG1-F760, в котором устранено связывание Fv4-IgG1 с FcγR мыши, является сравнимой с концентрацией у мышей, которым вводили Fv4-IgG1. Цитотоксическая активность в отношении мембранного антигена зависит от связывания FcγR и, таким образом, цитотоксическая активность утрачивается при устранении связывания FcγR. С другой стороны, даже при введении антитела, в котором устранено связывание FcγR мыши, против рецептора IL-6 человека, который представляет собой растворимый антиген, отсутствовал эффект на концентрацию рецептора IL-6 человека в плазме с течением времени у мышей, которым проводили введение. Таким образом, можно было предположить, что связывание антитела против растворимого антигена с FcγR не вносило вклад в концентрацию антигена с течением времени в плазме мышей, которым вводили антитело.
Однако неожиданно концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1022 с усиленным связыванием FcγR мыши, была значительно снижена по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 человека в плазме мышей, которым вводили Fv4-IgG1. Что касается степени снижения, было подтверждено, что концентрация снизилась ниже исходной концентрации рецептора IL-6 человека без введения антитела. В частности, концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1022, была снижена до приблизительно 1/100 через трое суток после введения по сравнению со случаем введения Fv4-IgG1. Эти данные демонстрируют, что, посредством введения мышам антитела, которое связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом и связывание с FcγR которого усилено, концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей может быть снижена и, что касается степени снижения, концентрация антигена в плазме может быть снижена ниже уровня до введения антитела.
Более того, было продемонстрировано, что, по сравнению с мышами, которым вводили Fv4-IgG1, концентрация рецептора IL-6 человека в плазме была снижена у мышей с Fv4-IgG1-Fuc, которое имеет цепь сахаров с низким содержанием фукозы и обладает увеличенной активностью связывания FcγR IV мыши. В частности, концентрация рецептора IL-6 человека в плазме мышей, которым вводили Fv4-IgG1-Fuc, была снижена приблизительно до 1/2 через семь суток после введения по сравнению со случаем введения Fv4-IgG1. Указанные выше данные демонстрируют, что, посредством введения мышам рН-зависимой антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, и связывание с FcγR которой усилено, концентрация растворимого антигена в плазме мышей может быть снижена. В этом случае, способы усиления связывания FcγR конкретно не ограничиваются внесением аминокислотных изменений. Было продемонстрировано, что такое усиление может быть достигнуто, например, с использованием Fc-области IgG человека, с которой связана цепь сахаров с низким содержанием фукозы в положении 297 (нумерация EU); однако эффект Fv4-IgG1-Fuc в отношении снижения концентрации антигена был меньше, чем у Fv4-F1022. На основе этого результата полагали, что среди нескольких FcγR (FcγRI, II, III и IV для мыши), mFcγIV, с которым усилено связывание у Fv4-IgG1-Fuc, не вносит большого вклада в снижение концентрации антигена в качестве FcγR.
Таким образом, было выявлено, что, посредством введения индивидууму антитела, которое связывается с растворимым антигеном рН-зависимым образом и связывание которого с FcγR усилено, концентрация растворимого антигена в плазме индивидуума может быть значительно снижена.
Без связи с конкретной теорией, неожиданное снижение концентрации растворимого антигена в плазме, которое наблюдали при введении антигенсвязывающей молекулы, которая содержит антигенсвязывающий домен, связывание которого с FcγR усилено, и антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, таких как рН, и FcRn-связывающий домен, который обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, может быть объяснено следующим образом.
IgG-антитела, которые неспецифически включаются в клетки, возвращаются на клеточную поверхность посредством связывания с FcRn в кислых условиях в эндососме, а затем диссоциируют от FcRn в нейтральных условиях в плазме. В таком случае, когда антитело, которое нейтрализует функцию растворимого антигена посредством связывания с антигеном, вводят мышам, у которых концентрация растворимого антигена сохраняется постоянной в плазме, растворимый антиген в плазме образует комплекс с введенным антителом. Полагают, что растворимый антиген, включенный в клетки, оставаясь в качестве комплекса, рециклирует, в состоянии, связанном с антителом, в плазму вместе с антителом, поскольку Fc-область антитела связывается с FcRn в кислых условиях в эндосоме.
Между тем, когда антитело против растворимого антигена представляет собой антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом (т.е. антитело, которое диссоциирует от растворимого антигена в кислых условиях в эндосоме), растворимый антиген, который неспецифически включается в клетки, оставаясь в качестве комплекса с антителом, диссоциирует от антитела в эндосоме и деградируется в лизосоме; таким образом, растворимый антиген не рециклирует в плазму. Следовательно, полагают, что Fv4-IgG1, включенное в качестве комплекса с растворимым антигеном в клетки, может диссоциировать от растворимого антигена в эндосоме, и, таким образом, ускорять элиминацию растворимого антигена.
Как описано выше, полагают, что антигенсвязывающие молекулы, такие как Fv4-IgG1, которые содержат антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от концентрации ионов, способны связываться с антигенами многократно несколько раз. Полагают, что эффект ускорения элиминации растворимых антигенов из плазмы посредством диссоциации их в эндосоме зависит от скорости включения комплекса антиген/антигенсвязывающая молекула в эндосому. Антигенсвязывающая молекула, которая содержит антигенсвязывающий домен, активность связывания которого с различными FcγR увеличена, и антигенсвязывающая активность которых изменяется, в зависимости от условий концентрации ионов, активно включается в клетки посредством связывания с различными FcγR, экспрессируемыми на клеточной мембране, и может перемещаться обратно в плазму посредством рециклирования через связывание между FcRn и FcRn-связывающим доменом, содержащимся в молекуле, которая обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Следовательно, полагают, что, поскольку указанная выше антигенсвязывающая молекула, которая образует комплекс с растворимым антигеном в плазме, активно включается в клетки через FcγR, экспрессируемый на клеточной мембране, ее эффект ускорения элиминации растворимого антигена из плазмы более выражен, чем у антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых с различными FcγR не была увеличена.
В живом организме различные FcγR экспрессируются на клеточной мембране иммунных клеток и выполняют различные функции. Любые FcγR можно использовать для включения антител в клетки. В частности, у людей известно присутствие ингибиторного FcγRIIb и активирующих FcγR, включая FcγRI, FcγRIIa и FcγRIIIa, и антитела могут включаться посредством любого из них. Антитела могут включаться посредством всех или любого из FcγR. Альтернативно антитела могут включаться опосредованно только различными активирующими FcγR или только ингибиторным FcγRIIb.
С другой стороны, для достижения указанных выше целей возможно использовать любые способы увеличения активности связывания FcγR у FcγR-связывающего домена антигенсвязывающих молекул. Например, как показано в примере 1, в FcγR-связывающий домен антигенсвязывающих молекул можно вносить аминокислотные мутации для повышения активности связывания FcγR или можно использовать антитела с низким содержанием фукозы. Между тем, эффект увеличения активности связывания FcγR, который обеспечивается такими способами, может представлять собой эффект усиления связывания с любым FcγR. В частности, возможно увеличивать активность связывания с любым одним, некоторыми или всеми из FcγR. Более того, можно только увеличить активность связывания с различными активирующими FcγR или ингибиторными FcγRIIb.
Активность связывания с FcγR антитела, которое связывается с мембранным антигеном, играет важную роль в цитотоксической активности антитела. Таким образом, когда необходимо, чтобы антитело, используемое в качестве фармацевтического средства, обладало цитотоксической активностью, используют изотип IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR. Кроме того, способы усиления цитотоксической активности таких антител посредством увеличения активности связывания антител с FcγR широко используются в данной области.
Между тем, роль активности связывания с FcγR антител, которые связываются с растворимыми антигенами и которые используют в качестве фармацевтических средств, не была известна в данной области. Отсутствовала достаточная оценка того, какое отличие в эффекте на живой организм, в который вводили антитела, обеспечивается отличием в активности связывания с FcγR между IgG1 человека с высокой активностью связывания FcγR и IgG2 человека и IgG4 человека с низкой активностью связывания FcγR. Фактически, в настоящем примере было продемонстрировано, что отсутствовало влияние на концентрацию растворимого антигена в плазме с течением времени у индивидуумов, которым вводили антитело, которое лишено активности связывания FcγR. Между тем в рамках настоящего изобретения было выявлено, что концентрация растворимого антигена была значительно снижена в плазме индивидуумов, которым вводили антигенсвязывающую молекулу, активность связывания FcγR которой была увеличена и которая содержит антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого изменяется в зависимости от условий концентрации ионов. В частности, можно сказать, что авторы настоящего изобретения впервые выявили пользу усиления связывания FcγR посредством комбинирования FcRn-связывающего домена, который обладает активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН с антигенсвязывающим доменом, связывание которого с растворимым антигеном изменяется в зависимости от условий концентрации ионов, содержащимся в антигенсвязывающей молекуле, нацеленной на растворимый антиген.
[Пример 3] Эффект элиминации антигенов из плазмы антигенсвязывающими молекулами, активность связывания FcγR которых превышает активность нативной Fc-области IgG человека и активность связывания FcRn человека которых увеличена в условиях диапазона кислых значений рН
(3-1) Получение антигенсвязывающих молекул, активность связывания с FcγR которых превышает активность связывания нативной Fc-области IgG человека и активность связывания которых с FcRn человека увеличивается в условиях диапазона кислых значений рН
Описанным способом увеличения удержания IgG-антитела в плазме является повышение связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Полагают, что, когда связывание FcRn в условиях диапазона кислых значений рН увеличивается посредством внесения аминокислотной замены в Fc-область IgG-антитела, это увеличивает эффективность рециклирования из эндосомы в плазму, что приводит к увеличению времени удержания в плазме IgG-антитела.
Существует множество сообщений об изменениях аминокислот для увеличения времени удержания в плазме посредством увеличения активности связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН. Такие изменения включают, например:
способ замены Met на Leu в положении 428 и Asn на Ser в положении 434 (нумерация EU) в IgG-антителе (Nat. Biotechnol, (2010) 28, 157-159); способ замены Asn на Ala в положении 434 (Drug. Metab. Dispos. (2010) 38 (4), 600-605); способ замены Met на Tyr в положении 252, Ser на Thr в положении 254 и Thr на Glu в положении 256 (J. Biol. Chem. (2006) 281, 23514-23524); способ замены Thr на Gln в положении 250 и Met на Leu в положении 428 (J. Immunol. (2006) 176 (1) 346-356); способ замены Asn на His в положении 434 (Clin. Pharm. & Ther. (2011) 89 (2) 283-290.); и WO 2010/106180; WO 2010/045193; WO 2009/086320; WO 2009/058492; WO 2008/022152; WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370; WO 2005/123780; WO 2005/047327; WO 2005/037867; WO 2004/035752; и WO 2002/060919.
VH3-IgG1-F1093 (SEQ ID NO: 43) с заменой Met на Leu в положении 428 и Asn на Ser в положении 434 (нумерация EU) в VH3-IgG1-F1022 получали для улучшения фармакодинамики Fv4-IgG1-F1022, для которого было продемонстрировано, что оно при введении вызывает эффект значительного снижения концентрации растворимого антигена в плазме, как описано в примере 2. Fv4-IgG1-F1093, содержащее VH3-IgG1-F1093 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, конструировали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
(3-2) Эффект элиминации антигенов из плазмы посредством антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых с FcγR является более высокой, чем у нативной Fc-области IgG человека и активность связывания которых с FcRn человека увеличена в условиях диапазона кислых значений рН
Испытание с инфузией in vivo проводили для Fv4-IgG1-F1093 тем же способом, как описано в примере (2-1-1), с использованием трансгенных мышей с FcRn человека, у которых концентрация растворимого рецептора IL-6 человека сохраняется постоянной в плазме. Концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме у мышей определяли способом, описанным в примере (2-1-2). Результат представлен на фиг. 4.
(3-2-1) Определение концентрации антитела против рецептора IL-6 человека в плазме способом ELISA
Концентрации антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала идиотипическое антитело F(ab') против Fv4 МАВТЕСН распределяли аликвотами в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International). Планшету позволяли стоять в течение ночи при 4°С с получением планшетов, на которые иммобилизовано идиотипическое антитело против Fv4. Идиотипическое антитело получали иммунизацией кролика посредством Fv4-M73 (WO 2009/125825). После очистки сыворотки с использованием ионообменной смолы антитело подвергали аффинной очистке с помощью колонки, на которой было иммобилизовано Fv4-M73, с последующей адсорбцией с использованием колонки с иммобилизованным антигеном человека. Получали образцы стандарта для кривой, содержащие антитело против рецептора IL-6 человека (концентрация в плазме: 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 и 0,0125 мкг/мл) и образцы плазмы мыши для анализа, разбавленные в 100 раз или более. 100 мкл каждого образца для стандартной кривой и образца для анализа комбинировали с 200 мкл растворимого рецептора IL-6 человека в концентрации 20 нг/мл. Полученным смесям позволяли стоять при комнатной температуре в течение одного часа и распределяли аликвотами в каждую лунку планшета с иммобилизованным идиотипическим антителом против Fv4. Планшету позволяли стоять при комнатной температуре в течение другого часа. Затем биотинилированное антитело против IL-6R человека (R&D) подвергали реакции с ним при комнатной температуре в течение одного часа. Затем стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) подвергали реакции с ним при комнатной температуре в течение одного часа. Хроматографическую реакцию реакционного раствора проводили с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции с 1 H серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение при 450 нм реакционного раствора в каждой лунке с помощью устройства для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме мыши определяли на основе поглощения стандартной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices).
Результат представлен на фиг. 5.
(3-3) Улучшение фармакодинамики посредством увеличения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН
Как показано на фиг. 5, в группе, в которой вводили Fv4-IgG1-F1022, полученное усилением активности связывания Fv4-IgG1 с FcγR в условиях диапазона нейтральных значений рН, было продемонстрировано, что удержание в плазме введенного антитела является сниженным по сравнению с группой, в которой вводили Fv4-IgG1. Между тем, в группе, в которой вводили Fv4-IgG1-F1093 вследствие усиления активности связывания Fv4-IgG1-F1022 с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, было продемонстрировано, что удержание в плазме введенного антитела было значительно увеличено по сравнению с группой, в которой вводили Fv4-IgG1-F1022.
Более того, как показано на фиг. 4, концентрация растворимого рецептора IL-6 человека в плазме с течением времени в группе введения Fv4-IgG1-F1022 была эквивалентной концентрации в группе введения Fv4-IgG1-F1093, вплоть до трех суток после введения антитела. На третьи сутки после введения по сравнению с группой введения Fv4-IgG1 концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме снижались вплоть до приблизительно 100 раз в группах введения как Fv4-IgG1-F1022, так и Fv4-IgG1-F1093. Однако на седьмые сутки после введения антитела наблюдали, что концентрация растворимого рецептора IL-6 человека в плазме повышена в группе введения Fv4-IgG1-F1022 по сравнению с третьими сутками после введения. С другой стороны, в группе введения Fv4-IgG1-F1093 не наблюдали увеличения концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека, что демонстрирует, что эффект снижения концентрации растворимого рецептора IL-6 человека был длительным в этой группе введения.
В частности, Fv4-IgG1-F1093, при введении, снижало концентрацию растворимого рецептора IL-6 человека в плазме у индивидуума после введения вплоть до приблизительно 1/100 по сравнению с Fv4-IgG1 и, кроме того, оно сохраняло это состояние в течение длительного периода времени. Таким образом, было продемонстрировано, что Fv4-IgG1-F1093 является превосходной антигенсвязывающей молекулой. Без связи с конкретной теорией, явление, наблюдаемое в этом случае, может быть объяснено следующим образом. Полагают, что Fv4-IgG1-F1022, в котором активность связывания Fv4-IgG1 с FcγR увеличена в условиях диапазона нейтральных значений рН, включается в большом количестве, в основном, в иммунные клетки, экспрессирующие FcγR на клеточной мембране. Включенное антитело переносится в эндосому и, посредством связывания с FcRn в эндосоме, антитело рециклирует в плазму. Полагают, что, когда активность связывания антитела с FcRn не является достаточно высокой в условиях кислых значений рН в эндосоме, антитело, включенное в эндосому, не способно в достаточной степени рециклировать. В частности, возможной причиной сниженного удержания в плазме Fv4-IgG1-F1022 относительно Fv4-IgG1 является то, что активность связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН является недостаточной для достаточного рециклирования включенного в эндосому антитела в плазму посредством связывания FcRn, и антитело, которое не рециклировало, деградировалось в лизосоме.
С другой стороны, полагают, что как и в случае Fv4-IgG1-F1022, Fv4-IgG1-F1093, полученное посредством усиления активности связывания Fv4-IgG1-F1022 с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, включается в большом количестве в основном в иммунные клетки, экспрессирующие FcγR на клеточной мембране. Антитело, включенное и перенесенное в эндосому, рециклирует в плазму посредством связывания с FcRn в эндосоме. Поскольку его активность связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН усилена, полагают, что Fv4-IgG1-F1093 обладает достаточной активностью связывания FcRn в эндосоме. Таким образом, после включения в клетки большая часть Fv4-IgG1-F1093 рециклирует в плазму. Таким образом, можно было предположить, что удержание в плазме Fv4-IgG1-F1093 было увеличено у индивидуумов, которым проводили его введение, по сравнению с Fv4-IgG1-F1022.
С другой стороны, известно, что удержание в плазме обычных антител улучшается, когда повышена их активность связывания с FcRn в условиях диапазона кислых значений рН. Однако полагают, что, когда время удержания в плазме антитела увеличено, время удержания в плазме связанных с антителом антигенов также увеличено, и это приводит к увеличению концентрации антигена в плазме. В действительности, как описано в WO 2010/088444, антитело 18Е, в которое внесено изменение YTE в антитело 18, которое представляет собой антитело IgG1 человека против IL-6, для увеличения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, продемонстрировало увеличенное время удержания в плазме яванских макаков и, в то же время, концентрация антигена IL-6 также была увеличена в плазме.
Однако неожиданно, при введении Fv4-IgG1-F1093, в которое внесено изменение, сходное с YTE, для увеличения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН в Fv4-F1022, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом и имеет увеличенную активность связывания FcγR, время удержания антитела в плазме значительно увеличивалось у индивидуумов, которым проводили его введение, без увеличения концентрации растворимого рецептора IL-6 человека, который представляет собой антиген. Вместо этого, на седьмые сутки после введения антитела концентрация растворимого рецептора IL-6 человека оставалась низкой у индивидуумов, которым вводили Fv4-IgG1-F1093, по сравнению с индивидуумами, которым вводили Fv4-F1022.
Без связи с конкретной теорией, явление, наблюдаемое в этом случае, может быть объяснено следующим образом. При введении в живой организм антитело без рН-зависимого связывания антигена неспецифически включается в клетки. Антигены, которые остаются связанными с антителом, рециклируют в плазму в той же степени, как и антитело. Между тем, для антитела с увеличенной активностью связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН, степень рециклирования в плазму у живого организма, которому вводили антитело, является более высокой, чем степень рециклирования антитела без увеличенной активности связывания FcRn, и это приводит к увеличенной степени рециклирования антител, связавшихся с антигеном в плазме живого организма. Таким образом, полагают, что вследствие увеличенного удержания в плазме антитела, введенного в живой организм, концентрация в плазме антигена, с которым связывается антитело, также увеличивается в живом организме.
Между тем при введении в живой организм антитело, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом и которое имеет увеличенную активность связывания FcγR, главным образом, включается в иммунные клетки, экспрессирующие FcγR на клеточной мембране и это снижает удержание в плазме. Более того, после включения в клетки, в связанном с антителом состоянии антиген диссоциирует от антитела в эндосоме, а затем деградируется в лизосоме, что приводит к снижению концентрации антигена в плазме в живом организме. Когда активность связывания FcRn увеличивается в условиях диапазона кислых значений рН, время удержания антитела в плазме, даже если и снижается вследствие увеличенной активности связывания FcγR, увеличивается посредством увеличения скорости рециклирования посредством FcRn. В этом случае, поскольку полагают, что антиген, связанный с антителом, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, диссоциирует от антитела в эндосоме и прямо деградируется в лизосоме, концентрация антигена увеличивается в плазме. Более того, полагают, что увеличенное удержание в плазме антитела, введенного в живой организм, обеспечивает эффект длительной элиминации антитела и поддержание концентрации антигена низкой в течение более длительного периода времени.
Описанные выше данные демонстрируют, что время удержания в плазме введенного антитела увеличивается в живом организме, которому вводят антитело, где активность связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН усилена в антигенсвязывающей молекуле, активность связывания FcγR которой является более высокой, чем у нативной Fc-области IgG человека. Более того, было выявлено, что в этом случае время удержания антитела в плазме увеличивается без ухудшения эффекта элиминации антигена.
[Пример 4] Дальнейшая оценка эффекта антигенсвязывающих молекул в отношении элиминации антигенов из плазмы, активность связывания которых с FcγR является более высокой, чем у нативной Fc-области IgG человека, и активность связывания у которых с FcRn человека увеличена в условиях диапазона кислых значений рН
(4-1) Эффект элиминации антигена в живом организме, в который вводили антитело, активность связывания которого с FcγR является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека, и которое обладает активностью связывания FcRn человека, увеличенной в условиях диапазона кислых значений рН
Как описано в примере 2, концентрация антигена в плазме была значительно снижена в группе, в которой вводили Fv4-IgG1-F1022 с усиленным связыванием FcγR мыши. Между тем, как показано в примере 3, сниженное время удержания в плазме, наблюдаемое в группе ведения Fv4-IgG1-F1022, значительно увеличивалось посредством увеличения активности связывания Fv4-IgG1-F1022 с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН. Далее, дополнительно оценивали, как описано ниже, эффект элиминации растворимых антигенов из плазмы посредством усиленного связывания FcγR мыши и эффект увеличения времени удержания в плазме антитела в живом организме, которому его вводили, посредством усиления активности связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН.
(4-2) Получение антитела против рецептора IL-6 человека с усиленным связыванием FcγR мыши
VH3-IgG1-F1087 (SEQ ID NO: 123), полученное путем замены Lys на Asp в положении 326 (нумерация EU) в VH3-IgG1, и VH3-IgG1-F1182 (SEQ ID NO: 124), полученное путем замены Ser на Asp в положении 239 и Ile на Glu в положении 332 (нумерация EU) в VH3-IgG1, получали в качестве антигенсвязывающих молекул с усиленным связыванием FcγR мыши. Fv4-IgG1-F1087, которое содержит VH3-IgG1-F1087 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, и Fv4-IgG1-F1182, которое содержит VH3-IgG1-F1182 в качестве тяжелой цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
(4-3) Оценка активности связывания FcγR мыши
VH3/L (WT)-IgG1-F1087 и VH3/L (WT)-IgG1-F1182, которые содержат VH3-IgG1-F1087 и VH3-IgG1-F1182 в качестве тяжелой цепи, соответственно, и L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) в качестве легкой цепи, получали способом, описанным в справочном примере 2. Эти антитела и VH3/L (WT)-IgG1-F1022 оценивали в отношении их активности связывания FcγR мыши способом, описанным в справочном примере 2. Результат представлен в таблице 8. Кроме того, соотношение увеличения активности связывания FcγR каждого варианта относительно IgG1 до изменения представлено в таблице 9.
Как показано в таблице 9, было продемонстрировано, что F1087 и F1022 имели увеличенную активность связывания с FcγRI мыши, FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши по сравнению с IgG1, в то время как их активность связывания FcγRIV мыши не была увеличена. Что касается активности связывания F1087 с FcγRI мыши, FcγRIIb мыши, FcγRIII мыши и FcγRIV мыши, было выявлено, что степень ее повышения является меньшей, чем у F1022. Между тем, было показано, что активность связывания F1182 с FcγRI мыши и FcγRIV мыши была значительно увеличена, в то время как степень увеличения его активности связывания с FcγRIIb и FcγRIII была меньшей, чем у F1022 и F1087. Как упоминалось выше, эти три типа вариантов продемонстрировали усиленное связывание с некоторыми FcγR мыши; однако было показано, что активность связывания с FcγR селективно увеличивается и степень увеличения варьирует в зависимости от варианта.
(4-4) Эффект элиминации антигенов из плазмы у индивидуума, которому вводили Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1182
С помощью того же способа, который описан в примере 2, испытания с инфузией in vivo с использованием трансгенных мышей с FcRn человека проводили для определения концентраций растворимого рецептора IL-6 в плазме мышей. Результат представлен на фиг. 6.
В обеих группах, в которых вводили in vivo Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1182, которые обладают увеличенной активностью связывания FcγR мыши по сравнению с Fv4-IgG1, концентрация в плазе in vivo растворимого рецептора IL-6 человека снижалась по сравнению с группой, в которой вводили Fv4-IgG1. Эффект снижения указанной выше концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека был высоким, особенно в группе, в которой вводили Fv4-IgG1-F1087, которое обладает усиленным связыванием с FcγRII мыши и FcγRIII мыши. Между тем, эффект введения F1182 на снижение концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 человека был небольшим в группе, в которой вводили in vivo F1182, которое обладает значительно увеличенной активностью связывания с FcγRI мыши и FcγRIV мыши (а также увеличенное в несколько раз связывание с FcγRII мыши и FcγRIII мыши). Исходя из этих результатов, было предположено что FcγR мыши, которые вносят значительно больший вклад в эффект эффективного снижения концентрации антигена в плазме у мышей, которым вводили антитело с рН-зависимым связыванием антигена, представляют собой FcγRII мыши и/или FcγRIII мыши. В частности, полагают, что концентрация антигена в плазме может быть более эффективно снижена in vivo посредством введения в живой организм антитела с рН-зависимым связыванием антигена с усиленным связыванием с FcγRII мыши и/или FcγRIII мыши.
(4-5) Получение антигенсвязывающих молекул, активность связывания которых с FcγR является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области IgG человека, и которые обладают увеличенной активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН
Как описано в примере 3, по сравнению с трансгенными мышами с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1-F1022, удержание в плазме введенного антитела значительно увеличивалось у трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1-F1093, полученное увеличением активности связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН у Fv4-IgG1-F1022, активность связывания которого с FcγR мыши увеличена. То, наблюдается ли этот эффект также у трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1182, и то, наблюдается ли этот же эффект у мышей, которым вводили варианты, активность связывания которых с FcRn человека увеличена в условиях диапазона кислых значений рН посредством добавления изменения, отличающегося от изменения, оцененного в примере 3, оценивали следующим образом.
VH3-IgG1-F1180 (SEQ ID NO: 125) и VH3-IgG1-F1181 (SEQ ID NO: 126) получали путем замены Met на Leu в положении 428 и Asn на Ser в положении 434 (нумерация EU) в тяжелых цепях VH3-IgG1-F1087 и VH3-IgG1-F1182, для увеличения активности связывания Fv4-IgG1-F1087 и Fv4-IgG1-F1182 с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН. Более того, получали VH3-IgG1-F1412 (SEQ ID NO: 127) путем замены Asn на Ala в положении 434 (нумерация EU) в тяжелой цепи VH3-IgG1-F1087, для увеличения активности связывания Fv4-IgG1-F1087 с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН. Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1181 и Fv4-IgG1-F1412, которые содержат описанные выше тяжелые цепи и VL3-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
(4-6) Улучшение фармакодинамики антител с увеличенной активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН
Испытания с инфузией in vivo проводили путем введения Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1181 и Fv4-IgG1-F1412, трансгенным мышам с FcRn человека в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2, для определения концентрации растворимого рецептора IL-6 в плазме мышей. Результаты в отношении концентраций антител в плазме в группах мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1087, Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1412 и Fv4-IgG1, представлены на фиг. 7. Результаты в отношении концентраций антител в плазме в группах мышей, в которых вводили Fv4-IgG1-F1182, Fv4-IgG1-F1181 и Fv4-IgG1, представлены на фиг. 8. Между тем, концентрации антитела в плазме в группах мышей измеряли способом, описанным в примере 3. Результаты в отношении концентраций растворимого рецептора IL-6 в плазме в группах мышей Fv4-IgG1-F1087, Fv4-IgG1-F1180, Fv4-IgG1-F1412 и Fv4-IgG1 представлены на фиг. 9; и результаты в отношении концентраций растворимого рецептора IL-6 в плазме в группах Fv4-IgG1-F1182, Fv4-IgG1-F1181 и Fv4-IgG1 представлены на фиг. 10.
Было подтверждено, что, по сравнению с группой мышей, в которой вводили Fv4-IgG1-F1182, время удержания введенных антител в плазме увеличивалось в группе мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1181, что приводит к увеличению активности связывания Fv4-IgG1-F1182 с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН. Между тем концентрация растворимого рецептора IL-6 в плазме в группах мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1181, была сравнимой с группой мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1182. По сравнению с группами мышей, которым вводили Fv4-IgG1, концентрация растворимого рецептора IL-6 в плазме была снижена в обеих группах.
С другой стороны, по сравнению с группой мышей, в которой вводили Fv4-IgG1-F1087, время удержания в плазме введенных антител было увеличено в обеих группах мышей, в которых вводили Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, полученных увеличением активности связывания Fv4-IgG1-F1087 с FcRn человека в диапазоне кислых значений рН, и неожиданно, время удержания в плазме увеличивалось вплоть до уровня, сравнимого с уровнем в группах мыши, в которых вводили Fv4-IgG1. Более того, продолжительность эффекта снижения концентрации растворимого рецептора IL-6 в плазме увеличивалась посредством увеличения времени удержания антитела в плазме в группах введенных мышей. В частности, в группах введенных мышей концентрации растворимого рецептора IL-6 в плазме через 14 суток и 21 сутки после введения Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412 были значительно снижены по сравнению с концентрациями через 14 суток и 21 сутки после введения Fv4-IgG1-F1087.
Ввиду вышесказанного, что касается групп мышей, которым вводили четыре иллюстративных антитела Fv4-IgG1-F1093, Fv4-IgG1-F1181, Fv4-IgG1-F1180 и Fv4-IgG1-F1412, было продемонстрировано, что время удержания в плазме может быть увеличено в живом организме, в который вводили антитело, где активность связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН усилена у антигенсвязывающей молекулы, активность связывания которой с FcγR является более высокой, чем активность связывания у нативной Fc-области IgG человека. Также было продемонстрировано, что в живом организме, в который вводили антигенсвязывающую молекулу, время удержания в плазме увеличивается без ухудшения эффекта элиминации антигенов из живого организма и, вернее, эффект элиминации антигена может быть длительным.
(4-7) Получение антигенсвязывающих молекул с увеличенной активностью связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и сниженным связыванием с ревматоидным фактором
В последние годы сообщалось, что молекула антитела, полученная путем замены Asn на His в положении 434 (нумерация EU) в гуманизированном антителе против CD4 для увеличения времени удержания в плазме посредством увеличения его активности связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, связывается с ревматоидным фактором (RF) (Clin. Pharmacol. Ther. (2011) 89 (2), 283-290). Это антитело обладает Fc-областью IgG1 человека и заменой Asn на His в положении 434 (нумерация EU) в участке связывания FcRn. Было продемонстрировано, что ревматоидный фактор распознает и связывается с областью с заменой.
Как описано в примере (4-6), по сравнению со случаем, где Fv4-IgG1-F1087 вводили трансгенным мышам с FcRn человека, Fv4-IgG1-F1180, полученное посредством увеличения в условиях диапазона кислых значений рН активности связывания Fv4-IgG1-F1087 с FcRn человека с увеличенной активностью связывания FcγR мыши, продемонстрировало увеличенное время удержания в плазме. Сообщалось, что различные изменения увеличивают активность связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН. Сообщалось, что среди таких модификаций вариант с заменой Met на Leu в положении 428 и Asn на Ser в положении 434 (нумерация EU) в тяжелой цепи демонстрирует усиленное связывание с ревматоидными факторами.
Однако вариант, который обладает заменой Tyr на Thr в положении 436 (нумерация EU) в дополнение к описанным выше заменам в положениях 428 и 434 (нумерация EU) демонстрирует значительно сниженное связывание с ревматоидными факторами при сохранении увеличенной активности связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН.
Следовательно, антигенсвязывающие молекулы, которые обладают увеличенной активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, но не обладают связыванием с ревматоидным фактором, можно получать путем внесения в участок Fc-области изменения, которое снижает активность связывания ревматоидного фактора отдельно без снижения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН.
Такие изменения, используемые для снижения активности связывания ревматоидного фактора, включают изменения в положениях 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 и 441-444 (нумерация EU), предпочтительно в положениях 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 и 440 (нумерация EU) и особенно предпочтительно изменение, которое заменяет Val на Glu или Ser в положении 422, изменение, которое заменяет Ser на Arg в положении 424, изменение, которое заменяет His на Asp в положении 433, изменение, которое заменяет Tyr на Thr в положении 436, изменение, которое заменяет Gln на Arg или Lys в положении 438 и изменение, которое заменяет Ser на Glu или Asp в положении 440 (нумерация EU). Эти изменения можно использовать отдельно или в комбинации.
Альтернативно возможно вносить последовательности гликозилирования N-типа для снижения активности связывания ревматоидного фактора. В частности, известные последовательности гликозилирования N-типа включают Asn-Xxx-Ser/Thr (Ххх представляет собой произвольную аминокислоту, отличную от Pro). Эта последовательность может быть встроена в Fc-область для добавления цепи сахаров N-типа и связывание с RF может ингибироваться из-за пространственного препятствования цепью сахаров N-типа. Изменения, используемые для добавления цепи сахаров N-типа, предпочтительно включают изменение, которое заменяет Lys на Asn в положении 248, изменение, которое заменяет Ser на Asn в положении 424, изменение, которое заменяет Tyr на Asn в положении 436 и Gln на Thr в положении 438, и изменение, которое заменяет Qln на Asn в положении 438, в соответствии с нумерацией EU, особенно предпочтительно изменение, которое заменяет Ser на Asn в положении 424 (нумерация EU).
(4-8) Оценка эффекта улучшения фармакодинамики антигенсвязывающих молекул с увеличенной активностью связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и сниженным связыванием с ревматоидным фактором
Для оценки эффекта антител с изменением, которое снижает упомянутую выше активность связывания ревматоидного фактора, Fv4-IgG1-F1782 с заменой Met на Leu в положении 428, Asn на Ser в положении 434 и Tyr на Thr в положении 436 (нумерация EU) в тяжелой цепи Fv4-IgG1-F1087, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Как описано в примере (4-7), Fv4-IgG1-F1782 представляет собой антитело, активность связывания которого с FcRn человека в условиях кислых значений рН и активность связывания которого с FcγR мыши увеличена, однако его активность связывания с ревматоидным фактором не увеличена по сравнению с нативным IgG1 человека. Для исследования того, увеличено ли время удержания антитела Fv4-IgG1-F1782 по сравнению с Fv4-IgG1-F1087, фармакодинамику антител в плазме трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили антитела, оценивали с помощью того же способа, как описано в примере 2. Концентрацию в плазме растворимого рецептора IL-6 человека определяли способом, описанным в примере (2-1-2), в то время как концентрации антитела в плазме определяли способом, описанным в примере (3-2-1).
Концентрация антитела в плазме с течением времени представлена на фиг. 11 и концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека с течением времени представлена на фиг. 12. Fv4-IgG1-F1782 продемонстрировало увеличенное время удержания антитела в плазме по сравнению с Fv4-IgG1-F1087. Между тем, концентрация в плазме растворимого рецептора IL-6 человека была значительно снижена в группах, в которых вводили упомянутые выше антитела, по сравнению с группой введения Fv4-IgG1.
Без связи с конкретной теорией, описанные выше результаты можно интерпретировать следующим образом. Результаты, описанные в примерах 3 и 4, демонстрируют, что удержание в плазме может быть продлено в живом организме, в который вводили антитело, полученное путем увеличения активности связывания с FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН антигенсвязывающей молекулы, активность связывания которой с FcγR является более высокой, чем активность связывания с Fc-области у природного IgG человека. Также было продемонстрировано, что в живом организме, в который вводили такую антигенсвязывающую молекулу, удержание в плазме продлевается без ухудшения эффекта элиминации антигенов из живого организма и, вернее, эффект элиминации антигена может быть длительным.
Однако существует опасение, что антигенсвязывающие молекулы, в которые внесено изменение для увеличения активности связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН, могут иметь риск увеличенной активности связывания ревматоидного фактора. Таким образом, время удержания в плазме может быть увеличено без увеличения активности связывания ревматоидного фактора посредством внесения в связывающие молекулы мутации, которая снижает активность связывания ревматоидного фактора при сохранении активности связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН.
Иными словами, было выявлено, что при введении в живой организм, антигенсвязывающие молекулы, которые обладают свойством связывания с антигенами рН-зависимым образом и имеют увеличенную активность связывания FcRn человека в условиях диапазона кислых значений рН и активность связывания которых с FcγR является более высокой, чем у Fc-области нативного IgG человека и которые обладают сниженной активностью связывания ревматоидного фактора, обладают превосходным свойством, состоящим в том, что антигенсвязывающие молекулы демонстрируют увеличенное время удержания в плазме без увеличения их активности связывания ревматоидного фактора и эффективно снижают концентрацию растворимого антигена в живом организме.
[Пример 5] Эффект элиминации антигенов из плазмы живого организма, в который вводили антигенсвязывающую молекулу, активность связывания с FcγR которой является более высокой, чем активность связывания нативной Fc-области IgG мыши
(5-1) Эффект элиминации антигена из плазмы живого организма, в который вводили антитело мыши с увеличенной активностью связывания FcγR
Как описано в примерах 1-4, было продемонстрировано, что элиминация растворимого рецептора IL-6 человека из плазмы мыши ускоряется в группах трансгенных мышей с FcRn человека, которым вводили антигенсвязывающие молекулы, полученные увеличением активности связывания FcγR мыши у антигенсвязывающих молекул, которые обладают Fc-областью антител человека и свойством связывания с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом. То, достигался ли этот эффект у нормальных мышей, имеющих FcRn мыши, которым вводили антигенсвязывающие молекулы, которые обладают Fc-областью антител мыши и свойством связывания с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, оценивали у нормальных мышей, имеющих FcRn мыши, следующим образом.
(5-2) Получение антител мыши с увеличенной активностью связывания FcγR
Для антитела IgG1 мыши, обладающего свойством связывания с рецептором IL-6 человека рН-зависимым образом, тяжелую цепь VH3-mIgG1 (SEQ ID NO: 128) и легкую цепь VL3-mk1 (SEQ ID NO: 129) конструировали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Между тем, для увеличения активности связывания VH3-mIgG1 с FcγR мыши, получали VH3-mIgG1-mF44 (SEQ ID NO: 130) посредством замены Ala на Asp в положении 327 (нумерация EU). Аналогично, VH3-mIgG1-mF46 (SEQ ID NO: 131) получали путем замены Ser на Asp в положении 239 и Ala на Asp в положении 327, в соответствии с нумерацией EU, в VH3-mIgG1. Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 и Fv4-mIgG1-mF46, которые содержат VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 и VH3-mIgG1-mF46, соответственно, в качестве тяжелой цепи и VL3-mk1 в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2.
(5-3) Оценка активности связывания FcγR мыши антител антитела мыши с усиленной активностью связывания FcγR
VH3/L (WT)-mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44 и VH3/L (WT)-mIgG1-mF46, которые содержат VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 и VH3-mIgG1-mF46, соответственно, в качестве тяжелой цепи и L (WT)-CK (SEQ ID NO: 42) в качестве легкой цепи, получали способом, описанным в справочном примере 2. Эти антитела оценивали в отношении их активности связывания FcγR мыши способом, описанным в справочном примере 25. Результат представлен в таблице 10. Кроме того, соотношение увеличения активности каждого варианта в отношении связывания FcγR мыши относительно mIgG1 до изменения представлено в таблице 11.
Результат оценки примера 4, демонстрирующего, что VH3/L (WT)-mIgG1, обладающее Fc-областью нативного IgG1-антитела мыши, связывается только с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши, но не с FcγRI мыши и FcγRIV мыши, указывает на то, что FcγR мыши, важный для снижения концентрации антигена, представляют собой FcγRII мыши и/или FcγRIII мыши. Было продемонстрировано, что VH3/L (WT)-mIgG-mF44 и VH3/L (WT)-mIgG1-mF46, в которые введено изменение, которое предположительно увеличивает активность связывания VH3/L (WT)-mIgG1 с FcγR, имеет увеличенную активность связывания как с FcγRIIb мыши, так и с FcγRIII мыши.
(5-4) Оценка эффекта в отношении снижения концентрации растворимого рецептора IL-6 в плазме нормальных мышей
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы нормальных мышей, которым вводили антитело против рецептора IL-6 человека Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1mF46, оценивали следующим образом.
Модель на животных, в которой концентрация растворимого рецептора IL-6 человека поддерживается постоянной в плазме, создавали посредством имплантации инфузионного насоса (MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet), содержащего растворимый рецептор IL-6 человека, под кожу спины нормальных мышей (мышь C57BL/6J, Charles River Japan). В модели на животных оценивали динамику in vivo после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Для подавления продукции нейтрализующих антител против растворимого рецептора IL-6 человека, моноклональное антитело против CD4 мыши вводили один раз в количестве 20 мг/кг в хвостовую вену. Затем в область спины мышей имплантировали инфузионный насос, содержащий 92,8 мкг/мл растворимого рецептора IL-6 человека. Через трое суток после имплантации инфузионного насоса вводили антитело против рецептора IL-6 человека один раз в сутки 1 мг/кг в хвостовую вену. Взятие крови от мышей проводили через 15 минут, семь часов, одни сутки, двое суток, четверо суток и семь суток после введения антитела против рецептора IL-6 человека. Сразу после этого собранную кровь центрифугировали при 15000 об./мин. и 4°С в течение 15 минут с получением плазмы. Выделенную плазму хранили в морозильной камере, установленной на -20°С или ниже до применения.
Концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме определяли способом, описанным в (2-1-2). Результат представлен на фиг. 13.
Неожиданно было продемонстрировано, что у мышей, которым вводили mF44 и mF46, в которые внесено изменение для увеличения активности связывания mIgG1 (нативный IgG1 мыши) с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши, концентрация рецептора IL-6 с плазме была значительно снижена по сравнению с мышами, которым вводили mIgG1. В частности, даже на 21 сутки после введения mF44, концентрация рецептора IL-6 в плазме в группе введения mF44 была снижена приблизительно в 6 раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме в группе без введения антитела и приблизительно в 10 раз по сравнению с группой введения mIgG1. С другой стороны, на седьмые сутки после введения mF46, концентрация в плазме рецептора IL-6 в группе введения mF46 была значительно снижена приблизительно в 30 раз по сравнению с концентрацией в плазме рецептора IL-6 в группе без введения антитела и приблизительно в 50 раз по сравнению с группой введения mIgG1.
Указанные выше данные демонстрируют, что элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы также ускорялась у мышей, которым вводили антитела, где активность связывания с FcγR мыши у антигенсвязывающей молекулы, обладающей Fc-областями IgG1-антитела мыши, увеличивается, как и в случае антител, где активность связывания FcγR мыши у антигенсвязывающей молекулы, обладающей Fc-областью IgG1-антитела человека, увеличивается. Без связи с конкретной теорией, описанное выше наблюдаемое явление может быть объяснено следующим образом.
При введении мышам антитела, которые связываются с растворимым антигеном рН-зависимым образом и обладают увеличенной активностью связывания FcγR, активно включаются в основном в клетки, экспрессирующие FcγR на клеточной мембране. Включенные антитела диссоциируют от растворимого антигена в условиях кислых значений рН в эндосоме, а затем рециклируют в плазму через FcRn. Таким образом, фактором, который обеспечивает эффект элиминации из плазмы растворимого антигена у такого антитела, является уровень активности связывания FcγR у антитела. В частности, поскольку активность связывания FcγR является более высокой, включение в экспрессирующие FcγR клетки происходит более активно и это делает элиминацию растворимых антигенов из плазмы более быстрой. Более того, при условии, что активность связывания FcγR увеличена, эффект может быть оценен аналогичным образом независимо от того, происходит ли Fc-область, содержащаяся в антителе, из IgG1 человека или мыши. В частности, оценку можно осуществлять для Fc-области любого вида животного, такого как любой из IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека, IgG4 человека, IgG1 мыши, IgG2a мыши, IgG2b мыши, IgG3 мыши, IgG крысы, IgG обезьяны и IgG крысы при условии, что активность связывания с FcγR у видов животных, подлежащих введению, увеличивается.
[Пример 6] Эффект элиминации антигена антителами с активностью связывания, увеличенной селективным в отношении FcγRIIb образом
(6-1) Эффект в отношении элиминации антигена у антител, в которых активность связывания FcγRIIb селективно увеличена
Мыши с дефицитом FcγRIII (мышь В6, 129P2-FcgrFcγR3tm1Sjv/J, Jackson Laboratories) экспрессируют FcγRI мыши, FcγRIIb мыши и FcγRIV мыши, но не FcγRIII мыши. Между тем, мыши с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора (Fcer1g mouse, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529) экспрессируют только FcγRIIb мыши, но не FcγRI мыши, FcγRIII мыши и FcγRIV мыши.
Как описано в примере 5, было продемонстрировано, что mF44 и mF46 с увеличенной активностью связывания нативного IgG1 с FcγR мыши демонстрируют селективное усиление связывания с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши. Было предположено, что с использованием селективно увеличенной активности связывания антител, условия, в которых вводят антитело с селективно усиленным связыванием FcγRIIb мыши, могут быть имитированы путем введения mF44 и mF46 мышам с дефицитом FcγRIII или мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которые не экспрессируют FcγRIII мыши.
(6-2) Оценка эффекта элиминации антигена в живом организме, в который вводили антитело с селективным усилением связывания с FcγRIIb мыши с использованием мышей с дефицитом FcγRIII
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у мышей с дефицитом FcγRIII, которым вводили антитело против рецептора IL-6 человека Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1-mF46, оценивали тем же способом, который описан в примере 5. Концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме у мышей определяли способом, описанным в примере (2-1-2). Результат представлен на фиг. 14.
Неожиданно, было продемонстрировано, что концентрации рецептора IL-6 в плазме у мышей с дефицитом FcγRIII, которым вводили mF44 и mF46, которые имитируют условия, в которых активность связывания mIgG1 (нативный IgG1 мыши) с FcγRIIb мыши селективно увеличена, была значительно снижена по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у мышей, которым вводили mIgG1. В частности, концентрация рецептора IL-6 в плазме в группе введения mF44 была снижена приблизительно в три раза по сравнению с группой введения mIgG1 и увеличение концентрации накопленного антигена вследствие введения антитела подавлялось. Между тем, на третьи сутки после введения концентрация IL-6 в плазме в группе введения mF46 была значительно снижена приблизительно в шесть раз по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 в плазме у группы без введения антитела и приблизительно в 25 раз превышала концентрацию рецептора IL-6 в плазме в группе введения mIgG1. Этот результат показывает, что, поскольку активность связывания FcγRIIb мыши у антитела против рецептора IL-6 человека, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом, является более высокой, концентрация рецептора IL-6 может быть в большей степени снижена у мышей, которым вводили антитело.
(6-3) Оценка эффекта элиминации антигена плазме живого организма, в который вводили антитело с селективным усилением связывания FcγRIIb мыши с использованием мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы у мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили антитело против рецептора IL-6 человека Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1mF46, оценивали тем же способом, который описан в примере 5. Концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме мышей определяли способом, описанным в примере (2-1-2). Результат представлен на фиг. 15.
Как и в случае, где mF44 и mF46 вводили мышам с дефицитом FcγRIII, было продемонстрировано, что концентрация рецептора IL-6 в плазме у мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили mF44 и mF46, которые имитируют условия селективного увеличения активности связывания mIgG1 с FcγRIIb мыши (нативный IgG1 мыши), была значительно снижена по сравнению с концентрацией рецептора IL-6 у мышей с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора, которым вводили mIgG1. В частности, концентрация рецептора IL-6 в плазме в группе введения mF44 была снижена приблизительно в три раза по сравнению с группой введения mIgG1 и увеличение концентрации накопленного антигена вследствие введения антитела подавлялось. Между тем, на третьи сутки после введения концентрация рецептора IL-6 в плазме в группе введения mF46 была значительно снижена приблизительно в пять раз по сравнению с группой без введения антитела и приблизительно в 15 раз по сравнению с группой введения mIgG1.
Результаты, описанные в примерах (6-2) и (6-3), демонстрируют, что концентрация растворимого антигена в плазме значительно снижается в группе, в которой вводили антитело, которое связывается с растворимым антиген рН-зависимым образом и обладает селективно увеличенной активностью связывания FcγRIIb мыши.
[Пример 7] Эффект антител в отношении элиминации антигена с селективным усилением связывания с FcγRIII
(7-1) Эффект элиминации антигена в плазме живого организма, в который вводили антитела с селективно усиленным связыванием FcγRIII
Мыши с дефицитом FcγRIIb (мышь FcgrFcγR2b (FcγRII), Taconic) (Nature (1996) 379 (6563), 346-349) экспрессируют FcγRI мыши, FcγRIII мыши и FcγRIV мыши, но не FcγRIIb мыши. Как описано в примере 5, было продемонстрировано, что mF44 и mF46, полученные посредством увеличения активности связывания нативного IgG1 мыши с FcγR, демонстрируют селективно усиленное связывание с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши. Было предположено, что, исходя из применения антител с селективно увеличенной активностью связывания, условия введения антитела с селективно усиленным связыванием с FcγRIII мыши можно имитировать путем введения mF44 или mF46 мышам с дефицитом FcγRIIb, которые не экспрессируют FcγRIIb мыши.
Как описано в примере 6, концентрация растворимого антигена была снижена в плазме у мышей с дефицитом FcγRIII, которые имитируют состояние введения антитела с селективно увеличенной активностью связывания FcγRIIb мыши. Между тем, то, снижается ли концентрация растворимого антигена в плазме мышей с дефицитом FcγRIIb, которые имитируют условия введения антитела с селективно увеличенной активностью связывания FcγRIII мыши, оценивали с помощью исследования, описанного ниже.
(7-2) Оценка эффекта элиминации антигена посредством селективного усиления связывания FcγRIII мыши с использованием мышей с дефицитом FcγRIIb
Эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из мышей с дефицитом FcγRIIb в плазме, которым вводили антитело против рецептора IL-6 человека Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 или Fv4-mIgG1mF46, оценивали тем же способом, который описан в примере 5. Концентрации растворимого рецептора IL-6 человека в плазме определяли способом, описанным в примере (2-1-2). Результат представлен на фиг. 16.
Неожиданно, в группах, в которых вводили mF44 и mF46, которые имитируют селективное увеличение активности связывания mIgG1 (нативный IgG1 мыши) с FcγRIII мыши, концентрация рецептора IL-6 в плазме снижалась, однако снижение не было подтверждено по сравнению с тем, что показано в примере 6.
Без связи с конкретной теорией, исходя из результатов, описанных в примерах 5, 6 и 7, возможно следующее обсуждение. Было выявлено, что элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы значительно ускорена у нормальных мышей, экспрессирующих как FcγRIIb мыши, так и FcγRIII мыши, которым вводили mF44 и mF46 с селективно увеличенной активностью связывания mIgG1 (нативный IgG1 мыши) с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши. Более того, было выявлено, что, когда mF44 и mF46 вводили мышам, которые экспрессируют FcγRIIb мыши, но не FcγRIII мыши (т.е., мышам с дефицитом FcγRIII и мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора), элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы у мышей также значительно ускорялась. Между тем, когда mF44 и mF46 вводили мышам, которые экспрессируют FcγRIII мыши, но не FcγRIIb мыши (т.е. мышам с дефицитом FcγRII), элиминация растворимого рецептора IL-6 из плазмы не ускорялась у мышей до той степени, как когда их вводили мышам с дефицитом FcγRIII или мышам с дефицитом γ-цепи Fc-рецептора.
Из указанных выше данных, полагали, что антитела mF44 и mF46, в которых активность связывания mIgG1 (нативный IgG1 мыши) с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши увеличена, включаются в экспрессирующие FcγR клетки в основном посредством FcγRIIb мыши и, таким образом, растворимый антиген в плазме, который связывается с антителами, элиминируется. Между тем, полагают, что опосредуемое FcγRIII включение комплексов антитело/антиген в экспрессирующие FcγR клетки не вносит значительного вклада в элиминацию растворимого антигена из плазмы.
Более того, как показано в примере 4, концентрация растворимого рецептора IL-6 в плазме была значительно снижена у мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1087, обладающее увеличенной активностью связывания, в частности, с FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши. Между тем, эффект элиминации растворимого рецептора IL-6 из плазмы мышей, которым вводили Fv4-IgG1-F1182 с увеличенной активностью связывания с FcγRI мыши и FcγRIV мыши, в частности, был меньшим, чем у Fv4-IgG1-F1087.
Более того, как показано в примере 2, у мышей, которым вводили Fv4-IgG1-Fuc, активность связывания которого с FcγRIV мыши значительно увеличена вследствие наличия цепи сахаров с низким содержанием фукозы (Science (2005) 310 (5753) 1510-1512), концентрации в плазме растворимого рецептора IL-6 была снижена по сравнению с концентрацией растворимого рецептора IL-6 у мышей, которым вводили Fv4-IgG1; однако эффект снижения был приблизительно в два раза меньшим. Таким образом, полагают, что опосредуемое FcγRIV мыши включение антител в экспрессирующие FcγR клетки не вносит значительный вклад в элиминацию растворимых антигенов из плазмы.
Ввиду вышесказанного, было продемонстрировано, что из нескольких FcγR мыши, FcγRIIb мыши и FcγIII мыши, в частности FcγRIIb мыши, играет основную роль во включении антитела в экспрессирующие FcγR клетки у мышей. Таким образом, можно предположить, что мутации, вносимые в FcγR-связывающий домен мыши, предпочтительно включают, но не ограничиваются ими, мутации, которые усиливают связывание с FcγRIIb мыши и FcγIII мыши, в частности, связывание с FcγRIIb мыши.
Описанные выше данные демонстрируют, что у мышей более предпочтительно активность связывания антитела, подлежащего введению, с FcγRIIb мыши и FcγIII мыши, в частности, активность связывания с FcγRIIb, увеличена для ускорения элиминации растворимых антигенов из плазмы живого организма посредством введения антигенсвязывающих молекул, которые связываются с растворимыми антигенами рН-зависимым образом и обладают увеличенной активностью связывания FcγR. В частности, при введении в живой организм, антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с растворимыми антигенами рН-зависимым образом и обладают увеличенной активностью с FcγRIIb мыши и FcγIII мыши, в частности, увеличенной активностью связывания FcγRIIb, могут ускорять элиминацию растворимых антигенов из плазмы и эффективно снижать концентрацию растворимых антигенов в плазме и, таким образом, было выявлено, что антигенсвязывающие молекулы демонстрируют очень эффективное действие.
[Пример 8] Оценка способности к агрегации антител, содержащих Fc-область, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание FcγRIIb
(8-1) Получение антител, содержащих Fc-область, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание FcγRIIb
Как описано в справочном примере 7, антигены можно эффективно элиминировать из плазмы живого организма посредством введения антител с селективно увеличенной активностью связывания FcγRIIb, в живой организм. Более того, полагают, что введение антител, содержащих Fc-область с селективно увеличенной активностью связывания FcγRIIb, является предпочтительным с точки зрения безопасности и побочных эффектов в живом организме, в который вводили такие антитела.
Однако в mF44 и mF46 усилено как связывание FcγRIIb мыши, так и связывание FcγRIII мыши, и, таким образом, усиление связывания не является селективным в отношении FcγRIIb мыши. Поскольку гомология между FcγRIIb мыши и FcγRIII мыши является высокой, было бы трудным найти изменение, которое усиливает селективное связывание с FcγRIIb, различающее их. Более того, отсутствуют предшествующие сообщения о Fc-областях с селективно усиленным связыванием FcγRIIb мыши. Также известно, что гомология между FcγRIIb человека и FcγRIIa человека (два аллотипа, 131Arg и 131His) является высокой. Более того, отсутствуют сообщения о Fc-областях, которые содержат изменение, которое усиливает селективное связывание с FcγRIIb человека, различающее их (Seung et al., (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933); Greenwood et al., (Eur. J. Immunol. (1993) 23 (5), 1098-1104)). Более того, описано, что связывание FcγRIIa играет важную роль в активности антитела в отношении агрегации тромбоцитов (Meyer et al., (J. Thromb. Haemost. (2009), 7 (1), 171-181); Robles-Carrillo et al., (J. Immunol. (2010), 185 (3), 1577-1583)). Ввиду этих сообщений, возможно, что антитело с усиленным связыванием FcγRIIa может увеличивать риск развития тромбоза в живом организме, которому вводят его. Таким образом, то, обладают ли антитела с усиленным связыванием FcγRIIa увеличенной активности агрегации тромбоцитов, оценивали следующим образом.
(8-2) Оценка активности связывания FcγR человека у антител, содержащих Fc-область, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание FcγRIIb
Антитела, содержащие Fc-область, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание FcγRIIb человека, анализировали в отношении их аффинности в отношении FcγRIa человека, FcγRIIa R-типа и Н-типа, FcγRIIb и FcγRIIIa по следующей методике. Н-цепь конструировали так, чтобы она имела в качестве вариабельной области Н-цепи человека вариабельную область антитела IL6R-H (SEQ ID NO: 132) против рецептора интерлейкина 6 человека, который описан в WO 2009/125825 и, в качестве константной области Н-цепи антитела, IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133), которая имеет G1d, полученный удалением С-концевого Gly и Lys из IgG1 человека. Затем, IL6R-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) конструировали посредством изменения Fc-области IL6R-G1d посредством замены Ser на Glu в положении 267 (нумерация EU) и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU), как описано в Seung et al., (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933). IL6R-L (SEQ ID NO: 135), которая представляет собой L-цепь антитела против рецептора интерлейкина 6 человека, использовали в качестве L-цепи обычного антитела и экспрессировали в комбинации с соответствующими Н-цепями в соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, и полученные антитела очищали. Далее, антитела, содержащие IL6R-G1d и IL6R-G1d-v3 в качестве тяжелой цепи, обозначают как IgG1 и IgG1-v3, соответственно.
Затем взаимодействие между FcγR и описанными выше антителами кинетически анализировали с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). Анализ взаимодействия проводили при 25°С с использованием HBS-EP+ (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера. Использованный чип представлял собой сенсорный чип СМ5 Series S (GE Healthcare), на который иммобилизован белок А способом присоединения аминов. Каждому FcγR, разбавленному подвижным буфером, позволяли взаимодействовать с представляющими интерес антителами, уловленными на чипе, для измерения связывания антител с каждым FcγR. После измерения 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) подвергали реакции с чипом для смывания уловленных антител, чтобы повторно использовать регенерированный чип. Сенсограмму, полученную в результате измерения, анализировали с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1 с помощью программного обеспечения Biacore Evaluation Software и вычисляли константу скорости связывания ka (л/моль/с) и константу скорости диссоциации kd (1/с), и из этих величин вычисляли константу диссоциации KD (моль/л). Величины KD IgG1 и IgG1-v3 в отношении каждого FcγR представлены в таблице 12 (величины KD каждого антитела в отношении каждого FcγR), в то время как относительные величины KD IgG1-v3, которые получены путем деления KD IgG1 в отношении каждого FcγR на KD IgG1-v3 в отношении каждого FcγR, представлены в таблице 13.
(8-3) Оненка способности агрегировать тромбоциты
Далее оценку того, изменяет ли увеличенная/сниженная аффинность в отношении FcγRIIa антитела, содержащего Fc-область с заменой Ser на Glu в положении 267 и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU) в Fc-области IgG1 способность тромбоцитов к агрегации, проводили с использованием тромбоцитов, полученных от доноров с FcγRIIa типа Н или типа R. Антитело, содержащее в качестве легкой цепи омализумаб_VL-CK (SEQ ID NO: 137) и омализумаб_VH-G1d (SEQ ID NO: 136), которые содержат вариабельную область тяжелой цепи антитела hIgG1 (константная область IgG1 человека), которое связывается с IgE, и константную область тяжелой цепи G1d, конструировали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Более того, омализумаб_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) конструировали путем замены Ser на Glu в положении 267 и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU) в омализумаб_VH-G1d. Омализумаб-G1d-v3, которое содержит омализумаб_VH-G1d-v3 в качестве тяжелой цепи и омализумаб_VL-CK в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Это антитело оценивали в отношении способности к агрегации тромбоцитов.
3
2
4
2
3
2
4
2
2
Агрегацию тромбоцитов анализировали с использованием агрегометра тромбоцитов НЕМА TRACER 712 (LMS Со.). Сначала приблизительно 50 мл цельной крови собирали в фиксированном количестве в 4,5-мл вакуумированных пробирках для сбора крови, содержащих 0,5 мл 3,8% цитрата натрия, и их центрифугировали при 200 g в течение 15 минут. Полученный супернатант собирали и использовали в качестве обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). После того, как PRP промывали буфером А (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO, 0,42 мМ NaHPO, 2 мМ MgCl, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстроза, 1,5 Е/мл апиразы, 0,35% BSA), буфер заменяли буфером В (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl 12 мМ NaHCO, 0, 42 мМ NaHPO, 2 мМ MgCl, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстроза, 2 мМ CaCl, 0,35% BSA). Это обеспечивало промытые тромбоциты при плотности приблизительно 300000/мкл. 156 мкл промытых тромбоцитов разделяли на аликвоты в кюветы для анализа, содержащие мешалку, в агрегометре для тромбоцитов. Тромбоциты перемешивали при 1000 об./мин. мешалкой в кюветах, поддерживаемых при 37,0°С, в агрегометре для тромбоцитов. 44 мкл иммунного комплекса омализумаб-G1d-v3 и IgE в молярном соотношении 1:1, приготовленного в конечных концентрациях 600 мкг/мл и 686 мкг/мл, соответственно, добавляли к кюветы. Тромбоциты подвергали реакции с иммунным комплексом в течение пяти минут. Затем при концентрации, которая не позволяет вторичную агрегацию тромбоцитов, к реакционной смеси добавляли аденозиндифосфат (ADP, SIGMA) для исследования того, усилилась ли агрегация.
Результат агрегации тромбоцитов для каждого донора с полиморфной формой FcγRIIa (R/H или Н/Н), полученной в анализе выше, представлен на фиг. 17 и 18, соответственно. Из результата на фиг. 17 агрегацию тромбоцитов наблюдают, когда иммунный комплекс добавляют к тромбоцитам донора с полиморфной формой FcγRIIa (R/H). Между тем, как показано на фиг. 18, агрегацию тромбоцитов не наблюдали, когда иммунный комплекс добавляли к тромбоцитам донора с полиморфной формой FcγRIIa (Н/Н).
Далее активацию тромбоцитов оценивали с использованием маркеров активации. Активацию тромбоцитов можно измерять на основе увеличенной экспрессии маркера активации, такого как CD62p (р-селектин), или активного интегрина на поверхности мембраны тромбоцитов. 2,3 мкл иммунного комплекса добавляли к 7,7 мкл промытых тромбоцитов, приготовленных способом, описанным выше. После реакции в течение пяти минут при комнатной температуре, активацию индуцировали добавлением ADP в конечной концентрации 30 мкМ и оценивали, усиливает ли иммунный комплекс зависимую от ADP активацию. Образец, в который был добавлен буфер (рН 7,4) (Gibco), вместо иммунного комплекса, использовали в качестве отрицательного контроля. Окрашивание проводили посредством добавления в каждый образец после реакции РЕ-меченного антитела против CD62 (BECTON DICKINSON), PerCP-меченного антитела против CD61 и FITC-меченного антитела РАС-1 (BD bioscience). Интенсивность флуоресценции каждым красителем измеряли с использованием проточного цитометра (FACS CantoII, BD bioscience).
Результат экспрессии CD62p, полученный указанным выше способом, представлен на фиг. 19. Результат активированной экспрессии интегринов представлен на фиг. 20. Использованные промытые тромбоциты получали от здорового индивидуума с полиморфной формой FcγRIIa R/H. Уровень экспрессии как CD62p, так и активного интегрина, экспрессированных на поверхности мембраны тромбоцитов, которые индуцируются посредством стимуляции ADP, увеличивался в присутствии иммунного комплекса.
Представленные выше результаты демонстрируют, что антитело, обладающее Fc-областью, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание FcγRIIb человека, которое представляет собой замену Ser на Glu в положении 267 и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU) в Fc-области IgG1, ускоряет агрегацию тромбоцитов, экспрессирующих FcγRIIa с аллотипом FcγRIIa, в котором аминокислота в положении 131 представляет собой R, по сравнению с тромбоцитами, экспрессирующими FcγRIIa с полиморфной формой FcγRIIa, в которой аминокислота в положении 131 представляет собой Н. Таким образом, было предположено, что риск развития тромбоза вследствие агрегации тромбоцитов может быть увеличен, когда антитело, содержащее Fc-область, в которую внесено известное изменение, которое усиливает связывание с известным FcγRIIb человека, вводят человеку, имеющему FcγRIIa R-типа по меньшей мере в одном аллеле. Было показано, что антигенсвязывающие молекулы, содержащие Fc-область по настоящему изобретению, которая усиливает связывание FcγRIIb более селективно, не только увеличивает время удержания антигена в плазме, но также возможно решает указанные выше проблемы. Таким образом, применимость антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению является очевидной.
(8-4) Сравнение способности к агрегации тромбоцитов между антителом (ВР230), содержащим Fc с селективно усиленным связыванием FcγRIIb, и антителом, содержащим известную Fc с селективно усиленным связыванием FcγRIIb
(8-4-1) Получение антител с селективно усиленным связыванием FcγRIIb
Как описано в примере (8-3), было показано, что антитела с усиленным связыванием FcγRIIa обладают усиленной способностью к агрегации тромбоцитов и увеличенной способностью к активации тромбоцитов, и они могут увеличивать риск развития тромбоза при введении человеку. Между тем, учитывая, что среди FcγR, только FcγRIIa экспрессируется на тромбоцитах, полагают, что антитела с селективно усиленным связыванием FcγRIIb не демонстрируют увеличенной способности агрегировать тромбоциты или способности к активации или не увеличивают риска развития тромбоза при введении человеку. Для подтверждения этого, антитела с селективно усиленным связыванием FcγRIIb фактически исследовали в отношении их способности агрегировать тромбоциты и способности активировать тромбоциты.
В частности, омализумаб_VH-G1d (SEQ ID NO: 136) и омализумаб_VL-CK (SEQ ID NO: 137), в качестве тяжелой цепи и легкой цепи hIgG1-антитела (константная область IgG1 человека), которое связывается с IgE, соответственно, получали способом, описанным в справочном примере 2. Затем для селективного увеличения активности связывания FcγRIIb человека у омализумаб_VH-G1d, получали омализумаб_VH-ВР230 (SEQ ID NO: 140) путем замены Glu на Asp в положении 233, Gly на Asp в положении 237, Pro на Asp в положении 238, His на Asp в положении 268, Pro на Gly в положении 271, Tyr на Asp в положении 296, Ala на Arg в положении 330 и Lys на Glu в положении 439 (нумерация EU). Аналогично, для увеличения активности связывания FcγRIIb и FcγRIIa R человека у омализумаб_VH-G1d, получали омализумаб_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) путем замены Ser на Glu в положении 267 и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU).
Омализумаб-ВР230, который содержит омализумаб_VH-ВР230 (SEQ ID NO: 140) в качестве тяжелой цепи и омализумаб_VH-CK (SEQ ID NO: 137) в качестве легкой цепи, и омализумаб-G1d-v3, который содержит омализумаб_VH-G1d-v3 (SEQ ID NO: 138) в качестве тяжелой цепи и омализумаб_VL-CK (SEQ ID NO: 137) в качестве легкой цепи, получали с использованием способа, описанного в справочном примере 2. Эти антитела оценивали в отношении их способности агрегировать и активировать тромбоциты.
(8-4-2) Оценка омализумаб-ВР230 и омализумаб-G1d-v3 в отношении их активности связывания FcγR человека
Результаты анализа аффинности между каждым FcγR человека и Fc-областью омализумаб-G1d-v3 в результате усиления связывания FcγRIIb человека с омализумабом, которое представляет собой известное антитело, представлены в примере (8-2). Аффинность Fc-области омализумаб-ВР230 в отношении каждого FcγR человека также анализировали аналогичным образом, и результаты представлены в таблице 22.
(8-4-3) Оценка способности агрегировать тромбоциты
Затем омализумаб-ВР230 и омализумаб-G1d-v3, полученные, как описано в примере (8-4-1), анализировали в отношении их связывания с использованием тромбоцитов из донора с полиморфной формой FcγRIIa (R/H). Результат анализа использовали для оценки того, изменяется ли способность к агрегации тромбоцитов в зависимости от уровня аффинности в отношении FcγRIIa.
3
2
4
2
3
2
4
2
2
Анализ агрегации тромбоцитов проводили с использованием агрегометра тромбоцитов НЕМА TRACER 712 (LMS Со.). Сначала приблизительно 50 мл цельной крови собирали в фиксированном количестве в 4,5-мл вакуумированных пробирках для сбора крови, содержащих 0,5 мл 3,8% цитрата натрия, и их центрифугировали при 200 g в течение 15 минут. Полученный супернатант собирали и использовали в качестве обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). После того, как PRP промывали буфером А (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO, 0,42 мМ NaHPO, 2 мМ MgCl, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстроза, 1,5 Е/мл апиразы, 0,35% BSA), буфер заменяли буфером В (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO, 0,42 мМ NaHPO, 2 мМ MgCl, 5 мМ HEPES, 5,55 мМ декстроза, 2 мМ CaCl, 0,35% BSA). Это обеспечивало промытые тромбоциты при плотности приблизительно 300000/мкл. 150,2 мкл промытых тромбоцитов разделяли на аликвоты в кюветы для анализа, содержащие мешалку, в агрегометре для тромбоцитов. Тромбоциты перемешивали при 1000 об./мин. мешалкой в кюветах, поддерживаемых при 37,0°С, в агрегометре для тромбоцитов. 24,3 мкл омализумаб-G1d-v3 или омализумаб-ВР230, приготовленных в конечной концентрации 600 мкг/мл, добавляли в кюветы. После реакции в течение одной минуты, добавляли 25,4 мкл IgE, который был приготовлен так, чтобы его молярное отношение к антителу составляло 1:1. Смеси инкубировали в течение пяти минут. Затем к реакционной смеси добавляли аденозиндифосфат (ADP, SIGMA) в концентрации, которая не индуцирует вторичной агрегации тромбоцитов, для исследования того, усиливается ли агрегация. Использованные промытые тромбоциты были получены от одного здорового индвидуума с полиморфной формой FcγRIIa R/H.
Результат, полученный с помощью описанного выше способа, представлен на фиг. 21. Результат, представленный на фиг. 21, показал, что тромбоциты сильно агрегировались при добавлении иммунного комплекса, содержащего омализумаб-G1d-v3. С другой стороны, не было отличий в агрегации тромбоцитов между тем, когда добавляли PBS, и тем, когда добавляли иммунный комплекс, содержащий омализумаб-ВР230.
Далее оценивали активацию тромбоцитов посредством омализумаб-G1d-v3 и омализумаб-ВР230. Активацию тромбоцитов можно измерять на основе увеличенной экспрессии маркера активации, такого как CD62p (р-селектин), или активного интегрина на поверхности мембраны тромбоцитов. 1,22 мкл омализумаб-G1d-v3 или омализумаб-ВР230, приготовленного в конечной концентрации 600 мкг/мл добавляли к 7,51 мкл промытых тромбоцитов, приготовленных способом, описанным выше. После реакции в течение пяти минут при комнатной температуре добавляли 1,27 мкл IgE, который был получен так, что его молярное отношение к антителу составляло 1:1. Затем после реакции в течение пяти минут при комнатной температуре, оценивали то, индуцируется ли активация тромбоцитов. Использованный отрицательный контроль представлял собой образец, в который был добавлен фосфатный буфер (рН 7,4, Gibco) вместо иммунных комплексов. После реакции каждый образец подвергали флуоресцентному окрашиванию с использованием РЕ-меченного антитела против CD62 (BECTON DICKINSON), PerCP-меченного антитела против CD61 и FITC-меченного антитела РАС-1 (BD bioscience) и определяли интенсивность флуоресценции с использованием проточного цитометра (FACS CantoII, BD bioscience). Использованные промытые тромбоциты были получены от одного здорового индивидуума с полиморфной формой FcγRIIa R/H.
Результаты, полученные с помощью описанного выше способа анализа, представлены на фиг. 22 и 23. Экспрессия как CD62p, так и активного интегрина, на поверхности мембраны тромбоцитов, увеличивалась при добавлении иммунного комплекса, содержащего омализумаб-G1d-v3. Между тем, экспрессия молекул на поверхности мембраны тромбоцитов при добавлении иммунного комплекса омализумаб-ВР230, была сравнимой с экспрессией на поверхности мембраны тромбоцитов при добавлении фосфатного буфера.
Представленные выше результаты демонстрируют, что антитело, которое содержит известную модифицированную Fc-область с заменами Ser на Glu в положении 267 и Leu на Phe в положении 328 (нумерация EU) в Fc-области IgG1 и которое обладает усиленным связыванием как с FcγRIIb человека, так и с FcγRIIa R человека, ускоряет агрегацию и активацию тромбоцитов, когда аминокислота в положении 131 представляет собой Arg по меньшей мере в любом из аллеллей полиморфного гена FcγRIIa, по сравнению с антителом, которое содержит Fc-область с заменами Glu на Asp в положении 233, Gly на Asp в положении 237, Pro на Asp в положении 238, His на Asp в положении 268, Pro на Gly в положении 271, Tyr на Asp в положении 296, Ala на Arg в положении 330 и Lys на Glu в положении 439 (нумерация EU) и которое обладает селективно усиленным связыванием с FcγRIIb человека. В частности, было предположено, что антитело, которое содержит вариант известной Fc-области с усиленным связыванием FcγRIIb человека имеет проблему, что оно может увеличивать риск развития тромбоза вследствие агрегации тромбоцитов у человека с аллелем R FcγRIIa; с другой стороны, было продемонстрировано, что вариант Fc-области с селективно усиленным связыванием FcγRIIb преодолевает эту проблему.
[Пример 9] Детальный анализ связывания FcγRIIb для вариантов, в которые внесено изменение в шарнирной области в дополнение к изменению P238D
В Fc, полученной путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp во встречающемся в природе IgG1 человека, ожидаемый комбинаторный эффект не мог быть достигнут даже путем комбинирования его с другим изменением, для которого предсказано, что оно далее повышает связывание FcγRIIb, исходя из анализа встречающихся в природе антител. Таким образом, чтобы найти варианты, которые далее усиливают связывание FcγRIIb, вносили всесторонние изменения в измененную Fc, полученную путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp. IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141) получали путем внесения изменения в виде замены Met в положении 252 (нумерация EU) на Tyr и изменения путем замены Asn в положении 434 (нумерация EU) на Tyr в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133), которую использовали в качестве Н-цепи антитела. Более того, IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142) получали путем внесения изменения путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp в IL6R-F11. Экспрессирующие плазмиды, содержащие последовательность Н-цепи антитела, получали для каждой из последовательностей Н-цепи антитела, полученных путем замены области вблизи остатка в положении 238 (нумерация EU) (положения с 234 по 237, и 239 (нумерация EU)) в IL6R-F652, в каждом случае на 18 аминокислот, за исключением исходных аминокислот и цистеина. Для всех антител в качестве L-цепи антитела использовали IL6R-L (SEQ ID NO: 135). Эти варианты экспрессировали и очищали способом справочного примера 2. Эти варианты Fc названы вариантами PD. Взаимодействия каждого варианта PD с FcγRIIa типа R и FcγRIIb детально оценивали способом справочного примера 25.
График, на котором показаны результаты анализа взаимодействия с соответствующими FcγR, строили в соответствии со следующим способом. Величина, полученная делением значения величины связывания каждого варианта PD с каждым FcγR на значение величины связывания FcγR предварительно измененного антитела, которое использовали в качестве контроля (IL6R-F652/IL6R-L, который имеет изменение в виде замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp, а затем умножения результата на 100, показана в качестве относительной величины активности связывания каждого варианта PD с каждым FcγR. На горизонтальной оси показаны относительные величины активности связывания FcγRIIb для каждого варианта PD, и на вертикальной оси показаны относительные величины активности связывания FcγRIIa типа R для каждого варианта PD (фиг. 24).
В результате было выявлено, что связывание FcγRIIb в случае одиннадцати типов изменении усиливалось по сравнению с антителом до внесения изменений, и они обладают эффектами сохранения или усиления связывания FcγRIIa типа R. Активность этих одиннадцати вариантов в отношении связывания FcγRIIb и FcγRIIa типа R обобщенно представлена в таблице 14. В таблице номера ID последовательностей относится к номерам Н-цепей вариантов и изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141).
На фиг. 25 показаны относительные величины для активности связывания FcγRIIb, полученной путем дальнейшего внесения указанных выше одиннадцати изменений в вариант, имеющий изменение P238D, и относительные величины для активности связывания FcγRIIb варианта, полученного путем внесения этих изменений в Fc, который не содержит P238D. Эти одиннадцать изменений усиливали связывание FcγRIIb по сравнению с тем, что было до внесения, когда их дополнительно вносили в вариант P238D. Напротив, наблюдали эффект снижения связывания FcγRIIb для восьми из этих изменений, за исключением G237F, G237W и S239D, когда их вносили в вариант, который не содержит P238D (данные не представлены).
Эти результаты показали, что, исходя из эффектов внесения изменений во встречающийся в природе IgG1 трудно предсказать эффекты комбинирования и внесения тех же изменений в вариант, содержащий изменение P238D. Иными словами, невозможно выявить эти восемь изменений, идентифицированных в этот раз, без этого исследования, в котором указанные изменения комбинируют и вносят в вариант, содержащий изменение P238D.
Результаты измерения величин KD вариантов, указанных в таблице 14 для FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIaV способом справочного примера 25, обобщенно представлены в таблице 15. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141). Матрица, использованная для получения IL6R-F11, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD(IIaR)/KD(IIb) и KD(IIaH)/KD(IIb) в таблице, соответственно, показывают величину, полученную путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD каждого варианта для FcγRIIb, и величины, полученной делением величины KD каждого варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) варианта относится к величине, полученной путем деления величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта для FcγRIIb.
Кроме того, в таблице 15 показаны величины KD для более сильной активности связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH каждого варианта/величины KD для более сильной активности связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. В этом случае, исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-F11 (SEQ ID NO: 141) в качестве Н-цепи. Было определено, что, вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать с помощью анализа кинетики, и, таким образом, закрашенные серым цветом ячейки в таблице 15 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 2 справочного примера 25.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-С.
В таблице 15 показано, что у всех вариантов аффинность связывания с FcγRIIb повышалась по сравнению с IL6R-F11, и диапазон улучшения составлял от 1,9 раза до 5,0 раз. Соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaH/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта в отношении FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания в отношении FcγRIIb. Для исходного полипептида IL6R-F11/IL6R-L, соотношение величина KD для FcγRIIaR/величина KD для FcγRIIb и соотношение величина KD для FcγRIIaH/величина KD для FcγRIIb в обоих случаях равно 0,7, и, соответственно, все варианты, представленные в таблице 15, продемонстрировали увеличение селективности связывания в отношении FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда отношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 0,7 до 5,0 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что связывание при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH вариантов, полученных на этот раз, было практически таким же или сниженным по сравнению с исходным полипептидом. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные в этом случае, имеют сохраненную или сниженную активность связывания с FcγRIIa типа R и типа Н, и усиленную активность связывания с FcγRIIb и, таким образом, обладают увеличенной селективностью в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-F11, все варианты имели более низкую аффинность в отношении FcγRIa и FcγRIIIaV.
[Пример 10] Рентгеноструктурный анализ комплекса, образованного между Fc, содержащей P238D, и внеклеточной областью FcγRIIb
Как показано ранее в примере 9, даже несмотря на то, что вносят изменение, для которого из анализа встречающихся в природе IgG1-антител предсказано, что оно повышает активность связывания FcγRIIb или селективность к FcγRIIb, в Fc, содержащую P238D, было выявлено, что активность связывания FcγRIIb снижается, и причиной для этого может быть то, что структура на поверхности взаимодействия между Fc и FcγRIIb изменяется вследствие внесения P238D. Таким образом, для установления причины этого явления определяли трехмерную структуру комплекса, образованного между Fc IgG1, содержащей мутацию P238D (далее, обозначаемой как Fc(P238D)), и внеклеточной областью FcγRIIb с помощью рентгеноструктурного анализа, и ее сравнивали с трехмерной структурой комплекса, образованного между Fc встречающегося в природе IgG1 (далее обозначаемой как Fc(WT)) и внеклеточной областью FcγRIIb, и сравнивали способы связывания. Было сделано множество сообщений о трехмерной структуре комплекса, образованного между Fc и внеклеточной областью FcγR; и были проанализированы трехмерные структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIb (Nature, 2000, 400: 267-273; J. Biol. Chem. 2011, 276: 16469-16477), комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108: 12669-126674), и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa (J. Immunol. 2011, 187: 3208-3217). Хотя трехмерная структура комплекса Fc(WT) /внеклеточная область FcγRIIb не была проанализирована, трехмерная структура комплекса, образованного с Fc(WT), известна для FcγRIIa и FcγRIIb, и их внеклеточные области совпадают на 93% по аминокислотной последовательности и имеют очень высокую гомологию. Таким образом, трехмерная структура Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb была предсказана путем моделирования с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa.
Трехмерная структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb была определена с помощью рентгеноструктурного анализа при разрешении 2,6 Å. Структура, полученная в результате этого анализа, представлена на фиг. 26. Внеклеточная область FcγRIIb связывается между двумя СН2-доменами Fc, и это было аналогично трехмерным структурам комплексов, образованных между  Fc(WT) и соответствующей внеклеточной областью FcγRI На, FcγRIIIb или FcγRIIa, проанализированных до настоящего времени.
Далее для детального сравнения кристаллическую структуру комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb накладывали друг на друга с помощью аппроксимации методом наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Cα в отношении  внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена A Fc (фиг. 27). В этом случае, степень перекрывания между СН2-доменами В Fc не была удовлетворительной, и в этой части были выявлены конформационные различия. Более того, с использованием кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb, отбирали пары атомов, которые имеют расстояние 3,7 Å или менее между отобранной внеклеточной областью FcγRIIb и СН2-доменом В Fc и сравнивали для сравнения межатомного взаимодействия между FcγRIIb и СН2-доменом В в Fc(WT) с межатомным взаимодействием между FcγRIIb и Fc(P238D). Как показано в таблице 16, межатомные взаимодействия между СН2-доменом В Fc и FcγRIIb в Fc(P238D) и Fc(WT) не совпадали.
Более того, детальные структуры в области P238D сравнивали путем наложения рентгеновской кристаллической структуры комплекса Fc (P238D)/внеклеточная область FcγRIIb на модельную структуру комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIb с использованием метода наименьших квадратов на основе атомного расстояния Са между СН2-доменами А и В Fc отдельно. Поскольку положение аминокислотного остатка в положении 238 (нумерация EU), т.е. положение мутагенеза Fc (P238D), изменено относительно Fc (WT), было выявлено, что структура петли в области аминокислотного остатка в положении 238 после шарнирной области отличается между Fc (P238D) и Fc (WT) (фиг. 28). Pro в положении 238 (нумерация EU) первоначально расположен внутри Fc (WT), образуя гидрофобную сердцевину с остатками в области положения 238. Однако если Pro в положении 238 (нумерация EU) изменен на высоко гидрофильный и заряженный Asp, присутствие измененного остатка Asp в гидрофобной сердцевине является энергетически преимущественным с точки зрения десольватации. Таким образом, в Fc(P238D) для устранения этой энергетически невыгодной ситуации, аминокислотный остаток в положении 238 (нумерация EU) изменяет его ориентацию в сторону растворителя, и это может вызвать это изменение в структуре петли вблизи аминокислотного остатка в положении 238. Более того, поскольку эта петля расположена недалеко от шарнирной области, сшитой связью S-S, ее структурное изменение не будет ограничено локальным изменением, и повлияет на относительно расположение СН2-домена А и домена В Fc. В результате, изменяются межатомные взаимодействия между FcγRIIb и СН2-доменом В Fc. Таким образом, предсказанные эффекты нельзя было наблюдать, когда изменения, которые повышают селективность и активность связывания с FcγRIIb во встречающемся в природе IgG комбинировали с Fc, содержащим изменение P238D.
Более того, в результате структурных изменений вследствие внесения P238D в СН2-домен A Fc, была выявлена водородная связь между основной цепью Gly в положении 237 (нумерация EU), которое является соседним с мутантным P238D и Tyr в положении 160 в FcγRIIb (фиг. 29). Остаток в FcγRIIa, который соответствует этому Tyr160, представляет собой Phe; и, когда происходит связывание с FcγRIIa, эта водородная связь не образуется. Учитывая, что аминокислота в положении 160 представляет собой одно из небольшого количества отличий между FcγRIIa и FcγRIIb на границе взаимодействия с Fc, и присутствие этой водородной связи, которая является специфичной к FcγRIIb, предположительно привело к повышению активности связывания FcγRIIb и снижению активности связывания FcγRIIa в Fc(P238D) и повышению его селективности. Более того, в СН2-домене В Fc наблюдают электростатическое взаимодействие между Asp в положении 270 (нумерация EU) и Arg в положении 131 в FcγRIIb (фиг. 30). В FcγRIIa типа Н, который является одним из аллотипов FcγRIIa, остаток соответствующий Arg в положении 131 FcγRIIb представляет собой His, и, таким образом, он не может образовывать это электростатическое взаимодействие. Это может объяснить, почему активность связывания Fc(P238D) снижается в FcγRIIa типа Н по сравнению с FcγRIIa типа R. Наблюдения, сделанные на основе таких результатов рентгеноструктурного анализа, показали, что изменение структуры петли вблизи P238D вследствие внесения P238D и сопутствующего изменения в относительном расположении доменов вызывает формирование новых взаимодействий, которые не встречаются при связывании встречающегося в природе IgG и FcγR, и это могло привести к селективному профилю связывания вариантов P238D в отношении FcγRIIb.
[Экспрессия и очистка Fc(P238D)]
Fc, содержащую изменение P238D, получали следующим образом. Сначала Cys в положении 220 (нумерация EU) hIL6R-IgG1-v1 (SEQ ID NO: 143) заменяли на Ser. Затем генетическую последовательность Fc(P238D) от Glu в положении 236 (нумерация EU) до ее С-конца клонировали способом ПЦР. С использованием этой клонированной генетической последовательности проводили продуцирование экспрессирующих векторов и экспрессию и очистку Fc(P238D) в соответствии со способом справочных примеров 1 и 2. Cys в положении 220 (нумерация EU) образует дисульфидную связь с Cys L-цепи в общем IgG1. L-цепь не коэкспрессируется, когда получают Fc отдельно, и, таким образом, остаток Cys заменяли на Ser, чтобы избежать образования ненужных дисульфидных связей.
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIb]
Внеклеточную область FcγRIIb получали в соответствии со способом справочного примера 25.
[Очитка комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
К 2 мг образца внеклеточной области FcγRIIb, полученного для применения в кристаллизации, добавляли 0,29 мг Endo F1 (Protein Science (1996) 5: 2617-2622), экспрессированного и очищенного из Escherichia coli, в качестве слитого белка глутатион-S-трансферазы. Смеси позволяли стоять при комнатной температуре в течение трех суток в 0,1 М буфере Bis-Tris при 6,5, и N-связанный олигосахарид отщепляли, за исключением N-ацетилглюкозамина прямо связанного с Asn внеклеточной области FcγRIIb. Далее образец внеклеточной области FcγRIIb, подвергнутый обработке для отщепления углевода, который концентрировали путем ультрафильтрации с 5000 MWCO, очищали гель-фильтрацией (Superdex200 10/300) с использованием колонки, уравновешенной в 20 мМ HEPS при рН 7,5, содержавшем 0,05 М NaCl. Более того, к полученной после отщепления углевода фракции внеклеточной области FcγRIIb добавляли Fc(P238D), так чтобы внеклеточная область FcγRIIb в молярном соотношении присутствовала в небольшом избытке. Смесь, концентрированную путем ультрафильтрации с 10000 MWCO, подвергали очистке гель-фильтрацией (Superdex200 10/300) с использованием колонки, уравновешенной в 20 мМ HEPS при рН 7,5, содержащем 0,05 М NaCl. Таким образом, получали образец комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb.
[Кристаллизация комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
С использованием образца комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, который концентрировали до приблизительно 10 мг/мл путем ультрафильтрации с 10000 MWCO, проводили кристаллизацию комплекса способом паровой диффузии с сидячей каплей. Для кристаллизации использовали Hydra II Plus One (MATRIX); и в качестве резервуарного раствора, содержавшего 100 мМ Bis-Tris рН 6,5, 17% PEG3350, 0,2 М ацетат аммония, и 2,7% (масс./об.) D-галактозу, кристаллизационную каплю получали путем смешения соотношения резервуарный раствор : образец для кристаллизации = 0,2 мкл: 0,2 мкл. Емкость закрывали, и кристаллу позволяли стоять при 20°С, и, таким образом, получали плоские кристаллы.
[Измерение данных рентгенодифракции в кристалле комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
1
Один из полученных монокристаллов комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb погружали в раствор 100 мМ Bis-Tris рН 6,5, 20% PEG3350, ацетат аммония, 2,7% (масс./об.) D-галактоза, 22,5% (об./об.) этиленгликоль. Монокристалл вылавливали из раствора с использованием булавки с прикрепленной тонкой нейлоновой петлей и замораживали в жидком азоте. Затем, данные рентгенодифракции кристалла измеряли на оборудовании с магнитотормозном излучением Photon Factory BL-1A in High Energy Accelerator Research Organization. В ходе измерения кристалл постоянно помещали в поток азота при -178°С для поддержания в замороженном состоянии, и было получено всего 225 рентгенограмм с использованием детектора Quantum 270 CCD (ADSC), подсоединенного к линии пучка, с вращением кристалла 0,8° за один раз. Определение параметров ячейки, индексирование дифракционных пятен, и обработку дифракционных данных из полученных рентгенограмм проводили с использованием программы Xia2 (ССР4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) и Scala (CCP4 Software Suite); и, наконец, получали данные об интенсивности дифракции кристалла при разрешении вплоть до 2,46 Å. Кристалл относится к пространственной группе P2, и имеет следующие параметры ячейки; а=48,85 Å, d=76,01 Å, с=115,09 Å, α=90°, β=100,70°, γ=90°.
[Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb]
Кристаллическую структуру комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (ССР4 Software Suite). Из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb было предсказано, что количество комплексов в асимметричном элементе равно единице. Из структурных координат кода PDB: 3SGJ, который представляет собой кристаллическую структуру комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 239-340 и В-цепи в положениях 239-340 брали в качестве отдельных координат, и они были приняты, соответственно, в качестве моделей для поиска СН2-доменов Fc. Участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 341-444 и В-цепи в положениях 341-443 брали в качестве единого набора координат из тех же структурных координат кода PDB: 3SGJ; и они были приняты в качестве модели для поиска СН3-доменов Fc. Наконец, из структурных координат кода PDB: 2FCB, что соответствует кристаллической структуре внеклеточной области FcγRIIb, участки аминокислотных остатков А-цепи в положениях 6-178 выбирали и они были приняты в качестве модели для поиска внеклеточной области FcγRIIb. Ориентацию и положение каждой поисковой модели в кристаллической решетке определяли в порядке СН3-домен Fc, внеклеточная область FcγRIIb и СН2-домен Fc, исходя из функции вращения и функции трансляции, с получением первоначальной модели кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. Когда на полученной первоначальной модели проводили уточнение жесткого тела, которое осуществляет движение двух СН2-доменов Fc, двух СН3-доменов Fc и внеклеточной области FcγRIIb, кристаллографический фактор достоверности, R-величина, становилась равной 40,4%, и свободная R-величина становилась равной 41,9% для данных интенсивности дифракции от 25 Å до 3,0 Å в этот момент времени. Более того, уточнение структуры с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite), и пересмотр модели для выявления карт электронной плотности, коэффициент которых имеет 2Fo-Fc или Fo-Fc, которые вычисляют, исходя из экспериментально определенного структурного фактора Fo, вычисленного структурного фактора Fc и вычисленной фазы с использованием модели, проводили с помощью программы Coot (Paul Emsley). Уточнение модели проводили путем повторения этих стадий. Наконец, в результате включения молекул воды в модель на основе карт электронной плотности, в которых используются 2Fo-Fc или Fo-Fc в качестве коэффициента, и последующего уточнения, кристаллографический фактор достоверности, R-величина, и свободная R-величина модели, содержащей 4846 не являющихся водородом атомами, становились равными 23,7% и 27,6% для 24291 данных интенсивности дифракции при разрешении от 25 Å до 2,6 Å, соответственно.
[Получение модельной структуры комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb]
Исходя из структурных координат кода PDB: 3RY6, что соответствует кристаллической структуре комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIa, функцию Build Mutants программы Discovery Studio 3.1 (Accelrys) использовали для внесения мутаций, чтобы они соответствовали аминокислотной последовательности FcγRIIb, в FcγRIIa в этих структурных координатах. В этом случае уровень оптимизации был установлен на высокий, радиус отсечения был установлен на 4,5, получали пять моделей, и модель с наилучшей энергетической оценкой среди них устанавливали в качестве модельной структуры для комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIb.
[Пример 11] Анализ связывания FcγR вариантами Fc, в которых участки изменения были определены на основе кристаллических структур.
Исходя из результатов рентгеноструктурного анализа комплекса, образованного между Fc(P238D) и внеклеточной областью FcγRIIb, полученной в примере 10, конструировали варианты путем внесения комплексных изменений в участки измененной Fc, имеющей замену Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp, которые, как было предсказано, повлияют на взаимодействие с FcγRIIb (остатки положений 233, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 и 334 (нумерация EU)), и исследовали, можно ли получить комбинации изменений, которые далее усиливают связывание FcγRIIb, в дополнение к изменению P238D.
IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) получали путем внесения в IL6R-G1d (SEQ ID NO: 134), изменения, полученного путем замены Lys в положении 439 (нумерация EU) на Glu. Далее, получали IL6R-BF648 путем внесения в IL6R-B3 замены, полученной путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве общей L-цепи антитела. Эти экспрессированные варианты антител очищали в соответствии со способом справочного примера 2. Связывание каждого из этих вариантов антител с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa типа Н, FcγRIIa типа R, FcγRIIb и FcγRIIIa типа V) детально оценивали способом справочного примера 25.
В соответствии со следующим способом строили график, чтобы показать результаты анализа взаимодействий с соответствующими FcγR. Значение величины связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на величину связывания предварительно измененного контрольного антитела (IL6R-BF648/IL6R-L, изменение путем замены Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp) с каждым FcγR, а затем полученную величину умножали на 100, и она показана в качестве величины относительной активности связывания каждого варианта с каждым FcγR. На горизонтальной оси показана величина относительной активности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и на вертикальной оси показана величина относительной активности связывания каждого варианта с FcγRIIa типа R (фиг. 31).
Как показано на фиг. 31, результаты показывают, что из всех изменений, как было выявлено, 24 типа изменений сохраняют или усиливают связывание FcγRIIb по сравнению с предварительно измененным антителом. Связывание этих вариантов с каждым из FcγR представлено в таблице 17. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*).
Результаты измерения величин KD вариантов, представленных в таблице 17 в отношении FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIa типа V с помощью способа справочного примера 25, обобщенно представлены в таблице 18. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD (IIaR) /KD (IIb) и KD (IIaH)/KD (IIb) в таблице, соответственно, соответствуют величине, полученной путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD каждого варианта для FcγRIIb, и величине, полученной делением величины KD каждого варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) измененного полипептида относится к величине, полученной делением величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. Кроме того, величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaFI каждого варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида представлена в таблице 18. Здесь исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) в качестве Н-цепи. Было определено, что, вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать с помощью анализа кинетики, и, таким образом, закрашенные серым цветом ячейки в таблице 18 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 2 справочного примера 25.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C
В таблице 18 показано, что, по сравнению с IL6R-B3, все варианты показали улучшение аффинности в отношении FcγRIIb, и диапазон улучшения составлял от 2,1 раза до 9,7 раз. Соотношение величина KD каждого варианта для FcγRIIaR/величина KD каждого варианта для FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта для FcγRIIaH/величина KD каждого варианта для FcγRIIb соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку соотношение величина KD для FcγRIIaR/величина KD для FcγRIIb, и соотношение величина KD для FcγRIIaH/величина KD для FcγRIIb в исходном полипептиде IL6R-B3/IL6R-L составляло 0,3 и 0,2, соответственно, все варианты в таблице 18 показали улучшение селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 4,6 до 34,0 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что по сравнению с исходным полипептидом варианты, полученные на этот раз, имели сниженное связывание при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные на этот раз, имеют сохраненную или сниженную активность связывания FcγRIIa типа R и типа Н, усиленную активность связывания FcγRIIb и увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-B3, все варианты имели более низкую аффинность к FcγRIa и FcγRIIIaV.
Что касается перспективных вариантов среди полученных комбинированных вариантов, факторы, обеспечивающие их эффекты, исследовали с использованием кристаллической структуры. На фиг. 32 показана кристаллическая структура комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре Н-цепь, расположенная слева, представляет собой А-цепь Fc, и Н-цепь, расположенная справа, представляет собой В-цепь Fc. Здесь можно видеть, что участок в положении 233 (нумерация EU) в А-цепи Fc, расположен вблизи Lys в положении 113 FcγRIIb. Однако в этой кристаллической структуре боковая цепь Е233 находится в состоянии в значительной степени высокой подвижности, и ее электронная плотность четко не выявляется. Таким образом, изменение, полученное путем замены Glu в положении 233 (нумерация EU) на Asp, приводит к снижению степени свободы боковой цепи, поскольку боковая цепь становится на один атом углерода короче. В результате, может быть снижена потеря энтропии при формировании взаимодействия с Lys в положении 113 FcγRIIb, и, следовательно, предположительно, это приводит к повышению свободной энергии связывания.
Аналогично, на фиг. 33 показано окружение вблизи участка в положении 330 (нумерация EU) в структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb. На этой фигуре показано, что окружение участка в положении 330 (нумерация EU) А-цепи Fc в Fc (P238D) представляет собой гидрофильное окружение, состоящее из Ser в положении 85, Glu в положении 86, Lys в положении 163 и т.п. FcγRIIb. Таким образом, изменение, полученное путем замены Ala в положении 330 (нумерация EU) на Lys или Arg, предположительно приводит к упрочнению взаимодействия с Ser в положении 85 или Glu в положении 86 в FcγRIIb.
На фиг. 34 представлены структуры Pro в положении 271 (нумерация EU) В-цепи Fc после наложения друг на друга кристаллической структуры комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb и комплекса Fc(WT)/внеклеточная область FcγRIIIa путем аппроксимации с помощью метода наименьших квадратов на основе расстояний между парами атомов Cα в отношении В-цепи Fc. Эти две структуры хорошо соответствуют, но имеют различные трехмерные структуры Pro в положении 271 (нумерация EU). Когда также учитывают слабую электронную плотность в этой области в кристаллической структуре комплекса Fc(P238D)/внеклеточная область FcγRIIb, предполагается, что существует возможность того, что Pro в положении 271 (нумерация EU) в Fc(P238D)/FcγRIIb вызывает большое напряжение в структуре, таким образом, нарушая равновесие структуры петли для достижения оптимальной структуры. Таким образом, изменение, полученное путем замены Pro в положении 271 (нумерация EU) на Gly, обеспечивает подвижность этой структуры петли и предположительно приводит к усилению связывания путем снижения энергетического барьера, когда позволяют образоваться оптимальной структуре в ходе взаимодействия с FcγRIIb.
[Пример 12] Исследование комбинаторного эффекта изменений, которые усиливают связывание FcγRIIb, при комбинировании с P238D.
Из изменений, полученных согласно примерам 9 и 11, изменения, которые усиливали связывание FcγRIIb или сохраняли связывание FcγRIIb и продемонстрировали эффекты подавления связывания с другими FcγR, комбинировали друг с другом, и их эффект исследовали.
Особенно удачные изменения, выбранные из таблиц 14 и 18, вносили в Н-цепь антитела IL6R-BF648 аналогично способу примера 22. IL6R-L использовали в качестве L-цепи, экспрессированные антитела очищали в соответствии со способом справочного примера 1. Связывание с каждым из FcγR (FcγRIa, FcγRIIa Н-типа, FcγRIIa R-типа, FcγRIIb, и FcγRIIIa V-типа) детально оценивали способом справочного примера 25.
В соответствии со следующим способом, относительную активность связывания вычисляли для результатов анализа взаимодействий с соответствующими FcγR. Значение величины связывания каждого варианта с каждым FcγR делили на значение величины связывания предварительно измененного контрольного антитела (IL6R-BF648/IL6R-L с заменами Pro в положении 238 (нумерация EU) на Asp с каждым FcγR, и умножали на 100; а затем эту величину представляли в качестве относительной активности связывания каждого варианта с каждым FcγR (таблица 19).
В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*).
Результаты измерения величин KD вариантов, представленных в таблице 19, для FcγRIa, FcγRIIaR, FcγRIIaH, FcγRIIb и FcγRIIIa типа V способом справочного примера 25, обобщенно представлены в таблицах 20-1 и 20-2. В таблице изменение относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Матрица, использованная для получения IL6R-B3, IL6R-G1d/IL6R-L, обозначена звездочкой (*). Более того, KD(IIaR)/KD(IIb) и KD(IIaH)/KD(IIb) в таблице, соответственно, соответствуют величине, полученной путем деления величины KD каждого варианта для FcγRIIaR на величину KD варианта для FcγRIIb, и величине, полученной путем деления величины KD варианта для FcγRIIaH на величину KD каждого варианта для FcγRIIb. KD(IIb) исходного полипептида/KD(IIb) измененного полипептида относится к величине, полученной путем деления величины KD исходного полипептида в отношении FcγRIIb на величину KD варианта для FcγRIIb. Кроме того, в таблицах 20-1 и 20-2 представлено соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH каждого варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Здесь, исходный полипептид относится к варианту, который имеет IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) в качестве Н-цепи. Было определено, что вследствие слабого связывания FcγR с IgG, его было невозможно точно проанализировать путем анализа кинетики, и, таким образом, величины в закрашенных серым цветом ячейках в таблицах 20-1 и 20-2 показывают величины, вычисленные с использованием уравнения 2 справочного примера 25.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C
В таблицах 20-1 и 20-2 показано, что, по сравнению с IL6R-В3, все варианты продемонстрировали увеличение аффинности к FcγRIIb, и диапазон улучшения составлял от 3,0 раз до 99,0 раз. Соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIaH/величина KD каждого варианта в отношении FcγRIIb соответствует активности связывания FcγRIIb относительно активности связывания FcγRIIaR и активности связывания FcγRIIaH, соответственно. Следовательно, эти величины показывают степень селективности связывания каждого варианта с FcγRIIb, и более высокая величина указывает на более высокую селективность связывания с FcγRIIb. Поскольку соотношение величина KD в отношении FcγRIIaR/величина KD в отношении FcγRIIb, и соотношение величина KD в отношении FcγRIIaH/величина KD для в отношении FcγRIIb исходного полипептида IL6R-B3/IL6R-L составляло 0,3 и 0,2, соответственно, все варианты в таблицах 20-1 и 20-2 показали увеличение селективности связывания с FcγRIIb по сравнению с исходным полипептидом. Когда соотношение величина KD для более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта/величина KD для более сильной из активностей связывания исходного полипептида равно 1 или более, это означает, что более сильная из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH варианта имеет эквивалентное или сниженное связывание по сравнению со связыванием при более сильной из активностей связывания FcγRIIaR и FcγRIIaH исходного полипептида. Поскольку эта величина составляла от 0,7 до 29,9 для вариантов, полученных на этот раз, можно сказать, что связывание при более сильной из активностей связывания вариантов FcγRIIaR и FcγRIIaH, полученных на этот раз, практически эквивалентно или снижено по сравнению с исходным полипептидом. Эти результаты показали, что, по сравнению с исходным полипептидом, варианты, полученные на этот раз, имеют сохраненную или сниженную активность связывания FcγRIIa типа R и типа Н, усиленную активность связывания FcγRIIb и увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Более того, по сравнению с IL6R-B3, все варианты имели более низкую аффинность в отношении FcγRIa и FcγRIIIaV.
[Пример 13] Получение вариантов с усиленным связыванием FcγRIIb
Как показано в примере 8, при усилении связывания FcγRIIb предпочтительно, чтобы связывание FcγRIIb усиливалось при максимальном подавлении связывания с другими активирующими FcγR. Таким образом, авторы настоящего изобретения дополнительно получили варианты с усиленным связыванием FcγRIIb или увеличенной селективностью в отношении FcγRIIb посредством комбинирования изменений, которые усиливают связывание FcγRIIb, или повышения селективности в отношении FcγRIIb. В частности, изменения, описанные в примерах 9, 11 и 12, для которых было выявлено, что они являются эффективными при комбинировании с изменением P238D, комбинировали друг с другом, на основе изменения P238D, которое продемонстрировало превосходный эффект усиления связывания FcγRIIb и повышения селективности к FcγRIIb.
Варианты получали путем комбинирования Fc-областей IL6R-G1d (SEQ ID NO: 133) и IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144) с изменениями E233D, L234Y, G237D, S267Q, H268D, P271G, Y296D, K326D, K326A, A330R и A330K, описанными в примерах 9, 11 и 12, которые, как было выявлено, являются эффективными при комбинировании с изменением P238D. С использованием IL6R-L (SEQ ID NO: 135) в качестве L-цепи антитела, антитела, содержащие описанные выше варианты в тяжелой цепи, экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Полученные варианты, соответственно, оценивали в отношении связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25.
KD каждого варианта в отношении каждого FcγR представлена в таблице 21. "Изменение" относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-B3/IL6R-L, которое используют в качестве матрицы для получения каждого варианта, указано звездочкой (*). "KD (IIaR)/KD (IIb)" в таблице демонстрирует величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR на KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Чем больше величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. "KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида" демонстрирует величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Между тем, KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида демонстрирует величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIaR на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR. В таблице 21 величина в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR с IgG является слишком слабым для анализа посредством анализа кинетики и, таким образом, его вычисляли с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Принимая связывание IL6R-B3/IL6R-L, полученного внесением изменения K439E в Н-цепь IL6R-G1d/IL6R-L, содержащего последовательность нативного IgG1 человека с каждым FcγR, за 1, связывание IL6R-G1d/IL6R-L с FcγRIa составляло 1,3 раза; связывание IL6R-G1d/IL6R-L с FcγRIIaR составляло 1,1 раза; связывание IL6R-G1d/IL6R-L с FcγRIIaH составляло 1,1 раза, связывание IL6R-G1d/IL6R-L с FcγRIIb составляло 1,2 раза и связывание IL6R-G1d/IL6R-L с FcγRIIIaV составляло 0,9 раз. Таким образом, для любого данного типа FcγR, связывание IL6R-B3/IL6R-L с FcγR было сравнимым со связыванием IL6R-G1d/IL6R-L с FcγR. Таким образом, сравнение связывания каждого варианта с каждым FcγR с IL6R-B3/IL6R-L перед внесением изменения предположительно эквивалентно сравнению связывания каждого варианта с каждым FcγR со связыванием IL6R-G1d/IL6R-L, содержащего последовательность нативного IgG1 человека, с каждым каждого FcγR. По этой причине в представленных ниже примерах активность связывания каждого варианта с каждым FcγR будут сравнивать с активностью связывания IL6R-B3/IL6R-L с каждым FcγR перед внесением изменения. В таблице 21 показано, что все варианты обладают увеличенной активностью связывания FcγRIIb по сравнению с IL6R-B3 перед внесением изменения. Активность связывания IL6R-BF648/IL6R-L, которая была наиболее низкой, была увеличена в 2,6 раза, в то время как активность связывания IL6R-BP230/IL6R-L, которая является наиболее высокой, была увеличена в 147,6 раз. Что касается величины KD (IIaR)/KD (IIb), которая соответствует селективности, величина для IL6R-BP234/IL6R-L, которая была наиболее низкой, составляла 10,0, в то время как величина для IL6R-BP231/IL6R-L, которая была наиболее высокой, составляла 32,2. По сравнению с 0,3 для IL6R-B3/IL6R-L перед внесением изменения, эти величины подразумевают, что все варианты обладают увеличенной селективностью. Все варианты продемонстрировали более низкую активностью связывания с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV, чем у IL6R-B3/IL6R-L, перед внесением изменения.
[Пример 14] Рентгеноструктурный анализ комплексов внеклеточной области FcγRIIb или внеклеточной области FcγRIIaR и Fc-области с усиленным связыванием FcγRIIb
Как показано в примере 13, связывание с FcγRIIb варианта IL6R-BP230/IL6R-L, активность связывания которого с FcγRIIb была в наибольшей степени усилена, было усилено приблизительно в 150 раз по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L перед внесением изменения, в то время как его связывание с FcγRIIaR подавлялось приблизительно в 1,9 раза. Таким образом, IL6R-BP230/IL6R-L является превосходным как в отношении связывания FcγRIIb, так и селективности. Однако авторы настоящего изобретения искали возможность создать более предпочтительные варианты с еще более усиленным связыванием FcγRIIb при подавлении связывания FcγRIIaR настолько, насколько это возможно.
Как показано на фиг. 30, описанной в примере 10, в Fc-области с изменением P238D, Asp в положении 270 (нумерация EU) в его СН2-домене В образует прочное электростатическое взаимодействие с Arg в положении 131 в FcγRIIb. Этот аминокислотный остаток в положении 131 представляет собой His в FcγRIIIa и FcγRIIaH, в то время как он представляет собой Arg в FcγRIIaR, как и в FcγRIIb. Таким образом, отсутствует отличие между FcγRIIaR и FcγRIIb с точки зрения взаимодействия аминокислотного остатка в положении 131 с Asp в положении 270 (нумерация EU) в СН2-домене В. Это предположительно является основным фактором низкой селективности между связыванием Fc-области с FcγRIIb и с FcγRIIaR.
С другой стороны, внеклеточные области FcγRIIa и FcγRIIb на 93% идентичны по аминокислотной последовательности и, таким образом, они обладают очень высокой гомологией. Исходя из структурного анализа кристаллов комплекса Fc-области нативного IgG1 (далее сокращенно обозначаемого как Fc (WT)) и внеклеточной области FcγRIIaR (J. Imunol. (2011) 187, 3208-3217), было выявлено различие поверхности контакта между FcγRIIaR и FcγRIIb в их взаимодействии, составляющее только три аминокислоты (Gln127, Leu132, Phe160). Таким образом, авторы настоящего изобретения предположили, что крайне трудно увеличить селективность Fc-области между связыванием FcγRIIb и связыванием FcγRIIaR.
В этом контексте авторы настоящего изобретения предположили, что для дальнейшего усиления активности связывания Fc-области с FcγRIIb и для повышения селективности Fc-областей в отношении связывания с FcγRIIb и FcγRIIaR, было важно установить тонкие различия между взаимодействием Fc-область-FcγRIIb и взаимодействием Fc-область-FcγRIIaR посредством анализа не только трехмерной структуры комплекса Fc-области с усиленным связыванием FcγRIIb и внеклеточной областью FcγRIIb, но также с трехмерной структурой комплекса Fc-области с усиленным связыванием FcγRIIb и внеклеточной областью FcγRIIaR. Сначала авторы настоящего изобретения проанализировали рентгеновскую кристаллическую структуру комплекса внеклеточной области FcγRIIb или FcγRIIaR и Fc (Р208), полученной устранением изменения K439E из Fc-области IL6R-BP208/IL6R-L, полученной, как описано в примере 12, которая была вариантом, используемым в качестве основы для получения IL6R-BP230/IL6R-L.
(14-1) Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc (Р208) и внеклеточной области FcγRIIb
[Экспрессия и очистка Fc (Р208)]
Fc (Р208) получали, как описано ниже. Сначала IL6R-P208 получали путем замены Glu на Lys в положении 439 (нумерация EU) в IL6R-BP208, как и в случае последовательности нативного IgG1 человека. Затем клонировали последовательность гена Fc (Р208), который клонировали способом ПЦР, от Glu в положении 216 (нумерация EU) до С-конца с использованием в качестве матрицы ДНК, кодирующей вариант с заменой Cys на Ser в положении 220 (нумерация EU). Конструирование экспрессирующего вектора, экспрессию и очистку осуществляли в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Между тем, Cys в положении 220 (нумерация EU) в обычном IgG1 образует дисульфидную связь с Cys в L-цепи. При получении Fc-области отдельно, L-цепь не экспрессируется в комбинации. Таким образом, Cys в положении 220 заменяли на Ser, чтобы избежать ненужного образования дисульфидной связи.
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIb]
Внеклеточную область FcγRIIb получали в соответствии со способом, описанным в справочном примере 25.
[Очистка комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
К 0,15 мг очищенного продукта Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622), экспрессированного в Е. coli в качестве слитого белка с глутатион-S-трансферазой, добавляли 1,5 образца для кристаллизации внеклеточной области FcγRIIb. Этому образу в 0,1 М буфере Bis-Tris (рН 6,5) позволяли стоять при комнатной температуре в течение трех суток для отщепления цепи сахаров N-типа, за исключением N-ацетилглюкозамина, прямо связанного с Asn в образце внеклеточной области FcγRIIb. Затем образец внеклеточной области FcγRIIb, подвергнутый обработке для расщепления цепи сахаров, концентрировали с помощью фильтра для ультрафильтрации 5000MWCO и очищали хроматографией с колонкой для гель-фильтрации (Superdex200 10/300), уравновешенной с помощью 20 мМ HEPES (рН 7,5)/0,1 М NaCl. Далее добавляли Fc (Р208) таким образом, чтобы внеклеточная область FcγRIIb присутствовала в немного избыточном молярном соотношении. После концентрирования с помощью фильтра для ультрафильтрации 10000MWCO, очищенную фракцию внеклеточной области FcγRIIb, подвергнутую расщеплению цепи сахаров, очищали хроматографией с колонкой для гель-фильтрации (Superdex200 10/300), уравновешенной 25 мМ HEPES (рН 7,5)/0,1 М NaCl. Очищенную фракцию, полученную, как описано выше, использовали в качестве образца комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb при последующей оценке.
[Кристаллизация комплекс Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
Образец комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, концентрированный приблизительно до 10 мг/мл с помощью фильтра для ультрафильтрации 10000MWCO, кристаллизовали с использованием способа висячей капли посредством диффузии в парах в комбинации со способом внесения затравки. Для кристаллизации использовали планшет VDXm (Hampton Research). С использованием резервуарного раствора 0,1 М Bis-Tris (рН 6,5)/19% (масс./об.) PEG3350/0,2 М двухосновный фосфат калия, получали кристаллизационные капли в соотношении смешения резервуарный раствор : образец для кристаллизации = 0,85 мкл:0,85 мкл. Кристаллы комплекса, полученного в тех же условиях, дробили с помощью Seed Bead (Hampton Research) для получения раствора с затравочными кристаллами. К кристаллизационным каплям добавляли 0,15 мкл разбавленного раствора, полученного из затравочного раствора, и позволяли стоять при 20°С в закрытых резервуарных лунках. Это обеспечило плоские кристаллы.
[Измерение данных рентгенодиффракции для кристалла комплекса Fc (Р208)/FcγRIIb]
1
Один кристалл комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, полученный, как описано выше, погружали в раствор 0,1 М Bis-Tris (рН 6,5)/24% (масс./об.) PEG3350/0,2 М двухосновный фосфат калия/20% (об./об.) этиленгликоль. Затем один кристалл вылавливали из раствора с использованием булавки с прикрепленной к ней нейлоновой петлей и замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодифракции монокристалла получали с помощью Spring-8 BL32XU. В процессе измерения кристалл был постоянно помещен в поток азота при -178°С для сохранения в замороженном состоянии. Было получено всего 300 рентгенодифракционных изображений монокристалла с использованием детектора CCD МХ-225НЕ (RAYONIX), подсоединенного к линии пучка с вращением монокристалла на 0,6° за раз. На основе полученных дифракционных изображений, определения константы решетки, индексирования дифракционных пятен, данных о дифракции проводили обработку с использованием программы Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125-132) и Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Наконец, получали данные об интенсивности монокристалла при разрешении вплоть до 2,81 . Кристалл принадлежит к пространственной группе C222 с константой решетки а=156,69 , b=260,17 , с=56,85, α=90°, β=90° и γ=90°.
[Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb]
Структуру комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). Количество комплексов в асимметричном элементе оценивали, исходя из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb. Сегменты, охватывающие аминокислотные остатки в положениях 239-340 А-цепи и в положениях 239-340 В-цепи, которые были установлены в качестве независимой координаты из структурной координаты кода PDB: 3SGJ для кристаллической структуры комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, использовали в качестве модели для поиска СН2-домена Fc-области. Аналогично, сегменты, охватывающие аминокислотные остатки в положениях 341-444 А-цепи и в положениях 341-443 В-цепи, которые были установлены в качестве координаты из структурной координаты кода PDB: 3SGJ, использовали в качестве модели для поиска СН3-домена Fc-области. Наконец, сегмент, охватывающий аминокислотные остатки в положениях 6-178 А-цепи, который был установлен из структурной координаты кода PDB: 2FCB для кристаллической структуры внеклеточной области FcγRIIb, использовали в качестве модели для поиска Fc (Р208). Авторы настоящего изобретения предприняли попытку определить ориентации и положения соответствующих моделей для поиска СН3-домена Fc-области, внеклеточной области FcγRIIb и СН2-домена Fc-области в кристаллических решетках на основе функции вращения и функции сдвига, но не смогли определить положение одного из СН2-доменов. Затем, ссылаясь на кристаллическую структуру комплекса Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIIa, положение последнего СН2-домена А было определено, исходя из карты электронной плотности, которую вычисляли на основе фазы, определенной для остальных трех частей. Таким образом, авторы настоящего изобретения получили исходную модель кристаллической структуры комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb. Величина кристаллографического фактора достоверности R структурной модели для данных интенсивности дифракции при от 25 до 3,0  составляла 42,6% и величина свободного R составляла 43,7% после детализации жесткого каркаса, где двум СН2-доменам и двум СН3-доменам Fc-области и внеклеточной области FcγRIIb позволяли отклоняться от полученной исходной структурной модели. Затем уточнения структурной модели достигали посредством повторения детализации структуры с использованием программы REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) с последующей проверкой структурной модели, проведенной с использованием программы Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) с помощью карт электронной плотности, где вычисляли коэффициенты 2Fo-Fc и Fo-Fc с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного в соответствии со структурной моделью, и фаз, вычисленных в соответствии со структурной моделью. Затем дальнейшую детализацию проводили на основе карт электронной плотности с коэффициентами 2Fo-Fc и Fo-Fc посредством включения молекул воды в структурную модель. С помощью 27259 данных интенсивности дифракции при разрешении от 25 до 2,81 , конечная величина кристаллографического фактора достоверности R составляла 24,5% и свободная величина R составляла 28,2% для структурной модели, содержащей 4786 атомов, не являющихся атомами водорода.
Трехмерную структуру комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb определяли при разрешении 2,81  посредством анализа структуры. Структура, полученная с помощью этого анализа, представлена на фиг. 35. Было выявлено, что внеклеточная область FcγRIIb связана и расположена между двумя СН2-доменами Fc-области, что напоминает трехмерные структуры ранее анализированных комплексов Fc (WT), которые представляют собой Fc нативного IgG и каждую из внеклеточных областей FcγRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2011) 108, 12 669-12 6674), FcγRIIIb (Nature (2000) 400, 267-273; J. Biol. Chem. (2011) 276, 16469-16477) и FcγRIIa (J. Immunol. (2011) 187 (6), 3208-3217).
Тщательное наблюдение за комплексом Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb выявило изменение в структуре петли в положениях 233-239 (нумерация EU) после шарнирной области в СН2-домене А Fc-области вследствие влияния внесенных изменений G237D и P238D по сравнению с комплексом Fc (WT)/внеклеточная область FcγRIIaR (фиг. 36). Это привело к тому, что главная цепь Asp в положении 237 (нумерация EU) в Fc (Р208) образовывала прочную водородную связь с боковой цепью Tyr в положении 160 в FcγRIIb (фиг. 37). Как в FcγRIIaH, так и в FcγRIIaR, аминокислотный остаток в положении 160 представляет собой Phe, который не способен образовывать такую водородную связь. Это указывает на то, что описанная выше водородная связь вносит важный вклад в усиление связывания FcγRIIb и приобретение селективности связывания Fc (Р208) с FcγRIIa, т.е. повышение активности связывания Fc (Р208)с FcγRIIb и уменьшение активности связывания Fc (Р208)с FcγRIIa.
С другой стороны, боковая цепь Asp в положении 237 (нумерация EU) в Fc (Р208) не формирует ни особенно значительного взаимодействия при связывании FcγRIIb, ни взаимодействия с другими остатками в Fc-области. Ile в положении 332, Glu в положении 333 и Lys в положении 334 (нумерация EU) в Fc-области расположены вблизи Asp в положении 237 (нумерация EU) (фиг. 38). Когда аминокислотные остатки в этих положениях заменены гидрофильными остатками для формирования взаимодействия с боковой цепью Asp в положении 237 (нумерация EU) в Fc (Р208) и структура петли может быть стабилизирована посредством взаимодействия, это может приводить к снижению потери энергии энтропии вследствие образования водородных связей между Fc-областью и Tyr в положении 160 в FcγRIIb и, тем самым, к увеличению свободной энергии связывания, т.е. увеличению активности связывания.
При сравнении рентгеновской кристаллической структуры комплекса Fc (P238D) с изменением P238D и внеклеточной области FcγRIIb, описанного в примере 10, с рентгеновской кристаллической структурой комплекса Fc (Р208) и внеклеточной области FcγRIIb, наблюдают отклонения в пяти участках Fc (Р208) по сравнению с Fc (P238D) и большинство изменений наблюдают только на уровне боковой цепи. Между тем, позиционное отклонение на уровне основной цепи вследствие изменения Pro на Gly в положении 271 (нумерация EU) также наблюдают в СН2-домене В Fc-области и, кроме того, существует структурное изменение в петле в положениях 266-270 (нумерация EU) (фиг. 39). Как описано в примере 11, предполагается, что, когда Asp в положении 270 (нумерация EU) в Fc (P238D) образует прочное электростатическое взаимодействие с Arg в положении 131 в FcγRIIb, взаимодействие может индуцировать стереохимическое напряжение в Pro в положении 271 (нумерация EU). Эксперимент, описанный в настоящем описании, указывает на то, что структурное изменение, наблюдаемое при изменении на Gly для аминокислоты в положении 271 (нумерация EU), предположительно, является результатом устранения структурного искажения, сосредоточенного у Pro, перед изменением и устранение приводит к увеличению свободной энергии для связывания FcγRIIb, т.е. увеличению активности связывания.
Более того, было продемонстрировано, что, вследствие изменения в структуре петли в положениях 266-271 (нумерация EU), Arg в положении 292 (нумерация EU) претерпевает структурное изменение, находясь в двух состояниях. В этом случае, электростатическое взаимодействие (фиг. 39), образованное между Arg в положении 292 (нумерация EU) и Asp в положении 268 (нумерация EU), который является измененным остатком в Fc (Р208), может приводить к стабилизации структуры петли. Поскольку электростатическое взаимодействие между Asp в положении 270 (нумерация EU) в петле и Arg в положении 131 в FcγRIIb по большей части вносит вклад в активность связывания Fc (Р208) с FcγRIIb, вероятно, стабилизация структуры петли в конформации связывания, снизит потерю энергии энтропии при связывании. Таким образом, ожидается, что изменение приведет к увеличению свободной энергии связывания, т.е. увеличению активности связывания.
Более того, исходя из результата структурного анализа, исследовали возможность изменения для увеличения активности. Было обнаружено, что Ser в положении 239 (нумерация EU) является кандидатом для участка внесения изменения. Как показано, на фиг. 40, Ser в положении 239 (нумерация EU) в СН2-домене В присутствует в положении, к которому наиболее естественным образом в структуре обращен Lys в положении 117 в FcγRIIb. Однако поскольку электронной плотности не наблюдали для Lys в положении 117 в FcγRIIb с помощью анализа, описанного выше, Lys не имеет уточненной структуры. В этой ситуации Lys117, вероятно, имеет только ограниченный эффект на взаимодействие с Fc (Р208). Когда Ser в положении 239 (нумерация EU) в СН2-домене В замещен отрицательно заряженным Asp или Glu, ожидается, что такое изменение вызовет электростатическое взаимодействие с положительно заряженным Lys в положении 117 в FcγRIIb, что, тем самым, приводит к повышению активности связывания FcγRIIb.
С другой стороны, наблюдение структуры Ser в положении 239 (нумерация EU) в СН2-домене А показало, что, вследствие образование водородной связи с главной цепью Gly в положении 236 (нумерация EU), боковая цепь этого Ser стабилизировала структуру петли в положениях 233-239, включая Asp в положении 237 (нумерация EU), который образует водородную связь с боковой цепью Tyr в положении 160 в FcγRIIb после шарнирной области (фиг. 37). Стабилизация структуры петли в конформации связывания может снизить потерю энергии энтропии при связывании и привести к увеличению свободной энергии связывания, т.е. увеличению активности связывания. Между тем, когда Ser в положении 239 (нумерация EU) в СН2-домене А заменен на Asp или Glu, структура петли может стать нестабильной вследствие потери водородной связи с главной цепью Gly в положении 236 (нумерация EU). Кроме того, изменение может приводить к электростатическому отталкиванию от Asp в положении 265 (нумерация EU), находящемуся радом, что приведет к дальнейшей дестабилизации структуры петли. Энергия дестабилизации соответствует потере свободной энергии для связывания FcγRIIb, что может приводить к снижению активности связывания.
(14-2) Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc (Р208) и внеклеточной области FcγRIIaR
[Экспрессия и очистка внеклеточной области FcγRIIaR]
Внеклеточную область FcγRIIaR получали в соответствии со способом, описанном в справочном примере 2.
[Очистка комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR]
К 1,5 мг очищенного образца внеклеточной области FcγRIIaR добавляли 0,15 мг очищенного продукта Endo F1 (Protein Science (1996) 5, 2617-2622), экспрессированного в Е. coli в качестве слитого белка с S-трансферазой, 20 мкл 5 Е/мл Endo F2 (QA-bio) и 20 мкл 5 Е/мл Endo F3 (QA-bio). После инкубации в течение 9 суток при комнатной температуре в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,5), к образцу далее добавляли 0,07 мг описанного выше Endo F1, 7,5 мкл описанного выше Endo F2 и 7,5 мкл описанного выше Endo F3, и инкубировали в течение трех суток для отщепления цепи сахаров N-типа, за исключением N-ацетилглюкозамина, прямо связанного с Asn в образце внеклеточной области FcγRIIaR. Затем образец внеклеточной области FcγRIIaR, концентрированный с помощью фильтра для ультрафильтрации 10000MWCO и подвергнутый описанной выше обработке для отщепления цепи сахаров, очищали хроматографией с колонкой для гель-фильтрации (Superdex200 10/300), уравновешенной 25 мМ HEPES (рН 7)/0,1 М NaCl. Далее добавляли Fc (Р208) таким образом, чтобы внеклеточная область FcγRIIaR присутствовала в немного избыточном молярном отношении. После концентрирования с помощью фильтра для ультрафильтрации 10000MWCO, очищенную фракцию внеклеточной области FcγRIIaR, подвергнутую описанной выше обработке для отщепления цепи сахаров очищали хроматографией с колонкой для гель-фильтрации (Superdex200 10/300), уравновешенной 25 мМ HEPES (рН 7)/0,1 М NaCl. Очищенную фракцию, полученную, как описано выше, использовали в качестве образца комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR при последующей оценке.
[Кристаллизация комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR]
Образец комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR, концентрированный приблизительно до 10 мг/мл с помощью фильтра для ультрафильтрации 10000MWCO, кристаллизовали с использованием способа висячей капли посредством диффузии в парах. С использованием резервуарного раствора 0,1 М Bis-Tris (рН 7,5)/26% (масс./об.) PEG3350/0,2 М сульфат аммония, получали кристаллизационные капли в соотношении смешения резервуарный раствор : образец для кристаллизации = 0,8 мкл:1,0 мкл. Капли плотно закрывали и позволяли им стоять при 20°С. Это обеспечило плоские кристаллы.
[Измерение данных рентгене-дифракции для кристалла комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR]
1
Один кристалл комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR, полученный, как описано выше, погружали в раствор 0,1 М Bis-Tris (рН 7,5)/27,5% (масс./об.) PEG3350/0,2 М двухосновный фосфат калия/20% (об./об.) глицерин. Затем один кристалл вылавливали из раствора с использованием булавки с прикрепленной к ней нейлоновой петлей и замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодифракции монокристалла получали на Photon Factory BL-17А института синхротронного излучения в High Energy Accelerator Research Organization. В процессе измерения кристалл был постоянно помещен в поток азота при -178°С для сохранения в замороженном состоянии. Было получено всего 225 рентгенодифракционных изображений монокристалла с использованием детектора CCD Quantum 315r (ADSC), оборудованного линией пучка с вращением монокристалла на 0,6° за раз. На основе полученных дифракционных изображений, определения константы решетки, индексирования дифракционных пятен, данных о дифракции проводили обработку с использованием программы Xia2 (J. Appl. Cryst. (2010) 43, 186-190), XDS Package (Acta Cryst. (2010) D66, 125- 132) и Scala (Acta Cryst. (2006) D62, 72-82). Наконец, получали данные об интенсивности монокристалла при разрешении вплоть до 2,87 . Кристалл принадлежит к пространственной группе C222 с константой решетки а=154,31 , b=257,61 , с=56,19 , α=90°, β=90° и γ=90°.
[Рентгеноструктурный анализ комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR]
Структуру комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674). Количество комплексов в асимметричном элементе оценивали, исходя из размера полученной кристаллической решетки и молекулярной массы комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR. С использованием, в качестве модели для поиска, кристаллографической структуры комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, полученного, как описано в примере (14-1), ориентацию и положение комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR в кристаллической решетке определяли на основе функции вращения и функции сдвига. Величина кристаллографического фактора достоверности R структурной модели для данных интенсивности дифракции при от 25 до 3,0  составляла 38,4% и величина свободного R составляла 30,0% после детализации жесткого каркаса, где двум СН2-доменам и двум СН3-доменам Fc-области и внеклеточной области FcγRIIaR позволяли отклоняться от полученной исходной структурной модели. Затем уточнения структурной модели достигали посредством повторения детализации структуры с использованием программы REFMAC5 (Acta Cryst. (2011) D67, 355-367) с последующей проверкой структурной модели, проведенной с использованием программы Coot (Acta Cryst. (2010) D66, 486-501) с помощью карт электронной плотности, где вычисляли коэффициенты 2Fo-Fc и Fo-Fc с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного в соответствии со структурной моделью, и фаз, вычисленных в соответствии со структурной моделью. Наконец, дальнейшую детализацию проводили на основе карт электронной плотности с коэффициентами 2Fo-Fc и Fo-Fc посредством включения молекул воды в структурную модель. С помощью 24838 данных интенсивности дифракции при разрешении от 25 до 2,87 , конечная величина кристаллографического фактора достоверности R составляла 26,3% и свободная величина R составляла 38,0% для структурной модели, содержащей 4758 атомов, не являющихся атомами водорода.
Трехмерную структуру комплекса Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR определяли при разрешении 2,87  посредством анализа структуры. Сравнение кристаллической структуры между комплексом Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIaR и комплексом Fc (Р208)/внеклеточная область FcγRIIb, описанным в примере (14-1), практически не выявило отличий на уровне общей структуры (фиг. 41), что отражает очень высокую идентичность аминокислот между двумя Fcy-рецепторами.
Однако точное наблюдение структур на уровне электронной плотности обнаружило некоторые различия, которые могут приводить к увеличению селективности между связыванием Fc-области с FcγRIIb и с FcγRIIaR. Аминокислотный остаток в положении 160 в FcγRIIaR представляет собой не Tyr, a Phe. Как показано на фиг. 42, ожидается, что водородная связь между аминокислотным остатком в положении 237 основной цепи (нумерация EU) в СН2-домене А Fc-области и Tyr в положении 160 в FcγRIIb, хотя и образовывалась при связывании между FcγRIIb и Fc-областью с изменением P238D, не будет образовываться при связывании между FcγRIIb и Fc-областью с изменением P238D. Отсутствие образования водородной связи может быть основным фактором повышения селективности между связыванием Fc-области, в которую внесено изменение P238D с FcγRIIb и с FcγRIIaR. Дальнейшее сравнение на уровне электронной плотности показало, что в комплексе Fc-область/FcγRIIb, электронная плотность отчетливо наблюдалась для боковых цепей Leu в положениях 235 (нумерация EU) и 234 (нумерация EU), в то время как электронная плотность боковых цепей была неясной в комплексе Fc-область/FcγRIIaR. Это указывает на то, что петля вблизи положения 237 (нумерация EU) колеблется вследствие сниженного взаимодействия FcγRIIaR в этом положении. Между тем, структурное сравнение СН2-домена В Fc-области (фиг. 43) в той же области выявило, что в комплексе Fc-области и FcγRIIb, наблюдали электронную плотность вплоть до Asp в положении 237 (нумерация EU), в то время как в структуре комплекса Fc-область и FcγRIIaR, электронную плотность наблюдали вплоть до трех остатков перед Asp в положении 237 (нумерация EU), т.е. вплоть до приблизительно Leu в положении 234 (нумерация EU), что указывает на то, что связывание FcγRIIaR формирует взаимодействие на протяжении большей области по сравнению со связыванием FcγRIIb. Описанное выше связывание указывает на вероятность того, что в СН2-домене А Fc-области, область в положениях от 234 до 238 (нумерация EU) вносит большой вклад в связывание между Fc-областью и FcγRIIb, в то время как в СН2-домене В Fc-области в положениях от 234 до 238 (нумерация EU) вносит большой вклад в связывание между Fc-областью и FcγRIIaR.
[Пример 15] Fc-варианты, для которых участки изменения были определены на основе кристаллической структуры
Как описано в примере 14, было предположено, что Asp в положении 268 (нумерация EU) электростатически взаимодействует с Arg в положении 292 (нумерация EU) (фиг. 39) в результате локального структурного изменения вследствие внесения изменения P271G в домен В варианта с усиленным связыванием FcγRIIb (Р208). Существует вероятность того, что структура петли в положениях 266-271 (нумерация EU) стабилизируется при формировании взаимодействия, что приводит к усилению связывания FcγRIIb. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, можно ли усилить связывание FcγRIIb посредством дополнительной стабилизации его структуры петли вследствие усиления электростатического взаимодействия посредством замены Asp на Glu в положении 268 (нумерация EU) в варианте. С другой стороны, как показано на фиг. 38, Tyr в положении 160 (нумерация EU) FcγRIIb взаимодействует с Asp основной цепи в положении 237 (нумерация EU) в домене А Р208. Между тем боковая цепь Asp в положении 237 (нумерация EU) расположена близко к Ile в положении 332, Glu в положении 333 и Lys в положении 334 (нумерация EU) в молекуле без формирования какого-либо особенно значимого взаимодействия. Таким образом, авторы настоящего изобретения также оценивали, может ли взаимодействие с Tyr в положении 160 в FcγRIIb быть усилено посредством стабилизации структуры петли в положениях 266-271 (нумерация EU) вследствие увеличенного взаимодействия с боковой цепью Asp в положении 237 (нумерация EU) посредством замены гидрофильных аминокислотных остатков в положениях, описанных выше.
Варианты, в которые внесено каждое из изменений Н268Е, I332T, I332S, I332E, I332K, E333K, E333R, E333S, Е333Т, K334S, K334T и K334E, которые были выявлены на основе структурной информации, получали с использованием в качестве матрицы IL6R- BP230/IL6R-L, полученного как описано в примере 13, который проявлял превосходную селективность в отношении FcγRIIb. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и описанные выше варианты тяжелой цепи, экспрессировали и очищали способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении их связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25.
KD каждого варианта в отношении FcγR представлена в таблице 22. В таблице "изменение" относится к изменению IL6R-BP3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-B3/IL6R-L, которое использовали в качестве матрицы для получения IL6R-BP230, указано звездочкой (*). KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида в таблице показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Между тем, KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγR IIaR на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR на KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. В таблице 22 число в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR в IgG было слишком слабым для корректного анализа с помощью кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Как активность связывания FcγRIIb, так и селективность в отношении FcγRIIb у IL6R-BP264/IL6R-L, IL6R-BP465/IL6R-L, IL6R-BP466/IL6R-L и IL6R-BP470, полученных внесением изменений Н268Е, E333K, E333R и Е333Т, соответственно, в IL6R-BP230/IL6R-L, были увеличенными по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L. Селективность в отношении FcγRIIb у IL6R-BP391/IL6R-L, в которое внесено изменение I332T, была снижена, в то время как его активность связывания FcγRIIb была увеличена по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L.
[Пример 16] Исчерпывающее внесение изменений в аминокислотные остатки в положении 271 (нумерация EU)
При структурном сравнении между Fc (Р208) и FcγRIIb и Fc (P238D)/FcγRIIb, наиболее значительное отличие выявлено в структуре в положении 271 (нумерация EU) в СН2-домене В Fc-области (фиг. 39). Как описано в примере 11, было предположено, что, когда в Fc (P238D) Asp в положении 270 (нумерация EU) формирует прочное электростатическое взаимодействие с Arg в положении 131 в FcγRIIb, взаимодействие может индуцировать стереохимическое напряжение у Pro в положении 271 (нумерация EU). В структуре Fc (Р208)/FcγRIIb, вследствие замены Pro на Gly в положении 271 (нумерация EU), происходило позиционное отклонение на уровне основного цепи, устраняющее структурное искажение, что приводило к значительному структурному изменению в области положения 271. Существует вероятность того, что дополнительная стабилизация структуры, измененной в области положения 271, далее снизит потерю энергии энтропии, вызываемую связыванием, при формировании электростатического взаимодействия с Arg в положении 131 в FcγRIIb. Таким образом, проводили поиск изменений, которые усиливают связывание Fc-области с FcγRIIb или увеличивают ее селективность в отношении FcγRIIb посредством исчерпывающего внесения изменений в аминокислотные остатки в области положения 271 (нумерация EU).
IL6R-BP267 конструировали в качестве матрицы для исчерпывающего внесения изменений путем внесения изменений E233D, G237D, P238D, Н268Е и P271G в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и описанные выше варианты тяжелой цепи, экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25. Аминокислоты в положениях 264, 265, 266, 267, 269 и 272 (нумерация EU) в IL6R-BP267 заменяли на каждую из 18 типов аминокислот, за исключением Cys и аминокислоты до замены. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и описанные выше варианты тяжелой цепи, экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочном примере 1 и 2. Антитела, очищенные способом справочного примера 25, оценивали в отношении их связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25. Варианты, связывание которых с FcγRIIb было усилено или селективность которых в отношении FcγRIIb была увеличена по сравнению со связыванием FcγRIIb или селективностью в отношении FcyIIb у IL6R-BP267/IL6R-L до внесения изменений, представлены в таблице 23.
Величина KD каждого варианта в отношении каждого FcγR представлена в таблице 23. В таблице "изменение" относится к изменению, внесенному в IL6R-BP3, которое использовали в качестве матрицы. IL6R-B3/IL6R-L, которое использовали в качестве матрицы для получения IL6R-BP267, обозначено звездочкой (*). В таблице KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Между тем, KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида показывает величину, полученную делением KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIaR на KD каждого варианта в отношении FcγR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением величины KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR на величину KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. В таблице 23, число в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR в IgG было слишком слабым для корректного анализа с помощью кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Активность связывания всех вариантов, представленных в таблице 23, в отношении FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV, была сравнимой или сниженной по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L. Между тем, активность связывания FcγRIIb вариантов, полученных добавлением изменений S267A, V264I, E269D, S267E, V266F, S267G и V266M, соответственно, к IL6R-BP267/IL6R-L, была увеличена по сравнению с IL6R-BP267/IL6R-L перед внесением изменения. Между тем, величины KD (IIaR)/KD (IIb) вариантов, полученных внесением изменений S267A, S267G, Е272М, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I и E272F, соответственно, в IL6R-BP267/IL6R-L, были увеличены по сравнению с IL6R-BP267/IL6R-L перед внесением изменения. Это демонстрирует, что изменения S267A, S267G, Е272М, E272Q, D265E, E272D, E272N, V266L, E272I и E272F вызывают эффект повышения селективности в отношении FcγRIIb.
[Пример 17] Усиление связывания FcγRIIb посредством внесения изменений в область СН3
Сообщалось, что изменение посредством замены Pro на Leu в положении 396 (нумерация EU) усиливает связывание FcγRIIb (Cancer Res. (2007) 67, 8882-8890). Аминокислота в положении 396 (нумерация EU) присутствует в положении, которое не прямо вовлечено во взаимодействие с FcγR. Однако можно предположить, что аминокислота обладает эффектом на взаимодействие с FcγR посредством изменения структуры антитела. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, усиливается ли связывание Fc-области с FcγRIIb или увеличивается ли ее селективность в отношении FcγRIIb посредством исчерпывающего внесения аминокислотных изменений в положении 396 (нумерация EU) в Fc-области.
При исчерпывающем внесении изменений IL6R-BP423 конструировали в качестве матрицы путем внесения изменений E233D, G237D, P238D, S267A, Н268Е, P271G и A330R в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Конструировали варианты, в которых аминокислоту в положении 396 (нумерация EU) в IL6R-BP423 заменяли каждым из 18 типов аминокислот, за исключением цистеина и аминокислоты до внесения замены. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и описанные выше варианты тяжелой цепи, экспрессировали и очищали способом, описанным в справочном примере 1. Очищенные антитела оценивали в отношении их связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25. Связывание полученных вариантов с каждым FcγR представлено в таблице 24.
В таблице "изменение, внесенное в IL6R-BP423," относится к изменению, внесенному в IL6R-BP423, которое использовали в качестве матрицы. IL6R-B3/IL6R-L, которое использовали в качестве матрицы для получения IL6R-BP423, обозначено звездочкой (*). В таблице KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Между тем, KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγR IIaR на величину KD каждого варианта в отношении FcγR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR, на KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. В таблице 24 число в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR в IgG было слишком слабым для корректного анализа с помощью кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в примере 25.
Результат, представленный в таблице 24, демонстрирует, что: активность связывания FcγRIIb у
IL6R-BP456/IL6R-L, полученного внесением изменения Р396М в IL6R-BP42 3/IL6R-L,
IL6R-BP455/IL6R-L, полученного внесением изменения P396L в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP464/IL6R-L, полученного внесением изменения P396Y в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP450/IL6R-L, полученного внесением изменения P396F в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP448/IL6R-L, полученного внесением изменения P396D в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP458/IL6R-L, полученного внесением изменения P396Q в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP453/IL6R-L, полученного внесением изменения P396I в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP449/IL6R-L, полученного внесением изменения Р396Е в IL6R-BP423/IL6R-L,
IL6R-BP454/IL6R-L, полученного внесением изменения P396K в IL6R-BP423/IL6R-L и
IL6R-BP459/IL6R-L, полученного внесением изменения P396R в IL6R-BP423/IL6R-L, во всех случаях была увеличена по сравнению с IL6R-BP423/IL6R-L перед внесением изменений. Между тем, величина KD (IIaR)/KD (IIb) для IL6R-BP456/IL6R-L, полученного внесением изменения Р396М в IL6R-BP423/IL6R-L, была более высокой по сравнению с IL6R-BP423/IL6R-L до внесения изменения, что демонстрирует увеличенную селективность в отношении FcγRIIb. Как видно из таблицы 24, активность связывания полученных вариантов с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV во всех случаях была более низкой, чем у IL6R-B3/IL6R-L, который представлял собой исходный полипептид.
[Пример 18] Получение вариантов с усиленным связыванием FcγRIIb с использованием последовательностей подклассов
Профиль связывания FcγR варьирует в зависимости от подкласса IgG человека. Авторы настоящего изобретения оценивали, можно ли использовать активность связывания каждого FcγR между IgG1 и IgG4 для увеличения активности связывания FcγRIIb и/или повышения селективности. Сначала IgG1 и IgG4 анализировали в отношении их активности связывания с каждым FcγR. IL6R-G4d (SEQ ID NO: 164), содержащий G4d, конструировали в качестве Н-цепи антитела. G4d представляет собой Fc-область, которая лишена С-концевого Gly и Lys и содержит замену Ser на Pro в положении 22 8 (нумерация EU) в IgG4 человека. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и IL6R-G1d/IL6R-L или IL6R-G4d/IL6R-L, экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении их связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25. Связывание полученных вариантов с каждым FcγR обобщенно представлено в таблице 25.
Было продемонстрировано, что связывание IL6R-G4d/IL6R-L с FcγRIIb было в 1,5 раза более сильным, чем у IL6R-G1d/IL6R-L, в то время как связывание IL6R-G4d/IL6R-L с FcγRIIaR было в 2,2 раза более слабым, чем у IL6R-G1d/IL6R-L. Между тем, активность связывания IL6R-G4d/IL6R-L с FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV более низкой, чем у IL6R-G1d/IL6R-L. Результат, описанный выше, показал, что IL6R-G4d имело предпочтительные характеристики по сравнению с IL6R-G1d с точки зрения как активности связывания FcγRIIb, так и селективности.
На фиг. 44 представлено выравнивание для сравнения последовательностей CH1 G1d и G4d вплоть до С-конца (положения с 118 по 445 (нумерация EU)). На фиг. 44, аминокислотные остатки, которые отличаются между G1d и G4d, заключены в жирную рамку. Авторы настоящего изобретения оценивали, может ли связывание FcγRIIb быть далее увеличено и/или может ли селективность в отношении FcγRIIb далее повышена путем выбора, из указанных выше отличающихся аминокислот, некоторых частей, которые, как предсказано, вовлечены во взаимодействие с FcγR, и пересадки по меньшей мере одного аминокислотного остатка или более из последовательности G4d, который сообщает свойство, предпочтительное с точки зрения как активности связывания, так и селективности в отношении FcγRIIb, варианту с усиленным связыванием FcγRIIb.
В частности, авторы настоящего изобретения получили:
IL6R-BP473, полученное внесением изменения A327G в IL6R-ВР230;
IL6R-BP472, полученное внесением изменения A330S в IL6R-ВР230;
IL6R-BP471, полученное внесением изменения P331S в IL6R-ВР230;
IL6R-BP474, полученное внесением изменения A330S и P331S в IL6R-BP230;
IL6R-BP475, полученное внесением изменения A327G и A330S в IL6R-BP230;
IL6R-BP476, полученное внесением изменения A327G, A330S и P331S в IL6R-BP230; и
IL6R-BP477, полученное внесением изменения A327G и P331S в IL6R-BP230. Более того, для конструирования IL6R-BP478, аминокислоты от Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (нумерация EU) в IL6R-BP230 заменяли на аминокислоты в последовательности G4d от Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (нумерация EU). IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и варианты тяжелой цепи, описанные выше, очищали в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении их активности связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25.
Величина KD каждого варианта в отношении каждого FcγR представлена в таблице 26. KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида в таблице показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. В таблице "изменение, внесенное в IL6R-BP230," относится к изменению, внесенному в IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L, использованное в качестве матрицы для получения IL6R-BP230, обозначено *1. Между тем, IL6R-BP478, в котором последовательность G4d от Ala в положении 118 вплоть до Pro в положении 222 (нумерация EU) заменена сегментом от Ala в положении 118 вплоть Thr в положении 225 (нумерация EU) в IL6R-ВР230, обозначена *2. KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγR IIaR на величину KD варианта в отношении FcγR IIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR, на KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. В таблице 2 6 число в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR в IgG было слишком слабым для корректного анализа с помощью кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Среди вариантов, представленных в таблице 2 6, IL6R-BP473/IL6R-L, в которое было внесено изменение A327G, продемонстрировало связывание FcγRIIb, усиленное в 1,2 раза по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L. Между тем, IL6R-BP478/IL6R-L, в котором аминокислоты от Ala в положении 118 до Thr в положении 225 (нумерация EU) в IL6R-BP230 заменены на аминокислоты от Ala в положении 118 до Pro в положении 222 (нумерация EU) в аминокислотной последовательности G4d, проявляло связывание FcγRIIb и FcγRIIaR, усиленное в 1,1 раза по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L. Все из вариантов показали более низкую активность связывания FcγRIa, FcγRIIaH и FcγRIIIaV по сравнению с исходным полипептидом IL6R-B3/IL6R-L.
Также оценивали варианты с модификациями в других участках, представленные на фиг. 44. В частности, в Н-цепь антитела IL6R-ВР230 вносили K274Q с получением IL6R-BP541; Y296F вносили для получения IL6R-BP542; H2 68Q вносили для получения IL6R-BP543; R355Q вносили для получения IL6R-BP544; D356E вносили для получения IL6R-BP545; L358M вносили для получения IL6R-BP546; K409R вносили для получения IL6R-BP547; и Q419E вносили для получения IL6R-BP548. Между тем, IL6R-L использовали в качестве L-цепи обычного антитела. Антитела, которые содержат описанный выше вариант тяжелой цепи и легкую цепь IL6R-L очищали способами, описанными в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом справочного примера 25.
KD каждого варианта в отношении каждого FcγR представлена в таблице 27. В таблице "KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида" соответствует величине, полученной делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. В таблице "изменение IL6R-BP230" относится к модификации, внесенной в IL6R-BP230. IL6R-B3/IL6R-L, использованный в качестве матрицы для получения IL6R-BP230, обозначен как *1. "KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида" соответствует величине, полученной делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIaR на величину KD того же варианта в отношении FcγRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) соответствуют величине, полученной делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR на KD того же варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb. В таблице 27, число в ячейке, закрашенной серым цветом, указывает на то, что связывание FcγR с IgG было слабым и было определено, что анализ не может быть корректно проведен посредством кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Как показано в таблице 27, IL6R-BP541/IL6R-L, полученное внесением K274Q в IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP544/IL6R-L, полученное внесением R355Q в IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L, полученное внесением D356E в IL6R-BP230/IL6R-L и IL6R-BP546/IL6R-L, полученное внесением L358M в IL6R-BP230/IL6R-L, продемонстрировало усиленное связывание FcγRIIb по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L до внесения изменения. Среди них было показано, что IL6R-BP544/IL6R-L, полученное внесением R355Q в IL6R-BP230/IL6R-L, IL6R-BP545/IL6R-L, полученное внесением D356E в IL6R-BP230/IL6R-L и IL6R-BP546/IL6R-L, полученное внесением L358M в IL6R-BP230/IL6R-L, имеет увеличенной величиной KD(IIaR)/KD(IIb) и повышенной селективностью в отношении FcγRIIb, по сравнению с IL6R-BP230/IL6R-L до внесения изменений.
[Пример 19] Оценка комбинаций изменений, которые усиливают связывание с FcγRIIb или повышают селективность в отношении FcγRIIb
Оценивали, что дополнительные комбинации изменений, описанных в настоящем описании в разделах вплоть до и включая пример 18, которые, как было обнаружено, являются эффективными в аспекте усиления связывания FcγRIIb или повышения селективности в отношении FcγRIIb. В частности, изменения, которые оценили как эффективные с точки зрения усиления связывания FcγRIIb и/или повышения селективности в отношении FcγRIIb вносили в комбинации в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). Более того, вносили известные изменения S267E и L328F, которые усиливают связывание FcγRIIb (Seung et al., (Mol. Immunol. (2008) 45, 3926-3933)) в IL6R-B3 с получением IL6R-BP253 в качестве контроля для сравнения. IL6R-L (SEQ ID NO: 135) использовали в качестве L-цепи антитела. Антитела, содержащие легкую цепь IL6R-L и описанные выше варианты тяжелой цепи, экспрессировали и очищали в соответствии со способом, описанным в справочных примерах 1 и 2. Очищенные антитела оценивали в отношении их связывания с каждым FcγR (FcγRIa, FcγRIIaH, FcγRIIaR, FcγRIIb или FcγRIIIaV) способом, описанным в справочном примере 25.
KD каждого варианта в отношении каждого FcγR представлена в таблице 28. В таблице "изменение" относится к изменению, внесенному в IL6R-B3 (SEQ ID NO: 144). IL6R-B3/IL6R-L, которое использовали в качестве матрицы для получения каждого варианта, обозначено звездочкой (*). KD (IIb) исходного полипептида/KD (IIb) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIb на величину KD каждого варианта в отношении FcγRIIb. Между тем, KD (IIaR) исходного полипептида/KD (IIaR) измененного полипептида показывает величину, полученную делением величины KD IL6R-B3/IL6R-L в отношении FcγRIIaR на KD варианта в отношении FcγRIIaR. KD (IIaR)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaR на KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb по сравнению с FcγRIIaR. Между тем, KD (IIaH)/KD (IIb) показывает величину, полученную делением KD каждого варианта в отношении FcγRIIaH на KD варианта в отношении FcγRIIb. Чем большей является величина, тем более высокой является селективность в отношении FcγRIIb по сравнению с FcγRIIaH. В таблице 28 число в закрашенных серым цветом ячейках указывает на то, что было сделано заключение, что связывание FcγR в IgG было слишком слабым для корректного анализа с помощью кинетического анализа и, таким образом, было вычислено с использованием:
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-C,
которое описано в справочном примере 25.
Среди вариантов, представленных в таблице 28, IL6R-BP253/IL6R-L, в который были внесены известные изменения, которые усиливают связывание FcγRIIb, проявляло активность связывания FcγRIIb и FcγRIIaR, увеличенную в 277 раз и 529 раз относительно IL6R-B3/IL6R-L до внесения изменений, соответственно. Более того, активность связывания FcγRIa IL6R-BP253/IL6R-L также была более высокой, чем у IL6R-B3/IL6R-L. Между тем, связывание FcγRIIaH и связывание FcγRIIIaV у IL6R-BP253/IL6R-L было снижено по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L. Среди других вариантов IL6R-BP436/IL6R-L и IL6R-BP438/IL6R-L продемонстрировало связывание FcγRIa, немного усиленное по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L до внесения изменений. Все другие варианты продемонстрировали сниженное связывание FcγRIa. Кроме того, все варианты проявляли сниженное связывание FcγRIIaH и связывание FcγRIIIaV по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L.
Варианты, полученные, как описано в этом разделе, сравнивали с IL6R-BP253/IL6R-L, которое представляет собой известный вариант с усиленным связыванием FcγRIIb. Величина KD(IIaH)/KD (IIb) IL6R-BP480/IL6R-L, которая является наиболее низкой, составляет 107,7, в то время как величина IL6R-ВР480/IL6R-L, которая является наиболее высокой, составляла 8362. Таким образом, величины для этих двух вариантов превышали величину 107,1 у IL6R-BP253/IL6R-L. Между тем, величина KD(IIaR)/KD(IIb) IL6R-BP479/IL6R-L, которая была наиболее низкой, составляла 16,1, в то время как величина IL6R-ВР559/IL6R-L, которая была наиболее высокой, составляла 58,4. Таким образом, величины этих двух вариантов превышали величину 0,2 у IL6R-BP253/IL6R-L. Эти результаты демонстрируют, что селективность в отношении FcγRIIb у вариантов, представленных в таблице 28, увеличена по сравнению с селективностью вариантов, в которые внесены известные модификации, которые усиливают связывание FcγRIIb. В частности, все из IL6R-BP559/IL6R-L, IL6R-BP493/IL6R-L, IL6R-BP557/IL6R-L, IL6R-BP492/IL6R-L и IL6R-BP500/IL6R-L, имеют активность связывания FcγRIIb, увеличенную в 100 раз или более, в то время как их связывание FcγRIIaR было в 1,5 раз или менее увеличенным, по сравнению с IL6R-B3/IL6R-L. Таким образом, ожидается, что эффект усиленного связывания FcγRIIb достигается при избегании побочных эффектов вследствие усиления связывания FcγRIIaR.
Что касается IL6R-BP489/IL6R-L, IL6R-BP487/IL6R-L, IL6R-BP499/IL6R-L, IL6R-BP498/IL6R-L, IL6R-BP503/IL6R-L, IL6R-BP488/IL6R-L, IL6R-BP490/IL6R-L, IL6R-BP445/IL6R-L, IL6R-BP552/IL6R-L, IL6R-BP507/IL6R-L, IL6R-BP536/IL6R-L, IL6R-BP534/IL6R-L, IL6R-491/IL6R-L, IL6R-BP553/IL6R-L, IL6R-BP532/IL6R-L, IL6R-BP506/IL6R-L, IL6R-BP511/IL6R-L, IL6R-BP502/IL6R-L, IL6R-BP531/IL6R-L, IL6R-BP510/IL6R-L, IL6R-BP535/IL6R-L, IL6R-BP497/IL6R-L, IL6R-BP533/IL6R-L, IL6R-BP555/IL6R-L, IL6R-BP554/IL6R-L, IL6R-BP436/IL6R-L, IL6R-BP423/IL6R-L, IL6R-BP440/IL6R-L, IL6R-BP538/IL6R-L, IL6R-BP429/IL6R-L, IL6R-BP438/IL6R-L, IL6R-BP565/IL6R-L, IL6R-BP540/IL6R-L, BP426/IL6R-L, IL6R-BP437/IL6R-L, IL6R-BP439/IL6R-L, IL6R-BP551/IL6R-L, IL6R-BP494/IL6R-L, IL6R-BP537/IL6R-L, IL6R-BP550/IL6R-L, IL6R-BP556/IL6R-L, IL6R-BP539/IL6R-L, IL6R-BP558/IL6R-L, IL6R-BP425/IL6R-L и IL6R-BP495/IL6R-L, их связывание FcγRIIb было более высоким, чем у IL6R-BP253/IL6R-L, в которое была внесена известная модификация, которая усиливает связывание FcγRIIb. Из указанного выше, усиление связывания FcγRIIb находится в диапазоне от 321 раз (наиболее низкое) до 3100 раз (наиболее высокое), по сравнению со связыванием IL6R-B3/IL6R-L (которое определено как 1), от IL6R-BP495/IL6R-L до IL6R-BP489/IL6R-L, соответственно. Таким образом, можно сказать, что эти варианты являются лучшими в отношении как уровня, так и селективности усиления активности связывания FcγRIIb по сравнению с уровнем техники.
[Пример 20] Получение антител, которые связываются с IgA человека зависимым от кальция образом
(20-1) Получение IgA человека (hIgA)
Примеры 2-4 демонстрируют, что молекулы, которые обладают усиленным связыванием FcγR мыши и которые связываются рН-зависимым образом с рецептором IL-6 человека в качестве антигена, могут значительно снизить концентрацию антигена в плазме. Затем проводили дополнительное испытание с использованием антител к IgA человека в качестве антигена, для оценки наличия сходного эффекта элиминации растворимых антигенов из плазмы в живом организме, в который вводили антитела, которые обладают усиленным связыванием FcγR мыши и которые связываются рН-зависимым образом с антигенами, отличными от рецептора IL-6 человека. Антиген, IgA человека (далее также обозначаемый как hIgA) (его вариабельная область происходит из антитела против IL6R человека) получали с использованием следующего рекомбинантного способа. hIgA экспрессировали путем культивирования клеток-хозяев, содержащих рекомбинантные векторы, содержащие Н (WT)-IgAl (SEQ ID NO: 145) и L (WT) (SEQ ID NO: 42), и очищали способом, известным специалистам в данной области, с использованием ионообменной хроматографии и гель-фильтрационной хроматографии.
(20-2) Экспрессия и очистка антитела, которое связывается с hIgA
6
2
2
GA2-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 146; легкая цепь, SEQ ID NO: 147) представляет собой антитело, которое связывается с hIgA. Последовательность ДНК, кодирующую GA2-IgG1 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 146; легкая цепь, SEQ ID NO: 147) встраивали в экспрессирующие плазмиды клеток животных способом, известным специалистам в данной области. Антитело экспрессировали и очищали способом, описанным ниже. Клетки, происходящие из клеток почки эмбриона человека Freestyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen). Суспензию клеток высевали при плотности клеток 1,33×10 клеток/мл в 3 мл в каждую лунку 6-луночного планшета. Затем полученную плазмиду вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе с CO (37°С, 8% CO, 90 об./мин.) в течение 4 суток. Из полученного культурального супернатанта антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение (длина волны: 280 нм) раствора очищенного антитела измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрацию антитела определяли с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного из измеренной величины способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(20-3) Оценка выделенного антитела в отношении его зависимой от кальция способности связывания hIgA
2
2+
2+
2+
Антитело, выделенное, как описано в примере (20-2), оценивали в отношении его активности связывания hIgA (константа диссоциации, KD (М)) с использованием Biacore Т200 (GE Healthcare). Активность связывания измеряли с использованием в качестве подвижного буфера 0,05% tween20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl (рН 7,4 или рН 5,8), содержащего 3 мкМ или 1,2 мМ CaCl. Соответствующее количество рекомбинантного белка А/G (Thermo Scientific) иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ5 (GE Healthcare) способом присоединения аминов, и антителу позволяли связываться с ним. Затем соответствующую концентрацию hIgA (описанный в (Al-1)) инжектировали в качестве анализируемого соединения и позволяли ему взаимодействовать с антителом на сенсорном чипе. Измерения проводили при 37°С. После измерения 10 ммоль/л глицин-HCl (рН 1,5) инжектировали для регенерации сенсорного чипа. Из результата измерения константу диссоциации KD (М) вычисляли посредством анализа аппроксимации кривой и анализа равновесия с использованием программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation Software (GE Healthcare). Результат представлен в таблице 29. GA2-IgG1 прочно связывалось с hIgA при концентрации Са 1,2 мМ и слабо связывалось с hIgA при концентрации Са 3 мкМ. Между тем, при концентрации Са 1,2 мМ, GA2-IgG1 прочно связывалось с IgA человека при рН 7,4 и слабо связывалось с IgA человека при рН 5,8. В целом, было продемонстрировано, что GA2-IgG1 связывается с IgA человека зависимым от рН- и кальция образом.
[Пример 21] Получение вариантов антител, которые связываются с hIgA зависимым от кальция образом
Далее, для дальнейшего ускорения элиминации антигена (hIgA) из плазмы, получали GA2-F1087 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 148) путем замены Lys на Asp в положении 326 (нумерация EU) в GA2-IgG1 для усиления связывания с FcγR мыши GA2-IgG1, которое связывается с hIgA зависимым от кальция образом. Последовательность ДНК, кодирующую GA2-F1087 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 148; легкая цепь, SEQ ID NO: 147) встраивали в экспрессирующую плазмиду животных способом, известным специалистам в данной области. Варианты антител экспрессировали описанным выше способом с использованием плазмиды. Концентрации вариантов измеряли после очистки. Антитела, содержащие описанную выше модификацию, проявляли значительно усиленное связывание FcγR мыши, как показано в примере (4-3).
[Пример 22] Оценка эффекта на время удержания антигена в плазме у нормальных мышей, которым вводили антитела с Са-зависимым связыванием hIgA
(22-1) Испытания in vivo с использованием нормальных мышей
hIgA (IgA человека, полученный как описано в примере (20-1)) вводили отдельно или в комбинации с антителом против hIgA антитело нормальным мышам (мышь C57BL/6J, Charles River Japan). После введения оценивали динамику in vivo hIgA и антител против hIgA. Раствор hIgA (80 мкг/мл) или смешанный раствор hIgA и антитела против hIgA вводили один раз в дозе 10 мл/кг в хвостовую вену. Используемые антитела против hIgA представляли собой GA2-IgG1 и GA2-F1087, описанные выше.
Во всех смешанных растворах концентрация hIgA составляла 8 0 мкг/мл и концентрация антитела против hIgA составляла 2,69 мг/мл. В этом эксперименте антитела против hIgA присутствовали в существенном избытке относительно hIgA и, таким образом, полагали, что основная часть hIgA связывалась с антителами. В группе, в которой вводили GA-IgG1, взятие крови от мышей проводили через пять минут, семь часов, одни сутки, двое суток, трое суток и семь суток после введения. Между тем, в группе, в которой вводили GA-F1087, взятие крови от мышей проводили через пять минут, 30 минут, один час, два часа, одни сутки, трое суток и семь суток после введения. Собранную кровь сразу центрифугировали при 12000 об./мин. и 4°С в течение 15 минут для выделения плазмы. Выделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до применения.
(22-2) Определение концентрации антитела против hIgA в плазме у нормальных мышей способом ELISA
Концентрации антитела против hIgA в плазме мыши измеряли способом ELISA. Сначала для получения планшета с иммобилизованным на нем антителом против IgG человека, антитело против F(ab')2-фрагмента IgG (специфичное к γ-цепи) (SIGMA) распределяли аликвотами в каждую лунку планшета Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International) и планшету позволяли стоять при 4°С в течение ночи. Образцы для калибровочной кривой антитела против hIgA, полученные в качестве стандартных разведений для концентраций в плазме (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563 и 0,007813 мкг/мл) и образцы плазмы мыши для анализа, разбавленные в 100 раз или более, распределяли аликвотами в упомянутый выше планшет с иммобилизованным на нем антителом против IgG. После инкубации планшета в течение одного часа при 25°С, в каждую лунку планшета распределяли аликвотами конъюгат антитела козы против IgG человека (специфичное к γ-цепи) с биотином (BIOT) (Southern Biotechnology Associates Inc.). Затем планшет инкубировали при 25°С в течение одного часа. Затем в каждую лунку планшета распределяли аликвотами стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies). Затем планшет инкубировали при 25°С в течение одного часа. Хромогенную реакцию проводили с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции 1 H серной кислотой (Showa Chemical), измеряли поглощение реакционного раствора в каждой лунке при 450 нм в устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антитела против hIgA в плазме мыши определяли на основе стандартной кривой поглощения с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрации антител GA2-IgG1 и GA2-F1087 с течением времени в плазме нормальных мышей после внутривенного введения, которые измеряли способом, описанным выше, представлены на фиг. 45. Результаты демонстрируют, что в отношении клона GA2-IgG1, который имеет рН-зависимую мощную активность связывания hIgA, концентрация в плазме антитела не снижалась значительно, даже если связывание FcγR усиливалось.
(22-3) Определение концентрации hIgA в плазме способом ELISA Концентрации hIgA в плазме мыши измеряли способом ELISA. Сначала для получения планшета с иммобилизованным антителом против IgA человека, козы против IgA человека (BETHYL) распределяли аликвотами в каждую лунку планшета Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International) и планшету позволяли стоять при 4°С в течение ночи. Образцы hIgA для калибровочной кривой получали в качестве стандартных растворов для концентрации в плазме (0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 и 0,00625 мкг/мл) и использовали. 100 мкл каждого из образцов для калибровочной кривой и образцы плазмы мыши для анализа, разбавленные в 100 раз или более, комбинировали с 200 мкл 500 нг/мл hsL6R. Их смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Затем 100 мкл смесей распределяли аликвотами в планшет с иммобилизованным антителом против IgA человека. Планшету позволяли стоять при комнатной температуре в течение одного часа. Далее биотинилированное антитело против IL-6 R человека (R&D) распределяли аликвотами в каждую лунку планшета. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре, стрептавидин-PolyHRPSO (Stereospecific Detection Technologies) распределяли аликвотами в каждую лунку планшета. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа. Хромогенную реакцию проводили с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции с 1 H серной кислотой (Showa Chemical), измеряли поглощение реакционного раствора в каждой лунке при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов. Концентрации в плазме мыши определяли, исходя из поглощения стандартной кривой, с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрация в hIgA в плазме у нормальных мышей с течением времени после внутривенного введения, которую измеряли описанным выше способом, представлена на фиг. 46.
Результат показал, что у мышей, которым вводили hIgA в комбинации с GA2-IgG1, обладающий Са-зависимой активностью связывания hIgA, увеличенной в 100 раз или более, элиминация hIgA была ускорена по сравнению с введением hIgA отдельно. Между тем, в плазме мышей, которым вводили GA2-F1087 с усиленным связыванием с hIgA и FcγR, концентрация hIgA была снижена ниже поддающегося измерению диапазона (0,006 мкг/мл или more) через одни сутки после введения и, таким образом, элиминация hIgA была значительно ускорена по сравнению с плазмой мышей, которым вводили GA-IgG1. Данные, описанные в примерах 2-7 выше, демонстрируют увеличенный эффект элиминации антигена у антител с усиленным связыванием FcγR у мышей, которым вводили IL6R и антитело против IL6R. Аналогично, также было продемонстрировано достижение сходного эффекта у мышей, которым вводили антиген hIgA и антитело против hIgA.
[Пример 23] Получение рН-зависимого антитела против IgE
(23-1) Получение антитела против IgE человека
Для получения рН-зависимого антитела против IgE человека, IgE человека (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 149; легкая цепь, SEQ ID NO: 150) (его вариабельная область происходит из антитела против глипикана 3 человека) экспрессировали в качестве антигена с использованием FreeStyle293 (Life Technologies).
Экспрессированный IgE человека получали и очищали общим способом хроматографии, известным специалистам в данной области. Антитело, которое связывается с IgE человека рН-зависимым образом, выбрали из множества выделенных антител. Вариабельные области выбранного антитела против IgE подвергали слиянию с константной областью тяжелой цепи IgG1 человека и константной областью легкой цепи IgG1 человека и полученный ген антитела встраивали в вектор. С использованием вектора, рекомбинантное антитело против IgE человека экспрессировали и очищали. Полученное антитело было названо клоном 278 (далее обозначаемым как 278-IgG1; тяжелая цепь, SEQ ID NO: 151, легкая цепь, SEQ ID NO: 152).
(23-2) Оценка антитела против IgE человека в отношении активности связывания IgE и рН-зависимой активности связывания
Антитела, способные диссоциировать от антигенов в эндосоме, можно получать таким образом, чтобы они связывались с антигенами не только рН-зависимым образом, но также и Са-зависимым образом. Таким образом, 278-IgG1 и контрольное IgG1-антитело человека Xolair (омализумаб, Novartis) без способности к рН/Са-зависимому связыванию IgE, оценивали в отношении способности к рН-зависимому связыванию и способности к рН/Са-зависимому связыванию IgE человека (hIgE). В частности, 278-IgG1 и Xolair оценивали в отношении их активности связывания hIgE (константа диссоциации, KD (М)) с использованием Biacore Т200 (GE Healthcare). Измерения проводили с использованием следующих трех типов подвижных буферов:
2
1,2 ммоль/л CaCl, 0,05% tween20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, рН 7,4,
2
1,2 ммоль/л CaCl, 0,05% tween20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, рН 5,8,
2
3 мкмоль/л CaCl, 0,05% tween20, 20 ммоль/л ACES, 150 ммоль/л NaCl, рН 5,8.
Соответствующее количество пептида (далее обозначаемого как "биотинилированный пептид GPC3"), полученное путем присоединения биотина к С-концевому Lys химически синтезированной последовательности, происходящей из белка глипикана 3 человека (SEQ ID NO: 153) наносили на сенсорный чип SA (GE Healthcare) и иммобилизовали на сенсорном чипе SA на основе аффинности биотин/стрептавидин. Соответствующую концентрацию IgE человека инжектировали и улавливали с помощью биотинилированного пептида GPC3 для иммобилизации IgE человека на чип. Соответствующую концентрацию 278-IgG1 инжектировали в качестве анализируемого соединения и позволяли ей взаимодействовать с IgE человека на сенсорном чипе. Затем 10 ммоль/л глицин-HCl (рН 1,5) инжектировали для регенерации сенсорного чипа. Весь анализ взаимодействия проводили при 37°С. С использованием программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation Software (GE Healthcare) результаты анализа анализировали посредством аппроксимации кривой для определения константы скорости связывания ka (1/Мс) и константы скорости диссоциации kd (1/с). Из указанных выше констант вычисляли константу диссоциации KD (М). Затем рН-зависимое связывание оценивали посредством вычисления соотношения KD каждого антитела между условиями рН 5,8/1,2 мМ Са и рН 7,4/1,2 мМ Са. рН/Са-зависимое связывание оценивали путем вычисления соотношения KD для каждого антитела между условиями рН 5,8/3 мкМ Са и рН 7,4/1,2 мМ Са. Результаты представлены в таблице 30.
[Пример 24] Получение варианта антитела, который связывается с IgE человека рН-зависимым образом
Далее, для дальнейшего ускорения элиминации антигена (IgE человека) из плазмы, последовательность ДНК, кодирующую 278-F1087 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 154; легкая цепь, SEQ ID NO: 152) с заменой Lys на Asp в положении 326 (нумерация EU) в 278-IgG1, встраивали в экспрессирующую плазмиду животных способом, известным специалистам в данной области, для усиления связывания FcγR мыши 278-IgG1, которое связывается с IgE человека рН-зависимым образом. Варианты антител экспрессировали упомянутым выше способом с использованием клеток животных, в которые вводили плазмиду. После очистки определяли концентрации вариантов антител.
[Пример 25] Оценка 278-IgG1 in vivo
(25-1) Получение IgE человека (hIgE (Asp6)) для оценки in vivo
hIgE (Asp6) (его вариабельная область происходит из антитела против глипикана 3), которое представляет собой IgE человека для оценки in vivo, содержащее тяжелую цепь (SEQ ID NO: 155) и легкую цепь (SEQ ID NO: 150), получали тем же способом, который описан в примере (23-1). hIgE (Asp6) представляет собой молекулу, в которой аспарагин заменен аспарагиновой кислотой в шести участках N-гликозилирования в IgE человека, так что на зависимые от времени изменения в концентрации IgE человека в качестве антигена не влияет гетерогенность N-связанных цепей сахаров IgE человека.
(25-2) Оценка эффекта ускорения элиминации IgE человека из плазмы нормальных мышей, которым вводили 278
Как описано в примерах 2-4 и 22, было продемонстрировано, что концентрация антигена была значительно снижена в плазме мышей, которым вводили молекулы, которые связываются рН-зависимым образом с рецептором IL-б человека или IgA человека в качестве антигена, и связывание которых с FcγR мыши было усилено. Дополнительное испытание проводили с использованием антител к IgE человека в качестве антигена для оценки того, достигается ли сходный эффект элиминации растворимых антигенов из плазмы живого организма, в который вводили антитела с усиленным связыванием FcγR мыши, которые связываются рН-зависимым образом с антигенами, отличными от рецептора IL-6 человека и IgA человека, когда связывание с FcγR усилено.
hIgE (Asp6) и антитела против IgE человека оценивали в отношении их динамики in vivo после введения hIgE (Asp6) отдельно или hIgE (Asp6) в комбинации с антителами против hIgE (278-IgG1 и 278-F1087) мышам C57BL/6J (Charles river Japan). hIgE (Asp6) (20 мкг/мл) или смесь hIgE (Asp6), и антитело против IgE вводили один раз в количестве 10 мл/кг в хвостовую вену (как описано в таблице 31, все антитела получали в одной и той же концентрации). В этом случае, каждое антитело присутствовало в значительном избытке относительно hIgE (Asp6) и, таким образом, как полагали, практически весь hIgE (Asp6) был связан с антителом. В группе, в которой вводили клон 278 (278-IgG1), взятие крови от мышей проводили через пять минут, два часа, семь часов, одни сутки, двое суток, четверо суток, пять суток, семь суток, 14 суток и 21 сутки после введения. В группе, в которой вводили 278-F1087, взятие крови от мышей проводили через пять минут, 30 минут, один час, два часа, одни сутки, трое суток, семь суток, 14 суток и 21 суток после введения. Собранную кровь сразу центрифугировали при 15000 об./мин. и 4°С в течение 5 минут для выделения плазмы. Выделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до применения.
(25-3) Определение концентрации антитела против IgE человека у нормальных мышей
Концентрации антитела hIgE в плазме мыши измеряли способом ELISA. Образцы для стандартной кривой получали для концентраций в плазме 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 и 0,00625 мкг/мл. Чтобы обеспечить однородность иммунного комплекса между hIgE (Asp6) и антителом против hIgE, hIgE (Asp6) добавляли в концентрации 1 мкг/мл к образцам стандартной кривой и образцам плазмы мыши для анализа. Образцам группы введения 2 7 8-hIgG1 и образцам для соответствующей стандартной кривой позволяли стоять при комнатной температуре в течение 3 0 минут. Между тем, образцы группы введения 278-F1087 и образцы для соответствующей стандартной кривой перемешивали при 37°С в течение ночи. После инкубации или перемешивания образцы для стандартной кривой и образцы плазмы мыши для анализа распределяли аликвотами в Immunoplate (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International)), на котором было иммобилизовано антитело против легкой цепи каппа человека (Bethyl Laboratories) и им позволяли стоять/перемешиваться при комнатной температуре в течение двух часов (образцы группы введения 278-F1087 и образцы для стандартной кривой 278-F1087) или позволяли стоять при 4°С в течение ночи (образцы группы введения 278-hIgG1 и образцы для стандартной кривой 278-hIgG1). Затем каждый из вторичного антитела кролика против IgG человека (Fc), конъюгированного с биотином (Pierce Biotechnology) и стрептавидин-PolyHRPSO (Stereospecific Detection Technologies) подвергали реакции последовательно в течение одного часа. Хромогенную реакцию проводили с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции 1 H серной кислотой (Showa Chemical), концентрации в плазме мыши определяли на основе развития окраски способом измерения поглощения при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации в плазме мыши определяли на основе поглощения стандартной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрации антитела в плазме с течением времени после внутривенного введения, которые определяли описанным выше способом, представлены на фиг. 47. Этот результат демонстрирует, что у мышей, которым вводили варианты, полученные усилением связывания 278-IgG1 с FcγR с рН-зависимой мощной активностью связывания IgE человека, концентрация антитела в плазме у мышей не была значительно снижена по сравнению с 278-IgG1.
(25-4) Определение концентрации hIgE (Asp6) в плазме у нормальных мышей mice
Концентрации антитела hIgE в плазме мыши измеряли способом ELISA. Образцы для стандартной кривой получали для концентраций в плазме 192, 96, 48, 24, 12, 6 и 3 нг/мл. Чтобы обеспечить однородность иммунного комплекса между hIgE (Asp6) и антителом против hIgE, в группе, в которой вводили 278-hIgG1, добавляли Xolair (Novartis) в концентрации 10 мкг/мл к образцам для стандартной кривой и образцам плазмы мыши для анализа и смесям позволяли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут. В группе, в которой вводили 278-F1087, 278-F1022 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 156; легкая цепь, SEQ ID NO: 152; полученное аналогично примеру 24) или 278-F760 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 157; легкая цепь, SEQ ID NO: 152; полученное согласно примеру 24) добавляли в концентрации 20 мкг/мл и смеси перемешивали при 37°С в течение 60 часов. Образцы плазмы мыши для анализа распределяли аликвотами в Immunoplate (МАВТЕСН), на который было иммобилизовано антитело против IgE, или Immunoplate (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)), на который было иммобилизовано антитело против IgE человека (клон 107, МАВТЕСН), и им позволяли стоять и перемешиваться при комнатной температуре в течение двух часов или позволяли стоять при 4°С у течение ночи. Затем каждый из корового белка GPC3 человека (SEQ ID NO: 158), антитела против GPC3 (полученное в собственной лаборатории) биотинилированного NHS-PEG4-6hothhom (Thermo Fisher Scientific) и стрептавидин-PolyHKP80 (Stereospecific Detection Technologies) подвергали реакции последовательно в течение одного часа. Хромогенную реакцию проводили с использованием в качестве субстрата ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). После завершения реакции 1 H серной кислотой (Showa Chemical), концентрации в плазме мыши определяли на основе развития окраски способом измерения поглощения при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Альтернативно хромогенную реакцию проводили с использованием в качестве субстрата хемилюминесцентного субстрата SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminesrent Substrate (Thermo Fisher Scientific) и концентрации в плазме определяли способом измерения интенсивности люминесценции с помощью устройства для считывания микропланшетов. Концентрации в плазме мыши определяли на основе поглощения или интенсивности люминесценции стандартной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Концентрации hIgE (Asp6) в плазме с течением времени после внутривенного введения, которые определяли описанным выше способом, представлены на фиг. 48.
Что касается элиминации IgE человека отдельно, результат демонстрирует, что у мышей, которым вводили IgE человека в комбинации с 278-IgG1, обладающим рН-зависимой мощной активностью связывания, элиминация IgE человека ускорялась по сравнению с введением IgE человека отдельно. Более того, у мышей, которым вводили IgE человека в комбинации с 278-F1087, полученным усилением связывания 278-IgG1 с FcγR, было продемонстрировано, что элиминация IgE человека является значительно ускоренной по сравнению с мышами, которым вводили IgE человека отдельно или IgE человека в комбинации с 278-IgG1. Следовательно, было показано, что элиминация антигена была ускорена не только у мышей, которым вводили упомянутое выше антитело против IL6R и антитело против IgA с усиленным связыванием FcγR, но также и у мышей, которым вводили антитело против IgE с усиленным связыванием FcγR.
[Справочный пример 1] Конструирование экспрессирующих векторов для IgG-антител с заменой аминокислот
Мутанты получали с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) способом, описанным в прилагаемых инструкциях. Фрагменты плазмиды, содержащие мутанты, встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных для конструирования желаемых экспрессирующих векторов Н-цепи и L-цепи. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессирующих векторов определяли способами, известными специалистам в данной области.
[Справочный пример 2] Экспрессия и очистка IgG-антител
5
2
2
Антитела экспрессировали с использованием следующего способа. Клетки клеточной линии, происходящей из рака почки эмбриона человека HEK293H (Invitrogen) суспендировали в DMEM (Invitrogen), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (Invitrogen). Клетки высевали в количестве 10 мл на чашку в чашки для не прикрепляющихся клеток (диаметром 10 см; CORNING) с плотностью клеток 5-6×10 клеток/мл и культивировали в CO-инкубаторе (37°С, 5% CO) в течение всего дня и ночи. Затем среду удаляли аспирированием и добавляли 6,9 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Полученную плазмиду вводили в клетки способом липофекции. Полученные культуральные супернатанты собирали, центрифугировали (приблизительно 2000×g, 5 мин, комнатная температура) для удаления клеток и стерилизовали фильтрацией через 0,22-мкм фильтр MILLEX (зарегистрированный торговый знак)-GV (Millipore) с получением супернатантов. Антитела очищали из очищенных культуральных супернатантов способом, известным специалистам в данной области с использованием rProtein А Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Для определения концентрации очищенного антитела измеряли поглощение при 280 нм с использованием спектрофотометра. Из определенных величин вычисляли концентрации антител с использованием коэффициента поглощения, вычисленного способом, описанным в Protein Science (1995) 4: 2411-2423.
[Справочный пример 3] Получение растворимого рецептора IL-6 человека (hsIL-6R)
Рекомбинантный рецептор IL-6 человека, который является антигеном, получали следующим образом. Получали клеточную линию СНО, конститутивно экспрессирующую растворимый рецептор IL-6 человека (далее hsIL-6R), имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из положений с 1 по 357 с N-конца, как описано в J. Immunol. 152: 4958-4968 (1994), способом известным специалистам в данной области. hsIL-6R человека экспрессировали путем культивирования этой линии СНО. hsIL-6R человека очищали из культурального супернатанта полученной линии СНО с помощью двух стадий: колоночная хроматография на Blue Sepharose 6 FF и гель-фильтрационная колоночная хроматография. Фракцию, элюированную в качестве главного пика на последней стадии, получали в качестве конечного продукта очистки.
[Справочный пример 4] Получение антител с низким содержанием фукозы
2
2
Антитела с низким содержанием фукозы экспресировали следующим образом. Клетки линии СНО с дефицитом переносчика фукозы (патентный документ WO 2006/067913), суспендированные в среде α-МЕМ (Invitrogen), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ССВ), высевали в концентрации 2Е+6 клеток/10 мл на чашки для прикрепляющихся клеток (диаметр: 10 см; CORNING). После культивирования в инкубаторе с CO (37°С, 5% CO) в течение одного дня и одной ночи, среду удаляли аспирированием, а затем в нее добавляли 7 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). 7 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen) добавляли к клеткам, которые были получены отдельно и в которые были введены плазмиды способом липофекции. Через 72 часа, культуральные супернатанты собирали центрифугированием (приблизительно 2000 g, 5 минут, комнатная температура) и стерилизовали фильтрацией через 0,22-мкм фильтр MILLEX(R)-GV (Millipore). Из полученных культуральных супернатантов антитела очищали способом, известным специалистам в данной области, с использованием rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences). Концентрации очищенных антител вычисляли с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом, описанным в Protein Science (1995) 4, 2411-2423, на основе поглощения при 280 нм, измеренного с помощью спектрофотометра.
[Справочный пример 5] Получение антител, которые связываются с рецептором IL-6 Са-зависимым образом, из библиотеки антител с использованием технологии фагового дисплея
(5-1) Получение библиотеки фагового дисплея для наивных антител человека
Библиотеку фагового дисплея для антител человека, состоящую из множества фагов, представляющих Fab-домены взаимно отличающихся последовательностей антител человека, конструировали в соответствии со способом, известным специалистам в данной области, с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека в качестве матрицы.
(5-2) Получение фрагментов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом из библиотеки посредством пэннинга гранул
Сконструированную библиотеку фагового дисплея для наивных антител человека подвергали первоначальной селекции посредством концентрирования только тех фрагментов антител, которые обладают способностью связывать антиген (рецептор IL-6), или концентрирования фрагментов антител с использованием зависимой от концентрации Са способности связывания антигена (рецептора IL-6) в качестве индикатора. Концентрирование фрагментов антител с использованием зависимой от концентрации Са способности связывать антиген (рецептор IL-6) в качестве индикатора проводили путем элюирования фагов фаговой библиотеки, связавшихся с рецептором IL-6 в присутствии ионов Са, с EDTA, которая хелатирует ионы Са. В качестве антигена использовали биотинилированный рецептор IL-6.
2
Фаги получали из Escherichia coli, содержащих сконструированную фагмиду фагового дисплея. Раствор фаговой библиотеки получали путем разбавления с помощью TBS популяции фагов, преципитированных добавлением 2,5 М NaCl/10% PEG к культуральному раствору Е. coli, в котором продуцировались фаги. Затем к раствору фаговой библиотеки добавляли BSA и CaCl в конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионов кальция 1,2 мМ. Обычный способ пэннинга с использованием антигена, иммобилизованного на магнитных гранулах, был назван способом пэниннга (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). В качестве магнитных гранул использовали покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBeads Neutravidin-coated) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads М-280 Streptavidin).
2
2
В частности, к полученному раствору фаговой библиотеки добавляли 250 пмоль меченного биотином антигена, чтобы обеспечить контактирование указанного раствора фаговой библиотеки с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, чтобы они связывались с комплексами антиген-фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали один раз с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBS (TBS, содержащий 1,2 мМ CaCl). Затем раствор фага выделяли с помощью общего способа элюирования для концентрирования фрагмента антитела, обладающего способностью связывать рецептор IL-б, или с помощью элюирования с гранул, суспендированных в 2 мМ EDTA/TBS (TBS, содержащий 2 мМ EDTA), для концентрирования фрагмента антитела с использованием способности связывать рецептор IL-6 зависимым от концентрации Са образом в качестве показателя. Раствор выделенного фага добавляли к 10 мл штамма Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coli культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coli. Инфицированные Е. coli инокулировали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем после инокуляции фаги выделяли из культуральной среды Е. coli для получения раствора фаговой библиотеки.
2
2
Во втором и последующем пэннинге фаги увеличивали в количестве с использованием зависимой от Са способности связывания в качестве индикатора. В частности, 40 пмоль меченного биотином антитела добавляли к полученному раствору фаговой библиотеки, чтобы обеспечить контактирование фаговой библиотеки с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, чтобы они связывались с комплексами антиген-фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали один раз с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST и 1,2 мМ CaCl/TBS. Затем гранулы, к которым добавляли 0,1 мл 2 мМ EDTA/TBS, суспендировали при комнатной температуре. Сразу после этого гранулы отделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора фага. Раствор выделенного фага добавляли к 10 мл штамма Е. coli TG1 в логарифмической фазе роста (OD600 0, 4-0, 7). Е. coli культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coli. Инфицированные Е. coli инокулировали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем после инокуляции фаги выделяли из культуральной среды Е. coli для получения раствора фаговой библиотеки. Пэннинг с использованием способности Са-зависимого связывания в качестве показателя повторяли несколько раз.
(5-3) Исследование с помощью ELISA фагов
Фаг, содержащий культуральный супернатант, собирали общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) из единичной колонии Е. coli, полученной, как описано выше.
2
2
2
2
2
Культуральный супернатант, содержащий фаги, в который были добавлены BSA и CaCl до конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионов кальция 1,2 мМ, подвергали ELISA, как описано ниже. На 96-луночный микропланшет для титрования StreptaWell (Roche) наносили в течение ночи 100 мкл PBS, содержащего меченный биотином антиген. Каждую лунку указанного планшета промывали PBST для удаления антигена, а затем лунки блокировали с помощью 250 мкл 4% BSA-TBS в течение 1 часа или дольше. Указанному планшету с полученным культуральным супернатантом, добавленным в каждую лунку, из которой был удален 4% BSA-TBS, позволяли стоять нетронутым при 37°С в течение 1 часа, позволяя связываться представляющему фаг антителу с антигеном, присутствующим в каждой лунке. В каждую лунку, промытую 1,2 мМ CaCl/TBST, добавляли 1,2 мМ CaCl/TBS или 1 мМ EDTA/TBS. Планшету позволяли стоять нетронутым в течение 30 минут при 37°С для инкубации. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгироваанное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS в конечной концентрации 4% BSA и концентрации ионизированного кальция 1,2 мМ, и планшет инкубировали в течение 1 часа. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST хромогенную реакцию раствора в каждой лунке, в которую добавляли только раствор ТМВ (ZYMED), останавливали добавлением серной кислоты. Затем указанный цвет определяли путем измерения поглощения при 450 нм.
В результате указанного выше ELISA фагов анализировали последовательность оснований гена, амплифицированного с помощью специфических праймеров и фрагмента антитела, идентифицированного как обладающего способностью зависимого от Са связывания антигена в качестве матрицы.
(5-4) Экспрессия и очистка антител
6
2
2
В результате описанного выше ELISA фагов, клон, идентифицированный как обладающий зависимой от Са способностью связывания антигена, вводили в экспрессирующую плазмиду для клеток животных. Антитела экспрессировали, как описано ниже. Штамм Freestyle 293-F (Invitrogen), происходящий из клеток почки эмбриона человека, суспендировали в среде Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen), а затем инокулировали по 3 мл в каждую лунку планшета с 6 ячейками с плотностью клеток 1,33×10 клеток/мл. Полученную плазмиду вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в течение 4 суток в инкубаторе с СО (37°С, 8% СО, 90 об./мин.). Антитела очищали из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, способом, известным в данной области, с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Поглощение очищенного раствора антитела измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрацию антитела вычисляли из данных измерения, полученных с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
[Справочный пример 6] Исследование зависимой от Са способности связывания полученных антител к рецептору IL-6 человека
2
2
Для исследования того, является ли активность связывания антител 6RL#9-IgG1 [тяжелая цепь (SEQ ID NO: 44; последовательность, в которой происходящая из IgG1 константная область связана с SEQ ID NO: 9); легкая цепь SEQ ID NO: 45] и FH4-IgG1 [тяжелая цепь, SEQ ID NO: 46; легкая цепь SEQ ID NO: 47], полученных согласно справочному примеру 5, с рецептором IL-6 человека зависимой от Са, проводили кинетический анализ реакций антиген-антитело для этих антител с рецептором IL-6 человека с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). H54/L28-IgG1 [тяжелая цепь SEQ ID NO: 36; легкая цепь SEQ ID NO: 37], описанное в WO 2009125825, использовали в качестве контрольного антитела, которое обладает Са-зависимой активностью связывания с рецептором IL-6 человека. Кинетический анализ реакций антиген-антитело проводили в растворах с концентрациями ионов кальция 2 мМ и 3 мкМ в качестве условий высокой и низкой концентрации ионов кальция, соответственно. Представляющее интерес антитело иммобилизовывали на сенсорном чипе СМ4 (GE Healthcare), на котором было иммобилизовано подходящее количество белка А (Invitrogen) способом присоединения аминов. В качестве подвижных буферов использовали два буфера [10 мМ ACES, 150 мМ NaCl, 0,05% (масс./об.) Tween 20, и 2 мМ CaCl (рН 7,4) или 10 мМ ACES, 150 мМ NaCl, 0.05% (масс./об.) Tween 20, и 3 мкмоль/л CaCl (рН 7,4)]. Эти буферы использовали для разбавления рецептора IL-6 человека. Все измерения проводили при 37°С.
В кинетическом анализе реакции антиген-антитело с использованием антитела H54L28-IgG1, антителу H54L28-IgG1, уловленному на сенсорном чипе, позволяли взаимодействовать с рецептором IL-6 путем инжекции разбавителя рецептора IL-6 и подвижного буфера (пустой образец) со скоростью потока 20 мкл/мин в течение 3 минут. Затем после выявления диссоциации рецептора IL-6 с использованием подвижного буфера со скоростью потока 2 0 мкл/мин в течение 10 минут, сенсорный чип регенерировали путем инъекции 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд. Из сенсограмм, полученных при измерении, вычисляли параметры кинетики: константу связывания (ka) (1/Мс) и константу скорости диссоциации (kd) (1/с). Эти величины использовали для вычисления константы диссоциации (KD) (М) антитела H54L28-IgG1 в отношении рецептора IL-6 человека. Каждый параметр вычисляли с использованием программного обеспечения Biacore Т100 Evaluation Software (GE Healthcare).
2
В кинетическом анализе реакции антиген-антитело с использованием антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, антителу FH4-IgG1 или 6RL#9-IgG1, уловленному на сенсорном чипе, позволяли взаимодействовать с рецептором IL-6 путем инжекции разбавителя рецептора IL-6 и подвижного буфера (пустой образец) со скоростью потока 5 мкл/мин в течение 15 минут. Затем сенсорный чип регенерировали путем инжекции 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд. Константы диссоциации (KD) (М) вычисляли из сенсограмм при измерении с использованием стационарной модели аффинности. Каждый параметр вычисляли с использованием программного обеспечения Biacore Т100 Evaluation Software (GE Healthcare). Константы диссоциации (KD) между каждым антителом и рецептором IL-6 в присутствии 2 мМ CaCl, определенные описанным выше способом, представлены в таблице 32.
Величину KD для антитела H54/L28-IgG1 в условиях концентрации Са 3 мкМ можно вычислять аналогично тому, как и в присутствии концентрации кальция Са 2 мМ. В условиях концентрации Са 3 мкМ наблюдали, что антитела FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 практически не связываются с рецептором IL-6, таким образом, вычисление величин KD способом, описанным выше, является трудным. Однако величины KD для этих антител в условиях концентрации Са 3 мкМ можно оценивать с использованием уравнения 3 (Biacore Т100 Software Handbook, BR-1006-48, AE 01/2007), описанного ниже.
[уравнение 3]
eq
max
R=C×R/(KD+C)+RI
Значение каждого параметра в упомянутом выше [уравнении 3] является следующим:
Req (RU): Уровень связывания в стационарном состоянии
Rmax (RU): Способность к поверхностному связыванию анализируемого соединения
RI (RU): Совокупный вклад индекса рефракции в образце
С (М): Концентрация анализируемого соединения
KD (М): Равновесная константа диссоциации
eq
max
Приблизительные результаты для величин константы диссоциации KD для антител и рецептора IL-6 при концентрации Са 3 мкмоль/л, оцененной с использованием уравнения 3, описанного выше, представлены в таблице 33. В таблице 33 величины R, R, RI и С оценены, исходя из результата анализа.
D
2
Исходя из данных, описанных выше, было предсказано, что K между рецептором IL-6 и антителом FH4-IgG1 или антителом 6RL#9-IgG1 увеличивалась приблизительно в 60 или 120 раз (аффинность снижалась в 60 или 120 раз или более), когда концентрацию CaCl в буфере снижали от 2 мМ до 3 мкМ.
D
2
В таблице 34 обобщенно представлены величины K при концентрациях CaCl 2 мМ и 3 мкМ и зависимость от Са для трех типов антител H54/L28-IgG1, FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1.
Не было выявлено отличий в связывании антитела H54/L28-IgG1 с рецептором IL-6 вследствие отличий в концентрации Са. С другой стороны, было выявлено, что связывание антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 с рецептором IL-6 было значительно ослаблено в условиях низкой концентрации Са (таблица 34).
[Справочный пример 7] Исследование связывания ионов кальция с полученным антителом
2
2
Затем измеряли промежуточную температуру термической денатурации (величину Tm) с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) в качестве показателя для исследования связывания ионов кальция с антителом (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) является показателем стабильности. Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) становится более высокой, когда белок стабилизирован путем связывания с ионами кальция, по сравнению с отсутствием связывания ионов кальция (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Активность связывания ионов кальция с антителом исследовали путем исследования изменений величины Tm антитела, в зависимости от изменений концентрации ионов кальция в растворе антитела. Очищенное антитело подвергали диализу (EasySEP, TOMY) с использованием внешнего раствора 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 2 мМ CaCl (рН 7,4), или 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 3 μМ CaCl (рН 7,4). Измерение DSC проводили при скорости нагревания 240°С/ч от 20 до 115°С с использованием раствора антитела, приготовленного в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл с диализатом в качестве исследуемого вещества. Промежуточные температуры термической денатурации (величины Tm) Fab-доменов каждого антитела, вычисленные исходя из кривой денатурации, полученной с помощью DSC, представлены в таблице 35.
Результаты, представленные в таблице 35, показывают, что величины Tm для Fab антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, которые проявляют зависимую от кальция способность связывания, варьировали при изменении концентрации ионов кальция, в то время как величины Tm для Fab антитела H54/L28-IgG1, которое не проявляет зависимой от кальция способности связывания, не варьируют при изменении концентрации ионов кальция. Варьирование величин Tm для Fab антител FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1 демонстрирует, что ионы кальция, связанные с этими антителами, стабилизируют Fab-части. Описанные выше результаты показывают, что ионы кальция связывались с антителами FH4-IgG1 и 6RL#9-IgG1, в то время как ионы кальция не связывались с антителом H54/L28-IgG1.
[Справочный пример 8] Идентификация участка связывания ионов кальция в антителе 6RL#9 с помощью рентгеноструктурного анализа
(8-1) Рентгеноструктурный анализ
Как описано в справочном примере 7, измерение температуры термической денатурации Tm показало, что антитело 6RL#9 связывается с ионами кальция. Однако было непредсказуемо, какая часть антитела 6RL#9 связывается с ионом кальция. Следовательно, с использованием способа рентгеноструктурного анализа идентифицировали остатки антитела 6RL#9, которые взаимодействуют с ионом кальция.
(8-2) Экспрессия и очистка антитела 6RL#9
6
2
2
Антитело 6RL#9 экспрессировали и очищали для рентгеноструктурного анализа. В частности, плазмиды для экспрессии у животных, сконструированные так, чтобы они были способны экспрессировать тяжелую цепь (SEQ ID NO: 44) и легкую цепь (SEQ ID NO: 45) антитела 6RL#9, вводили временно в клетки животных. Сконструированные плазмиды вводили способом липофекции в клетки линии, происходящей из клеток почек эмбриона человека FreeStyle 293-F (Invitrogen), суспендированные в 800 мл среды для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) (конечная плотность клеток: 1×10 клеток/мл). Клетки с введенной плазмидой культивировали в инкубаторе с CO (37°С, 8% CO, 90 об./мин.) в течение пяти суток. Из культурального супернатанта, полученного, как описано выше, антитела очищали способом, известным специалистам в данной области, с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Поглощение при 280 нм очищенных растворов антитела измеряли с использованием спектрофотометра. Из измеренных значений вычисляли концентрации антител с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(8-3) Очистка Fab-фрагмента антитела 6RL#9
Антитело 6RL#9 концентрировали до 21 мг/мл с использованием ультрафильтра с пределом молекулярной массы 10000 MWCO. Образец антитела в концентрации 5 мг/мл (2,5 мл) получали разбавлением раствора антитела с использованием буфера 4 мМ L-цистеин/5 мМ EDTA/20 мМ фосфат натрия (рН 6,5). К образцу добавляли 0,125 мг папаина (Roche Applied Science). После перемешивания образец инкубировали при 35°С в течение двух часов. После инкубации таблетку с ингибиторами протеаз Protease Inhibitor Cocktail Mini, не содержащую EDTA (Roche Applied Science) растворяли в 10 мл буфера 25 мМ MES, рН 6, и добавляли к образцу. Образец инкубировали на льду для остановки протеолитического расщепления папаином. Затем образец наносили на 1-мл катионнообменную колонку HiTrap SP HP (GE Healthcare), уравновешенную 25 мМ буфером MES (рН 6), ниже которой была последовательно подсоединена 1-мл колонка с белком A HiTrap MabSelect Sure Protein A column (GE Healthcare). Очищенную фракцию Fab-фрагмента антитела 6RL#9 получали, путем проведения элюирования с помощью линейного градиента концентрации NaCl вплоть до 300 мМ в описанном выше буфере. Затем полученную очищенную фракцию концентрировали до приблизительно 0,8 мл с использованием ультрафильтра 5000 MWCO. Концентрат наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную 100 мМ буфером HEPES (рН 8), содержащим 50 мМ NaCl. Очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 для кристаллизации элюировали с колонки с использованием того же буфера. Все обработки колонок, описанные выше, проводили при низкой температуре от 6 до 7,5°С.
(8-4) Кристаллизация Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в присутствии Са
2
2
Затравочные кристаллы Fab-фрагмента 6RL#9 получали заранее согласно общим условиям. Затем очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 в 5 мМ CaCl концентрировали до 12 мг/мл с помощью ультрафильтра 5000 MWCO. Далее, образец, концентрированный, как описано выше, кристаллизовали способом висячей капли посредством диффузии в парах с использованием 100 мМ буфера HEPES (рН 7,5), содержавшего 20%-29% PEG4000, в качестве резервуарного раствора. Описанные выше затравочные кристаллы, дробили в 100 мМ буфере HEPES (рН 7,5), содержавшем 29% PEG4000 и 5 мМ CaCl, и проводили серийное разведение в от 100 до 10000 раз. Затем 0,2 мкл разбавленных растворов комбинировали со смесью 0,8 мкл резервуарного раствора и 0,8 мкл концентрированного образца для получения кристаллизационных капель на покровном стекле. Каплям кристаллов позволяли держаться при 20°С в течение от двух до трех суток до получения плоских кристаллов. С использованием кристаллов получали данные рентгенодифракции.
(8-5) Кристаллизация Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие Са
Очищенный Fab-фрагмент антитела 6RL#9 концентрировали до 15 мг/мл с помощью ультрафильтра 5000 MWCO. Далее, образец, концентрированный, как описано выше, кристаллизовали способом висячей капли посредством диффузии в парах с использованием 100 мМ буфера HEPES (рН 7,5), содержавшего 18%-25% PEG4000, в качестве резервуарного раствора. Описанные выше затравочные кристаллы, дробили в 100 мМ буфере HEPES (рН 7,5), содержавшем 25% PEG4000, и проводили серийное разведение в от 100 до 10000 раз. Затем 0,2 мкл разбавленных растворов комбинировали со смесью 0,8 мкл резервуарного раствора и 0,8 мкл концентрированного образца для получения кристаллизационных капель на покровном стекле. Каплям кристаллов позволяли держаться при 20°С в течение от двух до трех суток до получения плоских кристаллов. С использованием кристаллов получали данные рентгенодифракции.
(8-6) Измерение данных рентгенодифракции кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в присутствии Са
2
Монокристалл Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученные в присутствии Са, смачивали 100 мМ раствором буфера HEPES (рН 7,5), содержавшим 35% PEG4000 и 5 мМ CaCl. Монокристалл вылавливали из раствора с использованием булавки с прикрепленной тонкой нейлоновой петлей и замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодифракции замороженного кристалла получали из линии пучка BL-17A Photon Factory в High Energy Accelerator Research Organization. В ходе измерения кристалл постоянно помещали в поток азота при -178°С для поддержания в замороженном состоянии. Всего было получено 180 дифракционных изображений с использованием CCD-детектора Quantum315r (ADSC), присоединенного к линии пучка при вращении кристалла на 1° за раз. Определение константы решетки, индексирование дифракционных пятен и анализ данных дифракции проводили с использованием программ Xia2 (ССР4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) и Scala (CCP4 Software Suite). Наконец, были получены данные интенсивности дифракции с разрешением вплоть до 2,2 . Кристалл принадлежит к группе симметрии Р212121 с константой решетки а=45,47 , b=79,86 , с=116,25 , α=90°, β=90° и γ=90°.
(8-7) Измерение данных рентгенодифракции кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в отсутствие Са
Кристаллы Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученные в отсутствие Са, смачивали 100 мМ раствором буфера HEPES (рН 7,5), содержавшим 35% PEG4000. Удалив внешней раствор с поверхности монокристалла с помощью булавки, с присоединенной тонкой нейлоновой петлей, монокристалл замораживали в жидком азоте. Данные рентгенодифракции замороженного кристалла получали из линии пучка BL-5A Photon Factory в High Energy Accelerator Research Organization. В ходе измерения кристалл постоянно помещали в поток азота при -178°С для поддержания в замороженном состоянии. Всего было получено 180 дифракционных изображений с использованием CCD-детектора Quantum315r (ADSC), присоединенного к линии пучка при вращении кристалла на 1° за раз. Определение константы решетки, индексирование дифракционных пятен и анализ данных дифракции проводили с использованием программ Xia2 (ССР4 Software Suite), XDS Package (Walfgang Kabsch) и Scala (CCP4 Software Suite). Наконец, были получены данные интенсивности дифракции с разрешением вплоть до 2,3 . Кристалл принадлежит к группе симметрии Р212121 с константой решетки а=45,40 , b=79,63 , с=116,07 , α=90°, β=90° и γ=90°, и, таким образом, он структурно идентичен кристаллу, полученному в присутствии Са.
(8-8) Анализ структуры кристалла Fab-фрагмента из антитела 6RL#9 в присутствии Са
Кристаллическую структуру Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в присутствии Са определяли способом молекулярного замещения с использованием программы Phaser (ССР4 Software Suite). Количество молекул в асимметричном элементе оценивали, исходя из размера кристаллической решетки и молекулярной массы Fab-фрагмента антитела 6RL#9. Исходя из гомологии первичной последовательности, часть из положений аминокислот 112-220 А-цепи и часть из положений аминокислот 116-218 В-цепи в конформационной координате PDB-кода 1ZA6, использовали в качестве модельных молекул для анализа областей CL и СН1. Затем часть из положений аминокислот 1-115 В-цепи в конформационной координате PDB-кода 1ZA6 использовали в качестве модельной молекулы для анализа VH-области. Наконец, часть из положений аминокислот 3-147 легкой цепи в конформационной координате PDB-кода 2А9М использовали в качестве модельной молекулы для анализа VL-области. Исходя из этого порядка, была получена первоначальная модель структуры Fab-фрагмента антитела 6RL#9 путем определения из функций сдвига и вращения положений и ориентации модельных молекул для анализа кристаллической решетки. Кристаллографический фактор достоверности R для данных отражения при разрешении от 25 до 3,0  составлял 46,9% и свободный R составлял 48,6% после детализации жесткого каркаса, где каждому из VH-, VL-, СН1- и CL-доменов позволяли отклоняться от первоначальной структурной модели. Затем детализации модели достигали путем повторения структурной детализации с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite) с последующей проверкой модели, проводимой с использованием программы Coot (Paul Emsley) на основании карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-Fc, где коэффициенты Fo-Fc и 2Fo-Fc вычисляли с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного на основе этой модели, и фаз. Конечную детализацию проводили с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite) на основе карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-Fc путем добавления молекулы воды и иона Са в модель. С помощью 21020 данных отражения при разрешении от 25 до 2,2 , в конечном итоге кристаллографический фактор достоверности R составил 20,0% и свободный R составил 27,9% для модели, состоящей из 3440 атомов.
(8-9) Определение данных рентгенодифракции кристалла Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие of Са
Кристаллическую структуру Fab-фрагмента антитела 6RL#9 в отсутствие Са определяли на основе структуры кристалла, полученного в присутствии Са. Молекулами воды и ионов Са пренебрегали в конформационных координатах кристалла Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученного в присутствии Са. Кристаллографический фактор достоверности R для данных отражения при разрешении от 25 до 3,0  составил 30,3% и свободный R составил 31,7% после детализации жесткого каркаса, где каждому из VH-, VL-, СН1- и CL-доменов позволяли отклоняться. Затем детализации модели достигали путем повторения структурной детализации с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite) с последующей проверкой модели, проводимой с использованием программы Coot (Paul Emsley) на основании карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-Fc, где коэффициенты Fo-Fc и 2Fo-Fc вычисляли с использованием экспериментально определенного структурного фактора Fo, структурного фактора Fc, вычисленного на основе этой модели, и фаз. Конечную детализацию проводили с использованием программы Refmac5 (ССР4 Software Suite) на основе карт электронной плотности Fo-Fc и 2Fo-F путем добавления молекулы воды в модель. С помощью 18357 данных отражения при разрешении от 25 до 2,3 , в конечном итоге кристаллографический фактор достоверности R составил 20,9% и свободный R составил 27,7% для модели, состоящей из 3351 атомов.
(8-10) Сравнение данных рентгеновской кристаллографической дифракции Fab-фрагментов антитела 6RL#9 в присутствии и в отсутствие Са
При сравнении кристаллических структур Fab-фрагментов антитела 6RL#9 в присутствии и в отсутствие Са, были выявлены значительные изменения в CDR3 тяжелой цепи. Структура CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, определенная рентгеноструктурным анализом, представлена на фиг. 49. В частности, ион кальция располагался в центре области петли CDR3 тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела 6RL#9, полученного в присутствии Са. Было предположено, что ион кальция взаимодействует с положениями 95, 96 и 100а (нумерация по Kabat) CDR3 тяжелой цепи. Было предположено, что петля CDR3 тяжелой цепи, которая является важной для связывания антигена, стабилизировалась связыванием кальция в присутствии Са, и становилась оптимальной структурой для связывания антигена. Отсутствуют сообщения, демонстрирующие, что кальций связывается с CDR3 тяжелой цепи антитела. Таким образом, связанная с кальцием структура CDR3 тяжелой цепи антитела является новой структурой.
Кальций-связывающий мотив, присутствующий в CDR3 тяжелой цепи, выявленный в структуре Fab-фрагмента антитела 6RL#9, также может стать новым элементом конструкции для Са-библиотеки для получения антигенсвязывающего домена, включенного в антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, который направлен против антигена в зависимости от концентрации ионов. Кальций-связывающий мотив встраивали в вариабельную область описанных ниже справочных примеров 18 и 19 и, например, полагают, что является возможной библиотека, содержащая CDR3 тяжелой цепи антитела 6RL#9 и нестрогие остатки в других CDR, включая легкую цепь.
[Справочный пример 9] Получение антител, которые связываются с IL-6 Са-зависимым образом, из библиотеки антител человека с использованием способов фагового дисплея
(9-1) Конструирование библиотеки фагового дисплея наивных антител человека
Библиотеку фагового дисплея антител человека, содержавшую множество фагов, которые экспонируют различные последовательности Fab-доменов антител человека, конструировали способом, известным специалистам в данной области с использованием, в качестве матрицы, поли-А-РНК, полученной из РВМС человека, коммерчески доступной поли-А-РНК человека и т.п.
(9-2) Получение фрагментов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом, из библиотеки с помощью пэннинга на гранулах
Первичную селекцию из сконструированных библиотек фагового дисплея наивных антител человека проводили путем обогащения фрагментами антител, которые имеют активность связывания антигена (IL-6). Использованный антиген представлял меченный биотином IL-6.
2
Фаги получали с помощью Е. coli, несущих фагмиды фагового дисплея. К осадку фагов, полученных с помощью Е. coli, добавляли 2,5 М NaCl/10% PEG в культуральную среду для Е. coli. Фракцию фагов разбавляли TBS для получения раствора с фаговой библиотекой. Затем к раствору с фаговой библиотекой добавляли BSA и CaCl до конечных концентраций 4% BSA и 1,2 мМ ионов кальция, соответственно. Использованный способ пэннинга представлял собой общепринятый способ пэннинга с использованием магнитных гранул с иммобилизованным на них антигеном (J Immunol Methods. 2008 Mar 20, 332(1-2): 2-9; J Immunol Methods. 2001 Jan 1, 247(1-2): 191-203; Biotechnol Prog. 2002 Mar-Apr, 18(2): 212-20; Mol Cell Proteomics. 2003 Feb, 2(2): 61-9). Использованные магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) и покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads М-280 Streptavidin).
2
2
В частности, 250 пмоль биотинилированного антигена добавляли к полученному раствору с фаговой библиотекой. Таким образом, раствор контактировали с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и комплексу антиген-фаг позволяли связываться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали три раза 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBS (TBS, содержащий 1,2 мМ CaCl). После этого к гранулам добавляли 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл. После диспергирования в течение 15 минут при комнатной температуре, гранулы сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора суспензии фагов. Полученную суспензию фагов добавляли к 10 мл Е. coli штамма TG1 в фазе логарифмического роста (OD600=0,4-0,7). Е. coli инкубировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа для инфицирования фагами. Инфицированные Е. coli высевали в чашку (225 мм × 225 мм). Затем из культуральной среды посеянных Е. coli собирали фаги для получения раствора с фаговой библиотекой.
2
2
2
При втором и последующих пэннингах, фаги обогащали с использованием способности к Са-зависимому связыванию в качестве индикатора. В частности, 40 пмоль меченного биотином антигена добавляли к полученному раствору фаговой библиотеки. Таким образом, фаговую библиотеку контактировали с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и комплексу антиген-фаг позволяли связаться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали один раз 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST (TBS содержащий 1,2 мМ CaCl и 0,1% Tween-20) и 1,2 мМ CaCl/TBS. Затем к гранулам добавляли 0,1 мл 2 мМ EDTA/TBS. После диспергирования при комнатной температуре гранулы сразу отделяли с использованием магнитного стенда для сбора суспензии фагов. Белок pIII (белок pIII, происходящий из фага-помощника) отщепляли от фагов, которые не экспонировали Fab, добавлением 5 мкл трипсина в концентрации 100 мг/мл к собранной суспензии фага для устранения способности фагов, не экспонирующих Fab, инфицировать Е. coli. Фаги, собранные из исходного раствора с фагом после обработки трипсином, добавляли к 10 мл клеток Е. coli штамма TG1 в фазе логарифмического роста (OD600=0,4-0,7). Е. coli инкубировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа для инфицирования фагами. Инфицированные Е. coli высевали в чашку (225 мм × 225 мм). Затем из культуральной среды посеянных Е. coli собирали фаги для получения жидкого исходного раствора с фаговой библиотекой. Пэннинг проводили три раза с использованием активности Са-зависимого связывания в качестве индикатора.
(9-3) Оценка с помощью ELISA фагов
2
2
2
2
2
Содержащие фаг культуральные супернатанты собирали из единичных колоний Е. coli, полученных способом, описанным выше, в соответствии с общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). В содержащие фаг культуральные супернатанты добавляли BSA и CaCl до конечных концентраций 4% BSA и 1,2 мМ ионов кальция, соответственно. Супернатанты подвергали ELISA по следующей методике. 96-луночные микропланшеты для титрования StreptaWell (Roche) покрывали в течение ночи с использованием 100 мкл PBS, содержащего меченный биотином антиген. Антиген удаляли из лунки путем промывания каждой лунки планшета PBST. Затем лунки блокировали 250 мкл 4% BSA-TBS в течение одного часа или более. После удаления 4% BSA-TBS в каждую лунку добавляли полученные культуральные супернатанты. Планшет инкубировали при 37°С в течение одного часа, так чтобы позволить экспонирующим антитело фагам связаться с антигеном на каждой лунке. После промывания каждой лунки 1,2 мМ CaCl/TBST, добавляли 1,2 мМ CaCl/TBS или 1 мМ EDTA/TBS. Планшет оставляли для инкубации при 37°С в течение 30 минут. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгированное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS, содержащим BSA и ионы кальция в конечных концентрациях 4% и 1,2 мМ ионов кальция, и планшет инкубировали в течение одного часа. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли раствор только ТМВ (ZYMED). Хромогенную реакцию в растворе в каждой лунке останавливали добавлением серной кислоты. Затем проявившийся цвет оценивали путем измерения поглощения при 450 нм.
Из 96 выделенных клонов с помощью ELISA фагов было получено антитело 6KC4-1#85, имеющее Са-зависимую активность связывания IL-6. С использованием фрагментов антител, для которых было предсказано, что они имеют Са-зависимую антигенсвязывающую активность, исходя из результата фагового ELISA, описанного выше, в качестве матрицы, гены амплифицировали со специфическими праймерами и их последовательности анализировали.
Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 6KC4-1#85 представлены в SEQ ID NO: 10 и 48, соответственно. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 49) связывали с полинуклеотидом, кодирующим последовательность, происходящую из IgG1 способом ПЦР. Полученный фрагмент ДНК встраивали в экспрессирующий вектор клеток животных для конструирования экспрессирующего вектора для тяжелой цепи SEQ ID NO: 48. Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи антитела 6KC4-1#85 (SEQ ID NO: 50), связывали с полинуклеотидом, кодирующим константную область природной каппа-цепи (SEQ ID NO: 100) способом ПЦР. Связанный фрагмент ДНК встраивали в экспрессирующий вектор клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области.
(9-4) Экспрессия и очистка антител
6
2
2
Клон 6KC4-1#85, который оценили как имеющий способность к Са-зависимому связыванию с помощью ELISA фагов, вводили в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с использованием следующего способа. Клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона FreeStyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и аликвоты объемом 3 мл высевали в каждую ячейку планшетов с 6 ячейками с плотностью клеток 1,33×10 клеток/мл. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе CO (37°С, 8% CO, 90 об./мин.) в течение четырех суток. Из полученных культуральных супернатантов антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Концентрации очищенных антител определяли путем измерения поглощения при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из установленных величин на основе коэффициента экстинкции, определенного способом РАСЕ (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
[Справочный пример 10] Оценка связывания антитела 6KC4-1#85 с ионом кальция
Антитело 6KC4-1#85 с кальций-зависимым связыванием, которое было выделено из библиотеки антител человека, оценивали в отношении связывания им кальция. Оценку того, варьирует ли измеренная величина Tm, в зависимости от концентрации ионизированного кальция, проводили способом, описанным в справочном примере 7.
Величины Tm для Fab-домена антитела 6KC4-1#85 представлены в таблице 36. Как показано в таблице 36, величина Tm для Fab-домена антитела 6KC4-1#85 варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция. Это демонстрирует, что антитело 6KC4-1#85 связывается с кальцием.
[Справочный пример 11] Идентификация участка связывания ионов кальция в антителе 6KC4-1#85
Как показано в справочном примере 10, антитело 6KC4-1#85 связывается с ионом кальция. Однако 6KC4-1#85 не имеет кальций-связывающего мотива, такого как последовательность hVk5-2, для которой путем оценки было выявлено, что она обладает кальций-связывающим мотивом. Затем подтверждение того, что ион кальция связывает с любой или обеими из тяжелой цепи и легкой цепи антитела 6KC4-1#85, проводили посредством оценки связывания ионов кальция измененными антителами вследствие замены тяжелой цепи и легкой цепи 6KC4-1#85, соответственно, на тяжелую цепь и легкую цепь антитела против глипикана 3 (последовательность тяжелой цепи GC_H (SEQ ID NO: 51), последовательность легкой цепи GC_L (SEQ ID NO: 52)), которое не связывает ион кальция. Величины Tm измененных антител, измеренных способом, описанным в справочном примере 7, представлены в таблице 37. Результат указывает на то, что тяжелая цепь антитела 6KC4-1#85 связывается с кальцием, поскольку величины Tm измененного антитела, имеющего тяжелую цепь антитела 6KC4-1#85, изменялись в зависимости от концентрации ионов кальция.
Таким образом, для дальнейшей идентификации остатков, ответственных за связывание ионов кальция антителом 6KC4-1#85, конструировали измененные тяжелые цепи (6_Н1-11 (SEQ ID NO: 53), 6_Н1-12 (SEQ ID NO: 54), 6_Н1-13 (SEQ ID NO: 55), 6_Н1-14 (SEQ ID NO: 56), 6_Н1-15 (SEQ ID NO: 57)) и измененные легкие цепи (6_L1-5 (SEQ ID NO: 58) и 6_L1-6 (SEQ ID NO: 59)) путем замены остатка Asp (D) в CDR антитела 6KC4-1#85 остатком Ala (А), который не участвует в связывании или хелатировании ионов кальция. Способом, описанным в справочном примере 9, измененные антитела очищали из культуральных супернатантов клеток животных, в которые введены экспрессирующие векторы, несущие гены измененных антител. Очищенные измененные антитела оценивали в отношении связывания ими кальция способом, описанным в примере 7. Результат измерения представлен в таблице 38. Как показано в таблице 38, замена остатком Ala остатка в положении 95 или 101 (нумерация Kabat) в CDR3 тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85 приводила к утрате активности антитела 6KC4-1#85 в отношении связывания кальция. Это указывает на то, что эти остатки ответственны за связывание кальция.
Кальций-связывающий мотив, расположенный в основании петли CDR3 в тяжелой цепи антитела 6KC4-1#85, которое было обнаружено на основе способности связывать кальций у антитела, измененного относительно 6KC4-1#85, может представлять собой новый фактор для конструирования Са-библиотек, которые используют для получения антигенсвязывающих доменов против антигена в зависимости от концентрации ионов, которые содержатся в антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению. В справочных примерах 18 и 19 ниже, кальций-связывающие мотивы вносили в вариабельную область легкой цепи. Между тем, такие библиотеки включают, например, библиотеки, содержащие CDR3 тяжелой цепи из антитела 6KC4-1#85 и нестрогие остатки в CDR, отличных от CDR3 тяжелой цепи, но включающих CDR легкой цепи.
[Справочный пример 12] Исследование эффектов антитела с Са-зависимым связыванием на удержание в плазме антигена с использованием нормальных мышей
(12-1) Исследование in vivo с использованием нормальных мышей
Нормальной мыши (мышь C57BL/6J, Charles River Japan), вводили hsIL-6R (растворимый рецептор IL-6 человека, полученный согласно справочному примеру 3) отдельно, или вводили hsIL-6R и антитело против рецептора IL-6 человека одновременно для исследования кинетики hsIL-6R и антитела против рецептора IL-6 человека in vivo. Однократную дозу (10 мл/кг) раствора hsIL-6R (5 мкг/мл) или hsIL-6R и антитела против рецептора IL-6 человека вводили в хвостовую вену. Указанные выше H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1 использовали в качестве антител против рецептора IL-6 человека.
Концентрация hsIL-6R во всех смесях составляет 5 мкг/мл. Концентрации антитела против рецептора IL-6 человека варьируют для антител: 0,1 мг/мл для H54/L28-IgG1 и 10 мг/мл для 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1. В это время полагали, что большинство hsIL-6R связываются с антителом, поскольку антитело против hsIL-6R человека присутствует в достаточном или избыточном количестве. Взятие образцов крови проводили через 15 минут, 7 часов и 1, 2, 4, 7, 14, 21 и 28 суток после введения. Полученные образцы крови сразу центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 12000 об./мин. для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили в морозильной камере при -20°С или ниже до времени измерения.
(12-2) Определение концентрации в плазме рецептора против IL-6 человека у нормальных мышей с помощью ELISA
Концентрацию антитела против рецептора IL-6 человека в плазме мыши определяли с помощью ELISA. Сначала F(ab')2-фрагмент антитела против IgG человека (специфичный к γ-цепи) (SIGMA) распределяли в планшеты Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp (Nalge nunc International) и позволяли им стоять в течение ночи при 4°С с получением планшетов с антителом против IgG человека в твердой фазе. Образцы для калибровочной кривой, имеющие концентрации в плазме 0,64, 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02 или 0,01 мкг/мл, и образцы плазмы мыши для измерения, разбавленные в 100 раз или более, распределяли в планшет с антителом против IgG человека на твердой фазе, а затем проводили инкубацию в течение 1 часа при 25°С. Затем планшету позволяли реагировать с биотинилированным антителом против IL-6 R человека (R&D) в течение 1 часа при 25°С, а затем проводили реакцию со стрептавидин-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) в течение 0,5 часа при 25°С. Хромогенную реакцию проводили с использованием ТМВ One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) в качестве субстрата. После остановки хромогенной реакции 1Н серной кислотой (Showa Chemical) измеряли поглощение цветного раствора при 450 нм на устройстве для считывания микропланшетов. Концентрации антител в плазме у мышей вычисляли из величин поглощения на калибровочной кривой с использованием аналитического программного обеспечения SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения в концентрациях в плазме антител H54/L28-IgG1, 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1, у нормальных мышей после внутривенного введения, измеренных как описано выше, представлено на фиг. 50.
(12-3) Определение концентрации в плазме hsIL-6R способом электрохемилюминесценции
Концентрацию hsIL-6R в плазме мыши определяли способом электрохемилюминесценции. Образец для калибровочной кривой hsIL-6R, приготовленный в концентрации 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 или 31,25 пг/мл, и образец плазмы мыши для измерения, разбавленный в 50 раз или выше, смешивали с моноклональным антителом против IL-6R человека (R&D), рутенированным с помощью SULFO-TAG NHS Ester (Meso Scale Discovery) и биотинилированным антителом против IL-6R человека (R&D), и тоцилизумабом (тяжелая цепь SEQ ID NO: 60, легкая цепь SEQ ID NO: 61), с последующей реакцией в течение ночи при 4°С. К этому времени буфер для анализа содержал 10 мМ EDTA для снижения концентрации свободного Са в образце и диссоциации практически всех hsIL-6R в образце от 6RL#9-IgGl или FH4-IgG1 для связывания с добавленным тоцилизумабом. Затем указанную реакционную жидкость распределяли в планшет со стрептавидином МА400 PR Streptavidin Plate (Meso Scale Discovery). Кроме того, после промывания каждой лунки планшета, которому позволяли реагировать в течение 1 часа при 25°С, в каждую лунку распределяли буфер для считывания Т (×4) (Meso Scale Discovery). Сразу после этого реакционную жидкость подвергали измерению с использованием устройства для считывания SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). Концентрацию hsIL-6R вычисляли из ответа калибровочной кривой с использованием программного обеспечения для анализа SOFTmax PRO (Molecular Devices). Изменения концентрации в плазме hsIL-6R у нормальной мыши после внутривенного введения, определенные как описано выше, представлены на фиг. 51.
В результате, исчезновение hsIL-6R было очень быстрым, когда hsIL-6R вводили отдельно, в то время как исчезновение hsIL-6R было значительно замедленным, когда hsIL-6R вводили одновременно с H54/L28-IgGl, обычным антителом, не обладающим активностью связывания Са с hsIL-6R. Напротив, исчезновение hsIL-6R было значительно ускорено, когда hsIL-6R вводили одновременно с 6RL#9-IgG1 или FH4-IgG1, обладающим в 100 раз или более высокой зависимой от Са способностью связывания с hsIL-6R. Концентрации в плазме hsIL-6R через одни сутки после введения hsIL-6R одновременно с 6RL#9-IgG1 и FH4-IgG1 были снижены в 39 раз и 2 раз, соответственно, по сравнению с одновременным введением с H54/L28-IgG1. Таким образом, было подтверждено, что антитела с зависимым от кальция связывания способны ускорять исчезновение антигена из плазмы.
[Справочный пример 13] Исследование последовательностей человека эмбрионального типа, которые связываются с ионами кальция
(13-1) Антитело, которое связывается с антигеном зависимым от кальция образом
Антитела, которые связываются с антигеном зависимым от кальция образом (антитела с зависимым от кальция связыванием антигена), представляют собой антитела, взаимодействия которых с антигеном изменяются, в зависимости от концентрации кальция. Полагают, что антитело с зависимым от кальция связыванием связывается с антигеном через ион кальция. Таким образом, аминокислоты, которые образуют эпитоп на одной стороне антигена, представляют собой отрицательно заряженные аминокислоты, которые могут хелатировать ионы кальция, или аминокислоты, которые могут являться акцептором водородной связи. Эти свойства аминокислот, которые образуют эпитоп, позволяют нацеливание на эпитоп, отличное от связывающих молекул, которые получают внесением остатков гистидина и которые связываются с антигеном рН-зависимым образом. Более того, полагают, что применение антигенсвязывающих молекул, обладающих свойствами кальций- и рН-зависимого связывания, позволит образование антигенсвязывающих молекул, которые могут быть индивидуально нацелены на различные эпитопы, имеющие широкие свойства. Таким образом, если конструируют совокупность молекул, содержащих кальций-связывающий мотив (Са-библиотека), из которых получают антигенсвязывающие молекулы, полагают, что будут эффективным путем получены антитела с зависимым от кальция связыванием антигена.
(13-2) Получение последовательностей человека эмбрионального типа
Примером совокупности молекул, содержащих кальций-связывающий мотив, является пример, в котором указанные молекулы представляют собой антитела. Иными словами, библиотека антител, содержащих кальций-связывающий мотив, может представлять собой Са-библиотеку.
Антитела с зависимым от ионов кальция связыванием, содержащие последовательности человека эмбрионального типа не были описаны. Таким образом, последовательности антител эмбрионального типа, обладающие последовательностями человека эмбрионального типа, клонировали с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной из поли-РНК селезенки эмбриона (Clontech) для оценки того, связываются ли антитела, обладающие последовательностями человека эмбрионального типа, с ионом кальция. Клонированные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Нуклеотидные последовательности сконструированных экспрессирующих векторов определяли способом, известным специалистам в данной области. SEQ ID представлены в таблице 39. С помощью ПЦР полинуклеотиды, кодирующие SEQ ID NO: 5 (Vkl), SEQ ID NO: 6 (Vk2), SEQ ID NO: 7 (Vk3), SEQ ID NO: 8 (Vk4) и SEQ ID NO: 62 (Vk5-2), связывали с полинуклеотидом, кодирующим природную константную область каппа-цепи (SEQ ID NO: 50). Связанные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Более того, полинуклеотиды вариабельной области тяжелой цепи, кодирующие SEQ ID NO: 63 (Vk1), SEQ ID NO: 64 (Vk2), SEQ ID NO: 65 (Vk3) и SEQ ID NO: 66 (Vk4), связывали способом ПЦР с полинуклеотидом, кодирующим IgG1 SEQ ID NO: 163 (имеющий делецию двух аминокислот на С-конце IgG1). Полученные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области.
(13-3) Экспрессия и очистка антител
6
2
2
Сконструированные экспрессирующие векторы клеток животных, в которые встроены фрагменты ДНК, имеющие пять типов последовательностей человека эмбрионального типа, вводили в клетки животных. Экспрессию антитела проводили следующим способом. Клетки клеточной линии, происходящей из почки эмбриона человека FreeStyle 293-F (Invitrogen) суспендировали в среде FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали с плотностью клеток 1,33×10 клеток/мл (3 мл) в каждую лунку планшета с 6 ячейками. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в течение четырех суток в инкубаторе с CO (37°С, 8% СО, 90 об./мин.). Из культуральных супернатантов, полученных как описано выше, антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенного антитела при 280 измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(13-4) Оценка антител, имеющих последовательности человека эмбрионального типа, в отношении их активности связывания ионов кальция
2
2
Очищенные антитела оценивали в отношении их активности связывания ионов кальция. Промежуточную температуру термической денатурации (величину Tm) измеряли с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) в качестве показателя для исследования связывания ионов кальция с антителом (MicroCal VP-Capillary DSC, MicroCal). Промежуточная температура термической денатурации (величина Tm) является показателем стабильности. Величина Tm становится более высокой, когда белок стабилизирован путем связывания с ионами кальция, по сравнению с отсутствием связывания ионов кальция (J. Biol. Chem. (2008) 283, 37, 25140-25149). Активность связывания ионов кальция с антителом исследовали путем исследования изменений величины Tm антитела, в зависимости от изменений концентрации ионов кальция в растворе антитела. Очищенное антитело подвергали диализу (EasySEP, TOMY) с использованием внешнего раствора 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 2 мМ CaCl (рН 7,4), или 20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, и 3 μМ CaCl (рН 7,4). Измерение DSC проводили при скорости нагревания 240°С/ч от 20 до 115°С с использованием раствора антитела, приготовленного в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл с диализатом в качестве исследуемого вещества. Промежуточные температуры термической денатурации (величины Tm) Fab-доменов каждого антитела, вычисленные исходя из кривой денатурации, полученной с помощью DSC, представлены в таблице 40.
Результат показал, что величины Tm Fab-доменов антител, имеющих последовательность hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4, не варьировали в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах, содержащих Fab-домен. Между тем, величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего последовательность hVk5, варьировала в зависимости от концентрации ионов кальция в растворе, содержащем Fab-домен. Это демонстрирует, что последовательность hVk5 связывается с ионами кальция.
(13-5) Оценка последовательности hVk5-2 в отношении связывания кальция
2
В (5-2) справочного примера 5, получали вариант 1 Vk5-2 (SEQ ID NO: 68) и вариант 2 Vk5-2 (SEQ ID NO: 69) в дополнение к Vk5-2 (SEQ ID NO: 4), все из которых классифицируют как Vk5-2. Эти варианты оценивали в отношении связывания ими кальция. Каждый из фрагментов ДНК для Vk5-2, варианта 1 Vk5-2 и варианта 2 Vk5-2 встраивали в экспрессирующие векторы для клеток животных. Нуклеотидные последовательности сконструированных экспрессирующих векторов определяли способом, известным специалистам в данной области. С помощью способа, описанного в (12-3) справочного примера 12, экспрессирующие векторы клеток животных, в которые были встроены фрагменты ДНК для Vk5-2, варианта 1 Vk5-2 и варианта 2 Vk5-2, вводили, в комбинации с экспрессирующим вектором животных, содержащим вставку для экспрессии CIM_H (SEQ ID NO: 67) в качестве тяжелой цепи, в клетки животных и антитела очищали. Очищенные антитела оценивали в отношении их активности связывания ионов кальция. Очищенные антитела подвергали диализу (EasySEP, TOMY) против 20 мМ Tris-HCl/150 мМ NaCl (рН 7,5) (в таблице 41, указано как концентрация ионов кальция 0 мМ) или 20 мМ Tris-HCl/150 мМ NaCl/2 мМ CaCl (рН 7,5). Измерение DSC проводили при скорости увеличения температуры 240°С/ч от 20 до 115°С с использованием растворов антител, приготовленных в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл с помощью того же раствора, который использовали для диализа. На основе полученных кривых денатурации DSC, промежуточную температуру термической денатурации (величина Tm) вычисляли для Fab-домена каждого антитела. Величины Tm представлены в таблице 41.
Результат показал, что величина Tm в отношении Fab-доменов антител, имеющих последовательность Vk5-2, варианта 1 Vk5-2 или варианта 2 Vk5-2 варьировала в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах, содержащих антитела, имеющие Fab-домены. Это демонстрирует, что антитела, имеющие последовательность, классифицируемую как Vk5-2, связываются с ионом кальция.
[Справочный пример 14] Оценка последовательности Vk5 человека (hVk5)
(14-1) Последовательность hVk5
Единственной последовательностью hVk5, зарегистрированной в базе данных Kabat, является последовательность hVk5-2. Далее hVk5 и hVk5-2 используются в качестве синонимов.
В WO 2010/136598 описано, что относительная распространенность последовательности hVk5-2 в последовательности эмбрионального типа составляет 0,4%. Также существуют другие сообщения, согласно которым относительная распространенность последовательности hVk5-2 в последовательности эмбрионального типа составляет 0-0,06% (J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86; Proc. Natl. Acad. Sci. (2009) 106, 48, 20216-20221). Как описано выше, поскольку последовательность hVk5-2 представляет собой последовательность с низкой частотой появления в последовательности эмбрионального типа, полагали, что она является неэффективной для получения антитела с кальций-зависимым связыванием из библиотеки антител, состоящей из последовательностей человека эмбрионального типа, или В-клеток, полученных путем иммунизации мыши, экспрессирующей антитела человека. Таким образом, возможно сконструировать Са-библиотеки, содержащие последовательность hVk5-2 человека. Между тем, описанные синтетические библиотеки антител (WO 2010/105256 и WO 2010/136598) не содержали последовательность hVk5. Кроме того, возможность реализации неизвестна, поскольку отсутствуют опубликованные сообщения о физических свойствах последовательности hVk5-2.
(14-2) Конструирование, экспрессия и очистка негликозилированной формы последовательности hVk5-2
Последовательность hVk5-2 имеет последовательность для гликозилирования N-типа в положении аминокислоты 20 (нумерация по Kabat). Цепи сахаров, присоединенные к белкам, проявляют гетерогенность. Таким образом, желательно устранить гликозилирование с точки зрения гомогенности вещества. В этом контексте, конструировали вариант hVk5-2_L65 (SEQ ID NO: 70), в котором остаток Asn (N) в положении 2 0 (нумерация по Kabat) заменен на Thr (Т). Аминокислотную замену проводили способом, известным специалистам в данной области, с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). ДНК, кодирующую вариант hVk5-2_L65, встраивали в экспрессирующий вектор животных. Экспрессирующий вектор животных, в который встроена конструированная ДНК, кодирующая вариант hVk5-2_L65, в комбинации с экспрессирующим вектором животных, имеющим вставку для экспрессии CIM_H (SEQ ID NO: 67) в качестве тяжелой цепи, встраивали в клетки животных способом, описанным в справочном примере 5. Антитело, содержащее hVk5-2_L65 и CIM_Н, которые экспрессировались в клетках животных, в которые были введены векторы, очищали способом, описанным в справочном примере 13.
(14-3) Оценка антитела, имеющего негликозилированную последовательность hVk5-2, в отношении физических свойств
Выделенное антитело, имеющее модифицированную последовательность hVk5-2_L65, анализировали ионообменной хроматографией для исследования того, является ли она менее гетерогенной, чем антитело, имеющее исходную последовательность hVk5-2, до изменения. Методика ионообменной хроматографии представлена в таблице 42. Результат анализа показал, что hVk5-2_L65, модифицированное в участке гликозилирования, было менее гетерогенным, чем исходная последовательность hVk5-2, как показано на фиг. 52.
Далее оценку того, связывается ли антитело, содержащее менее гетерогенную последовательность hVk5-2_L65, с ионом кальция, оценивали способом, описанным в справочном примере 13. Результат показал, что величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего hVk5-2_L65 с измененным участком гликозилирования, также варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител, как показано в таблице 43. В частности, было продемонстрировано, что Fab-домен антитела, имеющего hVk5-2_L65 с измененным участком гликозилирования, связывается с ионом кальция.
[Справочный пример 15] Оценка активности связывания ионов кальция молекулами антител, имеющими последовательность CDR из последовательности hVk5-2
(15-1) Конструирование, экспрессия и очистка модифицированных антител, имеющих последовательность CDR из последовательности hVk5-2
Последовательность hVk5-2_L65 представляет собой последовательность с измененными аминокислотами в участке гликозилирования каркасной области последовательности Vk5-2 человека. Как описано в справочном примере 14, было продемонстрировано, что связывание ионов кальция происходило даже после изменения участка гликозилирования. Между тем, с точки зрения иммуногенности, главным образом, желательно, чтобы каркасная последовательность представляла собой последовательность эмбрионального типа. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, может ли каркасная последовательность антитела быть заменена каркасной последовательностью негликозилированной последовательности эмбрионального типа при сохранении активности антитела в отношении связывания ионов кальция.
Полинуклеотиды, кодирующие химически синтезированные последовательности, которые содержат измененную последовательность каркасной области из последовательности hVk5-2, hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4 (CaVk1 (SEQ ID NO: 71), CaVk2 (SEQ ID NO: 72), CaVk3 (SEQ ID NO: 73) или CaVk4 (SEQ ID NO: 74), соответственно) связывали способом ПЦР с полинуклеотидом, кодирующим константную область (SEQ ID NO: 50) природной каппа-цепи. Связанные фрагменты ДНК встраивали в экспрессирующие векторы клеток животных. Последовательности сконструированных вариантов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Каждую плазмиду, сконструированную, как описано выше, встраивали в клетки животных в комбинации с плазмидой, в которую встроен полинуклеотид, кодирующий CIM_H (SEQ ID NO: 67), способом, описанным в примере 13. Экспрессированные молекулы представляющего интерес антитела очищали из культуральной среды клеток животных, в которые были введены плазмиды.
(15-2) Оценка измененных антител, имеющих последовательность CDR из последовательности hVk5-2, в отношении их активности связывания ионов кальция
Оценку того, связываются ли ионы кальция с измененными антителами, имеющими последовательность CDR из последовательности hVK5-2 и каркасные последовательности из последовательностей эмбрионального типа, отличные от hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 и hVk4), оценивали с использованием способа, описанного в справочном примере 5. Результат оценки представлен в таблице 44. Было выявлено, что величина Tm Fab-домена каждого из измененных антител варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител. Это демонстрирует, что антитела, имеющие каркасную последовательность, отличную от каркасной последовательности из последовательности hVk5-2, также связываются с ионами кальция.
Было продемонстрировано, что температура термической денатурации (величина Tm), в качестве индикатора термической стабильности Fab-домена каждого антитела, измененного так, чтобы оно имело последовательность CDR из последовательности hVK5-2 и каркасную последовательность эмбрионального типа, отличную от последовательности hVk5-2 (hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4) является более высокой, чем температура термической денатурации Fab-домена исходного антитела, имеющего последовательность hVk5-2. Этот результат показывает, что антитела, имеющие последовательность CDR из последовательности hVk5-2 и каркасную последовательность hVk1, hVk2, hVk3 или hVk4, не только обладают активностью связывания ионов кальция, но также являются превосходными молекулами с точки зрения термической стабильности.
[Справочный пример 16] Идентификация участка связывания ионов кальция в последовательности hVk5-2 человека эмбрионального типа
(16-1) Конструирование участка мутации в последовательности CDR из последовательности hVk5-2
Как описано в справочном примере 15, также было показано, что антитела, имеющие легкую цепь, полученную в результате введения области CDR последовательности hVk5-2 в каркасную последовательность отличающейся последовательности эмбрионального типа, связываются с ионом кальция. Этот результат указывает на то, что в hVk5-2 участок связывания ионов кальция локализован в его CDR. Аминокислоты, которые связываются с ионом кальция, т.е. хелатируют ион кальция, включают отрицательно заряженные аминокислоты и аминокислоты, которые могут быть акцептором водородной связи. Таким образом, исследовали, связываются ли антитела, имеющие мутантную последовательность hVk5-2 с заменой остатком Ala (А) остатка Asp (D) или Glu (Е) в последовательности CDR из последовательности hVk5-2, с ионом кальция.
(16-2) Конструирование последовательностей вариантов hVk5-2 с заменой на Ala, и экспрессия и очистка антител
Молекулы антител получали так, чтобы они содержали легкую цепь с заменой остатка Asp и/или Glu остатком Ala в последовательности CDR из последовательности hVk5-2. Как описано в справочном примере 14, негликозилированный вариант hVk5-2_L65 проявлял связывание ионов кальция, и было предположено, что он является эквивалентным последовательности hVk5-2 с точки зрения связывания ионов кальция. В этом примере аминокислотные замены вносили в hVk5-2_L65 в качестве матричной последовательности. Сконструированные варианты представлены в таблице 45. Аминокислотные замены проводили способами, известными специалистам в данной области, такими как использование набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), ПЦР или набора In fusion Advantage PCR Cloning Kit (TAKARA) для конструирования экспрессирующих векторов для измененных легких цепей, имеющих аминокислотную замену.
Нуклеотидные последовательности сконструированных экспрессирующих векторов подтверждали способом, известным специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы, сконструированные для измененных легких цепей, временно вводили, в комбинации с экспрессирующим вектором для тяжелой цепи CIM_Н (SEQ ID NO: 67), в клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона человека НЕК293Н (Invitrogen) или FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии антител. Из полученных культуральных супернатантов антитела очищали с использованием rProtein А SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенного антитела при 280 нм измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(16-3) Оценка антител, имеющих замену Ala в последовательности hVk5-2, в отношении активности связывания ионов кальция
Проводили исследование, связываются ли полученные очищенные антитела с ионами кальция, способом, описанным в справочном примере 13. Результат представлен в таблице 46. Было выявлено, что некоторые антитела, имеющие замену остатка Asp или Glu в последовательности CDR из последовательности hVk5-2 на остаток Ala, который не может быть вовлечен в связывание или хелатирование ионов кальция, имеют Fab-домен, Tm которого не варьировала, в зависимости от концентрации ионов кальция в растворах антител. Было показано, что участки замены, в которых замена на Ala не изменяла Tm (положения 32 и 92 (нумерация по Kabat)) являются в значительной степени важными для связывания антителом ионов кальция.
[Справочный пример 17] Оценка антител, имеющих последовательность hVk1 со связывающим ионы кальция мотивом
(17-1) Конструирование последовательности hVk1 со связывающим ионы кальция мотивом, и экспрессия и очистка антител
Результат, описанный в справочном примере 16, в отношении активности связывания кальция в случае замены Ala, демонстрирует, что остатки Asp или Glu в последовательности CDR из последовательности hVk5-2 были важными для связывания кальция. Таким образом, авторы настоящего изобретения оценивали, может ли антитело связываться с ионом кальция, когда остатки в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) отдельно вносили в другую последовательность вариабельной области эмбрионального типа. В частности, вариант LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 83) конструировали путем замены остатками в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) в последовательности hVk5-2 остатков в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) последовательности hVkl (последовательность человека эмбрионального типа). В частности исследовали, могут ли антитела, имеющие последовательность hVk1, в которую встроено только 5 остатков из последовательности hVk5-2, связывать кальций. Варианты получали тем же способом, который описан в справочном примере 16. Полученные варианты легкой цепи LfVk1_Ca и LfVk1, имеющие последовательность легкой цепи hVk1 (SEQ ID NO: 84) совместно экспрессировали с тяжелой цепью CIM_H (SEQ ID NO: 67). Антитела экспрессировали и очищали тем же способом, который описан в справочном примере 16.
(17-2) Оценка антител, имеющих последовательность hVk1 человека со связывающим ионы кальция мотивом, в отношении активности связывания ионов кальция
Оценку того, связывает ли очищенное антитело, полученное как описано выше, ионы кальция, проводили способом, описанным в справочном примере 13. Результаты представлены в таблице 47. Величина Tm для Fab-домена антитела, имеющего LfVk1 с последовательностью hVk1, не варьировала, в зависимости от концентрации кальция в растворах антител. Между тем, Tm антитела, имеющего последовательность LfVk1_Ca, сдвигалась на 1°С или более при изменении концентрации кальция в растворах антител. Таким образом, было показано, что антитело, имеющее LfVk1_Ca, связывается с кальцием. Результаты, описанные выше, демонстрирует, что полная последовательность CDR hVk5-2 не требуется, в то время как остатки, внесенные для конструирования последовательности LfVk1_Ca отдельно, являются достаточными для связывания ионов кальция.
(17-3) Конструирование, экспрессия и очистка устойчивой к деградации последовательности LfVk1_Ca
Как описано в (17-1) справочного примера 15, вариант LfVk1_Ca (SEQ ID NO: 66) конструировали так, чтобы он имел замену остатками в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) в последовательности hVk5-2 остатков в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация по Kabat) в последовательности hVk1 (последовательность человека эмбрионального типа). Было продемонстрировано, что вариант связывается с ионом кальция.
Таким образом, можно сконструировать Са-библиотеки, содержащие последовательность LfVk1_Ca. Между тем, отсутствуют сообщения о свойствах последовательности LfVk1_Ca, и, таким образом, ее осуществимость была неизвестна. Последовательность LfVk1_Ca имеет Asp в положениях 30, 31 и 32 (нумерация по Kabat). Таким образом, его последовательность CDR1 содержит последовательность Asp-Asp, которая, как было описано, деградирует в кислых условиях (J. Pharm. Biomed. Anal. (2008) 47(1): 23-30). Является желательным избегание деградации в кислых условиях с точки зрения стабильности при хранении. Затем, конструировали варианты LfVk1_Cal (SEQ ID NO: 85), LfVk1_Ca2 (SEQ ID NO: 86) и LfVk1_Ca3 (SEQ ID NO: 87), чтобы они имели замену остатками Аlа (А) трех остатков Asp (D), которые, возможно, являются чувствительными к деградации. Аминокислотную замену проводили способом, известным специалистам в данной области, с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). ДНК, кодирующие варианты, встраивали в экспрессирующие векторы животных. В комбинации с экспрессирующим вектором животных, имеющим вставку для экспрессии GC_H (SEQ ID NO: 51) в качестве тяжелой цепи, сконструированные экспрессирующие векторы животных, несущие вставки ДНК для вариантов, вводили в клетки животных способом, описанным в справочном примере 13. Антитела, экспрессированные в клетках животных, в которые были введены векторы, очищали способом, описанным в справочном примере 13.
(17-4) Оценка стабильности антител, имеющих устойчивую к деградации последовательность LfVk1_Ca
Оценку того, являлись ли антитела, полученные, как описано в (17-3) справочного примера 17, более устойчивыми к деградации в растворах при рН 6,0, чем исходные антитела, имеющие последовательность LfVk1_Ca, предназначенную для модификации, проводили путем сравнения гетерогенности между соответствующими антителами после термического ускорения. Каждое антитело подвергали диализу против раствора 20 мМ гистидин-HCl, 150 мМ NaCl (рН 6,0) в условиях 4°С в течение ночи. Подвергнутые диализу антитела доводили до 0,5 мг/мл и хранили при 5°С или 50°С в течение трех суток. Каждое антитело после хранения подвергали ионообменной хроматографии с использованием способа, описанного в справочном примере 14. Как показано на фиг. 53, результат анализа демонстрирует, что LfVk1_Ca1 с изменением в участке деградации было менее гетерогенным и значительно более устойчивым к деградации при термическом ускорении, чем исходная последовательность LfVk1_Ca. В частности, было продемонстрировано, что деградация происходила по остатку Asp (D) в положении 30 последовательности LfVk1_Ca, однако ее можно было предотвратить изменением аминокислоты.
(17-5) Конструирование последовательности легкой цепи LfVk1_Ca, устойчивой к деградации по остатку Asp в положении 30, и экспрессия и очистка антител
Результат, описанный в (17-4) справочного примера 17 в отношении устойчивости к деградации Ala-замещенной формы демонстрирует, что в кислых условиях последовательность LfVk1_Ca деградировала по остатку Asp (D) в положении 30 (нумерация по Kabat) в ее последовательности CDR и деградацию можно было предотвратить путем замены отличающейся аминокислотой (в (17-4), путем замены остатком А1а (А)) остатка в положении 30 (нумерация по Kabat). Затем, авторы настоящего изобретения исследовали, является ли устойчивой последовательность с заменой даже на Ser (S) - остаток, способный хелатировать ион кальция, остатка в положении 30 (нумерация по Kabat) (в отношении LfVk1_Ca6; SEQ ID NO: 88) к деградации при сохранении активности связывания кальция. Варианты получали способом, описанным в справочном примере 9. Измененные легкие цепи последовательностей LfVk1 Ca6 и LfVk1_Ca экспрессировали в комбинации с тяжелой цепью GC_H (SEQ ID NO: 51). Антитела экспрессировали и очищали тем же способом, как описано в примере 16.
(17-6) Оценка последовательности легкой цепи LfVk1_Ca, устойчивой к деградации по остатку Asp в положении 30
Очищенные антитела, полученные, как описано выше, оценивали в отношении их стабильности при хранении в кислых условиях способом, описанным в (17-4) справочного примера 17. Результат демонстрирует, что антитела, имеющие последовательность LfVk1_Ca6, являются более устойчивыми к деградации, чем антитела, имеющие исходную последовательность LfVk1_Ca, как показано на фиг. 18.
Затем проводили исследование того, связывают ли антитела, имеющие последовательность LfVk1_Ca, и антитела, имеющие последовательность LfVk1_Ca6, ионы кальция способом, описанным в примере 13. Результат представлен в таблице 48. Величины Tm Fab-доменов антител, имеющих последовательность LfVk1_Са, и антител, имеющих устойчивую к деградации последовательность LfVk1_Ca6, сдвигались на 1°С или более при изменении концентрации кальция в растворах антител.
[Справочный пример 20] Конструирование совокупности молекул антител (Са-библиотека) со связывающим ионы кальция мотивом, встроенным в вариабельную область, для эффективного получения антител, которые связываются с антигеном зависимым от концентрации Са образом
Предпочтительные кальций-связывающие мотивы включают, например, последовательность hVk5-2 и последовательность CDR, а также остатки в положениях 30, 31, 32, 50 и 92 (нумерация Kabat). Другие кальций-связывающие мотивы включают мотив EF-hand, которым обладают кальций-связывающие белки (например, кальмодулин) и лектин С-типа (например, ASGPR).
Са-библиотека состоит из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Последовательность антитела человека использовали в качестве вариабельной области, и кальций-связывающий мотив вносили в вариабельную область легкой цепи. Последовательность hVk1 была выбрана в качестве матричной последовательности вариабельной области легкой цепи для встраивания кальций-связывающего мотива. Было показано, что антитело, содержащее последовательность LfVk1_Ca, полученную путем встраивания последовательности CDR hVk5-2 (один из кальций-связывающих мотивов) в последовательность hVk1, связывается с ионами кальция, как показано в справочном примере 16. Множеству аминокислот позволяли оказаться в матричной последовательности, чтобы разнообразить антигенсвязывающие молекулы, которые составляют библиотеку. Положения, экспонированные на поверхности вариабельной области, которые, вероятно, взаимодействуют с антигеном, выбирали в качестве положений, где позволяли оказаться множеству аминокислот. В частности, в качестве нестрогих остатков были выбраны положения 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 и 96 (нумерация Kabat).
Определяли тип и частоту появления аминокислотных остатков, которым впоследствии позволяли появиться. Анализировали частоту появления аминокислотных остатков в нестрогих остатках последовательностей hVk1 и hVk3, зарегистрированных в базе данных Kabat (KABAT, Е.А. ЕТ AL.: "Sequence of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Исходя из результатов анализа, отбирали тип аминокислот, которым позволяли появиться в Са-библиотеке, из аминокислот с более высокой частотой появления в каждом положении. В это время, аминокислоты, для которых было определено, что частота их появления является низкой, исходя из результатов анализа, также отбирали во избежание отклонения свойств аминокислот. Частоту появления выбранных аминокислот определяли, ссылаясь на результаты анализа в базе данных Kabat.
Са-библиотеку, содержащую кальций-связывающий мотив с акцентом на разнообразии последовательностей, чтобы она содержала множество аминокислот в каждом остатке, отличном от мотива, конструировали в качестве Са-библиотеки с учетом аминокислот и частоты появления, как описано выше. Детальные конструкции Са-библиотеки представлены в таблицах 1 и 2 (где положения в каждой таблице соответствуют нумерации Kabat). Кроме того, что касается аминокислот, представленных в таблицах 1 и 2, если положение 92, соответствующее нумерации Kabat, представляет собой Asn (N), положение 94 может представлять собой Leu (L) вместо Ser (S).
[Справочный пример 19] Получение Са-библиотеки
Библиотеку генов вариабельных областей тяжелой цепи антител амплифицировали способом ПЦР с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека, и т.д. в качестве матрицы. Как описано в справочном примере 18, для участка вариабельной области легкой цепи антитела конструировали участки вариабельной области легкой цепи антитела, увеличивающие частоту появления антител, которые сохраняют кальций-связывающий мотив и могут связываться с антигеном зависимым от концентрации кальция образом. Кроме того, среди нестрогих остатков для аминокислотных остатков, отличных от остатков с внесенным кальций-связывающим мотивом, конструировали библиотеку вариабельных областей легкой цепи антитела с равномерно распределенными аминокислотами с высокой частотой появления в природных антителах человека, ссылаясь на информацию о частоте появления аминокислот в природных антителах человека (KABAT, Е.А. ЕТ AL.: "Seqeuences of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Комбинацию библиотек генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител, полученных как описано выше, встраивали в фагмидный вектор для конструирования библиотеки фагового дисплея антител человека, которая представляет Fab-домены, состоящие из последовательностей антител человека (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100). Определяли последовательности частей генов антител, выделенных из Е. coil, в которые были введены библиотеки генов антител согласно способу, описанному в справочном примере 23 ниже. Распределение аминокислот в последовательностях выделенных 290 типов клонов и модельное распределение аминокислот представлено на фиг. 55.
[Справочный пример 20] Исследование активности связывания ионов кальция у молекул, содержащихся в Са-библиотеке
(20-1) Активность связывания ионов кальций у молекул, содержащихся в Са-библиотеке
Как описано в справочном примере 14, последовательность hVk5-2, для которой было продемонстрировано, что она связывается с ионами кальция, представляет собой последовательность с низкой частотой появления в последовательности эмбрионального типа. Таким образом, полагали, что является недостаточным получение кальций-связывающего антитела из библиотеки антител, состоящей из последовательностей человека эмбрионального типа или из В-клеток, полученных путем иммунизации мыши, экспрессирующей антитела человека. В результате конструировали Са-библиотеку. Исследовали наличие или отсутствие клона, демонстрирующего связывание кальция, в сконструированной Са-библиотеке.
(20-2) Экспрессия и очистка антител
6
2
2
Клоны Са-библиотеки встраивали в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с использованием способа, описанного ниже. Клетки, происходящие из клеток почки эмбриона человека Freestyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде Freestyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали с плотностью клеток 1,33×10 клеток/мл (3 мл) в каждую лунку планшета с 6 ячейками. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе с CO (37°С, 8% CO, 90 об./мин.) в течение четырех суток. Способом, известным специалистам в данной области, из культуральных супернатантов, полученных как описано выше, очищали антитела с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Поглощение растворов очищенного антитела при 280 нм измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента поглощения, определенного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(20-3) Оценка полученных антител в отношении связывания ими ионов кальция
Антитела, очищенные, как описано выше, оценивали в отношении связывания ими ионов кальция способом, описанным в справочном примере 6. Результат представлен в таблице 49. Tm Fab-доменов множества антител в Са-библиотеке, изменялась в зависимости от концентрации ионов кальция, что указывает на то, что библиотека содержит молекулы, которые связываются с ионом кальция.
[Справочный пример 21] Выделение антител, которые связываются с рецептором IL-6 Са-зависимым образом
(21-1) Получение фрагментов антител, которые связываются с антигеном Са-зависимым образом из библиотеки посредством пэннинга гранул
Первую селекцию из сконструированной библиотеки антител, которые связываются с рецептором IL-6 Са-зависимым образом, проводили посредством обогащения только фрагментами антител, имеющими способность связываться с антигеном (IL-6 рецептор).
2
Фаги получали из Е. coil, содержащих сконструированную фагмиду для фагового дисплея. Для преципитации фагов в культуральную среду Е. coil, продуцирующей фаги добавляли 2,5 М NaCl/10% PEG. Преципитированную совокупность фагов разбавляли TBS с получением раствора с фаговой библиотекой. Затем в раствор с фаговой библиотекой добавляли BSA и CaCl для доведения конечной концентрации BSA до 4% и конечной концентрации ионов кальция до 1,2 мМ. Что касается способа пэннинга, авторы настоящего изобретения ссылаются на общие способы пэннинга с использованием антигенов, иммобилизованных на магнитные гранулы (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20; Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). Использованные магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBeads Neutravidin-coated) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads M-280 Streptavidin).
2
2
2
2
В частности, к полученному раствору с фаговой библиотекой добавляли 250 пмоль меченного биотином антигена, чтобы обеспечить контактирование указанного раствора фаговой библиотеки с антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, и позволяли им связываться с комплексами антиген-фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали один раз с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST (TBST, содержащий 1,2 мМ CaCl) а затем два раза с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBS (TBST, содержащий 1,2 мМ CaCl). Затем гранулы, комбинированные с 0,5 мл 1 мг/мл трипсина, суспендировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем гранулы сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагом. Собранный раствор с фагом добавляли к 10 мл Е. coil штамма ER2738 на логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coil инфицировали фагами посредством культивирования их при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа. Инфицированные Е. coil высевали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем из культуральной среды посеянных Е. coil собирали фаги, получая раствор с фаговой библиотекой.
2
2
На втором раунде пэннинга обогащение фагов проводили с использованием активности связывания антигена или активности Са зависимого связывания в качестве показателя. В частности, когда проводили обогащение с использованием антигенсвязывающей способности в качестве показателя, 40 пмоль меченного биотином антигена добавляли к полученному раствору с фаговой библиотекой, чтобы обеспечить контактирование раствора с фаговой библиотекой и антигена при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и позволяли им связываться с комплексами антиген/фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали три раза 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST, а затем два раза 1,2 мМ CaCl/TBS. Затем гранулы, к которым было добавлено 0,5 мл 1 мг/мл трипсина, суспендировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Сразу после этого гранулы разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагом. Для устранения способности фагов, экспонирующих Fab, инфицировать Е. coil, белок pIII (происходящий из фага-помощника белок pIII) фагов, не экспонирующих Fab, расщепляли добавлением 5 мкл 100 мг/мл трипсина к собранному раствору с фагами. Собранный раствор с фагами добавляли к 10 мл Е. coil штамма ER2738 на логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coil культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coll. Инфицированные Е. coil инокулировали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем из культуральной среды Е. coil после инокуляции собирали фаги, получая раствор с фаговой библиотекой.
2
2
Когда обогащение проводили с использованием способности к Са-зависимому связыванию в качестве показателя, 40 моль меченного биотином антигена добавляли к полученному раствору с фаговой библиотекой, чтобы обеспечить контактирование раствора с фаговой библиотекой и антигена при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и позволяли им связываться с комплексами антиген/фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST и 1,2 мМ CaCl/TBS. Затем гранулы, к которым было добавлено 0,1 мл 2 мМ EDTA/TBS (TBS, содержащий 2 мМ EDTA), суспендировали при комнатной температуре. Сразу после этого гранулы разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагом. Для устранения способности фагов, экспонирующих Fab, инфицировать Е. coil, белок pIII (происходящий из фага-помощника белок pIII) фагов, не экспонирующих Fab, расщепляли добавлением 5 мкл 100 мг/мл трипсина к собранному раствору с фагами. Собранный раствор с фагами добавляли к 10 мл Е. coil штамма ER2738 на логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coil культивировали при осторожном перемешивании при 37°С в течение 1 часа, чтобы позволить фагам инфицировать Е. coll. Инфицированные Е. coil инокулировали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем из культуральной среды Е. coil после инокуляции собирали фаги, получая раствор с фаговой библиотекой.
(21-2) Оценка с помощью ELISA фагов
Содержащие фаг культуральные супернатанты собирали из единичных колоний Е. coil, полученных, как описано выше, в соответствии с общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145).
2
2
2
2
2
Культуральный супернатант, содержащий фаги, в который были добавлены BSA и CaCl/ подвергали ELISA, как описано ниже. 96-луночный микропланшет для титрования StreptaWell (Roche) покрывали в течение ночи 100 мкл PBS, содержащего меченный биотином антиген. Каждую лунку указанного планшета промывали PBST для удаления антигена, а затем лунки блокировали с помощью 250 мкл 4% BSA-TBS в течение 1 часа или дольше. Указанному планшету с полученным куль туральным супернатантом, добавленным в каждую лунку, из которой был удален 4% BSA-TBS, позволяли стоять нетронутым при 37°С в течение 1 часа, позволяя связываться представляющему фаг антителу с антигеном, присутствующим в каждой лунке. В каждую лунку, промытую 1,2 мМ CaCl/TBST, добавляли 1,2 мМ CaCl/TBS или 1 мМ EDTA/TBS. Планшету позволяли стоять нетронутым в течение 30 минут при 37°С для инкубации. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгированное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS при концентрации ионизированного кальция 1,2 мМ, и планшет инкубировали в течение 1 часа. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST хромогенную реакцию раствора в каждой лунке, в которую добавляли только раствор ТМВ (ZYMED), останавливали добавлением серной кислоты. Затем указанный цвет определяли путем измерения поглощения при 450 нм.
Для клонов, подвергнутых ELISA фагов, анализировали последовательности оснований генов, амплифицированных с помощью специфических праймеров.
Результат ELISA фагов и анализа последовательностей представлен в таблице 50.
6
2
2
Клоны, которые определили как имеющие способность к Са-зависимому связыванию в результате ELISA фагов, вводили в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с использованием следующего способа. Клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона FreeStyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали в каждую ячейку планшетов с 6 ячейками с плотностью клеток 1,33×10 клеток/мл (3 мл). Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе с CO (37°С, 8% СO/ 90 об./мин.) в течение четырех суток. Из культуральных супернатантов, полученных, как описано выше, антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение при 280 нм растворов очищенного антитела измеряли с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из определенных величин с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
(21-4) Оценка способности полученных антител к Са-зависимому связыванию с рецептором IL-6 человека
2
2
Антитела 6RC1IgG_010 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 111; легкая цепь SEQ ID NO: 112), 6RC1IgG_012 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 113; легкая цепь SEQ ID NO: 114) и 6RClIgG_019 (тяжелая цепь, SEQ ID NO: 115; легкая цепь, SEQ ID NO: 116), выделенные, как описано выше, оценивали в отношении зависимости от Са их активности связывания рецептор IL-6 человека посредством анализа взаимодействия между антителами и рецептором IL-6 человека с использованием Biacore T100 (GE Healthcare). Тоцилизумаб (тяжелая цепь SEQ ID NO: 60; легкая цепь SEQ ID NO: 61) использовали в качестве контрольного антитела, которое не обладает Са-зависимой активностью связывания с рецептором IL-6 человека. Взаимодействие анализировали в растворах при концентрации ионов кальция 1,2 мМ и 3 мкМ, соответствующих условиям высокой и низкой концентрации ионов кальция, соответственно. Соответствующее количество белка A/G (Invitrogen) иммобилизовывали на сенсорный чип СМ5 (GE Healthcare) способом присоединения аминов и представляющие интерес антитела улавливали на чипе. Два типа используемых подвижных буферов представляли собой: 20 мМ ACES/150 мМ NaCl/0,05% (масс./об.) Tween20/l,2 мМ CaCl (рН 7,4); и 20 мМ ACES/150 мМ NaCl/0,05% (масс./об.) Tween20/3 мкМ CaCl (рН 7,4). Каждый из этих буферов использовали для разбавления рецептора IL-6 человека. Все измерения проводили при 37°С.
В анализе взаимодействия в реакции антиген-антитело с использованием антитела тоцилизумаба в качестве контрольного антитела и антител 6RC1IgG_010 и 6RC1IgG_012 и 6RC1IgG_019, разбавленный раствор рецептора IL-6 и подвижный буфер в качестве пустого образца инжектировали при скорости потока 5 мкл/мин в течением трех минут, чтобы позволить рецептору IL-6 взаимодействовать с антителами тоцилизумабом, 6RC1IgG 010 и 6RC1IgG 012 и 6RC1IgG 019, уловленными на сенсорном чипе. Затем, 10 мМ глицин-НСl (рН 1,5) инжектировали при скорости потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд для регенерации сенсорного чипа.
Сенсограммы при высокой концентрации ионов кальция, полученные посредством измерения с использованием описанного выше способа, представлены на фиг. 56.
В условиях низкой концентрации ионов кальция, сенсограммы антител тоцилизумаба, 6RC1IgG_010 и 6RC1IgG_012 и 6RC1IgG_019 также получали аналогичным способом. Сенсограммы при низкой концентрации ионов кальция представлены на фиг. 57.
Результаты, описанные выше, демонстрируют, что способность антител 6RC1IgG_010 и 6RC1IgG_012 и 6RC1IgG_019 связывать рецептор IL6 была значительно снижена, когда концентрация ионов кальция в буфере изменялась с 1,2 мМ до 3 мкМ.
[Справочный пример 22] Конструирование библиотеки антител с рН-зависимым связыванием
(22-1) Способ получения антител с рН-зависимым связыванием
В W02009/125825 описано антитело с рН-зависимым связыванием антигена, свойства которого изменяются в области нейтральных и кислых значений рН, вследствие внесения гистидина в антигенсвязывающую молекулу. Описанное антитело с рН-зависимым связыванием получают путем изменения для замены части аминокислотной последовательности представляющей интерес антигенсвязывающей молекулы гистидином. Для более эффективного получения антитела с рН-зависимым связыванием без предварительного получения представляющей интерес антигенсвязывающей молекулы, подлежащей модификации, одним из способов может быть получение антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с желаемым антигеном из совокупности антигенсвязывающих молекул (обозначаемой как His-библиотека) с гистидином, внесенным в вариабельную область (более предпочтительно, область, потенциально вовлеченную в связывание антигена). Может быть возможным эффективное получение антигенсвязывающей молекулы, обладающей желаемыми свойствами, из библиотеки His, поскольку гистидин встречается более часто в антигенсвязывающих молекулах из His-библиотеки, чем из общепринятых библиотек антител.
(22-2) Конструирование популяции молекул антител (His-библиотеки) с остатком гистидина, внесенным в их вариабельную область, для эффективного получения связывающих антител, которые связываются с антигеном рН-зависимым образом
Сначала выбирали положения для встраивания гистидина в His-библиотеке. В WO 2009/125825 описано получение антител с рН-зависимым связыванием антигена путем замены аминокислотных остатков в последовательностях антитела против рецептора IL-6, антитела против IL-6 и антитела против рецептора IL-31 на гистидин. Кроме того, получали антитело против лизоцима яичного белка (FEBS Letter 11483, 309, 1, 85-88) и антитело против гепцидина (WO 2009/139822), обладающие способностью рН-зависимого связывания антигена, путем замены в аминокислотной последовательности антигенсвязывающей молекулы на гистидин. Положения, где вносили остатки гистидина в антитело против рецептора IL-6, антитело против IL-6, антитело против рецептора IL-31, антитело против лизоцима яичного белка и антител против гепцидина, представлены в таблице 51. Положения, представленные в таблице 51, могут быть приведены в качестве положений-кандидатов, которые контролируют связывание антиген-антитело.
Кроме того, помимо положений, представленных в таблице 51, также пригодными для внесения остатков гистидина считали положения, которые вероятно контактируют с антигеном.
В His-библиотеке, состоящей из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, последовательность антитела человека использовали в качестве вариабельной области тяжелой цепи, и в вариабельную область легкой цепи вносили остатки гистидина. Положения, приведенные выше, и положения, которые могут быть вовлечены в связывание антигена, т.е. положения 30, 32, 50, 53, 91, 92 и 93 (нумерация Kabat, Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH) в легкой цепе отбирали в качестве положений для внесения остатков гистидина в His-библиотеку. Кроме того, последовательность Vk1 отбирали в качестве матричной последовательности вариабельной области легкой цепи для внесения остатков гистидина. Множеству аминокислот позволяли появляться в матричной последовательности, чтобы разнообразить антигенсвязывающие молекулы, которые составляют библиотеку. Положения, экспонированные на поверхности вариабельной области, которые вероятно будут взаимодействовать с антигеном, отбирали в качестве положений, где позволяли появиться множеству аминокислот. В частности, в качестве нестрогих остатков были выбраны положения 30, 31, 32, 34, 50, 53, 91, 92, 93, 94 и 96 легкой цепи (нумерация Kabat, Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).
Определяли тип и частоту появления аминокислотных остатков, которым впоследствии позволяли появиться. Анализировали частоту появления аминокислот в нестрогих остатках в последовательностях hVk1 и hVk3, зарегистрированных в базе данных Kabat (KABAT, Е.А. ET AL.: "Sequences of proteins of immunological interest", vol. 91, 1991, NIH PUBLICATION). Исходя из результатов анализа, отбирали тип аминокислот, которым позволяли появиться в His-библиотеке, из аминокислот с более высокой частотой появления в каждом положении. В то же время, аминокислоты, для которых было определено, что частота их появления является низкой, исходя из результатов анализа, также отбирали во избежание смещения свойств аминокислот. Частоту появления выбранных аминокислот определяли, ссылаясь на результаты анализа в базе данных Kabat.
В качестве His-библиотек конструировали His-библиотеку 1, которая зафиксирована так, чтобы обязательно включать один остаток гистидина в каждую CDR, и His-библиотеку 2, которая более сфокусирована на разнообразии последовательностей, чем His-библиотека 1, учитывая аминокислоты и частоту появления, как описано выше. Детальные конструкции His-библиотек 1 и 2 представлены в таблицах 3 и 4 (причем положения в каждой таблице соответствовали нумерации Kabat). Что касается частоты появления аминокислот, как описано в таблице 3 и 4, Ser (S) в положении 94 может быть исключен, если в положении 92, соответствующем нумерации Kabat, находится Asn (N).
[Справочный пример 23] Получение библиотеки фагового дисплея для антител человека (His-библиотека 1) для получения антитела, которое связывается с антигеном рН-зависимым образом.
Библиотеку генов вариабельных областей тяжелой цепи антител амплифицировали способом ПЦР с использованием поли-А РНК, полученной из РВМС человека, и коммерческой поли-А РНК человека в качестве матрицы. Библиотеку генов вариабельных областей легкой цепи антител, сконструированную в качестве His-библиотеки 1, как описано в справочном примере 22, амплифицировали с использованием ПЦР. Комбинацию библиотек генов вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител, полученных как описано выше, встраивали в фагмидный вектор для конструирования библиотеки фагового дисплея антител человека, которая представляет Fab-домены, состоящие из последовательностей антител человека. Для способа конструирования использовали (Methods Mol Biol. (2002) 178, 87-100) в качестве справочных материалов. Для конструирования библиотеки использовали линкерную часть, соединяющую фагмидный Fab с белком фага pIII, и последовательности библиотеки фагового дисплея с последовательностью расщепления трипсином, встроенной между доменами N2 и СТ гена белка pIII хелперного фага. Идентифицировали последовательности частей генов антител, выделенных из Е. coil, в которые были введены библиотеки генов антител, и получали информацию о последовательности для 132 клонов. Намеченное распределение аминокислот и распределение аминокислот в идентифицированных последовательностях представлено на фиг. 58. Конструировали библиотеку, содержащую различные последовательности, соответствующие намеченному распределению аминокислот.
[Справочный пример 24] Выделение антител, которые связываются с IL-6R рН-зависимым образом
(24-1) Выделение фрагментов антител, которые связываются с антигенами рН-зависимым образом, из библиотеки посредством пэннинга на гранулах
Первую селекцию из сконструированной His-библиотеки 1 проводили посредством обогащения только фрагментами антител, обладающих способностью к связыванию антигена (IL-6R).
2
Фаги получали с помощью Е. coil, содержащих сконструированные фагмиды для фагового дисплея. Для преципитации фагов в культуральную жидкость Е. coil для продукции фага добавляли 2,5 М NaCl/10% PEG. Преципитированную популяцию фагов разбавляли TBS, получая раствор с фаговой библиотекой. К раствору с фаговой библиотекой добавляли BSA и CaCl для доведения конечной концентрации BSA до 4% и конечной концентрации ионов кальция до 1,2 мМ. Что касается способа пэннинга, авторы настоящего изобретения использовали общие способы пэннинга с использованием антигенов, иммобилизованных на магнитные гранулы (J. Immunol. Methods. (2008) 332 (1-2), 2-9; J. Immunol. Methods. (2001) 247 (1-2), 191-203; Biotechnol. Prog. (2002) 18(2) 212-20, Mol. Cell Proteomics (2003) 2 (2), 61-9). Использованные магнитные гранулы представляли собой покрытые NeutrAvidin гранулы (Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads M-280 Streptavidin).
2
2
2
В частности, к полученному раствору фаговой библиотеки добавляли 250 пмоль меченного биотином антигена, чтобы обеспечить контактирование указанного раствора фаговой библиотеки с антигеном в течение 60 минут при комнатной температуре. Добавляли магнитные гранулы, блокированные с помощью BSA, и позволяли им связываться с комплексами антиген/фаг при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали три раза с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST (TBS, содержащий 1,2 мМ CaCl и 0,1% Tween20), а затем два раза с помощью 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBS (pH 7,6). Затем гранулы, к которым добавили 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл, суспендировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагом. Собранный раствор с фагом добавляли к 10 мл Е. coil штамма ER2738 на логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coil инфицировали фагами посредством культивирования их при осторожном перемешивания 37°С в течение одного часа. Инфицированные Е. coil высевали в чашку 225 мм ×225 мм. Затем из культуруальной жидкости посеянных Е. coil собирали фаги, получая раствор с фаговой библиотекой.
2
2
2
Для обогащения фагами, второй и последующие раунды пэннинга проводили с использованием антигенсвязывающей способности или способности к рН-зависимому связыванию в качестве показателя. В частности, 40 пмоль меченного биотином антигена добавляли в полученный раствор с фаговой библиотекой, чтобы обеспечит контактирование раствора с фаговой библиотекой и антигеном при комнатной температуре в течение 60 минут. Добавляли блокированные BSA магнитные гранулы и позволяли им связываться с комплексами антиген/фаг комплексы при комнатной температуре в течение 15 минут. Гранулы промывали несколько раз 1 мл 1,2 мМ CaCl/TBST и 1,2 мМ CaCl/TBS. Затем, при обогащении фагами с использованием антигенсвязывающей способности в качестве показателя, гранулы, в которые было добавлено 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл, суспендировали при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагами. Альтернативно, при обогащении фагами с использованием способности к рН-зависимому связыванию антигена в качестве показателя, гранулы, в которые было добавлено 0,1 мл 50 мМ MES/1,2 мМ CaCl/150 мМ NaCl (рН 5,5), суспендировали при комнатной температуре, а затем сразу разделяли с использованием магнитного стенда для сбора раствора с фагом. Для устранения способности фагов, не экспонирующих Fab, инфицировать Е. coil, белок pIII (происходящий из фага-помощника белок pIII) фагов, не экспонирующих Fab, расщепляли добавлением 5 мкл трипсина в концентрации 100 мг/мл к собранному раствору с фагом. Собранные фаги добавляли к 10 мл Е. coil штамма ER2738 на логарифмической фазе роста (OD600 0,4-0,7). Е. coil инфицировали фагами посредством культивирования их при осторожном перемешивании при 37°С в течение одного часа. Инфицированные Е. coil высевали в планшет 225 мм ×225 мм. Затем фаги собирали из культуральной среды посеянных Е. coil для сбора раствора с библиотекой фагов. Пэннинг с использованием антигенсвязывающей способности или способности к рН-зависимому связыванию в качестве показателя повторяли два раза.
(24-2) Оценка с помощью ELISA фагов
Содержание фаг культуральные супернатанты собирали в соответствии с общепринятым способом (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) из отдельных колоний Е. coil, полученных способом, описанным выше.
2
2
2
2
2
К содержащим фаг куль туральным супернатантам добавляли BSA и CaCl в конечной концентрации 4% BSA и в конечной концентрации ионов кальция 1,2 мМ. Эти содержащие фаг культуральные супернатанты подвергали ELISA по следующей методике. Микропланшет для титрования StreptaWell 96 (Roche) покрывали в течение ночи 100 мкл PBS, содержавшего меченный биотином антиген. После промывания каждой лунки планшета посредством PBST (PBS, содержащий 0,1% Tween 20) для удаления антигена, лунки блокировали 250 мкл 4% BSA/TBS в течение одного часа или более. После удаления 4% BSA/TBS полученные супернатанты добавляли в каждую лунку. Антителам, находящимся на фагах, позволяли связаться с антигенами на каждой лунке посредством инкубации планшета при 37°С в течение одного часа. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, 12, в каждую лунку добавляли мМ CaCWTBS (pH 7,6) или 1,2 мМ CaCl/TBS (pH 5,5). Планшет инкубировали при 37°С в течение 30 минут. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли конъюгированное с HRP антитело против М13 (Amersham Pharmacia Biotech), разбавленное TBS, содержащее 4% BSA и 1,2 мМ ионизированный кальций. Планшет инкубировали в течение одного часа. После промывания 1,2 мМ CaCl/TBST, в каждую лунку добавляли простой раствор ТМВ (ZYMED). Хромогенную реакцию в растворе каждой лунки останавливали добавлением серной кислоты, а затем измеряли поглощение при 450 нм для оценки развития окраски.
Когда обогащение проводили с использованием антигенсвязывающей способности в качестве показателя, ELISA фагов после двух раундов пэннинга показал, что 17 из 96 клонов были положительными в ELISA антигенспецифическим образом. Таким образом, клоны анализировали после трех раундов пэннинга. Между тем, когда обогащение проводили с использованием способности к рН-зависимому связыванию антигена в качестве показателя, ELISA фагов после двух раундов пэннинга показал, что 70 из 94 клонов были положительными в ELISA. Таким образом, клоны анализировали после двух раундов пэннинга.
Для клонов, подвергнутых описанному выше ELISA фагов, анализировали последовательность оснований гена, амплифицированного с помощью специфических праймеров. Результаты ELISA фагов и анализа последовательности представлены в таблице 52 ниже.
Тем же способом антитела со способностью к рН-зависимому связыванию антигена выделяли из библиотеки фагового дисплея нативных антител человека. Когда обогащение проводили с использованием антигенсвязывающей способности в качестве показателя, 13 типов антител с рН-зависимым связыванием было выделено из 88 исследованных клонов. Между тем, когда обогащение проводили с использованием способности к рН-зависимому связыванию антигена в качестве показателя, 27 типов антител с рН-зависимым связыванием было выделено из 83 исследованных клонов.
Описанный выше результат продемонстрировал, что варьирование клонов со способностью к рН-зависимому связыванию антигена из His-библиотеки 1 было более высоким по сравнению с библиотекой фагового дисплея наивных антител человека.
(24-3) Экспрессия и очистка антител
6
2
2
Клоны, которые оценили как имеющие способность к рН-зависимому связыванию антигенов, исходя из результатов ELISA фагов, вводили в экспрессирующие плазмиды клеток животных. Антитела экспрессировали с использованием описанного ниже способа. Клетки линии, происходящей из клеток почки эмбриона Freestyle 293-F (Invitrogen), суспендировали в среде для экспрессии FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen), и высевали при плотности клеток 1,33×10 клеток/мл (3 мл) в каждую лунку планшета с 6-ячейками. Полученные плазмиды вводили в клетки способом липофекции. Клетки культивировали в инкубаторе с СO (37°С, 8% СO, 90 об./мин.) в течение четырех суток. Из культуральных супернатантов, полученных как описано выше, антитела очищали с использованием rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) способом, известным специалистам в данной области. Поглощение растворов очищенных антител измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрации антител вычисляли из измеренных величин с использованием коэффициента поглощения, определенного способом РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(24-4) Оценка выделенных антител в отношении их способности к рН-зависимому связыванию с рецептором IL-6 человека
2
2
Антитела 6RpH#01 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 117; легкая цепь SEQ ID NO: 118), 6RpH#02 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 119; легкая цепь SEQ ID NO: 120), и 6RpH#03 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 121; легкая цепь SEQ ID NO: 122), выделенные, как описано в (24-3), оценивали в отношении зависимости от рН их активности связывания рецептора IL-6 человека посредством анализа взаимодействия между антителами и рецептором IL-6 человека с использованием Biacore Т100 (GE Healthcare). Тоцилизумаб (тяжелая цепь SEQ ID NO: 60; легкая цепь SEQ ID NO: 61) использовали в качестве контрольного антитела, которое не обладает рН-зависимой активностью связывания с рецептором IL-6 человека. Взаимодействие для реакции антиген-антитело анализировали в растворах при рН 7,4 и рН 6,0, соответствующих условиям нейтральных рН и кислых рН, соответственно. Соответствующее количество белка A/G (Invitrogen) иммобилизовывали на сенсорный чип СМ5 (GE Healthcare) способом присоединения аминов и приблизительно 300 RU каждого из представляющих интерес антител улавливали на чипе. Два типа используемых подвижных буфера представляли собой: 20 мМ ACES/150 мМ NaCl/0,05% (масс./об.) Tween20/l,2 мМ CaCl (рН 7,4); и 20 мМ ACES/150 мМ NaCl/0,05% (масс./об.) Tween20/l,2 мМ CaCl (рН 6,0). Каждый из этих буферов использовали для разбавления рецептора IL-6 человека. Все измерения проводили при 37°С.
В анализе взаимодействия в реакции антиген-антитело с использованием тоцилизумаба в качестве контрольного антитела и антител 6RpH#01, и 6RpH#02, и 6RpH#03, разбавленный раствор рецептора IL-6 и подвижный буфер в качестве пустого образца инжектировали при скорости потока 5 мкл/мин в течение трех минут, чтобы позволить рецептору IL-6 взаимодействовать с антителами тоцилизумабом, 6RpH#01, и 6RpH#02, и 6RpH#03, уловленными на сенсорном чипе. Затем инъецировали 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) при скорости потока 30 мкл/мин в течение 30 секунд для регенерации сенсорного чипа.
Сенсограммы при рН 7,4, полученные при измерении с использованием способа, описанного выше, представлены на фиг. 59. Сенсограммы в условиях рН 6,0, полученные тем же способом, представлены на фиг. 60.
Описанный выше результат показывает, что способность к связыванию рецептора IL-6 антител 6RpH#01, 6RpH#02 и 6RpH#03 была значительно снижена, когда рН буфера изменяли от рН 7,4 до рН 6,0.
(Справочный пример 25) Способ получения FcγR человека и способ анализа взаимодействия между измененным антителом и FcγR человека
Внеклеточные домены FcγR человека получали следующим способом. Сначала синтезировали ген внеклеточного домена FcγR способом, хорошо известным специалистам в данной области. В то же время получали последовательность каждого FcγR на основе информации, зарегистрированной в NCBI. В частности, FcγRI получали на основе последовательности с номером доступа NCBI №NM_000566 (версия №NM_000566.3), FcγRIIa получали на основе последовательности с номером доступа NCBI №NM_001136219 (версия №NM 001136219.1), FcγRIIb получали на основе последовательности с номером доступа NCBI №NM_004001 (версия №NM_004001.3), FcγRIIIa получали на основе последовательности с номером доступа NCBI №NM_001127593 (версия №NM_001127593.1) и FcγRIIIb получали на основе последовательности с номером доступа NCBI №NM_000570 (версия №NM 000570.3) и к С-концу присоединяли His-метку. Более того, известно о наличии полиморфизма для FcγRIIa, FcγRIIIa и FcγRIIIb и полиморфные участки получали согласно Warmerdam et al. (J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25) для FcγRIIa; Wu et al. (J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070) для FcγRIIIa; и Ory et al. (J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691) для FcγRIIIb.
Экспрессирующие векторы конструировали путем встраивания в экспрессирующие векторы клеток животных полученные фрагменты генов. Сконструированные экспрессирующие векторы временно вводили в клетки, происходящие из клеток рака почки эмбриона человека, FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии представляющих интерес белков. FcγRIIb для применения в кристаллографическом анализе получали так, чтобы цепь Сахаров, связанная с FcγRIIb, представляла собой цепь Сахаров с высоким содержанием маннозы посредством экспрессии представляющего интерес белка в присутствии кифунезина в конечной концентрации 10 мкг/мл. Жидкости, полученные фильтрацией через 0,22-мкм фильтр культуральных супернатантов, полученных из культуральной среды описанных выше клеток, подвергнутых временному введению, очищали, в основном, с помощью следующих четырех стадий:
первая стадия: катионообменная колоночная хроматография (SP Sepharose FF);
вторая стадия: аффинная колоночная хроматография для His-метки (HisTrap HP);
третья стадия: гель-фильтрационная колоночная хроматография (Superdex200); и
четвертая стадия: стерильная фильтрация.
Для очистки FcγRI в качестве первой стадии использовали анионообменную колоночную хроматографию с Q sepharose FF. Поглощение очищенного белка измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. На основе измеренных величин измеряли концентрации очищенных белков с использованием коэффициента экстинкции, определенного таким способом, как РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
Взаимодействие между каждым вариантом антитела и Fcγ-рецептором, полученным, как описано выше, анализировали с использованием Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100 и Biacore 4000. Использованный подвижный буфер представлял собой HBS-EP+(GE Healthcare) и температура измерения составляла 25°С. Использованный иммобилизованный чип представлял собой: сенсорный чип СМ5 Series S (GE Healthcare) или сенсорный чип СМ4 Series S (GE Healthcare), на который был иммобилизован антигенный пептид, белок A (Thermo Scientific), белок A/G (Thermo Scientific) или белок L (ACTIGEN или BioVision) любым способом присоединения аминов. Альтернативно чип с иммобилизованным антигеном представлял собой: сенсорный чип SA Series S (certified) (GE Healthcare), на который был иммобилизован пребиотинилированный антигенный пептид посредством взаимодействия пептида с чипом.
Представляющие интерес антитела улавливали на эти сенсорные чипы и Fcγ-рецептору, разбавленному подвижным буфером, позволяли взаимодействовать с ними. Связывающиеся с антителами количества измеряли и сравнивали между антителами. Поскольку связывающее количество Fcγ-рецептора зависит от количества уловленного антитела, сравнение проводили для нормализованных величин, полученных делением связывающегося количества с Fcγ-рецептором на количество каждого уловленного антитела. Между тем, 10 мМ глицин-HCl (рН 1,5) подвергали реакции для смывания уловленного антитела с сенсорного чипа, и, таким образом, сенсорный чип регенерировали для повторного применения.
Между тем, величину KD каждого варианта антитела в отношении FcγR подвергали кинетическому анализу следующим способом. Сначала представляющие интерес антитела улавливали на сенсорном чипе и Fcγ-рецептору, разбавленному подвижным буфером, позволяли реагировать с ними. Результаты измерения из полученных сенсограмм обрабатывали посредством глобальной аппроксимации в соответствии с моделью связывания Ленгмюра 1:1 с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation. Из величин константы скорости связывания ka (л/моль/с) и константы скорости диссоциации kd (1/с), определяли константу диссоциации KD (моль/л).
Когда взаимодействие между каждым из измененных антител и FcγR было слабым и с помощью упомянутого выше кинетического анализа определяли, что корректный анализ невозможен, KD для таких взаимодействий вычисляли с использованием следующего уравнения модели связывания 1:1, описанного в Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE.
Поведение взаимодействующих молекул в соответствии с моделью связывания 1:1 на Biacore может быть описано с помощью уравнения 4, представленного ниже.
[Уравнение 4]
eq
max
R=C⋅R/(KD+C)+RI,
Req: зависимость уровней связывания в стационарном состоянии от концентрации анализируемого соединения
С: концентрация
RI: совокупный вклад индекса рефракции в образец
Rmax: способность связывания поверхности с анализируемым соединением
После преобразования этого уравнения KD может быть выражена в качестве уравнения 2, представленного ниже.
[Уравнение 2]
max
eq
KD=C⋅R/(R-RI)-С
KD можно вычислять посредством присвоения величин Rmax, RI и С в этом уравнении. RI и С определяют из результата измерения на сенсограмме и условий изменения. Rmax вычисляли следующим способом. Для сравнимого антитела с достаточно сильным взаимодействием, которое одновременно оценивают в ходе периода измерения, величина Rmax, полученная посредством глобальной аппроксимации в соответствии с упомянутой выше моделью связывания Ленгмюра 1:1, делили на количество сравниваемого антитела, уловленного на сенсорном чипе, а затем его умножали на количество уловленного измененного антитела, подлежащего оценке. Полученную величину использовали в качестве Rmax.
Внеклеточный домен FcγR мыши получали следующим способом.
Сначала синтезировали гены для внеклеточных доменов FcγR способом, известным специалистам в данной области. Гены конструировали на основе информации о последовательности для каждого FcγR, зарегистрированного в NCBI. В частности, mFcγRI получали на основе эталонной последовательности NCBI:
NP_034316.1; mFcγRII получали на основе эталонной последовательности NCBI: NP_034317.1; mFcγRIII получали на основе эталонной последовательности NCBI: NP 034318.2; и mFcγRIV получали на основе эталонной последовательности NCBI:
NP_653142.2; и к их С-концам добавляли His-метку.
Культуральные супернатанты, полученные из культуральной среды для описанных выше клеток, подвергнутых временному введению, фильтровали через 0,22-мкм фильтр. Полученные жидкости очищали, в основном, с помощью следующих четырех стадий:
первая стадия: катионообменная колоночная хроматография (SP Sepharose FF);
вторая стадия: аффинная колоночная хроматография для His-метки (HisTrap HP);
третья стадия: гель-фильтрационная колоночная хроматография (Superdex200); и
четвертая стадия: стерильная фильтрация.
Между тем, при очистке FcγRI на первой стадии использовали анионообменную колоночную хроматографию с Q Sepharose FF. Поглощение очищенных белков измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. На основе измеренных величин вычисляли концентрации очищенных белков с использованием коэффициента экстинкции способом, таким как РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
Экспрессирующие векторы конструировали путем встраивания полученных фрагментов генов в экспрессирующие векторы клеток животных. Сконструированные экспрессирующие векторы временно вводили в клетки, происходящие из клетки рака почки эмбриона человека, FreeStyle293 (Invitrogen) для экспрессии представляющих интерес белков. Культуральные супернатанты, полученные из культуральных сред описанных выше клеток, подвергнутых временному введению, фильтровали через 0,22-мкм фильтр.
Полученные жидкости очищали, в основном с помощью следующих четырех стадий:
первая стадия: ионообменная колоночная хроматография;
вторая стадия: аффинная хроматография для His-метки (HisTrap HP);
третья стадия: гель-фильтрационная колоночная хроматография (Superdex200); и
четвертая стадия: стерильная фильтрация.
Между тем, для ионообменной колоночной хроматографии на первой стадии при очистке mFcγRI использовали Q Sepharose HP; при очистке mFcγRII и mFc*yRIV использовали SP Sepharose FF; и при очистке mFcγRIII использовали SP Sepharose HP. На третьей и последующих стадиях D-PBS(-) использовали в качестве растворителя, и при очистке mFcγRIII используемый растворитель представлял собой D-PBS(-), содержащий 0,1 М аргинин. Поглощение очищенных белков измеряли при 280 нм с использованием спектрофотометра. На основе измеренных величин, вычисляли концентрации очищенных белков с использованием коэффициента экстинкции, определенного способом, таким как РАСЕ (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
[Справочный пример 27] Изменение для подавления связывания с ревматоидным фактором
(27-1) Подавление связывания с ревматоидным фактором посредством вариантами Fv4-YTE, Fv4-N434H и LS
Для подавления связывания с ревматоидным фактором вариантами Fv4-YTE, Fv4-N434H и LS, в которых время удержания в плазме было увеличено вследствие увеличенного связывания FcRn в диапазоне кислых значений рН, в варианты вносили изменение Q438R/S440E или S424N. В частности, получали новые варианты Fc, представленные в таблице 53. Сначала варианты оценивали в отношении их аффинности связывания FcRn при рН 6,0. Результат представлен в таблице 53.
Затем варианты (Fv4-F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 и F1171) оценивали в отношении их связывания с ревматоидным фактором. Анализ связывания с ревматоидным фактором проводили при рН 7,4 способом электрохемилюминесценции (ECL). В этом анализе использовали сыворотки (Protogenex) 15 или 30 пациентов с ревматоидным артритом. Образцы сывороток, разбавленные в 50 раз, смешивали меченными биотином исследуемыми антителами (1 мкг/мл) и меченными SULFO-TAG NHS-ester исследуемыми антителами (1 мкг/мл). Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение трех часов. Затем смеси распределяли аликвотами в каждую лунку покрытого стрептавидином 96-луночного планшета MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery). Его инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре, каждую лунку планшета промывали и в него распределяли аликвотами буфер для считывания (×4). Планшет помещали в устройство для считывания SECTOR imager 2400 Reader (Meso Scale Discovery) для измерения хемилюминесценции в каждой лунке.
Результат представлен на фиг. 61. Связывание с ревматоидным фактором вариантов F1166 (Q438R/S440E) и F1167 (S424N) значительно подавлялось по сравнению с вариантом YTE, который проявлял высокую активность связывания с ревматоидным фактором в сыворотках доноров 90216S и 90214S. Что касается вариантов F1173 и F1171, содержащих модификацию S424N, их связывание ревматоидного фактора, которое происходило у вариантов N434H и LS, соответственно, значительно подавлялось. Однако изменение Q438R/S440E не могло полностью подавить связывание ревматоидного фактора, обеспечиваемое вариантами N434H и LS, и наблюдали связывание с ревматоидным фактором в сыворотке одного или двух доноров.
(27-2) Подавление связывания с ревматоидным фактором вариантом LS Как показано в таблице 54, варианты Fc получали путем внесения нового изменения в Fv4-LS. Среди них, варианты (Fv4-F1380, F1384-F1386, F1388 и F1389), которые сохраняют связывание с FcRn при рН 6,0, оценивали в отношении связывания ими ревматоидного фактора в соответствии со способом, описанным в примере (27-1). Результат представлен на фиг. 62. Эти варианты продемонстрировали значительно подавленное связывание с ревматоидным фактором в сыворотках доноров. В частности, связывание с ревматоидным фактором Fv4-F1389, содержащего Y436T, было сравнимым с нативным IgGl.
Как показано выше, можно получать антигенсвязывающие молекулы, которые не обладают активностью связывания ревматоидного фактора, и активность связывания которых с FcRn человека увеличивается в условиях диапазона кислых значений рН, посредством внесения в участке Fc-области модификации, которая снижает активность связывания с ревматоидным фактором отдельно, без снижения активности связывания FcRn в условиях диапазона кислых значений рН.
Такие изменения, которые снижают активность связывания ревматоидного фактора, включают изменения в положениях 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439 и 441-444 (нумерация EU). Предпочтительно используют изменения в положениях 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438 и 440 (нумерация EU). Особенно предпочтительно, используют изменение посредством замены Val на Glu или Ser в положении 422, изменение посредством замены Ser на Arg в положении 424, изменение посредством замены His на Asp в положении 433, изменение посредством замены Tyr на Thr в положении 436, изменение посредством замены Gin на Arg или Lys в положении 438 и изменение посредством замены Ser на Glu или Asp в положении 440 (нумерация EU). Эти изменения можно использовать отдельно или можно использовать несколько участков в комбинации.
Альтернативно можно вносить последовательность для присоединения N-связанной цепи для снижения активности связывания ревматоидного фактора. В частности, в качестве последовательности присоединения N-связанной цепи Сахаров, известна Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx соответствует произвольной аминокислоте, отличной от Pro) и эту последовательность можно вносить в Ес-область для присоединения N-связанной цепи Сахаров, пространственное препятствие N-связанной цепи Сахаров может ингибировать связывание RF. Для изменений в целях добавления N-связанной цепи Сахаров, используют изменение посредством замены Lys на Asn в положении 248, изменение посредством замены Ser на Asn в положении 424, изменение посредством замен Tyr на Asn в положении 436 и Gln на Thr в положении 438 и изменение посредством замены Qln на Asn в положении 438 (нумерация EU). Особенно предпочтительно, используют изменение посредством замены Ser на Asn в положении 424 (нумерация EU). Промышленная применимость
Настоящее изобретение относится к способам усиления захвата антигенов в клетки антигенсвязывающими молекулами, способам увеличения количества антигенов, с которым может связываться одна антигенсвязывающая молекула, и способам уменьшения концентрации антигена в плазме посредством введения их. Посредством усиления захвата антигенов в клетки антигенсвязывающих молекул, можно усиливать снижение концентрации антигена в плазме посредством введения антигенсвязывающих молекул и также улучшить фармакодинамику антигенсвязывающих молекул и увеличить количество антигенов, с которыми может связываться одна антигенсвязывающая молекула. Таким образом, антигенсвязывающие молекулы могут проявлять лучшие эффекты in vivo, чем обычные антигенсвязывающие молекулы.