СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПРОДУКТА, ОБОГАЩЕННОГО ФУКОКСАНТИНОЛОМ И МИТИЛОКСАНТИНОМ
METHOD FOR OBTAINING A FUNCTIONAL PRODUCT ENRICHED WITH FUCOXANTHINOL AND METHYLXANTHINE

Изобретение относится к области пищевой и фармацевтической промышленности и предназначено для получения функционального продукта из яйцеклеток и мягких тканей мидии М. galloprovincialis.
Известна Пищевая биологически активная добавка (варианты) (Пат.2225210, РФ, МПК A61K 35/00, 2002), которая в одном из вариантов состоит из пищевого рыбьего жира и биологических активных веществ в виде концентрата каротиноидов, полученного из гонад кукумарии Cucumaria frondosa (морского огурца) при соотношении компонентов: рыбий жир - 99,30-99,50%, концентрат каротиноидов из кукумарии - 0,50-0,70%. Жирорастворимый концентрат каротиноидов (КК) выделяют из гонад кукумарии Cucumaria frondosa, выловленной в Баренцевом море в весенний период, а затем смешивают его с рыбьим жиром. Суммарное содержание каротиноидов в продукте составляет 243 мг/100 г, среди которых идентифицированы: лютеин + зеоксантин - 104 мг, криптоксантин - 6 мг, астаксантин - 133 мг. Недостатки способа получения пищевого продукта заключаются в том, что авторы не рассматривают усиление протекторных свойств каротиноидов за счет добавки рыбьего жира [Maeda 2005; Maeda, 2007; Sugawara, 2002]. Недостатки также заключаются в способах получения концентрата каротиноидов по пат. РФ 2181976, 2112527. Так, в соответствии с патентом 2181976, первичную экстракцию проводят с помощью ацетона при соотношении сырье : растворитель 1:5. Смесь гомогенизируют в течение 5 минут и затем подвергают СВЧ обработке. Можно утверждать, что воздействие СВЧ излишне, так как при извлечении липидов оболочки клеток тканей гидробионтов, в отличие от растительных клеток, легко разрушаются при механическом воздействии в присутствии растворителя [Kapranova et al., 2019]. Ацетон - прекурсор. А применение технического ацетона, как минимум, опасно для здоровья. Далее проводят экстрагирование в течение 8-12 часов, затем смесь центрифугируют. Ацетоноводную фракцию концентрируют до 1/3 объема, проводят обезвоживание раствора путем фильтрации через безводный сульфат натрия, и в последующем концентрируют его до 1/2 от исходного объема. К полученному раствору добавляют петролейный эфир в соотношении 1:1, добавляют одну часть воды, настаивают в течение 3-4 часов, разделяют в делительной воронке, петролейную фракцию концентрируют до плотного остатка. Данная последовательность химических манипуляций сводится к разделению липидных и нелипидных компонентов. При этом применяют технику обезвоживания ацетона и обратную экстракцию петролейным эфиром. В известном патенте приемы разделения липидных и нелипидных компонентов слишком усложнены. Далее к остатку добавляют охлажденный до -20°С ацетон в соотношении остаток: ацетон 1:10. При этом происходит разделение плотного остатка на осадок - один из целевых продуктов, и экстракт каротиноидов, которые выделяют в виде целевого продукта после концентрирования. В способе с помощью ацетона снова пытаются разделить между собой компоненты липидной и нелипидной природы. К сожалению, не указав марку растворителя: чистого для анализа, химически чистого, технического или свежеперегнанного. Работа с прекурсорами требует особого разрешения и, как правило, их количество строго ограничено в применении. Выход сапонинов составляет 85% от их исходного содержания в сырье, а каротиноидов - 91%.
В способе по патенту 2112527 для извлечения каротиноидов ткани измельчают при помощи мясорубки и к 300 г полученного фарша добавляют 600 мл этанола и 600 мл хлороформа, т.е. смесь Фолча с соотношением компонентов 1:1. Смесь перемешивают в течение двух часов, отжимают, к полученному экстракту добавляют 600 мл дистиллированной воды, настаивают полученную смесь в течение 8-12 ч. Повторное экстрагирование проводят этанолом при комнатной температуре и при температуре кипения при соотношении осадок: этанол (1:3). Полученные экстракты объединяют. Плотный осадок, полученный при этом, высушивают при температуре от 60°С до 80°С, измельчают до состояния муки. Полученный продукт - белковая кормовая добавка, содержащая до 80% белка, при этом выход белковой добавки от массы исходного сырья составляет 78%. Объединенные экстракты фильтруют, упаривают в роторном испарителе, полученный остаток от 3 до 5 раз экстрагируют ацетоном при соотношении остаток: ацетон 1:5. В результате получают осадок, содержащий сапонины и ацетоновый экстракт, содержащий каротиноиды. Выбрано не самое оптимальное соотношение остаток : ацетон 1:5 при экстракции в пяти повторностях. Большой избыток растворителя усложняет дальнейший процесс пробоподготовки. Для выделения комплекса каротиноидов из ацетонового экстракта, его фильтруют, упаривают досуха и полученный остаток растворяют в этаноле при соотношении остаток : этанол 1:3, охлаждают в течение 8-10 ч при температуре -20°С, фильтруют и полученный фильтрат упаривают до плотного остатка, который содержит концентрат каротиноидов с содержанием целевых продуктов до 90% (содержание сухого остатка от 85% до 93%). Подобная технология также является очень сложной и направлена на биохимические исследования.
Известно Средство на основе биологически активных соединений морских гидробионтов, обладающее канцерпревентивным действием и повышающее терапевтическую активность противоопухолевых антибиотиков (Пат. 2659682 С1, РФ, МПК A61K 35/616, 2018), для которого получают компоненты: исходные каротиноиды из свежевыловленных, замороженных или высушенных бурых водорослей видов Laminaria japonica, Fucus evanescens, F. Vesiculosus; каротиноиды из морской звезды Patiria pectinifera или из экстракта морских ежей Scaphechinus mirabilis. Каждый полученный ингредиент переводят в растворимое состояние. В качестве растворителя используют лецитин. Лецитиновые эмульсии, взятые в равных массовых долях, объединяют и перемешивают в закрытой емкости при комнатной температуре до получения однородного препарата, который содержит: от 1,0% до 1,5% фукоксантина; от 1,0% до 1,5% астаксантина; от 0,3% до 0,4% лютеина; от 0,2% до 0,4% зеаксантина; от 0,7% до 1,0% эхинохрома. Готовый продукт помещают в желатиновые капсулы, исходя из рекомендуемой суточной дозы 4-6 мг активных компонентов на прием. Состав продукта подтверждают методом ВЭЖХ. Недостатком данного метода является очень сложные химические манипуляции на этапе выделения каротиноидов, дорогостоящие физико-химические методы исследований целевого продукта, а также применение желатиновой капсуляции, что приводит к значительному росту себестоимости целевого продукта, несмотря на достаточно высокий выход каротиноидов.
Наиболее близким техническим решением является Способ получения масляной композиции, обогащенной полиненасыщенными жирными кислотами и каротиноидами из мидии М. galloprovincialis (Пат.2743019, РФ, МПК A23D 9/00, 2020). Способ предусматривает получение спиртового экстракта из морских гидробионтов, соединение масла со спиртовым экстрактом и водой и отделение масляной фракции. В качестве сырья для получения спиртового экстракта используют собранные во время массового нереста половые продукты - яйцеклетки и сперматозоиды, или гонады мидии М. galloprovincialis, в качестве масляной композиции - 10% масляный раствор витамина Е.
Объединяют 10% масляный раствор витамина Е, спиртовой экстракт из морских гидробионтов и дистиллированную воду в соотношении 1:1:1, затем смесь перемешивают в течение 5 мин, отстаивают 30-40 мин и отделяют не содержащую спирта масляную фракцию. Недостатком изобретения является то, что для получения целевого продукта, обогащенного каротиноидами и полиненасыщенными жирными кислотами, сперва готовят спиртовой экстракт, а затем уже проводят реэкстракцию, насыщая масляный раствор биологически активными компонентами.
Задачей способа получения функционального продукта, обогащенного фукоксантинолом и митилоксантином, является расширение ассортимента функциональных продуктов на основе природного сырья морского происхождения; предложение новой технологии выделения каротиноидов, в т.ч. фукоксантинола и митилоксантина, из яйцеклеток и мягких тканей мидии М. galloprovincialis; усиление протекторных свойств фукоксантинола и митилоксантина посредствам рыбьего жира.
Технический результат от решения поставленной задачи проявляется: в увеличении физиологической эффективности фукоксантинола и митилоксантина в синергии с рыбьим жиром; получении стабильной пищевой композиции, в которой окислительные процессы сведены к минимуму.
Заявленный технический результат достигается благодаря тому, что в заявляемом способе, включающем измельчение сырья из мидии М. galloprovincialis и выделение из него жирорастворимых каротиноидов, а также отделение каротиноидов от растворителя, предусмотрен ряд изменений по Сравнению с прототипом. Так, для выделения жирорастворимых каротиноидов яйцеклетки и измельченные мягкие ткани мидии М. galloprovincialis смешивают с дистиллированной водой, гексаном и 96% этанолом в соотношении 1:1:2:1. Смесь перемешивают и отстаивают в течение 24 часов в темноте при температуре 20±2°С до образования окрашенного гексанового слоя, содержащего каротиноидный комплекс с последующим отделением растворителя. Каротиноидный комплекс, содержащий фукоксантинол и митилоксантин, растворяют в 96% этаноле в соотношении 1:5 и соединяют полученный спиртовой экстракт, рыбий жир и дистиллированную воду в соотношении 1:1:1. Полученную смесь отстаивают в темноте в течение 24 часов при температуре 20±2°С до образования масляного слоя, обогащенного фукоксантинолом и митилоксантином.
Общим с прототипами является экстракция каротиноидов из морских беспозвоночных. Новым в заявляемом способе является:
для получения целевого продукта в качестве органических растворителей применяют только 96% этанол и гексан;
- насыщение рыбьего жира фукоксантинолом и митилоксантином проводят путем смешивания в равных частях спиртового экстракта, содержащего фукоксантинол и митилоксантин, рыбьего жира и воды с целью усиления свойств пигментов в получаемом функциональном продукте;
- установленное авторами экспериментальным путем соотношение яйцеклеток и измельченных мягких тканей мидии М. galloprovincialis, дистиллированной воды, гексанаи 96% этанола - 1:1:2:1;
- отстаивание смеси 24 часа при температуре 20±2°С в темноте;
- для приготовления спиртового экстракта смешивают окрашенный в красно-коричневый цвет сухой остаток, образовавшийся после отгонки гексана, и 96% этанол в соотношении 1:5;
- для обогащения рыбьего жира его смешивают со спиртовым экстрактом и дистиллированной водой в соотношении 1:1:1; отстаивают смесь в темноте 24 часа при температуре 20±2°С для осуществления процесса перехода митилоксантина и фукоксантинола и других жирорастворимых каротиноидов из спиртового экстракта в рыбий жир; отделении масляного слоя.
Перечисленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о наличии новизны в предлагаемом техническом решении. Проведенные патентные исследования, а также изучение доступных научных публикаций, относящихся к теме изобретения, не обнаружили решений, имеющих признаки, сходных с предлагаемым изобретением. Температурные режимы и заявляемая последовательность операций способа подобраны авторами экспериментально в границах оптимального и эффективного достижения заявленного технического результата. Способ рассчитан на применение как в лабораторных условиях, так и в промышленном производстве. При промышленном применении способа условия его осуществления не изменятся.
Учеными из ФИЦ ИнБЮМ (РФ) и Японии [Иванов и др., 2009, Maoka et al., 2011] было доказано, что мягкие ткани и яйцеклетки черноморских мидий М. galloprovincialis содержат физиологически активные каротиноиды, например, фукоксантинол и митилоксантин в достаточно высоких концентрациях. Получать фукоксантинол химическими методами весьма сложно [Пат. 2548103, РФ, МПК С12Р 23/00, С09 В 61/00, 2015)]. Намного проще выделять его с другими каротиноидами, например, митилоксантином. С помощью рыбьего жира можно усилить эффективность воздействия фукоксантинола и митилоксантина на организм.
Химические свойства, в частности, растворимость в 96% этаноле и процесс перехода из разбавленного этанола (70% и ниже) в гексан у фукоксантинола и митилоксантина в невысоких концентрациях схожи [Fox, 1976].
Безусловно, в предложенном способе фукоксантинол и митилоксантин будут выделяться вместе с рядом других каротиноидов и примесями белка, которые никак не повлияют на свойства фукоксантинола и митилоксантина.
Метаболиты фукоксантина: фукоксантинол и митилоксантин, широко распространены в морских двустворчатых моллюсках. Гидробионты накапливают фукоксантин, потребляемый с пищей, и превращают его в более активный антиоксидант митилоксантин [Maoka et al., 2011]. Фукоксантинол -основной метаболит фукоксантина, образующийся под действием ферментов в организме, обладает в 1,5-2 раза большей биологической активностью, чем исходный каротиноид [Konishi, 2006; Sachindra, 2007; Sugawara, 2006].
Митилоксантин показал отличную антиоксидантную активность, ингибируя перекисное окисление липидов [Maoka et al., 2016]. Высокая биологическая активность каротиноидов является экспериментально подтвержденным фактом [Апрышко, 2005]. Известны противоопухолевые и антиканцерогенные свойства митилоксантина [Бородина, 2008].
Источником фукоксантинола и митилоксантина являются яйцеклетки и ткани мидии М. galloprovincialis, которые содержат эти пигменты в количествах, достаточных для их выделения [Иванов, 2009; Maoka et al., 2011].
Каротиноидный состав и процентное соотношение каротиноидов в теле М. galloprovincialis уже изучены; содержание фукоксантина составляет 3,1%, фукоксантинола - 7,2%, а митилоксантина - 11,5% от массы всех каротиноидов [Maoka et al., 2011]. Митилоксантин не содержится в водорослях и, следовательно, может быть образован только на основе процессов метаболической трансформации, которая, по-видимому, специфична для моллюсков.
Митилоксантин, являясь метаболитом фукоксантина, имеет меньшую биодоступность, чем другие питательные вещества класса каротиноидов [Hashimoto, 2012; Maoka et al., 2016]. Биодоступность фукоксантина и его метаболитов возрастает в рыбьем жире. Экспериментальным путем было доказано, что масляный раствор рыбьего жира, содержащий в своем составе полиненасыщенные омега-3 жирные кислоты, значительно повышает эффективность каротиноидов [Maeda 2005; Maeda, 2007; Sugawara, 2002].
В рыбьем жире высокое содержание 5, 8, 11, 14, 17-эйкозапентаеновой (С20:5ω3) и 4, 7, 10, 13, 16, 19-докозагексаеновой (С22:6ω3) полиненасыщенных жирных кислот, благотворно влияющих на здоровье [Simopoulos, 1991]. Хорошо известно, что рыбий жир проявляет синергетический эффект, например, с сезамином, предотвращая ожирение печени мышей [Yanagita et al., 2005]. При контакте с воздухом жидкий рыбий жир постепенно окисляется и теряет свои полезные свойства. Но в рыбьем жире, обогащенном каротиноидами, процесс окисления будет замедляться, так как каротиноиды -сильнейшие антиоксиданты [Апрышко и др., 2005]. Пример реализации способа.
Пример 1
Яйцеклетки, полученные путем температурной стимуляции нереста и осажденные при 1500 об/мин [Пат. 2599834], а также измельченные мягкие ткани, извлеченные у 50 отнерестившихся самок мидий М. galloprovincialis, заливали дистиллированной водой и гексаном (1:1:2), и добавляли одну часть 96% этанола. После тщательного перемешивания смесь отстаивали в делительной воронке 24 часа в темноте при температуре 20±2°С до разделения слоев. Отделяли окрашенный в красно-коричневый цвет (вы выше ввели в текст, и в примере обязательно надо повторить!) гексановый слой. Растворитель отгоняли на роторном испарителе.
Идентификацию фукоксантинола и митилоксантина в каротиноидном «комплексе» проводили спектрофотометрически в видимой области (400-800 нм). Максимумы поглощения в диэтиловом эфире: митилоксантин - 470 нм, фукоксантинол - 445 и 470 нм.
Образовавшийся каротиноидный «комплекс» растворяли в 96% этаноле в соотношении 1:5, смешивали спиртовой экстракт с рыбьим жиром и дистиллированной водой в соотношении 1:1:1. Отстаивали в делительной воронке 24 часа в темноте при температуре 20±2°С до образования масляного слоя, обогащенного фукоксантинолом и митилоксантином.
Сырая масса яйцеклеток, полученная из 50 мидий, составила 3 г. Содержание каротиноидов в мягких тканях 50 мидий М. galloprovincialis - 36 мг на 1000 г сырого веса. Содержание фукоксантинола в 3 г яйцеклеток - 0,01 мг; в 1000 г мягких тканей - 3 мг, а митилоксантина - 0,01 мг и 4 мг, соответственно. Полученный продукт представлял собой масляный раствор желто-оранжевого цвета с характерным запахом рыбьего жира и содержал не менее 3 мг фукоксантинола и 4 мг митилоксантина.
Полученный продукт в виде масляного экстракта морских каротиноидов перспективен для длительного хранения, так как не подвержен окислительной порче, а также пригоден для применения в качестве биологически активного компонента. Учитывая суточную дозу потребления в чистом виде труднодоступных и дорогостоящих фукоксантинола и митилоксантина, равную 2,4-8 мг, а также низкую вероятность употребления в пищу 50 мидий в сутки, минимальное количество рыбьего жира, обогащенного фукоксантинолом и митилоксантином, позволяет не только повысить эффективность фукоксантинола и митилоксантина, но и дает возможность дозированного приема этих ценных природных соединений для лечения и профилактики различного рода заболеваний.
Источники литературы, принятые во внимание:
1. Апрышко Г.Н. Противоопухолевые препараты из морских водорослей Средиземноморского бассейна / Г.Н. Апрышко, М.В. Нехорошее, В.Н. Иванов, Н.А. Мильчакова // Альгология. - 2005. - Т. 15, №4. - С. 485-490.
2. Бородина А.В. Противоопухолевые препараты в некоторых морских продуктах питания / А.В. Бородина, М.В. Нехорошев // Российский биотерапевтический журнал. - 2008. - Т.7, №1. - С. 36.
3. Иванов В.Н. Содержание липидов и каротиноидов в выметанных половых продуктах черноморской Mytilus galloprovincialis Lam. / В.Н. Иванов, Н.В. Караванцева, М.В. Нехорошев // Морской экологический журнал. - 2009. - Т. 4, №1. - С. 84.
4. Пат.2599834, Российская Федерация. МПК A23L/10, A23L 17/50. Способ получения биологически активного вещества из средиземноморской мидии Mytilus galloprovincialis Lam / Л.Л. Никонова (RU), М.В. Нехорошев (RU); заявитель и патентообладатель Институт морских биологических исследований (Россия) - №2014138314/13; заявл. 22.09.2014, опубл. 20.10.2016. Бюл. №29.
5. Пат.2548103, Российская Федерация. МПК С12Р 23/00, С09В 61/00. Способ получения транс-фукоксантинола / Н.В. Поспелова (RU), М.В. Нехорошев (RU), Владимир Вайсер (IL); заявитель и патентообладатель Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского (RU) - №101365 (UA); заявл. 03.10.2014, опубл. 10.04.2015. Бюл. №10.
6. Fox D.L. Animal biochromes and structural colours physical, chemical, distributional & physiological features of coulored bodies in the animal world / D.L. Fox. California: Berkeley [u.a.] Univ. of California Pr. 1976. - 432 p.
7. Hashimoto T. Pharmacokinetics of fucoxanthinol in human plasma after the oral administration of kombu extract / T. Hashimoto, Y. Ozaki, M. Mizuno, M. Yoshida, Y. Nishitani, T. Azuma, A. Komoto, T. Maoka, Y. Tanino, K. Kanazawa // British Journal of Nutrition. - 2012. - Vol.107, iss. 11:1566-9. https://doi.org/ 10.1017/S0007114511004879.
8. Kapranova L.L. Fatty acid composition of gonads and gametes in the Black Sea bivalve mollusk Mytilus galloprovincialis Lam. at different stages of sexual maturation / L.L. Kapranova, M.V. Nekhoroshev, L.V. Malakhova, V.I. Ryabushko, S.V. Kapranov, Т.V. Kuznetsova // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. - 2019. - Vol. 55, iss. 6. - P. 448-455. https://doi.org/10.1134/S0022093019060024.
9. Konishi I. Halocynthiaxanthin and fucoxanthinol isolated from Halocynthia roretzi induce apoptosis in human leukemia, breast and colon cancer cells / I. Konishi, M. Hosokawa, T. Sashima, H. Kobayashi, K. Miyashita // Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. - 2006. - Vol. 142, iss. 1-2. - P. 53-59. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2005.10.005.
10. Maeda H. Dietary combination of fucoxanthin and fish oil attenuates the weight gain of white adipose tissue and decreases blood glucose in obese/diabetic KK-Ay mice / H. Maeda, M. Hosokawa, T. Sashima, K. Miyashita // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2007. - Vol. 55, iss. 19. - P. 7701-7706. https://doi.org/ 10.1021/jf071569n.
11. Maeda H. Fucoxanthin from edible seaweed, Undaria pinnatifida, shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose tissues/ H. Maeda, M. Hosokawa, T. Sashima, K. Funayama, K. Miyashita //Biochemical and biophysical research communications. - 2005. - Vol. 332, iss. 2. - P. 392-397. https://doi.org/ 10.1016/j.bbrc.2005.05.002.
12. Maoka T. A Series of 190-Hexanoyloxyfucoxanthin Derivatives from the SeaMussel,Mytilus galloprovincialis, Grown in the Black Sea, Ukraine / T. Maoka, T. Etoh, A. V. Borodina, A. A. Soldatov // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2011. - Vol. 59. - P. 13059-13064. https://doi.org/ 10.1021/jf2035115.
13. Maoka Т. Anti-oxidative activity of mytiloxanthin, a metabolite of fucoxanthin in shellfish and tunicates / T. Maoka, A. Nishino, H. Yasui, Y. Yamano, A. Wada // Marine Drugs. - 2016. - Vol. 14, iss. 5: 93. https://doi.org/ 10.3390/mdl4050093.
14.SachindraN. M. Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine carotenoid fucoxanthin and its metabolites / N. M. Sachindra, E.Sato, H. Maeda, M. Hosokawa, Y. Niwano, M. Kohno, K. Miyashita // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2007. - Vol. 55, iss. 21. - P. 8516-8522. https://doi.org/ 10.1021/jf071848a.
15.Simopoulos A. P. Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development / A. P. Simopoulos // American Journal of Clinical Nutrition. - 1991. - Vol. 54. - P 438-63. https://doi.org/ 10.1093/ajcn/54.3.438.
16. Sugawara T. Brown algae fucoxanthin is hydrolyzed to fucoxanthinol during absorption by Caco-2 human intestinal cells and mice/ T. Sugawara, V. Baskaran, W. Tsuzuki, A. Nagao // Journal of Nutrition. - 2002. - Vol. 132, iss. 5. - P. 946-51. https://doi.org/ 10.1093/jn/132.5.946.
17. Sugawara T. Antiangiogenic activity of brown algae fucoxanthin and its deacetylated product, flicoxanthinol / T. Sugawara, K. Matsubara, R. Akagi, M. Mori, T. Hirata // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2006. - Vol. 54, iss. 26. - P. 9805-9810. https://doi.org/ 10.1021/jf062204q
18. Yanagita T. Conjugated linoleic acid-induced fatty liver can be attenuated by combination with docosahexaenoic acid in C57BL/6N mice / T. Yanagita, Y. M. Wang, K. Nagao, Y. Ujino, N. Inoue// Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2005. - Vol. 53. - P. 9629-9633. https://doi.org/10.1021/jf052203i.