Взаимодействие клеток крови: феномены и молекулярная сигнализация

УДК 612.1

М. Ю. Милорадов, Е. В. Узикова, С. В. Булаева

Взаимодействие клеток крови: феномены и молекулярная сигнализация

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.B37.21.0214 и при поддержке гранта РФФИ № 12-04-00550-а.

Известно, что кровь состоит из суспензии форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов) в плазме. Эти клетки крови могут взаимодействовать в потоке, например, выделением сигнальных молекул. Последнее способно приводить к изменению микрореологических свойств клеток. В связи с этим целью данного исследования стало изучение влияния лейкоцитов и тромбоцитов на микрореологические свойства эритроцитов.

Ключевые слова: агрегация эритроцитов, текучесть крови, тромбоциты, адгезия лейкоцитов, деформируемость эритроцитов, микрореологические свойства.

M. Ju. Miloradov, E. V. Uzikova, S. V. Bulaeva

Blood Cell Interaction: Phenomena and Molecular Signaling

Blood is a concentrated suspension of formed elements that includes red blood cells (RBCs), white blood cells (WBCs), and platelets. These cells can interact in a blood flow and their microrheological properties can be altered. The aim of this study was to investigate whether WBCs and platelets have an effect upon RBC microrheology.

Keywords: RBCs aggregation, blood fluidity, platelets, leukocyte adhesion, RBC deformability, microrheological properties.

Введение

Выполнение кровью присущих ей физиологических функций, особенно на уровне микроциркуляции, где диаметр сосудов соизмерим с размерами клеток и непосредственно осуществляется перфузия тканей и транскапиллярный обмен, во многом определяется способностью клеток крови к взаимодействию между собой, друг с другом и с клетками сосудистого эндотелия.

Имеются данные, свидетельствующие о том, что такие реологические параметры, как агрегация эритроцитов, влияют на адгезию лейкоцитов в сосудистом русле [17]. В свою очередь, активированные лейкоциты продуцируют сигнальные молекулы, способные действовать на эритроциты, изменяя их микрореологические свойства, и в том числе агрегацию [14]. Вместе с тем имеются лишь отдельные работы, в которых исследовано взаимодействие эритроцитов и лейкоцитов. В них анализируется влияние отдельных микрореологических изменений одних клеток крови на другие [12, 19, 23], тогда как комплексного исследования влияния лейкоцитов на микрореологические характеристики эритроцитов не проводилось.

Процесс агрегации тромбоцитов и эритроцитов изучается уже достаточно давно. В более ранних экспериментальных работах было показано влияние суспензионной среды и мембранных свойств на межэритроцитарные взаимодействия [1, 6, 8]. Многочисленные исследования ведутся и в отношении агрегации тромбоцитов [2-4]. Однако нами не было найдено исчерпывающей информации о взаимосвязи процессов агрегации эритроцитов и тромбоцитов, хотя в условиях течения in vivo эти два процесса происходят в сходных условиях и являются зависимыми от ряда общих факторов.

Целью данного исследования было изучение влияния лейкоцитов и тромбоцитов, а также продуцируемых ими веществ на микрореологические свойства эритроцитов.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на венозной крови практически здоровых мужчин и женщин в возрасте 20-30 лет (n=64). Забор крови производился утром натощак из локтевой вены без наложения жгута в условиях клинической лаборатории квалифицированным медицинским персоналом после получения информированного согласия донора. В качестве ан-

© Милорадов М. Ю., Узикова Е. В., Булаева С. В., 2012

тикоагулянта использовали гепарин (10 МЕ/мл). Все измерения и манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора.

Были организованы 3 серии исследований. В первой серии изучали влияние лейкоцитов, обработанных и не обработанных адреналином на агрегацию эритроцитов с использованием ранее описанных методик [5, 11].

Во второй серии эритроциты инкубировали в изотоническом растворе с одним из важных про-воспалительных цитокинов интерлейкином-8 (10 мкг/мл), и одним из ферментов, продуцируемых нейтрофилами, миелопероксидазой (МПО, в концентрациях 10нМ, и 50нМ). Время инкубации составляло 15 мин. С помощью метода оптической микроскопии определяли степень агрегации [10]; деформируемость эритроцитов оценивали путем определения индекса удлинения эритроцитов (ИУЭ) методом проточной микрокамеры.

В третьей серии опытов исследовали влияние тромбоцитов на агрегацию эритроцитов. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОБОГ. Т. П.) получали путем центрифугирования антикоагулированной крови в течение 7 мин. при 1000 об/мин. После ее отделения оставшуюся кровь центрифугировали в течение 20 мин. при 3000 об/мин., после чего разделяли обедненную тромбоцитами плазму (ОБЕДН. Т. П.) и эритроцитарную массу [2]. Для активации и индуцированной агрегации тромбоцитов в аликвоты

ОБОГ. Т. П. добавляли адреналин до конечной концентрации 1 мкМ. Образцы плазмы с препаратами оставляли на 10 мин. при комнатной температуре. Суспензию красных клеток крови в изотоническом растворе хлорида натрия при стандартном показателе Hct=40 % инкубировали в течение 15 мин. при температуре 37 0С. Затем эритроциты отделяли от раствора центрифугированием и ресуспендировали в заранее заготовленные образцы аутологичной плазмы с различной концентрацией тромбоцитов при стандартном показателе Hct=40 % и измеряли индексы агрегации эритроцитов с помощью агрего-метра МА1 (Myrenne, Германия) [13].

Статистическую обработку полученных цифровых материалов и все виды анализа результатов проводили на РС IBM, используя табличный редактор Microsoft Excel и программу "Statistica" (версия 6.0).

Результаты исследования и их обсуждение

В первой серии исследований путем оптической микроскопии была обнаружена тенденция к снижению ПА и ИИА на 9 и 5 % соответственно в присутствии лейкоцитов по сравнению с контролем (суспензия RBC без лейкоцитов) и достоверное снижение ПА и ИИА на 27 и 25 % соответственно в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином (рис. 1).

Контроль

О В присутствии лейкоцитов

В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином

Рис. 1. Изменение ПА и ИИА эритроцитов в присутствии лейкоцитов, обработанных и необработанных

адреналином, по сравнению с контролем.

* - различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контролем

При измерении агрегации с помощью полуав- (СА) эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не томатического агрегометра МА1 получили дос- обработанных адреналином) и эритроцитов (в товерное (p<0,01) снижение степени агрегации присутствии лейкоцитов, обработанных адрена-

лином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига (3 с"1) в интервале времени 10 с (М1ю), на 16 и 21 % соответственно. При измерении степени агрегации эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов,

обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига (3 с"1) в интервале времени 5 с (М15), отмечено достоверное снижение агрегации на 17 и 21 % соответственно (рис. 2).

О Контроль

В В присутствии лейкоцитов

В В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином

Рис. 2. Изменение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных и необработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с низкой скоростью сдвига в течение 10 и 5 с, по сравнению с контролем

** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.

При измерении агрегации с помощью полуавтоматического агрегометра МА1 получили достоверное снижение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига (600 с-1) в интервале времени 10 с (М10), на 14 и 22 % соответственно. При измерении СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, не обработанных адреналином) и эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига (600 с-1) в интервале времени 5 с (М5), отмечено снижение агрегации на 11 и 20 % соответственно (рис. 3).

Таким образом, присутствие лейкоцитов в суспензии эритроцитов сочетается с достоверным снижением их агрегации, что подтверждается измерением этой микрореологической характеристики двумя разными методами. Поскольку при регистрации агрегации прибором МА1 соотношение лейкоцитов и эритроцитов было примерно как 1:1000, вряд ли лейкоциты влияли на микрореологическое поведение эритроцитов ме-

ханическим способом. Вполне вероятно, что лейкоциты продуцируют какие-то сигнальные молекулы, которые действуют на эритроциты и выраженно снижают их агрегацию. Для понимания механизмов этого явления была проведена вторая серия исследований.

Активированные лейкоциты выделяют про-воспалительные цитокины. Под их воздействием происходит стимулирование функций клеток эндотелия и лейкоцитов. Интерлейкин-8, являясь основным хемотактическим фактором поли-морфноядерных нейтрофильных гранулоцитов, играет ведущую роль в их привлечении в очаг воспаления in vivo. Его роль в хемотаксисе ней-трофилов иллюстрируется тем, что инъекция ИЛ-8 вызывает сильную воспалительную реакцию, сопровождающуюся массивной лейкоцитарной инфильтрацией.

При инкубации эритроцитов с интерлейки-ном-8 прослеживалась тенденция к снижению ПА и ИИА на 10 и 7 % соответственно, и практически не наблюдалось изменение деформируемости (рис. 4).

О Контроль

О В присутствии лейкоцитов

О В присутствии лейкоцитов, обработанных адреналином

Рис. 3. Изменение СА эритроцитов (в присутствии лейкоцитов, обработанных и не обработанных адреналином), подвергнувшихся вращению с высокой скоростью сдвига в течение 10 и 5 с по сравнению с контролем

* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем; ** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.

I Контроль О Интерлейкин-8

R S

X

«

X

«

я

м

Н

120 100 80 60 40 20 0

Р

I

т

Ш

Р Р Р ¡1!

ПА

ИИА

ИУЭ

Рис. 4. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии интерлейкина-8 по сравнению с контролем

Миелопероксидаза (МПО) - железосодержащий фермент, который находится в азурофиль-ных гранулах нейтрофилов.

Было установлено, что МПО в концентрации 10 нМ способствовала достоверному снижению ПА и ИИА эритроцитов на 33 и 39 % соответственно и достоверному снижению деформируемости эритроцитов на 15 % (рис. 5).

В концентрации 50 нМ МПО привела к достоверному снижению ПА и ИИА на 49 и 50 % соответственно и достоверному снижению ИУЭ на 8 % (рис 6).

Согласно литературным данным измененные механические свойства эритроцитов, такие как мембранная жесткость, цитоплазматическая вязкость, снижают скорость и степень агрегации клеток [15, 18, 20, 21].

Нельзя исключить, что МПО проявляет свою ферментативную активность и продуцирует НОС1, которая может инициировать перекисное окисление липидов. Но, помимо этого, НОС1 может и по молекулярным механизмам (без образования свободных радикалов) модифицировать белки, липиды и другие биомолекулы.

Контроль И МПО

Рис. 5. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии МПО (10 нМ) по сравнению с контролем

** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем; *** - различия достоверны при р<0,001 по сравнению

с контролем.

120

Контроль В МПО

R S

X

«

X

100

80

60

40

20

ПА

ИИА

ИУЭ

к

0

Рис. 6. Изменение ПА, ИИА и ИУЭ эритроцитов в присутствии МПО (50 нМ) по сравнению с контролем

* - различия достоверны при р<0,05 по сравнению с контролем; ** - различия достоверны при р<0,01 по сравнению с контролем.

Возможен и другой, не имеющий отношения к ферментативной активности механизм. МПО как поликатионный белок может связываться с поверхностью клетки и изменять свойства ее плазматической мембраны.

При исследовании влияния тромбоцитов на про-агрегантные свойства эритроцитов агрегацию последних измеряли в разных сдвиговых условиях.

В результате исследования выяснили, что в отсутствие сдвигового течения индексы агрегации эритроцитов (М5 и М10), суспендированных в ОБОГ. Т. П., были на 16 % (р>0,01) и на 18 % (р>0,01) меньше соответствующих индексов, полученных в ОБЕДН. Т. П. Еще более выраженное снижение агрегации эритроцитов было в ОБОГ. Т. П. с добавлением адреналина, где оно составило 24 % (р>0,01) и 22 % (р>0,01) соответ-

ственно (рис. 7). Подобные изменения агрегации красных клеток крови наблюдались и в условиях низкосдвигового течения, когда оно способствовало сближению и взаимодействию клеток. Индексы агрегации эритроцитов (М15 и М1ю) снижались на 15 % и 14 % в ОБОГ. Т. П. и на 24 % и 25 % в ОБОГ. Т. П. с добавлением адреналина в сравнении с соответствующими индексами, измеренными в ОБЕДН. Т. П. (рис.7).

Таким образом, результаты исследования показывают, что тромбоциты влияют на проагре-гантные свойства эритроцитов. Присутствие тромбоцитов в суспензионной среде существенно снижало агрегацию красных клеток крови. Следует отметить, что тромбоциты, подвергшиеся влиянию адреналина, еще сильнее проявляли эти свойства.

ОБЕДН. Т. П.  ОБОГ. Т. П.  ОБОГ. Т. П.

100,00

5?

¡я 75,00 и н е

| 50,00 ¡S

25,00 0,00

М5

М10

М15

М110

Рис. 7. Индексы агрегации эритроцитов в ОБЕДН. Т. П. и ОБОГ. Т. П., измеренные в разных сдвиговых условиях

и временных интервалах

** - различия достоверны по сравнению с индексом агрегации в ОБЕДН. Т. П. при р<0,01; *** - различия достоверны по сравнению с индексом агрегации в ОБЕДН. Т. П. при р<0,001.

Адреналин вызывает агрегацию тромбоцитов без изменения дисковидной формы, взаимодействуя с а-адренорецепторами плазматической мембраны. Известно, что агрегация тромбоцитов, стимулированная адреналином, обусловлена активацией а2-адренорецепторов [7, 9]. При их активации происходит ингибирование аденилат-циклазы, при этом предполагается, что механизм действия адреналина связан с модуляцией мембран и изменением их проницаемости к ионам Са2+ [16]. Вход Са2+ в тромбоциты при их акти-

вации может сопровождаться снижением уровня свободного экстрацеллюлярного кальция в плазме, что, в свою очередь, способно быть причиной снижения агрегации эритроцитов. Тот же самый процесс может происходить и при спонтанной агрегации тромбоцитов в ОБОГ. Т. П., но менее интенсивно. С другой стороны, воздействие тромбоцитов может быть опосредовано рядом активных веществ, выделяющихся при их активации: простагландинов, простациклинов, тром-боксанов, гистамина, серотонина и т. д. [22].

Библиографический список

1. Блохина, Т. А. Роль плазменных факторов в регуляции реологических свойств эритроцитов человека [Текст] / Т. А. Блохина, С. Б. Назаров, В. В. Чемоданов // Мат. международн. конф. по гемореологии. -Ярославль, 2001. - С. 60-61.

2. Егорихина, М. Н. Роль фибриногена в агрегации клеток крови при ожоговой болезни [Текст] / М. Н. Егорихина // Тромбоз, гемостаз и реология. -2009. - № 3. - С. 67-75.

3. Кузник, Б. И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и при патологии [Текст] : монография / Б. И. Кузник. - Чита : Экспресс-издательство, 2010. - 832 с.

4. Левин, Г. Я. Нарушения гемостаза и ДВС-синдром в острый период ожоговой болезни [Текст] / Г. Я. Левин // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2004. -№ 4. - С. 55-62.

5. Михайлов, П. В. Влияние макро- и микрореологических параметров крови на адгезию лейкоцитов

[Текст] : автореф. дисс. ...канд. биол. наук / П. В. Михайлов. - Ярославль, 2004. - 22 с.

6. Муравьев, А. В. Анализ влияния плазменных и клеточных факторов на агрегацию эритроцитов разных возрастных популяций [Текст] / А. В. Муравьев, И. А. Тихомирова, Д. В. Борисов // Физиология человека. - 2002. - Т. 28, № 4. - С. 144-148.

7. Орлов, С. Н., Новиков, К. Н. Регуляция объема клеток : механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение [Текст] / С. Н. Орлов, К. Н. Новиков // Росс. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 1996. - Т. 82, № 8-9. - С. 1-15.

8. Тихомирова, И. А. Роль экстрацеллюлярных, мембранных и внутриклеточных факторов в процессе агрегации эритроцитов [Текст] : автореф. ... докт. биол. наук / И. А. Тихомирова. - Ярославль, 2006. -48 с.

9. Ткачук, В. А. Гормональная регуляция транспорта Са2+ в клетках крови и сосудов [Текст] /

**

В. А. Ткачук // Рос. физиол. журнал им. И. М Сеченова. - 1998. - Т. 84, № 10. - С. 1006-1018.

10. Узикова, Е. В. Молекулярные механизмы агрегации и адгезии эритроцитов [Текст] / Е. В. Узикова [и др.] // Ярославский педагогический вестник. - 2011. - Т. 3, № 4. - С. 105-107.

11. Узикова, Е. В. Взаимодействие клеток крови: влияние присутствия лейкоцитов в суспензионной среде на агрегацию эритроцитов [Текст] / Е. В. Узикова [и др.] // Тезисы докладов 5-й Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - М., 2012. - С. 125126.

12. Bagge U., Branemark P.-I. White blood cell rheology. An intravital study in man // Adv. Microcirculation. -1997. - Vol.7. - P.1-17.

13. Baskurt O. K., Farley R. A., Meiselman H. J. Erythrocyte aggregation tendency and cellular properties in horse, human, and rat: a comparative study // Amer. J. Physiol. - 1997. - Vol. 273. - P. H2604-H2612.

14. Baskurt O. K., Meiselman H. J. Cellular determinations of low-shear blood viscosity // Biorheology. -1997. - Vol.34. - №. - 3. - P. 235-247.

15. Bradley A. J., Murad K. L., Regan K. L., Scott M.D. Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter [Текст] // Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes. -2002. - Vol. 1561. - № 2. - P. 147-158.

16. Clerck F., Xhonneux B., Wiele R. Biochemical mechanisms in 5-hydroxy tryptamine-induced human

platelet aggregation // Agents Action. - 1985. - Vol. 17, №2. - P. 220-228.

17. Johnson P., Cabel M., Popel A. Venous resistance and red cell aggregation // Abstr. Microcirculatory Soc. 41st Annu. Conf.-Anaheim, California. - 1994. -P. 82-83.

18. Meiselman H. J. Red-blood-cell role in RBC aggregation [Текст] // Clin Hemorheol. - 1993. - № 13. -P. 575-592.

19. Munn L. L., Melder R. J., Jain R. K. The role of erythrocytes in leukocyte-endothelial interactions // Biorheology. - 1995. - Vol.32. - №2- 3. - p. 142.

20. Nash G. B., Wenby R. B., Sowemimo-Coker S. O., Meiselman H. J. Influence of cellular properties on red cell aggregation // Clin. Hemorheol. - 1987. - № 7. -P. 93-108.

21. Sowemimo-Coker S. O., Whittingstall P., Pietsch L. et al. Effects of cellular factors on the aggregation behavior of human, rat and bovine erythrocytes // Clin. Hemorheol. Microcirc. - 1989. - № 9. - P. 723-737.

22. Stoltz J.-F., Donner M. Hemorheology: importance of erythrocyte aggregation // Clin. Hemorheol. -1987. - № 7. - P. 15-23.

23.Wautier M-P., Boulanger E., Wautier J-L. Erythro-cytes from diabetic patients adhere to endothelium and potentiate leukocyte adhesion molecule expression // Materials of 11th International Congress of Biorheology and 4th International Conference on Clinical Hemorheology. -Antalya. - Turkey. - September 22-26, 2002. - P. 85.