КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИЗМЕРЕНИЯ И КАЛИБРОВКИ СИСТЕМАТИЧЕСКОЙ ОШИБКИ АМПЛИФИКАЦИИ В МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ПЦР-РЕАКЦИЯХ

1. Композиция для стандартизации эффективности амплификации набора олигонуклеотидных праймеров, который способен проводить амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, содержащем перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный участок и соединительный участок, причем композиция содержит:
множество матричных олигонуклеотидов, имеющих множество олигонуклеотидных последовательностей общей формулы:
5'-U1-B1-V-B2-R-B3-J-B4-U2-3' [I]
причем:
(a) V представляет собой полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 20 и не более 1000 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей вариабельный (V) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый V-полинуклеотид содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность;
(b) J представляет собой полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 15 и не более 600 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей соединительный (J) участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент, и каждый J-полинуклеотид содержит уникальную олигонуклеотидную последовательность;
(c) U1 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) первой специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно первой универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера;
(d) U2 либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотидную последовательность, выбранную из (i) второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера и (ii) второй специфической для секвенирующей платформы олигонуклеотидной последовательности, которая связана с положением 5' и находится в нем относительно второй универсальной последовательности олигонуклеотида-адаптера;
(e) каждый из B1, B2, B3 и B4 независимо либо отсутствует, либо содержит олигонуклеотид B, который содержит последовательность штрих-кода из 3-25 последовательных нуклеотидов, причем каждый из B1, B2, B3 и B4 содержит олигонуклеотидную последовательность, которая уникальным образом идентифицирует в качестве спаренной комбинации (i) уникальную олигонуклеотидную последовательность V из (a) и (ii) уникальную олигонуклеотидную последовательность J из (b);
(f) R либо отсутствует, либо содержит сайт распознавания рестрикционного фермента, который содержит олигонуклеотидную последовательность, отсутствующую в (a)-(e);
и причем:
(g) множество матричных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере a или по меньшей мере b уникальных олигонуклеотидных последовательностей в зависимости от того, какое значение больше, причем a представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта, и композиция содержит по меньшей мере один матричный олигонуклеотид для каждого уникального V-полинуклеотида и по меньшей мере один матричный олигонуклеотид для каждого уникального J-полинуклеотида.
2. Композиция по п. 1, в которой a находится в диапазоне от 1 до максимального количества сегментов V-гена в геноме млекопитающего субъекта.
3. Композиция по любому из пп. 1 или 2, в которой b находится в диапазоне от 1 до максимального количества сегментов J-гена в геноме млекопитающего субъекта.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, в которой a равно 1 или b равно 1.
5. Композиция по п. 1, в которой множество матричных олигонуклеотидов содержит по меньшей мере (a x b) уникальных олигонуклеотидных последовательностей, причем a представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта-млекопитающего, а b представляет собой количество уникальных сегментов гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы у субъекта-млекопитающего, и композиция содержит по меньшей мере один матричный олигонуклеотид для каждой возможной комбинации сегмента гена, кодирующего V-участок, и сегмента гена, кодирующего J-участок.
6. Композиция по любому из пп. 1-5, в которой J содержит константный участок генной последовательности, кодирующей J-участок рецептора адаптивной иммунной системы.
7. Композиция по любому из пп. 1-6, в которой рецептор адаптивной иммунной системы выбран из группы, состоящей из TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK и IGL.
8. Композиция по любому из пп. 1-7, в которой V-полинуклеотид из (a) кодирует полипептид V-участка рецептора TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK или IGL.
9. Композиция по любому из пп. 1-8, в которой J-полинуклеотид из (b) кодирует полипептид J-участка рецептора TCRB, TCRG, TCRA, TCRD, IGH, IGK или IGL.
10. Композиция по любому из пп. 1-9, дополнительно содержащая стоп-кодон между V и B2.
11. Композиция по любому из пп. 1-10, в которой каждый матричный олигонуклеотид во множестве матричных олигонуклеотидов присутствует в по существу эквимолярном количестве.
12. Композиция по любому из пп. 1-11, в которой множество матричных олигонуклеотидов имеет множество последовательностей общей формулы (I), которая выбрана из:
(1) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), в которой V- и J-полинуклеотиды имеют последовательности TCRB V и J, представленные в по меньшей мере одном наборе из 68 TCRB V и J SEQ ID NO на Фиг. 5a-5l как TCRB V/J набор 1, TCRB V/J набор 2, TCRB V/J набор 3, TCRB V/J набор 4, TCRB V/J набор 5, TCRB V/J набор 6, TCRB V/J набор 7, TCRB V/J набор 8, TCRB V/J набор 9, TCRB V/J набор 10, TCRB V/J набор 11, TCRB V/J набор 12 и TCRB V/J набор 13;
(2) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), в которой V- и J-полинуклеотиды имеют последовательности TCRG V и J, представленные в по меньшей мере одном наборе из 14 TCRG V и J SEQ ID NO на Фиг. 6a и 6b как TCRG V/J набор 1, TCRG V/J набор 2, TCRG V/J набор 3, TCRG V/J набор 4 и TCRG V/J набор 5;
(3) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), в которой V- и J-полинуклеотиды имеют последовательности IGH V и J, представленные в по меньшей мере одном наборе из 127 IGH V и J SEQ ID NO на Фиг. 7a-7m как IGH V/J набор 1, IGH V/J набор 2, IGH V/J набор 3, IGH V/J набор 4, IGH V/J набор 5, IGH V/J набор 6, IGH V/J набор 7, IGH V/J набор 8 и IGH V/J набор 9;
(4) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 3157-4014;
(5) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 4015-4084;
(6) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 4085-5200;
(7) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 5579-5821;
(8) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 5822-6066; и
(9) множества олигонуклеотидных последовательностей общей формулы (I), представленных в SEQ ID NO: 6067-6191.
13. Композиция по любому из пп. 1-12, в которой V представляет собой полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 30, 60, 90, 120, 150, 180 или 210 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей V-участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент.
14. Композиция по любому из пп. 1-13, в которой V представляет собой полинуклеотид, содержащий не более 900, 800, 700, 600 или 500 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей V-участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент.
15. Композиция по любому из пп. 1-14, в которой J представляет собой полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 16-30, 31-60, 61-90, 91-120 или 120-150 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей J-участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент.
16. Композиция по любому из пп. 1-15, в которой J представляет собой полинуклеотид, содержащий не более 500, 400, 300, или 200 последовательных нуклеотидов генной последовательности, кодирующей J-участок рецептора адаптивной иммунной системы или его комплемент.
17. Композиция по любому из пп. 1-16, в которой каждый матричный олигонуклеотид имеет длину менее 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 или 200 нуклеотидов.
18. Композиция по любому из пп. 1-17, дополнительно содержащая: набор олигонуклеотидных праймеров, который способен проводить амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы, содержащий множество a' уникальных олигонуклеотидных праймеров для V-сегмента и множество b' уникальных олигонуклеотидных праймеров для J-сегмента.
19. Композиция по п. 18, в которой a' находится в диапазоне от 1 до максимального числа сегментов V-гена в геноме млекопитающего, а b' находится в диапазоне от 1 до максимального числа сегментов J-гена в геноме млекопитающего.
20. Композиция по п. 19, в которой a' равно a.
21. Композиция по п. 19, в которой b' равно b.
22. Композиция по любому из пп. 18-21, в которой каждый олигонуклеотидный праймер для V-сегмента и каждый олигонуклеотидный праймер для J-сегмента в наборе олигонуклеотидных праймеров способен специфически гибридизироваться с по меньшей мере одним матричным олигонуклеотидом из множества матричных олигонуклеотидов.
23. Композиция по любому из пп. 18-22, в которой каждый олигонуклеотидный праймер для V-сегмента содержит нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, которая комплементарна по меньшей мере одному сегменту гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы.
24. Композиция по любому из пп. 18-23, в которой каждый олигонуклеотидный праймер для J-сегмента содержит нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, которая комплементарна по меньшей мере одному сегменту гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы.
25. Композиция по любому из пп. 18-24, в которой композиция содержит по меньшей мере один матричный олигонуклеотид, имеющий олигонуклеотидную последовательность общей формулы (I), с которым может специфически гибридизироваться каждый олигонуклеотидный праймер для V-сегмента, и по меньшей мере один матричный олигонуклеотид, имеющий олигонуклеотидную последовательность общей формулы (I), с которым может специфически гибридизироваться каждый олигонуклеотидный праймер для J-сегмента.
26. Способ определения неравномерного потенциала амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров, который способен проводить амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, содержащем перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем способ включает:
(a) амплификацию композиции по любому из пп. 18-25 в мультиплексной ПЦР-реакции для получения множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов;
(b) секвенирование указанного множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов для определения для каждого уникального составляющего указанное множество уникального матричного олигонуклеотида (i) последовательности матричного олигонуклеотида и (ii) частоты вхождения указанной последовательности матричного олигонуклеотида; и
(c) сравнение частоты вхождения каждой из указанных последовательностей матричных олигонуклеотидов с ожидаемым распределением, причем указанное ожидаемое распределение основано на заранее заданных молярных соотношениях указанного множества матричных олигонуклеотидов, составляющих указанную композицию, и причем отклонение указанной частоты вхождения указанных последовательностей матричных олигонуклеотидов от указанного ожидаемого распределения указывает на неравномерный потенциал амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации.
27. Способ по п. 26, в котором указанные заранее заданные молярные соотношения являются эквимолярными.
28. Способ по п. 27, в котором указанное ожидаемое распределение содержит равномерный уровень амплификации для указанного набора матричных олигонуклеотидов, амплифицированных указанным набором олигонуклеотидных праймеров.
29. Способ по п. 26, в котором каждая молекула амплифицированной матричной нуклеиновой кислоты имеет длину менее 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80 или 70 нуклеотидов.
30. Способ по любому из пп. 26-29, дополнительно включающий для каждого члена набора олигонуклеотидных праймеров, который демонстрирует неравномерный потенциал амплификации относительно ожидаемого распределения, коррекцию относительного представления члена набора олигонуклеотидных праймеров в наборе олигонуклеотидных праймеров для амплификации.
31. Способ по п. 30, в котором коррекция включает увеличение относительного представления члена в наборе олигонуклеотидных праймеров, посредством этого корректируя неравномерность потенциала амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров.
32. Способ по п. 30, в котором коррекция включает уменьшение относительного представления члена в наборе олигонуклеотидных праймеров, посредством этого исправляя неравномерность потенциала амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров.
33. Способ по любому из пп. 26-32, в котором указанный набор олигонуклеотидных праймеров не включает в себя олигонуклеотидные праймеры, которые специфически гибридизируются с псевдогеном или орфоном V-участка или с псевдогеном или орфоном J-участка.
34. Способ по любому из пп. 26-33, дополнительно включающий для каждого члена набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации, который демонстрирует неравномерный потенциал амплификации относительно ожидаемого распределения, расчет пропорционально возросшей или снизившейся частоты вхождения молекул амплифицированных матричных нуклеиновых кислот, амплификация которых обеспечивается указанным членом, посредством этого корректируя неравномерность потенциала амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров.
35. Способ количественного определения множества перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, содержащем перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, причем каждый рецептор адаптивной иммунной системы содержит вариабельный (V) участок и соединительный (J) участок, причем способ включает:
(А) амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот в мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая содержит:
(1) перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из биологического образца, содержащего лимфоидные клетки субъекта-млекопитающего;
(2) композицию по любому из пп. 1-17, в которой в известном количестве присутствует каждый из множества матричных олигонуклеотидов, имеющих уникальную олигонуклеотидную последовательность;
(3) набор олигонуклеотидных праймеров для амплификации, который способен проводить амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы из биологического образца, причем набор праймеров содержит:
(а) в по существу эквимолярных количествах множество олигонуклеотидных праймеров для V-сегментов, каждый из которых независимо способен специфически гибридизироваться с по меньшей мере одним полинуклеотидом, кодирующим полипептид V-участка рецептора адаптивной иммунной системы, или с его комплементом, причем каждый праймер для V-сегментов содержит нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, которая комплементарна по меньшей мере одному функциональному сегменту гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы, и причем множество праймеров для V-сегментов специфически гибридизируется с по существу всеми функциональными сегментами гена, кодирующего V-участок рецептора адаптивной иммунной системы, которые присутствуют в композиции; и
(b) в по существу эквимолярных количествах множество олигонуклеотидных праймеров для J-сегментов, каждый из которых независимо способен специфически гибридизироваться с по меньшей мере одним полинуклеотидом, кодирующим полипептид J-участка рецептора адаптивной иммунной системы, или с его комплементом, причем каждый праймер для J-сегментов содержит нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, которая комплементарна по меньшей мере одному функциональному сегменту гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы, и причем множество праймеров для J-сегментов специфически гибридизируется с по существу всеми функциональными сегментами гена, кодирующего J-участок рецептора адаптивной иммунной системы, которые присутствуют в композиции,
причем олигонуклеотидные праймеры для V-сегментов и J-сегментов способны обеспечить в указанной мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплификацию (i) по существу всех матричных олигонуклеотидов в композиции для получения множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов, причем указанное множество амплифицированных матричных молекул нуклеиновых кислот достаточно для количественного определения разнообразия матричных олигонуклеотидов в данной композиции, и (ii) по существу всех перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы адаптивной иммунной системы в биологическом образце, для получения множества амплифицированных перестроенных молекул ДНК, причем указанное множество амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот достаточно для количественного определения разнообразия перестроенных молекул нуклеиновых кислот в ДНК из биологического образца
и причем каждая амплифицированная молекула нуклеиновой кислоты во множестве амплифицированных матричных олигонуклеотидов и множестве амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот имеет длину менее 1000 нуклеотидов;
(B) количественное секвенирование указанных амплифицированных матричных олигонуклеотидов и указанных амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот для количественного определения (i) количества матричного продукта амплифицированных матричных олигонуклеотидов, которые содержат по меньшей мере одну олигонуклеотидную последовательность штрих-кода, и (ii) количества перестроенного продукта амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, в которых отсутствует олигонуклеотидная последовательность штрих-кода;
(C) вычисление коэффициента амплификации путем деления количества матричного продукта из (B)(i) на известное количество каждого из множества матричных олигонуклеотидов, имеющих уникальную олигонуклеотидную последовательность из (A)(2); и
(D) деление количества перестроенного продукта из (B)(ii) на коэффициент амплификации, вычисленный в (C), для количественного определения содержания уникальных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы адаптивной иммунной системы, в образце.
36. Способ по п. 35, в котором указанное количественно определенное содержание уникальных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы адаптивной иммунной системы, в образце представляет собой количество уникальных геномных матриц B-клеток или уникальных геномных матриц T-клеток в образце.
37. Способ вычисления среднего коэффициента амплификации в мультиплексном ПЦР-анализе, включающий:
получение биологического образца, который содержит перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего;
приведение указанного образца в контакт с известным количеством матричных олигонуклеотидов, составляющих композиции по любому из пп. 18-25;
амплификацию матричных олигонуклеотидов и перестроенных молекул нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего в мультиплексной ПЦР-реакции для получения множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов и множества амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот;
секвенирование указанного множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов для определения для каждого уникального матричного олигонуклеотида, составляющего указанное множество, (i) последовательности матричного олигонуклеотида и (ii) частоты вхождения указанной последовательности матричного олигонуклеотида; и
определение указанного среднего коэффициента амплификации для указанной мультиплексной ПЦР-реакции на основе среднего числа копий указанного множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов и указанного известного количества указанных матричных олигонуклеотидов.
38. Способ по п. 37, дополнительно включающий:
секвенирование указанного множества амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего для определения для каждой уникальной перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты, составляющей указанное множество, (i) последовательности перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) количества вхождений указанной последовательности перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты; и
определение количества лимфоидных клеток в указанном образце на основе среднего коэффициента амплификации для указанной мультиплексной ПЦР-реакции и указанного количества вхождений указанных перестроенных молекул нуклеиновых кислот.
39. Способ по п. 38, в котором определение количества лимфоидных клеток в указанном образце включает получение суммы количества вхождений каждой из указанных амплифицированных последовательностей перестроенных молекул нуклеиновых кислот и деление указанной суммы на указанный средний коэффициент амплификации.
40. Способ по п. 37, в котором указанное известное количество составляет одну копию для каждого из указанных матричных олигонуклеотидов.
41. Способ по п. 40, в котором 100 < a < 500.
42. Способ по п. 40, в котором 100 < b < 500.
43. Способ коррекции систематической ошибки амплификации в мультиплексной реакции ПЦР-амплификации для количественного определения перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, содержащем перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего, включающий:
(а) приведение указанного образца в контакт с композицией по любому из пп. 18-25 для получения образца с добавленным известным количеством матриц, причем указанные матрицы и указанные перестроенные молекулы нуклеиновых кислот содержат соответствующие последовательности V- и J-участков;
(b) амплификацию указанного образца с добавленным известным количеством матриц в мультиплексной ПЦР-реакции для получения множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов и множества амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих множество рецепторов адаптивной иммунной системы;
(c) секвенирование указанного множества амплифицированных матричных олигонуклеотидов для определения для каждого уникального матричного олигонуклеотида, составляющего указанное множество, (i) последовательности матричного олигонуклеотида и (ii) частоты вхождения указанной последовательности матричного олигонуклеотида;
(d) секвенирование указанного множества амплифицированных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или множество рецепторов адаптивной иммунной системы, для определения для каждой уникальной перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное множество рецепторов адаптивной иммунной системы, составляющей указанное множество, (i) последовательности перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) частоты вхождения указанной последовательности перестроенной молекулы нуклеиновой кислоты;
(e) сравнение указанной частоты вхождения указанных последовательностей матричных олигонуклеотидов с ожидаемым распределением, причем указанное ожидаемое распределение основано на заранее заданных молярных соотношениях для указанного множества матричных олигонуклеотидов, составляющих указанную композицию, и причем отклонение указанной частоты вхождения указанных последовательностей матричных олигонуклеотидов от указанного ожидаемого распределения указывает на неравномерный потенциал амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации;
(f) генерацию набора коррекционных значений для набора последовательностей матричных молекул и перестроенных молекул нуклеиновых кислот, амплифицированных с использованием указанных членов набора олигонуклеотидных праймеров для амплификации, имеющих указанный обозначенный неравномерный потенциал амплификации нуклеиновых кислот, причем указанный набор коррекционных значений обеспечивает коррекцию систематической ошибки амплификации в указанной мультиплексной ПЦР-реакции; и
(g) необязательно - применение указанного набора коррекционных значений к указанной частоте вхождения указанных последовательностей перестроенных молекул нуклеиновых кислот для коррекции систематических ошибок амплификации в указанной мультиплексной ПЦР-реакции.
44. Набор, содержащий:
реагенты, содержащие: композицию, которая содержит множество матричных олигонуклеотидов и множество олигонуклеотидных праймеров по любому из пп. 18-25;
инструкции по определению неравномерного потенциала амплификации нуклеиновых кислот среди членов набора олигонуклеотидных праймеров, который способен проводить амплификацию перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих один или более рецепторов адаптивной иммунной системы в биологическом образце, содержащем перестроенные молекулы нуклеиновых кислот из лимфоидных клеток субъекта-млекопитающего.
45. Набор по п. 44, дополнительно содержащий инструкции для коррекции для одного или более членов набора олигонуклеотидных праймеров, имеющего неравномерный потенциал амплификации нуклеиновых кислот.
46. Набор по п. 44, дополнительно содержащий инструкции для количественного определения содержания уникальных перестроенных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы адаптивной иммунной системы, в образце.