Производные 4-фенилпирролидона, обладающие противосудорожной и ноотропной активностью, как средства лечения эпилепсии и пароксизмальных состояний
DERIVATIVES OF 4-PHENYLPYRROLIDONE WITH ANTICONVULSANT AND NOOTROPIC ACTIVITY AS MEANS OF TREATING EPILEPSY AND PAROXYSMAL CONDITIONS

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области области медицины, биологии и химии, конкретно к новой группе производных (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты общей формулы (1),
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
где X может быть атомомами С и N, при этом, если X=С, то R, R, R, R, R могут быть водородами, алкильными, алкокси и трифторметильными группами; «n» может равняться 0 и 1; а если X=N, то R отсутствует, a R, R, R, R являются атомами водорода, «n» равняется 0.
Заявляемые соединения могут быть фармакологическими средствами лечения эпилепсии и пароксизмальных состояний, появляющихся при различных патологиях.
Предпосылки изобретения
Эпилепсия является одним из наиболее распространенных заболеваний ЦНС с хроническим проградиентным течением и высоким уровнем инвалидизации (Е.И. Гусев, 1994). Эпилепсией страдают все возрастные группы населения, с наиболее высоким процентом заболевших в детском возрасте. Распространенность эпилепсии в разных странах по данным ВОЗ варьирует от 1,5 до 50 случаев на 1000 населения (Atlas: Epilepsy Care in the World. World Health Organization, 2005; Forsgren L. The epidemiology of epilepsy in Europe a systematic review / L. Forsgren, E. Beghi, A. Oun, M. Sillanpa // Europ. J. Neurology. - 2005. - Vol. 12. - P. 245-253; Hauser W.A. Epidemiology of epilepsy / W.A. Hauser // X Всероссийский съезд неврологов с международным участием: материалы съезда. Нижний Новгород, - 2012. - С. - 313-314). В Российской Федерации распространенность эпилепсии составляет 2,98 на 1000 человек населения (Гехт, В.А. Хаузер, Л.Е. Мильчакова и др. // X Всероссийский съезд неврологов 125 с международным участием: материалы съезда. Нижний Новгород. - 2012. - С. 277).
Лечение эпилепсии осуществляется, главным образом, противоэпилептическими препаратами (ПЭП) и проводится непрерывно в течение многих лет, а иногда и всей жизни больного (Карлов В.А. Эпилепсия у детей и взрослых женщин и мужчин: руководство для врачей / В.А. Карлов. М: Медицина, 2010. - 717 с). Однако, эффективность противосудорожной терапии все еще остается неудовлетворительной и в 20-30% случаев судороги не поддаются контролю основными ПЭП. Наряду с этим, ПЭП обладают различными побочными эффектами (Карлов В.А. Эпилепсия у детей и взрослых женщин и мужчин: руководство для врачей / В.А. Карлов. М.: Медицина, 2010. - 717 с).
В связи с вышеизложенным, поиск и разработка новых высокоэффективных и низкотоксичных отечественных лекарственных средств для профилактики и лечения эпилепсии и других пароксизмальных состояний является крайне актуальной задачей.
Технический результат
В основу настоящего изобретения положена задача получения новых соединений, обладающих высокой противосудорожной активностью.
Предлагаемое техническое решение - производные (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты.
Соединения общей формулы 1 в специальной и патентной литературе не описаны. В качестве примеров соединений формулы 1 настоящего изобретения следует назвать:
2,6-диметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1а);
2,4,6-триметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1б);
2-метиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты (1в);
2-метоксианилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1 г);
3-трифторметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1д);
пирид-2-иланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1е);
бензиламид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1ж).
Наиболее близкими прототипами по химическому строению являются анилиды (2-оксо-4-(диалкоксифенил)пирролидин-1-ил)уксусной кислоты, которые являются ингибиторами фосфодиэстеразы IV [R. Liu, М. D. Vivo, H.-J. Hess, A. Hopper, Е. Kreuster, А. Tehim. Phosphodiesterase 4 inhibitors. US Patent 20030139406].
Среди производных пирролидона в медицине нашли применение пирацетам, прамирацетам, фенотропил (Shorvon S., Pyrrolidone derivetives, Lancet, Vol. 358, 1885-1892 (2001)), которые преимущественно используются для лечения когнитивных нарушений, но не обладают противосудорожной активностью, а также леветирацетам (Celikyurt I.K., Ulak G et all., Positive impact of levetiracetam on emotional learning and memory in naive mice, Life Sciences., 90, 185-189 (2012)) и его аналоги бриварацетам (Rolan Р, Sargentini-Maier ML, Pigeolet E, Stockis A (2008). "The pharmacokinetics, CNS pharmacodynamics and adverse event profile of brivaracetam after multiple increasing oral doses in healthy men". Br J Clin Pharmacol. 66 (1): 71-75) и селетрацетам (Pollard, JR; Kulig, K. "Seletracetam, a small molecule SV2A modulator for the treatment of epilepsy". Current Opinion in Investigational Drugs. 9 (1): 101-107), которые используются как противоэпилептические препараты.
Описанные ранее соединения отличаются от заявляемых по структуре и по фармакологическим свойствам.
Получение заявляемых соединений.
В соответствии с настоящим изобретением соединения общей формулы 1 можно получить по следующей общей схеме:
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
4-Фенилпирролидон-2 2 вводят во взаимодействие с этиловым эфиром бромуксусной кислоты в полярном апротонном растворителе, например, диоксане или тетрагидрофуране, в присутствии сильных оснований, например, гидридов щелочных металлов, при температуре от комнатной до 120°С, в результате чего получают этиловый эфир 4-фенил-2-оксопирролидин-1 -уксусной кислоты 3. Соединение 3 гидролизуют действием щелочи в водно-спиртовых растворах, что приводит к образованию 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4. Кислоту 4 вводят во взаимодействие с аминами общей формулы 5, где R, R, R, R, R, X и n имеют вышеуказанные значения, в органических растворителях, таких как, например, бензол, толуол, хлористый метилен, в присутствии оснований, таких как, например, карбонаты щелочных металлов или третичные амины, и конденсирующих агентов, таких как, например, изобутилхлорформиат, дициклогексилкарбодиимид или другие, что приводит к образованию производных (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты общей формулы 1, где R, R, R, R, R, X и n имеют вышеуказанные значения.
Соединения 1 представляют собой белые твердые кристаллические вещества нерастворимые в воде, растворимые в некоторых органических растворителях, таких как спирт, хлороформ, ДМСО.
1
Строение веществ общей формулы 1 подтверждены данными спектров ЯМР Н, а их чистота - данными элементного анализа.
Пример 1. 2,6-Диметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1а).
1.1. Этиловый эфир 4-фенил-2-оксопирролидин-1-ил-уксусной кислоты 3 [О.М. Глозман, И.С. Морозов, Л.А. Жмуренко, В.А. Загоревский, Синтез и противосудорожная активность амидов 4-фенилпирролидон-2-уксусной-1 кислоты. Хим-фарм. журнал, 1980, №11, с. 43-48].
К суспензии 0.47 моль (11.3 г) гидрида натрия в 250 мл безводного диоксана прибавляют по каплям раствор 0.428 моль (69.0 г) 4-фенилпирролидона-2 (2) в 800 мл диоксана, нагревают при 90°С в течение 1 часа и охлаждают. К смеси прибавляют по каплям раствор 0.47 моль (78.6 г) этилового эфира бромуксусной кислоты в 250 мл диоксана, нагревают при 125°С в течение 5 часов и оставляют на ночь при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают четыреххлористым углеродом. Объединенные фильтраты упаривают досуха, остаток перегоняют при 198-204°С (4-5 мм рт.ст.), получая 55.7 г этилового эфира 4-фенил-2-оксопирролидин-1-ил-уксусной кислоты 3 (выход 53%).
1.2. 4-Фенил-2-оксопирролидин-1-ил-уксусная кислота 4 [О.М. Глозман, И.С. Морозов, Л.А. Жмуренко, В.А. Загоревский, Синтез и противосудорожная активность амидов 4-фенилпирролидон-2-уксусной-1 кислоты. Хим-фарм. журнал, 1980, №11, с. 43-48]..
93 ммоль (23.1 г) этилового эфира 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 3 и раствор 5.6 г гидроксида калия в 60 мл воды и 60 мл спирта кипятят в течение 3 часов, отгоняют в вакууме спирт и подкисляют 10%-ным раствором соляной кислоты до рН 2.0. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат надо оксидом фосфора, получая 23 г 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 (выход 80%), т.пл. 162-163°С (из воды).
1.3. 2,6-Диметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1а).
20
22
2
2
3
2
2
1
2
3
2
3
2
К раствору 30 ммоль (6.57 г) 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 30 ммоль (3.03 г) триэтиламина в 200 мл безводного толуола по каплям прибавляют раствор 30 ммоль (4.10 г) изобутилхлорформиата в 15 мл безводного толуола при перемешивании при температуре -15°С в течение 15 минут. Реакционную смесь перемешивают в течение часа при температуре -10°С, после чего к ней прибавляют по каплям раствор 30 ммоль (3.63 г) 2,6-диметиланилина в 15 мл толуола при перемешивании при температуре -10°С в течение 15 минут. Реакционную смесь перемешивают в течение часа при температуре -10°С и выливают в 150 мл воды. К смеси добавляют 40 мл 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия и перемешивают. Органический раствор отделяют и промывают два раза по 80 мл 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия и два раза по 100 мл воды, сушат над сульфатом магния и упаривают досуха. Остаток растирают под диэтиловым эфиром и отфильтровывают образовавшийся осадок, получая 5.2 г 2,6-диметиланилида 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил уксусной кислоты (1а) в виде белого порошка (выход 54%). Т.пл. 115-116°С (из смеси бензол-петролейный эфир). Найдено (%): С, 74.81; Н, 6.94; N, 8.84. CHNO. Вычислено (%): С, 74.51; Н, 6.88; N, 8.84. ЯМР H (DMSO, δ, м.д.): 2.12 (с, 6 Н, 2 СН); 2.43 (д.д, 1 Н, Н(3а), J=16.4 Гц, J=8.6 Гц); 2.73 (д.д, 1 Н, Н(3b), J=16.4 Гц, J=9.0 Гц); 3.49 и 3.84 (два м, по 1 Н, (5)СН); 3.65 (м, 1 Н, Н(4)); 4.03 и 4.14 (два д, по 1 Н, СНСО, J=16.4 Гц); 7.06 (с, 3 Н, Аr); 7.20-7.40 (м, 5 Н, Ph); 9.36 (с, 1 Н, NH).
Пример 2. 2,4,6-триметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (16).
21
24
2
2
3
3
2
2
2
1
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 2,4,6-триметиланилина. Выход 60% (белый порошок). Т.пл. 135-136°С (из этилацетата). Найдено (%): С, 75.11; Н, 6.96; N, 8.55. CHNO. Вычислено (%): С, 74.96; Н, 7.19; N, 8.32. ЯМР Н (DMSO, δ, м.д.): 2.07 (с, 6 Н, 2 СН); 2.21 (с, 3 Н, СН); 2.44 и 2.72 (два м, по 1 Н, (3)СН); 3.48 и 3.83 (два м, по 1 Н, (5)СН); 3.64 (м, 1 Н, Н(4)); 4.05 и 4.12 (два д, по 1 Н, СНСО, J=16.7 Гц); 6.86 (с, 2 Н, Аr); 7.17-7.35 (м, 5 Н, Ph); 9.28 (с, 1 Н, NH).
Пример 3.2-Метиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты (1в).
19
20
2
2
3
2
2
1
2
3
2
3
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 2-метиланилина. Выход 43% (белый порошок). Т.пл. 100-101°С (из смеси бензол-петролейный эфир). Найдено (%): С, 74.08; Н, 6.52; N, 8.96. CHNO. Вычислено (%): С, 74.00; Н, 6.54; N, 9.08. ЯМР H (DMSO, δ, м.д.): 2.13 (с, 3 Н, СН); 2.42 (д.д, 1 Н, Н(3а),J=16.6 Гц, J=8.5 Гц); 2.74 (д.д, 1 Н, Н(3b),J=16.6 Гц, J=8.8 Гц); 3.48 и 3.83 (два м, по 1 Н, (5)СН); 3.64 (м, 1 Н, Н(4)); 4.08 и 4.17 (два д, по 1 Н, СНСО, J=16.8 Гц); 7.00-7.40 (м, 9 Н, Ph, Аr); 9.45 (с, 1 Н, NH).
Пример 4. 2-Метоксианилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1 г).
19
20
2
3
3
2
1
2
3
2
3
2
3
2
3
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 2-метоксианилина. Выход 53% (белый порошок). Т.пл. 94-95°С (из смеси этилацетат-гептан). Найдено (%): С, 70.33; Н, 6.39; N, 8.81. CHNO. Вычислено (%): С, 70.35; Н, 6.21; N, 8.64. ЯМР Н (DMSO, δ, м.д.): 2.41 (д.д, 1 Н, Н(3а), J=16.6 Гц, J=8.5 Гц); 2.74 (д.д, 1 Н, Н(3b), J=16.6 Гц, J=9.0 Гц); 3.48 (д.д, 1 Н, Н(5а), J=8.5 Гц, J=8.9 Гц); 3.81 (д.д, 1 Н, H(5b), J=8.5 Гц, J=8.5 Гц); 3.83 (с, 3 Н, ОСН); 3.62 (м, 1 Н, Н(4)); 4.11 и 4.90 (два д, по 1 Н, СНСО,J=17.0 Гц); 6.89-7.93 (м, 4 Н, Аr); 7.50-7.80 (м, 5 Н, Ph); 9.36 (с, 1 Н, NH).
Пример 5. 3-Трифторметиланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1д).
19
17
3
2
2
2
1
2
3
2
3
2
3
2
3
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 3-трифторметиланилина. Выход 54% (белый порошок). Т.пл. 160-161°С (из смеси этилацетат-гептан). Найдено (%): С, 62.82; Н, 4.67; N, 7.75. CHFNO. Вычислено (%): С, 62.98; Н, 4.73; N, 7.73. ЯМР H (DMSO, δ, м.д.): 2.43 (д.д, 1 Н, Н(3а), J=16.8 Гц, J=8.3 Гц); 2.75 (д.д, 1 Н, Н(3b), J=16.8 Гц, J=8.8 Гц); 3.47 (д.д, 1 Н, Н(5а), J=8.5 Гц, J=8.5 Гц); 3.84 (д.д, 1 Н, H(5b), J=8.5 Гц, J=8.5 Гц); 3.64 (м, 1 Н, Н(4)); 4.10 и 4.17 (два д, по 1 Н, СНСО, J=16.8 Гц); 7.20-8.15 (м, 9 Н, Ph, Аr); 10.47 (с, 1 Н, NH).
Пример 6. Пирид-2-иланилид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1е).
17
17
3
2
2
1
2
3
2
3
2
3
2
3
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и 2-аминопиридина. Выход 44% (белый порошок). Т.пл. 140-141°С (из этилацетата). Найдено (%): С, 69.15; Н, 5.99; N, 14.40. CHNO. Вычислено (%): С, 69.13; Н, 5.80; N, 14.23. ЯМР Н (DMSO, δ, м.д.): 2.41 (д.д, 1 Н, Н(3а), J=16.6 Гц, J=8.5 Гц); 2.75 (д.д, 1 Н, H(3b), J=16.6 Гц, J=8.8 Гц); 3.46 (д.д, 1 Н, H(5a), J=8.5 Гц, J=8.5 Гц); 3.82 (д.д, 1 Н, Н(5b), J=8.5 Гц, J=8.5 Гц); 3.63 (м, 1 Н, Н(4)); 4.14 и 4.22 (два д, по 1 Н, СНСО, J=16.8 Гц); 7.10-8.31 (4 м, по 1 Н, Ру); 7.50-8.02 (м, 5 Н, Ph); 10.65 (с, 1 Н, NH).
Пример 7. Бензиламид (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (1ж).
19
20
2
2
2
2
1
2
3
2
3
2
2
Получают в соответствии с пунктом 1.3. Примера 1 из 4-фенил-2-оксопирролидин-1-уксусной кислоты 4 и бензиламина. Выход 42% (белый порошок). Т.пл. 91-92°С (из смеси бензол-гептан). Найдено (%): С, 74.00; Н, 6.36; N, 9.33. CHNO. Вычислено (%): С, 73.99; Н, 6.54; N, 9.09. ЯМР H (DMSO, δ, м.д.): 2.40 (д.д, 1 Н, Н(3а), J=16.6 Гц, J=8.5 Гц); 2.71 (д.д, 1 Н, H(3b), J=16.6 Гц, J=8.8 Гц); 3.44 (м, 1 Н, Н(5а)); 3.62 (м, 1 Н, Н(4)); 3.77 (м, 1 Н, Н(5b)); 3.94 (с, 2 Н, CHPh); 4.30 (д, по 1 Н, СНСО, J=5.6 Гц); 7.20-7.38 (м, 10 Н, Ph); 8.49 (т, 1 Н, NH,J=5.6 Гц).
Фармакологическая часть.
В настоящей заявке представлены новые производные 4-фенилпирролидона, обладающие противосудорожной и ноотропной активностью. Показано, что производные 4-фенилпирролидона обладают широким спектром противосудорожных эффектов в широком диапазоне доз (от 2,5 до 20 мг/кг): устраняют генерализованные судороги в тестах антагонизма с коразолом, максимальным электрошоком и пилокарпином, ослабляют проявления эпилептического статуса. В тесте антагонизма с коразолом соединения увеличивают латентный период генерализованного клонико-тонического припадка и процент выживших после приступа животных, в тесте пилокарпиновых судорог существенно увеличивают (до 100%) выживаемость животных, а в тесте максимального электрошока соединение 1а уменьшает процент животных с тонической экстензией и повышает их выживаемость. Заявляемые соединения обладают отчетливым эффектом на модели литий-пилокарпинового эпилептического статуса, что выражается в способности достоверно ослаблять судорожные проявления эпилептического статуса, повышать до 100%) выживаемость животных и увеличивать латентный период наступления судорог. Наиболее активное соединение 1а превосходит препарат сравнения леветирацетам (Кепра) по эффективности и активности во всех тестах. Сходный противосудорожный эффект наблюдается при использовании соединения 1 а в дозе 5 мг/кг, а леветирацетама - в дозе 600 мг/кг.
Наряду с противосудорожной активностью, заявляемые производные 4-фенилпирролидона обладают отчетливой ноотропной активностью, что выражается в способности соединений улучшать как процесс обучения, так и процесс воспроизведения пространственного навыка в водном лабиринте Морриса. По ноотропной активности наиболее эффективное из заявляемых соединений - 1а (2,5 и 5 мг/кг) не уступает эталонному ноотропному препарату пирацетам (400 мг/кг). Структурный аналог соединения 1а - леветирацетам не оказывает влияния на обучение и уступает соединению 1а по влиянию на процесс воспроизведения.
В дозах 0,5-50 мг/кг заявляемые соединения не вызывают побочных эффектов: нарушения координации движений и мышечного тонуса (проявления неврологического дефицита) в тестах вращающегося стержня и подтягивания на перекладину. Соединение 1а в дозе 200 мг/кг не вызывает гибели животных, и, следовательно, терапевтический индекс, вычисляемый по соотношению эффективной и летальной доз (200 мг/кг:5 мг/кг) составляет величину более 40. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1а относится к классу нетоксичных веществ и имеет большую терапевтическую широту.
Экспериментальная фармакологическая часть.
Исследование противосудорожных свойств производных 4-фенилпирролидона проводили на животных, полученных из питомника «Столбовая» (Московская область), которых содержали в виварии в одинаковых условиях обитания и кормления (стандартный брикетированный корм). С животными работали в соответствии с действующими "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" и "Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" (Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Хроника ВОЗ, 1985, Т.39, №3, С. 3-9).
Изучение противосудорожной и ноотропной активности соединений проводили в соответствии с Методическими указаниями, изложенными в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть. 1. ФГБУ «НЦЭМСП». Москва, Изд-во Гриф и К, 2012, Глава 14, с 235-250; Т.А. Воронина, Р.У. Островская, Т.Л. Гарибова. Методические указания по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств», Издание ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразвития России, «Гриф и К», (редакционная коллегия: Миронов А.Н и другие), Москва, 2012 г., Часть 1, Глава 17, стр. 276-296).
Пример 1. Противосудорожное действие производных 4-фенилпирролидона на модели первично-генерализованных судорог, вызванных коразолом.
Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 20-26 г. Каждая доза соединения исследовалась на 8-10 животных. Тест антагонизма с коразолом также, как и тест максимального электрошока, является базисной методикой при оценке действия веществ с противосудорожной активностью (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть. 1. ФГБУ «НЦЭМСП». Москва, Изд-во Гриф и К, 2012, Глава 14, с 235-250; Loscher et al., The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazol seizure models. Epilepsy Res., 1991, v. 8, p. 171-189). В этой методике судороги вызываются химическим воздействием и моделируют первично-генерализованные судороги при так называемых «малых» (Petit mal) судорожных припадках.
Для получения судорожного припадка животным подкожно в область шейного отдела спины вводили антагонист ГАМК-А рецептора коразол (пентилентетразол, Sigma-Aldrich, США) в дозе 90 мг/кг. Затем животные наблюдались в течение 60 мин. Регистрировали: латентный период (ЛП) первого генерализованного приступа клонических судорог с потерей рефлекса переворачивания, число мышей без судорог и число погибших животных.
Исследуемые соединения, растворенные в физиологическом растворе, вводили животным однократно, внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл на 10 г веса мыши за 40 минут до коразола. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью статистических пакетов "BioStat" для Windows.
Установлено, что у контрольных животных после введения коразола в дозе 90 мг/кг латентный период (ЛП) первого генерализованного приступа с потерей рефлекса переворачивания составил 2,2 мин, генерализованные клонические судороги передних и задних конечностей с утратой рефлекса переворачивания наблюдались у 86% мышей, и гибель животных также составила 86% (таблица 1).
Соединение 1а статистически достоверно увеличивало латентный период первого генерализованного судорожного приступа: в дозе 5 мг/кг в 1,5 раза, а в дозе 10 мг/кг в 2,2 раза, по сравнению с контрольной группой животных (таблица 1). Наряду с этим, соединение 1а в дозе 5 мг/кг статистически достоверно увеличивало (до 83,3%) число выживших животных (в контроле 16%).
Соединение 1 г статистически достоверно увеличивало по сравнению с контролем латентный период первого генерализованного судорожного приступа: в дозах 2,5, 5 и 10 мг/кг (таблица 1). Соединение 1д достоверно увеличивало латентный период генерализованного судорожного приступа: в дозе 2,5 мг/кг, а соединение 1ж в дозе 5 мг/кг. Соединение 1в в дозах 2,5, 5 и 10 мг/кг не обладало противосудорожным действием в тесте антагонизма с коразолом.
Леветирацетам в дозе 2,5 мг/кг не оказывал противосудорожного эффекта в тесте антагонизма с коразолом, а в дозе 600 мг/кг статистически достоверно увеличивал латентный период генерализованных судорог, но не оказывал существенного влияния на выживаемость животных (Таблица 1).
Таким образом, противосудорожным эффектом в тесте антагонизма с коразолом обладают соединения 1а, 1г, 1д и 1ж, и среди них наибольшую эффективность проявляет соединение la, которое увеличивает латентный период генерализованного судорожного приступай процент выживших после приступа животных. Соединения 1б и 1в не проявляет противосудорожный эффект в тесте с коразолом.
*- достоверность отличий от группы контроля, при Р<0.05 (критерий Стьюдента). # -достоверность отличий от группы контроля, при р≤0,05 (точный критерий Фишера.
Таким образом, производное 4-фенилпирролидона 1 а в дозах 5 и 10 мг/кг обладает противосудорожным эффектом в тесте антагонизма с коразолом, что выражается в статистически достоверном увеличении латентного периода первого генерализованного судорожного приступа и в увеличении (до 90%) числа выживших животных. Препарат сравнения леветирацетам в дозе 600 мг/кг увеличивает выживаемость животных в тесте антагонизма с коразолом. Соединение 1а в тесте антогонизма с коразолом превосходит леветирацетам по активности и эффективности.
Пример 2. Противосудорожное действие производных 4-фенилпирролидона на модели первично-генерализованных судорог, вызванных максимальным электрошоком.
Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 21-27 г. Каждая доза соединения исследовалась на 8-10 животных. Методика максимального электрошока (МЭШ) моделирует первично-генерализованные судороги - так называемые «большие» (Grant mal) судорожные припадки и является базисным тестом при оценке действия веществ с противосудорожной активностью как в России, так и за рубежом (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ. «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть. 1. ФГБУ «НЦЭМСП». Москва, Изд-во Гриф и К, 2012, Глава 14, с 235-250; Loscher et al., The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. II. Maximal electroshock seizure models, Epilepsy Res., 1991, v.8, p. 79-94; Swinyard E.A. - Laboratory evaluation of antiepileptic drugs. Reviewof laboratory methods, Epilepsia, 1969, v. 10, pp. 107-119).
Максимальный электросудорожный припадок (МЭШ) создавали с использованием сертифицированной установки «Rodent Shocker RS», type 221 (Harvard Apparatus, GmbH, Германия). Животные получали через специальные корнеальные электроды электрические стимулы (100 МА, 50 Hz, длительностью 0,3 с.). Регистрировали следующие показатели: тоническую экстензию задних и передних конечностей, а затем, клонические судороги и гибель животных. Противосудорожный эффект заявляемых соединений оценивали по способности предупреждать развитие тонической экстензии, клонических судорог и гибель животных.
Соединения, растворенные в физиологическом растворе, вводили животным однократно, внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл на 10 г веса мыши за 40 минут до проведения МЭШ. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью статистических пакетов "BioStat" для Windows.
Установлено, что проведение МЭШ вызывало тоническую экстензию у 70% мышей, и гибель 80%) мышей (таблица 2). Соединение 1а в дозе 2,5 мг/кг достоверно увеличивало по сравнению с контролем процент выживших после проведения МЭШ животных (таблица 2). Соединение 1а в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг уменьшало по сравнению с контролем процент животных с клоническими судорогами и тонической экстензией и увеличивало количество выживших после проведения МЭШ животных, но этот эффект наблюдался только на уровне тенденции. Уменьшение дозы соединения 1а до 0,5 мг/кг или увеличение дозы до 10 мг/кг приводило к исчезновению противосудорожного действия, (таблица 2). Соединения 1в, 1г, 1д и 1ж в дозах 2,5 и 5 мг/кг не обладали противосудорожным эффектом в тесте антагоизма с МЭШ.
Леветирацетам в разных диапазонах доз: 2,5 и 600 мг/кг не оказывал достоверного противосудорожного эффекта в тесте антагонизма с МЭШ.
* - значимость отличий от контрольной группы, при р≤0,05 (точный критерий Фишера).
Таким образом, производные 4-фенилпирролидона 1а и 1б в тесте МЭШ оказывают противосудорожное действие, статистически достоверно увеличивая в дозах 2,5 мг/кг и 5 мг/кг процент выживших животных. Соединения 1в, 1г, 1д и 1ж в дозах 2,5 и 5 мг/кг и препарат сравнения леветирацетам в дозах 2,5 и 600 мг/кг не обладают противосудорожным эффектом в тесте антагонизма с МЭШ.
Пример 3. Противосудорожное действие производных 4-фенилпирролидона на модели эпилептического статуса, вызванного литием - пилокарпином.
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах, массой 220-240 г. Каждая доза соединения исследовалась на 7 животных.
Исследование проводили согласно методике, описанной ранее (Jope, R.S., Morrisett, R.A., Snead, О.С, Characterization of lithium potentiation of pilocarpine-induced status epilepticus in rats. Exp. Neurol. 1986. 91, 471-480; Klitgaard, H., Matagne, A., Grimee, R., Vanneste-Goemaere, J., Margineanu, D., Electrophysiological. Seizure. 2003. 12, 92- 100).
Согласно протоколу сначала животным вводили водный раствор хлорида лития - 127 мг/кг (внутрибрюшинно), а через 16 часов - пилокарпин (внутрибрюшинно) в дозе 40 мг/кг. В результате у 97-100% животных развивается эпилептический статус и гибель.
Исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно за 40 мин до введения пилокарпина.
Регистрировали латентное время возникновения миоклонии головы (ЛП1), латентное время первого генерализованного приступа (ЛП2), процент выживших животных через 90 минут и 24 часа после введения пилокарпина.
Установлено, что соединение 1а в дозах 2,5, 5 и 10 мг/кг статистически достоверно увеличивало латентный период возникновения миоклонических судорог головы, а в дозах 5 и 10 мг/кг достоверно увеличивало латентное время возникновения первого генерализованного судорожного приступа, протекающего по типу эпилептического статуса (таблица 3). Под влиянием соединения 1а в дозах 2,5, 5 и 10 мг/кг выживаемость крыс после судорожного приступа резко повышалась и составляла 100% как через 90 минут после статуса, так и через 24 часа (в контроле выживаемость составляла 15%).
Соединение 1д в дозе 5 мг/кг статистически достоверно увеличивало латентный период возникновения миоклонических судорог головы и повышало выживаемость животных до 87% при ее регистрации через 90 минут после приступа. Соединение 1г также повышало выживаемость животных до 87% при ее регистрации через 90 минут после приступа, но незначительно (на уровне тенденции) снижало другие показатели судорожной активности (таблица 3).
Леветирацетам в дозе 600 мг/кг статистически достоверно увеличивал латентный период возникновения миоклонических судорог головы, латентное время возникновения первого генерализованного судорожного приступа и повышал выживаемость животных до 100% при ее регистрации через 90 минут после приступа.
Таким образом, соединение 1а в дозах 2.5, 5 и 10 мг/кг обладает выраженным противосудорожным эффектом на модели литий -пилокарпиновых судорог, что выражается в способности соединения статистически достоверно увеличивать латентный период наступления судорог и повышать до 100% выживаемость животных. Противосудорожным эффектом на модели литий-пилокарпиновых судорог обладают также соединения 1г и 1д. Соединение 1а значительно превосходит леветирацетам по противосудорожной активности: сходный эффект наблюдается при использовании соединения 1а в дозе 5 мг/кг, а леветирацетама - в дозе 600 мг/кг.
*- достоверность отличий от группы контроля, при Р<0.05 (критерий Стьюдента). # -достоверность отличий от группы контроля, при р≤0,05 (точный критерий Фишера). & - - достоверность отличий от группы контроля, при р≤0,05 (Manna-Whitney тест).
Пример 4. Противосудорожное действие производных 4-фенилпирролидона на судороги, вызванные пилокарпином.
Эксперименты проводили на белых половозрелых беспородных крысах-самцах, массой 250-260 г. Каждая доза соединения исследовалась на 6 животных. Исследование проводили согласно широко используемой методике (Klitgaard, Н., Matagne, A., Gobert, J., Wulfert, Е., Evidence for a unique profile of Levetiracetam in rodent models of seizures and epilepsy. Eur. J. Pharmacol. 1998. 353, 191-206; Klitgaard, H., Matagne, A., Grimee, R., Vanneste-Goemaere, J., Margineanu, D.,. Electrophysiological. Seizure 2003, 12, 92- 100; J. P. Leite, N. Garcia-Cairasco and E.A. Cavalheiro New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Research 2002, V. 50, Issues 1-2, June P. 93-103).
Пилокарпин вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 350 мг/кг и затем в течение одного часа регистрировали: латентный период 1 (ЛП1) первого судорожного проявления (миоклония головы), латентный период 2 (ЛП2) первого генерализованного судорожного приступа, число животных с генерализованным судорожным приступом и число выживших животных. Исследуемые вещества вводили животным однократно, внутрибрюшинно за 40 мин до введения пилокарпина. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор. Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью статистических пакетов "BioStat" для Windows.
Установлено, что в контрольной группе животных после введения пилокарпина латентный период первого судорожного проявления (миоклония головы) составил 386 секунд, латентный период первого генерализованного приступа (ЛП2) - 1107 секунды и гибель животных наступала у 66 процентов животных через 1697 секунды после введения пилокарпина.
Соединение 1а в дозе 5 мг/кг достоверно увеличивало (на 365 секунд, в 2 раза) латентный период первого судорожного проявления, а латентный период первого генерализованного судорожного приступа соединение 1а увеличивало в 1,7 раза (таблица 4). Процент выживших животных после введения соединения 1а составил 100%.
Леветирацетам в дозе 600 мг/кг достоверно увеличивал (в 2,3 раза) латентный период первого судорожного проявления и в 1,6 раза латентный периодо генерализованного судорожного приступа. Процент выживших животных после введения леветирацетама составил 100%. Полученные результаты по противосудорожному действию леветирацетама в тесте антагонизма с пилокарпином подтверждаются данными литературы (Klitgaard, Н., Matagne, A., Gobert, J., Wulfert, Е., Evidence for a unique profile of Levetiracetam in rodent models of seizures and epilepsy. Eur. J. Pharmacol. 1998. 353, 191-206).
*- достоверность отличий от группы контроля, при Р<0.05 (критерий Стьюдента). # -достоверность отличий от группы контроля, при р≤0,05 (точный критерий Фишера).
Таким образом, соединение 1а в дозе 5 мг/кг обладает выраженным противосудорожным эффектом на модели пилокарпиновых судорог, что выражается в способности соединения статистически достоверно увеличивать латентный период наступления судорог, повышать выживаемость животных до 100%. Противосудорожный эффект соединения 1а имеет дозозависимый характер и повышается при увеличении дозы от 0,5 до 5 мг/кг. Максимальный эффект соединения 1а наблюдается в дозе 5 мг/кг при использовании которой у 83,3% крыс отсутствуют судорожные припадки (в контроле припадки наблюдаются у 100% крыс) и 100% животных выживают (в контроле выживает 33,3%).
Соединение 1а значительно превосходит леветирацетам по противосудорожной активности в тесте пилокарпиновых судорог: сходный противосудорожный эффект наблюдается при использовании соединения 1а в дозе 5 мг/кг, а леветирацетама - в дозе 600 мг/кг.
Пример 5. Ноотропное действие производных 4-фенилпирролидона в тесте пространственной памяти в водном лабиринте Морриса.
Исследование влияния веществ на процессы обучения и памяти проводили в эксперименте на белых беспородных мышах массой 23-26 г в водном лабиринте Морриса (Morris R.G.M., 1984) в модификации Frick (Frick Karin М., 2000), когда животное обучается избеганию принудительного плавания путем нахождения платформы. В исследовании была использована сертифицированная установка TS1004-M2 «Водный лабиринт (тест) Морриса» для крыс и мышей ООО «НПК Открытая Наука». Бассейн для воды изготовлен из полипропилена и установлен на стальную подставку с регулируемыми опорами. Цвет бассейна белый. Размеры бассейна: диаметр арены - 150 см, высота стенок - 60 см, диаметр платформы - 10 см. Платформа (остров), регулируется по высоте, выполнена из белого акрила с металлическим утяжелителем. Бассейн наполняли водой комнатной температуры (24±2), забеленной молоком на 40 см. Бассейн зрительно делился на 4 сектора и в одном и том же секторе (называемом «целевым») помещалась платформа.
До начала основного эксперимента проводили отбор животных, пригодных для обучения. Для этого платформу располагали на 0,5 см выше уровня воды и мышь помещали на платформу на 20 секунд. Затем мышь опускали в воду на противоположной стороне бассейна и позволяли ей в течение 60 секунд найти платформу и взобраться на нее, где оставляли животное на 20 секунд. Если животное было не в состоянии самостоятельно найти платформу в течение 60 секунд, экспериментатор помогал ему переместиться к платформе и взобраться на нее. Затем попытку повторяли, опуская мышь в воду с другого места противоположной стороны бассейна. Если животное не могло самостоятельно найти платформу в двух попытках подряд, то оно исключалось из опыта.
Животные пригодные для обучения рандомизированным методом были разделены на 5 равноценных групп, которым вводили исследуемые вещества и проводили последующее обучение. Обучение животных пространственному навыку проводили в течение 2-х последующих дней, когда платформа располагалась на 0,5 см ниже уровня замутненной воды и не была видна с поверхности воды. Каждый день перед первой попыткой животное на 20 секунд помещали на платформу. Затем, животным предоставляли по 4 попытки найти платформу в течение 60-ти секунд. Животных опускали в воду в 4-х различных точках на половине бассейна, противоположной по отношению к платформе. Интервал между попытками составлял 20 секунд, в течение которого мышь находилась на платформе. Регистрировали время, прошедшее от момента спуска животного в воду до влезания на платформу. Через 48 часов после второго дня обучения оценивали сохранение и воспроизведение пространственного навыка, для чего платформу убирали из бассейна, а животное однократно помещали в бассейн на 60 секунд. Регистрировали время, в течение которого животное находилось в квадранте, где в дни обучения располагалась платформа, что служило показателем эффективности обучения и воспроизведения пространственного навыка.
Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно за 30 минут до начала эксперимента трижды: в первый и во второй дни обучения и перед воспроизведением навыка. 1-й группе, контрольной) вводили физиологический раствор, 2-й группе - соединение 1а в дозе 2,5 мг/кг, 3-й группе соединение 1а в дозе 5 мг/кг, 4-й группе - леветирацетам в дозе 600 мг/кг, 5-й группе - пирацетам в дозе 400 мг/кг.
Установлено, что у контрольных животных среднее время нахождения скрытой платформы в бассейне в первый день обучения составило 35,2 секунды (Таблица 5). Соединение 1а в дозе 2,5 мг/кг достоверно уменьшало среднее время нахождения платформы в 1,8 раз, а в дозе 5 мг/кг - в 2 раза. Известный ноотропный препарат сравнения пирацетам в дозе 400 мг/кг уменьшал среднее время нахождения платформы в 1,6 раз, а леветирацетам в дозе 600 мг/кг не оказывал позитивного влияния на обучение животных пространственному навыку.
При воспроизведении обученного пространственного навыка через 48 часов после сеанса обучения у контрольных животных среднее время нахождения в секторе, где ранее (при обучении) находилась платформа, составило 9,71 с. Под влиянием соединения 1а в дозе 2,5 мг/кг среднее время нахождения в секторе, где ранее (при обучении) находилась платформа, достоверно увеличилось по сравнению с контролем в 1,6 раза, а при использовании соединения 1а в дозе 5 мг/кг - в 1,8 раза. Пирацетам в дозе 400 мг/кг достоверно увеличивал среднее время нахождения в секторе, где ранее (при обучении) находилась платформа, в 1,8 раз, а леветирацетам в дозе 600 мг/кг - в 1,4 раза. (Таблица 6).
* - достоверность различий с контролем при Р>0,05. N - число животных в группе.
* - достоверность различий с контролем при Р>0,05. N - число животных в группе.
Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1а в дозах 2,5 и 5 мг/кг обладает способностью улучшать обучение пространственному навыку и его воспроизведение в водном лабиринте Морриса. По влиянию на процессы обучения и воспроизведения соединение 1а в дозах 2,5 и 5 мг/кг не уступает ноотропному препарату пирацетаму в дозе 400 мг/кг и, таким образом, превосходит его по активности в 160 раз. Структурный аналог соединения 1а - леветирацетам в дозе 600 мг/кг не оказывает влияния на обучение и уступает соединению 1а по влиянию на процесс воспроизведения.
Таким образом, соединение 1а обладает отчетливой ноотропной активностью, что выражается в способности соединения улучшать как процесс обучения, так и процесс воспроизведения пространственного навыка в водном лабиринте Морриса. По ноотропной активности соединение 1а не уступает эталонному ноотропному препарату пирацетам. Структурный аналог соединения 1а - леветирацетам не оказывает влияния на обучение и уступает соединению 1а по влиянию на процесс воспроизведения обученного навыка.
Пример 6. Изучение возможных побочных эффектов (неврологического дефицита) производных 4-фенилпирролидона
Эксперименты проводили на белых аутбредных мышах-самцах массой 20-22 г. и крысах-самцах массой 210-250 г. Исследование проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследованию лекарственных средств» (Издание: ФГБУ «НЦЭМСП» Минздравсоцразвития России. Москва 2012. Часть 14. Глава 13. с. 235). Для оценки нарушения координации движений и миорелаксации у мышей использовали сертифицированную установку вращающегося стержня (Rota Rod фирма "Ugo Basile", Италия). На горизонтальный стержень диаметром 3 см, вращающийся со скоростью 10 об./мин., помещали мышей. Подсчитывали число падений со стержня. В тесте подтягивания на горизонтальной перекладине мышей подвешивали передними конечностями за проволоку (диаметр 0,4 см), натянутую на высоте 30 см от поверхности стола. Неспособность животных подтянуть задние конечности на проволоку регистрировали как проявление неврологического дефицита.
Соединения вводили однократно, внутрибрюшинно и регистрацию эффектов осуществляли через час после введения.
Установлено, что соединение 1а в диапазоне доз от 0,5 до 20 мг/кг не вызывает у мышей и крыс повышения возбудимости, повышения иди снижения двигательной активности, тремора, судорожных проявлений, гиперкинезов, подергиваний, изменения цвета кожных покровов и слизистых, взъерошивания шерсти, каталепсии, птоза, стереотипии, агрессии и груминга. Не изменяются болевой, роговичный и пиннеальный рефлексы. Соединение 1а в диапазоне доз 0,5-20 мг/кг не оказывает негативного влияния на координацию движений у мышей, регистрируемую по способности животных удерживаться на вращающимся стержне и не вызывает нарушения мышечного тонуса в тесте подтягивания на перекладину.
В эксперименте на крысах соединение 1а при однократном введении в дозе 50 мг/кг не вызывает нарушения общего состояния животных, их поведения и простых рефлексов через 1 час, 24 часа, 48 часов и 5 суток после введения. Через 1 час после введения соединения 1а в дозах 100, 150 и 200 мг/кг выявлено снижение двигательной активности и нарушение координации движений, а через 24 часа нарушение двигательной активности наблюдается только у крыс, получивших соединение 1а в дозе 200 мг/кг. Через 2-е и 5 суток после введения соединения 1а в дозах 100, 150 и 200 мг/кг нарушения общего состояния и поведения и простых рефлексов у крыс не наблюдалось.
Таким образом, соединение 1а в широком диапазоне доз (0,5-20 мг/кг у мышей и 50 мг/кг у крыс) не вызывает у животных нарушения общего состояния, поведения и простых рефлексов, не нарушает координацию движений и мышечный тонус, что свидетельствует об отсутствии неврологического дефицита. В дозах 100, 150 и 200 мг/кг соединение 1а через 1 час после введения вызывает снижение двигательной активности и нарушение координации движений у крыс, но эти нарушения не наблюдаются через 24 часа после введения соединения.
Пример 7. Изучение острой токсичности производного 4-фенилпирролидона (1а).
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах, массой 210-250 г, которых содержали в виварии в одинаковых условиях обитания и кормления (стандартный брикетированный корм). В каждой группе было по 5 животных.
Соединение 1а вводили однократно, внутрибрюшинно в дозах 50, 100, 150 и 200 мг/кг. Регистрацию гибели животных проводили через 1 час, 24 часа, 48 часов и 5 суток после введения.
Установлено, что через 1 час, 24 часа, 48 часов и 5 суток после однократного введения соединения 1а в дозах 50, 100, 150 и 200 мг/к гибели животных не наблюдалось.
Таким образом, соединение 1а в дозе 200 мг/кг гибели животных не вызывает и, следовательно, доза летальности выше этой дозы, а терапевтический индекс, вычисляемый по соотношению эффективной и летальной доз (200 мг/кг/5 мг/кг) составляет величину более 40.
Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение 1а относится к классу нетоксичных веществ и имеет большую терапевтическую широту, так как его терапевтический индекс составляет величину более 40.