СПОСОБ ОЦЕНКИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭОЗИНОФИЛОВ ПРИ ГЛИСТНОЙ ИНВАЗИИ
METHOD FOR ASSESSING MORPHOFUNCTIONAL ACTIVITY OF EOSINOPHILS IN HELMINTHOSIS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии, и может быть использовано в способах оценки риска развития клинических проявлений глистной инвазии по морфофункциональному состоянию эозинофилов.
Уровень техники
Известен метод диагностики глистной инвазии, включающий выявление из выделений человека при микроскопии фрагментов гельминтов, личинок и их яиц, при этом готовят гистологический микропрепарат из кала или мокроты человека, а глистную инвазию диагностируют по наличию фрагментов тел мелких гельминтов, паразитирующих в толстом кишечнике, их яиц, а также личинок нематод.
Методом выявляют фрагменты тел остриц, власоглавов, токсокар.
3
Способ приготовления гистологического препарата, включающий формирование пробы, консервирование, помещение в сетчатую оболочку, обезвоживание в спиртах, пропитку в диоксанах и парафине, последующую заливку с образованием парафинового блока, получение срезов на микротоме и окрашивание, при этом пробу из выделений человека дифференцируют на плотную или жидкую по консистенции, плотную пробу формируют с объемом 2-2,5 см, а жидкую пробу формируют с объемом, в 3-5 раз превышающим упомянутый объем плотной пробы, в качестве сетчатой оболочки используют безворсовую синтетическую ткань, преимущественно газовую, с размером пор менее 0,001 мм, причем перед заливкой пробы в парафин сетчатую оболочку в подогретом состоянии вскрывают и расплавляют, а остаток выделений формируют в единый комок, который затем заливают парафином.
В способе окрашивание срезов осуществляют гематоксилином и эозином (см. пат. RU №2186360, МПК G01N 1/28, G01N 33/483, опубл. 27.07.2002 г.).
Недостатком данного метода диагностики глистной инвазии и способа приготовления препарата является сложность, высокие затраты и невысокая точность диагностики.
Известен способ диагностирования глистной инвазии, заключающийся в том, что осуществляют исследование нижнего века пациента, а о глистной инвазии судят по наличию фолликул на нижнем веке пациента.
В способе по наличию фолликул с размером менее 0,2 мм судят об инвазии мелкими глистами.
В способе по наличию фолликул с размером 0,2 до 0,6 мм, характеризующихся вдавленной формой, судят об инвазии глистами от кошек.
В способе по наличию фолликул с размером 0,2 до 0,6 мм, характеризующихся выпуклой формой, судят об инвазии глистами от собак. В способе по наличию фолликул с размером более 0,6 мм судят о глистной инвазии власоглавом, (см. пат. RU №2401057, МПК A61B 5/00, опубл. 10.10.2010 г).
Недостатком данного способа диагностирования является невысокая точность диагностики
9
9
9
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии, включающий определение абсолютного и относительного количества эозинофилов, эозинофильный индекс и индекс аллергизации, при этом эозинофилия - повышение абсолютного количества эозинофилов в крови (более 0,4*10/л у взрослых и 0,6*10/л у детей в абсолютных единицах), наиболее часто сопровождаются эозинофилией паразитарные заболевания и атопическая аллергия, при аллергических состояниях заболевания и атопическая аллергия, при аллергических состояниях эозинофилия обычно умеренная - от 0,2 до 1,5*10/л (см. Giessibl, F. Advances in Atomic Force Microscopy / F.Giessibl // Reviews of Modern Physics. - 2003. - Vol.75, N3. - P.949-983).
Недостатком данного способа оценки является невысокая точность диагностики.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии, с помощью которого определяют зависимость морфофункционального состояния эозинофилов периферической крови больных глистными инвазиями от титра специфических антител.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к точности оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии.
Технический результат достигается способом оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии, включающим определение абсолютного количества эозинофилов, эозинофильный индекс и индекс аллергизации, при этом дополнительно устанавливают степень изменения размеров и функциональной активности эозинофилов с последующим проведением оценки морфофункционального состояния активности эозинофилов в зависимости от уровня титра специфических антител, при этом абсолютное количество эозинофилов определяют по формуле
где N - количество эозинофилов, сосчитанное в камере Фукса-Розенталя;
10 - степень разведения;
3,2 - емкость камеры Фукса-Розенталя,
эозинофильный индекс (ЭИ) определяют по формуле:
где
Пал.% - процентное содержание палочкоядерных нейтрофилов;
Нейтр.% _ процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов;
Эоз.% - процентное содержание эозинофилов,
оценку степени аллергизации в периферической крови определяют по индексу аллергизации (ИА) по формуле:
где
Лимф.% - процентное содержание лимфоцитов;
Эоз.% - процентное содержание эозинофилов;
Нейтр.% - процентное содержание нейтрофилов;
Мон.% - процентное содержание моноцитов;
-9
6
Баз.% - процентное содержание базофилов, а степень изменения размеров и функциональной активности эозинофилов устанавливают по высоте контура клетки, повышению относительного числа эозинофилов, повышению абсолютного числа эозинофилов, снижению удельной оптической плотности по красной компоненте и снижению среднего диаметра эозинофила, причем риск развития глистных инвазий устанавливают по повышению высоты контура клетки более 400*10 м - +4,3, повышению относительного числа эозинофилов более 10 - +3,5, повышению абсолютного числа эозинофилов более 400*10/л - +3,3, снижению удельной оптической плотности по красной компоненте менее 0,270 - +3,3, снижению среднего диаметра эозинофила менее 13,5 мкм - +2,9 и уровню титра специфических антител менее 1:800.
Сущность предлагаемого изобретения состоит в комплексном диагностическом исследовании, в котором определяют абсолютное и относительное количество эозинофилов, эозинофильный индекс, индекс аллергизации, устанавливают степень изменения размеров и функциональной активности эозинофилов, а по таблице прогностических коэффициентов Кубальта проводят интегральную оценку морфофункционального состояния эозинофилов при глистных инвазиях, протекающих с различным уровнем титра специфических антител.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии.
Пример. Одним из наиболее постоянных лабораторных показателей глистных инвазий является стойкая эозинофилия, относительный уровень которой иногда может достигать 90% от количества циркулирующих в периферической крови лейкоцитов (см. Бондарь Т.П. Лабораторная гемоцитология. Учебно-методическое пособие / Т.П.Бондарь, О.И.Запорожцева. - Ставрополь: Изд-во. СГУ, 2009. - 109 с.), при этом несмотря на повышенный интерес исследователей к проблеме эозинофилий в настоящее время механизмы и целесообразность развития гиперэозинофилии крови при патологических процессах изучены недостаточно, а имеющиеся в современной литературе данные касаются, в основном, лишь клинической стороны вопроса.
Исследованиями последних лет было показано, что эозинофил остается одной из наиболее агрессивных эффекторных клеток при возникновении противопаразитарного иммунитета (см. Козинец, Г.И.Кровь и инфекция / Г.И.Козинец, В.М.Погорелов. - М.: Триада-фарм, 2001. - 537 с.). Эозинофильные гранулы служат источником большого количества цитотоксических продуктов, повышенное содержание которых обусловливает формирование высокого микробиоцидного потенциала, действующего не только в отношении инородных субстанций, но и окружающих тканей, таким образом, эозинофилы являются одним из характерных и постоянных маркеров развития паразитоза в организме (см. Луговская, С.А. Лабораторная гематология / С.А.Луговская, В.Т.Морозова, М.Е.Почтарь. - М.: ЮНИМЕД-пресс, 2002, - 120 с.).
Эозинофилы - форменные элементы крови, разновидность полиморфно-ядерных лейкоцитов, обнаруживаемые в крови и тканях, отличающиеся наличием в цитоплазме специфических гранул, эозинофильная зернистость которых, поглощая кислую краску, окрашивает их в красно-оранжевый цвет (см. Hilliman, R.S. Hematology in clinical practice / R.S.Hilliman, K.A.Ault, H.M.Rinder. - McGraw-Hill, 2005. - P.784-788).
В настоящее время благодаря значительному расширению методов лабораторных исследований и внедрению новых технологий в клинической практике появилась возможность детального изучения морфометрических и морфологических особенностей эозинофилов и их плотностных характеристик. В изученной авторами литературе не имеется четких представлений о зависимости размеров эозинофилов и их активности при наличии в периферической крови специфических антител к тем или иным глистам, так же ранее не изучалось изменение показателей количественных, морфологических и функциональных особенностей эозинофилов при различном уровне антител к паразитам.
С целью оптимизации процесса прогнозирования риска развития клинических проявлений глистных инвазий изучена частота ряда признаков лабораторных показателей в группах людей с различным уровнем титра специфических антител с помощью последовательного статистического анализа Вальда был получен соответствующий диагностический коэффициент Кубальта для каждого признака, рассчитанного по формуле log×(P1/P2), для суждения о риске развития клинических признаков глистных инвазий полученные коэффициенты суммируют, цифровое обозначение алгебраической суммы соответствует определенному проценту ошибки предположения, вычисленному по методу Е.В.Гублера (см. Гублер, Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания паталогических процессов / Е.В.Гублер. - М., 1978. - 294 с.).
Подсчет форменных элементов крови проводят на гематологическом анализаторе «Medonic CA 530» с автоматическим взятием и разведением пробы, в котором используют кондуктометрический принцип для подсчета клеток и установления их размеров с помощью микропроцессора.
Подсчет абсолютного количества эозинофилов проводят в счетной камере Фукса-Розенталя по методике И.С.Пирашвили. Сосчитанное по всей камере количество эозинофилов умножают на степень разведения и делят на емкость камеры. Расчет выполняют по формуле 1:
Абсолютное количество эозинофилов
где N - количество эозинофилов, сосчитанное в камере;
10 - степень разведения;
3,2 - емкость камеры.
Для оценки состояния здоровья в исследуемых группах и осуществления мониторинга изменений в системе крови пациентов применяют эозинофильный индекс и индекс аллергизации.
Эозинофильный индекс рассчитывают по формуле 2:
где
Пал.% - процентное содержание палочкоядерных нейтрофилов;
Нейтр.% - процентное содержание сегментоядерных нейтрофилов;
Эоз.% - процентное содержание эозинофилов.
В норме эозинофильный индекс - 0,8-1,1 усл.ед. Значения эозинофильного индекса снижаются при нарастании в крови количества эозинофилов.
Для оценки степени аллергизации пациентов в периферической крови рассчитывают индекс аллергизации (ИА) по формуле 3:
где
Лимф.% - процентное содержание лимфоцитов;
Эоз.% - процентное содержание эозинофилов;
Нейтр.% - процентное содержание нейтрофилов;
Мон.% - процентное содержание моноцитов;
Баз.% - процентное содержание базофилов.
Выявление иммуноглобулинов класса IgG к антигенам токсокар, аскарид, эхинококков в плазме крови человека проводят при помощи иммуноферментной тест-системы «Тиатрис», выпускаемой ЗАО «Вектор-Бест» (чувствительность 91%, специфичность 85%) и автоматического иммуноферментного анализатора Personal-LAB. Потенциальный риск применения набора - класс 2а. Проведение исследований проводят с соблюдением правил техники безопасности и производственной санитарии.
Для изучения морфометрических параметров эозинофилов проводят компьютерную цитоморфометрию клеток. Компьютерное цитоморфометрическое исследование эозинофилов проводят на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Россия), оценивают диаметр клетки, площадь, фактор формы (ФФ), ядерно-цитоплазматическое соотношение (ЯЦС), индекс поляризации (ИП). Для определения интегральной оптической плотности цитоплазмы выполняют расчет индекса ИОП (формула 4),
где УСОП - удельная суммарная оптическая плотность эозинофила
(УСОП=УОПК+УОПЗ+УОПС), в усл.ед.;
2
Sк - площадь эозинофила, (мкм).
Sц - площадь цитоплазмы эозинофила (мкм2), где Sц=Sк-Sя.
Цитохимическое исследование эозинофилов включает в себя полуколичественное определение в клетках окислительных ферментов (пероксидазы) и неферментных катионных белков.
Наличие в клетках окислительных ферментов (пероксидаза) в эозинофилах проводят по методу Эпштейна.
Содержание неферментных катионных белков в эозинофилах периферической крови исследуют по методу М.Г.Шубина с бромфеноловым синим.
Для изучения закономерностей изменения структурных свойств мембраны эозинофилов, на нанометровом пространственном разрешении, применяют метод сканирующей зондовой микроскопии. Исследование проводят при помощи атомно-силового микроскопа «Интегра Прима» в ИТЦКП «Нанотехнологии и наноматериалы» Ставропольского государственного университета.
Статистическую обработку данных лабораторного обследования пациентов проводят с использованием последовательного анализа Вальда, что позволяет выделить ряд информативных признаков для предварительного суждения о риске развития клинических признаков глистных инвазий.
С помощью этого метода получают также диагностический коэффициент для каждого признака. Для суждения о вероятности развития клинических проявлений у пациентов, имеющих в крови специфические антитела, полученные диагностические коэффициенты суммируют. Цифровое значение алгебраической суммы соответствует определенному проценту ошибки предположения, вычисленному по методу Е.В.Гублера.
Чем меньше величина ошибки, тем больше вероятность развития клинических проявлений. При величине ошибки более 5% развитие признаков маловероятно (Таблица 1).
D1
Si
С целью выявления наиболее информативного сочетания лабораторных показателей для априорной вероятности метод вероятной оценки по теореме Байеса. Расчет вероятности варианта развития заболевания (P/) проводят по формуле 5:
где
D1
Si
P/ - вероятность определенного варианта D при наличии конкретных признаков 1, 2, 3…X;
S
D
P/ - частота симптомов при конкретном варианте D1, D2 и т.д.
В соответствии с предложенной схемой для проведения комплексного исследования морфофункциональных особенностей эозинофилов и статистических методов позволяет оценить изменение морфофункциональных параметров эозинофилов в норме и при патологии.
-9
6
Наиболее значимыми лабораторными критериями риска развития клинических проявлений глистных инвазий являются: повышение высоты контура клетки более 400*10 м - +4,3; повышение относительного числа эозинофилов более 10 - +3,5; повышение абсолютного числа эозинофилов более 400*10/л - +3,3; снижение удельной оптической плотности по красной компоненте менее 0,270 -+ 3,3; снижение среднего диаметра эозинофила менее 13,5 мкм - +2,9.
-9
Для возможно раннего выявления предпосылок, реализующих риск развития глистных инвазий у людей с титром антител менее 1:800, изучены частоты различных признаков. Как видно из таблицы 2, некоторые признаки, а именно повышение абсолютного количества эозинофилов более 400×106/л, снижение эозинофильного индекса менее 0,8 усл.ед., повышение высоты контура клетки более 400*10 м, снижение коэффициента выпуклости ядра менее 0,170 усл.ед., являются скринирующими, позволяющими заподозрить риск развития клинических признаков глистных инвазий у людей с уровнем титра специфических антител менее 1:800.
Применение предложенной таблицы 2 риска развития клинических признаков глистных инвазий у людей с тиром специфических антител менее 1:800 позволяет с высокой степенью достоверности предсказывать возможность развития заболевания для наиболее раннего выявления возможного варианта развития глистных инвазий и, следовательно, дальнейшего совершенствования лечебных и профилактических мероприятий.
Клинический пример 1.
Юлия К., 49 лет, поступила в диагностическое отделение инфекционной больницы с предварительным диагнозом субфебрилитет неясного генеза с абдоминальным синдромом 11.09.2008. Пациентку лихорадит в течение 5 месяцев. Из анамнеза известно, что в квартире содержит собаку и 2 кошки. Работает озеленителем. В результате обследования инфекционной патологии не выявлено, роста патогенной флоры не обнаружено. Учитывая эпидемиологический анамнез, назначено обследование на паразитарные заболевания. При обследовании пациентки: обнаружены антитела к аскаридозу в титре 1:400.
Данные общеклинического обследования пациентки Ю. представлены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели клинического анализа крови, с подсчетом индексов пациентки Ю. от 14.09.2008
Показатель
Ед. измерения
Результат
Норма
Относительное количество эозинофилов
%
11
1-5
Абсолютное количество эозинофилов
10<sup>6</sup>/л
534
70-350
Эозинофильный индекс
усл.ед.
0,684
0,8-1,01
Индекс аллергизации
усл.ед.
2,857
0,8-2,0
При общеклиническом исследовании периферической крови у пациентки Ю., отмечается повышение относительного и абсолютного количества эозинофилов, снижение эозинофильного индекса (ЭИ), повышение индекса аллергизации.
При исследовании морфометрических параметров эозинофилов пациентки Ю. обнаружились некоторые особенности. Данные морфофункциональных исследований эозинофилов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты КЦМЭо, цитохимического исследования и АСМ эозинофилов пациентки Ю. от 15.09.2008
Показатель
Ед. измерения
Результат
Норма (собственные данные)
Средняя площадь клетки
мкм<sup>2</sup>
147,0
159.57-165,99
Средняя площадь цитоплазмы
мкм<sup>2</sup>
94,5
105,97-114,39
Средний диаметр клетки
мкм
12,5
13,95-14,47
Индекс поляризации
усл.ед.
0,204
0,112-0,132
Коэффициент выпуклости ядра
усл.ед.
0,150
0,227-0,267
УОП<sub>К</sub>
усл.ед.
0,143
0,272-0,292
ИОП
усл.ед.
0,556
0,701-0,741
СЦК<sub>П</sub>
усл.ед.
0,5
1,80-3,20
СЦК<sub>КБ</sub>
усл.ед.
3,5
2,07-3,13
Высота h
10<sup>-9</sup> м
500
410-490
П
Исследование морфофункциональных показателей эозинофилов выявило снижение среднего цитохимического коэффициента пероксидазы (СЦК). При исследовании методом атомно-силовой микроскопии отмечается увеличение высоты профиля мембраны эозинофилов. Метод компьютерной цитоморфометрии эозинофилов позволил выявить появление в периферической крови эозинофилов пониженной плотности с измененными светооптическими характеристиками.
Сумма прогностических коэффициентов Кубальта (1, 2, 4, 6, 9, 10, 11, 12 и 14), в соответствии с приведенной таблицей 2, составила 20,6, что позволило предположить высокую вероятность развития клинических проявлений аскаридоза. Используя метод вероятности оценки (теоремы Байеса), вероятность развития аскаридоза у данной пациентки составляет 98,1%. Таким образом, предположение о развитии аскаридоза у пациентки Ю. подтвердилось дальнейшим дополнительными лабораторными исследованиями. Пациентка Ю. поставлена на диспансерный учет, в динамике рекомендовано повторное обследование на наличие специфических антител к аскаридозу. При динамическом наблюдении в течение года у пациентки Ю. отмечено нарастание уровня антител к антигенам аскарид. Увеличение в крови специфических антител послужило предпосылкой для проведения специфической терапий.
Клинический пример 2.
Евгений П., 37 лет, обратился в консультативный кабинет инфекционной больницы для обследования на глистные инвазии 5.06.2008. У больного навязчивое мнение о наличии паразитов в организме. Из анамнеза: проживает в сельской местности, работа связана с уходом за животными. Неоднократное обследование на наличие кишечных гельминтозов положительных результатов не дало. При обследовании пациента на наличие тканевых паразитозов обнаружены антитела к токсокарозу в титре 1:400. Данные общеклинического обследования пациента Е. представлены в таблице 3.
Таблица 3
Показатели клинического анализа крови с подсчетом индексов у пациента Е. от 7.06.2008
Показатель
Ед. измерения
Результат
Норма
Относительное количество эозинофилов
%
6
1-5
Абсолютное количество эозинофилов
10<sup>6</sup>/л
241
70-350
Эозинофильный индекс
усл.ед.
0,839
0,8-1,01
Индекс аллергизации
усл.ед.
1,586
0,8-2,0
Как видно из приведенных данных лабораторного обследования, у пациента Е показатели общепринятых методов исследования периферической крови выходят за пределы колебаний референтных величин. При исследовании морфометрических параметров эозинофилов пациента Е обнаружились некоторые особенности. Данные морфофункциональных исследований эозинофилов представлены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты морфофункциональных исследований эозинофилов у пациента Е.
Показатель
Ед. измерения
Результат
Норма (собственные данные)
Средняя площадь клетки
мкм<sup>2</sup>
146,0
159.57-165,99
Средняя площадь цитоплазмы
мкм<sup>2</sup>
103,0
105,97-114,39
Средний диаметр клетки
мкм
13,7
13,95-14,47
Индекс поляризации
усл.ед.
0,070
0,112-0,132
Коэффициент выпуклости ядра
усл.ед.
0,332
0,227-0,267
УОП<sub>К</sub>
усл.ед.
0,372
0,272-0,292
ИОП
усл.ед.
0,936
0,701-0,741
СЦК<sub>П</sub>
усл.ед.
3,0
1,80-3,20
СЦК<sub>КБ</sub>
усл.ед.
3,0
2,07-3,13
Высота h
10<sup>-9</sup> м
270
410-490
Сумма прогностических коэффициентов Кубальта (1, 5, 7 и 12), в соответствии с приведенной таблицей 2, составила 7,7, что позволило предположить низкую вероятность развития токсокароза. Используя метод вероятности оценки (теоремы Байеса), вероятность развития токсокароза у данного пациента составила 54,7%. Таким образом, предположение о развитии токсокароза у пациента Е. не подтвердилось.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- возможность оценки риска развития клинических проявлений глистной инвазии по морфофункциональному состоянию эозинофилов;
- возможность определения зависимости морфофункционального состояния эозинофилов периферической крови больных глистными инвазиями от титра специфических антител.