СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗИРОВАННЫХ МАТРИКСОВ ПАРЕНХИМАТОЗНЫХ ОРГАНОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR OBTAINING DECELLULARIZED MATRICES OF PARENCHYMAL ORGANS OF LABORATORY ANIMALS

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к биомедицине, а именно к органной трансплантации, тканевой инженерии, и может быть использовано на лабораторных животных в научных учреждениях.
Хроническая почечная недостаточность (ХПН) является одной из ведущих причин смертности (до 16% взрослой популяции) в мире. Частота встречаемости ХПН с каждым годом увеличивается. Результаты исследований показали, что почки млекопитающих обладают определенным регенеративным потенциалом, который появляется после частичной резекции. Этот потенциал обусловлен пролиферацией пула зрелых или стволовых клеток, представленных в почке, например, гломерулярными париетальными эпителиальными клетками (GPECs). Однако достижение регенерации клеточного состава клубочков с использованием GPECs для клинического применения затруднено вследствие комплексной структуры почечной ткани, а восстановление регенеративного потенциала с использованием клеток почечной линии дифференцировки недостаточно для восстановления функции почек при ХПН. Последние достижения в тканевой инженерии и регенеративной медицине позволили сформулировать ряд новых подходов к лечению ХПН. В частности, использование скаффолдов, представленных децеллюляризированным внеклеточным матриксом, проявило себя как многообещающая технология в области реконструкции почечной ткани. Децеллюляризированные матриксы почек можно рассматривать как очаги индуцирования регенерации почечной ткани, поскольку они способны эффективно вовлекать в этот процесс аутологичные стволовые или дифференцированные клетки.
Известен способ получения децеллюляризированных матриксов почек свиней, описанный Y. Guan с соавт. в статье «Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration» (Materials Science and Engineering C; v. 56, 2015; p. 451-456), который относится к детергентно-ферментативным методам децеллюляризации. После забора почек были различимы мочеточник, аорта и полая вена. Почечная артерия была каннюлирована с целью поддержания антеградной артериальной перфузии раствора гепаринизированного PBS для отмывания органов от крови. Процесс децеллюляризации происходил при комнатной температуре, при этом трубка, раннее введенная в почечную артерию, подключалась к перистальтическому насосу (производитель и модель, соответственно, Longer pump, ВТ-100В, трубки 16G) для последовательной инфузии паренхимы органов серией растворов в следующей последовательности: 1) дистиллированная вода со скоростью потока 10 мл/мин в течение 2 часов; 2) 1% додецилсульфат натрия с той же скоростью в течение 28 часов; 3) 1% Triton Х-100 в течение 2 часов. Затем органы отмывались от следовых количеств детергентов PBS 4 дня со скоростью 10 мл/мин. В дальнейшем полученные матриксы были охарактеризованы гистологически (окрашивание по Массону поперечных срезов нативных и децеллюляризированных образцов, ИГХ с первичными антителами на коллаген и ламинин с контрастированием с DAPI), количественным определением ДНК, коллагена и сульфатированных глюкозаминогликанов (sGAG) и биомеханическим тестированием: регистрировались деформация и максимальное сжатие (Y. Guan et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration». Materials Science and Engineering C; v. 56, 2015; p. 451-456). Фундаментальным недостатком использования свиных паренхиматозных органов в трансплантологии является их неудовлетворительная биосовместимость с человеческими тканями (причина - наличие α-гал эпитопа (Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R) у млекопитающих, не относящихся к высшим приматам); это обстоятельство приводит к необходимости получения и использования соответствующих нокаутов. В рассматриваемой работе авторы не характеризуют содержание α-гал эпитопа в полученных после децеллюляризации матриксов свиных почек. Другим недостатком рассматриваемого способа является отсутствие гарантии полного удаления ДНК, поскольку авторы не использовали ДНКазу.
Известен также способ получения экстрацеллюлярных матриксов кровеносных сосудов малого диаметра. В этом способе для получения биосовместимых децеллюляризированных матриксов сосудов малого диаметра использовали фрагменты артерии плаценты человека длиной до 5 см. Децеллюляризацию осуществляли в несколько этапов при постоянном перемешивании децеллюляризирующего раствора, для чего емкость с ним устанавливали на орбитальном шейкере со скоростью 30 оборотов в минуту и амплитудой движений 10 мм (орбитальный шейкер GFL 3005, GFL, Германия), и дополнительно созданной вибрации, с помощью небольшого мотора с эксцентриком, установленного на внешней стороне рабочей емкости с перфузатом. Первым этапом производили отмывание участка кровеносного сосуда от крови в дистиллированной воде в течение 1 часа при температуре +4°С. Затем участок кровеносного сосуда последовательно помещали в емкость с 0,05% раствором трипсина в фосфатно-солевом буфере с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ФСБ-ДТА) на 1 час при температуре +37°С, 0,075% раствором додецилсульфата натрия на 24 часа при температуре +26°С; 0,25% раствором Тритон Х-100 на 24 часа при температуре +26°С; с нуклеазами (РНКаза А 20 мкг/мл и ДНКаза I 200 мкг/мл). После каждого этапа участок артерии трижды промывали в ФСБ-ЭДТА по 10 минут. После окончательного трехкратного промывания участки артерий исследовали гистологическим анализом окрашиванием гематоксилином - эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону, а также дополнительным иммунохимическим окрашиванием на гладкомышечный актин (αSMA) («Способ децеллюляризации кровеносных сосудов малого калибра», RU 2504334, С1. Насрединов А.С. ФГБУ "Федеральный Центр сердца, крови и Эндокринологии имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 2014).
Недостатками данного способа являются в первую очередь необходимость многократной замены децеллюляризирующих растворов, невозможность регулирования ряда параметров, например скорости перфузии, температуры, влажности и газового состава; кроме того, данное техническое решение в большей степени ориентировано на децеллюляризацию сосудов небольшого диаметра (до 5 мм), его применение для получения децеллюляризированных матриксов крупных сосудов, паренхиматозных органов ограничено в силу ряда причин: во-первых, условия постоянного перемешивания могут оказать негативный эффект на целостность и сохранность рыхлого и непрочного матрикса паренхиматозных органов (почки, печень), во-вторых, рассматриваемое техническое решение требует индивидуальных камер и емкостей, сконструированных в зависимости от типа обрабатываемого объекта.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ получения децеллюляризированного матрикса свиных почек с использованием высокопроизводительной системы децеллюляризации. Способ заключается в том, что, с целью ускорения процесса децеллюляризации и повышения его результативности, авторами была сконструирована собственная высокопроизводительная система. Несколько резервуаров по 200 л каждый были заполнены одним из следующих растворов: 1X PBS или детергентом в соответствии с вариациями протокола (0,25% SDS, 0, 5% SDS или 1% Triton X100) для одновременной децеллюляризации нескольких органов. Система резервуаров соединялась с почками посредством серии цифровых приводов - дозаторов Masterflex L/S и системных клапанов (Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL), переключение которых регулирует поток перфузата в заданном направлении. Схема промывания почек была следующей: инфузия растворов осуществляется через каннюлированную коннектором люэр - замок - шип 1/8'' почечную артерию, при этом сам орган располагался в соответствующей камере. Обратный ток растворов от паренхимы происходил через неканюлированные, находящиеся в свободном доступе, вену и мочеточник, при заполнении камеры перфузат перетекал в сообщающуюся с камерами дренажную систему или циркулировал в объеме индивидуального контейнера. После окончания процесса децеллюляризации полученные скаффолды помещались в стерильный однократный PBS и подвергались облучению гамма-радиацией в дозе 10.0 kGy.
Полученные скаффолды были охарактеризованы при дифференциальном окрашивании гематоксилином-эозином, трихром по Массону или альциановым синим и Сириусом красным, количественным определением экстрагированной из срезов лиофилизированной ткани ДНК с помощью набора Quant-iT PicoGreen, количественным определением коллагена (Sircol Soluble Collagen Assay Kit) и сульфатированных гликозаминогликанов (Blyscan sGAG Assay Kit) (D.C. Sullivan с соавт. «Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system», Biomaterials, v. 33; 2012, p. 7756-7764). Недостатком данного способа является то, что эта установка требует достаточного большего объема рабочего пространства и интеграция ее в единый замкнутый герметичный модуль труднодостижима, кроме того, эксплуатация данной системы подразумевает достаточно значительный расход реагентов. Однако ее преимуществом является производительность, возможность одновременного процессинга нескольких крупных паренхиматозных органов, таких как свиные почки.
Техническим результатом предлагаемого нами способа получения децеллюляризированных матриксов паренхиматозных органов лабораторных животных является получение пригодных для аллотрансплантации, биосовместимых децеллюляризованных матриксов почек кролика и крысы, характеризующихся сохранением структурной целостности компонентов экстрацеллюлярного матрикса, а также с содержанием сульфатированных гликозаминогликанов и растворимого коллагена, сопоставимыми с нативными органами; полученные нами децеллюляризированные матриксы могут быть использованы для дальнейших этапов тканевой инженерии, в частности для последующих процедур криоконсервации, стерилизации и рецеллюляризации.
Указанный технический результат достигается использованием высокопроизводительной системы перфузии, представленной модулем для децеллюляризации, образованным резервуарами для перфузируемого раствора и паренхиматозного органа; системой силиконовых трубок с внутренним диаметром '' и 1/8''; перистальтических трубок с тремя маркированными стопперами для подключения к картриджам насоса Ismatec и системой люэр-фиттингов. Модуль в собранном виде подключается к проточному биореактору EBERS ТЕВ500 MasterUnit, и после подключения модуля децеллюляризации к биореактору проводят последовательную перфузию почек растворами следующего состава:
- 1X PBS с гепарином в течение 1 часа, скорость потока на этом этапе и на последующих одинакова и составляет для почки кролика - 26 мл/мин; для почки крысы - 15 мл/мин;
4
2
- 10 mM HEPES натриевой соли, 1 mM MgSO*6HO, 0,4% KCl в течение 5-6 часов с целью индукции осмотического шока;
- перфузия почки кролика 0,25% додецилсульфата натрия (SDS), 0,25% дезоксихолата натрия (SDC) и 0,25% Triton X100 (TNX), крысы - 0,1% SDS, 0,1% SDC и 0,25% TNX, в течение 24 часов;
- перфузия 0,3% SDS, 0,3% SDC и 0,4% TNX; 0,4% SDS, 0,4% SDC и 0,4% TNX почки кролика;
- перфузия 0,25% SDS, 0,25% SDC и 0,25% TNX; 0,3% SDS, 0,3% SDC и 0,3% TNX почки крысы.
Описание предлагаемого способа
Для эксперимента были выбраны кролик породы «советская шиншилла» весом 3,0 кг и крыса-самец линии Wistar, все манипуляции с животными выполняют в соответствии с правилами работы с лабораторными животными. После изъятия органов их помещают в три запаянных, заполненных стерильным физиологическим раствором или кустодиолом пакета, в транспортировочный контейнер с сухим льдом и транспортируют с места забора в лабораторию. Перед запуском процесса децеллюляризации органы подвергают предварительной обработке, также проводят настройку биореактора EBERS ТЕВ500 MasterUnit - устанавливают температуру 37°С, газовый состав (0,00% углекислого газа и кислорода), калибруют газовые сенсоры. С поверхности органа удаляют жировую ткань, почечные артерии каннюлируют с использованием катетера 24G (0,7 мм) для кроличьей артерии, а для крысиной аорты - 27G (0,4 мм); проверяют проходимость сосудистого аппарата почки, удаляют фибринозный налет с сосудов и избыточную адвентицию. Далее собирают модуль децеллюляризации, образованный резервуаром для размещения органа (бутыль 100 мл с резьбой GL 45 под трехпортовую крышку, крышка с 3 открытыми колпачками с резьбой GL14 - 1 порт под фильтрационную систему, остальные два - для приводящих раствор трубок), резервуаром для перфузата (собирается аналогично), системой трубок и люэр-фиттингов. Система трубок представлена приводящими и отводящими перфузируемый раствор силиконовыми трубками платинового отверждения с внутренними диаметрами '' и 1/8'', а также трехстопперными трубками Tygon, подключаемыми к перистальтическим помпам биореактора. Диаметр этих трубок подбирают в зависимости от морфологии и размера органа: для почки кролика - 2,54 мм, крысы - 1,52 мм. После приготовления растворов первых нескольких этапов (см. ниже) орган помещают в соответствующий резервуар, в противоположный резервуар добавляют перфузат и полностью готовый модуль децеллюляризации подключают к биореактору. Условия каждого этапа перфузии следующие.
1. Отмывание органов (и крысиной, и кроличьей почки) от резидуальной крови 1X PBS с гепарином в течение 1 часа. Скорость потока на этом этапе и на последующих одинакова и составляет для почки кролика - 26 мл/мин; для почки крысы - 15 мл/мин. Температура на данном этапе поддерживается равной 37°С.
2. Индукция осмотического шока за счет перфузии паренхимы почки кролика гипотоническим буфером состава 10 mM HEPES натриевая соль, 1 mM MgSO4*6Н2O, 0,4% KCL в течение 5-6 часов. Это начальный этап децеллюляризации, который позволяет добиться лизиса мембран клеток, облегчающий дальнейшее разрушение белок-белковых взаимодействий детергентами. Для крысиной почки на данном этапе проводят промывание 1X Tris EDTA в 0,1 М PBS без кальция и магния. Функции ЭДТА опосредованы связыванием ионов Са2+ и Mg2+, которые, во-первых, EDTA хелатирует ионы кальция, тем самым опосредуя структурные нарушения в трансмембранных белках, регулирующих адгезию и межклеточные взаимодействия, главным образом, интегринов; во-вторых, ЭДТА неселективно ингибирует металлопротеиназы внеклеточного матрикса, что предотвращает его саморазрушение.
3. Разрушение ядерных, цитозольных белков и белок-белковых взаимодействий зв результате перфузии паренхимы органов раствором, содержащим ионные (0, 25% додецилсульфат натрия SDS, 0,25% дезоксихолат натрия (SDC)) и неионные (Triton Х-100 0,25% для почки кролика, 0,1% SDS, 0,1% SDC и 0,25% TNX для крысиной почки) детергенты. Сочетание ионных и неионных детергентов при децеллюляризации органа позволяет добиться более надежного, сбалансированного эффекта по сравнению с использованием их по отдельности, поскольку неионные характеризуются более мягким эффектом по сравнению с ионными, в частности, они разрушают липид-липидные, липид-белковые, но не белок-белковые взаимодействия и в большей степени подходят для тонких тканей, в то время как при использовании исключительно ионных детергентов существует риск повредить структуру гликозаминогликанов и коллагенов межклеточного матрикса. Также важно отметить, что SDS достаточно цитотоксичен для последующей рецеллюляризации, поэтому целесообразно использовать его либо в сочетании с TritonX100 или CHAPS (3-[(3 холамидопропил)диметиламмоний-]-1-пропансульфонат), либо дополнительно отмывать паренхиматозный орган от остаточного SDS указанными детергентами.
Продолжительность третьего этапа - 24 часа.
4. Последовательная перфузия органов растворами детергентов в возрастающих концентрациях в течение 16 часов - для кроличьей почки 0,3% SDS, SD и TNX, 0,4%; 0,4% SDS, SD и TNX; для почки крысы - 0,25% SDS, SD и TNX; 0,3 SDS, SD и TNX.
5. Отмывание органов от следовых количеств детергента 1X PBS в течение 1,5 часов.
6. Извлечение органов из модулей децеллюляризации и взятие срезов для проведения гистологического анализа (окрашивание гематоксилином - эозином, альциановым синим и Сириусом красным, ПФР по Ван Гизону), количественного определения ДНК с использованием набора Quant-iT PicoGreen, количественного определения коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов.
7. Одновременно с этим проводят перфузию органа 1X раствором PBS, содержащим смесь криопротекторов DMSO и глицерина 10-15%, помещают полученный матрикс в криопакет и хранят на -80°С.
Положительный эффект способа. Способ позволяет получить децеллюляризированные матриксы паренхиматозных органов лабораторных животных, характеризующиеся: 1) отсутствием ядерного материала клеток; 2) сохранением структурной целостности ключевых компонентов внеклеточного матрикса, главным образом, коллагенов и протеогликанов, что подтверждается окраской срезов децеллюляризированных органов Сириусом красным и альциановым синим; 3) содержанием остаточной ДНК образцах высушенных и гомогенизированных срезов ткани, сопоставимым с референсной для децеллюляризированных матриксов величиной (<50 ng/mg).
Примеры осуществления способа
Пример 1. Децеллюляризированный матрикс почки кролика породы «Советская шиншилла», полученный нами с использованием высокоскоростной системы перфузии, образованной модулем децеллюляризации, интегрированным в проточный биореактор Ebers Teb 500 MasterUnit. Перед запуском процесса децеллюляризации почку кролика подвергают предварительной обработке, также проводят настройку биореактора EBERS ТЕВ500 MasterUnit - устанавливают температуру 37°С, газовый состав (0,00% углекислого газа и кислорода), калибруют газовые сенсоры. С поверхности органа удаляют жировую ткань, почечные артерии каннюлируют с использованием катетера 24G (0,7 мм); проверяют проходимость сосудистого аппарата почки, удаляют фибринозный налет с сосудов и избыточную адвентицию. Далее собирают модуль децеллюляризации, образованный резервуаром для размещения органа (бутыль 100 мл с резьбой GL 45 под трехпортовую крышку, крышка с 3 открытыми колпачками с резьбой GL14 - 1 порт под фильтрационную систему, остальные два - для приводящих раствор трубок), резервуаром для перфузата (собирается аналогично), системой трубок и люэр-фиттингов. Система трубок представлена приводящими и отводящими перфузируемый раствор силиконовыми трубками платинового отверждения с внутренними диаметрами '' и 1/8'', а также трехстопперными трубками Tygon, подключаемыми к перистальтическим помпам биореактора, диаметр которых для перфузионной децеллюляризации почки кролика подбирают равным 2,54 мм. После приготовления растворов первых нескольких этапов (см. ниже) орган помещают в соответствующий резервуар, в противоположный резервуар добавляют перфузат и полностью готовый модуль децеллюляризации подключают к биореактору. Условия каждого этапа перфузии следующие.
1. Отмывание кроличьей почки от резидуальной крови 1X PBS с гепарином в течение 1 часа. Скорость потока на этом этапе и на последующих одинакова и составляет 26 мл/мин. Температура на данном этапе поддерживается равной 37°С.
2. Индукция осмотического шока за счет перфузии паренхимы почки кролика гипотоническим буфером состава 10 mM HEPES натриевая соль, 1 mM MgSO4*6Н2O, 0,4% KCL в течение 5-6 часов.
3. Перфузия паренхимы кроличьей почки раствором, содержащим ионные (0, 25% додецилсульфат натрия SDS, 0,25% дезоксихолат натрия (SDC)) и неионные (Triton Х-100 0,25%) детергенты. Продолжительность третьего этапа - 24 часа.
4. Последовательная перфузия кроличьей почки растворами детергентов в возрастающих концентрациях в течение 16 часов - 0,3% SDS, SDC и TNX, 0,4%; 0,4% SDS, SD и TNX, для почки крысы - 0,25% SDS, SD и TNX; 0,3 SDS, SD и TNX.
5. Отмывание кроличьей почки от следовых количеств детергента 1X PBS в течение 1,5 часов.
6. Извлечение органа из модуля децеллюляризации и взятие срезов для проведения гистологического анализа (окрашивание гематоксилином - эозином, альциановым синим и Сириусом красным, ПФР по Ван Гизону), количественного определения ДНК с использованием набора Quant-iT PicoGreen, количественного определения коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов.
7. Одновременно с этим проводят перфузию органа 1X раствором PBS, содержащим смесь криопротекторов DMSO и глицерина 10-15%, помещают полученный матрикс в криопакет и хранят на -80°С.
Пример 2. Децеллюляризированный матрикс почки крысы Wistar, полученный нами с использованием высокоскоростной системы перфузии, образованной модулем децеллюляризации, интегрированным в проточный биореактор Ebers Teb 500 MasterUnit. Перед запуском процесса децеллюляризации почку крысы подвергают предварительной обработке, также проводят настройку биореактора EBERS ТЕВ500 MasterUnit - устанавливают температуру 37°С, газовый состав (0,00% углекислого газа и кислорода), калибруют газовые сенсоры. С поверхности органа удаляют жировую ткань, почечные артерии каннюлируют с использованием катетера 27G (0,4 мм); проверяют проходимость сосудистого аппарата почки, удаляют фибринозный налет с сосудов и избыточную адвентицию. Далее собирают модуль децеллюляризации, образованный резервуаром для размещения органа (бутыль 100 мл с резьбой GL 45 под трехпортовую крышку, крышка с 3 открытыми колпачками с резьбой GL14 - 1 порт под фильтрационную систему, остальные два - для приводящих раствор трубок), резервуаром для перфузата (собирается аналогично), системой трубок и люэр-фиттингов. Система трубок представлена приводящими и отводящими перфузируемый раствор силиконовыми трубками платинового отверждения с внутренними диаметрами '' и 1/8'', а также трехстопперными трубками Tygon, подключаемыми к перистальтическим помпам биореактора, диаметр которых для перфузионной децеллюляризации почки крысы подбирают равным 1,52 мм. После приготовления растворов первых нескольких этапов (см. ниже) орган помещают в соответствующий резервуар, в противоположный резервуар добавляют перфузат и полностью готовый модуль децеллюляризации подключают к биореактору. Условия каждого этапа перфузии следующие.
1. Отмывание крысиной почки от резидуальной крови 1X PBS с гепарином в течение 1 часа. Скорость потока на этом этапе и на последующих одинакова и составляет 15 мл/мин. Температура на данном этапе поддерживается равной 37°С.
2. Промывание 1X Tris EDTA в 0,1 М PBS без кальция и магния. Функции ЭДТА опосредованы связыванием ионов Са2+ и Mg2+, которые, во-первых, EDTA хелатирует ионы кальция, тем самым опосредуя структурные нарушения в трансмембранных белках, регулирующих адгезию и межклеточные взаимодействия, главным образом, интегринов; во- вторых, ЭДТА неселективно ингибирует металлопротеиназы внеклеточного матрикса, что предотвращает его саморазрушение.
3. Перфузия паренхимы кроличьей почки раствором, содержащим ионные (0, 1% додецилсульфат натрия SDS, 0,1% дезоксихолат натрия (SDC)) и неионные (Triton Х-100 0,25%) детергенты. Продолжительность третьего этапа - 24 часа.
4. Последовательная перфузия крысиной почки растворами детергентов в возрастающих концентрациях в течение 16 часов - крысы - 0,25% SDS, SD и TNX; 0,3% SDS, SD и TNX.
5. Отмывание кроличьей почки от следовых количеств детергента 1X PBS в течение 1,5 часов.
6. Извлечение органа из модуля децеллюляризации и взятие срезов для проведения гистологического анализа (окрашивание гематоксилином - эозином, альциановым синим и Сириусом красным, ПФР по Ван Гизону), количественного определения ДНК с использованием набора Quant-iT PicoGreen, количественного определения коллагена и сульфатированных гликозаминогликанов.
7. Одновременно с этим проводят перфузию органа 1X раствором PBS, содержащим смесь криопротекторов DMSO и глицерина 10-15%, помещают полученный матрикс в криопакет и хранят на -80°С.