КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЭМФИЗЕМЫ ЛЕГКОГО И ДРУГИХ ФОРМ ХОБЛ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF LUNG EMPHYSEMA AND OTHER FORMS OF COPD

Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармакотерапии. В частности, настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения эмфиземы легких с наличием ограничения воздушного потока или без него и других форм хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Уровень техники
ХОБЛ представляет собой одно из самых распространенных неинфекционных состояний. ХОБЛ представляет собой сложную клиническую ситуацию, которая в качестве распространенного фактора имеет связанное с курением фиксированное ограничение воздушного потока, которое существенно не меняется в течение нескольких месяцев наблюдения. Более того, обструкция дыхательных путей демонстрирует аномально быстрое прогрессирующее ухудшение с возрастом. Течение болезни переходит в хронические респираторные симптомы.
Патогенез ХОБЛ характеризуется хроническим воспалением и ускоренной потерей эластических волокон [1]  (цифры в квадратных скобках относятся к номерам в перечне ссылок в конце описания.). Хроническое ограничение воздушного потока при ХОБЛ вызывается заболеванием мелких дыхательных путей, разрушением паренхимы легких (т. е. эмфиземой) или их сочетанием [1]. Эмфизема представляет собой фенотип ХОБЛ, характеризующийся чрезмерной потерей волокон эластина в паренхиме легких вследствие дисбаланса протеазы/антипротеазы и разрушения/восстановления эластина. Хотя в патогенезе эмфиземы роль накопления коллагена в паренхиме легких оценивают в меньшей степени, чем роль разрушения эластина, оно является еще одной важной патогенетической характеристикой эмфиземы [2].
Эластин, основной компонент эластичных волокон, представляет собой уникальный белок, который обеспечивает эластичность, упругость и деформируемость легких, и поэтому он является основным условием для дыхания [3]. Эластин в основном вырабатывается в утробе матери и в раннем детстве [4].
Продукция волокон эластина начинается с синтеза тропоэластина, предшественника эластина, несколькими типами клеток [4]. Тропоэластин впоследствии секретируется во внеклеточный матрикс, транспортируется к фибриллярному каркасу, координируется со многими другими белками тропоэластина в полимеры и, наконец, сшивается с другими полимерами тропоэластина в зрелые и прочные волокна эластина, которые необходимы в течение всей жизни [4]. Процесс сшивки облегчается ферментами LOX и LOX-подобными белками (LOXL) с 1 по 4 [4]. Фибулины 4 и 5 также играют важную роль в развитии и поддержании волокон эластина. В то время как прототип LOX и фибулин-4 в основном участвуют в начальном развитии волокон эластина, LOXL1 и фибулин-5 важны для восстановления эластина.
Эластические свойства легких нарушаются при разрушении эластина [4], которое усиливается у пациентов с ХОБЛ вследствие дисбаланса между защитным действием антипротеаз и разрушающими свойствами протеаз [3]. Другим фактором деградации эластина является дисбаланс между разрушением эластина и восстановлением эластина, учитывая, что поврежденные волокна эластина более подвержены дальнейшему разрушению протеазами, чем нативные волокна [5]. Более того, волокна эластина, сшитые ферментами LOX, относительно устойчивы к протеазам, тогда как несшитые белки легко разрушаются [6-8]. Ускоренная деградация легочного эластина представляет собой важный патогенетический механизм эмфиземы, приводящий к потере функции легких [9].
1
Помимо ускоренной потери эластина, существует еще одна проблема во внеклеточном матриксе пациентов с эмфиземой. Было продемонстрировано, что уровни коллагена в легких у пациентов с эмфиземой повышены по сравнению с контролем [10] и находятся в обратной зависимости с объемом форсированного выдоха за одну секунду (FEV) [11].
Медь служит кофактором при активации ферментов LOX (т.е. прототипов LOX и LOXL1-4) [12]. Индуцированный дефицит меди у цыплят нарушает сшивку эластина вследствие снижения активности LOX и приводит к выраженному снижению содержания эластина [12]. Причина более низкого содержания эластина при дефиците меди, по-видимому, вызвана повышенным разрушением, поскольку несшитый тропоэластин намного более чувствителен к протеазам, чем надлежащим образом сшитый эластин [12]. Восполнение нехватки меди у цыплят с дефицитом меди восстанавливает отложение устойчивых к протеазам волокон эластина до значений, близких к нормальным [7].
Потеря волокон эластина вызывает ХОБЛ в легких, в то же время она вызывает образование морщин на коже [13]. Крем, содержащий медь, у здоровых людей вызывает увеличение сшивок эластина в коже [14].
Существуют данные, свидетельствующие о нехватке меди при эмфиземе легких. Эмфизематозные изменения могут быть вызваны у крыс и хомяков при кормлении их кормом с дефицитом меди [15,16]. Дефицит меди вызвал снижение содержания эластина на 17% и увеличение альвеолярных пространств на 35% в легких крыс [15]. Восполнение нехватки меди восстановило ультраструктуру легочного эластина почти до нормальной [15].
Экспрессия провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) усиливается при эмфиземе [17, 18]. У трансгенных мышей со сверхэкспрессией TNF-α, специфичной для легких, развиваются эмфизематозные поражения [19]. Был сделан вывод о том, что дефицит меди возникает после хронического воспаления легких, вызванного TNF-α, и, вероятно, играет важную роль в повреждении легких, вызванном воспалением.
Также существует исследование на людях, предполагающее местный дефицит меди в областях с эмфиземой. Белок, содержащий домен метаболизма меди-1 (COMMD1), является ключевым регулятором метаболизма меди [20]. Было продемонстрировано, что уровни COMMD1, а также активных LOX, LOXL1 и LOXL2, снижаются при эмфиземе легких [21].
1
Концентрация меди в конденсате выдыхаемого воздуха у пациентов с ХОБЛ снижена и обратно пропорциональна FEV [22]. Это может указывать на наличие дефицита меди в легких при ХОБЛ. В соответствии с этим, у людей с болезнью Менкеса, генетическим нарушением транспорта меди, может развиться тяжелая эмфизема [23].
Хотя предшествующий уровень техники может предполагать, что медь является подходящим стимулятором восстановления и развития эластина в легких с эмфиземой, существует одна важная проблема, которая препятствует применению меди в качестве терапии у пациентов с эмфиземой. Ферменты LOX являются не только стимуляторами сшивки эластина, но и сшивки коллагена. Повышенная сшивка коллагена приведет к улучшенной организации, созреванию и, таким образом, к накоплению коллагена в легких с эмфиземой, что является крайне нежелательным, учитывая тот факт, что уровни коллагена уже повышены у пациентов с эмфиземой и спровоцируют переход эмфиземы легких в фиброз легких, что представляет собой еще одно тяжелое заболевание легких. Таким образом, индуцированная медью стимуляция накопления коллагена предполагает отказ от применения меди в качестве терапии у пациентов с эмфиземой.
Наиболее важными жалобами пациентов с ХОБЛ являются одышка при физической нагрузке, и на более поздних стадиях также в состоянии покоя, и непереносимость физических упражнений. С механистической точки зрения кажется более подходящим рассматривать ХОБЛ как синдром, а не как единое заболевание. Обструкция дыхательных путей у пациентов с ХОБЛ вызвана заболеванием мелких дыхательных путей, эмфиземой легких или их комбинацией. Значительную эмфизему также часто обнаруживают на компьютерной томографии (КТ) у (бывших) курильщиков без ХОБЛ (то есть при отсутствии обструкции воздушного потока).
Клинически трудно отличить эмфизему от хронического бронхита из-за схожих симптомов одышки, кашля и хрипов. У значительной части пациентов присутствуют комбинации характеристик, приписываемых хроническому бронхиту или эмфиземе.
Общество визуализации грудной клетки Флейшнера опубликовало сообщение, в котором описаны подтипы ХОБЛ, определяемые с помощью компьютерной томографии. Основными патологическими категориями, которые можно выделить, являются утолщение стенки дыхательных путей, бронхоэктаз, заболевание мелких дыхательных путей и эмфизема.
Следует понимать, что эти радиологические аномалии также могут быть идентифицированы у людей без ХОБЛ. Эмфизема характеризуется необратимым поражением легких. В результате теряется эластичность легочной ткани, вызывая коллапс дыхательных путей и возникновение обструкции дыхательных путей. Хронический бронхит представляет собой воспалительное заболевание, которое начинается в более мелких дыхательных путях в легких, постепенно переходит в более крупные дыхательные пути. Он увеличивает количество слизи в дыхательных путях и увеличивает инфицирование бронхов бактериями, что, в свою очередь, препятствует прохождению воздуха.
Современная фармакологическая терапия ХОБЛ способна улучшить респираторные симптомы и частоту обострений, а также улучшить качество жизни и физическую работоспособность [1]. Сообщалось также о влиянии ингаляционной терапии бронходилататорами длительного действия и кортикостероидами, заключающемся в снижении скорости ухудшения функции легких [2-4]. К сожалению, ингаляционные бронходилататоры и кортикостероиды в основном нацелены на компонент дыхательных путей при ХОБЛ и не обладают такими благоприятными эффектами при доминирующей эмфиземе, как у пациентов с ХОБЛ с доминирующим компонентом дыхательных путей. Тем не менее, наличие эмфиземы на КТ является важным признаком, поскольку оно сильно связано со смертностью.
Ни одно единичное вмешательство при ХОБЛ, за исключением трансплантации легких, не было доказано как эффективное для восстановления функции легких [1]. Следовательно, существует острая необходимость в создании специфической фармакологической терапии для большой группы индивидуумов с эмфиземой.
В WO 03/068187 A1 раскрыто применение гликозаминогликанов, например, гепарина, для лечения респираторных заболеваний, таких как ХОБЛ, в частности хронического ограничения воздушного потока (CAL).
В WO 2012/073025 A1 раскрыты гликозаминогликаны, такие как гепарин, для применения для лечения и/или предотвращения ХОБЛ, в котором после введения субъекту гепарин снижает воспаление в легких субъекта.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что комбинацию меди и конкретных гликозаминогликанов, в частности гепарина, можно применять для лечения эмфиземы легких и других форм ХОБЛ. Комбинация оказывает благотворное влияние на восстановление и развитие волокон эластина в легких пациентов с эмфиземой и в то же время предотвращает индуцированную медью стимуляцию сшивки коллагена.
Хотя в предшествующем уровне техники раскрыто применение гепарина в качестве ингаляционной монотерапии для пациентов с ХОБЛ [24,25], в нем не продемонстрировано и не предложено синергетическое значение добавления гепарина к ингаляционной терапии с применением меди для дальнейшего стимулирования процессов восстановления/развития посредством стимуляции сшивки тропоэластина и, что более важно, предотвращения индуцированной медью стимуляции сшивки коллагена.
Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предложена композиция для применения в способе лечения эмфиземы легких и других форм ХОБЛ, содержащая активный агент, содержащий соединение меди и гликозаминогликан или его физиологически приемлемую соль. Особенно предпочтительным является введение путем ингаляции.
В предпочтительном варианте реализации композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве добавки к стандартному фармакологическому лечению ХОБЛ, которое включает бронходилататоры и иммуномодуляторы, такие как ингаляционные кортикостероиды и пероральные макролиды.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта, страдающего эмфиземой легких или другой формой ХОБЛ, который включает введение указанному субъекту терапевтически активного количества композиции активного агента, включающего соединение меди, и гликозаминогликана или его физиологически приемлемой соли.
Значение активных ингредиентов композиции согласно настоящему изобретению в отношении восстановления и развития волокон эластина и предотвращения накопления коллагена будет более полно описано в подробном описании, которое следует ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Эксплантированное правое легкое 55-летнего пациента мужского пола с комбинацией фиброза и эмфиземы легкого. A. Макроанатомия образца после резекции, демонстрирующая обширные изменения во всем легком, с развитой эмфиземой в верхней и средней долях, образованием пузырей в верхней доле и микронодулярными изменениями плевры в средней (*) и нижней долях, соответствующими обширному фиброзу паренхимы. B. Репрезентативная микроскопия (окраска гематоксилин-эозином, увеличение в 2,5 раза) верхней доли, показывающая обширные эмфизематозные изменения (*) и умеренный небольшой интерстициальный фиброз. C. Репрезентативная микроскопия (окраска гематоксилин-эозином, увеличение в 10 раз) нижней доли, характеризующейся выраженным фиброзом с нарушениями архитектоники и многочисленными фибробластическими очагами (**), что соответствует обычной картине интерстициальной пневмонии. Средняя доля продемонстрировала комбинацию эмфиземы и выраженного фиброза (не показано).
Фиг. 2: Относительные концентрации эластина, коллагена, (изо)десмозина (DES) и гидроксипролина (Hypro) в легких контрольных субъектов, пациентов с эмфиземой, идиопатическим легочным фиброзом и комбинированным легочным фиброзом (CPFE; в базальной и апикальной зонах легких). Уровни в контрольной группе установлены как 100%.
Фиг. 3: Относительные концентрации меди в сыворотке и конденсате выдыхаемого воздуха (EBC) у контрольных субъектов (установлено как 100%) и пациентов с эмфиземой и идиопатическим фиброзом легких (IPF).
Фиг. 4: Относительные концентрации меди в паренхиме легких контрольных субъектов (установлено как 100%) и пациентов с эмфиземой, идиопатическим фиброзом легких (IPF) и комбинированным фиброзом легких и эмфиземой (CPFE; апикальная и базальная области легких).
in vitro
Фиг. 5: Уровни (изо)десмозина (DES) в среде фибробластов (культуры клеток ) без дополнительной меди (начальный уровень) или (начальная концентрация меди) + 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 и 32 * начальный уровень меди.
(
in vitro
Фиг. 6: Относительная экспрессия генов лизилоксидазы (LOX), лизилоксидазоподобного фермента 1 (LOXL1), эластина (ELN), фибулина-5 и уровней тропоэластина, нерастворимого эластина, (изо)десмозина (DES) и коллагена в фибробластахкультурах клеток), выращенных при начальной концентрации + 8*начальная концентрация только меди, меди плюс ретиноевой кислоты (RA), меди плюс миноксидила и меди плюс гепарина.
in vitro
Фиг. 7: Относительные уровни нерастворимого эластина и (изо)десмозина (DES) в фибробластах (культурах клеток ), выращенных при начальной концентрации + 8*начальная концентрация только меди, меди плюс витамин K1, меди плюс витамин K2 и меди плюс сульфат магния.
Фиг. 8: Общая емкость легких (TLC) и средний линейный отрезок (Lm) у контрольных мышей, мышей, получавших медь, и мышей, получавших медь/гепарин.
Фиг. 9: (Изо)десмозин (DES), коллаген и гидроксипролин (Hypro) у контрольных мышей, мышей, получавших медь, и мышей, получавших медь/гепарин.
Фиг. 10: Микроскопия (10-кратное увеличение) легкого мыши из группы плацебо демонстрирует обширные эмфизематозные изменения.
Фиг. 11: Микроскопия (10-кратное увеличение) легкого мыши из группы медь/гепарин демонстрирует нормальные альвеолы без эмфизематозных изменений.
Фиг. 12: Первое измерение распределения частиц по размеру в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия с 5000 МЕ гепарина и 0,5 мг меди с применением лазерного дифракционного анализа.
Фиг. 13: Повторное измерение распределения частиц по размеру в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия с 5000 МЕ гепарина и 0,5 мг меди с применением лазерного дифракционного анализа.
Фиг. 14: Первое измерение распределения частиц по размеру в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия с 100 000 МЕ гепарина и 1,0 мг меди с применением лазерного дифракционного анализа.
Фиг. 15: Повторное измерение распределения частиц по размеру в 5 мл 0,9% раствора хлорида натрия с 100 000 МЕ гепарина и 1,0 мг меди с применением лазерного дифракционного анализа.
Подробное описание изобретения
Реактивация выработки легочных волокон эластина и восстановление поврежденных волокон эластина являются необходимыми условиями для восстановления функции легких. Решающее значение для выработки новых и восстановления поврежденных волокон эластина у взрослых имеют три стадии: (а) активация синтеза тропоэластина, (b) активация сборки белков тропоэластина в полимерные цепи и (c) активация сшивки, опосредованной лизилоксидазой.
Предложены композиции и способы лечения эмфиземы легких и других форм ХОБЛ. Эти композиции включают активный агент, содержащий медь, и гликозаминогликан или его физиологически приемлемую соль.
Композиции согласно настоящему изобретению следует применять для лечения субъектов, страдающих или подверженных риску развития эмфиземы легких, с ограничением воздушного потока или без него, и других форм ХОБЛ. Обычно субъектом является млекопитающее, в частности человек, но им может быть позвоночное животное. Ограничение воздушного потока обычно прогрессирует и связано со снижением эластичности волокон эластина в легких.
Предложены способы лечения эмфиземы легких и других форм ХОБЛ. Такие способы включают диагностику одного или более заболеваний легких у субъекта и введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей активный агент, содержащий медь, и гликозаминогликан или его физиологически приемлемую соль.
Термин «лечить» или «лечение» относится к осуществлению протокола, который может включать введение одной или более композиций или активных ингредиентов пациенту (человеку или другому) с целью восстановления поврежденных легких и/или предотвращения развития прогрессирования заболевания или расстройства. «Лечить» или «лечение» не подразумевает полного прекращения прогрессирования заболевания, не подразумевает полного восстановления всех повреждений легких и, в частности, включает протоколы, которые оказывают на пациента лишь незначительное влияние.
Термин «терапевтически эффективное количество» обозначает количество быстрорастворимой композиции, которое при введении пациенту является достаточным, чтобы привести к улучшению состояния пациента. Улучшение не означает излечение, и может включать лишь незначительное изменение состояния пациента. Оно также включает количество активных агентов, которые предотвращают состояние или останавливают или задерживают его прогрессирование.
Для целей настоящего изобретения «другие формы ХОБЛ» могут быть определены как состояние утолщения стенки дыхательных путей, бронхоэктаз, хронический бронхит и/или заболевание мелких дыхательных путей.
1
Субъект обычно представляет собой взрослого человека. Например, субъекту может быть от 21 до 85, предпочтительно от 25 до 70, более предпочтительно от 30 до 60 и еще более предпочтительно от 40 до 50 лет. Начало любого из упомянутых в настоящем документе или конкретных симптомов обычно приходится на взрослый возраст. Например, субъекту могло быть по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 30, еще более предпочтительно по меньшей мере 35 и даже более предпочтительно по меньшей мере 40 лет до возникновения конкретного симптома. В частности, симптомы, связанные с более поздними стадиями эмфиземы, такие как любые из упомянутых в настоящем документе, могут появиться на таких более поздних стадиях жизни. У субъектов с генетической предрасположенностью к развитию эмфиземы, например, у субъектов с дефицитом альфа-антитрипсина, заболевание может развиться раньше. Например, у них могут проявляться один или более или конкретный симптом в возрасте от 20 до 31, предпочтительно от 22 до 28 или более предпочтительно от 24 до 26 лет. В качестве альтернативы, впервые симптом может появиться у них в любом из возрастных диапазонов, упомянутых в настоящем документе. Субъекту может быть поставлен диагноз в любом возрасте или в любом из возрастных диапазонов, указанных в настоящем документе.
В случаях, когда субъект не является человеком, он может представлять собой домашнее животное или животное, имеющее важное значение для сельского хозяйства. Животное может представлять собой, например, овцу, свинью, корову, быка, домашнюю птицу или другое коммерчески выращиваемое животное. В частности, животное может представлять собой корову или быка, и предпочтительно дойную корову. Животное может представлять собой домашнее животное, например, собаку, кошку, птицу или грызуна. В предпочтительном варианте реализации животное может представлять собой кошку или другое животное, относящееся к кошачьим. Животное может представлять собой обезьяну, такую как примат, не являющийся человеком. Например, примат может представлять собой шимпанзе, гориллу или орангутанга. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения животное может представлять собой лошадь и, например, может представлять собой скаковую лошадь.
Основными терапевтически активными ингредиентами композиций согласно настоящему изобретению являются медь и гликозаминогликан. Данные ингредиенты будут более подробно рассмотрены ниже.
Медь
В композициях согласно настоящему изобретению применяют активный агент, содержащий соединение меди. В настоящем документе термин «активный агент» относится к химическому элементу соединения, который оказывает стимулирующее действие на восстановление и развитие легочного эластина. Активный агент включает соединение меди, в частности соль меди. Различные соли меди могут служить источником соединений меди. Подходящие соли меди включают, но не ограничиваются ими, сульфат меди, хлорид меди, глюконат меди, ацетат меди, гептаноат меди, оксид меди, метионат меди, оксид меди (I), хлорофиллин меди и эдетат меди-кальция. Из них предпочтительным является сульфат меди.
Гликозаминогликан
В композициях согласно настоящему изобретению применяют гликозаминогликаны и, в частности, гепарин. Гликозаминогликаны представляют собой линейные гетерополисахариды, обладающие характерными повторяющимися последовательностями дисахаридов, которые обычно являются высоко N- и O-сульфатированными по остаткам D-глюкозамина, галактозамина и уроновой кислоты.
В настоящем изобретении можно применять любой подходящий гликозаминогликан. Гликозаминогликаны и соли гликозаминогликанов, подходящие для применения в настоящем изобретении, будут иметь среднюю молекулярную массу от 12 до 18 кДа. Могут быть предложены гликозаминогликан или соль с различной молекулярной массой в данном диапазоне. Для дополнительных подробностей можно сослаться на предшествующий уровень техники, в частности, на WO 03/068187 и ее аналог ЕР 1511466, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Гликозаминогликан может представлять собой любой подходящий коммерчески доступный гликозаминогликан и может, например, представлять собой нефракционированный гликозаминогликан. Гликозаминогликан обычно выделяют из природных источников, таких как животное. В некоторых случаях гликозаминогликан может быть синтезирован, а не представлять собой природную молекулу.
В настоящем изобретении можно применять любую подходящую физиологически приемлемую соль гликозаминогликана, в частности соль металла, например, натриевую соль, соль щелочного металла или соль щелочноземельного металла. Другие соли включают соли кальция, лития и цинка. Также можно применять соли аммония. Соль может представлять собой гликозаминогликанат натрия или сульфат гликозаминогликана. Соли производных конкретных гликозаминогликанов, упомянутых в настоящем документе, также можно применять в настоящем изобретении. В настоящей заявке, где упоминается гликозаминогликан, такое упоминание также включает его физиологически приемлемые соли.
В особенно предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения применяемый гликозаминогликан представляет собой любой из хондроитинсульфатов от A до E, гепарин, гепаринсульфат, гепаран, гепарансульфат, гиалуроновую кислоту, кератансульфат, производное любого из них или его физиологически приемлемую соль или их смесь или любые два из них.
Гепарин представляет собой встречающийся в природе мукополисахарид, присутствующий в различных органах и тканях, особенно в печени, легких и крупных артериях. Гепарин представляет собой полимер, состоящий из чередующихся остатков a-D-глюкозамина и гексуроната, соединенных (1,4)-гликозидными связями. Когда гликозаминогликаны синтезируются в природе, обычно они конъюгированы с центральным ядром белка. Однако предпочтительно гликозаминогликаны, применяемые в изобретении, не имеют такого центрального ядра. Коммерчески доступные препараты гликозаминогликанов обычно не имеют ядра, и их можно применять.
Предпочтительно в составе применяют нефракционированный гепарин. Вместо нефракционированного гепарина можно применять низкомолекулярные гепарины, включающие далтепарин и эноксапарин, и другие члены семейства гликозаминогликанов, включая гепарансульфат, с соединением меди в составе для ингаляции для стимуляции полимеризации тропоэластина и/или предотвращения индуцированной медью сшивки коллагена.
Гепарин клинически применяют в качестве антикоагулянта, причем считается, что он оказывает свое действие за счет взаимодействия с антитромбином III (AT-III), кофактором гепарина II и другими факторами свертывания крови. Обычно гепарин сохраняет некоторую антикоагулянтную активность, то есть может увеличивать время свертывания крови у индивидуума. Таким образом, предпочтительно гепарин будет способен связывать антитромбин III (AT-III) и/или кофактор гепарина II (HCII) и, следовательно, ингибировать свертывание крови. Предпочтительно он будет способен образовывать комплекс с AT-III, тромбином и фактором свертывания крови. Однако в некоторых вариантах реализации можно также применять гепарин, который не обладает антикоагулянтной активностью или который имеет пониженную антикоагулянтную активность. Следовательно, гепарин может быть модифицирован таким образом, что он имеет от 0 до 80%, предпочтительно от 5 до 60%, более предпочтительно от 10 до 40% и еще более предпочтительно от 10 до 30% активности немодифицированной формы или в сравнении с немодифицированным гепарином. Другие гликозаминогликаны, в частности дерматансульфат, также обладают антикоагулянтной активностью. Следовательно, предпочтительно, чтобы применяемые гликозаминогликаны и их производные сохраняли некоторую антикоагулянтную активность, как обсуждалось выше для гепарина и его производных.
Другие компоненты
Для реактивации продуцирования легочных волокон эластина, восстановления поврежденных волокон эластина, замедления скорости разрушения эластина и ингибирования образования конечного продукта повышенного гликирования (AGE) объединение композиции согласно настоящему изобретению, содержащей соединение меди и гликозаминогликан, с другими полезными для здоровья или фармацевтически активными компонентами в одной композиции или в форме набора для одновременного, последовательного или раздельного введения, может быть предпочтительным. Например, предполагается, что композиция согласно настоящему изобретению может быть предложена в комбинации с лекарственными средствами или веществами, влияющими на метаболизм эластина в сосудистой сети, выбранными из полифенолов эпигаллокатехин-(3-)галлата (EGCG) и пентагаллоилглюкозы (PGG), АТФ-зависимых агентов, открывающих калиевые каналы, например, миноксидила, никорандила, диазоксида, пинацидила и кромакалина, магния, витамина K1, витамина K2, агентов, разрушающих AGE в артериях, например, аминогуанидина, пиридоксамина, N-фенацилтиазолия бромида, алагебриума и флавоноидов (например, кемпферола, генистеина, кверцитрина, кверцетина и эпикатехина), соединений с потенциальным воздействием на метаболизм эластина в легких, выбранных из витамина А, витамина D и пентагаллоилглюкозы.
Оценка субъекта
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим активный агент, содержащий соединение меди, и гликозаминогликан или его соль, для применения для облегчения восстановления и развития волокон эластина в легких пациентов с эмфиземой и предотвращения индуцированной медью стимуляции сшивки коллагена. Применяемые соединение меди и гликозаминогликан или соль, путь доставки и любые другие параметры композиции и субъекта, подвергаемого лечению, могут быть такими же, как описано в настоящем документе для любого из других вариантов реализации настоящего изобретения.
Композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно вызывают улучшение состояния субъекта и/или предотвращение/замедление прогрессирования заболевания. Таким образом, композиции можно применять для лечения пациента, страдающего или имеющего склонность к эмфиземе и/или другим формам ХОБЛ, как определено в настоящем документе. Они могут предотвратить, облегчить, улучшить или вылечить состояние. Они могут замедлить или остановить прогрессирующее ухудшение, характерное для эмфиземы и других форм ХОБЛ, или, в некоторых случаях, даже вызвать некоторое обратное развитие данного ухудшения. Они могут предотвратить, уменьшить или вызвать обратное развитие одного или более симптомов, связанных с эмфиземой и другими формами ХОБЛ. Они также предпочтительно улучшают самочувствие субъекта и качество его жизни.
Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно снижает, устраняет или по меньшей мере предотвращает дальнейшее увеличение одного или более из следующих:
1
- ускоренное снижение параметров функции легких, включая, помимо прочего, FEV и диффузионную емкость;
- повреждение структуры легкого.
Лечение композициями согласно настоящему изобретению также может означать, что соотношение FEV1/FVC больше не снижается или улучшается. Например, это соотношение может быть ближе к ожидаемому у здорового субъекта.
Композиции могут уменьшать разрушение легочного эластина и способствовать восстановлению легочного эластина. Они также могут оказывать профилактическое действие в отношении накопления коллагена в легких с эмфиземой.
Композиции согласно настоящему изобретению могут уменьшить разрушение структуры легких, такое как разрушение эластина в дыхательных путях и альвеолах, и, следовательно, потерю эластичности легких. Они могут уменьшить или предотвратить коллапс частей легкого и/или развитие увеличенных воздушных пространств, в которые может попасть воздух. Композиции могут предотвращать или уменьшать любые патологические изменения, связанные с эмфиземой и другими формами ХОБЛ, описанными в настоящем документе. В частности, они могут предотвращать прогрессирование патологического изменения. Они также могут предотвращать или задерживать возникновение конкретного патологического изменения.
1
1
1
Композиции согласно настоящему изобретению могут обычно уменьшать снижение параметров функции легких, таких как диффузионная емкость и FEV, на от 10 до 100%, предпочтительно от 20 до 80%, более предпочтительно от 30 до 60% и даже более предпочтительно от 40 до 50%. Они могут уменьшить ежегодное снижение FEV на от 10 до 100 мл, предпочтительно от 20 до 60 мл и еще более предпочтительно от 30 до 40 мл в год. В некоторых случаях при лечении субъект будет демонстрировать улучшение параметров функции легких таким образом, что FEV и диффузионная емкость составляют от 25 до 100%, предпочтительно от 40 до 100%, более предпочтительно от 60 до 100% и еще более предпочтительно от 80 до 100% от прогнозируемого значения.
Измерение плотности легких с помощью компьютерной томографии представляет собой удобный способ количественной оценки степени тяжести эмфиземы легких. Композиции согласно настоящему изобретению могут замедлять или останавливать прогрессирующее снижение плотности легких на КТ у пациентов с эмфиземой или даже увеличивать плотность легких.
Композиции согласно настоящему изобретению могут уменьшить разрушение легочной ткани и облегчить восстановление поврежденной легочной ткани.
Композиции согласно настоящему изобретению могут устранять, отсрочивать начало или уменьшать тяжесть любого из симптомов и признаков эмфиземы и других форм ХОБЛ, упомянутых в настоящем документе.
Введение и состав
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены путем приготовления по меньшей мере одного соединения меди, предпочтительно сульфата меди, и гликозаминогликана, предпочтительно гепарина, со стандартным физиологически и, в частности, фармацевтически приемлемым носителем и/или вспомогательным веществом, как это обычно осуществляют в данной области техники.
Точная природа состава будет зависеть от нескольких факторов, включая конкретное применяемое соединение меди и гликозаминогликан и необходимый путь введения. Подходящие типы составов полностью описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd Edition, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, США, описание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В особенно предпочтительном варианте реализации композиции, содержащие соединение меди и гликозаминогликан, вводят в форме ингаляционной терапии, включая, помимо прочего, ингаляцию состава с применением небулайзера, дозирующих ингаляторов или в форме, подходящей для ингалятора сухого порошка. Композиция может находиться в блистерной упаковке или в разбиваемой капсуле. Таким образом, введение обычно можно осуществлять через рот.
Поскольку композиции согласно настоящему изобретению обычно вводят путем ингаляции или установки, предпочтительно, чтобы они находились в форме, подходящей для введения таким путем. В частности, композиции могут быть в форме, подходящей для ингаляции и/или установки.
Подходящие способы приготовления и получения композиций для введения путем ингаляции хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы в настоящем изобретении. Композицию, представленную сульфатом меди и гепарином в качестве терапии с применением небулайзера, можно применять с вспомогательными веществами, содержащими физиологический раствор. Композицию в форме сухого порошка можно применять со вспомогательными веществами, содержащими лактозу. Композицию в дозирующем ингаляторе можно применять со вспомогательными веществами, включающими пропелленты, содержащие гидрофторалкан (HFA), сорастворители, содержащие этанол, и стабилизаторы, содержащие олеиновую кислоту.
Необходимую дозу для введения обычно определяет врач, но она будет зависеть от ряда факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, и состояние пациента. Примеры доз и диапазонов доз будут приведены ниже. Предпочтительная продолжительность введений, предпочтительная частота введений и предпочтительная доза введений зависят от множества факторов, включая, но не ограничиваясь ими, возраст, массу тела и тяжесть эмфизематозных поражений, определяемых количественно с помощью денситометрических измерений легких на КТ и тестов функции легких. Продолжительность лечения обычно может составлять от двух недель, месяца, шести месяцев в году и более. Во многих случаях субъект будет применять композиции согласно настоящему изобретению постоянно или в течение продолжительных периодов времени. У пациентов с более тяжелыми формами эмфиземы предпочтительная продолжительность применения настоящего изобретения представляет собой пожизненную продолжительность, и предпочтительная частота введения представляет собой один раз в день. При более легких формах эмфиземы может быть достаточно временного периода введения, и введения реже, чем один раз в день.
Тяжесть дефицита меди в легких является еще одним фактором, определяющим интенсивность лечения. Измерение содержания меди в конденсате выдыхаемого воздуха представляет собой удобный способ расчета дефицита меди в легких, чтобы определить интенсивность и продолжительность ингаляционной терапии с применением меди.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, примером которых являются сульфат меди и гепарин, предпочтительно и эффективно вводят в следующих дозах, в зависимости, среди прочего, от таких факторов, как возраст, пол, масса тела и состояние пациента. Предпочтительные дозы как сульфата меди, так и гепарина получены из исследований клеточных культур с фибробластами, описанных ниже (см. раздел «Экспериментальная часть»), в которых различные дозы и комбинации оценивают на предмет их влияния на восстановление и развитие эластина.
(а) В отношении соли меди, от 1 мкг до 10 мг в день, предпочтительно от 50 мкг до 2 мг в день, более предпочтительно от 100 мкг до 1 мг в день и наиболее предпочтительно от 200 до 500 мкг в день. Эти дозы обычно вводят один, два или три раза в день, предпочтительно один раз в день.
2
(b) В отношении гепарина, от 100 до 1500000 МЕ в день, предпочтительно от 5000 до 1000000 МЕ в день, более предпочтительно от 25000 до 500000 МЕ в день и наиболее предпочтительно от 50000 до 250000 МЕ в день. Единица активности гепарина (Фармакопея США) определяется как количество гепарина, которое предотвращает свертывание 1 мл цитратной плазмы овцы в течение одного часа после добавления 0,2 мл 1% CaCl. Эти дозы обычно вводят один, два или три раза в день, предпочтительно один раз в день.
Предпочтительная композиция для ингаляции содержит примерно 0,5-1 мг сульфата меди и примерно 150000 МЕ гепарина.
Терапевтически активные компоненты, которые составляют композицию согласно настоящему изобретению, предпочтительно вводят одновременно, но при желании их также можно вводить последовательно или раздельно.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в форме аэрозолей. Приготовление фармацевтических аэрозолей является обычным для специалистов в данной области техники, см., например, Sciarra, J. in Remington (см. Выше). Агенты могут быть приготовлены в виде растворов для аэрозолей, дисперсий или суспензионных аэрозолей из сухих порошков, эмульсий или полутвердых лекарственных средств. Аэрозоль можно доставлять с применением любой пропеллентной системы, известной специалистам в данной области техники. Аэрозоли можно применять на нижние дыхательные пути. Композиции, содержащие соединение меди и гепарин, могут быть доставлены с применением способов доставки липосом и наночастиц, которые известны специалисту в данной области техники. Липосомы, особенно катионные липосомы, можно применять в составах носителей.
Композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут включать, помимо активного ингредиента, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области техники. В частности, они могут включать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны влиять на эффективность активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала будет зависеть от пути введения. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington (см. выше).
Композиции согласно настоящему изобретению можно доставлять с помощью любого устройства, адаптированного для введения одной или более терапевтических композиций в нижние дыхательные пути. В некоторых предпочтительных вариантах реализации устройства согласно настоящему изобретению могут представлять собой дозирующие ингаляторы. Устройства могут быть адаптированы для доставки терапевтических композиций согласно настоящему изобретению в форме мелкодисперсного аэрозоля жидкости, пены или порошка. В устройстве может быть использован пьезоэлектрический эффект или ультразвуковая вибрация для вытеснения порошка, прикрепленного к поверхности, такой как лента, для создания аэрозоля, подходящего для вдыхания. В устройствах может быть использована любая пропеллентная система, известная специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, помпы, сжиженный газ, сжатый газ и т.п.
В случаях, когда соединение меди и гепарин вводят в форме частиц или капель, размер частицы/капли и/или другие свойства частицы/капли могут быть выбраны для обеспечения доставки частиц в конкретную область дыхательных путей. Например, они могут быть предназначены для достижения только нижних отделов дыхательных путей. В случаях, когда соединение меди и гепарин доставляют в водной форме, предпочтительно раствор является изотоническим, чтобы способствовать эффективной доставке субъекту. В частности, считается, что частицы диаметром 10 мкм эффективны для достижения нижних частей дыхательных путей и, следовательно, их можно применять там, где такое место является необходимой мишенью для композиций. В вариантах реализации, когда необходимо доставить композицию в нижние отделы дыхательных путей, такие как, например, альвеолы, диаметр вводимых частиц может быть менее 10 мкм, предпочтительно менее 8 мкм, более предпочтительно менее 6 мкм и даже более предпочтительно менее 4 мкм. В предпочтительном варианте реализации частицы могут иметь диаметр 3 мкм или менее и более предпочтительно могут иметь диаметр 2 мкм или менее. В особенно предпочтительном варианте реализации частицы имеют диаметр от 3 до 5 мкм. В некоторых случаях вводимые частицы могут иметь диаметр менее 1000 нм, предпочтительно менее 500 нм, более предпочтительно менее 250 нм и еще более предпочтительно менее 100 нм. Размеры могут относиться к частицам твердого вещества или каплям растворов и суспензий.
Размер частиц, необходимый для проникновения в конкретную часть дыхательных путей, известен в данной области техники, и, следовательно, размер частиц может быть выбран в соответствии с заданным размером. Для получения необходимых очень мелких частиц можно применять такие способы, как измельчение. В некоторых случаях необходимой частью дыхательных путей могут быть верхние дыхательные пути, и, следовательно, можно применять частицы большего размера. Плотность частиц и их форма также могут быть выбраны для облегчения их доставки в необходимое место.
Композиции согласно настоящему изобретению могут принимать различные формы. Они могут быть в форме порошков, порошковых микросфер, растворов, суспензий, гелей, суспензий наночастиц, липосом, эмульсий или микроэмульсий. Присутствующие жидкости могут представлять собой воду или другие подходящие растворители, такие как CFC или HFA. В случае растворов и суспензий они могут быть водными или включать растворы, отличные от воды.
Под устройствами согласно настоящему изобретению обычно понимают емкость с одним или более клапанами, через которые проходит поток терапевтической композиции, и активатором для управления потоком. Подходящие устройства для применения в настоящем изобретении можно найти, например, в Remington (см. выше). Устройства, подходящие для введения композиций согласно настоящему изобретению, включают ингаляторы и небулайзеры, такие как те, которые обычно применяют для доставки стероидов астматикам. В некоторых случаях спейсер можно применять вместе с ингалятором для обеспечения эффективной доставки.
В продаже имеются ингаляторы различных конструкций, которые можно применять для доставки композиций согласно настоящему изобретению. К ним относятся устройства Accuhaler, Aerohaler, Aerolizer, Airmax, Autohaler, Breezhaler, Clickhaler, Diskhaler, Easi-breathe inhaler, Easyhaler, Evohaler, Ellipta, Fisonair, Handihaler, Integra, Jet inhaler, Miat-haler, Nexthaler, Novolizer inhaler, Pulvinal inhaler, Respimat, Rotahaler, Spacehaler, Spinhaler, Syncroner inhaler и Turbohaler. В данной области известен ряд методик приготовления особенно желательных частиц, которые можно применять. Например, можно применять технологии нанокристалла, пульмосола и пульмосферы.
В некоторых случаях композиции можно вводить через установку. В таких случаях обычно композиция находится в жидкой форме и будет введена через искусственные дыхательные пути, такие как, например, эндотрахеальная трубка. Жидкость обычно набирают шприцем, и затем пропускают через искусственные дыхательные пути в дыхательные пути субъекта. Установку часто применяют в экстренных случаях. Во многих случаях ее можно применять, когда субъект имеет относительно тяжелую форму CAL и был госпитализирован.
Композиции могут включать различные компоненты, чтобы оптимизировать их пригодность для конкретного выбранного пути доставки. Вязкость композиций можно поддерживать на желаемом уровне с применением фармацевтически приемлемого загустителя. Загустители, которые можно применять, включают метилцеллюлозу, ксантановую камедь, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, карбомер, поливиниловый спирт, альгинаты, аравийскую камедь, хитозаны и их комбинации. Концентрация загустителя будет зависеть от выбранного агента и желаемой вязкости.
В некоторых вариантах реализации композиции могут включать увлажнитель. Он может помочь уменьшить или предотвратить высыхание слизистой оболочки и предотвратить раздражение оболочки. Подходящие увлажнители включают сорбит, минеральное масло, растительное масло и глицерин; успокаивающие агенты; кондиционирующие агенты оболочки; подсластители; и их комбинации.
Композиции могут включать поверхностно-активное вещество. Подходящие поверхностно-активные вещества включают неионные, анионные и катионные поверхностно-активные вещества. Примеры поверхностно-активных веществ, которые можно применять, включают, например, полиоксиэтиленовые производные неполных эфиров жирных кислот и ангидридов сорбита, такие как, например, твин 80, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен 50 стеарат, фузиаты (fusieates), соли желчных кислот и октоксинол.
Синергетические эффекты композиций согласно настоящему изобретению, содержащих активный агент, включающий соединение меди, и гликозаминогликан, при ингаляционной терапии, на примере сульфата меди и гепарина соответственно, будут дополнительно продемонстрированы в разделе «Экспериментальная часть».
Экспериментальная часть
Исследования, на которых основано настоящее изобретение, являются частью исследовательского проекта, основанного на систематическом подходе с целью разработки специфической терапии для пациентов с эмфиземой легких.
Основным направлением данного проекта являются макропротеины легочного внеклеточного матрикса эластин и коллаген, а также другие белки, играющие решающую роль в процессах развития и восстановления волокон эластина и коллагена: то есть тропоэластин, фибулин-4, фибулин-5 «прототип» LOX и LOXL1.
Уровень сшивки эластина количественно определяли путем измерения эластин-специфичных сшивающих аминокислот десмозина и изодесмозина (вместе называемых DES) [3], и уровень сшивки коллагена количественно определяли путем измерения коллаген-специфической сшивающей аминокислоты гидроксипролина.
В исследовательском проекте заявителей эксперименты проводили в следующем последовательном порядке:
1. Гистологическое исследование биоптатов легких пациентов с эмфиземой, идиопатическим фиброзом легких (IPF), комбинированным фиброзом легких и эмфиземой (CPFE) и контрольных субъектов без заболевания паренхимы легких.
2. Окрашивание биоптатов легких антителами против активных LOXL1 и LOXL2.
3. Исследования экспрессии генов в тканях легких пациентов с эмфиземой, IPF, CPFE и контрольных субъектов без заболевания паренхимы легких.
4. Измерения уровней меди в конденсате выдыхаемого воздуха у пациентов с эмфиземой и IPF и в контрольной группе без заболеваний легких.
5. Измерения уровней меди в тканях легких у пациентов с эмфиземой, IPF, CPFE и контрольных субъектов без заболевания паренхимы легких.
6. Культуры клеток с легочными фибробластами крыс.
7. Механизмы восстановления на модели эмфиземы, вызванной протеазой поджелудочной железы свиней, у мышей.
8. Анализ распыления посредством небулайзера растворов гепарина натрия и сульфата меди методом лазерной дифракции.
1. Гистологическое исследование биопсий легких
Научный замысел:
Авторы начали данный проект с исследования внеклеточного матрикса пациентов с эмфиземой, IPF, CPFE и контрольных субъектов. Причиной для изучения легких пациентов с фиброзом было ожидание авторов, что выяснение так называемого «фактора дивергенции» в патогенезе IPF и эмфиземы может помочь установить дефект, ответственный за неудачный процесс восстановления эластина в легких с эмфиземой, и облегчить определение специфической терапии для больных эмфиземой.
Способы:
Ткань легкого получали из образцов хирургической резекции легкого у пациентов с эмфиземой (n = 10) и здоровых людей из контрольной группы без ХОБЛ/эмфиземы (n = 10); была взята свободная от опухоли легочная ткань в субплевральной области на соответствующем расстоянии от опухоли. Ткань легкого получали из диагностической хирургической биопсии легкого у пациентов с IPF (n = 10). Ткани легкого из апикальных (эмфизематозных) и базальных (фиброзных) участков легких пациентов с CPFE были получены из эксплантатов легких (n = 4; фиг. 1). Сначала авторы исследовали внеклеточный матрикс легких с помощью гистологического анализа: Окраска трихром по Массону на коллаген и окраска Верхоффа-Ван Гизона на эластин.
Результаты:
Авторы обнаружили, что содержание эластина снижалось в паренхиме легких у пациентов с эмфиземой легких и увеличивалось у пациентов с IPF (фиг. 2). Содержание коллагена было увеличено у обоих пациентов с эмфиземой и IPF по сравнению с легкими контрольных пациентов; однако авторы наблюдали более выраженное увеличение волокон коллагена при IPF. У пациентов с CPFE содержание эластина увеличилось в паренхиме при фиброзе базальной части легкого и уменьшилось в паренхиме при эмфиземе апикальной части легкого. Содержание коллагена у пациентов с CPFE увеличилось как в паренхиме при эмфиземе апикальной части, так и в паренхиме при фиброзе базальной части легкого, но было более выражено в базальных областях легкого с фиброзом. Уровни DES были снижены в легких с эмфиземой и увеличены в легких с IPF. Уровни гидроксипролина были повышены как при эмфиземе легких, так и в легких с IPF, но в последних были намного выше. Примечательно, что относительная разница уровней коллагена между легкими с эмфиземой и с IPF была намного ниже, чем относительная разница уровней гидроксипролина между легкими с эмфиземой и с IPF, что указывает на то, что коллаген менее интенсивно сшивается при эмфиземе по сравнению с легкими с IPF.
Выводы:
Из данных анализов на легких с фиброзом и эмфиземой авторы пришли к выводу, что их специфическая терапия для пациентов с эмфиземой должна не только стимулировать восстановление и развитие волокон эластина, но также должна препятствовать созреванию, организации и накоплению коллагена, поскольку коллаген в большом количестве присутствует в легких с эмфиземой.
2. Окрашивание биопсий легких для определения активного LOXL1 и активного LOXL2
Научный замысел:
Ферменты LOX не только ответственны за сшивку предшественников тропоэластина в прочные волокна эластина, но также они сшивают предшественники проколлагена в прочные волокна коллагена. В то время как волокна эластина обеспечивают эластичность, упругость и деформируемость, волокна коллагена придают легким прочность на разрыв. Чрезмерное отложение коллагена является признаком фиброза легких. Стимуляция образования фиброза легких была бы нежелательным побочным эффектом стимуляции LOX. Авторы предположили, что количество ферментов LOX будет уменьшаться при эмфиземе и увеличиваться при фиброзе.
Способы:
Авторы окрашивали те же биопсии легких, которые применяли для гистологического анализа, с антителами к активного LOXL1 (Novus Biologicals; NBP1-82827) и активного LOXL2 (Novus Biologicals; NBP1-32954).
Результаты:
По сравнению с контрольными субъектами интенсивность окрашивания как активного LOXL1, так и активного LOXL2 была увеличена у пациентов с IPF и снижена у пациентов с эмфиземой. У пациентов с CPFE интенсивность окрашивания активного LOXL1 и активного LOXL2 была увеличена в паренхиме базальной части легкого с фиброзом и уменьшена в паренхиме апикальной части легкого с эмфиземой.
3. Анализы экспрессии генов в тканях легких
Научный замысел:
Авторы продолжили их систематический исследовательский проект путем анализа экспрессии генов (количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; qRT-PCR) в легких пациентов с эмфиземой, IPF и CPFE по сравнению с легкими контрольной группы, чтобы идентифицировать те гены/белки репарации эластина, которые недостаточно активируются при эмфиземе, и их следует стимулировать для достижения эффективного восстановления эластина.
Способы:
Авторы проанализировали экспрессию следующих генов в ранее упомянутых биопсиях легких: тропоэластина (ELN), LOX, LOXL1, LOXL2, фибулина-4 и фибулина-5.
Результаты:
К удивлению авторов, они обнаружили, что активность ELN и фибулина-5 была сильно повышена как у пациентов с эмфиземой, так и с IPF, что позволяет предположить, что эти белки не являются «фактором дивергенции» между эмфиземой легких и фиброзом. LOXL1 был активирован у пациентов с IPF по сравнению с контролем. Не было обнаружено значительных различий в экспрессии гена LOXL1 между пациентами с эмфиземой и контрольной группой.
Выводы:
На основании исследования экспрессии генов авторы пришли к выводу, что стимуляция синтеза ELN и фибулина-5 не может быть основной мишенью терапии восстановления легочного эластина, поскольку эти белки уже активированы в легких пациентов с эмфиземой.
Промежуточный анализ
Авторы столкнулись с парадоксом, что уровни активированного LOXL1 были снижены в легких с эмфиземой, однако экспрессия LOXL1 не снижалась в qRT-PCR. Основываясь на промежуточном анализе результатов систематического исследовательского проекта авторов изобретения, они пришли к выводу, что у пациентов не развивается эмфизема вследствие снижения уровня белка LOXL1, и предположили, что у пациентов может развиться эмфизема вследствие снижения уровня важнейшего кофактора LOXL1, то есть меди. Авторы провели несколько исследований, чтобы проверить эту гипотезу.
4. Медь в конденсате выдыхаемого воздуха и сыворотке
Научный замысел:
Поскольку медь является важнейшим кофактором для активации ферментов LOX, авторы предположили, что концентрация меди будет снижена у пациентов с эмфиземой.
Способы:
ТМ
Сначала авторы измерили уровень меди в сыворотке крови пациентов с эмфиземой (n = 10) и контрольной группы (n = 10). Впоследствии авторы собрали конденсат выдыхаемого воздуха (EBC) с помощью RTube (Respiratory Research; www.repiratoryresearch.com) и измерили уровни меди.
Результаты:
В отличие от гипотезы авторов, уровень меди в сыворотке не снижался, а повышался у пациентов с эмфиземой (фиг. 3). Однако концентрации меди в EBC были снижены у пациентов с эмфиземой по сравнению с контрольной группой.
Выводы:
При эмфиземе наблюдается локальный легочный дефицит и отсутствует системный дефицит меди.
5. Концентрация меди в биопсиях легкого
Научный замысел:
Поскольку медь является важнейшим кофактором для активации ферментов LOX, авторы предположили, что концентрация меди будет снижена у пациентов с эмфиземой и повышена у пациентов с IPF.
Способы:
Авторы измерили концентрации меди в паренхиме легких пациентов с эмфиземой, IPF и CPFE.
Результаты:
Авторы обнаружили, что концентрация меди действительно снижалась при эмфиземе и увеличивалась при фиброзе по сравнению с контрольными легкими (фиг. 4). Авторы также обнаружили сильный градиент концентраций меди между паренхимой апикальной части легкого с эмфиземой (низкие уровни меди) и базальной части легкого с фиброзом (высокие уровни меди) в легких пациентов с CPFE. Объяснение авторами этих удивительных различий в концентрациях меди в легких CPFE заключается в том, что доставка меди в верхние зоны легких намного ниже, чем в нижние зоны легких, что кажется логичным, учитывая, что апикальные зоны легких очень плохо орошаются.
Выводы:
Ингаляционная терапия с применением меди предпочтительнее системного пути введения, (а) поскольку верхние части легких вентилируются намного лучше, чем орошаются, и (b) поскольку существует местный и системный дефицит меди. Существует также третья важная причина предпочтения ингаляционной терапии медью относительно перорального введения. Уровни меди в сыворотке положительно связаны с риском развития болезни Альцгеймера [38]. Для достижения тех же концентраций меди в легких (особенно в апикальных зонах легких) при ингаляционной терапии необходимы гораздо более низкие дозы меди, чем при пероральной терапии. Авторы интратрахеально вводили медь мышам и действительно не обнаружили влияния этого вмешательства на концентрацию меди в мозге.
Высокие концентрации меди в паренхиме легких у пациентов с IPF и в базальных областях легких с фиброзом у пациентов с CPFE легли в основу опасений авторов, заключающихся в том, что стимуляция активации ферментов LOX с помощью ингаляционной терапии медью будет стимулировать сшивку коллагена и тем самым созревание/организацию коллагена, поскольку ферменты LOX являются сшивающими агентами не только эластина, но и коллагена [39]. Индуцированное медью накопление коллагена в легком с эмфиземой будет вредным, так как (а) уровни коллагена уже повышены в легких с эмфиземой и (b) оно может вызвать переход от эмфиземы к фиброзу (то есть переход одного тяжелого заболевания легких в другое).
Таким образом, авторы пришли к выводу, что следует комбинировать медь с одним или более другими ингредиентами в данном составе для ингаляций, чтобы предотвратить индуцированное медью накопление коллагена.
6a. Культура клеток фибробластов с добавлением меди
Научный замысел:
Основываясь на том, что дефицит меди является наиболее вероятной причиной неэффективного процесса восстановления эластина у пациентов с эмфиземой, авторы предположили, что добавление меди будет стимулировать процесс развития/восстановления эластина за счет активации большего количества ферментов LOX.
Способы:
Фибробласты выращивали в течение 21 дня, после чего их лизировали, и экстрагировали мРНК. Среду пополняли дважды в неделю. qPCR осуществляли для измерения экспрессии генов LOX, LOXL1 и эластина (ELN, кодирующего тропоэластин). Активность LOX измеряли с применением набора Amplite Fluorimetrix LOX Assay Kit (AAT Bioquest, Саннивейл, Калифорния, США). Общий нерастворимый эластин, отложившийся в клеточных слоях, и растворимый тропоэластин измеряли с помощью набора для анализа Fastin™ Elastin assay kit (Biocolor, Великобритания). Уровни DES измеряли с применением способа жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии в больнице Canisius-Wilhelmina (Неймеген, Нидерланды), как описано ранее [9]. Коллаген в среде и матриксе количественно определяли с помощью Sircol™ INSOLUBLE Collagen Assays (Biocolor, UK). Сначала авторы измерили уровень меди в среде фибробластов. Затем мы добавили дополнительный сульфат меди в возрастающих концентрациях, т.е. + 0,5 * начальная концентрация меди в среде фибробластов, + 1 * начальная концентрация меди, + 2 * начальная концентрация меди, + 4 * начальная концентрация меди, + 8 * начальная концентрация меди, + 16 * начальная концентрация меди и + 32 * начальная концентрация меди, чтобы осуществить зависимость доза-ответ между концентрацией меди и другими переменными.
Результаты:
Сульфат меди увеличивал экспрессию генов LOX и LOXL1, активность LOX, уровни DES (все благоприятные; фиг. 5), а также уровни нерастворимого коллагена (неблагоприятные) дозозависимым образом. Сульфат меди не влиял на экспрессию гена ELN.
Выводы:
Добавление дополнительного сульфата меди к среде для культивирования клеток оказало благоприятный стимулирующий эффект на накопление сшитых волокон эластина; однако он также оказывал неблагоприятное стимулирующее действие на накопление нерастворимого коллагена. Кривая доза-ответ, в отношении уровней DES достигает максимума при концентрации меди примерно +8* начальная концентрация меди в среде фибробластов (фиг. 5).
6b. Культуры клеток фибробластов для тестирования потенциальных синергетических эффектов ретиноевой кислоты, миноксидила и гепарина помимо сульфата меди
Научный замысел:
Во второй части исследований клеточных культур авторы оценили, стимулирует ли добавление других веществ к сульфату меди дополнительно процесс развития/восстановления эластина.
Способы:
Авторы добавляли ретиноевую кислоту, миноксидил и гепарин в обогащенную медью среду фибробластов (концентрация меди + 8*начальная концентрация меди в среде фибробластов).
Результаты
:
(фиг. 6)В отличие от монотерапии сульфатом меди добавление ретиноевой кислоты к сульфату меди оказало стимулирующее действие на экспрессию гена ELN и уровни тропоэластина. Добавление ретиноевой кислоты к сульфату меди также оказывало дополнительный стимулирующий эффект на уровни нерастворимого эластина; однако ретиноевая кислота не оказывала дополнительного эффекта на уровни DES. Ретиноевая кислота не оказывала дополнительного эффекта к монотерапии сульфатом меди на экспрессию генов LOX и LOXL1. Добавление миноксидила к сульфату меди оказало стимулирующее действие на экспрессию генов LOX, LOXL1, ELN и фибулина-5. Добавление миноксидила к сульфату меди оказало дополнительный стимулирующий эффект на уровни тропоэластина, нерастворимого эластина и DES по сравнению с монотерапией сульфатом меди. Добавление миноксидила к сульфату меди не оказало дополнительного стимулирующего эффекта на накопление коллагена по сравнению с монотерапией сульфатом меди; однако добавление миноксидила не оказало подавляющего действия на накопление коллагена. Добавление гепарина к сульфату меди не имело дополнительного эффекта по сравнению с монотерапией сульфатом меди на экспрессию генов LOX, LOXL1, ELN и фибулина-5; и не влияло на уровни тропоэластина. Добавление гепарина к сульфату меди оказало небольшое стимулирующее действие на общий уровень нерастворимого эластина по сравнению с монотерапией сульфатом меди; однако это не оказало дополнительного влияния на уровни DES. Что еще более важно и удивительно, добавление гепарина к сульфату меди оказало сильное подавляющее действие на накопление коллагена по сравнению с монотерапией сульфатом меди.
Выводы:
Добавление ретиноевой кислоты, миноксидила и гепарина имело некоторые дополнительные эффекты на процессы развития и восстановления эластина по сравнению с монотерапией сульфатом меди. Удивительно, но добавление гепарина к сульфату меди оказало сильное ингибирующее действие на уровень коллагена. Из этого исследования авторы пришли к выводу, что гепарин, по-видимому, является идеальным дополнением к меди для лечения пациентов с эмфиземой, чтобы предотвратить накопление коллагена, вызванное медью.
6c. Культуры клеток фибробластов для тестирования потенциальных синергических эффектов витамина К и сульфата магния помимо сульфата меди
Научный замысел:
В третьей части исследований клеточных культур авторы оценили, будет ли добавление других веществ к сульфату меди ингибировать скорость разрушения эластина.
Способы:
Авторы добавили витамин K1, витамин K2 и сульфат магния в обогащенную медью среду фибробластов (концентрация меди +8 *начальная концентрация меди в среде фибробластов).
Результаты:
Добавление витамина K1, K2 и сульфата магния к сульфату меди не оказало стимулирующего эффекта на экспрессию гена ELN, уровни тропоэластина или на экспрессию генов LOX и LOXL1. Однако добавление витаминов K1, K2 и сульфата магния к сульфату меди оказало дополнительный стимулирующий эффект на уровни нерастворимого эластина и накопление DES (фиг. 7). Добавление витамина K1, витамина K2 и сульфата магния к сульфату меди не оказало дополнительного стимулирующего эффекта на накопление коллагена по сравнению с монотерапией сульфатом меди; однако добавление витамина K1, витамина K2 и сульфата магния не оказало подавляющего действия на накопление коллагена.
Выводы:
Добавление витамина K1, витамина K2 и сульфата магния оказало дополнительное влияние на накопление эластина и DES по сравнению с монотерапией сульфатом меди. Наиболее вероятной механической причиной этого эффекта является ингибирующее действие витамина K1, витамина K2 и сульфата магния на разрушение эластина, поскольку витамин K1, витамин K2 и сульфат магния не оказывали никакого влияния на процессы развития эластина. На основании этого исследования авторы пришли к выводу, что витамин K1, витамин K2 и сульфат магния, по-видимому, являются подходящими дополнениями к меди для лечения пациентов с эмфиземой, чтобы замедлить скорость деградации эластина.
7. Эмфизема, вызванная интратрахеальным введением эластазы поджелудочной железы свиней
Научный замысел:
Основываясь на очень многообещающих эффектах добавления гепарина к сульфату меди на метаболизм эластина и коллагена в исследованиях клеточных культур, авторы дополнительно оценили эти эффекты на модели эмфиземы на животных.
Способы:
in vivo
Чтобы оценить влияние сульфата меди и гепарина на метаболизм эластина и коллагена , авторы применяли модель эмфиземы поджелудочной железы свиней, индуцированную эластазой поджелудочной железы (PPE). Исследование было проведено на самцах мышей BALB/c в возрасте 7 недель с начальной массой тела примерно 25 г. В течение периода исследования всех мышей содержали в обычных вивариях для животных с циклом свет-темнота 12/12 часов в клетках с верхними фильтрами, и они получали гранулированный корм и воду ad libitum. 1,5 Ед. эластазы поджелудочной железы свиньи в 25 мкл физиологического раствора вводили интратрахеально в день 1 под легкой анестезией. 25 мкл монотерапии сульфатом меди (12,5 мкг в 25 мкл физиологического раствора; n = 4), комбинация сульфата меди (12,5 мкг в 12,5 мкл физиологического раствора)/гепарин (1000 МЕ в 12,5 мкл физиологического раствора; n = 4) или плацебо (25 мкл физиологического раствора; n = 4) вводили интратрахеально под легкой анестезией на 1, 8, 15, 22 и 29 день. На 35 день мышам вводили внутрибрюшинную анестезию смесью ксилазина (8,5 мг/кг) и кетамина (130 мг/кг), им выполняли трахеотомию и всё тело помещали в плетизмограф для оценки функции легких. После измерения функции легких мышей умерщвляли внутрисердечным введением пентобарбитала. Левое легкое мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 °C для последующих исследований экспрессии генов, в которых измеряли ELN, LOX и LOXL1. Правое легкое фиксировали в 6% параформальдегиде при постоянном гидростатическом давлении 25 см столба жидкости в течение 24 часов. После дегидратации и заливки в парафин сагиттальные срезы окрашивали различными красителями и применяли для гистологического анализа для измерения увеличения воздушного пространства (средний линейный отрезок); и впоследствии это легкое применяли для измерения концентраций как DES, так и нерастворимого коллагена. Мозг извлекали для измерения концентрации меди.
Результаты:
В тестах на функцию легких мышей из группы плацебо присутствовало большее чрезмерное растяжение, чем из групп сульфата меди и сульфата меди/гепарина (фиг. 8). Уровни DES в легочной ткани были выше у мышей, получавших сульфат меди и сульфат меди/гепарин, чем у мышей, получавших плацебо (фиг. 9). Средний линейный отрезок был ниже у мышей, получавших сульфат меди и сульфат меди/гепарин, чем у мышей, получавших плацебо (фиг. 8, 10 и 11). Уровни нерастворимого коллагена и гидроксипролина были повышены у мышей, получавших монотерапию сульфатом меди, по сравнению с плацебо (фиг. 9). Уровни нерастворимого коллагена и гидроксипролина были значительно ниже у мышей, получавших сульфат меди/гепарин, по сравнению с мышами, получавшими монотерапию сульфатом меди, и немного ниже по сравнению с мышами, получавшими плацебо. Гепарин хорошо известен как антикоагулянт; однако гепарин, введенный интратрахеально, не оказал никакого эффекта на системную коагуляцию у мышей.
Выводы:
Авторы обнаружили, что сульфат меди очень эффективно стимулировал процесс восстановления эластина, но также индуцировал накопление и созревание коллагеновых волокон в легких. Комбинация сульфата меди и гепарина очень эффективно способствовала восстановлению поврежденных волокон эластина (даже лучше, чем монотерапия сульфатом меди), и авторы обнаружили, что, в отличие от монотерапии сульфатом меди, сульфат меди и гепарин не приводит к накоплению коллагена. Уровни коллагена и гидроксипролина после лечения сульфатом меди/гепарином были даже ниже, чем после лечения плацебо. Таким образом, вдыхаемый гепарин является идеальным соединением в качестве адъюванта к составу для ингаляции с медью для предотвращения индуцированного медью накопления коллагена и стимуляции процесса восстановления эластина.
8. Анализ распыления посредством небулайзера растворов гепарина натрия и сульфата меди методом лазерной дифракции
Научный замысел:
Важно знать, является ли распыление раствора, состоящего как из гепарина, так и из меди, с помощью традиционно используемой распылительной системы возможным, и приводит ли это к соответствующему процентному содержанию частиц размером < 5 мкм.
Способы 1:
Авторы начали свои эксперименты по распылению с относительно низкими концентрациями меди и гепарина. 26 мг гепарина натрия (191 МЕ/мг) растворяли в 1 мл 0,9% хлорида натрия, и 12,5 мг сульфата меди (5 мг меди) растворяли в 10 мл 0,9% хлорида натрия, из которых применяли 1 мл. 3 мл 0,9% хлорида натрия добавляли к 1 мл раствора гепарина натрия (5000 МЕ) и 1 мл раствора сульфата меди (0,5 мг меди). 5 мл раствора для распыления загружали в небулайзер многоразового применения (PARI LC Plus) и распыляли с помощью компрессора (PARI BOY SX). Аэрозоль анализировали каждые 30 секунд с применением лазерного дифракционного анализа (LDA), когда небулайзер начал распылять.
Результаты 1:
10
50
90
10
50
90
Время распыления составляло примерно 3 минуты. X составлял 0,81 мкм, X составлял 2,34 мкм, и X составлял 6,58 мкм. Процент частиц <5 мкм составлял 82,44% (фиг. 12). Было проведено повторное измерение эксперимента 1: время распыления составляло примерно 3 минуты, X составлял 0,80 мкм, X составлял 2,29 мкм, X составлял 6,34 мкм, и процент частиц <5 мкм составлял 83,58% (фиг. 13).
Способы 2:
100000 МЕ гепарина сульфата и 1 мг меди объединяли в растворе и добавляли 0,9% хлорид натрия до общего объема 5 мл.
Результаты 2:
10
50
90
10
50
90
Время распыления составляло примерно 4 минуты. X составлял 0,80 мкм, X составлял 2,32 мкм, и X составлял 6,86 мкм (фиг. 14). Процент частиц <5 мкм составлял 82,13%. Было проведено повторное измерение эксперимента 2: время распыления составляло примерно 5 минут, X составлял 0,80 мкм, X составлял 2,33 мкм, X составлял 7,05 мкм, и процент частиц <5 мкм составлял 81,19% (фиг. 15).
Выводы:
Возможно комбинировать гепарин и медь в составе для распыления с помощью небулайзера, и применение традиционно применяемой системы распыления приводит к высокому проценту частиц размером <5 мкм, которые могут эффективно достигать целевых альвеолярных областей в легких человека.
Перечень ссылок
1. From the Global Strategy for the Diagnosis, Management and Prevention of COPD, Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) 2017. Available from: http://goldcopd.org.
Elastin and collagen remodeling in emphysema. A scanning electron microscopy study.
2. Finlay GA, O'Donnell MD, O'Connor CM, et al.  Am J Pathol. 1996;149:1405-15.
Matrix elastin: a promising biomarker for chronic obstructive pulmonary disease.
3. Turino GM, Ma S, Lin YY, et al.  Am J Respir Crit Care Med. 2011;184:637-41.
Elastin.
4. Mithieux SM, Weiss AS.  Adv Protein Chem. 2005;70:437-61.
Liberation of desmosine and isodesmosine as amino acids from insoluble elastin by elastolytic proteases.
5. Umeda H, Aikawa M, Libby P.  Biochem Biophys Res Commun. 2011;411:281-6.
Elastolysis of normal and partially cross-linked elastin. Biochem Int.
6. Bostancioglu K, Mecham RP, Wallach JM.  1987;15:263-9.
Elastin metabolism during recovery from impaired crosslink formation.
7. Tinker D, Romero-Chapman N, Reiser K, et al.  Arch Biochem Biophys. 1990;278:326-32.
Elastic fiber homeostasis requires lysyl oxidase-like 1 protein.
8. Liu X, Zhao Y, Gao J, et al.  Nat Genet. 2004;36:178-82.
The Effect of Alpha-1 Proteinase Inhibitor on Biomarkers of Elastin Degradation in Alpha-1 Antitrypsin Deficiency: An Analysis of the RAPID/RAPID Extension Trials.
9. Ma S, Lin YY, Cantor JO, et al.  Chronic Obstr Pulm Dis. 2016;4:34-44.
Similar matrix alterations in alveolar and small airway walls of COPD patients.
10. Eurlings IM, Dentener MA, Cleutjens JP, et al.  BMC Pulm Med. 2014;14:90.
Enhanced bronchial expression of extracellular matrix proteins in chronic obstructive pulmonary disease.
11. Kranenburg AR, Willems-Widyastuti A, Moori WJ, et al.  Am J Clin Pathol. 2006;126:725-35.
Tropoelastin production and tropoelastin messenger RNA activity. Relationship to copper and elastin cross-linking in chick aorta.
12. Tinker D, Geller J, Romero N, et al.  Biochem J. 1986;237:17-23.
Systemic elastin degradation in chronic obstructive pulmonary disease.
13. Maclay JD, McAllister DA, Rabinovich R, et al.  Thorax. 2012;67:606-12.
Extracellular matrix in cutaneous ageing: the effects of 0.1% copper-zinc malonate-containing cream on elastin biosynthesis.
14. Mahoney MG, Brennan D, Starcher B, et al.  Exp Dermatol. 2009;18:205-11.
The lung of the copper-deficient rat. A model for developmental pulmonary emphysema.
15. O'Dell BL, Kilburn KH, McKenzie WN, et al.  Am J Pathol. 1978;91:413-32.
Mechanisms of lung injury in the copper-deficient hamster model of emphysema.
16. Soskel NT, Watanabe S, Sandberg LB.  Chest. 1984;85(6 Suppl):70S-73S.
Severity of elastase-induced emphysema is decreased in tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1beta receptor-deficient mice.
17. Lucey EC, Keane J, Kuang PP, et al.  Lab Invest. 2002;82:79-85.
Lymphoid tissue and emphysema in the lungs of transgenic mice inducibly expressing tumor necrosis factor-alpha.
18. Vuillemenot BR, Rodriguez JF, Hoyle GW.  Am J Respir Cell Mol Biol. 2004;30:438-48.
Copper Deficiency in the Lungs of TNF-α Transgenic Mice.
19. Liu L, Geng X, McDermott J, et al.  Front Physiol. 2016;7:234.
COMMD1 and ion transport proteins: what is the COMMection? Focus on "COMMD1 interacts with the COOH terminus of NKCC1 in Calu-3 airway epithelial cells to modulate NKCC1 ubiquitination".
20. McDonald FJ.  Am J Physiol Cell Physiol. 2013;305:C129-30.
The copper dependent-lysyl oxidases contribute to the pathogenesis of pulmonary emphysema in chronic obstructive pulmonary disease patients.
21. Besiktepe N, Kayalar O, Ersen E, et al.  J Trace Elem Med Biol. 2017;44:247-55.
Exhaled metallic elements and serum pneumoproteins in asymptomatic smokers and patients with COPD or asthma.
22. Mutti A, Corradi M, Goldoni M, et al.  Chest. 2006;129:1288-97.
Severe bilateral panlobular emphysema and pulmonary arterial hypoplasia: unusual manifestations of Menkes disease.
23. Grange DK, Kaler SG, Albers GM, et al.  Am J Med Genet A. 2005;139A:151-5.
Inhaled nebulised unfractionated heparin improves lung function in moderate to very severe COPD: A pilot study.
24. Shute JK, Calzetta L, Cardaci V, et al.  Pulm Pharmacol Ther. 2018;48:88-96.
Therapeutic use of heparin and derivatives beyond anticoagulation in patients with bronchial asthma or COPD.
25. Shute JK, Puxeddu E, Calzetta L.  Curr Opin Pharmacol. 2018;40:39-45.
Prevention of abdominal aortic aneurysm progression by oral administration of green tea polyphenol in a rat model.
26. Setozaki S, Minakata K, Masumoto H, et al.  J Vasc Surg. 2017;65:1803-12.
Elastin stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms.
27. Isenburg JC, Simionescu DT, Starcher BC, et al.  Circulation. 2007;115:1729-37.
Elasto-regenerative properties of polyphenols.
28. Sinha A, Nosoudi N, Vyavahare N.  Biochem Biophys Res Commun. 2014;444:205-11.
Vitamin a deficiency and alterations in the extracellular matrix.
29. Barber T, Esteban-Pretel G, Marín MP, et al. Nutrients. 2014;6:4984-5017.
All trans-retinoic acid selectively down-regulates matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and up-regulates tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) in human bronchoalveolar lavage cells.
30. Frankenberger M, Hauck RW, Frankenberger B, et al.  Mol Med. 2001;7:263-70.
Inhaled aerosolization of all-trans-retinoic acid for targeted pulmonary delivery.
31. Brooks AD, Tong W, Benedetti F, et al.  Cancer Chemother Pharmacol. 2000;46:313-8.
Inhaled all-trans retinoic acid in an individual with severe emphysema.
32. Frankenberger M, Heimbeck I, Möller W, et al.  Eur Respir J. 2009;34:1487-9.
Treatment with Minoxidil Induces Elastic Fiber Neosynthesis and Functional Improvement in the Aorta of Aged Mice.
33. Coquand-Gandit M, Jacob MP, Fhayli W, et al. Chronic  Rejuvenation Res. 2017;20:218-30.
Potassium channel openers increase aortic elastic fiber formation and reverse the genetically determined elastin deficit in the BN rat.
34. Slove S, Lannoy M, Behmoaras J, et al.  Hypertension. 2013;62:794-801.
Stimulation of elastin expression by minoxidil in chick skin fibroblasts.
35. Tajima S, Hayashi A, Suzuki T, et al.  Arch Dermatol Res. 1995;287:494-7.
Minoxidil stimulates elastin expression in aortic smooth muscle cells.
36. Hayashi A, Suzuki T, Wachi H, et al.  Arch Biochem Biophys. 1994;315:137-41.
Effects of chronic treatment with a low dose of nicorandil on the function of the rat aorta during ageing.
37. Raveaud S, Mezin P, Lavanchy N, et al.  Clin Exp Pharmacol Physiol. 2009;36:988-94.
Serum Copper, Zinc, and Iron Levels in Patients with Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis of Case-Control Studies.
38. Li DD, Zhang W, Wang ZY, et al.  Front Aging Neurosci. 2017;9:300.
Copper and the synthesis of elastin and collagen.
39. Harris ED, Rayton JK, Balthrop JE, et al.  Ciba Found Symp. 1980;79:163-82.
Хотя настоящее изобретение было описано в связи с проиллюстрированными вариантами реализации, следует понимать, что они не предназначены для ограничения этими вариантами реализации. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в настоящее изобретение, как определено прилагаемой формулой изобретения.