НЕРЕПЛИЦИРУЮЩИЕСЯ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ЗАЩИЩАЮЩИЕ ПРОТИВ ИНФЕКЦИЙ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
NON-REPLICATING PROBIOTIC MICROORGANISMS PROTECTING AGAINST INFECTIONS OF UPPER AIRWAY

Настоящее изобретение относится к нереплицирующимся пробиотическим микроорганизмам и оказываемой ими пользе для здоровья. Например, настоящее изобретение относится к содержащей нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы композиции, предназначенной для применения в профилактики инфекций верхних дыхательных путей и/или их симптомов. Воплощения настоящего изобретения предоставляют средство, помогающее родителям защищать их детей от таких инфекций верхних дыхательных путей.
Организмы, производящие в качестве главного метаболического компонента молочную кислоту, известны на протяжении длительного времени. Эти бактерии могут быть найдены в молоке или, соответственно, на молочных заводах, на живых или разлагающихся растениях, а также в кишечнике человека и животных. Эти микроорганизмы, совокупно именуемые термином «молочнокислые бактерии», представляют довольно неоднородную группу и содержат, например, роды Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus и т.д.
Молочнокислые бактерии применяются в качестве сбраживающих агентов для сохранения пищевых продуктов, получающих выгоды от низкого pH и действия продуктов ферментации, вырабатываемых в ходе ферментативной активности, с тем, чтобы замедлить рост бактерий, вызывающих порчу. Кроме того, молочнокислые бактерии также используются для приготовления из молока множества различных пищевых продуктов, таких как сыры, йогурты и другие ферментированные молочные продукты. Совсем недавно молочнокислые бактерии стали привлекать повышенное внимание в связи с обнаружение того, что некоторые штаммы демонстрируют ценные качества при приеме внутрь человеком или животным. В частности, найдено, что определенные штаммы Lactobacillus или Bifidobacterium способны колонизировать слизистую оболочку кишечника и содействовать обеспечению хорошего самочувствия человека или животного.
В этом отношении EP 0768375 раскрывает специфические штаммы рода Bifidobacterium, которые способны внедряться в кишечную флору и могут удерживаться на кишечных клетках. Сообщается, что эти Bifidobacteria, обладая способностью конкурентно исключать адгезию к кишечным клеткам патогенных бактерий, тем самым помогают в иммуномодуляции и поддержании здоровья человека.
Также исследования сосредоточилось на потенциале применения молочнокислых бактерий в качестве пробиотических агентов. Пробиотиками считаются жизнеспособные микробные препараты, которые способствуют поддержанию здоровья индивидуума посредством сохранения естественной микрофлоры кишечника. Полагают, что пробиотики прикрепляются к слизистой оболочке кишечника, колонизируют кишечный тракт и таким образом препятствуют закреплению на ней вредных микроорганизмов. Критически важное условие для осуществления их активности состоит в том, что они должны достичь слизистой оболочки кишечника в надлежащей и жизнеспособной форме и не разрушались бы в верхней части желудочно-кишечного тракта, в частности, под действием преобладающего в желудке низкого pH.
При этом часть исследовательских усилий направлена на обеспечение новых штаммов пробиотических бактерий, способных показывать новые полезные свойства для людей и/или животных, таких как домашние животные.
В этой связи WO 2008042101 предлагает способы снижения заболеваемости детей респираторными заболеваниями, содержащие: обеспечение культуры L. acidophilus; обнаружение детей, подверженных риску развития респираторных заболеваний; и введение культуры L. acidophilus детям с повышенным риском при таких условиях, которые снижают риск респираторных заболеваний.
Однако такое добавление живых пробиотических бактерий к продуктам, чтобы они оставались жизнеспособными до момента потребления, представляет собой нетривиальную задачу. Особенно труднодостижимо это для продуктов с длительными сроками хранения и может потребовать дополнительных технических усилий.
Поэтому было бы желательным иметь в наличии композицию, которая могла бы предоставлять полезные пробиотические эффекты, являясь при этом несложной в приготовлении и пригодной для хранения без потери активности.
Цель авторов настоящего изобретения состоит в предоставлении композиции, которая помогала бы родителям защищать себя и их детей от инфекций верхних дыхательных путей. Такая композиция должна быть несложной в приготовлении, а ее активность должна сохраняться высокой даже в условиях возможного хранения продукта в течение длительного времени. Такая композиция должна позволять безопасное осуществление терапии или профилактики инфекций верхних дыхательных путей без побочных эффектов. Должно быть уменьшено время протекания инфекций верхних дыхательных путей. Также должен быть снижен риск приобретения инфекций верхних дыхательных путей.
То есть цель настоящего изобретения состоит в обеспечении в данной области композиции, которая обращалась бы к одной или нескольким представленным выше потребностям.
Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что они могут достигнуть этого с помощью объектов независимых пунктов формулы изобретения. Основную идею настоящего изобретения развивают дополнительные пункты формулы изобретения.
Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, предназначенные для применения в профилактике или терапии инфекций верхних дыхательных путей.
Настоящее изобретения также относится к применению нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов для приготовления композиции, предназначенной для профилактики или терапии инфекций верхних дыхательных путей.
Композиции настоящего изобретения могу применяться для введения в течение осеннего и/или зимнего периода. В это время вероятность приобретения инфекций верхних дыхательных путей особенно высока.
Например, композиции могут предназначаться для приема утром с тем, чтобы укрепить защитную систему организма против инфекций верхних дыхательных путей в течение дня.
Композиция настоящего изобретения может предназначаться для приема людьми или домашними животными. Домашние животные могут быть, например, собаками или кошками.
Дети весьма вероятно приобретают инфекции верхних дыхательных путей, поскольку они вступают в тесный контакт со многими другими людьми, например, в школе или в детском саду.
Поэтому композиция настоящего изобретения может быть применимой для назначения детям, например, маленьким детям или младенцам.
У людей дети имеют возраст вплоть до 18 лет. Маленькие дети имеют возраст вплоть до 12 лет, а младенцами являются дети младше 12 месяцев.
«Нереплицирующиеся» пробиотические микроорганизмы включают пробиотические бактерии, подвергнутые тепловой обработке. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствующими в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения или материалы клеточной оболочки.
«Нереплицирующиеся» означает, что никаких жизнеспособных клеток и/или колониеобразующих единиц классическими методами культивирования обнаружено быть не может. Такие классические методы культивирования сведены воедино в книге по микробиологии James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology («Современная микробиология пищевых продуктов»). 7 издание, Springer Science, Нью-Йорк, N.Y. 790 стр. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть показано следующим образом: отсутствие каких-либо видимых колоний на чашках с агаровой средой или отсутствие возрастающего помутнения в жидкой среде для выращивания после засева бактериальными препаратами в различных концентрациях («нереплицирующиеся» образцы) и выдерживания в подходящих условиях (аэробная и/или анаэробная атмосфера на протяжении по меньшей мере 24 час).
Пробиотики для целей настоящего изобретения определяются как «препараты микробиологических клеток или компоненты микробиологических клеток, обладающие благотворным воздействием на состояние здоровья или самочувствие организма». (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. и др. "Probiotics: how should they be defined" («Пробиотики: как их следует определять») Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Возможность применения нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов предлагает несколько преимуществ. У младенцев или маленьких детей с серьезными иммунными нарушениями применение живых пробиотиков может быть ограничено исключительными случаями, обусловленными наличием потенциального риска развития бактериемии. Нереплицирующиеся пробиотики могут применяться безо всяких проблем.
Помимо этого, снабжение нереплицирующимися пробиотическими микроорганизмами делает возможным восстановление в горячей воде при сохранении полезных для здоровья качеств.
Композиция настоящего изобретения может быть любым видом композиции, подходящей для введения людям или домашним животным. Соответственно, данная композиция может быть пищевым продуктом, кормовым продуктом для домашнего животного, нутрицевтиком, пищевой добавкой, порошкообразной питательной композицией, добавкой к пищевому продукту или напитком.
Инфекции верхних дыхательных путей могут выбираться из группы, состоящей из ринита, риносинусита, назофарингита, фарингита, эпиглоттита, ларингита, ларинготрахеита, трахеита или их комбинаций.
Симптомы инфекций верхних дыхательных путей могут выбираться из группы, состоящей из кашля, боли в горле, выделений из носа, заложенности носа, головной боли, слабых проявлений лихорадки, ощущение давления в области лица, чихания и их комбинаций.
Так как инфекции верхних дыхательных путей обычно ассоциируются с дискомфортом, ухудшением производительности и потерей концентрации, имеется необходимость в защите детей против инфекций верхних дыхательных путей.
Авторы данного изобретения с удивлением обнаружили, что, например, в отношении укрепления иммунной системы и/или с точки зрения противовоспалительного действия нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы могут быть даже более эффективными, чем реплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
Помимо этого, нереплицирующиеся, подвергнутые тепловой обработке La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225) вызвали выраженную экспрессию дефензина. Дефензины представляют один из наиболее важных классов антимикробных пептидов у людей. Дефензины вырабатываются эпителиальными клетками легких, кожи, полости рта, мочеполового, дыхательного и желудочно-кишечного тракта. Среди них имеется семейство β-дефензинов, включающее дефензин 1 (hBDl) и 2 (hBD2). Например, было найдено, что подвергнутый тепловой обработке L. johnsonii (Lai, NCC 533, депозитарный номер CNCM 1-1225) активирует hBDl более сильно, чем его живая копия. HBD1 демонстрирует антибактериальную активность против широкого спектра бактерий, включая Е. coli и Pseudomonas aeruginosa, Н. pylori (Nuding, S., и др., 2009, Microbes.Infect. 11:384-393) и также против дрожжевых грибков, таких как Candida albicans (O′Neil, D.A. 2003, Mol. Immunol 40:445-450) и вирусы (вирус иммуннодефицита человека) (Kota, S. и др., 2008, J. Biol. Chem 283:22417-22429). Таким образом, эти антимикробные пептиды укрепляют мукозальный барьер и тем самым ограничивают бактериальную адгезию и инвазию.
Соответственно, композиция настоящего изобретения может быть предназначена для применения в целях защиты детей от инфекций верхних дыхательных путей.
В частности, композиция настоящего изобретения предоставляет родителям возможность защитить их детей от инфекций верхних дыхательных путей.
Композиция настоящего изобретения может также применяться для укрепления способности ребенка бороться с инфекциями верхних дыхательных путей. Активный образ жизни детей исключительно важен для их развития, но при этом также подразумевает контакт со многими возможными источниками инфекций. Сильные защитные механизмы против нежелательных инфекций будут содействовать их хорошему самочувствию.
Следовательно, композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть также предназначена для применения в целях содействия в менее частом приобретении детьми инфекций верхних дыхательных путей. Вероятность приобретения детьми инфекций верхних дыхательных путей может быть снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30% или предпочтительно по меньшей мере на 50%.
Улучшенные противовоспалительные свойства, улучшенная способность к укреплению иммунитета композиций настоящего изобретения и/или повышенная экспрессии дефензина композицией настоящего изобретения усиливают защитные механизмы, приводя к меньшему количеству инфекций верхних дыхательных путей.
Композиция настоящего изобретения также может быть предназначена для применения в целях сокращения времени протекания инфекций верхних дыхательных путей. Например, продолжительность инфекций верхних дыхательных путей может быть снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30% или предпочтительно по меньшей мере на 50%.
То есть нереплицирующиеся пробиотики настоящего изобретения представляют безопасную и естественную альтернативу лекарственной терапии.
Композиция настоящего изобретения может также содержать пребиотики. Пребиотики могут поддерживать рост пробиотиков до того, как те переводятся в нереплицирующееся состояние. Под «пребиотиком» подразумеваются неусваиваемые пищевые материалы, которые поддерживают рост полезных для здоровья микроорганизмов и/или пробиотиков в кишечнике. Они не подвергаются расщеплению в желудке и/или верхних отделах кишечника и не всасываются желудочно-кишечным трактом принимающего их человека, но они ферментируются желудочно-кишечной микробиотой и/или пробиотиками. Пребиотики, например, определяются публикацией Glenn R. Gibson and Marcel В. Roberfroid Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics (Диетическое модифицирование толстокишечной микробиоты человека: представление концепции пребиотиков), J. Nutr. 1995 125: 1401-1412.
Пребиотики, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, специальным образом не ограничиваются и включают все пищевые материалы, которые способствуют росту пробиотиков или полезных для здоровья микроорганизмов в кишечнике. Предпочтительно они могут выбираться из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащих фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности, растворимых волокон, волокон сои; инулина или их смесей. Предпочтительные пребиотики являются фруктоолигосахаридами (FOS), галактоолигосахаридами (IOS), изомальтоолигосахаридами (IMO), ксилоолигосахаридами (XOS), арабино-ксилоолигосахаридами (AXOS), маннанолигосахаридами (MOS), олигосахаридами сои, гликозилсахарозой (GS), лактосахарозой (LS), лактулозой (LA), палатинозоолигосахаридами (РАО), мальтоолигосахаридами, камедями и/или их гидролизатами, пектинами и/или их гидролизатами. Например, данные композиции могут содержать олигофруктозу, инулин или их комбинацию.
6
12
Композиция согласно настоящему изобретению может содержать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в любом эффективном количестве, например, в количестве, соответствующем по сухой массе до около 10-10 КОЕ/г.
Композиции настоящего изобретения содержат нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в количестве, достаточном для по меньшей мере частичного обеспечения благотворного воздействия на здоровье. Подходящее для обеспечения такого действия количество определяется как «терапевтически эффективная доза». Эффективные для этих целей количества зависят от многих известных специалистам в данной области факторов, таких как масса тела и общее состояние здоровья ребенка, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.
При профилактических применениях композиции согласно изобретению назначаются восприимчивым или иным образом подверженным риску развития определенного заболевания индивидуумам в количестве, которое является достаточным для по меньшей мере частичного снижения риска развития такого заболевания. Такое количество определяется как представляющее собой «профилактически эффективную дозу». Аналогично, точные количества зависят от ряда таких факторов, как состояние здоровья и масса ребенка, а также от эффекта, оказываемого матрицей пищевого продукта.
Специалисты в данной области смогут отрегулировать терапевтически эффективную дозу и/или, соответственно, профилактически эффективную дозу.
В целом композиция настоящего изобретения содержит нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.
Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в диапазоне около 0,005 мг - 1000 мг нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов в сутки.
4
12
4
12
В численном выражении подвергнутые «кратковременной высокотемпературной» обработке нереплицирующиеся микроорганизмы могут присутствовать в композиции в количествах, эквивалентно соответствующих между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, поэтому этот термин следует понимать как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получается из от 10 до 10 КОЕ/г реплицирующихся бактерий. Они включает микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержит данная композиция, вне зависимости от того, являются ли они на самом деле живыми, инактивированными, мертвыми или фрагментированными, или же представляют собой смесь любых из этих состояний, выражается в терминах способности данного количества микроорганизмов образовывать колонии (КОЕ), как если бы все эти микроорганизмы являлись бы живыми.
4
9
5
9
Предпочтительно нереплицирующиеся микроорганизмы присутствуют в количестве, эквивалентном величине между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции, еще более предпочтительно в количестве, эквивалентном величине между 10 и 10 КОЕ/г сухой композиции.
Пробиотики могут быть приведены в нереплицирующееся состояние любым известным в данной области способом.
Имеющиеся в настоящее время технологии, пригодные для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние, обычно представлены тепловой обработкой, γ-облучением, ультрафиолетовым светом или применением химических реагентов (формалин, параформальдегид).
Предпочтительной для приведения пробиотика в нереплицирующееся состояние была бы технология, которая являлась бы относительно простой в применении в производственных условиях пищевой промышленности.
Большинство представленных в настоящее время на рынке продуктов содержат пробиотики, подвергнутые в процессе их изготовления тепловой обработке. Поэтому было бы удобным иметь возможность обрабатывать пробиотики нагреванием либо вместе с вырабатываемым продуктом, либо по меньшей мере подобным способом, при том, чтобы пробиотики сохраняли или улучшали свои полезные качества, или даже приобретали бы новые полезные для потребителя свойства.
Однако инактивация пробиотических микроорганизмов тепловой обработкой по литературным данным, как правило, связана с по меньшей мере частичной потерей активности пробиотика.
Авторы настоящего изобретения в данное время с удивлением обнаружили, что приведение пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние, например, тепловой обработкой не приводит к потере полезных для здоровья качеств пробиотика, но, наоборот, может усиливать имеющийся благотворный эффект и даже приводить к созданию новых благоприятствующих здоровью свойств.
В этой связи одним воплощением настоящего изобретения является композиция, в которой нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы приводятся в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой.
Такая тепловая обработка может выполняться при по меньшей мере 71,5°C в течение по меньшей мере 1 секунды.
Может применяться как длительная тепловая обработка, так и кратковременная тепловая обработка.
В промышленных масштабах в настоящее время предпочтительными обычно являются способы краткосрочной тепловой обработки, такие как подобные UHT (ультравысокотемпературная) тепловой обработке. Этот вид тепловой обработки снижает бактериальную нагрузку и сокращает продолжительность обработки, тем самым снижая ухудшение качества питательных веществ.
Авторы данного изобретения впервые продемонстрировали, что пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при высоких температурах в течение непродолжительного времени, демонстрируют противовоспалительные иммунные профили независимо от своих исходных свойств. В частности, либо вырабатывается новой противовоспалительный профиль, либо существующий противовоспалительный профиль в результате такой тепловой обработки усиливается.
Поэтому теперь оказывается возможным вырабатывать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы с противовоспалительными иммунными профилями, применяя специальные параметры тепловой обработки, которые соответствуют типичным применяемым при тепловой обработке в промышленности, даже если их живые аналоги не являются штаммами, обладающими противовоспалительной активностью.
Поэтому тепловая обработка может представлять собой, например, высокотемпературную обработку при около 71,5-150°C в течение около 1-120 секунд. Высокотемпературная обработка может являться высокотемпературной/кратковременной (HTST) обработкой или ультравысокотемпературной (UHT) обработкой.
Пробиотические микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 71,5-150°C в течение короткого времени около 1-120 секунд.
Более предпочтительно микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 90-140°C, например, при 90-120°C в течение короткого времени около 1-30 секунд.
Эта высокотемпературная обработка переводит микроорганизмы, по меньшей мере частично, в нереплицирующееся состояние.
Высокотемпературная обработка может проводиться при нормальном атмосферном давлении, но также может быть выполнена под повышенным давлением. Типичные диапазоны давлений составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Очевидно, что предпочтительным будет, если пробиотики подвергаются тепловой обработке в питательной среде, которая при приложении теплоты является жидкостью или твердым веществом. Поэтому идеальная величина прикладываемого давления будет зависеть от природы композиции, которая обеспечивается микроорганизмами, и от используемой температуры.
Высокотемпературная обработка может выполняться в интервале температур около 71,5-150°C, предпочтительно около 90-120°C, еще более предпочтительно около 120-140°C.
Высокотемпературная обработка может проводиться в течение короткого времени около 1-120 секунд, предпочтительно около 1-30 секунд, еще более предпочтительно около 5-15 секунд.
Данный временной интервал относится ко времени, в течение которого пробиотические микроорганизмы подвергаются воздействию данной температуры. Следует заметить, что в зависимости от природы и количества обеспечиваемой микроорганизмами композиции, а также в зависимости от конструкции применяемого нагревательного устройства, продолжительность применяемого нагревания может изменяться.
Однако, как правило, композиция настоящего изобретения и/или микроорганизмы подвергаются высокотемпературной кратковременной (HTST) обработке, мгновенной пастеризации или ультравысокотемпературной () обработке.
обработка является ультравысокотемпературной обработкой или ультратепловой обработкой (обе сокращаются аббревиатурой UHT), включающей по меньшей мере частичную стерилизацию композиции при нагревании ее в течение короткого времени, приблизительно 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°C (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения в молоке спор бактерий. Например, такая обработка молока с помощью температур, превышающих 135°C, делает возможным снижение величины бактериальной нагрузки при таком обязательным времени пребывания (до 2-5 с), которое позволяет использовать режим непрерывного потока.
Есть два основных типа UHT-систем: прямые и непрямые системы. В прямой системе продукты обрабатываются впрыскиванием пара или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты подвергаются тепловой обработке с помощью пластинчатого теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. В процессе обработки продукта комбинации UHT-систем могут применяться на любом этапе или на ряде этапов.
Обработка HTST определяется следующим образом (высокая температура/короткое время): способ пастеризации, предназначенный для пятикратного по логарифмической шкале снижения количества жизнеспособных микроорганизмов в молоке с уничтожением 99,9999% их общего содержания. Это считается подходящим для истребления почти всех дрожжей, плесневых грибков и обычных вызывающих порчу бактерий, а также для обеспечения надлежащего уничтожения обычных патогенных теплоустойчивых организмов. При способе HTST молоко 15-20 секунд нагревается до 71,7°C (161°F).
Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Она выполняется перед расфасовкой в контейнеры для уничтожения вызывающих порчу микроорганизмов, придания продуктам большей безопасности и увеличения продолжительности их хранения. Жидкость двигается в контролируемом непрерывном потоке и при этом в течение около 15-30 секунд подвергается воздействию температур от 71,5°C (160°F) до 74°C (165°F).
Для целей настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» включает, например, кратковременную обработку при высокой температуре (HTST), UHT-обработку и мгновенную пастеризацию.
Так как такая тепловая обработка придает нереплицирующимся пробиотикам улучшенный противовоспалительный профиль, композиция настоящего изобретения может быть применена в профилактике или терапии воспалительных нарушений.
Если для приведения пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние применяется длительная тепловая обработка, такая тепловая обработка может осуществляться в интервале температур около 70-150°C в течение около 3 минут - 2 часов, предпочтительно в диапазоне 80-140°C от 5 минут до 40 минут.
В то время как существующий уровень техники в основном указывает, что бактерии, приведенные в нереплицирующееся состояние с помощью длительной тепловой обработки, обычно менее эффективны, чем живые клетки, в отношении проявления их пробиотических качеств, авторы настоящего изобретения смогли продемонстрировать, что подвергнутые тепловой обработке пробиотики превосходят свои живые аналоги в способности стимулировать иммунную систему.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пробиотические микроорганизмы, приведенные в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой в течение по меньшей мере около 3 минут при по меньшей мере около 70°C.
Усиливающее иммунную систему действие нереплицирующихся пробиотиков было подтверждено in vitro иммунным профилем. В применяемой in vitro модели используется цитокиновый профиль человеческих мононуклеаров периферической крови (РВМС) и хорошо принимается в данной области в качестве стандартной модели для исследования иммуномодулирующих соединений (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203).
Испытания РВМС in vitro применялись несколькими авторами / исследовательскими группами, например, для классифицирования пробиотиков согласно их иммунным профилям, то есть по их анти- или провоспалительным показателям (Kekkonen и др., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Было показано, например, что такие испытания позволяют прогнозировать противовоспалительное действие исследуемых пробиотиков в отношении кишечного колита в моделях на мышах (Foligne В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Более того, это испытание регулярно применяется в качестве показательного в клинических исследованиях и была продемонстрирована его способность представлять результаты, согласующиеся с клиническими данными (Schultz и др., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor и др., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).
За последние десятилетия непрерывно увеличивается распространенность аллергических заболеваний и в настоящее время они рассматриваются ВОЗ в качестве эпидемических. В общих чертах аллергия, как полагают, является следствием дисбаланса между иммунными ответами Th1 и Th2, приводящего к сильному сдвигу в сторону продуцирования медиаторов Th2. Поэтому аллергия может быть смягчена, подавлена или предотвращена посредством восстановления надлежащего соответствия между Th1 и Th2 компонентами иммунной системы. Это подразумевает необходимость в снижении Th2-ответов или усилении, по меньшей мере временном, ответа Th1. Последнее было бы показателем укрепления иммунной системы, часто сопровождаемого, например, высокими уровнями IFNγ, TNF-α и IL-12 (World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Viljanen M. и др., 2005, Allergy, 60, 494-500).
Композиция настоящего изобретения позволяет поэтому излечивать или предупреждать нарушения, связанные с повреждениями иммунной защиты.
Описанная в настоящем изобретении композиция позволяет также усиливать реакцию на вакцины, в частности, на пероральные вакцины.
Эффективными могут быть любые количества нереплицирующихся микроорганизмов. Однако предпочтительно, чтобы в целом по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являлись бы нереплицирующимися.
В одном воплощении настоящего изобретения все микроорганизмы являются нереплицирующимися.
Соответственно, в композиции настоящего изобретения по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, идеально по меньшей мере 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являются нереплицирующимися.
Для целей настоящего изобретения могут применяться любые пробиотические микроорганизмы.
Например, пробиотические микроорганизмы могут выбираться из группы, состоящей из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, пропионовокислых бактерий или их комбинаций, например, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и/или их смесей.
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может, например, содержать пробиотические нереплицирующиеся микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii Lai, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM17983, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 или их комбинаций.
Все эти штаммы были или депонированы согласно Будапештскому договору, и/или являются предлагаемыми в продаже.
Депонированными согласно Будапештскому договору являются следующие штаммы:
Bifidobacterium longum NCC 3001
ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705
CNCM I-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950
CNCM I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818
CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461
CNCM I-2116
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007
CGMCC 1.3724
Streptococcus themophilus NCC 2019
CNCM I-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059
CNCM I-4153
Lactococcus lactis NCC 2287
CNCM I-4154
Lactobacillus casei NCC 4006
CNCM I-1518
Lactobacillus casei NCC 1825
ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009
ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15
CNCM I-1198
Lactobacillus johnsonii Lai
CNCM I-1225
Lactobacillus reuteri DSM17983
DSM17983
Lactobacillus reuteri ATCC55730
ATCC55730
Escherichia coli Nissle 1917
DSM 6601
Штаммы, именуемые ATCC, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC Patent Depository), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, США.
Штаммы, именуемые CNCM, были депонированы в COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, Франция.
Штаммы, именуемые CGMCC, были депонированы в Китайском главном коллекционном центре микробиологических культур, Институт микробиологии Академии наук Китая, Zhongguancun, Р.О.Вох2714, Пекин 100080, Китай.
Штаммы, именуемые АСА-DC, были депонированы в Греческом координационном центре коллекций микроорганизмов, Лаборатория молочных продуктов, Отдел теоретических основ и технологии пищевых продуктов, Сельскохозяйственный университет Афин, 75, Ieraodos, Botanikos, Афины, 118 55, Греции.
Штаммы, именуемые DSM, были депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr., 7 B, 38124 Braunschweig, Германия.
Специалистам в данной области очевидно, что они могут свободно объединять все описанные здесь признаки настоящего изобретения без отступления от его раскрываемого здесь объема.
Дальнейшие признаки и преимущества настоящего изобретения будут явствовать из следующих далее чертежей и примеров.
Фигуры 1A и B показывают усиление противовоспалительных иммунных профилей пробиотиков, подвергнутых «кратковременной высокотемпературной обработке».
Фигура 2 показывает штаммы пробиотиков, не обладающие противовоспалительными качествами, которые становились противовоспалительными, то есть демонстрирующими выраженный противовоспалительный профиль in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.
Фигуры 3A и B показывают штаммы пробиотиков, применяемые в коммерчески доступных продуктах, которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки.
Фигуры 4A и B показывают штаммы молочной закваски (то есть заквасочные штаммы Lc1), которые демонстрируют усиленные или новоприобретенные противовоспалительные иммунные профили in vitro после кратковременной обработки при высоких температурах.
Фигура 5 показывает штамм пробиотика, не обладающий противовоспалительными качествами, который демонстрирует противовоспалительный иммунный профиль in vitro после HTST-обработки.
Фигура 6 - Метод главных компонент на данных РВМС (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10), демонстрируемых пробиотическими и молочными заквасочными штаммами в их живом и подвергнутом тепловой обработке (140°C в течение 15 секунд) состоянии. Каждая точка представляет один штамм, живой либо подвергнутый тепловой обработке и идентифицируемый его NCC-номером или названием.
Фигура 7 показывает отношения IL-12p40/IL-10 живых и подвергнутых тепловой обработке (85°C, 20 мин) штаммов. В целом тепловая обработка в течение 20 минут при 85°C приводит к возрастанию величин отношения IL-12p40/IL-10 по сравнению с кратковременной высокотемпературной обработкой настоящего изобретения (Фигуры 1, 2, 3,4 и 5).
Фигура 8 показывает повышение in vitro секреции цитокина из человеческих РВМС, стимулируемой подвергнутыми тепловой обработке бактериями.
Фигура 9 показывает процентную интенсивность диареи, наблюдаемой у OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации солевым раствором (отрицательный контроль), OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA (положительный контроль) и OVA-сенсибилизированных мышей, подвергнутых провокации OVA и терапии подвергнутыми тепловой обработке или живыми Bifidobacterium breve NCC2950. Результаты отображены в виде процента от интенсивности диареи (среднее ±SEM, рассчитанное по 4 независимым экспериментам) со 100% интенсивностью диареи, соответствующей симптомам, развившимся в группе с положительным контролем (сенсибилизация и провокация аллергеном).
Фигура 10 показывает, что La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225), подвергнутый тепловой обработке в течение 15 с при 120°C, очень сильно по сравнению с другими подвергнутыми тепловыми обработке штаммами индуцирует экспрессию мРНК hBD1 в кишечных эпителиальных клетках in vitro. С подвергнутыми тепловыми обработке штаммами в течение 4 час инкубировались клетки Т84. Экспрессия гена hBD1 анализировалась с помощью ПЦР в реальном времени. Столбцы представляют средние величины ±sem (стандартная погрешность среднего), нормализованные относительно базисной экспрессии не стимулировавшихся клеток.
Фигура 11 демонстрирует, что высокая температура и короткое время обработки La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225) показывает тенденцию к улучшению индуцирования экспрессию мРНК hBD1. Клетки Т84 стимулировались в течение 4 час с живым и подвергнутым тепловой обработке La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225) в течение 15 с при 120°C или 20 мин при 85°C. Экспрессия гена hBD1 анализировалась с помощью ПЦР в реальном времени. Столбцы представляют средние величины ±sem (стандартная погрешность среднего), нормализованные относительно базисной экспрессии не стимулировавшихся клеток.
Пример 1
Методика
Бактериальные препараты
Польза, предоставляемая живыми пробиотиками иммунной системе организма, как правило, рассматривается как штамм-специфическая. Было показано, что пробиотики, приводящие к высоким уровням IL-10 и/или вызывающие снижение уровней провоспалительных цитокинов in vitro (испытание РВМС) являются действенными противовоспалительными штаммами in vivo (Foligné В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
При исследованиях противовоспалительных свойств подвергнутых тепловой обработке пробиотиков было использовано несколько пробиотических штаммов. Это были Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825) и Escherichia coli Nissle. Были также исследованы несколько штаммов заквасочных культур, включая некоторые штаммы, применяемые промышленно для получения ферментированных Lcl продуктов Nestle: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 и Lactococcus lactis NCC 2287.
2
2
Бактериальные клетки культивировались в условиях, оптимизированных для каждого штамма, в 5-15 л биореакторах. Пригодными являются любые стандартные среды для выращивания бактериальных культур. Такие среды известны специалистам в данной области. После доведения pH до 5,5 в непрерывном режиме добавлялся 30% основной раствор (либо NaOH, либо Са(OH)). Когда это было необходимо, создавались анаэробные условия заполнением свободного пространства газообразным CO. Е. coli выращивалась при стандартных аэробных условиях.
9
10
Бактериальные клетки собирались центрифугированием (g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере (PBS) в объемах, подходящих для достижения конечной концентрации около 10-10 КОЕ/мл. Часть препарата была заморожена при -80°C с 15% глицерином. Другая часть клеток была подвергнута тепловой обработке с помощью:
- ультравысокой температуры: 140°C в течение 15 с; впрыскиванием глухого пара;
- высокой температуры в течение короткого времени (HTST): 74°C, 90°C и 120°C в течение 15 с впрыскиванием глухого пара;
- низкой температуры в течение длительного времени (85°C, 20 минут) на водяной бане;
При тепловой обработке образцы перед применением сохранялись в замороженном при -80C состоянии.
Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов
5
6
Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способность индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеары периферической крови (РВМС) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). РВМС (7×10 клеток на лунку) затем инкубировались с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×10 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 час. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на РВМС, полученных от 8 различных доноров, разделенных на два отдельных эксперимента. После 36 час инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°C. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и тоже серии РВМС) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.
После 36 час инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл) +/- SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом. Для каждого штамма было вычислено отношение IL-12p40/IL-10 в качестве прогностического показателя in vivo противовоспалительного эффекта (Foligné В. и др., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Численные характеристики цитокинов (пг/мл), определенные по данным ELISA (см. выше) для каждого штамма, были введены в программу BioNumerics v5.10 ((Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Бельгия). К этому набору данных был применен метод главных компонент (РСА, методика задания размерности). В этот анализ было включено определение разницы средних величин по признакам и деление полученного показателя на величину дисперсии по этим признакам.
Результаты
Противовоспалительные профили, обеспечиваемые видами обработки, сходными с ультравысокотемпературной (UHT) / кратковременной высокотемпературной (HTST) обработкой.
Штаммы пробиотиков при исследовании были подвергнуты серии тепловых обработок (ультравысокотемпературная (UHT), кратковременная высокотемпературная (HTST) и 20 мин при 85°C), и их иммунные профили были сравнены с аналогичными профилями живых клеток in vitro. Живые микроорганизмы (пробиотики и/или молочные заквасочные культуры) при инкубации с человеческими РВМС индуцировали различные уровни продуцирования цитокинов (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5). Тепловая обработка этих микроорганизмов модифицировала уровни продуцируемых РВМС цитокинов температурно зависимым образом. «Кратковременная высокотемпературная» обработка (120°C или 140°C в течение 15 с) приводила к получению нереплицирующихся бактерий с противовоспалительными иммунными профилями (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Фактически, штаммы, подвергнутые обработке, подобной ультравысокотемпературной (140°C, 15 с) индуцировали меньше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40) при сохранении или стимулировании продуцирования дополнительного IL-10а (в сравнении с живыми аналогами). Полученные величины отношения IL-12p40/IL-10a для всех штаммов, подвергнутых UHT-подобной обработке, по сравнению с живыми клетками были сниженными (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Это наблюдение было также действительно и для бактерий, подвергнутых HTST-подобной обработке, то есть 15 с при 120°C (Фигуры 1, 2, 3 и 4), или 15 с при 74°C и 90°C (Фигура 5). Тепловые обработки (UHT-подобные или HTST-подобные) имели сходное воздействие на in vitro иммунные профили штаммов пробиотиков (Фигуры 1, 2, 3 и 5) и молочных заквасочных культур (Фигура 4). Метод главных компонент на данных РВМС, полученных с живыми и подвергнутыми тепловой обработке (140°C, 15 с) штаммами пробиотиков и молочных заквасок, выявил, что живые штаммы распределяются по всей оси X, что показывает, что эти штаммы демонстрируют сильно различающиеся иммунные профили in vitro, от слабой (левая сторона) до сильной (правая сторона) индукции провоспалительных цитокинов. Группа подвергнутых тепловой обработке штаммов с левой стороны графика показывает, что подвергнутыми тепловой обработке штаммами провоспалительные цитокины индуцируются в значительно меньшей степени (Фигура 6). В отличие от этого, бактерии, подвергнутые тепловой обработке в течение 20 мин при 85°C, индуцировали больше провоспалительных цитокинов и меньше IL-10а, чем живые клетки, приводя к более высоким показателям отношения IL-12p40/IL-10a (Фигура 7).
Противовоспалительные профили, усиленные или полученные в результате UHT-подобной и HTST-подобной обработки.
Подвергнутые UHT- и HTST-обработке штаммы демонстрируют противовоспалительные профили независимо от их соответствующих исходных иммунных профилей (живые клетки). Было показано, что штаммы пробиотиков, известные в качестве противовоспалительных in vivo и демонстрирующие противовоспалительные профили in vitro (В. longum NCC 3001, В. longum NCC 2705, В. breve NCC 2950, В. lactis NCC 2818), демонстрируют усиленные противовоспалительные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной» обработки. Как показано на Фигуре 1, отношения IL-12p40/IL-10a подвергнутых UHT-подобной обработке штаммов Bifidobacterium были ниже, чем у живых аналогов, тем самым показывая улучшенные противовоспалительные профили образцов, подвергнутых UHT-подобной обработке. Еще более удивительно образование противовоспалительных профилей под действием UHT-подобной и HTST-подобной обработки, подтвержденное также и у не обладавших противовоспалительной активностью живых штаммов. Оба штамма живых L. rhamnosus NCC 4007 и L. paracasei NCC 2461 показывают высокие величины отношения IL-12p40/IL-10a in vitro (Фигуры 2 и 5). Было показано, что эти два живых штамма не обладают протективным действием против TNBS-индуцированного колита у мышей. Величины индуцированного L. rhamnosus NCC 4007 и L. paracasei NCC 2461 отношения IL-12p40/IL-10a резко снижались после «кратковременной высокотемпературной» обработки (UHT или HTST), достигая столь же низких уровней, как и полученные со штаммами Bifidobacterium. Такие низкие показатели отношения IL-12p40/IL-10a являются результатом низких уровней продуцирования IL-12p40 в сочетании с отсутствием изменений (L. rhamnosus NCC 4007) или сильным индуцированием секреции IL-10a (L. paracasei NCC 2461) (Фигура 2).
Как следствие:
- противовоспалительные профили живых микроорганизмов могут быть усилены UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработкой (например, В. longum NCC 2705, В. longum NCC 3001, B. breve NCC 2950, В. lactis NCC 2818);
- противовоспалительные профили могут быть получены у не обладающих противовоспалительной активностью живых микроорганизмов (например, L. rhamnosus NCC L. paracasei NCC 2461, молочные закваски S. thermophilus NCC 2019) посредством применения UHT-подобной и HTST-подобной тепловой обработки;
- продемонстрировано также наличие противовоспалительных профилей у штаммов, выделенных из представленных в продаже продуктов (Фигуры 3A и B), включая штамм пробиотической Е. coli.
Действие UHT/HTST-подобной обработки было сходным для всех исследовавшихся пробиотиков и молочных заквасок, например, молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков.
UHT/HTST-подобная обработка применялась к нескольким видам молочнокислых бактерий, бифидобактерий и стрептококков, демонстрирующим различные in vitro иммунные профили. Все штаммы после UHT/HTST-подобной обработки индуцировали меньше провоспалительных цитокинов, чем их живые экземпляры (Фигуры 1, 2, 3, 4, 5 и 6), демонстрируя, что действие UHT/HTST-подобной обработки на иммунные свойства конечных нереплицирующихся бактерий может быть обобщено на все пробиотики, в частности, на молочнокислые бактерии, бифидобактерии и определенные штаммы Е. coli, а также на все молочные заквасочные культуры, в частности, стрептококки, лактококки и молочнокислые бактерии.
Пример 2
Методика
Бактериальные препараты
При исследовании усиления иммунных свойства нереплицирующихся пробиотиков было использовано пять пробиотических штаммов: 3 вида бифидобактерии (В. longum NCC3001, В. lactis NCC2818, В. breve NCC2950) и 2 молочнокислых бактерий (L. paracasei NCC2461.Z. rhamnosus NCC4007).
10
Бактериальные клетки выращивались на среде MRS в режиме периодического культивирования в течение 16-18 час при 37C без контроля pH. Бактериальные клетки центрифугировались (5000 g, 4°C) и ресуспендировались в фосфатно-солевом буфере перед разведением в водно-солевом растворе до достижения конечной концентрации около 10 КОЕ/мл. В. longum NCC3001, В. lactis NCC2818, L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007 были подвергнуты тепловой обработке в течение 20 мин при 85°C на водяной бане. В. breve NCC2950 нагревались 30 минут на водяной бане при 90°C. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные суспензии аликвотировались и до применения сохранялись в замороженном при -80°C состоянии. Живые бактерии до применения сохранялись при -80°C в смеси PBS-глицерин (15%).
Оценка in vitro иммунного профиля бактериальных препаратов
5
6
Были выполнены оценки иммунных профилей живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (то есть способность индуцировать секрецию специфических цитокинов клетками крови человека in vitro). Мононуклеары периферической крови (РВМС) человека были выделены из фильтров для крови. После разделения по градиенту плотности клеток были отобраны мононуклеарные клетки и дважды промыты сбалансированным солевым раствором Хэнкса. Клетки затем были ресуспендированы в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков, (IMDM, Sigma), дополненной 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Bioconcept, Париж, Франция), 1% L-глютамина (Sigma), 1% пенициллина/стрептомицина (Sigma) и 0,1% гентамицина (Sigma). РВМС (7×10 клеток на лунку) затем инкубировались с живыми и подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалент 7×10 КОЕ на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 час. Влияние живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий было проверено на РВМС, полученных от 8 различных доноров, при разделении на два отдельных эксперимента. После 36 час инкубации культуральные планшеты были заморожены и до измерений цитокинов сохранялись при -20°C. Определение цитокиновых профилей выполнялось параллельно (то есть в одном эксперименте на одной и тоже серии РВМС) для живых бактерий и для их экземпляров, подвергнутых тепловой обработке.
После 36 час инкубации в супернатантах клеточной культуры были определены уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) методом ELISA (иммуноферментный анализ) (R&D DuoSet Human IL-10, BD OptEIA Human IL12p40, BD OptEIA Human TNFα, BD OptEIA Human IFN-γ) согласно инструкциям производителя. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-γ являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде среднего (пг/мл) +/- SEM по 4 индивидуальным донорам и являются репрезентативными для двух отдельных экспериментов, выполненных с 4 донорами в каждом.
Эффект in vivo живых и подвергнутых тепловой обработке Bifidobacterium breve NCC2950 в профилактике аллергической диареи.
Для проверки Th1-промотирующего действия В. breve NCC2950 использовалась модель аллергической диареи на мышах (Brandt Е.В и др. JCI 2003; 112 (11): 1666-1667). После сенсибилизации (2 интраперитонеальные инъекции яичного альбумина (OVA) и алюминиевокалиевых квасцов с интервалом в 14 дней; дни 0 и 14), самцы мышей линии Balb/c были подвергнуты 6-кратной пероральной провокации OVA (дни 27, 29, 32, 34, 36, 39), приводящей к кратковременным клиническим симптомам (диарея) и изменению иммунных параметров (плазменная концентрация общего IgE, OVA-специфического IgE, протеазы-1 тучных клеток мышей, то есть ММСР-1). Bifidobacterium breve NCC2950, живые или подвергнутые 30 мин тепловой обработке при 90°C, вводились чреззондовым питанием за 4 дня до OVA-сенсибилизации (дни -3, -2, -1, 0 и дни 11, 12, 13 и 14) и во время провокационного периода (дни 23 - 39). Использовалась суточная доза бактерий около 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) или эквивалентные количества в выражении КОЕ/мышь.
Результаты
Индукция секреции «провоспалительных» цитокинов после тепловой обработки
Была оценена in vitro способность подвергнутых тепловой обработке бактериальных штаммов стимулировать секрецию цитокинов мононуклеарами периферической крови (РВМС) человека. Иммунные профили, основанные на четырех цитокинах, продуцируемых при стимулировании РВМС подвергнутыми тепловой обработке бактериями, сравнивались с индуцируемыми живыми бактериальными клетками в условиях одинаковых испытаний in vitro.
Подвергнутые тепловой обработке препараты высевались на чашки и оценивались на отсутствие какого-либо количества жизнеспособных микроорганизмов. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные препараты не образовывали колоний после высевания на чашки.
Живые пробиотики при инкубации с человеческими РВМС индуцировали различные и зависящие от вида штамма уровни цитокинов (Фигура 8). Тепловая обработка пробиотиков модифицировала уровни продуцируемых РВМС цитокинов по сравнению с их живыми аналогами. Подвергнутые тепловой обработке бактерии индуцировали больше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), чем их живые аналоги. Напротив, подвергнутые тепловой обработке бактерии в сравнении с живыми клетками индуцировали подобные или более низкие количества IL-10а (Фигура 8). Эти данные показывают, что подвергнутые тепловой обработке бактерии способны в большей степени стимулировать иммунную систему, чем их живые аналоги, и поэтому могут эффективнее укреплять ослабленную иммунную защиту. Другими словами, in vitro данные иллюстрируют улучшение эффекта укрепления иммунитета бактериальными штаммами после тепловой обработки.
Для того чтобы показать повышенную эффективность подвергнутых тепловой обработке В. breve NCC2950 (по сравнению с живыми клетками) в отношении действия на иммунную систему, и живые, и подвергнутые тепловой обработке В. breve NCC2950 (штамм А) были проверены в модели аллергической диареи на животных.
По сравнению с группой позитивного контроля интенсивность диареи после терапии с подвергнутыми тепловой обработке В. breve NCC2950 была значительно и устойчиво снижена (41,1±4,8%), тогда как интенсивность диареи после терапии с живыми В. breve NCC2950 была снижена только на 20±28,3%. Эти результаты показывают, что подвергнутые тепловой обработке В. breve NCC2950 демонстрируют более выраженное протективное действие против аллергической диареи, чем их живые эквиваленты (Фигура 9).
В результате показано улучшение способности пробиотиков усиливать иммунную защиту после подвергания их тепловой обработке.
Пример 3
Описание эксперимента
6
2
Использовались клетки Т84 из пассажа 30-40 и культивировались в модифицированной по Дульбекко минимальной незаменимой среде / F-12 (Sigma D 6421), содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки (FCS) (Amined BioConcept) и 2 ммоль глутамина. Клетки были высеяны в концентрации 2×10 клеток на лунку в 6-луночных культуральных планшетах и выращивались в виде монослоев при 37°C в атмосфере из 5% CO и 95% воздуха. Клетки, выращенные к 1 неделе, после достижения конфлюэнтности инкубировались в не содержащей сыворотки и антибиотиков питательной среде в течение по меньшей мере 12 час. Этот этап был необходим для исключения вызываемой сывороткой экспрессии дефензина и предотвращения любого влияния антибиотиков на пробиотики и клеточный иммунный ответ. Далее клетки инкубировались с пробиотиками или подвергнутыми тепловой обработке штаммами в течение 4 час. После завершения инкубационного периода клетки промывались PBS и собирались с помощью изолирующего реагента TriPureTM согласно рекомендациям поставщика. Экспрессия генов человека hBD1 и hBD2 в подвергшихся такой обработке клетках оценивалась количественной ПЦР.
Использовавшиеся в этом эксперименте бактериальные штаммы были представлены В. longum (NCC 2705, депозитарный номер CNCM I-2618), В. lactis (NCC 2818, депозитарный номер CNCM I-3446), L.johnsonii (Lai, NCC 533, депозитарный номер CNCM I-1225), L. paracasei (ST11, NCC 2461, депозитарный номер CNCM I-2116). Эти исследовавшиеся штаммы были живыми или подвергнутыми тепловой обработке либо в течение 15 с при 120°C, либо в течение 20 мин при 85°C.
Результаты
Подвергшиеся тепловой обработке в течение 15 с при 120°C La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225), продемонстрировали сильную способность к индуцированию экспрессии мРНК hBD1 после 4 час инкубации (Фигура 10) в отличие от других исследовавшихся подвергнутых тепловых обработке штаммов. Эти данные являются уникальными, так как в настоящее время в научном сообществе считается, что являющаяся избирательной экспрессия HBD1 фактически не поддается модулированию микроорганизмами, микробными продуктами или воспалительными реакциями.
Как живые, так и подвергнутые тепловой обработке La1 (NCC533, депозитарный номер CNCM I-1225), вызывали сильную экспрессию мРНК hBD1, но наиболее высокая способность к индуцированию hBD1 проявлялась подвергнутыми тепловой обработке La1 (высокотемпературная и кратковременная обработка) (Фигура 11).