ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ н-БУТАНОЛА
Clostridium acetobutylicum STRAIN - n-BUTANOL PRODUCER

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению штамма-продуцента н-бутанола, используемого в качестве органического растворителя, биотоплива и основы для синтеза многих промышленноценных органических соединений.
Известен штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786, который на питательном субстрате из 6% водной суспензии ржаной муки синтезирует 7,9 г/л н-бутанола [1].
Ближайшим аналогом заявляемого штамма является штамм Clostridium acelobutylicum №6, который на питательном субстрате из 6% водной суспензии ржаной муки синтезирует до 8,3 г/л н-бутанола [1].
В качестве контрольного будем использовать штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10289, который на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой 1,35% РВИ мелассы синтезирует н-бутанол в количестве до 14 г/л (Заявка на патент РФ 2011105882).
Задача заявляемого изобретения - получить штамм бактерий Clostridium acetobutylicum с повышенным уровнем биосинтеза н-бутанола.
Задача решена путем получения штамма Clostridium acetobutylicum CB-2, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290.
Заявляемый штамм получен путем облучения ультрафиолетом суспензии бактерий штамма Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-4786 с последующей селекцией в анаэробных стационарных условиях и обладает следующими характеристиками.
Культурально-морфологические свойства
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
Через 4 суток роста в анаэробных условиях на агаризованной среде SOL (мас.%): КНРO - 0,07; KHPO - 0,07; MgSO·7HO - 0,01; MnSO·7HO - 0,002; FeSO·7HO - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1, пептон - 0,1; цистеин - 0,05; крахмал - 0,1; глюкоза 1; витаминный раствор - 1 мл/л, резазурин - 1 мг/л, вода - остальное; колонии плоские, центр колонии менее выражен, выглядит как цельная колония без ореола, края неровные. Штрих: поверхность ровная, края ровные.
Клетки в виде одиночных вытянутых палочек.
Физиологические свойства
Сбраживает сахара: гексозы (глюкозу, галактозу, маннозу, фруктозу), пентозы (ксилозу, арабинозу), дисахара (лактозу, сахарозу, мальтозу), олигосахара, крахмал и др.; в качестве источника азота использует пептон и аммонийный.
Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 синтезирует н-бутанол в количестве до 20 г/л на субстратах, состоящих из суспензии ржаной муки с добавкой мелассы и мальтозы.
Устойчив к содержанию в питательном субстрате до 30 мас.% культуральных жидкостей после маслянокислого брожения штаммов Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 или Clostridium butyricum ВКПМ В-9619.
Условия хранения
2
4
2
4
4
2
4
2
Штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 хранят в лаборатории №12 ФГУП «ГосНИИгенетика» (адрес: 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд д. 1) в споровом состоянии на среде следующего состава (мас.%): ржаная мука обдирная - 3; вода - остальное или среде MSS (мас.%): КНРO - 0,1; КНРO - 0,08; MgSO×7HO - 0,1; FeSO×7НО - 0,005; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,5; цистеин-HCl - 0,05; дрожжевой экстракт - 0,5; пара-аминобензойная кислота - 0,001; глюкоза - 2 вода -остальное.
Пересев осуществляют через полгода на один из питательных субстратов, указанных выше, термостатируют при t=37°С в течение 2-3 суток. Полученную суспензию бактерий хранят при t=4-6°C.
Во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 хранят в лиофилизированном виде.
Определение количества н-бутанола и других компонентов культуральной жидкости во всех примерах осуществляют методом газохроматографического анализа.
Пример 1. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 6% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы
3
3
Ферментацию заявляемого штамма проводят в лабораторных, статических, строго анаэробных условиях во флаконах общим объемом 120 см и рабочим объемом 50 см, доза посевного материала 4 об.% при рН 4,0-6,3, температуре 37°С, в течение 96 ч.
Характеристика используемого питательного субстрата: 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе (содержание условного крахмала 43,75 г/л).
Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 6% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог, родительский и контрольный штаммы как по уровню биосинтеза н-бутанола (9,4 вместо 8,3, 8,4 и 8,5 г/л, соответственно), так и ряду других приведенных в таблице показателей.
Пример 2. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 7% водной суспензии ржаной муки
Условия ферментации, как в примере 1, но время ферментации для заявляемого штамма 54 ч, для контроля и ближайшего аналога - 96 ч, для родительского 120 ч.
Характеристика используемого питательного субстрата: 7% водная суспензия ржаной муки (содержание крахмала 45,5 г/л).
Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 7% водную суспензию ржаной муки, заявляемый штамм превосходит ближайший аналог, родительский и контрольный штаммы как по уровню биосинтеза н-бутанола (12 г/л вместо 8,6, 9,0 и 8,8 г/л, соответственно), так и ряду других приведенных в таблице показателей при более коротком времени ферментации.
Пример 3. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на 7% водной суспензии ржаной муки с добавкой мелассы и мальтозы
Условия ферментации, как в примере 1, но время ферментации для заявляемого штамма - 96 ч.
Характеристика используемого питательного субстрата: 7% суспензия ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе и 1% мальтозы (содержание условного крахмала 59,75 г/л).
Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, представляющем собой 7% водную суспензию ржаной муки с добавкой мелассы в количестве 0,5% по сахарозе и 1% мальтозы, заявляемый штамм имеет высокие показатели как по уровню биосинтеза н-бутанола (20 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей.
Контрольный штамм и штамм-ближайший аналог такой субстрат не сбраживают.
Пример 4. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на субстрате, содержащем картофель и глюкозу
Условия ферментации, как в примере 1, но в течение 48 ч. Остаточная глюкоза - 0,74 мас.%.
Характеристика используемого питательного субстрата (мас.%): картофель - 25,0 г/л (75% влажность, 18% крахмала), уксуснокислый аммоний - 0,15; мел - 0,2; цистеин - 0,05; глюкоза - 5,0 (∑56,3 г/л условного крахмала).
Из результатов, приведенных в таблице 1, следует, что на субстрате, содержащем картофель и глюкозу, заявляемый штамм имеет высокие показатели как по уровню биосинтеза н-бутанола (12,2 г/л), так и ряду других приведенных в таблице показателей. Контрольный штамм и штамм-ближайший аналог такой субстрат не сбраживают.
Пример 5. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 8 мас.%
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
Подготавливают посевной материал штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-10406. Для этого используют питательный субстрат SOL следующего состава (мас.%): КНРO - 0,07; КНРO - 0,07; MgSO·7HO - 0,01; MnSO·7HO - 0,002; FeSO·7HO - 0,0015; NaCl - 0,001; ацетат аммония - 0,3; дрожжевой экстракт - 0,1, пептон - 0,1; цистеин - 0,05; витаминный раствор - 1 мл/л, вода - остальное. Содержание моносахаридов 2%. В качестве источников моносахаридов используют ферментативный гидролизат растительного сырья (кукурузная кочерыжка и др.) с добавками инвертированной мелассы в количестве 1% по сахарозе (мелассу применяют как источник биотина). Питательный субстрат стерилизуют при t=125°C в течение 1 ч. Выращивание ведут в течение 7 суток.
Полученный посевной материал в количестве 10 об.% засевают в биореактор, содержащий питательный субстрат выше указанного состава с концентрацией РВ=2 мас.% и проводят процесс маслянокислого брожения в течение 10 суток.
При приготовлении посевного материала и проведении маслянокислого брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 5,2. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.
Выросшую бактериальную биомассу отделяют центрифугированием (10 об/мин).
Фугат используют при приготовлении питательного субстрата для процесса ацетоно-бутилового брожения в количестве 8 мас.%.
Для ацетоно-бутилового брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 (СВ-2). Для получения посевного материала культуру засевают в количестве 4 об.% по отношению к объему субстрата следующего состава: 6% суспензия ржаной муки, меласса в количестве 0,5% по сахарозе (условный крахмал в субстрате 43,75 мас.%) и культивируют в течение 48 ч.
Полученный посевной материал в количестве 4 об.% засевают в биореактор со стерильным питательным субстратом. Состав субстрата: 6% суспензия ржаной муки, меласса в количестве 0,5% по сахарозе (условный крахмал в субстрате 43,75 мас.%), 8 мас.% культуральной жидкости после маслянокислого брожения со штаммом Clostridium tyrobutiricum ВКПМ-10406.
Процесс ацетоно-бутилового брожения проводят в течение 48 ч.
При приготовлении посевного материала и проведении ацетоно-бутилового брожения используют следующий технологический режим: t=37°C, pH 4,0-6,3. рН среды регулируют предпочтительно 25% раствором аммиачной воды.
Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (9,52 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.
Пример 6. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.% в течение 48 ч
Условия ферментации, как в примере 5, но с добавлением культуральной жидкости (КЖ) штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.%.
В качестве контроля использован штамм Clostridium tyrobutyricum №6 - ближайший аналог.
Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит ближайший аналог по уровню синтеза н-бутанола (5,42 г/л вместо 4,4 г/л).
Таблица 2
Содержание КЖ в питательном субстрате, штамм
Время, ч
Химический состав отработанной культуральной жидкости, г/л
Выход от условного крахмала, %
бутанол
ацетон
этанол
кислоты
бутанола
растворителей
масляная
уксусная
Субстрат - 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы и КЖ Clostridium tyrobutyricum ВКПМ-10406
КЖ 8 мас.% пример №5 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый)
48
9,52
4,75
1,04
0,67
1,39
21,8
35,0
КЖ 20 мас.% пример №6 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый)
48
5,42
3,25
0,32
2,17
1,69
КЖ 20 мас.% пример №6 Штамм №6 (ближайший аналог)
48
4,4
2,7
0,3
2,16
1,82
10,0
16,9
КЖ 20 мас.% пример №7 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый)
96
11,02
5,77
0,69
1,66
2,37
25,2
40,0
КЖ 30 мас.% пример 8 Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый)
96
10,2
5,10
0,83
0,89
1,73
23,3
36,9
Субстрат - 6% водная суспензия ржаной муки с добавкой мелассы и КЖ Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 в количестве 20 мас.%
Штамм ВКПМ В-10290 (заявляемый)
48
10,4
5,7
0,7
0,8
1,6
23,8
38,4
Штамм ВКПМ В-10289 (контрольный)
48
9,90
5,19
0,72
1,39
1,67
22,6
36,1
Штамм №6 (ближайший аналог)
48
0,15
0,04
0,03
0,95
0,83
0,3
0,5
Пример 7. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 20 мас.% в течение 96 ч
Условия ферментации, как в примере 6, но в течение 96 ч. Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (11,02 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.
Пример 8. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 30 мас.%
Условия ферментации, как в примере 7, но с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406 в количестве 30 мас.%.
Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм имеет высокие показатели по уровню синтеза н-бутанола (10,02 г/л), а также ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.
Пример 9. Биосинтез н-бутанола заявляемым штаммом на ржаной муке с добавлением культуральной жидкости штамма Clostridium butyricum ВКПМ-9619
Технологическая схема и субстраты аналогичны технологической схеме и субстратам, описанным в примере 5, но для проведения процесса ацетоно-бутилового брожения используют питательный субстрат с добавкой культуральной жидкости штамма Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 в количестве 20 мас.%. Для ацетоно-бутилового брожения используют штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 (СВ-2). Время брожения 48 ч.
Из результатов, приведенных в таблице 2, следует, что в предлагаемых условиях заявляемый штамм превосходит по уровню синтеза н-бутанола как ближайший аналог, так и контрольный (10,4 г/л вместо 0,15 г/л и 9,9 г/л, соответственно), а также превосходит ближайший аналог по ряду других, приведенных в таблице 2 показателей.
Таким образом, заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum ВКПМ В-10290 во всех предложенных условиях ферментации превосходит ближайший аналог по уровню биосинтеза н-бутанола.
Источники информации
1. Березина О.В., Синеокий С.П., Великодворская Г.А. и др. Внеклеточная гликозилгидролазная активность клостридий, образующих ацетон, бутанол и этанол // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - Т.44. - №1.