Получение вирусоподобной частицы вируса бешенства в растениях
PRODUCTION OF RABIES VIRUS-LIKE PARTICLE IN PLANTS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к получению нативных вирусных белков в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих нативный структурный белок вируса бешенства, в растениях. Техническим результатом заявленного изобретения является получение вирусоподобных частиц вируса бешенства (VLP) в растении, и применение указанных VLP для индукции защитного иммунного ответа против инфекции, вызванной вирусом бешенства.
Уровень техники
Вакцинация обеспечивает защиту от заболеваний, вызванных инфекционным агентом, путем индукции субъекта для установления защиты перед инфекцией. Обычно это выполняется посредством применения живых ослабленных или цельных инактивированных форм инфекционных агентов в качестве иммуногенов. Для того, чтобы избежать опасности использования цельного вируса (например, убитых или ослабленных вирусов) в качестве вакцины, рекомбинантные вирусные белки, например субъединицы, используют в качестве вакцин. Как пептидные, так и субъединичные вакцины подвержены ряду потенциальных ограничений. Субъединичные вакцины могут проявлять слабую иммуногенность вследствие неправильного сворачивания, слабой презентации антигена или различий в углеводном и липидном составе. Главной проблемой является трудность гарантии того, что конформация сконструированных белков имитирует конформацию антигенов в их природном окружении. Пригодные адъюванты и, в случае пептидов, белки-носители должны использоваться для стимулирования иммунного ответа. Кроме того, эти вакцины индуцируют прежде всего гуморальные ответы и, следовательно, могут не вызывать эффективного иммунитета. Субъединичные вакцины часто являются неэффективными в отношении заболеваний, в которых инактивированный цельный вирус может продемонстрировать обеспечение защиты.
Вирусоподобные частицы (VLP) являются потенциальными кандидатами для включения в иммуногенные композиции. Вирусоподобные частицы (VLP) имеют сходство со зрелыми вирионами, но не содержат генетический материал вируса. Таким образом, VLP являются нереплицируемыми по природе, что делает их безопасными для введения в качестве вакцины. Кроме того, VLP могут быть сконструированы для экспрессии вирусных гликопротеинов на поверхности VLP, что является их самой нативной физиологической конфигурацией. Более того, так как VLP имеют сходство с интактными вирионами и представляют собой поливалентные дисперсные структуры, VLP могут быть более эффективными в отношении индукции нейтрализующих антител к гликопротеину, чем растворимые оболочечные белковые антигены.
В настоящее время VLP получены для более 30 различных вирусов, которые инфицируют человека и других животных. Одной из самых поразительных особенностей этой группы является то, что группа сильно различается по структуре отдельных вирусов. Группа включает вирусы, которые содержат один капсидный белок, множество каспидных белков, а также вирусы с липидными оболочками и без них.
Технические трудности формирования VLP для вирусов с липидной оболочкой отличаются от трудностей формирования VLP для вирусов со множеством капсидов. Для этих вирусов выбор системы экспрессии может быть важным для эффективности формирования VLP. Например, вирус Хантаан легко формирует VLP, когда экспрессируется в клетках млекопитающего из вектора на основе вируса осповакцины, но формирование VLP является относительно неэффективным в клетках насекомых (Betenbaugh М с соавт. 1995, Virus Res. 38, 111-124).
Вирус бешенства (RV) является членом семейства рабдовирусов (Rhabdoviridae). Как и большинство членов данного семейства, вирус бешенства (RV) представляет собой вирус, содержащий нефрагментированную негативную однонитевую РНК, чей геном кодирует пять вирусных белков: РНК-зависимую РНК-полимеразу (L); нуклеопротеин (N); фосфорилированный белок (Р); матриксный белок (М), локализованный на внутренней стороне оболочки вирусного белка; и гликопротеин (G), локализованный на внешней поверхности вируса. (Dietzschold B с соавт., 1991, Crit. Rev. Immunol. 10:427-439.)
Вакцины против бешенства, полученные на культуре клеток, ограничены выращиванием инактивированных штаммов вируса в культурах клеток. Эти вакцины содержат вирус, выращенный в культурах клеток. Существующие в настоящее время биотехнологические подходы направлены на экспрессию гена поверхностного белка вируса бешенства для разработки безопасного рекомбинантного белка, который может быть использован в качестве активной вакцины. Стабильная экспрессия гликопротеина вируса бешенства была показана в клетках яичника китайского хомячка (Burger с соавт., 1991, J Gen Virol., Feb; 72 (Pt 2):359-67). Был получен гликозилированный белок полной длины 67К, который комигрировал с G-белком, выделенным из инфицированных вирусом клеток.
Экспрессия гена гликопротеина вируса бешенства бакуловирусными векторами в клетках насекомых дает выходы белка до 18% от общего клеточного белка через 48 часов после заражения. Prehaud D Н с соавт., (1989, Virology, Dec; 173(2):390-9) описывает помещение последовательности, кодирующей G-белок штамма CVS, под контроль промотора полигедрина AcNPV и экспрессию конструкции с использованием линии клеток Spodoptera fugiperda. Белок, полученный от насекомых, проявил измененную электрофоретическую подвижность по сравнению с диким типом вследствие различий в гликановых компонентах.
Rupprecht с соавт. (1993, Vaccine, 11(9):925-8) демонстрирует, что гликопротеин (штамм ERA), полученный из рекомбинантных инфицированных бакуловирусом клеток насекомых, является эффективным в качестве пероральной вакцины у енотов. В WO/1993/001833 описано получение вирусоподобных частиц (VLP) в бакуловирусной системе экспрессии, содержащей РНК-геном, включающий 3' домен и филлер-домен, окруженный оболочкой N-белка вируса бешенства и М-белка вируса бешенства. Вирусоподобная частица (VLP) также включает липидную оболочку G-белка вируса бешенства. Ввиду относительно высокой стоимости систем на основе клеток насекомых и млекопитающих, указанные системы не являются предпочтительными для экспрессии G-белка как стратегии для разработки вакцины против вируса бешенства.
McGarvey с соавт. (1995, Bio/Technology Vol. 13, No. 13, pp. 1484-1487) описывает трансформацию котиледонов томатов с использованием кДНК полной длины, кодирующей гликопротеин G вируса бешенства (штамм ERA) под управлением промотора 35S' вируса мозаики цветной капусты. Белок был экспрессирован в томатах и характеризовался молекулярной массой 62 и 60 kDa по данным вестерн-блоттинга после иммунопреципитации по сравнению с 66 kDa, наблюдаемой для G-белка из вируса, выращенного в клетках ВНК. Предполагается, что различие в молекулярной массе по сравнению с природным гликопротеином обусловлено посттрансляционной модификацией белка (протеолитическое расщепление и/или модифицированное гликозилирование). Было обнаружено, что количество иммунопреципитированного G-белка составило приблизительно 1-10 нг/мг растворимого белка, т.е. от 0.0001% до 0.001% растворимого белка. Низкий уровень экспрессии может быть обусловлен использованием слабо разработанного гена. Например, ген, кодирующий нативный G-белок, использовали вместе с его нативным сигнальным пептидом.
Иммунный ответ растений на заболевания, такие как энтерит норок и бешенство, отражался экспрессией вирусных эпитопов на поверхности вирусов растений после заражения восприимчивого хозяина рекомбинантным модифицированным вирусом (Modelska с соавт., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2481-2485; Yusibov с соавт., 2002, Vaccine 20:3155-3164). Размер антигенного полипептида, экспрессирующегося на поверхности вирусного вектора, был ограничен 37 аминокислотами, и требовалось эпитопное картирование антигена. Такое глубокое знание антигена обычно недоступно, особенно в отношении вновь открытых заболеваний, в которых экспрессия белков полной длины может являться единственным выбором. В отдельных случаях могут потребоваться множественные эпитопы для обеспечения приемлемой защиты от заражения патогенным вирусом. Кроме того, заражение может рассматриваться как значительная проблема на сельскохозяйственном уровне, особенно в случае применения стабильных в окружающей среде вирусов растений, например, вируса мозаики табака (Tobacco Mosaic Virus).
В WO 97/43428 описан способ получения в растениях гликопротеина G вируса бешенства или вируса, родственного вирусу бешенства. Конструкция включала последовательность, кодирующую химерный G-белок, содержащий зрелый вирусный G-белок с N-концевым сигнальным пептидом, отличным от пептида, естественным образом связанного с вирусным G-белком. Гликопротеин имел молекулярную массу приблизительно 66 kDa и являлся практически нерастворимым. Детергенты, такие как додецилсульфат натрия (SDS) или Тритон Х-100, были необходимы для экстракции и растворения гликопротеина. Авторы сделали вывод о том, что «нерастворимый» гликопротеин относился к присутствию С-концевого трансмембранного домена (участка из примерно от 40 до 60 аминокислот, расположенного на карбоксильном конце гликопротеина), который является важным для защитной реакции при использовании гликопротеина в качестве вакцины.
Оболочечные вирусы могут приобрести свою липидную оболочку при «отпочковывании» из инфицированной клетки, а мембрану из плазматической мембраны или из мембраны внутренних органелл. Например, во время процесса сборки в рабдовирусах комплекс N-P-L заключает в оболочку однонитевую геномную минус-РНК с образованием сердцевины рибонуклеопротеина (RNP). М-белок формирует капсулу или матрикс вокруг RNP, и комплекс RNP-M мигрирует в область плазматической мембраны, содержащей гликопротеиновые вставки. М-белок инициирует скручивание, и комплекс M-RNP связывается с гликопротеином, после чего готовый вирус выходит путем почкования из плазматической мембраны.
В центральной нервной системе (CNS) существует избирательный выход вирусных частиц путем почкования из плазматических мембран. Напротив, в слюнных железах вирус выходит путем почкования в основном из клеточной мембраны в ацинарный просвет. Вирусное почкование в слюнную железу и индуцированное вирусом агрессивное поведение хозяина-животного увеличивает шансы вирусной инфекции у нового хозяина. В системах на основе клеток млекопитающих или бакуловирусов, например, вирус бешенства почкуется из плазматической мембраны. Известно лишь несколько оболочечных вирусов, способных инфицировать растения (например, члены семейства топовирусов и рабдовирусов). Среди известных оболочечных вирусов растений они характеризуются почкованием из внутренних мембран клеток-хозяев, а не из плазматической мембраны. Однако рекомбинантные VLP были получены в растениях-хозяевах из плазматической мембраны (WO 2011/035422; которая включена в настоящий документ путем отсылки).
Сборка/почкование в рабдовирусах управляется главным образом матриксным (М) белком. Белок М содержит поздний домен почкования, который опосредует рекрутинг белков хозяина, связанный с путем вакуолярной сортировки белков клетки, для облегчения разделения вирус-клетка. Без привязки к какой-либо теории полагают, что почкование оболочечных вирусов из клеточных мембран зависит от присутствия трансмембранных шиповидных белков, взаимодействующих с цитоплазматическими компонентами вируса. Например, клетки, инфицированные мутантами вируса бешенства, которые были лишены гликопротеина G или цитоплазматического концевого сегмента G-белка, высвобождали лишенные шиповидных отростков частицы рабдовируса, показывая, что вирусный поверхностный белок не требуются для управления процессом почкования. (Mebatsion Т. С соавт., 1996, Cell, Маr 22:84(6):941-51). Напротив, инфекционные частицы, продуцированные мутантами вируса бешенства, лишенными М-белка, были преимущественно связанными с клетками, и выход бесклеточного инфекционного вируса был уменьшен не меньше чем в 500000 раз. Это демонстрирует значительную роль М-белка в почковании вируса. Супернатанты, полученные из клеток, инфицированных вирусом бешенства, лишенным М-белка, содержат скорее длинные палочкообразные вирионы, а не обычные пулеобразные частицы рабдовируса, дополнительно подтверждая нарушение процесса формирования вируса. Комплементация с М-белком, экспрессирующимся с плазмид, восстанавливала формирование рабдовируса. Таким образом, белок М играет важную роль в сжатии и нацеливании RNP на плазматическую мембрану, а также во встраивании G-белка в почкующиеся вирионы. (Mebatsion Т. С соавт., 1999, J Virol Jan; 73(1):242-50).
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к получению нативных вирусных белков в растениях. В частности, настоящее изобретение также относится к получению вирусоподобных частиц, содержащих нативный структурный белок вируса бешенства, в растениях.
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ (А) получения вирусоподобной частицы (VLP) вируса бешенства в растениях, включающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первый регуляторный участок, активный в растении, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нативный структурный белок вируса бешенства, в растение или часть растения,
b) инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, VLP вируса бешенства.
Нативный структурный белок вируса бешенства может представлять собой гликопротеин. В случае, если нативный структурный белок вируса бешенства представляет собой не М-белок, то способ (А), описанный выше, может дополнительно включать стадию:
c) введение второй нуклеиновой кислоты, содержащей второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок.
Первая или вторая нуклеотидная последовательность, или обе могут дополнительно кодировать, содержать, или кодировать и содержать один или несколько элементов амплификации. Один или несколько элементов амплификации могут быть выбраны из одного или нескольких элементов амплификации на основе геминивируса. Один или несколько элементов амплификации на основе геминивируса могут быть выбраны из длинной межгенной области вируса желтой карликовости бобовых (Bean Yellow Dwarf Virus, BeYDV LIR) и короткой межгенной области BeYDV (BeYDV SIR).
Первый регуляторный участок, активный в растении, и второй регуляторный участок, активный в растении, могут быть одинаковыми или различными.
Описанный выше способ может дополнительно содержать стадию:
d) сбора растения и экстракцию VLP.
Настоящее изобретение также включает способ (А), описанный выше, в котором первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторный участок, функционально связанный с одним или несколькими энхансерами на основе комовируса, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор сайленсинга, репликазу геминивируса или и то и другое, вводят в растение или часть растения. Альтернативно, первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую регуляторный участок, функционально связанный с одним или несколькими энхансерами на основе комовируса, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую супрессор сайленсинга, репликазу геминивируса или и то и другое, вводят в растение или часть растения. В случае если третья нуклеиновая кислота содержит только супрессор сайленсинга, то в растение или часть растения может быть введена четвертая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу геминивируса. Один или несколько энхансеров на основе комовируса могут представлять собой нетранслируемую область (UTR) комовируса, например, UTR гипертранслируемого вируса мозаики коровьего гороха (Cowpea Mosaic Virus hyperanslatable, CPMV-HT), такую как 5' и/или 3'UTR CPMV-HT.
Настоящее изобретение также включает способ (А), описанный выше, в котором на стадии введения (стадия а) первая нуклеиновая кислота транзиентно экспрессируется в растении. Альтернативно, на стадии введения (стадия а) первая нуклеиновая кислота стабильно экспрессируется в растении.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ (В) получения вирусоподобных частиц вируса бешенства (VLP), включающий:
а) обеспечение растения или части растения, содержащего первую нуклеиновую кислоту, содержащую первый регуляторный участок, активный в растении, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства,
b) инкубацию растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, нативных VLP вируса бешенства.
Первый регуляторный участок, активный в растении, и второй регуляторный участок, активный в растении, могут быть одинаковыми или различными.
Нативный структурный белок вируса бешенства в способе (В) может представлять собой гликопротеин. В случае если нативный структурный белок вируса бешенства представляет собой не М (матриксный) белок, то в способе (В), описанном выше, растение может дополнительно содержать вторую нуклеиновую кислоту, содержащую второй регуляторный участок, активный в растении и функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей матриксный белок. В альтернативном варианте первая нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую матриксный белок.
В способе, описанном выше (Способ В), первая нуклеиновая кислота или вторая нуклеиновая кислота, или обе могут дополнительно кодировать, содержать, или кодировать и содержать один или несколько элементов амплификации. Один или несколько элементов амплификации могут быть выбраны из одного или нескольких элементов амплификации на основе геминивируса. Один или несколько элементов амплификации на основе геминивируса могут быть выбраны из длинной межгенной области вируса желтой карликовости бобовых (Bean Yellow Dwarf Virus, BeYDV LIR) и короткой межгенной области BeYDV (BeYDV SIR).
В описанных выше способах (Способы A или B) растение или часть растения может дополнительно содержать еще одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую супрессор сайленсинга, например, HcPro или р19, репликазу геминивируса, или и то, и другое. В альтернативном варианте растение или часть растения может содержать еще одну нуклеиновую кислоту, кодирующую репликазу геминивируса.
Настоящее изобретение также включает способ (B), описанный выше, в котором растение или часть растения транзиентно экспрессирует первую нуклеиновую кислоту. В альтернативном варианте первая нуклеиновая кислота стабильно экспрессируется в растении или части растения.
Способ (B), описанный выше, может дополнительно содержать стадию:
d) сбора растения и экстракцию VLP.
Настоящее изобретение обеспечивает VLP, полученную способами (А) и/или (В), описанными выше. Вирусоподобная частица (VLP) может дополнительно содержать один или несколько липидов, полученных из растения. Один или более нативных структурных белков вируса бешенства, состоящих из VLP, могут содержать растение-специфические N-гликаны или модифицированные N-гликаны. Настоящее изобретение также обеспечивает поликлональное антитело, приготовленное с использованием VLP.
Настоящее изобретение включает композицию, содержащую эффективную дозу VLP, полученных описанными выше способами (А) или (В), для индукции иммунного ответа, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также включает способ индукции иммунитета к инфекции, вызванной вирусом бешенства, у субъекта, включающий введение VLP, как описано выше, субъекту. Вирусоподобную частицу (VLP) можно вводить субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Настоящее изобретение также обеспечивает растительный материал, содержащий VLP, полученную описанными выше способами (A) и/или (B). Растительный материал может быть использован для индукции иммунитета к инфекции, вызванной вирусом бешенства у субъекта. Растительный материал может быть также примешан в пищу в качестве пищевой добавки.
Данное краткое описание изобретения не обязательно описывает все признаки изобретения.
Краткое описание чертежей
Приведенные выше и прочие признаки изобретения будут более понятными из последующего подробного описания, в котором содержатся ссылки на прилагаемые чертежи, на которых:
Фигура 1 показывает анализ методом Вестерн-блоттинга транзиентной экспрессии G-белка вируса бешенства в Nicotiana benthamiana. Экспрессия G-белка вируса бешенства проходила под контролем CPMV-HT с системой амплификации ДНК на основе содержащего (1091) или не содержащего (1071) BeYDV (смотри таблицу 2 в Примерах для конструкций). Числа в скобках относятся к количеству культуры Agrobacterium в миллилитрах, используемой в приготовлении инокулюма бактерий. Растения, инфильтрованные AGL1/1091, собирали через 3 или 4 дня после инфильтрации (DPI). Листья инфильтрованных растений собирали и механически экстрагировали. Белковые экстракты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995).
Фигура 2 показывает сравнение содержания G-белка вируса бешенства в белковых экстрактах, полученных биохимическим и механическим методами экстракции G-белка вируса бешенства. Белковые экстракты разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995). Числа в скобках относятся к количеству культуры Agrobacterium в миллилитрах, используемой в приготовлении инокулюма бактерий (смотри таблицу 2 для конструкций).
Фигура 3А показывает анализ методом Вестерн-блоттинга содержания G-белка вируса бешенства после разделения методом эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных белковых экстрактов, полученных из растений, инфильтрованных AGL1/1091. Элюированные фракции после SEC разделяли методом SDS-PAGE и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995). Фигура 3В показывает анализ с помощью Вестерн-блоттинга содержания G-белка вируса бешенства после разделения методом эксклюзионной хроматографии (SEC) концентрированных белковых экстрактов, полученных из растений, инфильтрованных AGL1/1091 +AGL1/1086. Элюированные фракции после SEC разделяли методом SDS-PAGE и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител к G-белку вируса бешенства (Santa-Cruz SC-57995).
Фигура 4А показывает праймер IF-RabM-S3.c (SEQ ID NO: 1). Фигура 4В показывает праймер IF-RabM-S1-4.r (SEQ ID NO: 2). Фигура 4C показывает последовательность, кодирующую синтезированный М-белок (соответствующую nt 2496-3104 из Genbank accession number FJ 913470) (SEQ ID NO. 3). Фигура 4D показывает схематическое изображение конструкции номер 1191. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 4Е показывает конструкцию номер 1191 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 4). Фигура 4F показывает кассету экспрессии номер 1066 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Открытая рамка считывания М-белка из штаммов ERA вируса бешенства подчеркнута (SEQ ID NO: 5). Фигура 4G показывает аминокислотную последовательность М-белка из штамма ERA вируса бешенства (SEQ ID NO: 6). Фигура 4Н показывает схематическое изображение конструкции номер 1066.
Фигура 5А показывает схематическое изображение конструкции номер 1193. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 5В показывает конструкцию номер 1193 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза с экспрессионной кассетой Пластоцианин-TBSV Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 7). Фигура 5С показывает экспрессионную кассету номер 1086 от левого LIR BeYDV до правого LIR BeYDV. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 8). Фигура 5D показывает схематическое изображение конструкции номер 1086.
Фигура 6А показывает праймер IF-RabG-S2+4.c (SEQ ID NO: 9). Фигура 6B показывает праймер IF-RabG-S1-4.r (SEQ ID NO: 10). Фигура 6С показывает последовательность, кодирующую синтезированный G-белок вируса бешенства (соответствующую nt 3317-4891 из Genbank accession number EF 206707), (SEQ ID NO: 11). Фигура 6D показывает схематическое изображение конструкции номер 1192. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 6Е показывает конструкцию номер 1192 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 12). Фигура 6F показывает экспрессионную кассету номер 1071 от промотора 2X35S до терминатора NOS. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 13). Фигура 6G показывает аминокислотную последовательность PDISP-белок G из штамма ERA вируса бешенства (SEQ ID NO: 14). Фигура 6Н показывает схематическое изображение конструкции номер 1071.
Фигура 7А показывает схематическое изображение конструкции номер 1194. Сайты ферментов рестрикции SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, указаны на изображении. Фигура 7В показывает конструкцию номер 1194 от левых до правых границ t-ДНК (подчеркнуто). 2X35S/CPMV-HTVPDISP/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза с экспрессионной кассетой Пластоцианин-Р19-Пластоцианин (супрессор сайленсинга) (SEQ ID NO: 15). Фигура 7С показывает экспрессионную кассету номер 1091 от левого LIR BeYDV до правого LIR BeYDV. Открытая рамка считывания PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства подчеркнута. (SEQ ID NO: 16). Фигура 7D показывает схематическое изображение конструкции номер 1091.
Фигура 8А показывает SDS-PAGE при окрашивании Кумаси (Precast 4-12% от BioRad) G-белка препарата VLP. 1) препарат Rab-VLP, 2) маркер молекулярной массы. Фигура 8В показывает ответы нейтрализующих антител (МЕ/мл) в группе мышей (5 особей на группу), иммунизированных внутримышечно (i.m.) тремя дозами (D0, D7 и D28) 0.1 мл NG-VLP (Нативный G-белок VLP) вакцины с адьювантом и без него (Alhydrogel (Alhy)). Образцы крови брали на День 44, через 16 дней после 3-х доз. В методе тестирования использовали: тест RFFIT (быстрый тест на ингибирование флуоресцентного свечения): рассчитывали среднее геометрическое титра (GMT) с использованием индивидуальных значений, полученных для каждого животного, и указывали респондеров с положительным ответом. Столбцы представляют GMT с 95% CI. Статистический анализ Anova выполняли между всеми лечебными группами и статистически значимых различий не наблюдалось.
Подробное описание изобретения
Приведенное далее описание относится к предпочтительному варианту осуществления изобретения.
Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или более нативных структурных белков вируса бешенства, и способам получения VLP вируса бешенства в растениях. Вирусоподобные частицы (VLP) вируса бешенства могут содержать один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например, один или более гликопротеинов, один или более матриксных белков, или оба. Вирусоподобная частица (VLP) не содержит белки вируса из вируса растения.
Настоящее изобретение к тому же обеспечивает способ получения вирусоподобных частиц (VLP) вируса бешенства в растениях. Способ может включать введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторный участок, активный в растениях, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нативный структурный белок вируса бешенства, и одного или нескольких элементов амплификации в растение или часть растения. Далее следует инкубация растения или части растения в условиях, которые обеспечивают экспрессию нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, VLP.
Нативный структурный вирусный белок вируса бешенства (также называемый как нативный структурный вирусный белок вируса бешенства) может относиться ко всей или части последовательности нативного структурного белка вируса бешенства, выделенного из вируса бешенства, присутствующего в любом природном или вариантном штамме вируса бешенства, или изоляте. Таким образом, термин нативный структурный белок вируса бешенства и тому подобное включает природные варианты последовательности нативного структурного белка вируса бешенства, полученные путем мутации в течение жизненного цикла вируса или в ответ на селективное давление (например, лекарственную терапию, расширение тропизма клетки хозяина или инфекционность, и т.д.). Специалисту в данной области будет понятно, что такие последовательности нативного структурного белка вируса бешенства и его варианты могут быть также получены с использованием рекомбинантных технологий. Нативный структурный вирусный белок вируса бешенства не включает химерные белки, в которых, например, трансмембранный домен и/или цитоплазматический концевой сегмент заменены на гетерологичный трансмембранный домен и/или цитоплазматический концевой сегмент по отношению к нативному структурному белку вируса бешенства.
Неограничивающим примером нативного структурного белка вируса бешенства является белок гликопротеин (G) вируса бешенства, фрагмент G-белка, матриксный (М) белок, фрагмент М-белка или их комбинация. Неограничивающие примеры G-белка или фрагментов G-белка, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, включают G-белки из штамма ERA вируса бешенства. Пример G-белка, который не должен рассматриваться как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Кроме того, нативный структурный белок вируса бешенства может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 90-100% сходство с таковой, включая любой процент сходства в указанном диапазоне, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с таковой.
Подобие аминокислотных последовательностей или идентичность может быть вычислена с использованием программ BLASTP и TBLASTN, которые используют BLAST (основное средство поиска, основанное на локальных выравнивания) алгоритм 2.0. Методики для вычисления сходства аминокислотных последовательностей или идентичности хорошо известны специалистам в данной области, и использование алгоритма BLAST описано в ALTSCHUL с соавт. (1990, J Mol. Biol. 215:403-410) и ALTSCHUL с соавт. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).
Нативный структурный вирусный белок может существовать в виде мономера, димера, тримера или их комбинации. Тример представляет собой макромолекулярный комплекс, образованный тремя белками, обычно соединенными нековалентной связью. Без привязки к какой-либо теории полагают, что домен тримеризации белка может быть важным для образования таких тримеров. Таким образом, вирусный белок или его фрагмент может содержать домен тримеризации.
Под «матриксным белком» (также называемым как вирусный коровый белок) понимается белок, который участвует в сборке и стабилизирует структуру вириона. Вирусные матриксные белки обычно напрямую взаимодействуют с клеточными мембранами и могут быть вовлечены в процесс почкования. Вирусные коровые белки представляют собой белки, которые составляют часть нуклеокапсида и обычно напрямую связаны с вирусной нуклеиновой кислотой. Примерами вирусного матриксного или корового белка являются М-белок вируса бешенства, белок M1 вируса гриппа, белок М респираторно-синтициального вируса (RSV) и gag-белок ретровирусов. Примеры матриксных белков, которые можно использовать, как описано в настоящем документе, включают, но без ограничения, М-белок вируса бешенства. Неограничивающий пример последовательностей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включает М-белок из штамма ERA вируса бешенства. Иллюстративный М-белок состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. Кроме того, нативный структурный вирусный белок вируса бешенства может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, примерно 90-100% сходство последовательности с таковой, включая любой процент сходства внутри этих диапазонов, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходство последовательности с таковой.
Вирус везикулярного стоматита (семейство рабдовирусов, к которому относится вирус бешенства) и вирус простого герпеса (вирус герпеса, к которому относится вирус ветряной оспы) почкуются VSР4-зависимым образом (Taylor с соавт. J. Virol 81:13631-13639, 2007; Crump с соавт., J. Virol 81:7380-7387, 2007). Так как VSP4 взаимодействует с поздним доменом матриксного белка, можно сделать вывод о том, что матриксный белок необходим для почкования и, как следствие, для продукции VLP. Однако, как описано в настоящем документе, VLP нативного вируса бешенства могут быть получены в растениях с коэкспрессией матриксного белка или без нее. Таким образом, VLP нативного вируса бешенства, продуцированные в растениях из нативных структурных белков, полученных из вируса, в соответствии с настоящим изобретением могут содержать или могут не содержать вирусный матриксный (или вирусный коровый) белок.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения вирусоподобных частиц VLP вируса бешенства в растении, при этом нуклеиновая кислота (первая нуклеиновая кислота), кодирующая нативный структурный белок вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей вирусный матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной стадии или могут быть введены в растение последовательно.
Как описано более подробно ниже, VLP могут быть получены в растении путем экспрессии нуклеиновой кислоты (первой нуклеиновой кислоты), кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства. Вторая нуклеиновая кислота, кодирующая матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства, может коэкспрессироваться в растении. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной стадии, или могут быть введены в растение последовательно. Нуклеиновая кислота и вторая нуклеиновая кислота могут быть введены в растение транзиентным или стабильным образом.
К тому же, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, может быть трансформировано матриксным белком, например, но без ограничения, матриксным белком вируса бешенства (второй нуклеиновой кислотой) таким образом, что обе, первая и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируются в растении. В альтернативном варианте растение, которое экспрессирует матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства (вторую нуклеиновую кислоту), может быть трансформировано первой нуклеиновой кислотой, кодирующей один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, таким образом, что обе, первая и вторая нуклеиновые кислоты могут коэкспрессироваться в растении.
К тому же, первое растение, экспрессирующее первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например G-белок вируса бешенства, может быть скрещено со вторым растением, экспрессирующим вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую матриксный белок, например, но без ограничения, матриксный белок вируса бешенства, для получения потомственного растения, которое коэкспрессирует первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие нативный структурный белок вируса бешенства и матриксный белок, соответственно.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения VLP вируса бешенства в растении, который включает введение в растение или часть растения одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих один или более нативных структурных белков вируса бешенства, оперативно связанных с регуляторной областью, активной в растениях, и одного или нескольких элементов амплификации. Растение или часть растения затем инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию одной или более нуклеиновых кислот, с получением, таким образом, VLP вируса бешенства. Один или более нативных структурных белков вируса бешенства могут представлять собой один или более G-белков вируса бешенства, фрагмент G-белка, один или более М-белков, фрагмент М-белка или их комбинацию.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает VLP, содержащие один или более нативных структурных белков вируса бешенства, например, но без ограничения, один или более гликопротеинов вируса бешенства, один или более матриксных белков, или и то и другое. Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть получены способом, который предложен в настоящем изобретении.
Термин «вирусоподобная частица» (VLP) или «вирусоподобные частицы», или «VLP» относится к самоорганизующимся структурам, содержащим один или более структурных белков, таких как, например, нативный структурный белок вируса бешенства, например, но без ограничения, G-белок вируса бешенства. Обычно VLP морфологически и антигенно сходны с вирионами, образующимися при инфекции, но не несут генетической информации, достаточной для репликации, и поэтому неинфекционны. Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть получены в пригодных клетках-хозяевах, в том числе клетках растения-хозяина. После экстракции из клетки-хозяина и непосредственно после изоляции и дополнительной очистки в надлежащих условиях, VLP могут быть выделены в виде интактных структур.
Размер (т.е. диаметр) указанных выше VLP может быть измерен, например, с помощью методов динамического светорассеяния (DLS) или электронной микроскопии (ЕМ) и обычно составляет от 40 до 300 нм или любой размер в указанном диапазоне. В отдельных вариантах осуществления размер интактной структуры VLP может изменяться от примерно 40 нм до примерно 300 нм, или составлять любой размер в указанном диапазоне, например, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 110 нм, 120 нм, 130 нм, 140 нм, 150 нм, 160 нм, 170 нм, 180 нм, 190 нм, 200 нм, 210 нм, 220 нм, 230 нм, 240 нм, 250 нм, 260 нм, 270 нм или 280 нм, или любой размер в диапазоне указанных значений. В одном варианте осуществления размер интактной структуры VLP может изменяться от примерно 170 нм до примерно 200 нм, или составлять любой размер в указанном диапазоне, такой как 175 нм, 180 нм, 185 нм, 190 нм, 195 нм, или любой размер в диапазоне указанных значений.
Настоящее изобретение также обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более нативных структурных белков вируса бешенства, оперативно связанных с регуляторным участком, активным в растении. К тому же, один или более нативных структурных белков вируса бешенства могут быть оперативно связаны с одним или несколькими элементами амплификации. Один или более нативных структурных белков вируса бешенства могут представлять собой, например, один или более G-белков вируса бешенства, один или более М-белков, или оба.
Последовательность нуклеиновой кислоты, на которую сделано обращение в настоящем изобретении, может быть «гомологична по существу» или «сходна по существу» последовательности или комплементу последовательности, если последовательность нуклеиновой кислоты гибридизируется с одной или более чем одной нуклеотидной последовательностью или комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в жестких условиях гибридизации. Последовательности «гомологичны по существу», «сходны по существу», если по меньшей мере примерно 70% или между 70 и 100%, или любой промежуточный процент, например 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, или любой промежуточный процент нуклеотидов совпадают на протяжении определенной длины нуклеотидной последовательности, при условии, что такие гомологичные последовательности проявляют одно или несколько свойств последовательности или кодированного продукта, как описано в настоящем документе. Правильный фолдинг белка может быть важным для стабильности белка, формирования мультимеров, формирования VLP и функционирования. На сворачивание белка могут влиять один или более факторов, включая, но без ограничения, последовательность белка, относительное содержание белка, степень внутриклеточного краудинга, наличие кофакторов, которые могут быть связаны или транзиентно ассоциированы со свернутым, частично свернутым или несвернутым белком.
Такое сходство последовательностей может быть определено с помощью программы сравнения нуклеотидных последовательностей, например, программы, поставляемой в пакете DNASIS (с использованием, например, но без ограничения, следующих параметров: GAP penalty (штраф за пропуск в последовательности) 5, # of top diagonals (число совпадающих к-плетов) 5, fixed GAP penalty (фиксированная коррекция пропуска) 10, k-tuple (размер идентичного участка) 2, floating gap (плавающий пропуск) 10 и window size (размер окна) 5). Однако другие методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области, например, алгоритмы Смита и Ватермана (Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Нидлемана и Вунша (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Пирсона и Липмана (Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), и компьютеризированные реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST, находящиеся в открытом доступе в Национальных институтах здравоохранения, NIH), либо выравнивание вручную и визуальный осмотр (смотри, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel с соавт., eds. 1995 supplement), либо использование Саузерн или Нозерн гибридизации в жестких условиях (смотри Maniatis с соавт., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Предпочтительно, последовательности, которые являются по-существу гомологичными, проявляют, по меньшей мере, примерно 80% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% сходства последовательностей на протяжении определенной длины молекулы.
4
Примером одного из таких жестких условий гибридизации может являться гибридизация в течение ночи (в течение около 16-20 часов) в 4×SSC при 65°C с последующей отмывкой в 0.1×SSC при 65°C в течение часа или 2 отмывок в 0.1×SSC при 65°C, каждой в течение 20 или 30 минут. Альтернативно, примером жесткого условия гибридизации может служить гибридизация в течение ночи (16-20 часов) в 50%-ном формамиде, 4×SSC при 42°C с последующей отмывкой в 0.1×SSC при 65°C в течение часа или 2 отмывок в 0.1×SSC при 65°C, каждой в течение 20 или 30 минут, или в течение ночи (16-20 часов), или гибридизация в водном фосфатном буфере Черча (7% SDS; буфер 0.5 М NaPO pH 7.2; 10 мМ EDTA) при 65°C с 2 отмывками либо при 50°C в 0.1×SSC, 0.1% SDS по 20 или 30 минут, либо 2 отмывками при 65°C в 2×SSC, 0.1% SDS по 20 или 30 минут для индивидуальных участков последовательности.
Нуклеиновая кислота, кодирующая нативный структурный полипептид вируса бешенства или нативный структурный белок вируса бешенства, может быть описана как «нуклеиновая кислота вируса бешенства», «нуклеотидная последовательность вируса бешенства», «нативная нуклеиновая кислота вируса бешенства» или «нативная нуклеотидная последовательность вируса бешенства». Например, что не должно рассматриваться как ограничение, вирусоподобная частица, содержащая один или более нативных структурных белков вируса бешенства или нативных структурных полипептидов вируса бешенства, может быть описана как «VLP вируса бешенства» или «нативная VLP вируса бешенства».
Нативный структурный белок или полипептид вируса бешенства может включать сигнальный пептид, который является таким же или является гетерологичным по отношению к остальной части полипептида или белка. Термин «сигнальный пептид» хорошо известен в данной области и относится обычно к короткой (примерно 5-30 аминокислот) последовательности аминокислот, находящейся обычно на N-конце полипептида, которая может направлять транслокацию вновь транслированного полипептида в конкретную органеллу, или способствовать позиционированию специфических доменов полипептидной цепи относительно других. В качестве неограничивающего примера, сигнальный пептид может нацеливать транслокацию белка в эндоплазматический ретикулум и/или способствовать позиционированию N-концевого проксимального домена относительно мембранного якорного домена растущего полипептида для содействия отщеплению и сворачиванию зрелого белка, например, что не должно рассматриваться как ограничение, нативного структурного белка вируса бешенства.
Сигнальный пептид (SP) может быть нативным для белка или белка вируса, или сигнальный пептид может быть гетерологичным по отношению к первичной последовательности белка или белка вируса, который экспрессируется. Например, нативный сигнальный пептид нативного G-белка вируса бешенства или нативного M-белка вируса бешенства может быть использован для экспрессии нативного структурного белка вируса бешенства в растительной системе.
Сигнальный пептид может быть также ненативным, например, из белка, вирусного белка или нативного структурного белка вируса, отличного от белка вируса, или из растительного, животного или бактериального полипептида. Неограничивающим примером сигнального пептида, который может быть использован, является протеиндисульфидизомераза люцерны (PDI SP; нуклеотиды 32-103 входящий No. Z11499).
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает нативный структурный белок вируса бешенства, содержащий нативный или ненативный сигнальный пептид, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие структурные белки вируса бешенства.
Элемент амплификации
Нативный структурный белок или полипептид вируса бешенства может экспрессироваться в системе экспрессии, включающей систему экспрессии на основе вирусной ДНК или РНК, например, но без ограничения, экспрессионную кассету на основе комовируса, и элемент амплификации на основе геминивируса.
Система экспрессии, описанная в настоящем документе, может содержать экспрессионную кассету на основе двухкомпонентного вируса или вируса с двухкомпонентными геномом. Например, двухкомпонентные вирусы могут принадлежать семейству Comoviridae. Родовая принадлежность семейства Comoviridae включает комовирус, неповирус, фабавирус, черавирус и садвавирус.Комовирусы включают вирус мозаики коровьего гороха (Cowpea mosaic virus, CPMV), серьезный вирус мозаики коровьего гороха (Cowpea severe mosaic virus, CPSMV), вирус мозаики кабачка (Squash mosaic virus, SqMV), вирус крапчатости красного клевера (Red clover mottle virus, RCMV), вирус крапчатости бобов (Bean pod mottle virus, BPMV), вирус кольцевой пятнистости капусты полевой (Turnip ringspot virus, TuRSV), вирус мозаики кормовых бобов (Broad bean true mosaic virus, BBtMV), вирус пятнистости кормовых бобов (Broad bean stain virus, BBSV), вирус мозаики редиса (Radish mosaic virus, RaMV). Примеры последовательностей PHK-2 комовируса, содержащие элементы энхансера, которые могут быть полезными для различных аспектов изобретения, включают, но без ограничения: CPMV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_003550), RCMV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_003738), BPMV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_003495), CPSMV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_003544), SqMV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_003800), TuRSV PHK-2 (GenBank Accession No. NC_013219.1). BBtMV PHK-2 (GenBank Accession No. GU 810904), BBSV PHK-2 (GenBank Accession No. FJ 028650), RaMV (GenBank Accession No. NC_003800).
Сегменты двухкомпонентного комовирусного генома РНК называются РНК-1 и РНК-2. РНК-1 кодирует белки, вовлеченные в репликацию, тогда как РНК-2 кодирует белки, необходимые для межклеточного движения, и два капсидных белка. Могут быть использованы любые пригодные кассеты на основе комовируса, включая CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV или BPMV, например, экспрессионная кассета может быть основана на CPMV.
«Экспрессионная кассета» относится к нуклеотидной последовательности, содержащей представляющую интерес нуклеиновую кислоту под контролем или функционально (или оперативно) связанную с соответствующим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Система экспрессии может также содержать элементы амплификации из геминивируса, например, элемент амплификации из вируса желтой карликовости бобовых (BeYDV). BeYDV принадлежит роду Mastreviruses, адаптированному к двудольным растениям. BeYDV является однокомпонентным, имеющим кольцевой однонитевый ДНК-геном, и может реплицироваться с образованием большого числа копий путем механизма репликации по типу разматывающегося рулона. Векторные системы на основе репликона ДНК, полученного из BeYDV, использовали для быстрой продукции белка в растениях с высоким выходом.
Используемое в настоящем документе выражение «элементы амплификации» относятся к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему, по меньшей мере, часть одной или нескольких длинных межгенных областей или длинных межгенных повторов (LIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе «длинная межгенная область» или «длинный межгенный повтор» относится к участку длинной межгенной области, который содержит участок связывания Rep-белка, способный опосредовать вырезание и репликацию Rep-белком геминивируса. В отдельных аспектах сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий один или более LIR, может дополнительно содержать короткую межгенную область или малую межгенную область (SIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе «короткая межгенная область» или «малая межгенная область» относится к комплементарной цепи (короткой IR (SIR) Mastreviruses). Любой пригодный элемент амплификации на основе геминивируса может быть использован в настоящем документе. Смотри, например, WO 2000/20557; WO 2010/025285; Zhang X. с соавт. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. с соавт. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. с соавт. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); которые включены в настоящий документ путем отсылки. Если в конструкции используется больше, чем один LIR, например, два LIR, то промотор, участки CMPV-HT и представляющая интерес последовательность нуклеиновой кислоты, и терминатор являются охваченными каждым из двух LIR. Кроме того, элемент амплификации может, например, происходить из последовательности, описанной в Halley-Stott с соавт. (2007) Archives of Virology 152:1237-1240, доступной в Gen Bank accession number DQ 458791, включенном в настоящий документ путем отсылки. Сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий LIR, представляет собой объединенные нуклеотиды с 2401 по 2566 и с 1 по 128. Сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий SIR, представляет собой нуклеотиды с 1154 по 1212.
Как описано в настоящем документе, совместная доставка вектора, полученного из вируса желтой карликовости бобовых (BeYDV), и доставляющего вектора Rep/RepA путем агроинфильтрации листьев Nicotiana benthamiana привело к эффективной амплификации репликона и устойчивому продуцированию белка.
Экспрессионная кассета на основе комовируса и элемент амплификации, полученный из геминивируса, могут содержаться на отдельных векторах или компонентные части могут быть включены в один вектор. При использовании двух векторов, первый и второй векторы могут быть введены в клетку растения одновременно или по-отдельности.
Вирусная репликаза может быть также включена в систему экспрессии, как описано в настоящем документе, для увеличения экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Неограничивающим примером репликазы служит репликаза BeYDV (pRE110), кодирующая Rep и RepA BeYDV (С2/С1; Huang с соавт., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714; который включен в настоящий документ путем отсылки). Другой неограничивающий пример репликазы описан в Halley-Stott с соавт. (2007) Archives of Virology 152:1237-1240, из Gen Bank accession number DQ 458791, который включен в настоящий документ путем отсылки. Сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий ген С1:С2, представляет собой нуклеотиды с 1310 по 2400.
Под «коэкспрессированные» подразумевают, что экспрессия двух или более нуклеотидных последовательностей происходит в растения примерно в одно и то же время, причем в одной и той же ткани растения. Однако экспрессия нуклеотидных последовательностей не обязана происходить строго одновременно. Экспрессия двух или более нуклеотидных последовательностей должна осуществляться таким образом, чтобы была возможность взаимодействия между кодированными продуктами. Коэкспрессия двух или более нуклеотидных последовательностей может иметь место в системе транзиентной экспрессии, при этом две или более последовательностей вводят в растение приблизительно одновременно, в условиях, когда происходит экспрессия обеих последовательностей. В альтернативном варианте растение-платформа, содержащее одну из нуклеотидных последовательностей, может быть трансформировано стабильным образом, с дополнительной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, например, нативный структурный белок вируса бешенства, введенной в растение-платформу транзиентным образом.
Шаперон
Правильный фолдинг экспрессированного нативного структурного белка вируса бешенства может быть важным для стабильности белка, формирования мультимеров, формирования VLP, функционирования нативного структурного белка вируса бешенства и распознавания нативного структурного белка вируса бешенства антителом, помимо других характеристик. На фолдинг и накопление белка могут оказывать влияние один или более факторов, включая, но без ограничения, последовательность белка, относительное содержание белка, степень межклеточного краудинга, pH в клеточном компартменте, наличие кофакторов, которые могут связывать или быть транзиентно ассоциированными со свернутым, частично свернутым или несвернутым белком, присутствие одного или более белков-шаперонов, и т.п.
Белки теплового шока (Hsp) или стресс-белки являются примерами белков-шаперонов, которые могут принимать участие в различных клеточных процессах, в том числе синтезе белка, внутриклеточной миграции, предотвращении неправильного сворачивания, предотвращении агрегации белка, сборке и диссоциации белковых комплексов, сворачивании белка и дезагрегации белка. Примерами таких белков теплового шока служат, но без ограничения, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, Hsp100, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, FKBPs, циклофилины, ClpP, GrpE, убиквитин, калнексин, и протеиндисульфидизомеразы (смотри, например, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); патент США №5232833). Как описано в настоящем документе, белки теплового шока, например, но без ограничения, Hsp40 и Hsp70, могут быть использованы для обеспечения сворачивания белка вируса бешенства.
Примеры Hsp70 включают Hsp72 и Hsc73 клеток млекопитающих, DnaK бактерий, в частности микобактерий, таких как Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis (например, Bacille-Calmette Guerin: называемый в настоящем документе Hsp71). DnaK из Escherichia coli, дрожжей и других прокариот, и BiP и Grp78 эукариот, таких как A. thaliana (Lin с соавт. 2001 (Cell Stress and Chaperones 6:201-208). Конкретным примером Hsp70 является A. thaliana Hsp70 (кодирован Genbank ref: AY120747.1). Hsp70 способен специфически связывать ATP, а также несвернутые полипептиды и пептиды, участвуя, таким образом, в сворачивании и разворачивании белка, а также в сборке и разборке белковых комплексов.
Примеры Hsp40 включают DnaJ прокариот, таких как Е. coli и микобактерий, и HSJ1, HDJ1 и Hsp40 эукариот, таких как люцерна (Frugis с соавт., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Конкретным примером Hsp40 является М. sativa MsJ1 (Genbank ref: AJ000995.1). Hsp40 играет роль молекулярного шаперона в сворачивании белка, термоустойчивости и репликации ДНК, наряду с другими клеточными активностями.
Среди Hsp, Hsp70 и его кошаперон Hsp40 связаны со стабилизацией трансляции и вновь синтезированными полипептидами до завершения синтеза. Без привязки к какой-либо теории полагают, что Hsp40 связывается с гидрофобными участками развернутых (находящихся на стадии возникновения или вновь перенесенных) полипептидов, способствуя, таким образом, взаимодействию комплекса Hsp70-ATP с полипептидом. Гидролиз АТР приводит к формированию стабильного комплекса между полипептидом, Hsp70 и ADP, и высвобождению Hsp40. Связь комплекса Hsp70-ADP с гидрофобными участками полипептида предотвращает их взаимодействие с другими гидрофобными участками, предотвращая неправильное сворачивание и образование агрегатов с другими белками (рассмотрено в Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579).
Нативные белки-шапероны могут способствовать правильному сворачиванию низких уровней рекомбинантного белка, но по мере увеличения уровней экспрессии содержание нативных шаперонов может стать ограничивающим фактором. Высокие уровни экспрессии нативного структурного белка вируса бешенства в агроинфильтрованных листьях могут привести к накоплению нативного структурного белка вируса бешенства в цитозоле, и коэкспрессия одного или нескольких белков-шаперонов, таких как Hsp70, Hsp40, или обоих, Hsp70 и Hsp40, может понизить уровень искаженных или агрегированных белков и увеличить количество белков, проявляющих третичные и четвертичные структурные характеристики, которые обеспечивают формирование вирусоподобных частиц.
Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способ получения VLP вируса бешенства в растении, при этом первая нуклеиновая кислота, кодирующая нативный структурный белок вируса бешенства, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей шаперон. Первая и вторая нуклеиновые кислоты могут быть введены в растение за одну стадию, или могут быть введены в растение последовательно.
Регуляторный элемент
Под терминами «регуляторный участок», «регуляторный элемент» или «промотор» в настоящем описании подразумевается часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, расположенная ранее участка гена, кодирующего белок, и состоящая из ДНК или РНК, или обеих, ДНК и РНК. Если регуляторный участок является активным и оперативно ассоциирован или оперативно связан с представляющим интерес геном, это может привести к экспрессии представляющего интерес гена. Регуляторный элемент может влиять на органоспецифичность или регулировать временную активацию гена или активацию в ходе развития. «Регуляторный участок» включает элементы промоторов, коровые регуляторные элементы, проявляющие базовую промоторную активность, элементы, способные индуцироваться в ответ на внешнее воздействие, элементы, опосредующие промоторную активность, такие как негативные регуляторные элементы или усилители транскрипции. Используемый в настоящем документе «регуляторный участок» может также включать элементы, которые активны после транскрипции, например регуляторные элементы, модулирующие экспрессию генов, такие как усилители трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, расположенные ранее активирующие последовательности (upstream activating sequences) и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из последних упомянутых элементов могут быть расположены вблизи кодирующей области.
В рамках данного описания термин «регуляторный элемент» или «регуляторный участок», как правило, относится к последовательности ДНК, обычно, но не всегда, расположенной ранее (5') кодирующей последовательности структурного гена, которая регулирует экспрессию кодирующей области за счет распознавания РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на определенном участке. Однако следует учитывать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные в интронах или 3' последовательности могут также участвовать в регулировании экспрессии представляющей интерес кодирующей области. Примером регуляторного элемента, осуществляющего распознавание РНК-полимеразы или других факторов транскрипции, что обеспечивает ее начало в определенной позиции, является элемент промотора. Большая часть, но не все, регуляторные элементы эукариотов содержат ТАТА-бокс, то есть консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из пар азотистых оснований аденозин и тимидин, обычно расположенных приблизительно за 25 пар нуклеотидов ранее сайта начала транскрипции. Элемент промотора содержит базальный элемент промотора, ответственный за инициирование транскрипции, а также другие регуляторные элементы (как указано выше), модифицирующие экспрессию генов.
Существует несколько типов регуляторных участков, в том числе активные в ходе развития, индуцируемые или конститутивные. Регуляторный участок, активный в ходе развития или управляющий дифференциальной экспрессией гена, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени в процессе развития данного органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные участки, которые активны в ходе развития, могут быть предпочтительно активны в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, они могут также быть активны либо в ходе развития, либо на базовом уровне в других органах или тканях растения. Примерами тканеспецифических регуляторных участков, например, see-специфических регуляторных участков, являются промотор напина и промотор круциферина (Rask с соавт, 1998, J. Plant Physiol. 152:595-599; Bilodeau с соавт., 1994, Plant Cell 14:125-130). Примером промотора, специфического для листьев, является промотор пластоцианина (смотри патент США 7125978, который включен в настоящий документ путем отсылки).
Индуцируемым является регуляторный участок, который способен прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательностей ДНК или гена под действием индуктора. В отсутствие индуктора транскрипции последовательности ДНК или гена не происходит. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемым регуляторным участком для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную под действием индуктора. Однако белковый фактор может также и отсутствовать. В качестве индуктора может служить химический агент, такой как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение, или физиологический стресс, оказываемый непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами, или косвенно при действии патогенного или болезнетворного агента, например вируса. Действие индуктора на клетку растения, содержащую индуцируемый регуляторный участок, может происходить за счет внешнего воздействия, например, опрыскивания, полива, нагревания или прочих способов. Индуцируемые регуляторные элементы могут иметь происхождение из генов как растительного, так и нерастительного происхождения (например, Gatz, С. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; включенный в настоящий документ посредством отсылки). Примеры возможных индуцируемых промоторов включают, но без ограничения, индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; включенный в настоящий документ путем отсылки), индуцируемый стероидами промотор (Aoyama. Т. and Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404; включенный в настоящий документ путем отсылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., с соавт, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, М.Х., с соавт, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, включенные в настоящий документ путем отсылки), гены IB6 и CKI1, индуцируемые цитокином (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1., 1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985; включенные в настоящий документ путем отсылки), и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, Т., с соавт., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; включенный в настоящий документ путем отсылки).
Конститутивный регуляторный участок управляет экспрессией гена в различных частях растения и постоянно в ходе его развития. Примерами известных конститутивных регуляторных элементов являются промоторы, связанные с транскриптом CaMV 35S (Odell с соавт., 1985, Nature, 313:810-812), гены актина риса 1 (Zhang с соавт, 1991, Plant Cell, 3:1155-1165), актина 2 (An с соавт., 1996, Plant J., 10:107-121) или тропомиозина 2 (патент США №5,428,147, включенный в настоящий документ путем отсылки), и триозофосфатизомеразы 1 (Xu с соавт., 1994, Plant Physiol. 106:459-467), ген убиквитина кукурузы 1 (Cornejo с соавт., 1993, Plant Mol. Biol. 29:637-646), гены убиквитина Arabidopsis 1 и 6 (Holtorf с соавт., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-646), и фактора гена инициации трансляции табака 4A (Mandel с соавт., 1995, Plant Mol. Biol. 29:995-1004).
Используемый в настоящем документе термин «конститутивный» не означает обязательно, что экспрессия гена под управлением конститутивного регуляторного участка осуществляется на одном и том же уровне во всех типах клеток, но то, что экспрессия осуществляется в широком интервале типов клеток, хотя часто в различном количестве. Конститутивные регуляторные элементы могут быть связаны с другими последовательностями для дополнительного усиления транскрипции и/или трансляции нуклеотидной последовательности, с которой они оперативно связаны. Например, система CPMV-HT получена из нетранслируемых областей вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и демонстрирует усиленную трансляцию связанной кодирующей последовательности. Под «нативный» понимается, что нуклеиновая кислота или аминокислотная последовательность имеет природное происхождение или является «дикого типа». Под «функционально связанный» понимается, что определенные последовательности, например регуляторный элемент и представляющая интерес кодирующая область, взаимодействуют прямо или косвенно для осуществления заданной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии генов. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, осуществляться за счет белков, которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями.
Изобретение также обеспечивает VLP, которые приобретают липидную оболочку из плазматической мембраны клетки, в которой происходит экспрессия VLP. Например, если экспрессия одного или более нативных структурных белков вируса бешенства происходит в системе на основе растения, то полученные VLP могут приобрести липидную оболочку из плазматической мембраны клетки растения.
В общем случае термин «липид» относится к растворимым в жирах (липофильным) природным молекулам. Вирусоподобные частицы (VLP), полученные в растении согласно некоторыми аспектам изобретения, могут образовывать комплексы с липидами растительного происхождения. Липиды растительного происхождения могут присутствовать в форме липидного бислоя и могут дополнительно содержать оболочку, окружающую VLP. Липиды растительного происхождения могут содержать липидные компоненты плазматической мембраны растения, в котором были получены VLP, в том числе фосфолипиды, три-, да- и моноглицериды, а также жирорастворимый стерин или метаболиты, содержащие стерины. Примеры включают фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, гликосфинголипиды, фитостерины или их комбинации. Липид растительного происхождения может также быть назван «растительным липидом». Примеры фитостеринов включают кампестерин, стигмастерин, эргостерин, брассикастерин, дельта-7-стигмастерин, дельта-7-авенастерин, даукостерин, ситостерин, 24-метилхолестерин, холестерин или бета-ситостерин - смотри, например, Mongrand с соавт., 2004. Специалисту в данной области будет понятно, что липидный состав плазматической мембраны клетки может изменяться в зависимости от культуры или условий выращивания клеток или организма, или разновидностей, из которых получают клетку. Как правило, наиболее распространенным фитостерином является бета-ситостерин.
Клеточные мембраны обычно содержат липидные бислои и белки, выполняющие различные функции. Определенные липиды могут быть локализованы в липидном бислое, образуя так называемые «липидные рафты». Микродомены этих липидных рафтов могут быть обогащены сфинголипидами и стеринами. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, можно полагать, что липидный рафт играет значительную роль в эндо- и экзоцитозе, входе или выходе вирусов или других возбудителей инфекции, межклеточной сигнальной трансдукции, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внутриклеточные и внеклеточные матрицы.
Вирусоподобная частица (VLP), полученная в растении, может индуцировать нативный структурный белок вируса бешенства, содержащий растение-специфические N-гликаны. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает вирусоподобную частицу (VLP), содержащую нативный структурный белок вируса бешенства, содержащий растение-специфические N-гликаны.
Кроме того, модификация N-гликана в растениях известна (смотри, например, патент США 60/944344; который включен в настоящий документ путем отсылки), и возможно получение нативных структурных белков вируса бешенства, содержащих модифицированные N-гликаны. Возможно получение нативных структурных белков вируса бешенства с модифицированным паттерном гликозилирования, например, с пониженным уровнем фукозилирования, ксилозилирования или как фукозилирования, так и ксилозилирования N-гликанов, либо получение нативных структурных белков вируса бешенства с модифицированным паттерном гликозилирования, где в белке уменьшен уровень фукозилирования, ксилозилирования или и того, и другого, но присутствует повышенный уровень галактозилирования. Кроме того, модулирование пост-трансляционной модификации, например, присоединение терминальной галактозы, может привести к снижению степени фукозилирования и ксилозилирования экспрессированных нативных структурных белков вируса бешенства по сравнению с растением дикого типа, экспрессирующим нативный структурный белок вируса бешенства.
Например, что не следует рассматривать как ограничение, синтез нативных структурных белков вируса бешенства с модифицированным паттерном гликозилирования можно осуществить при коэкспрессии нативных структурных белков вируса бешенства с нуклеотидной последовательностью, кодирующей бета-1,4-галактозилтрансферазу (GalT), например, но без ограничения, GalT млекопитающих или GalT человека, однако также можно использовать GalT и из других источников. Каталитический домен GalT может быть также слит с доменом CTS (то есть цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стволовым участком) N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1) с образованием гибридного фермента GNT1-GalT, и указанный гибридный фермент может выделяться при коэкспрессии с нативным структурным белком вируса бешенства. Также может быть использована коэкспрессия нативного структурного белка вируса бешенства с нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnT-III), например, но без ограничения, GnT-III млекопитающих или GnT-III человека, однако также можно использовать GnT-III из других источников. Кроме того, можно также использовать гибридный фермент GNT1-GnT-III, состоящий из CTS GNT1, слитого с GnT-III.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к VLP, содержащим нативный структурный белок вируса бешенства с модифицированными N-гликанами.
Не желая ограничиваться конкретной теории, считают, что наличие растительных N-гликанов на нативном структурном белке вируса бешенства может стимулировать иммунный ответ, способствуя связыванию нативного структурного белка вируса бешенства антигенпредставляющими клетками. Стимулирование иммунного ответа с помощью растительных N-гликанов было предложено Saint-Jore-Dupas с соавт. (2007). Кроме того, конформация VLP может быть выгодной для представления антигена и повышать адъювантное действие VLP в комплексе с липидным слоем растительного происхождения.
Возникновение VLP может быть обнаружено с использованием любого подходящего способа, например, градиентов сахарозы или эксклюзионной хроматографии. VLP могут быть оценены в отношении структуры и размера с помощью, например, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии.
Для проведения эксклюзионной хроматографии суммарные растворимые белки экстрагируют из ткани растения путем гомогенизации (Polytron) образца растительного материала, измельченного в замороженном виде, в экстракционном буфере, и нерастворимый материал удаляют центрифугированием. Хорошие результаты могут быть получены и при осаждении ледяным ацетоном или PEG. Проводят количественное определение растворимого белка и экстракт пропускают через колонку Sephacryl, например, колонку Sephacryl™ S500. Декстран голубой (Blue Dextran 2000) может быть использован в качестве калибровочного стандарта. После хроматографии фракции можно дополнительно анализировать методом иммуноблоттинга для определения белкового состава фракции.
Отделенная фракция может представлять собой, например, супернатант (в случае центрифугирования, седиментации или осаждения) или фильтрат (в случае фильтрации) и является обогащенной белками или супраструктурными белками, такими как, например, розетковидные структуры или высшего порядка, более высокой молекулярной массы частицы, такие как VLP. Отделенная фракция может быть подвергнута дальнейшей обработке с использованием, например, дополнительных стадий центрифугирования, осаждения, хроматографии (например, эксклюзионной хроматографии, ионного обмена, аффинной хроматографии), тангенциальной поточной фильтрации или их комбинации для изоляции, очистки, концентрирования или их комбинации белков или супраструктурных белков. Присутствие очищенных белков или супраструктурных белков может быть подтверждено, например, нативным или SDS-PAGE, Вестерн анализом с использованием соответствующего идентифицирующего антитела, капиллярного электрофореза, электронной микроскопии или любого другого метода, что будет очевидно для опытного специалиста в данной области.
На Фигурьгх 3А и 3В показан пример профиля элюирования анализа методом эксклюзионной хроматографии экстракта растения, содержащего VLP. В этом случае VLP, содержащие нативные структурные белки вируса бешенства, элюируют во фракциях с 8 до приблизительно 11, розеткообразные и высокомолекулярные структуры элюируют во фракциях примерно с 12 до 14, и низкомолекулярную или растворимую форму нативного структурного белка вируса бешенства элюируют во фракциях примерно от 15 до 17.
Вирусоподобные частицы (VLP) могут быть очищены или экстрагированы с использованием любого подходящего способа, например, путем химической или биохимической экстракции. Вирусоподобные частицы (VLP) являются относительно чувствительными к обезвоживанию, нагреву, pН, поверхностно-активным веществам и детергентам. Таким образом, может быть полезным использовать способы, которые максимально повышают выход, максимально уменьшают загрязнение фракции VLP клеточными белками, сохраняют целостность белков или VLP и, при необходимости, связанной липидной оболочки или мембраны, способы ослабления клеточной стенки для высвобождения белков или VLP. Например, могут быть использованы способы получения протопласта и/или сферопластов (смотри, например, WO 2011/035422, которая включена в настоящий документ путем отсылки) для получения VLP, как описано в настоящем документе. Сведение к минимуму или исключение использования детергентов или поверхностно-активных веществ, таких как, например, SDS или Тритон Х-100, может быть полезным для улучшения выхода при экстракции VLP. Затем VLP могут быть оценены в отношении структуры и размера с помощью, например, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии, как указано выше.
Экспрессия одной или нескольких, или более генетических конструкций по настоящему изобретению может происходить в любом приемлемом растении-хозяине, трансформированном нуклеотидной последовательностью или конструкциями, или векторами в соответствии с настоящим изобретением. К таким хозяевам относятся, но без ограничения, сельскохозяйственные культуры, в том числе люцерна, канола, Brassica spp., кукуруза, Nicotiana spp., люцерна, картофель, женьшень, горох, овес, рис, соя, пшеница, ячмень, подсолнечник, хлопчатник и т.п.
Одна или более генетических конструкций по настоящему изобретению могут также содержать 3'-нетранслируемую область. Указанная 3'-нетранслируемая область относится к той части гена, включающей сегмент ДНК, которая содержит сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно способствует присоединению треков полиадениловой кислоты к 3'-концу прекурсора мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5-ААТААА-3', несмотря на то, что вариации не являются редкими. Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются нетранслируемые 3'-области транскрипции, содержащие сигнал полиаденилирования опухолеиндуцирующей Ti-плазмиды гена агробактерии Agrobacterium, например, нопалинсинтазы (NOS-ген), гены растений, такие как гены белков хранения сои и гены малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO; патент США 4962028; включенный в настоящий документ путем отсылки), промотор, используемый при регулировании экспрессии пластоцианина, описанный в патенте США 7125978 (который включен в настоящий документ путем отсылки).
Одна или более генетических конструкций по настоящему изобретению могут также включать при необходимости дополнительные энхансеры, как энхансеры трансляции, так и транскрипции. Энхансеры могут располагаться 5' или 3' к транскрибируемой последовательности. Энхансерные области хорошо известны специалистам в данной области и могут включать инициирующий кодон ATG, смежные последовательности и тому подобное. Инициирующий кодон, в случае присутствия, может быть в фазе с рамкой считывания («в рамке») кодирующей последовательности для обеспечения правильной трансляции транскрибируемой последовательности.
Конструкции по настоящему изобретению можно вводить в клетки растения методами Ti-плазмид, Ri-плазмид, векторов вирусов растений, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Для ознакомления с этими методами, см., например, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); и Miki and Iyer, Fundamentals of GeneTransfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). К другим методам относятся прямая абсорбция ДНК, применение липосом, электропорация, например, с помощью протопластов, микроинъекций, микроснарядов или вискеров, и вакуум инфильтрации. Смотри, например, Bilang с соавт. (Gene 100:247-250 (1991), Scheid с соавт. (Mol. Gen. Genet. 228:104-112, 1991), Guerche с соавт. (Plant Science 52:111-116, 1987), Neuhause с соавт.. (Theor. Appl Genet. 75:30-36, 1987), Klein с соавт., Nature 327:70-73 (1987); Howell с соавт. (Science 208: 1265, 1980), Horsch с соавт. (Science 227:1229-1231, 1985), DeBlock с соавт., Plant Physiology 91:694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), патенты США №№4945050; 5036006; и 5100792, заявки на патент США сер. №№08/438666, подана 10 мая 1995 года, и 07/951715, подана 25 сентября 1992 года (все документы включены в настоящий документ путем отсылки).
Как приведено в описании ниже, методы транзиентной экспрессии могут служить для экспрессии конструкций по настоящему изобретению (смотри Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; который включен в настоящий документ путем отсылки). В альтернативном варианте могут быть использованы методы транзиентной экспрессии на основе вакуума, описанные Kapila с соавт. 1997, включенные в настоящий документ путем отсылки. Указанные методы могут включать, например, но без ограничения, методы агроинокуляции или агроинфильтрации, инфильтрации шприцем, однако, как было отмечено выше, также могут быть применены другие транзиентные методы. Согласно способам агроинокуляции, агроинфильтрации или инфильтрации шприцем смесь агробактерий (Agrobacterid), содержащих заданную нуклеиновую кислоту, вводится в межклеточное пространство ткани, например, листья, надземную часть растения (включая стебель, листья и цветок), другие части растения (стебель, корни, цветок) или все растение. После перехода через эпидермис агробактерий (Agrobacterid) инфицируют копии t-ДНК и переносят их в клетки. Эписомная транскрипция t-ДНК и трансляция мРНК приводят к продукции целевого белка в инфицированных клетках, однако проникновение t-ДНК внутрь ядра является транзиентным.
Для более простой идентификации трансформированных клеток растения конструкции по настоящему изобретению можно далее изменять с включением селектируемых маркеров растений. К полезным селектируемым маркерам относятся ферменты, обеспечивающие устойчивость к химическим агентам, таким как антибиотики, например гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербициды, например, фосфинотрицин, глифосат, хлорсульфурон и т.п. Аналогичную роль могут играть ферменты, осуществляющие получение соединения, которое обнаруживается по изменению цвета, например бета-глюкуронидаза (GUS), или по свечению, например люцифераза или зеленый флуоресцентный белок (GFP).
Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, клетки или семена растений, содержащие конструкцию гена по настоящему изобретению. Способы регенерации целого растения из его клеток также известны в данной области. В целом, трансформированные клетки растения культивируют в соответствующей среде, которая может содержать селективные агенты, такие как антибиотики, при этом селектируемые маркеры служат для идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллюса, формирование ростков можно стимулировать действием соответствующих растительных гормонов известными способами, затем ростки переносят в субстрат для регенерации растения. Далее растения могут служить для производства следующих генераций, либо из семян либо методами вегетативного размножения. Трансгенные растения могут быть также получены без использования культур тканей.
Настоящее изобретение включает нуклеотидные последовательности:
Настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано в следующих примерах.
Примеры
Конструкции
Пример 1: Сборка кассет экспрессии с белком вируса бешенства
А-2Х35S/CPMV-НТ/М вируса бешенства/NOS (Конструкция номер 1066)
Последовательность, кодирующую М-белок из штамма ERA вируса бешенства, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиду, содержащую кассету экспрессии Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего метода на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий полную последовательность, кодирующую М-белок, амплифицировали с помощью праймеров IF-RabM-S3.c (Фигура 4А, SEQ ID NO: 1) и IF-RabM-S1-4.r (Фигура 4В, SEQ ID NO: 2) с использованием синтезированного гена М (соответствующего nt 2496-3104 из Genbank accession number FJ 913470) (Фигура 4С, SEQ ID NO: 3) в качестве шаблона. Продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion cloning system (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию 1191 (Фигура 4D) расщепляли ферментом рестрикции SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion assembly. Конструкция номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования «In Fusion» представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе CPMV-HT. Это также включает конструкцию гена для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Основа конструкции номер 1191 представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левых до правых границ t-ДНК представлена на Фигуре 4Е (SEQ ID NO: 4). Полученной конструкции был присвоен номер 1066 (Фигура 4F, SEQ ID NO: 5). Аминокислотная последовательность М-белка из штамма ERA вируса бешенства представлена на Фигуре 4G (SEQ ID NO: 6). Изображение плазмиды 1066 представлено на Фигуре 4Н.
B-2X35S/CPMV-HT/M вируса бешенства/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза (Конструкция номер 1086)
Последовательность, кодирующую М-белок из штамма ERA вируса бешенства, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую систему амплификации BeYDV + Репликаза в плазмиде, содержащей кассету экспрессии Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего метода на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий полную последовательность, кодирующую М-белок, амплифицировали с помощью праймеров IF-RabM-S3.c (Фигура 4А, SEQ ID NO: 1) и IF-RabM-S1-4.r (Фигура 4В, SEQ ID NO: 2) с использованием синтезированного гена М (соответствующего nt 2496-3104 из Genbank accession number FJ 913470) (Фигура 4С, SEQ ID NO: 3) в качестве шаблона. Продукт ПЦР клонировали в системе экспрессии 2X35S/CPMV-HTVNOS с использованием системы клонирования In-Fusion cloning system (Clontech, Mountain View, СА). Конструкцию 1193 (Фигура 5A, SEQ ID NO: B1) расщепляли ферментом рестрикции SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion assembly reaction. Конструкция номер 1193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для “In Fusion” клонирования представляющих интерес генов в кассете экспрессии на основе CPMV-HT в систему амплификации BeYDV. Это также включает конструкцию гена для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Основа конструкции номер 1193 представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левых до правых границ t-ДНК представлена на Фигуре 5В (SEQ ID NO: 7). Полученной конструкции был присвоен номер 1086 (Фигура 5С, SEQ ID NO: 8). Аминокислотная последовательность М-белка из штамма ERA вируса бешенства представлена на Фигуре 4G (SEQ ID NO: 6). Изображение плазмиды 1086 представлено на Фигуре 5D.
С-2Х35S/CPMV-HT/PDISP/G вируса бешенства/NOS (Конструкция номер 1071)
Последовательность, кодирующую G-белок из штамма ERA вируса бешенства, клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS в плазмиде, содержащей кассету экспрессии Plasto_pro/P19/Plasto_ter с использованием следующего метода на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую G-белок, без его сигнального пептида дикого типа амплифицировали с помощью праймеров IF-RabG-S2+4.c (Фигура 6А, SEQ ID NO: 9) и IF-RabG-S1-4.r (Фигура 6В, SEQ ID NO: 10) с использованием синтезированного гена G (соответствующего nt 3317-4891 из Genbank accession number EF 206707) (Фигура 6С, SEQ ID NO: 11) в качестве шаблона. Продукт ПЦР клонировали внутри рамки считывания с сигнальным пептидом люцерны PDI в системе экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion cloning system (Clontech, Mountain View, CA). Конструкцию 1192 (Фигура 6D) расщепляли ферментом рестрикции SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion assembly reaction. Конструкция номер 1192 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для “In Fusion” клонирования представляющих интерес генов в рамке с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (PDI) люцерны в кассете экспрессии на основе CPMV-HT. Это также включает конструкцию гена для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Основа конструкции 1192 представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левых до правых границ t-ДНК представлена на Фигуре 6Е (SEQ ID NO: 12). Полученной конструкции был присвоен номер 1071 (Фигура 6F, SEQ ID NO: 13). Аминокислотная последовательность PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства представлена на Фигуре 6G (SEQ ID NO: 14). Изображение плазмиды 1071 представлено на Фигуре 6Н.
D-2X35S/CPMV-HT/PDISP/G вируса бешенства/NOS в систему амплификации BeYDV + Репликаза (Конструкция номер 1091)
Последовательность, кодирующую G-белок из штамма ERA вируса бешенства, клонировали в 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS, содержащую систему амплификации BeYDV + репликаза в плазмиде, содержащей кассету экспрессии Plasto_pro/P19/Plasto_ter с использованием следующего метода на основе ПЦР. Фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую G-белок вируса бешенства, без его сигнального пептида дикого типа, амплифицировали с помощью праймеров IF-RabG-S2+4.c (Фигура 6А, SEQ ID NO: 9) и IF-RabG-S1-4.r (Фигура 6В, SEQ ID NO: 10) с использованием синтезированного G гена (соответствующего nt 3317-4891 из Genbank accession number EF 206707) (Фигура 6С, SEQ ID NO: 11) в качестве шаблона. Продукт ПЦР клонировали в рамке с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (PDI) люцерны в кассете экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV с использованием системы клонирования In-Fusion cloning system (Clontech, Mountain View, CA). Номер конструкции 1194 (Фигура 7A) расщепляли ферментом рестрикции SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion assembly reaction. Конструкция номер 1194 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для “In Fusion” клонирования представляющих интерес генов в рамке с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (PDI) люцерны в кассете экспрессии на основе CPMV-HT в систему амплификации BeYDV. Это также включает конструкцию гена для коэкспрессии супрессора сайленсинга TBSV Р19 под контролем промотора и терминатора гена пластоцианина люцерны. Основа конструкции номер 1194 представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA, и последовательность от левых до правых границ t-ДНК представлены на Фигуре 7В (SEQ ID NO: 15). Полученной конструкции присвоили номер 1091 (Фигура 7С, SEQ ID NO: 16). Аминокислотная последовательность PDISP/G-белок из штамма ERA вируса бешенства представлена на Фигуре 6G (SEQ ID NO: 14). Изображение плазмиды 1091 представлено на Фигуре 7D.
Пример 2: Подготовка растительной биомассы, инокулята и агроинфильтрации
Термины «биомасса» и «растительный материал», используемый в настоящем описании, означают любой материал, полученный из растения. Биомасса или растительный материал может включать растение целиком, ткань, клетки или любую их фракцию. Кроме того, биомасса или растительный материал может включать внутриклеточные компоненты растения, внеклеточные компоненты растения, жидкие или твердые экстракты растений или их комбинацию. Кроме того, биомасса или растительный материал может включать растение, клетки растения, ткань, жидкий экстракт или их комбинацию, из листьев растения, стеблей, плодов, корней или их комбинации. Часть растения может включать растительный материал или биомассу.
Растения Nicotiana benthamiana выращивали из семян в плоских поддонах, заполненных имеющимся в продаже субстратом из торфяного мха. Растения выращивали в теплице при световом периоде 16/8 и температурном режиме 25°C днем/20°C ночью. По истечении трех недель после посева семян отдельные ростки собрали, пересаживали в горшки и оставляли для роста в теплице еще в течение трех недель в тех же условиях окружающей среды.
600
2
Агробактерий (Agrobacteria), трансфецированные каждой конструкцией, выращивали в среде YEB, дополненной 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 20 мкМ ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина, рН 5.6, до момента достижения плотности клеток OD между 0.6 и 1.6. Взвеси агробактерий (Agrobacterium) центрифугировали перед использованием, и ресуспендировали в среде инфильтрата (10 мМ MgCl и 10 мМ MES, pН 5.6), и хранили в течение ночи при 4°C. В день выполнения инфильтрации партии культур разбавляли до 2.5 объемов культуры, и оставляли для нагревания перед использованием. Цельные растения N. benthamiana помещали на 2 минуты вверх корнями в бактериальную суспензию в герметичную емкость из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 Torr. Растения возвращали в теплицу на период инкубации в течение 2-6 дней перед сбором.
Штаммы A. tumefaciens, содержащие различные конструкции, описанные в настоящем документе, называются с использованием префикса «AGL1». Например, А. Tumefaciens, содержащий конструкцию под номером 1091, называется «AGL1/1091».
Отбор образцов листьев и экстракция общего белка (механическая экстракция)
После инкубации надземную часть растений собирали, замораживали при -80°C и измельчали на кусочки. Общие растворимые белки экстрагировали путем гомогенизации (Polytron) каждого образца замороженного раздробленного растительного материала в 3 объемах холодного 50 мМ Трис, рН 8.0, 150 мМ NaCl, 0.1% Тритон Х-100 и 1 мМ фенилметансульфонилфторида. После гомогенизации взвеси центрифугировали при 10000 г в течение 10 мин при 4°C, и эти осветленные сырые экстракты (супернатант) сохраняли для анализа.
Сбор листьев и экстракция общего белка (биохимическая экстракция)
4
После инкубации надземную часть растений собирали и разрезали на маленькие кусочки (3 мм квадратные) с помощью вращающегося ножа и предпринимали особые меры для того, чтобы не разрушать листья. Разрезанную биомассу инкубировали в течение 15-17 часов в 2.5 объемах 200 мМ маннитола, 125 мМ цитрата, 75 мМ NaPO, 500 мМ NaCl, 25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 1% (об/об) Multifect СХ CG (Genencor, Cat. No. A03140G190), 1% (об/об) Multifect СХ В (Genencor, номер по каталогу A03042G190) и 1% (об/об) Multifect Pectinase FE (Genencor, номер по каталогу A02080G190), рН 6.5 при 21°C при перемешивании со скоростью 100-200 об/мин. Разложенную биомассу затем фильтровали через нетканый материал Miracloth (Calbiochem, номер по каталогу 475855) и центрифугировали при 10000 г в течение 10 мин при 4°C. Супернатант переносили в чистую пробирку и снова центрифугировали в тех же условиях, и супернатант хранили для анализа.
Анализ белка методом иммуноблоттинга
Общее содержание белка в осветленных сырых экстрактах определяли при помощи анализа Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием альбумина бычьей сыворотки в качестве стандартного образца. Белки отделяли при помощи SDS-PAGE и электропереносили на мембраны из поливиниленфторида (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) для иммунодетекции. Перед проведением иммуноблоттинга мембраны были блокированы 5% снятым молоком и 0.1% Твин-20 в Трис-буферном солевом растворе (TBS-T) в течение 16-18 ч при 4°C. Иммуноблоттинг выполняли путем инкубации с 0.25 мкг/мкл первичного антитела Santa Cruz SC-57995 в 2% снятом молоке в TBS-Твин 20 0.1%. Хемилюминесцентное обнаружение проводили после инкубации с козьим анти-мышиным вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой (JIR, 115-035-146), разбавленным 1:10000 в 2% снятом молоке в TBS-Твин 20 0.1%. Иммунореактивные комплексы были обнаружены при помощи хемилюминесценции с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation).
Эксклюзионная хроматография экстрактов белка
Для проведения эксклюзионной хроматографии (SEC) супернатант из биохимически экстрагированной биомассы концентрировали путем центрифугирования при 70000 г в течение 20 мин при 4°C и полученные гранулы ресуспендировали в 1/50 объема холодного 50 мМ Трис pН 8.0, 150 мМ NaCl. Колонки для эксклюзионной хроматографии заполняли 32 мл фазы Sephacryl™ S-500 высокого разрешения (S-500 HR: GE Healthcare, Упсала, Швеция, номер по каталогу 17-0613-10) и приводили в равновесие вьфавнивающим/элюирующим буфером (50 мМ Трис рН8, 150 мМ NaCl). Полтора миллилитра концентрированного экстракта наносили на колонку, после чего элюировали 45 мл выравнивающего/элюирующего буфера. Элюат собирали в виде фракций объемом по 1.5 мл, и относительное содержание белка в элюированных фракциях контролировали, смешивая 10 мкл фракции с 200 мкл разбавленного реагента-красителя на белок Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Двести микролитров из каждой фракции осаждали путем добавления 5 объемов ледяного ацетона с последующим замораживанием в течение ночи при -20°C. Осажденные белки пеллетировали путем центрифугирования при 20000 г в течение 10 мин (4°C) и ресуспендировали в 50 мкл горячего буфера для нанесения образцов SDS-PAGE. Колонку промывали двукратным объемом по отношению к объему колонки 0.2N NaOH, а затем десятикратным объемом по отношению к объему колонки смеси 50 мМ Трис рН8, 150 мМ NaCl, 20% этанол. После каждого разделения проводили градуировку колонки красителем декстран голубой 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, США). Профили элюирования декстрана голубого 2000 и растворимых белков хозяина при каждом разделении сравнивали для обеспечения однородности профилей элюирования для каждой из используемых колонок.
Пример 3: Оценка экспрессии G-белка вируса бешенства и стратегии коэкспрессии.
Растения Nicotiana benthamiana агроинфильтровали инокулятами AGL1/1071 (с или без AGL1/1066) или AGL1/1091 (с или без AGL1/1086) при различной концентрации, и листья собирали через 5 дней после инфильтрации (DPI) для 1071- и 1071+1066-инфильтрованных растений, или через 3-4 дня после инфильтрации (DPI) для 1091- и 1091+1086-инфильтрованных растений. Вестерн-блоттинг экстрактов белков листьев от трансформированных растений показал, что элементы BeYDV требовались для достижения обнаруживаемого уровня накопления G-белка (сравнение 1071- и 1091-инфильтрованных растений на фигуре 1). Уровень максимального накопления достигался на 3 день после инфильтрации (DPI) для растений, инфильтрованных AGL1/1091 с коэкспрессией М-белка или без нее (AGL1/1086) (Фигура 1).
Способ биохимической экстракции сравнивали с механической экстракцией в отношении способности высвобождать G-белок вируса бешенства из листьев трансформированных растений. Вестерн-блоттинг экстрактов, полученных путем биохимической экстракции и механической экстракции на 1091- и 1091+1086-инфильтрованных растениях, показал, что белковые экстракты, полученные путем биохимической экстракции, содержали значительно больше G-белка, чем экстракт, полученный путем механической экстракции (Фигура 2).
Белковые экстракты из 1091- и 1091+1086-инфильтрованных растений подвергали эксклюзионной хроматографии для оценки их сборки в высокомолекулярные структуры. Элюированные фракции собирали и аликвоту каждой фракции концентрировали путем осаждения ацетоном и анализировали на содержание G-белка путем вестерн-блоттинга. Как показано на фигуре 3А, содержание G-белка достигает максимума в SEC элюированных фракциях с 8 по 10, соответствуя объему пустот колонки, где предполагается обнаружение оболочечных VLP. Аналогичный профиль элюирования был получен при разделении с помощью SEC белковых экстрактов из растений, экспрессирующих G-белок вируса бешенства с М-белком (1091+1086-инфильтрованные растения, фигура 3В).
Пример 4: Исследования на животных
Быстрая очистка вирусоподобных частиц вируса бешенства (Rab-VLP) из растений
Растения N. benthamiana были агроинфильтрованы AGL1/1091, как описано, например в WO/2011/035422, которая включена в настоящий документ путем отсылки.
Экстракцию Rab-VLP (также называемую как NG-VLP, нативный G-белок VLP, G-VLP или G-белок VLP) проводили, как описано выше. Вкратце, листья собирали на 4 день после инфильтрации, разрезали на кусочки размером ~1 см2 и расщепляли в течение 15 ч при комнатной температуре на орбитальном встряхивателе. Расщепляющий буфер содержал 1.0% (об/об) Multifect Pectinase FE, 1.0% (об/об) Multifect СХ CG и/или 1.0% (об/об) Multifect СХ В (все от Genencor), каждый в буферном растворе, содержащем 200 мМ маннитола, 75 мМ цитрата, 0.04%, 500 мМ NaCl бисульфита натрия, pН 6.0 с использованием соотношения биомасса: расщепляющий буфер 1:2.5 (масса/объем).
После расщепления апопластическую фракцию фильтровали через нейлоновый фильтр 400 мкм для удаления грубой нерасщепленной растительной ткани (<5% от исходной биомассы). Фильтрованный экстракт затем центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 мин при 5000 × г для удаления протопластов и внутриклеточных загрязняющих компонентов (белков, ДНК, мембран, везикул, пигментов и т.д.). Затем супернатант подвергали глубинной фильтрации (для осветления) с использованием фильтра из стекловолокна 1.2 мкм (Sartorius Stedim) и фильтра 0.45/0.2 мкм (Sartorius Stedim) перед подверганием хроматографии.
-1
-1
Для подготовки к проведению хроматографии экстракт может быть концентрирован подходящими способами, известными в данной области, например, экстракт может быть центрифугирован и гранулы ресуспендированы в соответствующем буфере и объеме, или экстракт может быть концентрирован и диафильтрован на системе тангенциальной поточной фильтрации (TFF), оснащенной соответствующей мембраной перед нанесением на среду для хроматографии. Мембраны могут представлять собой плоские или полые волокна, размер пор может изменяться в диапазоне между 100, 300, 500, 750 kDa или 1 мк границы отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов. Размер просвета может быть выбран в соответствии с производственной линией поставщика, как правило, размер просвета от 0.75 до 1 мм является предпочтительным. Скорости сдвига могут быть установлены между 2000 с до 10000 с с соответствующими скоростями потоков сохраненного вещества и растворенного вещества.
4
Осветленную апопластическую фракцию наносили на катионообменную колонку (Poros HS Applied Biosystems), приведенную в состояние равновесия уравновешивающим/элюирующим буфером (50 мМ NaPO, 100 мМ NaCl, 0.005% Твин 80 pН 6.0). После возвращения UV к нулю экстракт ступенчато элюировали уравновешивающим/элюирующим буфером, содержащим возрастающие концентрации NaCl (500 мМ). При необходимости хроматографические фракции концентировали 10 раз с использованием устройств Amicon™, оснащенных 10 kDa MWCO. Анализ белка проводили, как описано в предыдущих примерах.
В заключение, последним подходом может быть замена буфера конечной кандидатной вакцины способами, известными в данной области. Например, для этой цели может быть использована стадия центрифугирования или TFF, как описано выше.
В условиях, описанных выше, может быть получен состав вакцин Rab-VLP с чистотой 75% или больше с качеством, достаточным для исследования иммуногенности. Как проиллюстрировано на фигуре 8А, G-белок мигрирует при предполагаемой молекулярной массе 55 kDa. Размер Rab-VLP установлен между 175-190 нм путем динамического светорассеяния (Zeta sizer 90, Malvern instrument), размер частиц сходен с размером, описанным для вируса бешенства.
Исследования иммунизации у мышей
Иммуногенность Rab-VLP оценивали на модели мышей линии Balb/c. Вкратце, группы самок мышей линии BALB/c (возраст 8-10 недель; Charles River Laboratories, USA) иммунизировали всего тремя инъекциями (0.05 мл/участок) в каждый день иммунизации (Дни исследования 0, 7 и 28) в мышцу левой и правой задней конечности внутримышечно (i.m.) в общем инъецируемом объеме 0.1 мл, который содержал разные дозы вакцины Rab-VLP (1 или 5 мкг - с адъювантами или без них). Дозы были основаны на концентрациях G-белка, определенных при помощи анализа на основе бицинхониновой кислоты (ВСА) в сочетании с оценкой чистоты путем денситометрии. В качестве адъюванта использовали Alhydrogel при конечной концентрации 1%. Группу плацебо иммунизировали аналогично кандидатной вакцине с использованием такого же способа и схемы введения. Использовали пятнадцать мышей на группу для обеспечения адекватной статистической мощности. Образцы сыворотки собирали перед иммунизацией (преиммунная сыворотка) и на день 7, 21 и 44. Пять животных на группу умерщвляли на день 7, 21 и 44 для выполнения быстрого теста на ингибирование флуоресцентного свечения (RFFIT) для оценки защитного антитела в сыворотке. Защитная доза, установленная Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для вакцин против бешенства, составляет 0.5 международных единиц (IU) на мл. Как показано на фигуре 8b, безадъювантная вакцина Rab-VLP при дозах до 1 мкг обеспечивает достижение более высоких титров, чем стандартные титры, установленные ВОЗ.
Все цитируемые материалы включены в настоящий документ посредством отсылки.
Настоящее изобретение описано в отношении одного или более осуществлений. Однако для специалиста в данной области будет очевидно, что могут быть сделаны различные варианты и модификации без отступления от объема изобретения, представленного в формуле изобретения.