ШТАММ "БЕЛГОРОДСКИЙ-03" ВИРУСА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
BELGOROD-03 STRAIN OF RABBIT HEMORRHAGIC DISEASE VIRUS FOR PREPARING VACCINES AND DIAGNOSTIC PRODUCTS

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов.
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов - ВГБК (некротический гепатит, геморрагическая пневмония кроликов) - остро протекающая высококонтагиозная болезнь вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб кролиководству.
ВГБК характеризуется явлениями геморрагического диатеза во всех органах кроликов, в особенности в легких и печени. Поражаются кролики старше 1,5-месячного возраста. О заболевании этим вирусом животных других видов и человека не сообщалось. При ВГБК заболеваемость достигает 70-80%, а летальность - 90-100%. Болезнь широко распространена в мире, где есть восприимчивые животные, европейские кролики (Oryctolagus cuniculus).
Экономический ущерб, наносимый ВГБК, складывается из-за высокого процента гибели взрослых особей и молодых кроликов с момента отъема.
Вакцинопрофилактика ВГБК занимает основное место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для вакцинопрофилактики вирусной геморрагической болезни кроликов применяют инактивированные моно- и ассоциированные вакцины. Рекомбинантные вакцины против ВГБК в настоящее время тоже получены, но коммерчески широко не применяются.
Для изготовления инактивированных вакцин против ВГБК в России используется один из официально депонированных в коллекциях ФГУ «ВГНКИ» (регистрационный №1652) и ГНУ ВНИИВВИМ штамм «Воронежский-87» [3-5]. Молекулярно-генетические исследования зарубежных ученых за последнее десятилетие показывают, что все штаммы ВГБК (в тех областях, где болезнь была диагностирована) принадлежат к одному серотипу. Сравнительное секвенирование выделенных изолятов показывает, что в консервативных областях генома они имеют отличия по аминокислотному составу в пределах от 2 до 5%. Однако выделенные в последнее время температурозависимые изоляты вируса ГБК в Германии, Италии значительно отличаются по гемагглютинирующим свойствам при более низкой температуре +4°C и по аминокислотному составу от ранее известных вирусов ГБК в области Е генома, где у представителей калицивирусов представлены основные антигенные детерминанты. Кролики, привитые вакциной, приготовленной из ранее выделенных изолятов, имели более низкую степень защиты против выделенных изолятов ВГБК [1, 2]. Поэтому в России необходимо не только вести генетический мониторинг и сравнение гемагглютинирующих и иммунобиологических свойств вновь появляющихся изолятов ГБК в очагах инфекции, но и иметь в музейных коллекциях штаммы вируса ГБК, позволяющие изготавливать из них более эффективные средства специфической профилактики против ВГБК исходя из эпизоотической ситуации.
Целью настоящего изобретения явилось получение нового производственного и диагностического штамма вируса геморрагической болезни кроликов, сохраняющего свои иммунобиологические свойства после инактивации и пригодного для изготовления высокоиммуногенных вакцинных препаратов, диагностических систем (из неконцентрированного вируса), способных защитить поголовье европейского кролика (Oryctolagus cuniculus) от эпизоотического возбудителя геморрагической болезни кроликов и идентифицировать его, при заносе на территорию Российской Федерации.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса геморрагической болезни кроликов, отличающихся геномом и иммунобиологическими свойствами, обладающих высокой биологической антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации и пригодных для изготовления высокоэффективных вакцинных, лечебных и диагностических препаратов.
Данный технический результат достигнут получением штамма «Белгородский-03» вируса геморрагической болезни кроликов. Штамм «Белгородский-03» является новым и ранее неизвестным.
Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского Государственного Центра Качества и Стандартизации Лекарственных Средств для Животных и Кормов РОССЕЛЬХОЗНАДЗОРА (ФГУ «ВГНКИ») 19 ноября 2009 года под регистрационным шифром Штамм «Белгородский-03».
Штамм «Белгородский-03» отличается от ранее депонированного штамма ВГБК «Воронежский-87» на 13% по нуклеотидным последовательностям консервативной области гена VP-60 длиной 398 пар нуклеотидов. Вышеуказанные штаммы, основываясь на результатах филогенетического анализа, относятся к разным геногруппам.
Штамм «Белгородский-03» обеспечивает проведение серологической диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов и производство эффективной инактивированной вакцины против ВГБК, создающей надежную защиту диких и домашних европейских кроликов от указанного возбудителя заболевания.
Штамм «Белгородский-03» вируса геморрагической болезни кроликов характеризуется следующими признаками и свойствами.
Таксономическая характеристика заключается в том, что штамм «Белгородский-03» имеет форму и размеры, типичные для калицивирусов. В серологических реакциях (РЗГА, РСК, ИФА, РДП) выявляются антигены, общие для всех штаммов вируса ГБК. Основные маркерные характеристики штамма «Белгородский-03» вируса ГБК приведены в таблице.
Маркерные характеристики штамма «Белгородский-03» вируса ГБК
№ п/п
Основные свойства
Характеристики свойств
1
2
3
1
Молекулярно-генетические свойства
В капсидах вируса 180 субъединиц, формирующих пентамер-гексамеры, 4 вирионных белка - VP1, VP2, VP3 и VP4 мол. м. 60-61, 54,7, 52 и 26-28 кД соответственно. VP1 - основной капсидный белок, на долю которого приходится 54,7% массы капсидных белков. Нуклеотидная последовательностей консервативной области гена VP60, длиной 398 пар нуклеотидов: позиция в геноме: 6340-A, 6346-A, 6347-A, 6354-G, 6355-A, 6357-C, 6369-T, 6372-G, 6380-G, 6381-T, 6384-T, 6393-C, 6398-A, 6405-T, 6409-G, 6410-C, 6411-T, 6412-G, 6413-C, 6417-G, 6438-G, 6460-A, 6461-A, 6462-T, 6498-G
2
Адаптационные свойства и контагиозность
Вирус репродуцируется в высоких титрах только in vivo (на европейских кроликах, старше 2-мес. возраста). До настоящего времени не подобрано ни одной клеточной системы для репродукции вируса in vitro в высоких титрах. Высококонтагиозный штамм для европейского кролика (Oryctolagus cuniculus)
3
Патогенные свойства
Вирус проявляет высокую патогенность для домашних и диких европейских кроликов старше 2-мес. возраста при парентеральном способе заражения и не патогенен для остальных лабораторных животных
4
Свойства полезного вещества, продуцируемого вирусом
Вирус вызывает образование комплементсвязывающих, преципитирующих и задерживающих гемагглютинацию антител. После инактивации индуцирует иммунитет у диких и домашних европейских кроликов старше 1,5-2-мес. возраста против эпизоотических вариантов возбудителя ВГБК, циркулирующих на территории РФ
5
Свойства агглютинации
Агглютинирует эритроциты человека I (0) группы при 37°C и при 4°C, не агглютинирует эритроциты морской свинки, петуха, свиньи
6
Терморезистентность
Сохраняет инфекционную активность при 50°C - 1 час, при 56°C - 10 минут, чувствителен к высокой температуре свыше 60°C
7
Ингибиторочувствительность
Устойчив к воздействию растворителей липидов (эфир, хлороформ, фреоны). Чувствителен к хлорсодержащим дезинфектантам, перекиси водорода, растворам щелочей
8
Стабильность генетических иммунологических признаков
Стабильность генетических и иммунологических признаков штамма сохранялась в течение 5 пассажей на кроликах (срок наблюдения)
9
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами
Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами
10
Культуральные свойства и стандартные условия выращивания
Культуральные свойства не исследовались. Вирус воспроизводится только in vivo на европейских домашних или диких кроликах, старше 1,5-2-мес. возраста
11
Сохраняемость и условия храненния
Штамм стабилизируют обезжиренным молоком или другими стабилизаторами и хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40°C в ампулах под вакуумом. Вирус освежают пассированием его на кроликах один раз в пять лет
12
Оригинальность и патентоспособность
Штамм «Белгородский-03» вируса геморрагической болезни кроликов по показателям инфекционности, антигенности и иммуногенности является оригинальным, новым, ранее не известным вариантом вируса ГБК
Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения.
ПРИМЕР 1
4,0
3
3
3
50
50
Для получения вируса ГБК штамм «Белгородский-03», использовали три ампулы с вирусом, на уровне второго пассажа на кроликах, павших от введения им 10% суспензии печени от кроликов, павших в селе Ездоцкое Белгородской области в декабре 2003 года (инфекционная активность не ниже 10 ЛД/см). В каждую ампулу вносили стерильный растворитель (дистиллированная вода или физиологический раствор, pH 7,0-7,4) до объема, указанного на этикетке. Затем содержимое ампул объединяли и из общей пробы готовили разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД/см. Указанное разведение вируса вводили внутримышечно 5 кроликам в объеме 1,0 см. Инфицированных кроликов содержали в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных металлических клетках.
У инфицированных кроликов через 15-25 ч отмечали характерные клинические признаки болезни: угнетение, отказ от корма, повышение температуры тела до 40,7°C, носовое кровотечение и гибель в течение 24-96 ч. Трупы животных погружали на 5-10 мин в раствор марганцевокислого калия (1:10000), затем во вскрывочной комнате инфекционного вивария подвешивали на вешалки, снимали шкурки, обрабатывали брюшную полость раствором марганцевокислого калия (1:10000), разрезали брюшные мышцы по белой линии, извлекали печень, отделяли желчный пузырь. Печень брали только от трупов, при вскрытии которых обнаружены специфические паталогоанатомические изменения, свойственные ВГБК: геморрагии в трахее, геморрагическая пневмония, кровоизлияния под капсулой почек, селезенки, печень дряблой консистенции, которая легко рвется и имеет желто-коричневый цвет, местами с красноватым оттенком. Некроз печени и увеличение селезенки - первичные поражения. Острое поражение легких - результат венозного тромбоза, вызывающего острый отек, пенистый серозный или с примесью крови транссудат, который заполняет пеной трахею и выделяется постоянно из ноздрей. Инфаркты наблюдали почти во всех органах, а почки полностью инфарктны и имеют темно-коричневый цвет.
Материал помещали в стерильные флаконы, плотно укупоривали, снаружи дезинфицировали 5%-ным раствором хлорамина, помещали в термос со льдом и доставляли в стерильный бокс.
Каждый образец печени готовили отдельно, используя отдельную стерильную посуду. Образец печени измельчали ножницами, добавляли стерильный ФСБ (соотношение 1:10 - вес/объем), гомогенизировали в блендере при охлаждении в течение 10 мин. Отбирали в отдельную стерильную пробирку типа «Eppendorf» для идентификации в ПЦР. В оставшийся материал вносили хлороформ (конечная концентрация 2%) и помещали в камеру бытового холодильника на 18 ч при 4°C. После чего суспензию печени центрифугировали в течение 1 ч при 6000 g при 4°C. Супернатант ультрацентрифугировали при 80000 g в течение 2 ч при 4°C, через 20%-ный раствор сахарозы. Осадок ресуспендировали в ФСБ 1/100 от начального объема.
Для получения результатов молекулярно-генетической характеристики штамма «Белгородский-03» вируса ГБК было проведено нуклеотидное секвенирование консервативной области гена VP-60 длиной 398 п.н.
Нуклеотидное секвенирование участков гена VP60 вируса ВГБК проводили с использованием типоспецифических праймеров, разработанных для обнаружения вируса методом ПЦР. Выделение специфических продуктов амплификации из агарозного геля или реакционной смеси осуществляли коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот «DNA purification kit» (Fermentas, Латвия), с последующей реамплификацией фрагментов при помощи компонентов «BigDye v.3.1. Terminator» (Applied Biosystems, США). Реакцию с дефектными трифосфатами проводили в параллелях с прямым и обратным праймерами при следующих температурных режимах: 95°C - 10 сек, 50°C - 20 сек, 60°C - 4 мин - всего 25 циклов. По окончании реакции к смеси добавляли 45 мкл 96% этилового спирта и 2,5 мкл 125 мМ ЭДТА, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10-15 минут. Затем центрифугировали в течение 10-15 минут при 10000 g, надосадочную жидкость выбрасывали, а осадок промывали 75% этиловым спиртом по той же схеме с 10-15-мин экспозицией при комнатной температуре. Осадок после центрифугирования подсушивали, аккуратно растворяли в 10-12 мкл формамида. Полученную смесь денатурировали при 94°C в течение нескольких минут и резко охлаждали во льду. Секвенирование проводили в автоматическом анализаторе Genetic Analyzer 3130XL (Applied Biosystems, США).
50
3
Вируссодержащий материал всесторонне исследовали в соответствии с рекомендациями МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (2004) на отсутствие контаминации микоплазмами, бактериями и грибами путем посева на чувствительные питательные среды. Отсутствие контаминации посторонними вирусами и идентификацию вируса ГБК определяли методом негативного контрастирования электронной микроскопией. Определяли инфекционную активность на кроликах, гемагглютинирующую активность в РГА, антигенную активность в ТФ ИФА, специфичность в ТФ ИФА и РЗГА и на уровне 3 пассажа на кроликах вирус был расфасован, лиофилизирован и запаян в ампулы под вакуумом и заложен на хранение при температуре не выше минус 40°C в качестве Master seed (M.s.) с титром инфекционной активности не ниже 5,0 ЛД/см. Полученному штамму вируса геморрагической болезни кроликов присвоено авторское название «Белгородский-03».
ПРИМЕР 2
С целью определения биологической, антигенной и иммунологической активности вируса геморрагической болезни кроликов штамма «Белгородский-03» проводили гипериммунизацию клинически здоровых кроликов из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням хозяйств, живой массой не менее 2,5 кг, согласно 2-й схеме получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики ВГБК (патент №2077340 от 06 августа 1993 года). Для гипериммунизации кроликов использовали тканевую инактивированную вакцину, изготовленную из штамма вируса геморрагической болезни кроликов, штамм «Белгородский-03», в дозе 0,5 мл на голову. Путь введения препарата животным - внутримышечно. Кратность введения - двукратно, с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй иммунизации от гипериммунизированных животных получали сыворотку крови. Специфическую сыворотку проверяли на активность и специфичность в реакции задержки гемагглютинации. Результаты исследований приведены в таблице 1.
Приведенные в таблице 1 данные характеризуют высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность штамма «Белгородский-03» вируса геморрагической болезни кроликов при введении в организм лабораторным животным.
ПРИМЕР 3
50
3
3
Для получения вируса, используемого при изготовлении тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Белгородский-03», использовали полученную и охарактеризованную матровую расплодку Master seed (M.s.) вируса геморрагической болезни кроликов из вышеуказанного штамма. Изначально готовили разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД/см. Указанное разведение вируса вводили внутримышечно кроликам в объеме 1,0 см. Предварительно сыворотку крови кроликов исследовали на наличие антител к вирусу ВГБК в РЗГА с эритроцитами крови человека 0 (I) группы. При наличии специфических антител к вирусу геморрагической болезни кроликов в титре 1:4 и выше кроликов в опыт не брали. Инфицированных кроликов содержали в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных металлических клетках.
Из полученной от павших кроликов печени готовили 10%-ную вирусную суспензию на забуференном физрастворе (pH 7,0-7,4). В материал вносили хлороформ (конечная концентрация 2%) и помещали в холодильник при 4°C на 18 часов. Затем суспензию печени центрифугировали в течение 1 ч при 6000 g, при 4°C. Вирусная суспензия, используемая для изготовления тканевой инактивированной вакцины, должна иметь активность в РГА не менее 1:1280-1:2560 ГАЕ.
Инактивацию вируса проводили с помощью 4%-ного раствора формалина. Исходя из концентрации формальдегида готовили 4%-ный раствор формалина (т.е. 1,1-1,4% раствор формальдегида) на стерильной дистиллированной воде. Раствор формалина готовили в стеклянных бутылях в день составления сырья для вакцины и вносили в вирусную суспензию до конечной концентрации 0,14-0,1% формальдегида.
Инактивировали вирус при температуре 27-28°C в течение 3-х суток с периодическим перемешиванием (1 раз в час в течение 5 мин).
Началом инактивации считали время после доведения температуры в емкости до 27-28°C и добавления формалина. После инактивации формалином к суспензии при постоянном перемешивании добавляли метабисульфит натрия (1М раствор) до полной нейтрализации остаточного формальдегида.
3
Из инактивированного материала брали пробу для проверки стерильности, активности и полноты инактивации. Для проверки полноты инактивации двум кроликам массой 2,5-3,0 кг, не имеющим антител к вирусу геморрагической болезни кроликов, вводили по 3,0 см внутримышечно инактивированный материал. Животные в течение 7 суток наблюдения оставались здоровыми.
3
3
После окончания инактивации вируссодержащей суспензии в емкость с вирусной суспензией добавляли гель гидрата окиси алюминия (ГОА) с 3% сухого остатка после размола из расчета на 1000 см суспензии 150 см ГОА (20%) при pH 7,2-7,4 и температуре 4-8°C. Сорбцию проводили в течение 1-2 часов с периодическим перемешиванием. Вакцину хранили при 8°C до получения результатов контроля препарата. Смесь перед фасовкой перемешивали при температуре 10-12°C в течение 1 часа.
Содержание антигена в дозе вакцины на уровне 640-1280 ГАЕ является его оптимальным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.
Полученную вакцину проверяют на внешний вид, стерильность, уровень pH, полноту инактивации вируса, иммуногенность и безвредность.
Вакцина представляет собой прозрачную жидкость серо-коричневого цвета с рыхлым осадком, образующимся при хранении, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.
3
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Безвредность препарата определяют путем его введения четырем кроликам внутримышечно по 3 см. Вакцина считается безвредной, если она не вызывает гибель или заболевания кроликов, а также изменений некротического характера на месте введения в течение 14 суток наблюдения.
3
Полноту инактивации вируса в вакцине проверяют на 4 кроликах, которым вводят внутримышечно в область средней трети бедра по 3,0 см.
За кроликами ведут наблюдение в течение 10 дней. Вакцину считают не содержащей инфекционного вируса, если она не вызывает гибели кроликов от вирусной геморрагической болезни в течение 10 суток после введения препарата.
В используемых флаконах с вакциной определяют pH, средняя величина показателей должна быть в пределах 7,2-7,4.
2
Гемагглютинирующую активность антигена каждой серии вакцины определяют в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами человека 0 (I) группы и выражают в гемагглютинирующих единицах. Гемагглютинирующий титр в вакцине должен быть не ниже 8,0 log, что соответствует разведению 1:256 ГАЕ.
Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что тканевая инактивированная гидроокисьалюминевая вакцина против ВГБК из штамма «Белгородский-03» обладает высокой гемагглютинирующей активностью.
При изучении иммуногенной активности тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Белгородский-03» установлено, что у кроликов старше 1,5-2-мес. возраста, привитых однократно внутримышечно в дозе 0,5 мл, уже на 5 день после введения препарата индуцируется иммунный ответ, обеспечивающий 90-100% образование гуморальных антител и защиту от заболевания. Экспериментально показано, что одна прививная доза в объеме 0,5 мл содержит не менее 640-1280 ГАЕ. Результаты исследований, представленные в таблице 3, подтверждают высокую эффективность инактивированной вакцины против ВГБК из штамма «Белгородский-03».
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- штамм «Белгородский-03» вируса геморрагической болезни кроликов, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии,
- штамм «Белгородский-03», полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления вакцинных препаратов против ВГБК.
Источники информации
1. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus; Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A.; J. Gen. Virol. - 2002. - Vol.83. - P.2461-2467.
2. Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2004; PART 2; SECTION 2.8.; CHAPTER 2.8.3. RABBIT HAEMORRHAGIC DISEASE.
3. Патент РФ №2077340 от 06 августа 1993 г.
4. Патент РФ №2039570 от 20 июля 1995 г.
5. Авторское свидетельство №294945 от 22.08.1989 г.
Таблица 1
Уровень накопления антител, задерживающих гемагглютинацию при гипериммунизации кроликов инактивированным вирусом ВГБК штамм «Белгородский-03»
№ кроликов
Титр антител, задерживающих гемагглютинацию
До введения
После 1-й инъекции (log<sub>2</sub>)
После 2-й инъекции (log<sub>2</sub>)
1
0
6
11
2
0
7
10
3
0
8
12
4
0
7
12
Таблица 2
Гемагглютинирующая активность тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины
№ п/п
Серия вакцины
Гемагглютинирующая активность (ГАЕ)
1
Экспериментальная серия №10 от 16.12.2003
1:2048
2
Производственная серия №13 от 27.04.2004
1:1024
Таблица 3
Иммуногенная активность тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Белгородский-03»
№ п/п
Наименование испытуемого материала
Титры антител в РЗГА
До вакцинации (log<sub>2</sub>)
Через 5 дн. (log<sub>2</sub>)
Через 14 дн. (log<sub>2</sub>)
1
Сыворотка вакцинированного кролика
1
4
7
2
-*-
0
5
7
3
-*-
0
4
7
4
-*-
1
4
8
5
-*-
0
5
7
6
-*-
0
5
7
7
-*-
0
5
7
8
-*-
1
5
8
9
Сыворотка невакцинированного кролика
1
1
0
10
Сыворотка невакцинированного кролика
0
0
0