Способ моделирования микробиоты курицы в условиях искусственной слепой кишки
METHOD FOR MODELING CHICKEN MICROBIOTA IN AN ARTIFICIAL CAECUM

Настоящее изобретение относится к способам и системам моделирования желудочно-кишечных трактов животных, в частности, модели кишечника курицы.
В настоящее время происходит активная интенсификация сельхозиндустрии. На смену экстенсивным методам ведения хозяйства пришли методы интенсивного производства. В области животноводства интенсификация характеризуется широким внедрением искусственных кормов, витаминных, пробиотических и пребиотических питательных добавок, антимикробных средств, в рацион животных. При создании рецептур и составов кормов требуются методы, позволяющие оперативно и достоверно оценивать влияние внесенных изменений на пищевую ценность кормового продукта. В связи с этим получили широкое распространение искусственные кишечные системы, давшие разработчикам инструмент для оценки кормовых смесей в условиях лаборатории, что значительно ускорило разработку новых видов кормов.
Известен целый ряд способов моделирования процессов пищеварения у различных видов животных и человека. В патенте (CN104893957, C12M23/38, опубл. 15.06.2015) описывается устройство для симуляции рубца жвачных.
Бионическая пищеварительная система крысы описана в патенте (CN204423786, G09B23/36, опубл. 14.11.2014).
Известна система, симулирующая пищеварение цыпленка (CN101246650, G09B23/36, опубл. 22.02.2008).
in vitro
Известен способ анализа кормов для животных, использующий искусственную пищеварительную систему (RU2662776, C12Q1/37, опубл. 15.03.2013). Способ включает переваривание образца корма для животных  с использованием по меньшей мере одного пищеварительного фермента с получением ферментированного корма для животных, содержащего, по меньшей мере, один остаточный компонент, исследование указанного ферментированного корма для животных методом спектроскопии в ближней инфракрасной области с получением спектральных данных; сравнение указанных спектральных данных с компьютерной моделью с получением прогностической концентрации, по меньшей мере, одного остаточного компонента указанного ферментированного корма для животных.
in vitro
Однако известные способы моделирования пищеварительного тракта и симуляции пищеварительных процессов не учитывают фактор участия в пищеварительных процессах микробиоты кишечника, тогда как микроорганизмы, колонизирующие кишечник, оказывают значительное влияние на процессы пищеварения. Участие микробиоты рубца обеспечивает усвоение клетчатки, бактерии являются важным источником белка, который обеспечивает 75-80% метаболизируемого белка жвачных животных. Доказано влияние микробиоты кишечника крупного рогатого скота на качество продуцируемого молока DOI:10.1126/sciadv.aav8391. О масштабе влияния микроорганизмов можно судить по общему количеству микробных клеток в кишечнике, которое, например, у человека превосходит число собственных клеток тела DOI.org/10.1371/journal.pbio.1002533.
При осуществлении поиска перспективных пробиотических микроорганизмов исследователям приходится оценивать значительное количество потенциальных штаммов-пробиотиков. Проверка их свойств на модельных животных длительна и весьма трудоемка, в силу этого актуален способ, позволяющий провести такой скрининг на искусственной модели, в условиях, приближенных к кишечным.
Известно, что биохимическая активность бактерий зависит от условий внешней среды. В связи с этим исследования процессов, протекающих в микробиоте кишечника, в том числе, активности и свойств пробиотических бактерий, необходимо проводить в условиях, максимально соответствующим таковым в кишечнике.
Сущность изобретения заключается в том, что способ моделирования микробиоты слепой кишки курицы в искусственных кишечных системах, характеризующийся тем, что вначале в колбу, содержащую питательную среду состава с соотношением ингредиентов, г/л:  крахмал - 0.5-2.5 г, изолированный соевый белок – 10-–20  г, подсолнечное масло нерафинированное – 10-30 мл, MgSO4 - 0.25-1.5 г, NaCl – 3-6 г, K2HPO4 - 0.25-1.5 г, MnSO4 - 0.05- 0.06 г, FeSO4 - 0.05-0.06  г, Tween 80 - 0.5-1.5 мл, вода до 1 л, вносят размороженный стартер из содержимого слепой кишки кур, содержащего микроорганизмы, и инкубируют в анаэробной камере, в условиях, соответствующих моделируемому участку кишечника, затем помещают исследуемый образец в реактор - модель искусственного кишечника курицы, установив  при этом температурный и газовый режим соответствующий заданным условиям.
Технический результат заключается в том, что предлагаемое изобретение позволяет учитывать влияние микробиоты в системах искусственного пищеварительного тракта курицы, оценивать влияние вводимых добавок на микробиоту кишечника, а также проводить скрининг свойств штаммов-пробиотиков.
Нами была разработана модель искусственного кишечника курицы; разработанная модель аналогична лучшим мировым образцам моделей ЖКТ (желудочно-кишечного тракта), преимуществом ее является то, что она изначально разрабатывалась специально для проведения исследований в условиях, имитирующих различные отделы ЖКТ домашней птицы. Иерархическая микропроцессорная система управления и мониторинга обеспечивает проведение экспериментов произвольной длительности с управлением температурой химуса, величиной рН и обеспечением инертной атмосферы. Реакторы моделей могут масштабироваться и объединяться в цепи под общим управлением АСУ ТП. Обеспечивается протоколирование условий проведения экспериментов по управляемым параметрам.
Функциональный макет модуля модели ЖКТ включает в себя:
- резервуар с входными и выходными портами присоединения трубок и датчиков;
- система стабилизации температуры резервуара;
- насосная система дозирования и перекачки реагентов;
- система измерительных сенсоров;
- система управления модулем и регистрации данных, включая модули для присоединения сенсоров, модули управления насосами и нагревателем, управляющий контроллер, система индикации и локального задания параметров, источник питания, коммуникационный модуль;
- ПО управляющего контроллера макета.
Общеизвестно, что состав вторичных метаболитов, синтезируемых бактериальной клеткой, зависит от условий культивирования. Это означает, что бактерии на стандартных лабораторных средах и в кишечнике целевого организма могут по-разному проявлять свои свойства. Проведенные нами исследования показали, что условия культивирования оказывают значительное влияние на антиоксидантные и ДНК-протекторные свойства микроорганизмов кишечника.
Для обеспечения условий, наиболее приближенных к условиям цекального отдела (слепой кишки) кишечника курицы, содержимое кишечника кур было проанализировано на содержание аминокислот, жиров и углеводов. С учетом полученных данных нами была разработана жидкая питательная среда, предназначенная для моделирования процессов пищеварения в искусственных кишечных системах курицы, в качестве питательной основы она содержит: крахмал в качестве источника углеводов, подсолнечное масло в качестве источника жиров, изолированный соевый белок в качестве источника белков, Tween 80 в качестве эмульгатора.
4
2
4
4
4
При следующем соотношении ингредиентов, г/л: Крахмал - 0.5-2.5 г, изолированный соевый белок – 10-20 г, подсолнечное масло нерафинированное – 10-30 мл, MgSO - 0.25-1.5 г, NaCl – 3-6 г, KHPO - 0.25-1.5 г, MnSO - 0.05-0.06 г, FeSO - 0.05-0.06 г, Tween 80 - 0.5-1.5 мл, вода до 1 л.
2
Таким образом, разработанная модель позволяет поддерживать в течение длительного времени необходимые для развития кишечной микробиоты температуру, рН, уровень О, перемешивание, моделируя условия исследуемых отделов ЖКТ, в том числе, цекальный (слепую кишку).
Предлагаемое изобретение позволяет учитывать влияние микробиоты в системах искусственного пищеварительного тракта курицы, оценивать влияние вводимых добавок на микробиоту кишечника, а также проводить скрининг свойств штаммов-пробиотиков.
Способ осуществляется следующим порядком действий.
В колбу, содержащую питательную среду указанного состава, вносят размороженный стартер из содержимого слепой кишки кур, содержащего микроорганизмы, и инкубируют в анаэробной камере, в условиях, соответствующих моделируемому участку кишечника. Затем помещают исследуемый образец в реактор (модель искусственного кишечника курицы), устанавливают температурный и газовый режим, соответствующий заданным условиям, далее проводят моделирование процесса пищеварения согласно общей методике.
Способ поясняется чертежами, где на:
фиг. 1 - ДНК-протекторная активность пробиотических бацилл на лабораторной среде и в условиях искусственного кишечника курицы;
фиг 2 - ДНК-протекторная активность пробиотических лактобацилл на лабораторной среде и в условиях искусственного кишечника курицы;
фиг. 3 - антиоксидантная активность пробиотических бацилл на лабораторной среде и в условиях искусственного кишечника курицы;
фиг. 4 - антиоксидантная активность пробиотических лактобацилл на лабораторной среде и в условиях искусственного кишечника курицы.
Пример 1
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур, содержащего микроорганизмы, и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Затем помещали исследуемый образец в реактор (модель искусственного кишечника курицы), далее проводя моделирование процесса пищеварения согласно общей методике.
Bacillus
Lactobacillus
В качестве контроля пробиотические бактерии выращивали на лабораторных средах: LB для  и MRS для .
Исследование ДНК-протекторной активности проводили методом lux-биосенсоров.
Пример 2
2
2
2
В колбу, содержащую 100 мл среды, вносили 200 мкг размороженного стартера из содержимого слепой кишки кур содержащего микроорганизмы и инкубировали в анаэробной камере, в атмосфере 94% N, 5% CO, 1% O при температуре 42°С в течение 24 часов.
Bacillus
Lactobacillus
Затем добавляли исследуемый образец в реактор (модель искусственного кишечника курицы), далее проводя моделирование согласно общей методике. В качестве контроля пробиотические бактерии выращивали на лабораторных средах: LB для  и MRS для .
Исследование антиоксидантной активности проводили методом lux-биосенсоров.
L. johnsonii
L. acidophilus
L. crispatus
L. kitasatonis
L. crispatus
L. salivarius
Как видно из представленных данных, лактобактерии в разных условиях показывают разную антиоксидантную и ДНК-протекторную активность. Так, например, штамм  KL20, который не показал высокой активности на стандартной среде, в условиях, приближенных к кишечным, значительно увеличил как антиоксидантную, так и ДНК-протекторную активность. То же можно сказать и о штамме  L108. С другой стороны,  KL62,  KL73 и  KL82 почти не изменили своих свойств, а перспективный штамм  KL61 в условиях искусственного кишечника, напротив, почти потерял свои антиоксидантные и ДНК-протекторные свойства.
Это значит, что те данные, которые мы и другие исследователи получают об активности пробиотических штаммов в лабораторных условиях, могут не совпадать с тем, как штаммы поведут себя в условиях кишечника целевых животных. Предложенный нами способ культивирования позволяет получить более объективную информацию о свойствах кишечной микробиоты.
Список цитированных источников:
1. CN104893957  (Hunan Agricultural University)   2015-06-15.
2. CN204423786U   (Nantong Donggainian New Material Co Ltd) 2014-11-14.
3. CN101246650B   (Institute of Animal Science of CAAS)   2008-02-22.
4. RU2662776C2  (Олтек, Инк.) 2013-03-15.
5. Wallace, John & Sasson, Goor & Garnsworthy, Phil & Tapio, Ilma & Gregson, Emma & Bani, Paolo & Huhtanen, Pekka & Bayat, Alireza & Strozzi, Francesco & Biscarini, Filippo & Snelling, Timothy & Saunders, Neil & Potterton, Sarah & Craigon, James & Minuti, Andrea & Trevisi, Erminio & Callegari, Maria & Piccioli-Cappelli, Fiorenzo & Cabezas-Garcia, Edward Hernando & Mizrahi, Itzhak. (2019). A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions. Science Advances. DOI:10.1126/sciadv.aav8391.
6. R Sender R, Fuchs S, Milo R (2016) Revised Estimates for the Number of Human and Bacteria Cells in the Body. PLOS Biology 14(8): e1002533. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.100253.