СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ АНДРОСТЕНДИОНА В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ
METHOD OF ESTIMATING CONTENT OF ANDROSTENEDIONE IN PLACENTAL PLASMODIOTROPHOBLAST IN AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRAL INFECTION IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION

1. Цель изобретения - оценить характер влияния цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации на содержание андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, приводящей к нарушению развития и созревания органов плода в период гестации.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке гистохимического способа определения снижения содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре беременности.
3. Раскрытие изобретения
Во время гестации большое количество эстрогенов продуцируется из холестерина через образование ряда андрогенов - дегидроэпиандростерона и андростендиона. В плаценте основное количество андростендиона превращается в эстрон и далее в 17β-эстрадиол [7]. Поэтому уменьшение количества андростендиона приведет к нарушению формирования эстрона и эстрадиола в фетоплацентарной системе.
В третьем триместре беременности эстрогены необходимы для функционального созревания плаценты и плода. Они влияют на выработку других стероидных и белковых гормонов, контролируют экспрессию липопротеидов низкой плотности, стимулируют трансплацентарное окисление материнского кортизола, что приводит к созреванию у плода оси гипоталамус - гипофиз - надпочечник в конце беременности [5]. Эстрогены регулируют развитие легких, почек, печени, костной ткани и яичника плода [2, 5]. Снижение активности формирования эстрогеновых гормонов окажет влияние на развитие и созревание органов плода.
4. Новая техническая задача
Определить уровень содержания андростендиона в синцитиотрофобласте ворсинок при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации с целью оценки характера состояния фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие и созревание органов плода.
5. В доступной литературе имеются упоминания об исследовании обмена андростендиона радиометрическим методом в плаценте при гипертензии у беременных [4], при токсемии беременности [6], при экспериментальной стрептококковой инфекции радиоиммунологическим методом [3]. Недостатком вышеупомянутых методов является необходимость дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и реактивов: радиоактивных веществ, имеющих короткий срок хранения; соблюдение усиленных мер по технике безопасности, связанных с радиационным риском для персонала и окружающей среды. Биохимические методы не дают представления о месте локализации вещества.
В отличие от вышеприведенных прототипов в данной работе имеются существенные отличия: 1) анализ содержания андростендиона проводится с помощью гистохимической реакции, в качестве субстрата для которой используется андростендион; 2) изменения содержания андростендиона происходят под влиянием обострения цитомегаловирусной инфекции во время беременности. Метод прост в исполнении, не требует дорогостоящих реактивов, обладает хорошей разрешающей способностью и может быть рекомендован в проведении научно-исследовательских работ и лабораторной диагностики.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 38 беременных женщин 18-25 лет с обострением хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, контрольную группу составили 30 беременных женщин с хронической цитомегаловирусной инфекцией в латентной стадии. У беременных женщин симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение хронической цитомегаловирусной инфекции) устанавливается по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводят с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляют методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ДНК ЦМВ выявляют методами ПНР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
+
6.3. Активность андростендиондегидрогеназы гистохимически определяют на криостатных срезах свежезамороженной нефиксированной ткани плаценты следующим методом. Метод основан на восстановлении соли тетразолия в формазан электронами, акцептируемыми от субстрата через кофермент НАДФ [1]. Субстратом служит 2 мМ раствор андростендиона «Sigma» (США). Для его приготовления 6 мг 4-андростен-3,17-диона растворяют в 10 мл Ν,Ν-диметилформамида Инкубационный раствор готовится на основе 0,1 M фосфатного буфера рН 7,2-7,4 с добавлением нитросинего тетразолия фирмы «ICN Biomedicals)) (США) в конечной концентрации 5 ммоль, НАДФ фирмы «Applichem» (Германия) - 1 ммоль.
Состав инкубационной среды:
0,1 M фосфатный буфер рН 7,2-7,4 - 1 мл;
нитросиний тетразолий - 1 мг;
+
НАДФ - 1 мг;
2 мМ раствор андростендиона - 0,1 мл.
6.4. В 1 мл инкубационного раствора помещают свежеприготовленные срезы ткани. Инкубацию проводят при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывают дистиллированной водой, фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине при комнатной температуре, вновь промывают дистиллированной водой, подсушивают и заключают в глицерин-желатин. Контрольные срезы инкубировали в среде, содержащей вместо раствора андростендиона адекватное количество фосфатного буфера. Полученные гистологические препараты изучают цитофотометрическим компьютерным методом с помощью программы Scion (США) на цифровом микроскопе MEIJI (Япония).
1
2
6.5. Статистический анализ и обработка данных проводится с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений M±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий используется непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимаются во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
7. Полученные данные
В процессе исследования получены следующие результаты. На гистохимических препаратах плаценты беременных, перенесших обострение хронической цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации, при регистрации роста титра антител класса G к цитомегаловирусу до 1:1600 отмечается снижение активности реакции, отражающей содержание андростендиона до 32,1±2,88 усл. ед. (фигура 1); (контроль - 54,2±4,31 усл. ед.) (фигура 2), что создает угрозу на развитие и созревание органов плода в период гестации.
Литература
1. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы: пер. с англ. М.: Мир, 1982. 272 с.
2. Albrecht E.D., Pepe G.J. Central integrative role of oestrogen in modulating the communication between the placenta and fetus that results in primate fetal-placental development // Placenta. 1999. Vol.20, Is. 2. P. 129-139.
3. Gravett M.G., Haluska G.J., Cook M.J., Novy M.J. Fetal and maternal endocrine responses to experimental intrauterine infection in rhesus monkeys // Am. J. Obstet. Gynecol. 1996. Vol. 174, №6. P. 1725-1731.
4. Flannel M.E., Martin J.D., Michael C.A., Hahnel R. Metabolism of androstenedione by placental microsomes in pregnancy hypertension // Clin. Chim. Acta. 1989. Vol. 81, №1. P. 103-108.
5. Pepe G.J., Albrecht E.D. Central integrative role of oestrogen in the regulation of placental steroidogenic maturation and the development of the fetal pituitary-adrenocortical axis in the baboon // Hum. Reprod. Update. 1998. Vol.4, №4. P. 406-419.
6. Rahman S.A., Hingorani V., Laumas K. R. Biosynthesis of oestrogens and their inter-conversion in human placentae from normal and toxaemic pregnancies // Clin. Endocrinol. (Oxf). 1975. Vol.4, №4. P.333-341.
7. Strauss J.F., Martinez F., Kiriakidou M. Placental steroid hormone synthesis: unique features and unanswered questions // Biol. Reprod. 1996 Vol.54, №2. P. 303-311.