Устройство для культивирования биопленок микроорганизмов

Полезная модель относится к техническим устройствам для микробиологии, в частности к устройствам культивирования микроорганизмов, предназначенных для выращивания биопленок моно- и смешанных культур микробов на больших площадях поверхности с целью накопления больших объемов биомассы микроорганизмов в виде биопленок, для исследования биогенеза биопленок, для исследования различных биохимических процессов и структурных особенностей биопленок на стадиях их образования, созревания и лизиса, для исследования различных стрессовых воздействий, включая иммунные препараты, антибиотики, биоцины, дезинфектанты, бактериофаги, на сохранность биопленки и на морфо-функциональное состояние клеток в структуре микробной биоплёнки.
До настоящего времени все знания и достижения современной микробиологии о морфологии, физиологии, генетике и адаптационных свойствах микроорганизмов накоплены по результатам исследования планктонных форм микроорганизмов. Известно, что 99 % микроорганизмов в природных экосистемах существуют в виде прикрепленных к субстрату биопленок.
Биопленки - это физические структуры, образуемые микробами на поверхности раздела фаз: жидкость - твердая поверхность, жидкость - воздух, две несмешивающиеся жидкости, твердая поверхность - воздух. Биопленки могут формироваться бактериями одного вида или микробными сообществами. Зрелые, уже сформированные биопленки могут содержать обычные микробы, также покоящиеся или некультивируемые формы микроорганизмов. Биопленки могут образовываться на различных органах и тканях в организме человека и животных, а также на растениях.
Образование биопленок патогенными бактериями способствуют инфекционным поражениям большинства органов (верхних дыхательных путей, легких, сердца, почек, кожи, костей, системы пищеварения).
В связи с этим поиск, разработка и экспериментальный отбор эффективных лекарственных препаратов, иммунопрепаратов, ферментов, антибиотиков и дезинфектантов, предназначенных для подавления образования биопленок, разрушения биопленок и инактивации микробов внутри биопленок, является чрезвычайно важной и актуальной задачей микробиологии и медицины.
Известен способ получения биопленок микроорганизмов в лабораторных условиях при культивировании микробов в жидких питательных средах в колбах или в ферментерах, в которых помещают предметные или покровные стекла и тефлоновые блочки в качестве подложки для образования биопленок [Симонова И.Р., Головин С.Н., Веркина Л.М., Методы культивирования и изучения бактериальных биопленок. Естественные науки, 2017.-1, с.73-79].
Известный способ получения биопленок не позволяет получить большой объем биопленочной биомассы микроорганизмов для исследования в электронном микроскопе тонкой структуры биопленок, для выполнения биохимических и других исследований на биопленках и микробах.
Наиболее близким к предлагаемому устройству и способу культивирования биопленок микроорганизмов является способ культивирования биопленок микроорганизмов в лабораторных условиях в 96-луночных пластиковых планшетах. Суть метода состоит в том, что суспензию планктонной формы микроорганизмов вносят в лунки планшета и инкубируют в оптимальных условиях, затем планктонную форму микробов вместе с питательной средой удаляют из лунок, а биопленку визуализируют с помощью оптической или электронной микроскопии [Чернявский В.И. Бактериальные биопленки и инфекции (лекция)
ChernjavskyV.I. Bacterialbiofilmsandinfection (lecture). Annalsof MNechnikov Institute, 2013.-N].
Однако основными недостатками культивирования микробных биопленок в луночных пластиковых планшетах, являются:
отсутствие достаточного уровня биологической безопасности при выполнении работ по культивированию бактерий возбудителей опасных и особо опасных инфекций;
сложно, неудобно и небезопасно препарировать из лунок пластиковых планшетов биопленочную биомассу микроорганизмов для структурных, биохимических, иммунологических исследований;
не позволяет выращивать большое количество биопленочной биомассы микроорганизмов, необходимое для выполнения электронно-микроскопических исследований ультраструктуры биопленки, а также для количественной оценки морфо-функционального состояния бактерий в биопленке на разных стадиях её развития;
не позволяет получить большие объемы биопленочной биомассы, необходимых для испытания антибактериальных и биоцидных препаратов на структуру биопленок;
не обеспечивает стерильные условия при длительном культивировании микробов в луночных пластиковых планшетах;
не обеспечивает оптимальных условий питания и аэрации микробов при длительном культивировании.
Техническим результатом предлагаемого устройства является обеспечение биологической и технической безопасности при выполнении лабораторных работ по культивированию биопленок микроорганизмов, с более высокой производительностью, обеспечение стерильных условий культивирования микроорганизмов, обеспечение оптимальных условий питания и аэрации микробов при длительном культивировании, обеспечение условий для исследования действия различных факторов и средств на процесс пленкообразования и жизнедеятельность микробов, моделирование условий различных экосистем для исследования образования биопленок микроорганизмов, а также для экспериментального отбора средств лизиса, удаления и инактивации биопленок микроорганизмов.
Технический результат достигается тем, что предлагается устройство для культивирования биопленок микроорганизмов, изготовленное из нержавеющей стали AISI 304, которое представляет собой основание (1) в виде катушки c внешним диаметром D=44 мм, высотой H=56 мм и диаметром центрального стержня d=16 мм, в которую заправляется рентгенографическая плёнка (4) ГОСТ ISO 4090-2011 (без фотографической эмульсии) шириной 48 мм и длиной 300 мм.
В верхней части основания (1) предусмотрена технологическая перфорация, предназначенная для беспрепятственного проникновения жидкой питательной среды между слоями пленки (4). Там же расположен подвес (3), необходимый для помещения устройства в микробиологическую колбу или в ферментер.
Внутри катушки с двух сторон предусмотрена спиральная направляющая (5), в которую в заданном направлении (а) заправляется плёнка (4).
По бокам устройства с четырёх сторон расположены ограничители(6), служащие для усиления основания конструкции (1), а так же для предотвращения контакта верхнего слоя пленки с другими поверхностями.
Спецификация для фиг.1 (Устройство для культивирования биопленок микроорганизмов):
1. Основание
2. Перфорация
3. Подвес
4. Пленка для культивирования
5. Спиральная направляющая
6. Ограничитель(4 шт.)
3
3
3
7-8
.
3
Пример 1. Для испытания возможностей предлагаемого лабораторного устройства для культивирования биопленок микроорганизмов в круглодонной микробиологической колбе объемом 3000 см с внутренним диаметром горлышка не менее 50 мм в асептических условиях вносят не менее1200 смстерильного мясо-пептонного бульона (МПБ) и 9-10 см суспензии бактерий Esherichia coli шт. 1257 в концентрации 1-2×10м.кл/см(по стандарту мутности). В качестве плёнки-подложки для образования биопленки используют рентгеновскую пленку без фотографической эмульсии. Для этого в стерильное устройство для культивирования биопленок заправляют стерильную пленку шириной 48 мм и длиной 300 мм. Устройство вносят в колбу с питательной средой и инкубируют при 37°С на качалке в течение 72 ч. Затем из колбы извлекают устройство, а из устройства извлекают пленку-подложку. Затем плёнку-подложку отмывают в 2-3 сменах стерильной дистиллированной воды для удаления планктонных форм бактерий и остатков питательной среды. Анатомическим скальпелем или лезвием бритвы в небольшом объеме 2,0% раствора глутарового альдегида с двух сторон рентгеновской плёнки-подложки снимают биопленочную биомассу бактерий. Биопленочная влажная биомасса бактерий в количестве 250-300 мкл препарируют для исследования в электронном микроскопе методом ультратонких срезов. Биомассу фиксируют в 4,0 % рабочем растворе глутарового альдегида на какодилатном буфере (рН 7,0-7,2) в течение 18 ч, дофиксируют в 1,0% растворе четырехокиси осмия на ацетат-вероналовом буфере (рН 6,0-6,2), затем образцы биомассы биопленок обезвоживают в градиенте концентрации этанола, пропитывают и заключают в смесь эпоксидных смол. Из пластиковых блоков с биоматериалом на ультрамикротоме изготавливают ультратонкие срезы и визуализируют в просвечивающем электронном микроскопе структуру биопленки и бактерий.
Таким образом, полученные данные визуализации тонкой структуры биомассы биопленки и бактерий Esherichia coli шт. 1257 свидетельствуют о том, что предлагаемое устройство культивирования биопленок микроорганизмов позволяет получать в необходимом объеме биопленочную биомассу для выполнения электронно-микроскопических исследований тонкой структуры биопленки и оценки морфо-функционального состояния микробов в её структуре.
3
3
3
8
.
3
Пример 2. Испытания предлагаемого лабораторного устройства для культивирования биопленок микроорганизмов проводят в коничской микробиологической колбе объемом 3000 см с внутренним диаметром горлышка не менее 50 мм. В колбу вносят примерно 1100 см стерильного мясо-пептонного бульона (МПБ) и 9-10 см суспензии бактерий Staphylococcus aureus шт. 906 в концентрации 1-2×10м.кл/см(по стандарту мутности). В качестве плёнки-подложки для образования биопленки используют рентгеновскую пленку без фотографической эмульсии, для этого в стерильное устройство заправляют стерильную плёнку шириной 48 мм и длиной 290 мм. Устройство вносят в колбу с питательной средой и инкубируют при 37°С на качалке в течение 120 ч. Затем из колбы извлекают устройство, а из устройства плёнку-подложку. Проводят отмывку пленки-подложки в 2-3 сменах стерильной дистиллированной воды для удаления планктонных форм бактерий с поверхности плёнки и остатков культуральной жидкости. От плёнки-подложки отрезают 5-6 фрагментов плёнки с биопленкой размером 7×7 мм и помещают их в 4,0% раствор глутарового альдегида на какодилатном буфере на 24 ч для фиксации структуры биопленки и инактивации микробов. Поверхность фрагментов плёнки-подложки с интактной биопленкой после фиксации в глутаровом альдегиде и обезвоживания в градиенте концентрации этилового спирта, покрывают атомарным золотом в ионной напылительной установке. Образцы исследуют в сканирующем микроскопе с целью получения трехмерных изображений тонкой структуры поверхности микробной биопленки.
С обеих сторон рентгеновской пленки подложки анатомическим скальпелем в небольшом объеме 2,0% раствора глутарового альдегида снимаютвсю биомассу биопленки. Полученную биомассу биопленки бактерий в количестве 250-300 мкл влажной массы фиксируют и препарируют и для исследования в электронном микроскопе методом ультратонких срезов. В просвечивающем электронном микроскопе исследуют тонкую структуру биопленки и морфо-функциональное состояние бактерий в ее структуре.
Таким образом, испытание предлагаемого устройства культивирования биопленки микроорганизмов показало, что двухсторонняя поверхность плёнки-подложки в процессе культивирования бактерий  Staphiloccocus aureus шт. 906 обрастает многослойной сплошной биопленкой. На образцах плёнки-подложки, покрытой биопленкой, сканирующей микроскопией визуализируют трехмерную тонкую структуру биопленки и бактерий в ее матриксе. В просвечивающем электронном микроскопе визуализируют тонкую структуру биопленки и бактерий в ее структуре.
3
3
3
7-8
.
3
Пример 3. Испытания предлагаемого лабораторного устройства для культивирования биопленок микроорганизмов проводят в ферментере объемом 10000 см. В ферментер наливают 6000 смстерильного мясо-пептонного бульона (МПБ) и 600 см суспензии бактерий Pseudomonas aeruginosa в концентрации 1-2×10м.кл/см(по стандарту мутности). В качестве основы для образования биопленки используют рентгеновскую плёнку без фотографической эмульсии, для этого в стерильное устройство для культивирования биопленок заправляют стерильную плёнку шириной 48 мм и длиной 280 мм. Устройство вносят в ферментер и инкубируют при 37°С в течение 48 ч. Затем из ферментера извлекают устройство, а из устройства - плёнку-подложку. Плёнку отмывают в 2-3 сменах стерильной дистиллированной воды для удаления планктонных форм бактерий и остатков культуральной жидкости. От плёнки-подложки отрезают 5-6 фрагментов с биопленкой размером 10×10 мм и помещают в 4,0% раствор глутарового альдегида на какодилатном буфере на 24 ч для фиксации структуры биопленки и инактивации микробов.
С обеих сторон рентгеновской плёнки-подложки анатомическим скальпелем стерильно снимают биопленку. Полученную биомассу биопленки бактерий фиксируют и препарируют для исследования в электронном микроскопе методом ультратонких срезов. В просвечивающем электронном микроскопе визуализируют и исследуют тонкую структуру биопленки и морфо-функциональное состояние бактерий в её матриксе.
Поверхность фрагментов плёнки-подложки с биопленкой после фиксации в глутаровом альдегиде, обезвоживания в градиенте концентрации ацетона, поверхность покрывают атомарным золотом в ионной напылительной установке. Затем образцы исследуют в сканирующем микроскопе с целью получения трехмерных изображений тонкой структуры поверхности биопленки и информацию о характере распределения бактерий в матриксе биопленки.
Испытание предлагаемого устройства культивирования биопленки микроорганизмов в ферментере показало, что двухсторонняя поверхность плёнки-подложки в процессе культивирования бактерий  Pseudomonas aeruginosa обрастает многослойной сплошной биопленкой. На образцах рентгеновской плёнки-подложки, покрытой биопленкой, с помощью сканирующей электронной микроскопией визуализируют при различных увеличениях трехмерную тонкую структуру биопленки и бактерий в ее матриксе.
А накопление большого объема биопленочной биомассы на плёнках-подложках позволяет препарировать биомассу биопленок для ультраструктурных исследований в просвечивающем электронном микроскопе, а также для выполнения других различных лабораторных исследований.
3
Таким образом, испытания предлагаемого устройства культивирования биопленок различных микробов в микробиологических колбах и в ферментере объемом не более 10000 см показало, что в устройстве внутренняя и внешняя поверхности рентгеновской пленки-подложки в процессе культивирования микробов обрастают многослойной сплошной биопленкой. На образцах пленки-подложки, покрытой биопленкой, с помощью сканирующей электронной микроскопии всегда удается визуализировать при различных увеличениях трехмерную тонкую структуру биопленки, определить порядок распределения и упаковки микробов в матриксе биопленки, а также оценить структуру и морфометрические параметры микробов.
Предлагаемое лабораторное устройство позволяет в асептических и безопасных условиях обеспечить многократное увеличение полезной площади поверхности образования биопленки микробов и значительное увеличение количества (объема) биопленочной биомассы микробов для выполнения различных ультраструктурных, биохимических, иммунных исследований.
Предлагаемое лабораторное устройство культивирования биопленок микроорганизмов позволяет также на больших площадях поверхности плёнки-подложки моделировать различные условия образования микробных биопленок, а также проводить экспериментальный отбор антибиотиков, биоцинов, иммунологических препаратов, бактериофагов, дезинфектантов для разрушения биопленок и инактивации микробов в структуре биопленки.