УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОЗЫ НА ОСНОВЕ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ PENICILLIUM ADAMETZII И КИСЛОРОДНОГО ЭЛЕКТРОДА ТИПА КЛАРКА

Полезная модель относится к биосенсорным аналитическим устройствам с областью применения в биотехнологии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Биосенсор может быть использован для определения содержания глюкозы в пищевых продуктах, ферментационных процессах, а также в физиологических жидкостях.
Показано использование глюкозооксидазы (ГОД), синтезированной штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д, как биологической основы биосенсора для определения глюкозы.
Для иммобилизации ГОД использован метод иммобилизации ферментов в слое ДЭАЭ-декстрана, ковалентно связанного с нитроцеллюлозной мембраной посредством бензохинона (Зайцев М.Г, Ашин В.В, Решетилов А.Н. Новый метод иммобилизации метилотрофных клеток и алкогольоксидазы, выделенной из них, для биосенсорной детекции низших спиртов. Сборник тезисов III Международной молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва; 2007. С.35).
В предлагаемой, полезной модели в качестве биологически чувствительного элемента используется иммобилизованная. ГОД, в качестве преобразователя применяется кислородный электрод типа Кларка.
Ниже перечислены аналоги предлагаемого биосенсора на основе кислородного электрода.
Имплантируемый глюкозный биосенсор для непрерывного мониторинга уровня глюкозы в крови у больных диабетом представлен в работе (Gamburzev S., Atanasov P. et al. Performance of glucose biosensor based on oxygen electrode in physiological fluids and at body temperature // Sensors and Actuators B: Chemical. 1996. V.30. №3. P. 179-183). ГОД (выделена из Aspergillus niger) иммобилизовали на углеродном порошке с помощью сшивающего агента карбодиимида. Линейный диапазон составлял 0-2.4 мг/мл. Ответы сенсора были стабильны в течение 2 недель непрерывной работы сенсора в плазме крови.
Совместная иммобилизация ГОД (выделена из Aspergillus niger) и глюкоамилазы была использована при создании биосенсоров для детекции крахмала (Renneberg R., Scheller F., Rieldel К., Litschko E., Richter M. Development of anti-interference enzyme layer for a-amylase measurements in glucose containing samples // Anal. Lett. 1983. V. 16 (В 12). Р. 877-890.). Ферменты иммобилизовали на шелковой мембране кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. Верхний предел линейной зависимости составлял 5 мМ глюкозы. Время ответа составляло 10 с.
-5
-3
В качестве прототипа использован амперометрический биосенсор для детекции глюкозы, представленный в работе (Wu В., Zhang G. et al. Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane // Talanta. 2004. V. 64. №2. P. 546-553). ГОД (выделена из Aspergillus niger) иммобилизовали на оболочке яичной скорлупы с использованием глутарового альдегида. Время ответа сенсора составляло 100 с, стабильность при хранении в течение 4 мес составляла 85% начального уровня ответа. Линейный диапазон детекции составлял 1×10-1×10 M.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используется фермент глюкозооксидаза, синтезированная штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д, не использовавшийся ранее для указанных целей. Кроме того, отличием предлагаемой модели от ближайшего аналога является время отклика сенсора, которое в два раза меньше отклика в модели-прототипе. В предлагаемом типе биосенсора использован также новый способ иммобилизации фермента, обеспечивающий стабильность и пределы детекции, сопоставимые с параметрами прототипа.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, состоит в создании рецепторного элемента для биосенсора по определению глюкозы и применении в таких областях как пищевая промышленность, биотехнология, медицина и сельское хозяйство.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый рецепторный элемент позволяет исследовать кинетические параметры фермента и обладает малым временем ответа, в два раза меньшим, чем модели прототипа, высокой чувствительностью и стабильностью, позволяющей исследовать кинетические параметры фермента.
Сущность полезной модели заключается в том, что биорецептор, содержащий иммобилизованный на носителе фермент - глюкозооксидазу сопряжен с электродом типа Кларка.
На фиг.1 представлена схема устройства.
Предлагаемое устройство включает следующие элементы: биосенсор, состоящий из преобразователя - электрода Кларка (1), на котором размещен биорецептор (2), представляющий собой иммобилизованный на носителе фермент, а также измерительную кювету (3) и магнитную мешалку (4). Устройство содержит также блок регистрации и обработки данных на базе компьютера.
Основным аналитическим параметром биосенсора является градуировочная зависимость. Для ее построения в измерительную кювету вносили различные концентрации глюкозы. На фиг.2 представлена градуировочная зависимость сенсора на основе ГОД, синтезированной штаммом Penicillium adametzii F-3298 Д. Диапазон определяемых концентраций глюкозы составил 0.05-5 мМ. Отклики сенсора были сняты в 30 мМ калий-фосфатном буферном растворе с pH 6. Чувствительность в области линейного диапазона составила 1.6 (нА/с)/мМ. Время ответной реакции составляло 50 с.
max
м
Калибровочную зависимость аппроксимировали трехпараметрическим уравнением Хилла. Кажущиеся кинетические константы приведены в Таблице 1. Для сравнения был исследован коммерческий фермент глюкозооксидаза Aspergillus niger фирмы Sigma. Иммобилизованная ГОД Penicillium adametzii F-3298 Д обладает более высоким значением V пo сравнению с коммерческим ферментом, что свидетельствует о более высокой величине отклика сенсора. При этом ГОД Aspergillus niger имеет более низкую величину К, по сравнению с ГОД Penicillium adametzii.
Таблица 1.
Кинетические константы ГОД.
Штамм
Кажущиеся кинетические константы
Максимальная скорость реакции(V<sub>max</sub>)
Константа Михаэлиса (K<sub>M</sub>)
Параметр Хилла (h)
Penicillium adametzii F-3298 Д
4.47±0.30
1.77±0.23
1.30±0.10
Aspergillus niger (Sigma)
2.54±0.11
0.98±0.08
1.88±0.21
В результате проведенных исследований установлены основные свойства глюкозооксидазы Penicillium adametzii F-3298 Д, разработан биосенсор для определения глюкозы, который обеспечивает быстрое определение содержания глюкозы в образце без использования сложного дорогостоящего оборудования. Формирование биорецептора позволяет сократить время анализа.