МОДЕЛЬ ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ ОССИФИЦИРУЮЩЕЙ ФИБРОДИСПЛАЗИИ НА ГРЫЗУНАХ
MODEL OF PROGRESSIVE OSSIFICATION FIBRODYSPLASIYA IN RODENTS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/684582, поданной 13 июня 2018 года, и предварительной заявки на патент США №62/828532, поданной 3 апреля 2019 года, полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0002] Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным животным из отряда грызунов и моделям заболеваний человека на грызунах. Более конкретно, настоящее изобретение относится к генетически модифицированным грызунам, геном которых содержит модифицированный ген  грызуна; грызунам, проявляющим такой фенотипический признак прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии (FOP), как образование эктопической костной ткани; выделенным тканям и клеткам грызунов, геном которых содержит модифицированный ген  грызуна; выделенным нуклеиновым кислотам, содержащим модифицированный ген  грызуна; композициям и способам получения генетически модифицированных грызунов; способам скрещивания и способам применения генетически модифицированных грызунов.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[0003] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII под названием 36190_10461US01_ _SequenceListing.txt, размером 4 КБ, созданный 6 июня 2019 года и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] В тексте описания упоминаются различные публикации, включающие патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки, номера доступа, технические статьи и научные статьи. Каждая из упоминаемых публикаций включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей.
ACVR1
Acvr1
Acvr1
[0005] Acrv1 представляет собой рецептор костных морфогенетических белков (BMP) типа I. Определенные мутации в гене  человека, включающие мутации, приводящие к аминокислотной модификации R206H или R258G, тесно связаны с прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазией (FOP) (см., например, публикацию заявки на патент США №2009/0253132; Pignolo, R. J. (2011) Orphanet Journal of Rare Diseases, 6:80,1-6; и Kaplan et al., Am J Med Genet A. 2015; 167(10): 2265-2271). У химерных мышей, несущих мутацию R206H в , развивается FOP-подобный фенотип (см., например, Chakkalakal et al. (2012) J. Bone and Mineral Res. 27:1746-1756). Определенные мутации в гене , например, результатом которых является вариант белка Acvr1 c R206H, являются перинатальными летальными у мышей и создают проблему при передаче нокин-гена, содержащего мутацию, через зародышевую линию грызуна.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Acvr1
[0006] Настоящее изобретение направлено на генетически модифицированных животных из отряда грызунов, зародышевая линия которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащей модифицированный ген  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0007] Предусмотрены генетически модифицированные животные из отряда грызунов, зародышевая линия которых содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированный ген  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит условное изменение гена  грызуна, где упомянутое изменение делает животное из отряда грызунов предрасположенным к образованию эктопической костной ткани.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0008] Предусмотрены генетически модифицированные животные из отряда грызунов, содержащие в своей зародышевой линии последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую модифицированный ген  грызуна, содержащий условный измененный экзон , где индукция экспрессии условного измененного экзона  придает животному из отряда грызунов предрасположенность к образованию эктопической костной ткани. В одном варианте осуществления измененный экзон является экзоном 7. В конкретном варианте осуществления измененный экзон 7  содержит изменение, результатом которого является аминокислотная вариация R258G в белке Acvr1.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0009] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые при определенных условиях экспрессируют измененный аллель . В различных аспектах измененный аллель представляет собой аллель, который придает патологический фенотип животному из отряда грызунов, экспрессирующему данный аллель. В различных аспектах животные из отряда грызунов содержат измененный экзон аллеля , фланкированный выше и ниже сайтами распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), и животное из отряда грызунов содержит рекомбиназу, распознающую SRRS, где при этом активность рекомбиназы является индуцируемой.
Acvr1
[001] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые содержат модификацию гена  грызуна, которая обуславливает (в одном варианте осуществления у гетерозиготного животного; в одном варианте осуществления у гомозиготного животного) то, что животное из отряда грызунов становится предрасположенным к образованию эктопической костной ткани, способствует этому или обеспечивает это.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0011] Предусмотрены животные из отряда грызунов, которые содержат условное изменение гена  грызуна, где измененный аллель  не экспрессируется in utero и не экспрессируется в перинатальном периоде, и где механизм экспрессии измененного аллеля  у животных из отряда грызунов имеет обусловленный характер, где обусловленная экспрессия индуцируется посредством введения животному из отряда грызунов соединения, представляющего интерес.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0012] В одном аспекте предусмотрено животное из отряда грызунов, геном которого содержит модифицированный локус  грызуна, содержащий измененный экзон в антисмысловой ориентации, где измененный экзон фланкирован выше и ниже с помощью SRRS, ориентированных таким образом, чтобы направлять инверсию при воздействии рекомбиназы, распознающей SRRS.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0013] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено животное из отряда грызунов, геном которого содержит модифицированный ген грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна, модифицированный ген  грызуна, содержащий функционирующий экзон 7  в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы так, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7  с получением в результате измененного аллеля  (т. е. аллеля , содержащего изменение). В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена грызуна, например экзоны грызуна дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе  грызуна. В различных вариантах осуществления измененный аллель является аллелем, который придает патологический фенотип животному из отряда грызунов, экспрессирующему данный аллель.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0014] В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен генетически модифицированный грызун, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит (a) функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7  и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена грызуна, например, экзоны грызуна дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
[0015] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой встречающийся в природе функционирующий экзон 7 грызуна, т. е. экзон 7 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 . В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  представляет собой встречающийся в природе функционирующий экзон 7  человека, т. е. экзон 7  человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом (т. е. один или более нуклеотидов) и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека дикого типа и измененным экзоном 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека дикого типа.
[0016] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0017] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, который содержит модифицированный ген  грызуна в локусе  в зародышевой линии грызуна, где модифицированный ген  грызуна  содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена , (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена ) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7, и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена ) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.
[0018] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS представляет собой пару сайтов Lox2372, и вторая пара SRRS представляет собой пару сайтов LoxP. В других вариантах осуществления первая пара SRRS представляет собой пару сайтов LoxP, и вторая пара SRRS представляет собой пару сайтов Lox2372.
Acvr1
[0019] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное из отряда грызунов дополнительно содержит индуцируемую рекомбиназу, которая распознает SRRS и способна осуществить инверсию антисмыслового измененного экзона  с обеспечением его расположения в смысловой ориентации. В одном варианте осуществления ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу, находится в зародышевой линии грызуна, например интегрирован в эндогенный локус ROSA26 грызуна.
[0020] Индуцируемость рекомбиназы может быть достигнута на уровне транскрипции (экспрессии гена) или на уровне активности белка. В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена рекомбиназы является индуцируемой и/или регулируемой в процессе развития и/или специфичной по отношению к определенным типам тканей или клеток. В других вариантах осуществления экспрессия гена рекомбиназы является конститутивной, и активность рекомбиназы является индуцируемой.
T2
T2
T2
[0021] В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа представляет собой Cre. В некоторых вариантах осуществления SRRS представляют собой сайты lox или их варианты, распознаваемые Cre. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, восприимчивым к связыванию лигандом. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, который является лигандсвязывающим доменом рецептора, такого как стероидный рецептор, глюкокортикоидный рецептор, ретиноидный рецептор, тиреоидный рецептор или эстрогеновый рецептор (ER), или который получен из лигандсвязывающего домена рецептора. В некоторых вариантах осуществления Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом ER, содержащим мутации T2 (в данном документе она называется Cre-ER). Слитый белок Cre-ER является восприимчивым к (т. е. активируется посредством) связыванию лигандом, например тамоксифеном или его функциональными аналогами/производными. В одном варианте осуществления ген, кодирующий Cre-ER, присутствует в локусе ROSA26 генетически модифицированного грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0022] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен мутантный грызун, полученный от генетически модифицированного грызуна, описанного выше (т. е. полученный от генетически модифицированного грызуна, содержащего модифицированный ген  грызуна, который содержит условное изменение  в антисмысловой ориентации), где мутантный грызун обладает геномом, содержащим изменение в  в смысловой ориентации, и где ген , содержащий изменение, экспрессируется у мутантного грызуна, что в некоторых вариантах осуществления приводит в результате к образованию эктопической костной ткани.
Acvr1
; Gt(ROSA26)Sor
.
[R258G]FlEx/+
CreERt2/+
[0023] В одном варианте осуществления генетически модифицированный грызун представляет собой мышь, обладающую генотипом
Acvr1
Acvr1
[0024] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, который экспрессирует аллель , содержащий функционирующий экзон 7  (например, in utero и в перинатальный период), где при воздействии рекомбиназы на генетически модифицированного грызуна грызун экспрессирует вариант белка Acvr1, содержащий аминокислотную вариацию R258G.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0025] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, которая экспрессирует продукт гена , характеризующийся наличием вариации R258G, где по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток грызуна содержат измененный ген , кодирующий вариацию R258G. В других вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, в которой экспрессируется продукт гена , характеризующийся наличием вариации R258G в определенных типах тканей или клеток.
Acvr1
Acvr1
[0026] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен генетически модифицированный грызун, где данный грызун содержит модифицированный локус  грызуна в его зародышевой линии, с которого под воздействием рекомбиназы экспрессируется белок , содержащий вариацию R258G.
[0027] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен грызун, в котором экспрессируется вариант белка, содержащий вариацию R258G, где данный грызун является нехимерным (т. е. все клетки грызуна экспрессируют данный вариантный белок). В некоторых вариантах осуществления предусмотрена взрослая особь грызуна, в которой экспрессируется вариант белка, содержащий вариацию R258G, где по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% клеток грызуна экспрессируют данный вариант белка.
Acvr1
Acvr1
Acrv1
[0028] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен грызун, в котором экспрессируется вариант белка из модифицированного локуса  грызуна в зародышевой линии грызуна, где все Acvr1-экспрессирующие клетки грызуна содержат модифицированный ген  грызуна, который кодирует белок Acvr1, содержащий вариацию R258G. В одном варианте осуществления все зародышевые клетки грызуна содержат модифицированный локус  грызуна, содержащий условную генетическую модификацию, кодирующую белок Acvr1 с вариацией R258G.
Acvr1
[0029] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун является гетерозиготным по генетический модификации, т. е. по модифицированному гену  грызуна, содержащему условное изменение. В некоторых вариантах осуществления грызун является гомозиготным по генетический модификации.
[0030] В различных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун выбран из группы, состоящей из мыши, крысы и хомяка. В некоторых конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь. В некоторых конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой крысу.
Acvr1
[0031] В другом аспекте в данном документе раскрыта нуклеиновая кислота, содержащая модифицированный ген  грызуна, описанный в данном документе.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0032] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген  грызуна в нуклеиновой кислоте содержит функционирующий экзон 7 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации, фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 . В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны гена грызуна, например, экзоны дикого типа эндогенного гена  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0033] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген  грызуна в нуклеиновой кислоте содержит (a) функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и (b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7 и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны гена грызуна, например экзоны дикого типа гена  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
[0034] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой экзон 7 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 . В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  представляет собой экзон 7  человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека дикого типа и измененным экзоном 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека дикого типа.
[0035] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0036] В некоторых вариантах осуществления модифицированный ген  грызуна в нуклеиновой кислоте содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена , (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации; и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена ) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7 и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена ) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.
Acvr1
[0037] В другом аспекте в данном документе раскрыт геном грызуна, содержащий нуклеиновую кислоту, которая содержит модифицированный ген  грызуна, описанный выше.
[0038] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна дополнительно содержит ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу, которая распознает SRRS и способна осуществить инверсию измененного экзона 7 и осуществлять делецию функционирующего экзона 7.
T2
T2
[0039] В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа представляет собой Cre. В некоторых вариантах осуществления SRRS представляют собой сайты lox или их варианты, распознаваемые Cre. В некоторых вариантах осуществления рекомбиназа (например, Cre) слита с лигандсвязывающим доменом, восприимчивым к связыванию лигандом, например Cre-ER, который является восприимчивым к (т. е. активируется посредством) связыванию тамоксифеном или его функциональными аналогами/производными. В одном варианте осуществления ген, кодирующий Cre-ER, интегрирован в локус ROSA26 генома грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0040] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыта выделенная ткань или клетка грызуна, геном которой содержит нуклеиновую кислоту, описанную выше, т. е. геном из ткани или клетки содержит модифицированный ген  грызуна. В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат модифицированный ген  в пределах эндогенного локуса  грызуна. В некоторых вариантах осуществления выделенная клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку (ES). В некоторых вариантах осуществления выделенная ткань или клетка грызуна представляет собой яйцеклетку грызуна или эмбрион грызуна. Выделенные ткань или клетка грызуна включают, например, ткань или клетку мыши или крысы.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0041] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген  грызуна, содержащий функционирующий экзон 7 в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 . В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена грызуна, например экзоны дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0042] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген  грызуна, содержащий (a) функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, и (b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию функционирующего экзона 7 и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления экспрессия измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна, приводит в результате к образованию эктопической костной ткани. В различных вариантах осуществления остальные экзоны модифицированного гена грызуна, за исключением экзона 7, представляют собой функционирующие экзоны эндогенного гена грызуна, например экзоны дикого типа, присутствующие в эндогенном локусе  грызуна.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
[0043] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой экзон 7 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 . В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  представляет собой экзон 7  человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека дикого типа и измененным экзоном 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека дикого типа.
[0044] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0045] В некоторых вариантах осуществления выделенные ткань или клетка грызуна содержат в своем геноме модифицированный ген  грызуна, содержащий, в соответствии с направлением транскрипции гена , (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации, и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена ) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7, и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена ) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.
Acvr1
[0046] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыта конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена  в геноме грызуна, также называемая "нацеливающей нуклеиновой кислотой".
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0047] В некоторых вариантах осуществления нацеливающая нуклеиновая кислота содержит (a) функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 . В некоторых вариантах осуществления каждый из функционирующего экзона 7 и измененного экзона 7 фланкированы интронными последовательностями. Как правило, нацеливающая конструкция нуклеиновой кислоты содержит 5'- и 3'-плечи гомологии (нуклеотидные последовательности, гомологичные нуклеотидным последовательностям в локусе нацеливания), которые опосредуют гомологичную рекомбинацию и интеграцию последовательности нуклеиновой кислоты между плечами гомологии. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая конструкция нуклеиновой кислоты также содержит селектируемый маркерный ген для облегчения идентификации и отбора клонов, в которых происходит правильное нацеливание.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
ACVR1
[0048] В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой экзон 7 грызуна дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон 7 , кодирующий R258, представляет собой по сути человеческий экзон 7 . В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  представляет собой экзон 7  человека дикого типа. В других вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека дикого типа и измененным экзоном 7  грызуна. В некоторых вариантах осуществления по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека дикого типа.
[0049] В некоторых вариантах осуществления первая пара SRRS включает первый SRRS и второй SRRS, где первый и второй SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления вторая пара SRRS включает третий SRRS и четвертый SRRS, где третий и четвертый SRRS совместимы друг с другом и ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию, но не совместимы с первым или вторым SRRS.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0050] В некоторых вариантах осуществления нацеливающая нуклеиновая кислота содержит, в соответствии с направлением транскрипции гена , (i) функционирующий экзон 7 (например, по сути человеческий экзон 7) в смысловой ориентации и (ii) измененный экзон 7 в антисмысловой ориентации и содержит первую пару SRRS, состоящую из первого SRRS (SRRS1) и второго SRRS (SRRS2), а также вторую пару SRRS, состоящую из третьего SRRS (SRRS3) и четвертого SRRS (SRRS4); где SRRS1 совместим с SRRS2, SRRS3 совместим с SRRS4, однако ни SRRS1, ни SRRS2 не совместимы с SRRS3 или SRRS4, где SRRS1 расположен выше функционирующего экзона 7, SRRS2 расположен непосредственно ниже (в соответствии с направлением транскрипции гена ) антисмыслового измененного экзона 7, где SRRS1 и SRRS2 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию; где SRRS3 размещен между функционирующим экзоном 7 и измененным антисмысловым экзоном 7 и SRRS4 расположен ниже (в соответствии с направлением ориентации гена ) SRRS2, где SRRS3 и SRRS4 ориентированы таким образом, чтобы направлять инверсию. В некоторых вариантах осуществления каждый из SRRS 1-4 распознается одной и той же рекомбиназой, такой как Cre.
Acvr1
Acvr1
[0051] В другом аспекте в данном документе раскрыт способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модифицирование генома грызуна таким образом, чтобы он содержал модифицированный ген  грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна, как описано в данном документе.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0052] В некоторых вариантах осуществления геном грызуна модифицируют способом, включающим введение в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна нацеливающей конструкции нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе; получение ES-клетки грызуна, геном которой содержит модифицированный ген  грызуна; и получение генетически модифицированного грызуна с применением ES-клетки грызуна, содержащей модифицированный геном. Например, нацеливающую нуклеиновую кислоту вводят в ES-клетку грызуна, где нацеливающая нуклеиновая кислота содержит (a) функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и (b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS; где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 . Может быть выбрана ES-клетка грызуна, геном которой был модифицирован и содержит функционирующий экзон 7 , кодирующий R258 в смысловой ориентации, фланкированный выше и ниже первой парой SRRS; и измененный экзон 7  грызуна, кодирующий вариацию R258G в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS. Такую ES-клетку грызуна можно применять для получения грызуна.
Acvr1
Acvr1
[0053] В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный грызун, полученный с помощью настоящего способа и содержащий модифицированный ген  грызуна, дополнительно содержит индуцируемую рекомбиназу (например, Cre). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая индуцируемую рекомбиназу, присутствует в геноме ES-клетки грызуна, в которую вводят нацеливающую конструкцию нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления грызуна, содержащего в своем геноме модифицированный ген  грызуна, получают первым и затем скрещивают с другим грызуном, содержащим в своем геноме нуклеиновую кислоту, кодирующую индуцируемую рекомбиназу.
[0054] В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа активируется в грызуне и действует таким образом, что осуществляет инверсию измененного экзона 7 и делецию функционирующего экзона с обеспечением экспрессии белка Acvr1, содержащего изменение (например, R258G).
[0055] В дополнительном аспекте в данном документе раскрыт способ скрещивания полученных грызунов и потомства грызунов.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
ACVR1
[0056] В некоторых вариантах осуществления в данном документе раскрыт способ, включающий скрещивание первого грызуна, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна, со вторым грызуном с получением в результате грызуна-потомка, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна. В данном документе описан модифицированный ген  грызуна; например, модифицированный ген  грызуна может содержать функционирующий экзон 7 в смысловой ориентации и фланкированный выше и ниже первой парой SRRS, а также измененный экзон 7 грызуна в антисмысловой ориентации и фланкированный выше и ниже второй парой SRRS, где первая и вторая пары SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществить делецию функционирующего экзона 7 . В некоторых вариантах осуществления измененный экзон 7  грызуна кодирует вариацию R258G, и функционирующий экзон 7 представляет собой по сути человеческий экзон 7 , кодирующий R258.
T2
[0057] В некоторых вариантах осуществления второй грызун содержит индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа Cre представляет собой рекомбиназу Cre-ER, индуцируемую посредством связывания лиганда, такого как тамоксифен или его функциональное производное или аналог.
T2
[0058] В некоторых вариантах осуществления грызун-потомок содержит индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre. В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа Cre представляет собой рекомбиназу Cre-ER.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0059] В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа экспрессируется в клетке или ткани, например в выбранных клетках или тканях грызуна-потомка. В некоторых вариантах осуществления экспрессируемая рекомбиназа действует в клетке или ткани таким образом, что осуществляет инверсию измененного экзона 7 с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществляет делецию функционирующего экзона 7 , вследствие чего обеспечивается экспрессия измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7.
[0060] Также в данном документе предусмотрены грызуны-потомки, получаемые в результате скрещивания согласно способу, раскрытому в данном документе.
Acvr1
Acvr1
[0061] В еще одном аспекте генетически модифицированное животное из отряда грызунов, которое экспрессирует измененный аллель , применяют в качестве модели нарушения, характеризующегося эктопической оссификацией. В одном варианте осуществления нарушение, характеризующееся эктопической оссификацией, представляет собой прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию (FOP). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное из отряда грызунов, в котором экспрессируется измененный аллель , применяют для оценки кандидатного терапевтического соединения для определения того, может ли кандидатное соединение ингибировать развитие образования эктопической костной ткани у грызуна.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
фиг. 1
Acvr1
Acvr1
[0062] На проиллюстрирована схема превращения  дикого типа в R258G FlEx. На верхней схеме изображена геномная область  после нокина и делеции Neo. На нижней схеме показана геномная область после Cre-опосредованной инверсии и делеции, которые обеспечивают помещение мутантного экзона в его обычное место в обычной ориентации. Экзон (незакрашенный прямоугольник) и фланкирующие интронные (незакрашенная полоса) последовательности человека применяли для уменьшения уровня образования шпилек с инвертированными экзонными/интронными (заштрихованный прямоугольник/заштрихованная полоса) последовательностями мыши во время транскрипции. В экзон человека вводили дополнительные нуклеотидные изменения для дополнительного снижения степени идентичности последовательности с экзоном мыши.
фиг. 2
Acvr1
Gt(ROSA26)Sor
Acvr1
Gt(ROSA26)Sor
[R258G]FlEx/+
CreERt2/+
[R258G]FlEx/+
CreERt2/+
[0063] Напоказано, что у мышей с ; развилась гетеротопическая оссификация (HO) после обработки тамоксифеном. Четыре мыши с ; получили по 5 инъекций тамоксифена раз в день в дозе 40 мг/кг. Через 2 недели у всех мышей наблюдали образование HO.
фиг. 3
R258G
[0064] На  показано, что блокирующее антитело к активину A ингибирует образование HO у мыши с активным условным нокином Acvr1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0065] Прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (FOP) представляет собой аутосомно-доминантное нарушение, характеризующееся образованием эктопической костной ткани. Примерно 95% случаев FOP обусловлены мутацией R206H в рецепторе активина A типа I (Acvr1). Однако были описаны несколько других мутаций либо в домене GS, либо в домене киназы, включая R258G, которые обуславливают развитие атипичной формы FOP с более тяжелым фенотипом. У двух пациентов с мутацией R258G наблюдались значительные отклонения в развитии в дополнение к развитию гетеротопической оссификации после рождения (Kaplan et al., Am J Med Genet A. 2015; 167(10): 2265-2271).
Acvr1
[0066] Предусмотрены генетически модифицированные грызуны, которые способны к экспрессии белка Acvr1, содержащего изменение, которое приводит в результате к нарушению, характеризующемуся образованием эктопической костной ткани, например FOP. В некоторых вариантах осуществления грызуны, у которых экспрессируется измененный белок Acvr1, включают грызунов, которые не являются химерными, например грызунов, геномы которых несут модифицированный ген , содержащий условное изменение, которое при его экспрессии приводит в результате к образованию эктопической костной ткани у грызуна.
[0067] Предусмотрены генетически модифицированные грызуны, которые содержат конструкцию FlEx, которая обеспечивает условную делецию функционирующего экзона и замену функционирующего экзона измененным экзоном. Функционирующий экзон кодирует аминокислоты белка, который является функциональным, т. е. выполняет свою ожидаемую биологическую функцию. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон представляет собой встречающийся в природе экзон дикого типа. В некоторых вариантах осуществления функционирующий экзон кодирует те же аминокислоты, что и экзон дикого типа. FlEx обеспечивает образование условного аллеля посредством помещения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей измененный экзон, в антисмысловую цепь (далее называемой “инвертированный измененный экзон”) рядом с функционирующим экзоном, который позже подвергается делеции. C применением выбранных сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS) в присутствии их когнатной рекомбиназы инвертированный измененный экзон переносится в смысловую цепь и, следовательно, также в одну рамку считывания с остальной частью гена, при этом функционирующий экзон подвергается делеции. Данный FlEx-подход основываться на помещении несовместимых SRRS (например, lox2372 и loxP) в положениях, примыкающих к функционирующему и измененному экзонам. Таким образом, одним преимуществом FlEx-подхода является то, что (перинатальная/эмбриональная) летальный мутация не экспрессируется, пока на FlEx-аллель не воздействует(-ют) выбранная(-ые) рекомбиназа(-ы). Другим преимуществом данного FlEx-подхода является необратимое удаление функционирующего экзона при воздействии выбранной рекомбиназы, и таким образом после осуществления инверсии в геноме не остается инвертированного повтора, что исключает возможность восстановления аллеля дикого типа. Еще одним преимуществом FlEx-подхода является необратимое закрепление измененного экзона в смысловой цепи, что является результатом удаления по одному из каждых двух разных типов SRRS (например, одного из двух сайтов lox2372 и одного из сайтов loxP). Функционирующий экзон, получаемый посредством гуманизации экзона грызуна дикого типа, также минимизирует последовательность инвертированного повтора, таким образом облегчая стадии клонирования и уменьшая объем проблем, связанных с перегруппировками, во время и после нацеливания, а также количество артефактов сплайсинга РНК во время созревания соответствующей мРНК. В некоторых вариантах осуществления в конструкции FlEx применяют по сути человеческий экзон дикого типа. Выражение "экзон человека дикого типа" или "экзон человека" относится к встречающемуся в природе функционирующему экзону человека. Термин "по сути человеческий экзон дикого типа" или "по сути человеческий экзон" включает как встречающийся в природе функционирующий экзон человека, так и его модифицированные формы, где один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более) нуклеотидов встречающегося в природе экзона человека были изменены. В конкретных вариантах осуществления один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более) нуклеотидов были изменены без изменения кодируемых аминокислот (существенного изменяло выбор кодонов) для снижения степени идентичности последовательности с экзоном грызуна, что дополнительно минимизирует последовательность инвертированного повтора и снижает возможность перегруппировок.
T2
T2
T2
Acvr1
[0068] Если грызуна, несущего FlEx-аллель, скрестить с содержащим рекомбиназу грызуном, измененный аллель будет экспрессироваться у потомства in utero; и если изменение представляет собой перинатальное/эмбриональное летальное изменение, цель, состоящая в получении животного для исследований, экспрессирующего аллель, может оказаться под угрозой. Следовательно, грызуна, несущего FlEx-аллель, не скрещивают с грызуном с нерегулируемым содержанием рекомбиназы. Вместо этого грызуна, несущего FlEx-аллель, скрещивают с грызуном, который экспрессирует рекомбиназу, активность которой является индуцируемой (например, восприимчивой к индуктору) (т. е. индуцируемую рекомбиназу). Индуцируемая рекомбиназа может быть получена посредством слияния рекомбиназы с лигандсвязывающим доменом белка, который при связывании со своим когнатным лигандом или функциональными производными когнатного лиганда делает белок функциональным (например, путем стабилизации белка). Функциональные производные когнатного лиганда относятся к соединениям, которые являются аналогичными по структуре и выполняют по сути такую же функцию (т. е. связывают тот же рецептор), что и когнатный лиганд. Примеры таких лигандсвязывающих доменов включают без ограничения лигандсвязывающие домены стероидных рецепторов, глюкокортикоидных рецепторов, ретиноидных рецепторов и тиреоидных рецепторов (Eilers et al. (1989) Nature 340:66-68; Picard et al. (1988) Cell 54:1073-1080). В некоторых вариантах осуществления индуцируемая рекомбиназа представляет собой слитый белок, образованный Cre и эстрогеновым рецептором (ER), модифицированным посредством T2-мутаций (кодируемым аллелем Cre-ER). В случае данного слитого белка рекомбиназа Cre является неактивной в отсутствие лиганда для ER (см. Indra, A. et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27(22):4324-4327; Feil, R. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757; патент США №7112715), и рекомбиназа Cre становится активной при предоставлении лиганда для ER, например тамоксифена или функционального производного тамоксифена. Грызун, содержащий условный аллель, сконструированный с помощью Cre-восприимчивых SRRS, описанных в данном документе, и содержащий Cre-ER, будет, следовательно, экспрессировать аллель, содержащий функционирующий экзон, до тех пор, пока грызуна не подвергнут воздействию лиганда для ER с целью индуцирования активности Cre. Таким образом, получают грызунов, содержащих модифицированный ген  в их зародышевой линии, но не экспрессирующих соответствующий вариант белка Acvr1 до тех пор, пока грызунов не подвергнут воздействию лиганда ER (например, тамоксифена). После воздействия лиганда слитый белок Cre-ER активируется и условный аллель превращается в соответствующий измененный аллель.
[0069] Для индуцирования активности рекомбиназы лиганд можно вводить грызуну различными путями, включая парентеральные и непарентеральные пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, внутрилегочный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. В конкретных вариантах осуществления лиганд вводят грызуну путем внутрибрюшинной инъекции.
Acvr1
[0070] В различных вариантах осуществления переход к измененному аллелю является необратимым и сопровождается делецией функционирующего экзона. Таким образом линию грызунов, содержащую летальную в обычных условиях мутацию , можно поддерживать практически бесконечно, получая требуемое генетическое нарушение и сопутствующий ему фенотип когда потребуется.
[0071] Грызуны, предусмотренные в данном документе, включают, например, мышей, крыс и хомяков. В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В конкретных вариантах осуществления грызун представляет собой мышь. Acvr1 является высококонсервативным у различных видов, при этом R258 является консервативным и занимает одинаковое положение у мышей и крыс.
Mammalian Genome
Biotechniques
[0072] В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь линии C57BL, например линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В других вариантах осуществления грызун представляет собой мышь линии 129, например линии 129, выбранной из группы, состоящей из 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al. (1999),  10:836; Auerbach et al. (2000),  29(5):1024-1028, 1030, 1032). В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой мышь, которая представляет собой результат скрещивания вышеуказанной линии 129 и вышеуказанной линии C57BL/6. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания (т. е. гибрид) вышеуказанных линий 129, или результат скрещивания вышеуказанных линий C57BL, или результат скрещивания линии C57BL и линии 129. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания линии C57BL/6 и линии 129. В конкретных вариантах осуществления мышь относится к линии VGF1, также известной как F1H4, которая представляет собой гибрид C57BL/6 и 129. В других вариантах осуществления мышь относится к линии BALB, например линии BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь представляет собой результат скрещивания линии BALB и другой вышеуказанной линии.
[0073] В некоторых вариантах осуществления грызун представляет собой крысу. В определенных вариантах осуществления крыса выбрана из крыс линии Wistar, лини LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В других вариантах осуществления крыса представляет собой результат скрещивания двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линий Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.
Acvr1
фиг. 1
[0074] Условный аллель , содержащий вариацию R258G, может быть сконструирован с применением способа на основе FlEx. См., например, Schnutgen, F. et al. (2003) Nat. Biotech. 21:562-565; и патент США №7205148. Для FlEx используют пару мутантных сайтов Lox, называемых FlEx-матрицей, которые распознаются одной и той же рекомбиназой (Cre), но которые не вступают в реакцию друг с другом, и располагают их в виде конфигурации A-B/[A-B], где "[A-B]" находится в противоположной цепи по отношению к "A-B", для обеспечения инверсии последовательности ДНК, фланкированной этими матрицами. В некоторых вариантах осуществления пару LoxP-Lox2372 применяют в качестве комбинации мутантных сайтов Lox для условного аллеля, описанного в данном документе. Эти два мутантных сайта Lox не проявляют перекрестной реактивности. Последовательность, содержащаяся в пределах каждой матрицы, т. е. между сайтами LoxP и Lox2372 каждой матрицы, будет подвергаться делеции под воздействием Cre. Один вариант осуществления условного аллеля проиллюстрирован на .
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0075] Для  мыши продемонстрировано большое количество сплайс-вариантов (например, -201, 202, 203, 204). Экзоны, которые мутируют при FOP, являются общими для всех сплайс-вариантов , кодирующих белок. В одном варианте осуществления в данном документе раскрыт условный аллель , содержащий модификацию экзона 7 (ENSMUSE00001232449) изоформы -201.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
in vivo
[R258G]
FlEx
[0076] Аллель  может быть сконструирован путем помещения экзона  грызуна, кодирующего измененную версию аминокислоты 258 (например, ENSMUSE00001232449), в антисмысловую цепь таким образом, чтобы измененный экзон не являлся включенным в транскрипт . Так как последовательность, кодируемая экзоном 7, требуется для функционирования Acvr1, было необходимо, чтобы функционирующий экзон 7 был также включен в конструкцию (экзон 7 является общим для всех сплайс-вариантов , кодирующих белок). Кроме того, так как экзоны не распознаются как таковые без вспомогательных интронных последовательностей, последовательности, располагающиеся как выше, так и ниже данного экзона, были также включены как в измененный, так и в функционирующий экзоны, кодирующие аминокислоту 258. Однако, подобные действия привели бы к возникновению длинного инвертированного повтора, и такие ДНК-структуры по своей природе имеют тенденцию к рекомбинации как во время стадий, требуемых для построения нацеливающего вектора с помощью генной инженерии, так и в период после нацеливания  (Holkers, M. et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:1984-1999). Кроме того, если последовательность экзона, кодирующего аминокислоту 258, грызуна дикого типа и выше- и нижележащие интронные последовательности, связанные с экзоном, оставались интактными и были расположены перед измененным экзоном грызуна, то данная область дикого типа могла выступать в качестве плеча гомологии и использоваться во время нацеливания в ES-клетках грызуна, тем самым приводя в результате к исключению измененного экзона из аллеля нацеливания.
Acvr1
[R258G]
FlEx
[0077] Следовательно, аллель  может быть сконструирован таким образом, что будет обеспечиваться следующее.
ACVR1
a) Предотвращение возникновения длинного инвертированного повтора. Для этого экзон, кодирующий R258 (например, ENSMUSE00001232449), а также связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности могут быть заменены на соответствующие области из  человека.
b) Последовательность экзона, кодирующего R258, грызуна дикого типа (например, ENSMUSE00001232449) сохраняется на белковом уровне. Последовательности белка мыши и человека, кодируемые экзонами ENSMUSE00001232449 и ENSE00001009617 соответственно, являются идентичными. Однако по мере возможности кодоны в пределах последовательности экзона человека (например, ENSE00001009617) могут быть изменены с целью дополнительного снижения степени идентичности нуклеотидной последовательности экзонов грызуна и человека без изменения аминокислот, кодируемых экзоном.
Acvr1
[R258G]
c) Введенная последовательность человека удаляется полностью под воздействием Cre. Следовательно, в случае «активированного условного» состояния, когда транскрибируется мутантный ген , последовательностей человека не остается и, следовательно, любой полученный фенотип не может являться следствием присутствия инородной последовательности.
mmuAcvr1
hsaACVR1
hsaACVR1
Acvr1
Acvr1
[R258G]FlEx
[
R258G]FlEx
[0078] Более конкретно, в качестве примера, область, ограниченную нуклеотидами 58468399-58468770 в  (т. е. нуклеотиды 58468399-58468770 хромосомы 2 мыши, GRCm38/mm10), заменяли нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидов 157770252-157770625 из  (т. е. нуклеотиды 157770252-157770625 из хромосомы 2 человека, GRCh38/hg38), таким образом, чтобы введенная последовательность, которая содержит экзон ENSE00001009617 , транскрибировался как часть полученного модифицированного локуса . Кроме того, изменяя выбор кодонов, изменяли нуклеотидную последовательность экзона ENSE00001009617 человека с целью снижения степени идентичности последовательности экзона мыши и человека без изменения кодирования белка. Данная введенная последовательность человека далее упоминается в данном документе как hsa_e7+. Следовательно, до момента инверсии FlEx-элемента (измененный экзон ENSMUSE00001232449 и связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности - см. ниже) полученный локус  должен функционировать как локус дикого типа.
mmuAcvr1
mmuAcvr1
[0079] Вариацию R258G моделировали с помощью изменения экзона ENSMUSE00001232449 в соответствующем положении посредством изменения кодона, определенного нуклеотидами 58468530-58468532, с AGG (кодирующего аргинин) на GGG (кодирующий глицин). Полученный мутантный экзон вместе с фланкирующими интронными последовательностями помещали 3'-концом к hsa_e7+ и в антисмысловую цепь . Кроме того, осуществляли делецию нуклеотидов 58468771-58468815  с целью создания небольшой делеции для размещения LOA-зондов (Gomez-Rodriguez, J. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:e117; Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. 21:652-659). Данная введенная подвергнутая мутации последовательность мыши далее упоминается в данном документе как mmu_e7R258G+.
[0080] Иллюстративные последовательности экзона 7 человека, измененного экзона 7, кодирующего R258G, мыши и измененного экзона 7 человека вместе с выше- и нижележащими интронными последовательностями приведены ниже и представлены в перечне последовательностей.
SEQ ID NO Описание
1 Экзон 7 человека
2 Экзон 7 человека с изменениями кодонов
3 Последовательность человека, содержащая экзон 7 с измененными кодонами и примыкающие интроны
4 Измененный экзон 7 мыши, кодирующий R258G
5 Измененный экзон 7 мыши (в обратном порядке, как в конструкции)
6 Последовательность мыши, содержащая измененный экзон 7 и примыкающие интроны
7 Последовательность мыши, содержащая измененный экзон 7 и примыкающие интроны (в обратном порядке, как в конструкции)
8 Экзон 7 крысы
[0081] С целью обеспечения Cre-зависимой инверсии mmu_e7R258G+ и одновременной делеции hsa_e7+ комбинацию FlEx-подобных Lox-матриц применяли таким образом, чтобы
a) сайт LoxP предшествовал hsa_e7+, а сайт Lox2372 следовал за ней; для этого hsa_e7+ заключали в FlEx-подобную матрицу 5'-LoxP-Lox2372;
b) за mmu_e7R258G+ следовала FlEx-подобная матрица 3'-LoxP-Lox2372, однако данная матрица была сконструирована таким образом, чтобы ее конфигурация являлась зеркальным отображением FlEx-подобной матрицы 5' LoxP-Lox2372; это обеспечивает необратимую инверсию mmu_e7R258G+ с помещением в смысловую цепь с помощью Cre.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[R258G]
FlEx
[
R
258
G
]
[0082] Когда полученный аллель  подвергнется действию Cre, hsa_e7+ будет подвергнута делеции и mmu_e7R258G+ будет подвергнута инверсии с помещением в смысловую цепь. В результате этого  будет экспрессироваться вместо .
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[0083] Для введения FlEx-аллеля  в геном грызуна можно получить конструкцию нацеливающей нуклеиновой кислоты, содержащую FlEx-аллель , описанный выше. В дополнение к последовательности FlEx  (по сути человеческий экзон 7 в смысловой ориентации и примыкающие интронные последовательности, измененный экзон 7 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации и примыкающие интронные последовательности, а также сайты распознавания рекомбиназы), конструкция нуклеиновой кислоты может содержать фланкирующие последовательности, которые имеют подходящую длину и являются гомологичными последовательностям гена грызуна в эндогенном локусе  грызуна, для обеспечения ее способности опосредовать гомологичную рекомбинацию и интеграцию последовательности FlEx  в эндогенный локус  грызуна.
Acvr1
[0084] В некоторых вариантах осуществления конструкцию нацеливающей нуклеиновой кислоты, содержащую FlEx-аллель , вводят в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, чтобы модифицировать геном ES-клетки. Как ES-клетки мыши, так и ES-клетки крысы описаны в уровне техники. См., например, патенты США №№7576259, 7659442 и 7294754 и публикацию заявки на патент США №2008/0078000 A1 (все из которых включены в данный документ посредством ссылки), в которых описаны ES-клетки мыши и способ получения генетически модифицированной мыши VELOCIMOUSE; и публикацию заявки на патент США №2014/0235933 A1 и публикацию заявки на патент США №2014/0310828 A1 (все из которых включены в данный документ посредством ссылки), в которых описаны ES-клетки крысы и способы получения генетически модифицированной крысы.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
et al.
выше
[0085] Можно осуществить отбор ES-клеток, содержащих FlEx-аллель , интегрированный в эндогенный локус  грызуна. Затем ES-клетки, содержащие с FlEx-аллель , интегрированный в геном, применяют в качестве донорных ES-клеток для инъекции в эмбрион на стадии, предшествующей стадии морулы (например, эмбрион на стадии 8 клеток), с применением способа VELOCIMOUSE (см., например, патенты США №№7576259, 7659442 и 7294754 и публикацию заявки на патент США №2008/0078000 A1) или способов, описанных в публикациях заявок на патент США №№2014/0235933 A1 и 2014/0310828 A1. Эмбрион, содержащий донорные ES-клетки, инкубируют до стадии бластоцисты и затем имплантируют суррогатной матери с получением грызуна F0, полностью полученного из донорных ES-клеток. Детенышей грызуна, несущих FlEx-аллель, можно идентифицировать посредством генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с помощью, например, анализа потери аллеля (Valenzuela , ).
Acvr1
Acvr1
Acvr1
T2
T2
T2
[0086] В различных вариантах осуществления генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель , получают с помощью модифицирования ES-клетки грызуна таким образом, чтобы она содержала FlEx-аллель, и модифицирования той же ES-клетки таким образом, чтобы она содержала ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER), и применения этой ES-клетки в качестве донорной клетки для получения грызуна, содержащего FlEx-аллель и ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель , получают с применением ES-клетки грызуна, которая уже содержит ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER), и модифицирования такой ES-клетки грызуна таким образом, чтобы она содержала FlEx-аллель. В других вариантах осуществления получают генетически модифицированного грызуна, содержащего FlEx-аллель , и скрещивают с грызуном, содержащим ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу (например, Cre-ER), с получением потомка, содержащего FlEx-аллель и ген, кодирующий индуцируемую рекомбиназу.
Acvr1
; Gt(ROSA26)Sor
Acvr1
R258GFlEx/+
CreERt2/+
[0087] Взрослые особи мышейбыли фенотипически нормальными; однако общеорганизменная активация аллеля , кодирующего R258G, привела к развитию прогрессирующей оссификации, видимой при рентгенографическом исследовании уже через 2 недели после введения доз тамоксифена, аналогично тому, как это наблюдали у мыши Acvr1 R206H Flex, описанной в патенте США №9510569. См. также фиг. 2.
[0088] Применение грызунов, предусмотренных в данном документе, позволяет лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в основе развития нарушений, характеризующихся образованием эктопической костной ткани, таких как FOP. Кроме того, такие грызуны могут применяться для скрининга и разработки терапевтических соединений для ингибирования, предупреждения и/или лечения нарушений, характеризующихся образованием эктопической костной ткани, включая FOP.
in vivo
Acvr1
[0089] В некоторых вариантах осуществления кандидатное терапевтическое соединение испытывают  посредством введения соединения грызуну, раскрытому в данном документе, т. е. грызуну, несущему FlEx-аллель .
[0090] Кандидатные терапевтические соединения могут представлять собой без ограничения низкомолекулярные химические соединения, антитела, ингибиторные нуклеиновые кислоты или любую их комбинацию. В конкретном варианте осуществления соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например антитело к Acvr1 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит антагонист одного или более из рецептора активина 1, рецептора активина типа 2A и рецептора активина типа 2B. Любой такой антагонист может содержать антитело. В некоторых вариантах осуществления соединение содержит антитело к активину A. Антагонист или антитело к рецептору активина 1, к рецептору активина типа 2A, к рецептору активина типа 2B или к активину A могут представлять собой любой антагонист или антитело, описанные или проиллюстрированные в публикации заявки на патент США №2018/0111983, которая включена в данный документ посредством ссылки.
Acvr1
[0091] Введение соединения можно осуществлять до, во время или после индукции активности рекомбиназы у грызуна, обеспечивающей экспрессию мутантного аллеля . Дозы кандидатных терапевтических соединений можно вводить любым необходимым путем введения, включая парентеральные и непарентеральные пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, внутричерепной, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, внутрилегочный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. Введение также можно осуществлять путем непрерывной инфузии, местного применения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т. п.) и/или внутривенной инъекции.
[0092] Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических свойств вводимых соединений с применением образцов, полученных от описанных животных из отряда грызунов. Фармакокинетические свойства включают без ограничения характер переработки животным, отличным от человека, соединения в различные метаболиты (или выявление наличия или отсутствия одного или более метаболитов, в том числе без ограничения токсических метаболитов), период полувыведения, уровни циркулирующего в крови соединения (например, концентрация в сыворотке крови), ответ на введение соединения (например, выработка антител), всасывание и распределение, пути выведения и/или клиренс соединения.
[0093] В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение отличий между мутантным животным из отряда грызунов, которому вводилось соединение, и мутантным животным из отряда грызунов, которому не вводилось соединение, и определение способности соединения ингибировать развитие и/или прогрессирование образования эктопической костной ткани у грызунов.
[0094] Настоящее описание дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует понимать как ограничивающие каким-либо образом. Содержание всех приведенных ссылок (включая ссылки на литературу, выданные патенты и опубликованные заявки на патенты, приводимые в настоящей заявке) явным образом включено в данный документ посредством ссылки.
Пример 1
mmuAcvr1
hsaACVR1
hsaACVR1
Acvr1
Acvr1
[R258G]FlEx
[
R258G]FlEx
[0095] Область, ограниченную нуклеотидами 58468399-58468770 в  (т. е. нуклеотиды 58468399-58468770 хромосомы 2 мыши, GRCm38/mm10), заменяли нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидов 157770252-157770625 из  (т. е. нуклеотидов 157770252-157770625 из хромосомы 2 человека, GRCh38/hg38), таким образом, чтобы введенная последовательность, которая содержит экзон ENSE00001009617 , транскрибировалась как часть полученного модифицированного локуса . Кроме того, изменяя выбор кодонов, изменяли нуклеотидную последовательность экзона ENSE00001009617 человека с целью снижения степени идентичности последовательности экзона мыши и человека без изменения кодирования белка. Данная введенная последовательность человека далее упоминается в данном документе как hsa_e7+. Следовательно, до момента инверсии FlEx-элемента (измененный экзон ENSMUSE00001232449 и связанные с ним выше- и нижележащие интронные последовательности - см. ниже) полученный локус  должен функционировать как локус дикого типа.
mmuAcvr1
mmuAcvr1
[0096] Вариацию R258G моделировали с помощью изменения экзона ENSMUSE00001232449 в соответствующем положении посредством изменения кодона, определенного нуклеотидами 58468530-58468532, с AGG (кодирующего аргинин) на GGG (кодирующий глицин). Полученный измененный экзон вместе с фланкирующей интронной последовательностью помещали 3'-концом к hsa_e7+ и в антисмысловую цепь . Кроме того, осуществляли делецию нуклеотидов 58468771-58468815  с целью создания небольшой делеции для размещения LOA-зондов (Gomez-Rodriguez, J. et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36:e117; Valenzuela, D. et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. 21:652-659). Данная введенная подвергнутая мутации последовательность мыши далее упоминается в данном документе как mmu_e7R258G+.
[0097] С целью обеспечения Cre-зависимой инверсии mmu_e7R258G+ и одновременной делеции hsa_e7+ комбинацию FlEx-подобных Lox-матриц применяли таким образом, чтобы
a) сайт LoxP предшествовал hsa_e7+, а сайт Lox2372 следовал за ней; для этого hsa_e7+ заключали в 5' LoxP-Lox2372 FlEx-подобную матрицу;
b) за mmu_e7R258G+ следовала FlEx-подобная матрица 3'-LoxP-Lox2372, однако данная матрица была сконструирована таким образом, чтобы ее конфигурация являлась зеркальным отображением FlEx-подобной матрицы 5'-LoxP-Lox2372. Это обеспечивало необратимую инверсию mmu_e7R258G+ с помещением в смысловую цепь с помощью Cre.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
[R258G]FlEx
[R258G]
[0098] Когда полученный аллель  подвергался действию Cre, hsa_e7+ подвергалась делеции и mmu_e7R258G+ подвергалась инверсии с помещением в смысловую цепь. В результате этого  экспрессировался вместо .
Acvr1
[R258G]FlEx/ R258G]FlEx]
[0099] Гомозиготные мыши рождались в ожидаемом менделевском соотношении, что позволяло предположить, что у данной мыши сплайсинг прошел нормально и экспрессировался Acvr1 дикого типа.
Пример 2
Индуцирование FOP у мышей Acvr1
[R258G]FlEx
[R258G]FlEx
[R258G]FlEx
CreERT2/+
[R258G]
FlEx
CreERT2/+
[R258G]FlE
x
CreERT2/+
T2
аллеля
Acvr1
Gt(ROSA26)Sor
Acvr1
(ROSA26)Sor
Acvr1
Gt(ROSA26)Sor
in vivo
[0100] Для обеспечения управляемой по времени и при этом общеорганизменной инверсии - Acvr1, мышей спаривали с мышами для получения ; Gt. У них поддерживали гетерозиготность при смешанном C57BL/6NTac-129S6/SvEvTac генетическом фоне. Все эксперименты проводили в соответствии с протоколами Комитета по содержанию и использованию лабораторных животных компании Regeneron. Использовали как самцов, так и самок мышей в возрасте 8-11 недель, однако мышей распределяли между группами по возрастному и половому признаку. Фенотипов, связанных с полом или возрастом, не отмечено. Модель инициировали посредством инверсии экзона, кодирующего R258G, с помещением его в смысловую цепь, достижение чего обеспечивали путем обработки мышей ;  раствором тамоксифена (Sigma) в масле в дозе 40 мг/кг внутрибрюшинно (i. p.) ежедневно в течение 5 дней (для активации CreER). Для оценки гетеротопической оссификации мышей анестезировали изофлураном и подвергали сканированию всего тела с полем зрения 60 мм х 120 мм с применением микрокомпьютерной томографии  (Quantum FX, PerkinElmer, Хопкинтон, Массачусетс, США). В источнике рентгеновского излучения устанавливали значение тока 160 мкА, значение пикового напряжения - 90 кВп, при этом размер вокселя составлял 120 мкм или 240 мкм.
Acvr1
; Gt(ROSA26)Sor
Acvr1
Acvr1
R258GFlEx/+
CreERt2/+
[0101] Взрослые особи мышей были фенотипически нормальными; однако общеорганизменная активация мутантного аллеля  с R258G привела к развитию прогрессирующей оссификации, видимой при рентгенографическом исследовании уже через 2 недели после введения доз тамоксифена, аналогично тому, как это наблюдали у мышей R206HFlex, описанных в патенте США №9510569. См. также фиг. 2.
Введение доз антител мышам
Acvr1
; Rosa
in vivo
[R258G]FlEx/+
CreERT2
[0102] Для исследований с обработкой мышейразделяли на соответствующие группы по возрастному и половому признаку, обработки начинали в тот же день, в который начинали введение тамоксифена. Мышам вводили подкожные инъекции (s. c.) 25 мг/кг либо нейтрализующего антитела к активину A человека (заявка на патент США №2015/0037339),либо антитела изотипического контроля еженедельно в течение 6 недель. Мониторинг гетеротопической оссификации проводили еженедельно с помощью системы визуализации на основе μCT .
[0103] Как показано на фиг. 3, у мышей, получавших антитело изотипического контроля, HO развивалась на неделе 4, а у мышей, получавших блокирующее антитело к активину A, через 4 недели не наблюдали поддающегося обнаружению уровня образования HO, превышающего фоновые значения μCT.
ACVR1
ACVR1
R206H
R258G
[0104] Таким образом, аллели или  с активированным условным нокином обеспечивают точное моделирование прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии (FOP) у грызунов, таких как мыши; и нейтрализующее антитело к активину A блокирует развитие гетеротопической оссификации в такой модели на грызунах.
Дополнительные варианты осуществления
Acvr1
Acvr1
Acvr1
1. Генетически модифицированный грызун, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит:
ACVR1
ACVR1
ACVR1
a) по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека; и
Acvr1
b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;
Acvr1
ACVR1
Acvr1
Acvr1
где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7  и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна.
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
2. Генетически модифицированный грызун по пункту 1, где по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека и измененным экзоном 7  грызуна.
3. Генетически модифицированный грызун по пункту 1, где ген, кодирующий рекомбиназу, содержится в геноме генетически модифицированного грызуна и активность рекомбиназы является индуцируемой.
4. Генетически модифицированный грызун в соответствии с любым из пунктов 1-3, где рекомбиназа представляет собой Cre.
5. Генетически модифицированный грызун по пункту 4, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.
6. Генетически модифицированный грызун по пункту 5, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.
7. Генетически модифицированный грызун по пункту 5 или пункту 6, где лиганд представляет собой тамоксифен.
Acvr1
8. Генетически модифицированный грызун по любому из пунктов 1-7, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену .
Acvr1
Acvr1
9. Мутантный грызун, полученный от генетически модифицированного грызуна по любому из пунктов 1-8, где мутантный грызун имеет геном, содержащий измененный аллель , который содержит измененный экзон 7 в смысловой ориентации, и где измененный аллель  экспрессируется у мутантного грызуна, результатом чего является образование эктопической костной ткани.
10. Грызун в соответствии с любым из предыдущих пунктов, выбранный из мыши или крысы.
Acvr1
Acvr1
11. Нуклеиновая кислота, содержащая модифицированный ген  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит:
ACVR1
ACVR1
ACVR1
a) по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека; и
Acvr1
b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;
Acvr1
ACVR1
где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7 .
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
12. Нуклеиновая кислота по пункту 11, где по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7 человека и измененным экзоном 7  грызуна.
13. Нуклеиновая кислота по пункту 11, где активность рекомбиназы является индуцируемой.
14. Нуклеиновая кислота по любому из пунктов 11-13, где рекомбиназа представляет собой Cre.
15. Нуклеиновая кислота по пункту 14, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.
16. Нуклеиновая кислота по пункту 15, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.
17. Нуклеиновая кислота по пункту 15 или пункту 16, где лиганд представляет собой тамоксифен.
18. Нуклеиновая кислота по любому из пунктов 11-17, где грызун представляет собой мышь или крысу.
19. Геном грызуна, содержащий нуклеиновую кислоту по пункту 11 или пункту 12.
20. Геном грызуна по пункту 19, дополнительно содержащий ген, кодирующий рекомбиназу, которая распознает SRRS и осуществляет инверсию измененного экзона.
21. Геном грызуна по пункту 20, где активность рекомбиназы является индуцируемой.
22. Геном грызуна по пункту 21, где рекомбиназа представляет собой Cre.
23. Геном грызуна по пункту 22, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.
24. Геном грызуна по пункту 23, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.
25. Геном грызуна по пункту 23 или пункту 24, где лиганд представляет собой тамоксифен.
Acvr1
26. Геном грызуна по любому из пунктов 19-25, где геном грызуна является гомозиготным по модифицированному гену .
27. Геном грызуна по любому из пунктов 19-26, где грызун представляет собой мышь или крысу.
28. Выделенная ткань или клетка грызуна, содержащая геном грызуна по любому из пунктов 19-27.
29. Выделенная ткань или клетка грызуна по пункту 28, где грызун представляет собой мышь или крысу.
30. Выделенная ткань или клетка грызуна по пункту 28 или пункту 29, где клетка грызуна представляет собой эмбриональную стволовую клетку.
Acvr1
31. Конструкция нуклеиновой кислоты для целенаправленной модификации гена  в геноме грызуна, которая содержит:
ACVR1
ACVR1
ACVR1
a) по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека; и
Acvr1
b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;
Acvr1
ACVR1
Acvr1
Acvr1
где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию мутантного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7  и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна.
ACVR1
ACVR1
Acvr1
ACVR1
Acvr1
32. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где по сути человеческий экзон 7  отличается от экзона 7  человека по меньшей мере одним нуклеотидом и характеризуется сниженной степенью идентичности последовательности с измененным экзоном 7  грызуна по сравнению со степенью идентичности последовательности между экзоном 7  человека и измененным экзоном 7  грызуна.
33. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где первая и вторая пары SRRS представляют собой Lox2372 и LoxP или наоборот.
34. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 31, где рекомбиназа представляет собой Cre.
35. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 34, где Cre является слитой с эстрогеновым рецептором (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.
36. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 35, где ER содержит T2-мутации.
37. Конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 35, где лиганд представляет собой тамоксифен.
38. Конструкция нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из пунктов 31-37, где грызун выбран из мыши или крысы.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
39. Способ получения генетически модифицированного грызуна, включающий модифицирование генома грызуна таким образом, чтобы он содержал модифицированный ген  грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит:
ACVR1
ACVR1
ACVR1
a) по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека; и
Acvr1
b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;
Acvr1
ACVR1
Acvr1
Acvr1
где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7  и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна.
40. Способ по пункту 39, где геном грызуна модифицируют посредством способа, включающего:
a) введение конструкции нуклеиновой кислоты в эмбриональную стволовую (ES) клетку грызуна, где конструкция нуклеиновой кислоты содержит:
ACVR1
по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой SRRS; и
Acvr1
измененный экзон 7 грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS;
Acvr1
Acvr1
Acvr1
где конструкция нуклеиновой кислоты целенаправленно воздействует на эндогенный локус  грызуна с получением в результате модифицированного гена  грызуна в пределах эндогенного локуса  грызуна;
Acvr1
b) получение генетически модифицированной ES-клетки грызуна, геном которой содержит модифицированный ген  грызуна; и
c) получение генетически модифицированного грызуна с применением генетически модифицированной ES-клетки грызуна из b).
Acvr1
41. Способ по пункту 39 или пункту 40, где генетически модифицированный грызун является гомозиготным по модифицированному гену .
42. Способ по пункту 40 или пункту 41, где ES-клетка грызуна дополнительно содержит ген, кодирующий рекомбиназу.
43. Способ по любому из пунктов 39-42, где активность рекомбиназы является индуцируемой.
44. Способ в соответствии с любым из пунктов 39-43, где рекомбиназа представляет собой Cre.
45. Способ по пункту 44, где Cre является слитой с лигандсвязывающим доменом эстрогенового рецептора (ER) таким образом, что активность Cre индуцируется при связывании лиганда с ER.
46. Способ по пункту 45, где лигандсвязывающий домен ER содержит T2-мутации.
47. Способ по пункту 45 или пункту 46, где лиганд представляет собой тамоксифен.
Acvr1
48. Способ по любому из пунктов 43-47, дополнительно включающий индуцирование активности рекомбиназы в клетке или ткани грызуна, где рекомбиназа осуществляет инверсию измененного экзона 7, осуществляя делецию по сути человеческого экзона 7, вследствие чего обеспечивается экспрессия измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7, в клетке или ткани.
49. Способ в соответствии с любым из пунктов 40-48, где грызун выбран из мыши или крысы.
Acvr1
Acvr1
Acvr1
50. Способ скрещивания, включающий скрещивание первого грызуна, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна, со второй мышью с получением в результате грызуна-потомка, геном которого содержит модифицированный ген  грызуна, где модифицированный ген  грызуна содержит:
ACVR1
ACVR1
ACVR1
a) по сути человеческий экзон 7  в смысловой ориентации, фланкированный первой парой сайтов распознавания сайт-специфической рекомбиназы (SRRS), где по сути человеческий экзон 7  кодирует те же аминокислоты, что и экзон 7  человека; и
Acvr1
b) измененный экзон 7  грызуна, кодирующий R258G, в антисмысловой ориентации, фланкированный второй парой SRRS, которые отличаются от первой пары SRRS;
Acvr1
ACVR1
Acvr1
Acvr1
где первые и вторые SRRS ориентированы таким образом, чтобы рекомбиназа могла осуществить инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации, осуществить делецию по сути человеческого экзона 7  и обеспечить экспрессию измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна.
Acvr1
51. Способ по пункту 50, где первый грызун является гомозиготным по модифицированному гену грызуна.
52. Способ по пункту 50 или пункту 51, где второй грызун содержит индуцируемую рекомбиназу.
53. Способ по пункту 52, где индуцируемая рекомбиназа представляет собой индуцируемую рекомбиназу Cre.
T2
54. Способ по пункту 53, где индуцируемая рекомбиназа Cre включает индуцируемую тамоксифеном рекомбиназу Cre-ER.
Acvr1
ACVR1
Acvr1
Acvr1
55. Способ по любому из пунктов 52-54, дополнительно включающий индуцирование индуцируемой рекомбиназы в клетке или ткани у грызуна-потомка таким образом, чтобы индуцированная рекомбиназа осуществила инверсию измененного экзона 7  грызуна с обеспечением его расположения в смысловой ориентации и осуществила делецию по сути человеческого экзона 7  в клетке или ткани с получением в результате измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна.
56. Способ по любому из пунктов 50-55, где грызун представляет собой мышь или крысу.
57. Грызун-потомок, полученный согласно способу по любому из пунктов 50-56.
58. Способ испытания кандидатного терапевтического соединения для лечения, направленного против образования эктопической костной ткани, включающий:
получение генетически модифицированного грызуна в соответствии с любым из пунктов 1-8 и 10;
Acvr1
Acvr1
индуцирование активности рекомбиназы у грызуна для обеспечения экспрессии измененного аллеля , содержащего измененный экзон 7  грызуна;
введение кандидатного соединения грызуну; и
определение того, ингибирует ли кандидатное соединение развитие образования эктопической костной ткани у грызуна.
59. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение вводят грызуну до индукции активности рекомбиназы, во время этого или после этого.
60. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой низкомолекулярное химическое соединение.
61. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой нуклеиновую кислоту.
62. Способ по пункту 58, где кандидатное соединение представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
63. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина 1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
64. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина типа 2A или его антигенсвязывающий фрагмент.
65. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к рецептору активина типа 2B или его антигенсвязывающий фрагмент.
66. Способ по пункту 62, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антитело к активину типа A или его антигенсвязывающий фрагмент.
67. Способ в соответствии с любым из пунктов 58-66, где грызун представляет собой мышь или крысу.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Регенерон Фармасьютикалс, Инк.
<120>  Модель прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии на грызунах
<130>  36190PCT (10461WO01)
<160>  8
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  147
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
ggaaaggcag gtatggtgag gtgtggaggg gcagctggca aggggagaat gttgccgtga       60
agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcat ggttcaggga aacggaattg tacaacactg      120
tgatgctgag gcatgaaaat atcttag                                          147
<210>  2
<211>  147
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полинуклеотид
<400>  2
ggaaagggag atacggtgag gtgtggcgcg gatcttggca gggagagaac gttgccgtca       60
aaatttttag cagccgtgat gaaaaaagct ggtttagaga aacagagctc tataatacag      120
tcatgctgag gcacgagaac attctgg                                          147
<210>  3
<211>  374
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полинуклеотид
<400>  3
agcaatggag ggattaagag ttgcatgcac taaattaatt attcttaatg atgggctggc       60
tgcctccaaa atgactactg ttctgtgtca cctatgtttt gcttttcata gggaaaggga      120
gatacggtga ggtgtggcgc ggatcttggc agggagagaa cgttgccgtc aaaattttta      180
gcagccgtga tgaaaaaagc tggtttagag aaacagagct ctataataca gtcatgctga      240
ggcacgagaa cattctgggt aagtacaagg ataaccccct cattaattgt atctagggag      300
aaacaattgt ctgcctttgc tctctccgtt ttggtgaatg tgaattcgag agtgtctcct      360
aaaaagcaat atag                                                        374
<210>  4
<211>  147
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  4
ggaagggccg gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga       60
agatcttctc ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg      120
tgatgttggg gcatgaaaat atcttag                                          147
<210>  5
<211>  147
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  5
ctaagatatt ttcatgcccc aacatcacag tgttgtacaa ttccgtctcc ctgaaccatg       60
acttctcgtc tcgggaggag aagatcttca cagcgacatt ttcgccttgc cagctgcccc      120
tccatacttc tccataccgg cccttcc                                          147
<210>  6
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  6
gagaagagca ggaggttcaa atataaggac actgtcgggt tcactgtgtt tgagaggaaa       60
aggaaagcca acccatttct tacatatatc atctgttttg ctgtccacag ggaagggccg      120
gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga agatcttctc      180
ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg tgatgttggg      240
gcatgaaaat atcttaggtg agtaccaggt gagctttcac cagctggtct ccatagagat      300
aagggccggc cctttctctc tcccatttgc caaatctgag gtgtgtggag tctcttctgg      360
aaaacaacat ag                                                          372
<210>  7
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  7
ctatgttgtt ttccagaaga gactccacac acctcagatt tggcaaatgg gagagagaaa       60
gggccggccc ttatctctat ggagaccagc tggtgaaagc tcacctggta ctcacctaag      120
atattttcat gccccaacat cacagtgttg tacaattccg tctccctgaa ccatgacttc      180
tcgtctcggg aggagaagat cttcacagcg acattttcgc cttgccagct gcccctccat      240
acttctccat accggccctt ccctgtggac agcaaaacag atgatatatg taagaaatgg      300
gttggctttc cttttcctct caaacacagt gaacccgaca gtgtccttat atttgaacct      360
cctgctcttc tc                                                          372
<210>  8
<211>  147
<212>  ДНК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  8
ggaagggccg gtatggagaa gtgtggaggg gcagctggca aggcgaaaat gttgctgtga       60
agatcttctc ctcccgtgat gagaagtcgt ggttcaggga gacagaattg tacaacacgg      120
tgatgctgag gcatgagaat atcttag                                          147
<---