ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕКСТРИНСОДЕРЖАЩИХ СРЕД
ENZYMATIC SYNTHESIS OF ORGANIC COMPOUNDS USING DEXTRIN-CONTAINING MEDIA

Настоящее изобретение касается ферментативного получения органических соединений по меньшей мере с 3 атомами углерода или по меньшей мере с 2 атомами углерода и по меньшей мере 1 атомом азота с использованием декстринсодержащей среды, включающей в себя по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала, для культивирования микроорганизмов.
Содержащие сахар жидкие среды представляют собой основной источник питательных веществ для множества способов ферментации, используемые микроорганизмы метаболизируют содержащиеся в средах сахара, и при этом получают конечные органические продукты. Ассортимент синтезируемых таким образом продуктов микробного метаболизма, т.е, органических соединений, включает при этом, например, летучие низкомолекулярные соединения, например этанол, нелетучие продукты метаболизма, например аминокислоты, витамины и каротиноиды, а также множество других веществ.
Для таких общеизвестных способов ферментации с использованием микроорганизмов в зависимости от условий процесса используют различные источники углерода. Разнообразные варианты включают в себя чистую сахарозу, мелассу из свекловичного и тростникового сахара, так называемые «high test molasses» (высокосахаристые мелассы, обращенные тростниково-сахарные мелассы), вплоть до глюкозы из гидролизатов крахмала. Кроме того, для биотехнологического получения L-лизина в качестве дополнительных субстратов, применение которых возможно в технических масштабах, следует упомянуть уксусную кислоту и этанол (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.79 (2003), 59-112).
На использовании указанных источников углерода основаны различные методы и способы ферментативного получения нелетучих продуктов микробного метаболизма на базе сахара. На примере L-лизина, Pfefferle et al. (указ. соч.) описывают эти процессы с точки зрения развития штаммов, процесса и промышленного производства.
Важным источником ферментативного получения продуктов микробного метаболизма, опосредованного микроорганизмами, является крахмал. Прежде чем его можно будет использовать как источник углерода в ферментации, на предшествующих этапах реакции его необходимо подвергнуть сжижению и осахариванию. Крахмал для этих целей получают из природных источников крахмала, например картофеля, маниока, злаков, например пшеницы, кукурузы, ячменя, ржи, тритикале или риса, обычно прошедших предварительную очистку (мойку), а затем ферментативным способом сжижают и осахаривают, чтобы использовать его затем собственно в ферментации для получения желаемых продуктов метаболизма.
Помимо использования источников крахмала, прошедших такую предварительную очистку, описано также применение источников крахмала, не прошедших предварительную обработку, для создания источников углерода для ферментативного получения продуктов микробного метаболизма. Обычно источники крахмала при этом сначала измельчают размолом. Продукт помола затем подвергают сжижению и осахариванию. Поскольку этот продукт помола, естественно, состоит помимо крахмала еще и из ряда не содержащих крахмала компонентов, оказывающих отрицательное влияние на ферментацию, эти компоненты перед ферментацией обычно отделяют. Отделение можно проводить либо непосредственно после размола (международная заявка WO 02/277252; японские заявки JP 2001-072701; JP 56-169594; патент КНР CN 1218111), после сжижения (международная заявка WO 02/277252; патент КНР CN 1173541) или после осахаривания (патент КНР CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; NL8302229). Во всех вариантах, однако, в ферментации используют гидролизат крахмала высокой очистки.
В более новых технологиях используют, в частности, улучшенные методы, которые должны обеспечить возможность очищать, например, сжиженные и осахаренные растворы крахмала перед ферментацией (патент Японии JP 57159500) или создавать ферментационные среды из возобновляемых ресурсов (европейский патент ЕР 1205557).
С другой стороны, широко известно масштабное применение необработанных источников крахмала при ферментативном получении биоэтанола. При этом источники крахмала, обычно целые зерна злаков, сначала подвергают сухому помолу, а затем гидролизуют содержащую крахмал часть источника крахмала с использованием ферментов. При этом гидролиз можно проводить как прерывистым образом, например, в котлах с мешалкой, так и непрерывно, например, в сопловых котлах. Описания соответствующих процессов приведены, например, в «The Alcohol Textbook - А reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», Jaques et al. (Hg.), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, Kapitel 2, S.7-23, и в McAloon et al., «Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks», NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laboratory, October 2000.
Поскольку при ферментативном получении этанола биологического происхождения конечный продукт получают дистилляцией, использование источников крахмала в неочищенной форме после процессов сухого размола не представляет особой проблемы. При использовании же способа сухого размола для получения нелетучих продуктов микробного метаболизма возникает проблема, состоящая в потоке твердого вещества, вносимого сахарным раствором в ферментацию, поскольку оно может как отрицательно сказаться на ферментации, например, с точки зрения скорости кислородного обмена используемых микроорганизмов или их потребности в кислороде (ср. Mersmann, A. et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng Technol. 13 (1990), 357-370), так и существенно осложнить последующую переработку.
Кроме того, из-за внесения твердых веществ уже при создании крахмалсодержащей суспензии возможно достижение критических величин вязкости используемой среды, ввиду чего гомогенное перемешивание, например, суспензии, содержащей более 30% масс. кукурузной муки в воде, невозможно (Industrial Enzymology, 2. Aufl., T.Godfrey, S West, 1996). Поэтому концентрация глюкозы при использовании обычных технологий ограничена. С точки зрения ферментативного получения биоэтанола, это неважно, поскольку ввиду токсичности получаемого продукта для дрожжей, применяемых для ферментации, реакция при более высоких концентрациях все равно невозможна.
При ферментативном получении других органических продуктов метаболизма, кроме этанола, подавать на ферментацию содержащие сахар среды с низкой концентрацией сахара в принципе невыгодно, поскольку это ведет к непропорционально высокому разбавлению ферментационного бульона, а следовательно падает достигаемая конечная концентрация конечного продукта, что, с одной стороны, вызывает повышение расходов при его получении из ферментационной среды, а кроме того, снижается объемно-временной выход. Эти соображения особенно важны в том случае, когда гидролизат крахмала, приготовленный для крупномасштабного производства биоэтанола, который обычно содержит сахар или глюкозу в низких концентрациях, примерно до 30 или 33%, частично необходимо подавать на дополнительную ферментацию в малом объеме для получения других химикатов.
С другой стороны, повышенные концентрации пригодных к метаболизации моносахаридов в ферментационной среде могут вести к ингибированию ферментации или роста микроорганизма, либо же иметь следствием изменение метаболизма применяемых микроорганизмов. В случае E.coli повышенная концентрация глюкозы ведет, например, к образованию органических кислот (ацетата), в то время как Saccharomyces cerevisae в этом случае, например, переключается на сбраживание, хотя в вентилируемых ферментаторах достаточно кислорода (эффект Крэбтри). Поэтому на этапе загрузки повышенные концентрации метаболизируемых моносахаридов в подаваемых на ферментацию средах, содержащих сахар, могут отрицательно влиять на ферментацию. Использование сред более высокой концентрации представляет собой проблему также и в порционной фазе, т.е. в фазе роста микроорганизмов в ферментационном составе, прежде чем питающий поток подаст на ферментацию новые сахара. Это обусловлено тем, что многим штаммам для роста необходима концентрация глюкозы, не превышающая 6% масс.
Ввиду этих сложностей и ограничений способы сухого размола, которые широко применяют для получения биоэтанола, не имеют до сих пор заметного экономического значения при ферментативном получении других продуктов метаболизма, помимо этанола.
В настоящий момент имеются описания попыток переноса концепции сухого размола и принципиальных преимуществ, связанных с этим способом, на получение продуктов микробного метаболизма в промышленных масштабах только при использовании маниока в качестве источника крахмала. Так, в японской патентной заявке JP 2001/275693 описан способ ферментативного получения аминокислот, при котором в качестве источника крахмала используют очищенные от кожуры клубни маниока, которые размалывают в сухом виде. Для проведения процесса по этому способу, однако, необходимо задать в продукте помола размер частиц не более 150 мкм. При используемой для этого фильтрации перед сжижением/осахариванием имеющегося крахмала и последующей ферментацией отделяют часть используемого продукта помола, включая не содержащие крахмала компоненты. При этом способе получают умеренные концентрации сахара. Подобный же способ описан в японской патентной заявке JP 2001/309751 для получения кормовой добавки, содержащей аминокислоту.
Повышения концентрации сахара в используемой для ферментации жидкой среде можно достичь при использовании для осахаривания продуктов размола, включающих в основном твердые не содержащие крахмала компоненты источника крахмала, с помощью способа, описанного заявителем в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР2005/005728). Неожиданно оказалось, что перед ферментацией нет необходимости в отделении содержащихся в источнике крахмала твердых, не содержащих крахмала компонентов. Схожий способ с применением источников крахмала, который выбирают из зерен злаков, описан в европейской заявке на патент РСТ/ЕР2006/066057 (ранней немецкой заявке на патент DE 102005042541.0) заявителя.
Таким образом, задача настоящего изобретения состояла в том, чтобы предложить еще один способ получения органических соединений посредством ферментации, который не требовал бы предварительного отделения или хотя бы не требовал предварительного полного отделения имеющихся в источнике крахмала твердых компонентов, не содержащих крахмала. В частности, способ должен иметь относительно небольшие затраты на оборудование и позволить использовать среды с высоким содержанием сахара. Кроме того, он должен отличаться простотой использования применяемых сред, а также избежать сложности их применение в ферментации. В особенности же способ должен позволять использовать в качестве источника крахмала зерновые культуры
Неожиданно было обнаружено, что способ ферментативного получения органических соединений, несмотря на свойственное ему большое количество вносимых твердых веществ, можно эффективно применять, если размолом источника крахмала и его сжижением без предварительного полного отделения не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала создать содержащую декстрины среду (1) и без добавления осахаривающих ферментов использовать ее в ферментации Объектом изобретения, таким образом, является способ получения по меньшей мере одного органического соединения по меньшей мере с 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере одним атомом азота посредством ферментации, включающий в себя следующие этапы:
а1) размол источника крахмала с получением продукта помола, включающего по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала;
а2) приготовление суспензии продукта помола в жидкости на основе воды и сжижение содержащегося в жидкости на основе воды продукта помола в присутствии по меньшей мере одного осахаривающего крахмал фермента, причем получают содержащую декстрины водную среду (1), включающую по меньшей мере часть не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала; и
b) использование содержащей декстрины водной среды (1) в ферментации для культивирования микроорганизма, способного к повышенному производству органического соединения,
причем ферменты, гидролизующие декстрины до моносахаридов, не добавляют или добавляют в количестве менее 0,001% масс. от общей массы используемого источника крахмала.
Несмотря на содержание  не содержащих крахмала компонентов используемого источника крахмала в содержащей декстрины среде (1), способ ферментации согласно изобретению можно эффективно проводить без необходимости в добавлении осахаривающих ферментов. Можно, однако, добавлять небольшие количества, которых недостаточно для полного осахаривания, как правило, менее 0,001% масс., в частности менее 0,0005% масс., от общей массы используемого источника крахмала.
Ввиду использования декстринов для культивирования микроорганизма можно задать высокую концентрацию пригодных для метаболизации сахаров как в порционной фазе, так и в фазе подкормки, без того чтобы проявились нежелательные побочные реакции, так что можно избежать нежелательного разбавления ферментационного бульона. Кроме того, проблем, обусловленных вязкостью, которые возникают при сжижении источника крахмала при высоких концентрациях продукта помола, удается в основном избежать.
Здесь и в дальнейшем выражения «содержащая декстрины среда» и «содержащая декстрины жидкость» используют как синонимы. Специалисту понятно, что микроорганизм, используемый в ферментации, должен быть в состоянии метаболизировать декстрины, присутствующие в содержащей декстрины водной среде (1), без того чтобы возникла потребность гидролизовать их до дисахаридов и/или моносахаридов, добавляя извне осахаривающие ферменты. При этом микроорганизмы метаболизируют декстрины, предположительно после предварительного осахаривания их собственными осахаривающими ферментами штамма, например собственными глюкоамилазами штамма. Особо целесообразно в способе согласно изобретению в последнем случае, что во время ферментации происходит автоматическое согласование скорости осахаривания, в особенности высвобождения глюкозы, с потребностями микроорганизмов, с одной стороны, посредством количества биомассы, а с другой стороны, уровня экспрессии собственных осахаривающих ферментов штамма.
Термин «сжижение» здесь и ниже означает гидролитическое разложение крахмала до олигосахаридов, в частности до декстринов.
Термины «осахаривание» и «осахаривать» здесь и ниже означают гидролиз декстринов до моносахаридов, в частности до таких моносахаридов, как глюкоза. Под «осахаривающим ферментом» ниже подразумевают фермент, гидролизующий декстрины до моносахаридов.
Под термином «декстрин» здесь и ниже подразумевают олигосахариды, полученные гидролитической деградацией крахмала, которые состоят из 3-18, в особенности из 6-12 моносахаридных мономеров, в частности, из мономеров глюкозы.
Термины «содержание эквивалентов глюкозы» и «концентрация сахаров» означают общую концентрацию в среде моносахаридов, дисахаридов и олигосахаридов, потенциально доступных для ферментации. Термин «эквиваленты глюкозы» включает в себя также отличающиеся от глюкозы пригодные к метаболизации сахара или сахарные мономеры.
Термины «производящий с превышением» и «повышенное производство» здесь и ниже применяют к микроорганизму, чтобы охарактеризовать его свойство производить один или несколько продуктов своего метаболизма в количестве, которое превосходит количество, необходимое для размножения микроорганизма, благодаря чему в ферментационной среде идет обогащение, причем обогащение может быть внутриклеточным или внеклеточным.
Источниками крахмала для размола являются, в первую очередь, сухие плоды или семена зерновых, которые в сухом состоянии характеризуются долей крахмала не менее 40% масс., а предпочтительно не менее 50% масс. Сухие плоды или семена зерновых имеются во многих широкомасштабно культивируемых на сегодняшний день злаковых растениях, например кукурузе, пшенице, овсе, ячмене, ржи, тритикале, рисе и в различных сортах проса, например сорго и белом сорго. Предпочтительно выбирать источник крахмала из группы, включающей зерна кукурузы, ржи, тритикале и пшеницы. В принципе, способ согласно изобретению можно также применять и с использованием аналогичных источников крахмала, как, например, смеси различных содержащих крахмал плодов или семян зерновых.
Для получения содержащей декстрины жидкой среды на этапе а1) конкретный источник крахмала с добавлением жидкости, например воды, или без нее размалывают, предпочтительно без добавления жидкости. Возможно также сочетание сухого размола с последующим мокрым размолом.
Для сухого размола, как правило, используют молотковые дробилки, роторные мельницы или вальцовые дробилки, для мокрого размола пригодны смесители, шаровые мельницы с мешалкой, циркуляционные мельницы, дисковые мельницы, мельницы с кольцевой камерой, вибрационные или планетарные мельницы. В принципе, возможно использование и других мельниц. Необходимое для мокрого размола количество жидкости специалист может определить в процессе лабораторных опытов. Обычно его задают так, чтобы содержание сухого вещества находилось в пределах от 10 до 20% масс.
С помощью размола задают размер частиц, пригодный для последующих этапов способа. При этом оказалось целесообразно, чтобы при размоле, особенно в случае сухого размола, продукт помола, получаемый на этапе а1), содержал частицы муки, т.е. компоненты в виде частиц с размером в пределах от 100 до 630 мкм в количестве от 30 до 100% масс., предпочтительно, от 40 до 95% масс., а особо предпочтительно, от 50 до 90% масс. Целесообразно, чтобы полученный продукт помола содержал 50% масс., частиц муки размером более 100 мкм. Как правило, по меньшей мере 95% масс., полученных при размоле частиц муки, обладают размером менее 2 мм. Измерение размера частиц при этом проводят посредством ситового анализа с использованием вибрационной анализирующей машины. Малый размер частиц принципиально выгоден для достижения высокого выхода продукции. Слишком малый размер частиц, однако, может вызвать проблемы, в частности, ввиду образования агломератов при подмешивании продукта помола во время сжижения или последующей обработки, например при сушке твердых веществ после этапа ферментации.
Для обозначения видов муки обычно используют степень помола или тип муки, причем они соотносятся друг с другом так, что с ростом степени помола возрастает также и характеристическое число типа муки. Степень помола соответствует массе полученной муки относительно 100 частей размалываемого материала. В то время как на начальных этапах размола получают чистую и наиболее тонкую муку, например, из внутренней части зерна, при дальнейшем размоле, то есть при возрастании степени помола, возрастает доля грубых волокон и пленчатость (доля оболочек), а доля крахмала при этом уменьшается. Степень размола, следовательно, отображается также в так называемых типах муки, которые указывают в числах и используют для классификации муки, особенно муки злаковых, и которые основаны на содержании в муке золы (так называемая шкала зольности). Типы муки или номер типа при этом означает количество золя (минеральных веществ) в мг, которое остается при сжигании 100 г сухой муки. Для муки злаковых более высокий номер типа означает более высокую степень помола, поскольку внутренняя часть зерна злаковых содержит около 0,4% масс., а оболочка, напротив, около 5% масс. золя. Следовательно, при более низкой степени помола мука злаковых состоит преимущественно из измельченного эндосперма, т.е. крахмалистой части зерен злаковых; при более высокой степени помола мука злаковых содержит также измельченный алейроновый слой зерен злаковых, богатый белком, а в случае продуктов грубого дробления еще и компоненты зародышей, содержащие белок и жир, а также оболочек семян, содержащих грубые волокна и золы. Для целей согласно изобретению предпочтительны виды муки с высокой степенью помола либо высоким числом типа. Если в качестве источника крахмала используют злаковые, то предпочтительно размалывать и подвергать дальнейшей обработке целые неочищенные зерна, при необходимости, после предварительного механического отделения зародышей и лузги.
Согласно изобретению, используемый продукт помола содержит по меньшей мере часть, предпочтительно, не менее 20% масс., в частности, не менее 50% масс., в особых случаях, не менее 90% масс., а в весьма особых случаях, не менее 99% масс. имеющихся в размолотых зернах злаков не содержащих крахмал твердых компонентов, соответственно степени помола. При расчете относительно содержащих крахмал компонентов продукта помола (и, соответственно, относительно количества доступного для метаболизации сахара в среде М) доля не содержащих крахмал твердых компонентов предпочтительно составляет не менее 10% масс., в частности, не менее 15% масс., например, от 15 до 75% масс., а в особых случаях, от 20 до 60% масс.
Продукт помола, предназначенный для сжижения, на этапе а2) согласно изобретению смешивают с жидкостью на основе воды, например с чистой водой, рециркулированной водой из процесса, например из последующей ферментации, или со смесью этих жидкостей. При этом, как правило, получают водную суспензию. Как правило, с жидкостью на водной основе смешивают такое количество источника крахмала и продукта помола, чтобы полученная содержащая декстрины жидкость на основе воды (1) имела концентрацию эквивалентов глюкозы по меньшей мере 40% масс. от общей массы среды (1). Содержание сухой массы в полученной таким образом среде (1) обычно составляет по меньшей мере 50% масс. от общей массы среды (1).
Для проведения способа согласно изобретению возможно предварительно подогреть жидкость на водной основе, используемую для создания суспензии из твердого продукта помола, до несколько повышенной температуры, например, в пределах от 40 до 60°С. Предпочтительно, однако, использовать жидкость при комнатной температуре.
Для сжижения крахмальной доли в продукте помола согласно этапу а2) оказалось целесообразным перед началом помола смешивать с жидкостью на водной основе только часть всего продукта помола, а оставшийся продукт помола добавлять к жидкости на водной основе в непрерывном или периодическом режиме на протяжении сжижения.
Сжижение продукта помола согласно этапу а2) можно проводить обычными, известными специалисту методами, например согласно методам, описанным в цитированной вначале «The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», Kapitel 2, S.7 bis 23.
Согласно изобретению, сжижение на этапе а2) проводят в присутствии по меньшей мере одного сжижающего крахмал фермента. Для этого можно, в принципе, использовать все сжижающие крахмал ферменты, в частности α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), например α-амилазы, которые получают из Bacillus lichenformis или Bacillus staerothermophilus, а в особенности ферменты, применяемые для сжижения материалов, получаемых способом сухого размола в процессе получения биоэтанола. Пригодные для сжижения α-амилазы также представлены на рынке, например, от фирмы Novozymes под торговым названием Termamyl 120 L, тип L; или от фирмы Genencor под обозначением Spezyme. Также можно использовать для сжижения сочетание различных α-амилаз.
При этом получают жидкость на водной основе, которая содержит сжиженную крахмальную долю продукта помола, обычно декстрины, как правило, с 3-18, в частности, с 6-12 моносахаридными мономерами, при необходимости, прочие олигосахариды, при необходимости небольшие количества моно- и/или дисахаридов (как правило, до 30% масс., нередко до 25% масс., до 20% масс., в частности, до 10% масс., от общего количества моно-, дисахаридов и олигосахаридов), а также не содержащие крахмала компоненты используемого продукта помола, в частности, твердые, не содержащие крахмала компоненты продукта помола, используемого для сжижения.
-1
Целесообразно выбирать количества сжижающего крахмал фермента и продукта помола так, чтобы вязкость во время процесса желатинизации оказывалась снижена достаточно, чтобы было возможно эффективное перемешивание суспензии, например, мешалкой. Предпочтительно, чтобы вязкость реакционной смеси во время желатинизации составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 15 Па·с, а крайне предпочтительно максимум 8 Па·с. Измерение вязкости осуществляют, как правило, вискозиметром Haake типа Roto Visko RV20 с измерительной системой М5 и измерительным устройством MVDIN при температуре 50°С и скорости сдвига, составляющей 200 с.
α-Амилаза (либо используемый фермент, сжижающий крахмал) может быть заранее помещена в реакционный сосуд или же добавлена во время проведения этапа а2). Предпочтительно часть α-амилазы, необходимой на этапе а2), добавляют в начале этапа а2) или же помещают эту часть в реактор заранее. Общее количество α-амилазы обычно лежит в пределах от 0,002 до 3,0% масс., предпочтительно, от 0,01 до 1,5% масс., а особо предпочтительно, от 0,02 до 0,5% масс., от общего количества используемого источника крахмала.
Сжижение можно проводить при температуре выше или ниже температуры желатинизации. Предпочтительно сжижение на этапе а2) проводят по крайней мере некоторое время выше температуры желатинизации используемого крахмала (так называемый Cooking Process). Необходимая для этого в случае конкретного вида крахмала температура известна специалисту (см. цитированную в начале «The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», Kapitel 2, S.11) или может быть определена специалистом в процессе лабораторных опытов. Как правило, выбирают температуру в пределах от 80 до 165°С, предпочтительно, от 90 до 150°С, а особо предпочтительно, от 100 до 140°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала такую желатинизации по меньшей мере на 5 K, предпочтительно, не менее чем на 10 K, а особо предпочтительно, не менее чем на 20 K, например, на величину 10-100 K, в частности, на 20, 80 K. При таких температурах происходит разрушение зернистой структуры крахмала (желатинизация), благодаря чему становится возможно его ферментативное расщепление (сжижение).
2
4
3
4
Для оптимизации эффективности α-амилазы (или используемого сжижающего крахмал фермента) этап а2) целесообразно проводить по меньшей мере на протяжении некоторого времени при величине рН, оптимальной для сжижающего фермента, обычно при величине рН, лежащей в слабокислой области, предпочтительно между 4,0 и 7,0, особо предпочтительно от 5,0 до 6,5, причем обычно в начале этапа а2) или перед ним устанавливают величину рН; эту величину целесообразно контролировать и, при необходимости, корректировать во время сжижения. Установку величины рН предпочтительно проводить с помощью разбавленных минеральных кислот, например HSO или НРO, либо же с помощью разведенных щелочей, например водного раствора едкого натра (NaOH) или едкого кали (KОН).
В предпочтительной форме исполнения для сжижения доли крахмала в продукте помола на этапе а2) на протяжении сжижения периодическим или непрерывным способом добавляют в жидкость на водной основе по меньшей мере часть продукта помола, предпочтительно, не менее 40% масс., в частности, не менее 50% масс., а крайне предпочтительно, не менее 55% масс. Добавленное количество продукта помола не должно превышать 90% масс., в частности, 85% масс., а особо предпочтительно, 80% масс. Обычно часть продукта помола, добавляемую в реактор в процессе сжижения, вводят в тех условиях, которые и имеются при сжижении. Добавление можно осуществлять периодическим способом, т.е. частями в виде нескольких порций, которые в каждом случае составляют не более 30% масс., особо предпочтительно, не более 20% масс., например от 1 до 30% масс. в особенности, от 2 до 20%, общего количества подлежащего сжижению продукта помола, или же непрерывно В рамках изобретения существенно, чтобы к началу сжижения в реакторе находилась только часть продукта помола, предпочтительно не более 60% масс., в особенности, не более 50% масс., а особо предпочтительно, не более 45% масс. продукта помола, а остальное количество продукта помола добавляли во время сжижения.
Сжижение также можно проводить непрерывно, например в многоступенчатом каскаде реакций.
В предпочтительной форме исполнения этап а2) способа согласно изобретению проводят так, чтобы часть, составляющую не более 60% масс., предпочтительно, максимум 50% масс., а особо предпочтительно, максимум 45% масс., например, от 10 до 60% масс., в особенности, от 15 до 50% масс., а особо предпочтительно, 20-45% масс., от общего количества продукта помола, вначале развести с созданием суспензии в жидкости на основе воды, например в чистой воде, рециркулированной воде из процесса, например из ферментации или из последующей обработки, или в смеси этих жидкостей, а затем проводить сжижение.
В предпочтительной форме исполнения добавление, периодическое или непрерывное, в частности порционное, продукта помола осуществляют в присутствии по меньшей мере одной α-амилазы таким образом, чтобы вязкость жидкой среды составляла не более 20 Па·с, особо предпочтительно максимум 15 Па·с и крайне предпочтительно не более 8 Па·с. Для поддержания контроля вязкости оказалось целесообразно добавлять по меньшей мере 25% масс., предпочтительно, не менее 35% масс. и особо предпочтительно, не менее 50% масс. общего количества добавляемого продукта помола при температуре выше температуры желатинизации содержащегося в продукте помола крахмала. На управление вязкостью можно также влиять, добавляя по меньшей мере один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу, или/и по меньшей мере один осахаривающий фермент, предпочтительно глюкоамилазу, также порциями.
Для осуществления способа согласно изобретению жидкость на водной основе, используемая для приготовления суспензии твердого продукта помола, может быть предварительно подогрета до слегка повышенной температуры, например, в пределах от 40 до 60°С.Предпочтительно, однако, использовать жидкости при комнатной температуре.
Затем в эту суспензию вводят по меньшей мере один фермент, сжижающий крахмал, предпочтительно α-амилазу. Если часть продукта помола добавляют только в течение сжижения, то сначала целесообразно добавлять лишь часть α-амилазы, например, от 10 до 70% масс., а в особенности от 20 до 65% масс., от общего количества применяемой на этапе а2) α-амилазы. Добавленное к этому моменту количество α-амилазы задают соответственно активности конкретной α-амилазы относительно используемого источника крахмала с учетом условий реакции, оно располагается обычно в пределах от 0,0004 до 2,0% масс., предпочтительно, от 0,001 до 1,0% масс., а особо предпочтительно, от 0,02 до 0,3% масс., от общего количества используемого источника крахмала. В качестве альтернативы можно смешать эту часть α-амилазы с используемой жидкостью перед приготовлением суспензии.
При этом целесообразно добавлять часть α-амилазы в суспензию перед началом нагрева до температуры, имеющей место при сжижении, в частности, при комнатной температуре или при лишь слегка повышенной температуре, например, в пределах от 20 до 30°С.
Приготовленную таким образом суспензию целесообразно затем нагреть до температуры, превышающей температуру желатинизации используемого крахмала. Как правило, выбирают температуру в пределах от 80 до 165°С, предпочтительно, от 90 до 150°С, а особо предпочтительно, от 100 до 140°С, причем предпочтительно, чтобы температура превышала температуру желатинизации по меньшей мере на 5 K, предпочтительно, не менее, чем на 10 K, а особо предпочтительно, не менее, чем на 20 K, например, на величину 10-100 K, в частности, на 20-80 K. Контролируя вязкость, при необходимости, последовательно добавляют в содержащую крахмал суспензию дальнейшие количества источника крахмала, например, порциями, составляющими в каждом случае от 1 до 30% масс., а особенно, от 2 до 20% масс. от общего количества используемого продукта помола. Предпочтительно в этом случае добавлять в реакционную смесь в процессе сжижения подлежащую введению долю продукта помола не менее чем 2, предпочтительно, не менее чем 4 и особо предпочтительно, не менее чем 6 порциями. В качестве альтернативы можно осуществлять добавление части продукта помола, не введенной при приготовлении суспензии, непрерывно в процессе сжижения. Температуру при введении целесообразно поддерживать выше температуры желатинизации крахмала.
После достижения желаемой температуры или, при необходимости, после добавления всего количества муки реакционную смесь обычно некоторое время, например от 10 до 60 минут или дольше, если это необходимо, выдерживают при температуре, установленной выше температуры желатинизации крахмала, при этом крахмальные компоненты продукта помола вывариваются. Затем реакционную смесь, как правило, охлаждают до несколько более низкой температуры, но все же предпочтительно превышающей температуру желатинизации, например, до 70-90°С. После этого добавляют еще одну часть α-амилазы, предпочтительно, основную часть. В зависимости от активности используемой α-амилазы при условиях реакции количество α-амилазы, добавляемой в этот момент, предпочтительно составляет от 0,002 до 2,0% масс., особо предпочтительно, от 0,01 до 1,0% масс., а крайне предпочтительно, от 0,02 до 0,4% масс., от общего количества используемого источника крахмала.
Для полного расщепления крахмала до декстринов реакционную смесь выдерживают при заданной температуре, пока тест на крахмал с использованием йода или, при необходимости, иной тест на наличие крахмала не даст отрицательный или в основном отрицательный результат. При необходимости, в реакционную смесь при этом можно ввести еще одну или несколько порций α-амилазы, например, в пределах от 0,001 до 0,5% масс., а предпочтительно, от 0,002 до 0,2% масс., от общего количества используемого источника крахмала.
В качестве альтернативы для сжижения доли крахмала водную суспензию, содержащую продукт помола, можно сначала нагреть до температуры, превышающей температуру клейстеризации крахмала, который содержится в источнике крахмала или в продукте помола, путем введения водяного пара. Обычно нагрев проводят до температуры, которая превышает конкретную температуру клейстеризации по меньшей мере на 10 K, в особенности, по меньшей мере на 20 K, например, на величину от 10 до 100 K, в частности, на 20-80 K. В частности, суспензию нагревают до температур, лежащих в пределах от 90 до 150°С, и в особенности, в пределах от 100 до 140°С.
Пар, используемый для нагрева, как правило, представляет собой перегретый водяной пар, температура которого составляет по меньшей мере 105°С, в особенности, по меньшей мере 110°С, например, от 110 до 210°С. Целесообразно вводить пар в суспензию под повышенным давлением. Соответственно, предпочтительное давление пара составляет по меньшей мере 1,5 бар, например, от 1,5 до 16 бар, в особенности, от 2 до 12 бар.
Введение водяного пара в суспензию, как правило, осуществляют так, чтобы он поступал под избыточным давлением, предпочтительно, под избыточным давлением, составляющим от 1 до 10 или 11 бар, в частности, от 1,5 до 5 бар и предпочтительно с высокой скоростью. Благодаря введению пара суспензия мгновенно нагревается до температур более 90°С, то есть до температур, превышающих температуру клейстеризации.
Нагревание водяным паром целесообразно проводить в устройстве, работающем непрерывно, в которое непрерывно же под определенным давлением подают суспензию, причем давление определяют на основе вязкости суспензии, скорости подачи и геометрических характеристик устройства, а в области ввода суспензии в устройство подают через регулируемое сопло горячий пар под давлением, избыточным по сравнению с давлением подачи суспензии. Благодаря тому, что пар подают под избыточным давлением, происходит не только нагрев суспензии, но в нее еще и поступает механическая энергия, способствующая дальнейшему измельчению частиц продукта помола, обеспечивающая особо равномерное введение энергии и, соответственно, дающая в итоге особо равномерную клейстеризацию гранулярных частиц крахмала в продукте помола. Обычно такие устройства имеют форму трубы. Целесообразно осуществлять подачу пара в направлении продольной оси устройства, имеющего форму трубы. Ввод суспензии, как правило, осуществляют под углом, составляющим по меньшей мере 45° к ней, или перпендикулярно. Регулируемое сопло обычно имеет форму конуса, сужающегося в направлении потока пара. В этом сопле расположена игла, или на штоке, подвижном в продольном направлении, - конус. Игла или конус и конусообразное сопло образуют щель. Сдвигая иглу или шток в продольном направлении, можно достаточно просто регулировать размер щели и, следовательно, площадь сечения выходного отверстия сопла, управляя скоростью подачи пара.
Кроме того, обычно эти устройства оснащены трубой-смесителем, в которую суспензия поступает, выходя из устройства после введения пара. Эта труба-смеситель обычно расположена в направлении подачи пара и перпендикулярно направлению загрузки. Совместно с соплом труба-смеситель, как правило, образует щель, через которую перемещается суспензия. При транспортировке эта щель обеспечивает воздействие на суспензию дополнительных усилий сдвига, которые таким образом повышают ввод в суспензию механической энергии. Труба-смеситель может быть размещена с возможностью сдвига в продольном направлении. Сдвигая трубу-смеситель, можно легко регулировать размер щелевого отверстия и, соответственно, перепад давления в устройстве.
Из уровня техники такие устройства известны под названием «сопловых котлов» (Jet-Kocher), например устройство, представленное в «The Alcohol Textbook», гл. 2, в указанном месте, Фиг.13, и представлены на рынке, например, под наименованием HYDROHEATER производства фирмы Hydro Thermal Corp.Waukesha WI, USA.
При непрерывном проведении реакции суспензию, обработанную водяным паром, затем, как правило, направляют в постреакционную зону, чтобы продолжить желатинизацию крахмальных компонентов. Давление в постреакционной зоне повышено, абсолютное давление обычно находится в пределах от 2 до 8 бар. Температуры в постреакционной зоне лежат обычно в пределах от 90 до 150°С. Время пребывания в постреакционной зоне может в зависимости от температуры суспензии составлять от 1 минут до 4 часов. Обычно постреакционные зоны имеют форму трубы или колонны. В одной из форм исполнения постреакционная зона имеет форму вертикально расположенной колонны. При этом суспензию, покинувшую устройство для обработки паром, помещают в верхнюю часть колонны и извлекают из нижней части. В другой форме исполнения изобретения постреакционная зона имеет форму трубы.
После выхода из постреакционной зоны в суспензии, как правило, понижают давление, а затем проводят сжижение. Обычно понижение давления проводят как мгновенное испарение, чтобы охладить суспензию предпочтительно до температуры ниже 100°С, в особенности, ниже 85°С. Сжижение переведенного таким образом в растворимую форму крахмала проводят затем, как правило, в отдельной реакционной емкости. Сжижение можно проводить описанным выше способом.
В предпочтительной форме исполнения изобретения по меньшей мере часть или все количество, по меньшей мере 50%, в особенности, по меньшей мере 80% общего количества или же все количество сжижающего крахмал фермента вводят в суспензию продукта помола в жидкости на водной основе до нагревания водяным паром. Таким образом, осуществляют сжижение уже во время нагрева до температур, превышающих температуру клейстеризации. Нагрев водяным паром и постреакционную фазу проводят соответственно этому. Без последующего сжижения в отдельном реакционном сосуде можно обойтись. Целесообразно, однако, все же проводить такое сжижение в целях полноты деградации крахмала до декстринов.
2+
2
Для стабилизации используемых ферментов можно, при необходимости, отрегулировать концентрацию ионов Ca, например, доводя ее с помощью СаСl до оптимальной для конкретного фермента величины. Подходящие концентрации специалист может определить в процессе лабораторных опытов. Если в качестве α-амилазы используют, например, термамил, то целесообразно довести концентрацию
2+
Са в жидкой среде до величины, например, от 10 до 100 частей на млн., предпочтительно, от 20 до 80 частей на млн. и особо предпочтительно, от 30 до 70 частей на млн., причем данные в частях на млн. относятся к массе и означают г/1000 кг.
Для полного расщепления крахмала до декстринов реакционную смесь выдерживают при заданной температуре, пока тест на крахмал с использованием йода или, при необходимости, иной тест на наличие крахмала не даст отрицательный или в основном отрицательный результат. При необходимости, в реакционную смесь при этом можно ввести еще одну или несколько порций α-амилазы, например, в пределах от 0,001 до 0,5% масс., а предпочтительно, от 0,002 до 0,2% масс., от общего количества используемого источника крахмала.
Поскольку для получения содержащей декстрины жидкости (1) используют продукт помола, который в основном содержит все компоненты источника крахмала, или по меньшей мере, кроме крахмала, еще и часть твердых, не содержащих крахмал компонентов (т.е. полного отделения не содержащих крахмал твердых компонентов источника крахмала не проводят), полученная содержащая декстрины жидкость (1) включает в себя также часть или все количество не содержащих крахмала твердых компонентов источника крахмала. Нередко этим обусловлено поступление, например, из плода зерновых доли фитата, которой нельзя пренебречь. Чтобы избежать вызванного этим ингибирующего действия, в среду (1) на этапе а2) целесообразно добавить по меньшей мере одну фитазу, прежде чем подать ее на этап ферментации. Добавление фитазы можно осуществлять до сжижения, во время сжижения или после него, если она обладает достаточной температурной стабильностью для данного этапа. Можно применять любые фитазы в той мере, в которой их активность в условиях реакции по крайней мере не подвергается существенным ограничениям. Предпочтительны фитазы с температурной устойчивостью (Т50) выше 50°С и особо предпочтительно, выше 60°С. Количество фитазы составляет обычно от 1 до 10000 ед/кг источника крахмала, а в особенности, от 10 до 4000 ед/кг источника крахмала.
Оказалось целесообразным добавлять во время получения в содержащую декстрины жидкость (1), кроме того, другие ферменты, например пуллуланазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, глюканазы, ксиланазы, глюкозидазы или протеазы. Добавление этих ферментов может положительно сказаться на вязкости, т.е. снизить ее (например, ввиду расщепления длинноцепочечных глюканов и/или (арабино)ксиланов), обеспечить высвобождение пригодных для метаболизации глюкозидов и высвобождение (остаточного) крахмала. Использование протеаз дает аналогичные положительные результаты, причем дополнительно могут выделяться аминокислоты как факторы роста для ферментации.
Полученная на этапе а2) содержащая декстрины жидкость (1), как правило, характеризуется концентрацией эквивалентов глюкозы не менее 20% масс. (=200 г/кг), в частности, по меньшей мере 40% масс., а в особенности, по меньшей мере 50% масс., нередко в пределах от 30 до 75% масс., предпочтительно, в диапазоне от 40 до 70% масс., в особенности, от 50 до 65% масс., в каждом случае от общей массы среды (1).
Типичное содержание массы в полученной таким образом жидкости (1) составляет по меньшей мере 25% масс., предпочтительно, по меньшей мере 40% масс., в особенности, по меньшей мере 50% масс., в особых случаях, не менее 60% масс., и, как правило, не превышает 80% масс., в каждом случае от общей массы среды (1).
Содержащиеся в полученной таким образом включающей декстрины жидкости (1) эквиваленты глюкозы представлены в основном формой моносахаридов, в частности декстринов. Основным компонентом этих олигосахаридов или декстринов является обычно глюкоза, хотя среда может содержать также небольшие количества моно- и/или дисахаридов и олигосахаридных мономеров, состоящих из других моносахаридных мономеров. Обычно сахаросодержащие компоненты в содержащей декстрины среде (1), т.е. моносахариды, ди- и олигосахариды, включают в себя долю олигосахаридов, в частности декстринов, составляющую по меньшей мере 70% масс., нередко, минимум 75% масс., в частности, по меньшей мере 80% масс., а в особых случаях, не менее 90% масс., т.е. доля моносахаридов и дисахаридов ниже 30% масс., нередко, ниже 25% масс., в частности, ниже 20% масс., а в особых случаях, ниже 10% масс. Обычно доля глюкозы в свободной или связанной форме составляет среди эквивалентов глюкозы среды (1) величину в пределах от 50 до 99% масс., в частности, от 75 до 97% масс., а в особенности, от 80 до 95% масс, от общего количества эквивалентов глюкозы.
Полученную на этапе а2) содержащую декстрины жидкость (1) на водной основе используют согласно изобретению на этапе b) для ферментативного синтеза желательного органического соединения. Для этого содержащую декстрины жидкость (1) подают на ферментацию, где она служит для культивации используемых в ферментации микроорганизмов. Конкретное органическое соединение получают при этом в виде летучего или нелетучего продукта микробного метаболизма.
Как правило, содержащую декстрины жидкость (1) на водной основе прямо применяют в ферментации согласно этапу b) без подачи в отдельный бак осахаривания. Как правило, содержащую декстрины жидкость (1), прежде чем подавать ее на ферментацию, охлаждают до температуры ферментации, обычно в пределах от 32 до 37°С.
Содержащую декстрины жидкость (1) на водной основе перед ферментацией можно, при необходимости, стерилизовать, при этом микроорганизмы уничтожают, как правило, термическим или химическим способом. Для этого содержащую декстрины жидкость (1) на водной основе обычно нагревают до температур выше 80°С. Уничтожение или лизис клеток можно проводить непосредственно перед ферментацией. Для этого на лизис или уничтожение (микроорганизмов) подают всю содержащую декстрины жидкость (1). Его можно осуществлять, например, термическим или химическим способом. В рамках способа согласно изобретению, однако, оказалось, что проводить этап стерилизации, описанный здесь, перед ферментацией нет необходимости, но гораздо более целесообразным оказалось такой этап стерилизации не проводить. Соответственно к предпочтительной форме исполнения изобретения относится способ, при котором полученную на этапе а2) среду (1) непосредственно, т.е. без предварительной стерилизации, подают на ферментацию.
Метаболизация декстринов при ферментации согласно изобретению проходит в основном без добавления осахаривающих ферментов. При этом микроорганизмы метаболизуют декстрины, предположительно, после гидролиза их посредством присущих штамму осахаривающих ферментов, например присущих штамму глюкоамилаз. Возможно, что осахаривание сжиженных крахмальных компонентов происходит параллельно метаболизации микроорганизмами сахаров, в частности моносахарида глюкозы.
Следовательно, в предпочтительной форме исполнения микроорганизм, используемый для ферментации, выбирают среди микроорганизмов, экспрессирующих или производящих ферменты, которые гидролизуют декстрины до моносахаридов, в особенности, среди микроорганизмов, производящих или экспрессирующих глюкоамилазы. Подобные микроорганизмы известны специалисту, либо же их можно определить в лабораторных опытах, например, скринингом на глюкоамилазу, например, посредством выращивания микроорганизма в тесте в колбах со встряхиванием с последующим испытанием на ферментативную активность глюкоамилазы, или скринингом с помощью праймеров /зондов методами, описанными в разделе «Примеры», а также посредством поиска в базах данных ферментов, например:
Поскольку используемые для ферментации микроорганизмы производят собственные глюкоамилазы штамма, величину рН ферментационной среды можно довести до величины, оптимальной для действия глюкоамилазы, например до величины в диапазоне между 3,5 и 6,0. Нередко величину рН доводят до оптимального для ферментации значения, которое находится за пределами указанного диапазона, например в пределах от 6,0 до 8,0. Это может оказаться в общем целесообразным при ферментации, несмотря на ограничение активности многих глюкоамилаз в этой области рН, или же потребоваться по причине необходимых условий для ферментации, которые, в частности, следует привести в соответствие потребностям конкретного микроорганизма. Оптимальный для ферментации диапазон рН специалист может определить в процессе лабораторных опытов.
Чтобы добиться полноценного протекания реакции с декстринами, внесенными средой (1) в ферментационную среду, эту среду целесообразно выдерживать на протяжении некоторого времени, например от 2 до 72 часов или более, в той мере, в которой это необходимо, например, от 2 до 96 часов, в особенности, от 5 до 48 часов, при заданной температуре. Обычно метаболизация микроорганизмами моносахаридов, в частности глюкозы, полученных гидролизом из декстринов, проходит очень быстро, так что, как правило, определить высокие концентрации моносахаридов или глюкозы возможным не представляется.
Ферментация может проходить известным специалисту обычным образом. Для этого, как правило, культивируют конкретный желательный микроорганизм в полученной описанным здесь способом жидкой среде.
Процесс ферментации может проходить как периодически (порционный способ, Batch), так и «полунепрерывно» (Feel-Batch, порционный способ с подпиткой, включая порционный способ с подпиткой и промежуточным извлечением продукта), причем предпочтителен полунепрерывный способ.
Из среды (1), полученной способом согласно изобретению, при необходимости, с обычным источником сахара, т.е. пригодных к метаболизации моно-, дисахаридов и/или олигосахаридов, или сред, которые содержат пригодные к метаболизации моно-, дисахариды и/или олигосахариды, можно, например, при необходимости, после разбавления водой и добавления обычных компонентов среды, например буферных растворов, питательных солей, источников азота, например сульфата аммония, мочевины и т.д., сложных питательных компонентов, включая аминокислоты, например экстрактов дрожжей, пептонов, CSL и им подобных, создать инокулят (затравку) с желаемыми микроорганизмами и обеспечить их размножение в условиях ферментации, пока не будет достигнуто желательное для ферментации состояние равновесия. При этом происходит метаболизация содержащегося в ферментационной среде сахара и образование желаемого продукта метаболизма (так называемый порционный способ работы или порционная фаза).
При порционном способе работы с подпиткой следом за порционной фазой, например, когда общая концентрация сахара становится ниже определенной величины, в ферментационную среду непрерывно или периодически добавляют среду (1).
Типичная форма исполнения способа согласно изобретению представляет собой порционный способ с подпиткой, включающий следующие этапы:
b1) культивация микроорганизма, способного к повышенному производству органического соединения в водной ферментационной среде (2);
и
b2) добавление содержащей декстрины среды (1), при необходимости, вместе с обычным источником сахара к ферментационной среде (2), в которой микроорганизмы, избыточно производящие органическое соединение, метаболизируют содержащиеся в среде (1) декстрины, при необходимости, после осахаривания.
На этапе b1) можно, например, сначала довести обычную содержащую сахар среду, как правило, раствор глюкозы, или жидкую среду (1) согласно изобретению, или смесь (1) с обычным источником сахара, разводя ее жидкостью на основе воды, в частности водой, до подходящей концентрации сахара и добавить обычные для ферментации компоненты среды, например буферные растворы, питательные соли, источники азота, например сульфат аммония, мочевину и т.д., сложные питательные компоненты, включая аминокислоты, например экстракты дрожжей, пептоны, CSL и им подобные. При этом соотношение количества сахара к жидкости целесообразно, как правило, выбирать так, чтобы общая концентрация моносахаридов в ферментационной среде (2) составляла менее 6% масс., например, в пределах от ≥0 до 5% масс., которая рассчитана в эквивалентах глюкозы относительно общей массы ферментационной среды (2). В приготовленной таким образом порционной среде, содержащей сахар, и проводят его размножение в порционной среде (ферментационной среде (2)) при условиях ферментации, пока не будет достигнуто желательное для ферментации состояние равновесия. При этом происходит метаболизация помещенного в ферментационную среду (2) сахара и образование желаемого продукта метаболизма.
Во время последующей порционной фазы с подпиткой добавление содержащей декстрины среды (1) к ферментационной среде (2) поддерживает процесс ферментации, причем накопление может быть как внутриклеточным, так и внеклеточным. При этом объемное соотношение добавляемой среды (1) к имеющейся порционной среде, содержащей микроорганизмы (ферментационной среде (2)) в общем случае находится в пределах от примерно 1:10 до 10:1, а предпочтительно, от 1:5 до 5:1 и, в частности, в пределах от 1:1 до 5:1. Содержание сахара в ферментационной среде (2) можно, в частности, регулировать скоростью подачи среды (1). Как правило, скорость подачи задают так, чтобы общая концентрация сахаров, т е. сумма концентраций олигосахаридов и моносахаридов, не превышала величину 30% масс., в частности, 20% масс. Целесообразно, чтобы содержание моносахаридов в ферментационной среде находилось в пределах от >0 % масс. до примерно 5% масс., а в частности, чтобы оно не превосходило величину 3% масс.
В предпочтительной форме исполнения в состав ферментационной среды (2) на этапе b1) (т.е. в данном случае порционной среды) входят в основном содержащая декстрины среда (1), способные к избыточному производству органического соединения микроорганизмы, компоненты среды, например буферные растворы, питательные соли, источники азота, например сульфат аммония, мочевина и т.д., сложные питательные компоненты, включая аминокислоты, например экстракты дрожжей, пептоны, CSL, и при необходимости, вода для разбавления. Для этого содержащую декстрины среду (1) следует, при необходимости, разбавить до желательной концентрации декстринов, например до концентрации в пределах от 15 до 30% масс., рассчитанной в эквивалентах глюкозы относительно общей массы среды (1), непосредственно использовать ее для приготовления ферментационной среды (2) (порционной среды)
Содержание декстринов в содержащей декстрины среде, используемой для поддержания ферментации согласно этапу b2), обычно выше, ее поддерживают, например, в упомянутых выше пределах, чтобы минимизировать разбавление ферментационной среды (2)
Целесообразно действовать таким образом, чтобы создать содержащую декстрины среду (1) с более высокой концентрацией декстринов, например, по меньшей мере 30% масс., в частности, по меньшей мере 40% масс., а в особенности, по меньшей мере 50% масс., рассчитанной в эквивалентах глюкозы относительно общей массы среды (1). Эту среду (1) затем используют, с одной стороны, на этапе b1) после разбавления водой для приготовления порционной среды (ферментационной среды (2)), а с другой стороны - на этапе b2) для добавления в ферментационную среду (2).
С использованием содержащей декстрины среды (1) можно ферментативным способом получать летучие и нелетучие, в частности, нелетучие продукты микробного метаболизма по меньшей мере с 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере одним атомом азота.
При этом под нелетучими продуктами микробного метаболизма подразумевают соединения, которые в общем случае невозможно удалить из ферментационного бульона путем дистилляции, не подвергнув их разрушению. Эти соединения, как правило, характеризуются точкой кипения выше температуры кипения воды, нередко выше 150°С, а в особенности, выше 200°С при нормальном давлении. Как правило, это соединения, которые при нормальных условиях (298 K, 101,3 кПа) находятся в твердом агрегатном состоянии.
Возможно, однако, также использовать содержащую декстрины водную среду (1) в ферментации для получения нелетучих продуктов микробного метаболизма, которые при нормальном давлении характеризуются точкой плавления ниже температуры кипения воды или/и обладают маслянистой консистенцией.
6
12
Термин «нелетучие продукты микробного метаболизма» в данном случае включает в себя, в частности, органические монокарбоновые, ди- и трикарбоновые кислоты, предпочтительно с 3-10 атомами углерода, имеющие, при необходимости, одну или несколько, например 1, 2, 3 или 4 гидроксильные группы, например винную кислоту, итаконовую кислоту, янтарную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, 3-гидроксипропионовую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, 2,5-фурандикарбоновую кислоту, глутаровую кислоту, левулиновую кислоту, глюконовую кислоту, аконитовую и диаминопимелиновую кислоту, лимонную кислоту; протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, например лизин, глутамат, метионин, фенилаланин, аспарагиновую кислоту, триптофан и треонин, пуриновые и пиримидиновые основания; нуклеозиды и нуклеотиды, например никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и аденозин-5'-монофосфат (АМФ); липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно с 10-22 атомами углерода, например γ-линоленовую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, арахидоновую кислоту, эйкозопентаеновую кислоту и докозогексаеновую кислоту; диолы, предпочтительно с 3-8 атомами углерода, например пропандиол и бутандиол; многоатомные спирты с 3 или более, например 3, 4, 5 или 6 гидроксильными группами, например глицерин, сорбит, манит, ксилит и арабинит; длинноцепочечные (иногда также обозначаемые как «более длинноцепочечные») спирты по меньшей мере с 4 атомами углерода, например, имеющие 4-22 атома углерода, например бутанол, углеводы, например гиалуроновую кислоту и трегалозу; ароматические соединения, например ароматические амины, ванилин и индиго; витамины и провитамины, например аскорбиновую кислоту, витамин B, витамин B и рибофлавин, софакторы и так называемые нутрицевтики; белки, например ферменты, например амилазы, пектиназы, кислые, гибридные или нейтральные целлюлазы, эстеразы, например липазы, панкреазы, протеазы, ксиланазы и оксидоредуктазы, например лакказу, каталазу и пероксидазу, глюканазы, фитазы; каротиноиды, например ликопин, β-каротин, астаксантин, зеаксантин и кантаксантин; кетоны, предпочтительно с 3-10 атомами углерода и, при необходимости, одной или несколькими гидроксильными группами, например ацетон и ацетоин; лактоны, например γ-бутинолактон, циклодекстрины, биополимеры, например полигидроксиацетат, полиэфиры, например полилактид, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды; а также предшественники и производные упомянутых соединений. Прочие соединения, представляющие собой нелетучие продукты микробного метаболизма, описаны Gutcho в Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086.
В понятие «софактор» включены небелковые соединения, необходимые для проявления нормальной активности фермента. Эти соединения могут быть органическими или неорганическими; молекулы софакторов согласно изобретению, предпочтительно органические. Примерами таких молекул являются НАД и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), предшественником этих софакторов является ниацин. Понятие «нутрицевтик» включает в себя пищевые добавки, укрепляющие здоровье растений и животных, в особенности человека. Примерами таких молекул являются витамины, антиоксиданты и определенные липиды, например многократно ненасыщенные жирные кислоты
Производимые продукты метаболизма в особенности относятся к ферментам, аминокислотам, витаминам, дисахаридам, алифатическим монокарбоновым и дикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, алифатическим гидроксикарбоновым кислотам с 3-10 атомами углерода, кетонам с 3-10 атомами углерода, алканолам с 4-10 атомами углерода и алкандиолам с 3-10 атомами углерода, а в особенности, с 3-8 атомами углерода.
Специалисту понятно, что соединения, произведенные ферментативным путем согласно изобретению, получают в каждом случае в форме оптического изомера, производимого данными микроорганизмами (если существуют различные энантиомеры). Так, например, аминокислоты, как правило, получают в форме L-энантиомеров.
Использование в ферментации тех или иных микроорганизмов определяют в каждом случае известным образом через конкретный продукт метаболизма, как это в подробностях описано ниже. Они могут быть природного происхождения или продуктами генетической модификации. Примеры подходящих микроорганизмов и способов ферментации приведены в нижеследующей таблице А.
В предпочтительных формах исполнения изобретения синтезируемое органическое соединение выбирают из группы, включающей органические монокарбоновые, ди- и трикарбоновые кислоты, предпочтительно с 3-10 атомами углерода, имеющие, при необходимости, гидроксильные группы, протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды, липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты; диолы с 4-10 атомами углерода, многоатомные спирты с 3 или более гидроксильными группами, более длинноцепочечные спирты по меньшей мере с 4 атомами углерода, углеводы, ароматические соединения, витамины, провитамины, софакторы, нутрицевтики, белки, каротиноиды, кетоны с 3-10 атомами углерода, лактоны, биополимеры и циклодекстрины.
Первая предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении ферментов, например фитаз, ксиланаз или глюканаз.
Вторая предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении аминокислот, например лизина, метионина, треонина и глутамата.
Еще одна предпочтительная форма исполнения изобретения касается применения получаемой согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении витаминов, например пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и производных.
Особо предпочтительная форма изобретения касается ферментативного получения
- монокарбоновых, ди- и трикарбоновых кислот, особенно алифатических монокарбоновых, ди- и трикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, как то: пропионовой, фумаровой, янтарной кислоты, итаконовой, лимонной и диметилмалоновой кислоты,
- алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например молочной кислоты и 3-гидроксипропионовой кислоты,
- длинноцепочечных алканолов, как это указано выше, в частности алканолов с 4-10 атомами углерода, например бутанола;
- диолов, как указано выше, в частности алкандиолов с 3-10, а в особенности с 3-8 атомами углерода, например пропандиола,
- кетонов, как указано выше, в частности кетонов с 3-10 атомами углерода, например, ацетона; и
- углеводов, как указано выше, в особенности дисахаридов, например трегалозы.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продуктами метаболизма, производимыми микроорганизмами при ферментации, являются полигидроксиалканоаты, например поли-3-гидроксибутират и сополиэфиры с другими органическими гидроксикарбоновыми кислотами, например 3-гидроксивалериановой кислотой, 4-гидроксимасляной кислотой и другими, описанные, например, у Steinbüchel (указано там же), например также длинноцепочечные (иногда называемые «более длинноцепочечными», гидроксикарбоновые кислоты, например 3-гидроксиоктановая кислота, 3-гидроксидекановая и 3-гидрокситетрадекановая кислота, а также их смеси. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в S.Y.Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), S.431-438.
В предпочтительной форме исполнения применяемые в ферментации микроорганизмы, соответственно, выбирают среди природных или рекомбинантных микроорганизмов, пригодных к повышенному получению по меньшей мере одного из следующих продуктов метаболизма:
- ферментов, например фитаз, ксиланаз или глюканаз, в частности фитаз;
- аминокислот, например лизина, метионина или треонина, особенно лизина и метионина;
- витаминов, например пантотеновой кислоты и рибофлавина, их предшественников и/или производных;
- дисахаридов, например трегалозы;
- алифатических монокарбоновых, ди- и трикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например пропионовой, фумаровой, янтарной кислоты, итаконовой, лимонной и диметилмалоновой кислоты;
- полигидроксиалканоатов, например поли-3-гидроксибутирата и сополиэфира 3-гидроксимасляной кислоты;
- алифатических гидроксикарбоновых кислот с 3-10 атомами углерода, например молочной кислоты и 3-гидроксипропионовой кислоты;
- кетонов с 3-10 атомами углерода, например ацетона;
- алканолов с 4-10 атомами углерода, например бутанола; и
- алкандиолов с 3-8 атомами углерода, как, например, пропандиола.
Подходящие микроорганизмы обычно выбирают из родов Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus и Clostridium, в частности из штаммов Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger или Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmannii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus и Rhizopus oryzae.
В предпочтительной форме исполнения микроорганизм, используемый в ферментации, представляет собой штамм из рода Corynebacterium, в частности штамм Corynebacterium glutamicum В особенности подразумевается штамм рода Corynebacterium, а именно Corynebacterium glutamicum, который избыточно производит аминокислоту, а именно лизин, метионин или глутамат.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения микроорганизм, используемый в ферментации, представляет собой штамм из рода Escherichia, в частности штамм Escherichia coli. В особенности же подразумевается штамм рода Escherichia, а именно Escherichia coli, который избыточно производит аминокислоту, а именно лизин, метионин или треонин.
В особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, представляет собой лизин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например в соответствующих местах у Pfefferle et al. и в патенте США US 3,708,395. В принципе, возможна работа как в непрерывном, так и в периодическом (Batch или Fed-Batch, порционном или с подпиткой) режиме, а предпочтителен режим с подпиткой.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, представляет собой метионин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 03/087386 и WO 03/100072.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продуктом метаболизма, производимого микроорганизмами при ферментации, является пантотеновая кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/021772.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продукт метаболизма, производимый микроорганизмами при ферментации, представляет собой рибофлавин. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/011052, немецком патенте DE 19840709, международной заявке WO 98/29539, европейском патенте ЕР 1186664 и в Fujioka, К.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продуктом метаболизма, производимого микроорганизмами при ферментации, является фумаровая кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в Rhodes et al., Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продуктом метаболизма, производимого микроорганизмами при ферментации, является янтарная кислота. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в Int. J.Syst. Bacteriol 26, 498-504 (1976); в европейском патенте ЕР 249773 (1987), изобретатели: Lemme и Datta; патенте США US 5504004 (1996), изобретатели: Guettler, Jain и Soni; Arch. Microbiol. 167, 332-342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus succinogenes sp.nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol 1999 Jan; 49 Pt 1:207-16; патенты США US 5,723,322, US 5,573,931, US 5,521,075, международная заявка WO 99/06532, патенты США US 5,869,301 или US 5,770,435.
Еще в одной особо предпочтительной форме исполнения продуктом метаболизма, производимого микроорганизмами при ферментации, является фитаза. Для проведения ферментации в этом случае можно использовать условия и способы работы, аналогичные тем, которые были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 98/55599.
При ферментации получают ферментационный бульон, который помимо желательного продукта микробного метаболизма содержит образовавшуюся при ферментации биомассу, не прошедшие метаболизацию компоненты сжиженного раствора крахмала и, в частности, не содержащие крахмала твердые компоненты источника крахмала, как, например, волокна и не используемые сахара, а также не используемые буферные и питательные соли. Эту жидкую среду в настоящей заявке также называют ферментационным бульоном, причем ферментационный бульон включает в себя также добавленную содержащую декстрины среду (1), в которой прошло лишь частичное или неполное ферментативное преобразование содержащихся в ней сахаров, т.е. частичная или неполная метаболизация микробами пригодных к употреблению сахаров (например, моно- и дисахаридов).
Перед выделением или обеднением продукта микробного метаболизма или же отделением летучих компонентов ферментационного бульона, при необходимости, описанным выше способом проводят этап стерилизации.
Особая форма исполнения (I) настоящего изобретения касается способа, при котором в ферментационном бульоне обедняют или выделяют из него по меньшей мере один продукт микробного метаболизма. Летучие компоненты ферментационного бульона затем в основном удаляют, при этом получают твердый или частично твердый белковый состав. Полное описание проведения такого способа и получаемого при этом белкового состава являются объектом международной заявки WO 2005/116228 (РСТ/ЕР2005/005728) фирмы-заявителя, на которую дана ссылка в отношении прочих подробностей.
Выделение из ферментационного бульона или обеднение в нем продукта метаболизма осуществляют, как правило, таким образом, чтобы выделить от ферментационного бульона или обеднить в нем содержание этого продукта метаболизма настолько, чтобы содержание этого продукта метаболизма в остаточном ферментационном бульоне составляло не более 20% масс., в частности, не более 10% масс., в особенности, не более 5% масс., а крайне желательно, не более 2,5% масс., в каждом случае от общей массы остаточного ферментационного бульон.
Выделение из ферментационного бульона или обеднение содержания в нем продукта метаболизма можно осуществлять в один или несколько этапов. Важным этапом при этом является отделение от ферментационного бульона его твердых компонентов. Его можно проводить перед выделением конечного продукта или после него. Как для выделения ценных веществ, так и для отделения твердых веществ, т. е. разделения твердой и жидкой фаз, в отрасли известны обычные методы, которые также включают в себя стадии грубой и тонкой очистки ценных веществ, а также регулирования свойств (например, описано в Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH).
В целях выделения конечного продукта целесообразно действовать следующим образом: вначале удалить из ферментационного бульона твердые компоненты, например, посредством центрифугирования или фильтрования, а затем выделить конечный продукт из жидкой фазы, например, путем кристаллизации, осаждения, адсорбции или дистилляции. В качестве альтернативы можно также выделять конечный продукт непосредственно из ферментационного бульона, например, применяя хроматографические способы или экстракцию. Среди хроматографических способов следует особо упомянуть ионообменную хроматографию, при которой конечный продукт можно избирательно выделить на хроматографической колонке. В этом случае отделение твердых веществ от остаточного ферментационного бульона целесообразно проводить, например, декантацией, выпариванием или/и сушкой.
В случае летучих или маслянистых соединений, как правило, необходимо контролировать максимальные температуры во время обработки, в особенности, во время сушки. Также целесообразно получать эти соединения, осуществляя их формирование в псевдотвердой форме на адсорбентах. Пригодные в этих целях адсорбенты приведены, например, в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР2005/005728) фирмы-заявителя. Примерами соединений, которые таким образом целесообразно получать способом согласно изобретению, являются γ-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозопентаеновая кислота и докозогексаеновая кислота, а также пропионовая кислота, молочная кислота, пропандиол, бутанол и ацетон. Эти соединения в псевдотвердом виде также рассматривают в рамках настоящего изобретения как нелетучие продукты микробного метаболизма в твердой форме.
Еще одна особая форма исполнения (II) касается способа, при котором проводят полное удаление летучих компонентов из ферментационного бульона без предварительного выделения нелетучего продукта микробного метаболизма или обеднения его содержания и, при необходимости, без предварительного отделения твердых компонентов, причем получают твердый состав нелетучего продукта микробного метаболизма. Подробное описание к проведению такого способа приведено в европейской заявке на патент РСТ/ЕР2006/066057 (ранняя немецкая заявка на патент DE 102005042541.0) фирмы-заявителя.
«Полное» означает, что после удаления летучих компонентов остается твердый или хотя бы частично твердый остаток, который, при необходимости, можно перевести в твердую форму добавлением твердых веществ. Как правило, это означает удаление летучих компонентов до остаточного содержания влаги, не превышающего 30% масс., часто не более 20% масс., а особенно, не более 15% масс. Обычно представляется целесообразным удалять из ферментационного бульона его летучие компоненты до остаточной влажности в пределах от 0,2 до 30%масс, предпочтительно, от 1 до 20% масс., особо предпочтительно, от 2 до 15% масс. и крайне предпочтительно от 5 до 15% масс., от определенного после сушки общей массы твердых компонентов. Содержание остаточной влажности можно определить обычными, известными специалисту методами, например с помощью термогравиметрии (Hemminger et al., Methoden der thermischen Analyse, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989).
Получение из ферментационного бульона нелетучего продукта (нелетучих продуктов) метаболизма в твердой форме, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения проводят в один, два или несколько стадий, в частности, в виде одно- или двухстадийного процесса. Как правило, по меньшей мере одна, в частности, завершающая стадия получения продукта метаболизма в твердой форме включает в себя этап сушки.
При работе в одну стадию летучие компоненты ферментационного бульона, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения удаляют, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
При работе в две или несколько стадий ферментационный бульон, при необходимости, после вышеупомянутого предварительного отделения вначале концентрируют, например, посредством фильтрации (микрофильтрации, ультрафильтрации) или термическим способом, выпаривая часть летучих компонентов. Доля летучих компонентов, которую удаляют на этом этапе, составляет, как правило, от 10 до 80% масс., а в особенности, от 20 до 70% масс. от общей массы летучих компонентов ферментационного бульона. На одной или нескольких последующих стадиях процесса удаляют остальные летучие компоненты ферментационного бульона, пока не будет достигнуто желаемое остаточное содержание влаги.
Согласно этой форме исполнения (II) удаление летучих компонентов жидкой среды проводят в основном без предварительного обогащения или, тем более, выделения основного продукта. Следовательно, при удалении летучих компонентов ферментационного бульона нелетучий продукт метаболизма большей частью не удаляют вместе с летучими компонентами жидкой среды, он остается в получаемом остатке вместе с основным количеством, а в особенности, со всем количеством остальных твердых компонентов ферментационного бульона. Согласно изобретению, однако, возможно, что часть, предпочтительно небольшая, желаемого нелетучего продукта микробного метаболизма, как правило, максимум 20% масс., например от 0,1 до 20% масс., предпочтительно, не более 10, а в особенности, не более 5% масс., особо предпочтительно, максимум 2,5% масс. и крайне предпочтительно, максимум 1% масс. от общей сухой массы продукта метаболизма, при удалении летучих компонентов ферментационного бульона удаляют вместе с ними. В особо предпочтительной форме исполнения желаемый нелетучий продукт микробного метаболизма по меньшей мере на 90% масс., в частности, не менее чем на 95% масс., в особенности, на 99% масс., а крайне предпочтительно, на 100% масс., в каждом случае от общей сухой массы продукта метаболизма, в виде твердого вещества остается в смеси с полученной после удаления летучих компонентов частью или совокупностью твердых компонентов ферментационной среды.
Если это желательно, то перед удалением летучих компонентов можно удалить из ферментационного бульона часть, например от 5 до 80% масс., а особенно от 30 до 70% масс., не содержащих крахмала твердых, т.е. нерастворимых компонентов, например, посредством центрифугирования или фильтрации. При необходимости, проводят такое предварительное разделение, чтобы удалить крупные твердые частицы, которые не содержат нелетучих продуктов микробного метаболизма или содержат очень малые их количества. Для предварительной фильтрации можно использовать обычные методы, известные специалисту, например, с использованием крупноячеистых сит, сеток, дырчатых пластин или подобных устройств. При необходимости, можно также провести удаление крупных твердых частиц в центробежном сепараторе. Используемые для этого устройства, например декантаторы, центрифуги, седиканторы и сепараторы также известны специалисту. Таким образом получают твердый или, например, пастообразный остаток, который содержит нелетучий продукт метаболизма и нелетучие, как правило, твердые, не содержащие крахмала компоненты источника крахмала или, по меньшей мере, большую их часть, нередко по меньшей мере 90% масс. или все количество твердых, не содержащих крахмала компонентов.
Посредством добавления вспомогательных рецептурных средств, например носителей и покрывающих материалов, связывающих средств и прочих добавок, можно известным образом целенаправленно регулировать свойства высушенного и находящегося в смеси с твердыми компонентами ферментации продукта метаболизма с точки зрения различных параметров, например содержания действующего вещества, зернистости, формы частиц, склонности к пылеобразованию, гигроскопичности, стабильности, в особенности лежкости, цвета, запаха, текучести, склонности к агломерации, электростатического заряда, чувствительности к свету и температуре, механической прочности и пригодности к редиспергированию.
К применяемым обычно вспомогательным средствам составов относятся, например, связующие средства, материалы-носители, средства, модифицирующие порошкообразование или текучесть, а также красители, биоциды, диспергаторы, пеногасители, средства, регулирующие вязкость, кислоты, щелочи, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, адсорбаты, жиры, жирные кислоты, масла или их смеси. Такие вспомогательные средства составов целесообразно применять, в частности, в качестве средств, способствующих сушке при использовании способов формирования смесей и сушки, например распылительной сушки, сушки в вихревом слое и низкотемпературной сушки. В связи с дальнейшими подробностями дана ссылка на европейскую заявку на патент РСТ/ЕР2006/066057 (ранняя заявка DE 102005042541.0).
В зависимости от конкретных требований данного продукта метаболизма, а также в зависимости от свойств используемых добавок доля вышеупомянутых дополнительных веществ и, при необходимости, прочих добавок, например материалов оболочек, может широко варьировать и находиться в пределах, например, от 0,1 до 80% масс., а особенно, в пределах от 1 до 30% масс., в каждом случае от общей массы готового состава продукта или смеси веществ.
Добавлять вспомогательные средства состава можно до дополнительной обработки ферментационного бульона (называемой также составлением продукта или «дизайном твердых веществ»), во время ее или по ее окончании, а в особенности, во время сушки. Добавление вспомогательных средств состава до дополнительной обработки ферментационного бульона или продукта метаболизма может быть особенно целесообразно для улучшения пригодности к обработке веществ или продуктов, подлежащих этой обработке. Вспомогательные средства состава можно добавлять как к продукту метаболизма, получаемому в твердой форме, так и к раствору или суспензии, содержащей продукт метаболизма, например, по окончании ферментации непосредственно в ферментационный бульон или перед сушкой в раствор или суспензию, получаемые в процессе дополнительной обработки, перед завершающим этапом сушки.
Так, например, вспомогательные вещества можно, перемешивая, вводить в суспензию продукта микробного метаболизма; такую суспензию можно также наносить на материал-носитель, например, путем распыления или подмешивания. Добавление вспомогательных средств состава во время сушки может играть роль, например, если раствор или суспензию, содержащие продукт метаболизма, распыляют. Добавление вспомогательных средств состава после сушки производят, например, в особенности при покрытии высушенных частиц специальными составами. Прочие вспомогательные вещества можно добавлять в продукт как после сушки, так и после, возможно, имеющего место этапа покрытия.
Удаление летучих компонентов из ферментационного бульона осуществляют известным способом, используя обычные методы отделения твердой фазы от жидкой, включая фильтрационные методы и способы выпаривания летучих компонентов жидких фаз. Такие способы, которые могут также включать этапы грубой очистки концентрата, а также этапы дополнительной обработки, описаны, например, в Belter, P.A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Aufl. auf CD-ROM, Wiley-VCH. Известные специалисту и применимые в рамках составления продукта или дополнительной обработки по окончании ферментации способы, аппаратура, вспомогательные вещества, а также общие и особые формы исполнения также описаны в европейских патентах ЕР 1038527, ЕР 0648076, ЕР 835613, ЕР 0219276, ЕР 0394022, ЕР 0547422, ЕР 1088486, ЕР 0758018 и международных заявках WO 98/55599, WO 92/12645.
В первом варианте этой формы исполнения (II) нелетучий продукт микробного метаболизма, постольку поскольку он содержится в жидкой фазе в растворенном виде, переводят из жидкой фазы в твердую, например, путем кристаллизации или осаждения. Затем осуществляют отделение нелетучих твердых компонентов, включая продукт метаболизма, от жидких компонентов, например, посредством центрифугирования, декантации или осаждения. Подобным же образом можно отделить маслянистые продукты метаболизма, причем конкретные маслянистые продукты ферментации переводят в твердую форму добавлением адсорбентов, например кремниевой кислоты, силикагелей, глин и активированного угля.
Во втором предпочтительном варианте этой формы исполнения (II) летучие компоненты удаляют выпариванием. Выпаривание можно осуществлять известными способами. Примерами подходящих способов для выпаривания летучих компонентов являются распылительная сушка, сушка или агломерация в вихревом слое, сушка с замораживанием, поточная или контактная сушка, а также экструзионная сушка. Также возможно сочетание упомянутых способов с формообразующими технологиями, например экструзией, зернением или производством окатышей. В последних случаях предпочтительно использовать содержащие продукт метаболизма смеси веществ, частично или в основном прошедшие предварительную сушку.
В предпочтительной форме исполнения удаление летучих компонентов ферментационного бульона включает в себя распылительную сушку или сушку в вихревом слое, включая гранулирование в вихревом слое. Для этого ферментационный бульон, при необходимости, после предварительного разделительного этапа для отделения грубых частиц, не содержащих нелетучих продуктов микробного метаболизма или же содержащих их в незначительном количестве, подают в одну или несколько установок для распылительной сушки или сушки в вихревом слое. Транспортировку или подачу нагруженного твердыми веществами ферментационного бульона целесообразно осуществлять с помощью обычных транспортных устройств для жидкостей, содержащих твердые вещества, например насосов, в частности эксцентриковых шнековых насосов (например, от фирмы Delasco PCM) или насосов высокого давления (например, от фирмы LEWA Herbert Ott GmbH).
Проведение ферментации с использованием содержащей сахар жидкой среды согласно изобретению можно также проводить следующим образом:
(i) от полученной на этапе а2) содержащей декстрины среды (1), которая включает в себя не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, отбирают часть, составляющую не более 50% масс., например в пределах от 5 до 45% масс., от общей массы, а остаток подают на ферментацию для получения первого продукта метаболизма (А), например нелетучего продукта метаболизма (А) в твердой форме или летучего продукта метаболизма (А); а
(ii) отобранную часть, отделив от нее полностью или частично не содержащие крахмал твердые компоненты источника крахмала, подвергают ферментации для получения второго продукта метаболизма (В), который идентичен продукту метаболизма (А) или отличен от него.
В случае отделения не содержащих крахмала твердых компонентов согласно (ii), содержание твердого вещества в остающейся доле содержащей сахар среды должно составлять не более 50% масс., предпочтительно - не более 30% масс., особо предпочтительно - максимум 10% масс. и крайне предпочтительно - максимум 5% масс. Особо предпочтительно в этом случае перед ферментацией для получения второго продукта метаболизма (В) отделить все твердые вещества.
Такой метод позволяет использовать в отдельной ферментации согласно ii) микроорганизмы, требующие выполнения определенных минимальных условий, например, относительно скорости кислородного обмена. Такими микроорганизмами, используемыми в отдельной ферментации согласно viii) могут быть, например, Bacillus species, предпочтительно, Bacillus subtilis. К соединениям, производимым такими микроорганизмами в отдельной ферментации, относятся, в частности, витамины, софакторы и нутрицевтики, пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды, липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, ароматические соединения, белки, каротиноиды, в особенности, витамины, софакторы и нутрицевтики, белки и каротиноиды, а особо, рибофлавин и пантотенат кальция.
Предпочтительный вариант этого способа работы означает параллельное получение одинаковых продуктов (А) и (В) в двух отдельных процессах ферментации. Это целесообразно, в частности, в тех случаях, когда к одному и тому же продукту метаболизма в различных его применениях предъявляют различные требования по чистоте. Соответственно, первый продукт метаболизма (А), например предназначенную для использования в качестве кормовой добавки аминокислоту, например лизин, метионин, треонин или глутамат, производят с использованием содержащего твердые вещества ферментационного бульона, а второй такой же продукт метаболизма (В), например такую же аминокислоту, но предназначенную уже для использования в качестве пищевой добавки, производят с использованием ферментационного бульона, содержание твердых веществ в котором понижено согласно ii). Благодаря полному или частичному отделению не содержащих крахмала твердых компонентов можно снизить затраты на очистку при последующей обработке продукта метаболизма, область применения которого требует более высокой чистоты, например, в качестве пищевой добавки.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения такого способа можно действовать, например, следующим образом. Запускают ферментацию, предпочтительно в большом объеме, для получения продуктов метаболизма А, например аминокислот, в частности лизина, метионина, глутамата или треонина, лимонной кислоты или этанола, например, по способу, описанному в международной заявке WO 2005/116228 (РСТ/ЕР2005/005728) или РСТ/ЕР2006/066057 (ранняя немецкая заявка DE 102005042541.0) или согласно способам, известным для ферментативного получения биоэтанола. Согласно i) отделяют часть среды (1), полученной на этапе а2). Часть, отделенную согласно i), можно согласно ii) полностью или частично очистить обычными способами, например центрифугированием или фильтрацией, от твердых веществ, в зависимости от потребностей ферментации для получения В. Полученную при этом среду (1), полностью или частично освобожденную от твердых веществ, подают согласно ii) на ферментацию для получения продукта метаболизма В. Поток твердого вещества, отделенный согласно i), целесообразно возвращать в поток среды (1) для ферментации в большом объеме.
Если продукт микробного метаболизма (А), получаемый при ферментации в крупном объеме, представляет собой этанол, то концентрация моно-, дисахаридов или олигосахаридов в полученной после этапа ii) среде (1) соответствует среде, обычной для ферментативного получения этанола (биоэтанола), например, в пределах от 25 до 33% масс. Отделение твердых веществ согласно этапу ii) проводят в соответствии с требованиями, предъявляемыми ферментацией для получения конкретного продукта метаболизма В.
В предпочтительной форме исполнения этого способа продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является рибофлавин. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в международных заявках WO 01/011052 и WO 98/29539, немецком патенте DE 19840709, европейском патенте ЕР 1186664 и Fujioka, K.: New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31(3), 44-48.
Для проведения работ по этому варианту способа запускают ферментацию, предпочтительно в большом объеме, для получения продуктов метаболизма А, например аминокислот, в частности лизина, метионина, глутамата или треонина, лимонной кислоты или этанола, как описано выше. Согласно i) отделяют часть полученной после этапа а2) среды (1), а согласно ii) полностью или частично освобождают ее от твердых веществ обычными способами, например центрифугированием или фильтрацией. Полученную при этом среду (1), полностью или частично освобожденную от твердых веществ, подают согласно ii) на ферментацию для получения продукта метаболизма В, в данном случае рибофлавина. Поток твердого вещества, отделенный согласно ii), целесообразно возвращать в поток среды (1) для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом содержащего рибофлавин ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в немецких патентах DE 4037441, DE 3819745, европейских патентах ЕР 464582 и ЕР 438767. После лизирования клеточной массы проводят отделение рибофлавина, присутствующего в кристаллической форме, предпочтительно путем декантации. Другие способы отделения твердых веществ, например фильтрование, также возможны. Затем рибофлавин сушат, предпочтительно с помощью распылительных сушилок и сушилок с вихревым слоем. В качестве альтернативы содержащую рибофлавин ферментационную смесь, полученную согласно ii), обрабатывают, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны в европейских патентах ЕР 1048668 и ЕР 730034. В этом случае после пастеризации ферментационный бульон центрифугируют, а остающуюся фракцию, содержащую твердые вещества, обрабатывают минеральной кислотой. Образовавшийся рибофлавин фильтруют из кислой водной среды, при необходимости, отмывают, а затем сушат.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения этого способа продуктом метаболизма В, производимым микроорганизмами во время ферментации, является пантотеновая кислота. При проведении ферментации в этом случае можно применять условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в международной заявке WO 01/021772.
Для проведения этого варианта способа можно действовать, например, как описано выше для рибофлавина. Жидкую среду (1), содержащую сахар, предварительно очищенную согласно i), предпочтительно в основном освобожденную от твердых веществ, подают согласно ii) на ферментацию для получения пантотеновой кислоты. При этом особые преимущества дает сниженная по сравнению с содержащей твердые вещества жидкой средой вязкость. Отделенный поток твердого вещества целесообразно возвращать в поток содержащей сахар жидкой среды (1) для ферментации в большом объеме.
Дальнейшую обработку полученного таким образом согласно ii) содержащего пантотеновую кислоту ферментационного бульона можно проводить, применяя условия и способы работы, аналогичные тем, что были описаны для других источников углерода, например, в европейском патенте ЕР 1050219 и международной заявке WO 01/83799. После пастеризации ферментационного бульона остающиеся твердые вещества отделяют, например, центрифугированием или фильтрованием. Фильтрат после отделения твердых веществ частично выпаривают, при необходимости, добавляют к нему хлорид кальция и сушат, в частности, распылением.
Отделенные твердые вещества получают в рамках протекающего параллельно процесса ферментации в большом объеме вместе с конкретным желаемым нелетучим продуктом микробного метаболизма (А).
После сушки и/или составления или сборки в продукт состава могут быть добавлены целые или размолотые семена зерновых, предпочтительно кукуруза, пшеница, ячмень, просо, тритикале и/или рожь.
Нижеследующие примеры служат для иллюстрации отдельных аспектов настоящего изобретения, однако ни в коем случае не имеют ограничений.
Примеры
I. Размол источника крахмала
Используемые ниже материалы помола были изготовлены следующим образом. Целые кукурузные зерна полностью размололи с применением роторной мельницы. С использованием различных ударных механизмов, путей помола и встроенных сит при этом получили три различные степени тонкости. Ситовый анализ материала помола с помощью лабораторного вибрационного сита (вибрационный анализатор: Retsch Vibrotronic Тур VE1; время просеивания 5 мин; амплитуда: 1,5 мм) дал результаты, приведенные в таблице 1.
Таблица 1
Номер эксперимента
Т 70/03
Т 71/03
Т 72/03
<2 мм / %
99,4
100
100
<0,8 мм / %
66
100
99
<0,63 мм / %
58,6
98,5
91
<0,315 мм / %
48,8
89
65
<0,1 мм / %
25
9,6
<0,04 мм / %
8
3,2
Общее количество материала помола
20 кг
11,45 кг
13,75 кг
II. Ферментативное сжижение и осахаривание крахмала
II.1. Без фитазы на этапе осахаривания
II.1а) Ферментативное сжижение крахмала
2
4
Из 320 г кукурузной муки, полученной сухим размолом (Т71/03), приготовили при постоянном перемешивании суспензию в 480 г воды и добавили 310 мг хлорида кальция. Перемешивание продолжали в течение всего эксперимента. После доведения рН с помощью HS0 до величины 6,5 и нагрева до 35°С добавили 2,4 г Termamyl 120L Тур L (Novozymes A/S). На протяжении 40 минут реакционную смесь нагревали до 86,5°С, причем рН, при необходимости, доводили до ранее заданной величины с помощью NaOH. В течение 30 минут добавили еще 400 г кукурузной муки, полученной сухим размолом (Т71/03), при этом температуру повысили до 91°С. Реакционную смесь выдерживали при этой температуре около 100 минут. Затем добавили еще 2,4 г Termamyl 120L и удерживали температуру около 100 минут. В процессе работы сжижение контролировали с помощью реакции крахмала с йодом. В завершение температуру подняли до 100°С и кипятили реакционную смесь еще 20 минут. К этому моменту крахмал более не был обнаружен. Реактор охладили до 35°С.
II.3. Прочие указания по ферментативному сжижению крахмала
II. 3а) Кукурузная мука
2
2
2
2+
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. 1,54 мл маточного раствора CaCl (100 г CaCl×2НО / л) добавляют до конечной концентрации Са в кашице 70 частей на млн. Постоянно перемешивая, медленно разводят в воде 240 г кукурузной муки. После доведения рН до 6,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 4,0 мл (=2% масс. фермента/на сухую массу) Termamyl 120 L Тур L (Novozymes A/S) Затем кашицу быстро нагревают до 85°С. При этом необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, корректировать величину рН.
2
2
2
2+
По достижении конечной температуры начинают добавлять следующие порции муки, сначала 50 г.Дополнительно в кашицу вводят 0,13 мл маточного раствора CaCl, чтобы поддержать концентрацию Са на уровне 70 частей на млн. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Чтобы обеспечить полноту прохождения реакции, ждут не менее 10 минут, прежде чем добавить еще одну порцию (50 г муки и 0,13 мл маточного раствора CaCl). После добавления двух порций вводят 1,67 мл Termamyl; затем добавляют еще две порции (каждый раз 50 г муки и 0,13 мл маточного раствора СаСl). Достигают содержания сухой массы 55% масс. После добавления температуру доводят до 100°С и кипятят кашицу 10 минут.
Отбирают пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска указывает на присутствие остаточного крахмала; если крахмал полностью гидролизовался, происходит коричневое окрашивание. Если тест указывает на наличие остаточного крахмала, температуру снова понижают до 85°С и поддерживают на этом уровне. Добавляют еще 1,67 мл Termamyl, пока реакция йода с крахмалом не даст отрицательный результат.
II.3b) Ржаная мука (включая предварительную обработку целлюлазой/гемицеллюлазой)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Постоянно перемешивая, медленно разводят в воде 155 г ржаной муки. Поддерживают постоянную температуру 50°С. После доведения рН до 5,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 3,21 мл (=2,5% масс. фермента/на сухую массу) Viscozyme L (Novozymes A/S). Через 30 минут начинают добавлять следующие порции муки, сначала добавляют 55 г муки. Еще через 30 минут снова добавляют 50 г муки; 30 минут спустя еще 40 г муки. Через 30 минут после последнего добавления можно начинать сжижение.
2
2
2
Добавляют 1,7 мл маточного раствора CaCl (100 г CaCl×2НО / л). После доведения рН до 6,5 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 5,0 мл (=2% масс. фермента/на сухую массу) Termamyl 120 L Тур L (Novozymes A/S). Затем кашицу быстро нагревают до 85°С. При этом необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, корректировать величину рН.
2
2
2
2+
По достижении конечной температуры начинают добавлять следующие порции муки, сначала 60 г. Дополнительно в кашицу вводят 0,13 мл маточного раствора CaCl, чтобы поддержать концентрацию Са на уровне 70 частей на млн. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Чтобы обеспечить полноту прохождения реакции, ждут не менее 10 минут, прежде чем добавить еще одну порцию (40 г муки и 0,13 мл маточного раствора СаСl). Добавляют 1,1 мл Termamyl; затем добавляют еще одну порцию (40 г муки и 0,13 мл маточного раствора СаСl. Достигают содержания сухой массы 55% масс. После добавления температуру доводят до 100°С и кипятят кашицу 10 минут.
Отбирают пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска указывает на присутствие остаточного крахмала; если крахмал полностью гидролизовался, происходит коричневое окрашивание. Если тест указывает на наличие остаточного крахмала, температуру снова понижают до 85°С и поддерживают на этом уровне. Добавляют еще 1,1 мл Termamyl, пока реакция йода с крахмалом не даст отрицательный результат.
II. 3с) Пшеничная мука (включая предварительную обработку ксиланазой)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Воду нагревают до 55°С, а рН с помощью 50% масс водного раствора NaOH доводят до 6,0. После установления температуры и рН добавляют 3,21 мл (=2,5% масс. фермента к сухой массе) Shearzyme 500L (Novozymes A/S). Непрерывно перемешивая, медленно разводят в воде 155 г пшеничной муки. Температуру и рН поддерживают постоянными. Через 30 минут начинают добавлять следующие порции муки, сначала добавляют 55 г муки. Еще через 30 минут снова добавляют 50 г муки, 30 минут спустя еще 40 г муки. Через 30 минут после последнего добавления можно начинать сжижение.
Сжижение и осахаривание проводят так, как описано в II. 3b.
fbr
III. Штамм АТСС13032 lysC
fbr
В одном из следующих примеров использовали модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum, описанный под названием АТСС13032 lysC в международной заявке WO 05/059144
IV: Идентификация штаммов, экспримирующих/производящих глюкоамилазу
IVa) Скрининг по генетическим базам данных
Поиск штаммов, продуцирующих глюкоамилазу
1. Глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюкан глюкогидролаза) имеет классификационный номер ЕС 3.2.1.3 [1].
2. Поиск по запросу «ЕС 3.2.1.3» провели в следующих базах данных: Brenda, Swissprot, ERGO-WIT, CAZY и PIR, причем в каждом случае получили список белков, характеризуемых ЕС 3.2.1.3.
3. Списки результатов объединили, провели фильтрацию результатов по таксономическим царствам простейших, бактерий и грибов и рассортировали по названиям видов.
4. Виды, соответствующие критериям фильтрации, указанным в пункте 3, и относительно которых хотя бы в одном из указанных в пункте 2 базах данных была найдена запись об амилазе, с высокой вероятностью обладают способностью производить глюкоамилазу. Конкретно речь идет о следующих видах:
IVb) Скрининг в тесте со встряхиванием колб с последующим тестом ферментативной активности
В тесте со встряхиванием колб различные микроорганизмы исследуют на предмет активности глюкоамилазы. В качестве среды можно использовать любую обычную среду, которая пригодна для роста организма и ведет к экспрессии глюкоамилазы. Подходящие среды коммерчески доступны, либо их можно изготовить согласно опубликованным прописям (например, как описано в каталогах American Type Culture Collection).
Например, в заданной среде можно использовать в качестве единственного источника углерода смесь олигомеров глюкозы с различной длиной цепи. Поскольку в условиях ферментации термический гидролиз олигосахаридов не происходит, в этой среде могут расти только штаммы, обладающие активностью глюкоамилазы и/или мальтазы. В качестве субстрата можно использовать, например, Maldex 150 (Amylum Group). Скрининг проводят в различных условиях ферментации (рН, температура).
Чтобы отличить активность глюкоамилазы от активности мальтазы, перед опытом состав смеси олигосахаридов анализируют, например, посредством ВЭЖХ. Так, например, состав Maldex 150 следующий (см. Таблицу 2).
Таблица 2
Состав Maldex 150 (Amylum Group)
Степень полимеризации
[%]
DP1
1,1
DP2
4,0
DP3
7,4
DP4
5,0
DP5
4,8
DP6
8,4
DP7
9,6
DP8
4,6
DP9
3,5
>DP9
51,6
Соответственно этому анализу создают контрольную среду с мальтозой и глюкозой. Рост и синтез лизина в олигосахаридной среде, превышающие их величины в контрольной, однозначно обусловлены активностью глюкоамилазы.
Как альтернативу мальтодекстриновой смеси в качестве источника углерода для скрининга можно применять чистую мальтотетраозу, мальтопентаозу и т.д. После прерывания культивации биомассу отделяют центрифугированием, а супернатант фильтруют.
Прозрачный супернатант подвергают тесту на активность глюкоамилазы (CHEN et al., J. Gen. Appl. Microbiol., 51, 175-181 (2005)). Для этого используют смесь из 0,2 мл 50 мМ ацетатного буфера (ацетат натрия, рН 5,0) с 0,5% растворимого крахмала и 0,2 мл супернатанта. По прошествии времени реакции, составляющего 10 минут при 60°С, реакцию останавливают кипячением в течение 10 минут при 100°С. Количество высвободившейся глюкозы определяют с помощью метода глюкозооксидазы/пероксидазы (Bergmayer и Bernt, 1974). Единицу глюкоамилазной активности при этом определяют как количество фермента, которое при данных условиях реакции высвобождает из растворимого крахмала 1 мкмоль глюкозы в минуту.
IV c) Скрининг с помощью праймеров/зондов
Альтернативный метод проверки, обладает ли исследуемый организм последовательностями, кодирующими глюкоамилазу, состоит в скрининге с помощью праймеров или зондов, которые специфичны для этой последовательности.
i) Опираясь на законсервированные участки известных генов глюкоамилазы, сооружают зонд для идентификации у различных организмов последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды с глюкоамилазной активностью, и их клонирования. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК желаемого организма, за чем следует Southern Blot по стандартной методике, чтобы идентифицировать искомый ген.
Указания по идентификации последовательностей ДНК посредством гибридизации доступны специалисту в т.ч. в руководстве „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" от фирмы Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Германия, 1993) и в Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).
ii) Опираясь на законсервированные участки известных генов глюкоамилазы, конструируют праймер для ПЦР. Его применяют в ПЦР с ДНК подлежащего исследованию организма. Если присутствуют соответствующие точки связывания праймера, т.е. гены, кодирующие глюкоамилазу, то возможна идентификация соответствующих олигонуклеотидов, подвергшихся амплификации, с помощью проводимого затем гель-электрофореза. Руководства по амплификации последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) гибридизации доступны специалисту в т.ч. в руководстве Gait: Oligonucleotide sythesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) и в Newton и Graham PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Пример 1
Сжиженный гидролизат кукурузной муки использовали в опыте с колбами и шейкером с применением Corynebacterium glutamicum.
I) Сжижение
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Постоянно перемешивая, медленно разводят в воде 240 г кукурузной муки. После доведения рН до 5,8 с помощью 50% масс. водного раствора NaOH добавляют 4,0 мл (=2% масс. фермента/на сухую массу) Liquozyme SC (Novozymes A/S). Затем кашицу быстро нагревают до 85°С. При этом необходимо постоянно контролировать и при необходимости корректировать величину рН.
По достижении конечной температуры начинают добавлять дальнейшие порции муки, сначала 50 г. В процессе добавления поддерживают постоянную температуру 85°С. Чтобы обеспечить полноту прохождения реакции, ждут не менее 10 минут, прежде чем добавить еще одну порцию (50 г муки). После добавления двух порций вводят 1,67 мл Liquozyme; затем добавляют еще две порции (каждый раз 50 г) муки. Достигают содержания сухой массы 55% масс. После добавления температуру доводят до 100°С и кипятят кашицу 10 минут.
Отбирают пробу и охлаждают ее до комнатной температуры. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора Люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска указывает на присутствие остаточного крахмала; если крахмал полностью гидролизовался, происходит коричневое окрашивание. Смесь, результат тестирования которой на крахмал был отрицателен, в горячем виде перелили в стерильные емкости и после охлаждения хранили при 4°С.
II) Ферментация Corynebacterium glutamicum
Штамм
fbr
Использовали модифицированный дикий тип с регуляцией аспартокиназы по принципу обратной связи АТСС13032 lysC.
Получение инокулята
610
После посева на стерильный полноценный агар с аминокислотами из казеина (состав: см. таблицу 3; 20 мин при 121°С) клетки инкубировали ночь при 30°С. Затем клетки соскоблили с пластинок и ресуспендировали в солевой среде. 25 мл среды (см. таблицу 4) в 250-мл конических колбах с двумя дефлекторами в каждом случае привили таким количеством среды, чтобы оптическая плотность ODпри 610 нм достигла величины 0,5.
Таблица 3
Состав полноценного агара с аминокислотами из казеина
Концентрация
Компонент
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCl
2,0 г/л
мочевина
5,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
5,0 г/л
экстракт дрожжей (Difco)
5,0 г/л
экстракт говядины (Difco)
20,0 г/л
аминокислоты казеина
20,0 г/л
агар
Получение ферментационного бульона
Состав среды в колбах приведен в Таблице 4. Опыт проводили трижды.
Таблица 4
Среда в колбах
Гидролизат кукурузной муки
180 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
20 г/л
мочевина
5 г/л
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
0,113 г/л
K<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
0,138 г/л
ACES
52 г/л
MOPS
21 г/л
лимонная кислота х Н<sub>2</sub>О
0,49 г/л
3,4-дигидроксибензойная кислота
3,08 мг/л
NaCl
2,5 г/л
KСl
1 г/л
MgSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>O
0,3 г/л
FeSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>O
25 мг/л
MnSO<sub>4</sub>×4-6H<sub>2</sub>O
5 мг/л
ZnCl<sub>2</sub>
10 мг/л
СаСl<sub>2</sub>
20 мг/л
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
150 мкг/л
CoCl<sub>2</sub>×6Н<sub>2</sub>O
100 мкг/л
CuCl<sub>2</sub>×2Н<sub>2</sub>O
100 мкг/л
NiSO<sub>4</sub>×6Н<sub>2</sub>O
100 мкг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2Н<sub>2</sub>O
25 мкг/л
биотин (витамин Н)
1050 мкг/л
тиамин × НСl (витамин B<sub>1</sub>)
2100 мкг/л
никотинамид
2,5 мг/л
пантотеновая кислота
125 мг/л
цианокобаламин (витамин B<sub>12</sub>)
1 мкг/л
4-аминобензойная кислота (РАВА; витамин H<sub>1</sub>)
600 мкг/л
фолиевая кислота
1,1 мкг/л
пиридоксин (витамин B<sub>6</sub>)
30 мкг/л
рибофлавин (витамин В<sub>2</sub>)
90 мкг/л
CSL
40 мл/л
рН*
6,85
* устанавливают разбавленным водным раствором NaOH
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение трех дней при 30°С в движении (200 об/мин). После прерывания ферментации концентрацию лизина определили с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ провели с помощью прибора 1100 Series LC System производства Agilent. Предколоночная дериватизация ортофталевым альдегидом позволяет квалифицировать образовавшиеся аминокислоты, разделение смеси аминокислот осуществляют колонкой Hypersil AA производства Agilent.
Результаты представлены в Таблице 5.
Таблица 5
Продукция лизина (средние величины)
Продолжительность ферментации
Лизин [г/л]
45 ч
11,5
70 ч
12,8
Контроль (45 ч)
11,1
Пример 2
Сжиженный гидролизат кукурузной муки задействовали в опытах со встряхиванием колб с использованием Aspergillus niger.
I) Сжижение
Сжижение проводили согласно пункту I) примера 1.
II) Ферментация с Aspergillus niger
Штамм
Производящий фитазу штамм Aspergillus niger с 6 копиями гена phyA от Aspergillus ficuum под контролем промотора gIaA был получен аналогично подробно описанному в международной заявке W098/46772 получению NP505-7. В качестве контроля использовали штамм с 3 модифицированными ампликонами glaA (аналогично ISO 505), но без интегрированного полигенного экспрессирующего кластера phyА.
Получение инокулята
20 мл среды предварительной культуры (см. в таблице 6) в 100-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 100 мкл замороженной культуры и инкубировали 24 часа при 34°С в движении (170 об/мин) в увлажняемом шкафу-шейкере.
Таблица 6
Состав среды предварительной культуры
Компонент
Концентрация
глюкоза
30,0 г/л
пептон из казеина
10,0 г/л
экстракт дрожжей
5,0 г/л
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1,0 г/л
МgSО<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0.5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub>×1Н<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>O
3 мг/л
Tween 80
3,0 г/л
пенициллин
50000 ЕД/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,5
* устанавливают разбавленной серной кислотой
50 мл среды основной культуры (см. в таблице 7) в 250-мл конических колбах с одним дефлектором в каждом случае привили 5 мл предварительной культуры.
Получение ферментационного бульона
Состав среды в колбах приведен в Таблице 7. Использовали по две колбы каждой пробы.
Таблица 7
Среда в колбах
Гидролизат кукурузной муки
200 г/л
Пептон из казеина
25,0 г/л
Экстракт дрожжей
12,5 г/л
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1,0 г/л
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
2,0 г/л
MgSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>O
0,5 г/л
ZnCl<sub>2</sub>
30 мг/л
CaCl<sub>2</sub>
20 мг/л
MnSO<sub>4</sub>×1Н<sub>2</sub>O
9 мг/л
FeSO<sub>4</sub>×7Н<sub>2</sub>O
3 мг/л
пенициллин
50000 IU/л
стрептомицин
50 мг/л
рН*
5,6
* устанавливают разбавленной серной кислотой
2
4
После прививки колбы инкубировали в увлажняемом шкафу-шейкере в течение 6 суток при 34°С в движении (170 об/мин). После прерывания ферментации активность фитазы определили с использованием фитиновой кислоты в качестве субстрата и на подходящем уровне активности фитазы (стандарт: 0,6 ЕД/мл) в буфере состава: 250 мМ уксусной кислоты /ацетата натрия/ Tween 20 (0,1 вес.%), рН 5,5. Тест был стандартизирован для применения на микротитровальных пластинах (МТР). 10 мкл раствора фермента смешали с 140 мкл 6,49 мМ раствора фитата в 250 мМ ацетатном буфере (ацетат натрия), рН 5,5 (фитат:додеканатриевая соль фитиновой кислоты). После одного часа инкубации при 37°С реакцию остановили добавлением равного объема (150 мкл) трихлоруксусной кислоты. Аликвоту этой смеси (20 мкл) перенесли в 280 мкл раствора, содержащего 0,32 N HSO, 0,27% масс. молибдата аммония и 1,08% масс. аскорбиновой кислоты. Затем инкубировали 25 минут при 50°С. Поглощение света синим раствором измеряли при длине волны 820 нм. Результаты представлены в таблице 8.
Таблица 8
Активность фитазы после прерывания ферментации
Колба
Активность фитазы [ЕД/мл]
1
569
2
696
Контроль
393