Штамм вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота Dermatitis nodularis bovum, рода Capripoxvirus для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота
STRAIN OF NODULAR DERMATITIS VIRUS OF CATTLE DERMATITIS NODULARIS BOVUM, GENUS CAPRIPOXVIRUS TO PRODUCE BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSIS AND SPECIFIC PREVENTION OF NODULAR DERMATITIS OF CATTLE

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму нодулярного дерматита (НД) КРС, который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота.
Нодулярный дерматит (узелковый дерматит, кожно-узелковая сыпь, лоскутная болезнь кожи, кожная бугорчатка, Dermatitis nodularis bovum, Lumpy Skin Disease) - контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся персистентной лихорадкой, поражением лимфатической системы, отеками подкожной клетчатки внутренних органов, образованием кожных узлов (бугорков), поражением глаз и слизистых оболочек органов дыхания и пищеварения [1, 2, 8].
Возбудитель - ДНК-содержащий оболочечный вирус, имеет антигенной родство со штаммами вирусов, вызывающих оспу у овец и коз, которые отличаются на генетическом уровне, и вместе с ним образуют самостоятельный род Capripoxvirus семейства Poxviridae [2,8].
Вирусы рода Capripoxvirus имеют кирпичеобразную форму размером 300×270×200 нм. В центре вириона находится нуклеотид, содержащий ДНК. К нему прилегают боковые тела, придающие нуклеотиду вид гантели, и наружная двухслойная оболочка. Геном состоит из 150÷160 тыс. пар нуклеотидов. ДНК не обладает инфекционностью; 88% массы вириона составляют белки, 5% - ДНК, 4% - липиды и 3% - углеводы [2].
Нодулярный дерматит относят к особо опасным болезням животных, способным вызывать эпизоотии и наносить значительный экономический ущерб. В соответствии с новой классификацией он включен в список болезней МЭБ, подлежащих обязательному уведомлению (нотификации), в категорию «Болезни и инфекции крупного рогатого скота» [3, 4, 6].
В настоящее время заболевание встречается в 34 странах Африки и Азии. По официальным сводкам МЭБ за три года (с 2013 по 2015 г.) это заболевание широко распространилось в странах Ближнего Востока. По данным национальных ветеринарных служб в 2014 г. заболевание КРС ВНД было выявлено в Турции - 230 очагов, Ливане - 32, Азербайджане и Ираке - по 16, Египте и Иране - по 6 очагов. В 2014-2015 г. болезнь была диагностирована на Кипре и в Греции [4, 6].
В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данному заболеванию. Однако в 2015 г. первые случаи нодулярного дерматита в России были зарегистрированы на территории Республики Дагестан и Чеченской Республики. Это обстоятельство указывает на то, что угроза возникновения заболевания в других регионах Северного Кавказа и его дальнейшее распространение в Российской Федерации крайне велика и может способствовать серьезным социально-экономическим последствиям для отечественного животноводства [4, 6].
В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудитель нодулярного дерматита и быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство требует постоянных поисков новых штаммов, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВНД КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.
Указанная задача решена получением штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 (авторское наименование), используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма ВНД КРС/Дагестан/2015, был выделен в 2015 г. от коров, больных нодулярным дерматитом КРС на территории Республики Дагестан.
Для получения штамма ВНД КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали субкультуру тестикул ягненка (ТЯ) и перевиваемую линию культуры клеток яичников домашней козы (ЯДК-04) [5], как высокочувствительные к ВНД КРС. В результате проведения серии последовательных пассажей изолята на данных культурах клеток был получен штамм ВНД КРС/Дагестан/2015, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления средств диагностики и специфической профилактики нодулярного дерматита КРС.
50
3
Накопление вируса штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 в культурах клеток ТЯ и ЯДК-04 обеспечивалось на уровне от 4,5 до 5,5 lg ТЦД/см.
Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 депонирован 28 марта 2016 г. в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой) - ВНД КРС/Дагестан/2015 (диагностический).
Сущность изобретения пояснена на графических изображениях, на которых:
Фиг. 1 - представлено положение штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 на филогенетическом древе каприпоксвирусов (дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей фрагмента открытой рамки считывания 026 (ОРС-026));
Фиг. 2 - монослой незараженной культуры клеток ЯДК-04 (контроль культуры клеток);
Фиг. 3 - клетки монослоя культуры клеток ЯДК-04, после инфицирования ВНД КРС через 48 ч;
Фиг. 4 - монослой незараженной культуры клеток ТЯ (контроль культуры клеток);
Фиг. 5 - клетки монослоя культуры клеток ТЯ, после инфицирования ВНД КРС через 48 ч.
Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 относится к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus, виду Dermatitis nodularis bovum (лат.) или Lumpy Skin Disease (англ.) и обладает морфологическими признаками, характерными для представителей каприпоквирусов: вирионы кирпичеобразной формы, имеют двойную липидную оболочку, плотную сердцевину и боковые тельца.
Антигенные свойства
Антигенные свойства, вариабельность и родство ВНД полностью не изучены. В антигеном отношении ВНД родственен вирусу оспы овец и оспы коз. В реакции нейтрализации в культуре клеток показать существенное отличие вируса оспы овец от ВНД штамма Neethling не удается [7].
У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в ИФА и РМН. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в РМН на культуре клеток ЯДК-04.
Введение штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 крупному рогатому скоту сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:64.
При гипериммунизации морских свинок и кроликов концентрированный антиген ВНД штамм Дагестан/2015 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РМН в титре 1:128÷1:512 или в ИФА в разведении 1:640÷1:2560.
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 проявляет высокую биологическую, антигенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 репродуцируется в монослойных культурах клеток: ТЯ и ЯДК-04, в которых в течение 2÷3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 4,5 lg ТЦД/см. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Генотаксономическая характеристика
Геном вируса имеет двухспиральную линейную молекулу ДНК, содержащую 150÷160 тыс. пар нуклеотидов. ДНК не обладает инфекционностью. В составе вирионов обнаружено более 100 полипептидов. Белки составляют 88% массы вириона, 5% - ДНК, 4% - липиды и 3% - углеводы.
Физические свойства
3
Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см. Наиболее стабилен при рН 6,6÷8,6.
Устойчивость к внешним факторам
Вирус стабилен в окружающей среде при комнатной температуре с сохранением инфекционной активности до 18 дн, в пораженных участках кожи - не менее 33 дн, в слюне - 11 дн, сперме быков - 22 дн, в культуре клеток при 4°С÷6 мес. Показывает незначительное снижение титра при 37°С в течение 5 дн, переносит 3-кратное замораживание и оттаивание, чувствителен к эфиру, хлороформу, высокой температуре. Сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет при температуре минус 80°С.
Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, в культурах клеток ТЯ и ЯДК-04. В процессе адаптации было установлено, что культуры клеток ТЯ и ЯДК-04 высокочувствительны к ВНД и оказались оптимальными культурами для получения расплодки штамма.
В дальнейшем, для получения расплодки, вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 20°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса микротитрованием в культуре клеток ЯДК-04.
3
-1
-7
3
3
Титрование проводили в стерильных 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах в объеме 0,2 см/лунку. Предварительно готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала на среде ПСП, начиная с 10 до 10. Подготовленные разведения вируса переносили, начиная с наивысшего разведения, в культуральные планшеты по 0,1 см. К полученным разведениям вируса добавляли по 0,1 см клеточной суспензии ЯДК-04 на среде ПСП с содержанием 1÷2% фетальной сыворотки КРС.
2
2
50
3
Планшет закрывали крышкой, помещали в CO - инкубатор с содержанием 5% CO при температуре 37°С и вели наблюдения с использованием инвертируемого микроскопа. Заключительный учет результатов титрования вируса проводили через 96-120 ч инкубирования при условии сохранения целостности монослоя клеток в контрольных лунках. Расчет инфекционной активности проводили по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД/см.
50
3
Биологическая активность штамма ВНД/Дагестан/2015 при титровании в культуре клеток ЯДК-04 составила 5,03 ТЦД/см. Результаты представлены в таблице 1.
Проявление ЦПД в КК ЯДК-04 характеризовалось образованием большого числа округлых клеток. К 96 ч культивирования большая часть клеток отслаивалась от стекла и деградировала до детрита, а не разрушенные пораженные клетки собирались в крупные конгломераты (фиг.2, фиг.3).
При последовательной репродукции ВНД в КК ТЯ через 24 ч после заражения в монослое отмечали появление веретенообразных клеток, которые позже округлялись и через 48-72 ч в большей части отслаивались от стекла (фиг. 4, фиг. 5).
Контроль стабильности штамма определяли в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ЯДК-04 и ТЯ. Результаты изучения стабильности штамма по его биологической активности в течение 5 пассажей представлены в таблице 2.
50
50
3
3
В ходе проведенных исследований установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 в течение 5 последовательных пассажей в культурах клеток ЯДК-04 и ТЯ проявлял стабильную биологическую активность, которая находилась в пределах 5,0-5,17 lg ТЦД/см и 5,0-5,5 ТЦД/см соответственно.
Пример 2
Контроль отсутствия контаминации бактериями, грибами и микоплазмами (микробиологическими методами).
Для проведения испытания на стерильность использовали 5 флаконов с образцом исследуемого штамма ВНД КРС/Дагестан/2015. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами проводили в соответствии с ГОСТ 28085-13 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности».
3
Содержимое флаконов растворяли в стерильном физиологическом растворе до первоначального объема перед лиофилизацией (2 см), т.е. ресуспензировали.
3
3
3
Суспензию из каждого флакона по 1 см высевали в 3 пробирки с тиогликолевой средой. Две засеянные пробирки выдерживали в термостате в течение 14 суток: одну - при 21÷22°С, другую - при 37°С, а третью  выдерживали в течение 7 суток при (37±0,5)°С. Затем из нее делали пересев по 0,5 см по одной пробирке на следующие среды: МПА, МППБ, МПБ, Сабуро жидкий и по 1 см на МППБ.
Пересевы на МПА, МПБ, МППБ выдерживали еще в течение 7 суток при 37°С, а пересев на Сабуро - при 21÷22°С.
При микробиологическом испытании образца штамма проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в термостате в течение 14 суток при 37°С, со средой Сабуро - при 21÷22°С.
3
3
Для исключения контаминации микоплазмами суспензию образца штамма по 0,5 см высевали в пробирку, содержащую 4,5 см жидкой среды Каган 0,3%, и выдерживали в термостате при 37°С.
При отсутствии роста микоплазм в течение 7 суток на жидкой среде (сохранение цвета индикатора) далее через каждые 7 суток проводили 2 последовательных пассажа на твердую среду Каган 1,3%.
При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте образца штамма.
В результате исследований установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 не контамирован бактериями, грибами и микоплазмами.
Высевы ресуспензированного образца штамма вируса на соответствующие питательные среды были без проростов в течение всех сроков наблюдения.
Пример 3
Получение антигена ВНД КРС.
3
3
50
Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х флаконов штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (2 см), тщательно перемешивали и объединяли. Двухсуточную культуру клеток ЯДК-04 или ТЯ, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражали в дозе 0,3÷0,5 lg ТЦД/см. Матрасы помещали на один час в термостат при температуре 37°С для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносили поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергали двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.
Полученную вирусную суспензию использовали в качестве матровой расплодки, которой заражали клинские матрасы с культурой клеток ЯДК-04 или ТЯ, как описано выше. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя культуральные матрасы подвергали двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.
Вируссодержащую культуральную жидкость очищали от балластных белков и фрагментов клеток низкоскоростным центрифугированием при 4800 g в течение 40 минут.
Полученную осветленную надосадочную жидкость центрифугировали при 45000 g в течение 120 минут, после чего надосадочную жидкость удаляли, а осадок суспендировали в 10 мл буферном растворе TNE и подвергали дальнейшему центрифугированию через слой 30% сахарозы при 10600 g в течение 180 минут. Полученный осадок ресуспендировали в TNE буферном растворе в соотношении 1/100 от начального объема.
Полученный данным способом антиген использовали в серологических реакциях для определения уровня антител к ВНД КРС, а также для изготовления диагностических сывороток.
3
Результаты исследований, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 3, получен антиген с активностью в культуре клеток 6,0 lg ТЦД/см, в ИФА 1:640.
Пример 4
Получение гипериммунной сыворотки.
Штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 используют для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для оценки иммунобиологических свойств ВНД КРС, а также контроля качества антигенного сырья, используемого при производстве диагностических препаратов.
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный антиген ВНД КРС, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 производства фирмы "SEPPIC"(в соотношении 1:1).
3
Кроликов иммунизировали в дозе 2 см трехкратно по схеме:
1) в мякиши задних конечностей;
2) через 7÷10 дней после первой иммунизации в подколенные лимфоузлы;
3) через 21 день после первой - внутримышечно.
3
Морских свинок иммунизировали полученной эмульсией в дозе 1 см в заднебедренную группу мышц. Инъекцию повторяли через 7, 14, 21 день, меняя при этом место введения.
Через 10÷15 дней после окончания гипериммунизации доноров обескровливали и получали сыворотку крови для исследования на наличие антител. Титр антител определяли в РМН и ИФА.
Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 4, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.
Пример 5
Контроль специфичности штамма в реакции микронейтрализации (РМН).
Для проведения РМН использовали гипериммунные сыворотки крови кроликов, полученные на штамм ВНД КРС/Дагестан/2015. В качестве тест-системы использовали суспензию перевиваемой культуры клеток ЯДК-04.
Постановку РМН проводили в 96-луночных планшетах, используя штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 в последовательных десятикратных разведениях и гипериммунную сыворотку крови кроликов с постоянной дозой. В качестве контроля использовали нормальную сыворотку крови кроликов. Реакцию учитывали через 5÷6 суток по мере развития цитопатического действия вируса в контрольных лунках, не содержащих исследуемые сыворотки. Титром вируса считали предельное ее разведение, тормозящее развитие цитопатического действия вируса в 50% зараженных лунок с культурой клеток. Индекс нейтрализации рассчитывали по стандартной формуле [2]. Результаты представлены в таблице 5.
-1
-3
3
3
50
50
Из данных таблицы 5 видно, что цитопатический эффект вируса со специфической сывороткой крови кроликов наблюдали в разведениях вируса от 10 до 10, титр вируса составлял 2,05 lg ТЦД/см. В лунках, куда вносили вирус с нормальной сывороткой, титр вируса составлял 5,00 lg ТЦД/см.
50
3
Индекс нейтрализации составил 2,44 lg ТЦД/см, что свидетельствует о том, что тип исследуемого вируса соответствует типу специфической сыворотки.
Пример 6
Антигенную активность штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 определяли на 5 быках. Для этого использовали суспензию патологического материала (нодулы), полученные от КРС, а также суспензию вируса, полученную после проведения 4-х пассажей на культуре клеток ТЯ.
3
3
Суспензию патологического материала приготавливали стандартным способом и вводили внутрикожно в области средней трети шеи первому животному 5,0, второму 10,0 см. В дальнейшем двум другим животным вводили культуральную вируссодержащую суспензию в области средней трети шеи с обеих сторон: первому животному по 5,0 см, второму по 10,0 см. Также проводили внутривенное заражение одного животного культуральной суспензией.
До введения вируса, через 14, 21, 28 день после введения вируссодержащей суспензии у животных отбирали кровь для определения титра вируснейтрализующих антител в сыворотке крови.
За зараженными животными наблюдали в течение 28 суток. При этом ежедневно регистрировали клинические признаки проявления данного заболевания и проводили отбор проб биоматериала.
50
2
3
Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РМН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 lg ТЦД/см. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в CO-инкубаторе при температуре 37°С в течение одного часа.
2
2
После часового контакта во все лунки планшета вносили суспензию культуры клеток ЯДК-04 и помещали в CO-инкубатор с содержанием 5% CO при температуре 37°С на 96-120 ч. Наблюдения проводили с использованием инвертируемого микроскопа, регистрируя лунки с выраженным ЦПД вируса и/или с цельным неповрежденным монослоем.
При постановке РМН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 6. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:4÷1:64.
Пример 7
Идентификация и филогенетическое родство штамма (ПЦР). Видовая принадлежность штамма ВНД КРС/Дагестан/2015 к вирусу нодулярного дерматита подтверждена методом видовой дифференциации каприпоксвирусов, основанном на ПЦР. Из вируссодержащего материала штамма ВНД КРС выделяли ДНК. Проводили мультиплексную ПЦР с тремя парами праймеров, специфичными для ВНД, вируса оспы овец (BOO) и вируса оспы коз (ВОК). В результате филогенетического анализа был получен специфический фрагмент ДНК длиной 254 пары нуклеотидов с праймерами, специфичными для ВНД. С двумя другими парами праймеров, специфичными для BOO и ВОК, в ПЦР был получен отрицательный результат.
Вместе с этим было установлено, что штамм ВНД КРС/Дагестан/2015 без контаминации другими штаммами/изолятами вирусов рода Capripoxvirus.
Источники информации1. Гуненков В.В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота // Сборник науч. тр. ВГНКИ. - М, 2005. - Т. 66. - С.46-54.
2. Инфекционная патология животных / Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонов, Е.С. Воронина // М.: Академкнига, 2006. - Т. 1. -С.782-786.
3. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ / Т.1. - 23 изд. - Paris, 2014. - Гл. 1.2. Критерии включения болезней, инфекций и инфестаций в список МЭБ. - С.5.
4. Официальный сайт Международного эпизоотического бюро (МЭБ) - URL: http://www.oie.int/eng/info/
5. Пат. РФ 235537, МПК C12N 5/06 Линия клеток яичников домашней Capra hircus L. ЯДК-04 для репродукции вирусов животных / Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Дьяконов Л.П., Груздев К.Н., Захаров В.М., Манин Б.Л. - №2006114337/13; заявл. 26.04.2006, опубл. 10.10.2008
6. Россельхознадзор / Официальный сайт федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. - URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/foreign.html
7. Evaluation of different diagnostic methods for diagnosis of lumpy skin diseases in cows / W.S. Awad, A.K. Ibrahim, K. Mahran [et al.] // Trop.Anim. Health. Prod. - 2010. - Vol.42. - P. 777-783.
8. Weiss K.E. Lumpy skin disease // Virol. Monogr. - Vienna, New York, 1968.-Vol. 3.- P. 111-131.