Способ прижизненной дифференциальной диагностики туберкулёза и микобактериозов крупного рогатого скота
METHOD OF LIFETIME DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF BOVINE TUBERCULOSIS AND MYCOBACTERIOSES

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного (ХЛ) анализа в ветеринарии, медицине, экологии.
В ветеринарии предлагаемый способ можно использовать как дополнительный в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий в хозяйствах с неясной эпизоотической ситуацией по туберкулезу крупного рогатого скота, но с перманентным выявлением положительно реагирующих на ППД-туберкулин (протеинпурифиеддериват, культуральный фильтрат туберкулезных микобактерий) животных.
Известна симультанная аллергическая проба для дифференциации специфических и параспецифических реакций у крупного рогатого скота, сенсибилизированных комплексом авиум-интрацеллюларе или атипичными микобактериями. Эта проба также используется для диагностики при первичной постановке диагноза и контроля за благополучием животных. Симультанная аллергическая проба заключается в одновременном введении животным двух аллергенов - ППД-туберкулина для млекопитающих в стандартном растворе и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) и определения достоверности различия в интенсивности (степени проявления) реакций на эти аллергены (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002, с. 12-13, 18).
Известен также пальпебральный метод туберкулинизации для дифференциации специфических и параспецифических реакций при первичной постановке диагноза. Крупному рогатому скоту туберкулин вводят пальпебрально (в толщу нижнего века). Учет и оценку реакции проводят через 72 часа после введения препарата. Оценку реакции проводят визуально, сравнивают веки в месте введения туберкулина и без введения туберкулина (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002, с. 22).
Недостатками обоих методов является длительность постановки диагноза-учет реакции только через 72 часа. Также аллергены, в этих методах, используют только in vivo.
Наиболее близким техническим решением является изобретение «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (см. патент РФ №2563617 от 25 августа 2015 г., G01N 33/49, G 21/76). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.
Данный способ применяется для диагностики туберкулеза, поэтому он не позволяет с высокой степенью эффективности дифференцировать сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями животных от больных туберкулезом.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение достоверности прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий, что позволит ускорить постановку предварительного диагноза (до контрольно-диагностического убоя) и предотвратит необоснованный убой животных.
Заявленный технический результат способа прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используют сыворотку от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с неясной эпизоотической ситуацией по туберкулезу, в качестве основного индуктора используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), а в качестве дополнительного используют аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР).
КАМ - комплексный аллерген из атипичных микобактерий M.smegmatis, M.fortuitum, M.intracellularae, М. Scrofulaceum. Используется in vivo в симультанной аллергической пробе с ППД-туберкулином для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием животных по туберкулезу в хозяйствах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией атипичными микобактериями (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002, с. 12-18). Представляет собой белковые фракции, выделенные из культуральной жидкости скотохромогенных и нефотохромогенных атипичных микобактерий, выращенных на синтетической питательной среде (Интернет: tandem-industry.ru/catalog?id=2494), (Наставление по применению сухого очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий в симультанной аллергической пробе при диагностике туберкулеза у животных (Утверждено Главным управлением ветеринарии с Государственной ветеринарной инспекцией Государственного агропромышленного комитета СССР от 24.041986 г.). Выпускается ФГУП "Курская биофабрика».
Аллерген туберкулезный рекомбинантный "ДИАСКИНТЕСТ" Аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) изготовлен ЗАО «Фармацевтическая фирма "Лекко" (Россия) по генно-инженерной технологии и применяется в медицинской практике для диагностики туберкулеза, оценки активности процесса и выявления лиц с высоким риском развития активного туберкулеза, для дифференциальной диагностики туберкулеза, дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинальной аллергии, оценки эффективности противотуберкулезного течения в комплексе с другими методами.
Аллерген туберкулезный рекомбинантный АТР в стандартном разведении представляет собой рекомбинантный белок, продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21 (DE3)/PCFP-ESAT, разведенный в стерильном изотоническом фосфатном буфере, с консервантом. Препарат содержит два связанных между собой антигена CFP10 и ESAT6, присутствующих в вирулентных штаммах микобактерий туберкулеза и отсутствующих в вакцинном штамме БЦЖ (Рекомендации по применению аллергена туберкулезного рекомбинантного в стандартном разведении (раствора для внутрикожного введения), приказ №855 от 29 октября 2009 г., Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации).
Иммунологические свойства. Действие препарата аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) основано на выявлении клеточного иммунного ответа на специфические для Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis антигены.
ППД-туберкулин для млекопитающих. Интернет-сайт: nt-kursk.ru. ППД-туберкулин изготовлен из белковой фракции продуктов роста и термического разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида на синтетической питательной среде. Основная фракция - белок (73-90%), полисахариды, нуклеиновые кислоты, до 11% - липиды. Белок состоит из 18 аминокислот (В.П. Шишков, В.П. Урбан. Туберкулез сельскохозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, 1991, с. 87-90. - Научные труды ВАСХНИЛ)
Предназначен для аллергической диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота, верблюдов, буйволов, оленей, свиней, коз, овец и других млекопитающих. Выпускается ФГУП "Курская биофабрика».
Приготовление люминола - люминол-гидразид - 3 - фталевой кислоты), 40 мг люминола растворяли горячим (~95-98°С) раствором 0,01 Н NaOH на дезинтеграторе MSE при амплитуде 16 microns до получения прозрачного раствора, в течение 7-10 мин. Определяли рН 7,2 и доводили общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.
Приготовление индукторов - комплексного аллергена из атипичных микобактерий и аллергена туберкулезного рекомбинантного (разведения).
Готовили разведения согласно «Схема последовательного разведения сыворотки» (Ж. Ветеринарная лабораторная практика, 1963, Москва, Т. 1, с. 13).
Из таблицы 1 видно, что оптимальным для КАМ является разведение 1:50 для использования in vitro, для АТР оптимальным является стандартное разведение, применяемое in vivo, и способное индуцировать ХЛ in vitro.
Для регистрации спонтанной и индуцированной хемилюминесценции использовали иммунохимический анализатор «Флюорофот» (ООО «СКБ «ПРОБАНАУЧПРИБОР», Россия, г. Санкт-Петербург). Функционирование осуществляли под управлением подключаемой к анализатору ПЭВМ с программным управлением. Измеряли ХЛ монохроматического излучения находящейся в лунке жидкости (опытные и контрольные образцы), возникающего в результате химической реакции с участием люминофора фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) в режиме значений интенсивности хемилюминесценции.
Регистрацию проводили в цифровых показателях - единицы счета числа фотонов (условные единицы, у.е.) при длине волны λ 460, 545, 642 нм. При интерпретации полученных результатов учитывали степень превышения уровня свечения исследуемой пробы по сравнению с отрицательным контролем антигена.
Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с неясной эпизоотической ситуацией по туберкулезу, в частности, приграничных; получают сыворотку стандартным способом путем отстаивания крови в термостате, обводки образовавшегося сгустка и дальнейшего центрифугирования образовавшейся сыворотки. В качестве основного индуктора ХЛ используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), в качестве дополнительного - аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР), ППД-туберкулин используют в качестве положительного контроля антигенов.
В плоскодонный 96-луночный планшет последовательно добавляют:
20 мкл раствор люминола, 50 мкл сыворотки, по 50 мкл специфических индукторов - аллерген КАМ, аллерген туберкулезный рекомбинантный, 50 мкл ППД-туберкулина для млекопитающих и 50 мкл раствора Хэнкса без фенолового красного для отрицательного контроля антигена, с последующей регистрацией спонтанной и индуцированной ХЛ. Оценка результатов проводят в количественных (условных ед.) показателях.
Для выполнения поставленной задачи проведена серия экспериментов на морских свинках. При проведении экспериментов лабораторных животных содержат в условиях вивария, кормление осуществляют согласно «Правилам работы с использованием лабораторных животных» №755 от 12.08.1977 г.
Опыт 1. Объект исследований - пробы сыворотки крови от 36 морских свинок.
Опытную группу - морских свинок (30 голов), экспериментально заражают музейной культурой М. bovis штамм 8 в дозе 0,1 мг на 1 мл растворителя подкожно во внутреннюю часть бедра. Контрольной группе -здоровые морские свинки 6 голов - вводят физиологический раствор в дозе 1 мл подкожно.
Аллергические исследования ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 25 ME внутрикожно проводят перед заражением -отрицательный результат - отсутствие инфильтрата и гиперемии; на 13-й, 27-й, 44-й, 59-й, 74-й дни после заражения - положительный результат, зона инфильтрата и гиперемии ~5 мм. Учет аллергической реакции проводят через 48 час.
Забор крови проводят на 14-й, 28-й, 45-й, 60-й, 75-й дни после заражения.
При исследовании в ХЛ сыворотки крови зараженных животных во все сроки - индуцированная ХЛ с КАМ составила 6,25 условн.ед., что ниже значений отрицательного контроля спонтанной ХЛ - 10,0 условн.ед., положительный контроль с ППД - 31,25 условн.ед., показатели ХЛ исследуемых проб с аллергеном туберкулезным рекомбинантным - 36,5 условн.ед.
У здоровых животных в контрольной группе во все сроки исследований результат отрицательный на уровне отрицательного контроля.
При патологоанатомической экспертизе внутренних органов с 1-го срока и в последующие наблюдали картину нарастающего инфекционного процесса: в месте введения заражающей суспензии - инфильтраты, региональные лимфоузлы увеличены, в печени - мелкие очажки и очаги желтоватого цвета по всей поверхности глинистого цвета; в селезенке -выраженная зернистость, характерно - у всех животных в легких мелкие множественные и сливные очаги («мраморность») во все сроки, при этом животные не были истощены даже до 45-го дня эксперимента, были в удовлетворительном состоянии, лимфатические узлы находились в жировой капсуле, но в последующем туберкулезная интоксикация стала более выраженной - общее состояние ухудшилось, животные были истощены, в месте введения заражающей суспензии наблюдали абсцессы величиной с горох и боб с казеозно-некротическим содержимым.
Достоверность результатов ХЛ исследований в опытах подтверждена результатами бактериологических исследований - из биоматериала опытных морских свинок выделили исходную заражающую культуру во все сроки после заражения.
В результате ХЛ исследований сыворотки крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis штамм 8, установлено превышение уровня сверхслабого свечения опытных проб с аллергеном туберкулезным рекомбинантным над отрицательным контролем антигена в 3,0 и более раз во все сроки исследований, показатели с КАМ были на уровне отрицательного контроля (спонтанной ХЛ).
Результаты эксперимента показали, что чувствительность аллергена туберкулезного рекомбинантного при использовании in vitro в ХЛ во все сроки после заражения составила: на 14-й день - 80%, 28-й день - 80%, 45-й день - 60%), на 60-й день - 100%. Внутрикожная проба ППД была положительна с первого срока исследования после заражения.
Таким образом, аллерген туберкулезный рекомбинантный при использовании in vitro в ХЛ с сывороткой крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis, является специфичным, чувствительность составила 80%).
Опыт 2. Объект исследований - пробы сыворотки крови от 30 морских свинок, экспериментально зараженных атипичными микобактериями.
Опытные группы по 5 голов на 5 сроков взятия кров подкожно заражают музейной культурой атипичных микобактерий 4-й группы по классификации Раньона (M.smegmatis + М. phlei) в дозе 40 мг /гол. в 1 мл растворителя, контрольной группе (5 голов) вводят физиологический раствор в дозе 1 мл подкожно.
Аллергические исследования ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 25 ME внутрикожно проводят перед заражением -отрицательный результат;
на 13-й, 27-й, 44-й, 59-й, 74-й дни после заражения - положительный результат. Учет аллергической реакции через 24-48 час.
На 14-е, 28-е, 45-е, 60-е, 75-е сутки после заражения от каждой группы зараженных берут пробы крови, получают сыворотку с последующим исследованием в ХЛ реакции с аллергенами КАМ, АТР в стандартных разведениях.
При интерпретации полученных результатов учитывают степень превышения уровня свечения исследуемой пробы по сравнению с отрицательным контролем антигена.
При исследовании в ХЛ сыворотки крови зараженных животных во все сроки - спонтанная ХЛ (отрицательный контроль) - 1,28-1,43-1,93 условн.ед., индуцированная ХЛ с КАМ составила 10,77-16,4 условн.ед., показатели ХЛ исследуемых проб с аллергеном туберкулезным рекомбинантным - на уровне отрицательного контроля.
У здоровых животных значения ХЛ во все сроки были на уровне отрицательного контроля.
Таким образом, используемые аллергены являются специфичными и могут быть применены для дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий, способствуют повышению точности и достоверности дифференциальной диагностики, позволяют ускорить постановку предварительного диагноза уже до контрольно-диагностического убоя.
Пример 1. В научно-производственном опыте на крупном рогатом скоте проверена специфичность показаний ХЛ сыворотки с аллергеном туберкулезным рекомбинантным АТР и КАМ. Работа проведена в благополучных по туберкулезу хозяйствах, где перманентно выявляются положительно реагирующие на ППД-туберкулин коровы и нетели, одно из них - ЗАО «Солнцево» Исилькульского района Омской области, находится в приграничной зоне. В таблице 1 представлены результаты ХЛ исследований сыворотки крови крупного рогатого скота со специфическими индукторами КАМ и АТР.
Из таблицы 2 видно, что при исследовании 60 проб сыворотки крови крупного рогатого скота - интенсивность спонтанной ХЛ (отрицательный контроль) - 8,32-19,44 условн.ед., индуцированная ХЛ с КАМ составила 23,32-41,07 условн.ед., индуцированная с ППД (положительный контроль) 11,93-20,45; с АТР - 8,63-21,42.
То есть, показатели исследованных проб сыворотки с АТР из всех трех хозяйств находятся на уровне отрицательного контроля, с КАМ - показатели превышены в 3,8 раза у животных ЗАО «Неудачино», в ЗАО «Рассвет» - в 2,1 раза, что подтверждается выделением атипичных микобактерий 3 и 4 групп по Раньону при бактериологических исследованиях 26 проб послеубойного биоматериала на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л.
Культур патогенных микобактерий бычьего, человеческого, птичьего видов не выделено.
Отсутствие туберкулеза в данных хозяйствах также подтверждено отрицательными результатами биологической пробы на морских свинках. На основании проведенных комплексных ветеринарно-диагностических исследований в 2016 г. в данных хозяйствах туберкулез крупного рогатого скота исключен.
Таким образом, предлагаемый метод с аллергенами КАМ и АТР при использовании в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий способствует повышению достоверности прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов.
Пример 2. В научно-производственном опыте проверена диагностическая эффективность показаний ХЛ с КАМ и АТР. Для этого работа проведена в хозяйстве с неясной эпизоотической ситуацией по туберкулезу крупного рогатого скота. Данные представлены в таблице 3.
Из таблицы 3 видно, что в данном хозяйстве проведено 1958 исследований внутрикожной пробой ППД для млекопитающих. Положительно реагировали на внутрикожную пробу ППД 53 голов крупного рогатого скота, которые дополнительно были исследованы пальпебральной пробой. От всех положительно прореагировавших животных на внутрикожную реакцию ППД взяты пробы крови и исследованы в ХЛ с антигенами КАМ и АТР. С антигеном АТР - результат отрицательный во всех пробах, с антигеном КАМ в 39 - положительный.
Отсутствие туберкулеза в данном хозяйстве впоследствии подтверждено отрицательными результатами:
контрольно-диагностического убоя - при патологоанатомической экспертизе внутренних органов туберкулезных изменений не обнаружено;
биологической пробы на морских свинках;
при бактериологических исследованиях при посеве послеубойного материала на плотные питательные среды Фаст-3Л и Левенштейна-Йенсена микобактерий бычьего, человеческого, птичьего видов не выделено, выделены атипичные микобактерий 3 и 4 группы по Раньону; из проб кормов и от голубей, постоянно присутствующих на фермах, также выделены атипичные микобактерий 3 и 4 группы по Раньону.
Для дальнейшего хозяйственного использования сохранены 39 голов крупного рогатого скота.
Таким образом, аллергены КАМ и АТР при использовании их in vitro в ХЛ показали диагностическую эффективность - отрицательные результаты с АТР проб сывороток крови от положительно реагирующих на ППД-туберкулин животных, положительные результаты (71%) в ХЛ при использовании КАМ.
Использование предлагаемого способа в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий в хозяйствах с неясной эпизоотической ситуацией по туберкулезу, в частности, приграничных, позволит ускорить и повысить достоверность прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота, предотвратить необоснованный убой продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских и личных подсобных.