МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ВНЕПЕЧЕНОЧНЫХ ЖЕЛЧНЫХ ПУТЕЙ И СПОСОБЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ

1. Композиция, содержащая мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего, способные дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, причем клетки получают из ткани желчных путей млекопитающего.
2. Композиция по п.1, в которой мультипотентная стволовая клетка/клетка-предшественник представляет собой мультипотентную стволовую клетку.
3. Композиция по п.1, в которой эндоермальная клеточная линия представляет собой линию печеночных клеток, линию билиарных клеток, линию панкреатических клеток или их комбинацию.
4. Композиция по п.1, в которой ткань желчных путей представляет собой любую область желчных путей, включая ворота, общий печеночный проток, пузырный проток, общий проток, общий гепатопанкреатический проток и желчный пузырь.
5. Композиция по п.1, в которой млекопитающим является человек.
6. Композиция по п.5, в которой млекопитающее-человек представляет собой плод, новорожденного, ребенка, взрослого или умершего человека вплоть до момента 72 часа после смерти.
7. Композиция по п.6, в которой млекопитающее представляет собой умершего человека в пределах 10 часов после смерти.
8. Композиция по п.1, в которой ткань желчных путей содержит перибилиарные железы или клетки-предшественники или стволовые клетки перибилиарных желез.
9. Композиция по п.1, в которой ткань желчных путей имеет места, в которых желчные пути разветвляются.
10. Композиция по п.1, в которой мультипотентные клетки экспрессируют:
(i) по меньшей мере один маркер, характерный для линии печеночных клеток на ранней стадии;
(ii) по меньшей мере один маркер, характерный для линии панкреатических клеток на ранней стадии; и по меньшей мере один маркер, выбранный из категорий (а)-(в):
(а) по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках;
(б) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников; и
(в) ген плюрипотентности с экспрессией от слабой до умеренной.
11. Композиция по п.10, в которой по меньшей мере один маркер, характерный для линии печеночных клеток на ранней стадии, представляет собой HNF6, HES1, СК19, альбумин или альфа-фетопротеин (AFP).
12. Композиция по п.10, в которой по меньшей мере один маркер, характерный для линии панкреатических клеток на ранней стадии, представляет собой PDX1, PROX1, NGN3 или инсулин.
13. Композиция по п.10, в которой по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках, представляет собой CD133 (проминин), CD44H (рецептор гиалуронана), N- CAM, CXCR4 или ЕрСАМ.
14. Композиция по п.10, в которой по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников, представляет собой SOX 9, SOX17 или FOXA2.
15. Композиция по п.10, в которой ген плюрипотентности представляет собой SOX2, NANOG, KLF4, OCT4A или OCT4.
16. Композиция по п.1, в которой мультипотентные клетки экспрессируют:
(i) по меньшей мере один маркер, характерный для линии печеночных клеток на ранней стадии;
(ii) по меньшей мере один маркер, характерный для линии панкреатических клеток на ранней стадии;
(iii) по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках;
(iv) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников; и
(v) ген плюрипотентности с экспрессией от слабой до умеренной.
17. Композиция по п.1, в которой мультипотентные клетки осуществляют экспрессию по меньшей мере одного из нижеприведенных элементов:
(i) ядерную экспрессию белка теломеразы;
(ii) экспрессию от низкой до умеренной генов плюрипотентности;
(iii) ядерную или околоядерную экспрессию классических эндодермальных транскрипционных факторов;
(iv) экспрессию поверхностных маркеров эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников;
(v) отсутствие экспрессии или экспрессия (от низкой до переменной) маркеров линии зрелых печеночных клеток, зрелых клеток желчного протока или зрелых клеток эндокринной части поджелудочной железы;
(vi) отсутствие экспрессии маркеров мезенхимальных клеток, эндотелиальных клеток или гемопоэтических клеток.
18. Композиция по п.10, в которой по поверхностные маркеры, находящиеся на эндодермальных стволовых клетках/клетках-предшественниках, включают CD326/молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), CD56/молекулу клеточной адгезии нервных клеток (NCAM); CD 133 (проминин), CD44H (рецептор гиалуронана), CXCR4 или их комбинации.
19. Композиция по п.10, в которой классические эндодермальные транскрипционные факторы включают SOX17, SOX 9, FOXA2, HES1, HNF6, PROX1, HNF3B (гепатоцитарный ядерный фактор -3В, FOXA2), SALL4 (подобный белок sal-4), PDX1, NGN3 или их комбинации.
20. Композиция по п.10, в которой маркеры линии зрелых печеночных клеток включают Р450- 3А4, трансферрин, тирозин аминотрансферазу (TAT) и высокие уровни альбумина; маркеры линии зрелых клеток желчного протока включают АЕ2, CFTR, рецептор секретина, аквапорины или их комбинацию, и маркеры линии зрелых клеток поджелудочной железы включают высокие уровни инсулина, глюкагон, соматостатин, амилазу или их комбинации.
21. Композиция по п.10, в которой маркеры мезенхимальных клеток включают CD146, десмин, альфа- актин гладких мышц (ASMA) или их комбинации; маркеры эндотелиальных клеток включают рецептор VEGF, CD31, фактор фон Виллебранда или их комбинации; и типовой маркер гемопоэтических клеток представляет собой CD45.
22. Композиция по п.10, в которой экспрессию определяют ОТ-ПЦР анализом с определением по конечной точке и количественным ОТ-ПЦР анализом и/или иммуногистохимическим анализом ткани in vivo, свежевыделенных клеток, или культивированных клеток.
23. Композиция по п.10, в которой ткань желчных путей включает пузырный проток, ворота, общий печеночный проток, общий гепатопанкреатический проток, желчный пузырь и любые участки желчных путей, соединяющие их, или их комбинации.
24. Композиция по п.10, в которой ткань желчных путей включает места разветвления желчных путей.
25. Композиция, содержащая популяцию клеток, включающую мультипотентные стволовые/клетки-предшественники клетки млекопитающего по п.1.
26. Композиция, содержащая популяцию клеток, обогащенную мультипотентными стволовыми клетками/клетками-предшественниками млекопитающего по п.1.
27. Способ получения мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, способных дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, причем клетки получают из ткани желчных путей млекопитающего, включающий получение ткани желчных путей, и последовательно, в любом порядке, или по существу одновременно, получение клеток, позитивных:
(i) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии печеночных клеток на ранней стадии;
(ii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии панкреатических клеток на ранней стадии; и, необязательно,
по меньшей мере по одному маркеру, выбранному из категорий (а)-(в):
(а) по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках;
(б) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников; и
(в) ген плюрипотентности с экспрессией от слабой до умеренной.
28. Способ по п.27, в котором выделение осуществляют способом иммуноселекции и/или в селективных условиях культивирования.
29. Способ по п.28, в котором способ иммуноселекции включает пэннинг, селекцию с помощью магнитных гранул, проточную цитометрию или их комбинации.
30. Способ по п.29, в котором способ иммуноселекции представляет собой проточную цитометрию.
31. Способ по п.28, в котором селективные условия культивирования включают посев клеток на пластике, на гиалуронанах или на пластике, необязательно покрытом коллагеном IV, коллагеном III, ламинином, гиалуронанами, другими компонентами матрикса из эмбриональных, фетальных тканей, тканей новорожденных или их комбинаций.
32. Способ по п.28, дополнительно включающий инкубацию клеток в бессывороточной среде, содержащей минимальную среду с низким содержанием кальция, не содержащей меди и дополненной инсулином, трансферрином/Fe, селеном, цинком, свободными жирными кислотами, связанными с сывороточным альбумином, и, необязательно, липопротеином высокой плотности.
33. Способ по п.32, в котором минимальная среда представляет собой RPMI 1640.
34. Способ по п.32, в котором минимальная среда содержит менее 0.5 мМ кальция.
35. Способ по п.28, в котором клетки культивируют в течение 7 дней- 21 дня или дольше.
36. Способ по п.27, в котором ткань желчных путей включает ворота, общий печеночный проток, пузырный проток, общий проток, общий гепатопанкреатический проток и желчный пузырь или их комбинации.
37. Способ по п.27, в котором ткань желчных путей взята из мест, в которых желчные пути разветвляется или содержит большое число перибилиарных желез.
38. Способ идентификации и выделения популяции мультипотентных клеток млекопитающего, содержащей мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники, способные дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, причем клетки получают из ткани желчных путей млекопитающего, включающий получение ткани желчных путей, а затем последовательно, в любом порядке, или по существу одновременно, получение клеток, позитивных:
(i) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии печеночных клеток на ранней стадии;
(ii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии панкреатических клеток на ранней стадии; и
по меньшей мере по одному маркеру, выбранному из категорий (а) - (в):
(а) по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках;
(б) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток / клеток-предшественников; и
(в) ген плюрипотентности с экспрессией от слабой до умеренной.
39. Способ идентификации и выделения популяции мультипотентных клеток млекопитающего, обогащенной мультипотентными стволовыми клетками/клетками-предшественниками млекопитающего по п.1, включающий получение ткани билиарного дерева, и затем последовательно, в любом порядке, или по существу одновременно, получение клеток, позитивных:
(i) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии печеночных клеток на ранних стадиях;
(ii) по меньшей мере по одному маркеру, характерному для линии панкреатических клеток на ранних стадиях; и
по меньшей мере по одному маркеру, выбранному из категорий (а)-(в):
(а) по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках;
(б) по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток /клеток-предшественников; и
(в) ген плюрипотентности с экспрессией от слабой до умеренной.
40. Способ по п.38 или 39, в котором по меньшей мере один маркер, характерный для линии печеночных клеток на ранних стадиях, представляет собой HNF6, HES1, СК19, альбумин или AFP.
41. Способ по п.38 или 39, в котором по меньшей мере один маркер, характерный для линии панкреатических клеток на ранних стадиях, представляет собой PDX1, PROX1, NGN3 или инсулин.
42. Способ по п.38 или 39, в котором по меньшей мере один поверхностный маркер, находящийся на стволовых клетках/клетках-предшественниках, представляет собой CD 133 (проминин), CD44H (рецептор гиалурона), N- CAM, CXCR4 или ЕрСАМ.
43. Способ по п.38 или 39, в котором по меньшей мере один транскрипционный фактор, характерный для эндодермальных стволовых клеток/клеток-предшественников представляет собой SOX 9, SOX17 или FOXA2.
44. Способ по п.38 или 39, в котором ген плюрипотентности представляет собой SOX2, NANOG, KLF4, ОСТ4А или ОСТ4.
45. Способ выращивания и/или размножения мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего по п.1 или популяции, содержащей такие клетки или обогащенной такими клетками, включающий: культивирование клеток на пластике или гиалуронанах, или, необязательно, на пластике, покрытом коллагеном типа III или IV, или гиалуронаном, или другим компонентом матрикса из фетальной ткани, ткани новорожденных или эмбриональной ткани, и в минимальной среде, не содержащей меди, с низким содержанием кальция (<0.5 мМ), содержащей инсулин, трансферрин/Fe, смесь свободных жирных кислот, связанных с сывороточным альбумином, и, необязательно, липопротеин высокой плотности.
46. Способ выращивания и/или размножения клеток- партнеров мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего по п.1, включающий: культивирование клеток на пластике или гиалуронанах, или, необязательно, на пластике, покрытом коллагеном типа III или IV, или гиалуронаном, или другим компонентом матрикса из фетальной ткани, ткани новорожденных или эмбриональной ткани, и в минимальной среде, не содержащей меди, с низким содержанием кальция (<0.5 мМ), содержащей инсулин, трансферрин/Fe, смесь свободных жирных кислот, связанных с сывороточным альбумином, и, необязательно, липопротеин высокой плотности, причем такие клетки-партнеры включают мезенхимальные клетки, ангиобласты и звездчатые клетки или клетки-предшественники.
47. Способ линиеспецифической рестрикции мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, способных дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, и/или популяций мультипотентных клеток, содержащих такие мультипотентные стволовые клетки /клетки-предшественники млекопитающего или обогащенных такими клетками, по печеночным клеткам, который включает:
(а) получение клеточной суспензии, содержащей мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего, способные дифференцироваться в несколько линий эндодермальных клеток, причем клетки получают из ткани желчных путей млекопитающего;
(б) включение клеточной суспензии в гидрогель, содержащий гиалуронан или гиалуронан в смеси с другими компонентами матрикса; и
(в) культивирование клеточной суспензии в минимальной среде, дополненной медью, кальцием (≥0.5 мМ), инсулином, трансферрином/Fe, bFGF, гидрокортизоном, глюкагоном, галактозой, трийодтироксином (Т3), эпидермальным фактором роста (EGF), фактором роста гепатоцитов (HGF), липопротеином высокой плотности и смесью свободных жирных кислот, связанных с альбумином, в течение времени, достаточного для их дифференцировки в печеночные клетки.
48. Способ по п.47, в котором другие компоненты матрикса включают коллаген типа IV, ламинин или и то, и другое.
49. Способ по п.47, в котором культивирование проводят в течение 7-14 дней.
50. Способ линиеспецифической рестрикции мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, способных дифференцироваться в несколько эндодермальных клеточных линий, и/или популяций мультипотентных клеток, содержащих такие мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего или обогащенных такими клетками, по панкреатическим клеткам, который включает:
(а) получение клеточной суспензии, содержащей мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего, способные дифференцироваться в несколько линий эндодермальных клеток, причем клетки получают из ткани отделов желчных путей млекопитающего;
(б) включение клеточной суспензии в гидрогель, содержащий гиалуронаны или гиалуронаны в смеси с другими компонентами матрикса; и
(в) культивирование клеточной суспензии в минимальной среде, дополненной медью, кальцием (≥0.5 мМ), В27, аскорбиновой кислотой, инсулином, трансферрином/Fe, bFGF, циклопамином, ретиноевой кислотой, эксендином 4, липопротеином высокой плотности и смесью свободных жирных кислот, связанных с альбумином; и не содержащей гидрокортизон, в течение времени, достаточного для их дифференцировки в панкреатические клетки.
51. Способ по п.50, в котором другие компоненты матрикса включают коллаген типа IV, ламинин или и то, и другое.
52. Способ линиеспецифической рестрикции мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего, способных дифференцироваться в несколько линий эндодермальных клеток, и/или популяций мультипотентных клеток, содержащих такие мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего или обогащенных такими клетками, по клеткам желчных путей, который включает:
(а) получение клеточной суспензии, содержащей мультипотентные стволовые клетки/клетки-предшественники млекопитающего, способные дифференцироваться в различные линии эндодермальных клеток, причем клетки получают из ткани отделов желчных путей млекопитающего;
(б) включение клеточной суспензии в гидрогель, содержащий гиалуронаны или гиалуронаны в смеси с другими компонентами матрикса; и
(в) культивирование клеток в минимальной среде, дополненной медью, кальцием (≥0.5 мМ), инсулином, трансферрином/Fe, гидрокортизоном, bFGF, фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактором роста гепатоцитов (HGF), липопротеином высокой плотности и смесью свободных жирных кислот, связанных с альбумином, в течение времени, достаточного для их дифференцировки в холангиоциты.
53. Способ по п.52, в котором клетки желчных путей представляют собой холангиоциты.
54. Способ по п.52, в котором другие компоненты матрикса включают коллаген типа I.
55. Способ дифференцировки клеток in vivo, включающий трансплантацию мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего по п.1, или популяций, содержащих такие клетки или обогащенных такими клетками, in vivo в виде клеточных суспензий, или имплантатов, или графтов, с предварительной линиеспецифической рестрикцией или без предварительной линиеспецифической рестрикции в подходящих условиях культивирования, в печень, где они дифференцируются в печеночную ткань.
56. Способ дифференцировки клеток in vivo, включающий трансплантацию мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего по п.1, или популяций, содержащих такие клетки или обогащенных такими клетками, in vivo в виде клеточных суспензий, или имплантатов, или графтов, с предварительной линиеспецифической рестрикцией или без предварительной линиеспецифической рестрикции в подходящих условиях культивирования, в желчный проток, где они дифференцируются в ткань желчных путей.
57. Способ дифференцировки клеток in vivo, включающий трансплантацию мультипотентных стволовых клеток/клеток-предшественников млекопитающего по п.1, популяций, содержащих такие клетки или обогащенных такими клетками, in vivo в виде клеточных суспензий, или имплантатов, или графтов, с предварительной линиеспецифической рестрикцией или без предварительной линиеспецифической рестрикции в подходящих условиях культивирования, в поджелудочную железу, под почечную капсулу или в эпидидимальное жировое тело, где они дифференцируются в функциональную ткань поджелудочной железы.