ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К β-ЛАКТАМАМ ПАТОГЕНОВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(от мутного, серозно-гнойного до прозрачного, серозного), появление ярко-красных мелкозернистых грануляций, уменьшение признаков индуративного целлюлита без дополнительного лечения. К 5 суткам отмечалось очищения язвенной поверхности, активизации процессов грануляции и эпителизации. Дно ТЯ было заполнено сочными грануляциями.

В первой и второй возрастных группах пациентов, в лечении которых использовался левосин, очищение трофической язвы наступало к 6-7 суткам. На фоне грануляционной ткани, выполняющей язвенную поверхность, отмечалась краевая эпителизация. В третьей возрастной группе пациентов у 4 больных (36,36%) на фоне грануляций отмечались на отдельных участках - налеты фибрина.

У пациентов, в лечении которых использовался мирамистин, полное очищения трофической язвы наступило к 7 суткам только у

6 больных первой возрастной группы, что составило 54,54%. Во второй и третьей возрастных группах пациентов полного очищения ТЯНК и купирования признаков воспаления не происходило. На фоне грануляционной ткани отмечались тонкие фибриноидные наложения. У отдельных больных сохранялась умеренная экссудация.

Таким образом, проведенное клиническое исследование показало, что томицид является эффективным средством при лечении венозных трофических язв в 1-11 фазы раневого процесса. В сравнении с левосином и мира-мистином, применение томицида позволило достоверно эффективнее сократить площадь и объем язвенного дефекта.

Вероятно, это объясняется тем, что помимо антибактериального и гиперосмолярного эффекта томицид обладает еще и местным

иммуномодулирующим действием [5]. Он стимулирует выход из кровеносного русла фагоцитирующих клеток, что способствует сокращению сроков очищения трофической язвы от некротизированных масс и более быстрому переходу в фазы грануляции и эпи-телизации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Васютков В.Я., Проценко Н.В. Трофические язвы стопы и голени. - М.: Медицина. -1993. - 160 с.

2. ГуревичД.В. Производство консервативное и современное // Фармацевтический вестник. -2004. - № 14. - С. 12.

3. Лазаренко В.А., Калуцкий П.В., Хруслов М.В., Иванов А.В. Способ оценки эффективности лечения венозных трофических язв // Курский научн.-практ. вестн. "Человек и его здоровье". - 2008. - № 3. - С. 130-134.

4. Липницкий Е.М. Лечение трофических язв нижних конечностей. - М.: Медицина, 2001. -160 с.

5. Стойко Ю.М., Шайдаков Е.В., Ермаков Н.А. Комплексное лечение хронической венозной недостаточности нижних конечностей в стадии трофических расстройств // Consilium medicum. Хирургия. - 2001. - Прил. -С. 28-31.

6. Cornwall S.V., Dore C.Y., Levis J.D. Leg ulcers: epidemiology band actiology // Br. J. Surg. -1986.- N 9. - P.693-696.

7. Ditrichova D., Kolarova H. Vynziti helium-neonoveho laseru v lecbe vredu dolnich konce-tin // Ces. dermatol. - 1988. - Vol. 63, N 2. -P.77-85.

8. Rucley СУ. Socioeconomic impact of chronic venous infficiency and leg ulcer // Angiolog. -1997. - N 48. - P. 67-69.

9. Stacey M.C., Baker S.R. Epidemiology of chronic venous ulcers // Eur. Journ. Angiology. - 1991. -Vol. 3. - P. 171.

УДК 615.33:616-022.7

ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К р-ЛАКТАМАМ ПАТОГЕНОВ ВНУТРИБОЛЬНИЧНЫХ

ИНФЕКЦИЙ

© Миронов А.Ю., * Крапивина И.В., **Иванов Д.В., **Мудрак Д.Е.

Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва;

*

детская городская клиническая больница № 9 им. Г.Н. Сперанского, Москва;

Г осударственный научный центр по антибиотикам, Москва

E-mail: profmironov@mmascience.ru

На основании данных локального микробиологического мониторинга изучены профили и механизмы резистентности к Р-лактамным антибиотикам изолятов грамотрицательных микроорганизмов, патогенов ВБИ в ОРИТ и отделениях хирургического профиля стационара. В исследование включены 210 клинических изолятов патогенов ВБИ. Pseudomonas aeruginosa - 86 (40,9%), Acinetobacter baumannii - 45 (21,4%), Klebsiellaрneumoniae - 52 (24,8%), Escherichia coli - 23 (11,0%), Enterobacter spp. - 4 (1,9%). Изучены профили антибиотикорезистентности методом серийных микроразведений и проведена детекция методом ПЦР и секвенирования наиболее распространенных и клинически значимых генов Р-лактамаз грамотрицательных микроорганизмов. Наибольшей активностью обладают карбапенемы и цефаперазон/сульбактам. Выявлены локальные особенности распространения генов, кодирующих Р-лактамазы (ТЕМ, SHV, CTX) у K. рneumoniae и E. coli. Выявлены 11 изолятов P. aeruginosa, устойчивых к карбапенемам, у которых подтверждено наличие генетических детерминант, относящихся к VIM-группе, кодирующих металло-бета-лактамазы. Приведённые данные позволяют оценить показатели резистентности к Р-лактамным антибиотикам, основные механизмы устойчивости возбудителей нозокомиальных инфекций. Такие исследования являются уникальными для каждого ОРИТ, из них необходимо брать основную концепцию этиотропной и эмпирической терапии.

Ключевые слова: ВБИ, антибиотикорезистентность, грамотрицательные микроорганизмы.

PHENOTYPIC AND GENETIC STUDY OF ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY AND MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO B-LACTAMS OF MICROBIAL PATHOGENS OF

NOSOCOMIAL INFECTIONS

Mironov А. Yu., Krapivina I. V., Ivanov D. V., Mudrak D.E.

Microbiology, Virology and Immunology Department of the I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow;

G.N. Speransky Municipal Children’s Clinical Hospital N 9, Moscow;

National Research Center of Antibiotics, Moscow On the basis of the data of local microbiological monitoring the profiles and mechanisms of resistance to P-lactam antibiotics оf gram-negative microorganism isolates, microbial pathogens of nosocomial infections have been studied in the Intensive Care Unit and surgical department. 210 clinical isolates of microorganisms causing nosocomial infections were included in the research. Among them were: 86 (40,9%) - Pseudomonas aeruginosa, 45 (21,4%) - Acinetobacter baummanii, 52 (24,8%) - Klebsiella pneumoniae, 23 (11,0%) - Escherichia coli, 4 (1,9%) - Enterobacter spp.The profiles of antimicrobial resistance were studied by the method of serial microcultivations and the detection by PCR-method and sequencing of the most widespread and clinically significant genes of P-lactamases of gram-negative microorganisms were performed. Carbapenems and cephaperason/sulbactam possess the maximum activity. The local features of distribution of the genes coding p-lactamases (TEM, SHV, and CTX) in K. pneumoniae and E. coli were revealed. 11 isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems, in which the presence of genetic determinants concerning the VIM-group coding metallo-beta-lactamases was confirmed, have been revealed. The data obtained allow us to estimate the parameters of resistance to P-lactam antibiotics, the basic mechanisms of stability of nosocomial infective microbial pathogens. Such researches are unique for every Intensive Care Units and the basic concept of etiotropic and empirical therapy has to be taken as priority. Keywords: nosocomial infections, antimicrobial resistance, gram-negative microorganisms.

Внутрибольничные инфекции (ВБИ) остаются одной из острейших проблем в современном здравоохранении во всём мире. Несмотря на противоэпидемические мероприятия, частота их возникновения, летальность от них и стоимость терапии ВБИ продолжают возрастать [14]. В основном это связано с ростом и распространением нозокомиальных возбудителей, резистентных к антимикробным препаратам, что является серьёзным фактором, как влияющим на клинический исход, так и приводящим к значительному увеличению затрат на лечение инфекций [14, 19].

ВБИ увеличивают длительность госпитализации, ухудшают прогноз больных, снижают эффективность антибактериальной терапии, ухудшают эпидемиологическую ситуацию в плане распространения в стационаре резистентных штаммов бактерий. Для совершенствования борьбы с ВБИ под руководством академика РАМН В.И. Покровского разработана и принята Минздравом РФ в 1999 г. "Концепция профилактики внутрибольничных инфекций" [3]. Одним из основных положений её является определение уровня резистентности патогенов ВБИ.

Антибактериальная терапия ВБИ основана в большинстве случаев на эмпирическом подходе, особенно до получения результатов микробиологического исследования. В этом случае необходимы знания о приоритетных патогенах определённых нозологических форм инфекционных осложнений, спектре природной активности антибиотиков и приобретённой резистентности в данном регионе и конкретном стационаре.

В этиологической структуре ВБИ ведущая роль принадлежит грамотрицательным микроорганизмам, в частности энтеробактериям и неферментирующим грамотрицательным бактериям. Для этих микроорганизмов характерны множественные и сложные механизмы резистентности к антибиотикам, формирование в процессе лечения множественной лекарственной устойчивости, что усложняет выбор рациональной антибиотикотерапии.

В клинике основную проблему составляют грамотрицательные патогены, продуцирующие Р-лактамазы. Среди них наибольшие трудности для лечения инфекционных осложнений создают Р-лактамазы расширен-

ного спектра действия и металло-Р-лактамазы (MBL). Именно производство грамотрица-тельными микроорганизмами этих ферментов обусловливает неэффективность целой группы антибиотиков - Р-лактамов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании данных локального микробиологического мониторинга в исследование включены 210 штаммов наиболее часто выделяемых грамотрицательных бактерий. Материал получен от 174 больных с подозрением на ВБИ и 9 смывов с объектов окружающей среды из хирургических отделений и отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского г. Москвы в период с 2003 г. по 2005 г. Из них: 86 штаммов (40,9%) - Pseudomonas aeruginosa, 45 штаммов (21,4%) -

Acinetobacter baumannii, 52 штамма (24,8%) -Klebsiella рпеитотае, 23 штамма (11,0%) -Escherichia coli, 4 штамма (1,9%) -

Enterobacter spp.

Материалом для микробиологических исследований являлись: отделяемое раневых поверхностей, патологическое отделяемое дренажей при абдоминальных инфекциях, трахеобронхиальный аспират, кровь, смывы с поверхностей окружающей среды.

Идентификация выделенных культур и

определение чувствительности к антибактериальным препаратам проводилась с помощью автоматических анализаторов Vitek 32 и ATB Еxpression, "BioMerieux" (Франция). Для дальнейшего изучения штаммов грамотрица-тельных бактерий, подозрительных по фенотипу на продукцию Р-лактамаз расширенного спектра действия (ESBL) и металло-Р-

лактамаз (MBL), проводилась оценка их ан-тибиотикочувствительности методом серийных микроразведений в ионосбалансированном бульоне Мюллера-Хинтона (Becton Dickinson, США) в соответствии с критериями CLSI (ранее NCCLS) [15, 16]. Чувствительность к антибактериальным препаратам энтеробактерий определялась к ампициллину, ампициллин/сульбактаму, цефокситину, це-фотаксиму, цефтазидиму, цефтазидиму с добавлением клавулановой кислоты в концентрации 4 мкг/мл, цефоперазону, цефопера-

зон/сульбактаму, цефепиму, имипенему, ме-ропенему. Антибиотикочувствительность грамотрицательных неферментирующих бактерий определялась к следующим антибактериальным препаратам: цефтазидим, цефопе-разон, цефоперазон/сульбактам, цефепим, имипенем, меропенем. Устойчивые к имипе-нему и/или меропенему штаммы P. aeruginosa являлись подозрительными на продукцию MBL. Продукция MBL класса В данными штаммами синегнойной палочки изучалась в подтверждающем тесте - "метод двойных дисков" (double-disk approximation test) с ингибитором металло-Р-лактамаз -ЭДТА. Для контроля качества постановки теста чувствительности к антибиотикам использовались референтные штаммы E. coli АТСС 25922, E. coli АТСС 700603 и P. aeruginosa АТСС 27853.

Штаммы энтеробактерий с подтвержён-ным ESBL-фенотипом включили в исследование методом ПЦР для детекции наиболее распространенных и клинически значимых генов Р-лактамаз молекулярного класса А (TEM, SHV, CTX), а изоляты P. aeruginosa с выявленным синергизмом карбапенема и ЭДТА - для детекции генов MBL молекулярного класса В (VIM, IMP, SPM, GIM) [1, 8, 13]. ПЦР проводили в ПЦР-пробирках на 0,6 мл (QSP, США) в объёме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: ^Taq ДНК полимеразный буфер, 1 ЕД Taq ДНК полимераза (СибЭнзим, Россия), 200 мкмоль дезокси-нуклиотидов трифосфатов по 15 пмоль прямого и обратного праймера (табл. 1, 2) и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификация проводилась в амплификаторе "Терцик" (ДНК-Технология, Россия) по стандартному протоколу [6].

Минисеквенирование Р-лактамаз ТЕМ-типа проводили в ПЦР пробирках на 0,6 мл в объёме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 66 мМ трис-HCL (pH=9.0, "Sigma", США); 25 мМ магния хлорида ("Sigma", США); 16 мМ аммония сернокислого ("Sigma", США); 0,1% раствор желатина;

0,05% раствор твин-20 ("Sigma", США); 5% глицерин; раствор дезоксинуклеотидтрифос-фатов (НТФ) (НПО "Вектор", Новосибирск), концентрация каждого дНТФ - 250 мкМ; 1 ед. Taq-полимеразы (НПФ "Литех", г. Москва); по 20 пмоль прямого и обратного

праймера (ТЕМ-fw и TEM-rev) и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе PTC-240 DNA Engine Tetrad2 ("MJ Research Bio-Rad", США) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 минут при 940С, затем 35 циклов амплификации

(30 секунд денатурация при 940С, 10 секунд отжиг праймеров при 550С, 20 секунд элонгация при 720С). Анализ продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле.

Для дефосфорилирования 5'-концевых фосфатных групп dNTP, продукты амплификации гена ТЕМ инкубировали с 0,5 ед. фос-фатазы арктических креветок ("Promega", США) в течение 30 минут при 370С с последующей инактивацией фермента прогреванием в течение 10 минут 850С.

Реакцию термоциклического минисекве-нирования проводили в реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl pH 9,0; 16,6 мM (NH4)2SO4;

2,5 hM MgCl2; по 0,2 мМ необходимых dNTP и/или ddNTP; по 40 пмоль каждого праймера (табл. 3) и 2 ед. TermiPol DNA Polymerase ("Solis Biodyne", Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты гена ТЕМ. Наработку продуктов минисе-квенирования осуществляли по профилю: 940С - 20 сек, 490С - 20 сек, 720С - 20 сек, 70 циклов, в амплификаторе DNA Engine Tetrad™ ("MJ Research", США). Очистку продуктов минисеквенирования проводили с помощью SpectroCLEAN Kit ("Sequenom", США) согласно инструкции фирмы-производителя. Аликвоту образца (0,2-1 мкл), полученного после процедуры очистки, наносили на высушенную на мишени AnchorChip (400 мкм, "Bruker Daltonics", Германия) матрицу, приготовленную из насыщенного раствора 3-гидроксипиколиновой кислоты ("Fluka", Германия) в 50% ацетонитриле ("Merck", Германия) с добавлением 10 г/л цитрата аммония двухосновного ("Fluka", Германия) и высушивали на воздухе. Все использованные растворители, включая воду ("Merck", Германия), были только аналитической чистоты или специальные для масс-спектрометрии. Масс-спектрометрический анализ осуществляли с помощью MALDI ToF масс-спектрометра Microflex ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенного азотным лазером (А,=337 нм) с частотой импульсов до

20 Гц. Для записи, обработки и анализа масс- спектров использовали программное обеспе-

Таблица 1

Праймеры, использованные для детекции генов Р-лактамаз класса А у штаммов энтеробактерий, выделенных при ВБИ в хирургических отделениях и ОРИТ ДГКБ № 9 г. Москвы

Мишень Праймер Последовательность праймера

TEM TEM-F AAACGCTGGTGAAAGTA 774 2S0-295 AY62S199

TEM-R TAATCAGTGAGGCACCTATCTC 1032-1053

SHV SHV-F TTATCTCCCTGTTAGCCACC 731 193-212 AY223S63

SHV-R TGCTTTGTTATTCGGGCCAA 903-922

CTX-M CTX-M-F ATGTGCAGTACCAGTAAGGTGATGGC 53S 210-235 Y14156

CTX-M-R GCGATATCGTTGGTGGTGCC 729-74S

CTX- M1group CTX-M1-F AAATCACTGCGTCAGTTCACGC S64 б04-б25 AJ416340

CTX-M1-R CAAACCGTTGGTGACGAT 1450-14б7

CTX- M2group CTX-M2-F ATGATGACTCAGAGCATTCG S69 1-20 AB176535

CTX-M2-R CCGTGGGTTACGATTTTCGC S50-S69

CTX- MSgroup CTX-MS-F ATGATGAGACATCGCGTTAA S70 274-293 AF1S9721

CTX-MS-R TCCGTCGGTGACGATTTTCGCG 1122-1143

CTX- M9group CTX-M9-F ATGGTGACAAAGAGAGTGC S69 б33б-б354 AF174129

CTX-M9-R CCTTCGGCGATGATTCTCGC 71S5-7204

CTX- M25group CTX-M25-F ATGATGAGAAAAAGCGTAAG S69 2321-2340 AF51S567

CTX-M25-R CCGTCGGTGACAATTCTGGC 3170-31S9

Таблица 2

Праймеры, использованные для детекции методом ПЦР генов карбапенемаз молекулярного

подкласса ВІ-VIM, IMP, SPM и GIM

Ген- мишень Праймер Последовательность нуклеотидов

VIM VIM-F ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG 781 29б9- 2989 EF614235 5б

VIM-R CTACTCAACGACTGAGCG 3733- 3750

IMP IMP-F ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC 5бб 1251- 1270 EF375699 5б

IMP-R ACAACCAGTTTTGCCTTACC 1797- 1817

SPM SPM-F GCGTTTTGTTTGTTGCTC 800 2335- 2352 AY341249 5б

SPM-R TTGGGGATGTGAGACTAC 3118- 3135

GIM GIM-F AGAACCTTGACCGAACGCAG 5б

GIM-R ACTCATGACTCCTCACGAGG

чение фирмы "Bruker Daltonics" (Германия): flexControl 2.4 (Build 38) и flexAnalysis 2.4 (Build 11).

Секвенирование Р-лактамаз SHV-типа проводили в ПЦР-пробирках G,6 в объёме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 66 мМ трис-HCL (pH=9.0, "Sigma", США); 25 мМ магния хлорида ("Sigma", США);

16 мМ аммония сернокислого ("Sigma", США); G,1% раствор желатина; G,G5% раствор твин-20 ("Sigma", США); 5% глицерин; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов

(НТФ) (НПО "Вектор", Новосибирск), концентрация каждого дНТФ - 25G цМ; 1 ед. Taq-полимеразы (НПФ "Литех", г. Москва),

по 10 пмоль прямого и обратного праймера и 5 мкл раствора матрицы ДНК. Амплифи-

Таблица 3

Праймеры, использованные для минисеквенирования генов Р-лактамаз ТЕМ-типа

Олигонуклеотид Последовательность

TEM-Fw ATAAAATTCTTGAAGACGAAA

TEM-Rew GACAGTTACCAATGCTTAATCA

238TemF1 ATTGCTGATAAATCTGGA

238TemF2 TGCTGATAAATCTGGAGCC

238TemF3 CTGAT AAAT CTGGAACC

238TemR1 GATACCGCGAGATCCACGCT

238TemR2 ATACCGCGAGACCCACGCT

TEM164f ATCATGTAACCCGCCTTGAT

TEM164f1 ATGTAACCCGCCTTGATA

TEM164r TCAGCTCCGGTTCCCAA

TEM104f CTCAGAATGACTTGGTT

Таблица 4

Праймеры, использованные для секвенирования генов Р-лактамаз SHV-типа

Олигонуклеотид Последовательность

SHV intF TTGACCGCTGGGAAACGGAA

SHV intR CGGCGAGTAGTCCACCAGA

SHV-F GTATTATCTCCCTGTTAGCC

SHV-R GCAGCACGGAGCGGATCAACG

кацию проводили в амплификаторе PTC-240 DNA Engine Tetrad2 ("MJ Research Bio-Rad", США) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 минут при 940С, затем 35 циклов амплификации (30 секунд денатурация при 940С, 10 секунд отжиг праймеров при 600С, 20 секунд элонгация при 720С).

Анализ продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле. Для дефосфорили-рования 5'-концевых фосфатных групп dNTP, продукты амплификации гена SHV инкубировали с 0,5 ед. фосфатазы арктических креветок ("Promega", США) в течение 30 минут при 370С с последующей инактивацией фермента прогреванием в течение 10 минут 85 0С. Реакцию термоциклического секвенирования проводили в реакционной смеси: 66 мМ Tris-HCl pH 9,0; 16,6 mM (NHO2SO4;

2,5 mM MgCl2; по 0,2 мМ необходимых ddNTP; по 3 пмоль каждого праймера (табл. 4) и 2 ед. TermiPol DNA Polymerase ("Solis Biodyne", Эстония), используя в качестве матрицы амплифицированные фрагменты гена SHV. Наработку продуктов минисе-квенирования осуществляли по профилю: 940С - 30 сек, 550С - 20 сек, 600С - 4 мин, / 25 циклов, в амплификаторе DNA Engine

Tetrad™ ("MJ Research", США). Определение нуклеотидной последовательности гена SHV проводили с использованием прибора ABI Prism 3100 Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США; "Hitachi" Япония) в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Полноразмерную последовательность SHV гена получали путём склеивания нуклеотидных фрагментов А, В, C и D с использованием программного продукта "Vector NTI Suite v. 9" ("Informax Inc", США).

Результаты статистически обработаны с помощью компьютерной программы WHO-NET 5.0. и Excel (Microsoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По данным локального микробиологического мониторинга, грамотрицательные микроорганизмы занимают лидирующую позицию в развитии госпитальных инфекционных осложнений у больных ОРИТ в ДГКБ № 9 (рис. 1). Среди всех микроорганизмов их доля составляет 49%. Проведённый микробиологический мониторинг показал, что в видовом составе приоритетными патогенами среди

грамотрицательных микроорганизмов явля-

ются: Pseudomonas aeruginosa, A. baumannii,

10%

49%

Грам

микроорганизмы

Q Грам

микроорганизмы

Грибы

Рис. 1. Частота выделения патогенов ВБИ в ДГКБ N° 9 в 2GG3-2GG5 гг.

S.saprophyticus S.maltophiliae Candida spp. Enterobacter spp. S.epidermidis C.albicans K.pneumoniae A.baumannii E.coli S.auerus P.aeruginosa Enterococcus spp.

15%

15%

18%

Рис. 2. Видовой состав патогенов ВБИ в ОРИТ ДГКБ М 9 в 2GG3-2GG5 гг.

E. coli, K. рneumoniae, Enterobacter spp. (рис. 2).

Наибольшая частота случаев ВБИ регистрируется в ожоговых ОРИТ - 64%, реже в общехирургических ОРИТ (28-31%) [18].

Специфика изученных нозологических форм указывает на преобладание больных с диагнозом "ожоговая травма".

Исследования показали, что синегнойная палочка является наиболее частым патогеном

ВБИ среди грамотрицательных бактерий. Штаммы P. aeruginosa обладают множеством механизмов резистентности к антимикробным препаратам. Поэтому особенностью этого микроорганизма является непредсказуемость фенотипа, что значительно затрудняет выбор оптимальной антибактериальной терапии. По некоторым данным, активность Р-лактамных антибиотиков (не учитывая кар-бапенемов) убывает в следующем порядке:

цефепим, цефалоспорины III поколения (це-фтазидим, цефоперазон) [4]. Наши данные подтверждают это. Антибактериальная активность обоих препаратов (имипенем и ме-ропенем) была одинаковой (65,1% чувствительных штаммов). Карбапенемы обладают наибольшей активностью из всех Р-лактамных антибиотиков в отношении штаммов P. Aeruginosa, т.к. имеют небольшую молекулярную массу, легко диффундируют через клеточную стенку микроба за счёт наличия в их молекуле двух противоположных электрических зарядов, и обладают улучшенными фармакодинамическими и фармакокинетическими свойствами [4]. Из цефалоспо-ринов III и IV поколений самым активным препаратом был ингибиторозащищённый це-фоперазон - цефоперазон/сульбактам (66,4% чувствительных штаммов). К цефтазидиму чувствительны 51,2% штаммов P. aeruginosa, а к цефоперазону всего лишь 43%. Относительно неплохую активность показал цефепим (58,1% чувствительных штаммов).

Наибольшей активностью среди антибиотиков в отношении штаммов A. baumannii обладают карбапенемы (100%) и цефопера-зон/сульбактам (95,6%).

K. рneumoniae является одним из ведущих возбудителей ВБИ. Они вызывают от 2 до 20% всех случаев ВБИ [17]. Из всех механизмов антибиотикорезистентности для K. рпеи-moniae самым важным является продукция ESBL, которые разрушают все Р-лактамные антибиотки, за исключением цефамицинов (цефокситин) и карбапенемов. В целом по РФ 39% клебсиелл продуцируют ESBL, хотя в отдельных стационарах частота выделения продуцентов среди бактерий рода Klebsiella возрастает до 79% [10]. По данным многоцентрового исследования "Micromax", проведенного в ОРИТ стационаров города Москвы в 1999 году, частота продукции ESBL у Klebsiella spp. колебалась в пределах от 0 до 93%, у E. coli - от 8 до 48% [9]. Штаммы K. рпеитотае отличались высокой резистентностью к ампициллину - 97,7%, ингибиторозащищённому ампициллину - ампицил лин/сульбактаму - 84,1%, цефалоспоринам III-IV поколений (к цефоперазону - 86,4%, цефотаксиму - 72,7%, цефтазидиму - 43,2%, цефепиму - 40,9%). При очень низкой активности цефоперазона, цефоперазон/сульбак-

там, напротив, показал высокую активность -75% чувствительных к нему штаммов K. рпеитотае. Низкая активность цефалос-поринов III-IV поколений даёт возможность предположить наличие среди исследованных штаммов клебсиелл продуцентов ESBL. Среди 52 штаммов 48 (92%) имели сниженную чувствительность (МПК>2 мкг/мл) хотя бы к одному из цефалоспоринов III поколения.

Используя фенотипический тест для подтверждения продукции ESBL, выявлено, что 41 из 52 (79%) исследуемых штаммов клеб-сиелл являются потенциальными продуцентами ESBL. Кроме продукции ESBL, важным механизмом, обусловливающим резистентность к цефалоспоринам, является гиперпродукция хромосомных Р-лактамаз класса С. Признаком продукции Р-лактамаз класса С является устойчивость к цефокситину. Устойчивость к цефокситину выявлена у 18 штаммов (34,6%) K. pneumoniae.

Штаммы E. coli отличались высокой резистентностью к ампициллину - 94,7%, ингибиторозащищённому ампициллину - ампицил-лину/сульбактаму - 36,8% резистентных и 47,4% умеренно-резистентных штаммов и цефалоспоринам III поколения (цефотакси-му - 52,6%; цефоперазону - 73,7% устойчивых штаммов). Активность цефтазидима и цефепима была выше и составила 57,9% и 78,9% чувствительных штаммов E. coli соответственно. Использование фенотипического метода подтверждения продукции ESBL выявило 18 (78%) штаммов E. coli, потенциально продуцирующих ферменты данного типа. Устойчивость к цефокситину выявлена у

7 (30,4%) из всех изученных штаммов E. coli. Все штаммы E. coli чувствительны к кар-бапенемам.

Детекция генов, кодирующих продукцию ESBL, проводилась методом ПЦР. Для исследования взяты 79 штаммов грамотрицатель-ных бактерий с подтверждённым ESBL-фенотипом (K. рпеитотае - 52, E. coli - 23 и Enterobacter spp. - 4). Наличие генов наиболее распространённых групп Р-лактамаз (ТЕМ, SHV, CTX) подтверждено у 54 штаммов (68,4%).

Гены, кодирующие Р-лактамазы ТЕМ-1 групп, обнаружены у 48 изолятов энтеробактерий: у 34

штаммов K. рneumoniae, у 12 (52,2% от числа

всех кишечных палочек) штаммов E. coli, у 2

Рис. 3. Продуценты и непродуценты ESBL среди штаммов рода Klebsiella, выделенных при ВБИ в хирургических отделениях и ОРИТ ДГКБ № 9 г. Москвы.

%

25

20

15

10

5-\

0

.N*'' .NX к*

Г-Ч

\* .is - Х° чх S>

&

Рис. 4. Частота встречаемости генов наиболее распространённых Р-лактамаз среди штаммов ^ рпеитотае, выделенных при ВБИ в хирургических отделениях и ОРИТ ДГКБ № 9 г. Москвы.

(5G% от числа всех энтеробактеров) штаммов Enterobacter spp.

Гены, кодирующие Р-лактамазы SHV-групп, обнаружены у 38 изолятов энтеробактерий. Из них 31 штамм продуцирует Р-лактамазы SHV-1 типа (29 штаммов K. рneumoniae и 2 Enterobacter spp.) и 7 штаммов Р-лактамазы расширенного спектра действия (у K. рneumoniae: SHV-11 - 4 штамма, SHV-12 - 1 штамм, SHV-5 - 1 штамм; у E. coli SHV-2a - 1 штамм).

Гены, кодирующие Р-лактамазы CTX-групп, обнаружены у 44 изолятов энтеробактерий, причём также осуществлялась детекция подгрупп ферментов типа CTX: СТХ-М1 обнаружены у 28 (53,8% от числа всех клеб-сиелл) штаммов K. рneumoniae, 11 (47,8% от числа всех кишечных палочек) штаммов E. coli, 2 (5G% от числа всех энтеробактеров) штаммов Enterobacter spp. Гены ферментов подгруппы СТХ-М9 выявлены у 3 (5,8% от

числа всех клебсиелл) штаммов ^ рпеитопіае.

В ходе исследования гены всех трёх основных групп Р-лактамаз обнаружены у энтеробактерий как в изолированном виде, так и в различных комбинациях.

Большинство исследованных штаммов, выделенных из патологического материала при ВБИ, содержат гены, кодирующие продукцию одновременно Р-лактамаз широкого и расширенного спектра действия.

Представительство Р-лактамаз распределилось следующим образом. Из 52 штаммов К. рпеитопіае гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра действия, выявлены у 37 изолятов (71,2%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаруже-

ны у 32 штаммов, что составляет 61,5% (рис. 3). У 29 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра и ESBL-ферменты. Распределение генов Р-лактамаз у клебсиелл представлено на рис. 4.

Из 23 штаммов E. тН гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия, выявлены у 12 штаммов (52,2%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаружены у 12 штаммов, что составляет 52,2% (рис. 5). У 6 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие Р-лактамазы широкого спектра и ESBL-ферменты. Распределение генов ESBL-ферментов у кишечных палочек представлено на рис. 6.

47,8%

Рис. 5. Продуценты и непродуценты ESBL среди штаммов E. coli, выделенных при ВБИ в хирургических отделениях и ОРИТ ДГКБ № 9 г. Москвы.

TEM-1 SHV-2A CTX-M1 TEM-1+CTX-M1

Рис. 6. Частота встречаемости генов наиболее распространённых р-лактамаз среди штаммов E. шИ, выделенных при ВБИ в хирургических отделениях и ОРИТ ДГКБ № 9 г. Москвы.

Из 4 штаммов Enterobacter spp. гены, кодирующие продукцию Р-лактамаз широкого спектра действия выявлены у 3 штаммов (75%). Гены, кодирующие продукцию ESBL-ферментов, обнаружены у 2, что составляет 5G%. У 2 штаммов одновременно обнаружены гены, кодирующие и Р-лактамазы широкого спектра, и ESBL-ферменты. Гены ESBL-ферментов у энтеробактеров представлены ферментами СТХ-М1 группы.

Отобраны изоляты P. aeruginosa со сниженной активностью и устойчивые к кар-бапенемам (имипенему и/или меропенему). Таких штаммов синегнойной палочки, подозрительных на продукцию ферментов MBL, оказалось 23 (26,7%). Затем с этими изолята-ми провели подтверждающий фенотипический тест на выявление у них продукции ферментов MBL класса В. Тестирование выполнено методом "двойных дисков": диски с имипенемом, меропенемом и ингибитором металло-бета-лактамаз класса В - ЭДТА [8]. В результате исследований из 86 штаммов P. aeruginosa у 11 (12,8%) фенотипически доказана выработка ферментов металло-бета-лактамаз класса В.

Генотипическую детекцию ферментов ме-талло-бета-лактамаз класса В (VIM, IMP, SPM и GIM-групп) проводили методом ПЦР. У всех 11 штаммов P. aeruginosa с доказанным фенотипом выявлено наличие генов ме-талло-бета-лактамаз группы VIM.

Таким образом, на основании проведённых исследований можно сделать следующие выводы:

1. Приоритетными патогенами ВБИ в ОРИТ ДГКБ М 9 среди грамотрицательных бактерий являются, A. baumannii, E. coli, K. рneumoniae, Enterobacter spp.

2. Среди изученных антибактериальных препаратов карбапенемы обладают наибольшей активностью по отношению ко всем видам изученных микроорганизмов. Высокая активность наблюдалась у цефоперазон/суль-бактама, цефепима, амикацина, ципрофлок-сацина.

3. Фенотипический скриниг выявил 12,8% штаммов P. aeruginosa, подозрительных на выработку энзимов MBL класса В,

79% подозрительных на продукцию ESBL K. pneumoniae и 78% штаммов E. coli.

4. Генотипирование доказало наличие MBL VIM-группы у 12,8% штаммов P. aeruginosa.

5. Среди K. pneumoniae подтверждено наличие генов ESBL у 61,5% штаммов. Наиболее часто встречалась комбинация генов, кодирующих ESBL типа SHV-1, ТЕМ-1 и ESBL-ферменты подгруппы СТХ-М1, в 23,1% случаев.

6. Среди E. coli подтверждено наличие ESBL-ферментов у 52,2% штаммов. Наиболее часто у E. coli встречаются ферменты Р-лак-тамаз широкого спектра ТЕМ-1 типа и его комбинация с ESBL СТХ-М1.

Исследования подтвердили, что на фоне общей негативной тенденции к росту анти-биотикорезистентности, уровень резистентности может в значительной степени различаться между разными ЛПУ и географическими регионами [2, 4, 7, 11, 12].

Представленные профили чувствительности к антибактериальным препаратами и генетические основы антибиотикорезистентно-сти являются уникальными для данного стационара. Они позволяют оценить уровень и прогноз резистентности к Р-лактамным антибиотикам, выявить основные механизмы устойчивости патогенов ВБИ, сформулировать рекомендации по рациональной анти-биотикотерапии в ОРИТ и отделениях хирургического профиля ДГКБ № 9 г. Москвы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Березин А.Г., Ромашов О.М., Яковлев С.В., Сидоренко С.В. Характеристика и клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра // Антибиотики и химиотерапия. -2003. - Т. 48, № 7. - С. 5-11.

2. Гельфанд Б.Р., Белоцерковский Б.З., Попов Т.В., Карабак В.И. Этиологическая и нозологическая структура госпитальных инфекций в отделении реанимации хирургического профиля // Инфекции в хирургии. - 2003. - Т. 1, № 4. - С. 2-10.

3. Концепция профилактики внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - № 5. - С. 4-8.

4. Решедько Г.К., Рябкова Е.Л. Чувствительность грамотрицательных нозокомиальных возбу-