СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ МАРГАНЦА НА ОРГАНИЗМ ДЕТЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОЙ НАГРУЗКИ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ
METHOD FOR DETERMINATION OF MANGANESE TOXICITY IN CHILDREN BEING RESIDENTS OF TECHNOGENICALLY-LOADED TERRITORIES

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики токсического действия марганца на организм детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания, и может быть использован для раннего выявления нарушений здоровья детей, а также при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, обуславливающих формирование экологически обусловленной патологии у детей.
Среда обитания промышленных городов характеризуется многосредовым загрязнением химическими веществами. Одним из приоритетных загрязнителей из ряда тяжелых металлов является марганец, накопление которого в организме оказывает токсический эффект, запуская процессы перекисного окисления липидов и каскад патогенных реакций, которые обуславливают развитие экологически обусловленной патологии, выражающейся в росте заболеваемости, в частности нарушение эндокринной системы и обмена веществ, снижение иммунитета, поражение органов дыхания и пищеварения.
Из уровня техники известен ряд патентов на способы оценки воздействия химических техногенных факторов, в частности металлов, на здоровье населения.
Например, известны способы, касающиеся диагностики конкретных нозологических патологий, согласно которым определяют концентрацию макромикроэлементов в биосредах и по этому содержанию судят о заболевании (Патент РФ №2340284 «Способ прогнозирования доклинической манифестации рассеянного склероза у больных оптическим невритом»; Патент РФ №2229711 «Способ определения функции щитовидной железы при аутоиммунном тиреоидите»). Однако все указанные известные способы не устанавливают токсическое действие определяемых металлов.
Также известен ряд способов диагностики конкретных заболеваний через определение лабораторных клинических показателей, на которые влияют тяжелые металлы (Патент РФ №2160446 «Способ определения риска формирования экообусловленной нефропатии у детей»; Патент РФ №2137422 «Способ диагностики экологически обусловленной патологии у населения»). Однако указанные способы направлены на выявление уже имеющейся патологии, являются затратными и трудоемкими в исполнении.
Из уровня техники также известны способы, обеспечивающие выявление токсического действия тяжелых металлов на здоровье человека.
Например, известен способ определения чувствительности мембран эритроцитов к воздействию тяжелых металлов (Патент РФ №2332668).
4
4
4
3
2
Изобретение заключается в том, что для исследования набирают 0,02 мл капиллярной крови, помещают в охлажденную смесь, состоящую из 0,5 мл 0,15 М фосфатного буфера, имеющего рН 7,4 и 0,5 мл 0,25% раствора глутарового альдегида, в соотношении 1:1, ресуспендируют, оставляя в холодильнике при 4°С на 60 мин для фиксации формы клеток, затем после фиксации содержание пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток и вычисляют количество дискоцитов в нативном препарате, берут 0,08 мл охлажденной клеточной взвеси, наливают в четыре пробирки: в одну пробирку добавляют 0,02 мл 0,01% раствора ZnSO, в другую пробирку - 0,02 мл 0,1% MnSO, в третью пробирку - 0,02 мл 0,005% раствор NiSO, в четвертую пробирку - 0,02 мл 0,01% Рb(NO) и при комнатной температуре 18-20°С инкубируют в течение 30 минут, после инкубации содержимое пробирки вновь ресуспендируют и, поместив 0,01 мл клеточной взвеси на предметное стекло, отсчитывают 250 клеток, вычисляют количество дискоцитов и коэффициент чувствительности мембран эритроцитов
ЧМ
где К - коэффициент чувствительности мембран эритроцитов; Дн - количество дискоцитов в нативном мазке, %; Дм - количество дискоцитов при воздействии конкретных тяжелых металлов, %, при этом, если Кчм менее 95% от первоначального уровня, то клеточные мембраны чувствительны к данному тяжелому металлу.
Данный известный способ определяет гематоксическое действие тяжелых металлов и чувствительность мембран к конкретному тяжелому металлу. Целесообразным же будет являться определение эффекта, который обуславливается мембранотоксическими свойствами тяжелых металлов для прогнозирования патологических изменений.
-1
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения токсичности действия тяжелых металлов на организм (Патент РФ №2138816), согласно которому определяют содержание тяжелых металлов в сыворотке крови и дополнительно лабораторный показатель - активность каталазы в эритроцитах, и при ее снижении (при норме 72,5-106,1 с/г гемоглобина) в сочетании с повышенным уровнем тяжелых металлов по сравнению с нормой действие последних определяют как токсическое.
Недостатком данного известного способа является его недостаточная информативность, поскольку уровень каталазы не отражает всего спектра реакций антиоксидантной системы и является лишь косвенным критерием активности перекисного окисления липидов.
Кроме того, данный способ верифицирован только с характером течения гастроэнтерологической патологии, что делает его малоинформативным для выявления других донозологических форм нарушений здоровья детей.
Известный способ недостаточно точен, поскольку при его реализации не устанавливается зависимость уровня лабораторного показателя - каталазы - от уровня содержания в крови тяжелых металлов.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении точности и информативности за счет расширения информационных связей между содержанием марганца непосредственно в биологической среде (крови) и предлагаемыми лабораторными показателями, комплексно отражающими работу антиоксидантной системы организма, при их одновременном определении.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом определения токсичности действия марганца на организм детей, проживающих в условиях техногенной нагрузки среды обитания, включающим определение содержания марганца в цельной крови и определение лабораторных показателей, при этом, согласно изобретению, в качестве лабораторных показателей определяют уровень антиоксидантной активности и содержание малонового диальдегида в плазме крови, дополнительного проводят корреляционный анализ между самими лабораторными показателями и уровнем марганца в крови, и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности и/или повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови, действие марганца определяют как токсичное.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
Следует пояснить, что показатель антиоксидантной активности плазмы крови характеризует совокупную работу всех антиоксидантов организма по защите от негативного действия свободных радикалов, образующихся в результате перекисного окисления липидов, процесс которого запускается в результате мембранотоксического действия марганца.
Уровень малонового диальдегида в плазме крови характеризует активность свободно-радикального окисления, поскольку является конечным продуктом этого процесса.
Благодаря тому что в предлагаемом способе в качестве лабораторных характеристик (показателей) не используют, как в прототипе, показатель - каталазу, отражающий только первичное звено антиоксидантов, а учитывают совокупный показатель всех групп антиоксидантов - антиоксидантную активность плазмы крови в сочетании с показателем активности свободно-радикального окисления - уровня малонового диальдегида в плазме крови с использованием корреляционного анализа, обеспечивается дополнительная информационная связь лабораторных показателей с содержанием марганца в крови и одновременно информационная связь между самими указанными лабораторными показателями, что делает способ более точным и достоверным.
Использование в качестве показателей антиоксидантной активности и уровеня малонового диальдегида позволяет повысить информативность способа за счет комплексной характеристики патологического процесса, обусловленного действием марганца, и обеспечить установление влияния тяжелого металла - марганца - на различные донозологические формы нарушения здоровья детей, проживающих в условиях техногенной химической нагрузки среды обитания, без ограничения лишь гастроэнтерологической патологией, как в прототипе.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет на ранней стадии, еще до проявления клинических признаков, прогнозировать вероятность заболеваний органов дыхания, пищеварительной системы, иммунной системы у детей, обусловленных мембранотоксическими эффектами воздействия марганца.
Все это повысит эффективность планирования санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности марганца, обуславливающих экологически обусловленную патологию у детей.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом, реализуя его на конкретном примере:
- выбирают экологически неблагополучную территорию по высокой нагрузке химических факторов среды обитания. В качестве такой территории был выбран город Пермь, характеризующийся наличием экологически вредных веществ в атмосфере и в воде поверхностных водоемов, и в частности марганец является приоритетным компонентом выбросов промышленных предприятий;
- отбирают случайным образом группу детей, проживающих на этой территории. Было отобрано 168 детей из организованного коллектива, проживающих на территории Перми. В обследовании принимали участие дети, прошедшие утренний фильтр, следовательно без клинических проявлений заболеваний;
- у указанной группы детей проводят отбор венозной цельной крови в две пробирки. Одну пробирку используют для определения содержания марганца в цельной крови, вторую пробирку - для получения плазмы крови;
- в цельной крови из первой пробирки определяют уровень содержания марганца на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer 3110 с использованием в качестве окислителя ацетилентно-воздушной смеси с детектированием в режиме пламенной атомизации;
- в плазме крови, полученной из второй пробирки, определяют уровень антиоксидантной активности и уровень малонового диальдегида;
- для проведения сравнительного анализа в качестве группы сравнения было обследовано 100 детей из района с относительно благоприятной санитарно-гигиенической ситуацией;
- далее проводят расчет вероятности изменения исследуемых показателей, включая линейный корреляционный анализ (зависимости показателей детей из Перми: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности и/или повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови).
Проверка статистических гипотез относительно полученных корреляционных зависимостей проводится с использованием критерия Стьюдента. Различия считают статистически значимыми при вероятности p<0,05.
3
Анализ определяемых концентраций марганца в крови при обследовании 168 детей позволил установить статистически достоверное повышенное содержание марганца (средняя концентрация превысила референтный уровень в 2,1 раза, р≤0,001) у 74% обследованных. Различия с группой сравнения были достоверны (р=0,003). В группе сравнения средняя концентрация марганца в крови не превышала референтного уровня, который равен 0,011±0,002 мл/дм;
3
В результате лабораторного обследования детей, проживающих на промышленно развитой территории Перми, выявлено снижение уровня антиоксидантной активности плазмы крови у 62,5% и ее повышение у 28% детей на фоне повышенного уровня малонового диальдегида в плазме крови у 64,3% детей. Различия были достоверны как с физиологической нормой (антиоксидантная активность (р=0,003), малоновый диальдегид (р≤0,001)), так и с показателями группы сравнения (антиоксидантная активность (р=0,004), малоновый диальдегид (p≤0,003)). В группе сравнения зафиксировано повышение уровня антиоксидантной активности плазмы крови лишь у 25,3% и ее снижение у 5,6% детей, причем различия с нормой были недостоверными;затем сопоставляют уровень марганца в цельной крови с уровнем антиоксидантной активности в плазме крови и уровнем малонового диальдегида в плазме крови. При значении уровня антиоксидантной активности плазмы крови ниже нормы (референтный уровень равен 36,2%) в сочетании с повышением уровня содержания малонового диальдегида (референтный уровень равен 1,8 мл/дм) в плазме крови на фоне повышенного уровня марганца в цельной крови, при установлении достоверных зависимостей: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности и/или повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови, действие марганца определяют как токсичное (а именно, мембранотоксичное).
Оценка результатов математического моделирования причинно-следственных связей позволила установить зависимость снижения уровня антиоксидантной активности плазмы крови и повышения уровня малонового диальдегида плазмы крови от повышения концентрации в крови марганца, также была установлена зависимость снижения уровня антиоксидантной активности плазмы крови и повышения малонового диальдегида плазмы крови. Данные приведены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Результаты корреляционного анализа между содержанием марганца и уровнем конкретных лабораторных показателей
Вещество в крови
Лабораторный показатель плазмы крови
r
p
Марганец
антиоксидантная активность
-0,742
0,03
малоновый диальдегид
0,652
0,02
Таблица 2
Результаты корреляционного анализа между уровнем лабораторных показателей
Лабораторный показатель плазмы крови
Лабораторный показатель плазмы крови
r
p
антиоксидантная активность
малоновый диальдегид
0,834
0,03
r - коэффициент корреляции; p - достоверность различия
У детей группы сравнения корреляционная зависимость между снижением уровня антоксидантной активности плазмы крови и повышением малонового диальдегида плазмы крови от повышения концентрации в крови марганца была недостоверна (p>0,05).
Точность предлагаемого способа по сравнению с прототипом обусловлена использованием совокупного показателя всех групп антиоксидантов - антиоксидантной активности плазмы крови в сочетании с показателем результативности работы антиоксидантной системы - уровнем малонового диальдегида в плазме крови, с использованием корреляционного анализа взаимосвязи лабораторных показателей и вероятности их изменения от уровня содержания марганца в крови детей.
После обследования детей предлагаемым способом было установлено, что у 79 из 168 детей, проживающих на промышленно развитой территории Перми, имеется риск развития экологически обусловленных заболеваний, ассоциированных с токсическим действием марганца на организм.
Для доказательства такого вывода из указанных 79 детей (у которых выявлены одновременно три достоверные зависимости: повышенный уровень марганца в крови - пониженный уровень антиоксидантной активности в плазме крови, повышенный уровень марганца в крови - повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови, пониженный уровень антиоксидантной активности - повышенный уровень малонового диальдегида в плазме крови), через 6 месяцев был проведен анализ заболеваемости. Из этих детей у 11 была выявлена бронхиальная астма, у 21 - гастродоуденальная патология, у остальных - частые манифестации ОРВИ в сочетании с хронической ЛОР-патологией. Согласно токсикологическим свойствам марганца все указанные болезни обусловлены воздействием повышенного содержания марганца в организме.
Такому же анализу подверглась заболеваемость 45 детей из этой же группы с повышенным содержанием марганца, но без установления (т.е. без подтверждения) корреляционной зависимости между уровнем содержания марганца в цельной крови и лабораторными показателями антиоксидантной системы. Установлено, что у 8 детей установлена патология миндалин и аденоидов, выявлен 1 случай бронхиальной астмы, у 16 зарегистрировано более 2 случаев ОРВИ за этот период, у 11 детей по одному эпизоду ОРВИ, у 9 детей клинической манифестации заболеваний не установлено. То есть заболеваемость на порядок ниже, чем у вышеназванных 79 детей.
Анализ заболеваемости 44 детей с уровнем марганца в крови, не превышающим референтное значение, показал, что у 20 детей зарегистрировано по 1 случаю ОРВИ, у 5 выявлена хроническая патология ЛОР-органов, у остальных детей клинической манифестации заболеваний не установлено.
Вышеуказанные данные являются доказательством того, что только при наличии предложенной взаимосвязи содержания марганца в крови и уровня заявленных лабораторных показателей обеспечивается точность и информативность предлагаемого способа, посредством которого можно определить токсическое (мембранотоксическое) действие марганца на организм ребенка.
Таким образом, использование предлагаемого способа при обследовании детей, проживающих в экологически неблагополучных условиях, позволяет:
- обеспечить возможность выявления с высокой точностью на ранней стадии мембранотоксического действия марганца;
- обеспечить прогноз возникновения и характера течения заболевания различных нозологий;
- обосновать необходимость углубленного клинического обследования ребенка именно в отношении заболеваний, характерных для повышенного содержания марганца.