ЛЕЧЕБНОЕ СРЕДСТВО ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПЕЧЕНИ
THERAPEUTIC AGENT FOR PREVENTING AND TREATING CHRONIC LIVER DISEASES

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к гепато-протекторным препаратам и может быть использовано при разработке новых лекарственных средств растительного происхождения для коррекции цитолитического синдрома при профилактике и лечении хронических заболеваний печени.
Известен гепатопротекторный препарат Эссенциале производства "Rhone-Poulenc Rorer", США/Франция; "Natterman", Германия, в состав которого входят эссенциальные фосфолипиды (EFL) высокой степени очистки - диглицериновые эфиры холинфосфорной кислоты и ненасыщенные жирные кислоты экстракта из бобов сои. Кроме того, эссенциале содержит рибофлавин, тиамин, пиридоксин, цианокобаламин, токоферол, никотинамид и пантотеновую кислоту (Sports Wiki.ru).
Известный препарат ингибирует процессы свободнорадикального окисления (СРО) липидов, оказывает влияние на физико-химические свойства мембраны, уменьшает вязкость липидного слоя, модулирует активность мембрано-связанных ферментов. Восстанавливает функции клеточных мембран. Способствует улучшению самочувствия пациентов.
Известно использование в качестве профилактического средства при токсическом гепатите масла семян амаранта, полученное экстракционным способом в дозе 0,5 мл на кг массы тела (Близнецова Г.Н., Рецкий М.И., Полякова-Семенова Н.Д. и др. Роль процессов свободнорадикального окисления в механизме гепатопротекторного действия масла из семян амаранта // Биомедицина. 2006. №2. С.105-112). Установлено, что масло оказывает выраженное гепатопротекторное действие, однако дозы для лечения заболеваний печени не установлены.
Кроме того, экстракционный способ получения масла из семян амаранта не гарантирует химической чистоты, содержащихся в нем фосфолипидов, токоферола, ненасыщенных жирных кислот, сквалена, фитостеринов, эфиров стеринов, и снижает эффективность лечебного воздействия.
Задача изобретения - расширение ассортимента лекарственных средств растительного происхождения и создание отечественного препарата для профилактики и лечения хронических заболеваний печени.
Технический результат - повышение положительного эффекта на биохимические процессы в крови и ткани печени при лечении токсического гепатита.
Технический результат достигается тем, что в лечебном средстве профилактики и лечения хронических заболеваний печени, представляющее собой амарантовое масло, последнее получено холодным прессованием зародышей и оболочек семян амаранта, которое применяется в дозе 62,5-250 мг/кг массы тела.
Амарантовое масло, полученное холодным прессованием содержит фосфолипиды, токоферол, ненасыщенные жирные кислоты, сквален, фито-стерины и эфиры стеринов при следующем соотношении компонентов, мас.%: фосфолипиды 7-9, токоферол 0,3, ненасыщенные жирные кислоты 51,25, сквален 3-12, фитостерины 2, эфиры стеринов 1,7. Влияние последних в виде амарантового масла, которое содержится в лекарственном средстве в дозе 62,5-250 мг/кг массы тела изучено в динамике развития экспериментального токсического гепатита (ЭТГ).
Препаратом сравнения для лекарственного действия являлось средство растительного происхождения, а именно, эссенциале в дозе 80 мг/кг.
Эксперимент выполнен на 30 белых крысах-самцах массой 180-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко.
4
4
Опыты проводились в весенний период. В каждой серии опытов использовали крыс одной возрастной группы, предварительно голодавших 18-20 ч. Затравку животных осуществляли введением CCl на протяжении 1 суток, что позволяло добиться поражения паренхимы печени. Однодневное токсическое поражение печени формировали путем подкожного ведения 50% раствора CCL на персиковом масле в дозе 0,4 мл на 100 г массы животного однократно. В процессе моделирования экспериментального гепатита смертность животных не наблюдалась.
4
Данная схема и доза CCl считаются достаточными для создания полноценной биохимической картины токсического поражения паренхимы печени, а также дают возможность проследить за направленностью индуцированного патологического процесса.
Перед проведением терапии оценивали биохимические индексы крови, а также гистологические и гистохимические срезы печени, почек и надпочечников, на предмет признаков гепатита, определяли биохимические показатели: концентрацию малонового диальдегида (МДА), АсАт, АлАт, гексозы, связанные с белком и тиоловые пробы.
У животных интактных и с ЭТГ применяли масло зародышей и оболочек семян амаранта (далее - Амарантовое масло), содержащее фосфолипиды, токоферол, ненасыщенные жирные кислоты, сквален, фитостерины и эфиры стеринов при следующем соотношении компонентов, мас.%: фосфолипиды 7-9, токоферол 0,3, ненасыщенные жирные кислоты 51,25, сквален 3-12, фитостерины 2, эфиры стеринов 1,7.
4
Контрольным животным масло вводили через рот при помощи металлического зонда в количестве 62,5, 125 и 250 мг/кг, а животным опытной группы - за 1 ч до введения CCl. Забой животных контрольной и опытной групп осуществляли методом одномоментной декапитации под хлороформным наркозом через 1 сутки от начала затравки соответственно. Исследование проводили в сравнении с раствором Эссенциале, вводимым в желудок в дозе 80 мг/кг.
Развитие ЭТГ подтверждали биохимическим и морфологическим методами исследования. Биохимическому исследованию подвергалась сыворотка, полученная путем центрифугирования цельной крови в течение 15 мин при 3000 об/мин, спектрофотометрическим методом.
Для морфологического исследования образцы ткани доли печени размером 3×3×2 мм, а также почек, сердца, надпочечников и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону.
4
После однократного введения CCl у экспериментальных животных развивалось токсическое поражение печени, что подтверждалось:
- повышением активности по отношению к исходному уровню ферментов-маркеров печеночного цитолиза АлАТ и АсАТ соответственно на 143,1% и 83,5% (р<0,05);
- увеличением в сыворотке крови общиего билирубина на 63,8%. Это говорит или о распаде эритроцитов и гемоглобин или о нарушение в системе переноса прямого билирубина из печеночной клетки в желчь;
- увеличением общих гексоз на 19,46%, что свидетельствует о воспалении;
- уменьшением свободныех SH-групп 9,4%, очевидно связанное со снижением активности пероксидаз;
- увеличение концентрации малоновыого дальдегида по сравнению с исходной веичиной на 25%, что свидетельствует о об активации ПОЛ и деградации полиненасыщенных жиров реактивными формами кислорода.
Однократное подкожное введение крысам Эссенциале в дозе 0,085 мг/кг вызывало по отношению к контролю:
- снижение активности АсАТ, АлАТ практически до исходного туровня, то есть соответственно на 64,5% и 52,2%;
- увеличение в сыворотке крови общего билирубина на 13% по отношению к контролю;
- уменьшение общих гексоз на 22,5%.
Морфологически сохранялось дольковое строение печени, преобладала жировая крупнокапельная центробулярная форма дистрофии, мелкокапельная наблюдалась при переходе к относительно сохраненной перипортальной зоне.
4
В таблице 1 представлены биохимические показатели при гепатите вызванном CCl на фоне применения в различных дозах масла, выделенного холодным прессованием зародышей и оболочек семян амаранта, при следующем соотношении компонентов, мас.%: фосфолипиды 7-9, токоферол 0,3, ненасыщенные жирные кислоты 51,25, сквален 3-12, фитостерины 2, эфиры стеринов 1,7.
4
max
лат
сф
50
В экспериментах использовали эритроциты крови белых беспородных крыс, которую забирали из хвостовых вен путем резекции кончика хвоста. Кровь самотеком собирали в пробирку, содержащую 0,1 мл гепарина (5000 ЕД в 1 мл) из расчета на 1-1,5 мл крови. Кровь центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Затем убирали надосад очную жидкость и трижды промывали при тех же условиях. Суспензию чистых эритроцитов готовили с использованием прибора ПЭ5400 ВИ, концентрацию контролировали спектрофотометрически. Кислотную резистентность эритроцитов оценивали с использованием метода регистрации кислотных эритрограмм. Гемолиз индуцировали 0,1 М соляной кислотой. Эритрограммы регистрировали после предварительного перорального введения исследуемых веществ (за сутки однократно) с использованием металлического зонда, сконструированного д.м.н., проф. В.А. Никалаевским. За час до забора крови в/б вводили CCl в дозе 0,4 мл/кг в виде 50% раствора на оливковом масле. Эритрограммы оценивали по показателям K, t, G, G, данные которых представлены в таблице 2.
Таблица 2
Показатели
K<sub>max</sub>, отн.ед.
Gсф, %
t<sub>лат</sub>, С
G50, %
контроль
5.777±0.93
-2.6±1.3
125±45.3
256,7±37,9
Амарантовое масло, 62,5 мг/кг
4.455±0.23; t=2.4; Р=0.07
-1.25±0.95; t=-1.5; p=0.2
65±31.2 t=1,87; Р=0.13
235±8,7; t=0.96; P=0.39
Амарантовое масло, 125 мг/кг
5.26±0.97; t=0.65; P=0.55
-1.2±1.22; t=-1.4; Р=0.23
105±30; t=0.6; Р=0.56
246.7±15.3: t=0.42; P=0.7
Амарантовое масло, 250 мг/кг
4.4±0.71; t=2.04; P=0.111
-2.65±0.3; t=0.01; Р=0.99
105±21.2; t=0.55; Р=0.61
230±40; t=0.8; Р=0.45
Эссенциале Н, 80 мг/кг
5.89±0.37; t=-0.19; Р=0.86
-0.48±1.1 t=-2.2; Р=0.09
80±48.2; t=1.17; Р=0.31
228.3±2.9; t=1.29; P=0.27
ССl<sub>4</sub>
8,114±0.0005; t=-4.4; Р=0.01
-0.45±0.096; t=-2.9; P=0.04
50±17.3; t=2.65; Р=0.05
205±8.7; t=3.7; P=0.02
max
Анализ K, который отражает долю эритроцитов, одновременно вступающих в стадию собственно гемолиза, показал, что скорость гемолиза эритроцитов основной среднестойкой популяции эритроцитов при введении Амарантового масла в дозах 62,5-125-250 мг/кг и эссенциале в дозе 80 мг/кг достоверно не отличается от контрольного опыта.
max
4
4
Однако предварительное введение Амарантового масла в дозах 62,5-600-1200 мг/кг в среднем способствует снижению K относительно контрольного опыта на 22,9%, 8,8%, 23,8% соответственно, в случае применения эссенциале перед введением CCl доля эритроцитов, одновременно вступающих в стадию собственно гемолиза, была выше на 2% по сравнению с эритроцитами животных, не получавших исследуемых веществ. Однократное в/б введение CCl в дозе 0,4 мл/кг за 1 час до регистрации эритрограмм сопровождалось достоверным увеличением скорости гемолиза эритроцитов среднестойкой популяции на 40,6% относительно контрольного опыта.
4
4
4
Таким образом, на основании экспериментов in vivo установлено, что CCl при указанном способе и дозе введения вызывает повреждение цитоплазматической мембраны основной популяции эритроцитов, возможно за счет увеличения окислительных процессов в мембране клеток. Предварительное введение эссенциале и Амарантового масла способствует ослаблению повреждающего действия CCl, возможно, за счет доказанных антиоксидантных свойств этих фармакологически активных веществ, которые реализуются увеличением порога проницаемости мембран для ионов водорода относительно применения CCl в отдельности.
сф
При введении амарантового масла в дозах 62,5-125-250 мг/кг значение G достоверно не отличалось от контроля. Однако в дозах 62,5-125 мг/кг доля сфероцитов по средним значениям была в два раза менее контроля, в дозах 250 мг/кг практически равна ему.
сф
4
сф
При введение Эссенциале в дозе 80 мг/кг тенденция к уменьшению G более выражена (Р=0,09), о чем свидетельствует уменьшение доли эритроцитов, одновременно находящихся в стадии сфероцитоза на 84,6% относительно контроля. При введение CCl G достоверно (Р<0,05) менее контроля на 73%.
4
4
Таким образом, CCl снижает кислотную резистентность эритроцитов низкостойкой популяции на 73% по отношению к контролю, а предварительное применение амарантового масла значительно предотвращает непосредственное повреждающее действие CCl на мембраны «старых» эритроцитов.
лат
4
t кислотного гемолиза, отражающая продолжительность во времени латентного периода гемолиза, при использовании Амарантового масла в дозах 62,5-125-250 мг/кг и Эссенциале в дозе 80 мг/кг достоверно не отличалось от контроля и находилось примерно на одном уровне с контролем. Однако в/б введение CCl в дозе 0,4 мл/кг, сопровождалось сокращением латентного времени гемолиза на 60% относительно контроля.
4
Таким образом, применение CCl в отдельности вызывает ускорение перехода эритроцитов их стадии сферуляции в стадию собственно гемолиза более чем в два раза, тогда как предварительное введение амарантового масла и эссенциале замедляют развитие стадии собственно гемолиза и приближают его к контрольному уровню.
50
4
4
4
Анализ время наступления 50% гемолиза (G,%) показал, что амарантовое масло во всех дозах и Эссенциале вызывают замедление развития гемолиза эритроцитов основной среднестойкой популяции относительно применения CCl в отдельности. Это нашло свое отражение в том, что при предварительном внутрижелудочном введение Амарантового масла в дозах 62,5-125-250 мг/кг и Эссенциале в дозе 80 мг/кг перед применением CCl, значение изучаемого показателя практически и достоверно не отличались от таковых у контрольной группы животных, которым внутрижелудочно вводился однократно физиологический раствор NaCl, а введение CCl вызывало уменьшение времени 50% гемолиза на 20,1% относительно контроля.
4
4
+
Исходя из всего вышеперечисленного установлено, что в условиях конкретного эксперимента in vivo профилактическое применение амарантового масла в дозах 62,5-125-250 мг/кг и эссенциале в дозе 80 мг/кг способствует увеличению кислотной резистентности эритроцитов на фоне введения CCl, ослабляя непосредственное повреждающее действие последнего на эритроцитарные мембраны. Это связано с доказанными антиоксидантными свойствами указанных веществ. Кроме того, имеет место быть взаимодействие с белково-липидными комплексами мембран клеток, что приводит к изменению структурно-функциональных свойств эритроцитарных мембран и реализуется в снижение проницаемости мембран для ионов Н относительно применения CCl в отдельности.