Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

С. С. Курашова1, А. А. Ишмухаметов1 2, М. С. Егорова1, М. В Баловнева1,

Т. К. Дзагурова1, Е. А. Ткаченко1, 2

ЭО!: 10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29

1 ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М. П. Чумакова РАН», Москва

2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России

Резюме

Представлены результаты применения различных способов инактивирования вируса Пуумала, включая ультрафиолетовые лучи (УФ), в-пропиолактон (БПЛ) и формалин. Иммуногенность вакцинных препаратов, полученных с использованием этих способов инактивирования вируса, не имела достоверных отличий в опытах на мышах BALB/c. Существенным преимуществом УФ и БПЛ по сравнению с формальдегидом является короткое время инактивирования вируса.

Ключевые слова: геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), вирус, вакцина, инактивация, формалин, бета-пропиолактон, УФ-лучи, ПЦР в режиме реального времени

Для цитирования: Курашова С. С., Ишмухаметов А. А., Егорова М. С. и др. Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2018; 17 (4): 26-29. DOI: 10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29_

Comparative Characteristics of Inactivation Agents for HFRS Vaccine Development

C. C. Kurashova1, А. А. Ishmukhametov1,2, M. C. Egorova1, M. V. Balovneva1, Т. К. Dzagurova1, Е. А. Tkachenko1,2 DOI: 10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29

1 Federal State Budget Institution of Science «Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and-Biological Products of Russian Academy of Sciences», Moscow

2 Sechenov First Moscow State Medical University, of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Abstract

The results of various methods of Puumala virus inactivation, including ultraviolet rays (UV), в-propiolactone (BPL) and formalin are presented. Immunogenicity of vaccine preparations obtained using these virus inactivation methods did not differ significantly in the experiments on BALB/c mice. Essential advantage of UV and BPL in relation to formaldehyde is the short time of virus inactivation. Key words: hemorrhagic fever with renal syndrom (HFRS), virus, vaccine, inactivation, formalin, в-propiolactone, UV rays, real-time PCR

For citation: Kurashova C. C., Ishmukhametov А. А., Egorova M. C. et al.Comparative Characteristics of Inactivation Agents for HFRS Vaccine Development. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2018; 17 (4): 26-29. DOI: 10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29

Введение

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусный нетрансмиссивный зооноз, широко распространенный в Евразии, занимающий в России одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека [1]. Более 95% заболеваемости ГЛПС в РФ ассоциировано с вирусом Пуумала, остальные случаи, регистрируемые на европейской территории, вызываются двумя подтипами Куркино и Сочи хантавируса Добрава/Белград, на Дальнем Востоке - вирусами Хантаан, Амур и Сеул. До сих пор не существует эффективных методов лечения хантавирусных инфекций, которые были бы направлены на элиминацию

возбудителя. Наиболее действенным методом борьбы с ГЛПС могла бы стать вакцинопрофилактика. Важным условием эффективности вакцин является выбор инактиватора и оптимальных условий инактивации, позволяющих лишить вирус инфекци-онности при максимальном сохранении его имму-ногенных свойств.

Для инактивации вирусов используют различные физические и химические методы. Из физических методов наиболее распространенными являются: у-лучи [2, 3], УФ-лучи [4], воздействие температуры [5]. В практике создания инактивированных вакцин в течение десятилетий наиболее широко применяются такие химические инактиваторы

как формальдегид и в-пропионлактон (БПЛ), которые используются при производстве лицензированных вирусных вакцин [6]. Выбор способа инактивации основывается на механизме действия инактиватора и свойствах инактивируемого вируса.

Наиболее общепринятым инактивирующим агентом является формальдегид. Для термолабильных хантавирусов с целью сохранения максимальной антигенной активности было предложено использовать схему инактивации, которая включает экспозицию вируссодержащего субстрата при температуре 6±2 °С в присутствии 0,025% раствора формалина в течение 30 суток. Несмотря на ряд преимуществ, этот метод не вполне технологичен, и в ряде случаев для полной уверенности в инактивации требуется дополнительно не менее 30 суток [7].

Цель работы - выбор наиболее безопасного и технологичного метода инактивации хантавиру-сов на примере вируса Пуумала.

Материалы и методы

Вакцинный материал был получен на основе штамма PUU-TKD-VERO вируса Пуумала (ПУУ) по ранее описанной технологии [8].

Процесс получения вакцины включает: репродуцирование вируса в культуре клеток, сбор ви-руссодержащего субстрата, концентрирование, хроматографическую очистку, инактивирование, сорбцию инактивированного вируса на гидроокиси алюминия. Были испытаны вакцинные препараты, инактивированные различными способами: А препарат - УФ (расстояние от лампы до емкости с вируссодержащим препаратом 24 см, высота слоя инактивируемого препарата - 2 см);

Б препарат - БПЛ в концентрации 1:4000 при температуре 6 ± 2°С; В препарат - формалин в концентрации 1:4000 при t = 6 ± 2 °С.

Вакцинные препараты вводили в/м взрослым (20-25 г) мышам BALB/c по 0,5 мл в мышечную ткань бедра. Для каждого варианта использовали по 7 мышей. Иммунизировали мышей по схеме: 3 иммунизации с двухнедельным интервалом, забор крови через 2 недели после последней иммунизации. Кровь забирали тотально. Каждая проба сыворотки крови трехкратно исследована в реакции нейтрализации в культуре клеток Vero-E6. Результат представлен в виде среднегеометрического значения титров антител по 50% редукции числа ФОЕ. Для количественной оценки РНК в вакцинном материале использовали ПЦР в режиме реального времени со штаммоспецифичными праймерами Ufa F_R, и зондом Ufa Z.

Результаты и обсуждение

В результате изучения кинетики инактивации вакцинных препаратов было показано (рис. 1), что вирус Пуумала с исходным титром 5,8 lg ФОЕ/мл инактивировался: А - при облучении УФ - в течение 3 минут; Б - при использовании БПЛ при 6 ± 2 °С - в течение 1 часа; В - в присутствии формалина (0,025%) при 6 ± 2 °С - в течение 30 суток.

Вирус полностью инактивировался при 22 °С в течение 2-х недель, при 6 ± 2 °С через 30 суток. Таким образом, при температуре 6 ± 2 °С время инактивации вируса в присутствии 0,025% формалина практически совпадает с таковым в результате термоинактивации.

При введении мышам BALB/c испытуемых вакцинных препаратов (А, Б, В) каких-либо побочных

Рисунок 1.

Динамика инактивации вируса Пуумала Dynamics of Inactivation of the Puumala Virus

Таблица 1.

Содержание РНК в вакцинном материале после инактивации RNA Content in the Vaccine Material after Inactivation

Штамм Strain Способ инактивации Inactivation Method Значение Ct *

PUU-TKD-VERO УФ ultraviolet, 3 мин minutes 23

БПЛ в-propionylactone, 3 часа hours (6 ± 2 °С) 25

Формалин Formalin, 30 х twenty-four hours суток (6 ± 2 °С) 26

+22 °С - 2 недели weeks 26

6 ± 2 °С - 4 недели weeks 23

К - (без инактивации, without inactivation) 21

* Значение порогового цикла nreshold cycle value

эффектов, как местного, так и общего характера не наблюдалось. Среднегеометрическое титров нейтрализующих антител в ответ на введение вакцинных препаратов составили: А (УФ) - 7,41 ± 0,03; Б (БПЛ) - 8,17 ± 0,01; В (формалин) - 7,93 ± 0,16.

По результатам ПЦР в режиме реального времени не было выявлено существенной разницы между образцами вирусных препаратов, инактиви-

00 рованных разными способами (табл. 1).

1 Поскольку БПЛ в первую очередь взаимодей-£ ствует с ДНК или РНК, предполагается, что им-^ муногенные эпитопы белка будут незначительно л повреждены, в отличие от инактивирования фор-| мальдегидом [9-11]. Другим важным преимуще-| ством БПЛ по сравнению с формалином является "о его способность гидролизоваться в водных рас-§ творах из-за быстрого гидролиза, который позво-| ляет ему реагировать с гидроксильными, амино-, ™ карбоксильными, сульфгидрильными и феноль-§ ными группами в течение нескольких часов с § образованием не токсичных, не канцерогенных | продуктов [12]. Избыточный БПЛ можно нейтра-I лизовать добавлением тиосульфата [13]. Важным т моментом эксперимента является то, что значение порогового цикла С при постановке ПЦР в режиме реального времени не выявило отличий инактивированных препаратов от контрольного нативного образца.

Выводы

1. Применение вакцинных препаратов вируса Пуумала, инактивированных различными способами: А - УФ, Б - БПЛ, В - формалином, не выявило статистически достоверных различий в их иммуногенности, несмотря на более высокие титры нейтрализующих антител после иммунизации вакциной Б.

2. Наиболее перспективными являются инактива-торы: УФ и БПЛ по сравнению с формалином, поскольку имеют ряд преимуществ: время инактивации значительно короче, в меньшей степени повреждаются белки.

3. Результаты свидетельствуют о том, что вероятное функциональное изменение геномного материала, в частности при использовании УФ и БПЛ [6] не влияет на выявление вирусной РНК вируса Пуумала с помощью видоспецифичных праймеров.

Несмотря на очевидные преимущества УФ и БПЛ, в настоящее время формальдегид более широко используется для инактивации патогенов, возможно, из-за исторического многолетнего опыта использования его, что упрощает пути для лицензирования вакцин. Тем не менее, как показал эксперимент, УФ и БПЛ можно рассматривать в качестве доступных, более технологичных и безопасных методов инактивации, в частности, в производстве инактивированных хантавирусных вакцин.

Литература

1. Ткаченко Е. А., Дзагурова Т. К., Ишмухаметов А. А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в России: успехи и актуальные проблемы на современном этапе. Биомедицина XXI века: достижения и перспективные направления развития. Сборник научных трудов. 2016; 331-344.

2. Martin, S. S., Bakken, R. R., Lind, C. M., Garcia, P., Jenkins, E., Glass, P. J.,& Fine, D. L. Comparison of the immunological responses and efficacy of gamma-irradiated V3526 vaccine formulations against subcutaneous and aerosol challenge with Venezuelan equine encephalitis virus subtype IAB. Vaccine. 2010; 28 (4): 1031-1040.

3. Alsharifi M., Mullbacher A. The y-irradiated influenza vaccine and the prospect of producing safe vaccines in general //Immunology and cell biology. 2010; 88 (2): 103-105.

4. Budowsky, E. I., Kostyuk, G. V., Kost, A. A., & Savin, F. A. Principles of selective inactivation of viral genome. Archives of virology. 198; 68 (3): 239-247.

5. Nims R. W., Plavsic M. Polyomavirus inactivation-a review //Biologicals. 2013; 41(2): 63-70.

6. Sanders B., Koldijk M., Schuitemaker H. Inactivated viral vaccines //Vaccine Analysis: Strategies, Principles, and Control. Berlin, Heidelberg; Springer, 2015; 45-80.

7. Ткаченко Е. А., Ишмухаметов А. А., Дзагурова Т. К., Синюгина А. А., Коротина Н. А., Набатников П. А. и др. Разработка экспериментально-промышленной технологии производства вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Ремедиум. 2015; 6: 47-53.

8. Бархалёва О. А., Воробьёва М. С., Ладыженская И. П., Ткаченко Е. А., Дзагурова Т. К. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Биопрепараты. 2011; 1: 27-30.