Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения
BIO TRANSPLANT FOR THE JOINTS DYSPLASIA TREATMENT AND METHOD OF ITS PREPARATION

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается получения культуры генетически немодифицированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и способа лечения дисплазии суставов.
В настоящее время в ветеринарной ортопедической практике возрастает число животных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата. Так по статистике Ортопедического фонда животных (Orthopedic Foundation for Animals), для 50 наиболее подверженных дисплазиям пород, из 430000 обследованных собак дисплазия тазобедренного сустава присутствует в 21%, а дисплазии локтя в 16% из 180000 обследованных животных. Дегенеративные формы артритов составляют приблизительно одну треть причин, вызывающих хромоту у животных, наиболее часто встречающимися являются остеоартрозы. Вместе с тем, этиология возникновения остеоартроза до сих пор до конца не выяснена. Считают, что они могут быть вызваны травмами, возрастными изменениями, генетическими и другими факторами риска. Потеря способности передвигаться из-за болезни опорно-двигательного аппарата является ключевой причиной эвтаназии у большинства животных. Существующие методы лечения, как консервативные, так и хирургические, не позволяют ветеринарному врачу добиться полного выздоровления или ремиссии на длительный срок [Csaki С, Matis U, et al., 2007; Arends В, Vankelecom H., et al., 2009].
В последнее время во всем мире все большее внимание уделяется использованию стволовых клеток в терапии различных заболеваний. Изначально мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) привлекли к себе внимание в научном мире из-за их способности к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты и возможной трансдифференцировки в нейроны, глиальные и эндотелиальные клетки. Эта широкая пластичность под влиянием клеточного микроокружения, межклеточных структур и ряда химических факторов позволяет использовать ММСК в качестве ключевого механизма процессов репарации [Горностаева С.Н., 2006; Bronckaers A., Hilkens P., et. al. 2014].
ММСК, являясь клетками тканей взрослого организма, обладают ограниченным потенциалом дифференцировки. Тем не менее, с точки зрения этики, являются более приемлемым для клинического использования материалом. Популяции ММСК базируются в костном мозге, в жировом депо, а также могут присутствовать и во многих других тканях как резидентные клеточные компоненты. Их способность к дальнейшей дифференцировке определяется как клеточным, так и гуморальным микроокружением. Эти клетки формируют своеобразный «резерв», способный в случае необходимости мобилизоваться и перемещаться к зонам повреждения для участия в восстановлении пораженных участков ткани.
Еще одной очень важной особенностью ММСК является их низкая иммуногенность и, более того, способность подавлять посттрансплантационный иммунный ответ организма, что крайне важно при осуществлении различного рода аллогенных трансплантаций [Рябцева Е.С., Кривенко С.И., и др., 2006; Herrmann R.P., Sturm M.J., 2014].
Одним из приоритетных направлений является лечение заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата, дефектов суставного хряща, остеоартрита, которые являются растущей проблемой для человека и домашних животных и которые требуют разработки новой и усовершенствованной терапевтической стратегии.
Благодаря ряду уникальных свойств, в частности, способности дифференцироваться в различные типы клеток соединительной ткани, ММСК привлекают пристальное внимание исследователей. Эти свойства определяют перспективность применения ММСК в биотехнологии и регенеративной медицине.
Dalemans W., Lombardo Е. и Dekker R. представили способ «Mesenchymal stromal cells fortreating rheumatoid arthritis» (WO 2016001845 (A1) - England2016, A61K 35/28; A61P 9/02) для лечения ревматоидного артрита, включающий использование мезенхимальных стромальных клеток. Было обнаружено, что введение мезенхимальных стромальных клеток (МСК), в частности полученных из жировой ткани человека (hASCs), могут быть полезными при лечении ревматоидного артрита. Изобретение относится к композиции, содержащей мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которая примененяется в лечении ревматоидного артрита. Изобретение также учитывает применение мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в производстве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.
Недостатком этого способа является использование фетальной бычьей сыворотки или сывороточного альбумина человека, что приводит к невысокой пролиферативной активности ММСК жировой ткани в культуре. Использование дополнительных питательных и ростовых компонентов может стать решением этого вопроса. В частности замена такого стандартного компонента ростовой среды как эмбриональная телячья сыворотка на пуллированную плазму, обогащенную тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Использование в заявляемом способе пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови позволяет получить культуру клеток ММСК жировой ткани аутологичных пациенту в условиях in vitro, которая будет отличаться высокой пролиферативной активностью, низким апоптотическим индексом, более высоким процентом жизнеспособных клеток и безопасностью в связи с отсутствием ксеногенных компонентов питательной среды.
Наиболее близким по технической сущности заявляемому (или выбранному в качестве прототипа) является способ «Биотрансплантат и способ лечения остеопороза» (патент РФ № RU 2265442 С1, 2004 г., A61K 35/28 (2000.01); A61K 35/48 (2000.01); А61Р 19/10 (2000.01)). Биотрансплантат для лечения остеопороза содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы. Способ лечения остеопороза заключается во внутривенном капельном введении МСК от 50 до 500 млн. в 50-100 мл физиологического раствора.
В связи с тем, что фетальные донорские клетки являются плюрипотентными, они обладают высокой пролиферативной активностью, что наряду с высокой вариабельностью генома зачастую может привести к развитию злокачественных новообразований, в случае применения этих клеток парентеральным путем. При внутривенном капельном введении аутологичного материала, регенераторная эффективность этих клеток крайне мала за счет системного действия, относительно малого количества и неспособности преодолеть васкулярно-эндотелиальный барьер.
Заявляемый способ локального лечения дисплазии суставов является методом внутрисуставного введения клеточного материала в очаг деструкции ткани, что предполагает непосредственное взаимодействие клеточного трансплантата с окружающей тканью с экскрецией в межклеточное пространство всех противовоспалительных и ростовых факторов, а также прямой контакт с клеточным и внеклеточным тканевым микроокружением реципиента.
Задачей заявляемого изобретения является разработка высокоэффективного способа клеточной терапии дисплазий суставов для применения в ветеринарной медицине.
Поставленная задача решается тем, что в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения», при котором в биотрансплантанте содержатся мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из аутологичного материала и согласно изобретению содержится от 5 млн. мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, предназначенных для введения во внутрисуставную сумку, причем биотрансплантан используется для лечения дисплазии суставов у собак. Используемые в изобретении «Биотрансплантат для лечения дисплазии суставов и способ его получения» мезенхимальные стволовые клетки (МСК), получают из аутологичного материала, который измельчают, ферментативно дезагрегируют и полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, причем согласно изобретению мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, получают из жирового биоптата аутологичного материала и культивируют в среде с добавлением пуллированной, обогащенной тромбоцитами плазмы крови.
Способ осуществляется следующим образом.
3
2
Биоптат жировой ткани объемом 4-6 см промывается раствором D-PBS, в пропорции 1:2, для удаления примеси клеточных компонентов крови, далее биоптат гомогенезируется. Полученная гомогенная смесь из жировой ткани инкубируется в присутствии смеси ферментов в шейкере инкубаторе при 37°С и 200 об/мин в течение часа. После окончания инкубации непереваренный остаток жировой ткани тщательно пипетируется, отбирается водная фаза содержащая суспензию клеток от жировой фазы, и промывается средой, содержащей сыворотку в соотношении 1:1, центрифугированием в 50 мл пробирках при 800 g и +4°С в течение 10 мин. После первой промывки супернатант сливается, клеточный осадок ресуспендируется в 40 мл раствора Хэнкса и центрифугируется при 400 g и +4°С в течение 5 мин. После центрифугирования надосадок сливается и добавляется 1 мл полной питательной среды (DMEM : F12 (1:1), 5% пуллированной обогащенной тромбоцитами плазмы, penicillin, streptomicin, L-glutamine) и ресуспендируется. Количество ядросодержащих клеток (ЯСК) и их жизнеспособность определяется путем подсчета в камере Горяева с использованием Trypan blue 0,4%. Полученная суспензия клеток ММСК жировой ткани для дальнейшего культивирования засевается в культуральные флаконы площадью 25 см, с плотностью посева 10-50×103 ЯСК/см2 в соответствующем объеме полной (ростовой) питательной среды при 37°С и 5% CO2. Через 24-48 часов неприкрепившиеся клетки удаляют и заменяют ростовую среду. В дальнейшем замену среды производят через каждые 2 дня.
Условия культивирования позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных ММСК.
Условия культивирования позволяют сохранить мультипотентность культуры клеток.
Условия культивирования позволяют получить большое количество ММСК, необходимое для инъекции и формирования клеточного банка пациента, что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.
Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте противовоспалительных и регенеративных свойствах мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках.
Динамика роста клеточной культуры ММСК из жировой ткани животного показана в таблице, где:
Т - общее количество клеток в культуре;
L - количество живых клеток в культуре;
D - количество мертвых клеток в культуре;
V - жизнеспособность.
На Фиг. 1. показаны культуры ММСК 1 и 2-го пассажей:
а) Пассаж 1, конфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.
b) Пассаж 2, субконфлуентная культура ММСК; отсутствуют морфологические признаки старения, отмечен упорядоченный рост культуры; фазовый контраст, увеличение ×100.
По достижении культурой 75-85% конфлюэнтности, монослой трипсинизируют и пересевают в новые культуральные флаконы. После получения нужной концентрации клеток, необходимых для инъекции, с высоким пролиферативным потенциалом и жизнеспособностью не менее 95% клетки в количестве 5 млн. ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора. К концу культивирования клетки имеют фибробластоподобный фенотип, морфологические признаки старения культуры отсутствуют (фиг. 1.). Трансплантацию осуществляют в условиях хирургического отделения ветеринарной клиники. Суспензия мезенхимальных стволовых клеток под контролем ультразвукого аппарата (УЗИ) вводится во внутрисуставную сумку.
Таким образом, в заявляемом способе лечения дисплазии суставов с использованием биотрансплантата, биотрансплантат содержит мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из жирового биоптата аутологичного происхождения, при этом ткань гомогенезируют, ферментируют колагеназой, полученную клеточную суспензию отмывают и культивируют в питательной среде, содержащей глютамин, гентамицин и 5% пулированной плазмы, обогащенной тромбоцитами, полученную от доноров того же вида. Способ лечения дисплазии суставов заключается во внутрисуставном введении 5 млн. ММСК в 1 мл физиологического раствора. Изобретение обеспечивает восстановление хрящевой ткани сустава, приводит к снижению воспалительных процессов, позволяющих улучшить двигательную активность пациента.
Литература
1. Csaki С., Matis U., Mobasheri A., Ye Н., Shakibaei М. Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study. Histochem Cell Biol. 2007; 128(6): 507-20.
2. Arends В., Vankelecom H., Vander Borght S., Roskams Т., Penning L.C., Rothuizen J., Spee B. The dog liver contains a "side population" of cells with hepatic progenitorlike characteristics. Stem Cells Dev. 2009; 18(2): 343-50.
3. Горностаева C.H., Миогенная дифференцировка ультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека in vitro и in vivo. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2006 г.
4. Bronckaers A., Hilkens P., Martens W., Gervois P., Ratajczak J., Struys Т., Lambrichts I. Mesenchymal stem/stromal cells as a pharmacological and therapeutic approach to accelerate angiogenesis. Pharmacol Ther. 2014; 143(2): 181-96.
5. Рябцева E.C., Кривенко С.И., Левин В.И., Луц Л.С., Белевцев М.В., Усс А.Л., Змачинский В.А. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани: характеристика и аспекты использования при трансплантации гемопоэтических клеток. Известия НАН Беларуси. 2006, 1: 81-87.
6. Herrmann R.P., Sturm M.J. Adult human mesenchymal stromal cells and the treatment of graft versus host disease. Stem Cells Cloning. 2014; 7:45-52.