Оценка чувствительности Allium сера и Lepidium sativum с использованием ксенобиотиков адамантанового ряда

УДК 574.2

ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ALLIUM СЕРА

И LEPIDIUM SATIVUM С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КСЕНОБИОТИКОВ АДАМАНТАНОВОГО РЯДА

©2010 Ю.Г. Шутова1

В данной статье проанализирована сравнительная чувствительность двух растительных тест-объектов: Allium cepa и Lepidium sativum по оценке токсического воздействия ксенобиотиков адамантанового ряда. Выявлено, что Allium cepa является более предпочтительным тест-объектом для оценки токсичности антропогенных ксенобиотиков.

Ключевые слова: Allium cepa, токсичность, адамантаны.

Введение

Одной из наиболее опасных форм антропогенного воздействия на биосферу является химическое загрязнение окружающей среды, масштабы которого за последние десятилетия резко увеличились. Каждый год не менее 3 тысяч новых вводится в качестве реальных загрязнителей окружающей среды [1]. Многие ксенобиотики, с которыми человек сталкивается в процессе жизнедеятельности, оказывают негативное влияние на организм, что выражается в росте аллергических заболеваний, отравлений и врожденных пороков развития. Кроме того, для ксенобиотиков, как и для радиационного воздействия, предельно допустимой дозы не существует, т. е. порог действия практически отсутствует [2].

Это обусловливает потребность создания оперативной и экономичной системы тестирования химических соединений в отношении их потенциальной опасности для человека.

В настоящее время созданы сотни тест-систем, однако немногие из них в результате длительных исследований признаны валидными [1]. В представленной работе мы анализировали соединения ряда адамантана, широко используемые в настоящее время в медицине как лекарственные препараты и в сельском хозяйстве как пестициды.

Целью нашего исследования было сравнение чувствительности двух растительных тест-объектов — Allium cepa и Lepidium sativum по оценке токсичности ада-мантанов.

1Шутова Юлия Георгиевна (shutova79@yandex.ru), кафедра зоологии, генетики и общей экологии Самарского государственного университета, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

Материалы и методы исследования

Анализировали токсичность следующих адамантанов: адаманта-на (I); аминоадамантана (II); 6-амино-адамантилгалактопиранозы (III); 3-(М-адамантиламино)-3-дезокси-1,2,5,6-ди-О-изопропилиденксилофуранозы (IV); 3-(М-адамантиламино)-3-дезокси-1,2,5,6-ди-О-изопропилиденаллофуранозы (V); 1-амино-3-метиладамантана (VI); 1-амино-3-этиладамантаан (VII); 2-дез-окси-2-амино-(М-адамантил)-глюкопиранозы (VIII). Вещества анализировали в виде водных растворов в концентрациях 0,005; 0,05; 0,25; 0,5 и 1 мг/мл.

Токсичность адамантанов оценивали по способности ингибировать прорастание и рост семян по стандартной методике [3]. Для сравнительной оценки чувствительности выбранных тест-объектов мы использовали такие показатели, как энергия прорастания, всхожесть семян, относительный прирост корня в длину.

Достоверность различий в токсичности растворов адамантанов разных концентраций и разного строения оценивали с помощью полного двухфакторного дисперсионного анализа [4].

Результаты и их обсуждение

Наиболее чувствительным показателем токсического воздействия загрязнителей окружающей среды на растения является ингибирование их корневого роста [3], так как клетки зоны меристемы (зоны роста) весьма восприимчивы к неблагоприятному воздействию химических агентов среды [5].

Результаты исследования влияния адамантанов на энергию прорастания семян Allium cepa суммированы в табл. 1.

Таблица 1

Влияние адамантанов на энергию прорастания семян Allium cepa, %

Адамантаны Концентрация, мг/мл

0 0,005 0,05 0,25 0,5 1

I 33±2,4 51±3,2 52±3,2 22±3,0 20±3,2 28±3,2

II 72,5±1,4 73,3±2,8 71,2±3,0 70±3,0 70±3,2 52,7±3,1

III 23,3±2,6 23,3±3,5 20,5±3,6 18,3±3,2 15±3,2 15±3,0

IV 38,3±3,2 33,3±3,2 33,3±3,2 63±3,2 55±3,2 46,6±3,2

V 18,33±3,6 11,67±3,2 8,33±3,2 6,67±3,2 6,67±3,2 1,67±3,2

VI 56,9±1,6 54,7±1,3 53,5±1,1 44±3,2 14±3,2 0±0,2

VII 33,3±3,2 26,6±3,2 18,3±3,2 6,6±3,2 3,3±0,1 0±0,2

VIII 66,6±1,2 70±1,1 50±3,2 45±3,2 43,3±3,2 28,3±3,2

Все исследуемые адамантаны проявили токсичность. В низких концентрациях действие адамантанов II, III, IV, V, VI, VII было минимальным, а вещества I, VIII оказывали слабое стимулирующее действие. При увеличении концентрации веществ наблюдалось усиление их токсичности. Вещество IV в концентрациях 0,25; 0,5 и 1 мг/мл достоверно (р < 0,01) стимулировало прорастание семян А. сера.

В образцах, подвергшихся воздействию адамантанов VI и VII в концентрации 1 мг/мл, после трехдневной экспозиции проросших семян А. сера обнаружено не было.

Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ выявил достоверные различия в действии как концентраций (р < 0,001), так и в строении анализируемых веществ (р < 0,001). Максимальное ингибирующее действие проявляли адаманта-ны в концентрациях 0,25; 0,5 и 1 мг/мл (р < 0,01).

Ранняя всхожесть семян в значительной степени зависит от наличия доступной воды. Полученные нами результаты позволяют предполагать, что адамантаны, являясь мембранотропными веществами, вступая во взаимодействие с биомембранами, нарушают проводимость ионных каналов и изменяют скорость поступления воды и рН клетки, что приводит к снижению энергии прорастания семян. Однако это справедливо только для начального этапа прорастания семян.

На следующем этапе мы проанализировали воздействие адамантанов на всхожесть семян А. сера, подвергшихся токсическому стрессу в течение пяти суток. Результаты эксперимента показаны на рис. 1.

Рис. 1. Всхожесть Allium cepa под воздействием адамантанов на пятые сутки

относительно контроля

Пятидневная экспозиция семян показала, что число проросших семян и в контроле, и в опыте увеличилось, однако общая тенденция токсического действия изменилась незначительно, и с увеличением концентрации анализируемых адаман-танов увеличились и их токсические свойства.

Чтобы выявить влияние строения адамантанов и концентрации используемых растворов, нами был проведен полный двухфакторный дисперсионный анализ, который показал достоверное влияние концентрации раствора на токсичность (p > 0,01) и достоверное влияние строения адамантанов, выражающееся в инги-бировании всхожести семян (p > 0, 01).

Анализ результатов выявил, что максимальной токсичностью обладают ал-кильные производные адамантана, на втором месте стояли адамантаны, в состав которых входили сахара. По-видимому, адамантаны, имеющие полярную группировку, с такой же скоростью проникают в растительные клетки, как и гликози-лированные адамантаны, вызывая ингибирование ростовых процессов.

Однако этиладамантан (VII), имеющий наиболее простое строение, оказался высокотоксичным соединением, и в концентрации 1 мг/мл он полностью подавлял всхожесть семян. На основании проведенного исследования можно сказать, что токсичность, проявляющаяся в снижении всхожести семян, убывает в следующем ряду: VII > VI > V > III > IV > VIII = II > I.

Мониторинг токсичности многих ксенобиотиков показал, что различные виды растений обладают различной толерантностью к действию антропогенных поллю-

тантов. Поэтому мы исследовали воздействие адамантанов на широко применяемый в экологическом тестировании тест-объекте Lepidium sativum (табл. 2).

Таблица 2

Всхожесть семян Lepidium sativum под воздействием адамантанов

на третьи сутки, %

Соединения Концентрация, мг/мл

0 0,005 0,05 0,25 0,5 1

I 95±2,5 95±2,5 91,6±2,9 91,6±2,9 95±2,5 93,3±2,6

II 90±2,9 80±4,9 78,3±4,8 80±4,9 80±4,9 85±4,6

III 98±1,8 91,6±2,1 93,3±2,6 93,3±2,6 91,6±2,9 91,6±2,9

IV 98±1,8 95±2,5 85±4,6 88,3±4,2 91,6±2,9 93,3±2,6

V 96,66±2,1 95±2,5 90±2,9 91,7±2,5 88,33±4,2 85±4,3

VI 98,33±1,8 95±2,5 98,33±1,8 83,3±4,6 75±4,9 50±5,1

VII 98,33±1,8 98,33±1,8 95±2,5 96,7±2,5 73,33± 55±5,4

VIII 98,33±1,8 98±1,8 97,1±1,8 96,8±2,5 95,5±2,5 94,7±2,5

В ходе проведенных исследований мы обнаружили, что Lepidium sativum оказался более устойчив к токсическому действию исследуемых адамантанов. Вещества VIII и VI являлись наиболее токсичными и в концентрациях 0,5 и 1 мг/мл приводили к заметному снижению всхожести семян.

Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что для L. Sativum все исследуемые адамантаны проявляли слабую токсичность, однако с ростом концентрации токсичность соединений достоверно возрастала (p < 0, 005). Сами адамантаны по способности ингибировать всхожесть семян L. Sativum не имели статистически значимых различий. Таким образом, семена L. Sativum оказались менее чувствительны к воздействию адамантанов, чем семена лука.

Длительное воздействие соединений на растения ингибирует не только энергию прорастания семян, но и ростовые процессы корневой системы. Для оценки токсического влияния соединений адамантана на онтогенез растений нами было проанализировано их действие на ростовые процессы, для этого использовали такие параметры, как длина корня и относительный прирост корней после пятидневной экспозиции семян Allium cepa и четырехдневной экспозиции семян Lepidium sativum с исследуемыми адамантанами.

Результаты исследований представлены на рис. 2 и 3.

адамантанов

-.-I -a- II III »IV »V -.-VI -"-VII »VIII —0

1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Рис. 3. Относительная длина корней Lepidium sativum, подвергшихся воздействию

адамантанов

В результате проведенных исследований мы выявили, что у семян A. cepa, выращенных на водных растворах адамантанов, длина корней была достоверно ниже (p < 0,005), чем в контроле. Для A. cepa максимальной токсичностью обладали вещества VI и VII. Однако вещества I, V, VI, VIII в концентрации 0,005 мг/мл оказывали стимулирующее действие на рост корней A. cepa в длину. Подобное стимулирующее действие эти вещества в концентрации 0,005 мг/мл оказывали и на всхожесть семян A. cepa. Анализ механизмов противовирусного действия ада-мантанов показал, что адамантаны, взаимодействуя с биологическими мембранами, приводят к сдвигу рН клетки в кислую сторону [6]. Мы предполагаем, что именно это изменение рН клеточной оболочки вызывало более сильное подкисле-ние клеточной оболочки и быстрое ее разрушение, что выражалось в повышении всхожести семян и длины корня по сравнению с контролем. Анализ ростовых процессов корней Lepidium sativum показал, что длина корней во всех опытных образцах достоверно (p < 0,005) ниже, чем в контрольных образцах. Наименьший прирост корней мы наблюдали в образцах, обработанных растворами адаманта-нов II, IV, VI, VII. Проведенный двухфакторный анализ выявил статистически значимые различия (p < 0,005) как в действии концентраций, так и в действии адамантанов на исследуемые тест-объекты. Полученные результаты согласуются с данными анализа всхожести семян L. Sativum и сохраняют те же тенденции. Мы выявили, что длина корней A. Cepa положительно коррелирует со всхожестью семян (r = 0, 77), для семян L. Sativum эта корреляция выражена слабее (r = 0, 63).

Для оценки токсичности на основе полученных экспериментальных данных нами были рассчитаны дозы LD50 для A. Cepa и L. Sativum по методу пробит-ана-лизов Прозоровского для всех исследованных адамантанов (табл. 3).

Полученные результаты позволили нам построить следующие убывающие ряды токсичности:

• VII>VI>V>II>VIII>II>IV>I для Allium cepa;

• VI>VII>II>IV>VIIIV>IV>I для Lepidium sativum.

На основе полученных нами результатов исследований мы предполагаем, что адамантаны обладают высокой способностью взаимодействовать с биомембранами. Адамантаны, будучи высоколипофильными соединениями, хорошо проникают в биомембраны и интегрируются в липидном слое. Производные адамантана вызывают изменения физических свойств мембран. Это приводит к снижению скорости

концентрации

Таблица 3

Доза LD50 для Allium cepa и Lepidium sativum

Вещества Доза LD50, мг/мл

Allium cepa Lepidium sativum

I 3,98 99,61

II 1,87 3,55

III 2,315 24,44

IV 3,36 4,86

V 0,66 6,23

VI 0,42 0,96

VII 0,27 1,02

VIII 2,015 5,78

поступления воды в семя и, как следствие, уменьшению энергии прорастания, что негативно сказывается на росте корней в длину.

Анализируя полученные нами результаты, можно сказать, что оба тест-объекта являются пригодными для целей мониторинга антропогенных ксенобиотиков. Однако Lepidium sativum оказался менее чувствителен как тест-объект к действию адамантанов, чем Allium cepa. Максимальную токсичность на семена обоих проанализированных тест-объектов оказывали вещества VI и VII.

Оцениваемые нами параметры, такие как энергия прорастания, всхожесть семян и относительный прирост корня в длину, показали высокую информативность в оценке токсичности соединений. Однако использование параметра "энергия прорастания" для L. Sativum является нецелесообразным ввиду морфофизиологиче-ских особенностей данного тест-объекта.

Литература

[1] Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. М.: Медицина, 1998. 326 с.

[2] Шигаева М.К., Акматулина Н.Б. Хромосомная индикация загрязнений окружающей среды с использованием древесных объектов // Успехи совр. генетики. 1982. Вып. 10. С. 115-131.

[3] Довгалюк А.И., Калиняк Т.Б., Блюм Я.Б. Оценка фито- и цитотоксической активности соединений тяжелых металлов и алюминия с помощью корневой апикальной меристемы лука // Цитология и генетика. 2001. № 1. С. 3-10.

[4] Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1998. 352 с.

[5] Тихая Н.И., Федоровская М.Д. Биохимическая адаптация корневых клеток ячменя к токсическим веществам. Действие тяжелых металлов на фосфо-гидролазную активность // Известия РАН. Сер.: Биологическая. 2000. № 6. С. 688-694.

[6] Козелецкая К.Н. Ремантадин как химиопрепарат для экстренной профилактики и лечения гриппа А // Consilium medicum. 2004. № 6. С. 35-39.

Поступила в редакцию 22/ VIII/2010; в окончательном варианте — 22/ VIII/2010.

ASSESSMENT OF SENSITIVITY OF ALLIUM CEPA AND LEPIDIUM SATIVUM WITH USE OF XENOBIOTICS OF ADAMANTANS

© 2010 J.K. Shutova2

In this article comparative sensitivity of two vegetable test-objects: Allium сера and Lepidium Sativum according to the toxic influence of xenobiotics of adamantans is analysed. It is revealed, that A. cepa is more preferential the test-object for an assessment of toxicity of anthropogenous xenobiotics.

Key words: Allium cepa, toxicity, adamantan.

Paper received 22/ VIII/2010. Paper accepted 22/ VIII/2010.

2Shutova Julia Georgievna (shutova79ayandex.ru), the Dept. of Zoology, Genetics and General Ecology, Samara State University, Samara, 443011, Russian Federation.