СПОСОБ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ЛИСТЬЯХ КРАПИВЫ ДВУДОМНОЙ ПРИ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ ХЛОРОФИЛЛА, КАРОТИНОИДОВ И ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ
METHOD FOR SPECTROPHOTOMETRIC MEASUREMENT OF COMBINATION OF CHLOROPHYLL, CAROTINOIDS AND HYDROXYCINNAMIC ACID IN GREAT NETTLE LEAVES

Изобретение относится к медицине, а именно к исследованию и анализу медицинских препаратов, и может быть использовано при стандартизации лекарственного растительного сырья, например, крапивы двудомной, а также лекарственных препаратов на его основе по содержанию основных групп биологически активных веществ (БАВ), а также использовано в фармацевтической, косметологической и пищевой промышленности для идентификации и количественного определения в лекарственном растительном сырье крапивы двудомной и лекарственных препаратов на его основе хлорофиллов, каротиноидов и гидроксикоричных кислот при совместном присутствии.
Известны способы отдельного определения хлорофиллов, каротиноидов и гидроксикоричных кислот в различных видах лекарственного растительного сырья методами бумажной и тонкослойной хроматографии, фотоэлектроколориметрии, хроматомасс-спектроскопии и спектрофотометрии.
Известен способ определения состава липофильной фракции настоек гомеопатических матричных крапивы двудомной и крапивы жгучей, полученных из свежесобранного и высушенного сырья по методике общей фармакопейной статьи Государственной Фармакопеи, используя в качестве экстрагента 86 и 62% (по массе) этанол соответственно (Лапинская Е.С., Копытько Я.Ф. Изучение состава липофильной фракции настоек гомеопатических матричных крапивы двудомной и крапивы жгучей. Хим. - фарм. журн. - 2008. - Том 42. - №12. - СС.26-29). Способ заключается в следующем: в делительную воронку вместимостью 50 мл помещают 10 мл настойки и 20 мл н-гексана, встряхивают в течение 10 мин. Гексановое извлечение сливают в круглодонную колбу вместимостью 50 мл. Экстракцию проводят повторно с таким же количеством растворителя. Извлечения объединяют и отгоняют досуха на вакуум-выпарном ротационном аппарате при температуре около 50°C. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата. Для анализа вводят 0,2 мкл пробы в испаритель хроматомасс-спектрометра. Идентификацию разделенных компонентов проводили с использованием библиотеки масс-спектров NIST 98 и алгоритмов сравнения программного обеспечения Saturn V/S (Varian). Количественную оценку содержания БАВ осуществляли методом внутренней нормализации по площади пиков (полный ионный ток) идентифицированных соединений с использованием автоматической системы обработки данных.
Известен способ определения пигментов (хлорофилла и каротиноидов) в свежем растительном материале (Струсовская О.Г. Определение пигментного состава Cochlearia officinalis, произрастающей на островах соловецкого архипелага. Материалы V международной конференции «Фармация и общественное здоровье». Екатеринбург, 2012. - сс.184-187. 3. Землянухин А.А., Землянухин Л.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: Учебн. пособие. - Воронеж: ВГУ, 1996. - 188 с.), включающий измельчение сырья и обработку его раствором аммиака с концентрацией 1 моль/л и 10-кратным объемом ацетона с последующим фильтрованием и спектрометрическим измерением при длинах волн 440,5 нм, 644, 649, 662 и 665 нм, в которых находятся основные максимумы поглощения каротиноидов, хлорофилла «а», «ф» и «б» и расчетом данных БАВ по Хольму-Ветштейну (для 100% ацетона) или по Вертону (для 80% ацетона).
Известен способ совместного определения гидроксикоричных кислот и флавоноидов в листьях крапивы узколистной (Матющенко Н.В. Влияние условий сушки на содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот в листьях крапивы узколистной. Сборник научных трудов: «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции». - Пятигорск. - Вып.67. - 2012. - С.78-79), включающий измельчение сырья и обработку его 70% этанолом спиртом с последующим прямым спектрометрическим определением гидроксикоричных кислот в пересчете на кофейную кислоту при длине волны 328 нм. Определение флавоноидов проводится отдельно методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом.
В литературе (Лупинская С.М., Орехова С.В., Васильева О.Г. Изучение биологически активных веществ липы, крапивы и душицы и сывороточных экстрактов на их основе. Химия раст. сырья. - 2010.- №3. сс.143-145; Юдина Н.В., Иванов А.А., Лоскутова Ю.В. и др. Влияние параметров диспергирования крапивы двудомной на изменения степени измельчения, выходов и свойств экстрактивных веществ. Химия растит. сырья. - 2012. - №1. - СС.137-142.) приведены методики качественного совместного определения хлорофиллов и каротиноидов в различных растительных объектах методом хроматографии на бумаге или в тонком слое с использованием отличных условий хроматографирования. Однако работ по определению каротиноидов, гидроксикоричных кислот и хлорофиллов при совместном присутствии методом ТСХ не обнаружено.
Известен способ определения хлорофилла в растениях гречихи (RU 2244916, G01N 21/25, C09B 61/00, 2005), включающий измельчение сырья и обработку его спиртом с последующим спектрометрическим измерением при двух длинах волн 665 и 649 нм, в которых находятся основные максимумы поглощения хлорофилла «а» и «б» и расчетом хлорофилла по формулам. Используют 96% спирт. Экстракцию проводят в герметически закрытых емкостях в течение 24-48 часов.
Недостатками указанных способов являются громоздкость и длительность выделения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья, использование различных экстрагентов и режимов экстракции, применение дорогостоящих стандартных образцов.
В научно-фармацевтической, медицинской и патентной литературе способов, позволяющих за одну процедуру экстракции лекарственного растительного сырья проводить одновременное спектрофотометрическое определение гидроксикоричных кислот, каротиноидов и хлорофилла в листьях крапивы двудомной без предварительного разделения данных групп биологически активных веществ, не выявлено.
Задача изобретения - разработка способа одновременного определения подлинности и количественного содержания хлорофиллов, каротиноидов и гидроксикоричных кислот в листьях крапивы двудомной методом спектрофотометрии при совместном присутствии для стандартизации лекарственного растительного сырья и лекарственных препаратов, изделий пищевой и косметологической промышленностей.
Технический результат заключается в доступности, простоте выполнения, экономичности и малой ошибкой определения.
Технический результат заключается в том, что способ спектрофотометрического количественного определения в листьях крапивы двудомной при совместном присутствии хлорофилла, каротиноидов и гидроксикоричневых кислот включает дробную экстракцию в течение 1 ч по 30 мин каждая измельченного сырья со степенью измельчения 1,0 мм на водяной бане 70% этанолом в соотношении сырье:экстрагент 1:100, объединение извлечений и доведение используемым растворителем до 100 мл, с последующим разведением полученного раствора в соотношении 2:25 96% этанолом, измерение оптической плотности раствора относительно 95% этанола в максимумах поглощения 328±1 нм, 442±1 нм и 667±1 нм, вычисление содержания суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту, каротиноидов в пересчете на виолоксантин и хлорофилла в процентах в пересчете на абсолютно сухую массу сырья по формулам.
Статистическая обработка результатов эксперимента показала, что средняя ошибка определения не превышает 6,17%.
На фиг.1 представлен спектр поглощения извлечения из листьев крапивы двудомной; на фиг.2 представлено влияние состава экстрагента на извлечение изучаемых групп БАВ; на фиг.3 представлена Таблица с метрологическими характеристиками методики количественного определения БАВ (%) (n=9; f=8; P=95%).
Способ иллюстрируется следующим примером.
В качестве объекта исследования использовали готовое измельченное сырье листьев крапивы двудомной отечественного производителя. Электронные спектры поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (РФ) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм в диапазоне волн 200-800 нм.
При изучении спектральных характеристик извлечений из листьев крапивы двудомной, полученных с применением различных экстрагентов (вода, водно-спиртовые смеси различной концентрации, ацетон), наблюдали основные поглощения в области 323±5 нм, характерные для гидроксикоричных кислот; 442±2 нм, характерные для каротиноидов (виолоксантин) и 667±3 нм, свойственные для хлорофилла (фиг.1).
Так как максимумы поглощения исследуемых биологически активных веществ не накладываются (фиг.1), то возможно проводить одновременное определение гидроксикоричных кислот, каротиноидов и хлорофилла в листьях крапивы прямым спектрофотометрическим методом без предварительного разделения.
При разработке методики изучены и установлены оптимальные параметры извлечения гидроксикоричных кислот, каротиноидов и хлорофилла из сырья: степень измельчения сырья - 1,0 мм; экстрагент - 70% этанол (спирт этиловый); соотношение сырье:экстрагент 1:100; время экстракции - 1 ч (дробно по 30 мин). Выбор экстрагента осуществляли на основании полученных данных по влиянию полярности растворителя на извлечение БАВ (фиг.2). Установлено, что с увеличением полярности до 6,0 единиц происходит повышение экстрагируемости всех изучаемых групп БАВ. Дальнейшее увеличение полярности экстрагента нецелесообразно ввиду снижения их содержания в извлечении (фиг.2).
Пример.
Около 0,5 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл и экстрагировали 50 мл 70% спирта этилового в течение 30 мин. После охлаждения извлечение декантировали и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Остаток в колбе заливали 50 мл 70% спирта этилового и экстрагировали еще раз в течение 30 мин. Объединенные извлечения в мерной колбе доводили 70% спиртом этиловым до метки (раствор А). 2 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем 95% спиртом этиловым до метки (раствор Б). Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (РФ) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 328±1 нм, 442±1 нм и 667±1 нм. Раствором сравнения служил 95% спирт этиловый. Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту, каротиноидов в пересчете на виолоксантин и хлорофилла в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухую массу сырья вычисляли по формулам (1-3)
<mrow><mi>X</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>25</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>507</mn><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>250000</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>507</mn><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mtext>                       </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>1</mn><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
<mrow><mi>X</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>25</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>2500</mn><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>100</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mtext>                                </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>2</mn><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
<mrow><mi>X</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>25</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>944,5</mn><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>A</mi><mo>⋅</mo><mn>250000</mn></mrow><mrow><mi>m</mi><mo>⋅</mo><mn>944,5</mn><mo>⋅</mo><mn>2</mn><mo>⋅</mo><mo stretchy="false">(</mo><mn>100</mn><mo>−</mo><mi>W</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow></mfrac><mtext>                       </mtext><mo stretchy="false">(</mo><mn>3</mn><mo stretchy="false">)</mo></mrow>
где А - оптическая плотность раствора Б в соответствующем максимуме поглощения; m - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 507 - удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 327±1 нм; 2500 - удельный показатель поглощения виолоксантина при 442±2 нм; 944,5 - удельный показатель поглощения хлорофилла при 663±5 нм.
Результаты количественного определения изучаемых групп БАВ в листьях крапивы двудомной и метрологическая характеристика методики представлена в таблице (фиг.3).
Статистическая обработка результатов эксперимента показала, что средняя ошибка определения не превышает 6,17% (табл. фиг.3), что свидетельствует о возможности ее использования и включения в современную нормативную документацию для стандартизации и оценки качества листьев крапивы двудомной.
Способ позволяет одновременно проводить определение подлинности и количественного содержания биологически активных веществ в листьях крапивы двудомной методом прямой спектрофотометрии, и стандартизировать лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты по содержанию хлорофиллов, каротиноидов и гидроксикоричных кислот при совместном присутствии. Разработанный способ отличается доступностью, простотой выполнения, экономичностью и малой ошибкой определения.