"метод шахматной доски" как тест для оценки снижения уровня резистентности грамотрицательных микроорганизмов к карбапенемам в присутствии бисфосфоната

«Метод шахматной доски» как тест для оценки снижения уровня резистентности грамотрицательных микроорганизмов к карбапенемам в присутствии бисфосфоната

А. Г. Афиногенова1, Т. М. Ворошилова2, Г. Е. Афиногенов1, Г. Г. Родионов2

1 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

2 Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А. М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург, Россия

Одним из основных механизмов резистентности грамотрицательных микроорганизмов к антимикробным препаратам является ферментативный гидролиз бета-лактамазами (в частности, металло-бета-лактамазы). Одним из путей усиления действия карбапенемов является их сочетанное применение с препаратами, ингибирующими действие металло-бета-лактамаз, независимо от генотипа ферментов и их локализации, в частности лекарственными средствами из группы бисфосфонатов, разрешенными для применения в клинике. Впервые в наших исследованиях показано, что сочетан-ное применение меропенема или имипенема с препаратом «Бонефос» (клодроновая кислота) усиливает действие соответствующего антиби-

отика в 4-1024 раза. Данный эффект выявлен у бисфосфоната в концентрациях ниже МПК карбапенемов в 2^64 раза, которые оказались в 2^68 раз меньше максимальной концентрации этого препарата в сыворотке крови через 30 мин после перорального приема однократной дозы. Сочетанное применение карбапенемов и бис-фосфонатов позволит клиницистам добиться эффективной терапии тяжелых инфекций, вызванных грамотрицательными высокорезистентными бактериями, продуцирующими металло-бета-лактамазы.

Ключевые слова: карбапенемы, бета-лакта-мазы, бисфосфонаты, метод шахматной доски, антибиотикорезистентность.

«Checkerboard Array» as a Test for Evaluation of Decrease in Gram-Negative Bacteria Resistance to Carbapenems in the Presence of Bisphosphonate

A. G. Afinogenova1, T. M. Voroshilova2, G. E. Afinogenov1, G. G. Rodionov2

1 Saint-Petersburg State University, St. Petersburg, Russia

2 The Nikiforov Russian Center of Emergency and Radiation Medicine, St. Petersburg, Russia

One of the main mechanisms of resistance of Gramnegative microorganisms to antibiotics is enzymatic hydrolysis by beta-lactamases (for example, metallo-beta-lactamases). Searching of paths of strengthening

Контактный адрес:

Анна Геннадьевна Афиногенова

Эл. почта: spbtestcenter@mail.ru

of carbapenems action is possible due to their combined application with the preparations inhibiting the action of metallo-beta-lactamases, irrespective of a genotype of enzymes and their localization (for example, among pharmaceuticals from group of bisphosphonates, allowed for application in clinic). For the first time in our researches it is shown that the combined application of meropenem or imipenem with the preparation «Bonefos» (clodronic acid) strengthens action of the corresponding antibiotic from

4 to 1024 times. This effect is revealed at bisphospho-nate in concentration from 1/2 MIC to 1/64 MIC which appeared up to 68 times less maximal concentration of this preparation in blood serum in 30 minutes after per os single-pass dose. The combined application of carbapenems and bisphosphonates will allow clinical

physicians to achieve efficient therapy of the heavy infections caused by Gram-negative high-resistance bacteria producing metal-beta-lactamases.

Key words: carbapenems, beta-lactamases, bisphosphonates, checkerboard array, antimicrobial resistance.

Введение

В настоящее время у пациентов, находящихся на стационарном лечении, наблюдается увеличение доли грамотрицательных аэробных бактерий как возбудителей инфекций [1]. Речь идет о Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Klebsiela spp., Stenotrophomonas maltophilia и др. Эти микроорганизмы, как правило, обладают низкой чувствительностью к различным классам антибиотиков, а также способностью приобретать резистентность в процессе лечения, что представляет существенные проблемы при проведении антибактериальной терапии и резко ограничивает арсенал применяемых для лечения больных антибактериальных препаратов, в том числе карбапенемов. Устойчивость среди Enterobacteriaceae обусловлена комбинацией нескольких механизмов, например гиперпродукцией бета-лактамаз и снижением проницаемости внешней мембраны микробной клетки (обычно это связано с утратой пориновых белков). Все известные в настоящее время бета-лактамазы делят на четыре молекулярных класса, в пределах которых ферменты характеризуются общностью свойств и определенной аминокислотной гомологией. Бета-лактамазы классов A, C, D относятся к ферментам «серинового» типа (по аминокислоте, находящейся в активном центре фермента). Ферменты класса В относятся к металло-бета-лактамазам (М/ЗЛ), поскольку в качестве ко-энзима в них присутствует цинк (Zn2+) [2] .

Ранее были проведены исследования М/ЗЛ у грамотрицательных бактерий с помощью этилен-диаминтетраацетата (ЭДТА) [1]. Этот тест показывает способность ЭДТА ингибировать М/ЗЛ у грамотрицательных бактерий, что проявляется в расширении зон задержки роста вокруг диска с карбапенемом. Синтез бета-лактамаз грамотри-цательными бактериями и возникшая в этой связи их устойчивость к бета-лактамным антибиотикам очень часто не может быть определена традиционными, привычными для лабораторной службы клинических учреждений фенотипическими методами — методом дисков и методом серийных разведений. Есть специальные методы, но далеко не все из них стандартизированы и в большинстве случаев не получили формального признания, не «узаконе-

ны» [3]. Сравнительно высокая токсичность ЭДТА и легкость проникновения внутрь клетки ограничивают его применение в лечебной практике. В связи с этим несомненный интерес могут представлять нетоксичные хелатообразующие лекарственные препараты, разрешенные к клиническому применению.

Целью нашего исследования было изучение возможности усиления действия карбапенемов в отношении резистентных грамотрицательных микроорганизмов с помощью лекарственного препарата «Бонефос» из группы бисфосфонатов.

Ранее в наших исследованиях методом «двойных дисков с ЭДТА» [1] выявлена хелатирующая активность веществ из группы бисфосфонатов, которая не уступала таковой у ЭДТА в отношении штамма P. aeruginosa — продуцента М/ЗЛ [4]. Наиболее признанным по изучению эффекта сочетанного действия антибиотиков является так называемый «метод шахматной доски» [3, 5, 6], который был использован в нашей работе.

Материал и методы

Стандартными методами [7,8] были выделены 20 изолятов грамотрицательных микроорганизмов из клинического материала пациентов (кровь, ликвор, мокрота, раневое отделяемое, моча) клиники № 2 ФГБУ ВЦЭРМ им. А. М. Никифорова МЧС России. Идентификацию проводили на бактериологическом анализаторе VITEK-2 (Биомерье, Франция). Уровень резистентности выделенных изолятов определяли методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон (OXOID) с определением минимальных подавляющих концентраций (МПК) антибиотиков [9]. Фенотипическую детекцию М/ЗЛ тест-штаммов с высоким уровнем резистентности к карбапенемам проводили с помощью Е-теста (имипенем и имипенем + ЭДТА, Биомерье, Франция). Методом ПЦР проводили генотипирова-ние карбапенемаз у всех штаммов грамотрицатель-ных микроорганизмов с использованием приборов Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), CFX96 (Bio-Rad, США) и наборов реагентов для выделения генов карбапенемаз «АмплиСенс» (предоставлены ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). В работе использовали бисфос-

Таблица 1. Уровень резистентности к карбапенемам у грамотрицательных микроорганизмов в зависимости от генотипа карбапенемаз

№ п/п № штамма TecT-MHKpoopraHH3M МПК антибиотика, мкг/мл меропенем имипенем Генотип карбапенемазы

1 346/14 A. baumannii 128 256 0XA-40

2 947/12 A. baumannii 64 128 0XA-40

3 2847 A. baumannii 128 32 0XA-40

4 4459/13 A. baumannii 32 32 OXA-23

5 598/13 A. baumannii 64 32 0XA-40

6 798/12 A. baumannii 128 128 0XA-40

7 965/12 A. baumannii 16 16 OXA-23

8 807/12 A. baumannii 32 64 0XA-40

9 944/12 A. baumannii 32 64 0XA-40

10 792/12 A. baumannii 64 64 0XA-40

11 4459/13 A. baumannii 16 32 OXA-23

12 193 A. baumannii 16 8 OXA-23

13 2474/14 A. baumannii 32 32 0XA-40

14 532/14 P. aeruginosa 512 512 VIM

15 53/14 P. aeruginosa 512 512 VIM

16 827 P. aeruginosa 32 128 VIM

17 2314 P. aeruginosa 16 16 VIM

18 2365/14 P. aeruginosa 32 128 VIM

19 886 K. pneumoniae 16 8 NDM

20 4058/13 K. pneumoniae 128 128 NDM

фонат «Бонефос» (клодроновая кислота) и ЭДТА в качестве контроля.

Изучение усиления действия карбапенемов (имипенема и меропенема) в сочетании с ЭДТА или Бонефосом проводили «методом шахматной доски». В исследованиях использовали микроразведения в полистироловых 96-луночных планшетах (ОАО «Медполимер», Россия). Для данного исследования готовили раствор ЭДТА с содержанием 50 мг препарата в 1 мл стерильной дистиллированной воды, далее в среде Мюллера-Хинтон получали 2-кратные разведения. В ячейки, содержащие по 100 мкл разведения антибиотиков, вносили по 100 мкл разведений ЭДТА, объем смеси составил 200 мкл. При этом в ряду А2 — А8 содержалось по 200 мкл разведений ЭДТА, тогда как в ряду Б1 — З1 содержалось по 200 мкл разведений антибиотика. Ячейка А1 — контроль культуры 200 мкл, ячейка З8 — контроль среды 200 мкл. Аналогичным способом готовили разведения препарата Бонефос.

Исследования проводили с тест-культурами P. aeruginosa штамм 532/14 и Acinetobacter baumannii штамм 346/14 с наиболее высоким уровнем устойчивости к карбапенемам.

Для получения инокулюма готовили исходную суспензию суточной культуры микроба по стандарту 0,5 McFarland, далее суспензию разводили в 31 раз в бульоне Мюллера-Хинтон, при этом полученная взвесь содержала 5х106 КОЕ/мл. Далее во все ячейки, кроме ячейки 38 (контроль среды), вносили по 10 мкл микробной взвеси. Таким образом, в каждой ячейке конечная микробная нагрузка соответствующего тест-штамма составляла 5х104 КОЕ в 200 мкл. Разведение в ячейке, содержимое которой было прозрачным, принимали за МПК препаратов после высева на плотную питательную среду и получения роста тест-штамма.

Результаты и обсуждение

Полученные результаты при генотипировании карбапенемаз тест-культур и значения МПК исследуемых карбапенемов представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, все выделенные изоляты обладали высоким уровнем резистентности к карбапенемам. Так, для А. ЬаитаппИ МПК меропенема составляла от 16 до 128 мкг/мл, МПК имипенема — от 8 до 256 мкг/мл. Основными генотипами карбапенемаз у А. ЬаитаппИ являлись 0ХА-40 и ОХА-23. По данным литературы [10],

Рис. 1. Оценка наличия М/ЗЛ у P. aeruginosa штамм 532/14 с помощью Е-теста

Рис. 2. Оценка наличия М/ЗЛ у A. baumannii штамм 346/14 с помощью Е-теста

группа ферментов ОХА-40 и ОХА-23 имеют плаз-мидную или хромосомную локализацию и характерны преимущественно для Acinetobacter spp. МПК меропенема и имипенема для изолятов P. aeruginosa составляла от 16 до 512 мкг/мл. Ферменты группы VIM являются одними из наиболее значимых среди М/ЗЛ, описанных у P. aeruginosa [11]. Они гидролизуют все бета-лактамы, кроме монобакта-мов. МПК в отношении изолятов K. pneumoniae составила от 16 до 128 мкг/мл для меропенема и от 8 до 128 мкг/мл для имипенема. Ферменты группы NDM также являются значимыми среди металло-бета-лактамаз.

Генотипированием у штамма P. aeruginosa 532/14 выявлена М/ЗЛ генотипа VIM, а у A. bau-mannii 346/14 показано наличие карбапенемаз типа ОХА. Однако с помощью Е-теста с ЭДТА показано наличие М/ЗЛ у обоих штаммов, при этом наблюдалось снижение МПК имипенема до 1 мкг/мл (рис. 1, 2).

Влияние перспективного препарата бисфосфона-та — ингибитора М/ЗЛ — изучали «методом шахматной доски», где в контрольных тестах использовали сочетание одного из карбапенемов с ЭДТА. При обосновании заключения об усилении действия антибиотика в присутствии хелатирующего агента оценивали индекс фракционной ингибирующей концентрации (Z FIC), который находили по формуле [5]:

МПКас МПКбс

2 FIC = „гт/с +-бс , где

МПКа МПКб

МПКас — минимальная подавляющая концентрация антибиотика (в мкг/мл), взятого в сочетании с комплексоном;

МПКа — минимальная подавляющая концентрация антибиотика, взятого как монопрепарат (в мкг/мл); МПКбс — минимальная подавляющая концентрация комплексона (в мкг/мл), взятого в сочетании с антибиотиком;

МПКб — минимальная подавляющая концентрация комплексона, взятого как монопрепарат (в мкг/мл).

Авторами метода предложена следующая трактовка индекса: синергизм — индекс до 0,5; индифферентность — индекс от 0,51 до 4; антагонизм — индекс более 4.

В опыт с ЭДТА был взят антибиотик имипенем в разведениях от 1/16 до 1/1024 МПК (табл. 2). Использовали комплексон в дозах как превышающих МПК в 2-16 раз, так и ниже МПК в 2 и 4 раза. При этом в дозах, меньших МПК, наблюдали синергидное действие, при котором чувствительность антибиотика повышалась в 1024 раз. Следует отметить, что наши данные по МПК ЭДТА (1562 мкг/мл) совпадают с данными литературы [11].

Таким образом, по схеме «шахматной доски» (см. табл. 2) минимальная концентрация имипене-ма в первом эффективном сочетании с ЭДТА составила 0,5 мкг/мл, а комплексона — соответственно 390 мкг/мл (ячейка Б2).

2 FIC + 0,25

512 1562

По формуле получаем, что индекс FIC составил 0,25, то есть в отношении P. aeruginosa штамм 532/14 наблюдали синергидный эффект таких концентраций комплексона и имипенема, что позволило повысить чувствительность микроорганизма к антибиотику в 1024 раза.

В табл. 3 представлен аналогичный эффект сочетания меропенема с ЭДТА в отношении P. aeruginosa штамм 532/14. Индекс FIC составил 0,25 (синергидный эффект).

Таблица 2. Чувствительность P. aeruginosa штамм 532/14 (МПК имипенема 512 мкг/мл) к сочетанному действию имипенема и ЭДТА

№ ячейки ЭДТА, мкг/мл

Имипенем, мкг/мл

К,

0,5

2

4

16

32

390 781 1562 3125 6250 12 500 25 000

Р Р Р

А

Д

Ж

Меропенем, мкг/мл

К

Примечание. Здесь и в табл. 3-8: Р — рост есть; «—» — роста нет; К1 — контроль культуры, рост есть; К2 — контроль питательной среды, роста нет.

Таблица 3. Чувствительность P. aeruginosa штамм 532/14 (МПК меропенема 512 мкг/мл) к сочетанному действию меропенема и ЭДТА

№ ячейки ЭДТА, мкг/мл К1 0,5 1 2 4 8 16 32

1 Р Р Р Р Р Р Р Р

2 390 Р — — — — — — —

3 781 Р — — — — — — —

4 1562 — — — — — — — —

5 3125 — — — — — — — —

6 6250 — — — — — — — —

7 12 500 — — — — — — — —

8 25 000 — — — — — — — К2

А Б В Г Д Е Ж З

1

8

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Р

Б

В

Г

Е

З

Таблица 4. Чувствительность P. aeruginosa штамм 532/14 (МПК имипенема 512 мкг/мл) к сочетанному действию имипенема и Бонефоса

Имипенем, мкг/мл

№ ячейки Бонефос, мкг/мл К1 0,5 1 2 4 8 16 32

1 Р Р Р Р Р Р Р Р

2 469 Р Р Р Р Р Р Р Р

3 938 Р Р Р Р Р Р Р Р

4 1875 Р Р Р Р Р Р Р —

5 3750 Р Р Р Р Р Р Р —

6 7500 Р Р Р — — — — —

7 15 000 Р Р Р — — — — —

8 30 000 — — — — — — — К2

АБВГДЕЖЗ

В дальнейшем во всех опытах с бисфосфонатом получены и описаны данные по двум ячейкам — с МПК Бонефоса и его минимальной эффективной

концентрацией, усиливающей действие антибиотика. Это сделано с целью показать синергидный эффект препарата, концентрация которого после-

Таблица 5. Чувствительность P. aeruginosa штамм 532/14 (МПК меропенема 512 мкг/мл) к сочетанному действию меропенема и Бонефоса

Меропенем, мкг/мл

№ ячейки Бонефос, мкг/мл К1 0,5 1 2 4 8 16 32

1 Р Р Р Р Р Р Р Р

2 469 Р Р Р Р Р Р Р —

3 938 Р Р Р Р Р Р Р —

4 1875 Р Р Р Р Р Р Р —

5 3750 Р Р Р Р Р Р — —

6 7500 Р — — — — — — —

7 15000 Р — — — — — — —

8 30000 — — — — — — — К2

АБВГДЕЖЗ

Таблица 6. Чувствительность A. baumannii штамм 346/14 (МПК имипенема 256 мкг/мл) к сочетанному действию имипенема и Бонефоса

Имипенем, мкг/мл

№ ячейки Бонефос, мкг/мл К1 0,5 1 2 4 8 16 32

1 Р Р Р Р Р Р Р Р

2 469 Р Р Р Р Р Р Р Р

3 938 Р Р Р Р Р Р Р Р

4 1875 Р Р Р Р Р Р Р Р

5 3750 Р Р — — — — — —

6 7500 Р Р — — — — — —

7 15 000 Р — — — — — — —

8 30 000 — — — — — — — К2

АБВГДЕЖЗ

Таблица 7. Чувствительность A. baumannii штамм 346/14 (МПК меропенема 128 мкг/мл) к сочетанному действию меропенема и Бонефоса

№ ячейки Бонефос, мкг/мл

Меропенем, мкг/мл

К

0,5

2

4

16

32

469 938 1875 3750 7500 15 000 30 000

Р Р Р Р Р Р Р

Р Р Р Р

Р Р Р Р

Р Р Р Р

Р Р Р Р

А

Д

Р Р Р

Р Р

К

Ж

1

8

Р

Б

В

Г

Е

З

однократного внутривенного или перорального введения постепенно снижается в организме пациента как в крови, так и в пораженных тканях. При этом в наших исследованиях полученные данные

по МПК Бонефоса 30 000 мкг/мл совпадают с данными литературы, где описана МПК аналогичного препарата Синдронат на основе натриевой соли клодроновой кислоты [13] .

При использовании сочетаний Бонефоса с ими-пенемом выявлены следующие закономерности (табл. 4). В опыт были взяты следующие концентрации Бонефоса: МПК в отношении тест-штамма (30 000 мкг/мл), а также 1/2^ 1/64 МПК. Выявлено максимальное увеличение чувствительности P. aeruginosa штамм 532/14 к имипенему в 256 раз при сочетании с дозой Бонефоса, равной 1/4 МПК (ячейка Г6). Индекс FIC в данном опыте составил 0,25 (синергидный эффект). Необходимо отметить увеличение чувствительности тест-культуры к имипенему в 16 раз при сочетании с дозой Бонефоса, равной 1/16 МПК (ячейка З4). Индекс FIC при этом составил 0,12 (синергидный эффект).

При сочетании Бонефоса с меропенемом (табл. 5) максимальное усиление действия антибиотика в 1024 раза получено при дозе комплексона 1/4 МПК (ячейка Б6). Индекс FIC составил 0,25 (синергидный эффект). Следует отметить, что при повышении чувствительности тест-штамма к меро-пенему в 16 раз доза Бонефоса составила 1/64 МПК (ячейка З2). Индекс FIC при этом был равен 0,08. Таким образом, в данных опытах был также выявлен эффект синергизма меропенема и Бонефоса.

В другой группе опытов изучали сочетанное действие бисфосфоната и карбапенемов в отношении тест-штамма A. baumannii 346/14. Бонефос использовали в концентрациях, равных МПК, а также 1/2^ 1/64 МПК. Наблюдали усиление действия имипенема (табл. 6) в 512 раз при сочетании с Бонефосом в дозе 1/2 МПК (ячейка Б7). Индекс FIC составил 0,5 (синергидный эффект). При сочетанном использовании препарата в дозе 1/8 МПК получено усиление действия имипенема в 256 раз (ячейка В5). При этом индекс FIC равен 0,13 (синергидный эффект) .

При сочетании Бонефоса в дозе 1/8 МПК с меропенемом (табл. 7) получено усиление действия антибиотика в 256 раз (ячейка Б5). Индекс FIC равен 0,13 (синергидный эффект). Увеличение чувствительности тест-штамма A. baumannii 346/14 в 4 раза наблюдали в сочетании с Бонефосом в дозе 1/64 МПК (ячейка З2). Индекс FIC в этом случае составил 0,27 (синергидный эффект) .

Таким образом, выявлено синергидное действие бисфосфоната Бонефос и карбапенемов в отношении штаммов P. aeruginosa 532/14 и A. baumannii 346/14, продуцирующих ЭДЗЛ.

Следует отметить, что при генотипировании A. baumannii штамм 346/14 М/ЗЛ не были выявлены, но их наличие подтверждено фенотипически с помощью Е-теста с ЭДТА. Можно предположить, что данный тест-штамм обладает редким видом М^Л, которая не была выявлена с помощью ПЦР.

Известно, что ЭДТА не ингибирует другие группы бета-лактамаз, в том числе бета-лактамазы расширенного спектра и AmpC-бета-лактамазы. Таким образом, чувствительность к ингибитору является одним из важнейших маркеров образования МвЛ [3] .

K. Bush и G. Jacoby [14] классифицировали бета-лактамазы, учитывая их принадлежность к тому или иному молекулярному классу по R. Ambler [2], но при этом брали за основу спектр их действия на антибиотики бета-лактамной структуры и чувствительность к ингибиторам бета-лактамаз [15] .

Проведенные нами ранее исследования [16] показали, что хелатообразующие агенты, в частности ЭДТА, продуцирующие стабильные комплексы с катионами металлов, способны изменять проницаемость бактериальных мембран. Это обусловлено быстрым выделением из клеточной оболочки в окружающую среду липополисахарида и некоторых белков, которые удерживаются в наружной мембране грамотрицательных бактерий за счет связывания их ионами металлов через фосфатные группы. В результате обработки микробных клеток ЭДТА возрастает их проницаемость для многих антибиотиков (актиномицина, полимиксина В, тетрациклина, хлорамфеникола и пенициллинов), а также антисептиков (хлоргексидина, диметилбен-зилалкиламмоний хлорида) .

Результаты последних исследований показали высокий уровень резистентности к карбапене-мам клинических штаммов P. aeruginosa 532/14 и A. baumannii 346/14 и его снижение в присутствии препарата Бонефос в 4^1024 раза (синергид-ный эффект), поэтому можно предположить, что Бонефос способен ингибировать металло-бета-лак-тамазы. Эти данные свидетельствуют о возможном действии бисфосфонатов на разные механизмы резистентности у микроорганизмов, а именно: ингибирование М/ЗЛ и повышение проницаемости клеточных мембран.

Заключение

Все выделенные изоляты P. aeruginosa обладали металло-бета-лактамазой VIM. Тест-культуры A. baumannii содержали карбапенем-гидролизую-щие бета-лактамазы класса D (OXA-23, OXA-40) .

Достижение синергидного действия двух антибиотиков с целью повышения эффективности химиотерапии привлекает самое большое внимание исследователей. При этом можно выделить два положения: 1) синергидное действие достижимо при использовании определенного круга антимикробных препаратов; 2) синергидный эффект проявляется относительно не часто, методы его про-

гнозирования пока недостаточно надежны [17]. На сегодняшний день изучен принцип эффективного сочетанного действия антибиотиков на микроб — подавление одним из препаратов механизма защиты микроорганизма. Ингибиторы бета-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам) оказывают слабое действие на микроорганизмы, но отличаются высоким сродством к бета-лак-тамазам. Именно эти препараты обеспечивают инактивацию ферментов до того, как последние успевают расщепить -С-Ы-связь в структуре другого антибиотика.

К сожалению, современные ингибиторы бета-лактамаз не универсальны по действию на бактериальные ферменты, число которых растет. Кроме того, подобрать сочетание ингибитора с активным антибактериальным веществом непросто, для этого оба препарата должны иметь совпадающие (хотя бы частично) фармакокинетические свойства, иначе они будут действовать не синергидно. Среди других механизмов синергидного действия можно допустить возможность того, что угнетение двумя антибиотиками разных мишеней в бактериальной клетке будет способствовать потенцированному эффекту.

Бисфосфонаты обладают высоким сродством к минеральным компонентам костной ткани. Основным механизмом действия клодроновой кислоты (Бонефос) является подавление активности остеокластов и уменьшение опосредованной ими резорбции костной ткани. При применении этого препарата в максимальных дозах влияние на нормальную минерализацию кости у человека не наблюдается [18]. Бисфосфонаты — лекарственные средства, применяемые, в основном, для профилактики и лечения остеолитических метастазов злокачественных опухолей и миеломной болезни (множественной миеломы), а также гиперкальцие-мии, обусловленной злокачественными опухолями. Они разрешены для системного применения (перо-рального и внутривенного). При этом отмечено, что явная связь между концентрацией клодроно-вой кислоты в плазме крови и терапевтическим эффектом или побочными реакциями отсутствует [18]. Курс лечения Бонефосом составляет 7 дней (максимальная суточная доза при пероральном приёме — 3200 мг, при внутривенном введении — 1500 мг). Всасывание клодроновой кислоты в ЖКТ происходит быстро и составляет приблизительно 2% от суточной пероральной дозы в 1600 мг [18]. При этом внутривенное введение препарата гарантирует 100% биодоступность, так как клодронат практически моментально всасывается из крови в костную и мышечную ткани [19]. Степень абсорб-

ции препарата и его выведения могут значительно варьировать у различных пациентов. Отмечено, что около 70-80% абсорбированного препарата выводится почками в течение 1-2 дней после приема суточной дозы, т. е. 20-30% клодроната остаются абсорбированными в костной ткани и выводятся из организма в течение длительного времени [18, 20]. Имеются данные о фармакокинетике клодроната, введенного внутривенно в дозе 200 мг/сутки, где отмечено, что 50% препарата выводится почками и 50% абсорбируется в костную ткань. Таким образом, показано, что 100 000 мкг препарата остаются в тканях [19]. В то же время необходимо отметить, что в соответствии с Инструкцией по медицинскому применению препарата, на которую должны ориентироваться клинические фармакологи и практикующие врачи, максимальная суточная доза Бонефоса при внутривенном введении составляет 1500 мг, при пероральном применении — 1600 мг (максимальная доза — 3200 мг в сутки) [18].

Сочетанное применение бисфосфоната (препарата «Бонефос») с карбапенемами приводило к усилению действия соответствующего антибиотика по принципу синергидного эффекта, при этом были получены следующие закономерности. Во всех опытах наблюдали синергидное действие совместного применения Бонефоса с импенемом или меропенемом в отношении обоих тест-штаммов грамотрицательных микроорганизмов. В сочетании с Бонефосом в отношении P. aeruginosa штамм 532/14 отмечено усиление действия имипе-нема в 16-256 раз, меропенема — в 16-1024 раза; в отношении A. baumannii штамм 346/14 наблюдали увеличение активности имипенема в 256-512 раз, меропенема — в 4-256 раз. Следует отметить, что такой эффект получен при использовании Бонефоса в концентрациях, равных от 1/2 МПК (15 000 мкг/мл) до 1/64 МПК (469 мкг/мл) .

Основываясь на данных литературы о фармако-кинетике клодроната, нами была проведена оценка возможной терапевтической эффективности полученных концентраций Бонефоса, при которых наблюдали синергидное действие с карбапе-немами. Так, концентрация препарата 3750 мкг/мл соответствует эффективному пероральному приему 937,5 мг клодроната при условии всасывания 2% из них и остаточной абсорбции в костной ткани 20%, тогда как рекомендованная суточная доза составляет 1600 мг. Таким образом, полученное нами эффективное (до уровня чувствительности) снижение МПК карбапенемов в присутствии Бонефоса наблюдали в концентрациях препарата 3750-7500 мкг/мл, что значительно ниже содержания клодроната в тканях скелета человека после

перорального приема или внутривенного введения ингибиторов МуЗЛ, особенно при инфекционно-рекомендованных суточных доз. воспалительных заболеваниях костной ткани.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования бисфосфонатов как

Литература

1. Шевченко О. В., Эйдельштейн М. В., Степанова М. Н. Металло-/3-лактамазы: значение и методы выявления у грамотрицательных неферментирующих бактерий. Клин микробиол антимикроб химиотер 2007; 9(3):211-19.

2. Ambler R., Coulson A., Frere J., et al. A standart numbering scheme for the Class A beta-lactamases. Biochem J 1991; 276 (1):269-72.

3. Поляк М. С. Лабораторное обеспечение антибиотико-терапии 2012; 256.

4. Афиногенова А. Г., Мадай Д. Ю., Афиногенов Г. Е., Лебедева И. К., Петрова Т. М. Влияние бисгуаниди-нов и бисфосфонатов на факторы антибиотикорези-стентности грамотрицательных бактерий. Инфекции в хирургии 2013; 11 (3):15-8.

5. Eliopoulos G. M., Moellering R. C. 1991. Antimicrobial combinations, p. 432-492. In: V. Lorian (ed.), Antibiotics in laboratory medicine. The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD.

6. Moody J. Sinergism Testing: Broth Microdilution Checkerboard and Broth Macrodilution Methods. In H. Isenberg (Ed.) Clinical Microbiology Procedures Handbook 2004; 2:5.12.1-21.

7. Приказ МЗ СССР от 22.04.1985 г. № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

8. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I. Под редакцией Лабинской А. С., Волиной Е. Г. 2008; 1080.

9. Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». МУК 4.2.1890-04.

10. Сидоренко С. В., Партина И. В., Агеевец В. А. Имипе-нем: 30 лет терапии. Антибиотики и химиотерапия 2013; 58 (5-6):55-61.

11. Watanabe M., Iyobe S., Inoue M., Mitsuhashi S. Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35:147-51.

12. Lambert R. G.W. The synergistic effect of EDTA/anti-microbial combinations on Pseudomonas aeruginosa. JAMA 2004; 96:244-53.

13. Kruszewska H. Search of antimicrobial activity of selected non-antibiotic drugs. Acta Pol Pharm 2002; 59(6):436-9.

14. Bush K., Jacoby G. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54(3):969-76.

15. Drawz S., Bonomo R. Three decades of beta-lactamase inhibitors. Clin Microbiol Rev 2010; 23 (1):160-201.

16. Афиногенов Г.Е, Панарин Е. Ф., Копейкин В. В. Влияние полимерных комплексонов на основе сополимеров винилпирролидона с винилиминодиуксусной кислотой и метакрилоилацетоном на чувствительность к антибиотикам антибиотикочувствительных штаммов бактерий. Антибиотики 1978; 5:419-24.

17. Поляк М. С. Антибиотикотерапия. Теория и практика 2010; 424.

18. Государственный реестр лекарственных средств РФ (http://grls.rosminzdrav.ru).

19. Muratore M. Clinical utility of clodronate in the prevention and management of osteoporosis in patients intolerant of oral bisphosphonates. Drug Design, Development and Therapy 2011; 5:445-54.

20. Castren-Kortekangas P., Löyttyniemi E., Liukko-Sipi S., Juhakoski A, Smal J., Laitinen L. Pooling of clodranate urinary excretion data: A new pharmacokinetic method to study drugs with highly variable gastrointestinal absorption. J Bone Miner Res 1997; 12:66-71.