ПЛАЗМИНОГЕН-ЗАМЕСТИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ ДЕФИЦИТЕ ПЛАЗМИНОГЕНА
PLASMINOGEN-REPLACEMENT THERAPY FOR PLASMINOGEN DEFICIENCY

Область техники
Данное изобретение относится к области медицины. Конкретные аспекты изобретения относятся к способам и применениям для восполнения плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
Уровень техники
Плазминоген (Pg) представляет собой встречающийся в природе белок, синтезируемый печенью и циркулирующий в крови. После активации плазминоген становится плазмином, ферментативным компонентом фибринолитической системы и основным ферментом, участвующим в лизисе сгустков и клиренсе экстравазированного фибрина.
Механизм действия плазминогена человека:
Физиологически, плазминоген участвует во внутрисосудистом и экстраваскулярном фибринолизе (Castillino and Ploplis, 2005).  В плазме человека существуют две основные гликоформы плазминогена: Плазминоген типа 1, который содержит два гликозилирующих фрагмента (N-связанный с N289 и O-связанный с T346) и плазминоген типа 2, который содержит только один O-связанный сахар (O-связанный с T346). Плазминоген 2-го типа предпочтительно привлекается к клеточной поверхности, тогда как плазминоген типа 1 более предпочтительно привлекается к кровяным сгусткам.
Плазминоген активируется до плазмина путем расщепления пептидной связи Arg561-Val562 либо активатором плазминогена тканевого типа (tPA), либо активатором плазминогена урокиназного типа.  В результате данного расщепления образуется α-тяжелая цепь, состоящей из пяти кринглов с связывающими лизин сайтами и β-легкая цепь с каталитической триадой His603, Asp646 и Ser741. Активный плазмин участвует в лизисе фибриновых сгустков в кровотоке. Было показано, что при связывании с фибриновым сгустком нативный плазминоген с N-концевой глутаминовой кислотой (Glu-плазминоген) легко расщепляется и превращается в модифицированный плазминоген (83 кДа) с N-концевым лизином (Lys-плазминоген) (как показано на фиг. 1).  Этот Lys-плазминоген является превосходным субстратом для активации с помощью tPA (Fredenburg and Nesheim, 1992).
Потребность в области техники:
Не существует эффективного и неинвазивного лечения субъектов с дефицитом плазминогена. Существует необходимость в новых стратегиях лечения дефицита плазминогена. Восполнение плазминогена неинвазивно, и, к сожалению, не существует никакой терапии восполнения плазминогена, которая предлагается этим субъектам с дефицитом плазминогена. Таким образом, существует потребность в предоставлении терапии восполнения плазминогена.
Дополнительные признаки изобретения будут очевидны из обзора обсуждения, фигур и описания изобретения в данном документе.
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение относится к способу восполнения плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена, применению плазминогена для восполнения плазминогена, плазминогену для применения в добавке плазминогена субъекту с дефицитом плазминогена, способу повышения уровня активности плазминогена в плазме у субъекта с дефицитом плазминогена и применению плазминогена для изготовления лекарственного средства для повышения уровня активности плазминогена у субъекта.
Данное изобретение относится к следующему:
1. Способ восполнения плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена, в котором субъект с дефицитом плазминогена имеет пониженную активность плазминогена в плазме относительно нормальной активности плазминогена в плазме, причем способ включает введение субъекту с дефицитом плазминогена повторяющейся эффективной дозы плазминогена для увеличения уровня активности у субъекта плазминогена по меньшей мере на 1 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что введенный плазминоген представляет собой Glu-плазминоген.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет дефицит плазминогена типа I.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет дефицит плазминогена типа II.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет приобретенный дефицит плазминогена.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что приобретенный дефицит плазминогена связан с болезнью Кавасаки; тромболитическим эпизодом у новорожденных или детей; ожогами; тяжелыми ожогами; гетеротопической оссификацией; синдромом гиалиновой мембраны у новорожденных; синдромом неонатальной респираторной болезни диссеминированной внутрисосудистой коагуляции; сепсисом; тромболитической терапией у взрослых; инсультом; острым повреждением легких; острым респираторным дистресс-синдромом у взрослых; диабетом; фульминантной печеночной недостаточностью; синдромом Бадда-Киари; микроангиопатической гемолитической анемией или атипичным гемолитическим уремическим синдромом.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что пониженная активность плазминогена в плазме менее чем или равна около 70 % от нормальной активности плазминогена.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что субъект с дефицитом плазминогена страдает от деревянистого конъюнктивита.
9. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток, два раза в неделю или еженедельно.
10. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят внутривенно.
11. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается, по меньшей мере, на 5 % от нормальной активности плазминогена и поддерживается на указанном увеличенном уровне активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается, по меньшей мере, на 10 % от нормальной активности плазминогена и поддерживается на указанном увеличенном уровне активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 200 % от нормальной активности плазминогена.
14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 150 % от нормальной активности плазминогена.
15. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 100 % от нормальной активности плазминогена.
16. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят ежесуточно в дозе, равной по меньшей мере 0,5 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
17. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят каждые двое суток в дозе, равной по меньшей мере 1,5 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
18. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят дважды в неделю в дозе, равной по меньшей мере 6 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
19. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводят еженедельно в дозе, равной по меньшей мере 45 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
20. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводится ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток или каждые четверо суток в дозе около 2 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
21. Способ по п. 2, отличающийся тем, что Glu-плазминоген вводится каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток или еженедельно в дозе около 6 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что вводимый плазминоген эффективен для: i) сокращения, лечения или предотвращения повреждения, связанного с дефицитом плазминогена, ii) улучшения  сниженного общего клинического впечатления или iii) улучшения  сниженного качества жизни.
23. Применение плазминогена для изготовления лекарственного средства для восполнения плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена, имеющего пониженную активность плазминогена в плазме относительно нормальной активности плазминогена в плазме, причем лекарственное средство предназначено для введения эффективной дозы плазминогена субъекту с дефицитом плазминогена для увеличения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
24. Применение по п. 23, отличающееся тем, что вводимый плазминоген представляет собой Glu-плазминоген.
25. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет дефицит плазминогена типа I.
26. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет дефицит плазминогена типа II.
27. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что субъект с дефицитом плазминогена имеет приобретенный дефицит плазминогена.
28. Применение по п. 27, отличающееся тем, что приобретенный дефицит плазминогена связан с болезнью Кавасаки; тромболитическим эпизодом у новорожденных или детей; ожогами; тяжелыми ожогами; гетеротопической оссификацией; синдромом гиалиновой мембраны у новорожденных; синдромом неонатальной респираторной болезни диссеминированной внутрисосудистой коагуляции; сепсисом; тромболитической терапией у взрослых; инсультом; острым повреждением легких; острым респираторным дистресс-синдромом у взрослых; диабетом; фульминантной печеночной недостаточностью; синдромом Бадда-Киари; микроангиопатической гемолитической анемией или атипичным гемолитическим уремическим синдромом.
29. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что пониженная активность плазминогена в плазме менее чем или равна около 70 % от нормальной активности плазминогена.
30. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что субъект с дефицитом плазминогена страдает от деревянистого конъюнктивита.
31. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для введения ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток, два раза в неделю или еженедельно.
32. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для внутривенного введения.
33. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для увеличения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере 5 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
34. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для увеличения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
35. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 200 % от нормальной активности плазминогена.
36. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 150 % от нормальной активности плазминогена.
37. Применение по п. 23 или 24, отличающееся тем, что уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на около 100 % от нормальной активности плазминогена.
38. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для ежесуточного введения дозы, равной по меньшей мере, 0,5 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
39. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для введения каждые двое суток дозы, равной по меньшей мере, 1,5 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
40. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для введения дважды в неделю дозы, равной по меньшей мере, 6 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
41. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для еженедельного введения дозы, равной по меньшей мере, 45 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
42. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для введения ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток или каждые четверо суток дозы около 2 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
43. Применение по п. 24, отличающееся тем, что лекарственное средство предназначено для введения каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток или еженедельно дозы около 6 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена.
44. Применение по любому из пп. 23-43, отличающееся тем, что вводимый плазминоген эффективен для: i) сокращения, лечения или предотвращения повреждения, связанного с дефицитом плазминогена, ii) улучшения  сниженного общего клинического впечатления или iii) улучшения  сниженного качества жизни.
45. Применение плазминогена и измеренной пониженной активности плазминогена для идентификации субъекта с дефицитом плазминогена, имеющего пониженную активность плазминогена по отношению к нормальной активности плазминогена, и для восполнения плазминогена у субъекта для увеличения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 1 % нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
46. Плазминоген для применения в восполнении плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена, имеющего пониженную активность плазминогена относительно нормальной активности плазминогена, причем восполнение плазминогена осуществляется для увеличения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания указанного повышенного уровня активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
47. Способ повышения уровня активности плазминогена и поддержания повышенного уровня активности плазминогена в течение периода восполнения у субъекта с дефицитом плазминогена, имеющего пониженную активность плазминогена относительно нормальной активности плазминогена, причем увеличение составляет по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена, при этом указанный способ включает введение указанному субъекту с дефицитом плазминогена Glu-плазминогена (i) дозы около 2,0 мг/кг массы субъекта ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток или каждые четверо суток; (ii) дозы около 6,0 мг/кг массы субъекта каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток или еженедельно.
Дальнейшие аспекты изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники из следующего описания, формулы изобретения и обобщений в данном документе.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлена схема аминокислотной цепи Glu-плазминогена, ее сайта конверсии в Lys-плазминоген, его A- и B-цепей и его структур крингл.
На фиг. 2 представлена фотография 4-летнего пациента, страдающего от деревянистого конъюнктивита в обоих глазах (Schuster and Seregard, 2003).
На фиг. 3 представлена фотография генерализованой десенной гиперплазии с узелковым разрастанием, покрытым желтоватыми псевдомембранами (Silva, 2006).
На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий используемую в данном документе терминологию для описания фаз типичного повторяющегося введения и «повышенной активности плазминогена» в соответствии с данным изобретением.
Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетический профиль (PK) активности плазминогена в плазме у пяти субъектов с дефицитом плазминогена, которые получили разовую дозу 2 мг/кг Glu-плазминогена, его среднее значение и предсказанный PK, уравнение, определяемое приложением Phoenix WinNonlin на основе указанного среднего значения.
Фиг. 6 представляет собой график, демонстрирующий предсказанный PK (определенный указанным уравнением) для разовой дозы, равной 2 мг/кг, 6 мг/кг и 12 мг/кг.
На фиг. 7А представлена фотография правого века субъекта 2 на 0 сутки (до инфузии) в исследовании, описанном в примере 2. На фиг. 7B представлена фотография правого века субъекта 2 на 1 сутки в исследовании, описанном в примере 2.
Фиг. 7С представляет собой график, демонстрирующий активность плазминогена с учетом исходных условий субъекта 2 через 5-15 минут, 1 час, 6 часов, 24 часа и 48 часов после окончания инфузии разовой дозы 2 мг/кг.
На фиг. 8А представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для ежесуточного введения 2 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 8B представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для ежесуточного введения 0,5 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 9А представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для введения каждые двое суток 2 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 9В представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для введения каждые двое суток 1,5 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 10А представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для введения дважды в неделю 2 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 10B представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для введения дважды в неделю 6 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 10C представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для введения дважды в неделю 12 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 11A представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для еженедельного введения 12 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
На фиг. 11B представлен график, демонстрирующий предсказанный фармакокинетический профиль активности плазминогена в плазме (выше исходного уровня) для еженедельного введения 45 мг/кг Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена.
Фиг. 12 представляет собой фотографию рентгеновского снимка грудной клетки, на которой представлен общий ателектаз левого легкого из-за обструкции дыхательных путей у субъекта, описанного в примере 4 до восполнения Glu-плазминогеном.
На фиг. 13А и 13В представлены бронхоскопические фотографии трахеи субъекта, описанного в примере 4, демонстрирующие вязкие выделения (А) и обструктивные поражения в трахее (В), соответственно.
На фиг. 14 представлена активность плазминогена и время введения доз плазминогена в течение первых 144 часов восполнения Glu-плазминогенмо у субъекта в примере 4.
На фиг. 15 представлен уровень D-димеров и активность плазминогена в течение первых 144 часов восполнения Glu-плазминогеном в примере 4.
На фиг. 16 представлен график, демонстрирующий фармакокинетический профиль (PK) активности плазминогена в плазме у семи субъектов с дефицитом плазминогена, которые получили разовую дозу 6 мг/кг Glu-плазминогена, их средние значения и кривую для указанных средних значений.
На фиг. 17-23 представлены графики, демонстрирующие уровни активности плазминогена (активность плазминогена, обнаруженная до дозы Glu-плазминогена), измеренные в течение 12-недельного периода восполнения Glu-плазминогеном, состоящего из повторяющихся доз 6 мг/кг, вводимых внутривенно каждые 2 суток (qod) или каждые 3 суток (q3d). Остаточные уровни у субъектов 01-001, 01-002, 01-006, 01-007, 01-008, 01-009 и 01-010 приведены на графиках фиг. 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, соответственно.  Базовая линия + 10 % приведена для справки.
На фиг. 24 представлена шкала оценки общего улучшения.
На фиг. 25 представлена шкала оценки качества жизни.
Подробное описание сущности изобретения
Данное изобретение относится к «восполнению плазминогена», которое также может быть обозначено как «заместительная терапия плазминогеном» или «терапия плазминогеном» или «лечение дефицита плазминогена». Дефицит плазминогена включает врожденный дефицит плазминогена и приобретенный дефицит плазминогена.
Данное изобретение относится к способу i) восполнения плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена или ii) предоставления указанному субъекту плазминогена, причем субъект с дефицитом плазминогена имеет пониженную активность плазминогена в плазме относительно нормальной активности плазминогена в плазме и при этом способ включает введение указанному субъекту эффективной дозы плазминогена для повышения уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена. В предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию определения активности плазминогена в плазме субъекта перед введением плазминогена. В другом варианте осуществления введение эффективных доз плазминогена заключается в увеличении уровня активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена и для поддержания уровня активности плазминогена у субъекта, превышающего указанный уровень активности плазминогена у субъекта плюс 1 % нормальной активности плазминогена в течение периода восполнения. Таким образом, для поддержания указанного уровня активности плазминогена выше желаемого порога можно вводить повторяющиеся дозы плазминогена или осуществлять непрерывное введение плазминогена. Связанное применение плазминогена для получения лекарственного средства для увеличения уровня активности плазминогена в плазме субъекта с дефицитом плазминогена также является предметом данного изобретения.
В одном варианте осуществления субъект, нуждающийся в данном изобретении, является «субъектом с дефицитом плазминогена». «Субъект с дефицитом плазминогена» определяется как субъект, который обладает плазматической активностью плазминогена, которая ниже уровня активности плазминогена в плазм у нормального субъекта с отсутствием дефицита плазминогена (называемого «нормальной активностью плазминогена»). Так как существует вариабельность активности плазминогена у нормального субъекта, нормальную активность плазминогена предпочтительно рассчитывают в пуле плазмы, собранной у субъектов с отсутствием дефицита плазминогена нормальными или здоровыми субъектами. Указанный пул плазмы предпочтительно собирают у достаточно большого количества субъектов, чтобы нормализовать вариацию, обнаруженную у индивидуумов. Предпочтительно, указанный пул плазмы собирают, по меньшей мере, от 240 нормальных субъектов, без дефицита плазминогена, например, 120 здоровых взрослых мужчин и 120 здоровых взрослых женщин, в возрасте от 20 до 80 лет. В другом варианте осуществления нормальная активность плазминогена соответствует средней активности плазминогена, определенной в популяции здоровых (например, не страдающих дефицитом плазминогена) субъектов. В данной области техники известны несколько способов измерения активности плазминогена. Например, активность плазминогена обычно определяется хромогенными или флуорогенными анализами. Пул субъектов для определения нормальной активности плазминогена, а также способ измерения активности плазминогена, которые предпочтительно используются в соответствии с данным изобретением, описаны в Criteria for specific measurement of plasminogen (enzymatic; procedure) in human plasma, Electronic Journal Of The International Federation Of Clinical Chemistry And Laboratory Medicine, Vol. 12, No. 3, 2000: www.ifcc.org/ifccfiles/docs/plasminogen.pdf.
Существуют различные типы субъектов с дефицитом плазминогена, которые включают, без ограничения, человека, страдающего i) острым дефицитом плазминогена, такого как новорожденные или недоношенные дети, ii) хронические пациенты с дефицитом плазминогена, такие как пациенты, страдающие по причине мутации, iii) острым неонатальным респираторным дистресс-синдромом (NRDS/HMD), iv) острого респираторного дистресс-синдрома взрослых (ОРДС), v) диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (DIC) и vi) деревянистого конъюнктивита.
Согласно одному аспекту изобретения субъект представляет собой человека. В вариантах осуществления изобретения субъект является взрослым, новорожденным, младенцем, ребенком или подростком.
Термин «пониженная активность плазминогена» обозначает активность плазминогена, измеренную у субъекта с дефицитом плазминогена. Термин «пониженная активность плазминогена» также относится к уровню активности плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена до введения плазминогена в соответствии с данным изобретением. В случае, когда субъект имеет дефицит плазминогена типа I, его количество плазминогена в плазме ниже, чем уровень, обнаруженный у здоровой популяции, и полученная в результате активность плазминогена ниже, чем указанная нормальная активность плазминогена. В случае, когда субъект имеет дефицит плазминогена типа II, его количество плазминогена в плазме может быть или не быть ниже уровня, обнаруженного у здоровой популяции; однако его плазминоген мутирован таким образом, что полученная активность плазминогена ниже, чем указанная нормальная активность плазминогена. В случае, когда субъект имеет плохо контролируемый или неконтролируемый сахарный диабет, его количество плазминогена в плазме может быть или не быть ниже уровня, обнаруженного у здоровой популяции; однако его плазминоген гликозилирован таким образом, что полученная активность плазминогена ниже, чем указанная нормальная активность плазминогена. Следовательно, во всех этих случаях уровни активности плазминогена у этих субъектов ниже, чем нормальная активность плазминогена. В одном аспекте изобретения снижение активности плазминогена составляет 70 % от нормальной активности плазминогена или менее, 60 % от нормальной активности плазминогена или менее, 50 % от нормальной активности плазминогена или менее, 40 % от нормальной активности плазминогена или менее 35 % нормальной активности плазминогена или менее, или 30 % от нормальной активности плазминогена или менее.
Авторы изобретения определили, что эффективная доза плазминогена представляет собой дозу, которая увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена на по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена. В одном варианте осуществления указанная эффективная доза плазминогена увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена и поддерживает указанный повышенный уровень активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения. В еще одном варианте осуществления эффективная доза плазминогена увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 5 % от нормального уровня активности плазминогена.  В другом варианте осуществления эффективная доза плазминогена увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 5 % от нормальной активности плазминогена и поддерживает указанный повышенный уровень активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения. В еще одном другом варианте осуществления эффективная доза плазминогена увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 10 % от нормальной активности плазминогена. В другом варианте осуществления эффективная доза плазминогена увеличивает уровень активности плазминогена у субъекта на по меньшей мере около 10 % от нормальной активности плазминогена и поддерживает указанный повышенный уровень активности плазминогена у субъекта в течение периода восполнения.
Нормальная активность плазминогена произвольно представлена как 100 %. Таким образом, увеличение на по меньшей мере около 10 % нормальной активности плазминогена (100 %) составляет по меньшей мере около 10 %. Например, в случае, когда снижение активности плазминогена определяется как 40 %, тогда повышенная активность плазминогена после введения плазминогена составляет по меньшей мере около 50 %. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения снижение активности плазминогена увеличивается на по меньшей мере около 10 %, около 15 %, около 20 %, около 25 %, около 30 %, около 35 %, около 40 %, около 45 % или около 50 % от нормальной активности плазминогена.
В одном варианте осуществления, когда уровень активности плазминогена увеличивается до желаемого уровня и поддерживается на указанном желаемом уровне в течение периода добавления, дозу плазминогена можно вводить в нескольких дозах, чтобы создать концентрацию в плазме до желаемого уровня и поддерживать ее. Для каждой вводимой дозы наблюдается пик уровня в плазме, который достигается с последующим уменьшением. Между двумя вводимыми дозами достигается минимальный уровень в плазме, который называется остаточным (см. фиг. 4). Таким образом, пик соответствует максимальной активности после введения одной дозы; и остаточный уровень соответствует самой низкой активности, достигаемой между введениями двух доз (см. фиг. 4). Первоначально при введении повторяющиеся доз плазминоген накапливается в плазме до определенного ритма, который зависит от его собственного периода полувыведения плазминогена у субъекта, количества вводимого плазминогена и частоты его введения.  Уровень активности плазминогена в плазме будет увеличиваться в течение периода, называемого «периодом накопления» (см. фиг. 4), который, как правило, в 3-5 раз превышает период полувыведения соединения в плазме субъекта. После этого периода накопления элиминация плазминогена и поступление плазминогена доходят до равновесия, а уровень активности плазминогена в плазме прекращает расти и достигает плато, которое называется «стационарной фазой» (см. фиг. 4). В течение стационарной фазы остаточный уровень остается стабильным на определенном уровне. Это остаточный уровень в стационарной фазе, который соответствует «повышенному уровню активности плазминогена у субъекта» в соответствии с данным изобретением. В соответствии с данным изобретением пики активности плазминогена в стационарной фазе выше, чем повышенный уровень активности плазминогена, а остаточная активность плазминогена в стационарной фазе определяет указанный повышенный уровень активности плазминогена. Таким образом, когда в данном изобретении обсуждается увеличение и поддержание активности плазминогена в плазме субъекта до уровня, который увеличивается на по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена, он относится к остаточному уровню, полученному путем повторяющегося введения плазминогена. Следует понимать, что в соответствии с данным изобретением в любое время в течение стационарной фазы активность плазминогена (пиковый и остаточный уровень) составляет по меньшей мере около 1 % от нормальной активности плазминогена или по меньшей мере около 5 % от нормальной плазминогена, по меньшей мере около 10 % нормальной активности плазминогена.
В одном варианте осуществления желательно, чтобы пиковый уровень активности плазминогена в стационарной фазе не превышал в около 8 раз нормальную активность плазминогена (около 800 %), в около 5 раз нормальную активность плазминогена (около 500 %), в около 3 раза нормальную активность плазминогена (около 300 %), в около 2,5 раз нормальную активность плазминогена (около 250 %), в около 2 раз нормальную активность плазминогена (около 200 %), в около 1,75 раз нормальную активность плазминогена (около 175 %), в около 1,5 раз нормальную активность плазминогена (около 150 %), в около 1,25 раз нормальную активность плазминогена (около 125 %) или в около 1 раза нормальную активность плазминогена (около 100 %). В вариантах осуществления уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на 200 % от нормальной активности плазминогена, не более чем на 150 % от нормальной активности плазминогена или не более чем на 100 % от нормальной активности плазминогена. В этом случае, когда уровень активности плазминогена у субъекта увеличивается не более чем на определенную величину, предполагается, что максимальный уровень активности плазминогена не превышает некоторого значения. В одном варианте осуществления желательно, чтобы остаточный уровень был выше минимального значения, а пиковый уровень был ниже максимального значения, причем указанное минимальное значение предпочтительно равно базовому уровню субъекта + 1 %, 5 % или 10 % от нормального уровня, а максимальное значение составляет 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 250 %, 300 %, 500 % или 800 % от нормального уровня.
В соответствии с одним аспектом изобретения субъект с дефицитом плазминогена может страдать от дефицита плазминогена типа I, дефицита плазминогена типа II или приобретенного дефицита плазминогена. Дефицит плазминогена типа I и II обозначаются как врожденный дефицит плазминогена.
Существует два типа врожденного дефицита плазминогена:
Дефицит плазминогена типа I и дефицит плазминогена типа II. Гипоплазмогенемия, также известная как дефицит плазминогена типа I, представляет собой редкое аутосомно-рецессивное расстройство, характеризующееся снижением уровня как иммунореактивного, так и функционального плазминогена и приводящее к тяжелым клиническим проявлениям в первую очередь из-за образования волокнистых отложений на слизистых оболочках по всему телу (Schott D. et al., 1998 Therapy with a Purified Plasminogen Concentrate in an Infant with Ligneous Conjunctivitis and Homozygous Plasminogen Deficiency. New Engl. J. Med. (339):1679). При дефиците плазминогена типа II или дисплазминогении уровень антигена плазминогена является нормальным или слегка сниженным, но специфичная функциональная активность плазминогена заметно снижается.
Наиболее распространенным и четко определенным состоянием, связанным с гипоплазминогнемией, является деревянистый конъюнктивит, который характеризуется густым, древесным (лигническими) разрастанием конъюнктивы глаза. На фиг. 2 представлена фотография 4-летнего пациента, страдающего от деревянистого конъюнктивита в обоих глазах (Schuster V. and Seregard S. 2003 Ligneous conjunctivitis. Surv. Ophthalmol. 48(4), pp. 369-388).
Оставленный без лечения, деревянистый конъюнктивит может привести к слепоте. Наиболее подверженными случаям деревянистого конъюнктивита являются младенцы и дети с дефицитом плазминогена, средний возраст первого клинического проявления наблюдается приблизительно через 10 месяцев (Schuster V. et al. 2007 Plasminogen deficiency. J. Thromb. Haemost. 5(12), pp. 2315-2322; Bateman J.B. et al. 1986 Ligneous conjunctivitis: an autosomal recessive disorder. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 23(3), pp. 137-140). Считается, что деревянистый конъюнктивит вызван местной инфекцией или хирургическими вмешательствами на глазу (Schuster V. and Seregard S. 2003 Ligneous conjunctivitis. Surv. Ophthalmol. 48(4), pp. 369-388).
В дополнение к деревянистому конъюнктивиту, гипоплазмогенемия является многосистемным заболеванием, которое также может влиять на уши, пазухи, трахеобронхиальное дерево, мочеполовой путь и десны. На фиг. 3 представлена фотография генерализованой десенной гиперплазии с узелковым разрастанием, покрытым желтоватыми псевдомембранами (Silva G.B. et al. Clinical manifestations due to severe plasminogen deficiency: a case report. 2006 J. Dent. Child (Chic). 73(3), pp. 179-82). Трахеобронхиальные поражения с гипервязкими секретами могут привести к респираторной недостаточности. Кроме того, сообщается о гидроцефалии у примерно 10 % детей с тяжелым дефицитом плазминогена, что, по-видимому, связано с отложением фибрина в церебральной желудочковой системе. Лечение гидроцефалии может потребовать имплантации шунта, что может быть осложнено повторяющимися закупорками из-за отсутствия нормального лизиса сгустка и приведет к смерти. Сообщалось также о тяжелом заживлении ран кожи, связанном с дефицитом плазминогена. Хотя реже сообщалось об участии желудочно-кишечного тракта, почечной системы и мальформации мозжечкового червя, известного как мальформация Дэнди-Уокера, также сообщалось (Schott D. et al., 1998 Therapy with a Purified Plasminogen Concentrate in an Infant with Ligneous Conjunctivitis and Homozygous Plasminogen Deficiency. New Engl. J. Med. (339):1679). Прогноз гипоплазмогенемии варьирует в зависимости от степени, длины и места повреждений и может приводить к задержанному умственному росту, потере функции органа, а иногда и к смерти (Mingers A.M. et al. Homozygous type I plasminogen deficiency. 1997 Semin. Thromb. Hemost. 23(3), pp. 259-269; Schuster V. et al. Plasminogen deficiency. 2007 J. Thromb. Haemost. 5(12), pp. 2315-2322; Mehta R. и Shapiro A.D. Plasminogen deficiency. 2008 Haemophilia. 14(6), pp. 1261-1268).
Генетическая основа гипоплазмогенемии или дисплазиногенемии:
Диагноз тяжелой гипоплазмогенемии основан на признании клинических проявлений и лабораторных анализов на активность плазминогена и уровни антигена. Диагноз может быть подтвержден при помощи анализа гена плазминогена.
Ген плазминогена охватывает приблизительно 52,5 килобаз (кб) ДНК и состоит из 19 экзонов, разделенных 18 интронами. кДНК плазминогена 2,7 kb кодирует белок, состоящий из 791 аминокислот.  Два экзоновых кодируют пять крингл доменов плазминогена.  Мутации в гене плазминогена могут приводить к либо дефициту плазминогена типа I (гипоплазмогенемия), при котором уменьшаются циркулирующий антиген и активность плазминогена, или дефициту плазминогена типа II (дисплазминогнемия), при котором циркулирующая активность плазминогена снижается, но уровень антигена плазминогена остается нормальным.
Наиболее распространенным клиническим проявлением дефицита плазминогена типа I является деревянистый конъюнктивит. Mingers, 1997 был первым, кто продемонстрировал сильно сниженный уровень антигена плазминогена и уровень активности плазминогена у трех неродственных девушек с деревянистым конъюнктивитом. Schuster V. et al. (2007) идентифицировал гомозиготную точечную мутацию Gly-Ala в экзоне 7, положение 780 у молодой девушки с деревянистым конъюнктивитом. Эта мутация приводит к замене Arg216 на His. Родители и сестра пациентки были гетерозиготными по этой мутации и не демонстрировали признаков клинических проявлений. Вторая молодая девушка с деревянистым конъюнктивитом имела гомозиготную точечную мутацию Gly-Ala в экзоне 15, положение 1924, что привело к образованию стоп-кодона (Trp59-Stop). Опять же, родители пациентки были бессимптомными и гетерозиготными по этой мутации.  Отец этой второй пациентки также имел мутацию в своем втором аллеле в том же кодоне, которая привела к замещению Trp597 на Cys (сложная гетерозиготность). Эти исследования были первым доказательством того, что деревянистый конъюнктивит может быть вызван мутациями в гене плазминогена. Другие мутации, которые были выявлены у пациентов с деревянистым конъюнктивитом с дефицитом плазминогена типа I, включают: экзон 11, положение 1511 (Gly-Thr) у трех пациентов, что приводит к стоп-мутации (Glu460-Stop); сложная гетерозигота, Lys19-Glu/Arg513-His, Lys19-Glu/Arg216-His и Lys19-Glu/Leu128-Pro; и мутация делеции сайта сплайсинга Lys в интроне Q у двух дополнительных пациентов.  Schuster et al. (2007) обнаружили гетерозиготную точечную мутацию Ala-Gly, что привело к замене Lys19-Glu у двух пациентов и той же гомозиготной мутации у двух других пациентов.
В исследовании 50 пациентов с дефицитом плазминогена из 44 семей 40 (80 %) имели деревянистый конъюнктивит, у 17 (34 %) был деревянистый гингивит, а у 7 пациентов наблюдались оба заболевания (Tefs K. et al. Molecular and clinical spectrum of type I plasminogen deficiency: A series of 50 patients. 2006 Blood. 108(9), pp. 3021-3026.). У 15 пациентов (30 %) заболевание включало верхний и нижний дыхательные пути (уши, синус, гортань, бронхи и легкие), а у 4 (8 %) пациентов заболевание затронуло женскую половую систему. Наиболее распространенным дефектом гена плазминогена у этих 50 пациентов была мутация Lys19-Glu (17 пациентов [34 %]), а базовый уровень активности плазминогена у этих пациентов варьировал от 27 % до 35 % от нормального уровня активности плазминогена. У пациентов с другими мутациями, такими как мутация R216H, уровень активности плазминогена снижается до 2 % от нормального уровня активности плазминогена. Полученный в результате уровень активности плазминогена специфичен для мутации.
Приобретенный дефицит плазминогена: Не связанное с генетикой снижение уровня плазминогена, называемое приобретенным дефицитом плазминогена, было продемонстрировано в нескольких условиях, включая, но не ограничиваясь ими, диссеминированную внутрисосудистую коагуляцию (DIC), сепсис, лейкоз, гиалиновую болезнь, болезнь печени, аргентинскую геморрагическую лихорадку, гипертиреоз, последствия терапии L-аспарагиназой, тромболитическую терапию и хирургию. Снижение плазминогена в некоторых из этих состояний может являться отрицательным прогностическим признаком. Существует несколько механизмов, которые могут вызвать приобретенный дефицит плазминогена. Увеличение потребления плазминогена, а также сниженный синтез плазминогена может быть причиной дефицита, наблюдаемого при тяжелой болезни печени. Чрезмерное высвобождение природных активаторов плазминогена, вызванных массивными стимулами (обширное повреждение ткани, стресс, удар, некоторые лекарственные средства и т.д.), может привести к истощению уровня плазминогена. Например, считается, что деградация плазминогена в низкомолекулярный плазминоген лейкоцитарной эластазой является причиной снижения функционального плазминогена, наблюдаемого у субъектов с сепсисом и при аргентинской геморрагической лихорадке.
Существуют различные заболевания или состояния, которые представляют собой приобретенный дефицит плазминогена, например:
a) Болезнь Кавасаки
b) Тромболитический эпизод новорожденных/детей
c) Ожоги и тяжелые ожоги
d) Гетеротопическая оссификация (Myositis Ossificans)
e) Синдром гиалиновых мембран в синдроме респираторного заболевания новорожденных (NRDS)
f) Синдром диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (DIC)
g) Сепсис
h) Тромболитическая терапия у взрослых
i) Инсульт
j) Острое повреждение легких (ОПЛ)/ Синдром респираторного дистресса взрослых (острый) (ОРДС)
k) Диабет (Тип: 1, 1,5, 2 и 3)
l) Болезнь печени (фульминантная печёночная недостаточность)
m) Синдром Бадда-Киари
n) Микроангиопатическая гемолитическая анемия (MAHA)
o) Атипичный гемолитический уремический синдром
Болезнь Кавасаки: Болезнь Кавасаки представляет собой заболевание, при котором воспаляются кровеносные сосуды по всему телу. Наиболее распространенные симптомы включают лихорадку, которая длится более пяти суток и не контролируется обычными лекарственными средствами, увеличением лимфатических узлов в области шеи, сыпью в области гениталий и красными глазами, губами, ладонями или ступнями ног. У некоторых детей аневризмы коронарной артерии могут образовываться в сердце. Если коронарные артерии вовлечены, может потребоваться постоянное лечение или операция. Без лечения проблемы с коронарной артерией возникают до 25 %, и около 1 % умирают. Сердечные осложнения являются наиболее важным аспектом болезни Кавасаки. Это основная причина сердечных заболеваний, приобретенных в детстве в Соединенных Штатах и Японии. Смерть может произойти из-за инфаркта миокарда, вторичного по отношению к образованию тромбов (тромбоза) в аневризме коронарной артерии или к разрыву аневризмы большой коронарной артерии. Тромболитическая терапия с использованием тканевого активатора плазминогена (t-PA/u-PA) обычно используется при тромболитических эпизодах. Активатору плазминогена требуется плазминоген в качестве субстрата для получения плазмина, который затем инициирует фибринолитический процесс на сгустках крови, вызывая тромбоз. Сообщалось, что у пациентов с болезнью Кавасаки уровень активности плазминогена составляет всего 50 %, что ограничивает терапевтическое преимущество лечения болезни Кавасаки (Saji B.T. et al., Kawasaki Disease: Current Understanding of the Mechanism and Evidence-Based Treatment. 2017 Ed. Springer ISBN 978-4-431-56039-5). Таким образом, пациенты с болезнью Кавасаки могли получить пользу от восполняющей терапии плазминогена по данному изобретению, чтобы обеспечить быстрое разрешение угрожающего жизни/конечности тромболитического эпизода.
th
Тромболитический эпизод новорожденных/детей Новорожденные, младенцы и иногда дети имеют 40-50 % активности плазминогена по сравнению со взрослыми. Этот низкий уровень плазминогена замедляет образование плазмина и уменьшает тромболитический эффект экзогенной/эндогенной стептокиназы, урокиназы (u-PA) и активатора тканевого плазминогена (t-PA) при возникновении тромболитического события. Венозные тромболитические события (VTE) у новорожденных/младенцев/детей, а иногда и подростки могут получать дополнительную терапию плазминогеном. Кроме того, есть рекомендация Американского колледжа врачей грудной клетки: «Мы полагаем, что если требуется тромболизис, используется активатор тканевого плазминогена (tPA), а не другие литические агенты (класс 2C), и мы предлагаем введение плазминогена (свежезамороженная плазма) до начала терапии (класс 2C)» (Monagle P. et al. Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9 ED: ACCP Guidelines Chest 2012; 141(2) (Suppl):e737S–e801S).
Ожоги и тяжелые ожоги, и гетеротопическая оссификация (Myositis Ossificans): Гетеротопическая оссификация (HO) представляет собой наличие кости в мягких тканях, где кость обычно не существует. Приобретенная форма НО чаще всего проявляется либо при ожоге, либо при сильном ожоге, мышечно-скелетной травме, травме спинного мозга или травме центральной нервной системы. Например, пациенты, которые недавно подверглись тотальному эндопротезированию тазобедренного сустава или имеют параплегию после травмы спинного мозга, подвержены риску заболевания НО.
Термин гетеротопическая оссификация (НО) описывает формирование кости на аномальном анатомическом участке, обычно в мягких тканях. HO можно разделить на следующие 3 типа: Myositis ossificans progressiva (фибродисплазия оссифицирующая прогрессирующая). Это расстройство относится к числу редчайших генетических состояний с частотой 1 случай на 2 миллиона человек. Передача является аутосомной доминантой с переменной экспрессией. Состояние характеризуется (а) рецидивирующим, болезненным разбуханием мягких тканей, которое приводит к НО, и (б) врожденным пороком большого пальца ноги. Травматический оссифицирующий миозит. В этом состоянии болезненная область развивается в мышцах или мягких тканях после одного удара по области, разрыва мышцы или повторяющейся незначительной травмы. Нейрогенная гетеротопическая оссификация Это условие является тем, что приходит на ум, когда используется общая фраза «гетеротопическая оссификация». В последнее время существенная роль плазминогена в профилактике НО была обнаружена во время исследований переломов, в которых мы также определили, что плазминоген необходим для лечения переломов. Порог активности плазмина, необходимый для предотвращения HO: из этих исследований мы определили, что циркулирующий уровень плазминогена > 60 % необходим для предотвращения образования HO после травмы скелетных мышц.
Пациенты, обладающие ожогами с площадью поверхности тела > 30 %, испытывают 50 %-ное снижение уровней плазминогена и увеличение частоты образования НО (Mignemi N et al. Plasminogen is Essential to Prevent Heterotypic Ossification Following Traumatic Muscle Injury. 2016 The FASEB Journal, 30(1) Supplement 83.3). Очевидно, что пациенты с НО и, в частности, ожоговые пациенты, могли бы использовать восполняющую терапию плазминогена по данному изобретению для предотвращения образования НО.
Синдром гиалиновых мембран в синдроме респираторного заболевания новорожденных (NRDS)Гиалиновая мембрана (HMD), более ранний термин и синоним синдрома детского респираторного дистресса (IRDS) или неонатального респираторного дистресс-синдрома (NRDS), относится к микроскопическому появлению гладких, гомогенных, эозинофильных мембран, которые выстилают терминальные бронхиолы и альвеолярные протоки новорожденных. Гиалиновые мембраны состоят из некротических альвеолярных клеток, плазменных трансудированных, аспирационных плоскоклеточных клеток и значительного количества фибрина. Полиморфноядерные клетки могут проникать в мембраны, если инфекция осложняется NRDS. Хотя гиалиновые мембраны могут присутствовать уже через 3, 4 часа после рождения у новорожденных, которые позже умерли от NRDS, они обычно хорошо развиваются через 12-24 часа. Гиалиновые мембраны обычно организуются и отделяются от подстилающей альвеолярной или бронхиальной стенки в течение 36-48 часов, если не требуется высокое давление кислорода и давление вентиляции, и они в конечном счете очищаются альвеолярными макрофагами, иначе это может привести к гибели новорожденного.
При микроскопическом исследовании небольшие дыхательные пути, содержащие гиалиновые мембраны, окружены разрушенными ацинами из сурфактант-дефицитных легких. Следовательно, RDS новорожденного представляет собой острое заболевание легких, которое обычно поражает недоношенных детей и вызвано, прежде всего, недостаточным количеством сурфактанта. Уменьшение количества сурфактанта приводит к недостаточному поверхностному натяжению альвеолы во время выдоха, что приводит к ателектазу, уменьшению газообмена, тяжелой гипоксии и ацидозу.
Основным дефектом, вызывающим RDS у недоношенных детей, является незрелость легких, особенно пневмоцитов типа II. Качественно и количественно, сурфактант плода менее эффективен, чем сурфактант взрослое в снижении альвеолярного поверхностного натяжения и сохранении расправленных альвеол. Поскольку легкие недостаточно покрыты сурфактантом, это приводит к утечке плазмы в альвеолярные пространства с последующим расслоением фибрина и некротическим повреждением клеток («гиалиновых мембран») вдоль поверхности альвеолярных протоков и респираторных бронхиол. Отложение гиалиновых мембран, в свою очередь, еще больше препятствует прохождению кислорода из альвеолярных пространств через респираторную поверхность в легочную сосудистую сеть.
Сообщалось, что у новорожденных, родившихся в срок, активность плазминогена составляет около 40 % или является нормальной (взрослой), а недоношенные новорожденные, весившие менее 2000 г, имеют активность плазминогена всего 20 % по сравнению с тем же контролем. Следовательно, новорожденные как недоношенные, так и доношенные имеют естественный низкий уровень плазминогена, но когда они сочетают этот факт с клинической физиопатологией NRDS, при которой происходит интенсивное осаждение фибрина в альвеолах, это приводит к немедленному выводу, что эти пациенты могут получить пользу из восполняющей терапии плазминогена по данному изобретению.
Синдром диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (DIC) Диссеминированная внутрисосудистая коагуляция (DIC) представляет собой клинико-патологический синдром, при котором происходит широкомасштабная внутрисосудистая коагуляция в результате воздействия или продуцирования прокоагулянтов, недостаточно сбалансированных природными антикоагулянтными механизмами и эндогенным фибринолизом. Пертуберация эндотелия в микроциркуляции вместе со стимулированными воспалительными клетками и высвобождение медиаторов воспаления играют ключевую роль в этом механизме. DIC может вызвать тканевую ишемию от окклюзионной микротромбии и кровотечение от потребления тромбоцитов и факторов свертывания крови и, в некоторых случаях, чрезмерный фибринолитический ответ.
Существует два фенотипа диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (DIC). Хотя активация тканевого фактор-зависимого пути в качестве начальной стадии коагуляционного каскада и наличие недостаточных антикоагулянтных систем одинаковы, DIC можно подразделить на фибринолитический (геморрагический) и антифибринолитический (тромботический) фенотипы. При DIC с фибринолитическим фенотипом может сосуществовать DIC и системный фибрин(оген)олизис.
Лечение DIC с фибринолитическим фенотипом включают хирургическое восстановление травмы, облегчение шока и быструю и достаточную замену концентрата тромбоцитов, свежезамороженной плазмы и истощенных факторов свертывания. Известно, что уровень активности плазминогена в плазме снижается до 70 % (30 % остаточной активности нормального) при диссеминированной внутрисосудистой коагуляции (Rutherford E.J. et al. Hematologic principles in surgery. в: Townsend C.M. et al., editors. Sabiston Textbook of Surgery 17th Ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2004. pp. 113–136; Lackner H. and Javid J.P.
:
Сепсис Сепсис определяется как угрожающая жизни дисфункция органов, вызванная дисрегулированным ответом хозяина на инфекцию. Это определение подчеркивает первичность реакции негомеостатического хозяина на инфекцию, потенциальную летальность, которая значительно превышает прямую инфекцию, и необходимость срочного распознавания. Следовательно, сепсис является потенциально опасным для жизни осложнением инфекции и возникает, когда химические вещества, высвобождаемые в кровоток для борьбы с инфекцией, вызывают воспалительные реакции во всем теле. Это воспаление может вызвать каскад изменений, которые могут повредить несколько систем органов, в результате чего они откажут. Сепсис определяется как тяжелый, когда эти события возникают в связи с признаками дисфункций органов, такая как гипоксемия, олигурия, лактоацидоз, повышение уровня ферментов печени, и изменение церебральной функции. Почти всем жертвам тяжелого сепсиса требуется лечение в отделении интенсивной терапии в течение нескольких суток или недель. Если сепсис прогрессирует до септического шока, артериальное давление резко падает, что может привести к смерти (Mervyn S. et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). 2016 JAMA, 315(8), pp. 801-810). Септический и геморрагический шок несет риск высокой смертности. Отказ микроциркуляции, вторичный по отношению к изменениям гемостаза и фибринолиза, играет важную роль в патогенезе шока. В некоторых случаях плазминоген был значительно ниже у невыживших до 1-х суток, а комплекс плазмин-антиплазмин значительно выше на 4-е сутки по сравнению с оставшимися в живых. Было отмечено, что последовательное увеличение эндогенного плазминогена на 4 и 7 сутки было значительно сильнее у выживших. Фибринолиз, измеряемый повышенной способностью и отзывчивостью, явно прогностичен и играет значительную роль в выживании, возможно, благодаря его очищающей функции в микроциркуляции (Helling et al. Clinical Hemorheology and Microcirculation, 2010, 45(2-4), pp. 295-300; Seitz R. et al. Reduced fibrinolytic capacity and its restoration by plasminogen substitution in acute renal failure. 1989 Int. J. Tissue React. 11(1), pp. 39-46). Следовательно, при сепсисе уровень активности плазминогена сильно снижается, и пациенты могут извлечь пользу из восполняющей терапии плазминогеном для улучшения их клинического исхода.
:
Тромболитическая терапия у взрослых У взрослых до или во время тромболитической терапии с высокими дозами стрептокиназы, урокиназы или тканевого активатора плазминогена происходит истощение плазминогена, которое может прекратить действие тромболитических лекарственных средств, поскольку плазминоген является субстратом для этих активаторов. Такое состояние включает, но ограничивается инсультом. Поэтому использование тромболитических агентов должно всегда включать тщательный мониторинг компонентов системы плазминоген-плазмин, особенно при длительном тромболитическом лечении. В этих клинических случаях пациенты могут получить пользу от терапии восполнения плазминогена по данному изобретению, при которой это может привести к уменьшению времени лизиса сгустка и потенциальному уменьшению количества активатора плазминогена.
Острое повреждение легких (ОПЛ)/ Синдром респираторного дистресса взрослых (острый) (ОРДС):
2
2
Острое повреждение легких (ОПЛ) определяется как острое повреждение легких с двусторонним легочным инфильтратом в рентгенограмме грудной клетки в соответствии с наличием отека и отсутствием клинических доказательств левожелудочной гипертензии и давления заклинивания в лёгочной артерии, равного 18 мм рт.ст. или менее. Кроме того, отношение артериального кислорода к фракции вдыхаемого кислорода (PaO/FiO) должно составлять 300 мм рт.ст. или менее, независимо от уровня положительного давления в конце выдоха (PEEP). Взрослый острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), наиболее тяжелая форма ОПЛ, и определяется отношением артериального кислорода к фракции вдыхаемого кислорода, равным 200 мм рт.ст. или менее. Хотя термин ОРДС часто используется взаимозаменяемо с ОПЛ, по строгим критериям, ОРДС следует зарезервировать для самой тяжелой формы заболевания. Отмечается, что патофизиология NRDS и ОРДС различна, но наличие фибрина в альвеолах является общим гистологическим признаком, свидетельствующим, что фибринолитическая система каким-то образом нарушена, и в отличие от NRDS, путь в ОРДС до сих пор не был полностью выяснен.
Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) характеризуется высокой смертностью. Из исследования, проведенного для отбора протеома бронхоальвеолярной лаважной жидкости (BALF) и идентификации белков, которые отличают выживших от невыживших с ОРДС. В ранних фазах белки ОРДС, более распространенные у выживших, сопоставляются с онтологиями, указывающими на скоординированную компенсаторную реакцию на травмы и стресс. К ним относятся коагуляция и фибринолиз; активация иммунной системы; и гомеостаз катионов и железа. Было установлено, что белки ранних фаз, отличающие выживших от невыживших, являются кандидатами биомаркеров для прогнозирования выживаемости при ОРДС и оценке плазминогена (Bhargava M. and Becker T.L. Proteomic Profiles in Acute Respiratory Distress Syndrome Differentiates Survivors from Non-Survivors, PLoS ONE 9(10): e109713. http://dx.doi:10.1371/journal.pone.0109713). В этом исследовании пациенты, оставшиеся в живых при ОРДС, примерно удвоили уровни плазминогена по сравнению с невыжившими с ОРДС. Система гомеостаза играет такую важную роль в ОРДС, и восполняющая терапия плазминогена по данному изобретению может быть полезна для пациентов с ОРДС/ОПЛ, повышая их уровень плазминогена и увеличивая вероятность их выживания.
:
Диабет (Тип: 1, 1,5, 2 и 3) Пациенты с диабетом имеют повышенный риск атеротромботических эпизодов с плохим коротким и долгосрочным прогнозом после инфаркта миокарда по сравнению с популяцией без диабета. Формирование обструктивного тромбоцитарного фибринового сгустка в коронарной артерии представляет собой заключительную стадию атеротромботического процесса, приводящего к инфаркту миокарда. Диабет связан с гипофибринолитическим состоянием, представляющим собой один из механизмов увеличения сердечно-сосудистого риска у данной популяции. Ряд факторов был связан с нарушением лизиса фибринового сгустка при диабете, включая измененную структуру фибриновой сети, усиление включения антифибринолитических белков и ингибирование фибринолитического процесса. Диабет также связан с увеличением включения ингибитора плазминогена и комплемента C3 в сгусток, причем оба белка проявляют антифибринолитическую активность. Более того, концентрации ингибитора-активатора плазминогена-1 в плазме повышаются при диабете и резистентных к инсулину состояниях, что ставит под угрозу фибринолитический процесс за счет лимитированного образования плазмина. Все эти изменения способствуют ингибированию лизиса сгустка и потенциально способствуют развитию и тяжести ишемического сердечно-сосудистого заболевания у лиц с диабетом.
Болезнь периферических артерий (PAD) представляет собой состояние, характеризующееся атеросклеротическим окклюзионным заболеванием нижних конечностей. В то время как PAD является основным фактором риска для ампутации нижних конечностей, она также сопровождается высокой вероятностью симптоматического сердечно-сосудистого и цереброваскулярного заболевания. Хотя многое известно о PAD среди населения в целом, оценка и лечение PAD у лиц с диабетом менее ясна и представляет собой некоторые особые проблемы.
Болезнь периферических артерий (PAD) чаще встречается у пациентов с диабетом, и около половины пациентов с диабетической язвенной болезнью, присутствующей совместно с PAD. Атеросклеротическая артериальная окклюзионная болезнь ниже уровня паховой связки приводит к уменьшению кровотока к нижней конечности. Болезнь периферических артерий при сахарном диабете является состоянием преимущественно из инфра-паховой сосудов и отличается от таковой у пациентов без диабета по своим характеристикам, лечению и результатам. Идентификация PAD среди пациентов с изъязвлением стопы имеет важное значение, поскольку ее присутствие связано с худшими результатами, такими как более медленное (или отсутствие) заживление язв стопы, ампутации нижних конечностей, последующие сердечно-сосудистые события и преждевременная смертность. Диагностика PAD является сложной задачей у пациентов с диабетом, поскольку у них часто отсутствуют типичные симптомы, такие как хромота или боль при потере даже при наличии серьезной потери ткани. Артериальная кальцификация, инфекция стопы, отеки и периферическая невропатия, каждый из которых часто присутствует при язвенной болезни диабета и может отрицательно влиять на эффективность диагностических тестов для PAD (http://www.iwgdf.org/files/2015/website_pad.pdf).
Была изучена активность плазминогена у пациентов с диабетом, и было установлено, что диабет ассоциируется с нарушением лизиса сети фибрина плазмы, который частично нормализуется при облегчении гликемии. Сделан вывод о том, что глицинация плазминогена при диабете напрямую влияет на фибринолиз, уменьшая образование плазмина и снижая удельную активность белка (Ramzi A. and Gamlen T. Diabetes is associated with posttranslational modifications in plasminogen resulting in reduced plasmin generation and enzyme-specific activity. 2013 Blood (122) pp. 134-142). Восполняющую терапию плазминогеном по данному изобретению можно использовать для резорбции гипофибринолитического состояния этих пациентов с диабетом и привести к улучшению их общего клинического прогноза.
Болезнь печени (фульминантная печёночная недостаточность) и Синдром Бадда-Киари: Аномалии свертывания крови и фибринолиза являются важной частью фульминантной недостаточности печени. В опубликованном исследовании фибринолитическая система была определена у 42 пациентов с этим состоянием (Pernambuco J.R. et al. Activation of the fibrinolytic system in patients with fulminant liver failure. 1993 Hepatology 18(6), pp. 1350-1356). Уровни поступления активности плазминогена в плазме были низкими (9,1 % от нормы). Активность активатора тканевого плазминогена была обнаружена при нормальных уровнях, тогда как уровень его быстрого ингибитора, ингибитора-активатора плазминогена-1 значительно увеличился по сравнению с уровнем контроля, указывающим на сдвиг в сторону ингибирования фибринолиза у этих пациентов. Также были обнаружены высокие уровни D-димера в плазме, фрагмент кросс-связанного фибрина, коррелирующий с повышенным уровнем комплекса тромбин-антитромбин. Был сделан вывод о наличии грубых аномалий фибринолитической системы при фульминантной печеночной недостаточности, но поскольку ингибирующая активность, по-видимому, присутствует в достаточных количествах, это ограничивает заболеваемость кровотечением из-за фибринолиза.
Синдром Бадда-Киари представляет собой заболевание печени, вызванное окклюзией печеночных вен, которое истощает печень. Он характеризуется классической триадой боли в животе, асцит и увеличение печени. Образование кровяного сгустка в печеночных венах может привести к синдрому Бадда-Киари. Синдром может быть молниеносным, острым, хроническим или бессимптомным
Тромбоз является основным фактором риска смерти у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, а в предыдущих случаях отмечается, что венозный тромбоз (например, печени) у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией поддается тромболизису.
У пациентов, отобранных для лечения синдрома Бадда-Киари, tPA вводили в виде внутривенной инфузии и свежезамороженной плазмы (FFP), когда считалось, что низкий уровень плазминогена является ограничивающим для фибринолитической активности, индуцированной tPA (Araten D.J. et al. 2012 Thrombolytic therapy is effective in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Haematologica 97(3), pp. 344–352). Рекомендуется внимательно следить за уровнем активности плазминогена. FFP имеет определенные ограничения, одним из которых является ограниченное количество плазминоген/мл FFP и введение нескольких других белков, которые могут быть ненужными и даже вредными для лечения. Следовательно, пациенты с синдромом Бадда-Киари и пациенты с болезнью печени могли бы получить пользу от восполняющей терапии плазминогена по данному изобретению.
Микроангиопатическая гемолитическая анемия (MAHA): Атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS):Атипичный гемолитический уремический синдром (aHUS) представляет собой тромботическую микроангиопатию, вызванную неконтролируемой активацией альтернативного пути комплемента на уровне поверхности клетки, что приводит к микроангиопатической гемолитической анемии, тромбоцитопении и острой почечной недостаточности. Примерно у половины затронутых пациентов идентифицированы варианты патогенной потери функции в регуляторах комплемента или варианты усиления функции в эффекторах комплемента, что явно подразумевает комплемент к aHUS. Однако существуют убедительные доказательства, подтверждающие наличие дополнительных генетических вкладов в эту болезнь. Попытки идентифицировать новые гены, связанные с aHUS, были завершены, путем завершения обширного скрининга путей комплемента и коагуляции у 36 пациентов со спорадическим aHUS с использованием целевого геномного обогащения и массового параллельного секвенирования. Несколько генов в пути коагуляции также были идентифицированы как важные в патогенезе aHUS. В частности, плазминоген нёс больше патогенных вариантов, чем любой другой ген коагуляции, включая три известных мутации типа 1 плазминогенного дефицита и предсказанный патогенный вариант. Bu F. et al. (Bu et al. Comprehensive genetic analysis of complement and coagulation genes in atypical hemolytic uremic syndrome. 2014 J. Am. Soc. Nephrol.; 25(1), pp. 55-64) постулировали, что среди фармакологических возможностей этап 1 или инициатор  начала развития aHUS может быть низкий уровень плазминогена из-за различных вариантов, определенных в их исследовании. Таким образом, восполняющая терапия плазминогена по данному изобретению может принести пользу этой популяции пациентов.
Восполняющая терапия плазминогена: Субъекты, страдающие дефицитом плазминогена, включая любой из дефицита плазминогена типа I, дефицита плазминогена типа II и приобретенного дефицита плазминогена, могут воспользоваться режимом приема по данному изобретению. Согласно одному варианту осуществления изобретения, когда субъект имеет дефицит плазминогена типа I, пониженная активность плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена может составлять около 70 % или менее, около 60 % или менее, около 50 % или менее, около 40 % или менее, около 35 % или менее, или около 30 % от нормальной активности плазминогена или менее. Некоторые субъекты имеют очень низкий уровень активности плазминогена в плазме, который может быть ниже 5 % от нормальной активности плазминогена. В этих случаях ситуация может стать опасной для жизни, и потребность в восполнении плазминогена может быть срочной. В этих случаях может быть допущен высокий уровень пиков и/или восполнение с высокой частотой введения может быть разработано таким образом, чтобы как можно быстрее накапливать плазминоген в плазме до желаемого уровня.  Согласно другому варианту осуществления изобретения, когда субъект имеет дефицит плазминогена типа II, пониженная активность плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена может составлять около 70 % или менее, около 60 % или менее, около 50 % или менее, около 40 % или менее, около 35 % или менее, или около 30 % или менее от нормальной активности плазминогена.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, субъект с дефицитом плазминогена страдает от деревянистого конъюнктивита. Деревянистый конъюнктивит характеризуется заметно нарушенным внеклеточным фибринолизом, приводящим к образованию деревянистых (одревесневшие) псевдомембран на слизистых поверхностях, в том числе глаза, рта, пазух, кожи, трахеобронхиального дерева, желудочно-кишечного тракта, бронхолегочного дерева и мочеполового тракта. Дефицит плазминогена может также влиять на ротоглотку, органы дыхания, мочеполовые органы и кожу (ювенильная коллоидная дегенерация кожи). Деревянистые (одревесневшие) псевдомембраны на поверхностях слизистой оболочки также называются в данном документе поражением или «поражением, связанным с дефицитом плазминогена». Дефицит плазминогена также связан с врожденной окклюзионной гидроцефалией.
В одном аспекте данного изобретения повышенную активность плазминогена поддерживают путем введения повторяющихся эффективных доз плазминогена и, более конкретно, Glu-плазминогена. Указанные повторяющиеся дозы вводятся более одного раза в сутки, ежесуточно, каждые двое суток, каждые трое суток, два раза в неделю, каждые четверо суток, каждые пять суток или еженедельно. Может быть желательным выбрать высокую частоту введения в течение периода накопления, чтобы быстро достичь желаемого уровня, а затем уменьшить частоту введения до желаемой скорости. В другом варианте осуществления частота введения может быть уменьшена через определенный период, если будут достигнуты некоторые клинические преимущества.  Альтернативно, в другом варианте осуществления частота введения может быть увеличена через определенный период, если не будут достигнуты некоторые клинические преимущества. В другом варианте осуществления частота введения может оставаться неизменной в течение всего периода восполнения, то есть периода накопления и стационарной фазы.
В варианте осуществления изобретения плазминоген вводят одним из следующих способов введения: внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, назальным, легочным или ректальным, причем подкожное введение адаптировано для доставки с замедленным высвобождением, непрерывной доставки или множественной доставки. В одном варианте осуществления плазминоген вводят внутривенно. В другом варианте осуществления подкожное введение осуществляют с имплантатом, содержащим композицию с замедленным высвобождением или помпу для непрерывной инъекции или множественных инъекций. В следующем варианте осуществления плазминоген вводят подкожно и непрерывно, так что достигается желаемое повышение уровня активности плазминогена. Например, можно использовать непрерывную подкожную инфузию, чтобы увеличить и поддерживать желаемый уровень активности плазминогена в соответствии с данным изобретением.
Согласно одному из вариантов осуществления плазминоген предпочтительно вводят ежесуточно в дозе, равной по меньшей мере около 0,5 мг/кг, по меньшей мере около 1 мг/кг, по меньшей мере около 1,5 мг/кг или, по меньшей мере около 2 мг/кг масса субъекта с дефицитом плазминогена. Согласно другому варианту осуществления плазминоген предпочтительно вводят каждые сутки в дозе, равной по меньшей мере около 1,5 мг/кг, по меньшей мере около 2 мг/кг, по меньшей мере около 2,5 мг/кг, по меньшей мере около 3 мг/кг, по меньшей мере около 4 мг/кг, по меньшей мере около 5 мг/кг или, по меньшей мере около 6 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена. Согласно еще одному варианту осуществления плазминоген предпочтительно вводить дважды в неделю, каждые двое суток, каждые трое суток, каждые четверо суток, каждые пять суток или еженедельно в дозе, составляющей по меньшей мере около 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг или 10 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена. Согласно еще одному варианту осуществления плазминоген предпочтительно вводят еженедельно в дозе, составляющей, по меньшей мере, около 45 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена. Согласно другому дополнительному варианту осуществления плазминоген вводят в дозе от около 1,5 мг/кг до около 12 мг/кг и с частотой от одного раза в сутки до одного раза в неделю.
Данное изобретение относится к применению плазминогена и, в частности, к Glu-плазминогену человека, который, как известно, имеет период полувыведения около 2,2 суток у нормальных субъектов без дефицита плазминогена. Композиция Glu-плазминогена содержит предпочтительно высокоочищенный Glu-плазминоген, который составляет более чем около 70 %, более чем около 80 %, более чем около 90 % или более чем около 95 %. Плазминоген может быть получен рекомбинантно или получен путем очистки из плазмы. Плазминоген, используемый в описанных в данном документе исследованиях, был получен способом, описанным в публикации РСТ WO 2006/120423.
В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген не подвергается радиоактивному мечению. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит дополнительного белка. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит альбумин. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит апротинин. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая по существу свободна от ингибитора трипсина. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит ингибитор сериновой протеазы. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит плазмин. В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, которая свободна от или практически не содержит поверхностно активное вещество, например, концентрация поверхностно активного вещества составляет менее чем около 0,01 мМ.
В одном варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, имеющей чистоту около 70 % или более, около 80 % или более, около 85 % или более, около 90 % или более, около 95 % или более и около 98 % или более. В другом варианте осуществления данного изобретения плазминоген содержится в фармацевтической композиции, в которой общее количество белка, отличного от плазминогена, составляет менее чем около 30 %, менее чем около 20 %, менее чем около 15 %, менее чем около 10 %, менее чем около 5 % или менее чем около 2 %.
В соответствии с данным изобретением «период восполнения» может варьировать. В одном варианте осуществления период восполнения составляет по меньшей мере 48, 72, 96, 120 или 144 часа. В другом варианте осуществления период восполнения длится в течение жизни. В другом варианте осуществления период восполнения прекращается, когда достигаются желаемые клинические преимущества. Необязательно, другой дополнительный период может начинаться с потребностей дальнейших клинических преимуществ. В соответствии с данным изобретением «период восполнения» может варьировать и устанавливаться врачом.
В данном описании активность плазминогена либо сообщается как измеренная, либо приводится с поправкой на исходный уровень. Активность плазминогена с поправкой на исходный уровень представляет собой значение измеренной активности плазминогена за вычетом значения активности плазминогена до начала введения плазминогена.  Активность плазминогена перед восполнением плазминогена может быть обозначена как исходная активность плазминогена, активность плазминогена в 0 сутки или до введения первой дозы плазминогена. Таким образом, активность плазминогена с поправкой на исходный уровень демонстрирует только увеличение активности плазминогена, возникающее в результате введения Glu-плазминогена.
В некоторых вариантах осуществления количество плазминогена рассчитывают путем измерения антигена плазминогена с помощью ELISA (твердофазного ИФА), нефелометрии или радиальной иммунодиффузии.
Эффективность активности плазминогена, создаваемая восполнением плазминогена по данному изобретению, может быть продемонстрирована клиническими наблюдениями, как упомянуто выше, а также уровнем D-димеров. D-димеры представляют собой фрагменты деградации фибрина, возникающие в результате активности плазминогена, который деградирует фибрин. Повышенный уровень D-димера является указателем i) наличия повреждений и ii) фибринолитической эффективности вводимого плазминогена.
В одном варианте осуществления вышеупомянутый способ включает измерение активности плазминогена в образце от субъекта для определения того, имеет ли указанный субъект дефицит плазминогена, и если субъект имеет дефицит плазминогена, проведение способа восполнения плазминогена или лечения дефицита плазминогена, описанных в данном документе, у указанного субъекта.
Примеры: Следующие примеры дополнительно иллюстрируют практику данного изобретения, но не предназначены для его ограничения.
Пример 1: Препарат Glu-плазминогена
Glu-плазминоген является высокоочищенным (> 95 % чистоты), полученным из объединенной плазмы человека, которая поступает из центров сбора плазмы США, лицензированных FDA/EMA. Присутствие мономера плазминогена составляет более 95 %. Glu-плазминоген получали, как описано ранее в публикации РСТ WO 2006/120423.
Плазминоген человека состоит из приблизительно 75 миллиграммов на флакон лиофилизированного плазминогена. Перед инфузией лиофилизированный порошок во флаконе разводят в 12,5 мл воды для внутривенной инъекции. Конечная композиция содержит цитрат натрия, хлорид натрия, глицин и сахарозу для обеспечения приемлемой стабильности белка, ионной силы и рН.
Пример 2a: Разовая доза (2 мг/кг) Glu-плазминогена у субъектов-людей с дефицитом плазминогена и фармакокинетика
Исследование, описанное в данном документе, является первым исследованием Glu-плазминогена человека у пациентов с дефицитом плазминогена типа I. Исследование представляет собой фазу 1, нерандомизированного, открытого исследования разовой дозы у пациентов с диагнозом гипоплазминогнемия. Три человека и два подростка получили разовую дозу 2 мг/кг Glu-плазминогена путем внутривенного введения (в/в). Время инфузии составляло 10 минут.
Активность плазминогена и уровни антигена измеряли таким образом, чтобы получить фармакокинетический (PK) профиль плазминогена. Эти образцы крови были протестированы в следующие моменты времени: Скрининг (посещение 1, -19 сутки); исходный уровень непосредственно перед дозированием (посещение 2, 0 сутки); через 5-15 минут, 1 час, 6 часов (1 сутки), 24 часа (посещение 3, 2 сутки), 48 часов (посещение 4, 3 сутки), 72 часа (посещение 5, 4 сутки), 96 часов (посещение 6, 5 сутки), 120 часов (посещение 7, 6 сутки), 168 часов (посещение 8, 8 сутки) и 216 часов (посещение 9, 10 сутки) после окончания инфузии. Субъекты вернулись через 30 суток после дозирования в ходе посещения 11 (31 сутки, последующий визит для оценки безопасности) для определения неблагоприятных событий, тестирования на иммуногенность, регулярных тестов и процедур безопасности и окончательного тестирования на вирусологическую безопасность. Не сообщалось о каких-либо неблагоприятных явлениях.
Уровни антигена плазминогена и уровни активности плазминогена для всех субъектов, измеренные при скрининге (-19 сутки) и до инфузии (0 сутки) и представлены в таблице 1. Уровень активности плазминогена, измеренный до инфузии, используется для определения базовой линии фармакокинетического профиля.  Активность плазминогена рассчитывали как процент активности по отношению к уровню активности плазминогена из объединенной плазмы здоровых субъектов.  Антиген плазминогена измеряли с помощью анализа ELISA (твердофазный ИФА) с использованием набора ELISA для анализа общего антигена плазминогена человека Cell Sciences. Можно отметить, что у субъекта может наблюдаться изменчивость уровня активности эндогенного плазминогена, при котором некоторые субъекты остаются относительно стабильными, о чем свидетельствуют вариации активности плазминогена, наблюдаемые в -19 сутки и 0 сутки у одного и того же субъекта (таблица 1).
После инфузии плазминогена уровни активности плазминогена каждого субъекта корректировались с их собственным исходным значением (0 сутки) путем вычитания исходного значения, чтобы получить уровень активности плазминогена, скорректированный по исходному уровню. Указанные уровни активности плазминогена, скорректированные по основному уровню для каждого субъекта (тонкая линия) в течение 48 часов, представленные на фиг. 5 вместе со средним значением (незакрашенный круг) для каждой временной точки и прогнозируемой фармакокинетической кривой, рассчитанной с применением Phoenix WinNonlin (версия 6.4) корпорации Pharsight. Приложение Phoenix WinNonlin использует средние значения испытуемых субъектов и параметры исследования и генерирует одно или более уравнений и соответствующие кривые для прогнозирования PK соединения. Модель PK, которая идеально соответствует средним значениям, была выбрана и представленных на фиг. 5 (толстая линия). Наблюдаемые средние значения подтверждают, что введение 2 мг/кг Glu-плазминогена привело к среднему уровню активности плазминогена, который увеличивается (относительно исходного уровня) по меньшей мере на 10 % от нормальной активности плазминогена в течение 48 часов.
Пример 2b: Разовая доза (2 мг/кг) Glu-плазминогена у субъектов-людей с дефицитом плазминогена и эффективность
Среди исследования фазы 1, описанного в примере 2а, у субъекта 2 был деревянистый конъюнктивит в веке правого глаза. Фотографии поражения на 0 сутки (до инфузии) и на 1-е сутки представлены на фиг. 7А и 7В соответственно. Было отмечено, что утолщение, вызванное лигническим конъюнктивитом, резорбируется через 24 часа после инфузии плазминогена. Хотя один случай регрессии деревянистого конъюнктивита не является статистически значимым, это наблюдение, тем не менее, является обнадеживающим и свидетельствует о клиническом эффекте данной заместительной терапии Glu-плазминогеном.
Уровень активности плазминогена с поправкой на исходный уровень субъекта 2 представлен на фиг. 7C через 5-15 минут после дозы плазминогена до 2-х суток. Можно отметить, что в/в доза 2 мг/кг способна повысить активность плазминогена выше его начального уровня в течение по меньшей мере 2 суток. На основании фиг. 5 можно сделать вывод, что введение дозы около 2 мг/кг массы субъекта с дефицитом плазминогена в сутки или каждые двое суток является достаточным для повышения уровня активности плазминогена у субъекта на около 10 % от нормальной активности плазминогена, и поэтому было бы также достаточно увеличить его на 5 % или 1 % от нормальной активности плазминогена.
Пример 3: Модель повторяющейся дозы на основе результатов разовой дозы примера 2.
На основании уравнения, определенного с применением Phoenix WinNonlin (см. пример 2а), можно предсказать кривую элиминации Glu-плазминогена (или профиль ПК) у субъекта с дефицитом плазминогена в любой дозе. Прогнозируемые кривые для введения разовой дозы 2, 6 и 12 мг/кг в течение 96 часов приведены на фиг. 6.
На основе этого уравнения были предсказаны повторяющиеся дозы с разными частотами введения: каждые сутки, каждые двое суток, два раза в неделю и один раз в неделю. Различные комбинации доз и частот были оценены с использованием этого уравнения. Фиг. 8А и 8В представляют собой активность плазминогена, скорректированную по начальному уровню, для ежесуточного введения доз 2 мг/кг и 0,5 мг/кг, соответственно. Фиг. 9А и 9В представляют собой активность плазминогена, скорректированную по начальному уровню, для введения каждые двое суток доз 2 мг/кг и 1,5 мг/кг, соответственно. Фиг. 10A, 10B и 10C представляют собой активность плазминогена, скорректированную по начальному уровню, для введения дважды в неделю доз 2 мг/кг, 6 мг/кг и 12 мг/кг. Фиг. 11A и 11B представляют собой активность плазминогена, скорректированную по начальному уровню, для еженедельного введения доз 12 мг/кг и 45 мг/кг, соответственно. Уровень активности плазминогена, соответствующий остаточному уровню и пиковому уровню в стационарной фазе для каждой из этих частот введения и доз, приведен в таблице 2.
С этими предсказаниями можно было определить минимальную дозу, которая необходима для повышения уровня активности плазминогена (остаточный уровень в стационарной фазе), на по меньшей мере 1 % или на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена выше начального уровня. Начальный уровень представляет собой активность плазминогена у субъекта до лечения. Таблица 2 полезна для определения комбинаций дозы и частоты, которые приводят к увеличению на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена и увеличению на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена. Было обнаружено, что минимальная доза, необходимая для повышения остаточного уровня активности плазминогена минимум на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена составляет около 0,5 мг/кг при ежесуточном введении, около 1,5 мг/кг при введение раз в двое суток, около 2,0 мг/кг при введение раз в двое суток, около 6 мг/кг при введении два раза в неделю и около 45 мг/кг при еженедельном введении. Было обнаружено, что минимальная доза, необходимая для повышения остаточного уровня активности плазминогена минимум на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена составляет около 2 мг/кг при введении два раза в неделю и около 12 мг/кг при еженедельном введении. Очевидно, что другие комбинации доз и частот могут быть оценены с помощью этого уравнения, но комбинация, представленная в таблице 2, дает хорошее представление о пределах комбинаций, которые повышают остаточный уровень активности плазминогена как минимум на по меньшей мере 1 %, 5 % или 10 %.
В таблице 2 также представлена информация о максимальном уровне активности плазминогена, который может быть достигнут в плазме субъекта (пиковый уровень в стационарной фазе), возникающий в результате каждой комбинации дозы и частоты. Целью повторяющегося введения является поиск наилучших комбинаций дозы и частоты, которые позволяют поддерживать активность плазминогена выше желаемого уровня (на 1 %, 5 % или 10 % выше исходного уровня), избегать достижения нежелательных высоких пиковых значений и получить частоту введения, которая удобна для соблюдения субъектом. В данном случае нежелательный высокий пиковый уровень еще не достигнут в клинических исследованиях, так как не наблюдается неблагоприятного эффекта в комбинации дозы и частоты, которые были протестированы.
Пример 4: Повторяющиеся дозы Glu-плазминогена у плазминоген-дефицитных детей
У особи мужского пола турецкого происхождения диагностировали в возрасте 4 недель врожденную гипоплазмогенемию с последующим возникновением типичного деревянистого конъюнктивита. Уровень активности плазминогена в сыворотке был ниже 2 %, и диагноз был подтвержден генетическим тестированием, продемонстрировавшим новую гомозиготную мутацию сайта сплайсинга в гене PLG (1587 + 1 G>A).
В возрасте 2 месяцев испытуемый страдал тяжелой инфекцией респираторно-синцитиального вируса (RSV), требующей вспомогательной искусственной вентиляции лёгких в течение 5 суток и 1-месячной госпитализации. С этого момента у субъекта наблюдались рецидивирующие проблемы с дыханием. С 4-месячного возраста испытуемого лечили свежей замороженной плазмой (FFP) 20 мл/кг/неделя. В возрасте 18 месяцев у субъекта было обнаружено экзофитное поражение как в правом, так и в левом основных бронхах. У субъекта наблюдался один эпизод острой одышки с цианозом, который отвечал на неинвазивную инсуффляцию кислородом. Впоследствии субъект подвергали повторяющимся бронхоскопиям с лазерным удалением бронхиальных повреждений с покрытием FFP. В возрасте 20 месяцев, во время подготовки к бронхоскопии, у субъекта наблюдался эпизод острого цианоза и остановки сердца с асистолией, и он был реанимирован через 30 минут. Рентгенограмма грудной клетки продемонстрировала ателектаз левого легкого и правой нижней доли (см. фиг. 12). Субъект был госпитализирован в отделение интенсивной терапии и требовал как вентиляции, так и поддержки кровообращения. Бронхоскопия выявила вязкие выделения (см. фиг. 13А) и обструктивные поражения в трахее (см. фиг. 13В). Выделялись обильные вязкие выделения из легких. Через шесть суток после события остановки сердца субъекту была назначена первая доза Glu-плазминогена 4 мг/кг, вторая доза 6 мг/кг и последующие дозы 6,5 мг/кг; каждую дозу вводили каждые 48 часов. Измерения активности плазминогена, выраженные в  %, в течение первых 144 часов представлены на фиг. 14. Можно отметить, что исходная активность плазминогена у субъекта перед первой дозой Glu-плазминогена составляла 21 %, что, скорее всего, связано с предыдущей терапией FFP. После восполнения Glu-плазминогена было отмечено прогрессирующее растворение мембран и экзофитных поражений с несколькими пятнами крови, что было связано с уменьшением потребностей в кислороде. Также наблюдалось улучшение очагов поражения. Через 4 суток лечения Glu-плазминогеном субъекта экстубировали, но потребовалась повторная реинтубация через 36 часов из-за истощения.  Через неделю после приема первой дозы Glu-плазминогена субъекта снова эксубировали, и субъект мог тогда нормально дышать. Замена плазминогена продолжалась с режимом 6,5 мг/кг каждые вторые сутки. Наблюдалось прогрессирующее растворение мембран со значительно уменьшенными поражениями, наблюдавшимися после 6 недель лечения Glu-плазминогеном. Восполнение Glu-плазминогена у этого сильно пострадавшего пациента было очень эффективным. Все симптомы, вызванные у него отсутствием плазминогена, были либо рассеяны, либо значительно уменьшены. Значительных побочных эффектов не наблюдалось. Эффективность восполнения Glu-плазминогена у субъекта была продемонстрирована наблюдаемыми клиническими преимуществами.
Чтобы продемонстрировать, что восполненный Glu-плазминоген эффективно деградировал фибрин и поэтому активно лечил состояния, связанные с дефицитом плазминогена, было измерено содержание в D-димерах. На фиг. 15 наложены профиль D-димеров и профиль уровня активности плазминогена в первые 144 часа восполнения плазминогена у указанного субъекта. На фиг. 15 показано, что пики D-димеров подтверждают пики активности плазминогена. Это подтверждает, что восполненный Glu-плазминоген был активен у субъекта.
Пример 5: Разовая доза (6 мг/кг) Glu-плазминогена у субъектов-людей с дефицитом плазминогена и фармакокинетика
Исследование фазы I, описанное в примере 2а, проводилось при внутривенном введении разовой дозы 6 мг/кг Glu-плазминогена в когорте № 2, содержащей семь человек, в возрасте от 14 до 38 лет. Их исходный уровень активности плазминогена представлен в таблице 3.
Уровни активности плазминогена, скорректированные по исходному уровню для каждого субъекта (тонкая линия) в течение 120 часов, представлены на фиг. 16 вместе со средним значением (незакрашенный круг) для каждой временной точки и итоговой средней кривой (толстая линия). Наблюдаемые средние значения подтверждают, что введение 6 мг/кг Glu-плазминогена привело к среднему уровню активности плазминогена, который увеличивается (относительно исходного уровня) по меньшей мере на 10 % от нормальной активности плазминогена в течение 96 часов. Кривая, полученная из средних значений, следует схеме математического уравнения, установленного математическим уравнением, определенным с применением Phoenix WinNonlin (пример 2a), и подтверждает, что указанное уравнение адекватно представляет профиль PK Glu-плазминогена у человека с дефицитом плазминогена.
Определен индивидуальный период полувыведения и он колеблется от 14,5 часов до 53,3 часов в когорте 1 (2 мг/кг) и от 17,2 часов до 50,0 часов в когорте 2 (6 мг/кг). Хотя наблюдалась большая изменчивость среди субъектов, не было признаков нелинейной кинетики. Данные не представлены для всех субъектов.  Средний период полувыведения был относительно постоянным от дозы 2 мг/кг (35,6 ± 17,6 часа) до дозы 6 мг/кг (35,7 ± 12,3 часа).
Пример 6: Повторяющаяся доза (6 мг/кг) Glu-плазминогена у субъектов-людей с дефицитом плазминогена и фармакокинетика
В базовом исследовании фазы 2/3 дозы 6 мг/кг Glu-плазминогена неоднократно вводили в когорте из девяти субъектов с дефицитом плазминогена с частотой i) каждые двое суток или через сутки (qod), или ii) каждые трое суток (q3d). Их исходный уровень активности плазминогена представлен в таблице 4.
Каждую неделю или две, активность плазминогена контролировали до введения последующей дозы, а указанная активность плазминогена до инфузии дозы представляла собой остаточный уровень в профиле плазминогена в плазме у субъекта. Остаточные уровни у субъектов 01-001, 01-002, 01-006, 01-007, 01-008, 01-009 и 01-010 приведены на отдельных графиках, представленных на фиг. 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23, соответственно.  Пунктирная линия представляет исходное значение у соответствующего субъекта плюс 10 % нормальной активности плазминогена. Это было продемонстрировано на каждом графике, чтобы легко сравнить полученное увеличение с увеличением 10 % от нормальной активности плазминогена.
У всех субъектов остаточный уровень повышался по меньшей мере на 10 % от нормальной активности плазминогена после первой недели (идентифицированной как неделя 2) восполнения Glu-плазминогена. Наблюдение субъекта 01-001 начали на неделе 3, а не на неделе 2.
У всех субъектов (кроме субъекта 01-001) остаточный уровень поддерживался выше 10 % от нормальной активности плазминогена на протяжении всего контролируемого восполнения Glu-плазминогена. У субъекта 01-001 остаточный уровень снизился до 30 % на 10-й неделе, что на 1 % выше его собственного исходного значения и вернулся на следующую контролируемую неделю (неделя 12). Было прекращено лечение этого субъекта между 8-й и 10-й неделями, и это, вероятно, является причиной того, что уровень активности плазминогена снизился и возобновился после возобновления восполнения.  Таким образом, восполнение Glu-плазминогеном 6 мг/кг каждые трое суток (q3d) успешно повышала и поддерживала активность плазминогена на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена в течение периода восполнения и, более конкретно, на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена в течение периода восполнения.
Кроме того, восполнение Glu-плазминогеном 6 мг/кг каждые двое суток (qod) успешно повышала и поддерживала активность плазминогена на по меньшей мере 1 % от нормальной активности плазминогена в течение периода восполнения и, более конкретно, на по меньшей мере 10 % от нормальной активности плазминогена в течение периода восполнения.
Как описано в данном документе, период накопления, как правило, в 3-5 раз превышает период полувыведения соединения в плазме субъекта. У субъектов с дефицитом плазминогена в ходе исследования фазы I период полувыведения Glu-плазминогена составлял около 35,7 часа или 1,5 суток (см. пример 5). Таким образом, на основе определенного периода полувыведения период накопления будет составлять от 107 часов (4,5 суток) до 179 часов (7,4 суток). На фиг. 17, 18, 19, 20, 21, 22 и 23 можно видеть, что стационарная фаза начинается примерно через одну неделю с начала периода восполнения. Это подтверждает период полувыведения Glu-плазминогена у субъекта с дефицитом плазминогена, который был определен в данном документе.  Опять же, изменчивость потребления плазминогена является индивидуальным субъектом время от времени из-за многих факторов, которые приводят к наблюдаемой кривой остаточного уровня, которая немного отличается от теории, как описано на фиг. 4. Среднее значение близко к теории (не представлено).
Пример 7: Повторяющаяся доза (6 мг/кг) Glu-плазминогена у субъектов-людей с дефицитом плазминогена и эффективность
Одной из целей восполнения Glu-плазминогена по данному изобретению является предоставление восполнения Glu-плазминогена, которое эффективно уменьшает и/или излечивает по меньшей мере один симптом, связанный с дефицитом плазминогена. Субъекты фазы II были подвергнуты мониторингу в отношении их видимых повреждений (таблица 5), общего улучшения (таблица 6) и качества жизни (таблица 6) на 0 сутки, 4 неделю, 8 неделю и/или 12 неделю.
Из наблюдения видимых повреждений можно отметить, что некоторые повреждения были уменьшены, например, у субъекта 01-010, или полностью устранены на 4-й неделе, например, у субъектов 01-001, 01-002, 01-006 и 01-008, или не наблюдались у субъектов 01-009, у которых не было видимых повреждений на 0 сутки. Таким образом, добавление Glu-плазминогена по данному изобретению уменьшает повреждение, лечит повреждение или предотвращает повреждение у субъекта с дефицитом плазминогена.
Общее улучшение было оценено с использованием вопроса и ответов, представленных на фиг. 24.
В Таблице 6 можно отметить, что большинство испытуемых испытали значительное улучшение своего клинического общего впечатления на 4-й неделе, которое по-прежнему улучшалось в течение всего периода наблюдения. В частности, балл CGI был либо «очень улучшенным», либо «значительно улучшенным», за исключением субъекта 01-007, для которой он не изменился. Таким образом, восполнение плазминогена успешно улучшает ухудшение клинического глобального впечатления.
Качество жизни оценивали с использованием шкалы, разработанной Американской ассоциацией хронической боли, которая обычно используется для оценки качества жизни у любых пациентов. Шкала качества жизни подробно описана на фиг. 25.
В Таблице 6 можно отметить, что качество жизни для тех, кто еще не собирался работать каждый день или имел нормальную повседневную деятельность (оценка 10), улучшилось на 4-й неделе, и для одного из них оно продолжало улучшаться на 8 неделе. Для субъектов, имеющих 10 баллов на 0 сутки, сохранилось хорошее качество жизни в течение контролируемого периода. Поэтому можно сделать вывод, что восполнение Glu-плазминогена улучшает качество жизни у субъекта, у которого есть ухудшение качества жизни или оценка качества жизни ниже 10.
* * *
Заголовки включены в данный документ для справки и для помощи в определении определенных разделов. Эти заголовки не предназначены для ограничения объема концепций, описанных в них, и эти концепции могут иметь применимость в других разделах по всему описанию. Таким образом, данное изобретение не ограничивается представленными в данном документе вариантами осуществления, но должно предоставляться в самом широком объеме, согласующемся с принципами и новыми признаками, раскрытыми в данном документе. Использование определений в единственном числе не исключает возможности наличия определений во множественном числе, если обратное прямо не указано в контексте. Если не указано иное, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции, концентрации, свойства и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «около». По меньшей мере, каждый численный параметр должен, по меньшей мере, интерпретироваться в свете количества зарегистрированных значащих цифр и применения обычных методов округления. Соответственно, если не указано обратное, числовые параметры, указанные в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными, которые могут варьировать в зависимости от свойств, которые требуется получить. Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, определяющие широкий диапазон вариантов осуществления, являются приближениями, численные значения, указанные в конкретных примерах, сообщаются как можно точнее. Однако любое числовое значение содержит определенные ошибки, возникающие в результате изменений в экспериментах, тестированиях, статистических анализах и т.д.