3,11b-ЦИС-ДИГИДРОТЕТРАБЕНАЗИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ВОСПАЛЕНИЯ
3,11b-CIS-DIHYDROTETRABENAZINE FOR TREATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASE OR INFLAMMATION

Данное изобретение относится к применению дигидротетрабеназина для профилактики или лечения воспалительных заболеваний и злокачественных опухолей.
Уровень техники
Рак является общим термином, данным группе заболеваний, характеризующихся аномальным или неконтролируемым ростом клеток. В норме клетки растут и делятся с образованием новых клеток, только когда организм нуждается в них. Когда клетки стареют и погибают, их место занимают новые клетки. Мутации генов в клетке могут иногда нарушить этот процесс таким образом, что новые клетки появляются, когда организм не нуждается в них, и старые клетки не погибают, когда должна иметь место их гибель. Дополнительные клетки образуют массу ткани, называемую ростом, новообразованием или опухолью. Опухоли могут быть доброкачественными (не раковыми) или злокачественными (раковыми). Доброкачественные опухоли не проникают в другие области организма, и они редко представляют угрозу для жизни, в то время как злокачественные опухоли могут распространяться (метастазировать) и угрожать жизни. Злокачественные опухоли происходят от одной клетки и, следовательно, их можно классифицировать, основываясь на типе клетки, от которой они берут свое начало, и по локализации клетки. Так, аденомы происходят от железистой ткани, карциномы происходят от эпителиальных клеток, лейкемии получают развитие от стволовых клеток костного мозга, лимфомы происходят от лимфатической ткани, меланомы начинают свое развитие в меланоцитах, саркомы - в соединительной ткани костей или мышц, и тератомы развиваются из зародышевых клеток.
Существуют различные способы лечения злокачественных опухолей, и чаще всего это хирургическая операция, химиотерапия и лучевая терапия. Как правило, выбор лечения зависит от локализации и категории опухоли и стадии заболевания. Если опухоль является локализованной, то часто хирургическая операция является предпочтительным видом лечения. Примеры общих хирургических вмешательств включают простатэктомию для рака простаты и мастэктомию для рака молочной железы. Целью операций является либо удаление только опухоли, либо всего органа. Поскольку одна раковая клетка может развиться до опухоли значительных размеров, то удаление только опухоли сопряжено с большей вероятностью возникновения рецидива. Химиотерапия включает лечение рака лекарственными препаратами, которые могут нарушить или остановить рост раковых клеток. Альтернативные механизмы, используемые в химиотерапии злокачественных опухолей, включают антиангиогенные препараты, действие которых проявляется в нарушении кровеносных сосудов, поставляющих кровь в опухоли, и иммунотерапевтические средства, которые стимулируют проявление иммунного ответа у хозяина против опухолевой ткани. Нормальные клетки растут и погибают контролируемым путем. В случае злокачественных опухолей клетки в организме, которые являются аномальными, сохраняют деление и образование всего большего количества клеток без контроля. Механизм одной группы противоопухолевых лекарственных средств заключается в индукции гибели делящихся клеток или остановки их роста или размножения. Также при этом могут быть затронуты здоровые клетки, особенно которые быстро делятся, и это может привести к проявлению побочных эффектов. Лучевая терапия основана на применении ионизирующей радиации для того, чтобы вызвать гибель клеток и элиминацию опухолей. Лучевая терапия приводит к повреждению или разрушению клеток в области, которая подвергается воздействию («ткани-мишени»), посредством повреждения их генетического материала, делая невозможным для данных клеток продолжать рост и деление. Несмотря на то, что радиация повреждает как раковые, так и нормальные клетки, большая часть нормальных клеток может восстановиться от действия облучения и правильно функционировать. Целью лучевой терапии является повреждение как можно большего количества раковых клеток, одновременно ограничивая вредное действие в отношении смежной здоровой ткани. Лучевую терапию можно использовать для лечения почти всех типов солидных опухолей, включая злокачественные опухоли мозга, молочной железы, рак шейки матки, злокачественные опухоли гортани, поджелудочной железы, простаты, рак кожи, позвоночника, злокачественные опухоли желудка, матки или саркомы мягких тканей. Облучение также можно использовать для лечения лейкемии и лимфомы (злокачественные заболевания соответственно кроветворных клеток и лимфатической системы).
Сообщалось, что лиганды сигма (δ)-рецепторов обладают способностью подавлять рост опухолевых клеток (Berthois et al., British Journal of Cancer (2003), 88, 438-446). Bourrie et al. (Current Opinion in Investigational Drugs (2004), 5(11): 1158-63) сообщили, что два подтипа сигма-рецепторов и два связанных с ними белка также экспрессируются на опухолевых клетках.
Сигма-рецепторы являются клеточными поверхностными рецепторами, которые рассматривают в качестве подтипа опиатных рецепторов, но в настоящее время показано после характеристики рецепторов и открытия специфических лигандов для рецепторов, что они отличаются от опиатных рецепторов (см. Bourrie et al. (2004)).
Сигма-рецепторы можно разделить на подтипы сигма-1 (σ-1) и сигма-2 (σ-2). Клонирован σ-1-рецептор, который, как полагают, содержит 223 аминокислоты (Hanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996), 93: 8072-8077), и было установлено, что у него отсутствует гомология первичной последовательности по отношению к любой другой группе рецепторов. Однако он обладает 30,3% идентичностью к последовательности стерол-С8-С7-изомеразы грибов, и также было установлено, что он близок к другому белку с неизвестной функцией, SRBP2 (SR-31747-связывающий белок 2), который имеет высокую гомологию с данным ферментом. Рецептор σ-2 пока еще не клонирован.
Wang et al., Breast Cancer Research & Treatment (2004), 87(3): 205-14, исследовали экспрессию сигма-1-рецептора в злокачественной опухоли молочной железы человека и обнаружили наличие сверхэкспрессии мРНК сигма-1-рецептора в 64% злокачественных опухолей молочной железы по сравнению с нормальной тканью, на основе этих данных авторы пришли к заключению, что некоторые нормальные и большинство злокачественных эпителиальных клеток молочной железы и клеточные линии обычно могут экспрессировать сигма-1-рецептор. Они также обнаружили, что галоперидол, неспецифический лиганд сигма-1, в высоких концентрациях подавлял рост данных клеток и усиливал действие химиотерапии в условиях in vitro.
in vitro
Berthois et al. (2003) описали результаты исследований, в которых оценивалось влияние сигма-рецептора лиганда SR31747A на пролиферацию человеческих эпителиальных клеток злокачественной опухоли молочной железы и злокачественной опухоли простаты. Они сообщили, что в условиях  SR31747A в наномолярных концентрациях существенно подавлял пролиферацию клеток в обеих гормон-зависимых и гормоннезависимых злокачественных клеточных линиях. Они также установили, что развитие опухолей в значительной мере подавлялось у мышей, которые подвергались обработке SR31747A.
Spruce et al., Cancer Research (2004), 64: 4875-4886, сообщили, что антагонист σ-1 рецептора с небольшой молекулой подавляет рост возникающих и развившихся гормон-чувствительных и гормон-нечувствительных ксенотрансплантатов карциномы молочной железы, ортотопических опухолей простаты и ксенотрансплантатов карциномы легких без р53 у мышей с нарушением иммунной реактивности при отсутствии побочных эффектов. Они обнаружили, что антагонисты σ-1 индуцировали апоптоз (запрограммированную гибель клеток) опухолевых клеток, но не большинства нормальных типов клеток. Spruce et al. пришли к заключению, что применение антагонистов σ-1 может представлять собой предполагаемый способ индукции элиминации опухолей, не затрагивая при этом нормальные ткани.
Другие сообщения о применении лигандов σ-1-рецепторов для подавления пролиферации раковых клеток можно найти в источниках, цитированных Spruce et al. (2004), см., например, Brent et al., Eur. J. Pharmacol., (1995), 278: 151-60 и Crawford et al., Cancer Research (2002), 62: 313-22.
Следовательно, четко установлено, что лиганды сигма-рецепторов могут подавлять пролиферацию раковых клеточных линий и могут индуцировать апоптоз раковых клеток, и на основе данного факта предполагается, что лиганды сигма-рецепторов, такие как антагонисты сигма-1, будут полезными для лечения злокачественных опухолей.
Также сообщалось, что лиганды сигма-рецепторов обладают противовоспалительной активностью. Например, Bourrie et al., Eur. J. Pharmacol. (2002), 456(1-3): 123-31 сообщают, что соединение SSR125329A (химическое название [(Z)-3-(4-адамантан-2-ил-3,5-дихлорфенил)аллил]циклогексилэтиламин), полученное Sanofi-Synthelabo Recherche, представляет собой лиганд сигма-рецептора с высокой аффинностью, обладающий высокой противовоспалительной активностью. Bourrie et al. пришли к заключению, что результаты их исследований являются вескими доказательствами того, что лиганды сигма-рецепторов могут представлять новый эффективный подход для лечения ревматоидного артрита.
Другой антагонист сигма-рецептора Sanofi (SR31747) в настоящее время находится на стадии клинических испытаний, проводимых с целью лечения ревматоидного артрита.
Тетрабеназин (химическое название: 1,3,4,6,7,11b-гексагидро-9,10-диметокси-3-(2-метилпропил)-2Н-бензо(а)хинолизин-2-он) применяют в качестве фармацевтического препарата с конца 50-х годов прошлого века. Разработанный первоначально в качестве антипсихотического средства в настоящее время тетрабеназин применяют для симптоматического лечения гиперкинетических двигательных нарушений, таких как болезнь Гентингтона, гемибаллизмус, старческая хорея, тик, поздняя дискинезия и синдром Туретта, см., например, Jankovic et al., Am. J. Psychiatry (1999) Aug., 156(8): 1279-81 и Jankovic et al., Neurology (1997) Feb., 48(2): 358-62.
Химическая структура тетрабеназина приведена на фиг.1 ниже.
Фиг.1 - Структура тетрабеназина
Соединение имеет хиральные центры в 3 и 11b атомах углерода и, следовательно, теоретически может находиться в виде четырех изомеров, как показано на фиг.2.
Фиг.2 - Возможные изомеры тетрабеназина
th
На фиг.2 стереохимия каждого изомера определяется с использованием номенклатуры «R и S», разработанной Cahn, Ingold и Prelog, см. Advanced Organic Chemistry by Jerry March, 4 Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, pages 109-114. На фиг.2 и в других местах данной заявки на патент обозначения «R» или «S» даны в порядке номеров положений атомов углерода. Так, например, RS представляет стенографическое обозначение 3R,11bS. Аналогично, когда присутствует три хиральных центра, как это имеет место в дигидротетрабеназине, представленном ниже, то обозначения «R» или «S» приводятся в порядке атомов углерода 2, 3 и 11b. Так, изомер 2S,3R,11bR относится к стенографическому обозначению SRR и так далее.
Промышленно доступный тетрабеназин представляет рацемическую смесь R- и SS-изомеров, и оказалось, что RR- и SS-изомеры (ниже относится по отдельности или в общем к транс-тетрабеназину, поскольку атомы водорода в положениях 3 и 11b имеют относительную транс-ориентацию) являются наиболее термодинамически стабильными изомерами.
Тетрабеназин обладает несколько слабой и колеблющейся биодоступностью. Он подвергается интенсивному метаболизму и в моче, как правило, обнаруживается незначительное количество неизмененного тетрабеназина или он вовсе отсутствует. Основным метаболитом является дигидротетрабеназин (химическое название: 2-гидрокси-3-(2-метилпропил)-1,3,4,6,7,11b-гексагидро-9,10-диметоксибензо(а)хинолизин), который образуется при восстановлении 2-кетогруппы в тетрабеназине, и полагают, что он является ответственным за проявление активности лекарственного препарата (см. Mehvar et al., Drug Metab. Disp., 15, 250-255 (1987) и J. Pharm. Sci., 76, № 6, 461-465 (1987)).
Раннее были идентифицировано и охарактеризовано четыре изомера дигидротетрабеназина, все они были получены из более стабильных RR- и SS-изомеров исходного тетрабеназина, и они имеют относительную транс-ориентацию между атомами водорода в положениях 3 и 11b (см. Kilbourn et al., Chirality, 9: 59-62 (1997) и Brossi et al., Helv. Chim. Acta, vol. XLI, No 193, pp. 1793-1806 (1958)). Четырьмя изомерами являются (+)-α-дигидротетрабеназин, (-)-α-дигидротетрабеназин, (+)-β-дигидротетрабеназин и (-)-β-дигидротетрабеназин. Структуры четырех известных изомеров дигидротетрабеназина представляют собой следующее:
Фиг.3 - Структуры известных изомеров дигидротетрабеназина
11
11
11
3
11
in vivo
in vitro
Kilbourn et al. (см. Eur. J. Pharmacol., 278: 249-252 (1995) и Med. Chem. Res., 5: 113-126 (1994)) исследовали специфическое связывание отдельных меченных радиоактивной меткой изомеров дигидротетрабеназина в мозге здоровой крысы. Они обнаружили, что (+)-α-[C]дигидротетрабеназин, (2R,3R,11bR)-изомер, накапливается в областях мозга, ассоциированных с более высокими концентрациями нейронного мембранного переносчика дофамина (DAT) и везикулярного переносчика моноамина (VMAT2). Однако по существу неактивный изомер (-)-α-[C]дигидротетрабеназин был практически однородно распределен в ткани мозга, на основании чего можно предположить, что в данном случае отсутствует специфическое связывание с DAT и VMAT2. Результаты исследований в условиях  коррелировали с данными опытов , которые показали, что изомер (+)-α-[C]дигидротетрабеназин имеет более высокое значение Ki для [H]метокситетрабеназина более чем в 2000 раз выше по сравнению с Ki для изомера (-)-α-[C]дигидротетрабеназина.
В более ранней международной заявке на патент настоящих заявителей № PCT/GB2005/000464 раскрывается получение и применение фармацевтических изомеров дигидротетрабеназина, полученных из RS- и SR-изомеров (ниже относится по отдельности или в общем к цис-тетрабеназину, поскольку атомы водорода в положениях 3 и 11b имеют относительную цис-ориентацию) тетрабеназина. В PCT/GB2005/000464 приводятся экспериментальные данные, показывающие, что изомеры цис-дигидротетрабеназина связываются с сигма-1- и сигма-2-рецепторами, но не раскрывают какие-либо терапевтические применения за счет использования способности к связыванию с сигма-рецепторами.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению цис-дигидротетрабеназина, описанного в более ранней заявке настоящих заявителей № PCT/GB2005/000464, для лечения воспалительных заболеваний и злокачественных опухолей.
Следовательно, в первом аспекте изобретение относится к 3,11b-цис-дигидротетрабеназину для применения в профилактике или лечении пролиферативного заболевания или воспалительного заболевания.
В одном варианте осуществления пролиферативное заболевание представляет собой рак.
Следовательно, изобретение относится к 3,11b-цис-дигидротетрабеназину для применения в профилактике или лечении пролиферативного заболевания, такого как рак.
Также изобретение относится к
• применению 3,11b-цис-дигидротетрабеназина для производства лекарственного средства для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак;
• применению цис-дигидротетрабеназина для производства лекарственного средства для профилактики или лечения заболевания, или состояния (например, рака), возникающего в результате аномального роста клеток;
• способу лечения заболевания или состояния (например, рака), вызванного или возникающего в результате аномального роста клеток у млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества цис-дигидротетрабеназина;
• способу лечения заболевания или состояния (например, рака), вызванного или возникающего в результате аномального роста клеток у млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему цис-дигидротетрабеназина в количестве, эффективном для подавления аномального роста клеток;
• способу ослабления или снижения частоты развития заболевания или состояния (например, рака), вызванного или возникающего в результате аномального роста клеток у млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему цис-дигидротетрабеназина в количестве, эффективном для подавления аномального роста клеток.
Предусматривается, что соединения по изобретению будут пригодными для лечения или профилактики одного или более злокачественных заболеваний, выбранных из
аденом;
карцином;
лейкемий;
лимфом;
меланом;
сарком и
тератом.
Конкретные примеры злокачественных заболеваний, развитие которых можно подавлять или которые можно лечить, включают, но не ограничиваются этим, карциному, например карциному мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки (например, колоректальные карциномы, такие как аденокарцинома ободочной кишки и аденома ободочной кишки), почек, эпидермальную карциному, карциному печени, легких, например аденокарциному, мелкоклеточную карциному легких и немелкоклеточную карциному легких, карциному пищевода, желчного пузыря, яичников, поджелудочной железы, например экзокринную карциному поджелудочной железы, карциному желудка, рак шейки матки, карциному щитовидной железы, простаты или рак кожи, например плоскоклеточную карциному; гематопоэтическую опухоль лимфоидного происхождения, например лейкемию, острую лимфоцитарную лейкемию, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, не-ходжкинскую лимфому, волосистоклеточную лимфому или лимфому Беркитта; гематопоэтическую опухоль миелоидного происхождения, например острые и хронические миелогенные лейкемии, миелодиспластический синдром или промиелоцитарную лейкемию; фолликулярную карциному щитовидной железы; опухоль мезенхимного происхождения, например фибросаркому или габдомиосаркому; опухоль центральной или периферической нервной системы, например астроцитому, нейробластому, глиому или шванному; меланому; семиному; тератокарциному; остеосаркому; пигментную ксенодерому; кератоакантому; фолликулярную карциному щитовидной железы или саркому Капоши.
Конкретнее, злокачественные опухоли, которые можно лечить или подавлять их рост при применении цис-дигидротетрабеназина, представляют собой злокачественные опухоли, которые являются чувствительными к лигандам сигма-рецепторов, например антагонистам σ-1.
Дополнительными примерами злокачественных опухолей, которые можно лечить или подавлять их рост при применении цис-дигидротетрабеназина, являются такие злокачественные опухоли, в которых имеет место гиперэкспрессия сигма-рецепторов.
В конкретном варианте осуществления карцинома представляет карциному молочной железы.
В другом конкретном варианте осуществления карцинома представляет опухоль простаты, например ортотопическую опухоль простаты.
В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль представляет злокачественную опухоль легких.
В другом общем варианте осуществления изобретение относится к 3,11b-цис-дигидротетрабеназину для применения при лечении воспалительного заболевания.
Также изобретение относится к
• применению 3,11b-цис-дигидротетрабеназина для производства лекарственного средства для профилактики или лечения воспалительного заболевания;
• способу профилактики или лечения воспалительного заболевания или состояния у пациента (например, млекопитающего, такого как человек), где способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества 3,11b-цис-дигидротетрабеназина.
Примеры воспалительных заболеваний или состояний включают, но не ограничиваются этим, ревматоидный артрит, остеоартрит, травматический артрит, подагрический артрит, артрит при коревой краснухе, псориатический артрит и другие виды артритов; острые или хронические воспалительные заболевания, такие как воспалительная реакция, индуцированная эндотоксином, или воспалительное заболевание кишечника; синдром Рейтера, подагру, ревматоидный спондилит, хроническое воспалительное заболевание легких, болезнь Крона и язвенный колит.
Конкретными воспалительными заболеваниями и состояниями являются таковые, которые чувствительны к лигандам сигма-рецепторов, например антагонистам сигма.
Одно конкретное воспалительное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.
Цис-дигидротетрабеназин, используемый в настоящем изобретении, является 3,11b-цис-дигидротетрабеназином.
3,11b-Цис-дигидротетрабеназин, используемый в изобретении, может находиться в основном в чистой форме, например с изомерной чистотой выше 90%, как правило, выше 95% и наиболее предпочтительно выше 98%.
Термин «изомерная чистота» в настоящем контексте относится к присутствующему количеству 3,11b-цис-дигидротетрабеназина относительно общего количества или концентрации дигидротетрабеназина во всех изомерных формах. Например, если в композиции 90% от общего имеющегося содержания дигидротетрабеназина представляет 3,11b-цис-дигидротетрабеназин, то изомерная чистота составляет 90%.
11b-Цис-дигидротетрабеназин, используемый в изобретении, может находиться в форме композиции, которая в основном не содержит 3,11b-транс-дигидротетрабеназин, предпочтительно содержит менее чем 5% 3,11b-транс-дигидротетрабеназина, более предпочтительно менее чем 3% 3,11b-транс-дигидротетрабеназина и наиболее предпочтительно менее чем 1% 3,11b-транс-дигидротетрабеназина.
Термин «3,11b-цис», в том смысле, в котором он используется в описании, означает, что атомы водорода в положениях 3 и 11b формулы дигидротетрабеназина находятся в относительной цис-ориентации. Следовательно, изомеры по изобретению представляют собой соединения формулы (I) и их антиподы (зеркальные отражения).
Имеется четыре возможных изомера дигидротетрабеназина, имеющих 3,11b-цис-конфигурацию, и они представляют собой 2S,3S,11bR-изомер, 2R,3R,11bS-изомер, 2R,3S,11bR-изомер и 2S,3R,11bS-изомер. Четыре изомера были выделены и охарактеризованы, и в другом аспекте изобретение относится к отдельным изомерам 3,11b-цис-дигидротетрабеназина. В частности, изобретение относится к
(а) 2S,3S,11bR-изомеру 3,11b-цис-дигидротетрабеназина с формулой (Ia):
(b) 2R,3R,11bS-изомеру 3,11b-цис-дигидротетрабеназина с формулой (Ib):
(с) 2R,3S,11bR-изомеру 3,11b-цис-дигидротетрабеназина с формулой (Iс):
и
(d) 2S,3R,11bS-изомеру 3,11b-цис-дигидротетрабеназина с формулой (Id):
Отдельные изомеры по изобретению можно охарактеризовать по их спектроскопическим, оптическим и хроматографическим свойствам и также по их абсолютным стереохимическим конфигурациям, которые определяют рентгеновской кристаллографией.
Без учета любой конкретной абсолютной конфигурации или стереохимии четыре новых изомера могут быть охарактеризованы следующим образом:
Изомер А
1
13
3
3
Оптическая активность, определенная ORD (оптическая вращательная дисперсия) (метанол, 21°С): левовращающий (-); ИК-спектр (твердый КBr), Н-ЯМР-спектр (CDCl) и С-ЯМР-спектр (CDCl), в основном, как представлено в таблице 1.
Изомер В
1
13
3
3
Оптическая активность, определенная ORD (метанол, 21°С): правовращающий (+); ИК-спектр (твердый КBr), Н-ЯМР-спектр (CDCl) и С-ЯМР-спектр (CDCl), в основном, как представлено в таблице 1, и свойства в рентгеновской кристаллографии, как описано в примере 4.
Изомер С
1
13
3
3
Оптическая активность, определенная ORD (метанол, 21°С): правовращающий (+); ИК-спектр (твердый КBr), Н-ЯМР-спектр (CDCl) и С-ЯМР-спектр (CDCl), в основном, как представлено в таблице 2.
Изомер D
1
13
3
3
Оптическая активность, определенная ORD (метанол, 21°С): левовращающий (-); ИК-спектр (твердый КBr), Н-ЯМР-спектр (CDCl) и С-ЯМР-спектр (CDCl), в основном, как представлено в таблице 2.
Значения, полученные ORD, для каждого изомера приведены в примерах ниже, но следует отметить, что эти значения приводятся в качестве примера и могут варьировать в зависимости от степени чистоты изомера и влияния других переменных величин, таких как колебания температуры и влияние остаточных молекул растворителя.
Каждый из энантиомеров A, B, C и D может находиться в основном в энантиомерно чистой форме или в виде смесей с другими энантиомерами по изобретению.
Термины «энантиомерная чистота» и «энантиомерно чистый» в настоящем контексте относятся к присутствующему количеству данного энантиомера 3,11b-цис-дигидротетрабеназина по отношению к общему количеству или концентрации всех энантиомеров и изомеров дигидротетрабеназина. Например, если в композиции 90% от общего присутствующего количества дигидротетрабеназина находится в виде одного изомера, то энантиомерная чистота составляет 90%.
В качестве примера в каждом аспекте и варианте осуществления изобретения каждый отдельный энантиомер, выбранный из изомеров A, B, C и D, может иметь энантиомерную чистоту, равную, по меньшей мере, 55% (например, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 100%).
Изомеры по изобретению также могут находиться в виде смесей одного или более изомеров A, B, C и D. Такие смеси могут представлять собой рацемические смеси или нерацемические смеси. Примеры рацемических смесей включают рацемическую смесь изомера А и изомера В и рацемическую смесь изомера С и изомера D.
Фармацевтически приемлемые соли
Если в контексте не требуется иначе, то в данной заявке обращение к дигидротетрабеназину и его изомерам относится не только к свободному основанию дигидротетрабеназина, но также его солям и, в частности, аддитивным солям кислоты.
Конкретные кислоты, из которых получают аддитивные соли кислоты, включают кислоты, имеющие значение рК ниже 3,5 и, как правило, ниже 3. Например, аддитивные соли кислоты можно получить из кислоты, имеющей значение рК в пределах от +3,5 до -3,5.
Предпочтительные аддитивные соли кислоты включают таковые, полученные из сульфоновых кислот, таких как метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота.
Одной конкретной кислотой, из которой можно получить аддитивные соли кислоты, является метансульфоновая кислота.
Аддитивные соли кислоты можно получить способами, описанными в описании, или обычными химическими способами, такими, как описаны в Pharmaсeuticals Salts: Properties, Selection and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002. Как правило, такие соли можно получить взаимодействием свободного основания соединения с соответствующим основанием или кислотой в воде или органическом растворителе, или смеси этих двух компонентов; обычно используются неводные среды, такие как диэтиловый эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил.
Как правило, соли являются фармацевтически приемлемыми солями. Однако также можно получить соли, которые не являются фармацевтически приемлемыми солями, в качестве промежуточных продуктов, которые затем можно превратить в фармацевтически приемлемые соли. Такие не фармацевтически приемлемые соли также формируют часть изобретения.
Способы получения изомеров дигидротетрабеназина
Дигидротетрабеназин можно получить способом, включающим взаимодействие соединения формулы (II):
с реагентом или реагентами, подходящими для гидратации по 2,3-двойной связи в соединении формулы (II) и затем, когда это требуется, отделение и выделение желаемого изомера дигидротетрабеназина.
Гидратацию по 2,3-двойной связи можно провести гидроборированием с использованием боранового реагента, такого как диборан, или комплекса боран-простой эфир (например, комплекса боран-тетрагидрофуран (ТГФ)) c получением промежуточного аддукта алкилборана с последующим окислением аддукта алкилборана и гидролизом в присутствии основания. Как правило, гидроборирование проводят в сухом неполярном растворителе, таком как простой эфир (например, ТГФ), обычно при невысокой температуре, например при комнатной температуре. Как правило, аддукт алкенборан окисляют окислителем, таким как перекись водорода в присутствии основания, обеспечивающего источник гидроксидных ионов, такого как гидроксид аммония или гидроксид щелочного металла, например гидроксид калия или гидроксид натрия. Обычно последовательность реакций гидроборирование-окисление-гидролиз в способе А обеспечивает изомеры дигидротетрабеназина, в которых атомы водорода в положениях 2 и 3 имеют относительную трансориентацию.
Соединения формулы (II) можно получить восстановлением тетрабеназина с получением дигидротетрабеназина с последующей дегидратацией дигидротетрабеназина. Восстановление тетрабеназина можно провести с использованием гидрида алюминия, такого алюмогидрид лития, или боргидрида, такого как боргидрид натрия, боргидрид калия, или производного боргидрида, например алкилборгидрида, такого как три-вторичный бутилборгидрид лития. Альтернативно стадию восстановления можно проводить с использованием каталитического гидрирования, например, с использованием катализатора никеля Ренея или оксида платины. Подходящие условия проведения стадии восстановления более подробно описаны, и их можно найти в патенте США 2843591 (Hoffmann-La Roche) и Brossi et al., Helv. Chim. Acta, vol. XLI, № 193, pp. 1793-1806 (1958).
За счет того, что тетрабеназин, используемый в качестве исходного вещества для реакции восстановления, как правило, представляет смесь RR- и SS-изомеров (т.е. транс-тетрабеназин), то дигидротетрабеназин, образовавшийся на стадии восстановления, будет иметь ту же транс-конфигурацию в отношении положений 3 и 11b и будет принимать форму одного или более известных изомеров дигидротетрабеназина, представленных на фиг.3, выше. Таким образом, способ А включает приобретение известных изомеров дигидротетрабеназина, их дегидратацию с получением алкена (II) и затем «регидратацию» алкена (II) с использованием условий, которые обеспечивают новые изомеры цис-дигидротетрабеназина по изобретению.
3
5
Дегидратацию дигидротетрабеназина в алкен (II) можно провести с использованием различных обычных условий для дегидратации спиртов с получением алкенов, например, см. J. March (в том же источнике), страницы 389-390 и цитированные там источники. Примеры таких условий включают применение дегидратирующих реагентов на основе фосфора, таких как галогениды фосфора или оксигалогениды фосфора, например POCl и PCl. В качестве альтернативного способа прямой дегидратации гидроксильную группу дигидротетрабеназина можно превратить в уходящую группу L, такую как атом галогена (например, атом хлора или брома) и затем подвергнуть воздействию условий (например, в присутствии основания) для удаления H-L. Превращение гидроксильной группы в галогенид можно провести с использованием способов, хорошо известных специалистам в области химии, например, взаимодействием с тетрахлоридом углерода или тетрабромидом углерода в присутствии триалкил- или триарилфосфина, такого как трифенилфосфин или трибутилфосфин.
Тетрабеназин, используемый в качестве исходного вещества для восстановления с получением дигидротетрабеназина, можно получить из промышленных источников или можно синтезировать способом, описанным в патенте США 2830993 (Hoffmann-La Roche).
Другой способ (способ В) получения дигидротетрабеназина по изобретению включает воздействие на соединение формулы (III):
условий для раскрытия цикла 2,3-эпоксидной группы в соединении формулы (III) и затем, когда это требуется, отделение и выделение желаемого изомера дигидротетрабеназина.
Раскрытие цикла можно провести, следуя известным способам раскрытия эпоксидных групп. Однако в настоящее время предпочтительным способом раскрытия цикла эпоксида является восстановительное раскрытие цикла, которое достигается с использованием восстанавливающего реагента, такого как комплекс боран-ТГФ. Реакцию с комплексом боран-ТГФ можно провести в полярном, непротонном растворителе, таком как простой эфир (например, тетрагидрофуран), как правило, при температуре окружающей среды, где затем полученный таким образом борановый комплекс гидролизуют при нагревании в присутствии воды и основания при температуре кипения растворителя. Как правило, с помощью способа В получают изомеры дигидротетрабеназина, в которых атомы водорода в положениях 2 и 3 имеют относительную цис-ориентацию.
Эпоксидные соединения формулы (III) можно получить эпоксидированием алкена формулы (II), представленной выше. Реакцию эпоксидирования можно провести с использованием условий и реагентов, хорошо известных специалистам в области химии, см., например, J. March (в том же источнике), страницы 826-829 и цитированные там источники. Как правило, для эпоксидирования, можно использовать перкислоту, такую как мета-хлорпербензойная кислота (МСРВА), или смесь перкислоты и дополнительного окислителя, такого как перхлорная кислота.
В том случае, если исходные вещества для способов А и В, приведенных выше, являются смесями энантиомеров, то тогда продукты способов, как правило, будут представлять пары энантиомеров, возможно, вместе с примесями диастереоизомеров. Нежелательные диастереоизомеры можно удалить способами, такими как хроматография (например, ВЭЖХ), и отдельные энантиомеры можно разделить различными методами, известными специалистам в области химии. Например, их можно разделить посредством
(i) хиральной хроматографии (хроматографии на хиральной основе); или
(ii) получения соли оптически чистой хиральной кислоты, разделения солей двух диастереоизомеров фракционированной кристаллизацией и затем выделения дигидротетрабеназина из соли; или
(iii) получения производного (такого как сложный эфир) с помощью оптически чистого хирального дериватизирующего реагента (например, этерифицирующего реагента), разделения полученных эпимеров (например, хроматографией) и затем превращения производного в дигидротетрабеназин.
Один способ разделения пар энантиомеров, полученных каждым из способов А и В, и которые, как было установлено, являются особенно эффективными, представляет собой этерификацию гидроксильной группы дигидротетрабеназина с помощью оптически активной формы кислоты Мошера, такой как R(+)-изомер, представленный ниже, или ее активной формы:
Затем полученные эфиры двух энантиомеров дигидротетрабеназина можно разделить хроматографией (например, ВЭЖХ) и разделенные эфиры гидролизовать с получением отдельных изомеров дигидротетрабеназина с использованием основания, такого как гидроксид щелочного металла (например, NaOH), в полярном растворителе, таком как метанол.
В качестве альтернативы использованию смесей энантиомеров в качестве исходных веществ в способах А и В и затем проведению разделения энантиомеров каждый из способов А и В можно провести на исходных веществах, представляющих отдельные энантиомеры, что дает продукты с преобладанием одного энантиомера. Отдельные энантиомеры алкена (II) можно получить, подвергнув RR/SS-тетрабеназин стереоселективному восстановлению с использованием три-вторичного бутилборгидрид лития с получением смеси SRR- и RSS-энантиомеров дигидротетрабеназина, разделением энантиомеров (например, фракционированной кристаллизацией) и затем дегидратацией выделенного отдельного энантиомера дигидротетрабеназина с получением преимущественно или исключительно одного энантиомера соединения формулы (II).
Способы А и В более подробно приведены ниже, соответственно, на схемах реакций 1 и 2.
Схема реакций 1
На схеме 1 показано получение отдельных изомеров дигидротетрабеназина с 2S,3S,11bR- и 2R,3R,11bS-конфигурациями, в которых атомы водорода в положениях 2 и 3 расположены в относительной транс-конфигурации. Данная схема реакций 1 включает способ А, представленный выше.
Исходной точкой для последовательности реакций на схеме 1 является промышленно доступный тетрабеназин (IV), который представляет рацемическую смесь оптических RR- и SS-изомеров тетрабеназина. В каждом из RR- и SS-изомеров атомы водорода в положениях 3 и 11b располагаются в относительной транс-конфигурации. В качестве альтернативы использованию промышленно доступного соединения тетрабеназин можно синтезировать согласно способу, описанному в патенте США № 2830993 (в частности, см. пример 11).
Рацемическую смесь RR- и SS-тетрабеназина восстанавливают с использованием восстановителя боргидрида, три-вторичного бутилборгидрида лития («L-селектрида»), с получением смеси известных 2S,3S,11bR- и 2R,3R,11bS-изомеров (V) дигидротетрабеназина, из которых представлен для простоты только 2S,3S,11bR-изомер. При использовании более стерически «жесткого» L-селектрида в качестве восстановителя-боргидрида, а не боргидрида натрия, образование RRR- и SSS-изомеров дигидротетрабеназина является минимальным или подавляется.
Изомеры дигидротетрабеназина (V) подвергают взаимодействию с дегидратирующим реагентом, таким как пентахлорид фосфора в непротонном растворителе, таком как хлорированный углеводород (например, хлороформ или дихлорметан, предпочтительно дихлорметан) с получением ненасыщенного соединения (II) в виде пары энантиомеров, из которых на схеме реакций показан только R-энантиомер. Как правило, реакцию дегидратации проводят при температуре ниже комнатной температуры, например на уровне примерно 0-5°С.
Затем ненасыщенное соединение (II) подвергают стереоселективной регидратации с получением дигидротетрабеназина (VI) и его зеркального отражения или антипода (не показан), в котором атомы водорода в положениях 3 и 11b расположены в относительной цис-ориентации и атомы водорода в положениях 2 и 3 расположены в относительной транс-ориентации. Стереоселективную регидратацию проводят гидроборированием с использованием комплекса боран-ТГФ в тетрагидрофуране (ТГФ) с получением промежуточного боранового комплекса (не показан), который затем подвергают окислению перекисью водорода в присутствии основания, такого как гидроксид натрия.
Затем можно провести первоначальную стадию очистки (например, ВЭЖХ) с получением продукта (V) последовательности реакций регидратации в виде смеси 2S,3S,11bR- и 2R,3R,11bS-изомеров, из которых на схеме реакций показан только 2S,3S,11bR-изомер. Для разделения изомеров смесь обрабатывают R(+)-кислотой Мошера в присутствии оксалилхлорида и диметиламинопиридина (DMAP) в дихлорметане с получением пары диастереоизомерных сложных эфиров (VII) (из которых показан только один диастереоизомер), которую затем можно разделить с использованием ВЭЖХ. Затем отдельные сложные эфиры можно подвегнуть гидролизу с использованием гидроксида щелочного металла, такого как гидроксид натрия, с получением одного изомера (VI).
В варианте последовательностей стадий, приведенных на схеме реакций 1, после восстановления RR/SS-тетрабеназина полученную смесь энантиомеров дигидротетрабеназина (V) можно разделить с получением отдельных энантиомеров. Разделение можно провести при получении соли хиральной кислоты, такой как (+) или (-) камфорсульфоновая кислота, разделением полученных диастереоизомеров фракционированной кристаллизацией с получением соли одного энантиомера и затем выделением свободного основания из соли.
Отделенный энантиомер дигидротетрабеназина можно подвергнуть дегидратации с получением одного энантиомера алкена (II). Затем последующая регидратация алкена (II) дает преимущественно или исключительно один энантиомер цис-дигидротетрабеназина (VI). Преимуществом данного варианта способа является то, что в нем не используется получение сложных эфиров кислоты Мошера и, следовательно, не требуется хроматографического разделения, как правило, применяемого для разделения сложных эфиров кислоты Мошера.
На схеме реакций 2 показано получение отдельных изомеров дигидротетрабензина с 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-конфигурациями, в которых атомы водорода в положениях 2 и 3 находятся в относительной цис-ориентации. Данная схема реакций включает способ В, представленный выше.
Схема реакций 2
5
На схеме реакций 2 ненасыщенное соединение (II) получают восстановлением тетрабеназина с получением 2S,3R,11bR- и 2R,3S,11bS-изомеров (V) дигидротетрабеназина и дегидратацией с помощью PCl способом, представленным выше на схеме реакций 1. Однако вместо гидроборирования соединения (II) 2,3-двойную связь превращают в эпоксид взаимодействием с мета-хлорпербензойной кислотой (МСРВА) и перхлорной кислотой. Реакцию эпоксидирования обычно проводят в спирте, таком как метанол, как правило, при комнатной температуре.
Затем эпоксид (VII) подвергают восстановительному раскрытию цикла с использованием комплекса боран-ТГФ в качестве электрофильного восстановителя с получением промежуточного боранового комплекса (не показан), который затем окисляют и расщепляют перекисью водорода в присутствии щелочи, такой как гидроксид натрия, с получением дигидротетрабеназина (VIII) в виде смеси 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров (V) дигидротетрабеназина, из которых представлен для простоты только 2R,3S,11bR-изомер. Обработка смеси изомеров (VIII) R(+)-кислотой Мошера в присутствии оксалилхлорида и диметиламинопиридина (DMAP) в дихлорметане дает пару эпимерных эфиров (IX) (из которых показан только один эпимер), которую затем можно разделить хроматографией и гидролизовать с помощью гидроксида натрия в метаноле способом, описанным выше на схеме реакций 1.
Биологическая активность
Производные цис-дигидротетрабеназина по изобретению связываются с обоими сигма-1- и сигма-2-рецепторами, как показано в примерах, представленных ниже. Четыре изомера цис-дигидротетрабеназина примерно в равной степени эффективны в качестве лигандов сигма-2-рецептора, но изомеры В и D связываются сильнее с сигма-1-рецептором по сравнению с изомерами А и С.
Предполагается на основе данных по их способности к связыванию с сигма-рецепторами, что производные цис-дигидротетрабеназина по изобретению будут пригодными для подавления или предупреждения пролиферации опухолевых клеток.
Способность соединений ингибировать или предупреждать пролиферацию опухолевых клеток можно оценить тестированием соединений в отношении различных линий опухолевых клеток, например, как описано в примере 6 ниже, или при использовании методов, описанных Spruce et al., Cancer Research (2004), 64: 4875-4886.
in vitro
in vivo
В дополнении к исследованиям в условиях  соединения также можно тестировать в условиях  на человеческих опухолевых ксенотрансплантатах на мышах с нарушенной иммунной реактивностью, например, как описано Spruce et al. (2004), стр. 487.
Также предусматривается, что соединения по изобретению будут активными в качестве противовоспалительных препаратов. Противовоспалительную активность соединений можно оценить с использованием различных методов, хорошо известных специалистам в данной области.
Способность соединений по изобретению лечить артрит можно показать в одном или более из следующих тестов и на следующих моделях:
(i) модель индуцированного коллагеном артрита на мышах, описанная Kakimoto et al., Cell Immunol., 142: 326-337, 1992;
(ii) модель индуцированного коллагеном артрита на крысах, описанная Knoerzer et al., Toxicol. Pathol., 25: 13-19, 1997;
(iii) модель адъювантного артрита на крысах, описанная Halloran et al., Arthritis Rheum., 39: 810-819, 1996;
(iv) модель артрита, индуцированная клеточными оболочками стрептококков на крысах, описанная Schimmer et al., J. Immunol., 160: 1466-1477, 1998;
(v) модель человеческого ревматоидного артрита на мышах SCID, описанная Oppenheimer-Marks et al., J. Clin. Invest., 101: 1261-1272, 1998.
Способность соединений по изобретению лечить воспалительное повреждение легких можно показать в одном или более из следующих тестов и на следующих моделях:
(vi) модель индуцированного кислородом повреждения легких на мышах, описанная Wegner et al., Lung, 170: 267-279, 1992;
(vii) модель индуцированного иммунным комплексом повреждения легких на мышах, описанная Mulligan et al., J. Immunol., 154: 1350-1363, 1995;
(viii) модель индуцированного кислотой повреждения легких, описанная Nagase et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 154: 504-510, 1996.
Способность соединений по изобретению лечить воспалительное заболевание кишечника можно показать на модели индуцированного химическим соединением колита на кроликах, описанной Bennet et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 280: 988-1000, 1997.
Способность соединений по изобретению лечить воспалительное повреждение печени можно показать на модели повреждения печени на мышах, описанной Tanaka et al., J. Immunol., 151: 5088-5095, 1993.
Способность соединений по изобретению лечить воспалительное повреждение клубочков почек можно показать на модели нефротоксического сывороточного нефрита, описанной Kawasaki et al., J. Immunol., 150: 1074-1083, 1993.
На противовоспалительную активность соединений по изобретению также указывает их способность снижать продукцию цитокинов провоспаления и подавлять пролиферацию Т-клеток, как описано в примерах ниже.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Как правило, производные дигидротетрабеназина вводят в виде фармацевтических композиций.
Фармацевтические композиции могут находиться в любой форме, подходящей для перорального, парентерального, местного, интраназального, внутрибронхиального, внутриглазного, внутриушного, ректального, интравагинального или трансдермального введения. В тех случаях, когда композиции предназначаются для парентерального введения, их можно формулировать для внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного введения или прямой доставки в орган- или ткань-мишень инъекцией, инфузией или другими способами доставки.
Фармацевтические лекарственные формы для перорального введения включают таблетки, капсулы, небольшие капсулы, пилюли, лозенджиз, сиропы, растворы, спреи, порошки, гранулы, эликсиры и суспензии, сублингвальные таблетки, спреи, облатки или пластыри, и буккальные пластыри.
Фармацевтические композиции, содержащие производные дигидротетрабеназина по изобретению, можно формулировать согласно известным способам, см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.
Так, таблетки могут содержать разовую лекарственную форму активного соединения вместе с инертным разбавителем или носителем, таким как сахар или сахарный спирт, например лактоза, сахароза, сорбит или маннит; и/или разбавителем, не относящимся к сахару, таким как карбонат натрия, фосфат кальция, тальк, карбонат кальция или целлюлоза или ее производное, такое как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, и крахмалы, такие как кукурузный крахмал. Таблетки могут также содержать такие обычные ингредиенты, как связующие и гранулирующие вещества, такие как поливинилпирролидон, разрыхлители (например, набухающие, поперечно-сшитые полимеры, такие как поперечно-сшитая карбоксиметилцеллюлоза), связующие вещества (например, стеараты), консерванты (например, парабены), антиоксиданты (например, ВНТ), забуферивающие вещества (например, фосфатный или цитратный буферы) и вспенивающие вещества, такие как смеси цитрат/бикарбонат. Такие наполнители являются хорошо известными и не нуждаются в подробном обсуждении.
Капсулы могут быть твердыми желатиновыми или мягкими желатиновыми капсулами и могут содержать активный компонент в твердой, полутвердой или жидкой форме. Желатиновые капсулы можно приготовить из желатина животного происхождения или его равноценных вариантов синтетического или растительного происхождения.
ТМ
Твердые лекарственные формы (например, таблетки, капсулы и т.д.) могут быть покрытыми или не покрытыми оболочкой, но как правило, они имеют оболочку, например защитную пленочную оболочку (например, из воска или лака) или оболочку для контролируемого высвобождения. Можно сконструировать оболочку (например, из полимера Eudragit) для высвобождения активного компонента в желаемом месте в желудочно-кишечном тракте. Так, можно выбрать оболочку с деградацией при определенных значениях рН в желудочно-кишечном тракте, тем самым с избирательным высвобождением соединения в желудке или подвздошной или двенадцатиперстной кишке.
Вместо или в дополнение к оболочке лекарственный препарат может находиться в твердом матриксе, содержащем вещество для контролируемого высвобождения, например вещество для замедленного высвобождения, которое может быть адаптировано для избирательного высвобождения соединения в условиях с различной кислотностью или щелочностью в желудочно-кишечном тракте. Альтернативно вещества матрикса или оболочки для замедленного высвобождения могут иметь форму расщепляемого полимера (например, полимера ангидрида малеиновой кислоты), который в основном непрерывно расщепляется по мере прохождения лекарственной формы через желудочно-кишечный тракт.
Композиции для местного применения включают мази, крема, спреи, пластыри, гели, жидкие капли и вставки (например, внутриглазные вставки). Такие композиции можно формулировать известными способами.
Как правило, композиции для парентерального введения представлены в виде стерильных водных или масляных растворов или тонких суспензий, или их можно приготовить в виде мелко измельченного стерильного порошка для восстановления стерильной водой для инъекций экстемпоро.
Примеры лекарственных форм для ректального или интравагинального введения включают вагинальные свечи и суппозитории, которые можно приготовить, например, из имеющего определенную форму, отлитого или воскообразного материала, содержащего активное вещество.
Композиции для ингаляционного введения могут иметь форму порошка для ингаляций или жидких или порошкообразных спреев, и их можно вводить в обычной форме с использованием ингаляторов для порошков или дозирующих устройств для аэрозолей. Такие устройства являются хорошо известными. Для ингаляционного введения, как правило, порошкообразные композиции содержат активное соединение вместе с инертным твердым порошкообразным разбавителем, таким как лактоза.
Обычно соединения по изобретению находятся в разовой лекарственной форме и, в таком случае, как правило, содержат достаточное количество соединения для обеспечения желаемого уровня проявления биологической активности. Например, композиция, предназначенная для перорального введения, содержит от 2 мг до 200 мг активного ингредиента, чаще всего от 10 мг до 100 мг, например 12,5 мг, 25 мг и 50 мг.
Активное соединение вводят пациенту, нуждающемуся в этом (например, человеку-пациенту или животному-пациенту) в количестве, достаточном для получения терапевтического эффекта.
Субъект, нуждающийся в таком введении, как правило, является пациентом, страдающим или с риском развития пролиферативного заболевания, такого как злокачественное заболевание, или воспалительного заболевания, определенных выше.
Как правило, соединения вводят в количествах, которые являются терапевтически или профилактически пригодными и которые обычно являются нетоксичными. Однако в некоторых ситуациях, в частности в случае лечения злокачественного заболевания, полезный эффект от введения производного дигидротетрабеназина по изобретению может перевешивать недостатки любых токсических эффектов или побочных эффектов, в этом случае считается желательным вводить соединения в количествах, которые ассоциированы со степенью токсичности.
Типичная суточная доза соединения может составлять до 1000 мг в сутки, например она может находиться в пределах от 0,01 мг до 10 мг на кг массы тела, конкретнее от 0,025 мг до 5 мг на кг массы тела, например до 3 мг на кг массы тела, и конкретнее от 0,15 мг до 5 мг на кг массы тела, хотя, если это требуется, можно вводить более высокие или более низкие дозы.
Для лечения злокачественных заболеваний соединения формулы (I) можно вводить в виде одного лекарственного средства или их можно вводить в виде комбинированной терапии с одним или более препаратом для лечения конкретного заболевания, например злокачественного заболевания, определенного выше. Примеры таких лекарственных препаратов и способов, которые можно использовать или вводить вместе (независимо от того, одновременно или в различные интервалы времени) с соединением формулы (I), включают, но не ограничиваются этим
• ингибиторы топоизомеразы I (например, препараты камптотецина, такие как топотекан (гикамтин), иринотекан и СРТ11 (камптосар);
• антиметаболиты (например, противоопухолевые нуклеозиды, такие как 5-фторурацил, гемцитабин (гемзар), ралтитрексед (томудекс), капецитабин (кселода), пеметрексед (алимта), цитарабин или цитозин арабинозид, или арабинозилцитозин [АраС] (Cytosar), метотрексат (матрекс), флударабин (флудара) и тегафур;
• средства с действием против тубулина (например, алкалоиды растения барвинок розовый, винбластин и препараты таксана, такие как винкристин (онковин), винорелбин (навелбин), винбластин (велбе), паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотере);
• препараты, связывающиеся с ДНК, и ингибиторы топоизомеразы II (например, производные подофиллотоксина и производные антрациклина, такие как этопозид (эпозин, этофос, вепезид, VP-16), тенипозид (вумон), даунорубицин (церубидин, ДауноКсом), эпирубицин (фарморубицин), доксорубицин (адриамицин; доксил; рубекс), идарубицин (заведос), пэгилированный липосомальный доксорубицин гидрохлорид (каеилкс), липосомальный инкапсулированный доксорубицин цитрат (миосет), митоксантрон (новатрон, онкотрон);
• алкилирующие агенты (например, алкилирующие агенты на основе азотистых ипритов или нитрозомочевины и азиридины, такие как циклофосфамид (эндоксана), мелфалан (алкеран), хлорамбуцил (лейкеран), бусульфан (милеран), кармустин (BiCNU), ломустин (ССNU), ифосфамид (митоксана), митомицин (митомицин С Киома);
• алкилирующие агенты (например, соединения платины, такие как цисплатин, карбоплатин (параплатин) и оксалиплатин (элоксатин);
• моноклональные антитела (например, семейство EGF и его рецепторы, и семейство VEGF и его рецепторы, конкретнее трастузумаб (герцептин), цетуксимаб (эрбитукс), ритуксимаб (мабтера), тозитумомаб (бекксар), гемтузумаб озогамицин (милотарг) и бевацизумаб (авастин);
• антигормональные средства (например, антиандрогены, включая антиэстрогены) (например, ингибиторы ароматазы), такие как тамоксифен (нолвадекс D, солтамокс, тамофен), фулвестрант (фаслодекс), ралоксифен (эвиста), торемифен (фарестон), дролоксифен, летразол (фемара), анастразол (аримидекс), эксеместан (аромазин), ворозол (ривизор), бикалутамид (казодекс, козудекс), лупролид (золадекс), мегестрол ацетат (мегаце), аминоглутетимид (цитадрен) и бексаротен (таргретин);
• ингибиторы передачи сигналов (такие как гефитиниб (иресса), иматиниб (гливек), эрлотиниб (тарцева) и целекоксиб (целебрекс);
• ингибиторы протеасом, такие как бортезимиб (велкаде);
• ингибиторы метилтрансферазы ДНК, такие как темозоломид (темодар);
• цитокины и ретиноиды, такие как интерферон альфа (интронА, роферон-А), интерлейкин-2 (алдеслейкин, пролейкин) и полностью транс-ретиноевая кислота [ATRA] или третиноин (везаноид);
• лучевая терапия.
В тех случаях, когда соединения по изобретению вводят вместе с другими терапевтическими средствами или терапевтическими способами в комбинированной терапии, то два или более препарата можно вводить по индивидуально различающимся схемам введения доз и различными путями.
Когда соединение по изобретению вводят в комбинированной терапии с одним или более другими терапевтическими средствами, то соединения можно вводить одновременно или последовательно. При последовательном введении их можно вводить с максимально приближенными интервалами времени (например, в течение 5-10 мин) или с большими интервалами времени (например, спустя 1, 2, 3, 4 и более часов или даже, если требуется, спустя более длинные интервалы времени), где точная схема введения согласуется со свойствами лекарственного препарата(ов).
Соединения по изобретению также можно вводить в сочетании с видами лечения, отличными от химиотерапии, такими как лучевая терапия, фотодинамическая терапия, генная терапия; хирургическая операция и контролируемые диеты.
Для применения в комбинированной терапии с другим химиотерапевтическим препаратом соединение по изобретению и один, два, три, четыре или более других лекарственных препаратов можно, например, формулировать вместе в одной лекарственной форме, содержащей два, три, четыре или более лекарственных препаратов. Альтернативно, отдельные лекарственные препараты можно формулировать по отдельности и представить в виде набора, необязательно с инструкциями по применению.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию TNFα моноцитами.
На фиг.2 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию IL-4 моноцитами.
На фиг.3 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию IL-2 человеческими моноцитами.
На фиг.4 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию IL-5 человеческими моноцитами.
На фиг.5 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию IL-10 человеческими моноцитами.
На фиг.6 показано влияние соединений по изобретению, изомера В (RU350) и изомера D (RU356), на продукцию IL-12 человеческими моноцитами.
ПРИМЕРЫ
Последующие не ограничивающие примеры иллюстрируют синтез и свойства производных дигидротетрабеназина по изобретению.
Пример 1
Получение 2S,3S,11bR- и 2R,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
1А. Восстановление RR/SS-тетрабеназина
1М раствор L-селектрида в тетрагидрофуране (135 мл, 135 ммоль, 2,87 экв.) медленно добавляли в течение 30 мин к перемешиваемому раствору RR/SS-рацемата тетрабеназина (15 г, 47 ммоль) в смеси этанола (75 мл) и тетрагидрофурана (75 мл) при 0°С. После окончания добавления смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и затем давали подогреться до комнатной температуры.
Смесь выливали на измельченный лед (300 г) и добавляли воду (100 мл). Раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (2×200 мл) и объединенные эфирные экстракты промывали водой (100 мл) и частично высушивали над безводным карбонатом калия. Высушивание завершали с использованием безводного сульфата магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении (защита от света, температура бани <20°С) с получением бледно-желтого твердого вещества.
Твердое вещество суспендировали в петролейном эфире (30-40°С) и фильтровали с получением белого порошкообразного твердого вещества (12 г, 80%).
1В. Дегидратация восстановленного тетрабеназина
Пентахлорид фосфора (32,8 г, 157,5 ммоль, 2,5 экв.) добавляли порциями в течение 30 мин к перемешиваемому раствору продукта, восстановленного тетрабеназина из примера 1А (20 г, 62,7 ммоль), в дихлометане (200 мл) при 0°С. После окончания добавления смесь перемешивали при 0°С еще в течение 30 мин и раствор медленно выливали в 2М водный раствор карбоната натрия, содержащего измельченный лед (0°С). После окончания первоначального выделения газа смесь подщелачивали (примерно до рН 12) с использованием твердого карбоната натрия.
Щелочной раствор экстрагировали с использованием этилацетата (800 мл) и объединенные органические экстракты высушивали над безводным сульфатом магния. После фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении с получением коричневого масла, которое очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния, этилацетат) с получением полуочищенного алкена в виде желтого твердого вещества (10,87 г, 58%).
1С. Гидратация неочищенного алкена, полученного в примере 1В
Раствор неочищенного алкена (10,87 г, 36,11 ммоль) из примера 1В в сухом ТГФ (52 мл) обрабатывали при комнатной температуре 1М раствором комплекса боран-ТГФ (155,6 мл, 155,6 ммоль, 4,30 экв.) при добавлении по каплям. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, добавляли воду (20 мл) и раствор подщелачивали до рН 12 30% водным раствором гидроксида натрия.
Водный 30% раствор перекиси водорода (30 мл) добавляли к перемешиваемой реакционной смеси с щелочным рН и раствор нагревали до кипения в течение 1 ч перед охлаждением. Добавляли воду (100 мл) и смесь экстрагировали этилацетатом (3×250 мл). Органические экстракты объединяли и высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении с получением желтого масла (9 г).
-1
Масло очищали с использованием препаративной ВЭЖХ (колонка: Lichrospher Si60, 5 мкм, 250×21,20 мм, подвижная фаза: смесь гексан:этанол:дихлорметан (85:15:5); УФ 254 нм, скорость потока: 10 мл мин) при нанесении 350 мг с последующим концентрированием интересующих фракций в вакууме. Затем масляный продукт растворяли в диэтиловом эфире и вновь концентрировали в вакууме с получением рацемата дигидротетрабеназина, представленного выше, в виде желтой пены (5,76 г, 50%).
1D. Получение сложных эфиров Мошера
R-(+)-α-Метокси-α-трифторметилфенилуксусную кислоту (5 г, 21,35 ммоль), оксалилхлорид (2,02 мл) и ДМФА (0,16 мл) добавляли к безводному дихлорметану (50 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Раствор концентрировали при пониженном давлении и остаток вновь переводили в безводный дихлометан (50 мл). Полученный раствор охлаждали с использованием бани со смесью лед-вода и добавляли диметиламинопиридин (3,83 г, 31,34 ммоль) с последующим добавлением предварительно высушенного раствора (над ситами 4Е) в безводном дихлометане твердого продукта из примера 1С (5 г, 15,6 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 45 мин добавляли воду (234 мл) и смесь экстрагировали диэтиловым эфиром (2×200 мл). Экстракт в диэтиловом эфире высушивали над безводным сульфатом магния, пропускали через слой диоксида кремния и продукт элюировали диэтиловым эфиром.
Собранный эфирный элюат концентрировали при пониженном давлении с получением масла, которое очищали с использованием колоночной хроматографии (диоксид кремния, смесь гексан:диэтиловый эфир (10:1)). Выпаривание собранных с колонки интересующих фракций и удаление растворителя при пониженном давлении давали твердое вещество, которое дополнительно очищали с использованием колоночной хроматографии (диоксид кремния, смесь гексан:этилацетат (1:1)) с получением трех основных компонентов, которые частично разделялись в пики 1 и 2 сложных эфиров Мошера.
-1
Препаративная ВЭЖХ трех компонентов (колонка: 2×Lichrospher Si60, 5 мкм, 250×21,20 мм, подвижная фаза: смесь гексан:изопропанол (97:3); УФ 254 нм, скорость потока: 10 мл·мин) при нанесении 300 мг с последующим концентрированием интересующих фракций в вакууме давали очищенные производные сложных эфиров Мошера.
Пик 1 (3,89 г, 46,5%)
Пик 2 (2,78 г, 33%)
Фракции, соответствующие двум пикам, подвергали гидролизу с выделением отдельных изомеров дигидротетрабеназина, идентифицированных и охарактеризованных как изомеры А и В. Полагают, что каждый из изомеров А и В имеет одну из следующих формул
Конкретнее, полагают, что изомер В имеет абсолютную 2S,3S,11bR-конфигурацию, основываясь на данных рентгеновской кристаллографии, описанных в примере 4 ниже.
1Е. Гидролиз пика 1 с получением изомера А
Водный 20% раствор гидроксида натрия (87,5 мл) добавляли к раствору пика 1 сложного эфира Мошера (3,89 г, 7,27 ммоль) в метаноле (260 мл) и смесь перемешивали и нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 150 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли воду (200 мл) и раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (600 мл), высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования концентрировали при пониженном давлении.
Остаток растворяли с использованием этилацетата (200 мл), раствор промывали водой (2×50 мл), органическую фазу высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования концентрировали при пониженном давлении с получением желтой пены. Данное вещество очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния, градиентное элюирование от смеси этилацетат:гексан (1:1) до этилацетата). Интересующие фракции объединяли и растворитель удаляли в вакууме при пониженном давлении. Остаток переводили в диэтиловый эфир и растворитель еще раз удаляли при пониженном давлении с получением изомера А в виде не совсем белой пены (1,1 г, 47%).
1
13
Изомер А, который, как полагают, имеет 2R,3R,11bS-конфигурацию (абсолютная стереохимия не установлена), был охарактеризован Н-ЯМР, С-ЯМР, ИК, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и ORD. Данные по ИК, ЯМР и МС для изомера А представлены в таблице 1 и данные по хиральной ВЭЖХ и ORD приведены в таблице 3.
1F. Гидролиз пика 2 с получением изомера В
Водный 20% раствор гидроксида натрия (62,5 мл) добавляли к раствору пика 2 сложного эфира Мошера (2,78 г, 5,19 ммоль) в метаноле (185 мл) и смесь перемешивали и нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 150 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли воду (142 мл) и раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (440 мл), высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования концентрировали при пониженном давлении.
Остаток растворяли с использованием этилацетата (200 мл), раствор промывали водой (2×50 мл), органическую фазу высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли петролейный эфир (30-40°С) и раствор концентрировали в вакууме с получением изомера В в виде белой пены (1,34 г, 81%).
1
13
Изомер В, который, как полагают, имеет 2S,3S,11bR-конфигурацию, был охарактеризован Н-ЯМР, С-ЯМР, ИК, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ, ORD и рентгеновской кристаллографией. Данные по ИК, ЯМР и МС для изомера В представлены в таблице 1 и данные по хиральной ВЭЖХ и ORD приведены в таблице 3. Результаты рентгеновской кристаллографии приведены в таблице 4.
Пример 2
Получение 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
2А. Получение 2,3-дегидротетрабеназина
5
Раствор, содержащий рацемическую смесь (15 г, 47 ммоль) RR- и SS-энантиомеров тетрабеназина в тетрагидрофуране, подвергали восстановлению с использованием L-селектрида, следуя способу примера 1А, с получением смеси 2S,3R,11bR- и 2R,3S,11bS-энантиомеров дигидротетрабеназина в виде белого порошкообразного твердого вещества (12 г, 80%). Затем частично очищенный дигидротетрабеназин подвергали дегидратации с использованием PCl, следуя способу примера 1В, с получением полуочищенной смеси 11bR- и 11bS-изомеров 2,3-дигидротетрабеназина (11bR-энантиомера, который представлен ниже) в виде желтого твердого вещества (12,92 г, 68%).
2В. Эпоксидирование неочищенного алкена, полученного в примере 2А
К перемешиваемому раствору неочищенного алкена, полученного в примере 2А (12,92 г, 42,9 ммоль), в метаноле (215 мл) добавляли 70% раствор перхлорной кислоты (3,70 мл, 43 ммоль) в метаноле (215 мл). К реакционной смеси добавляли 77% раствор 3-хлорпероксибензойной кислоты (15,50 г, 65 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре, защищая от света.
Реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор сульфита натрия (200 мл) и добавляли воду (200 мл). К полученной эмульсии добавляли хлороформ (300 мл) и смесь подщелачивали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (400 мл).
Собирали органический слой и водную фазу промывали дополнительным количеством хлороформа (2×150 мл). Объединенные хлороформные слои высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении с получением коричневого масла (14,35 г, выход >100% - возможно, в продукте остается растворитель). Данное вещество использовали без дополнительной очистки.
2С. Восстановительное раскрытие цикла эпоксида, полученного в примере 2В
Перемешиваемый раствор неочищенного эпоксида из примера 2В (14,35 г, 42,9 ммоль; с учетом 100% выхода) в сухом ТГФ (80 мл) медленно обрабатывали 1М раствором комплекса боран/ТГФ (184,6 мл, 184,6 ммоль) в течение 15 мин. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, добавляли воду (65 мл) и раствор нагревали при перемешивании до кипения с обратным холодильником в течение 30 мин.
После охлаждения к реакционной смеси добавляли 30% раствор гидроксида натрия (97 мл) с последующим добавлением 30% раствора перекиси водорода (48,6 мл) и реакционную смесь перемешивали и нагревали до кипения с обратным холодильником еще в течение 1 ч.
Охлажденную реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (500 мл), высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении с получением масла. К маслу добавляли гексан (230 мл) и раствор вновь концентрировали при пониженном давлении.
Маслянистый остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния, этилацетат). Интересующие фракции объединяли и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток еще раз очищали с использованием колоночной хроматографии (диоксид кремния, градиент, от гексана до диэтилового эфира). Интересующие фракции объединяли и растворители выпаривали при пониженном давлении с получением бледно-желтого твердого вещества (5,18 г, 38%).
2D. Получение сложных эфиров Мошера 2R,3S,11bR- и 2S,3R,11bS-изомеров дигидротетрабеназина
R-(+)-α-метокси-α-трифторметилфенилуксусную кислоту (4,68 г, 19,98 ммоль), оксалилхлорид (1,90 мл) и ДМФА (0,13 мл) добавляли к безводному дихлорметану (46 мл) и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин. Раствор концентрировали при пониженном давлении и остаток вновь переводили в безводный дихлометан (40 мл). Полученный раствор охлаждали с использованием бани со смесью лед-вода и добавляли диметиламинопиридин (3,65 г, 29,87 ммоль) с последующим добавлением предварительно высушенного раствора (над ситами 4Е) в безводном дихлометане (20 мл) твердого продукта из примера 2С (4,68 г, 14,6 ммоль). После перемешивания в течение 45 мин добавляли воду (234 мл) и смесь экстрагировали диэтиловым эфиром (2×200 мл). Экстракт в диэтиловом эфире высушивали над безводным сульфатом магния, пропускали через слой диоксида кремния и продукт элюировали диэтиловым эфиром.
Собранный эфирный элюат концентрировали при пониженном давлении с получением масла, которое очищали с использованием колоночной хроматографии (диоксид кремния, смесь гексан:диэтиловый эфир (1:1)). Выпаривание собранных с колонки интересующих фракций и удаление растворителя при пониженном давлении давали розовое твердое вещество (6,53 г).
-1
Препаративная ВЭЖХ твердого вещества (колонка: 2×Lichrospher Si60, 5 мкм, 250×21,20 мм, подвижная фаза: смесь гексан:изопропанол (97:3); УФ 254 нм, скорость потока: 10 мл·мин) при нанесении 100 мг с последующим концентрированием интересующих фракций в вакууме давали твердое вещество, которое суспендировали в петролейном эфире (30-40°С) и собирали фильтрованием с получением чистых сложных эфиров Мошера.
Пик 1 (2,37 г, 30%)
Пик 2 (2,42 г, 30%)
Фракции, соответствующие двум пикам, подвергали гидролизу с выделением отдельных изомеров дигидротетрабеназина, идентифицированных и охарактеризованных как изомеры C и D. Полагают, что каждый из изомеров C и D имеет одну из следующих формул:
2F. Гидролиз пика 1 с получением изомера C
Водный 20% раствор гидроксида натрия (53 мл) добавляли к перемешиваемому раствору пика 1 сложного эфира Мошера (2,37 г, 4,43 ммоль) в метаноле (158 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 150 мин. После охлаждения к реакционной смеси добавляли воду (88 мл) и полученный раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (576 мл). Органический экстракт высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли этилацетат (200 мл) и раствор промывали водой (2×50 мл). Органический раствор высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении.
Данный остаток обрабатывали петролейным эфиром (30-40°С) и полученное суспендированное твердое вещество собирали фильтрованием. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и вторую порцию суспендированного твердого вещества собирали фильтрованием. Обе порции собранного твердого вещества объединяли и высушивали при пониженном давлении с получением изомера С (1,0 г, 70%).
1
13
Изомер С, который, как полагают, имеет 2R,3S,11bR- или 2S,3R,11bS-конфигурацию (абсолютная стереохимия не установлена), был охарактеризован Н-ЯМР, С-ЯМР, ИК, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и ORD. Данные по ИК, ЯМР и МС для изомера С представлены в таблице 2 и данные по хиральной ВЭЖХ и ORD приведены в таблице 4.
2G. Гидролиз пика 2 с получением изомера D
Водный 20% раствор гидроксида натрия (53 мл) добавляли к перемешиваемому раствору пика 2 сложного эфира Мошера (2,42 г, 4,52 ммоль) в метаноле (185 мл) и смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 150 мин. После охлаждения к реакционной смеси добавляли воду (88 мл) и полученный раствор экстрагировали диэтиловым эфиром (576 мл). Органический экстракт высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли этилацетат (200 мл) и раствор промывали водой (2×50 мл). Органический раствор высушивали над безводным сульфатом магния и после фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении.
Данный остаток обрабатывали петролейным эфиром (30-40°С) и полученное суспендированное оранжевое твердое вещество собирали фильтрованием. Твердое вещество растворяли в смеси этилацетат:гексан (15:85) и очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния, градиент от смеси этилацетат:гексан (15:85) до этилацетата). Интересующие фракции объединяли и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток суспендировали в петролейном эфире (30-40°С) и полученную суспензию собирали фильтрованием. Собранное твердое вещество высушивали при пониженном давлении с получением изомера D в виде белого твердого вещества (0,93 г, 64%).
1
13
Изомер D, который, как полагают, имеет 2R,3S,11bR- или 2S,3R,11bS-конфигурацию (абсолютная стереохимия не установлена), был охарактеризован Н-ЯМР, С-ЯМР, ИК, масс-спектрометрией, хиральной ВЭЖХ и ORD и рентгеновской кристаллографией. Данные по ИК, ЯМР и МС для изомера D представлены в таблице 2 и данные по хиральной ВЭЖХ и ORD приведены в таблице 4.
1
13
+
В таблицах 1 и 2 приведены данные по инфракрасным спектрам, которые снимали с использованием метода с таблетками KBr. Н-ЯМР-спектры растворов соединений снимали в дейтерированном хлороформе с использованием спектрометра Varian Gemini NMR (200 МГц). С-ЯМР-спектры растворов соединений снимали в дейтерированном хлороформе с использованием спектрометра Varian Gemini NMR (50 МГц). Масс-спектры получали с использованием спектрометра Micromass Platform II (условия ES). В таблицах 3 и 4 приведены результаты оптической вращательной дисперсии, полученные с использованием прибора Optical Activity PolAAr 2001 в растворе метанола при 24°С. Время удерживания при проведении ВЭЖХ определяли с использованием хроматографа для ВЭЖХ НР1050 с УФ-детектированием.
Таблицы 1 и 2 - Данные спектроскопии
<b>Таблица 1</b>
<b>Изомер</b><b>дигидротетрабеназина</b>
<sup>1</sup><b>Н-ЯМР-спектр</b><b>(CDCl</b><sub>3</sub><b>)</b>
<sup>13</sup><b>С-ЯМР-спектр</b><b>(CDCl</b><sub>3</sub><b>)</b>
<b>ИК-спектр</b><b>(твердый KBr)</b>
<b>Масс-спектр</b><b>(ES</b><sup>+</sup><b>)</b>
Изомеры А и В
6,67 δ 1H(с);
147,7δ;
2950 см<sup>-1</sup>;
МН<sup>+</sup>320
6,57 δ 1H(с);
147,6δ;
2928 см<sup>-1</sup>;
3,84 δ 6H(с);
130,5 δ;
2868 см<sup>-1</sup>;
<img file="00000024.tif" he="67" wi="46" img-content="undefined" img-format="tif" />
3,55 δ 1H(ушир.д);
127,6 δ;
2834 см<sup>-1</sup>;
3,08 δ 1H(м);
112,1 δ;
1610 см<sup>-1</sup>;
2,79 δ 2H(м);
108,4 δ;
1511 см<sup>-1</sup>;
2,55 δ 3H(м);
70,5 δ;
1464 см<sup>-1</sup>;
2,17 δ 1H(м);
57,5 δ;
1364 см<sup>-1</sup>;
1,72 δ 6H(м);
56,5 δ;
1324 см<sup>-1</sup>;
1,02 δ 1H(м);
56,3 δ;
1258 см<sup>-1</sup>;
0,88 δ 6H(т);
54,8 δ;
1223 см<sup>-1</sup>;
53,2 δ;
1208 см<sup>-1</sup>;
40,4 δ;
1144 см<sup>-1</sup>;
40,1 δ;
1045 см<sup>-1</sup>;
36,0 δ;
1006 см<sup>-1</sup>;
28,8 δ;
870 см<sup>-1</sup>;
26,2 δ;
785 см<sup>-1</sup>;
23,7 δ;
764 см<sup>-1</sup>;
22,9 δ;
<b>Таблица 2</b>
<b>Изомер</b><b>дигидротетрабеназина</b>
<sup>1</sup><b>Н-ЯМР-спектр</b><b>(CDCl</b><sub>3</sub><b>)</b>
<sup>13</sup><b>С-ЯМР-спектр</b><b>(CDCl</b><sub>3</sub><b>)</b>
<b>ИК-спектр</b><b>(твердый KBr)</b>
<b>Масс-спектр</b><b>(ES</b><sup>+</sup><b>)</b>
Изомеры C и D
6,68 δ 1H (с);
147,8 δ;
3370 см<sup>-1</sup>;
МН<sup>+</sup>320
6,58 δ 1H (с);
147,7 δ;
2950 см<sup>-1</sup>;
3,92 δ 1H (м);
130,4 δ;
2929 см<sup>-1</sup>;
<img file="00000025.tif" he="73" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
3,84 δ 6H (с);
127,2 δ;
1611 см<sup>-1</sup>;
3,15 δ 1H (м);
112,0 δ;
1512 см<sup>-1</sup>;
2,87 δ 3H (м);
108,3 δ;
1463 см<sup>-1</sup>;
2,43 δ 4H (м);
72,4 δ;
1362 см<sup>-1</sup>;
1,81 δ 1H (м);
61,2 δ;
1334 см<sup>-1</sup>;
1,64 δ 4H (м);
58,3 δ;
1259 см<sup>-1</sup>;
1,21 δ 1H (м);
56,5 δ;
1227 см<sup>-1</sup>;
0,94 δ 3H (д);
56,3 δ;
1148 см<sup>-1</sup>;
0,89 δ 3Н (д)
52,7 δ;
1063 см<sup>-1</sup>;
38,6 δ;
1024 см<sup>-1</sup>;
36,7 δ;
885 см<sup>-1</sup>;
34,4 δ;
766 см<sup>-1</sup>;
29,6 δ;
26,5 δ;
24,4 δ;
22,5 δ;
Таблицы 3 и 4 - Данные спектроскопии и ORD
<b>Таблица 3</b>
<b>Изомер</b><b>дигидротетрабеназина</b>
<b>Методы хиральной ВЭЖХ и</b><b>время удерживания</b>
<b>ORD</b><b>(MeOH, 21°С)</b>
Изомеры А и В
Колонка:
Изомер А
<img file="00000026.tif" he="76" wi="47" img-content="undefined" img-format="tif" />
Chirex (S)-VAL, (R)-NEA, 250×4,6 мм
[α<sub>D</sub>]-114,6°
Подвижная фаза: смесь гексан:1,2-дихлорэтан:этанол (36:62:2)
Скорость потока:1,0 мл мин<sup>-1</sup>
Изомер В
УФ: 254 нм
[α<sub>D</sub>]+123°
Время удерживания:
Изомер А 16,6 мин
Изомер В 15,3 мин
<b>Таблица 4</b>
<b>Изомер дигидротетрабеназина</b>
<b>Методы хиральной ВЭЖХ и время удерживания</b>
<b>ORD</b><b>(MeOH, 21°С)</b>
Изомеры С и D
Колонка:
Изомер C
<img file="00000027.tif" he="75" wi="51" img-content="undefined" img-format="tif" />
Chirex (S)-VAL, (R)-NEA, 250×4,6 мм
[α<sub>D</sub>]+150,9°
Подвижная фаза: смесь гексан:этанол (92:8)
Скорость потока:1,0 мл·мин<sup>-1</sup>
Изомер D
УФ: 254 нм
[α<sub>D</sub>]-145,7°
Время удерживания:
Изомер C 20,3 мин
Изомер D 19,4 мин
Пример 3
Альтернативный способ получения изомера В и получение мезилата
3А. Восстановление RR/SS-тетрабеназина
1М раствор L-Селектрида в тетрагидрофуране (52 мл, 52 ммоль, 1,1 экв.) медленно добавляли в течение 30 мин к охлажденному (на ледяной бане), перемешиваемому раствору рацемата тетрабеназина (15 г, 47 ммоль) в тетрагидрофуране (56 мл). После окончания добавления смеси давали подогреться до комнатной температуры и перемешивали еще в течение шести часов. Анализ ТСХ (диоксид кремния, этилацетат) указывал на наличие только очень небольших количеств оставшегося исходного вещества.
Смесь выливали на перемешиваемую смесь из измельченного льда (112 г), воды (56 мл) и ледяной уксусной кислоты (12,2 г). Полученный желтый раствор промывали диэтиловым эфиром (2×50 мл) и подщелачивали медленным добавлением твердого карбоната натрия (примерно 13 г). К смеси добавляли петролейный эфир (30-40°С) (56 мл) при перемешивании и неочищенный β-DHTBZ собирали фильтрованием в виде белого твердого вещества.
Неочищенное твердое вещество растворяли в дихлорметане (примерно 150 мл) и полученный раствор промывали водой (40 мл), высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении до объема примерно 40 мл. Образовывалась густая суспензия. Добавляли петролейный эфир (30-40°С) (56 мл) и суспензию перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Продукт собирали фильтрованием и промывали на фильтре до получения белоснежного цвета с использованием петролейного эфира (30-40°С) (40-60 мл) перед высушиванием на воздухе при комнатной температуре с получением β-DHTBZ (10,1 г, 67%) в виде белого твердого вещества. Данные анализа ТСХ (диоксид кремния, этилацетат) указывали на присутствие только одного компонента.
3В. Получение и фракционированная кристаллизация соли камфорсульфоновой кислоты рацемата β-DHTBZ
Продукт из примера 3А и 1 экв. S-(+)-камфор-10-сульфоновой кислоты растворяли при нагревании в минимальном количестве метанола. Полученному раствору давали охладиться и затем медленно разбавляли диэтиловым эфиром до полного окончания образования полученного твердого осадка. Полученное твердое белое кристаллическое вещество собирали фильтрованием и промывали диэтиловым эфиром перед высушиванием.
Соль камфорсульфоновой кислоты (10 г) растворяли в смеси горячего абсолютного этанола (170 мл) и метанола (30 мл). Полученный раствор перемешивали и давали охладиться. Через 2 ч образовавшийся осадок собирали фильтрованием в виде белого кристаллического твердого вещества (2,9 г). Пробу кристаллического вещества встряхивали в делительной воронке с избытком насыщенного водного раствора карбоната натрия и дихлорметаном. Органическую фазу отделяли, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в петролейном эфире (30-40°С) и органический раствор концентрировали еще раз. Данные анализа соли хиральной ВЭЖХ с использованием колонки Chirex (S)-VAL и (R)-NEA 250×4,6 мм и смеси гексан:этанол (98:2) в качестве элюента при скорости потока 1 мл/мин показывали, что выделенный β-DHTBZ обогащен одним энантиомером (е.е. примерно 80%).
Обогащенную соль камфорсульфоновой кислоты (14 г) растворяли в горячем абсолютном этаноле (140 мл) и добавляли пропан-2-ол (420 мл). Полученный раствор перемешивали и в течение 1 мин начинал выпадать осадок. Смеси давали охладиться до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Выпавший осадок собирали фильтрованием, промывали диэтиловым эфиром и высушивали с получением белого кристаллического твердого вещества (12 г).
Кристаллическое вещество встряхивали в делительной воронке с избытком насыщенного водного раствора карбоната натрия и дихлорметаном. Органическую фазу отделяли, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в петролейном эфире (30-40°С) и органический раствор концентрировали еще раз с получением (после высушивания в вакууме) (+)-β-DHTBZ (6,6 г, ORD +107,8°). Выделенный энантиомер имел е.е. >97%.
3С. Получение изомера В
Раствор пентахлорида фосфора (4,5 г, 21,6 ммоль, 1,05 экв.) в дихлорметане (55 мл) непрерывно добавляли в течение 10 мин к перемешиваемому, охлажденному (на ледяной бане) раствору продукта из примера 3В (6,6 г, 20,6 ммоль) в дихлометане (90 мл). После окончания добавления полученный желтый раствор перемешивали еще в течение 10 мин перед тем, как вылить в быстро перемешиваемую смесь карбоната натрия (15 г) в воде (90 мл) и измельченного льда (90 г). Смесь перемешивали еще в течение 10 мин и переносили в делительную воронку.
После разделения фаз коричневый дихлорметановый слой удаляли, высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением промежуточного продукта неочищенного алкена в виде коричневого масла (примерно 6,7 г). Данные анализа ТСХ (диоксид кремния, этилацетат) указывали на отсутствие (+)-β-DHTBZ в неочищенном продукте.
Неочищенный алкен переводили (в атмосфере сухого азота) в безводный тетрагидрофуран (40 мл) и добавляли раствор борана в ТГФ (1М раствор, 2,5 экв., 52 мл) при перемешивании в течение 15 мин. Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Данные анализа ТСХ (диоксид кремния, этилацетат) указывали на отсутствие промежуточного продукта алкена в реакционной смеси.
Раствор гидроксида натрия (3,7 г) в воде (10 мл) добавляли к перемешиваемой реакционной смеси с последующим добавлением водного раствора перекиси водорода (50% раствор, примерно 7 мл) и образовавшуюся двухфазную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 1 ч. В это время данные анализа органической фазы ТСХ (диоксид кремния, этилацетат) указывали на появление продукта с предполагаемым значением Rf, соответствующим изомеру В. Также обнаруживался характерный неполярный компонент.
Реакционной смеси давали охладиться до комнатной температуры и переносили в делительную воронку. Верхний органический слой удаляли и концентрировали при пониженном давлении с удалением большей части ТГФ. Остаток переводили в диэтиловый эфир (стабилизированный (ВНТ), 75 мл), промывали водой (40 мл), высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением бледно-желтого масла (8,1 г).
Желтое масло очищали с использованием колоночной хроматографии (диоксид кремния, смесь этилацетат:гексан (80:20) с увеличением содержания этилацетата до 100%) и желаемые фракции с колонки собирали, объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением бледно-желтого масла, которое обрабатывали диэтиловым эфиром (стабилизированным, 18 мл) и концентрировали при пониженном давлении с получением бледно-желтой твердой пены (2,2 г).
Данные хиральной ВЭЖХ с использованием условий, приведенных в примере 3В, подтверждали, что изомер В получали в энантиомерном избытке (е.е.), равном более чем 97%.
D
Оптическое вращение определяли с использованием поляриметра Bellingham Stanley ADP220, и установленное значение составляло [α]+123,5°.
3D. Получение мезилата изомера В
Соль метансульфоновой кислоты изомера В получали растворением смеси 1 экв. изомера В, полученного в примере 3С, и 1 экв. метансульфоновой кислоты в минимальном объеме этанола и затем добавлением диэтилового эфира. Выпавший белый осадок собирали фильтрованием и высушивали в вакууме с получением мезилата с выходом, составляющим примерно 85%, и чистотой (по данным ВЭЖХ) примерно 96%.
Пример 4
Рентгеновская кристаллография изомера В
Получали соль (S)-(+)-камфор-10-сульфоновой кислоты изомера В и один кристалл подвергали рентгеновской кристаллографии в следующих условиях:
дифрактометр: детектор площади Nonius Kappa CCD (сканы t/i и сканы OJ до заполнения асимметричной единицы);
определение ячейки: DirAx (Duisenberg, A.J.M. (1992). J. Appl. Cryst. 25, 92-96);
сбор данных: Collect (Collect: программа Data collection software, R. Hooft, Nonius B. V., 1998);
восстановление данных и обработка ячейки: Demo (Z. Otwinowski & W. Minor, Methods in Enzymology (1997) Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307-326; C.W. Carter, Jr & R.M. Sweet, Eds., Academic Press);
корректировка поглощения: Sheldrick, G.M. SADABS-детектор площади Bruker Nonius и корректировка поглощения - V2.\0;
раствор структуры: SHELXS97 (G.M. Sheldrick, Acta Cryst. (1990) А46 467-473);
обработка структуры: SHELXL97 (G.M. Sheldrick (1997), University of Gottingen, Германия);
графика: Cameron - A Molecular Graphics Package (D.M. Watkin, L. Pearce and C.K. Prout, Chemical Crystallography Laboratory, University of Oxford, 1993);
особые детали: все атомы водорода расположены в идеализированных положениях и обработаны с использованием модели, за исключением таковых в группах NH и ОН, которые расположены в другой карте и обработаны с использованием ограничений. Хиральность: NI=R, CI2=S, CI3=S, CI5=S, C21=S, C24=R.
Результаты данных исследований приведены ниже в таблицах A, B, C, D и Е.
В таблицах обозначение RUS0350 относится к изомеру В.
<b>Таблица А</b>
Идентификационный код
<b>2005bdy0585</b><b>(RUS0350)</b>
<img file="00000029.tif" he="51" wi="52" img-content="undefined" img-format="tif" />
Эмпирическая формула
С<sub>29</sub>Н<sub>45</sub>NO<sub>7</sub>S
Молекулярная масса
551,72
Температура
120(2) К
Длина волны
0,71073 Å
Кристаллическая система
орторомбическая
Пространственная группа
Р2<sub>1</sub>2<sub>1</sub>2<sub>1</sub>
Размеры ячейки
<i>а</i>=7,1732(9) Å
<i>b</i>=12,941(2) Å
<i>с</i>=31,025(4) Å
Объем
2880,1(7) Å<sup>3</sup>
<i>Z</i>
4
Плотность (рассчитанная)
1,272 Mg/m<sup>3</sup>
Коэффициент поглощения
0,158 мм<sup>-1</sup>
<i>F(000</i>)
1192
Кристалл
Бесцветная пластинка
Размеры кристалла
0,2×0,2×0,04 мм<sup>3</sup>
<i>Θ</i> пределы сбора данных
3,06-27,37°
Пределы показателей
-8 ≤ h ≤ 9,-16 ≤ <i>k </i>≤16,-36 ≤ <i>l </i>≤ 39
Собранные отражения
36802
Независимые отражения
6326 [R<sub>int</sub>=0,0863]
Полнота до <i>Θ</i> = 27,37°
97,1%
Корректировка поглощения
Полуэмпирическая изэквивалентов
Максимальная и минимальная трансмиссия
0,9937 и 0,9690
Метод обработки
Метод наименьшихплощадей полногоматрикса по F<sup>2</sup>
Данные/ограничения/параметры
6326/1/357
Доброкачественность по F<sup>2</sup>
1,042
Конечные показатели R [F<sup>2</sup> > 2σ(F<sup>2</sup>)]
R1=0,0498,
<i>wR2=0,0967</i>
Показатели R (все данные)
R1=0,0901,
<i>WR2 =0,1108</i>
Абсолютный структурный параметр
0,04(8)
Коэффициент экстинкции
0,0059(7)
Самый крупный пик и отверстие
0,236 и -0,336 е Å<sup>-3</sup>
<b>Таблица В</b><b>Координаты атомов [×10</b><sup>4</sup><b>], эквивалентные изотропные параметры замещения [А</b><sup>2</sup><b>×10</b><sup>3</sup><b>] и факторы мест занятости. U</b><sub>eq</sub><b> определяется как одна треть графика ортогонализированного тензора U</b><sup>jj</sup>
<b>Атом</b>
<b><i>x</i></b>
<b><i>y</i></b>
<b><i>z</i></b>
<b><i>Ueq</i></b>
<b><i>S.o.f.</i></b>
N1
4839(3)
11119(2)
2180(1)
24(1)
1
01
2515(3)
13171(1)
349(1)
31(1)
1
02
5581(3)
14030(1)
598(1)
32(1)
1
03
9220(3)
12834(2)
2385(1)
36(1)
1
C1
870(4)
12674(2)
190(1)
36(1)
1
C2
3176(3)
12838(2)
739(1)
25(1)
1
C3
2346(4)
12109(2)
997(1)
25(1)
1
C4
3124(3)
11821(2)
1395(1)
24(1)
1
C5
4773(3)
12276(2)
1527(1)
23(1)
1
C6
5629(4)
13024(2)
1262(1)
24(1)
1
C7
4861(4)
13308(2)
875(1)
25(1)
1
C8
7189(4)
14582(2)
747(1)
38(1)
1
C9
2182(3)
11023(2)
1673(1)
28(1)
1
C10
2759(3)
11118(2)
2137(1)
26(1)
1
C11
5366(3)
11096(2)
2656(1)
25(1)
1
С12
7292(4)
11536(2)
2747(1)
25(1)
1
С13
7468(4)
12663(2)
2590(1)
25(1)
1
С14
5988(4)
12911(2)
2252(1)
25(1)
1
С15
5773(4)
12010(2)
1943(1)
24(1)
1
С16
7734(4)
11477(2)
3232(1)
28(1)
1
С17
7752(4)
10418(2)
3449(1)
34(1)
1
С18
9198(6)
9696(3)
3249(1)
65(1)
1
С19
8114(4)
10562(2)
3930(1)
41(1)
1
С20
7509(4)
8131(2)
1250(1)
31(1)
1
S1
7409(1)
8792(1)
1754(1)
27(1)
1
04
7758(2)
7965(1)
2064(1)
30(1)
1
05
8831(3)
9582(2)
1760(1)
49(1)
1
06
5524(2)
9221(1)
1798(1)
32(1)
1
07
7406(3)
6932(1)
498(1)
48(1)
1
С21
6858(3)
8622(2)
830(1)
25(1)
1
С22
7154(4)
7851(2)
459(1)
30(1)
1
С23
7073(4)
8450(2)
40(1)
32(1)
1
С24
6648(3)
9544(2)
203(1)
28(1)
1
С25
4742(3)
8877(2)
787(1)
29(1)
1
С26
4742(3)
8877(2)
787(1)
29(1)
1
С27
7773(4)
9610(2)
630(1)
25(1)
1
С28
7431(4)
10628(2)
868(1)
29(1)
1
С29
9895(4)
9489(2)
569(1)
36(1)
1
<b>Таблица С</b><b>Длина связей [А] и углы [°]</b>
N1-C10
1,498(3)
C14-C15
1,518(3)
N1-C15
1,522(3)
C16-C17
1,526(3)
N1-C11
1,524(3)
C17-C18
1,527(4)
01-C2
1,368(3)
C17-C19
1,527(4)
01-C1
1,432(3)
C20-C21
1,525(3)
02-C7
1,369(3)
C20-S1
1,784(2)
02-C8
1,433(3)
S1-05
1,4442(19)
03-C13
1,425(3)
S1-04
1,4607(17)
C2-C3
1,372(3)
S1-06
1,4676(18)
C2-C7
1,417(3)
07-C22
1,208(3)
C3-C4
1,407(3)
C21-C22
1,537(4)
C4-C5
1,384(3)
C21-C26
1,559(3)
C4-C9
1,506(3)
C21-C27
1,565(3)
C5-C6
1,411(3)
C22-C23
1,517(4)
C5-C15
1,516(3)
C23-C24
1,535(4)
C6-C7
1,372(3)
C24-C25
1,548(4)
C9-C10
1,504(3)
C24-C27
1,554(4)
C11-C12
1,521(3)
C25-C26
1,557(4)
C12-C16
1,540(3)
C27-C28
1,529(3)
C12-C13
1,544(3)
C27-C29
1,542(4)
C13-C14
1,524(3)
C10-N1-C15
113,33(19)
C12-C11-N1
113,43(19)
C10-N1-C11
109,46(18)
C11-C12-C16
110,5(2)
C15-N1-C11
111,96(19)
C11-C12-C13
111,7(2)
C2-01-C1
116,6(2)
C16-C12-C13
109,84(19)
C7-02-C8
116,27(19)
03-C13-C14
106,0(2)
01-C2-C3
125,5(2)
03-C13-C12
111,1(2)
01-C2-C7
115,0(2)
C14-C13-C12
111,0(2)
C3-C2-C7
119,5(2)
C15-C14-C13
110,1(2)
C2-C3-C4
121,5(2)
C5-C15-C14
114,3(2)
C5-C4-C3
119,2(2)
C5-C15-N1
112,0(2)
C5-C4-C9
120,3(2)
C14-C15-N1
108,7(2)
C3-C4-C9
120,5(2)
C17-C16-C12
118,4(2)
C4-C5-C6
119,4(2)
C16-C17-C18
112,2(2)
C4-C5-C15
124,1(2)
C16-C17-C19
108,7(2)
C6-C5-C15
116,6(2)
C18-C17-C19
110,8(3)
C7-C6-C5
121,3(2)
C21-C20-S1
122,51(18)
02-C7-C6
125,4(2)
05-S1-04
112,93(11)
02-C7-C2
115,4(2)
05-S1-06
112,47(12)
C6-C7-C2
119,2(2)
04-S1-06
111,93(11)
C10-C9-C4
111,7(2)
05-S1-C20
108,81(13)
N1-C10-C9
111,0(2)
04-S1-C20
102,60(11)
06-S1-C20
107,44(12)
C23-C24-C25
106,4(2)
C20-C21-C22
109,0(2)
C23-C24-C27
103,3(2)
C20-C21-C26
117,3(2)
C25-C24-C27
102,3(2)
C22-C21-C26
102,1(2)
C24-С25-C26
102,9(2)
C20-C21-C27
123,4(2)
C25-C26-C21
104,2(2)
C22-C21-C27
100,21(19)
C28-C27-C29
107,8(2)
C26-C21-C27
101,7(2)
C28-C27-C24
112,0(2)
07-C22-C23
126,4(2)
C29-C27-C24
113,7(2)
07-C22-C21
125,9(2)
C28-C27-C21
116,5(2)
C23-C22-C21
107,7(2)
C29-C27-C21
112,3(2)
C22-C23-C24
101,3(2)
C24-C27-C21
94,27(19)
<b>Таблица Е</b><b>Координаты атомов водорода [×10</b><sup>4</sup><b>] и изотропические параметры замещения [Е</b><sup>2</sup><b>×10</b><sup>3</sup><b>]</b>
<b>Атом</b>
<b><i>x</i></b>
<b><i>y</i></b>
<b><i>z</i></b>
<b><i>U</i></b><sub>eq</sub>
<b><i>S.o.f.</i></b>
H98
5190(40)
10528(15)
2062(10)
70(8)
1
H99
10030(50)
12950(30)
2575(12)
70(8)
1
H1A
1107
11933
156
54
1
H1B
529
12973
-89
54
1
H1C
-154
12777
395
54
1
H3
1220
11793
904
30
1
H6
6760
13337
1353
29
1
H8A
6872
14966
1009
58
1
H8B
7600
15065
523
58
1
H8C
8193
14091
810
58
1
H9A
814
11106
1651
33
1
H9B
2505
10324
1567
33
1
H10A
2250
11767
2259
32
1
H10B
2235
10534
2304
32
1
H11A
4431
11494
2822
30
1
H11B
5322
10372
2759
30
1
H12
8230
11108
2589
30
1
H13
7334
13145
2840
30
1
H14A
4783
13050
2397
30
1
H14B
6354
13538
2090
30
1
H15
7056
11776
1864
29
1
H16A
8973
11796
3278
33
1
H16B
6813
11911
3386
33
1
1 H17
6493
10098
3412
41
1
H18A
8906
9588
2944
97
1
H18B
9176
9031
3400
97
1
H18C
10440
10005
3276
97
1
H19A
9329
10894
3971
62
1
H19B
8110
9887
4073
62
1
H19C
7135
10999
4054
62
1
H20A
8824
7924
1207
37
1
H20B
6787
7484
1286
37
1
H23A
6070
8190
-151
38
1
H23B
8277
8423
-116
38
1
H24
6928
10107
-8
33
1
H25A
3773
9195
153
37
1
H25B
4152
10235
426
37
1
H26A
3994
8237
764
35
1
H26B
4300
9279
1039
35
1
H28A
8160
10638
1135
44
1
1 H28B
6103
10692
936
44
1
H28C
7811
11207
684
44
1
H29A
10358
10042
381
54
1
H29B
10159
8817
436
54
1
H29C
10517
9531
849
54
1
<b>Таблица 6</b><b>Водородные связи [Е и °]</b>
<b><i>D</i>-H···<i>A</i></b>
<b><i>d(D-H)</i></b>
<b><i>d</i>(H···<i>A)</i></b>
<b><i>d</i>(<i>D</i>···<i>A)</i></b>
<b><(<i>D</i>H<i>A</i>)</b>
N1-H98<b>···</b>O6
0,885(10)
1,895(12)
2,773(3)
171(3)
N1-H98<b>···</b>S1
0,885(10)
2,914(14)
3,771(2)
163(3)
O3-H99<b>···</b>O4<sup>i</sup>
0,84(4)
1,94(4)
2,766(3)
165(3)
O3-H99<b>···</b>S1<sup>i</sup>
0,84(4)
2,98(4)
3,811(2)
169(3)
Использованные трансформации симметрии для получения эквивалентных атомов:
(i) -x+2, y+1/2, -z+1/2
Термические эллипсоиды, нарисованные с 30% долей вероятности
На основе данных, представленных выше, полагается, что изомер В имеет 2S,3S,11bR-конфигурацию, которая соответствует формуле (Ia):
Пример 5
Опыты по связыванию с сигма-рецептором
Четыре изомера дигидротетрабеназина A, B, C и D исследовали в тестах специфического связывания для оценки их способности связываться с сигма-1- и сигма-2-рецепторами. Результаты приведены в таблице 5.
(а) Рецептор σ
1
Источник литературы: Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289: 251-260 (1999).
Источник: человеческие клетки jurkat.
Лиганд: 8 нМ [3H] галоперидол.
Растворитель: 1% ДМСО.
Время инкубации/температура: 4 ч при 25°С.
2
4
2
4
Буфер для инкубации: 5 мМ буфер КРО/КНРО, рН 7,5.
Неспецифический лиганд: 10 мкМ галоперидол.
d
К: 5,8 нМ.
max
B: 0,71 пкмоль/мг белка.
Специфическое связывание: 80%.
Количественный метод: связывание радиоактивного лиганда.
Критерий статистической значимости: ≥50% максимальной стимуляции или ингибирования.
(b) Рецептор σ
2
Источник литературы: Hashimoto et al., Eur. J. Pharmacol., 236: 159-163 (1993).
Источник: мозг крыс Вистар.
Лиганд: 3 нМ [3H] ифенпродила.
Растворитель: 1% ДМСО.
Время инкубации/температура: 60 мин при 37°С.
Буфер для инкубации: 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 7,4.
Неспецифический лиганд: 10 мкМ ифенпродила.
d
К: 4,8 нМ.
max
B: 1,3 пкмоль/мг белка.
Специфическое связывание: 85%.
Количественный метод: связывание радиоактивного лиганда.
Критерий статистической значимости: ≥50% максимальной стимуляции или ингибирования.
<b>Таблица 5</b><b>Процент ингибирования специфического связывания с сигма-1- и сигма-2-рецепторами под действием 10 мкМ растворов изомеров дигидротетрабеназина</b>
<b>Рецептор/белок</b>
<b>Изомер А</b>
<b>Изомер В</b>
<b>Изомер С</b>
<b>Изомер D</b>
(g) σ<sub>1</sub>-рецептор
48
82
59
82
(h) σ<sub>2</sub>-рецептор
64
64
61
69
Данные свидетельствуют о том, что все четыре изомера связываются с обоими сигма-1- и сигма-2-рецепторами. Четыре изомера обладают примерно одинаковой способностью к связыванию с сигма-2-рецептором, но изомеры B и D проявляют более сильное связывание с сигма-1-рецептором.
Пример 6
Антипролиферативная активность
Антипролиферативную активность соединений по изобретению можно оценить по способности соединений подавлять рост клеток ряда клеточных линий. Подавление роста клеток определяют с использованием теста с аламаром синим (Nociari M.M., Shalev A., Benias P., Russo C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167). Метод основан на способности живых клеток восстанавливать резазурин до его флуоресцирующего продукта резоруфина. Для постановки каждого теста для оценки пролиферации клетки высевают в 96-луночные планшеты и культивируют в течение 16 ч перед добавлением ингибирующих соединений для последующего культивирования еще в течение 72 ч. В конце инкубационного периода вносят 10% (об./об.) аламар синий и инкубируют еще в течение 6 ч перед определением флуоресцирующего продукта при длинах волн 535 нм экстинкция/590 нм эмиссия. В случае постановки непролиферирующего клеточного теста клетки культивируют до слияния в течение 96 ч перед добавлением ингибирующих соединений для культивирования еще в течение 72 ч. Количество живых клеток определяют с использованием теста с аламаром синим, как описано выше. Все клеточные линии получали из ЕСАСС (Европейской коллекции клеточных культур). Примерами таких клеточных линий являются клеточные линии человеческой нейробластомы SK-N-SH и крысиной глиомы С6.
Пример 7
Определение влияния соединений по изобретению на индуцированную LPS/IFN продукцию цитокинов человеческими моноцитами
Соединения по изобретению тестировали с целью определения того, в какой степени они могут модулировать продукцию цитокинов человеческими моноцитами. Моноциты являются предшественниками макрофагов, и они представляют собой основной источник цитокинов воспаления при широком ряде заболеваний. Следовательно, способность соединений по изобретению ингибировать их продукцию моноцитами является хорошим показателем вероятности того, что соединения обладают противовоспалительной активностью.
Сформировали следующие опытные группы.
<b>Группа</b>
<b>Обработка</b>
A
Неиндуцированные контрольные моноциты
F
Неиндуцированные моноциты + набилон (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
G
Неиндуцированные моноциты + изомер D (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
H
Неиндуцированные моноциты + изомер В (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
I
Одни индуцированные LPS/IFNγ моноциты
N
Индуцированные моноциты + набилон (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
O
Индуцированные моноциты + изомер D (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
P
Индуцированные моноциты + изомер В (100 мкМ/10 мкМ/1 мкМ/100 нМ/10 нМ/1 нМ/100 пкМ/10 пкМ)
Ход анализа
Модуляция продукции цитокинов человеческими моноцитами
Материалы
Буфер MACS: 1×PBS, рН 7,2, 2 мМ ЭДТА (Sigma), 5% человеческий сывороточный AB.
Культуральная среда: 500 мл среды RPMI 1640 (Invitrogen), 5 мл Penstrep (Sigma), 5 мл L-глутамина (Invitrogen), 10 мл HEPES (Sigma), 5% аутологичной плазмы.
Соединения: маточный раствор с концентрацией 10 мМ в абсолютном этаноле.
LPS: Salmonella abortis с концентрацией 1 мг/мл (Sigma, номер по каталогу #L1887).
IFNγ: рекомбинантный человеческий белок с концентрацией 10 мкг/мл (BD Pharmacia, номер по каталогу #554617).
Шарики для позитивного отбора на CD14 MACS и колонки LS (Miltenyi Biotech).
Антитела, меченные ФИТЦ, против CD14 (Miltenyi Biotech).
Светлый слой кровяного сгустка, полученный от Bristol National Blood Services.
6
1 мл крови должен давать в целом 7×10клеток.
Получение аутологичной плазмы
Светлый слой кровяного сгустка центрифугируют при 3500 об./мин в течение 10 мин.
Удаляют верхний слой плазмы крови и инактивируют при нагревании при 56°С в течение 30 мин.
Для удаления белков комплемента, инактивированных при нагревании и тому подобное, центрифугируют при 3500 об/мин в течение 10 мин.
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)
1. Оставшуюся часть светлого слоя кровяного сгустка ресуспендируют в равном объеме среды RPMI 1640 и перемешивают при переворачивании.
2. Предварительно нагретый до комнатной температуры (RT) реактив histopaque (Sigma) добавляют в количестве 10 мл к универсальному раствору.
3. Осторожно наносят 15 мл смеси кровь/среда.
4. Центрифугируют при 1600 об/мин в течение 25 мин при комнатной температуре (без разбивания).
5. РВМС отделяют в виде слоя между средой и реактивом histopaque, переносят клетки в 50 мл Falcon и добавляют 10 мл среды.
6. Центрифугируют при 1800 об/мин при комнатной температуре.
7. Промывают 3 раза 40 мл среды RPMI и ресуспендируют в культуральной среде.
Выделение клеток CD14
позитивным отбором с использованием микрошариков CD14
+
+
Работу проводят на льду, с заранее охлажденными растворами.
4
8
1. Определяют количество клеток (313×10×5×10=1,565×10 клеток в целом).
2. Отбирают 100 мкл пробы клеток для анализа на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACS) (проба перед отбором).
3. Центрифугируют при 1800 об/мин в течение 10 мин при 4°С.
7
4. Осадок после центрифугирования ресуспендируют из расчета 80 мкл буфера на 1×10 клеток (2400 мкл/общее количество клеток).
7
5. Вносят 20 мкл микрошариков CD14 на 1×10 общего количества клеток (400 мкл/общее количество клеток).
6. Тщательно перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при 4-8°С.
7. Промывают клетки 1-2 мл буфера, центрифугируют при 300×g, 10 мин при 4°С. Удаляют супернатант.
8
8. Клетки ресуспендируют из расчета 1×10 клеток в 500 мкл буфера (1 мл/общее количество клеток).
Магнитное разделение с помощью колонки LS
1. Колонку помещают в магнитное поле сепаратора MACS. Промывают колонку 3 мл буфера для проведения MACS.
2. Наносят клеточную суспензию на колонку.
3. Собирают немеченые клетки, которые прошли через колонку. Промывают колонку 3×3 мл буфера, позволяя резервуару колонки полностью освободиться между каждым промыванием. Собирают весь элюат (фракция немеченых клеток).
4. Отделяют колонку от сепаратора и соединяют со сборной пробиркой.
5. Наносят на колонку 5 мл буфера, сразу же промывают фракцию с меченными магнитом клетками с помощью колоночного плунжера.
6. Клетки центрифугируют в буфере для MACS и ресуспендируют клеточный осадок в среде.
7. Определяют количество позитивно отобранных клеток.
4
7
8
71×20×5×10=7,1×10клеток/мл. Будет 1,75 мл ∴ 1,24×10 общего количества клеток.
8. Отбирают пробу для проверки чистоты с использованием FACS - вносят 10 мкл меченных ФИТЦ антител против CD14 и инкубируют в течение 5 мин при 4-8°С.
Подготовка соединений
Готовят раствор соединений с концентрацией 10 мМ в абсолютном этаноле. Разбавляют перед инкубацией в среде для получения необходимых концентраций.
Культивирование клеток
+
6
Выделенные CD14 моноциты культивируют в 24-луночных планшетах с титром 1×10 клеток/мл/лунку. Моноциты культивируют в присутствии тестируемых соединений и контролей при различных разведениях, указанных в таблице ниже. После инкубации в течение ночи вносят LPS (10 мкг/мл) и IFNγ (100 нг/мл) для индукции активации моноцитов и повышения экспрессии СВ2. Через 48 ч супернатанты удаляют для анализа на цитокины СВА.
Анализ цитокинов СВА (набор BenderMedSystems Human Th1/Th2
[Cat # BMS716FF])
Все буферы подогревают до комнатной температуры и перемешивают на вортексе перед применением.
2
1. Готовят буфер для анализа добавлением 450 мл дистиллированной НО и осторожно перемешивают. Хранят при 4°С.
2. Готовят смесь биотин-конъюгат внесением 600 мкл каждой смеси биотин-конъюгат в универсальный раствор.
3. Готовят смесь шариков добавлением 300 мкл каждого вида шариков.
2
4. Восстанавливают каждый стандарт дистиллированной НО, как указано на этикетке флакона. Вносят 100 мкл буфера для анализа в пробирку с меткой стандарт 1. Добавляют 10 мкл каждого восстановленного стандарта и перемешивают. Готовят серийные разведения смеси стандартов (100 мкл буфера для анализа в пробирки 2-7, вносят 50 мкл стандарта 1 в пробирку 2, перемешивают и переносят 50 мкл в пробирку 3 и т.д.).
5. Пробирки метят для проведения FACS и вносят 25 мкл стандартов 1-7 в указанные пробирки. В контрольную пробирку вносят 25 мкл буфера для анализа.
6. Вносят 25 мкл пробы в указанные пробирки для проб.
7. Вносят 25 мкл смеси шариков во все пробирки.
8. Вносят 50 мкл смеси биотин-конъюгат во все пробирки.
9. Перемешивают на вортексе, затем накрывают фольгой и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.
10. Готовят раствор стрептавидин-РЕ смешиванием 176 мкл в 5324 мкл буфера для анализа. Вносят 1 мл буфера для анализа во все пробирки и центрифугируют при 200×g в течение 5 мин. Отделяют супернатант. Повторяют стадию промывки и отделяют супернатант.
11. Добавляют 50 мкл раствора стрептавидин-РЕ во все пробирки. Перемешивают на вортексе, затем накрывают фольгой и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.
12. Повторяют стадию промывания 2 раза.
13. Вносят 500 мкл буфера для анализа во все пробирки.
Установка проточного цитометра
Пропускают позитивные и негативные шарики (имеющиеся в наборе) для оптимизации установки и уравновешивания и т.д. Строят калибровочную кривую перед анализом проб при подсчете 3000 событий на популяции, для которой настроено окно возбуждения (300 событий/анализируемую пробу).
Результаты
Результаты приведены на фиг.1-6. На чертежах обозначение RU348 означает изомер D.
Как следует из данных фиг.1-6, два цис-изомера дигидротетрабеназина В и D приводили к снижению продукции ряда различных цитокинов в моноцитах, которые были индуцированы LPS/IFN.
Так, изомер В снижал продукцию цитокинов IL-2 и IL-12 во всех тестированных концентрациях и снижал продукцию цитокинов IL-4, IL-5 и IL-10 в большинстве тестированных концентраций.
Изомер D снижал продукцию цитокинов IL-2, IL-4, IL-5 и IL-12 во всех тестированных концентрациях и снижал продукцию цитокинов TNFα, IL-4, IL-5 и IL-10 в большинстве тестированных концентраций.
Пример 8
Оценка влияния соединений по изобретению на пролиферацию Т-клеток
Соединения по изобретению тестировали с целью определения того, насколько они могут подавлять пролиферацию Т-клеток. Т-клетки ответственны за координацию адаптивного иммунного ответа и являются регуляторами воспаления при широком ряде заболеваний.
Следовательно, способность соединений по изобретению ингибировать пролиферацию Т-клеток является хорошим показателем вероятности того, что соединения обладают противовоспалительной активностью.
Материалы
HBSS+2% HEPES буфера (500 мл+10мл), альфа-МЕМ (500 мл)+2% HEPES (10 мл)+1% Pen/strep (5 мл)+2% L-глутамина (10 мл)+50 мкМ 2-МЕ (500 мкл) и нормальная мышиная сыворотка (NMS).
Методы
1. Колонки 1-8, ряды А-Н, трех 96-луночных планшетов покрывают 100 мкл антимышиного CD3 в концентрации 1 мкг/мл в PBS. В целом 192 лунки, следовательно, готовят 24 мл реактива в PBS добавлением 17 мкл маточного раствора с концентрацией 1,44 мг/мл. Инкубируют в течение 2 час при 37°С.
2. Отбирают кровь у 2 мышей balb/c сердечной пункцией для получения NMS и переносят селезенки в HBSS+HEPES.
3. Помещают кровь на 30 мин при 37°С для свертывания, центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге с охлаждением. Удаляют сыворотку, стерилизуют фильтрованием и хранят в холодильнике до использования.
4. Переносят селезенки в чашки Петри с 10 мл HBSS, используют чистое стерильное проволочное сито, помещают на него селезенку для отделения клеток с использованием стеклянной палочки. Смывают клетки с сита с использованием пастеровской пипетки и переносят в пробирку емкостью 15 мл. Центрифугируют при 1000 об./мин в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
5. Ресуспендируют клетки, вносят 0,5 мл стерильного DW для лизиса эритроцитов, перемешивают и сразу же разводят HBSS, переносят в пробирку емкостью 50 мл через сито для клеток (70 мкМ) для удаления клеточных дебрисов, центрифугируют, как описано выше, клетки промывают еще раз HBSS и окончательно ресуспендируют в 2 мл альфа-МЕМ с добавками (описанными выше).
4
7
8
6
6. Определяют количество клеток - 252 клеток×2×5×10=2,52×10клеток/мл в 4 мл = 10 клеток в целом. Разводят 2 мл до 25 мл с получением титра клеток, равного 2×10 клеток/мл.
7. Добавляют 250 мкл NMS к клеткам с получением концентрации, равной 1%.
8. Промывают покрытые анти-CD3 планшеты 3 раза PBS.
9. Переносят порции клеток объемом 100 мкл в покрытые лунки, ряды А-Н колонок 1-8 трех 96-луночных планшетов. Добавляют равный объем соединений, разведенных в 96-луночном планшете, как описано ниже.
Соединения
Переносят 3,5 мкл растворов соединения с концентрацией 10 мМ в 346,5 мкл среды (1/100), переносят 35 мкл разведения 1/100 в 315 мкл среды (1/10) и так далее в планшете с получением разведений соединения 1/10. Переносят аликвотные порции объемом 100 мкл различных разведений соединений в лунки трех параллельных планшетов, содержащих Т-клетки.
<b>Набилон</b>
<b>Изомер D</b>
<b>Изомер B</b>
<b>Среда</b>
1/100
100 мкМ
100 мкМ
100 мкМ
1/10
10 мкМ
10 мкМ
10 мкМ
1/10
1 мкМ
1 мкМ
1 мкМ
1/10
100 нМ
100нМ
100 нМ
1/10
10 нМ
10 нМ
10 нМ
1/10
1 нМ
1 нМ
1 нМ
1/10
100 пкМ
100 пкМ
100 пкМ
1/10
10 пкМ
10 пкМ
10 пкМ
3
3
2
Культивируют в течение 48 ч, затем вносят каплю (16 мкл) Н-тимидина в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 37°С в атмосфере 5% СО. Собирают. Определяют включение Н-тимидина.
Результаты
3
Интенсивность пролиферации Т-клеток, о чем свидетельствуют уровни включения Н-тимидина, приведены в таблице ниже.
<b>Пролиферация Т-клеток</b>
<b>Планшет 1</b>
<b>Набилон</b>
<b>RU346</b>
<b>RU350</b>
<b>Среда</b>
A
42
1
37,3
28
36361,9
B
40910,7
94808,1
74,7
42663,8
C
52155,5
55277,3
46179,1
48044,3
D
41607,6
52138
54194,4
53253,6
E
36442
49102,4
53277,2
46372,2
F
37988,7
51285
58924,4
62391,8
G
37202,7
53139,1
46056,3
52016,7
H
38818,1
50602,8
52646,7
64420,5
<b>Планшет 2</b>
<b>Набилон</b>
<b>RU346</b>
<b>RU350</b>
<b>Среда</b>
A
18,7
14
42
68823,2
B
72188,2
1
108341,6
36745,1
51978,8
C
48534,9
66042,8
62557,5
58244,3
D
65222
49013,1
63867,2
62197,1
E
44970,2
55537,9
66290
42555,2
F
36994,3
59320,9
49054,3
58165,6
G
44920,7
47373,7
60937,4
40598,4
H
34530
52070,6
41897,1
42487
<b>Планшет 3</b>
<b>Набилон</b>
<b>RU346</b>
<b>RU350</b>
<b>Среда</b>
A
46,7
18,7
51,4
63111,1
B
78370,5
84079,6
110594,7
51408,2
C
44235,7
123241,3
58812,6
41777,6
D
55348,5
61529
67792,8
79248,8
E
46765,1
57697,5
70736,7
56283,9
F
35152,2
72051,9
74224
68615,4
G
36359,1
74186,6
59965,8
62897,8
H
39295,7
72606,4
57220,4
42878,1
В таблице «RU346» относится к изомеру D и «RU350» относится к изомеру В.
Результаты показывают, что каждое из соединений в самых высоких тестированных концентрациях подавляет пролиферацию Т-клеток.
Пример 9
Фармацевтические композиции
(i) Таблетки - I
Таблетки, содержащие дигидротетрабеназин по изобретению, готовят смешиванием 50 мг дигидротетрабеназина с 197 мг лактозы (BP) в качестве разбавителя, и 3 мг стеарата магния в качестве скользящего вещества и прессуют в таблетки известным способом.
(ii) Таблетки - II
Таблетки, содержащие дигидротетрабеназин по изобретению, готовят смешиванием соединения (25 мг) с оксидом железа, лактозой, стеаратом магния, белым кукурузным крахмалом и тальком и прессуют в таблетки известным способом.
(iii) Капсулы
Капсулы готовят смешиванием 100 мг дигидротетрабеназина по изобретению со 100 мг лактозы и полученную смесь помещают в стандартные непрозрачные твердые желатиновые капсулы.
Эквивалентные варианты
Очевидно, понятно, что могут быть сделаны различные модификации и изменения в отношении конкретных вариантов осуществления, не отступая от принципов, лежащих в основе изобретения. Все такие модификации и изменения предназначаются для включения в данное изобретение.