Полногеномная оценка инбридинга у молочного скота

DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10612 УДК575.174.015

Полногеномная оценка инбридинга у молочного скота*

М. Г. СМАРАГДОВ, А. А. КУДИНОВ

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственньхживотньх - филиал Федерального научного центра животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста, Московское ш., 55а, Санкт-Петербург, 196601, Российская Федерация

Резюме. Современная молекулярная генетика позволяет идентифицировать в геноме животных протяженные гомозиготные районы (ROH), свидетельствующие о наличии близкородственных скрещиваний в родословной. Целью исследования было рассчитать коэффициент инбридинга у коров, исходя из полногеномных ROH-данных голштинизированных черно-пестрых коров из четырех племенных заводов Ленинградской области. Из каждого стада отбирали от 46 до 85 животных, всего 263 головы. ДНК для гено-типирования чипом BovineSNP50 выделяли из крови фенол-хлороформным методом. Критерии редактирования генотипов были следующими: SNPs (Single nucleotide polymorphism - однонуклеотидный полиморфизм) c частотой встречаемости в геноме коров менее 5 % удаляли; генотипы SNPs, не удовлетворяющие распределению Харди-Вайнберга с достоверностью p = 0,0001, удаляли. В результате редактирования из 54609 SNPs осталось 43298. Качество генотипирования (QS) составило 0,99. Выявление ROH в геноме коров осуществляли с использованием пакета программ Plink 1.9. Критерии отбора ROH следующие: рамка сканирования включала 50 SNPs; введен запрет на гетерозиготные SNPs в ROH; число пропущенных SNPs в ROH не более двух. В результате сканирования генома 263 коров среднее число ROH на геном составило от 23 до 25. Средняя длина ROH в геноме коров варьировала от 6729 до 7220 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). При этом суммарная длина ROH у отдельных животных составляла от 24 до 380 м.п.н. (миллионов пар нуклеотидов). Рассчитанный коэффициент инбридинга у отдельных коров варьировал от 1,0 до 15,1 %. Средний коэффициент инбридинга в четырех стадах составлял от 5,5 до 8,0 %. Таким образом, молекулярные показатели на основе rOh позволяют оценить коэффициент инбридинга у коров в стадах, и этот метод следует использовать в селекционной работе. Ключевые слова: ROH, инбридинг, молочный скот, стада.

Сведения об авторах: М. Г Смарагдов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник (e-mail: mik7252@yandex.ru); А. А. Кудинов, научный сотрудник (e-mail: kudinov_aa@list.ru).

Для цитирования: Смарагдов М. П, Кудинов А. А. Полногеномная оценка инбридинга у молочного скота // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т 33. № 6. С. 51-53. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10612.

Исследования выполнены в рамках Государственного задания министерства науки и высшего образования России тема № АААА-А18-118021590138-1.

ЗООТЕХНИЯ И ВЕТЕРИНАРИЯ

Full Genome Inbreeding Assessment of Dairy Cattle

M. G. Smaragdov, A. A. Kudinov

All-Russian Research Institute of Genetics and Breeding of Farm Animals - the branch of Federal Scientific Center of Animal Husbandry - L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, Moskovskoe sh., 55a, Sankt-Peterburg, 196601, Russian Federation

Abstract. Modern molecular genetics allows identifying runs of homozygosity (ROH) in the animal genome indicating the presence of closely related crosses in the pedigree. The purpose of the research was to calculate the inbreeding coefficient for cows based on the full genome ROH data of Holsteinized Black-and-White cows from four breeding farms of the Leningrad region. From each herd from 46 to 85 animals were selected, a total of 263 heads. DNA for genotyping with BovineSNP50 chip was isolated from the blood by the phenol-chloroform method. Criteria for editing genotypes were the following: SNPs (single nucleotide polymorphism) with the frequency of occurrence in the genome of cows less than 5% were removed; SNPs genotypes that did not satisfy the Hardy-Weinberg distribution with confidence p=0.0001 were removed. As a result of the editing of 54,609 SNPs, 43,298 SNPs remained. The quality of genotyping (QS) was 0.99. ROHs in the cow genome were identified using Plink 1.9 software. The ROH selection criteria were as follows: the scanning frame included 50 SNPs; heterozygous SNPs in ROH were banned; the number of missing SNPs in ROH was no more than two. The scanning of the genome of 263 cows showed that the average number of ROH per genome varied from 23 to 25. The average length of ROH in the cow genome varied from 6729 kbp to 7220 kbp (kilobase pairs). Thus, the total ROH length of individual animals ranged from 24 Mbp to 380 Mbp (megabase pairs). The calculated inbreeding coefficient for individual cows varied from 1.0 to 15.1%. The average inbreeding coefficient in four herds varied from 5.5% to 8.0%. Thus, molecular indicators based on ROH allow evaluating the inbreeding coefficient of cows in herds, and this method should be used in breeding. Keywords: ROH; inbreeding; dairy cattle; herds.

Author Details: M. G. Smaragdov, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow (e-mail: mik7252@yandex.ru); A. A. Kudinov, research fellow (e-mail: kudinov_aa@list.ru).

For citation: Smaragdov M. G., Kudinov A.A. Full Genome Inbreeding Assessment of Dairy Cattle. DostizheniyanaukiitekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No 6. Pp. 51-53 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10612.

Вначале XXI века были сделаны высокотехнологичные разработки во всех сферах человеческой деятельности. Так, появление массивов (arrays) на основе однонуклеотидного полиморфизма в ДНК (SNP) привело к развитию геномной селекции в молочном животноводстве [1]. Применение таких SNP-массивов, наряду с секвенированием ДНК, стимулировало исследования, направленные на более полное понимание функционирования генома животных и растений. В 2008 г. на фирме Illumina для крупного рогатого скота был разработан SNP-чип средней плотности BovineSNP50, включающий 54609 SNPs. За последние 10 лет было опубликовано много результатов исследований с его использованием, направленных на выявление протяженных гомозиготных последовательностей (ROH) в геноме сельскохозяйственных животных. Наличие ROH в геноме животных обусловлено близко родственными скрещива-

ниями. Для каждого животного ROH-последовательности содержат информацию о предках до 50 предшествующих поколений [2].

Минимизация инбридинга необходима, так как он способствует гибридной депрессии [3]. При селекции молочного скота подбирают оптимальных родителей для обеспечения максимальной племенной ценности животных при минимальном инбридинге. Традиционно расчет коэффициента инбридинга осуществляют с использованием родословных записей [4]. Однако этот показатель, вычисленный на основании ROH, более точен, так как он опирается на реализованные геномные данные, а не на вероятностные расчеты из родословных.

В Ленинградской области в 1959 г. была официально зарегистрирована черно-пестрая порода, выведенная скрещиванием черно-пестрых быков и первотелок из Дании, Голландии и Швеции. Для улучшения ее генетическо-

го потенциала с 1978 г. из США и с 2003 г. из Голландии постоянно импортировали сперму и быков голштинской породы. В результате сейчас в Ленинградской области эта порода рассматривается как голштинизированная черно-пестрая.

Цель исследования - рассчитать коэффициент инбридинга у коров, исходя из полногеномных ROH-данных, для его минимизации при селекции животных.

Для ее достижения решали следующие задачи: выявить ROH у коров и определить их число, длину каждого отдельного ROH, суммарную длину ROH у каждой особи; вычислить средние показатели ROH по стадам; сравнить опубликованные ROH-данные для животных голштинской породы и изучаемых коров из Ленинградской области.

Условия, материалы и методы. Для проведения исследований в Ленинградской области были выбраны четыре племенных завода со средними удоями коров 8100...11300 кг молока. Порода - голштинизированная черно-пестрая. В каждом заводе отобрали от 46 до 85 животных (всего 263 коровы) 2011-2013 г. рождения. Исследуемое количество коров от каждого завода было следующим: стадо 1 - 58 коров, стадо 2 - 85 коров, стадо 3 - 74 коров и стадо 4 - 46 коров [5]. ДНК из образцов крови коров выделяли фенол-хлороформным методом. Для генотипирования использовали SNP-чип BovineSNP50 v.2 (Illumina Inc., USA) (далее обозначим его как 50К). Генотипирование проводили в Ирландии (Weatherbys Co., UK). Редактирование SNPs осуществляли пакетом программ Plink 1.9 [6] по следующим критериям: число негенотипированных SNPs не более 5 %; генотипы SNPs, не удовлетворяющие распределению Харди-Вайнберга с достоверностью p = 0,0001, удаляли. В результате редактирования осталось 43298 SNPs из 54609. При этом качество генотипирования (QS) составило 0,99. Тестирование на идентичность данных, полученных при использовании программ Plink, Beagle, SVS и CGATOH, показало, что Beagle уступает Plink по точности выявления ROH, тогда как платная программа SVS дает идентичные Plink результаты [2]. CGATOH незначительно превосходит Plink по числу выявляемых ROH, но сейчас разработчики ее не поддерживают. Исходя из этого, мы выбрали программу Plink 1.9. При этом были установлены следующие параметры для сканирования генома: рамка сканирования 50 SNPs; число гетерозиготных SNPs в ROH последовательности равно нулю; число пропущенных SNPs в

ROH не более двух. Такие параметры обусловлены тем, что рамка сканирования, включающая 50 SNPs, наиболее приемлема для вычисления коэффициента инбридинга у крупного рогатого скота [2]. Исключение гетерозиготных SNPs в выявляемых ROH-последовательностях нужно, для того чтобы предотвратить объединение смежных ROH, которое может привести к неправильному определению длин ROH в геноме животного [2]. Статистическую оценку данных осуществляли с использованием пакета Excel (Microsoft). Коэффициент инбридинга рассчитывали как отношение суммы всех длин ROH в миллионах пар нуклеотидов (м.п.н.) в геноме коровы к размеру генома крупного рогатого скота в м.п.н., составляющему 2512 м.п.н. для 29 аутосом крупного рогатого скота, перекрываемых SNPs, выраженному в процентах [2].

Результаты и обсуждение. Аутозиготность (то есть, в нашем случае, идентичное происхождение SNP) возникает, когда родители имеют общих родственников, от которых передается идентичность по происхождению (IBD) [7]. На молекулярном уровне IBD реализуется как ROH. Таким образом, измеряя ROH, можно оценивать инбридинг у животных.

Установлено, что 50К панель средней плотности переоценивает короткие (1...4 м.п.н.) ROH, тогда как 600К (Bovine HD) панель высокой плотности недооценивает ROH более 8 м.п.н. [8]. Следовательно, для корректной оценки ROH на 50К панели следует учитывать ROH более 4 м.п.н. При сканировании генома рамкой 50 SNPs такое условие выполняется.

В наших исследованиях для всех четырех стад среднее число ROH-последовательностей на корову статистически не различалось (p < 0,05) (табл. 1). Распределения нормальные, за исключением стада 4. Следует отметить меньшее среднее число ROH на геном коров из Ленинградской области (23.25), по сравнению с голштинскими животными в США (40) и Италии (82) [9, 10]. Для пород мясо-молочного направления (Brown Swiss, Fleckvieh) и молочного направления (норвежская красная) величина этого показателя также больше (99, 99 и 80, соответственно) [2]. Это, по-видимому, обусловлено последствиями скрещивания черно-пестрой и голштинской пород. Например, у овец пород Border Leicester (BL) и Merino (MER) среднее число ROH на геном 50 и 8 соответственно, тогда как у гибридов BL x MER оно равно 0,3 [2].

Показатель Среднее значение Стандартная ошибка Медиана Минимум Максимум Сумма

Стадо 1

Количество ROH, шт. 25 0,9 24 15 41 1388

Длина одного ROH, т.п.н. 7076 224 7181 4690 9927 403353

Суммарная длина всех ROH, т.п.н. 180371 8329 172728 61980 344421 10461518

Коэффициент инбридинга, % 7,1 - - 2,5 13,7 -

Стадо 2

Количество ROH, шт. 25 0,6 25 11 36 2094

Длина одного ROH, т.п.н. 7220 137 7093 4712 11461 613741

Суммарная длина всех ROH, т.п.н. 177126 4904 173185 51832 274695 15055691

Коэффициент инбридинга, % 8,0 - - 2,1 10,9 -

Стадо 3

Количество ROH, шт. 23 0,7 23 10 36 1691

Длина одного ROH, т.п.н. 6897 148 6570 4953 10369 510369

Суммарная длина всех ROH, т.п.н. 157994 5868 156476 55002 310283 11691555

Коэффициент инбридинга, % 6,3 - - 2,2 12,3 -

Стадо 4

Количество ROH, шт. 25 4,8 19 4 236 1129

Длина одного ROH, т.п.н. 6729 201 6427 4462 11177 309541

Суммарная длина всех ROH, т.п.н. 137935 22427 130623 24158 380010 6345010

Коэффициент инбридинга, % 5,5 - - 1,0 15,1 -

Таблица 1. Показатели ROH в четырех стадах голштинизированного черно-пестрого скота Ленинградской области

Средние длины ROH животных в стадах также были близки. Только стада 2 и 4 статистически различались (p < 0,05). У американских голштинских коров средняя длина ROH составляет 6670 т.п.н. (тысяч пар нуклеотдов) [9], а у особей из стад Ленинградской области - 6729.7220 т.п.н. Следовательно, величины этих показателей близки для обеих популяций.

Достоверно различались средние суммарные длины ROH в геноме коров из стад 1 и 3 (p < 0,03), 1 и 4 (p < 0,002), 2 и 4 (p < 0,001).

Только в стаде 4 были две коровы с суммарной длиной ROH в геноме более 350 м.п.н. В стаде 2 не было животных, у которых суммарная длина ROH превышает 300 м.п.н. Если учесть численность коров в стадах, то в стаде 1 и 2 особей с суммарной длиной ROH в геноме более 200 м.п.н. почти в два раза больше, чем в стадах 3 и 4. У большинства коров в четырех стадах суммарная длина ROH превышала 100 м.п.н. (табл. 2). Так как суммарная длина ROH у каждого животного характеризует степень его инбридинга, то у большинства коров в стадах она одинакова.

Таблица 2. Число коров с различной суммарной длиной ROH в геноме в четырех стадах

Суммарная длина ROH в геноме Стадо

1

Более 350 м.п.н. 0 0 0 2

Более 300 м.п.н. 2 0 1 2

Более 250 м.п.н. 6 7 2 2

Более 200 м.п.н. 16 23 13 6

Более 100 м.п.н. 56 83 65 32

Среднее значение

FsT для стада* 0,0047 0,0049 0,0038 0,0087

* - данные по [5]

Исходя из полученных данных, можно оценить минимальный и максимальный коэффициент инбридинга у животных в стадах. Для стада 1 он будет варьировать от 2,5 до 13,7 %; для стада 2 - от 2,1до 10,9 %; для стада 3 - от 2,2 до 12,3 %; для стада 4 - от 1,0 до 15,1 % (см. табл. 1). Из этого следует, что наибольшая изменчивость коэффициента инбридинга характерна для четвертого стада. Использование индекса фиксации С. Райта для определения различий частот аллелей SNPs у коров между стадами также свидетельствует о существовании генетических различий [11]. Так, индекс фиксации С. Райта для стада 4 был равен 0,008.0,012, для других стад - 0,002.0,006. В среднем для стада 4 наблюдается двукратное увеличение индекса фиксации (см. табл. 2). У животных из этого стада средний

коэффициент инбридинга составил 5,5, что меньше, чем в других стадах (6.3.8.0). Этот факт обусловлен использованием в четвертом стаде быков только из Голландии, тогда как в других стадах преимущественно использовали быков из США и Канады.

В западных странах с развитым молочным животноводством на протяжении последних 10 лет успешно используют геномную селекцию, позволившую сократить генерационный интервал для голштинской породы в США между «быком-производителем» и «быком» c семи до двух с половиной лет, увеличить генетический прогресс для признаков молочной продуктивности на 50.100 %, а для признаков с низкой наследуемостью (воспроизводство, продолжительность жизни) - на 300...400 % [12]. За прошедшие годы на основе SNPs-платформ были генотипированы десятки тысяч быков и миллионы коров разных пород [12]. Это позволяет более точно проверять происхождение животного и его коэффициент инбридинга, а также идентифицировать известные рецессивные летальные мутации [12]. Как мы отмечали ранее, молекулярный способ определения коэффициента инбридинга точнее классического. Так, для голштинской породы в США коэффициент инбридинга, вычисленный из родословных, составил в среднем 0,043, а из ROH-данных - 0,086 [9], похожее соотношение наблюдали и для итальянской голштинской породы: 0,044 против 0,116 [10]. При этом для молекулярного метода не требуется информация о родословной животного. Вычисление инбридинга на основе ROH может найти применение при разведении малочисленных пород скота и консервации пород.

Выводы. В геноме голштинизированных черно-пестрых коров из племенных заводов Ленинградской области есть ROH-последовательности, свидетельствующие о наличии близкородственных скрещиваний в родословной. Число ROH-последовательностей у животных в изученных стадах значительно меньше (23.25), чем у американских голштинских коров (40.43). Этот факт может быть обусловлен скрещиванием черно-пестрой породы с голштинской. Коэффициент инбридинга у отдельных коров в четырех стадах варьирует от 1,0 до 15,1 %, средние коэффициенты инбридинга на основе выборок из четырех стад - от 5,5 до 8,0 %. Таким образом, молекулярные данные позволяют оценить коэффициент инбридинга у коров в стадах. Мы предлагаем использовать этот метод для мониторинга инбридинга в стадах, крупного рогатого скота и других сельскохозяйственных животных.

Литература.

1. Смарагдов М. Г. Геномная селекция молочного скота. Пять лет практического использования // Генетика. 2013. Т. 49. № 11. С. 1-10.

2. Runs of homozygosity: current knowledge and applications in livestock/ E. Peripolli, D. P. Vunari, M. V. G. Silva, eta. //Animal Genetics. 2017. Vol. 48. No 3. P. 255-271.

3. Charlesworth D., Willis J. H. The genetics of inbreeding depression// Nature Reviews Genetics. 2009. Vol. 10. P. 783-796.

4. Wright S. Coefficient of inbreeding and relationship // American Naturulist. 1922. Vol. 56. P. 330-338.

5. Smaragdov M. G., KudinovA. A., Uimari P. Assessing the genetic differences of Holstein cattle herds in the Leningrad region using Fst statistics //Agricultural and Food Science. 2018. Vol. 27. P. 96-101.

6. PLINK: a tool set for whole genome association and population based linkage analyses / S. Pursell, B. Neale, K. Todd-Brown, etc. //American Journal of Human Genetics. 2007. Vol. 81. P. 559-575.

7. Powell J. E., Visscher P. M., Goddard M. E. Reconciling the analysis of IBD and IBS in complex trait studies // Nature Reviews Genetics. 2010. Vol. 11. P. 800-805.

8. Runs of homozygosity and population history in cattle / C. Purfield, D. Berry, S. McParland, etc. // BMC Genetics. 2012. Vol. 13. P. 70.

9. Effect of artificial selection on runs of homozygosity in U.S. Holstein cattle / E. S. Kim, J. B. Cole, H. Huson, etc. // PLoS One. 2013. Vol. 8. No 11. e80813.

10. Analysis of runs of homozygosity and their relationship with inbreeding in five cattle breeds farmed in Italy/G. Marras, G. Gaspa, S. Sorbolini, etc. Animal Genetics// 2015. Vol. 46. No 2. P. 110-121.

11. Смарагдов М. Г. Полногеномная оценка межстадного генетического различия крупного рогатого скота //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 4. С. 47-49.

12. Georges M., Charlier C., Hayes B. Harnessing genomic information for livevestock improvement // Nature Reviews Genetics. 2019. Vol. 20. P. 135-156.