КАТИОННЫЙ ЛИПИД
CATIONIC LIPID

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к катионному липиду, способному переносить нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента во многие типы клеток, тканей или органов. Настоящее изобретение также относится к липидной частице, содержащей катионный липид, и к композиции, содержащей липидную частицу и нуклеиновую кислоту.
Уровень техники
[0002] В последние годы активно исследуются и разрабатываются лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента. Например, было проведено много исследований лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновую кислоту, такую как siРНК, миРНК, миметик миРНК или антисмысловая нуклеиновая кислота, и обладающих эффектом деградации или функциональной супрессии мРНК-мишени. Также были проведены исследования лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот для внутриклеточной экспрессии представляющего интерес белка, содержащих мРНК, кодирующую представляющий интерес белок, и тому подобное. В связи с такими исследованиями и разработками были разработаны способы переноса нуклеиновой кислоты в клетки, ткань или орган с высокой эффективностью в качестве средств доставки лекарственных средств (DDS).
[0003] Методы смешивания нуклеиновой кислоты с липидом с образованием комплекса с последующим поглощением нуклеиновой кислоты клеткой через комплекс до сих пор были известны как способы DDS. Катионные липиды, гидрофильные полимерные липиды, вспомогательные липиды и т.п. до сих пор были известны как липиды для использования в образовании комплексов. Например, следующие соединения, описанные в документах предшествующего уровня техники, известны как катионные липиды.
[0004] В патентном документе 1 описано соединение, представленное следующей формулой, или его соль и т.д.
[0005] Формула 1
1
2
3
1
2
3
8
24
8
24
1
8
1
6
1
8
Формула определяется следующим образом: R каждый независимо выбран из группы, состоящей из необязательно замещенного C-C алкила и необязательно замещенного C-C алкенила; R и R каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, необязательно замещенного C-C алкила, необязательно замещенного арилалкила и т.п.; Y и Y каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, необязательно замещенного C-C алкила, необязательно замещенного арилалкила и т.п.; Y, если присутствует, каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, необязательно замещенного C-C алкила, необязательно замещенного арилалкила и т.п.; m равно любому целому числу от 1 до 4, n равно любому целому числу от 0 до 3, p равно 0 или 1, и сумма m, n и p равна 4; k равно любому целому числу от 1 до 5; q равно 0 или 1.
[0006] В патентном документе 2 описано соединение, представленное следующей формулой, или его соль и т.д.
[0007] Формула 2
1
2
+
3
4
5
-
1
2
3
4
5
-
A
B
C
A
B
C
A1
A2
B1
B2
C1
C2
1-4
1-4
1-6
4-10
В формуле: W представляет собой группу -NRR или группу -NRRR(Z), R и R каждый независимо представляет собой C алкильную группу или атом водорода, R, R и R каждый независимо представляет собой C алкильную группу, Z представляет собой анион, X представляет собой необязательно замещенную C алкиленовую группу, Y, Y и Y каждый независимо представляет собой необязательно замещенную метиновую группу, L, L и L каждый независимо представляет собой необязательно замещенную метиленовую группу или связь, и R, R, R, R, R и R каждый независимо представляет собой необязательно замещенную C алкильную группу.
Список цитированной литературы
Патентная литература
[0008]
Патентный документ 1: WO 2003/102150
Патентный документ 2: WO 2016/021683.
Сущность изобретения
Техническая задача
[0009] Предполагается, что катионные липиды, способные с высокой эффективностью переносить нуклеиновую кислоту в клетку, будут способствовать разработке лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот, которые обладают высокой лекарственной эффективностью, безопасностью (низкой токсичностью) и т.д. и обладают высоким терапевтически эффектом. Кроме того, предполагается, что катионные липиды, способные переносить нуклеиновую кислоту в различные клетки, позволят разработать лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот для лечения различных типов заболеваний, развившихся в различных тканях. Однако пока не найдено ни одного продукта, способного в достаточной мере удовлетворить эти предположения.
[0010] Целью настоящего изобретения является обеспечение способа, с помощью которого можно переносить нуклеиновую кислоту в клетку с высокой эффективностью, и катионного липида для применения в данном способе и т.д. В еще одном аспекте целью настоящего изобретения является обеспечение способа, с помощью которого можно переносить нуклеиновую кислоту в различные клетки, и соединения для применения в данном способе и т.д.
Решение технической задачи
[0011] Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для достижения указанных целей и, таким образом завершили настоящее изобретение, установив, что использование соединения, представленного нижеприведенной формулой, или его соли может достичь указанных целей.
[0012] В частности, настоящее изобретение относится, по меньшей мере, к следующим аспектам.
1. Соединение, представленное формулой (I):
Формула 3
где n1 равно целому числу от 2 до 6, n2 равно целому числу от 0 до 2, n3 равно целому числу от 0 до 2,
L представляет собой -C(O)O- или -NHC(O)O-,
5-13
13-17
17
Ra представляет собой линейную C алкильную группу, линейную C алкенильную группу или линейную C алкадиенильную группу,
2-9
Rb представляет собой линейную C алкильную группу,
2-9
Rc представляет собой атом водорода или линейную C алкильную группу,
2-9
Rd представляет собой атом водорода или линейную C алкильную группу,
2-9
Re представляет собой линейную C алкильную группу, и
2-9
Rf представляет собой линейную C алкильную группу,
или его соль.
2. 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат или его соль.
3. 2-(((4,5-Дибутилнонаноил)окси)метил)-2-(((5-(диметиламино)пентаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдидеканоат или его соль.
4. 3-((6-(Диметиламино)гексаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат или его соль.
5. 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дипентилдеканоат или его соль.
6. 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4-гептилундеканоат или его соль.
7. Липидная частица, содержащая соединение в соответствии с п.1 или его соль.
8. Композиция для переноса нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту и липидную частицу по п.7.
9. Композиция по п.8, где нуклеиновая кислота представляет собой РНК.
10. Композиция по п.9, где РНК представляет собой мРНК или siРНК.
[0013] В рамках настоящего изобретения, «соединение, представленное формулой (I)», также относится к «соединению (I)». «Соединение, представленное формулой (I), или его соль» также относится к «соединению по настоящему изобретению». «Липидная частица, содержащая (или включающая) соединение, представленное формулой (I), или его соль (соединение по настоящему изобретению)», также относится к «липидной частице по настоящему изобретению». «Композиция для переноса нуклеиновой кислоты, содержащая (или включающая) нуклеиновую кислоту и липидную частицу по настоящему изобретению», также относится к «композиции по настоящему изобретению».
Преимущественные эффекты изобретения
[0014] Настоящее изобретение позволяет переносить нуклеиновую кислоту в клетку, ткань или орган с высокой эффективностью. Настоящее изобретение также позволяет переносить нуклеиновую кислоту во многие типы клеток, тканей или органов (например, опухолевые клетки). Настоящее изобретение позволяет получить лекарственное средство или реагент для исследования, который переносит нуклеиновую кислоту во многие типы клеток, тканей или органов. В случае переноса нуклеиновой кислоты в клетку, ткань или орган по настоящему изобретению эффективность проявления активности (например, эффективности лекарственного средства) нуклеиновой кислоты является высокой.
[0015] Подробное описание изобретения
[0016] Далее каждый заместитель, используемый в настоящем описании, будет описан подробно. Каждый заместитель имеет следующее определение, если не указано иное.
5-13
[0017] В рамках настоящего изобретения, примеры «линейной C алкильной группы» включают пентил, гексил, гептил, октил, нонил, деканил, ундеканил, додеканил и тридеканил.
13-17
13-17
[0018] В рамках настоящего изобретения, примеры «линейной C алкенильной группы» включают: 1-тридеценил, 2-тридеценил, 3-тридеценил, 4-тридеценил, 5-тридеценил, 6-тридеценил, 7-тридеценил, 8-тридеценил, 9-тридеценил, 10-тридеценил, 11-тридеценил и 12-тридеценил; 1-тетрадеценил, 2-тетрадеценил, 3-тетрадеценил, 4-тетрадеценил, 5-тетрадеценил, 6-тетрадеценил, 7-тетрадеценил, 8-тетрадеценил, 9-тетрадеценил, 10-тетрадеценил, 11-тетрадеценил, 12-тетрадеценил и 13-тетрадеценил; 1-пентадеценил, 2-пентадеценил, 3-пентадеценил, 4-пентадеценил, 5-пентадеценил, 6-пентадеценил, 7-пентадеценил, 8-пентадеценил, 9-пентадеценил, 10-пентадеценил, 11-пентадеценил, 12-пентадеценил, 13-пентадеценил и 14-пентадеценил; 1-гексадеценил, 2-гексадеценил, 3-гексадеценил, 4-гексадеценил, 5-гексадеценил, 6-гексадеценил, 7-гексадеценил, 8-гексадеценил, 9-гексадеценил, 10-гексадеценил, 11-гексадеценил, 12-гексадеценил, 13- гексадеценил, 14-гексадеценил и 15-гексадеценил; и 1-гептадеценил, 2-гептадеценил, 3-гептадеценил, 4-гептадеценил, 5-гептадеценил, 6-гептадеценил, 7-гептадеценил, 8-гептадеценил, 9-гептадеценил, 10-гептадеценил, 11-гептадеценил, 12- гептадеценил, 13-гептадеценил, 14-гептадеценил, 15-гептадеценил и 16-гептадеценил. Данные линейные C алкенильные группы содержат одну двойную углерод-углеродную связь и поэтому могут иметь цис- и транс-конфигурацию, любая из которых может быть допустимой.
17
11
[0019] В рамках настоящего изобретения, примеры «линейной C алкадиенильной группы» включают 1,3-гептадекадиенил, 1,4-гептадекадиенил, 1,5-гептадекадиенил, 1,6-гептадекадиенил, 1,7-гептадекадиенил, 1,8-гептадекадиенил, 1,9-гептадекадиенил, 1,10-гептадекадиенил, 1,11-гептадекадиенил, 1,12-гептадекадиенил, 1,13-гептадекадиенил, 1,14-гептадекадиенил, 1,15-гептадекадиенил, 1,16-гептадекадиенил, 2,4-гептадекадиенил, 2,5-гептадекадиенил, 2,6-гептадекадиенил, 2,7-гептадекадиенил, 2,8-гептадекадиенил, 2,9-гептадекадиенил, 2,10-гептадекадиенил, 2,11-гептадекадиенил, 2,12-гептадекадиенил, 2,13-гептадекадиенил, 2,14-гептадекадиенил, 2,15-гептадекадиенил, 2,16-гептадекадиенил, 3,5-гептадекадиенил, 3,6-гептадекадиенил, 3,7-гептадекадиенил, 3,8-гептадекадиенил, 3,9-гептадекадиенил, 3,10-гептадекадиенил, 3,11-гептадекадиенил, 3,12-гептадекадиенил, 3,13-гептадекадиенил, 3,14-гептадекадиенил, 3,15-гептадекадиенил, 3,16-гептадекадиенил, 4,6-гептадекадиенил, 4,7-гептадекадиенил, 4,8-гептадекадиенил, 4,9-гептадекадиенил, 4,10-гептадекадиенил, 4,11-гептадекадиенил, 4,12-гептадекадиенил, 4,13-гептадекадиенил, 4,14-гептадекадиенил, 4,15-гептадекадиенил, 4,16-гептадекадиенил, 5,7-гептадекадиенил, 5,8-гептадекадиенил, 5,9-гептадекадиенил, 5,10-гептадекадиенил, 5,11-гептадекадиенил, 5,12-гептадекадиенил, 5,13-гептадекадиенил, 5,14-гептадекадиенил, 5,15-гептадекадиенил, 5, 16-гептадекадиенил, 6,8-гептадекадиенил, 6,9-гептадекадиенил, 6,10-гептадекадиенил, 6,11-гептадекадиенил, 6,12-гептадекадиенил, 6,13-гептадекадиенил, 6,14-гептадекадиенил, 6,15-гептадекадиенил, 6,16-гептадекадиенил, 7,9-гептадекадиенил, 7,10-гептадекадиенил, 7,11-гептадекадиенил, 7,12-гептадекадиенил, 7,13-гептадекадиенил, 7,14-гептадекадиенил, 7,15-гептадекадиенил, 7,15-гептадекадиенил 7,16-гептадекадиенил, 8,10-гептадекадиенил, 8,11-гептадекадиенил, 8,12-гептадекадиенил, 8,13-гептадекадиенил, 8,14-гептадекадиенил, 8,15-гептадекадиенил, 8,16-гептадекадиенил, 9,11-гептадекадиенил, 9,12-гептадекадиенил, 9,13-гептадекадиенил, 9,14-гептадекадиенил, 9,15-гептадекадиенил, 9,16-гептадекадиенил, 10,12-гептадекадиенил, 10,13-гептадекадиенил, 10,14-гептадекадиенил, 10,15-гептадекадиенил, 10,16-гептадекадиенил, 11,13-гептадекадиенил, 11,14-гептадекадиенил, 11,15-гептадекадиенил, 11,16-гептадекадиенил, 12,14-гептадекадиенил, 12,15-гептадекадиенил, 12,16-гептадекадиенил, 13,15-гептадекадиенил, 13,16-гептадекадиенил и 14,16-гептадекадиенил. Данные линейные C алкадиенильные группы содержат две двойные углерод-углеродные связи и поэтому могут принимать цис- и транс-конфигурацию на каждой из связей независимо, любая из которых может быть допустимой.
2-9
[0020] В рамках настоящего изобретения, примеры «линейной C алкильной группы» включают этил, бутил, пропил, пентил, гексил, гептил, октил и нонил.
[0021] Соответствующие предпочтительные примеры n1, n2, n3, L, Ra, Rb, Rc, Rd, Re и Rf в формуле (I) являются следующими.
n1 предпочтительно равно целому числу от 3 до 5.
n2 предпочтительно равно целому числу от 0 до 2.
n3 предпочтительно равно целому числу от 0 до 2.
L предпочтительно представляет собой -C(O)O-.
5-9
13-17
17
Ra предпочтительно представляет собой линейную C алкильную группу, линейную C алкенильную группу или линейную C алкадиенильную группу.
4-8
Rb предпочтительно представляет собой линейную C алкильную группу.
4-7
Rc предпочтительно представляет собой атом водорода или линейную C алкильную группу.
3-6
Rd предпочтительно представляет собой атом водорода или линейную C алкильную группу.
3-6
Re предпочтительно представляет собой линейную C алкильную группу.
3-7
Rf предпочтительно представляет собой линейную C алкильную группу.
[0022] Предпочтительными конкретными примерами соединения (I) являются следующие.
5-9
4-8
3-6
3-7
Соединение (I-A): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0, n3 равно целому числу от 0 до 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой атом водорода, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
5-9
4-8
5-7
3-6
3-7
Соединение (I-B): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0 или 1, n3 равно 0 или 1, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой линейную C алкильную группу, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
5-9
4-8
3-6
3-6
3-7
Соединение (I-C): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0 или 1, n3 равно целому числу от 0 до 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой атом водорода, Rd представляет собой линейную C алкильную группу, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
13-17
17
3-6
3-6
2-6
2-7
Соединение (I-D): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0 или 1, n3 равно целому числу от 0 до 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкенильную группу или линейную C алкадиенильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой линейную C алкильную группу, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
[0023] Более предпочтительными конкретными примерами соединения (I) являются следующие.
7
6
5-6
6-7
Соединение (a): соединение, где n1 равно 3 или 4, n2 равно 0, n3 равно 0 или 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную Cалкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой атом водорода, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
6-7
5-6
5-6
4-5
5-6
Соединение (b): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0 или 1, n3 равно 0 или 1, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой линейную C алкильную группу, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
5-9
4-8
3-5
3-5
3-5
Соединение (c): соединение, в котором n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0, n3 равно 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой атом водорода, Rd представляет собой линейную C алкильную группу, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
13-17
17
3-5
3-5
3-6
3-7
Соединение (d): соединение, где n1 равно целому числу от 3 до 5, n2 равно 0 или 1, n3 равно целому числу от 0 до 2, L представляет собой -C(O)O-, Ra представляет собой линейную C алкенильную группу или линейную C алкадиенильную группу, Rb представляет собой линейную C алкильную группу, Rc представляет собой линейную C алкильную группу, Rd представляет собой атом водорода, Re представляет собой линейную C алкильную группу, и Rf представляет собой линейную C алкильную группу.
[0024] Особенно предпочтительными конкретными примерами соединения (I) являются следующие:
3-((5-(диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат;
2-(((4,5-дибутилнонаноил)окси)метил)-2-(((5- (диметиламино)пентаноил)окси)метил) пропан-1,3-диилдидеканоат;
3-((6-(диметиламино)гексаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат;
3-((5-(диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дипентилдеканоат; и
3-((5-(диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4-гептилундеканоат.
[0025] Соль соединения (I) предпочтительно представляет собой фармакологически приемлемую соль. Ее примеры включают соли неорганических оснований, соли органических оснований, соли неорганических кислот, соли органических кислот и соли основных или кислых аминокислот.
[0026] Предпочтительные примеры солей неорганических оснований включают: соли щелочных металлов, такие как соль натрия и соль калия; соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция и соль магния; соль алюминия; и соль аммония. Соль натрия, соль калия, соль кальция и соль магния являются предпочтительными, и соль натрия и соль калия являются еще более предпочтительными.
[0027] Предпочтительные примеры солей органических оснований включают соли триметиламина, триэтиламина, пиридина, пиколина, этаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, трометамина [трис (гидроксиметил)метиламина], трет-бутиламина, циклогексиламина, бензиламина, дициклогексиламина и N,N-дибензилэтиламина.
[0028] Предпочтительные примеры солей неорганических кислот включают соли фтористоводородной кислоты, соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, азотной кислоты, серной кислоты и фосфорны кислотой. Соли соляной кислоты и соли фосфорной кислоты являются предпочтительными.
[0029] Предпочтительные примеры солей органических кислот включают соли муравьиной кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислотой, фталевой кислотой, фумаровой кислотой, щавелевой кислоты, винной кислоты, малеиновой кислоты, лимонной кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты, метансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты и п-толуолсульфоновой кислоты.
[0030] Предпочтительные примеры солей основных аминокислот включают соли аргинина, лизина и орнитина.
[0031] Предпочтительные примеры солей кислых аминокислот включают соли аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
[0032] В рамках настоящего изобретения, соединение по настоящему изобретению можно использовать в качестве катионного липида. Катионный липид может образовывать комплекс с множеством молекул в растворителе или дисперсионной среде. Комплекс может содержать дополнительный компонент в дополнение к соединению по настоящему изобретению. Примеры дополнительного компонента включают другие липидные компоненты и нуклеиновые кислоты.
[0033] Примеры других липидных компонентов включают структурированные липиды, которые могут составлять липидные частицы. Например, по меньшей мере, один член, выбранный из группы, включающей:
стерины (например, холестерин, сложный эфир холестерина и холестерина гемисукцинат);
фосфолипиды (например, фосфатидилхолины (например, дипальмитоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, пальмитоилолеоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин, дилиноленоилфосфтидилхолин, МС-1010 (NOF Corporation), МС-2020 (NOF Corporation), МС-4040 (NOF Corporation), МС-6060 (NOF Corporation) и МС-8080 (NOF Corporation)), фосфатидилсерины (например, дипальмитоилфосфатидилсерин, дистеароилфосфатидилсерин, диолеоилфосфатидилсерин и пальмитоилолеоилфосфатидилсерин), фосфатидилэтаноламины (например, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, дистеароилфосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилэтаноламин, пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин и лизофосфатидилэтаноламин), фосфатидилинозитол и фосфатидная кислота); и
полиэтиленгликоль-содержащие липиды (PEG-липиды) (например, PEG-DAA, PEG-DAG, конъюгат PEG-фосфолипид, PEG-Cer, PEG-холестерин, PEG-C-DOMG, 2KPEG-CMG, GM-020 (NOF Corporation), GS -020 (NOF Corporation) и GS-050 (NOF Corporation))
можно использовать в качестве такого структурированного липида. В настоящем изобретении все три члена на основе стерина (в частности, холестерин), фосфолипид (в частности, фосфатидилхолин) и полиэтиленгликоль-содержащий липид предпочтительно используются в качестве структурированных липидов.
[0034] Соотношение между соединением по настоящему изобретению и структурированным липидом в смешанном липидном компоненте, образующем липидную частицу по настоящему изобретению, можно соответствующим образом корректировать в соответствии с целью или применением. Например, соотношение структурированного липида обычно составляет от 0,008 до 4 моль, предпочтительно от 0,4 до 1,5 моль, на 1 моль соединения по настоящему изобретению. Согласно другому определению, содержание в смешанном липидном компоненте обычно составляет от 1 до 4 моль соединения по настоящему изобретению, обычно от 0 до 3 моль стерина, обычно от 0 до 2 моль фосфолипида и обычно от 0 до 1 моль полиэтиленгликоль-содержащего липида. В более предпочтительном аспекте, в случае использования соединения по настоящему изобретению и дополнительного липидного компонента в смеси, содержание составляет от 1 до 1,5 моль соединения по настоящему изобретению, от 0 до 1,25 моль стерина, 0 до 0,5 моль фосфолипида и от 0 до 0,125 моль полиэтиленгликоль-содержащего липида.
[0035] Соединение по настоящему изобретению можно использовать для получения липидной частицы по настоящему изобретению. Липидная частица по настоящему изобретению означает комплекс, описанный выше, за исключением того, что комплекс не содержит нуклеиновой кислоты. Форма липидной частицы по настоящему изобретению особым образом не ограничивается и включает, например, комплекс, собранный соединением по настоящему изобретению, и т.д., с образованием сферической формы, комплекс, собранный без образования определенной формы, комплекс, растворенный в растворителе, и комплекс, равномерно или неоднородно диспергированный в дисперсионной среде.
[0036] Липидную частицу по настоящему изобретению (например, липидную частицу, состоящую из соединения по настоящему изобретению и дополнительного структурированного липида) можно использовать для получения, например, композиции по настоящему изобретению, содержащей липидную частицу и нуклеиновую кислоту (в частности, нуклеиновую кислоту, которая является веществом, используемым для фармацевтического применения или применения в исследовательских целях). Композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства или реагента. В композиции по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы максимально возможное относительное количество нуклеиновой кислоты было инкапсулировано в липидной частице (т.е. степень инкапсулирования должна быть высокой).
[0037] «Нуклеиновая кислота» может представлять собой любую молекулу полимеризованных нуклеотидов и молекулы, имеющие функции, эквивалентные функциям нуклеотидов. Их примеры могут включать РНК, которая представляет собой полимер из рибонуклеотидов, ДНК, которая представляет собой полимер из дезоксирибонуклеотидов, полимер из смеси рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, и нуклеотидный полимер, содержащий аналог нуклеотида. Альтернативно можно использовать нуклеотидный полимер, содержащий производное нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота может представлять собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту или двухцепочечную нуклеиновую кислоту. Двухцепочечная нуклеиновая кислота также включает двухцепочечную нуклеиновую кислоту, в которой одна из цепей гибридизуется в жестких условиях с другой цепью.
[0038] Аналог нуклеотида может представлять собой любую молекулу при условии, что эта молекула представляет собой рибонуклеотид, дезоксирибонуклеотид, РНК или ДНК, модифицированные для повышения устойчивости к нуклеазам, для повышения стабильности, для повышения сродства к комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, для увеличения проницаемости клетки или для визуализации молекулы, по сравнению с исходной РНК или ДНК. Аналог нуклеотида может быть молекулой природного происхождения или молекулой неприродного происхождения. Их примеры включают аналог нуклеотида с модифицированной сахарной группой и аналог нуклеотида с модифицированной фосфодиэфирной связью.
[0039] Аналог нуклеотида с модифицированной сахарной группой может представлять собой любую молекулу при условии, что произвольное химическое структурное соединение добавлено или заменено для части или всей химической структуры сахара в нуклеотиде. Его конкретные примеры включают аналог нуклеотида, замещенный 2'-O-метилрибозой, аналог нуклеотида, замещенный 2'-O-пропилрибозой, аналог нуклеотида, замещенный 2'-метоксиэтоксирибозой, аналог нуклеотида, замещенный 2'-O-метоксиэтилрибозой, аналог нуклеотида, замещенный 2'-O-[2- (гуанидин)этил]рибозой, аналог нуклеотида, замещенный 2'-фторрибозой, аналог нуклеиновой кислоты с группой сахара, замещенной морфолиным кольцом (морфолиновая нуклеиновая кислота), мостиковую нуклеиновую кислоту (BNA), имеющую две циклические структуры введением мостиковой структуры в сахарную группу, более конкретно, «запертая» нуклеиновая кислота (LNA) с атомом кислорода в положении 2' и атомом углерода в положении 4', соединенных мостиковой связью через метилен, и нуклеиновую кислоту с этиленовым мостиком (ENA) [Nucleic Acid Research, 32, e175 (2004)], и нуклеиновую кислоту с амидным мостиком (AmNA) с атомом углерода в положении 2' и атомом углерода в положении 4', которые соединены мостиком через амидную связь, и могут дополнительно включать пептидную нуклеиновую кислоту (PNA) [Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)], оксипептидную нуклеиновую кислоту (OPNA) [J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)] и пептидную рибонуклеиновую кислоту (PRNA) [J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)].
[0040] Аналогом нуклеотида с модифицированной фосфодиэфирной связью может быть любая молекула, при условии, что произвольное химическое структурное соединение добавлено или заменено для части или всей химической структуры фосфодиэфирной связи в нуклеотиде. Его конкретные примеры могут включать аналог нуклеотида, замещенный фосфоротиоатной связью, и аналог нуклеотида, замещенный N3'-P5' фосфорамидатной связью [Cell Engineering, 16, 1463-1473 (1997)] [RNAi Method and Antisense Method, Kodansha Ltd. (2005)].
[0041] Производное нуклеиновой кислоты может быть любой молекулой при условии, что эта молекула представляет собой нуклеиновую кислоту с другим химическим соединением, добавленным к ней, для повышения устойчивости к нуклеазам, для повышения стабильности, для повышения сродства к комплементарной цепи нуклеиновой кислоты, для увеличения проницаемости клетки или для визуализации молекулы, по сравнению с исходной нуклеиновой кислотой. Его конкретные примеры могут включать производное с добавленным 5'-полиамином, производное с добавленным холестерином, производное с добавленным стероидом, производное с добавленной желчной кислотой, производное с добавленным витамином, производное с добавленным Cy5, производное с добавленным Cy3, производное с добавленным 6-FAM и производное с добавленным биотином.
[0042] Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению особым образом не ограничивается и может представлять собой нуклеиновую кислоту, нацеленную, например, на ослабление заболевания, симптома, нарушения или заболеваемости, и подавление заболевания, симптома, нарушения или патологического состояния или предупреждение начала его развития (в настоящем описании, также относится к «лечению и т.д. заболевания»), или может представлять собой нуклеиновую кислоту для регуляции экспрессии желаемого белка, пригодного для исследований, хотя и не способствующего лечению заболевания.
[0043] Информация о гене или полинуклеотиде, связанном с заболеванием (в настоящем описании, также относится к «гену, связанному с заболеванием»), доступна, например, в Институте генетической медицины МакКьюсика-Натанса Университета Джона Хопкинса (Балтимор, Md.) и Национальном центре биотехнологической информации, Национальной медицинской библиотеки США (Bethesda, MD).
[0044] Конкретные примеры нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению включают siРНК, миРНК, миметик siРНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим, мРНК, нуклеиновую кислоту-ловушку и аптамер. Нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой РНК, такую как siРНК или мРНК, или их аналог или производное, полученные искусственной модификацией.
[0045] В рамках настоящего изобретения, «siРНК» означает двухцепочечную РНК из 10-30 оснований, предпочтительно 15-25 оснований, или ее аналог, содержащий комплементарные последовательности. siРНК предпочтительно имеет от 1 до 3, более предпочтительно 2 выступающих основания на 3'-конце. Фрагмент комплементарной последовательности может быть полностью комплементарным или может содержать некомплементарное основание, но предпочтительно является полностью комплементарным.
[0046] siРНК по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, и, например, можно использовать siРНК для нокдауна экспрессии гена, связанного с заболеванием. Связанный с заболеванием ген относится к произвольному гену или полинуклеотиду, который дает продукт транскрипции или трансляции на аномальном уровне или в аномальной форме в клетке, происходящей из пораженной ткани, по сравнению со здоровой контрольной тканью или клеткой. Альтернативно siРНК для регуляции экспрессии желаемого белка, пригодного для исследований, можно использовать в качестве siРНК по настоящему изобретению.
[0047] В рамках настоящего изобретения, «мРНК» означает РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, транслируемую в белок. мРНК по настоящему изобретению особым образом не ограничивается, при условии, что мРНК может вызывать внутриклеточную экспрессию желаемого белка. мРНК предпочтительно представляет собой мРНК, пригодную для фармацевтического применения (например, для применения в лечении заболеваний) и/или для применения в исследовательских целях. Примеры такой мРНК включают мРНК для внутриклеточной экспрессии маркерного белка, такого как люцифераза.
[0048] Примеры заболевания, описанного выше, включают, не ограничиваясь этим, заболевания, приведенные ниже. Примеры гена, связанного с заболеванием, приведены в скобках «()», за исключением случая, когда описаны конкретные примеры заболевания. Примеры нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению также включают нуклеиновые кислоты, регулирующие уровни экспрессии этих связанных с заболеванием генов (или белков, кодированных ими).
(1) Гематологические заболевания [анемия (CDAN1, CDA1, RPS19, DBA, PKLR, PK1, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG, RH50A, NRAMP2, SPTB, ALAS2, ANH1, ASB, ABCB7, ABC7 и ASAT), синдром «голых» лимфоцитов (TAPBP, TPSN, TAP2, ABCB3, PSF2, RING11, MHC2TA, C2TA и RFX5), заболевания, сопровождающиеся кровотечением (TBXA2R, P2RX1 и P2X1), дефицит фактора H и H-подобного фактора 1 (HF1, CFH и HUS), дефицит фактора V и фактора VIII (MCFD2), дефицит фактора VII (F7), дефицит фактора X (F10), дефицит фактора XI (F11), дефицит фактора XII (F12 и HAF), дефицит фактора XIIIA (F13A1 и F13A), дефицит фактора XIIIB (F13B), анемия Фанкони (FANCA, FACA, FA1, FA, FAA, FAAP95, FAAP90, FLJ34064, FANCB, FANCC, FACC, BRCA2, FANCD1, FANCD2, FANCD, FACD, FAD, FACE, FANCF, XRCC9, FANCG, BRIP1, BACH1, FANCJ, PHF9, FANCL, FANCM и KIAA1596), гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (PRF1, HPLH2, UNC13D, MUNC13-4, HPLH3, HLH3 и FHL3), гемофилия А (F8, F8C и HEMA), гемофилия B (F9 и HEMB), нарушения свертываемости крови (PI, ATT и F5), аномалии лейкоцитов (ITGB2, CD18, LCAMB, LAD, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, LVWM, CACH, CLE и EIF2B4), серповидно-клеточная анемия (HBB), талассемия (HBA2, HBB, HBD, LCRB и HBA1) и т.д.];
(2) воспалительные или иммунологические заболевания [СПИД (KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB11, KIR3DS1, IFNG, CXCL12 и SDF1), аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (TNFRSF6, APT1, FAS, CD95 и ALPS1A), комбинированное иммунодефицитное заболевание (IL2RGG, SCIDX1, SCIDX и IMD4), ВИЧ-инфекция (CCL5, SCYA5, D17S135E, TCP228, IL10, CSIF, CMKBR2, CCR2, DMKBR5, CCCKR5 и CCR5), иммунодефицитное заболевание (CD3E, CD3G, AICDA, AID, HIGM2, TNFRSF5, CD40, UNG, DGU, HIGM4, TNFSF5, CD40LG, HIGM1, IGM, FOXP3, IPEX, AIID, XPID, PIDX, TNFRSF14B и TACI), воспаление (IL-10, IL-1, IL-13, IL-17, IL-23 и CTLA4), тяжелый комбинированный иммунодефицит (JAK3, JAKL, DCLRE1C, ATREMIS, SCIDA, RAG1, RAG2, ADA, PTPRC, CD45, LCA, IL7R, CD3D, T3D, IL2RG, SCIDX1, SCIDX и IMD4), ревматоидный артрит, псориаз, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит), синдром Шегрена, болезнь Бехчета, рассеянный склероз, системная красная волчанка, волчаночный нефрит, дискоидная красная волчанка, болезнь Кастлемана, анкилозирующий спондилит, полимиозит, дерматомиозит, узелковый полиартериит, смешанное заболевание соединительной ткани, склеродермия, глубокая красная волчанка, хронический тиреоидит, болезнь Грейвса, аутоиммунный гастрит, сахарный диабет I и II типа, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунная нейтропения, тромбоцитопения, атопический дерматит, хронический активный гепатит, миастения, болезнь «трансплантат против хозяина», болезнь Аддисона, аномальный иммунный ответ, артрит, дерматит, радиодермит, первичный билиарный цирроз и т.д.];
(3) метаболические заболевания, заболевания печени или почек [амилоидная нейропатия (TTR и PALB), амилоидоз (APOA1, APP, AAA, CVAP, AD1, GSN, FGA, LYZ, TTR и PALB), неалкогольный стеатогепатит и фиброз печени (COL1A1), цирроз печени (KRT18, KRT8, CIRH1A, NAIC, TEX292 и KIAA1988), кистозный фиброз (CFTR, ABCC7, CF и MRP7), болезнь накопления гликогена (SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL и PFKM), гепатоцеллюлярная аденома (TCF1, HFN1A и MODY3), печеночная недостаточность (SCOD1 и SCO1), недостаточность печеночной липазы (LIPC), гепатобластома (CTNNB1, PDFGR1, PDGRL, PRLTS, AXIN1, AXIN, TP53, P53, LFS1, IGF2R, MPRI, MET, CASP8 и MCH5), медуллярная кистозная болезнь почек (UMOD, HNFJ, FJHN, MCKD2 и ADMCKD2), фенилкетонурия (PAH, PKU1, QDPR, DHPR и PTS), поликистоз почек и печени (FCYT, PKHD1, APRKD, PDK1, PDK2, PDK4, PDKTS, PRKCSH, G19P1, PCLD и SEC63) и т.д.];
(4) неврологические заболевания [боковой амиотрофический склероз (SOD1, ALS2, STEX, FUS, TARDBP и VEGF), болезнь Альцгеймера (APP, AAA, CVAP, AD1, APOE, AD2, PSEN2, AD4, STM2, APBB2, FE65L1, NOS3, PLAU, URK, ACE, DCP1, ACE1, MPO, PACIP1, PAXIP1L, PTIP, A2M, BLMH, BMH, PSEN1 и AD3), аутизм (BZRAP1, MDGA2, GLO1, MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, NLGN4, NLGN3, KIAA1260 и AUTSX2), синдром ломкой Х-хромосомы (FMR2, FXR1, FXR2 и mGLUR5), болезнь Хантингтона (HD, IT15, PRNP, PRIP, JPH3, JP3, HDL2, TBP и SCA17), болезнь Паркинсона (NR4A2, NURR1, NOT, TINUR, SNCAIP, TBP, SCA17, SNCA, NACP, PARK1, PARK4, DJ1, DBH и NDUFV2), синдром Ретта (MECP2, RTT, PPMX, MRX16, MRX79, CDKL5 и STK9), шизофрения (GSK3, 5-HTT, COMT, DRD, SLC6A3, DAOA и DTNBP1), расстройство, связанное с секретазой (APH-1) и т.д.];
(5) глазные болезни [возрастная макулярная дегенерация (Abcr, Ccl2, cp, Timp3, катепсин D, Vldlr и Ccr2), катаракта (CRYAA, CRYA1, CRYBB2, CRYB2, PITX3, BFSP2, CP49, CP47, PAX6, AN2, MGDA, CRYBA1, CRYB1, CRYGC, CRYG3, CCL, LIM2, MP19, CRYGD, CRYG4, BSFP2, CP49, CP47, HSF4, CTM, MIP, AQP0, CRYAB, CRYA2, CTPP2, CRYBB1, CRYGD, CRYG4, CRYA1, CJAB, CX50, CAE1, GJA3, CX46, CZP3, CAE3, CCM1, CAM и KRIT1), помутнение роговицы (APOA1, TGFB1, CSD2, CDGG1, CSD, BIGH3, CDG2, TASTD2, TROP2, M1S1, VSX1, RINX, PPCD, PPD, KTCN, COL8A2, FECD, PPCD2, PIP5K3 и CFD), семейно-наследственные аномалии роговицы (KERA и CNA2), глаукома (MYOC, TIGR, GLC1A, JOAG, GPOA, OPTN, GLC1E, FIP2, HYPL, NRP, CYP1B1, GLC3A, OPA1, NTG, NPG, CYP1B1 и GLC3A), врожденный амавроз Лебера (CRB1, RP12, CRX, CORD2, CRD, RPGRIP1, LCA6, CORD9, RPE65, RP20, AIPL1, LCA4, GUCY2D, GUC2D, LCA1, CORD6, RDH12 и LCA3), макулярная дистрофия (ELOVL4, ADMD, STGD2, STGD3, RDS, RP7, PRPH2, PRPH, AVMD, AOFMD и VMD2) и т.д.]; и
(6) неопластические заболевания [злокачественная опухоль, неоваскулярная глаукома, гемангиома у детей, множественная миелома, хроническая саркома, метастатическая меланома, саркома Капоши, васкулярная пролиферация, кахексия, метастазы рака молочной железы и т.д., различные типы рака (например, колоректальный рак (например, семейный колоректальный рак, наследственный неполипозный колоректальный рак и стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта), рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и злокачественная мезотелиома), мезотелиома, рак поджелудочной железы (например, протоковый рак поджелудочной железы), рак желудка (например, папиллярная аденокарцинома, аденокарцинома слизистой и аденосквамозная карцинома), рак молочной железы (например, инвазивный протоковый рак молочной железы, неинвазивный протоковый рак молочной железы и воспалительный рак молочной железы), рак яичников (например, эпителиальный рак яичников, внегонадная опухоль из зародышевых клеток, опухоль яичника из зародышевых клеток и опухоль яичника с низким злокачественным потенциалом), рак предстательной железы (например, гормонозависимый рак предстательной железы и гормононезависимый рак предстательной железы), рак печени (например, первичный рак печени и рак внепеченочных желчных протоков), рак щитовидной железы (например, медуллярный рак щитовидной железы), рак почки (например, почечно-клеточный рак и переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника), рак матки, опухоль головного мозга (например, астроцитома пинеальной области, пилоцитарная астроцитома, диффузная астроцитома и анапластическая астроцитома), меланома, саркома, рак мочевого пузыря, рак крови и т.д., включая множественную миелому, аденома гипофиза, глиома, акустическая шваннома, саркома сетчатки, рак горла, рак голосовых связок, рак языка, тимома, рак пищевода, рак двенадцатиперстной кишки, рак толстой кишки, рак прямой кишки, гепатоцеллюлярная карцинома, эндокринная опухоль поджелудочной железы, рак желчных протоков, рак желчного пузыря, рак полового члена, рак мочеточника, опухоль яичка, рак вульвы, рак шейки матки, рак тела матки, саркома матки, трофобластическая болезнь, рак влагалища, рак кожи, грибовидный микоз, базально-клеточная опухоль, саркома мягких тканей, злокачественная лимфома, болезнь Ходжкина, миелодиспластический синдром, Т-клеточный лейкоз взрослых, хроническое миелопролиферативное заболевание, эндокринная опухоль поджелудочной железы, фиброзная гистиоцитома, лейомиосаркома, рабдомиосаркома и рак неизвестного первичного происхождения), лейкоз (например, острый лейкоз (например, острый лимфолейкоз и острый миелоидный лейкоз, хронический лейкоз (например, хронический лимфолейкоз и хронический миелоидный лейкоз) и миелодиспластический синдром), саркома матки (например, смешанная мезодермальная опухоль, лейомиосаркома матки и опухоль стромы эндометрия), миелофиброз и т.д.].
[0049] Композицию по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства можно получить способом, известным в области технологий приготовления фармацевтических препаратов, с использованием фармацевтически приемлемого носителя. Примеры лекарственной формы лекарственного средства могут включать препараты для парентерального введения (например, растворы, такие как инъекционные растворы) с добавлением обычно используемых вспомогательных агентов, таких как буфер и/или стабилизатор, и препараты для местного применения, такие как мази, кремы, растворы или пластыри с добавлением обычно используемых фармацевтических носителей.
[0050] Композицию по настоящему изобретению можно использовать для переноса активного ингредиента во многие типы клеток, тканей или органов. Примеры клетки, для которой можно использовать композицию по настоящему изобретению, включают клетку селезенки, нервную клетку, глиальную клетку, В-клетку поджелудочной железы, клетку костного мозга, мезангиальную клетку, клетку Лангерганса, эпидермальную клетку, эпителиальную клетку, эндотелиальную клетку, фибробласт, клетку волокна, мышечную клетку (например, клетку скелетной мышцы, клетку сердечной мышцы, миобласт и клетку-сателлит), жировую клетку, иммунную клетку (например, макрофаг, Т-клетку, В-клетку, естественную клетку-киллер, тучную клетку, нейтрофил, базофил, эозинофил, моноцит и мегакариоцит), синовиальную клетку, хрящевую клетку, костную клетку, остеобласт, остеокласт, клетку молочной железы, клетку печени или стромальную клетку, яйцеклетку, сперматозоид или клетки-предшественники, индуцируемые для дифференцировки в указанные клетки, стволовые клетки (включая, например, индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (iPS-клетку) и эмбриональную стволовую клетку (ES-клетку)), клетку крови, ооцит и оплодотворенную яйцеклетку. Примеры ткани или органа, для которых можно использовать композицию по настоящему изобретению, включают любую ткань или орган, где присутствует вышеуказанная клетка, например, такие как головной мозг, каждый участок мозга (например, обонятельная луковица, миндалевидное тело, церебральные базальные ганглии, гиппокамп, таламус, гипоталамус, ядро гипоталамуса, кора головного мозга, продолговатый мозг, мозжечок, затылочная доля, лобная доля, височная доля, путамен, хвостатое ядро, мозолистое тело и черная субстанция), спинной мозг, гипофиз, желудок, поджелудочная железа, почка, печень, половые железы, щитовидная железа, желчный пузырь, костный мозг, надпочечники, кожа, мышцы, легкие, желудочно-кишечный тракт (например, толстый и тонкий кишечник), кровеносный сосуд, сердце, вилочковая железа, селезенка, поднижнечелюстная железа, периферическая кровь, клетка периферической крови, предстательная железа, семенники, яичко, яичник, плацента, матка, кости, суставы и скелетные мышцы. Эти клетки, ткани или органы могут представлять собой опухолевые клетки, опухолевые ткани и т.п., возникшие в результате злокачественной трансформации.
[0051] В одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию по настоящему изобретению используют для переноса нуклеиновой кислоты в качестве активного ингредиента в клетку, отличную от клетки сердечной мышцы, или ткань или орган, отличные от сердца.
[0052] Композиция по настоящему изобретению является высокоэффективной, в частности, с точки зрения эффективности переноса нуклеиновой кислоты в опухолевую клетку.
[0053] Соединение, липидную частицу и композицию по настоящему изобретению можно использовать со стабильностью, низкой токсичностью и безопасностью. В случае применения композиции по настоящему изобретению in vivo или в качестве лекарственного средства композицию можно вводить реципиенту (например, человеку или млекопитающему, отличному от человека (например, мыши, крысе, хомяку, кролику, кошке, собаке, крупному рогатому скоту, овце или обезьяне) (предпочтительно человеку)), таким образом, что эффективное количество нуклеиновой кислоты доставляется в целевую клетку.
[0054] В случае применения композиции по настоящему изобретению in vivo или в качестве лекарственного средства композицию можно безопасно вводить в виде фармацевтического препарата, например, такого как таблетки (включая таблетки с сахарным покрытием, таблетки с пленочным покрытием, сублингвальные таблетки и перорально распадающиеся таблетки), порошки, гранулы, капсулы (включая мягкие капсулы и микрокапсулы), растворы, пастилки, сиропы, эмульсии, суспензии, инъекционные растворы (например, инъекционные растворы для подкожного введения, инъекционные растворы для внутривенного введения, инъекционные растворы для внутримышечного введения и инъекционные растворы для внутрибрюшинного введения), препараты для наружного применения (например, препараты для трансназального введения, препараты для трансдермального введения, мази), суппозитории (например, ректальные суппозитории и вагинальные суппозитории), гранулы, средства для трансназального введения, средства для транспульмонарного введения (ингалянты) или капли для перорального или парентерального пути введения (например, местного, ректального или внутривенного введения). Эти препараты могут представлять собой препараты с контролируемым высвобождением, такие как препараты с быстрым высвобождением или препараты с замедленным высвобождением (например, микрокапсулы с замедленным высвобождением).
[0055] Далее будет описан способ получения соединения по настоящему изобретению.
[0056] Исходное вещество или реагент, используемые на любой стадии способа получения, приведенного ниже, и полученное соединение каждое из них может образовывать соль. Примеры такой соли включают такую же, как вышеуказанная соль соединения по настоящему изобретению.
[0057] Когда соединение, полученное на любой стадии, является свободным соединением, то это соединение можно превратить в представляющую интерес соль известным способом. С другой стороны, когда соединение, полученное на любой стадии, представляет собой соль, то эта соль можно превратить в свободную форму или другой тип представляющей интерес соли известным способом.
[0058] Соединение, полученное на любой стадии, можно использовать в следующей реакции в виде реакционного раствора или после получения в виде неочищенного продукта. Альтернативно, соединение, полученное на любой стадии, может быть выделено и/ или очищено из реакционной смеси с помощью подхода разделения, такого как концентрирование, кристаллизация, перекристаллизация, перегонка, экстракция растворителем, фракционирование или хроматография в соответствии с обычным методом.
[0059] Если исходное вещество или соединение-реагент для любой стадии является коммерчески доступным, то коммерчески доступный продукт можно использовать непосредственно.
[0060] В реакции на любой стадии время реакции может различаться в зависимости от используемого реагента или растворителя и обычно составляет от 1 мин до 48 ч, предпочтительно от 10 мин до 8 ч, если не указано иное.
[0061] В реакции на любой стадии температура реакции может различаться в зависимости от используемого реагента или растворителя и обычно составляет от -78°C до 300°C, предпочтительно от -78°C до 150°C, если не указано иное.
[0062] В реакции на любой стадии давление может различаться в зависимости от используемого реагента или растворителя и обычно составляет от 1 атм до 20 атм, предпочтительно от 1 атм до 3 атм, если не указано иное.
[0063] В реакции на любой стадии можно использовать реактор для микроволнового синтеза, например, Initiator, производства Biotage Japan Ltd. Температура реакции может различаться в зависимости от используемого реагента или растворителя и обычно составляет от комнатной температуры до 300°С, предпочтительно от комнатной температуры до 250°С, более предпочтительно от 50°С до 250°С, если не указано иное. Время реакции может различаться в зависимости от используемого реагента или растворителя и обычно составляет от 1 мин до 48 ч, предпочтительно от 1 мин до 8 ч, если не указано иное.
[0064] В реакции на любой стадии реагент используется в количестве от 0,5 экв до 20 экв, предпочтительно от 0,8 экв до 5 экв, в расчете на субстрат, если не указано иное. В случае использования реагента в качестве катализатора, то реагент используется в количестве от 0,001 экв до 1 экв, предпочтительно от 0,01 экв до 0,2 экв, в расчете на субстрат. Когда реагент также служит растворителем в реакции, то реагент используется в том же количестве, что и растворитель.
[0065] В реакции на любой стадии, эту реакцию проводят без растворителя или при растворении или суспендировании в подходящем растворителе, если не указано иное. Конкретные примеры растворителя включают растворители, описанные в примерах, и являются следующими:
[0066] спирты: метанол, этанол, изопропанол, изобутанол, трет-бутиловый спирт, 2-метоксиэтанол и тому подобное;
простые эфиры: диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, дифениловый эфир, тетрагидрофуран, 1,2-диметоксиэтан, циклопентилметиловый эфир и тому подобное;
ароматические углеводороды: хлорбензол, толуол, ксилол и тому подобное;
насыщенные углеводороды: циклогексан, гексан, гептан и тому подобное;
амиды: N,N-диметилформамид, N-метилпирролидон и т.п.;
галогенированные углеводороды: дихлорметан, четыреххлористый углерод и тому подобное;
нитрилы: ацетонитрил и тому подобное;
сульфоксиды: диметилсульфоксид и тому подобное;
ароматические органические основания: пиридин и тому подобное;
ангидриды кислот: уксусный ангидрид и тому подобное;
органические кислоты: муравьиная кислота, уксусная кислота, трифторуксусная кислота и тому подобное;
неорганические кислоты: соляная кислота, серная кислота и т.п.;
сложные эфиры: этилацетат, изопропиловый эфир уксусной кислоты и тому подобное.;
кетоны: ацетон, метилэтилкетон и тому подобное; и
вода.
Два или более из этих растворителей можно использовать в виде смеси в соответствующем соотношении.
[0067] В случае использования основания в реакции на любой стадии, например, используется следующее основание или основание, описанное в примерах:
[0068] неорганические основания: гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид магния и тому подобное;
основные соли: карбонат натрия, карбонат кальция, бикарбонат натрия и тому подобное;
органические основания: триэтиламин, диэтиламин, N,N-диизопропилэтиламин, пиридин, 4-диметиламинопиридин, N,N-диметиланилин, 1,4-диазабицикло[2.2.2]октан, 1,8-диазабицикло [5.4.0]-7-ундецен, имидазол, пиперидин и тому подобное;
алкоксиды металлов: этоксид натрия, трет-бутоксид калия, трет-бутоксид натрия и тому подобное;
гидриды щелочных металлов: гидрид натрия и тому подобное;
амиды металлов: амид натрия, диизопропиламид лития, гексаметилдисилазид лития и тому подобное; и
органические соединения лития: н-бутиллитий, втор-бутиллитий и тому подобное.
[0069] В случае использования кислоты или кислотного катализатора в реакции на любой стадии, например, используется следующий кислый или кислотный катализатор или кислота или кислотный катализатор, описанные в примерах:
[0070] неорганические кислоты: соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота и тому подобное;
органические кислоты: уксусная кислота, трифторуксусная кислота, лимонная кислота, п-толуолсульфоновая кислота, 10-камфорсульфоновая кислота и тому подобное; и
кислоты Льюиса: комплекс трифторид бора-диэтиловый эфир, йодид цинка, безводный хлорид алюминия, безводный хлорид цинка, безводный хлорид железа и т.п.
[0071] Реакцию на любой стадии проводят известным способом, например, способом, описанным в The Fifth Series of Experimental Chemistry, Vol. 13 to Vol 19 (edited by The Chemical Society of Japan); Shin Jikken Kagaku Koza (in Japanese, translated title: New Experimental Chemistry), Vol. 14 to Vol. 15 (edited by The Chemical Society of Japan); Seimitsu Yuki Kagaku (in Japanese, translated title: Precise Organic Chemistry, original title: Reaktionen und Synthesen im organisch-chemischen Praktikum und Forschungslaboratorium) Revised, 2nd Ed. (L. F. Tietze, Th. Eicher, Nankodo Co., Ltd.); Organic Named Reactions; The Reaction Mechanism and Essence, Revised (Hideo Tougo, Kodansha Ltd.); Organic Syntheses Collective Volume I to VII (John Wiley & Sons, Inc.); Modern Organic Synthesis in the Laboratory: A Collection of Standard Experimental Procedures (Jie Jack Li, Oxford University Press); Comprehensive Heterocyclic Chemistry III, Vol. 1 to Vol. 14 (Elsevier Japan KK); Strategic Applications of Named Reactions in Organic Synthesis (translated by Kiyoshi Tomioka, published by Kagaku-Dojin Publishing Company, Inc.); Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers, Inc.) (1989) и т.д., или способом, описанным в примерах, если не указано иное.
[0072] На любой стадии реакцию защиты или снятия защиты функциональной группы проводят в соответствии с известным способом, например, способом, описанным в монографии «Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed.» (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts), Wiley-Interscience (2007); «Protecting Groups, 3rd Ed.» (P.J. Kocienski), Thieme Medical Publishers (2004) и т.д., или способом, описанным в примерах.
[0073] Примеры защитной группы для гидроксигруппы или фенольной гидроксигруппы в спирте и т.п. включают: защитные группы типа простого эфира, такие как метоксиметиловый эфир, бензиловый эфир, п-метоксибензиловый эфир, трет-бутилдиметилсилиловый эфир, трет-бутилдифенилсилиловый эфир и тетрагидропираниловый эфир; защитные группы типа сложного эфира карбоновой кислоты, такие как сложный эфир уксусной кислоты; защитные группы типа сложного эфира сульфоновой кислоты, такие как сложный эфир метансульфоновой кислоты; и защитные группы типа сложного эфира карбоновой кислоты, такие как трет-бутилкарбонат.
[0074] Примеры защитной группы для карбонильной группы в альдегиде включают: защитные группы типа ацеталя, такие как диметилацеталь; и защитные группы типа циклического ацеталя, такие как циклический 1,3-диоксан.
[0075] Примеры защитной группы для карбонильной группы в кетоне включают: защитные группы типа кеталя, такие как диметилкеталь; защитные группы типа циклического кеталя, такие как циклический 1,3-диоксан; защитные группы типа оксима, такие как О-метилоксим; и защитные группы типа гидразона, такие как N,N-диметилгидразон.
[0076] Примеры защитной группы для карбоксильной группы включают: защитные группы сложноэфирного типа, такие как метиловый эфир; и защитные группы амидного типа, такие как N,N-диметиламид.
[0077] Примеры защитной группы для тиола включают: защитные группы типа простого эфира, такие как бензилтиоэфир; и защитные группы сложноэфирного типа, такие как сложный эфир тиоуксусной кислоты, тиокарбонат и тиокарбамат.
[0078] Примеры защитной группы для аминогруппы или ароматического гетероциклического кольца, такого как имидазол, пиррол или индол, включают: защитные группы карбаматного типа, такие как бензилкарбамат; защитные группы амидного типа, такие как ацетамид; защитные группы алкиламинового типа, такие как N-трифенилметиламин; и защитные группы сульфонамидного типа, такие как метансульфонамид.
[0079] Такие защитные группы можно удалить с использованием известного метода, например, метода с использованием кислоты, основания, ультрафиолетового света, гидразина, фенилгидразина, N-метилдитиокарбамата натрия, фторида тетрабутиламмония, ацетата палладия или триалкилсилилгалогенида (например, триметилсилилйодида и триметилсилилбромида) или метода восстановления.
[0080] В случае проведения реакции восстановления на любой стадии примеры используемого восстанавливающего агента включают: гидриды металлов, такие как алюмогидрид лития, триацетоксиборгидрид натрия, цианоборгидрид натрия, гидрид диизобутилалюминия (DIBAL-H), боргидрид натрия и триацетоксиборгидрид тетраметиламмония; бораны, такие как комплекс боран-тетрагидрофуран; никель Ренея; кобальт Ренея; водород; и муравьиная кислота. Например, никель Ренея или кобальт Ренея можно использовать в присутствии водорода или муравьиной кислоты. В случае восстановления двойной или тройной углерод-углеродной связи может быть использован способ с использованием катализатора, такого как палладий на угле или катализатор Линдлара.
[0081] В случае проведения реакции окисления на любой стадии примеры используемого окисляющего агента включают: перкислоты, такие как м-хлорпербензойная кислота (MCPBA), пероксид водорода и трет-бутилгидропероксид; перхлораты, такие как перхлорат тетрабутиламмония; хлораты, такие как хлорат натрия; хлориты, такие как хлорит натрия; периодаты, такие как периодат натрия; реагенты на основе гипервалентного йода, такие как йодозилбензол; реагенты, содержащие марганец, такие как диоксид марганца и перманганат калия; соединения свинца, такие как тетраацетат свинца; реагенты, содержащие хром, такие как хлорхромат пиридиния (PCC), дихромат пиридиния (PDC) и реагенты Джонса; галогенсодержащие соединения, такие как N-бромсукцинимид (NBS); кислород; озон; комплекс триоксид серы-пиридин; тетраоксид осмия; диоксид селена; и 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон (DDQ).
[0082] В случае проведения реакции радикальной циклизации на любой стадии примеры используемого радикального инициатора включают: азосоединения, такие как азобисизобутиронитрил (AIBN); водорастворимые радикальные инициаторы, такие как 4-4'-азобис-4-цианопентановая кислота (ACPA); триэтилбор в присутствии воздуха или кислорода; и бензоилпероксид. Примеры используемого радикального реакционного агента включают трибутилстаннан, тристриметилсилилсилан, 1,1,2,2-тетрафенилдисилан, дифенилсилан и йодид самария.
[0083] В случае проведения реакции Виттига на любой стадии примеры используемого реагента Виттига включают алкилиденфосфораны. Алкилиденфосфораны можно получить известным способом, например, взаимодействием соли фосфония и сильного основания.
[0084] В случае проведения реакции Хорнера-Эммонса на любой стадии примеры используемого реагента включают: сложные эфиры фосфоноуксусной кислоты, такие как метилдиметилфосфоноацетат и этилдиэтилфосфоноацетат; и основания, такие как гидриды щелочных металлов и органические соединения лития.
[0085] В случае проведения реакции Фриделя-Крафтса на любой стадии примеры используемого реагента включают кислоту Льюиса и хлорангидрид или алкилирующий агент (например, алкилгалогениды, спирты и олефины). Альтернативно, вместо кислоты Льюиса можно использовать органическую кислоту или неорганическую кислоту, и вместо хлорангидрида можно использовать ангидрид кислоты, такой как уксусный ангидрид.
[0086] В случае проведения реакции ароматического нуклеофильного замещения на любой стадии в качестве реагентов используется нуклеофил (например, амины и имидазол) и основание (например, основные соли и органические основания).
[0087] В случае проведения реакции нуклеофильного присоединения с использованием карбаниона, реакции нуклеофильного 1,4-присоединения (реакция присоединения Михаэля) с использованием карбаниона или реакции нуклеофильного замещения с использованием карбаниона на каждой стадии, то примеры основания, используемого для образования карбаниона, включают органические соединения лития, алкоксиды металлов, неорганические основания и органические основания.
[0088] В случае проведения реакции Гриньяра на любой стадии примеры реактива Гриньяра включают галогениды арилмагния, такие как бромид фенилмагния; и галогениды алкилмагния, такие как бромид метилмагния и бромид изопропилмагния. Реагент Гриньяра может быть получен известным способом, например, взаимодействием алкилгалогенида или арилгалогенида и металлического магния с простым эфиром или тетрагидрофураном в качестве растворителя.
[0089] В случае проведения реакции конденсации Кневенагеля на любой стадии в качестве реагентов используются соединение с активной метиленовой группой, окруженной двумя электронно-притягивающими группами (например, малоновая кислота, диэтилмалонат и малононитрил), и основание (например, органические основания, алкоксиды металлов и неорганические основания).
[0090] В случае проведения реакции Вильсмайера-Хаака на любой стадии в качестве реагентов используются фосфорилхлорид и производное амида (например, N,N-диметилформамид).
[0091] В случае проведения реакции азидирования спиртов, алкилгалогенидов или сложных эфиров сульфоновой кислоты на любой стадии примеры используемого азидирующего агента включают дифенилфосфорилазид (DPPA), триметилсилилазид и азид натрия. В случае азидирования, например, спиртов, можно использовать метод с использованием дифенилфосфорилазида и 1,8-диазабицикло[5.4.0] ундек-7-ена (DBU), метод с использованием триметилсилилазида и кислоты Льюиса или тому подобное.
[0092] В случае проведения реакции восстановительного аминирования на любой стадии примеры используемого восстанавливающего агента включают триацетоксиборгидрид натрия, цианоборгидрид натрия, водород и муравьиную кислоту. Когда субстратом является амин, то примеры используемого карбонильного соединения включают п-формальдегид, а также альдегиды, такие как ацетальдегид, и кетоны, такие как циклогексанон. Когда субстрат представляет собой карбонильное соединение, то примеры используемых аминов включают: первичный амин, такой как аммиак и метиламин; и вторичный амин, такой как диметиламин.
[0093] В случае проведения реакции Мицунобу на любой стадии в качестве реагентов используют сложные эфиры азодикарбоновой кислоты (например, диэтилазодикарбоксилат (DEAD) и диизопропилазодикарбоксилат (DIAD)) и трифенилфосфин.
[0094] В случае проведения реакции этерификации, реакции амидирования или реакции образования производных мочевины на любой стадии, примеры используемого реагента включают: ацилгалогенидную форму хлорангидрида, бромангидрид и тому подобное; и активированные карбоновые кислоты, такие как ангидрид кислоты, форма активного сложного эфира и форма сложного эфира серной кислоты. Примеры активатора карбоновой кислоты включают: карбодиимидные конденсирующие агенты, такие как 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (WSCD); триазиновые конденсирующие агенты, такие как 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид-н-гидрат (DMT-MM); конденсирующие агенты на основе сложного эфира карбоновой кислоты, такие как 1,1-карбонилдиимидазол (CDI); дифенилфосфорилазид (DPPA); соль бензотриазол-1-илокси-трисдиметиламинофосфония (реагент BOP); йодид 2-хлор-1-метилпиридиния (реагент Мукаямы); тионилхлорид; галогенформиат низшего алкила, такой как этилхлорформиат; О-(7-азабензотриазол-1-ил)-N, N, N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат (HATU); серная кислота; и их комбинации. В случае использования карбодиимидного конденсирующего агента в реакцию можно дополнительно добавить такое дополнительное соединение, как 1-гидроксибензотриазол (HOBt), N-гидроксисукцинимид (HOSu) или диметиламинопиридин (DMAP).
[0095] В случае проведения реакции сочетания на любой стадии примеры используемого металлического катализатора включают: соединения палладия, такие как ацетат палладия (II), тетракис(трифенилфосфин)палладий (0), дихлорбис(трифенилфосфин) палладий (II), дихлорбис(триэтилфосфин)палладий (II), трис (дибензилиденацетон)дипалладий (0), 1,1'-бис(дифенилфосфино) ферроценпалладий (II) хлорид и ацетат палладия (II); соединения никеля, такие как тетракис(трифенилфосфин)никель (0); соединения родия, такие как трис(трифенилфосфин)родия хлорид (III); соединения кобальта; соединения меди, такие как оксид меди и йодид меди (I); и соединения платины. Для реакции дополнительно может быть добавлено основание. Примеры такого основания включают неорганические основания и основные соли.
[0096] В случае проведения реакции тиокарбонилирования на любой стадии в качестве тиокарбонилирующего агента обычно используют пентасульфид фосфора. Реагент, имеющий структуру 1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфида, такой как 2,4-бис (4-метоксифенил-1,3,2,4-дитиадифосфетан-2,4-дисульфид (реагент Лавессона)) можно использовать вместо пентасульфида фосфора.
[0097] В случае проведения реакции Воля-Циглера на любой стадии примеры используемого галогенирующего агента включают N-йодсукцинимид, N-бромсукцинимид (NBS), N-хлорсукцинимид (NCS), бром и сульфурилхлорид. Реакцию можно ускорить дополнительным добавлением тепла, света, радикального инициатора, такого как бензоилпероксид или азобисизобутиронитрил, для реакции.
[0098] В случае проведения реакции галогенирования гидроксигруппы на любой стадии примеры используемого галогенирующего агента включают галогенводородную кислоту и галогенангидрид неорганической кислоты, в частности соляную кислоту, тионилхлорид и оксихлорид фосфора для хлорирования, и 48% бромистоводородную кислоту для бромирования. Также можно использовать способ получения алкилгалогенидной формы из спирта под действием трифенилфосфина и четыреххлористого углерода, четырехбромистого углерода или т.п. В качестве альтернативы может быть использован способ синтеза алкилгалогенидной формы посредством двухстадийных реакций, включающих превращение спирта в сложный эфир сульфоновой кислоты и последующую реакцию с бромидом лития, хлоридом лития или иодидом натрия.
[0099] В случае проведения реакции Арбузова на любой стадии примеры используемого реагента включают: алкилгалогениды, такие как этилбромацетат; и фосфиты, такие как триэтилфосфит и три(изопропил)фосфит.
[0100] В случае проведения реакции этерификации сульфона на любой стадии примеры используемого сульфонилирующего агента включают метансульфонилхлорид, п-толуолсульфонилхлорид, метансульфоновый ангидрид, п-толуолсульфоновый ангидрид и трифторметансульфоновый ангидрид.
[0101] В случае проведения реакции гидролиза на любой стадии в качестве реагента используют кислоту или основание. В случае проведения реакции кислотного гидролиза трет-бутилового эфира можно добавить муравьиную кислоту, триэтилсилан или тому подобное, для восстановительного улавливания побочного продукта трет-бутильного катиона.
[0102] В случае проведения реакции дегидратации на любой стадии примеры используемого дегидратирующего агента включают серную кислоту, пентоксид фосфора, оксихлорид фосфора, N, N'-дициклогексилкарбодиимид, оксид алюминия и полифосфорную кислоту.
[0103] Соединение (I) можно получить, например, способом получения, приведенным ниже. В настоящем изобретении соединение (I), имеющее желаемую структуру, можно синтезировать с использованием исходного вещества, подходящего для структуры интересующего соединения (I), в частности, для этерификации. Соль соединения (I) можно получить подходящим смешиванием с неорганическим основанием, органическим основанием, органической кислотой или основной или кислой аминокислотой.
[0104] Формула 4-1
Формула 4-2
Формула 4-3
Формула 4-4
[0105] Далее будут описаны способы получения липидной частицы, содержащей соединение по настоящему изобретению, и композиции для переноса нуклеиновой кислоты (трансфекции), содержащей липидную частицу и нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента.
[0106] Липидную частицу по настоящему изобретению можно получить известным способом получения липидных частиц из липидных компонентов после смешивания соединения по настоящему изобретению в виде катионного липида, если необходимо, с дополнительным липидным компонентом. Например, (смешанный) липидный компонент, описанный выше, растворяют в органическом растворителе, и полученный раствор в органическом растворителе можно смешать (например, методом эмульгирования) с водой или буферным раствором с получением дисперсии липидных частиц. Смешивание можно выполнить с использованием микрожидкостной системы смешивания (например, устройства NanoAssemblr (Precision NanoSystems Inc.)). Полученная липидная частица может быть подвергнута обессоливанию или диализу и стерильной фильтрации. При необходимости может быть проведена корректировка pH или осмотического давления.
[0107] Соединение (I) может принимать множество структур за счет комбинаций значений n1, n2, n3, L, Ra, Rb, Rc, Rd, Re и Rf в формуле (I). При получении липидной частицы можно использовать один тип соединения, имеющий конкретную структуру, в качестве соединения (I) или можно использовать несколько типов соединений, различающихся по структуре, в виде смеси.
[0108] Примеры «дополнительного липидного компонента» включают структурированные липиды, упомянутые выше, например стерины, фосфолипиды и полиэтиленгликоль-содержащие липиды. «Дополнительный липидный компонент» используется, например, в количестве от 0,008 до 4 моль из расчета на 1 моль соединения по настоящему изобретению. Для использования соединение по настоящему изобретению предпочтительно смешивают с дополнительным липидным компонентом (в частности, холестерином, фосфатидилхолином и полиэтиленгликоль-содержащим липидом). В случае использования соединения по настоящему изобретению и дополнительного липидного компонента в смеси, то предпочтительным вариантом является смесь, включающая от 1 до 4 моль соединения по настоящему изобретению, от 0 до 3 моль стерина, от 0 до 2 моль фосфолипида и от 0 до 1 моль полиэтиленгликоль-содержащего липида. В случае использования соединения по настоящему изобретению и дополнительного липидного компонента в смеси, то более предпочтительным вариантом является смесь, включающая от 1 до 1,5 моль соединения по настоящему изобретению, от 0 до 1,25 моль стерина, от 0 до 0,5 моль фосфолипида и от 0 до 0,125 моль полиэтиленгликоль-содержащего липида.
[0109] Концентрация соединения по настоящему изобретению или смеси соединения по настоящему изобретению с дополнительным липидным компонентом в растворе в органическом растворителе, описанном выше, предпочтительно составляет от 0,5 до 100 мг/мл.
[0110] Примеры органического растворителя включают метанол, этанол, 1-пропанол, 2-пропанол, 1-бутанол, трет-бутанол, ацетон, ацетонитрил, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид и их смеси. Органический растворитель может содержать от 0 до 20% воды или буферного раствора.
[0111] Примеры буферного раствора включают кислые буферные растворы (например, ацетатный буферный раствор, цитратный буферный раствор, буферный раствор на основе 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES) и фосфатный буферный раствор) и нейтральные буферные растворы (например, буферный раствор на основе 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), буферный раствор на основе трис(гидроксиметил) аминометана (Трис), фосфатный буферный раствор и забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)).
[0112] В случае проведения смешивания с использованием микрофлюидной системы смешивания 1-5 частей по объему воды или буферного раствора предпочтительно смешивают с 1 частью по объему раствора в органическом растворителе. В системе скорость потока смешанного раствора (смешанный раствор из раствора в органическом растворителе с водой или буферным раствором) составляет, например, от 0,01 до 20 мл/мин, предпочтительно от 0,1 до 10 мл/мин, и температура равняется, например, от 5°C до 60°C, предпочтительно от 15°C до 45°C.
[0113] Композицию по настоящему изобретению можно получить в виде дисперсии липидных частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, добавлением нуклеиновой кислоты к воде или буферному раствору с получением липидной частицы или дисперсии липидных частиц. Нуклеиновая кислота предпочтительно добавляется таким образом, чтобы концентрация нуклеиновой кислоты в воде или буферном растворе составляла, например, от 0,01 до 20 мг/мл, предпочтительно от 0,05 до 2,0 мг/мл.
[0114] Альтернативно, композицию по настоящему изобретению можно получить в виде дисперсии липидных частиц, содержащих активный ингредиент, смешиванием липидной частицы или дисперсии липидных частиц с нуклеиновой кислотой или ее водным раствором известным способом. Дисперсию липидных частиц можно получить диспергированием липидных частиц в подходящей дисперсионной среде. Водный раствор активного ингредиента можно приготовить растворением активного ингредиента в подходящем растворителе.
[0115] Содержание соединения по настоящему изобретению в композиции по настоящему изобретению, исключая дисперсионную среду и растворитель, обычно составляет от 10 до 70 мас.%, предпочтительно от 40 до 70 мас.%.
[0116] Содержание нуклеиновой кислоты в композиции по настоящему изобретению, исключая дисперсионную среду и растворитель, обычно составляет от 0,1 до 25 мас.%, предпочтительно от 1 до 20 мас.%.
[0117] Дисперсионную среду в дисперсии липидных частиц или дисперсии, содержащей композицию, можно заменить на воду или буферный раствор диализом. Диализ проводят при температуре от 4°C до комнатной температуры с использованием ультрафильтрационной мембраны, имеющей отсечение по молекулярной массе от 10 до 20 K. Диализ можно проводить неоднократно. При замене дисперсионной среды может применяться тангенциальная проточная фильтрация (TFF). После замены дисперсионной среды при необходимости может быть проведена корректировка pH или осмотического давления. Примеры регулятора pH включают гидроксид натрия, лимонную кислоту, уксусную кислоту, триэтаноламин, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия. Примеры регулятора осмотического давления включают: неорганические соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидрофосфат натрия и дигидрофосфат калия; полиолы, такие как глицерин, маннит и сорбитол; и сахара, такие как глюкоза, фруктоза, лактоза и сахароза. pH обычно устанавливается в диапазоне от 6,5 до 8,0, предпочтительно от 7,0 до 7,8. Осмотическое давление предпочтительно устанавливается от 250 до 350 Осм/кг.
[0118] Композиция по настоящему изобретению может содержать, если необходимо, компонент, отличный от липидной частицы и нуклеиновой кислоты. Примеры такого компонента включают соответствующие количества стабилизатора и антиоксиданта.
[0119] Примеры стабилизатора включают, не ограничиваясь этим, сахара, такие как глицерин, маннит, сорбит, лактозу и сахарозу.
[0120] Примеры антиоксиданта включают аскорбиновую кислоту, мочевую кислоту, цистеин, гомологи токоферола (витамин Е, четыре изомера токоферола, α, β, γ и δ и т.д.), ЭДТА и цистеин.
[0121] Далее будут описаны способы анализа липидной частицы, содержащей соединение по настоящему изобретению, и композиции, содержащей липидную частицу и нуклеиновую кислоту в качестве активного ингредиента.
[0122] Размер липидной частицы (в композиции) можно определить известным способом. Например, размер частиц можно рассчитать как Z-средний размер частиц с помощью кумулянтного анализа автокорреляционной функции с использованием анализатора для определения размера частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), основанного на методике измерения динамического рассеяния света. Размер (средний размер частиц) липидной частицы (в композиции) составляет, например, от 10 до 200 нм, предпочтительно от 60 до 170 нм.
[0123] Концентрацию и степень инкапсулирования нуклеиновой кислоты (например, siРНК или мРНК) в композиции по настоящему изобретению можно определить с помощью известного подхода. Например, нуклеиновую кислоту метят флуоресцентной меткой с помощью Quant-iT™ RiboGreen (Invitrogen Corp.), и можно измерить интенсивность флуоресценции для определения концентрации и степени инкапсулирования. Концентрацию нуклеиновой кислоты в композиции можно рассчитать с использованием калибровочной кривой, построенной для водных растворов нуклеиновых кислот с известными концентрациями. Степень инкапсулирования может быть рассчитана на основе разницы в интенсивности флуоресценции в присутствии и отсутствии добавления Тритона-X 100 (поверхностно-активного вещества для разрушения липидной частицы). Концентрация нуклеиновой кислоты в композиции относится к общей концентрации нуклеиновой кислоты, инкапсулированной в липидной частице, и неинкапсулированной нуклеиновой кислоты. Степень инкапсуляции относится к отношению нуклеиновой кислоты, инкапсулированной в липидной частице, ко всем нуклеиновым кислотам в композиции.
Примеры
[0124] Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры, примеры получения и экспериментальные примеры, приведенные ниже. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами. В него могут быть внесены изменения или модификации, не выходя за рамки объема настоящего изобретения.
[0125] В приведенных ниже примерах термин «комнатная температура» обычно относится к температуре примерно от 10°C до примерно 35°C. Соотношение, указанное в смешанном растворителе, относится к объемному соотношению, если не указано иное. Термин «%» относится к «мас.%», если не указано иное.
254
[0126] В примерах элюирование для колоночной хроматографии выполняли под контролем ТСХ (тонкослойной хроматографии), если не указано иное. При контроле с помощью ТСХ пластинки 60 F производства Merck KGaA использовали в качестве пластинок для ТСХ, и в качестве проявляющего растворителя использовали растворитель, используемый в качестве элюирующего растворителя в колоночной хроматографии. Для детектирования использовали УФ-детектор, и для наблюдения при необходимости использовали хромогенный реагент для ТСХ. В колоночной хроматографии на силикагеле термин «NH» означает, что использовался силикагель, связанный с аминопропилсиланом, и термин «диол» означает, что использовался силикагель, связанный с 3-(2,3-дигидроксипропокси)пропилсиланом. В препаративной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) термин «C18» означает, что использовался связанный с октадецилом силикагель. Соотношение, указанное в элюирующем растворителе, относится к объемному соотношению, если не указано иное.
1
1
[0127] H ЯМР определяли с помощью ЯМР с преобразованием Фурье. H ЯМР анализировали с использованием программного обеспечения ACD/SpecManager (торговое название) или подобного. Очень слабые пики протонов, например, гидроксильной группы и аминогруппы, могут быть не описаны.
[0128] МС анализировали с помощью ЖХ/МС и MALDI/TOFMS. ESI, APCI или MALDI использовали в качестве метода ионизации. CHCA использовали в качестве матрицы. Измеренные значения (найденные) приведены в данных. Обычно наблюдается пик молекулярного иона. Однако наблюдаемый пик может относиться к фрагментному иону. Для соли наблюдаемый пик обычно относится к свободному молекулярному иону, катионам, анионам или фрагментному иону.
[0129] В приведенных ниже примерах используются следующие сокращенные обозначения.
МС: масс-спектр
M: молярная концентрация
N: нормальность
3
CDCl: дейтерированный хлороформ
6
ДМСО-d: дейтерированный диметилсульфоксид
1
H ЯМР: протонный ядерный магнитный резонанс
ЖХ/МС: жидкостный хроматограф-масс-спектрометр.
ESI: ионизация электрораспылением
APCI: химическая ионизация при атмосферном давлении
MALDI: матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация
TOFMS: времяпролетная масс-спектрометрия
CHCA: α-циано-4-гидроксикоричная кислота
ДМФА: N,N-диметилформамид
THF: тетрагидрофуран
DMAP: 4-диметиламинопиридин
TBAF: фторид тетрабутиламмония
DIBAL-H: гидрид диизобутилалюминия
DBU: 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен
[0130] Пример 1. 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил-4-гептилундеканоат
A) Метиловый эфир 2-гептилнонановой кислоты
В атмосфере азота и при охлаждении на льду 60% суспензию гидрида натрия (в минеральном масле) (3,78 г) в дегидратированном ДМФА (100 мл) перемешивали в течение 10 мин. Затем по каплям добавляли диметилмалонат (5,0 г) при 10°C или ниже. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 10 мин, добавляли по каплям 1-йодгептан (18,3 мл) и смесь нагревали до комнатной температуры. Через 4 ч реакционную смесь нейтрализовали 6 Н соляной кислотой, затем разбавляли этилацетатом, дважды промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток растворяли в ДМСО (75 мл). К раствору добавляли воду (0,68 мл) и хлорид лития (3,21 г), и смесь нагревали до 165°C. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 16 ч, добавляли воду и смесь разбавляли этилацетатом. Разбавленный раствор дважды промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (8,14 г).
1
H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm 0,84-0,90 (6H, м), 1,20-1,32 (20H, м), 1,36-1,47 (2H, м), 1,54-1,62 (2H, м), 2,33 (1H, тт, J=9,0, 5,4 Гц), 3,67 (3H, с).
[0131] B) 2-гептилнонан-1-ол
В атмосфере азота и при охлаждении на льду раствор метилового эфира 2-гептилнонановой кислоты (7,67 г) в дегидратированном ТГФ (50 мл) добавляли по каплям к суспензии алюмогидрида лития (2,15) в дегидратированном ТГФ (92 мл), и смесь перемешивали при 10°C или ниже в течение 1 ч. Затем реакционную смесь подогревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 3 ч. После охлаждения до 10°C или ниже добавляли небольшими порциями сульфата натрия декагидрат. После разбавления этилацетатом нерастворимое вещество отфильтровывали через целит. Растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (6,91 г).
1
H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm 0,86-0,91 (6H, м), 1,16-1,34 (25H, м), 1,41-1,49 (1H, м), 3,54 (2H, т, J=5,2 Гц).
[0132] C) 2-гептилнонанал
В атмосфере азота раствор оксалилхлорида (4,9 мл) в дихлорметане (30 мл) охлаждали до -70°C и добавляли по каплям раствор диметилсульфоксида (6,1 мл) в дихлорметане (30 мл) при температуре -60°C или ниже. После перемешивания при -70°C в течение 15 мин добавляли по каплям раствор 2-гептилнонан-1-ола (6,9 г) в дихлорметане (25 мл) при температуре -60°C или ниже. После перемешивания при -70°C в течение 2 ч добавляли триэтиламин (23,8 мл) и смесь подогревали до комнатной температуры. Реакционную смесь подвергали операции разделения жидкостей добавлением насыщенного водного раствора хлорида аммония и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/ гексан) с получением указанного в заголовке соединения (6,06 г).
1
H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm 0,85-0,92 (6H, м), 1,19-1,33 (20H, м), 1,37-1,47 (2H, м), 1,56-1,65 (2H, м), 2,18-2,25 (1H, м), 9,55 (1H, д, J=3,2 Гц).
[0133] D) Этил-4-гептилундек-2-еноат
В атмосфере азота и при охлаждении на льду 60% суспензию гидрида натрия (в минеральном масле) (1,4 г) в дегидратированном ТГФ (70 мл) перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли по каплям этил(диэтоксифосфорил)ацетат (16,8 г) при 10°C или ниже. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 10 мин, добавляли по каплям раствор 2-гептилнонаналя (6,0 г) в дегидратированном ТГФ (60 мл) и смесь подогревали до комнатной температуры. Реакционную смесь некоторое время перемешивали, и затем нагревали до 50°C. После перемешивания в течение 6 ч реакционную смесь доводили до температуры 5°C или ниже, и после добавления воды разбавляли этилацетатом, дважды промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (5,4 г).
1
H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm 0,87 (6H, т, J=6,0 Гц), 1,16-1,34 (25H, м), 1,37-1,45 (2H, м) 2,07-2,15 (1H, м), 4,19 (2H, кв, J=7,5 Гц), 5,75 (1H, д, J=16,0 Гц), 6,75 (1H, дд, J=16,0, 10,0 Гц)
[0134] E) 4-гептилундекановая кислота
К раствору этил-4-гептилунд-2-еноата (5,40 г) в этаноле (100 мл) при комнатной температуре добавляли 10% Pd на угле (1,08 г) и смесь перемешивали в течение 20 ч в атмосфере водорода. После реакции Pd на угле отфильтровывали. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К полученному остатку добавляли 8 Н водный раствор гидроксида натрия (6,38 мл) в этаноле (20 мл), и смесь перемешивали при 60°C в течение 5 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Затем остаток подкисляли 6 Н соляной кислотой. Остаток разбавляли гексаном, один раз промывали насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,73 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,88 (6H, т, J=7,5 Гц), 1,17-1,41 (25H, м), 1,16-1,34 (2H, м), 2,22-2,34 (2H, м).
[0135] F) 2-(((трет-Бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2- (гидроксиметил)пропан-1,3-диол
К смеси 2,2-бис (гидроксиметил)пропан-1,3-диола (5,0 г), 1H-имидазола (2,5 г) и ДМФА (200 мл) добавляли раствор трет-бутилхлордифенилсилана (5,1 г) в ДМФА (10 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 18 ч реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, трижды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (6,4 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 1,07 (9H, с), 2,34 (3H, т, J=5,5 Гц), 3,67 (2H, с), 3,74 (6H, д, J=5,7 Гц), 7,39-7,48 (6H, м), 7,63-7,67 (4H, м).
[0136] G) (5-(((трет-Бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанол
К раствору 2-(((трет-бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2- (гидроксиметил)пропан-1,3-диола (3,5 г) и 2,2-диметоксипропана (1,5 г) в ацетоне (35 мл), добавляли п-толуолсульфоновой кислоты моногидрат (89 мг) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 2 ч реакционную смесь нейтрализовали добавлением разбавленного водного раствора аммиака. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/ гексан) с получением указанного в заголовке соединения (2,7 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 1,07 (9H, с), 1,27 (3H, с), 1,41 (3H, с), 2,12-2,18 (1H, м), 3,69-3,78 (8H, м), 7,38-7,47 (6H, м), 7,65-7,69 (4H, м).
[0137] H) (5-(Гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил) метил 4-гептилундеканоат
К раствору (5-(((трет-бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола (3,56 г), DMAP (1,37 г) и 4-гептилундекановой кислоты (3,18 г) в ДМФА (30 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (2,47 г) при 50°C. После перемешивания в течение 6 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат и смесь промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К раствору полученного остатка (6,15 г) в ТГФ (20 мл) добавляли раствор TBAF в ТГФ (1 M раствор, 10,3 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 4 ч реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (2,34 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,88 (6H, т, J=6,9 Гц), 1,22-1,32 (25H, м), 1,42 (6H, с), 1,57-1,62 (2H, м), 2,30-2,35 (2H, м), 3,48 (2H, д, J=6,6 Гц), 3,71-3,73 (4H, м), 4,25 (2H, с).
[0138] I) (5-(((5-Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4-гептилундеканоат
К раствору (5-(гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4-гептилундеканоата (1,2 г), DMAP (0,94 г) и 5-(диметиламино)пентановой кислоты гидрохлорида (0,74 г) в ДМФА (30 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,94 г) при 40°C. После перемешивания в течение 4 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (1,37 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,88 (6H, т, J=6,9 Гц), 1,20-1,32 (25H, м), 1,42 (6H, с), 1,45-1,52 (2H, м) , 1,54-1,67 (4H, м), 2,21 (6H, с), 2,23-2,31 (4H, м), 2,35 (2H, т, J=7,5 Гц), 3,75 (4H, с), 4,11 (2H, с), 4,12 (2H, с).
[0139] J) 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил-4-гептилундеканоат
К (5-(((5-диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4-гептилундеканоату (1,37 г) добавляли уксусную кислоту (6,85 мл) и воду (3,43 мл) и смесь перемешивали при 70°C в течение 2 ч. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли этилацетат и насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, и смесь перемешивали в течение 2 ч. Реакционную смесь дважды промывали водой, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К полученному остатку (400 мг) добавляли раствор DMAP (478 мг) и октановой кислоты (327 мг) в ДМФА (4 мл), и затем добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (478 мг) при 50°C. После перемешивания в течение 4 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали насыщенным водным раствором карбоната натрия и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (300 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,86-0,91 (12H, м), 1,15-1,34 (45H, м), 1,45-1,52 (2H, м), 1,53-1,66 (4H, м), 2,20 (6H, с), 2,23-2,36 (10H, м), 4,11 (8H, с).
[0140] Пример 8. 2-(((6-(Диметиламино)гексаноил)окси)метил-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноат)
А) 2-гексилоктановая кислота
В атмосфере азота и при охлаждении на льду 60% суспензию гидрида натрия (в минеральном масле) (3,78 г) в дегидратированном ДМФА (90 мл) перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли по каплям диметилмалонат (5,0 г) при 10°C или ниже. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 10 мин, добавляли по каплям 1-йодогексан (16,8 мл) и смесь подогревали до комнатной температуры. Через 8 ч к реакционной смеси добавляли уксусную кислоту (1 мл). Затем смесь разбавляли этилацетатом, дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток растворяли в EtOH (80 мл). К раствору добавляли 8 Н водный раствор гидроксида натрия (25 мл), и смесь перемешивали при 60°C в течение 6 ч. Реакционную смесь нейтрализовали 6 Н соляной кислотой, затем разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток нагревали при 160°C в течение 1,5 ч, охлаждали до комнатной температуры и затем очищали колоночной хроматографией на силикагеле (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (7,45 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,92 (6H, м), 1,22-1,35 (16H, м), 1,38-1,52 (2H, м), 1,56-1,67 (2H, м), 2,34 (1H, ддд, J=8,7, 5,4, 3,3 Гц).
[0141] B) (2-(4-Метоксифенил)-1,3-диоксан-5,5-диил) диметанол
Раствор 2,2-бис (гидроксиметил)пропан-1,3-диола (506 г) в воде (2,0 л) перемешивали при 50°C. К нему добавляли концентрированную соляную кислоту (18 мл) и добавляли по каплям п-метоксибензальдегид (474 мл) при температуре примерно 30°C в течение 3 ч. Затем реакционный раствор доводили до 25°C и перемешивали в течение 5 ч. К нему добавляли 2 Н водный раствор гидроксида натрия (120 мл), и смесь перемешивали в течение 1 ч. Кристаллы отфильтровывали, промывали водой и затем перекристаллизовывали из смеси этилацетата/гексана с получением указанного в заголовке соединения (769 г).
1
6
H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ ppm 3,24 (2H, д, J=5,0 Гц), 3,67 (2H, д, J=5,4 Гц), 3,74 (3H, с), 3,77 (2 H , д, J=11,3 Гц), 3,88 (2H, т, J=11,3 Гц), 4,53 (1H, т, J=5,4 Гц), 4,62 (1H, т, J=5,0 Гц), 5,34 (1H, с), 6,90 (2H, д, J=8,9 Гц), 7,33 (2H, д, J=8,9 Гц).
[0142] C) 9-(4-Метоксифенил)-3,3-диметил-2,4,8,10-тетраоксаспиро[5.5]ундекан
К раствору (2-(4-метоксифенил)-1,3-диоксан-5,5-диил) диметанола (2,00 г) и 2,2-диметоксипропана (2,46 г) в ДМФА (8 мл) добавляли п-толуолсульфонат пиридиния (20 мг) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 4 ч реакционную смесь разбавляли этилацетатом, дважды промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и дважды насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом магния. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток перекристаллизовывали из смеси этилацетат/гексан с получением указанного в заголовке соединения (1,62 г).
1
6
H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ ppm 1,34 (6H, с), 3,33 (2H, с), 3,63 (2H, д, J=11,7 Гц), 3,74 (3H, с), 3,99 (2H, с), 4,12 (2H, д, J=11,7 Гц), 5,37 (1H, с), 6,90 (2H, д, J=8,8 Гц), 7,34 (2H, д, J=8,8 Гц).
[0143] D) (5-(((4-Метоксибензил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанол
К суспензии 9-(4-метоксифенил)-3,3-диметил-2,4,8,10-тетраоксаспиро[5,5]ундекана (22,0 г) в толуоле (200 мл) добавляли по каплям 1,5 М раствор DIBAL-H (60 мл) при температуре от 5°C до 20°C, и смесь перемешивали при 15°C в течение 3 ч. К нему добавляли метанол (22 мл), и затем добавляли по каплям 2 Н водный раствор гидроксида натрия (100 мл) и 4 Н водный раствор гидроксида натрия (200 мл) в указанном порядке. После перемешивания в течение 1,5 ч слой толуола отделяли и промывали 5% насыщенным раствором соли. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (14,7 г).
1
6
H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ ppm 1,29 (3H, с), 1,29 (3H, с), 3,35 (2H, с), 3,39 (2H, д, J=5,1 Гц), 3,61 (4H, с), 3,74 (3H, с), 4,38 (2H, с), 4,59 (1H, т, J=5,1 Гц), 6,90 (2H, д-подобный, J=7,5 Гц), 7,24 (2H, д-подобный, J=7,5 Гц).
[0144] E) (5-(((4-Метоксибензил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метилоктаноат
К раствору (5-(((4-метоксибензил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола (2,00 г), DMAP (412 мг) и октановой кислоты (1,27 г) в ДМФА (20 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (1,94 г) при 50°C. После перемешивания в течение 4 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (2,78 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,91 (3H, м), 1,22-1,33 (8H, м), 1,40 (6H, с), 1,53-1,61 (2H, м), 2,26 (2H, т, J=7,6 Гц), 3,39 (2H, с), 3,68-3,74 (2H, м), 3,76-3,80 (2H, м), 3,80 (3H, с), 4,15 (2H, с), 4,42 (2H, с), 6,87 (2H, д, J=7,8 Гц), 7,20-7,24 (2H, м).
[0145] F) 3-Гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-(((4-метоксибензил)окси)метил)пропилоктаноат
К раствору (5-(((4-метоксибензил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метилоктаноата (754 мг) в ТГФ (6 мл) добавляли 1 Н раствор соляной кислоты (6 мл), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч. К нему добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия или 2 Н водный раствор гидроксида натрия (4 мл) с последующей экстракцией этилацетатом. Экстракты промывали водой и насыщенным раствором соли. Эту серию операций повторяли четыре раза до завершения снятия защиты. После завершения реакции растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (608 мг).
1
6
H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ ppm 0,85 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,15-1,30 (9H, м), 1,40-1,50 (2H, м), 2,22 (2H, т, J=7,5 Гц), 3,31 (2H, с), 3,39 (4H, д, J=5,4 Гц), 3,76 (3H, с), 3,95 (2H, с), 4,35 (2H, с), 4,43 (2H, т, J=5,4 Гц), 6,89 (2H, д, J=6,6 Гц), 7,21 (2H, д, J=6,6 Гц).
[0146] G) 2-(((4-Метоксибензил)окси)метил)-2- ((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноат)
К раствору 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-(((4-метоксибензил)окси)метил)пропилоктаноата (2,0 г), DMAP (0,64 г) и 2-гексилоктановой кислоты (2,63 г) в ДМФА (20 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (2,41 г) при комнатной температуре. После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (3,48 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,91 (15H, м), 1,19-1,33 (42H, м), 1,37-1,47 (4H, м), 1,51-1,61 (4H, м), 2,24 (2H, т, J=7,6 Гц), 2,32 (2H, шир. т, J=5,4 Гц), 3,41 (2H, с), 3,80 (3H, с), 4,08-4,16 (6H, м), 4,39 (2H, с), 6,86 (2H, д, J=7,6 Гц), 7,19 (2H, д, J=8,8 Гц).
[0147] H) 2-(Гидроксиметил)-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноат)
К раствору 2-(((4-метоксибензил)окси)метил)-2- ((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноат) (3,48 г) в этаноле (30 мл), добавляли 10% Pd на угле (280 мг) при комнатной температуре и смесь перемешивали в течение 7 ч в атмосфере водорода. После реакции Pd на угле отфильтровывали. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (1,68 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,91 (15H, м), 1,19-1,33 (42H, м), 1,41-1,51 (4H, м), 1,54-1,63 (4H, м), 2,30-2,38 (4H, м), 2,61-2,64 (1H, м), 3,48 (2H, д, J=7,3 Гц), 4,08-4,14 (6H, м).
[0148] I) 2-(((6-(Диметиламино)гексаноил)окси)метил-2- ((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноат)
К раствору 2-(гидроксиметил)-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-гексилоктаноата) (600 мг), DMAP (54 мг) и 6-(диметиламино)гексановой кислоты (280 мг) в ДМФА (6 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (303 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 40°C в течение 15 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (513 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,92 (15H, м), 1,19-1,34 (42H, м), 1,39-1,50 (6H, м), 1,52-1,73 (8H, м), 2,21 (6H, с), 2,21-2,35 (8H, м), 4,10 (8H, с).
[0149] Пример 10. 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
А) Этил-3-бутилгепт-2-еноат
В атмосфере азота и при охлаждении на льду 60% суспензию гидрида натрия (в минеральном масле) (3,94 г) в дегидратированном ТГФ (100 мл) перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли по каплям этил(диэтоксифосфорил)ацетат (23,7 г) при 10°C или ниже. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 10 мин, добавляли нонан-5-он (10,0 г) и смесь подогревали до комнатной температуры. Реакционную смесь некоторое время перемешивали, и затем нагревали до 50°C. После перемешивания в течение 10 ч реакционную смесь доводили до 5°C или ниже, и после добавления воды разбавляли этилацетатом, дважды промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (4,47 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,92 (6H, тд, J=7,3, 3,2 Гц), 1,25-1,47 (11H, м), 2,14 (2H, тд, J=7,6, 1,1 Гц), 2,57-2,62 (2H, м), 4,14 (2H, кв, J=7,1 Гц), 5,62 (1H, с).
[0150] В) Этил-3-бутилгептаноат
К раствору этил 3-бутилгепт-2-еноата (5,80 г) в этаноле (25 мл) при комнатной температуре добавляли 10% Pd на угле (1,50 г) и смесь перемешивали в течение 5 ч в атмосфере водорода. После реакции Pd на угле отфильтровывали. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (5,49 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,93 (6H, м), 1,21-1,33 (15H, м), 1,80-1,88 (1H, м), 2,22 (2H, д, J=6,9 Гц), 4,12 (2H, кв, J=7,1 Гц).
[0151] C) Этил 2,3-дибутилгептаноат
В атмосфере азота раствор диизопропиламина (11,8 мл) в дегидратированном ТГФ (59 мл) охлаждали до -10°C, и постепенно добавляли по каплям 1,6 М раствор н-BuLi в гексане (35,2 мл). После завершения добавления по каплям реакционный раствор доводили до 0°C и перемешивали в течение 10 мин. После повторного охлаждения до -10°C добавляли по каплям раствор этил-3-бутилгептаноата (5,49 г) в дегидратированном ТГФ (16 мл) и смесь перемешивали при -5°C в течение 30 мин. Затем добавляли по каплям 1-йодбутан (9,43 г), и смесь некоторое время перемешивали, и затем доводили до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч, затем нейтрализовали 6 Н соляной кислотой, затем разбавляли этилацетатом, дважды промывали 10% водным раствором тиосульфата натрия и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (5,57 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,93 (9H, м), 1,17-1,41 (20H, м), 1,51-1,65 (2H, м), 2,34 (1H, ддд, J=10,6 , 6,5, 3,8 Гц), 4,07-4,19 (2H, м).
[0152] D) 2,3-Дибутилгептан-1-ол
В атмосфере азота и при охлаждении на льду раствор этил-2,3-дибутилгептаноата (5,50 г) в дегидратированном ТГФ (10 мл) добавляли по каплям к суспензии алюмогидрида лития (1,54 г) в дегидратированном ТГФ (66 мл). После завершения добавления по каплям смесь перемешивали в течение 10 мин и снова доводили до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, и затем охлаждали до 5°C или ниже и небольшими порциями добавляли сульфат натрия декагидрат. После того, как пенообразование больше не наблюдали, смесь разбавляли этилацетатом, и нерастворимое вещество отфильтровали через целит. Растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,67 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,86-0,93 (9H, м), 1,12-1,34 (19H, м), 1,37-1,46 (1H, м), 1,47-1,61 (1H, м), 3,49-3,62 (2H, м).
[0153] E) 2,3-Дибутилгептанал
В атмосфере азота раствор 2,3-дибутилгептан-1-ола (4,60 г) и DBU (6,02 мл) в дихлорметане (46 мл) охлаждали до -10°C и добавляли раствор N-трет-бутилбензолсульфинимидоилхлорида (6,52 г) в дихлорметане (20 мл), поддерживая температуру при -5°C или ниже. Смесь перемешивали при -10°C в течение 3 ч, и затем подкисляли 1 Н соляной кислотой. После операции разделения жидкостей растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, один раз промывали насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (4,11 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,96 (9H, м), 1,15-1,39 (16H, м), 1,52-1,60 (1H, м), 1,62-1,74 (2H, м), 2,22-2,27 (1H, м), 9,64 (1H, д, J=2,8 Гц).
[0154] F) Этил-4,5-дибутилнон-2-еноат
В атмосфере азота и при охлаждении на льду 60% суспензию гидрида натрия (в минеральном масле) (1,0 г) в дегидратированном ТГФ (41 мл) перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли по каплям этил (диэтоксифосфорил)ацетат (6,10 г) при 10°C или ниже. После перемешивания при той же температуре, указанной выше, в течение 10 мин, добавляли по каплям раствор 2,3-дибутилгептаналя (4,10 г) в дегидратированном ТГФ (8 мл) и смесь нагревали до комнатной температуры. Реакционную смесь некоторое время перемешивали, и затем нагревали до 50°C. После перемешивания в течение 5 ч реакционную смесь доводили до 5°C или ниже, и после добавления воды разбавляли этилацетатом, дважды промывали насыщенным раствором соли и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (4,14 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,97 (9H, м), 1,14-1,38 (22H, м), 2,16-2,30 (1H, м), 4,10-4,22 (2H, м), 5,72-5,78 (1H, м), 6,80 (1H, дд, J=15,6, 9,6 Гц).
[0155] G) 4,5-дибутилнон-2-еновая кислота
Раствор этил 4,5-дибутилнон-2-еноата (4,10 г) и 8 Н водный раствор гидроксида натрия (6,1 мл) в этаноле (30 мл) перемешивали при 60°C в течение 2 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и остаток подкисляли 1 Н соляной кислотой. Остаток разбавляли этилацетатом, дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (2,80 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,81-0,93 (9H, м), 1,06-1,47 (19H, м), 2,16-2,33 (1H, м), 5,75-5,80 (1H, м), 6,92 (1H, дд, J=15,8, 9,8 Гц).
[0156] H) 3-Гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-(((4-метоксибензил)окси)метил)пропил-4,5-дибутилнон-2-еноат
К раствору (5-(((4-метоксибензил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола (600 мг), DMAP (240 мг) и 4,5-дибутилнон-2-еновой кислоты (706 мг) в ДМФА (4 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (582 мг) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в ТГФ (12 мл). Затем к раствору добавляли 1 Н раствор соляной кислоты (6 мл) и смесь перемешивали в течение 3 дней. К реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали 5% водным раствором бикарбоната натрия и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (870 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,93 (9H, м), 1,13-1,36 (18H, м), 1,40-1,47 (1H, м), 2,21 (1H, дт, J=9,3, 4,8 Гц), 2,69 (2H, тд, J=6,6, 2,5 Гц), 3,48 (2H, с), 3,55-3,67 (4H, м), 3,80-3,82 (3H, м), 4,23-4,32 (2H, м), 4,45 (2H, с), 5,74-5,79 (1H, м), 6,82-6,91 (3H, м), 7,21-7,25 (2H, м).
[0157] I) 3-((4-Метоксибензил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил-4,5-дибутилнон-2-еноат
К раствору 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-(((4-метоксибензил)окси)метил)пропил-4,5-дибутилнон-2-еноата (870 мг), DMAP (210 мг) и октановой кислоты (545 мг) в ДМФА (6 мл), добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (757 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 60°C в течение 4 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (1,26 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,93 (15H, м), 1,13-1,45 (35H, м), 1,52-1,61 (4H, м), 2,17-2,31 (5H, м), 3,43 (2H, с), 3,80 (3H, с), 4,10-4,22 (6H, м), 4,40 (2H, с), 5,73 (1H, д, J=15,4 Гц), 6,78-6,90 (3H, м), 7,19 (2H, д, J=7,9 Гц).
[0158] J) 3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил-4,5-дибутилнонаноат
К раствору 3-((4-метоксибензил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнон-2-еноата (1,26 г) в смешанном растворителе из этанола (10 мл) и этилацетата (10 мл), добавляли 10% Pd на угле (110 мг) при комнатной температуре, и смесь перемешивали в течение ночи в атмосфере водорода. После реакции Pd на угле отфильтровывали. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К раствору остатка (500 мг), DMAP (95 мг) и 5-(диметиламино)пентановой кислоты гидрохлорида (170 мг) в ДМФА (4 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид (194 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 50°C в течение 7 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (250 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,91 (15H, м), 1,09-1,31 (37H, м), 1,42-1,52 (2H, м), 1,54-1,66 (6H, м), 1,76-1,97 (1H, м), 2,21 (6H, м), 2,24-2,35 (10H, м), 4,07-4,13 (8H, м).
[0159] Пример 14. 2-(((4,5-Дибутилнонаноил)окси)метил)-2-((((5-(диметиламино)пентаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдидеканоат
А) Этил-4,5-дибутилнонаноат
К раствору этил 4,5-дибутилнон-2-еноата (2,50 г) в этаноле (20 мл) при комнатной температуре добавляли 10% Pd на угле (0,54 г) и смесь перемешивали в течение 5 ч в атмосфере водорода. После реакции Pd на угле отфильтровывали. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (2,49 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,82-1,00 (9H, м), 1,10-1,33 (23H, м), 1,46-1,63 (2H, м), 2,19-2,36 (2H, м), 4,06-4,19 (2H, м).
[0160] В) 4,5-Дибутилнонановая кислота
Раствор этил 4,5-дибутилнонаноата (2,49 г) и 8 Н водный раствор гидроксида натрия (3,55 мл) в этаноле (12,5 мл) перемешивали при 60°C в течение 7 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, и остаток подкисляли 1 Н соляной кислотой. Остаток разбавляли этилацетатом, дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (2,36 г).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,83-0,94 (9H, м), 0,95-1,33 (20H, м), 1,49 (1H, ддт, J=13,7, 9,3, 6,8, 6,8 Гц), 1,56-1,74 (1H, м), 2,26-2,42 (2H, м).
[0161] С) (5-(Гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил) метил 4,5-дибутилнонаноат
К раствору (5-(((трет-бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола (800 мг), DMAP (306 мг) и 4,5-дибутилнонановой кислоты (678 мг) в ДМФА (8 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (555 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 50°C в течение 8 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан). К раствору этого соединения в ТГФ (4 мл) добавляли раствор TBAF в ТГФ (1 M раствор, 2,32 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, промывали один раз насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (680 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,89 (9H, т, J=6,8 Гц), 1,09-1,31 (20H, м), 1,42 (6H, с), 1,45-1,54 (1H, м), 1,57-1,62 (1H, м), 2,29-2,37 (3H, м), 3,48 (2H, д, J=6,6 Гц), 3,70-3,75 (4H, м), 4,25 (2H, д , J=1,9 Гц).
[0162] D) (5-(((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4,5-дибутилнонаноат
К раствору (5-(гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4,5-дибутилнонаноата (680 мг), DMAP (388 мг) и 5- (диметиламино)пентановой кислоты гидрохлорида (576 мг) в ДМФА (7 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (669 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 50°C в течение 7 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь промывали дважды водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (740 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,89 (9H, т, J=6,9 Гц), 1,09-1,31 (21H, м), 1,42 (6H, с), 1,48 (3H, дт, J=15,1, 7,6 Гц), 1,60-1,66 (2H, м), 2,21 (6H, с), 2,22-2,32 (4H, м), 2,35 (2H, т, J=7,6 Гц), 3,75 (4H, с), 4,09-4,13 (4H, м).
[0163] E) 2-(((4,5-Дибутилнонаноил)окси)метил)-2-(((5- (диметиламино)пентаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдидеканоат
К (5-(((5-(диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4,5-дибутилнонаноату (1,68 г) добавляли уксусную кислоту (8,4 мл) и воду (4,2 мл), и смесь перемешивали при 75°C в течение 2 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли этилацетат и насыщенный водный раствор гидроксида натрия, и смесь перемешивали в течение 2 ч. Органический слой промывали насыщенным водным раствором гидроксида натрия и насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. К раствору остатка (700 мг), DMAP (497 мг) и декановой кислоты (701 мг) в ДМФА (7 мл) добавляли 1-этил-3- (3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (859 мг) при комнатной температуре. После перемешивания при 50°C в течение 7 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь дважды промывали водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан, этилацетат/ метанол и NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (405 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,93 (15H, м), 1,10-1,32 (44H, м), 1,40-1,54 (3H, м), 1,54-1,66 (7H, м), 2,21 (6H, с), 2,23-2,35 (10H, м), 4,11 (8H, с).
[0164] Пример 18. 3-(((4-(Диметиламино)бутил)карбамоил) окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил-4,5-дибутилнонаноат
К раствору (5-(гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил 4,5-дибутилнонаноата (0,50 г) в тетрагидрофуране (7,5 мл) добавляли 1,1-карбонилдиимидазол (0,28 г) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 1 ч реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли гексаном и нерастворимое вещество удаляли. Затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. К остатку добавляли тетрагидрофуран (10 мл), (4-аминобутил)диметиламин (0,20 г) и триэтиламин (0,24 мл) при комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение 20 ч, затем разбавляли этилацетатом и последовательно промывали водой, водным раствором хлорида аммония и водным раствором бикарбоната натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли уксусную кислоту (3,3 мл) и воду (1,7 мл), и смесь перемешивали при 65°C в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом и последовательно промывали водным раствором бикарбоната натрия и водой. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. К остатку добавляли N,N-диметилформамид (4 мл), DMAP (61 мг), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (288 мг) и октановую кислоту (0,19 мл). После перемешивания при 60°C в течение 3 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь последовательно промывали водой и насыщенным раствором соли. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (215 мг).
1
3
H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ ppm 0,88 (15H, т, J=7,09 Гц) 1,10-1,33 (32H, м) 1,40-1,62 (14H, м) 2,21 (6H, с) 2,25-2,32 (8H, м) 3,16 (2H, м) 4,10 (8H, с) 5,84 (1H, м).
[0165] Пример 20. 3-((3-Бутилгептаноил)окси)-2-(((3-бутилгептаноил)окси)метил)-2-(((4-(диметиламино)бутаноил)окси) метил)пропил (9Z)-гексадек-9-еноат
A) (5-(((трет-Бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил (9Z)-гексадек-9-еноат
К раствору (5-(((трет-бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола (1,50 г), DMAP (0,49 г) и пальмитолеиновой кислоты (1,01 г) в ДМФА (15 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,83 г) при 50°C в атмосфере азота. После перемешивания в течение 21 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат и смесь промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (2,11 г).
1
3
H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 0,85-0,94 (3H, м), 1,01-1,10 (9H, м), 1,24-1,35 (16H, м), 1,40 (6H, д, J=10,3 Гц), 1,52-1,61 (2H, м), 1,97-2,07 (4H, м), 2,25 (2H, т, J=7,6 Гц), 3,66 (2H, с), 3,77 (4H, кв , J=11,8 Гц), 4,18 (2H, с), 5,35 (2H, ддд, J=5,8, 3,4, 2,7 Гц), 7,36-7,47 (6H, м), 7,65-7,69 (4H, м).
[0166] B) 3-((трет-Бутил(дифенил)силил)окси)-2,2-бис(((3-бутилгептаноил)окси)метил)пропил (9Z)-гексадек-9-еноат
К (5-(((трет-бутил(дифенил)силил)окси)метил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил (9Z)-гексадек-9-еноату (2,11 г) добавляли уксусную кислоту (10,6 мл) и воду (5,3 мл) в атмосфере азота, и смесь перемешивали при 75°C в течение 8 ч. После охлаждения до комнатной температуры растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, последовательно промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и водой и сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении с получением остатка (1,95 г). Остаток (0,95 г) взвешивали в атмосфере азота и растворяли в растворе ДМФА (9,5 мл). Затем к раствору добавляли DMAP (0,42 г) и 3-бутилгептановую кислоту (0,64 г), и смесь некоторое время перемешивали. Затем добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,69 г) при 50°C. После перемешивания в течение 6 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат и смесь промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (0,71 г).
1
3
H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 0,84-0,93 (15H, м), 1,05 (9H, с), 1,18-1,37 (40H, м), 1,51-1,60 (2H, м), 1,78 (2H, шир. д, J=5,2 Гц), 1,97-2,07 (4H, м), 2,17-2,26 (6H, м), 3,63 (2H, с), 4,10-4,17 (6H, м), 5,35 (2H, ддд, J=5,6, 3,5, 2,2 Гц), 7,35-7,48 (6H, м), 7,60-7,65 (4H, м).
[0167] C) 3-((3-Бутилгептаноил)окси)-2-(((3-бутилгептаноил)окси)метил)-2-(((4-(диметиламино)бутаноил)окси) метил)пропил (9Z)-гексадек-9-еноат
К раствору 3-((трет-бутил(дифенил)силил)окси)-2,2-бис (((3-бутилгептаноил)окси)метил)пропил (9Z)-гексадек-9-еноата (0,71 г) в ТФК (2,1 мл) добавляли раствор TBAF в ТФК (1 M, 0,9 мл) при комнатной температуре. После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли этилацетатом, промывали один раз насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток растворяли в растворе ДМФА (5,3 мл). Затем к раствору добавляли DMAP (0,14 г) и 4-(диметиламино)бутановой кислоты гидрохлорид (0,19 г), и смесь некоторое время перемешивали. Затем добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,24 г) при 50°C. После перемешивания в течение 8 ч к реакционной смеси добавляли этилацетат, и смесь промывали один раз водой и один раз насыщенным раствором соли, и затем сушили над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель отгоняли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (NH, смесь этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (0,31 г).
1
3
H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ ppm 0,85-0,94 (15H, м), 1,20-1,37 (40H, м), 1,55-1,66 (2H, м), 1,66-1,86 (4H, м), 1,97-2,08 (4H, м), 2,21 (6H, с), 2,22-2,39 (10H, м), 4,08-4,17 (8H, м), 5,35 (2H, ддд, J=5,6, 3,5 , 2,1 Гц).
1
[0168] Соединения из примеров 2-7, 9, 11-13, 15-17, 19 и 21, приведенные ниже в таблицах, были получены любым из способов, описанных в примерах, и эквивалентными им способами. Названия соединений и их структурные формулы, химические сдвиги в H ЯМР и массовые числа (в таблицах, обозначенные МС), полученные во время синтеза, приведены в таблице 1 для этих примеров, и также примеров 1, 8, 10, 14, 18 и 20.
[0169]
Таблица 1-1
Пр.№
Название по IUPAC
Структурная формула
Данные ЯМР
МС;m/z(M+H)
1
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис ((октаноилокси)метил)пропил 4-гептилундеканоат
<img file="00000008.jpg" he="19" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>46</sub>H<sub>87</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:781,6432Молекулярная масса: 782,1849
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,86-0,91 (12H, м), 1,15-1,34 (45H, м), 1,45-1,52 (2H, м), 1,53-1,66 (4H, м), 2,20 (6H, с), 2,23-2,36 (10H, м), 4,11 (8H, с)
782,18
2
2-(((4-(Диметиламино)бутаноил)окси)метил)-2-(((2-гексилоктаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдиоктаноат
<img file="00000009.jpg" he="19" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>41</sub>H<sub>77</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:711,5649Молекулярная масса: 712,0520
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,80-0,95 (12H, м), 1,15-1,35 (32H, м), 1,37-1,64 (8H, м), 1,70-1,83 (2H, м), 2,20 (6H, с), 2,23-2,41 (9H, м), 4,11 (8H, с)
712,46
3
2-(((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2-(((2-гексилоктаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдиоктаноат
<img file="00000010.jpg" he="19" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>42</sub>H<sub>79</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:725,5806Молекулярная масса: 726,0786
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,81-0,93 (12H, м), 1,14-1,35 (32H, м), 1,39-1,66 (12H, м), 2,20 (6H, с), 2,22-2,38 (9H, м), 4,11 (8H, с)
726,48
4
2-(((4-(Диметиламино)бутаноил)окси)метил)-2-((гептаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис (2-пентилгептаноат)
<img file="00000011.jpg" he="19" wi="44" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>42</sub>H<sub>79</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:725,5806Молекулярная масса: 726,0786
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,78-0,95 (15H, м), 1,14-1,35 (30H, м), 1,37-1,57 (10H, м), 1,68-1,83 (2H, м), 2,20 (8H, с), 2,23-2,42 (8H, м), 4,10 (8H, с)
726,53
5
2-(((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2-((гептаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис(2-пентилгептаноат)
<img file="00000012.jpg" he="19" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>43</sub>H<sub>81</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:739,5062Молекулярная масса: 740,1051
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,81-0,94 (15H, м), 1,14-1,35 (30H, м), 1,37-1,66 (14H, м), 2,20 (6H, с), 2,22-2,39 (8H, м), 4,10 (8H, с)
740,56
6
2-(((4-(Диметиламино)бутаноил)окси)метил)-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис (2-гексилоктаноат)
<img file="00000013.jpg" he="19" wi="46" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>47</sub>H<sub>89</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:795,6588Молекулярная масса: 796,2115
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,81-0,94 (15H, м), 1,14-1,36 (40H, м), 1,39-1,61 (10H, м), 1,70-1,83 (2H, м), 2,20 (6H, с), 2,23-2,41 (8H, м), 4,10 (8H, с)
796,58
7
2-(((5-Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис (2-гексилоктаноат)
<img file="00000014.jpg" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>45</sub>H<sub>91</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:809,6745Молекулярная масса: 810,2380
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,81-0,93 (15H, м), 1,13-1,35 (40H, м), 1,36-1,67 (14H, м), 2,20 (6H, с), 2,22-2,39 (8H, м), 4,10 (8H, с)
810,58
Таблица 1-2
Пр.№
Название по IUPAC
Структурная формула
Данные ЯМР
МС;m/z(M+H)
8
2-(((6-(Диметиламино)гексаноил)окси)метил-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис (2-гексилоктаноат)
<img file="00000015.jpg" he="20" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>49</sub>H<sub>93</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:823,6901Молекулярная масса: 824,2646
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,83-0,92 (15H, м), 1,19-1,34 (42H, м), 1,39-1,50 (6H, м), 1,52-1,73 (8H, м), 2,21 (6H, с), 2,21-2,36 (8H, м), 4,10 (8H, с)
824,67
9
2-(((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)метил-2-((октаноилокси)метил)пропан-1,3-диил бис (3-пентилоктаноат)
<img file="00000016.jpg" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>49</sub>H<sub>87</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:781,6432Молекулярная масса: 782,1849
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,88 (15H, т, J=7,09 Гц), 1,22-1,33 (40H, м), 1,45-1,53 (2H, м), 1,55-1,68 (4H, м), 1,77-1,86 (2H, м), 2,22 (6H, с), 2,21-2,36 (10H, м), 4,10 (8H, с)
782,65
10
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
<img file="00000017.jpg" he="20" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>45</sub>H<sub>85</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:767,6275Молекулярная масса: 768,1583
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,84-0,91 (15H, м), 1,09-1,31 (36H, м), 1,42-1,52 (3H, м), 1,54-1,66 (7H, м), 2,21 (6H, с), 2,24-2,35 (10H, м), 4,07-4,13 (8H, с)
768,63
11
3-((6-(Диметиламино)гексаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
<img file="00000018.jpg" he="19" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>46</sub>H<sub>87</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:781,6432Молекулярная масса: 782,1849
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,85-0,92 (15H, м), 1,11-1,16 (2H, м), 1,18-1,34 (38H, м), 1,41-1,51 (3H, м), 1,54-1,66 (6H, м), 1,77 (1H, шир. с), 2,21 (6H, с), 2,22-2,33 (10H, м), 4,11 (8H, с)
782,65
12
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((гексаноилокси)метил)пропил 4,5-дипентилдеканоат
<img file="00000019.jpg" he="19" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>44</sub>H<sub>83</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:753,6119Молекулярная масса: 754,1317
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,89 (15H, тд, J=7,1, 4,4 Гц), 1,06-1,18 (3H, м), 1,19-1,35 (30H, м), 1,49 (3H, дт, J=15,3, 7,5 Гц), 1,54-1,68 (8H, м), 2,22 (6H, с), 2,24-2,36 (10H, м), 4,11 (8H, с)
754,62
13
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дипентилдеканоат
<img file="00000020.jpg" he="19" wi="48" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>48</sub>H<sub>91</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:809,6745Молекулярная масса: 810,2380
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,86-0,91 (15H, м), 0,98-1,18 (2H, м), 1,19-1,33 (40H, м), 1,48 (3H, дт, J=15,1, 7,4 Гц), 1,54-1,72 (7H, м), 2,21 (6H, с), 2,23-2,35 (10H, м), 4,11 (8H, с)
810,68
14
2-(((4,5-Дибутилнонаноил)окси)метил)-2-(((5-(диметиламино)пентаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдидеканоат
<img file="00000021.jpg" he="20" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>49</sub>H<sub>93</sub>NO<sub>5</sub>Точная масса:823,6901Молекулярная масса: 824,2646
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm:0,84-0,93 (15H, м), 1,10-1,32 (44H, м), 1,40-1,54 (3H, м), 1,54-1,66 (7H, м), 2,21 (6H, с), 2,23-2,35 (10H, м), 4,11 (8H, с)
824,70
Таблица 1-3
Пр.№
Название по IUPAC
Структурная формула
Данные ЯМР
МС;m/z(M+H)
15
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((гексаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
<img file="00000022.jpg" he="19" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>41</sub>H<sub>77</sub>NO<sub>6</sub>Точная масса:711,5649Молекулярная масса: 712,0520
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,85-0,93 (15H, м), 1,11-1,35 (29H, м), 1,41-1,52 (3H, м), 1,55-1,66 (8H, м), 2,21 (6H, с), 2,23-2,36 (10H, м), 4,12 (8H, с)
712,57
16
2-(((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)метил)-2-(((4,5-дипропилоктаноил)окси)метил)пропан-1,3-диилдидеканоат
<img file="00000023.jpg" he="19" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>45</sub>H<sub>56</sub>NO<sub>6</sub>Точная масса:781,6432Молекулярная масса: 782,1849
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,85-0,91 (15H, м), 1,11 (3H, дтд, J=12,6, 6,1, 6,1, 2,8 Гц), 1,18-1,32 (34H, м), 1,42-1,54 (3H, м), 1,55-1,65 (8H, м), 2,21 (6H, с), 2,22-2,35 (10H, м), 4,11 (8H, с)
782,65
17
3-((5-(Диметиламино)пентаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дипропилоктаноат
<img file="00000024.jpg" he="19" wi="46" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>42</sub>H<sub>79</sub>NO<sub>8</sub>Точная масса:725,5806Молекулярная масса: 726,0786
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,85-0,93 (15H, м), 1,07-1,15 (3H, м), 1,18-1,33 (26H, м), 1,42-1,51 (3H, м), 1,55-1,66 (8H, м), 2,20 (6H, с), 2,22-2,35 (10H, м), 4,12 (8H, с)
726,59
18
3-(((4-(Диметиламино)бутил)карбамоил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
<img file="00000025.jpg" he="20" wi="51" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>45</sub>H<sub>56</sub>N<sub>2</sub>O<sub>8</sub>Точная масса:782,6384Молекулярная масса: 783,1729
1Н ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,88 (15H, т, J=7,09 Гц), 1,10-1,33 (32H, м), 1,40-1,62 (14H, м), 2,21 (6H, с), 2,25-2,32 (8H, м), 3,16 (2H, м), 4,10 (8H, с), 5,84 (1H, м)
783,65
19
3-((4-(Диметиламино)бутаноил)окси)-2,2-бис((октаноилокси)метил)пропил 4,5-дибутилнонаноат
<img file="00000026.jpg" he="21" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>44</sub>H<sub>53</sub>NO<sub>8</sub>Молекулярная масса:754,15
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,89 (15H, дкв, J=6,7, 3,4 Гц), 1,05-1,17 (3H, м), 1,21-1,34 (31H, м), 1,45-1,83 (10H, м), 2,22 (6H, с), 2,24-2,39 (10H, м), 4,09-4,18 (8H, м)
754,62
20
3-((3-Бутилгептаноил)окси)-2-(((3-бутилгептаноил)окси)метил)-2-(((4-(диметиламино)бутаноил)окси)метил)пропил(9Z)-гексадек-9-еноат
<img file="00000027.jpg" he="18" wi="56" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>49</sub>H<sub>91</sub>NO<sub>8</sub>Молекулярная масса:822,27С16:1
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,85-0,94 (15H, м), 1,20-1,37 (40H, м), 1,55-1,66 (2H, м), 1,66-1,86 (4H, м), 1,97-2,08 (4H, м), 2,21 (6H, с), 2,22-2,39 (10H, с), 4,08-4,17 (8H, м), 5,35 (2H, ддд, J=5,6, 3,5, 2,1 Гц)
822,68
21
3-((3-Бутилгептаноил)окси)-2-(((3-бутилгептаноил)окси)метил)-2-(((4-(диметиламино)бутаноил)окси)метил)пропил (9Z,12Z) -октадека-9,12-диеноат
<img file="00000028.jpg" he="18" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />Химическая формула: C<sub>51</sub>H<sub>93</sub>NO<sub>6</sub>Точная масса:847,6901Молекулярная масса: 848,2860
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ ppm: 0,84-0,93 (15H, м), 1,19-1,40 (38H, м), 1,54-1,87 (6H, м), 2,00-2,09 (4H, м), 2,19-2,38 (16H, с), 2,77 (2H, т, J=5,9 Гц), 4,10 (8H, с), 5,28-5,43 (4H, м)
848,70
[0170]
Пример получения 1. Пример получения липидной наночастицы с инкапсулированной siРНК
Смесь липидов (катионный липид:DPPC:холестерин:GS-020=молярное соотношение 60:10,6:28:1,4) растворяли в смеси 90% EtOH и 10% 25 мМ ацетатного буферного раствора (pH 4,0) с получением липидного раствора с концентрацией 7,4 мг/мл. siРНК люциферазы (luc) (см. таблицу 2) растворяли в 25 мМ ацетатном буферном растворе (pH 4,0) с получением раствора нуклеиновой кислоты 0,15 мг/мл. Полученный липидный раствор и раствор нуклеиновой кислоты смешивали при соотношении скоростей потока 1 мл/мин:5 мл/мин при комнатной температуре с использованием микрофлюидной системы Asia (Syrris Ltd.) с получением дисперсии, содержащей композицию. Полученную дисперсию диализовали против воды при комнатной температуре в течение 1 ч и против PBS при комнатной температуре в течение 18 ч с использованием Slyde-A-Lyzer (отсечение по молекулярной массе: 20 К, Thermo Fischer Scientific Inc.). Затем диализат фильтровали через шприцевой фильтр 0,2 мкм (Iwaki) и хранили при 4°C. Результаты анализа приведены в таблице 3. В дальнейшем размер липидной частицы в композиции рассчитывали как Z-средний размер частиц с помощью кумулянтного анализа автокорреляционной функции с использованием анализатора для определения размера частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), основанного на методе измерения динамического рассеяния света.
[0171]
Таблица 2Последовательность siРНК Luc
Смысловая цепь
5' - [mC][mU][mU]A[mC]G[mC][mU]GAG[mU]A[mC][mU][mU][mC]GA[ts]t - 3'
Антисмысловая цепь
5'- UCGAAGUACUCAGCGUAAG[ts]t-3'
N: РНК
n: ДНК
[mN]: 2'-OMe РНК
[ns]: фосфоротиоатная связь
[0172]
Таблица 3
Катионный липид
Средний размер частиц (нм)
Концентрация siРНК (мкг/мл)
Степень инкапсулирования (%)
Пример 2
71
415
96
Пример 3
81
445
96
Пример 4
73
121
91
Пример 5
83
120
96
Пример 6
77
389
93
Пример 7
73
376
97
[0173]
Пример получения 2. Пример получения липидной наночастиц с инкапсулированной мРНК
Смесь липидов (катионный липид:DPPC:холестерин:GS-020=молярное соотношение 60:10,6:28:1,4) растворяли в 90% EtOH и 10% воды с получением липидного раствора с концентрацией 8,5 мг/мл. мРНК люциферазы (TriLink BioTechnologies, Inc.) растворяли в 10 мМ буферном растворе 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES) (pH 4,0) с получением раствора нуклеиновой кислоты 0,22 мг/мл. Полученный липидный раствор и раствор нуклеиновой кислоты смешивали при соотношении скоростей потока 3 мл/мин:6 мл/мин при комнатной температуре с использованием прибора NanoAssemblr (Precision NanoSystems Inc.) с получением дисперсии, содержащей композицию. Полученную дисперсию диализовали против воды при комнатной температуре в течение 1 ч и против PBS при 4°C в течение 48 ч с использованием Slyde-A-Lyzer (отсечение по молекулярной массе: 20 K, Thermo Fischer Scientific Inc.). Затем диализат фильтровали через шприцевой фильтр 0,2 мкм (Iwaki) и хранили при 4°C. Результаты анализа представлены в таблице 4.
[0174]
Таблица 4
Катионный липид
Средний размер частиц (нм)
Концентрация siРНК (мкг/мл)
Степень инкапсулирования (%)
Пример 1
112
145
96
Пример 8
103
97
91
Пример 9
96
77
94
Пример 10
123
83
96
Пример 11
122
78
93
Пример 12
134
160
93
Пример 13
119
155
99
Пример 14
88
134
94
Пример 15
164
127
99
Пример 16
109
134
94
Пример 17
152
116
87
Пример 18
77
103
99
[0175]
Экспериментальный пример 1. Экспериментальный пример трансфекции культивируемых клеток с использованием siРНК
Клетки линии Hep3B, полученной из злокачественной опухоли печени человека, стабильно экспрессирующие люциферазу, культивировали при плотности клеток 6000 клеток/лунку в 96-луночном планшете. Через 24 ч в среду добавляли 10 мкл липидной частицы, содержащей siРНК люциферазы. Через 48 ч после добавления siРНК определяли степень снижения экспрессии (нокдаун) люциферазы с использованием набора Picagene LT2.0 (Toyobo Co., Ltd.). Концентрация siРНК, необходимая для 50% нокдауна, рассчитанная по результатам измерений, показана в таблице 5.
[0176]
Таблица 5
Катионный липид
Концентрация siРНК, необходимая для 50% нокдауна (нМ)
Пример 2
14
Пример 3
55
Пример 4
190
Пример 5
28
Пример 6
41
Пример 7
1,2
[0177]
Экспериментальный пример 2. Экспериментальный пример трансфекции культивируемых клеток с использованием мРНК
Клетки линии HCT116, полученной из колоректальной карциномы человека, культивировали при плотности клеток 6000 клеток/лунку в 96-луночном планшете. Через 24 ч в среду добавляли 10 мкл липидной частицы, содержащей 10 нг мРНК люциферазы. Через 24 ч после добавления мРНК добавляли реагент из набора Picagene LT2.0 (Toyobo Co., Ltd.) в культуральный планшет с HCT116. Люминесценцию (имп/с (сП)) люциферазы измеряли с использованием планшетного ридера для определения люминесценции EnVision (PerkinElmer, Inc.). Результаты измерений представлены в таблицах 6-10.
[0178]
Таблица 6
Катионный липид
Среднее значение люминесценции (имп/с) для 3 лунок
PBS контроль
1040
Пример 8
381693
[0179]
Таблица 7
Катионный липид
Среднее значение люминесценции (имп/с) для 3 лунок
PBS контроль
413
Пример 9
63493
[0180]
Таблица 8
Катионный липид
Среднее значение люминесценции (имп/с) для 3 лунок
PBS контроль
1293
Пример 10
500747
Пример 11
572560
[0181]
Таблица 9
Катионный липид
Среднее значение люминесценции (имп/с) для 3 лунок
PBS контроль
80
Пример 10
176813
Пример 12
62587
Пример 13
269467
[0182]
Таблица 10
Катионный липид
Среднее значение люминесценции (имп/с) для 3 лунок
PBS контроль
293
Пример 1
110733
Пример 10
112893
Пример 14
178133
Пример 15
3293
Пример 16
141560
Пример 17
7987
Пример 18
12813
[0183] Пример получения 3. Пример получения липидной наночастицы с инкапсулированной siРНК
Смесь липидов (катионный липид:DPPC:холестерин:GS-020=молярное соотношение 60:10,6:28:1,4) растворяли в смеси 90% EtOH и 10% 25 мМ ацетатного буферного раствора (pH 4,0) с получением липидного раствора с концентрацией 7,4 мг/мл. siРНК против гена коллагена 1a1 (Col1a1) и siРНК против гена фактора VII (FVII) растворяли в равных массовых количествах в 25 мМ ацетатном буферном растворе (pH 4,0) с получением раствора нуклеиновой кислоты 0,15 мг/мл. Последовательности siРНК Col1a1 и siРНК FVII взяты из публикаций Hepatology, Vol. 672, No. 4, 2015, и Silence, Vol. 1, № 16, 2010, соответственно. Каждая последовательность siРНК представлена в таблице 11. Полученный липидный раствор и раствор нуклеиновой кислоты смешивали при соотношении скоростей потока 1 мл/мин:5 мл/мин с использованием микрофлюидного смесительного аппарата NanoAssemblr (Precision NanoSystems Inc.) с получением дисперсии, содержащей композицию. Полученную дисперсию диализовали против воды при комнатной температуре в течение 1 ч и против PBS при комнатной температуре в течение 18 ч с использованием Slyde-A-Lyzer (отсечение по молекулярной массе: 20 К, Thermo Fischer Scientific Inc.). Затем диализат фильтровали через шприцевой фильтр 0,2 мкм (Iwaki) и хранили при 4°C. Результаты анализа липидных наночастиц с инкапсулированной siРНК, приведены в таблице 12. Липидные наночастицы с инкапсулированной siРНК, были получены с высоким выходом с использованием соединения по настоящему изобретению.
[0184]
Таблица 11Последовательность siРНК Col1a1
Смысловая цепь
5'-G[mU][mC][mU]AGA[mC]A[mU]G[mU][mU][mC]AG[mC][mU][mU][ts]t - 3'
Антисмысловая цепь
5' - AAGCUGAA[mC]AUGUC[mU]AGAC[ts]t - 3'
Последовательность siРНК FVII
Смысловая цепь
5' -GGA[fU][fC]A[fU][fC][fU][fC]AAG[fU][fC][fU][fU]A[fC][ts]t - 3'
Антисмысловая цепь
5' - G[fU]AAGA[fC][fU][fU]GAGA[fU]GA[fU][fC][fC][ts]t - 3'
N: РНК
n: ДНК
[mN]: 2'-OMe РНК
[ns]: фосфоротиоатная связь
[fN]: 2'-F РНК
[0185]
Таблица 12Результаты анализа липидной частицы с инкапсулированной siРНК
Катионный липид
Размер частиц (нм)
Концентрация siРНК Col1a1+siРНК FVII(мкг/мл)
Степень инкапсулирования(%)
Пример 1
111
128
98
Пример 10
101
137
97
Пример 11
91
320
97
Пример 13
103
122
97
Пример 14
97
126
96
Пример 16
103
124
96
Пример 19
89
112
96
[0186]
Экспериментальный пример 3. Экспериментальный пример нокдауна гена печеночного коллагена 1a1 на мышиной модели фиброза печени CCl4
Инкапсулированную в липидной наночастице siРНК Col1a1 вводили в дозе 0,1 мг/кг в орбитальный венозный синус 8-недельных мышей-самцов Balb/c. Через 3 ч CCl4, смешанный с кукурузным маслом, вводили перорально в дозе 0,1 мл/кг (10 мл/ кг) принудительным однократным введением (n=6 в каждой группе). Через 4 дня после введения липидных наночастиц с инкапсулированной siРНК, у мышей, подвергнутых эвтаназии под анестезией, отбирали образцы печени с последующим анализом экспрессии генов с использованием количественной ПЦР. Уровень экспрессии гена Col1a1 и уровень экспрессии гена FVII нормализовали к уровню экспрессии GAPDH. Степень снижения экспрессии гена Col1a1 по сравнению с группой, не получавшей siРНК, рассматривали в качестве степени нокдауна. Полученные результаты приведены в таблице 13. У мышей, которым внутривенно вводили липидную наночастицу с инкапсулированной siРНК, полученную с использованием соединения по настоящему изобретению, наблюдали высокий нокдаун маркерного гена Col1a1 активированных звездчатых клеток по сравнению со степенью нокдауна маркерного гена FVII печеночных паренхиматозных клеток.
[0187]
Таблица 13Результаты оценки нокдауна гена Col1a1 и гена FVII на мышиной модели фиброза печени, индуцированного CCl4
Катионный липид
siРНК Col1a1+siРНК FVII (мг/кг)
Степень нокдауна Col1a1 (%)
Степень нокдауна FVII (%)
Пример 1
0,1+0,1
86
0
Пример 10
0,1+0,1
77
0
Пример 11
0,1+0,1
77
21
Пример 13
0,1+0,1
86
15
Пример 14
0,1+0,1
76
16
Пример 16
0,1+0,1
74
15
Пример 19
0,1+0,1
71
31
Промышленная применимость
[0188] Соединение, липидная частица или композиция по настоящему изобретению способны эффективно переносить нуклеиновую кислоту в различные клетки, ткани или органы. Таким образом, соединение, липидную частицу или композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве способа DDS для лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот. Кроме того, соединение, липидную частицу или композицию по настоящему изобретению также можно использовать в качестве реагента для переноса нуклеиновой кислоты для исследований.
Свободный текст списка последовательностей
[0189]
SEQ ID NO: 1 и 2: siРНК (смысловая цепь и антисмысловая цепь, см. таблицу 2) для супрессии экспрессии гена люциферазы, использованная в примере получения 2. SEQ ID NO: 3 и 4: siРНК (смысловая цепь и антисмысловая цепь, см. таблицу 11) для супрессии экспрессии гена коллагена 1A1, используемого в примере получения 3. SEQ ID NO: 5 и 6: siРНК (смысловая цепь и антисмысловая цепь, см. таблицу 11) для супрессии экспрессии гена фактора VII, используемого в примере получения 3.
Список последовательностей
<110>  TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED
<120>  Катионный липид
<130>  PT38-9035WO
<150>  JP2018-151583
<151>  2018-08-10
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК Luc (смысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (1)..(1)
<223>  «с» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (2)..(2)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание e
<222>  (3)..(3)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (5)..(5)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (7)..(7)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (8)..(8)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (12)..(12)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (14)..(14)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (15)..(15)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (16)..(16)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (17)..(17)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(21)
<223>  Нуклеозиды (t и t) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  1
cuuacgcuga guacuucgat t                                                 21
<210>  2
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК Luc (антисмысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (41)..(42)
<223>  Нуклеозиды (n и n) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  2
ucgaaguacu gagcguaagt t                                                 21
<210>  3
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК Col1a1 (смысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (2)..(2)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (3)..(3)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (4)..(4)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (8)..(8)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (10)..(10)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (12)..(12)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (13)..(13)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (14)..(14)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (17)..(17)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (18)..(18)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (19)..(19)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(21)
<223>  Нуклеозиды (t и t) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  3
gucuagacau guucagcuut t                                                 21
<210>  4
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК Col1a1 (антисмысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (9)..(9)
<223>  «c» обозначает 2'-O-метилцитидин (cm)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (15)..(15)
<223>  «u» обозначает 2'-O-метилуридин (um)
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (20)..(21)
<223>  Нуклеозиды (t и t) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  4
aagcugaaca ugucuagact t                                                 21
<210>  5
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК фактора VII (смысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (4)..(4)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (5)..(5)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (7)..(7)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (8)..(8)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (9)..(9)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (10)..(10)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (14)..(14)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (15)..(15)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (16)..(16)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (17)..(17)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (19)..(19)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(21)
<223>  Нуклеозиды (t и t) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  5
ggaucaucuc aagucuuact t                                                 21
<210>  6
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  siРНК фактора VII (антисмысловая цепь)
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(21)
<223>  Последовательность содержит основания РНК и ДНК, некоторые из которых представляют модифицированные основания.  «t» обозначает 2'-дезокситимидин.
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (2)..(2)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание <222>  (7)..(7)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  modified_base
<222>  (8)..(8)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (9)..(9)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (14)..(14)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (17)..(17)
<223>  «u» обозначает 2'-дезокси-2'-фторуридин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (18)..(18)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  модифицированное основание
<222>  (19)..(19)
<223>  «c» обозначает 2'-дезокси-2'-фторцитидин
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(21)
<223>  Нуклеозиды (t и t) связаны фосфоротиоатной связью.
<400>  6
guaagacuug agaugaucct t                                                 21