СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ПЕРЕД КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ
METHOD OF MESENCHYMAL STEM CELL ISOLATION FROM BONE MARROW BEFORE CULTIVATION

Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием относится к области медицины - трансфузиологии.
В медицинской практике известно решение метода выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием, см. статью авторов: В.И.Шумаков, ЭН.Казаков, Н.А.Онищенко, С.В.Гуреев, Е.Н.Остроумов, В.В.Честухина, М.Е.Крашенинников, Б.Л.Миронков. А.Ш.Хубутия «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции мокарда», «Российский кардиологический журнал» №5 (43) 2003 г., с.42-50. Из различных направлений клеточной трансплантации наиболее перспективным является трансплантация прокультивированных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК), выделенных из костного мозга. Эти клетки, будучи аутологичными для реципиента, устраняют необходимость иммуносупрессивной терапии. Забор аутологичного костного мозга осуществляется под местной анестезией в условиях операционной путем пункции гребня подвздошной кости больных, готовящихся к трансплантации МСК. Аспират в количестве 150-300 мл помещали в пробирки, содержащие гепарин, затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. Полученный осадок клеток ресуспендировали в лизирующем гипотоническом растворе, затем интенсивно перемешивали и вновь центрифугировали в течение 5 минут в том же режиме. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, свободный от эритроцидных и тромбоцитарных элементов, ресуспендировали в ростовой среде с добавками. Суспензию клеток высевали для культивирования. Процесс подготовки и культивирования МСК для трансплантации их во время кардиохирургической операции осуществлялся в течение 3 месяцев.
Недостатками такого способа выделения МСК из костного мозга перед культивированием являются: слишком большое количество аспирированного костного мозга - 150-300 мл, за одну биопсию брать такое количество аутологичного костного мозга травматично для пациента, если было проведено несколько эксфузий, то не указано, по какой дозе костного мозга было взято, сколько проведено аспираций, с каким промежутком времени и как был восстановлен пациент, также в этом способе отсутствует проверка костного мозга и полученных стволовых клеток на контаминацию, инфицирование, гистосовместимость, биологический посев, резус-фактор, группу крови, при проведении операций инфаркта миокарда (сердечной недостаточности, ишемии и др.), зачастую срочных, срок получения и культивирования - 3 месяца - очень длителен, кроме того, поскольку это первый опыт, то получение МСК было проведено в лабораторных условиях, для промышленного применения этот способ недостаточно отработан, т.е способ нетехнологичен.
В медицинской практике известен и другой способ получения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, см. патент РФ №2292895 от 18.04.2005 г., дата публикации 10.02.2007 г., А61К 35/28 с названием «Способ выделения мононуклеарных клеток из костного мозга человека», который можно взять за прототип, включающий проведение местной анестезии посредством воздействия лидокаином на место биопсии подвздошной кости. Пунктируется крыло подвздошной кости пациента в области ее передне-верхней трети. Взятие аспирата костного мозга объемом 100 мл выполняют в два шприца объемом по 60 мл, в каждом из которых содержится 25000 ЕД гепарина и 10 мл физиологического раствора. Полученный аспират отстаивают для осаждения эритроцитов в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают 2/3 клеточной взвеси, обедненной эритроцитами, и разводят в 2 раза гепаринованным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД/мл. Полученную смесь наслаивают на раствор HISTOPAQU-1077 (SIGMA diagnostics) и центрифугируют в течение 30 мин с ускорением 400G и температуре 18-22°C. Собирают слой мононуклеарных клеток с границы раздела фаз и отмывают с 20 мл гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД/мл трехкратным центрифугированием по 10 мин с ускорением 400G и температурой 18-22°С.
Недостатками указанного выше способа являются: большое процентное - 10% - количество лидокаина в качестве местного анестетика обладает токсичностью, может вызвать аллергические реакции, судороги, резкое снижение артериального давления, при этом способе не проводят анализы на инфецировонность, биологический посев, т.е. способ травматичен. Кроме того, способ нетехнологичен, проводится в лабораторном режиме, для промышленного применения не отработан. Производить аспирацию шприцем в крыло подвздошной кости в области передне-верхней его части несколько неопределенно, можно сломать иглу шприца, доза костного мозга при эксфузии в 100 мл является большим объемом, и приходится производить биопсию в два этапа, т.к за одну аспирацию, не повредив здоровью пациента, можно взять лишь 30-50 мл. В 2/3 клеточной взвеси после отстоя раствора костного мозга с гепарином и физиологическим раствором входят не только эритроциты, но и лейкоциты, плазма, тромбоциты, и не указано, как их удаляют при сборе мононуклеарного слоя, куда входят и мезенхимальные стволовые клетки. В этом способе не определяют фенотип полученных стволовых клеток из мононуклеарного слоя клеточной взвеси.
Техническим результатом способа выделения стволовых клеток из костного мозга является: повышение однородности и качества получения популяции мезенхимальных стволовых клеток с улучшением чистоты их отмывания, использование более современной, оптимальной и эффективной ростовой среды для получения МСК, повышение качественного анализа на наличие контаминации в мезенхимальных стволовых клетках, конфлюэнтности и технологичности их получения.
2
Этот результат достигается тем, что в способе выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием, включающем получение аспирата костного мозга во время пункции подвздошной кости, использование вещества для создания градиента плотности (1,077), центрифугирование костного мозга и сбор выделенных мононуклеарных клеток с границы раздела фаз, предварительно после идентификации костного мозга проводят анализы образца костного мозга на наличие инфекционных агентов и бактериальной контаминации, потом образцы костного мозга размещают в 50 мл пробирках с 15 мл гепариновой воды, полученной разбавлением 5 мл гепарина в 200 мл физиологического раствора, в подготовленных помещении и аппаратуре с проведенной дезинфекцией от бактерий посредством освещения их ультрафиолетовым светом в течение 15-20 минут и протиркой 70% раствором этилового спирта поверхностей ламинарного бокса и приготавливают в этом боксе ростовую среду путем добавления к 45 мл среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media 5 мл фетальной коровьей сыворотки с концетрацией не менее 10%, прогревая ее до температуры 37°С, после разбавления образца костного мозга раствором Хэнкса в 1,5-2 раза наслаивают образовавшуюся суспензию костного мозга на фиколл в соотношении 30 мл суспензии на 15 мл фиколла и центрифугируют последний раствор с ускорением 800G в течение 30 минут, после чего собирают образовавшиеся два верхних слоя, в которых нижний из этих слоев выполнен в виде белого кольца, размещенного на фиколле, с выделением чистых лейкоцитов, переносят эти слои в пробирку, содержащую 7 мл культуральной среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media, и центрифугируют полученный раствор с ускорением 400G в течение 5 минут, к оставшемуся осадку после слива супернатанта добавляют 5-10 мл подготовленной ростовой среды и полученную суспензию пипетируют на 1-2 флакона с площадью дна, равной 25 см, для последующего культивирования стволовых клеток.
Сущность изобретения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого решением технического результата.
Существенными признаками предложенного решения, совпадающими с известными признаками прототипа, являются: А - получение аспирата костного мозга во время пункции подвздошной кости; Б - использование вещества для создания градиента плотности (1,077); В - центрифугирование костного мозга; Г - сбор выделенных мононуклеарных клеток с границы раздела фаз.
2
Существенными отличительными признаками способа выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга являются: Д - предварительно после индентификации костного мозга проводят анализы образца костного мозга на наличие инфекционных агентов и бактериальной контаминации; Е - образцы костного мозга размещают в 50 мл пробирках с 15 мл гепариновой воды, полученной разбавлением 5 мл гепарина в 200 мл физиологического раствора, в подготовленных помещении и аппаратуре с проведенной дезинфекцией от бактерий посредством освещения их ультрафиолетовым светом в течение 15-20 минут и протиркой 70% раствором этилового спирта поверхностей ламинарного бокса и приготавливают в этом боксе ростовую среду путем добавления к 45 мл среды МЕМ-а либо Advanced Stem Cell Media 5 мл фетальной коровьей сыворотки с концентрацией не менее 10%, прогревая ее до температуры 37°С; Ж - после разбавления образца костного мозга раствором Хэнкса в 1,5-2 раза наслаивают образовавшуюся суспензию костного мозга на фиколл в соотношении 30 мл суспензии на 15 мл фиколла и центрифугируют последний раствор с ускорением 800G в течение 30 минут; И - собирают образовавшиеся два верхних слоя, в которых нижний из этих слоев выполнен в виде белого кольца, размещенного на фиколе, с выделением чистых лейкоцитов; К - переносят эти слои в пробирку, содержащую 7 мл культуральной среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media, и центрифугируют полученный раствор с ускорением 400G в течение 5 минут; Л - к оставшемуся осадку после слива супернатанта добавляют 5-10 мл подготовленной ростовой среды и полученную суспензию пипетируют на 1-2 флакона с площадью дна, равной 25 см, для последующего культивирования стволовых клеток.
2
Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием заключается в следующем. Чтобы получить аутологичные (или аллогенные) МСК, необходимо провести аспирацию костного мозга из подвздошной кости, т.к. в отличие от других мест их можно получить в достаточном количестве и с наименьшими технологическими и экономическими затратами. Эксфузию костного мозга проводят путем пункций передне-верхней трепанацией крыла подвздошной кости. Получив отфильтрованную дозу костного мозга и разместив ее в стерильном пакете с гепарином, индентифицируют образец костного мозга на причастность его к данному пациенту. Проводят тщательный анализ образца костного мозга на наличие антител к инфекционным агентам, а именно ВИЧ, гепатит В и С, сифилис, а также на наличие бактериальной контаминации. Образец с костным мозгом поступает в стерильных 50 мл пробирках с 15 мл гепариновой воды, полученной разбавлением дозы 5 мл гепарина в 200 мл физиологического раствора. Все процедуры по выделению концентрата стволовых клеток проводят в подготовленных продезинфицированных от бактерий помещении и аппаратуре посредством освещения ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 15-20 минут и протиркой салфеткой, смоченной 70% раствором этилового спирта, поверхностей ламинарного бокса, в котором приготавливают ростовую среду путем добавления к 45 мл среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media 5 мл фетальной коровьей сыворотки с концентрацией не менее 10%, прогревая ее до температуры 37°С, т.е. эта среда, в которой должны расти МСК. Чтобы костный мозг был не столь густым, его разбавляют раствором Хэнкса в 1,5-2 раза в зависимости от его густоты. Образовавшуюся суспензию костного мозга наслаивают на вещество-фиколл в соотношении 30 мл суспензии на 15 мл фиколла. Фиколл создает градиент плотности (1,077), поэтому лейкоциты и эритроциты, у которых разная плотность, разделяются в пробирке, наверху всплывают белое кольцо лейкоцитов с мезенхимальными стволовыми клетками, а внизу осаждаются эритроциты. Для получения стволовых клеток все растворы должны быть теплыми - 35-38°С. Далее центрифугируют суспензию костного мозга с фиколлом с ускорением 800G в течение 30 минут на центрифуге СМ-6М. Не допуская смешивания, очень осторожно и аккуратно собирают образовавшиеся два верхних слоя, нижний из этих слоев должен выглядеть как белое кольцо на поверхности фиколла, таким образом выделяют чистые лейкоциты, в которых находятся мезенхимальные стволовые клетки, и переносят их в пробирку, содержащую 7 мл культуральной среды МЕМ-α либо Advanced Stem Cell Media. Лейкоциты с культуральной средой центрифугируют с ускорением 400G в течение 5 минут. Сливают полученный супернатант, к осадку добавляют 5-10 мл культуральной среды в зависимости от количества клеток. Пипеткой переносят полученную суспензию на 1-2 флакона площадью 25 см. Таким образом выделенные лейкоциты с мезенхимальными стволовыми клетками разбавляются средой, в которой они растут, и находятся во флаконах, в которых продолжается их дальнейший рост, и далее происходит процесс их культивирования.
Использование «Способа выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга перед культивированием» по сравнению с прототипом позволяет повысить однородность и качество получения популяции мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга с повышенной чистотой их отмывания. Применение этого способа позволяет улучшить качественный анализ на наличие контаминации в мезенхимальных стволовых клетках и наиболее эффективным и технологичным путем с применением более современной и оптимальной для мезенхимальных стволовых клеток среды получить более высокий выход мезенхимальных стволовых клеток, пригодных для клинического применения. Предложенный способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга многократно использован в практике предприятия «ООО Покровский Банк стволовых клеток», работающего на базе Покровской больницы г.Санкт-Петербурга, показал хорошие и качественные результаты при небольших затратах времени их получения и может быть рекомендован к промышленному применению технологического процесса по выделению мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга разными лечебными больницами и госпиталями.