БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭТИЛЕНДИАМИНТЕТРАУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ КОМПЛЕКСОВ С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, а именно к устройствам для определения аминополикарбоксильных кислот.
5
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), благодаря способности образовывать стабильные водорастворимые комплексы с двух- и трехвалентными металлами, широко используется в промышленности. ЭДТА применяется для производства поверхностно-активных веществ (в том числе жидких мыл и шампуней), средств защиты растений, очистки поверхностей металлов перед покрытием их в гальванотехнике, для удаления следов металлов из растительных масел, лекарственных веществ (Egli Т., Weilenmann H.U., El-Banna Т., Auling G. Gram-negative, aerobic, nitrilo-triacetate-utilizing bacteria from wastewater and soil // Syst. Appl. Microbiol. 1988. V.10. P.297-305). Суммарное мировое производство ЭДТА в 2000 г. достигло 2·10 тонн, при этом 70-80% потребленного ЭДТА поступает в окружающую среду (Дедюхина Э.Г., Салмов Н., Чистякова Т.Н., Минкевич И.Г., Вайнштейн М.Б. Бактериальный штамм - облигатный деструктор ЭДТА и перспективы его использования для очистки воды // Вода: химия и экология. 2008. №2. С.31-34). Поэтому закономерен интерес исследователей к мониторингу ЭДТА в водной среде.
Известные методы определения ЭДТА предусматривают использование дорогостоящего стационарного оборудования, в частности, хроматографа (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) и УФ-детектором (285 нм) при анализе методом жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ)(Kluener Т., Norteman В., Hempel D.C. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V.49. P.194-201). Кроме того, известен титриметрический метод определения ЭДТА (Пшипенко А.Т., Демуцкая Л.Н., Онопа Н.В., Фалендыш, Н.Ф., Арендарюк Е.Н. Способ определения этилендиаминтетраацетата в воде //АС 1525574 А1. 1989. Бюл. №44). При титриметрическом методе используется легковоспламеняющаяся жидкость ацетон.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва, Mg, Са, Mn, Со, Cd, Zn, Ni, Сu, простого по конструкции и эксплуатации.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2
Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержания ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва, Mg, Ca, Mn, Co, Cd, Zn, Ni, Сu, без использования сложного стационарного дорогостоящего оборудования и легковоспламеняющейся жидкости.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов включает кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе бактериальные клетки Chelativorans oligotrophicus LPM-4 M.
т
т
т
Штамм LPM-4 - облигатный деструктор ЭДТА, обладающий специфической потребностью в ЭДТА как единственном источнике углерода, азота и энергии и не растет на органических сахарах и кислотах. Он был выделен из очистных сооружений г.Пущино и отнесен к новому роду и виду Chelativorans oligotrophicus LPM-4 sp. nov. (типовой штамм LPM-4=BKMB2395=BKMB2445=DSM19276) (Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Badrutdinova D.N., Yudina E.I., Minkevich I.G., Vainshtein M.B. EDTA-dependent assimilation of glucose and organic acids by an EDTA-degrading bacterium // Apll. Microbiol. Biotechnol. 2008. V.77. №6. Р.1367-1370).
Биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов включает кислородный электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, содержащий иммобилизованные на носителе клетки (ИмК) Chelativorans oligotrophicus LPM-4 с помощью фиксатора 3. Измерения проводят с помощью гальваностата-потенциостата IPC-Micro (OOO «Кронас», Россия), интегрированного с персональным компьютером. Регистрируемым параметром является максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt (нА/мин), связанная пропорциональной зависимостью со скоростью изменения концентрации потребленного кислорода. Для обработки данных используют SigmaPlot 11.0.
2+
2+
2+
2
2+
2+
2+
2+
2
Нижний предел детекции ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва, Mg, Са, Мn, Со, Cd, Zn, Ni, Сu - 0,125 мМ; операционная стабильность - 3 суток, продолжительность анализа - 20 мин, ошибка измерения - 8%.
Биосенсор чувствителен к наличию промежуточных продуктов деградации ЭДТА этилендиаминдиацетата, глиоксилата, а также таких соединений как иминодиацетат и пировиноградная кислота.
На фиг.1 представлена схема биосенсора для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов. На фиг.2 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения ЭДТА (а), Ва ЭДТА (б), Mg-ЭДТА (в), Са-ЭДТА (г). На фиг.3 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения Мn-ЭДТА (д), Со ЭДТА (е), Cd-ЭДТА (ж), Zn-ЭДТА (з). На фиг.4 представлены калибровочные кривые сенсора на основе клеток бактериального штамма Chelativorans oligotrophicus LPM-4 для определения Ni-ЭДТА (и), Сu-ЭДТА (к).
В качестве носителя для клеток, используемых в биорецепторе, могут использоваться полисахаридные гели, поливиниловые спирты, целлюлозные мембраны, стекловолокна, в частности, стеклобумага.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
Для создания биорецептора используют облигатный деструктор Chelativorans oligotrophicus LPM-4. Бактериальная культура обладает способностью к утилизации ЭДТА и ее комплексов с ионами Ва, Са, Mn, Co, Cd, Zn, Ni, Cu. Деградация осуществляется монооксигеназной системой с потреблением молекулярного кислорода в устойчивых стехиометрических соотношениях между поглощенным количеством кислорода и деградированным количеством ЭДТА.
4
2
2
4
2
2
2
4
2
3
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
12
Штамм Chelativorans oligotrophicus LPM-4 выращивают первоначально на агаризованной среде состава (г/л): MgSO*7HO - 1,0; KHPO - 0,26; CaCl*2HO - 0,40; NaHPO*12HO - 0,63; ЭДТА - 1,0. Микроэлементы (мг/л): FеСl*4НO - 1,5; НВО - 0,06; MnCl*4HO - 0,1; CoCl*6HO - 0,12; ZnCl - 0,07; NiCl*6HO - 0,025; CuCl*2HO - 0,015; NaMoO - 0,025; агар - 20,0. Витамины (мг/л): пиридоксин*НСl - 0,1; тиамин*НСl - 0,05; рибофлавин - 0,05; никотиновая кислота - 0,05; кальция пантотенат - 0,05; Р-аминобензойная кислота - 0,05; липоевая кислота - 0,05; никотинамид - 0,05; витамин B - 0,05; биотин - 0,02; фолиевая кислота - 0,02. Витамины и микроэлементы готовят в виде концентрированных стерильных растворов и добавляют в среду в количестве 1 2 мл/л соответственно. Для получения биомассы культивирование бактерий проводят в жидкой среде того же состава (рН 7,0) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с 200 мл питательной среды на качалке 150 об/мин при температуре 29°С.
Культуральную жидкость, взятую в конце экспоненциальной фазы роста штамма, центрифугируют при 5000 g в течение 20 мин., дважды промывают 30 мМ HEPES буфером (рН 7,4), бактериальные клетки ресуспендируют в том же буфере и иммобилизуют на носителе.
Иммобилизацию клеток проводят методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Whathman GF/A (Великобритания). Клеточную суспензию наносят на бумагу и дают высохнуть на воздухе. Масса иммобилизованных клеток (ИмК) на рецепторе составляет 2 мг сырого веса. Полученный биорецептор помещают на рабочую поверхность кислородного электрода Кларка и фиксируют его с помощью нейлоновой сетки.
Принцип определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов основан на измерении скорости потребления кислорода ИмК Chelativorans oligotrophicus LPM-4 в процессе деградации ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов, содержащихся в образце.
Биосенсор для определения ЭДТА и ее комплексов с ионами металлов работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим ИмК Chelativorans oligotrophicus LPM-4, погружают в измерительную ячейку вместимостью 2 мл с 30 мМ HEPES буферным раствором (рН 7.2) и регистрируют силу тока, отражающее содержание кислорода в среде (фоновое).
Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют потребление кислорода. Рассчитывают величину изменения максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/мин) и определяют концентрацию ЭДТА или Ме-ЭДТА по предварительно построенным калибровочным кривым (фиг.2-4)
Измерения проводят при температуре 30-32°С и постоянном перемешивании.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
Таким образом, предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение содержание ЭДТА или ее комплексов с ионами Ba, Ca, Мn, Со, Cd, Zn, Ni, Сu без использования сложного дорогостоящего оборудования и легковоспламеняющихся жидкостей.
Кроме того, биосенсор может быть использован в полевых условиях.