СКОНСТРУИРОВАННАЯ СПОСОБАМИ ИНЖЕНЕРИИ ПЛАТФОРМА ДЛЯ ВСТРАИВАНИЯ ТРАНСГЕНА (ETIP) ДЛЯ НАЦЕЛИВАНИЯ ГЕНОВ И СТЭКИНГА ПРИЗНАКОВ

1. Способ получения трансгенной клетки растения, причем способ включает:
предоставление клетки растения, имеющей геномную ДНК, содержащую поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты, причем поддающаяся нацеливанию молекула нуклеиновой кислоты содержит:
по меньшей мере один участок распознавания сайт-специфической нуклеазой;
первый фрагмент первого маркерного гена; и
второй фрагмент второго маркерного гена;
трансформацию клетки растения донорной молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой нуклеиновой кислоты сайт-специфической нуклеазы;
расщепление по меньшей мере одного участка распознавания сайт-специфической нуклеазой;
встраивание донорной молекулы нуклеиновой кислоты в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты, где встраивание в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один функциональный маркерный ген; и
получение трансгенной клетки растения, причем трансгенная клетка растения содержит поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты и встроенную донорную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащие по меньшей мере один функциональный маркерный ген.
2. Способ по п. 1, где донорная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты первого и второго участков гомологии.
3. Способ по п. 2, где последовательность нуклеиновой кислоты участка гомологии представляет собой интрон.
4. Способ по п. 2, где последовательности нуклеиновой кислоты первого и второго участков гомологии обладают менее чем 50% идентичностью последовательностей.
5. Способ по п. 2, где последовательности нуклеиновой кислоты первого и второго участков гомологии имеют длину от 50
п.н. до 3 т.п.н.
6. Способ по п. 1, где донорная молекула нуклеиновой кислоты встраивается в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты не зависимым от гомологии способом.
7. Способ по п. 1, где донорная молекула нуклеиновой кислоты встраивается в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты зависимым от гомологии способом.
8. Способ по п. 1, где оба конца донорной молекулы нуклеиновой кислоты встраиваются в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты с перестройками нуклеотидной последовательности, где перестройки нуклеотидной последовательности включают инсерции, делеции, инверсии и повторы.
9. Способ по п. 1, где оба конца донорной молекулы нуклеиновой кислоты встраиваются в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты без перестроек нуклеотидной последовательности, где перестройки нуклеотидной последовательности включают инсерции, делеции, инверсии и повторы.
10. Способ по п. 1, где первый конец донорной молекулы нуклеиновой кислоты встраивается в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты без перестроек нуклеотидной последовательности и второй конец донорной молекулы нуклеиновой кислоты встраивается в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты с перестройками нуклеотидной последовательности, где перестройки нуклеотидной последовательности включают инсерции, делеции, инверсии и повторы.
11. Способ по п. 1, где из трансгенной клетки растения получают трансгенную ткань растения или ее регенерируют в целое трансгенное растение.
12. Способ по п. 1, где поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты встраивают в геномный локус.
13. Способ по п. 12, где встраивание поддающейся нацеливанию молекулы нуклеиновой кислоты в геномный локус не оказывает неблагоприятного влияния на агрономические или качественные
свойства клетки растения.
14. Способ по п. 12, где геномный локус выбран из группы, состоящей из геномного локуса FAD2, геномного локуса FAD3 и геномного локуса IPK1.
15. Способ по п. 14, где геномный локус FAD2 выбран из группы, состоящей из FAD2A, FAD2A', FAD2C и FAD2C'.
16. Способ по п. 14, где геномный локус FAD3 выбран из группы, состоящей из FAD3A, FAD3A', FAD3A", FAD3C, FAD3C' и FAD3C".
17. Способ по п. 1, где донорная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну экспрессирующую кассету для гена.
18. Способ по п. 1, где экспрессирующая кассета для гена содержит трансген.
19. Способ по п. 18, где трансген выбран из группы, состоящей из трансгена устойчивости к инсектициду, трансгена устойчивости к гербициду, трансгена эффективности утилизации азота, трансгена эффективности утилизации воды, трансгена питательного качества, ДНК-связывающего трансгена и трансгена селективного маркера.
20. Способ по п. 1, где по меньшей мере один участок распознавания сайт-специфической нуклеазой расщепляется сайт-специфической нуклеазой.
21. Способ по п. 20, где сайт-специфическая нуклеаза представляет собой слитый белок, содержащий ДНК-связывающий домен и домен расщепления или половинный домен расщепления.
22. Способ по п. 21, где ДНК-связывающий домен выбран из группы, состоящей из ДНК-связывающего домена мегануклеазы, ДНК-связывающего домена РНК-направляемых CRISPR-Cas9, ДНК-связывающего домена лейциновой молнии, ДНК-связывающего домена белка, подобного активатору транскрипции (TAL), рекомбиназы, ДНК-связывающего домена белка с цинковыми пальцами и химерных комбинаций любого из указанных выше.
23. Способ по п. 21, где слитый белок представляет собой нуклеазу с цинковыми пальцами.
24. Способ по п. 21, где домен расщепления или половинный
домен расщепления выбран из группы, состоящей из половинного домена расщепления сайт-специфической нуклеазы рестрикции типа IIS, половинного домена расщепления из сайт-специфической нуклеазы FokI, половинного домена расщепления из сайт-специфической нуклеазы StsI и сайт-специфической хоминг-нуклеазы.
25. Способ по п. 1, где второй фрагмент первого маркерного гена расположен на 5'-конце донорной молекулы нуклеиновой кислоты и первый фрагмент второго маркерного гена расположен на 3'-конце донорной молекулы нуклеиновой кислоты.
26. Способ по п. 25, где встраивание донорной молекулы нуклеиновой кислоты в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты приводит к функциональному первому маркерному гену, содержащему первый маркерный ген.
27. Способ по п. 25, где встраивание донорной молекулы нуклеиновой кислоты в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты приводит к функциональному второму маркерному гену, содержащему второй маркерный ген.
28. Способ по п. 26, где скрининг первого маркерного белка проводят с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS).
29. Способ по п. 27, где скрининг второго маркерного белка проводят с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS).
30. Способ по п. 26 и 27, где первый и второй маркерные гены экспрессируют маркерные белки, имеющие различные способы действия.
31. Способ по п. 1, где второй фрагмент первого маркерного гена расположен на 5'-конце донорной молекулы нуклеиновой кислоты, где 5'-конец донорной молекулы нуклеиновой кислоты содержит промотор, функционально связанный с интроном, и первый фрагмент второго маркерного гена расположен на 3'-конце донорной молекулы нуклеиновой кислоты, где 3'-конце донорной молекулы нуклеиновой кислоты содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с интроном.
32. Способ по п. 1, где первый или второй маркерный ген(ы)
выбран из группы, состоящей из PMI, YFP, Xyl(A), RFP, DSR, GFP, GUS, NPTII, AAD-1, AAD-12, AHAS, PAT, DSM-2, DGT-28, HPH, BAR и флуоресцентных белков.
33. Способ по п. 1, где трансгенную клетку растения выделяют с использованием проточной цитометрии.
34. Трансгенная ткань растения или целое трансгенное растение, полученные способом по п. 11.
35. Хромосомный участок-мишень Brassica napus, выбранный из группы, состоящей от нуклеотидов 1-579 SEQ ID NO: 431 до нуклеотидов 166-732 SEQ ID NO: 432, от нуклеотидов 1-550 SEQ ID NO: 433 до нуклеотидов 190-653 SEQ ID NO: 434, от нуклеотидов 1-298 SEQ ID NO: 435 до 51-644 SEQ ID NO: 436, от нуклеотидов 1-536 SEQ ID NO: 437 до нуклеотидов 146-545 SEQ ID NO: 438, от нуклеотидов 1-431 SEQ ID NO: 439 до нуклеотидов 167-685 SEQ ID NO: 440, от нуклеотидов 1-599 SEQ ID NO: 441 до нуклеотидов 116-521 SEQ ID NO: 442, от нуклеотидов 1-298 SEQ ID NO: 443 до нуклеотидов 193-775 SEQ ID NO: 444 и от нуклеотидов 1-651 SEQ ID NO: 445 до нуклеотидов 120-578 SEQ ID NO: 446.
36. Хромосомный участок-мишень Brassica napus по п. 34, где участок-мишень содержит поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую:
по меньшей мере один участок распознавания сайт-специфической нуклеазой;
первый фрагмент первого маркерного гена; и
второй фрагмент второго маркерного гена.
37. Хромосомный участок-мишень Brassica napus по п. 34, где участок-мишень содержит pDAS000036 или pDAS000037.
38. Хромосомный участок-мишень Brassica napus по п. 34, где участок-мишень содержит экзогенную полинуклеотидную последовательность.
39. Способ получения трансгсенной клетки растения, причем способ включает:
предоставление клетки-растения, имеющей геномную ДНК, содержащую поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты, причем поддающаяся нацеливанию молекула нуклеиновой кислоты содержит:
по меньшей мере один участок распознавания сайт-специфической нуклеазой;
первый фрагмент первого маркерного гена; и
второй фрагмент некодирующей полинуклеотидной последовательности;
трансформацию клетки растения донорной молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой нуклеиновой кислоты сайт-специфической нуклеазы;
расщепление по меньшей мере одного участка распознавания сайт-специфической нуклеазой;
встраивание донорной молекулы нуклеиновой кислоты в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты, где встраивание в поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один функциональный маркерный ген; и
получение трансгенной клетки растения, причем трансгенная клетка растения содержит поддающуюся нацеливанию молекулу нуклеиновой кислоты и встроенную донорную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один функциональный маркерный ген.
40. Способ по п. 39, где донорная молекула нуклеиновой кислоты содержит первую и вторую последовательности нуклеиновой кислоты участка гомологии.
41. Способ по п. 39, где последовательность нуклеиновой кислоты первого участка гомологии представляет собой интрон.
42. Способ по п. 39, где последовательность нуклеиновой кислоты второго участка гомологии представляет собой некодирующую полинуклеотидную последовательность.