НОВЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ
NEW IMMUNOGENIC PEPTIDES

НОВЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ ОПИСАНИЕ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам. Эти пептиды используются в системах in vitro и in vivo для создания антигенспецифических цитолитических CD4+ Т-клеток. Пептиды и полученные с помощью этих пептидов клетки используют в качестве фармацевтически активных пептидов для целого ряда нарушений, включающих в себя такие аутоиммунные заболевания, как рассеянный склероз.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В WO 2008/017517 раскрыт новый класс пептидов, которые содержат Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена и последовательность редокс-мотива.
Последовательности редокс-мотива были рассмотрены в Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225. Различные альтернативы последовательности редокс-мотива представляют собой С(Х)2С [SEQ ID NO: 71], C(X)2S [SEQ ID NO: 72], C(X)2T [SEQ ID NO: 73], S(X)2C [SEQ ID NO: 74]. В другом предшествующем уровне техники по последовательностям редокс-мотива высказываются замечания относительно значимости гистидина в последовательности редокс-мотива [Kortemme et al. (1996) Biochemistry 35, 14503-14511].
В WO 2008/017517 объясняется, что комбинация Т-клеточного эпитопа и последовательности редокс-мотива в приближенности друг друга внутри пептида обеспечивает свойства, которые ранее не были распознаны. А именно, такие пептиды обладают способностью вызывать популяцию CD4+ цитолитических Т-клеток, которые специфически уничтожают антигенпрезентирующие клетки, которые представляют антиген, содержащий Т-клеточный эпитоп, который присутствует в пептиде.
Следовательно, эти пептиды можно использовать для блокирования иммунного ответа на очень ранней стадии, то есть на уровне представления антигена. В WO 2008/017517 демонстрируется медицинское применение этих пептидов в лечении и профилактике аллергии и иммунных нарушений. Концепция изобретения была позже опубликована в Carlier et al. (2012) Plos one 7,10 e45366. В других патентных заявках демонстрировали, что такие пептиды могут быть использованы в других медицинских применениях, где необходимо избегать иммунных ответов, таких как лечение опухолей, отторжение трансплантатов, иммунные ответы на растворимые аллофакторы, иммунные ответы на вирусные белки, кодируемые скелетом вирусных векторов.
В приведенных выше публикациях обсуждается тип последовательности редокс-мотива и интервал между редокс-мотивом и последовательностью Т-клеточного эпитопа. О дополнительных детерминантах в пептидах, которые могут обеспечить пептидам улучшенные свойства, не сообщалось.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Различные альтернативы последовательности редокс-мотива из 4 аминокислот, как указано во введении, могут также быть записаны как [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO: 76] или C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 77]. В настоящем изобретении показано, что присутствие дополнительной аминокислоты гистидина, непосредственно примыкающей снаружи мотива (N-конец мотива (положение -1) или С-конец мотива (положение +5)) повышает стабильность редокс-мотива. Таким образом, настоящее изобретение относится к модифицированным редокс-мотивам с общей структурой или H-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78] или [CST]-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 79].
При такой улучшенной стабильности специфическая восстановительная активность пептида увеличивается, так что, например, может быть использовано меньшее количество пептида или снижено количество инъекций, по сравнению с пептидом, в котором дополнительного гистидина нет.
Первый аспект относится к выделенным иммуногенным пептидам от 13 до 100 аминокислот, содержащим Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена и непосредственно примыкающую или отделенную не более чем 7 аминокислотами от указанного эпитопа последовательность редокс-мотива H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] ([SEQ ID NO: 78], [SEQ ID NO: 90] или [SEQ ID NO: 91]) или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 79], [SEQ ID NO: 92] или [SEQ ID NO: 93]) для применения в качестве лекарственного средства.
Согласно определенному варианту осуществления указанный антиген не содержит в своей последовательности указанный мотив в пределах 10 аминокислот указанного эпитопа или даже не содержит указанный мотив в своей последовательности.
Согласно конкретным вариантам осуществления мотив представляет собой последовательность редокс-мотива H-X-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 90] или [CST]-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 92] или представляет собой последовательность редокс-мотива Н-С-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78] или [CST]-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 79].
Согласно другим вариантам осуществления мотив представляет собой Н-Х(0,2)-С-Х(2)-С ([SEQ ID NO: 80], [SEQ ID NO: 96] или [SEQ ID NO: 97]) или C-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 83], [SEQ ID NO: 94] или [SEQ ID NO: 95]).
Согласно еще другим вариантам осуществления мотив представляет собой Н-С-Х(2)-С [SEQ ID NO: 80] или С-Х(2)-С-Н [SEQ ID NO: 83].
Согласно конкретным вариантам осуществления пептиды характеризуются длиной от 13 до 75 аминокислот, от 13 до 50 аминокислот или от 13 до 30 аминокислот.
Т-клеточный эпитоп МНС класса II может отделяться от указанного мотива последовательностью не более чем из 4 аминокислот или последовательностью из 2 аминокислот.
Согласно конкретным вариантам осуществления X в редокс-мотиве представляет собой Gly или Pro или X в редокс-мотиве не представляет собой Cys.
Согласно другому конкретному варианту осуществления X вне редокс-мотива не представляет собой Cys, Ser или Thr.
Пептиды могут быть использованы для профилактики или лечения рассеянного склероза (MS), при котором антиген представляет собой аутоантиген, вовлеченный в рассеянный склероз, такой как MOG.
Конкретные варианты осуществления пептида для MS содержат эпитопную последовательность VVHLYRNGK [SEQ ID NO: 3], такую как HCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 1], HxCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 115] или HxxCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 116].
Эти пептиды могут быть использованы для профилактики или лечения сахарного диабета, при котором антиген представляет собой, например, проинсулин.
Другой аспект относится к выделенным иммуногенным пептидам от 13 до 100 аминокислот, содержащим Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена и непосредственно примыкающую или отделенную не более чем 7 аминокислотами от указанного эпитопа последовательность редокс-мотива H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] ([SEQ ID NO: 78] или [SEQ ID NO: 90], или [SEQ ID NO: 91]) или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 79], [SEQ ID NO: 92] или [SEQ ID NO: 93], при условии, что указанный антиген не содержит в своей последовательности указанный мотив в пределах 10 аминокислот указанного эпитопа.
Согласно определенному варианту осуществления антиген не содержит в своей последовательности указанный мотив.
Конкретные варианты осуществления мотивов представляют собой Н-Х-С-Х(2)-[CST] [SEQ ID NO: 90], [CST]-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 92], H-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78] или [CST]-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 79], X(0,2)-C-X(2)-C ([SEQ ID NO: 80], [SEQ ID NO: 96] [SEQ ID NO: 97]), C-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 83], [SEQ ID NO: 94] [SEQ ID NO: 95]) H-C-X(2)-C [SEQ ID NO: 80] или C-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 83].
Согласно конкретным вариантам осуществления пептидов, если указанный мотив представляет собой H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91], мотив находится со стороны N-конца от Т-клеточного эпитопа в пределах пептида, а если указанный мотив представляет собой [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93], мотив расположен со стороны С-конца от Т-клеточного эпитопа.
Мотив может располагаться со стороны N-конца от Т-клеточного эпитопа. Пептиды могут характеризоваться длиной от 13 до 75 аминокислот, от 13 до 50 аминокислот, от 13 до 30 аминокислот.
Согласно конкретным вариантам осуществления Т-клеточный эпитоп МНС класса II отделен от указанного мотива последовательностью не более чем из 4 аминокислот или отделен от указанного мотива последовательностью из 2 аминокислот.
Согласно конкретным вариантам осуществления X в редокс-мотиве представляет собой Gly или Pro, или X в редокс-мотиве не представляет собой Cys.
Согласно конкретным вариантам осуществления X вне редокс-мотива не представляет собой Cys, Ser или Thr.
Конкретные пептиды из аутоантигена представляют собой MOG или проинсулин.
Конкретные пептиды содержат эпитопную последовательность VVHLYRNGK [SEQ ID NO: 3], такую как НСР YC SRV VHL YRNGKD [SEQ ID NO: 1], HxCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 115] или HxxCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 116].
Другой аспект представляет собой способы лечения или профилактики, предусматривающие стадию введения эффективного количества иммуногенного пептида длиной от 13 до 100 аминокислот, содержащего Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена и непосредственно примыкающую или отделенную не более чем 7 аминокислотами от указанного эпитопа последовательность редокс-мотива Н-Х(0,2)-С-X(2)-[CST] ([SEQ ID NO: 78], [SEQ ID NO: 90] или [SEQ ID NO: 91]) или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 79], [SEQ ID NO: 92] или [SEQ ID NO: 93]).
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению in vitro описанного выше способа получения антигенспецифических CD4+ цитолитических Т-клеток.
Другой аспект относится к способу получения популяционных CD4+ Т-клеток, которые являются цитолитическими против клеточного антигена, причем способ предусматривает следующие стадии: предоставление клеток периферической крови; контактирование указанных клеток in vitro с иммуногенным пептидом длиной от 13 до 100 аминокислот, содержащим Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена и непосредственно примыкающую или отделенную не более чем 7 аминокислотами от указанного эпитопа последовательность редокс-мотива H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] ([SEQ ID NO: 78], [SEQ ID NO: 90] или [SEQ ID NO: 91]) или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H ([SEQ ID NO: 79], [SEQ ID NO: 92] или [SEQ ID NO: 93]); и размножение указанных клеток в присутствии IL-2.
Другой аспект относится к популяции клеток, получаемых вышеуказанным способом, для применения в качестве лекарственного средства.
Другой аспект относится к способам лечения и профилактики, предусматривающим стадию введения эффективного количества клеток, как описано выше.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Ответ клеточной линии наивных CD4+ Т-клеток человека на пептиды с Т-клеточным эпитопом MOG и редокс-мотивом без (правые столбцы) [SEQ ID NO: 7] и с дополнительным гистидином (левые столбцы). [SEQ ID NO: 1]
Подробное описание настоящего изобретения
Определения
Используемый в настоящем документе термин «пептид» относится к молекуле, содержащей аминокислотную последовательность длиной от 2 до 200 аминокислот, связанную пептидными связями, но которая может содержать неаминированные аминокислотные структуры. Пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать любую из обычных 20 аминокислот или их модифицированных вариантов или могут содержать неприродные аминокислоты, включенные химическим пептидным синтезом или посредством химической или ферментативной модификации. Используемый в настоящем документе термин «антиген» относится к структуре макромолекулы, как правило, белка (с полисахаридами или без них), или изготовлен из протеиновой композиции, содержащей один или несколько гаптенов и содержащий Т-клеточные эпитопы. Используемый в настоящем документе термин «антигенный белок» относится к белку, содержащему один или несколько Т-клеточных эпитопов. Используемый в настоящем документе аутоантиген или аутоантигенный белок относится к белку человека или животного, присутствующему в организме, который вызывает иммунный ответ внутри одного и того же организма человека или животного.
Термин «пищевой или фармацевтический антигенный белок» относится к антигенному белку, естественно присутствующему в пищевом продукте или таком фармацевтическом продукте, как вакцина. Термин «эпитоп» относится к одному или нескольким участкам (которые могут определять конформационный эпитоп) антигенного белка, который специфически распознается и связывается с помощью антитела или его части (Fab', Fab2' и т.д.), или рецептору, представленному на клеточной поверхности В- или Т-клеточного лимфоцита, и который посредством указанного связывания способен индуцировать иммунный ответ. Термин «Т-клеточный эпитоп» в контексте настоящего изобретения относится к доминантному, субдоминантному или минорному Т-клеточному эпитопу, т.е. части антигенного белка, которая специфически распознается и связывается рецептором на клеточной поверхности Т-лимфоцита. Является ли эпитоп доминантным, субдоминантным или минорным зависит от иммунной реакции, вызванной эпитопом. Доминирование зависит от частоты, с которой такие эпитопы распознаются Т-клетками и способны активировать их среди всех возможных Т-клеточных эпитопов белка.
Т-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, распознаваемый молекулами МНС класса II, который состоит из последовательности +/-9 аминокислот, которые помещаются в бороздку молекулы МНС II. В пределах пептидной последовательности, представляющей Т-клеточный эпитоп, аминокислоты в эпитопе пронумерованы от Р1 до Р9, аминокислоты N-конца эпитопа пронумерованы Р-1, Р-2 и так далее, аминокислоты С-конца эпитопа пронумерованы Р+1, Р+2 и т.д. Пептиды, распознаваемые молекулами МНС класса II, а не молекулами МНС класса I, относятся к рестриктированным по МНС класса II Т-клеточным эпитопам.
Термин «МНС» относится к «основному антигену гистосовместимости». У людей гены МНС известны как гены HLA («человеческий лейкоцитарный антиген»). Хотя нет последовательного соблюдения конвенции, в некоторой литературе используется HLA для обозначения белковых молекул HLA, а МНС - для обозначения генов, кодирующих белки HLA. Таким образом, термины «МНС» и «HLA» являются эквивалентами при использовании в настоящем документе. Система HLA у человека имеет свой эквивалент у мыши, то есть в системе Н2. Наиболее интенсивно изучаемыми генами HLA являются девять так называемых классических генов МНС: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA DQB1, HLA-DRA и HLA-DRB1. У людей МНС разделяется на три области: класс I, II и III. Гены А, В и С относятся к МНС класса I, тогда как шесть D-генов относятся к классу II. Молекулы МНС класса I состоят из одной полиморфной цепи, содержащей 3 домена (альфа 1, 2 и 3), который связывается с бета2-микроглобулином на поверхности клетки. Молекулы класса II состоят из 2 полиморфных цепей, каждая из которых содержит 2 цепи (альфа 1 и 2 и бета 1 и 2).
Молекулы МНС класса I экспрессируются практически на всех ядерных клетках.
Пептидные фрагменты, представленные в контексте молекул МНС класса I, распознаются CD8+ Т-лимфоцитами (цитолитическими Т-лимфоцитами или CTL). CD8+ Т-лимфоциты часто созревают в цитолитические эффекторы, которые могут лизировать клетки, несущие стимулирующий антиген. Молекулы МНС класса II экспрессируются в основном на активированных лимфоцитах и антигенпрезентирующих клетках. CD4+ Т-лимфоциты (хелперные Т-лимфоциты или Th) активируются с распознаванием уникального пептидного фрагмента, представленного молекулой МНС класса II, как правило, находящегося в такой антигенпрезентирующей клетке, как макрофаг или дендритная клетка. CD4+ Т-лимфоциты пролиферируют и секретируют такие цитокины, как IL-2, IFN-гамма и IL-4, которые поддерживают антитело-опосредованные и клеточно-опосредованные ответы.
Функциональные HLA характеризуются глубокой связывающей бороздкой, с которой связываются как эндогенные, так и чужеродные, потенциально антигенные пептиды. Бороздка дополнительно характеризуется четко определенной формой и физико-химическими свойствами. Сайты связывания HLA класса I закрыты, так как концы пептида закреплены на концах бороздки. Они также участвуют в сети водородных связей с консервативными остатками HLA. Ввиду этих ограничений длина связанных пептидов ограничена 8-10 остатками. Однако было продемонстрировано, что пептиды до 12 аминокислотных остатков также способны связывать HLA класса I. Сравнение структур разных комплексов HLA подтверждает общий способ связывания, при котором пептиды принимают относительно линейную, удлиненную конформацию или могут включать в себя центральные остатки для выпучивания из бороздки.
В отличие от сайтов связывания HLA класса I, сайты класса II открыты с обоих концов. Это позволяет пептидам простираться от фактической области связывания, таким образом «зависая» на обоих концах. Таким образом, HLA класса II могут связывать пептидные лиганды переменной длины в пределах от 9 до более чем 25 аминокислотных остатков. Подобно HLA классу I, аффинность лиганда класса II определяется «константной» и «переменной» компонентой. Константная часть снова представляет собой результат сети водородных связей, образованных между консервативными остатками в бороздке HLA II класса и основной цепью связанного пептида. Однако этот профиль водородных связей не ограничен N- и C-концевыми остатками пептида, а распределен по всей цепи. Последнее важно, поскольку он ограничивает конформацию связанных пептидов до строго линейного способа связывания. Это характерно для всех аллотипов класса II. Второй компонент, определяющий аффинность связывания пептида, является вариабельным из-за определенных положений полиморфизма в сайтах связывания класса И. Различные аллотипы образуют различные комплементарные карманы в пределах бороздки, тем самым определяя зависимый от подтипа отбор пептидов или специфичность. Важно отметить, что ограничения на аминокислотные остатки, содержащиеся в карманах класса II, в целом «более мягкие», чем для класса I. Существует гораздо большая перекрестная реактивность пептидов среди разных аллотипов HLA класса II. Последовательность из +/-9 аминокислот Т-клеточного эпитопа МНС класса II, которые помещаются в бороздку молекулы МНС II, как правило, нумеруются от Р1 до Р9. Дополнительные аминокислоты N-конца эпитопа нумеруются Р-1, Р-2 и так далее, аминокислоты С-конца эпитопа нумеруются Р+1, Р+2 и так далее.
Используемый в настоящем документе термин «гомолог» по отношению к эпитопам, используемым в контексте настоящего изобретения, относится к молекулам, характеризующимся идентичностью аминокислотной последовательности, составляющей по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%, по отношению к природному эпитопу, тем самым сохраняя способность эпитопа связываться с антителом или рецептором клеточной поверхности В и/или Т-клетки. Конкретные гомологи эпитопа соответствуют природному эпитопу, модифицированному не более чем в трех, более конкретно, не более чем в 2, наиболее предпочтительно в одной аминокислоте.
Используемый в настоящем документе термин «производное» применительно к пептидам согласно настоящему изобретению относится к молекулам, которые содержат по меньшей мере часть активного пептида (т.е. способны вызывать цитолитическую активность CD4+ Т-клеток), и, кроме того, содержат комплементарную часть, которая может применяться в различных целях, таких как стабилизация пептидов или изменение фармакокинетических или фармакодинамических свойств пептида.
Используемый в настоящем документе термин «идентичность последовательностей» двух последовательностей относится к числу положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленными на количество нуклеотидов или аминокислот в более короткой последовательности, когда две последовательности выровнены. В частности, идентичность последовательности составляет от 70% до 80%, от 81% до 85%, от 86% до 90%, от 91% до 95%, от 96% до 100% или 100%.
Используемые в настоящем документе термины «кодирующий пептид полинуклеотид (или нуклеиновая кислота)» и «полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующий пептид» относятся к нуклеотидной последовательности, которая при экспрессии в подходящей среде приводит к получению соответствующей последовательности пептида или его производному или гомологу. Такие полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты включают в себя нормальные последовательности, кодирующие пептид, а также производные и фрагменты этих нуклеиновых кислот, способных экспрессировать пептид с требуемой активностью. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно настоящему изобретению или его фрагмент, представляет собой последовательность, кодирующую пептид или его фрагмент, происходящий от млекопитающего или соответствующий таковому млекопитающего, наиболее предпочтительно фрагмент пептида человека.
Термин «иммунные нарушения» или «иммунные заболевания» относится к заболеваниям, в которых реакция иммунной системы ответственна за неработоспособность или нефизиологическую ситуацию в организме или поддерживает их. К иммунным нарушениям относятся, помимо прочего, аллергические нарушения и аутоиммунные заболевания.
Используемые в настоящем документе термины «аллергические заболевания» или «аллергические нарушения» относятся к заболеваниям, которые характеризуются реакциями гиперчувствительности иммунной системы к конкретным веществам, называемым аллергенами (такими как пыльца, жала, лекарства или пища). Аллергия представляет собой совокупность признаков и симптомов, наблюдаемых всякий раз, когда страдающий атопией отдельный пациент сталкивается с аллергеном, к которому он был сенсибилизирован, что может привести к развитию различных заболеваний, в частности респираторных заболеваний, и таких симптомов, как бронхиальная астма. Существуют различные типы классификаций, и большинство аллергических нарушений имеют разные названия в зависимости от того, где в организме млекопитающих это происходит.«Гиперчувствительность» представляет собой нежелательную (повреждающую, вызывающую дискомфорт и иногда фатальную) реакцию, возникающую у человека при воздействии антигена, к которому он стал сенсибилизированным; «гиперчувствительность немедленного типа» зависит от продукции антител IgE и поэтому эквивалентна аллергии.
Термины «аутоиммунное заболевание» или «аутоиммунное нарушение» относятся к заболеваниям, которые являются следствием аберрантного иммунного ответа организма на его собственные клетки и ткани вследствие неспособности организма распознавать его собственные составляющие части (вплоть до субмолекулярного уровня) как «собственные». Группа заболеваний может быть разделена на две категории: органоспецифические и системные заболевания. «Аллерген» определяется как вещество, как правило, макромолекула или протеолитическая композиция, которое вызывает продукцию антител IgE у предрасположенных, особенно генетически расположенных к этому, отдельных пациентов (срадающих атопией). Аналогичные определения представлены в Liebers et al. (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494-516.
Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству пептида согласно настоящему изобретению или его производного, которое дает желаемый терапевтический или профилактический эффект у пациента. Например, в отношении заболевания или нарушения это количество представляет собой количество, которое в какой-то степени снижает один или несколько симптомов заболевания или нарушения и, более конкретно, возвращает к нормальным, частично или полностью, физиологическим или биохимическим параметрам, связанным с заболеванием или нарушением или вызывающим их. Как правило, терапевтически эффективное количество представляет собой количество пептида согласно настоящему изобретению или его производного, которое приведет к улучшению или восстановлению нормальной физиологической ситуации. Например, при использовании для терапевтического лечения млекопитающего с иммунным заболеванием, оно представляет собой ежедневное количество пептида/кг массы тела указанного млекопитающего. Альтернативно, когда введение осуществляется посредством генной терапии, количество голых ДНК или вирусных векторов корректируют для обеспечения локального производства соответствующей дозировки пептида согласно настоящему изобретению, его производного или его гомолога.
Термин «природный» при упоминании пептида относится к тому факту, что последовательность идентична фрагменту встречающегося в природе белка (дикого типа или мутанта). В противоположность этому термин «искусственный» относится к последовательности, которая как таковая не встречается в природе. Искусственную последовательность получают из природной последовательности с помощью ограниченных модификаций, таких как изменение/удаление/вставка одной или нескольких аминокислот в природной последовательности или путем добавления/удаления аминокислот с N- или С-конца из встречающейся в природе последовательности.
В этом контексте понятно, что пептидные фрагменты производятся из антигенов, как правило, в контексте эпитопного сканирования. По совпадению такие пептиды могут содержать в своей последовательности эпитоп МНС класса II и в непосредственной близости последовательность с модифицированным редокс-мотивом Н-Х(0,2)-С-Х(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93]. В настоящем документе «близость» означает, что между последовательностью эпитопа МНС класса II и между указанными выше мотивами H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93] может быть аминокислотная последовательность не более чем из 7 аминокислот, не более чем из 4 аминокислот, не более чем из 2 аминокислот или даже из 0 аминокислот (другими словами эпитоп и последовательность мотива непосредственно соседствуют друг с другом).
Соответственно, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения исключают пептидные фрагменты антигенов, которые случайно содержат также Т-клеточный эпитоп МНС класса и последовательность редокс-мотива, непосредственно примыкающие друг к другу или разделенные аминокислотной последовательностью до 2, 4 или 7 аминокислот.
Другие конкретные варианты осуществления настоящего изобретения исключают пептидные фрагменты антигенов, которые случайно содержат также Т-клеточный эпитоп МНС класса II и последовательность редокс-мотива, независимо от расстояния между эпитопом и модифицированным мотивом редокс-мотива.
Пептидные фрагменты антигенов исследуют на иммуногенные свойства, но как правило, не используют терапевтическое средство (кроме поля аллергии и опухолевой вакцинации). Таким образом, при отсутствии каких-либо сведений об улучшенных свойствах пептидов согласно настоящему изобретению использование таких пептидов в качестве лекарственных средств является беспрецедентным
Аминокислоты упоминаются в настоящем документе с их полным названием, трехбуквенной аббревиатурой или аббревиатурой из одной буквы.
Мотивы аминокислотных последовательностей записываются в настоящем документе в соответствии с форматом Prosite. Мотивы используются для описания определенного разнообразия последовательностей в определенных частях последовательности. Символ X используется для положения, в котором допускается любая аминокислота. Альтернативы указаны путем перечисления приемлемых аминокислот для данного положения между квадратными скобками ('[]'). Например: [CST] означает аминокислоту, выбранную из Cys, Ser или Thr. Аминокислоты, которые исключаются в качестве альтернатив, указаны путем перечисления их между фигурными скобками ('{}'). Например: {AM} обозначает любую аминокислоту, кроме Ala и Met. Различные элементы в мотиве отделены друг от друга дефисом. Повторение идентичного элемента внутри мотива может быть обозначено путем размещения за этим элементом числового значения или числового диапазона между круглыми скобками. Например: Х(2) соответствует Х-Х; Х(2, 5) соответствует 2, 3, 4 или 5 X аминокислотам, А(3) соответствует А-А-А.
Таким образом, Н-С-Х(2)-С [SED ID NO: 80] можно записать как НСХХС [SED ID NO: 80].
Равным образом С-Х(2)-С-Х(0,2) представляет три возможности, при которых между Н и С отсутствуют аминокислоты, есть одна или две; а именно СХХСН [SEQ ID NO: 83], СХХСХН [SEQ ID NO: 94] и СХХСХХН [SEQ ID NO: 95].
Равным образом Н-Х(0,2)-С-Х(2)-С представляет три возможности, при которых между Н и С отсутствуют аминокислоты, есть одна или две, а именно НСХХС [SEQ ID NO: 80], НХСХХС [SEQ ID NO: 96] и НХХСХХС [SEQ ID NO: 97].
Чтобы различать аминокислоты X, те, которые находятся между Н и С, называются внешними аминокислотами X (подчеркнуты одной линией в приведенной выше последовательности), те, которые находятся внутри редокс-мотива, называются внутренними аминокислотами X (подчеркнуты двойной линией в приведенной выше последовательности).
X представляет собой любую аминокислоту, в частности L-аминокислоту, более конкретно одну из 20 встречающихся в природе L-аминокислот.
Пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп и модифицированную последовательность пептидного мотива, обладающую восстановительной активностью, способен производить популяцию антигенспецифической цитолитической CD4+ Т-клетки по отношению к антигенпрезентирующим клеткам.
Соответственно, в самом широком смысле настоящее изобретение относится к пептидам, которые содержат по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп антигена (собственного или несобственного) с потенциалом запускать иммунную реакцию и модифицированный мотив последовательности тиоредуктазы с восстановительной активностью на пептидных дисульфидных связях. Т-клеточный эпитоп и модифицированная последовательность редокс-мотива могут непосредственно примыкать друг к другу в пептиде или необязательно быть разделены одной или несколькими аминокислотами (так называемой линкерной последовательностью). Необязательно пептид дополнительно содержит эндосомную нацеливающую последовательность и/или дополнительные «фланкирующие» последовательности.
Пептиды согласно настоящему изобретению содержат Т-клеточный эпитоп МНС класса II антигена (собственного или несобственного) с потенциалом запуска иммунной реакции и модифицированным редокс-мотивом. Восстанавливающую активность последовательности мотива в пептиде можно анализировать на его способность восстанавливать сульфгидрильную группу, такую как в анализе растворимости инсулина, в котором растворимость инсулина изменяется после восстановления или с флуоресцентно меченным субстратом, таким как инсулин. Пример такого анализа более подробно описан в экспериментальном разделе настоящей заявки.
Модифицированный редокс-мотив может быть расположен на стороне амино-конца Т-клеточного эпитопа или на карбокси-конце Т-клеточного эпитопа.
Пептидные фрагменты с восстановительной активностью встречаются в тиоредуктазах, которые представляют собой небольшие восстанавливающие дисульфид ферменты, включающие в себя глутаредоксины, нуклеоредоксины, тиоредоксины и другие тиол/дисульфид оксидоредуктазы (Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem. Pharm. 64, 1065-1069). Они многофункциональны, повсеместны и встречаются у многих прокариотов и эукариот. Они проявляют восстановительную активность для дисульфидных связей на белках (таких как ферменты) через редокс-активные цистеины в консенсусных последовательностях с консервативной активной областью: С-Х(2)-С [SEQ ID NO: 71], C-X(2)-S [SEQ ID NO: 72], C-X(2)-T [SEQ ID NO: 73], S-X(2)-C [SEQ ID NO: 74], T-X(2)-C [SEQ ID NO: 75] (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225; Fomenko et al. (2002) Prot. Science 11, 2285-2296), где X обозначает любую аминокислоту. Такие домены также встречаются в более крупных белках, таких как белок дисульфидизомераза (PDI) и фосфоинозитид-специфическая фосфолипаза С.
Редокс-мотив из 4 аминокислот, как известно, например, из Fomenko и WO 2008/017517, содержит цистеин в положении 1 и/или 4; таким образом, мотив представляет собой либо C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO:77], либо [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO: 76]. Такая тетрапептидная последовательность будет называться «мотивом». Мотив в пептиде может представлять собой любую из альтернатив СХ(2)-С [SEQ ID NO: 71], SX(2)-C [SEQ ID NO: 74], TX(2)-C [SEQ ID NO: 75], CX(2)-S [SEQ ID NO: 72] или CX(2)-T [SEQ ID NO: 73]. В частности, пептиды содержат мотив последовательности СХ(2)-С [SEQ ID NO: 71].
«Модифицированный» редокс-мотив пептидов согласно настоящему изобретению отличается от предшествующего уровня техники тем, что непосредственно примыкает к цистеину и вне мотива присутствует гистидин, другими словами модифицированный редокс-мотив записывается как HX(0,2)-CX(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-CX(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93].
Варианты осуществления настоящего изобретения представляют собой Н-ХХ-С-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 91], H-X-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 90], H-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78], [CST]-X(2)-C-XX-H [SEQ ID NO: 93], [CST]-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 92] и [CST]-X(2)-CH [SEQ ID NO: 79],
Более конкретные варианты осуществления
H-C-X(2)-S [SEQ ID NO: 81],
H-X-C-X(2)-S [SEQ ID NO:98],
H-XX-C-X(2)-S [SEQ ID NO: 99],
H-C-X(2)-T [SEQ ID NO: 82],
H-X-C-X(2)-T [SEQ ID NO: 100],
H-XX-C-X(2)-T [SEQ ID NO: 101],
S-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 84],
S-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 102],
S-X(2)-CXX-H [SEQ ID NO: 103],
T-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 85],
T-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 104],
T-X(2)-C-XX-H [SEQ ID NO: 105],
C-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 83],
C-X(2)-C-X-H [SEQ ID NO: 94],
C-X(2)-C-XX-H [SEQ ID NO: 95],
H-C-X(2)-C [SEQ ID NO: 80],
H-X-C-X(2)-C [SEQ ID NO: 96],
H-XX-C-X(2)-C [SEQ ID NO: 97].
Согласно конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения пептиды с мотивом Н-С-Х(2)-С-Н [SEQ ID NO: 86] исключены из объема настоящего изобретения.
Другие конкретные варианты осуществления представляют собой пептиды, в которых аминокислота цистеин редокс-мотива фланкирована двумя гистидиновыми последовательностями, такими как НСНхС [SEQ ID NO: 106] или СххНСН [SEQ ID NO: 107]
Как подробно объяснено далее, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены химическим синтезом, который позволяет включать неприродные аминокислоты. Соответственно, «С» в приведенных выше редокс-модифицированных редокс-мотивах представляет собой либо цистеин, либо другие аминокислоты с тиольной группой, такие как меркаптовалин, гомоцистеин или другие природные или неприродные аминокислоты с тиольной функцией. Для того чтобы иметь восстановительную активность, цистеины, присутствующие в модифицированном редокс-мотиве, не должны присутствовать как часть цистинового дисульфидного мостика. Тем не менее, редокс-модифицированный редокс-мотив может содержать модифицированные цистеины, такие как метилированный цистеин, который превращается в цистеин со свободными тиоловыми группами in vivo. X может представлять собой любую из 20 природных аминокислот, включая в себя S, С или Т, или может быть неприродной аминокислотой. Согласно конкретным вариантам осуществления X представляет собой аминокислоту с небольшой боковой цепью, такую как Gly, Ala, Ser или Thr. Согласно дополнительным конкретным вариантам осуществления X не представляет собой аминокислоту с объемной боковой цепью, такую как Trp. Согласно дополнительным конкретным вариантам осуществления X не представляет собой цистеин. Согласно дополнительным конкретным вариантам осуществления по меньшей мере один X в модифицированном редокс-мотиве представляет собой His. Согласно другим дополнительным конкретным вариантам осуществления по меньшей мере один X в модифицированном редокс-мотиве представляет собой Pro.
2
2
Пептиды могут дополнительно содержать модификации для повышения стабильности или растворимости, такие как модификация N-концевой NH-группы или C-концевой COOH-группы (например, модификация СООН в CONH-группу).
В пептидах согласно настоящему изобретению, содержащих модифицированный редокс-мотив, мотив расположен таким образом, что, когда эпитоп входит в бороздку МНС, мотив остается снаружи бороздки связывания МНС. Модифицированный редокс-мотив помещается либо непосредственно рядом с последовательностью эпитопа внутри пептида (другими словами, линкерная последовательность из нуля аминокислот между мотивом и эпитопом), либо отделена от Т-клеточного эпитопа линкером, содержащим аминокислотную последовательность из 7 аминокислот или меньше. Более конкретно, линкер содержит 1, 2, 3 или 4 аминокислоты. Конкретные варианты осуществления представляют собой пептиды с линкерами из 0, 1 или 2 аминокислот между эпитопной последовательностью и модифицированной последовательностью редокс-мотива. Альтернативно, линкер может содержать 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. В тех пептидах, где модифицированная последовательность редокс-мотива примыкает к последовательности эпитопа, это указано как положение от Р-4 до Р-1 или от Р+1 до Р+4, по сравнению с последовательностью эпитопа. Помимо пептидного линкера в качестве линкера могут быть использованы другие органические соединения для связывания частей пептида друг с другом (например, модифицированная последовательность редокс-мотива с последовательностью Т-клеточного эпитопа).
Пептиды согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать дополнительные короткие аминокислотные последовательности на N- или С-конце последовательности, содержащей Т-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив. Такую аминокислотную последовательность, как правило, называют в настоящем документе «фланкирующей последовательностью». Фланкирующая последовательность может быть расположена между эпитопом и эндосомальной нацеливающей последовательностью и/или между модифицированным редокс-мотивом и эндосомальной нацеливающей последовательностью. В некоторых пептидах, не содержащих эндосомальную нацеливающую последовательность, короткая аминокислотная последовательность может присутствовать на N- и/или С-конце модифицированного редокс-мотива и/или эпитопной последовательности в пептиде. Более конкретно, фланкирующая последовательность представляет собой последовательность из 1-7 аминокислот, наиболее предпочтительно последовательность из 2 аминокислот.
Модифицированный редокс-мотив может быть расположен на N-конце от эпитопа.
Согласно некоторым вариантам осуществления, при которых модифицированный редокс-мотив содержит один цистеин, этот цистеин присутствует в модифицированном редокс-мотиве в положении, удаленном от эпитопа, поэтому модифицированный редокс-мотив встречается, например, в виде Н-С-Х(2)-Т [SEQ ID NO: 82] или Н-С-Х(2)-S [SEQ ID NO: 81] на N-конце эпитопа или встречается в виде Т-Х(2)-С-Н [SEQ ID NO: 85] или S-X(2)-C-H [SEQ ID NO: 84] на С-конце эпитопа.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены пептиды, содержащие одну эпитопную последовательность и модифицированную последовательность редокс-мотива. Согласно дополнительным определенным вариантам осуществления модифицированный редокс-мотив встречается в пептиде несколько раз (1, 2, 3, 4 или даже больше раз), например, в виде повторов модифицированного редокс-мотива, которые могут быть отделены друг от друга одним или несколькими аминокислотами, или в виде повторов, которые непосредственно примыкают друг к другу. Альтернативно, один или несколько модифицированных редокс-мотивов предусмотрены как на N-, так и на С-конце Т-клеточной эпитопной последовательности.
Другие варианты, предусмотренные для пептидов согласно настоящему изобретению, включают в себя пептиды, которые содержат повторы Т-клеточной эпитопной последовательности, причем каждой последовательности эпитопа предшествует модифицированный редокс-мотив и/или он следуют за ней (например, повторы «модифицированный редокс-мотив-эпитоп» или повторы «модифицированный редокс-мотив-эпитоп-модифицированный редокс-мотив»). В этом случае модифицированные редокс-мотивы могут характеризоваться одной и той же последовательностью, но это не обязательно. Следует отметить, что повторяющиеся последовательности пептидов, которые содержат эпитоп, который сам по себе содержит модифицированный редокс-мотив, также приведут к последовательности, содержащей как «эпитоп», так и «модифицированный редокс-мотив». В таких пептидах модифицированный редокс-мотив в пределах одной эпитопной последовательности функционирует как модифицированный редокс-мотив вне второй последовательности эпитопа.
Как правило, пептиды согласно настоящему изобретению содержат только один Т-клеточный эпитоп. Как описано ниже, Т-клеточный эпитоп в последовательности белка может быть идентифицирован с помощью функциональных анализов и/или одного или нескольких предсказывающих анализов in silica. Аминокислоты в последовательности Т-клеточных эпитопов нумеруются в соответствии с их положением в связывающей бороздке белков МНС. Т-клеточный эпитоп, присутствующий в пептиде, состоит из 8-25 аминокислот, более предпочтительно из 8-16 аминокислот, наиболее предпочтительно состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот.
Согласно более конкретному варианту осуществления Т-клеточный эпитоп состоит из последовательности из 9 аминокислот. Согласно другому конкретному варианту осуществления Т-клеточный эпитоп представляет собой эпитоп, который презентируется Т-клеткам молекулами МНС класса II [рестриктированные по МНС класса II Т-клеточные эпитопы]. Типичная последовательность Т-клеточных эпитопов относится к октапептиду или, более конкретно, к нонапептидной последовательности, которая укладывается в расщелину белка МНС II.
Т-клеточный эпитоп пептидов согласно настоящему изобретению может соответствовать либо природной последовательности эпитопа белка, либо может представлять собой его модифицированный вариант, при условии, что модифицированный Т-клеточный эпитоп сохраняет свою способность связываться в пределах расщелины МНС, аналогично природному Т-клеточному эпитопу. Модифицированный Т-клеточный эпитоп может иметь такую же аффинность связывания с белком МНС, что и природный эпитоп, но может также характеризоваться пониженной аффинностью. В частности, аффинность связывания модифицированного пептида не менее чем в 10 раз меньше, чем исходного пептида, более конкретно, не менее чем в 5 раз меньше. Пептиды согласно настоящему изобретению оказывают стабилизирующее действие на белковые комплексы. Соответственно, стабилизирующий эффект комплекса пептид-МНС компенсирует пониженную аффинность модифицированного эпитопа к молекуле МНС.
Последовательность, содержащая Т-клеточный эпитоп и восстанавливающее соединение в пептиде, может быть дополнительно связана с аминокислотной последовательностью (или другим органическим соединением), которая облегчает захват пептида в поздние эндосомы для обработки и презентации в детерминантах МНС класса II. Позднее нацеливание эндосом опосредуется сигналами, присутствующими в цитоплазматическом хвосте белков, и соответствует хорошо идентифицированным пептидным мотивам, таким как основанный на дилейцине мотив [DE]XXXL[LI] [SEQ ID NO: 87] или DXXLL [SEQ ID NO: 88], основанный на тирозине мотив УХХФ [SEQ ID NO: 89] или так называемый кислый кластерный мотив. Символ Ф представляет собой аминокислотные остатки с объемными гидрофобными боковыми цепями, такими как Phe, Tyr и Trp. Последовательности позднего нацеливания эндосомы обеспечивают возможность обработки и эффективной презентации Т-клеточного эпитопа, полученного из антигенов молекулами МНС класса II. Такие последовательности эндосомального нацеливания содержатся, например, в белке gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J. Cell. Biol. 130, 807-820), белке CD3 гамма человека, HLA-BM 11 (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027), цитоплазматическом хвосте рецептора DEC205 (Mahnke et al. (2000) J. Cell Biol. 151, 673-683). Другие примеры пептидов, которые функционируют как сигналы сортировки для эндосомы, раскрыты в обзоре Bonifacio and Traub (2003) Annu. Rev. Biochem. 72, 395-447. Альтернативно, последовательность может представлять собой последовательность субдоминантного или минорного Т-клеточного эпитопа из белка, которая облегчает поглощение в поздней эндосоме без преодоления Т-клеточного ответа в отношении антигена. Последовательность позднего нацеливания эндосомы может быть расположена либо на аминоконце, либо на карбоксиконце полученного из антигена пептида, для эффективного захвата и процессинга, а также может быть связана через фланкирующую последовательность, такую как пептидная последовательность до 10 аминокислот. При использовании минорного Т-клеточного эпитопа для целей нацеливания последний, как правило, располагается на аминоконце полученного из антигена пептида.
Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены пептиды антигенных белков и их применение для выявления специфических иммунных реакций. Эти пептиды могут в равной степени соответствовать фрагментам белков, которые содержат в своей последовательности, то есть восстанавливающее соединение и Т-клеточный эпитоп отделены не более чем 10, предпочтительно 7, аминокислотами или менее. Альтернативно, и для большинства антигенных белков, пептиды согласно настоящему изобретению получают путем связывания восстанавливающего соединения, более конкретно восстанавливающего модифицированного редокс-мотива, описанного в настоящем документе, на N-конце или С-конце с Т-клеточным эпитопом антигенного белка (либо непосредственно рядом с ним или с линкером не более чем из 10, более конкретно не более чем из 7 аминокислот). Более того, последовательность Т-клеточного эпитопа белка и/или модифицированного редокс-мотива может быть модифицирована и/или может быть введена (или модифицирована) одна или несколько фланкирующих последовательностей и/или последовательность-мишень, по сравнению с природной последовательностью. Таким образом, в зависимости от того, могут или нет признаки настоящего изобретения быть найдены в последовательности представляющего интерес антигенного белка, пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать последовательность, которая представляет собой «искусственную» или «встречающуюся в природе».
Пептиды согласно настоящему изобретению могут существенно изменяться по длине. Длина пептидов может варьировать от 13 или 14 аминокислот, то есть состоять из эпитопа из 8-9 аминокислот, примыкающего к нему модифицированного редокс-мотива из 5 аминокислот с гистидином, до 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 или 200 аминокислот. Например, пептид может содержать эндосомальную нацеливающую последовательность из 40 аминокислот, фланкирующую последовательность из приблизительно 2 аминокислот, описанный в настоящем документе мотив из 5 аминокислот, линкер из 4 аминокислот и Т-клеточный эпитоп-пептид из 9 аминокислот.
Соответственно, согласно конкретным вариантам осуществления целые пептиды состоят из от 13 аминокислот до 50, 75, 100 или 200 аминокислот. Более конкретно, если восстанавливающее соединение представляет собой описанный в настоящем документе модифицированный редокс-мотив, длина (искусственной или природной) последовательности, содержащей эпитоп и модифицированный редокс-мотив, необязательно соединенные линкером (обозначаемым в настоящем документе как последовательность «эпитоп-модифицированный редокс-мотив»), без эндосомальной нацеливающей последовательности, является критической. «Эпитоп-модифицированный редокс-мотив» более конкретно имеет длину 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 аминокислот. Такие пептиды из от 13 или 14 до 19 аминокислот необязательно могут быть связаны с эндосомальным нацеливающим сигналом, размер которого менее критичен.
Как подробно описано выше, согласно конкретным вариантам осуществления пептиды по настоящему изобретению содержат описанный в настоящем документе восстанавливающий модифицированный редокс-мотив, связанный с последовательностью Т-клеточного эпитопа.
Небольшое количество белковых последовательностей, фрагментов белков или синтетических пептидов может по совпадению содержать последовательность модифицированного редокс-мотива. Однако вероятность того, что эти белки содержат Т-клеточный эпитоп класса МНС вблизи модифицированной редокс последовательности, становится очень малой. Хотя существование таких пептидов будет, вероятно, известно из экспериментов по сканированию эпитопов, в которых синтезируются наборы перекрывающихся пептидных фрагментов. В таких публикациях интерес представляет эпитоп и пренебрегают значимостью модифицированного редокс-мотива с гистидином и значимостью таких пептидов в медицинских применениях.
Таким образом, такие пептиды являются случайными раскрытиями, не связанными с концепцией настоящего изобретения.
Согласно дополнительным конкретным вариантам осуществления пептиды согласно настоящему изобретению представляют собой пептиды, содержащие Т-клеточные эпитопы, которые не содержат аминокислотную последовательность с редокс свойствами в пределах своей природной последовательности.
Однако, согласно альтернативным вариантам осуществления Т-клеточный эпитоп может содержать любую последовательность аминокислот, обеспечивающую связывание эпитопа с расщелиной МНС. Когда представляющий интерес эпитоп антигенного белка содержит модифицированный редокс-мотив, такой как описан в настоящем документе, в пределах его эпитопной последовательности, иммуногенные пептиды согласно настоящему изобретению содержат последовательность описанного в настоящем документе модифицированного редокс-мотива и/или другой восстанавливающей последовательности, связанной на N- или С-конце с последовательностью эпитопа, так что (вопреки модифицированному редокс-мотиву, присутствующему в эпитопе, который утоплен в расщелине) присоединенный модифицированный редокс-мотив может обеспечить восстанавливающую активность.
Соответственно, Т-клеточный эпитоп и мотив непосредственно примыкают друг к другу или отделены друг от друга и не перекрываются. Для оценки понятия «непосредственно примыкают» или «отделены» определяют последовательность из 8 или 9 аминокислот, которая совпадает с расщелиной МНС, и определяют расстояние между этим октапептидом или нонапептидом и пентапептидом модифицированного редокс-мотива.
Как правило, пептиды по настоящему изобретению представляют собой не природные (т.е. не содержат фрагментов белков как таковых), а искусственные пептиды, которые содержат, помимо Т-клеточного эпитопа, описанный в настоящем документе модифицированный редокс-мотив, посредством чего модифицированный редокс-мотив немедленно отделяется от Т-клеточного эпитопа с помощью линкера, содержащего до семи, наиболее предпочтительно до четырех или до двух, аминокислот.
Было показано, что при введении (т.е. инъекции) млекопитающему пептида согласно настоящему изобретению (или композиции, содержащей такой пептид), пептид вызывает активацию Т-клеток, распознающих полученный из антигена Т-клеточный эпитоп, и обеспечивает дополнительный сигнал к Т-клетке за счет уменьшения поверхностного рецептора. Эта сверхоптимальная активация приводит к тому, что Т-клетки приобретают цитолитические свойства для клетки, презентирующей Т-клеточный эпитоп, а также супрессивные свойства на Т-клетках с неканоническим фенотипом. Таким образом, пептиды или композиция, содержащая описанные в настоящем изобретении пептиды, которые содержат полученный из антигена Т-клеточный эпитоп и, вне эпитопа, модифицированный редокс-мотив могут быть использованы для непосредственной иммунизации млекопитающих, включающих в себя человека. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены пептиды согласно настоящему изобретению или его производные для применения в качестве лекарственного средства. Соответственно, в настоящем изобретении предусмотрены терапевтические способы, которые предусматривают введение одного или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением нуждающемуся в этом пациенту.
Настоящее изобретение предлагает способы, посредством которых антигенспецифические Т-клетки, обладающие цитолитическими свойствами, могут быть получены путем иммунизации небольшими пептидами. Было обнаружено, что пептиды, которые содержат (i) последовательность, кодирующую Т-клеточный эпитоп из антигена, и (ii) консенсусную последовательность с редокс свойствами и дополнительно необязательно также содержащую последовательность, облегчающую захват пептида в поздние эндосомы для эффективного представления МНС класса II, вызывают супрессорные Т-клетки.
Иммуногенные свойства пептидов согласно настоящему изобретению представляют особый интерес для лечения и профилактики иммунных реакций.
Пептиды, описанные в настоящем документе, применяются в качестве лекарственного средства, более конкретно, применяются для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения иммунного нарушения у млекопитающего, в частности у человека.
В настоящем изобретении описаны способы лечения или профилактики иммунного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении или профилактике, с использованием пептидов согласно настоящему изобретению, их гомологов или производных, способы, предусматривающие стадию введения указанному млекопитающему, страдающему от иммунного заболевания или характеризующегося риском его развития, терапевтически эффективного количества пептидов согласно настоящему изобретению, их гомологов или производных, например, для уменьшения симптомов иммунного заболевания. Предусматривается лечение как людей, так и животных, таких как домашние животные и сельскохозяйственные животные. Согласно одному варианту осуществления подлежащее лечению млекопитающее представляет собой человека. Иммунные нарушения, упомянутые выше, согласно конкретному варианту осуществления выбраны из аллергических заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Аллергические заболевания, как правило, описываются как опосредуемые типом 1 заболевания или опосредованные IgE заболевания. Клинические проявления аллергических заболеваний включают в себя бронхиальную астму, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевую гиперчувствительность и анафилактические реакции на укусы насекомых или лекарственные средства. Аллергические заболевания вызываются реакциями гиперчувствительности иммунной системы на специфические вещества, называемые аллергенами (такие как пыльца, жала, лекарственные средства или пища). Самой тяжелой формой аллергического нарушения является анафилактический шок, который нуждается в неотложной медицинской помощи. Аллергены включают в себя переносимые по воздуху аллергены, такие как аллергены из домашней пыли, домашних животных и пыльцы. Аллергены также включают в себя проглатываемые аллергены, ответственные за пищевую гиперчувствительность, включающие в себя фрукты, овощи и молоко. Для лечения вышеуказанных заболеваний пептиды согласно настоящему изобретению получают из антигенных белков или аллергенов, известных или считающихся причинным фактором заболевания. Аллергены, которые можно использовать для отбора Т-клеточных эпитопов, как правило, являются аллергенами, которые выбирают из группы, состоящей из пищевых аллергенов, присутствующих в арахисе, рыбе, например, треске, яичном белке, ракообразных, например, креветках, молоке, например, коровьем молоке, пшенице, злаках, плодах семейства Rosacea (яблоня, слива, земляника), овощах семейства Liliacea, Cruciferae, Solanaceae и Umbelliferae, орехах, кунжуте, арахисе, сое и другие аллергены семейства бобовых, специях, авокадо, манго, инжире, банане, аллергенов клещей домашней пыли, полученных из Dermatophagoides spp или D. pteronyssinus, D. farinae и D. microceras, Euroglyphus maynei или Blomia sp., аллергенов из насекомых, присутствующих в таракане или Hymenoptera, аллергенов из пыльцы, особенно пыльцы дерева, травы и сорняков, аллергенов из животных, особенно кошек, собак, лошадей и грызуна, аллергенов из грибов, особенно из Aspergillus, Altemaria или Cladosporium, а также профессиональные аллергены, присутствующие в таких продуктах, как латекс, амилаза и т.п.
В качестве примера аллергенов в контексте настоящего изобретения пептид derp 2 CGFSSNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID NO: 9] модифицируют в HCGFSSNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID NO: 10] или HCGFCSNYCQIYPPNANKIR [SEQ ID NO: 11]. В качестве дополнительного примера аллергенов пептид der p 2 CHGSEPCIIHRGKPF (SEQ ID NO: 12) модифицируют в HCHGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID NO: 13], HCHGCEPCIIHRGKPF [SEQ ID NO: 14] в HCxGSEPCIIHRGKPF [SEQ ID NO: 15] или HCxGCEPCIIHRGKPF, где x представляет собой не His или Cys [SEQ ID NO: 16].
В качестве дополнительного примера аллергенов пептид бета-лактоглобулин CHGCAQKKIIAEK [SEQ ID NO: 17] модифицируют в HCHGCAQKKIIAEK [SEQ ID NO: 18], более типично в HCxGCAQKKIIAEK, где x представляет собой не Cys или His [SEQ ID NO: 19].
В качестве примера аутоиммунного заболевания пептид тиреоидную пероксидазу CGPCMNEELTERL [SEQ ID NO: 20] модифицируют в HCGPCMNEELTERL [SEQ ID NO: 21].
В качестве примера аутоиммунного заболевания пептид тиреоглобулин CGPSAALTWVQTH [SEQ ID NO: 22] модифицируют в HCGPCAALTWVQTH [SEQ ID NO: 23].
Настоящее изобретение, кроме того, относится к пептидам с модифицированным редокс-мотивом, содержащим Т-клеточные эпитопы МНС класса II вирусных белков, которые кодируются остовом вирусных векторов, используемых в генной терапии и генной вакцинации. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения или профилактики иммунного ответа на вирусный вектор. Примеры вирусных векторов (например, от аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса герпеса или поксвируса, ретровирусов или лентивируса) и вирусных белков (например, капсидный белок) раскрыты в WO 2009101204.
В качестве примера идеи согласно настоящему изобретению аденовирусный пептид CHGCPTLLYVLFEV [SEQ ID NO: 24] модифицируют в HCHGCPTLLYVLFEV [SEQ ID NO: 25], более типичный HCxGCPTLLYVLFEV, где X представляет собой не Cys или His [SEQ ID NO: 26]
В качестве дополнительного примера, пептид аденовирусного позднего белка 2 CGPCGGYVPFHIQVP [SEQ ID NO: 27] модифицируют в HCGPCGGYVPFHIQVP [SEQ ID NO: 28].
Настоящее изобретение дополнительно относится к пептидам с модифицированным редокс-мотивом, содержащим Т-клеточные эпитопы МНС класса II белков внутриклеточных патогенов. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения и профилактики инфекций с внутриклеточными патогенами. Примеры внутриклеточных патогенов (вирусов [ДНК против РНК-вирусов, ss против ds вирусов, бактерий, микобактерий или паразитов с внутриклеточным жизненным циклом) и антигенов обсуждаются в WO 2009101208 (например, Herpesviridae, Flaviviridae и Picornaviridae, вирусы гриппа, кори и иммунодефицита, папилломавирусы, бактерии и микобактерий, включающие в себя Mycobacterium tuberculosis и другие микобактерий, патогенные для людей или животных, такие как Yersiniae, Brucellae, Chlamydiae, Mycoplasmae, Rickettsiae, Salmonellae и Shigellae. Паразиты включают в себя Plasmodium, Leishmanias, Trypanosomas, Toxoplasma gondii, Listeria sp., Histoplasma sp.
В качестве дополнительного примера антиген CSP малярии CGHCDKHIEQYLK [SEQ ID NO: 29] модифицируют в HCGHCDKHIEQYLK [SEQ ID NO: 30], более типично в HCGxCDKHIEQYLK, где x представляет собой не Cys или His [SEQ ID NO: 31].
В качестве дополнительного примера пептид CGHCEKKICKMEK [SEQ ID NO: 32] того же антигена модифицируют в HCGHCEKKICKMEK [SEQ ID NO: 33], более типично в HCGxCEKKICKMEK [SEQ ID NO: 34], где x не представляет собой Cys или His.
В качестве дополнительного примера пептид из гемагглютинина гриппа модифицируют из CGHCKYVKQNTLK [SEQ ID NO: 35] в HCGHCKYVKQNTLK [SEQ ID NO: 36], более типично в HCGxCKYVKQNTLK, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 37].
В качестве дополнительного примера пептид из Lack-антигена Leishmania CGHCEHPIVVSGS [SEQ ID NO: 38] модифицируют в HCGHCEHPIVVSGS [SEQ ID NO: 39], более типично в HCGxCEHPIVVSGS, где X не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 40].
В качестве дополнительного примера пептид субъединицы gpl20 белка Env ВИЧ модифицируют из CGHCRAMYAPPIA [SEQ ID NO: 41] в HCGHCRAMYAPPIA [SEQ ID NO: 42], более типично в HCGxCRAMYAPPIA, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 43].
Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам с модифицированным редокс-мотивом, содержащим Т-клеточные эпитопы МНС класса II растворимых аллофакторов, таких как используемые в замещающих терапиях. Настоящее изобретение также относится к способам лечения и профилактики иммунных реакций на растворимые аллофакторы. Примеры растворимых аллофакторов раскрыты в WO 2009101206.
В качестве примера настоящего изобретения пептид определяющей комплементарность области (CDR) 3 области VH антитела В02С11 против фактора VIII CHGCYCAVPDDPDA [SEQ ID NO: 44] модифицируют в HCHGCYCAVPDDPDA [SEQ ID NO: 45], более типично в HCxGCYCAVPDDPDA, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 46].
В качестве дополнительного примера пептид, полученный из другого антитела к фактору VIII CGHCGGIRLHPTHYSIR [SEQ ID NO: 47] модифицируют в HCGHCGGIRLHPTHYSIR [SEQ ID NO: 48], более типично в HCGxCGGIRLHPTHYSIR, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 49].
Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидам с модифицированным редокс-мотивом, содержащим Т-клеточные эпитопы МНС класса II связанных с опухолью антигенов. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения и профилактики опухолей. Примеры соответствующих опухолей (например, онкоген, протоонкоген, вирусный белок, антиапоптический фактор, клонотипическая детерминанта) и связанные с опухолью антигены описаны в W0 929101205. Такие связанные с опухолью антигены включают в себя вирусные антигены вызывающих опухоль вирусов, такие как HPV, связанные с опухолью антигены пациента, которые содержат последовательность дикого типа, но характеризуются повышенной экспрессией в опухолях, или антигены, которые содержат мутированную последовательность посредством точечных мутаций, делеций, сдвигов рамки или хромосомных перестроек.
В качестве примера идеи настоящего изобретения пептид MAGE-3 CHGCYRQVPGSDP [SEQ ID NO: 50] модифицируют в HCHGCYRQVPGSDP [SEQ ID NO: 51], более типично в HCxGCYRQVPGSDP, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 52].
В качестве дополнительного примера пептид cyclin D CHGCFVALCATDV [SEQ ID NO: 53] модифицируют в HCHGCFVALCATDV [SEQ ID NO: 54], более типично в HCxGCFVALCATDV, где X не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 55].
В качестве дополнительного примера антиапоптический пептид CHGCFKELEGWEP [SEQ ID NO: 56] модифицируют в HCHGCFKELEGWEP [SEQ ID NO: 57], более типично в HCxGCFKELEGWEP, где X не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 58].
В качестве дополнительного примера пептид вируса Эпштейна-Барра CHGCVASSYAAAQ [SEQ ID NO: 59] модифицируют в HCHGCVASSYAAAQ [SEQ ID NO: 60], более типично в HCxGCVASSYAAAQ, где X не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 61].
Настоящее изобретение, кроме того, относится к пептидам с модифицированным редокс-мотивом, содержащим Т-клеточные эпитопы МНС класса II аллоантигенного белка аллотрансплантата. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам лечения и предупреждения отторжения аллотрансплантата. Примерами являются трансплантаты костного мозга, трансплантаты паренхиматозных органов, такие как почка, легкое, сердце, печень, поджелудочная железа, кость или кожа, или клеточные трансплантаты, такие как трансплантат пуповинной крови, трансплантат стволовых клеток или трансплантат островковых клеток поджелудочной железы. Примеры аллоантигенных белков описаны в WO 2009100505, например, минорные антигены гистосовместимости, основные антигены гистосовместимости или тканеспецифические антигены.
В качестве примера настоящего изобретения пептид из мышиного антигена Dby CHGCFNSNRANSS [SEQ ID NO: 62] модифицируют в HCHGCFNSNRANSS [SEQ ID NO: 63], более конкретно в HCxGCFNSNRANSS, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 64].
В другом примере последовательность из Dby человека CGHCLVLAPTREL [SEQ ID NO: 65] модифицируют в HCGHCLVLAPTREL [SEQ ID NO: 66], более конкретно в HCGxCLVLAPTREL, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 67].
В другом примере мышиный штамм-специфический пептид Black 6 CGHCPEFLEQKRA [SEQ ID NO: 68] модифицируют в HCGHCPEFLEQKRA [SEQ ID NO: 69], более типично в HCGxCPEFLEQKRA, где x не представляет собой Cys или His [SEQ ID NO: 70].
Для всех вышеуказанных пептидов предусматривается дополнительный вариант, в котором между гистидином и цистеином присутствуют одна или две аминокислоты X. Как правило, эта внешняя аминокислота(ы) X представляет собой не His, Cys, Ser или Thr.
Пептиды по настоящему изобретению могут также использоваться в диагностических способах in vitro для обнаружения рестриктированных по классу II CD4+ Т-клеток в образце. В этом способе образец контактирует с комплексом молекулы МНС класса II и пептидом в соответствии с настоящим изобретением. CD4+ Т-клетки обнаруживали посредством измерения связывание комплекса с клетками в образце, причем связывание комплекса с клеткой указывает на наличие CD4+ Т-клеток в образце.
Комплекс может представлять собой слитый белок пептида и молекулы МНС класса II.
Альтернативно, молекулы МНС в комплексе представляют собой тетрамеры. Комплекс может быть предусмотрен в виде растворимой молекулы или может быть присоединен к носителю.
Т-клеточный эпитоп, соответствующий антигенному белку (или иммунологу), подходящий для применения в контексте настоящего изобретения, как правило, представляет собой универсальный или неизбирательный Т-клеточный эпитоп (т.е. Т-клеточный эпитоп, способный связываться с большинством молекул МНС класса II), более конкретно, присутствующий на ингаляционном аллергене или пищевом аллергене. Согласно конкретным вариантам осуществления аллерген выбирают из группы, состоящей из аллергенов рино-синусита, аллергенов аллергической бронхиальной астмы и аллергенов атопического дерматита. Аллергены также могут быть главными аллергенами, присутствующими в плесени или различных лекарственных средствах, такими как гормоны, антибиотики, ферменты и т.д. (смотрите также определение в Clin. Exp. Allergy 26, 494-516 (1996) и в Molecular Biology of Allergy and Immunology, Ed. R. Bush (1996)). Другие аллергены, относящиеся к конкретным аллергическим заболеваниям, также хорошо известны в настоящей области техники и могут быть найдены в интернете, например, на сайте www.allergome.org.
Аутоиммунные заболевания широко классифицируются на две категории, органоспецифические и системные заболевания. Точная этиология системных аутоиммунных заболеваний не выявлена. В противоположность этому, органоспецифические аутоиммунные заболевания связаны со специфическим иммунным ответом, включающим в себя В- и Т-клетки, которые направленно воздействуют на орган и тем самым индуцируют и поддерживают хроническое состояние местного воспаления. Примеры органоспецифических аутоиммунных заболеваний включают в себя сахарный диабет типа 1, миастению, тиреоидит и рассеянный склероз. В каждом из этих состояний был идентифицирован один или небольшое количество аутоантигенов, включая в себя инсулин, мышечный рецептор ацетилхолина, пероксидазу щитовидной железы и основной главный белок, соответственно. Хорошо известно, что подавление этого органоспецифического иммунного ответа благоприятно и приводит к частичному или полному восстановлению функции органа. Однако, не существует терапии, которая подавляла бы такой иммунный ответ антиген-специфическим образом. Текущая терапия скорее использует неспецифическую супрессию, полученную при использовании кортикостероидов и иммунодепрессантов, причем все они проявляют значительные побочные эффекты, связанные с отсутствием специфичности, тем самым ограничивая их использование и общую эффективность. Неограниченный перечень примеров органоспецифических аутоиммунных нарушений и вовлеченных в это аутоантигенов, которые предусматриваются в контексте настоящего изобретения, представляет собой:
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрены иммуногенные пептиды, которые содержат Т-клеточный эпитоп антигена (собственного или несобственного) с потенциалом для запуска иммунной реакции. Согласно конкретному варианту осуществления Т-клеточный эпитоп представляет собой доминантный Т-клеточный эпитоп.
Соответственно, согласно конкретным вариантам осуществления способы лечения и профилактики по настоящему изобретению предусматривают введение описанного в настоящем документе иммуногенного пептида, причем пептид содержит Т-клеточный эпитоп антигенного белка, который играет роль в подлежащем лечению заболевании (например, таком как описанные выше). Согласно дополнительным определенным вариантам осуществления используемый эпитоп представляет собой доминантный эпитоп.
Настоящее изобретение также относится к способам получения пептидов с Т-клеточным эпитопом МНС класса II и модифицированным редокс-мотивом.
На первой стадии способ предусматривает стадию обеспечения последовательности представляющего интерес антигенного белка и идентификацию последовательности Т-клеточного эпитопа МНС класса II в антигене. Эпитопные последовательности, возможно, были описаны еще для рассматриваемого антигенного белка. Альтернативно, они определяются посредством способов in silico, способов in vitro или способов in vivo. Кроме того, антигенный белок подвергают скринингу на присутствие модифицированного редокс-мотива, который не требует специфических способов in silico.
Существует очень небольшой, но существующий шанс того, что антигенный белок содержит в своей последовательности мотив H-X(0,2)C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93] в непосредственной близости от последовательности Т-клеточного эпитопа (т.е. отделен от Т-клеточного эпитопа посредством 7 или менее аминокислот). Если это так, фрагмент антигенного белка, содержащий Т-клеточный эпитоп и мотив, может быть использован для способов и применений профилактического изобретения. Эпитоп в таких белках, возможно, обсуждался в предшествующем уровне техники, но присутствие, не говоря уже о значимости такого модифицированного редокс-мотива, не обсуждалось. Соответственно, в предшествующем уровне техники не было стимула отбирать такие пептидные фрагменты или использовать такие пептидные фрагменты для описанных в настоящем документе способов. Согласно некоторым вариантам осуществления, в которых пептид основан на фрагменте белка, который содержит Т-клеточный эпитоп МНС класса II и модифицированный редокс-мотив, такая пептидная последовательность может быть дополнительно модифицирована путем изменения длины последовательности между эпитопом и модифицированным редокс-мотивом, изменения аминокислот в линкерной последовательности, изменения Ser или Thr в мотиве на цистеин или изменения аминокислот в одном или обоих положениях X в пределах мотива.
Другие антигенные белки, которые используются для разработки пептидов, могут содержать последовательность H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93] в своей последовательности, которая дополнительно удалена от Т-клеточного эпитопа МНС класса II (более чем на 7 аминокислот от последовательности эпитопа).
В таких случаях может быть получен пептид, в котором только расстояние между эпитопом и мотивом укорачивается и посредством чего сохраняется последовательность мотива и соседних аминокислот. Если это считается подходящим, аминокислоты вне мотива, серии или треонин в мотиве или одно или оба положения X изменяются.
Более общие антигенные белки, которые используются для разработки пептидов, не будут содержать последовательность H-X(0,2)-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93] в своей белковой последовательности. Пептиды в соответствии с настоящим изобретением будут получены посредством синтеза пептида, причем Т-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив будут разделены 0-7 аминокислотами. Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный редокс-мотив может быть получен путем введения 1, 2 или 3 мутаций вне эпитопной последовательности, чтобы сохранить контекст последовательности как происходящий в белке. Как правило, аминокислоты в Р-2 и Р-1, а также в Р+10 и Р+11, по отношению к нонапептиду, которые являются частью природной последовательности, сохраняются в пептидной области. Эти фланкирующие остатки, как правило, стабилизируют связывание с МНС класса II. Согласно другим вариантам осуществления последовательность N-конца или С-конца эпитопа не будет связана с последовательностью антигенного белка, содержащего последовательность Т-клеточного эпитопа.
Согласно другим конкретным вариантам осуществления пептиды получают путем модификации пептидов с помощью Т-клеточного эпитопа и мотива C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 77] или [CST]-X(2)-C [SEQ ID NO: 76], как раскрыто в WO 2008/017517. Добавление гистидина или модификация аминокислоты в гистидине приводит к пептидам по настоящему изобретению с последовательностью H-X(2,0)-C-X(2)-[CST] [SEQ ID NO: 78, 90 или 91] или [CST]-X(2)-C-X(0,2)-H [SEQ ID NO: 79, 92 или 93].
Таким образом, на основе вышеуказанных способов разработки пептида, пептид производят химическим пептидным синтезом, рекомбинантными способами экспрессии или, в более исключительных случаях, протеолитической или химической фрагментацией белков.
Полученные в вышеуказанных способах пептиды могут быть исследованы на присутствие Т-клеточного эпитопа в способах in vitro и in vivo, могут быть исследованы на их понижающую активность в анализах in vitro. В качестве окончательного контроля качества пептиды могут быть исследованы в анализах in vitro для проверки того, могут ли пептиды образовывать CD4+ Т-клетки, которые цитолитичны через апоптотический путь для антигенпрезентирующих клеток, представляющих антиген, который содержит эпитопную последовательность, которая также присутствует в пептиде с модифицированным редокс-мотивом.
Идентификация и селекция Т-клеточного эпитопа из антигенных белков для использования в контексте настоящего изобретения известна специалисту в настоящей области техники.
Для идентификации эпитопа, подходящего для использования в контексте настоящего изобретения, выделенные пептидные последовательности антигенного белка исследуют, например, с помощью способов биологии Т-клеток, чтобы определить, вызывают ли пептидные последовательности Т-клеточный ответ. Те пептидные последовательности, которые, как обнаружено, вызывают Т-клеточный ответ, определяются как обладающие стимулирующей активностью Т-клеток.
Стимулирующую активность Т-клеток человека можно дополнительно исследовать путем культивирования Т-клеток, полученных от индивидуума, чувствительного, например, к аллергену клеща (т.е. индивидууму, который характеризуется опосредованным IgE иммунным ответом на клеточный аллерген) с пептидом/эпитопом, полученным из аллергена, и определения того, происходит ли пролиферация Т-клеток в ответ на пептид/эпитоп, как измерено, например, посредством клеточного захвата меченного тритием тимидина. Индексы стимуляции для ответов Т-клетками на пептиды/эпитопы можно рассчитать как максимальную СРМ в ответ на пептид/эпитоп, деленный на контрольную СРМ. Индекс стимуляции Т-клеток (S.I.), равный или превышающий двукратный уровень фона, считается «позитивным». Позитивные результаты используются для расчета среднего индекса стимуляции для каждого пептида/эпитопа для группы исследуемых пептидов/эпитопов.
Неприродные (или модифицированные) Т-клеточные эпитопы могут быть дополнительно необязательно исследованы на их аффинность связывания с молекулами МНС класса И. Это можно сделать по-разному. Например, растворимые молекулы HLA класса II получают путем лизиса клеток, гомозиготных для данной молекулы класса II. Последние очищают посредством аффинной хроматографии. Растворимые молекулы класса II инкубируют с меченным биотином эталонным пептидом, полученным в соответствии с его сильной связывающей аффинностью к этой молекуле класса II. Пептиды, подлежащие оценке на связывание с классом II, затем инкубируют в разных концентрациях, и их способность замещать эталонный пептид из его связывания класса II рассчитывают добавлением нейправидина. Способы могут быть найдены, например, в Texier et al., (2000) J. Immunology 164, 3177-3184).
В соответствии с настоящим изобретением иммуногенные свойства Т-клеточных эпитопов повышаются посредством его связывания с модифицированным редокс-мотивом, который обладает улучшенными восстанавливающими свойствами. В частности, пептиды по настоящему изобретению, содержащие по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп и модифицированный редокс-мотив, как описано в настоящем документе, имеют средний показатель стимуляции Т-клеток, превышающий или равный 2,0. Пептид, характеризующийся индексом стимуляции Т-клеток, превышающим или равным 2,0, считается применимым в качестве терапевтического средства. Более конкретно, пептиды согласно настоящему изобретению характеризуются средним показателем стимуляции Т-клеток по меньшей мере 2,5, по меньшей мере 3,5, по меньшей мере 4,0 или даже по меньшей мере 5,0. Кроме того, пептиды, как правило, характеризуются индексом позитивности (P.I.) по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере приблизительно 200 или по меньшей мере приблизительно 250. Индекс позитивности для пептида определяется путем умножения среднего показателя стимуляции Т-клеток на процент индивидуумов в популяции индивидуумов с иммунным ответом (например, чувствительных к домашнему пылевому клещу) (например, по меньшей мере 9 индивидуумов, по меньшей мере 16 индивидуумов или по меньшей мере 29 или 30 или даже больше), у которых есть Т-клетки, которые реагируют на пептид (таким образом, соответствующий SI, умноженный на неизбирательность пептида/эпитопа). Таким образом, индекс позитивности представляет собой как силу ответа Т-клеток на пептид (S.I.), так и частоту ответа Т-клеток на пептид в популяции индивидуумов с иммунным ответом (например, чувствительным к домашнему пылевому клещу).
Для определения оптимальных Т-клеточных эпитопов, например, с помощью способов тонкого картирования, пептид, обладающий Т-клеточной стимулирующей активностью и, таким образом, содержащий по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп, как определено способами биологии Т-клеток, модифицируют добавлением аминокислотных остатков или делецией их либо по амино-, либо по карбокси-концу пептида и исследуют для определения изменения реакционной способности Т-клеток к модифицированному пептиду. Было обнаружено, что если два или более пептидов, которые характеризуются наличием общей области перекрытия в нативной последовательности белка, обладают стимулирующей Т-клетки человека активностью, что определяется способами биологии Т-клеток, могут быть получены дополнительные пептиды, содержащие все или часть таких пептидов, и эти дополнительные пептиды могут быть исследованы посредством аналогичной процедуры. Следуя этой технике, пептиды отбирают и продуцируют рекомбинантно или синтетически. Т-клеточные эпитопы или пептиды выбирают на основе различных факторов, включающих в себя силу ответа Т-клеток на пептид/эпитоп (например, индекс стимуляции) и частоту ответа Т-клеток на пептид в популяции индивидуумов.
Дополнительно и/или альтернативно, один или несколько алгоритмов in vitro могут быть использованы для идентификации последовательности Т-клеточного эпитопа в антигенном белке. Подходящие алгоритмы включают в себя, без ограничения, те, которые описаны в Zhang et al. (2005) Nucleic Acids Res 33, W180-W183 (PREDBALB); Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7, 501 (MHCBN); Schuler et al. (2007) Methods Mol. Biol. 409, 75-93 (SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34, W194-W197 (SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276, 172-174, Guan et al. (2003) Appl. Bioinformatics 2, 63-66 (MHCPred) и Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17, 1236-1237 (Propred).
Более конкретно, такие алгоритмы позволяют предсказание в пределах антигенного белка одной или нескольких окта- или нонапеапептидных последовательностей, которые будут подходить к бороздке молекулы МНС II, и это для разных типов HLA.
Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием технологий рекомбинантных ДНК в бактериях, дрожжах, клетках насекомых, растительных клетках или клетках млекопитающих. Ввиду ограниченной длины пептидов они могут быть получены химическим пептидным синтезом, при котором пептиды получают путем связывания различных аминокислот друг с другом. Химический синтез особенно подходит для включения, например, D-аминокислот, аминокислот с не встречающимися в природе боковыми цепями или природных аминокислот с модифицированными боковыми цепями, такими как метилированный цистеин.
Способы химического пептидного синтеза хорошо описаны, и пептиды могут быть заказаны у таких компаний, как Applied Biosystems и другие компании.
Синтез пептидов может быть осуществлен либо как твердофазный пептидный синтез (SPPS), либо в противоположность, как синтез пептидов в фазе раствора. Наиболее известными способами SPPS являются химия твердой фазы t-Boc и Fmoc.
Во время пептидного синтеза используют несколько защитных групп. Например, гидроксильная и карбоксильная функциональные группы защищают трет-бутильной группой, лизин и триптофан защищают группой t-Boc (трет-бутоксикарбонильной), а аспарагин, глутамин, цистеин и гистидин защищают тритильной группой и аргинин защищают группой pbf. Если необходимо, такие защитные группы могут быть оставлены на пептиде после синтеза. Пептиды могут быть связаны друг с другом с образованием более длинных пептидов с использованием стратегии лигирования (хемоселективное связывание двух незащищенных пептидных фрагментов), как первоначально описано в Kent (Schnelzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40, 180-193) и рассмотрено, например, в Tarn et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205, где предусмотрен огромный потенциал для достижения синтеза белка, который выходит за рамки SPPS. Этим способом успешно синтезированы многие белки с размером 100-300 остатков. Синтетические пептиды продолжают играть все более важную роль в исследовательских областях биохимии, фармакологии, нейробиологии, энзимологии и молекулярной биологии из-за огромных достижений в SPPS.
Альтернативно, пептиды могут быть синтезированы с использованием молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют пептиды согласно настоящему изобретению в соответствующем экспрессирующем векторе, который включает в себя кодирующие нуклеотидные последовательности. Такие молекулы ДНК могут быть легко получены с использованием автоматизированного синтезатора ДНК и хорошо известной связи между кодонами и аминокислотами генетического кода. Такая молекула ДНК также может быть получена как геномная ДНК или как кДНК с использованием олигонуклеотидных зондов и обычных способов гибридизации. Такие молекулы ДНК могут быть включены в векторы экспрессии, включающие в себя плазмиды, которые адаптированы для экспрессии ДНК и продуцирования полипептида в подходящем хозяине, таком как бактерия, т.е. Escherichia coli, дрожжевая клетка, животная клетка или растительная клетка.
Физические и химические свойства представляющего интерес пептида (например, растворимость, стабильность) исследуют для определения того, является ли пептид подходящим для применения в терапевтических композициях. Как правило, их оптимизируют путем корректировки последовательности пептида. Необязательно, пептид может быть модифицирован после синтеза (химических модификаций, например, добавления/удаления функциональных групп) с использованием способов, известных в настоящей области техники.
Т-клеточные эпитопы сами по себе, как полагают, запускают ранние события на уровне Т-хелперной клетки, связываясь с соответствующей молекулой HLA на поверхности антигенпрезентирующей клетки и стимулируя соответствующую субпопуляцию Т-клеток. Эти события приводят к пролиферации Т-клеток, секреции лимфокинов, локальным воспалительным реакциям, вовлечению дополнительных иммунных клеток к сайту и активации каскада В-клеток, приводящему к образованию антител. Один изотип этих антител, IgE, принципиально важен в развитии аллергических симптомов, и на его производство влияют в начале каскада событий, на уровне Т-хелперной клетки, по характеру секретируемых лимфокинов. Т-клеточный эпитоп представляет собой основной элемент или наименьшую единицу распознавания рецептором Т-клеток, где эпитоп содержит аминокислотные остатки, необходимые для распознавания рецептора, которые являются смежными в аминокислотной последовательности белка.
Однако при введении пептидов с Т-клеточным эпитопом и редокс-мотивом, как предполагается, происходят следующие события:
активация антигена (i) специфических Т-клеток, представляющих собой результат родственного взаимодействия с полученным из антигена пептидом, представленным молекулами МНС класса II;
последовательность редуктазы восстанавливает белки поверхности Т-клеток, такие как молекула CD4, второй домен которой содержит ограниченный дисульфидный мост. Это трансформирует сигнал в Т-клетки. Среди ряда последствий, связанных с увеличением окислительного пути, важными событиями являются увеличенный приток кальция и транслокация транскрипционного фактора NF-kB в ядро. Последнее приводит к увеличению транскрипции IFN-гамма и гранзимов, что позволяет клеткам приобретать цитолитические свойства через механизм индуцирования апоптоза; цитолитическое свойство влияет на клетки, представляющие пептид, с помощью механизма, который включает в себя секрецию гранзима В и Fas-FasL-взаимодействия. Поскольку эффект уничтожения клеток достигается посредством апоптотического пути, цитологические клетки являются более подходящим термином для этих клеток, чем цитотоксические клетки. Разрушение антигенпрезентирующих клеток-мишеней предотвращает активацию других Т-клеток, специфических для эпитопов, расположенных на одном и том же антигене, или с несвязанным антигеном, который будет обрабатываться той же антигенпрезентирующей клеткой; дополнительное следствие активации Т-клеток представляет собой подавление активации неспецифических Т-клеток зависимым от межклеточного контакта механизмом. В этом случае Т-клетки, активированные антигеном, представленным другой антигенпрезентирующей клеткой, также подавляются при условии, что как цитолитические Т-клетки, так и неспецифические Т-клетки находятся в непосредственной близости, а именно активированы на поверхности той же антигенпрезентирующей клетки.
Вышеуказанный механизм действия обосновывается экспериментальными данными, раскрытыми в цитированной выше заявке РСТ и публикациях настоящего изобретателя.
В настоящем изобретении предусмотрены способы получения антигенспецифических цитолитических CD4+ Т-клеток либо in vivo, либо in vitro и, независимо от этого, способы распознавания цитолитических CD4+ Т-клеток от других популяций клеток, таких как Foxp3+ Treg, на основе данных характеристической экспрессии.
Настоящее изобретение описывает in vivo способы получения антигенспецифических CD4+ Т-клеток. Конкретный вариант осуществления относится к способу получения или выделения CD4+ Т-клеток путем иммунизации животных (включая в себя людей) пептидами согласно настоящему изобретению, как описано в настоящем документе, и затем выделения CD4+ Т-клеток из иммунизированных животных. Настоящее изобретение описывает in vitro способы получения антигенспецифических цитолитических CD4+ Т-клеток в отношении АРС. В настоящем изобретении предусмотрены способы производства антигенспецифических цитолитических CD4+ Т-клеток в отношении АРС.
Согласно одному варианту осуществления предусмотрены способы, которые предусматривают выделение клеток периферической крови, стимуляцию клеточной популяции in vitro иммуногенным пептидом согласно настоящему изобретению и размножение популяции стимулированных клеток, в частности, в присутствии IL-2. Способы в соответствии с настоящим изобретением имеют преимущество в том, что посредством них получают большое количество CD4+ Т-клеток и что могут производиться CD4+ Т-клетки, которые являются специфическими для антигенного белка (с использованием пептида, содержащего антигенспецифический эпитоп).
Согласно альтернативному варианту осуществления CD4+ Т-клетки могут быть получены in vivo, то есть путем инъекции описанных в настоящем документе иммуногенных пептидов субъекту и сбора цитолитических CD4+ Т-клеток, полученных in vivo.
Антигенспецифические цитолитические CD4+ Т-клетки к АРС, полученные способами согласно настоящему изобретению, представляют особый интерес для введения млекопитающим для иммунотерапии, для предотвращения аллергических реакций и лечения аутоиммунных заболеваний. Предусмотрено применение как аллогенных, так и аутогенных клеток.
Популяции цитолитических CD4+ Т-клеток получают, как описано ниже.
Описанные в настоящем документе антигенспецифические цитолитические CD4+ Т-клетки могут быть использованы в качестве лекарственного средства, более конкретно для применения в адоптивной клеточной терапии, более конкретно при лечении острых аллергических реакций и рецидивов аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз. Выделенные цитолитические CD4+ Т-клетки или популяции клеток, более конкретно антигенспецифические цитолитические популяции CD4+ Т-клеток, используются для производства лекарственного средства для профилактики или лечения иммунных заболеваний. Раскрыты способы лечения с использованием выделенных или полученных цитолитических CD4+ Т-клеток.
Как объяснено в WO 2008/017517, цитолитические CD4+ Т-клетки по отношению к АРС можно отличить от природных клеток Treg на основании характеристик экспрессии клеток. Более конкретно, популяция цитолитических CD4+ Т-клеток демонстрирует одну или несколько из следующих характеристик по сравнению с природной популяцией клеток Treg:
увеличенная экспрессия поверхностных маркеров, включая в себя CD 103, CTLA-4, Fasl и ICOS после активации,
промежуточная экспрессия CD25,
экспрессия CD4, ICOS, CTLA-4, GITR и низкая экспрессия CD127 (IL7-R) или отсутствие экспрессии или отсутствие экспрессии CD27.
экспрессия транскрипционного фактора T-bet и egr-2 (Krox-20), но не транскрипционного репрессора Foxp3,
высокое производство IFN-гамма и отсутствие следовых количеств IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 или TGF-бета.
Кроме того, цитолитические Т-клетки экспрессируют CD45RO и/или CD45RA, не экспрессируют CCR7, CD27 и присутствуют высокие уровни гранзима В и других гранзимов, а также Fas-лиганда.
Пептиды согласно настоящему изобретению при введении животному, как правило, человеку, будут вызывать специфические Т-клетки, проявляющие подавляющую активность на неспецифических Т-клетках.
Этот механизм также подразумевает, и экспериментальные результаты показывают, что пептиды согласно настоящему изобретению, хотя они содержат специфический Т-клеточный эпитоп определенного антигена, могут быть использованы для профилактики или лечения нарушений, вызванных иммунной реакцией против других Т-клеточных эпитопов того же антигена или при определенных обстоятельствах даже для лечения нарушений, вызванных иммунной реакцией на другие Т-клеточные эпитопы других различных антигенов, если они будут представлены через тот же механизм молекулами МНС класса II в непосредственной близости от активированных пептидами согласно настоящему изобретению Т-клеток.
Раскрыты выделенные клеточные популяции типа клеток с описанными выше характеристиками, которые, кроме того, являются антигенспецифическими, т.е. способными подавлять антигенспецифический иммунный ответ.
Пептиды согласно настоящему изобретению могут также использоваться в способах генной терапии, хорошо известных в настоящей области техники, и используемая в настоящем документе терминология, объясняющая применение пептидов согласно настоящему изобретению, также включает в себя применение нуклеиновых кислот, кодирующих или экспрессирующих иммуногенные пептиды согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение описывает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, и способы их применения. Различные способы достижения посредством генной терапии уровней пептидов, гомологов или их производных в соответствии с настоящим изобретением у млекопитающих in vivo предусматриваются в контексте настоящего изобретения.
Молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие белковые последовательности, могут быть использованы в качестве голой ДНК или в липосомах или других липидных системах для доставки в клетки-мишени. Другие способы прямого переноса плазмидной ДНК в клетки хорошо известны специалистам в настоящей области техники для использования в генной терапии человека и включают в себя направленное воздействие ДНК на рецепторы на клетках путем комплексообразования плазмидной ДНК с белками. В своей простейшей форме перенос гена может быть осуществлен путем простого введения небольших количеств ДНК в ядро клетки через процесс микроинъекции. Как только рекомбинантные гены вводятся в клетку, они могут быть распознаны нормальными механизмами клеток для транскрипции и трансляции, и продукт гена будет экспрессирован. Были также предприняты другие попытки введения ДНК в большее число клеток. Другие способы предусматривают: трансфекцию, при которой ДНК осаждается фосфатом кальция и попадает в клетки посредством пиноцитоза; электропорацию, при которой клетки подвергаются воздействию импульсов большого напряжения для введения отверстий в мембрану); слияние липофекции/липосомы, где ДНК упаковывают в липофильные везикулы, которые сливаются с клеткой-мишенью; и бомбардировки частицами с использованием ДНК, связанной с небольшими снарядами. Другой способ введения ДНК в клетки представляет собой соединение ДНК с химически модифицированными белками. Аденовирусные белки способны дестабилизировать эндосомы и усиливать проникновение ДНК в клетки. Смешение аденовируса с растворами, содержащими ДНК-комплексы, или связывание ДНК с полилизином, ковалентно присоединенным к аденовирусу с использованием белковых сшивающих средств, существенно улучшает захват и экспрессию рекомбинантного гена. Аденоассоциированные вирусные векторы могут также использоваться для доставки гена в сосудистые клетки. Используемый в настоящем документе термин «перенос гена» означает способ введения чужеродной молекулы нуклеиновой кислоты в клетку, который, как правило, выполняют для обеспечения возможности экспрессии определенного продукта, кодируемого геном. Продукт может включать в себя белок, полипептид, антисмысловую ДНК или РНК или ферментативно активную РНК. Перенос гена может осуществляться в культивируемых клетках или путем непосредственного введения млекопитающим. Согласно другому варианту осуществления предусмотрен вектор, содержащий последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно настоящему изобретению. Согласно конкретным вариантам осуществления вектор образуется таким образом, что последовательность молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируется только в определенной ткани. Способы достижения тканеспецифической генной экспрессии хорошо известны в настоящей области техники. Это может быть, например, достигнуто путем помещения последовательности, кодирующей пептид согласно настоящему изобретению, под контроль промотора, который направляет экспрессию в одной или нескольких конкретных тканях.
Векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса, РНК-вирусы или вирус папиломы крупного рогатого скота, могут быть использованы для доставки нуклеотидных последовательностей (например, кДНК), кодирующих пептиды, гомологи или их производные согласно настоящему изобретению, в ткани-мишени или клеточную популяцию-мишень. Способы, которые хорошо известны специалистам в настоящей области техники, могут быть использованы для конструирования рекомбинантных вирусных векторов, содержащих такие кодирующие последовательности.
Соответственно, настоящее изобретение раскрывает применение нуклеиновой кислоты, которая способна экспрессировать пептиды согласно настоящему изобретению, in vivo для лечения и/или профилактики заболеваний, вызванных иммунным ответом на чужеродный или собственный агент. Согласно одному варианту осуществления нуклеиновая кислота, способная экспрессировать пептид согласно настоящему изобретению in vivo, представляет собой последовательность, кодирующую такой пептид, который функционально связан с промотором. Такую последовательность можно вводить прямо или опосредованно. Например, вектор экспрессии, содержащий кодирующую последовательность для пептида согласно настоящему изобретению, может быть встроен в клетки, после чего клетки выращиваются in vitro, а затем инъецируются или вводятся пациенту. Альтернативно, нуклеиновая кислота, способная экспрессировать пептид согласно настоящему изобретению in vivo, представляет собой последовательность, которая модифицирует эндогенную экспрессию клеток. Способ генной терапии может предусматривать использование аденовирусного вектора, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую пептиды, гомологи или их производные в соответствии с настоящим изобретением, или молекулы голой нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно настоящему изобретению. Альтернативно, могут быть инъецированы полученные посредством генной инженерии клетки, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид согласно настоящему изобретению.
Если введение одного или нескольких пептидов согласно настоящему изобретению обеспечивается посредством переноса генов (то есть введения нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает экспрессию пептидов согласно настоящему изобретению in vivo при введении), подходящую дозу нуклеиновой кислоты можно определить на основании количества пептида, экспрессированного в результате нуклеиновой кислоты, например, путем определения концентрации пептида в крови после введения. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления пептиды согласно настоящему изобретению вводят с использованием полинуклеотидов, кодирующих пептиды, независимо от того, экспрессируют ли они вектор экспрессии или нет, и поэтому настоящее изобретение также относится к способам генной терапии. Другой конкретный вариант осуществления относится к применению способов индуцирования локальной сверхэкспрессии пептидов согласно настоящему изобретению для лечения или профилактики иммунных нарушений.
В настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие один или несколько пептидов в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно содержащие фармацевтически приемлемый носитель. Как подробно описано выше, настоящее изобретение также относится к композициям для применения в качестве лекарственного средства или к способам лечения млекопитающего с иммунным нарушением с использованием композиции и для использования композиций для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения иммунных нарушений. Фармацевтическая композиция может представлять собой, например, вакцину, подходящую для лечения или профилактики иммунных нарушений, особенно ингаляционной и пищевой аллергии, а также заболеваний аллергического происхождения. В качестве описанного далее в настоящем документе примера фармацевтической композиции, пептид согласно настоящему изобретению адсорбируется на адъюванте, подходящем для введения млекопитающим, таком как гидроксид алюминия (квасцы). Как правило, 50 мкг пептида, адсорбированного на квасцах, инъецируют подкожным путем 3 раза с интервалом 2 недели. Для специалистов в настоящей области техники очевидно, что возможны другие пути введения, включая в себя пероральный, интраназальный или внутримышечный. Кроме того, количество инъекций и вводимое количество могут варьировать в зависимости от состояний, которые необходимо лечить. Кроме того, могут быть использованы другие адъюванты, чем квасцы, при условии, что они облегчают презентацию пептида при презентации МНС-класса II и активации Т-клеток. Таким образом, хотя активные ингредиенты можно вводить отдельно, они, как правило, представлены в виде фармацевтических составов. Составы как для ветеринарии, так и для применения для человека согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один активный ингредиент, как описано выше, вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента один или несколько пептидов в соответствии с настоящим изобретением в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению должна содержать терапевтически эффективное количество активного ингредиента, как указано ниже в отношении способа лечения или профилактики. Необязательно композиция дополнительно содержит другие терапевтические ингредиенты. Подходящие другие терапевтические ингредиенты, а также их обычная доза в зависимости от класса, к которому они относятся, хорошо известны специалистам в настоящей области техники, и они могут быть выбраны из других известных лекарственных средств, используемых для лечения иммунных нарушений.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает любой материал или вещество, с которым составляется активный ингредиент, чтобы облегчить его применение или распространение к подвергаемому лечению локусу, например, путем растворения, диспергирования или диффузии композиции и/или для облегчения его хранения, транспортировки или обработки без ущерба для его эффективности. Они включают в себя любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и тому подобное. Дополнительные ингредиенты могут быть включены для контроля продолжительности действия иммуногенного пептида в композиции. Фармацевтически приемлемый носитель может быть твердым или жидким или представлять собой газ, который был спрессован с образованием жидкости, т.е. композиции согласно настоящему изобретению могут быть соответственно использованы в качестве концентратов, эмульсий, растворов, гранулятов, пыли, спреев, аэрозолей, суспензий, мазей, кремов, таблеток, пеллет или порошков. Подходящие фармацевтические носители для применения в фармацевтических композициях и их составах хорошо известны специалистам в настоящей области техники, и нет особых ограничений для их выбора в рамках настоящего изобретения. Они могут также включать в себя такие добавки, как смачивающие средства, диспергирующие средства, наклейки, адгезивы, эмульгаторы, растворители, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол, сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические средства (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п., при условии, что они согласуются с фармацевтической практикой, то есть с носителями и добавками, которые не вызывают постоянного повреждения у млекопитающих. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены любым известным способом, например, путем гомогенного смешивания, покрытия и/или размалывания активных ингредиентов в одностадийной или многостадийной процедуре с выбранным материалом носителя и, при необходимости, другими добавками, такими как поверхностно-активные вещества. Они также могут быть получены микронизацией, например, с целью получения их в форме микросфер, как правило, имеющих диаметр приблизительно 1-10 мкм, а именно для изготовления микрокапсул для контролируемого или замедленного высвобождения активных ингредиентов.
Подходящими поверхностно-активными средствами, также известными как эмульгаторы или эмульсификаторы, которые должны применяться в фармацевтических композициях настоящего изобретения, являются неионные, катионные и/или анионные материалы, обладающие хорошими эмульгирующими, диспергирующими и/или смачивающими свойствами. Подходящие анионные поверхностно-активные вещества включают в себя как водорастворимые мыла, так и водорастворимые синтетические поверхностно-активные вещества. Подходящими мылами являются соли щелочных или щелочно-земельных металлов, незамещенные или замещенные аммониевые соли высших жирных кислот (С10-С22), т.е. натриевые или калиевые соли олеиновой или стеариновой кислоты или смеси природных жирных кислот, получаемые из кокосового масла или таллового масла. Синтетические поверхностно-активные вещества включают в себя натриевые или кальциевые соли полиакриловых кислот; жирные сульфонаты и сульфаты; сульфированные производные бензимидазола и алкиларилсульфонаты. Жирные сульфонаты или сульфаты, как правило, находятся в форме солей щелочных или щелочно-земельных металлов, незамещенных солей аммония или солей аммония, замещенных алкильным или ацильным радикалом, имеющим от 8 до 22 атомов углерода, т.е. натриевая или кальциевая соль лигносульфокислоты или додецилсульфокислоты или смесь сульфатов жирных спиртов, полученных из природных жирных кислот, солей щелочных или щелочноземельных металлов сложных эфиров серной или сульфоновой кислоты (таких как лаурилсульфат натрия) и сульфокислот жирного спирта/этиленоксидных аддуктов. Подходящие производные сульфированного бензимидазола, как правило, содержат от 8 до 22 атомов углерода. Примерами алкиларилсульфонатов являются натриевые, кальциевые или альканоламиновые соли додецилбензолсульфоновой кислоты или дибутилнафталинсульфокислоты или продукт конденсации нафталин-сульфокислоты и формальдегида. Подходящими являются также соответствующие фосфаты, т.е. соли эфира фосфорной кислоты и аддукт п-нонилфенола с этиленом и/или пропиленоксидом или фосфолипидами. Подходящими фосфолипидами для этой цели являются природные (происходящие из животных или растительных клеток) или синтетические фосфолипиды типа цефалина или лецитина, такие как, например, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, лизолецитин, кардиолипин, диоктанилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин и их смеси.
Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя полиэтоксилированные и полипропоксилированные производные алкилфенолов, жирных спиртов, жирных кислот, алифатических аминов или амидов, содержащих по меньшей мере 12 атомов углерода в молекуле, такие алкиларенсульфонаты и диалкилсульфосукцинаты, как производные полигликолевого эфира алифатических и циклоалифатических спиртов, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и алкилфенолы, производные, как правило, содержащие от 3 до 10 гликолевых эфирных групп и от 8 до 20 атомов углерода в (алифатическом) углеводородном фрагменте и от 6 до 18 атомов углерода в алкильной части алкилфенола. Дополнительными подходящими неионными поверхностно-активными веществами являются водорастворимые аддукты полиэтиленоксида с полипропиленгликолем, этилендиаминополипропиленгликолем, содержащим от 1 до 10 атомов углерода в алкильной цепи, причем эти аддукты содержат от 20 до 250 этиленгликолевых эфирных групп и/или от 10 до 100 пропиленгликолевых эфирных групп. Такие соединения, как правило, содержат от 1 до 5 единиц этиленгликоля на единицу пропиленгликоля. Типичными примерами неионных поверхностно-активных веществ являются нонилфенол-полиэтоксиэтанол, простые полигликолевые эфиры касторового масла, аддукты полипропилена с полиэтиленоксидом, трибутилфеноксиполиэтоксиэтанол, полиэтиленгликоль и октилфеноксиполиэтоксиэтанол. Эфиры жирных кислот полиэтиленсорбитана (такие как триолеат полиоксиэтиленсорбитана), глицерин, сорбитан, сахароза и пентаэритрит, также являются подходящими неионными поверхностно-активными веществами. Подходящие катионные поверхностно-активные вещества включают в себя соли четвертичного аммония, особенно галогениды, содержащие 4 углеводородных радикала, необязательно замещенных галогеном, фенилом, замещенным фенилом или гидроксигруппой; например, четвертичные аммониевые соли, содержащие в качестве N-заместителя по меньшей мере один С8С22-алкильный радикал (например, цетил, лаурил, пальмитил, миристил, олеил и т.п.) и в качестве дополнительных заместителей незамещенный или галогенированный низший алкил, бензил и/или гидрокси(низшие) алкильные радикалы.
Более подробное описание поверхностно-активных средств, пригодных для этой цели, можно найти, например, в "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), "Tensid-Taschenbucw', 2 d ed. (Hanser Verlag, Vienna, 1981) и "Encyclopaedia of Surfactants, (Chemical Publishing Co., New York, 1981). Пептиды, гомологи или их производные согласно настоящему изобретению (и их физиологически приемлемые соли или фармацевтические композиции, все включенные в термин «активные ингредиенты») могут вводиться любым путем, подходящим для подлежащего лечению состояния и подходящим для соединений, в данном случае белков и фрагментов для введения. Возможные пути включают в себя региональные, системные, пероральные (твердая форма или ингаляция), ректальные, назальные, местные (включая в себя глазные, буккальные и подъязычные), вагинальные и парентеральные (включая в себя подкожные, внутримышечные, внутривенные, внутрикожные, внутриартериальные, интратекальные и эпидуральные). Предпочтительный способ введения может варьировать, например, вместе с состоянием реципиента или с подлежащими лечению заболеваниями. Как описано в настоящем документе, носитель (носители) оптимально «приемлемы» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не вредны для его реципиента. Составы включают в себя те, которые подходят для перорального, ректального, назального, местного (включая в себя буккальное и подъязычное), вагинальное или парентеральное (включая в себя подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутриартериальное, интратекальное и эпидуральное) введения. Составы могут быть удобно представлены в виде единичной дозированной формы и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в фармации. Такие способы предусматривают стадию объединения активного ингредиента с носителем, который составляет один или несколько дополнительных ингредиентов. Обычно составы готовят путем равномерного и тщательного объединения активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с ними обоими, а затем, при необходимости, формования продукта. Составы по настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки или таблетки, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии масло-в-воде или жидкой эмульсии вода-в-масле. Активный ингредиент также может быть представлен в виде болюса, электуария или пасты. Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящей машине активного ингредиента в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно в смеси со связующим веществом, скользящим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим средством. Формованные таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки могут быть необязательно покрыты или на них могут быть нанесены риски и могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента в них.
Для локального лечения, например, на коже, например, сустава, составы необязательно наносят в виде местной мази или крема, содержащего активный ингредиент(ы), в количестве, например, от 0,075 до 20% по массе (включая в себя активный ингредиент(ы) в диапазоне от 0,1 до 20% с шагом 0,1% по массе, например 0,6% по массе, 0,7% по массе и т.д.), в частности, от 0,2 до 15% по массе и конкретнее от 0,5 до 10% по массе. При составлении в виде мази активные ингредиенты могут быть использованы либо с парафиновой, либо с водорастворимой мазевой основой. Альтернативно, активные ингредиенты могут быть составлены в виде крема с кремовой основой масло-в-воде. При желании водная фаза кремовой основы может включать в себя, например, по меньшей мере 30% по массе многоатомного спирта, то есть спирта, имеющего две или более гидроксильные группы, такого как пропиленгликоль, 1,3-диолбутан, маннит, сорбит, глицерин и полиэтиленгликоль (включая в себя PEG400) и их смеси. Местные составы могут при желании включать в себя соединение, которое усиливает абсорбцию или проникновение активного ингредиента через кожу или другие пораженные участки. Примеры таких дермальных усилителей проникновения включают в себя диметилсульфоксид и родственные аналоги. Масляная фаза эмульсий настоящего изобретения может быть образована из известных ингредиентов известным способом. Хотя фаза может содержать только эмульсификатор (иначе известный как эмульгатор), она желательно содержит смесь по меньшей мере одного эмульгатора с жиром или маслом или с жиром и маслом. Необязательно, гидрофильный эмульгатор включен вместе с липофильным эмульгатором, который действует как стабилизатор, как правило, путем включения как масла, так и жира. Вместе, эмульгатор(ы) со стабилизатором(ами) или без него составляют так называемый эмульгирующий воск, а воск вместе с маслом и жиром составляют так называемую эмульгирующую мазевую основу, которая образует маслянистую дисперсную фазу кремовых составов.
Выбор подходящих масел или жиров для состава основан на достижении желаемых косметических свойств, поскольку растворимость активного соединения в большинстве масел, которые могут быть использованы в рецептурах фармацевтических эмульсий, является очень низкой. Таким образом, крем необязательно должен быть нежирным, не окрашивающимся и моющимся продуктом с подходящей консистенцией, чтобы избежать утечки из тюбиков или других контейнеров. Могут быть использованы одно- или двухосновные алкиловые сложные эфиры с прямыми или разветвленными цепями, такие как диизоадипат, изоцетилстеарат, диэфир пропиленгликоля кокосовых жирных кислот, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпальмитат и особенно бутилстеарат, 2-этилгексилпальмитат или смесь сложных эфиров с разветвленной цепью, известная как Crodamol САР. Они могут использоваться отдельно или в комбинации в зависимости от требуемых свойств. Альтернативно, могут использоваться липиды с высокой температурой плавления, такие как белый мягкий парафин и/или жидкий парафин или другие минеральные масла. Составы, подходящие для местного введения в глаз, также включают в себя глазные капли, в которых активный ингредиент растворяют или суспендируют в подходящем носителе, особенно в водном растворителе для активного ингредиента. Активный ингредиент необязательно присутствует в таких составах в концентрации от 0,5 до 20%, преимущественно от 0,5 до 10%, особенно приблизительно 1,5% по массе. Составы, подходящие для местного введения во рту, включают в себя леденцы для рассасывания, содержащие активный ингредиент в ароматизированной основе, как правило, сахарозу и аравийскую камедь или трагакант; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь; и жидкости для полоскания рта, содержащие активный ингредиент в подходящем жидком носителе. Составы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящей основой, содержащей, например, масло какао или салицилат. Составы, подходящие для назального введения, где носитель представляет собой твердое вещество, включают в себя крупный порошок, характеризующийся размером частиц, например, в диапазоне от 20 до 500 микрон (включая в себя размеры частиц в диапазоне от 20 до 500 микрон с шагом 5 микрон, например, 30 микрон, 35 микрон и т.д.), который вводят таким способом, при котором употребляют нюхательный табак, то есть путем быстрой ингаляции через носовой ход из контейнера с порошком, удерживаемым близко к носу. Подходящие составы, в которых носитель представляет собой жидкость, для введения, например, в виде назального спрея или капель в нос, включают в себя водные или масляные растворы активного ингредиента. Составы, пригодные для введения в аэрозоле, могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами и могут поставляться с другими терапевтическими средствами. Составы, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пеноматериалов или аэрозольных составов, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые известны в настоящей области техники, как подходящие. Составы, подходящие для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной с кровью предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие средства и загустители. Составы могут быть представлены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах и флаконах, и могут храниться в лиофилизированном состоянии в условиях лиофилизации, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного приема инъекционные растворы и суспензии могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного выше типа.
Обычные однодозовые составы представляют собой составы, содержащие суточную дозу или единичную суточную субдозу, как указано выше, или их соответствующую фракцию активного ингредиента. Следует понимать, что в дополнение к указанным выше ингредиентам составы по настоящему изобретению могут содержать другие средства, обычные в настоящей области техники, в зависимости от типа рассматриваемого состава, например, те, которые подходят для перорального введения, могут содержать ароматизаторы. Пептиды, их гомологи или их производные в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для получения фармацевтических составов с контролируемым высвобождением, содержащих в качестве активного ингредиента одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению («составы с контролируемым высвобождением»), в которых высвобождение активного ингредиента можно контролировать и регулировать для обеспечения возможности введения дозы с меньшей частотой или для улучшения фармакокинетического или токсического профиля соединения согласно данному изобретению. Составы с контролируемым высвобождением, адаптированные для перорального введения, в которых дискретные единицы, содержащие одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами. Дополнительные ингредиенты могут быть включены для контроля продолжительности действия активного ингредиента в композиции. Таким образом, композиции с контролируемым высвобождением могут быть получены путем выбора подходящих полимерных носителей, таких как, например, сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилена и винилацетата, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, протаминсульфат и тому подобное. Скорость высвобождения лекарственного средства и продолжительность действия можно также контролировать путем включения активного ингредиента в частицы, например, микрокапсулы, полимерного вещества, такого как гидрогели, полимолочная кислота, гидроксиметилцеллюлоза, полиэтилметакрилат и другие вышеописанные полимеры. Такие способы предусматривают системы доставки коллоидных лекарств, такие как липосомы, микросферы, микроэмульсии, наночастицы, нанокапсулы и так далее. В зависимости от способа введения фармацевтическая композиция может требовать защитных покрытий. Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают в себя стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для их немедленного приготовления. Поэтому типичные носители для этой цели включают в себя биосовместимые водные буферы, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п. и их смеси. Принимая во внимание тот факт, что, когда несколько активных ингредиентов используются в комбинации, они не обязательно вызывают совместный терапевтический эффект непосредственно в то же время у подлежащего лечению млекопитающего, соответствующая композиция может также быть в форме медицинского набора или упаковки, содержащей два ингредиента в отдельных, но смежных хранилищах или компартментах. В последнем контексте каждый активный ингредиент может, поэтому, быть составлен таким образом, который подходит для пути введения, отличающегося от способа введения другого ингредиента, например, один из них может быть в форме перорального или парентерального состава, тогда как другой находится в форме ампулы для внутривенной инъекции или аэрозоля.
Цитолитические CD4+ Т-клетки, полученные в настоящем изобретении, индуцируют апоптоз АРС после зависимой от МНС класса II активации аутоиммунных механизмов, воздействуя как на дендритные, так и на В-клетки, как продемонстрировано in vitro и in vivo, и (2) супрессируют неспецифические Т-клетки посредством зависимого от контакта механизма в отсутствие IL-10 и/или TGF-бета. Цитолитические CD4+ Т-клетки можно отличить как от природных, так и адаптивных Treg, как подробно описано в WO2008/017517.
Настоящее изобретение будет теперь проиллюстрировано с помощью следующих примеров, которые представлены без каких-либо ограничений. Кроме того, все ссылки, описанные в настоящем документе, явно включены в настоящее описание посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: способ оценки восстановительной активности пептидов
Редуктазную активность пептидов определяли с использованием флуоресценции, описанной в Tomazzolli et al. (2006) Anal. Biochem. 350, 105-112. Два пептида с меткой FITC становятся самозатухающими, когда они ковалентно связаны друг с другом через дисульфидный мост. При восстановлении пептидом в соответствии с настоящим изобретением восстановленные отдельные пептиды снова становятся флуоресцентными.
Контрольные эксперименты проводили с пептидом с «нормальным» восстанавливающим пептидом, то есть пептидом с редокс-мотивом, но без дополнительного гистидина и с пептидом, не содержащим редокс-мотив.
Пример 2: определение активации клеток.
Антигенспецифические цитолитические клетки, полученные посредством пептидов по настоящему изобретению, способны приводить антигенпрезентирующие клетки к апоптозу. Для оценки активации и предотвращения возможной чрезмерной активации цитолитических клеток, которые сами могли бы стимулировать их к апоптозу, состояние фосфорилирования Akt и Shp позволяет провести корреляцию между активацией клетки (способной к апоптозу) и чрезмерной активацией клетки (самоапоптоз).
Пример 3: разработка полученных посредством MOG пептидов.
Пример пептидов по настоящему изобретению представляет собой пептид с последовательностью HCPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 1]. Этот пептид содержит фрагмент SRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 2] белка MOG человека (миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин) (учетный номер uniprot Q16653), который сам содержит последовательность Т-клеточного эпитопа МНС класса II нонапептида VVHLYRNGK [SEQ ID NO: 3]. Согласно определениям, упомянутым в заявке, этот пептид 17 АА содержит:
- модифицированный редокс-мотив Н-С-Х(2)-С [SEQ ID NO: 80] с Pro и Енк в виде х,
- линкер из 2 аминокислот (Ser, Arg) между мотивом и последовательностью Т-клеточного эпитопа,
- Т-клеточный эпитоп класса МНС из девяти аминокислот с последовательностью VVHLYRNGK [SEQ ID NO: 3],
- одну аминокислотную фланкирующую последовательность (Asp) на С-конце эпитопа.
По сравнению с последовательностью фрагмента пептида MOG YRPPFSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 4], YRPPF [SEQ ID NO: 5] в последовательности была заменена последовательностью HCPYC [SEQ ID NO: 6].
Контрольные пептиды представляют собой:
YRPPFSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO:4], то есть вышеуказанный фрагмент MOG.
CPYCSRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 7], с мотивом C(X)2C [SEQ ID NO: 71], но без дополнительного гистидина.
SRVVHLYRNGKD [SEQ ID NO: 2], не содержащий также мотива С(Х)2С [SEQ ID NO: 71].
Пептиды были получены с помощью пептидного синтеза с модифицированным CONH2 карбокситермином и испытаны на чистоту с помощью масс-спектрометрии и ВЭЖХ.
Пример 4. Размножение клеточных линий in vitro.
Реакция наивных линий CD4+ Т-клеток человека на пептиды с Т-клеточным эпитопом MOG и редокс-мотивом без дополнительного гистидина (правые столбцы фиг.1) [SEQ ID NO: 7] и с ним (левые столбцы фиг. 1) [SEQ ID NO: 1].
Равные количества обоих пептидов добавляли к различным наивным линиям CD4+ Т-клеток человека. Результаты представляют собой число клеток (в виде % от начального высева клеток) в конце клинического масштабного процесса, приводящего к образованию дифференцированных Т-клеток с цитолитическими свойствами.
Это значительное увеличение конверсии клеток in vitro, таким образом, получают при добавлении добавленного гистидина, но только для клеточных линий у лиц, представляющих собой гаплотип DR2, а не для других гаплотипов.
Использование таких пептидов, таким образом, особенно интересно для популяции DR2+ (опять же 70% популяции MS), кажется, что существует определенное (и неожиданное) преимущество использования содержащих his пептидов.
Пример 5: Использование Т-клеточного эпитопа белка MOG в модели рассеянного склероза in vivo.
Рассеянный склероз может быть индуцирован в экспериментальных моделях путем иммунизации пептидом миелиновых олигодендроцитарных гликопротеинов (MOG) с Т-клеточным эпитопом.
Группу мышей C57BL/6 подвергали адоптивному переносу с CD4+ MOG-специфическим клоном эффекторных Т-клеток в соответствии с протоколом, предназначенным для индуцирования подобного рассеянному склерозу синдрома. Он включает в себя введение пептида MOG в полный адъювант Фрейнда и 2 инъекции коклюшного токсина. Этот протокол вызывает размножение клона эффекторных Т-клеток, что приводит к развитию признаков, сравнимых с рассеянным склерозом, в течение 12 дней после введения пептида MOG. Вторую группу мышей C57BL/6 сначала подвергали адоптивному переносу с MOG-специфическим цитолитическим клоном Т-клеток (полученным с использованием пептида с [SEQ ID NO: 1]), а затем через 1 день полному протоколу индукции заболевания.
В качестве контролей используют пептиды с SEQ ID NO: 2, 4 и 7.
Пример 6: Предотвращение и подавление рассеянного склероза.
6
6
Группы мышей C57BL/6 иммунизируют подкожно (20 мкг) пептидом из примера 1, который содержит модифицированный мотив последовательности [SEQ ID NO: 1] или контрольный пептид [SEQ ID NO: 2, 4 или 7], адсорбированный на гидроксиде алюминия. Три инъекции выполняют с двухнедельными интервалами. Через 10 дней после последней иммунизации мышей умерщвляют и из селезенки, используя магнитные шарики, получают CD4+ Т-клетки (2×10 клеток). CD4+ Т-клетки затем стимулируют in vitro Т-клеточным эпитопом MOG (20 мкг/мл), представленным адгезивными клетками селезенки (2×10 клеток).
+
-
+
-
После четырех повторных стимуляций Т-клеточную линию исследуют в анализе неспецифической супрессии с использованием в качестве клеток-мишеней поликлональных CD4CD25 клеток, полученных от животных, в которых эффективен ЕАЕ (экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит). Только клетки, полученные от животных, иммунизированных пептидом с SEQ ID NO: 1 и 7, содержащим мотив последовательности НС(Х)2С [SEQ ID NO: 80] или С(Х)2С [SEQ ID NO: 71], характеризуются способностью индуцировать гибель в клетках-мишенях, по сравнению с контролем, состоящим в эффекторных CD4CD25 из животных ЕАЕ.
Группу мышей C57BL/6 подвергали адоптивному переносу с помощью CD4+ MOG-специфического клона CD4+ Т-клеток, а затем через 1 день - протоколу, предназначенному для индукции синдрома рассеянного склероза. Он включает в себя введение пептида MOG в полный адъювант Фрейнда и 2 инъекции коклюшного токсина. Этот протокол вызывает размножение клона эффекторных Т-клеток, что приводит к развитию признаков, совместимых с рассеянным склерозом, в течение 12 дней после введения пептида MOG. Клинический ответ, развиваемый мышами, предварительно обработанными клоном цитолитических Т-клеток, сравнивают с мышами, получающими только полный протокол индукции заболевания.
Пример 7. Предотвращение рассеянного склероза путем иммунизации пептидом.
В модельной группе мыши C57BL6 получали в день 0 подкожную инъекцию 100 мкг пептида MOG/400 мкг Mycobacterium butyricum в CFA и внутрибрюшинную инъекцию 300 нг Bortetella pertussis в NaCl. В день +2 вводят вторую инъекцию В. pertussis.
В группе профилактики мышей C57BL/6 иммунизируют 5 инъекциями 20 мкг пептида с SEQ ID NO: 1, который содержит мотив последовательности НС(Х)2С [SEQ ID NO: 80] в IFA за 14 дней до индукции заболевания, как в группе модели. Контрольные эксперименты проводят с пептидами с SEQ ID NO: 2, 4 и 7.
Оценки устанавливаются как 0: нет болезни, 1: хромота, 2: хромота и потеря массы более 10%, 3: частичный паралич задних конечностей.
Пример 9.
Оценка активности редуктазы на синтетическом пептиде
ox
ox
Синтезировали пептид FITC-NH-Gly-Cys-Asp-COOH (Eurogentec, Бельгия) и подвергали самостоятельному гашению путем растворения в DMSO ((FITC-Gly-Cys-Asp)). Восстановление 2,5 мкМ (FITC-Gly-Cys-Asp) продолжалось на 96-луночном планшете в течение 40 минут (25°С) после инкубации в PBS с пептидом (25 мкМ), как указано в прилагаемой таблице, или с 2 мМ дитиотреитола (DTT). Восстановление измеряли как функцию увеличения флуоресценции, считываемой при 530 нм после возбуждения на 494 нм, с использованием мультипланшетного ридера CytoFluor (Applied Biosystems). Результаты показаны в таблице примера 10 под заголовком «Активность редуктазы».
Пример 10.
Полимеризация человеческого рекомбинантного CD4
Рекомбинантный CD4 человека (300 нг) инкубируют в буфере Hepes с 50 мкМ пептида, указанного в таблице, в течение 15 минут при 68°С. Пятьдесят мкМ DTT используют в качестве положительного контроля в тех же условиях. Затем добавляют буфер для образца LDS (7,5 мкл, невосстанавливающий) к 15 мкл смеси пептид/CD4. Смесь затем подают на невосстанавливающий ПААГ. После окрашивания Coomassie Blue полосы белка анализируют на наличие мономерного, димерного или мультимерного recCD4, что определяется уменьшенными миграционными способностями в геле. В таблице указано, имела ли место полимеризация (+).
В таблице представлены различные комбинации аминокислотных последовательностей, добавленных на аминоконце эпитопа человеческого проинсулина, рестриктированного по классу II. Эти последовательности состоят из аминоконцевой последовательности (N-конец) перед первым цистеином мотива, содержащего тиоредуктазу, сам мотив, линкер, эпитоп и С-терминальный конец (С-конец). Активность редуктазы выражают в %, как описано в примере 1. Полимеризацию человеческого рекомбинантного CD4 измеряют в соответствии с примером 2.
Пептиды, раскрытые в заявке.
В нижеследующих последовательностях 1-70, где встречается х, х не представляет собой цистеин или не представляет собой гистидин.
Обзор раскрытых пептидных последовательностей.