Эстрогены и модуляция гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси при хронической эндогенной интоксикации у крыс

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

С. А. Калашникова, В. В. Новочадов

Кафедра патологической анатомии ВолГМУ, лаборатория клинической фармакологии ВНЦ РАМН

ЭСТРОГЕНЫ И МОДУЛЯЦИЯ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-ТИРЕОИДНОЙ ОСИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У КРЫС

УДК 616.43-092.4

Выявлены структурные и функциональные нарушения в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси, возникающие при хронической эндогенной интоксикации. Показана модулирующая роль эстрогенов, при этом избыток гормонов оказывал умеренное протективное действие, а дефицит эстрогенов усугублял течение эндогенной интоксикации и приводил к более значимым структурным преобразованиям, чем у животных без предшествующего гормонального дисбаланса.

Ключевые слова: эндогенная интоксикация, эстрогены, гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная ось. S.A. Kaiashnikova, V.V. Novochadov

ESTROGENS AND MODULATION OF HYPOTHALAMO-PITUITARY-THYROID AXIS IN CHRONIC ENDOGENOUS INTOXICATION IN RATS

The structural and functional disorders in hypothalamo-pituitary-thyroid axis were revealed in chronic endogenous intoxication. The modulation of estrogens was shown both when they were excessive ( moderate protective action), and in estrogen deficiency (more severe duration of endogenous intoxication). In the latter case more significant structural changes in thyroid grand were found.

Key words: endogenous intoxication, estrogen, hypothalamo-pituitary-thyroid axis.

По современным представлениям, основу эндогенной интоксикации (ЭИ) самого различного происхождения составляют эффекты бактериального липополисахарида (ЛПС) и обусловленный им выброс цитокинов. Эти эффекты настолько стереотипны, что они рассматриваются некоторыми авторами как модель хемоиндуцированного стресса [5, 7]. Применительно к органопатологии данного процесса корректнее использовать термин — «синдром системного воспалительного ответа» (SIRS — systemic inflammatory response syndrome) [1,6,10].

Нейро-иммунно-эндокринные компоненты SIRS реализуются через центральные гипоталами-ческие структуры, при этом в патологический процесс вовлекается не только классическая стрес-сорная, но и тиреоидная, и стероидная оси, так что итоговые пулы тиреоидных гормонов и эстрогенов во многом модулируют общую выраженность, продолжительность реакции и влияют на ее исход [8, 9]. Несмотря на это, отсутствуют данные

о характере морфологических изменений, возникающих в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси в зависимости от уровня эстрогенов в периферической крови крыс при хронической эндогенной интоксикации.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследовать модулирующий эффект эстрогенов в отношении патологии гипоталамо-гипофи-зарно-тиреоидной оси при хронической ЭИ у крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящее исследование выполнено в соответствии с принципами 01-Р [4], протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (решение № 37-2006). В опыте использовали 36 нелинейных крыс-самок, массой (201 ± 11) г, с синхронизованным эстральным циклом. Хроническую ЭИ моделировали путем многократного введения бактериаль-

ного ЛПС S. thyphimurium (Sigma, USA) в дозе 0,2 мг/кг в сочетании с тетрахлорметаном (ТХМ) по 0,5 мл/кг массы [2]. Для создания гиперэстроге-немии крысам внутримышечно вводили 0,1%-й масляный раствор «Эстрадиола» из расчета 50 мкг/ кг/сут в течение 7 дней. Гипоэстрогенемию моделировали введением антитиэстрогенного препарата «Кломифена», перорально в дозе 5 мг/кг/сут в течение 5 дней. Изменения оценивались в трех временных интервалах (30,60 и 90-е сут.). Контролем служили интактные крысы. Выведение из эксперимента проводили передозировкой нембутала (100 мг/кг массы).

Хроническую ЭИ верифицировали по увеличению содержания в плазме веществ средней молекулярной массы, их олигопептидных фракций, концентрации малонового диапьдегида, снижению активности ацилазы печени и почек [3].

Определение концентрации плазменного ти: реотропного гормона (ТТГ), общей и свободной фракций трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4), ти-реоглобулина (ТГ), эстрадиола проводилось в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием системы Stat Fax 2100/2600 (AWARENESS Technology, USA) наборами тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия).

Для проведения морфологического исследования фрагменты головного мозга, содержащие гипоталамус, гипофиз и щитовидную железу (ЩЖ) фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, материал заливали в парафин по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. При морфометрическом исследовании паравентрикулярного ядра (ПВЯ) гипоталамуса определяли объемную долю перикарионов (%), средний объем ядер нейронов (мкм3) и коэффициент микроглия/нейрон. При морфометрии аденогипофи-за определяли объемную долю хромофобов, аци-дофилов, базофилов, стромы и сосудистого русла ( %). При морфометрии ЩЖ измеряли средний диаметр фолликулов, высоту фолликулярного эпителия (мкм), относительный объем фолликулярного и интерфолликулярного эпителия, коллоида, объемную долюстромально-сосудистого компонента (%).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении гормонов гипофизарно-тиреоид-ной оси в сыворотке крови были выявлены существенные изменения гормонального профиля у животных с хронической ЭИ по сравнению с интактны-ми крысами (рис. А). По мере увеличения длительности эксперимента зарегистрировано снижение ТГ, максимально выраженное к 90-м сут. (в 4,1 раза), незначительное снижение ТТГ с последующим увеличением кокончанию эксперимента практически до величин у интактных животных. Наибольшие изменения зарегистрированы при определении концентрации тироксина, которые заключались в снижении

свободной фракции Т4 на фоне увеличения содержания общего Т4. Уровень эстрадиола на протяжении всего эксперимента снижался и к 90-м сут. был в 4,7 раза ниже, чем у интактных самок (Р < 0,01).

При проведении корреляционного анализа между уровнями ТТГ и периферических гормонов гипофизарно-тиреоидной оси в сыворотке крови крыс в динамике хронической ЭИ были установлены следующие взаимозависимости: на 30-е сут. усиливались связи между ТТГ и периферическими тиреоидными гормонами. При этом наиболее сильными были взаимосвязи ТТГ с общим трийиодтиронином и общим тироксином (Я? = 0,81и Я = 0,99 соответственно). На 60-е сут. патологического процесса произошло разобщение связи ТТГ-Т4о6щий, которая стала сильной отрицательной (г = -0,85). К 90-м сут. эксперимента связь ТТГ — Т3о6щий отсутствовала, а с тироксином и его свободной фракцией была сильно отрицательной. Таким образом, происходящие в ходе хронической эндогенной интоксикации гормональные нарушения затрагивали как горизонтальные, так и вертикальные внутриосевые взаимоотношения.

в

Рис. Особенности профиля тироидных гормонов в сыворотке крови крыс при хронической ЭИ, модулируемой эстрогенами. Обобщенные уровни гормонов, за единицу принято значение показателя в интакт-

ной группе животных: А — ЭИ без предшествующего гормонального дисбаланса; Б — ЭИ на фоне гиперэстрогенемии; В — ЭИ на фоне гипоэстрогенемии

По мере развития хронической ЭИ у крыс с исходной гиперэстрогенемией (рис. Б) зарегистрировано незначительное снижение ТТГ на 60-е сут., с последующим увеличением к 90-м сут. в 1,03 раза по сравнению с уровнем гормона у контрольных животных (Р<0,05). Уровень ТГ в 4,71 раза превысил значения у крыс с ЭИ аналогичного срока без предшествующего эстрогенно-го дисбаланса. Содержание периферических ти-реоидных гормонов при избыточном содержании эстрогенов не имело достоверных различий по сравнению с интактными животными (Р > 0,05). На протяжении всего эксперимента у животных данной опытной группы выявлялись сильные и умеренные корреляционные связи между уровнем ТТГ и тироксином. При этом исходно высокий уровень эстрад иола плавно увеличивался, и к 90-м сут. превышал содержание в крови интактных животных в 2,23 раза.

При дефиците эстрогенов в периферической крови у животных с хронической ЭИ выявлены существенные изменения профиля тиреоидных гормонов (рис. В). На ранних сроках эксперимента (30-е сут.) зарегистрирован резкий скачок ТТГ в 4,03 раза по сравнению с животными контрольной группы и в 4,34 раза по сравнению с крысами аналогичного срока эндогенной интоксикации без пред-шествующего эстрогенового дисбаланса (Р < 0,01). По мере нарастания ЭИ содержание ТТГ снизилось, и к 90-м сут. было в 1,19 раза меньше, чем в группе интактных крыс (Р< 0,05). Уровень ТГ, который в начале эксперимента был ниже значений ТГ у интактных крыс (в 3,44 раза), к 90-м сут. ЭИ повысился, превышая данный показатель в группе интактных животных в 1,4 раза (Р< 0,05). Корреляционный анализ установил наличие слабой зависимости между уровнем ТТГ и содержанием Т3 в периферической крови (Р = 0,35). Изменение профиля тиреоидных гормонов в периферической крови свидетельствовало о глубоких функциональных нарушениях и разобщении внутриосе-вых связей гипофизарно-тиреоидной системы, усугубляющихся по мере увеличения длительности ЭИ на фоне дефицита эстрогенов.

При развитии хронической ЭИ в ПВЯ гипоталамуса крыс отмечалась стертость рисунка ткани, при этом нейроны были увеличены в размерах. Доминировали клетки с вакуолизированной цитоплазмой перикариона, ядра нередко были деформированы и смещены к периферии клетки, некоторые из них не имели ядрышка. Среди сохранившихся нейронов выявлялись единичные клет-ки-тени, явления нейронофагии сочетались с набуханием и частичной фрагментацией окружающих нервных проводников, вблизи поперечных срезов полнокровных сосудов весьма отчетливо обнаруживались зоны периваскулярного отека. По мере нарастания эндогенной интоксикации происходи-

ло уменьшение объемной доли перикарионов, более выраженное в модели ЭИ, моделируемой на фоне гипоэстрогенемии (табл. 1). ТАБЛИЦА 1

Показатели морфометрии ПВЯ гипоталамуса у крыс при хронической эндогенной интоксикации

Экспериментальные группы Сроки эксперимента

30-е сут I 60-е сут | 90-е сут

Объемная д оля перикарионов,%

лпс+тхм 37,11 ±7,58 26,03 ±5.81' 22,14 ±6,73'

Гиперэстрогенемия 40,73 ±8,89 37.59 ± 5,6 38.21 ± 7.91

Гипоэстрог енемия 39,21 ±8,51 25,11 ± 6,19е 21,17 ±6.01*"

Средний объем ядер нейронов, мкм''

лпс+тхм 410,14 ± 22,51 397,03 ± 19,33* 368,34 ± 20,47*

Гиперэстрогенемия 431,74 ± 19,10' 424.67 ±21,9* 415,91 ±21,1*

Гипоэстрогенемия 408,11 ±21,90 366.39 ± 19,17** 319,21 ±21.23**

Коэффициент микроглия/нейрон

лпс+тхм 8,99 ±0,57 10,75 ±0,75 12.04 ±0,91*

Гиперэстрогенемия 8,49 ±0,58 9,21 ±0,61 9,97 ± 0.61"

Гипоастрогенемия 8,48 ± 0,59 11,01 ±0,71 14,59 ± 0,73*"

* Р < 0,05 по сравнению с интактными крысами, ' Р < 0,05 по сравнению с показателем базовой модели.

На 90-е сут. эксперимента у крыс данной группы достоверно уменьшился размер ядер нейронов по сравнению с изучаемым параметром ПВЯ гипоталамуса у животных контрольной группы (в 1,41 раза), базовой модели (в 1,15 раза) и в группе крыс с ЭИ на фоне гипоэстрогенемии (в 1,3 раза). Изменения нейронапьной структуры сопровождались увеличением коэффициента микро-глия/нейрон. Выраженность изменений ПВЯ гипоталамуса у крыс с гиперэстрогенемией была достоверно ниже, чем у крыс с ЭИ, моделируемой на фоне гипоэстрогенемии (Р< 0,01), и у животных с ЭИ без гормонального дисбаланса (Р < 0,05). Таким образом, исходно небольшое глиальное представительство в ПВЯ гипоталамуса при развитии хронической ЭИ не обеспечивало защиты нейронов от повреждения.

Основные изменения в аденогипофизе на светооптическом уровне характеризовались увеличением ацидофильных аденоцитов, наиболее выраженным у крыс с дефицитом эстрогенов. Отмечено умеренное снижение числа базофилов, появление базофильных аденоцитов с вакуолизированной цитоплазмой, снижение числа хромофоб-ных клеток. При морфометрии выявлено достоверное снижение объемной доли базофилов к 60-м сут. (в 1,41 раза — при моделировании базовой модели ЭИ; в 1,1 раза — на фоне гипоэстрогенемии) (табл. 2).

На 90-е сут. эксперимента происходило дальнейшее уменьшение объемной доли базофилов по сравнению с количеством базофилов в аденогипофизе крыс контрольной группы (в 1,73 и 1,45 раза соответственно), Р< 0,05, При ЭИ, моделируемой на фоне избытка эстрогенов в периферической крови, происходило увеличение базофилов, которое было максимально выраженным к 90-м сут. эксперимента (в 1,39 раза по сравнению с конт-

рольной группой). Достоверное увеличение объемных долей стромы и сосудистого русла зарегистрировано у животных всех экспериментальных групп (Р< 0,05). ТАБЛИЦА 2

Показатели морфометрии аденогипофиза у крыс при хронической эндогенной интоксикации

* Р < 0,05 по сравнению с интактными крысами,

*Р < 0,05 по сравнению с показателем базовой модели.

В периферическом органе гипоталамо-гипо-физарно-тиреоидной оси — щитовидной железе структурные изменения были наиболее вариабельными. Поражение ЩЖ у крыс с ЭИ без гормонального дисбаланса характеризовалось чередованием участков фолликулярного эпителия, находящегося в состоянии гипо- и гиперсекреции. О последнем свидетельствовала повышенная резорбция коллоида и преобразование кубического фолликулярного эпителия в призматический, наряду с появлением уплощенных тироцитов с овальным ядром и фолликулов с более интенсивной окраской коллоида.

На протяжении длительного времени (до 60-х сут.) ЩЖ сохраняла нормопластический тип строения, однако к 90-м сут ЭИ приобрела микрофолликулярный тип. Средний наружный диаметр фолликула достоверно снижался, и к 90-м сут. эксперимента был ниже, чем у крыс контрольной группы в 1,21 раза (Р < 0,05). Высота фолликулярного эпителия на различных сроках эксперимента была чрезвычайно вариабельной, что является косвенным свидетельством изменения функциональной активности тироцитов (табл. 3). Параллельно с этими изменениями происходило уменьшение диаметра ядер тироцитов, что свидетельствовало о снижении их пролиферативной активности. Содержание коллоида в ЩЖ максимально изменялось к 90-м сут., снижаясь в 1,8 раза.

Обращает на себя внимание тот факт, что на 60-е сут. эксперимента его содержание превышало таковой показатель у интактных животных в 1,06 раза. К окончанию эксперимента относительный объем стромы увеличился в 16,8 раза. ТАБЛИЦА 3

Показатели морфометрии щитовидной железы у крыс при хронической эндогенной интоксикации

Экспериментальные группы Сроки эксперимента

30-е сут | 60-е сут I 90-е сут

Средний наружный диаметр фолликула, мкм

лпс+тхм 118,9 ± 7,1 115,1 ±6,9 91,3 ±5,2*

Гиперэстрогенемия 139,9 ± 11,1 150,7 ± 10,5** 178,7± 11,1**

Гипоэстрогенемия 119,3 ±97 111,4 ± 6,7 103,8 ±6,1*

Высота фолликулярного эпителия, мкм

ЛПС+ТХМ 28,1 ± 1,7 39,8 ±2,3 43,5 ± 2,9*

Гиперэстрогенемия 26,2 ± 2,6 21,3 ±2,6** 19,8 ± 1,9*"

Гипоэстрогенемия 35,4 ± 2,7 38,3 ± 1,9 45,8 ±3,1*

Относительный объем коллоида, %

ЛПС+ТХМ 17,9 ±1,1 19,9 ± 1,2 6,5 ±0,4*

Гиперэстрогенемия 20,8 ± 1,3 28,7 ± 1,5** 35,1 ± 1,9*"

Гипоэстрогенемия 19,2 ± 1,2 15.8 ±0,9 8,1 ±0,5*

Относительный объем фолликулярного эпителия, %

ЛПС+ТХМ 72,4 ±4,3 60,2 ± 3,4 78,6 ±2,3

Гиперэстрогенемия 72,5 ±4.1 58,5 ±3,1* 53,0 ±3,1*

Гипоэстрогенемия 72,2 ± 4,4 67,0 ± 3,9 79,0 ±4,1

Относительный объем интерфолликулярного эпителия, %

ЛПС+ТХМ 4,5 ±0,3 4,40 ± 0,25 4,9 ±0.31

Гиперэстрогенемия 3,5 ±0,21 3,40 ±0,29 2,9 ±0,19*

Гипоэстрогенемия 4,4 ±0,31 5,70 ±0,31 6,2 ± 0,5**

Относительный объем стромы. %

ЛПС+ТХМ 2,4 ±0,1 6,1 ± 0,4* 4,9 ±0,3*

Гиперэстрогенем ия 1,1 ±0,1" 2,1 ± 0,3** 2,3 ± 0,2*"

Гипоэстрогенемия 1,9 ± 0,1* 2,8 ±0,2*" 2,9 ±0,3*

Относительный объем сосудистого русла, %

ЛПС+ТХМ 2,9 ±0.1 9,5 ±0,9** 5,1 ± 0,5**

Гиперэстрогенемия 1,9 ±0,1 7,3 ± 0,4** 6,7 ± 0,7**

Гипоэстрогенемия 2,3 ±0,3 87 ±0,8** 3,8 ± 0,3**

* Р < 0,05 по сравнению с интактными крысами, *Р< 0,05 по сравнению с показателем базовой

модели.

Щитовидная железа крыс при ЭИ на фоне гиперэстрогенемии имела макрофолликулярный тип строения. Фолликулярный эпителий был кубической формы, ядра вытянутые, эндотелиоподоб-ной формы с расположением большой оси параллельно базапьной мембране. Отсутствовала пролиферация фолликулярного эпителия, отмечено незначительное содержание межфолликулярного эпителия. В просвете фолликулов определялось значительное количество компактного коллоида, без явлений краевой вакуолизации. По данным морфометрии, наружный диаметр фолликулов ЩЖ плавно увеличивался по мере продолжительности эксперимента и к 90-м сут. превышал исходные значения в 1,43 раза, Р < 0,01. В 1,9 раз возрос относительный объем интрафолликулярного коллоида. Высота фолликулярного эпителия к 60-м сут. эксперимента снизилась в 1,41 раза по сравнению с исходными значениями, а к 90-м сут. эндогенной интоксикации была ниже в 1,52 раза. Кроме

Экспериментальные группы Сроки эксперимента

30-е сут | 60-е сут | 90-е сут

Объемная доля ацидофилов,

ЛПС+ТХМ 38,14 ±2,58 47,05 ± 1,95* 45,34 ± 2,47*

Гиперэстрогенемия 42,67 ±279 38,24 ±3,10" 37,97 ± 2,79"

Гипоэстрогенемия 43,21 ±2,91 47,18 ±2,99* 50,04 ± 3.27*

Объемная доля базофилов,

ЛПС+ТХМ 18,06 ± 1,38 14,81 ± 1,25* 12,11 ± 1,71*

Гиперэстрогенемия 21,97 ± 1,35 27,03 ± 1,29" 29,14 ± 1,67*"

Гипоэстрогенемия 19,12 ± 1,41 20,08 ± 1,31" 14,31 ± 1,31*

Объемная доля хромофобов,

ЛПС+ТХМ 31,20 ±2,13 17,58 ± 1,68* 19.64 ±1,61*

Гиперэстрогенемия 18,96 ±2,21*" 15,53 ± 1,79* 11,89 ± 1,91*"

] Гипоэстрогенемия 25,06 ±2,19*" 18,31 ±2,19* 16,96 ±2,31*.

Объемная доля стромы,

ЛПС+ТХМ 6,10 ± 0,91* 7,1 ± 1,1* 9.8 ±1,64*

Гиперэстрогенемия 7,50 ± 1,1* 8,40 ±0,91* 9.10 ± 1,1*

Гипоэстрогенемия 5,23 ± 0,9* 6,19 ±0,9* 7.78 ± 0,5*

Объемная доля сосудистого русла,

ЛПС+ТХМ 6,50 ± 0,11 13,46 ± 0,71* 13,11 ± 0,69*

Гиперэстрогенемия 8,90 ± 0,48 10,8 ± 0,5* 11,9 ± 0,65*

Гипоэстрогенемия 7,4 ±0,3 8,18 ±0,40" 10,91 ±0,9*

этого обнаружено значительное уменьшение относительного объема фолликулярного эпителия, количество которого к окончанию эксперимента (90-е сут.) было ниже исходного показателя в 1,36 раза. Отмечено увеличение объемной доли стромально-сосудистого компонента.

Щитовидная железа крыс при ЭИ на фоне гипоэстрогенемии имела микрофолликулярный тип строения. Уменьшение размеров ее фолликулов сопровождалось увеличением высоты фолликулярного эпителия и уменьшением количества рыхлого коллоида с явлениями краевой вакуолизации. Визуально определялось увеличение количества интрафолликулярного эпителия, наличие пролиферации фолликулярного эпителия. При морфометрии установлено достоверное уменьшение среднего наружного диаметра фолликула, увеличение высоты фолликулярного эпителия и уменьшение относительного объема коллоида. Объем интрафолликулярного эпителия к 90-м сут. эксперимента превышал исходные значения 1,6 раза (Р < 0,05). Таким образом, выявленные изменения свидетельствовали о повышении функциональной активности щитовидной железы у крыс с ЭИ на фоне гипоэстрогенемии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования установлено, что структурно-функциональные изменения при хронической ЭИ затрагивают все компоненты гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной оси.

При этом избыточное содержание эстрогенов в периферической крови оказывает протективное действие и достоверно уменьшает выраженность патологических изменений тиреоидной оси. В противовес этому, дефицит эстрогенов усугубляет течение эндогенной интоксикации и приводит к более значимым структурным преобразованиям, чем у животных без предшествующего гормонального дисбаланса

ЛИТЕРАТУРА

1. Акмаев И. Г., Гриневич В. В. Нейроиммуноэндокрино-логия гипоталамуса. — М.: Медицина, 2003. — 168 с.

2. Новочадов В. В., Писарев В. Б. Эндотоксикоз: Моделирование и органспатология. Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2005. — 240 с.

3. Малахова М. Я. Метод оценки эндогенной интоксикации. — СПб, 1995. — 72 с.

4. Правила лабораторной практики в Российской Федерации II Приказ Минздрава РФ от 19 июня 2003 г. № 267.

5. BeishuizenA., Thijs L. G. II J. Endotoxin. Res. — 2003. — Vol.9, № 1. — P. 3—24.

6. Daniel G„ Remick M. D. II Am. J. Pathol. - 2007. - Vol. 170, N 5.-P. 1435-1444.

7 Fernandes G. A., Perks P., Сох N. К. II J. Neuroendocrinol. - 2002. - Vol. 14, № 7. - P. 593-602.

8. Grinevich V., Ma X.-M., Herman J. P., et a I. II J. Neuroendocrinol. - 2001. - Vol.13. - P. 711-723.

9. Rinaman L. II Front. Neuroendocrinol. — 2007. — Vol. 28, № 1. — P. 50—60.

10. Robertson С. M., Coopersmith С. M. II Microb. Infect. — 2006. - Vol.12, № 8. - P. 1382-1389.