Композиция на основе празиквантеля для лечения описторхоза
COMPOSITION ON THE BASIS OF THE PRAZIQUANTEL FOR THE TREATMENT OF OPISTHORCHOSIS

Изобретение относится к фармацевтике, фармацевтической промышленности и может быть использовано при лечении гельминтного заболевания описторхоза, вызываемого Opisthorchis felineus.
У человека зарегистрировано 364 вида гельминтов. Гельминтозы распространены от арктических широт до экватора. Гельминтами заражено более миллиарда человек. По числу больных заражение кишечными гельминтами занимает третье место в мире. По данным ВОЗ, общее число заболеваний и смертей от гельминтозов выше, чем от бактериальных, вирусных инфекций и других паразитарных болезней, вместе взятых. Пораженность населения России гельминтозами составляет в среднем около 2%, в южных районах страны она достигает 7-10%. Особое место среди этих заболеваний занимает описторхоз, вызываемый трематодами Opisthorchis felineus. Так, пораженность описторхозом в эндемичных регионах Западной Сибири составляет не менее 30-60%, на Урале - 20-40% населения. Довольно часто практикуемое в настоящее время лечение описторхоза felinea недостаточно эффективно, что приводит к тяжелым последствиям заболевания - истощению иммунной системы и возникновению вторичного иммунодефицита, нарушениям механизмов гомеостаза, возникновениям аритмий, нарушениям психики, тяжелым поражениям печени и поджелудочной железы. Наиболее грозное осложнение описторхоза - малигнизация органов, заселяемых гельминтами.
Празиквантел (ПЗК) - Международное наименование: Praziquantel, регистрационный номер CAS: 55268-74-1 - является противогельминтным лекарственным веществом (ЛВ), производным пиразинизохинолина. Структурная формула празиквантела представлена на Фиг. 1.
2+
Обладает широким спектром действия, которое распространяется на многие виды трематод и цестод. Так, празиквантел активен в отношении всех патогенных для человека возбудителей шистосомозов, клонорхоза, парагонимоза, описторхоза, а также в отношении Fasciolopsisbuski, Hetorophyesheterophyes и Metagonimusyokogawai (кишечные сосальщики). Празиквантел быстро повышает проницаемость мембран клеток гельминтов для Са, что в свою очередь ведет к генерализованному сокращению мускулатуры, переходящему в стойкий паралич и ведущему к гибели. Кроме того, препарат вызывает вакуолизацию и последующее повреждение тегумента червей, что делает паразитов уязвимым перед иммунной системой хозяина и его пищеварительными ферментами.
Для эффективного лечения инвазий, вызванных Opisthorchis felineus, а также близких видов печеночных сосальщиков (Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis) приходится применять большие дозы препарата - 45-70 мг на 1 кг веса пациента, то есть до ~6 г препарата в сутки. Вследствие этого, велика вероятность возникновения нежелательных побочных явлений - тошноты, рвоты, боли в животе, диареи с примесью крови, головокружения, головной боли, сонливости, заторможенности, дезориентации, повышенной потливости, лихорадки, аллергических реакций (кожные высыпания, зуд). Однако при снижении дозы (в связи с противопоказаниями) снижается и антипаразитарная эффективность празиквантела: 40 мг/кг - 80%; 25 мг/кг - 60% (1. Удилов B.C. Борзунов В.М., Солдатов Д.А. Оценка эффективности антипаразитарной терапии при суперинвазии Opisthorchis felineus. Здоровье населения и среда обитания. 2013,9(246):40-42).
Следует отметить, что празиквантел является основным лекарственным средством для лечения описторхоза у человека, вследствие этого весьма важно повысить безопасность и эффективность его применения. По нашему мнению, необходимо повышение его антигельминтной активности и снижение действующих доз.
Аналогами нашего изобретения являются ряд патентов, описывающих получение и использование комбинированных препаратов, содержащих празиквантел и другие антигельминтные и вспомогательные вещества и предназначенные в основном для лечения с/х и домашних животных. Среди них: (2. Патент РФ 2417101 «Эндопаразитицидное средство» опубл. 27.04.2011 г., 3. Патент РФ 2100022 «Антигельминтное средство "азинокс плюс" опубл. 27.12.1997 г., 4. Патент РФ 2412700 - «Способ лечения паразитарных болезней водоплавающих птиц и лекарственное средство для его осуществления» опубл. 27.12.2011 г., 5. Патент РФ 2611387 «Способ получения противопаразитарного препарата пролонгированного действия для животных» опубл. 21.02.2017 г.и др.) В указанных документах отсутствуют сведения о повышении эффективности действия патентуемых препаратов против описторхоза и о возможности снижения его действующих доз.
Ближайшим аналогом нашего изобретения, является (6. Патент РФ 2613490 «Композиция на основе R(-)-празиквантела для лечения и профилактики гельминтозов у теплокровных» опубл. 20.08.2016). Авторы изобретения включили в лекарственную композицию R(-)энантиомер празиквантеля вместо обычно используемой рацемической смеси. Кроме празиквантеля в состав композиции входили - другое антигельминтное средство пирантелапамоат, бета-циклодекстрин, наполнители и вспомогательные добавки. Препарат использовался в виде водно-масленой эмульсии. Учитывая, что именно R(-) изомер проявляет антигельминтную активность, удалось продемонстрировать повышенную антигельминтную активность препарата по празиквантелю при испытаниях на домашних животных. Недостатком заявляемого подхода является необходимость использования именно R(-)энантиомера празиквантеля. Это вещество существенно дороже субстанции празиквантеля, так как требует дополнительного разделения энантиомеров. Указанный энантиомер не зарегистрирован в качестве лекарственного средства, а разработанная авторами патента лекарственная форма (водно-масляная эмульсия) имеет недостатки в виде невысокой физико-химической стабильности при хранении. Кроме того, заявленная композиция не испытывалась на противоописторхозное действие, в последнем случае показанное на других гельминтозах повышение целевого действия против Opisthorchis felineus и Opisthorchis viverrini не очевидно.
Известно изобретение (7. Патент РФ 2545797 «Композиция на основе албендазола с противоописторхозной фармакологической активностью» опубл. 10.04.2017 г.) которое относится к композиции на основе албендазола и способу ее получения. Указанная композиция состоит из субстанции албендазола и полисахарида арабиногалактана из лиственницы сибирской или Гмелина при массовых соотношениях компонентов албендазол: арабиногалактан 1:5-20, Заявленная композиция обладает более высокой противоописторхозной активностью, чем албендазол, а также не вызывает токсического повреждения гепатоцитов. Суть изобретения состоит в составе композиции и способе ее получения. Разработанная композиция в водных растворах образует межмолекулярные комплексы типа гость-хозяин, за счет чего достигается повышенная водорастворимость албендазола и усиление его фармакологического действия.
1
2
Известны также изобретения (8. Патенты РФ №2546535 «Противопаразитарное средство на основе альбендазола и способ его использования для лечения кишечных гельминтозов млекопитающих» опубл. 10.04.2015 г., 9. Патент РФ №2558922 «Антигельминтное средство и способ его получения» опубл. 10.08.2015 г., 10. Патент РФ №2588368 «Супрамолекулярный комплекс с никлозамидом и способ его получения» опубл. 27.06.2016 г..) в которых описано получение и испытания композиций антигельминтного действия на основе албендазола, фенбендазола и никлозамида с водорастворимыми полимерами природного и синтетического происхождения - арабиногалактаном, гидроксиэтилкрахмалом, поливинилпирролидоном, полиэтиленгликолем и т.д. Разработанные композиции в водных растворах также образует межмолекулярные комплексы малорастворимых антигельминтных веществ с используемыми полимерами типа гость-хозяин, за счет чего достигается их повышенная водорастворимость и усиление его антигельминтного действия (снижения действующих доз до 10 раз), изученного на широком спектре гельминтозов на лабораторных и с/х животных. Однако противоописторхозное действие полученных композиций не проверялось. Кроме того, использованные антигельминтные вещества - албендазол, фенбендазол, никлозамид - отличаются крайне малой растворимостью (1-5 мг/л) и, вследствие этого низкой биодоступностью. В следствие свой высокой липофильности их молекулы способны образовывать «прочные» комплексы включения типа гость-хозяин с гидрофильными полимерами, что обеспечивает многократное повышение (в 10-10 раз) растворимости действующих веществ и биологической доступности антигельминтной активности. В противоположность этому, молекулы празиквантеля менее липофильны, его водорастворимость составляет 0,2-0,3 г/л. Он хорошо абсорбируется в ЖКТ и его биодоступность составляет 75-100%. Наши предварительно проведенные исследования показали, что использованный в вышеописанных аналогах нашего изобретения феномен комплесообразования с гидрофильными полимерами оказался неэффективен для повышения растворимости ПЗК.
Известно также исследование (11. А.В. Душкин, Е.С. Метелева, Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, М.П. Долгих, Г.А. Толстиков. Комплексирование фармаконов с глицирризиновой кислотой - путь создания лекарственных препаратов повышенной эффективности // Химия в интересах устойчивого развития. 2010. - Т. 18. №4 - С. 517-525.). В этой работе исследовались физико-химические свойства и фармакологическая активность комплексов малорастворимых лекарственных веществ из классов НПВС (ибупрофен, бутадион) и транквилизаторов (сибазона и азалептина) с растительным сапонином - глицирризиновой кислотой (ГК). Во всех случаях наблюдалось определенное повышении растворимости указанных соединений. Однако фармакологические испытания на лабораторных животных не дали объяснимых однородных результатов. Так, для композиций на основе ибупрофена и азалептина была показана возможность снижения их действующих доз при сохранении базовой активности препаратов. В то же время комплексирование бутадиона и сибазона не изменили их фармакологической активности. Аналогичные результаты были также продемонстрированы для комплексов ГК с нифедипином (гипотензивное средство), варфарином (антикоагулянт) ипропранололом (антиаритмическое средство). Где только в случае нифедипина и пропранолола было обнаружено значительное улучшение фармакологических свойств.
В работах (12. Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, А.О. Брызгалов, Г.И. Лифшиц, М.В. Хвостов. «Использование подхода комплексообразования с глицирризиновой кислотой для создания новых кардиотропных средств» Биомедицина, 2006, №4, С. 115-117.; 13. T.G. Tolstikova, А.О. Bryzgalov, I.V. Sorokina, M.V. Hvostov, A.S. Ratushnyak, T.A. Zapara, O.G. Simonova. Increase in Pharmacological activity of drugs in their clathrates with plant glycoside Lett. Drug.Des.Discov., 2007, V. 4, №3, 168-170.; 14. Т.Г. Толстикова, Г.И. Лифшиц, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, И.В. Сорокина Комплексообразование в создании низкодозных Р-адреноблокаторов (экспериментальное исследование) Вестник НГУ, 2007, Т. 5, N.2, 70-73.; 15. T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, А.О. Bryzgalov, A.V. Dushkin, E.S. Meteleva Complex of nifedipine with Glycyrrhizic Acid as a novel water-soluble antihypertensive and antiarrhythmic agent Lett. Drug Des.Discov., 2009, V. 6, N 2, 155-158; 16. T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, A.O. Bryzgalov The Complexes of drugs with carbohydrate-containing plant metabolites as pharmacologically promising agents (обзор) Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2009, V. 9, N 11, pp 1317-1328; 17. A.B. Душкин, E.C. Метелева, Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, М.П. Долгих, Г.А. Толстяков Комплексирование фармаконов с глицирризиновой кислотой путь создания лекарственных препаратов повышенной эффективности Химия в интересах устойчивого развития, 2010, Т. 18, №4, С. 517-525; 18. Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, А.В. Душкин Улучшение фармакологических свойств нифедипина путем механохимического комплексирования с глицирризиновой кислотой Биомедицинская химия, 2010, Т. 56, N 2, С. 187-194.; 19. Т.Г. Толстикова, М.В. Хвостов, А.О. Брызгалов, И.Ф. Беленичев, С.В. Павлов Глицидипин - перспективный гипотензивный и кардиопротективный агент Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 2011, V. 151, # 5, 532-535.; 20.T.G. Tolstikova, M.V. Khvostov, G.I. Lifshits, A.V. Dushkin, E.S. Meteleva Alteration of Warfarin's Pharmacologic Properties in Clathrates with Glycyrrhizic Acid and Arabinogalactan Lett. DrugDes.Discov., 2011, V. 8, N 3, 201-204) было показано, что ГК может использоваться для повышения растворимости и фармакологической активности малорастворимых ЛВ. Однако, направление изменения фармакологического действия таких комплексов не предсказуемо. Комплексы ГК с противогельминтными препаратами не синтезировались и не испытывались, следовательно, их действие в качестве  антигельминтиков и в особенности против описторхоза, неизвестно. Кроме того, ГК как вспомогательное вещество имеет существенный недостаток, заключающий в «желируемости» ее растворов, что затрудняет их аналитический контроль и применение. В медицинской практике используются, как правило, не сама ГК, а ее соли с аммонием и щелочными металлами. Какие-либо данные о возможности комплексообразования этих солей с малорастворимыми ЛВ отсутствуют.
В основу нашего изобретения положено получение и фармакологические исследования противоописторхозного действия механохимически полученных твердых композиций празиквантеля с натриевой солью ГК.
По сравнению с известными заявляемое техническое решение обладает новизной поскольку именно заявляемый состав композиции обеспечивает высокую противоописторхозную активность и пониженную токсичность.
Проведенный патентный поиск позволил установить, что аналогичных составов композиций, обладающих повышенной фармакологической активностью и пониженным токсическим действием не обнаружено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».
Заявляемая порошкообразная композиция легко может смешиваться с равным количеством или избытком вспомогательных веществ из классов фармакологически нейтральных моно-, ди- и полисахаридов и растительных сапонинов для облегчения смачиваемости при суспендировании в водных растворах для последующего перорального приема.
Задачей заявляемого технического решения является создание композиции на основе празиквантеля, которая может быть использована для эффективного лечения описторхоза felinea при пониженных дозировках действующего вещества без побочных токсических эффектов.
Поставленная задача решается благодаря тому, что композиция включает комплекс празиквантеля и натриевой соли растительного сапонина-глициризиновой кислоты при массовых соотношениях компонентов празиквантел : натриевая соль глициризиновой кислоты, соответственно, 1:5-20, полученный путем совместной механоактивации смеси порошкообразных исходных компонентов.
2
Глицирризиновая кислота (ГК), структурная формула которой изображена на Фиг. 2, - хорошо растворимый растительный сапонин, который экстрагируется из корня солодки. ГК является конъюгатом двух молекул глюкуроновой кислоты и молекулы глицирретовой кислоты и способна к самоассоциации в водных растворах по причине своих амфифильных свойств. В широком диапазоне концентраций она образует мицеллы с молекулярной массой 50-100 кДа. ГК обладает определенным спектром биологической активности и оказывает противовирусное, противовоспалительное и даже противоопухолевое действие. Также используется в качестве подсластителя в пищевой промышленности. ГК способна образовывать нековалентные межмолекулярные комплексы с молекулами лекарственных веществ, либо включать их в супрамолекулярные образования - мицеллы. Это в ряде случаев позволяет повысить водорастворимость малорастворимых ЛВ, увеличить их биодоступность и усилить фармакологическое действие. В этом случае ГК не выступает как терапевтический агент, а только как вспомогательное вещество - средство доставки. В литературе отсутствует информация о ее токсичности при таком использовании. Недостатком ГК при ее применении в качестве вспомогательного вещества является образование желеобразных не текучих растворов, что затрудняет технологические и аналитические процедуры. В нашем изобретении вместо ГК мы впервые использовали ее двунатриевую соль NaГК. Это вещество также формирует мицеллы при растворении, хорошо растворяется, образуя маловязкие растворы, при этом не происходит их «желирование». Возможно также применение всего спектра натриевых и калиевых солей ГК с различными степенями замещения.
2
Целесообразность использования массовых соотношений празиквантеля и NaГКот 1:5 до 1:20 обусловлена следующим:
- при увеличении относительного содержания празиквантеля (>1:5) в композиции, достигаемое увеличение растворимости за счет образования водорастворимых комплексов недостаточно для усиления биологической активности;
2
- при понижении относительного содержания празиквантеля (<1:20) -композиция оказывается «перегружена» вспомогательным веществом(NaГК), что приводит к нежелательному увеличению массы препарата, а также к увеличению его себестоимости.
2
2
1
Для получения композиции используют механохимический подход, заключающийся в обработке смеси твердых компонентов интенсивными механическими воздействиями - давлением и сдвиговыми деформациями, реализуемыми преимущественно в мельницах различного типа, осуществляющих ударно-истирающие воздействия на вещества. В нашем случае смесь субстанций празиквантеля и NaГК подвергается механической обработке в шаровых мельницах. Однако можно использовать мельницы других конструкции, как и выбирать другие формы мелющих тел. При растворении в водных растворах полученных композиций, молекулы действующего вещества (ПЗК) включаются в мицеллы, образованные NaГК и ГК, образовавшейся в результате гидролиза натриевой соли. При этом происходит увеличение растворимости ПЗК, а также снижение вращательной диффузионной подвижности его молекул за счет их «присоединения» к высокомолекулярным структурам - мицеллам. Снижение подвижности отражается в укорочении времен спин-спиновой релаксации протонов ПЗК в спектрах Н ЯМР водных растворах. Именно факторы увеличения растворимости и сокращение времени спин-спиновой релаксации доказывают включение молекул ПЗК в высокомолекулярные супрамолекулярные образования - комплексы, мицеллы - что, по нашему мнению, должно способствовать ускорению его абсорбции в ЖКТ из твердой лекарственной формы, тем самым усиливая противоописторхозное действие. Необходимо отметить, что наше предположение об увеличении фармакологической активности не является очевидным, так как биодоступность ПЗК, по литературным данным составляет 75-100%, то есть практически вся доза препарата всасывается в ЖКТ без необходимости увеличения его растворимости. Таким образом, в качестве количественных критериев условий механохимической обработки нами были выбраны показатели увеличения растворимости и сокращения времен спин-спиновой релаксации протонов ПЗК.
Техническим результатом нашего изобретения является получение композиции на основе празиквантеля с усиленным противоописторхозным действием и пониженной токсичностью.
Предлагаемое техническое решение иллюстрируется нижеследующими примерами его применения.
Пример 1. Получение и физико-химические свойства композиций.
2
Смеси субстанций празиквантеля с NaГК, взятые в весовых соотношениях 1:5, 1:10 и 1:20 были подвергнуты обработке ударно-истирающими воздействиями в шаровой ротационной/валковой мельнице ВМ-1, в течение 2-24 часов (механическая активация). Затем были определены водорастворимость празиквантеля и измерены времена спин-спиновой релаксации его протонов в водных растворах исходной субстанции и полученных комплексов. Для исследования водорастворимости, 0,6 г навески исследуемого материала суспендировали в 10 мл дистиллированной воды при +25°С на орбитальном шейкере (170об/мин) в течение 4 часов. Концентрация празиквантеля в растворе определялась хроматографированием на хроматографе Agilent 1200 (колонка ZorbaxEclipseXDB-C18, 4.6×50 мм; температура колонки 30°С, элюент - система ацетонитрил/вода 1/1, скорость потока 1 мл/мин., объем пробы 5 мкл, детектирование на длинах волн 230,8 и 290,8 нм) относительно приготовленных калибровочных образцов спиртовых растворов.
1
Н ЯМР спектры растворов празиквантеля и его комплексов регистрировались в растворах D20 на спектрометре Avance III 500 MHz (Bruker, Германия). Измерение времен спин-спиновой релаксации Т2 проводилось с использованием стандартной последовательности Кара-Парсела-Мебума-Гилла (CPMG). Растворы готовились путем перемешивания на магнитной мешалке в течение 1 часа при комнатной температуре. Времена спин-спиновой релаксации измерялись при одинаковой концентрации Na2ГК=5 мМ, при Т=30 С.Полученные физико-химические данные композиций приведены в Таблице 1.
м/а - механически активированная
2
Во всех случаях имеет место увеличение водорастворимости празиквантеля из механохимически полученных композиций с Na2ГК, по сравнению с исходной субстанцией до~2,4-3,5 раз. Эти характеристики композиций доказывают образование межмолекулярных ассоциатов молекул празиквантеляи NaГК в водных растворах, которые и обеспечивают противоописторхозное действие заявляемых композиций, (см. пример реализации 2).
2
2
Образование ассоциатов празиквантела с динатриевой солью глицирризиновой кислоты (NaГК) в водных растворах подтверждено методом динамического 1Н ЯМР по уменьшению времени спин-спиновой релаксации протонов празиквантела в присутствие NaГК (Таблица 1) не менее, чем в 1,7 раза. Наблюдаемое время релаксации зависит от концентрации комплекса. Увеличение концентрации комплекса до 7 мМ (по ГК) приводит к сокращению времени спин-спиновой релаксации более, чем в 10 раз по сравнению с исходной субстанцией празиквантеля.
2
Интересно отметить, что повышение растворимости, а также сокращение времен релаксации Т2 также наблюдается в растворах не обработанных смесей ПЗК и NaГК, что также указывает на их комплексирование в водных растворах. Однако прочность таких комплексов существенно ниже, если судить по разнице величин, приведенных в Таблице 1. Это указывает на эффективность механохимичсекого пути заявляемых композиций.
2
2
2
50
50
Пример 2. Исследование противоописторхозной активности in vitro Проведено сравнительное тестирование ПЗК, глицирризината натрия и заявляемого комплекса ПЗК с глицирризинатом натрия (ПЗК: NaГК, 1:10).Тестирование препаратов ПЗК, NaГК и комплекса ПЗК: NaГК (1:10) проводили на живых интактных паразитах Opisthorchis felineus, добавляя исследуемые препараты в инкубационную среду и оценивая их эффективность в течение 24 часов. Жизнеспособность паразитов определяли по степени их подвижности (21. Keiser J., Manneck Т., Vargas М. Interactions of mefloquine with praziquantel in the Schistosoma mansoni mouse model and in vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2011. doi:10.1093/jac/dkri78.). Кроме того, использовали морфологические методы оценки. Для вычисления IC каждого вещества использовали не менее 4 концентраций. Для каждой концентрации использовали по 6-10 взрослых марит Opisthorchis felineus. Опыт повторяли не менее 2 раз. Значения IC вычисляли с помощью программы CompuSyn (22. Chou ТС and Martin N. CompuSyn for Drug Combinations: PC Software and User's Guide: A Computer Program for Quantitation of Synergism and Antagonism in Drug Combinations, and the Determination of IC50and ED50 and LD50 Values, ComboSynlnc, Paramus, (NJ), 2005).
50
2
Глицирризинат натрия не влиял на подвижность взрослых паразитов (IС=12899 мкг/мл), не изменял их форму, цвет и перистальтику кишечника (Фиг. 3а). Празиквантел дозозависимо угнетал двигательную активность, приводил к изменению формы паразитов (укорачивание и «складывание пополам»), начиная с первой минуты после добавления препарата (Фиг. 3б). Подобный эффект оказывал и комплекс ПЗК: NaГК. При этом черви принимали вытянутую форму, сворачивались, становились малоподвижными или полностью неподвижными, в зависимости от концентрации комплекса (Фиг. 3в).
2
2
Зависимость ингибирующего действия на подвижность марит Opisthorchis felineus препаратов ПЗК, NaГК и комплекса ПЗК: NaГК (1:10) от их концентрации.
2
2
На Фиг. 4 показана зависимость ингибирующего действия на подвижность марит Opisthorchis felineus препаратов ПЗК, NaГК и комплекса ПЗК: NaГК (1:10) от их концентрации.
50
Эффективность комплекса существенно не отличалась от эффективности ПЗК (см. Фиг. 4). Действие обоих препаратов выражалось в длительном угнетении подвижности паразитов (не менее 24 ч) и снижении их жизнеспособности в дальнейшем. Полуэффективная концентрация (IC), приводящая к угнетению подвижности червей на 50%, для комплекса была равна 1.4 мкг/мл, а для ПЗК - 0.291 мкг/мл (Фиг. 4), то есть эффективность комплекса в 4.8 раза меньше. Однако при пересчете на концентрацию действующего вещества (празиквантела), входящего в состав комплекса, полуэффективная концентрация равна 0.127 мкг/мл. Таким образом, можно утверждать, что эффективность ПЗК, применяемого в комплексе с глицирризинатом натрия (1:10) более чем в 2 раза превышает эффективность «чистого» ПЗК.
Пример 3. Исследование противоописторхозной активности in vivo.
2
Инфицирование хомячков (100 метацеркарий на животное) осуществляли перорально. На стадии хронического описторхоза (через 3 мес после инфицирования) животных разделили на три группы (в каждой по 8 хомячков) и однократно вводили: 1) 400 мг/кг ПЗК, разведенный в 10% твине 80; 2) 400 мг/кг комплекса ПЗК: NaГК (1:10), разведенный на питьевой воде; 3) растворитель - 10% твин 80. Доза препарата была выбрана из предварительных исследований (23. Pakharukova M.Y., Shilov A.G., Pirozhkova D.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. The first comprehensive study of praziquantel effects in vivo and in vitro on European liver fluke Opisthorchis felineus (Trematoda). Int. J. Antimicrob. Agents. 2015, 46(1):94-100). Через месяц после введения препаратов оценивали эффекты: количество червей в желчных протоках печени и относительную массу печени и селезенки, биохимические параметры, клеточный состав крови, костномозговой гемопоэз, а также ежемесячно контролировали динамику веса хомячков (см. Фиг. 2-4, Таблицу 3).
Клеточный состав крови хомячков оценивали с помощью гематологического анализатора РСЕ-90 (ERMAInc, Япония). Относительное количество форменных элементов крови подсчитывали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, затем рассчитывали их абсолютную численность.
4
2
Для гемопоэтического анализа костный мозг животных вымывали из бедренной кости средой для культуральных исследований RPMI1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Подсчитывали количество клеток костного мозга в 1 мл среды с помощью гематологического анализатора. Для определения числа коммитированных (запрограммированных на определенный путь дифференцировки) предшественников клетки костного мозга в концентрации 2,0×10/мл инкубировали в метилцеллюлозной среде М3434 (StemCellTechnology, Canada), содержащей цитокины - фактор стволовых клеток (SCF), эритропоэтин (ЕРО), интерлейкин-3, интерлейкин-6. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (БОЕ-Э, КОЕ-Э), гранулоцитарно-эритроидно-макрофагально-мегакариоцитарные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывали под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 37°С, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО.
При биохимическом анализе с помощью стандартных наборов реактивов («Biocon») в сыворотке крови определяли активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержание глюкозы, общего белка, холестерина и малонового диальдегида (МДА). Активность каталазы определяли в реакции с молибдатом аммония против стандарта (каталаза печени быка 38,08 ед/мл, «ICN Biomedicals))). Измерения были выполнены на биохимическом полуавтоматическом анализаторе «Фотометр-5010» («Boehringer Mannheim», Germany).
2
2
Показано, что комплекс ПЗК: NaГК, в котором содержание празиквантела было приблизительно 36 мг/кг оказывал сопоставимый с ПЗК (400 мг/кг) излечивающий от описторхоза эффект на животных (р<0.001 - для обоих веществ) (См. Фиг. 2). В обоих случаях полностью излечить животных от описторхоза не удалось: 2.9±1.23 червей после ПЗК и 8.0±1.78 червей после комплекса выжило. Однако высокая эффективность действия заявляемого мицеллярного комплекса ПЗК: NaГК (1:10) на выживаемость червей in vivo говорит о том, что данный комплекс может быть использован для лечения описторхозной инвазии Opisthorchis felineus.
Обнаружено, что комплекс не влиял на относительную массу печени, в отличие от празиквантела, на фоне которого масса печени снижалась, что можно объяснить меньшим содержанием оставшихся червей в печени после лечения и, соответственно, лучшим желчеотделением (см Фиг. 3). В то же время, и празиквантел, и новый комплекс не изменяли относительную массу основного периферического органа иммунной системы - селезенки. Таким образом, можно предположить, что новый комплекс, содержащий 36 мг/кг празиквантела, не оказывает заметного негативного влияния на функции печени и селезенки.
2
2
Новый мицеллярный комплекс ПЗК:NaГК (1:10), также как и ПЗК, не оказывал негативного влияния на такой физиологический показатель, как прирост массы тела. Животные всех трех сравниваемых групп хомячков одинаково набирали массу тела и имели статистически значимое увеличение этого параметра в конце эксперимента относительно результатов первого месяца. Таким образом, мицеллярный комплекс ПЗК:NaГК (1:10), наравне с ПЗК, не ухудшает видимого физиологического состояния инфицированных хомячков, оцениваемого по массе тела.
2
2
Результатами исследования гемопоэтической активности показано снижение численности всех колониеобразующих клеток костного мозга после введения инфицированным хомячкам мицеллярного комплекса ПЗК:NaГК (1:10). Действие комплекса было более эффективным, чем действие ПЗК, который оказал аналогичное влияние по двум из четырех оцениваемых параметров. Регуляция кроветворения зависит от многих внешних и внутренних факторов. Инфекционные заболевания, сопровождающиеся воспалительными процессами в организме, стимулируют пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток (24., King K.Y., Goodell М.А. Inflammatory modulation of HSCs: viewing the HSC as a foundation for the immune response. Nature. 2011, 11:685-692). Для хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus, это было показано на сроке 2-недельного заражения (25.Avgustinovich D.F., Orlovskaya I.A., Toporkova L.B., Vishnivetskaya G.B., Katokhin A.V., Lvova M.N., Kashina E.V., Bondar N.P., Feofanova N.A., Mordvinov V.A. Experimental opisthorchiasis: study of blood cell composition, hematopoiesis, and startle reflex in laboratory animals. Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2017, 7:82-92). Однако, в приведенной работе не исследовались терапевтические эффекты празиквантела и, тем более, нового мицеллярного комплекса. Таким образом, впервые установлено снижение гемопоэза, отражающее, возможно, подавление воспаления у О. felineus-инфицированных хомячков на фоне антигельминтных препаратов. Причем новый комплекс ПЗК:NaГК (1:10) был более эффективным.
2
2
Результаты оценки клеточного состава крови установили сравнимое действие празиквантела и комплекса ПЗК:NaГК (1:10) на такие показатели, как абсолютное число эритроцитов и гематокрит. Оба препарата увеличивали эти показатели. При этом они снижали абсолютное число тромбоцитов, более выраженно оказывал эффект празиквантел. Комплекс ПЗК:NaГК (1:10), содержание ПЗК в котором было в 11 раз меньше, оказывал эффект на уровне тенденции. Учитывая то, что при описторхозе черви могут питаться кровью млекопитающих, переводя гемоглобин в пигмент гемозоин (26. Lvova M.N., Zhukova M.V., Kiseleva E.V., Mayboroda O.A., Hensbergen P., Kizilova E.A., Besprozvannykh V.V., Sripa В., Katokhin A.V., Mordvinov V.A. Hemozoin is a product of heme detoxification in the gut of the most medically important species of the family Opisthorchiidae. Int. J. Parasitology. 2016, 46:147-156), а также то, что при инфекционных заболеваниях повышается абсолютное число тромбоцитов, может сделать заключение, что получены лечебные эффекты мицеллярного комплекса на некоторые показатели крови, сравнимые с действием лекарства - празиквантелем.
2
Результаты биохимического исследования показали, что новый комплекс ПЗК:NaГК, также как и празиквантел, снижают уровни общего белка и холестерина в крови инфицированных хомячков, что может расцениваться как лечебное действие препаратов. В отношении ферментов АЛТ и ACT, отражающих состояние печени, лечебное действие оказал ПЗК, который снижал активность ферментов. Комплекс, содержащий в 11 раз меньшую дозу ПЗК, оказался неэффективным в отношении этих ферментов печени.
2
На Фиг. 5. показано влияние празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:NaГК) на количество червей в желчных протоках печени хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus.
2
На Фиг 6. показано влияние празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:NaГК) на относительную массу печени и селезенки хомячков, инфицированных Opisthorchis felineus.
2
На Фиг. 7. показаны изменения массы тела у хомячков на фоне инфицирования Opisthorchis felineus (1-3 мес), а также после введения празиквантела (ПЗК) и комплекса празиквантела с глицирризинатом натрия (ПЗК:NaГК) (4 мес).
Примечание: * р<0.05; ** р<0.01; (*) 0.05<р<0.1 - по сравнению с группой растворитель»; # р<0.05 - по сравнению с группой «празиквантел».
2
Пример 4. Определение фармакокинетических параметров празиквантеля и его композиции с NaГК в массовых соотношении 1:10.
2
В эксперименте использовали самцов белых беспородных мышей массой 22-30 г по 5 шт.в группе. Празиквантел и комплекс ПЗК:NaГК вводили внутрижелудочно, натощак, однократно в дозе 400 мг/кг в пересчете на чистый ПЗК. Через 5,15, 30, 60, 90 и 120 минут после введения, животных декапировали и собирали кровь для получения сыворотки. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 3000 об./мин в течение 15 мин. Затем образцы замораживали для дальнейшего определения концентрации празиквантеля.
2
2
Фармакокинетические параметры празиквантеля и его композиции с NaГК представлены на фиг. 8 (Фармакокинетические кривые ПЗК и его комплекса с NaГК) и в таблице 3.
2
Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении биодоступности пракзиквантеля из комплекса с NaГК.
1
Заявляемая композиция повышает водорастворимость празиквантеля не менее, чем в 2,4 раза, времена Н ЯМР спин-спиновой релаксации протонов празиквантеля в водных растворах композиций сокращаются более, чем в 1,7 раз, при этом; биодоступность празиквантеля увеличивается в 3 раза.