НОВОЕ АНТИТЕЛО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И (ИЛИ) ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАКА
NOVEL ANTIBODY FOR DIAGNOSIS AND/OR PROGNOSIS OF CANCER

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования и/или диагностики пролиферативного заболевания у пациента. Более конкретно, изобретение относится к новым антителам, способным специфично связываться с человеческим рецептором cMet, а также к аминокислотным последовательностям и последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим данные антитела. Подобным образом, изобретение включает применение указанных антител и соответствующего способа для детекции и диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных расстройств, ассоциированных с экспрессией cMet. В определенных воплощениях расстройствами являются онкогенные расстройства, ассоциированные с повышенной экспрессией полипептида cMet относительно нормальной экспрессии, или с любой другой патологией, связанной со сверхэкспрессией cMet. Наконец, изобретение включает продукты и/или композиции, или наборы, содержащие по меньшей мере такие антитела для прогнозирования или диагностики определенных раковых заболеваний.
Таргетные агенты в отношении рецепторных тирозинкиназ (RTK), такие как ингибиторы трастузумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, иматиниб и гефитиниб, проиллюстрировали интерес в использовании данного класса белков в качестве мишени для лечения избранных раковых заболеваний.
cMet является прототипическим членом подсемейства RTK, которое также включает RON и SEA. Семейство RTK cMet структурно отличается от других семейств RTK, и он является единственным известным высокоаффинным рецептором фактора роста гепатоцитов (HGF), также именуемого рассеивающим фактором (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10: 2867-2878]. cMet и HGF широко экспрессируются в целом ряде тканей, и их экспрессия обычно ограничена клетками эпителиального и мезенхимного происхождения соответственно [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6: 1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123: 223-235]. Они оба требуются для нормального развития млекопитающих и, как было показано, являются особенно важными в миграции клеток, морфогенетической дифференцировке и организации трехмерных трубчатых структур, а также в росте и ангиогенезе [F. Baldt et al., Nature 1995, 376: 768-771; С. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. В то время как было показано, что контролируемая регуляция cMet и HGF являются важными в развитии млекопитающих, поддержании и репарации тканей [Nagayama Т et al., Brain Res. 2004, 5; 999 (2): 155-66; Tahara Y et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307 (1): 146-51], их неправильную регуляцию связывали с развитием раковых заболеваний.
Нарушенная сигнализация, управляемая неадекватной активацией cMet, является одним из самых частых изменений, наблюдаемых при человеческих раковых заболеваниях, и она играет решающую роль опухолегенезе и метастазах [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2 (4): 289-300].
Неадекватная активация cMet может возникать посредством лиганд-зависимых и независимых механизмов, которые включают сверхэкспрессию cMet и/или паракринную или автокринную активацию, или посредством мутации, приводящей к приобретению новой функции [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226: 1-26]. Однако олигомеризация рецептора cMet в присутствии или в отсутствии лиганда требуется для регуляции аффинности связывания и кинетики связывания киназы в отношении АТФ и пептидных субстратов, содержащих тирозин [Hays JL et al., Biochemistry, 2004 Aug 17, 43: 10570-8]. Активированный cMet рекрутирует сигнальные эффекторы к его сайту мультидокинга, расположенному в цитоплазматическом домене, что приводит к активации нескольких ключевых сигнальных путей, включающих Ras-MAPK, PI3K, Src и Stat3 [Gao CF et al., Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Данные пути являются существенными для пролиферации опухолевых клеток, инвазии и ангиогенеза и для уклонения от апоптоза [Furge КА et al., Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S et al., Oncogene. 2000 Apr 27, 19 (18): 2212-23]. Кроме того, уникальным аспектом сигнализации cMet относительно других RTK является его описанное взаимодействие с фокальными комплексами адгезии и некиназными партнерами связывания, такими как α6β4 интегрины [Trusolino L et al., J Biol Chem. 1999, 274 (10): 6499-506], плексин B1 или семафорины [Giordano S et al., Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P et al., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23: 5131-7], что может дополнительно увеличивать сложность регуляции функции клетки данным рецептором. Наконец, недавние данные демонстрируют то, что cMet мог бы участвовать в резистентности опухоли к гефитинибу или эрлотинибу, свидетельствуя о том, что комбинация соединения, имеющего в качестве мишени как EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), так и cMet, могла бы представлять значительный интерес [Engelman JA at al., Science, 2007, 316: 1039-43].
В последние несколько лет было разработано много разных стратегий для ослабления сигнализации cMet в линиях раковых клеток. Данные стратегии включают i) нейтрализующие антитела против cMet или HGF/SF [Сао В et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98 (13): 7443-8; Martens T et al., Clin Cancer Res. 2006, 12 (20): 6144-52] или применение NK4 - антагониста HGF/SF для предупреждения связывания лиганда с cMet [Kuba К et al., Cancer Res., 2000, 60: 6737-43], ii) маленькие ингибиторы АТФ-связывающего сайта cMet, которые блокируют киназную активность [Christensen JG et al., Cancer Res. 2003, 63: 7345-55], iii) сконструированный полипептид с доменом SH2, который препятствует доступу к сайту мультидокинга, и РНКи (интерферирующая РНК) или рибозим, которые уменьшают экспрессию рецептора или лиганда. Большинство данных подходов демонстрируют селективное ингибирование cMet, приводящее к ингибированию опухоли, и показывая, что cMet мог бы представлять интерес для терапевтического вмешательства в раковое заболевание.
Целью настоящего изобретения является предложение по меньшей мере одного реактива, который можно использовать в качестве диагностического или прогнозирующего биомаркера для детектирования и/или отслеживания онкогенных расстройств, особенно онкогенных расстройств, характеризующихся экспрессией cMet, или онкогенных расстройств, которые опосредованы нарушенной экспрессией cMet.
Здесь описаны новые антитела, которые удовлетворяют этим критериям.
Другие отличительные признаки и преимущества изобретения будут очевидными из подробного описания и примеров, которые следуют ниже.
В первом аспекте предметом изобретения является связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное, который специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой белка cMet (cMet), предпочтительно с человеческим cMet, с высокой аффинностью и, таким образом, может быть полезным в способах диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных расстройств, опосредованных экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
Независимая от лиганда активация связана с конститутивным фосфорилированием cMet либо после 1) димеризации рецептора, которая происходит в отсутствие HGF в случае сверхэкспрессии cMet (обычно связанной с амплиикацией гена cMet), либо после 2) активирующих мутаций во внутриклеточном домене cMet, либо после 3) их обоих.
В первом аспекте изобретение касается связывающего белка или его функционального фрагмента, или производного, который на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet.
Под выражением «связывающий белок» следует понимать любую пептидную цепь, имеющую специфичную или общую аффинность по отношению к другому белку или молекуле. При возможности связывания белки приводятся в контакт и образуют комплекс. Связывающий белок по изобретению предпочтительно может быть, без ограничения, антителом, фрагментом или производным антитела, белком или пептидом.
Выражения «функциональный фрагмент(ты) и/или производное(ные)» будут подробно определены позднее в настоящем описании изобретения.
Под выражением «на опухоли» следует понимать то, что приведенные свойства связывающего белка согласно изобретению существуют в опухолевом окружении in vivo, а не только в примерах in vitro. Более конкретно, они были продемонстрированы, как будет очевидно из следующих примеров, в экспериментах ex vivo, представляющих среду настолько близкую к природной, насколько это возможно, или в анализе человеческой опухоли на имеющихся в продаже тканевых микрочипах (ТМА).
Здесь следует понимать, что изобретение не относится к белку в природной форме, другими словами, они не находятся в их природном окружении, но их можно было выделять или получать очисткой из природных источников, или иначе получать генетической рекомбинацией, или химическим синтезом, и что они тогда могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано далее.
Согласно одному воплощению изобретения раскрыт связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное, как описано ранее, который не блокирует связывание лиганда - фактора роста гепатоцитов (HGF) с cMet.
Более конкретно, связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению взаимодействует с внеклеточной областью cMet между аминокислотными остатками 1 и 950.
Согласно первому воплощению изобретение относится к связывающему белку или его функциональному фрагменту, или производному, содержащему по меньшей мере одну CDR (область, определяющая комплементарность), выбранную среди CDR последовательностей, содержащих по меньшей мере SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 или 21, или по меньшей мере одну CDR, последовательность которой имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 или 21 после оптимального выравнивания.
Согласно второму воплощению изобретение относится к связывающему белку или его функциональному фрагменту, или производному, содержащему по меньшей мере одну CDR, выбранную среди CDR последовательностей, включающих по меньшей мере SEQ ID No 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 или 26, или по меньшей мере одну CDR, последовательность которой имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 или 26 после оптимального выравнивания.
2
«Функциональный фрагмент» антитела означает в частности фрагмент антитела, такой как фрагменты Fv, scFv (sc=простая цепь), Fab, F(ab’), Fab’, scFv-Fc или диатела, или любой фрагмент, период полувыведения которого был увеличен. В настоящем описании такие функциональные фрагменты будут подробно описаны позднее.
«Производное соединение» или «производное» антитела означает в частности связывающий белок, состоящий из пептидного каркаса и по меньшей мере одной из CDR исходного антитела для того, чтобы сохранять его способность к распознаванию. В настоящем описании такие производные соединения, хорошо известные специалисту в данной области, будут более подробно описаны позднее.
В первом воплощении связывающий белок или его функциональный фрагмент или производное по изобретению содержит антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 1-6.
В другом воплощении связывающий белок или его функциональный фрагмент или производное по изобретению содержит антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 9-14.
Кроме того, в предпочтительном воплощении изобретения указанный белок или его функциональный фрагмент, или производное состоит из выделенного антитела.
Более предпочтительно, изобретение включает антитела, их производные соединения или их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению, полученные генетической рекомбинацией или химическим синтезом.
Согласно предпочтительному воплощению антитело согласно изобретению или его производные соединения, или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они состоят из моноклинального антитела.
Следует понимать, что термин «моноклональное антитело» означает антитело, происходящее из практически гомогенной популяции антител. Более конкретно, индивидуальные антитела популяции являются идентичными за исключением нескольких возможных встречающихся в природе мутаций, которые можно обнаружить в минимальных соотношениях. Другими словами, моноклональное антитело состоит из гомогенного антитела, возникающего в результате роста одиного клона клеток (например, гибридома - эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело и т.д.), и обычно характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена.
Здесь следует понимать, что данное изобретение не относится к антителам в природной форме, т.е. они не взяты из их природного окружения, но выделены или получены посредством очистки из природных источников или получены генетической рекомбинацией или химическим синтезом, и, таким образом, они могут нести неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.
Более конкретно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 1, 2, 3, 17, 18 или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 1, 2, 3, 17, 18 после оптимального выравнивания.
Даже более предпочтительно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:
- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1 или 17, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 1 или 17 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 содержит последовательности SEQ ID No. 2 или 18, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 2 или 18 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания.
В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но и) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 2, CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3.
Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или произвдных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 17, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 18, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3.
Согласно другому воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 4, 5, 6, 19, 20 или 21, или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 4, 5, 6, 19, 20 или 21 после оптимального выравнивания.
Предпочтительным образом антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-Н1, CDR-H2 и CDR-H3, где:
- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4 или 19, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 4 или 19 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 содержит последовательности SEQ ID No. 5 или 20, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 5 или 20 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6 или 21, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 6 или 21 после оптимального выравнивания.
В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6.
Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-Н1 содержит последовательность SEQ ID No. 19, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 20, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 21.
Более конкретно, антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 9, 10, 11, 22, 23 или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%- ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 9, 10, 11, 22, 23 после оптимального выравнивания.
Даже более предпочтительно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:
- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9 или 22, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 9 или 22 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 содержит последовательности SEQ ID No. 10 или 23, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 10 или 23 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 11 после оптимального выравнивания.
В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 10, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11.
Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 22, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 23, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11.
Согласно другому воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 12, 13, 14, 24, 25, 26, или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 12, 13, 14, 24, 25, 26 после оптимального выравнивания.
Предпочтительным образом антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-Н1, CDR-H2 и CDR-H3, где:
- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12 или 24, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 12 или 24 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 содержит последовательности SEQ ID No. 13 или 25, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 13 или 25 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 содержит последовательности SEQ ID No. 14 или 26, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 14 или 26 после оптимального выравнивания.
В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 13, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 14.
Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-Н1 содержит последовательность SEQ ID No. 24, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 25, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 26.
В настоящем описании термины «полипептиды», «полипептидные последовательности», «пептиды» и «белки, присоединенные к соединениям антитела или к их последовательностям» являются взаимозаменимыми.
Здесь следует понимать, что данное изобретение не относится к антителам в природной форме, т.е. они не взяты из их природного окружения, но выделены или получены посредством очистки из природных источников или получены генетической рекомбинацией или химическим синтезом, и, таким образом, они могут нести неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.
th
В первом воплощении область, определяющая комплементарность, или CDR, означает гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5 Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние издания). Имеются три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Здесь термин «CDR» используется для указания, в зависимости от случая, одной или более чем одной, или даже всех областей, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно распознает.
Во втором воплощении подразумевается, что области CDR или CDR указывают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено IMGT.
Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов, независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. При уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одинаковое положение, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT дает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1-IMGT: положения от 1 до 26, FR2-IMGT: от 39 до 55, FR3-IMGT: от 66 до 104 и FR4-IMGT: от 118 до 128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: от 27 до 38, CDR2-IMGT: от 56 до 65 и CDR3-IMGT: от 105 до 117. Поскольку пробелы представляют собой незанятые положения, длины CDR-IMGT (показанные в скобках и разделенные точками, например, [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в двухмерных графических представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] и в трехмерных структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
Существуют три CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин CDR используется здесь для того, чтобы указать, в соответствии с ситуацией, одну из данных областей или несколько, или даже все эти области, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно распознает.
Для большей ясности следует понимать, что в следующем описании и, более конкретно, в таблицах 2а, 2б и 3 CDR будут определены нумерацией IMGT и нумерацией Kabat.
Фраза «процентная доля идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот в том смысле, в котором она используется в настоящем изобретении, означает процентную долю идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученную после оптимального выравнивания, причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями распределены по их длине случайным образом. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей традиционно проводится сравнением последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение можно проводить по отрезкам или с использованием «интервала выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, помимо сравнения вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App.Math. 2:482], посредством алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством способа поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444] или посредством компьютерной программы, использующей данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или программой для сравнения BLAST NR или BLAST P).
Процентная доля идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислотными последовательностями определяется сравнением двух оптимально выровненных последовательностей, в которых последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, подлежащая сравнению, может иметь присоединения или делеции по сравнению с контрольной последовательностью для оптимального выравнивания между двумя последовательностями. Процентная доля идентичности рассчитывается определением числа положений, в которых аминокислота, нуклеотид или остаток являются идентичными между двумя последовательностями, путем деления числа идентичных положений на общее число положений в интервале выравнивания и умножения результата на 100 с получением процентной доли идентичности между двумя последовательностями.
Например, можно использовать программу BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (а именно для параметров «штраф за создание пробела»: 5 и «штраф за удлинение пробела»: 2; причем выбранной матрицей является, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная программой); процентная доля идентичности между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, рассчитывается непосредственно программой.
Для аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с контрольной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают примеры, содержащие контрольную последовательность, определенные модификации, а именно делецию, присоединение или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательных или непоследовательных аминокислот, предпочтительными являются замены, при которых замененные аминокислоты заменяются «эквивалентными» аминокислотами. Здесь подразумевается, что выражение «эквивалентные аминокислоты» указывает на любые аминокислоты, вероятно подлежащие замене на одну из структурных аминокислот, однако, без модификации биологических активностей соответствующих антител и из тех конкретных примеров, которые определены ниже.
Эквивалентные аминокислоты можно определять либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которыми они заменяются, либо по результатам сравнительных тестов биологической активности между разными антителами, которые вероятно будут получены.
В качестве неограничивающего примера, в таблице 1, приведенной ниже, обобщены возможные замены, которые вероятно будут проводиться, не приводя к значительной модификации биологической активности соответствующего модифицированного антитела; естественно, при тех же самых условиях возможны обратные замены.
Таблица 1
Исходный остаток
Замена(ны)
Ala (А)
Val, Gly, Pro
Arg (R)
Lys, His
Asn (N)
Gln
Asp (D)
Glu
Cys (C)
Ser
Gln (Q)
Asn
Glu (G)
Asp
Gly (G)
Ala
His (H)
Arg
Ile (I)
Leu
Leu (L)
Ile, Val, Met
Lys (K)
Arg
Met (M)
Leu
Phe (F)
Tyr
Pro (P)
Ala
Ser (S)
Thr, Cys
Thr (T)
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr (Y)
Phe, Trp
Val (V)
Leu, Ala
Специалистам в данной области известно, что при современном уровне техники наибольшая изменчивость (по длине и составу) между шестью CDR обнаруживается в трех CDR тяжелой цепи и, более конкретно, в CDR-H3 данной тяжелой цепи.
В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к мышиному антителу или его производным соединениям, или функциональным фрагментам.
В другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:
- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 1 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 2 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 3 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания, и
тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:
- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 4 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 5 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 6 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.
В предпочтительном воплощении антитело или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, содержит а) легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3, и б) тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6.
Кроме того, в другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:
- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 9 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 9 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 10 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 10 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 11 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 11 после оптимального выравнивания, и
тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:
- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 12 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 12 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 13 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 13 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 14 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 14 после оптимального выравнивания.
В предпочтительном воплощении антитело или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, содержит а) легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 10, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11, и б) тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 13, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 14.
Кроме того, в другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов, или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно Kabat:
- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 17 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 17 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 18 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 18 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 3 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания, и
тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно Kabat:
- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 19 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 19 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 20 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 20 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 21 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 21 после оптимального выравнивания.
Кроме того, в другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно Kabat:
- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 22 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 22 после оптимального выравнивания;
- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 23 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 23 после оптимального выравнивания; и
- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 11 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 11 после оптимального выравнивания, и
тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно Kabat:
- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 24 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 24 после оптимального выравнивания;
- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 25 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 25 после оптимального выравнивания; и
- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 26 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 26 после оптимального выравнивания.
Согласно еще одному другому воплощению антитело по изобретению или его функциональный фрагмент, или производное характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 7 после оптимального выравнивания; и/или вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 8 или последоваельность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 8 после оптимального выравнивания.
В изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7, и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 8.
Согласно еще одному другому воплощению антитело по изобретению или его функциональный фрагмент, или производное характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 15 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 15 после оптимального выравнивания; и/или вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 16 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 16 после оптимального выравнивания.
В изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 15, и вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 16.
Как понятно из приведенного выше, изобретение также относится к любому соединению, происходящему из антитела, как описано в данном изобретении.
Более конкретно, антитела по изобретению или производные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что указанные производные соединения состоят из связывающих белков, содержащих пептидный каркас, на который пересажена по меньшей мере одна CDR таким образом, чтобы сохранить все или часть распознающих свойств паратопа исходных антител.
Одна или более чем одна последовательность среди последовательностей CDR, описанных в настоящем изобретении, также может присутствовать на разных каркасах иммуноглобулиновых белков. В данном случае последовательность белка позволяет воссоздать пептидный скелет, благоприятный для сворачивания пересаженных CDR, давая им возможность сохранять антигенсвязывающие свойства их паратопа.
В общем, специалист в данной области знает как определять тип белкового каркаса, на который пересаживается по меньшей мере одна из CDR, происходящая из исходного антитела. Более конкретно, известно, что для выбора такие каркасы должны удовлетворять огромному числу следующих критериев (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187):
- хорошая филогенетическая консервативность;
- известная трехмерная структура (определенная, например, кристаллографией, ЯМР спектроскопией или любой другой методикой, известной специалисту в данной области);
- маленький размер;
- небольшое число или отсутствие посттранскрипционных модификаций; и/или
- легкость получения, экспрессии и очистки.
Источником таких белковых каркасов могут быть структуры, выбранные из, но не ограничивающиеся следующими: фибронектин и, предпочтительно, домен 10 фибронектина типа III, липокалин, антикалин (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74 (4): 257-75), белок Z, происходящий из домена В белка A Staphylococcus aureus, тиоредоксин А или белки с повторяющимся мотивом, таким как «анкириновый повтор» (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), «повтор армадилло», «обогащенный лейцином повтор» и «тетратрикопептидный повтор».
Также следует упомянуть каркасы, происходящие из токсинов, таких как, например, токсины из скорпионов, насекомых, растений, моллюсков, и т.д., и белки-ингибиторы нейрональной NO синтазы (PIN).
Ни в коей степени не ограничивающим примером таких гибридных конструкций является вставка CDR-H1 (тяжелая цепь) антитела против CD4, а именно 13 В8.2, в одну из петель PIN, причем новый связывающий белок, полученный таким образом, сохраняет такие же связывающие свойства, что и исходное антитело (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343 (1), 334-344). На чисто иллюстративной основе также может быть упомянута пересадка CDR-H3 (тяжелая цепь) VHH антитела против лизоцима на одну из петель неокарциностатина (Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13 (7): 1882-1891).
Наконец, как описано выше, такие пептидные каркасы могут содержать от одной до шести CDR, происходящих из исходного антитела. Предпочтительно, но не являясь требованием, специалист в данной области выберет по меньшей мере одну CDR из тяжелой цепи, причем последняя известна как в первую очередь ответственная за специфичность антитела. Выбор одной или более чем одной релевантной CDR очевиден специалисту в данной области, который затем выберет подходящие известные методики (Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).
Настоящее изобретение, таким образом, относится к антителу или его производным соединениям, или функциональным фрагментам, характеризующимся тем, что пептидный каркас выбран среди белков, которые являются а) весьма консервативными филогенетически, б) имеют прочную структуру, в) имеют хорошо известную трехмерную молекулярную организацию, г) имеют маленький размер и/или д) содержат области, которые могут быть модифицированы делецией и/или вставкой без модификации свойств стабильности.
Согласно предпочтительному воплощению антитело по изобретению или его производные соединения, или функциональные фрагменты характеризуются тем, что указанный пептидный каркас выбран из i) каркасов, происходящих из фибронектина, предпочтительно домена 10 фибронектина типа 3, липокалина, антикалина, белка Z, происходящего из домена В белка A Staphylococcus aureus, тиоредоксина А или белков с повторяющимся мотивом, таким как «анкириновый повтор» (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), «повтор армадилло», «обогащенный лейцином повтор» и «тетратрикопептидный повтор» или ii) белков-ингибиторов нейрональной NO синтазы (PIN).
Другой аспект изобретения относится к функциональным фрагментам антитела, описанным выше.
2
Более конкретно, изобретение направлено на антитело или его производные соединения, или функциональные фрагменты, характеризующиеся тем, что указанный функциональный фрагмент выбран среди фрагментов Fv, Fab, (Fab’), Fab’, scFv-Fc или диател, или любого фрагмента, период полувыведения которого был увеличен, такого как ПЭГилированные фрагменты.
2
2
Такие функциональные фрагменты антитела согласно изобретению состоят, например, из фрагментов Fv, scFv (sc=простая цепь), Fab, F(ab'), Fab', scFv-Fc или диател, или любого фрагмента, период полувыведения которого был увеличен химической модификацией, такой как добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) (ПЭГилированные фрагменты именуются как Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab’)-PEG и Fab’-PEG), или включением в липосому, микросферы или PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), причем указанные фрагменты обладают по меньшей мере одной характерной CDR по изобретению, которая в значительной степени способна оказывать активность обычного типа, даже частичную, антитела, из которого она происходит.
Предпочтительно указанные функциональные фрагменты будут содержать или включать частичную последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, из которого они происходят, причем указанная частичная последовательность является достаточной для сохранения такой же специфичности связывания, что и у антитела, из которого она происходит, и достаточной аффинности, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100, более предпочтительно по меньшей мере 1/10 от аффинности антитела, из которого она происходит.
Такой функциональный фрагмент будет содержать по меньшей мере пять аминокислот, предпочтительно 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 или 100 последовательных аминокислот последовательности антитела, из которого он происходит.
2
Предпочтительно данные функциональные фрагменты будут типа Fv, scFv, Fab, F(ab’), F(ab)’, scFv-Fc или диател, которые обычно имеют ту же самую специфичность связывания, что и антитело, из которого они происходят. Согласно настоящему изобретению фрагменты антитела по изобретению можно получать из антител, описанных выше, такими способами, как ферментативное расщепление, включая расщепление пепсином или папаином, и/или расщепление дисульфидных связей химическим восстановлением. Фрагменты антител также могут быть получены методиками рекомбинантной генетики, также известными специалисту в данной области, или пептидным синтезом, например, посредством автоматических синтезаторов пептидов, таких как синтезаторы, продаваемые Applied BioSystems, и т.д.
Для большей ясности в таблице 2а, приведенной ниже, обобщены разные аминокислотные последовательности, соответствующие антителу по изобретению, согласно IMGT, тогда как в таблице 26 обобщены разные аминокислотные последовательности, соответствующие антителу по изобретению согласно Kabat.
Таблица 2а
(где Mu.=мышиный)
Антитело
Нумерация CDR
Тяжелая цепь
Легкая цепь
SEQ ID NO.
227D3
IMGT
CDR-L1
1
CDR-L2
2
CDR-L3
3
CDR-H1
4
CDR-H2
5
CDR-H3
6
Mu. вариабельный домен
7
Mu. вариабельный домен
8
205А5
IMGT
CDR-L1
9
CDR-L2
10
CDR-L3
11
CDR-H1
12
CDR-H2
13
CDR-H3
14
Mu. вариабельный домен
15
Mu. вариабельный домен
16
Таблица 2б
(где Mu.=мышиный)
Антитело
Нумерация CDR
Тяжелая цепь
Легкая цепь
SEQ ID NO.
227D3
Kabat
CDR-L1
17
CDR-L2
18
CDR-L3
3
CDR-H1
19
CDR-H2
20
CDR-H3
21
205А5
Kabat
CDR-L1
22
CDR-L2
23
CDR-L3
11
CDR-H1
24
CDR-H2
25
CDR-H3
26
Согласно другому аспекту изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать моноклональное антитело согласно изобретению, а именно - гибридоме мышиного происхождения, депонированной в CNCM, Institut Pasteur, Париж, Франция 18 ноября 2009 года под номером I-4247. Указанную гибридому получали слиянием спленоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток линий миеломы Sp 2/O-Ag 14.
Моноклональное антитело, именуемое здесь 227D3, или его производные соединения, или функциональные фрагменты, характеризующиеся тем, что указанное антитело секретируется гибридомой, депонированной в CNCM 18 ноября 2009 года под номером I-4247, и в явной форме образует часть настоящего изобретения.
Изобретение, таким образом, также охватывает моноклональное антитело, происходящее из гибридомы I-4247 или ее субклона, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet.
Согласно другому аспекту изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать моноклональное антитело согласно изобретению, а именно - к гибридоме мышиного происхождения, депонированной в CNCM, Institut Pasteur, Париж, Франция 18 ноября 2009 года под номером I-4247. Указанную гибридому получали слиянием спленоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток линий миеломы Sp 2/O-Ag 14.
Моноклональное антитело, именуемое здесь 205А5, или его производные соединения, или функциональные фрагменты характеризуются тем, что указанное антитело секретируется гибридомой, депонированной в CNCM 18 ноября 2009 года под номером I-4246, и в явной форме образует часть настоящего изобретения.
Изобретение, таким образом, также охватывает моноклональное антитело, происходящее из гибридомы I-4246 или ее субклона, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet.
В другом воплощении изобретение касается выделенной нуклеиновой кислоты, характеризующейся тем, что она выбрана из следующих нуклеиновых кислот:
а) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей связывающий белок, как описано выше;
б) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей антитело, как описано выше;
в) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность ДНК, содержащую последовательности SEQ ID No. 27-32 или 35-40;
г) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность ДНК, содержащую последовательности SEQ ID No. 33, 34, 41 или 42;
д) соответствующих РНК нуклеиновых кислот, как определено в в) или г); или
е) нуклеиновых кислот, комплементарных нуклеиновым кислотам, как определено в а), б), в) или г).
В Таблице 3, приведенной ниже, обобщены разные нуклеотидные последовательности, касающиеся антитела по изобретению. Все CDR определены здесь согласно IMGT (определения CDR согласно Kabat не представлены в таблице 3, но для специалиста в данной области будет очевидно как определить их, принимая во внимание последовательности таблицы 2б).
Таблица 3
Антитело
Нумерация CDR
Тяжелая цепь
Легкая цепь
SEQ ID NO.
227D3
IMGT
CDR-L1
27
CDR-L2
28
CDR-L3
29
CDR-H1
30
CDR-H2
31
CDR-H3
32
Mu. вариабельный домен
33
Mu. вариабельный домен
34
205А5
IMGT
CDR-L1
35
CDR-L2
36
CDR-L3
37
CDR-H1
38
CDR-H2
39
CDR-H3
40
Mu. вариабельный домен
41
Mu. вариабельный домен
42
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность», «последовательность нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность» используются в настоящем описании взаимозаменяемо, подразумевая точную последовательность нуклеотидов, модифицированную или немодифицированную, определяющую фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержащую неприродные нуклеотиды или не содержащую, и являющуюся либо двухцепочечной ДНК, либо одноцепочечной ДНК, либо транскрипционными продуктами указанных ДНК.
Здесь также следует добавить, что настоящее изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природном хромосомном окружении, т.е., в природном состоянии. Последовательности по настоящему изобретению были выделены и/или очищены, т.е., они были отобраны прямо или непрямо, например, посредством копии, причем их окружение было по меньшей мере частично модифицировано. Здесь также следует упомянуть выделенные нуклеиновые кислоты, полученные рекомбинантной генетикой, посредством, например, клеток-хозяев, или полученные химическим синтезом.
Фраза «нуклеиновые последовательности, демонстрирующие процентную долю идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% с предпочтительной последовательностью после оптимального выравнивания» означает нуклеиновые последовательности, демонстрирующие определенные модификации по отношению к контрольной нуклеиновой последовательности, такие как, в частности, делеция, усечение, удлинение, химерное слияние и/или замена, а именно точечная. Предпочтительно они представляют собой последовательности, которые кодируют те же самые аминокислотные последовательности, что и контрольная последовательность, причем это относится к вырожденности генетического кода, или комплементарные последовательности, которые вероятно специфично гибридизуются с контрольными последовательностями, предпочтительно при очень жестких условиях, а именно - при условиях, определенных ниже.
Фраза «гибридизация при очень жестких условиях» означает то, что условия, относящиеся к температуре и ионной силе, выбраны таким образом, что они допускают поддержание гибридизации между двумя фрагментами комплементарных ДНК. На чисто иллюстративной основе, очень жесткие условия стадии гибридизации с целью определения описанных выше полинуклеотидных фрагментов преимущественно являются следующими.
ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизация проводится в два этапа: (1) предгибридизация при 42°C в течение трех часов в фосфатном буфере (20 мМ, pH 7,5), содержащем 5Х SSC (1Х SSC соответствует раствору 0,15 М NaCl + 0,015 М цитрат натрия), 50% формамида, 7% додецилсульфата натрия (SDS), 10Х раствор Денхардта, 5% декстрансульфата и 1% ДНК из спермы лосося; (2) первичная гибридизация в течение 20 часов при температуре, зависящей от длины зонда (т.е.: 42°C для зонда >100 нуклеотидов в длину), с последующими двумя 20-минутными промывками при 20°C в 2Х SSC+2% SDS, одной 20-минутной промывкой при 20°C в 0,1Х SSC + 0,1% SDS. Последняя промывка проводится в 0,1Х SSC + 0,1% SDS в течение 30 минут при 60°C для зонда >100 нуклеотидов в длину. Очень жесткие условия гибридизации, описанные выше для полинуклеотида определенного размера, могут быть адаптированы специалистом в данной области для более длинных или коротких олигонуклеотидов, согласно методикам, описанным в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).
Изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, как описано в изобретении.
Изобретение в значительной мере направлено на клонирующие и/или экспрессионные векторы, которые содержат такую нуклеотидную последовательность.
Векторы по изобретению предпочтительно содержат элементы, которые обеспечивают экспрессию и/или секрецию нуклеотидных последовательностей в данной клетке-хозяине. Вектор, таким образом, должен содержать промотор, сигналы инициации и терминации трансляции, а также подходящие области регуляции транскрипции. Он должен иметь способность стабильно поддерживаться в клетке-хозяине и возможно может иметь специфичные сигналы, которые точно определяют секрецию транслированного белка. Эти разные элементы выбираются и оптимизируются специалистом в данной области согласно используемой клетке-хозяину. С этой целью нуклеотидные последовательности можно вставлять в самореплицирующиеся векторы в выбранном хозяине, или они могут быть интегративными векторами выбранного хозяина.
Такие векторы получают способами, типично используемыми специалистом в данной области, и образующиеся клоны можно вводить в подходящего хозяина стандартными способами, такими как липофекция, электропорация, тепловой шок, или химические способы.
Векторы, например, представляют собой векторы плазмидного или вирусного происхождения. Их используют для трансформации клеток-хозяев для того, чтобы клонировать или экспрессировать нуклеотидные последовательности по изобретению.
Изобретение также включает клетки-хозяева, трансформированные или содержащие вектор, как описано в настоящем изобретении.
Клетку-хозяин можно выбрать среди прокариотических или эукариотических систем, таких как, например, бактериальные клетки, но также дрожжевые клетки или клетки животных, а именно клетки млекопитающих. Также можно использовать клетки насекомых или растений.
Изобретение также относится к животным, отличным от человека, которые имеют трансформированную клетку согласно изобретению.
Другой аспект изобретения относится к способу получения антитела или одного из его функциональных фрагментов, способного к специфичному связыванию с независимой от лиганда активированной формой белка cMet согласно изобретению, характеризующемуся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
а) культура в среде и в подходящих культуральных условиях для клетки-хозяина согласно изобретению; и
б) выделение указанного антитела или одного из его функциональных фрагментов, полученного таким образом, из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.
Трансформированные клетки согласно изобретению являются полезными в способах получения рекомбинантных полипептидов согласно изобретению. Настоящее изобретение также включает способы получения полипептида согласно изобретению в рекомбинантной форме, характеризующиеся тем, что в указанных способах используется вектор и/или клетка, трансформированная вектором согласно изобретению. Предпочтительно клетку, трансформированную вектором согласно изобретению, культивируют при условиях, которые обеспечивают экспрессию вышеупомянутого полипептида и выделение указанного рекомбинантного пептида.
Как уже упоминалось, клетка-хозяин может быть выбрана среди прокариотических или эукариотических систем. В частности, возможно идентифицировать нукеотидные последовательности по изобретению, которые облегчают секрецию в такой прокариотической или эукариотической системе. Вектор согласно изобретению, несущий такую последовательность, таким образом, преимущественно может быть использован для получения рекомбинантных белков, которые будут секретироваться. В самом деле, очистка этих интересующих рекомбинантных белков будет облегчена из-за того, что они присуствуют в супернатанте культуры клеток, а не внутри клеток-хозяев.
Полипептиды по изобретению также можно получать химическим синтезом. Один такой способ получения также является целью изобретения. Специалист в данной области знает способы химического синтеза, такие как твердофазные методики (смотрите в частности Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) или частично твердофазные методики, путем конденсации фрагментов или посредством традиционного синтеза в растворе. Полипептиды, полученные химическим синтезом, и которые могут содержать соответствующие неприродные аминокислоты, также включены в изобретение. Антитела или их производные соединения, или функциональные фрагменты, которые вероятно будут получены способом по изобретению, также включены в настоящее изобретение.
Изобретение также включает применение связывающего белка или моноклинального антитела согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного для идентификации независимой от лиганда активированной формы cMet.
В другом воплощении изобретение касается способа различения между независимой от лиганда активированной формой cMet и другими формами cMet, включая неактивированные или зависимые от лиганда активированные формы cMet, в образце, который включает стадии:
а) приведения в контакт указанного образца со связывающим белком или антителом согласно изобретению или с его функциональным фрагментом, или производным и
б) детектирования связывания указанного связывающего белка или антитела с образцом.
Также раскрыто применение связывающего белка и более конкретно антитела по изобретению в качестве биомаркера. Данные способы можно использовать для детекции или диагностики разных гиперпролиферативных онкогенных расстройств, ассоциированных с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet, иллюстрируемых примерами, но не ограничивающихся следующими: остеосаркомы, рак легкого, рак молочной железы, рак эндометрия, глиобластома, рак толстой кишки, рак желудка, рак почки, гепатокарциномы или любое другое раковое заболевание, ассоциированное с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet. Как понял бы обычный специалист в данной области, уровень экспрессии связывающего белка и/или антитела, ассоциированного с конкретным расстройством, будет варьировать, в зависимости от природы и/или тяжести предсуществующего состояния.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ детекции или диагностики, или определения стадии in vivo у пациента гиперпролиферативных онкогенных расстройств, ассоциированных с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet, особенно указанных гиперпролиферативных онкогенных расстройств, как процитировано выше, включающий стадии:
а) введения связывающего белка и/или антител по настоящему изобретению, предпочтительно меченых, пациенту, нуждающемуся в этом; и
б) детекции, предпочтительно посредством визуализации, связывания указанного связывающего белка или антитела с независимой от лиганда активированной формой cMet, экспрессируемой у пациента, предпочтительно органом пациента, в котором подозревается или известно о присутствии опухолевых клеток или опухоли (особенно для определения стадии).
Введение связывающего белка и/или антител по настоящему изобретению любым из традиционных способов, известных специалисту в данной области (например, местным, парентеральным, внутримышечным и т.д.), будет обеспечивать крайне полезный способ детектирования в образце дисластических клеток, а также позволять врачу-клиницисту отслеживать терапевтическую схему пациента, подвергающегося лечению в отношении гиперпролиферативного расстройства, ассоциированного с или опосредованного экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции для визуализации in vivo онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet, содержащей приведенный выше связывающий белок и/или антитело или его фрагмент, которое является меченым и которое связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet in vivo; и фармацевтически приемлемый носитель.
Связывающий белок и антитело по изобретению или его функциональный фрагмент, или производное будут использоваться в разных медицинских или исследовательских целях, включая детекцию, диагностику и определение стадии разных патологий, ассоциированных с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
Определение стадии имеет потенциальное прогностическое значение и предоставляет критерии для разработки оптимальной терапии. Simpson et al., J. Clin. Oncology 18: 2059 (2000). В общем, патологическое определение стадии заболевания при раке молочной железы, например, является предпочтительным относительно клинического определения стадии заболевания, так как первое дает более точный прогноз. Однако клиническое определение стадии заболевания было бы предпочтительным, если бы оно было таким же точным, как и патологическое определение стадии заболевания, так как оно не зависит от инвазивной процедуры получения ткани для патологической оценки.
При использовании с подходящими метками или другими подходящими детектируемыми биомолекулами или химическими соединениями, связывающий белок и/или антитело по изобретению является особенно полезным для диагностических и прогностических приложений in vitro и in vivo.
Метки для применения в иммуноанализах обычно известны специалистам в данной области и включают ферменты, радиоизотопы и флуоресцентные, люминисцентные и хромогенные вещества, включая окрашенные частицы, такие как коллоидное золото или латексные шарики. Подходящие иммуноанализы включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Разные типы меток и способов конъюгирования меток со связывающим белком и/или антителами по изобретению хорошо известны специалистам в данной области, такие как типы меток и способы конъюгирования, изложенные ниже.
Подразумевается, что термин «онкогенное расстройство, ассоциированное с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet» в том виде, как он здесь используется, включает заболевания и другие расстройства, при которых было показано, что присутствие высоких уровней или ненормально низких уровней независимой от лиганда активированной формы cMet (аберрантной) у субъекта, страдающего от расстройства, является или подозревается либо в качестве ответственного за патофизиологию расстройства, либо служит фактором, который способствует ухудшению расстройства. В качестве альтернативы, присутствие таких расстройств можно доказать, например, по увеличению уровней независимой от лиганда активированной формы cMet на поверхности клетки, которые приводят к повышенному автофосфорилированию тирозина cMet в пораженных клетках или тканях субъекта, страдающего от расстройства. Увеличение уровней независимой от лиганда активированной формы cMet можно детектировать, например, с использованием антитела 205А5 или 227D3 по изобретению. Кроме того, оно относится к клеткам, которые демонстрируют относительно автономный рост, так что они демонстрируют нарушенный ростовой фенотип, характеризующийся значительной потерей контроля над пролиферацией клеток. В качестве альтернативы, клетки могут экспрессировать нормальные уровни независимой от лиганда активированной формы cMet, но характеризуются ненормальной пролиферацией.
В определенных воплощениях «повышенная экспрессия» в том виде, в котором она относится к независимой от лиганда активированной форме cMet, относится к уровням белка или экспрессии гена, которые демонстрируют статистически значимое увеличение экспрессии (при измерении по экспрессии РНК или экспрессии белка) относительно контроля.
Более конкретно, рассматривается применение связывающего белка или антитела или его функционального фрагмента, или производного согласно изобретению, как было описано, для диагностики in vitro онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet, или определения in vitro прогноза развития онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
Другой широкий аспект согласно изобретению касается способа диагностики патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства или чувствительности к патологическому состоянию, ассоциированному с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet у субъекта, включающего определение присутствия или отсутствия в образце клеток, несущих независимую от лиганда активированную форму cMet, и диагностику патологического состояния или чувствительности к патологическому состоянию на основе присутствия или отсутствия указанных клеток, несущих независимую от лиганда активированную форму cMet. Диагностические применения связывающего белка или антитела по изобретению включают первичные опухоли, раковые заболевания и метастазы. Связывающий белок или антитело могут присутствовать в форме иммуноконъюгата или меченого связывающего белка/антитела так, чтобы получать детектируемый и/или количественно оцениваемый сигнал.
Более конкретно, предпочтительным объектом согласно изобретению является способ детектирования in vitro присутствия и/или локализации у субъекта опухоли, экспрессирующей независимую от лиганда активированную форму cMet, где указанный способ включает стадии а) приведения в контакт образца от субъекта со связывающим белком или антителом или его функциональным фрагментом, или производным согласно изобретению и б) детектирования связывания указанного связывающего белка или антитела с образцом. Другим аспектом объекта является последующее наблюдение экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в качестве ответа на таргетную терапию в отношении cMet во время клинических испытаний и, более конкретно, когда понижающая регуляция и/или деградация независимой от лиганда активированной формы cMet является одним из компонентов механизма действия тестируемого соединения.
Как будет очевидно специалисту, детекция связывания связывающего белка или антитела по изобретению может осуществляться разными анализами. Несмотря на то, что совместимыми с изобретением являются любые способы для проведения анализов, в качестве примеров могут быть упомянуты FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток), ELISA или IHC (иммуногистохимия).
Подразумевается, что термин «образец» в том виде, как он здесь используется, означает любую биологическую жидкость, клетку, ткань, орган или его часть, которая включает или потенциально включает неопластическую клетку, такую как клетка из толстой кишки, желудка, прямой кишки, молочной железы, яичника, простаты, почки, легкого, крови, мозга или другого органа или ткани, которая содержит или подозревается в том, что содержит неопластическую клетку. Данный термин включает образцы, присуствующие у индивидуума, а также образцы, полученные или происходящие от индивидуума. Например, образец может быть гистологическим срезом или образцом, полученным биопсией, или клетками, которые помещены в или адаптированы для культуры ткани. Образец кроме того может быть субклеточной фракцией или экстрактом, или неочищенной или по существу чистой молекулой нуклеиновой кислоты или белковым препаратом.
Подразумевается, что клинический образец охватывает целый ряд типов образцов, полученных от субъекта и полезных в методике по изобретению, такой как, например, диагностический или отслеживающий анализ по определению или детектированию уровней экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet. Данное определение охватывает образцы твердой ткани, полученные хирургическим удалением, патологический образец, архивный образец или образец биопсии, культуру ткани или клетки, происходящие из них, и их потомство, и срезы или мазки, полученные из любых из данных источников. Неограничивающими примерами являются образцы, полученные из ткани молочной железы, лимфатических узлов, толстой кишки, поджелудочной железы, простаты и т.д. Данное определение также охватывает жидкие образцы биологического происхождения и может относиться либо к клеткам, либо к клеточным фрагментам, суспендированным из них, либо к жидкой среде и растворенным в ней веществам.
Другой аспект согласно изобретению относится к способу определения уровня экспрессии in vitro независимой от лиганда активированной формы cMet в опухоли, экспрессирующей cMet, от субъекта, где указанный способ включает стадии а) приведения в контакт образца от субъекта со связывающим белком или антителом или его функциональным фрагментом, или производным согласно изобретению и б) количественного измерения уровня связывания связывающего белка или антитела с независимой от лиганда активированной формой cMet в указанном образце.
Как будет очевидно специалисту, уровень связывания связывающего белка или антитела с независимой от лиганда активированной формой cMet можно количественно измерять целым рядом способов, таких как разные анализы. Несмотря на то, что с изобретением совместимы любые способы проведения анализов, предпочтительный способ пускает в ход иммуноферментативные процессы согласно методике ELISA, иммунофлуоресценцию, иммуногистохимию или методику радиоиммуноанализа (RIA) или эквивалентные методики.
В предпочтительном воплощении способа по изобретению уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet измеряется иммуногистохимией (IHC).
Предпочтительно биологический образец образован биологической жидкостью, такой как сыворотка, цельная кровь, клетки, образец ткани или биопсии человеческого происхождения. Образец, например, может включать ткань, полученную биопсией, которую можно с удобством проанализировать на присутствие патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
Как только сделано определение количества независимой от лиганда активированной формы cMet, присутствующей в тестируемом образце, результаты можно сравнить с результатами контрольных образцов, которые получают аналогичным способом, что и тестируемые образцы, но от индивидуумов, которые не имеют, или у которых отсутствует гиперпролиферативное онкогенное расстройство, ассоциированное с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet. Если уровень независимой от лиганда активированной формы cMet значительно увеличен в тестируемом образце, можно сделать заключение о повышенной вероятности того, что субъект, от которого он был получен, имеет или у него разовьется указанное расстройство.
Более конкретно, изобретение относится к способу диагностики in vitro опухоли, экспрессирующей независимую от лиганда активированную форму cMet, или определения in vitro прогноза развития опухоли, экспрессирующей независимую от лиганда активированную форму cMet, у субъекта, где указанный способ включает стадии а) определения уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet, как описано выше, и б) сравнения уровня экспрессии со стадии а) с контрольным уровнем экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet из нормальной ткани или ткани, не экспресирующей независимую от лиганда активированную форму cMet.
Подразумевается, что термин «диагностика» заболевания в том виде, как он используется в данной заявке, включает, например, диагностику или детектирование присутствия патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства, ассоциированного с или опосредованного экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet, отслеживание развития заболевания и идентификацию или детекцию клеток или образцов, которые указывают на расстройство, ассоциированное с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.
Термин «прогноз» в том виде, как он используется в данной заявке, означает вероятность выздоровления от заболевания или предсказание возможного развития или результата заболевания. Например, если образец от субъекта является позитивным в отношении окрашивания связывающим белком или антителом по изобретению, тогда «прогноз» для данного субъекта лучше, чем в ситуации, когда образец был негативным в отношении окрашивания на независимую от лиганда активированную форму cMet. Образцы можно подвергать бальной оценке на уровни экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet по подходящей шкале, как будет более подробно описано ниже.
Однако другой аспект изобретения также относится к отслеживанию экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в отношении терапевтических соединений, которые индуцируют деградацию cMet в качестве одного из их механизмов действия. В данном случае отслеживание экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet на клеточной мембране могло бы быть критически важным инструментом для оценки эффективности лечения во время клинических испытаний и «персонализированных» терапий.
Уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet преимущественно сравнивают или измеряют в связи с уровнями в контрольной клетке или образце, также именуемыми как «контрольный уровень» или «контрольный уровень экспрессии». В данном описании термины «контрольный уровень», «контрольный уровень экспрессии», «уровень в контроле» и «контроль» используются взаимозаменяемо. В общих чертах, «уровень в контроле» означает отдельный базовый уровень, измеренный в сопоставимой контрольной клетке, которая обычно не поражена заболеванием или раковым заболеванием. Она может происходить из того же самого индивидуума или из другого индивидуума, который является нормальным или не имеет того же самого заболевания, от которого получен пораженный заболеванием или тестируемый образец. В контексте настоящего изобретения термин «контрольный уровень» относится к экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet «в контроле», используемой для оценки тестируемого уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в образце от пациента, содержащем раковую клетку. Например, когда уровень независимой от лиганда активированной формы cMet в биологическом образце пациента выше, чем контрольный уровень независимой от лиганда активированной формы cMet, будет считаться, что клетки имеют высокий уровень экспрессии или сверхэкспрессию независимой от лиганда активированной формы cMet. Контрольный уровень можно определять целым рядом способов. Уровни экспрессии, таким образом, могут определять клетки, несущие независимую от лиганда активированную форму cMet, или, в качестве альтернативы, уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet не зависит от числа клеток, экспрессирующих независимую от лиганда активированную форму cMet. Таким образом, контрольный уровень для каждого пациента может быть оглашен по контрольному соотношению независимой от лиганда активированной формы cMet, где контрольное соотношение может быть определено любым из способов для определения описанных здесь контрольных уровней.
Например, контролем может быть заданное значение, которое может принимать целый ряд форм. Оно может быть одним предельным значением, таким как медиана или среднее. «Контрольный уровень» может быть одним числом, равным образом применимым индивидуально к каждому пациенту, или контрольный уровень может варьировать согласно конкретным подпопуляциям пациентов. Таким образом, например, более пожилые мужчины могут иметь другой контрольный уровень, чем более молодые мужчины для того же самого ракового заболевания, и женщины могут иметь другой контрольный уровень, чем мужчины для того же самого ракового заболевания. В качестве альтернативы, «контрольный уровень» может быть определен измерением уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в неонкогенных раковых клетках из той же самой ткани, что и ткань неопластических клеток, подлежащих тестированию. Также «контрольный уровень» может быть определенным отношением независимой от лиганда активированной формы cMet в неопластических клетках пациента относительно уровней независимой от лиганда активированной формы cMet в неопухолевых клетках в том же самом пациенте. «Контрольный уровень» также может быть уровнем независимой от лиганда активированной формы cMet в клетках, культивируемых in vitro, которыми можно манипулировать для имитирования опухолевых клеток, или можно манипулировать любым другим способом, который дает уровни экспрессии, которые позволяют точно определять контрольный уровень. С другой стороны, «контрольный уровень» может быть установлен на основе сравнительных групп, как, например, в группах, не имеющих повышенных уровней независимой от лиганда активированной формы cMet, и группах, имеющих повышенные уровни независимой от лиганда активированной формы cMet. Другим примером сравнительных групп были бы группы, имеющие конкретное заболевание, состояние или симптомы, и группы без заболевания. Заданное значение может быть получено, например, когда тестируемую популяцию делят равными долями (или неравными долями) на группы, такие как группу малого риска, группу среднего риска и группу высокого риска, или на квадранты или квинтили, причем к низшему квадранту или квинтилю принадлежат индивидуумы с наименьшим риском или наивысшим количеством независимой от лиганда активированной формы cMet, и к наивысшему квадранту или квинтилю принадлежат индивидуумы с набольшим риском или наименьшим количеством независимой от лиганда активированной формы cMet.
Контрольный уровень также можно определять сравнением уровня независимой от лиганда активированной формы cMet в популяциях пациентов, имеющих то же самое раковое заболевание. Это можно осуществлять, например, анализом гистограммы, на которой графически представлена вся когорта пациентов, где первая ось представляет уровень независимой от лиганда активированной формы cMet, и вторая ось представляет число пациентов в когорте, опухолевые клетки которых экспрессируют независимую от лиганда активированную форму cMet с заданным уровнем. Две или более чем две отдельные группы пациентов можно определять путем идентификации поднаборов популяций в когорте, которые имеют одинаковые или аналогичные уровни независимой от лиганда активированной формы cMet. Определение контрольного уровня тогда можно осуществлять на основе уровня, который лучше всего различает эти отдельные группы. Контрольный уровень также может представлять уровни двух или более чем двух маркеров, одним из которых является независимая от лиганда активированная форма cMet. Два или более чем два маркера могут быть представлены, например, отношением значений для уровня каждого маркера.
Подобным образом, по-видимому, здоровая популяция будет иметь другой «нормальный» интервал, чем популяция, которая, как известно, имеет состояние, ассоциированное с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet. Соответственно, при выбранном заданном значении может приниматься во внимание категория, в которую попадает индивидуум. Подходящие интервалы и категории могут быть выбраны обычными специалистами в данной области с использованием не более чем обычного экспериментирования. Под «повышенным», «увеличенным» подразумевается высокий относительно выбранного контроля. Типично контроль будет основан на, по-видимому, здоровых нормальных индивидуумах в подходящей возрастной группе.
Также будет понятно, что контролями согласно изобретению, помимо заданных значений, могут быть образцы материалов, тестируемые параллельно с экспериментальными материалами. Примеры включают ткань или клетки, полученные в то же самое время из того же самого субъекта, например, части одной биопсии или части одного клеточного образца от субъекта.
При клинической диагностике или мониторинге пациентов с заболеваниями, опосредованными независимой от лиганда активированной формой cMet, детекция клеток, экспрессирующих независимую от лиганда активированную форму cMet, или увеличение уровней независимой от лиганда активированной формы cMet, по сравнению с уровнями в соответствующем биологическом образце от нормального субъекта или в нераковой ткани, обычно указывает пациента имеющего, или у которого подозревается заболевание, опосредованное независимой от лиганда активированной формой cMet.
Согласно приведенному выше, в изобретении предложен способ предсказания чувствительности к раковому заболеванию, включающий детектирование уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в образце ткани, причем ее присутствие указывает на чувствительность к раковому заболеванию, где уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet коррелирует с уровнем чувствительности. Таким образом, в конкретных воплощениях исследуют экспрессию независимой от лиганда активированной формы cMet, например, в тканях предстательной железы, ткани остеосаркомы, легочной ткани, ткани поджелудочной железы, ткани толстой кишки, ткани молочной железы, глиобластомной ткани, тканях яичника или любой другой ткани, в которой подозреваются клетки, экспрессирующие независимую от лиганда активированную форму cMet, причем присутствие независимой от лиганда активированной формы cMet в образце дает указание чувствительности к раковому заболеванию или появления или существования тканеспецифичной опухоли.
Также предложен способ оценки агрессивности опухоли. В одном воплощении способ наблюдения за развитием злокачественного заболевания у индивидуума во времени включает определение уровня независимой от лиганда активированной формы cMet, экспрессируемой клетками в образце опухоли, сравнение уровня, определенного таким способом, с уровнем независимой от лиганда активированной формы cMet, экспрессируемой в эквивалентном образце ткани, взятом у того же самого индивидуума в другое время, где степень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в образце ткани во времени дает информацию по развитию ракового заболевания.
В еще одном другом воплощении в заявке предложены способы определения подходящего терапевтического протокола для субъекта. Конкретно, связывающий белок или антитела по изобретению будут очень полезными для отслеживания хода ослабления злокачественного образования у индивидуума, особенно в тех обстоятельствах, когда субъекта лечат белком, связывающим cMet, или антителом, которое не конкурирует со связывающим белком или антителами по изобретению за связывание с независимой от лиганда активированной формой cMet. Присутствие или отсутствие, или изменение уровня независимой от лиганда активированной формы cMet согласно изобретению может указывать на то, что субъект вероятно имеет рецидив или прогрессирующее, или стойкое раковое заболевание, ассоциированное с независимой от лиганда активированной формой cMet. Таким образом, путем измерения увеличения числа клеток, экспрессирующих независимую от лиганда активированную форму cMet, или изменений концентрации независимой от лиганда активированной формы cMet, присутствующей в разных тканях или клетках, можно определить, является ли эффективной конкретная терапевтическая схема, направленная на ослабление злокачественного заболевания, ассоциированного с независимой от лиганда активированной формой cMet.
Другим предметом изобретения является способ визуализации in vivo онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet. Например, такой способ можно использовать у пациента, демонстрирующего симптомы онкогенного расстройства. Если пациент имеет, например, повышенные уровни экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet, тогда данный пациент вероятно страдает от ракового расстройства. Также данный способ может быть полезным для отслеживания развития и/или ответа не лечение у пациентов, у которых ранее диагностировали раковое заболевание, опосредованное независимой от лиганда активированной формой cMet. Согласно приведенной выше цели, в изобретении предложен реактив для визуализации in vivo, содержащий связывающий белок или антитело согласно изобретению или его функциональный фрагмент, или производное, предпочтительно меченое, особенно радиоактивно меченое, и его применение в медицинской визуализации. Таким образом, общий способ согласно изобретению работает путем введения пациенту эффективного для визуализации количества визуализирующего реактива, такого как описанный выше связывающий белок или антитело, которое является меченым, и фармацевтически эффективного носителя и затем детектирования агента после его связывания с независимой от лиганда активированной формой cMet, присутствующей в образце. В определенных воплощениях данный способ работает путем введения эффективного для визуализации количества визуализирующего агента, содержащего группировку, направленную на мишень, и активную группировку. Визуализирующий агент вводится в эффективном количестве для диагностического применения у млекопитающего, такого как человек, и затем детектируется локализация и накопление визуализирующего агента. Локализацию и накопление визуализирующего агента можно детектировать радиоизотопной визуализацией, радиосцинтиграфией, визуализацией посредством ядерного магнитного резонанса, компьютерной томографией, позитронно-эмиссионной томографией, компьютеризированной аксиальной томографией, способом рентгеновской или магнитно-резонансной визуализации, флуоресцентной детекцией и хемилюминисцентной детекцией.
В том, что касается разработки таргетной противоопухолевой терапии, диагностика иммуногистологическими методиками дает in situ информацию по уровню экспрессии рецептора и, таким образом, позволяет выбирать пациентов, чувствительных к лечению, отслеживая уровень экспрессии рецепторов, необходимый для такого лечения.
Для иммунотерапии с использованием моноклональных антител, ответ на лечение, в зависимости от целевого уровня экспрессии рецептора, как в случае лечения трастузумабом, когда осуществляется определение сверхэкспрессии Her2 при карциноме молочной железы, теперь имеет большое клиническое значение с появлением гуманизированного моноклонального антитела трастузумаб против Her2. Демонстрация сверхэкспрессии Her2 является предпосылкой для лечения трастузумабом, поскольку он действует путем специфичного использования в качестве мишени карциномных клеток, сверхэкспрессирующих Her2. Точное тестирование в отношении Her2 направлено на обеспечение того, что затратное и потенциально токсичное лечение трастузумабом не дается пациентам с несверхэкспрессирующими опухолями, и что каждый пациент, которому может помочь трастузумаб, получает подходящее лечение.
Идея с трастузумабом относительно отбора пациентов, которые сверхэкспрессировали Her2, показала пользу определения уровня экспрессии рецептора при применении терапии моноклинальным антителом и разработки, в то же самое время, что и терапевтического моноклонального антитела, моноклонального антитела, которое можно использовать для отбора пациентов.
Как следствие, изобретение относится к способу определения in vitro статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли субъекта, где указанный способ включает стадии а) определения уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet, как описано выше, б) бальной оценки указанной опухоли в отношении уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet и в) сравнения указанной бальной оценки с бальной оценкой от контрольного образца.
В пределах значения по изобретению «статус независимой от лиганда активированной формы cMet» относится к классификации опухоли на класс позитивной в отношении независимой от лиганда активированной формы cMet [независимая от лиганда активированная форма cMet (+)] или негативной в отношении независимой от лиганда активированной формы cMet [независимая от лиганда активированная форма cMet (-)], на основе определения уровня экспрессии гена cMet независимой от лиганда активированной формы, при измерении любыми способами, такими как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), хромогенная гибридизация in situ (CISH), генный чип или другие способы, известные специалисту в данной области.
В предпочтительном воплощении антитело для диагностики должно иметь способность связываться с рецептором-мишенью, когда образцы ткани зафиксированы в формалине и залиты в парафин.
Более конкретно уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet измеряют иммуногистохимией (IHC).
+
+
+
+
+
+
+
В качестве примера, образцы можно подвергать бальной оценке на уровни экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet по шкале от 0 до 3 в отношении уровней окрашивания на связывающий белок или антитело, где 0 представляет собой отсутствие, и 1-3 представляет собой положительное окрашивание на четырех полуколичественных уровнях возрастающей интенсивности. Баллы 1-3 можно записывать как положительные, так как каждый положительный балл может быть ассоциирован со значительно пониженным риском рецидивирующего и смертельного заболевания по сравнению с баллом 0 (отсутствие), но возрастающая интенсивность среди положительных баллов может давать дополнительное снижение риска. Для оценки прогнозного значения независимой от лиганда активированной формы cMet можно использовать любой традиционный способ анализа опасности. Показательные способы анализа включают регрессионный анализ Кокса, который представляет собой полупараметрический способ моделирования данных по выживанию или времени до события в присутствии цензурированных случаев (Hosmer and Lemeshow, 1999; Сох, 1972). В отличие от других анализов выживания, например таблиц выживания или анализа Каплан-Мейер, анализ Кокса обеспечивает включение в модели предикторных переменных (ковариат). С использованием традиционного способа анализа, например анализа Кокса, можно протестировать гипотезу относительно корреляции статуса экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в первичной опухоли со временем до начала рецидива заболевания (время жизни без заболевания или время до метастатического заболевания), либо со временем до смерти от заболевания (общее время жизни). Регрессионный анализ Кокса также известен как анализ пропорциональных рисков Кокса. Данный способ является стандартным для тестирования прогнозного значения опухолевого маркера от времени жизни пациента. При использовании в многофакторном режиме, эффект нескольких ковариат тестируется параллельно, так что можно идентифицировать индивидуальные ковариаты, которые имеют независимое прогнозное значение, т.е. большинство полезных маркеров. Термин позитивный или негативный «статус независимой от лиганда активированной формы cMet» [также именуемый независимая от лиганда активированная форма cMet (+) или независимая от лиганда активированная форма cMet (-)] опухолей относится к баллу 0 или баллам 1-3 соответственно.
+
+
+
+
Образец можно «подвергать бальной оценке» во время диагностики или отслеживания ракового заболевания. В его самой простой форме бальная оценка может быть категориальной отрицательной или положительной, судя по визуальному исследованию образцов посредством иммуногистохимии. Более количественная бальная оценка включает суждение по двум параметрам: интенсивности окрашивания и доле окрашенных («позитивных») клеток, которые отбираются. На основе этих двух параметров можно приписать числовые значения, которые отражают возрастающие уровни позитивного окрашивания. Allred et al (Allred, Harvey et al. 1998) описали один способ достижения этого, который включал бальную оценку обоих параметров по шкале от 0 (отсутствие) до 3 и обобщение баллов индивидуальных параметров на общей шкале. Это приводит к шкале с возможными баллами 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 (Payne et al. Predictive markers in brest cancer - the present. Histopathology 2008, 52, 82-90) (заметьте, что балл 1 по шкале Allred не возможен). В некоторой степени более простой способ бальной оценки интегрирует интенсивность окрашивания ядер и долю клеток, которые демонстрируют окрашенные ядра, на объединенной шкале от 0 до 3. Любой из двух способов бальной оценки можно применять для бальной оценки интенсивности и доли окрашивания активированного Stat5 в клеточном ядре. Термины позитивный или негативный «статус независимой от лиганда активированной формы cMet» опухолей, используемый в настоящем описании, относится к уровням экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet, которые соответствуют баллам 0 или 1-3 на простейшей шкале соответственно.
+
+
Обычно результаты теста или анализа согласно изобретению можно представлять в любом из целого ряда форматов. Результаты можно представлять в качественном виде. Например, сообщение о результатах теста может указывать только был ли или нет детектирован конкретый полипептид, возможно также с указанием пределов детекции. Результаты могут быть представлены полуколичественным способом. Например, могут быть определены разные интервалы, и интервалам может быть приписан балл (например, от 1 до 3), который дает определенную степень количественной информации. Такой балл может отражать разные факторы, например, число клеток, в которых детектирована независимая от лиганда активированная форма cMet, интенсивность сигнала (которая может указывать уровень экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet или число клеток, несущих независимую от лиганда активированную форму cMet) и т.д. Результаты могут быть представлены количественным способом, например, в виде процентной доли клеток, в которых детектирован полипептид (независимая от лиганда активированная форма cMet), в виде концентрации белка и т.д. Как будет понятно обычному специалисту в данной области, предоставленный тестом тип вывода результатов будет варьировать, в зависимости от технических ограничений теста и биологической значимости, связанной с детекцией полипептида. Например, в случае определенных полипептидов чисто качественный вывод результатов (например, детектируется или нет полипептид при определенном уровне детекции) обеспечивает значимую информацию. В других случаях необходимо более количественное выведение результатов (например, отношение уровня экспрессии полпептида в образце тестируемое относительно нормального уровня).
+
+
В более предпочтительном воплощении бальная оценка уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet имеет градацию от 0 до 3, на основе оценки интенсивности продукта реакции и процентной доли позитивных клеток. Для большей ясности в таблице 4 ниже обобщены данные параметры. Следует рассматривать реактивность инвазивной опухоли только по всей окружности мембраны, и часто она имеет сходный внешний вид с «мелкоячеистой проволочной сеткой». При настоящих указаниях образцы, подвергнутые бальной оценке на независимую от лиганда активированную форму cMet посредством IHC на пограничном уровне (балл 2 или более), должны рассматриваться как независимая от лиганда активированная форма cMet (+), и для них требуется дополнительная оценка. Анализ IHC должен быть отброшен и либо повторен, либо необходимо провести тестирование FISH или любым другим способом, если, в качестве неограничивающего примера, контроли не являются такими, как ожидается, артефакты затрагивают большую часть образца, и образец имеет сильную мембранную позитивность нормальных протоков молочной железы (внутренние контроли), свидетельствующую об избыточном демаскировании антигена.
Таблица 4
Статус
Описние IHC
0
Нет реактивности или мембранная реактивность у менее чем 10% опухолевых клеток
1<sup>+</sup>
Незначительная/едва ощутимая мембранная реактивность детектируется у более чем 10% опухолевых клеток. Клетки являются иммунореактивными только в части мембраны.
2<sup>+</sup>
Реактивность всей мембраны от слабой до умеренной наблюдается у более чем 10% опухолевых клеток.
3<sup>+</sup>
Сильная полная реактивность наблюдается у более чем 10% опухолевых клеток.
В более предпочтительном воплощении способа согласно изобретению указанная бальная оценка включает применение подходящей шкалы на основе двух параметров, которыми являются интенсивность окрашивания и процентная доля позитивных клеток.
+
+
В предпочтительном воплощении способ согласно изобретению относится к подходящей шкале - шкале от 0 до 3, где отсутствию мембранной реактивности опухолевых клеток дается бальная оценка 0, и сильной полной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бальная оценка 3.
+
+
+
Более подробно, как описано выше, указанная подходящая шкала представляет собой шкалу от 0 до 3, где отсутствию мембранной реактивности опухолевых клеток дается бальная оценка 0; незначительной ощутимой мембранной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бальная оценка 1; от слабой до умеренной реактивности всей мембраны у более чем 10% опухолевых клеток дается бальная оценка 2; и сильной полной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бальная оценка 3.
+
В конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой независимую от лиганда активированную форму cMet (+) с бальной оценкой 2.
+
В конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой независимую от лиганда активированную форму cMet (+) с бальной оценкой 3.
+
+
В другом конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой независимую от лиганда активированную форму cMet (+) с бальной оценкой 2 или 3.
Согласно изобретению также описан способ определения того, чувствительно ли онкогенное расстройство к лечению связывающим белком или антителом против независимой от лиганда активированной формы cMet или его фрагментом, или производным, где указанный способ включает стадии (а) определения in vitro статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли субъекта, как описано выше, и (б) определение того, что, если статусом является независимая от лиганда активированная форма cMet (+), онкогенное расстройство является чувствительным к лечению связывающим белком или антителом против независимой от лиганда активированной формы cMet или его фрагментом, или производным.
В другом аспекте изобретения рассматривается набор, полезный для такого способа диагностики или прогнозирования, содержащий связывающий белок и/или антитело по изобретению.
Для удобства упакованная комбинация реактивов в заданных количествах с инструкциями для проведения диагностического анализа, например, наборы, также находятся в пределах объема изобретения. Набор содержит связывающие белки или антитела для детекции и количественного измерения независимой от лиганда активированной формы cMet in vitro, например, в ELISA или вестерн-блоттинге. Связывающий белок или антитело по настоящему изобретению могут быть предоставлены в наборе для детекции и количественного измерения независимой от лиганда активированной формы cMet in vitro, например, в ELISA или вестерн-блоттинге. При мечении связывающего белка или антитела ферментом, набор будет включать субстраты и кофакторы, требующиеся для фермента (например, субстратный предшественник, который дает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизисный буфер) и тому подобное. Такой набор может включать коробку, разделенную перегородками для вмещения одного или более чем одного контейнера, такого как флаконы, пробирки и тому подобное, причем в таких контейнерах содержатся отдельные элементы по изобретению. Например, один контейнер может содержать первый связывающий белок или антитело, связанное с нерастворимым или частично растворимым носителем. Второй контейнер может содержать растворимый, детектируемо меченый второй связывающий белок или антитело в лиофилизированной форме или в растворе. Коробка также может содержать третий контейнер, содержащий детектируемо меченый третий связывающий белок или антитело в лиофилизированной форме или в растворе. Набор данного типа можно использовать в сэндвич-анализе по изобретению. На этикетке или листке-вкладыше в упаковку может быть приведено описание композиции, а также инструкции для намеченного применения in vitro или диагностического применения.
Относительные количества разных реактивов могут широко варьировать для обеспечения концентраций реактивов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реактивы могут быть предоставлены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включающих эксципиенты, которые при растворении будут давать раствор реактива, имеющий подходящую концентрацию.
В еще одном другом аспекте изобретения связывающие белки, антитела или их связывающие фрагменты, как здесь подробно описано, предоставлены меченными детектируемой группировкой так, что они, например, могут быть упакованы и использованы в наборах для диагностики или идентификации клеток, имеющих вышеупомянутый антиген. Неограничивающие примеры таких меток включают флуорофоры, такие как флуоресцеина изотиоцианат; хромофоры, радиоизотопы или ферменты. Такие меченые антитела или связывающие фрагменты можно использовать, например, для гистологической локализации антигена, ELISA, сортировки клеток, а также других иммунологических методик для детекции и количественного измерения независимой от лиганда активированной формы cMet и клеток, несущих данный антиген.
Также предложены наборы, которые являются полезными в качестве позитивного контроля для анализов апоптоза, для очистки или иммунопреципитации из клеток независимой от лиганда активированной формы cMet. Для выделения и очистки независимой от лиганда активированной формы cMet набор может содержать описанные здесь антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, связанные с шариками (например, сефарозные шарики). Могут быть предложены наборы, которые содержат связывающий белок или антитела для детекции и количественного измерения независимой от лиганда активированной формы cMet in vitro, например, в ELISA или вестерн-блоттинге. Что касается готового изделия, набор содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковку на или в ассоциации с контейнером. В контейнере содержится композиция, содержащая по меньшей мере один связывающий белок или антитело, или его связывающий фрагмент по изобретению против независимой от лиганда активированной формы cMet. Могут быть включены дополнительные контейнеры, которые содержат, например, разбавители и буферы, контрольные антитела. На этикетке или листке-вкладыше в упаковку может быть приведено описание композиции, а также инструкции для намеченного применения in vitro или диагностического применения.
Более конкретно, изобретение касается набора для определения статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли любым способом, известным специалисту в данной области. В предпочтительном воплощении, как будет описано в примере, изобретение относится к набору для определения статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли способами IHC.
В конкретном воплощении изобретение заключается в наборе, содержащем по меньшей мере связывающий белок или антитело, или его функциональный фрагмент, или производное, как описано выше, причем указанный связывающий белок или антитело являются мечеными.
Следует понимать, что специалист в данной области может использовать любой способ мечения, такой как, например, применение вышеупомянутых меток.
В предпочтительном воплощении набор согласно изобретению, полезный для детектирования in vitro присутствия и/или локализации у субъекта опухоли, экспрессирующей независимую от лиганда активированную форму cMet, дополнительно содержит реактив, полезный для детектирования степени связывания между указанным меченым связывающим белком или антителом и независимой от лиганда активированной формой cMet.
В другом предпочтительном воплощении набор по изобретению, полезный для определения in vitro уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet в опухоли, экспрессирующей независимую от лиганда активированную форму cMet, дополнительно содержит реактив, полезный для количественного измерения уровня связывания между указанным меченым связывающим белком или антителом и независимой от лиганда активированной формой cMet.
В еще одном другом воплощении набор согласно изобретению, полезный для определения in vitro статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли, доплнительно содержит:
а) реактив, полезный для детектирования степени связывания между указанным меченым связывающим белком или антителом и независимой от лиганда активированной формой cMet; и
б) образцы позитивного и негативного контроля, полезные для бальной оценки уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet.
Указанный набор для определения in vitro статуса независимой от лиганда активированной формы cMet опухоли может дополнительно содержать:
i) второе меченое поликлональное антитело, специфичное к мышиным антителам;
ii) реактив, полезный для детектирования степени связывания между указанным вторым меченым антителом и мышиными антителами с независимой от лиганда активированной формой cMet; и
iii) образцы позитивного и негативного контроля, полезные для бальной оценки уровня экспрессии независимой от лиганда активированной формы cMet.
Изобретение также включает связывающий белок, или его функциональный фрагмент, или производное, включая антитело, который перекрестно конкурирует за связывание с независимой от лиганда активированной формой cMet со связывающим белком согласно изобретению.
Изобретение также включает связывающий белок, или его функциональный фрагмент, или производное, включая антитело, который перекрестно конкурирует за связывание с независимой от лиганда активированной формой cMet с антителом согласно изобретению.
В другом воплощении изобретение также касается применения связывающего белка или антитела согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного для идентификации связывающих белков, включая антитела, способных специфично связываться с независимой от лиганда активированной формой cMet.
Более конкретно, в предпочтительном воплощении описан способ идентификации партнера связывания с независимой от лиганда активированной формой cMet, который включает стадии:
а) приведения в контакт независимой от лиганда активированной формы cMet со связывающим белком или антителом согласно изобретению или его функциональным фрагментом, или производным;
б) приведения в контакт комплекса а) с библиотекой соединений;
в) идентификации соединения, которое разрушает комплекс а).
Изобретение также включает способ очистки независимой от лиганда активированной формы cMet, где указанный способ включает следующие стадии:
а) инкубирование связывающего белка или антитела согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного с образцом при условиях для обеспечения специфичного связывания указанного связывающего белка или антитела и независимой от лиганда активированной формы cMet; и
б) отделение связывающего белка или антитела от образца и получение очищенной независимой от лиганда активированной формы cMet.
В другом конкретном аспекте изобретение включает комплекс, образованный связыванием связывающего белка согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного и независимой от лиганда активированной формы cMet.
Аналогично, изобретение также включает комплекс, образованный связыванием антитела согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного и независимой от лиганда активированной формы cMet.
В другом воплощении изобретение касается применения связывающего белка или антитела согласно изобретению или его функционального фрагмента, или производного в качестве носителя, предназначенного для специфичного направления биологически-активного соединения в клетки, экспрессирующие независимую от лиганда активированную форму cMet. Более конкретно, указанное биологически-активное соединение выбрано из группы, состоящей из химиотерапевтических агентов, радиоизотопов или токсинов.
В еще одном другом воплощении изобретение заключается в способе генерации антитела или его функционального фрагмента, или производного, которое i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанный способ характеризуется тем, что он включает стадии:
а) иммунизации животного трансфицированными или опухолевыми линиями клеток, экспрессирующими белок cMet или его фрагмент;
б) удаления из животного клеток, продуцирующих антитела;
в) слияния указанных клеток, продуцирующих антитела, с миеломными клетками так, чтобы получить гибридомные клетки;
г) проведения скрининга так, чтобы отобрать гибридомные клетки, которые продуцируют антитело, которое i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet;
д) культивирования отобранной гибридомы в культуре клеток, которая продуцирует антитело; и
е) удаления антитела из культуры клеток.
В более предпочтительном воплощении скрининг с вышеописанной стадии г) заключается в скрининге посредством IHC.
В другом более предпочтительном воплощении указанный скрининг посредством IHC включает стадии:
а) отбора срезов ткани из опухолей, которые экспрессируют разные формы cMet,
б) проведения IHC окрашивания одновременно на срезах разных тканей со стадии а) с использованием гибридомных клеток со стадии в) способа получения антитела или его функционального фрагмента, или производного, которое i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, описанными выше,
в) отбора гибридомных клеток, имеющих специфичную реактивность на срезах ткани, которая экспрессирует независимую от лиганда активированную форму cMet, и не имеющих реакивность на других срезах ткани.
Другие характеристики и преимущества изобретения проявятся в продолжении описания с примерами и графическими материалами, легенды которых представлены ниже.
Фиг.1А-1Б: распознавание FACS cMet посредством Mab (монолональное антитело) m205A5 (А) или m227D3 (Б).
Фиг.2: кривые титрования Mab m205A5 и m227D3 на иммобилизованном димерном белке cMet.
Фиг.3А-3В: IHC картина распознавания m227D3 и m205A5 на опухолях, залитых в парафин (MCF7, U87MG и Hs746T).
Фиг.4А-4B: IHC панель распознавания m227D3 и имеющимся в продаже антителом против cMet 3D4 на опухолях, залитых в парафин (MCF7, U87MG, Hs746T, MKN45 и ЕВС-1).
Фиг.5: конкурентный анализ HGF с Mab m205A5 и m227D3 посредством ELISA.
Фиг.6: противоопухолевая активность m224G11 на модели ксенотрансплантатов Hs746T.
Фиг.7: анализ ex vivo экспрессии cMet на опухолях Hs746T контрольных мышей и мышей, обработанных m224G11, посредством анализа вестерн-блоттингом.
Фиг.8А-8Б: анализ ex vivo экспрессии cMet на опухолях Hs746T контрольных мышей и мышей, обработанных m224G11, посредством IHC с использованием m205A5.
Фиг.9: IHC окрашивание залитых в парафин срезов из тканей опухоли печени, экспрессирующих разные уровни cMet.
Пример 1: генерация антитела против независимой от лиганда активированной формы cMet, которое могло бы использоваться для диагностической цели
6
Для генерации антител против cMet 8-недельных мышей BALB/c иммунизировали либо 3-5 раз подкожно линией трансфицированных клеток СНО, которые экспрессируют cMet на их плазматической мембране (20×10 клеток/дозу/мышь), либо 2-3 раза слитым белком с внеклеточным доменом cMet (10-15 мкг/дозу/мышь) (R&D Systems, Кат. №358МТ), либо фрагментами данного рекомбинантного белка, смешанными с полным адъювантом Фрейнда для первой иммунизации и неполным адъювантом Фрейнда для следующей иммунизации. За трое суток до слияния клеток мышей подвергали бустерной иммунизации в.б. (внутрибрюшинно) или в.в. (внутривенно) рекомбинантным белком или фрагментами. Затем отбирали селезенки мышей, осуществляли слияние с миеломными клетками SP2/0-Ag14 (АТСС) (Американская коллекция типовых культур) и подвергали селекции HAT. В общем, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно сделать ссылку на методики, которые в частности описаны в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), или на методику получения гибридом, описанную Kohlerand Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).
5
3
3
Полученные гибридомы исходно подвергали скринингу ELISA на димерном рекомбинантном белке cMet-Fc. Вкратце, рекомбинантным человеческим белком cMet покрывали 96-луночные планшеты Immulon в течение ночи при 4°C и, после 1 ч стадии блокирования раствором 0,5% желатина, добавляли чистый супернатант гибридомы в течение еще 1 ч при 37°C. Затем планшеты промывали и добавляли IgG козы, специфичный к антителам мыши, конъюгированный с HRP (пероксидаза хрена) (Jackson), в течение 1 ч при 37°C. Проявление реакции осуществляли с использованием раствора субстрата ТМВ (тетраметилбензидин). Затем проводили второй скрининг посредством анализа FACS на линии клеток А459, которая экспрессирует cMet на уровне от умеренного до высокого, чтобы убедиться, что полученные антитела также смогут распознавать нативный рецептор на опухолевых клетках. С этой целью 2×10 клеток инкубировали с 10 мкг/мл каждого из m205A5, m227D3 или m10D9 (Mab - изотипический контроль lgG1) в течение 20 мин при 4°C. После 3 промывок в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), дополненном 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) и 0,01% NaN, клетки инкубировали со вторичным антителом козы против мышиного антитела, коньюгированным с Alexa 488 (разведение 1/500) в течение 20 минут при 4°C. После 3 дополнительных промывок в PBS, дополненном 1% BSA и 0,1% NaN, клетки анализировали FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Анализировали по меньшей мере 5000 клеток для расчета среднего значения интенсивности флуоресценции.
Таблица 5
Данные анализа проточной цитометрией (MFI) (средняя интенсивность флуоресценции), проведенной с Mab 205A5 и 227D3 на 5 линиях человеческих опухолевых клеток (АТСС)
А549
ВХРС-3
MCF7
U87MG
HepG2
Только клетки
13,98
11,87
9,87
9,10
10,52
Вторичное антитело
11,98
13,23
11,10
11,20
15,85
Изотипический контроль
11,83
14,77
12,06
11,56
18,12
205А5
189,94
217,87
22,78
48,71
151,89
227D3
144,28
158,04
15,89
35,35
110,83
Позитивные в данном анализе гибридомы амплифицировали, клонировали, изотипировали и размножали. Затем отбирали супернатанты новых гибридом, определяли содержание в них IgG. Проводили дополнительный цитометрический анализ в группе из 5 линий человеческих опухолевых клеток (А459, ВХРС3, MCF7, U87MG и HepG2). Все эти линии клеток были предоставлены АТСС. Полученные данные представлены на Фиг.1, и значения MFI представлены в Таблице 5.
Делали дополнительные эксперименты с очищенными антителами 205А5 или 227D3. Проводили титрование первым антителом на димерном белке cMet-Fc. Кривые титрования представлены на Фиг.2.
Антитела 205А5 и 227D3 удовлетворяли 2 описанным выше критериям: (i) распознавание cMet в анализе ELISA, (ii) связывание с нативным cMet, экспрессируемым на поверхности клеток человеческих опухолевых линий, и были отобраны для дальнейших анализов.
Отбирали Мао для конечного теста по распознаванию cMet на залитых в парафин срезах ксенотрансплантатов опухолей, экспрессирующих cMet. Для этой оценки срезы опухолей от ксенотрансплантатов MCF7, U87-MG и Hs746T (опухоли, для которых известно, что они экспрессируют варьирующие уровни cMet) депарафинизировали, регидратировали и помещали в буфер для демаскировки мишени 1Х (Dako S1699) в кипящей бане, предварительно нагретой при 98°C, для индуцированной нагреванием демаскировки эпитопа при 98°C в течение 30 минут и затем еще на 30 минут в буфер для демаскировки мишени. После 3 промывок в физиологическом растворе на основе Tris буфера - 0,05% Tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), эндогенную пероксидазную активность блокировали с использованием реактива, блокирующего пероксидазу (Dako К4007) в течение пяти минут. Срезы промывали TBS-T и инкубировали с блокирующим реактивом (UltraV block-TA-125UB- LabVision) в течение 5 минут перед добавлением мышиного моноклонального антитела против cMet, подлежащего тестированию (5 мкг/мл). В качестве негативного контроля использовали мышиный lgG1/каппа (5 мкг/мл, Х0931, Dako). Затем срезы инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре, промывали TBS-T и инкубировали с Envision Dual Link Peroxydase System (Dako K4061). Для проявления коричневого продукта реакции использовали пероксидазный субстрат диаминобензидин (DAB).
Результаты, показанные на Фиг.3, продемонстрировали, что, как и ожидалось, не наблюдалось окрашивания с изотипическим контролем lgG1 (Фиг.3, панель А), и что как 227D3 (Фиг.3, панель Б), так и 205А (Фиг.3, панель В) могли распознавать cMet только на ксенотрансплантатах опухолей Hs746T, тогда как все 3 опухоли экспрессировали разные уровни cMet. Эти первые результаты свидетельствуют о том, что и 205A5, и 227D3 антитела распознают конкретную форму cMet, которая экспрессируется только на амплифицированных опухолевых клетках.
Для подтверждения картины распознавания данных Mab тестировали группу опухолей от мышей, подвергнутых ксенотрансплантации, на экспрессию cMet с использованием каждого из 205A5, 227D3 или 3D4 - имеющегося в продаже антитела от Invitrogen, описанного в отношении распознавания им cMet на IHC. Как показано на Фиг.4, панель B, 3D4 распознавало cMet во всех опухолях. С использованием 227D3 (панель А) или 205А5 (данные не показаны) сильное мембранное окрашивание наблюдали только на 3 типах опухолей, несущих конститутивно активированную форму cMet (из-за амплификации cMet, приводящей к сверхэкспрессии cMet): Hs746T, MKN45 и ЕВС-1. Как и ожидалось, не наблюдалось окрашивания с изотипическим контролем mlgG1 (Фиг.4, панель Б).
Пример 2: эксперименты по конкуренции с HGF, проведенные в присутствии антител 205A5 или 227D3
2
4
Для дальнейшей характеризации диагностических Mab проводили конкурентные анализы с HGF. Первую реакционную смесь, содержащую белок cMet в присутствии или в отсутствие Mab, подлежащих тестированию, получали на отдельном насыщенном (0,5%-ный желатин в PBS 1Х) планшете. Осуществляли последовательные разведения 1:2 (начиная с 40 мкг/мл в 12 вертикальных рядах) мышиных антител (контроли и Mab, подлежащие исследованию). Затем добавляли 0,8 мкг/мл белка rh cMet-Fc (RDSystems, ref. 358-MT/CF), за исключением полосы с негативным контролем, которая содержала только разбавитель ELISA (0,1% желатин, 0,05% Tween 20 в PBS 1Х). После гомогенизации на планшеты, покрытые HGF, загружали образцы для конкурентного анализа с 0,3 мкг/мл раствора rhHGF в PBS (RDSystems, ref. 294-HGN/CF). После инкубации и нескольких промывок связавшиеся белки cMet детектируются с использованием антитела козы против человеческого IgG, конъюгированного с HRP (Jackson, ref. 109-035-098). Сразу после связывания на планшеты добавляли субстрат ТМВ. Реакцию останавливали добавлением раствора кислоты HSO, и полученные оптические плотности считывали при 450 нм с использованием планшет-ридера.
Эксперимент проводили с 205А5 и 227D3 в присутствии или в отсутствие рекомбинантного белка cMet-Fc (смотрите Фиг.5). Данный эксперимент показал, что Mab 205A5 и 227D3 не конкурировали за связывание cMet на его иммобилизованном лиганде рецептора.
Пример 3: специфичность антител
Обработка m224G11 мышей, несущих опухоль Hs746T, индуцировала значительное снижение роста опухоли (Фиг.6). При анализе опухоли из данного эксперимента, противоопухолевая активность приводила к снижению экспрессии Ki67 у мышей, обработанных m224G11, по сравнению с контрольными мышами (данные не показаны) и к сильной понижающей регуляции экспрессии cMet, продемонстрированной анализом посредством вестерн-блоттинга (Фиг.7). Для проведения анализа WB (вестерн-блоттинг), опухоли удаляли и быстро замораживали в азоте. Затем их лизировали, и анализирвали иммуноблоттингом одинаковые количества белка. Наконец, выявляли cMet, используя имеющееся в продаже Mab 25Н2 против бета субъединицы Met от Cell Signalling.
При анализе посредством IHC опухолей из того же самого эксперимента с использованием 205A5, у обработанных мышей наблюдали ожидаемую понижающую регуляцию экспрессии cMet, тогда как все опухолевые клетки контрольной группы были Met позитивными (Фиг.8).
В самом деле, как показано на Фиг.8А, при окрашивании опухолей от контрольных мышей с использованием Mab 205A5 в опухолевых клетках всех 3 мышей наблюдали сильное мембранное и гомогенное окрашивание. При окрашивании 205А5 опухолей от мышей, обработанных m224G11, наблюдали сильное уменьшение мембранного окрашивания (Фиг.8Б). Эти данные согласуются с данными, наблюдаемыми ранее посредством анализа вестерн-блоттингом (Фиг.7), демонстрируя, что 205A5 специфично распознает cMet.
Пример 4: бальная оценка тканей в отношении экспрессии независимой от лиганда активированной формы с Met с Mab m224G11
С использованием протокола, описанного выше и обобщенного на Фиг.9, окрашивали набор залитых в парафин тканей человеческих опухолей, экспрессирующих варьирующие уровни независимой от лиганда активированной формы cMet, посредством Mab m205A5.
Результаты, показанные на Фиг.9, продемонстрировали, что при печеночно-клеточной карциноме m205A5 могло различать человеческие опухоли с варьирующими уровнями независимой от лиганда активированной формы cMet. С использованием данного антитела опухоли могли быть подвергнуты бальной оценке как:
- 0: негативные опухоли, в которых окрашивание мембраны не наблюдалось или наблюдалось менее чем 10% мембранопозитивных клеток,
+
- 1: едва ощутимое окрашивание у более чем 10% опухолевых клеток,
+
- 2: умеренное окрашивание всей мембраны, наблюдаемое у более чем 10% опухолевых клеток,
+
- 3: сильное полное окрашивание более чем 10% опухолевых клеток.