Способ определения степени окраски эндотелиальных клеток
METHOD FOR DETERMINING THE DEGREE OF STAINING OF ENDOTHELIAL CELLS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностических целей в гематологии, онкологии, гинекологии, гастроэнтерологии, проктологии, отоларингологии и других отраслях медицины, а также в ветеринарии, биологии.
Степень окраски клеток организма человека позволяет судить об их морфофункциональном состоянии, отражающем эндотелиальную дисфункцию, которая развивается при многих патологических процессах.
Степень окраски клеток фигурирует в ряде исследований, в частности оценка степени экспрессии антител при изучении процессов атеросклероза проводится полуколичественным методом анализа окраски клеток (липофагов) по шкале от 0 до 3.(Евдокименко А.Н., Гулевская Т.С., Танашян М.М, Иммуногистохимические и ультраструктурные признаки нарушения атромбогенных свойств эндотелия при атеросклерозе каротидного синуса. Анналы неврологии, Т. 10, №4. 2016. С. 32-38).
Известен способ изучения матриксной металлопротеиназы - 9 (ММР-9) у пациентов с внутривенной опухолевой инвазией, позволяющий судить о распространении почечно-клеточного рака (Щукин Д.В., Лесовой В.Н., Яковцова И.И. и др. Активность матриксной металлопротеиназы - 9 (ММР-9) при внутривенозном распространении почечно - клеточного рака. Вiсник проблем бiологii i медицини - 2015 - Вип. 2, том 1 (118) с. 283-289). Исследованию подлежали опухолевые клетки, эндотелиоциты опухолевого тромба, эндотелий вен почек. Одним из факторов анализа экспрессии ММР-9, являлась оценка степени выраженности (интенсивности) окраски цитоплазмы клеток.
Однако данный способ не обладает высокой точностью, так как при анализе окраски используется полуколичественная шкала, по которой оценка идет в параметрах: слабая, умеренная, выраженная цитоплазматическая реакция.
Известен «Способ определения степени тяжести острого панкреатита» (патент РФ № 2712917, МПК), взятый в качестве прототипа. Согласно известному способу, в первые 1-2 дня от начала лечения и во второй раз на 7-9 день от начала лечения, определяют количество десквамированных эндотелиальных клеток, а также количество нормохромно окрашенных и гиперхромно окрашенных десквамированных эндотелиальных клеток и вычисляют коэффициент степени окраски десквамированных эндотелиальных клеток (Ko) по отношению количества нормохромно окрашенных (N) к количеству гиперхромно окрашенных десквамированных эндотелиальных клеток (G). При снижении Ko при втором измерении по сравнению с первым на 1,3 и более, судят о благоприятном прогнозе, а при повышении Ko на 0,4 и более, судят о развитии осложнений острого панкреатита.
Однако известный способ не обладает высокой точностью определения степени окраски оцениваемых эндотелиоцитов, допускает определенную вариабельность полученных результатов.
Задачей заявленного изобретения является повышение точности определения степени окраски эндотелиальных клеток.
Поставленная задача осуществляется тем, что согласно способу определения степени окраски эндотелиальных клеток, включающему определение физических показателей, в качестве физических показателей определяют напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране вне клеточного поля и напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране в границах цитоплазмы клетки, а коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток рассчитывают по формуле:
Ко=(1-С/О)×100%, где
Ko - коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток, %;
С - напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране в границах цитоплазмы клетки, вольт;
О - напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране вне клеточного поля, вольт;
при значении 0≤Ko<20,86% судят о гипохромной окраске эндотелиоцита, при значениях 20,86%≤Ko≤38,8% судят о нормохромности окраски, а при 38,8%<Ko≤100% судят о гиперхромном окрашивании.
Заявленный способ обладает высокой точностью, позволяет исследовать помимо эндотелиоцитов и другие клетки, макрофаги, лейкоциты, позволяет создать аналитические шкалы и для других типов клеток, расширяет возможности при использовании методик для диагностики заболеваний, определении эффективности лечения. Позволяет быстро и в более полном объеме получить необходимую информацию о степени эндотелиальной дисфункции, выраженности патологического процесса, осуществлять динамическое изучение эффективности проводимого лечения.
Способ определения степени окраски эндотелиальных клеток осуществляется следующим образом.
Изображения эндотелиоцитов при помощи прибора (например, при помощи прибора «Цито-эксперт», патент РФ № 2168176.
(Оптимизирующее устройство для микроскопа) выводят на экран. Изображение увеличивают до размера, необходимого для оценки хромности клетки. Далее при помощи солнечной батареи, например, TRONY sc 1025i (прибора преобразующего солнечную энергию в постоянный электрический ток) и мультиметра S - Line DT-7000 D, определяют напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране вне клеточного поля и напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране в границах цитоплазмы клетки. Замеры производят путем непосредственного приложения фотодиода солнечной батареи к изображению десквамированного эндотелиоцита на экране и к изображению пустого поля около эндотелиоцита.
При этом необходимо соблюдать ряд правил:
1. Изображение должно быть четким, без искажений.
2. Для измерения уровня освещенности, как в клетке, так и вне ее выбираются максимально однородные зоны без резко выделяющихся включений.
3. При измерении уровня освещенности «пустого поля» вне клетки, зона обследования должна быть выбрана максимально близко к цитоплазматической мембране (ЦПМ) клетки, но не заходить на нее.
4. При измерении уровня освещенности над клеткой следует избегать попадания ядра клетки в зону исследования и наложения зоны на ЦПМ.
5. Так как по всему периметру ЦПМ освещенность разная, то для объективизации результатов необходимо сделать несколько (5-6) замеров, как вне клетки, так и внутри, с последующим расчетом средней арифметической величины.
При отсутствии возможности проведения нескольких замеров необходимо выбрать две максимально близкие точки, одну внутри клетки, другую снаружи, удовлетворяющие первым 4-м пунктам.
Коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток рассчитывают по формуле: Ко=(1-С/О)×100%, где
Ko - коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток, %;
С - напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране в границах цитоплазмы клетки, вольт;
О - напряжение, выходящее с солнечной батареи при нахождении ее над областью изображения на экране вне клеточного поля, вольт.
При выполнении нескольких замеров уровня освещенности вне клеточного поля и в границах цитоплазмы клетки необходимо сначала рассчитать их среднюю арифметическую величину и только после этого вставить в формулу.
При значении 0≤Ko<20,86% судят о гипохромной окраске эндотелиоцита, при значениях 20,86%≤Ko≤38,8% судят о нормохромности окраски, а при 38,8%<Ko≤100% судят о гиперхромном окрашивании.
Пример 1. Больной 32 лет поступил в хирургическое отделение ГКБ №6 Ижевска в состоянии средней тяжести с диагнозом: острый панкреатит. При использовании знакопеременного микроэлектрофореза и солнечной батареи TRONY sc1025i с мультиметром S-Line DT-700D при определении степени окраски эндотелиоцитов выяснилось, что коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток равен 18,2, что позволяет сделать вывод о гипохромной окраске эндотелиальных клеток. На основании проведенного исследования крови диагноз острый панкреатит легкой степени тяжести подтвержден. Проведено консервативное лечение, выписан с улучшением.
Пример 2. Больной 53 лет поступил в хирургическое отделение ГКБ №6, г. Ижевска, в состоянии средней тяжести с признаками острого панкреатита. При использовании знакопеременного микроэлектрофореза и солнечной батареи TRONY sc1025i с мультиметром S-Line DT-700D при определении степени окраски эндотелиоцитов выяснилось, что коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток равен 24,6, что позволяет сделать вывод о нормохромной окраске эндотелиальных клеток. На основании проведенного комплексного исследования и исследования эндотелиоцитов крови, установлен диагноз - хронический панкреатит. Назначено консервативное лечение. Переведен в терапевтическое отделение для продолжения комплексного терапевтического лечения.
Пример 3. Больной 64 лет поступил в хирургическое отделение больницы в состоянии средней тяжести с признаками острого деструктивного панкреатита. При использовании знакопеременного микроэлектрофореза и солнечной батареи TRONY sc1025i с мультиметром S-Line DT-700D при определении степени окраски эндотелиоцитов выяснилось, что коэффициент степени окраски эндотелиальных клеток равен 43,8, что позволяет сделать вывод о гиперхромной окраске эндотелиальных клеток. На основании проведенного исследования крови диагноз деструктивный панкреатит (крупноочаговый инфицированный панкреонекроз) подтвержден. Проведено хирургическое вмешательство. Зафиксирован летальный исход на 19 сутки госпитализации.