СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТЕОРЕЗОРБЦИИ В УСЛОВИЯХ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА
METHOD FOR SIMULATING OSTEORESORPTION UNDER OSTEOGENESIS CONDITIONS

Предлагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины и патофизиологии, а именно к моделированию резорбции костной ткани у экспериментальных животных (крыс) и может быть использовано для экспериментальной разработки новых методов лечения и профилактики нарушений метаболизма костной ткани в процессе репаративной регенерации.
Известно, что резорбция костной ткани - это процесс ее разрушения, который существенно ускоряется при некоторых заболеваниях опорно-двигательного аппарата, эндокринной системы и других патологических состояниях. Следствием ускоренного разрушения кости является остеопороз.
Известен способ стимуляции костной резорбции у лабораторных животных, включающий увеличение уровня эндогенных глюкокортикоидов в организме путем активации коры надпочечников в результате создания ситуации, приводящей к эмоциональному напряжению. Для этого животных ежедневно в течение 7 суток помещают в прозрачную цилиндрическую пластиковую камеру с отверстиями для доступа воздуха, размер которой как в длину, так и в диаметре превышает размеры животного на 1-2 см. Продолжительность пребывания в камере составляет 6 часов в день. Животных выводят из эксперимента на 8 сутки. При морфологическом исследовании у животных, характеризовавшихся высокой эмоциональной реактивностью, наблюдают повышение активности остеокластов (Пат. 2384891 РФ, МПК G09D 23/28, Способ стимуляции костной резорбции у лабораторных животных. / Подковкин В.Г., Иванов Д.Г. , №2008118969/14; заявл. 13.05.2008; опубл. 20.03.2010).
К недостаткам известного способа следует отнести то, что резорбция костной ткани выражена у особей с высокой эмоциональной реактивностью, следовательно, для стандартизации получаемых результатов необходим предварительный отбор животных. Кроме этого, длительное поддержание высокого уровня глюкокортикоидов может индуцировать остеонекроз вместо увеличения резорбции.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ моделирования остеопороза у самок крыс, заключающийся в проведении двусторонней овариэктомии с последующим введением омепразола в дозе 0,3-0,4 мг/кг перорально в течение 6 месяцев. Для осуществления известного способа в условиях хирургической стадии нембуталового наркоза (40 мг/кг массы тела) лабораторному животному проводят срединную лапаротомию, выделяют трубы матки, взяв их на лигатуру, осуществляют перевязку яичниковых артерий. Затем выделяют яичники и пересекают проксимальный конец труб матки за лигатурой; а резецированный конец труб с лигатурой погружают в полость живота и осуществляют тщательный гемостаз, ушивая двойным швом апоневроз и кожу. В течение 6 месяцев перорально вводят омепразол в дозе 0,3-0,4 мг/кг. Спустя полгода в хирургической стадии нембуталового наркоза осуществляют забор костной ткани из области диафиза бедренной кости и грудины. В образцах костной ткани обнаруживают истончение костных балок и дистрофию остеобластов (Пат. 2384894 Российская Федерация МПК G09D 23/28, Способ моделирования остеопороза у самок крыс. / Лазебник Л.Б., Лычкова А.Э., Петраков А.В., №2008142636/14; заявл. 27.10.2008; опубл. 20.03.2010).
К недостаткам известного способа следует отнести:
- использование только самок лабораторных животных;
- необходимость проведения полостной операции;
- длительное время, необходимое для получения остеопороза (6 месяцев), необходимость длительного содержания лабораторных животных в условиях вивария;
- большая трудоемкость.
Следовательно, известный способ не позволяет быстро и экономично получить модель резорбции костной ткани.
Задачей заявляемого технического решения является разработка способа моделирования остеорезорбции при репаративном остеогенезе, позволяющего в более быстрые сроки и более экономично получить локальную резорбцию костной ткани.
Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности получения локальной резорбции костной ткани в условиях репаративного остеогенеза, а также сокращение времени и трудозатрат, необходимых для получения модели локальной резорбции костной ткани.
Технический результат достигается тем, что способ моделирования остеорезорбции в условиях репаративного остеогенеза включает введение препарата экспериментальному животному.
Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что в качестве препарата используют раствор селенометионина в концентрации 2 мкг/мл, который вводят внутрибрюшинно, однократно в дозе 10 мкг/кг веса животного, а через сутки, на хирургической стадии наркоза, выполняют стандартный перелом верхней трети диафиза бедренной кости с интрамедуллярным остеосинтезом стальным штифтом, после чего животное содержат в условиях вивария на стандартном рационе в течение 9-35 суток.
Проведенный сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна», поскольку проведенные патентные исследования по подклассам G01N 33/48, 33/53, 33/68, 33/74, G09B 23/28, A61B 6/00, A61B 10/00, A61B 17/56, A61K 31/5513, A61P 19/10 и анализ научно-медицинской информации, отражающий существующий уровень моделирования процессов резорбции костной ткани, не выявили способов, идентичных предлагаемому. Следовательно, заявляемый способ моделирования остеорезорбции, основанный на введении препарата селена в процессе сращения стандартного перелома бедренной кости у крыс, является новым.
Взаимосвязь и взаимодействие существенных признаков предлагаемого способа, а именно:
- в качестве препарата используют раствор селенометионина (Sigma, кат. S3132) в концентрации 2 мкг/мл;
- раствора селенометионина вводят внутрибрюшинно в количестве 1 мл, что составляет 10 мкг/кг веса тела экспериментального животного;
- последующее выполнение стандартного перелома верхней трети диафиза бедренной кости с интрамедуллярным остеосинтезом стальным штифтом
обеспечили возможность достижения технического результата, именно: получить в более короткие сроки и с меньшими экономическими затратами модель локальной резорбции костной ткани в процессе заживления стандартного перелома бедренной кости у крыс.
Изложенное позволяет сделать вывод о том, что предложенное техническое решение имеет «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ моделирования остеорезорбции в условиях репаративного остеогенеза является промышленно применимым в области экспериментальной медицины, так как может быть воспроизведен неоднократно. Для его использования необходимы общедоступные условия, инструменты и вещества. Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Заявляемый способ осуществляют следующим образом:
Лабораторные животные: крысы-самцы породы Вистар. За 1 сутки до оперативного вмешательства, в условиях операционной, проводят внутрибрюшинную инъекцию 1 мл раствора селенометионина (Sigma, кат. S3132) концентрацией 2 мкг/мл, что составляет 10 мкг/кг веса тела. На следующий день в асептических условиях, на хирургической стадии кетаминового наркоза (50 мг/кг массы тела), выполняют стандартный перелом верхней трети диафиза бедренной кости с интрамедуллярным остеосинтезом стальным штифтом. Осуществляют тщательный гемостаз. Через 9, 14, 21, 28 и 35 суток животных выводят из эксперимента. Для гистоморфологического исследования забирают фрагменты оперированной конечности, оценивают выраженность локальной остеорезорбции места перелома.
Сущность предложенного способа моделирования остеорезорбции поясняется фигурами 1-6.
Так, на фигуре 1 приведена морфологическая фотография зоны перелома у животного контрольной группы на 35 сутки, окраска гематоксилинэозином, увеличение 40. Видны сформированные костные балки 1.
На фигуре 2 приведена морфологическая фотография зоны перелома у животного опытной группы на 35 сутки, видны истонченные костные балки 2 в зоне репарации; окраска гематоксилин-эозином, увеличение 40.
На фигуре 3 показана морфологическая фотография зоны перелома у животного контрольной группы на 14 сутки, где выявлены единичные остеокласты 3 в зоне перелома; иммуногистохимическая окраска на специфический маркер остеокластов - карбоангидразу II типа, увеличение 400.
На фигуре 4 показана морфологическая фотография зоны перелома у животного опытной группы на 14 сутки, где выявлено большое количество остеокластов 3 в зоне перелома; иммуногистохимическая окраска на карбоангидразу II типа, увеличение 400.
На фигуре 5 показана морфологическая фотография зоны перелома у животного контрольной группы на 35 сутки, где показано отсутсвие остеокластов в зоне перелома, сформированные костные балки 1; иммуногистохимическая окраска на карбоангидразу II типа, увеличение 400.
На фигуре 6 показана морфологическая фотография зоны перелома у животного опытной группы на 35 сутки, где показано большое количество остеокластов 3 в зоне перелома, истончение костных балок 2; иммуногистохимическая окраска на карбоангидразу II типа, увеличение 400.
Предлагаемый способ моделирования остеорезорбции в условиях репаративного остеогенеза путем введения препарата селена в процессе сращения стандартного перелома бедренной кости у крыс поясняется примером конкретного выполнения.
Исследование проведено на 60 белых крысах-самцах линии «Вистар» 6-месячного возраста с массой тела 220-250 г. Экспериментальную группу составили 30 крыс, которым была выполнена модель остеорезорбции, и 30 крыс составили контрольную группу.
Всех животных содержали в условиях вивария, при естественном освещении, на стандартном рационе питания и свободном доступе к воде и пище, что соответствует нормативам ГОСТа «Содержание экспериментальных животных в питомниках НИИ» (виварий I категории, ветеринарное удостоверение 238 №0015220 от 25 марта 2009 г., служба ветеринарии Иркутской области). Опыты на животных выполняли в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, регламентированными «Правилами выполнения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.1985 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных». Все оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях под общим обезболиванием. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦРВХ» СО РАМН.
За 1 сутки до оперативного вмешательства, в условиях операционной, крысам опытной группы однократно, внутрибрюшинно проводили инъекцию 1 мл раствора селенометионина (Sigma, кат. S3132) концентрацией 2 мкг/мл, что составило 10 мкг/кг веса тела. Контрольной группе животных аналогичным образом вводили 1 мл 0,85% раствора NaCl. На следующий день в асептических условиях, на хирургической стадии кетаминового наркоза (50 мг/кг массы тела), всем животным выполняли стандартный перелом верхней трети диафиза бедренной кости с интрамедуллярным остеосинтезом стальным штифтом. Осуществляли тщательный гемостаз.
Животных выводили из эксперимента на 9, 14, 21, 28 и 35 сутки после операции. Для этого в асептических условиях после внутрибрюшинного введения кетамина (50 мг/кг веса тела) проводили декапитацию животных. Для гистологического исследования забирали фрагменты конечности. Окраску препаратов проводили гематоксилин-эозином. У всех животных опытной группы получена резорбция в области срастающегося перелома, стимуляция остеокластической активности. Различия между опытной и контрольной группами наблюдались с 9 по 35 сутки с максимумом выраженности на 35 сутки (фиг.1 и фиг.2).
Для изучения остеокластической активности в ходе репаративного процесса применяли окраску на специфический маркер остеокластов - карбоангидразу II типа.
При исследовании препаратов контрольной группы установлено, что остеокластическая активность отмечается в зоне перелома с 9 суток - фиксируются единичные восьмиядерные клетки в зоне перелома и перестройки кости. На 14 сутки остеокластическая активность нарастает, достигая максимума - остеокласты располагаются в основном в зоне резорбции костных отломков (фиг.3, позиция 3). К 21 суткам остеокластическая активность в зоне отломков снижается - наблюдаются ярко окрашенные одно-четырехядерные клетки в зоне формирования молодой кости, а к 35 суткам в зоне перелома остеокласты не регистрировались (фиг.5).
В сроки 9-35 суток у всех животных опытной группы, т.е. с введением препарата селена, отмечена высокая остеокластическая активность как в зоне резорбции костных отломков, так и в зоне роста молодой кости. На 9-е сутки у животных опытной группы отмечено большое количество остеокластов в зоне резорбции кости в области перелома. К 14 суткам наряду с большим количеством остеокластов в области отломков обнаруживается большое количество остеокластов в зоне формирования молодой костной ткани (фиг.4, позиция 3). Высокая остеокластическая активность сохраняется на 21 и 35 дни наблюдения (фиг.6, позиция 3).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить модель остеорезорбции в условиях репаративного остеогенеза в процессе сращения стандартного перелома бедренной кости у крыс. Воспроизводимость модели составляет 100%.
Заявляемый способ моделирования остеорезорбции в условиях репаративного остеогенеза может быть использован при экспериментальной разработке новых методов лечения и профилактики нарушений метаболизма костной ткани в процессе регенерации.