ИССЛЕДОВАНИЯ N-ГЛИКАНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКЗОГЛИКОЗИДАЗ

1. Способ, включающий стадии: получения препарата гликана; обработки первого образца препарата гликана согласно первой процедуре обработки экзогликозидазой; обработки второго образца препарата гликана согласно второй процедуре обработки экзогликозидазой, при этом вторая процедура обработки экзогликозидазой отличается от первой процедуры обработки экзогликозидазой, и дополнительно первая и вторая процедура обработки экзогликозидазой выбрана из группы, состоящей из:
последовательной обработки и
одновременной обработки;
характеристики продуктов расщепления после проведения первой и второй процедуры обработки экзогликозидазой; и
сравнения результатов характеристики продуктов расщепления после первой процедуры обработки экзогликозидазой с результатами характеристики продуктов расщепления после второй процедуры обработки экзогликозидазой для возможности определения по меньшей мере одной характеристики гликозилирования препарата гликана.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия сравнения включает сравнение результатов характеристики продуктов расщепления после проведения процедуры обработки первой или второй экзогликозидазой с продуктами расщепления эталонного образца.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что первая или вторая процедура обработки экзогликозидазой включает по меньшей мере одну:
а) обработку образца препарата гликана одной экзогликозидазой, выбранной из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы, маннозидазы и их комбинаций;
б) обработку образца препарата гликана по меньшей мере двумя экзогликозидазами, выбранными из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы, маннозидазы и их комбинаций.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что одна из процедура обработки первой или второй экзогликозидазой включает последовательную обработку образца препарата гликана по меньшей мере одной экзогликозидазой; а другая из первой или второй процедур обработки экзогликозидазой включает одновременную обработку образца препарата гликана по меньшей мере двумя экзогликозидазами.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере один продукт расщепления содержит сульфатированный гликан, фосфорилированный гликан, сиаловую кислоту, связанную с N-ацетилглюкозамином, ацетилированный гликан, продукт антеннального фуколизирования, одноцепочечный участок лактозамина или ядро пентасахарида, состоящее из трех остатков маннозы и 2 остатков N-ацетилглюкозамина.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия получения препарата гликана включает:
a) наличие множества гликопротеинов, причем каждый гликопротеин состоит по меньшей мере из одного N-гликана, связанного с гликопротеином из этого множества,
б) удаление по меньшей мере одного N-гликана из по меньшей мере одного гликопротеина,
в) необязательно, выделение удаленных N-гликанов.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия анализа включает применение к продуктам расщепления процедуры, выбранной из группы, состоящей из хроматографических методов, жидкостной хроматографии (LC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC), тонкослойной хроматографии (ТСХ), хроматографии с применением колонки с амидной фазой, масс-спектрометрии (MS), тандемной масс-спектрометрии, сочетания жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS), сочетания жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS), масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрии с преобразованием Фурье (FTMS), спектрометрии ионной подвижности и масс-спектрометрии (IMS-MS), диссоциации при переносе электронов и масс-спектрометрии (ETD-MS), электрофоретических способов, капиллярного электрофореза (CE), капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии (CE-MS), гель-электрофореза, электрофореза в агарозном геле, электрофореза в акриламидном геле, электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом на основе антител, которые распознают конкретные структуры гликана, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), одномерной спектроскопии ЯМР (1D-ЯМР), двумерной спектроскопии ЯМР (2D-ЯМР), корреляционной спектроскопии ЯМР (COSY-ЯМР), полной корреляционной спектроскопии ЯМР (TOCSY-ЯМР), двумерной гетероядерной одноквантовой спектроскопии ЯМР (HSQC-ЯМР), двумерной гетероядерной многоквантовой спектроскопии ЯМР (HMQC-ЯМР), спектроскопии ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат (ROESY-ЯМР) и спектроскопии ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY-ЯМР) и комбинаций вышеуказанных способов.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает оценку наличия модификаций в препарате N-гликана, выбранных из группы, состоящей из фосфорилирования, сульфатирования, удлинения фрагментом лактозамина и антеннального фукозилирования.
9. Способ анализа множества N-гликанов, связанных с белком, состоящий из стадий: a) получения множества гликопротеинов, причем каждый гликопротеин состоит по меньшей мере из одного N-гликана, который связан с гликопротеином из этого множества, где характер гликозилирования по меньшей мере одного элемента множества отличается от характера гликозилирования по меньшей мере другого элемента множества, б) удаления по меньшей мере одного N-гликана по меньшей мере из одного гликопротеина, в) необязательно, выделения удаленных N-гликанов, г) расщепления по меньшей мере одной конечной гликозидной связи у нередуцирующего конца по меньшей мере одного удаленного N-гликана путем обработки по меньшей мере одного отделенного N-гликана по меньшей мере одним ферментом экзогликозидазы с получением множества продуктов расщепления, д) анализа продуктов расщепления и е) по выбору сравнения результатов анализа продуктов расщепления с эталонным образцом.
10. Способ, включающий стадии: обработки препарата гликана с помощью процедуры обработки экзогликозидазой, при этом процедура обработки экзогликозидазой включает последовательное введение множества экзогликозидаз и приводит к расщеплению гликанов в препарате гликанов, получения по меньшей мере первого образца из препарата гликанов при процедуре обработки экзогликозидазой, и анализа расщепленных гликанов по меньшей мере в одном полученном образце.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что: стадия получения включает отбор множества образцов, полученных с разделением по времени, из препарата гликана, а стадия анализа включает анализ расщепленных гликанов в одном или нескольких отобранных образцах.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что обработка экзогликозидазой включает последовательную обработку по меньшей мере первой и второй экзогликозидазой, а стадия получения включает: отбор по меньшей мере первого образца после обработки первой экзогликозидазой, но перед обработкой второй экзогликозидазой; и отделение по меньшей мере второго образца после обработки второй экзогликозидазой.
13. Способ сравнения партий гликопротеина, включающий стадии: получения первого препарата гликана из первой партии гликопротеина, получения второго препарата гликана из второй партии гликопротеина, обработки первого и второго препаратов гликана процедурой обработки экзогликозидазой для специфического отщепления моносахаридов от нередуцирующих концов N-связанных гликанов в препаратах гликанов, и сравнения продуктов расщепления, полученных из первого препарата гликана с продуктами расщепления, полученными из второго препарата, таким образом, чтобы оценить совместимость этих двух партий.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что процедура обработки экзогликозидазой включает обработку первого и второго препаратов гликана одной экзогликозидазой, выбранной из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы, маннозидазы и их комбинаций.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что по меньшей мере один продукт расщепления включает гликоформу, выбранную из группы, состоящей из ядра пентасахарида, включающего три остатка маннозы и 2 остатка N-ацетилглюкозамина, продукта антеннального фукозилирования, продукта удлинения фрагментом лактозамина, сульфатированного гликана, фосфорилированного гликана, сиаловой кислоты, связанной с N-ацетилглюкозамином, и ацетилированного гликана.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что стадия получения препарата гликана включает: а) удаление по меньшей мере одного N-гликана по меньшей мере из одного гликопротеина первой или второй партии, б) необязательно, выделение удаленных N-гликанов.
17. Способ контроля получения гликопротеина, включающий стадии: отделения в процессе получения гликопротеина по меньшей мере первого и второго гликансодержащих образцов из производственной системы, обработки первого и второго гликансодержащих образцов процедурой обработки экзогликозидазой для специфического отщепления моносахаридов из невосстанавливающихся концов N-связанных гликанов в гликансодержащих образцах и сравнения продуктов расщепления, полученных из первого гликансодержащего образца, с продуктами расщепления, полученными из второго гликансодержащего образца, для определения различия и, следовательно, контроля за процессом получения гликопротеина.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют при завершении процедуры обработки экзогликозидазой примерно на 10%.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют до завершения процедуры обработки экзогликозидазой на 100%.
20. Способ по п.17, отличающийся тем, что по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют до расщепления гликанов на 100%.