СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ВОДОРОСЛИ РОДА CHLORELLA
METHOD OF EXTRACTING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM BIOMASS OF UNICELLULAR ALGAE OF CHLORELLA SPECIES

Изобретение относится к микробиологической промышленности и позволяет извлекать биологически активные вещества из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella. Извлекаемые биологически активные вещества могут применяться в качестве кормовых добавок в сельском хозяйстве, а также в изготовлении косметических средств.
Клеточная стенка водоросли рода Chlorella состоит из целлюлозоподобных углеводов, белков и незначительного количества пигментов-каротиноидов. Устойчивая к химическим воздействиям клеточная стенка является основным препятствием для извлечения из клетки биологически активных веществ.
Обычно для переработки водоросли рода Chlorella используют комплексные методы, включающие кипячение или замораживание биомассы с целью разрушения клеток и ферментативный гидролиз компонентов биомассы, позволяющий перевести биологически активные вещества в водорастворимое состояние.
Известен способ получения комплекса биологически активных веществ из биомассы Chlorella vulgaris (Патент РФ №2256700 С1, опубл. 20.07.2006) [1]. Способ предусматривает культивирование биомассы водоросли, разрушение клеток биомассы и экстракцию биологически активных веществ. Для разрушения клеточных стенок авторы используют двукратное замораживание биомассы при температуре от -4°С до -15°С в течение 6 часов. В качестве экстрагента используют католит, полученный в диафрагменном электролизере. Данное техническое решение имеет ряд недостатков, главный из которых - неэффективность разрушения клеток биомассы методом замораживания. Кроме этого использование дорогого в получении католита отрицательно сказывается на суммарной экономической эффективности процесса получения биологически активных веществ.
Известен также способ извлечения липидов из биомассы (РФ №2388812 С1, опубл. 10.05.2010) [2] для получения альтернативного биодизельного топлива на основе липидов, экстрагированных из биомассы микроводоросли Chlorella. На первой стадии суспензия биомассы Chlorella подвергается обработке в аппарате, создающем вихревое электромагнитное поле с хаотически движущимися ферромагнитными частицами. В результате данной обработки клетки биомассы разрушаются, что облегчает последующую экстракцию липидов при помощи органических растворителей и обработки в импульсно-кавитационном аппарате. В описанном техническом решении можно отметить следующие недостатки. Разрушение клеток путем взаимодействия с хаотически движущимися ферромагнитными частицами неэффективно благодаря большим затратам электроэнергии на создание вихревого электромагнитного поля. Кроме того, клеточные стенки разрушенных клеток сохраняют свою исходную морфологию, что недостаточно способствует последующему процессу экстракции. Также подобные клеточные стенки малоактивны при химическом взаимодействии с ферментами или другими гидролизующими реагентами. Использование таких дорогих, токсичных и горючих органических растворителей, как хлороформ и четыреххлористый углерод, делает предложенный авторами способ неэкологичным и чрезвычайно опасным для здоровья обслуживающего персонала.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ извлечения биологически активных веществ из биомассы микроводоросли рода Chlorella (Патент РФ №2044770 С1, опубл. 27.09.1995) [3]. Способ заключается в многостадийной обработке биомассы Chlorella органическими растворителями и ферментами, проявляющими целлюлазную и протеазную активность.
На первой стадии для экстракции липидно-пигментного комплекса к биомассе микроводоросли Chlorella добавляют органические растворители (этанол или бензин) в соотношении 10 л растворителя на каждый килограмм сухой биомассы. Спустя 9 часов суспензию фильтруют, из растворимой части выпариванием растворителей получают липидно-пигментный комплекс, а нерастворимую часть подвергают дальнейшей обработке. Недостатком данной стадии является длительность проведения экстракции, а также чрезмерно большие объемы используемых растворителей. Данный недостаток обусловлен тем, что клеточные стенки не разрушаются, их структура остается неразупорядоченной и слабопроницаемой для органических растворителей.
На второй стадии нерастворимую в органических растворителях часть суспендируют в 10-кратном количестве воды и разваривают в течение 5-10 минут при температуре 100°С. При этом увеличивается проницаемость и реакционная способность клеточных стенок, что способствует протеканию дальнейшего ферментативного гидролиза. Недостатком данной стадии является использование высокой температуры для увеличения реакционной способности клеточных стенок. Это приводит к удорожанию конечного продукта, а также к термической денатурации большей части биологически активных веществ белковой природы. Кроме того, разваривание увеличивает проницаемость клеточных стенок без разрушения клеток.
На третьей стадии суспензию разваренной биомассы Chlorella подвергают ферментативному гидролизу. Для этого в суспензию вносят ферменты с целлюлазной или протеазной активностью и проводят гидролиз в течение 9-18 часов при температуре 45-50°С. После этого ферменты инактивируют нагреванием до 100-105°С. Центрифугированием при 6000 об/мин отделяют водорастворимую часть от нерастворимой. Водорастворимая фракция содержит углеводы, аминокислоты и нуклеотиды. Нерастворимая фракция содержит белок, низкомолекулярные пептиды и углеводные соединения типа крахмала. Недостатком данной стадии является чрезмерная длительность ферментативного гидролиза, обусловленная недостаточным активирующим действием термического разваривания на клеточные стенки.
Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в создании экологически чистого, простого способа извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella.
2
Поставленная задача решается благодаря заявляемому способу извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella, включающему экстракцию липидно-пигментного комплекса органическим растворителем, фильтрование экстракта с последующим выпариванием растворителей из растворимой части и получением сухого липидно-пигментного комплекса, смешивание нерастворимой части экстракта с ферментными препаратами с целлюлазной или протеазной активностью, последующий ферментативный гидролиз, центрифугирование гидролизата и сушку растворимой и нерастворимой частей с получением сухих продуктов, отличающемуся тем, что биомассу одноклеточной водоросли рода Chlorella предварительно обрабатывают в мехактиваторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типа, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с и время пребывания в зоне обработке 0,5-10 мин, экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 3-5 часов с применением бензина или этилового спирта, а ферментативный гидролиз проводят с использованием ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Протосубтилин г3х» или их смесей в течение 4-8 часов, при рН 4-6, при температуре 50-65°С, при этом ферментные препараты добавляют к нерастворимой части экстракта в количестве 0,5-10 мас.%.
Предпочтительно при экстракции липидно-пигментного комплекса 1 кг сухой биомассы обрабатывают 5-7 литрами бензина или этилового спирта.
Предпочтительно ферментативный гидролиз проводят при концентрации твердой фазы в растворе 10-20 мас.%.
При механической активации биомассы водоросли в указанных условиях происходит механическое разрушение клеток, разупорядочение надмолекулярной структуры клеточных стенок, повышение их проницаемости по отношению к ферментам и повышение их реакционной способности при последующем ферментативном гидролизе.
Механический способ получения активированных клеточных стенок более эффективен, чем разваривание в жидкой фазе при высокой температуре, так как не требует больших количеств воды и поддержания повышенной температуры. Биомасса, активированная механически, представляет собой разрушенные клетки и обладает большей реакционной способностью, чем разваренная при нагревании без разрушения клеток, о чем свидетельствуют меньшие времена, необходимые для осуществления экстракции органическими растворителями липидно-пигментного комплекса и ферментативного гидролиза. Разрушенные клеточные стенки, получаемые после механической активации, представляют собой воздушно сухой порошок от светло- до темно-зеленого цвета, который может непосредственно использоваться для дальнейшей экстракции липидно-пигментного комплекса и проведения ферментативного гидролиза.
После механической активации полупродукт суспендируют в органических растворителях и проводят экстракцию липидно-пигментного комплекса. Экстракт фильтрацией разделяют на растворимую часть, содержащую липидно-пигментный комплекс, и нерастворимую часть, сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Выход сухого порошкообразного липидно-пигментного комплекса составляет 12-13 мас.% от исходной биомассы водоросли Chlorella. Нерастворимая часть экстракта используется для проведения дальнейшего ферментативного гидролиза.
Нерастворимую часть, полученную после экстракции органическими растворителями, суспендируют в воде и смешивают с ферментатативным комплексом, проявляющим целлюлазную или протеазную активность, и проводят ферментативный гидролиз. Полупродукт, полученный в результате ферментативного гидролиза, центрифугированием разделяют на растворимую (содержащую растворимые углеводы, аминокислоты, олигопептиды и нуклеотиды), нерастворимую (содержащую белки и углеводные полимеры) части и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Выход гидролизата, полученного сушкой растворимой части, составляет 59-66 мас.%. Выход высушенной нерастворимой части составляет 21-29 мас.%.
Ферментативный гидролиз нерастворимой части, полученной после экстракции органическими растворителями, проводят с применением ферментных препаратов «Целлолюкс-А» и «Протосубтилин г3х» или их смесей, проявляющих целлюлазную и протеазную активность в диапазоне рН 4-6, контролируемом стандартным буферным раствором, состоящим из 3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды. Ферментные препараты добавляют к биомассе водоросли в количестве 0,5-10 мас.%. Концентрация твердой фазы при ферментативном гидролизе составляет 10-20 мас.%. Температура 50-65°С, продолжительность гидролиза 4-8 часов.
Проведенный патентный поиск не выявил аналогичных способов извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella, поэтому сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Совокупность существенных признаков заявляемого способа также не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого препарата и способа его получения критерию «изобретательский уровень».
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
2
Высушенную до влажности 10 мас.% биомассу одноклеточной водоросли Chlorella механически активируют в проточном активаторе типа ЦЭМ или ВЦМ, обеспечивающем ускорение мелющих тел 60 м/с и время пребывания в зоне обработки 0,5 минут.
Полученный полупродукт суспендируют в 5 литрах бензина и проводят экстракцию в течение 5 часов при комнатной температуре. После этого экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Растворимая часть экстракта содержит липидно-пигментный комплекс. После высушивания выход липидно-пигментного комплекса составляет 12 мас.% от взятой сухой биомассы.
Высушенную нерастворимую часть, полученную после экстракции бензином, смешивают с ферментативным комплексом «Целлолюкс-А» (производство ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающим целлюлазной активностью, равной 2000 ед./г, в количестве 0,5 мас.%. К смеси добавляют буферный раствор (3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды) с рН 4-6 до концентрации твердой фазы 10 мас.% и проводят ферментативный гидролиз в течение 4 часов при температуре 50°С. После проведения ферментативного гидролиза суспензию разделяют на растворимую и нерастворимую части центрифугированием при 6000 об/мин и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Растворимая часть содержит растворимые углеводы, аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, и ее выход после сушки составляет 59 мас.% от исходной сухой биомассы. Нерастворимая часть содержит белки, углеводные полимеры, и ее выход после сушки составляет 29 мас.% от исходной сухой биомассы.
2
При ускорении мелющих тел менее 60 м/с не обеспечивается достаточная разупорядоченность супрамолекулярной структуры клеточных стенок биомассы водоросли, что снижает эффективность последующего ферментативного гидролиза. Применение обработки менее 0,5 минут не обеспечивает необходимой степени разрушения клеток водоросли и накопления механической энергии. Понижение температуры ферментативного гидролиза ниже 50°С отрицательно сказывается на скорости протекания гидролиза, а проведение прогрева менее чем за 4 часа не обеспечивает оптимальной степени превращения. Понижение концентрации твердой фазы менее 10 мас.% нецелесообразно из экономических соображений, так как связано с дальнейшей необходимостью удаления лишнего объема воды.
Пример 2.
2
Высушенную до влажности 10 мас.% биомассу одноклеточной водоросли Chlorella механически активируют в проточном активаторе типа ЦЭМ или ВЦМ, обеспечивающем ускорение мелющих тел 400 м/с и время пребывания в зоне обработки 10 минут.
Полученный полупродукт суспендируют в 7 литрах этилового спирта и проводят экстракцию в течение 3 часов при комнатной температуре. После этого экстракт фильтрованием разделяют на растворимую и нерастворимую части и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Растворимая часть экстракта содержит липидно-пигментный комплекс. После высушивания выход липидно-пигментного комплекса составляет 13 мас.% от взятой сухой биомассы.
Высушенную нерастворимую часть, полученную после экстракции этиловым спиртом, смешивают с ферментативным комплексом «Целлолюкс-А» (производство ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающим целлюлазной активностью, равной 2000 ед./г, в количестве 10 мас.%. К смеси добавляют буферный раствор с рН 4-6 (3,0-3,2 г уксусной кислоты и 6,7-7,2 г трехводного ацетата натрия на 1,0 литр воды) до концентрации твердой фазы 20 мас.% и проводят ферментативный гидролиз в течение 8 часов при температуре 65°С.
После проведения ферментативного гидролиза суспензию разделяют на растворимую и нерастворимую части центрифугированием при 6000 об/мин и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Растворимая часть содержит растворимые углеводы, аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, и ее выход после сушки составляет 63 мас.% от исходной сухой биомассы. Нерастворимая часть содержит белки, углеводные полимеры, и ее выход после сушки составляет 24 мас.% от исходной сухой биомассы.
Повышение интенсивности механической активации позволяет использовать для экстракции этиловый спирт вместо бензина, снизить продолжительность экстракции и повысить выход липидно-пигментного комплекса.
2
При ускорении более 400 м/с происходит разогрев обрабатываемой биомассы, что может привести к разрушению биологически активных веществ белковой природы. Применение обработки свыше 10 минут также может приводить к механической деструкции целевых компонентов. Повышение температуры ферментативного гидролиза выше 65°С приводит к денатурации ферментативного комплекса. Увеличение времени прогрева свыше 8 часов несущественно сказывается на степень превращения ввиду постепенного уменьшения скорости реакции от времени. Повышение концентрации твердой фазы более 20 мас.% нецелесообразно ввиду высокой вязкости реакционной смеси.
Пример 3.
Осуществляется в условиях примера 2. В качестве ферментативного комплекса используется равновесомая смесь ферментативного комплекса «Целлолюкс-А», обладающего целлюлазной активностью, равной 2000 ед./г, и ферментативного комплекса «Протосубтилин г3х» (производство ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающего протеазной активностью по отношению к белкам клеточной стенки, равной 11070 ед./г. Оптимальная температура проведения ферментативного гидролиза для данного ферментативного комплекса 60°С. Продолжительность реакции 6 часов.
Составленная таким образом смесь ферментных комплексов имеет 1000 ед./г целлюлазной активности и 5535 ед./г протеазной активности.
После проведения ферментативного гидролиза суспензию разделяют на растворимую и нерастворимую части центрифугированием при 6000 об/мин и сушат при помощи вакуумного испарителя или распылительной сушки. Растворимая часть содержит растворимые углеводы, аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, и ее выход после сушки составляет 66 мас.% от исходной сухой биомассы. Нерастворимая часть содержит белки, углеводные полимеры, и ее выход после сушки составляет 21 мас.% от исходной сухой биомассы.
Использование смеси ферментативных комплексов, обладающих целлюлазной и протеазной активностью, позволяет увеличить выход водорастворимой части гидролизата, а также увеличить скорость ферментативной реакции гидролиза клеточной стенки за счет комплексного воздействия на ее структурные компоненты.
Пример 4.
Осуществляется в условиях примера 3. В качестве механического активатора используют планетарную мельницу АГО-2, позволяющую получать в лабораторных условиях небольшие партии продукта для научных исследований и отработки технологических стадий.
По сравнению с прототипом заявляемое техническое решение позволяет проще и с большими выходами извлекать биологически активные вещества из биомассы одноклеточной водоросли рода Chlorella. Применение в заявленном способе дополнительной механической обработки биомассы Chlorella в мехактиваторах планетарного, вибрационного или виброцентробежного типа позволяет разрушить клетки водоросли, а также разупорядочить структуру клеточных стенок. Это приводит к увеличению проницаемости клеточных стенок для органических растворителей и ферментов, возрастанию их реакционной способности, позволяет сократить продолжительность операций экстракции и ферментативного гидролиза, затраты органических растворителей. Одновременно с этим увеличивается выход биологически активных веществ. Перечисленные выше достоинства заявленного способа делают его более экологически чистым, простым в исполнении и экономически эффективным, чем способ по прототипу.