АММОНИЕВАЯ СОЛЬ ПЕПТИДА HAEE ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
AMMONIUM SALT OF HAEE PEPTIDE FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES

Изобретение относится к однозамещенной или двузамещенной аммониевых солей пептида HAEE, где HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu. Настоящее изобретение также относится к способу получения аммониевых солей пептида HAEE (варианты), к фармацевтическим композициям на основе аммониевых солей пептида HAEE и применению аммониевых солей пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (РС), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray C.H., Wijeyekoon R., Yarnall A.J. et al. ICICLE-PD study group. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https://doi.org/10.1002/mds.26563). Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (Аβ). N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к пептиду Аβ (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of CuII amyloid-β16/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Аβ с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei P., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p. 109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Аβ и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов Аβ (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A:1012934207456). Поэтому применение цинка и других катионов в фармацевтических препаратах, которые могут взаимодействовать с таргетными мишенями в организме и лечить нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.
На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.
2
Из WO 2012/056157 и патента РФ № 2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH (далее - HAEE). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н -гистидин, А - аланин, Е - глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Аβ с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида Аβ в присутствии ионов Zn (II) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Aβ. Было показано, что инкубация агрегатов Аβ с HAEE в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ HAEE приводит к дезагрегации таких агрегатов.
Из патента РФ № 2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности НАЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с пептидом Аβ. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, а pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи.
Из патента РФ № 2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа HAEE имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ № 2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки HAEE через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность HAEE.
Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса HAЕЕ с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%. Из патента РФ № 2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.
Однако известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1, в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А.И. Глухова, Е.С. Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.
Прототипом изобретения был выбран источник WO 2012/056157, в котором описывается пептид с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу (НАЕЕ). Фармацевтически приемлемые соли для НАЕЕ не были ранее получены и охарактеризованы, а их свойства в твердой фазе неизвестны.
Получение фармацевтически приемлемых солей лекарственных веществ способствует улучшению их растворимости, биодоступности, повышению стабильности и других полезных биофармацевтических характеристик.
4
4
2
Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении эффективного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний в виде неизвестных ранее аммониевых солей НАЕЕ, включая однозамещенную (НАЕЕ-NH) и двузамещенную ((НАЕЕ-(NH)) аммониевые соли НАЕЕ, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на основе такого средства и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний.
В соответствии с настоящим изобретением описываются аммониевые соли пептида HAEE.
В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний полезно использовать аммониевые соли НАЕЕ. Использование аммониевых солей пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида HAEE, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.
Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и аммониевых солей пептида HAEE в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что 3D-структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был введен в плазму крови мышей дикого типа, отличается от 3D-структуры нативного HAEE в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выходa с хроматографической колонки пробы HAEE, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы HAEE, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время 3D-структура HAEE в форме аммониевых солей оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора аммониевой соли пептида HAEE и после экстрагирования из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала 3D-структуре нативного пептида HAEE, экстрагированного из исходного водного раствора. По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида HAEE во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе аммониевой соли. Изменение времени выхода нативного пептида HAEE или аммониевой соли пептида HAEE с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида HAEE с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей 3D-структурой пептида HAEE в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что 3D-структура пептида HAEE, которая соответствует «развернутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида HAEE в исходном водном растворе, соответствует 3D-структуре аммониевой соли пептида HAEE в водном растворе и остается неизменной в случае экспозиции аммониевой соли пептида HAEE в плазме крови, в то время как нативный пептид HAEE в плазме крови утрачивает «развернутую» конформацию.
В данном случае термин 3D-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле HAEE в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий HAEE с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде аммониевой соли.
Известно, что нарушение 3D-структуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, K., Jaśkiewicz, M., Neubauer, D., Migoń, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides-an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнерами белковой природы пептид HAEE должен находиться в «развернутой» конформации (Barykin E. P., Garifulina A. I., Tolstova A. P., Anashkina A. A., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ // International journal of molecular sciences. - 2020. - T. 21, № 17. - C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде HAEE имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развернутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты HAEE.
Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности пептида НАЕЕ в форме аммониевой соли НАЕЕ вследствие сохранения 3D-структуры данной соли в «развернутой» конформации.
Изобретение также имеет отношение к применению аммониевой соли пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Аммониевая соль пептида HAEE может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.
Аммониевая соль пептида HAEE может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.
Техническим результатом изобретения является:
- возможность использования аммониевой соли пептида HAEE при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;
- повышенная стабильность аммониевой соли пептида HAEE по сравнению с НАЕЕ;
- устойчивость «развернутой» конформации 3D молекулы НАЕЕ после растворения аммониевой соли HAEE в плазме крови по сравнению с НАЕЕ.
Заявляемая в настоящем изобретении однозамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ в соответствии с используемым способом получения может быть получена в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг. 1). Двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ представляет собой слабо закристаллизованную фазу (Фиг. 2).
Аммониевые соли пептида НАЕЕ характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК-кривой характеризуется широким пиком с началом при 62°С и максимумом при 89°С; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227,5°С с началом при 188°С (Фиг. 3). Погрешность при многократном измерении оценивается в ± 3°С.
4
HAEE-NH на ДСК-кривой характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60°С и имеет широкий максимум при 90-100°С; второй начинается при 197°С с максимумом при 208°С, третий пик начинается с 215°С с максимумом при 234°С. (Фиг. 4).
4
2
HAEE-(NH) на ДСК-кривой имеет сложный характер и характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60°С с максимумом при 98°С, второй пик начинается от 112°С с максимумом при 130°С, третий пик начинается от 174°С с максимумом при 202°С и четвертый максимум плавления наблюдается при 234°С (Фиг 5).
ДСК-кривые показывают, что термическое поведение аммониевых солей пептида НАЕЕ (Фиг. 4,5) отличается от поведения НАЕЕ (Фиг. 3), температура плавления аммониевых солей выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.
ИК-спектр с Фурье преобразованием аммониевых солей пептида НАЕЕ представлен на Фиг. 6. ИК-спектры аммониевых солей повторяет все основные линии ИК-спектра НАЕЕ.
4
3
3
2
-1
-1
+
-1
+
-1
-1
-1
-1
-1
В ИК-спектре HAEE-NH максимум при 3075 см сместился в 3050 см (валентные колебания в -NH). Исчез максимум при 2975 см (соли аминов RNH). Максимум при 1625 см сместился в 1640 см (плоские деформационные колебания -NН). Произошли смещения и изменения в области длин волн 1235-1320 см (С-N). Произошло изменение интенсивности максимумов при 1250 сми 1310 см (С-N) на 25% (Фиг. 6,7).
4
2
-1
-1
-1
Отличие ИК-спектра HAEE-(NH) от HAAE заключается в перераспределение интенсивностей максимумов при 1250 и 1310 см (С-N) на 25%. Наблюдаются новые максимумы при 875 и 935 см (кольцо имидазола) и 985 см (Фиг. 6,7).
Таким образом в ИК-спектре аммониевых солей пептида НАЕЕ произошли изменения колебаний связи в молекуле НАЕЕ, преимущественно аминогрупп, что связано с образованием солей аммония.
Способ получения аммониевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов HAEE и водного раствора соединения аммония в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-30 мин и высушивании раствора.
4
4
4
2
4
Для получения HAEE-NH стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:NH должно быть 1:1 по молям. Для получения HAEE-(NH) стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:NH должно быть 1:2 по молям.
Во время перемешивания допускается нагревание до 50°С.
Высушивание выполняется стандартными методами органический химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50°С. Аммониевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается.
В заявляемом способе получения соединениями аммония являются гидроксид, гидрокарбонат или карбонат аммония.
Вариант способа получения аммониевых солей пептида НАЕЕ заключается в смешивании при комнатной температуре водных растворов HAEE и водного раствора сульфата аммония в стехиометрических соотношениях, перемешивании в течение 5-10 мин, добавлении стехиометрических количеств водного раствора гидроксида бария для осаждения сульфат-аниона, перемешивании в течение 10-30 мин, удаление осадка сульфата бария и высушивании раствора.
4
4
4
2
4
Для получения HAEE-NH стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:NH должно быть 1:1 по молям. Для получения HAEE-(NH) стехиометрическое соотношение компонентов НАЕЕ:NH должно быть 1:2 по молям.
4
2-
2+
После добавления раствора гидроксида бария во время перемешивания допускается нагревание до 50°С. Для осаждения сульфат-аниона стехиометрическое соотношение компонентов SO:Ba должно быть 1:1 по молям.
Удаление осадка сульфата бария выполняется фильтрованием или центрифугированием и декантацией супернатанта, содержащего раствор аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Высушивание выполняется стандартными методами органический химии, преимущественно под вакуумом. Температура сушки не должна превышать 50°С. Аммониевые соли пептида НАЕЕ могут быть получены в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной лиофильной сушки. Для лиофильного высушивания раствор предварительно замораживается.
При получении аммониевых солей пептида НАЕЕ в зависимости от способа высушивания может оставаться остаточная влажность до 5% масс. При этом аммониевые соли пептида НАЕЕ не набирают дополнительную воду при хранении и стабильны в течение длительного времени.
Еще одним объектом изобретения является фармацевтические композиции с эффективным количеством аммониевой соли пептида НАЕЕ и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства однозамещенная или двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ может быть использована без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.
Эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.
Фармацевтическая композиция аммониевой соли пептида НАЕЕ может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции аммониевой соли пептида НАЕЕ содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена высушиванием раствора активного вещества и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к порошку аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Высушенная или лиофилизированная аммониевая соль пептида НАЕЕ может находиться в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг. 1, 2.
Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Фармацевтическая композиция аммониевой соли пептида НАЕЕ в виде водного раствора содержит эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним объектом изобретения является применение аммониевой соли пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении аммониевой соли пептида НАЕЕ в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество аммониевой соли пептида НАЕЕ зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.
Введение аммониевой соли пептида НАЕЕ пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении аммониевой соли пептида НАЕЕ в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении аммониевой соли пептида HAEE в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, как одного из самых распространенных нейродегенеративных расстройств, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSEN1dE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S1389-0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций.
В настоящем изобретении аммониевые соли пептида НАЕЕ вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Giménez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.
4
2
4
По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6 ±13,3 (%). Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ = 12,6 ±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. У группы трансгенных мышей линии APP/PS1, получавшей НАЕЕ значение КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Группа трансгенных мыши линии APP/PS1, получавшая однозамещенную и двузамещенную аммониевую соль пептида HAEE показали значения КЗШ = 41,5±9,5 (%) и КЗШ = 47,4±10,2 (%), соответственно (Таблица 4). Эти данные свидетельствуют о том, что использование аммониевой соли пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE. НАЕЕ-(NH) на уровне тенденции имеет большую эффективность по сравнению с НАЕЕ-NH.
Таким образом, аммониевые соли пептида НАЕE могут эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.
4
4
2
Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31,7 ± 4,9, в группе мышей, получавших НАЕЕ, значение ЧБ составило 24,7±3,4. В группе мышей, получавших НАЕЕ-NH и НАЕЕ-(NH), значение ЧБ составило 9,5±3,9 и 8,9±2,8, соответственно.
Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что введение аммониевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность аммониевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
on
off
D
4
on
off
D
4
2
D
3
-1
-1
-3
-1
-6
3
-1
-1
-3
-1
-6
-4
В качестве одного из механизмов действия аммониевых солей пептида НАЕЕ на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета-амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия аммониевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны k = (1,41±0,06) × 10 Ms; k = (5,78±0,06) × 10 s; K = (4,1±0,3) × 10 М для НАЕЕ-NH и значения k = (1,35±0,06) × 10 Ms; k = (5,65±0,06) × 10 s; K = (4,19±0,3) × 10 для НАЕЕ-(NH). Поскольку значение K ≤ 10 М, то такое взаимодействие является биологически значимым. В отличие от аммониевых солей, нативный пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.
Это различие между нативным пептидом НАЕЕ и аммониевыми солями пептида НАЕЕ может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций - эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности аммониевых солей пептида НАЕЕ. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как аммониевая соль пептида HAEE до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион аммония играет защитную роль для сохранения «развернутой» конформации пептида HAEE в данных солях, что, возможно, также предотвращает взаимодействие с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного HAEE в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов HAEE с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.I. et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p. 909, doi: 10.3390/biom11060909).
В совокупности можно сделать вывод о том, что аммониевые соли пептида НАЕЕ имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку после введения аммониевой соли в организм, НАЕЕ существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
4
Фиг. 1. Дифрактограмма HAEE-NH.
4
2
Фиг. 2. Дифрактограмма HAEE-(NH).
Фиг. 3. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 - ДСК-кривая; 2 - ТГ-кривая.
4
Фиг. 4. ДСК-ТГА кривая HAEE-NH.
4
2
Фиг. 5. ДСК-ТГА кривая HAEE-(NH).
4
2
4
Фиг. 6. ИК-спектр c Фурье преобразованием НАЕЕ (1), НАЕЕ-(NH) (2) и НАЕЕ-NH (3).
-1
4
2
4
Фиг. 7. ИК-спектр c Фурье преобразованием в характеристичной области 1800-700 см. НАЕЕ (1), НАЕЕ-(NH) (2) и НАЕЕ-NH (3).
1
Фиг. 8. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для Н-ЯМР-анализа.
1
Фиг. 9. Н-ЯМР спектр НАЕЕ.
1
4
Фиг. 10. Н-ЯМР спектр НАЕЕ-NH.
1
4
2
Фиг. 11. Н-ЯМР спектр НАЕЕ-(NH).
Описание приборов.
Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке - 40 кВ, ток трубки - 30 мА, материал анода трубки - Cu. Гониометр: Θ/Θ вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра - 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 2Θ составил от 3 до 70 градусов.
Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.
2
Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм, количество измерений - 3.
-1
-1
Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) c приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см с разрешением 2 см, количество сканов - 10.
1
1
Н-спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер H.
Взаимодействие с бета-амилоидом фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа CM4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета-амилоида (Aβ42), на C-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда.
Лиганд (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали аммониевые соли НАЕЕ или HAEE.
Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1-0,2 мбар.
Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert HCP50 при 40°С и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1.
.
4
Получениеоднозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ (HAEE-NH)
-3
4
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл NHOH c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм. рт. ст. при температуре 40°С. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 88%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,015 мбар в течение 24 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
4
Еще одним вариантом способа получения HAEE-NH является использование гидрокарбоната аммония.
-3
4
3
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл NHНСО c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм. рт. ст. при температуре 35°С. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 86%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 36 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 99%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
4
Еще одним вариантом способа получения HAEE-NH является использование карбоната аммония.
-3
4
2
3
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 5 мл (NH)СО c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 25 мин при температуре 50°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две части по 50 и 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
4
Еще одним вариантом способа получения HAEE-NH является использование сульфата аммония.
-3
4
2
4
2
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 5 мл (NH)SO c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН) с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°С. Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 9 мм. рт. ст. при 30°С. Получили белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 82%.
-3
4
2
4
2
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 5 мл (NH)SO c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН) с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 91%. Продукт представлял собой белый порошок однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов однозамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата аммония показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 1, 4, 6, 7, 10).
4
4
Все полученные образцы НАЕЕ-NH характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг. 1). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) HAEE-NH характеризуется тремя эндотермическими максимумами: первый широкий эндотермический пик начинается от 60°С и имеет широкий максимум при 90-100°С; второй начинается при 197°С с максимумом при 208°С, третий пик начинается с 215°С с максимумом при 234°С. (Фиг. 4).
Методом ДСК-ТГА было показано, что аммониевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5% масс.
4
3
3
2
-1
-1
+
-1
+
-1
-1
-1
-1
-1
В ИК-спектре HAEE-NH в отличие от ИК-спектра НАЕЕ максимум при 3075 см сместился в 3050 см (валентные колебания в -NH). Исчез максимум при 2975 см (соли аминов RNH). Максимум при 1625 см сместился в 1640 см (плоские деформационные колебания -NН). Произошли смещения и изменения в области длин волн 1235-1320 см (С-N). Произошло изменение интенсивности максимумов при 1250 сми 1310 см (С-N) на 25% (Фиг. 6,7).
1
2
3
3
2
2
2
2
2
2
Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР H[500.13Mhz; DO; 298K; d, м.д.]:1.27 (3H, d, j=7.13Hz, CH(16)), 1.87 (5H, m, CH(3), 1/2CH(21),1/2CH(33)), 1.99 (2H, sx, j=7.45Hz 1/2CH(21),1/2CH(33)), 2.28 (4H, m, 2CH(22,34 )), 3.13, 3,03 (2H, m, CH(8)), 4.19 (3H, m, 3CH (15,20,29)), 4.56 (1H, t, j=6.86Hz, CH(5)), 7.19 (1H, s, CH(10)), 8.50 (1H, s, CH(12)) (Фиг. 8,9).
4
В НАЕЕ-NH положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 10, что свидетельствует о влиянии иона аммония на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде аммониевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблица 1, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д.
1
Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом аммония при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому наибольшее взаимодействие наблюдается у атомов 21, 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамата.
Пример 2.
(
.
4
2
Получение двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕHAEE-(NH))
-3
4
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл NHOH c концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при температуре 40°С. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 87%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 28 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
4
2
Еще одним вариантом способа получения HAEE-(NH) является использование гидрокарбоната аммония.
-3
4
3
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл NHНСО c концентрацией 0,02 М и перемешивали в течение 30 мин при температуре 40°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части по 55 мл.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 8 мм. рт. ст. при температуре 35°С. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 34 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 98%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
4
2
Еще одним вариантом способа получения HAEE-(NH) является использование карбоната аммония.
-3
4
2
3
К 100 мл буферного раствора НАЕЕ с pH = 7 и с концентрацией 10 М добавляли 10 мл (NH)СО c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 50°С вплоть до прекращения выделения пузырьков диоксида углерода. Полученный раствор разделили на две равные части.
Первую часть высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 6 мм. рт. ст. при комнатной температуре. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 83%.
Вторую часть раствора объемом 55 мл разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 5 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 30 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 97%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ показало, что независимо от способа высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
4
2
Еще одним вариантом способа получения HAEE-(NH) является использование сульфата аммония.
-3
4
2
4
2
К 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл (NH)SO c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН) с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 20 мин при температуре 35°С. Полученный раствор с осадком центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин и декантировали надосадочную жидкость, которую высушивали на ротационном испарителе под вакуумом 7 мм. рт. ст. при 30°С. Получили белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, выход продукта с учетом потерь составил 84%.
-3
4
2
4
2
В еще одном варианте осуществления изобретения к 100 мл водного раствора НАЕЕ с концентрацией 10 М добавляли 10 мл (NH)SO c концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 5 мин при комнатной температуре. После чего добавляли к получившемуся раствору добавляли 5 мл раствора Ba(ОН) с концентрацией 0,01 М и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Полученный раствор с осадком фильтровали через бумажный фильтр под вакуумом. Профильтрованный раствора разливали в пенициллиновые пузырьки объемом по 2 мл и замораживали в холодильной установке при -20°С и затем лиофильно высушивали в стандартном режиме при давлении 0,02 мбар в течение 32 ч. Выход продукта с учетом потерь составил 89%. Продукт представлял собой белый порошок двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ.
Исследование образцов двузамещенной аммониевой соли пептида НАЕЕ, полученные из сульфата аммония показало, что независимо от способа фильтрования и высушивания они имеют идентичные характеристики (Фиг. 2, 5, 6, 7, 11).
4
2
Все полученные образцы НАЕЕ-(NH) характеризуются слабо закристаллизованной формой на дифрактограмме (Фиг. 2).
4
2
На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) HAEE-(NH) характеризуется характеризуется четырьмя эндотермическими пиками. Первый имеет начало при 60°С с максимумом при 98°С, второй пик начинается от 112°С с максимумом при 130°С, третий пик начинается от 174°С с максимумом при 202°С и четвертый максимум плавления наблюдается при 234°С (Фиг 5).
Методом ДСК-ТГА было показано, что двузамещенная аммониевая соль пептида НАЕЕ может содержать остаточную влажность до 5% масс.
4
2
-1
-1
-1
ИК-спектр с Фурье преобразованием НАЕЕ-(NH) по сравнению с НАЕЕ характеризуется перераспределением интенсивностей максимумов при 1250 и 1310 см (С-N) на 25%. Наблюдаются новые максимумы при 875 и 935 см (кольцо имидазола) и 985 см (Фиг. 6,7).
4
2
В НАЕЕ-(NH) положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 10, что свидетельствует о влиянии иона аммония на молекулы НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении стерической структуры молекулы НАЕЕ как в твердом виде в виде аммониевой соли, так и в растворе, что важно для фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблице 1, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02-0,03 м.д.
1
4
4
2
Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом аммония при образовании соли; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому взаимодействие наблюдается у атомов 21, 22, 33, 34 (Glu), что свидетельствует об образовании соли по карбоксильной группе глутамина. В отличие от НАЕЕ-NH в НАЕЕ-(NH) во взаимодействие включается имидазольная группа гистидинового фрагмента, что видно по смещению сигналов у протонов 8, 10, 12 (His1).
Пример 3.
ВЭЖХ аммониевых солей пептида НАЕЕ.
in vitro
in vitro
4
4
2
2
Сравнительный анализ аммониевых солей пептида НАЕЕ и нативного пептида НАЕЕ методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA - муравьиная кислота, 50% МеОН (1:1)) показал, что в водных растворах  при физиологических значениях pH их хроматографическая подвижность практически идентична HAЕЕ в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки для НАЕЕ-NH составляло 2,80 мин, для НАЕЕ-(NH) - 2,81 мин, для НАЕЕ - 2,85 мин. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin E.P., Garifulina A.I., Tolstova A.P. et al. (2020). Tetrapeptide Ac-HAEE-NH Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведенные результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи аммониевой соли пептида HAEE и пептида HAEE в условиях  идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.
4
4
2
После введения аммониевых солей пептида НАЕЕ внутривенно в организм здоровых мышей (n = 5) с последующим забором крови у животных и экстракцией из забранных образцов крови фракции, содержащей HAEE, было найдено, что время выхода HAEE на хроматограммах проб, приготовленных из образцов крови животных, которым вводили НАЕЕ-NH или НАЕЕ-(NH) не изменялось и составляло 2,80 мин и 2,81 мин, соответственно. Однако, неожиданно было обнаружено, что время выхода основного пика HAEE на хроматограмме пробы, приготовленной из образцов крови животных, которым вводили пептид HAEE, стало 1,27 мин и только около 8% HAEE выходило в хроматографическом пике на времени 2,85 мин.
Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови человека или мыши конформация пептида HAEE резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для аммониевой соли. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови аммониевая соль пептида HAEE сохраняет свою конформацию (предположительно, «развернутую») неизменной, в то время как HAEE приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что молекула НАЕЕ в форме аммониевой соли устойчива к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта от аммониевых солей пептида HAEE, так и от HAEE требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия аммониевой соли пептида НАЕЕ и нативного HAEE, что исключает их биоэквивалентность.
Пример 4.
Стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ.
Была определена стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 2). Аммониевые соли пептида НАЕЕ сохранили свой цвет, консистенцию, не набирали воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не теряли активное вещество. Образец НАЕЕ с течением времени набирал воду (до 7% масс.) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Таким образом, стабильность аммониевых солей пептида НАЕЕ оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ.
Пример 5.
Фармацевтические композиции на основеаммониевых солей пептида НАЕЕ.
Фармацевтические композиции на основе аммониевых солей пептида HAEE могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 3). Указанные композиции получены отдельно для каждой из однозамещенной и двузамещенной аммониевых солей пептида НАЕЕ. Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг.
Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0,1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.
Пример 6.
Влияние аммониевых солей пептида HAEE на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных.
Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространенности нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.
Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSEN1dE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1. У мышей APP/PS1, начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski T., Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974-5).
Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (n = 12 в каждой группе):
1. контроль 1. Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
3. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE;
4
4. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-NH;
4
2
5. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-(NH).
Препараты HAEE и аммониевые соли пептида НАЕЕ вводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni T., Eckhaus M., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от 2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами HAEE и аммониевых солей пептида НАЕЕ.
В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).
6.1. Анализ улучшения поведенческих функций
у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием HAEE и аммониевых солей пептида НАЕЕ был проведен с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа. Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 х 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.
4
4
2
По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ = 50,6±13,3 (%). Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ = 12,6±4,2 (%), что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. В группе мышей, получавших HAEE, значения КЗШ составило 20,6±7,3 (%). Для групп мышей, получавших НАЕЕ-NH и НАЕЕ-(NH), значение КЗШ составило 41,5±9,5 и 47,4±10,2 (%), соответственно (Таблица 4).
Эти данные свидетельствуют о том, что использование аммониевых солей пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE.
6.2. Гистохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек
в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол - 10 мин, 100% этанол - 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1:1) - 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол - 5 мин, 90% этанол - 2 мин, 75% этанол - 2 мин, вода - 5 мин (три смены), раствор конго красного - 5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin K., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
4
4
2
У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ = 31,7 ± 4,9. В группе 3, в которой трангсенным мышам APP/PS1 вводили HAEE, значение ЧБ оказалось равным 24,7 ± 3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-NH, значение ЧБ составило 9,5±3,9. В группе 5, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили HAEE-(NH), значение ЧБ оказалось равным 8,9±2,8. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции аммониевых солей пептида НАЕЕ приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность аммониевых солей пептида НАЕЕ примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
Пример 7.
Специфическое связывание аммониевых солей пептида HAEE с человеческим бета-амилоидом (Aβ42).
D
D
-4
Дополнительно была проведена оценка связывания аммониевых солей пептида HAEE с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данной соли при нейродегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование соли между находящимся в растворе аналитом (аммониевая соль пептида HAEE или нативный HAEE) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (K) взаимодействия. Если значение K ≤ 10 М, то взаимодействие между аммониевой солью пептида HAEE и бета-амилоидом является биологически значимым.
on
off
D
4
on
off
D
4
2
3
-1
-1
-3
-1
-6
3
-1
-1
-3
-1
-6
Взаимодействий между HAEE и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении аммониевых солей пептида HAEE было обнаружено их взаимодействие с иммобилизованным Aβ42 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия аммониевых солей пептида НАЕЕ и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны k = (1,41±0,06) × 10 Ms; k = (5,78±0,06) × 10 s; K = (4,1±0,3) × 10 М для НАЕЕ-NH и значения k = (1,35±0,06) × 10 Ms; k = (5,65±0,06) × 10 s; K = (4,19±0,3) × 10 для НАЕЕ-(NH).
Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета-амилоидом (Aβ42) и аммониевыми солями пептида HAEE. В отличие от аммониевых солей пептида HAEE, нативный пептид HAEE в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с Aβ42.
Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности HAEE связываться с Aβ42. Напротив, аммониевые соли пептида HAEE способны связываться с Aβ42. Несмотря на то, что и HAEE и аммониевые соли пептида HAEE при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 6.1 и 6.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия HAEE и аммониевых солей пептида HAEE, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность HAEE и аммониевых солей пептида HAEE при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний. Поэтому можно заключить, что НАЕЕ и аммониевые соли пептида HAEE небиоэквивалентны между собой.
Таблица 1. Смещение сигналов протонов в <sup>1</sup>Н-ЯМР-спектре аммониевых солей НАЕЕ по сравнению c HAEE.
Номер СН-группы в молекуле НАЕЕ (Фиг. 8) и принадлежность аминокислоте
Сигнал в молекуле НАЕЕ, м.д. (Фиг. 9)
Сигнал в НАЕЕ-NH<sub>4</sub>, м.д. (Фиг. 10) и разница сигнала Δ, м.д.
Сигнал в НАЕЕ- (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>, м.д. (Фиг. 11) и разница сигнала Δ, м.д.
His1
8
3.03/3.13
2.99/3.06
<b>Δ</b><b><u> = 0.04/0.07</u></b>
2.92/2.98Δ<b><u> = 0.11/0.15</u></b>
10
7.19
7.09Δ<b><u> = 0.10</u></b>
6.91Δ<b><u> = 0.28</u></b>
12
8.50
8.25Δ<b><u> = 0.25</u></b>
7.78Δ<b><u> = 0.72</u></b>
Glu3/Glu4
22, 34
2.28
2.16Δ<b><u> = 0.12</u></b>
2.15Δ<b><u> = 0.13</u></b>
Ala2
16
1.27
1.25Δ<b><u> = 0.02</u></b>
1.24Δ<b><u> = 0.03</u></b>
CαH: 15(Ala) 20(Glu) 29(Glu)
4.19
4.18Δ = 0.01
4.17Δ<b><u> = 0.02</u></b>
CβH2: 21(Glu), 33(Glu)
1.99
1.95Δ<b><u> = 0.04</u></b>
1.95Δ<b><u> = 0.04</u></b>
3 (Ас)
1.87
1.86Δ = 0.01
1.86Δ = 0.01
Таблица 2. Данные по стабильности аммониевых солей пептида HAEE в тесте ускоренного хранения (40°С, 75% влажности) в течение 6 месяцев.
Образец
Срок хранения, мес
0
1
2
3
5
6
Содержание действующего вещества в % (метод ВЭЖХ), погрешность 1%
НАЕЕ-NH<sub>4</sub>
100,0
99,8
99,3
99,8
99,4
99,7
НАЕЕ-(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>
100,0
99,2
99,3
99,6
99,7
99,5
НАЕЕ
100,0
97,6
94,2
89,1
81,7
67,4
Таблица 3. Состав фармацевтических композиций с аммониевыми солями (НАЕЕ-NH<sub>4</sub> и HAEE-(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>) пептида HAEE. В/м - внутримышечное введение, в/в - внутривенное введение. 100,0 92,1 71,9
№
Кол-во аммониевой соли НАЕЕ (в пересчете на НАЕЕ), мг
Форма
Вспомогательные вещества
1
0,1
лиофилизат
-
2
0,5
лиофилизат
-
3
1
лиофилизат
-
4
5
лиофилизат
-
5
10
лиофилизат
-
6
25
лиофилизат
-
7
50
лиофилизат
-
8
100
лиофилизат
-
9
0,1
лиофилизат
маннитол - 0,1 мгповидон К 17 - 0,1 мг
10
10
лиофилизат
маннитол -1 мгповидон К 17 - 1 мг
11
50
лиофилизат
маннитол -10 мгповидон К 17 - 17 мг
12
100
лиофилизат
маннитол -100 мгповидон К 17 - 104 мг
13
5
таблетка
лактозы моногидрат - 71 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 100 мг, магния стеарат - 0,5 мг
14
10
таблетка
лактозы моногидрат - 95 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 140 мг, магния стеарат - 0,5 мг
15
25
таблетка
лактозы моногидрат - 105 мг, целлюлоза микрокристаллическая - 180 мг, магния стеарат - 0,5 мг
16
0,1
жидкая, для в/в
набор солей для поддержания осмотического давления 290-310 мОсм/л,вода до 100%
17
0,5
жидкая, для в/в
0,9% - хлорид натрия0,1 М раствор натрия гидроксида - до pH 5,0 - 7,5вода - до 100%
18
1
жидкая, р-р для в/м
0,9% - хлорид натрия0,1 М раствор хлористоводородной кислоты -до pH 5,0-7,5вода - до 100%
19
5
жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 17
20
10
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 18
21
25
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 17
22
50
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 18
23
100
жидкая, р-р для в/в
- Аналогично примеру 18
24
1
жидкая, ингаляционная
0,9% - хлорид натрия,регулятор pH до 5,5-7сахароза - до 5%,гистидин, полоксамер 407 - до 1%вода - до 100%
25
5
жидкая, интроназальная
Аналогично примеру 24
26
10
жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 24
27
25
Жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 24
28
10
жидкая ингаляционная
0,9% - хлорид натрия,регулятор pH до 5,5-7,5вода - до 100%
29
100
жидкая, интроназальная
Аналогично примеру 28
30
1
Жидкая, в/в или в/м
маннитол - 0,5 мг;трометамол - 12 мг;динатрия эдетат - 1 мгвода - до 100%
Таблица 4. Влияние аммониевых солей пептида HAEE на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
№
Группа животных
Количество закопанных шариков более чем на 2/3 (КЗШ), %
Количество амилоидных бляшек на 1 срез мозга, гистологический анализ
1.
Группа 1. Контроль 1. Мыши дикого типа, физиологический раствор
50,6 ± 13,3
отсутствуют
2.
Группа 2. Контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, физиологический раствор
12,6 ± 4,2
31,7 ± 4,9
3.
Группа 3. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE 0,05 мг/кг
20,6 ± 7,3
24,7 ± 3,4
4.
Группа 4. трансгенные мыши APP/PS1, в/в НАЕЕ-NH<sub>4</sub>, 0,05 мг/кг
41,5 ± 9,5
9,5 ± 3,9
5.
Группа 5. трансгенные мыши APP/PS1, в/в НАЕЕ-(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>, 0,05 мг/кг
47,4 ± 10,2
8,9 ± 2,8