РАСТВОР ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ДЛЯ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ И КОНДЕНСИРОВАННЫЙ РАСТВОР
SOLUTION FOR PRELIMINARY PROCESSING FOR IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING AND CONDENSED SOLUTION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к раствору для предварительной обработки и его концентрату для иммуногистохимического окрашивания, причем раствор обеспечивает возможность проведения иммуногистохимического окрашивания за короткий промежуток времени и с меньшими затратами труда, причем иммуногистохимическое окрашивание включает: элюирование содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в качестве антигена, залитого в среду; извлечение антигена; промывание; взаимодействие с антителом; и окрашивание. В частности, настоящее изобретение относится к раствору для предварительной обработки и его концентрату для иммуногистохимического окрашивания, причем раствор функционирует как для элюирования с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, содержащей парафин заливочной среды для иммуногистохимического окрашивания, так и для извлечения антигенности, что обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании, и что поддерживает элюированную заливочную среду, диспергированную в ней, даже после ее первого использования, и может использоваться три или более раз.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
При патоморфологическом исследовании предварительная обработка для депарафинизации и извлечения антигена для иммуногистохимического окрашивания предметного стекла с образцом ткани, обычно включает, как описано в непатентной публикации 1: первую стадию депарафинизации путем пропускания фиксированного формалином, залитого в парафин среза ткани через слой органического растворителя, такого как ксилол, бензол или толуол, 3 раза в течение 3 минут каждый; вторую стадию регидратации покровного стекла и образца ткани путем их пропускания через амфифильный раствор, такой как этанол, 4 раза по 3 минуты каждый; и третью стадию извлечения антигена из регидратированного образца ткани термической обработкой регидратированного образца ткани, погруженного в раствор для извлечения антигена, такой как цитратный буфер или раствор Трис-ЭДТА.
Органические растворители, используемые на первой стадии предварительной обработки, такие как ксилол, бензол или толуол, являются высокотоксичными и летучими, что требует использования оборудования для вытяжной вентиляции, такого как вытяжной шкаф, и оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду, в которой работает задействованный технический персонал.
В качестве замены неблагоприятных органических растворителей, в продаже имеются высокобезопасные агенты для депарафинизации, такие как Hemo-De (торговое название, производимый компанией FALMA), органический растворитель, экстрагированный и очищенный из цитрусовых корок, Clear-Plus и Hemo-Clear (оба торговые названия, производятся компанией FALMA) с использованием алифатических углеводородов (алканов) и Tissue Clear (торговое название, производится компанией SACURA FINETEK JAPAN CO., LTD).
Вместо использования высокобезопасных депарафинизирующих агентов, желательны более удобные способы, где три стадии предварительной обработки выполняются одновременно в одном растворе, и для этого были сделаны некоторые предложения.
Например, в патентном документе 1, предложен способ предварительной обработки, где депарафинизация и извлечение антигена выполняются одновременно нагреванием до температуры, превышающей точку плавления парафина, залитого в парафин образца ткани в растворе, содержащем растворяющий парафин органический растворитель, выбранный из ароматического углеводорода, терпена или изопарафинового углеводорода, полярного органического растворителя, извлекающего антиген компонента и поверхностно-активного вещества. В патентной публикации 1 также указано, что для удаления остаточного поверхностно-активного вещества на стадии промывания, следующей за способом предварительной обработки, в промывающем растворе может содержаться циклодекстрин, который связывается с поверхностно-активным веществом.
С другой стороны, в патентной публикации 1 в примере 7 указано, что когда указанный выше раствор, используемый при предварительной обработке, используется последовательно, то остаточный парафин, элюированный в растворе после предварительной обработки, сцепляется со следующим предметным стеклом, так что этот раствор не подходит для последующего использования.
Кроме того, когда раствор композиции, описанной в патентной публикации 1, приготовлен для получения щелочного рН, при иммуногистохимическом окрашивании после предварительной обработки, предметное стекло со сцепленным с ним образцом ткани имеет склонность к отталкиванию окрашивающего реагента в частях, свободных от образца ткани, что приводит к неравномерному окрашиванию.
В патентных публикациях 2 и 3 указано, что депарафинизация и извлечение антигена могут осуществляться одновременно с использованием раствора, содержащего различные буферы, поверхностно-активные вещества, этиленгликоль и тому подобные, также как в способе предварительной обработки, описанном в патентной публикации 1.
Однако в этих публикациях последовательное использование раствора для предварительной обработки также не предусмотрено, аналогично раствору патентной публикации 1, и в ней нет описания такой технологии, которая используется для диспергирования элюированного парафина в растворе или тому подобной. Таким образом, вероятно, что растворы для предварительной обработки, описанные в этих публикациях, при последовательном применении также имеют такие же проблемы, как те, которые указаны в патентной публикации 1.
Между прочим, некоторые растворы для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, которые одновременно осуществляют депарафинизацию и извлечение антигенов, уже имеются в продаже, такие как растворы, раскрытые в указанных выше патентных публикациях, включая раствор Trilogy для однократного применения (торговое название, производится компанией Cell Marque Corporation), или раствор Target Retrieval Solution pH9 (3-в-1) (торговое название, производится компанией DAKO) для последовательного трехразового применении в пределах одной недели.
Композиции этих имеющихся в продаже продуктов неизвестны, но они не содержат циклодекстрин. Кроме того, во всех таких продуктах, гидрофобный парафин, элюированный в раствор для предварительной обработки во время применения, часто плавает на поверхности раствора.
Такой нерастворимый парафин на поверхности раствора сцепляется с предметным стеклом с образцом ткани, когда оно извлекается из раствора, так что требуется больше стадий промывания перед последующим окрашиванием, что осложняет операцию. В противном случае, нерастворимый парафин оказывает неблагоприятные воздействия на последующее иммуногистохимическое окрашивание. Кроме того, когда окрашивание выполняется в автоматическом устройстве для иммуногистохимического окрашивания, нерастворимый парафин может оказывать неблагоприятное воздействие на устройство для окрашивания.
Публикации уровня техники
Патентные публикации
Патентная публикация 1: JP-2001-505297-А.
Патентная публикация 2: JP-2003-526086-А.
Патентная публикация 3: патент США № 6649368-B1.
Непатентные публикации
th
Непатентный документ 1: “Koso Koutai Hou” (Imminoenzymatic technique), Revised 4 Edition, Watanabe and Nakane, Kakusai Kikaku (2002).
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблемы, подлежащие решению изобретением
Целью настоящего изобретения является получение раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который функционирует при иммуногистохимическом окрашивании как для элюирования содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в форме среза ткани, сцепленного с предметным стеклом, и залитым в среду, так и для извлечения антигенов из образца ткани, который обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании, который поддерживает элюированную заливочную среду диспергированной в нем после его первого применения, который может использоваться три или более раз последовательно и который характеризуется высокой безопасностью.
Другой целью настоящего изобретения является получение раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, который разрешает указанные выше проблемы и который, после окрашивания вслед за обработкой раствором содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани в форме среза ткани, сцепленным с предметным стеклом и залитым в среду, и извлечения антигенов из образца ткани, ингибирует отталкивание окрашивающего реагента на части предметного стекла без образца ткани для предотвращения посредством этого неравномерного окрашивания.
Другой целью настоящего изобретения является получение концентрата раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, из которого можно легко получить раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, достигая указанные выше цели.
Средства для решения проблем
Заявители провели интенсивные исследования для достижения указанных выше целей. Во-первых, исследователи были нацелены на получение растворов для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, которые из соображений безопасности не содержат обычные органические растворители, такие как ксилол, бензол или толуол, и которые главным образом составлены из воды с учетом среды и других факторов. В этом отношении исследователи изучали различные поверхностно-активные вещества в качестве компонента раствора для предварительной обработки, который оказывает и эффекты достаточного элюирования содержащей парафин заливочной среды с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и ингибирования плавания элюированной заливочной среды на поверхности раствора для диспергирования среды в растворе с целью обеспечения возможности последующего использования раствора для предварительной обработки.
В результате, было выявлено, что указанные выше два эффекта невозможно получить одновременно только одним поверхностно-активным веществом, что эти два эффекта могут быть получены в некоторой степени при использовании двух определенных поверхностно-активных веществ, но если получен щелочной раствор для предварительной обработки, и он используется последовательно три раза или более, то вероятно отталкивание красящего агента на части предметного стекла без образца, что приводит к неравномерному окрашиванию на стадии окрашивания после использования последовательно использованного раствора для предварительной обработки.
Затем, был предпринят поиск компонентов, которые, как считалось, решают такие проблемы, путем комбинирования двух определенных поверхностно-активных веществ с различными полимерными соединениями.
Кроме того, для подтверждения способности одного раствора одновременно элюировать заливочную среду и извлекать антигены и оказывать небольшой эффект на интенсивность окрашивания на стадии окрашивания, для решения указанных выше проблем были исследованы различные комбинации компонентов с обычными агентами для извлечения антигенов.
Кроме того, исследователи были нацелены на применение циклодекстрина и его производных, которые не использовались в растворе для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, но, как было описано в патентной публикации 1, способны удалять остаточные поверхностно-активные вещества при их содержании в промывающем растворе, используемом после раствора для предварительной обработки.
В результате, посредством экспериментирования было выявлено, что когда циклодекстрин или его производное добавляется в количестве 2% масс. в раствор для предварительной обработки наряду с двумя указанными выше определенными поверхностно-активными веществами и агентом для извлечения антигена, то действие самих поверхностно-активных веществ ингибировалось, возможно, вследствие связывания с поверхностно-активными веществами, как описано в патентной публикации 1, диспергируемость заметно ухудшалась, и проблема нерастворимого парафина возникала снова, и ее следовало решать. Кроме того, интенсивность окрашивания на стадии окрашивания значительно снижалась, и ожидаемый эффект невозможно было достичь. Однако неожиданно было подтверждено, что циклодекстрин или его производное в определенном содержании может предотвратить ингибирование действия поверхностно-активных веществ, может ингибировать ухудшение интенсивности окрашивания и может решить различные указанные выше проблемы.
Кроме того, было обнаружено, что когда амфифильный раствор добавлялся к указанной выше композиции, то интенсивность окрашивания дополнительно усиливалась, и можно было дополнительно улучшить эффект ингибирования отталкивания окрашивающего реагента, который, в противном случае, возникает, когда раствор для предварительной обработки является щелочным.
В соответствии с настоящим изобретением получен раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания для элюирования содержащего парафин заливочного раствора с предметного стекла с образцом ткани, залитым в указанную среду, и для извлечения антигенности указанного образца ткани, причем указанный раствор для предварительной обработки может использоваться три или более раз, причем указанный раствор для предварительной обработки содержит агент для извлечения антигенов, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир и циклодекстрин или его производное, причем остальное количество составляет не менее чем 80% масс. воды, где содержание указанного агента для извлечения антигенов таково, что pH указанного раствора для предварительной обработки составляет от 5,0 до 10,0, и содержание указанного циклодекстрина или его производного составляет от 0,01 до 1,0% масс., и где указанный раствор для предварительной обработки необязательно содержит амфифильный раствор.
В соответствии с настоящим изобретением также получен концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, содержащий меньше воды, чем указанный выше раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный раствор для предварительной обработки предназначен для использования в качестве раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания при заданном pH путем добавления к нему заданного количества воды при использовании.
В соответствии с настоящим изобретением, кроме того, получен указанный выше концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный заданный pH составляет от 5,0 до 7,0, и где указанный концентрат раствора для предварительной обработки поставляется одной частью.
В соответствии с настоящим изобретением также получен указанный выше концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания, где указанный концентрат раствора для предварительной обработки поставляется в двух частях и состоит из первого концентрата раствора, содержащего агент для извлечения антигенов, и второго концентрата раствора, содержащего неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтиленсорбитан, циклодекстрин или его производное и, необязательно, амфифильный раствор, и где указанный концентрат раствора для предварительной обработки предназначен для применения путем смешивания указанного первого концентрата раствора, указанного второго концентрата раствора и заданного количества воды для установки указанного заданного pH от 8,0 до 10,0.
Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением содержит агент для извлечения антигенов, два определенных поверхностно-активных вещества и определенное содержание циклодекстрина или его производного и в качестве остальной части не менее чем 80% масс. воды. Таким образом, раствор функционирует и для элюирования содержащей парафин заливочной среды, используемой при иммуногистохимическом окрашивании, с предметного стекла с образцом ткани, залитым в среду, и для извлечения антигенности образца ткани; обеспечивает возможность достаточной интенсивности окрашивания при последующем иммуногистохимическом окрашивании; поддерживает диспергированную в нем элюированную заливочную среду даже после первого использования для предотвращения появления нерастворимого парафина на поверхности раствора после использования; и может использоваться три или более раз последовательно. Кроме того, настоящий раствор для предварительной обработки, не содержащий органических растворителей, таких как ксилол, имеет высокую безопасность и экологические преимущества. Кроме того, даже при получении в виде щелочного раствора, раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением все же ингибирует отталкивание окрашивающего реагента.
Поэтому, путем использования раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, иммуногистохимическое окрашивание может проводиться в течение короткого периода времени и с меньшими затратами труда.
Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, когда он дополнительно содержит амфифильный раствор, обеспечивает возможность еще более усиленной интенсивности окрашивания и обеспечивает еще лучший эффект ингибирования отталкивания окрашивающего реагента.
Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, содержащий меньше воды, чем раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, может легко использоваться в качестве раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания при заданном pH путем добавления заданного количества воды при использовании.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Теперь настоящее изобретение будет объяснено подробно.
Раствор для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания и концентрат этого раствора в соответствии с настоящим изобретением предназначены для так называемого иммуногистохимического окрашивания, при котором специфическое вещество (антиген), присутствующий в нормальной или опухолевой тканях или клетках живых организмов, выявляется на основании специфической реакции антиген-антитело для патоморфологической диагностики.
Образцы ткани, подлежащие иммуногистохимическому окрашиванию, обычно фиксированы формалином, спиртом и тому подобными веществами, и залиты в заливочную среду, содержащую парафин, для длительного хранения. Получают срезы такого фиксированного формалином, залитого в парафин блока и сцепляют их с предметным стеклом для иммуногистохимического окрашивания, депарафинизации и извлечения антигенов, которые должны проводиться в зависимости от вида первичного антигена, который предстоит использовать.
Общие процедуры для депарафинизации и извлечения антигенов включают три стадии, т.е. депарафинизацию, например, фиксированного формалином залитого в парафин образца ткани, как указано выше, органическим раствором, таким как ксилол, бензол или толуол; регидратацию депарафинизированного образца ткани амфифильным раствором, таким как этанол, и извлечение антигенов, присутствующих в регидрированном депарафинизированном образце ткани. После этих стадий проводят иммуногистохимическое окрашивание, включая промывание и окрашивание.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность одновременного проведения трехэтапной предварительной обработки в одном растворе, т.е. растворе для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания. Растворы для предварительной обработки, используемые таким образом, ранее были предложены и имелись в продаже, но большинство из них предназначалось для однократного применения, и немногие из них могут использоваться три или более раз последовательно, например, последовательно примерно от трех до четырех раз. Настоящее изобретение относится к получению такого раствора для предварительной обработки и его концентрату, которые могут использоваться три раза или более, предпочтительно, от трех до пяти раз.
Раствор для предварительной обработки в соответствии с настоящим изобретением содержит не менее чем 80% масс., предпочтительно, не менее чем 85% масс., более предпочтительно, не менее чем 90% масс. воды, не содержит обычно применяемые органические растворители, такие как ксилол, из-за опасений относительно безопасности, и содержит извлекающий антигены агент, два определенных неионных поверхностно-активных вещества, и циклодекстрин или его производное. Вода предпочтительно представляет собой деионизированную воду. В данном случае это содержание воды включает любое содержание влаги других компонентов.
Агент, извлекающий антигены, конкретно не ограничивается, пока он является обычным и обеспечивает возможность извлечения антигенности термической обработкой, и могут быть соответственно выбраны агенты, способные регулировать pH в зависимости от ткани, подлежащей обработке. Примеры агента, извлекающего антигены, могут включать различные буферные растворы, такие как цитратные буферы, Трис-буферы, SSC (солевые, натриево-цитратные) буферы и указанные соединения, смешанные с хелатирующим агентом, таким как ЭДТА.
Содержание извлекающего антигены агента может быть соответственно выбрано в зависимости от подлежащей обработке ткани с тем, чтобы pH раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению укладывался в пределы диапазона от 5,0 до 10,0, предпочтительно от 6,0 до 9,0.
Два конкретных поверхностно-активных вещества представляют собой неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен (далее обозначаемый аббревиатурой POE)-алкилфенилэфир и неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан.
В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению, неионное поверхностно-активное вещество POE-алкилфенилэфир, главным образом, участвует в депарафинизации и может предпочтительно представлять собой, например, по меньшей мере, одно из NP-40, Тритона X-100, Тритона X-104 или IGEPAL CA-630.
Содержание неионного поверхностно-активного вещества POE-алкилфенилэфира может быть соответственно выбрано с учетом указанной выше функции и обычно составляет от 0,01 до 1,0% масс., предпочтительно, от 0,01 до 0,5% масс., более предпочтительно, от 0,05 до 0,3% масс. При слишком низком содержании неионного поверхностно-активного вещества POE-алкилфенилэфира, эффект депарафинизации может быть небольшим, тогда как при слишком высоком содержании может быть трудно поддерживать заданную температуру при нагревании для извлечения антигенов, что будет обсуждено ниже.
В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан главным образом выполняет функцию поддержания дисперсии в нем элюированного парафина в течение трех или более раз использования, посредством взаимодействия с циклодекстрином или его производным, что будет обсуждено ниже. Неионное поверхностно-активное вещество POE-сорбитан может представлять собой, по меньшей мере, одно из Твина 20, Твина 40 или Твина 80.
Содержание неионного поверхностно-активного вещества POE-сорбитана может быть соответственно выбрано с учетом указанной выше основной функции и обычно составляет от 0,3 до 3,0% масс., предпочтительно, от 0,5 до 1,5% масс., более предпочтительно, от 0,5 до 1,0% масс. При слишком низком содержании неионного поверхностно-активного вещества POE-сорбитана может нарушаться диспергируемость парафина при последовательном использовании, тогда как при слишком высоком содержании может быть трудно поддерживать заданную температуру при нагревании для извлечения антигенов, что будет обсуждено ниже.
В растворе для предварительной обработки по настоящему изобретению циклодекстрин или его производное главным образом участвует в ингибировании отталкивания окрашивающего реагента предметным стеклом на стадии окрашивания после предварительной обработки, а также при поддержании элюированного парафина диспергированным в растворе для предварительной обработки. Циклодекстрин или его производное может представлять собой, по меньшей мере, одно из α-, β- и γ-циклодекстрина, которые представляют собой натуральные продукты, в частности, с улучшенной растворимостью в воде путем добавления гидроксильной группы и т.п. Предпочтительные примеры могут включать гидроксиалкилциклодекстрины, такие как гидроксиалкил-α-циклодекстрин, гидроксиалкил-β-циклодекстрин и гидроксиалкил-γ-циклодекстрин, причем особенно предпочтителен гидроксиалкил-β-циклодекстрин. Алкил может представлять собой, например, этил или пропил.
Содержание циклодекстрина или его производного составляет от 0,01 до 1,0% масс., предпочтительно, от 0,05 до 0,5% масс, более предпочтительно, от 0,05 до 0,3% масс. При содержании циклодекстрина или его производного менее чем 0,01% масс. нельзя достичь эффекта ингибирования отталкивания окрашивающего реагента предметным стеклом. С другой стороны, при содержании более 1,0% масс. происходит неблагоприятное воздействие на указанный выше эффект поддержания элюированного парафина диспергированным в растворе для предварительной обработки, и ингибируется эффект поверхностно-активного вещества. Также ингибируется извлечение антигенов и невозможно достичь достаточной интенсивности окрашивания. Таким образом, необходимо внимательно следить за верхним пределом содержания циклодекстрина или его производного, поскольку может ингибироваться желательный эффект настоящего изобретения.
Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может необязательно содержать другие компоненты, в дополнение к указанным выше основным компонентам, с целью улучшения желательных эффектов или проявления других эффектов без ингибирования желательных эффектов настоящего изобретения.
В качестве таких других компонентов, амфифильный раствор может предпочтительно содержаться для возможности обеспечения улучшенной интенсивности окрашивания при окрашивании после предварительной обработки и для дополнительного улучшения эффекта ингибирования отталкивания окрашивающего реагента от предметного стекла комбинацией с циклодекстрином или его производным.
Амфифильный раствор конкретно не ограничивается, пока можно ожидать улучшения указанных выше эффектов, и может предпочтительно представлять собой, например, по меньшей мере, одно из этиленгликоля, пропиленгликоля или 1,3-бутиленгликоля. Среди них этиленгликоль имеет особые преимущества для использования три или более последовательных раз, поскольку, в дополнение к улучшению указанных выше эффектов, он оказывает эффект ингибирования повторного сцепления с предметным стеклом мелких частиц элюированного парафина, диспергированных в растворе для предварительной обработки.
Содержание амфифильного раствора, если он входит в состав раствора для предварительной обработки в соответствии с настоящим изобретением, может соответственно выбираться с учетом его эффекта и может обычно составлять от 1,0 до 5,0% масс., предпочтительно, от 2,0 до 4,0% масс. При слишком низком содержании амфифильного раствора ожидаемое улучшение эффектов может не быть достигнуто, тогда как при слишком высоком содержании может неблагоприятно подавляться эффект ингибирования нерастворимого парафина, который является одним из эффектов раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению.
Другие компоненты могут дополнительно включать, кроме амфифильного раствора, по меньшей мере, один из консервантов и дезинфицирующих средств, таких как азид натрия, тимеросал, гентамицин, ProClin (торговое название, производимый SUPELCO), п-гидроксибензоаты (парабен), бензалконий хлорид и циклопиридиния хлорид. Содержание таких других компонентов может быть соответственно выбрано с учетом их функций, пока не ингибируются эффекты настоящего изобретения.
Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением предназначен для получения указанного выше раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению, содержит меньше воды, чем раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению, и предназначен для использования при заданном pH путем добавления к нему заданного количества воды при использовании.
Уровень концентрации может быть соответственно выбран и может обычно быть 5-20-кратным, предпочтительно, 5-10-кратным.
Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, когда заданный pH составляет от 5,0 до 7,0, предпочтительно поставляется в одной части для улучшенной устойчивости при хранении.
С другой стороны, когда заданный pH составляет от 8,0 до 10,0, то концентрат раствора для предварительной обработки может поставляться в двух частях и составлен из первого концентрата раствора, содержащего извлекающий антигены агент и, необязательно, консервант, и второго концентрата раствора, содержащего неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-алкилфенилэфир, неионное поверхностно-активное вещество полиоксиэтилен-сорбитан, циклодекстрин или его производное и, необязательно, амфифильный раствор и буфер.
Концентрат раствора для предварительной обработки для иммуногистохимического окрашивания в соответствии с настоящим изобретением, поставляемый или в одной, или в двух частях, может быть превращен в раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению смешиванием с заданным количеством воды, такой как деионизированная вода, для установки на заданный уровень pH.
Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может использоваться или в ручном способе, или в автоматизированном устройстве. В частности, удобно и предпочтительно использование автоматизированного устройства с регулируемой температурой или автоматического устройства для иммуногистохимического окрашивания.
Предварительная обработка для иммуногистохимического окрашивания с использованием раствора для предварительной обработки по настоящему изобретению может проводиться, например, введением образца, такого как предметное стекло с образцом ткани, залитом в содержащую парафин заливочную среду, в раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению, температура которого регулируется обычно от 20 до 70°C, предпочтительно, до уровня не ниже чем точка плавления заливочной среды, такой как парафин, и встряхиванием системы множество раз для содействия депарафинизации. В этот момент обычно следует подтвердить удаление парафина.
Затем, температуру раствора для предварительной обработки поднимают для стимуляции извлечения антигенов в условиях необязательного повышения давления для укорочения времени реакции. Температура обычно составляет от 80 до 130°C, предпочтительно, от 90 до 120°C, и время удерживания при такой температуре составляет обычно от 1 до 70 минут, предпочтительно, примерно от 5 до 60 минут.
После обработки при повышенной температуре температура раствора для предварительной обработки снова снижается до примерно 20-70°C, и систему встряхивают для завершения посредством этого предварительной обработки.
Раствор для предварительной обработки по настоящему изобретению может использоваться три или более, обычно, от трех до пяти, предпочтительно, от трех до четырех последовательных раз, с тем, чтобы предварительная обработка следующего образца ткани могла проводиться аналогичным образом используемым раствором для предварительной обработки, и если раствор предназначен для пятиразового использования, то аналогичные результаты окрашивания могут быть получены от первой и пятой предварительной обработки.
Предварительно обработанное предметное стекло может быть подвергнуто иммуногистохимическому окрашиванию путем выполнения последующей стадии промывания и стадии иммуногистохимического окрашивания посредством обычных способов.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение будет подробнее объяснено со ссылкой на примеры, контрольные примеры и сравнительные примеры, которые не ограничивают настоящее изобретение.
В приведенных ниже примерах, оценки проводили следующим образом.
Предмет оценки (1): Возможно или невозможно одновременное проведение депарафинизации и извлечения антигенов в одном растворе для предварительной обработки.
Оценки были обозначены как «Y» для возможных оценок и «N» для невозможных оценок.
Предмет оценки (2): Визуальное наблюдение нерастворимого парафина на поверхности раствора после депарафинизации и извлечения антигена раствором для предварительной обработки.
Оценки были обозначены в виде 5 баллов для растворов с налетом на поверхности, 4 балла для растворов с небольшим налетом на поверхности, 3 балла для растворов с небольшими массами налета на поверхности, 2 балла для растворов со смешанными небольшими и большими массами налета на поверхности и 1 балл для растворов с большими массами налета на поверхности (результаты представлены в виде средней величины трех раз использования).
Предмет оценки (3): Визуальное наблюдение отталкивания реагента для иммуногистохимического окрашивания на предметном стекле.
Оценки были обозначены в виде 5 баллов для наблюдений без отталкивания, 4 балла для наблюдений с несколькими мелкими частями отталкивания, 3 балла для наблюдений с множественными мелкими частями отталкивания, 2 балла для наблюдений со смешанными мелкими и крупными частями отталкивания и 1 балл для наблюдений с крупными частями отталкивания или серьезными проблемами.
Предмет оценки (4): Интенсивность окрашивания, наблюдаемая под оптическим микроскопом
Оценки обозначались в виде двух 2 баллов для наблюдений с более высокой интенсивностью, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 1 балл для наблюдений с несколько более высокой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3, 0 баллов для наблюдений с интенсивностью, сравнимой с с контрольными примерами 1-3, -1 балл для наблюдений с несколько более низкой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3 и -2 балла для наблюдений с более низкой интенсивностью по сравнению с контрольными примерами 1-3.
Предмет оценки (5): Толщина ткани после депарафинизации и извлечения антигенов раствором для предварительной обработки (чем тоньше ткань, тем больше парафина и тому подобных материалов, присутствующих внутри образца ткани было достаточно элюировано).
Оценки обозначались в виде 5 баллов для наблюдений, сравнимых с контрольными примерами 1-3, 4 баллов для наблюдений, где образцы ткани были несколько толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 3 баллов для наблюдений, где образцы ткани были слегка толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3, 2 баллов для наблюдений, где образцы ткани были толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3 и 1 балла для наблюдений, где образцы ткани были значительно толще, по сравнению с контрольными примерами 1-3.
Предмет оценки (6): Определение того, возможны ли или нет три последовательных раза использования раствора для предварительной обработки с точки зрения предметов оценки (1)-(5).
Оценки обозначались как «Y» для случаев возможной оценки и «N» для случаев невозможной оценки.
Контрольные примеры 1-3
(депарафинизацию, регидратацию и извлечение антигенов проводили отдельно в соответствии с обычной практикой)
(A) Предварительная обработка
Депарафинизация и регидратация
Получали срезы толщиной 3 мкм фиксированной формалином, залитой в парафин ткани небных миндалин, прикрепляли к покрытым предметным стеклам (покрытие MAS (силикат магния алюминия), выпускаемое компанией MATSUNAMI GLASS IND., LTD.) и сушили при 37°C в течение 18 часов. Предметное стекло депарафинизировали трехминутным отстаиванием в слое ксилола три раза и затем регидратировали трехминутным отстаиванием в слое этанола четыре раза. После конечного отстаивания в слое этанола предметное стекло промывали в фосфатном буфере при pH 7,6 три раза в течение трех минут каждый.
Извлечение антигенов
Регидратированное и промытое предметное стекло помещали в термоустойчивый контейнер, заполненный цитратным буфером с pH 6,0 (контрольный пример 1), цитратным буфером с pH 7,0 (контрольный пример 2) или буфером Трис-HCl с pH 9,0, содержащим ЭДТА (контрольный пример 3), причем ни один из буферов не содержал поверхностно-активные вещества. Каждый термоустойчивый контейнер помещали в настольный автоклав (выпускаемый компанией ALP CO., LTD) и автколавировали при 121°C в течение 20 минут. После автоклавирования каждый термоустойчивый контейнер извлекали и оставляли для отстоя при комнатной температуре в течение 20 минут для извлечения антигенности.
(B) Промывание
После завершения 20-минутного отстаивания, предментное стекло переносили в фосфатный буфер с pH 7,6 и промывали пятиминутным отстаиванием три раза.
(C) Иммуногистохимическое окрашивание
(1) Ручное иммуногистохимическое окрашивание
Предметное стекло, подвергнутое стадии промывания (B), помещали в 3% раствор пероксида водорода/метанола, слегка встряхивали и оставляли для отстоя в течение 10 минут. Затем предметное стекло переносили в фосфатный буфер с pH 7,6 и промывали пятиминутным отстаиванием три раза.
Влагу удаляли из полученного в результате предметного стекла и маркером PAP PEN (выпускаемый компанией DAIDO SANGYO Co., LTD.) рисовали круг вокруг образца ткани. Затем, в качестве первичного антитела на предметное стекло по каплям добавляли CD3 кроличье моноклональное антитело (SP7) (торговое название, выпускаемое компанией NICHIREI BIOSCIENCES INC.), и реакцию проводили при 25°C в течение 60 минут. После завершения реакции, предметное стекло переносили в фосфатный буфер с pH 7,6 и промывали пятиминутным отстаиванием три раза.
Затем влагу удаляли с промытого предметного стекла, и на предметное стекло по каплям добавляли краситель Histofine Simple Stain MAX-PO (MULTI) (торговое название, выпускаемый компанией NICHIREI BIOSCIENCE INC.) в качестве вторичного антитела, и реакцию проводили при 25°C в течение 30 минут. После завершения реакции предметное стекло переносили в фосфатный буфер с pH 7,6 и промывали пятиминутным отстаиванием три раза.
После промывания, на предметное стекло, лишенное влаги, добавляли раствор DAB (диметиламиноазобензол), полученный с использованием набора субстрата DAB (торговое название, выпускаемого компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.) в качестве хромогенного субстрата, и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 5 минут. Предметное стекло промывали в проточной воде в течение 5 минут, удаляли влагу, проводили реакцию с гематоксилином Майера в течение 30 секунд для проявления цвета и промывали в проточной воде в течение 5 минут.
Затем влагу удаляли, и предметное стекло подвергали дегидратации и очистке пропусканием через слой этанола три раза, однократному трехминутному отстаиванию в слое этанола, однократному пропусканию через слой ксилола и двукратному пятиминутному отстаиванию в слое ксилола и затем помещали в неводную среду для гистологического среза (выпускаемой компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.).
Иммуногистохимическое окрашивание в автоматическом устройстве для иммуногистохимического окрашивания
(2)
Предметное стекло, подвергнутое стадии промывания (B), устанавливали в штатив для предметных стекол автоматического устройства для иммуногистохимического окрашивания, HISTOSTAINER (торговое название, выпускаемого компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.) (далее именуемого HISTOSTAINER). Ткань покрывали фосфатным буфером с pH 7,6 для предотвращения высыхания. Предметное стекло, установленное в устройство, промывали в PBS для HISTOSTAINER и сушили воздухом. Трехпроцентный раствор пероксида водорода (выпускаемый компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.) по каплям добавляли на предметное стекло в устройстве и подвергали реакции в течение 5 минут.
После завершения реакции предметное стекло промывали PBS для HISTOSTAINER и сушили воздухом. CD3 кроличье моноклональное антитело (SP7) (торговое название, выпускаемое компанией NICHIREI BIOSCIENCES INC.) в качестве первичного антитела по каплям добавляли на предметное стекло, и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции предметное стекло дважды промывали PBS для HISTOSTAINER. После воздушной сушки на предметное стекло по каплям добавляли краситель HISTOFINE SIMPLE STAIN MAX-PO (MULTI) для HISTOSTAINER (торговое название, выпускаемый компанией NICHIREI BIOSCIENCES INC.) в качестве вторичного антитела и реакцию проводили при комнатной температуры в течение 30 минут. После завершения реакции предметное стекло дважды промывали PBS для HISTOSTAINER.
Затем на предметное стекло в качестве хромогенного субстрата, полученного с использованием набора субстрата DAB (торговое название, выпускаемого компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.), добавляли раствор DAB, и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 10 минут. После завершения реакции предметное стекло однократно промывали в PBS для HISTOSTAINER и однократно споласкивали в воде. Окрашенное предметное стекло извлекали и промывали в проточной воде в течение 5 минут. После этого влагу удаляли и на предметное стекло воздействовали гематоксилином Майера в течение 30 секунд с последующим промыванием в проточной воде в течение 5 минут.
Затем влагу удаляли, и предметное стекло подвергали дегидратации и очистке пропусканием через слой этанола три раза, однократному трехминутному отстаиванию в слое этанола, однократному пропусканию через слой ксилола и двукратному пятиминутному отстаиванию в слое ксилола и затем помещали в неводной среде для гистологического среза (выпускаемой компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.).
Пример 1: Получение раствора для предварительной обработки при pH 9,0 без амфифильного раствора
Получали десятикратный концентрат раствора буфера Трис-HCl, содержащий ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
(A) Предварительная обработка
Депарафинизация и извлечение антигена
Полученный выше раствор для предварительной обработки помещали в автоматическое устройство с регулируемой температурой PTModule (торговое название, выпускаемое компанией THERMO FISHER SCIENTIFIC K.K.) (далее сокращенно именуемое PTModule) и нагревали до 65°C.
С другой стороны, получали срезы толщиной 3 мкм фиксированной формалином, залитой в парафин ткани небных миндалин, прикрепляли к покрытым предметным стеклам (покрытие MAS, выпускаемое компанией MATSUNAMI GLASS IND., LTD.) и сушили при 37°C в течение 18 часов. Предметное стекло устанавливали в штатив для предметных стекол автоматического устройства для иммуногистохимического окрашивания HISTOSTAINER.
Когда температура раствора в PTModule достигала 65°C, крышку открывали, и штатив для предметных стекол, в который было установлено предметное стекло, помещали в раствор и встряхивали несколько раз. Штатив извлекали из раствора для подтверждения того, что на предметном стекле не остался парафин, и затем устанавливали в PTModule и закрывали крышкой. Предметное стекло подвергали термообработке в PTModule в соответствии с предварительно установленной программой (температуру раствора поднимали от 65°C до 100°C, удерживали на уровне 100°C в течение 40 минут и снижали до 65°C).
(B) Промывание
После завершения термообработки, предметное стекло при установке в штатив для предметных стекол, слегка встряхивали, затем переносили в фосфатный буфер с pH 7,6, содержащий 0,05% масс. Твин 20, и оставляли для отстаивания в течение 5 минут. Проводили визуальные наблюдения для выявления какого-либо остаточного парафина на образце ткани или предметном стекле (наблюдался ли какой-либо остаточный парафин, который невозможно было удалить промыванием), и какого-либо нерастворимого парафина на поверхности раствора, после того как раствор для предварительной обработки оставляли для охлаждения до комнатной температуры после предварительной обработки.
(C) Иммуногистохимическое окрашивание в автоматическом устройстве для иммуногистохимического окрашивания
Предметное стекло, установленное в штатив для HISTOSTAINER и подвергнутое стадии промывания (B), устанавливали в HISTOSTAINER без дополнительных воздействий, промывали в PBS для HISTOSTAINER и сушили воздухом. Трехпроцентный раствор пероксида водорода (выпускаемый компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.) по каплям добавляли на предметное стекло и подвергали реакции в течение 5 минут.
После завершения реакции предметное стекло промывали PBS для HISTOSTAINER и сушили воздухом. CD3 кроличье моноклональное антитело (SP7) (для HISTOSTAINER) (торговое название, выпускаемое компанией NICHIREI BIOSCIENCES INC.) в качестве первичного антитела по каплям добавляли на предметное стекло, и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. После завершения реакции, предметное стекло дважды промывали PBS для HISTOSTAINER. После воздушной сушки на предметное стекло по каплям добавляли краситель HISTOFINE SIMPLE STAIN MAX-PO (MULTI) (для HISTOSTAINER) (торговое название, выпускаемый компанией NICHIREI BIOSCIENCES INC.) в качестве вторичного антитела, и реакцию проводили при комнатной температуры в течение 30 минут. После завершения реакции предметное стекло дважды промывали PBS для HISTOSTAINER.
Затем на предметное стекло в качестве хромогенного субстрата, полученного с использованием набора субстрата DAB (для HISTOSTAINER) (торговое название, выпускаемый компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.), добавляли раствор DAB, и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 10 минут. После завершения реакции предметное стекло однократно промывали в PBS для HISTOSTAINER и однократно споласкивали в воде. Окрашенное предметное стекло извлекали и промывали в проточной воде в течение 5 минут. После этого, влагу удаляли и на предметное стекло воздействовали гематоксилином Майера в течение 30 секунд с последующим промыванием в проточной воде в течение 5 минут.
Влагу удаляли, и предметное стекло подвергали дегидратации и очистке пропусканием через слой этанола три раза, однократному трехминутному отстаиванию в слое этанола, однократному пропусканию через слой ксилола и двукратному пятиминутному отстаиванию в слое ксилола и затем помещали в неводную среду для гистологического среза (выпускаемая компанией NICHEREI BIOSCIENCES INC.).
Указанные выше стадии (A)-(C) повторяли три раза без замены раствора для предварительной обработки. Результаты указанных выше оценок на третий раз показаны в таблице 1 вместе с результатами контрольных примеров 1-3, которые были результатами одной обработки.
Пример 2: Получение раствора для предварительной обработки при pH 9,0, содержащего амфифильный раствор
Получали десятикратный концентрат раствора буфера Трис-HCl, содержащего ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. и этиленгликоль в конечной концентрации 3,0% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки проводили таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. Результаты показаны в таблице 1.
К тому же, оценки также проводили таким же образом как в примере 2 с α-, β- или γ-циклодекстрином вместо гидроксипропил-β-циклодекстрина, для получения аналогичных результатов. Было выявлено, что гидроксипропил-β-циклодекстрин был наиболее предпочтителен с точки зрения легкости манипулирования, поскольку α- и β-циклодекстрин были не растворимы при комнатной температуре, и их эффекты не проявлялись до растворения после термической обработки.
Пример 3: Получение раствора для предварительной обработки с pH 6,0 без амфифильного раствора
Получали десятикратный концентрат цитратного буфера и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 6,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. и этиленгликоль в конечной концентрации 3,0% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. Результаты показаны в таблице 1.
Пример 4: Получение раствора для предварительной обработки с pH 6,0, содержащего амфифильный раствор
Получали десятикратный концентрат цитратного буфера и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 6,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. и этиленгликоль в конечной концентрации 3,0% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. Результаты показаны в таблице 1.
Пример 5: Получение раствора для предварительной обработки с pH 7,0 без амфифильного раствора
Получали десятикратный концентрат цитратного буфера и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 7,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. и этиленгликоль в конечной концентрации 3,0% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. Результаты показаны в таблице 1.
Пример 6: Получение раствора для предварительной обработки с pH 7,0, содержащего амфифильный раствор
Получали десятикратный концентрат цитратного буфера и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 7,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и гидроксипропил-β-циклодекстрин в конечной концентрации 0,1% масс. и этиленгликоль в конечной концентрации 3,0% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. Результаты показаны в таблице 1.
Сравнительный пример 1: Получение раствора для предварительной обработки с pH 9,0 без амфифильного раствора и цилодекстрина
Получали десятикратный концентрат Трис-HCl буфера, содержащего ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные, для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше. В данном случае, раствор для предварительной обработки сравнительного примера 1 невозможно было использовать последовательно, так что результаты второго использования показаны в таблице 1.
Сравнительный пример 2: Получение раствора для предварительной обработки с pH 9,0 без цилодекстрина
Получали десятикратный концентрат Трис-HCl буфера, содержащего ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации 1,0% масс., оба неионные поверхностно-активные вещества, и полиэтиленгликоль в конечной концентрации 30% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Полученный таким образом концентрат раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем проводили стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали раствором, полученным выше.
Сравнительные примеры 3 и 4: Получение раствора для предварительной обработки с pH 9,0 без циклодекстрина
Растворы для предварительной обработки получали таким же образом как в сравнительном примере 2, за исключением того, что этиленгликоль замещали пропиленгликолем (сравнительный пример 3) или 1,3-бутиленгликолем (сравнительный пример 4), и стадии с (A) по (C), и оценки выполняли таким же образом как в примере 1.
<b>Таблица 1</b>
Предмет оценки (1)
Предмет оценки (2)
Предмет оценки (3)
Предмет оценки (4)
Предмет оценки (5)
Предмет оценки (6)
Контрольный пример 1
-
-
5 баллов
0 баллов
5 баллов
-
Контрольный пример 2
-
-
5 баллов
0 баллов
5 баллов
-
Контрольный пример 3
-
-
5 баллов
0 баллов
5 баллов
-
Пример 1
Y
5 баллов
4 балла
0 баллов
4 балла
Y
Пример 2
Y
4,5 балла
4 балла
2 балла
4 балла
Y
Пример 3
Y
4,5 балла
5 баллов
0 баллов
4 балла
Y
Пример 4
Y
4,5 балла
5 баллов
2 балла
4 балла
Y
Пример 5
Y
4,5 балла
5 баллов
0 баллов
4 балла
Y
Пример 6
Y
4,5 балла
5 баллов
2 балла
4 балла
Y
Сравнительный пример 1
Y
5 баллов
1 балл
0 баллов
4 балла
N
Сравнительный пример 2
Y
4,5 балла
2 балла
2 балла
4 балла
N
Сравнительный пример 3
Y
4 балла
2 балл
0 баллов
4 балла
N
Сравнительный пример 4
Y
4 балла
2 балла
1 балл
4 балла
N
Результаты, показанные в таблице 1, демонстрируют, что растворы для предварительной обработки сравнительных примеров 1-4 без циклодекстрина невозможно использовать последовательно ввиду отталкивания окрашивающего агента предметными стеклами (предмет оценки (3)). При использовании растворов для предварительной обработки сравнительных примеров 2-4, содержащих амфифильный раствор, отталкивание несколько устранялось, по сравнению со сравнительным примером 1, но растворы для предварительной обработки не обладали свойствами выдерживать использование три или более последовательных раз. В отличие от этого, растворы примеров можно было использовать три раза последовательно. В частности, видно, что с амфифильным раствором интенсивность окрашивания (предмет оценки (4)) имел тенденцию к большему улучшению.
К тому же, было подтверждено, что в примере 2, когда Тритон X был замещен NP-40, Тритоном X-114 или IGEPAL CA-630, и Твин 20 был замещен Твином 40 или Твином 80, были достигнуты аналогичные эффекты.
Контрольный сравнительный пример 1: Получение раствора для предварительной обработки с pH 9,0, исследование с одним неионным поверхностно-активным веществом
Получали десятикратный концентрат раствора буфера Трис-HCl, содержащего ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли каждое из неионных поверхностно-активных веществ, как показано в таблице 2, в конечной концентрации 0,1% масс. для получения посредством этого концентрата раствора для предварительной обработки.
Каждый из полученных таким образом концентратов раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем однократно проводили стадии с (A) по (C), и оценки проводили в отношении предметов оценки (1)-(4) таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали растворами, полученными выше. Результаты показаны в таблице 2.
<b>Таблица 2</b>
Вид поверхностно-активного вещества
Предмет оценки (1)
Предмет оценки (2)
Предмет оценки (3)
Предмет оценки (4)
Тритон X-100
Y
1 балл
2 балла
0 баллов
NP-40
Y
1 балл
2 балла
0 баллов
Тритон X-114
Y
1 балл
2 балла
0 баллов
Твин 20
N
4 балла
1 балл
-1 балл
Твин 40
N
4 балла
1 балл
-1 балл
Твин 80
N
4 балла
1 балл
-1 балл
Результаты, показанные в таблице 2, демонстрируют, что только с одним поверхностно-активным веществом последовательное использование не может быть осуществлено.
Контрольный сравнительный пример 2: Получение раствора для предварительной обработки с pH 9,0, исследование с двумя неионными поверхностно-активными веществами
Получали десятикратный концентрат раствора буфера Трис-HCl, содержащего ЭДТА, и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0. К полученному таким образом десятикратному концентрату раствора добавляли Тритон X-100 в конечной концентрации 0,1% масс. и Твин 20 в конечной концентрации, как показано в таблице 2, оба неионные поверхностно-активные вещества, для получения посредством этого концентратов растворов для предварительной обработки.
Каждый из полученных таким образом концентратов раствора для предварительной обработки разбавляли в 10 раз деионизированной водой для получения раствора для предварительной обработки.
Затем дважды проводили стадии с (A) по (C), и оценки проводили в отношении предметов оценки (1)-(5) таким же образом как в примере 1, за исключением того, что раствор для предварительной обработки замещали растворами, полученными выше. Результаты второго раза использования показаны в таблице 3.
<b>Таблица 3</b>
Конечная концентрация Твина 20
Предмет оценки (1)
Предмет оценки (2)
Предмет оценки (3)
Предмет оценки (4)
Предмет оценки (5)
0,1% масс.
Y
2 балла
1 балл
0 баллов
3 балла
0,3% масс.
Y
3 балла
1 балл
0 баллов
3 балла
0,5% масс.
Y
4 балла
1 балл
0 баллов
4 балла
1,0% масс.
Y
5 баллов
1 балл
0 баллов
4 балла
2,0% масс.
Y
5 баллов
1 балл
0 баллов
4 балла
3,0% масс.
Y
5 баллов
1 балл
0 баллов
4 балла
Результаты, показанные в таблице 3, демонстрируют, что даже с двумя определенными поверхностно-активными веществами не может быть осуществлено последовательное использование.
Примеры 7-10 и сравнительные примеры 5 и 6: исследование содержания циклодекстрина
Получали растворы для предварительной обработки и оценки проводили таким же образом как в примере 2, за исключением того, что конечную концентрацию гидроксипропил-β-циклодекстрина 0,1% масс. изменяли на конечную концентрацию 0,01% масс. (пример 7), 0,05% масс. (пример 8), 0,5% масс. (пример 9), 1,0% масс. (пример 10), 2,0% масс. (сравнительный пример 5) или 15,0% масс. (сравнительный пример 6). Результаты показаны в таблице 4 вместе с результатами примера 2.
<b>Таблица 4</b>
Конечная концентрация гидроксипропил-β-циклодекстрина
Предмет оценки (1)
Предмет оценки (2)
Предмет оценки (3)
Предмет оценки (4)
Предмет оценки (5)
Предмет оценки (6)
Пример 2
0,1% масс.
Y
4,5 балла
4 балла
2 балла
4 балла
Y
Пример 7
0,01% масс.
Y
4 балла
3 балла
2 балла
4 балла
Y
Пример 8
0,005% масс.
Y
4 балла
3,5 балла
2 балла
4 балла
Y
Пример 9
0,5% масс.
Y
4 балла
4 балла
1 балл
4 балла
Y
Пример 10
1,0% масс.
Y
3,5 балла
4,5 балла
0 баллов
4 балла
Y
Сравнительный пример 5
2,0% масс.
Y
2,5 балла
4,8 балла
-1 балл
4 балла
N
Сравнительный пример 6
15,0% масс.
Y
2 балла
5 баллов
-1 балл
4 балла
N
Результаты, показанные в таблице 4, демонстрируют, что если содержание циклодекстрина, даже если он входит в состав, находится за пределами определенного диапазона, то эффект итогового последовательного использования не может быть получен.
Пример 11: Пример концентрата раствора для предварительной обработки, поставляемого двумя частями
Получали раствор A, составленный из десятикратного концентрата раствора 500 мМ буфера Трис-HCl, содержащего 100 мМ ЭДТА, и когда концентрат раствора для предварительной обработки, подлежащий получению ниже, разбавляли в десять раз этим буфером, то pH полученного раствора для предварительной обработки мог составлять 9,0, и 0,01% масс. азида натрия в качестве консерванта.
С другой стороны, получали раствор B, составленный из 1 мМ цитратного буфера, 1% масс. Тритона X-100 и 10% масс. Твина 20, обоих неионных поверхностно-активных веществ, 1% масс. гидроксипропил-β-циклодекстрина и 30% масс. этиленгликоля.
Растворы A и B смешивали с деионизированной водой в соотношении 1:1:8 для получения раствора для предварительной обработки с pH 9,0.
Оценки полученного раствора для предварительной обработки проводили таким же образом как в примере 2. Было выявлено, что в отношении всех предметов оценки были получены результаты, аналогичные результатам примера 2.
Контрольный сравнительный пример 3: Исследование полисахаридов, углеводородных полимеров или высших полимеров вместо циклодекстрина
Получали раствор для предварительной обработки таким же образом как в примере 1, за исключением того, что гидроксипропил-β-циклодекстрин замещали различными полисахаридами, углеводородными полимерами или высшими полимерами, показанными в таблице 5.
Полученные таким образом растворы для предварительной обработки оценивали в отношении предметов оценки (1)-(3) и (6) таким же образом как в примере 1. Результаты показаны в таблице 5.
<b>Таблица 5</b>
Полимер вместо гидроксипропил-β-циклодекстрина
Предмет оценки (1)
Предмет оценки (2)
Предмет оценки (3)
Предмет оценки (6)
Декстран (Мм (молекулярная масса) 35000-45000) (1% масс.)
N
1 балл
1 балл
N
Декстран (Мм 400000-500000) (1% масс.)
N
1 балл
1 балл
N
Декстран (Мм 2000000) (1% масс.)
Y
2 балла
3 балла
N
Декстран (Мм 5000000-20000000) (1% масс.)
Y
1 балл
3 балла
N
D-сорбит (1% масс.)
N
1 балл
2 балла
N
Трегалоза (1% масс.)
N
1 балл
2 балла
N
PVP (Мм 58000) (1% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP (Мм 58000) (5% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP (Мм 34000) (1% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP (Мм 130000) (1% масс.)
Y
3 балла
1 балл
N
PVP/VA (Мм 58000) (1% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP/VA (Мм 58000) (3% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP/VA (Мм 58000) (5% масс.)
Y
4 балла
2 балла
N
PVP: поливинилпирролидонPVP/VA: сополимер поливинилпирролидона и винилацетата
Результаты, показанные в таблице 5, демонстрируют, что когда в растворе для предварительной обработки из декстранов, имеющих линейные сахара, содержатся декстраны, имеющие относительно низкие молекулярные массы, моносахарид, такой как сорбит, или дисахарид, такой как трегалоза, то депарафинизация, которая в иных случаях достигается, не может быть осуществлена. Предполагается, что эффекты Твина 20 или Тритона X-100 ингибировались этими компонентами. С другом стороны, было обнаружено, что декстраны, имеющие высокие молекулярные массы, при нагревании выделяют имеющие запах вещества.
PVP и его сополимеры используются в качестве эксципиентов лекарственных препаратов для диспергирования нерастворимых в воде веществ. В ожидании такого эффекта исследовали некоторые PVP, и результаты, как показано выше в таблице 5, указывают на то, что были достигнуты хорошие результаты в отношении нерастворимого парафина (предмет оценки (2)), но результаты, достаточные для последовательного использования, не были достигнуты в отношении отталкивания окрашивающего реагента на предметных стеклах (предмет оценки (3)). Было также выявлено, что PVP с более высокой молекулярной массой имел более высокую вязкость и, таким образом, был неудобен для использования.