Связь между множественной лекарственной устойчивостью и дифференцировкой в популяциях клеток эритробластоза мыши

Рис. 4. Изменение активности НАГ на 30-й неделе (¿) после однократного облучения и на 35-й неделе (б) после фракционированного облучения.'

По оси абсцисс — доза (в Гр).

зависимости активности фермента после фракционированного облучения на 35-й неделе после облучения. ФИД гипоксии составлял 1,39.

Динамика активности лизосомального фермента НАГ представлена на рис. 3. Как видно, после однократного облучения наблюдается рост активности фермента в зависимости от дозы облучения (максимум после облучения на воздухе в дозе 18 Гр 12,2 и 19,3 Ед. акт./ммоль креат. соответственно на 20-й и 30-й неделе). При облучении в той же дозе в условиях гипоксии ферментурия была достоверно ниже на всех сроках наблюдения. В конце эксперимента (на 30-й неделе) различия в активности фермента между экспериментальными группами'были выражены в большей степени (см. рис. 3, а).

Результаты Измерения активности НАГ в динамике (с 23-й по 35-ю неделю) после 5-кратного облучения представлены на рис. 3, б. Полученные данный свидетельствуют о том, что рост ферменту-рии в большинстве экспериментальных групп прогрессирует во времени. Максимум активности отмечен при 35 Гр (до '24,8 Ед. акт./ммоль креат. на 35-й неделе по сравнению с 15 Ед. акт./моль кре-ат. при 40 Гр в условиях гипоксии).

На рис. 4 показано изменение активности фермента в моче соответственно однократно и фрак-ционированно облученных мышей на последних сроках наблюдения (30-я и 35-я неделя). ФИД гипоксии на этих сроках составил 1,38 и 1,3 соответственно.

Таким образом, установлено, что активность ферментов в моче .имеет дозовую зависимость. При облучении в условиях гипоксии ферментурия выражена в меньшей степени. ФИД гипоксии составляет 1,25—1,39. Переход от однократного

ФИД гипоксии после однократного и фракционированного облучения почек мышей

Срок после облучения, ФИД

нед Y-ГТ НАГ

Однократное облучение

20 1,3 1,3

23 1,38 1,38

30 1,3 1,38

Фракционированное облучение

,23 1,3 1,25

25' 1,27 1,36

30 1,33 1,3

35 1,39 1,3

к фракционированному облучению не приводит к выраженному изменению модифицирующего действия гипоксии. Из таблицы видно, что в динамике наблюдения ФИД в условиях гипоксии как при однократном, так и фракционированном облучении колебался в одних и, тех же пределах, составляя соответственно для -у-ГТ 1,3—1,38 и 1,3—1,38, а для НАГ 1,27—1,39 и 1,25—1,36.

По нашим предварительным данным, изменение активности ферментов проявляется в более ранние сроки, чем другие тесты, используемые для диагностики лучевого поражения почек (на 8—12-й неделе после облучения по сравнению с 19—20-ю неделями для гематокрита); •

Таким образом, можно считать, что данный тест может использоваться для диагностики позднего лучевого поражения проксимальных канальцев нефрона.

ЛИТЕРАТУРА

1. Казымбетов П., Ярмоненко С. П., Вайнсон А. А. // Мед. радиол.— 1988.— Т. 33, № 8.— С. 55—58.

2. Любимова Н. В., Бассалык J1. С., Вайнсон А. А. и др. //

Вестн. ВОНЦ АМН СССР.— 1991 (в печати).

3/ Тачев Т., Вацек А., Стрнад В. и др. // Мед. радиол,—

1990.— Т. 35, № 3,— С. 9— И. "

4. Хворостенко М. И. // Там же.— 1989.— Т. 34, № 9.— С: 32— .37.

5. Ярмоненко С. П., Вайнсон А. А., Магдон Э. Кислородный эффект и лучевая терапия опухолей.— М., 1980.

6. Kunkler Р. В., Farr R. F., Luxton R. W. // Brit. J. Radiol.— 1952.—Vol. 25.—P. 190—201.

7. Maruhn D. // Gesamte Inn. Med.— 1983.— Bd 38,— S. 557— 562.

8. Stevens G. N., Joiner B., Denecamp J. // Int. J. Radiat. Oncol.'Biol. Phys.— 1989,—Vol. 16,—P. 1165—1168.

9. Williams M. V., Denekamp J. // Radiat. Res.— 1983.— Vol. 94,— P. 305—317.

Поступила 13.05.91

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1991 /

УДК 616.61-018.1-022.7:579.252.55-092.9-07

Ф. X. Джураева, А. А. Ставровская, Т. П. Стромская

СВЯЗЬ МЕЖДУ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ В ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК ЭРИТРОБЛАСТОЗА МЫШИ

НИИ канцерогенеза

Данная работа посвящейа изучению изменений фенотипа малигнизированных клеток при возникновении и развитии множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). МЛУ — широко изучаемый феномен, суть которого заключается в том, что при воздействии на опухолевые клетки одного химиопрепарата возникает устойчивость клеток к целому ряду препаратов, разных по структуре и механизму действия [2, 8]. В основе возникновения и развития МЛУ чаще всего лежит повышение способности клеток к активному выбросу гидрофобных токсических соединений,, связанное с гиперэкспрессией в резистентных клетках генов группы mdr и кодируемого одним из этих генов мембранного белка с мол. массой 170 кД (Р170) [2, 8]. Среди достаточно разнообразных изменений фенотипа, наблюдающихся в клетках с МЛУ, особого внимания заслуживает реверсия признаков трансформированного фенотида клеток, отмечавшаяся в ряде

опухолевых клеточных линий с МЛУ, культивируемых in vitro. К таким признакам относятся: снижение опухолеродности клеток, повышение зависимости их размножения от прикрепления к субстрату, нормализация морфологии и др. [1—3, 7, 8]. Причины и закономерности такой нормализации опухолевых клеток остаются неясными.

В последнее время в литературе начали появляться данные, свидетельствующие о связи диф-ференцировки клеток и МЛУ. Так, было показано, что экспрессия генов mdr значительно варьирует в различных нормальных тканях млекопитающих от минимальной в клетках мышц, кожи и кроветворных клетках до максимальной (повышенной в десятки раз и более)' в клетках'надпочечников",'' почки, эпителия прямой кишки и некоторых других [9, 15]. Эти факты рассматриваются как свидетельство преимущественной экспрессии генов mdr в секретирующих клетках. Обнаружено также, что ген mrdl сильнее экспрессируется в более дифференцированных опухолях или более дифференцированных участках опухолей [10]. Кроме того, было показано, что ряд агентов, индуцирующих диф-ференцировку, усиливает также экспрессию гена mdrl [6, 14]. Отдельные линии клеток с МЛУ оказались более чувствительными к агентам, индуцирующим дифференцировку, чем соответствующие исходные клетки [12]. Ранее мы исследовали трансформированные клетки эпителия почки собаки (линия MDCK) и нашли, что большинство независимо полученных сублиний клеток MDCK, устойчивых к колхицину и имеющих МЛУ, в большей степени, чем исходные клетки, способны к спонтанной дифференцировке и проявляют повышенную чувствительность к индукторам дифферен-цировки [5]. На основании полученных данных была высказана гипотеза о том, что отбор на повышение экспрессии гена mdr ведет к отбору вариантов, в большей степени способных к дифференцировке, чем вся популяция [5]. Клетки почки, на которых было выполнено упомянутое выше исследование, относятся к клеткам с высоким уровнем экспрессии генов mdr. В данной работе для селекции вариантов с МЛУ использованы клетки с низким уровнем экспрессии гена mdr, клетки мышиного эритролейкоза. Вопрос заключался в том, будут ли отбираться при селекции на МЛУ более дифференцированные варианты и в тех случаях, когда речь идет о клетках с исходно низким уровнем экспрессии гена mdr (клетках эритроидного ряда).

Материалы и методы. Клетки мышиного эритролейкоза линии DS-19 [17] и гепатомы крысы МсА RH 7777 культивировали в среде RPMI-1640 с 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, пересевая их через каждые 3 дня. Резистентные к цито-статикам сублинии DS-19 поддерживали в среде с соответствующей селективной дозой препарата (колхицина или винбластина). О чувствительности клеток к цитостатикам судили по дозе препарата, которая подавляла размножение 50 % клеток (LD50) на 6-е сутки инкубации.

LD50 определяли, рассевая чувствительные и резистентные клетки на 96-луночные плато (фирма «Flow») по 2-104 клеток на лунку в 0,2 мл культуральной среды. При рассеве в среду добав-

ляли цитостатик в различных дозах (от 0,002 до -2,0 мкг/мл). На каждую дозу препарата брали не менее двух лунок. На 6—7-е сутки производили подсчет клеток в камере Горяева. Для каждой сублинии клеток опыты повторяли не менее 2—

3 раз. На основании полученных данных на кривых зависимости числа клеток от концентрации колхицина в среде определяли LD50.

Окраску родамином 123 (5 мкг/мл) проводили по методике [4]. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендировали в среде с родамином на 5—10 мин при температуре 37 °С. Затем клетки дважды промывали теплым фосфатным буфером и помещали в чистую питательную среду на 30 мин при температуре 37 °С.

Для блокирования кальциевых каналов в некоторых группах опыта в среду с краской и в среду для отмывания краски добавляли 10 мкг/мл вера-памила. Окрашенные родамином 123 клетки наблюдали в флюоресцентном микроскопе (фирма «Opton») при увеличении 1400.

Для выявления клеток, синтезирующих гемоглобин, их окрашивали бензидином по методу [17]. Бензидин (фирма «Sigma») растворяли в 6 % уксусной кислоте, к этому раствору непосредственно перед окраской добавляли 5 % раствор перекиси водорода. Через несколько минут после добавления краски определяли соотношение окрашенных и неокрашенных бензидином клеток при увеличении микроскопа 100 (анализировали не менее чем 200 клеток на точку).

Опыты по изучению влияния диметилсульфокси- • да (ДМСО) на синтаз клетками гемоглобина ставили следующим образом: ДМСО (фирмы

«Merck» или «Serva») добавляли в среду в концентрациях 0,25 %, 0,5 %, 1,0 % і 2,0 % к клеткам, рассеянным в 96-луночные плато (фирма «Flow») (2-Ю4 клеток на лунку). Добавление ДМСО производили при рассеве клеток. После окончания инкубации культур с ДМСО (от 1 до 7 сут) определяли число синтезирующих гемоглобин клеток, окрашивая их бензидином (см. выше).

Результаты. Получение сублиний DS-19, устойчивых к колхицину и винбластину

Нами получены 3 независимые сублинии клеток DS-19, пролиферирующие в присутствии относи-

Таблица 1

Сублинии клеток DS-19, полученные в работе, и их характеристика ^

Клетки LD50, мкг/мл Уровень устойчи- вости Окраска родами- ном-123

DS-19 0,027±0,00058 1 +

DS-19/0,05/1 0,0584-1-0,00405 21,5

DS-19/0,05/2 0,0815±0,00750 29,9 —

DS-19/0,05/3 0,0334 ±0,00326 11,8 —

DS-19/0,5/2 0,7500+0,02646 275,7 —

DS-19/0,5/3 0,5330 188,3 —

DS-19/1,0/1 1,0670±0,16756 493,7 —

DS-19/0,05/4/vb* 0,0554 20,5 —

Примечание. Обозначения линий: в числителе — селективная доза колхицина (в мкг/мл), в знаменателе — порядковый номер линии. Общие порядковые номера означают, что данные линии имеют общее происхождение. Звездочка — клетки, резистентные к винбластину. Все остальные устойчивые линии резистентны к колхицину. + при окраске родамином-123 в течение 15 мин с последующим помещением в постинкубационную среду клетки флюоресцируют, при той же обработке клетки не окрашиваются (не светятся).

.тельно низкои концентрации колхицина в среде (0,05 мкг/мл), и 1 независимая сублиния клеток, устойчивых к 0,05 мкг/мл винбластина (табл. 1). Получение сублиний клеток проводили путем- ступенчатой селекции, постепенно повышая концентрацию цитостатика в культуральной среде. Селекцию начинали с дозы 0,005—0,007 мкг/мл колхицина. Нужно заметить, что исходные клетки DS-19 оказались весьма чувствительными к цитостати-кам. Мы сравнили LD50 колхицина для линии DS-19 и для двух других линий клеток — клеток гепатомы МсА RH 7777 и клеток почки MDCK. Эта доза составила для DS-19 0,0027±

±0,0006 мкг/мл, для MDCK 0,02±0,004 мкг/мл и для МсА RH 7777 также 0,02±0,000 мкг/мл. Выявленные нами 10-кратные различия в чувствительности клеток разного тканевого происхождения к цитостатику, очевидно, связаны с уровнем экспрессии в этих клетках гена (генов)-mdr. Показано, что клетки почки и печени характеризуются в 10 раз и более высоким уровнем экспрессии гена mdrl, чем клетки системы кроветворения [9]. Уровень чувствительности клеток DS-19 к колхицину свидетельствует в пользу того, что работа проведена на клетках с весьма низким уровнем экспрессии гена (генов) mdr.

Результаты опытов по исследованию степени устойчивости к колхицину различных сублиний 05-19, приведенные в табл. 1, показывают, что клетки, растущие в среде с 0,05 мкг/мл колхицина или винбластина, имели уровень устойчивости от 12 до 30 раз. Ранее было показано [4], что клетки, устойчивые к некоторым цитостатикам и обладающие МЛУ, выбрасывают флюоресцентные красители и поэтому не светятся в флюоресцентном микроскопе, тогда как чувствительные клетки этим красителем при прочих равных условиях окрашиваются и сохраняют окраску более часа. Как видно из табл. 1, полученные нами устойчивые варианты не окрашивались родамином-123. Обработка этих клеток блокатором кальциевых каналов верапамилом делала их окрашиваемыми. Эти опыты свидетельствуют о том, что клетки всех полученных линий характеризуются МЛУ. По нашим предварительным данным, изменение характера окраски родамином, свойственного клеткам дикого типа, наблюдалось как при селекции клеток почки [5], так и при отборе резистентных эритробластов (в данной работе) при примерно одинаковой концентрации цитостатика в культуральной среде (около 0,05 мкг/мл). Очевидно, в обоих случаях мы имеем дело с клетками примерно одного этапа селекции, который, если судить по окраске флюоресцентным красителем, можно считать первой ступенью отбора устойчивых к препарату вариантов.

Полученные варианты 05-19, устойчивые к 0,05 мкг/мл колхицина, послужили основой для дальнейшей селекции сублиний :С более высоким уровнем резистентности. Из 05-19/0,05/1 ‘получили 05-19/0,3/1 и 05-19/1,0/1, резистентные к0,3 и 1,0 мкг/мл колхицина соответственно, из 05-19/0,05/2 — 05-19/0,5/2 и из 05-19/0,05/3 — 05-19/0,5/3. Таким образом, были получены сублинии клеток с разными уровнями лекарственной устойчивости, наиболее резистентные клетки были

примерно в 500 раз устойчивее клеток дикого типа (см. табл. 1).

Спонтанный уровень клеток, синтезирующих гемоглобин, в популяциях чувствительных и резистентных к цитостатикам сублиний 05-19

Популяции резистентных клеток чаще всего содержали больше окрашиваемых бензидином, т. е. синтезирующих гемоглобин, клеток, чем популяция исходных ОБ-19 (рис. 1). Так, в наших опытах в контрольных, ничем не обработанных культурах 05-19 обычно наблюдалось около 1 % клеток, окрашенных бензидином (см. рис. 1), а в популяциях устойчивых сублиний спонтанный уровень синтезирующих гемоглобин клеток составил от 1,7 до 6,9 %, превышая число окрашенных бензидином клеток в линии дикого типа либо незначительно (05-19/0,05/3), либо в несколько раз (05-19/0,3/1). Наши данные совпадают с полученными другими авторами результатами, показавшими, что количество клеток, окрашенных бензидином, в популяции клеток 05-19, не подвергавшихся экспериментальным воздействиям, не превышает 1—2 % [12, 16], тогда как среди клеток сублинии ОБ-19, устойчивой к винбластину, число клеток, окрашиваемых бензидином, нарастает [12]. При повышении уровня лекарственной устойчивости спонтанное количество синтезирующих гемоглобин клеток могло существенно возрастать: 05-19/0,05/1 против 05-19/0,3/1, а также 05-19/0,05/2 против 05-19/0,5/2 (см. рис. 1). Однако этот показатель мог и оставаться на прежнем уровне или даже снижаться с нарастанием резистентности (05-19/0,05/3 против 05-19/0,5/3 и 05-19/1,0/1 против 05-19/0,3/1). Таким образом, прямой зависимости между уровнем устойчивости к колхицину и спонтанным уровнем синтеза клетками гемоглобина в наших опытах не наблюдалось. Несомненно, однако, наблюдается корреляция между развитием МЛУ в популяциях вновь полученных нами сублиний и повышением числа спонтанно дифференцирующихся клеток.

Влияние ДМСО на число клеток, синтезирующих гемоглобин, в популяциях чувствительных и резистентных к цитостатикам сублиний й8-19

Как известно, существует ряд агентов, вызы-

Юг-

II

ЛС-19 0.0S/10.3ІП0ІІ 0,05/205/2 0.05/305130.05/4/vb

Рис. 1. Процент клеток, синтезировавших гемоглобин, в популяции исходных клеток 05-19 и устойчивых к цитостатикам сублиний 05-19, не подвергавшихся экспериментальным воз-, действиям.

Здесь и на рис. 2—4 по вертикали — процент клеток, окрашенных бензидином.

2 В-к ВОНЦ № 4

9

2 З 4 5 6 7 8

^ Время вДМСО

—МС-19 -о-05% . А 1% -¿х-2°/о Контроль Нлетни с ДМСОв концентрации

Рис. 2. Зависимость процента клеток, синтезировавших гемоглобин, в популяции клеток 05-19 от концентрации ДМСО в культуральной среде и времени культивирования в среде с ДМСО.

/ •— 08-19, контроль; 2 — клетки с ДМСО в концентрации 0,5%, З — 1 %, 4.-2%. Здесь и на рис. 3 по горизонтали — время в ДМСО (в днях).

вающих дифференцировку клеток DS-19 и других клеток мышиных эритролейкозов, культивируемых in vitro [18]. Мы использовали один из таких индукторов — ДМСО. При обработке ДМСО культур DS-19 наблюдалось увеличение числа клеток, окрашиваемых бензидином. Число окрашенных клеток зависело от концентрации индуктора в среде и времени инкубации клеток с ним (рис. 2), что отмечали и другие авторы, работавшие с этими клетками [19]. Как видно на рис. 2, наибольшее количество клеток DS-19 окрашивалось бензидином при воздействии 2 % ДМСО на 5-й день экспозиции.

Дальнейшей задачей работы было выяснение вопроса, есть ли различия в чувствительности к ДМСО резистентных к колхицину клеток и клеток дикого типа. Мы использовали разные концентрации ДМСО, в том числе и низкие, к которым клетки DS-19 были малочувствительны. Как видно из табл. 2, две из трех сублиний клеток первого этапа селекции колхицином (DS-19/0,05/2 и DS-19/0,05/3) оказались более чувствительными к воздействию низких концентраций ДМСО (0,25—0,5 %), чем исходные клетки: На рис. 3 приведены результаты одного из экспериментов по влиянию ДМСО на клетки DS-19 и клетки DS-19/0,05/3. Видно, что на 4-е сутки инкубации

Таблица 2

Синтез гемоглобина сублиниями 05-19 с низкими уровнями МЛУ при воздействии различных концентраций ДМСО

Линия клеток Концентрация ДМСО в среде, %

0,25 .0,5 . і

число опытов ' + число опытов + . . число ОПЫТОВ +

DS-19/0,05/1 3 1 5 2 3 1

DS-19/0,05/2 3 3 3 2 4 2

DS-19/0,05/3 1 1 6 6 1 1

DS-19/0,05/4/vb 1 0 4 2 2 1

Примечание. + число клеток, окрашенных бензидином, больше в культурах клеток, резистентных к цитостатикам, чем в исходных при воздействии ДМСО. Указано число опытов, поставленных с использованием дайной концентрации, ДМСО.

ь-ДС-19

Нонтроль

Время: вДМСО

-0.0513 Нонтроль

-JTC-ft 05% ДМСО

-0,0513 05% ДМСО

Рис. 3. Зависимость процента клеток, синтезировавших г'емо-' глобин, в популяциях 135-19 и 05-19/0,05/3 от времени инкуба-' цИи с 0,5 % ДМСО в культуральной среде.

/ — 08-19, контроль; 2— 05-19 с 0,5 % ДМ СО; 3— 05-19/0,05/3, контроль,

4 — 05-19/0,05/3 с 0,5 % ДМСО. .

с 0,5 % ДМСО окрашивался 21 % клеток 05-19, тогда как в популяции 05-19/0,05/3 при таких же условиях окрашивалось 47 % всех клеток. Клетки 05-19/0,05/1, резистентные к колхицину, и 05-19/0,05/4-уЬ, устойчивые к винбластину, реагировали на воздействие индуктора дифференци-ровки так же, как клетки дикого типа (рис. 4, табл. 2). Таким образом, две из четырех сублиний клеток 05-19, имеющие МЛУ, не отличались от клеток дикого типа по чувствительности к агенту, индуцирующему дифференцировку.

На рис. 4 видно, что с увеличением уровня лекарственной устойчивости чувствительность клеток к низким концентрациям ДМСО достаточно часто (но не всегда, см. 05-19/0,55/3 и 05-19/0,05/3) повышается. Об этом свидетельствует повышение чувствительности к ДМСО сублиний с высокими уровнями лекарственной устойчивости, полученными из 05-19/0,05/1 и 05-19/0,05/2.

Скорость размножения чувствительных и устойчивых к цитостатикам сублиний Б8-19 .

100г-

>60

ДС-19 0.05/10.3/1 101, 0,05/2 05/2 0.05/3 05/3

Клетки

Рис. 4. Процент клеток, синтезировавших гемоглобин, при инкубации в культуральной среде с 0,5 % ДМСО в популяциях исходных клеток Ь5-19 и устойчивых к колхицину сублинйй клеток.

Сгруппированные сублинии имеют общее происхождение.

©

Различия в способности клеток отвечать на аген-< ты, индуцирующие дифференцировку, можно было бы связать со скоростью их- размножения: известно, что устойчивые кфазличным ядам клетки обычно пролиферируют медленнее, чем исходные, не резистентные клетки. При сравнении пролиферативной способности исходных клеток и полученных нами резистентных вариантов мы обнаружили^,, что различия в ответе клеток на ДМСО не связаны со скоростью размножения клеток, Так, клетки 05-19/0,05/1, не отличавшиеся от клеток дикйго типа по реакции на. ДМСО, размножались медленнее, чем исходные клетки (рис. 5 а), а клетки 05-19/0,05/3, оказавшиеся гораздо более чувствительными к ДМСО, практически не отличались по скорости пролиферации от 05-19 (рис. 5 6). Эти данные позволяют полагать, что более выраженная реакция клеток с МЛУ на агент, вызывающий дифференцировку, связана не с замедлением их пролиферации, а с какими-то иными причинами.

Обсуждение. В данной работе нами получены

4 независимые сублинии клеток 05-19 первого

—•—ДС-19 -о- 0.05/1

Б

—%—ДС-19 —о—0-05/3

Рис. 5. Нарастание количества клеток 08-19 и устойчивых к колхицину сублиний в зависимости от времени после рассева культуры.

0-05-19 (/) и 05-19/0,05/1 (2); 6- 05-19 (/) 05-19/0,05/3 (2). По вертикали — число клеток-104; по горизонтали — время после рассева (в сут).

этапа селекции колхицинбм и винбластином, имеющие МЛУ. О асом, что новые линии действительно характеризуются МЛУ, свидетельствуют опыты с окраской клеток родамином 123 и влиянием вера-памила на выброс краски -из них. Эти результаты показываю^гчто из популяций клеток, весьма ела-бо экспрессирующих или совсем не экспрессирующих ген (гены) mdr, можно отобрать варианты, в которых в отличие от клеток дикого типа хорошо функционирует белок МЛУ Р170. Отдельные при* меры линий клеток с МЛУ, изолированных из популяций клеток, практически не экспрессирую.1 щих ген (гены) mdr уже имеются [11, 12]. Получение нами серии независимых линий с МЛУ свидетельствует о том, что в популяциях клеток с отсутствием экспрессии" гена mdr или с очень слабой экспрессией этого гена в результате тех или иных генетических событий, как правило, возникают варианты с более выраженной степенью экспрессии этого гена. Наши данные можно объяснить также тем, что в популяциях появляются варианты, которые могут отвечать на воздействие цитостатиков усилением экспрессии гена (генов) mdr. Вполне вероятно, что оба предположения верны. Очевидно также, как следует из наших: данных (низкие начальные концентрации селективных агентов и длительность процесса селекции), частота таких- вариантов в популяции клеток DS-19 гораздо ниже, чем в популяциях с более высоким исходным уровнем экспрессии гена mdr. -

В популяциях резистентных к цитостатикам сублиний DS-19 обычно наблюдалось большее количество клеток, Спонтанно синтезирующих гемоглобин. „Кроме того, Две из четырех сублиний DS-19 первого этапа селекции на МЛУ отвечали на воздействие низких концентраций ДМСО большим количеством синтезирующих гемоглобин клеток, чем популяция клеток дикого типа. Более выраженную чувствительность клеточной популяции к агентам, вызывающим дифференцировку, можно объяснить тем, что эта популяция содержит большую долю более дифференцированных клеток. Возможно также, что повышается вероятность для каждой клетки данной популяции вступить на путь дифференцировки под влиянием индуктора. Какое бы из этих объяснений ни оказалось правильным, ясно, что уже на первых этапах селекции из популяций с очень низким уровнем экспрессии гена mdr могут отбираться варианты, экспрессирующие ген mdr и одновременно более дифференцированные (относится ли это ко всей популяции в целом или к какой-то доле клеток в этой популяции). Результаты, полученные, недавно группой других авторов, также свидетельствуют о повышении чувствительности сублиний клеток DS-19 к другому индуктору дифференцировки эритробластов НМВА при приобретении ими устойчивости к вин-бластину [12, 13]. Эти авторы показали, что в популяции резистентных клеток возрастает количество детерминированных (коммитированных) клеток [12]. В предыдущем исследовании мы нашли, что все 5 сублиний-клеток почки собаки MDCK первого этапа селекции на МЛУ имели более дифференцированный фенотип ([5] и неопубликованные данные). Четыре из зтих сублиний были более чувствительны к дифференцирующему действию ДМСО и ретиноевой кислоты. Оче-

видно, повышенная чувствительность к различным агентам, вызывающим дифференцировку, является одной из характерных черт фенотипа клеток с МЛ У.

Такая особенность клеток с МЛУ может объясняться тем, что одни и те же агенты регулируют экспрессию гена (генов) mdr и группы генов, отвечающих за разине типы дифференцировки, синтез различных белков. Действительно, было показано, что агенты, индуцирующие дифференцировку, усиливают экспрессию гена mdr l [6, 14]. Корреляция между МЛУ и большей степенью дифференцировки различных клеток может свидетельствовать о том, что большие группы генов, включающие ген (гены) mdr, ген гемоглобина и некоторые другие, имеют общие механизмы регуля: ции (например, гомологичные последовательности в регуляторных областях). Нельзя исключить также, что белок МЛУ Р170 сам по себе каким-то способом влияет на регуляцию других генов, в том числе генов, отвечающих за дифференцировку клеток.

Число полученных нами линий как в данном, так и в предыдущем исследовании [5] сравнительно невелико, однако полученные данные позволяют полагать, что из популяций клеток с высокой экспрессией гена mdr чаще отбираются более дифференцированные варианты, чем из популяций клеток с низким уровнем экспрессии этого гена. Это предположение заслуживает дальнейшей проверки. Косвенным доводом в пользу этого предположения являются полученные в данной работе результаты, свидетельствующие о том, что если на первых этапах селекции более чувствительными к воздействию индуктора дифференцировки в наших опытах оказались лишь две из четырех сублиний DS-19, то на более высоких уровнях отбора все полученные клеточные линии стали, во-первых, более чувствительными к ДМСО, во-вторых — к его более низким концентрациям, чем исходные клетки DS-19. Вероятно., при дальнейшем повышении уровня устойчивости чаще отбираются клетки, обладающие более дифференцированным фенотипом, чем клетки дикого типа и клетки первого этапа селекции.

Таким образом, результаты данной работы наряду с данными, полученными на клетках почки собаки [5] и результатами исследований, полученными другими авторами [11, 12, 13], свидетельствуют о закономерности отбора более дифференцированных вариантов клеток при отборе на повышенную экспрессию гена mdr при развитии МЛУ. Этот факт, на наш взгляд, целесообразно учитывать, рассматривая проблемы химиотерапии опухолей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдряшитов Р. И., Бершадский А. Д., Какпакова Е. С. // Экспер. онкол,— 1989.— № 5.— С. 26—30.

2. Гудков Д. В. // Молекул, генетика.— 1987,— № 8.— С. 3-9.

3. Какпакова Е. С. // Бюл. экспер. биол.— 1983.— № 7.— С. 89—92.

4. Нейфах А. А., Александрова А. Ю. // Докл. АН СССР.— 1987 —Т. 291,—С. 989—991.

5. Ставровская А. А., Стромская Т. П., Чернова О. Б., Джу-раева Ф. X. II Молекул, генетика.— 1990.— № 5.— С. 3—7.

6. Bates S. Е., Mickley L. A., Chen Y.-N. et al. // Molec. cell Biol.— 1989.—Vol. 9, N 10.—P. 4337—4344.

7. Biedler ]., Reihm H., Peterson R. H. et al. // J. Nat. Cancer Inst — 1975,— Vol. 55,— P. 671—680.

8. Bradley G., Juranka P. F., Ling V. // Biochim. biophys. Acta.— 1988.— Vol. 948.— P. 87—128.

9. Fojo A. T„ Ueda K-, Slamon D. J. et al. // Proc. nat. Acad. Sei USA.— 1987.— Vol. 84,— P. 265—269.

10. Goldstein L. J., Galski H., Fojo A. et al. // J. nat. Cancer Inst.— 1989.—Vol. 81,— P. 116—124.

11. Lemontt J. F., Azzaria M., Gros P. // Cancer Res.— 1988.— Vol. 48,— P. 6348—6353,

12. Melloni E., Pontremoli S., Damiani G. et al. 11 Proc. nat. Acad. Sei. USA.— 1988.— Vol. 85,— P. 3835—3839.

13. Michaeli }., Lebedev У. B., Richon V. M. et al. 11 Molec. cell Biol.— 1990,— Vol. 10.— P. 3535—3540.

14. Mickley L. A., Bates S. E., Richert N. D. et al. // J. Biol. Chem.— 1989,— Vol. 264,— P. 18 031 —18 040.

15. Noonan К F., Beck C., Holzmayer Т. A. et al. // Proc. nat. Acad. Sei. USA.— 1990.—Vol. 87,—P. 7160—7164.

16. Ohta Y., Tanaka M., Terada M. et al. // Ibid.— 1976.— Vol. 73,— P. 1232—1236.

17. Orkin S. H., Haros E. L, Leder P. // Ibid.— 1975.— Vol. 72,— P. 98—102.

18. Paul A., Marks M. // Cancer (Philad.).— 1984.— Vol. 54.— P. 2766—2769.

19. Singer D., Cooper M., Maniatis G. M. et al. // Proc. nat. Acad. Sei. USA.— 1974.—Vol. 71,— P. 2668—2670.

Поступила 05.03.91

Клинические исследования

© КОЛЛЕКТИВАВТОРОВ. 1991 УДК 616-006.6-085:615.37

В. А. Нормантович, К. П. Лактионов, 3. Г. Кадагидзе, Е. В. Савельева, А. В. Хлебное, Т. Н. Заботина, И. В. Высоцкая•

ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЛИМФЫ ПРИ АДОПТИВНОЙ ИММУНОХИМИОТЕРАПИИ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ФОРМ РАКА

НИИ клинической онкологии

Разработанный способ аутолимфохимиотерапии (АЛХТ) базируется на воздействии высоких доз химиопрепаратов на собственные лимфоидные клетки, возможности использования для повышения противоопухолевого эффекта.

Известен определенный эффект от активации неиммунных аутологичных лимфоцитов с помощью митогенов — фитогемагглютинина, конканавали-на А. Результаты улучшились при использовании для получения лимфоцитов сепаратора крови, однако клинический эффект был получен лишь при небольших опухолевых узлах [4].

В ВОНЦ АМН СССР удалось достичь значительного улучшения показателей иммунного ответа путем воздействия на аутологичные лимфоидные клетки малыми дозами химиопрепаратов, например метотрексата [3]. Больным со злокачественной меланомой проводили стимуляцию собственных лимфоцитов, полученных с помощью сепаратора крови «Aminko Centrifuge» й активированных in vitro малыми дозами метотрексата или фи-тогемагглютинином [1]. Установлено, что этот вид лечения может быть рекомендован только больным с заболеванием в ранних стадиях после хирургического удаления первичного очага или локальных метастазов для профилактики рецидивов и мета-стазирования.

Исследования, посвященные изучению эффекта