СОЕДИНЕНИЕ ЭКСТРАКТА КАКАО И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
COCOA EXTRACT COMPOUND AND METHODS OF ITS OBTAINING AND APPLICATION

Делается ссылка на находящиеся на рассмотрении заявки США: №08/709406, поданную 6 сентября 1996 г., 08/631661, поданную 2 апреля 1996 г., и 08/317226, поданную 3 октября 1994 г. (в настоящее время патент США 5554645), и РСТ/US 96/4497, каждая из которых включена в данное описание путем ссылки.
Данное изобретение относится к экстрактам какао и соединениям из них, таким как полифенолы, предпочтительно полифенолы, обогащенные процианидинами. Данное изобретение также относится к способам получения подобных экстрактов и соединений и к их применению, например, в качестве противоопухолевых (антибластомных) агентов, антиоксидантов, ингибиторов ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II, модуляторов циклооксигеназы и/или липоксигеназы, модуляторов NO (оксид азота) или NO-синтазы, как нестероидных противовоспалительных агентов, модуляторов апоптоза, модуляторов агрегации тромбоцитов, модуляторов глюкозы в крови или in vitro, антимикробных агентов и ингибиторов окислительного повреждения ДНК.
Полный список всех документов, цитируемых в настоящем описании, приводится в конце описания перед формулой изобретения в разделе "Библиография". Эти документы относятся к области настоящего изобретения, при этом каждый цитируемый документ включен в данное описание путем ссылки.
Полифенолы представляют собой невероятно разнообразную группу соединений (Ferreira et al., 1992), широко распространенную в различных видах растений, некоторые из которых входят в пищевую цепь. В некоторых случаях этот класс соединений имеет важное значение в питании человека. Хотя считается, что некоторые из полифенолов не имеют питательной ценности, интерес к ним растет благодаря тому, что они, как предполагается, могут оказывать благоприятное воздействие на здоровье человека.
Например, исследования на экспериментальных животных показали, что кверцетин (флавоноид) обладает антиканцерогенной активностью (Deshner et al., 1991, and Kato et al., 1983). Показано, что (+)-катехин и (-)-эпикатехин (флаван-3-олы) ингибируют активность обратной транскриптазы вируса лейкоза (Chu et al., 1992). Также показано, что ноботанин (олигомерный гидролизуемый танин) обладает противоопухолевой активностью (Okuda et al., 1992). Также в статистических отчетах сообщается, что смертность от рака желудка значительно ниже в областях Японии, производящих чай. Есть сообщения, что галлат эпигаллокатехина является фармакологически активным веществом, присутствующим в зеленом чае, и ингибирует рост кожных опухолей у мышей (Okuda et al., 1992). Также на модели опухоли у различных животных показано, что эллаговая кислота обладает антиканцерогенной активностью (Bukharta et al., 1992). Наконец, олигомеры проантоцианидина запатентованы Kikoman Corporation для использования в качестве антимутагенов. Действительно, недавно на 202-м Национальном собрании Американского химического общества были представлены доклады, касающиеся областей распространения фенольных соединений в пищевых продуктах и их модуляции развития опухолей на экспериментальных моделях животных (Но et al., 1992; Huang et al., 1992).
Однако ни в одном из этих сообщений не были предложены ни экстракты какао или соединения из них, ни способы получения подобных экстрактов или соединений, или использования экстрактов какао или соединений из них в качестве антибластомных агентов, антиоксидантов, ингибиторов фермента ДНК-топоизомеразы II, модуляторов циклооксигеназы и/или липоксигеназы, модуляторов NO (оксида азота) или NO-синтазы, как нестероидных противовоспалительных агентов, модуляторов апоптоза, модуляторов агрегации тромбоцитов, модуляторов глюкозы в крови и in vitro, антимикробных агентов или ингибиторов окислительного повреждения ДНК.
Так как неферментированные какао-бобы содержат существенное количество полифенолов, авторы настоящего изобретения считают, что подобная активность и возможность использовать экстракты какао, например соединения, присутствующие в какао, могут быть выявлены путем экстрагирования подобных соединений из какао и последующего скрининга данных экстрактов на соответствующую активность. Национальный онкологический институт произвел скрининг различных видов Theobroma и Herrania на противораковую активность в рамках широкой программы по отбору натуральных продуктов. У экстрактов из тканей какао-бобов были обнаружены низкие уровни активности, и работа не была продолжена. Таким образом, исследователи пришли к заключению, что какао и его экстракты не могут использоваться в качестве антибластомных или противораковых средств, и это привело к тому, что специалисты в области противоопухолевой или противораковой терапии отказались от использования какао и его экстрактов для лечения рака.
Поскольку в целях изучения возможности применения полифенолов какао для изготовления ароматизирующих веществ был разработан ряд аналитических методов (Clapperton et al., 1992), настоящие заявители решили применить аналогичные методы к получению образцов для их скрининга на противораковую активность, несмотря на существующее мнение относительно бесполезности использования какао в противоопухолевой или противораковой терапии. Неожиданно и в противовес известному уровню техники, например результатам скрининга, проведенного Национальным онкологическим институтом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что полифеноловые экстракты какао, содержащие процианидины, обладают значительным полезным действием в качестве противораковых или антибластомных агентов.
Кроме того, заявители продемонстрировали, что экстракты какао, содержащие процианидины, и соединения из экстрактов какао могут быть использованы в качестве антибластомных агентов, антиоксидантов, ингибиторов ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II, модуляторов циклооксигеназы и/или липоксигеназы, модуляторов NO (оксида азота) или NO-синтазы, нестероидных противовоспалительных агентов, модуляторов апоптоза, модуляторов агрегации тромбоцитов, модуляторов глюкозы в крови и in vitro, антимикробных агентов или ингибиторов окислительного повреждения ДНК. Предметом настоящего изобретения являются способы получения экстракта какао и/или соединений из них.
Другим объектом настоящего изобретения является экстракт какао и/или соединения из него.
n
Еще одним объектом настоящего изобретения является полимерное соединение формулы A, где А является мономером, имеющим формулу:
где n представляет целое число от 2 до 18, так чтобы
присутствовала по меньшей мере одна концевая мономерная единица А и множество дополнительных мономерных единиц;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН, 3-(α)-O-caxap или 3-(β)-O-caxap;
связывание между смежными мономерами происходит по положениям 4, 6 или 8,
связывание дополнительных мономерных единиц по положению 4 имеет α или β стереохимию;
X, Y и Z выбраны из группы, состоящей из мономерной единицы А, водорода и сахара, при условии, что по крайней мере одна концевая мономерная единица, связанная с дополнительной мономерной единицей, находится в положении 4, и что Y=Z=водород;
сахар необязательно замещен фенольным остатком в любом положении, например, через сложную эфирную связь,
и фармацевтически приемлемые соли или их производные (включая окисленные продукты).
n
Еще одним объектом настоящего изобретения является полимерное соединение формулы A, в котором А является мономером, имеющим формулу:
где n представляет целое число от 2 до 18, например 3-18;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-OH, 3-(α)-О-caxap или 3-(β)-O-caxap;
смежные мономеры связываются по положениям 4 путем (4→6) или (4→8);
каждый из X, Y и Z является водородом, сахаром или смежным мономером при условии, что если X и Y являются смежными мономерами, Z представляет собой Н или сахар, и если X и Z являются смежными мономерами, Y представляет собой Н или сахар, и таким образом, чтобы по крайней мере один из двух концевых мономеров, связанных со смежным мономером, находился в положении 4, и необязательно Y=Z=водород;
связывание по положению 4 имеет α или β стереохимию;
сахар необязательно замещен фенольным остатком в любом положении, например, через сложную эфирную связь,
и фармацевтически приемлемые соли или их производные (включая окисленные продукты).
Еще одним объектом изобретения является антиоксидантная композиция.
Еще одним объектом изобретения является способ ингибирования ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II.
И еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения опухолей или рака.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются противораковые, противоопухолевые или антибластомные композиции.
Еще одним объектом настоящего изобретения является антимикробная композиция.
Еще одним объектом настоящего изобретения является циклооксигеназная и/или липоксигеназная модулирующая композиция.
Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, модулирующая NO или NO-синтазу.
Еще одним объектом настоящего изобретения является нестероидная противовоспалительная композиция.
Еще одним объектом настоящего изобретения является глюкозо-моделирующая композиция в крови и in vitro.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения больных антибластомной, антиоксидантной, антимикробной, модулирующей циклооксигеназу и/или липооксигеназу, или модулирующей NO или NO-синтазу, модулирующей нестероидные противовоспалительные агенты и/или модулирующей глюкозу в крови и in vitro композициями.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является композиция и способ ингибирования окислительного повреждения ДНК.
Еще одним дополнительным объектом изобретения является композиция и способы модуляции агрегации тромбоцитов.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции и способы модуляции апоптоза.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения любой из вышеприведенных композиций.
Еще одним объектом изобретения является набор для применения в вышеперечисленных способах или для получения вышеперечисленных композиций.
Неожиданно было обнаружено, что экстракт какао и композиции из него обладают противоопухолевой, противораковой или антинеопластической активностью или являются антиоксидантом, или обладают способностью ингибировать ферментативную активность ДНК-топоизомеразы II, или являются антимикробным агентом, модулятором циклооксигеназы и/или липоксигеназы, модулятором NO или NO-синтазы, нестероидным противовоспалительным агентом, модулятором апоптоза, модулятором агрегации тромбоцитов или модулятором глюкозы в крови или in vitro, или ингибитором окислительного повреждения ДНК.
В соответствии с этим настоящее изобретение предлагает по существу чистый экстракт какао и соединения из него. Экстракт или соединения предпочтительно содержат полифенол (или полифенолы), такие как полифенол(ы), обогащенный полицианидином(ами) какао, такой как полифенолы, содержащие по меньшей мере один полицианидин какао, выбранный из (-) эпикатехина, (+) катехина, процианидина В-2, олигомеров процианидина от 2 до 18, например 3-18, таких как 2-12 или 3-12, предпочтительно 2-5 или 4-12, более предпочтительно 3-12 и более предпочтительно 5-12, процианидина В-5, процианидина А-2 и процианидина С-1.
Настоящее изобретение также предлагает противоопухолевую, противораковую или антибластомную или антиоксидантную композиции, или композицию, ингибирующую ферментативную активность ДНК-топоизомеразы II, или антимикробную, или модулирующую циклооксигеназу и/или липоксигеназу, или модулирующую NO или NO-синтазу, или композицию, представляющую нестероидный противовоспалительный агент, модулятор апоптоза, модулятор агрегации тромбоцитов или модулятор глюкозы в крови или in vitro, или композицию, являющуюся ингибитором окислительного повреждения ДНК, содержащую, в основном, чистый экстракт какао или соединение из него, или синтетические полифенолы какао, такие как полифенол(ы), обогащенные процианидином(ами), и подходящий носитель, например, приемлемый в фармацевтической, ветеринарной и пищевой отрасли науки. Экстракт или соединения из него предпочтительно содержат процианидин(ы) какао. Экстракт какао или соединения из него предпочтительно получают способом, предусматривающим растирание какао-бобов в порошок, обезжиривание полученного порошка и экстрагирование из этого порошка активных соединений.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ лечения больных, нуждающихся в лечении противоопухолевым, противораковым или антибластомным агентом, или антиоксидантом, или ингибитором ДНК-топоизомеразы II, или антимикробным агентом, модулятором циклооксигеназы и/или липоксидазы, или модулятором NO или NO-синтазы, или нестероидным противовоспалительным агентом, модулятором апоптоза, модулятором агрегации тромбоцитов или модулятором глюкозы в крови или in vitro, или ингибитором окислительного повреждения ДНК, содержащими эффективное количество в основном чистого экстракта какао или соединения из него, или синтетического полифенола(ов) какао или процианидина(ов) и носитель, например носитель, приемлемый в фармацевтической, ветеринарной и пищевой области. Экстракт какао или соединение из него могут быть процианидином(ами) какао и предпочтительно получаются путем размола зерен какао в порошок, обезжиривания порошка и экстрагирования и очищения активного компонента (или активных компонентов) из порошка.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает набор для лечения больных, нуждающихся в лечении противоопухолевым, противораковым или антибластомным агентом, или антиоксидантом, или ингибитором ДНК-топоизомеразы II, или антимикробным агентом, модулятором циклооксигеназы и/или липоксидазы, или модулятором NO или NO-синтазы, или нестероидным противовоспалительным агентом, модулятором апоптоза, модулятором агрегации тромбоцитов или модулятором глюкозы в крови или in vitro, ингибитором окислительного повреждения ДНК, содержащими эффективное количество в основном чистого экстракта какао или соединения из него, или синтетического полифенола(ов) какао или процианидина(ов) и подходящий носитель, например носитель, приемлемый в фармацевтической, ветеринарной и пищевой области, для смешивания с экстрактом или соединением из него, или синтетическим(ими) полифенолом(ами) или процианидином(ами).
Настоящее изобретение предлагает соединения, проиллюстрированные на фиг. 38А-38В и 39А-39АА, причем связи в положениях 4→6 и 4→8 в настоящее время предпочтительны.
Изобретение, кроме того, включает в себя композиции для сохранения и приготовления пищевых продуктов, содержащие соединение изобретения, и способы приготовления или сохранения пищевых продуктов путем добавления в пищу данной композиции.
И, кроме того, изобретение включает ингибитор ДНК-топоизомеразы II, содержащий соединение изобретения и подходящий носитель или разбавитель, и способы лечения больного, нуждающегося в подобном лечении, путем назначения композиции.
Если рассматривать в целом приведенные выше выполнения, включающие экстракты какао, то изобретение также включает такие варианты выполнения, в которых соединение по изобретению используют вместо или в качестве экстрактов какао. Таким образом, изобретение включает наборы, способы и композиции, аналогичные вышеприведенным для экстрактов какао и соединений по изобретению.
Эти и другие объекты и выполнения раскрываются или становятся очевидными из следующего детального описания.
Последующее подробное описание дается со ссылками на прилагаемые чертежи.
Фиг.1 показывает характерную хроматограмму, полученную при фракционировании неочищенных процианидинов какао с помощью гель-проникающей хроматографии;
фиг.2А показывает характерную хроматограмму, полученную с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и показывающую разделение (профиль элюирования) процианидинов какао, экстрагированных из неферментированного какао;
фиг.2В показывает характерное разделение процианидинов какао, экстрагированных из неферментированного какао, с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой;
фиг.3 показывает несколько характерных структур процианидина;
фиг.4А-4Е показывают характерные ВЭЖХ хроматограммы пяти фракций, использованных в скрининге на противораковую или антинеопластическую активность;
фиг.5 и 6A-6D показывают дозовую зависимость между экстрактами какао и раковыми клетками ACHN (фиг.5) и РС-3 (фиг.6А-6D) (доля выживших клеток относительно дозы, мкг/мл); М&М2 F4/92, М&МА+Е U12P1, М&МВ+Е Y192P1, М&МС+Е U12P2, M&MD+E U12P2;
фиг.7А-7Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, А+В, А+Е и A+D и линией клеток РС-3 (доля выживших клеток относительно дозы, мкг/мл); ММ-1А 0212РЗ, ММ-1 В 0162Р1, ММ-1 С 0122РЗ, ММ-1 D 0122РЗ, ММ-1 Е 0292Р8, ММ-1 А/В 0292Р6, ММ-1 А/Е 0292Р6, ММ-1 A/D 0292P6;
фиг.8А-8Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, А+В, В+Е и D+E и клеточной линией носоглоточной KB/HeLa (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1А 092К3, ММ-1 В 0212К5, ММ-1 С 0162К3, ММ-1 D 0212K5, ММ-1 Е 0292К5, ММ-1 А/В 0292К3, ММ-1 В/Е 0292К4, ММ-1 D/E 0292K5;
фиг.9А-9Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, B+D, А+Е и D+E и клеточной линией НСТ-116 (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1 С 0192Н5, D 019H5, Е 0192Н5, ММ-1 B&D 0262H2, А/Е 0262Н3, ММ-1 D&E 0262H1;
фиг.10А-10Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, E, B+D, C+D и А+Е и почечной клеточной линией ACHN (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1 А 092А5, ММ-1 В 092А5, ММ-1 С 0192А7, ММ-1 D 0192А7, М&М1 Е 0192А7, ММ-1 B&D 0302A6, ММ-1 C&D 0302A6, ММ-1 А&Е 0262А6;
фиг.11А-11Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, А+Е, В+Е, и С+Е клеточной линией легких А-549 (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1 А 019258, ММ-1 В 09256, ММ-1 С 019259, ММ-1 D 019258, ММ-1 Е 019258, А/Е 026254, ММ-1 В&Е 030255, ММ-1 С&Е N6255;
фиг.12А-12Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, В+С, C+D и D+E клеточной линией меланомы SK-5 (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1 A 021S4, ММ-1 В 0212S4, ММ-1 С 0212S4, ММ-1 D 0212S4, ММ-1 Е N32S1, ММ-1 В&С N32S2, ММ-1 C&D N32S3, ММ-1 D&E N32S3;
фиг.13А-13Н показывают типичную дозовую зависимость между фракциями процианидина какао А, В, С, D, Е, В+С, С+Е и D+E клеточной линией молочной железы MCF-7 (доля выживших клеток/доза, мкг/мл); ММ-1 A N22M4, ММ-1 В N22M4, ММ-1 С N22M4, ММ-1 D N22M3, ММ-1 Е 0302М2, ММ-1 В/С 0302М4, ММ-1 С&Е N22M3, ММ-1 D&E N22M3;
фиг.14 показывает типичную дозовую зависимость между процианидином какао (в частности, фракцией D) и клеточной линией CCRF-CEM Т-клеточного лейкоза (клетки/мл относительно дней роста; незакрашенный кружок - контроль, закрашенный кружок - 125 мкг - фракция D, незакрашенный перевернутый треугольник - 250 мкг - фракция D, закрашенный перевернутый треугольник - 500 мкг - фракция D).
фиг.15А показывает сравнение анализов, проведенных с использованием ХТТ и кристаллического фиолетового, на цитотоксичность против клеточных линий рака молочной железы MCF-7 р168, обработанных фракцией D+E (незакрашенный кружок обозначает ХТТ, а закрашенный кружок обозначает кристаллический фиолетовый);
фиг.15В показывает типичную кривую зависимости доза-ответ, построенную для линии клеток молочной железы MDA МВ231, обработанных различными количествами неочищенных полифенолов, полученных из генотипа какао UIT-1 (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает носитель, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 250 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл; оптическая плотность 2,0 является максимальной для планшет-ридера и необязательно соответствует количеству клеток);
фиг.15С показывает типичную кривую зависимости доза-ответ, построенную для линии клеток рака предстательной железы РС-3, обработанных различными количествами неочищенных полифенолов, полученных из генотипа какао UIT-1 (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает носитель, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 250 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл);
фиг.15D показывает типичную кривую зависимости доза-ответ, построенную для линии клеток рака молочной железы MCF-7 p168, обработанных различными количествами неочищенных полифенолов, полученных из генотипа какао UIT-1 (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает носитель, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 250 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл; оптическая плотность 2,0 является максимальной для планшет-ридера и необязательно соответствует количеству клеток);
фиг.15Е показывает типичную кривую доза-ответ, построенную для клеточной линии рака шейки матки Hela, обработанных различными количествами неочищенных полифенолов, полученных из генотипа какао UIT-1 (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает носитель, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 250 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл; оптическая плотность 2,0 является максимальной для планшет-ридера и необязательно соответствует количеству клеток);
фиг.15F показывает эффект против линии клеток рака шейки матки Hela, обработанных различными фракциями (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает 100 мкг/мл фракции А-Е, закрашенный кружок обозначает 100 мкг/мл фракции А-С, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 100 мкг/мл фракции D&E; оптическая плотность 2,0 является максимальной для планшет-ридера и необязательно соответствует количеству клеток);
фиг.15G показывает цитотоксический эффект при дозе 100 мкг/мл против линии клеток рака молочной железы SKBR-3, обработанных различными полифеноловыми фракциями какао (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает фракции А-Е, закрашенный кружок обозначает фракции А-С, незакрашенный перевернутый квадрат обозначает фракции D&E);
Фиг.15Н показывает типичную зависимость доза-ответ между фракцией D+E процианидина какао и клетками Hela (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 75 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 50 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 25 мкг/мл, закрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл; оптическая плотность 2,0 является максимальной для планшет-ридера и необязательно соответствует количеству клеток);
фиг.15I показывает типичную зависимость доза-ответ между фракцией D+E процианидина какао и клетками SKBR-3 (оптическая плотность (540 нм) - относительно дней; незакрашенный кружок обозначает контроль, закрашенный кружок обозначает 100 мкг/мл, незакрашенный перевернутый треугольник обозначает 75 мкг/мл, закрашенный перевернутый треугольник обозначает 50 мкг/мл, незакрашенный квадрат обозначает 25 мкг/мл, закрашенный квадрат обозначает 10 мкг/мл);
фиг.15J показывает типичную зависимость доза-ответ между фракцией D+E процианидина какао и клетками Hela в анализе, проводимом путем клонирования в мягком агаре (гистограмма; число колоний относительно контроля, 1, 10, 50 и 100 мкг/мл);
фиг.15К показывает ингибирование роста клеток линии Hela, обработанных неочищенными полифеноловыми экстрактами, полученными из восьми различных генотипов какао (% от контроля относительно концентрации, мкг/мл; незакрашенный кружок обозначает С-1, закрашенный кружок представляет С-2, незакрашенный перевернутый треугольник представляет С-3, закрашенный перевернутый треугольник представляет С-4, незакрашенный квадрат представляет С-5, закрашенный квадрат представляет С-6, незакрашенный треугольник представляет С-7, закрашенный треугольник представляет С-8;
C-1=UF-12: сорт культуры Trinitario и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао UF-12 (Бразилия) (декофеинированные/детеоброминированные);
C-2=NA-33: сорт культуры = Forastero и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао NA-33 (Бразилия) (декофеинированные/детеоброминированные);
C-3=EEG-48: сорт культуры = Forastero и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао EEG-48 (Бразилия) (декофеинированные/детеобромированные);
С-4 = неизвестен: сорт культуры = Forastero и описание - неочищенные экстракты неизвестных полифенолов какао (Западная Африка) (декофеинированные/детеоброминированные);
С-5=UF-613: сорт культуры = Trinitario и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао UF-613 (Бразилия) (декофеинированные/детеоброминированные);
C-6=ICS-100: сорт культуры = Trinitario (предок Nicaraguan Criollo) и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао ICS-100 (Бразилия) (декофеинированные/детеоброминированные);
C-7=ICS-139: сорт культуры = Trinitario (предок Nicaraguan Criollo) и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао ICS-139 (Бразилия) (декофеинированные/детеоброминированные);
C-6=UIT-1: сорт культуры = Trinitario и описание - неочищенные экстракты полифенолов какао UIT-1 (Малайзия) (декофеинированные/детеоброминированные);
фиг.15L показывает ингибирование роста клеток линии Hela, обработанных неочищенными экстрактами полифенолов, полученными из ферментированных бобов какао и высушенных бобов какао (во всех случаях проводили стадии ферментации и сушки на солнце; % от контроля относительно концентрации, мкг/мл; незакрашенные кружки представляют фракцию нулевого дня, закрашенный кружок представляет фракцию первого дня, незакрашенный перевернутый треугольник представляет фракцию второго дня, закрашенный перевернутый треугольник представляет фракцию 3 дня, незакрашенный квадрат представляет фракцию 4 дня, закрашенный квадрат представляет фракцию 9 дня);
фиг.15М показывает действие ферментативно окисленных процианидинов какао против клеток линии Hela (дозозависимое действие полифенолов какао, обработанных полифенолоксидазой); % от контроля относительно концентрации; мкг/мл; закрашенный квадрат представляет неочищенный UIT-1 (с кофеином и теобромином), незакрашенный кружок представляет неочищенный UIT-1 (без кофеина и теобромина) и закрашенный кружок представляет неочищенный UIT-1 (катализированный полифенолоксидазой);
фиг.15N показывает характерное разделение объединенных фракций D и Е процианидинов какао с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой;
фиг.15O показывает характерное разделение неочищенного экстракта полифенолов какао с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с нормальной фазой;
фиг.16 показывает характерную кривую окисления рацемата для экстракта и фракций полицианидинов какао по сравнению с кривыми, полученными для синтетических антиоксидантов ВНА и ВНТ (условные единицы относительно времени; пунктирная линия и крестики (+) представляют ВНА и ВНТ; * представляет D-E; X представляет неочищенный экстракт; незакрашенные квадраты представляют фракции А-С; незакрашенные ромбы представляют контроль);
фиг.17 показывает типичный агарозный гель, указывающий на ингибирование катализируемой топоизомеразой II декатенации кинетопластной ДНК фракциями процианидинов какао (дорожка 1 содержит 0,5 мкг мономерных колец "маркерной" (М) кинетопластной ДНК; дорожки 2-20 содержат кинетопластную ДНК, которую инкубировали с топоизомеразой II в присутствии 4% ДМСО, но в отсутствие каких-либо процианидинов какао (контроль - С); дорожки 3 и 4 содержат кинетопластную ДНК, которую инкубировали с топоизомеразой II в присутствии 0,5 и 5,0 мкг/мл фракции А процианидинов какао; дорожки 5 и 6 содержат кинетопластную ДНК, которую инкубировали с топоизомеразой II в присутствии 0,5 и 5,0 мкг/мл фракции В процианидинов какао; дорожки 7, 8, 9, 13, 14 и 15 представляют копии кинетопластной ДНК, которые инкубировали в присутствии 0,05, 0,5 и 5,0 мкг/мл фракции D процианидинов какао; дорожки 10, 11, 12, 16, 17 и 18 представляют копии кинетопластной ДНК, которые инкубировали с топоизомеразой II в присутствии 0,05, 0,5 и 5,0 мкг/мл фракции Е процианидинов какао; дорожка 19 представляет копию кинетопластной ДНК, которую инкубировали с топоизомеразой II в присутствии 5,0 мкг/мл фракции Е процианидинов какао);
фиг.18 показывает дозозависимую активность фракции D процианидинов какао против клеточных линий, способных к репарации ДНК, и клеточных линий с недостаточной способностью к репарации ДНК (доля выживших клеток относительно мкг/мл; левый график - клеточная линия xrs-6 с недостаточной способностью к репарации ДНК, ММ-1 D D282X1; правый график - клеточная линия BR1, способная к репарации ДНК, ММ-1 D D282B1);
фиг.19 показывает кривые зависимости "доза-ответ" для сравнения адриамицинрезистентных клеток MCF-7 с родительской клеточной линией MCF-7 р168, обработанной фракцией D+E (% от контроля относительно концентрации, мкг/мл; незакрашенные кружки представляют MCF-7 р168; закрашенные кружки MCF-7 ADR);
фиг.20А и В показывают дозозависимое действие на клетки линий Hela и SKBR-3 при их обработке концентрациями 100 мкг/мл и 25 мкг/мл двадцати фракций, полученных с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с нормальной фазой (гистограмма; % от контроля относительно контроля и фракций 1-12);
фиг.21 показывает разделение неочищенных, обогащенных и очищенных пентамеров из экстрактов какао с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой;
фиг.22А, В и С показывают MALDI-TOF/MS пентамера, обогащенного процианидинами, фракций А-С и фракций D-E соответственно;
фиг.23А показывает профиль элюирования олигомерных процианидинов, очищенных с помощью модифицированной полупрепаративной ВЭЖХ;
фиг.23В показывает профиль элюирования тримера процианидина, очищенного с помощью модифицированной полупрепаративной ВЭЖХ;
фиг.24А-В показывают структуры с минимальной энергией для всех пентамеров со связью (4→8), основанных на структуре эпикатехина;
фиг.25А показывает относительную флуоресценцию эпикатехина после тиолиза с бензилмеркаптеном;
фиг.25В показывает относительную флуоресценцию катехина после тиолиза с бензилмеркаптеном;
фиг.25С показывает относительную флуоресценцию димеров (В2 и В5) после тиолиза с бензилмеркаптеном;
фиг.26А показывает относительную флуоресценцию димеров после тиолиза;
фиг.26В показывает относительную флуоресценцию В5 димера после тиолиза димера и последующей десульфуризации;
фиг.27А показывает относительный объем опухоли во время лечения на модели голых мышей MDA MB 231 при их обработке пентамером;
фиг.27В показывает относительную кривую выживания обработанных пентамером экспериментальных голых мышей MDA 231;
фиг.28 показывает профиль элюирования при свободном от галогена аналитическом разделении ацетонового экстракта процианидинов, полученного из экстракта какао;
фиг.29 показывает влияние размеров пор стационарной фазы на разделение процианидинов с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой;
фиг.30А показывает использование субстрата во время ферментации какао-бобов;
фиг.30В показывает выработку метаболита во время ферментации;
фиг.30D показывает расчеты планшетов во время ферментации какао-бобов;
фиг.30В показывает относительные концентрации каждого компонента в ферментированном растворе какао-бобов;
фиг.31 показывает ацетилхолин-индуцированное расслабление аорты крысы, NO-зависимой и предварительно сокращенной с помощью фенилэфрина;
фиг.32 показывает профили толерантности к глюкозе крови при использовании различных тестируемых смесей;
фиг.33А-В показывают воздействие индометацина на активность СОХ-1 и СОХ-2;
50
фиг.34А-В показывают корреляцию между уровнем полимеризации и IC относительно СОХ-1/СОХ-2 (мкм);
фиг.35 показывает корреляцию между воздействием соединений на активность СОХ-1 и СОХ-2, выраженную в мкм;
50
фиг.36A-V показывают значения IC (мкм) образцов, содержащих процианидины с СОХ-1/СОХ-2;
фиг.37 показывает схему очищения при выделении процианидинов из какао;
фиг.38А-38В показывают предпочтительные структуры пентамеров;
фиг.39А-АА показывают стереохимическую библиотеку пентамеров;
фиг.40А-В показывают 70-минутные градиенты для разделения процианидинов с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой, проявленные при УФ-облучении и флуоресценции соответственно;
фиг.41А-В показывают 30-минутные градиенты для разделения процианидов с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой, проявленные при УФ-облучении и флуоресцентном исследовании соответственно;
фиг.42 показывает разделение процианидинов с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой;
фиг.43А-G показывают CD (круговой дихроизм) спектра димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров, гептамеров и октамеров процианидина соответственно;
1
13
фиг.44А показывает структуру и данные Н и С ЯМР для эпикатехина;
1
13
фиг.44В-F показывают спектр APT, COSY, XHCORR, Н и С ЯМР для эпикатехина;
1
13
фиг.45А показывает структуру и данные Н и С ЯМР для катехина;
1
фиг.45В-Е показывают спектр Н, APT, XHCORR и COSY ЯМР для катехина;
1
13
фиг.46А показывает структуру и данные Н и С ЯМР для В2 димера;
13
1
фиг.46В-G показывают спектр С, APT, H, HMQC и COSY и НОНАНА ЯМР для В2 димера;
1
13
фиг.47А показывает структуру и данные Н и С ЯМР для В5 димера;
1
13
фиг.47В-С показывают спектр Н, С, APT, COSY, HMQC, НОНАНА ЯМР для В5 димера;
1
фиг.48А-D показывают спектр Н, COSY, HMQC и НОНАНА ЯМР для эпикатехин/катехин тримера;
1
фиг.49А-В показывают спектр Н, COSY, HMQC и НОНАНА ЯМР для тримера эпикатехина;
фиг.50А и В показывают действие фракций А и С процианидина какао соответственно на давление крови; уровень давления крови снижается на 21,43% в течение минуты после применения фракции А, возвращается к нормальному через 15 минут, тогда как после применения фракции С давление крови снижается на 50,5% в течение 1 минуты и возвращается к нормальному через 5 минут;
фиг.51 показывает действие фракций процианидина какао на артериальное давление крови находящихся под анестезией морских свинок;
фиг.52 показывает действие L-NMMA на изменение кровяного давления у находящихся под анестезией морских свинок, вызванное фракцией С процианидина какао;
фиг.53 показывает действие брадикинина на выработку NO в HUVEC (клетках эндотелия пупочной вены человека);
фиг.54 показывает действие фракций процианидинов какао на выработку макрофагами NO в HUVEC.
фиг.55 показывает действие фракций процианидинов какао на выработку NO макрофагами;
фиг.56 показывает действие фракций процианидина на LPS -индуцированные и гамма-интерферон-праймированные макрофаги;
фиг.57 показывает мицеллярное электрокинетическое капиллярное хроматографическое разделение олигомеров процианидинов какао;
+2
+2
+2
+3
+2
+2
фиг.58А-F показывают данные масс-спектрального анализа MALDI-TOF для присоединенных к тримеру ионов Cu-, Zn-, Fe-, Fe-, Ca- и Mg- соответственно;
фиг.59 показывает данные масс-спектрального анализа MALDI-TOF олигомеров процианидина какао (от тетрамеров до октадекамеров);
фиг.60 показывает дозозависимое действие олигомеров процианидина какао на кошачью лимфобластную клеточную линию FeA вируса лейкоза;
фиг.61 показывает дозозависимое действие олигомеров процианидинов какао на кошачью клеточную линию CRFK нормальной почки;
фиг.62 показывает дозозависимое действие олигомеров процианидина какао на собачью клеточную линию MDCK нормальной почки;
фиг.63 показывает дозозависимое действие между олигомерами процианидинов какао и собачьей линией клеток GH нормальной почки;
фиг.64 показывает эффект зависимости время - температура на гидролиз гексамера и
фиг.65 показывает эффект зависимости время - температура на образование тримера.
Соединения по изобретению
Как обсуждалось выше, неожиданно было обнаружено, что экстракты какао или соединения, извлеченные из них, проявляют противораковую, противоопухолевую или антинеопластическую активность, антиоксидантную активность, ингибируют фермент ДНК-топоизомеразу II и окислительное повреждение ДНК, обладают антибактериальной активностью, модулируют циклооксигеназу и/или липоксигеназу, NO (оксид азота) или NO-синтазу, апоптоз, агрегацию тромбоцитов, глюкозу в крови и in vitro, a также эффективны в качестве нестероидных противовоспалительных агентов. Данные экстракты, соединения или комбинация соединений, выделенных из них, в основном получают путем размола зерен какао в порошок, обезжиривания порошка и экстрагирования и очищения активного компонента соединения(ний) из обезжиренного порошка. Порошок может быть получен путем сублимирования бобов какао и мякоти плода, освобождения какао-бобов от мякоти, удаления кожуры от сублимированных какао-бобов и размола лишенных кожуры бобов. Экстракцию активного компонента соединения(ний) можно осуществить с помощью техники экстракции из раствора. Экстракты, содержащие активные соединения, могут быть очищены, например, до значительной чистоты, например, с помощью гель-проникающей хроматографии или препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или комбинации таких методов.
Ссылки, касающиеся выделения и очистки соединений изобретения, извлеченных из какао, позволяют понять, что могут применяться любые виды Theobroma, Herrania или гибриды от их внутри- или межвидовых скрещиваний. С этой точки зрения делается ссылка на Schultes, "Synopsis of Herrania" Journal of the Arnold Arboretum, Vol. XXXIX, pp.217-278, plus plates I-XVII (1985), Cuatrecasas, "Cocoa and Its Allies, A Taxonomic Revision of the Genus Teobroma", Bulletin of the United States National Museum, Vol.35, part 6, pp.379-613, plus plates 1-11 (Smithsonian Institution, 1964), and Addison et al., "Observation on the Species of the Genus Theobroma Which Occurs in the Amazon", Bol. Tech. Inst. Agronomico de Nortes, 25(3) (1951).
Кроме того, в примере 25 представлен список до этого не описанных видов Theobroma и Herrania и их гибридов от внутри- и межвидовых скрещиваний, в которых обнаружены определенные концентрации соединений изобретения; пример 25 также описывает способы модуляции количества соединений изобретения, которые могут быть получены из какао путем умелого подбора условий ферментации какао.
Основные принципы построения схемы очистки, использующиеся в выделении в основном чистого полицианида, показаны на фиг.37. Стадии 1 и 2 схемы очистки описаны в примерах 1 и 2; стадии 3 и 4 описаны в примерах 3, 13 и 23; стадия 5 описана в примерах 4 и 14 и стадия 6 описана в примерах 4, 14 и 16. Специалисту, однако, будет понятно, какие модификации показанной на фиг.37 схемы очистки для получения активного компонента могут быть осуществлены, не отступая от существа и объема, и без проведения необязательных экспериментов.
Экстракты, соединения из них и комбинация соединений, обладая активностью, без необходимости быть привязанными к какой-либо определенной теории, идентифицированы как полифенол(ы) какао, такие как процианидины. Эти процианидины какао обладают значительной противораковой, противоопухолевой или антинеопластической активностью, антиоксидантной активностью; ингибируют фермент ДНК-топоизомеразу II и окислительное повреждение ДНК; обладают антибактериальной активностью; способны модулировать циклооксигеназу и/или липоксигеназу, NO или NO-синтазу, апоптоз, агрегацию тромбоцитов и глюкозу в крови и in vitro, и эффективны как нестероидные противовоспалительные агенты.
Настоящее изобретение предлагает соединение формулы:
где n представляет целое число от 2 до 18, например 3-12, так чтобы присутствовала первая мономерная единица А и множество других мономерных единиц;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН, 3-(α)-О-caxap или 3-(3)-О-caxap;
положение 4 представляет альфа или бета стереохимию;
X, Y и Z представляют положения для связывания между мономерными единицами, при условии, что связывание первой мономерной единицей других мономерных единиц происходит по положению 4 и Y=Z=водород, и что если не касаться связывания мономерных единиц, X, Y и Z являются водородом, или Z, Y представляют сахар, а X представляет водород, или X представляет альфа или бета сахар, a Z, Y представляет водород, или их комбинации. В соединении n может иметь значение 5-12, а в некоторых предпочтительных соединениях n равно 5. Сахар может быть выбран из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, ксилозы, рамнозы и арабинозы. Сахар любого или всех R, X, Y и Z может быть необязательно замещен фенольным остатком через сложную эфирную связь.
Таким образом, изобретение предлагает соединение формулы:
где n представляет целое число от 2 до 18, например 3-12, преимущественно 5-12, и предпочтительно n равно 5, так что первая мономерная единица А имеет следующий вид:
и множество других мономерных единиц А;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН, 3-(α)-О-сахар или 3-(β)-О-сахар;
положение 4 представляет альфа или бета стереохимию;
X, Y и Z представляют позиции для связывания между мономерными единицами при условии, что связывание первой мономерной единицей другой мономерной единицы происходит по положению 4 и Y=Z=водород, и что если не касаться связывания мономерных единиц, X, Y и Z являются водородом, или Z, Y представляют сахар, а X представляет водород, или X представляет альфа или бета сахар, a Z, Y представляет водород, или их комбинации;
названный сахар необязательно замещен фенольным остатком через сложную эфирную связь.
n
Соответственно, настоящее изобретение предлагает полимерное соединение формулы A, где А представляет мономер, имеющий формулу:
где n представляет целое число от 2 до 18, так чтобы присутствовала, по крайней мере, одна концевая мономерная единица и, по крайней мере, одна или множество дополнительных мономерных единиц;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН, 3-(α)-О-caxap или 3-(β)-O-caxap;
связывание смежных мономеров происходит в положении 4, 6 или 8;
присоединение дополнительной мономерной единицы по положению 4 имеет α и β стереохимию;
X, Y и Z выбирают из группы, состоящей из мономерной единицы А, водорода и сахара, при условии, что связывание по крайней мере одной концевой мономерной единицей дополнительной мономерной единицы (то есть связывание мономерной единицы, смежной с концевой мономерной единицей) происходит по положению 4, и что необязательно Y=Z=водород;
сахар необязательно замещается фенольным остатком в любом положении, например, через сложную эфирную связь, и фармацевтически приемлемые соли или их производные (включая продукты окисления).
В предпочтительном варианте n может быть равно 3-18, 2-18, 3-12, например 5-12, и преимущественно n равно 5. Сахар выбирают из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, ксилозы, рамнозы или арабинозы. Сахар любого или всех R, X, Y и Z может быть необязательно замещен в любом положении фенольным остатком через сложную эфирную связь. Фенольный остаток выбирают из группы, состоящей из кофеиновой, цинамоновой, кумаровой, феруловой, галловой, гидроксибензойной и синапиновой кислот.
n
Кроме того, настоящее изобретение предлагает полимерное соединение формулы A, где А представляет мономер, имеющий формулу:
где n представляет целое число от 2 до 18, например 3-18, преимущественно 3-12, например 5-12, предпочтительно n равно 5;
R представляет 3-(α)-ОН, 3-(β)-ОН, 3-(α)-О-сахар или 3-(β)-О-сахар;
связывание смежных мономеров происходит в положении 4, как (4→6) или (4→8);
каждая X, Y и Z представляет Н, сахар или смежный мономер: при условии, что если X и Y являются смежными мономерами, Z представляет Н или сахар, и если X и Z являются смежными мономерами, Y представляет Н или сахар и так, чтобы по меньшей мере один из двух концевых мономеров, связанных со смежным мономером, находился в положении 4, и необязательно Y=Z=водород;
связывание в положении 4 имеет α или β стереохимию;
сахар, необязательно, замещен фенольным остатком в любом положении, например, через сложную эфирную связь,
и фармацевтически приемлемые соли или их производные (включая продукты окисления).
n
Что касается выражения "по меньшей мере одной концевой мономерной единицы А", то следует понимать, что соединения по изобретению имеют две концевые мономерные единицы и что две концевые мономерные единицы А могут быть одинаковыми, а могут быть разными. Кроме того, следует понимать, что слова о "по меньшей мере одной концевой мономерной единице А" включают выполнение, в котором они относятся к "первой мономерной единице", причем слова о "первой мономерной единице" относятся к тому мономеру, к которому присоединяются другие мономерные единицы, образуя в результате полимерное соединение формулы A. Более того, что касается по меньшей мере одного из двух концевых мономеров, связывание смежных мономеров происходит по положению 4 и, необязательно, Y=Z=водород.
Относительно выражения "их комбинация" следует понимать, что одно или большее количество соединений изобретения может быть использовано одновременно, например, при назначении нуждающемуся в лечении больному готовой препаративной формы, содержащей одно или большее количество соединений по изобретению.
Соединения по изобретению или их комбинации демонстрируют полезное действие, отмеченное выше для экстрактов какао, и вследствие этого термин "экстракт какао" может быть заменен словами - соединения по изобретению или их комбинации, так что следует понимать, что соединения по изобретению или их комбинации могут быть экстрактами какао.
Термин "олигомер", используемый в данном описании, относится к соединениям (или их сочетанию) формулы, представленной выше, в которой n представляет число 2-18. Когда n равно 2, олигомер называется "димер"; когда n равно 3, олигомер называется "тример"; когда n равно 4, олигомер называется "тетрамер"; когда n равно 5, олигомер называется "пентамер"; подобное заявление может относиться к олигомерам, имеющим большее значение n, включая 18, так, что когда n равно 18, олигомер называется "октадекамер".
Соединения по изобретению или их комбинации могут быть выделены, например, из природного источника какао, такого как любой вид Theobroma, Herrania или их гибриды от меж- или внутривидового скрещивания; или соединения изобретения или их комбинации могут быть очищены, например соединения или их комбинации могут быть в основном чистыми; например, могут быть очищены до явной гомогенности. Чистота является относительным понятием, и множество примеров демонстрируют выделение соединений изобретения или их комбинаций, как и их очистку, так что с помощью приведенных в качестве примеров способов квалифицированный специалист может получить довольно чистые соединения изобретения или их сочетания, или очистить их до очевидно гомогенного состояния (например, чистота по изолированному отдельному пику при хроматографии). Исходя из примеров (например, примера 37) соединение или комбинация соединений значительной чистоты имеют по меньшей мере 40% чистоту, например по меньшей мере около 50%, преимущественно по меньшей мере 60% чистоту, например по меньшей мере 70% чистоту, более преимущественно по меньшей мере около 75-80% чистоту, предпочтительно по меньшей мере около 90% чистоту, более предпочтительно более 90% чистоту. Например, по меньшей мере 90-95% чистоту, или даже чище, более 95% чистоту, например 95-98%.
Кроме того, примеры мономерных единиц, содержащих используемые здесь олигомеры, представляют (+)-катехин и (-)-эпикатехин, сокращенно называемые как С и ЕС соответственно. Связи между смежными мономерами осуществляются между положениями 4 и 6 или между положением 4 и положением 8; и эта связь между положением 4 мономера и положением 6 и 8 смежной мономерной единицы обозначается здесь, как (4→6) или (4→8). Существуют 4 возможные стереохимические связи между положением 4 мономера и положением 6 и 8 смежного мономера; и стереохимические связи между мономерными единицами обозначаются здесь, как (4α→6) или (4β→6), или (4α→8), или (4β→8). Если С связывается с другим С или ЕС, такая связь обозначается здесь, как (4α→6) или (4α→8). Когда ЕС связывается с другим С или ЕС, такая связь обозначается здесь, как (4β→6) или (4β→8).
2
2
2
2
3
3
2
3
4
3
3
3
4
Примеры соединений, проявляющих обозначенную выше активность, включают димеры, ЕС-(4β→8)-ЕС и ЕС-(4β→6)-ЕС, где ЕС-(4β→8) предпочтителен; тримеры [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-С и [ЕС-(4β→6)]-ЕС, где [ЕС-(4β→8)]-ЕС предпочтителен; тетрамеры [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где [ЕС-(4β→8)]-ЕС предпочтителен; и пентамеры [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы пентамера необязательно дериватизированы галлатом или β-D-глюкозой; [ЕС-(4β→8)]-ЕС предпочтителен.
Кроме того, соединения, проявляющие обозначенную выше активность, включают соединения от гексамеров до додекамеров, примеры которых приводятся ниже:
5
4
4
4
5
гексамер, в котором один мономер (С или ЕС), имеющий связи с другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы гексамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении гексамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
6
5
5
5
6
гептамер, в котором комбинация двух мономеров (С и/или ЕС), имеющих связи с одним другим (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4α→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы гептамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении гептамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
7
6
6
6
7
октамер, в котором любая комбинация трех мономеров (С и/или ЕС), имеющих связи с одним другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы октамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении октамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
8
7
7
7
8
нонамер, в котором любая комбинация четырех мономеров (С и/или ЕС), имеющих связи с одним другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы нонамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении, нонамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
9
8
8
8
9
декамер, в котором любая комбинация пяти мономеров (С и/или ЕС), имеющих связи с одним другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы декамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении декамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
10
9
9
9
10
ундекамер, в котором любая комбинация шести мономеров (С и/или ЕС), имеющий связи с одним другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы ундекамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении ундекамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС;
11
10
10
10
11
додекамер, в котором любая комбинация семи мономеров (С и/или ЕС), имеющих связи с одним другим мономером (4β→8) или (4β→6) при связывании ЕС с другим ЕС или С, и (4α→8) или (4α→6) при связывании С с другим С или ЕС; с последующим связыванием (4β→8) с пентамерным соединением, из перечисленных выше, например, [ЕС-(4β→8)]-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-ЕС, [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→8)-С и [ЕС-(4β→8)]-ЕС-(4β→6)-С, где положение 3 концевой мономерной единицы додекамера необязательно дериватизирована галлатом или β-D-глюкозой; в предпочтительном воплощении додекамер представляет [ЕС-(4β→8)]-ЕС.
Из подробного описания становится понятно, что вышеприведенное перечисление является лишь примером и предлагается как иллюстративный источник многих, не ограниченных данными примерами, соединений по изобретению, которые, конечно, не являются исчерпывающим списком соединений настоящего изобретения.
Примеры 3А, 3В, 4, 14, 23, 24, 30 и 34 описывают способы разделения соединений по изобретению. Примеры 13, 14A-D и 16 описывают способы очистки таких соединений. Примеры 5, 15, 18, 19, 20 и 29 описывают способы определения соединений по изобретению. Фиг.38А-В и 39А-АА иллюстрируют стереохимическую библиотеку характерных пентамеров по изобретению. Пример 17 описывает способ получения молекулярной модели по изобретению. Пример 36 предлагает признаки для определения высших олигомеров, содержащихся в какао, где n равно 13-18.
Кроме того, несмотря на то, что изобретение прежде всего описывает экстракты какао, предпочтительно содержащие процианидины какао, из данного описания специалист без сомнения определит путь искусственного получения и/или приготовления активного соединения (см., например, пример 11). Соответственно, изобретение включает синтетические полифенолы или процианидины какао или их производные и/или их синтетические предшественники, которые включают, не ограничиваясь ими, гликозиды, галаты, сложные эфиры и т.д. и им подобные. Соединения по изобретению могут быть получены выделением из какао или из любого другого вида Theobroma и Herrania, так же как и искусственным путем; и производные и искусственные предшественники соединений изобретения, такие как глюкозиды, галлаты, сложные эфиры и т.д. включены в соединения изобретения. Производные могут также включать соединения вышеприведенной формулы, где остаток сахара или галлата находится на концевом мономере в положении Y или Z, или замещенные остатки сахара или галлата находятся на концевом мономере в положении Y или Z.
Например, способ С примера 8 описывает использование ферментов какао для окислительной модификации соединений по изобретению или их комбинации с целью улучшения цитотоксичности (см. фиг.15М), направленной против нескольких линий раковых клеток. Изобретение включает возможность ферментативной модификации (например, отщепление или присоединение химически важного фрагмента) соединения по изобретению, например, ферментативно с помощью сочетания оксидазы полифенола, пероксидазы, каталазы и/или таких ферментов, как гидролазы, эстеразы, редуктазы, трансферазы и подобные, и в любом сочетании, принимая во внимание кинетические и термодинамические факторы (см. также пример 41, касающийся гидролиза).
rd
rd
Что касается синтеза соединений по изобретению, квалифицированные специалисты без излишнего экспериментирования смогут найти дополнительные пути синтеза, основанные на этом описании и известном уровне техники, например на тщательном ретросинтетическом анализе как полимерных, так и мономерных соединений. Например, имея фенольную характеристику соединений изобретения, квалифицированный специалист может воспользоваться различными способами селективного введения/снятия защитных групп, объединенных с органометаллическими добавками, фенольным связыванием и фотохимическими реакциями, например, в конвергентном, линейном или биомиметрическом подходе, или их комбинации, вместе со стандартными реакциями, известными специалистам в области химии органического синтеза, и дополнительными способами синтеза для получения соединения изобретения, без ненужных экспериментов. В связи с этим сделаны ссылки на W.Carruthers, Some Modern Methods of Organic Syntesis, 3 ed., Cambridge University Press, 1986, and J.March, Advanced Organic Chemistry, 3 ed., John Willey & Sons, 1985, van Rensburg et al., Chem. Comm., 24: 2705-2706 (Dec. 21, 1996), Ballenegger et al., (Zyma SA) Europian Patent 0096 007 Bl, и документацию, приведенную ниже в разделе "Библиография", содержание которой включено здесь в качестве ссылок.
Полезность соединений изобретения
Что касается соединений изобретения, то к удивлению было обнаружено, что соединения по изобретению обладают различными видами активности и, являясь таковыми, имеют широкую область применения в лечении различных патологических состояний, обсужденных здесь выше.
Полезность, связанная с COX/LOX
Атеросклероз, наиболее распространенное из сердечно-сосудистых заболеваний, является основной причиной инфарктов, инсультов и других проблем, связанных с циркуляцией крови. Атеросклероз - комплексное заболевание, в котором задействованы многие виды клеток, биохимические процессы и молекулярные факторы. Существует несколько аспектов этого заболевания, его болезненных состояний и прогрессирования, которые характеризуются взаимозависимыми последовательными процессами окисления липопротеинов низкой плотности (LDL), биохимии циклооксигеназы (СОХ)/липогеназы (LOX) биохимии оксида азота (NO).
2
2
Клинические исследования позволили точно установить, что увеличение в плазме концентрации LDL связано с ускорением развития атеросклероза. Холестерин, который накапливается в атеросклеротических очагах, происходит преимущественно из липопротеинов плазмы, включающих LDL. Окисление LDL является критическим событием в пусковом механизме формирования атеромы и связано с повышенным производством супероксидного анионного радикала (О•-). Окисление LDL О•- или другими реактивными группами (например, •ОН, ONOO•-, липидным пероксирадикалом, ионом меди и ионом с белковым основанием) снижает аффинитет LDL к поглощению клетками путем рецепторно обусловленного эндоцитоза. Модифицированные путем окисления LDL затем быстро захватываются макрофагами, которые впоследствии трансформируются в клетки, очень напоминающие "пенные клетки", наблюдаемые в атеросклеротических очагах на ранней стадии образования.
Окисленные липопротеины также могут способствовать повреждению сосудов путем образования гидропироксидов внутри LDL частиц. Это запускает радикальную цепь реакций окисления ненасыщенных LDL, таким образом производя больше окисленных LDL, захватываемых макрофагами.
Массовое скопление пенных клеток, насыщенное окисленными LDL, образующимися в результате этих процессов, приводит к ранним повреждениям в виде "жировых полос", которые со временем прогрессируют с образованием более развитого комплекса атеросклеротических повреждений, приводящих к коронарным заболеваниям.
Как обсуждалось в общем смысле Jean Marx на странице 320 Science, Vol.265 (July 15, 1994), каждый год около 330000 больных в Соединенных Штатах подвергаются пластике коронарных и/или периферических сосудов, процессу, приводящему к освобождению просвета кровяных сосудов, например коронарных артерий, закупоренных опасными атеросклеротическими бляшками (атеросклероз), и таким путем к восстановлению нормального кровотока. Для большинства этих пациентов операция проходит, как задумано. Однако у около 33% этих больных (и по некоторым подсчетам возможно больше) вновь развивается стеноз, когда прооперированные артерии снова быстро закупориваются. У этих больных не наступает улучшения, и иногда им становится хуже, чем было до ангиопластики. Чрезмерная пролиферация клеток гладкой мускулатуры (SMC) в стенках кровеносного сосуда способствует рестенозу. Повышенная аккумуляция окисленных LDL внутри поврежденных (SNC) может способствовать атерогенно-зависимым процессам, подобным рестенозу. Zhou et al., "Association Between Prior Cytomegalovirus Infection And The Risk Of Restenosis After Coronary Atherectomy", август 29, 1996, New England Journal of Medicine, 335:624-630, и приведенная там документация включены в данное описание в качестве ссылок. Соответственно, полезность настоящего изобретения с точки зрения атеросклероза может состоять в его применении при рестенозе.
С точки зрения ингибирования соединениями изобретения циклооксигеназы (СОХ; простагландин-эндопероксид-синтаза) известно, что циклооксигеназа является центральным ферментом в продукции простагландинов и других метаболитов арахидоновой кислоты (то есть эйкозаноидов), включенных во многие физиологические процессы. СОХ-1 является конститутивным ферментом, экспрессированным во многих тканях, включая тромбоциты, тогда как СОХ-2, вторая изоформа фермента, стимулируется различными цитокинами, гормонами и опухолевыми активаторами. СОХ 1 производит тромбоксан А2, который включен в агрегацию тромбоцитов, которая в свою очередь включена в развитие атеросклероза. На подавлении этих процессов основан профилактический эффект в отношении сердечно-сосудистых заболеваний.
Активность СОХ-1 и СОХ-2 подавляется аспирином и другими нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NSAID), и считается, что желудочные побочные эффекты NSAID связаны с подавлением СОХ-1. Более того, обнаружено, что у больных, регулярно получавших NSAID, риск заболеть раком кишечника на 40-50% ниже по сравнению с теми, кто не получал медикаментов подобного рода, и значения мРНК для СОХ-2 заметно повышаются в 86% случаев аденосаркомы кишечника.
Одно важное свойство линий клеток, экспрессирующих СОХ-2, состоит в повышенной экспрессии генов, участвующих в модуляции апоптоза, то есть запрограммированной смерти клеток. Несколько NSAID имеют отношение к повышенной смертности клеток и индукции апоптоза у эмбриональных фибробластов цыплят.
Клеточная липоксигеназа также включена в процесс окислительной модификации LDL через пероксидацию ненасыщенных липидов. Образование липидных пероксирадикалов приводит к дальнейшей радикальной цепи окисления ненасыщенных LDL липидов, производя больше окисленных LDL для захватывания макрофагами.
Неожиданно обнаружено, что соединения по изобретению обладают полезностью в лечении заболеваний, связанных с COX/LOX. В примере 28 СОХ подавлялась отдельными соединениями изобретения в концентрациях, подобных известному NSAID, индометацину.
Соединения изобретения, предназначенные для подавления СОХ, представляют собой олигомеры, где n равно 2-18. В предпочтительном варианте соединения по изобретению являются олигомерами, в которых n равно 2-10, и более предпочтительно соединения изобретения являются олигомерами, в которых n равно 2-5.
Примеры соединений, обладающие ингибиторной активностью по отношению к обозначенным выше COX/LOX, включают димеры, тримеры, тетрамеры и пентамеры, обсужденные выше.
Следовательно, учитывая значительную способность соединений изобретения к ингибированию СОХ-2, вместе с цитотоксическим эффектом на предполагаемую экспрессию СОХ-2 в раковой клеточной линии толстой кишки, компоненты по изобретению обладают апоптозной активностью в качестве ингибиторов многоступенчатого процесса, приводящего к карциномам, а кроме того, обладают активностью в качестве препаратов медикаментозной группы NSAID, обладающей широким спектром различных видов профилактической активности (см., например, пример 8, фиг.9D-9Н).
2
2
Кроме того, простагландины - предпоследние продукты СОХ-катализируемого преобразования арахидоновой кислоты в простагландин Н, участвуют в таких процессах как воспаление, боль, лихорадка, фетальное развитие, роды и агрегация тромбоцитов. Следовательно, соединения по изобретению эффективны при тех же условиях, что и NSAID, например, против сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта и т.д. (действительно, на ингибировании тромбоцитов СОХ-1, что снижает продукцию тромбоксана А, основаны профилактические эффекты аспирина при сердечно-сосудистых заболеваниях).
2
2
Воспаление - реакция живых тканей на их повреждение. Оно включает сложный комплекс активации ферментов, высвобождения медиаторов, транссудации жидкостей, миграции клеток, повреждения тканей и их восстановления. Воспаление активизируется фосфолипазой А, которая высвобождает арахидоновую кислоту, субстрат СОХ и LOX ферментов. СОХ преобразовывает арахидоновую кислоту в простагландин PGE, основной эйкозаноид, обнаруженный при различных воспалительных процессах от острого отека до хронического артрита. Ингибирование, осуществляемое NSAID, лежит в основе лечения.
Артрит является одним из ревматических заболеваний, который охватывает широкий круг заболеваний и патологических процессов, в большинство из которых вовлечены суставные ткани. Основная структура, страдающая при этих болезнях, это - соединительная ткань, в которую входят синовиальные мембраны, хрящи, кости, сухожилия, связки, и интерстициальные ткани. Непостоянные синдромы, связанные с соединительной тканью, включают растяжения и деформации, тендениты и аномалии влагалища сухожилий. Наиболее серьезными формами артрита являются ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра и системная эритематозная ("красная") волчанка.
Кроме ревматических, воспалением сопровождаются другие заболевания. При гингивитах и периодонтитах развивается патологическая картина, сходная с симптомами ревматоидного артрита. Воспалительные заболевания кишечника включают идиопатические хронические воспалительные состояния кишечника, неспецифический язвенный колит и болезнь Крона. Спондилез относится к хроническому воспалению сочленений позвонков. Имеется также много случаев остеоартритов, связанных с ожирением.
Таким образом, соединения изобретения полезны в лечении состояний, включающих воспаление, боль, лихорадку, патологии развития плода и родового процесса и агрегации тромбоцитов.
2
2
2
2
Ингибирование СОХ и с помощью соединений изобретения также замедляло бы образование простагландинов, например PGD и PGE. Таким образом, соединения изобретения полезны в лечении состояний, связанных с простагландинами PGD и PGE.
Полезность, связанная с NO
Оксид азота (NO), как известно, замедляет агрегацию тромбоцитов, адгезию моноцитов и хемотаксис, и пролиферацию гладкомышечной ткани сосудистой стенки, то есть процессов, вовлеченных в атерогенез. Это с очевидностью подтверждает ту точку зрения, что количество NO снижено в атеросклеротических тканях благодаря реакции со свободными радикалами кислорода. Потеря NO вследствие этих реакций ведет к увеличению количества тромбоцитов и адгезии воспалительных клеток к стенкам сосуда, что ведет к дальнейшему ослаблению механизмов релаксации, связанных с NO. Таким образом, потеря NO поддерживает атерогенные процессы, приводя к прогрессированию болезненного состояния.
Артериальная гипертензия является ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включающих удар, сердечный приступ, порок сердца, аритмии и поражение почек. Артериальная гипертензия представляет собой состояние, при котором давление крови внутри кровеносных сосудов во время ее циркуляции по сосудам организма, выше нормы. Когда в течение некоторого непрерывного периода времени систолическое давление превышает 150 мм рт.ст. или диастолическое давление превышает 90 мм рт.ст., то страдает весь организм. Например, чрезмерное систолическое давление может в некоторых местах приводить к разрыву кровеносных сосудов. Когда это происходит внутри мозга, результатом становится удар (инсульт). Это может также вызывать утолщение и сужение кровеносных сосудов, что может привести к атеросклерозу. Повышенное кровяное давление может также вызвать гипертрофию сердечной мышцы, поскольку она вынуждена работать интенсивнее, чтобы при выталкивании крови преодолеть повышенное (диастолическое) давление. Эта гипертрофия может в конечном счете привести к аритмиям или пороку сердца. Артериальная гипертензия названа "тихим убийцей", потому что она может протекать бессимптомно и обнаруживаться только при проверке кровяного давления.
+2
Регулирование кровяного давления представляет комплекс явлений, при которых один механизм включает в себя экспрессию конститутивного Са/кальмодулин-зависимой формы синтазы оксида азота (NOS), сокращенно eNOS. NO, выработанный с помощью этого фермента, вызывает мышечную релаксацию сосуда (дилатация), которая понижает кровяное давление. Мышцы сосудистой стенки не расслабляются в должной мере, когда не происходит производства нормального уровня производимого с помощью eNOS оксида азота, или в результате того, что его производство блокировано ингибитором, или в патологических состояниях, таких как атеросклероз. Сохранившаяся в результате вазоконстрикция приводит к повышению кровяного давления и может быть ответственна за некоторые формы артериальной гипертензии.
+2
+2
+2
+2
2+
Сосудистые эндотелиальные клетки содержат eNOS. NO, синтезируемый с помощью eNOS, диффундирует в разных направлениях и, когда достигает основного гладкомышечного слоя сосудистой стенки, связывается с гемгруппой гуанилилциклазы, вызывающей повышение cGMP. Повышение cGMP вызывает уменьшение внутриклеточного свободного Са. Циклический GMP может активировать протеинкиназу, которая фосфорилирует переносчики Са, заставляя Са секвестроваться в межклеточных структурах мышечных клеток. Так как для мышечного сокращения необходим Са, сила сокращения уменьшается при снижении концентрации Са. Мышечная релаксация приводит к расширению сосуда, что понижает кровяное давление. Подавления eNOS, следовательно, вызывает повышение кровяного давления.
Когда не происходит выработки NO в нормальном количестве, или вследствие блокирования выработки при применении ингибитора NOS или, возможно, в патологических состояниях, сосудистая мускулатура не расслабляется в должной мере. Происходящая в результате вазоконстрикция повышает кровяное давление и может быть ответственна за некоторые формы артериальной гипертензии. Значительный интерес представляет обнаружение терапевтических способов увеличения активности eNOS у больных, страдающих гипертонией, но нет сообщений о практике подобного лечения. Фармакологические агенты, способствующие высвобождению NO, такие как нитроглицерин или изосорбит динитрат, остаются основными сосудорасширяющими средствами.
Хотя соединения по изобретению замедляют окисление LDL, более общий эффект этих соединений состоит в их многоплановом воздействии на атеросклероз посредством NO. Модулирование NO соединениями по изобретению вызывает комплекс положительных эффектов, включающий модуляцию артериальной гипертензии, снижение вызванной NO гиперхолестеринемии, замедление агрегации тромбоцитов и адгезии моноцитов, которые вовлечены в процесс развития атеросклероза.
Роль NO в иммунной системе отлична от ее функции в кровеносных сосудах. Макрофаги содержат такую форму NOS, которая является индуцируемой, а не конститутивной и далее называется iNOS. Транскрипция iNOS гена управляется как положительно, так и отрицательно рядом биологических модификаторов реакции, называемых цитокинами. Наиболее важными возбудителями являются гамма-интерферон, фактор некроза опухоли, интерлейкин-1, интерлейкин-2 и липополисахариды (LPS), которые являются компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Стимулированные макрофаги производят достаточно NO для ингибирования редуктазы рибонуклеазы, фермента, преобразовывающего рибонуклеотиды в дезоксирибонуклеотиды, необходимые для синтеза ДНК. Подавление синтеза ДНК может стать важным путем, которым макрофаги и другие ткани, несущие iNOS, могут замедлять рост быстро делящихся клеток опухоли или инфекционных бактерий.
Что касается эффектов NO и инфекционных бактерий, микроорганизмы играют значительную роль в инфекционных процессах, которые отражают влияние на организм вредных привычек, профессиональных вредностей, окружающей среды человека, также как пищевых заболеваний, вызванных неправильным хранением, обращением и заражением продуктов.
Соединения по изобретению, их комбинации и содержащие их композиции пригодны в лечении состояний, связанных с модулированием концентраций NO. Пример 9 описывает антиоксидантную активность (как ингибиторов свободных радикалов) соединений по изобретению. При условии, что NO является свободным радикалом и что соединения изобретения являются сильными антиоксидантами, предполагалось, что применение соединений по изобретению в экспериментах на моделях in vitro и in vivo вызовет снижение уровней NO. Любое снижение NO привело бы скорее к гипертензивному, чем к гипотензивному эффекту. Вопреки ожиданиям, соединения по изобретению показали увеличение NO в экспериментах in vitro и произвели гипотензивный эффект в исследованиях in vivo (примеры 31 и 32). Эти результаты явились неожиданными и абсолютно непредвиденными.
Пример 27 описывает эритему (покраснение лица), появляющуюся вскоре после выпивания раствора, содержащего соединения изобретения и глюкозу, таким образом демонстрируя эффект расширения сосудов.
Пример 31 описывает гипотензивный эффект, вызванный соединениями изобретения у подопытного животного in vivo, демонстрируя эффективность соединений по изобретению в лечении артериальной гипертензии. В этом примере соединения изобретения, их комбинации и включающие их композиции содержат олигомеры, в которых n равно 2-18 и предпочтительно n равно 2-10.
Пример 32 описывает модулирование продукции NO соединениями по изобретению на модели in vitro. В этом примере соединения изобретения, их комбинации и содержащие их композиции содержат олигомеры, в которых n равно 2-18 и предпочтительно n равно 2-10.
+2
+2
+3
Кроме того, пример 35 предлагает доказательства образования Cu-, Fe- и Fe- олигомерных комплексов, выявляемых с помощью MALDI/TOF/MS. Эти результаты указывают, что соединения по изобретению могут соединяться с ионами меди и/или железа, для того чтобы минимизировать их воздействие на окисление LDL.
Кроме того, соединения по изобретению обладают полезной антимикробной активностью при лечении заразных заболеваний и для предупреждения порчи продовольствия. Примеры 22 и 30 описывают антимикробную активность соединений изобретения против отдельных представителей микроорганизмов, имеющую клиническое и пищевое значение, как показано ниже.
Микроорганизм
Тип
Клиническая/продовольственная ценность
Helicobacter pylori
Грамотрицательный
Гастриты, язвы, рак желудка
Виды Bacillus
Грамположительный
Пищевые отравления, инфицированные раны, бычий мастит, сепсис
Виды Salmonella
Грамотрицательный
Пищевое отравление, понос
Staphyloccocus aureus
Грамположительный
Кипение, карбункулы, инфицированные раны, сепсис, абсцессы молочной железы
Escherichia coli
Грамотрицательный
Понос младенцев, инфекция мочевого тракта
Виды Pseudomonas
Грамотрицательный
Инфекции мочевого тракта, инфицированные раны, "ухо пловца"
Saccharomyces cervisea
Дрожжи
Порча продовольствия
Acetobacter pasteurianus
Грамотрицательный
Порча продовольствия
Пример 33 описывает эффект соединений по изобретению на производство NO макрофагами. В этом примере результаты демонстрируют, что соединения по изобретению индуцируют производство NO моноцитами/макрофагами как независимо, так и зависимо от стимуляции полисахаридами (LPS) или цитокинами. Производство макрофагами NO может ингибировать рост инфекционных микроорганизмов.
Соединения по изобретению, обладающие антимикробной активностью, представляют собой олигомеры, в которых n равно 2-18, и предпочтительно являются олигомерами, в которых n равно 2, 4, 5, 6, 8 и 10.
Примеры составов, обнаруживающих антимикробную активность, связанную с вышеописанным влиянием NO, включают димеры, тетрамеры, гексамеры, октамеры и декамеры, обсужденные выше.
Противораковая полезность
Раковые заболевания классифицированы на три группы: карциномы, саркомы и лимфомы. Карцинома представляет собой злокачественное новообразование, которое возникает в коже, эпителии, выстилающем внутренние поверхности различных органов, железах и тканях. Саркома представляет собой злокачественное новообразование, которое возникает в костях, мышцах или в соединительной ткани. Третья группа включает лейкозы и лимфомы, так как и то, и другое развивается в органах, образующих клетки крови. Основными типами раковых заболеваний являются рак простаты, молочной железы, легких, толстого кишечника, мочевого пузыря, лимфома типа не-Ходжкин, рак матки, меланома кожи, рак почки, лейкоз, рак яичника и поджелудочной железы.
Рак развивается вследствие изменения ДНК клеток, которое вызывается многими факторами, такими как наследственный генетический фактор, влияние радиации, загрязнителей, радона и повреждение ДНК свободными радикалами. В клетках, несущих мутации, происходит нарушение нормального процесса клеточного деления. Эти клетки в должной мере не подвергаются апоптозу и продолжают делиться, что знаменует начало развития злокачественной опухоли или допускают появление большего количества мутаций в течение некоторого времени, что приводит к развитию злокачественного новообразования.
Существует три главных черты, общих для различных раковых образований. Это (1) способность к непредсказуемому распространению; (2) врастание опухоли в окружающую ткань и (3) процесс метастазирования.
Разные виды рака метастазируют характерным для них образом. Например, раковые образования щитовидной железы, легкого, грудной железы, почки и простаты часто дают метастазы в кости. Рак легкого обычно распространяется в мозг и надпочечники, рак толстой кишки часто метастазирует в печень. Лейкоз с самого начала рассматривается как генерализованное заболевание, которое обнаруживается в костном мозге организма.
Неожиданно было обнаружено, что соединения изобретения являются пригодными в лечении раковых заболеваний, обсужденных выше. Примеры 6, 7, 8 и 15 описывают соединения изобретения, которые проявляют противораковую активность против рака человека HeLa (цервикального), рака простаты, грудной железы, почек, против Т-клеточного лейкоза и клеточной линии рака толстой кишки. Пример 12 (фиг.20) иллюстрирует дозовую зависимость клеточных линий рака молочной железы HeLa SKBR-3, обработанных олигомерными (димерами - додекамерами) процианидинами, которые были существенно очищены с помощью ВЭЖХ. Цитотоксичность против этих раковых клеточных линий зависела от наличия процианидинов от пентамера до додекамера, в то время как низшие олигомеры не проявляли подобного эффекта.
Не связывая это ни с какой теорией, оказалось, что существует минимальный структурный фрагмент, ответственный за описанные выше эффекты. Пример 37 также показывает такой же цитотоксический эффект высших олигомеров (пентамеров-декамеров) против кошачей клеточной линии лимфобластомы. Также наблюдалась цитотоксичность высших олигомеров (фиг.58-61) против нормальных собачьей и кошачей клеточных линий.
В примере 8 (фиг.9D-Н) показано, что соединения по изобретению проявляют цитотоксичность против предполагаемой экспрессии СОХ-2 клеточной линии рака толстой кишки человека (НСТ 116).
Пример 9 описывает антиоксидантную активность соединений по изобретению. Соединения по изобретению ингибируют появление разрывов в цепи ДНК, образование перекрестного связывания белок-ДНК и окисление свободных радикалов нуклеотидов для снижения и/или предотвращения возникновения мутаций.
Пример 10 описывает соединения по изобретению, такие как ингибиторы топоизомеразы II, которые являются мишенью для химиотерапевтических агентов типа доксорубицина.
Пример 21 описывает эффект in vivo по существу чистого пентамера, который проявлял противоопухолевую активность против раковой клеточной линии человека (MDA-MB-231/LCC6) на модели голой мыши (средний вес мыши - приблизительно 25 г). Повторные эксперименты in vivo с пентамерами в более высоких дозировках (5 мг) не были полностью успешными из-за непредвиденной токсичности для животных. В настоящее время полагают, что эта токсичность может быть связана с сосудорасширяющим эффектом соединений по изобретению.
Пример 33 описывает действие соединения по изобретению на выработку макрофагами NO. Макрофаги, вырабатывающие NO, могут замедлять рост быстро делящихся опухолевых клеток.
Кроме того, изобретение включает использование соединений изобретения для стимуляции ингибирования клеточной пролиферации путем апоптоза.
Для проявления противораковой активности соединения по изобретению должны быть олигомерами, в которых n равно 2-18, например 3-18, типа 3-12, и предпочтительно n равно 5-12, наиболее предпочтительно n равно 5.
Соединения, которые проявляют ингибирующую активность по отношению к приведенным выше видам раковых заболеваний, включают пентамеры-додекамеры, обсужденные выше.
Готовые препаративные формы и способы применения
Таким образом, соединения изобретения, их комбинации и содержащие их композиции проявляют широкий спектр активностей против отдельных проявлений атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, рака, модулирования кровяного давления и/или артериальной гипертензии, воспалительных заболеваний, инфекционных агентов и порчи продовольствия.
2
Следовательно, соединения изобретения, их комбинации и содержание их композиции являются ингибиторами СОХ, влияющими на агрегацию тромбоцитов путем ингибирования образования тромбоксана А, снижая, таким образом, риск тромбоза. Кроме того, ингибирование СОХ приводит к снижению адгезии тромбоцитов и воспалительных клеток к стенкам сосудов, причем улучшается NO-обусловленный механизм релаксации. Эти результаты, вместе с ингибированием СОХ при концентрациях, подобных концентрациям известного NSAID, индометацина, указывают на эффективность соединения изобретения в качестве антимикробных агентов.
Кроме того, соединения изобретения, их комбинации и содержащие их композиции являются антиоксидантами, которые подавляют окисление LDL путем снижения уровня супероксидного радикального аниона и медиированных липоксигеназой липидных пероксирадикалов. Ингибирование окисления LDL на этой стадии замедляет активацию макрофагов и уменьшает образование "пенных клеток" (губчатой ткани), что прерывает дальнейшее прогрессирование атеросклероза. Ингибирование окисления LDL может также замедлить прогрессирование рестеноза. Таким образом, соединения изобретения, или их комбинации, или содержащие их композиции могут использоваться для предотвращения и/или лечения атеросклероза и/или рестеноза. И таким образом, соединения изобретения могут применяться до или после пластической операции на сосудах или подобных процедур с целью предотвращения или лечения рестеноза у склонных к нему пациентов.
Для лечения или предотвращения рестеноза и/или атеросклероза соединение изобретения или соединения или композиция, содержащая соединение или соединения изобретения, сами по себе или в сочетании с другими лечебными средствами могут применяться по назначению квалифицированного лечащего врача исходя из этого описания и известного уровня техники, например, при первых признаках или симптомах рестеноза и/или атеросклероза, немедленно до, одновременно или после ангиопластики, или позже в соответствии с предписанием квалифицированного лечащего врача, без какого-либо излишнего экспериментирования; применение соединения или соединений изобретения, или их композиций самих по себе или вместе с другими способами лечения может быть продолжено в виде курса, например, ежемесячного, двухмесячного, два раза в год, ежегодного или в каком-либо другом режиме, определенном квалифицированным лечащим врачом на необходимое время без какого-либо излишнего экспериментирования.
Кроме того, соединения изобретения, их комбинации и содержащие их композиции продемонстрировали произведенный ими гипотензивный эффект in vivo и стимулирование NO in vitro. Эти результаты могут иметь практическое применение в лечении артериальной гипертензии и в различных клинических случаях, включающих гиперхолестеринемию, при которой уровень NO заметно снижен.
Готовые препаративные формы соединений изобретения, их комбинаций и содержащих их композиций могут быть приготовлены стандартными способами, известными в фармацевтике пищевой промышленности, в области медицины и ветеринарии, в форме жидкости, суспензии, таблетки, капсулы, инъекционного раствора или свечей, с немедленным или с замедленным высвобождением активных соединений.
Носителем может также быть полимерная система отсроченного высвобождения. Синтетические полимеры, в частности, находят применение в готовой препаративной форме композиции с управляемым высвобождением. Первым примером подобной формы была полимеризация метилметакрилата в сферы с диаметром меньше одного микрона с образованием так называемых наночастиц, как сообщалось Kreuter, J., Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (Ed). CRC Press, p.125-148. Часто в качестве носителя фармацевтического препарата и реже для антигенов выбирают поли (d,l-лактидкогликолид) (PLGA). Он представляет собой биодеградируемый полиэфир, который имеет длительную историю использования в медицине, как вещества для получения рассасывающегося шовного материала, металлических пластинок для скрепления обломков кости и для других временных протезов, и при этом он не проявил какой-либо токсичности. Разнообразные виды фармацевтических препаратов оформляются в PLGA микрокапсулы. Собрано достаточно данных по адаптации PLGA для обеспечения контролируемого выхода, как рассмотрено, например, Eldridge, J.H., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146:59-66. При оральном применении эффективно содержание в PLGA микросфер размером 1-10 микрон в диаметре. При процессе микроинкапсуляции PLGA используется фазовое эмульсионное разделение вода-в-масле. Соединение или соединения изобретения готовятся как водный раствор и PLGA растворяют в подходящих органических растворителях, таких как метиленхлорид и этилацетат. Эти два несмешивающихся раствора совместно эмульгируются при высокоскоростном перемешивании. Затем добавляют вещество, не являющееся растворителем для полимера, вызывая его осаждение вокруг водяных капель с образованием зародышевых микрокапсул. Микрокапсулы собирают и стабилизируют с одним из агентов, выбранных из поливинилового спирта (PVA), желатина, альгинатов и метилцеллюлозы, и затем растворитель удаляют или высушиванием в вакууме, или экстракцией растворителя.
Дополнительно, относительно приготовления препаративных форм с замедленным высвобождением, делаются ссылки на патенты США № 5024843, 5091190, 5082668, 4612008 и 4327725, включенные в данное описание в виде ссылок.
Кроме того, селективные процедуры вместе с определением представляющих интерес генотипов какао могут использоваться для создания изделий из шоколада, как входящих в Стандарт идентичности (SOI), так и не входящих, таких как наполнитель, предназначенный для доставки активных компонентов нуждающемуся в лечении пациенту, страдающему описанными выше болезнями, а также средств для обеспечения определенного уровня соединений изобретения.
В этом отношении дается ссылка на одновременно регистрируемую заявку США серийный № 08/709406, поданную 6 сентября 1966, включенную в данное описание в виде ссылки. Заявка USSN 08/709406 касается способа получения масла какао и/или сухого вещества какао, при котором сохраняется уровень полифенолов какао-бобов, и использующего уникальную комбинацию стадий приготовления, которая не требует отдельного оборудования для обжаривания или влажного размалывания бобов, давая возможность обрабатывать какао-бобы без того, чтобы подвергать их чрезмерной тепловой обработке в течение длительного периода времени и/или без использования экстрагирования жирового компонента растворителем. Преимущество этого процесса состоит в повышенной концентрации полифенолов по сравнению с концентрацией, получаемой при традиционных способах обработки какао-бобов, так отношение начального количества полифенолов, обнаруженных в необработанных бобах, к тем, которые определяются после процесса обработки, меньше или равно 2.
Композиции по изобретению включают одно или более указанных выше соединений в виде готовых препаративных форм, содержащих фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, и соединения изобретения, имеющие противораковую, противоопухолевую или антинеопластическую активность, антиоксидантную активность, ингибируют ферментативную активность ДНК-топоизомеразы II, ингибируют окислительное повреждение ДНК, индуцируют моноцит/макрофагальную выработку NO, обладают антимикробной активностью, а также активностью в качестве модуляторов циклооксигеназы и/или липоксигеназы, NO или NO-синтазы, апоптоза, агрегации тромбоцитов и глюкозы в крови и in vivo, и имеют эффективность как нестероидные противовоспалительные агенты.
Другой вариант изобретения включает композиции, содержащие соединения изобретения или их комбинации, так же как по меньшей мере одно дополнительное противоопухолевое средство, средство снижающее кровяное давление, противовоспалительный, антимикробный, антиоксидантный и гемопоэтический агенты, в дополнение к фармацевтически приемлемому носителю или эксципиенту.
50
Такие композиции могут назначаться нуждающемуся в них пациенту в таких дозировках и такими способами, которые известны квалифицированным специалистам в области медицины, питания или ветеринарии, с учетом обсуждаемых данных и таких факторов как возраст, пол, масса, наследственность и условия жизни определенного субъекта или пациента, а также учитывая путь введения, относительную концентрацию определенных олигомеров и токсичность (например, LD).
Композиции могут назначаться одновременно или последовательно с другими антибластомными и противораковыми средствами, антиоксидантами, агентами, ингибирующими ферментативную активность ДНК-топоизомеразы II, с агентами, моделирующими ингибиторы окислительного повреждения ДНК или циклооксигеназу и/или липоксигеназу, апоптоз, агрегацию тромбоцитов, глюкозу в крови и in vivo или NO или NO-синтазу, с нестероидными противовоспалительными агентами и/или с агентами, которые уменьшают или облегчают болезненные эффекты антибластомных, противораковых, противоопухолевых агентов, антиоксидантов, агентов, ингибирующих ферментативную активность ДНК-топоизомеразы II, ингибитора окислительного повреждения ДНК, агентов модулирующих циклооксигеназу и/или липоксигеназу, апоптоз, агрегацию тромбоцитов, глюкозу в крови и in vivo, NO или NO-синтазу, и/или нестереоидных противовоспалительных агентов; и на этот раз учитывая такие факторы как возраст, пол, масса, наследственность и условия жизни определенного субъекта или пациента и путь введения.
Примеры композиций по изобретению, предназначенные для использования человеком или в ветеринарии, включают съедобные композиции для перорального приема, такие как твердые или жидкие готовые препаративные формы, например капсулы, таблетки, пилюли и т.п., а также твердые препараты в виде жвачки, к которым вполне применимо настоящее изобретение, поскольку в нем использовали источник, пригодный для употребления в пищу (например, твердые композиции, ароматизированные какао или шоколадом); жидкие композиции для введения в различные полости организма, например, для перорального, интраназального, анального, вагинального и т.п. введения, такие как суспензии, сиропы или эликсиры (включая композиции, ароматизированные какао или шоколадом); препараты для парентерального, подкожного, чрезкожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, путем инъекций), такие как суспензии или эмульсии. Однако каждый специалист должен иметь в виду, что активный ингредиент, присутствующий в композициях, может образовывать комплекс с белками кровотока, в результате чего благодаря преципитации белков крови может происходить свертывание крови. В такие композиции активный экстракт какао может быть введен в смеси с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, ДМСО, этиловый спирт или подобные. Активный экстракт какао настоящего изобретения может быть получен в лиофилизированной форме с последующим восстановлением, например, в изотоническом водном, солевом, глюкозном или ДМСО буфере. В некоторых физиологических растворах наблюдалась небольшая преципитация, и это наблюдение может быть использовано в качестве способа для выделения соединений по изобретению, например, высаливанием.
Пример 38 описывает получение соединений по изобретению в препаративной форме в виде таблеток для применения в области фармацевтики, пищевых добавок и продовольствия. Далее, пример 39 описывает приготовление соединений по изобретению в препаративной форме в виде капсул для такого же применения. Пример 40 описывает готовую препаративную форму шоколада, входящего в Стандарт идентичности (SOI), и шоколада, не входящего в SOI, содержащего соединения по изобретению или твердые композиции какао, полученные способами, описанными в одновременно зарегистрированной заявке США, серийный номер 08/709406, включенной в данное описание путем ссылки.
Наборы
Далее, изобретение также относится к набору, включающему активный экстракт какао. Данный набор может представлять собой отдельный контейнер, содержащий подходящий носитель, разбавитель или эксципиент. Набор может также содержать дополнительный противораковый, противоопухолевый или антибластомный агент, антиоксидант, ингибитор ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II, или ингибитор окислительного повреждения ДНК, или антибактериальный агент, или агент, модулирующий циклооксигеназу и/или липоксигеназу, NO или NO-синтазу, нестероидные противовоспалительные агенты, апоптоз и агрегацию тромбоцитов, агент, модулирующий глюкозу в крови или in vivo, и/или агент, снижающий или облегчающий эффекты антибластомных, противоопухолевых или противораковых агентов, ингибитора ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II, антимикробных агентов, или циклооксигеназы и/или липоксигеназы, NO или NO-синтазы, апоптоза, агрегации тромбоцитов и глюкозы в крови или in vivo и/или нестероидных противовоспалительных агентов, предназначенных для совместного или последовательного применения. Дополнительный агент (или агенты) может быть помещен в отдельный контейнер (контейнеры) либо он может быть смешан с активным экстрактом какао. Кроме того, набор может включать в себя инструкции по смешиванию или объединению ингредиентов и/или по их применению.
Идентификация генов
Еще одно выполнение изобретения включает модуляцию генов, экспрессированных в результате близкого контакта клеток с соединениями изобретения или комбинацией соединений. С этой точки зрения настоящее изобретение содержит способы идентификации генов, индуцированных или подавленных соединениями изобретения или комбинацией соединений, которые связаны с отдельными болезнями, включая, но не ограничиваясь ими, атеросклероз, артериальную гипертензию, рак, сердечно-сосудистые заболевания и воспаление. В особенности, гены, которые дифференцированно экспрессируются при этих болезненных состояниях в сравнении с их экспрессией в "нормальных" неболезненных состояниях, идентифицированы и описаны до и после контакта с соединениями по изобретению или комбинацией соединений.
Как указано в предыдущем обсуждении, эти болезни и болезненные состояния частично основаны на свободных радикальных взаимодействиях с разнообразными биомолекулами. Основной момент в развитии этих болезней состоит в том, что многие из свободных радикальных реакций вовлекают частицы реактивного кислорода, которые в свою очередь приводят к физиологическим условиям, вовлеченным в прогрессирование болезни. Например, частицы реактивного кислорода вовлечены в регулирование факторов транскрипции, таких как ядерный фактор (NF)-kB. Гены-мишени для NF-kB включают ряд генов, связанных с координированным воспалительным ответом. Он включает гены, кодирующие фактор некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкин (IL)-l, IL-6, IL-8, индуцируемый NOS, главный комплекс гистосовместимости (МНС) антигены I класса и другие. Также гены, которые модулируют активность факторов транскрипции, могут, в свою очередь, индуцироваться окислительным стрессом. Окислительный стресс представляет собой отсутствие баланса между радикальной очисткой и радикальными генерирующими системами. Несколько известных примеров (Winyard и Blake, 1997) этих условий включают gaddl53 (ген, индуцируемый задержкой роста и повреждением ДНК), продукт которого, как показано, связывает NF-IL-6 и формирует гетеродимер, который не может связываться с ДНК. NF-IL-6 регулирует экспрессию отдельных генов, включая кодирующие интерлейкины 6 и 8. Другим примером индуцируемых генов окислительного стресса является qadd45, который регулирует эффекты фактора транскрипции р53 при задержке роста. р53 кодирует белок р53, который может останавливать клеточное деление и стимулировать апоптоз аномальных клеток (например, раковых).
Чтобы дать полную картину непредвиденных, неочевидных и новых применений соединений изобретения или комбинации соединений, полезных в другой группе болезней, частично основанных на свободных радикальных механизмах, изобретение далее включает стратегию определения темпорального эффекта на ген(ы) или продукт(ы) экспрессии генов соединениями изобретения на моделях животных определенных болезней или болезненных состояний in vitro или in vivo, используя анализ экспрессии генов. Эти анализы включают, не ограничиваясь перечисленным, дифференциальную демонстрацию, секвенирование библиотек последовательностей кДНК, серийный анализ экспрессии генов (SAGE), регистрацию экспрессии путем гибридизации с олигонуклеотидными последовательностями высокой плотности и разнообразные цепные реакции полимеризации обратной транскриптазы (RT-PCR), основанные на протоколах или комбинации перечисленных выше методов анализа (Lockhart и другие, 1996).
Всесторонние физиологические эффекты соединений изобретения или комбинаций соединений, воплощенные в изобретении, вместе с процессом генетической оценки позволяют обнаруживать гены и генные продукты как известные, так и новые, индуцированные или подавленные. Например, изобретение включает in vitro и in vivo индукцию и/или репрессию цитокинов (например, IL-I, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF-α) в лимфоцитах с использованием RT-PCR.
2
2
Аналогичным образом изобретение включает применение дифференциальной демонстрации, чтобы установить индукцию и/или репрессию выбранных генов, для сердечно-сосудистой области (например, супероксид дисмутазы, гемоксидаза, СОХ 1 и 2 и другие гены защиты от окислителя) в условиях стимулирования и/или окислительного стимулирования (например, TNF-α или НО). Для области рака, изобретение включает применение дифференциальной демонстрации для подтверждения индукции и/или репрессии генов или генных продуктов типа CuZn-супероксида дисмутазы, Mn-супероксида дисмутазы, каталазы и т.д., в клетках контроля и в клетках, подвергнутых окислительному стрессу. Следующие, не ограничивающие примеры приводятся только для иллюстрации и не должны рассматриваться как некое ограничение изобретения, причем в указанные примеры может быть введено множество очевидных изменений, не выходя за рамки объема и существа изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Источники какао и способы получения
Некоторые генотипы Teobroma cacao, которые представляют собой три известных культурных сорта какао (Enriques, 1967; Engels, 1981), получали из трех главных регионов мира, производящих какао. Перечень генотипов, используемых в данном исследовании, приводится в таблице 1. Собранные плоды какао раскрывали и из них извлекали бобы с мякотью для сушки замораживанием. Затем от высушенной массы вручную отделяли мякоть, а бобы подвергали анализу, описанному ниже. Неферментированные и высушенные заморозкой какао-бобы сначала вручную отделяли от кожуры, а затем измельчали на мельнице TEKMAR, получая мелкую порошкообразную массу. Затем полученную массу обезжиривали до утра путем экстракции (Soxhlet) с использованием в качестве растворителя гексана, подвергнутого повторной перегонке. Остаточный растворитель удаляли из обезжиренной массы путем вакуумной отгонки при температуре окружающей среды.
Таблица 1Описание Teobroma cacao как источника материала
Генотип
Регион происхождения
Культурный сорт
UIT-1
Малайзия
Trinitario
Неизвестен
Западная Африка
Forastero
ICS-100
Бразилия
Trinitario (предок Nicaraguan Criollo)
ICS-39
Бразилия
Trinitario (предок Nicaraguan Criollo)
UF-613
Бразилия
Trinitario
EEG-48
Бразилия
Forastero
UF-12
Бразилия
Trinitario
NA-33
Бразилия
Forastero
ПРИМЕР 2
Методы экстрагирования процианидина
А. Метод 1
3
2
Процианидины экстрагировали из обезжиренных, неферментированных и высушенных заморозкой какао-бобов примера 1, используя модификацию метода, описанного Jalan & Collin (1977). Процианидины дважды экстрагировали из 50-граммовых партий обезжиренной массы какао 400 мл смеси 70% ацетон/деионизированная вода, а затем 400 мл 70% метанол/деионизированная вода. Экстракты объединяли, а растворители удаляли выпариванием при температуре 45°С на роторном испарителе в частичном вакууме. Полученную водную фазу разводили деионизированной водой до объема в 1 литр, а затем дважды экстрагировали 400 мл CHCl. Фазу, содержащую растворитель, отбрасывали. Затем водную фазу четыре раза экстрагировали 500 мл этилацетата. Каждую из полученных эмульсий разрушали центрифугированием на центрифуге Sorvall RC 208 при 2000хg в течение 30 минут при температуре 10°С. К объединенным этилацетатным экстрактам добавляли 100-200 мл деионизированной воды. Затем растворитель удаляли при температуре 45°С на роторном испарителе в частичном вакууме. Полученную водную фазу замораживали в жидком N, а затем сушили вымораживанием с использованием системы сушки вымораживанием LABCONCO. Выходы неочищенных процианидинов, полученных из различных генотипов какао, представлены в таблице 2.
Таблица 2Выход неочищенных процианидинов
Генотип
Регион происхождения
Выход (г)
UIT-1
Малайзия
3, 81
Неизвестен
Западная Африка
2,55
ICS-100
Бразилия
3,42
ICS-39
Бразилия
3,45
UF-613
Бразилия
2,98
EEG-48
Бразилия
3,15
UF-12
Бразилия
1,21
NA-33
Бразилия
2,23
В. Метод 2
Альтернативно процианидины экстрагировали из обезжиренных, неферментированных высушенных заморозкой какао-бобов, полученных, как описано в примере 1, с использованием 70% водного раствора ацетона. Десять граммов обезжиренного материала суспендировали в течение 5-10 минут 100 мл растворителя. Полученную суспензию центрифугировали при 3000хg в течение 15 минут при 4°С и супернатант пропускали через стекловату. Фильтрат подвергали дистилляции в частичном вакууме и полученную в результате водную фазу замораживали в жидком азоте с последующим высушиванием заморозкой на системе LABCONCO Freeze Dry System. Выход неочищенных процианидинов составлял 15-20%.
Не претендуя на какую-либо конкретную теорию, можно предположить, что различия в выходе неочищенных процианидинов обусловлены различиями генотипов, географического происхождения и способов получения.
ПРИМЕР 3
Частичная очистка процианидинов какао
А. Гель-проникающая хроматография
Процианидины, полученные, как описано в примере 2, частично очищали с помощью жидкостной хроматографии на Сефадексе (Sephadex LH-20) (28x2,5 см). Разделение проводили с использованием ступенчатого градиента деионизированная вода → метанол. В качестве начального градиентного состава использовали 15% раствор метанола в деионизированной воде, а затем путем ступенчатого увеличения через каждые 30 минут 25% раствор метанола в деионизированной воде, 35% раствор метанола в деионизированной воде, 70% раствор метанола в деионизированной воде и наконец 100% метанол. Жидкость, вытекающую после элюирования ксантиновых алкалоидов (кофеин и теобромин), собирали как одну фракцию. Данная фракция давала субфракцию, не содержащую ксантинового алкалоида, которую затем подвергали дополнительному фракционированию с получением пяти субфракций, обозначенных как ММ2А-ММ2Е. Из каждой субфракции удаляли растворитель путем выпаривания при 45°C на роторном испарителе, работающем в частичном вакууме. Полученную водную фазу замораживали в жидком азоте и сушили вымораживанием в течение ночи на системе LABCONGO Freeze Dry System. Характерная хроматограмма, полученная при проведении гель-проникающей хроматографии и иллюстрирующая фракционирование, показана на фиг.1. Таким способом фракционированию подвергали приблизительно 100 мг материала.
Условия проведения хроматографии:
колонка: 28х2,5 см, Сефадекс LH-20;
подвижная фаза: ступенчатый градиент метанол/вода 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0 через 30-минутные интервалы;
скорость потока: 1,5 мл/мин;
1
2
УФ-детектор при λ=254 нм и λ=365 нм;
скорость движения диаграммной бумаги: 0,5 мм/мин;
загрузка колонки: 120 мг.
В. Полупрепаративная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Метод 1: разделение с обратной фазой
Процианидины, полученные, как описано в примере 2 и/или 3А, частично очищали с помощью полупрепаративной ВЭЖХ (ВЭЖХ-система Hewlett Packard 1050, снабженная детектором с переменной длиной волны и инжекторным клапаном Rheodyne 7010 с 1-миллиметровой инъекционной петлей), соединяли с коллектором фракций Farmacia Frac-100, разделение проводили на колонке (250 х 22,5 мм) Phenomenex Ultracard, соединенной с предколонкой (60 х 10 мм) Phenomenex 10 мкм ODS Uitracarb. Подвижная фаза состава А=вода; В=метанол, использованный в линейном градиенте в следующих условиях (время; %А): (0, 85), (60, 50), (90, 0) и (110, 0) при скорости потока 5 мл/мин. Компоненты выявляли УФ при 254 нм. Характерная кривая, полученная при проведении полупрепаративной ВЭЖХ для разделения процианидинов, присутствующих во фракциях D+E, показана на фиг.15N. Отдельные пики или выбранные хроматографические зоны собирали через определенные интервалы времени или вручную, путем сбора фракций для дополнительной очистки и последующей оценки. Нанесенный с помощью шприца образец составлял 25-100 мг материала.
Метод 2. Разделение с нормальной фазой
Процианидиновые экстракты, полученные, как описано в примере 2 и/или 3А, частично очищали с помощью полупрепаративной ВЭЖХ, ВЭЖХ-система Hewlett Packard 1050 с детектором Millipore-Waters Model 480 LC, установленным на 254 нм, соединяли с коллектором фракций Farmacia Frac-100. Разделение проводили на колонке Supelco 5 мкм Supeicosil LC-Si (250x10 мм), соединенной с предколонкой Supelco 5 мкм Supelguard LC-Si (20x4,6 мм). Процианидины элюировали линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), с последующим 10-минутным переуравновешиванием. Подвижная фаза состава: А=дихлорметан, В=метанол и С=уксусная кислота/вода (1:1). Скорость потока составляла 3 мл/мин. Компоненты выявляли с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм и регистрировали с использованием самописца Kipp & Zonan BD41. Объем вводимых образцов составлял от 100 до 250 мкл экстрактов 10 мг процианидина, разведенных в 0,25 мл 70% водного ацетона. Характерная хроматограмма, полученная при проведении полупрепаративной ВЭЖХ, показана на фиг.15О. Отдельные пики или выбранные хроматографические зоны собирали через определенные интервалы времени или вручную путем сбора фракций для дополнительной очистки и последующей оценки.
Условия проведения ВЭЖХ:
250х10 мм полупрепаративная колонка Supelco Supelcosil LC-Si (5 мкм);
20х4,6 мм предколонка Supeico Supelcosil LC-Si (5 мк);
детектор: Waters LC;
спектрофотометр модель 480 при 254 нм;
скорость потока: 3 мл/мин;
температура колонки: температура окружающей среды;
нанесение: 250 мкл экстракта в 70% водном ацетоне.
Градиент:время (мин)
CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>
Метанол
Уксусная кислота:Н<sub>2</sub>О (1:1)
0
82
14
4
30
67,6
28,4
4
60
46
50
4
65
10
86
4
70
10
86
4
Получены следующие фракции:
Фракции
Вид
1
Димеры
2
Тримеры
3
Тетрамеры
4
Пентамеры
5
Гексамеры
6
Гептамеры
7
Октамеры
8
Нонамеры
9
Декамеры
10
Ундекамеры
11
Додекамеры
12
Высшие олигомеры
ПРИМЕР 4
Анализ процианидиновых экстрактов с помощью аналитической ВЭЖХ
Метод 1: разделение с обращенной фазой
возб.
изл.
Процианидиновые экстракты, полученные, как описано в примере 3, фильтруют через 0,45 мк-фильтр и анализируют на состоящей из трех частей ВЭЖХ-системе Hewlett Packard 1090, снабженной фотодиодным и программируемым флуоресцентным детектором 1046A модели HP. Разделение осуществляли при 45°С на колонке (200 х 2,1 мм) Hewlett-Packard с Hypersil ODS (5 мк). Флаванолы и процианидины элюировали линейным градиентом 60% B до A с последующим промыванием колонки растворителем В при скорости потока 0,3 мл/мин. Состав подвижной фазы: В=0,5% уксусная кислота в метаноле и А=0,5% уксусная кислота в деионизированной воде. Количество уксусной кислоты в подвижных фазах А и В может быть увеличено до 25%. Компоненты выявлены путем измерения флуоресцентного излучения, где λ=276 нм и λ=316 нм. Концентрации (+)-катехина и (-)-эпикатехина определяли по отношению к эталонным стандартным растворам. Уровни процианидина оценивали с использованием фактора реактивности для (-)-эпикатехина. На фиг.2А показана характерная ВЭЖХ-хроматограмма, иллюстрирующая разделение различных компонентов для одного генотипа какао. Аналогичные ВЭЖХ-профили получали и для других генотипов какао.
Условия проведения ВЭЖХ:
Колонка 200x2,1 мм, Hewlett-Packard Hypersil ODS (5 мкм).
Предколонка: 20x2,1 мм, Hewlett-Packard Hypersil ODS (5 мкм).
возб.
изл.
Детекторы: диодный матричный детектор, при 280 нм, флуоресцентный детектор, при λ=276 нм и λ=316 нм.
Скорость потока: 3 мл/мин.
Температура колонки: 45°С.
Градиент:время (мин)
0,5% уксусной кислоты в деионизированной воде
0,5% уксусной кислоты в метаноле
0
100
0
50
40
60
60
0
100
Метод 2: разделение с нормальной фазой
возб.
изл.
Процианидиновые экстракты, полученные, как описано в примерах 2 и/или 3, фильтровали через 0,45 мк-фильтр и анализировали с помощью ВЭЖХ-системы Hewlett-Packard 1090, снабженной программируемым флуоресцентным детектором HP модели 1046А и фотодиодным матричным детектором. Разделение проводили при 37°С на колонке (250x3,2 мм) с Phenomenex Lichroshere Silica 100 (5 мкм), соединенной с предколонкой (20x4,6) с Supelco Superguard LC-Si (5 мкм). А процианидины элюировали линейным градиентом в следующих условиях: время, %А, %В): (0, 82, 14), (30, 67,6, 26,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86) с последующим 8-минутным переуравновешиванием. Состав подвижной фазы %А=дихлорметан, В=метанол и С=уксусная кислота/вода в объемном отношении 1:1. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Компоненты выявляли путем измерения флуоресцентного излучения, где λ=276 нм и λ=316 нм, а УФ-излучение при 280 нм. На Фиг.2В показана характерная ВЭЖХ-хроматограмма, иллюстрирующая разделение различных процианидинов для одного генотипа. Аналогичные ВЭЖХ-профили получали для других генотипов какао.
Условия проведения ВЭЖХ:
Колонка размером 250x3,2 мм с Phenoinenex Lichrosphere Silica 100 (5 мкм) и предколонка размером 20 х 4,6 мм с Superguad LC-Si (5 мкм).
возб.
изл.
Детекторы: фотодиодный матричный детектор при 2380 нм, флуоресцентный детектор; λ=276 нм и λ=316 нм.
Скорость потока: 0,5 мл/мин.
Температура колонки: 37°С.
Градиент:время (мин)
CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>метилхлорид
Метанол
Уксусная кислота/вода (1:1)
0
82
14
4
30
67,6
28,4
4
60
46
50
4
65
10
86
4
70
10
86
4
ПРИМЕР 5
Идентификация процианидинов
Процианидины очищали с помощью жидкостной хроматографии на колонке (28x2,5 см) с Суфадексом LH-20 с последующим проведением полупрепаративной ВЭЖХ на колонке (100x8 мм) с Bondapak C18 (10 мкм) или с помощью полупрепаративной ВЭЖХ на колонке (250x10 мм) с Sepelcosil LC-Si (5 мкм).
Частично очищенные изоляты анализировали методом масс-спектрометрии с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB-MC=Fast Atom Bombardment - Mass Spectrometry), проводимой на МС-системе XG ZAD-T с высоким разрешением с использованием техники жидкостной спектрофотометрии вторичных ионов (LSIMS) в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов. В качестве источника ионизации при 30 кВ использовали цезиевую ионную пушку, а в качестве донора протонов использовали "Magic Bullet Matrix" (1:1 дитиотреитол/дитиоэритритол).
В результате аналитических исследований указанных фракций с помощью LSIMS было обнаружено присутствие ряда олигомеров Флаван-3-ола, как показано в таблице 3.
Таблица 3Данные для фракций процианидина какао, полученные с помощью LSIMS (положительный ион)
Олигомер
(M+1)<sup>+</sup>,m/z
(M+Na)<sup>+</sup>,m/z
Молекулярная масса
Мономеры (катехины)
291
313
290
Димер(ы)
577/579
599/601
576/578
Тример(ы)
865/867
887/889
864/866
Тетрамер(ы)
1155
1177
1154
Пентамер(ы)
1443
1465
1442
Гексамер(ы)
1731
1753
1730
Гептамер(ы)
-
2041
2018
Октамер(ы)
-
2329
2306
Нонамер(ы)
-
2617
2594
Декамер(ы)
-
2905
2882
Ундекамер(ы)
-
-
3170
Додекамер(ы)
-
-
3458
+
+
+
+
Основные массы ионных фрагментов соответствовали данным, полученным ранее с помощью FAB-MC-анализа процианидинов, проводимого методом ионизации положительными и отрицательными ионами (Self et al., 1986, and Porter et al., 1991). При этом предполагалось, что ион, соответствующий m/z=577 (M+H) и его натриевый аддукт с m/z=599 (M+Na), свидетельствуют о наличии в изолятах димеров процианидина с двойной связью. Интересно отметить, что высшие олигомеры с большей вероятностью образуют натриевые аддукты (M+Na), чем их протонированные молекулярные ионы (М+Н). Изомеры процианидинов В-2, В-5 и С-1 были ориентировочно идентифицированы исходя из данных, полученных в работах Revilla et al. (1991), Self et al. (1986) and Porter et al. (1991). Процианидины вплоть до октамеров и декамеров подтверждали с помощью Fab-MC в частично очищенных фракциях. Кроме того, присутствие процианидинов со структурой вплоть до декамера подтверждали анализом с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой (см. фиг.2В). В таблице 4 приводятся относительные концентрации процианидинов, обнаруженных в изолятах, не содержащих ксантинового алкалоида, анализом с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. В таблице 5 приводятся относительные концентрации процианидинов, обнаруженных анализом с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой.
Таблица 4Относительные концентрации процианидинов в изолятах, не содержащих ксантинового алкалоида
Компонент
Количество
(+)-Катехин
1,6%
(-)-Эпикатехин
38,2 %
В-2 димер
11,0%
В-5 димер
5,3%
C-1 тример
9,3%
Димеры с двойной связью
3,0%
Тетрамер(ы)
4,5%
Пентамер-октамер
24,5%
Неизвестные и высшие олигомеры
2,6%
Таблица 5Относительные концентрации процианидинов в экстрактах водного ацетона
Компонент
Количество
(+)-Катехин и (-)-эпикатехин
41,9%
В-2 димер и В-5 димер
13,9%
Тримеры
11,3%
Тетрамеры
9,9%
Пентамеры
7,8%
Гексамеры
5,1%
Гептамеры
4,2%
Октамеры
2,8%
Нонамеры
1,6%
Декамеры
0,7%
Ундекамеры
0,2%
Додекамеры
<0,1%
На фиг.3 показано несколько структур процианидинов, а на фиг.4А-4Е показаны характерные ВЭЖХ-хроматограммы пяти фракций, использованных в описанном ниже скрининге на противораковую или противоопухолевую активность. Для ВЭЖХ, проиллюстрированной на фиг.4А-4Е, использовали следующие условия:
ВЭЖХ условия: состоящая из трех частей ВЭЖХ-система Hewlett Packard 1090, снабженная программируемым флуоресцентным детектором HP модели 1046А.
Колонка: Hewlett-Packard 5 мкм Hypersil ODS (200 х 2,1 мм);
возб.
изл.
Линейный градиент 60% В до А при скорости потока 0,3 мл/мин В=0,5% уксусная кислота в метаноле; А=0,5% уксусная кислота в деионизированной воде. λ=276 нм и λ=316 нм.
На фиг.15О показана характерная хроматограмма, полученная при проведении полупрепаративной ВЭЖХ для дополнительных 12 фракций, использованных в скрининге на противораковую или антинеопластическую активность (условия проведения ВЭЖХ указаны выше.
ПРИМЕР 6
Противораковая, противоопухолевая или антинеопластическая активность экстрактов какао (процианидины)
Для скрининга испытуемых образцов, полученных, как описано в примере 5, осуществляли анализ на цитотоксичность с тетразолом с использованием планшетов для микротитрования и реагента МТТ (бромида 3-[4,5-диметилтриазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия). Испытуемые образцы, стандарты (циплатин и хлорамбуцил) и реагент МТТ растворяли в 100% ДМСО (диметилсульфоксид) при концентрации 10 мг/мл. Серийные разведения получали из исходных растворов. В случае испытуемых образцов разведения получали в интервале от 0,01 до 100 мкг/мл в 0,5% ДМСО.
2
Все клеточные линии опухолей человека получали из Американской коллекции типовых культур. Культуры культивировали в виде монослоев в среде альфа-MEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 240 ед./мл нистатина. Клетки выдерживали во влажной атмосфере 5% СО при 37°С.
5
После трипсинизации клетки пересчитывали и доводили до концентрации 50х10 клеток/мл, варьируемой в зависимости от раковой клеточной линии. 200 мл клеточной суспензии высевали в лунки четырех рядов 96-луночного планшета для микротитрования. Затем клетки оставляли на 4 часа для связывания, после чего в лунки (в четырех дубликатах) добавляли 2 мкл ДМСО, содержащего растворы испытуемых образцов. Первоначальные эксперименты по выявлению кривой зависимости "доза-ответ" с использованием ряда кратных разведений испытуемого образца проводили в целях определения интервалов доз, которые требуют оценки. Затем с помощью планшет-ридера BIO RAD МР450 определяли оптические плотности лунок при 540 нм. Среднее значение оптической плотности лунок, обработанных испытуемым образцом в четырех дубликатах, сравнивали с контрольным значением и полученные результаты выражали в виде процента от контрольной оптической плотности +/- стандартное отклонение. Восстановление МТТ до формазанового продукта пурпурного цвета линейно коррелирует с числом выживших клеток в лунке. Таким образом, путем измерения оптической плотности может быть определен процент клеток, выживших при данной дозе испытуемого образца. Контрольные лунки содержали конечную концентрацию 1% ДМСО.
По этой схеме сначала тестировали два образца. Образец ММ1 представлял собой очень грубый изолят процианидинов какао и содержал количества кофеина и теобромина. Образец ММ2 - изолят процианидина какао, частично очищенный с помощью гель-проникающей хроматографии. В образце ММ2 отсутствовали кофеин и теобромин. Используя описанную выше методику, оба образца скринировали на активность против следующих раковых клеточных линий:
НCТ - 116 - клеточная линия рака толстой кишки
ACHN - клеточная линия аденокарциномы почек
SK-5 - клеточная линия меланомы
А-498 - клеточная линия аденокарциномы почек
MCF-7 - клеточная линия рака молочной железы
РС-3 - клеточная линия рака предстательной железы
CAPAN - клеточная линия рака поджелудочной железы
50
Образец ММ1 обнаруживал незначительную активность или вообще не обнаруживал какой-либо активности в отношении исследованных раковых клеточных линий. Образец ММ2 обладал активностью против раковых клеточных линий НСТ-116, РС-3 и ACHN. Однако при этом было обнаружено, что ММ1 и ММ2 интерферируют с МТТ таким образом, что это препятствует снижению оптической плотности, которая коррелирует со снижением числа выживших клеток. Такая интерференция также приводит к увеличению величины ошибки, поскольку химическая реакция, очевидно, проходит более быстро в лунках, расположенных по периметру планшета. Типичный пример такого эффекта показан на фиг.5. При этом следовало ожидать, что значительное снижение числа выживших клеток вместо указанных уровней выживших клеток будет наблюдаться при высоких концентрациях испытуемого материала. Тем не менее микроскопические исследования показали, что цитотоксический эффект имеет место, несмотря на явление интерференции с ММТ. Так, например, в этом эксперименте величина IC, полученная для ММ2 с использованием клеточной линии ACHN, составляла 0,5 мкг/мл.
2
2
Эти предварительные результаты с точки зрения авторов настоящего изобретения требуют изменения методики осуществления анализа в целях устранения интерференции с ММТ. Эти изменения были проведены следующим образом. После инкубирования планшетов в течение 18 часов при 37°С во влажной 5% СО-атмосфере среду осторожно отсасывали и заменяли свежей средой альфа-MEM. Затем на третий день анализа среду снова отсасывали из лунок и заменяли 100 миллилитрами свежеприготовленной среды McCoy. Затем в лунки каждого планшета добавляли 11 мкл 5 мг/мл-исходного раствора МТТ в PBS (забуференном фосфатном физиологическом растворе). После 4-часового инкубирования во влажной 5% СО-атмосфере при 37°С во все лунки планшетов добавляли 0,4 н. HCl в изопропаноле, а затем тщательно размешивали для солюбилизации формазана, продуцируемого любыми жизнеспособными клетками. Кроме того, для определения конкретных компонентов, ответственных за активность, было решено провести субфракционирование процианидинов.
Процедуру субфракционирования, описанную выше, осуществляли в целях получения образцов для последующего скрининга. В результате получали пять фракций, представляющих собой области, показанные на фиг.1, и распределение компонентов, показанное на фиг.4А-4Е. Для аналитической характеризации и для указания на отсутствие кофеина и теобромина образцы обозначали ММ2А-ММ2Е.
Каждую фракцию отдельно скринировали на активность против раковых клеточных линий НСТ-116, РС-3 и ACHN. Полученные результаты показали, что эта активность не концентрируется в какой-либо одной конкретной фракции. Такие результаты не рассматривались как необычные, поскольку компоненты в изолятах "активных" натуральных продуктов могут оказывать синергическое действие. Так в случае изолята процианидина какао (ММ2) обнаружено, что он содержит свыше двадцати определяемых компонентов. Считается возможным, что активность изолята связана скорее не с каким-либо отдельным(и) компонентом(ами), а с комбинацией компонентов, присутствующих в различных фракциях.
50
50
Исходя из этих результатов было решено объединить фракции и повторить анализы на активность против тех же самых раковых клеток. Эти анализы показали, что комбинации различных фракций производили цитотоксические эффекты против раковых клеточных линий РС-3. В частности, значения IC, полученные для комбинации ММ2А и ММ2Е, составляли 40 мкг/мл, а значения IC, полученные для комбинации ММ2С и ММ2Е, составляли 20 мкг/мл. Наблюдалась также активность против клеточных линий НСТ-116 и ACHN, но как указывалось выше, интерференция с ММТ-индикатором препятствовала проведению точных измерений. Для уточненных данных проводили повторные эксперименты в дубликатах для клеточных линий НСТ-116 и ACHN. Однако эти результаты оказались ненадежными из-за бактериального загрязнения и истощения испытуемого материала. На фиг.6А-6D показана кривая зависимости "доза-ответ", полученная в результате взаимодействия между фракциями и раковой клеточной линией РС-3.
Тем не менее полученные данные со всей очевидностью показали, что экстракты какао, особенно полифенолы или процианидины какао, обладают значительной противоопухолевой, противораковой или антинеопластической активностью, особенно против таких клеточных линий, как РС-3 (рак предстательной железы), НСТ-116 (рак толстой кишки) и ACHN (рак почек). Кроме того, полученные результаты дают основание предположить, что конкретные фракции процианидинов могут быть ответственны за активность против клеточной линии РС-3.
ПРИМЕР 7
Противораковая, противоопухолевая и антинеопластическая активность экстрактов какао (процианидины)
Для подтверждения полученных результатов и дальнейшего исследования комбинаций фракций проводили другой более детальный скрининг.
Все полученные материалы и проводимые процедуры аналогичны описанным выше, за исключением того, что вместо стандартных 4 дубликатов на дозу, было сделано 8 и 12 дубликатов на испытуемую дозу. Для эксперимента отдельно взятые и сочетания пяти фракций процианидинов какао скринировали против следующих раковых клеточных линий:
РС-3 - предстательной железы
KB - носоглоточной области/Hela
НСТ - 116 - толстой кишки
ACHN - почек
MCF-7 - молочной железы
SK-5 - меланомы
А-549 - легких
CCRF-CEM - Т-клеточного лейкоза
Скрининг отдельных фракций заключается в анализе различных доз (0,01-100 мкг/мл) фракций А, В, С, D и Е (см. фиг.4А-4Е и их обсуждение, приведенное выше) против каждой из клеточных линий. Скрининг комбинации фракций включал объединение равных доз этих фракций А+В, A+C, A+D, А+Е, B+C, B+D, B+E, C+D, С+Е и D+E и анализ их воздействия на каждую из клеточных линий. Результаты воздействия на клеточные линии обсуждались отдельно, а затем суммировались.
А. Клеточная линия рака предстательной железы РС-3
50
50
50
На фиг.7А-7Н показаны кривые зависимости "доза-ответ", полученные при взаимодействии между фракциями процианидинов какао и клеточной линией РС-3. На фиг.7D-7Е показано, что фракции D и Е обладают активностью при IC=75 мкг/мл. Величины IC, которые получали исходя из кривых зависимости "доза-ответ" для других комбинаций фракций процианидинов, включающих в себя фракции D или Е, составляли 60-80 мкг/мл. Остальные величины IC показаны в таблице 6.
В. Клеточная линия рака носоглотки KB/HeLa
50
50
50
50
На фиг.8А-8Н показаны кривые зависимости "доза-ответ", полученные в результате взаимодействия между фракциями процианидинов какао и клеточной линией носоглотки KB/HeLa. На Фиг.8D и 8Е показано, что фракции D и Е обладают активностью при IC=75 мкг/мл. На Фиг.8Е-8Н представлены характерные результаты, полученные на основании исследования комбинации фракций. В этих исследованиях было установлено, что комбинация А+В не обладает активностью, тогда как комбинации В+Е и D+Е обладают активностью при IC=60 мкг/мл. Значения IC, которые получали исходя из кривых зависимости "доза-ответ" для других комбинаций фракций процианидинов, включающих фракции D или Е, составляли 60-80 мкг/мл. Отдельные значения IC показаны в таблице 6. Эти данные в основном аналогичны данным, полученным для клеточной линии РС-3.
С. Клеточная линия рака толстой кишки НСТ-116
50
50
50
50
50
На фиг.9А-9Н показаны типичные дозовые зависимости между фракциями процианидина и клеточной линией рака толстой кишки НСТ-116. На фиг.9D и 9Е продемонстрировано, что фракция Е обладает активностью при значении IC, равном приблизительно 400 мкг/мл. Эта величина была получена путем экстраполяции имеющейся кривой. При этом следует отметить, что наклон кривой "доза-ответ" для фракции D также свидетельствует об активности фракции D. Однако исходя из этой кривой не было определено значение IC, поскольку данная кривая является слишком пологой для получения надежного результата. На фиг.9F-9Н представлены характерные результаты, полученные на основании исследований комбинаций фракций. В этом исследовании было выявлено, что комбинация фракций процианидина B+D не обладает заметной активностью, тогда как комбинации фракций А+Е и D+Е обнаруживали активность при значении IC=500 мкг/мл и 85 мкг/мл соответственно. Значения IC, полученные исходя из кривых дозовой зависимости для других комбинаций, содержащих фракцию Е, составляли в среднем около 250 мкг/мл. В приведенной ниже таблице 6 представлены экстраполированные значения IC.
D. Клеточная линия аденокарциномы почек ACHN
50
50
На фиг.10А-10Н показаны типичные дозовые зависимости между фракциями процианидина какао и почечной клеточной линией ACHN. Фиг.10А-10Е показывают, что отдельные фракции не обладают активностью против этой клеточной линии. На фиг.10F-10Н представлены характерные результаты, полученные на основании исследований комбинаций фракций. В этих исследованиях комбинация процианидиновой фракции В+С не обнаруживала активности, а экстраполированное значение IC, полученное для комбинации А+Е, составляло приблизительно 500 мкг/мл. Сделан вывод, что комбинации, дающие кривые зависимости "доза-ответ", подобные кривой для комбинации C+D, не обладают активностью, поскольку указанная кривая является слишком пологой. Экстраполированные значения IC для других комбинаций фракций приводятся в таблице 6.
Е. Клеточная линия рака легких А-549
На фиг.11А-11Н показаны типичные дозовые зависимости между фракциями процианидина какао и клеточной линией рака легких А-549. При дозах, использованных в этом эксперименте, не было выявлено какой-либо активности как отдельных фракций, так и их комбинаций. Однако фракции процианидина тем не менее могут быть использованы в отношении этой клеточной линии.
F. Клеточная линия меланомы SK-5
На фиг.12А-12Н представлены типичные дозовые зависимости между фракциями процианидина какао и клеточной линией меланомы SK-5. При дозах, использованных в этом эксперименте, не было выявлено какой-либо активности ни отдельных фракций, ни их комбинаций. Однако фракции процианидина тем не менее могут быть использованы в отношении этой клеточной линии.
G. Клеточная линия рака молочной железы MCF-7
На фиг.13A-13Н представлены типичные дозовые зависимости между фракциями процианидина какао и клеточной линией рака молочной железы MCF-7. При дозах, использованных в этом эксперименте, не было выявлено какой-либо активности ни отдельных фракций, ни их комбинаций. Однако фракции процианидина тем не менее могут быть использованы в отношении этой клеточной линии.
Н. Клеточная линия Т-клеточного лейкоза CCRF-CEM
Первоначально типичные кривые "доза-ответ" получали для линии Т-клеточного лейкоза CCRF-CEM. Однако подсчет с помощью микроскопа числа клеток в зависимости от времени при различных концентрациях показал, что 500 мкг фракций А, В и D вызывали 80%-ное ингибирование роста клеток за период времени 5 дней. Типичные кривые зависимости "доза-ответ" представлены на фиг.14.
I. Краткое резюме
50
Все значения IC, полученные в результате описанных опытов для всех клеточных линий за исключением линии Т-клеточного лейкоза CCRF-CEM, перечислены в таблице 6. Данные для Т-клеточного лейкоза были намеренно исключены из таблицы, поскольку для их получения использовалась другая процедура анализа. Обобщение полученных результатов показало, что наибольшая активность ассоциируется с фракциями D и Е. Эти фракции проявляют наибольшую активность против клеточных линий PC-3 (предстательной железы) и KB (носоглоточной карциномы/HeLa). Эти фракции также обнаруживали активность против клеточных линий НСТ-116 (толстой кишки) и ACHN (почки), но лишь при значительно более высоких дозах. Активности против клеточных линий MCF-7 (молочной железы), SK-5 (меланомы) и А-549 (легких) не наблюдалось. Однако фракции процианидина могут быть тем не менее использованы в отношении этих клеточных линий. Кроме того, наблюдалась активность против клеточной линии CCRF-CEM (Т-клеточного лейкоза). Следует также отметить, что по своему составу фракции D и Е являются наиболее сложными. Тем не менее из полученных данных очевидно, что экстракты какао, а особенно процианидины какао, обладают значительной противоопухолевой, противораковой или антинеопластической активностью.
Таблица 6Значения IC<sub>50</sub> для фракций процианидинов какао, обладающих активностью против различных клеточных линий (значения IC<sub>50</sub> выражены в мкг/мл)
Фракция
РС-3
KB
НСТ-116
ACHN
MCF-7
SK-5
A -549
A
B
C
D
90
80
E
75
75
400
A+B
A+C
125
100
A+D
75
75
A+E
80
75
500
500
B+C
B+D
75
80
B+E
60
65
200
C+D
80
75
1000
C+E
80
70
250
D+E
80
60
Указанные выше значения 100 мкг/мл получали путем экстраполяции кривых "доза-ответ"
ПРИМЕР 8
Противораковая, противоопухолевая и антинеопластическая активность экстрактов какао (процианидины)
Для дополнения и расширения результатов, представленных в примерах 6 и 7, проводили несколько дополнительных анализов in vitro.
Метод А. Анализ путем окрашивания кристаллическим фиолетовым
2
Все опухолевые клеточные линии человека получали из Американской коллекции типовых культур. Клетки культивировали в виде монослоев в среде IMEM, содержащей 10% фетальную сыворотку и не содержащей антибиотиков. Клетки поддерживали в увлажненной 5% СО-атмосфере при 37°С.
После трипсинизации клетки пересчитывали и доводили до концентрации 1000-2000 клеток на 100 мл. Клеточную пролиферацию определяли путем высевания клеток в 96-луночный планшет для микротитрования (1000-2000 клеток/лунка). После добавления 100 мкл клеток в лунку клетки оставляли на 24 часа для связывания. После завершения 24-часового периода добавляли различные фракции какао в различных концентрациях, в результате чего получали данные зависимости "доза-ответ". Затем фракции какао растворяли в среде 2-кратной концентрации и 100 мкл каждого раствора добавляли в лунки в тройных дубликатах. В последующие дни планшеты в течение 15 минут окрашивали 50 мкл кристаллического фиолетового (2,5 г кристаллического фиолетового, растворенного в 125 мл метанола, 375 мл воды). Затем краситель удаляли, планшет осторожно погружали в холодную воду для удаления избыточного окрашивания. После этого планшеты промывали еще два раза и оставляли для просушивания. Остаточный краситель солюбилизировали добавлением в каждую лунку 100 мкл смеси 0,1 М цитрат натрия/50% этанол. После солюбилизации подсчитывали количество клеток с помощью ELISA-планшет-ридера при 540 нм (эталонный фильтр при 410 нм). На основании полученных результатов строили графики зависимости, где по оси абсцисс (х) отложено время роста (дни), а по оси ординат (y) - оптическая плотность.
Метод В. Анализ клонирования в мягком агаре
Клетки клонировали в мягком агаре в соответствии с методом, описанным Nawata et al. (1981). Суспензии отдельных клеток приготавливали в средах, содержащих 0,8% агар с различными концентрациями фракций какао. Аликвоты суспензий вносили в 35-миллиметровые чашки, покрытые средой, содержащей 1,0% агар. После 10-дневного инкубирования число колоний диаметром более 60 мкм определяли с помощью аналитической системы Ominicron 3600 Image. На основании полученных результатов строили графики зависимости числа колоний (ось y) от концентрации фракций какао (ось х).
Метод С. Анализ методом микрокультирования с использованием тетразолия (ХТТ)
Метод ХТТ-анализа, описанный Scudiero et al. (1988), использовали для скрининга различных фракций какао. Анализ с использованием ХТТ проводили тем же методом, что и анализ с использованием МТТ (см. пример 6), за исключением некоторых следующих  модификаций. ХТТ (гидроксид (2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино)карбонил]-2Н-тетразолия) приготавливали в концентрации 1 мг/мл в бессывороточной среде, предварительно нагретой до 37°С. PMS приготавливали в 5 мМ PBS. Затем ХТТ и PMS смешивали вместе и в каждую лунку добавляли 10 мкл PMS на 1 мл ХТТ и 50 мкл PMS-XTT. После 4-часового инкубирования при 37°С планшеты перемешивали в течение 30 минут на механическом шейкере и определяли оптическую плотность при 450-600 нм. Исходя из полученных результатов строили графики зависимости оптической плотности (ось y) от времени (дни) или концентрации (ось х).
При проведении анализов методами А и С результаты выражали в виде % от контроля и строили графики зависимости % контроля (ось y) от времени (дни) или концентрации (ось х).
Для того чтобы определить, который из анализов является наиболее чувствительным, проводили сравнение методов анализа с использованием ХТТ и анализа с использованием кристаллического фиолетового, осуществляемых для оценки активности фракций D и Е (пример 3В) против клеточной линии рака молочной железы р168 MCF-7. Как показано на фиг.15А, оба анализа дали аналогичные зависимости "доза-ответ" для концентраций >75 мкг/мл. При более низких концентрациях результаты анализа, проводимого с использованием кристаллического фиолетового, показали более высокие значения стандартных отклонений, чем результаты анализа, проводимого с использованием ХТТ. Однако, поскольку метод проведения анализа с использованием кристаллического фиолетового является более простым, то все последующие анализы, если это не оговорено особо, осуществляли этим методом.
50
На фиг.15В-15Е представлены результаты анализов, проведенных с использованием кристаллического фиолетового для иллюстрации воздействия неочищенного полифенолового экстракта (пример 2) на клеточную линию рака молочной железы MDA MB231, клеточную линию рака предстательной железы РС-3, клеточную линию рака молочной железы MCF-7 р163 и клеточную линию рака матки Hela соответственно. Во всех случаях доза 250 мкг/мл полностью ингибировала рост всех раковых клеток за период 5-7 дней, Очевидно, что клеточная линия Hela является более восприимчивой к действию экстракта, поскольку его доза 100 мкг/мл также ингибировала рост клеток. Фракции какао, полученные, по примеру 3В, также анализировали на активность против клеточной линии Hela и против клеточной линии рака молочной железы SKBR-3. Результаты этих анализов (фиг.15F и 15G) показали, что фракции D и Е обладают наибольшей активностью. Как видно на фиг.15Н и 15I, значения IC, полученные для обеих клеточных линий, составили около 40 мкг/мл D и Е.
Фракции какао D и Е были также подвергнуты анализу методом клонирования в мягком агаре для определения способности испытуемого соединения (или соединений) ингибировать свободный ("безъякорный") рост клеток. Как показано на фиг.15J, концентрация соединения 100 мкг/мл полностью ингибировала образование колоний клеток Hela.
Неочищенные полифеноловые экстракты, полученные из восьми различных генотипов какао, представляющих собой три культурных сорта какао, также анализировали на активность против клеточной линии Hela. Как видно на фиг.15К, экстракты всех сортов какао показали аналогичные зависимости "доза-ответ". Наибольшую активность против клеточной линии Hela обнаружил сорт UIT-1. Полученные результаты свидетельствовали о том, что все генотипы какао имеют полифеноловые фракции, обладающие активностью против, по крайней мере, одной клеточной линии раковой опухоли человека, причем эта активность не зависит от географического происхождения сорта культуры и генотипа.
Другую серию анализов осуществляли с использованием неочищенных полифеноловых экстрактов, полученных путем традиционной 5-дневной ферментации бобов бразильского какао при масштабе производства 1 тонна в день с последующей 4-дневной сушкой. Результаты, представленные на фиг.15L, не показали заметного эффекта от таких ранних стадий обработки, что позволяет сделать предположение о незначительном изменении в составе полифенолов. Однако известно (Lehrian and Patterson, 1983), что полифенолоксидаза (PPO) может окислять полифенолы на стадии ферментации. Для того чтобы определить, какой активностью будут обладать ферментативно окисленные полифенолы, был осуществлен другой эксперимент. Неочищенную полифенолоксидазу (РРО) получали путем экстрагирования тонко измельченных неферментированных, высушенных заморозкой обезжиренных бобов бразильского какао ацетоном при соотношении 1 г порошка на 10 мл ацетона. Полученную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Эту процедуру повторяли три раза, каждый раз удаляя супернатант, а после четвертой экстракции его выливали через фильтровальную воронку Бюхнера. Экстрагированный ацетоном порошок оставляли на воздухе для просушивания, а затем анализировали в соответствии с методикой, описанной McLord and Kilara (1983). К раствору неочищенных полифенолов (100 мг/10 мл цитрат-фосфатного буфера, 0,02 М, рН 5,5) добавляли 100 мг ацетонового порошка (4000 актив.ед./мг белка) и оставляли для перемешивания в течение 30 минут с одновременным барботированием воздуха через суспензию. Образец центрифугировали при 5000xg в течение 15 минут и супернатант три раза экстрагировали 20 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяли, сушили досуха путем дистилляции в частичном вакууме, добавляли 5 мл воды и затем подвергали лиофилизации. После этого полученный материал анализировали на активность против клеток Hela, зависимость "доза-ответ", полученную для этого материала, сравнивали с соответствующими зависимостями, полученными для неочищенных полифеноловых экстрактов, которые не были подвергнуты ферментативной обработке. В результате такого сравнивания (фиг.15М) был обнаружен значительный сдвиг кривой дозовой зависимости для ферментативного окисления экстракта, что свидетельствует о том, что окисленные продукты обладают большей ингибирующей способностью, чем их нативные формы.
ПРИМЕР 9
Антиоксидантная активность экстрактов какао, содержащих процианидины
Данные, сообщаемые в литературе, позволяют предположить наличие определенной взаимосвязи между потреблением природных антиоксидантов (витаминов С, Е и В-каротина) и низким уровнем заболеваемости, включая заболеваемость раком (Designing Foods, 1993; Caragay, 1992). В основном известно, что эти антиоксиданты оказывают воздействие на некоторые окислительные процессы и процессы образования свободных радикалов, стимулирующие рост некоторых типов опухолей. Кроме того, некоторые растительные полифеноловые соединения, которые, как было показано, обладают антиканцерогенным действием, обладают также значительной антиоксидантной активностью (Но et al., 1992; Huang et al., 1992).
Для того чтобы определить, обладают ли экстракты какао, содержащие процианидины, антиоксидантными свойствами, был использован стандартный метод Rancimat. Для получения экстрактов какао использовали методы, описанные в примерах 1, 2 и 3, после чего полученные экстракты подвергали гель-проникающей хроматографии с получением двух фракций. Фактически, эти две фракции представляли собой объединенные фракции А-С и D и Е (см. фиг.1), антиоксидантные свойства которых сравнивали со свойствами синтетических антиоксидантов ВНА и ВНТ.
Арахисовое масло отжимали из необжаренного арахиса, с которого предварительно была снята кожура. Каждое испытываемое соединение добавляли в масло в двух концентрациях ~100 и ~20 ч/млн. (конкретные концентрации приведены в таблице 7). Затем для диспергирования антиоксиданта к каждому образцу добавляли 50 мкл антиоксиданта, солюбилизированного в метаноле. Контрольный образец получали с 50 мкл метанола, не содержащего антиоксидант.
Полученные образцы оценивали в дубликатах на устойчивость к окислению с использованием теста Rancimat при температуре 100°С и скорости потока воздуха
3
20 см/мин. Экспериментальные параметры выбирали так, чтобы они соответствовали параметрам, используемым с применением активного кислорода (АОМ) или быстром тесте на стабильность (Van Oosten et al., 1981). Типичная кривая Rancimat показана на фиг.16. Результаты анализов, выраженные как время (часы), необходимое для достижения уровня пероксида 100 мэкв, приведены в таблице 8.
Таблица 7Концентрации антиоксидантов
Образец
Уровень 1 (ч/млн.)
Уровень 2 (ч/млн.)
Бутилированный гидрокситолуол (ВНТ)
24
120
Бутилированный гидроксианизол (ВНА)
24
120
Неочищенная этилацетатная фракция какао
22
110
Фракция А-С
20
100
Фракция D-Е
20
100
Таблица 8Устойчивость к окислению арахисового масла c различными антиоксидантами
Образец
20 (ч/млн.)
100 (ч/млн.)
среднее
Контроль
10,5±0,7
ВНТ
16,5+2,1
12,5+2,1
ВНА
13,5+2,1
14,0+1,4
Неочищенная фракция какао
18,0+0,0
19,0+1,4
Фракция А-С
16,0+6,4
17,5+0,0
Фракция D-E
14,0+1,4
12,5+0,7
Полученные результаты продемонстрировали повышенную устойчивость арахисового масла к окислению всеми испытываемыми добавками. Наибольшая устойчивость к окислению наблюдалась у образца, обработанного неочищенным экстрактом какао. Эти результаты показали, что экстракты какао, содержащие процианидины, обладают антиоксидантной активностью, равной или превышающей антиоксидантную активность синтетических антиоксидантов ВНА и ВНТ при тех же дозах. В соответствии с этим экстракты настоящего изобретения могут быть использованы, например, в качестве антиоксиданта и/или пищевой добавки вместо ВНТ и ВНА. В этой связи следует также отметить, что экстракт по изобретению происходит из источника, пригодного для употребления в пищу. С учетом полученных результатов каждый специалист может легко определить без излишнего экспериментирования количество соединения по изобретению, например количество пищевых добавок, которое можно использовать вместо ВНА и ВНТ.
ПРИМЕР 10
Исследование ингибирования топоизомеразы II
ДНК-топоизомеразы I и II представляют собой ферменты, которые катализируют разрыв и репарацию нуклеотидных цепей ДНК, контролируя тем самым топологическое состояние ДНК (Wang, 1985). Помимо исследования внутриклеточной функции топоизомеразы, наиболее ценная информация была получена в результате идентификации топоизомеразы II как главной клеточной мишени для ряда клинически важных противоопухолевых соединений (Yamashita et al., 1990), включая интеркалирующие агенты (m-AMSA, адриамицин и эллиптицин), а также интеркалирующие эпиподофиллотоксины. Ряд имеющихся данных свидетельствуют о том, что некоторые противоопухолевые лекарственные средства обладают общим свойством стабилизации комплекса "ДНК-топоизомераза II" ("расщепляемого комплекса"), который может расщепляться под действием денатурирующих агентов, индуцирующих отщепление ДНК (Muller et al., 1989). Было сделано предположение, что образование расщепляемого комплекса противоопухолевыми лекарственными средствами приводит к продуцированию объемных ДНК-аддуктов, которые, в свою очередь, приводят к гибели клеток.
В соответствии с этой перспективной моделью новый специфический индуктор, стимулирующий образование расщепляемого комплекса ДНК-топоизомеразы II, может быть использован в качестве противоракового, противоопухолевого или антибластомного агента. При попытке идентифицировать цитотоксические соединения с активностью, направленной на ДНК-мишень, процианидины какао сканировали на повышенную цитотоксическую активность против нескольких клеточных линий, чувствительных к повреждению ДНК, и проводили ферментативный анализ с использованием топоизомеразы II человека, полученной из лимфомы.
А. Декатенация кинетопластной ДНК топоизомеразой II
2
In vitro-ингибирование декатенации кинетопластной ДНК топоизомеразой II, как описано Muller et al., 1989, осуществляли следующим образом. Ядерные экстракты, содержащие топоизомеразную (II) активность, получали из лимфомы человека путем модификации методов Miller et al. (1981) and Banks et al. (1988). Одной единицы очищенного фермента оказалось достаточно для декатенации 0,25 мкг кинетопластной ДНК в течение 30 минут при 34°С. Кинетопластную ДНК получали из трипаносомы Crithidia fasciculata. Каждую реакцию проводили в 0,5-миллилитровой центрифужной пробирке, содержащей 19,5 мкл воды, 2,5 мкл 10Х буфера (1Х-буфер содержит 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 120 мМ KCl, 10 мМ MgCl, 0,5 мМ АТР, 0,5 мМ дитиотриола и 30 мкг BSA/мл), 1 мкл кинетопластной ДНК (0,2 мкг) и 1 мкл ДМСО, содержащий испытуемые фракции процианидина какао в различных концентрациях. Эту реакционную смесь тщательно перемешивали и выдерживали на льду. Затем непосредственно перед инкубированием добавляли одну единицу топоизомеразы и смесь инкубировали на водяной бане в течение 30 минут при 34°С.
После инкубирования анализ на декатенацию останавливали добавлением 5 мкл стоп-буфера (5% саркосил, 0,0025% бромфеноловый синий, 25% глицерин) и смесь помещали на лед. ДНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере, содержащем этидийбромид (0,5 мкг/мл). Визуализацию ДНК осуществляли путем УФ-облучения на длине волны 310 нм. Затем гель фотографировали фотокамерой Polaroid Land.
Результаты этих экспериментов представлены на фиг.17. Полностью катенированная кинетопластная ДНК не мигрирует в 1% агарозный гель. В результате декатенации кинетопластной ДНК топоизомеразой II образуются полосы мономерной ДНК (мономерное кольцо, формы I и II), которая мигрирует в гель. При добавлении процианидинов какао происходит ингибирование фермента, о чем свидетельствует прогрессирующее исчезновение полос по мере увеличения концентрации процианидинов. На основании полученных результатов было показано, что фракции процианидинов А, В, D и Е ингибируют топоизомеразу II при концентрациях от 0,5 до 5,0 мкг/мл. Эти ингибирующие концентрации очень близки к концентрациям, полученным для митоксантрона и m-AMSA [4'-(9-акридиламино)метансульфон-м-анизидид].
В. Клеточные линии, восприимчивые к лекарственному средству
Процианидины какао подвергали скринингу на цитотоксичность против нескольких клеточных линий, чувствительных к повреждению ДНК. Одна из клеточных линий представляла собой мутант (xrs-6) по репарации двухцепочечного разрыва в ДНК, полученный Jeggo (Kemp et al., 1984). Неспособность клеточной линии xrs-6 к репарации ДНК делает ее чувствительной к рентгеновскому излучению, а также к действию соединений, непосредственно индуцирующих двухцепочечный разрыв в ДНК, таких как блеомицин, и соединений, ингибирующих топоизомеразу II, в результате чего, такая способность клеточной линии к репарации ДНК может, как предполагают Warters et al., (1991), опосредованно индуцировать двухцепочечные разрывы. Цитотоксичность по отношению к клеточной линии, неспособной к репарации ДНК, сравнивали с цитотоксичностью против линии клеток СНО (BR1), способной к репарации ДНК. Повышенная цитотоксичность против клеточной линии (xrs-6), не способной к репарации, была интерпретирована как доказательство образования двухцепочечного разрыва в отщепляемой ДНК.
6
2
Линия клеток СНО, BR1, способная к репарации ДНК, была получена Barrows et al. (1987), и помимо ДНК-репаративных ферментов нормальных СНО, эта линия клеток способна экспрессировать О-акилгуанин-ДНК-алкилтрансферазу. Линия (xrs-6), не способная к репарации двухцепочечного разрыва ДНК СНО, является ценным подарком Dr. P.Jeggo и его сотрудников (Jeggo et al., 1989). Обе эти клеточные линии культивировали в виде монослоев в среде альфа-MEM, содержащей сыворотку и антибиотики, как описано в примере 6. Клетки выдерживали при 37°С во влажной 5% СО-атмосфере. Перед обработкой процианидинами какао клетки, культивированные в виде монослоев, выделяли обработкой трипсином. Анализ проводили методом с использованием МТТ, как описано в примере 6.
Полученные результаты (фиг.18) не показали повышенной цитотоксичности по отношению к клеткам xrs-6, что позволяет предположить, что процианидины какао ингибируют топоизомеразу II в соответствии с механизмом, отличающимся от образования расщепляемого двухцепочечного разрыва. То есть процианидины какао взаимодействуют с топоизомеразой II перед ее взаимодействием с ДНК, тем самым образуя нерасщепляемый комплекс.
Соединения, образующие нерасщепляемый комплекс, являются относительно новыми. Все члены таких групп соединений, как антрациклины, подофиллиновые алкалоиды, антрацендионы, акридины и эллиптисины, были апробированы для клинического противоракового, противоопухолевого или антинеопластического использования и способны продуцировать расщепляемые комплексы (Liu, 1989). Недавно было идентифицировано несколько новых классов ингибиторов топоизомеразы II, которые, по-видимому, не продуцируют расщепляемых комплексов. Такими соединениями являются амонафид (Hsiang et al., 1989), дистамицин (Fesen et al., 1989), флаваноиды (Yamashita et al., 1990), саинтопин (Yanashita et al., 1991), мембранон (Drake et al., 1989), терпеноиды (Kawada et al., 1991), антрапиразолы (Fry et al., 1985), диоксопиперазины (Tanabe et al., 1991) и морской акридиндерцитин (Burres et al., 1989).
Поскольку процианидины какао инактивируют топоизомеразу II до образования расщепляемых комплексов, то они могут быть использованы в химиотерапии как отдельно, так и в комбинации с другими известными и механически определенными ингибиторами топоизомеразы II. Кроме того, также очевидно, что процианидины какао являются новым классом ингибиторов топоизомеразы II (Kashiwada et al., 1993) и поэтому они могут оказаться менее токсичными для клеток, чем другие известные ингибиторы, что позволит использовать их в химиотерапии с большей эффективностью.
Для проведения анализа на активность фракции D+E использовали клеточную линию рака молочной железы человека MCF-7 (ADR), экспрессирующую мембранный гликопротеин (gp170), в качестве клеточной линии с множественной лекарственной устойчивостью и ее родительскую линию MCF-7 р168. Как показано на фиг.19, родительская клеточная линия ингибировалась при возрастающих дозах фракции D и E, тогда как андрамицин-резистентная линия (ADR) подвергалась меньшему воздействию при более высоких дозах. Эти результаты показали, что фракция какао D и E обладает активностью против клеточных линий с множественной лекарственной устойчивостью.
ПРИМЕР 11
Синтез процианидинов
Синтез процианидинов осуществляли по методике, разработанной Delcour et al., (1983), но с некоторой модификацией. Помимо конденсации (+)-катехина с дигидрокверцетином в условиях восстановления, также использовали (-)-эпикатехин для воспроизведения высоких концентраций (-)-эпикатехина, присутствующих в природных неферментированных какао-бобах. Синтезированные продукты выделяли, очищали, анализировали и идентифицировали в соответствии с методикой, описанной в примерах 3, 4 и 5. Согласно этой методике получали бифлавоноиды, трифлавоноиды и тетрафлавоноиды и использовали их в качестве аналитических стандартов (см. выше) по отношению к экстрактам какао.
ПРИМЕР 12
Анализ фракций, полученных с помощью полупрепаративной хроматографии с нормальной фазой
Поскольку полифеноловые экстракты являются сложными по своему составу, то для последующей очистки, анализа зависимости "доза-ответ" и полной структурной идентификации необходимо определить, какие компоненты обладают активностью против раковых клеточных линий. Исходя из размеров олигомеров для выделения процианидинов какао использовали полупрепаративную ВЭЖХ с нормальной фазой (пример 3В). Для определения олигомера, обладающего наибольшей активностью, помимо исходного экстракта получали двенадцать фракций (фиг.2В и 15О) и эти двенадцать фракций анализировали при дозах 100 мкг/мл и 25 мкг/мл на их активность против клеточной линии Hela и SKBR-3. Как показано на фиг. 20А и 20В, фракции 4-11 (пентамер-додекамер) в значительной степени ингибируют раковые клеточные линии Hela и SKBR-3 при значении 100 мкг/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что указанные специфические олигомеры обладают наибольшей активностью против клеток Hela и SKBR-3. Кроме того, анализ фракций какао D и E с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой показал, что эта фракция, использующаяся в предыдущих исследованиях, например в примере 7, содержит повышенное количество этих олигомеров.
ПРИМЕР 13
Способы очистки с помощью ВЭЖХ
Метод A. GPC очистка
Проциадины, полученные, как описано в примере 2, частично очищали с помощью жидкостной хроматографии на Сефадексе LH 20 (72,5 х 2,5 см), с использованием 100% метанола в качестве элюирующего растворителя, при скорости потока 3,5 мл/мин. Фракции элюента собирали спустя первые 1,5 часа, концентрировали на роторном испарителе, снова растворяли в воде и сушили заморозкой. Эти фракции представляли собой обогащенные фракции пентамеров. Подобным образом приблизительно 2,00 г экстракта, полученного в примере 2, подвергали субфракционированию. Результаты показаны в таблице 9.
Метод В. Разделение с нормальной фазой
возб.
изл.
Процианидины, полученные, как описано в примере 2, подвергали очистке разделением с помощью хроматографии с нормальной фазой на колонке Supelcosil LC-Si, 100 Å, 5 мкм (250 х 4,6 мм), при скорости потока 1,0 мл/мин, или альтернативно, на колонке Lichrosphere Silica 100 Å, 5 мкм (235 х 3,2 мм) при скорости потока 0,5 мл/мин. Разделение осуществляли ступенчатым градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86). Состав подвижной фазы: А=дихлорметан; В=метанол и С=уксусная кислота/вода (1:1). Компоненты определяли флуоресценцией при λ=276 нм и λ=316 нм и ультрафиолетовым облучением при 280 нм. Объем нанесенного образца составлял 5,0 мкл (20 мг/мл) процианидинов, полученных, как в примере 2. Эти результаты показаны на фиг.40А и 40В.
В другом случае разделение осуществляли ступенчатым градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 76, 20); (25, 46, 50); (30, 10, 86). Состав подвижной фазы: А=дихлорметан; В=метанол и С=уксусная кислота:вода (1:1). Результаты показаны на фиг.41А и 41В.
Метод С. Разделение с обращенной фазой
возб.
изл.
Процианидины, полученные, как описано в примере 2, очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на колонке Hewlett Packard Hypersil ODS 5 мк (200х2,1 мм), с предколонкой Hewlett Packard Hypersil ODS 5 мк (20x2,1 мм). Процианидины элюировали линейным градиентом 20% В до А в течение 20 минут с последующим промыванием колонки 100% В при скорости потока 0,3 мл/мин. Состав подвижной фазы: дегазированная смесь В=1,0% уксусная кислота в метаноле и А=2,0% уксусная кислота в деионизированной воде. Компоненты определяли УФ-облучением при 280 нм, и флуоресценцией при λ=276 нм и λ=316 нм; объем нанесенного образца составлял 2,0 мкл (20 мг/мл).
ПРИМЕР 14
Разделение обогащенных фракций пентамеров с помощью ВЭЖХ
Метод А. Полупрепаративная ВЭЖХ с нормальной фазой
Обогащенные фракции пентамеров подвергали дальнейшей очистке с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с нормальной фазой на ВЭЖХ-системе Hewlett Packard 1050, снабженной LC детектором Millipore-Waters Model 480, установленным на 254 нм, и соединенной с коллектором фракций Pharmacia Frac-100, установленным на режим пика. Разделения проводили на колонке Supelco 5 мкм Supelcosel LC-Si, 100Å (250 х 10 мм), соединенной с предколонкой Supelco 5 мк Supelguard LC-Si (20х4,6 мм). Процианидины элюировали линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86) с последующим 10-минутным переуравновешиванием. Состав подвижной фазы: А=дихлорметан; В=метанол и С=уксусная кислота:вода (1:1). Скорость потока составляла 3 мл/мин. Компоненты определяли при УФ-облучении и регистрировали с использованием самописца Kipp & Zonan BD41. Объем введенных образцов варьировали от 100-250 мкл 10 мг экстрактов процианидина, растворенных в 0,25 мл 70%-ного водного ацетона. Отдельные пики или отобранные хроматографические зоны собирали через определенные интервалы времени или путем ручного сбора фракций для дополнительной очистки и последующей оценки.
Условия ВЭЖХ:
Полупрепаративная колонка: 250х100 мм Supelco Supelcosil LC-Si (5 мк), предколонка 20х4,6 мм Supelco Supelcosil LC-Si (5 мк).
Детектор: Waters LC спектрофотометр модель 480 с длиной волны 254 нм.
Скорость потока 3 мл/мин.
Температура колонки: температура окружающей среды.
Нанесение образца: 250 мкл обогащенного экстракта пентамеров.
Градиент
CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>
Метанол
Уксусная кислота: вода (1:1)
0
82
14
4
30
67,6
28,4
4
60
46
50
4
65
10
86
4
70
10
86
4
Метод В. Разделение с обращенной фазой
возб.
изл.
Экстракты процианидина, полученные, как описано в примере 13, фильтровали через нейлоновый фильтр с порами 0,45 мк и анализировали на состоящей из трех частей ВЭЖХ-системе Hewlett Packard 1090, снабженной фотодиодным матричным детектором и программируемым флуоресцентным детектором 1046А модели HP. Разделение осуществляли при 45°С на колонке Hewlett Packard 5 мк Hypersil ODS (200х2,1 мм). Процианидины элюировали линейным градиентом 60% В до А с последующим промыванием колонки растворителем В при скорости потока 0,3 мл/мин. Состав подвижной фазы: дегазированная смесь из В=0,5% уксусная кислота в метаноле и А=0,5% уксусная кислота в деионизированной воде. Уровень уксусной кислоты в составляющих А и В подвижной фазы может быть увеличен до 2%. Компоненты определяли флуоресценцией при λ=276 нм и λ=316 нм и УФ-облучением с длиной волны 280 нм. Концентрации (+)-катехина и (-)-эпикатехина определяли относительно стандартных растворов. Уровни процианидинов оценивали с использованием фактора ответа для (-)-эпикатехина.
Метод С. Разделение с нормальной фазой
возб.
изл.
Экстракты процианидина, обогащенные пентамерами, полученные, как описано в примере 13, фильтровали через нейлоновый фильтр с порами 0,45 мк и анализировали на ВЭЖХ-системе Hewlett Packard 1090 Series II, снабженной программируемым флуоресцентным детектором HP Model 1046А и фотодиодным матричным детектором. Разделение осуществляли при 37°С на колонке 5 мк Phenomenex Lichrosphere Silica 100 (250x3,2 мм), соединенной с предколонкой Supelco Supelguard LC-Si 5 мк (20x4,6 мм). Процианидины элюировали линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), с последующим 8-минутным переуравновешиванием. Состав подвижной фазы: А=дихлорметан, В=метанол и С=уксусная кислота:вода в объемном соотношении 1:1. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Компоненты определяли флуоресценцией при λ=276 нм и λ=316 нм или УФ-облучением с длиной волны 280 нм. На фиг.2 показана характерная ВЭЖХ-хроматограмма для одного генотипа, показывающая разделение различных процианидинов. Подобный ВЭЖХ-профиль был получен при разделении других видов Theobroma, Herrania и/или их гибридов от меж- и внутривидового специфического скрещивания.
Условия ВЭЖХ:
Колонка (250x3,2 мм) Phenomenex Lichrosphere Silica 100 (5 мк).
Предколонка (20x4,6 мм) Supelco Supelguard LC-Si (5 мк).
возб.
изл.
Детекторы: фотодиодный матричный детектор, работающий на 280 нм и флуоресцентный детектор при λ=276 нм и λ=316 нм.
Скорость потока: 0,5 мл/мин.
Температура колонки: 37°С.
Градиент
CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>
Метанол
Уксусная кислота: вода (1:1)
0
82
14
4
30
67,6
28,4
4
60
46
50
4
65
10
86
4
70
10
86
4
Метод D. Препаративное разделение с нормальной фазой
Обогащенные фракции пентамеров, полученные, как описано в примере 13, дополнительно очищали с помощью препаративной хроматографии с нормальной фазой, применяя модифицированную методику Rigaud et al. (1993), J. Chrom. 654, 255-260.
Разделение осуществляли при температуре окружающей среды на колонке 5 мк Supelcosil LC-Si 100Å (50x2 см) с соответствующей предколонкой. Процианидины элюировали линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В, скорость потока); (0, 92,5, 7,5, 10); (10, 92,5, 7,5, 40); (30, 91,5, 18,5, 40); (145, 88, 22, 40); (150, 24, 86, 40); (155, 24, 86, 50); (180, 0, 100, 50). До использования компоненты подвижной фазы смешивали в соответствии со следующей схемой.
2
2
Приготовление растворителя А (82% CHCl, 14% метанол, 2% уксусная кислота, 2% вода)
1. Отмерить 80 мл воды и налить в 4-литровую бутыль.
2. Отмерить 80 мл уксусной кислоты и налить в ту же самую 4-литровую бутыль.
3. Отмерить 560 мл метанола и налить в ту же самую 4-литровую бутыль.
4. Отмерить 3280 мл метиленхлорида и налить в 4-литровую бутыль.
5. Закрыть бутыль и хорошо смешать.
6. Очистить смесь с помощью высокочистого гелия в течение 5-10 минут для дегазирования.
Повторить этапы 1-6 два раза, чтобы получить выход 8 объемов растворителя А.
Приготовление растворителя В (96% метанол, 2% уксусная кислота, 2% вода)
1. Отмерить 80 мл воды и налить в 4-литровую бутыль.
2. Отмерить 80 мл уксусной кислоты и налить в ту же самую 4-литровую бутыль.
3. Отмерить 3840 мл метанола и налить в ту же самую бутыль.
4. Закрыть бутыль и тщательно смешать.
5. Очистить смесь с помощью высокочистого гелия в течение 5-10 минут для дегазирования.
Повторить этапы 1-5, чтобы получить выход 4 объемов растворителя В. Состав подвижной фазы: А=метиленхлорид с 2% уксусной кислоты и 2% воды; В=метанол с 2% уксусной кислоты и 2% воды. Загрузка колонки составляла 0,7 г в 7 мл. Компоненты определяли УФ-облучением при длине волны 254 нм. Типичное разделение процианидинов какао с помощью препаративной ВЭЖХ с нормальной фазой показано на фиг.42.
Условия ВЭЖХ:
Колонка: (50х2 см) 5 мк Supelcosil LC-Si при температуре окружающей среды.
Подвижная фаза: А=метиленхлорид с 2% уксусной кислоты и 2% воды, В=метанол с 2% уксусной кислоты и 2% воды.
Градиент/Профиль потока:
Время(мин)
%А
%В
Скорость потока (мл/мин)
0
92,5
7,5
10
10
92,5
7,5
40
30
91,5
8,5
40
145
88,0
22,0
40
150
24,0
86,0
40
155
24,0
86,0
50
180
0,0
100,0
50
ПРИМЕР 15
Идентификация процианидинов
Процианидины, полученные, как описано в примере 14, метод D, анализировали с помощью метода матричной принудительной лазерно-десорбционной ионизации-время пролета/масс-спектрометрия (MALDI-TOF/MS) с использованием системы HP G2025A MALDI-TOF/MS, снабженной осциллоскопом Lecroy 9350 500 MГц. Инструментарий откалиброван в соответствии с инструкцией изготовителя по стандартному белку с низкой молекулярной массой (HP Part No G2051A) или белковому стандарту (HP No G2052A) с 2,5-дигидроксибензойной кислотой (DHB) (HP No G2056A) в виде стандартной матрицы. Один (1,0) мл образца растворяли в 500 мл 70/30 метанол/вода и затем образец смешивали с DHB матрицей в соотношении 1:1, 1:10 или 1:50 (образец:матрица) и высушивали на поддоне в вакууме. Образцы анализировали в режиме регистрации положительных ионов на детекторе с напряжением 4,75 кВ и лазером с мощностью от 1,5 и 8 мкJ. Данные собирали в виде суммы набора отдельных кадров и представляли в единицах молекулярной массы и времени пролета. Характерные спектры MALDI-TOF/MS показаны на фиг.22А.
Фиг.22В и 22С показывают MALDI-TOF/MS-спектры, полученные при исследовании частично очищенных процианидинов, подготовленных, как описано в примере 3, метод А, и используемых для оценки in vitro, как описано в примерах 6 и 7; результаты суммированы в таблице 6. Эти данные иллюстрируют, что описанные здесь соединения изобретения были преимущественно обнаружены во фракциях D-E, но не во фракциях А-С.
Спектры получали следующим образом: очищенную фракцию D-E анализировали методом MALDI-TOF/MS, как описано выше, за исключением того, что предварительно фракцию очищали с помощью SEP-PACK С-18 картриджа. Пять миллиграммов фракции D-E в 1 мл деионизированной воды загружали в предварительно уравновешенный SEP-PACK картридж. Колонку промывали 5 мл деионизированной воды, чтобы устранить загрязнения, и процианидины элюировали 1 мл 20% метанола. Фракции А-С использовали непосредственно, так как они были выделены в примере 3, метод А, без дополнительной очистки.
+
+
+
+
+
++
Эти результаты подтверждают и расширяют ранее полученные результаты (см. пример 5, таблица 3, фиг.20А и 20В), и указывают, что соединения изобретения пригодны в качестве секвестрантов катионов. В частности, результаты MALDI-TOF/MS-анализа окончательно указывают на то, что олигомеры процианидинов с n=5 и выше (см. фиг.20А и 20В и формулу в разделе "аспекты и сущность изобретения") непосредственно связаны с противораковой активностью при исследовании на моделях раковых клеточных линий HeLa и SKBR-3. Олигомеры с n=4 или меньше были неэффективны на этих моделях. Структура пентамера, очевидно, включает в себя структурный фрагмент, который представлен как в нем, так и в высших олигомерах и обеспечивает их активность. Кроме того, наблюдалось, что MALDI-TOF/MS-данные показали сильные М ионы Na, 2 Na, K, 2 K, Са, демонстрируя полезность в качестве секвестрантов катионов.
ПРИМЕР 16
Очистка фракций олигомеров
Метод А. Очистка с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой
Процианидины, полученные в примере 14, методы А, В и D, подвергали дополнительному разделению для получения экспериментальных количеств подобных олигомеров для дальнейшей структурной идентификации и раскрытия (например, примеры 15, 18, 19 и 20). ВЭЖХ-систему Hawlett Packard 1050, снабженную детектором с переменной длиной волны и инжекторным клапаном Rheodyne 7010 с 1-миллиметровой инжекционной петлей, присоединяли к коллектору фракций Pharmacia FRAC-100. Разделение осуществляли на колонке Phenomenex Ultracarb 10 мк ODS (250x22,5), соединенной с предколонкой Phenomenex 10 мк ODS Ultracarb (60x10 мм). Состав подвижной фазы: А=вода; В=метанол, использовали с линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А); (0, 85), (60, 50), (90, 0) и (110, 0) при скорости потока 5 мл/мин. Отдельные пики и выбранные хроматографические зоны собирали через определенные интервалы времени или путем сбора фракций вручную для дальнейшей оценки с помощью MALDI-TOF/MS и ЯМР. Загружаемые образцы составляли от 25 до 100 мг материала. Характерный элюционный профиль показан на фиг.23B.
Метод В. Модифицированная полупрепаративная ВЭЖХ
Процианидины, полученные в примере 14, метод А, В и D, подвергали дальнейшему разделению, чтобы получить экспериментальные количества подобных олигомеров для дальнейшей структурной идентификации и раскрытия (например, примеры 15, 18, 19 и 20). Колонка Supelcosil LC-Si 5 мк (250x10 мм) с предколонкой Supelcosil LC-Si 5 мк (20x2 мм). Разделение осуществляли при скорости потока 3,0 мл/мин, при температуре окружающей среды. Состав подвижной фазы: А=дихлорметан; В=метанол и С=уксусная кислота:вода (1:1), использовали с линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14); (22, 74, 21); (32, 74, 21); (60, 74, 50,4), (61, 82, 14), с последующим 7-минутным переуравновешиванием колонки. Объем нанесенного образца составлял 60 мкл, содержащих 12 мг обогащенного пентамера. Компоненты определяли УФ-облучением при длине волны 280 нм. Характерный элюционный профиль показан на фиг.23А.
ПРИМЕР 17
Молекулярное моделирование пентамеров
4
Структуры с минимальной энергией определяли с помощью молекулярного моделирования с использованием Desktop Molecular Modeller, версия 3.0, Oxford University Press, 1994. Четыре характерных картины [ЕС(4→8)]-ЕС (ЕС=эпикатехин) пентамеров, имеющих в основании структуру эпикатехина, показаны на фиг.24A-24D. Предполагается спиральная структура. В целом, когда эпикатехин является первым мономером и связывание происходит по положениям 4→8, в результате образуется бета-конфигурация, а когда первым мономером является катехин и связывание происходит по положениям 4→8, в результате образуется альфа-конфигурация; эти результаты получаются вне зависимости от того, является ли второй мономер катехином или эпикатехином (исключением является ent-EC(4→8)ent-EC). На фиг.38А-38B показаны предпочтительные пентамеры, а на фиг.39А-39B показана библиотека стереоизомеров, вплоть до и включая пентамеры, исходя из которой можно без излишнего экспериментирования получить другие соединения, входящие в объем данного изобретения.
ПРИМЕР 18
ЯМР-оценка процианидинов
13
13
13
С ЯМР-спектроскопия считается в целом полезной методикой для изучения процианидинов, особенно потому, что фенолы обычно дают спектры хорошего качества, в то время как протонные ЯМР-спектры значительно размыты. С ЯМР-спектры олигомеров давали полезную информацию о картине замещения в кольцах А и В, сравнительной стереохимии кольца С и в некоторых случаях о положении связей между флаваноидами. В любом случае С ЯМР-спектры представляли полезную информацию.
1
13
Кроме того, НОНАНА использует пульсовую методику для перенесения намагничивания последовательно от первого водорода ко второму, чтобы получить перекрестные пики, соответствующие альфа-, бета-, гамма- или дельта-протонам. COSY представляет собой модификацию методики ЯМР 2D-Fourier, где вертикальные и горизонтальные оси представляют химический сдвиг Н и спектр 1D; точка пересечения обозначает корреляцию между протонами, посредством чего может быть определено спин-спиновое взаимодействие. HMQC-спектр усиливает чувствительность ЯМР-спектра ядер, отличных от протонов, и может выявлять перекрестные пики от вторичного и третичного углерода с соответствующими пиками протонов. APT представляет собой С методику, применяющуюся для определения числа атомов водорода, присутствующих на углероде. Четное число протонов в углероде приведет к положительному сигналу, в то время как нечетное число протонов в углероде приведет к отрицательному сигналу.
13
1
Таким образом С ЯМР, Н ЯМР, НОНАНА (гомоядерная по методу Хартмана-Хана), HMQC (гетероядерная множественная квантовая когерентность), COSY (гомоядерная корреляция спектроскопии), APT (тест присоединения протона) и XHCORR (вариация HMQC) методы спектроскопии использовали для выяснения структуры соединений по изобретению.
Метод А. Мономеры
Все спектры определяли в растворе дейтерированного метанола при комнатной температуре, при приблизительной концентрации образца 10 мг/мл. Спектры определяли на Bruker 500 MГц ЯМР, используя метанол в качестве внутреннего стандарта.
1
13
1
Фиг.44А-44Е представляют ЯМР-спектры, которые использовали, чтобы охарактеризовать структуру мономера эпикатехина. На фиг.44А показаны химические сдвиги Н и С в табличной форме. На фиг.44В-44Е показаны Н, APT, XHCORR и COSY-спектры для эпикатехина.
1
13
1
13
Точно так же фиг.45А-45F представляют ЯМР-спектры, которые использовали, чтобы охарактеризовать структуру мономера катехина. На фиг.45А показан химический сдвиг Н и С в табличной форме. На фиг.44В-44F показаны спектры Н, С, APT, XHCORR и COSY для катехина.
Метод В. Димеры
2
Все спектры определяли в 75% дейтерированном ацетоне в DO, используя ацетон как внутренний стандарт, и при приблизительной концентрации образца 10 мг/мл.
1
13
Фиг.46А-G представляют спектры, которые использовали, чтобы охарактеризовать структуру димера В2. На фиг.46А показаны химические сдвиги Н и С в табличной форме. Термин Т и В указывает на верхнюю половину димера и нижнюю половину димера.
13
На фиг.46В и С показаны спектры С и APT соответственно, полученные на Bruker 500 MГц NMR при комнатной температуре.
1
На фиг.46D-G показаны Н, HMQC, COSY и НОНАНА соответственно, которые получали на AMZ-360 MГц NMR при -7°С. COSY-спектр был определен при использовании пульсового градиента.
1
13
Фиг.47А-G представляют спектры, использованные, чтобы охарактеризовать структуру димера В5. Фиг.47А показывает химические сдвиги Н и С в табличной форме.
1
13
Фиг.47В-D показывают Н, С и APT, соответственно, полученные на Bruker 500 MГц NMR, при комнатной температуре.
Фиг.47Е показывает COSY-спектры, полученные на АМХ-360, при комнатной температуре с использованием пульсового градиента.
Фиг.47F и G показывают HMQC и НОНАНА соответственно, полученные на АМХ-360 MГц NMR, при комнатной температуре.
Метод С. Тример - эпикатехин/катехин
2
Все спектры определяли в 70% дейтерированном ацетоне в DO при -3°С, используя ацетон как внутренний стандарт, на АМХ-360 MГц NMR и при соответствующей типовой концентрации 10 мг/мл.
1
Фиг.48А-D представляют спектры, которые использовали, чтобы охарактеризовать структуру тримера эпикатехин/катехин. Эти фигуры показывают Н, COSY, HMQC и НОНАНА соответственно. COSY-спектр получен с использованием пульсационного градиента.
Метод D. Тример - полностью эпикатехин
2
Все спектры определяли в 70% дейтерированном ацетоне в DO при -1,8°С, используя ацетон как внутренний стандарт, на АМХ-360 MГц NMR и при соответствующей концентрации образца 10 мг/мл.
1
Фиг.49А-49D представляют спектр, который использовали, чтобы охарактеризовать структуру тримера, полностью состоящего из эпикатехина. Эти фигуры показывают Н, COSY, HMQC и НОНАНА соответственно. Спектр COSY получен с использованием пульсационного градиента.
ПРИМЕР 19
Тиолизис процианидинов
Чтобы охарактеризовать структуру процианидинов, бензилмеркаптан (ВМ) подвергали взаимодействию с катехином, эпикатехином или димерами В2 и В5. Бензилмеркаптан, также как фторглюцинол и тиофенол, может быть использован в гидролизе (тиолизе) процианидинов в среде спирт/уксусная кислота. Катехин, эпикатехин или димер (1:1 смесь В2 и В5 димеров) (2,5 мг) растворяли в 1,5 мл этилового спирта, 100 мкл ВМ и 50 мкл уксусной кислоты и из сосуда (сосуд Бекмана для анализа аминокислот) удаляли воздух, многократно продували азотом и после последней продувки сосуд плотно закупоривали. Реакционный сосуд помещали в высокотемпературный блок при 95°С и проводили забор реакционных аликвот на 30, 60, 120 и 240 минутах. Относительная флуоресценция каждой аликвоты, показанная на фиг.25А-С, представляет эпикатехин, катехин и димер соответственно. Высшие олигомеры подвергали тиолизу подобным образом.
ПРИМЕР 20
Тиолиз и десульфуризация димеров
Димеры В2 и В5 гидролизовали с бензилмеркаптаном путем растворения димера В2 или В5; 1/0 мл) в 600 мкл этанола, 40 мкл ВМ и 20 мкл уксусной кислоты. Смесь нагревали при 95°С в течение 4 часов в атмосфере азота в сосуде Бекмана для анализа аминокислот. Отдельные порции выделяли для анализа с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и 75 мкл каждой порции в этанольном растворе Никеля Ренея и галловой кислоте (10 мг/мл) добавляли к оставшейся реакционной среде в 2 мл гиповиала. Сосуд продували током водорода и периодически взбалтывали в течение часа. Продукт реакции фильтровали через 0,45 мк фильтр и анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. Характерный элюционный профиль показан на фиг.26А и В. Высшие олигомеры подвергали обессериванию подобным образом. Эти данные показывают полимеризацию эпикатехина или катехина и таким образом представляют путь искусственного получения соединений по изобретению.
ПРИМЕР 21
Активность пентамера in vivo на модели голых мышей MDA MB 231
2
Клеточная линия MDA-MB-231/LCC6. Клеточную линию выращивали в улучшенной минимально необходимой среде (IMEM), содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки и хранившейся в увлажненной атмосфере с 5% CO при 37°С.
Мыши. Шести-восьми-недельных самок NCr ню/ню (без тимуса) приобретали через NCI, размещали в виварии и содержали согласно нормам, изложенным отделом по сельскому хозяйству Соединенных Штатов и Американской ассоциацией защиты лабораторных животных. Мышей с опухолями взвешивали через день и еженедельно для определения соответствующей дозировки лекарственного средства.
6
6
Имплантация опухоли. MDA-MD-231, подготовленный разбавлением культуры тканей IMEM 3,3х10 клетки/мл и 0,15 мл (то есть 0,5х10 клеток), вводили подкожно между 2 и 3 сосками на каждой стороне мыши. Объем опухоли рассчитывали при следующем умножении: длина х ширина х высота х 0,5. Объем опухоли вне обработанной группы усредняли и использовали тест Стьюдента для вычисления значения р.
Подготовка образца. Образцы плазмы получали кардиальной пункцией и хранили при -70°С с 15-20 мм ЭДТА с целью определения химического состава крови. Между группой контроля и экспериментальной группой не было отмечено никаких различий.
Пятнадцать голых мышей, предварительно инфицированных подкожным введением 500000 клеток с опухолевыми клетками линии MDA-MB-231, случайным образом разделяли на три группы по 5 животных в каждой и инъецировали внутрибрюшинно одним из: (I) плацебо, содержащее только растворитель (ДМСО); (II) 2 мг/мышь экстракта очищенного пентамерного процианидина, выделенного, как описано в примере 14, метод D, в растворителе (ДМСО); (III) 10 мг/мышь экстракта очищенного пентамерного процианидина, выделенного, как описано в примере 14, метод D, в растворителе (ДМСО).
Мыши группы (III) умерли в период времени приблизительно от 48 до 72 часов после введения 10 мг, в то время как мыши группы (II), казалось, чувствовали себя нормально. Причина смерти мышей группы (III) не была установлена; она не может быть обязательно приписана применению соединения изобретения. Тем не менее 10 мг рассматриваются, как верхний предел допустимой токсичности.
Обработку групп (I) и (II) повторяли один раз в неделю и рост опухоли контролировали в каждой экспериментальной и контрольной группе. После двух недель обработки у мышей группы (II) никаких признаков токсичности не наблюдалось, и дозу, применяемую в этой группе, вводили с пошаговым увеличением на 1/2 по логарифмической шкале в каждую последующую неделю. Следующая таблица представляет дозировки, применяемые в течение периода обработки мышей группы (II):
Неделя
Доза (мг/мл)
1
2
2
2
3
4
4
5
5
5
6
5
7
5
Результаты обработки показаны на фиг.27А и В и в таблице 10.
Таблица 10Результаты противораковой обработки in vivo
День
% выживания группа (I)
% выживания группа (II)
% выживания группа (III)
1
100
100
100
2
100
100
100
3
100
100
0
4
100
100
5
100
100
6
100
100
7
100
100
8
100
100
9
100
100
10
100
100
11
100
100
12
100
100
13
100
100
14
100
100
15
100
100
16
100
100
17
100
100
18
100
100
19
100
100
20
100
100
21
100
100
22
75
100
23
75
100
24
75
100
25
75
100
26
75
100
27
75
100
28
75
100
29
50
100
30
50
100
31
50
100
32
50
100
33
50
100
34
50
100
35
50
100
36
25
100
37
25
100
38
25
100
39
25
100
40
25
100
41
25
100
42
25
100
43
25
80
44
25
80
45
25
80
46
25
80
47
25
80
48
25
80
49
25
80
50
25
60
51
25
60
52
25
60
53
25
60
54
25
60
55
25
60
56
25
60
57
0
40
58
40
59
40
60
40
61
40
62
40
63
40
64
40
Эти результаты демонстрируют, что фракции по изобретению и соединения, действительно, имеют полезность в качестве противоопухолевых (антибластомных) композиций и в низких и средних дозах не являются токсичными, причем токсичность при более высоких дозировках можно определить без излишнего экспериментирования.
ПРИМЕР 22
Антимикробная активность экстрактов какао
Метод А
2
4
Исследование проводили с целью излучения антимикробной активности экстрактов неочищенных процианидинов какао-бобов против различных микроорганизмов, участвующих в порче пищевых продуктов или в патогенезе заболеваний. В этом исследовании использовали экстракты какао из примера 2, метод А. Агаровую среду подходящую для роста каждой исследуемой культуры (99 мл) засевали 1 мл суспензии каждой клеточной культуры в 0,45% физиологическом растворе (конечное содержание 10-10кое/мл) и выливали в чашки Петри. В застывшем агаре были сделаны лунки #2 пробковым сверлом (5 мм в диаметре). Чашки охлаждали при 4°С в течение ночи, позволяя экстракту диффундировать в агар, и затем инкубировали при температуре, подходящей для роста исследуемого микроорганизма. Получали следующие результаты:
Зона ингибирования образца (мм)
Концентрация экстракта (мг/мл)
B.Sphericus
B.Cereus
S.Aureus
P.Aeruginosa
В. Subtilis
0
NI
NI
NI
NI
NI
25
NI
12
NI
11
NI
250
12
20
19
19
11
500
14
21
21
21
13
NI=нет подавления
Антимикробную активность экстрактов очищенных процианидинов из какао-бобов демонстрировали в другом исследовании, проводимом с применением анализа диффузии из лунок, описанном выше (в методе А) со Staphyloccocus aureus тестовой культуре.
Получали следующие результаты:
Экстракты какао: 10 мг/100 мл декофеинизированного/детеобромированного ацетонового экстракта, как в примере 13, метод А.
10 мг/100 мл димера (99% чистоты), как в примере 14, метод D.
10 мг/100 мл тетрамера (95% чистоты), как в примере 14, метод D.
10 мг/100 мл гексамера (88% чистоты), как в примере 14, метод D.
10 мг/100 мл октамера/нонамера (92% чистоты), как в примере 14, метод D.
10 мг/100 мл нонамера и более высшие олигомеры (87% чистоты), как в примере 14, метод D.
Зона подавления образца (мм)
0,45% физиологический раствор
0
Димер
33
Тетрамер
27
Гексамер
24
0,45% физиологический раствор
0
Октамер
22
Нонамер
20
Декофеин/детеобром
26
Метод В
5
Неочищенные процианидины по примеру 2, метод 2, добавляли в различных концентрациях к TSB (триптиказа соевый бульон) с феноловым красным (0,08 г/л). На TSB высевали культуры Salmonella enteritidis или S.newport (10кое/мл) и инкубировали в течение 18 часов при 35°С. Получали следующие результаты:
S. Enteritidis
S.Newpor
0 мг/мл
+
+
50
+
+
100
+
+
250
+
-
500
-
-
750
-
-
где + = рост, - = отсутствие роста, как становится очевидным по изменению цвета в культуре бульона от красного до желтого, связанного с выработкой кислоты. Подтверждение ингибирования получали при перемещении из TSB-пробирок на XLD-планшеты.
Эти примеры демонстрируют, что соединения по изобретению полезны при приготовлении и хранении пищи.
Этот пример также демонстрирует, что рост грамотрицательных и грамположительных бактерий может ингибироваться соединениями по изобретению. Исходя из этого можно сказать, что соединения по изобретению могут использоваться для ингибирования Helicobacter pylori. Helicobacter pylori участвуют в развитии язвы желудка и рака желудка. Соответственно, соединения изобретения могут использоваться для лечения или предупреждения этих и других заболеваний бактериального происхождения. Учитывая известные параметры, такие как вид заболевания, а также возраст, масса, пол и общее состояние здоровья пациента, могут быть определены без излишнего экспериментирования подходящие пути введения, дозировки и готовые препаративные формы.
ПРИМЕР 23
Свободное от галогена аналитическое разделение экстракта
Процианидины, полученные в примере 2, частично очищали аналитическим разделением с помощью свободной от галогена хроматографии с нормальной фазой на 100Å Supelcosil LC-Si 5 мкм (250x4,6 мм) при скорости потока 1,0 мл/мин и при температуре колонки 37°С. Разделение осуществляли линейным градиентом в следующих условиях: (время, %А, %В); (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4); (60, 46, 50).
Состав подвижной фазы: А=30/70% диэтиловый эфир/толуол; В=метанол и С=уксусная кислота/вода (1:1). Компоненты определяли УФ-излучением с длиной волны 280 нм. Характерный профиль элюирования показан на фиг.28.
ПРИМЕР 24
Значение размера пор стационарной фазы при разделении процианидинов с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой
возб.
изл.
Для улучшения разделения процианидинов исследовали применение силиконовой стационарной фазы с большим размером пор. Разделение осуществляли на Silica-300, 5 мкм, 300Å (250x2,0 мм), или альтернативно, на Silica-1000, 5 мк, 1000Å (250x2,0 мм). Использовали линейный градиент, поскольку подвижная фаза представляла: А=дихлорметан; В=метанол и С=уксусная кислота/вода (1:1). Компоненты определяли флуоресценцией при λ=276 нм и λ=316 нм и на УФ-детекторе при 280 нм. Скорость потока составляла 1,0 мл/мин и температура термостата 37°С. Характерная хроматограмма, полученная на трех различных колонках (размер пор 100Å, из примера 13, метод D) показана на фиг.29. Она показывает эффективный размер пор для разделения процианидинов.
ПРИМЕР 25
Получение желаемых процианидинов посредством управляемой ферментации
Представители различных видов микробов из группы, связанной с ферментацией какао, отбирали из M&M/Mars коллекции для культуры какао. Использовали следующие изоляты:
Acetobacter aceti ATCC 15973
Lactobacillus sp. (BH 42)
Candida cruzii (BA 15)
Saccharomyces cerevisiae (BA 13)
Bacillus cereus (BE 35)
Bacillus sphaericus (ME 12).
Каждый вид переносили из исходной культуры в свежую среду. Дрожжи и Acetobacter инкубировали в течение 72 часов при 26°С и bacilli и Lactobacillus инкубировали в течение 48 часов при 37°С. До использования скошенный агар обработали 5 мл фосфатного буфера.
Какао-бобы собирали, освобождая от кожуры, мякоти и скорлупы. Бобы стерилизовали с пероксидом водорода (35%) в течение 20 секунд с последующей обработкой каталазой до прекращения выделения пузырьков. Затем бобы дважды промывали стерилизованной водой и процесс повторяли. Бобы распределяли по стеклянным флягам и обрабатывали в соответствии с режимом, детально представленным в следующей таблице:
Вода
Этанол/кислота
Ферментационный инфузат
Модель ферментации
Ежедневно переносить в свежую воду
Ежедневно переносить в раствор спирта и кислоты, соответствующий уровню, определенному на каждой стадии модели ферментации мякоти
Ежедневно переносить в ферментированную мякоть, пастеризуемую в каждый последовательный день ферментации
Модель стендовой ферментации стерильной мякоти совместно инокулированной с тестируемыми штаммами
Стендовую ферментацию дублировали. Все образцы инкубировали, как показано ниже:
День 1
26°С
День 2
от 26°С до 50°С
День 3
50°С
День 4
45°С
День 5
40°С
Ферментационную модель контролировали в течение всего излучения путем подсчета планшетов с целью оценки микробной популяции и ВЭЖХ-анализа среды ферментации в плане наличия микробных метаболитов. После обработки бобы высушивали в ламинарном тепловом потоке до активности воды 0,64 и обжаривали при 66°С в течение 15 мин. Образцы подготавливали к анализу процианидинов. Три боба на одну обработку размалывали и обезжиривали с гексаном с последующим экстрагированием раствором ацетон:вода:уксусная кислота (70:29,5:0,5%). Ацетоновый раствор экстракта фильтровали в склянки и уровни полифенолов определяли количественно с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой, как в примере 13, метод В. Оставшиеся бобы размалывали и испытывали на вкус. Культуральный и аналитический профиль процесса стендовой ферментации показан фиг.30А-С. Профиль процианидинов какао-бобов, подвергнутых различной ферментативной обработке, показан на фиг.30D.
Этот пример демонстрирует, что изобретение не должно быть ограничено каким-либо определенным генотипом какао и что благодаря управляемой ферментации уровни процианидинов, выработанных определенными разновидностями Theobroma и Herrania или их гибридами от меж- или внутривидового скрещивания, можно модулировать, например расширять.
Следующая таблица показывает уровни процианидинов, определенные в образцах, которые характерны для видов Theobroma и их гибридов от меж- и внутривидового специфического скрещивания. Образцы подготавливали, как в примерах 1 и 2, (методы 1 и 2) и анализировали, как описано в примере 13, метод В. Эти данные поясняют, что экстракты, содержащие соединения по изобретению, найдены в видах Theobroma и Herrania и в их гибридах от меж- и внутривидового специфического скрещивания.
ПРИМЕР 26
Эффект процианидинов на NO
Метод А
Цель этого исследования состоит в том, чтобы установить связь между процианидинами (как в примере 14, метод D) и NO, который, как известно, стимулирует расширение сосудов мозга. Оценены эффекты мономеров и высших олигомеров, в концентрациях в пределах от 100 мкг/мл до 0,1 мкг/мл, на выработку нитратов (катаболитов NO) из HUVEC (клетки эндотелия пупочной вены человека). HUVEC (из Clonetics) исследуют в присутствии или отсутствие каждого процианидина в течение от 24 до 48 часов. В конце экспериментов собирали супернатанты и определяли содержание нитратов путем калориметрического исследования. В отдельных экспериментах HUVEC инкубировали с ацетилхлорином, который, как известно, стимулирует выработку NO, в присутствии или отсутствие процианидинов в течение от 24 до 48 часов. В конце экспериментов собирали супернатанты и определяли содержание нитратов путем калориметрического исследования. Роль NO устанавливают добавлением нитроаргинина или (1)-N-метиларгинина, которые являются специфическими блокаторами NO-синтазы.
Метод В. Вазорелаксация артерии крысы, сокращенной фенилэфрином
Эффект каждого из процианидинов (100 мк/мл - 0,1 мкг/мл) на артерию крысы является целью изучения релаксации артерии крысы, находящейся в состоянии фенилэфрин-индуцированного сокращения. Изолированную артерию крысы инкубируют в присутствии или отсутствие процианидинов (как в примере 14, метод D) и изменение мышечного тонуса оценивают путем визуального осмотра. Определяют как сокращение, так и расслабление артерии крысы. Затем, используя другие органы, предварительное сокращение изолированной артерии крысы вызывают добавлением эпинефрина. Добившись стабильного сокращения, добавляли процианидины и определяли сокращение или релаксацию артерии крысы. Действие NO ускорялось добавлением нитроаргинина или (1)-N-метиларгинина. Ацетилхлорином вызванная релаксация NO, как она проявляется на аорте крысы, предварительно сокращенной фенилэфрином, показана на фиг.31.
Метод С. Индуцирование гипертонии у крысы
Этот метод направлен на эффект каждого процианидина (как в примере 14, метод D), оказываемый на кровяное давление. К крысам подключали аппаратуру для контроля систолического и диастолического давления крови. Каждый из процианидинов вводили внутривенно (диапазон дозировки=100-0,1 мкг/кг) и оценивали изменение кровяного давления. Кроме того, определяли эффект каждого процианидина на изменение давления, вызванное адреналином. Роль NO определяли при добавлении нитроаргинина или (1)-N-метиларгинина.
Эти исследования, вместе со следующим примером, демонстрируют, что соединения изобретения полезны для модуляции расслабления сосудов, а также для модуляции кровяного давления или направлены на изменение состояния коронарного кровообращения и состояния при мигрени.
ПРИМЕР 27
Эффект полифенолов какао на насыщение
Используя уровень глюкозы в крови в качестве указателя на появление результатов, которые наступают in vivo при регулировании аппетита и насыщения, проводили ряд простых экспериментов, в которых участвовали здоровые взрослые добровольцы мужского пола, 48 лет, и которые проводили с целью определения, будут ли полифенолы какао модулировать уровень глюкозы. Полифенолы какао частично очищали из бразильских какао-бобов согласно методам, описанным Clapperton et al. (1992). Этот материал не содержал никакого кофеина или теобромина. Быстрое изменение уровня глюкозы в крови при голодании анализировали в зависимости от времени после употребления 10 жидких унций Дексиколы 75 (свободного от кофеина) с помощью теста на толерантность к глюкозе (Curtin Matheson 091-421) без и с 75 мг полифенолов какао. Этот уровень полифенолов представлял 0,1% всей глюкозы тестируемого напитка и отражал приблизительное количество, которое присутствовало бы в стандартной 100-граммовой плитке шоколада. Уровни глюкозы в крови определяли, используя Accu-Chek III систему контроля глюкозы в крови (Boehringer Mannheim Corporation). Уровни глюкозы в крови измеряли перед выпиванием тестируемого напитка и после выпивания тестируемого напитка через следующие интервалы времени: 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120 и 180 минут. Перед началом каждой пробы на толерантность к глюкозе определяли контроли для высокого и низкого уровня глюкозы. Каждую пробу на толерантность к глюкозе проводили дважды. Также был изготовлен контрольный тестируемый раствор, содержащий 75 мг полифенолов какао, растворенных в 10 жидких унциях дистиллированной воды (без глюкозы).
Таблица 11, приведенная ниже, представляет данные испытаний и контроля, полученные для каждого эксперимента на толерантность к глюкозе, проводимого в этом исследовании. Фиг.32 представляет диаграмму средних значений со среднеквадратичными отклонениями уровней глюкозы в крови, полученных в течение всего трехчасового курса. Совершенно очевидно, что имеется реальное увеличение уровня сахара в крови, полученное после выпивания тестируемой смеси, содержащей полифенолы какао. Разница между двумя основными профилями толерантности к глюкозе не могла определяться только профилем, полученным после выпивания раствора полифенолов какао. Добавление полифенолов какао к испытательному раствору глюкозы значительно поднимало профиль толерантности к глюкозе. Подобное увеличение уровня глюкозы в крови не выходит за рамки диапазона, рассматриваемого как умеренно диабетический, несмотря на то, что типичный профиль толерантности к глюкозе считался нормальным (Davidson, I. et al., Eds. Todd - Sandford Clinical Diagnosis by Laboratory Methods 14th edition; W.D.Saunders Co; Philadelfia, PA 1969 Ch. 10, pp.550-9). Предполагается, чтобы дополнительная глюкоза, определившая эту разницу, была выброшена в кровоток из запасов гликогена в результате воздействия соединений изобретения. Таким образом, соединения изобретения могут быть использованы для модулирования уровня глюкозы в крови в присутствии сахаров.
Таблица 11Результаты пробы на толерантность к глюкозе(опыт и контроль)
Неделя
Описание
Контроль высоких значений
Контроль низких значений
0
Толерантность к глюкозе
265 мг/дл
53 мг/дл
1
Толерантность к глюкозе с 0,1% полифенолов
310
68
2
Толерантность к глюкозе
315
66
4
Толерантность к глюкозе с 0,1% полифенолов
325
65
5
0,1% полифенолов
321
66
а=ожидаемый диапазон: 253-373 мг/дл,
b=ожидаемый диапазон: 50-80 мг/дл.
У участника эксперимента также наблюдалось покраснение лица (эритема) и головокружение (lightheadedness), появляющиеся после употребления соединений по изобретению, что указывает на модуляцию вазодилятации соединениями по изобретению.
Данные, представленные в таблицах 12 и 13, иллюстрируют тот факт, что экстракты изобретения, относящиеся к какао-порошку и коммерческим видам шоколада, и соединения по изобретению, содержащиеся в них, могут использоваться как носители в фармацевтических, ветеринарных и пищевых препаратах и их применении.
Таблица 13Уровни процианидинов в коммерческом шоколаде (мг/г)
Образец
Мономеры
Димеры
Тримеры
Тетрамеры
Пентамеры
Гексамеры
Гептамеры и выше
Общее
Марка 1
366
166
113
59
56
23
18
801
Марка 2
344
163
111
45
48
ND*
ND
711
Марка 3
316
181
100
41
40
7
ND
685
Марка 4
310
122
71
27
28
5
ND
563
Марка 5
259
135
90
46
29
ND
ND
559
Марка 6
308
139
91
57
47
14
ND
656
Марка 7
196
98
81
58
54
19
ND
506
Марка 8
716
472
302
170
117
18
ND
1795
Марка 9
1185
951
633
298
173
25
21
3286
Марка 10
1798
1081
590
342
307
93
ND
4211
Марка 11
1101
746
646
372
347
130
75
3417
Марка 12
787
335
160
20
10
8
ND
1320
ND=нe определено
Таблица 14Уровни процианидинов в сырье какао (мг/г)
Образец
Мономеры
Димеры
Тримеры
Тетрамеры
Пентамеры
Гексамеры
Гептамеры и выше
Общее
Неферментированные
13440
6425
6401
5292
4236
3203
5913
44910
Ферментированные
2695
1538
1362
740
470
301
277
7383
Обжаренные
2656
1597
921
337
164
ND
ND
5675
Жидкий шоколад
2805
1446
881
442
184
108
ND
5866
Скорлупа какао
114
53
14
ND
ND
ND
ND
181
Порошок какао, 1% жира
506
287
112
ND
ND
ND
ND
915
Порошок какао, 11% жира
1523
1224
680
46
ND
ND
ND
3473
Красный голландский порошок какао, рН 7,4, 11% жира
1222
483
103
ND
ND
ND
ND
1808
Красный голландский порошок какао, рН 8,2, 23% жира
168
144
60
ND
ND
ND
ND
372
ND=не определено
ПРИМЕР 28
Эффект процианидинов на циклооксигеназу 1 и 2
50
50
Эффект процианидинов на активность циклооксигеназы 1 и 2 (СОХ1/СОХ2) оценивали при инкубировании ферментов, полученных из семенных пузырьков овцы и плаценты овцы, соответственно, с арахидоновой кислотой (5 мкМ) в течение 10 минут при комнатной температуре в присутствии различных концентраций растворов процианидина, содержащих олигомеры мономера-декамера и смеси процианидинов. Изменение активности оценивали и с использованием PGE2 EIA наборов фирмы Interchim (Франция). Индометацин использовали как соединение для сравнения. Результаты представлены в следующей таблице, где значения IC выражены в единицах мкМ (кроме S11, который представляет собой смесь процианидинов, подготовленную, как в примере 13, метод А, и где образцы S1-S10 представляют собой последовательные олигомеры процианидинов (мономеры-декамеры), как в примере 14, метод D, и IC выражены в мг/мл).
Образец #
IC<sub>50</sub> СОХ-1 (*)
IC<sub>50</sub> COX-2 (*)
Соотношение IC<sub>50</sub> COX2/COX1
1
0,074
0,197
2,66
2
0,115
0,444
3,86
3
0,258
0,763
2,96
4
0,154
3,73
24,22
5
0,787
3,16
4,02
6
1,14
1,99
1,75
7
1,89
4,06
2,15
8
2,25
7,2
3,20
9
2,58
2,08
0,81
10
3,65
3,16
0,87
11
0,0487
0,0741
1,52
Индометацин
0,599
13,5
22,54
(*) выраженное как мкМ за исключением образца 11, который выражен в мг/мл.
50
50
50
Результаты изучения ингибирования представлены на фиг.33А и В, которые показывают действие индометацина на активность СОХ1 и СОХ2. Фиг.34А и В показывают корреляцию между степенью полимеризации процианидина и IC с СОХ1 и СОХ2; фиг.35 показывает корреляцию между значением IC для СОХ1 и СОХ2. и фиг.36А-Y показывают значения IC для каждого образца (S1-S11) с СОХ1 и СОХ2.
Эти результаты указывают, что соединения изобретения могут быть полезны как анальгезирующее, антикоагулирующее и противовоспалительное средство. Кроме того, СОХ2 связан с раком толстого кишечника. Подавление активности СОХ2 соединениями по изобретению иллюстрирует вероятный механизм противоопухолевой активности соединений по изобретению против рака толстой кишки.
СОХ1 и СОХ2 также вовлечены в синтез простагландинов. Таким образом, результаты этого примера также указывают на то, что соединения изобретения могут модулировать функционирование почек, иммунные реакции, лихорадку, боль, митогенез, апоптоз, синтез простагландинов, образование язвы (например, желудка) и механизмы воспроизводства. Обратите внимание, что модуляция функционирования почек может влиять на кровяное давление, опять включая соединения по изобретению в модуляцию кровяного давления, расширения сосудов и состояния коронарного кровообращения (например, модуляция ангиотензина, брадикина).
Делаются ссылки на Seibert et al., PNAS USA 91:12013-12017 (December 1994), Mitchell et al., PNAS USA 90:11693-11697 (December 1994), Dewitt et al., Cell 83:345-348 (November 3, 1995), Langenbach et al., Cell 83:483-92 (November 3, 1995) и Sujii et al., Cell 83:493-501 (November 3, 1995), Morham et al., Cell 83:473-82 (November 3, 1995).
Кроме того, делаются ссылки на примеры 9, 26 и 27. В примере 9 показана антиоксидантная активность соединений изобретения. В примере 26 продемонстрировано воздействие на NO. И пример 27 с очевидностью демонстрирует расширение сосудов лица. Результаты этих примеров в сочетании с примерами 9, 26 и 27 показывают, что соединения изобретения могут модулировать свободнорадикальные механизмы управления физиологическими эффектами. Точно так же липоксигеназа, опосредованно участвующая в типичных свободнорадикальных реакциях, биохимически направленных на синтез лейкотреина, может модулироваться соединениями по изобретению, таким образом влияя на последующие физиологические эффекты (например, воспаление, иммунную реакцию, состояние коронарного кровообращения, канцерогенные механизмы, лихорадку, боль, образование язв).
Таким образом, кроме наличия анальгезирующих свойств, имеет место синергический эффект соединений по изобретению при их назначении вместе с анальгетиками. Аналогично, кроме наличия противоопухолевых свойств, может также иметь место синергический эффект соединения по изобретению при их применении с другими антибластомными агентами.
ПРИМЕР 29
Исследование кругового дихроизма (CD) процианидинов
Были предприняты CD исследования с целью выяснения структуры очищенных процианидинов, полученных, как в примере 14, метод D. Спектры собирали при 25°С, используя спектральный мягкий носитель AVIV 60DS V4.1f.
Образцы сканировали при 300-185 нм, каждый 1,0 нм, при ширине полосы 1,50 нм. Характерные спектры показаны на фиг.43А-G, которые показывают CD-спектры олигомеров от димера до октамера.
Эти результаты показательны для спиральной природы соединений изобретения.
ПРИМЕР 30
Эффект ингибирования процианидинами какао Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus
Исследование проводили с целью оценки антимикробной активности олигомеров процианидинов против Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus. Материал обогащенных пентамеров приготавливали, как описано в примере 13, метод А, и анализировали, как описано в примере 14, метод С, при содержании 89% пентамеров и 11% высших олигомеров (n равно 6-12). Очищенный пентамер (96,3%) приготавливали, как описано в примере 14, метод D.
Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Для Н.pylori пузырек регидратировали с 0,5 мл триптиказа соевым бульоном и суспензию переносили на скошенный агар свежей TSA, содержащей 5 мкг дефибринированной крови овцы. Скошенный агар инкубировали при 37°С от 3 до 5 дней в микроаэрофильных условиях в анаэробных флягах (5-10% диоксида углерода; CampyPakPlus, BBL). Когда был установлен хороший рост на дне скошенного агара, бульон использовали для прививания дополнительного скошенного агара TSA с кровью овцы. Из-за уменьшения жизнеспособности при продолжительном культивировании бульон, собранный со скошенного агара, объединяли и хранили при 80°С. Культуры для анализа использовали непосредственно из замороженных пузырьков. Культуру S.aureus сохраняли на TSA-скошенном агаре и переносили на свежий агар за 24 часа до использования.
8
9
6
7
Подготавливали клеточную суспензию каждой культуры (Н.pylori, 10-10 кое/мл; S.aureus 10-10 кое/мл) и 0,5 мл распределяли на планшете с TSA с 5% кровью овцы. Стандартные аналитические диски (Difco) помещали в стерилизованные фильтрованием серийные разведения пентамера (23 мг/мл в стерилизованной воде). Тестируемые диски и стерильные контрольные диски (стерилизованная вода) размещали на привитых планшетах. Контрольные диски, содержащие 80 мкг метронидазола (подавляющего Н.pylori) или 30 мкг ванкомицина (подавляющего S.aureus) (BBL Sensidiscs), также размещали на соответствующем наборе планшетов. Планшеты с Н.pylori инкубировали в микроаэрофильных условиях. Набор S.aureus инкубировали в анаэробных условиях. Зоны подавления измеряли при наблюдении за внешним ростом.
Таблица 14Биоисследование пентамеров против Helicobacter pylori и Staphylococcus aureus
ПентамерОбогащенная фракции(мг/мл )
S.aureusПодавление (мм)
Н. pyloriПодавление (мм)
0
NI
NI
15
0
10
31
10
10
62
11
11
125
13
13
250
15
13
Ванкомицин стандарт
15
-
Метронидазол стандарт
-
11
Пентамер 96% чистоты
15
11
NI=нет подавления
ПРИМЕР 31
NO-зависимая гипертензия у морских свинок
Был исследован эффект пяти фракций процианидинов на кровяное давление морской свинки. Коротко, морские свинки (приблизительно 400 г вес тела; самцы и самки) получали анестезию впрыскиванием 40 мг/кг фенобарбитала натрия. Сонную артерию катетеризировали для контроля внутриартериального кровяного давления. Каждую из пяти фракций процианидинов какао вводили внутривенно (диапазон дозы 0,1 мг/кг - 100 мг/кг) через яремную вену. Изменения кровяного давления регистрировали на полиграфе. В этих экспериментах роль NO устанавливали при применении L-N-метиларгинина (1 мг/кг) за десять минут до применения фракций процианидинов какао.
Фракции процианидинов какао подготавливали и анализировали согласно методикам, описанным в патенте США 5554645, включенном в данное описание в виде ссылки.
Фракция А представляет фракцию, полученную при препаративной ВЭЖХ, включающую олигомеры от мономеров до тетрамеров. ВЭЖХ-анализ показал следующий состав:
Мономеры
47,2%
Димеры
23,7
Тримеры
18,7
Тетрамеры
10,3
Фракция В представляет собой фракции, полученные при препаративной ВЭЖХ, включающие олигомеры от пентамеров до декамеров. ВЭЖХ-анализ показал следующий состав:
Пентамеры
64,3%
Гексамеры
21,4
Гептамеры
7,4
Октамеры
1,9
Нонамеры
0,9
Декамеры
0,2
Фракция С представляет собой фракцию, обогащенную процианидинами какао, пригодную для получения фракций А и В, представленных выше. ВЭЖХ-анализ показал следующий состав:
Мономеры
34,3%
Димеры
17,6
Тримеры
16,2
Тетрамеры
12,6
Пентамеры
8,5
Гексамеры
5,2
Гептамеры
3,1
Октамеры
1,4
Нонамеры
0,7
Декамеры
0,3
Фракция D представляет собой экстракт процианидина, приготовленный из молочного шоколада. ВЭЖХ-анализ показал состав, подобный представленному в таблице 12 для марки 8. Кроме того, в ней присутствовало 10% кофеина и 6,3% теобромина.
Фракция Е представляет собой экстракт процианидинов, полученный из темного шоколада, приготовленного с алкализованной жидкой какао-массой. ВЭЖХ-анализ показал состав, подобный представленному в таблице 12 для марки 12. Кроме того, в ней присутствовало 16,0% кофеина и 5,8% теобромина.
В трех отдельных экспериментах исследовали эффекты от применения 10 мкг/кг фракций процианидинов какао на артериальное кровяное давление находящихся под анестезией морских свинок. При внутривенном введении фракции процианидинов А и Е вызывали уменьшение кровяного давления приблизительно на 20%. Это уменьшение лишь незначительно отличалось от полученного при использовании растворителя (ДМСО) как контроля (15±5%, n=5). Напротив, фракции процианидинов В, С и D (10 мг/кг) вызывали заметное снижение кровяного давления, вплоть до 50-60% для фракции С. В этих экспериментах степень проявления гипотензивного эффекта была следующей: C>B>D>>A=E.
Типичная картина кровяного давления после введения фракций процианидинов показана на фиг.50А для фракции А и на фиг.50В для фракции С. Фиг.51 иллюстрирует сравнительные эффекты этих фракций на кровяное давление.
Возможное участие NO в развитии гипотонии у морских свинок, вызванное применением фракции С, анализировали с использованием L-N-метиларгинина (L-NMMA). Этот фармакологический агент замедляет выработку NO, не ингибируя NO-синтазу. L-NMMA применяли в дозе 1 мг/кг за десять минут до введения фракций процианидинов какао. Как показано на фиг.52, обработка животных L-NMMA полностью блокировала гипотензию, вызванную фракциями процианидина С. Действительно, при последующей обработке этим ингибитором изменение кровяного давления, вызванное фракцией С, было подобно тому, которое было отмечено при применении одного растворителя.
ПРИМЕР 32
Действие фракций процианидина какао на выработку NO в эндотелиальных клетках пупочной вены человека
2
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека получали из Clonetics и культуры содержали согласно спецификации изготовителя. Клетки HUVEC высевали в количестве 5000 клеток/см в 12-луночный планшет (Falcon). После третьей пересадки в тех же самых условиях им позволяли достичь стадии слияния. Супернатант заменяли новой средой, содержащей определенные концентрации брадикинина (25, 50 и 100 нм) или фракции процианидинов какао А-Е (100 мкг/мл), как описано в примере 31. Культивирование продолжали 24 часа и свободные от супернатанта клетки собирали и хранили замороженными до оценки содержания NO, как описано ниже. В отдельных экспериментах антагонист NO-синтазы (NOS), сложный метиловый эфир Nω-нитро-L-аргинина (L-NAME, 10 мкМ) добавляли, чтобы оценить участие NOS в наблюдаемой выработке NO.
Выработку NO в HUVEC оценивали измерением концентрации нитритов в культуральном супернатанте с помощью реакции Griess. Griess реагент представлял собой 1% сульфаниламид, 0,1% дигидрохлорид N-(1-нафтил)этилендиамина. Коротко, 50 мкл порции удаляли из различных супернатантов четырех дубликатов и инкубировали с 150 мл реагента Griess. Поглощение при длине волны 540 нм определяли в мультисканирующей установке (Labsystems Multiskans MCC/340). Нитрат натрия в определенных концентрациях использовали для получения стандартных кривых. Поглощение среды, не содержащей клеток (пустой), вычитали из значения, полученного при исследовании супернатанта, содержащего клетки.
Фиг.53 иллюстрирует эффект брадикинина на выработку NO из HUVEC, где отслеживается дозо-зависимое высвобождение NO. Ингибитор L-NAME полностью замедлял индуцированное брадикинином высвобождение NO.
Фиг.54 иллюстрирует эффект фракций процианидинов какао на выработку NO клетками HUVEC.
Фракции В, С и D вызвали выработку умеренного, но значимого количества NO в HUVEC. Более того, фракция С наиболее эффективно индуцировала выработку NO, как было оценено с помощью нитритов, в то время как фракция Е была почти неэффективна. Действие фракции С на выработку NO было резко уменьшено в присутствии L-NAME. Интересно отметить, что фракции В, С и D содержали большее количество олигомеров процианидинов, чем фракции А и Е. Определенная разница между фракциями D и Е состояла в том, что Е была приготовлена из темного шоколада, в котором, как часть рецепта, использовали алкализованную жидкую какао-массу. Подщелачивание приводит к катализируемой основанием полимеризации процианидинов, которая быстро истощает уровни этих соединений. Аналитическое сравнение уровней процианидинов, обнаруженных в этих типах шоколада, представлено в таблице 12, где марка 12 представляет темный шоколад, приготовленный с алкализованной жидкой какао-массой, а марка 11 представляет обычный молочный шоколад. Таким образом, экстракты, полученные из молочного шоколада, содержат высокие соотношения олигомеров процианидинов, которые способны к индуцированию NO. Добавление NO-ингибитора L-NMMA к образцу фракции С очевидно приводило к ингибированию NO. Результаты, полученные при исследовании фракций процианидина, были совместимы с теми, которые наблюдались в экспериментах с индуцированием NO брадикинином (см. фиг.53).
Как в случае результатов с HUVEC, фракция С процианидинов какао проявляла наибольший гипотензивный эффект на морских свинках, в то время как фракции А и Е были наименее эффективны. И на этот раз присутствие высокомолекулярных олигомеров процианидина было вовлечено в модуляцию выработки NO.
ПРИМЕР 33
Эффект фракций процианидинов какао на выработку NO макрофагами
6
Свежую гепаринизированную кровь человека (70 мл) добавляли к равному объему забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) при комнатной температуре. Раствор Ficoll-Hypaque наслаивали под смесью кровь-PBS, используя разведение в соотношении 3 мл Ficoll-Hypaque к 10 мл смеси кровь-PBS. Пробирки центрифугировали в течение 30 минут при 2000 оборотов в минуту при 18-20°С. Верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, отбрасывали. Слой мононуклеарных клеток переносили в другую центрифужную пробирку и клетки промывали дважды в сбалансированном физиологическом растворе Хенкса. Мононуклеарные клетки повторно суспендировали в полном RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, обсчитывали и определяли жизнеспособность методом исключения с трипановым синим. Клеточный гранулят повторно суспендировали в полном RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка до конечной концентрации 1x10 клетки/мл. Определенные количества клеточной суспензии помещали в 96-луночный планшет с культурой, трижды промывали RPMI 1640 с 10% фетальной сывороткой теленка и неприклеенные клетки (лимфоциты) удаляли.
Эти клетки инкубировали в течение 48 часов в присутствии или отсутствие пяти фракций процианидина, описанных в примере 31. В конце инкубационного периода культуральную среду собирали, центрифугировали и свободные от клеток супернатанты хранили замороженными для определения нитратов.
Выработку NO макрофагами определяли путем измерения концентрации нитритов с помощью реакции Greiss. Greiss реагент представлял собой 1% сульфаниламид, 0,1% дигидрохлорид N-(1-нафтил)этилендиамина. Коротко, 50 мкл аликвоты удаляли из супернатанта в четырех дубликатах и инкубировали с 150 мкл реагента Greiss. Поглощение при 540 нм определяли на мультисканирующей установке (Labsystem Multiskans MCC/340). Нитрат натрия использовали в определенных концентрациях для определения стандартных кривых. Поглощение среды, не содержащей клеток (пустой контроль), вычитали из значения, полученного при исследовании супернатанта, содержащего клетки.
В отдельном эксперименте макрофаги праймировали в течение 12 часов в присутствии 5 ед/мл гамма-интерферона и затем стимулировали 10 мкг/мл LPS в течение последующих 36 часов в присутствии или отсутствие 100 мкг/мл пяти фракций процианидина.
5
Фиг.55 показывает, что только процианидиновая фракция С при 100 мкг/мл может стимулировать выработку NO моноцитами/макрофагами. Исходная выработка NO этими клетками не поддавалась определению, и нитриты не могли быть обнаружены в какой-либо из фракций процианидина при 100 мкг/мл. Фиг.56 показывает, что процианидиновые фракции А и D не увеличили LPS-индуцированную выработку NO моноцитами/макрофагами, праймированными гамма-интерфероном. Процианидиновая фракция С была незначительно эффективна, когда LPS-стимулированные моноциты/макрофаги, культивированные в отсутствие фракций процианидина, вырабатывали только 4 мкмолей/10 клеток/за 48 часов. Гамма-интерферон сам по себе был неэффективен в стимулировании NO.
Все вместе эти результаты демонстрируют, что смеси соединений по изобретению, используемые в определенных концентрациях, способны к индуцированию выработки NO моноцитами/макрофагами как зависимо, так и независимо от стимуляции LPS или цитокинами.
Из вышесказанного ясно, что экстракты и полифенолы какао, особенно соединения изобретения, так же как и композиции, способы и наборы по изобретению обладают существенными и многочисленными сферами применения.
Противоопухолевая полезность ясно демонстрируется данными, полученными in vivo и in vitro и показывает, что соединения изобретения могут использоваться вместо или вместе с обычными антибластомными агентами.
Соединения по изобретению обладают антиоксидантной активностью, подобной активности ВНТ и ВНА, так же как и окислительной стабильностью. Таким образом, изобретение может применяться вместо или вместе с ВНТ или ВНА в случаях известных применений ВНА и ВНТ, таких как антиоксиданты, например, в качестве антиоксидантов, пищевых добавок.
Изобретение может также найти применение вместо или вместе с ингибиторами топоизомеразы II, в случаях ее известного в настоящее время применения.
Соединения по изобретению могут быть использованы в приготовлении или консервировании пищи, так же как и в предупреждении заболеваний бактериального происхождения. Проще говоря, соединения по изобретению могут использоваться как антимикробные агенты.
Соединения по изобретению также могут использоваться как модуляторы циклооксигеназы и/или липоксигеназы, NO или NO-синтазы, глюкозы в крови или in vivo и, таким образом, являются пригодными в лечении или предупреждении или модулировании боли, лихорадки, воспалений, расстройств коронарного кровообращения, язвообразования, механизмов карциногенеза, вазодилатации, так же как и в качестве анальгезирующих, антикоагулирующих, противовоспалительных агентов и модуляторов иммунного ответа.
Кроме того, соединение включает использование соединений или экстрактов в качестве носителей для приготовления фармацевтических препаратов. Соответственно, существует много композиций и способов, представленных изобретением. Например, антиоксидантные и консервирующие составы; композиции, ингибирующие топоизомеразу II; способы консервирования пищевых продуктов или любых желаемых объектов, например, от окисления и способы ингибирования топоизомеразы II. Композиции могут содержать соединения изобретения. Способы могут включать контакт пищи, других объектов или топоизомеразы II с ожидаемой композицией или с соединениями изобретения. Другие композиции, способы и воплощения изобретения будут очевидны из последующего изложения.
С этой точки зрения можно отметить, что изобретение имеет съедобный источник и что активность in vitro может показывать по меньшей мере некоторую часть активности, проявленной in vivo; исходя из представленных здесь данных экспериментов in vitro и in vivo, дозы пути введения и готовые препаративные формы могут быть определены без излишнего экспериментирования.
ПРИМЕР 34
Мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография процианидинов какао
Был разработан быстрый способ определения олигомеров процианидинов с использованием мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии (МЕСС). Данный способ является модификацией метода, описанного Delgado et al., 1994. При использовании МЕСС-метода требуется только 12 минут для получения такого же разделения, какое получают за 70 минут при анализе с помощью ВЭЖХ с нормальной фазой. Фиг.57 представляет МЕСС-разделение процианидинов какао, полученных в примере 2.
Условия проведения МЕСС
Экстракт процианидинов какао подготовляли способом, описанным в примере 2, и растворяли с получением концентрации 1 мг/мл в МЕСС-буфере, содержащем 200 мМ борной кислоты, 50 мМ додецилсульфата натрия (электрофоретически чистый) и NaOH, доводящий рН до 8,5.
Образец пропускали через 0,45 мкм фильтр и подвергали электрофорезу с использованием системы Hewlett Packard HP-3D CZE, работающей в следующих условиях:
Вводимый буфер: рабочий буфер, как описано выше.
Выводимый буфер: рабочий буфер, как описано выше.
Капилляры с внутренним диаметром 50 см х 75 мкм из плавленого кварца без покрытия.
Детектирование: 200 нм, с диодным матричным детектором.
Введение: 50 мбар в течение 3 секунд (150 мбар/сек).
Напряжение: 6 ватт.
Сила тока: предел системы (<300 мкА).
Температура: 25°С.
Капиллярные условия: 5 минут быстрого прогрева до и после каждого разделения.Этот метод может быть изменен при профилировании температуры, давления и параметров напряжения, также как и включением органических модификаторов и хирально-селективных агентов в рабочем буфере.
ПРИМЕР 35
MALDI-TOF/MS-анализ олигомеров процианидинов с растворами солей металлов
Ряд MALDI-TOF/MS-исследований проводили на тримерах, объединенных с различными растворами солей металлов, для определения возможности обнаружения аддуктов катиона олигомера. Значение эксперимента заключалось в доказательстве того, что олигомеры процианидинов имеют физиологическое значение в секвестировании in vitro и in vivo или в доставке катионов металлов, имеющих важное значение в развитии физиологических процессов и болезненных состояний.
Этот метод использовали так, как описано в примере 15. Коротко, 2 мкл 10 мМ растворов дигидросульфата цинка, хлорида кальция, сульфата магния, гексагидрата хлорида железа, гептагидрата сульфата железа и сульфата меди каждый по отдельности объединяли с 4 мкл тримера (10 мг/мл), очищенного до очевидной однородности, как описано в примере 14, и добавляли 44 мкл DHB.
+
+
+
+2
+
Результаты (фиг.58А-F) показали [металл-тример+Н] ионы для меди и железа (двух- и трехвалентного железа), чьи значения m/z соответствовали ±l amu среднеквадратичное отклонение для теоретических расчетных масс. [Металл-тример+Н] массы для кальция и магния не могут быть однозначно определены, исходя из [металл-тример+Н] массы для натрия и калия, чьи значения m/z не выходили за рамки ±1 amu значения среднеквадратичного отклонения. [Zn-тример+Н] ион не мог быть обнаружен. Так как несколько этих катионов являются многовалентными, возможно образование разновидности лигандов металл-олигомер и/или металл-мультиолигомер. Однако сканирование для этих аддуктов при их предсказанных массах было неудачным.
Результаты, показанные выше для меди, железа, кальция, магния и цинка, можно использовать как общие инструкции для последующего анализа реакции между другими ионами металлов и соединениями изобретения, принимая во внимание такие факты, как состояние окисления и относительное положение обсуждаемого иона в Периодической таблице.
ПРИМЕР 36
MALDI-TOF/MS-анализ высокомолекулярных олигомеров процианидинов
Аналитическую экспертизу осуществляли на GPC элюентах, связанных с процианидинами с высокой молекулярной массой, приготовленными, как описано в примере 3, метод А. Ее цель состояла в том, чтобы определить, были ли представлены олигомеры процианидинов с n>12. Если представлены, тогда эти олигомеры представляют собой дополнительные соединения изобретения. Регулирование существующих способов выделения, разделения и очистки, воплощенных в изобретении, может быть осуществлено для получения этих олигомеров с целью их последующей оценки in vitro и in vivo на противораковую, противоопухолевую или антинеопластическую активность, антиоксидантную активность, ингибирование ферментативной активности ДНК-топоизомеразы II, на ингибирование окислительного повреждения ДНК, на наличие антимикробной активности и активности как модуляторов NO или NO-синтазы, апоптоза, агрегации тромбоцитов, глюкозы в крови или in vivo, а также на эффективность в качестве нестероидных противовоспалительных агентов.
+
+
+
Фиг.59 представляет MALDI-TOF масс-спектр образца GPC-элюента, описанного выше. Совершенно очевидно, что [M+Na] и/или [М+К] и/или [M+2Na] ионы характеризуют олигомеры процианидинов от тетрамеров до октадекамеров.
Определено, что кислотная и термообработка вызывает гидролиз олигомеров процианидинов. Следовательно, изобретение включает управляемый гидролиз олигомеров процианидинов высокой молекулярной массы (например, где n равно 13-18), в качестве способа получения олигомеров процианидинов с более низкой молекулярной массой (например, где n равно 2-12).
ПРИМЕР 37
Зависимость доза-ответ между олигомерами процианидинов и собачьими и кошачьими клеточными линиями
Оценивали зависимость доза-ответ олигомеров процианидинов против нескольких собачьих и кошачьих клеточных линий, полученных от Центра питания домашних животных Waltham, Waltham on-the-Wolds, Melton Mowbray, Leicestershire, Великобритания. Эти клеточные линии представляли собой
нормальную собачью клеточную линию почки GH;
нормальную собачью клеточную линию почки MDCK;
нормальную кошачью клеточную линию почки CRFK и
кошачью лимфобластную клеточную линию FeA, производящую вирус лейкоза, которые культивировали в условиях, описанных в примере 8, метод А.
Мономеры и олигомеры процианидинов, где n равно 2-10, очищали, как описано в примере 14, метод D. Олигомеры также исследовали с помощью аналитической ВЭЖХ с нормальной фазой, как описано в примере 14, метод С, причем получали следующие результаты:
Процианидины
% чистоты после ВЭЖХ
Мономеры
95,4
Димеры
98,0
Триммеры
92,6
Тетрамеры
92,6
Пентамеры
93,2
Гексамеры
89,2 (содержат 4,4% пентамеров)
Гептамеры
78,8 (содержат 18,0% гексамеров)
Октамеры
76,3 (содержат 16,4% гептамеров)
Нонамеры
60,3 (содержат 27,6% октамеров)
Декамеры
39,8 (содержит 22,2% нонамеров,16,5% октамеров и 13,6% гептамеров)
В таких случаях, когда чистота олигомеров составляет <90%, методы, воплощенные в изобретении, используются для их повторной очистки.
Каждую клеточную линию соединяли с мономерами и каждым из олигомеров процианидинов в дозах 10 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл, и результаты показаны на фиг.60-63. Как видно на фигурах, при применении высоких доз (100 мкг/мл) отдельных олигомеров получен одинаковый подавляющий эффект на кошачью лимфобластную клеточную линию FeA и на кошачью клеточную линию нормальной почки CRFK. В этих случаях цитотоксичность проявилась с тетрамером, и более высшие олигомеры демонстрировали все более и более высокие цитотоксические результаты. По контрасту, при воздействии высоких доз (100 мкг/мл) отдельных олигомеров на собачьи клеточные линии нормальной почки GH и MDCK для проявления цитотоксичности требовались более высшие олигомеры. На собачьей клеточной линии нормальной почки GH цитотоксичность появилась при применении пентамера. На собачьей клеточной линии нормальной почки MDCK цитотоксичность появилась при применении гексамера. В обоих из этих случаев применение более высших олигомеров вызывало увеличение уровня цитотоксичности.
ПРИМЕР 38
Таблетированные готовые препаративные формы
Таблетированную готовую препаративную форму готовили с использованием твердого какао, полученного методами, описанными в заявке США серийный номер 08/709406, поданной 6 сентября 1996, включенной в данное описание в виде ссылки. Кратко, этот съедобный материал приготавливали с помощью процесса, который увеличивает естественное содержание соединения по изобретению по сравнению с их уровнем в какао, полученном традиционным методом, так что отношение начального количества соединений изобретения, находящихся в необработанных бобах, к их содержанию после приготовления составляет меньше 2 или равно 2. Для простоты, материал сухого вещества какао называется здесь как твердое вещество СР-какао. Соединение или соединения по изобретению, например, в изолированной и/или очищенной форме могут использоваться в таблетках, как описано в примере, вместо или в сочетании с твердым веществом СР-какао.
Таблетированная готовая препаративная форма включает следующие составляющие (выраженные в процентах по массе):
Твердое вещество СР-какао
24,0%
4-кратный натуральный ванильный экстракт (Bush Boake Allen)
1,5
Стеарат магия (сухой смазочный материал) (AerChem, Inc.)
0,5%
Таблетированный сахар Dipac (сахарная корпорация Amstar)
37,0%
Ксилит (American Xyrofin, Inc.)
37,0%
100,0%
Твердое вещество СР-какао и ванильный экстракт смешивают вместе в пищевом комбайне в течение 2 минут. Сахар и стеарат магния осторожно перемешивают с последующим соединением со смесью сухого вещества СР-какао/ванилин. Материал пропускают через таблетирующий пресс (ВЗВ) при максимальном давлении и уплотнении для получения круглых таблеток (15 мм х 5 мм) с массой 1,5-1,8 грамм. Другой вид таблеток с вышеприведенным составом готовят с использованием коммерчески доступного натурального порошка какао с низкой жирностью (11% жиров) вместо твердого вещества СР-какао (11% жиров). Оба вида таблеток получают с соответствующими ароматическими характеристиками и свойствами текстуры.
Анализ двух таблетированных препаративных форм проводили с использованием методики, описанной в примере 4, метод 2. В этом случае анализы, сосредоточенные на концентрации пентамера и общем уровне мономеров и соединений по изобретению, где n равно 2-12, представлены ниже.
Образец таблетки
Пентамер (мкг/г)
ОбщееКол-во
Пентамер (мкг/1,8 г сохранения)
Общее кол-во (мкг/1,8 г сохранения)
Таблетки с твердым веществомСР-какао
239
8277
430
14989
Таблетки с коммерческим порошком какао с низкой жирностью
не определено
868
не определено
1563
Эти данные продемонстрировали большее содержание пентамеров и общее количество соединений по изобретению в таблетках, приготовленных на основе твердого СР-какао, по сравнению с другими таблетированными формами. Таким образом, таблетированные формы, приготовленные с твердым веществом СР-какао, представляют идеальное средство для доставки соединения по изобретению оральным путем при фармацевтическом применении в качестве пищевых добавок и при использовании в пищу.
Квалифицированный специалист в данной области может легко приготовить другие таблетированные формы, включающие широкий спектр ароматизаторов, красителей, эксципиентов, витаминов, минералов, ОТС-медикаментов, сахарных наполнителей, агентов, защищающих от УФ-облучения (например, диоксид титана, красители и т.д.), связывающих веществ, гидрогелей и подобных, за исключением поливинилпирролидона, который бы необратимо связывал соединения по изобретению или их комбинации. Количество сахарных наполнителей можно регулировать, что позволяет изменять дозировки соединений по изобретению или их комбинации.
Самоочевидно множество возможных вариаций приведенного выше, не отходя от сущности и объема данного примера.
ПРИМЕР 39
Капсулированная готовая препаративная форма
Вариантом примера 38 для орального применения соединений изобретения является форма разъемных капсул, сделанных из желатина, так же как мягких герметично запечатанных капсул, сделанных из желатина и пластификатора типа глицерина. Разъемные капсулы содержат соединение по изобретению или комбинацию соединений, или твердое вещество СР-какао, как описано в примерах 38 и 40, в форме порошка, который может быть необязательно смешан с наполнителями типа лактозы или сахарозы, что позволяет менять дозировки соединений изобретения. В мягких капсулах соединения по изобретению или комбинация соединений, или твердое вещество СР-какао находятся в подходящей жидкости типа жирных масел или масла какао или их комбинаций. Так как соединение или соединения по изобретению могут быть очень чувствительны, например чувствительны к УФ-облучению, капсула может содержать агенты, защищающие от УФ-облучения, типа диоксида титана или подходящих красителей. Капсулы могут также содержать наполнители, приведенные в предыдущем примере. Самоочевидно множество возможных вариаций изложенного выше, не отходя от сущности и объема данного примера.
ПРИМЕР 40
Готовые препаративные формы в виде входящего (SOI) и не входящего(non-SOI) в Стандарт идентичности темного и молочного шоколада
Готовые препаративные формы соединений изобретения или комбинаций соединений, полученных способами, воплощенными в изобретении, могут быть в SOI или non-SOI форме темного и молочного шоколада, представляя собой средство для доставки соединения человеку и животным. Делается ссылка на находящуюся на рассмотрении заявку США серийный номер 08/709406, поданную 6 сентября 1996, включенную в данное описание путем ссылки. Заявка США 08/709406 касается метода получения масла какао и/или твердого вещества какао с сохранением уровня соединений изобретения как в какао-бобах, в котором используется уникальная комбинация этапов приготовления. Коротко, съедобное твердое вещество какао, полученное этим методом, сохраняет природное содержание соединений изобретения в отличие от тех уровней, которые сохраняются в традиционно обрабатываемом какао, а именно отношение начального количества соединений изобретения в необработанных бобах к полученному после изготовления составляет менее двух или равно 2. Для простоты этот материал твердого вещества какао обозначен здесь как твердое вещество СР-какао. Твердое вещество СР-какао используют как порошок или жидкость для приготовления SOI или non-SOI шоколада, напитков, закусок, выпечки и ингредиентов кулинарного назначения.Термин "SOI-шоколад" при использовании здесь обозначает любой шоколад, использующийся в Соединенных Штатах в качестве продовольственного продукта, который подчиняется Стандарту идентичности, установленному Управлением США по применению продовольственных товаров и лекарственных средств, в соответствии с Федеральным актом по продовольствию, лекарственным и косметическим средствам. Определения и стандарты для различных типов шоколада хорошо установлены. Термин "шоколад non-SOI" при использовании здесь обозначает любые нестандартизированные виды шоколада, которые содержат композиции, выходящие за пределы диапазонов, указанных для стандартизированного шоколада.
Примеры нестандартизированных видов шоколада получаются, когда масло какао или молочный жир заменены частично или полностью или когда подслащивающее вещество в виде углеводов с высокой пищевой ценностью заменено частично или полностью, или в случае добавления ароматизаторов, имитирующих молоко, масло, порошок какао или шоколад, или в случае других дополнений или исключений из рецепта, выходящих за рамки Федерального стандарта идентичности для шоколада или его различных видов.
Как кондитерское изделие шоколад может быть в форме твердого кускового шоколада, например в форме плиток или новых форм, и также может в качестве компонента входить в состав других, более сложных кондитерских изделий, где шоколад необязательно сочетается с любыми веществами Ассоциации, производящей ароматизаторы и экстракты, с натуральными соками, специями, травами и экстрактами, входящими в категорию натуральных ароматизирующих веществ, с веществами, идентичными натуральным, с искусственными ароматизаторами, определенными в списке FEMA GRASS, FEMA&FDA, в списке Европейского совета (СоЕ), Международной организацией производства пищевых добавок (IOFI), принимающих FAO/WHO программу пищевых стандартов, пищевой кодекс и кодекс пищевых веществ, а также с другими пищевыми продуктами, такими как карамель, нуга, фруктовые дольки, орехи, вода и подобные. Эти пищевые продукты обладают микробиологической стабильностью при 65-85°F (18-28°С) в нормальных атмосферных условиях. Другие сложные кондитерские изделия получают заливкой размягченным шоколадом различных включений, таких как "пьяные вишни" или ореховое масло. Другие сложные кондитерские изделия получают из покрытого шоколадом мороженого или других охлажденных или замороженных десертов. В целом можно сказать, что шоколад, использующийся для покрытия или заливки продуктов, должен быть более жидким, чем шоколад для производства плиточного твердого шоколада или новых его форм.
Кроме того, шоколад может также представлять собой шоколад с низкой жирностью, содержащий жиры и нежирные твердые вещества, имеющий подслащивающие вещества в виде углеводов с высокой пищевой ценностью и съедобные эмульгаторы. По поводу шоколада с пониженной жирностью делается ссылка на Патент США № 4810516, 4701337, 5464649, 5474795 и WO 99/19923.
Темный шоколад получает свой темный цвет благодаря определенному количеству жидкой какао-массы или алкализованной жидкой какао-массе, или твердому какао, или алкализованному твердому какао, использующимся в любой готовой препаративной форме. Однако использование алкализованного сухого вещества какао или жидкой какао-массы не применялось бы в препаративных формах темного шоколада в данном изобретении, так как пример 27, таблица 13, показывает, что из-за процесса подщелачивания происходит потеря соединения изобретения.
Примеры готовых препаративных форм SOI и non-SOI темного и молочного шоколада перечислены в таблицах 16 и 17. В этих препаративных формах количество соединений изобретения, представленных в твердом веществе СР-какао, сравнивали с соединениями изобретения, представленными в коммерчески доступном твердом веществе какао.
Следующее описание представляет этапы приготовления данных готовых препаративных форм шоколада.
Процесс приготовления non-SOI темного шоколада
1. Хранить все лопастные и роторные мешалки закрытыми в течение всего процесса, чтобы избежать попадания света.
2. Загрузить партии всех ингредиентов за исключением 40% свободного жира (масло какао и сухой молочный жир), поддерживая температуру 30-35°С.
3. Измельчить до 20 микрон.
4. Сухое конширование в течение 1 часа при 35°С.
5. Прибавить весь лецитин и 10% масла какао в начале цикла влажного конширования; влажное конширование в течение 1 часа.
6. Прибавить весь оставшийся жир, стандартизировать в случае необходимости и перемешивать 1 час при 35°С.
7. Темперировать, формовать и упаковать шоколад.
Процесс приготовления SOI темного шоколада
1. Загрузить партии ингредиентов, за исключением молочного жира при температуре 60°С.
2. Измельчить до 20 микрон.
3. Сухое конширование в течение 3,5 часов при 60°С.
4. Прибавить лецитин и молочный жир и провести влажное конширование в течение 1 часа при 60°С.
5. Стандартизировать в случае необходимости и перемешивать в течение часа при 35°С. Темперировать, формовать и упаковать шоколад.
Процесс приготовления non-SOI шоколада
1. Хранить все лопастные и роторные мешалки закрытыми в течение всего процесса, чтобы избежать попадания света.
2. Загрузить сахар, цельный молочный порошок, солодовый молочный порошок и 66% масла какао, коншировать в течение 2 часов при 75°С.
3. Охладить партию до 35°С и прибавить порошок какао, этиловый ванилин, жидкую шоколадную массу и 21% масла какао, перемешивать 20 минут при 35°С.
4. Измельчить до 20 микрон.
5. Прибавить остаток масла какао, провести сухое конширование в течение 1,5 часов при 35°С.
6. Прибавить сухой молочный жир и лецитин, провести влажное конширование в течение часа при 35°С.
7. Стандартизировать, темперировать, формовать и упаковать шоколад.
Процесс получения молочного шоколада SOI
1. Загрузить партии всех ингредиентов за исключением 65% масла какао и молочного жира при температуре 60°С.
2. Измельчить до 20 микрон.
3. Провести сухое конширование в течение 3,5 часов при 60°С.
4. Прибавить лецитин, 10% масла какао и сухой молочный жир; провести влажное конширование в течение 1 часа при 60°С.
5. Прибавить остальное масло какао, стандартизировать в случае необходимости и перемешивать в течение 1 часа при 35°С.
6. Темперировать, формовать и упаковать шоколад.
Твердое вещество СР-какао и коммерческие жидкие шоколадные массы, используемые в готовых препаративных формах, анализировали для определения пентамеров и общего уровня мономеров и соединений изобретения, в которых n равно 2-12, как описано в методе 2 примера 4, до их включения в готовые препаративные формы. Эти значения затем использовали для вычисления ожидаемых уровней в каждом рецепте шоколада, как показано в таблицах 16 и 17. В случаях non-SOI темного шоколада и non-SOI молочного шоколада изделия из них таким же образом анализировали для определения пентамеров и общего уровня мономеров и соединений изобретения, где n равно 2-12. Результаты представлены в таблицах 16 и 17.
Результаты проводимых в этих примерах исследований готовых препаративных форм показывают, что SOI и non-SOI темный и молочный шоколад, приготовленный на основе твердого вещества СР-какао, содержит приблизительно в 6,5 раз больше пентамеров и в 3,5 раза больше общего количества мономеров и соединений изобретения, чем ожидалось в SOI и non-SOI темном шоколаде; приблизительно в 4,5; 7,0 раз более ожидаемого количества пентамеров и в 2,5; 3,5 раза более ожидаемого общего количества в SOI и non-SOI молочном шоколаде соответственно.
Исследования некоторых изделий из шоколада не были проведены, так как разность между ожидаемыми уровнями соединений изобретения в готовых шоколадных продуктах, подготовленных с твердым веществом СР-какао, была существенно выше, чем в приготовленных по тем же рецептам, но с имеющимся в продаже сухим какао. Однако результаты приготовления оценивали для изделий из non-SOI темного молочного шоколада. Как показано в таблицах, происходит 25-50% потеря пентамеров, в то время как наблюдаются лишь небольшие расхождения в общих уровнях. Не желая связывать это с какой-либо теорией, полагаем, что эти потери происходят из-за нагревания и/или благодаря низкоцепочечным жирным кислотам, входящим в состав молока (например, уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота), которые могут приводить к гидролизу олигомеров (например, тримеры могут гидролизоваться до мономеров и димеров). Альтернативно длительный поэтапный процесс изготовления может сохранить окислительное или необратимое связывание соединений изобретения с источниками белка в рамках данного рецепта. Таким образом, изобретение включает в себя альтернативные способы приготовления готовых препаративных форм шоколада и процессы, позволяющие предупредить или минимизировать эти потери.
Для квалифицированного специалиста понятны возможные многочисленные вариации этих примеров, позволяющие охватить широкий диапазон рецептов, ингредиентов, способов приготовления и смесей для того, чтобы рационально регулировать естественные уровни соединений изобретения для различных применений шоколада.
Таблица 16Готовая препаративная форма темного шоколада, приготовленная с неалкализованными игредиентами какао
non-SOI темный шоколад на основе твердого вещества СР-какао
SOI темный шоколад на основе твердого вещества СР-какао
SOI темный шоколад на основе коммерческого сухого какао
Готовая препаративная форма
Готовая препаративная форма
Готовая препаративная форма
41,49% сахара
41,49% сахара
41,49% сахара
3% цельного сухого молока
3% цельного сухого молока
3% цельного сухого молока
26% твердого СР-какао
52,65% СР-жидкого
52,65% коммерч. жидкого
4,5% коммерч. жидкого
2,35% сухого молочн. жира
2,35 сухого молочного жира
21,75% масла какао
0,01% ванилина
0,01% ванилина
2,75% сухого молочного жира
0,5% лецитина
0,5% лецитина
0,01% ванилина
0,5% лецитина
Общая жирность: 31%
Общая жирность: 31%
Общая жирность: 31%
Размер частиц: 20 микрон
Размер частиц: 20 микрон
Размер частиц: 20 микрон
Ожидаемые уровни пентамеров и общий уровень олигомерных процианидинов (мономеры и олигомеры с n=2-12; в мкг/г)
Пентамер: 1205
Пентамер: 1300
Пентамер: 185
Общее: 13748
Общее: 14646
Общее: 3948
Действительные уровни пентамеров и всех олигомерных процианидинов (мономеры и олигомеры с n=2-12, в мкг/г)
Пентамеры: 561 Общее: 14097
Не проводилось
Не проводилось
Таблица 17Готовая препаративная форма молочного шоколада, приготовленная с неподщелаченными ингредиентами какао
non-SOI темный шоколад на основе твердого вещества СР-какао
SOI темный шоколад на основе твердого вещества СР-какао
SOI темный шоколад на основе коммерческого сухого какао
Готовая препаративная форма
Готовая препаративная форма
Готовая препаративная форма
46,99,65 сахара
46,99,65 сахара
46,99,65 сахара
15,5% цельного сухого молока
15,5% цельного сухого молока
15,5% цельного сухого молока
4,5 твердого СР-какао
13,9% СР-жидкого
13,9% комерч. жидкого
5,5% коммерч. жидкого
1,6% сухого молочного жира
1,6% сухого молочного жира
24,4% масла какао
0,035% ванилина
0,0035% ванилина
1,6% сухого молочного жира
0,5% лецитина
0,5% лецитина
0,035% ванилина
17,5% масла какао
17,5% масла какао
0,5% лецитина
4,0% солод. сухого молока
4,0% солод. сухого молока
4,0% солодового сухого молока
Общая жирность: 31,75%
Общая жирность: 31,75%
Общая жирность: 31,75%
Размер частиц: 20 микрон
Размер частиц: 20 микрон
Размер частиц: 20 микрон
Ожидаемые уровни пентамеров и общий уровень олигомерных процианидинов (мономеры и олигомеры с n=2-12; в мкг/г)
Пентамер: 225 Общее: 2734
Пентамер: 343Общее: 3867
Пентамер: 49Общее: 1042
Действительные уровни пентамеров и всех олигомерных процианидинов (мономеры и олигомеры с n=2-12, в мкг/г)
Пентамеры: 163 Общее: 2399
Не проводилось
Не проводилось
ПРИМЕР 41
Гидролиз олигомеров процианидинов
Пример 14, метод D, описывает проведение ВЭЖХ с нормальной фазой, проводимой с целью очистки соединений изобретения. Олигомеры получали в виде фракций, растворенных в подвижной фазе. Растворитель затем удаляли с помощью стандартной вакуумной дистилляции (20-29 дюйма Hg, 40°С) на роторном испарителе. Наблюдалось, что потери определенных олигомеров увеличивались с уменьшением величины олигомера, с увеличением времени пребывания в вакуумном дистилляторе или при применении температуры >40°С.
Потери определенных олигомеров, связанные с уменьшением величины олигомера, были приписаны фактору время-температура кислотного гидролиза остаточной уксусной кислотой, присутствующей в растворе подвижной фазы. Это наблюдение было подтверждено следующим экспериментом, в котором 100 мг гексамера растворяли в 50 мл подвижной фазы, содержащей метиленхлорид, уксусную кислоту, воду и метанол (см. пример 14, метод D, для пропорций растворителя) и подвергали воздействию температура/времязависимой дистилляции. В определенные моменты времени забирали определенные порции для проведения аналитической ВЭЖХ с нормальной фазой, как описано в примере 4, метод 2. Результаты проиллюстрированы на фиг.64 и 65, где уровни гексамеров уменьшались в зависимости от увеличения температуры/времени.
Фиг.65 поясняет появление одного из продуктов гидролиза (тримера) в зависимости от температуры/времени. Мономер и другие олигомеры (от димера до пентамера) также демонстрировали зависимость от температуры/времени.
Эти результаты указывали, что следует проявлять чрезвычайную осторожность и принимать меры предосторожности во время работы с полимерными соединениями изобретения.
Результаты, представленные выше, вместе с результатами, полученные в примерах 5, 15, 18, 19, 20 и 29, показывают, что метод, описанный выше, может использоваться для дополнения других методов, воплощенных в изобретении, с целью идентификации любого данного олигомера изобретения.
Например, полный гидролиз любого из приведенных олигомеров, который дает исключительно (+)-катехин или (-)-эпикатехин, исключает возможность получения структуры олигомера на основе "смешанных мономеров" и снижает возможность стереохимических связей, которые являются характерными для каждого мономера, составляющего любой из вышеуказанных олигомеров.
Далее, полный гидролиз любого данного олигомера, который дает как (+)-катехин, так и (-)-эпикатехин в определенных соотношениях, обеспечивает специалиста информацией о мономерном составе данного олигомера и, следовательно, дает стереохимическую характеристику возможных связей для каждого включенного в олигомер мономера.
3
Для квалифицированного специалиста понятно, что может происходить катализируемая кислотой эпимеризация отдельных мономеров и что должны быть предусмотрены соответствующие эксперименты для контроля и мягкие условия гидролиза (например, использование органических кислот, типа уксусной кислоты, вместо концентрированной HCl, HNO и т.д.).
Таким образом, хотя настоящее изобретение подробно описано в своих предпочтительных воплощениях, должно быть понято, что изобретение, определенное предложенной формулой изобретения, не должно быть ограничено конкретными, приведенными выше деталями, так как возможны их очевидные изменения не выходящие за рамки объема и существа представленного изобретения.
Источники информации
6
6
1. Barrows, L.R., Borchers, A.H., and Paxton, M.S., Transfectant CHO cells Expressing O-alkylguanine - DNA-alkyltransferase Display Increased Resistance to DNA Damage Other than О-guanine Alkylation, Carcinogenesis, 8:1853 (1987).
th
2. Boukharta, M., Jalbert, G. and Castonquay, A., Efficacy of Ellagitannins and Ellagic Acid as Cancer Chemopreventive Agents - Presented at the XVI International Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992.
3. Burres, N.S., Sazesh, J., Gunawardana, G.P., and Clement, J.J., Antitumor Activity and Nucleic Acid Binding Properties of Dercitin, a New Acridine Alkaloid Isolated from a Marine Dercitus species Sponge, Cancer Research, 49, 5267-5274 (1989).
4. Caragay, А.В., Cancer Preventive Foods and Ingredients, Food Technology, 46:4, 5-9 (1992).
5. Chu, S.-C., Hsieh, Y.-S. and Lin, J.-Y., Inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity, J. of Natural Products, 55:2, 179-183 (1992).
th
6. Clapperton, J., Hammerstone, J.F. Jr., Ronanczyk, L.J. Jr., Chan, J., Yow, S., Lirn, D. and Lockwood, R., Polyphenols and Cocoa Flavor - Presented at the XVIInternational Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992.
7. Banks, M.K., Schmidt, C.A., Cirtain, M.C., Suttle, D.P., and Beck, W.T., Altered Catalytic Activity of and DNA Cleavage by DNA Topoisomerase II from Human Leukemic Cells Selected for Resistance to VM-26, Biochem., 27:8861 (1988).
8. Delcour, J.A., Ferreira, P. and Roux, D.G., Synthesis of Condensed Tannins, Part 9, the Condensation Sequence of Leucocyanidin with (+)-Catechin and with the Resultant Procyanidins, J.Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1711-1717 (1983).
9. Deschner, E.E., Ruperto, J., Wong, G. and Newmark, H.L., Quercetin and Rutin as Inhibitors of Azoxylnethanol - Induced Coionic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (1991).
10. Designing Foods, Manipulating Foods to Promote Health, Inform, 4:4, 344-369 (1993).
11. Drake, F.H., Hofmann, G.A., Mong., S.-M., Bartus, J.O., Hertzberg, R.P., Johnson, R.K., Mattern, M.R., and Mirabeili, C.K., in vitro and Intercellular Inhibition of Topoisomerase II by the Antitumor Agent Membranone, Cancer Research, 49, 2578-2583 (1989).
12. Engels J.M.M., Genetic Resources of Cacao: A Catalogue of the CATIE Collection, Tech. Bull. 7, Turrialba, Costa Rica (1981).
13. Enriquez G.A. and Soria J.V., Cocoa Cultivars Register II CA, Turrialba, Costa Rica (1967).
14. Ferreira, D., Steynberg, J.P., Roux, D.G. and Brandt, E.V., Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803 (1992).
15. Fesen, M. and Pommier, Y., Maminalian Topoisomerase II Activity is Modulated by the DNA Minor Groove Binder -Distainycin in Simian Virus 40 DNA, J. Biol. Chem., 264, 11354-11359 (1989).
16. Fry, D.W., Boritzki, T.J., Besserer, J.A., and Jackson, R.C., in vitro Strand Scission and Inhibition of Nucleic Acid Synthesis on L1210 Leukemia Cells by a New Class of DNA Complexes, the anthra [1,9-CD]pyrazol-6(2H)-ones (anthrapyrazoles), Biochem. Pharmacol., 34, 3499-3508 (1985).
17. Hsiang, Y.-H., Jiang, J.B., and Liu, L.F., Topoisomerase II Mediated DNA Cleavage by Amonafide and Ist Structural Analogs, Mol. Pharmacol., 36, 371-376 (1989).
18. Jalal, M.A.F and Collin, H.A., Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacoa, Phytochemistry, 6, 1377-1380 (1978).
19. Jeggo, P.A., Caldecott, K., Pidsley, S., and Banks, G.R., Sensitivity of Chinese Hamster Ovary Mutants Defective in DNA Double Strand Break Repair to Topoisomerase II Inhibitors, Cancer Res., 49:7057 (1989).
20. Kashiwada, Y., Nonaka, G.-I., Nishioka, I., Lee, K.J.-H., Bori, I., Pukushima, У., Bastow, K.F., and Lee, K.-H., Tannin as Potent Inhibitors of DNA Topoisomerase II in vitro. J. Pharm. Sci., 82:5, 487-492 (1993).
21. Kato, R., Nakadate, Т., Yamamoto, S. and Sugimura, Т., Inhibition of 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate Induced Tumor Promotion and Omithine Decarboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983).
22. Kawada, S.-Z., Yamashita, У., Fujii, N. and Nakano, H., Induction of Heat Stable Topoisomerase II-DNA Cleavable Complex by Nonintercalative Terpenoids, Terpentecin and Clerocidin, Cancer Research, 51, 2922-2929 (1991).
23. Kemp, L.M., Sedgwick, S.G. and Jeggo, P.A., X-ray Sensitive Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells Defective in Double Strand Break Rejoining, Mutat. Res., 132: 189 (1984).
24. Kikkoman Corporation, Antimutagenic Agent Containing Proanthocyanidin Oligomer Preferably Having Flavan-3-ol-Diol Structure, JP 04190774-A, July 7, 1992.
25. Lehrian, D.W.; Patterson, G.R. in Biotechnology; Reed, G., Ed.; Verlag Chemie: Weinheim, 1983, Vol. 5, Chapter 12.
r
26. Leonessa, F., Jacobson, M., Boyle, В., Lippman, J., McGarvey, M., and Clarke, R. Effect of Tamoxifen on the Multidrug-Resistant Phenotype in Human Breast Cancer Cells: Isobolograms, Drug Accumulation, and M 170,000 Glycoprotein (gp 170) Binding Studies, Cancer Research, 54, 441-447 (1994).
27. Liu, L.F., DNA Toposimerase Poisons as Antitumor Drugs, Ann. Rev. Biochem., 58, 351-375 (1989).
28. McCord, J.D. and Kilara A. Control of Enzymatic Browning in Processed Mushrooms (Agaricus bisporus). J. Food Sci., 48:1479 (1983).
29. Miller, K.G., Liu, L.F. and Englund, P.A., Homogeneous Type II DNA Topoisomerase from Hela Cell Nuclei, J. Biol. Chem., 256:9334 (1981).
30. Mosmann, Т., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytoxicity Assays, J. Inmunol. Methods, 65, 55 (1983).
31. Muller, M.T., Helal, K., Soisson, S. and Spitzer, J.R., A Rapid and Quantitative Microtiter Assay for Eukaryotic Topoisomerase II, Nuc. Acid Res., 17:9499 (1989).
32. Nawata, H., Chong, M.T., Bronzert, P. and Lippinan, M.E. Estradioi-independent growth of a Subline of MCF-7 Human Breast Cancer Ceils in Culture, J. Biol. Chem., 256:13, 6895-6902 (1981).
th
33. Okuda, Т., Yoshida, Т., and Hatano, Т., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols -Oligomeric Hydrolyzable Tannins and Others - Presented at the XVI International Conference of the Groupe Polyphenols, Lisbon, Portugal, July 13-16, 1992.
34. Phenolic Compounds in Foods and Their Effects on Health II. Antioxidants & Cancer Prevention, Huang, M.-Т., Ho, C.-T., and Lee, C.Y. editors, ACS Symposium Series 507, American Chemical Society, Washington, D.C. (1992).
35. Phenolic compounds in Foods and Their Effects on Health I, Analysis, Occurrence & Chemistry, Но, С.Т., Lee, C.Y., and Huang, M.-T editors, ACS Symposium Series 506, American Chemical Society, Washington, D.C. (1992).
36. Porter, L.J., Ma, Z. and Chan, B.G., Cocoa Procyanidins: Major Flavanoids and Identification of Some Minor Metabolites, Phytochemistry, 30, 1657-1663 (1991).
37. Revilla, E., Bourzeix, M. and Alonso, E., Analysis of Catechins and Procyanidins in Grape Seeds by HPLC with Photodiode Array Detection, Chromatographia, 31, 465-468 (1991).
38. Scudiero, P.A., Shoemaker, R.H., Pauli, K.D., Monks, A., Tierney, S., Nofziger, Т.Н., Currens, M.J., Seniff, D., and Boyd, M.R. Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines, Cancer Research, 48, 4827-4833 (1988).
39. Self, R., Eagles, J., Galletti, G.C., Mueller-Harvey, I., Hartley, R.D., Lee, A.G.H., Magnolato, D., Richli, U., Gujur, R. and Haslam, E., Fast Atom Bombardnent Mass Spectrometry of Polyphenols (syn. Vegetable Tannins), Biomed Environ. Mass Spec. 13, 449-468 (1986).
40. Tanabe, K., Ikegami, Y., Ishda, R. and Andoh, Т., Inhibition of Topoisomerase II by Antitumor Agents bis(2,6-dioxopiperazine) Derivatives, Cancer Research, 51, 4903-4908 (1991).
41. Van Oosten, C.W., Foot, C. and A.C. Hensen, The Precision of the Swift Stability Test, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 83:4, 133-135 (1981).
42. Wang, J.C., DNA Topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 54, 665-697 (1985).
43. Warters, R.L., Lyons, B.W., Li, T.M. and Chen, D.J., Topoisomerase II Activity in a DNA Double-Strand Break Repair Deficient Chinese Hanster Ovary Cell Line, Mutat. Res., 254:167 (1991).
44. Yamashita, Y., Kawada, S.-Z. and Nakano, H., Induction of Mammalian Topoismerase II Dependent DNA Cleavage by Nonintercalative Flavanoids, Genistein and Orbol., Biochem Pharm, 39:4, 737-744 (1990).
45. Yamashita, Y., Kawada, S.-Z., Fujii, N. and Nakano, H., Induction of Mammalian DNA Topoisomerase I and II Mediated DNA Cleavage by Saintopin, a New Antitumor Agent from Fungus, Biochem., 30, 5838-5845 (1991).
46. Feidman, P.L., Griffith, O.W., and Stuehr, D.J. The Surprising Life of Nitric Oxide, Chem. & Eng. News, Dec. 20, 1993, p. 26-38.
47. Jia, L., Bonaventura, C. and Stamler, J.S., S-Nitrosohaemoglobin: A Dynamic Activity of Blood Involved in Vascular Control, Nature, 380, 221-226 (1996).
48. Radomski, M.W., Palmer, R.M.J. and Moncada, S. Comparative Pharmacology of Endothelium Derived Relaxing Factor, Nitric Oxide and Prostacyclin in Platelets, Brit. J. Pharmacol, 92, 789-795 (1939).
49. Stamler, J.S., Mendelsohn, M.E., Amarante, P., Smick, D., Andon, N., Davies, P.F, Cooke, J.P., and Loscalzo, N-Acetylcysteine Potentiates Platelet Inhibitio By Edothelium -Derived Relaxing Factor, J. Circ. Research, 65, 789-795 (1989).
50. Bath, P.M.W., Hassail, P.G., Gladwin, A.M., Palmer, R.M.J. and Martin, J.F., Nitric Oxide and Prostacyclin. Divergence of Inhibitory Effects on Monocyte Chemotaxis and Adhesion to endothelimn In Vitro. Arteriosci. Throm., II, 254-260 (1991).
51. Garg, U.C. and Hassid, A. Nitric Oxide Generating Vasodilators and 8-Bromo-Cyclicguanosine Monophosphate Inhibit Mitogenesis and Proliferation of Cultured Rat Vascular Smoothe Muscle Cells, J. Clin. Invest., 83, 1774-1777 (1989).
52. Creager, M.A., Cooke, J.P., Mendelsohn, M.E., Gallagher, S.J., Coleman, S.M., Loscaizo, J. and Dzau, V.J. Impaired Vasodilation of Forearm Resistance Vessels in Hypercholesterolemic Humans, J. Clin. Invest., 86, 228-234 (1990).
53. Steinberg, D., Parthasarathy, S., Carew, Т.Е., Khoo, J.C. and Witzium, J.L. Beyond Cholesterol. Modifications of Low Density Lipoproteins that Increase its Atherogenicity. The New England J. of Med, 320, 915-924 (1989).
54. Tsuiji, M. and DuBois, R.N. Alterations in Cellular Adhesion and Apoptosis in Epithelial Cells Overexpressing Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2, Cell, 83, 493-501 (1995).
55. Marcus, A.J. Aspirin as Prophylaxis Colorectal Cancer, The New Eng. Y. Med., 333: 10, 656-658 (1995).
56. P.J. Pastricha, Bedi, A., O'Connor, K., Rashid, A., Akhatar, A.J., ZahuraK, M.L., Piantadosi, S., Hamilton, S.R. and Giardielio, F.M. The Effects of Sulindac on Colorectal Proliferation and Apoptosis in Fainilial Adenomatous Poliopsis. Gastroenterology, 109, 994-998 (1995).
57. Lu, X., Xie, W., Reed, P., Bradshaw, W. and Simmons, D. Nonsteroidal Anti Inflammatory Drugs Cause Apoptosis and Induce Cyclooxygenase in Chicken Embryo Fibroblasts. P.N.A.S. U.S.A., 92, 7961-7965 (1995).
58. Gajewski, T. F. and Thompson, С.В. Apoptosis Meets Signal Transduction: Elimination of A BAP Influence. Cell, 87, 589-592 (1996).
59. Funk, C.D., Funk, L.B, Kennedy, M.E., Pong, A.S. and Fitzgerald, G.A. Human Platelet/Erythroleukemiz Cell Prostaglandin G/H Synthase: cDNA Cloning, Expression and Gene Chromosomal Assignment, FASEB J., 5: 2304-2312 (1991).
60. Patrono, C. Aspirin as an Antipiatelet Drug. The New Eng. J. Mod., 333: 18, 1287-1294 (1994).
61. Howell, Т.Н. and Williams, R.C. Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs as Inhibitors of Periodonal Disease Progression. Crit. Rev. of Oral Biol & Med., 4: 2, 117-195 (1993).
62. Brisham, M.B. Oxidants and Free Radicals in Inflammatory Bowel Disease. Lancet, 344, 859-861 (1994).
63. Gates, J.A. The 1982 Nobel Prize in Physiology and Medicine, Science, 218, 765-768 (1996).
64. Hunter, T. and Pines, J. Cyclins and Cancer II: Cyclin D and CDK Inhibitors Come of Age, Cell, 79, 573- 582 (1994).
65. King, R.W., Jackson, P.K. and Kirschner, M.W. Mitosis in Transition, Cell, 79, 563-571 (1994).
66. Sherr, C.J. Gl Phase Progession: Cycling on Cue, Cell, 79, 551-555 (1994).
67. Nurse, P. Ordering S Phase and M Phase in the Cell Cycle, Cell, 79, 547-550 (1994).
68. Decross, A.J., Marshall, B.J., McCallum, R.W., Hoffman, S.R., Barrett, L.J. and Guerrant, R.L. Metronidazole Susceptibility Testing for Helicobacter pylori: Comparison of Disk, Broth and Agar Dilution Methods and Their Clinical Relevance, J. Clin. Microbiol., 31, 1971-1974 (1993).
69. Anon., Flavor and Fragrance Materials - 1981: Worldwide reference list of materials used in compounding flavors and fragrances, Chemical Sources Association, Allured Publishing Corp.
70. Van Rensburg, H., van Heerden, P.S., Bezuidenhoudt, B.C.B. and Ferreira, D., The first enantioselective synthesis of trans- and cis-dihydroflavanols, Chem. Comm. 24, 2705-2706 (1996).
71. Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettre, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H., Brown, E.L. Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Assays, Nature Biotechnology, 14, 1675-1680 (1996).
72. Winyard, P.G. and Blake, D.R. Antioxidants, Redox-Regulated Transcription Factors, and Inflammation, Advances in Pharmacology, 38, 403-421 (1997).
73. Schwartz, M.A., Rose, B.F., Holton, R.A., Scott, S.W. and Vishnuvajjala, B. Intramolecular Oxidative Coupling of Diphenolic, Monophenolic and Nonphenolic Substrates, J. Am. Chem. Soc. 99: 8, 2571-2575 (1977).
74. Greene, T.W. "Protecting Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York (1981).
75. Warren, S. "Designing Organic Syntheses. A Programmed Introduction to the Synthon Approach", Wiley, New York (1978).
76. Collman, J.P., Hegedus, L.S., Norton, J.R. and Finke, R.G. "Principles and Applications of Organotransition Metal Chemistry", University Science Books (1987).
77. Tsujii, M. and DuBois, R.N. Alterations in Cellular Adhesion and Apoptosis in Epithelial Cells Overexpressing Prostaglandin Endoperoxide Synthase 2, Cell, 83, 493-501 (1995).
78. Pashricha, P.J., Bedi, A., O'Connor, K., Rashid, A., Akhtar, D.J., Zahurak, M.L., Piantadosi, S., Hamilton, S.R. and Giardiello F.M. The Effects of Sulindac on Colorectal Proliferation and Apoptosis in Familial Adenomatous Polyposis, Gastroenterology, 109, 994-998 (1995).
79. Verhagan, J.V., Haenen, G.R.M.M. and Bast, A. Nitric Oxide Radical Scavenging by Wines, J. Agric. Food Chem. 44, 3733-3734 (1996).
80. Aruoma, O.I. Assessment of Potential Prooxidant and Antioxidant Actions, J.A.O.C.S., 73: 12, 1617-1625.
81. Stoner, O.P. and Mukhtar, H. Polyphenols as Cancer Chemopreventive Agents, J. Cell. Biochem. 22, 169-180 (1995).
82. Gali, H.U., Perchellet, E.M., Klish, D.S., Johnson, J.M. and Percheilet, J-P. Antitumor-promoting activities of hydrolyzable tannins in mouse skin, Carcinogenesis, 13: 4, 715-718 (1992).
83. Tabib, K., Besancon, P. and Rouanet, J-M. Dietary Grape Seed Tannins Affect Lipoproteins, Lipoprotein Lipases and Tissue Lipids in Rats Fed Hypercholesterolemic Diets, J. Nutrition, 124:12, 2451-2457.
84. Paolino, V.J. and Kashket, S. Inhibition by Cocoa Extracts of Biosynthesis of Extracellular Polysaccharide by Human Oral Bacteria, Archs. Oral Biol. 30:4, 359-363 (1985).
85. Lockhart, D.J., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang, C., Kobayashi, M., Horton, H., and Brown, E.L., Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays, Nature Biotech., 14, 1675-1680 (1996).
86. Kreiner, T. Rapid genetic sequence analysis using a DNA probe array system. Am. Lab., March, 1996.
87. Lipshutz, R.J., Morris, D., Chee, M., Hubbell, E., Kozai, M.J., Shah, N., Shen, N., Yang, R. and Fodor, S.P.A. Using Oligonucleotide Probe Arrays to Access Genetic Diversity, Biotechniques, 19: 3, 442-447 (1995).
88. Borman, S. DNA Chips Come of Age, Chem. & Eng. News, 42-43, Dec. 9, 1996.
89. Tahara, H., Mihara, Y., Ishii, Y., Fujiwara, M., Endo, H., Maeda, S and Ide, T. Telomerase Activity in Cellular Immortalization, Cell Structure and Function, 20: 6, 1B-1615 (1995).
90. Heller, K., Kilian, A., Paityszek, M.A., and Kleinhofs, A. Telomerase activity in plant extracts, Mol. Gen. Genet. 252, 342-345 (1996).
91. Goffeau, A. Molecular fish on chips, Nature, 385, 202-203 (1997).
92. Friedrich, G.A. Moving beyond the genome projects, Nature Biotechnology, 14, 1234-1237 (1996).
93. Bianchard, R.K. and Cousins, R.J. Differential display of intestingal mRNAs regulated by dietary zinc., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 6863-6868 (1996).
94. Pennisi, E., Opening the Way to Gene Activity, Science, 275: 155-157 (1997).
95. Medlin, J. The Amazing Shrinking Laboratory, Environmental Healt Perspectives, 103: 3, 244 246.
96. Luehrsen, K.R., Marr, L.L., van der Knaap, E. and Cumberledge, S. Analysis of Differential Display RT-PCR Products Using Fluorescent Primers and GENESCAN Software, Biotechniques, 22: 1, 168-174.
97. Geiss, F., Heinrich, M., Hunkler, D. and Rimpler, H. Proanthocyanidins with (+)-Epicatechin Units from Byronima Crassifolia Bark, Phytochemistry, 39: 1, 635-643 (1995).
98. Iibuchi, S., Minoda, Y. and Yamada, K. Studies on Tannin Acyl Hydrolase of Microorganisms, Part II. A New Method Determining the Enzyme Activity Using the Change of Ultra Violet Absorption, Agr. Siol. Chem. 31: 5, 513-518 (1967).
99. Ferreira, D., Steynberg, J. P., Roux, D.G. and Brandt, E.V. Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48: 10, 1743-1803 (1992).