СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ У ПАЦИЕНТОВ С НЕПРОЗРАЧНЫМИ ОПТИЧЕСКИМИ СРЕДАМИ ГЛАЗА
METHOD OF DIAGNOSING COMPLICATIONS IN CASE OF PROLIFERATIVE DIABETIC RETONOPATHY IN PATIENTS WITH NON-TRANSPARENT OPTIC EYE MEDIA

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для диагностики развития осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза. Способ позволяет диагностировать наличие осложненной стадии ПДР у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза, когда офтальмоскопическая диагностика данного состояния не представляется возможной. Это может служить показанием к проведению эндовитреального хирургического вмешательства.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения, включающий определение наличия осложнений пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами с помощью ультразвукового исследования и обработки полученных изображений с применением нелинейного контрастирования (Нероев В.В., Кодзов М.Б., Гаврилов А.В., Малюта Г.Д., Сарыгина О.И. Нелинейное контрастирование в ультразвуковой дифференциальной диагностике пленчатых образований стекловидного тела и отслойки сетчатки у больных с пролиферативной диабетической ретинопатией // Российский офтальмологический журнал. - Том.2. - №1. - 2009. - С.28-32).
Для диагностики осложнений пролиферативной диабетической ретинопатии в условиях непрозрачных оптических сред и отсутствия возможности офтальмоскопии авторы применяли ультразвуковое исследование с последующей обработкой изображений методом нелинейного контрастирования с помощью автоматизированной радиологической, включающей ультразвук информационной системы Multivox. В начале производилось ультразвуковое сканирование глаз с пролиферативной диабетической ретинопатией и подозрением на наличие осложнений в виде организовавшегося гемофтальма и/или отслойки сетчатки. Полученная серия акустических сечений вводилась в память компьютера и обрабатывалась методом нелинейного контрастирования, позволяющим изменять высоту эхо-сигналов с целью выделения и анализа спорных участков сканограммы, что позволяло более точно диагностировать осложнения ПДР. Пленчатые образования в случае организовавшегося гемофтальма характеризовались неравномерной толщиной и гетерогенной структурой, отслойка сетчатки - одинаковой толщиной и гомогенной структурой.
Недостатком данного способа является необходимость применения дорогостоящего ультразвукового оборудования, а также, для повышения его диагностической эффективности, специальной компьютерной программы для проведения нелинейного контрастирования, так как рутинное ультразвуковое исследование не всегда позволяет с высокой точностью установить наличие осложнений пролиферативной диабетической ретинопатии и определить показания к эндовитреальному хирургическому вмешательству.
Раскрытие изобретения.
Задачей изобретения является разработка нового подхода в диагностике осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза.
Основную роль в патогенезе неоваскуляризации на фоне ишемии и гипергликемии у больных с диабетической ретинопатией играет сосудистый эндотелиальный фактор роста - VEGF (vascular endothelial growth factor). Кроме того, известна его определяющая роль в регуляции сосудистой проницаемости, а также процессах эмбрионального васкулогенеза, ретинального лейкостаза, иммуносупрессии и нейропротекции [Bhisitkul R.В. Vascular endothelial growth factor biology: clinical implications for ocular treatments // Br. J. Ophthalmol. - 2006. - Vol.90, №12. - P.1542-1547].
Одним из основных антагонистов VEGF является PEDF (Pigment-epithelium-derived factor), обладающий антиангиогенными, нейротрофическими и нейропротекторными свойствами, выявленными как in vitro, так и in vivo, связанными со способностью данного фактора поражать апоптозные пути [Tombran-Tink J., Barnstable С.J. PEDF: a multifaceted neurotrophic factor // Nat. Rev. Neuros. - 2003. - Vol.4, №8. - P.628-636].
Повышенные уровни VEGF и низкая концентрация PEDF определялись в камерной влаге и стекловидном теле пациентов с различными стадиями диабетической ретинопатии, диабетическим макулярным отеком, вторичной неоваскулярной глаукомой [Patel J.I., Tombran-Tink J., Hykin P.G. et al. Vitreous and aqueous concentrations of proangiogenic, antiangiogenic factors and other cytokines in diabetic retinopathy patients with macular edema: Implications for structural differences in macular profiles // Exp. Eye. Res. - 2006. - Vol.82, №5. - P.798-806]. В ряде исследований выявлена корреляция между уровнем VEGF, балансом про- и антиангиогенных факторов в витреальной полости больных с ПДР до операции и исходами интравитреальных вмешательств [Funatsu Н., Yamashita Н., Noma Н. et al. Risk evaluation of outcome of vitreous surgery for proliferative diabetic retinopathy based on vitreous level of vascular endothelial growth factor and angiotensin II // Br.J.Ophthalmol. - 2004. - Vol.88, №8. - P.1064-1068]. Однако исследования концентрации VEGF и PEDF в легко доступной для анализа среде - слезной жидкости пациентов с диабетической ретинопатией, ранее не проводились.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является диагностика осложнений пролиферативной диабетической ретинопатии у пациентов с непрозрачными оптическими средами глаза без использования дорогостоящей аппаратуры и соответственно увеличение арсенала средств диагностики данного вида патологии.
Технический результат достигается за счет определения сосудистого эндотелиального фактора роста и фактора, выделенного из пигментного эпителия, в слезной жидкости пациентов с пролиферативной стадией диабетической ретинопатии.
В отличие от ближайшего аналога предлагаемый нами способ не требует наличия дорогостоящего оборудования и специальных компьютерных программ для повышения его диагностической эффективности. Предлагаемый способ подразумевает исследование концентраций в слезной жидкости двух основных про- и антиангиогенных факторов, ведущая роль которых в патогенезе пролиферативной диабетической ретинопатии и развитии ее осложненной стадии доказана многими контролируемыми исследованиями.
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом.
Уровни VEGF и PEDF определяют в слезной жидкости с помощью иммуноферментного анализа. Забор слезы проводят с помощью стерильной градуированной пипетки из нижнего конъюнктивального свода в объеме 0,3-0,5 мл. Все пробы слезной жидкости незамедлительно замораживают.
При иммуноферментном анализе использовали наборы для количественного определения человеческого VEGF и PEDF. Данные тесты основаны на «сэндвич»-методе твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки микропланшета, покрытого антителами к VEGF или PEDF, добавляли стандарты и неизвестные образцы. Все пробы изучались в дуплетах. Во время первой инкубации факторы роста связывались с иммобилизованными в ячейках антителами одним сайтом связывания. После промывки добавляли биотинилированные антитела против VEGF или PEDF, которые во время второй инкубации связывались с иммобилизованными ростовыми факторами. После удаления избытка биотинилированных антител в ячейки вносилась стрептавидин-пероксидаза, которая, в свою очередь, присоединялась к биотинилированным антителам. Таким образом, формировался «сэндвич-комплекс», состоящий из 4 реагентов. После третьей инкубации и промывки не связавшийся фермент удалялся, в ячейки добавляли хромогенный субстратный раствор, который при взаимодействии с ферментом образовывал цветной комплекс. После внесения стоп-раствора определяли оптическую плотность на спектрофотометре Мультискан (США) при длине волны 450 нм по отношению к хромогенному бланку, представляющему собой смесь 100 мкл хромогенного раствора тетраметилбензидина и 100 мкл стоп-раствора. Основываясь на известной концентрации стандарта VEGF или PEDF и полученной оптической плотности, строили стандартную кривую, по которой в дальнейшем определяли уровни факторов в исследуемых образцах. Для вычисления показателей использовали Microsoft Office Excel. Статистическая обработка данных проведена на ЭВМ с использованием пакета прикладных программ STATIS-TICA, версия 6.0 (StatSoft Inc., США).
Для осложнений пролиферативной диабетической ретинопатии характерны значения VEGF в слезной жидкости, равные 467 пг/мл и выше, и/или PEDF, равные 1,84 нг/мл и ниже.
Пример 1.
Пациент 37 лет. Диагноз: ОИ пролиферативная диабетическая ретинопатия. ОД незрелая осложненная катаракта. Производилось определение концентрации VEGF и PEDF в слезной жидкости ОД методом ИФА с использованием наборов для количественного определения факторов роста: «Human VEGF ELISA Kit», BioSource International Inc., USA, «ChemiKine™ Pigment Epithelium-Derived Factor Sandwich ELISA Kit», Chemicon International Inc., USA. Концентрация VEGF - 470 пг/мл (более 467 пг/мл), PEDF - 1,2 нг/мл (менее 1,84 нг/мл). Таким образом, оба значения VEGF и PEDF находились в пределах, характерных для пролиферативной диабетической ретинопатии с осложнениями, что подтвердилось при хирургическом вмешательстве. Пациенту проведено комбинированное хирургическое вмешательство на ОД: факоэмульсификация осложненной катаракты и трансцилиарная витрэктомия, в ходе которых на оперируемом глазу была обнаружена пролиферативная диабетическая ретинопатия, осложненная организовавшимся гемофтальмом.
Пример 2.
Пациент 47 лет. Диагноз: ОИ пролиферативная диабетическая ретинопатия, незрелая осложненная катаракта. Производилось определение концентрации VEGF и PEDF в слезной жидкости OS методом ИФА с использованием тех же наборов. Концентрация VEGF - 500 пг/мл (более 467 пг/мл), PEDF - 3,3 нг/мл. Таким образом, только показатель VEGF соответствовал значению, характерному для развития осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии, наличие которых подтвердилось при хирургическом вмешательстве. Пациенту проведено комбинированное хирургическое вмешательство на OS: факоэмульсификация осложненной катаракты и трансцилиарная витрэктомия, в ходе которых на оперируемом глазу была обнаружена пролиферативная диабетическая ретинопатия, осложненная гемофтальмом с локальной тракционной отслойкой сетчатки.
Пример 3.
Пациент 44 лет. Диагноз: ОИ пролиферативная диабетическая ретинопатия. OS зрелая осложненная катаракта. Производилось определение концентрации VEGF и PEDF в слезной жидкости OS методом ИФА с использованием тех же наборов. Концентрация VEGF - 332 пг/мл, PEDF - 1,52 нг/мл (менее 1,84 нг/мл). Таким образом, только показатель PEDF соответствовал значению, характерному для развития осложнений при пролиферативной диабетической ретинопатии, наличие которых подтвердилось при хирургическом вмешательстве. Пациенту проведено комбинированное хирургическое вмешательство на OS: факоэмульсификация осложненной катаракты и трансцилиарная витрэктомия, в ходе которых на оперируемом глазу была обнаружена пролиферативная диабетическая ретинопатия, осложненная гемофтальмом и тракционной отслойкой сетчатки с захватом макулярной зоны.