БЫСТРЫЙ НАПРАВЛЕННЫЙ АНАЛИЗ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОНОРНОЙ ВСТАВКИ

1. Способ обнаружения сайт-специфической интеграции донорной полинуклеотидной последовательности в целевой участок генома, где способ включает:
a. амплификацию геномной ДНК в первом раунде ПЦР с получением первого ампликона при использовании первого внешнего ПЦР-праймера, предназначенного для связывания с целевым участком геномной ДНК, и первого внутреннего ПЦР-праймера, предназначенного для связывания интегрированной донорной полинуклеотидной последовательности;
b. амплификацию первого ампликона во втором раунде ПЦР с использованием праймеров, специфичных к последовательностям, расположенным в первом ампликоне, с получением второго ампликона; и,
c. обнаружение присутствия второго ампликона, где получение второго ампликона указывает на присутствие события сайт-специфической интеграции.
2. Способ по п.1, где целевой участок генома включает эндогенный или сконструированный целевой участок генома.
3. Способ по п.1, где первый внутренний ПЦР-праймер представлен в более низкой концентрации, чем первый внешний ПЦР-праймер.
4. Способ по п.1, где первый раунд ПЦР проводят при использовании относительной концентрации первого внешнего ПЦР-праймера к первому внутреннему ПЦР-праймеру приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1.
5. Способ по п.1, где первый внутренний ПЦР-праймер включает концентрацию 0,05-0,09 мкМ, и первый внешний ПЦР-праймер включает концентрацию по меньшей мере 0,1 мкМ.
6. Способ по любому из пп.1-5, где второй раунд ПЦР включает второй внешний ПЦР-праймер, предназначенный для связывания с целевым участком геномной ДНК первого ампликона, и второй внутренний ПЦР-праймер, предназначенный для связывания интегрированной донорной полинуклеотидной последовательности первого ампликона.
7. Способ по п.6, где второй внутренний ПЦР-праймер представлен в более низкой концентрации, чем второй внешний ПЦР-праймер.
8. Способ по п.6, где второй раунд ПЦР проводят при использовании относительной концентрации второго внешнего ПЦР-праймера ко второму внутреннему ПЦР-праймеру приблизительно 4:1, 3:1 или 2:1.
9. Способ по п.6, где второй внутренний ПЦР-праймер включает концентрацию 0,05-0,1 мкМ, и второй внешний ПЦР-праймер включает концентрацию 0,2 мкМ.
10. Способ по п.1, где геномная ДНК, включающая сайт-специфическую интеграцию донорной полинуклеотидной последовательности в целевой участок генома, является растительной геномной ДНК.
11. Способ по п.10, где растительная геномная ДНК выделена из однодольного растения.
12. Способ по п.10, где растительная геномная ДНК выделена из двудольного растения.
13. Способ по п.10, где сайт-специфическую интеграцию донорной полинуклеотидной последовательности в целевой участок генома производят при расщеплении целевого участка геномной ДНК с помощью сайт-специфической нуклеазы.
14. Способ по п.13, где сайт-специфическая нуклеаза выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевой нуклеазы, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALEN или мегануклеазы.
15. Способ по п.13, где сайт-специфическая интеграция донорной полинуклеотидной последовательности в целевой участок генома проходит по механизму негомологичного соединения концов.
16. Способ по п.1, где этап обнаружения включает электрофорез второго ампликона в геле.
17. Способ по п.1, где этап обнаружения включает секвенирование второго ампликона.
18. Способ обнаружения сайт-специфической интеграции донорной полинуклеотидной последовательности в целевой участок генома трансфицированных растительных клеток, где указанный способ включает:
a. амплификацию геномной ДНК в первом раунде ПЦР с получением первого ампликона, где указанную ПЦР проводят при использовании первого внешнего ПЦР-праймера, предназначенного для связывания с целевым участком генома, и первого внутреннего ПЦР-праймера, предназначенного для связывания донорной полинуклеотидной последовательности, а также где указанный первый внутренний ПЦР-праймер представлен в более низкой концентрации, чем первый внешний ПЦР-праймер;
b. амплификацию первого ампликона во втором раунде ПЦР с использованием праймеров, специфичных к последовательностям, расположенным в первом ампликоне, с получением второго ампликона; и
c. обнаружение присутствия второго ампликона, где получение второго ампликона указывает на присутствие события сайт-специфической интеграции.