ЛИПОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ХЛЕБОПЕЧЕНИИ
LIPOLYTIC ENZYME FOR USE IN BAKING

Ссылка на перечень последовательностей
Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ с помощью ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым липолитическим ферментам, особенно к липолитическим ферментам с усовершенствованными свойствами для применения в тесте, где они могут, например, заменить эмульгаторы, обычно используемые в хлебопечении.
Предпосылки изобретения
Белый мякиш и тонкая структура мякиша являются важными характеристиками для потребительского предпочтения хлеба; особенно промышленно упакованного хлеба, такого как хлеб для тостов. Тонкую структуру мякиша обычно получают путем введения эмульгатора в тесто в процессе изготовления хлеба. В настоящее время потребители предпочитают избегать употребления хлебобулочных изделий, содержащих эмульгаторы.
Использование липолитических ферментов в хлебопечении известно уже многие годы.
Fusarium oxysporum
В WO 98/26057 раскрыты липаза/фосфолипаза из и их применение в хлебопечении.
В WO 2004/099400 раскрыты различные липолитические ферменты и их применение в хлебопечении для уменьшения липкости теста.
В WO 1999/053769 раскрыто применение мальтогенной альфа-амилазы и фосфолипазы для улучшения мягкости хлебобулочных изделий в начальный период после выпечки.
Применение липолитических ферментов в хлебопечении может придавать нежелательный привкус из-за образования свободных цепочек жирных кислот.
Настоящее изобретение относится к новым липолитическим ферментам, способным обеспечивать белую крошку и крошку с тонкой структурой, не создавая нежелательного привкуса.
Краткое описание изобретения
Изобретателями был найден новый липолитический фермент, который неожиданно способствует образованию белого мякиша и мякиша с очень тонкой структурой, и в то же время этот липолитический фермент не придает нежелательный привкус при использовании в хлебопечении, поэтому мы заявляем:
Полипептид, обладающий активностью липолитического фермента, выбранный из группы, состоящей из:
a) полипептида с по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с аминокислотами в положениях от 21 до 309 последовательности SEQ ID NO: 1;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной жесткости с кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 2;
c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности, кодирующей полипептид, с SEQ ID NO: 2; и
(d) фрагмента полипептида (a), (b) или (c), обладающего активностью липолитического фермента.
В одном варианте осуществления предложен липолитический фермент согласно данному изобретению, который по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентичен последовательности аминокислот в положениях от 21 до 903 последовательности SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления липолитический фермент согласно данному изобретению содержит каталитический сегмент с аминокислотной последовательностью G-H-S-L-G.
В одном варианте осуществления липолитический фермент согласно данному изобретению действует как липаза, фосфолипаза и/или галактолипаза; особенно липолитический фермент действует как липаза и фосфолипаза.
В одном варианте осуществления мы заявляем выделенный полинуклеотид, кодирующий липолитический фермент согласно данному изобретению.
В одном варианте осуществления мы заявляем конструкцию нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащие полинуклеотид, кодирующий липолитический фермент согласно данному изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием полипептида у экспрессирующего хозяина.
В одном варианте осуществления мы заявляем рекомбинантную клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид, кодирующий липолитический фермент согласно данному изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием полипептида.
В одном варианте осуществления мы заявляем способ получения липолитического фермента согласно данному изобретению, включая культивирование клетки-хозяина в условиях, благоприятных для продуцирования полипептида.
В одном варианте осуществления мы заявляем гранулят или стабилизированную жидкость, содержащие липолитический фермент согласно данному изобретению.
В одном варианте осуществления мы заявляем композицию, содержащую липолитический фермент согласно данному изобретению и один или несколько дополнительных ферментов, выбранных из группы, состоящей из аминопептидазы, амилазы, альфа-амилазы, мальтогенной альфа-амилазы, бета-амилазы, карбоксипептидазы, каталазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстрин гликозилтрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, галактаназы, глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазы, глюканазы, альфа-галактозидазы, бета-галактозидазы, глюкоамилазы, альфа-глюкозидазы, бета-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, маннаназы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитических ферментов, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фосфолипазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглютаминазы и ксиланазы; в частности, композицию, содержащую липолитический фермент согласно данному изобретению и один или несколько дополнительных ферментов, выбранных из группы, состоящей из мальтогенной альфа-амилазы, бета-амилазы и глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролазы; особенно композицию, содержащую липолитический фермент согласно данному изобретению и мальтогенную альфа-амилазу.
В одном варианте осуществления мы заявляем способ приготовления хлебобулочного изделия, включающий в себя стадию введения в тесто перед выпеканием липолитического фермента согласно данному изобретению, гранулята или стабилизированной жидкости согласно данному изобретению или композиции согласно данному изобретению.
В одном варианте осуществления содержание липолитического фермента согласно данному изобретению составляет от 0,01 до 100 мг, предпочтительно - от 0,05 до 50 мг, более предпочтительно - от 0,1 до 25 мг, и еще более предпочтительно - от 0,1 до 15 мг белка фермента на кг муки в тесте или жидком тесте.
В одном варианте осуществления мы заявляем применение липолитического фермента согласно данному изобретению в хлебопечении и/или при изготовлении кондитерских изделий.
В одном варианте осуществления мы заявляем применение гранулята или стабилизированной жидкости, содержащих липолитический фермент согласно данному изобретению в хлебопечении и/или при изготовлении кондитерских изделий.
В одном варианте осуществления мы заявляем применение композиции, содержащей липолитический фермент согласно данному изобретению и один или несколько дополнительных ферментов, в хлебопечении и/или при изготовлении кондитерских изделий.
В одном варианте осуществления мы заявляем применение липолитического фермента согласно данному изобретению в улучшителях хлеба и/или кондитерских смесях или полуфабрикатах.
Подробное описание изобретения
Определения
Липолитический фермент:
Термин "липолитический фермент" включает в себя фермент (EC 3.1.1), который действует как липаза, фосфолипаза и/или галактолипаза; особенно липолитический фермент, который действует как липаза и фосфолипаза. Липолитический фермент может проявлять и другие типы действия. Термин "липолитический фермент" используется взаимозаменяемо с термином "полипептид, обладающий активностью липолитического фермента".
В соответствии с настоящим изобретением липазную активность можно измерять следующим методом:
Липазную активность можно определять, используя трибутирин в качестве субстрата. Этот метод основан на гидролизе трибутирина ферментом, а расход щелочи для поддержания стабильного pH в ходе гидролиза измеряют как функцию времени.
Единица липазной активности (LU) определяется как количество фермента, которое в стандартных условиях (то есть при 30°C; pH 7,0; с 0,1% (вес/об.) гуммиарабика в качестве эмульгатора и 0,16 M трибутирина в качестве субстрата), дает 1 микромоль титруемой масляной кислоты в минуту.
Используемым протоколом для определения липазной активности с применением планшетов с трибутирином является нижеследующий:
Смесь для субстрата с трибутирином:
15 мл глицеринтрибутирата (трибутирина)
2 г гуммиарабика.
2
285 мл HO
Для двух планшетов используют:
• 5 мл смеси с трибутирином с добавлением 50 мл 0,02 M универсального буфера с pH 7,0
• Предварительно нагревают до 60°C
• Гомогенизируют с помощью Ultra turax в течение 60 секунд для получения тонкой эмульсии
Готовят 2%-ный раствор агарозы:
2
• 2 г в 100 мл HO
• Доводят до кипения и охлаждают раствор до 60°C (используя водяную баню)
Смешивают 50 мл раствора трибутирина/буфера с 50 мл 2%-ной агарозы, добавляют 250 микролитров 4%-ного кристаллвиолета. Наливают по 50 в каждый OmniTray планшет с одной лункой, кат. № 242811, и Nunc TSP 96 кат. № 445497. Можно применять образцы по 10 микролитров. Планшеты можно инкубировать при 30°C в течение от примерно 1 часа до 3 часов. Активность можно регистрировать путем фотографирования.
Липазная активность:
Триглицериновая липазная активность (EC 3.1.1.3), т.е. гидролитическое действие на карбоксильные связи сложных эфиров в триглицеридах, например, трибутиринах.
Фосфолипазная активность:
Фосфолипазная активность (A1 или A2, EC 3.1.1.32 или 3.1.1.4), т.е. гидролитическое действие на одну или обе карбоксильные связи сложных эфиров в фосфолипидах, таких как лецитин.
Галактолипазная активность:
Галактолипазная активность (EC 3.1.1.26), т.е. гидролитическое действие на карбоксильные связи сложных эфиров в галактолипидах, таких как DGDG (дигалактозилдиглицерид).
Кодирующая последовательность.
Термин "кодирующая последовательность" означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность полипептида. Пределы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, cDNA, синтетическую ДНК или их комбинацию.
Фрагмент:
Термин "фрагмент" означает полипептид, содержащий один или несколько (например, некоторое количество) аминокислот с амино и/или карбоксильного конца зрелого полипептида или домена; где фрагмент обладает активностью липолитического фермента.
Клетка-хозяин:
Термин ''клетка-хозяин'' означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции на основе нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид настоящего изобретения.
Выделенный:
Термин "выделенный" означает вещество в форме или среде, которые не встречаются в природе. Неограничивающие примеры выделенных веществ предусматривают (1) любое не встречающееся в природе вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одного или нескольких или всех встречающихся в природе составляющих, с которыми они связаны в природе; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в природе (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в природе с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце в виде ферментационного бульона.
Зрелый полипептид:
Термин "зрелый полипептид" означает полипептид в его окончательной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д.
Последовательность, кодирующая зрелый полипептид:
Термин ʺпоследовательность, кодирующая зрелый полипептидʺ означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий активностью липолитического фермента.
Условия умеренной жесткости:
Выражение "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.
Условия умеренно высокой жесткости:
Выражение "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В заключение, материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.
Условия высокой жесткости:
Термин "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых, а также 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В конце материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.
Условия очень высокой жесткости.
Выражение "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде после стандартных процедур Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. В конце материал-носитель промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут, с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.
Идентичность последовательностей:
J. Mol. Biol.
et al.
Trends Genet.
Сродство между двумя аминокислотными последовательностями описывается параметром ʺидентичность последовательностейʺ. В целях настоящего изобретения идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970,  48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice , 2000,  16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются: штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выходные данные в Needle, помеченные как "самая длинная идентичность" (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
Полипептид, обладающий активностью липолитического фермента, может быть модифицирован, т.е. может содержать замену, вставку и/или делецию в одном или нескольких (например, нескольких) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей определенное положение, другой аминокислотой; делеция означает устранение аминокислоты, занимающей определенное положение; а вставка означает добавление аминокислоты рядом и непосредственно после аминокислоты, занимающей определенное положение.
выше
et al.
В контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей у двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, ), который применен в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice , 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выходные данные в Needle, помеченные как "самая длинная идентичность" (полученные с применением опции nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:
(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).
Улучшенное свойство:
Внесение эффективного количества липолитического фермента согласно данному изобретению в тесто улучшает одно или несколько свойств теста или хлебобулочного изделия, изготовленного из него.
Термин "улучшенное свойство" в данном контексте означает свойство теста и/или продукта, изготовленного из теста, в частности, хлебобулочного изделия, которое улучшается благодаря действию липолитического фермента согласно данному изобретению по сравнению с тестом или продуктом, изготовленным из теста, в состав которых не входит липолитический фермент согласно данному изобретению.
Улучшенное свойство может включать в себя, но без ограничения, улучшенную белизну мякиша хлебобулочного изделия, улучшенную структуру мякиша хлебобулочного изделия, улучшенную мягкость мякиша хлебобулочного изделия, улучшенный вкус хлебобулочного изделия и/или улучшенные свойства, препятствующие черствению хлебобулочного изделия.
Улучшенные свойства оценивают по сравнению с тестом и/или хлебобулочным изделием, полученным с добавлением или без добавления липолитического фермента согласно данному изобретению. Органолептические качества можно оценивать, используя процедуры, установившиеся в хлебопекарной промышленности, которые могут включать в себя, например, комиссию по сенсорной оценке продукта.
Улучшенная структура мякиша хлебобулочного изделия
: Термин "улучшенная структура мякиша хлебобулочного изделия" в данном контексте означает хлебобулочное изделие с более тонкой структурой мякиша. Улучшенная тонкость мякиша связана с более мелкими ячейками и/или более тонкостенными ячейками в мякише и/или более равномерным/гомогенным распределением ячеек в мякише, и обычно оценивается визуально пекарем/комиссией по сенсорной оценке, или анализом цифрового изображения, как это принято в уровне техники (например, C-cell, Calibre Control International Ltd, Уоррингтон, Великобритания, как показано в Примерах 2-3 настоящего изобретения).
Улучшенная белизна мякиша:
Тонкость мякиша часто оценивают путем измерения белизны хлебного мякиша, поскольку более тонкая структура мякиша отражает свет таким образом, что мякиш выглядит более белым. Белизну мякиша можно измерять, как это принято в области техники, например, используя HunterLab L-значение, измеренное с помощью цветоделительного устройства.
Улучшенная мягкость мякиша хлебобулочного изделия
: Термин "улучшенная мягкость мякиша хлебобулочного изделия" противоположна "плотности" и в данном контексте означает свойство хлебобулочного изделия, которое позволяет легче сжимать изделие, и его либо эмпирически оценивает опытный эксперт-пекарь/комиссия по сенсорной оценке, либо измеряют с помощью анализатора текстуры (например, TAXT2 или TA-XT Plus от компании Stable Micro Systems Ltd, Суррей, Великобритания) как это принято в области техники.
Улучшенный вкус хлебобулочного изделия
: Термин "улучшенный вкус хлебобулочного изделия" определяет квалифицированная экспертная комиссия и/или оценивают с помощью химического анализа (например, парофазный ГХ-МС анализ). Улучшенный вкус хлебобулочного изделия включает в себя уменьшение неприятного(ых) привкуса(ов) хлебобулочного изделия.
Улучшенные свойства, препятствующие черствению хлебобулочного изделия
: Термин "улучшенные свойства, препятствующие черствению хлебобулочного изделия" в данном контексте означают свойства хлебобулочного изделия, которые снижают скорость ухудшения характеристик качества, например, мягкости и/или эластичности, при хранении.
Объем хлебобулочного изделия
: Термин "объем хлебобулочного изделия" измеряют как объем выбранного батона хлеба. Объем можно определять методом с использованием рапсовых семян.
Неприятный привкус:
Термин имеет или нет хлебобулочное изделие неприятный привкус определяет квалифицированная экспертная комиссия и/или оценивают с помощью химического анализа, как это принято в области техники.
Липолитические ферменты согласно данному изобретению
Липолитические ферменты, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают полипептид, обладающий активностью липолитического фермента, выбранный из группы, состоящей из:
a) полипептида с по меньшей мере 65% идентичностью последовательности с аминокислотами в положениях от 21 до 309 последовательности SEQ ID NO: 1;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях умеренной жесткости с кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 2;
c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 65% идентичностью последовательности, кодирующей полипептид, с SEQ ID NO: 2; и
(d) фрагмента полипептида (a), (b) или (c), обладающего активностью липолитического фермента.
В контексте настоящего изобретения зрелый полипептид, раскрытый в SEQ ID NO: 1, применяют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другом липолитическом ферменте.
J. Mol. Biol.
et al.
Trends Genet.
Аминокислотную последовательность другого липолитического фермента выравнивают со зрелым полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 1, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в зрелом полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 1, определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970,  48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice , 2000,  16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются: штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS).
В одном варианте осуществления предложен липолитический фермент согласно данному изобретению, который по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% идентичен последовательности аминокислот в положениях от 21 до 903 последовательности SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления липолитический фермент согласно данному изобретению содержит каталитическую триаду с аминокислотной последовательностью G-H-S-L-G.
Липолитический фермент по настоящему изобретению предпочтительно содержит, или состоит из аминокислот в положениях от 21 до 903 последовательности SEQ ID NO: 1; или является ее аллельным вариантом; или представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью липолитического фермента.
et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью липолитического фермента, кодируемому полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень низкой жесткости, условиях низкой жесткости, условиях умеренной жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с последовательностью SEQ ID NO: 2 (Sambrook , 1989, , 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).
например
например
32
3
35
Полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 2 или его подпоследовательность, а также полипептид с SEQ ID NO: 1 или его фрагмент можно применять для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей полипептид, обладающий активностью липолитического фермента, из штаммов разных родов или видов в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки после стандартных процедур Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, однако должны иметь в длину по меньшей мере 15, , по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, , имеет в длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Как правило, зонды метят для выявления соответствующего гена (например, с помощью P, H, S, биотина или авидина). Такие зонды охватываются настоящим изобретением.
Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из других таких штаммов, можно подвергать скринингу в отношении ДНК, которая гибридизируется с описанными выше зондами и кодирует полипептид, обладающий активностью липолитического фермента. Геномную или другую ДНК из других таких штаммов можно разделять с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно переносить и иммобилизировать на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизируются с SEQ ID NO: 2 или ее подпоследовательностью, в Саузерн-блоттинге можно применять материал-носитель.
В контексте настоящего изобретения гибридизация указывает на то, что полинуклеотид гибридизируется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 2; (ii) последовательности, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 2, кодирующей полипептид; (iii) последовательности полной длины, комплементарной ей; или (iv) ее подпоследовательности; в условиях от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми в данных условиях гибридизируется зонд на основе нуклеиновой кислоты, можно выявлять с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных из уровня техники.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, обладающему активностью липолитического фермента, кодируемому полинуклеотидом, обладающим идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 2 по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
например,
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам зрелого полипептида под SEQ ID NO: 1, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой в одном или нескольких (некоторых) положениях. В одном варианте осуществления количество аминокислотных замен, делеций и/или вставок, введенных в зрелый полипептид под SEQ ID NO: 1, составляет не более 20, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, или 19. Изменения аминокислот могут быть незначительного характера, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на укладку и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на аминном или карбоксильном конце, такими как метиониновый остаток на аминоконце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку с помощью изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый тракт, антигенный эпитоп или связывающий домен.
In
The Proteins
Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют удельную активность, известны из уровня техники и описаны, например, в H. Neurath и R.L. Hill, 1979, , , Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.
Альтернативно, изменения аминокислот имеют такой характер, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термоустойчивость полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять pH-оптимум и т. п.
Science
et al.
J. Biol. Chem.
Незаменимые аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными из уровня техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989,  244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят в каждый остаток в молекуле, и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении активности липолитического фермента с целью идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также Hilton , 1996,  271: 4699-4708.
et al.
Science
et al.
J. Mol. Biol.
et al.
FEBS Lett.
Активный сайт для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно определять также с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего сайта. См., например, de Vos , 1992,  255: 306-312; Smith , 1992,  224: 899-904; Wlodaver , 1992,  309: 59-64. Об идентичности незаменимых аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.
Science
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
например
et al.
Biochemistry
et al.
Gene
et al.
DNA
Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществлять и исследовать с помощью известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, например, таких, как раскрыты в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988,  241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989,  86: 2152-2156; WO 95/17413 или WO 95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР пониженной точности, фаговый дисплей (, Lowman , 1991,  30: 10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204) и мутагенез, направленный на участок (Derbyshire , 1986,  46: 145; Ner , 1988,  7: 127).
et al.
Nature Biotechnology
Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединять со способами автоматизированного скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных, подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness , 1999,  17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлекать из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов из уровня техники. Такие способы предусматривают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.
Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором область одного полипептида составлена с N-концом или C-концом области другого полипептида.
et al
EMBO J.
et al.
Science
Полипептид может представлять собой составной полипептид или расщепляемый составной полипептид, в котором другой полипептид составлен с N-концом или C-концом полипептида настоящего изобретения. Составной полипептид получают с помощью слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом настоящего изобретения. Методики получения составных полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, так, чтобы они находились в рамке, и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(промоторов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются посттрансляционно (Cooper ., 1993,  12: 2575-2583; Dawson , 1994,  266: 776-779).
et al
J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
et al.
J. Biotechnol.
et al.
Appl. Environ. Microbiol.
et al.
Biotechnology
et al.
Biotechnology
et al.
Biochemistry
et al.
Biotechnology
et al.
Proteins: Structure, Function, and Genetics
Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin ., 2003,  3: 568-576; Svetina , 2000,  76: 245-251; Rasmussen-Wilson , 1997,  63: 3488-3493; Ward , 1995,  13: 498-503; и Contreras , 1991,  9: 378-381; Eaton , 1986,  25: 505-512; Collins-Racie , 1995,  13: 982-987; Carter , 1989,  6: 240-248; и Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Источники полипептидов, обладающих активностью липолитического фермента
Полипептид, обладающий активностью липолитического фермента согласно настоящему изобретению, можно получить из микроорганизмов любого рода. В контексте настоящего изобретения выражение ʺполученный изʺ, которое применяется в данном документе применительно к определенному источнику, будет означать, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, продуцируется источником или штаммом, в который был введен полинуклеотид из источника. В одном аспекте полипептид, полученный из данного источника, вырабатывается внеклеточно.
Valsaria
Valsaria rubricosa
В одном аспекте полипептид получают из , такого как, но не ограничиваясь этим, .
Штаммы данных видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц во многих коллекциях культур, таких как Американская коллекция типовых культур (ATCC), Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ), Центральное бюро плесневых культур (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований, Северный региональный исследовательский центр (NRRL).
Полипептид можно идентифицировать и получить из других источников, в том числе из микроорганизмов, выделенных из природной среды (например, почвы, компостов, воды и т.д.), или образцов ДНК, полученных непосредственно из природных материалов (например, почвы, компостов, воды и т.д.), с применением вышеупомянутых зондов. Методики выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из естественных мест обитания хорошо известны из уровня техники. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, можно затем получить подобным образом путем скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК другого микроорганизма или образца смешанной ДНК. После того, как полинуклеотид, кодирующий полипептид, был выявлен зондом(ами), полинуклеотид можно выделить или клонировать с использованием методик, которые известны специалисту в данной области техники.
Полинуклеотиды
Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептид по настоящему изобретению, описанный в данном документе.
et al.
PCR: A Guide to Methods and Application
Valsaria,
Valsaria rubricosa,
Методики, применяемые для выделения или клонирования полинуклеотида, известны из уровня техники и включают выделение из геномной ДНК или кДНК или их комбинации. Клонирование полинуклеотидов из геномной ДНК можно осуществлять, например, с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) или скрининга библиотек экспрессии с помощью антител для выявления клонированных фрагментов ДНК с общими структурными особенностями. См., например, Innis , 1990, , Academic Press, New York. Можно применять другие процедуры амплификации нуклеиновой кислоты, такие как лигазная цепная реакция (LCR), активированная лигированием транскрипция (LAT) и реакция транскрипционной амплификации (NASBA). Полинуклеотиды можно клонировать из штамма  например, или родственного огранизма.
et al.
Protein Expression and Purification
Модификация полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению, может быть необходимой для синтеза полипептидов, по сути аналогичных указанному полипептиду. Термин ʺпо сути аналогичныйʺ в отношении полипептида относится к не встречающимся в естественных условиях формам полипептида. Эти полипептиды могут отличаться некоторыми особенностями, обусловленными их конструированием, от полипептида, выделенного из его нативного источника, например, как варианты, которые отличаются специфической активностью, термостабильностью, оптимальным значением pH и т.п. Варианты можно сконструировать на основе полинуклеотида, присутствующего в виде кодирующей зрелый полипептид последовательности с SEQ ID NO: 2, кодирующей зрелый полипептид, например, ее подпоследовательности, и/или путем введения нуклеотидных замен, которые не приводят в результате к изменению аминокислотной последовательности полипептида, но которые соответствуют частоте использования кодонов у организма-хозяина, предполагаемого для выработки фермента, или путем введения нуклеотидных замен, которые могут привести к образованию различных аминокислотных последовательностей. В отношении общего описания нуклеотидных замен см., например, Ford , 1991, 2: 95-107.
Конструкции нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, соответствующих регуляторным последовательностям.
С полинуклеотидом можно производить действия при помощи ряда способов для обеспечения экспрессии полипептида. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой, в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы рекомбинантных ДНК, хорошо известны из уровня техники.
Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который распознается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид по настоящему изобретению. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию полипептида. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные, либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.
Векторы экспрессии
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и регуляторные последовательности можно соединить вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может содержать один или несколько подходящих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замены в таких сайтах полинуклеотида, кодирующего полипептид. Альтернативно, полинуклеотид можно экспрессировать посредством вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими регуляторными последовательностями для экспрессии.
Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобным образом подвергать процедурам рекомбинантной ДНК и который может обеспечивать экспрессию полинуклеотида. Как правило, выбор вектора будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.
Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, мини-хромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Альтернативно, при введении в клетку-хозяина вектор может интегрироваться в геном и реплицироваться вместе с хромосомой (хромосомами), в которые он был интегрирован. Более того, можно применять один вектор или плазмиду либо два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина или транспозон.
Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.
Клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида по настоящему изобретению. Конструкция или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Термин "клетка-хозяин" охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего полипептид, и его источника.
Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную для рекомбинантного получения полипептида согласно настоящему изобретению, например, прокариотическую или эукариотическую.
Bacillus
Clostridium
Enterococcus
Geobacillus
Lactobacillus
Lactococcus
Oceanobacillus
Staphylococcus
Streptococcus
Streptomyces
E. coli
Flavobacterium
Fusobacterium
Helicobacter
Ilyobacter
Neisseria
Pseudomonas
Salmonella
Ureaplasma
Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают, без ограничения, , , , , , , , , , и . Грамотрицательные бактерии включают, без ограничения, , , , , , , , , и .
Bacillus
Bacillus alkalophilus
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus brevis
Bacillus circulans
Bacillus clausii
Bacillus coagulans
Bacillus firmus
Bacillus lautus
Bacillus lentus
Bacillus licheniformis
Bacillus megaterium
Bacillus pumilus
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis
Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клетку , в том числе, без ограничения, клетки , , , , , , , , , , , , ,  и .
Streptococcus
Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой также любую клетку , в том числе, без ограничения, клетки Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis и Streptococcus equi подвида Zooepidemicus.
Streptomyces
Streptomyces achromogenes
Streptomyces avermitilis
Streptomyces coelicolor
Streptomyces griseus
Streptomyces lividans
Бактериальная клетка-хозяин может также представлять собой любую клетку , в том числе, без ограничения, клетки , , ,  и .
Клетка-хозяин может также быть эукариотической клеткой, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растения или гриба.
.
Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi
Клетка-хозяин может представлять собой клетку гриба. "Грибы", как применяется в данном документе, включают отделы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota, а также Oomycota и все митоспоровые грибы (как определено Hawksworth и соавт в , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).
Biology and Activities of Yeast
Soc. App. Bacteriol. Symposium Series
Клетка-хозяин, относящаяся к грибам, может представлять собой клетку, относящуюся к дрожжам. ʺДрожжиʺ в контексте данного документа включают аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (бластомицетам). Поскольку классификация дрожжей в будущем может измениться, в контексте настоящего изобретения дрожжи следует определять согласно описанному в  (Skinner, Passmore, and Davenport, editors,  No. 9, 1980).
Candida
Hansenula
Kluyveromyces
Pichia
Saccharomyces
Schizosaccharomyces
Yarrowia
Kluyveromyces lactis
Saccharomyces carlsbergensis
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces diastaticus
Saccharomyces douglasii
Saccharomyces kluyveri
Saccharomyces norbensis
Saccharomyces oviformis
Yarrowia lipolytica
Дрожжевой клеткой-хозяином может быть клетка , , , , ,  или , такая как , , , , , , , , или клетка .
et al.
выше
Saccharomyces cerevisiae
Клетка-хозяин, относящаяся к грибам, может представлять собой клетку нитчатого гриба. "Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подотделов Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth , 1995, ). Нитчатые грибы, как правило, характеризуются клеточной стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит посредством удлинения гиф, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как , происходит посредством почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным.
Acremonium
Aspergillus
Aureobasidium
Bjerkandera
Ceriporiopsis
Chrysosporium
Coprinus
Coriolus
Cryptococcus
Filibasidium
Fusarium
Humicola
Magnaporthe
Mucor
Myceliophthora
Neocallimastix
Neurospora
Paecilomyces
Penicillium
Phanerochaete
Phlebia
Piromyces
Pleurotus
Schizophyllum
Talaromyces
Thermoascus
Thielavia
Tolypocladium
Trametes
Trichoderma
Клетка-хозяин нитчатого гриба может быть клеткой , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  или .
Aspergillus awamori
Aspergillus foetidus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus japonicus
Aspergillus nidulans
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Bjerkandera adusta
Ceriporiopsis aneirina
Ceriporiopsis caregiea
Ceriporiopsis gilvescens
Ceriporiopsis pannocinta
Ceriporiopsis rivulosa
Ceriporiopsis subrufa
Ceriporiopsis subvermispora
Chrysosporium inops
Chrysosporium keratinophilum
Chrysosporium lucknowense
Chrysosporium merdarium
Chrysosporium pannicola
Chrysosporium queenslandicum
Chrysosporium tropicum
Chrysosporium zonatum
Coprinus cinereus
Coriolus hirsutus
Fusarium bactridioides
Fusarium cerealis
Fusarium crookwellense
Fusarium culmorum
Fusarium graminearum
Fusarium graminum
Fusarium heterosporum
Fusarium negundi
Fusarium oxysporum
Fusarium reticulatum
Fusarium roseum
Fusarium sambucinum
Fusarium sarcochroum
Fusarium sporotrichioides
Fusarium sulphureum
Fusarium torulosum
Fusarium trichothecioides
Fusarium venenatum
Humicola insolens
Humicola lanuginosa
Mucor miehei
Myceliophthora thermophila
Neurospora crassa
Penicillium purpurogenum
Phanerochaete chrysosporium
Phlebia radiata
Pleurotus eryngii
Thielavia terrestris
Trametes villosa
Trametes versicolor
Trichoderma harzianum
Trichoderma koningii
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma reesei
Trichoderma viride
Aspergillus oryzae
Например, клеткой-хозяином нитчатого гриба может быть клетка , , , , , , , , , , , , ,, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , или ; в частности, клеткой .
per se
Aspergillus
Trichoderma
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Bio/Technology
Fusarium
et al.
Gene
в
Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology
Methods in Enzymology
et al.
J. Bacteriol.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Клетки, относящиеся к грибам, можно трансформировать с помощью способа, предусматривающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, известным . Подходящие процедуры для трансформации клеток-хозяев  и  описаны в EP 238023, Yelton , 1984,  81: 1470-1474, и Christensen , 1988, 6: 1419-1422. Подходящие способы трансформации видов  описаны в Malardier , 1989,  78: 147-156, и WO 96/00787. Дрожжи можно трансформировать с применением методик, описанных Becker and Guarente,  Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, , , Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito , 1983,  153: 163; и Hinnen , 1978,  75: 1920.
Способы получения
Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида согласно настоящему изобретению, включающим (a) культивирование клетки, которая в своей форме дикого типа вырабатывает полипептид, в условиях, благоприятных для выработки полипептида и необязательно (b) извлечение полипептида.
Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида согласно настоящему изобретению, включающим (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению в условиях, благоприятных для выработки полипептида и необязательно (b) извлечение полипептида.
Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для выработки полипептида, с применением способов, известных из уровня техники. Например, клетки можно культивировать посредством культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, периодической с подпиткой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения полипептида. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных из уровня техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными композициями (например, в каталогах американской коллекции типовых культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, то полипептид можно извлечь непосредственно из среды. Если полипептид не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.
Полипептид можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими в отношении липолитических ферментов. Данные способы выявления включают без ограничения применение специфических антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, анализ ферментативной активности можно применять для определения активности полипептида.
Полипептид можно извлечь с применением способов, известных из уровня техники. Например, полипептид можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых методик, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрации, экстракции, распылительной сушки, выпаривания или осаждения. В одном аспекте извлекают ферментативный бульон, содержащий полипептид.
Protein Purification
Полипептид можно очистить с помощью ряда методик, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и эксклюзионной хроматографии), электрофоретических методик (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждения сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, , Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением практически чистых полипептидов.
В альтернативном аспекте полипептид не извлекают, а вместо этого в качестве источника полипептида используют клетку-хозяина согласно настоящему изобретению, экспрессирующую полипептид.
Растения
Настоящее изобретение также относится к выделенным растениям, например, трансгенным растению, части растения или растительной клетке, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению с тем, чтобы экспрессировать и продуцировать полипептид или домен в извлекаемых количествах. Полипептид или домен можно извлечь из растения или части растения. В качестве альтернативы растение или часть растения, содержащие полипептид или домен, можно применять без дополнительной очистки для улучшения качества пищи или корма, например, улучшения пищевой ценности, вкусовой привлекательности и реологических свойств, или для устранения фактора, препятствующего усвоению питательных веществ.
например
Трансгенное растение может иметь две семядоли (двудольное) или одну семядолю (однодольное). Примерами однодольных растений являются злаковые растения, такие как мятлик (мятлик луговой, Poa), кормовая трава, такая как Festuca, Lolium, трава умеренной климатической зоны, такая как Agrostis, и зерновые растения, , пшеница, разновидности овса, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза).
Настоящее изобретение также относится к способам получения полипептида или домена по настоящему изобретению, включающим (a) культивирование трансгенных растения или растительной клетки, содержащих полинуклеотид, кодирующий полипептид или домен в условиях, благоприятных для выработки полипептида или домена; и (b) выделение полипептида или домена.
Составы ферментационного бульона или клеточные композиции
Настоящее изобретение также относится к составу ферментационного бульона или клеточным композициям, содержащим полипептид по настоящему изобретению. Продукт в виде ферментационного бульона дополнительно содержит дополнительные ингредиенты, применяемые в процессе ферментации, такие как, например, клетки (в том числе клетки-хозяева, содержащие ген, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, которые применяют для получения полипептида, представляющего интерес), клеточный дебрис, биомассу, ферментационную среду и/или продукты ферментации. В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой цельный бульон с погибшими клетками, содержащий органическую кислоту(кислоты), погибшие клетки и/или клеточный дебрис и среду культуры.
например
например
например
Термин "ферментационный бульон", применяемый в данном документе, относится к препарату, получаемому посредством клеточной ферментации, который не подвергается или подвергается минимальному извлечению и/или очистке. Например, ферментационные бульоны получают, когда микробные культуры выращивают до насыщения, инкубируют в углерод-ограничивающих условиях для обеспечения синтеза белка (, экспрессии ферментов клетками-хозяевами) и секреции в среду культуры клеток. Ферментационный бульон может содержать нефракционированные или фракционированные составляющие ферментационных материалов, образованных в конце ферментации. Как правило, ферментационный бульон является нефракционированным и содержит истощенную среду культуры и клеточный дебрис, присутствующий после удаления микробных клеток (, клеток нитчатых грибов), , посредством центрифугирования. В некоторых вариантах осуществления ферментационный бульон содержит истощенную среду культуры клеток, внеклеточные ферменты и жизнеспособные и/или нежизнеспособные микробные клетки.
В одном варианте осуществления состав ферментационного бульона и клеточные композиции содержат первый компонент на основе органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 1-5 атомами углерода и/или ее соль, и второй компонент на основе органической кислоты, содержащий по меньшей мере одну органическую кислоту с 6 или более атомами углерода и/или ее соль. В конкретном варианте осуществления компонент первой органической кислоты представляет собой уксусную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, ее соль или смесь двух или более из приведенных выше кислот и компонент второй органической кислоты представляет собой бензойную кислоту, циклогексанкарбоновую кислоту, 4-метилвалериановую кислоту, фенилуксусную кислоту, ее соль или смесь двух или более из приведенных выше кислот.
В одном аспекте композиция содержит органическую кислоту(кислоты) и необязательно дополнительно содержит погибшие клетки и/или клеточный дебрис. В одном варианте осуществления погибшие клетки и/или клеточный дебрис удаляют из цельного бульона с погибшими клетками с получением композиции, которая не содержит данные компоненты.
например
Составы ферментационного бульона или клеточные композиции могут дополнительно содержать консервант и/или противомикробное средство (, бактериостатическое средство), в том числе без ограничения сорбит, хлорид натрия, сорбат калия и другие, известные из уровня техники.
например
Цельный бульон с погибшими клетками или композиция могут содержать нефракционированные составляющие ферментационных материалов, образованных в конце ферментации. Как правило, цельный бульон с погибшими клетками или композиция содержат истощенную среду культуры и клеточный дебрис, присутствующие после выращивания до насыщения микробных клеток (, клеток нитчатых грибов), инкубированных в углерод-ограничивающих условиях с обеспечением синтеза белка. В некоторых вариантах осуществления цельный бульон с погибшими клетками или композиции содержат истощенную среду культуры клеток, внеклеточные ферменты и погибшие клетки нитчатых грибов. В некоторых вариантах осуществления микробные клетки, присутствующие в цельном бульоне с погибшими клетками или композиции, могут быть пермеабилизированы и/или лизированы с применением способов, известных из уровня техники.
Цельный бульон или клеточная композиция, описанные в данном документе, обычно представляют собой жидкость, но могут содержать нерастворимые компоненты, такие как погибшие клетки, клеточный дебрис, компоненты среды культуры и/или нерастворимый(нерастворимые) фермент(ферменты). В некоторых вариантах осуществления нерастворимые компоненты можно удалять с получением осветленной жидкой композиции.
Составы на основе цельного бульона и клеточные композиции по настоящему изобретению могут быть получены посредством способа, описанного в WO 90/15861 или WO 2010/096673.
Композиции, содержащие липолитический фермент согласно данному изобретению
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим липолитический фермент согласно данному изобретению.
Композиция может дополнительно содержать один или несколько дополнительных ферментов, в частности, один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из аминопептидазы, амилазы, альфа-амилазы, мальтогенной альфа-амилазы, бета-амилазы, карбоксипептидазы, каталазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстрин гликозилтрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, галактаназы, глюканазы, альфа-галактозидазы, бета-галактозидазы, глюкоамилазы, альфа-глюкозидазы, бета-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, маннаназы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитических ферментов, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фосфолипазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглютаминазы и ксиланазы; особенно мальтогенную альфа-амилазу.
Композиции можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники, и они могут быть в любом физическом состоянии, таком как жидком, пастообразном или твердом. Например, композицию можно составлять, используя способы, известные в области составления композиций ферментов и/или фармацевтических продуктов, например, в виде гранул с покрытием или без покрытия или микрогранул.
Липолитический фермент согласно данному изобретению и, необязательно, любые дополнительные ферменты, которые должны войти в композицию, можно стабилизировать в соответствии со способами, известными в области техники, например, путем стабилизации полипептида в композиции введением антиоксиданта или восстановителя, чтобы ограничить окисление полипептида, или его можно стабилизировать добавлением полимеров, таких как ПВП, ПВА, ПЭГ или других подходящих полимеров, которые известны своим благоприятным влиянием на стабильность полипептидов в твердых или жидких композициях.
При составлении рецептур с липолитическим ферментом согласно данному изобретению в виде гранулята или агломерированного порошка, частицы, как правило, имеют узкое распределение по размерам с более чем 95% (по весу) частиц с размером в интервале от 25 до 500 микрометров.
Грануляты и агломерированные порошки можно приготовлять традиционными способами, например, распылением липолитического фермента на носитель в грануляторе с псевдоожиденным слоем. Носитель может состоять из ядер частиц, имеющих подходящий размер частиц. Носитель может быть растворимым или нерастворимым, например, солью (такой как NaCl или сульфат натрия), сахаром (таким как сахароза или лактоза), сахарным спиртом (таким как сорбит), крахмалом, рисом, кукурузной крупой или соей. Композиция предпочтительно имеет форму сухого порошка или гранулята, в частности непылящего гранулята.
Следовательно, в изобретении также предложен гранулят или стабилизированная жидкость, содержащие липолитический фермент согласно данному изобретению.
Дополнительные ферменты
Необязательно, один или несколько дополнительных ферментов, таких как аминопептидаза, амилаза, альфа-амилаза, мальтогенная альфа-амилаза, бета-амилаза, карбоксипептидаза, каталаза, хитиназы, кутиназа, циклодекстрин-гликозилтрансфераза, дезоксирибонуклеаза, эстераза, галактаназа, глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролаза, глюканаза, альфа-галактозидаза, бета-галактозидаза, глюкоамилаза, альфа-глюкозидаза, бета-глюкозидаза, галопероксидаза, инвертаза, лакказа, маннаназа, маннозидаза, оксидаза, пектинолитические ферменты, пептидоглутаминаза, пероксидаза, фосфолипаза, фитаза, полифенолоксидаза, протеолитический фермент, рибонуклеаза, трансглютаминаза и/или ксиланаза, могут применяться вместе в липолитическим ферментом согласно данному изобретению.
A. niger
A. awamori
A. oryzae
Глюкоамилаза для применения в настоящем изобретении включает глюкоамилазы, последовательность которых по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности  G1 или G2 глюкоамилазы (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102),  глюкоамилазы, раскрытой в WO 84/02921, или  глюкоамилазы (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949).
B. stearothermophilus
Bacillus
B. licheniformis
B. amyloliquefaciens
Bacillus
A. oryzae
Амилаза может быть грибковой или бактериальной, например, мальтогенная альфа-амилаза из или альфа-амилаза из , например, или , бета-амилаза, например, из растения (например, сои) или из микробных источников (например, ), или грибковой альфа-амилазой, например, из .
Мальтогенная альфа-амилаза может также быть мальтогенной альфа-амилазой, как раскрыта, например, в WO1999/043794; WO2006/032281; или WO2008/148845.
Пригодными мальтогенными альфа-амилазами, поступающими в продажу, являются NOVAMYL, OPTICAKE 50 BG и OPTICAKE 3D (можно приобрести у Novozymes A/S). Пригодными поступающими в продажу композициями, включающими грибковые мальтогенные альфа-амилазы, являются, например, BAKEZYME P 300 (можно приобрести у DSM) и FUNGAMYL 2500 SG, FUNGAMYL 4000 BG, FUNGAMYL 800 L, FUNGAMYL ULTRA BG и FUNGAMYL ULTRA SG (можно приобрести у Novozymes A/S).
Pseudomonas
Амилазой, препятствующей черствению, может также быть амилаза (глюкан-1,4-альфа-мальтотетрагидролаза (EC 3.2.1.60)) из, например, , такая как любая из амилаз, раскрытых в WO1999/050399, WO2004/111217 или WO2005/003339.
Aspergillus niger
Глюкозооксидаза может быть грибковой глюкозооксидазой, в частности, глюкозооксидазой из  (такой как GLUZYME, которую можно приобрести у Novozymes A/S).
Aspergillus
A. aculeatus, A. niger
A. Awamori
A. tubigensis
Trichoderma
T. reesei
Humicola
H. insolens
Гемицеллюлаза может быть пентозаназой, например, ксиланазой, которая может быть микробного происхождения, например, получена из бактерии или гриба, такого как  штамм, в частности, ,  или , из штамма , например, , или из штамма , например, .
Пригодными поступающими в продажу рецептурами, включающими ксиланазу, для применения в настоящем изобретении являются PANZEA BG, PENTOPAN MONO BG и PENTOPAN 500 BG (можно приобрести у Novozymes A/S), GRINDAMYL POWERBAKE (можно приобрести у DuPont) и BAKEZYME BXP 5000 и BAKEZYME BXP 5001 (можно приобрести у DSM).
Bacillus
B. Amyloliquefaciens,
Thermus aquaticus
Протеаза может быть из , например, или из .
Тесто
В одном аспекте в данном изобретении предложен способ приготовления теста или хлебобулочного изделия из теста, который включает введение в тесто липолитического фермента согласно данному изобретению.
В другом аспекте в данном изобретении предложено тесто, содержащее муку, воду и эффективное количество пекарской композиции или полуфабрикатной смеси, содержащей липолитический фермент согласно данному изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способам приготовления теста или хлебобулочного изделия, включающие в себя введение в тесто эффективного количества пекарской композиции настоящего изобретения, которая улучшает одно или несколько свойств теста или хлебобулочного изделия, полученного из теста, по сравнению с тестом или хлебобулочным изделием, в которые не введен липолитический фермент.
Фраза ʺвведение в тестоʺ в данном контексте означает добавление пекарской композиции согласно данному изобретению в тесто, к любому ингредиенту, из которого должно быть изготовлено тесто, и/или к любой смеси ингредиентов теста, из которых должно быть изготовлено тесто. Другими словами, пекарскую композицию согласно данному изобретению можно добавлять на любой стадии получения теста и можно добавлять на одной, двух или более стадиях. Композицию добавляют к ингредиентам теста, которое замешивают и выпекают для изготовления хлебобулочного изделия, применяя способы, хорошо известные в данной области.
Термин "эффективное количество" в данном контексте означает количество пекарской композиции согласно данному изобретению, которое достаточно для обеспечения измеряемого воздействия на по меньшей мере одно интересующее свойство теста и/или хлебобулочного изделия.
Термин ʺтестоʺ определен в данном документе как смесь муки и других ингредиентов, достаточно плотная для замешивания или раскатывания. В контексте настоящего изобретения жидкое тесто охватывается термином "тесто".
Тесто данного изобретения может содержать муку, полученную из любого зерна злаков или других источников, включая пшеницу, пшеницу-двузернянку, полбу, пшеницу-однозернянку, ячмень, рожь, овес, кукурузу, сорго, рис, просо, ширицу, квиною и маниоку.
Тесто также может содержать другие традиционные ингредиенты теста, например, белки, такие как сухое молоко, глютен и соя; яйца (или цельные яйца, или яичные желтки, или яичные белки); окислитель, такой как аскорбиновая кислота, бромат калия, йодат калия, азодикарбонамид (ADA) или персульфат аммония; аминокислоту, такую как L-цистеин; сахар; соль, такую как хлорид натрия, ацетат кальция, сульфат натрия или сульфат кальция и/или эмульгатор.
Тесто может содержать жир (триглицерид), такой как гранулированный жир или саломас.
Тесто по данному изобретению может быть свежим, замороженным или частично выпеченным (предварительно выпеченным).
Тесто по данному изобретению обычно представляет собой заквашенное тесто или тесто, подлежащее разрыхлению.
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae
Тесто можно разрыхлять различными способами, например, путем добавления химических разрыхлителей, например, пекарского порошка, бикарбоната натрия, или путем добавления закваски (заквашивание теста), но предпочтительно разрыхлять тесто путем добавления подходящей дрожжевой культуры, такой как культура (пекарские дрожжи), например, коммерчески доступного штамма .
Липолитический фермент согласно данному изобретению может в значительной степени не изменять объем хлебобулочного изделия, в частности, объем батона; как правило, объем может увеличиться или уменьшиться на 0-5%.
Содержание липолитического фермента согласно данному изобретению может составлять 0,01-100 мг белка фермента на кг муки в тесте, в частности, 0,05-50 мг белка фермента на кг муки, в частности, 0,1-25 мг белка фермента на кг муки, в частности, 0,1-15 мг белка фермента на кг муки в тесте.
Эмульгаторы
Для некоторых применений эмульгатор не требуется; для некоторых применений эмульгатор может потребоваться.
Подходящим эмульгатором для применения в настоящем изобретении предпочтительно является эмульгатор, выбранный из группы, состоящей из сложные эфиры моноглицеридов диацетил-винной кислоты (DATEM), стеароиллактилат натрия (SSL), стеароиллактилат кальция (CSL), этоксилированные моно- и диглицериды (EMG), дистиллированные моноглицериды (DMG), полисорбаты (PS) и сукцинилированные моноглицериды (SMG).
В некоторых применениях липолитический фермент согласно настоящему изобретению заменяет весь/все эмульгатор(ы), обычно присутствующие в рецептуре теста.
Улучшители хлеба и/или кондитерские смеси или полуфабрикаты
Липолитический фермент согласно данному изобретению может быть полезно включать в состав улучшителя хлеба или кондитерской смеси или полуфабриката.
"Улучшители хлеба" (также называемые "кондиционирующая добавка для теста" или "улучшители теста" или "средства-улучшатели" или "вещества для обработки муки") обычно добавляют в тесто для улучшения консистенции, структуры, объема, вкуса и сохранения свежести хлебобулочного изделия, а также для улучшения обрабатываемости и стабильности теста.
Обычно улучшители хлеба содержат или состоят из: одного или нескольких ферментов (таких как, например, амилазы (альфа-амилазы, бета-амилазы, глюкоамилазы, амилазы, разлагающие сырой крахмал), ксиланазы (гемицеллюлазы), целлюлазы, пектиназы, протеазы, пектатлиазы, оксидазы (пероксидазы, глюкозооксидаза, пиранозооксидазы, гексозооксидазы, оксидазы L-аминокислот, оксидазы углеводов, сероводородные оксидазы), липоксигеназы, дегидрогеназв, лакказы, трансглютаминазы, ацилтрансферазы, белок дисульфидизомеразы), один или несколько окислителей или восстановителей (таких как, например, аскорбиновая кислота, глутатион, цистеин), один или несколько эмульгаторов (таких как, например, сложные эфиры моноглицеридов диацетил-винной кислоты (DATEM), стеароиллактилат натрия (SSL), стеароиллактилат кальция (CSL), моностеарат глицерина (GMS), моносахариды, лецитины, сложные эфиры сахарозы, соли желчных кислот), один или несколько жировых материалов (таких как, например, сливочное масло, растительное масло, саломас), один или несколько сахаров, один или несколько типов муки или фракций муки, один или несколько витаминов (таких как, например, витамин В5 и витамин E), одну или несколько смол, и/или один или несколько источников волокон (таких как, например, овсяные волокна).
Смеси для кексов (кондитерские) обычно содержат все ингредиенты рецептуры кекса, за исключением воды, жира (растительного масла, сливочного масла, маргарина) и яиц. Яйца можно добавлять в смеси для кексов (кондитерскую) в порошкообразном виде. Смеси для кексов (кондитерские) обычно являются такими смесями для кексов, из которых удалена вся мука или сахар или их часть.
Хлебобулочные изделия
Способ данного изобретения может применяться для любого типа хлебобулочного изделия, изготовленного из теста, особенно мягкого теста, любого типа, т.е. белого, светлого или темного. Примерами являются хлеб (в частности, белый, цельнозерновой или ржаной), как правило, в виде буханок, булочек, батонов, лавашей, кексов, блинов, печенья, вафель, мягкого печенья, пирогов, парового хлеба, пиццы и т.п.
Настоящее изобретение дополнительно описано с помощью следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Клонирование, экспрессия и ферментация липолитического фермента согласно данному изобретению
Valsaria rubricosa
Кат. № 6560-200 от компании MP Biochemicals
Геномную ДНК извлекали из штамма , используя Fast DNA Spin в наборе для грунта () и следуя инструкции производителя.
Valsaria rubricosa
Штамм  извлекли из грунта в Hunan, Китай, в 2002 г.
Как известно в области техники, SEQ ID NO: 1 и 2 амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК, используя прямого и обратного праймера (SEQ ID NO: 3 и 4).
SEQ ID NO: 1
(сигнальный пептид: 1-20):
MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAAAAYCPDNNDSPDTKLTCSVGNCPLVEADTTSTVTEFENSLETDVTGYVATDSTRELIVVAFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWTSWTEARTGVLAAVASAAAANPSYTVAVTGHSLGGAVAALAAGALRNAGYTVALYSFGAPRVGDETLSEYITAQAGGNYRITHLNDPVPKLPPLLLGYRHISPEYYISSGNNVTVTADDVEEYTGTINLSGNTGDLTFDTDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV
SEQ ID NO: 2:
ATGAAGTCCGCTTCGATCTTACTCAGGGTAGCTGCCCTCCTCCTCCCTGCTGTATCTGCACTGCCACTTGAAAGAAGAGGTATGGACGAACTATCCTAGCGATCAGTGTGTCTATTTTGCCTAACCTAGCAAAGCTATATCCGCGGATCTCCTGGCAACCTTCAGCCTCTTCGAGCAGTTCGCAGCCGCAGCATATTGTCCGGATAACAACGACAGTCCCGACACCAAGCTTACTTGCTCTGTCGGAAACTGCCCGCTTGTCGAAGCTGACACGACCAGCACGGTCACTGAATTCGAAAAGTACATCTTACACGACCCCGTTCACCTACAGACAAAGTCCCAGCTAACGTCCACCTCTATCTCTGTCCCTTTAGCTCGCTCGAAACCGACGTCACTGGCTACGTCGCGACTGACAGCACACGAGAGCTCATCGTTGTGGCATTCCGCGGGAGTTCCTCGATCCGGAACTGGATCGCCGACATCGACTTTCCCTTCACCGACACCGACCTCTGCGATGGCTGCCAGGCAGCCTCGGGCTTCTGGACGTCCTGGACGGAGGCACGGACAGGGGTGCTGGCGGCGGTGGCGAGCGCTGCCGCGGCCAACCCGTCCTATACCGTTGCCGTGACGGGCCACAGCCTCGGCGGGGCCGTGGCCGCGCTGGCCGCTGGCGCCCTCCGGAACGCGGGCTACACGGTCGCGCTATACAGCTTCGGAGCGCCTCGCGTGGGTGACGAGACCCTCAGCGAGTACATCACTGCGCAGGCGGGTGGAAACTACCGCATCACGCACCTCAACGACCCAGTGCCGAAGCTGCCCCCGCTGCTCCTGGGGTATCGCCACATCAGCCCGGAATACTACATCAGCAGCGGGAACAACGTGACCGTGACGGCGGATGACGTGGAGGAGTACACCGGCACGATCAACCTGAGTGGGAACACGGGCGATCTGACGTTCGACACGGATGCGCACAGTTGGTACTTCAACGAGATCGGGGCATGCGATGATGGTGAGGCTTTGGAGTGGAAGAAGCGGGGGGTAGAAGTTCAGTGGGTTTAA
SEQ ID NO: 3 (праймер):
5' ACACAACTGGGGATCCACCATGAAGTCCGCTTCGATCTTACTCAGG -3'
SEQ ID NO: 4 (праймер):
5' AGATCTCGAGAAGCTTAAACCCACTGAACTTCTACCCCCC -3'
Bam
Hind
Продукт ПЦР очищали с применением набора для очистки ДНК из полоски геля после проведения ПЦР ILLUSTRA™ GFX™ (GE Healthcare,  Дания) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенный продукт ПЦР, соответствующий SEQ ID NO:2, клонировали в вектор экспрессии pDAu109 (WO 2005/042735), который перед этим приводили в линейную форму с помощью  HI и  III, используя набор для ПЦР-клонирования IN-FUSION™ (BD Biosciences, Пало Альто, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Aspergillus oryzae
1 мкл неразведенной смеси для лигирования использовали для трансформации клеток Multi shot TOP 10 Chemical Competent Cells кат. № 44-0091, полученные от Invitrogen. Отбирали одну колонию в чашке с LB агаровой средой, содержащей 100 мкг ампициллина на мл, и культивировали в течение ночи в 2 мл LB среды, дополненной 100 мкг ампициллина на мл. Плазмидную ДНК очищали, используя набор Jetquick Plasmid Miniprep Spin Kit (Genomed GmbH,  Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательность SEQ ID NO:2 подтверждали с помощью секвенирования по Сэнгеру перед гетерологичной экспрессией. Одну плазмиду (содержащую ген с SEQ ID NO: 2) отбирали для гетерологичной экспрессии в клетках-хозяевах .
A. oryzae
Aspergillus oryzae
A. oryzae
Aspergillus oryzae
Клетка-хозяин  MT3568 представляет собой производное  JaL355 (WO 2002/40694) с разрушенным геном amdS (ацетамидаза), в котором аксотрофия по pyrG была восстановлена путем разрушения гена ацетамидазы (amdS) геном pyrG в. Протопласты  получали согласно описанию в WO 95/002043.
Aspergillus oryzae
Aspergillus
Valsaria rubricosa.
2
Сто мкл протопластов  смешивали с 1-2 мкг вектора экспрессии  с клонированным SEQ ID: 2 геном, и 250 мкл 60%-ного ПЭГ 4000 (Applichem, Дармштадт, Германия) (полиэтиленгликоль с молекулярным весом 4000), 10 мM CaCl и 10 мM Tris-HCl pH 7,5 осторожно перемешивали. Через 30 мин инкубирования при 37°C, добавляли 4 мл верхнего агара (темп. 40°C), и протопласты распределяли на планшеты COVE для проведения отбора. После инкубирования в течение 4-7 суток при 37°C споры четырех трансформантов высевали на 0,5 мл среды DAP-4C-01 в 96-луночные планшеты с глубокими лунками. Через 4-5 дней культивирования при 30°C, культуральные бульоны анализировали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза, чтобы выявить трансформанты, продуцирующие наибольшее количество рекомбинантного белка из
Споры наилучшего трансформанта с последовательностью гена SEQ ID NO:2 распределяли на поверхности планшетов COVE, содержащих 0,01% TRITON X-100 с целью выделения отдельных колоний. Распределение по поверхности повторяли еще раз перед сохранением клонов.
Ферментация с целью очистки
Aspergillus oryzae
Трансформант , сконструированный согласно описанию выше, подвергали ферментации в 150 мл DAP-4C-01 среды в 500 мл рифленых встряхиваемых колбах, инкубировали при 30°C в качающейся платформе-инкубаторе, вращающейся со скоростью 150 об/мин в течение 3-5 дней, и затем анализировали, как описано ниже.
Используемые среды
Содержимое чашек с LB состояло из 10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г хлорида натрия, 15 г бактоагара и деионизированной воды в объеме до 1 литра.
Среда LB состояла из 10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, и 10 г хлорида натрия с добавлением деионизированной воды до 1 литра.
DAP-4C-1
11 г MgSO4,7H2O
1 г KH2PO4
2 г C6H8O7,H2O
20 г декстрозы
10 г мальтозы
5,2 г K3PO4,H2O
0,5 г экстракта дрожжей
0,5 мл KU6 раств. микропримесей металлов (AMG) (MSA-SUB-FS-0042)
Перемешивание до полного растворения
Добавляли 1 мл Dowfax 63N10
Доведение объема до 1000 мл с помощью Milli-Q-воды
CaCO3 табл. по 0,5 г (добавить 1 табл./200 мл)
Перед посевом в каждую встряхиваемую колбу по 150 мл добавляли 3,5 мл диаммония гидрофосфат (NH4)2HPO4 50% и 5,0 мл молочной кислоты 20%.
KU6 раств. микропримесей металлов (AMG) (MSA-SUB-FS-0042)
2
6,8 г ZnCl
4
2
2,5 г CuSO.5HO
0,13 г хлорида никеля, безводного
2
13,9 г FeSO4.7HO
4
2
8,45 г MnSO.HO
6
8
7
2
3 г CHO.HO
Вода, полученная с помощью ионообмена, до 1000 мл
Содержимое чашек с сахарозой COVE состояло из 342 г сахарозы, 20 г порошка агара, 20 мл солевого раствора COVE и деионизированной воды в объеме до 1 литра. Среду стерилизовали в автоклаве при давлении 15 фунт/кв. дюйм в течение 15 минут (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A, 1998). Среду охлаждали до 60°C и добавляли 10 мМ ацетамида, TRITON X-100 (50 мкг/500 мл).
4
2
2
4
Солевой раствор COVE состоял из 26 г MgSO⋅7HO, 26 г KCL, 26 г KHPO, 50 мл раствора металлов COVE, содержащихся в следовых количествах, и деионизированной воды до 1 литра.
2
4
7
2
4
2
4
2
4
2
2
4
2
4
2
Раствор металлов COVE, содержащихся в следовых количествах, состоял из 0,04 г NaBO⋅10HO, 0,4 г CuSO⋅5HO, 1,2 г FeSO⋅7HO, 0,7 г MnSO⋅HO, 0,8 г NaMoO⋅2HO, 10 г ZnSO⋅7HO и деионизированной воды до 1 литра.
Признаки SEQ ID NO: 1:
Липолитический фермент (SEQ ID NO:1) содержит типичный фрагмент липолитического фермента с каталитической триадой, выраженной в пентапептиде: G-H-S-L-G.
Липолитический фермент (SEQ ID NO:1) согласно данному изобретению был активен по отношению к трибутирину, MGDG (моногалактозилдиацилглицерину), DGDG (дигалактозилдиацилглицерину), APE (N-ацил-фосфатидилэтаноламину) и ALPE (N-ацил-лизо-фосфатидилэтаноламину), что говорит о липазной активности (трибутирин), фосфолипазной активности (APE/ALPE) и галактолипазной активности (MGDG/DGDG) фермента.
pH профиль активности последовательности SEQ ID NO:1
:
Очищенный SEQ ID NO:1 разбавляли, используя 0,5, 0,125, 0,031 и 0,0078 мг белка фермента/мл и 0,01% Triton X-100.
20 мкл разбавленных образцов фермента смешивали с 40 мкл pH буфера (0,1 M ацетата натрия, 0,1 M фосфата натрия, 1 мM CaCl2, доведенного до pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, используя NaOH/HCl) и 40 мкл раствора субстрата в оливковом масле (12,5 мг/мл оливкового масла, 0,1% гуммиарабика, 1,5 мM CaCl2, гомогенизированного с помощью Ultra Turrax) в лунках 96-луночного микротитровального планшета.
После инкубирования при 37°C в течение 30 мин в Eppendorf Thermomixer, реакцию останавливали добавлением 10 мкл стоп-реагента (1 M фосфорной кислоты, 10% Triton X-100) и перемешиванием.
Концентрацию высвободившихся несвязанных жирных кислот из субстрата оливкового масла затем определяли количественно, используя набор NEFA kit (Wako Diagnostics): 100 мкл R1 реагента из набора (Wako NEFA-HR (2) R1 SET, 434-91795) смешивали с 25 мкл реакционного объема, и считывали поглощение при 546 нм в считывающем устройстве для планшетов SpectraMax Plus. Затем добавляли 50 мкл R2 реагента из набора (Wako NEFA-HR (2) R2 SET, 436-91995) и после 20 мин инкубирования при комнатной температуре (при встряхивании) снова считывали поглощение при 546 нм. Из разности этих двух значений вычисляли концентрацию несвязанных жирных кислот, используя результаты стандартной кривой для олеиновой кислоты (1, 0,5, 025, 0,125, 0,0625, 0,03125 и 0 мM олеиновой кислоты). Концентрации липазы, дающие ответы в линейном диапазоне, использовали для расчета активности при каждом рН. В Таблице А приведены активности по отношению к активности при рН4 (оптимальный рН).
Таблица А: pH профиль активности последовательности SEQ ID NO:1:
pH
Активность SEQ ID NO:1<u></u>относительно активности при pH 4 (%)
2
0,8
3
9,4
4
100
5
60,6
6
4,7
7
0,3
8
0,0
9
0,1
Пример 2
Образцы хлеба готовили по обычной рецептуре хлеба смешиванием следующих ингредиентов (количество теста подбирали так, чтобы оно соответствовало исследованию выпечки):
Пшеничная мука
(мука Crousti, Dossche Mills, Deinze, Бельгия) 1000 г
Водопроводная вода 570 г
Сахароза 60 г
Дрожжи 30 г
Рапсовое масло 20 г
Соль 19 г
Пропионат кальция 5 г
Аскорбиновая кислота 40 м.д.
Novamyl 10.000BG™ (Novozymes A/S) 40 м.д.
Panzea Dual™ (Novozymes A/S) 25 м.д.
Готовили следующие образцы теста и из каждого приготовляли 3 образца хлеба. Soft'r Silk представляет собой коммерческий DMG продукт, изготавливаемый компанией Puratos NV (Groot-Bijgaarden, Бельгия), который использовали в качестве образца действия коммерческих DMG продуктов. Soft'r Silk дозировали в соответствии с содержанием муки.
Таблица 1. Доза фермента:
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Контроль
-
1% Soft'r Silk
-
SEQ ID NO:1
0,4
SEQ ID NO:1
1,0
Тесто готовили, смешивая ингредиенты в спиральном смесителе (Diosna SP12, Dierks & Söhne, Оснабрюк, Германия) в течение 2 минут на низкой скорости (17 об/мин) и 7 мин на высокой скорости (35 об/мин). После перемешивания тесто оценивали перед взвешиванием (600 г). Взвешенному тесту давали расстояться еще 15 минут перед раскатыванием. Раскатанное тесто помещали в открытые стальные формы объемом 2200 мл (габаритные размеры: 260 мм(длина) × 125 мм(ширина) × 80 мм(высота)) и расстаивали в течении 90 мин при 35°C, относительная влажность 86%.
После расстаивания тесто выпекали в настольной духовке (Wachtel Piccolo, Wachtel GmbH, Хильденд, Германия) в течение 25 мин при 230°C. В духовке используются короткие впрыски пара в начальной стадии выпечки. Испеченный хлеб вынимали из форм и давали охладиться при комнатной температуре в течение 2 часов. Объем образцов хлеба определяли, используя лазерное сканирующее устройство Volscan Profiler 600 (Stable Micro Systems, Суррей, Великобритания). Затем образцы хлеба упаковывали в атмосфере азота в герметично закрытые пластиковые мешки (PA/PE, 90 мкм).
Через два дня хранения при комнатной температуре из середины каждого образца вырезали два куска хлеба электрической ломтерезкой (Graef Master M182 Slicer, Graef & Co GmbH, Арнсберг, Германия). На срезе каждого куска проводили одно измерение, используя прибор с C-ячейкой, применяя программу системы анализа изображения C-ячейки, вариант 2.0 (Calibre Control International Ltd, Уоррингтон, Великобритания).
В С-ячейке используется изображение с высоким разрешением и регулируемым освещением образца для получения оптимального качества изображения. Целый срез анализируют, получая данные с 48 значениями и 5 обработанных изображений, которые отражают определенные признаки образца. Белизну мякиша можно оценить по параметру 'яркость среза'. Измерение яркости представляет собой средний уровень серого цвета всех пикселей на срезе.
Более тонкая структура мякиша даст более высокое значение 'яркости среза'.
Таблица 2. Данные об объеме хлеба
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Объем хлеба (мл/г)
Контроль
-
5,45
1% Soft'r Silk
5,18
SEQ ID NO:1
0,4
5,64
SEQ ID NO:1
1,0
5,28
Таблица 3. Значения 'яркости среза' для исследованных образцов.
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Параметр С-ячейки 'яркость среза'
Контроль
-
144
1% Soft'r Silk
148,6
SEQ ID NO:1
0,4
147,4
SEQ ID NO:1
1,0
149,7
Из Таблицы 3 видно, что благодаря применению липолитического фермента согласно данному изобретению, яркость на срезе выше, чем у контрольного образца, а также лучше, чем 1% Soft'r Silk при использовании 1 мг липолитического фермента на кг муки.
Пример 3
Образцы хлеба готовили также, как в Примере 2, за исключением того, что муку King Midas Special (Ardent Mills Corp. Денвер, Колорадо, США) использовали вместо муки Crousti, и 600 г воды добавляли вместо 570 г воды, добавляемой в Примере 2. Также, это исследование не включало контрольный образец, но использовали только сравнительный образец с 1% Soft'r Silk.
Таблица 4. Доза фермента
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
1% Soft'r Silk
-
SEQ ID NO:1
0,4
SEQ ID NO:1
1,0
Таблица 5. Данные об объеме хлеба
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Объем хлеба (мл/г)
1% Soft'r Silk
5,42
SEQ ID NO:1
0,4
5,27
SEQ ID NO:1
1,0
5,68
Таблица 6. Значение 'яркости среза' исследованных образцов.
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Параметр С-ячейки 'яркость среза'
1% Soft'r Silk
-
151,1
SEQ ID NO:1
0,4
152,0
SEQ ID NO:1
1,0
153,6
Из Таблицы 6 видно, что благодаря применению липолитического фермента согласно данному изобретению, яркость на срезе выше, чем у 1% Soft'r Silk (как при использовании 0,4 мг, так и при 1,0 мг липолитического фермента на кг муки).
Пример 4
Варианты конструкции
Aspergillus oryzae
SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9 конструировали следующим образом: Выравнивание с SEQ ID NO:1 выполняли по 100 наиболее гомологичным липазам. На основании результатов выравнивания было выбрано несколько положений, в которых SEQ ID NO:1 отличается в среднем от других липаз. В выбранном положении проводили мутацию на аминокислоту, наиболее часто встречающуюся в других липазах. Были сконструированы четыре синтетических гена, кодирующих варианты липазы, и эти гены экспрессировали в .
SEQ ID NO: 6
(сигнальный пептид: 1-20, 13 мутаций по сравнению с SEQ ID NO: 1 в зрелой последовательности):
MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAAAAYCPNNNNSPDTKLTCSQGNCPLVEAATTSTVTEFENSLSTDVTGYVAVDSTRELIVVAFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWTEARTGVTAAVASAAAQNPSYTVVVTGHSLGGAVAALAAGALRNQGYTVALYSFGAPRVGNETLSEYITAQAGGNYRITHLNDPVPKLPPLLLGYRHISPEYYISSGNNVTVTANDVEEYTGTINLSGNTGDLTFDTDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV
SEQ ID NO: 7
(сигнальный пептид: 1-20, 27 мутаций по сравнению с SEQ ID NO:1 в зрелой последовательности):
MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFSLFEQFAAAAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVEAATTNTVTEFENSLSTDVTGYVAVDSTNELIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWTEARTTVTAAVAQAAAQNPSYQVVVTGHSLGGAIAALAAGALRNQGYTVDLYSFGAPRVGNETLSEYITNQAGGNYRITHLNDPVPKLPPLLMGYRHISPEYYISSGNNVTVTANDVQEYTGTINLQGNTGDLTFDIDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV
SEQ ID NO: 8
(сигнальный пептид: 1-20, 41 мутаций по сравнению с SEQ ID NO:1 в зрелой последовательности):
MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLATFQFFEQYAAAAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVQAATTNTVYEFENSLSTDVTGYVAVDSTNKLIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWLEARTTVTPAVAQARAQNPDYQVVVTGHSLGGAIAALAAGDLRNQGYTVDLYTFGAPRVGNETLSEYITNQAGGNYRITHWNDPVPKLPPLLMGYVHISPEYYISSGNNVTVTANDVQEYTGTINLQGNTGDLTFDIDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV
SEQ ID NO: 9
(сигнальный пептид: 1-20, 56 мутаций по сравнению с SEQ ID NO:1 в зрелой последовательности):
MKSASILLRVAALLLPAVSALPLERRAISADLLDTFQFFEQYAAAAYCPNNNNSPGTKLTCSQGNCPLVQAADTNTVYEFENSLSTDVTGYVAVDHTNKLIVVSFRGSSSIRNWIADIDFPFTDTDLCDGCQAASGFWQSWLEARDTVTPAVYQARAQKPDYQVVVTGHSLGGAIAALAAGDLRNQGYTVDLYTFGAPRVGNSTLSEYITNQPGGNYRVTHWNDPVPKLPPLLMGYVHISPEYYISSPNNVTVTANDVQVYEGVINLQGNEGDLTTDIDAHSWYFNEIGACDDGEALEWKKRGVEVQWV
Пример 5
Выпечка Американского тостового хлеба с различными липолитическими ферментами
Хлеб изготавливали так, как описано в Примере 2.
Липолитические ферменты SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7 добавляли в тесто в количестве 0,4, 1 и 2 мг белка фермента (БФ)/кг муки. Липолитические ферменты получали, как описано в Примере 4.
Измеряли объем хлеба и параметр C-ячейки 'яркость среза'.
Были получены следующие результаты:
Таблица 7.
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Объем хлеба (мл/г)
Параметр С-ячейки 'яркость среза'
Контроль
5,08
138,2
1% Soft'r Silk
4,85
149,5
SEQ ID NO:6
0,4
4,24
145,7
SEQ ID NO:6
1
5,09
144,8
SEQ ID NO:6
2
5,11
139,8
SEQ ID NO:7
0,4
5,07
141,0
SEQ ID NO:7
1
5,23
147,5
SEQ ID NO:7
2
5,10
148,3
Из Таблицы 7 видно, что благодаря применению липолитического фермента (SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7) согласно данному изобретению, яркость на срезе выше, чем у контрольного образца, а у SEQ ID NO:7 она почти такого же порядка, что и у 1% Soft'r Silk.
Пример 6
Выпечка Американского тостового хлеба с различными липолитическими ферментами
Хлеб изготавливали так, как описано в Примере 2.
Липолитические ферменты SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9 добавляли в тесто в количестве 0,4, 1 и 2 мг белка фермента (БФ)/кг муки (SEQ ID NO:8) и 0,4 мг белка фермента (БФ)/кг муки (SEQ ID NO:9). Липолитические ферменты получали, как описано в Примере 4.
Измеряли объем хлеба, L-значения по HunterLab и параметр C-ячейки 'яркость среза'.
HunterLab представляет собой колориметрический спектрофотометрический метод, в котором используется источник света для освещения образца и измеряют световой поток при различных длинах волн. Свет, отраженный образцом, проходит через дифракционную решетку, на которой он расщепляется на спектральные компоненты. Цветовое пространство Hunter Lab представляет собой 3-мерное прямоугольное цветовое пространство, где по оси L (яркости): 0 - это черный, и 100 - это белый. Численное значение соотносится с тем, что вы видите.
Использовали по 2 куска каждого хлеба и измерения проводили на срезе каждого куска один раз, используя методику HunterLab.
Были получены следующие результаты:
Таблица 8.
Образец
Доза липолитического фермента (мг БФ/кг муки)
Объем хлеба (мл/г)
L-значение по HunterLab
Параметр С-ячейки 'яркость среза'
Контроль
5,17
79,6
134,7
1% Soft'r Silk
5,15
82,3
145,8
SEQ ID NO:8
0,4
5,36
80,2
140,6
SEQ ID NO:8
1
5,25
81,3
143,2
SEQ ID NO:8
2
5,24
80,3
140,6
SEQ ID NO:9
0,4
5,38
81,3
141,1
Из Таблицы 8 видно, что благодаря применению липолитического фермента (SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9) согласно данному изобретению, яркость на срезе и /HunterLab L значения выше, чем у контрольного образца. Из этого заключаем, что и SEQ ID NO:8, и SEQ ID NO:9 придают мякишу белизну.
Пример 7
Мягкие печенья без неприятного привкуса
Мягкое печенье приготовляли, используя ингредиенты, указанные в Таблице 9.
Таблица 9: ингредиенты мягкого печенья
Рецептура (г)
A
B
C
Tegral Patacrout* (Puratos, Бельгия)
400
400
400
Яйцо
40
40
40
Сливочное масло
160
160
160
Lipopan 50 (Novozymes A/S)
0,04
SEQ ID NO:1 (мг БФ)**
0,92
* Содержит пшеничную муку, сахар, пшеничный глютен, пекарский порошок (дифосфат динатрия)
** 0,92 мг (белка фермента с SEQ ID NO:1) вносили на 400 г Tegral Patacrout
Способ приготовления:
Ингредиенты смешивали в миксере Hobart в течение 2 мин на 1-ой скорости. Тесто упаковывали в пластиковую пленку и давали расстояться в течение ночи при 25°C.
На следующий день тесто раскатывали между 2-мя листами вощеной бумаги до толщины 2 мм. Вырезали кружки диаметром 6,5 см.
Кружки выпекали в духовке Miwe Condo в течение 11 мин при 180°C. При выпекании пар не вводили.
Анализ мягкого печенья:
Летучие вещества из образца определяли, используя методику микроэкстракции летучих веществ из твердой фазы в сочетании с ГХ-МС. Использовали волокна дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксана (DVB/CAR/PDMS) для экстрагирования летучих компонентов.
Образцы сначала предварительно нагревали в течение 10 мин при 80°C при скорости перемешивания 250 об/мин, а затем проводили экстракцию в течение 30 мин при 80°C при такой же скорости перемешивания.
Анализ ГХ/МС выполняли на газовом хроматографе Agilent 5890A, оборудованном масс-спектрометром 5975C с инертным MSD с детектором Triple-Axis Detector и автоматическим пробоотборником Gerstel MPS, настроенном на автоматический анализ микроэкстракцией летучих веществ из твердой фазы. Отделение анализируемых веществ выполняли в капиллярной колонке RESTEK Stabilwax, 30 м × 0,25 мм × 0,50 мкм толщиной пленки. Колоночную печь программировали в следующем режиме: начальная температура 80°C в течении 10 мин, подъем со скоростью 16°C/мин до 220°C, и выдерживание при 220°C в течение 8 мин. В качестве носителя использовали гелий при постоянном расходе, равном 1 мл/мин. Летучие компоненты идентифицировали сравнением с масс-спектрами из библиотеки NIST MS Search 2.0 library.
Летучие компоненты, а именно, масляная, капроновая, каприловая и каприновая кислоты, вызывают сильный неприятный привкус. В Таблице 8 приведены концентрации масляной, капроновой, каприловой и каприновой кислот.
Таблица 10: Относительная концентрация (площадь пика) летучих компонентов, выявленных в образцах мягкого печенья
A
B
C
Масляная кислота
151,000,000
1191,000,000
243,000,000
Капроновая кислота
398,000,000
2050,000,000
580,000,000
Каприловая кислота
210,000,000
2650,000,000
200,000,000
Каприновая кислота
Не обнаружено
989,000,000
28,100,000
В Таблице 10 показано, что мягкое печенье, изготовленное с использованием коммерческой липазы имеют значительно более высокое содержание масляной, капроновой, каприловой и каприновой кислот по сравнению с мягким печеньем, изготовленным с использованием липолитического фермента согласно данному изобретению.
Соответственно, обученный пекарский персонал не смог определить какой-либо нежелательный привкус в мягком печенье, изготовленном с использованием липолитического фермента согласно данному изобретению, но они смогли распознать сильный привкус в мягком печенье, изготовленном с использованием коммерческой липазы.
Пример 8
Бриоши без неприятного привкуса
Бриоши приготовляли, используя ингредиенты, указанные в Таблице 11.
Таблица 11: ингредиенты бриошей
Рецептура (г)
D
E
F
Мука (мука Crousti, Dossche Mills, Deinze, Бельгия) при 7°C
1500
1500
1500
Вода при 4°C
450
450
450
Дрожжи (растворимые дрожжи Bruggeman Brown)
30
30
30
Соль
24
24
24
Сахар S1
270
270
270
Сливочное масло
225
225
225
Яйцо
300
300
300
AML Brioche (Puratos, Бельгия)*
30
30
30
Lipopan 50 (Novozymes A/S)
1,15
SEQ ID NO:1 (мг БФ)**
3,47
* Содержит пшеничную муку, гидролизованный пшеничный глютен, антиоксидант (аскорбиновую кислоту) и ферменты.
** 3,47 мг (белка фермента с SEQ ID NO:1) вносили на 1500 г муки
Способ приготовления:
Использовали следующий способ приготовления:
Разные ингредиенты смешивали в Diosna SP24 в течение 6 мин на низкой скорости и в течение 11 мин на высокой скорости (жир добавляли только через 4 мин быстрого перемешивания). Конечная температура теста была около 27°C.
Ферментацию в объеме выполняли в течение 10 минут при температуре окружающей среды 25°C.
Масштаб операции - 500 г теста.
Хлеб формировали вручную.
Промежуточное расстаивание проводили в течение 20 мин при 25°C.
Формировали на Jac Unic с R4,5 и L16.
Расстаивание в течение 165 мин при 28°C и 95% относительной влажности в ферментационном помещении Koma.
Выпечка 30 минут при 200°C в духовке Miwe Condo.
Бриошам давали охладиться в течение 90 минут и упаковывали в пластиковые мешки.
Анализ бриошей:
Бриоши анализировали на летучие вещества (те же летучие вещества, что описаны в Примере 4).
В Таблице 12 приведены концентрации масляной, капроновой, каприловой и каприновой кислот.
Таблица 12: Относительная концентрация (площадь пика) летучих компонентов, выявленных в образцах бриошей
D
E
F
Масляная кислота
69,700,000
74,800,000
65,400,000
Капроновая кислота
101,000,000
513,000,000
187,000,000
Каприловая кислота
93,800,000
625,000,000
151,000,000
Каприновая кислота
Не обнаружено
140,000,000
Не обнаружено
В Таблице 12 показано, что бриоши, изготовленные с использованием коммерческой липазы имеют более высокое содержание масляной, капроновой, каприловой и каприновой кислот по сравнению с бриошами, изготовленными с использованием липолитического фермента согласно данному изобретению.
Соответственно, обученный пекарский персонал не смог определить какой-либо нежелательный привкус в бриошах, изготовленных с использованием липолитического фермента согласно данному изобретению, но они смогли распознать сильный привкус в бриошах, изготовленных с использованием коммерческой липазы.
Следует отметить, что в бриошах, изготовленных с использованием ферментов (E и F), получают более мелкую крошку, чем в бриошах, изготовленных с использованием только масла (по мнению обученного пекарского персонала).
Пример 9
Хлеб, полученный с применением фермента согласно данному изобретению
Хлеб приготовляли, используя ингредиенты, указанные в Таблице 13.
Таблица 13: Ингредиенты хлеба
Рецептура (г)
G
H
I
J
Мука (мука Crousti, Dossche Mills, Deinze, Бельгия) при 7°C
1500
1500
1500
1500
Вода при 12°C
810
810
810
810
Свежие дрожжи
45
45
45
45
Соль
28,5
28,5
28,5
28,5
Сахар (сахароза)
90
90
90
90
Рапсовое масло
30
30
30
30
Пропионат кальция
7,5
7,5
7,5
7,5
Улучшитель хлеба (Puratos, Бельгия)*
15
15
15
15
SEQ ID NO:1 (мг БФ)**
3,47
Bakezyme L80000 (DSM, Нидерланды) (мг)
4,2
Amanolipase DF15 (Amano, Япония) (мг)
22,5
* Содержит пшеничную муку, антиоксидант (аскорбиновую кислоту) и ферменты (амилазу, ксиланазу).
** 3,47 мг (белка фермента с SEQ ID NO:1) вносили на 1500 г муки
Способ приготовления:
Использовали следующий способ приготовления:
Разные ингредиенты смешивали в Diosna SP24 в течение 2 мин на низкой скорости и в течение 7 мин на высокой скорости. Конечная температура теста была около 26°C.
Ферментацию в объеме выполняли в течение 5 минут при температуре окружающей среды 25°C.
Масштаб операции - 600 г теста.
Хлеб формировали вручную.
Промежуточное расстаивание проводили в течение 15 мин при 25°C.
Формировали на Jac Unic с R4,5 и L15.
Расстаивание в течение 110 мин при 35°C и 95% относительной влажности в ферментационном помещении Koma.
Выпечка 25 минут при 220/230°C (выше/ниже) в духовке Miwe Condo.
Хлебу давали охладиться в течение 120 минут и упаковывали хлеб в пластиковые мешки.
Измерение текстуры хлеба
Для измерения плотности использовали TA.XT, производство компании Stable Micro Systems (TA.XT plus). Измерения проводили в 10 повторностях (разный хлеб) зондом с диаметром 25 мм со скоростью 2 мм/сек и сжатием с силой, равной 25% от суммарной высоты и приложенной к хлебному мякишу.
Результаты измерений плотности показаны в таблице 14.
Таблица 14: Измерения плотности образцов хлеба, измеренной на 2-ой день
G
H
I
J
Плотность (средняя) (г)
211
161
200
195
ст.отклонение
21
14
12
15
Результаты показывают, что хлеб, изготовленный с применением фермента согласно данному изобретению значительно мягче, чем образец сравнения. Хлеб, изготовленный с применением имеющихся в продаже липаз, сходен по своей мягкости с образцом сравнения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Novozymes A/S
Puratos NV
<120>  ЛИПОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ХЛЕБОПЕЧЕНИИ
<130>  14303-WO-PCT
<160>  9
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  309
<212>  БЕЛОК
<213>  Valsaria rubricosa
<400>  1
Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro
1. 5                   10                  15
Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys
35                  40                  45
Pro Asp Asn Asn Asp Ser Pro Asp Thr Lys Leu Thr Cys Ser Val Gly
50                  55                  60
Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Asp Thr Thr Ser Thr Val Thr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Glu Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Thr Asp Ser
85                  90                  95
Thr Arg Glu Leu Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
100                 105                 110
Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys
115                 120                 125
Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Thr Ser Trp Thr Glu Ala
130                 135                 140
Arg Thr Gly Val Leu Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala Ala Ala Asn Pro
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Thr Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala
165                 170                 175
Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Val Ala Leu
180                 185                 190
Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asp Glu Thr Leu Ser Glu Tyr
195                 200                 205
Ile Thr Ala Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp
210                 215                 220
Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Leu Gly Tyr Arg His Ile Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asp
245                 250                 255
Asp Val Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Ser Gly Asn Thr Gly
260                 265                 270
Asp Leu Thr Phe Asp Thr Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile
275                 280                 285
Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val
290                 295                 300
Glu Val Gln Trp Val
305
<210>  2
<211>  1059
<212>  ДНК
<213>  Valsaria rubricosa
<400>  2
atgaagtccg cttcgatctt actcagggta gctgccctcc tcctccctgc tgtatctgca       60
ctgccacttg aaagaagagg tatggacgaa ctatcctagc gatcagtgtg tctattttgc      120
ctaacctagc aaagctatat ccgcggatct cctggcaacc ttcagcctct tcgagcagtt      180
cgcagccgca gcatattgtc cggataacaa cgacagtccc gacaccaagc ttacttgctc      240
tgtcggaaac tgcccgcttg tcgaagctga cacgaccagc acggtcactg aattcgaaaa      300
gtacatctta cacgaccccg ttcacctaca gacaaagtcc cagctaacgt ccacctctat      360
ctctgtccct ttagctcgct cgaaaccgac gtcactggct acgtcgcgac tgacagcaca      420
cgagagctca tcgttgtggc attccgcggg agttcctcga tccggaactg gatcgccgac      480
atcgactttc ccttcaccga caccgacctc tgcgatggct gccaggcagc ctcgggcttc      540
tggacgtcct ggacggaggc acggacaggg gtgctggcgg cggtggcgag cgctgccgcg      600
gccaacccgt cctataccgt tgccgtgacg ggccacagcc tcggcggggc cgtggccgcg      660
ctggccgctg gcgccctccg gaacgcgggc tacacggtcg cgctatacag cttcggagcg      720
cctcgcgtgg gtgacgagac cctcagcgag tacatcactg cgcaggcggg tggaaactac      780
cgcatcacgc acctcaacga cccagtgccg aagctgcccc cgctgctcct ggggtatcgc      840
cacatcagcc cggaatacta catcagcagc gggaacaacg tgaccgtgac ggcggatgac      900
gtggaggagt acaccggcac gatcaacctg agtgggaaca cgggcgatct gacgttcgac      960
acggatgcgc acagttggta cttcaacgag atcggggcat gcgatgatgg tgaggctttg     1020
gagtggaaga agcggggggt agaagttcag tgggtttaa                            1059
<210>  3
<211>  46
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  3
acacaactgg ggatccacca tgaagtccgc ttcgatctta ctcagg                      46
<210>  4
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  4
agatctcgag aagcttaaac ccactgaact tctacccccc                             40
<210>  5
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Каталитический сегмент
<400>  5
Gly His Ser Leu Gly
1. 5
<210>  6
<211>  309
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  6
Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro
1. 5                   10                  15
Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys
35                  40                  45
Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Asp Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly
50                  55                  60
Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Thr Thr Ser Thr Val Thr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser
85                  90                  95
Thr Arg Glu Leu Ile Val Val Ala Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
100                 105                 110
Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys
115                 120                 125
Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Thr Glu Ala
130                 135                 140
Arg Thr Gly Val Thr Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala Ala Gln Asn Pro
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Thr Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala
165                 170                 175
Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Ala Leu
180                 185                 190
Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr
195                 200                 205
Ile Thr Ala Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp
210                 215                 220
Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Leu Gly Tyr Arg His Ile Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn
245                 250                 255
Asp Val Glu Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Ser Gly Asn Thr Gly
260                 265                 270
Asp Leu Thr Phe Asp Thr Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile
275                 280                 285
Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val
290                 295                 300
Glu Val Gln Trp Val
305
<210>  7
<211>  309
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  7
Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro
1. 5                   10                  15
Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Thr Phe Ser Leu Phe Glu Gln Phe Ala Ala Ala Ala Tyr Cys
35                  40                  45
Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly
50                  55                  60
Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Thr Thr Asn Thr Val Thr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser
85                  90                  95
Thr Asn Glu Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
100                 105                 110
Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys
115                 120                 125
Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Thr Glu Ala
130                 135                 140
Arg Thr Thr Val Thr Ala Ala Val Ala Gln Ala Ala Ala Gln Asn Pro
145                 150                 155                 160
Ser Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala
165                 170                 175
Ala Leu Ala Ala Gly Ala Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu
180                 185                 190
Tyr Ser Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr
195                 200                 205
Ile Thr Asn Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Leu Asn Asp
210                 215                 220
Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Arg His Ile Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn
245                 250                 255
Asp Val Gln Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Gln Gly Asn Thr Gly
260                 265                 270
Asp Leu Thr Phe Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile
275                 280                 285
Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val
290                 295                 300
Glu Val Gln Trp Val
305
<210>  8
<211>  309
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  8
Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro
1. 5                   10                  15
Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu
20                  25                  30
Leu Ala Thr Phe Gln Phe Phe Glu Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Tyr Cys
35                  40                  45
Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly
50                  55                  60
Asn Cys Pro Leu Val Gln Ala Ala Thr Thr Asn Thr Val Tyr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp Ser
85                  90                  95
Thr Asn Lys Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
100                 105                 110
Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys
115                 120                 125
Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Leu Glu Ala
130                 135                 140
Arg Thr Thr Val Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Arg Ala Gln Asn Pro
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala
165                 170                 175
Ala Leu Ala Ala Gly Asp Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu
180                 185                 190
Tyr Thr Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Glu Thr Leu Ser Glu Tyr
195                 200                 205
Ile Thr Asn Gln Ala Gly Gly Asn Tyr Arg Ile Thr His Trp Asn Asp
210                 215                 220
Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Val His Ile Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Gly Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn
245                 250                 255
Asp Val Gln Glu Tyr Thr Gly Thr Ile Asn Leu Gln Gly Asn Thr Gly
260                 265                 270
Asp Leu Thr Phe Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile
275                 280                 285
Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val
290                 295                 300
Glu Val Gln Trp Val
305
<210>  9
<211>  309
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  9
Met Lys Ser Ala Ser Ile Leu Leu Arg Val Ala Ala Leu Leu Leu Pro
1. 5                   10                  15
Ala Val Ser Ala Leu Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ile Ser Ala Asp Leu
20                  25                  30
Leu Asp Thr Phe Gln Phe Phe Glu Gln Tyr Ala Ala Ala Ala Tyr Cys
35                  40                  45
Pro Asn Asn Asn Asn Ser Pro Gly Thr Lys Leu Thr Cys Ser Gln Gly
50                  55                  60
Asn Cys Pro Leu Val Gln Ala Ala Asp Thr Asn Thr Val Tyr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Glu Asn Ser Leu Ser Thr Asp Val Thr Gly Tyr Val Ala Val Asp His
85                  90                  95
Thr Asn Lys Leu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg
100                 105                 110
Asn Trp Ile Ala Asp Ile Asp Phe Pro Phe Thr Asp Thr Asp Leu Cys
115                 120                 125
Asp Gly Cys Gln Ala Ala Ser Gly Phe Trp Gln Ser Trp Leu Glu Ala
130                 135                 140
Arg Asp Thr Val Thr Pro Ala Val Tyr Gln Ala Arg Ala Gln Lys Pro
145                 150                 155                 160
Asp Tyr Gln Val Val Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Ile Ala
165                 170                 175
Ala Leu Ala Ala Gly Asp Leu Arg Asn Gln Gly Tyr Thr Val Asp Leu
180                 185                 190
Tyr Thr Phe Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Ser Thr Leu Ser Glu Tyr
195                 200                 205
Ile Thr Asn Gln Pro Gly Gly Asn Tyr Arg Val Thr His Trp Asn Asp
210                 215                 220
Pro Val Pro Lys Leu Pro Pro Leu Leu Met Gly Tyr Val His Ile Ser
225                 230                 235                 240
Pro Glu Tyr Tyr Ile Ser Ser Pro Asn Asn Val Thr Val Thr Ala Asn
245                 250                 255
Asp Val Gln Val Tyr Glu Gly Val Ile Asn Leu Gln Gly Asn Glu Gly
260                 265                 270
Asp Leu Thr Thr Asp Ile Asp Ala His Ser Trp Tyr Phe Asn Glu Ile
275                 280                 285
Gly Ala Cys Asp Asp Gly Glu Ala Leu Glu Trp Lys Lys Arg Gly Val
290                 295                 300
Glu Val Gln Trp Val
305
<---