ДРОЖЖИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭКТОИН
YEAST PRODUCING EKTOIN

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области биопродукции эктоина.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидинкарбоновая кислота) является гетероциклической аминокислотой, естественным образом продуцируемой галофильными организмами в природе. Действительно, чтобы выжить в соленой окружающей среде, эти организмы вырабатывают эктоин как совместимый осмолит, который служит осмотическим противовесом.
Эктоин действительно также способен защищать нуклеиновые кислоты, белки, клеточные мембраны, а также целые клетки от денатурации, вызванной многочисленными аггресивными воздействиями внешней среды, такими как УФ-излучение, нагревание, замораживание или химические вещества, но также от денатурации, вызванной высыханием (см., например, Lentzen G et al. Appl Microbiol Biot. 2006; 72: 623-34 и Graf R et al. Clin Dermatol. 2008; 26: 326-33). Как таковой он используется в косметике для ухода за кожей.
Кроме того, было обнаружено, что эктоин представляет интерес в качестве стабилизатора белков, косметической добавки, усилителя ПЦР (полимеразная цепная реакция) и средства для защиты от высыхания микроорганизмов.
Благодаря этим выгодным свойствам эктоин все чаще вырабатывается в бактериальных процессах с использованием, в частности, галофильных бактерий, таких как Halomonas elongata. Однако эти способы требуют высокой концентрации соли, что усложняет процесс и приводит к увеличению затрат, связанных со значительной коррозией оборудования.
Кроме того, производство незаменимых аминокислот, таких как эктоин, через биосинтетические пути бактерий и дрожжей требует значительного количества восстановительной мощности в форме NADPH. Однако основным путем метаболизма глюкозы в этих микроорганизмах, и в частности в дрожжах, является гликолиз с последующей ферментацией, которая продуцирует только NADH. Таким образом, поддержание приемлемого баланса NADPH/NADH в микроорганизме, хотя и является сложным, представляет собой существенное условие для оптимизации биопродукции эктоина при сохранении жизнеспособного рекомбинантного микроорганизма.
Соответственно, в данной области все еще существует потребность в дополнительных способах получения эктоина, обеспечивающих его высокоэффективный синтез и секрецию.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, продуцирующим эктоин, в геноме которых:
(A) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как NAD (никотинамидадениндинуклеотид), так и NADP (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(C) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(D) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(iii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(E) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(F) (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, были удалены и/или разделены, и/или
(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу, независимо находятся:
- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
- под контролем слабого промотера; и/или
- в дестабилизированной форме.
Как показано в прилагаемых примерах, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению имеют повышенную продукцию эктоина.
Указанное полезное свойство может быть дополнительно увеличено путем рекомбинации дрожжей с дополнительными модификациями, описанными ниже.
Следовательно, рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, можно преимущественно использовать в способе получения эктоина, как описано ниже, или использовать для получения эктоина.
Настоящее изобретение также относится к способу получения эктоина, включающему стадии:
(а) культивирование рекомбинантных дрожжей согласно изобретению в культуральной среде и
(b) выделение эктоина из указанной культуральной среды.
Предпочтительно культуральная среда содержит по меньшей мере источник углерода, предпочтительно источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и сахарозы.
Изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей согласно изобретению для получения эктоина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения разработали генетически модифицированные микроорганизмы и, в частности, генетически модифицированные дрожжи, обладающие повышенной способностью продуцировать эктоин по сравнению с исходными микроорганизмами и в частности по сравнению с исходными дрожжами.
Эти генетически модифицированные микроорганизмы, включая эти генетически модифицированные дрожжи, описаны в настоящем описании.
Определения терминов
Термин «микроорганизм» в контексте настоящего описания относится к дрожжам, которые не модифицированы искусственно. Микроорганизм может быть «донором», если он обеспечивает генетический элемент для интеграции в микроорганизм-«акцептор», который будет экспрессировать этот чужеродный генетический элемент, или если он используется в качестве инструмента для генетических конструкций или экспрессии белка. Микроорганизм согласно изобретению выбран bp дрожжей, которые экспрессируют гены для биосинтеза эктоина.
Термин «рекомбинантный микроорганизм», или «генетически модифицированный микроорганизм», или «рекомбинантные дрожжи», или «генетически модифицированные дрожжи», как используется в данном документе, относится к дрожжам, генетически модифицированным или генетически сконструированным. Это означает, в соответствии с обычным значением этих терминов, что микроорганизм согласно изобретению не обнаружен в природе и модифицируется либо путем вставки, либо путем удаления, либо путем модификации генетических элементов эквивалентного микроорганизма, обнаруженного в природе. Его также можно модифицировать путем форсирования развития и эволюции новых метаболических путей, сочетая направленный мутагенез и эволюцию под определенным давлением отбора (см., например, WO 2004/076659).
Микроорганизм может быть модифицирован для экспрессии экзогенных генов, если эти гены вводятся в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Микроорганизм может быть модифицирован для модуляции уровня экспрессии эндогенного гена. Модификация или «трансформация» микроорганизма, такого как дрожжи, экзогенной ДНК является обычной задачей для специалистов в данной области техники. В частности, генетическая модификация микроорганизма в соответствии с изобретением, более конкретно генетическая модификация(-и), определенная в данном документе, может быть осуществлена с использованием системы CRISPR-Cas, как описано у DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., Vol. 41, № 7, 2013: 4336-4343).
Термин «эндогенный ген» означает, что ген присутствовал в микроорганизме до каккой-либо генетической модификации в штамме дикого типа. Эндогенные гены могут быть сверхэкспрессированы путем введения гетерологичных последовательностей в дополнение к или для замены эндогенных регуляторных элементов или путем введения одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду. Эндогенные гены также могут быть модифицированы для модуляции их экспрессии и/или активности. Например, мутации могут быть введены в кодирующую последовательность для модификации продукта гена, или гетерологичные последовательности могут быть введены в дополнение или для замены эндогенных регуляторных элементов. Модуляция эндогенного гена может приводить к повышенной регуляции и/или усилению активности продукта гена или, альтернативно, к пониженной регуляции и/или ослаблению активности продукта эндогенного гена. Другим способом усиления экспрессии эндогенных генов является введение одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.
Термин «экзогенный ген» означает, что ген был введен в микроорганизм с помощью средств, хорошо известных специалисту в данной области, причем этот ген не встречается в природе у микроорганизма дикого типа. Микроорганизм может экспрессировать экзогенные гены, если эти гены вводятся в микроорганизм со всеми элементами, обеспечивающими их экспрессию в микроорганизме-хозяине. Трансформация микроорганизмов с помощью экзогенной ДНК является обычной задачей для специалиста в данной области. Экзогенные гены могут быть встроены в хромосому хозяина или могут быть экспрессированы внехромосомно из плазмид или векторов. Разнообразные плазмиды, которые различаются точкой начала репликации и количеству копий в клетке, все известны в данной области. Последовательность экзогенных генов может быть адаптирована для ее экспрессии в микроорганизме-хозяине. Действительно, специалисту в данной области техники известно понятие предпочтения кодонов и того, как адаптировать нуклеиновые последовательности для конкретного предпочтения кодонов без модификации выведенного белка.
Термин «гетерологичный ген» означает, что ген получен из вида микроорганизма, отличного от микроорганизма-реципиента, который его экспрессирует. Это относится к гену, который не встречается в природе у микроорганизма.
В настоящей заявке все гены обозначены их общепринятыми названиями и со ссылками на их нуклеотидные последовательности и, в случае необходимости, на их аминокислотные последовательности. Используя приведенные ссылки на регистрационные номера для известных генов, специалисты в данной области способны определить эквивалентные гены в других организмах, бактериальных штаммах, дрожжах, грибах, млекопитающих, растениях и т.д. Эта рутинная работа преимущественно выполняется с использованием консенсусных последовательностей, которые могут быть определены путем проведения выравнивания последовательностей с генами, происходящими из других микроорганизмов, и разработки вырожденных зондов для клонирования соответствующего гена в другом организме.
Специалисту в данной области известны различные способы модулирования и, в частности, повышения или понижения экспрессии эндогенных генов. Например, способом усилить экспрессию или сверхэкспрессию эндогенных генов является введение одной или более дополнительных копий гена в хромосому или плазмиду.
Другой способ заключается в замене эндогенного промотора гена более сильным промотором. Эти промоторы могут быть гомологичными или гетерологичными. Промоторы, представляющие особый интерес для настоящего изобретения, описаны более подробно в другом месте настоящего описания.
Экспрессионная конструкция нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать 5' и/или 3' узнаваемые последовательности и/или маркеры отбора.
Термин «сверхэкспрессия» означает, что экспрессия гена или фермента увеличивается по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Увеличение экспрессии фермента достигается путем увеличения экспрессии гена, кодирующего указанный фермент. Увеличение экспрессии гена может быть осуществлено всеми способами, известными специалисту в данной области. В этом отношении следует особо упомянуть использование сильного промотора выше нуклеиновой кислоты, подлежащей сверхэкспрессии, или введение множества копий указанной нуклеиновой кислоты между промотором, особенно сильным промотором, и терминатором.
Термин «сниженная экспрессия» означает, что экспрессия гена или фермента снижена по сравнению с немодифицированным микроорганизмом. Уменьшение экспрессии фермента достигается уменьшением экспрессии гена, кодирующего указанный фермент. Уменьшение экспрессии гена может быть осуществлено всеми способами, известными специалисту в данной области. В связи с этим следует особо упомянуть использование слабого промотора выше нуклеиновой кислоты, подлежащей сниженной экспрессии. Также можно упомянуть использование нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант указанного фермента, который менее активен, чем исходный фермент, или вариант указанного фермента, который быстрее разрушается в клетке, чем исходный фермент. Варианты исходного фермента, которые быстрее разрушаются, чем указанный исходный фермент, включают ферменты, меченные дегроном. Также можно упомянуть снижение экспрессии активатора транскрипции представляющего интерес гена.
Термин «индуцибельный промотор» используется для определения промотора, активность которого индуцирована, то есть повышена:
- в присутствии одного или более конкретных метаболитов. Чем выше концентрация метаболита в среде, тем сильнее активность промотора; или
- в присутствии низкой концентрации или в отсутствие одного или более метаболитов. Эти метаболиты отличаются от тех, чье присутствие в повышенной концентрации индуцирует активность промотора. Чем ниже концентрация метаболита в среде, тем сильнее активность промотора.
Термин «репрессируемый промотор» используется для определения промотора, чья активность подавлена, то есть снижена:
- в присутствии одного или более конкретных метаболитов. Чем выше концентрация метаболита в среде, тем слабее активность промотора; или
- в присутствии низкой концентрации или в отсутствие одного или более метаболитов. Эти метаболиты отличаются от тех, чье присутствие в повышенной концентрации подавляет активность промотора. Чем ниже концентрация метаболита в среде, тем слабее активность промотора.
В контексте настоящего изобртения термин «меченный дегроном» фермент означает фермент, содержащий добавленную сигнальную аминокислотную последовательность разрушения белка, которая служит сигналом разрушения, который будет вызывать разрушение указанного фермента, которое может представлять собой (i) убиквитин-независимое разрушение или (ii) убиквитин-зависимое разрушение. Указанный добавленный сигнал разрушения белка, который в данной области также называют «дегроном», охватывает аминокислотную последовательность, которая служит сигналом разрушения, причем указанная аминокислотная последовательность состоит из переносимого сигнала разрушения, вызывающего целевое разрушение белка. Дегроны включают «N-дегроны», которые являются переносимыми N-концевыми аминокислотами, которые вызывают разрушение целевого белка в соответствии с хорошо известным правилом N-конца (Bachmair et al., 1986, Science, Vol. 234 (4773): 179- 186). Нестабильная природа N-дегрона объясняется его первыми аминокислотами, которые склонны к модификациям посредством ацетилирования или аргинилирования и в конечном счете приводят к убиквитинированию и разрушению. Как правило, дегрону требуется по меньшей мере два компонента для обеспечения целевого разрушения белка: (i) метка распознавания мишени для разрушения, такая как полиубиквитиновая метка, и (ii) неструктурированная аминокислотная последовательность в непосредственной близости от метки распознавания для разрушения. Описание мечения белка дегроном, и в частности, мечения дегроном фермента, специалист в данной области может обратиться к Yu et al. (2015, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204), Cho et al. (2010, Genes & Development, Vol. 24: 438-442) или Fortmann et al. (2015, J Mol Biol, Vol. 427 (17): 2748-2756), Ravid et al. (2008, Nat Rev Mol Cell Biol, Vol. 9 (9): 679-690) и Hochstrasser (1996, Annu Rev Genet, Vol. 30: 405-439).
«Активность» фермента используется взаимозаменяемо с термином «функция» и в контексте изобретения обозначает способность фермента катализировать желаемую реакцию.
Термины «пониженная активность» или «ослабленная активность» фермента означают либо пониженную удельную каталитическую активность белка, полученную в результате мутации в аминокислотной последовательности, и/или пониженные концентрации белка в клетке, полученные в результате мутации нуклеотидной последовательности или делеции соответствующего родственного гена, или также мечения белка дегроном.
Термин «повышенная активность» фермента обозначает либо повышенную специфическую каталитическую активность фермента, и/или повышенное количество/доступность фермента в клетке, полученную, например, в результате сверхэкспрессии гена, кодирующего фермент.
Термины «кодирующий» или «кодирование» относятся к процессу, посредством которого полинуклеотид с помощью механизмов транскрипции и трансляции, продуцирует аминокислотную последовательность.
Ген(-ы), кодирующий фермент(-ы), рассматриваемый в настоящем изобретении, может быть экзогенным или эндогенным.
«Аттенюация» генов означает, что гены экспрессируются в меньшей степени, чем у немодифицированного микроорганизма. Аттенюация может быть достигнута средствами и способами, известными специалисту в данной области, и включающими делецию гена, полученную путем гомологичной рекомбинации, аттенюацию гена путем вставки внешнего элемента в ген или экспрессию гена под контролем слабого промотора. Специалисту в данной области известно множество промоторов разной силы, и то, какой промотор использовать для слабой экспрессии гена.
Способы, реализованные в настоящем изобретении, предпочтительно требуют применения одной или более хромосомных интегрирующих конструкций для стабильного введения гетерологичной нуклеотидной последовательности в конкретное положение на хромосоме или для функционального нарушения одного или более генов-мишеней в генетически модифицированной микробной клетке. В некоторых вариантах осуществления разрушение гена-мишени предотвращает экспрессию соответствующего функционального белка. В некоторых вариантах осуществления нарушение гена-мишени приводит к экспрессии нефункционального белка из нарушенного гена.
Параметры хромосомных интегрирующих конструкций, которые могут варьироваться при реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, длины гомологичных последовательностей; нуклеотидную последовательность гомологичных последовательностей; длину интегрирующей последовательности; нуклеотидную последовательность интегрирующей последовательности; и нуклеотидную последовательность локуса-мишени. В некоторых вариантах осуществления эффективный диапазон длины каждой гомологичной последовательности составляет от 20 до 5000 пар оснований, предпочтительно от 50 до 100 пар оснований. В конкретных вариантах осуществления длина каждой гомологичной последовательности составляет около 50 пар оснований. Для получения дополнительной информации о длине гомологии, необходимой для нацеливания на гены, см. D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
В некоторых вариантах осуществления (а) нарушенный ген(-ы), для вставки в который вышеуказанная(-ые) конструкция(-и) ДНК предназначена(-ы), может преимущественно содержать один или более селектируемых маркеров, подходящих для отбора трансформированных микробных клеток. Предпочтительно, указанный селектируемый маркер(-ы) содержится в ДНК конструкции(-ях) согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер представляет собой маркер устойчивости к антибиотику. Иллюстративные примеры маркеров устойчивости к антибиотикам включают, но не ограничиваются, продукты генов NAT1, AUR1-C, HPH, DSDA, KAN<R> и SH BLE. Продукт гена NAT 1 из S. noursei придает устойчивость к нурсеотрицину; продукт гена AUR1-C из Saccharomyces cerevisiae придает устойчивость к ауэробазидину A (AbA); продукт гена HPH из Klebsiella pneumonia придает устойчивость к гигромицину B; продукт гена DSDA из E.coli позволяет клеткам расти на чашках с D-серином в качестве единственного источника азота; ген KAN<R> из транспозона Tn903 придает устойчивость к G418; и продукт гена SH BLE из Streptoalloteichus hindustanus придает устойчивость к зеоцину (блеомицину).
В некоторых вариантах осуществления маркер устойчивости к антибиотику удаляют после выделения генетически модифицированной микробной клетки согласно изобретению. Специалист в данной области способен выбрать подходящий маркер в конкретном генетическом контексте.
В некоторых вариантах осуществления селектируемый маркер исправляет ауксотрофию (например, ауксотрофию питания) в генетически модифицированной микробной клетке. В таких вариантах осуществления исходная микробная клетка содержит функциональное нарушение в одном или более генных продуктах, которые функционируют в пути биосинтеза аминокислот или нуклеотидов, таких как, например, продукты генов HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 и URA3 в дрожжах, которые делают исходную микробную клетку неспособной к росту в среде без добавления одного или более питательных веществ (ауксотрофный фенотип). Ауксотрофный фенотип может быть затем исправлен путем трансформации исходной микробной клетки с помощью интеграции в хромосому, кодирующей функциональную копию нарушенного продукта гена (NB: функциональная копия гена может происходить от близких видов, таких как Kluveromyces, Candida и т. д.), и генерируемая генетически модифицированная микробная клетка может быть отобрана исходя из потери ауксотрофного фенотипа исходной микробной клетки.
Для каждой из последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих последовательность промотора, кодирующую последовательность (например, последовательность, кодирующую фермент) или последовательность терминатора, в настоящем документе описаны референсные последовательности. Настоящее описание также охватывает последовательности нуклеиновых кислот, имеющие определенный процент идентичности нуклеиновых кислот референсной последовательности нуклеиновой кислоты.
Для каждой или представляющей интерес аминокислотной последовательности в настоящем документе описаны референсные последовательности. Настоящее описание также охватывает аминокислотные последовательности (например, аминокислотные последовательности фермента), имеющие определенный процент идентичности аминокислот референсной аминокислотной последовательности.
По очевидным причинам во всем настоящем описании конкретная последовательность нуклеиновой кислоты или конкретная аминокислотная последовательность, которая соответствует, соответственно, рассматриваемой нуклеотидной или аминокислотной идентичности, должна дополнительно приводить к получению белка (или фермента), который отображает желаемую биологическую активность. В контексте данного документа «процент идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или между двумя аминокислотными последовательностями определяется путем сравнения обеих оптимально выровненных последовательностей в пределах окна сравнения.
Таким образом, часть нуклеотидной или аминокислотной последовательности в окне сравнения может включать вставки или делеции (например, «гэпы») по сравнению с референсной последовательностью (которая не включает эти вставки или эти делеции), чтобы получить оптимальное выравнивание обеих последовательностей.
Процент идентичности рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное нуклеиновое основание или идентичный аминокислотный остаток могут быть отмечены для обеих сравниваемых последовательностей, затем деления числа положений, в которых можно наблюдать идентичность между обоими нуклеиновыми основаниями или между обоими аминокислотными остатками, на общее число позиций в окне сравнения, затем результат умножают на сто, чтобы получить процент идентичности нуклеотидов между двумя последовательностями или процент идентичности аминокислот между двумя последовательностями.
Сравнение оптимального выравнивания последовательностей может выполняться с помощью компьютера с использованием известных алгоритмов.
Наиболее предпочтительно процент идентичности последовательности определяется с использованием программного обеспечения CLUSTAL W (версия 1.82), параметры которого устанавлены следующим образом: (1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" и (18) TREE GRAP DISTANCES="hide".
«Ферментацию» или «культивирование» обычно проводят в ферментерах с подходящей культуральной средой, адаптированной к культивируемому микроорганизму, содержащей по меньшей мере один простой источник углерода и, если необходимо, субстратные кофакторы.
Описанные в настоящем документе микроорганизмы могут быть выращены в ферментационных средах для получения продукта из оксалоацетата. Для максимальной продукции эктоина штаммы микроорганизмов, используемые в качестве продуцентов-хозяев, предпочтительно имеют высокую степень потребления углеводов. Эти характеристики могут быть приданы путем мутагенеза и отбора, генной инженерии или могут быть природными. Ферментационная среда или «культуральная среда» для настоящих клеток может содержать по меньшей мере около 10 г/л глюкозы. Дополнительные углеродные субстраты могут включать, но не ограничиваться, моносахариды, такие как фруктоза, манноза, ксилоза и арабиноза; олигосахариды, такие как лактоза, мальтоза, галактоза или сахароза; полисахариды, такие как крахмал или целлюлоза, или их смеси, и неочищенные смеси из возобновляемых видов сырья, таких как пермеат подсырной сыворотки, кукурузный экстракт, сахарная свекольная патока и ячменный солод. Другие углеродные субстраты могут включать глицерин.
Следовательно, предполагается, что источник углерода, используемый в настоящем изобретении, может охватывать широкий спектр углеродсодержащих субстратов и будет ограничен только выбором организма.
Хотя предполагается, что все вышеупомянутые углеродные субстраты и их смеси являются подходящими в настоящем изобретении, предпочтительными углеродными субстратами являются глюкоза, фруктоза и сахароза или их смеси с С5-сахарами, такими как ксилоза и/или арабиноза, для микроорганизмов, модифицированных для использования C5-сахаров и, в частности, глюкозы.
Предпочтительным углеродным субстратом является глюкоза.
В дополнение к подходящему источнику углерода среда для ферментации может содержать подходящие минералы, соли, кофакторы, буферы и другие компоненты, известные специалистам в данной области, подходящие для выращивания культур и стимулирования ферментативного пути, необходимого для продуцирования желаемого продукта.
Кроме того, могут быть рассмотрены дополнительные генетические модификации, подходящие для выращивания рекомбинантных микроорганизмов согласно изобретению.
Термины «аэробные условия» относятся к концентрациям кислорода в культуральной среде, достаточным для того, чтобы аэробный или факультативно-анаэробный микроорганизм использовал кислород в качестве конечного акцептора электронов.
2
«Микроаэробное условие» относится к культуральной среде, в которой концентрация кислорода меньше, чем в воздухе, т.е. концентрация кислорода составляет до 6 % O.
«Подходящая культуральная среда» обозначает среду (например, стерильную, жидкую среду), содержащую питательные вещества, необходимые или полезные для поддержания и/или роста клетки, такие как источники углерода или углеродный субстрат, источники азота, например, пептон, дрожжевые экстракты, мясные экстракты, солодовые экстракты, мочевину, сульфат аммония, хлорид аммония, нитрат аммония и фосфат аммония; источники фосфора, например монокалийфосфат или дикалийфосфат; микроэлементы (например, соли металлов), например соли магния, соли кобальта и/или соли марганца; а также факторы роста, такие как аминокислоты, витамины, стимуляторы роста и тому подобное. Термин «углеродный источник», или «углеродный субстрат», или «источник углерода» в соответствии с настоящим изобретением обозначает любой источник углерода, который может быть использован специалистами в данной области для поддержания нормального роста микроорганизма, включая гексозы (такие как глюкоза, галактоза или лактоза), пентозы, моносахариды, олигосахариды, дисахариды (такие как сахароза, целлобиоза или мальтоза), мелассу, крахмал или его производные, целлюлозу, гемицеллюлозу и их комбинации.
Общие признаки генетических модификаций, введенных согласно изобретению
- Гены сверхэкспрессируют с помощью двух видов не взаимоисключающих модификаций:
Помещение их под контроль сильного промотора; и/или
Вставка множества копий рассматриваемого гена.
- Все модификации генома вводятся в дрожжи в соответствии с известными методами генной инженерии:
- Последовательные гены, включенные в генетическую конструкцию, которая вводится в геном дрожжей согласно изобретению, имеют следующую структуру:
1
1
1
2
2
2
n
n
n
Пром-ORF-терм-ORF-gene-терм-…/…- Пром-ORF-терм, где:
- Пром1 представляет собой последовательность, регулирующую экспрессию кодирующей последовательности ORF1,
- ORF1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый белок PROT1 и, в частности, желаемый фермент PROT1,
- терм1 представляет собой последовательность терминатора транскрипции, которая опосредует терминацию транскрипции, обеспечивая сигналы во вновь синтезированной мРНК, которые запускают процессы, высвобождающие мРНК из транскрипционного комплекса, и
- «1», «2», …/… «n» может описывать или не описывать один и тот же ORF (открытая рамка считывания), промотор или терминатор. Порядок генов не имеет значения. «n» представляет собой целое число, обычно варьирующееся от 5 до 20. Эти конструкции вставляются в одну из дрожжевых хромосом в контролируемом положении. В некоторых вариантах осуществления сайт вставки не является существенным ни для функциональности вставленной конструкции, ни для жизнеспособности полученных в результате генетически модифицированных дрожжей.
- Когда дрожжами являются, например, Saccharomyces cerevisiae, гены, введенные в геном дрожжей и происходящие из других организмов, отличных от Saccharomyces cerevisiae, обычно «транскодированы» (как правило, оптимизированы по кодонам), что означает, что эти гены синтезируются с оптимальным использованием кодонов для экспрессии в S. cerevisiae. Нуклеотидная последовательность (а не белковая последовательность) некоторых генов из S. cerevisiae также была модифицирована («транскодирована») для минимизации рекомбинации с эндогенной копией указанного гена.
- Гены могут быть удалены с помощью стандартных процедур, используемых в генной инженерии дрожжей. В некоторых вариантах осуществления гены, являющиеся мишенью для делеции, могут быть разорваны путем вставки одной из вышеописанных генетических конструкций, или, альтернативно, гены, являющиеся мишенью для делеции, заменяют коротким участком нуклеотида.
- Понижение регуляции экспрессии гена можно получить путем нарушения эндогенной копии гена и замены ее копией ORF под контролем слабого промотора. Список и последовательности слабых промоторов описаны в другом месте настоящего описания.
- Ген можно сделать «индуцибельным или репрессируемым» путем удаления эндогенной копии гена (если необходимо) и помещения новой копии ORF под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора. Индуцибельный или репрессируемый промотор представляет собой промотор, активность которого модулируется или контролируется, то есть либо увеличивается, либо уменьшается при изменении условий окружающей среды или внешних раздражителей. Индукция или репрессия могут контролироваться искусственно, что включает индукцию или репрессию с помощью абиотических факторов, таких как химические соединения, не встречающиеся в природе в представляющем интерес организме, свет, уровень кислорода, тепло или холод. Список и последовательность индуцибельных или репрессируемых промоторов описаны в другом месте настоящего описания.
- Как уже указывалось в другом месте данного документа, белок может быть снижено эксперссирован путем дестабилизации с использованием технологии «дегрона», которая описана в Yu et al. 2015 (Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204). Вкратце, эта технология заключается во введении в последовательность белка модификации, которая делает его мишенью для разрушения. Она может состоять только из двух первых аминокислот, следуя принципу, известному как правило N-конца, или из более крупной последовательности, нацеливающей весь белок на убиквитин-протеасомный путь разрушения.
Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению
Авторы изобретения разработали рекомбинантные микроорганизмы и, в частности, рекомбинантные дрожжи, обладающие повышенной способностью продуцировать эктоин.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, имеющим повышенную продукцию эктоина, где повышенная продукция эктоина получена путем множества изменений, внесенных в их геном методами генной инженерии.
Данное изобретение относится к рекомбинантным дрожжам, продуцирующим эктоин, в геноме которых:
(A) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартокиназу HOM3, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаткиназу АК, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(B) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты HOM2, и/или по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты HOM2, которая может использовать в качестве кофермента как NAD, так и NADP, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(C) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу EctB, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(D) (i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу MET2, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(iii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты EctA, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(E) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая эктоинсинтазу EctC, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
(F) (i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоти, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, были удалены, и/или
(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, независимо находятся:
- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
- под контролем слабого промотора; и/или
- в дестабилизированной форме.
Авторы изобретения обнаружили, что повышенная продукция эктоина дрожжевыми клетками может быть достигнута путем введения в геном этих дрожжевых клеток множества генетических изменений. Как полностью описано в настоящем документе, указанное множество генетических изменений включает сверхэкспрессию определенных генов, контролируемую экспрессию некоторых других генов, а также репрессию или делецию дополнительных других генов.
Авторы изобретения достигли увеличения продуцирования эктоина дрожжевыми клетками путем оптимизации метаболизма оксалоацетата и ацетил-КоА с тем, чтобы направить последующий искусственно модифицированный метаболический путь главным образом на выработку эктоина, в то же время, поддерживая оптимальную жизнеспособность получаемых в результате генетически модифицированных дрожжевых клеток.
После продолжительного периода исследований авторы настоящего изобретения определили, что высокая продукция эктоина дрожжевыми клетками достигается за счет увеличения превращения оксалоацетата в последовательные промежуточные метаболиты фосфоаспартил и аспартил-полуальдегид и, кроме того, за счет повышения превращения аспартил-полуальдегида в эктоин, при этом, в особенности, поддерживая окислительно-восстановительный статус и, более конкретно, адаптированный баланс NADH/NADPH, обеспечивающий хорошую жизнеспособность полученных в результате рекомбинантных дрожжевых клеток. Этот последний пункт является существенным и представляет значительную проблему для изобретателей на протяжении всей их исследовательской работы.
Предложенное решение в соответствии с изобретением неожиданно позволяет поддерживать жизнеспособное равновесие NADH/NADPH в дрожжевых клетках на всем пути продукции эктоина за счет потребления меньшей восстановительной способности, потребления восстановительной способности в форме NADH, а не NADPH, и/или производства NADH вместо NADPH.
Как подробно описано в настоящем описании, полученные рекомбинантные дрожжевые клетки генетически модифицированы таким образом, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию (i) гена, кодирующего аспартокиназу (HOM3), и/или (ii) гена, кодирующего аспартаткиназу (AK), в частности гена, кодирующего аспартаткиназу (AK), предпочтительно сверхэкспрессию гена аспартаткиназы (AK).
Кроме того, рекомбинантные дрожжи в соответствии с изобретением содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита фосфоаспартила для продуцирования аспартил-полуальдегида, причем указанные дополнительные генетические модификации включают сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты (HOM2), и/или гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которая может использовать в качестве кофермента как NADH, так и NADPH.
Кроме того, рекомбинантные дрожжи в соответствии с изобретением содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита аспартил-полуальдегида для продукции эктоина, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена диаминобутират-аминотрансферазы (EctB), (ii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу (MET2; METX), и/или гена ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты (EctA), (iii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена эктоинсинтазы (EctC) и (iv) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена гомосериндегидрогеназы (HOM6).
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные дрожжи содержат дополнительные генетические модификации для оптимального использования промежуточного метаболита оксалоацетата для продуцирования аспартата, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена аспартаттрансаминазы (AAT2) и/или (ii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена глутаматдегидрогеназы, которая превращает оксоглутарат в глутамат (GDH).
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные дрожжи содержат дополнительные генетические модификации для оптимальной секреции продуцируемого эктоина, причем указанные дополнительные генетические модификации включают (i) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (AGP3), (ii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена пермеазы 3 аминокислот с разветвленной цепью (BAP3), (iii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена пермеазы 2 аминокислот с разветвленной цепью (BAP2), (iv) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (GAP1), (v) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена высокоаффинной пермеазы глутамина (GNP1), (vi) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена общей пермеазы аминокислот (AGP1), (vii) пониженную экспрессию и/или контролируемую экспрессию гена низкоаффинной пермеазы метионина (MUP3; MUP1), (viii) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена вероятного транспортера (AQR1) и/или (ix) сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена транспортера полиамина 1 (TPO1).
В конкретном варианте осуществления по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот, пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, общую пермеазу аминокислот GAP1, высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, общую пермеазу аминокислот AGP1, низкоаффинную пермеазу метионина MUP3 и высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, независимо представляет собой нуклеиновую кислоту из дрожжей, предпочтительно из Saccharomyces cerevisiae.
Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению продуцируют эктоин с более высоким выходом, чем исходные дрожжи, которые не содержат генетических модификаций, описанных выше.
Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению были генетически сконструированы так, чтобы стимулировать экспрессию ферментов, использующих NADH, а не NADPH, таких как соответствующая глутаматдегидрогеназа или соответствующая дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессированная дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты состоит из эндогенного гена S. cerevisiae, который находится под контролем сильных промоторов и/или индуцибельных или репрессируемых промоторов.
В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты предпочтительно кодируется геном S. cerevisiae HOM2.
В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты наиболее предпочтительно кодируется вариантом гена HOM2 S. cerevisiae , который кодирует мутированный белок HOM2, который использует как NAD, так и NADP, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах. Такой вариант гена, например, иллюстрируется в примерах и называется HOM2-2. Он соответствует гену HOM2 S. cerevisiae, мутированному, как описано ниже.
Природа мутаций, нацеленных на несколько аминокислотных остатков в варианте дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты для ослабления высокой селективности HOM2 в отношении NADP в качестве кофермента и усиления аффинности фермента к NAD, известна специалисту в данной области и описана, например, в Faehnle, C. R. et al., Journal of Molecular Biology 1055-1068 (2005). В частности, можно упомянуть мутацию S39 в E39, соответствующую замене нуклеотидов TCT в положении от 115 до 117 нуклеотидной последовательности на нуклеотиды GAG.
В соответствии с номенклатурой аминокислот, хорошо известной специалисту в данной области, S представляет собой серин, и E представляет собой глутаминовую кислоту.
В некоторых вариантах осуществления аспартокиназа наиболее предпочтительно кодируется геном HOM3 S. cerevisiae, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартокиназу
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессия гена, кодирующего аспартокиназу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартокиназу. Аспартокиназа и ген, кодирующий аспартокиназу, охватываемые изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартокиназу, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартокиназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий аспартокиназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
В этих вариантах осуществления контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартокиназу, может быть получена путем вставки в месте расположения открытой рамки считывания аспартокиназы природных дрожжей индуцибельной регуляторной последовательности, такой как индуцибельный или репрессируемый промотор, который заменяет эндогенный промотор, первоначально присутствующий в дрожжевом геноме в этом месте расположения генома.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что при сверхэкспрессии гена, кодирующего аспартокиназу, достигается контролируемый уровень превращения аспартата в аспартилфосфат (аспартил-P), также называемый фосфоаспартил, который должен способствовать высокому уровню жизнеспособности рекомбинантных дрожжей согласно изобретению. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая аспартокиназу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартокиназу, представляет собой ген HOM3 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартокиназу, помещают под контроль сильного промотора pCCW12 или индуцибельного или репрессируемого промотора pCUP-1-1.
В качестве иллюстрации, ген аспартокиназы может быть встроен в ген HOM6 и/или в ген SAM3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего аспартаткиназу
Альтернативно или в дополнение к сверхэкспрессии и/или контролируемой экспрессии аспартокиназы, как обсуждалось выше, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению также могут быть такими, что они включают сверхэкспрессию и/или контролируемую экспрессию гена, кодирующего аспартаткиназу.
Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего аспартаткиназу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаткиназну. Аспартаткиназа и ген, кодирующий аспартаткиназу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаткиназу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартаткиназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий аспартаткиназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что с помощью контролируемой экспрессии гена, кодирующего аспартаткиназу, достигается контролируемый уровень превращения аспартата в аспартилфосфат (аспартил-Р), который будет способствовать высокому уровню жизнеспособности рекомбинантных дрожжей согласно изобретению.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаткиназу, представляет собой ген AK из Bacillus subtilis, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаткиназу, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU7.
В качестве иллюстрации, ген аспартаткиназы может быть встроен в ген TRP1, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей по изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты. Дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты и ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может усиливать превращение промежуточного метаболита аспартилфосфата (аспартил-Р) в аспартил-полуальдегид. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В некоторых вариантах осуществления дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты может представлять собой вариант фермента, который использует как NADH, так и NADPH для катализа превращения аспартилфосфата (аспартил-P) в аспартил-полуальдегид.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, представляет собой ген HOM2 из Saccharomyces cerevisiae или альтернативно вариант HOM2, использующий как NADH, так и NADPH, как показано в приведенных в настоящем описании примерах и обсуждалось ранее.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU5 или сильного промотора pCCW12.
В качестве иллюстрации ген дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть встроен в ген HIS3 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего диаминобутират-аминотрансферазу
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего диаминобутират-аминотрансферазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую диаминобутират-аминотрансферазу. Диаминобутират-аминотрансфераза и ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую диаминобутират-аминотрансферазы, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию диаминобутират-аминотрансферазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая ограничиваться какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может усиливать превращение промежуточного метаболита аспартил-полуальдегида в 2,4-диаминобутират. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, представляет собой ген EctB из Pseudomonas aeruginosa или ген EctB из Halomonas elongata (иногда также называемого Chromohalobacter salexigens), как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий диаминобутират-аминотрансферазу, помещают под контроль сильного промотора pCCW12 и/или сильного промотора pTDH3.
В качестве иллюстрации ген диаминобутират-аминотрансферазы может быть встроен в ген HOM6, и/или в ген SAM3, и/или в ген MUP3, и/или в ген URA3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего гомосерин-O-ацетилтрансферазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза и ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию гомосерин-O-ацетилтрансферазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия гомосерин-O-ацетилтрансферазы позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита 2,4-диаминобутирата-в ацетил-2,4-диаминобутират, в присутствии ацетил-КоА. То же самое применимо, когда, по меньшей мере одна последовательность, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, представляет собой ген MET2 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, представляет собой ген METX из Corynebacterium glutamicum, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В особенно предпочтительном варианте осуществления рекомбинантные дрожжи согласно изобретению содержат по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, который представляет собой ген MET2 из Saccharomyces cerevisiae, и по меньшей мере один ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, который представляет собой ген METX от Corynebacterium glutamicum.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий гомосерин-O-ацетилтрансферазу, независимо для каждой копии указанного гена, если присутствует несколько копий, помещают под контроль сильного промотора pPDC1 или индуцибельного или репрессируемого промотора pACU6.
В качестве иллюстрации, ген гомосерин-O-ацетилтрансферазы может быть встроен в ген SAM3 и/или в ген HIS3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты. Ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты и ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита 2,4-диаминобутирата в ацетил-2,4-диаминобутират в присутствии ацетил-КоА. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, представляет собой ген EctA из Halomonas elongata (иногда также называемого Chromohalobacter salexigens), как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, помещают под контроль сильного промотора pPDC1.
В качестве иллюстрации ген ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть встроен в ген LYP1 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В конкретном варианте осуществления рекомбинантные дрожжи согласно изобретению являются такими, что их геном содержит:
- по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, которая сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и предпочтительно под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; и
- по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую ацетилтрансферазу EctA диаминомасляной кислоты, которая сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и предпочтительно под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия гена, кодирующего эктоинсинтазу
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессию гена, кодирующего эктоинсинтазу, получают путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую эктоинсинтазу. Эктоинсинтаза и ген, кодирующий эктоинсинтазу, которые охватываются настоящим изобретением, подробно описаны в других частях настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую эктоинсинтазу, содержит(-ат) регуляторные последовательности, обеспечивающие всокую экспрессию эктоинсинтазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий эктоинсинтазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия эктоинсинтазы позволяет и, следовательно, повышает уровень превращения промежуточного метаболита ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая эктоинсинтазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий эктоинсинтазу, представляет собой ген EctC из Halomonas elongata, как показано в приведенных в настоящем описании примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий эктоинсинтазу, помещают под контроль сильного промотора pTDH3 и/или сильного промотора pTEF1.
Иллюстративно, ген эктоинсинтазы может быть встроен в ген LYP1, и/или в ген MUP3, и/или в ген URA3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Делеция или пониженная экспрессия гомосериндегидрогеназы
Рекомбинантные дрожжи согласно изобретению дополнительно определяются как имеющие геном, в котором:
(i) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, были удалены и/или разорваны, и/или
(ii) по меньшей мере одна, предпочтительно все нуклеиновые кислоты, кодирующие гомосериндегидрогеназу HOM6, независимо находятся:
- под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора;
- под контролем слабого промотора; и/или
- в дестабилизированной форме.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что пониженная экспрессия гена гомосериндегидрогеназы должна увеличивать продукцию 2,4-диаминобутирата рекомбинантными дрожжами за счет снижения потребления полученного аспартил-полуальдегида путем его превращения в гомосерин.
В некоторых вариантах осуществления экспрессия гомосериндегидрогеназы может быть сделана выполняемой при определенных условиях, например, путем помещения экспрессии этого гена под контроль репрессируемых регуляторных последовательностей, таких как индуцибельные или репрессируемые промоторы.
Способы подавления экспрессии генов, разрыва генов-мишеней или делеции генов-мишеней хорошо известны специалисту в данной области.
Экспрессируемая гомосериндегидрогеназа также включает вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированную гомосериндегидрогеназу. Дестабилизированная гомосериндегидрогеназа представляет собой вариант гомосериндегидрогеназы, который быстрее разрушается в дрожжевой клетке, чем исходная гомосериндегидрогеназа.
В предпочтительных вариантах осуществления дестабилизированная гомосериндегидрогеназа состоит из меченного дегроном белка гомосериндегидрогеназы.
Например, ген гомосериндегидрогеназы может быть разорван loxP или, например, URA3.Kl-loxP, и, таким образом, удален (что также можно назвать инактивированным).
Альтернативно, он может быть разорван кассетой, содержащей представляющие интерес гены, как показано в приведенных примерах.
АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)
Фермент аспартокиназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат. Аспартокиназа, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться HOM3.
Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартокиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному Stadtman et al. (1961, J Biol Chem, Vol. 236 (7): 2033-2038).
Предпочтительной аспартокиназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ (код фермента) 2.7.2.4.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Bacillus subtilis и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 1, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 1 кодирует аспартокиназу, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которую также может называться HOM3.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 25 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68%, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83%, 84%, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активностью той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78%, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность аспартокиназы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP010972 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 2, описанной в настоящем документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартокиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотной идентичности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, аспартокиназа, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 25 % аминокислотную идентичность аспартокиназе с SEQ ID NO: 2.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 25 % аминокислотную идентичность референсной последовательностью нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательностью, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательностью, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности.
Как указано выше, уровень экспрессии аспартокиназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, таким как определено более подробно далее в настоящем доументе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аспартокиназу.
Как указано в другом месте настоящего описания, аспартокиназа сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартокиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще дополнительных вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартокиназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартокиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
АСПАРТАТКИНАЗА (AK)
Фермент аспартаткиназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат. Аспартаткиназа, кодируемая геном Bacillus subtilis, может называться AK.
Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартаткиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области и является таким же, как тот, который был указан ранее для аспартокиназы.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Bacillus subtilis и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.
Что касается последовательности нуклеиновой кислоты, ее можно отнести к последовательности, описанной под номером NC_000964.3 в базе данных NCBI.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 %, идентичность нуклеиновой кислоты  нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 3, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 3 кодирует аспартаткиназу, происходящую из Bacillus subtilis, которая также может называться AK.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 25 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность аспартаткиназы из Bacillus substilis специалист в данной области может найти под регестрационным номером NP_389558.2 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 4, описанной в настоящем документе.
Согласно другому конкретному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаткиназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 25 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 4, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, аспартаткиназа, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 25 % аминокислотную идентичность аспартокиназой с SEQ ID NO: 4.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение L-аспартата в присутствии АТФ в 4-фосфо-L-аспартат.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 25 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 % , 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % , 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотной идентичности референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии аспартаткиназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аспартаткиназу.
Как указано в другом месте настоящего описания, аспартаткиназа сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартаткиназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаткиназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартаткиназу, в пределах генома указанных рекомбинантных дрожжей.
ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
Дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты представляет собой белок, который, как известно из данной области техники, катализирует NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида посредством восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата. Дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, кодируемую геном Saccharomyces cerevisiae, можно назвать HOM2.
Способ, применяемый для измерения уровня активности дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты, известен специалистам в данной области.
Предпочтительной дегидрогеназой полуальдегида аспарагиновой кислоты в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.2.1.11.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой вариант или мутант дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты из Saccharomyces cerevisiae, где указанный вариант фермента или указанный мутант фермента использует как NADH, так и NADPH для каталитических реакций. Такие варианты или мутантные ферменты известны в данной области и ранее обсуждались в настоящем тексте.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичности нуклеиновой кислоты нуклеинове кислотой, выбранной из группы, состоящей из референсных последовательностей нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновые кислоты с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 кодируют дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которая в данном документе также может обобщено называться HOM2.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида путем восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 27 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 95 %, 98 % и 99 % нуклеотидной идентичности указанным референсным последовательностям нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанным референсным последовательностям нуклеиновых кислот, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP010442 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO. 7, описанной в настоящем документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере, 80 %, аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности  SEQ ID NO: 7, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты, происходящая из Lactobacillus wasatchensis, имеет 27 % аминокислотную идентичность дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты с SEQ ID NO: 7.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать NADPH-зависимое образование L-аспартат-полуальдегида посредством восстановительного дефосфорилирования L-аспартил-4-фосфата.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 27 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсой аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотной идентичности указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положении, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты.
Как указано в другом месте настоящего описания, дегидрогеназа полуальдегида аспарагиновой кислоты сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В других вариантах осуществления изобретения сверхэкспрессия дегидрогеназы полуальдегида аспарагиновой кислоты может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
Фермент диаминобутират-аминотрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират. Диаминобутират-аминотрансфераза, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctB или EctB.He.
Способ, применяемый для измерения уровня активности диаминобутират-аминотрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.
Предпочтительной диаминобутират аминотрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.6.1.76.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Pseudomonas aeruginosa, Halomonas elongata или Sporocarcina newyorkensisn, и предпочтительно из Pseudomonas aeruginosa или Halomonas elongata.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 35 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 % , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидной идентичности указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательности диаминобутират-аминотрансферазы из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_013332345.1 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, описанным в настоящем документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая диаминобутират-аминотрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение аспартил-полуальдегида в присутствии глутамата в 2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 35 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии диаминобутират-аминотрансферазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную диаминобутира-аминотрансферазу.
Как указано в другом месте настоящего описания, диаминобутират-аминотрансфераза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей диаминобутират-аминотрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия диаминобутират-аминотрансферазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей диаминобутират-аминотрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)
Фермент гомосерин-O-ацетилтрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа реакции между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КоА и ацетил-2,4-диаминобутират. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться MET2.
Способ, применяемый для измерения уровня активности гомосерин-O-ацетилтрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Shuzo Yamagata (1987, The Journal of Bacteriology, Vol. 169 (8): 3458-3463).
Предпочтительной гомосерин-O-ацетилтрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.31.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Corynebacterium glutamicum и дрожжей. В некоторых других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую (-ые)кислоту(-ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу METX, представляет собой нуклеиновую кислоту из бактерии, в частности из бактерии, выбранной независимо из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Haemophilius influenza, Streptomyces lavendulae, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumonia и Mycobacterium tuberculosis.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 12, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 12 кодирует гомосерин-O-ацетилтрансферазу, происходящую из Saccharomyces cerevisiae, которая также может назваться MET2. Гомосерин-O-ацетилтрансфераза, происходящая из Corynebacterium glutamicum, обычно называется METX.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует реакцию между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КoA и ацетил-2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 27 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность гомосерин-O-ацетилтрансферазы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером NP014122 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 13, описанной в данном документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая гомосерин-O-ацетилтрансферазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 27 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и также биологическую активность той же природы. В качестве иллюстрации, гомосерин-O-ацетилтрансфераза, происходящая из Aquamarina atlantica, имеет 27 % аминокислотную идентичность гомосерин-O-ацетилтрансферазе с SEQ ID NO: 13.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать реакцию между ацетил-КоА и 2,4-диаминобутиратом в КoA и ацетил-2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 27 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии гомосерин-O-ацетилтрансферазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гомосерин-O-ацетилтрансферазу.
Как указано в другом месте настоящего описания, в некоторых вариантах осуществления изобретения гомосерин-O-ацетилтрансфераза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-O-ацетилтрансферазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-О-ацетилтрансферазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей гомосерин-O-ацетилтрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия гомосерин-О-ацетилтрансферазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей гомосерин О-ацетилтрансферазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА ДИАМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ (EctA)
Фермент ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират. Ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctA или EctA.He.
Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.
Предпочтительной ацетилтрансферазой диаминомасляной кислоты в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.178.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Chromohalobacter salexigens, Pseudomonas aeruginosa, Thaurea sp.28 или Halomonas elongata.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 30 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 14, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 30 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_035409657.1 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 15, описанной в данном документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 30 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение 2,4-диаминобутирата в присутствии ацетил-КоА в ацетил-2,4-диаминобутират.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 30 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты.
Как указано в другом месте настоящего описания, ацетилтрансфераза диаминомасляной кислоты сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом контроля соответствующего гена с поомщью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия ацетилтрансферазы диаминомасляной кислоты может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей ацетилтрансферазу диаминомасляной кислоты, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
Эктоинсинтаза (EctC)
Фермент эктоинсинтаза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин. Эктоинсинтаза, кодируемая геном Halomonas elongata, может называться EctC или EctC.He.
Способ, применяемый для измерения уровня активности эктоинсинтазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ono H et al., 1999, Journal of Bacteriology, стр. 91-99.
Предпочтительной эктоинсинтазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.2.1.108.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из бактерий, и особенно из Pseudomonas aeruginosa, Halomonas elongata или Micrococcus luteus.
Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты нуклеиновой кислоте с SEQ ID NO: 16, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 35 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 % , 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной референсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность указанной рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность эктоинсинтазы из Halomonas elongata специалист в данной области может найти под регистрационным номером WP_013332346 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 17, описанной в данном документе.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая эктоинсинтазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 35 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение ацетил-2,4-диаминобутирата в эктоин.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 35 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 % , 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной рференсной последовательности нуклеиновой кислоты, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность рефересной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность указанной референсной аминокислотной последовательности, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии эктоинсинтазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях, соответственно, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную эктоинсинтазу.
Как указано в другом месте настоящего описания, эктоинсинтаза сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора в рекомбинантных дрожжах по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей эктоинсинтазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В других вариантах осуществления изобретения сверхэкспрессия эктоинсинтазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей эктоинсинтазу, в пределах генома указанных рекомбинантных дрожжей.
ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)
Фермент гомосериндегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения L-гомосерина в L-аспартат-4-полуальдегид в присутствии NAD или NADP. Гомосериндегидрогеназа, кодируемая геном Saccharomyces cerevisiae, может называться HOM6.
Способ, применяемый для измерения уровня активности гомосериндегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Calnyanto et al. (2006, Microbiology, Vol. 152: 105-112).
Предпочтительной гомосериндегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.3.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из дрожжей, и особенно из Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая гомосериндегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 18. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO: 18 кодирует гомосериндегидрогеназу, происходящую из Saccharomyces, которую также можно назвать HOM6.
Аминокислотную последовательность гомосериндегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может найти под регистрационным номером AJR75529 или NP012673 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 19, описанной в данном документе.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии гомосериндегидрогеназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гомосериндегидрогеназу.
Как указано в другом месте настоящего описания, в некоторых вариантах осуществления изобретения гомосериндегидрогеназа (а) полностью или частично удалена или разорвана, или (b) находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора; под контролем слабого промотора; и/или в дестабилизированной форме в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.
Конкретные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин
Cверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия аспартаттрансаминазы
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая аспартаттрансаминазу, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Фермент аспартаттрансаминаза (также известный как аспартатаминотрансфераза) представляет собой белок, который описан в данной области для катализа реакции L-аспартата и 2-оксоглутарата для получения оксалоацетата и L-глутамата. Фермент аспартаттрансаминаза, кодируемый геном Saccharomyces cerevisiae, может называться AAT2.
В соответствии с этими вариантами осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего аспартаттрансаминазу, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаттрансаминазу. Аспартаттрансаминаза и ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую аспартаттрансаминазу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию аспартаттрансаминазы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим воплощениям рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, по меньшей мере, один ген, кодирующий аспартат-трансаминазу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может вызывать высокий уровень превращения оксалоацетата в аспартат. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая аспартаттрансаминазу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Способ, применяемый для измерения уровня активности аспартаттрансаминазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Yagi et al. (1982, Biochem, VOl. 92: 35-43).
В некоторых вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, представляет собой ген AAT2 из Saccharomyces cerevisiae, как показано в приведенных в данном описанни примерах.
В предпочтительных вариантах осуществления аспартатаминотрансфераза кодируется AAT2-геном A. Thaliana.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий аспартаттрансаминазу, помещают под контроль индуцибельного или репрессируемого промотора pACU1, или сильного промотора pADH1, или сильного промотора pPGK1.
В качестве иллюстрации, ген AAT2 может быть вставлен в ген CAN1, и/или в ген GNP1, и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем описании примерах.
Предпочтительная аспартаттрансаминаза в настоящем описании известна под шифром КФ 2.6.1.1.
Нуклеиновая(-ые) кислота(и), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), происходящую из архебактерий. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из дрожжевого организма, и наиболее предпочтительно Saccharomyces cerevisiae.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(ы), кодирующая аспартаттрансаминазу или AAT2, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 39 %, предпочтительно по меньшей мере 65 % и предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует реакцию L-аспартата и 2-оксоглутарата с образованием оксалоацетата и L-глутамата.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 39 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 40 % 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 % , 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 20, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность аспартаттрансаминазы AAT2 из Saccharomyces cerevisiae специалист в данной области может може найти под регистрационным номером NP013127 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 21, описанной в данном документе. В качестве иллюстрации, аспартаттрансаминаза, происходящая из E. coli, имеет 39 % аминокислотную идентичность аспартаттрансаминазе AAT2 с SEQ ID NO: 21.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая аспартаттрансаминазу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 39 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности такая же, как описано ранее, то есть способность катализировать реакцию L-аспартата и 2-оксоглутарата с образованием оксалоацетата и L-глутамата.
Как описано в настоящем документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 39 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % , 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность рефренсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии аспартаттрансаминазы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аспартаттрансаминазу.
Как указано в другом месте настоящего описания, аспартаттрансаминаза сверхэкспрессируется в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей аспартаттрансаминазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В других вариантах осуществления сверхэкспрессия аспартаттрансаминазы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей аспартаттрансаминазу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
Сверхэкспрессия и/или контролируемая экспрессия глутаматдегидрогеназы
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, которая превращает оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Соответственно, в конкретном варианте осуществления геном рекомбинантных дрожжей согласно настоящему изобретению такой, что по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая глутаматдегидрогеназу, которая превращает оксоглутарат в глутамат, сверхэкспрессируется и/или находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Фермент глутаматдегидрогеназа (также известный как NAD-специфическая глутаматдегидрогеназа) представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения 2-оксоглутарата с получением L-глутамата. Таким образом, глутаматдегидрогеназа представляет собой фермент, специфически участвующий в химической реакции, включающей превращение 2-оксоглутарата в L-глутамат в присутствии NADH.
В соответствии с этими вариантами осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего фермент глутаматдегидрогеназу, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую глутаматдегидрогеназу. Глутаматдегидрогеназа и кодирующий глутаматдегидрогеназу ген, которые охватываются изобретением, подробно описаны в другом месте настоящего описания.
В некоторых из этих вариантов осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую глутаматдегидрогеназу, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию глутаматдегидрогеназы, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В дополнение или в качестве альтернативы этим вариантам осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению по меньшей мере один ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, может находиться под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, который функционирует в клетках дрожжей.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы путем преобразования оксоглутарата в глутамат одновременно генерирует NAD. То же самое применимо, когда по меньшей мере одна последовательность, кодирующая глутаматдегидрогеназу, находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора.
Способ, применяемый для измерения уровня активности глутаматдегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Noor and Punekar (2005, Microbiology, Vol. 151: 1409-1419).
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, кодирует глутаматдегидрогеназу, которая использует NADH вместо NADPH, в частности, ген GDH из Entodinium caudatum (представлен как GDH.Eca или GDH2.Eca) или Saccharomyces cerevisiae (представлен как GDH2), как показано в приведенных в настоящем документе примерах. В конкретном варианте осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, кодирует глутаматдегидрогеназу из Entodinium caudatum.
Предпочтительной глутаматдегидрогеназой в настоящем описании может представлять собой, в частности, фермент, имеющий шифр КФ 1.4.1.2.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий глутаматдегидрогеназу, помещают под контроль сильного промотора pTDH3 или индуцибельного или репрессируемого промотора pCUP1-1.
В качестве иллюстрации ген глутаматдегидрогеназы может быть встроен в ген HIS3 и/или в ген MUP3, как это показано в приведенных в настоящем документе примерах.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из группы, включающей прокариотические организмы и эукариотические организмы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из архебактерий. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), происходящую из организмов, предпочтительно выбранных из Entodinium caudatum, Bacillus subtilis, Clostridium symbiosium.
В соответствии с еще более предпочтительным вариантом осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 49 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % идентичность нуклеиновой кислоты последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы. Нуклеиновая кислота с SEQ ID NO. 22 кодирует глутаматдегидрогеназу, происходящую из Entodinium caudatum, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована по кодонам для ее экспрессии в дрожжах, и особенно в Saccharomyces cerevisiae.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности заключается в способности кодировать фермент, который катализирует превращение 2-оксоглутарата для получения L-глутамата.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 49 % нуклеотидную идентичность рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 65 % нуклеотидную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в настоящем документе, последовательность нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере 80 % нуклеотидную идентичность рефренсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % нуклеотидную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 22, и также биологическую активность той же природы.
Аминокислотную последовательность глутаматдегидрогеназы из Entodinium caudatum специалист в данной области может найти под регистрационным номером AAF15393 в базе данных UniProt или обратиться к SEQ ID NO: 23, описанной в настоящем документе. В качестве иллюстрации глутаматдегидрогеназа, происходящая из Giardia intestinalis, имеет 49 % аминокислотную идентичность глутаматдегидрогеназе с SEQ ID NO: 23.
Согласно другому конкретному варианту осуществления нуклеиновая(-ые) кислота(-ы), кодирующая глутаматдегидрогеназу, может представлять собой нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 49 %, предпочтительно по меньшей мере 65 %, предпочтительно по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.
Биологическая активность той же природы в отношении этой последовательности является такой, как описано ранее, то есть способность катализировать превращение 2-оксоглутарата для получения L-глутамата.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 49 % аминокислотную идентичность референсной последовательности нуклеиновой кислоты, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 % , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 65 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.
Как описано в данном документе, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 80 % аминокислотную идентичность референсной аминокислотной последовательности, включает аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % и 99 % аминокислотную идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23, и также биологическую активность той же природы.
Как упомянуто выше, уровень экспрессии глутаматдегидрогеназы в настоящем изобретении регулируется по меньшей мере одним промотором и по меньшей мере одним терминатором, как более подробно описано далее в настоящем документе, которые присутствуют в 5' и 3' положениях соответственно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную глутаматдегидрогеназу.
Как указано в другом месте настоящего описания, глутаматдегидрогеназа сверхэкспрессируется в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах.
В некоторых других вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом присутствия множества копий последовательности, кодирующей глутаматдегидрогеназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
В еще других вариантах осуществления сверхэкспрессия глутаматдегидрогеназы может быть результатом как (i) контроля соответствующего гена с помощью сильного промотора в указанных рекомбинантных дрожжах, так и (ii) наличия множества копий последовательности, кодирующей глутаматдегидрогеназу, в геноме указанных рекомбинантных дрожжей.
Выделение представляющих интерес соединений
В других вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки может быть усилено посредством (i) экспрессии генов, кодирующих пермеазы дрожжей, и (ii) экспрессии генов, кодирующих белки-экспортеры аминокислот, или (iii) как экспрессии генов, кодирующих пермеазы дрожжей, так и экспрессии генов, кодирующих белки-экспортеры аминокислот.
Пониженная экспрессия гена(-ов), кодирующего(-их) пермеазу
Как описано ниже, гены, кодирующие пермеазу, которые могут быть пониженно экспрессированы в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению, включают AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 и MUP1.
AGP1 представляет собой общую пермеазу 1 аминокислот из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AGP1 можно найти под регистрационным номером NP_009905 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178671 в базе данных NCBI.
AGP3 является общей пермеазой 3 аминокислоты из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AGP3 можно найти под регистрационным номером NP_116600 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрацинным номером NM_001179912 в базе данных NCBI.
BAP3 представляет собой пермеазу аминокислоты валина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность BAP3 можно найти под регистрационным номером NP_010331 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001180354 в базе данных NCBI.
BAP2 представляет собой пермеазу аминокислот Leu/Val/Ile из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность BAP2 можно найти под регистрационным номером NP_009624 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178416 в базе данных NCBI.
GAP1 является общей пермеазой аминокислот из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность GAP1 можно найти под регистрационным номером NP_012965.3 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179829 в базе данных NCBI.
GNP1 является высокоаффинной пермеазой глутамина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность GNP1 можно найти под регистрационным номером NP_010796 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001180816 в базе данных NCBI.
MUP3 представляет собой низкоаффинную пермеазу метионина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность MUP3 можно найти под регистрационным номером NP_011827 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179116 в базе данных NCBI.
MUP1 представляет собой низкоаффинную пермеазу метионина из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность MUP можно найти под регистрационным номером NP_011569 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181184 в базе данных NCBI.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению указанные рекомбинантные дрожжи дополнительно определяются как обладающие пониженной экспрессией одного или более генов, кодирующих пермеазу, которые охватывают пермеазы AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 и MUP1.
Соответственно, в конкретном варианте осуществления геном рекомбинантных дрожжей согласно изобретению является таким, что была выполнена по меньшей мере одна из следующих модификаций:
(A) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP3, были удалены из генома дрожжей, и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP3, была вставлена;
(B) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 3 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена;
(C) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную пермеазу 2 аминокислот с разветвленной цепью, была вставлена;
(D) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот GAP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот GAP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот GAP1, была вставлена;
(E) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу глутамина GNP1, была вставлена;
(F) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие общую пермеазу аминокислот AGP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая общую пермеазу аминокислот AGP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную общую пермеазу аминокислот AGP1, была вставлена;
(G) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая низкоаффинную пермеазу метионина MUP3, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную низкоаффинную пермеазу метионина мMUP3, была вставлена;
(H) по меньшей мере одна, предпочтительно все эндогенные нуклеиновые кислоты, кодирующие высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, были удалены из генома дрожжей и, необязательно:
(i) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, была вставлена и находится под контролем индуцибельного или репрессируемого промотора, и/или
(ii) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая дестабилизированную высокоаффинную пермеазу метионина MUP1, была вставлена;
(I) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая вероятный транспортер AQR1, сверхэкспрессируется; и/или
(J) по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая транспортер полиамина 1, сверхэкспрессируется.
В конкретном варианте осуществления были выполнены по меньшей мере две, предпочтительно по меньшей мере три из этих модификаций.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения считают, что пониженная экспрессия любого из генов пермеазы должна увеличивать выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки, например, в питательную среду.
Что касается пермеаз, пониженная экспрессия одного или более из этих генов включает полное подавление их экспрессии, например, разрывом или делецией указанного одного или более генов пермеазы.
В некоторых вариантах осуществления пониженная экспрессия гена, кодирующего пермеазу, может быть сделана зависящей от определенных условий, например, путем помещения экспрессии этого гена под контроль репрессируемых регуляторных последовательностей, таких как индуцибельные или репрессируемые промоторы.
Способы подавления экспрессии генов, разрыва генов-мишеней или делеции генов-мишеней хорошо известны специалисту в данной области.
Что касается гена пермеазы, то пониженная экспрессия также подразумевает вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированный белок пермеазы, или вставку нуклеиновой кислоты, кодирующей дестабилизированный белок пермеазы, или и то, и другое.
Дестабилизированная пермеаза представляет собой вариант пермеазы, который быстрее разрушается внутри дрожжевой клетки, чем исходная пермеаза.
В предпочтительных вариантах осуществления дестабилизированная пермеаза состоит из меченного дегроном белка пермеазы.
Как показано в примерах, ген AGP3, ген BAP3, ген GAP1, ген GNP1 и ген MUP3 могут быть разорваны loxP и, таким образом, удалены.
Сверхэкспрессия гена(-ов), кодирующего(-их) белок-экспортер аминокислот
Как описано ниже, гены, кодирующие белок-экспортер, которые могут быть сверхэкспрессированы в рекомбинантных дрожжах согласно изобретению, включают AQR1 и TPO1.
AQR1 является транспортером из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность AQR1 можно найти под регистрационным номером NP_014334 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182903 в базе данных NCBI.
ТРО1 является транспортером полиаминов из Saccharomyces cerevisiae. Аминокислотную последовательность TPO1 можно найти под регистрационным номером NP_013072 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181848 в базе данных NCBI.
В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантных дрожжей согласно изобретению сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более дополнительных копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую указанный транспортер.
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, должна увеличивать выделение продуцируемого эктоина за пределы дрожжевой клетки, например, в культуральную среду.
В некоторых вариантах осуществления сверхэкспрессия гена, кодирующего транспортер, достигается путем вставки в выбранном положении(-ях) генома дрожжей одной или более дополнительных копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую ген транспортера. В некоторых из этих вариантов осуществления указанные одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую транспортер, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию указанного транспортера, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В некоторых других вариантах осуществления одну копию гена, кодирующего транспортер, вставляют в выбранное положение в геноме дрожжей. В этих других вариантах осуществления указанная одна или более копий кассеты экспрессии, содержащей последовательность, кодирующую транспортер, содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие высокую экспрессию указанного транспортера, такие как сильный промотор, который функционирует в клетках дрожжей.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, AQR1 помещают под контроль сильного промотора pTEF3.
В качестве иллюстрации ген AQR1 может быть вставлен в ген PYK1, как это показано в примерах, приведенных в настоящем описании.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, TPO1 находится под контролем сильного индуцибельного или репрессируемого промотора pSAM4 или сильного конститутивного промотора pTEF1.
TPO1-1 может использоваться вместо TPO1. ТРО1-1 представляет собой искусственный аллель, в котором лизины 10, 49, 86, 143, 144 и 145 заменены аргининами.
Авторы изобретения полагают, что эти модификации защищают TPO1 от разрушения по убиквитин-протеасомному пути, тем самым стабилизируя его.
В предпочтительных вариантах осуществления указанный ген, кодирующий белок-экспортер аминокислот, TPO1 находится под контролем сильного промотора pTEF3.
В качестве иллюстрации ген TPO1 может быть вставлен в ген PYK1, как это показано в примерах, приведенных в настоящем документе.
Для дополнительного увеличения продукции эктоина рекомбинантные дрожжи согласно изобретению могут содержать дополнительные генетические изменения, так что они продуцируют большие количества промежуточного продукта оксалоацетата. Эти необязательные генетические изменения описаны в настоящем документе ниже.
Дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей согласно настоящему изобретению продукция эктоина может быть дополнительно увеличена путем помещения указанных рекомбинантных дрожжей в условия, приводящие к увеличению продукции промежуточного метаболита оксалоацетата.
Помещение указанных рекомбинантных дрожжей в условия, приводящие к увеличению продукции оксалоацетата, может быть осуществлено путем введения дополнительных генетических модификаций в геном дрожжей.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что оптимальное увеличение продукции эктоина может быть достигнуто путем внесения дополнительных генетических изменений в рекомбинантные дрожжи продуцирующие, эктоин, которые описаны ниже.
Первые дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин
В соответствии с этими первыми дополнительными вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин, согласно изобретению, выполняют дополнительные генные модификации рекомбинантных дрожжей с целью увеличения продукции промежуточного продукта фосфоенолпирувата (PEP).
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что дополнительные генетические изменения, вносимые в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, (i) вызывают сверхпродукцию NADPH, (ii) вызывают контролируемое и сбалансированное превращение фосфоенолпирувата в оксалоацетат и пируват, соответственно, и (iii) вызывают пониженное превращение пирувата в этанол и перенаправление в сторону превращения фосфоенолпирувата в оксалоацетат.
Эти дополнительные генетические изменения, внесенные с помощью генной инженерией в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, согласно изобретению, более подробно описаны ниже.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы (также называемой MET19 или ZWF1) и декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1 (также называемой GND1). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретатения считают, что сверхэкспрессия MET19 и GND1 вызывает увеличение продукции NADPH.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию фосфоенолпируваткарбоксилазы (также называемой PEPC или PPC) и/или фосфоенолпируваткарбоксикиназы [АТФ] (также называемой PCK1 или PEPCK).
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию пируваткиназы 1 (также называемой PYK1 или CDC19) и пируваткиназы 2 (также называемой PYK2). В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK2 может быть удален вместо обеспечения пониженной экспрессии.
В некоторых из этих вариантов осуществления один или более генов, кодирующих пируватдекарбоксилазу, инактивированы, предпочтительно путем делеции. Гены, кодирующие пируватдекарбоксилазу, охватывают гены, называемые PDC1, PDC5 и PDC6, соответственно. В соответствии с некоторыми из этих вариантов осуществления гены PDC1 и/или PDC6 инактивированы предпочтительно путем разрыва или делеции, тогда как другой ген, кодирующий пируватдекарбоксилазу, PDC5 остается неизменным; или его экспрессия снижена путем контроля с помощью слабого промотора.
В некоторых из этих вариантов осуществления активность алкогольдегидрогеназы рекомбинантных дрожжей снижена путем изменения экспрессии одного или более генов, кодирующих алкогольдегидрогеназу. В некоторых из этих вариантов осуществления экспрессия ADH1 снижена путем помещения гена под контроль слабого промотора или путем продуцирования дестабилизированного фермента ADH1. В некоторых из этих вариантов осуществления один или более из ADH3, ADH4 и ADH5 могут быть инактивированы, предпочтительно путем разрыва или делеции.
В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий ацетилдегидрогеназу (также называемую MHPF), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.
В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий ацетаткиназу (также называемую ACKA), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.
В некоторых из этих вариантов осуществления экзогенный ген, кодирующий фосфатацетилтрансферазу (также называемую PTA), может быть введен в дрожжевой геном и сверхэкспрессирован.
Глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа
Фермент глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения D-глюкозо-6-фосфата в 6-фосфо-D-глюконо-1,5-лактон с сопутствующим восстановлением NADP до NADPH.
Способ, применяемый для измерения уровня активности глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Kuby, S. et al. (1966) Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9, 116-117.
Предпочтительной глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.49.
Аминокислотную последовательность глюкозо-6-фосфат-1-дегидрогеназы (также называемой MET19) можно найти под регистрационным номером NP_014158.1 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183079.1 в базе данных UniProt.
6-фосфоглюконатдегидрогеназа, декарбоксилирующая 1
2
Фермент декарбоксилирующая 6-фосфоглюконатдегидрогеназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа окислительного декарбоксилирования 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата и СО, с сопутствующим восстановлением NADP до NADPH.
Способ, применяемый для измерения уровня активности декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области техники.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в He W. et al. (2007) BMC Structural Biology, 7:38.
Предпочтительной декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназой 1 в настоящем описании, является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.44.
Аминокислотную последовательность декарбоксилирующей 6-фосфоглюконатдегидрогеназы 1 (также называемой GND1) можно найти под регистрационным номером NP_012053 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001179314 в базе данных NCBI.
Пируваткиназа 1
Фермент пируваткиназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения пирувата в фосфоенолпируват в присутствии АТФ.
Способ, применяемый для измерения уровня активности пируваткиназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Susan-resiga и Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).
Предпочтительной пируваткиназой 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.7.1.40.
Аминокислотную последовательность пируваткиназы 1 (также называемой PYK1) можно найти под регистрационным номером NP_009362 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178183 в базе данных NCBI.
Пируваткиназа 2
Фермент пируваткиназа 2 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения пирувата в фосфоенолпируват в присутствии АТФ. Пируваткиназа 2 может использоваться дрожжевой клеткой в условиях, когда уровень гликолитического потока очень низок.
Способ, применяемый для измерения уровня активности пируваткиназы 2, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Susan-resiga и Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245).
Предпочтительной пируваткиназой 2 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.7.1.40.
Аминокислотную последовательность пируваткиназы 2 (также называемой PYK2) можно найти под регистрационным номером NP_014992 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183767 в базе данных NCBI.
Изофермент пируватдекарбоксилазы 1
Изофермент пируватдекарбоксилазы 1 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.
Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).
Предпочтительным изоферментом пируватдекарбоксилазы 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.
Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 1 (также называемой PDC1) можно найти под регистрационным номером NP_013145 в базе данных UniProt. Последовательности нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181931 в базе данных NCBI.
Изофермент пируватдекарбоксилазы 5
Изофермент пируватдекарбоксилазы 5 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.
Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).
Предпочтительный изофермент пируватдекарбоксилазы 5 в настоящем описании представляет собой фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.
Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 5 (также называемой PDC5) можно найти под регистрационным номером NP_013235 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182021 в базе данных NCBI.
Изофермент пируватдекарбоксилазы 6
Изофермент пируватдекарбоксилазы 6 представляет собой белок, который описан в данной области техники как участвующий в неокислительном превращении пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода во время спиртового брожения.
Способ, применяемый для измерения уровня активности изофермента пируватдекарбоксилазы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763).
Предпочтительным изоферментом пируватдекарбоксилазы 6 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.1.
Аминокислотную последовательность изофермента пируватдекарбоксилазы 6 (также называемой PDC6) можно найти под регистрационным номером NP_013235 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182021 в базе данных NCBI.
Ацетальдегиддегидрогеназа
Ацетальдегиддегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения ацетальдегида в ацетил-КоА с использованием NAD и кофермента А.
Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетальдегиддегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Fisher et al. (2013) Chemi. Biol. Interact. 202 70-77.
Предпочтительной ацетальдегиддегидрогеназой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.10.
Аминокислотную последовательность ацетальдегиддегидрогеназы (также называемой MHPF) можно найти под регистрационным номером NP_414885 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913.3 в базе данных NCBI.
Ацетаткиназа
Ацетаткиназа представляет собой белок, который описан в данной области для образования ацетилфосфата из ацетата и АТФ.
Способ, применяемый для измерения уровня активности ацетаткиназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Sagers et al. J.Bacteriology (1961) 82 233-238.
Аминокислотную последовательность ацетаткиназы (также называемой ACKA) можно найти под регистрационным номером NP_416799 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913.3 в базе данных NCBI.
Фосфатацетилтрансфераза
Фосфатацетилтрансфераза представляет собой белок, который описан в данной области для катализа обратимого взаимопревращения ацетил-КоА и ацетилфосфата.
Способ, применяемый для измерения уровня активности фосфатацетилтрансферазы, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Castano-Cerezo and Canovas, Microbial Cell Factories 2009, 8:54.
Предпочтительной фосфатацетилтрансферазой в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 2.3.1.8.
Аминокислотную последовательность фосфатацетилтрансферазы (также называемой PTA) можно найти под регистрационным номером NP_416800 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты относится к той, которая раскрыта под регистрационным номером NC_000913 в базе данных NCBI.
Алкогольдегидрогеназа 1
Алкогольдегидрогеназа 1 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.
Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 1, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 1 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.
Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 1 (также называемой ADH1) можно найти под регистрационным номером NP_014555 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001183340 в базе данных NCBI.
Алкогольдегидрогеназа 3
Алкогольдегидрогеназа 3 представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.
Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 3, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 3 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.
Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 3 (также называемой ADH3) можно найти под регистрационным номером NP_013800 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001182582 в базе данных NCBI.
Алкогольдегидрогеназа 4
Алкогольдегидрогеназа 4 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.
Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 4, относится к общим знаниям специалистам в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 4 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.
Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 4 (также называемой ADH4) можно найти под регистрационным номером NP_011258 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001181122 в базе данных NCBI.
Алкогольдегидрогеназа 5
Алкогольдегидрогеназа 5 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения первичных неразветвленных спиртов в их соответствующие альдегиды.
Способ, применяемый для измерения уровня активности алкогольдегидрогеназы 5, относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61.
Предпочтительной алкогольдегидрогеназой 5 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.1.
Аминокислотную последовательность алкогольдегидрогеназы 5 (также называемой ADH5) можно найти под регистрационным номером NP_009703 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_001178493 в базе данных NCBI.
Вторые дополнительные варианты осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин
В соответствии с этими дополнительными вариантами осуществления рекомбинантных дрожжей, продуцирующих эктоин, согласно изобретению, выполняют дополнительные генетические модификации рекомбинантных дрожжей с целью увеличения продукции промежуточного продукта фосфоенолпирувата (PEP).
Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что дополнительные генетические изменения, вносимые в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, (i) вызывают сверхпродукцию NADPH, (ii) вызывают контролируемое и сбалансированное превращение фосфоенолпирувата в оксалоацетат и пируват, соответственно, и (iii) вызывают пониженное превращение пирувата в этанол и перенаправление в сторону превращения фосфоенолпирувата в оксалоацетат.
Для этой цели авторы изобретения разработали совершенно новый метаболический путь, начинающийся от фосфенолпирувата и заканчивающийся продукцией оксалоацетата.
Эти дополнительные генетические изменения, внесенные с помощью генной инженерии в рекомбинантные дрожжи, продуцирующие эктоин, согласно изобретению, более подробно описаны ниже.
Согласно этим вариантам осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию пируваткиназы 1 (также называемую PYK1) и, необязательно, также пируваткиназы 2 (также называемую PYK2). В некоторых из этих вариантов осуществления PYK1 может быть пониженно экспрессирован путем помещения гена под контроль слабого промотора или индуцибельного или репрессируемого промотора. В некоторых из этих вариантов осуществления PYK2 может быть инактивирован, например, путем разрыва или делеции. В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK1 может быть удален, а не пониженно экспрессирован. В некоторых из этих вариантов осуществления ген PYK1 и ген PYK2 могут быть удалены, а не пониженно экспрессированы.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию фосфоенолпируваткарбоксикиназы [АТФ] (также называемую PCK, или PCKA, или PEPCK), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) посредством индуцибельной сверхэкспрессии.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию в цитоплазме малатдегидрогеназы, такой как пероксисомальная малатдегидрогеназа (также называемая MDH3), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) путем индуцибельной сверхэкспрессии.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3 (также называемый ME3 или NADP-ME3), либо (i) путем конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) путем индуцибельной сверхэкспрессии.
В соответствии с этими вариантами осуществления генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать пониженную экспрессию одной или более алкогольдегидрогеназ(-ы), предпочтительно, одной или более алкогольдегидрогеназ(-ы), выбранных из группы, включающей алкогольдегидрогеназу 1 (также называемую ADH1), алкогольдегидрогеназу 3 (также называемую ADH3), алкогольдегидрогеназу 4 (также называемую ADH4) и алкогольдегидрогеназу 5 (также называемую ADH5), например (i) путем помещения соответствующей кодирующей последовательности под контроль слабого промотора или индуцибельного или репрессируемого промотора или (ii) путем продуцирования дестабилизированной формы указанной алкогольдегидрогеназы(ы).
Тем не менее, в соответствии с этими вариантами осуществления, генетические изменения вводят таким образом, чтобы вызвать сверхэкспрессию экзогенной ацетальдегиддегидрогеназы (также называемой MHPF), либо (i) посредством конститутивной сверхэкспрессии, либо (ii) посредством индуцибельной сверхэкспрессии.
Фосфоенолпируваткарбоксикиназа (PPCK)
Фермент фосфоенолкарбоксикиназа [АТФ] представляет собой белок, который описан в данной области для катализа превращения оксалоацетата в фосфоенолпируват посредством прямого переноса фосфорила между нуклеозидтрифосфатом и оксалоацетатом.
Способ, применяемый для измерения уровня активности фосфоенолкарбоксикиназы [АТФ], относится к общим знаниям специалиста в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Bazaes S. et al. (2007) The Protein Journal, 26, 265-269 и Mariët J. Van der Werf et al.·(1997) Arch Microbiol 167: 332-342.
Предпочтительной фосфоенолкарбоксикиназой [АТФ] в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 4.1.1.49.
Аминокислотную последовательность фосфоенолкарбоксикиназы [АТФ] (также называемой PCKA) можно найти под регистрационным номером NP_417862 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты, ее можно отнести к последовательности, описанной под регистрационным номером NC_000913 в базе данных NCBI.
Предпочтительная фосфоенолкарбоксикиназа в соответствии с изобретением может быть выбрана из фосфоенолпируваткарбоксикиназы PPCK, такой как PEPCK, имеющей шифр КФ 4.1.1.32.
Малатдегидрогеназа
Фермент малатдегидрогеназа представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения малата в оксалоацетат в присутствии NADH.
Способ, применяемый для измерения уровня активности малатдегидрогеназы, относится к общим знаниям специалиста в данной области. Например, можно упомянуть коммерчески доступный набор, продаваемый Sigma, под названием «Набор для анализа малатдегидрогеназы» под номером MAK196-1KT.
Аминокислотную последовательность малатдегидрогеназы (также называемой MDH3) можно найти под регистрационным номером NP_010205 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_00118037 в базе данных NCBI.
NADP-зависимая малатдегидрогеназа 3
Фермент NADP-зависимая малатдегидрогеназа 3 представляет собой белок, который описан в данной области техники для катализа превращения малата в пируват в присутствии NADP.
Способ, применяемый для измерения уровня активности NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3, относится к общим знаниям специалистам в данной области.
В этом отношении специалист в данной области техники может преимущественно обратиться к способу, описанному в Gerrard-Wheeler et al. FEBS Journal 276 (2009) 5665-5677.
Предпочтительной NADP-зависимой малатдегидрогеназой 3 в настоящем описании является фермент, имеющий шифр КФ 1.1.1.40.
Аминокислотную последовательность NADP-зависимой малатдегидрогеназы 3 (также называемой NADP-ME3 или ME3) можно найти под регистрационным номером NP_197960 в базе данных UniProt. Последовательность нуклеиновой кислоты можно найти под регистрационным номером NM_122489 в базе данных NCBI.
Алкогольдегидрогеназа 1, алкогольдегидрогеназа 3, алкогольдегидрогеназа 4, алкогольдегидрогеназа 5 и ацетальдегиддегидрогеназа являются такими, как указано в данном документе выше.
ПРОМОТОРЫ
Как описано в настоящем документе, экспрессия представляющих интерес генов, которые генетически сконструированы для получения рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, включает соответствующие регуляторные последовательности, которые являются функциональными в клетках дрожжей, в том числе в Saccharomyces cerevisiae.
Как описано в настоящем описании, различные промоторы могут быть использованы для желаемой экспрессии представляющих интерес кодирующих последовательностей, которые включают (i) конститутивные сильные промоторы (также называемые сильными промоторами в настоящем тексте), (ii) конститутивные слабые промоторы (также называемые слабыми промоторами в настоящем тексте) и (iii) индуцибельные или репрессируемые промоторы. Список дрожжевых промоторов с их относительной активностью в разных средах можно найти в Keren et al. (2013) Molecular Systems Biology 9: 701.
Промоторы, обеспечивающие конститутивную сверхэкспрессию данного гена, можно найти в литературе (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251).
Сильные промоторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:
• pTDH3 (SEQ ID NO: 24),
• pENO2 (SEQ ID NO: 25),
• pTEF KI (SEQ ID NO: 26),
• pTEF3 (SEQ ID NO: 27),
• pTEF1 (SEQ ID NO: 28),
• pADH1 (SEQ ID NO: 29),
• pGMP1 (SEQ ID NO: 30),
• pFBA1 (SEQ ID NO: 31),
• pPDC1 (SEQ ID NO: 32),
• pCCW12 (SEQ ID NO: 33), и
• pGK1 (SEQ ID NO: 34).
В соответствии с конкретным вариантом осуществления сильный промотор согласно изобретению независимо выбран из группы, состоящей из pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 и pGK1.
Слабые промоторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:
• pURA3 (SEQ ID NO: 36),
• pRPLA1 (SEQ ID NO: 37),
• pNUP57 (SEQ ID NO: 119), и
• pGAP1 (SEQ ID NO: 120).
Согласно конкретному варианту осуществления слабый промотор согласно изобретению независимо выбран из группы, состоящей из pURA3, pRPLA1, pNUP57 и pGAP1.
Как упоминалось ранее, индуцибельные или репрессируемые промоторы представляют собой промоторы, активность которых контролируется наличием или отсутствием биотических или абиотических факторов, и также количеством указанного фактора. Соответственно, для некоторых промоторов их активность, в частности, будет индуцирована и, следовательно, увеличена, когда количество данного фактора увеличивается или является увеличенным, и, соответственно, активность этих же промоторов может быть подавлена и, таким образом, уменьшена, когда количество указанного фактора уменьшается или является уменьшенным. Количество указанного фактора(-ов) в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих индуцибельные или репрессируемые промоторы, может быть определено и, таким образом, контролироваться специалистом в данной области.
Например, увеличение количества метионина в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих промотор pSAM4, будет индуцировать и, следовательно, увеличивать транскрипцию гена под контролем этого промотора. Напротив, уменьшение количества метионина в указанной культуральной среде приведет к репрессии и, следовательно, к уменьшенной транскрипции гена под контролем этого промотора.
В другом примере увеличение количества меди в культуральной среде рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, содержащих промотор pCTR1, будет репрессировать и, таким образом, уменьшать транскрипцию гена под контролем этого промотора. Напротив, уменьшение количества меди в указанной культуральной среде приведет к индуцированной и, следовательно, повышенной транскрипции гена под контролем этого промотора.
По этой причине следующие промоторы упоминаются в настоящем тексте как «индуцибельные или репрессируемые промоторы».
Согласно первому варианту осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые треонином, и, в частности, выбраны из группы, состоящей из:
• pSAM4 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 38),
• pCUP1-1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 39),
• pCUP1.cgla - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 40),
• pCUP1.sba - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 41),
• pACU1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 42),
• pACU2 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 43),
• pACU3p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 44),
• pACU4p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 45),
• pACU5 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 46),
• pACU6 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 47),
• pACU7 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 48),
• pACU8 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 49),
• pACU9 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 50),
• pACU10p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 51),
• pACU11 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 52),
• pACU12 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 53),
• pACU13 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 54),
• pACU14 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 55),
• pACU15 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 56),
• pGAL/CUP1p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 57),
• pCRS5 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 58), и
• pCHA1 - индуцируемый или репрессируемый треонином (SEQ ID NO: 59).
В соответствии с этим вариантом осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор согласно изобретению может, в частности, независимо быть выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5 , pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 и pCHA1.
Таким образом, активность этих промоторов индуцируется увеличивающимся присутствием метионина, меди или треонина, как указано выше, и их активность уменьшается, то есть подавляется, когда количество метионина, меди или треонина уменьшается.
Согласно второму варианту осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые лизином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и, в частности, быть выбраны из группы, состоящей из:
• pCTR1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 60),
• pCTR3 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 61),
• pCUR1 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 62),
• pCUR2 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 63),
• pCUR3 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 64),
• pCUR4 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 65),
• pCUR5p - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 66)
• pCUR6 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 67),
• pCUR7 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 68),
• pCUR8 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 69),
• pCUR9 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 70),
• pCUR10 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 71),
• pCUR11 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 72),
• pCUR12 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 73),
• pCUR13 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 74),
• pCUR14 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 75),
• pCUR15 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 76),
• pCUR16 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 77),
• pCUR17 - индуцируемый или репрессируемый медью (SEQ ID NO: 78),
• pLYS1 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 79),
• pLYS4 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 80),
• pLYS9 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 81),
• pLYR1p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 82),
• pLYR2p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 83),
• pLYR3p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 84),
• pLYR4p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 85),
• pLYR5p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 86),
• pLYR6p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 87),
• pLYR7p - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 88),
• pLYR8 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 89),
• pLYR9 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 90),
• pLYR10 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 91),
• pLYR11 - индуцируемый или репрессируемый лизином (SEQ ID NO: 92),
• pMET17 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 93),
• pMET6 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 94),
• pMET14 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 95),
• pMET3 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 96),
• pSAM1 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 97),
• pSAM2 - индуцируемый или репрессируемый метионином (SEQ ID NO: 98),
• pMDH2 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 35),
• pJEN1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 118),
• pICL1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 119),
• pADH2 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 120), и
• pMLS1 - индуцируемый или репрессируемый глюкозой (SEQ ID NO: 121).
В соответствии с этим конкретным вариантом осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор согласно изобретению может независимо быть выбиран из группы, состоящей из pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.
Таким образом, активность этих промоторов подавляется увеличивающимся присутствием метионина, меди, лизина или глюкозы, как указано выше, и их активность увеличивается, то есть индуцируется, когда количество метионина, меди, лизина или глюкозы уменьшается.
В конкретном варианте осуществления индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут быть выбраны из группы, включающей промоторы, индуцируемые или репрессируемые медью, промоторы, индуцируемые или репрессируемые глюкозой, промоторы, индуцируемые или репрессируемые лизином, промоторы, индуцируемые или репрессируемые метионином, и промоторы, индуцируемые или репрессируемые треонином.
В более конкретном варианте осуществления индуцибельный или репрессируемый промотор по изобретению может быть независимо выбран из группы, состоящей из pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 и pMLS1.
Более конкретно, указанные промоторы, одинаковые или разные, могут предпочтительно характеризоваться последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80 % идентичность последовательностям SEQ ID NO: 24-98 и 116-121.
Синтетические промоторы, как описано в Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58, также могут быть использованы.
Сильные, слабые и индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению могут происходить из любого организма из класса Saccharomycetes и, в частности, могут независимо происходить из организма, выбранного из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii, Ashbya gossypii, Kluveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida glabrata, Candida tropicalis, Debaryomyces castelii, Yarrowia lipolitica и Cyberlindnera jadinii.
Сильные, слабые и индуцибельные или репрессируемые промоторы согласно изобретению предпочтительно могут происходить из организма, выбранного из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces castelii, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces arboricola, Saccharomyces kudriavzevii и Kluveromyces lactis.
ТЕРМИНАТОРЫ
Как описано в данном документе, экспрессия представляющих интерес генов, которые были генетически сконструированы для получения рекомбинантных дрожжей согласно изобретению, включает соответствующие последовательности терминаторов транскрипции, которые функционируют в клетках дрожжей, в том числе в Saccharomyces cerevisiae.
Указанные терминаторы транскрипции, одинаковые или разные, можно найти в литературе Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347.
Терминаторы, представляющие особый интерес в настоящем изобретении, могут быть выбраны из группы, включающей:
• tTDH2 из гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, изофермент 2 (ген TDH2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 99),
• tCYC1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 100),
• tTDH3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 101) и
• tADH1 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 102),
• tADH2 из гена, кодирующего алкогольдегидрогеназу (ген ADH2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 103),
• tTPI1 из гена, кодирующего триозофосфатизомеразу (ген TPI1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 104),
• tMET17 из гена, кодирующего O-ацетилгомосерин-O-ацетилсеринсульфгидрилазу (ген Met17 соответствует последовательности SEQ ID NO: 105),
• tENO2 из гена, кодирующего енолазу II (ген ENO2 соответствует последовательности SEQ ID NO: 106),
• tMET3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 107) и
• tPGK1 из гена, кодирующего 3-фосфоглицераткиназу (ген PGK1 соответствует последовательности SEQ ID NO: 108),
• tDIT1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 109),
• tRPL3 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 110),
• tRPL41B (соответствует последовательности SEQ ID NO: 111),
• tRPL15A (соответствует последовательности SEQ ID NO: 112),
• tIDP1 (соответствует последовательности SEQ ID NO: 113).
Более конкретно, указанный терминатор, одинаковый или различный, предпочтительно может быть охарактеризован последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, имеющих по меньшей мере 80 % идентичность последовательностям SEQ ID NO: 99-113.
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ДРОЖЖИ
Как правило, дрожжи могут быстро расти, и могут быть культивированы при более высокой плотности по сравнению с бактериями, и не требуют асептической среды в промышленных условиях. Кроме того, дрожжевые клетки легче отделить от культуральной среды по сравнению с бактериальными клетками, что значительно упрощает процесс выделения и очистки продукта.
Предпочтительно, дрожжи согласно изобретению могут быть выбраны из рода Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus или Malassezia.
Более предпочтительно, дрожжи могут быть Crabtree(Крэбтри)-положительными дрожжами рода Saccharomyces, Dekkera, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora Zigosaccharomyces или Brettanomycces.
Более предпочтительно, дрожжи могут относиться к видам Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa или Torulaspora glabrata.
Более предпочтительно, рекомбинантные дрожжи могут принадлежать к роду Saccharomyces и предпочтительно к виду Saccharomyces cerevisiae.
Как упомянуто выше, рекомбинантные дрожжи согласно изобретению обладают пируватдекарбоксилазной активностью, которая снижается путем введения по меньшей мере одной ДНК-конструкции, выбранной из тех, которые описаны в настоящем документе.
Способы, применяемые для вставки конкретной ДНК-конструкции в ген, относятся к общим знаниям специалиста в данной области. Связанный способ описан более подробно в настоящем документе в примерах, приведенных ниже.
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
Настоящее изобретение также относится к применению рекомбинантных дрожжей, таких как определенные выше, для получения эктоина.
Настоящее изобретение также относится к способу получения эктоина, включающему следующие стадии:
- обеспечение рекомбинантного микроорганизма, как описано ранее, культивирование рекомбинантного микроорганизма в культуральной среде, содержащей источник углерода, и
- выделение эктоина.
Как правило, микроорганизмы согласно изобретению выращивают при температуре в диапазоне от около 20 до около 37°С, предпочтительно при температуре в диапазоне от 27 до 34°С, в соответствующей культуральной среде.
Когда рекомбинантные дрожжи согласно изобретению принадлежат к виду S. cerevisiae, температура может предпочтительно составлять в диапазоне от 27 до 34°С в подходящей культуральной среде.
Подходящими питательными средами для дрожжей являются обычные коммерческие готовые среды, такие как бульон, который включает основу азотного агара для дрожжей, сульфат аммония и декстрозу в качестве источника углерода/энергии, или среда YPD, смесь пептона, дрожжевого экстракта и декстрозы в оптимальных пропорциях для выращивания. Также могут быть использованы другие определенные или синтетические питательные среды, и специалисту в области микробиологии или ферментации будут известны подходящие среды для роста конкретного микроорганизма.
Термин «подходящая культуральная среда» определен выше.
Примеры известных питательных сред для рекомбинантных дрожжей в соответствии с настоящим изобретением известны специалисту в данной области и представлены в следующей публикации D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000).
Подходящие диапазоны рН для ферментации могут составлять от 3,0 до 7,5, где рН от 4,5 до 6,5 является предпочтительным в качестве начального условия.
Ферментация может проводиться в аэробных или микроаэробных условиях.
Количество продукта в ферментационной среде может быть определено с использованием ряда методов, известных в данной области, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или газовой хроматографии (ГХ).
Настоящий процесс может использовать периодический метод ферментации. Классическая периодическая ферментация представляет собой закрытую систему, в которой состав среды устанавливается в начале ферментации и не подвергается искусственным изменениям во время ферментации. Таким образом, в начале ферментации средe засеивают желаемым организмом или организмами, и ферментация может происходить без добавления чего-либо в систему. Как правило, однако, «периодическая» ферментация является периодической в отношении добавления источника углерода, и часто предпринимаются попытки контроля таких факторов, как температура, pH и концентрация кислорода. В периодических системах состав метаболитов и биомассы системы постоянно изменяется до момента, когда ферментация прекращается. В периодических культурах клетки проходят через статическую фазу задержки роста в логарифмическую фазу быстрого роста и, наконец, в стационарную фазу, где скорость роста уменьшается или останавливается. Без обработки клетки в стационарной фазе в конечном итоге погибнут. Клетки в логарифмической фазе обычно отвечают за основную массу продукции конечного продукта или промежуточного продукта.
2
Система стационарного культивирования с подпиткой (система Fed-Batch) также может быть использована в настоящем изобретении. Система Fed-Batch похожа на типичную периодическую систему, за исключением того, что субстрат источника углерода добавляют порциями по мере ферментации. Системы Fed-Batch полезны, когда катаболитная репрессия (например, репрессия глюкозы) способна ингибировать метаболизм клеток и когда желательно иметь ограниченные количества субстрата в среде. Измерение фактической концентрации субстрата в системах Fed-Batch является сложным и поэтому оценивается на основе изменений измеряемых факторов, таких как pH, растворенный кислород и парциальное давление отработанных газов, таких как CO.
Ферментации являются общепринятыми и хорошо известными в данной области техники, и примеры могут быть найдены в Sunderland et al., (1992), включенной в настоящее описание посредством ссылки. Хотя настоящее изобретение выполняют в периодическом режиме, предполагается, что способ может быть адаптирован к непрерывной ферментации.
Непрерывная ферментация представляет собой открытую систему, в которой определенную ферментационную среду непрерывно добавляют в биореактор и одновременно убирают равное количество кондиционированной среды для обработки. Непрерывная ферментация, как правило, поддерживает культуры с постоянной высокой плотностью, где клетки в основном находятся в логарифмической стадии роста.
Непрерывная ферментация позволяет модулировать один фактор или любое количество факторов, которые влияют на рост клеток или концентрацию конечного продукта. Например, в одном способе будут поддерживать ограничение питательных веществ, таких как источник углерода или уровень азота, на фиксированном уровне, в то время как все другие параметры будут изменяться. В других системах ряд факторов, влияющих на рост, может изменяться непрерывно, в то время как концентрацию клеток, измеренная по мутности среды, поддерживают постоянной. Непрерывные системы стремятся поддерживать условия роста в устойчивом состоянии, и, таким образом, потеря клеток из-за откачиваемой среды должна быть сбалансирована скоростью роста клеток в процессе ферментации. Способы модуляции питательных веществ и факторов роста для процессов непрерывной ферментации, а также методы максимизации скорости образования продукта хорошо известны в области промышленной микробиологии.
Предполагается, что настоящее изобретение может быть осуществлено с использованием периодических, Fed-Batch или непрерывных процессов и что любой известный способ ферментации будет подходящим. Кроме того, предполагается, что клетки могут быть иммобилизованы на субстрате в качестве цельноклеточных катализаторов и подвергнуты условиям ферментации для осуществления получения.
Чтобы дополнительно улучшить продукцию эктоина, конкретный вариант осуществления может состоять из культивирования рекомбинантных дрожжевых клеток в подходящей культуральной среде, такой как указано выше, где указанная культуральная среда содержит оптимальное количество источника углерода, в частности, глюкозы.
Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение только части всей продолжительности культивирования. В некоторых вариантах осуществления дрожжевые клетки инкубируют в указанной оптимальной культуральной среде через 10 часов или более после начала культивирования, что охватывает 11, 12, 13, 14, 15 или 16 часов или более после начала культивирования.
Предпочтительно клетки культивируют в такой оптимальной культуральной среде в течение периода времени от 5 до 15 часов, что включает от 6 до 10 часов, например 8 часов, после начала культивирования.
В предпочтительных вариантах осуществления источник углерода, содержащийся в указанной оптимальной культуральной среде, состоит из глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления указанная оптимальная культуральная среда содержит 12 мас.% или более глюкозы, включая 15 мас.% или более глюкозы. В предпочтительных вариантах осуществления указанная оптимальная культуральная среда содержит не более 40 мас.% глюкозы, что включает не более 35 мас.% глюкозы.
Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, описанных выше, способ получения эктоина согласно изобретению может дополнительно включать, между этапами (а) и (с), промежуточную стадию (b), состоящую из культивирования дрожжевых клеток в указанной оптимальной культуральной среде.
ОЧИСТКА ЭКТОИНА
Согласно конкретному аспекту изобретения ферментативное получение эктоина включает стадию выделения эктоина из культуральной среды. Выделение эктоина из культуральной среды является обычной задачей для специалиста в данной области. Оно быть осуществлено с помощью ряда методик, хорошо известных в данной области, включая, но не ограничиваясь, дистилляцию, отдувку газом, испарение через полупроницаемую мембрану, селективное осаждение или жидкостную экстракцию. Специалист в данной области знает, как адаптировать параметры каждого метода в зависимости от характеристик материала, подлежащего разделению.
Дрожжи в качестве модели микроорганизма в настоящем изобретении были сохранены в том смысле, что синтезированный эктоин полностью выделяется за пределы клеток, что упрощает процесс очистки.
Синтезированный эктоин могут быть собран дистилляцией. Дистилляция может включать необязательный компонент, отличный от культуральной среды, чтобы облегчить выделение эктоина путем образования азеотропа, и в частности с водой. Этот необязательный компонент представляет собой органический растворитель, такой как циклогексан, пентан, бутанол, бензол, толуол, трихлорэтилен, октан, диэтиловый эфир или их смесь.
Отдувку газом осуществляют с помощью отдувочного газа, выбранного из гелия, аргона, диоксида углерода, водорода, азота или их смеси.
Жидкостную экстракцию осуществляют с помощью органического растворителя в качестве гидрофобной фазы, такого как пентан, гексан, гептан или додекан.
Термины «между…и…» и «в пределах от…до…» следует понимать как включающие пределы, если не указано иное.
Следующие примеры и графические материалы представлены в качестве иллюстрации и не подразумевают ограничение изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Протокол получения рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae согласно изобретению
Все реализованные далее рекомбинантные штаммы Saccharomyces cerevisiae были сконструированы из стандартных штаммов с использованием стандартной процедуры молекулярной генетики дрожжей (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
Кластер из упомянутых далее генов был встроен в рекомбинантные дрожжи за один раз с использованием способности дрожжей эффективно рекомбинировать свободные концы ДНК, имеющие гомологию последовательности.
Кроме того, для лучшего понимания следующих генотипов:
- ade2, his3, leu2, trp1 и ura3 являются маркерными генами ауксотрофии.
- Буквы в нижнем регистре означают, что рассматриваемый ген неактивен, буквы в верхнем регистре отражают активный ген.
- «::»: за названием гена означает, что ген разорван тем, что следует далее (если вставлено более одного гена, они отмечаются в скобках []). Разрыв гена сопровождается полной делецией кодирующей последовательности, но при этом сохраняется промотор. В результате ген, за которым следует «::», является неактивеным и отмечен буквами в нижнем регистре. Если это не указано, транскрипция вставленного гена контролируется промотором разорванного гена.
- «gene.Kl» означает, что ген происходит от Kluyveromyces lactis.
Более конкретно, кодирующие последовательности, подлежащие клонированию, были искусственно синтезированы. Для гетерологичных последовательностей (не дрожжевых) нуклеиновые последовательности были модифицированы для получения синонимичной кодирующей последовательности с использованием дрожжевых кодонов. Используя рестриктазу и классическую технологию клонирования, каждую синтетическую последовательность клонировали между промотором транскрипции и терминатором транскрипции. Каждой промоторной последовательности предшествовало от 50 до 200 нуклеотидных последовательностей, гомологичных последовательности терминатора вышестоящего гена. Аналогично, за терминатором каждого гена (геном, содержащим промотор-кодирующую последовательность-терминатор) следуют последовательности, гомологичные гену, непосредственно следующим за ним. Таким образом, каждое звено, подлежащее встраиванию, имеет от 50 до 200 перекрывающихся нуклеотидов как с вышерасположенным звеном, так и с нижерасположенным. Промотору первого звена предшествуют от 50 до 200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотиду хромосомы дрожжей для локуса, в который он будет встроен. Аналогично, за терминатором последнего звена следуют от 50 до 200 нуклеотидов, гомологичных нуклеотиду хромосомы дрожжей для локуса, в который он будет встроен.
Затем каждое звено амплифицируют с помощью ПЦР из плазмидных конструкций, получая Х звеньев линейной ДНК, имеющих перекрывающиеся последовательности. По крайней мере, один из этого гена является ауксотрофным маркером, позволяющим выбрать событие рекомбинации. Все линейные фрагменты трансформируются в дрожжах за один раз, и рекомбинантные дрожжи отбирают для ауксотрофии, связанной с используемым маркером. Целостность последовательности затем проверяют с помощью ПЦР и секвенирования.
Пример 2: Сравнительные примеры для получения эктоина
А. Сначала получают два рекомбинантных штамма: YA3370-20 и YA3371-46. Эти два штамма были рекомбинированы таким образом, чтобы включать только часть модификаций согласно изобретению.
Соответственно, эти два штамма являются следующими:
YA3370-20: ade2, can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4, hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1::[LEU2.Kl-RS,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF3-AQR1-tRPL41B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pPDC1-METX.Cg-tRPL3-pTDH3-MHPF.ec-tIDP1]x2, trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6, ura3
YA3371-46: ade2, can1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-PPC-5.Ec-tTPI1]x4, his3::[pACU5-HOM2-2-tRPL3-pTDH3-GDH-2.Eca-tIDP1]x4, hom6::[URA3-pCCW12-ECTB.He-tIDP1]x5, leu2, lyp1::[pPDC1-ECTA.He-tCYC1-pTDH3-ECTC.He-tTDH3]x2, pyk1::[LEU2.Kl-RS,pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1,pTEF3-AQR1-tRPL41B, pCUR3-PYK1-tPYK1], sam3::[pCCW12-ECTB.Pa-tRPL3-pTDH3-MHPF.Ec-tRPL41B]x4, trp1::[pPDC1-PPC-5.Ec-tRPL3-pACU7-AK.Bs-tIDP1-TRP1]x6, ura3
PEPCK-1 является формой PEPCK, стабилизированной путем модификации аминокислоты аргинина в положении 2 глицином.
PPC-5 является более стабильной формой PPC, в которой был добавлен аланин в N+1.
4
Все эти штаммы выращивали в течение 24 часов в YE (дрожжевой экстракт) 2% и в глюкозе 8%, и через 8 часов добавляли 500 мкМ CuSO. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.
Количество эктоина, полученное с этими различными штаммами, соответственно:
-1
- YA3370-20: 1 г/л.
-1
- YA3371-46: 1,55 г/л.
Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.
Из этого сравнительного эксперимента следует, что рекомбинантный штамм, содержащий модификации согласно изобретению, продуцирует большее количество эктоина при культивировании в тех же условиях, что и другие рекомбинантные штаммы, не содержащие все генетические модификации согласно изобретению.
B. Также были получены пять других рекомбинантных штаммов: YA3380-40B, YA3595-25 и YA3595-34.
Эти три штамма являются следующими:
YA3380-40B: gnp1::[LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[pACU5-ME3.At- tRPL3 -pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x11, hom6::[ TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], trp1, ura3
YA3595-25: ade2, gnp1::[LEU2.Kl-RS,pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6::[ TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[ pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3 -pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7, trp1, ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x14
YA3595-34: ade2, gnp1::[LEU2.Kl-RS,pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET25, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, hom6::[TRP1.Kl, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, mup3::[HIS5.Sp, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-2.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[LEU2.Kl, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tDIT1]x7, trp1, ura3::[ pCCW12-ECTB.Ab- tRPL3 -pTDH3-ECTC.He-tRPL41B.Sba]x9
4
2
4
Штаммы YA3380-40B и YA3595-25 выращивали в течение 24 часов в среде YPA (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 0,01% гемисульфат аденина), 8% глюкозы, 50 мМ (NH)SO и 0,5 мМ метионина и 0,85 мМ треонина. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.
PEPCK-1 является формой PEPCK, стабилизированной путем модификации аминокислоты аргинина в положении 2 глицином.
Количество эктоина, полученное с этими двумя штаммами, соответственно:
-1
- YA3380-40B: 211 мг/л.
-1
- YA3595-25: 1,29 г/л.
Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.
4
2
4
Штамм YA3595-34, а также штамм YA3595-25 выращивали в течение 24 часов в среде YPA (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 0,01% гемисульфат аденина), сахароза 8%, 50 мМ (NH)SO и 0,5 мМ метионина и 0,85 мМ треонина. Содержание эктоина в среде анализировали через 24 часа с использованием метода предколоночной дериватизации AccQ-Tag для определения аминокислот с использованием набора для дериватизации AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit от Waters, как рекомендовано производителем.
Количество эктоина, полученное с этими двумя штаммами, соответственно:
-1
- YA3595-25: 2,63 г/л.
-1
- YA3595-34: 2,58 г/л.
Для сравнения, нативный штамм не продуцирует эктоин.
Из этого сравнительного эксперимента следует, что рекомбинантный штамм, содержащий модификации согласно изобретению, продуцирует большее количество эктоина при культивировании в тех же условиях, что и другие рекомбинантные штаммы, не содержащие все генетические модификации согласно изобретению.
C. Также были получены три других рекомбинантных штамма: YA4440, YA4442 и YA4444.
Эти три штамма являются следующими:
YA4440: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH2-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4442: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH1-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
YA4444: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl-RS, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3::[HIS3-pACU5-ME3.At-tRPL3, pACU6-METX-1.Cg-tIDP1]x5, hom6::[TRP1.Kl-RS, pCCW12.Sba-HOM3-tDIT1], leu2, lys2Δ201, mup3::[HIS5.sp-RS, pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCCW12-HOM2-1-tTDH3, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-MDH3-1-tRPL15A, pCUP1-1-GDH-21.Eca-tTPI1, pTDH3.Sba-ECTB.He-tIDP1, pPDC1-ECTA.He-tRPL41B, pTEF1.Sba-ECTC.He-tRPL15A], pyk1::[ LEU2.Kl-RS, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pTEF3-TPO1-tENO2, pCUR3-PYK1-7-tCYC1], sam3::[pACU7-PEPCK-1.Ec-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1-sam3]x5, trp1, trp4::[LYS2-loxP, pCCW12 -PEPCK-1.Ec-tTPI1, pCCW12-GDH2.Eca-tRPL3, pCCW12-METX-1.Cg-tRPL41B.Sba, pCCW12.Sba-HOM3-tRPL15A], ura3::[ECTB.Ab-ECTC.He-URA3]x7
GDH1 и GDH2 являются эндогенными ферментами Saccharomyces cerevisiae, тогда как GDH2.Eca является ферментом GDH из Entodimium caudatum.
4
4
Эти штаммы выращивали в колбах Эрленмейера при 28°С в течение 16 ч в дрожжевом экстракте 2%, сахарозе 8%, метионине 0,5 мМ, треонине 4,2 мМ, мочевине 50 мМ, витамине В5 4 мкМ, витамине В1 6 мкМ, витамине В6 10 мкМ, витамине B10 1,5 мкМ, витамине B3 2,9 мкМ, витамине B2 0,5 мкМ, витамине B8 0,08 мкМ, витамине B9 4,5 нМ, CuSO 500 мкМ. Через 16 часов добавляли 500 мкМ CuSO и 100 мМ мочевины и культуры выращивали в течение еще 8 часов.
Продукцию эктоина затем оценивали по существу, как описано в Ono H, et al. (1999) Journal of Bacteriology, p, 91-99, за исключением того, что эктоин обнаруживали с помощью ВЭЖХ-УФ.
В этих условиях YA4440 продуцировал 6,4 г/л эктоина, YA4442 продуцировал 4,7 г/л эктоина и YA4444 производил 6,1 г/л эктоина. Напоминаем, что в этих же условиях штамм дикого типа (например, нерекомбинантный) не продуцирует определяемое количество эктоина.
Эти три штамма идентичны, но для фермента GDH сверхэкспрессированы. Приведенные выше результаты показывают, что сверхэкспрессия NADH-зависимого GDH (GDH2 в YA4440 и GDH2.Eca в YA4444) позволяет продуцировать больше эктоина, чем сверхэкспрессия NADPH-зависимого GDH (GDH1 в YA4442).
Таким образом, сверхэкспрессия NADH-зависимой глутаматдегидрогеназы позволяет продуцировать больше эктоина, чем сверхкспрессия NADPH-зависимой глутаматдегидрогеназы (GDH1).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> АЛЬДЕРИ
<120> ДРОЖЖИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ ЭКТОИН
<130> PR75767
<150> EP17305910
<151> 2017-07-11
<160> 121
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 1583
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)
<220>
<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)
<400> 1
atgccaatgg atttccaacc tacatcaagt cattcgaact gggtcgtgca aaagttcggt      60
ggtacatctg tcggtaaatt tcccgtccaa atagtggatg acattgtgaa gcactattct     120
aaacctgacg gcccaaacaa taatgtcgct gtcgtttgtt ccgcccgttc ttcatacacc     180
aaggctgaag gtaccacttc tcgtcttttg aaatgttgtg atttggcttc gcaagaatct     240
gaatttcaag acattatcga agttatcaga caagaccata tcgataatgc cgaccgcttc     300
attctcaatc ctgccttgca agccaagtta gtggatgata ccaataaaga acttgaactg     360
gtcaagaaat atttaaatgc ttcaaaagtt ttgggtgaag tgagttcacg tacagtagat     420
ctggtgatgt catgtggtga gaagttgagt tgtttgttca tgactgcttt atgtaatgac     480
cgtggctgta aggccaaata tgtggatttg agccacattg ttccctctga tttcagtgcc     540
agcgctttgg ataacagttt ctacactttc ctggttcaag cattgaaaga aaaattggcc     600
ccctttgtaa gtgctaaaga gcgtatcgtt ccagtcttta cagggttttt tggtttagtt     660
ccaactggtc ttctgaatgg tgttggtcgt ggctataccg atttatgtgc cgctttgata     720
gcagttgctg taaatgctga tgaactacaa gtttggaagg aagttgatgg tatatttact     780
gctgatcctc gtaaggttcc tgaagcacgt ttgctagaca gtgttactcc agaagaagct     840
tctgaattaa catattatgg ttccgaagtt atacatcctt ttacgatgga acaagttatt     900
agggctaaga ttcctattag aatcaagaat gttcaaaatc cattaggtaa cggtaccatt     960
atctacccag ataatgtagc aaagaagggt gaatctactc caccacatcc tcctgagaac    1020
ttatcctcat ctttctatga aaagagaaag agaggtgcca ctgctatcac caccaaaaat    1080
gacattttcg tcatcaacat tcattccaat aagaaaaccc tatcccatgg tttcctagct    1140
caaatattta ccatcctgga taagtacaag ttagtcgtag atttaatatc tacttctgaa    1200
gttcatgttt cgatggcttt gcccattcca gatgcagact cattaaaatc tctgagacaa    1260
gctgaggaaa aattgagaat tttaggttct gttgatatca caaagaagtt gtctattgtt    1320
tcattagttg gtaaacatat gaaacaatac atcggcattg ctggtaccat gtttactact    1380
cttgctgaag aaggcatcaa cattgaaatg atttctcaag gggcaaatga aataaacata    1440
tcctgcgtta tcaatgaatc tgactccata aaagcgctac aatgtattca tgccaagtta    1500
ctaagtgagc ggacaaatac ttcaaaccaa tttgaacatg ccattgatga acgtttagaa    1560
caattgaaaa gacttggaat taa                                            1583
<210> 2
<211> 526
<212> ПРТ
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)
<220>
<223> АСПАРТОКИНАЗА (HOM3)
<400> 2
Pro Met Asp Phe Gln Pro Thr Ser Ser His Ser Asn Trp Val Val Gln
1               5                   10                  15
Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Gly Lys Phe Pro Val Gln Ile Val Asp
20                  25                  30
Asp Ile Val Lys His Tyr Ser Lys Pro Asp Gly Pro Asn Asn Asn Val
35                  40                  45
Ala Val Val Cys Ser Ala Arg Ser Ser Tyr Thr Lys Ala Glu Gly Thr
50                  55                  60
Thr Ser Arg Leu Leu Lys Cys Cys Asp Leu Ala Ser Gln Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Phe Gln Asp Ile Ile Glu Val Ile Arg Gln Asp His Ile Asp Asn Ala
85                  90                  95
Asp Arg Phe Ile Leu Asn Pro Ala Leu Gln Ala Lys Leu Val Asp Asp
100                 105                 110
Thr Asn Lys Glu Leu Glu Leu Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Ser Lys
115                 120                 125
Val Leu Gly Glu Val Ser Ser Arg Thr Val Asp Leu Val Met Ser Cys
130                 135                 140
Gly Glu Lys Leu Ser Cys Leu Phe Met Thr Ala Leu Cys Asn Asp Arg
145                 150                 155                 160
Gly Cys Lys Ala Lys Tyr Val Asp Leu Ser His Ile Val Pro Ser Asp
165                 170                 175
Phe Ser Ala Ser Ala Leu Asp Asn Ser Phe Tyr Thr Phe Leu Val Gln
180                 185                 190
Ala Leu Lys Glu Lys Leu Ala Pro Phe Val Ser Ala Lys Glu Arg Ile
195                 200                 205
Val Pro Val Phe Thr Gly Phe Phe Gly Leu Val Pro Thr Gly Leu Leu
210                 215                 220
Asn Gly Val Gly Arg Gly Tyr Thr Asp Leu Cys Ala Ala Leu Ile Ala
225                 230                 235                 240
Val Ala Val Asn Ala Asp Glu Leu Gln Val Trp Lys Glu Val Asp Gly
245                 250                 255
Ile Phe Thr Ala Asp Pro Arg Lys Val Pro Glu Ala Arg Leu Leu Asp
260                 265                 270
Ser Val Thr Pro Glu Glu Ala Ser Glu Leu Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu
275                 280                 285
Val Ile His Pro Phe Thr Met Glu Gln Val Ile Arg Ala Lys Ile Pro
290                 295                 300
Ile Arg Ile Lys Asn Val Gln Asn Pro Leu Gly Asn Gly Thr Ile Ile
305                 310                 315                 320
Tyr Pro Asp Asn Val Ala Lys Lys Gly Glu Ser Thr Pro Pro His Pro
325                 330                 335
Pro Glu Asn Leu Ser Ser Ser Phe Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Gly Ala
340                 345                 350
Thr Ala Ile Thr Thr Lys Asn Asp Ile Phe Val Ile Asn Ile His Ser
355                 360                 365
Asn Lys Lys Thr Leu Ser His Gly Phe Leu Ala Gln Ile Phe Thr Ile
370                 375                 380
Leu Asp Lys Tyr Lys Leu Val Val Asp Leu Ile Ser Thr Ser Glu Val
385                 390                 395                 400
His Val Ser Met Ala Leu Pro Ile Pro Asp Ala Asp Ser Leu Lys Ser
405                 410                 415
Leu Arg Gln Ala Glu Glu Lys Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Asp Ile
420                 425                 430
Thr Lys Lys Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Gly Lys His Met Lys Gln
435                 440                 445
Tyr Ile Gly Ile Ala Gly Thr Met Phe Thr Thr Leu Ala Glu Glu Gly
450                 455                 460
Ile Asn Ile Glu Met Ile Ser Gln Gly Ala Asn Glu Ile Asn Ile Ser
465                 470                 475                 480
Cys Val Ile Asn Glu Ser Asp Ser Ile Lys Ala Leu Gln Cys Ile His
485                 490                 495
Ala Lys Leu Leu Ser Glu Arg Thr Asn Thr Ser Asn Gln Phe Glu His
500                 505                 510
Ala Ile Asp Glu Arg Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Gly Ile
515                 520                 525
<210> 3
<211> 1215
<212> ДНК
<213> Bacillus subtilis
<220>
<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)
<220>
<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)
<400> 3
atggctatta tcgtccaaaa attcggagga actagcgtta aggatgacaa agggagaaag      60
ttggccttag ggcacattaa ggaggcaatt tcagagggtt ataaggtggt tgtagttgta     120
tcggctatgg gtagaaaagg ggacccctac gcgacggact cactattggg tttactttac     180
ggggatcaat cagcaatcag cccaagagag caggatctgc tgctatcatg tggagaaacc     240
atatcctcgg ttgtgttcac cagcatgtta ttagataatg gagtaaaagc agcagccctg     300
acgggagccc aggctggttt tttaaccaac gatcagcata ctaatgcaaa aattatagag     360
atgaagcctg aacgtctttt cagtgttctt gcaaaccacg acgcagttgt cgtcgctgga     420
tttcagggcg ctaccgagaa aggagatact accacaatcg gtagaggtgg ctcggacacg     480
tcagctgcag ccctaggtgc tgctgttgat gcagagtaca tagatatctt tactgacgta     540
gaaggggtga tgaccgcaga tccaagagta gtagaaaatg caaagccact accagtggta     600
acttataccg aaatctgcaa cttggcttac caaggtgcta aggtaatatc tccaagagct     660
gtggaaattg ctatgcaagc aaaggttcct atccgtgtta ggagtactta ttcaaacgat     720
aaaggtacgt tagtaactag tcatcatagt tccaaagttg gctctgacgt ctttgaaagg     780
ttaatcactg gtatcgcaca tgttaaagac gtcactcaat tcaaggtccc ggcgaaaata     840
ggtcaatata acgttcaaac agaagtgttt aaagcgatgg cgaatgccgg tatatctgtc     900
gatttcttta atattacacc ctctgaaata gtatatacag tcgcgggtaa taagactgaa     960
acagctcaaa ggattttgat ggatatgggc tatgatccta tggtcacaag aaattgtgcc    1020
aaggtgtctg ccgtgggtgc tggcattatg ggtgtcccag gtgtgacatc gaaaattgtt    1080
tctgccttat ctgaaaaaga aattccgatt ttgcaatctg ctgattccca tacaacaatt    1140
tgggttttgg ttcatgaagc cgatatggtt cctgctgtta atgccttgca cgaagttttt    1200
gaattgtcca aataa                                                     1215
<210> 4
<211> 404
<212> ПРТ
<213> Bacillus subtilis
<220>
<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)
<220>
<223> АСПАРТАТКИНАЗА (AK)
<400> 4
Met Ala Ile Ile Val Gln Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Lys Asp Asp
1               5                   10                  15
Lys Gly Arg Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Lys Glu Ala Ile Ser Glu
20                  25                  30
Gly Tyr Lys Val Val Val Val Val Ser Ala Met Gly Arg Lys Gly Asp
35                  40                  45
Pro Tyr Ala Thr Asp Ser Leu Leu Gly Leu Leu Tyr Gly Asp Gln Ser
50                  55                  60
Ala Ile Ser Pro Arg Glu Gln Asp Leu Leu Leu Ser Cys Gly Glu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Val Phe Thr Ser Met Leu Leu Asp Asn Gly Val Lys
85                  90                  95
Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Leu Thr Asn Asp Gln
100                 105                 110
His Thr Asn Ala Lys Ile Ile Glu Met Lys Pro Glu Arg Leu Phe Ser
115                 120                 125
Val Leu Ala Asn His Asp Ala Val Val Val Ala Gly Phe Gln Gly Ala
130                 135                 140
Thr Glu Lys Gly Asp Thr Thr Thr Ile Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr
145                 150                 155                 160
Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Asp Ala Glu Tyr Ile Asp Ile
165                 170                 175
Phe Thr Asp Val Glu Gly Val Met Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Glu
180                 185                 190
Asn Ala Lys Pro Leu Pro Val Val Thr Tyr Thr Glu Ile Cys Asn Leu
195                 200                 205
Ala Tyr Gln Gly Ala Lys Val Ile Ser Pro Arg Ala Val Glu Ile Ala
210                 215                 220
Met Gln Ala Lys Val Pro Ile Arg Val Arg Ser Thr Tyr Ser Asn Asp
225                 230                 235                 240
Lys Gly Thr Leu Val Thr Ser His His Ser Ser Lys Val Gly Ser Asp
245                 250                 255
Val Phe Glu Arg Leu Ile Thr Gly Ile Ala His Val Lys Asp Val Thr
260                 265                 270
Gln Phe Lys Val Pro Ala Lys Ile Gly Gln Tyr Asn Val Gln Thr Glu
275                 280                 285
Val Phe Lys Ala Met Ala Asn Ala Gly Ile Ser Val Asp Phe Phe Asn
290                 295                 300
Ile Thr Pro Ser Glu Ile Val Tyr Thr Val Ala Gly Asn Lys Thr Glu
305                 310                 315                 320
Thr Ala Gln Arg Ile Leu Met Asp Met Gly Tyr Asp Pro Met Val Thr
325                 330                 335
Arg Asn Cys Ala Lys Val Ser Ala Val Gly Ala Gly Ile Met Gly Val
340                 345                 350
Pro Gly Val Thr Ser Lys Ile Val Ser Ala Leu Ser Glu Lys Glu Ile
355                 360                 365
Pro Ile Leu Gln Ser Ala Asp Ser His Thr Thr Ile Trp Val Leu Val
370                 375                 380
His Glu Ala Asp Met Val Pro Ala Val Asn Ala Leu His Glu Val Phe
385                 390                 395                 400
Glu Leu Ser Lys
<210> 5
<211> 1098
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<400> 5
atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc      60
attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga     120
tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa     180
tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc     240
gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct     300
ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt     360
gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag     420
gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt     480
ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact     540
actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt     600
ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag     660
aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa     720
atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc     780
tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa     840
gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat     900
gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac     960
ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt    1020
tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta    1080
gcaagaaact tgatttaa                                                  1098
<210> 6
<211> 1098
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<400> 6
atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc      60
attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga     120
tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa     180
tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc     240
gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct     300
ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt     360
gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag     420
gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt     480
ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact     540
actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatc     600
ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag     660
aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa     720
atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc     780
tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa     840
gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat     900
gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac     960
ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt    1020
tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta    1080
gcaagaaact tgatttaa                                                  1098
<210> 7
<211> 365
<212> ПРТ
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<220>
<223> ДЕГИДРОГЕНАЗА ПОЛУАЛЬДЕГИДА АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ (HOM2)
<400> 7
Met Ala Gly Lys Lys Ile Ala Gly Val Leu Gly Ala Thr Gly Ser Val
1               5                   10                  15
Gly Gln Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ala Asn His Pro His Phe Glu Leu
20                  25                  30
Lys Val Leu Gly Ala Ser Ser Arg Ser Ala Gly Lys Lys Tyr Val Asp
35                  40                  45
Ala Val Asn Trp Lys Gln Thr Asp Leu Leu Pro Glu Ser Ala Thr Asp
50                  55                  60
Ile Ile Val Ser Glu Cys Lys Ser Glu Phe Phe Lys Glu Cys Asp Ile
65                  70                  75                  80
Val Phe Ser Gly Leu Asp Ala Asp Tyr Ala Gly Ala Ile Glu Lys Glu
85                  90                  95
Phe Met Glu Ala Gly Ile Ala Ile Val Ser Asn Ala Lys Asn Tyr Arg
100                 105                 110
Arg Glu Gln Asp Val Pro Leu Ile Val Pro Val Val Asn Pro Glu His
115                 120                 125
Leu Asp Ile Val Ala Gln Lys Leu Asp Thr Ala Lys Ala Gln Gly Lys
130                 135                 140
Pro Arg Pro Gly Phe Ile Ile Cys Ile Ser Asn Cys Ser Thr Ala Gly
145                 150                 155                 160
Leu Val Ala Pro Leu Lys Pro Leu Ile Glu Lys Phe Gly Pro Ile Asp
165                 170                 175
Ala Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gln Ala Ile Ser Gly Ala Gly Phe Ser
180                 185                 190
Pro Gly Val Pro Gly Ile Asp Ile Leu Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ile
195                 200                 205
Gly Gly Glu Glu Asp Lys Met Glu Trp Glu Thr Lys Lys Ile Leu Ala
210                 215                 220
Pro Leu Ala Glu Asp Lys Thr His Val Lys Leu Leu Thr Pro Glu Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys Val Ser Ala Gln Cys Asn Arg Val Ala Val Ser Asp Gly His
245                 250                 255
Thr Glu Cys Ile Ser Leu Arg Phe Lys Asn Arg Pro Ala Pro Ser Val
260                 265                 270
Glu Gln Val Lys Thr Cys Leu Lys Glu Tyr Val Cys Asp Ala Tyr Lys
275                 280                 285
Leu Gly Cys His Ser Ala Pro Lys Gln Thr Ile His Val Leu Glu Gln
290                 295                 300
Pro Asp Arg Pro Gln Pro Arg Leu Asp Arg Asn Arg Asp Ser Gly Tyr
305                 310                 315                 320
Gly Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Glu Asp Pro Leu Leu Asp Phe Lys
325                 330                 335
Met Val Val Leu Ser His Asn Thr Ile Ile Gly Ala Ala Gly Ser Gly
340                 345                 350
Val Leu Ile Ala Glu Ile Leu Leu Ala Arg Asn Leu Ile
355                 360                 365
<210> 8
<211> 1413
<212> ДНК
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<400> 8
atggctcacg ttgctacatc agttatcgag gaccaaccct tacgcgccac tcccgcagaa      60
ggcgagactc tgtacgagtt ctcccaatct cctctcttag aacgtcagtc tcgccaagag     120
agcaatgctc gaagctatcc acgtagaata ccacttgcat taaagaaggc ccgaggtctg     180
ctagtggaag acgtcgaagg gaggactttc attgactgtc tcgccggtgc aggaacccta     240
gcattgggac ataatcaccc ggtagttata gaagccatta gacaggttct tgctgatgaa     300
ttgcccttgc acaccttaga tttgacgacc cctgtgaagg accaattcgt ccaggattta     360
tttgggttgc tcccacctgc tttggcagcg gaagccaaga tccaattctg tgggccaaca     420
ggaacagacg cagttgaggc cgctcttaag cttgtgcgga cggcgactgg ccgttctaca     480
atactaagtt ttcaaggagg atatcacgga atgtcccaag gtgcactggg cttgatgggc     540
aacctcggtc caaagaagcc attgggcgca gtactctcaa ccggcgtcca attcctccca     600
tacccgtacg attacagatg tccattcggt ctgggtggcg aagctggagt caaggcgaat     660
ctacattact tagaaaattt gctcaatgat cctgaaggag gtgtacaatt gccggccgct     720
gtcattgttg aagttgtaca aggcgaaggt ggggtcgtgc cagcagattt ggactggtta     780
cgaggattac gtaggattac tgagcaggcc ggtgtagccc ttattgtgga tgaaattcaa     840
tccggctttg cgcgtactgg tcggatgttc gcctttgagc atgccggcat cgtgcctgat     900
gtggtagtgc tttccaaagc tatcggtggc tccctccctt tagctgtggt cgtatatcgg     960
gaatggctag acaagtggca acctggggca catgctggaa ccttcagagg caatcagatg    1020
gcgatggcag ctggcagtgc agtcatgaga tacctaaaag agcatgatct ggcagcccat    1080
gcagccgcca tgggcgaacg actagctgag catctcagga tcttgcagag agactatccg    1140
cagttaggtg atatacgagg ccgcggctta atgttaggtg tcgagatagt agatccgcag    1200
ggcgaagctg acgctctagg tcatccaccc actgacggag ccctggcctc gcgggtacaa    1260
cgggaatgtt tgagaagagg tctcatattg gaattaggcg ggcgacacgg atctgttgta    1320
agattcttgc cacctttgat tattggggca gaacagatag acgaagtggc gcgtagattt    1380
gccagggcat taggagctgc ccttgctggg taa                                 1413
<210> 9
<211> 1266
<212> ДНК
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<400> 9
atgcagacac aaatcttgga acgtatggaa tccgacgtca gaacgtactc aagatctttc      60
cctgtagtct ttaccaaggc gcgaaatgct cgacttaccg acgaagaagg gcgagagtac     120
atagacttcc tagcaggcgc tggtacgcta aattatgggc ataacaatcc acacctgaag     180
caagcattac tcgactacat tgattcagac ggcattgtcc atggtctgga tttctggacc     240
gcggcaaagc gcgattacct tgagacactc gaagaggtca ttttgaaacc gcgtggtttg     300
gactataagg ttcacttacc gggcccaacg ggcaccaatg cagttgaagc cgccattcgt     360
ttggccaggg tcgccaaagg tcgtcataat attgtctctt ttacaaatgg ctttcacggt     420
gttactatgg gcgctctggc gacgaccggt aacagaaagt ttcgggaagc gacaggtggc     480
gtccctactc aggcagcgag cttcatgcca tttgacgggt atcttggctc ttccactgat     540
acacttgatt acttcgaaaa gttattgggt gataagtcag gtgggcttga tgtgccagcc     600
gcggtaatag ttgaaacagt ccaaggagaa ggcggaataa acgttgcggg acttgagtgg     660
ctcaagagat tagaaagcat ttgtagagca aatgatattt tgttaatcat cgatgatata     720
caagccggct gcggaagaac tggaaagttc ttctcattcg aacatgctgg tattactcct     780
gatattgtca caaactcgaa atctttgtca ggatatggtt tgccctttgc tcatgtgctt     840
atgagaccgg agcttgataa atggaaacca ggacaatata acggaacatt ccggggtttc     900
aatctagctt tcgcgaccgc tgctgcagca atgaggaaat actggtcgga cgatacgttt     960
gaacgagacg ttcaaaggaa agctagaata gttgaggaaa gatttggtaa aatcgcagct    1020
tggctttctg aaaacggtat tgaagcttcc gaacggggta ggggtttgat gagaggtatc    1080
gacgttggtt ctggggacat agcagataaa attacgcatc aagcgtttga aaatggttta    1140
atcatcgaaa caagtggtca agatggtgag gttgttaaat gcttatgccc cttaaccata    1200
ccagatgaag atttagtaga aggtttagac atattagaaa ctagcacaaa acaagccttc    1260
tcttaa                                                               1266
<210> 10
<211> 470
<212> ПРТ
<213> Pseudomonas aeruginosa
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<400> 10
Met Ala His Val Ala Thr Ser Val Ile Glu Asp Gln Pro Leu Arg Ala
1               5                   10                  15
Thr Pro Ala Glu Gly Glu Thr Leu Tyr Glu Phe Ser Gln Ser Pro Leu
20                  25                  30
Leu Glu Arg Gln Ser Arg Gln Glu Ser Asn Ala Arg Ser Tyr Pro Arg
35                  40                  45
Arg Ile Pro Leu Ala Leu Lys Lys Ala Arg Gly Leu Leu Val Glu Asp
50                  55                  60
Val Glu Gly Arg Thr Phe Ile Asp Cys Leu Ala Gly Ala Gly Thr Leu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Gly His Asn His Pro Val Val Ile Glu Ala Ile Arg Gln Val
85                  90                  95
Leu Ala Asp Glu Leu Pro Leu His Thr Leu Asp Leu Thr Thr Pro Val
100                 105                 110
Lys Asp Gln Phe Val Gln Asp Leu Phe Gly Leu Leu Pro Pro Ala Leu
115                 120                 125
Ala Ala Glu Ala Lys Ile Gln Phe Cys Gly Pro Thr Gly Thr Asp Ala
130                 135                 140
Val Glu Ala Ala Leu Lys Leu Val Arg Thr Ala Thr Gly Arg Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ser Phe Gln Gly Gly Tyr His Gly Met Ser Gln Gly Ala Leu
165                 170                 175
Gly Leu Met Gly Asn Leu Gly Pro Lys Lys Pro Leu Gly Ala Val Leu
180                 185                 190
Ser Thr Gly Val Gln Phe Leu Pro Tyr Pro Tyr Asp Tyr Arg Cys Pro
195                 200                 205
Phe Gly Leu Gly Gly Glu Ala Gly Val Lys Ala Asn Leu His Tyr Leu
210                 215                 220
Glu Asn Leu Leu Asn Asp Pro Glu Gly Gly Val Gln Leu Pro Ala Ala
225                 230                 235                 240
Val Ile Val Glu Val Val Gln Gly Glu Gly Gly Val Val Pro Ala Asp
245                 250                 255
Leu Asp Trp Leu Arg Gly Leu Arg Arg Ile Thr Glu Gln Ala Gly Val
260                 265                 270
Ala Leu Ile Val Asp Glu Ile Gln Ser Gly Phe Ala Arg Thr Gly Arg
275                 280                 285
Met Phe Ala Phe Glu His Ala Gly Ile Val Pro Asp Val Val Val Leu
290                 295                 300
Ser Lys Ala Ile Gly Gly Ser Leu Pro Leu Ala Val Val Val Tyr Arg
305                 310                 315                 320
Glu Trp Leu Asp Lys Trp Gln Pro Gly Ala His Ala Gly Thr Phe Arg
325                 330                 335
Gly Asn Gln Met Ala Met Ala Ala Gly Ser Ala Val Met Arg Tyr Leu
340                 345                 350
Lys Glu His Asp Leu Ala Ala His Ala Ala Ala Met Gly Glu Arg Leu
355                 360                 365
Ala Glu His Leu Arg Ile Leu Gln Arg Asp Tyr Pro Gln Leu Gly Asp
370                 375                 380
Ile Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly Val Glu Ile Val Asp Pro Gln
385                 390                 395                 400
Gly Glu Ala Asp Ala Leu Gly His Pro Pro Thr Asp Gly Ala Leu Ala
405                 410                 415
Ser Arg Val Gln Arg Glu Cys Leu Arg Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu
420                 425                 430
Gly Gly Arg His Gly Ser Val Val Arg Phe Leu Pro Pro Leu Ile Ile
435                 440                 445
Gly Ala Glu Gln Ile Asp Glu Val Ala Arg Arg Phe Ala Arg Ala Leu
450                 455                 460
Gly Ala Ala Leu Ala Gly
465                 470
<210> 11
<211> 421
<212> ПРТ
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<220>
<223> ДИАМИНОБУТИРАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗА (EctB)
<400> 11
Met Gln Thr Gln Ile Leu Glu Arg Met Glu Ser Asp Val Arg Thr Tyr
1               5                   10                  15
Ser Arg Ser Phe Pro Val Val Phe Thr Lys Ala Arg Asn Ala Arg Leu
20                  25                  30
Thr Asp Glu Glu Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Phe Leu Ala Gly Ala Gly
35                  40                  45
Thr Leu Asn Tyr Gly His Asn Asn Pro His Leu Lys Gln Ala Leu Leu
50                  55                  60
Asp Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Ile Val His Gly Leu Asp Phe Trp Thr
65                  70                  75                  80
Ala Ala Lys Arg Asp Tyr Leu Glu Thr Leu Glu Glu Val Ile Leu Lys
85                  90                  95
Pro Arg Gly Leu Asp Tyr Lys Val His Leu Pro Gly Pro Thr Gly Thr
100                 105                 110
Asn Ala Val Glu Ala Ala Ile Arg Leu Ala Arg Val Ala Lys Gly Arg
115                 120                 125
His Asn Ile Val Ser Phe Thr Asn Gly Phe His Gly Val Thr Met Gly
130                 135                 140
Ala Leu Ala Thr Thr Gly Asn Arg Lys Phe Arg Glu Ala Thr Gly Gly
145                 150                 155                 160
Val Pro Thr Gln Ala Ala Ser Phe Met Pro Phe Asp Gly Tyr Leu Gly
165                 170                 175
Ser Ser Thr Asp Thr Leu Asp Tyr Phe Glu Lys Leu Leu Gly Asp Lys
180                 185                 190
Ser Gly Gly Leu Asp Val Pro Ala Ala Val Ile Val Glu Thr Val Gln
195                 200                 205
Gly Glu Gly Gly Ile Asn Val Ala Gly Leu Glu Trp Leu Lys Arg Leu
210                 215                 220
Glu Ser Ile Cys Arg Ala Asn Asp Ile Leu Leu Ile Ile Asp Asp Ile
225                 230                 235                 240
Gln Ala Gly Cys Gly Arg Thr Gly Lys Phe Phe Ser Phe Glu His Ala
245                 250                 255
Gly Ile Thr Pro Asp Ile Val Thr Asn Ser Lys Ser Leu Ser Gly Tyr
260                 265                 270
Gly Leu Pro Phe Ala His Val Leu Met Arg Pro Glu Leu Asp Lys Trp
275                 280                 285
Lys Pro Gly Gln Tyr Asn Gly Thr Phe Arg Gly Phe Asn Leu Ala Phe
290                 295                 300
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Met Arg Lys Tyr Trp Ser Asp Asp Thr Phe
305                 310                 315                 320
Glu Arg Asp Val Gln Arg Lys Ala Arg Ile Val Glu Glu Arg Phe Gly
325                 330                 335
Lys Ile Ala Ala Trp Leu Ser Glu Asn Gly Ile Glu Ala Ser Glu Arg
340                 345                 350
Gly Arg Gly Leu Met Arg Gly Ile Asp Val Gly Ser Gly Asp Ile Ala
355                 360                 365
Asp Lys Ile Thr His Gln Ala Phe Glu Asn Gly Leu Ile Ile Glu Thr
370                 375                 380
Ser Gly Gln Asp Gly Glu Val Val Lys Cys Leu Cys Pro Leu Thr Ile
385                 390                 395                 400
Pro Asp Glu Asp Leu Val Glu Gly Leu Asp Ile Leu Glu Thr Ser Thr
405                 410                 415
Lys Gln Ala Phe Ser
420
<210> 12
<211> 1461
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)
<220>
<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)
<400> 12
atgtcgcata ctttaaaatc gaaaacgctc caagagctgg acattgagga gattaaggaa      60
actaacccat tgctcaaact agttcaaggg cagaggattg ttcaagttcc ggaactagtg     120
cttgagtctg gcgtggtcat aaataatttc cctattgctt ataagacgtg gggtacactg     180
aatgaagctg gtgataatgt tctggtaatt tgtcatgcct tgactgggtc cgcagatgtt     240
gctgactggt ggggccctct tctgggtaac gacttagcat tcgacccatc aaggtttttt     300
atcatatgtt taaactctat gggctctcca tatgggtctt tttcgccatt aacgataaat     360
gaggagacgg gcgttagata tggacccgaa ttcccattat gtactgtgcg cgatgacgtt     420
agagctcaca gaattgttct ggattctctg ggagtaaagt caatagcctg tgttattggt     480
ggctctatgg gggggatgct gagtttggaa tgggctgcca tgtatggtaa ggaatatgtg     540
aagaatatgg ttgctctggc gacatcagca agacattctg cctggtgcat atcgtggtct     600
gaggctcaaa gacaatcgat ttactcagat cccaactact tggacgggta ctatccggta     660
gaggagcaac ctgtggccgg actatcggct gcacgtatgt ctgcattgtt gacgtacagg     720
acaagaaaca gtttcgagaa caaattctcc agaagatctc cttcaatagc acaacaacaa     780
aaagctcaaa gggaggagac acgcaaacca tctactgtca gcgaacactc cctacaaatc     840
cacaatgatg ggtataaaac aaaagccagc actgccatcg ctggcatttc tgggcaaaaa     900
ggtcaaagcg tggtgtccac cgcatcttct tcggattcat tgaattcttc aacatcgatg     960
acttcggtaa gttctgtaac gggtgaagtg aaggacataa agcctgcgca gacgtatttt    1020
tctgcacaaa gttacttgag gtaccagggc acaaagttca tcaataggtt cgacgccaat    1080
tgttacattg ccatcacacg taaactggat acgcacgatt tggcaagaga cagagtagat    1140
gacatcactg aggtcctttc taccatccaa caaccatccc tgatcatcgg tatccaatct    1200
gatggactgt tcacatattc agaacaagaa tttttggctg agcacatacc gaagtcgcaa    1260
ttagaaaaaa ttgaatctcc cgaaggccac gatgccttcc tattggagtt taagctgata    1320
aacaaactga tagtacaatt tttaaaaacc aactgcaagg ccattaccga tgccgctcca    1380
agagcttggg gaggtgacgt tggtaacgat gaaacgaaga cgtctgtctt tggtgaggcc    1440
gaagaagtta ccaactggta g                                              1461
<210> 13
<211> 486
<212> ПРТ
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)
<220>
<223> ГОМОСЕРИН-O-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА (MET2; METX)
<400> 13
Met Ser His Thr Leu Lys Ser Lys Thr Leu Gln Glu Leu Asp Ile Glu
1               5                   10                  15
Glu Ile Lys Glu Thr Asn Pro Leu Leu Lys Leu Val Gln Gly Gln Arg
20                  25                  30
Ile Val Gln Val Pro Glu Leu Val Leu Glu Ser Gly Val Val Ile Asn
35                  40                  45
Asn Phe Pro Ile Ala Tyr Lys Thr Trp Gly Thr Leu Asn Glu Ala Gly
50                  55                  60
Asp Asn Val Leu Val Ile Cys His Ala Leu Thr Gly Ser Ala Asp Val
65                  70                  75                  80
Ala Asp Trp Trp Gly Pro Leu Leu Gly Asn Asp Leu Ala Phe Asp Pro
85                  90                  95
Ser Arg Phe Phe Ile Ile Cys Leu Asn Ser Met Gly Ser Pro Tyr Gly
100                 105                 110
Ser Phe Ser Pro Leu Thr Ile Asn Glu Glu Thr Gly Val Arg Tyr Gly
115                 120                 125
Pro Glu Phe Pro Leu Cys Thr Val Arg Asp Asp Val Arg Ala His Arg
130                 135                 140
Ile Val Leu Asp Ser Leu Gly Val Lys Ser Ile Ala Cys Val Ile Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ser Met Gly Gly Met Leu Ser Leu Glu Trp Ala Ala Met Tyr Gly
165                 170                 175
Lys Glu Tyr Val Lys Asn Met Val Ala Leu Ala Thr Ser Ala Arg His
180                 185                 190
Ser Ala Trp Cys Ile Ser Trp Ser Glu Ala Gln Arg Gln Ser Ile Tyr
195                 200                 205
Ser Asp Pro Asn Tyr Leu Asp Gly Tyr Tyr Pro Val Glu Glu Gln Pro
210                 215                 220
Val Ala Gly Leu Ser Ala Ala Arg Met Ser Ala Leu Leu Thr Tyr Arg
225                 230                 235                 240
Thr Arg Asn Ser Phe Glu Asn Lys Phe Ser Arg Arg Ser Pro Ser Ile
245                 250                 255
Ala Gln Gln Gln Lys Ala Gln Arg Glu Glu Thr Arg Lys Pro Ser Thr
260                 265                 270
Val Ser Glu His Ser Leu Gln Ile His Asn Asp Gly Tyr Lys Thr Lys
275                 280                 285
Ala Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ile Ser Gly Gln Lys Gly Gln Ser Val
290                 295                 300
Val Ser Thr Ala Ser Ser Ser Asp Ser Leu Asn Ser Ser Thr Ser Met
305                 310                 315                 320
Thr Ser Val Ser Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Asp Ile Lys Pro Ala
325                 330                 335
Gln Thr Tyr Phe Ser Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Thr Lys
340                 345                 350
Phe Ile Asn Arg Phe Asp Ala Asn Cys Tyr Ile Ala Ile Thr Arg Lys
355                 360                 365
Leu Asp Thr His Asp Leu Ala Arg Asp Arg Val Asp Asp Ile Thr Glu
370                 375                 380
Val Leu Ser Thr Ile Gln Gln Pro Ser Leu Ile Ile Gly Ile Gln Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Glu Gln Glu Phe Leu Ala Glu His Ile
405                 410                 415
Pro Lys Ser Gln Leu Glu Lys Ile Glu Ser Pro Glu Gly His Asp Ala
420                 425                 430
Phe Leu Leu Glu Phe Lys Leu Ile Asn Lys Leu Ile Val Gln Phe Leu
435                 440                 445
Lys Thr Asn Cys Lys Ala Ile Thr Asp Ala Ala Pro Arg Ala Trp Gly
450                 455                 460
Gly Asp Val Gly Asn Asp Glu Thr Lys Thr Ser Val Phe Gly Glu Ala
465                 470                 475                 480
Glu Glu Val Thr Asn Trp
485
<210> 14
<211> 579
<212> ДНК
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)
<220>
<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)
<400> 14
atgactccca caacagaaaa ttttactcct agtgcagatc tggctcgccc ttcagtggct      60
gacaccgtta ttggctccgc caagaaaaca ctattcatca gaaagcctac cacggacgat     120
ggttggggta tctacgagtt agttaaggcg tgcccaccct tggacgtaaa ctctggatac     180
gcttacttat tattagccac gcaatttagg gatacgtgtg ctgtcgctac cgacgaggaa     240
ggggagatcg ttggctttgt atcaggatac gttaagcgta acgcacctga tacctatttt     300
ctatggcaag ttgctgtggg cgaaaaggct cgtgggacgg gtcttgcaag aagattagtc     360
gaagccgtat tgatgagacc aggtatggga gatgtccggc acctggagac taccataact     420
cctgataacg aagcaagctg gggtctcttt aaacgacttg ccgatagatg gcaagcgcca     480
ttgaattcta gggaatattt ctctactggt cagttgggtg gtgaacatga tccggaaaat     540
ctggtgagaa ttggaccgtt cgaaccacag caaatttaa                            579
<210> 15
<211> 192
<212> ПРТ
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)
<220>
<223> АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА КИСЛОТЫ (EctA)
<400> 15
Met Thr Pro Thr Thr Glu Asn Phe Thr Pro Ser Ala Asp Leu Ala Arg
1               5                   10                  15
Pro Ser Val Ala Asp Thr Val Ile Gly Ser Ala Lys Lys Thr Leu Phe
20                  25                  30
Ile Arg Lys Pro Thr Thr Asp Asp Gly Trp Gly Ile Tyr Glu Leu Val
35                  40                  45
Lys Ala Cys Pro Pro Leu Asp Val Asn Ser Gly Tyr Ala Tyr Leu Leu
50                  55                  60
Leu Ala Thr Gln Phe Arg Asp Thr Cys Ala Val Ala Thr Asp Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gly Glu Ile Val Gly Phe Val Ser Gly Tyr Val Lys Arg Asn Ala Pro
85                  90                  95
Asp Thr Tyr Phe Leu Trp Gln Val Ala Val Gly Glu Lys Ala Arg Gly
100                 105                 110
Thr Gly Leu Ala Arg Arg Leu Val Glu Ala Val Leu Met Arg Pro Gly
115                 120                 125
Met Gly Asp Val Arg His Leu Glu Thr Thr Ile Thr Pro Asp Asn Glu
130                 135                 140
Ala Ser Trp Gly Leu Phe Lys Arg Leu Ala Asp Arg Trp Gln Ala Pro
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Arg Glu Tyr Phe Ser Thr Gly Gln Leu Gly Gly Glu His
165                 170                 175
Asp Pro Glu Asn Leu Val Arg Ile Gly Pro Phe Glu Pro Gln Gln Ile
180                 185                 190
<210> 16
<211> 414
<212> ДНК
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)
<220>
<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)
<400> 16
atgatagttc gtaacctgga ggaagctagg caaacagata gattagtgac cgctgagaat      60
ggcaactggg acagtaccag attatcatta gctgaggacg gaggtaattg ttcttttcac     120
attaccagaa tatttgaagg gactgaaact cacatacact acaagcatca ctttgaagcc     180
gtttactgca tcgagggtga aggagaagtc gaaaccctcg ctgatggaaa gatctggccc     240
ataaaacctg gggatattta tattttggat cagcatgacg aacatttgct tagggcttcg     300
aaaactatgc atctagcatg cgtattcacg ccgggtctaa ctggtaatga agttcatcga     360
gaagacggtt cctatgcacc agcggatgaa gcagatgatc agaaaccact ttaa           414
<210> 17
<211> 137
<212> ПРТ
<213> Halomonas elongata
<220>
<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)
<220>
<223> ЭКТОИНСИНТАЗА (EctC)
<400> 17
Met Ile Val Arg Asn Leu Glu Glu Ala Arg Gln Thr Asp Arg Leu Val
1               5                   10                  15
Thr Ala Glu Asn Gly Asn Trp Asp Ser Thr Arg Leu Ser Leu Ala Glu
20                  25                  30
Asp Gly Gly Asn Cys Ser Phe His Ile Thr Arg Ile Phe Glu Gly Thr
35                  40                  45
Glu Thr His Ile His Tyr Lys His His Phe Glu Ala Val Tyr Cys Ile
50                  55                  60
Glu Gly Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Ala Asp Gly Lys Ile Trp Pro
65                  70                  75                  80
Ile Lys Pro Gly Asp Ile Tyr Ile Leu Asp Gln His Asp Glu His Leu
85                  90                  95
Leu Arg Ala Ser Lys Thr Met His Leu Ala Cys Val Phe Thr Pro Gly
100                 105                 110
Leu Thr Gly Asn Glu Val His Arg Glu Asp Gly Ser Tyr Ala Pro Ala
115                 120                 125
Asp Glu Ala Asp Asp Gln Lys Pro Leu
130                 135
<210> 18
<211> 1080
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)
<220>
<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)
<400> 18
atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc      60
ttggatcaat tgttagccat gaagtctacc attacttaca atctagttct tttggctgaa     120
gctgagcgtt ctttaatctc caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag     180
gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg     240
aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt     300
ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt     360
tcctctgatt tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc     420
tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt     480
caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt     540
ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt     600
gctaaaaaat tgggttatac tgaaccagat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt     660
gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc     720
ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc     780
ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact     840
gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccaccaaatc tgtgtctgta     900
ggaattgaaa agtacgatta ctcacaccca ttcgcatcat tgaagggatc agataacgtt     960
atttccatca agactaagcg ttacaccaat cctgttgtca ttcaaggtgc cggtgccggt    1020
gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttaa    1080
<210> 19
<211> 308
<212> ПРТ
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)
<220>
<223> ГОМОСЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗА (HOM6)
<400> 19
Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val
1               5                   10                  15
Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr
20                  25                  30
Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys
35                  40                  45
Asp Phe Ser Pro Leu Asn Val Gly Ser Asp Trp Lys Ala Ala Leu Ala
50                  55                  60
Ala Ser Thr Thr Lys Thr Leu Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala His Leu
65                  70                  75                  80
Lys Thr Ser Pro Lys Pro Val Ile Leu Val Asp Asn Thr Ser Ser Ala
85                  90                  95
Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile
100                 105                 110
Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys
115                 120                 125
Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala
130                 135                 140
Thr Val Gly Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Phe Leu Arg Glu Ile Ile
145                 150                 155                 160
Gln Thr Gly Asp Glu Val Glu Lys Ile Glu Gly Ile Phe Ser Gly Thr
165                 170                 175
Leu Ser Tyr Ile Phe Asn Glu Phe Ser Thr Ser Gln Ala Asn Asp Val
180                 185                 190
Lys Phe Ser Asp Val Val Lys Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Thr Glu
195                 200                 205
Pro Asp Pro Arg Asp Asp Leu Asn Gly Leu Asp Val Ala Arg Lys Val
210                 215                 220
Thr Ile Val Gly Arg Ile Ser Gly Val Glu Val Glu Ser Pro Thr Ser
225                 230                 235                 240
Phe Pro Val Gln Ser Leu Ile Pro Lys Pro Leu Glu Ser Val Lys Ser
245                 250                 255
Ala Asp Glu Phe Leu Glu Lys Leu Ser Asp Tyr Asp Lys Asp Leu Thr
260                 265                 270
Gln Leu Lys Lys Glu Ala Ala Thr Glu Asn Lys Val Leu Arg Phe Ile
275                 280                 285
Gly Lys Val Asp Val Ala Thr Lys Ser Val Ser Val Gly Ile Glu Lys
290                 295                 300
Tyr Asp Tyr Ser
305
<210> 20
<211> 1257
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)
<220>
<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)
<400> 20
atgtctgcca ctctgttcaa taacatcgaa ttgctgcccc ctgatgccct ttttggtatt      60
aagcaaaggt acgggcaaga tcaacgtgct accaaggtcg acttgggtat cggggcctac     120
agagacgaca acggtaaacc atgggtcttg ccaagtgtta aagccgccga aaagctaatt     180
cataacgaca gctcctacaa ccatgaatac ctcggtatta ccggtctgcc aagtttgaca     240
tctaacgccg ccaagatcat cttcggtacg caatccgatg cctttcagga agacagagta     300
atctcagtac aatcactgtc tggtacgggt gctcttcata tatctgcgaa gtttttttca     360
aaattcttcc cagataaact ggtctatttg tctaagccta cttgggccaa ccacatggcc     420
atttttgaga atcaaggctt gaaaacggcg acttaccctt actgggccaa cgaaactaag     480
tctttggacc taaacggctt tctaaatgct attcaaaaag ctccagaggg ctccattttc     540
gttctgcact cttgcgccca taacccaact ggtctggacc ctactagtga acaatgggtt     600
caaatcgttg atgctatcgc ctcaaagaac cacatcgcct tatttgacac cgcctaccaa     660
gggtttgcca ctggagattt ggacaaggat gcctatgctg tgcgtctagg tgtggagaag     720
ctttcaacgg tctctcccgt ctttgtctgt cagtcctttg ccaagaacgc cggtatgtac     780
ggtgagcgtg taggttgttt ccatctagca cttacaaaac aagctcaaaa caaaactata     840
aagcctgctg ttacatctca attggccaaa atcattcgta gtgaagtgtc caacccaccc     900
gcctacggcg ctaagattgt cgctaaactg ttggaaacgc cagaattaac ggaacagtgg     960
cacaaggata tggttaccat gtcctccaga attacgaaaa tgaggcacgc attaagagac    1020
catttagtca agttgggcac tcctggcaac tgggatcata tagtaaatca atgcgggatg    1080
ttctccttta cagggttgac tcctcaaatg gttaaacgac ttgaagaaac ccacgcagtt    1140
tacttggttg cctcaggtag agcttctatt gctggattga atcaaggaaa cgtggaatac    1200
gtggctaaag ccattgatga agtggtgcgc ttctatacta ttgaagctaa attgtaa       1257
<210> 21
<211> 418
<212> ПРТ
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)
<220>
<223> АСПАРТАТТРАНСАМИНАЗА (AAT2)
<400> 21
Met Ser Ala Thr Leu Phe Asn Asn Ile Glu Leu Leu Pro Pro Asp Ala
1               5                   10                  15
Leu Phe Gly Ile Lys Gln Arg Tyr Gly Gln Asp Gln Arg Ala Thr Lys
20                  25                  30
Val Asp Leu Gly Ile Gly Ala Tyr Arg Asp Asp Asn Gly Lys Pro Trp
35                  40                  45
Val Leu Pro Ser Val Lys Ala Ala Glu Lys Leu Ile His Asn Asp Ser
50                  55                  60
Ser Tyr Asn His Glu Tyr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Pro Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ser Asn Ala Ala Lys Ile Ile Phe Gly Thr Gln Ser Asp Ala Phe Gln
85                  90                  95
Glu Asp Arg Val Ile Ser Val Gln Ser Leu Ser Gly Thr Gly Ala Leu
100                 105                 110
His Ile Ser Ala Lys Phe Phe Ser Lys Phe Phe Pro Asp Lys Leu Val
115                 120                 125
Tyr Leu Ser Lys Pro Thr Trp Ala Asn His Met Ala Ile Phe Glu Asn
130                 135                 140
Gln Gly Leu Lys Thr Ala Thr Tyr Pro Tyr Trp Ala Asn Glu Thr Lys
145                 150                 155                 160
Ser Leu Asp Leu Asn Gly Phe Leu Asn Ala Ile Gln Lys Ala Pro Glu
165                 170                 175
Gly Ser Ile Phe Val Leu His Ser Cys Ala His Asn Pro Thr Gly Leu
180                 185                 190
Asp Pro Thr Ser Glu Gln Trp Val Gln Ile Val Asp Ala Ile Ala Ser
195                 200                 205
Lys Asn His Ile Ala Leu Phe Asp Thr Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Thr
210                 215                 220
Gly Asp Leu Asp Lys Asp Ala Tyr Ala Val Arg Leu Gly Val Glu Lys
225                 230                 235                 240
Leu Ser Thr Val Ser Pro Val Phe Val Cys Gln Ser Phe Ala Lys Asn
245                 250                 255
Ala Gly Met Tyr Gly Glu Arg Val Gly Cys Phe His Leu Ala Leu Thr
260                 265                 270
Lys Gln Ala Gln Asn Lys Thr Ile Lys Pro Ala Val Thr Ser Gln Leu
275                 280                 285
Ala Lys Ile Ile Arg Ser Glu Val Ser Asn Pro Pro Ala Tyr Gly Ala
290                 295                 300
Lys Ile Val Ala Lys Leu Leu Glu Thr Pro Glu Leu Thr Glu Gln Trp
305                 310                 315                 320
His Lys Asp Met Val Thr Met Ser Ser Arg Ile Thr Lys Met Arg His
325                 330                 335
Ala Leu Arg Asp His Leu Val Lys Leu Gly Thr Pro Gly Asn Trp Asp
340                 345                 350
His Ile Val Asn Gln Cys Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Thr Pro
355                 360                 365
Gln Met Val Lys Arg Leu Glu Glu Thr His Ala Val Tyr Leu Val Ala
370                 375                 380
Ser Gly Arg Ala Ser Ile Ala Gly Leu Asn Gln Gly Asn Val Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Val Ala Lys Ala Ile Asp Glu Val Val Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Ala
405                 410                 415
Lys Leu
<210> 22
<211> 1317
<212> ДНК
<213> Entodinium caudatum
<220>
<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)
<220>
<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)
<400> 22
atgatagatt tagaagcgag aaaccctgct caacccgaat tcattcaagc cagtagagaa      60
gtaatcgaat cgatcattga tgttgttaat agcaatccga aatacctgga aaacaaaatt     120
ttggagagaa ttacggaacc aaacctaatt cacgaattca aagtcgaatg ggagaatgac     180
aagcacgaaa tcatggtgaa caaaggttat cgtattcagt tcaataatgc gataggtccc     240
tataagggag gcctaaggtt tcacagagca gtcactctag gtactctgaa attccttggt     300
tttgaacaga tatttaagaa ttccttgaca ggattaccta tgggaggtgg caaaggtggt     360
tcagattttg atcctagagg taaatcagat gccgagattt taagattctg taggtctttt     420
atgacttcgt tgttcaaata tattgggcca gagatagatg ttcctgctgg agatataggt     480
gtcggaggta gggaaattgg ttacttgttt ggccaataca aaagactgac ccaacaacat     540
gaaggagttc taactggtaa gggtcttaac tggggtggct ctcttgttag acctgaagcc     600
acaggttttg gaacgatgta ttttgctaac gaagtcttac atgcacatgg tgacgacatc     660
aaggggaaaa ccattgccat atccggattt ggtaatgttg cctttggtgc tgtcttaaaa     720
gcgaaacaat taggcgctaa ggtagtcact atatctggcc cagatggtta catttatgac     780
gagaatggga taaacaccga cgagaaaatc aactacatgt tggaattaag agcctcaaat     840
aatgatgtgg ttgcgccatt tgcagagaag tttggtgcaa aattcatacc agggaagaag     900
ccatgggaag ttccagtgga tatggctttt ccctgtgcca ttcagaacga attgaatgcc     960
gaagatgctg ccactttaca taagaatgga gtgaaatatg tgatcgagac atccaatatg    1020
ggctgtacag cagatgctgt gcaatacttc attaagaacc gtattgtttt cgctccgggt    1080
aaagcagcta atgctggtgg tgttgcagta tctgggttgg aaatgagcca aaactcaatg    1140
aagttgaact ggacagctga agaagttgac gctaaattga agaatatcat gaccaatatt    1200
catgcaagtt gcgtaaagga aggaaaagag agtgacgggt atatcaatta cgttaaaggc    1260
gcaaatatag caggcttcaa gaaagtagct gatgcaatgg tagatcttgg ctattaa       1317
<210> 23
<211> 438
<212> ПРТ
<213> Entodinium caudatum
<220>
<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)
<220>
<223> ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА (GDH)
<400> 23
Met Ile Asp Leu Glu Ala Arg Asn Pro Ala Gln Pro Glu Phe Ile Gln
1               5                   10                  15
Ala Ser Arg Glu Val Ile Glu Ser Ile Ile Asp Val Val Asn Ser Asn
20                  25                  30
Pro Lys Tyr Leu Glu Asn Lys Ile Leu Glu Arg Ile Thr Glu Pro Asn
35                  40                  45
Leu Ile His Glu Phe Lys Val Glu Trp Glu Asn Asp Lys His Glu Ile
50                  55                  60
Met Val Asn Lys Gly Tyr Arg Ile Gln Phe Asn Asn Ala Ile Gly Pro
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Arg Ala Val Thr Leu Gly Thr Leu
85                  90                  95
Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Gly Leu
100                 105                 110
Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Arg Gly Lys
115                 120                 125
Ser Asp Ala Glu Ile Leu Arg Phe Cys Arg Ser Phe Met Thr Ser Leu
130                 135                 140
Phe Lys Tyr Ile Gly Pro Glu Ile Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly
145                 150                 155                 160
Val Gly Gly Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Leu
165                 170                 175
Thr Gln Gln His Glu Gly Val Leu Thr Gly Lys Gly Leu Asn Trp Gly
180                 185                 190
Gly Ser Leu Val Arg Pro Glu Ala Thr Gly Phe Gly Thr Met Tyr Phe
195                 200                 205
Ala Asn Glu Val Leu His Ala His Gly Asp Asp Ile Lys Gly Lys Thr
210                 215                 220
Ile Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn Val Ala Phe Gly Ala Val Leu Lys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Gln Leu Gly Ala Lys Val Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly
245                 250                 255
Tyr Ile Tyr Asp Glu Asn Gly Ile Asn Thr Asp Glu Lys Ile Asn Tyr
260                 265                 270
Met Leu Glu Leu Arg Ala Ser Asn Asn Asp Val Val Ala Pro Phe Ala
275                 280                 285
Glu Lys Phe Gly Ala Lys Phe Ile Pro Gly Lys Lys Pro Trp Glu Val
290                 295                 300
Pro Val Asp Met Ala Phe Pro Cys Ala Ile Gln Asn Glu Leu Asn Ala
305                 310                 315                 320
Glu Asp Ala Ala Thr Leu His Lys Asn Gly Val Lys Tyr Val Ile Glu
325                 330                 335
Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Phe Ile Lys
340                 345                 350
Asn Arg Ile Val Phe Ala Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val
355                 360                 365
Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Ser Gln Asn Ser Met Lys Leu Asn Trp
370                 375                 380
Thr Ala Glu Glu Val Asp Ala Lys Leu Lys Asn Ile Met Thr Asn Ile
385                 390                 395                 400
His Ala Ser Cys Val Lys Glu Gly Lys Glu Ser Asp Gly Tyr Ile Asn
405                 410                 415
Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Lys Lys Val Ala Asp Ala
420                 425                 430
Met Val Asp Leu Gly Tyr
435
<210> 24
<211> 554
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pTDH3" <223> "pTDH3
<220>
<223> pTDH3
<220>
<223> pTDH3
<400> 24
ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt      60
tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa     120
aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc     180
tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat     240
ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat     300
ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga     360
aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa     420
agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact     480
tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca     540
cataaacaaa caaa                                                       554
<210> 25
<211> 550
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pENO2" <223> "pENO2
<220>
<223> pENO2
<220>
<223> pENO2
<400> 25
cgctcagcat ctgcttcttc ccaaagatga acgcggcgtt atgtcactaa cgacgtgcac      60
caacttgcgg aaagtggaat cccgttccaa aactggcatc cactaattga tacatctaca     120
caccgcacgc cttttttctg aagcccactt tcgtggactt tgccatatgc aaaattcatg     180
aagtgtgata ccaagtcagc atacacctca ctagggtagt ttctttggtt gtattgatca     240
tttggttcat cgtggttcat taattttttt tctccattgc tttctggctt tgatcttact     300
atcatttgga tttttgtcga aggttgtaga attgtatgtg acaagtggca ccaagcatat     360
ataaaaaaaa aaagcattat cttcctacca gagttgattg ttaaaaacgt atttatagca     420
aacgcaattg taattaattc ttattttgta tcttttcttc ccttgtctca atcttttatt     480
tttattttat ttttcttttc ttagtttctt tcataacacc aagcaactaa tactataaca     540
tacaataata                                                            550
<210> 26
<211> 419
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pTEF Kl" <223> "pTEF Kl
<220>
<223> pTEF Kl
<220>
<223> pTEF Kl
<400> 26
ctctctcgca ataacaatga acactgggtc aatcatagcc tacacaggtg aacagagtag      60
cgtttataca gggtttatac ggtgattcct acggcaaaaa tttttcattt ctaaaaaaaa     120
aaagaaaaat ttttctttcc aacgctagaa ggaaaagaaa aatctaatta aattgatttg     180
gtgattttct gagagttccc tttttcatat atcgaatttt gaatataaaa ggagatcgaa     240
aaaatttttc tattcaatct gttttctggt tttatttgat agtttttttg tgtattatta     300
ttatggatta gtactggttt atatgggttt ttctgtataa cttcttttta ttttagtttg     360
tttaatctta ttttgagtta cattatagtt ccctaactgc aagagaagta acattaaaa      419
<210> 27
<211> 598
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pTEF3" <223> "pTEF3
<220>
<223> pTEF3
<220>
<223> pTEF3
<400> 27
ggctgataat agcgtataaa caatgcatac tttgtacgtt caaaatacaa tgcagtagat      60
atatttatgc atattacata taatacatat cacataggaa gcaacaggcg cgttggactt     120
ttaattttcg aggaccgcga atccttacat cacacccaat cccccacaag tgatccccca     180
cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt tctcggactc     240
cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt cccctctttc     300
ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa aagagaccgc     360
ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt tctttttctt     420
gaaaattttt ttttttgatt tttttctctt tcgatgacct cccattgata tttaagttaa     480
taaacggtct tcaatttctc aagtttcagt ttcatttttc ttgttctatt acaacttttt     540
ttacttcttg ctcattagaa agaaagcata gcaatctaat ctaagtttta attacaaa       598
<210> 28
<211> 383
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pTEF1" <223> "pTEF1
<220>
<223> pTEF1
<220>
<223> pTEF1
<400> 28
gtttagcttg cctcgtcccc gccgggtcac ccggccagcg acatggaggc ccagaatacc      60
ctccttgaca gtcttgacgt gcgcagctca ggggcatgat gtgactgtcg cccgtacatt     120
tagcccatac atccccatgt ataatcattt gcatccatac attttgatgg ccgcacggcg     180
cgaagcaaaa attacggctc ctcgctgcag acctgcgagc agggaaacgc tcccctcaca     240
gacgcgttga attgtcccca cgccgcgccc ctgtagagaa atataaaagg ttaggatttg     300
ccactgaggt tcttctttca tatacttcct tttaaaatct tgctacgata cagttctcac     360
atcacatccg aacataaaca acc                                             383
<210> 29
<211> 700
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pADH1" <223> "pADH1
<220>
<223> pADH1
<220>
<223> pADH1
<400> 29
gggtgtacaa tatggacttc ctcttttctg gcaaccaaac ccatacatcg ggattcctat      60
aataccttcg ttggtctccc taacatgtag gtggcggagg ggagatatac aatagaacag     120
ataccagaca agacataatg ggctaaacaa gactacacca attacactgc ctcattgatg     180
gtggtacata acgaactaat actgtagccc tagacttgat agccatcatc atatcgaagt     240
ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt     300
ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa     360
aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt     420
tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca     480
cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga     540
aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt     600
ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt     660
tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca                           700
<210> 30
<211> 549
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pGPM 1" <223> "pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
<220>
<223> pGPM 1
<400> 30
gccaaacttt tcggttaaca catgcagtga tgcacgcgcg atggtgctaa gttacatata      60
tatatatata tatatatata tatatatata gccatagtga tgtctaagta acctttatgg     120
tatatttctt aatgtggaaa gatactagcg cgcgcaccca cacacaagct tcgtcttttc     180
ttgaagaaaa gaggaagctc gctaaatggg attccacttt ccgttccctg ccagctgatg     240
gaaaaaggtt agtggaacga tgaagaataa aaagagagat ccactgaggt gaaatttcag     300
ctgacagcga gtttcatgat cgtgatgaac aatggtaacg agttgtggct gttgccaggg     360
agggtggttc tcaactttta atgtatggcc aaatcgctac ttgggtttgt tatataacaa     420
agaagaaata atgaactgat tctcttcctc cttcttgtcc tttcttaatt ctgttgtaat     480
taccttcctt tgtaattttt tttgtaatta ttcttcttaa taatccaaac aaacacacat     540
attacaata                                                             549
<210> 31
<211> 650
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pFBA1" <223> "pFBA1
<220>
<223> pFBA1
<220>
<223> pFBA1
<400> 31
acgcaagccc taagaaatga ataacaatac tgacagtact aaataattgc ctacttggct      60
tcacatacgt tgcatacgtc gatatagata ataatgataa tgacagcagg attatcgtaa     120
tacgtaatag ttgaaaatct caaaaatgtg tgggtcatta cgtaaataat gataggaatg     180
ggattcttct atttttcctt tttccattct agcagccgtc gggaaaacgt ggcatcctct     240
ctttcgggct caattggagt cacgctgccg tgagcatcct ctctttccat atctaacaac     300
tgagcacgta accaatggaa aagcatgagc ttagcgttgc tccaaaaaag tattggatgg     360
ttaataccat ttgtctgttc tcttctgact ttgactcctc aaaaaaaaaa aatctacaat     420
caacagatcg cttcaattac gccctcacaa aaactttttt ccttcttctt cgcccacgtt     480
aaattttatc cctcatgttg tctaacggat ttctgcactt gatttattat aaaaagacaa     540
agacataata cttctctatc aatttcagtt attgttcttc cttgcgttat tcttctgttc     600
ttctttttct tttgtcatat ataaccataa ccaagtaata catattcaaa                650
<210> 32
<211> 700
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pPDC1" <223> "pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<220>
<223> pPDC1
<400> 32
ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag      60
cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc     120
cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca     180
taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt     240
ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta     300
tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct     360
ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg     420
tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag     480
ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg     540
aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg     600
gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac     660
tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa                           700
<210> 33
<211> 998
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCCW12" <223> "pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<220>
<223> pCCW12
<400> 33
aaccagggca aagcaaaata aaagaaactt aatacgttat gccgtaatga agggctacca      60
aaaacgataa tctcaactgt aaacaggtac aatgcggacc cttttgccac aaaacataca     120
tcattcattg ccggaaaaag aaagaagtga agacagcagt gcagccagcc atgttgcgcc     180
aatctaatta tagatgctgg tgccctgagg atgtatctgg agccagccat ggcatcatgc     240
gctaccgccg gatgtaaaat ccgacacgca aaagaaaacc ttcgaggttg cgcacttcgc     300
ccacccatga accacacggt tagtccaaaa ggggcagttc agattccaga tgcgggaatt     360
agcttgctgc caccctcacc tcactaacgc tgcggtgtgc ggatacttca tgctatttat     420
agacgcgcgt gtcggaatca gcacgcgcaa gaaccaaatg ggaaaatcgg aatgggtcca     480
gaactgcttt gagtgctggc tattggcgtc tgatttccgt tttgggaatc ctttgccgcg     540
cgcccctctc aaaactccgc acaagtccca gaaagcggga aagaaataaa acgccaccaa     600
aaaaaaaaat aaaagccaat cctcgaagcg tgggtggtag gccctggatt atcccgtaca     660
agtatttctc aggagtaaaa aaaccgtttg ttttggaatt ccccatttcg cggccaccta     720
cgccgctatc tttgcaacaa ctatctgcga taactcagca aattttgcat attcgtgttg     780
cagtattgcg ataatgggag tcttacttcc aacataacgg cagaaagaaa tgtgagaaaa     840
ttttgcatcc tttgcctccg ttcaagtata taaagtcggc atgcttgata atctttcttt     900
ccatcctaca ttgttctaat tattcttatt ctcctttatt ctttcctaac ataccaagaa     960
attaatcttc tgtcattcgc ttaaacacta tatcaata                             998
<210> 34
<211> 700
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pGK1" <223> "pGK1
<220>
<223> pGK1
<220>
<223> pGK1
<400> 34
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc     240
tcgacttcct gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag     300
cgacggctca caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt     360
agtaccacat gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg     420
ttactctctc tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca     480
cacactcttt tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac     540
atttacatat atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt     600
tctaattcgt agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc     660
aaggaagtaa ttatctactt tttacaacaa atataaaaca                           700
<210> 35
<211> 913
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMDH2" <223> "pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<220>
<223> pMDH2
<400> 35
ccttcgctaa ataataaacc tgaactgtac ttagcgaagc cttcatagca cctacgtaca      60
cgtatatata gacattttac gtaatggaga aactgaggtt tttgttttca ctttttttct     120
ttctttttca ctattgctcg aaccgcctgc gatgagctaa gaaaaaaaag tgaaagaaat     180
catagaaagc aaaaatgaga ttatatagcc cagagccctc ttctggcgcc tgtcccaagg     240
cggaccaaca acaacacttg cccaaaccta agaaaatccc ctcatacttt tccgtttgta     300
tctcctactt tcttacttcc tttttttctt ctttatttgc ttggtttacc attgaagtcc     360
atttttacta cagacaatag ctagtcattc gctatcttcc gtttgtcact ttttttcaaa     420
tttctcatct atatagcgaa gtacggaaaa gatgtcactt gccggcatct cggccttccc     480
cggccaaatg gactcatcat ctacgatacg gcccctttaa tccgcaatta ctttgcccat     540
tcggccgtag ccgttctaaa gccgccgtgc cttgccccca atactcccct aatgatccgg     600
gaagttccgg tttttttcct ttgtttagtg gcattttgtg ttgcccaagg ttgggaaggt     660
ccgatttgac tttaaggaac tacggaaggt atctaaggtt tctaaaaaca atatacacgc     720
gcgtgcgtag atatataaag ataaagattt atcgatatga gataaagatt gctgcatgat     780
tctccttctg attctttttc cctgtatata ttttctcccc ttctgtataa atcgtacagt     840
cagaagtagt ccagaatata gtgctgcaga ctattacaaa agttcaatac aatatcataa     900
aagttatagt aac                                                        913
<210> 36
<211> 406
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pURA3" <223> "pURA3
<220>
<223> pURA3
<220>
<223> pURA3
<400> 36
ggtacccaaa ccgaagttat ctgatgtaga aaaggattaa agatgctaag agatagtgat      60
gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac cttttttgcg aggcatattt     120
atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg tggctgtggt ttcagggtcc     180
ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt ttttgattcc ggtttctttg     240
aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact     300
tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt     360
aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatc                    406
<210> 37
<211> 535
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pRPLA1" <223> "pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<220>
<223> pRPLA1
<400> 37
tcaagttgga tactgatctg atctctccgc cctactacca gggaccctca tgattaccgc      60
tcgaatgcga cgtttcctgc ctcataaaac tggcttgaaa atatttattc gctgaacagt     120
agcctagctt ataaaaattt catttaatta atgtaatatg aaaactcaca tgccttctgt     180
ttctaaaatt gtcacagcaa gaaataacat taccatacgt gatcttatta aactctagta     240
tcttgtctaa tacttcattt aaaagaagcc ttaaccctgt agcctcatct atgtctgcta     300
catatcgtga ggtacgaata tcgtaagatg ataccacgca actttgtaat gatttttttt     360
ttttcatttt ttaaagaatg cctttacatg gtatttgaaa aaaatatctt tataaagttt     420
gcgatctctt ctgttctgaa taatttttag taaaagaaat caaaagaata aagaaatagt     480
ccgctttgtc caatacaaca gcttaaaccg attatctcta aaataacaag aagaa          535
<210> 38
<211> 400
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pSAM4" <223> "pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<220>
<223> pSAM4
<400> 38
agattttggt gttagatggt actcttgcat atgtaacctt taataaattt tgcaaatcga      60
attcctttgt aacgtgcaaa gcattttata gcctggcgct cgcattgtta agcaacaggc     120
ggtgcggcaa cgttgaaatg tttcacgcag ggttttttac gtactgcacg gcattctgga     180
gtgaaaaaaa atgaaaagta cagctcgaag ttttttgtcc atcggttgta ctttgcagag     240
tattagtcat ttttgatatc agagtactac tatcgaagca tttttacgct tgaataactt     300
gaatattatt gaaagcttag ttcaaccaag ctgaaaagaa ccattattca acataattgg     360
aaatcatttc gttactaaat cgtccgaaaa ttgcagaaaa                           400
<210> 39
<211> 505
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCUP1-1" <223> "pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<220>
<223> pCUP1-1
<400> 39
cggcaaactt caacgatttc tatgatgcat tttataatta gtaagccgat cccattaccg      60
acatttgggc gctatacgtg catatgttca tgtatgtatc tgtatttaaa acacttttgt     120
attatttttc ctcatatatg tgtataggtt tatacggatg atttaattat tacttcacca     180
ccctttattt caggctgata tcttagcctt gttactagtt agaaaaagac atttttgctg     240
tcagtcactg tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc     300
gtcttttccg ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgcaatatgg attgtcagaa     360
tcatataaaa gagaagcaaa taactccttg tcttgtatca attgcattat aatatcttct     420
tgttagtgca atatcatata gaagtcatcg aaatagatat taagaaaaac aaactgtaca     480
atcaatcaat caatcatcac ataaa                                           505
<210> 40
<211> 500
<212> ДНК
<213> Candida glabrata
<220>
<223> pCUP1.Cgla" <223> "pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<220>
<223> pCUP1.Cgla
<400> 40
cacaccacac aaccgtcagc accccggctg tacgtctgtg aaggctgcgg tatagacacg      60
gactgcgata cagaactcat gacttatatc tgtagactcc tctgcttcaa tgcgaactcc     120
aggatcaccg aatagcatgc gatgagctgt tgattcttat atataattat ctattgcatt     180
ttttttttaa tgctgcatgg gggggcctag taaatcaccc gtacaagtca cgcgtgagag     240
aaagagaagg gccctttcgt cgtggaagcg tggatcgtga gcgacctgtt tctaaatata     300
gcttttgggt aggatattat attaagtgaa attttattag agggtaaatg tatgtgaaag     360
ttatgtataa tatgttgcta aattagcgat cgtgaatgca tagaatctaa tcgttataga     420
aaaccgcaac ttgtgctgtt ttgttgtgtt ttcttgtcgt ttttttatat tatttatcta     480
gtattttgct ttagttgtta                                                 500
<210> 41
<211> 425
<212> ДНК
<213> Saccharomyces bayanus
<220>
<223> pCUP1.Sba" <223> "pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<220>
<223> pCUP1.Sba
<400> 41
agaaggaggg gtcctattac caatacttgg acgctatacg tgcatatgta catgtacgta      60
tctgtattta aacacttttg tattattttc tttatatatg tgtataggtt tacatggttg     120
acttttatca ttgtttgtgc acatttgcaa tggccatttt tttgtttttg agaaaggtat     180
tattgctgtc actattcgag atgcttttgc tgacattcct cctagaagcc aaaaggccga     240
tgcgtttttt ccgctgagag gataccagca aaaaaagcta ccagtacaag atgggacggc     300
aaaagcgtat aaaagaagaa gcaaaatgac cagatatgct ttcaatttca tcaatgtttc     360
tttctccctg ttatgatcca gaagaataat caaaagcaaa acatctattc aatcaatctc     420
ataaa                                                                 425
<210> 42
<211> 741
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU1" <223> "pACU1
<220>
<223> pACU1
<220>
<223> pACU1
<400> 42
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc     420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca     480
acgaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac     540
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat     600
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct     660
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat     720
tctattaccc ccatccatac a                                               741
<210> 43
<211> 757
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU2" <223> "pACU2
<220>
<223> pACU2
<220>
<223> pACU2
<400> 43
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg     360
tcaagagatt cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg     420
ctgaaccgtt ccagcaaaaa agactaccaa cgaattccac gtgaagctgt cgatattggg     480
gaactgtggt ggttggcaaa tgactaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac     540
tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg     600
atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc     660
ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca     720
gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca                              757
<210> 44
<211> 498
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU3p" <223> "pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<220>
<223> pACU3p
<400> 44
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag     180
attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc     240
gttccagcaa aaaagactac caacgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt     300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat     360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct     420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt     480
caaggagaaa aaactata                                                   498
<210> 45
<211> 498
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU4p" <223> "pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<220>
<223> pACU4p
<400> 45
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa     180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg     240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt     300
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat     360
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct     420
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt     480
caaggagaaa aaactata                                                   498
<210> 46
<211> 530
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU5" <223> "pACU5
<220>
<223> pACU5
<220>
<223> pACU5
<400> 46
ggaggacgaa acaaaaaagt gaaaaaaaat gaaaattttt ttggaaaacc aagaaatgaa      60
ttatatttcc gtgtgagacg acatcgtcga atatgattca gggtaacagt attgatgtaa     120
tcaatttcct acctgaatct aaaattcccg gaattcgaaa aagacatttt tgctgtcagt     180
cactgtcaag agattctttt gctggcattt cttccagaag caaaaagagc gatgcgtctt     240
ttccgctgaa ccgttccagc aaaaaagact accaacgaat tccgagcaga tccgccaggc     300
gtgtatatat agcgtggatg gccaggcaac tttagtgctg acacatacag gcatatatat     360
atgtgtgcga cgacacatga tcatatggca tgcatgtgct ctgtatgtat ataaaactct     420
tgttttcttc ttttctctaa atattctttc cttatacatt aggacctttg cagcataaat     480
tactatactt ctatagacac acaaacacaa atacacacac taaattaata                530
<210> 47
<211> 867
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU6" <223> "pACU6
<220>
<223> pACU6
<220>
<223> pACU6
<400> 47
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc     420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca     480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat     540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga     600
ctaccaacga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat     660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa     720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg     780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga     840
tacaattcta ttacccccat ccataca                                         867
<210> 48
<211> 867
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU7" <223> "pACU7
<220>
<223> pACU7
<220>
<223> pACU7
<400> 48
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct     420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt     480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt     540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg     600
tctttttcga attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat     660
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa     720
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg     780
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga     840
tacaattcta ttacccccat ccataca                                         867
<210> 49
<211> 1119
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU8" <223> "pACU8
<220>
<223> pACU8
<220>
<223> pACU8
<400> 49
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tcgaaaaaga catttttgct gtcagtcact gtcaagagat tcttttgctg gcatttcttc     420
cagaagcaaa aagagcgatg cgtcttttcc gctgaaccgt tccagcaaaa aagactacca     480
acgaattcga aaaagacatt tttgctgtca gtcactgtca agagattctt ttgctggcat     540
ttcttccaga agcaaaaaga gcgatgcgtc ttttccgctg aaccgttcca gcaaaaaaga     600
ctaccaacga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc     660
tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa     720
aaaagactac caacgaattc gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc     780
ttttgctggc atttcttcca gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc     840
cagcaaaaaa gactaccaac gaattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa     900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct     960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt    1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt    1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca                           1119
<210> 50
<211> 624
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU9" <223> "pACU9
<220>
<223> pACU9
<220>
<223> pACU9
<400> 50
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac      60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag     120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg     180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgaaaaa     240
gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag attcttttgc tggcatttct tccagaagca     300
aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc gttccagcaa aaaagactac caacgaattc     360
gaaaaagaca tttttgctgt cagtcactgt caagagattc ttttgctggc atttcttcca     420
gaagcaaaaa gagcgatgcg tcttttccgc tgaaccgttc cagcaaaaaa gactaccaac     480
gaattcgggc tctttacatt tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat     540
ggtggtaatg ccatgtaata tgattattaa acttctttgc gtccatccaa aaaaaaagta     600
agaatttttg aaaattcaat ataa                                            624
<210> 51
<211> 876
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU10p" <223> "pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<220>
<223> pACU10p
<400> 51
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attggttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa     180
aagacgcatc gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg     240
actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca     300
gcggaaaaga cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg     360
acagtgactg acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac     420
ggttcagcgg aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat     480
ctcttgacag tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc     540
tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa     600
aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tccaattcgg atgataatgc     660
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct     720
attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt     780
tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat     840
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata                               876
<210> 52
<211> 633
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU11" <223> "pACU11
<220>
<223> pACU11
<220>
<223> pACU11
<400> 52
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc      60
aacttgcggg aattcgaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg     120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca     180
aaaaagacta ccaacgaatt ccaccgcacg ccttttttct gaagcccact ttcgtggact     240
ttgccatata tgcaaaattc atgaagtgtg ataccaagtc agcatacacc tcactagggt     300
agtttctttg gttgtattga tcatttggtt catcgtggtt cattaatttt ttttctccat     360
tgctttctgg ctttgatctt actatcattt ggatttttgt cgaaggttgt agaattgtat     420
gtgacaagtg gcaccaagca tatataaaaa aaaaaagcat tatcttccta ccagagttga     480
ttgttaaaaa cgtatttata gcaaacgcaa ttgtaattaa ttcttatttt gtatcttttc     540
ttcccttgtc tcaatctttt atttttattt tatttttctt ttcttagttt ctttcataac     600
accaagcaac taatactata acatacaata ata                                  633
<210> 53
<211> 1119
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU12" <223> "pACU12
<220>
<223> pACU12
<220>
<223> pACU12
<400> 53
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct     420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt     480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt     540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg     600
tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc     660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca     720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga     780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg     840
acagcaaaaa tgtctttttc caattctaat taagttagtc aaggcgccat cctcatgaaa     900
actgtgtaac ataataaccg aagtgtcgaa aaggtggcac cttgtccaat tgaacacgct     960
cgatgaaaaa aataagatat atataaggtt aagtaaagcg tctgttagaa aggaagtttt    1020
tcctttttct tgctctcttg tcttttcatc tactatttcc ttcgtgtaat acagggtcgt    1080
cagatacata gatacaattc tattaccccc atccataca                           1119
<210> 54
<211> 1497
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU13" <223> "pACU13
<220>
<223> pACU13
<220>
<223> pACU13
<400> 54
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tggttggtag tcttttttgc tggaacggtt cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct     420
tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt     480
tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt     540
tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg     600
tctttttcga attcgttggt agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc     660
gctctttttg cttctggaag aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca     720
aaaatgtctt tttcgaattc gttggtagtc ttttttgctg gaacggttca gcggaaaaga     780
cgcatcgctc tttttgcttc tggaagaaat gccagcaaaa gaatctcttg acagtgactg     840
acagcaaaaa tgtctttttc gaattcgttg gtagtctttt ttgctggaac ggttcagcgg     900
aaaagacgca tcgctctttt tgcttctgga agaaatgcca gcaaaagaat ctcttgacag     960
tgactgacag caaaaatgtc tttttcgaat tcgttggtag tcttttttgc tggaacggtt    1020
cagcggaaaa gacgcatcgc tctttttgct tctggaagaa atgccagcaa aagaatctct    1080
tgacagtgac tgacagcaaa aatgtctttt tcgaattcgt tggtagtctt ttttgctgga    1140
acggttcagc ggaaaagacg catcgctctt tttgcttctg gaagaaatgc cagcaaaaga    1200
atctcttgac agtgactgac agcaaaaatg tctttttcca attctaatta agttagtcaa    1260
ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct    1320
tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc    1380
tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt    1440
cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga tacaattcta ttacccccat ccataca       1497
<210> 55
<211> 1011
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU14" <223> "pACU14
<220>
<223> pACU14
<220>
<223> pACU14
<400> 55
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc      60
aacttgcggg aattggaaaa agacattttt gctgtcagtc actgtcaaga gattcttttg     120
ctggcatttc ttccagaagc aaaaagagcg atgcgtcttt tccgctgaac cgttccagca     180
aaaaagacta ccaacgaatt cgaaaaagac atttttgctg tcagtcactg tcaagagatt     240
cttttgctgg catttcttcc agaagcaaaa agagcgatgc gtcttttccg ctgaaccgtt     300
ccagcaaaaa agactaccaa cgaattcgaa aaagacattt ttgctgtcag tcactgtcaa     360
gagattcttt tgctggcatt tcttccagaa gcaaaaagag cgatgcgtct tttccgctga     420
accgttccag caaaaaagac taccaacgaa ttcgaaaaag acatttttgc tgtcagtcac     480
tgtcaagaga ttcttttgct ggcatttctt ccagaagcaa aaagagcgat gcgtcttttc     540
cgctgaaccg ttccagcaaa aaagactacc aaccaattcc accgcacgcc ttttttctga     600
agcccacttt cgtggacttt gccatatatg caaaattcat gaagtgtgat accaagtcag     660
catacacctc actagggtag tttctttggt tgtattgatc atttggttca tcgtggttca     720
ttaatttttt ttctccattg ctttctggct ttgatcttac tatcatttgg atttttgtcg     780
aaggttgtag aattgtatgt gacaagtggc accaagcata tataaaaaaa aaaagcatta     840
tcttcctacc agagttgatt gttaaaaacg tatttatagc aaacgcaatt gtaattaatt     900
cttattttgt atcttttctt cccttgtctc aatcttttat ttttatttta tttttctttt     960
cttagtttct ttcataacac caagcaacta atactataac atacaataat a             1011
<210> 56
<211> 398
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pACU15" <223> "pACU15
<220>
<223> pACU15
<220>
<223> pACU15
<400> 56
tatagttttt tctccttgac gttaaagtat agaggtatat taacaatttt ttgttgatac      60
ttttatgaca tttgaataag aagtaataca aactgaaaat gttgaaagta ttagttaaag     120
tggttatgca gcttttccat ttatatatct gttaatagat caaaaatcat cgcttcgctg     180
attaattacc ccagaaataa ggctaaaaaa ctaatcgcat tatcatccga attcgttggt     240
agtctttttt gctggaacgg ttcagcggaa aagacgcatc gctctttttg cttctggaag     300
aaatgccagc aaaagaatct cttgacagtg actgacagca aaaatgtctt tttcgaattc     360
gggctcttta catttccaca acatataagt aagattag                             398
<210> 57
<211> 428
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pGAL/CUP1p" <223> "pGAL/CUP1p
<220>
<223> pGAL/CUP1p
<220>
<223> pGAL/CUP1p
<400> 57
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attcgaaaaa gacatttttg ctgtcagtca ctgtcaagag     180
attcttttgc tggcatttct tccagaagca aaaagagcga tgcgtctttt ccgctgaacc     240
gttccagcaa aaaagactac caacgcaata tggattgtca gaatcatata aaagagaagc     300
aaataactcc ttgtcttgta tcaattgcat tataatatct tcttgttagt gcaatatcat     360
atagaagtca tcgaaataga tattaagaaa aacaaactgt acaatcaatc aatcaatcat     420
cacataaa                                                              428
<210> 58
<211> 518
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCRS5" <223> "pCRS5
<220>
<223> pCRS5
<220>
<223> pCRS5
<400> 58
gtggacgaaa agacataact gcagaagtac agctgccttt atttcttgtg gtcatttatt      60
gcttttattt tcaagtcaga tatacaagaa aatcaaatcc catcgtcaac gtcacgtata     120
aacgattaat ttacagtaat accatactct accaacatta ttttagtccg acgttcagtc     180
ctgtaggtgt tccaaatcct tctggcattg acttctgtgc agaaaccctt caaaatgagt     240
tccactttac gtcagatcgc ataacaaccg gtcatatatt tttttctttt gctaaacccc     300
ctactgcaag cacttttaag aaaaagaaca ataaatgcgt ctttattgct gtgtggaagt     360
gatttttgtc tttcggacaa aaaaaggata gggatgcgag agggctgtga agtagtgatc     420
aagcggggcc tatataagaa gggcgcacat cgtcccccct aagaatagcg aagcgatatt     480
acactgaaca ctacaatgtc aaatagtact caataaat                             518
<210> 59
<211> 510
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCHA1" <223> "pCHA1
<220>
<223> pCHA1
<220>
<223> pCHA1
<400> 59
gatctctgct gacgttgtat ccacagatct aattgcaaga tagcctcttg cgaccttatt      60
aaaagcctct ccgtgatatc ctctagggct tgggttgcca ttaatcgatg tgtccttgtt     120
tccttatgcg agctgtttct tatctatctt atggtcccat tctttactgc actgtttaca     180
ttttgatcaa ttgcgaaatg ttcctactat ttttcttttt ctcttttcgc gagtactaat     240
caccgcgaac ggaaactaat gagtcctctg cgcggagaca tgattccgca tgggcggctc     300
ctgttaagcc ccagcggaaa tgtaattcca ctgagtgtca ttaaatagtg ccaaagcttt     360
atcaaattgt ttgcgatgag ataagataaa agggacaata tgaggaggaa cacaggtata     420
taaatatcgc caaataaaag gaaaatgttt atacagtttt ctctttttta agtgctggat     480
agacaagaga caggaaaatt aaccagcgag                                      510
<210> 60
<211> 601
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCTR1" <223> "pCTR1
<220>
<223> pCTR1
<220>
<223> pCTR1
<400> 60
caagtccgat tgttcctctt caggagcttc ctgaaccaaa ctttttccgc aaggccgcat      60
tttgaaccgt attttgctcg ttccagcctt tccacgtttt tgttatctaa gcaacttggc     120
acatttccct actatactac aaaccgatac gtaaatactt ccctaaatag catatgaatt     180
attcagtaat ttttaaggat cgaaactgca cctcaactat tcgttactgt ggttatgttc     240
tcatgtattg atgcaaatca tgggatattt gctcaagacg acggtaaaat gagcaaaaat     300
ggcacgatcc tgaaaagagc acttttcaag attcgggcta caaaatgcaa cataaaaaat     360
gttgtattgt catctcgaca gggtcttgta tgttttattc ctcttatgat tagttcacat     420
tagtaaaaca gatacgcagt gtgctcttaa taaacaacta ctccatagct ttatttgcat     480
aacaaaactt ttaagcacaa acttaaacag gtggagtaat agttcggcgg cgactcaaat     540
tacatttgtt ggaagaatcg aatagaaaat aaaaaaaagt gtattatatt tgacattcaa     600
a                                                                     601
<210> 61
<211> 522
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pCTR3" <223> "pCTR3
<220>
<223> pCTR3
<220>
<223> pCTR3
<400> 61
gatgtgatga caaaacctct tccgataaaa acatttaaac tattaacaaa caaatggatt      60
cattagatct attacattat gggtggtatg ttggaataaa aatcaactat catctactaa     120
ctagtattta cgttactagt atattatcat atacggtgtt agaagatgac gcaaatgatg     180
agaaatagtc atctaaatta gtggaagctg aaacgcaagg attgataatg taataggatc     240
aatgaatatt aacatataaa acgatgataa taatatttat agaattgtgt agaattgcag     300
attccctttt atggattcct aaatcctcca ggagaacttc tagtatatct acatacctaa     360
tattattgcc ttattaaaaa tggaatccca acaattacat caaaatccac attctcttca     420
cttctccgat agacttgtaa tttatcttat ttcatttcct aacactttga tcgaagaaga     480
gggataacaa cagacgaaaa cacatttaag ggctatacaa ag                        522
<210> 62
<211> 675
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR1" <223> "pCUR1
<220>
<223> pCUR1
<220>
<223> pCUR1
<400> 62
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat     420
tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa taaccgaagt     480
gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata agatatatat     540
aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct ctcttgtctt     600
ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata caattctatt     660
acccccatcc ataca                                                      675
<210> 63
<211> 674
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR2" <223> "pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<220>
<223> pCUR2
<400> 63
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgatt     360
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt     420
ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg     480
tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata     540
aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt     600
tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta     660
cccccatcca taca                                                       674
<210> 64
<211> 794
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR3" <223> "pCUR3
<220>
<223> pCUR3
<220>
<223> pCUR3
<400> 64
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
taggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt     420
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt     480
gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt     540
ctaattaagt tagtcaaggc gccatcctca tgaaaactgt gtaacataat aaccgaagtg     600
tcgaaaaggt ggcaccttgt ccaattgaac acgctcgatg aaaaaaataa gatatatata     660
aggttaagta aagcgtctgt tagaaaggaa gtttttcctt tttcttgctc tcttgtcttt     720
tcatctacta tttccttcgt gtaatacagg gtcgtcagat acatagatac aattctatta     780
cccccatcca taca                                                       794
<210> 65
<211> 850
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR4" <223> "pCUR4
<220>
<223> pCUR4
<220>
<223> pCUR4
<400> 65
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat     420
tgtcatggga tatttgctca agacgacggt aaaatgagca aatatggcac gatcctcaat     480
gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatggcacg atcctcaatt     540
gtcatgggat atttgctcaa gacgacggta aaatgagcaa atatcccatg acaattctaa     600
ttaagttagt caaggcgcca tcctcatgaa aactgtgtaa cataataacc gaagtgtcga     660
aaaggtggca ccttgtccaa ttgaacacgc tcgatgaaaa aaataagata tatataaggt     720
taagtaaagc gtctgttaga aaggaagttt ttcctttttc ttgctctctt gtcttttcat     780
ctactatttc cttcgtgtaa tacagggtcg tcagatacat agatacaatt ctattacccc     840
catccataca                                                            850
<210> 66
<211> 491
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR5p" <223> "pCUR5p
<220>
<223> pCUR5p
<220>
<223> pCUR5p
<400> 66
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag     180
caaatatggc acgatcctca attgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag     240
caaatatggc acgatcccaa ttcggatgat aatgcgatta gttttttagc cttatttctg     300
gggtaattaa tcagcgaagc gatgattttt gatctattaa cagatatata aatggaaaag     360
ctgcataacc actttaacta atactttcaa cattttcagt ttgtattact tcttattcaa     420
atgtcataaa agtatcaaca aaaaattgtt aatatacctc tatactttaa cgtcaaggag     480
aaaaaactat a                                                          491
<210> 67
<211> 833
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR6" <223> "pCUR6
<220>
<223> pCUR6
<220>
<223> pCUR6
<400> 67
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccgaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc     360
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc     420
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt gaggatcgtg ccatatttgc tcattttacc     480
gtcgtcttga gcaaatatcc catgacaatt catgatcgca aaatggcaaa tggcacgtga     540
agctgtcgat attggggaac tgtggtggtt ggcaaatgac taattaagtt agtcaaggcg     600
ccatcctcat gaaaactgtg taacataata accgaagtgt cgaaaaggtg gcaccttgtc     660
caattgaaca cgctcgatga aaaaaataag atatatataa ggttaagtaa agcgtctgtt     720
agaaaggaag tttttccttt ttcttgctct cttgtctttt catctactat ttccttcgtg     780
taatacaggg tcgtcagata catagataca attctattac ccccatccat aca            833
<210> 68
<211> 803
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR7" <223> "pCUR7
<220>
<223> pCUR7
<220>
<223> pCUR7
<400> 68
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca     240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc     360
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     420
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     480
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     540
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     600
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     660
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     720
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta     780
ctttttacaa caaatataaa aca                                             803
<210> 69
<211> 863
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR8" <223> "pCUR8
<220>
<223> pCUR8
<220>
<223> pCUR8
<400> 69
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca     240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc     420
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     480
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     540
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     600
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     660
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     720
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     780
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta     840
ctttttacaa caaatataaa aca                                             863
<210> 70
<211> 863
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR9" <223> "pCUR9
<220>
<223> pCUR9
<220>
<223> pCUR9
<400> 70
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt     240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc     420
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     480
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     540
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     600
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     660
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     720
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     780
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta     840
ctttttacaa caaatataaa aca                                             863
<210> 71
<211> 923
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR10" <223> "pCUR10
<220>
<223> pCUR10
<220>
<223> pCUR10
<400> 71
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt     240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc     480
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     540
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     600
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     660
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     720
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     780
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     840
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta     900
ctttttacaa caaatataaa aca                                             923
<210> 72
<211> 983
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR11" <223> "pCUR11
<220>
<223> pCUR11
<220>
<223> pCUR11
<400> 72
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt     240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc     540
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     600
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     660
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     720
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     780
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     840
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     900
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta     960
ctttttacaa caaatataaa aca                                             983
<210> 73
<211> 1043
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR12" <223> "pCUR12
<220>
<223> pCUR12
<220>
<223> pCUR12
<400> 73
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca     240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca     420
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     540
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc     600
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     660
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     720
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     780
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     840
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     900
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     960
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta    1020
ctttttacaa caaatataaa aca                                            1043
<210> 74
<211> 1043
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR13" <223> "pCUR13
<220>
<223> pCUR13
<220>
<223> pCUR13
<400> 74
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt     240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt     420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     540
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc     600
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     660
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     720
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     780
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta     840
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa     900
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt     960
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta    1020
ctttttacaa caaatataaa aca                                            1043
<210> 75
<211> 1223
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR14" <223> "pCUR14
<220>
<223> pCUR14
<220>
<223> pCUR14
<400> 75
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattctc atgggatatt     240
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     300
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     360
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt     420
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     480
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     540
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctc atgggatatt     600
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     660
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctcaattgtc atgggatatt     720
tgctcaagac gacggtaaaa tgagcaaata tggcacgatc ctgaattctt cctgtcttcc     780
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     840
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     900
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca     960
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta    1020
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa    1080
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt    1140
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta    1200
ctttttacaa caaatataaa aca                                            1223
<210> 76
<211> 1283
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR15" <223> "pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<220>
<223> pCUR15
<400> 76
gtgagtaagg aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc      60
gcgaatcctt tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt     120
ttccctcctt cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga     180
aattaccgtc gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaattcag gatcgtgcca     240
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     300
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     360
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     420
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca     480
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     540
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     600
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattcag gatcgtgcca     660
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     720
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gacaattgag gatcgtgcca     780
tatttgctca ttttaccgtc gtcttgagca aatatcccat gagaattctt cctgtcttcc     840
tattgattgc agcttccaat ttcgtcacac aacaaggtcc tagcgacggc tcacaggttt     900
tgtaacaagc aatcgaaggt tctggaatgg cgggaaaggg tttagtacca catgctatga     960
tgcccactgt gatctccaga gcaaagttcg ttcgatcgta ctgttactct ctctctttca    1020
aacagaattg tccgaatcgt gtgacaacaa cagcctgttc tcacacactc ttttcttcta    1080
accaaggggg tggtttagtt tagtagaacc tcgtgaaact tacatttaca tatatataaa    1140
cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac atatttggtc ttttctaatt cgtagttttt    1200
caagttctta gatgctttct ttttctcttt tttacagatc atcaaggaag taattatcta    1260
ctttttacaa caaatataaa aca                                            1283
<210> 77
<211> 686
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR16" <223> "pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<220>
<223> pCUR16
<400> 77
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc      60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     180
cacgatcctc aatgtcatgg gatatttgct caagacgacg gtaaaatgag caaatatggc     240
acgatcctga attccaccgc acgccttttt tctgaagccc actttcgtgg actttgccat     300
atatgcaaaa ttcatgaagt gtgataccaa gtcagcatac acctcactag ggtagtttct     360
ttggttgtat tgatcatttg gttcatcgtg gttcattaat tttttttctc cattgctttc     420
tggctttgat cttactatca tttggatttt tgtcgaaggt tgtagaattg tatgtgacaa     480
gtggcaccaa gcatatataa aaaaaaaaag cattatcttc ctaccagagt tgattgttaa     540
aaacgtattt atagcaaacg caattgtaat taattcttat tttgtatctt ttcttccctt     600
gtctcaatct tttattttta ttttattttt cttttcttag tttctttcat aacaccaagc     660
aactaatact ataacataca ataata                                          686
<210> 78
<211> 747
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pCUR17" <223> "pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<220>
<223> pCUR17
<400> 78
gctcagcatc tgcttcttcc caaagatgaa cgcggcgtta tgtcactaac gacgtgcacc      60
aacttgcggg aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     120
cacgatcctc aattgtcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     180
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     240
cacgatcctc aattctcatg ggatatttgc tcaagacgac ggtaaaatga gcaaatatgg     300
cacgatcctg aattccaccg cacgcctttt ttctgaagcc cactttcgtg gactttgcca     360
tatatgcaaa attcatgaag tgtgatacca agtcagcata cacctcacta gggtagtttc     420
tttggttgta ttgatcattt ggttcatcgt ggttcattaa ttttttttct ccattgcttt     480
ctggctttga tcttactatc atttggattt ttgtcgaagg ttgtagaatt gtatgtgaca     540
agtggcacca agcatatata aaaaaaaaaa gcattatctt cctaccagag ttgattgtta     600
aaaacgtatt tatagcaaac gcaattgtaa ttaattctta ttttgtatct tttcttccct     660
tgtctcaatc ttttattttt attttatttt tcttttctta gtttctttca taacaccaag     720
caactaatac tataacatac aataata                                         747
<210> 79
<211> 500
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pLYS1" <223> "pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<220>
<223> pLYS1
<400> 79
gcaagttaac attagggaga acgtggggcc ttcctccatg agtgcagagc aattgaagat      60
gtttagaggt ttaaaggaga ataaccagtt gctggatagc tctgtgccag ctacagttta     120
tgccaaattg gcccttcatg gtattcctga cggtgttaat ggacagtact tgagctataa     180
tgaccctgcc ttggcggact ttatgccttg aggatagcag gtacatataa attgttacat     240
actaagtcga tgagtcaaaa aagactctta tacatttata cattttgcat tattattttt     300
tttttccagc ggaatttgga attccgctct caaccgccaa aattcccctg cgatttcagc     360
gacaaagagt cataaagtca tcctcgagaa accacgatga aatatataaa aagcccatct     420
tccctgacgg aaactggtat tttaggaggc ataccataag ataacaacga aaacgcttta     480
tttttcacac aaccgcaaaa                                                 500
<210> 80
<211> 650
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pLYS4" <223> "pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<220>
<223> pLYS4
<400> 80
ttgaaaaatg cgaagttgaa gtgccataga agagaaacag cccacacagg ggagaagccc      60
actggaaagg gggcactgac caactttaaa taggaaacag aagataccac aagccagcga     120
tacaacagca ccaaacaccg aaaagaatag ccaaagctgt cctctggtgt tggaaaaact     180
ggaaaaaacg caactgcgtt ggctgctacg gtgaaaaatt ttcctatgac ttttttcact     240
gcttgttcgt gcgaaattac cgcaaacccg gtaaaatgta cacgtatcaa gtgataaaca     300
atttcgtgtc aagtgagcag aatggagcga tttggaaaaa aaaaattttt attgtttttt     360
cccccgggat tttgctcgag atgactgaaa ttttgtaatc gatgagtcta taccagaggc     420
agcaaatatc accaacatac acaggtatac acaatctcat gtccacacac acgtacagac     480
acgcacatat atatatatat atatatatcc ccataggtat ttatatatac aaaagaatcc     540
tcgtgtgttt gtgtgtgcaa tagctagttt tgcgctgcct cttatagtag acaatatcac     600
tttttcaata aaatagaact tgcaaggaaa caaaattgta tcgcttcaag                650
<210> 81
<211> 500
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pLYS9" <223> "pLYS9
<220>
<223> pLYS9
<220>
<223> pLYS9
<400> 81
acatatgcaa gagtcttatg tatcgtatct aagtgccacg taggggattc ccatcatttg      60
atgatttcca aatataatac ctgtagagag cggtggagca aaagtcaaat tttaatcgca     120
actgcagaca agtcaagctg aggaaattgt ggatgatctc ttgtttcttt tgatattcac     180
cacaacagaa gtgaagagtg tgattgcggt tactactgac cacgaagcaa tgcgtttagt     240
agtgaaaaga attactcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag     300
tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag     360
atgatagaaa gtagcacaga atttggctta atggtatata aaccgtaggg tcctggtaaa     420
attacatggg aaggatcctt aggcagtagg gaaaacttat caggacaatt gagttatatt     480
aacgtattat atattttaat                                                 500
<210> 82
<211> 494
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR1p" <223> "pLYR1p
<220>
<223> pLYR1p
<220>
<223> pLYR1p
<400> 82
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt     180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta     240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt     300
ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa     360
aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt     420
caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag     480
gagaaaaaac tata                                                       494
<210> 83
<211> 494
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR2p" <223> "pLYR2p
<220>
<223> pLYR2p
<220>
<223> pLYR2p
<400> 83
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat     180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa     240
tttcgattcc agagtatgag gaattcggat gataatgcga ttagtttttt agccttattt     300
ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat ataaatggaa     360
aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt acttcttatt     420
caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt taacgtcaag     480
gagaaaaaac tata                                                       494
<210> 84
<211> 616
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR3p" <223> "pLYR3p
<220>
<223> pLYR3p
<220>
<223> pLYR3p
<400> 84
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt     180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta     240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa     300
ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat     360
tatcagcaat agatgataga aagaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat     420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg     480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta     540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca     600
aggagaaaaa actata                                                     616
<210> 85
<211> 616
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR4p" <223> "pLYR4p
<220>
<223> pLYR4p
<220>
<223> pLYR4p
<400> 85
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat     180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa     240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa     300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg     360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattcgg atgataatgc gattagtttt ttagccttat     420
ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct attaacagat atataaatgg     480
aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt tcagtttgta ttacttctta     540
ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat acctctatac tttaacgtca     600
aggagaaaaa actata                                                     616
<210> 86
<211> 738
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR5p" <223> "pLYR5p
<220>
<223> pLYR5p
<220>
<223> pLYR5p
<400> 86
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat     180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa     240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa     300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg     360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg     420
aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac     480
ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt     540
atttctgggg taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat     600
ggaaaagctg cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct     660
tattcaaatg tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt     720
caaggagaaa aaactata                                                   738
<210> 87
<211> 1104
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR6p" <223> "pLYR6p
<220>
<223> pLYR6p
<220>
<223> pLYR6p
<400> 87
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attgctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt     180
cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta     240
tcagcaatag atgatagaaa gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa     300
ttcgctttgt agtgaaaaat aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat     360
tatcagcaat agatgataga aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa     420
aattcgcttt gtagtgaaaa ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga     480
attatcagca atagatgata gaaacaattg ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga     540
aaaattcgct ttgtagtgaa aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg     600
gaattatcag caatagatga tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg     660
gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa     720
tggaattatc agcaatagat gatagaaaga attcctcata ctctggaatc gaaattccgt     780
tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc     840
aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa caattcggat gataatgcga ttagtttttt     900
agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat taacagatat     960
ataaatggaa aagctgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc agtttgtatt    1020
acttcttatt caaatgtcat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac ctctatactt    1080
taacgtcaag gagaaaaaac tata                                           1104
<210> 88
<211> 1836
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR7p" <223> "pLYR7p
<220>
<223> pLYR7p
<220>
<223> pLYR7p
<400> 88
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata      60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg     120
tggaaatgta aagagcccga attgtttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat     180
tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa     240
tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa     300
attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg     360
aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg     420
aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac     480
ggaatttcga ttccagagta tgagcaattg tttctatcat ctattgctga taattccatt     540
ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca     600
acggaatttc gattccagag tatgaggaat tctttctatc atctattgct gataattcca     660
ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag cgaatttttc     720
caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg ctgataattc     780
cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa agcgaatttt     840
tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag caattgtttc tatcatctat tgctgataat     900
tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac aaagcgaatt     960
tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg aggaattctt tctatcatct attgctgata    1020
attccattgg aaattctcaa taccctttat tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa    1080
tttttccaac ggaatttcga ttccagagta tgaggaattc tttctatcat ctattgctga    1140
taattccatt ggaaattctc aatacccttt attgacatct ttatttttca ctacaaagcg    1200
aatttttcca acggaatttc gattccagag tatgagcaat tgtttctatc atctattgct    1260
gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat ctttattttt cactacaaag    1320
cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga attctttcta tcatctattg    1380
ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac atctttattt ttcactacaa    1440
agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag gaattctttc tatcatctat    1500
tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg acatctttat ttttcactac    1560
aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg agcaattcgg atgataatgc    1620
gattagtttt ttagccttat ttctggggta attaatcagc gaagcgatga tttttgatct    1680
attaacagat atataaatgg aaaagctgca taaccacttt aactaatact ttcaacattt    1740
tcagtttgta ttacttctta ttcaaatgtc ataaaagtat caacaaaaaa ttgttaatat    1800
acctctatac tttaacgtca aggagaaaaa actata                              1836
<210> 89
<211> 981
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR8" <223> "pLYR8
<220>
<223> pLYR8
<220>
<223> pLYR8
<400> 89
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag     420
atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga     480
attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa     540
agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa     600
gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat     660
aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga     720
aacaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac     780
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat     840
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct     900
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat     960
tctattaccc ccatccatac a                                               981
<210> 90
<211> 981
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR9" <223> "pLYR9
<220>
<223> pLYR9
<220>
<223> pLYR9
<400> 90
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat     420
ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga     480
attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac     540
atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag     600
gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg     660
acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg     720
agcaattcta attaagttag tcaaggcgcc atcctcatga aaactgtgta acataataac     780
cgaagtgtcg aaaaggtggc accttgtcca attgaacacg ctcgatgaaa aaaataagat     840
atatataagg ttaagtaaag cgtctgttag aaaggaagtt tttccttttt cttgctctct     900
tgtcttttca tctactattt ccttcgtgta atacagggtc gtcagataca tagatacaat     960
tctattaccc ccatccatac a                                               981
<210> 91
<211> 1225
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR10" <223> "pLYR10
<220>
<223> pLYR10
<220>
<223> pLYR10
<400> 91
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgtttctatc atctattgct gataattcca ttggaaattc tcaataccct ttattgacat     420
ctttattttt cactacaaag cgaatttttc caacggaatt tcgattccag agtatgagga     480
attctttcta tcatctattg ctgataattc cattggaaat tctcaatacc ctttattgac     540
atctttattt ttcactacaa agcgaatttt tccaacggaa tttcgattcc agagtatgag     600
gaattctttc tatcatctat tgctgataat tccattggaa attctcaata ccctttattg     660
acatctttat ttttcactac aaagcgaatt tttccaacgg aatttcgatt ccagagtatg     720
aggaattctt tctatcatct attgctgata attccattgg aaattctcaa taccctttat     780
tgacatcttt atttttcact acaaagcgaa tttttccaac ggaatttcga ttccagagta     840
tgaggaattc tttctatcat ctattgctga taattccatt ggaaattctc aatacccttt     900
attgacatct ttatttttca ctacaaagcg aatttttcca acggaatttc gattccagag     960
tatgagcaat tctaattaag ttagtcaagg cgccatcctc atgaaaactg tgtaacataa    1020
taaccgaagt gtcgaaaagg tggcaccttg tccaattgaa cacgctcgat gaaaaaaata    1080
agatatatat aaggttaagt aaagcgtctg ttagaaagga agtttttcct ttttcttgct    1140
ctcttgtctt ttcatctact atttccttcg tgtaatacag ggtcgtcaga tacatagata    1200
caattctatt acccccatcc ataca                                          1225
<210> 92
<211> 1347
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> pLYR11" <223> "pLYR11
<220>
<223> pLYR11
<220>
<223> pLYR11
<400> 92
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgaat     360
tgctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg aaaaataaag     420
atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat gatagaaaga     480
attcctcata ctctggaatc gaaattccgt tggaaaaatt cgctttgtag tgaaaaataa     540
agatgtcaat aaagggtatt gagaatttcc aatggaatta tcagcaatag atgatagaaa     600
gaattcctca tactctggaa tcgaaattcc gttggaaaaa ttcgctttgt agtgaaaaat     660
aaagatgtca ataaagggta ttgagaattt ccaatggaat tatcagcaat agatgataga     720
aagaattcct catactctgg aatcgaaatt ccgttggaaa aattcgcttt gtagtgaaaa     780
ataaagatgt caataaaggg tattgagaat ttccaatgga attatcagca atagatgata     840
gaaagaattc ctcatactct ggaatcgaaa ttccgttgga aaaattcgct ttgtagtgaa     900
aaataaagat gtcaataaag ggtattgaga atttccaatg gaattatcag caatagatga     960
tagaaagaat tcctcatact ctggaatcga aattccgttg gaaaaattcg ctttgtagtg    1020
aaaaataaag atgtcaataa agggtattga gaatttccaa tggaattatc agcaatagat    1080
gatagaaaca attctaatta agttagtcaa ggcgccatcc tcatgaaaac tgtgtaacat    1140
aataaccgaa gtgtcgaaaa ggtggcacct tgtccaattg aacacgctcg atgaaaaaaa    1200
taagatatat ataaggttaa gtaaagcgtc tgttagaaag gaagtttttc ctttttcttg    1260
ctctcttgtc ttttcatcta ctatttcctt cgtgtaatac agggtcgtca gatacataga    1320
tacaattcta ttacccccat ccataca                                        1347
<210> 93
<211> 686
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMET17" <223> "pMET17
<220>
<223> pMET17
<220>
<223> pMET17
<400> 93
ttacattatc aatccttgcg tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt      60
tgcgtcatct tctaacaccg tatatgataa tatactagta acgtaaatac tagttagtag     120
atgatagttg atttttattc caacactaag aaataatttc gccatttctt gaatgtattt     180
aaagatattt aatgctataa tagacattta aatccaattc ttccaacata caatgggagt     240
ttggccgagt ggtttaaggc gtcagattta ggtggattta acctctaaaa tctctgatat     300
cttcggatgc aagggttcga atcccttagc tctcattatt ttttgctttt tctcttgagg     360
tcacatgatc gcaaaatggc aaatggcacg tgaagctgtc gatattgggg aactgtggtg     420
gttggcaaat gactaattaa gttagtcaag gcgccatcct catgaaaact gtgtaacata     480
ataaccgaag tgtcgaaaag gtggcacctt gtccaattga acacgctcga tgaaaaaaat     540
aagatatata taaggttaag taaagcgtct gttagaaagg aagtttttcc tttttcttgc     600
tctcttgtct tttcatctac tatttccttc gtgtaataca gggtcgtcag atacatagat     660
acaattctat tacccccatc cataca                                          686
<210> 94
<211> 510
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMET6" <223> "pMET6
<220>
<223> pMET6
<220>
<223> pMET6
<400> 94
ccacaggaaa tatttcacgt gacttacaaa cagagtcgta cgtcaggacc ggagtcaggt      60
gaaaaaatgt gggccggtaa agggaaaaaa ccagaaacgg gactactatc gaactcgttt     120
agtcgcgaac gtgcaaaagg ccaatatttt tcgctagagt catcgcagtc atggcagctc     180
tttcgctcta tctcccggtc gcaaaactgt ggtagtcata gctcgttctg ctcaattgag     240
aactgtgaat gtgaatatgg aacaaatgcg atagatgcac taatttaagg gaagctagct     300
agttttccca actgcgaaag aaaaaaagga aagaaaaaaa aattctatat aagtgataga     360
tatttccatc tttactagca ttagtttctc ttttacgtat tcaatatttt tgttaaactc     420
ttcctttatc ataaaaaagc aagcatctaa gagcattgac aacactctaa gaaacaaaat     480
accaatataa tttcaaagta catatcaaaa                                      510
<210> 95
<211> 508
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMET14" <223> "pMET14
<220>
<223> pMET14
<220>
<223> pMET14
<400> 95
cctatgcatg tttagagcaa gcgcctttgt gagccctccc ggttacgacg ccttggcaat      60
gtagcagata actctgcact tctagaatca ttccactacg acatttggct catcaccagc     120
tcgcgagaaa tgtaaataag ccaacaacca agaatgcgta acattaaaga atacagttgc     180
tttcatttcg gcgtgatggt acggcaccca cggttcctta cattattctc gaaaaatagc     240
tgcacgcttt tccaggaata aaagaccgtg ccactaattt cacgtgatca atatatttac     300
aagccacctc aaaaaatgtg gcaatggaga agaggatgaa cgactcaata tgacttcaac     360
ttcatgaatt tgtcaaaata tctatataag atgcaaaatt tctatacaac atcagttgcg     420
tatccgttaa tgtcgttcat tttctctctt tgttcgaact tgacatcaag aaaagttgga     480
attatttctc caagcacact gtacacca                                        508
<210> 96
<211> 552
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMET3" <223> "pMET3
<220>
<223> pMET3
<220>
<223> pMET3
<400> 96
aacgatatgt acgtagtggt ataaggtgag ggggtccaca gatataacat cgtttaattt      60
agtactaaca gagacttttg tcacaactac atataagtgt acaaatatag tacagatatg     120
acacacttgt agcgccaacg cgcatcctac ggattgctga cagaaaaaaa ggtcacgtga     180
ccagaaaagt cacgtgtaat tttgtaactc accgcattct agcggtccct gtcgtgcaca     240
ctgcactcaa caccataaac cttagcaacc tccaaaggaa atcaccgtat aacaaagcca     300
cagttttaca acttagtctc ttatgaagtt acttaccaat gagaaataga ggctctttct     360
cgacaaatat gaatatggat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatgt     420
aaacttggtt cttttttagc ttgtgatctc tagcttgggt ctctctctgt cgtaacagtt     480
gtgatatcgt ttcttaacaa ttgaaaagga actaagaaag tataataata acaagaataa     540
agtataatta ac                                                         552
<210> 97
<211> 363
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pSAM1" <223> "pSAM1
<220>
<223> pSAM1
<220>
<223> pSAM1
<400> 97
gaaacggacg taagacggaa atagaatttg aagataaagt tatatatcac tacacacgaa      60
tactttcttt tttttttttc acaggaaaac tgtggtggcg cccttgccta ctagtgcatt     120
tcttttttcg ggttcttgtc tcgacgaaat tttagcctca tcgtagtttt tcactctggt     180
atcgatgaaa aagggaagag taaaaagttt tccgtttagt acttaatggg attggtttgg     240
gacgtatata tcgactggtg ttgtctgtta ttcatcgttg tttttcggtt agcttcgaaa     300
aaaaaataga gtaaaaacca ggaatttacc ctaaaaacaa gaaaaaataa gataaacgaa     360
aat                                                                   363
<210> 98
<211> 500
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pSAM2" <223> "pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<220>
<223> pSAM2
<400> 98
gagctttgct ctattatata agataaaata tgcactaaaa gtttgcattt ctttacataa      60
ctaaaactaa gacattatgc atagcttacc tgatcaaaaa gtatgtaaac ttgttaacat     120
cttcacatgt gattcatctg gtcgtacttt cttgcggtgc agtgtaatat ttctacccac     180
gtgactataa ttgagcttga aaactgtggc gtttttccac cgatgggtcc acgccagata     240
ttaaccgaag ccaaaatacc gatgaaattt ctgagatagc tcttgtaaac gacgtcaaat     300
cttcatatgc aaggagatct tgatttcttt ttggtagtca tctgtcgtct tgaggcgtat     360
aagaaggagg ttatatctgt cctttctaca aagtattttc gagaatcttg cttctgcccc     420
ttttttcttt ttttaaaagg tttaaaaaac ataactgtct tcaatatatc cagtatttac     480
gacaatatac aaacataatc                                                 500
<210> 99
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tTDH2" <223> "tTHD2
<220>
<223> tTDH2
<220>
<223> tTHD2
<400> 99
atttaactcc ttaagttact ttaatgattt agtttttatt attaataatt catgctcatg     60
acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca    120
gggattcgat ttttttggaa gtttttgttt ttttttcctt gagatgctgt agtatttggg    180
aacaattata caatcgaaag atatatgctt acattcgacc gttttagccg tgatcattat    240
cctatagtaa cataacctga agcataactg acactactat catcaatact tgtcacatga    300
<210> 100
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tCYC1" <223> "tCYC1
<220>
<223> tCYC1
<220>
<223> tCYC1
<400> 100
acaggcccct tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc     60
cctcctccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc    120
cctatttatt ttttttaata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt    180
ttcttttttt tctgtacaaa cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg    240
agaaggtttt gggacgctcg aaggctttaa tttgcaagct tcgcagttta cactctcatc    300
<210> 101
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tTDH3" <223> "tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<220>
<223> tTDH3
<400> 101
gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag     60
tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt    120
tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag    180
atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat    240
aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat    300
<210> 102
<211> 354
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tADH1" <223> "tADH1
<220>
<223> tADH1
<220>
<223> tADH1
<400> 102
actagttcta gagcggccgc caccgcggtg ggcgaatttc ttatgattta tgatttttat      60
tattaaataa gttataaaaa aaataagtgt atacaaattt taaagtgact cttaggtttt     120
aaaacgaaaa ttcttattct tgagtaactc tttcctgtag gtcaggttgc tttctcaggt     180
atagcatgag gtcgctctta ttgaccacac ctctaccggc atgccgagca aatgcctgca     240
aatcgctccc catttcaccc aattgtagat atgctaactc cagcaatgag ttgatgaatc     300
tcggtgtgta ttttatgtcc tcagaggaca acacctgttg taatcgttct tcca           354
<210> 103
<211> 301
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tADH2" <223> "tADH2
<220>
<223> tADH2
<220>
<223> tADH2
<400> 103
gcggatctct tatgtcttta cgatttatag ttttcattat caagtatgcc tatattagta     60
tatagcatct ttagatgaca gtgttcgaag tttcacgaat aaaagataat attctacttt    120
ttgctcccac cgcgtttgct agcacgagtg aacaccatcc ctcgcctgtg agttgtaccc    180
attcctctaa actgtagaca tggtagcttc agcagtgttc gttatgtacg gcatcctcca    240
acaaacagtc ggttatagtt tgtcctgctc ctctgaatcg tctccctcga tatttctcat    300
t                                                                    301
<210> 104
<211> 299
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tTPI1" <223> "tTPI1
<220>
<223> tTPI1
<220>
<223> tTPI1
<400> 104
gattaatata attatataaa aatattatct tcttttcttt atatctagtg ttatgtaaaa     60
taaattgatg actacggaaa gcttttttat attgtttctt tttcattctg agccacttaa    120
atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg    180
cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa    240
gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc     299
<210> 105
<211> 299
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tMET17" <223> "tMET17
<220>
<223> tMET17
<220>
<223> tMET17
<400> 105
gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact     60
tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac    120
tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa    180
gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag    240
ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt     299
<210> 106
<211> 305
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tENO2" <223> "tENO2
<220>
<223> tENO2
<220>
<223> tENO2
<400> 106
ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata     60
gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata    120
cagttttata agttactttt tcaaagactc gtgctgtcta ttgcataatg cactggaagg    180
ggaaaaaaaa ggtgcacacg cgtggctttt tcttgaattt gcagtttgaa aaataactac    240
atggatgata agaaaacatg gagtacagtc actttgagaa ccttcaatca gctggtaacg    300
tcttc                                                                305
<210> 107
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tMET3" <223> "tMET3
<220>
<223> tMET3
<220>
<223> tMET3
<400> 107
tcgtcataaa atgctcccat ctcaaaagta gggcaaaatt catgatcgac cgcgcaaaat     60
aaatagattt gcaaataagt tttgtatgta catttattaa tatatataat atatcaaaag    120
aaaaaaatca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgcactctt attcagtcat caattacaaa    180
acctagagat agcgatggtg catattcaat aaaaaactcc ttatactgtc gagaaagctt    240
attattggta cttctcgaag atactaaaaa aggttaattt ttggagacgg aggcaatagc    300
<210> 108
<211> 301
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tPGK1" <223> "tPGK1
<220>
<223> tPGK1
<220>
<223> tPGK1
<400> 108
attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac     60
gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga    120
ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt    180
taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat    240
tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc tttcgagaag gatattattt    300
a                                                                    301
<210> 109
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tDIT1" <223> "tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<220>
<223> tDIT1
<400> 109
taaagtaaga gcgctacatt ggtctacctt tttgttcttt tacttaaaca ttagttagtt     60
cgttttcttt ttctcatttt tttatgtttc ccccccaaag ttctgatttt ataatatttt    120
atttcacaca attccattta acagaggggg aatagattct ttagcttaga aaattagtga    180
tcaatatata tttgcctttc ttttcatctt ttcagtgata ttaatggttt cgagacactg    240
caatggccct agttgtctaa gaggatagat gttactgtca aagatgatat tttgaatttc    300
<210> 110
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tRPL3" <223> "tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<220>
<223> tRPL3
<400> 110
gaagttttgt tagaaaataa atcatttttt aattgagcat tcttattcct attttattta     60
aatagtttta tgtattgtta gctacataca acagtttaaa tcaaattttc tttttcccaa    120
gtccaaaatg gaggtttatt ttgatgaccc gcatgcgatt atgttttgaa agtataagac    180
tacatacatg tacatatatt taaacatgta aacccgtcca ttatattgct tactttcttc    240
ttttttgccg ttttgacttg gacctctggt ttgctatttc cttacaatct ttgctacaat    300
<210> 111
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tRPL41B" <223> "tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<220>
<223> tRPL41B
<400> 111
gcggattgag agcaaatcgt taagttcagg tcaagtaaaa attgatttcg aaaactaatt     60
tctcttatac aatcctttga ttggaccgtc atcctttcga atataagatt ttgttaagaa    120
tattttagac agagatctac tttatattta atatctagat attacataat ttcctctcta    180
ataaaatatc attaataaaa taaaaatgaa gcgatttgat tttgtgttgt caacttagtt    240
tgccgctatg cctcttgggt aatgctatta ttgaatcgaa gggctttatt atattaccct    300
<210> 112
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tRPL15A" <223> "tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<220>
<223> tRPL15A
<400> 112
gctggttgat ggaaaatata attttattgg gcaaactttt gtttatctga tgtgttttat     60
actattatct ttttaattaa tgattctata tacaaacctg tatatttttt ctttaaccaa    120
tttttttttt tatagaccta gagctgtact tttattctgc tatcaagcaa acccctaccc    180
cctcttctca atcctcccct caggcagaac ttatctacct gtatcaagga gcggacgagg    240
gagtcctaat tgttctacgt ataccaatgc tagcagctta cataggtggt ggcactacca    300
<210> 113
<211> 300
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> tIDP1" <223> "tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<220>
<223> tIDP1
<400> 113
tcgaatttac gtagcccaat ctaccacttt tttttttcat tttttaaagt gttatactta     60
gttatgctct aggataatga actacttttt tttttttttt tttactgtta tcataaatat    120
atatacctta ttgttgtttg caaccgtcgg ttaattcctt atcaaggttc cccaagttcg    180
gatcattacc atcaatttcc aacattttca tgagttcttc ttcttcatta ccgtgtttta    240
gggggctgtt cgcacttcta atagggctat caccaagctg ttctaattcg tccaaaagtt    300
<210> 114
<211> 1089
<212> ДНК
<213> Kluveromyces lactis
<220>
<223> Leu2" <223> "Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 114
atgtctaaga atatcgttgt cctaccgggt gatcacgtcg gtaaagaagt tactgacgaa      60
gctattaagg tcttgaatgc cattgctgaa gtccgtccag aaattaagtt caatttccaa     120
catcacttga tcgggggtgc tgccatcgat gccactggca ctcctttacc agatgaagct     180
ctagaagcct ctaagaaagc cgatgctgtc ttactaggtg ctgttggtgg tccaaaatgg     240
ggtacgggcg cagttagacc agaacaaggt ctattgaaga tcagaaagga attgggtcta     300
tacgccaact tgagaccatg taactttgct tctgattctt tactagatct ttctcctttg     360
aagcctgaat atgcaaaggg taccgatttc gtcgtcgtta gagaattggt tggtggtatc     420
tactttggtg aaagaaaaga agatgaaggt gacggagttg cttgggactc tgagaaatac     480
agtgttcctg aagttcaaag aattacaaga atggctgctt tcttggcatt gcaacaaaac     540
ccaccattac caatctggtc tcttgacaag gctaacgtgc ttgcctcttc cagattgtgg     600
agaaagactg ttgaagaaac catcaagact gagttcccac aattaactgt tcagcaccaa     660
ttgatcgact ctgctgctat gattttggtt aaatcaccaa ctaagctaaa cggtgttgtt     720
attaccaaca acatgtttgg tgatattatc tccgatgaag cctctgttat tccaggttct     780
ttgggtttat taccttctgc atctctagct tccctacctg acactaacaa ggcattcggt     840
ttgtacgaac catgtcatgg ttctgcccca gatttaccag caaacaaggt taacccaatt     900
gctaccatct tatctgcagc tatgatgttg aagttatcct tggatttggt tgaagaaggt     960
agggctcttg aagaagctgt tagaaatgtc ttggatgcag gtgtcagaac cggtgacctt    1020
ggtggttcta actctaccac tgaggttggc gatgctatcg ccaaggctgt caaggaaatc    1080
ttggcttaa                                                            1089
<210> 115
<211> 362
<212> ПРТ
<213> Kluveromyces lactis
<220>
<223> Leu2 " <223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<220>
<223> Leu2
<400> 115
Met Ser Lys Asn Ile Val Val Leu Pro Gly Asp His Val Gly Lys Glu
1               5                   10                  15
Val Thr Asp Glu Ala Ile Lys Val Leu Asn Ala Ile Ala Glu Val Arg
20                  25                  30
Pro Glu Ile Lys Phe Asn Phe Gln His His Leu Ile Gly Gly Ala Ala
35                  40                  45
Ile Asp Ala Thr Gly Thr Pro Leu Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ala Ser
50                  55                  60
Lys Lys Ala Asp Ala Val Leu Leu Gly Ala Val Gly Gly Pro Lys Trp
65                  70                  75                  80
Gly Thr Gly Ala Val Arg Pro Glu Gln Gly Leu Leu Lys Ile Arg Lys
85                  90                  95
Glu Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Leu Arg Pro Cys Asn Phe Ala Ser Asp
100                 105                 110
Ser Leu Leu Asp Leu Ser Pro Leu Lys Pro Glu Tyr Ala Lys Gly Thr
115                 120                 125
Asp Phe Val Val Val Arg Glu Leu Val Gly Gly Ile Tyr Phe Gly Glu
130                 135                 140
Arg Lys Glu Asp Glu Gly Asp Gly Val Ala Trp Asp Ser Glu Lys Tyr
145                 150                 155                 160
Ser Val Pro Glu Val Gln Arg Ile Thr Arg Met Ala Ala Phe Leu Ala
165                 170                 175
Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn
180                 185                 190
Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile
195                 200                 205
Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser
210                 215                 220
Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val
245                 250                 255
Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu
260                 265                 270
Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser
275                 280                 285
Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu
290                 295                 300
Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly
305                 310                 315                 320
Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg
325                 330                 335
Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala
340                 345                 350
Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala
355                 360
<210> 116
<211> 499
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pNUP57
<220>
<223> pNUP57
<400> 116
tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt      60
gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc     120
cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata     180
agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa     240
atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat     300
tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc     360
aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa     420
atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc     480
ttgttgacca attgatcac                                                  499
<210> 117
<211> 451
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pGAP1
<220>
<223> pGAP1
<400> 117
cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac      60
ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc     120
ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat     180
ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac ttaattttga     240
tatataaagg gtggatcttt ttcattttga atcagaattg gaattgcaac ttgtctcttg     300
tcactattac ttaatagtaa ttatatttct tattaacctt ttttttaagt caaaacacca     360
aggacaagaa ctactcttca aaggtatttc aagttatcat acgtctcaca cacgcttcac     420
agtttcaagt aaaaaaaaag aatattacac a                                    451
<210> 118
<211> 998
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pJEN1
<220>
<223> pJEN1
<400> 118
aatgtgttta taaattattt tttttgctgg tagcaaaatc aactcattgt cttccattca      60
gagtctaatc gaacgttatc gcaatgcttg cacactttta aacaatacga tttagtttaa     120
gtggatggac ccccacgctt agtgttccac aggtttgtcc ccactgtttt tacattccac     180
tgtacatttt tgcaatagaa ggtcattgta tgctaccttg ggcggctaag aatacctgta     240
aaaatttgga gaaattagat tcgtaaagaa tgactcgcaa cgactccaat gatttcttct     300
tttcaccctt tgaacggccg atatccgcgc gggatcctga ccccgcaatt tactccacta     360
gaccggcgtg tttctctttt tccttttcct ggggttagag cccaagagct aatagccgac     420
aaacggactc caaaaaaaaa aggaggcaca ggacaaacgc agcacctgcg tcattcacgc     480
tgaagcggca gcaagcattt tcgatcagct ccaattaaat gaagactatt cgccgtaccg     540
ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact     600
atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta     660
agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct     720
tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta     780
ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag     840
caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt     900
tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa     960
gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat                             998
<210> 119
<211> 450
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pICL1
<220>
<223> pICL1
<400> 119
ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat      60
ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg     120
aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa     180
atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa     240
gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct     300
ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa     360
tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct     420
tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa                                      450
<210> 120
<211> 598
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pADH2
<220>
<223> pADH2
<400> 120
tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc      60
gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg     120
atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc     180
taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg     240
acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac     300
accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa     360
aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct     420
atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata     480
ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat     540
atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca       598
<210> 121
<211> 793
<212> ДНК
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<223> pMLS1
<220>
<223> pMLS1
<400> 121
tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt      60
gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata     120
tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt     180
agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa     240
cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg     300
gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc     360
gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg     420
ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt     480
atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt     540
tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat     600
tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta     660
aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc     720
tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa     780
aagaattaag aaa                                                        793
<---