ПОЛИПЕПТИДЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ВВЕДЕНИЯ
LONG-ACTING POLYPEPTIDES AND METHODS OF THEIR PREPARATION AND ADMINISTRATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] В настоящем изобретении предложены CTP-модифицированные полипептиды гормона роста человека, фармацевтические составы и фармацевтические композиции, содержащие указанные полипептиды, а также способы их получения и применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] Полипептиды чувствительны к денатурации или ферментативному расщеплению в крови, печени или почках. Соответственно, полипептиды, как правило, имеют короткий период полувыведения, составляющий несколько часов. Вследствие своей низкой стабильности пептидные лекарственные препараты обычно доставляют с постоянной частотой, чтобы поддержать эффективную концентрацию активного пептида в плазме крови. Помимо этого, поскольку пептидные лекарственные препараты обычно вводят путем инфузии, частые инъекции пептидных лекарственных препаратов вызывают значительный дискомфорт у субъекта.
[003] Неблагоприятные параметры фармакокинетики, например, короткий период полувыведения из сыворотки крови, могут препятствовать фармацевтической разработке многих препаратов-кандидатов, перспективных в отношении других показателей. Период полувыведения из сыворотки крови является эмпирической характеристикой молекулы и должен быть определен экспериментально для каждого нового потенциального лекарственного препарата. Например, в случае полипептидных препаратов с более низкой молекулярной массой физиологические механизмы клиренса, такие как почечная фильтрация, могут сделать поддержание терапевтических уровней препарата невозможным, вследствие стоимости или частоты применения требуемой схемы дозирования. Напротив, длительный период полувыведения из сыворотки крови является нежелательным, если лекарственный препарат или его метаболиты оказывают токсическое побочное действие.
[004] Следовательно, существует потребность в технологиях, которые позволят удлинить период полувыведения терапевтических полипептидов, сохраняя при этом их высокую фармакологическую эффективность. Указанные желаемые пептидные лекарственные препараты также должны соответствовать требованиям, касающимся повышенной стабильности в сыворотке крови, высокой активности и низкой вероятности индукции нежелательного иммунного ответа при их введении субъекту. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этой потребности путем обеспечения CTP-модифицированных пептидов, имеющих длительный период полувыведения при сохранении высокой фармакологической эффективности и при этом обладающих повышенной стабильностью в сыворотке крови, высокой активностью и низкой вероятностью индукции нежелательных иммунных ответов у субъекта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[005] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический состав, содержащей буфер, агент, регулирующий тоничность, и CTP-модифицированный полипептид, состоящий из гормона роста и одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, а также двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой гормон роста человека (СТГ человека). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент, регулирующий тоничность, представляет собой хлорид натрия. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения агент, регулирующий тоничность, представляет собой хлорид натрия в концентрации 147 мМ. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения состав представляет собой жидкий состав. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения показатель рН указанного состава равен приблизительно 6,2-6,4.
[006] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен состав для введения один раз в неделю субъекту, имеющему дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта, имеющего дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок, имеющий дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ получения фармацевтического состава для введения один раз в неделю субъекту, имеющему дефицит гормона роста, причем указанный способ включает следующие этапы:
a). модифицирование гормона роста путем присоединения одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, а также двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста;
b). смешивание указанного модифицированного гормона роста, полученного в соответствии с этапом (a), с указанным буфером и указанным агентом, регулирующим тоничность, при показателе рН равном 6,2-6,4; и
c). предварительное заполнение шприца указанным составом.
[007] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для введения один раз в неделю субъекту, имеющему дефицит гормона роста, содержащая CTP-модифицированный полипептид, причем указанный CTP-модифицированный полипептид состоит из гормона роста и одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, а также двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой гормон роста человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта, имеющего дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок, имеющий дефицит гормона роста.
[008] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложена лекарственная форма для введения один раз в неделю, содержащая фармацевтический состав согласно настоящему изобретению или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению.
[009] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ заполнения шприца составом, предложенным в настоящем изобретении, включающий этапы:
a). изготовления лекарственной формы указанного CTP-модифицированного СТГ человека для введения один раз в неделю, содержащей заранее определенное количество CTP-модифицированного СТГ человека; и
b). заполнения шприца указанным составом.
[0010] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже подробного описания, примеров и чертежей. Следует понимать, однако, что подробное описание и конкретные примеры, описывающие предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации, которые находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, будут очевидны для специалистов в данной области техники на основании подробного описания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0011] Следующие чертежи являются частью настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения, принципы которого будут более понятны со ссылкой на один или более из указанных чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов, предложенных в настоящем изобретении. Патент или файл заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикации заявки на патент, содержащей цветной чертеж(ы), будут предоставлены Патентным управлением по запросу и после уплаты требуемой пошлины.
[0012] На фиг. 1 представлены результаты исследования методом вестерн-блоттинг, которые характеризуют молекулярную массу и идентичность MOD-4020 (SEQ ID NO: 36), MOD-4021 (SEQ ID NO: 37), MOD-4022 (SEQ ID NO: 38), MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) и MOD-4024 (SEQ ID NO: 40). Гель после электрофореза в ДСН-ПААГ подвергали блоттингу и окрашивали с использованием моноклональных антител к СТГ человека. Фотография свидетельствует о том, что аналогично коммерческому препарату СТГ человека и СТГ человека дикого типа варианты MOD-7020-4 распознаются антителами к СТГ человека.
[0013] На фиг. 2 представлена гистограмма, свидетельствующая об увеличении веса крыс с удаленным гипофизом после введения полипептидов СТГ-CTP согласно настоящему изобретению.
[0014] На фиг. 3 представлены две схемы: (1) карта плазмиды pCI-dhfr CTP-СТГ человека-CTP-CTP и (2) структурная формула белка CTP-СТГ человека-CTP-CTP.
[0015] На фиг. 4 приведены графики, на которых представлены средние концентрации CTP человека-СТГ-CTP-CTP или СТГ в плазме крови (пг/мл) после внутривенного (в/в) или подкожного (п/к) введения однократной дозы CTP-СТГ человека-CTP-CTP или СТГ у крыс (n=3-6 на одну дозу/путь введения).
[0016] На фиг. 5 приведены графики, на которых представлено среднее приростное увеличение веса после п/к введения однократных доз CTP-СТГ человека-CTP-CTP (0,4, 0,8 и 4 мг/кг) у крыс с удаленным гипофизом по сравнению с таковым после ежедневных инъекций СТГ (0,1 мг/кг/сутки) (n=10 для одной дозы).
[0017] На фиг. 6 представлен график, свидетельствующий о том, что значения площади под кривой «концентрация-время» после однократной инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP коррелируют с увеличением веса тела у крыс.
[0018] На фиг. 7 представлен график, на котором приведены значения приростного увеличения веса после п/к введения доз CTP-СТГ человека-CTP-CTP (0,4, 0,8 и 4 мг/кг) с интервалом в 4 дня у крыс с удаленным гипофизом по сравнению с аналогичным показателем после ежедневных инъекций СТГ (0,1 мг/кг/сутки) (n=10 для одной дозы).
[0019] На фиг. 8 представлен график, на котором приведены концентрации СТГ человека в сыворотке крови крыс с удаленным гипофизом после п/к инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP и коммерческого СТГ человека. Однократную дозу CTP-СТГ человека-CTP-CTP 0,6 или 1,8 мг/кг и биотропина 0,35 или 1,05 мг/кг вводили путем подкожной инъекции крысам с удаленным гипофизом для определения профиля фармакокинетики/фармакодинамики (ФК/ФД). Концентрации СТГ человека в сыворотке крови после инъекции измеряли с помощью специфичных наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
[0020] На фиг. 9 представлен график, на котором приведены уровни ИФР-1 в сыворотке крови крыс с удаленным гипофизом после п/к инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP и коммерческого СТГ человека. Однократную дозу CTP-СТГ человека-CTP-CTP 0,6 или 1,8 мг/кг и биотропина 0,35 или 1,05 мг/кг вводили путем подкожной инъекции крысам с удаленным гипофизом, чтобы определить профиль ФК/ФД. Концентрации ИФР-1 в сыворотке крови после инъекции измеряли с помощью специфичных наборов для ИФА (Roche Diagnostics).
[0021] На фиг. 10 представлена схема дизайна клинического исследования фазы II.
[0022] На фиг. 11 представлен индекс стандартного отклонения (SDS) для уровней ИФР-1 после 4-й еженедельной дозы - все когорты.
[0023] На фиг. 12 представлено среднее изменение относительно начального уровня концентрации ИФР-1 в плазме крови после подкожного введения MOD-4023 взрослым пациентам, имеющим дефицит гормона роста (стадия I, после 4-й инъекции).
[0024] На фиг. 13 представлены средние уровни ИФР-1 (определенные на 4 сутки после введения дозы) в течение 4-месячного дополнительного клинического исследования (52 пациента).
[0025] На фиг. 14 представлена схема клинического исследования фазы II MOD-4023.
[0026] На фиг. 15 представлен график, на котором приведены: (А) средний профиль ФК MOD-4023, вводимого еженедельно, и (В); средний профиль ФК СТГ человека, вводимого ежедневно.
[0027] На фиг. 16 представлен график, на котором приведен средний профиль SDS для уровней ИФР-1 в течение 6-месячной педиатрической фазы II клинического исследования MOD-4023.
[0028] На фиг. 17 представлен график, на котором приведен профиль ИФР-1-СБ-3 в течение 2-й недели при каждой конечной дозе для педиатрической фазы II клинического исследования MOD-4023.
[0029] На фиг. 18 представлен график, на котором приведен средний профиль ИФР-1-СБ-3 для 6-месячной педиатрической фазы II клинического исследования MOD-4023.
[0030] На фиг. 19 представлен график, на котором приведены результаты оценки среднегодовой скорости роста для всех пациентов, завершивших 6-месячный период лечения в педиатрической фазе II клинического исследования MOD-4023 продолжительностью 6 месяцев, направленной на оценку скорости роста.
[0031] На фиг. 20 представлен график, на котором приведены: (А) результаты определения SDS скорости роста в педиатрической фазе II предварительного клинического исследования MOD-4023, направленного на оценку скорости роста, и (В) результаты определения SDS скорости роста в течение 6 месяцев.
[0032] На фиг. 21 представлен график, на котором приведен профиль ФД (SDS ИФР-1) при каждой конечной дозе для педиатрической фазы II клинического исследования MOD-4023.
[0033] На фиг. 22 представлен график, на котором приведены величины SDS для относительного изменения скорости роста (ΔСР).
[0034] На фиг. 23 представлен график, на котором показано изменение концентрации ИФР-1, по сравнению с начальным уровнем, при конечной дозе в педиатрической фазе II клинического исследования MOD-4023.
[0035] На фиг. 24 представлена таблица, в которой приведены характеристики партий, произведенных не в рамках требований НПП и в рамках требований НПП, которые получены в 10 мМ цитрата, 147 мМ NaCl при рН=6.
[0036] На фиг. 25А представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 2 MOD-4023 с помощью ОФ-ВЭЖХ при -20°C.
[0037] На фиг. 25B представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 2 MOD-4023 с помощью ОФ-ВЭЖХ при 5°C.
[0038] На фиг. 26 представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 2 MOD-4023 с помощью ОФ-ВЭЖХ при 25°C.
[0039] На фиг. 27А представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 28 (Xcellerex) при -20°C (ОФ-ВЭЖХ).
[0040] На фиг. 27B представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 28 (Xcellerex) при 5°C (ОФ-ВЭЖХ).
[0041] На фиг. 28А представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности клона 28 (Xcellerex) при 25°C (ОФ-ВЭЖХ).
[0042] На фиг. 28B представлен график, на котором приведены результаты сравнения профилей стабильности клонов 2 и 28 при 5°C (ОФ-ВЭЖХ).
[0043] На фиг. 29 представлена таблица, показывающая перенос производства MOD-4023 из Xcellerex (XC) в Rentschler (RB).
[0044] На фиг. 30A представлен график, на котором приведены различия оценок стабильности, полученных с помощью ОФ-ВЭЖХ, между На Rentschler (RB) и Xcellerex (XCLX) - основной пик.
[0045] фиг. 30B представлена таблица, в которой приведены результаты оценки стабильности основного пика GMP1 (RB).
[0046] На фиг. 30C представлена таблица, в которой приведены результаты оценки стабильности основного пика XCLX (испытано в RB).
[0047] На фиг. 31A представлен график, на котором приведены различия оценок стабильности, полученных с помощью ОФ-ВЭЖХ, между Rentschler (RB) и Xcellerex (XCLX) - пик 3.
[0048] На фиг. 31B представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости пика 3 GMP1 (RB).
[0049] На фиг. 31C представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости пика 3 XCLX (испытано в RB).
[0050] На фиг. 32A представлен график, на котором приведены различия оценок стабильности, полученных с помощью ОФ-ВЭЖХ, между Rentschler (RB) и Xcellerex (XCLX) - пик 5.
[0051] На фиг. 32B представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости пика 5 GMP1 (RB).
[0052] На фиг. 32C представлена таблица, в которой приведены результаты оценки устойчивости пика 5 XCLX (испытано в RB).
[0053] На фиг. 33А представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности с помощью ОФ-ВЭЖХ после 3-х месяцев хранения при температуре 25°C, партия GMP Xcellerex. Пик 7 не наблюдался в материале XC.
[0054] На фиг. 33В представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности с помощью ОФ-ВЭЖХ. Партия GMP-1 в Rentschler. Пик 7, который не наблюдался в материале ХС, появился через 2 недели хранения при 25°C.
[0055] На фиг. 34 представлен график, на котором приведены результаты оценки стабильности GMP-1 с помощью ОФ-ВЭЖХ после 3-х месяцев хранения при температуре 25°C. Стрелка указывает на новый пик (7), который не наблюдался в материале XC.
[0056] На фиг. 35А представлен профиль ИЭФ партий MOD-4023. В диапазоне значений ИЭТ от 3,5 до 4,2 наблюдали сходный характер полос. В одной партии XCLX на границе высокой ИЭТ присутствуют изоформы с менее слабой интенсивностью полос. В партии RB на границе низкой ИЭТ присутствуют изоформы с более слабой интенсивностью полос.
[0057] На фиг. 35В приведены результаты оценки стабильности (ИЭФ) из RB и XCLX (3 месяца при 25°C). В образце XCLX присутствуют более диффузные полосы.
[0058] На фиг. 36A-D приведены результаты оценки влияния высоких температур на % пиков (клон 2) (фиг. 36А - основной пик; фиг. 36D). Образование обоих пиков (3 и 5) зависит от температуры и ускоряется при высокой температуре. (фиг. 36В и фиг. 36С)
[0059] На фиг. 37A-D приведены результаты оценки влияния рН на % пиков (клон 2) (фиг. 37A - основной пик; фиг. 37D). Пик 3: отсутствуют изменения % пика после инкубации в течение 5 дней при рН=4 и в течение не более 2 часов при рН=12 (фиг. 37В). Пик 5: отсутствуют изменения % пика после инкубации в течение не более 6 часов при рН=4. Однако после 6 часов наблюдали резкое увеличение % пика. При инкубации в течение не более 2 часов при рН=12 пик исчезает (фиг. 37C).
[0060] На фиг. 38 приведены результаты исследований с принудительной деградацией в Rentschler (клон 28). Наложение увеличенных областей нативного (выше) и подвергнутого стрессу (ниже) действующего вещества MOD-4023. Подвергнутый стрессу образец действующего вещества MOD-4023 (CTP-СТГ человека-CTP-CTP) получали (65°C в течение приблизительно трех дней) для исследования родственной формы 5 в действующем веществе MOD-4023, поскольку пик ниже предела количественного определения для образца, не подвергнутого стрессу.
[0061] На фиг. 39 приведены результаты оценки влияния рН на родственные формы, которое оценивали с помощью ОФ-ВЭЖХ. Испытываемые образцы: RB - 40 мг/мл, рН=5,9; RB - 10 мг/мл, рН=6,2; XCLX - 40 мг/мл, рН=6,2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0062] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно публикации заявки на патент США №US-2014-0113860-A1, поданной 21 октября 2013, и заявке на патент США №14/309496, поданной 19 июня 2014 г. Указанные заявки на патент полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[0063] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический состав, содержащий буфер, агент, регулирующий тоничность, и CTP-модифицированный полипептид, состоящий из гормона роста и одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, а также двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста.
[0064] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен состав для введения один раз в неделю субъекту, имеющему дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта, имеющего дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъектом является ребенок, имеющий дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ получения фармацевтического состава для введения один раз в неделю субъекту, имеющему дефицит гормона роста, причем указанный способ включает следующие этапы:
a). модифицирование гормона роста путем присоединения одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста;
b). смешивание указанного модифицированного гормона роста, полученного в соответствии с этапом (a), с указанным буфером и указанным агентом, регулирующим тоничность, при рН=6,2-6,4; и
c). предварительное заполнение шприца указанным составом.
[0065] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ заполнения шприца составом, предложенным в настоящем изобретении, включающий этапы:
a). изготовления лекарственной формы указанного CTP-модифицированного гормона роста человека (СТГ человека) для введения один раз в неделю, содержащей заранее определенное количество CTP-модифицированного СТГ человека; и
b). заполнения шприца указанным составом.
[0066] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении описаны полипептиды длительного действия, а также способы их получения и применения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды длительного действия содержат карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP выступает в качестве агента, защищающего белки или пептиды, полученные из них, от деградации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP увеличивает продолжительность периода полувыведения белков или пептидов, полученных из них. Согласно некоторым вариантам реализации CTP увеличивает эффективность белков или пептидов, полученных из них.
[0067] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения в настоящей заявке термины «CTP-пептид», «карбокси-концевой пептид», «последовательность CTP» и «С-концевой пептид хорионического гонадотропина» используются взаимозаменяемо. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид представляет собой полноразмерный CTP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид представляет собой усеченный CTP. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0068] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения в настоящей заявке термины «сигнальная последовательность» и «сигнальный пептид» используются взаимозаменяемо. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термин «последовательность», при использовании в отношении полинуклеотида, может относиться к кодирующей части. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0069] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения в настоящей заявке термины «пептид, представляющий интерес» и «полипептидная последовательность, представляющая интерес» используются взаимозаменяемо. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения представляющий интерес пептид представляет собой полноразмерный белок. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения представляющий интерес пептид представляет собой фрагмент белка. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0070] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический состав, содержащий полипептид, который состоит из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух карбокси-концевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический состав, содержащий полипептид, который состоит из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, двух карбокси-концевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, и сигнального пептида, присоединенного к амино-концу одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтический состав дополнительно содержит буфер и агент, регулирующий тоничность. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения буфер представляет собой 10 мМ цитрат, и агент, регулирующий тоничность, представляет собой 147 мМ NaCl. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения показатель pH указанного состава равен приблизительно 6,0. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения показатель pH указанного состава равен приблизительно 6,2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения показатель pH указанного состава равен приблизительно 6,4. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения показатель pH указанного состава находится в диапазоне приблизительно от 6,0 до 6,4. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения буфер представляет собой 10 мМ цитрат, агент, регулирующий тоничность, представляет собой 147 мМ NaCl и показатель рН равен 6,0. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения состав представляет собой жидкий состав.
[0071] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложена лекарственная форма для введения один раз в неделю, содержащая фармацевтический состав, предложенный в настоящей заявке.
[0072] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, состоящий из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух карбокси-концевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, состоящий из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, двух карбокси-концевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, и сигнального пептида, присоединенного к амино-концу одного указанного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина.
in vivo
in vivo
in vivo
[0073] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста, содержащий блоки CTP, описанный в настоящей заявке, имеет повышенную биологическую активность в условиях  по сравнению с аналогичным гормоном роста, не содержащим CTP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста, содержащий по меньшей мере один CTP, присоединенный к его амино-концу, и по меньшей мере два CTP, присоединенных к его карбокси-концу, имеет повышенную биологическую активность в условиях  по сравнению с аналогичным гормоном роста, не содержащим CTP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста, содержащий один CTP, присоединенный к его амино-концу, и два CTP, присоединенных к его карбокси-концу, имеет повышенную биологическую активность в условиях  по сравнению с аналогичным гормоном роста, не содержащим CTP.
[0074] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид, содержащий последовательности по меньшей мере двух карбокси-концевых пептидов (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенные к полипептидной последовательности, представляющей интерес, в котором первая последовательность CTP из по меньшей мере двух последовательностей CTP, присоединена к амино-концу полипептидной последовательности, представляющей интерес, и вторая последовательность CTP из по меньшей мере двух последовательностей CTP, присоединена к карбокси-концу полипептидной последовательности, представляющей интерес. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность карбокси-концевого пептида (CTP) представляет собой последовательность хорионического гонадотропина человека.
[0075] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой субъекта-человека. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект-человек имеет дефицит гормона роста. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект имеет дефицит гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой домашнее животное. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой млекопитающее. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой сельскохозяйственное животное. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой собаку. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой кошку. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой обезьяну. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой лошадь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой корову. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой мышь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой крысу. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения субъект мужского пола. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект женского пола. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой взрослого субъекта, имеющего дефицит гормона роста (СТГ). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой ребенка в препубертатном возрасте, имеющего дефицит гормона роста (ДГР). Как описано в настоящей заявке, различные дозы MOD-4023 (CTP-СТГ человека-CTP-CTP) обеспечивали хороший догоняющий рост у детей в препубертатном возрасте (см. пример 10).
[0076] Выражение «полипептидная последовательность, представляющая интерес» относится, в другом варианте реализации настоящего изобретения, к любой полипептидной последовательности, такой как последовательность, имеющая биологическую активность. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид является гликозилированным. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид является негликозилированным. Примеры полипептидов, которые получают преимущества от увеличения продолжительности периода полувыведения, включают, но не ограничиваются ими, эритропоэтин (ЭПО), интерфероны, гормон роста человека (СТГ человека) и глюкагон-подобный пептид-1 (ГПП-1). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой гормон роста (СГР). В другом варианте полипептид представляет собой гормон роста человека (СТГ человека).
[0077] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения конфигурация CTP-СТГ-CTP-CTP, описанная в настоящей заявке, содержит гормон роста или его активный фрагмент, соединенный посредством линкера по меньшей мере с одним блоком CTP. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения линкер представляет собой пептидную связь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конфигурация CTP-СТГ-CTP-CTP, описанная в настоящей заявке, содержит гормон роста или его активный фрагмент, соединенный посредством пептидной связи по меньшей мере с одним блоком CTP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конфигурация CTP-СТГ-CTP-CTP, описанная в настоящей заявке, содержит гормон роста или его активный фрагмент, соединенный посредством пептидной связи по меньшей мере с одним блоком CTP, который соединен с дополнительным блоком CTP посредством пептидной связи. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид, описанный в настоящей заявке, содержит фрагменты гормона роста и блоки CTP и/или их фрагменты, которые соединены между собой посредством пептидной связи. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, описанный в настоящей заявке, содержащий гормон роста и/или его фрагменты и блоки CTP и/или их фрагменты.
[0078] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) присоединен к последовательности полипептида, представляющего интерес, посредством линкера. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере один CTP необязательно присоединен к указанной полипептидной последовательности, представляющей интерес, посредством линкера. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкер, который соединяет последовательность CTP и полипептидную последовательность, представляющую интерес, представляет собой ковалентную связь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкер, который соединяет последовательность CTP и полипептидную последовательность, представляющую интерес, представляет собой пептидную связь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкер, который соединяет последовательность CTP и полипептидную последовательность, представляющую интерес, представляет собой замещенную пептидную связь. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность карбокси-концевого пептида (CTP) содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 48.
[0079] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность SEQ ID NO: 48 содержит следующую аминокислотную последовательность (AA): DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ (SEQ ID NO: 48).
[0080] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) гибридизован с белком. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) гибридизован с пептидом указанного белка. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения белок или его пептид представляет собой гормон роста. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения белок или его пептид представляет собой гормон роста человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина человека гибридизован с гликопротеином. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) ХГЧ гибридизован с гормоном-гликопротеином. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP ХГЧ гибридизован с пептидом, полученным из гормона-гликопротеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гормоны-гликопротеины включают эритропоэтин (ЭПО), ФСГ или ТТГ, а также пептиды, полученные из них.
[0081] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце и карбокси-конце полипептида обеспечивает повышенную защиту белка от деградации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности CTP на амино-конце и карбокси-конце полипептида обеспечивают более длительный период полувыведения присоединенного белка.
[0082] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, обеспечивают повышенную защиту белка от деградации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, обеспечивают более длительный период полувыведения присоединенного белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, обеспечивают повышенную активность присоединенного белка.
[0083] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на амино-конце, обеспечивают повышенную защиту прикрепленного белка от деградации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на амино-конце, обеспечивают более длительный период полувыведения присоединенного белка. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце полипептида и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на амино-конце, обеспечивают повышенную активность присоединенного белка.
max
max
1/2
[0084] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности CTP на амино-конце гормона роста и карбокси-конце гормона роста обеспечивают повышенную защиту гормона роста от деградации. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и два блока CTP на карбокси-конце гормона роста обеспечивают повышенную защиту от клиренса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и два блока CTP на карбокси-конце гормона роста обеспечивают более длительный период клиренса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и два блока CTP на карбокси-конце гормона роста повышают C гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и два блока CTP на карбокси-конце гормона роста увеличивают T гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и два блока CTP на карбокси-конце гормона роста увеличивают T.
[0085] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательности CTP на амино-конце гормона роста и карбокси-конце гормона роста увеличивают продолжительность периода полувыведения модифицированного гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и по меньшей мере две последовательности CTP на карбокси-конце гормона роста обеспечивают более длительный период полувыведения модифицированного гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и две последовательности CTP на карбокси-конце гормона роста обеспечивают более длительный период полувыведения присоединенного гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения одна последовательность CTP на амино-конце гормона роста и две последовательности CTP, присоединенные тандемным образом к карбокси-концу гормона роста, обеспечивают более длительный период полувыведения модифицированного гормона роста.
[0086] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце полипептида, последовательность CTP на карбокси-конце гормона роста и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, обеспечивают повышенную защиту гормона роста от деградации. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце гормона роста, последовательность CTP на карбокси-конце гормона роста и по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, увеличивают продолжительность периода полувыведения гормона роста. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения последовательность CTP на амино-конце гормона роста, последовательность CTP на карбокси-конце гормона роста по меньшей мере одна дополнительная последовательность CTP, присоединенная тандемным образом к последовательности CTP на карбокси-конце, усиливают биологическую активность гормона роста.
[0087] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна последовательность CTP состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения карбокси-концевой пептид (CTP) согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты в положении 112 до аминокислоты в положении 145 хорионического гонадотропина человека, приведенную в SEQ ID NO: 17. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты в положении 118 до аминокислоты в положении 145 хорионического гонадотропина человека, приведенную в SEQ ID NO: 18. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP также начинается от любого положения между положениями 112-118 и заканчивается в положении 145 хорионического гонадотропина человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептидная последовательность CTP имеет в длину 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34 аминокислоты и начинается в положении 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 118 аминокислотной последовательности CTP.
[0088] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 1-5 консервативных замен аминокислот, описанных в патенте США №5712122. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 1 консервативной замены аминокислоты. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 2 консервативных замен аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 3 консервативных замен аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 4 консервативных замен аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пептид CTP представляет собой вариант CTP хорионического гонадотропина, который отличается от нативного CTP наличием 5 консервативных замен аминокислот. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 70% гомологии с аминокислотной последовательностью нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 80% гомологии с аминокислотной последовательностью нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 90% гомологии с аминокислотной последовательностью нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 95% гомологии с аминокислотной последовательностью нативного CTP или его пептида.
[0089] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность ДНК пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 70% гомологии с последовательностью ДНК нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность ДНК пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 80% гомологии с последовательностью ДНК нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность ДНК пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 90% гомологии с последовательностью ДНК нативного CTP или его пептида. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения последовательность ДНК пептида CTP согласно настоящему изобретению имеет по меньшей мере 95% гомологии с последовательностью ДНК нативного CTP или его пептида.
[0090] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина является укороченной. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения обе аминокислотные последовательности CTP хорионического гонадотропина являются укороченными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 2 из аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина являются укороченными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 2 или более аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина являются укороченными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения все аминокислотные последовательности CTP хорионического гонадотропина являются укороченными. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 10 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 11 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 12 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 13 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 14 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 15 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит первые 16 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения укороченный CTP содержит последние 14 аминокислот из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 43.
[0091] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения по меньшей мере одна из аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина является гликозилированной. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения обе аминокислотные последовательности CTP хорионического гонадотропина являются гликозилированными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 2 из аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина являются гликозилированными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 2 или более из аминокислотных последовательностей CTP хорионического гонадотропина являются гликозилированными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения все аминокислотные последовательности CTP хорионического гонадотропина являются гликозилированными. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один сайт гликозилирования. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP согласно настоящему изобретению содержит 2 сайта гликозилирования. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP согласно настоящему изобретению содержит 3 сайта гликозилирования. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательность CTP согласно настоящему изобретению содержит 4 сайта гликозилирования. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0092] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термин «гомология» в соответствии с настоящим изобретением также включает делеции, инсерции или варианты замены, включая замену аминокислоты в них и их биологически активные полипептидные фрагменты.
in vivo
[0093] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гормон роста человека (СТГ человека) используется в соответствии с принципами настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присоединение последовательности CTP к амино-концу и карбокси-концу белка СТГ человека приводит к повышенной эффективности (фиг. 2, 3, 5, 7 и 9). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присоединение последовательности CTP к амино-концу и карбокси-концу белка СТГ человека приводит к более длительной активности в условиях . В одном варианте реализации настоящего изобретения полипептиды CTP-СТГ человека согласно настоящему изобретению приведены в SEQ ID NO: 39-41.
[0094] В настоящей заявке раскрыто, что у крыс с удаленным гипофизом (у которых отсутствует секреция гормона роста) после инъекции CTP-СТГ человека наблюдали усиление роста. В настоящей заявке дополнительно раскрыто, что усиление роста, которое хорошо коррелировало с догоняющим ростом пациентов, было выявлено у детей в препубертатном возрасте, имеющих дефицит гормона роста (см. пример 10 в настоящей заявке).
[0095] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ достижения восстановления нормального роста у ребенка в препубертатном возрасте, имеющего дефицит гормона роста, причем указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей CTP-модифицированный гормон роста, предложенный в настоящем изобретении. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ достижения восстановления роста у ребенка в препубертатном возрасте, имеющего дефицит гормона роста, причем указанный способ включает введение фармацевтической композиции, содержащей CTP-модифицированный гормон роста, предложенный в настоящем изобретении.
[0096] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения выражение «гормон роста человека» (СТГ человека) относится к полипептиду, например, зарегистрированному в GenBank под номером доступа P01241 (SEQ ID NO: 47), который проявляет активность СТГ человека (т.е. стимуляцию роста).
[0097] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термин «гормон роста человека» (СТГ человека) относится к полипептиду, например, зарегистрированному в GenBank под номером доступа P01241, который проявляет активность СТГ человека (т.е. стимуляцию роста). В другом варианте реализации настоящего изобретения термин «СТГ» согласно настоящему изобретению также относится к гомологам. В другом варианте реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность СТГ в соответствии со способами и композициями согласно настоящему изобретению по меньшей мере на 50% гомологична последовательности СТГ, приведенной в настоящей заявке, согласно результатам определения с помощью программного обеспечения BLASTP Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием параметров по умолчанию. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет 60%. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет 70%. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет 80%. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет 90%. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет по меньшей мере 95%. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения процент гомологии составляет более 95%. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[0098] Типичные полипептиды CTP-СТГ и полипептиды CTP-СТГ человека согласно настоящему изобретению представлены в последовательностях, приведенных в SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41.
[0099] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид гормона роста (СТГ), содержащий дополнительно по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, предложенный в настоящей заявке, который предназначен для стимуляции роста мышц.
[00100] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, который предназначен для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, который предназначен для стимуляции роста мышц. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, который предназначен для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, который предназначен для стимуляции роста мышц. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для стимуляции роста мышц.
[00101] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ уменьшения частоты дозирования гормона роста у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, уменьшая тем самым частоту дозирования гормона роста у субъекта.
[00102] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ улучшения показателя площади под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) для гормона роста у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, уменьшая тем самым частоту дозирования гормона роста у субъекта.
[00103] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен состав, содержащий полипептид, который состоит из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, при этом указанный состав обладает повышенной стабильностью. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения состав является стабильным в течение по меньшей мере одного года. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения состав является стабильным в течение по меньшей мере двух лет.
[00104] Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в терапии СТГ, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, уменьшая тем самым частоту дозирования гормона роста у субъекта.
[00105] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ повышения уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, обеспечивая тем самым увеличение уровня инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта.
[00106] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ поддержания уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, обеспечивая тем самым поддержание уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта. В другом варианте реализации уровни ИФР-1 поддерживают в пределах определенного диапазона, как дополнительно обеспечено в настоящей заявке.
[00107] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ повышения и поддержания уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) в пределах определенного диапазона у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, состоящего из гормона роста, одного карбокси-концевого пептида хорионического гонадотропина (CTP), присоединенного к амино-концу указанного гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, тем самым увеличивая и поддерживая у субъекта уровни инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) в пределах определенного диапазона.
max
trough
[00108] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения определенный диапазон представляет собой терапевтический диапазон доз, достигнутый путем введения CTP-модифицированного гормона роста, предложенного в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения определенный диапазон представляет собой тот, в котором величины C и C синусоидального профиля ИФР-1 поддерживаются после последовательных введений CTP-модифицированного гормона роста, как дополнительно предусмотрено в настоящей заявке (см. пример 15). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения определенный диапазон представляет собой терапевтический диапазон доз для последовательного введения CTP-модифицированного гормона роста, предложенного в настоящей заявке, который вызывает надлежащий ответ у субъекта и нуждается в минимальной модификации дозы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения определенный диапазон сопоставим с диапазоном уровней ИФР-1 у индивидуумов, которые считаются нормальными. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения определенный диапазон представляет собой нормальный диапазон уровней/значений ИФР-1 у нормальных индивидуумов. В другом варианте реализации определенный диапазон находится в пределах нормального диапазона, когда значения индекса стандартного отклонения (SDS) ИФР-1 находятся в пределах ±2 SDS.
[00109] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для стимулирования роста костей.
[00110] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для стимулирования роста костей.
in vivo
in vivo
in vivo
[00111] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгированные гормоны роста согласно настоящему изобретению применяют способом, аналогичным таковому для немодифицированных гормонов роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгированные гормоны роста согласно настоящему изобретению имеют более длительный период полувыведения и время удержания в плазме крови, сниженный клиренс и увеличенную клиническую активность в условиях . Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, благодаря улучшенным свойствам конъюгированных гормонов роста, описанных в настоящей заявке, указанные конъюгаты вводят с меньшей частотой, чем немодифицированные гормоны роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгированные гормоны роста, описанные в настоящей заявке, вводят с частотой от одного раза в неделю до одного раза в две недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгированные гормоны роста, описанные в настоящей заявке, вводят с частотой от одного раза каждые две недели до одного раза каждые три недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения конъюгированные гормоны роста, описанные в настоящей заявке, вводят с частотой от одного раза в сутки до трех раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения сниженная частота введения приведет к улучшению приверженности пациентов требованиям схемы лечения, что обеспечит улучшение результатов лечения, а также улучшение качества жизни пациентов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения было обнаружено, что, по сравнению с обычными конъюгатами гормона роста, связанными с полиэтиленгликолем, конъюгаты гормона роста и CTP, имеющие молекулярную массу и структуру линкера, которая аналогична таковой для конъюгатов согласно настоящему изобретению, имеют улучшенную эффективность, улучшенную стабильность, повышенные уровни AUC и более длительный период полувыведения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения было обнаружено, что, по сравнению с обычными конъюгатами гормона роста, связанными с полиэтиленгликолем, гормоны роста, имеющие молекулярную массу и структуру линкера, которая аналогична таковой для конъюгатов согласно настоящему изобретению, имеют улучшенную эффективность, улучшенную стабильность, повышенные уровни AUC и более длительный период полувыведения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного гормона роста представляет собой количество конъюгата, необходимое для получения ожидаемой биологической активности, которая поддается измерению в условиях . Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста, используемый в соответствии с принципами настоящего изобретения, проявляет повышенную эффективность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения присоединение последовательности CTP к амино-концу и карбокси-концу гормона роста обеспечивает длительную активность в условиях .
[00112] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного гормона роста определяют в соответствии с факторами, такими как точный тип состояния, подлежащего лечению, состояние пациента, которого лечат, а также наличие других ингредиентов в композиции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного гормона роста составляет от 0,01 до 10 мкг на кг массы тела при введении один раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного гормона роста составляет от 0,1 до 1 мкг на кг массы тела при введении один раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию, содержащую конъюгированный гормон роста, изготавливают с содержанием активного ингредиента, которое будет эффективным для введения пациенту-человеку с помощью различных средств.
[00113] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой любой гормон роста, известный специалистам в данной области техники. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой гормон роста человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой нечеловеческий гормон роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нуклеотидная последовательность и/или аминокислотная последовательность гормона роста имеются в базе данных банка генов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой гомолог. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гомолог также относится к делеции, вставке или варианту замены, включая замену аминокислоты в нем, и его биологически активные полипептидные фрагменты.
[00114] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста представляет собой вариант СТГ человека, не содержащий экзоны 2, 3, 4 или любую их комбинацию. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста содержит сигнальный пептид. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста содержит сайт отщепления сигнальной последовательности. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP согласно настоящему изобретению, содержат рекомбинантный гормон роста.
[00115] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ согласно настоящему изобретению для поддержания качества мышц.
[00116] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ согласно настоящему изобретению для поддержания качества костной ткани.
[00117] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты СТГ-CTP согласно настоящему изобретению для поддержания качества костной ткани.
[00118] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для лечения синдрома истощения.
[00119] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для лечения синдрома истощения.
[00120] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для увеличения сердечной функции.
[00121] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для увеличения сердечной функции.
[00122] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептиды СТГ, описанные в настоящей заявке, для увеличения липолиза.
[00123] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для увеличения липолиза.
[00124] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают любой из CTP-модифицированных пептидов СТГ, описанных в настоящей заявке, для улучшения баланса жидкости.
[00125] В другом варианте реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа AAA72260. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа AAK69708. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа CAA01435. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа CAA01329. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа CAA00380. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа AAA72555. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NP_000506.2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NP_072053.1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NP_072054.1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NP_072055.1. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста согласно настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NP_072056.1.
[00126] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения баланса жидкости. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения баланса жидкости. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения баланса жидкости. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения баланса жидкости. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для улучшения баланса жидкости.
[00127] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, для лечения остеопороза.
[00128] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для лечения остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую СТГ пептид, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для лечения остеопороза.
[00129] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, для ингибирования остеопороза.
[00130] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую СТГ пептид, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для ингибирования остеопороза. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для ингибирования остеопороза.
[00131] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ согласно настоящему изобретению для улучшения способности переносить физическую нагрузку.
[00132] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, для улучшения функции легких.
[00133] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения функции легких. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для улучшения функции легких.
[00134] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на C-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, для улучшения иммунитета.
[00135] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую СТГ пептид, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую СТГ пептид, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для улучшения иммунитета. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для улучшения иммунитета.
[00136] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, для восстановления роста жизненно важных органов.
[00137] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления роста жизненно важных органов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, для восстановления роста жизненно важных органов.
[00138] В другом варианте реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ согласно настоящему изобретению для улучшения чувства благополучия.
[00139] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 23, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 36, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 37, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 38, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 39, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 40, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 41, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ, приведенный в последовательности SEQ ID NO: 42, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают пептид СТГ, модифицированный CTP, как это предусмотрено в настоящей заявке, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна.
[00140] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид СТГ, дополнительно содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 44, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и один пептид CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 45, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце, предназначенный для восстановления фазы быстрого сна. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают нуклеиновую кислоту, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 46, кодирующую пептид СТГ, содержащий один пептид CTP на N-конце и два пептида CTP на С-конце для восстановления фазы быстрого сна.
de novo
[00141] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белок СТГ, описанный в настоящей заявке. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий СТГ, модифицированный CTP, для стимулирования роста мышц, увеличения функции сердца, стимулирования роста костей, поддержания целостности мышц, поддержания баланса метаболизма мышц, индукции наращивания мышечной массы, индукции наращивания мышечной массы , увеличения нагрузки на кости, лечения симптомов, связанных с остеопорозом, лечения синдрома истощения, увеличения липолиза, улучшения баланса жидкости, лечения остеопороза, улучшения функции легких, улучшения иммунитета, восстановления роста жизненно важного органа, усиления чувства благополучия, восстановления фазы быстрого сна, или любой их комбинации.
[00142] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения термин «гомология» в соответствии с настоящим изобретением включает также делеции, инсерции или варианты замены, включая замену аминокислоты в них, и их биологически активные полипептидные фрагменты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариант замены представляет собой тот, в котором глутамин в положении 65 СТГ замещен валином [Gellerfors et al., J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].
[00143] Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гормон роста, описанный в настоящей заявке, кодирует любую аминокислотную последовательность гормона роста, известного специалисту в данной области техники. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гормон роста, описанный в настоящей заявке, кодирует СТГ человека. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гормон роста, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NM_000515.3. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей гормон роста, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NM_022559.2. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей гормон роста, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NM_022560.2. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей гормон роста, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NM_022561.2. Согласно другому варианту молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей гормон роста, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, зарегистрированную в GeneBank под номером доступа NM_022562.2.
[00144] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гомолог также относится к делеции, вставке или варианту замены, включая замену аминокислоты в нем, и его биологически активные полипептидные фрагменты.
[00145] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептидная последовательность, представляющая интерес, представляет собой СТГ человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептидная последовательность, представляющая интерес, представляет собой пептид или белок, включая любую модифицированную форму.
[00146] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают СТГ человека, дополнительно содержащий по меньшей мере один пептид CTP на N-конце и по меньшей мере один пептид CTP на C-конце, предназначенный для лечения синдрома истощения, СПИД, кахексии или дефицита СТГ человека.
[00147] Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение применяют в ветеринарии. Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения одомашненных млекопитающих, которых содержат в качестве животных-компаньонов человека (например, собак, кошек, лошадей), которые имеют значительную коммерческую ценность (например, молочные коровы, крупный рогатый скот, спортивные животные), которые имеют значительное научное значение (например, живущие в неволе или свободноживущие особи исчезающих видов), или которые имеют иное значение.
[00148] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модификация последовательностей CTP является предпочтительной, поскольку обеспечивает возможность использования более низких дозировок.
[00149] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в настоящей заявке термин «полипептид» включает нативные полипептиды (продукты деградации, синтетически синтезированные полипептиды, или рекомбинантные полипептиды) и пептидомиметики (как правило, синтетические полипептиды), а также пептоиды и семипептоиды, которые представляют собой полипептидные аналоги, содержащие, в некоторых вариантах, модификации, которые придают полипептидам повышенную стабильность в организме или более высокую способность проникать в клетки.
2
2
2
2
2
2
[00150] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения модификации включают, но не ограничиваются ими, модификации N-конца, модификации C-конца, модификации полипептидной связи, включая, но не ограничиваясь ими, CH-NH, CH-S, CH-S=O, O=C-NH, CH-O, CH-CH, S=C-NH, CH=CH или CF=CH, модификации остова и модификации остатков. Способы получения соединений пептидомиметиков хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. Более подробная информация, касающаяся этого аспекта, приведена ниже.
3
2
2
2
2
[00151] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи (-CO-NH-) в полипептиде являются замещенными. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены N-метилированными связями (-N(CH)-CO-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены сложноэфирными связями (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены кетометиленовыми связями (-СО-СН-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены α-аза связями (-NH-N(R)-CO-), в которых R представляет любой алкил, например, метил, карбо-связями (-СН-NH-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены гидроксиэтиленовыми связями (-CH(OH)-CH-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены тиоамидными связями (-CS-NH-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены олефиновыми двойными связями (-CH=CH-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены ретро-амидными связями (-NH-CO-). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептидные связи замещены полипептидными производными (-N(R)-CH-CO-), в которых R представляет собой «неразветвленную» боковую цепь, присутствующую в природных условиях на атоме углерода. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные модификации происходят в любой из связей вдоль полипептидной цепи и даже в нескольких связях (2-3 связи) одновременно.
[00152] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения природные ароматические аминокислоты полипептида, такие как Trp, Tyr и Phe, замещены синтетической неприродной кислотой, такой как фенилглицин, TIC, нафтилаланин (Nol), производными Phe с метилированным кольцом, галогенированными производными Phe или о-метилтирозином. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению содержат одну или более модифицированную аминокислоту или один или более мономеров, не относящихся к аминокислотам (например, жирные кислоты, сложные углеводы и т.д.).
in vivo
[00153] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термины «аминокислота» или «аминокислоты» включают 20 природных аминокислот; те аминокислоты, которые часто подвергаются посттрансляционным модификациям в условиях , включая, например, гидроксипролин, фосфосерин и фосфотреонин; и другие нетипичные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь ими, 2-аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «аминокислота» включает как D-аминокислоты, так и L-аминокислоты.
[00154] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению используют в терапии, для которой полипептиды должны быть в растворимой форме. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению содержат одну или более неприродных или природных полярных аминокислот, включая, но не ограничиваясь ими, серин и треонин, которые способны повышать растворимость полипептида благодаря их гидроксилсодержащей боковой цепи.
[00155] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению используют в линейной форме, хотя специалист в данной области техники поймет, что в тех случаях, когда циклизация не оказывает существенного влияния на характеристики полипептидов, также могут быть использованы циклические формы полипептида.
[00156] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению синтезированы биохимически, например, с использованием стандартных методик твердофазного синтеза. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные биохимические способы включают полный твердофазный синтез, частичный твердофазный синтез, конденсацию фрагментов или классический синтез в растворе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные способы используют, когда полипептид является относительно коротким (около 5-15 кДа) и/или когда он не может быть получен с помощью рекомбинантных методик (т.е. не кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты) и, следовательно, содержит различные химические фрагменты.
[00157] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методики твердофазного синтеза полипептидов хорошо известны специалистам в данной области техники и дополнительно описаны John Morrow Stewart и Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения синтетические полипептиды очищают с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.], и их состав может быть подтвержден с помощью секвенирования аминокислот с помощью способов, известных специалисту в данной области техники.
[00158] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методики получения рекомбинантных белков используют для синтеза полипептидов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методики получения рекомбинантных белков используют для синтеза относительно длинных полипептидов (например, более 18-25 аминокислот). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методики получения рекомбинантных белков используют для синтеза большого количества полипептида согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рекомбинантные методики описаны в работах Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 и Brogli et al, (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 и Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.
[00159] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептид согласно настоящему изобретению синтезируют с использованием полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно настоящему изобретению, лигируют в вектор для экспрессии, в котором контроль транскрипции осуществляется цис-регуляторной последовательностью (например, последовательностью промотора). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цис-регуляторная последовательность пригодна для направления конститутивной экспрессии полипептида согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цис-регуляторная последовательность пригодна для направления тканеспецифичной экспрессии полипептида согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения цис-регуляторная последовательность пригодна для направления индуцируемой экспрессии полипептида согласно настоящему изобретению.
[00160] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотиды, которые экспрессируют полипептиды согласно настоящему изобретению, приведены в последовательностях SEQ ID NO: 44, 45 и 46.
[00161] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения тканеспецифичные промоторы, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают последовательности, которые функциональны в определенной популяции клеток, например, включают, но не ограничиваются ими, промоторы, такие как промотор альбумина, который специфичен для печени [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], промоторы, специфичные для лимфоидной ткани [Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; в частности, промоторы Т-клеточных рецепторов [Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] и иммуноглобулинов; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], нейронспецифичные промоторы, такие как промотор нейрофиламентов [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], промоторы, специфичные для поджелудочной железы [Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916], или промоторы, специфичные для молочной железы, такие как промотор молочной сыворотки (патент США №4873316 и публикация заявки на европейский патент №264166). Индуцируемые промоторы, пригодные для использования в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, тетрациклин-индуцируемый промотор (Srour, M.A., et al., 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
[00162] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения выражение «полинуклеотид» относится к последовательности одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая будет выделена и обеспечена в виде последовательности РНК, комплементарной полинуклеотидной последовательности (кДНК), геномной полинуклеотидной последовательности и/или составных полинуклеотидных последовательностей (например, комбинации последовательностей, указанных выше).
in vivo
in vitro
[00163] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «комплементарная полинуклеотидная последовательность» относится к последовательности, которая синтезируется в результате обратной транскрипции РНК с использованием обратной транскриптазы или любой другой РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения последовательность затем может быть амплифицирована в условиях  или в условиях  с использованием ДНК-полимеразы.
[00164] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «геномная полинуклеотидная последовательность» относится к последовательности, полученной (выделенной) из хромосомы и, следовательно, она представляет собой непрерывную часть хромосомы.
[00165] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «составная полинуклеотидная последовательность» относится к последовательности, которая является по меньшей мере частично комплементарной и по меньшей мере частично геномной. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения составная последовательность может содержать некоторые экзонные последовательности, необходимые для кодирования полипептида согласно настоящему изобретению, а также некоторые интронные последовательности, вставленные между ними. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения интронные последовательности могут быть получены из любого источника, включая другие гены, и, как правило, будут включать консервативные сигнальные последовательности сплайсинга. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения интронные последовательности содержат цис- действующие элементы, регулирующие экспрессию.
[00166] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотиды согласно настоящему изобретению дополнительно содержат сигнальную последовательность, кодирующую сигнальный пептид для секреции полипептидов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сигнальные последовательности содержат, но не ограничиваются ими, эндогенную сигнальную последовательность для ЭПО, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 19, или эндогенную сигнальную последовательность для IFN-β1, приведенную в последовательности SEQ ID NO: 26. В другом варианте реализации настоящего изобретения сигнальная последовательность расположена на N-конце по отношению к последовательности CTP, которая в свою очередь расположена на N-конце по отношению к полипептидной последовательности, представляющей интерес; например, последовательность представляет собой (a) сигнальную последовательность, (b) CTP-, (c) последовательность, представляющую интерес, (d) необязательно 1 или более дополнительных последовательностей CTP. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения 1 или более последовательностей CTP вставлены между сигнальной последовательностью полипептидной последовательности, представляющей интерес, и самой полипептидной последовательностью, представляющей интерес, прерывая тем самым представляющую интерес последовательность дикого типа. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант реализации настоящего изобретения.
[00167] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста дополнительно содержит сигнальный пептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сигнальные последовательности содержат, но не ограничиваются ей, эндогенную сигнальную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения сигнальные последовательности содержат, но не ограничиваются ей, эндогенную сигнальную последовательность любого известного гормона роста или гормонов роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды и способы согласно настоящему изобретению обеспечивают гормон роста, дополнительно содержащий сигнальный пептид, содержащий следующую аминокислотную последовательность: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 49).
[00168] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения после экспрессии и секреции сигнальные пептиды отщепляются от белков-предшественников, что приводит к получению зрелых белков.
[00169] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полинуклеотиды согласно настоящему изобретению получают с помощью методик ПЦР с использованием процедур и способов, известных специалисту в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения процедура включает лигирование двух различных последовательностей ДНК (см., например, «Current Protocols in Molecular Biology», eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
[00170] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотиды согласно настоящему изобретению вставлены в векторы для экспрессии (т.е. конструкцию нуклеиновой кислоты), чтобы обеспечить экспрессию рекомбинантного полипептида. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вектор для экспрессии согласно настоящему изобретению содержит дополнительные последовательности, которые делают этот вектор пригодным для репликации и интеграции у прокариот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вектор для экспрессии согласно настоящему изобретению содержит дополнительные последовательности, которые делают этот вектор пригодным для репликации и интеграции у эукариот. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вектор для экспрессии согласно настоящему изобретению содержит челночный вектор, который делает этот вектор пригодным для репликации и интеграции как у прокариот, так и эукариот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы для клонирования включают последовательности инициации транскрипции и трансляции (например, промоторы, энхансер) и терминаторы транскрипции и трансляции (например, сигналы полиаденилирования).
[00171] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ряд прокариотических или эукариотических клеток может быть использован в качестве системы-хозяина для экспрессии полипептидов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные клетки включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные вектором для экспрессии, содержащим рекомбинантную ДНК бактериофага, плазмидную ДНК или космидную ДНК, который содержит последовательность, кодирующую полипептид; дрожжи, трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими последовательность, кодирующую полипептид; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами для экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом табачной мозаики, ВТМ) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами для экспрессии, такими как Ti-плазмида, содержащими последовательность, кодирующую полипептид.
[00172] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используют небактериальные системы экспрессии (например, системы экспрессии млекопитающих, такие как клетки линии СНО), чтобы экспрессировать полипептид согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вектор для экспрессии, используемый для экспрессии полинуклеотидов согласно настоящему изобретению в клетках млекопитающих, представляет собой вектор pCI-DHFR, содержащий промотор цитомегаловируса (ЦМВ) и ген устойчивости к неомицину. Конструкция вектора pCI-DHFR описана, в соответствии с одним вариантом реализации, в примере 1 и на фиг. 3.
E. coli
et al
[00173] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения в бактериальных системах согласно настоящему изобретению ряд векторов для экспрессии может быть предпочтительно выбран в зависимости от способа применения, предполагаемого для экспрессируемого полипептида. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения желательным является большое количество полипептида. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения желательными являются векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней белкового продукта, возможно, в виде гибридного белка с гидрофобной сигнальной последовательностью, которая направляет экспрессируемый продукт в периплазму бактерий или культуральную среду, из которой белковый продукт может быть легко очищен. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения определенный гибридный белок конструируют с включением специфичного сайта расщепления, чтобы облегчить выделение полипептида. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения векторы, пригодные для такой манипуляции, включают, но не ограничиваются ими, серию векторов для экспрессии pET в  [Studier ., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
[00174] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения используют системы экспрессии дрожжей. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, можно использовать в дрожжах, как описано в патенте США №5932447. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения используют векторы, которые стимулируют интеграцию чужеродных последовательностей ДНК в хромосому дрожжей.
[00175] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вектор для экспрессии согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать дополнительные полинуклеотидные последовательности, которые обеспечивают, например, трансляцию нескольких белков из одной мРНК, такие как участок внутренней посадки рибосомы (IRES) и последовательности для геномной интеграции промотора-химерного полипептида.
[00176] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы экспрессии млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, которые доступны от Invitrogen, pCI, который доступен от Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV и pBK-CMV, которые доступны от Strategene, pTRES, который доступен от Clontech, и их производные.
+
+
[00177] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы для экспрессии, содержащие регуляторные элементы из эукариотических вирусов, таких как ретровирусы, используют в соответствии с настоящим изобретением. Векторы SV40 включают pSVT7 и pMT2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы, полученные из бычьего вируса папилломы, включают pBV-1MTHA, и векторы, полученные из вируса Эпштейна-Барр, включают pHEBO и p2O5. Примеры других векторов включают pMSG, pAV009/A, pMTO10/A, pMAMneo-5, бакуловирус pDSVE и любой другой вектор, обеспечивающий экспрессию белков под контролем промотора ранних генов SV-40, промотора поздних генов SV-40, промотора металлотионеина, промотора вируса опухоли молочной железы мышей, промотора вируса саркомы Рауса, промотора полиэдрина или других промоторов, которые, как было показано, являются эффективными для экспрессии в эукариотических клетках.
in vivo
[00178] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рекомбинантные вирусные векторы можно использовать для экспрессии в условиях  полипептидов согласно настоящему изобретению, поскольку они обеспечивают ряд преимуществ, таких как латеральная инфекция и нацеленная специфичность. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения латеральная инфекция присуща жизненному циклу, например, ретровирусов, и представляет собой процесс, с помощью которого одна инфицированная клетка продуцирует много вирионов-потомков, которые отпочковываются и инфицируют соседние клетки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения результатом является то, что большая область быстро становится инфицированной, большая часть которой изначально не была инфицирована посредством исходных вирусных частиц. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения получают вирусные векторы, которые не способны распространяться латерально. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная особенность может быть благоприятной, если желаемая цель представляет собой введение конкретного гена только в локализованном количестве намеченных клеток.
[00179] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для введения в клетки вектора для экспрессии согласно настоящему изобретению можно использовать различные способы. Такие способы в целом описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) и Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] и включают, например, стабильную или кратковременную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфицирование рекомбинантными вирусными векторами. Также см. патенты США №5464764 и 5487992, в которых описаны способы положительной-отрицательной селекции.
[00180] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение нуклеиновой кислоты с помощью вирусной инфекции имеет ряд преимуществ по сравнению с другими способами, такими как липофекция и электропорация, поскольку более высокая эффективность трансфекции может быть получена благодаря инфекционной природе вирусов.
in vivo
ex vivo
[00181] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения следует понимать, что полипептиды согласно настоящему изобретению также можно экспрессировать из конструкции нуклеиновой кислоты, введенной индивидууму с использованием любого подходящего способа введения, описанного выше (т.е. генной терапии в условиях ). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения конструкцию нуклеиновой кислоты вводят в подходящую клетку с помощью соответствующего носителя/способа для доставки генов (трансфекция, трансдукция, гомологичная рекомбинации и т.д.) и системы экспрессии, если это необходимо, и затем модифицированные клетки размножают в культуре и трансплантируют индивидууму (т.е. генная терапия в условиях ).
et al
et al
et al
et al
et al
[00182] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения используют векторы для экспрессии у растений. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения экспрессия последовательности, кодирующей полипептид, контролируется рядом промоторов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения используют вирусные промоторы, такие как промоторы 35S РНК и 19S РНК CaMV [Brisson ., Nature 310:511-514 (1984)], или промотор белка оболочки ВТМ [Takamatsu ., EMBO J. 6:307-311 (1987)]. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения используют растительные промоторы, такие как, например, промотор малой субъединицы RUBISCO [Coruzzi ., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); и Brogli ., Science 224:838-843 (1984)], или промоторы белков теплового шока, например, hsp17.5-E или hsp17.3-B сои [Gurley ., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения конструкции вводят в растительные клетки с помощью Ti-плазмиды, Ri-плазмиды, растительных вирусных векторов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и других способов, хорошо известных специалисту в данной области техники. См., например, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]. Другие системы экспрессии, такие как системы на основе клеток-хозяев насекомых и млекопитающих, которые хорошо известны в данной области техники, также могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением.
[00183] Следует понимать, что помимо необходимых элементов для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности (кодирующей полипептид), конструкция для экспрессии согласно настоящему изобретению также может содержать последовательности, сконструированные для оптимизации стабильности, производства, очистки, выхода или активности экспрессированного полипептида.
[00184] Согласно некоторым вариантам реализации для введения вектора экспрессии согласно настоящему изобретению в систему клетки-хозяина можно использовать различные способы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения такие способы в целом описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) и Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] и включают, например, стабильную или кратковременную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфицирование рекомбинантными вирусными векторами. Также см. патенты США №5464764 и 5487992, в которых описаны способы положительной-отрицательной селекции.
[00185] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения трансформированные клетки культивируют в эффективных условиях, которые обеспечивают экспрессию больших количеств рекомбинантного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффективные условия культивирования включают, но не ограничиваются ими, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и кислородные условия, которые обеспечивают продукцию белка. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения эффективная среда относится к любой среде, в которой клетку культивируют для получения рекомбинантного полипептида согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения среда, как правило, включает водный раствор, содержащий источники усвояемого углерода, азота и фосфата, а также соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать в стандартных биореакторах для ферментации, встряхиваемых колбах, пробирках, планшетах для микротитрования и чашках Петри. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения культивирование осуществляют при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбор условий культивирования находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники.
E. coli
[00186] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, в зависимости от вектора и системы-хозяина, используемых для производства, полученные полипептиды согласно настоящему изобретению остаются в рекомбинантной клетке, секретируются в ферментационную среду, секретируются в пространство между двумя клеточными мембранами, такое как периплазматическое пространство у ; или задерживаются на внешней поверхности клетки или вирусной мембраны.
[00187] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения после заранее определенного периода культивирования осуществляют выделение рекомбинантного полипептида.
[00188] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в настоящей заявке выражение «выделение рекомбинантного полипептида» относится к сбору всей ферментационной среды, содержащей полипептид, и не обязательно подразумевает дополнительные этапы разделения или очистки.
[00189] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению очищают с использованием различных стандартных методик очистки белков, включая, но не ограничиваясь ими, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, фильтрацию, электрофорез, гидрофобную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, хроматографию с обращенной фазой, хроматографию с использованием конканавалина А, хроматографическое фокусирование и дифференциальную солюбилизацию.
et al
et al
[00190] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, чтобы облегчить выделение, экспрессированная кодирующая последовательность может быть сконструирована так, чтобы кодировать полипептид согласно настоящему изобретению и гибридизованный отщепляемый фрагмент. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок может быть сконструирован так, чтобы полипептид можно было легко выделить с помощью аффинной хроматографии; например, путем иммобилизации на колонке, специфичной в отношении отщепляемого фрагмента. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения сайт расщепления конструируют между полипептидом и отщепляемым фрагментом, и полипептид может быть высвобожден из хроматографической колонки с помощью обработки соответствующим ферментом или агентом, который специфично расщепляет гибридный белок в этом сайте [например, см. Booth ., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); и Gardella ., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
[00191] В одном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению выделяют в «по существу чистой» форме.
[00192] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения выражение «по существу чистый» относится к чистоте, которая обеспечивает возможность эффективного использования белка в соответствии со способами применения, описанными в настоящей заявке.
in vitro
in vitro
[00193] В одном варианте полипептид согласно настоящему изобретению также может быть синтезирован с использованием систем для экспрессии в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения способы синтеза в условиях  хорошо известны в данной области техники, и компоненты системы являются коммерчески доступными.
in vivo
in vitro
[00194] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рекомбинантные полипептиды синтезируют и очищают; их терапевтическую эффективность можно оценить в условиях  или в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения получение СТГ, модифицированного CTP, осуществляют с использованием технологии рекомбинантных ДНК.
in vivo
in vitro
[00195] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения рекомбинантные полипептиды синтезируют и очищают; их терапевтическую эффективность можно оценить в условиях  или в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения активность связывания рекомбинантного СТГ, модифицированного CTP, согласно настоящему изобретению можно определить с помощью различных количественных способов исследований.
in vivo
in vitro
in vivo
[00196] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены полипептиды CTP-СТГ-CTP. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для получения полипептидов CTP-СТГ-CTP используют методики рекомбинантных ДНК. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены полипептиды CTP-СТГ-CTP-CTP. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения для получения полипептидов CTP-СТГ-CTP-CTP используют методики рекомбинантных ДНК, описанные в примере 1 и на фиг.1 Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтическую эффективность полипептидов CTP-СТГ-CTP или полипептидов CTP-СТГ-CTP-CTP согласно настоящему изобретению количественно исследуют в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтическую эффективность полипептидов CTP-СТГ-CTP или CTP-СТГ-CTP-CTP согласно настоящему изобретению количественно исследуют в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения связывающую активность рекомбинантных полипептидов СТГ согласно настоящему изобретению измеряют с использованием Nb2 (пролактин-зависимой линии клеток лимфомы крыс (ЕСАСС банк клеток)) или мышиной линии клеток FCD-Р1, предварительно трансфицированных рецептором гормона роста человека. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения связывание СТГ с этими рецепторами индуцирует пролиферацию клеток, которую, в одном варианте реализации настоящего изобретения, измеряют на основании уровней окрашивания клеток MTT в зависимости от активности СТГ. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения активность в условиях  оценивают путем измерения увеличения веса в зависимости от времени у обработанных животных, имеющих дефицит гормона роста.
[00197] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ индукции роста или увеличения веса у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего гормон роста, один карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенный к амино-концу указанного гормона роста, и два CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу гормона роста, индуцируя тем самым рост или увеличение веса у субъекта.
[00198] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ индукции роста или увеличения веса у субъекта, отличного от человека, включающий этап введения указанному субъекту, отличному от человека, терапевтически эффективного количества вектора для экспрессии, содержащего полинуклеотид, состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, причем указанный полипептид состоит из нечеловеческого гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного нечеловеческого гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного нечеловеческого гормона роста, причем указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, индуцируя тем самым рост или увеличение веса у субъекта, отличного от человека.
[00199] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложен способ индукции потери веса или уменьшения содержания жира в организме у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего гормон роста, один карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенный к амино-концу указанного гормона роста, и два CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, индуцируя тем самым потерю веса или уменьшение содержания жира в организме указанного субъекта. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный субъект страдает ожирением. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный субъект имеет избыточный вес тела.
[00200] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ снижения содержания жира в организме субъекта, не относящегося к человеку, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества вектора для экспрессии, содержащего полинуклеотид, причем указанный полинуклеотид состоит из нечеловеческого гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного нечеловеческого гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного нечеловеческого гормона роста, при этом указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, индуцируя тем самым рост или увеличение веса у субъекта, не относящегося к человеку.
[00201] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ снижения жировых отложений у субъекта. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ увеличения мышечной массы у субъекта. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ стимуляции роста мышц у субъекта. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ увеличения соотношения мышечной массы и жира. Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ снижения индекса массы тела (ИМТ) или индекса Кетле.
[00202] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению веса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению высоты. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению веса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению мышечной массы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению веса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению костной массы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению веса. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют по увеличению мышечной массы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения увеличение веса происходит вследствие увеличения веса костной ткани и/или мышечной ткани. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рост измеряют с помощью любой известной оценки, известной специалисту в данной области техники.
Mycobacterium avium
[00203] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды гормона роста человека согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения субъекта, имеющего заболевания, связанные с нарушением роста и веса, такие как дефицита роста, СПИД-ассоциированное истощение, старение, нарушение функции иммунной системы ВИЧ-инфицированных субъектов, катаболическая болезнь, восстановление после хирургического вмешательства, застойная кардиомиопатия, пересадка печени, регенерация печени после резекции печени, хроническая почечная недостаточность, почечная остеодистрофия, остеопороз, ахондроплазия/гипохондроплазия, дисплазия скелета, хроническое воспалительное заболевание или нарушение обмена веществ, такое как болезнь Крона, синдром короткой кишки, ювенильный хронический артрит, муковисцидоз, мужское бесплодие, Х-сцепленный гипофосфатемический рахит, синдром Дауна, расщепление позвоночных дуг, синдром Нунан, ожирение, ухудшение мышечной силы и фибромиалгия. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полипептиды интерферона согласно настоящему изобретению используют для лечения субъекта, имеющего различные заболевания, такие как лейкоз ворсистых клеток (ВКЛ), саркома Капоши (KS), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический гепатит С (ХГС), остроконечные кондиломы (CA), хронический гепатит B, злокачественная меланома, фолликулярная неходжкинская лимфома, рассеянный склероз, хроническая гранулематозная болезнь, комплекс  (MAC), легочный фиброз и остеопороз.
[00204] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть предложены индивидууму по отдельности. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть предложены индивидууму как часть фармацевтической композиции, в которой они смешаны с фармацевтически приемлемым носителем.
[00205] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату одного или более активных ингредиентов, описанных в настоящей заявке, в комбинации с другими химическими компонентами, такими как физиологически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция предназначена для облегчения введения соединения в организм.
[00206] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «активный ингредиент» относится к полипептидной последовательности, представляющей интерес, которая обеспечивает биологический эффект.
[00207] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая из композиций согласно настоящему изобретению будет содержать по меньшей мере две последовательности CTP, связанные белком, представляющим интерес, в любой форме. Согласно одному варианту реализации в настоящем изобретении предложены комбинированные препараты. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «комбинированный препарат» означает «набор компонентов» в том смысле, что компоненты комбинации, определенные выше, можно дозировать независимо друг от друга или путем использования различных фиксированных комбинаций с различными количествами компонентов композиции, т.е. одновременно, совместно, раздельно или последовательно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения части набора компонентов затем можно вводить, например, одновременно или в хронологическом порядке с перерывами, то есть в различные моменты времени и с одинаковыми или различными интервалами времени для любой части набора компонентов. Полные количества компонентов композиции в определенном соотношении, в некоторых вариантах реализации изобретения, могут быть введены в комбинированном препарате. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения специалист в данной области техники может легко изменить комбинированный препарат, например, для того чтобы удовлетворить потребности субпопуляции пациентов, подлежащих лечению, или потребности конкретного пациента, чьи различные потребности могут быть обусловлены конкретным заболеванием, тяжестью заболевания, возрастом, полом или весом тела.
[00208] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения выражения «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут быть использованы взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения в организме и не устраняет биологическую активность и свойства вводимого соединения. Указанные выражения включают адъювант. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения один из ингредиентов, включенных в фармацевтически приемлемый носитель, может представлять собой, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), биологически совместимый полимер с широким диапазоном растворимости в органических и водных средах (Mutter et al. (1979).
[00209] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения термин «вспомогательное вещество» относится к инертному веществу, добавленному к фармацевтической композиции, чтобы дополнительно облегчить введение активного ингредиента. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вспомогательные вещества включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и различные типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.
[00210] Методики изготовления и введения лекарственных препаратов можно найти в «Remington’s Pharmaceutical Sciences,» Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание, которое включено в настоящую заявку посредством ссылки.
[00211] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подходящие пути введения включают, например, пероральную, ректальную, через слизистую оболочку, трансназальную, интестинальную или парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные и интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.
[00212] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения препарат вводят, как правило, местно, а не системно, например, с помощью инъекции препарата непосредственно в конкретную область тела пациента.
[00213] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, в котором фармацевтический состав или фармацевтическую композицию вводят пациенту путем инъекции, введение осуществляют с помощью шприца или шприца-ручки.
[00214] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP согласно настоящему изобретению, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-50 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-25 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 50-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 10-50 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 5 миллиграмм (мг) в 1 мл раствора или 10 мг в 1 мл раствора, или 20 мг в 1 мл раствора, или 40 мг в 1 мл раствора.
[00215] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции один раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции два раза в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции три раза в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции один раз в две недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции один раз через каждые 17 дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептиды, содержащие гормон роста, модифицированный CTP, вводят в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (в/м) инъекции, подкожной (п/к) инъекции или внутривенной (в/в) инъекции один раз каждые 19 дней. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения введение осуществляют путем внутримышечной (в/м) инъекции. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения введение осуществляют путем подкожной (п/к) инъекции. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения введение осуществляют путем внутривенной (в/в) инъекции.
[00216] В область настоящего изобретения включены различные варианты диапазонов дозировок. Дозировка полипептида согласно настоящему изобретению, в одном варианте реализации настоящего изобретения, находится в диапазоне 0,05-80 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,05-50 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,5-5 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 5-80 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 35-65 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 35-65 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 20-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 45-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 120-240 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 240-400 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 45-60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 15-25 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/сутки.
[00217] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 20 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 30 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 40 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 50 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 60 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 70 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 80 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 90 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 100 мг/сутки.
[00218] Дозировка СТГ, модифицированного CTP, согласно настоящему изобретению, в одном варианте реализации настоящего изобретения, находится в диапазоне 0,005-100 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,005-5 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-50 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-5 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,01 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,1 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,2-15 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 0,8-65 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 1-50 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 8-15 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 10-20 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 20-40 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 12-40 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 50-100 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 1-60 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 15-25 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 1-5 мг/неделю.
[002019] В другом варианте реализации дозировка СТГ, введенная субъекту, составляет 50% от стандартной дозировки, введенной контрольному субъекта из этой же популяции субъектов (например, дети, пожилые пациенты, мужчины, женщины, субъекты с дефицитом СТГ, субъекты определенной национальности и т.д.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 30% от дозы, введенной субъекту из конкретной популяции субъектов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 45% от дозы, введенной субъекту из конкретной популяции субъектов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 100% от дозы, введенной субъекту из конкретной популяции субъектов.
[002020] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-5 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 2 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 4 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1,2 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1,8 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка приблизительно соответствует дозировкам, описанным в настоящей заявке.
[00221] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-5 мг/введение. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 2 мг/введение. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 4 мг/введение. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1,2 мг/введение. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1,8 мг/введение. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композицию вводят один раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию вводят один раз в две недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию вводят ежемесячно. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композицию вводят ежедневно.
[00222] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, изготавливают в виде жидкой композиции.
[00223] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, изготавливают в виде лекарственной формы для интраназального введения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, изготавливают в виде лекарственной формы для инъекций. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,0001 мг до 0,6 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,001 мг до 0,005 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,005 мг до 0,01 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,01 мг до 0,3 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,2 мг до 0,6 мг.
[00224] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 1 до 100 мкг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 10 до 80 микрограмм. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 20 до 60 микрограмм. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 10 до 50 микрограмм. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 40 до 80 микрограмм. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 10 до 30 микрограмм. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 30 до 60 микрограмм.
[00225] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 0,2 мг до 2 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 2 мг до 6 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 4 до 10 мг. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту в дозе, которая находится в диапазоне от 5 мг и 15 мг.
[00226] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят путем инъекции в мышцу (внутримышечная инъекция). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят путем инъекции под кожу (подкожная инъекция). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят путем инъекции в мышцу. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят путем инъекции под кожу.
[00227] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению включают повышение приверженности пациентов требованиям схемы лечения с использованием СТГ, включая предоставление субъекту, нуждающемуся в этом, СТГ, модифицированного CTP, повышая тем самым приверженность пациентов требованиям схемы лечения с использованием гормона роста.
in vivo
[00228] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения белковые лекарственные препараты с молекулярной массой менее 50000 дальтон, такие как СТГ, модифицированный CTP, согласно настоящему изобретению, как правило, являются короткоживущими молекулами в условиях  с непродолжительным периодом полувыведения, составляющим несколько часов. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения подкожный путь введения в целом обеспечивает более медленное высвобождение в кровоток. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP-модифицированный полипептид согласно настоящему изобретению увеличивает период полувыведения белковых лекарственных препаратов с молекулярной массой менее 50000 дальтон, таких как СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP-модифицированный полипептид согласно настоящему изобретению позволяет интерферонам оказывать благоприятное действие в течение более длительного периода времени.
[00229] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения иммуногенность CTP-модифицированного полипептида, содержащего гормон роста, модифицированный CTP, соответствует таковой выделенного СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения иммуногенность CTP-модифицированного полипептида, содержащего гормон роста, модифицированный CTP, сопоставима с таковой выделенного СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модификация СТГ, описанная в настоящей заявке, с использованием пептидов CTP уменьшает иммуногенность СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения активность CTP-модифицированного полипептида, содержащего гормон роста, соответствует активности выделенного белка СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP-модифицированный полипептид, содержащий гормон роста, является более активным, чем выделенный СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CTP-модифицированный полипептид, содержащий гормон роста, максимально увеличивает защитную способность гормона роста в отношении деградации и минимально снижает его биологическую активность.
1/2
[00230] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению включают увеличение приверженности требованиям схемы лечения у субъектов, страдающих хроническими заболеваниями, которые нуждаются в терапии СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению обеспечивают снижение частоты дозирования СТГ путем модификации СТГ с использованием CTP, как описано выше. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения термин «приверженность» включает соблюдение предписанного режима. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения способы согласно настоящему изобретению включают увеличение приверженности пациентов, нуждающихся в терапии СТГ, путем снижения частоты введения СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения уменьшение частоты введения СТГ достигается за счет модификаций CTP, которые увеличивают стабильность CTP-модифицированного СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения уменьшение частоты введения СТГ достигается в результате увеличения T гормона роста. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения уменьшение частоты введения СТГ достигается в результате увеличения времени клиренса СТГ. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения уменьшение частоты введения гормона роста достигается в результате увеличения величины AUC гормона роста.
[00231] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ снижения содержания жира в организме у субъекта, не являющегося человеком, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества вектора для экспрессии, содержащего полинуклеотид, причем указанный полинуклеотид состоит из нечеловеческого гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного нечеловеческого гормона роста, а также двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного нечеловеческого гормона роста, при этом указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, индуцируя тем самым рост или увеличение веса у субъекта, не являющегося человеком.
[00232] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ повышения уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта-человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего гормон роста, один карбокси-концевой пептид (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенный к амино-концу указанного гормона роста, и два CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного гормона роста, увеличивая тем самым уровни ИФР-1 у указанного субъекта.
[00233] Согласно другому варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ повышения уровней инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) у субъекта, не являющегося человеком, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества вектора для экспрессии, содержащего полинуклеотид, причем указанный полинуклеотид состоит из нечеловеческого гормона роста, одного карбокси-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина, присоединенного к амино-концу указанного нечеловеческого гормона роста, и двух CTP хорионического гонадотропина, присоединенных к карбокси-концу указанного нечеловеческого гормона роста, при этом указанный полипептид необязательно содержит сигнальный пептид, присоединенный к амино-концу указанного одного CTP, индуцируя тем самым рост или увеличение веса у субъекта, не являющегося человеком.
[00234] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения увеличение уровней ИФР-1 у субъекта-человека может быть эффективным при лечении, профилактике или подавлении сахарного диабета 1 типа, сахарного диабета 2 типа, бокового амиотрофического склероза (БАС, также известного как «болезнь Лу Герига»), тяжелой ожоговой травмы и миотонической мышечной дистрофии (ММД).
[00235] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полипептид, содержащий СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в два дня. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в три дня. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в четыре дня. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в пять дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в шесть дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз в неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз каждые 7-14 дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз каждые 10-20 дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз каждые 5-15 дней. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят субъекту один раз каждые 15-30 дней.
[00236] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 50-500 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 50-150 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 100-200 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 150-250 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 200-300 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 250-400 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 300-500 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка находится в диапазоне 350-500 мг/сутки.
[00237] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 20 мг/сутки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 30 мг/сутки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 40 мг/сутки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 50 мг/сутки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 0,01 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 0,1 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 0,530 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 0,05 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 50 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 20-70 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 5 мг/сутки.
[00238] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/2 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/3 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/4 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/5 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/6 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/9 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/11 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 1-90 мг/14 сут.
[00239] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка гормона роста составляет 10-50 мг/сутки. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/2 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/3 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/4 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/5 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/6 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/неделю. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/9 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/11 сут. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения дозировка составляет 10-50 мг/14 сут.
[00240] Пероральное введение, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, включает стандартную лекарственную форму, включающую таблетки, капсулы, пастилки, жевательные таблетки, суспензии, эмульсии и тому подобное. Перечисленные стандартные лекарственные формы содержат безопасное и эффективное количество желаемого соединения или соединений, каждое из которых согласно одному варианту реализации настоящего изобретения составляет от приблизительно 0,7 или 3,5 мг до приблизительно 280 мг/70 кг, или, в другом варианте, от приблизительно 0,5 или 10 мг до приблизительно 210 мг/70 кг. Фармацевтически приемлемые носители, пригодные для получения стандартных лекарственных форм для перорального введения, хорошо известны в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения таблетки, как правило, содержат стандартные фармацевтически совместимые адъюванты в качестве инертных разбавителей, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, маннит, лактоза и целлюлоза; связующие вещества, такие как крахмал, желатин и сахароза; разрыхлители, такие как крахмал, альгиновая кислота и кроскармеллоза; смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота и тальк. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения улучшающие скольжение вещества, такие как диоксид кремния, могут быть использованы для улучшения характеристик текучести порошковой смеси. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения красители, такие как красители FD&C, могут быть добавлены для улучшения внешнего вида. Подсластители и ароматизаторы, такие как аспартам, сахарин, ментол, перечная мята и фруктовые отдушки, можно применять в качестве адъювантов для жевательных таблеток. Капсулы, как правило, содержат один или более твердых разбавителей, раскрытых выше. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбор носителей зависит от второстепенных факторов, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не являются критическими для целей настоящего изобретения, и может быть легко сделан специалистом в данной области техники.
[00241] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственная форма для перорального введения имеет заранее определенный профиль высвобождения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственная форма для перорального введения согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки или жевательные таблетки с пролонгированным высвобождением. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственная форма для перорального введения согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки или жевательные таблетки с медленным высвобождением. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственная форма для перорального введения согласно настоящему изобретению включает таблетки, капсулы, пастилки или жевательные таблетки с немедленным высвобождением. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственную форму для перорального введения изготавливают в соответствии с желаемым профилем высвобождения фармацевтического активного ингредиента, известным специалисту в данной области техники.
[00242] Композиции для перорального введения, в некоторых вариантах реализации, включают жидкие растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемые носители, пригодные для получения указанных композиций, хорошо известны в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения жидкие композиции для перорального введения содержат от приблизительно 0,012% до приблизительно 0,933% желаемого соединения или соединений, или, в другом варианте реализации настоящего изобретения, от приблизительно 0,033% до приблизительно 0,7%.
[00243] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции для применения в способах согласно настоящему изобретению включают растворы или эмульсии, которые, в некоторых вариантах реализации, представляют собой водные растворы или эмульсии, включающие безопасное и эффективное количество соединений согласно настоящему изобретению и необязательно другие соединения, предназначенные для местного интраназального введения. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции содержат от приблизительно 0,01% до приблизительно 10,0%, масс./об. соединения согласно настоящему изобретению, более предпочтительно от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,0%, которое используют для системной доставки соединений интраназальным путем.
[00244] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят путем внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции жидкого препарата. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения жидкие составы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и тому подобное. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят внутривенно, и для этой цели их изготавливают в форме, пригодной для внутривенного введения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят внутриартериально, и для этой цели их изготавливают форме, пригодной для внутриартериального введения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят внутримышечно, и для этой цели их изготавливают в форме, пригодной для внутримышечного введения.
[00245] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции наносят местно на поверхность тела, и для этой цели их изготавливают в форме, пригодной для местного введения. Подходящие составы для местного применения включают гели, мази, кремы, лосьоны, капли и тому подобное. Для местного введения соединения согласно настоящему изобретению комбинируют с дополнительным соответствующим терапевтическим агентом или агентами, получают и наносят в виде растворов, суспензий или эмульсий в физиологически приемлемом разбавителе с добавлением фармацевтически приемлемого носителя или без него.
[00246] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению изготавливают с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, например, с помощью стандартных способов смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, встраивания или лиофилизации.
[00247] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением изготавливают обычным способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, содержащих вспомогательные вещества и наполнители, которые облегчают переработку активных ингредиентов в препараты, которые могут быть использованы для фармацевтических целей. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения состав зависит от выбранного пути введения.
[00248] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции для инъекций согласно настоящему изобретению изготавливают в виде водных растворов. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции для инъекций согласно настоящему изобретению изготавливают в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнка, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составы для введения через слизистую содержат проникающие вещества, соответствующие типу барьера, который необходимо преодолеть. Такие проникающие вещества, как правило, известны в данной области техники.
[00249] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения препараты, описанные в настоящей заявке, изготавливают для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения составы для инъекций обеспечены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах, необязательно с добавленным консервантом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиции представляют собой суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях и содержат вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.
[00250] Композиции также содержат, в некоторых вариантах реализации, консерванты, такие как хлорид бензалкония, тимеросал и тому подобное; хелатирующие агенты, такие как эдетат натрия и другие; буферы, например, на основе фосфата, цитрата и ацетата; регулирующие тоничность агенты, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит и другие; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистеин, метабисульфит натрия и другие; ароматические агенты; регуляторы вязкости, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт и кислоты и основания для корректировки показателя рН указанных водных композиций, если необходимо. Композиции также содержат, в некоторых вариантах реализации, местные анестетики или другие активные вещества. Композиции могут быть использованы в качестве спреев, аэрозолей, капель и тому подобного.
[00251] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. Помимо этого суспензии активных ингредиентов, в некоторых вариантах реализации, получают в виде подходящих масляных или водных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают, в некоторых вариантах реализации, жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций содержат, в некоторых вариантах реализации, вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения суспензия также содержит подходящие стабилизаторы или агенты, которые повышают растворимость активных ингредиентов, чтобы обеспечить получение высококонцентрированных растворов.
Science
[00252] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения активное соединение может быть доставлено в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer,  249:1527-1533 (1990); Treat et al., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; см. в основном там же).
Biomed. Eng.
N. Engl. J. Med.
Medical Applications of Controlled Release
[00253] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию, доставляемую с использованием системы с контролируемым высвобождением, изготавливают для введения с помощью внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, шприца, липосом или других способов введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения используется насос (см. Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref.  14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al.,  321:574 (1989). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения могут быть использованы полимерные материалы. В другом варианте реализации система с контролируемым высвобождением может быть помещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, т.е. в мозг, что позволяет вводить только часть системной дозы (см., например, Goodson, в , выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer (Science 249: 1527-1533 (1990).
[00254] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения активный ингредиент находится в форме порошка для восстановления подходящим носителем, например, стерильным, не содержащим пирогенов, водным раствором непосредственно перед использованием. Композиции изготавливают, в некоторых вариантах реализации, для введения путем распыления и ингаляции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения композиции содержатся в контейнере с присоединенными средствами распыления.
[00255] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения препарат согласно настоящему изобретению изготовлен в виде композиций для ректального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием, например, обычных основ для суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.
[00256] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения препарат согласно настоящему изобретению изготовлен в виде жидких составов для инъекций с помощью шприца или шприца-ручки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции, подходящие для применения в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения поставленной цели. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, которое является эффективным для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или продления жизни субъекта, подлежащего лечению.
[00257] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения определение терапевтически эффективного количества находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.
[00258] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения составы, предложенные в настоящей заявке, также содержат консерванты, такие как хлорид бензалкония, тимеросал и тому подобное; хелатирующие агенты, такие как эдетат натрия и другие; буферы, например, на основе фосфата, цитрата и ацетата; регулирующие тоничность агенты, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит и другие; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистеин, метабисульфит натрия и другие; ароматические агенты; регуляторы вязкости, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт, а также кислоты и основания для корректировки показателя рН указанных водных композиций, если необходимо. Композиции также содержат местные анестетики и другие активные вещества. Композиции могут быть использованы в качестве спреев, аэрозолей, капель и тому подобного.
[00259] Некоторые примеры веществ, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, включают сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; твердые смазывающие вещества, такие как стеариновая кислота и стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновую кислоту; эмульгаторы, такие как эмульгаторы Tween™; смачивающие агенты, такие, лаурилсульфат натрия; красители; ароматизаторы; агенты для таблетирования, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; не содержащую пирогенов воду; изотонический солевой раствор; и фосфатные буферные растворы. Выбор фармацевтически приемлемого носителя для использования в комбинации с соединением в основном определяется способом, которым должно быть введено соединение. Если соединение согласно настоящему изобретению предназначено для введения путем инъекции, в одном варианте реализации, то фармацевтически приемлемый носитель представляет собой стерильный физиологический солевой раствор, содержащий совместимый с кровью суспендирующий агент, показатель рН которого был доведен до приблизительно 7,4.
[00260] Помимо этого составы дополнительно содержат связующие вещества (например, гуммиарабик, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этилцеллюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, повидон), дезинтегрирующие агенты (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, диоксид кремния, кроскармеллозу натрия, кросповидон, гуаровую камедь, крахмалгликолят натрия), буферы (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат), имеющие различные показатели рН и ионной силы, добавки, такие как альбумин или желатин для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, твин-20, твин-80, плюроновую кислоту F68, соли желчных кислот), ингибиторы протеазы, поверхностно-активные вещества (например, лаурилсульфат натрия), усилители проникновения, солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтиленгликоль глицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия, бутилированный гидроксианизол), стабилизаторы (например, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу), повышающие вязкость агенты (например, карбомер, коллоидный диоксид кремния, этилцеллюлозу, гуаровую камедь), подсластители (например, аспартам, лимонную кислоту), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), смазывающие вещества (например, стеариновую кислоту, стеарат магния, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат натрия), облегчающие скольжение агенты (например, коллоидный диоксид кремния), пластификаторы (например, диэтилфталат, триэтилцитрат), эмульгаторы (например, карбомер, гидроксипропилцеллюлозу, лаурилсульфат натрия), полимерные покрытия (например, полоксамеры или полоксамины), покрытия и пленкообразующие агенты (например, этилцеллюлозу, акрилаты, полиметакрилаты) и/или адъюванты.
[00261] Типичные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жидкую сахарозу, сорбит и воду. Типичные суспендирующие агенты для получения суспензии включают метилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, целлюлозу (например, Avicel™, RC-591), трагакант и альгинат натрия; типичные смачивающие агенты включают лецитин и полиэтиленоксид сорбит (например, полисорбат 80). Типичные консерванты включают метилпарабен и бензоат натрия. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения жидкие композиции для перорального введения также содержат один или более компонентов, таких как подсластители, ароматизаторы и красители, описанные выше.
in vivo
in vivo
[00262] Составы, предложенные в настоящей заявке, также включают встраивание активного материала внутрь или на поверхность дисперсных препаратов полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.д., или на поверхность липосом, микроэмульсий, мицелл, однослойных или многослойных везикул, теней эритроцитов или сферопластов. Такие композиции будут влиять на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения в условиях  и скорость клиренса в условиях .
[00263] В область настоящего изобретения также включены дисперсные композиции, покрытые полимерами (например, полоксамерами или полоксаминами) и соединение, связанное с антителами, направленными против тканеспецифичных рецепторов, лигандов или антигенов, или связанное с лигандами тканеспецифичных рецепторов.
in vivo
[00264] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены соединения, модифицированные путем ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения модифицированные соединения обладают значительно более длительным периодом полувыведения после внутривенной инъекции, чем соответствующие немодифицированные соединения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения модификации также увеличивают растворимость соединения в водном растворе, устраняют агрегацию, усиливают физическую и химическую стабильность соединения, а также значительно уменьшают иммуногенность и реакционную способность соединения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения желаемая биологическая активность в условиях  достигается за счет введения таких аддуктов полимер-соединение с меньшей частотой или в меньших дозах, чем немодифицированного соединения.
in vitro
[00265] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения получение эффективного количества или дозы можно первоначально оценить на основании результатов количественных исследований в условиях . Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения доза может быть определена в животных моделях, и такая информация может быть использована для более точного определения подходящих доз у человека.
in vitro
in vitro
[00266] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения токсичность и терапевтическую эффективность активных ингредиентов, описанных в настоящей заявке, можно определить с помощью стандартных фармацевтических методик в условиях , в клеточных культурах или на экспериментальных животных. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения данные, полученные с помощью количественных исследований в условиях  и с использованием клеточных культур, а также исследований на животных, могут быть использованы при определении диапазона доз для применения у человека. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дозы варьируются в зависимости от используемой лекарственной формы и пути введения. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния пациента. [См., например, Fingl, et al., (1975) «The Pharmacological Basis of Therapeutics», Ch. 1 p.1].
[00267] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, в зависимости от тяжести и восприимчивости состояния, подлежащего лечению, дозу можно водить с помощью одного или более введений, при этом курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких недель или до выздоровления, или до снижения степени тяжести патологического состояния.
[00268] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения количество композиции или состава для введения будет, очевидно, зависеть от субъекта, подлежащего лечению, тяжести заболевания, способа введения, решения лечащего врача и т.д.
[00269] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции, включая препарат согласно настоящему изобретению, изготовленные в совместимом фармацевтическом носителе, также должны быть получены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния.
[00270] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, вводят системно. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гормон роста, описанный в настоящей заявке, вводят путем внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения СТГ, модифицированный CTP, представляет собой лиофилизированный (т.е. высушенный с помощью сублимационной сушки) препарат в комбинации со сложными органическими вспомогательными веществами и стабилизаторами, такими как неионные поверхностно-активные вещества (т.е. сурфактанты), различные сахара, органические полиолы и/или сывороточный альбумин человека. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, в стерильной воде для инъекций. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный гормон роста, описанный в настоящей заявке, в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) для инъекций. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный гормон роста, описанный в настоящей заявке, в стерильном 0,9% растворе NaCl для инъекций.
[00271] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, также изготовлена с добавлением сложных носителей, таких как сывороточный альбумин человека, полиолы, сахара и анионные поверхностно-активные стабилизирующие агенты. См., например, WO 89/10756 (Hara et al., с содержанием полиола и п-гидроксибензоата). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит гормон роста, описанный в настоящей заявке, и также изготовлена с добавлением лактобионовой кислоты и ацетатного/глицинового буфера. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, также изготовлена с добавлением аминокислот, таких как аргинин или глутамат, которые повышают растворимость композиций интерферона в воде. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, и также изготовлена с добавлением глицина или сывороточного альбумина человека (САЧ), буфера (например, ацетата) и изотонического агента (например, NaCl). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, и также изготовлена с добавлением фосфатного буфера, глицина и САЧ.
[00272] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабильна при внесении в забуференные растворы, имеющие показатель рН в диапазоне от приблизительно 4 до 7,2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабильна при внесении в забуференные растворы, имеющие показатель рН в диапазоне от приблизительно 6 до 6,4. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабильна при внесении в забуференные растворы, имеющие показатель рН равный 6,0. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабильна при внесении в забуференные растворы, имеющие показатель рН равный 6,2. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабильна при внесении в забуференные растворы, имеющие показатель рН равный 6,4. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, стабилизирована аминокислотой в качестве стабилизирующего агента и, в некоторых случаях, солью (если аминокислота не содержит заряженную боковую цепь). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна при комнатной температуре. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна при 4°C. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна при 5°C. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна при -20°C. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна в течение по меньшей мере трех месяцев. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна в течение по меньшей мере шести месяцев. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна в течение по меньшей мере одного года. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция стабильна в течение по меньшей мере двух лет.
[00273] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, изготовлена в виде жидкой композиции, содержащей стабилизирующий агент в количестве от приблизительно 0,3% до 5% по массе, который представляет собой аминокислоту.
[00274] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, обеспечивает точность дозирования и безопасность продукта. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, обеспечивает биологически активный, стабильный жидкий состав для применения путем инъекций. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит нелиофилизированный СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке.
[00275] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, обеспечивает жидкий состав, который можно хранить в течение длительного периода времени в жидком состоянии, облегчая тем самым хранение и транспортировку перед введением.
[00276] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит твердые липиды в качестве матриксного материала. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция для инъекций, содержащая гормон роста, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит твердые липиды в качестве матриксного материала. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения получение липидных микрочастиц путем распылительного замораживания было описано в работе Speiser (Speiser et al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54), с последующим получением липидных наноосадков для перорального введения (Speiser EP 0167825 (1990)). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения используемые липиды хорошо переносятся организмом (например, глицериды, состоящие из жирных кислот, которые присутствуют в эмульсиях для парентерального питания).
[00277] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, обеспечена в виде липосом (J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267-275).
[00278] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит полимерные микрочастицы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция для инъекций, содержащая гормон роста, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит полимерные микрочастицы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит наночастицы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит липосомы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит липидную эмульсию. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит микросферы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит липидные наночастицы. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит липидные наночастицы, содержащие амфифильные липиды. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция, содержащая СТГ, модифицированный CTP, описанный в настоящей заявке, содержит липидные наночастицы, содержащие лекарственный препарат, липидный матрикс и поверхностно-активное вещество. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения содержание моноглицеридов в липидном матриксе составляет по меньшей мере 50% масс./масс.
[00279] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения композиции согласно настоящему изобретению обеспечены в упаковке или дозирующем устройстве, таком как набор, одобренный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA), который содержит одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения упаковка или дозирующее устройство сопровождается инструкциями по введению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения упаковка или дозирующее устройство сопровождается уведомлением, связанным с контейнером, в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов, при этом уведомление отражает одобрение указанным агентством формы указанных композиций для введения человеку или животным. Такое уведомление, в одном варианте, представляет собой маркировку, одобренную Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США, для отпускаемых по рецепту лекарственных препаратов или одобренный листок-вкладыш.
[00280] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения следует понимать, что СТГ, модифицированный CTP, согласно настоящему изобретению, может быть предложен индивидууму с дополнительными активными агентами для достижения улучшенного терапевтического эффекта по сравнению с лечением каждым агентом по отдельности. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, чтобы свести до минимума количество нежелательных побочных эффектов, которые связаны с комбинированной терапией, предпринимают определенные меры (например, дозирование и выбор дополнительного агента).
[00281] Дополнительные цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники после изучения следующих примеров, которые не являются ограничивающими. Помимо этого каждый из различных вариантов реализации и аспектов настоящего изобретения, описанных выше и заявленных в формуле изобретения, находит экспериментальное подтверждение в нижеследующих примерах.
ПРИМЕРЫ
[00282] В целом номенклатура, используемая в настоящей заявке, и лабораторные методики, используемые в настоящем изобретении, включают методики молекулярной биологии, биохимии и микробиологии, а также методики рекомбинантных ДНК. Такие методики подробно описаны в литературе. См., например, «Molecular Cloning: A laboratory Manual» Sambrook et al., (1989); «Current Protocols in Molecular Biology» Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., «Recombinant DNA», Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) «Genome Analysis: A Laboratory Manual Series», Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики, приведенные в патентах США 4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; «Cell Biology: A Laboratory Handbook», Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); «Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique» by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; «Current Protocols in Immunology» Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), «Basic and Clinical Immunology» (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), «Selected Methods in Cellular Immunology», W. H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммунологические количественные способы исследований подробно описаны в патентах и специальной литературе, см., например, патенты США №№3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; «Oligonucleotide Synthesis» Gait, M. J., ed. (1984); «Nucleic Acid Hybridization» Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); «Transcription and Translation» Hames, B. D., и Higgins S. J., eds. (1984); «Animal Cell Culture» Freshney, R. I., ed. (1986); «Immobilized Cells and Enzymes» IRL Press, (1986); «A Practical Guide to Molecular Cloning» Perbal, B., (1984) и «Methods in Enzymology» Vol. 1-317, Academic Press; «PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications», Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., «Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual» CSHL Press (1996); все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки. Другие общие ссылки приведены в тексте данного документа.
ПРИМЕР
1
Получение конструкций СТГ человека
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
[00283] Были синтезированы четыре клона СТГ человека (варианты белка массой 20 кДа). Фрагменты XbaI -NotI, содержащие последовательности СТГ человека из четырех вариантов, лигировали в эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr, предварительно расщепленный с использованием ферментов рестрикции XbaI и NotI. Получали ДНК из 4 клонов (401-0, 1, 2, 3 и 4). Также синтезировали другой частичный клон СТГ человека (1-242 п.о.) из белка 22 кДа (0606114). Праймеры заказывали в Sigma-Genosys. Последовательности праймеров, использованные для получения полипептидов СТГ человека-CTP согласно настоящему изобретению, приведены в таблице 1 ниже.
<b>Таблица 1</b>
Номер праймера
SEQ ID NO
Последовательность
Сайт рестрикции (подчеркнут в последова-тельности)
25
27
5’ CTCTAGAGGACATGGCCAC 3’
XbaI
32<sup>R</sup>
28
5’ ACAGGGAGGTCTGGGGGTTCTGCA 3’
33
29
5’ TGCAGAACCCCCAGACCTCCCTGTGC 3’
4<sup>R</sup>
30
5’ CCAAACTCATCAATGTATCTTA 3’
25
31
5’ CTCTAGAGGACATGGCCAC 3’
XbaI
35<sup>R</sup>
32
5’ CGAACTCCTGGTAGGTGTCAAAGGC 3’
34
33
5’ GCCTTTGACACCTACCAGGAGTTCG 3’
37<sup>R</sup>
34
5’ ACGCGGCCGCATCCAGACCTTCATCACTGAGGC 3’
NotI
39<sup>R</sup>
35
5’ GCGGCCGCGGACTCATCAGAAGCCGCAGCTGCCC 3’
Конструкция 402-0-p69-1 (СТГ человека) SEQ ID NO: 36:
[00284]  MOD-4020 представляет собой рекомбинантный гормон роста человека дикого типа (без CTP), который был получен для использования в качестве контроля в описанных ниже экспериментах.
R
[00285] Выполняли три реакции ПЦР. Первую реакцию выполняли с использованием праймеров 25 и 32 и плазмидной ДНК 0606114 (частичный клон СТГ человека, содержащий 1-242 п.н.) в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 245 п.н.
R
[00286] Вторую реакцию проводили с использованием праймеров 33 и 4 и плазмидной ДНК 401-0-p57-2 в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 542 п.н.
R
[00287] Последнюю реакцию проводили с использованием праймеров 25 и 4 и смеси продуктов двух предыдущих реакций в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 705 п.н., и лигировали в TA-вектор для клонирования (Invitrogen, каталожный номер K2000-01). Фрагмент XbaI-NotI, содержащий последовательность СТГ-0 человека, лигировали в эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr. Клетки СНО DG-44 трансфицировали указанным вектором. Клетки выращивали в среде, не содержащей белков.
Конструкция 402-1-p83-5 (СТГ человека-CTP) - SEQ ID NO: 37 и 402-2-p72-3 (СТГ человека-CTP×2) - SEQ ID NO: 38:
[00288]  MOD-4021 представляет собой рекомбинантный гормон роста человека, который был гибридизован с 1 копией C-концевого пептида бета-цепи хорионического гонадотропина человека (CTP). Кассету CTP MOD-4021 присоединяли к С-концу (одна кассета). MOD-4022 представляет собой рекомбинантный гормон роста человека, который был гибридизован с 2 копиями С-концевого пептида бета-цепи хорионического гонадотропина человека (CTP). Два кассеты CTP MOD-4022 присоединяли к С-концу (две кассеты).
[00289] Конструирование СТГ человека-CTP и СТГ человека-CTP-CTP проводили аналогичным образом, как и конструирование СТГ человека-0. pCI-dhfr-401-1-p20-1 (hGH*-ctp) и pCI-dhfr-401-2-p21-2 (hGH*-ctp x2) использовали в качестве матриц во второй реакции ПЦР.
[00290] MOD-4021 и MOD-4022 экспрессировали в клетках СНО DG-44. Клетки размножали в среде, не содержащей белка. Молекулярная масса MOD-4021 составляет ~30,5 кДа поскольку СТГ человека имеет молекулярную массу 22 кДа, тогда как каждая «кассета CTP» добавляет по 8,5 кДа к общей молекулярной массе (см. фигуру 1). Молекулярная масса MOD-4022 составляет ~39 кД (см. фигуру 1).
Конструирование 402-3-p81-4 (CTP-СТГ человека-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 39 и 402-4-p82-9 (CTP*СТГ человека-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 40:
[00291]  MOD-4023 представляет собой рекомбинантный гормон роста человека, который был гибридизован с 3 копиями C-концевого пептида бета-цепи хорионического гонадотропина человека (CTP). Три кассеты CTP MOD-4023 присоединяли к N-концу (одна кассета) и С-концу (две кассеты). MOD-4024 представляет собой рекомбинантный гормон человека роста, который гибридизовали с 1 укороченной и 2 полноразмерными копиями C-концевого пептида бета-цепи хорионического гонадотропина человека (CTP). Кассету усеченного CTP MOD-4024 присоединяли к N-концу, и две кассеты CTP присоединяли к С-концу (две кассеты).
R
R
R
[00292] Проводили три реакции ПЦР. Первую реакцию проводили с использованием праймера 25 и праймера 35 и плазмидной ДНК p401-3-p12-5 или 401-4-p22-1 в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 265 или 220 п.н. Вторую реакцию проводили с использованием праймера 34 и праймера 37 и плазмидной ДНК TA-hGH-2-q65-1 в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 695 п.н. Последнюю реакцию проводили с использованием праймеров 25 и 37 и смеси продуктов предыдущих двух реакций в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 938 или 891 п.н., и лигировали в TA-вектор для клонирования (Invitrogen, каталожный номер K2000-01). Фрагмент XbaI-NotI, содержащий последовательность СТГ человека, лигировали в эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr. (фигура 3)
[00293] MOD-4023 и MOD-4024 экспрессировали в клетках СНО DG-44. Клетки размножали в среде, не содержащей белков. Молекулярная масса MOD-4023 составляет ~47,5 кДа (см. фигуру 1), и молекулярная масса MOD-4024 составляет ~ 43,25 кДа (фигура 1).
Конструкция 402-6-p95a-8 (CTP-СТГ человека-CTP) - SEQ ID NO: 41:
[00294]  Конструирование СТГ-6 человека проводили таким же образом, как и конструирование СТГ-3 человека. pCI-dhfr-402-1-p83-5 (СТГ человека-CTP) использовали в качестве матрицы во второй реакции ПЦР.
Конструкция 402-5-p96-4 (CTP-СТГ человека) - SEQ ID NO: 42:
R
[00295]  Реакцию ПЦР проводили с использованием праймера 25 и праймера 39 и плазмидной pCI-dhfr-ctp-EPO-ctp (402-6-p95a-8) в качестве матрицы; в результате ПЦР-амплификации получали продукт, содержащий 763 п.н., и лигировали в TA-вектор для клонирования (Invitrogen, каталожный номер K2000-01). Фрагмент XbaI-NotI, содержащий последовательность CTP-СТГ человека, лигировали в эукариотический вектор экспрессии pCI-dhfr с получением клона 402-5-p96-4.
ПРИМЕР
2
Исследования биологической активности полипептидов СТГ человека-CTP согласно настоящему изобретению в условиях in vivo
[00296] Следующий эксперимент проводили, чтобы испытать потенциальную биологическую активность полипептидов СТГ человека-CTP на протяжении длительного периода времени, по сравнению с коммерческим рекомбинантным СТГ человека и MOD-4020.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
[00297] Самкам крыс с удаленным гипофизом (60-100 г) еженедельно вводили путем подкожной инъекции 21,7 мкг полипептидов СТГ человека-CTP или 5 мкг контрольного коммерческого рСТГ человека путем п/к инъекции один раз в сутки.
[00298] Вес измеряли у всех животных до начала лечения, через 24 часа после первой инъекции, а затем через день до завершения исследования на 21-й день, Каждая точка представляет процент среднего увеличения веса в группе ((вес 0-й день - вес последний день)/вес 0-й день). Среднее увеличение веса нормировали к аналогичному показателю для коммерческого СТГ человека, который вводили путем инъекции один раз в сутки. Схема лечения представлена в таблице 2.
<b>Таблица 2</b>
<b></b><b><i>№</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Лекарственный препарат</i></b><b></b>
<b></b><b><i>N</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Путь введения</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Схема лечения</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Эквимолярная доза</i></b><b></b><b></b><b><i>(мкг/крысу)</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Совокупная доза (мкг/крысу)</i></b><b></b>
<b></b><b><i>Объем дозы (мл)</i></b><b></b>
<b></b><b><i>1</i></b><b></b>
Носитель
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
Нет данных
Нет данных
0,25
<b></b><b><i>2</i></b><b></b>
Пустой вектор
7
п/к
Дни 1, 7 и 13;1/неделю
Нет данных
Нет данных
0,25
<b></b><b><i>3</i></b><b></b>
MOD-4020SEQ ID NO: 36
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>4</i></b><b></b>
MOD-4021SEQ ID NO: 37
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>5</i></b><b></b>
MOD-4022SEQ ID NO: 38
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>6</i></b><b></b>
MOD-4023SEQ ID NO: 39
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>7</i></b><b></b>
MOD-4024SEQ ID NO: 40
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>8</i></b><b></b>
Коммерческий СТГ человека v.1
7
п/к
Дни 1, 7 и 13; 1/неделю
21,7
65
0,25
<b></b><b><i>9</i></b><b></b>
Коммерческий СТГ человека v.1
7
п/к
Дни 1-13; 1/неделю
5
65
0,25
РЕЗУЛЬТАТЫ
[00299] Результаты обобщены на фигуре 2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) и MOD-4024 (SEQ ID NO: 40) индуцировали более чем 120%-ное увеличение веса по сравнению с коммерческим рСТГ человека, индуцировавшим 100%-ное увеличение веса.
ВЫВОД
[00300] Три еженедельные дозы (дни инъекций: 1, 7 и 13) 21,7 мкг MOD-4023 (SEQ ID NO: 39) и MOD-4024 (SEQ ID NO: 40) индуцировали увеличение веса у крыс с удаленным гипофизом, которое на 30% превышало увеличение веса для коммерческого рСТГ человека, который ежедневно вводили путем инъекции в аналогичной совокупной дозе 5 мкг/сутки в течение 13 дней.
ПРИМЕР 3
Фармакокинетические исследования CTP-модифицированного СТГ
[00301] Фармакокинетические исследования с введением однократных доз проводили на крысах Sprague-Dawley. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с Законом об охране животных, требованиями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, а также под наблюдением и при наличии одобрения Институциональных комитетов по уходу и использованию животных Modigene, Biotechnology General Ltd. Крыс содержали по отдельности или по две особи в каждой клетке в помещениях с 12-часовым циклом свет/темнота. Доступ к воде (коммунального водоснабжения) и несертифицированному корму для грызунов был неограниченным.

[00302] Чтобы сравнить фармакокинетику CTP-СТГ человека-CTP-CTP и СТГ у крыс, формировали четыре группы крыс Sprague-Dawley (270-290 г), включавшие от трех до шести самцов крыс в группе. Крыс случайным образом распределяли на четыре группы (таблица 3). Крысам однократно вводили путем п/к или в/в инъекции СТГ (50 мкг/кг в/в или п/к) или CTP-СТГ человека-CTP-CTP (108 мкг/кг в/в или п/к). За исключением образца, отобранного до введения дозы, который получали под анестезией изофлураном, сбор крови проводили у животных без анестезии. Образцы крови (приблизительно 0,25 мл) собирали в покрытые ЭДТА пробирки Microtainer для исследований плазматической концентрации CTP-СТГ человека-CTP-CTP с помощью ИФА в моменты времени, указанные в таблице 11. После каждого отбора проб объем крови восполняли равным объемом стерильного 0,9% физиологического раствора. Образцы хранили на льду не более 1 часа перед центрифугированием и сбором плазмы. Образцы плазмы хранили при приблизительно -20°C до проведения исследований.
<b>Таблица 3</b><b>Экспериментальный дизайн исследования фармакокинетики у крыс</b>
Группа лечения
Исследуемый препарат
Кол-во животных в группе/временная точка
Путь введения
Пол
Уровень дозы(мкг/кг)
Введенный объем (мкл)
Конц. (мкг/мл)/Общий объем (мл)
Временные точки*(часы после введения дозы)
1
Биотропин
6#
п/к
Самцы
50
500
20/5
0 (до введения дозы), 0,5, 2, 4, 8, 24, 48
2
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
6#
п/к
Самцы
108
500
43,2/5
0,5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96
3
Биотропин
6#
в/в
Самцы
50
300
20/3
0, 0,12, 2, 4, 8, 24
4
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
6#
в/в
Самцы
108
300
43,2/3
0,12, 2, 4, 8, 24, 48, 72
Объем образца крови/временная точка - 500 мкл
Последние образцы крови
#3 крыс на каждую временную точку.
[00303] Коммерческий набор для сэндвич-ИФА, специфичный для детектирования гормона роста человека (Roche Diagnostics), использовали для оценки образцов плазмы крови крыс. Этот набор позволяет детектировать гормон роста человека в плазме крови с помощью антитела при проведении исследования с помощью сэндвич-ИФА. Указанный набор первоначально использовали для измерения концентрации CTP-СТГ человека-CTP-CTP в плазме крови крыс. Для этих образцов плазмы использовали стандартную кривую CTP-СТГ человека-CTP-CTP (1,2-100 нг/мл), и концентрации CTP-СТГ человека-CTP-CTP в плазме крови крыс интерполировали из этой кривой.
1/2
max
max
[00304] Стандартные фармакокинетические параметры, включая клиренс (CL или CL/F), объем распределения (Vd или VD/F), период полувыведения (T), площадь под кривой плазматическая концентрация-время (AUC), максимальную наблюдаемую концентрацию в плазме (C) и время до достижения максимальной наблюдаемой концентрации в плазме крови (T), получали на основании кривых зависимости концентрации альбутропина или СТГ в плазме крови от времени с помощью некомпартментного метода анализа, используя программы для моделирования WinNonlin (Pharsight, версия 3.1). Данные о концентрации CTP-СТГ человека-CTP-CTP или СТГ в плазме крови были равномерно взвешены для этого анализа. Величины AUC рассчитывали, используя логарифмическо-линейный метод трапеций для данных, полученных при в/в введении, и линейно-логарифмический метод трапеций для данных, полученных при п/к введении. Профили концентрации в плазме для каждой крысы (за исключением данных, полученных при п/к введении альбутропина) или обезьян исследовали по отдельности, и средние значения ± стандартная ошибка среднего (S.E.M.) для фармакокинетических параметров приведены в таблице 4 и на фигуре 4.
[00305] CTP-СТГ человека-CTP-CTP представляет собой одноцепочечный белок, состоящий из 275 аминокислот и не более двенадцати О-связанных углеводов. Структура состоит из модифицированного гормона роста человека (соматотропина), присоединенного к трем копиям С-концевого пептида (CTP) бета-цепи хорионического гонадотропина человека (ХГЧ); одна копия присоединена на N-конце и две копии (тандемным образом) на С-конце. Гормон роста человека содержит 191 аминокислоту. CTP содержит 28 аминокислот и четыре О-связанных сахарных цепи.
ПРИМЕР 4
Фармакокинетика CTP-модифицированного СТГ у крыс линии Sprague-Dawley
[00306] Фармакокинетику CTP-СТГ человека-CTP-CTP оценивали и сопоставляли с фармакокинетикой коммерческого СТГ человека (биотропина).
[00307]
<b>Таблица 4</b><b>Средние значения фармакокинетических параметров после в/в и п/к введения однократной дозы CTP-СТГ человека-CTP-CTP и СТГ (биотропина) у крыс Sprague-Dawley.</b>
Статистика ФК
п/к
в/в
Параметры
Единицы
Биотропин
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
Биотропин
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
Доза
мг/кг
50
50
50
50
AUClast
ч∙нг/мл
41
680
162,7
1568,3
C<sub>max</sub>
нг/мл
13
36,8
275,8
926
T<sub>max</sub>
ч
0,5
8
0
0
MRT
ч
2,5
12,9
0,5
9,9
T<sub>1/2</sub>α
ч
1,58
0,74
T<sub>1/2</sub>β
ч
1,73
9
0,5
6,9
Статистический анализ данных
[00308] Исследование образцов сыворотки крови проводили для того чтобы определить конкретные концентрации для каждого образца. Концентрацию и данные в каждой временной точке обрабатывали с использованием некомпартментного анализа WinNonlin.
1/2
max
max
[00309] Параметры, которые были определены, включали: AUC, MRT, T, C и T. На фигуре 4 приведен более благоприятный фармакокинетический профиль концентрации CTP-СТГ человека-CTP-CTP в плазме крови по сравнению с концентрацией СТГ (пг/мл) после однократного в/в или п/к введения дозы CTP-СТГ человека-CTP-CTP или СТГ у крыс (n=3-6 на дозу/путь введения).
[00310] После однократного подкожного введения дозы 50 мкг/кг клиренс CTP-СТГ человека-CTP-CTP из крови крыс SD был значительно медленнее, чем клиренс CTP-СТГ человека-CTP и биотропина. Соответствующие рассчитанные величины периода полувыведения и AUC составили:
Биотропин
T<sub>1/2</sub>
1,7 ч
AUC
41 ч∙нг/мл
CTP-СТГ человека-CTP
T<sub>1/2</sub>
8,5 ч
AUC
424 ч∙нг/мл
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
T<sub>1/2</sub>
9,0 ч
AUC
680 ч∙нг/мл
Вывод: CTP-СТГ человека-CTP-CTP был выбран в качестве окончательного кандидата из 6 других вариантов. CTP-СТГ человека-CTP-CTP продемонстрировал превосходную функциональность с точки зрения биологической активности и фармакокинетики.
ПРИМЕР 5
Количественное исследование увеличения веса (WGA) для CTP-модифицированного СТГ при введении однократной дозы/многократных доз
[00311] Самцов крыс с удаленным гипофизом (интерауральный метод), 3-4-недельного возраста, получали из CRL Laboratories. Во время послеоперационного периода акклиматизации продолжительностью 3 недели крыс исследовали и взвешивали два раза в неделю, чтобы исключить животных, которые, как предполагали, имели не полностью удаленный гипофиз, о чем свидетельствовало увеличение веса тела, аналогичное таковому у ложнооперированных крыс. Крыс с не полностью удаленным гипофизом исключали из исследования. Во время эксперимента средний вес тела крыс с удаленным гипофизом составил 70-90 г. Это стандартное количественное биологическое исследование, соответствующее требованиям Фарм. США и Фарм. ЕС, для определения СТГ человека. Гипофизэктомированные крысы (крысы, у которых был удален гипофиз) теряют способность набирать вес. Инъекции СТГ человека (и CTP-СТГ человека-CTP-CTP) указанным крысам приводят к увеличению веса. На основании измеренного увеличения веса на протяжении определенного периода времени и количества введенного гормона роста определяют удельную активность СТГ человека (и CTP-СТГ человека-CTP-CTP). Крысам вводили либо однократную п/к дозу 0,4, 0,8 и 4 мг/кг, либо многократные п/к дозы 0,6 и 1,8 мг/кг в течение 3 недель с 4-дневными интервалами между введениями. Индивидуальные значения веса тела всех животных определяли при рандомизации, перед введением первой дозы, затем каждые два дня или, в случае умерших животных, в момент смерти, и перед умерщвлением.
Количественное исследование увеличения веса при введении однократных и многократных доз
[00312] Результаты сравнения ответной ростовой реакции всего тела после применения различных схем дозирования CTP-СТГ человека-CTP-CTP у крыс с удаленным гипофизом приведены на фигуре 5. Результаты указывают на то, что действие однократной инъекции 0,4 и 0,8 мг/кг/сутки СТГ человека-CTP было эквивалентно таковому 4 ежедневных инъекций 0,1 мг/кг/сутки биотропина. Пик эффекта СТГ человека-CTP наблюдали через два дня.
[00313] На фигуре 6 еще раз показано, что площадь под кривой после однократной инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP коррелирует с увеличением веса тела крыс. Следовательно, совокупные данные указывают на то, что увеличение веса тела значительно коррелирует с величиной кумулятивной AUC.
[00314] Конструкция СТГ человека-CTP, при введении с интервалом в 4 дня, обеспечивает увеличение веса, которое аналогично таковому после ежедневных инъекций биотропина, как показано на фигуре 7. Как ожидается, у человека период полувыведения СТГ человека будет в 5 раз лучше, чем у крыс, это указывает на то, что потенциальное максимальное действие у человека будет достигнуто через 10 дней для однократной инъекции. Полученные результаты поддерживают целесообразность введения конструкции СТГ человека-CTP, CTP-СТГ человека-CTP-CTP, один раз в неделю или раз в две недели у человека.
ПРИМЕР 6
Исследования фармакодинамики/фармакокинетики CTP-модифицированного СТГ
[00315] Самцов крыс с удаленным гипофизом (интерауральный метод), 3-4-недельного возраста, получали из CRL Laboratories. Во время послеоперационного периода акклиматизации продолжительностью 3 недели крыс исследовали и взвешивали два раза в неделю, чтобы исключить животных, которые, как предполагали, имели не полностью удаленный гипофиз, о чем свидетельствовало увеличение веса тела, аналогичное таковому у ложнооперированных крыс. Крыс с не полностью удаленным гипофизом исключали из исследования. Во время эксперимента средний вес тела крыс с удаленным гипофизом составил 70-150 г.
[00316] Крысам вводили однократно п/к CTP-СТГ человека-CTP-CTP, носитель, гормон роста человека CTP-СТГ человека-CTP-CTP, или гормон роста человека (20 мкг/крысу) вводили путем подкожной инъекции в объеме 0,2 мл/крысу. Доза СТГ составила 0,35 и 1,05 мкг/кг, доза гормона роста, которая была эквимолярна количеству СТГ, содержащемуся в соответствующих дозах CTP-СТГ человека-CTP-CTP 0,6 и 1,8 мкг/кг. Описание исследуемых групп приведено в таблице 5. После инъекции образцы плазмы для исследований концентрации ИФР-1 получали в моменты времени, описанные в таблице 5. Образцы исследовали для определения концентрации ИФР-1 с использованием коммерческого набора для ИФА (R&D systems).
<b>Таблица 5</b><b>Схема лечения в исследовании крыс с удаленным гипофизом</b>
Группа лечения
Исследуемое соединение
Кол-во животных в группе/временная точка
Путь введения
Экв. доза(мг/крысу)
Экв. дозировка(мг/кг)
Конц. CTP-СТГ человека-CTP-CTP (мг/мл)
Объем дозы (мл)
Временные точки*(часы после введения дозы)
M7
Биотропин
9
п/к
0,032
0,35
0,16
0,2
0 (до введения дозы), 0,5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96
M8
Биотропин
9
п/к
0,095
1,05
0,475
0,2
0 (до введения дозы), 0,5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96
M9
EN648-01-08-005
12
п/к
0,032 (0,055)
0,35 (0,6)
0,275
0,2
1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96
M10
EN648-01-08-005
12
п/к
0,095 (0,165)
1,05 (1,8)
0,825
0,2
1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96
Объем образца крови/временная точка - 500 мкл
Последние образцы крови
max
max
[00317] Некомпартментный фармакокинетический анализ проводили на кривых зависимости средней концентрации в плазме крови от времени для каждой группы. Величина C CTP-СТГ человека-CTP-CTP была значительно выше, чем величина C биотропина. Терминальный период полувыведения CTP-СТГ человека-CTP-CTP был в 6 раз больше, чем аналогичный показатель для биотропина.
[00318]
<b>Таблица 6</b><b>Оценки фармакокинетических параметров CTP-СТГ человека-CTP-CTP и биотропина после однократной подкожной инъекции у крыс с удаленным гипофизом</b>
Группа
Доза
Пол
C<sub>max</sub>
T<sub>max</sub>
AUC<sub>0-∞</sub>
AUC<sub>0-t</sub>
CL/F
T<sub>1/2</sub>
мг/кг
нг/мл
ч
нг∙ч/мл
нг∙ч/мл
мл/ч/кг
ч
CTP-СТГ человека-CTP-CTP
1,8
M
2,150
8
37,713
37,695
0,928
6,86
0,6
M
681
8
11,505
11,489
3,042
6,8
СТГ человека
1,05
M
1,078
0,5
3,541
3,540
9,884
1
0,35
M
439
0,5
1,279
1,279
27,36
1
0-t
0-∞
max
max
max
1/2
[00319] Величины AUC и AUC были очень близкими, это указывает на то, что продолжительность отбора образцов была надлежащей для получения характеристик профилей фармакокинетики. Величина AUC CTP-СТГ человека-CTP-CTP была в 10 раз выше, чем у биотропина. Помимо этого величина C в целом была пропорциональна дозе, и для CTP-СТГ человека-CTP-CTP она была в два раза выше, чем C биотропина. Однако, как показано на фигуре 8, величина T CTP-СТГ человека-CTP-CTP составила 8 ч по сравнению с 0,5 ч для биотропина, и терминальный период полувыведения, по-видимому, не изменялся в зависимости от уровня дозы. Показатель T CTP-СТГ-CTP-CTP был в 6,8 раза выше, чем у биотропина.
[00320] Косвенное воздействие СТГ главным образом опосредовано инсулиноподобным фактором роста I (ИФР-1), гормоном, который выделяется из печени и других тканей в ответ на гормон роста. Большая часть эффектов гормона роста, направленных на усиление роста, фактически обусловлена ИФР-1, который действует на свои клетки-мишени. Соответственно, оценивали влияние конструкции CTP-СТГ человека, CTP-СТГ человека-CTP-CTP, на уровни ИФР-1 в сыворотке крови крыс с удаленным гипофизом. На фигуре 9 представлены результаты определения уровней ИФР-1 в сыворотке крови у крыс с удаленным гипофизом после п/к инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP и коммерческого СТГ человека.
[00321] Однократную дозу CTP-СТГ человека-CTP-CTP 0,6 или 1,8 мг/кг и однократную дозу биотропина 0,35 или 1,05 мг/кг вводили путем подкожной инъекции крысам с удаленным гипофизом для определения профиля ФК/ФД. Уровни ИФР-1 в сыворотке крови после инъекции измеряли с помощью специфичных наборов для ИФА (Roche Diagnostics).
max
max
max
max
[00322] Совокупные уровни ИФР-1 в сыворотке крови после инъекции CTP-СТГ человека-CTP-CTP были значительно выше, чем после инъекции биотропина. Величина C в целом была пропорциональна дозе, и C CTP-СТГ-CTP-CTP была в 3-4 раза выше, чем C биотропина. Величина T CTP-СТГ человека-CTP-CTP составила 36-48 ч, по сравнению с 20-24 ч для биотропина. В заключение следует отметить, что более высокие уровни СТГ человека и более длительное присутствие в сыворотке крови приводят к значительному увеличению уровней ИФР-1.
ПРИМЕР 7
Содержание углеводов и содержание сиаловых кислот в CTP-модифицированном СТГ
[00323] Исследование O-гликанов основано на использовании набора Prozyme. O-гликаны химически и ферментативно отщепляют от белка и отделяют от пептидов с использованием бумажной хроматографии. Секвенирование пула O-гликанов осуществляют с помощью последовательных ферментативных расщеплений (используя экзогликозидазы) с последующим анализом методом ВЭЖХ в сравнении со стандартами.
Гликопрофилирование с анализом последовательностей
[00324] Гликопрофилирование было проведено компанией Ludger Ltd. Два образца (EN648 и RS0708) получали с помощью высвобождения с тремя повторами, и каждое высвобождение также исследовали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тремя повторами. Три образца EN648 и RS0708 массой 300 мкг и один 100 мкл образец буфера на основе цитрата/хлорида натрия, а также положительный контроль фетуин (250 мкг) и 100 мкл воды, в качестве отрицательного контроля, подвергали ультрафильтрации путем центрифугирования с использованием мембран с молекулярной массой отсечения 10000 кДа, чтобы заменить буфер водой, и затем подвергали гидразинолизу в условиях O-режима (6 ч при 60°C). Высвобожденные гликаны повторно N-ацетилировали и очищали с помощью картриджей LudgerClean CEX. Аликвоту высвобожденных гликанов затем метили 2-аминобензамидом (2AB), очищали с помощью картриджей Ludger Clean S и исследовали с помощью ВЭЖХ, основанной на гидрофильном взаимодействии (HILIC-HPLC), LudgerSep-N2.
Содержание моносахаридов
[00325] Исследование нейтральных моносахаридов требует гидролиза гликанов от их составных моносахаридных компонентов. Гидролиз был проведен компанией Ludger Ltd на интактных образцах гликопротеина. В частности, 50 мкг интактного гликопротеина подвергали кислотному гидролизу, метили с использованием 2-АВ (2-аминобензамида) и исследовали на колонке для ВЭЖХ с обращенной фазой. Указанный метод позволяет гидролизовать все гликаны, присутствующие на гликопротеине, включая N- и O-связанные типы.
Получение профилей сиаловых кислот
[00326] Исследовали два образца (EN648 и RS0708) и контрольный буфер. Исследование сиаловых кислот требует высвобождения в слабой кислоте моносахаридов с последующим мечением флуорофором DMB и исследованием с помощью ВЭЖХ на колонке LudgerSep-R1. Для проведения каждого исследования 50 мкг интактного гликопротеина подвергали кислотному гидролизу.
Исследование гликанов CTP-СТГ человека-CTP-CTP
[00327]
<b>Таблица 7</b><b>Исследование гликанов. Структурные связи и процентные значения площадей пиков основаны на данных ВЭЖХ и ферментативного расщепления.</b><img file="00000001.jpg" he="125" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
[00328] Профили моносахаридов указывают, что образцы гликопротеинов CTP-СТГ человека-CTP-CTP содержат преимущественно O-связанные гликаны. Основной пик O-гликанов представляет собой сиалированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc). Основной сиаловой кислотой является Neu5Ac, также присутствует несколько незначительных пиков, которые указывают на существование 3-4% диацетилированной сиаловой кислоты, N-ацетил-9-O-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5,9Ac2), и менее 1% N-гликолилнейраминовой кислоты. Также присутствуют небольшие количества Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAc.
ПРИМЕР 8
Исследования фармакокинетики/токсикокинетики CTP-модифицированного СТГ у макак резусов
[00329] Кривые зависимости концентрации в плазме крови от времени получали для каждого животного. Некомпартментный анализ проводили с использованием WinNonlin, профессиональная версия 5.2.1 (Pharsight Corporation, Маунт-Вью, Калифорния, США). Расчетные фармакокинетические параметры приведены в таблице 8 ниже.
[00330]
<b>Таблица 8</b><b>Оценки фармакокинетических параметров CTP-СТГ человека-CTP-CTP (среднее значение </b>±<b>SD), полученные с помощью некомпартментного анализа, после однократной подкожной инъекции у макак-резусов</b>
Параметр
1,8 мг/кг
90 мг/кг
C<sub>max</sub> (мкг/мл)
2,073±0,417
108,7±46,0
T<sub>max</sub> (ч)
4±0
11±7
AUC<sub>0-t </sub>(мкг∙ч/мл)
38,7±7,4
2,444±394
AUC<sub>0-∞ </sub>(мкг∙ч/мл)
39,0±7,3
2,472±388
CL/F (мл/ч/кг)
47,5±9,0
37,04±4,78
T<sub>1/2 </sub>(ч)
10,00±1,47
9,85±1,07
Vz/F (мл/кг)
701±236
529±104
0-t
0-∞
max
max
max
[00331] Величины AUC и AUC были сопоставимыми, это указывает на то, что продолжительность отбора образцов была надлежащей для определения характеристик фармакокинетических профилей. Величина C была пропорциональна дозе. T была достигнута позже при более высокой дозе. Величина T составила 4 часа у всех животных в группе, получавшей низкую дозу, и 8 или 24 часа в группе, получавшей высокую дозу. Терминальные периоды полувыведения были одинаковы для обеих групп дозирования.
[00332] Величина AUC была приблизительно пропорциональна дозе, при этом величина AUC при более высокой дозе незначительно превышала расчетную пропорциональную величину, что привело к более низкому значению CL/А и Vz/А по сравнению с аналогичными показателями при более низкой дозе. Не представляется возможным сделать выводы о том, являются ли величины CL и Vz более низкими при более высокой дозе, или является ли величина F более низкой при более низкой дозе. Между группами существовало перекрывание показателей, поэтому маловероятно, что обнаруженное различие величин CL/F и Vz/F является значимым.
[00333] Фармакокинетические параметры, рассчитанные с помощью модели, были в значительной степени близки тем, которые были получены с помощью некомпартментного анализа. Величины скорости всасывания и периода полувыведения представлены в таблице 9, приведенной ниже:
[00334]
<b>Таблица 9</b><b>Оценки всасывания и периода полувыведения CTP-СТГ человека-CTP-CTP (среднее значение </b>±<b>SD) после подкожной инъекции, полученные на основании моделирования фармакокинетики у макак-резусов</b>
Доза
T<sub>1/2 abs</sub> (ч)
T<sub>1/2 el</sub> (ч)
1,8 мг/кг
1,17±0,40
10,41±2,36
90 мг/кг
6,49±1,87
7,26±1,85
1/2el
max
[00335] Полученные данные указывают на то, что величины скорости выведения в значительной степени близки между группами, при этом в группе, получавшей низкую дозу, величина T ниже. Однако всасывание более чем в 5 раз медленнее после подкожного введения 90 мг/кг по сравнению с этим показателем после введения 1,8 мг/кг. Как и в случае некомпартментного анализа, результаты моделирования указывают на большее значение T при высокой дозе.
[00336] Несмотря на то, что добавка СТГ является эффективной при лечении дефицита гормона роста у детей и взрослых, недостатки ежедневных инъекций в течение длительных периодов времени ограничивают его использование врачами в некоторых популяциях пациентов, а также увеличивают риск ошибки дозирования, количество лиц, обеспечивающих уход, стоимость лечения и несоблюдение требований схемы лечения. В определенных популяциях, таких как низкорослые дети, которые не могут понять последствий несоблюдения назначенной схемы дозирования СТГ, особенно важной является необходимость соблюдения требований схемы лечения для достижения оптимального положительного эффекта от лечения СТГ. Проблема нахождения более подходящей альтернативы для ежедневных инъекций гормона роста и последующего соблюдения требований схемы лечения приобретает дополнительное значение, поскольку СТГ-дефицитные дети переходят в группу взрослых пациентов с постоянной потребностью в лечении СТГ. Потребность в ежедневной терапии в значительной степени обусловлена коротким периодом полувыведения из циркуляции рекомбинантного СТГ и привела к разработке лекарственной формы гормона роста с пролонгированным высвобождением (Reiter EO. Attire KM., Mashing TJ. Silverman BL. Kemp SF. Neolith RB. Ford KM. and Sanger P. A multimember study of the efficacy and safety of sustained release GH in the treatment of naive pediatric patients with GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001), pp. 4700-4706.).
[00337] У крыс фармакокинетический профиль СТГ-CTP, гибридного белка рекомбинантного гормона роста человека и CTP, описанного в настоящей заявке, имеет большую продолжительность, чем таковой для СТГ. Этот уникальный фармакокинетический профиль обеспечивает периодическое введение СТГ-CTP для достижения фармакодинамического действия у крыс с дефицитом гормона роста, о чем свидетельствует рост и увеличение уровней ИФР-1 в плазме крови, соответственно.
[00338] СТГ-CTP обеспечивает лучший фармакокинетический профиль по сравнению с таковым для СТГ при п/к введении у крыс. Существуют значительные различия величины плазматического клиренса СТГ-CTP по сравнению с СТГ. В частности, после подкожного дозирования плазматический клиренс СТГ-CTP более чем в 6 раз медленнее, чем аналогичный показатель СТГ. Терминальный период полувыведения и среднее время удержания СТГ-CTP были приблизительно в шесть раз больше, чем аналогичные показатели СТГ у крыс после подкожного введения. Помимо этого Cl/F после подкожного дозирования был в 10 раз ниже для СТГ-CTP, чем для СТГ.
[00339] Для того чтобы изучить возможность перенесения фармакокинетических преимуществ у крыс на фармакодинамические преимущества, исследовали способность СТГ-CTP стимулировать рост у СТГ-дефицитных крыс с удаленным гипофизом при использовании схемы дозирования с менее частым введением, в сравнении с ежедневным введением, при эквимолярных уровнях доз CTP-СТГ человека-CTP-CTP и СТГ. Однократная п/к инъекция СТГ-CTP способствовала приростному увеличению веса, которое было эквивалентно таковому при 4 ежедневных последовательных инъекциях гормона роста. Помимо этого схема введения СТГ-CTP на каждый четвертый день обеспечивает большее увеличение веса тела по сравнению с СТГ.
[00340] Исходя из показателей фармакодинамики, длительное время циркуляции СТГ-CTP по сравнению с СТГ у крыс с удаленным гипофизом приводило к более длительному ответу ИФР-1, согласно результатам измерения уровней ИФР-1 в плазме крови после однократной подкожной инъекции. У крыс с удаленным гипофизом подкожное введение однократной дозы СТГ-CTP увеличивало концентрацию циркулирующего ИФР-1 в зависимости от дозы. При самой высокой дозе альбутропина концентрации ИФР-1 повышались выше начальных значений в течение 75 часов после однократного введения. Следовательно, повышенное время циркуляции однократной дозы СТГ-CTP привело к существенному улучшению фармакодинамических параметров по сравнению с однократной дозой СТГ, увеличивая вероятность того, что СТГ-CTP может обеспечить аналогичное улучшение роста при сниженной частоте дозирования по сравнению со стандартными схемами лечения с использованием СТГ.
[00341] Однократная доза CTP-модифицированного СТГ человека 90 мг/кг у макак-резусов и 180 мг/кг у крыс хорошо переносились у обоих видов. Аллометрический фактор между крысами и приматами составляет приблизительно Х2 на основании ожидаемого клиренса белков у этих животных. Эти данные соответствуют одобренным промышленным моделям экстраполяции для увеличения периода полувыведения терапевтических белков между видами (руководство FDA). У приматов профиль ФК для дозы 90 мг/кг незначительно лучше, чем профиль ФК для 180 мг/кг CTP-модифицированного СТГ у крыс. Следовательно, аллометрическая экстраполяция данных на человека поддерживает схему лечения с использованием однократной еженедельной инъекции или инъекции один раз в две недели.

J. Pediatr. Endocrinol. Metab.
15
[00342] Предложенная в настоящем изобретении концепция применения конструкции CTP-СТГ обеспечивала снижение частоты дозирования по сравнению с коммерческим рекомбинантным продуктом СТГ. Нутропин Депо (Nutropin Depot) представляет собой состав с пролонгированным высвобождением СТГ, одобренный для использования у педиатрических пациентов. Однако сравнение с историческим контролем выявило, что темпы роста в течение 1 и 2 лет значительно (р<0,001) ниже у детей, получавших нутропин депо (темп роста в течение 1 года составил 8,2±1,8 см/год), чем у детей, получавших СТГ (темп роста в течение 1 года составил 10,1 ±2,8 см/год) (Silverman BL, et al.  (2002), pp. 715-722.). Местные нежелательные эффекты введенного подкожно нутропина депо включают узелки, эритему, боль в месте инъекции, головную боль и рвоту. Доклинические исследования токсикологии у крыс и обезьян выявили, что п/к введение CTP-СТГ человека-CTP-CTP не вызывает местных реакций, в сравнении с носителем. Учитывая медицинскую потребность в лекарственной форме СТГ с менее частым введением, фармакологические свойства CTP-СТГ человека-CTP-CTP в данном исследовании на крысах свидетельствуют о том, что этот продукт также обеспечивает преимущества с точки зрения токсикологии и приверженности пациентов требованиям схемы лечения. Данные о пролонгированной активности CTP-СТГ человека-CTP-CTP у крыс поддерживают его потенциальную пригодность в качестве агента, требующего только периодического введения для достижения терапевтической пользы, которая достигнута в настоящее время с использованием ежедневного введения.
ПРИМЕР 9
CTP-модифицированный вариант человеческого гормона роста (СТГ человека-CTP) с длительным действием был высокоэффективен у взрослых пациентов с дефицитом гормона роста - клиническое исследование фазы II
[00343] Рандомизированное, открытое, клиническое исследование фазы II проводили для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетических и фармакодинамические свойств СТГ человека-CTP, вводимого путем инъекции один раз в неделю или два раза в месяц, у пациентов, которые в настоящее время получают ежедневные инъекции гормона роста. Исследование проводили в нескольких центрах в шести странах. Три главные когорты в исследовании получили однократную еженедельную дозу СТГ человека-CTP, содержащую 30%, 45% или 100% эквивалентной совокупной дозы коммерческого СТГ человека, которую взрослые пациенты с дефицитом гормона роста получают в течение семи дней в виде ежедневных инъекций (обозначенные как когорты «30%», «45%» и «100%», соответственно). Полученные данные отражают результаты 39 пациентов, по 13 в каждой когорте. В каждую когорту были включены 2 женщины.
[00344] В дополнение к трем основным когортам взрослых пациентов с дефицитом гормона роста зачисляли в экспериментальную четвертую когорту, исследование которой проводили не в рамках официального клинического исследования фазы II. Пациенты в экспериментальной четвертой когорте получали однократную инъекцию СТГ человека-CTP один раз в две недели, которая содержала 50% от совокупной коммерческой дозы, которую взрослые пациенты с дефицитом гормона роста получали в течение двухнедельного периода в виде ежедневных инъекций.
[00345] Эффективность для трех основных когорт, получавших однократную еженедельную инъекцию СТГ человека-CTP, определяют путем измерения ежедневных уровней инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) в пределах желаемого терапевтического диапазона в течение семи дней (в течение последней недели лечения в исследовании). Желаемый терапевтический диапазон определяется как диапазон от +2 стандартных отклонений до -2 стандартных отклонений относительно средних уровней ИФР-1, которые ожидаются в нормальной популяции, с разбивкой по возрастным группам и полу. Помимо этого в исследовании измеряли уровни ИФР 1 в пределах более узкого диапазона ±1,5 стандартного отклонения, чтобы наблюдать дисперсию у пациентов в пределах нормального диапазона.
Результаты:
max
[00346] В таблице 10 приведен средний процент дней в пределах нормального терапевтического диапазона (±2 SD), средний процент дней в пределах более узкого нормального терапевтического диапазона (±1,5 SD) и среднее значение C (самая высокая концентрация) ИФР-1 у мужчин, измеренное в течение последней недели лечения, выраженное как стандартные отклонения от среднего уровня ИФР-1 в нормальной популяции.
<b>Таблица 10</b><b>Результаты клинического исследования фазы II с участием людей</b>
Когорта
% дней в пределах узкого нормального диапазона уровней ИФР-1 (±1,5 SD)
% дней в пределах нормального диапазона уровней ИФР-1 (±2 SD)
Среднее значение C<sub>max</sub> ИФР-1 (предпочтительно ниже +2 SD)
30%
57%
100%
-0,9
45%
100%
100%
0,1
100%
86%
100%
0,4
[00347] Доза СТГ человека-CTP 2 мг/неделю, содержащая 50% от совокупной недельной дозы СТГ человека, которая, как правило, будет назначена взрослому пациенту в качестве начальной дозы лечения, с высокой вероятностью может быть определена как начальная доза для мужчин и женщин в клиническом исследовании фазы III с участием взрослых пациентов.
[00348] Отсутствовали проблемы, связанные с безопасностью и/или переносимостью, также отсутствовали признаки того, что СТГ человека-CTP, при применении в высоких дозах, индуцировал избыточные уровни ИФР-1 у пациентов или даже уровни, превышающие нормальный диапазон.
[00349] Выводы и перспективы клинического исследования фазы II, направленного на оценку уровней ИФР-1
Дизайн и задачи клинического исследования фазы II MOD-4023:
[00350] Было завершено двухэтапное клиническое исследование фазы II, направленное на подтверждение целесообразности еженедельной схемы введения CTP-СТГ человека-CTP-CTP (MOD-4023) (см. фигуру 10). Указанное исследование представляло собой переход от исследования, проведенного с участием пациентов с дефицитом гормона роста (ДГР), которые в настоящее время ежедневно получают СТГ человека, которых рассматривали как стабильных в период их ежедневного лечения перед введением MOD-4023, о чем свидетельствуют уровни SDS ИФР-1 в пределах нормального диапазона (±2SDS). Этап I указанного исследования представлял собой 4-недельное исследование по подбору дозы (4 инъекции), поддержанное полным исследованием фармакокинетики/фармакодинамики (ФК-ФД) в течение недели после введения 4-й дозы MOD-4023. Основная цель этой части исследования заключалась в определении терапевтического диапазона доз, при котором уровень ИФР-1 поддерживается в пределах определенного диапазона. Другая цель заключалась в оценке профиля ФК/ФД MOD-4023 при 3-х различных дозах/мультипликаторах и подтверждении зависимости ответа от дозы. Второй этап указанного исследования (этап II) представлял собой 16-недельный период лечения и титрования дозы MOD-4023. Все пациенты, которые продолжили участие в этапе II указанного исследования, начали получать аналогичный уровень дозы MOD-4023 (61,7% от их личной, оптимизированной, еженедельной совокупной дозы СТГ человека), однако доза этих пациентов могла быть модифицирована на основании контролируемых уровней ИФР-1 у них.
[00351] В первой части исследования дозы вводили на основании процента от еженедельной совокупной дозы СТГ человека, чтобы оценить первоначальный ответ после еженедельной схемы введения MOD-4023. Например: пациент, получавший 1 мг/сутки СТГ человека, который был рандомизирован в 55% когорту, получал MOD-4023 в дозе 1 мг * 7дней * 0,55 путем инъекции на еженедельной основе.
Результаты
max
[00352] В качестве первичной конечной точки эффективности в данном исследовании был выбран средний временной интервал уровней ИФР-1, которые находились в пределах нормального диапазона после введения последней дозы во время этапа I, выраженный в часах. Согласно результатам окончательного анализа уровни ИФР-1 у большинства пациентов в течение этой недели находились в пределах нормы в течение всей недели (таблица 11). Пациентам, показатели которых находились в пределах указанного диапазона SDS в конечной точке времени, присваивали значение временного интервала 168 часов. Ни один из пациентов не превысил +2 SDS для C, это указывает на отсутствие избыточных уровней ИФР-1. Восемьдесят пять процентов мужчин (28/33 мужчин) имели средний SDS ИФР-1 в пределах нормального диапазона (±2 SDS) (фигура 11). Средний временной интервал для уровней ИФР-1, которые находятся в пределах ± нормального диапазона, всех трех когорт не показал значительного изменения, поскольку все средние временные интервалы находились в пределах 1 стандартного отклонения друг от друга.
[00353]
<b>Таблица 11</b><b>Временной интервал для уровней ИФР-1, которые находятся в пределах </b>±<b>2SDS после введения 4-й дозы во время этапа I</b>
Когорта 237% от недельной дозы СТГ человека
Когорта 355% от недельной дозы СТГ человека
Когорта 1a123,4% от недельной дозы СТГ человека
156,37 ч120,9±66,24 (ч)
168 ч146,49±50,62(ч)
151,17 ч119,9±66,51(ч)
[00354] Как и предполагалось, введение 37% от недельной дозы СТГ человека привело к получению значений SDS ИФР-1 в нижней части нормального диапазона и меньшей продолжительности в пределах нормального диапазона. Значительное улучшение уровней ИФР-1, о котором свидетельствует продолжительность в пределах нормального диапазона, наблюдали при введении более высокой дозы (55% от недельной совокупной дозы СТГ человека).
[00355] Дозазависимый ответ ИФР-1, по сравнению с начальным уровнем, приведен на фигуре 12. Результаты, представленные на фигуре 12, поддерживают представление о том, что уровни ИФР-1 увеличиваются в зависимости от дозы MOD-4023, что обеспечивает возможность корректировки еженедельного профиля ИФР-1. Помимо этого среднее изменение концентраций ИФР-1, относительно начального уровня, через 120-168 ч после введения дозы вернулось к начальным значениям, это указывает на то, что в указанной стабильной популяции взрослых пациентов с дефицитом гормона роста (ДГР) остаточные уровни ИФР-1 являются устойчивыми без ухудшения (фигура 12).
0-24/24ч
0-168/168ч,
[00356] Показатель Cavg (AUC/время), который представляет собой среднее воздействие ИФР-1, стабильных пациентов, получавших ежедневные инъекции, сравнивали с таковым у этих же пациентов после еженедельного лечения с использованием MOD-4023 (AUC по сравнению с AUC соответственно). Еженедельные дозы 55-123,4% от совокупной еженедельной дозы СТГ человека обеспечивали сравнимую величину воздействия ИФР-1, о чем свидетельствует Cavg, в то время как у пациентов, получавших 37% от недельной дозы, наблюдали сниженное значение Cavg, что соответствовало ожиданиями в связи с относительно низкой еженедельной дозой (таблицы 12 и 13).
[00357]
<b>Таблица 12</b><b>Обобщенные данные по фармакодинамическим параметрам для ИФР-1 после подкожного введения рекомбинантного СТГ человека взрослым пациентам с дефицитом гормона роста перед введением MOD-4023 (этап I; 4 нед)</b>
Параметр
Когорта* (оптимизированное лечение СТГ человека)
2
3
1a
C<sub>avg</sub> (нг/мл)
174±57,0(11)
178±43,1(11)
154±28,5(11)
*Среднее значение ± стандартное отклонение (N).
[00358]
<b>Таблица 13</b><b>Обобщенные данные по фармакодинамическим параметрам для ИФР-1 после подкожного введения MOD-4023 взрослым пациентам с дефицитом гормона роста (этап I; 4 нед)</b>
Параметр
Когорта* (лечение MOD-4023)
2 (37%)
3 (55,5%)
1a (123,4%)
C<sub>avg</sub> (нг/мл)
117±32,5(11)
147±50,9(11)
50,4±132(11)
max
trough
0-168/168ч
[00359] На основании исследования ФД во время этапа I клинического исследования фазы II были сделаны следующие выводы: 1) несмотря на то, цель настоящего исследования не заключалась в оптимизации уровней ИФР-1 пациентов путем снижения значения SDS ИФР-1 до 0, (поскольку оптимизация SDS ИФР-1 требует относительно длительного периода титрования), терапевтический диапазон доз для еженедельного введения MOD-4023 все равно может быть установлен: приблизительно 56% -123% от еженедельной совокупной дозы СТГ человека, вводимой ежедневно. 2) Профиль ИФР-1 после еженедельного введения MOD-4023 относительно плоский, о чем свидетельствует довольно небольшое различие между C и C. 3) Величина показателя Cavg (AUC), который представляет собой среднее еженедельное воздействие ИФР-1, коррелирует со значениями на 4-й день. Соответственно, 4-й день после введения MOD-4023 был выбран в качестве дня для мониторинга уровней ИФР-1.
Результаты и перспективы этапа II клинического исследования фазы II (4-месячное дополнительное исследование):
[00360] Возможность поддержания ИФР-1 в пределах нормального диапазона при оптимальной дозе и в течение более длительного периода времени при еженедельном введении MOD-4023 рассматривали во время второй части исследования (этап II - 4-месячный дополнительный период; фигура 10). В этом исследовании эта же популяция пациентов из первого этапа получала 61,7% от их недельной дозы СТГ человека, и уровни ИФР-1 контролировали через каждые две недели. Большинство пациентов поддерживали значение SDS для уровней ИФР-1 в пределах нормального диапазона на протяжении всего исследования, согласно результатам измерения на 4-й день после инъекции. Дозу пациентов, у которых уровни ИФР-1 были ниже нормального диапазона, дополнительно титровали, и увеличивали дозу MOD-4023 у таких пациентов (в соответствии с клинической практикой).
[00361] Меньшая часть пациентов со значениями SDS ИФР-1 ниже нормального диапазона нуждалась в дополнительном титровании, но продемонстрировала значительное улучшение SDS ИФР-1, это указывает на то, что профиль ИФР-1 может быть оптимизирован с помощью положительного/отрицательного приращения дозы MOD-4023. Требовалась высокая восприимчивость и минимальная модификация дозы, как представлено на фигуре 13 и обобщено в таблице 14 ниже.
[00362]
<b>Таблица 14</b><b>Обобщенные данные по необходимым модификациям дозы во время этапа II</b>
Количество модификаций дозы
Мужчины
Женщины
Нет модификаций дозы
22 (из 34)
3 (из 8)
1 модификация дозы
6 (из 34)
1 (из 8)
2 модификации дозы
3 (из 34)
3 (из 8)
3 модификации дозы
3 (из 34)
1 (из 8)
max
trough
[00363] На основании значений SDS ИФР-1 на 4-й день (коррелировавших с Cavg), значительное улучшение уровней ИФР-1, по сравнению с этапом I исследования, наблюдали у отдельных пациентов. Это наблюдение дополнительно поддержало представление о том, что период корректировки необходим, чтобы достичь оптимального уровня и профиля ИФР-1. Женщины, как известно, менее чувствительны к заместительной терапии СТГ человека (также MOD-4023), и, как правило, требуют более высоких доз и более длительного периода титрования. Помимо этого уровни SDS ИФР-1, измеренные на 4-й день, постоянно поддерживались на аналогичных значениях в пределах нормального диапазона в течение 4-месячного дополнительного периода, это указывает на то, что MOD-4023 можно вводить еженедельно. После последовательных введений MOD-4023 не наблюдали серьезного снижения уровня ИФР-1 на 4-й день, это указывает на то, что C и C «синусоидального» профиля ИФР-1 сохраняются на протяжении исследования, еще раз подтвердив целесообразность еженедельной схемы введения MOD-4023.
[00364] В заключение следует отметить, что MOD-4023 должен устранить необходимость многочисленных инъекций, которые требуются в настоящее время для лечения дефицита СТГ. Результаты этого исследования показали, что MOD-4023 можно вводить путем инъекции один раз в неделю и достичь клинических конечных точек эффективности, которые оценивали в данном исследовании, сохраняя при этом благоприятный профиль безопасности. Схема лечения с использованием СТГ, которая требует менее частых инъекций, может улучшить приверженность пациентов и потенциальные клинические результаты.
[00365] Следовательно, на основании достигнутого профиля ИФР-1 и результатов оценки безопасности и переносимости в фазе II, рекомендуемая частота инъекций и дозирования для исследования фазы III является следующей: однократная еженедельная инъекция MOD-4023, содержащая 61,7% от совокупной еженедельной дозы СТГ человека, индивидуально подобранная для каждого пациента.
ПРИМЕР 10
Введение CTP-модифицированного варианта гормона роста человека (СТГ человека-CTP) улучшило фармакокинетику у детей в препубертатном возрасте с дефицитом гормона роста (ДГР)
[00366] Рандомизированное, открытое, клиническое исследование фазы II проводили для оценки безопасности, переносимости, параметров фармакокинетики и фармакодинамики трех доз MOD-4023, в сравнении с коммерчески доступным стандартным ежедневным рекомбинантным гормоном роста человека. Исследование включало 6-месячный период скрининга и два периода активного лечения: период лечения в течение 6 месяцев, включая отбор образцов для определения ФК/ФД с последующим дополнительным 6-месячным периодом с непрерывным многократным дозированием, как показано на фигуре 14. Вторичные цели заключались в оценке профилей фармакокинетики (ФК) и фармакодинамики (ФД) трех различных доз MOD-4023 у детей в препубертатном возрасте с дефицитом гормона роста (ДГР) и в выборе оптимальной дозы MOD-4023 для последующего исследования фазы III на основании данных по безопасности и эффективности.
[00367] Для того чтобы начать постепенно вводить наивным пациентам назначенные дозы MOD-4023 (таблица 15), осуществляли ступенчатое увеличение дозы. Все пациенты, рандомизированные для получения одной из трех доз MOD-4023, начали лечение в течение 2-х недель с использованием низкой дозы MOD-4023 (0,25 мг/кг). На основании назначенной пациенту дозы, дозу увеличивали до следующего уровня дозы каждые две недели до достижения окончательной назначенной дозы.
<b>Таблица 15</b><b>Когорты дозирования</b>
Когорта
Доза MOD-4023/генотропин
1
0,25 мг MOD-4023 белка/кг/неделю эквивалентно еженедельной инъекции 0,18 мг/кг СТГ человека
2
0,48 мг MOD-4023 белка/кг/неделю эквивалентно еженедельной инъекции 0,35 мг/кг СТГ человека
3
0,66 мг MOD-4023 белка/кг/неделю эквивалентно еженедельной инъекции 0,48 мг/кг СТГ человека
4
Генотропин: 0,034 мг/кг/сутки.
[00368] После второго введения целевой дозы проводили ограниченный отбор образцов (на основании популяций) для определения параметров ФК/ФД, как описано в таблице 16.
<b>Таблица 16</b><b>Схема увеличения дозы для когорт MOD-4023</b>
Когорта
Схема дозирования
Неделя 1
Неделя 2
Неделя 3
Неделя 4
Неделя 5
Неделя 6
Когорта 1
0,25 мг белка/кг/неделю
отбор образцов для ФК/ФД
Когорта 2
0,25 мг белка/кг/неделю
0,48 мг белка/кг/неделю
отбор образцов для ФК/ФД
Когорта 3
0,25 мг белка/кг/неделю
0,48 мг белка/кг/неделю
0,66 мг белка/кг/неделю
отбор образцов для ФК/ФД
[00369] Пациентов, распределенных в когорту дозирования MOD-4023, рандомизировали в пределах когорты в один из трех блоков и проводили у них ограниченный отбор образцов для определения ФК/ФД (4 пробы для одного пациента в течение одной недели), в соответствии с таблицей 17, приведенной ниже.
[00370] Пациенты, распределенные в 1 когорту, прошли ограниченный отбор образов для ФК/ФД после введения 2-й дозы MOD-4023 (V2a-g - 2-я неделя) и вернулись в медицинские центры для выполнения одного визита через 4 дня после дозирования в течение 6-й недели (V4h).
[00371] Пациенты, распределенные во 2 когорту, посетили медицинские центры для проведения однократного визита через 4 дня после дозирования в течение 2-й недели (V2h), прошли ограниченный отбор образцов для ФК/ФД после введения 4-й дозы MOD-4023 (4-я неделя: вторая доза при назначенном уровне дозы; V3a-g) и вернулись в медицинские центры для проведения одного визита через 4 дня после дозирования в течение 6-й недели (V4h).
[00372] Пациенты, распределенные в 3 когорту, посетили медицинские центры для проведения одного визита через 4 дня после дозирования в течение 2 и 4 недель (V2h и V3h) и прошли ограниченный отбор образцов для ФК/ФД после введения 6 дозы MOD-4023 (неделя 6: вторая доза при назначенном уровне дозы, V4a-g).
[00373] Во время визитов 2a и 2h, 3a и 3h, а также 4a и 4h пациенты прошли следующие исследования: физический осмотр, оценку жизненно важных показателей, НЯ, местной переносимости, сопутствующих препаратов, показателей метаболизма глюкозы (глюкоза натощак и инсулин; HbA1c только в V4), уровней других гормонов (ТСГ, fT4, Т3, кортизол), стандартный биохимический и полный анализ крови для оценки клинической безопасности (визиты 2а и 2h, 4а и 4h), оценку роста и веса пациента, параметров липидного обмена, а также сывороточных уровней ИФР-1 и ИФР-1-БС-3.
[00374] Пациенты, распределенные в когорту генотропина (когорта 4), посетили медицинские центры для проведения визитов 2 и 4 во время 2-й и 6-й недель лечения. Были проведены следующие исследования: физический осмотр, оценка жизненно важных показателей, НЯ, местной переносимости препарата, сопутствующих препаратов, показателей метаболизма глюкозы (глюкоза натощак и инсулин, HbA1c только в V4), уровней других гормонов (ТТГ, fT4, Т3, кортизол), стандартный биохимический и полный анализ крови для оценки клинической безопасности, оценка роста и веса пациента, показателей липидного обмена, а также сывороточных уровней ИФР-1 и ИФР-1-БС-3 (фигура 17).
[00375] Также после введения 8-й дозы генотропина (начало 2-й недели дозирования препарата), пациентов, распределенных в когорту генотропина, рандомизировали в один из трех блоков и проводили у них ограниченный отбор образцов для определения ФК/ФД (4 образца для одного пациента в течение 24 часов), в соответствии с таблицей 18, приведенной ниже:
[00376] После первых 6 недель исследования все пациенты посещали госпиталь на ежемесячной основе (недели 10, 14, 18, 22 и 26). Пациентов, распределенных в когорту дозирования MOD-4023 (когорты 1-3), попросили вернуться через 4 дня после введения MOD-4023 для определения уровней MOD-4023, ИФР-1 и ИФР-1-БС-3 и проведения рутинных оценок безопасности. Помимо этого через 5 месяцев дозирования пациентов, распределенных в когорту дозирования MOD-4023, попросили вернуться в медицинский центр в утренние часы до дозирования для того чтобы определить остаточный уровень MOD-4023 и получить образцы для определения ФД (ИФР-1 и ИФР-1-БС-3). Пациентов, распределенных в когорту дозирования генотропина (когорта 4), попросили вернуться в любой день в течение соответствующей недели дозирования.
Результаты:
[00377] Демографические характеристики в исследовании представлены для всех пациентов в таблице 19 ниже:
[00378]
<b>Таблица 19</b><b>Исходные демографические характеристики исследования фазы II</b>
Когорта 1
Когорта 2
Когорта 3
Когорта 4
Доза
0,25 мг/кг/нед. MOD-4023
0,48 мг/кг/нед. MOD-4023
0,66 мг/кг/нед. MOD-4023
0,034 мкг/кг/сут генотропин
N
9
9
10
7
Среднее
SD
Среднее
SD
Среднее
SD
Среднее
SD
Возраст (г)
6,44
2,3
6,33
2,1
6,10
2,2
5,43
1,9
Пик СТГ(нг/мл)*
2,84
2,9
3,58
1,7
4,41
3,2
2,92
2,4
HVSDS
-3,05
2,0
-2,82
1,1
-3,11
1,8
-3,36
2,0
HTSDS
-3,99
0,9
-3,82
0,8
-3,91
1,1
-4,79
1,7
HtSDS-TH SDS
-3,47
0,9
-3,23
0,7
-3,15
1,3
-4,20
1,8
Скрининг IGF-1 SDS
-2,48
0,8
-2,28
0,7
-1,81
0,7
-2,34
1,2
Пол (%)
Ж1 (11,1)
М8 (88,8)
Ж4 (44,4)
М5 (55,6)
Ж3 (30)
М7 (70)
Ж3 (42,9)
М4 (57,1)
[00379] Средний профиль ФК MOD-4023, введенного наивным пациентам с ДГР при их окончательном уровне дозы, приведен на фигуре 15, и параметры ФК представлены в таблице 20 ниже:
<b>Таблица 20</b><b>Сравнительные усредненные параметры ФК</b>
Единицы
MOD-4023
СТГ человека
C1 (n=13)
C2 (n=12)
C3 (n=13)
C4 (n=11)
T<sub>1/2</sub>
ч
36,1
29,2
29,1
3,6
T<sub>max</sub>
ч
12
12
12
2
C<sub>max</sub>
нг/мл
459,9
810,2
795,5
17,3
AUC 0-inf_obs
нг/мл∙ч
10943,4
20050,3
25503,1
135,7
Cl/F_obs
(мг/кг)/(нг/мл)/ч
2,28×10<sup>-5</sup>
2,39×10<sup>-5</sup>
2,59×10<sup>-5</sup>
2,51×10<sup>-5</sup>
[00380] Как и ожидалось, MOD-4023, при введении один раз в неделю, продемонстрировал длительный период полувыведения, которой, как было показано, в 8 раз выше, по сравнению с таковым для СТГ человека при ежедневном введении. Кроме того наблюдали зависимость ответа от дозы, о чем свидетельствуют значения AUC для каждой дозы MOD-4023.
[00381] Дозазависимый ответ сохранялся в течение первых 6 месяцев еженедельного введения MOD-4023 (данные не показаны).
[00382] Концентрации ИФР-1, который является одобренным суррогатным маркером активности СТГ человека, также увеличивались дозазависимым образом (фигура 23), поддерживая целевые значения (выше -2 индекса SD роста [SDS]) для большинства недель без избыточных уровней (>2SDS, фигура 21). Уровни SDS ИФР-1 продолжали умеренно повышаться в зависимости от дозы в течение первых 6 месяцев исследования, при этом они не достигали избыточно высоких уровней, которые выше 2SDS (фигура 16).
[00383] Группа, получавшая СТГ человека (когорта 4), также продемонстрировала повышение значений SDS ИФР-1, которые были очень сходны с тенденцией, наблюдаемой для двух когорт, получавших самые высокие дозы MOD-4023. Помимо этого уровни ИФР-1 БС-3 также увеличивались дозазависимым образом при введении MOD-4023, достигая стационарных значений приблизительно на 15 неделе (фигура 17 и 18, соответственно). В общей сложности два фармакодинамических профиля ИФР-1 и ИФР-1-БС-3 подтверждают, что однократная еженедельная инъекция MOD-4023 может заменить 7 ежедневных инъекций в аналогичном диапазоне доз.
[00384] Скорость роста контролировали перед введением дозы и через 6 месяцев после еженедельного введения MOD-4023 или ежедневного введения СТГ. Для всех когорт превосходный ростовой ответ получили без статистически достоверных различий между разными когортами (таблица 21 и фигура 19), это дополнительно подтверждает, что еженедельная инъекция MOD-4023 может обеспечить надлежащий рост, как и ежедневные инъекции СТГ человека.
<b>Таблица 21</b><b>Среднегодовая скорость роста при введении MOD-4023 в течение 6 месяцев - у всех пациентов, завершивших 6-месячный период лечения</b>
Когорта
Доза
N
Среднее (CM)
Стандартное отклонение
Когорта 1
0,25 мг/кг/неделю MOD-4023
9
13,48
2,71
Когорта 2
0,48 мг/кг/неделю MOD-4023
9
12,25
2,64
Когорта 3
0,66 мг/кг/неделю MOD-4023
10
14,37
5,26
Когорта 4
0,034 мкг/кг/сутки генотропина
7
15,46
2,68
Исторические данные - ежедневные инъекции СТГ человека
~10
[00385] Одновременно, также получили очень благоприятное увеличение SDS скорости роста (таблица 22, таблица 23 и фигура 20). Наконец, дельта SDS скорости роста хорошо коррелировала с догоняющим ростом пациентов (фигура 22).
[00386]
<b>Таблица 22</b><b>Педиатрическая фаза 2 клинического исследования MOD-4023 - результаты предварительного исследования SDS скорости роста</b>
Когорта
Доза
N
Среднее
Станд. откл.
Станд. ошиб. сред.
Когорта 1
0,25 мг/кг/неделю MOD-4023
8
-3,21
2,05
0,72
Когорта 2
0,48 мг/кг/неделю MOD-4023
8
-2,94
1,14
0,40
Когорта 3
0,66 мг/кг/неделю MOD-4023
10
-3,11
1,79
0,56
Когорта 4
0,034 мкг/кг/сутки генотропина
7
-3,36
1,98
0,75
[00387]
<b>Таблица 23</b><b>Педиатрическая фаза 2 клинического исследования MOD-4023 - результаты исследования SDS скорости роста в течение 6 месяцев лечения</b>
Когорта
Доза
N
Среднее
Станд. откл.
Станд. ошиб. сред.
Когорта 1
0,25 мг/кг/неделюMOD-4023
8
5,03
1,23
0,44
Когорта 2
0,48 мг/кг/неделюMOD-4023
8
3,23
1,88
0,67
Когорта 3
0,66 мг/кг/неделюMOD-4023
10
5,73
3,72
1,18
Когорта 4
0,034 мкг/кг/сутки генотропина
7
5,67
1,53
0,58
Вывод
[00388] Все дозы обеспечили хороший догоняющий ростовой ответ. Предварительный статистический анализ указывает на то, что между когортами отсутствуют статистически значимые различия, но есть некоторые ограничения относительно небольшого числа пациентов в когорте и относительно пациентов с тяжелым ДГР.
ПРИМЕР 11
Разработка состава MOD-4023
Белок:
[00389]  MOD-4023 представляет собой длительно действующий рекомбинантный гормон роста человека (СТГ человека) для подкожного введения. MOD-4023 состоит из СТГ человека, гибридизованного с тремя копиями С-концевого пептида (CTP) бета-цепи хорионического гонадотропина человека (ХГЧ); CTP содержит четыре сайта O-гликозилирования, и, следовательно, этот белок представляет собой одну цепь, содержащую 275 аминокислот и вплоть до двенадцати О-связанных углеводов. Белок производится в клетках СНО из продуцирующего клона.
Продуцирующий клон:
[00390]  Клон #2 представлял собой исходный клон, использованный для ранних токсикологических исследований, фазы I и фазы II (взрослые). Данные о стабильности для DS и DP для этого клона доступны на срок до 2-х лет при -20°C и 5°C. Переход на новый продуцирующий клон (клон # 28) осуществляли с целью повышения производительности и стабильности клона. Клон # 28 DP поддерживал долгосрочные токсикологические исследования и исследования фазы II у детей, а также будет поддерживать все дальнейшие клинические мероприятия и коммерческое производство. Данные о стабильности для DP для этого клона доступны на срок до 1 года при -20°C и 5°С.
Производство CMO:
[00391]  производство MOD-4023 было выполнено Xcellerex (США) на ранних стадиях и поддержало доклинические исследования до фазы II. Способ был передан Rentschler Biotechnologie (RB), (Германия). Две партии в соответствии с требованиями НПП уже были произведены в RB.
Дополнительная информация
[00392] Физико-химические свойства -
[00393] Сильно гликозилирован и отрицательно заряжен с ИЭТ = 3-4,5
[00394] Плотность: 1,0216 г/мл
[00395] Растворим в водном растворе
[00396] Жидкий состав для DS и DP: 10 мМ цитрата, 147 мМ NaCl, рН=6.
[00397] Конечная концентрация DS: 40 мг/мл
[00398] Конечная концентрация DP: 5, 10, 20 и 40 мг/мл
[00399] Первичная упаковка -
[00400] 2R флаконы (Schott)
[00401] Пробки (West)
[00402] Алюминиевые колпачки (West)
[00403] Будущая первичная упаковка - шприц-ручка
Обоснование оптимизации состава
Разработка стабильного жидкого состава для MOD-4023:
[00404]
[00405] 1. Первая цель: стабильность в течение 2 лет при 5°C в ампулах
[00406] 2. Вторая цель: стабильность в течение 2 лет при 5°C в картриджах
Необходимые аналитические исследования:
[00407]
[00408] ОФ-ВЭЖХ (утвержденный метод)
[00409] ВЭЖХ с эксклюзионной хроматографией (утвержденный метод)
[00410] Капиллярный зонный электрофорез (TBD) (установленный метод)
График:
[00411]
[00412] На основании данных о стабильности 2-недельный период испытаний при 25°С может быть использован для прогнозирования стабильности продукта при температуре 5°C, чтобы обеспечить первоначальную оценку для комплексного исследования матрикса состава.
Данные о стабильности
[00413] Приведены данные для партий, произведенных в рамках НПП и вне рамок НПП, изготовленных в 10 мМ цитрата, 147 мМ NaCl, рН=6 (фигура 24). Данные также показывают, что клон 2 MOD-4023 стабилен при температуре 5°C в течение 24 месяцев при концентрации 20 мг/мл, и что профиль стабильности аналогичен для 5 мг/мл и 20 мг/мл (см. фигуру 25A и 25B). Кроме того, клон 2 MOD-4023 стабилен в течение 3 месяцев при комнатной температуре (см. фигуру 26). Клон 28 MOD-4023 стабилен при 5°C в течение 12 месяцев при концентрации 20 мг/мл или 40 мг/мл; характеристика основного пика DP>88% (фигура 27А и фигура 27В). Клон 28 MOD-4023 является стабильным в течение по меньшей мере одного месяца при комнатной температуре. (фигура 28А).
[00414] На основании сходства между клоном 28 и клоном 2, который стабилен при температуре 5°C в течение 24 месяцев, ожидается, что клон 28, полученный в Xcellerex (XC), будет стабильным в течение 24 месяцев при 5°C; характеристика основного пика DP >88% (фигура 28B).
Производство MOD-4023
[00415] Профиль при Т=0 сопоставим между Xcellerex (XC) и Rentschler (RB) DS (фигура 29). На фигурах 30-34 отражены различия в стабильности между ХС и RB. Результаты изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) указывают на то, что существует аналогичная структура полос в диапазоне ИЭТ-значений от 3,5 до 4,2. В одной партии XC присутствуют менее слабые изоформы в верхней границе ИЭТ, и в партии RB присутствуют более слабые изоформы в нижней границе ИЭТ (фигура 35А). Кроме того, в образце XC существуют более диффузные полосы, по сравнению с образцом RB (фигура 35B).
[00416] Дополнительные наблюдения показали, что формирование обоих пиков (3 и 5 - определения пиков приведены ниже) зависит от температуры и ускоряется при высокой температуре (фигура 36A-D.). Кроме того, отсутствовали изменения % пика 3 после инкубации в течение 5 дней при рН=4 и до 2 часов при рН=12 (фигура 37B, 37D), также отсутствовали изменения % пика после инкубации в течение до 6 часов при рН=4. Однако после 6 часов наблюдали резкое увеличение % пика; при инкубации в течение не более 2 часов при рН=12- пик исчезает (фигура 37A-D).
Исследования принудительной деградации в RB (клон 28)
[00417] Подвергнутый стрессу образец действующего вещества MOD-4023 получали (65°C в течение приблизительно трех дней) для исследования родственной формы 5 в действующем веществе MOD-4023, поскольку пик ниже предела количественного определения для образца, не подвергнутого стрессу.
[00418] Для того чтобы проверить влияние рН три образца исследовали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ родственных форм:
[00419] RB - 40 мг/мл, рН=5,9.
[00420] RB - 10 мг/мл, рН=6,2.
[00421] XC - 40 мг/мл, рН=6,2.
[00422] Результаты представлены на фигурах 38 и 39.
Выделение и характеристика пиков родственных форм (1-7) - M-Scan
[00423] Пик 1 - окисление дезамидированного MOD-4023
[00424] Пик 2 - деамидирование MOD-4023
[00425] Пик 3 - частичное окисление MOD-4023
[00426] Пик 5 - расщепление пептидной связи между аминокислотными остатками 167 и 168 и между аминокислотными остатками 171 и 172 MOD-4023. дисульфид
[00427] Пик 6 и пик 7- усеченные формы
Выводы
(см. фигуры 24-39)
Стабильность
[00428] Продукт, полученный из клона 2, стабилен в течение периода не более 2-х лет при 5°С.
[00429] Продукт, полученный из клона 28, произведенного в XC, стабилен в течение по меньшей мере 1 года при 5°C с профилем стабильности, аналогичным таковому для клона 2.
[00430] Продукт, полученный из клона 28, произведенного в RB, имеет измененный профиль стабильности с ускоренным формированием родственных форм (в основном пика 5) и формированием нового пика (пик 7), который ранее не наблюдали.
[00431] Предыдущие исследования показали, что пик 3 и 5 имеют аналогичную молекулярную массу в качестве основного пика и реагируют с антителом к СТГ, с образованием полосы, соответствующей полосе MOD-4023.
[00432] Оба пика, 3 и 5, зависят от температуры (% пиков возрастает при повышении температуры).
[00433] Не наблюдали изменений доли высокомолекулярных форм во время инкубации при -20°C и 5°C.
[00434] Стабильность продукта RB GMP1 (после инкубации в течение 2 недель) при различных температурах, 5, 25, 37, 50 и 65°C, выявила, что образование пика 7 ускоряется при 25°C и 37°C, но не наблюдается при 50°C и 65°C.
[00435] Инкубация образцов RB в течение 10 мин при 65°C с последующей инкубацией при 25°C устраняла образование пика 7 (через 2 недели при 25°C).
[00436] Выше были описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения со ссылками на прилагаемые чертежи, при этом следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено точными вариантами реализации, и различные изменения и модификации могут быть осуществлены в настоящем изобретении специалистом в данной области техники, не отступая от объема или сущности настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  OPKO BIOLOGICS LTD.
FARES, Fuad
FIMA, Udi Eyal
<120>  ПОЛИПЕПТИДЫ ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ВВЕДЕНИЯ
<130>  P-9520-PC6
<150>  14/059,134
<151>  2013-10-21
<150>  14/309,496
<151>  2014-06-19
<160>  50
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  221
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180                 185                 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195                 200                 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
210                 215                 220
<210>  2
<211>  249
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180                 185                 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195                 200                 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser
210                 215                 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210>  3
<211>  277
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20                  25                  30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35                  40                  45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50                  55                  60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85                  90                  95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100                 105                 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115                 120                 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130                 135                 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145                 150                 155                 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165                 170                 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180                 185                 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195                 200                 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Ser Ser Ser
210                 215                 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
245                 250                 255
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
260                 265                 270
Pro Ile Leu Pro Gln
275
<210>  4
<211>  387
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180                 185                 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195                 200                 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro
210                 215                 220
Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
225                 230                 235                 240
Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu
245                 250                 255
Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp
260                 265                 270
Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu
275                 280                 285
Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn
290                 295                 300
Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val
305                 310                 315                 320
Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln
325                 330                 335
Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg
340                 345                 350
Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn
355                 360                 365
Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr
370                 375                 380
Gly Asp Arg
385
<210>  5
<211>  221
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20                  25                  30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35                  40                  45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50                  55                  60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85                  90                  95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100                 105                 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115                 120                 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130                 135                 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145                 150                 155                 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165                 170                 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180                 185                 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195                 200                 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg
210                 215                 220
<210>  6
<211>  249
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20                  25                  30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35                  40                  45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50                  55                  60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85                  90                  95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100                 105                 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115                 120                 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130                 135                 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145                 150                 155                 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165                 170                 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180                 185                 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195                 200                 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Ser Ser Ser
210                 215                 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210>  7
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Artificial
<220>
<223>  Forward primer for EPO-CTP constructs
<400>  7
aatctagagg tcatcatggg ggtgc                                             25
<210>  8
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  8
attgcggccg cggatccaga agacctttat tg                                     32
<210>  9
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  9
taaatattgg ggtgtccgag ggccc                                             25
<210>  10
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  10
ccaatattac cacaagcccc accacgcctc at                                     32
<210>  11
<211>  35
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  11
tgcggccgcg gatccttatc tgtcccctgt cctgc                                  35
<210>  12
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  12
gccctgctgt cggaagc                                                      17
<210>  13
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  13
attgcggccg cggatccaga agacctttat tg                                     32
<210>  14
<211>  32
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  14
ctttgaggaa gaggagccca ggactgggag gc                                     32
<210>  15
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  15
cctgggctcc tcttcctcaa aggc                                              24
<210>  16
<211>  193
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180                 185                 190
Arg
<210>  17
<211>  34
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность CTP
<400>  17
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20                  25                  30
Pro Gln
<210>  18
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность CTP
<400>  18
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20                  25
<210>  19
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly
20                  25
<210>  20
<211>  786
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
tctagaggtc atcatggggg tgcacgaatg tcctgcctgg ctgtggcttc tcctgtccct       60
tctgtcgctc cctctgggcc tcccagtcct gggctcctct tcctcaaagg cccctccccc      120
gagccttcca agtccatccc gactcccggg gccctcggac accccaatat taccacaagc      180
cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt cctggagagg tacctcttgg aggccaagga      240
ggccgagaat atcacgacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgaga atatcactgt      300
cccagacacc aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtcgggc agcaggccgt      360
agaagtctgg cagggcctgg ccctgctgtc ggaagctgtc ctgcggggcc aggccctgtt      420
ggtcaactct tcccagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg      480
ccttcgcagc ctcaccactc tgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc      540
tccagatgcg gcctcagctg ctccactccg aacaatcact gctgacactt tccgcaaact      600
cttccgagtc tactccaatt tcctccgggg aaagctgaag ctgtacacag gggaggcctg      660
caggacaggg gacagatcct cttcctcaaa ggcccctccc ccgagccttc caagtccatc      720
ccgactcccg gggccctcgg acaccccgat cctcccacaa taaaggtctt ctggatccgc      780
ggccgc                                                                 786
<210>  21
<211>  873
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
tctagaggtc atcatggggg tgcacgaatg tcctgcctgg ctgtggcttc tcctgtccct       60
tctgtcgctc cctctgggcc tcccagtcct gggctcctct tcctcaaagg cccctccccc      120
gagccttcca agtccatccc gactcccggg gccctcggac accccaatat taccacaagc      180
cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt cctggagagg tacctcttgg aggccaagga      240
ggccgagaat atcacgacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgaga atatcactgt      300
cccagacacc aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtcgggc agcaggccgt      360
agaagtctgg cagggcctgg ccctgctgtc ggaagctgtc ctgcggggcc aggccctgtt      420
ggtcaactct tcccagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg      480
ccttcgcagc ctcaccactc tgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc      540
tccagatgcg gcctcagctg ctccactccg aacaatcact gctgacactt tccgcaaact      600
cttccgagtc tactccaatt tcctccgggg aaagctgaag ctgtacacag gggaggcctg      660
caggacaggg gacagatcct cttcctcaaa ggcccctccc ccgagccttc caagtccatc      720
ccgactcccg gggccctccg acacaccaat cctgccacag agcagctcct ctaaggcccc      780
tcctccatcc ctgccatccc cctcccggct gcctggcccc tctgacaccc ctatcctgcc      840
tcagtgatga aggtcttctg gatccgcggc cgc                                   873
<210>  22
<211>  221
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Ser Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180                 185                 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195                 200                 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
210                 215                 220
<210>  23
<211>  217
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50                  55                  60
Val Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210                 215
<210>  24
<211>  166
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1               5                   10                  15
Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20                  25                  30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35                  40                  45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50                  55                  60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65                  70                  75                  80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85                  90                  95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100                 105                 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115                 120                 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130                 135                 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210>  25
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  25
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20                  25                  30
<210>  26
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1               5                   10                  15
Thr Thr Ala Leu Ser
20
<210>  27
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер XbaI для конструктов HGH-CTP
<400>  27
ctctagagga catggccac                                                    19
<210>  28
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  28
acagggaggt ctgggggttc tgca                                              24
<210>  29
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  29
tgcagaaccc ccagacctcc ctgtgc                                            26
<210>  30
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  30
ccaaactcat caatgtatct ta                                                22
<210>  31
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер XbaI для конструктов HGH-CTP
<400>  31
ctctagagga catggccac                                                    19
<210>  32
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  32
cgaactcctg gtaggtgtca aaggc                                             25
<210>  33
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Прямой праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  33
gcctttgaca cctaccagga gttcg                                             25
<210>  34
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер NotI для конструктов HGH-CTP
<400>  34
acgcggccgc atccagacct tcatcactga ggc                                    33
<210>  35
<211>  34
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов HGH-CTP
<400>  35
gcggccgcgg actcatcaga agccgcagct gccc                                   34
<210>  36
<211>  217
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210                 215
<210>  37
<211>  245
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
210                 215                 220
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
225                 230                 235                 240
Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210>  38
<211>  273
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
210                 215                 220
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
225                 230                 235                 240
Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245                 250                 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260                 265                 270
Gln
<210>  39
<211>  301
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20                  25                  30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35                  40                  45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50                  55                  60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85                  90                  95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100                 105                 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115                 120                 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130                 135                 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165                 170                 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180                 185                 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195                 200                 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210                 215                 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245                 250                 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260                 265                 270
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
275                 280                 285
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
290                 295                 300
<210>  40
<211>  285
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20                  25                  30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
35                  40                  45
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
50                  55                  60
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
85                  90                  95
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
100                 105                 110
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
115                 120                 125
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
130                 135                 140
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
145                 150                 155                 160
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
165                 170                 175
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
180                 185                 190
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
195                 200                 205
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
210                 215                 220
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
225                 230                 235                 240
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
245                 250                 255
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
260                 265                 270
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
275                 280                 285
<210>  41
<211>  273
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20                  25                  30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35                  40                  45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50                  55                  60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85                  90                  95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100                 105                 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115                 120                 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130                 135                 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165                 170                 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180                 185                 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195                 200                 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210                 215                 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245                 250                 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260                 265                 270
Gln
<210>  42
<211>  245
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20                  25                  30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35                  40                  45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50                  55                  60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85                  90                  95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100                 105                 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115                 120                 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130                 135                 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145                 150                 155                 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165                 170                 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180                 185                 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195                 200                 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210                 215                 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ser Cys Gly Phe
245
<210>  43
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность CTP
<400>  43
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
1               5                   10
<210>  44
<211>  853
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg       60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct      120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac      180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct      240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag      300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa      360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat      420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta      480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac      540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta      600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct      660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag      720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc      780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgcctcagt gatgaaggtc      840
tggatgcggc cgc                                                         853
<210>  45
<211>  937
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg       60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct      120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac      180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct      240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag      300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa      360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat      420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta      480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac      540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta      600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct      660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag      720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc      780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc      840
taaggcccct cctccatccc tgccatcccc ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc      900
tatcctgcct cagtgatgaa ggtctggatg cggccgc                               937
<210>  46
<211>  889
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg       60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccgagcct      120
gcccttcccc accatccccc tgagcaggct gttcgacaac gccatgctga gggctcacag      180
gctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagttcgag gaagcctaca tccccaagga      240
gcagaagtac agcttcctgc agaaccccca gacctccctg tgcttcagcg agagcatccc      300
cacccccagc aacagagagg agacccagca gaagagcaac ctggagctgc tgaggatctc      360
cctgctgctg atccagagct ggctggagcc cgtgcagttc ctgagaagcg tgttcgccaa      420
cagcctggtg tacggcgcca gcgacagcaa cgtgtacgac ctgctgaagg acctggagga      480
gggcatccag accctgatgg gccggctgga ggacggcagc cccaggaccg gccagatctt      540
caagcagacc tacagcaagt tcgacaccaa cagccacaac gacgacgccc tgctgaagaa      600
ctacgggctg ctgtactgct tcagaaagga catggacaag gtggagacct tcctgaggat      660
cgtgcagtgc agaagcgtgg agggcagctg cggcttcagc tccagcagca aggcccctcc      720
cccgagcctg ccctccccaa gcaggctgcc tgggccctcc gacacaccaa tcctgccaca      780
gagcagctcc tctaaggccc ctcctccatc cctgccatcc ccctcccggc tgcctggccc      840
ctctgacacc cctatcctgc ctcagtgatg aaggtctgga tgcggccgc                  889
<210>  47
<211>  217
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35                  40                  45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50                  55                  60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65                  70                  75                  80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85                  90                  95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100                 105                 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115                 120                 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130                 135                 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145                 150                 155                 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165                 170                 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180                 185                 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195                 200                 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210                 215
<210>  48
<211>  33
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20                  25                  30
Gln
<210>  49
<211>  26
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20                  25
<210>  50
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер для конструктов EPO-CTP
<400>  50
gcttccgaca gcagggc                                                 17
<---