Исследование возможности использования сайт-специфического мутагенеза в конструировании живых гриппозных вакцин

Исследование возможности использования сайт-специфического мутагенеза в конструировании живых гриппозных вакцин

С.Г. Маркушин (markushin@rambler.ru), В.Ю. Кост, И.И. Акопова, И.Б. Коптяева, К.В. Лисовская, А.Д. Переверзев, Т.М. Цфасман

ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАН, Москва

Резюме

Сравнительное изучение фенотипических характеристик одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью обратной генетики между холодоадаптированным (ХА) штаммом донором аттенуации А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) и вирулентным штаммом А/WSN/33(H1N1), показало, что РВ1-ген ХА штамма содержит одну из ключевых детерминант, определяющих ts-фенотип и att-фенотип этого штамма. В работе была исследована возможность переноса мутации из РВ1-гена ХА штамма, ответственного за аттенуацию этого штамма (147 Ile Thr) в геном вирулентного штамма А/WSN/33 с целью его аттенуации. Мутация была получена с помощью сайт-специфического мутагенеза. Исследование фенотипических признаков полученного варианта W9 показало, что полученный вариант приобрел ts-фенотип и характеризовался резко сниженной вирулентностью для мышей. Обсуждается возможность использования сайт-специфического мутагенеза для получения вакцинных штаммов вируса гриппа типа А.

Ключевые слова: вирус гриппа, сайт-специфические мутации, фенотипические признаки, аттенуация

The Investigation of the possibility of Site-Specific Mutagenesis Using in construction of Live Influenza Vaccines

S.G. Markushin (markushin@rambler.ru), V.Yu. Kost, I.I. Akopova, I.B. Koptiaeva, K.V. Lisovskaya, A.D. pereversev, T.M. Tsfasman Federal State Budgetary Institution «Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera», Russian Academy of Sciences, Moscow Abstract

Comparative investigation of singlegenic and polygenic reassortments phenotypic characteristics obtained with help of reverse genetics between cold-adapted (CA) A/Krasnodar/101/35/59(H2N2) strain-donor of attenuation and virulent A/WSN/33 strain points out, that pB1-gene of CA strain contains one of key determinants, which determine ts-phenotype and att-phenotype of this strain. The possibility of mutation transfer from pB1-gene of CA strain, responsible for the attenuation of this strain (147 Ile Thr) in the genome of virulent A/WSN/33 strain with aim of its attenuation. The mutation was created by site-specific mutagenesis. phenotypic characteristics of W9 variant were investigated. It was shown that created W9 variant acquired ts-phenotype and was characterized by low virulence for mice. The possibility of using site-specific mutagenesis for creation of influenza vaccine strains type A is discussed. Key words: influenza virus, site-specific mutations, phenotypic characteristics, attenuation

Введение

Использование генно-инженерных возможностей при получении гриппозных живых вакцин значительно расширяет возможности их конструирования. В частности, один из генно-инженерных подходов предполагает получение рабочего комплекса из шести плазмид, содержащих «внутренние» гены холодоадаптированного (ХА) штамма -донора аттенуации и двух плазмид, содержащих гены, кодирующие поверхностные белки вириона (гемагглютинин и нейраминидазу) от антигенно-актуального эпидемического варианта. Совместная трансфекция с использованием всех восьми плазмид позволяет получить требуемые реассор-танты - кандидаты в живые гриппозные вакцины, минуя трудоемкую стадию анализа генома реассортантов [1, 2].

Однако возможен другой генно-инженерный подход к решению данной проблемы, предполагающий, в первую очередь, прямое включение

заранее известных и изученных {э-мутаций, взятых из геномов штаммов - доноров аттенуации, в геном вирулентного штамма вируса гриппа [3 - 6].

Учитывая обнаруженные серьезные недостатки ХА-штамма - донора А/Ленинград/134/17/57(1-^2) (гетерогенность популяции, реактогенность для детей младшего возраста), в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова был получен новый ХА-штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), выявлены мутации в РНК-сегментах генома (Гендон Ю.З. и соавт, 2013) и определены гены, несущие генетические детерминанты, ответственные за аттенуацию этого штамма: Р61-ген и МБ-ген [7, 8]. В данной работе мы попытались исследовать возможность прямого включения мутации, локализованной в РВ1-гене ХА -штамма А/Краснодар/101/35/59 и ответственной за полезные свойства этого штамма, в геном вирулентного штамма А/WSN/33(Н1N1) с целью его аттенуации.

Материалы и методы

Вирусы. В работе были использованы ХА-штамм - донор аттенуации для живых гриппозных вакцин А/Краснодар/101/35/59 (H2N2), полученный методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK при постепенно снижающейся температуре [9]; вирулентный штамм A/WSN/33(H1N1), а также одногенный реассор-тант между ХА-штаммом и штаммом A/WSN/33, унаследовавший РВ1-ген от ХА-штамма, и остальные гены от штамма A/WSN/33.

Куриные эмбрионы (КЭ). Все использованные в работе вирусы поддерживали путем пассажей в 10 - 11-дневных куриных эмбрионах. Активность репродукции вирусов гриппа при разной температуре инкубации оценивали по результатам титрования в КЭ, инкубированных при +34 или +38 °С, и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures). RCT38 = (Ig ЭИД50/0,2 мл при 34 °C - Ig ЭИД50/0,2 мл при 38 °С). Вирусы считали темпера-турочувствительными (ts-фенотип), если RCT38 был более 5,0 Ig ЭИД50/0,2 мл.

Культуры клеток. В опытах по трансфекции использовали клетки Т293 и линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера (Франция). Все клетки выращивались при 37 С в СО2-инкубаторе. Клеточные культуры пассировались на среде МЕМ (фирма ПанЭко, Москва, РФ), содержащей 5% фе-тальной бычьей сыворотки и гентамицин в количестве 1 мг на 450 мл среды.

Рекомбинантная ДНК и обратно-генетические методы

Плазмиды и бактерии. В экспериментах использовали плазмиду pHW2000 [10], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики. Плазмида pHW2000, а также плазмиды со вставками генов штамма вируса гриппа А/WSN/33 были любезно предоставлены доктором Вебстером (Мемфис, США). Для накопления плаз-мид использовали штамм E. coli DH5aIpha.

Накопление и концентрирование вирусов. Вирусы накапливали в куриных эмбрионах по стандартной методике. Для последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифугированием. Вначале аллантоисную жидкость осаждали в центрифуге Beckman J2-21 (ротор JA-14) при 6000 об./ мин в течение 30 мин для осаждения клеточного дебриса. Вирус осаждали из надосадочной жидкости на высокоскоростной центрифуге Beckman J2-21 c использованием ротора JA-14 (14 000 об./мин; 2,5 часа). Осадок вирионов ресуспендировали в буфере STE (10 мМ TrisHCL, 100 мМ NaCI, 1 мМ EDTA) (pH 7,4) в гомогенизаторе Даунса.

Выделение РНК. Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи Набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

ОТ-ПЦР. Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР, при помощи ревертазы M-MuLV

(«СибЭнзим», г. Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР ставили с высокоточной полимеразой Tersus («Евроген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора фирмы Fermentas (Thermo Fisher Scientific, США).

Клонирование в E. coli. Опыты по клонированию (работа с бактериями, рестрикция, лигирова-ние и т.п.) проводились по стандартным методикам или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4-лигаза, рестриктазы Esp31 и Eco311).

Секвенирование. Секвенирование вставок в полученных плазмидах проводилось фирмой «Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500.

Трансфекция. Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen) либо в кокультуре клеток 293Т и MDCK, либо в однодневном монослое клеток 293Т (плотность клеточного монослоя - около 70%) в соответствии с методикой, прилагаемой к реагенту Lipofectamine LTX. В качестве отрицательного контроля использовали монослой клеток с добавлением липофектамина и без добавления плазмид. В качестве положительного контроля к культуре клеток добавляли восемь плазмид, содержащих все гены исходного штамма A/WSN/33. В ряде экспериментов через 48 часов после трансфекции материал вводили в куриные эмбрионы. Клетки снимали трипсином, после чего вводили по 0,5 мл неразведенной суспензии в куриные эмбрионы. Через 48 часов определяли гемагглютинирующий титр вируса в куриных эмбрионах.

Репродукция вирусов в легких мышей. Изучение att-фенотипа проводили по следующей методике: группы самок беспородных мышей (по пять - десять особей на группу) инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107 ЭИД50/0,2 мл (в дозе 50 мкл на мышь). Через 72 часа мышей усыпляли и извлекали легочную ткань. Из легочной ткани готовили 10%-ную суспензию в ступках с тертым стеклом. Инфекционный титр вируса в 10%-ной суспензии легких определяли в куриных эмбрионах и выражали в lg ЭИД50/0,2 мл. Все реассортанты были исследованы в трех независимых опытах в группах по пять мышей на каждый реассортант.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием среднего квадратическо-го отклонения.

Результаты и обсуждение

Используя двухступенчатую полимеразную реакцию в гене, кодирующем РВ1-белок штамма A/WSN/в позиции 464, была индуцирована ну-клеотидная замена U-C, которая сопровождалась

Таблица 1.

Фенотипические характеристики штамма А/WSN/33(Н1N1), ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59(H2N2), сайт-специфического мутанта W9 (H1N1) и реассортанта между А/Краснодар/101/35/59 и А/WSN/33

Исследуемые вирусы фенотипические характеристики вирусов

титр вирусов, ЭИД50/0,2 мл титр вирусов в легких мышей, ЭиД50/0,2 мл

+34 °С +38 °С

А/Краснодар/101/35/59(H2N2) 7,0 ± 0,5 < 1,0 < 1,0

7,0 ± 0,5 < 7,0 ± 0,5 6,0 ± 0,25

Сайт-специфический мутант W9 6,5 ± 0,32 2,0 ± 0,25 3,0 ± 0,4

Реассортант между А/Краснодар/101/35/59(H2N2) и А^^33(ЖШ) 6,5 ± 0,4 1,5 ± 0,4 2,0 ± 0,25

заменой Пе-Т1пг в позиции 147 белка РВ1. Полученный ген РВ1 с включенной мутацией был клонирован в плазмиду pHW2000. С помощью метода трансфекции при использовании набора плазмид с генами штамма А/WSN/33, включая мутантный РВ1-ген, был получен вариант W9, у которого были исследованы основные фенотипические признаки. Мы провели сравнительное исследование аналогичных фенотипических признаков у ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2), вирулентного штамма А/WSN/33(H1N1) и одногенного реассортанта между ХА-штаммом А/Краснодар/101/35/59 и штаммом А/WSN/33, в геном которого был включен целый РВ1-ген от ХА-штамма.

Как видно из таблицы 1, ХА-штамм А/Красно-дар/101/35/59 полностью утратил способность размножаться в куриных эмбрионах при 38 °С, однако хорошо размножался при +34 °С. При заражении куриных эмбрионов ХА-штаммом инфекционные титры составляли 107.0 ЭИД50/0,2 мл при +34 °С и при +38 °С - менее 101.0 ЭИД50/0,2 мл. Таким образом этот штамм обладал выраженным ts- фенотипом. При интраназальном заражении мышей данный штамм утерял способность размножаться в легких мышей. В то же время титры вирулентного штамма А/WSN/33(Н1N1) составляли при +38 и +34 °С 107.0 ЭИД50/0,2 мл. Вирулентный штамм А/WSN/33, как видно из таблицы 1, хорошо размножался в легких мышей при интраназальном заражении.

Мутант W9 сохранил способность активно размножаться в куриных эмбрионах при +34 °С, однако резко снизил эту способность при температуре +38 °С, то есть приобрел {э-фенотип. Одновременно он резко снизил способность размножаться и в легких мышей при интраназальном заражении. По своим фенотипическим характеристикам он значительно приблизился к одногенному реассортан-ту между А/Краснодар/101/35/59 и А/WSN/33, унаследовавшему РВ1-ген от ХА-штамма.

Из таблицы 1 видно, что перенос мутации и-С в позиции 464 нуклеотидной последовательности РВ1-гена ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в геном вирулентного штамма А/WSN/33 сопровождался резким изменением фенотипических ха-

рактеристик этого штамма. В отличие от родительского штамма А/WSN/33 мутант W9 резко снизил способность реплицироваться при повышенной температуре (+38 °С), а также снизил способность к размножению в легких мышей. Полученные нами данные еще раз свидетельствуют о том, что данная мутация является одной из ключевых детерминант, определяющих {е- и аН-фенотипы ХА-штамма. Резкое изменение фенотипических характеристик штамма А/WSN/33 под влиянием перенесенной мутации из гена РВ1 ХА-штамма также указывает на возможность использования сайт-специфического мутагенеза при конструировании штаммов доноров аттенуации для получения рекомбинантных вакцинных штаммов вируса гриппа типа А.

В настоящее время в литературе имеется ряд сообщений о получении аттенуированных гриппозных штаммов путем включения ts-мутаций в геном эпидемических и пандемических штаммов вируса гриппа А [11 - 13]. Полученные данные свидетельствуют о том, что на эффективность этого методического подхода влияют многочисленные факторы. Включения пяти {э-мутаций из генома ХА-штамма А/Энн Арбор/6/60 (РВ1-К391Е, D581G, А661Т, PB2-N265S, NP-D34G) было достаточно, чтобы передать штамму А/PR/8/34 {э-фенотип [14]. Однако включение этих пяти критических мутаций в геном североамериканского тройного реассортанта гриппа свиней вызвало только частичную аттенуацию этого вируса [4]. Превращение пандемического штамма rA/New York/1682/2009 вируса свиней (Н^1) в аттенуированный штамм rNew York-TS2 потребовало включения восьми {э-мутаций, локализованных в генах РВ1 и РВ2 [6]. Накопленные факты свидетельствуют о различной эффективности включения набора одних и тех же {э-мутаций в геном сезонных штаммов или эпидемических вариантов вируса гриппа, что, по-видимому, связано с различными причинами, в том числе с запасом генетической стабильности у каждого полученного аттенуированного варианта.

Как видно из наших экспериментов, включения одной-единственной мутации из генома ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59 достаточно для резкого

изменения фенотипических характеристик вирулентного штамма А/WSN/33. Однако генетическая стабильность этого варианта, естественно, будет невысокой. Дальнейшие эксперименты покажут, какое количество мутаций необходимо будет включить в геном варианта W9, чтобы обеспечить его гарантированную генетическую стабильность.

Выводы

1. Перенос мутации и-С в позиции 464 нуклеотид-ной последовательности Р61-гена ХА-штамма А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) в геном виру-

лентного штамма A/WSN/33 приводил к резкому изменению фенотипических характеристик этого штамма. 2. Данный факт свидетельствует о возможности использования сайт-специфического мутагенеза при конструировании штаммов-доноров ат-тенуации для получения рекомбинантных живых гриппозных вакцин. ш

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки по Соглашению № 14.616.21.0022 от27.11.2014.

Литература

1. Maassab H.F., Bryant M.I. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999; 9 (4): 237 - 244.

2. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines. Virol. Immunol. 2002; 15(2): 295 323.

3. Hickman D., Hossain M.J., Song H., Araya Y., Solorzano A., Perez D.R. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J. Gen. Virol. 2008; 89 (11): 2682 - 2690.

4. Solorzano A., Ye J., Perez D.R. Alternative live-attenuated influenza vaccines based on modifications in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J. Virol. 2010; 84 (9): 4587 - 4596.

5. Pena L., Vincent A.L., Ye J. Modifications in the polymerase genes of a swine - like triple-reassortant influenza virus to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J. Virol. 2011; 85 (1): 456 - 469.

6. Zhou B., Li Y., Speer S.D., Subba A., Lin X., Wentworth D. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. Vaccine. 2012; 30 (24): 3691 - 3702.

7. Терехов А.В., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Кост В.Ю. Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 донора для живых гриппозных вакцин. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2013; 3 (70): 70 - 77.

8. Терехов А.В., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Кост В.Ю. Изучение att-фенотипа реассортантов между вирулентным штаммом вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33 и вакцинным холодоадаптированным штаммом вируса гриппа А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2013; 5 (72): 41 - 47.

9. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М., Акопова И.И., Ахматова Н.К., Коптяева И.Б. Новые холодоадаптированные штаммы доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013. 58 (1): 11 - 17.

10. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. PNAS. 2000; 97 (11): 6108 - 6113.

11. Subbarao E.K., Kawaoka Y., Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 1993; 67 (12): 7223 - 7227.

12. Subbarao E.K., Park E.J., Lawson C.M., Chen A.Y., Murphy B.R. Sequential addition of temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J. Virol. 1995. 69 (10): 5969 5977.

13. Parkin N.T., Chu P., Coelingh K. Genetically engineered live attenuated influenza A virus vaccine candidates. J. Virol. 1997. 71 (4): 2772 - 2778.

14. Jin H., Lu B., Zhou H. Ma C., Zhao J., Yang C., Kemble G., Greenberg H. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains ( FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. Virology. 2003; 306 (1): 18 - 24.

References

1. Maassab H.F., Bryant M.I. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999; 9 (4): 237 - 244.

2. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines. Virol. Immunol. 2002; 15(2): 295 - 323.

3. Hickman D., Hossain M.J., Song H., Araya Y., Solorzano A., Perez D.R. An avian live attenuated master backbone for potential use in epidemic and pandemic influenza vaccines. J. Gen. Virol. 2008; 89 (11): 2682 - 2690.

4. Solorzano A., Ye J., Perez D.R. Alternative live-attenuated influenza vaccines based on modifications in the polymerase genes protect against epidemic and pandemic flu. J. Virol. 2010; 84 (9): 4587 - 4596.

5. Pena L., Vincent A.L., Ye J. Modifications in the polymerase genes of a swine -like triple-reassortant influenza virus to generate live attenuated vaccines against 2009 pandemic H1N1 viruses. J. Virol. 2011; 85 (1): 456 - 69.

6. Zhou B., Li Y., Speer S.D., Subba A., Lin X., Wentworth D. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses. Vaccine. 2012; 30 (24): 3691 - 3702.

7. Terechov A.V., Tsfasman Т.М., Markushin S.G., Koptiaeva I.B., Lisovskaya К.У, Kost V.Yu. Genetic bases of the attenuation of A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59-cold-adapted strain for live influenza vaccines. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2013; 70 (3): 70 - 77 (in Russian).

8. Terechov A.V., Tsfasman Т.М., Markushin S.G., Koptiaeva I.B., Lisovskaya К.У, Kost V.Yu. The study of att-phenotype of reassortants between virulent A(H1N1)/ WSN/33 influenza strain and vaccine A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59. 2013; 72 (5): 41 - 47 (in Russian).

9. Ghendon Yu.Z., Markushin S.G., Tsfasman Т.М., Akopova I.I., Achmatova N.K., Koptiaeva I.B. New cold-adapted strains-donors of attenuation for live influenza vaccines. Vopr. Virusol. 2013; 58 (1): 11 - 17 (in Russian).

10. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. PNAS. 2000; 97 (11): 6108 - 6113.

11. Subbarao E.K., Kawaoka Y., Murphy B.R. Rescue of an influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 1993; 67 (12): 7223 - 7227.

12. Subbarao E.K., Park E.J., Lawson C.M., Chen A.Y., Murphy B.R. Sequential addition of temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine. J. Virol.1995; 69 (10): 5969 - 5977.

13. Parkin N.T., Chu P., Coelingh K. Genetically engineered live attenuated influenza A virus vaccine candidates. J. Virol. 1997; 71 (4): 2772 - 2778.

14. Jin H., Lu B., Zhou H. Ma C., Zhao J., Yang C., Kemble G., Greenberg H.. Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity to human influenza virus vaccine strains ( FluMist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60. Virology. 2003; 306 (1): 18 - 24.