Твердая дисперсия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для изготовления лекарственной формы и способ лечения хронических инфекционных заболеваний
SOLID DISPERSION of 4- (3-ETHOXY-4-HYDROXIBENZIL) -5-OXO-5,6-DIHYDRO-4H- [1,3,4] -THIADIAZINE-2- (2,4-DIFLUOROPHENYL) -CARBOXAMIDE FOR PRODUCING PHARMACEUTICAL FORMULATION AND METHOD OF TREATMENT OF CHRONIC INFECTIOUS DISEASES

Область техники
Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине, и, конкретно, к области медицинской микробиологии и разработки антибактериальных препаратов.
Уровень техники
Разработка новых антибактериальных препаратов, эффективных в отношении резистентных к антибиотикам бактерий и не вызывающих развития резистентности, является ключевой проблемой в области инфекционных заболеваний. В феврале 2017 года ВОЗ опубликовала список устойчивых к действию антибиотиков «приоритетных патогенов» - 12 видов бактерий, представляющих наибольшую угрозу для здоровья человека. В первую категорию приоритетности в области создания новых антибиотиков «критически высокий уровень приоритетности» включены Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae.
Фундаментальные исследования, проведенные в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи», позволили разработать инновационный антибактериальный препарат, механизм действия которого отличен от действия антибиотиков и основан на подавлении вирулентности патогенов, что приводит к блокированию инфекции в зараженном организме. Основной механизм действия основан на ингибировании системы секреции III типа, которая присутствует только у патогенных грамотрицательных бактерий: Yersinia sp., Pseudomonas spp., E.coli (EPEC and EHEC), Shigella spp., Salmonella spp., Chlamydia spp., Bordetella, Burkholderia, Citrobacter rodentium и др. всего 174 вида.
В структуре внутрибольничных инфекций, Pseudomonas aeruginosa является второй по распространенности причиной внутрибольничных пневмоний, третьей по распространенности причиной инфекций мочевыводящих путей, четвертой по распространенности причиной хирургических инфекций, седьмой по распространенности инфекцией крови. Что наиболее важно, Pseudomonas aeruginosa является лидирующей инфекцией среди антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий, вызывающих пневмонию у госпитализированных больных. Борьба с внутрибольничными инфекциями требует значительных затрат, связанных с контролем и своевременной диагностикой инфекции, подбором эффективной терапии, необходимостью использования отделений интенсивной терапии, длительностью нахождения в стационаре, тяжелыми осложнениями данных заболеваний, вплоть до летальных исходов. Экономический ущерб в РФ оценивается в 5 миллиардов рублей в год. Кроме того, во всем мире существует устойчивая тенденция к росту внутрибольничных инфекций и, особенно, к росту инфекций, резистентных к антибиотикам. (Pang Z., Raudonis R., Glick B. R., Lin T-J., Cheng Z. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa: mechanisms and alternative therapeutic strategies // Biotechnology Advances. 2019. №37. P.177-192).
Проблемами лечения инфекций, вызванных Pseudomonas aeruginosa, являются низкая эффективность антибиотикотерапии в отношении резистентных штаммов, частота выявления которых колеблется от 14 до 52% от общего количества выявленных случаев и быстрое возникновение резистентности к новым препаратам во время лечения. (Chatterjee M., Anju C.P., Biswas L., Kumar V. A., Mohan C. G., Biswas R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options // International Journal of Medical Microbiology. 2016. №306. P. 48-58).
Одним из наиболее тяжелых заболеваний, осложненным хроническим инфицированием антибиотикорезистентными бактериями является муковисцидоз. (Шагинян И. А., Чернуха М. Ю., Аветисян Л. Р., Сиянова Е. А., Кулястова Д. Г., Медведева О. С., Припутневич Т. В., Трофимов Д. Ю., Гордеев А. В., Кондратьева Е. И., Амелина Е. Л., Красовский С. А. Эпидемиологические особенности хронической инфекции легких у больных муковисцидозом // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2017. № 6 (97). С. 5-13). Муковисцидоз наследственное летальное заболевание, ключевым фактором которого является хроническая инфекция нижних дыхательных путей, определяющим тяжесть клинического течения и рассматривается как ведущий фактор смертности, связанный с преждевременной смертью 90% пациентов. Pseudomonas aeruginosa чаще других патогенов выделяется из образцов мокроты и бронхоальвеолярного лаважа больных муковисцидозом всех возрастов. (Winstanley C., O’Brien S., Brockhurst M. A. Pseudomonas aeruginosa evolutionary adaptation and diversification in cystic fibrosis chronic lung infections // Trends in Microbiology. 2016. Vol. 24. N. 5. P. 327-337). Этот возбудитель трудно эрадицируется, вызывает выраженную воспалительную реакцию, приводя к быстрому ухудшению функций легких и неблагоприятному прогнозу. Согласно данным национальных регистров и общеевропейского Регистра (2014 года) распространенность Pseudomonas aeruginosa среди больных Муковисцидозом вариабельна между странами Европы: в России - около 32%, от 14,29% в Словении до 65,57% в Молдове; в США - 47,5%.
Важно так же отметить, что штаммы Pseudomonas aeruginosa, выделенные у больных муковисцидозом, обладают рядом отличий от микроорганизмов, выделенных из биологических сред пациентов с другой патологией. Хронические инфекции при муковисцидозе требуют длительных и многократных курсов антибиотикотерапии, что сопряжено с возрастающим риском развития резистентности. Хорошо известен факт о развитии множественно резистентных штаммов у больных муковисцидозом. (Поликарпова С.В., Кондратьева Е.И., Шабалова Л.А., Пивкина Н.В., Жилина С.В., Воронкова А.Ю., Шерман В.Д., Никонова В.С., Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Семыкин С.Ю., Амелина Е.Л., Красовский С.А. Микрофлора дыхательных путей у больных муковисцидозом и чувствительность к антибиотикам в 15-летнем наблюдении (2000-2015 гг.) //  Медицинский совет. 2016. №15. С 84-89). Несмотря на появление новых специфических антибактериальных средств, считается, что полная эрадикация синегнойной палочки при хронической инфекции у больных муковисцидозом практически не возможна и антибиотикотерапия может лишь снижать колонизацию дыхательных путей. В этой связи представляется важным использование эффективных антибактериальных препаратов не только для лечения обострения в составе комплексной терапии, но и в межрецидивный период, как в составе комплексной антибактериальной терапии, так и в режиме монотерпиии для увеличения периодов между обострениями, уменьшения частот рецидивов и их тяжести. (Caverly Lindsay J., LiPuma John J. Cystic fibrosis respiratory microbiota: unraveling complexity to inform clinical practice // Expert Rev Respir Med. 2018. October. № 12(10). P. 857-865).
Бронхоэктатическая болезнь (БЭ) - это заболевание легких, вызывающее патологические изменения дыхательных путей. Как правило, в основе развития БЭ, а также хронических обструктивных болезней легких лежат рецидивирующие инфекции нижних дыхательных путей, локальная воспалительная реакция и повреждение бронхиальной стенки. Течение заболевания характеризуется хронической инфекцией дыхательных путей, развитием частых эпизодов обострений, проявляющихся усилением локального воспалительного процесса и респираторных симптомов. Известно, что колонизация нижних дыхательных путей P. aeruginosa сопряжена c рядом неблагоприятных последствий. Согласно результатам 21 когортного обсервационного исследования с участием 3683 больных с БЭ, наличие в бронхах колонизации P. aeruginosa практически в три раза увеличивает риск смерти по сравнению со сходными по симптоматике пациентами с БЭ, у которых из соответствующих респираторных образцов выделен другой вид микроорганизма. Вероятность госпитализации у таких больных возрастает практически в семь раз. При выявлении в единичных или повторно определяемых образцах мокроты или бронхиального секрета культуры P. aeruginosa значительно увеличивается риск обострений. Антибиотики являются основным методом лечения инфекций грудной клетки, но их использование должно быть соотнесено с возможными побочными эффектами и риском роста устойчивости к антибактериальной терапии. Одна из стратегий для улучшения ответа и/или уменьшения устойчивости к антибиотикам предполагает использование одновременно двух антибактериальных средств с повышением применяемых доз. (Синопальников А. И., Зайцев А. А.  Антибактериальная терапия обострений хронического бронхита/хронической обструктивной болезни легких. Ключевые положения. Медицинский  совет, 2017, 18 стр.14-20. А.И. Синопальников. ХОБЛ и бронхоэктазы. "ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ. Пульмонология и оториноларингология" 2015, № 3-4 (30).  Sethi S., Murphy T.F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease // N. Engl. J. Med. 2008. Vol. 359. № 22. P. 2355-2365).
В связи с вышесказанным, крайне актуально разрабатывать принципиально новые подходы к разработке препаратов для лечения бактериальных инфекций, вызванных антибиотикорезистентными патогенами, которые могут применяться как самостоятельно, так и в составе комбинированной терапии.
Для разработки таких принципиально новых препаратов с альтернативным антибиотикам механизмом действия в качестве мишеней для подавления выбираются различные факторы патогенности, такие как, токсины, секреторные системы, факторы адгезии, молекулы системы «кворум сенсинг», факторы образования биопленок. Разработка антибактериальных препаратов, подавляющих различные факторы вирулентности бактерий, перспективное направление, которое в настоящее время очень активно развивается в различных научных центрах и фармацевтических компаниях. При этом многие препараты находятся на стадии научных разработок или доклинических испытаний, лишь несколько проходят клинические исследования и только единицы зарегистрированы FDA (англ. Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) Эффективность показывают препараты на основе иммуноглобулинов и моноклональных антител, специфически связывающихся с токсинами или мембранными факторами вирулентности. В заявленном изобретении в качестве основной мишени выбран универсальный фактор патогенности грамотрицательных бактерий - система секреции III типа. Этот секреторный аппарат необходим широкому кругу патогенов для установления инфекции, он отсутствует у нормальной микрофлоры. Ключевым фактором патогенности Pseudomonas aeruginosa является система секреции III типа (ССТТ), которая обеспечивает колонизацию респираторного тракта и длительную персистенцию.
Наиболее близким аналогом технического решения заявленного изобретения является патент РФ № 2624846, включенный в настоящее описание в качестве ссылки «Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) -карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к  антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, и способ подавления этой инфекции».
В рассматриваемом патенте было экспериментально продемонстрировано, что полученное низкомолекулярное соединение, 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид, является ингибитором ССТТ Pseudomonas aeruginosa. Полученное соединение специфически ингибирует секрецию токсинов - эффекторов системы секреции III типа псевдомонад, вызывающих гибель эукариотических клеток. Блокирование in vitro системы секреции III типа Pseudomonas aeruginosa было показано для клинических штаммов с различными генотипами по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.
Была достигнута поставленная в данном изобретении задача, а именно:
• подавление инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa с различным генотипом по генам эффекторных белков ССТТ и различным профилем антибиотикорезистентности.
• подавление развития инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa у зараженного организма на модели in vivo, вне зависимости от приобретенной антибиотикорезистентности.
• отсутствие ингибирующего действия на нормальную микрофлору макроорганизма при применении 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида.
Однако можно отметить некоторые недостатки рассматриваемого изобретения:
• полученный низкомолекулярный ингибитор ССТТ является лекарственной субстанцией, которая не может быть использована для дальнейшей разработки антибактериального препарата без создания лекарственной формы;
• для полученного ингибитора не были изучены фармакокинетические свойства, определяющие фармакодинамику и эффективность лекарственного препарата;
• не было проведено исследований по физико-химическим свойствам ингибитора, влияющим на биодоступность препарата;
• не были изучены условия, способствующие повышению биодоступности полученного ингибитора 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида, характеризующегося ограниченной растворимостью в водных растворах.
Таким образом, необходимо проведение дальнейшей работы по созданию лекарственной формы на основе полученного ингибитора системы секреции III типа, обладающей высокой биодоступностью для проведения доклинических и клинических исследований с последующей регистрацией разрабатываемого инновационного лекарственного препарата, эффективного в отношении антибиотикорезистентных патогенов.
Предпосылки создания настоящего изобретения
Разработанное действующее вещество 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид, показало активность по отношению к инфекции, вызванной устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, в опытах in vitro и in vivo (Патент РФ № 2624846 «Применение 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) -карбоксамида для подавления инфекции, вызванной устойчивыми к  антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, и способ подавления этой инфекции»).
Проведение дальнейших работ показало, что можно расширить область применения действующего вещества по патенту РФ № 2624846, то есть применить его в качестве антибактериального препарата для лечения хронических инфекций, вызванных антибиотикорезистентными патогенами, у больных муковисцидозом путем создания фармацевтической композиции с высокой биодоступностью.
В связи с актуальностью медицинской проблемы резистентности патогенов к антибиотикам, высокой частотой рецидивов у пациентов с хроническими инфекциями, неэффективностью лечения хронических инфекций по стандартным клиническим протоколам и у пациентов со сниженной способностью к всасыванию в связи с патологией желудочно-кишечного тракта (что характерно в частности для больных муковисцидозом), очевидна необходимость разработки антибактериального лекарственного средства в виде твердой дозированной лекарственной формы для перорального применения, содержащей действующее вещество, с повышенной биодоступностью. Твердые пероральные фармацевтические композиции должны обеспечить поступление в организм пациента действующего вещества, в достаточном для эффективной терапии количестве, обеспечить высвобождение действующего вещества из лекарственной формы, а также обеспечить химическую стабильность действующего вещества. Для обеспечения удобства применения пероральная фармацевтическая композиция не должна приниматься чаще трех раз в день, а в случае, если она имеет форму таблетки или капсулы, их размер не должен быть слишком большим, чтобы не вызвать затруднений при глотании. Тип и количество вспомогательных веществ в сочетании с технологией производства являются существенными с точки зрения свойств высвобождения, биологической доступности соединения у млекопитающих, стабильности и применимости технологии изготовления фармацевтической композиции в производственных условиях.
Раскрытие изобретения.
Задачей настоящего изобретения является разработка твердой дисперсии в качестве полупродукта, предназначенного для изготовления пероральных лекарственных форм, обеспечивающих высокую биодоступность действующего вещества, необходимую для антимикробного действия при лечении хронических инфекций.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в получении твердой дисперсии, обладающей повышенной биодоступностью по сравнению с действующим веществом в кристаллическом виде и терапевтической эффективностью по отношению к инфекциям, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa.
Технический результат достигается за счет разработки твердой дисперсии для изготовления лекарственных форм, которая включает действующее вещество 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый полимер, причем действующее вещество содержится в аморфной форме или в аморфной форме с примесью микрокристаллической и кристаллической фазы.
Причем фармацевтически приемлемый полимер содержится в твердой дисперсии при соотношении действующего вещества к полимеру от 1:1 до 1:10; а также фармацевтически приемлемый полимер выбран из сополимера ПЭГ 6000, винилкапролактама и винилацетата, сополимера N-винилпирролидона и винилацетата, или сополимера бутилметакрилата, 2-диметиламиноэтилметакрилата и метилметакрилата.
Кроме того, твердая дисперсия дополнительно включает, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество в количестве от 1 до 20 масс частей относительно веса действующего вещества.
Также фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество имеет величину HLB от 3 до 40; а приемлемое поверхностно-активное вещество выбрано из натрия додецил сульфата или сорбитан лауреата.
Также технический результат достигается тем, что твердая дисперсия может быть использована для производства пероральных твердых дозированных лекарственных форм в виде таблеток, покрытых или непокрытых оболочкой, твердых капсул, дозированного порошка, порошка для приготовления раствора или суспензии для приема внутрь.
Также технический результат достигается за счет разработки способа лечения хронических инфекций дыхательной системы, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами Pseudomonas aeruginosa, включающий применение твердой дисперсии в эффективной терапевтической дозе для человека в количестве от 1 до 4 мг/кг в пересчете на действующее вещество; где инфекционные заболевания выбраны из пневмонии; хронических инфекций при муковисцидозе, бронхоэктатической болезни, дефектах развития органов дыхания и патологиях дыхательной системы.
Осуществление изобретения.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Результаты рентгенофазового анализа стандартного образца действующего вещества 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в кристаллической форме.
Фиг. 2. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме. Состав полупродукта - действующее вещество - Eudragit E PO в соотношении 1:4, 30 мг натрия додецил сульфат.
Фиг. 3. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме с примесью микрокристаллической фазы Состав полупродукта -действующее вещество - Eudragit E PO в соотношении 1:4, 50 мг сорбитан-лаурат (Span 20), 30 мг натрия додецил сульфат.
Фиг. 4. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме с примесью микрокристаллической фазы. Состав полупродукта - действующее вещество - Soluplus в соотношении 1:1.
Фиг. 5. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме с примесью микрокристаллической фазы. Состав полупродукта - действующее вещество - Soluplus в соотношении 1:2
Фиг. 6. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме с примесью микрокристаллической фазы. Состав полупродукта - действующее вещество - Kollidon VA 64 в соотношении 1:1
Фиг. 7. Результаты рентгенофазового анализа твердой дисперсии содержащей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил) - карбоксамид в аморфной форме с примесью микрокристаллической фазы. Состав полупродукта - действующее вещество - Kollidon VA 64 в соотношении 1:2.
Фиг. 8. Исследование действующего вещества в кристаллической форме методом дифференциальной сканирующей калориметрии, измерение точки плавления.
Фиг. 9. Исследование полимера Эудрагит Е РО методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Определение точки стеклования Еудрагита E PO.
Фиг. 10. Исследование твердой дисперсии на основе действующего вещества и Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом дифференциальной сканирующей калориметрии.
Фиг. 11. Исследование действующего вещества в кристаллической форме методом электронной сканирующей микроскопии, разрешение 10 мкм.
Фиг. 12. Исследование полимера Эудрагит Е РО методом электронной сканирующей микроскопии, разрешение 10 мкм.
Фиг. 13. Исследование твердой дисперсии на основе действующего вещества и Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом электронной сканирующей микроскопии.
Фиг.14. Концентрация связанного действующего вещества в составе твердой дисперсии и в кристаллическом виде в крови.
Фиг. 15. Концентрация свободного действующего вещества в составе твердой дисперсии и в кристаллическом виде в крови.
Фиг.16. Концентрация свободного действующего вещества в составе твердой дисперсии и в кристаллическом виде в печени.
Фиг. 17. Концентрация связанного действующего вещества в составе твердой дисперсии и в кристаллическом виде в печени.
Фиг.18. Подавление образования биопленок P.aeruginosa и цитотоксичности для клеток MDCK под влиянием действующего вещества после 4-х часов контакта. 1 - P.aeruginosa 28Р23 (х400); 2 - P.aeruginosa 28Р23 + 40 мкг/мл ДВ (х400); 3- P.aeruginosa 28Р23 (х1000); 4 - P.aeruginosa 28Р23 + 40 мкг/мл ДВ (х1000). Стрелками обозначены биопленки псевдомонад.
Настоящее изобретение направлено на способ получения твердой дисперсии, включающей 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид в преимущественно аморфной форме, по крайней мере, в одном фармацевтически приемлемом полимере, и содержащей или не содержащей одно или несколько поверхностно активных веществ.
Авторами была поставлена задача повысить биодоступность действующего вещества 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида путем получения твердых дисперсий. Действующее вещество в кристаллической форме является малорастворимым в воде веществом, в связи с чем возникают технологические сложности в процессе создания на его основе готовых лекарственных форм с высокой биодоступностью. Подбор состава вспомогательных веществ таким образом, чтобы увеличить биодоступность действующего вещества является не тривиальной задачей. Повышенная биодоступность непосредственно определяет терапевтическую эффективность лекарственного препарата. Полученные варианты твердой дисперсии имеют перспективы для внедрения в клиническую практику для лечения тяжелых хронических инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами микроорганизмов. Полученные технические результаты не являются очевидными, и их нельзя было предвидеть специалисту на основании имеющегося уровня техники.
Известно, что для повышения растворения и биодоступности плохо растворимых веществ используется метод введения вещества в твердые дисперсии, любым доступным способом, что позволяет стабилизировать действующее вещество в аморфной форме. В составе твердых дисперсий действующее вещество находится в аморфном виде или в виде аморфной фазы с примесью кристаллической или мелкокристаллической. Твердые дисперсии высвобождают действующее вещество в аморфной форме при взаимодействии с жидкой средой организма, такой как биологические жидкости желудочно-кишечного тракта, быстрее и эффективнее, чем лекарственные формы, содержащие действующее вещество в кристаллическом виде. Это объясняется тем, что растворение облегчается, по крайней мере, частично за счет снижения энергии, требуемой для высвобождения компонентов из твердой дисперсии, по сравнению с энергией, требуемой для растворения компонентов из кристаллической или микрокристаллической твердой фазы. Кроме того, необходимо, чтобы действующее вещество, высвобождающееся из твердой дисперсии, сохраняло способность солюбилизироваться в биологических жидкостях желудочно-кишечного тракта, так как в противном случае, высвободившееся действующее вещество может кристаллизоваться и осаждаться в желудочно-кишечном тракте и не всасываться, что приведет к снижению биодоступности. Полимеры и поверхностно активные вещества, используемые для получения твердых дисперсий, должны поддерживать действующее вещество в солюбилизированном состоянии в биологических жидкостях желудочно-кишечного тракта.
Учитывая тот факт, что действующее вещество характеризуется высокой липофильностью, позволяющей проникать через клеточные мембраны и обеспечивать приемлемую кишечную проницаемость, высвобождение действующего вещества из твердого раствора является ключевым фактором, влияющим на биодоступность разрабатываемого лекарственного средства. Более того, использование фармацевтически приемлемых полимеров позволяет обеспечить высвобождение действующего вещества более длительно, и всасывание не только преимущественно в желудке, но и в различных отделах кишечника. Применение поверхностно активных веществ позволяет увеличивать солюбилизацию в биологических средах организма и предотвращать осаждение растворившегося действующего вещества.
Термин «твердая дисперсия» в данном случае определяет систему в твердом состоянии, включающую, по крайней мере два компонента, где один компонент диспергирован в большей или меньшей степени равномерно по всему объему другого компонента или компонентов. Твердая дисперсия представляет собой такую дисперсию компонентов, в которой система является химически и физически однородной по всему объему или преимущественно состоит из одной фазы, аморфного вещества - твердый раствор. Твердые дисперсии в этом случае не содержат значительных количеств действующего вещества в кристаллическом или микрокристаллическом состоянии, что подтверждается данными качественного рентгенофазового анализа. Кроме того, термин также включает твердые дисперсии, которые являются менее однородными и могут содержать более чем одну фазу. Например, частицы, имеющие домены или небольшие области, где диспергированы в большей или меньшей степени равномерно аморфная, микрокристаллическая и/или кристаллическая фазы.
Действующее вещество в тексте данного документа: 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида (соединение CL-55).
Термин «фармацевтически приемлемый» подразумевает в контексте данного документа вспомогательные вещества, которые допустимо и обосновано с медицинской точки зрения применять для изготовления пероральных дозированных лекарственных форм, которые не имеют нежелательной токсичности, раздражающего действия, не взывают аллергических реакций и применение которых благоприятно с точки по показателям соотношения риска и пользы.
Согласно условиям, дозированная форма может включать, по крайней мере, одно поверхностно-активное вещество, имеющее величину гидрофильного липофильного баланса (HLB) от примерно 3 до примерно 40. Система HLB (Fiedler, H.В., Encyclopedia of Excipients, 5th ed., Aulendorf: ECV-Editio-Cantor-Verlag (2002), Encyclopedia of Biocolloid and Biointerface Science 2V Set, Volume I&II, 2016) присваивает поверхностно-активным веществам номерные значения, причем липофильные вещества получают более низкие значения HLB, а гидрофильные вещества получают более высокие значения HLB.
Полимеры, подходящие для использования в составе твердой дисперсии по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения перечисленными, гомополимеры и сополимеры N-виниллактамов, в особенности гомополимеры и сополимеры N-винилпирролидона, например поливинилпирролидон (ПВП), сополимеры N-винилпирролидона и винилацетата или винилпропионата, сложные эфиры целлюлозы и простые эфиры целлюлозы, в частности метилцеллюлозу и этилцеллюлозу, гидроксиалкилцеллюлозы, в частности гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиалкилалкилцеллюлозы, в частности гидроксипропил- метилцеллюлозу, фталаты или сукцинаты целлюлозы, в частности фталат ацетилцеллюлозы и фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы или ацетат сукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы; высокомолекулярные оксиды полиалкилена, такие как полиэтиленоксид и полипропиленоксид и сополимеры оксида этилена и оксида пропилена, полиакрилаты и полиметакрилаты, такие как метакриловая кислота/сополимеры этилакрилата, метакриловая кислота/ сополимеры метилметакрилата, бутилметакрилат/ сополимеры 2-диметиламиноэтил метакрилата, поли(гидроксиалкил акрилаты), поли(гидроксиалкил метакрилаты), полиакриламиды, полимеры винилацетата, такие как сополимеры виниладетата и кротоновой кислоты, частично гидролизованного поливинилацетата (также называемого частично омыленным "поливиниловым спиртом"), поливиниловый спирт, олиго- и полисахариды, такие как каррагинаны, галактоманнаны и ксантановая смола, или смеси одного или более этих компонентов. Особое предпочтение отдается полиакрилатам и полиметакрилатам, таким как метакриловая кислота/сополимеры этилакрилата, метакриловая кислота/сополимеры метилметакрилата, бутилметакрилат/ сополимеры 2-диметиламиноэтил метакрилата, поли(гидроксиалкил акрилаты), поли(гидроксиалкил метакрилаты), еще более предпочтительно использование полимеров Eudragit (полиметакрилаты), которые производит Evonik, представляют собой синтетические катионные или анионные полимеры диметиламиноэтилметакрилатов, сложных эфиров метакриловой кислоты и метакриловой кислоты в различных соотношениях. Еще более предпочтительно использовать Eudragit EPO, катионный полимер, который получают сополимеризацией бутилметакрилата, 2-диметиламиноэтилметакрилата и метилметакрилата в следствие наиболее предпочтительного профиля растворения в органических растворителях, в которых действующее вещество имеет наибольшую растворимость.
Дозированная форма в ряде случаев включает по меньшей мере одно поверхностно активное вещество, для поддержания действующего вещества в солюбилизированном состоянии в биологических жидкостях желудочно-кишечного тракта. Поверхностно-активные вещества, имеющие величину HLB примерно от 3 до 40, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают, включают в себя, без ограничения перечисленными: додецил сульфат натрия, простые эфиры полиоксиэтиленалкила, например полиоксиэтилен лауриловый эфир, полиоксиэтилен цетиловый эфир, полиоксиэтилен стеариловый эфир, полиоксиэтилен стеариловый эфир; полиоксиэтилен простые алкилариловые эфиры, например полиоксиэтилен нонилфениловый эфир, полиоксиэтилен  нонилфениловый эфир, полиоксиэтилен нонилфениловый эфир, полиоксиэтилен октилфениловый эфир; сложные эфиры полиэтиленгликолевой жирной кислоты, например ПЭГ-200 монолаурат, ПЭГ-200 дилаурат, ПЭГ-300 дилаурат, ПЭГ-400 дилаурат, ПЭГ-300 дистеарат, ПЭГ-300 диолеат; алкиленгликолевые моносложные эфиры жирной кислоты, например монолаурат пропиленгликоля; сложные эфиры жирной кислоты сахарозы, например моностеарат сахарозы, дистеарат сахарозы, монолаурат сахарозы, дилаурат сахарозы; или моносложные эфиры жирной кислоты сорбитана, такие как монолаурат сорбитана, сорбитана моноолеат, монопальмитат сорбитана, или сорбитана стеарат, или смеси одного или более этих компонентов. Особое предпочтение отдается натрия додецил сульфату, используемого как в качестве единственного ПАВ, так и в комплексе с другими ПАВ. Поверхностно активные вещества могут быть введены в состав твердой дисперсии и / или добавлены в качестве вспомогательного вещества в состав готовой фармацевтической композиции.
Твердые пероральные лекарственные формы включают, не ограничиваясь перечисленным: таблетки, покрытые и непокрытые оболочкой, диспергируемые таблетки, капсулы твердые желатиновые, дозированные порошки, порошки для приготовления суспензий для приема внутрь. Выбор твердых дозированных форм, включающих действующее вещество в виде твердой дисперсии, основан на их свойствах и известен специалистам в данной области техники. Предпочтительными дозированными формами являются таблетки. Для облегчения глотания такой дозированной формы желательно придать ей соответствующую форму. Таблетки, которые удобно глотать, имеют предпочтительно вытянутую форму. Пленочная оболочка таблетки дополнительно способствует облегчению глотания. Для производства фармацевтических композиций с использованием действующего вещества в аморфной форме в составе твердой дисперсии согласно данному изобретению могут использоваться разнообразные методы. Сами по себе процессы изготовления твердых дозированных форм с момента получения полупродукта во всем остальном является стандартными и легко осуществимыми. Таблетки могут производиться с помощью обычных способов получения таблеток с обычными широкодоступными эксципиентами и на обычном оборудовании для производства таблеток. Данные методы включают приготовление твердой дисперсии и формование в требуемую форму таблетки. Альтернативно, из твердой дисперсии могут быть получены гранулы, например путем измельчения или размалывания, гранулы могут смешиваться с необходимыми вспомогательными веществами и уплотняться в таблетки или использоваться для изготовления других дозированных форм. Вспомогательные вещества, подходящие для использования в составе фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают в себя, без ограничения перечисленными функциональными классами: наполнители, связывающие, разрыхляющие, модификаторы поверхности и поверхностно-активные вещества, буферные агенты, скользящие, смазывающие, подсластители, ароматизаторы и красители и вспомогательные вещества других классов, для обеспечения приемлемых технологических свойств массы для получения твердой дозированной формы фармацевтической композиции.
max
Полупродукт, описанный в настоящем изобретении и который может быть использован для изготовления фармацевтической композиции, проявляет поведение, характеризующееся высокими достижимыми показателями AUC, высокими C по сравнению с действующим веществом в кристаллическом виде (Пример 4).
Вспомогательное вещество: это вещества органической или неорганической природы, которые используют в процессе производства готовых лекарственных форм для придания им необходимых свойств. Примеры вспомогательных веществ по функциональным характеристикам включают, без ограничения перечисленным, связывающие вещества, стабилизаторы, наполнители, носители, разрыхлители, скользящие, разбавители, и др. Специалист в данной области техники может выбрать один или более вышеупомянутых вспомогательных веществ необходимого функционального назначения для обеспечения требуемых свойств твердой пероральной лекарственной формы. Количество каждого применяемого вспомогательного вещества изменяется в известных пределах. Вспомогательные вещества и их функциональные назначения, применяемые для получения пероральных лекарственных форм, описаны в следующих публикациях, включенных в настоящее описание в качестве ссылки. См. "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4-е изд., ред. Rowe и др., American Pharmaceuticals Association (2003), и Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 18.06.2019 N 103 "О справочнике функциональных назначений вспомогательных веществ, используемых при производстве лекарственных средств".
Фармацевтическая композиция: смесь, содержащая определенное количество действующего вещества и вспомогательные вещества, предназначенная для введения пациенту, для лечения заболеваний, вызванных резистентными микроорганизмами.
Полупродукт в контексте данного документа подразумевается твердая дисперсия, которая может быть использована для изготовления фармацевтической композиции для перорального применения.
Термин «AUC» означает «площадь под кривой» и используется в его обычном значении, т.е. как площадь под кривой зависимости концентрации в крови от времени.
max
Термин «C» обозначает максимальную концентрацию в крови.
Существуют разнообразные технологические приемы для получения твердых дисперсий, включающие экструзию расплава, сушку распылением и выпаривание раствора, в экспериментальной работе в большинстве случаев использовали метод выпаривания из раствора.
Процесс получения твердых дисперсий методом выпаривания раствора является самым простым и наименее ресурсоемким способом и включает следующие этапы:
1) смешивание компонентов: действующего вещества и одного или нескольких полимеров;
2) растворение в смеси органических растворителей до однородного состояния;
3) выливание указанного раствора на большую поверхность для образования тонкой пленки;
4) выпаривание растворителя;
5) высушивание до полного испарения органических растворителей;
6) измельчение полученной смеси.
Однако при масштабировании производства возможен переход к экструзии расплава или использовании распылительной сушки, как взаимозаменяемых процессов, что показано при наработке экспериментальных образцов различными способами.
Процесс экструзии расплава включает следующие этапы:
1) смешивание компонентов: действующего вещества и одного или нескольких полимеров;
2) нагревание смеси до получения однородного расплава;
3) пропускание полученного таким образом проплава через одну или несколько насадок;
4) охлаждение расплава до затвердевания;
5) измельчение охлажденного расплава.
Примеры получения твердой дисперсии:
Пример 1.
Наименование
Масса, г
Фтортиазинон
100
Kollidon VA64
400
Смесь Ацетон Этанол 50-50
До полного растворения (900 мл)
Взвесили необходимое количество Фтортиазинона и Kollidon VA64, растворили в смеси этанол/ацетон, при нагревании до 50°С, полученную смесь вылили на поддон и производили удаление растворителя в сушильном шкафу «Memmert», в течение 24 часов.
После окончания сушки производили стандартные аналитические процедуры, используя стандартное оборудование в данной области техники:
1 - Остаточные органические растворители методом газовой хроматографии.
2 - Родственные примеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3 - Количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
4 - Порошковая дифракция на определение степени кристалличности вещества.
Пример 2.
Наименование
Масса, г
Фтортиазинон
100
Soluplus
400
Натрия додецил сульфат (НДС
10
Взвесили необходимое количество Фтортиазинона и Soluplus, НДС и проводили процесс экструзии горячего расплава в экструдере Thermo при крутящем моменте 3 Torque и температуре 140°С.
После окончания процесса производили стандартные аналитические процедуры, используя стандартное оборудование в данной области техники:
1 - Родственные примеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2 - Количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3 - Порошковая дифракция на определение степени кристалличности вещества.
Пример 3.
Наименование
Масса, г
Фтортиазинон
100
Soluplus
400
Натрия додецил сульфат (НДС)
400
Взвесили необходимое количество Фтортиазинона и Soluplus, НДС и проводили процесс экструзии горячего расплава в экструдере Thermo при крутящем моменте 5 Torque и температуре 150°С.
После окончания процесса производили стандартные аналитические процедуры, используя стандартное оборудование в данной области техники:
1 - Родственные примеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2 - Количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3 - Порошковая дифракция на определение степени кристалличности вещества.
Пример 4.
Наименование
Масса, г
Фтортиазинон
100
Eudragit EPO
400
Span 20
200
Взвесили необходимое количество Фтортиазинона и Eudragit EPO, Span 20 и проводили процесс экструзии горячего расплава в экструдере Thermo при крутящем моменте 3 Torque и температуре 130°С.
После окончания процесса производили стандартные аналитические процедуры, используя стандартное оборудование в данной области техники:
1 - Родственные примеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2 - Количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3 - Порошковая дифракция на определение степени кристалличности вещества.
Пример 5.
Наименование
Масса, г
Фтортиазинон
100
Eudragit EPO
400
Span 20
800
Этанол абсолютный
2000
Взвесили необходимое количество Фтортиазинона и Eudragit EPO, Span 20 и растворили в Этаноле абсолютном и проводили процесс распылительной сушке в сушилке Buchi при температуре 180°С.
После окончания процесса производили стандартные аналитические процедуры, используя стандартное оборудование в данной области техники:
1 - Остаточные органические растворители методом газовой хроматографии.
2 - Родственные примеси методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
3 - Количественное определение методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
4 - Порошковая дифракция на определение степени кристалличности вещества.
Специалист в данной области техники способен оптимизировать параметры процессов выпаривания, экструзии расплава и распылительной сушки в соответствии со свойствами действующего вещества, полимеров и конфигурации используемого оборудования. Специалист в данной области легко определит наиболее подходящее оборудование, для получения объекта по настоящему изобретению.
Распылительная сушка компонентов раствора также дает выход твердой дисперсии указанных компонентов и может быть полезной альтернативой процессу экструзии расплава.
Предпочтительно твердая дисперсия находится в форме твердого раствора, включающего действующее вещество в аморфной форме и один или несколько полимеров, включать или не включать одно или несколько поверхностно активных веществ. Альтернативно, она может быть в форме дисперсии, где действующее вещество представлено в аморфном виде с примесью кристаллической или микрокристаллической фазы, диспергированной в большей или меньшей степени равномерно в твердом растворе (Пример 1).
Свойства полученных твердых дисперсий исследователи оценивали при помощи анализа растворения.
Для измерения степени кристалличности использовали следующие методы (Примеры 2 и 3):
1. Дифференциальная сканирующая калориметрия позволяет определить тепловой эффект растворения, который при постоянном атмосферном давлении соответствует изменению энтальпии и характеризует степень кристалличности вещества. Энтальпия растворения пропорциональна количеству растворенного вещества.
2. Рентгенодифракционный анализ порошков. Дифрактограммы позволяют оценить форму и размеры кристаллитов (0,005 - 0,0005 мм), а также соотношение кристаллической и аморфной фаз.
3. Сканирование с помощью электронной микроскопии.
Полученная твердая дисперсия позволила увеличить биодоступность (Пример 4) и антибактериальную эффективность in vitro и при лечении модельных инфекций на животных (Примеры 5-10).
Достигнутый технический результат предлагаемого изобретения соответствует поставленным задачам. Представленные ниже примеры подтверждают достижение указанных технических результатов, а именно, возможность получения заявляемой твердой дисперсии и иллюстрируют (без ограничения объема притязаний) свойства полученного полупродукта.
Перечень приведенных примеров
Пример 1. Разработка состава твердой дисперсии с применением скрининга методом растворения в различных буферных средах (при pH 1,2; 4,5 и 6,8), получение композиции для производства твердых лекарственных форм для перорального применения.
Пример 2. Сравнительное исследование действующего вещества в кристаллической форме, полимера Эудрагит Е РО и твердой дисперсии на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом дифференциальной сканирующей калориметрии.
Пример 3. Сравнительное исследование действующего вещества в кристаллической форме, полимера Эудрагит Е РО и твердой дисперсии на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом электронной сканирующей микроскопии.
Пример 4. Исследование пероральной биологической доступности у крыс действующего вещества в кристаллической и аморфной форме.
Пример 5. Характеристика клинических изолятов P.aeruginosa от больных муковисцидозом по наличию генов системы секреции III типа и активности этого секреторного аппарата.
Пример 6. Ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида)- в аморфной форме на ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов P.aeruginosa.
Пример 7. Подавление образования биопленок P.aeruginosa на поверхности эпителиальных клеток в экспериментах in vitro под влиянием действующего вещества в аморфной форме.
Пример 8. Изучение терапевтической эффективности действующего вещества в аморфной форме на модели острой пневмонии, вызванной P.aeruginosa.
Пример 9. Изучение терапевтической эффективности действующего вещества в аморфной форме на модели подострой инфекции респираторного тракта, вызванной клиническим изолятом P.aeruginosa, полученным от больного муковисцидозом.
Представленные ниже примеры иллюстрируют и подтверждают возможность получения заявляемой твердой дисперсии и решения поставленных задач.
Пример 1. Разработка состава твердой дисперсии с применением скрининга методом растворения в различных буферных средах (при pH 1,2; 4,5 и 6,8), получение композиции для производства твердых лекарственных форм для перорального применения.
Состав полупродукта твердой дисперсии подбирали исходя из анализа растворения твердой дисперсий на основе водорастворимых сополимеров, для специалиста в данной области техники является неоспоримым фактом, что сополимеры создают гораздо более лучшие с точки зрения растворения твердые дисперсные системы, чем монополимеры. В скриниге участвовали 3 сополимера с торговыми названиями Kollidon VA 64, Eudragit EPO, Soluplus обладающих различными физико-химическими свойствами. Для выбора лидирующего состава твердой дисперсии проводили исследование растворения твердых дисперсий в соотношениях действующего вещества к полимеру от 1:1 до 1:10 в трех различных буферных средах (при pH 1,2; 4,5 и 6,8). Сравнительная кинетика растворения в водной среде при различных физиологических значениях рН твердой дисперсии с использованием Eudragit E PO в качестве дисперсной фазы на аппарате «лопастная мешалка» при скорости вращения 75 об/мин при температуре 37±0,5°C. через 45 мин. Количественное определение высвободившегося действующего вещества проводили методом ВЭЖХ.
Чем меньше кристалличность действующего вещества, тем выше его растворение, что наглядно показано в таблице 1. Наилучшими свойствами обладают твердые дисперсии на основе сополимеров метакриловой кислоты, коммерчески доступных под торговым названием Eudragit, в данном исследовании предпочтительные свойства продемонстрировал Eudragit EPO.
Качественный рентгенофазовый анализ проводился с использованием автоматического порошкового дифрактометра Ultima IV-285 (Rigaku). Дифрактограммы позволяют оценить форму и размеры кристаллов, а также соотношение кристаллической и аморфной фаз. Дифрактограммы исследованных образцов приведены на Фиг.1-7. Действующее вещество представляет собой кристаллическое вещество, имеющее кристаллическую решетку без пространственных дефектов, и обладает практически 100 % кристалличностью (Фиг. 1). Твердые дисперсии, получаемые с различными полимерами в различных соотношениях полимеров с добавлением поверхностно активных веществ или без них, позволяют получать действующее вещество в однородном аморфном или аморфном с примесью микрокристаллической и кристаллической фазы виде (Фиг.2-7).
Различные полимеры позволяют получить стабильную аморфную фазу действующего вещества при различном соотношении компонентов. Приведены дифрактограммы твердых дисперсий полученных на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 с добавлением и натрия додецил сульфата; Soluplus, в соотношении 1:1 и 1:2; Kollidon VA 64 в соотношении 1:1 и 1:2.
Повышение растворения в трех буферных средах коррелирует с увеличением аморфности по результатам дифракционного анализа и повышением биодоступности и эффективности в пилотных экспериментах на животных. Практически все твердые дисперсии, полученные в эксперименте, позволили увеличить растворение. Выбор соотношения полимера и действующего вещества осуществляли исходя из разумного баланса между растворением и объемом получаемого полупродукта, что важно для разработки готовой лекарственной формы приемлемой для перорального применения - ее должно быть удобно использовать пациенту. В связи с этим дальнейшие исследования проводили с твердой дисперсией на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4.
Для более эффективного поддержания действующего вещества в солюбилизированном состоянии в биологических жидкостях желудочно-кишечного тракта, использовали поверхностно активные вещества. Любое из проанализированных поверхностно активных веществ, использованных в сочетании с твердой дисперсией как в ее составе, так и при внесении в качестве вспомогательного вещества, несколько увеличивает растворение и биодоступность в пилотных экспериментах по фармакокинетике. Наилучшим из проанализированных поверхностно активных веществ является натрия додецил сульфат. Также повышение аморфности действующего вещества в составе твердой дисперсии показал сорбитан-лаурат.
Таблица 1. Показатели растворения в трех средах
в/в
Soluplus
Kollidon  VA 64
Eudragit E PO
рН
1.2
4.5
6.8
1.2
4.5
6.8
1.2
4.5
6.8
Соотношение масс. API:Полимер
Концентрация Мкг/мл
1:0
0,29
0,78
0,34
0,29
0,78
0,34
0,29
0,78
0,34
1:1
1,20
1,99
2,09
5,80
6,68
7,89
8,95
18,84
8,14
1:2
2,70
2,34
2,27
8,65
7,15
9,67
14,63
61,87
9,04
1:3
2,75
2,47
2,44
9,86
7,26
9,77
18,16
64,19
9,08
1:4
2,89
2,55
2,50
10,86
13,29
10,95
28,18
111,14
9,18
1:5
3,09
2,76
2,53
14,22
16,09
14,53
29,24
157,34
9,21
1:6
3,21
3,23
3,34
14,72
16,20
13,34
33,01
210,99
11,02
1:7
3,53
3,45
3,52
14,78
16,08
14,23
49,35
213,10
11,52
1:8
4,56
4,61
3,56
23,63
16,43
22,42
64,67
217,54
11,80
1:9
6,28
6,32
3,57
23,72
26,04
22,31
64,98
230,17
12,04
1:10
18,27
9,65
4,00
25,91
23,90
35,57
82,91
222,50
12,27
Соотношение масс. API:Полимер:ПАВ
Концентрация Мкг/мл
10:10:1
1,70
2,99
2,69
7,80
7,68
8,89
10,95
23,84
11,14
1:1:10
2,70
4,11
3,15
8,43
8,51
9,11
11,45
25,34
12,31
10:100:1
20,27
10,32
4,35
26,62
25,21
36,31
83,32
223,25
14,34
1:10:20
23,21
13,11
5,54
27,32
28,31
38,51
85,21
229,32
16,01
Приведенный пример показывает, что, заявленное изобретение позволяет получить полупродукт (твердую дисперсию), обладающий улучшенной кинетикой растворения во всем диапазоне физиологических значений рН по сравнению с действующим веществом в кристаллической форме.
Пример 2. Сравнительное исследование действующего вещества в кристаллической форме, полимера Эудрагит Е РО и твердой дисперсии на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом дифференциальной сканирующей калориметрии.
Твердую дисперсию на основе Eudragit E PO в соотношении 1:4 исследовали методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Дифференциальный термический анализ позволяет дать оценку фазовых равновесий как чистых компонентов, так и смесей. Фазовые переходы регистрируются как функция температуры и времени. По данным измерений при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (анализ ДСК) можно судить о термическом поведении индивидуальных веществ и смесей: определять температуру плавления и теплоту фазовых переходов. Важными физическими характеристиками, которые учитываются при разработке твердых дисперсий, является температура стеклования твердой дисперсии и температура плавления компонентов твердой дисперсии - действующего вещества и полимеров, так как в процессе производства применяется термическое воздействие (экструзия, выпаривание растворителя).
Вывод. На приведенных термограммах (Фиг. 8-10) видно, что температура плавления действующего вещества - 134°С (Фиг. 8), Точка стеклования Еудрагита E PO находится в минимуме кривой на температуре 54°С (Фиг. 9). Исходя из термограммы твердой дисперсии (Фиг. 10) можно сделать вывод, что она ведет себя как самостоятельная система, в которой не содержится кристаллической фазы действующего вещества. Это самостоятельная система со своими термодинамическими свойствами отличительными от чистых веществ.
Пример 3. Сравнительное исследование действующего вещества в кристаллической форме, полимера Эудрагит Е РО и твердой дисперсии на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 методом электронной сканирующей микроскопии
Образцы действующего вещества в кристаллической форме, полимера Эудрагит Е РО и твердой дисперсии на основе Эудрагита Е РО, в соотношении 1:4 исследованы методом электронной сканирующей микроскопии. Электронные микрофотографии представлены на Фиг. 11-13. Они наглядно демонстрируют наличие крупных кристаллов в образцах действующего вещества и полимера и однородную аморфную фазу с включениями микрокристаллов.
Вывод. Микроскопическая картина твердой дисперсии подтверждает отсутствие кристаллической структуры, свойственной индивидуальным веществам, входящим в ее состав.
Пример 4. Исследование пероральной биологической доступности у крыс действующего вещества в кристаллической и аморфной форме.
Исследование сравнительной биологической доступности проводили на крысах. В исследовании использовали 60 самцов аутбредных крыс, массой 180-200 грамм, возрастом 7-8 недель. Все животные были здоровы, при проведении эксперимента получали сбалансированный кормовой рацион и воду в неограниченном количестве. Каждой крысе вводили перорально в дозе 50 мг/кг в пересчете на действующее вещество в кристаллической форме и твердой дисперсией следующего состава: действующее вещество 100 мг, Eudragit E PO в соотношении 1:5, 50 мг сорбитан-лаурат (Span 20), 30 мг натрия додецил сульфат. Препарат вводили через зонд в виде суспензии. У животных брали кровь 0, 1/2, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 ч после введения лекарственного средства. У животных получали образцы печени и легких для оценки накопления действующего вещества и метаболита. После перорального введения действующее вещество связывается с глюкуроновой кислотой и переходит в метаболит. Исследовали действующее вещество в свободном виде и в связанном (метаболит глюкуронид).
Метод определения аналитов в биологических образцах. Анализ проводился методом ВЭЖХ-МС/МС с использованием жидкостного хроматографа модели Acquity UPLC (Waters Inc., США) с системой автоматического ввода образцов (автосамлер), автоматическим устройством ввода пробы (автосамплер), термостатом колонки и дегазатором, масс-спектрометрический детектор TQS Micro с электрораспылительной ионизацией с нагреваемым потоком, система сбора и обработки данных с применением программного обеспечения MassLynx. Количественное определение основано на методе соотношения площади пика аналита и внутреннего стандарта (родственного соединения). Для исследования использована цельная кровь с натрия цитратом в качестве стабилизатора. Для оценки степени глюкуронирования проводили анализ проб крови после инкубации с раствором β-глюкоронидазы. Органы промывали, гомогенизировали, выделяли и анализировали содержание действующего вещества. Для оценки степени глюкуронирования проводили анализ проб гомогената после инкубации с раствором β-глюкоронидазы. Фармакокинетические параметры рассчитаны с использованием модуля Pk Solver.
Таблица 2. Фармакокинетические параметры действующего вещества и его метаболита в крови.
Параметр
Размерность
ДВ в кристаллическом виде
ДВ в аморфном виде
ДВ
метаболит
ДВ
метаболит
Т<sub>1/2</sub>
ч
45,5
6,05
51,58
4,54
Т<sub>max</sub>
ч
0,5
0,5
8
8
C<sub>max</sub>
нг/мл
4,97
30,92
8,95
67,2
AUC<sub>0-t</sub>
нг/мл*ч
47,94
198,21
112,86
701,02
AUC<sub>0-∞</sub>
нг/мл*ч
89,94
198,74
184,54
701,53
MRT<sub>0-t</sub>
ч
19,64
9,40
14,56
9,05
MRT<sub>0-∞</sub>
ч
63,53
9,53
56,45
9,09
Таблица 3. Фармакокинетические параметры действующего вещества и его метаболита в легких
Параметры
Размерность
ДВ в кристаллическом виде
ДВ в аморфном виде
ДВ
метаболит
ДВ
метаболит
Т<sub>1/2</sub>
ч
21,77
7,19
14,53
9,64
Т<sub>max</sub>
ч
0,5
1
0,5
8
C<sub>max</sub>
нг/мл
115,99
59,74
313,40
81,06
AUC<sub>0-t</sub>
нг/мл*ч
593,29
351,21
836,59
1002,72
AUC<sub>0-∞</sub>
нг/мл*ч
682,96
359,76
991,04
1016,87
MRT<sub>0-t</sub>
ч
12,57
7,59
12,50
13,65
MRT<sub>0-∞</sub>
ч
21,34
8,80
21,30
14,32
fT
12,38
1,77
7,41
1,43
Таблица 4. Фармакокинетические параметры действующего вещества и его метаболита в печени
Параметры
Размерность
ДВ в кристаллическом виде
ДВ в аморфном виде
ДВ
метаболит
ДВ
метаболит
Т<sub>1/2</sub>
ч
8,67
6,07
6,68
8,25
Т<sub>max</sub>
ч
0,5
1
8
8
C<sub>max</sub>
нг/мл
455,98
3404,96
476,74
4253,38
AUC<sub>0-t</sub>
нг/мл*ч
2585,88
36083,40
6062,29
58439,55
AUC<sub>0-∞</sub>
нг/мл*ч
2644,44
36303,64
6137,98
59606,37
MRT<sub>0-t</sub>
ч
9,98
9,73
9,96
13,13
MRT<sub>0-∞</sub>
ч
11,10
10,02
10,55
14,05
fT
53,94
182,04
53,72
83,36
Таблица 5. Биодоступность действующего вещества в аморфной форме по сравнению с кристаллической формой
Относительная биодоступность
Значение
кровь
235,4%
легкие
141%
печень
234,4%
Вывод: заявленное изобретение позволяет получить твердую дисперсию - полупродукт, обладающий повышенной биодоступностью по сравнению с действующим веществом в кристаллическом виде.
Пример 5. Характеристика клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa, полученных  от больных муковисцидозом, по наличию генов системы секреции III типа и активности этого секреторного аппарата
Известно, что тяжелое течение бронхолегочного процесса у больных муковисцидозом (МВ) определяется инфицированием дыхательных путей Pseudomonas aeruginosa, который в настоящее время остается ведущим патогеном, определяющим прогрессирующее поражение бронхолегочной системы и прогноз заболевания в целом. Возбудитель практически невозможно элиминировать и инфекция переходит в хроническую форму. Проводимые курсы антибактериальной терапии часто приводят к формированию антибиотикорезистентных псевдомонад, что делает антибиотикотерапию малоэффективной. Кроме того, в ходе длительного хронического инфицирования Pseudomonas aeruginosa может адаптироваться к персистенции с изменением вирулентных свойств. В связи с этим была проведена характеристика полученных от больных муковисцидозом изолятов Pseudomonas aeruginosa, что позволило оценить наличие генов системы секреции III типа (ССТТ) и активность секреторного аппарата как мишени для подавления изучаемым действующим веществом.
Исследование проводили на 11 изолятах синегнойной палочки, выделенных из мокроты пациентов с муковисцидозом в возрасте от 15 до 40 лет. Видовая идентификация была подтверждена в реакции ПЦР при использовании видоспецифических праймеров к гену trpE P.aeruginosa. Все штаммы характеризовались множественной резистентностью.
Изучение частоты встречаемости генов, кодирующих белки - эффекторы ССТТ псевдомонад у полученных штаммов, проводили с помощью ПЦР с ДНК штаммов. При отработке условий проведения реакции были использованы референс-штаммы P.aeruginosa с известным ССТТ генотипом, РАО (exoS+exoT+ exoY+ exoU) и PA103 (exoS - exoT+ exoY+ exoU+). В таблице 6 представлена последовательность праймеров, выбранных для определения наличия генов ССТТ Paeruginosa.
Таблица 6. Последовательность праймеров для определения наличия генов ССТТ P.aeruginosa.
Наименование олигонуклеотида
Исследуемый ген
Последовательность
5-PrimerS
exoS
GCG AGG TCA GCA GAG TAT CG
3-PrimerS
TTC GGC GTC ACT GTG GAT GC
5-PrimerT
exoT
AAT CGC CGT CCA ACT GCA TGC G
3-PrimerT
TGT TCG CCG AGG TAC TGC TC
5-PrimerU
exoU
CCG TTG TGG TGC CGT TGA AG
3-PrimerU
CCA GAT GTT CAC CGA CTC GC
5-PrimerY
exoY
CGG ATT CTA TGG CAG GGA GG
3-PrimerY
GCC CTT GAT GCA CTC GAC CA
Среди всех проанализированных штаммов P.aeruginosa exoU+ генотип был выявлен у 1 пациента, все остальные изоляты относились к exoS+ генотипу. Таким образом, все изоляты, полученные от пациентов с хронической псевдомонадной инфекцией, имели в своем геноме полный набор генов, кодирующих эффекторные белки ССТТ.
Характеристику функциональной активности ССТТ клинических изолятов P. aeruginosa проводили методом определения цитотоксичности. Токсичность в отношении эукариотических клеток, связанная с секрецией ExoU или ExoS белков, в условиях in vitro проявляется очень быстро, в течение первых 3 часов для еxoU и 5 часов для еxoS генотипа, и выражается в нарушении целостности клеточной мембраны с последующей гибелью клеток путем некроза. Мы использовали в тестах на цитотоксичность клетки линии СНО (Сhinese hamster ovary cells) и оценивали гибель клеток в тесте по количественному определению лактатдегидрогеназы в культуральной среде через 3 или 5 часов после внесения на клетки штаммов псевдомонад.
К суточному монослою клеток СНО, выращенному в 96-луночном планшете, добавляли 18-часовую культуру псевдомонад с МОИ 10 и инкубировали 3 или 5 часов. Планшет центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин для осаждения бактерий, а надосадок отбирали. Определение лактатдегидрогеназы проводили с помощью набора CytoTox Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции. Цитотоксичность выражали в процентах по отношению к значениям в незараженных клетках.
В таблице 7 представлены результаты анализа цитотоксичности изолятов псевдомонад. exoU генотип проявлял высокую токсичность - 90%. Среди 9 штаммов с exoS генотипом токсичность не проявлялась у 2-х изолятов, для других была показана достоверно выраженная токсичность, связанная с ССТТ.
Таблица 7. Результаты анализа цитотоксичности изолятов P. aeruginosa, выделенных от пациентов с муковисцидозом, полученные методом определения лактатдегидрогеназы.
N образца
Возраст пациента
Генотип CCТТ
Токсичность (3 ч)
Токсичность (5 ч)
28P23
39,9
еxoS
21,0%
28P24
31,5
еxoS
20,0%
28P26
28,4
еxoS
-
12,7%
28P27
25,5
еxoS
67,0%
28P29
24,5
еxoS
-
-
28P30
22,4
еxoS
-
10,0%
28P31
19,8
еxoS
19,7%
28P32
21,7
еxoU
90%
28P35
21,9
еxoS
10,4%
28P36
21,0
еxoS
12,8%
NS25
15
еxoS
-
8%
Вывод. Проведенная характеристика клинических изолятов P. aeruginosa, выделенных при хроническом инфицировании респираторного тракта больных муковисцидозом, по наличию генов системы секреции III типа и активности этого секреторного аппарата, показала, что все изоляты имеют полноценный набор генов белков-токсинов ССТТ. Кроме того, для большинства изолятов, 9 из 11, была выявлена цитотоксичность в клеточных тестах in vitro, что свидетельствует о функциональной активности системы секреции III типа у изолятов, выделенных от хронически инфицированных пациентов.
Пример 6. Ингибирующее действие 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4H-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида) в аморфной форме на ССТТ клинических антибиотикорезистентных штаммов P.aeruginosa.
Изучение влияния ингибитора ССТТ (ДВ) на цитотоксичность изолятов псевдомонад для клеток СНО проводили по описанной выше методике (Пример 5). Ингибитор добавляли в разных концентрациях (40 мкг/мл и 50 мкг/мл) к суспензии бактериальных клеток и инкубировали 30 мин до внесения на клетки СНО.
При изучении цитотоксичности свежевыделенных штаммов бактерий P. aeruginosa на клеточной линии СНО было показано, что добавление псевдомонад, изучаемых штаммов к клеткам в дозе 10 МОИ, вызывало сильную цитотоксичность клеток. Предварительное инкубирование бактерий с ингибитором ССТТ в дозе 50 мкг/мл практически полностью снижало цитотоксичность. В таблице 8 представлены данные по действию ингибитора системы секреции III типа (ДВ) на цитотоксичность изолятов P.aeruginosa в отношении клеток СНО.
Таблица 8. Результаты по подавлению цитотоксичности изолятов P. aeruginosa, выделенных от пациентов с муковисцидозом, в присутствии действующего вещества (ДВ), полученные методом определения лактатдегидрогеназы.
N образца
Токсичность (5 ч)
В присутствии ДВ
40 мкг/мл
50 мкг/мл
28P23
23%
8 %
0%
28P24
22%
12 %
2%
28P26
14%
5 %
0%
28P27
67 %
34 %
5%
28P29
-
-
-
28P30
10 %
7%
2%
28P31
21%
14%
8%
28P32
-
-
-
28P35
12%
8%
2%
28P36
14%
3%
0%
NS25
8%
2%
0%
Таким образом, экспериментально было показано, что при действии низкомолекулярного ингибитора ССТТ - действующего вещества на изученные изоляты псевдомонад подавлялась их цитотоксичность в отношении эукариотических клеток, связанная с эффекторными белками ССТТ - ExoU и ExoS.
Вывод. Таким образом, в совокупности, полученные данные свидетельствуют о наличии ССТТ и ее активности у клинических изолятов, полученных от больных муковисцидозом при хроническом инфицировании, с различным профилем антибиотикорезистентности и говорят в пользу ключевой роли системы секреции III типа в развитии инфекционного процесса, что делает ССТТ перспективной мишенью для подавления инфекции,. Изучение действия ДВ на цитотоксичность клинических изолятов P.aeruginosa показало эффективное подавление секреции токсинов ССТТ, что дает основание рассматривать ССТТ в качестве перспективной мишени для подавления хронической инфекции, вызванной мультирезистентными  штаммами синегнойной палочки.
Пример 7. Подавление образования биопленок P.aeruginosa на поверхности эпителиальных клеток в экспериментах in vitro под влиянием действующего вещества.
Одной из самых распространенных форм антибиотикорезистентности патогенных бактерий является их устойчивость к воздействию антибиотиков в составе биопленок.
Биопленки представляют собой особую форму существования бактерий в виде прикрепленных к субстрату конгломератов, заключенных в матрикс, состоящий из полисахаридов и внеклеточной ДНК. Согласно современным данным, более чем в 80 % случаев инфекционный процесс в организме человека сопровождается образованием биопленок. В составе биопленок устойчивость бактерий к антибиотикам повышается более чем в 1000 раз. Псевдомонады образуют биопленки на эпителии легких, мочевого пузыря, на раневых поверхностях, на почечных камнях.
Изучение влияния действующего вещества (ДВ) на образование биопленок проводили на модели биотической поверхности с использованием перевиваемой линии эпителиальных клеток MDCK (почки собаки).
Подавление образования биопленок P.aeruginosa
В экспериментах использовали изолят P.aeruginosa, полученный от больного муковисцидозом 28Р23. Бактерии инкубировали с ДВ в концентрациях 20  и 40 мкг/мл в присутствии ЭГТА в течение 30 мин до внесения на монослой эукариотических клеток. Затем вносили на клетки MDCK с МОИ 10 и инкубировали 4 часа. Часть образцов окрашивали кристаллвиолетом и просматривали в световом микроскопе. В другой части препаратов для количественного учета бактерий в биопленках монослой тщательно отмывали от не связавшихся бактерий, а клетки с прикрепленными к ним биопленками обрабатывали 0,1 % Тритоном Х-100 и ультразвуком для разрушения биопленок. Из дезинтегратов проводили посевы серийных разведений на цитримидный агар для подсчета КОЕ в составе биопленок. Эксперимент повторяли 3 раза.
На микрофотографиях через 4 часа после контакта P.aeruginosa изолята 28Р23 с клетками MDCK наблюдали выраженную токсичность, которая появлялась в разрушении монослоя клеток. В этих препаратах наблюдали формирование биопленок псевдомонад как на поверхности клеток, так и на стекле (Фиг.18). После действия ДВ цитотоксичность существенно снижалась, монослой сохранялся. При этом формирующихся биопленок было существенно меньше (Фиг.18).
Результаты высева из дезинтегратов биопленок, образующихся на поверхности эпителиальных клеток, показали, что количество псевдомонад в составе биопленок после воздействия ДВ достоверно снижалось по сравнению с контролем, а снижение имело дозозависимый характер (Таблица 9).
Таблица 9. Результаты высевов на цитримидный агар образцов биопленок P.aeruginosa в КОЕ/мл.
№
Название образца
Время культивирования, час
Кол-во КОЕ/ мл
1
P.aeruginosa
4
(6,38 ± 2,20)х10<sup>8</sup>
2
P.aeruginosa 20 мкг/ мл ДВ
4
(1,12 ± 0,28)х10<sup>7</sup>
3
P.aeruginosa 40 мкг/ мл ДВ
4
(1,98 ± 2,7)х10<sup>6</sup>
Таким образом, было показано, что ДВ подавляет процесс формирования биопленок на поверхности эпителиальных клеток, что указывает на участие ССТТ в этом процессе. Активность ДВ в отношении формирования биопленок псевдомонад является принципиально значимой его характеристикой, т.к. биопленки представляют серьезную проблему при лечении псевдомонадных инфекций.
Вывод. Хорошо известно, что способность бактерий формировать биопленки и длительно в них персистировать, несмотря на применение антибактериальных препаратов, создает крайне проблемную ситуацию с лечением хронических инфекций. Это в полной мере относится к неэффективности лечения хронического инфицирования больных муковисцидозом. Показанный эффект действия разрабатываемой твердой дисперсии на процесс формирования биопленки на поверхности эпителиальных клеток является принципиальным преимуществом этого препарата перед антибиотиками.
Пример 8. Изучение терапевтической эффективности действующего вещества в аморфной форме в виде твердой дисперсии на модели острой пневмонии, вызванной P.aeruginosa
P.aeruginosa - возбудитель респираторных заболеваний, среди которых тяжелые внутрибольничные пневмонии и хронические инфекции, характерные для пациентов с муковисцидозом. Хронические инфекции при муковисцидозе требуют длительных и многократных курсов антибиотикотерапии, что сопряжено с возрастающим риском развития резистентности. Серьезной проблемой является биодоступность антибактериальных препаратов в силу нарушения кишечной всасываемости и затрудненным проникновением препаратов в просвет бронхов у этой категории больных. Разработка антибактериального препарата, эффективного в отношении антибиотикорезистентных штаммов грамотрицательных бактерий и имеющего приемлемую биодоступность и способность накапливаться в легких, крайне актуальна для лечения хронических инфекций у больных муковисцидозом.
7
75
Для изучения терапевтической эффективности твердой дисперсии была разработана модель острой пневмонии на чувствительной линии мышей DBA/2 при заражении госпитальным изолятом P.aeruginosa КБ6, выделенным из мокроты пациента в отделении реанимации. Была определена доза заражения для изучения динамики гибели животных при развитии пневмонии в течение 5-ти дней наблюдения. При интраназальном введении P.aeruginosa эта доза составила 2х10КОЕ (колониеобразующих единиц) / мышь, что соответствовало ЛД.
Лечение проводили твердой дисперсией следующего состава: действующее вещество 100 мг,  Eudragit E PO в соотношении 1:5, 50 мг сорбитан-лаурат (Span 20), 30 мг натрия додецил сульфат.  Дозы действующего вещества для мышей составили: 12,5 мг/кг; 25 мг/кг и 50 мг/кг один раз в день. Эквивалентная доза для человека в мг/кг (ЭДЧ) рассчитывается  по дозе для животного (мг/кг), разделив дозу для животного на коэффициент пересчета (КП) для человека. При пересчете дозы с мыши на человека КП составляет 12. Таким образом, суточные дозы в пересчете на человека (средний вес 75 кг) составили 12,5 мг/кг (мышь) - 1 мг/кг (человек) или 75 мг; 25 мг/кг (мышь) - 2 мг/кг (человек)  или 150 мг;  и 50 мг/кг (мышь) - 4 мг/кг (человек) или 300 мг.  Для сравнения терапевтической эффективности полученной твердой дисперсии с действующим веществом в аморфной форме с действующим веществом в кристаллической форме сформировали группу животных, которым вводили перорально действующее вещество в кристаллической форме, суспендированное в 2% крахмале в терапевтически эффективной дозе -150 мг/кг один раз в день. Лечение начинали одновременно с заражением. Лечение проводили в течение 4-х дней, на 5-й день останавливали опыт. Эффективность лечения препаратом проводили по динамике выживаемости и состоянию животных.
Наблюдения за животными показали, что в контрольных группах в первые 3 дня после заражения выжившие мыши теряли в весе, не питались, были малоподвижны. В группах леченных твердой дисперсией животных состояние было болезненным в первые 2 дня, но на 3-и сутки животные становились более активными, начинали питаться и постепенно прибавляли в весе. В группе лечения действующим веществом в кристаллической форме  состояние мышей было удовлетворительным при введении дозы 150 мг/кг. Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11. Результаты изучения антибактериальной эффективности действующего вещества в аморфной форме в виде твердой дисперсии (ТД) в суточных дозах 12,5 мг/кг (75 мг), 25 мг/кг (150 мг) и 50 мг/кг (300 мг) при сравнении с действующим веществом в кристаллической форме (ДВК) в суточной дозе 150 мг/кг.
Группа
Количество мышей в группе
% павших мышей
Средняя продолжительностьжизни %
Среднее значение КОЕ/ легкое на 5-ые сутки
% животных отрицательных по высевам
1 группа-контроль заражения
12
75
48
6,4±4,5х10<sup>2</sup>
0
2 группа-сравненияЛечение ДВК150мг/кг
12
0
100
27 КОЕ*
91,7
3 группа-опытнаяЛечение ТД 12,5мг/кг
12
41,6
70
3,6±1,5,х10<sup>1</sup>
33,3
4 группа-опытнаяЛечение ТД25 мг/кг
12
16,6
81
70 КОЕ
75,1
5 группа-опытная Лечение ТД50 мг/кг
12
0
100
20 КОЕ*
91,7
Примечание: * - различие в сравнении с контролем значимо по непараметрическому критерию Манна-Уитни (p<0,05).
7
Проведенные эксперименты по оценке антибактериальной эффективности твердой дисперсии при пероральном введении мышам в суточных дозах 12,5 мг/кг (75 мг); 25 мг/кг (150 мг) и 50 мг/кг (300 мг) для лечения острой пневмонии, вызванной госпитальным штаммом P.aeruginosa КБ6, показали зависимое от дозы антибактериальное действие препарата. При интраназальном заражении изолятом КБ6 в дозе 2х10КОЕ/мышь развивалась острая пневмония, вызывающая гибель 75% животных. Пероральное применение твердой дисперсии 1 раз в день в течение 4-х дней в дозе 12,5 мг/ кг повысило выживаемость мышей в 2,3 раза. Для дозы 25 мг/кг было показано увеличение выживаемости в 3,3 раза, а для дозы 50 мг/ кг гибели животных не наблюдали.
При сравнении эффективности терапии твердой дисперсией с действующим веществом в аморфной форме с терапией действующим веществом в кристаллической форме в дозе 150 мг/кг, обладающей 100% протективным эффектом, было показано, что твердая дисперсия обладает большей эффективностью, т.к. 100% выживаемость животных наблюдается при меньшей дозе - 50 мг/кг. Тем самым при создании твердой дисперсии была достигнута поставленная цель по повышению биодоступности и терапевтической эффективности действующего вещества.
Вывод. Полученные данные свидетельствуют об эффективности лечебного действия действующего вещества в аморфной форме в виде твердой дисперсии (ТД) на модели пневмонии, вызванной клиническим изолятом P.aeruginosa, характеризующимся множественной резистентностью к антибиотикам. Была выбрана эффективная доза действующего вещества в аморфной форме в виде твердой дисперсии, защищающая 100% животных от гибели. Разработанная твердая дисперсия позволила снизить дозу препарата в 3 раза в сравнении с действующим веществом в кристаллической форме, что свидетельствует о повышении биодоступности действующего вещества в составе твердой дисперсии.
Пример 9. Изучение терапевтической эффективности действующего вещества в аморфной форме в виде твердой дисперсии на модели подострой инфекции респираторного тракта, вызванной клиническим изолятом P.aeruginosa, полученным от больного муковисцидозом.
Для пациентов с муковисцидозом характерно хроническое инфицирование патогенами, среди которых наибольшее клиническое значение имеет P.aeruginosa, при этом длительные курсы антибактериальной терапии не позволяют достичь эффективной эрадикации возбудителя в силу приобретенной антибиотикорезистентности этими бактериями. Более того, псевдомонады адаптируются к длительной колонизации респираторного тракта благодаря изменению вирулентных свойств, что направлено на менее агрессивное влияние на организм хозяина и хроническое инфицирование. В нашем исследовании для изучения терапевтической эффективности действующего вещества в аморфной форме была разработана модель хронического инфицирования респираторного тракта мышей, которую воспроизводили при заражении животных клиническим изолятом P.aeruginosa 28Р23, полученным от больного муковисцидозом.
7
8
8
9
Эксперименты проводились на инбредной линии мышей DBA/2, самцах в возрасте 4-6 недель, весом 14-16 г. Заражение животных изолятом  P.aeruginosa 28Р23 интраназально в дозах 5х10, 1х10, 5х10, 1х10КОЕ/мышь не приводило к инфицированию мышей. Это связано со снижением вирулентности псевдомонад, выделенных от хронически инфицированных пациентов с муковисцидозом. В дальнейшем была отработана модель при внутрибрюшинном заражении этим изолятом. что позволило воспроизвести подострую системную инфекцию с колонизацией респираторного тракта.
9
Для внутрибрюшинного заражения животным вводили культуру бактерий в физиологическом растворе в дозе 1х10 КОЕ/мышь, объем вводимой суспензии составлял 100 мкл на животное. После заражения ежедневно проводили мониторинг продолжительности жизни мышей (критерий - смертность). Материалом для посева для определения количества псевдомонад служили гомогенаты легких и селезенок.
Лечение проводили твердой дисперсией следующего состава: действующее вещество 100 мг, Eudragit E PO в соотношении 1:5, 50 мг сорбитан-лаурат (Span 20), 30 мг натрия додецил сульфат.  Для лечения животных готовили навески твердой дисперсии с действующим веществом в аморфной форме индивидуально для каждого животного относительно его веса. Непосредственно перед введением препарата в пробирку с навеской наливали 200 мкл питьевой воды. Встряхивали пробирку на вортексе до растворения навески. Суспензию вводили мышам интрагастрально с помощью зонда. Лечение проводили 1 раз в день в течение 8 дней в дозе 50 мг/кг а пересчете на действующее вещество, которая показала свою эффективность на модели острой пневмонии. На 9-й день после заражения выживших животных эвтаназировали, отобранные легкие и селезенки гомогенизировали и делали высевы на селективную среду. Эксперимент был выполнен в 2-х повторах. Чашки Петри инкубировали при 37°С и через 20 часов культивирования производили подсчет колоний. Концентрацию псевдомонад в органах выражали числом КОЕ в 1 мл. Схема эксперимента представлена в таблице 12.
9
Таблица 12. Схема эксперимента. Заражение клиническим изолятом P.aeruginosa 28Р23 в дозе 1х10КОЕ/мышь и лечение действующим веществом в аморфной форме в виде твердой дисперсии (ТД) в дозе 50 мг/кг один раз в день.
Группа
Кол-во животных
Доза препарата
Схема введения препарата
Суммарная длительностьвведенияпрепарата
Метод исследования
1Контроль заражения1х10<sup>9</sup>КОЕ/ мышь
4х2
-
-
-
Высевы из органов, динамика гибели
2Заражение1х10<sup>9</sup>КОЕ/ мышьЛечение ТД
4х2
50 мг/кг
1 раз в день
8 дней
Высевы из органов, динамика гибели
В течение первых двух дней эксперимента незначительные симптомы обезвоживания наблюдались в обеих группах, с третьего дня в группе лечения состояние мышей нормализовалось в обоих повторах. Состояние мышей контрольной группы в обоих повторах варьировало от нормального до угнетенного, выраженно апатичного, которое сопровождалось также симптомами обезвоживания. В контрольной группе пали мыши с наиболее выраженными признаками апатии и обезвоживания.
В группе контроля отмечали гибель мышей на пятый и седьмой день эксперимента. От общего количества животных в группе процент павших мышей составил 25%. В группе лечения не было зарегистрировано гибели животных. Средняя продолжительность жизни в группе контроля составила 75,4%, в то время как в группе лечения этот параметр был равен 100%.
9
Таблица 13. Результаты наблюдения за динамикой гибели и освобождения организма мышей от возбудителя при  заражении P.aeruginosa 28Р23 в дозе 1х10 КОЕ/мышь и лечении действующим веществом в аморфной форме виде твердой дисперсии (ТД) в дозе 50 мг/кг.
Группа
Кол-во мышей в группе
% павших мышей
Средняяпродолжительностьжизни в  %
Среднее значение КОЕ/орган на 9-ые сутки
Кол-во животных, отрицательных по высевам
легкое
селезенка
легкое
селезенка
1Контроль заражения1х10<sup>9</sup>КОЕ/ мышь
4х2
25
75
1,1х10<sup>2</sup>
2,5х10<sup>2</sup>
5
2
2Заражение1х10<sup>9</sup>КОЕ/ мышьЛечение ТД
4х2
0
100
0
50 *
8
6
Примечание: * - различие в сравнении с контролем значимо по непараметрическому критерию Манна-Уитни (p<0,05).
На 9-й день выживших животных эвтаназировали. На вскрытии отмечалась спленомегалия, у контрольной группы выраженная значительнее, чем у группы лечения. Макроскопическая картина поражения легких присутствовала в группе лечения у 3-х мышей из 8 в виде мелких очаговых поражений. В группе контроля у всех мышей отмечались мелкие очаговые поражения легких, у некоторых из мышей - с тенденцией к слиянию. Морфологическая картина изменений в легких указывала на развитие пневмонии.
Легкие и селезенки отбирали, гомогенизировали и делали серийные разведения высевов гомогенатов на чашки Петри с цитримидным агаром. Результаты высевов представлены в таблице 13.
2
При учете количества псевдомонад в высевах из легких отмечали, что среднее значение для группы контроля было 1,1х10КОЕ/мл, двое животных были отрицательными по высевам в данной группе. В группе лечения псевдомонады из легких не высевались ни у одной мыши, т.е. все 8 мышей были отрицательно по высевам.
2
В группе контроля, среднее количество бактерий в высевах из селезенок составило 2,5х10КОЕ/мл, и лишь 2 мыши были отрицательны по высевам из селезенок. В группе лечения у 6 животных не высевались псевдомонады из селезенок.
Статистический анализ количества псевдомонад в высевах из органов мышей выявляли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Разница в количестве бактерий в высевах из селезенок между контрольной и опытной группами у мышей, зараженных изолятом P.aeruginosa 28Р23 и леченых  твердой дисперсией (ТД), является статистически достоверной (p<0,05).
Вывод. Было показано, что клинический изолят P.aeruginosa 28Р23, выделенный от больного муковисцидозом, вызывает у мышей подострую пневмонию с длительным течением. В контрольной группе инфекция вызывала 25% летальность, а морфологические изменения в легких свидетельствовали о развитии пневмонии. Пероральное лечение препаратом твердой дисперсии в дозе 50 мг/кг один раз в день показало 100% протективное действие и увеличение средней продолжительности жизни мышей в период наблюдения. Состояние мышей на 9-ый день после заражения характеризовалось как нормальное. Терапия действующим веществом в аморфной форме приводила к полной эрадикации возбудителя из легких и значительно снижала бактериальную нагрузку в селезенке животных.
max
Приведенные примеры подтверждают, что коллективом изобретателей выполнена поставленная задача настоящего изобретения по разработке новых и более эффективных лекарственных форм, содержащих действующее вещество в аморфной форме в составе твердой дисперсии. Получен полупродукт (твердая дисперсия) пригодный для изготовления лекарственных форм, содержащий действующее вещество в аморфном виде; обладающий более высокими показателями растворения в тесте кинетики растворения в трех средах по сравнению с кристаллической формой; обладающий более высокой биодоступностью, (что характеризуется высокими достижимыми показателями AUC, более высокими достижимыми C). Для действующего вещества была показана ингибирующая активность в отношении системы секреции III типа у изолятов P.aeruginosa, полученных при хроническом инфицировании больных муковисцидозом. Для действующего вещества было продемонстрировано подавление образования псевдомонадами биопленок, структур, которые серьезно осложняет течение хронических инфекций. Биопленки принципиально затрудняют антибактериальную терапию, при которой необходимо использовать значительно более высокие дозы антибиотиков и комбинировать несколько препаратов. Полученные результаты в экспериментах in vitro по ингибирующей активности действующего вещества на вирулентность P.aeruginosa, указывают на антибактериальную эффективность разработанной твердой дисперсии для лечения хронических инфекций. Эффективное количество действующего вещества в твердой дисперсии в пересчете на человека составляет 75- 300 мг в сутки. Дозировка рассчитана, исходя из экспериментов in vivo, с использованием коэффициентов межвидового пересчета. Эквивалентную дозу для человека в мг/кг (ЭДЧ) рассчитывали по дозе для животного (мг/кг), разделив дозу для животного на коэффициент пересчета (КП) для человека. При пересчете дозы с мыши на человека КП составляет 12. Эффективная терапевтическая доза должна обеспечивать достаточные для подавления микробного роста концентрации в биологических средах организма, а также для обеспечения возможности дозирования препарата на вес пациента, в зависимости от тяжести заболевания. Длительность терапии определяется врачом исходя из особенностей заболевания. Полученные результаты открывают перспективы применения препаратов, содержащих действующее вещество в аморфной форме, для лечения рецидивирующих и хронических инфекций, вызванных крайне актуальным патогеном P.aeruginosa, вне зависимости от приобретенной резистентности к антибиотикам.