СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИМОНА in vitro
METHOD OF CULTURING LEMON in vitro

Способ относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к культуре тканей в условиях in vitro и может быть использован для микроразмножения и создания in vitro коллекций многолетних древесных культур.
Известно, что культивирование in vitro вегетативных органов древесных плодовых культур сопряжено с рядом трудностей, таких как сложность получения стерильной культуры, низкие коэффициенты размножения и укоренения, низкий уровень жизнеспособности микропобегов. Повышение эффективности размножения и надежности сохранения in vitro сортов коллекции цитрусовых возможно путем оптимизации состава питательных сред и использования техники микропрививки.
Аналогичные способы культивирования цитрусовых in vitro выполнены на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982; Marin, Duran Villa, 1999; Chaturvedi et al., 2002; Avenido et al., 2004; Jajoo, 2009; Benabdesselam, 2011; Chen, 2012 и др.). Однако при культивировании сеянцев сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5-10 и более лет. Альтернативным путем надежного сохранения сортов цитрусовых in vitro является микропрививка, которая впервые была разработана L. Navarro для культивирования цитрусовых in vitro в 1980-х годах, затем эта техника модифицировалась другими авторами (Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Hančević et al., 2009). Однако предлагаемая ими техника является трудоемкой и характеризуется высоким риском возникновения вторичной инфекции, так как для культивирования микропривитых растений используются жидкая питательная среда с перфорированными мостиками из фильтровальной бумаги.
Преимущество разработанного нами способа культивирования лимона in vitro состоит в том, что он позволяет сохранять и размножать генотипы с высокой степенью надежности и генетической стабильности за счет модификации техники микропрививки и состава питательной среды.
Научно-техническая задача, на решение которой направлено изобретение - оптимизировать протокол культивирования лимона in vitro для микроразмножения и сохранения ценных генотипов и создания депонированной коллекции цитрусовых культур. Технический результат заключается в увеличении коэффициента размножения и приживаемости микропрививки.
Поставленная задача достигается культивированием микропобегов в 3 этапа:
- культивирование стерильных пазушных почек от молодых побегов на питательной среде МС с добавлением БАП 0,1 мг/л, НУК 0,5 мг/л, агар 0,7%, при стандартных условиях - световом режиме 16/8, температуре +22±2°С;
- выращивание подвоев in vitro - стерильные семена помещают на среду WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 0,7%;
- прививка меристем с 2-3 примордиями от стерильных микропобегов на подвой - 3-4-х недельные сеянцы, выращенные in vitro с последующим культивированием на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.
Сущность заявленного изобретения иллюстрируется следующими материалами:
На фиг. 1 изображены введенные в культуру пазушные почки лимона через 8 дней (слева) и их пролиферация через 30 дней (справа).
На фиг. 2 изображены подвои - 5-недельные сеянцы для микропрививки. На фиг. 3 изображены микропривитые растения лимона Новоафонский на лимон Мейера через 20 (слева), через 40 (справа) дней после прививки.
На фиг. 3 изображены микропривитые растения лимона Новоафонский на лимон Мейера через 20 (слева), через 40 (справа) дней после прививки.
На первом этапе для введения в культуру пазушных почек молодые побеги обрабатывают 10% раствором Белизны 15 мин, затем 0,3% раствором Велтолен 25 мин и после трехкратной промывки стерильной дистиллированной водой помещают на среду почка с сегментом побега длиной 0,7-1,0 см.
Дальнейшее культивирование полученных из почек микропобегов цитрусовых осуществляется путем микропрививки. Подвой - сеянцы лимона Мейера (Citrus х meyeri Meyer) - получают следующим путем: стерильные семена очищают от семенных оболочек и помещают на среду WPM с добавлением БАП 1, ГК 2 мг/л, при стандартных световом и температурном режимах.
Прививку делают на подвой - 3-5-недельные сеянцы. В качестве привоя используют стерильные меристемы с 2-3 примордиями, размером 0,4-0,6 мм. Меристемы получают от деревьев открытого грунта (in vivo) и от введенных в стерильную культуру пазушных почек (in vitro). Прививку делают следующим способом: отрезают верхнюю часть сеянца, оставляя эпикотиль длиной 1,3-1,5 см. В месте среза делают L-образный надрез коры, под которую помещают меристему привоя. Корневую систему сеянца оставляют длиной 1-1,5 см. Далее микропривитые растения культивируют на свежей питательной среде.
Пример культивирования цитрусовых in vitro показан на 4 генотипах лимона. Первый этап - введение пазушных почек в стерильную культуру путем обработки побегов Белизной 10, 15% (10 мин) с последующей обработкой раствором Велтолен 0,2, 0,3, 0,4% (25 мин). Результат введения в стерильную культуру устанавливался по количеству стерильных жизнеспособных эксплантов (таблица 1).
Лучшим вариантом стерилизации оказался вариант III, где количество стерильных жизнеспособных почек составило 29,7%. В других вариантах этот показатель был ниже по причине контаминации либо некротических поражений тканей дезинфицирующими веществами.
Второй этап - выращивание подвоев in vitro. На этом этапе выявлена оптимальная комбинация регуляторов роста в среде WPM, позволяющая получать коэффициент размножения сеянцев до 4,2 (таблица 2, фиг. 2).
05
05
Третий этап - микропрививка сортов на сеянцы лимона Мейера (фиг. 3). Изучаемый показатель - процент приживаемости меристем в прививке - составил 65,8-81,6% при использовании in vitro культивируемых побегов в качестве источника меристем, в 2-3 превысив приживаемость in vivo меристем (таблица 3). Все различия достоверны (Fф≥F) и существенны (HCP=8,33). В аналогичных работах по процент успешных микропрививок колеблется от 30 до 75% (Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Hančević et al., 2009). Микропривитые растения культивируют на среде WPM с добавлением БАП 1 мг/л, ГК 2 мг/л, агар 7 г/л, сахарозы 20 г/л.
Предложенный способ культивирования лимона in vitro позволяет обеспечить надежное сохранение генотипов и увеличить коэффициент размножения в 1,6 раза и приживаемость микропрививки на 6,6-35,1% по сравнению с аналогичными работами в этой области.
В целом заявленный способ дает возможность сохранять в коллекции in vitro ценные генотипы лимона с высокой степенью генетической стабильности и однородности растительного материала.