ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ИНГИБИТОР РОСТА HELICOBACTER PYLORI И СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ АНТИХЕЛИКОБАКТЕРНОЙ ТЕРАПИИ
MEDICINAL AGENT, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, HELICOBACTER PYLORI GROWTH INHIBITOR AND METHOD OF ANTIHELICOBACTERY THERAPY

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована в качестве лекарственного средства, ингибитора роста бактерий рода Helicobacter pylori при проведении антихеликобактерной терапии.
Helicobacter pylori (H.pylori) является хорошо изученным патогеном человека, одним из представителей обширного рода бактерий, поражающих желудочно-кишечный тракт млекопитающих. Эпидемический процесс H.pylori-инфекции носит глобальный и массовый характер, инфицировано более 60% населения планеты. В России распространенность инфекции H.pylori высока. В Хакасии, Новосибирске, Санкт-Петербурге инфицировано от 80 до 95% взрослого населения.
Отличительной чертой эпидемического процесса H. pylori-инфекции в России является значительная пораженность взрослого населения, отсутствие эффекта снижения превалентности H.pylori в целом и экспансия среди детского и подросткового населения тех заболеваний, которые причинно связаны с этим микроорганизмом - гастритов и язвенной болезни (Жебрун А.Б. Инфекция Helicobacter pylori. 2006, 1-379).
Было замечено, что антиинфекционная терапия гастрита и связанных с ним болезней, приводит к исчезновению H. pylori из слизистой по данным гистологического и бактериологического исследования биоптатов (Rauws E., Tytgat G. Campylobacter pylori. Amsterdam, 1989, 169 р.). В Маастрихтском консенсусе отмечено, что H. pylori является наиболее доказанным фактором риска развития некардиального рака желудка, который ассоциирован с H. pylori в среднем в 71% случаев. Эрадикация H. pylori предупреждает развитие предраковых изменений в слизистой оболочке желудка и экономически эффективна.
Антихеликобактерная терапия гастрита способна остановить прогрессирование атрофических и метапластических изменений в слизистой и вызывать у части больных редукцию явлений атрофии и, возможно, метаплазии. В 2005 году приняты Стандарты «Диагностика и терапия кислотозависимых заболеваний, в том числе и ассоциированных с Helicobacter pylori» (3-е Московское соглашение, 4 февраля 2005 г.). Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2005; №3: Приложение С.1-4).
Быстроразвивающая антибиотикорезистентность современных штаммов H. pylori потребовала гибких подходов к эрадикационной терапии и выработке рекомендуемых схем терапии «первой линии», терапии «второй линии» и «терапии спасения».
Абсолютными показаниями к антихеликобактерной терапии являются язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (как в фазе обострения, так и в фазе ремиссии), включая осложненную язвенную болезнь; MALT-лимфома; атрофический гастрит; состояние после резекции желудка по поводу рака.
Основной схемой терапии «первой линии» согласно Маастрихтскому консенсусу является схема тройной терапии, проводимой в течение 7 дней и включающей ингибитор протонной помпы, кларитромицин (при первичной резистентности к кларитромицину в соответствующем регионе или в популяции, не превышающей 15-20%) и амоксициллин или метронидазол. Учитывая небольшое преимущество метронидазола перед амоксициллином, рекомендовано использовать схему с метронидазолом в тех случаях, когда резистентность к этому препарату ниже 40%.
При неэффективности тройной терапии предлагается классическая квадротерапия с препаратами висмута. В случае неэффективности обоих курсов антихеликобактерной терапии предлагается несколько вариантов так называемой «терапии спасения», которая обязательно должна базироваться на исследовании чувствительности к используемым антимикробным препаратам. Неэффективность терапии заключается также и в том, что бактерии поражают не только слизистую желудка, но и колонизируют подслизистое пространство желудка, образуя малодоступные зоны, где рН среды существенно выше и там создаются все условия для роста и размножения этих бактерий. Кроме того, эти бактерии обладают повышенной кислотоустойчивостью, которая связана с выработкой таких ферментов как уреаза и аргиназа (маркером этой инфекции является уреазный тест, на основании которого дают заключение о наличии инфекции в организме) Это свойство бактерий также осложняет борьбу с ней.
Антимикробные препараты, применяемые в качестве ингибитора в схемах антихеликобактерной терапии - метронидазол и амоксициллин представляют собой сильнодействующие лекарственные вещества, применение которых сопровождается нежелательными побочными эффектами. Кроме того, синтетические препараты обладают токсическим действием на печень.
Метранидазол представляет собой антибактериальное, противопротозойное средство и используется при заболеваниях ЖКТ, трихомониаза, лямблиоза, амебиоза, в комбинированной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Амоксициллин представляет собой антибиотик широкого спектра действия, который проявляет антибактериальное и бактерицидное действие, активен в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий Препарат применяют при бактериальных инфекциях мочеполовой системы, желудочно-кишечного тракта, в комбинированной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и др.
Наиболее близким аналогом изобретения, можно считать работу Баранской Е.К. Язвенная болезнь и инфекция Helicobacter pylori. Болезни органов пищеварения, 2000, 2 (1), с.8-14, в которой описана антихеликобактерная терапия с применением в качестве ингибиторов антимикробных препаратов, в частности метронидазола, который используют во всех схемах лечения.
Недостатками описанного выше способа являются традиционное при лечении антибиотиками нежелательное побочное влияние на органы пациента, например, на печень, кровь и т.д. Кроме того, устойчивость бактерий рода Н.Pylori к этим антибиотикам дает незначительный результат при лечении, так как появилось очень много полирезистентных штаммов к антибиотикам, что не позволяет полностью подавить рост бактерий и справиться с инфекцией.
Задачи, на решение которых направлены изобретения, заключаются в создании нового средства, свободного от вышеуказанных недостатков, и способа лечения подобных заболеваний.
Поставленные задачи решены следующим образом. Лекарственное средство для антихеликобактерной терапии представляет собой хвойную хлорофилло-каротиновую пасту (ХХКП). Фармацевтическая композиция для антихеликобактерной терапии содержит хвойную хлорофилло-каротиновую пасту в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемые носители и/или растворители. Фармацевтическая композиция выполнена в виде раствора, суспензии, капсулы, таблетки.
Хвойную хлорофилло-каротиновую пасту применяют в качестве активного ингредиента фармацевтической композиция Биоэффектив A» (CGNC) для антихеликобактерной терапии. Она является ингибитором бактерий рода Helicobacter pylori при проведении антихеликобактерной терапии. Способ проведения антихеликобактерной терапии включает введение больным эффективного количества хлорофилло-каротиновой пасты в виде самостоятельного препарата или в составе фармацевтической композиции.
Хвойную хлорофилло-каротиновую пасту (ХХКП) выделяют из древесной зелени хвойных пород сосны и ели. Она представляет собой густую темно-зеленую пасту с запахом хвои, состоящую из 35-45% воды (влажность) и нейтрализованных до рН 7,8-9,0 водным раствором едкого натра экстрагируемых углеводородным растворителем экстрактивных веществ и обладает антимикробным, ранозаживляющим, фунгицидным и интерфероногенным действием.
В таблице приведен химический состав ХХКП, в % от массы органических веществ.
Таблица 1
Компоненты
Количество
Производные хлорофилла
1-2
Бета-каротин и другие каратиноиды
0,04-0,06
Натриевые соли жирных, смоляных двухосновных, оксо- и оксикислот, в том числе пинифоловая кислота
44-60
10-25
Воскообразные вещества
5-8
Эфирные масла
1-1,2
Нейтральные вещества (спирты, альдегиды, сложные
40-55
эфиры) в том числе неомыляемые веществаиз них
20-30
лабданоиды
30-50
Изобретения осуществляются следующим образом.
В процессе проведенных исследований было выявлено новое свойство растительного препарата ХХКП, а именно применение его в качестве ингибитора роста бактерий рода Helicobacter pylori в модельной системе in vitro. Было проведено сравнение действия ХХКП с антимикробными препаратами - метронидазол и амоксициллин.
Основанием для применения препарата ХХКП по заявленному назначению послужило выявление ряда новых активностей, ранее не известных для него.
Для исследования у 27 больных с различными заболеваниями ЖКТ (хронический гастрит, хронический гастродуоденит, хронический атрофический гастрит, эрозивный гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) методом фиброгастроскопии был взят биопсийный материал. Посевом биопсийного материала было получено 15 штаммов Н.pylori.
ХХКП исследовали в дозах: 50-100-300 мг/мл. Исследования проводились с помощью бактериологического метода. Исследовалось влияние на рост Н.pylori трех концентраций препарата ХХКП: 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 300 мкг/мл. С этой целью применялся метод серийных разведений на плотных питательных средах, содержащих нарастающие концентрации исследуемого вещества. Контролями роста микроба служили изоляты Helicobacter pylori, высеваемые на стандартные для бактерий этого рода среды (без добавления ХХКП). Действие препарата сравнивалось с плацебо (стерильным физиологическим раствором - 0,15 М раствором NaCl, pH 7,0-7,2). В опыте сравнения исследовалось влияние на рост Н.pylori антимикробных препаратов - амоксициллина (20 мкг/мл) и метронидазола (80 мкг/мл).
Результаты, полученные при внесении растительного препарата ХХКП в агаризованную ростовую среду, представлены в таблице 2.
Изучение влияния ХХКП на рост Helicobacter pylori.
Из вышеприведенного следует, что препарат ХХКП в концентрации 300 мг/мл оказывает ингибирующее влияние на рост всех 15-и исследуемых штаммов Helicobacter pylori (максимальный срок наблюдения 12 дней).
В концентрации 50 мг/мл препарат не оказывает влияния на рост изолятов Helicobacter pylori (максимальный срок наблюдения 12 суток). Препарат ХХКП в концентрации 100 мг/мл частично приводил к образованию кокковых форм бактерий (при микроскопии колоний часть бактерий находилась в виде кокков, часть в виде характерных изогнутых палочек). Известно что наряду с палочковидной формой, существует «кокковая» форма Н.pylori, которую микроорганизм принимает при воздействии неблагоприятных для него факторов внешней среды. Эта форма определяется и в биоптатах слизистой, и в условиях искусственного культивирования Кокковидная форма Н. pylon некультивируема.
Было замечено, что переход Н.pylori в кокковидную форму свидетельствует об адаптивном характере изменения формы бактерий в целях выживания и преодоления неблагоприятных условий среды.
Это свидетельствует о том, что ХХКП в концентрации 100 мг/мл создает неблагоприятные условия для роста и размножения этого микроба. Реверсии в вегетативную форму и восстановления способности к размножению при пассажах кокковидной формы Н.pylori не наблюдалось, так как считается, что кокковидная форма Н.pylori не относится к фазе покоящихся жизнеспособных бактерий и представляет собой популяцию дегенерирующих и мертвых клеток.
В качестве препаратов сравнения были выбраны лекарственные препараты, которые наиболее часто используются в комбинированной антихеликобактерной терапии - метронидазол и амоксициллин. В опыте сравнения действия на Helicobacter pylori растительного препарата ХХКП в концентрации 300 мкг/мл, амоксициллина в концентрации 20 мкг/мл и метронидазола в концентрации 80 мкг/мл было исследовано 4 штамма (№№782, 785, 786, 787) (таблица 3). Эти штаммы Н. pylori выделены от больных с хроническим гастродуоденитом, гастритом культи желудка, язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и рефлюкс-эзофагитом. Выявлена ингибирующая активность ХХКП (концентрация 300 мг/мл) и амоксициллина (концентрация 20 мкг/мл). Метронидазол (концентрация 80 мкг/мл) ингибирующего действия на рост этих штаммов Н. pylori не оказывал. Результаты опыта представлены в таблице 3.
Изучение влияния препаратов сравнения на рост Н. pylori.
Таблииа 3
№ штамма (код больного)
Диагноз
Действующее вещество
Амоксициллин (20 мкг/мл)
Метронидазол (80 мкг/мл)
ХХКП (300 мг/мл)
Плацебо (физиологический раствор рН 7,0-7,2)
782
ХГД
+
-
+
-
785
Гастрит культи желудка
+
-
+
-
786
ЯБДК, рефлюкс-эзофагит
+
-
+
-
787
ХГД
+
-
+
-
Условные обозначения:
ХГД - хронический гастродуоденит
ЯБДК - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки
(+) - оказывается ингибирующее действие
(-) - ингибирующего действия нет.
В результате проведенных исследований было показано следующее:
- Препарат ХХКП в концентрации 300 мг/мл оказывал ингибирующее влияние на рост изолятов Helicobacter pylori (максимальный срок наблюдения 12 дней).
- Препарат ХХКП в концентрациях 50 мг/мл и 100 мг/мл не оказывал влияния на рост изолятов Helicobacter pylori (максимальный срок наблюдения 12 суток).
- Препарат ХХКП в концентрации 100 мг/мл частично приводил к образованию кокковых форм бактерий (при микроскопии колоний часть бактерий находилась в виде кокков, часть в виде изогнутых палочек).
- Внесение в ростовую агаризованную среду плацебо (стерильного физиологического раствора, рН 7,0-7,2), не оказывало влияния на рост исследуемого микроорганизма.
- В опыте сравнения действия на Helicobacter pylori ХХКП в концентрации 300 мг/мл, амоксициллина в концентрации 20 мкг/мл и метронидазола в концентрации 80 мкг/мл выявлена ингибирующая активность у ХХКП и амоксициллина. Метронидазол ингибирующего действия на рост Н.pylori не оказывал.
Ниже приведены результаты искусственного культивирования Helicobacter pylori с внесением определенного числа клеток Н.pylori в среду и эффект действия ХХКП/CGNC с целью установления минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для ХХКП.
Результаты количественного исследования ингибирующей активности ХХКП на рост Helicobacter pylori.
Таблица 4
Посевная доза (число клеток Н.pylori на 1 чашку Петри)
Концентрация ХХКП
Контроль(чашки с чистой культурой Н.pylori)
50 мкг/мл
100 мкг/мл
300 мкг/мл
0,4×10<sup>9</sup>
рост Н.pylori
рост Н.pylori
нет роста Н.pylori
Сплошной рост
0,4×10<sup>8</sup>
рост Н.pylori
рост Н.pylori
нет роста Н.pylori
>20 колоний
0,4×10<sup>7</sup>
рост Н.pylori
нет роста Н.pylori
нет роста Н.pylori
20 колоний
0,4×10<sup>6</sup>
рост Н.pylori
нет роста Н.pylori
нет роста Н.pylori
10 колоний
0,4×10<sup>5</sup>
рост Н.pylori
нет роста Н.pylori
нет роста Н.pylori
до 6 колоний
-7
В результате этих исследований было установлено, что хвойная хлорофилло-каротиновая паста обладает отчетливой ингибирующей активностью на рост бактерий Н.pylori при искусственном культивировании бактерий на плотной питательной среде. Минимальная эффективная ингибирующая концентрация пасты: 100 мкг/мл питательной среды обеспечивает полное подавление роста посевной дозы Н.pylori, равной 0,4·10бактериальных клеток.
Выявленная способность препарата ХХКП подавлять рост Helicobacter pylori позволит найти применение данного препарата в комплексной терапии Н.pylori - ассоциированных заболеваний.
ХХКП, несмотря на применение в более высокой чем амоксициллин концентрации, имеет ряд преимуществ:
- состоит из природных соединений, более адаптированных к человеку, чем синтетические антибиотики;
- отсутствует «привыкание» штаммов патогенна к препарату из-за воздействия суммы соединений, обладающей бактерицидной и бактериостатической активностью: терпены, смоляные кислоты, лабданоиды и др. соединения;
- относится к IV классу опасности по сравнению с другими используемыми для хеликобактерной терапии соединениями;
- получают из доступного сырья хвои, сосны - отхода лесозаготовительной промышленности известными способами;
- может использоваться непосредственно или в виде субстанции для получения лекарственной формы.
Примеры фармацевтических композиций включают любые твердые (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и т.д.) или жидкие (растворы, суспензии, эмульсии) лекарственные формы для приема внутрь, традиционные формы для парентерального введения или для ректального (в виде свеч) введения.
Композиции для приема внутрь могут содержать традиционные для них наполнители, их можно готовить в твердой или жидкой форме: в виде таблеток, капсул, раствора, суспензии или сиропа; они могут содержать любые приемлемые эксципиенты, такие как связующие агенты (например, сахар, желатин, сорбитол, каррагинин или поливинилпирролидон), наполнители (лактоза, лецитин, соевое масло, крахмал, фосфат кальция, сорбитол), таблетирующие лабриканты (например, стеарат магния, диоксид кремния), дезинтеграторы (например, гидроксипропилкрахмал, глицерин, поливинилпирролидон, микрокристаллическую целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу), увлажнители (например, натрия лаурил сульфат), поверхностно-активные или диспергирующие вещества. Жидкие формы для приема внутрь могут включать растворители (вода, растительные или животные масла, минеральное масло), декстрозу, иные растворы сахаридов, гликоли и поверхностно-активные или диспергирующие вещества (ПАВ). Указанные композиции готовят традиционными общепринятыми методами. Такие методы включают смешивание активного ингредиента с носителем, который может включать один или более вспомогательных ингредиентов и получение из смеси готового к продаже продукта.
Таблетки можно получать прессованием на соответствующем оборудовании, при этом активный ингредиент в форме порошка или гранул в случае необходимости смешивается со связующими добавками (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), лубрикантами, инертными растворителями, дезинтеграторами (такими как производные целлюлозы, поперечно-связанный повидон, натрия карбоксиметилцеллюлоза), поверхностно-активными или диспергирующими веществами. Таблетки, полученные формованием на соответствующем оборудовании, содержат смесь увлажненного порошка ХХКП с инертными жидкими растворителями. В случае необходимости таблетки можно покрывать оболочкой для замедленного или контролируемого высвобождения активного ингредиента. Оболочки можно получать, например, из гидроксипропилкрахмала, двухосновного фосфата натрия, глицерина, или гидроксипропилметилцеллюлозы, или ее смеси с желирующими веществами (каррагинин, желатин, воски) в разных соотношениях для обеспечения желательного профиля высвобождения.
Композиции для парентерального введения можно готовить как традиционными в фармации методами (растворы, суспензии), так и виде водных микроэмульсий согласно патенту RU 2189231 на основе раствора Хенкса с 10% этанола или другими методами. Они могут включать воду, фармацевтически приемлемые жиры или масла, спирты или другие органические растворители, поверхностно-активные вещества и/или антиоксиданты, консерванты. Обычные концентрации CGNC (ХХКП) находятся в диапазоне от 0,05% до 80%. Готовые составы могут содержать разовую дозу или выполняться в виде ампул или флаконов, содержащих несколько разовых доз. Готовые лекарственные формы в случае необходимости могут содержать стабилизаторы, буферные системы, и иные вспомогательные средства.
Средства для ректального введения могут включать традиционные для данной формы парафин, растительные, животные или минеральные жиры и масла, эмульгаторы, полиэтиленгликоль, лаурилсульфат или соли лаурил сульфата, минеральные кислоты или натрия гидрокарбонат.
Примеры фармацевтических композиций:
Пример 1: жидкая пероральная форма, мас.%:
CGNC (ХХКП)
0,050-50
Вода очищенная и/или дистиллированная,
и/или минеральная
Остальное до 100
Смешивают хвойную пасту - CGNC (хвойную хлорофилло-каротиновую пасту -ХХКП) и очищенную воду при нагревании до 40°С в указанной пропорции, перемешивают в течение 10-15 минут, охлаждают до температуры 5-8°С в холодильнике, отстаивают при этой температуре в течение 1 суток, фильтруют через фильтр, стерилизуют в автоклаве и разливают во флаконы с дозатором.
Пример 2: мягкие овощные капсулы, мас.%
CGNC (ХХКП)
22,7-33,2
Наполнители: соевое масло и/или лецитин,
и/или диоксид кремния
45,2-50,0%
Мягкая оболочка овощных капсул:
Каррагенан
4,9
Фосфат натрия двухосновный
0,4
Гидрооксипропил крахмала
15,1%
Глицерин
11,8
Очищенная вода
Остальное 100
Указанные ингредиенты смешивают, помещают в капсулы темного цвета, состоящие из натуральных инградиентов: каррагенана, гидрооксипропил крахмала, глицерина с добавлением фосфата натрия и воды, упаковывают во флаконы или в блистерную упаковку, стерилизуют.
Пример 3: таблетки с оболочкой, мас.%
CGNC (ХХКП)
15,38-49,23
Крахмал картофельный
10,76-0,538
Сахар молочный (лактоза)
30,77-29,23
Микрокристаллическая целлюлоза с влажн. 5%
40,0-18,0
Поливинилпирролидон (ПВП), мед. низкомолекулярный
2,15-2,05
Кальций стериновокислый
0,94-0,92 масс%
Таблетки получают в «кипящем слое» путем перемешивания основных компонентов смеси, затем смесь увлажняют, готовят отдельно водный раствор ПВП, который при перемешивании добавляют в хвойную хлорофилло-каротиновую пасту (CGNC), перемешивают, фильтруют через капроновое сито. По окончании подачи увлажнителя систему промывают теплой воды при температуре 50-60°С и отключают насос. Смесь сушат при температуре 55-60°С в течение 8-10 минут, затем установку отключают и загружают рецептурное количество опудривающих веществ: микрокристаллической целлюлозы и стеариновокислого кальция. Смесь сушат в течение 1-2 минуты при температуре 55-60°С. По окончании процесса сушки и опудривания смесь выгружают из аппарата и просеивают на вибросите. Готовый гранулят таблетируют в таблетки массой 0,65 г с содержанием пасты хвойной хлорофилло-каротиновой (CGNC) 0,1 г - 0,32 г, упаковывают во флаконы или в блистерную упаковку.