Способ определения производных стероидных гормонов в моче
METHOD FOR DETERMINATION OF STEROID HORMONE DERIVATIVES IN URINE

Изобретение относится к области медицины, а точнее клинической химии, в частности, к способам определения эндогенных стероидных гормонов в организме человека.
Известны способы определения стероидных гормонов в моче человека методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [Analysis of steroids in urine by gas chromatography-capillary photoionization-tandem mass spectrometry / , K. Scholz, N.  [et al.] // J. Chromatogr. A. 2019. V. 1598, P. 175-182; пат. 2380704, RU, МПК G01N 33/48 (2006.01); пат. 2467331, RU, МПК G01N 33/50 (2006.01); G01N 33/52 (2006.01); G01N 33/74 (2006.01)].
Общим недостатком, присущим данным способам, является негативное влияние воды и других протонных растворителей на получение производных, которые не способны образоваться в их присутствии, вследствие чего используется длительная и трудоемкая подготовка проб к анализу для получения летучих производных стероидных гормонов.
Известен способ определения 17β-эстрадиола в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ детектированием [, Е. Dispersive liquid-liquid microextraction as an effective preanalytical step for the determination of estradiol in human urine / E. , K.  // J. Sep.Sci. 2017. V. 40. P. 2620-2628].
Образец мочи объемом 2 мл, содержащий 8% хлорид натрия, обрабатывают ультразвуком в течение 2 минут. Затем быстро вводят в образец 600 мкл смеси, состоящей из тетрахлорметана и этанола (1:5), и перемешивают его 1 минуту с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 10000 об./мин. Органический слой отбирают шприцем в стеклянную виалу и упаривают досуха в водяной бане. После этого перерастворяют сухой остаток в 50 мкл этанола для анализа.
Анализ проводят с использованием аналитической колонки Nucleosil С-18 (250 × 4 мм, 5 мкм) с применением подвижной фазы, состоящей из метанола и воды в режиме изократического элюирования, и УФ детектированием при длине волны 280 нм.
К недостаткам данного способа относятся невоспроизводимость результатов и невысокая чувствительность определения, что обусловлено необходимостью анализа конъюгатов.
Известен также способ определения стероидных гормонов в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием [Hexafluoroisopropanol-alkyl carboxylic acid high-density supramolecular solvent based dispersive liquid-liquid microextraction of steroid sex hormones in human urine / Y. Zong, J. Chen, J. Hou [et al.] // J. Chromatogr. A. 2018. V. 1580. P. 12-21].
Согласно этому способу к образцу мочи объемом 900 мкл добавляют 100 мкл концентрированной соляной кислоты и инкубируют его в водяной бане 2 часа при 80°С. После гидролиза проводят дисперсионную жидкость-жидкостную микроэкстракцию следующим образом: в образец мочи быстро вводят смесь, состоящую из 20 мкл 2% октановой кислоты и 70 мкл 7% гексафторизопропанола, затем образец перемешивают и оставляют на 10 минут. После этого его центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин для разделения фаз, отбирают нижнюю фазу в виалу и упаривают ее практически досуха при 80°С в токе азота. В виалу добавляют 60 мкл аммиачного буферного раствора (рН 8), 40 мкл аммиачного буферного раствора (рН 10), 100 мкл раствора дансил хлорида и перемешивают. Далее виалу термостатируют в течение 9 минут при 80°С для получения производных стероидных гормонов.
Анализ проводят с использованием аналитической колонки Sepax BR-C18 column (150 × 2.1 мм, 3 мкм) с применением подвижной фазы, состоящей из муравьиной кислоты в воде и муравьиной кислоты в ацетонитриле в режиме градиентного элюирования, а также тандемным масс-спектрометрическим детектированием.
Недостатком указанного способа является получение невоспроизводимых результатов из-за возможной деградации аналитов по причине использования концентрированной соляной кислоты для гидролиза конъюгатов. Кроме того, данный способ имеет неудовлетворительную селективность хроматографического разделения из-за использования дансил хлорида в качестве дериватизирующего агента.
Наиболее близким к заявленному способу является способ определения стероидных гормонов в моче человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием [Quantification of steroid hormones in human urine by DLLME and UHPLC-HRMS detection / E. Dmitrieva, A. Temerdashev, A. Azaryan [et al.] // J. Chromatogr. B. 2020. V. 1159. №122390.].
Пробоподготовку осуществляют путем введения в образец мочи объемом 3 мл, содержащим внутренний стандарт, фосфатного буферного раствора (рН 6.5), содержащего фермент β-глюкуронидазу Е. coli, с последующим инкубированием смеси в течение 30 минут при 50°С. Далее в смесь добавляют 1 мл боратного буфера (рН 9) и 150 мг хлорида натрия, затем в анализируемую пробу при помощи шприца вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и 1100 мкл ацетонитрила, образец перемешивают в течение 15 сек, далее центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин. После разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают его в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл водно-метанольного раствора (1:1).
Анализ проводят с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием аналитической колонки Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм) и подвижной фазы, состоящей из 0.1% муравьиной кислоты в воде и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле в режиме градиентного элюирования, а также квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием.
Недостатком указанного способа является невысокая чувствительность определения большинства стероидов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение чувствительности определения стероидов.
Технический результат достигается тем, что в способе определения стероидных гормонов в моче человека, включающем приготовление анализируемой пробы путем введения в образец мочи, содержащий внутренний стандарт фиксированной концентрации, фосфатный буферный раствор (pH 6.5) с ферментом Р-глюкуронидазы Е. Coli, с последующим инкубированием полученной смеси в течение 30 минут при 50°С, и вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и диспергента, в качестве которого используют ацетон в количестве 500 мкл, перемешивают в течение 15 сек, центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин, после разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл разбавителя, в качестве которого применяют водный раствор гидроксиламина и метанола (1:1). Полученную смесь инкубируют в течение не менее 90 минут при температуре не менее 70°С. Последующее хроматографическое разделение осуществляют с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием. Заявляемый способ отличается от прототипа тем, что:
- в качестве диспергента используют ацетон в количестве 500 мкл;
- в качестве разбавителя применяют 100 мкл смеси водного раствора гидроксиламина и метанола (1:1);
- смесь инкубируют в течение не менее 90 минут при температуре не менее 70°С.
На фигуре представлена зависимость степени протекания реакции от: а) температуры при времени термостатирования 90 минут и концентрации гидроксиламина 1.6 М; б) времени термостатирования при температуре термостатирования 70°С и концентрации гидроксиламина 1.6 М.
Для осуществления способа использовали хроматограф Bruker Elute, соединенный с масс-спектрометрическим детектором с источником электрораспылительной ионизации Bruker MaXis Impact, и колонку Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм). Элюирование проводили с использованием двухкомпонентной системы, а именно, 0.1% муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле (элюент Б).
Обсуждение параметров способа, позволяющих достичь положительного результата.
Экспериментально было выявлено, что при добавлении к 1 мл синтетической мочи смеси хлороформа и ацетона, представляющих собой экстрагент и диспергент соответственно, достигают наивысшей степени извлечения стероидов. Объемы хлороформа и ацетона, обеспечивающие количественное извлечение стероидов, устанавливали путем проведения дисперсионной жидкость-жидкостной микроэкстракции с различными объемами хлороформа в диапазоне 50-150 мкл и ацетона в диапазоне 450- 550 мкл. Использование 150 мкл хлороформа 500 мкл ацетона привело к количественному извлечению всех стероидов, поэтому данные объемы хлороформа и ацетона были выбраны для использования в дальнейших экспериментах.
Затем изучали зависимость степени протекания реакции от температуры и времени. Данные по оптимизации условий получения производных стероидов представлены на фиг., где по горизонтали представлены стероиды, а по вертикали - степень протекания реакции. Как видно на фиг.а), температура не менее 70°С является оптимальной для получения производных стероидов, а оптимальным временем протекания реакции - не менее 90 минут, см. фиг..б).
В этих условиях на хроматограммах отсутствуют пики, принадлежащие исходным соединениям, в то время как пики производных стероидных гормонов достигают максимальных значений, что свидетельствует о полноте протекания реакции получения производных стероидов.
Пример конкретного выполнения.
К 1 мл образца мочи добавляют 100 мкл внутреннего стандарта метилтестостерона (конечная концентрация - 100 нг/мл мочи) и 0.3 мл фосфатного буферного раствора (pH 6.5), содержащего фермент 0- глюкуронидазу Е. coli, с ее последующим инкубированием в течение 30 минут при 50°С. Далее в пробу мочи при помощи шприца вводят смесь, состоящую из 150 мкл хлороформа и 500 мкл ацетона, образец перемешивают в течение 15 сек, далее центрифугируют 10 минут при 10000 об./мин. После разделения фаз проводят отбор нижнего органического слоя, упаривают его в токе азота и к сухому остатку добавляют 100 мкл 1.6 М водного раствора гидроксиламина и метанола (1:1). Смесь инкубируют в течение 90 минут при 70°С для получения производных стероидных гормонов.
Анализ проводят с использованием хроматографа Bruker Elute, соединенного с масс-спектрометрическим детектором с источником электрораспылительной ионизации Bruker MaXis Impact, и колонкой Phenomenex Kinetex С18 (100 х 2.1 мм, 1.7 мкм). Элюирование проводят с использованием двухкомпонентной системы, а именно, 0.1% муравьиной кислоты в воде (элюент А) и 0.1% муравьиной кислоты в метаноле (элюент Б), по следующей программе: 1.00 мин - 95% А, 2.70 мин - 40% А, 4.00 мин - 40% А, 5.00 мин - 10% А, 7.50 мин - 10% А, 7.51 мин - 95% А, 9.00 мин - 95% А. Скорость потока составляет 0.4 мл/мин при температуре термостата 40°С. Условия масс-спектрометрического детектирования представлены в табл. 1.
Обсуждение преимуществ заявляемого способа.
Для сравнения чувствительности предлагаемого способа и способа прототипа готовили градуировочные растворы в диапазоне концентраций стероидных гормонов 0.1-100 нг/мл. Подготовку проб к анализу проводили в оптимальных условиях по каждому из способов. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Использование заявленного способа позволяет увеличить чувствительность определения стероидных гормонов, а именно: тестостерона, дигидротестостерона, эстрона, прогестерона, 11α-гидроксипрогестерона, что особенно важно, учитывая их крайне низкие концентрации в моче человека. Кроме того, увеличение чувствительности определения позволяет снизить требуемое количество образца мочи, а также объемы используемых токсичных растворителей без ухудшения аналитических характеристик методики.
Из этой таблицы видно, что заявляемый способ позволяет достичь увеличения чувствительности в 2-100 раз для большинства определяемых соединений, а у кортизона и кортизола чувствительность является сопоставимой, но при этом объем пробы в 3 раза меньше.