Влияние сублингвальной формы галавита на иммунофенотип и функциональную активность иммунокомпетентных клеток мышей

УДК 615.277.3:616.006-092.6

M. A. Baryshnikova, F. V. Donenko, I. Zh. Shubina, M. V. Kiselevsky

GALAVIT SUBLINGUAL FORM EFFECT ON IMMUNOPHENOTYPE AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF IMMUNOCOMPETENT MURINE CELLS

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

The study investigated immunotropic activity of injection and sublingual form of galavit. The results show that the drug stimulates NK-activity of MNC and enhances lymphocyte prolipherative activity. The ability of sublingual galavit tablets to stimulate innate immunity is similar to the drug injection form.

Key words: galavit, immunotropic activity, prolipherative activity, sublingual tablets.

М. А. Барышникова, Ф. В. Доненко, И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский

ВЛИЯНИЕ СУБЛИНГВАЛЬНОЙ ФОРМЫ ГАЛАВИТА НА ИММУНОФЕНОТИП И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК МЫШЕЙ

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Проведено исследование иммунотропной активности инъекционной и сублингвальной форм галавита. Показано, что препарат стимулирует НК-активность мононуклеарных клеток крови, повышает пролиферативную активность лимфоцитов. Способность сублингвальных таблеток галавита активировать врожденный иммунитет приближается к инъекционной лекарственной форме этого препарата.

Ключевые слова: галавит, иммунотропная активность, пролиферативная активность, сублингвальные таблетки.

ВВЕДЕНИЕ

Определение субпопуляционного состава и НК-активности лимфоцитов имеет важное значение в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов для прогнозирования течения и оценки эффективности терапии различных заболеваний [5-7]. Изменение этих параметров может служить характеристикой эффективности воздействия иммуномодулирующих препаратов, которые зарекомендовали себя как эффективные средства профилактики и лечения иммунодефицитных состояний [6]. В ряде исследований показана высокая иммуномодулирующая активность нового синтетического иммунотропного препарата галавит.

Галавит разработан ЗАО «Центр современной медицины «Медикор». Активное действующее вещество - 5-амино-1,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидрофталазин-2-ид натрия дигидрат. В 1997 г. галавит зарегистрирован в России и рекомендован к применению в виде сухой

рассыпки для приготовления раствора для инъекций у взрослых в составе комплексной терапии для коррекции иммунодефицитных состояний [2; 4].

Разработка галавита и внедрение его в клиническую практику обусловлены постоянным ростом аллергических, аутоиммунных, инфекционновоспалительных и онкологических заболеваний, а также отсутствием желаемого эффекта при традиционной этиотропной терапии [3; 8].

Механизм действия галавита обусловлен его способностью воздействовать на функциональное состояние макрофагов и нейтрофилов. Галавит показан для лечения вторичных иммунодефицитов при инфекционных заболеваниях различной этиологии [3].

В настоящее время разработана сублингвальная форма галавита [1], однако ее иммунтропная активность не исследована. В этой связи в сравнительном аспекте было изучено влияние инъекционной и суб-

лингвальной форм галавита на иммунофенотип и НК-активность мононуклеарных клеток крови (МНК) селезенок мышей линии СВА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мышам линии СВА вводили галавит по 200 мкг однократно, внутрибрюшинно или сублингвально с помощью зонда по 40 мкг каждый час в течение 5 ч (суммарная доза составила 200 мкг). Интервал дачи препарата был выбран экспериментально при визуальном контроле рассасывания части таблетки с чередованием сторон ее закладывания. Контрольной группе животных сублингвально давали крахмал. Каждая группа состояла из 10 животных.

Выделение МНК селезенок мышей

Через различные интервалы времени из селезенок мышей линии СВА были выделены МНК. Взвесь спленоцитов, разведенную средой 199, центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколла-урографина («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3). МНК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и 3-кратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Концентрацию клеток доводили до 1 х 106 кл/мл.

Цитотоксический тест

Для выявления цитотоксической активности клеток использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест), который является одним из основных нерадиометрических методов оценки жизнеспособности и пролиферативной активности клеток. Суть метода заключается в метаболическом превращении МТТ в диформазан НАДФ*Н-зависимыми оксидазами клеток, активность которых увеличивается в процессе митогенеза. Образующийся диформазан элюируется с клеточных мембран диметилсульфоксидом, и результат оценивается спектрофометрически при длине волны 540 нм. Цитотоксическую активность МНК определяли на НК-чувствительной линии лейкоза мышей Yac-1. Опухолевые клетки (1 х 104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МНК в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (фирмы Costar, Франция) 18 ч при 37 °С и 4 % СО2 . Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ (фирмы Sigma, США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане MS (фирмы Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).

Оценка пролиферативной активности МНК

Пролиферативную активность МНК при действии галавита оценивали в колориметрическом тесте с использованием витального красителя AlamarBlue (Bio-sours, США) в стерильных условиях. Суспензию МНК в обогащенной среде РПМИ 1640 вносили в 96-луночные планшеты в количестве 10х103 кле-

ток/лунку, инкубировали в течение 4 сут в стандартных условиях культивирования. По окончании инкубации в лунки вносили краситель AlamarBlue (10 %). Флюоресценцию измеряли после 4-ч инкубации при 37 °С, 5% СО2 на флюориметре VersaFluor V13 (Vtocal) при длине волны возбуждения 530-560 нм, эмиссии 590 нм и выражали в условных единицах (у.е.) флюоресценции. Рассчитывали индекс стимуляции (ИС), представляющий собой отношение пролиферативной активности МНК у особей после введения галавита МНК и интакных животных.

Световую микроскопию и фотографирование клеток, генерированных из МНК периферической крови, во взвеси и в окрашенных мазках проводили с помощью системы AxioVision 4 (фирмы Carl Zeiss, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как показано на рис.1, фрагмент таблетированной формы препарата галавит помещали с использованием катетера в защечный мешок мыши до полного рассасывания, затем процедура повторялась 5 раз с интервалом 1 ч. В группе сравнения препарат вводили внутрибрюшинно. У мышей после внутрибрюшинно-го и сублингвального введения галавита отмечали достоверное увеличение пролиферативной активности МНК, при этом более выраженный эффект наблюдали у мышей при воздействии инъекционной формы препарата (табл. 1). Спонтанная НК-активность МНК составила 32 % и повышалась при введении инъекционной формы галавита до 58 %, при сублингвальной -до 51 % (табл. 2). На рис. 2 показан эффект лизиса клеток НК-чувствительной линии YAC1 при коинку-бации с МНК селезенки интактных мышей и особей, получавших сублингвальную форму препарата гала-вит. Как следует из представленных материалов, МНК мышей, получавших галавит, более эффективно лизи-руют опухолевые клетки. Сублингвальная форма га-лавита несколько уступает инъекционной по своему стимулирующему действию на показатели врожденного иммунитета у мышей, однако оказывает качественно сходное действие.

Рис. 1. Введение сублингвальной формы галавита в защечный мешок мыши

Таблица 1

Влияние галавита на пролиферативную активность МНК селезенок мышей линии СВА

Условия культивирования Оптическая плотность, у.е М±т Индекс стимуляции, М±т Жизнеспособные клетки, % М±т

Контроль 0,095±0,02 - 96,0±0,2

Галавит Инъекционная форма 0,255±0,05* 2,68* 95,9±0,6

Сублингвальная форма 0,137±0,04* 1,44* 97,3±0,9

Статистически значимые различия (р<0,05) по 1-критерию Стьюдента для сопряженных пар признаков по сравнению с интактными мышами

Таблица 2

НК-активность МНК селезенок мышей линии СВА после введения галавита, %

Препарат Цитотоксичность

Контроль 32,0±4,0

Галавит инъекционная форма 58±3,8*

сублингвальная форма 51,±5,3*

Статистически значимые различия (р<0,05) по 1-критерию Стьюдента для сопряженных пар признаков по сравнению с интактными мышами

. *•«' жь •гСг*.» V***..-~ ул-яйь»-ч

А Б В

Рис. 2. Цитотоксическая активность МНК селезенок интактных и получавших галавит сублингвально мышей линии СВА:

А - МНК мышей контрольной группы;

Б - МНК интактных мышей;

В - МНК мышей, получавших галавит сублингвально.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате сравнительного исследования иммунотропной активности инъекционной и сублингвальной форм было показано, что препарат стимулирует НК-активность МНК и повышает пролиферативную активность лимфоцитов. Сублингвальная форма препарата галавит по своей способности активировать врожденный иммунитет приближается к инъекционной.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барышникова М. А., Орлова О. Л., Шпрах З. С. Разработка новой лекарственной формы галавита в виде сублингвальных таблеток // РБЖ. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 86-90.

2. Галавит в эксперименте и клинике / Под ред. М. Т. Абидова. - М., 1999. - 60 с.

3. Добрица В. П., Ботерашвили Н. М., Добри-ца Е. В. Современные иммуномодуляторы для клини-

ческого применения / Руководство для врачей. - СПб.: Политехника. - С. 164-5.

4. Коробкова Л. И., Вельшер Л. З., Германов А. Б. и др. Роль иммуномодулятора Галавит в онкологической и хирургической практике // РБЖ. - 2004. - Т. 3, № 3. - С. 87-92.

5. Сибиряк С. В., Юсупова Р. Ш., Курчатова Н. Н. Иммунофенотипирование лимфоцитов в клинической практике. - Краткое методическое руководство. -Уфа, 1997. - С. 9.

6. Симонова А. В., Лиознер Л. А., Сидоренко И. В. Анализ субпопуляций лимфоцитов методом проточ-

ной цитометрии в разных группах доноров // Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 72-5.

7. Филатов А. В., Бачурин П. С., Маркова Н. А. и др. Исследование субпопуляционного состава ли-фоцитов человека с помощью панели моноклональных антител // Гематол. и трансфузиол. - 1990. -№ 4. - С. 16-7.

8. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Вторичные иммунодефициты: клиника, диагностика, лечение // Иммунология. - 1999. - № 2. - С. 14-7.

Поступила 11.12.2006.