СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПОЛИМЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Legionella pneumophila 1,3 И 6 СЕРОГРУПП (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR POLYMER IMMUNOGLOBULIN DIAGNOSTICUM ENGINEERING FOR DETECTING SEROGROUP 1, 3 AND 6 Legionella pneumophila (VERSIONS)

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике при идентификации патогенных бактериальных культур - возбудителя пневмоний человека Legionella pneumophila.
В настоящее время фирмами Оксоид (Англия), Биорад (США) и Микроген (Англия) выпускаются наборы латекс-диагностикумов, позволяющие в течение 2-3 мин выявлять в реакции на стекле все 14 серогрупп основного патогена L.pneumophila и ряд других видов этого возбудителя. Один препарат диагностикума выявляет 1 серогруппу L.pneumophila, другой - 2-14 группы суммарно. Наборы диагностикумов отличаются высокой активностью и специфичностью, Однако весьма дорогостоящи. Кроме того, в данных наборах отдельные серогруппы L.pneumophila, почти такие же практически важные, как и 1 серогруппа, - 3 и 6, остаются индивидуально вне досягаемости, последние чаще других серогрупп наиболее широко распространены во внешней среде и вызывают легионелез человека.
За прототип выбран способ изготовления легионеллезных латекс-диагностикумов для слайд-агглютинации (см. в работе Sedgwick А.а. Tilton R. Identification of L.pneumophila by latex agglutination // J. Clin. Microbiol. - 1983, - 17. - 2. - P.365-368) заключающийся в том, что из 10% полистирола (Dow Chemical Со, США ) изготавливают микросферы 0,8 мкм, нагрузку последних антителами осуществляли путем контакта их с разведенными иммунными сыворотками при 37°C в течение 2-х часов. Препараты разводили 1:20 глициновым буфером с 1% БСА, жидкость фильтровали от аггрегировавших частиц, с последующим использованием ее в реакции слайд-агглютинации ,учет результатов прводили через 2-3 мин и наблюдали в положительном случае бесцветный агглютинат клеточных взвесей, в отрицательном - взвесь оставалась равномерно мутной.
Однако, при достаточной активности и специфичности, известным диагностикумом невозможно выявлять по отдельности ряд эпидемически важных серогрупп, а именно 3 и 6-ю, возбудителя легионеллеза наиболее широко распространенных во внешней среде и чаще других серогрупп вызывающих пневмонию у человека.
Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке диагностикума для обнаружения возбудителя легионеллеза конкретной серогруппы, а именно 1, 3 и 6 с высокой специфичностью, демонстративностью и низкой себестоимостью.
3
Поставленная техническая задача достигается тем, что в известном способе конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающем получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L. pneumophila в реакции слайд-агглютинации, и отличающимся тем что в качестве полимерного носителя антител используют полиакролеин, обработанный на стадии полимеризации сафранином Т, а микросферы выполняют диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных группы 0,4 мкмоль/г , затем носитель дополнительно обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°С в течении трех часов и выдерживают 15 часов при комнатной температуре, отмывают водой посредством центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl , после этого проводят сенсибилизацию микросфер легионеллезной кроличьей сывороткой, для этого 25 мг носителя суспендировали в 0,9 мл физиологического раствора и добавляли 0,1 мл разведенной (1:40) сыворотки, полученную суспензию перемешивают в течение 2-х часов при комнатной температуре, затем 15 часов при 4°С отмывают раствором хлористого натрия и суспендируют их в 1 мл того же раствора с 1% желатозой, проводят консервацию полученного диагностикума и разливают его в 5 мл емкости для использования и хранения.
Кроме того для диагностикума 1 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (1),которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин., причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных ( латексных ) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агглютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.
При этом для диагностикума 3 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (3), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600, сенсибилизацию этих антител на полимерных (латексных) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агглютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы..
Кроме того для диагностикума 6 серогруппы готовят легионеллезную кроличью сыворотку соответствующей серогруппы (6), которую получают к прогретым клеткам легионелл при 100°С в течение 20 мин, причем титры антител должны быть не менее 1:1600 , сенсибилизацию этих антител на полимерных ( латексных ) микросферах используют для выявления в реакции слайд-агтлютинации клеток штаммов L. pneumophila, содержащих гомологичные липополисахаридные антигены, которые определяют искомые серогруппы.
При этом реакцию слайд-агглютинации проводят на стекле, смешивая каплю исследуемого материала, в которую вносят микропипеткой (0,02-0,05) мкл одного из диагностикумов 1,3 или 6 серогруппы, помешивают в течение 1 мин и учитывают результат реакции как положительный по наличию ярко-красного агглютината с последующим просветлением жидкости, что подтверждает присутствие легионелл соответствующей серогруппы.
Способ осуществляется следующим образом. Для проведения способа в качестве полимерного носителя антител используют - полиакролеин, из которого получают полимеризацией в водно-щелочной среде в присутствии радикального инициатора микросферы диаметром 1 мкм с содержанием альдегидных групп 0,4 мкмоль/ г.
При этом на стадии полимеризации добавляют сафронин Т, который окрашивает микросферы в красный цвет.
3
Для повышения сорбционной емкости микросферы обрабатывают 5% водным раствором танина при 37-40°С в течение 3 часов, затем выдерживают 15 часов при комнатной температуре и отмывают водой с помощью центрифугирования до отрицательной реакции в супернатанте на фенолы с FeCl .
Следующм этапом способа является приготовление кроличьих иммунных легионелезных сывороток. Иммунизацию животных проводят по общепринятой схеме ,а иммунизирующими препаратами взяты типовые культуры Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп. Легионелезные кроличьи сыворотки получают к прогретым клеткам легионел при 100°С в течение 20 мин. Прогреванием культур устраняют в них белковые и сохраняют нужные липополисахаридные антигены. Титры антител в получаемых сыворотках были не меньше 1:1600.
Сенсибилизация микросфер легионеллезными сыворотками осуществляют следующим образом: 25 мг носителя суспендируют в 0,9 мл физиологического раствора и добавляют 0,1 мл разведенной 1:40 сыворотки. Суспензию перемешивают в течение 2 - часов при комнатной температуре, затем 15 часов - при 4°С, отмывают физиологическим раствором и суспендируют их в 1 мл 0,9% хлористого натрия с 1% желатозы.
Для консервации препарата добавляют мертиолат (1:10000) и разливают в 5 мл пластиковые емкости (микропробирки) и хранят при температуре 6-8°С. Активность диагностикумов при сохранении их при температуре холодильника не снижалась в течение года. Методика постановки реакции.
8
9
Для постановки реакции слайд-агглютинации на стеклянное дно чашки Петри наносят каплю (25 мкл) 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Петлей, забирая из газона культуру, делают в ней взвесь плотностью около 10-10 м.к./мл и вносят микропипеткой (0,02-0,03) мкл взвеси диагностикума, распределяя его по капле. Далее стекло круговыми движениями покачивают в течение 1-3 мин, заставляя взвесь перемещаться. Результат реакции учитывают по наступающей в позитивном случае агглютинации микроба в капле. Микробные клетки агглютинируют в агрегат красного цвета, капля просветляется. При отрицательном результате взвесь клеток остается мутной красноватого цвета..
Разработанный набор латекс-диагностикумов для серогрупп - 1,3 и 6 - изготовлен в трех сериях и проверен как в экспериментальных лабораторных испытаниях, так при при полевых исследованиях различных водных обьектов внешней среды на легионеллы, а также при комиссионных испытаниях. Результаты испытаний видны из примеров 1, 2, 3.
8
10
Пример 1. Экспериментальные лабораторные испытания латекс-диагностикумов на 1, 3 и 6 серогруппы с типовыми штаммами L. pneumophila. Культуры легионелл выращивают на плотной легионеллезной питательной среде СЭЛ, созданной в Ростовском ПЧИ, в течение 2-х суток при 35°С, смывают калий-фосфатным буфером (рН - 7,1 ) и готовят исходную взвесь клеток плотностью 10-10 м.к./мл. Для реакции можно брать как живую взвесь культуры, так и автоклавированную при 121°С в течение 15 мин.
Проводят реакцию слайд-агглютинации . На стекло наносят каплю взвеси и вносят в нее маленькую капельку (0,02-0,03 мл) диагностикума. Взвесь перемешивают стеклянной палочкой или петлей в течение 1-2 мин и учитывают реакцию по образованию красного агглютината-положительный результат, который начинает образовываться на первой же минуте перемешивания и достигает максимума через 2 мин. Жидкость при этом просветляется. Отрицательный результат - капля остается равномерно красно-мутной без образования агглютината и просветления.
Параллельно для контроля проводили латекс-агглютинацию с диагностикумами на 1 и 2-14 серогруппы L. pneumophila фирмы Оксоид, а также для контроля культур - обычную агглютинацию на стекле с соответствующими серогрупповыми легионеллезными сыворотками в разведении 1:100.
Результаты данных испытаний представлены в таблице 1. Все три испытуемых диагностикума были специфичны и демонстративны четко выявляли штаммы собственной серогруппы (1, 3 и 6-й) и не реагировали со штаммами L. pneumophila других серогрупп.
Пример 2. Изучена специфичность предлагаемых диагностикумов в отношении свежевыделенных и коллекционных полевых штаммов L. pneumophila различных серогрупп.
Приготовление культур легионелл, постановка реакции слайд-агглютинации и контроли соответствуют описанным в примере 1. Результаты отражены в таблице 2 . Как видно, испытуемые диагностикумы отличались достаточно хорошей специфичностью и демонстративностью выявляя искомые серогруппы легионелл и не реагируя на гетерогенные серогруппы.
Пример 3. В этом испытании изучена специфичность диагностикумов в отношении гетерологичных видов микроорганизмов из коллекции Ростовского ПЧИ. Приготовление культур для реакции: штаммы холерных вибрионов выращивали на агаре Мартена, других видов - на агаре Хоттингера в течение 1 сут при 36°С. Плотность суспензий бактерий - 1 млрд м.к./мл. Постановка реакции слайд-агглютинации и контроли - так, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, все диагностикумы были специфичными и не реагировали на посторонние культуры. Высокоспецифичными были также и диагностикумы фирмы Оксоид.
Использование предполагаемого изобретения позволяет осуществлять конструирование диагностикумов для обнаружения возбудителя легионелеза конкретной серогруппы L.pneumophila, а именно 1, 3 и 6 .
При этом созданные латекс-диагностикумы для выявления в слайд-агглютинации 1, 3 и 6 серогрупп представляют собой специфичные диагностические препараты, которые не уступают международно признанному набору легионеллезных диагностикумов фирмы Оксоид. Достоинством набора диагностикумов Ростовского ПЧИ является четкость и демонстративность реакции, а также возможность выявлять по отдельности наиболее важные с точки зрения эпидемиологии легионеллеза 1, 3 и 6 серогруппы L. pneumophila. При этом набор в стоимостном отношении более дешев, чем выпускаемые указанными фирмами.
Таблица 1
сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзны латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» с гомологичными микроорганизмами
Исследуемые штаммы
Латекс - диагностикумы
«Oxoid»
серогруппы
1
3
6
1
2-14
L. pneumophila серогруппа 1 штамм Philadelphia АТСС 33152
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппа 2 штамм Togus АТСС 33154
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппа 3 штамм Blumington АТСС 33155
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппа 4 штамм Los-Angeles АТСС 33156
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппа 5 штамм Dallas АТСС 33216
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппа 6 штамм Chicago 2 АТСС 33215
+
-
+
L. pneumophila серогруппа 7 штамм Chicago 8 АТСС 33823
-
-
-
-
+
Таблица 2
сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзных латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» со штаммами L. pneumophila, выделенными из объектов окружающей среды
Исследуемые штаммы
Латекс-диагностикумы
Oxoid
серогрупы
1
3
6
1
2-14
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-2
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-3
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-4
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-5
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-6
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм ДХ-7
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм 41
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм Р-1
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 1 штамм Р-3
+
-
-
+
-
L. pneumophila серогруппы 2 штамм 33154
+
L. pneumophila серогруппы 2 штамм 38
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 2 штамм 39
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 2 штамм 40
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 33156
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм B-l-7
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм В-1-4
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм С-1-6
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 40к
+
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 13
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 38к
+
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 42
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 3 штамм 19
-
+
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 4 штамм 33156
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 4 штамм 13-1
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 4 штамм 15-1
-
-
-
-
+
L. pneumophila
-
-
-
-
+
серогруппы 4 штамм 5-4
L. pneumophila серогруппы 4 штамм 23-1
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 5 штамм 33216
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 5 штамм 42-1
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 5 штамм 99-1
--
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 6 штамм 33215
-
-
+
-
+
L. pneumophila серогруппы 6 штамм 22-3
-
-
+
-
+
L. pneumophila серогруппы 6 штамм 5
-
-
+
-
+
L. pneumophila серогруппы 7 штамм 16411
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 7 штамм 23-5
-
-
-
-
+
L. pneumophila серогруппы 7 штамм 43-2
-
-
-
-
+
Таблица 3
сравнение специфичности набора экспериментальных легионеллёзных латекс-диагностикумов и коммерческой тест-системы фирмы «Oxoid» с гетерологичными микроорганизмами
Исследуемые штаммы
Латекс-диагностикумы
«Oxoid»
серогруппа
1
3
6
1
2-14
Y. pestis штамм 17691
-
-
-
-
-
Y. pestis EV-76 линии НИИЭГ
-
-
-
-
F. tularensis штамм 240
-
-
-
-
-
F. tularensis штамм 543
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 1 штамм 12659
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 2 штамм 14842
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 3 штамм 12310
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 4 штамм 1995
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 5 штамм 282
-
-
-
-
-
Y. pseudotuberculosis серовар 6 штамм
5504
Br.abortus штамм1151
-
-
-
-
-
Br. melitensis штамм1150
-
-
-
-
-
Br. suis штамм 1152
-
-
-
-
-
Y. enterocolitica серовар 09 штамм 2131
-
-
-
-
-
V. cholerae eltor штамм 9963
-
-
-
-
-
E. coliATCC 25922
-
-
-
-
-
Campylobacter jejuni штамм 457
-
-
-
-
-
С. Diphtheriae gravis штамм «Тимаков»
-
-
-
-
-
Staphylococcus aureus
-
-
-
-
-
Streptococcus pneumonia
-
-
-
-
-
Klebsiella pneumonia
-
-
-
-
-
L. monocytogenes серогруппы 1 штамм 18875
-
-
-
-
-
Salmonella typhimurium
-
-
-
-
-