СПОСОБ HLA-ТИПИРОВАНИЯ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ
METHOD OF WHOLE BLOOD HLA-TYPING

Способ HLA-типирования цельной крови относится к области медицины, биотехнологии и генной инженерии.
Быстрое развитие биотехнологии привело к созданию и развитию направления на стыке физико-химических и биомедицинских областей. Для восстановления утраченной структуры или функции органов все шире используются новые методы, основанные на применении клеточной трансплантологии тканевой инженерии. Клеточная трансплантология подразумевает использование для терапии клеточных продуктов. Тканевая инженерия подразумевает конструирование живых эквивалентов тканей или органов ex vivo с последующей трансплантацией в организм. Полный спектр задач в этой области включает доставку к пораженным участкам тела биосовместимых материалов, стволовых клеток, а также сигнальных молекул, инициирующих регенеративные процессы на клеточном уровне.
Цельная кровь - это и периферическая и пуповинная/плацентарная кровь. Пуповинная кровь известна как богатый источник гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которые все чаще используют для эффективного лечения разных заболеваний. Несформировавшиеся клетки пуповинной крови могут служить альтернативой костному мозгу при аллогенной трансплантации ГСК. Открытие коммерческих банков стволовых клеток позволяет сохранять пуповинную кровь ребенка в течение многих лет, обеспечивая, таким образом, его биологическую страховку. Организация таких банков требует разработки совершенной методики обработки и замораживания образца, которая способна обеспечить наибольшую сохранность клеток.
Лимитирующим фактором при трансплантации ГСК является система главного комплекса гистосовместимости - HLA-система (Human Leukocyte Antigen - человеческий лейкоцитарный антиген) - это набор антигенов на поверхности лейкоцитов, который определяет основную функцию лейкоцитов - иммунный ответ. Благодаря таким свойствам HLA-системы, как полиморфизм, полигенность и кодоминантный тип экспрессии, набор лейкоцитарных рецепторов отличается у каждого человека. Для успешной трансплантации и приживления новых клеток необходимо максимальное совпадение HLA-системы у донора и реципиента. Проведение HLA-типирования очень важно при создании регистра доноров пуповинной крови. HLA-диагностика или тканевое типирование применяется для решения вопросов трансплантации костного мозга и органов для диагностики наследственных заболеваний, ассоциированных с генами главного комплекса гистосовместимости (болезни Бехтерева, сахарного диабета, цилиакии, рассеянного склероза и т.д.), а также в диагностике некоторых форм бесплодия, связанных с совпадениями HLA у супругов.
В последнее десятилетие благодаря достижениям молекулярной биологии и генетики появилась возможность изучения не только антигенов HLA, но и кодирующих их генов. Разработанный несколько лет назад молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и применение его в ДНК-генотипировании аллелей HLA открыл перспективы в повышении эффективности изучения генетической предрасположенности к заболеваниям, что позволяет выявлять случаи более высокого относительного риска развития патологии, быстро и объективно проводить обследование значительных контингентов населения, а также проводить обследование здоровых сибсов с целью прогноза развития целого ряда заболеваний, например инсулинозависимого сахарного диабета, в семьях с высокой заболеваемостью.
Определение антигенов системы HLA проводят несколькими способами. Молекулярный метод HLA-типирования использует в настоящее время три основные технологии идентификации ДНК: 1- SSP, 2 - SSO, 3-Секвенирование. Типирование антигенное - это совокупность методов серологических исследований антигенной структуры клеток в отношении определенных групп антигенов, применяется при определении тканевой совместимости.
SSP (Sequnce Specific Primers)-НLА-типирование называется так потому, что искомые HLA, участки ДНК улавливаются специфическими праймерами в процессе амплификации. На первом этапе этого метода необходимо выделить ДНК из исследуемого образца крови, костного мозга или ткани. Затем следует этап ДНК-амплификации в термоциклере. ДНК раскапывается в лунки ПЦР планшета, каждая из которых содержит праймеры определенной специфичности. Количество лунок (ПЦР реакции) определяют количеством типируемых локусов и количеством аллельных вариантов в каждом локусе. Так, например, для низкоразрешающего (скринингового) типирования локуса DR определяют около 24 специфичностей (24 лунки ПЦР планшета). После амплификации ампликоны переносятся в лунки агарозного геля, где проводится электрофорез, В тех лунках, где специфичности праймеров совпали со специфическими участками ДНК видят полосу продукта геля. По таблице интерпретации или при помощи программы определяют какой HLA-аллели она соответствует. Этот метод позволяет разделить аллели, т.к. амплификация гена происходит в лунках с разными праймерами, специфичными к полиморфным последовательностям. Индентификация гена происходит по наличию продукта ПЦР. Визуализацию продуктов ПЦР производят электрофоретическим разделением в агарозном геле, см. статью «HLA-типирование и анализ предшествующих анти-HLA антител» WWW.BOCHEMMACK.RU.
Недостатками такого способа HLA-типирования является его низкая производительность. В 96-луночный термоциклер при низкоразрешающем типировании можно поместить только один образец (DR-локус - 24 пробирки, А локус - 24 пробирки, В локус - 48 пробирок). Время, затраченное таким образом на типирование одного образца, например, по А, В, DR от выделения ДНК до интерпретации результатов составит 3 часа. За день можно лишь протипировать 2-3 человека. Способ описан слишком схематично, не раскрыта технология выделения ДНК, не указана проверка ее концентрации, не раскрыта конкретная методика определения HLA-типирования образцов ДНК крови
В литературных источниках по теме HLA-типирования имеются краткие сообщения о молекулярно-генетическом HLA-типировании с использованием метода ПЦР, например, по адресу http.//www.biochemmack. ru/userful/articles/hla_tiping/, но самым близким решением является описанное в разделе Системы для HLA-генотипирования в реферате диссертации Болдыревой М.Н. на соискание ученой степени доктора медицинских наук сообщение о HLA-генотипировании. Из перифрической крови методом высаливания выделяли геномную ДНК. Полученные образцы ДНК сразу используют для генотипирования либо хранят при -20°С. Концентрацию ДНК определяют по флуоресценции на мини-флуориметре. HLA-генотипирование образцов ДНК проводят методом мультпраймерной полимеразной цепной реакции. Для типирования генов HLA класса 11 (DRBI, DQAI, DQBI) использовали наборы HLA - ДНК-Тех. Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и концентрации компонентов. 0,2 мМ каждого дНТФ(дАТФ, ДЦТФ, дТТФ, дГТф), 67 мМ Трис-НСl(рН 8,8), 2,5 mM MgCl, 50 mM NaCl, 1 mM 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Амплификацию проводят на многоканальном термоциклере «МС2» (НПФ «ДНК-Технология», Москва). Типирование локуса DRBI проводят в два этапа. В первом этапе геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRBI, а во второй - пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR03,05, 06,08. В обоих случаях выдерживался температурный режим амплификации с параметрами по времени и количеству циклов. На втором этапе проводилось точное регулирование с температурным режимом с параметрами по времени и числу циклов. Типирование локуса DQAI проводят также в два этапа, в которых использовались праймеры, амплифицирующие со своей специфичностью со своими температурным режимом, временем и количеством циклов. Типирование локуса DQBI также проводят в два этапа с использованием праймеров, амплифицирующих все специфичности для этого локуса со своими параметрами по температуре, времени и количеству циклов.
После процесса амплификации осуществляют визуализацию продуктов ПЦР посредством электрофореза. В каждую лунку 3% агарозного геля под буфер вносят по 5 мкл окрашенного амплификата. Окрашивание геля проводят бромистым этидием. Электрофорез проводят при напряжении 200-250 В. После проведения электрофореза гель вынимают из прибора и просматривают на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. В качестве маркера длин используют перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp 1.
Недостатками такого решения HLA-типирования крови являются: концентрация ДНК при выделении методом высаливания составляет 50-100 мкг/мл, что недостаточно для более точного ее определения, отсутствует оценка качества чистоты ДНК, т.к. примеси и белковые компоненты могут препятствовать процессу ПЦР, процесс HLA-типирования проводят в несколько стадий, что занимет много времени при одинаковом результате определения генотипирования. Визуалиацию продуктов ПЦР проводят в агарозном геле при напряжении 200-250 В. Большое напряжение приводит к нагреву буфера в электрофоретической ячейке, что негативно влияет на расхождение фрагментов ДНК и может привести к неверной интерпретации результатов.
Техническим результатом изобретения является повышение надежности определения результатов HLA-генотипирования, сокращение времени для быстрого типирования донорской крови, улучшение качества чистоты выделения ДНК, повышение технологичности с уменьшением экономических затрат при использовании современного импортного оборудования с высокой степенью автоматизации и эффективных программ.
Этот результат достигается тем, что в способе HLA-типирования цельной крови, включающем выделение ДНК из крови с промежуточным хранением ее образцов, проверку концентрации ДНК и осуществление HLA-генотипирования образцов ДНК крови посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем проведения амплификации на термоциклере, а после процесса амплификации осуществляют с помощью агарозного геля с его окрашиванием бромистым этидием визуализацию продуктов ПЦР и маркера с использованием электрофореза в проходящем ультрафиолетовом свете, при выделении ДНК из крови в первую пробирку вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови, раствор буфера ELB А, предварительно охлажденного до температуры +4°С, инкубируют их на шейкере в течение 15', центрифугируют смесь при 3000 g 1', удаляют супернатант и эритроциты, оставляя лейкоциты в пробирке после центрифугирования, в пробирку добавляют 1 мл раствора буфера ELB В, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют содержимое пробирки на вортексе до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант и остатки эритроцитов, затем к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере в течение 15' до полного растворения осадка, добавляют 400 мкл раствора TBS и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца, далее во вторую пробирку помещают колонку с мембраной, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их при комнатной температуре в течение 1', центрифугируют с ускорением 10000g в течение 2', после чего удаляют фильтрат, помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS, центрифугируют 1' с ускорением 10000g, повторяя процедуру отмывания с удалением фильтрата, добавлением в пробирку с установленной в ней мембраной с ДНК 600 мкл раствора этого же буфера и центрифугированием с такими же параметрами, вновь повторяют ту же процедуру, но при центрифугировании 18000g в течение 2', затем вставляют колонку с мембраной с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора буфера DEB, элюирующего ДНК, инкубируют их, центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы чистой ДНК, при невозможности немедленного использования элюированной ДНК хранят последнюю в течение двух недель при температуре +4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени, проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре, вставляют в него микрокювету на 75 мкл с чистой бидистиллированной водой, в микропробирку с 49 мкл бидистиллированной воды вносят 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают и выливают полученный раствор в новую микрокювету, установив ее в спектрофотометр, проводят анализ на концентрацию ДНК в растворе, смешивание растворов для проведения процесса полимеразной цепной реакции осуществляют в ПЦР-боксе, устанавливая в нем и облучая ультрафиолетовым светом рабочую станцию, предварительно охлажденную до -20°С, размещают в станции планшету с лиофилизированными праймерами HLA-A*,-B*,-DRBI*, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл, перемешивая ее на вортексе, вносят 10 мкл раствора в лунку с негативным контролем, добавляют 1 мкг образца ДНК в смесь, перемешивают полученный раствор на вортексе и вносят последний раствор в лунки планшета, помещают планшету с образцами в термоциклер по установленной программе с осуществлением стадий действий денатурации, отжигов и элонгации с параметрами по времени, температурам и количеству циклов, после окончания амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении, визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером ТАЕ, разведенных в бидистиллированной воде, сваренного в микроволновой печи, охлажденного до 60°С и окрашенного раствором 10 мкл бромистого этидия, затем вливают расплавленную агарозу с бромистьм этидием в подложку для геля и охлаждают его до застывания, помещают застывший гель в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мкл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки, раствор из планшеты с амплифицированными образцами ПЦР переносят в лунки агарозного геля, при этом в каждую полоску лунок в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20 минут при 170 В, после окончания его выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа определения HLA-типирования цельной крови являются: А - выделение ДНК из крови с промежуточным хранением ее образцов; Б - проверка концентрации ДНК; В - осуществление HLA-генотипирования образцов ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) путем проведения амплификации на термоциклере; Г - после процесса амплификации осуществляют с помощью агарозного геля с его окрашиванием бромистым этидием визуализацию продуктов ПЦР и маркера с использованием электрофореза в проходящем ультрафиолетовом свете.
Существенными отличительными признаками предложенного способа являются: Д - при выделении ДНК из крови в первую пробирку вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови, раствор буфера ELB А, предварительно охлажденного до температуры +4°С; Е - инкубируют их на шейкере в течение 15', центрифугируют при 3000g 1', удаляют супернатант и эритроциты, оставляя лейкоциты в пробирке после центрифугировании; Ж - в эту же пробирку добавляют 1 мл раствора буфера ELB В, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют содержимое пробирки на вортексе до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант и остатки эритроцитов; И - к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере в течение 15' до полного растворения осадка, добавляют 400 мкл раствора TBS и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца; К - во вторую пробирку помещают колонку с мембраной, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их в течение 1', центрифугируют с ускорением 10000g в течение 2', после чего удаляют фильтрат; Л - помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS, центрифугируют 1' с ускорением 10000g, повторяя процедуру отмывания с удалением фильтрата, добавлением в пробирку с установленной мембраной с ДНК 600 мкл раствора этого же буфера и центрифугированием с такими же параметрами; М - вновь повторяют ту же процедуру, но при центрифугировании 18000g в течение 2'; Н - вставляют колонку с мембраной с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора DEB, элюирующего ДНК, инкубируют их, центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы очищенной ДНК, при невозможности немедленного использования элюированной ДНК хранят последнюю в течение двух недель при температуре 4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени; П - проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре, вставляют в него микрокювету на 75 мкл с чистой бидистиллированной водой, в микропробирку с 49 мкл бидистиллированной воды вносят 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают и выливают полученный раствор в новую микрокювету, устанавив ее в спектрофотометр; проводят анализ на концентрацию ДНК в растворе; Р - смешивание растворов для проведения процесса полимеразной цепной реакции осуществляют в ПЦР-боксе, устанавливая в нем и облучая ультрафиолетовым светом рабочую станцию, предварительно охлажденную до -20°С, размещают в станции планшету с лиолифизированными праймерами HLA-A*,-B*, -DRBI*, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов из последнего набора D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл, перемешивая ее на вортексе, вносят 10 мкл раствора в лунку планшеты с негативным контролем, добавляют 1 мкг образца ДНК в смесь, перемешивают полученный раствор на вортексе и вносят последний раствор в лунки планшеты; С - помещают планшету с образцами в термоциклер по установленной программе с осуществлением стадий действий денатурации, отжигов и элонгации с параметрами по времени, температурам и количеству циклов и после окончания процесса амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении; Т - визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером ТАЕ, разведенных в бидистиллированной воде, сваренного в микроволновой печи, охлажденного до 60°С и окрашенного раствором 10 мкл бромистым этидием, затем вливают расплавленную агарозу с бромистым этидием в подложку для геля и охлаждают его до застывания, помещают застывший гель в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки, раствор из планшеты с амплифицированными образцами ПЦР переносят в лунки агарозного геля, при этом в каждую лунку в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20' при 170 В, после окончания его выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.
Способ HLA-типирования заключается в следующем. Вначале необходимо выделить ДНК из исследуемого образца цельной крови. При выделении ДНК из крови используют специальный набор с реагентами и элементами PROTRANS DNA Box 500, обеспечивающий процесс выделения ДНК. Поэтому в первую пробирку объемом 2 мл вливают 0,7 мл исследуемой цельной крови и раствор буфера ELB A (Ery Lysis Buffer A) из набора реагентов, предварительно охлажденного до температуры +4°С, инкубируют их на шейкере в течение 15' при комнатной температуре (18-20°С), эритроциты лопаются, остаются только лейкоциты, которые содержат ДНК. Центрифугируют смесь при 3000g в течение 1', удаляют супернатант, оставив нетронутым прозрачный опаллесцирующий осадок, представляющий собой белые клетки крови (лейкоциты), т.е. остатки эритроцитов (влияющих на загрязнение ДНК) в супернатанте удаляются, остается осадок лейкоцитов. Далее осуществляют отмыв от остатков эритроцитов. В пробирку с осадком добавляют 1 мл раствора буфера ELB В (Ery Lysis Buffer В) из набора реагентов Protrans DNA Box 500, охлажденного предварительно до температуры +4°С, ресуспендируют осадок (содержимое в пробирке) на вортексе - устройство, осуществляющее водоворотное перемешивание, до растворения осадка, центрифугируют с ускорением 2000g в течение 2' и удаляют супернатант. Затем к оставшемуся осадку добавляют 400 мкл раствора буфера LBS из этого же набора реагентов, ресуспендируют осадок на вортексе, инкубируют при постоянном перемешивании на шейкере (устройство перемешивания покачиванием) в течение 15' до полного растворения осадка. Добавленный раствор растворяет мембраны клеток и высвобождает ДНК в раствор. Далее берут раствор TBS (Binding Solution) из набора, встряхивают его, добавляют 400 мкл его и перемешивают содержимое в пробирке на вортексе с получением образца до полной гомогенизации раствора. Этот раствор связывает ДНК, придает ей дополнительный заряд для связывания с мембраной. Во вторую пробирку объемом 2 мл помещают колонку с мембраной из этого же набора Protrans, в центр мембраны с помощью электронного дозатора вносят раствор полученного образца из первой пробирки, инкубируют их при комнатной температуре в течение 1'. ДНК связывается с мембраной, а остатки мембран и клеток проходят сквозь мембрану и удаляются. Центрифугируют содержимое во второй пробирке в течение 2' с ускорением 10000g, удаляют фильтрат, помещают во вторую пробирку колонку с мембраной с полученной ДНК, осевшей на мембране, добавляют 600 мкл раствора буфера WB MS (Wash Buffer) из набора реагентов и центрифугируют 1' с ускорением 10000g. ДНК промывают раствором, содержащим спирт, происходит очистка ДНК. Процесс отмывания повторяют дважды, т.е. удаляют фильтрат, помещают колонку с мембраной с ДНК, осевшей на мембране, во вторую пробирку, добавляют 600 мкл буфера WB VS и центрифугируют 1' при ускорении 10000g. Удаляют фильтрат, помещают колонку с мембраной с ДНК во вторую пробирку и центрифугируют ее содержимое с ускорением 18000g в течение 2'. Таким образом удаляют все остатки влаги. Затем вставляют колонку с мембраной и с осевшей на мембране ДНК в третью пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 200 мкл подогретого в термоблоке до 60°С раствора буфера DEB из набора, элюирующего ДНК, и инкубируют их при комнатной температуре. Центрифугируют смесь с ускорением 6000g в течение 1', получая образцы очищенной ДНК. Добавленный здесь раствор нарушает связь ДНК с мембраной и ДНК проходит сквозь поры мембраны и попадает в чистую пробирку. При невозможности немедленного использования элюированной ДНК ее хранят в течение 2-х недель при температуре 4°С или при температуре -20°С в течение продолжительного времени. Проверку концентрации ДНК в растворе осуществляют на спектрофотометре DU 800 (Becman Culter, США). Вначале проводят анализ чистой воды, чтобы в последующем сравнить с ней оптическую плотность в растворе ДНК. Вставляют в спектрофотометр микрокювету на 75мкл с чистой бидистиллированной водой. В микропробирке на 0,5 мл смешивают 49 мкл бидистиллированной воды с 1 мкл раствора ДНК, тщательно размешивают пипетированием и выливают полученный раствор в новую кювету, устанавливая ее в спектрофотометр, и проводят анализ на концентрацию ДНК. В спектрофотометре происходит считывание оптической плотности ДНК в ультрафиолете на длине волны 260 нм и белка на длине волны 280 нм и с оценкой их концентраций. По отношению концентраций определяется их чистота. Все результаты анализа заносятся в протокол исследования. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) смешивание растворов проводят в ПЦР-боксе, представляющем настольный бокс, в котором хранятся все необходимые расходные материалы, облучают элементы для обеззараживания ультрафиолетовым светом и проводят их промывку, чтобы не занести в исследуемый образец чужеродную ДНК (контаминировать). Достают из морозильной камеры (-20°С) рабочую станцию (Protrans PCR workstantion), представляющую пластину органического стекла с отверстиями для пробирок, поддерживающую долго низкую температуру, необходимую для проведения процесса ПЦР и не загрязняющую исследуемый образец ДНК (лучше, чем использование льда). На этой станции размещают планшету с лиолифизированными праймерами из следующего набора Protrans HLA-A* -В*, -DRBI* Cyclerplate, приготавливают в ПЦР-боксе смесь буферов из последнего набора D 280 мкл, 560 мкл Y и 6,5 мкл Taq Polymerase 5 ед/мкл. Эти растворы буферов необходимы для реакции, а полимераза - это фермент, синтезирующий ДНК. Перемешивают растворы на вортексе. Для негативного контроля в одну из лунок планшеты вносят 10 мкл перемешанного раствора буферов для проверки ДНК на наличие примесей. В смесь буферов с полимеразой добавляют 1 мкг образца ДНК, перемешивают их на вортексе. Вносят последний раствор в лунки планшеты, помещают планшету с образцами в термоциклер (My Cycler Bio-Rad, США) и по установленной программе осуществляют амплификацию по стадиям действий с соответствующими параметрами. Установленная программа показана в таблице.
Название стадий
Температура, °С
Время
Количество циклов
начальная денатурация
94
2 минуты
удержание
денатурация
94
15 секунд
10 циклов
отжиг и элонгация
65
60 секунд
10 циклов
денатурация
94
15 секунд
20 циклов
отжиг
61
50 секунд
20 циклов
элонгация
72
30 секунд
20 циклов
охлаждение
4
15 минут
удержание
После окончания амплификации планшету из термоциклера ставят в холодильник с температурой +4°С до проверки в течение 2-х дней или в морозильную камеру при долгом хранении.
Визуализацию результатов ПЦР осуществляют посредством 2% раствора агарозы с буфером 1×TAE, разведенных в бидистиллированной воде. Агарозу расплавляют и варят в микроволновой печи, т.к. она растворяется только при высокой температуре, когда раствор кипит. Затем ее охлаждают до температуры 60°С и добавляют в нее 10 мкл раствора бромистого этидия (или этидиума бромида), окрашивая агарозу. Потом вливают расплавленную агарозу с бромистым этидием в подложку для геля и охлаждают до его застывания. Агароза при застывании превращается в лист толщиной несколько мм. Гребенки, установленные на подложке для геля агарозы, своими зубчиками делают отверстия в агарозе (лунки), куда добавляют амплификаты. Помещают застывший гель агарозы в подложке в электрофоретическую ячейку, наливают буфер 50 мл 50×ТАЕ, смешанный с 2,450 л бидистиллированной воды, заполняя все лунки агарозного геля. В каждую лунку в геле вносят маркер молекулярного веса ДНК 50-1000 пар нуклеотидов, подключают электрофоретическую ячейку к источнику питания, осуществляя электрофорез в течение 20 минут при напряжении 170 В. Под действием тока заряженная ДНК проходит сквозь пористый гель к отрицательному электроду, молекулы ДНК в геле расходятся в зависимости от своей массы. По наличию продукта в лунке и по сравнению со специфическими праймерами в данной лунке определяется HLA-генотип. После окончания электрофореза выполняют снимок геля и заносят результаты ПЦР в протокол.
Использование решения «Способ HLA-типирования цельной крови» по сравнению с прототипом повышает надежность определения результатов HLA-генотипирования, т.к. использованы стандартизованные аллель-специфические смеси праймеров, заранее разлитых в соответствующие лунки на микропланшете. Качество получаемых результатов типирования соответствует существующим в трансплантологии требованиям по типированию органов и костного мозга. Предложенный способ определения генотипирования очень хорошо подходит по затратам времени для быстрого типирования в экстренных случаях, например для определения качества донорской крови по гистосовместимости. Для запуска амплификации при проведении молекулярно-генетического метода полимеразной цепной реакции требуется внесение одного единственного реагента - смеси ДНК и фермента в буферной среде, что и экономично, и занимает меньше времени по сравнению с аналогичными способами определения человеческого лейкоцитарного антигена. В предложенном способе HLA-генотипирования цельной крови выделенная ДНК не имеет примеси и белковых фракций, которые бы влияли на проведение процесса полимеразной цепной реакции. Концентрация ДНК составляет 100-200 мкг/мл, такого количества достаточно для проведения нескольких тестов без повторного выделения. Для HLA-генотипирования пуповинной крови для трансплантации достаточно анализа трех локусов: HLA-A, HLA-B, HLA-DRBI. Весь процесс генотипирования проводят в одну стадию, в одной планшете, используя одну программу по методике и с помощью наборов Protrans HLA-A*, -В*, DRBI* Cyclerplate System, что и технологичней, и занимает меньше времени на исследования. Предложенный способ автоматизирован, использует современное оборудование высокого качества и надежности, на котором было проведено предприятием «ООО Покровский банк стволовых клеток» в городе Санкт-Петербург более 80 исследований и анализов высокого качества и надежности на определение HLA-типирования цельной крови, т.е. периферической и пуповинной крови.