Способ получения молекулярных маркеров для определения вероятной внешности человека методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК
METHOD FOR PRODUCTION OF MOLECULAR MARKERS FOR DETERMINATION OF PROBABLE HUMAN APPEARANCE BY MULTIPLEX AMPLIFICATION FOR WORK WITH DEGRADED DNA SAMPLES

Изобретение относится к области молекулярной биологии и прогностических тестов внешности человека и используется для определения вероятности цвета глаз и волос индивидуума. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Изобретение дает возможность выявить однонуклеотидные ДНК-маркеры цвета глаз и волос из образцов геномной ДНК человека, в том числе в случае, когда ДНК в исследуемом образце находится в деградированном виде, а именно амплифицировать короткие фрагменты ДНК, содержащие специфические мутации в генах MC1R, TUBB3, SLC45A2, KITLG, IRF4, TYR, ОСА2, SLC24A4, HERC2, PIGU, TYRP1, LOC105374875 и LOC105370627, NPLOC4, RAB38 и FANCA.
Уровень техники
Системы для ДНК-идентификации черт внешности необходимы как для криминалистических целей, так и широкого круга научных задач, в частности, воспроизведения вероятной внешности индивидов из археологических раскопок. В начале 2000-х годов было выявлено, что цвет глаз и волос не являются моногенными признаками, как это предполагалось ранее. Одна из наиболее значимых работ принадлежит группе Liu и др [1], давшей основу для формирования нескольких альтернативных наборов ДНК-маркеров для определения цвета глаз и волос [2-6]. Наиболее широкое распространение для дальнейших исследовательских и криминалистических работ получили системы, опубликованные в работах Walsh и др. [2] и Ruiz и др [3]. Эти системы были разработаны на основании генетических данных для европейских популяций, а также прошли успешную апробацию на других популяционных исследованиях [7, 8]. Изначально обе системы для ДНК-идентификации цвета глаз и волос были разработаны в качестве вспомогательных средств для криминалистических целей, дополняя ДНК-идентификацию с помощью STR-маркеров. Однако, в работах последнего десятилетия ДНК-идентификация черт внешности также активно используется отдельно для исторических находок и характеристик массовых захоронений [9-11]. Система HirisPlex, предложенная Walsh и др., основана на 23 ОНП и 1 инделе [2] и позволяет различить светлый/темный/промежуточный цвет радужки глаз, цвет волос блондин/шатен/рыжий/брюнет, а также 2 оттенка волос - светлый/темный. Однако, в последних научно-исследовательских работах было выявлено, что данная система менее эффективна для народностей азиатского происхождения, в частности, HirisPlex не определяет различия между темным и промежуточным цветом глаз, в то время как с помощью набора маркеров, опубликованный Ruiz, такое различие возможно [7, 12, 13]. Исследования европейских популяций, наоборот, подтверждают более высокую предиктивную способность системы HirisPlex [8]. Кроме того, за последние несколько лет были выявлены новые гены и однонуклеотидные маркеры, влияющие на цвет глаз и волос, а также окраску меха и шерсти млекопитающих [14-16]. Поскольку Российская федерация расположена как на территории Азии, так и Европы, и населена около 200 народностями, рационально использовать маркеры из обеих систем и учитывать маркеры из последних исследований, не мономорфные для населения России.
Таким образом, техническая проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в расширении арсенала технических средств, которые используются для определения вероятности цвета глаз и волос индивидуумов на территории России.
Выбор набора маркеров
2
Коллекция данных секвенирования из 330 образцов ДНК граждан РФ с различным цветом глаз, волос и этническим происхождением использовалась для выявления маркеров внешности, информативных для населения РФ. Для всех образцов были доступны оценки экспертов цвета глаз и волос (для глаз: темный, смешанный-темный, смешанный-светлый и светлый цвет, для волос: темный, промежуточный, светлый оттенок и наличие рыжего оттенка). В биоинформатическом анализе участвовали 36 маркеров, включающих 24 маркера HirisPlex [2], 9 маркеров из Ruiz и др. [3] и 3 маркера из гена, выявленного в Manakhov и др. [15]. Для всех маркеров была посчитана корреляция с меткой-цветом глаз, для этого метка принимала числовые значения (1 для "светлого", 2 для "смешанного", 3 для "темного"). Далее, были исключены маркеры, мономорфные для РФ и незначимые после поправки на множественное тестирование по методу Бенджамини-Хохберга. Далее была выполнена проверка сцепленности значимых признаков (в vcftools по алгоритму PLINK), которая выявила две пары маркеров, имеющих коэффициент сцепленности r>lll0.8. Аналогично был проведен выбор ДНК маркеров, информативных для цвета волос.
К полученному набору ДНК-маркеров были подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры таким образом, чтобы полученный ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволило бы повысить результативность при исследовании деградированной ДНК (табл. 1). Праймеры подобраны также с учетом того, чтобы можно было эффективно амплифицировать все целевые локусы в ходе одной мультиплексной ПЦР. Авторами была проведена серия испытаний набора реактивов. Авторы изобретения провели полногеномное секвенирование образцов ДНК различных индивидов и выявили соответствие с генотипами маркеров в ПЦР продуктах, полученными с помощью данного набора олигонуклеотидов на тех же образцах ДНК. Возможность точного определения генотипов для всех 28 маркеров была показана для более, чем 50 различных образцов ДНК. Также, было показано преимущество разработанного авторами набора ДНК-маркеров перед системой Forenseq DNA Signature в случаях применения способа выявление внешности индивида для образцов, где ДНК находится в деградированном виде или в малых количествах (например, для работы с "древней ДНК").
Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры к целевым SNP-маркерам внешности.
SEQ IID
ID маркера
Ген
Нуклеотидная последовательность праймеров
Размер ампликона, п.н.
12
rs16891982
SLC45A2
>AAGTGAGGAAAACACGGAGTTG>TAGTGCACACAACTCCACAGAG
94
34
rs28777
SLC45A2
>TCCACTCAGTTGATTTCATGTGATC>CCTGATAGATTATCTACCTCTTTGA
133
56
rs12203592
IRF4
>AGTAGTGCCTTATCATGTGAAACCA>TGGCTAAACCTGGCACCAAAAGTAC
141
910
rs683
TYRP1
>TAGTATCACAAAACCACCTGGTTGA>GGTCTTCCCAGCTTTGAAAA
138
1112
rs1042602
TYR
>AAATGAAAAATGGATCAACACCCAT>CTTCATGGGCAAAATCAATGTCTCT
138
1314
rs1393350
TYR
>TGCGTGCATATCCACCAACTCCTAC>AACAGAAAGTCACTGTTTGTATCTG
131
1516
rs12821256
KITLG
>ATAAGGAATTCAGGTGTGAAGTTGT>TGTTCCAACTTAGTCATAAAGTTCC
133
1718
rs12896399
LOCI 05370 627
>TCTGGCGATCCAATTCTTTGTTCTT>GACCCTGTGTGAGACCCAGTACTTA
126
1920
rs2402130
SLC24A4
>GCTGTGTGACACCACATGCTGTATG>CCTGGACTTCACCTCGATGACGATG
140
2122
rs12913832
HERC2
>TGTTAATACAAAGGTACAGGAACAA>CCCCTGATGATGATAGCGTGCAGAA
125
2324
rs1800407
OCA2
>CGATGAGACAGAGCATGATGA>CACTCTGGCTTGTACTCTCTCTG
96
2526
rs11547464
MC1R
>GTGATCACCTGCAGCTCC>TGCGTAGAAGATGGAGATGT
84
2728
rs1805005
MC1R
>TCCATCTCTGACGGGCTC>CAGTACATGGGTGAGTGCA
110
29
rs1805006,
MC1R
>ATCGCCAAGAACCGGAAC
120
30
rs2228479
>CTCCAGCAGGAGGATGAC
3132
rs1805007,rs201326893,rs1110400, rs1805008,
MC1R
>GGACCGCTACATCTCCATC>ATGAAGAGCGTGCTGAAGAC
120
3334
rs1805009
TUBB3
>CTTTCTCGCCCTCATCATCTGCAAT>CCCTCTGCCCAGCACACTTAAAGCC
147
3536
rs312262906
MC1R
>GCTGTGCAGGGATCCCAGAGAAGAC>GGCTGAGGAAGAGCCCGTCAGAGAT
139
3738
rs885479
MC1R
>CCGTGGACCGCTACATCTCCATCTT>CACGTGGTCGTAGTAGGCGATGAAG
142
3940
rs2378249
PIGU
>TACTCTACCTGCAGAAGACCTCAGT>TTTCAGTCTGGAGACTTTATTTAAT
138
4142
rs4778138
OCA2
>GAAAGTCTCAAGGGAAATCAGA>GCTGTAAATTTCCTCCCATCA
109
4344
rs9894429
NPLOC4
>TGCTGTTTCTCTCTTTGTTGC>GGCTGTGCAGTAACCATCAT
99
4546
rs302646
RAB38
>AAGTCCACGCCGATTGT>TGGTGATTGGCGACCTG
100
4748
rs 12931267
FANCA
>TGCTGAAGTTCCCAGTTCTC>TTGTTGACTAATGTGAGGGTCA
87
Данная система полностью совместима с маркерами внешности коммерческой системы для масштабного параллельного секвенирования Forenseq DNA Signature (Ilumina) и Ion Ampliseq DNA Phenotyping Panel (Thermo Fisher).
Осуществление способа
Пример генотипирования биологического образца.
Возможность определения маркеров цвета глаз и волос показана на образцах полногеномной ДНК и деградированной геномной ДНК индивидов с различными цветами глаз и волос путем проведения мультиплексного ПНР-анализа с последующим масштабным параллельным секвенированием полученных ДНК-образцов. ДНК-идентификация по маркерам цвета глаз и волос проводится на образце ДНК в количестве не менее 100 пкг, выделенная из любого биоматериала человека.
Получение ДНК
ДНК может быть получена из любой ткани человека, содержащей клеточные ядра, например, лейкоцитов, волосяных фолликулов, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образа при помощи любого ранее широко применяемого метода выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным. В частности, есть несколько готовых наборов для выделения ДНК из различных тканей человека (например, представленных фирмой Qiagen)
Амплификация участков генома содержащих исследуемые маркеры
Амплификация участков генома содержащих исследуемые маркеры может быть осуществлена с помощью наборов Multiplex PCR kit компании «Qiagen», на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems».
Состав реакционной смеси для мультиплексной ПЦР:
- исследуемая ДНК
- полимераза (Taq-, HotTaq-, или иная);
4
2
4
2
- буфера, оптимизированного для работы соответствующей полимеразы, например: 70 mM Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С); 17 mM (NH)SO; 0.01% Tween-20. 2 ммоль MgCl;
- смеси дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP);
- смеси праймеров в конечной концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ.
Рекомендуемое количество ДНК для мультиплексной ПЦР - 1 нг. Также необходимо проводить параллельно контрольную реакцию (отрицательный контроль), где вместо ДНК добавляется деионизированная вода.
Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, или планшетах предназначенных для ПЦР. После приготовления, смесь для амплификации помещают в амплификатор и выставляется программа:
№
Температура
Время
Количество циклов
1
95°С
15 мин
1
2
95°С
30 сек
3
57°С
90 сек
35
4
72°С
90 сек
5
72°С
10 мин
1
Наличие продуктов амплификации исследуемой ДНК и отсутствие продуктов амплификации в отрицательном контроле проверяют с помощью электрофореза в агарозном геле. Продукты амплификации очищают от остаточных праймеров с помощью соответствующих мини-колонок (например, Qiagen MinElute system) в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Полученные в результате мультиплексной амплификации очищенные ПЦР продукты, содержащие маркеры для определения вероятной внешности неизвестного индивида используются в качестве матрицы для приготовления фрагментных геномных библиотек для секвенирования.
Приготовление фрагментных библиотек
Предварительно необходимо провести измерение концентрации очищенных ПЦР-фрагментов, полученных на предыдущем этапе мультиплексной амплификации на приборах NanoDrop или Qubit (ThermoFisher) в соответствии с инструкцией к прибору. Для приготовления фрагментных библиотек оптимально использовать около 300 нг ДНК очищенных ПЦР-продуктов мультиплексной амплификации. Приготовление фрагментных геномных библиотек проводят с использованием наборов реагентов Illumina. TruSeq DNA PCR-Free library prep kit в соответствии с инструкцией к набору. Для секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек одновременно необходимо использовать индексированные адаптеры (например, Dual index adaptors Illumina). Для каждого образца библиотеки используется отдельный индексируемый адаптер, который необходимо записать в таблицу для дальнейшего учета при анализе результатов секвенирования нескольких образцов фрагментных библиотек. Для приготовления фрагментных библиотек рекомендуется/возможно использовать 1/2 от объема всех реагентов, входящих в набор Illumina. TruSeq UN A PCR-Free library prep kit, прописанного в инструкции к набору.
Этапы 1-3 являются рекомендованными, но не обязательными.
1. Очистка фрагментных библиотек: необходимо нанести весь объем элюата в одну лунку 2% агарозного геля с красителем SYBR Gold (например, с использованием готового 2%-ного E-gel (Invitrogen)). Провести электрофорез с использованием маркера молекулярных весов 50 bp Ladder в течение 10 минут (в случае использования системы e-gel (Invitrigen)).
2. С использованием стерильного одноразового скальпеля вырезать кусочки геля, с фрагментами библиотеки от 220 п. н. и больше. Светящиеся фрагменты длиной меньше 150 п. н. соответствуют димерам адаптеров и не должны быть использованы для дальнейшего анализа.
3. Провести очистку вырезанных фрагментов ДНК с использованием набора реагентов MinElute gele extraction kit (Qiagen). Эллюировать в 20-22 мкл буфера ЕВ (Qiagen).
Приготовленные описанным выше способом фрагментные библиотеки можно напрямую использовать для секвенирования на технологической платформе Illumina, предварительно проведя оценку качества полученных фрагментных библиотек.
Качественную и количественную оценку фрагментных библиотек можно проводить стандартными методами, рекомендованными фирмой производителем платформ для секвенирования Illumina. Для оптимизации рабочего процесса рекомендуем использовать следующие этапы: Измерить концентрации фрагментных библиотек на приборе Qubit с использованием набора реагентов HS. Для дальнейшего секвенирования рекомендуется использовать фрагментные библиотеки с концентрацией не менее 2 нМ/мкл.
Перед секвенированием необходимо провести мультиплексирование библиотек в эквимолярных количествах (объединение библиотек для нескольких образцов). Не допускается объединение в один пул библиотек с одинаковыми индексами.
Приготовленные фрагментные библиотеки секвенируют методом параллельного широкомасштабного секвенирования на технологической платформе Illumina в парноконцевом режиме с длинной прочтения не менее 75+75 п.о. Рекомендуемый прибор секвенатор MiSeq (Illumina).
Анализ результатов секвенирования
Анализ результатов секвенирования проводят следующим образом:
- Картировать полученные прочтения на референсного генома человека с помощью программы bwamem или аналогичной.
- Определить генотипы по исследуемым маркерам с помощью программ GATK, freebayes или аналогичных.
Литературные источники
1. Liu F. et al. Digital Quantification of Human Eye Color Highlights Genetic Association of Three New Loci // PLoS Genet. / ed. McCarthy M.I. 2010. Vol. 6, №5. P. e1000934.
2. Walsh S. et al. The HirisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA// Forensic Sci. Int. Genet. Elsevier Ireland Ltd, 2013. Vol. 7, №1. P. 98-115.
3. Ruiz Y. et al. Further development of forensic eye color predictive tests // Forensic Sci. Int. Genet. 2013. Vol. 7, №1. P. 28-40.
4. Allwood J.S., Harbison S. SNP model development for the prediction of eye colour in New Zealand // Forensic Sci. Int. Genet. 2013. Vol. 7, №4. P. 444-452.
5. Hart K.L. et al. Improved eye- and skin-color prediction based on 8 SNPs // Croat. Med. J. 2013. Vol. 54, №3. P. 248-256.
6. Chaitanya L. et al. The HIrisPlex-S system for eye, hair and skin colour prediction from DNA: Introduction and forensic developmental validation // Forensic Sci. Int. Genet. 2018. Vol. 35. P. 123-135.
7. Freire-Aradas A. et al. Exploring iris colour prediction and ancestry inference in admixed populations of South America // Forensic Sci. Int. Genet. 2014. Vol. 13. P. 3-9.
8. Salvoro C. et al. Performance of four models for eye color prediction in an Italian population sample // Forensic Sci. Int. Genet. 2019. Vol. 40. P. 192-200.
9. Chaitanya L. et al. Bringing colour back after 70 years: Predicting eye and hair colour from skeletal remains of World War II victims using the HirisPlex system // Forensic Sci. Int. Genet. 2017. Vol. 26. P. 48-57.
10. King Т.Е. et al. Identification of the remains of King Richard III // Nat. Commun. 2014. Vol. 5, №1. P. 5631.
11. Gomes C. et al. Phenotyping the ancient world: The physical appearance and ancestry of very degraded samples from a chalcolithic human remains // Forensic Sci. Int. Genet. Suppl. Ser. 2017. Vol. 6. P. e484-e486.
12. Schmidt N. et al. Genome wide SNP typing of ancient DNA: Determination of hair and eye color of Bronze Age humans from their skeletal remains // Am. J. Phys. Anthropol. 2020. Vol. 172, №1. P. 99-109.
13. Bulbul O., Zorlu Т., Filoglu G. Prediction of human eye colour using highly informative phenotype SNPs (PISNPs) // Aust. J. Forensic Sci. 2020. Vol. 52, №1. P. 27-37.
14. Simcoe M. et al. Genome-wide association study in almost 195,000 individuals identifies 50 previously unidentified genetic loci for eye color // Sci. Adv. 2021. Vol. 7, №11. P. eabd1239.
15. Manakhov A.D. et al. Genome analysis of American minks reveals link of mutations in Ras-related protein-38 gene to Moyle brown coat phenotype // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, №1. P. 15876.
16. Manakhov A.D. et al. Genome analysis identifies the mutant genes for common industrial Silverblue and Hedlund white coat colours in American mink. // Sci. Rep.2019.