Биоразнообразие микроорганизмов гипергалинного озера Дунино, изученное методом метагеномного секвенирования

УДК 579.2

БИОРАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ГИПЕРГАЛИННОГО ОЗЕРА ДУНИНО, ИЗУЧЕННОЕ МЕТОДОМ МЕТАГЕНОМНОГО

СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Селиванова Е.А., Хлопко Ю.А., Пошвина Д.В., Плотников А.О.

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН,

Оренбург, Россия

Впервые методом высокопроизводительного секвенирования изучено биоразнообразие про- и эукариот гипергалинного озера Дунино (Оренбургская область). Видовое богатство микроорганизмов было незначительным и составило 41 вид прокариот и 7 видов эукариот. По численности преобладали археи (среди прокариот) и зеленые водоросли (среди эукариот). Определен доминирующий комплекс микроорганизмов, представленный зелеными одноклеточными водорослями Dunaliella salina, археями Halonotius sp., бактериями Salinibacter sp. и гетеротрофными жгутиконосцами Halocafeteria sp. Среди выявленных микроорганизмов многие не идентифицированы, и возможно представляют собой новые виды.

The prokaryotic and eukaryotic diversity in hypersaline Dunino Lake has been investigated for the first time with high-throughput sequencing. The species diversity of microorganisms was not large. There were 41 prokaryotic and 7 eukaryotic species. Archaea (among prokaryotes) and green algae (among eukaryotes) were the most abundant. Assemblage of predominant microorganisms was represented by unicellular green alga Dunaliella salina, archaea Halonotius sp., bacterium Salinibacter sp. and heterotrophic flagellate Halocafeteria sp. There were a lot of unidentified microorganisms among detected OTUs, which possibly represent new species.

Гипергалинные озера встречаются на всех континентах, особенно они многочисленны в аридных и полуаридных зонах. На территории Оренбургской области располагается группа соленых Соль-Илецких озер, привлекающая внимание исследователей. Известно, что таксономическая структура биоценозов гипергалинных местообитаний достаточно примитивна, включает в себя преимущественно прокариот (археи и бактерии), ряд одноклеточных эукариот, таких как фотосинтетические и гетеротрофные протисты и грибы, а также ракообразных рода Artemia [4, 11]. Однако, применение генетических методов оценки разнообразия гипергалинных водоемов привело в последние годы к обнаружению новых таксонов прокариот, например Haloquadratum walsbyi и Salinibacter ruber [3, 8]. Последние публикации свидетельствуют о возможности обнаружения крупных таксонов прокариот, которые пока не подвергаются культивированию и могут быть изучены только in situ, например новый класс архей Nanohaloarchaea или достигающие массового развития гамма-протеобактерии Spiribacter salinus [6, 9]. В то же время данные по результатам изучения микробиоценозов гипергалинных водоемов различных географических локализаций довольно скудны и представлены в основном исследованиями талассогалинных соленых водоемов, тогда как аталассогалинные водоемы, разнообразные по своим условиям и химическому составу, остаются практически не изученными [12]. С этой точки зрения актуальным представляется исследование состава про- и эукариот гипергалинных Соль-Илецких водоемов, для которых ранее методы высокопроизводительного секвенирования не использовались. Из всей группы озер особое внимание привлекает состояние экосистемы природно-карстового озера Дунино, включенного в региональный список памятников природы и наряду с другими водоемами являющегося частью Соль-Илецкого грязе-рапного курорта. В связи с этим, целью данной работы явилась характеристика структуры и биоразнообразия микробного сообщества с помощью высокопроизводительного 16S и 18S метагеномного секвенирования в гипергалинном озере Дунино (г. Соль-Илецк, Оренбургская область).

Планктонные пробы воды из оз. Дунино были отобраны в октябре 2015 г. Согласно Венецианской классификации оз. Дунино (51°15,076' с.ш., 55°00,402' в.д.) является гипергалинным, соленость в нем близка к уровню насыщения (300 г/л), состав основных ионов представлен в таблице 1.

Химический состав рапы оз. Дунино

Ион Na+ K+ Mg 2+ Ca2+ Cl- SO42- hco- 3

Содержание (г/л) 124,32 0,63 10,96 18,44 192,85 7,34 0,067

Образцы рапы объемом 50-100 мл фильтровались через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм (для прокариот и эукариот, соответственно). Тотальная ДНК с фильтров выделялась модифицированным методом механической гомогенизации с последующим ферментативным лизисом [1]. Модификация заключалась в дополнительном этапе инкубации с лизоцимом для эффективного разрушения Грам-положительных бактерий. К образцам добавляли 400 мкл ТСБ буфера и гомогенизировали с шариками диаметром 1,4 мм в течение 1 мин на максимальных оборотах. После чего добавляли 50 мкл ТСБ с лизоцимом и инкубировали 60 мин при 37°С. Затем в смесь вносили 50 мкл 10% додецилсульфат натрия (итоговая концентрация составляла 1%) и 2 мкл протеиназы К и инкубировали 60 мин при 60°С. После экстракции фенол-хлороформ-изоамиловым спиртом (25:24:1) и хлороформ-изоамиловым спиртом (24:1) ДНК в водной фазе осаждали ацетатом аммония в трехкратном объеме абсолютного спирта при -20°C в течение ночи. После центрифугирования и двойного отмывания 80% этанолом, ДНК высушивали и растворяли в 30 мкл MQ. Для исключения возможной контаминации использовали отрицательный контроль, в котором 100 мкл деионизированной автоклавированной воды обрабатывали с использованием описанной выше методики. Чистоту ДНК контролировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Концентрацию ДНК определяли с использованием Флюориметра Qubit 2.0 с китом Quanti Fluor dsDNA (Life Technologies). ДНК библиотеки для секвенирования были созданы по протоколу Illumina (http://support.illumina.com/ documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf) с праймерами к V3 и V4 регионам 16S рРНК для прокариот (прямой S-D-Bact-0341-b-S-17 и обратный S-D-Bact-0785-a-A-21) (Klindworth A. et al., 2013) и к V4 региону 18S рРНК для эукариот (прямой TAReuk454FWD1 и обратный TAReukRev3). Метагеномное секвенирование проводилось на секвенаторе MiSeq (Illumina, США) в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Данные по составу сообществ обрабатывались комплексом биоинформационных программ USEARCH v8.0.1623_win32 [5], включая слияние парных ридов, фильтрацию по качеству ридов и отбор по длине ампликонов (минимальный размер -300 bp). Таксономическая классификация последовательностей проводилась с использованием базы данных VAMPS [7].

Всего из образцов рапы озера Дунино было выделено 1520 ридов прокариот, объединившихся в 41 операционных таксономических единицы (ОТЕ), относящиеся к 17 родам, 7 классам и 6 филумам. Наиболее разнообразно был представлен филум Euryarchaeota, к которому относились 23 ОТЕ (рисунок 1). Все они принадлежали экстремально галофильным археям класса Halobacteria. Также разнообразно был представлен филум Bacteroidetes и недавно описанный филум некультивируемых архей Nanohaloarchaeota (на рисунке включен в состав архей).

Наиболее многочисленными среди прокариот оказались представители филума Euryarchaeota, на долю которых приходилась более половины всех ридов (рисунок 2). Доля бактерий Bacteroidetes и архей Nanohaloarchaeota составила 19 и 21%, соответственно. Филум Proteobacteria, представленный классом Gammaproteobacteria, а также Firmicutes и неклассифицированные на уровне филума бактерии составили меньшую часть прокариотного сообщества. Наиболее разнообразно были представлены роды Salinibacter, Candidatus Haloredivivus, Haloarcula, Candidatus Nanosalina, Halorubrum (по 4-6 ОТЕ).

Анализудельнойчисленностипрокариотнауровнерода(таблица2)продемонстрировал доминирование архей рода Halonotius, бактерий рода Salinibacter и некультивируемых форм Candidatus Haloredivivus. Все зарегистрированные в озере Дунино прокариоты являются экстремальными галофилами, большинство из которых ранее обнаруживались

в гипергалинных местообитаниях других локализаций, в том числе недавно описанные бактерии рода Spiribacter и археи класса Nanohaloarchaea. Однако, несмотря на сходство таксономической структуры и списка родов прокариот в гипергалинных местообитаниях, есть и существенные различия в составе доминантных комплексов. Так, для кристаллизационных солтернов в Испании, Израиле, Австралии, Турции и Тунисе с соленостью близкой к уровню насыщения доминирующими родами были археи Haloquadratum и бактерии Salinibacter, в то же время в озере Дунино распространенный и массово развивающийся род Haloquadratum не был зарегистрирован [10]. По данным предшествующих исследований, другим родом архей, доминирующим в гипергалинных озерах и солтернах в случае отсутствия либо незначительного развития Haloquadratum, является род На1огиЬгит. По нашим данным, в озере Дунино развитие представителей данного рода было сравнительно незначительным. Кроме того, в списке ОТЕ есть много прокариот, неидентифицированных на уровне вида и даже на уровне более крупных таксонов, что делает перспективным дальнейший поиск, выделение и изучение культур прокариот из озера Дунино.

Рисунок 1. Таксономический состав прокариот на уровне филума.

Удельная численность доминирующих родов

Род %

Halonotius 27,8

Salinibacter 16,4

Candidatus Haloredivivus 13,1

Candidatus Nanosalina 7,4

Haloarcula 7,4

«Spiribacter» 6,3

Halorubrum 4,6

Halobellus 4,0

Unclassified Bacteria 3,0

Unclassified «Bacteroidetes» 2,3

Halohasta 2,2

Natronomonas 1,5

По результатам метагеномного секвенирования эукариот озера Дунино выявлено 49824 рида протистов, составивших 10 операционных таксономических единиц и относящихся к 6 родам, 5 классам и 3 филумам. Наиболее разнообразно был представлен филум Chlorophyta, на долю которого приходилось более 50% всех обнаруженных ОТЕ (рисунок 3). Также были выявлены представители Bacillariophyta и Bigyra.

Chlorophyta были представлены одноклеточными зелеными водорослями рода Dunalella (D. salina, D. viridis, D. parva), Tetraselmis sp., Chlamydomonas uva-maris. Bigyra, включающие в свой состав гетеротрофных протистов, были представлены двумя ОТЕ Halocafeteria sp. и Paraphysomonas sp. Среди Bacillariophyta был зарегистрирован один вид - Nitzschia microcephala. Интересно, что видовой список, полученный с применением метагеномного подхода отличается в значительной степени от данных, полученных ранее с помощью микроскопического метода. Так среди зеленых одноклеточных водорослей наряду с представителями родов Dunalella и Chlamydomonas, присутствие которых было ранее зарегистрировано, впервые были выявлены микроводоросли рода Tetraselmis. Что касается гетеротрофных протистов, то присутствие экстремально галофильных жгутиконосцев рода Halocafeteria неудивительно, однако обнаруженные в озере Дунино последовательности имеют существенные отличия от описанного вида Halocafeteria seosinensis (Bicosoecida), и возможно, принадлежат новому виду того же рода. Присутствие Paraphysomonas sp. в гипергалинном озере Дунино отмечено впервые. В то же время не было зарегистрировано присутствие гетеротрофных жгутиконосцев рода Percolomonas и гетеролобозных амеб, которые регулярно выделялись в культуре [2], что, вероятно, связано с недостаточной специфичностью используемых праймеров и свидетельствует о необходимости их дальнейшего подбора для 18S метагеномного секвенирования эукариот.

Анализ удельной численности эукариот на уровне ОТЕ (рисунок 4) продемонстрировал доминирование зеленых одноклеточных водорослей D. salina, на долю которых приходилось 99,4% всех выявленных ридов. Массовое развитие D. salina в условиях солености 300 г/л объяснимо с учетом высоких адаптационных возможностей и пластичности этого вида, благодаря которым именно он зачастую является основным продуцентом органического вещества в условиях экстремальных уровней солености и действия других неблагоприятных для большинства организмов факторов. Ранее цветение озера Дунино регистрировали только в зимние месяцы, так как в осенне-летний период численность микроводорослей в значительной мере ограничивалась развитием жаброногих рачков Artemia salina. Однако соленость рапы в озере Дунино, повысившаяся в последние годы со 150 до 300 г/л, лимитирует развитие зоопланктона. В подобных условиях возрастает роль гетеротрофных протистов, играющих роль единственных консументов. Среди гетеротрофных микроорганизмов численно преобладали жгутиконосцы Halocafeteria sp., на долю которых приходилось 0,3% всех видов.

Таким образом, в результате проведенного исследования впервые методом высокопроизводительного секвенирования изучено биоразнообразие про- и эукариот гипергалинного озера Дунино. Видовое богатство микроорганизмов было незначительным и составляло 41 вид прокариот и 7 видов эукариот. По численности и таксономическому разнообразию преобладали археи (среди прокариот) и зеленые водоросли (среди эукариот). Определен доминирующий комплекс микроорганизмов, представленный зелеными одноклеточными водорослями D. salina, археями Halonotius sp., бактериями Salinibacter sp. и гетеротрофными жгутиконосцами Halocafeteria sp. Среди выявленных микроорганизмов многие не идентифицированы, и возможно представляют собой новые виды. Поскольку

характеристика микробиоценоза озера Дунино с применением метагеномного подхода не проводилась ранее, полученные данные уникальны, соответствуют мировому уровню исследований и расширяют наши представления об особенностях биоценозов этих важных в природном, бальнеологическом и биотехнологическом отношении водоемов. Результаты исследования дополняют имеющиеся в литературе сведения о микробном разнообразии географически отдаленных гипергалинных водоемов, отличающихся по происхождению и составу солей, и демонстрируют уникальность этого аталассогалинного озера в сравнении с другими гипергалинными местообитаниями. Несомненно, перспективным является дальнейшее изучение Соль-Илецких озер, как с использованием метагеномных, так и культуральных подходов, с целью описания новых видов галофильных микроорганизмов и раскрытия их роли в биоценозе водоемов.

Авторы выражают благодарность к.б.н. О.А. Гоголевой за помощь в выделении ДНК из образцов.

Работа была выполнена на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» ИКВС УрО РАН и поддержана грантами РФФИ (14-04-01796, 15-29-02749, 16-44-560316р-а, 16-44-560234р-а).

Список литературы

1. Белькова Н.Л. Модифицированная методика выделения суммарной ДНК из водных проб и грунтовых вытяжек методом ферментативного лизиса // Молекулярно-генетические методы анализа микробных сообществ. Разнообразие микробных сообществ внутренних водоемов России: Учебно-методическое пособие. - Ярославль: Изд-во ООО «Принтхаус», 2009. - С. 53-63.

2. Плотников А.О., Селиванова Е.А., Немцева Н.В.Видовой состав гетеротрофных жгутиконосцев соленых Соль-Илецких озер // Известия Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского, 2011. - № 25. - С. 548-557.

3. Anton J., Oren A., Benlloch S., Rodriguez-Valera F., Amann R., Rossello-Mora R. Salinibacter ruber gen. nov., sp. nov., a novel, extremely halophilic member of the Bacteria from saltern crystallizer ponds // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002. - V. 52. - P. 485-491.

4. De la Haba R., Sanchez-Porro C., Marquez M.C., Ventosa A. Taxonomy of halophiles // Extremophiles Handbook / Eds. Horikoshi K., Antranikian G., Bull A., Robb F., Stetter K.: Springer, 2011. - Р. 344-361.

5. Edgar R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST // Bioinformatics, 2010. - V. 26. - № 19. - Р. 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461.

6. Ghai R., Pasic L., Fernandez A.B., Martin-Cuadrado A.B., Mizuno C.M., McMahon K.D., Papke R.T., Stepanauskas R., Rodriguez-Brito B., Rohwer F., Sanchez-Porro C., Ventosa A., Rodriguez-Valera F. // New abundant microbial groups in aquatic hypersaline environments / Scientific Reports, 2011. - V. 1:135.

7. Huse S.M., Mark Welch D.B., Voorhis A., Shipunova A., Morrison H.G., Eren A.M., Sogin ML. VAMPS: a website for visualization and analysis of microbial population structures // BMC Bioinformatics, 2014. - V. 15:41.

8. Legault B.A., Lopez-Lopez A., Alba-Casado J.C., Doolittle W.F., Bolhuis H., Rodriguez-Valera F., Papke R.T. Environmental genomics of «Haloquadratum walsbyi» in a saltern crystallizer indicates a large pool of accessory genes in an otherwise coherent species // BMC Genomics, 2006. - V. 7:171.

9. Leon M.J., Fernandez A.B., Ghai R., Sanchez-Porro C., Rodriguez-Valera F., Ventosa A. From metagenomics to pure culture: isolation and characterization of the moderately halophilic bacterium Spiribacter salinus gen. nov., sp. nov. // Applied and Environmental Microbiology, 2014. - V. 80. - P. 3850-3857.

10. Trigui H., Masmoudi S., Brochier-Armanet C., Barani A., Gregori G., Denis M., Dukan Sa., Maalej S. Characterization of heterotrophic prokaryote subgroups in the Sfax coastal solar salterns by combining flow cytometry cell sorting and phylogenetic analysis // Extremophiles, 2011. - V. 15. - P.347-358.

11. Ventosa A. Unusual microorganisms from unusual habitats: hypersaline environments // Prokaryotic Diversity: Mechanisms and Significance / Eds. Logan N.A., Lappin-Scott H.M., Oyston P.F.C.: Cambridge University Press, 2006. - Р. 223-253.

12. Ventosa A., de la Haba R.R, Sanchez-Porro C., Papke R.T. Microbial diversity of hypersaline environments: a metagenomic approach // Current Opinion in Microbiology, 2015. - V. 25. - P. 80-87.