ШТАММ "СТАВРОПОЛЬ 01/08" ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
STRAIN "STAVROPOL 01/08" OF AFRICAN SWINE PLAGUE VIRUS FOR VIROLOGICAL, MOLECULAR-GENETIC AND MONITORING RESEARCH

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.
В странах Африканского, Американского и Европейского континентов выделено более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обладающих различными биологическими свойствами. Рядом авторов проводились исследования по классификации имеющихся изолятов вируса АЧС. С этой целью они использовали перекрестное заражение свиней, реакцию задержки гемадсорбции (РЗГАд) в культуре клеток костного мозга свиней (КМС) или лейкоцитов свиней (ЛС), рестрикционный анализ ДНК, генотипирование вируса и др. [1, 3, 4, 5].
Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серотипов [2]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серотипам; Референс-штаммом I-го серотипа определен штамм «Лиссабон 57», II-го - «Конго 49», III-го - «Мозамбик 78», IV-го «Франция 32» [1].
Целью данного изобретения является получение нового вирулентного штамма вируса африканской чумы свиней, обладающего стабильными культуральными и вирулентными свойствами для свиней различных возрастных групп для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований.
Поставленная цель достигается путем выделения вируса АЧС от свиньи, павшей в ТОО «Горькая Балка» Советского района Ставропольского края во время эпизоотии болезни в 2008 г., который является новым, ранее неизвестным штаммом этого возбудителя, выделенным на территории РФ. Полученный вирулентный штамм обозначен как штамм «Ставрополь 01/08» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН под №278.
Новый вирулентный штамм обладает следующими свойствами.
3
Морфологические и молекулярно-генетичесие свойства. При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают округлые частицы диаметром 175-215 нм, состоящие из плотного нуклеотида, 2-слойного икосаэдрического капсида и наружной оболочки. Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1.19-1.24 г/см, коэффициент седиментации 1800-8000 S. Нуклеотид содержит ДНК, белок и окружен электронно-прозрачным слоем. Геном вируса представлен неинфекционной, двуспиральной, линейной молекулой ДНК, состоящей из 170-190 тыс. пар нуклеотидов. На основании результатов секвенирования фрагментов гена, кодирующего структурный белок Р 72, штамм отнесен к 2-му генотипу вируса АЧС.
Антигенные свойства. Антигенные свойства штамма типичны для вируса АЧС. В вирионах идентифицированы 54 полипептида. Вирусспецифические антигены выявляются в реакциях преципитации, связывании комплемента, иммуноферментном анализе, иммунофлуоресценции, задержки гемадсорбции и др.
Типовая принадлежность. По результатам РЗГАд с использованием полученных в ГНУ ВНИИВВиМ референс-сывороток штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа.
50/cм3
Культуральные свойства. Штамм размножается в первичных культурах клеток КМС и ЛС. Репродукция вируса сопровождается адсорбцией эритроцитов свиней на инфицированных клетках (феномен гемадсорбции) на 3-5 сутки культивирования и их лизисом через 120-144 часов. Накопление вируса в эти сроки составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ. В течение 20 серийных пассажей (срок наблюдения) штамм сохраняет эти свойства. Штамм не размножается в перевиваемых культурах клеток почки поросенка, тестикул поросенка, почки сибирского горного козерога, почки зеленой мартышки.
Инфекционная активность. Инфекционная активность штамма в культуре клеток КМС и на свиньях составляет
соответственно.
Патогенные свойства. Штамм патогенен только для свиней всех пород и возрастных групп. При внутримышечном заражении вирус вызывает их гибель с признаками острой формы болезни с характерными клиническими симптомами АЧС. У заболевших свиней на 3-5 сутки после заражения отмечают повышение температуры тела до 41,5-42,0°С, цианоз кожи, угнетение, отказ от корма, нарушение координации движений, учащенное дыхание, у отдельных животных парез задних конечностей. Длительность болезни у животных составляет от 3 до 6 суток. В ряде случаев животные погибают без проявления характерных клинических признаков АЧС на 3-4 сутки после внутримышечного заражения (сверхострая форма).
Патологоанатомические изменения. Патоморфологические изменения у взрослых свиней характерны для острой формы АЧС. На серозных оболочках внутренних органов наблюдаются кровоизлияния, в грудной и брюшной полостях скопление серозно-геморрагического экссудата, междольковая ткань легких отечна, у отдельных животных с признаками серозно-геморрагической пневмонии. Лимфоузлы увеличены, темно-красного цвета, на разрезе геморрагически воспалены. Селезенка увеличена, кровенаполнена, черного цвета. Печень кровенаполнена, дряблой консистенции, темно-коричневого цвета.
Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают АЧС при совместном содержании с инфицироваными штаммом «Ставрополь 01/08» животными.
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.
Способ получения и условия хранения. Штамм хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной вируссодержащей крови, которую получают от внутримышечно зараженных свиней, находящихся в агональном состоянии. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Накопление вируса в культуре клеток КМС
В табл.1 приведены сведения по культивированию штамма «Ставрополь 01/08»» вируса АЧС в монослое культуры клеток КМС, в течение 20 последовательных пассажей.
Таблица 1
Накопление вируса АЧС в процессе пассирования
Характеристика штамма
* Доза заражения
Накопление вируса (lg ГАЕ<sub>50/см3</sub>)
1 пас.
5 пас.
10 пас
20 пас.
Лиофилизиро-ванная вирус-кровь (2 пассаж)
1,0
6,0
6,25-6,5
6,5-6,75
6,25-7,0
0,1
6,0-6,25
6,5
6,5-7,0
6,5-6,75
0,001
6,0-6,25
6,25-7,0
6,5-6,75
6,25-7,0
Примечание: * - Доза заражения приведена в lg ГАЕ<sub>50/клетка.</sub>
50/см3.
50/клетка
50/клетка.
Как видно из табл.1, в течение 20 последовательных пассажей штамм «Ставрополь 01/08» вируса АЧС стабильно размножается в монослое культуры клеток КМС. Через 96-120 часов культивирования при температуре 37,0-37,5°С накопление вируса составляло 6,0-7,0 lg ГАЕ Размножение вируса сопровождалось феноменом гемадсорбции с последующим цитолизом инфицированных клеток. Заражающая доза 1,0-0,01 ГАЕ не влияла на накопление вируса. В более ранние сроки (48-72 час) цитолиз клеток наступает при инфицирующей дозе 1 ГАЕ
Полученный вируссодержащий материал обладает высокой инфекционной активностью и может быть использован при проведении фундаментальных и прикладных НИОКР.
Пример 2.
Определение типовой принадлежности штамма «Ставрополь 01/08»
Типовая принадлежность штамма определена в РЗГАд со специфическими референс-сыворотками I-VIII серотипов по разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ методике. Установлено, что только специфическая референс-сыворотка, полученная на штамм Родезия вируса АЧС, вызывает задержку гемадсорбции штамма «Ставрополь 01/08». На основании этих исследований штамм «Ставрополь 01/08» отнесен к вирусу АЧС VIII-го серотипа и принят в качестве референс-штамма.
Результаты типирования штамма приведены в табл.2.
Таблица 2
Результаты типизации штамма «Ставрополь 01/08» вируса АЧС в РЗГАд
Штаммы вируса АЧС
Типовые референс-сыворотки (серотип)
Серотип вируса
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
Референс-штаммы
Лиссабон - 57
-
+
+
+
+
+
+
+
I
Конго - 49
+
-
+
+
+
+
+
+
II
Мозамбик - 78
+
+
-
+
+
+
+
+
III
Франция - 32
+
+
+
-
+
+
+
+
IV
ТСП - 80
+
+
+
+
-
+
+
+
V
ТС/7
+
+
+
+
+
-
+
+
VI
Уганда
+
+
+
+
+
+
-
+
VII
Родезия
+
+
+
+
+
+
+
-
VIII
Испытуемый вирус
Ставрополь 01/08
+
+
+
+
+
+
+
-
VIII
Примечание: (-) - отсутствие (задержка) ГАд
(+) - специфическая ГАд
Пример 3
Изучение биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.
При изучении биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных при мониторинговых исследованиях в РФ, в качестве референс-штамма использовали штамм «Ставрополь 01/08». Результаты этих исследований приведены в табл.3.
Таблица 3
Результаты изучения вируса АЧС, выделенного в РФ
Наименование штаммов и изолятов
Биологические свойства
Наличие ГАд
* Титр вируса в культуре КМС
Форма болезни
Генотип
Серотип
Референс-штамм
Ставрополь 01/08
+
6.0-7.0
Острая
2
VIII
Изучаемые изоляты
Краснодар 01/09
+
6.0-6,5
Острая
2
VIII
Северная Осетия
+
6.0-6,5
Острая
2
VIII
Ростов 01/09
+
6.25-,70
Острая
2
VIII
Чечня 04/09
+
6.0-,75
Острая
2
VIII
Примечание: (+) - признак положительный
* - титр вируса выражен в lg ГАЕ<sub>50/см3</sub>
Как видно из табл.3, изоляты вируса АЧС «Краснодар 01/09», «Северная Осетия», «Ростов 01/09», «Чечня 04/09» имели сравнимые характеристики с референс-штаммом «Ставрополь 01/08». Это указывает на общность происхождения и идентичность возбудителя АЧС, циркулирующего на территории РФ.
Источники информации
1.Диагностика африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И.Митин, А.Н.Курносов, В.М.Колосов, Ф.А.Бадаев, И.В.Федорищев, В.А.Бурлаков // Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1992. - С.57-70.
2. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф.Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практич. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С.141-143.
3. Селянинов Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О.Селянинов, В.М.Балышев, С.Ж.Цыбанов / Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - №5. - С.75-76.
4. Genotyping fielstraing of African swine fever by partial p72 gene characterization. A.D.S. Bastos [et al.] // Arch. Virol - 2003, vol.148, - P.693-706.
5. Malmguist W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus / W.A. Malmguist // Amer. J. Vet. Res. 1963. - P.24.