Энзиматический синтез эфиров капроновой кислоты

УДК 577.151

К. Л. Шнайдер, Г. Р. Сабирзянова, М. Х. Низамутдинова, М. Е. Зиновьева, А. Ф. Каюмова

ЭНЗИМАТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ЭФИРОВ КАПРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Ключевые слова: панкреатическая липаза, изоамилкапронат, аллилкапронат.

Экспериментально определены параметры энзиматического синтеза эфиров капроновой кислоты. Показана возможность синтеза изоамилкапроната с применением в качестве сырья сивушного масла. Установлено, что этерификация аллилового спирта протекает медленно из-за ингибирующего действия аллилового спирта на фермент.

Keywords: pancreatic lipase, isoamyl caproate, allyl caproat.

Experimentally parameters for the enzymatic synthesis of esters of сaproic acid was determined. Possibility of the synthesis of isoamyl caproate with the use offusel oil has been shown. Esterification of allyl alcohol proceeds more slowly because of the alcohol inhibits the enzyme.

Капроновая кислота, ее еще называют гексано-вая, маслянистая жидкость без цвета и с неприятным запахом. В природе встречается в кокосовых, пальмовых, а также маслах животного происхождения. В некотором количестве содержится в козьем молоке. Капроновая кислота широко используется для получения сложных эфиров, применяемых в качестве ароматизаторов. Применяется в производстве пластификаторов, мыла, цветоизменяющих составов, смазочных масел. Также с помощью капроновой кислоты получают гексилрезорцин и полиамидные синтетические волокна, которые широко используются в производстве нейлона [1-2].

Применение в качестве катализатора ферментов для синтеза сложных эфиров капроновой кислоты является перспективным направлением энзимологии [3-5]. С каждым годом спектр выпускаемых ферментных препаратов расширяется, и в скором времени, они вытеснят химические катализаторы.

В данной работе экспериментально подобраны параметры энзиматического синтеза душистых веществ - изоамилкапроната и аллилкапроната.

Материалы и методы

Для синтеза был использован коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II лио-фильно высушенный с активностью 100-500 ед./мг белка (107 ед./мг белка с использованием оливкового масла в качестве субстрата), производство -США. Реакция проводилась в системе жидкость -твердая фаза. При синтезе варьировали количество фермента, времени проведения эксперимента, температуру процесса и применяли различные растворители.

В типичном эксперименте концентрация капроновой кислоты составляла 0,1 М/л, концентрация спирта менялась от 0,1 до 0,25 М/л. Концентрация фермента изменялась от 3 мг/мл до 20 мг/мл.

Методика эксперимента: к сухому ферментному препарату добавляли раствор субстратов в гексане. Полученную суспензию тщательно перемешивали и выдерживали в течение 0-30 часов без перемешивания. Температура проведения процесса составляла 25-37 °С.

Контрольные пробы не содержали ферментного препарата. В контрольный образец вносили фер-

ментный препарат непосредственно перед проведением титрования.

По истечении заданного времени опытные и контрольные пробы оттитровывали свежеприготовленным 0,1 н спиртовым раствором едкого натра в присутствии 2-3 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина.

Конверсию масляной кислоты (W, %) рассчитывали по формуле

^ J-ZO-. 100,

K

где К - объем 0,1 н спиртового раствора едкого натра пошедшего на титрование контрольной пробы, мл; О - объем 0,1 н спиртового раствора едкого натра пошедшего на титрование опытной пробы, мл.

Все эксперименты проводились не менее чем в пяти повторностях. Расчет погрешности измерений произведен по стандартной методике, используя критерий Стьюдента при доверительной вероятности 0,95.

В качестве источника изоамилового спирта использовалось сивушное масло. Состав сивушного масла был определен методом газо-жидкостной хроматографии.

Результаты и их обсуждение

Изоамилкапронат обладает фруктовым запахом и широко используется в парфюмерных композициях и отдушках при дозировке до 3 %, а также в пищевых ароматических эссенциях. Обычно его получают этерификацией капроновой кислоты изоамило-вым спиртом, выделяемым из сивушного масла [2]. В данной работе было решено в качестве источника изоамилового спирта, использовать непосредственно сивушное масло. Это позволяет снизить затраты на производство душистого вещества. Используемое сивушное масло содержит 73,4% изоамилового спирта (табл. 1). Внесение сивушного масла в реакционную среду производилось с учетом содержания в нем изоамилового спирта.

Аллилкапронат обладает сильным фруктовым запахом (запахом ананаса) с жирной нотой и оттенком рома. Применяется во многих пищевых ароматических эссенциях, также парфюмерии и косметологии [2].

Таблица 1 - Состав сивушного масла, определенный методом ГЖХ

Компонент Содержание, масс.доля, %

Сивушное масло

Метанол -

Этанол 4,50

Пропанол-2 -

Пропанол-1 9,25

2-Метилпропанол-2 (трет-бутиловый спирт) -

Бутанол-2 -

2-Метилпропанол-1(изобутиловый спирт) 11,93

Бутанол-1 0,29

Изоамиловые спирты 73,41

Вторичные амиловые спирты -

Третичные амиловые спирты 0,002

Пентанол-1 0,02

Изомеры спирта С6 0,02

Гексанол-1 0,04

Спирты С7 0,05

Спирты С8 0,33

Ацетон -

Диэтиловый эфир -

Этилацетат -

2-пропенол-1(аллиловый спирт) 0,10

Неидентифицированные компоненты 0,03

В данной работе экспериментально установлены оптимальные параметры синтеза душистых веществ - производных капроновой кислоты. Соотношение реагентов оказывает существенное влияние на протекание любой химической реакции. Поэтому на первом этапе установлена зависимость конверсии капроновой кислоты от соотношения кислота:спирт. В качестве растворителя использовали гексан. Количество фермента составлял 10 мг при температуре 30 0С. Результаты экспериментов представлены на рисунке 1.

_ 100 30 Я 80 н О 70 У 60 Э 50 5 40 о 30 е- 20 и 1оо 26 84 88 II 34 37 84

и 1,0:0,5 1.0:1,0 1,0: 1,5 1.0:2.0 1.0:2.5

Соотношение кислота:спирт,МЛ-!

- изоамишсапронат - аллилкапронат

Рис. 1 - График зависимости конверсии кислоты в зависимости от соотношения К : С

Как видно из результатов, для проведения синтеза изоамилкапроната наилучшей оказалась среда, содержащая капроновую кислоту: сивушное масло в соотношении 1:1,5, а для синтеза аллилкапроната наиболее высокий выход целевого продукта наблюдается при соотношении реагентов 1:1. Это связано с более сильным ингибирующим влиянием непредельного аллилового спирта на фермент-катализатор. В дальнейших экспериментах для проведения ферментативного синтеза использовали оптимальные для каждого соединения соотношения.

На втором этапе работы было определено, как влияет концентрация фермента на выход изоамилкапроната. При этом время синтеза составляло 24 часа, температура 30°С, соотношение реагентов оптимальное, в качестве растворителя использовался гексан. Влияние количества фермента на выход сложного эфира показано на рисунке 2.

Й 5 10 20

Количество фермента,мг/мп - изоамишсапронат  - аллшисапронат

Рис. 2 - График зависимости конверсии кислоты от концентрации фермента

Полученные данные показывают, что в случае синтеза изоамилкапроната увеличение концентрации фермента до 20 мг/мл реакционной среды не приводит к увеличению степени конверсии кислоты. А вот в случае аллилкапроната увеличение содержания фермента, имеет выраженный положительный эффект, что подтверждает предположение о ингибировании липазы аллиловым спиртом. Дальнейшее увеличение содержания фермента в среде нецелесообразно из экономических соображений.

На третьем этапе работы было проведено исследование влияния различных растворителей на конверсию капроновой кислоты. В исследованиях были использованы такие растворители как гексан, гептан, бензол и декан. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние растворителя на конверсию капроновой кислоты

Раство- Конверсия кислоты Конверсия кисло-

ритель при синтезе аллил- ты при син-

капроната, % тезеизоамилка-проната, %

Гексан 45,03±4 87,1±3

Декан 8,9±2 71,5±3

Бензол 2,0±0,6 76,0±6

Как показывают результаты экспериментов, гек-сан является наилучшей средой реакции для прове-

дения синтеза с участием панкреатической липазы. Конверсия капроновой кислоты при проведении реакции синтеза в среде гексана на много выше по сравнению с другими растворителями.Таким образом, гексан оказывает наименее негативное влияние на фермент, при достаточно полном растворении субстратов.

Липолитические ферменты могут действовать в достаточно широком диапазоне температур, особенно при применении их в неводных средах. Поэтому было изучено изменение активности пакреатической липазы в диапазоне температур от 25 до 37°С, которая представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние на конверсию капроновой кислоты температурного режима проведения процесса

к гидролизу уже образовавшихся эфиров и поэтому нецелесообразно.

Температура, °С Конверсия кислоты при синтезе аллил-капроната, % Конверсия кислоты при синтезе изоамилкапрона-та, %

25 32,48±2 65,0±2

30 45,31±2 87,1±3

35 12,6±2 70,0±3

Как видно из представленных данных, наибольшая конверсия капроновой кислоты наблюдается при температуре 30°С. Снижение температуры уменьшает диффузию субстратов к границе раздела фаз,а повышение приводит к увеличению совместного ингибирующего действия органического растворителя и субстратов на фермент, что особенно ярко проявляется в случае синтеза аллилкапроната.

Изучение динамики синтеза эфиров капроновой кислоты показало, что максимальный выход эфиров наблюдается через 24 часа реакции. Дальнейшее увеличение продолжительности процесса приводит

Рис. 3 - График зависимости конверсии кислоты от продолжительности процесса

Таким образом, осуществлен ферментативный синтез сложных эфиров капроновой кислоты в неводных средах. Экспериментально установлены оптимальные параметры проведения процесса.

Литература

1

получения капроновой

Патент № 1049469. Способ кислоты. Бюл. № 39. 23.10.83.

С.А. Войткевич. 865 душистых веществ для парфюмерии и бытовой химии// М.: Пищевая промышленность, 1994г. - 594с.

V.S. Gamayurova, K.L. Shnaider, S.K. Zaripova, M.J. Jamai. Synthesis of aliphatic flavoring substances by lipase / J. Adv. Chem. Sci. 2(2) (2016) 259-260.

Гамаюрова В.С., Зиновьева М.Е., Шнайдер К.Л. Сравнение синтетазной активности двух видов липаз в неводных средах / В.С. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева, К.Л. Шнайдер // Вестник Казанского технологического университета. - 2011. - № 6. - С. 211-218

Елизарова Е. В. Ферментативная этерификация органических кислот алифатическими спиртами / Е. В. Елизарова, М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова // Вестник КГТУ. - 2006. - №6. - С. 69-73.

© К. Л. Шнайдер, к.х.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ,: 0202-84@mail.ru; Г. Р. Сабирзянова, магистрант кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ, sabirzyanova-r@mail.ru; М. Х. Низамутдинова, магистрант кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ, milyash7@mail.ru; М. Е. Зиновьева, к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии КНИТУ; zino-mari@yandex.ru; А. Ф. Каюмова - бакалавр группы 623111 той же кафедры.

© K. L. Shnaider - PhD in Chemical sciences, Associate Professor at the Department of Food biotechnology KNRTU, G. R. Sabir-zyanova - master student at the Department of Food biotechnology KNRTU; M. H. Nizamutdinova - master student at the Department of Food biotechnology KNRTU; M. E. Zinov'eva - PhD in Engineering sciences KNRTU, Associate Professor at the Department of Food biotechnology, KNRTU; A. F. Kayumova - Bachelor at the Department of Food biotechnology KNRTU.

2

3

4

5