СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА РЫБ, ЗАРАЖЕННЫХ ГЕЛЬМИНТАМИ
METHOD TO DETERMINE QUALITY OF WORM-INFESTED FISHES

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарно-санитарной экспертизе.
После прекращения жизни рыб в их теле происходят необратимые процессы, протекающие в мышечной ткани, и распад промежуточных продуктов при окислении органических веществ.
В связи с этим нами была установлена концентрация промежуточных продуктов при распаде органических веществ в мышечной ткани рыб при различной степени инвазии личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб), что позволит установить влияние продуктов их жизнедеятельности на накопление летучих органических веществ.
Известен калориметрический метод определения медных солей жирных кислот в сыворотке или в плазме крови [см. А.И.Карпищенко и др. Справочник Медицинские лабораторные технологии, под ред. А.И.Карпищенко //Санкт-Петербург «Интермедика», 1999 г в 2-х томах, Т.2. С.91-92], где метод основан на экстрагировании медных солей жирных кислот из водных растворов при нейтральных и слабощелочных значениях водородных ионов различными растворителями (в данном случае смесью: хлороформ-гептан-метанол). В этих случаях ионы меди остаются в водной среде. Количество меди, перешедшее в органическую фазу, отражает содержание неэстерифицированных (свободных) жирных кислот. Медь определяют по цветной реакции с 1,5-дифенил-карбазидом. К 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы крови добавляют 3 мл экстракционной смеси и 0,9 мл медного реактива, закрывают пробирку и встряхивают в течение 3-х минут, после чего центрифугируют 10 минут при 2500 об/мин. Отбирают 1,8 мл раствора 1,5-дифенил-карбазида. Через 15 минут фотометрируют при длине волны 550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контрольного раствора из 0,5 мл 1,5-дифенил-карбазида и 1,8 мл экстракционной смеси. Расчет концентрации неэстерифицированных жирных кислот проводят по калибровочному графику, для построения которого используют рабочие калибровочные растворы, содержащие 400-1000 мкмоль жирной кислоты в 1 л хлораформа; рабочий калибровочный раствор объемом 0,05 мл обрабатывают так же, как и исследуемую биологическую жидкость. Увеличение количества неэстерифицированных жирных кислот обусловлено приемом пищи, а также различными факторами, стимулирующими липолиз (гепарин, адреналин и другие вещества с аналогичным физиологическим действием). Если концентрация глюкозы в крови возрастает, то содержание неэстерифицированных жирных кислот уменьшается. Их количество возрастает при атеросклерозе, после инфаркта миокарда и при других видах патологии.
Также известен унифицированный метод определения триглицеридов по реакции с ацетилацетатом после экстракции смесью гептана и изопропилового спирта [см. А.И.Карпищенко и др. Справочник Медицинские лабораторные технологии, под ред. А.И.Карпищенко, в 2-х томах, Т.2 С.92-93], где метод основан на экстрагировании триглицеридов смесью гептана и изопропилового спирта, в которую переходят неполярные липиды; более полярные остаются в водной фазе. Триглицериды гидролизуются щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетилацетоном.
Ход определения включает: экстрагирование триглицеридов смесью гептана и изопропилового спирта. Для окисления глицерина до формальдегида добавляют йодную кислоту и ацетилацетоновый реактив, в результате которого образуется желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют фотометрированием при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против контрольной пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала используют 0,5 мл дистиллированной воды. Калибровочную пробу обрабатывают так же, как и опытную, но вместо исследуемой сыворотки или плазмы крови вносят 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл дистиллированной воды. Развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л. Расчет проводят по правилу пропорции или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.
Наиболее близким по технической сущности является способ, включающий определение концентрации компонентов летучих органических веществ в вытяжке, полученной из биопробы путем паровой дистилляции с помощью газового хроматографа [Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук, автор Хмельков Я.Т. «Экологическая структура, патогенез и лечение вторичных застойных дистоний преджелудков у коров», Белград, 2006, с.8].
Недостатками известных методов является отсутствие возможности определения количественного состава летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб).
Техническим решением задачи является расширение технологических возможностей, снижение трудозатрат и упрощение процесса исследований.
Поставленная задача достигается тем, что в способе оценки качества рыб, зараженных гельминтами, включающем определение концентрации компонента летучих органических веществ в вытяжке, полученной путем паровой дистилляции из пробы с помощью газового хроматографа, согласно изобретению для пробы используют органы и мышечную ткань рыбы, которую измельчают, получают вытяжку и помещают в газовый хроматограф и по полученным результатам общей концентрации альдегидов 40-60 мг/кг и сложных эфиров 45-70 мг/кг и по образованию 1-бутанола, 1-амилола, метанола и накоплению спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% в процессе жизнедеятельности гельминтов, ухудшающих физико-химические показатели рыбы, определяют их доброкачественность, при превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг и сложных эфиров 45 мг/кг при интенсивной инвазии личинками Anisakis simplex и плероцеркоидами ремнеца Ligula inteestinalis рыбы, например путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7 относительно контрольного результата, относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки.
Преимущество данного метода состоит в следующем: высокая эффективность разделения компонентов, недоступная при других методах исследованиях; низкий расход реактивов и растворителей; простота аппаратуры; высокая скорость анализа и высокая воспроизводимость условий реакции; хорошая растворимость производных в водной среде; широкие возможности газожидкостной хроматографии для выявления летучих органических веществ в вытяжке мышц различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб). Кроме того, заявляемое предложение является более экономичным, т.к. не требует применения особо дорогостоящих химических реактивов.
Способ оценки количественного состава летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб) на газожидкостном хроматографе (ГАЛС-311), включает разделение смесей летучих веществ, при многократном динамическом перераспределении их компонентов между сорбентом и газоносителем при его движении вдоль слоя сорбента.
Новизна заявленного предложения обусловлена тем, что экспресс-анализом установлены параметры изменения концентрации летучих органических веществ в вытяжке мышечной ткани различных видов рыб, пораженных личинками Anisakis simplex (морских рыб) и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis (прудовых рыб), на газожидкостном хроматографе.
Пример конкретного осуществления способа оценки качества рыб, зараженных гельминтами
Состав летучих компонентов изучали на газовом хроматографе «Кристалл-2000 М», оборудованном 50 м кварцевой капиллярной колонкой HP FFAP с внутренним диаметром 0,32 мм, производства США.
3
Для изучения летучих компонентов в мышечной ткани проводят подготовку проб рыб. С этой целью в количестве 4-6 г навеску рыбы берут и помещают в прибор для отгонки летучих продуктов с водяным паром. Проводят перегонку мышечной ткани рыб, при этом полученную вытяжку собирают в мерную колбу на 50 см. Вытяжку из мышечной ткани рыб используют для определения летучих компонентов на газожидкостном хроматографе. Объем вытяжки делят на массу навески, таким образом, производят разбавление исходной пробы, что учитывают в количественных расчетах.
Для определения летучих компонентов (альдегиды, спирты, уксусная, масляная, валериановая кислоты и другие) 2 мкл вытяжки из органов и тканей с использованием заранее проведенной калибровки дозируют в газожидкостной хроматограф.
3
3
3
3
Режим работы газового хроматографа: кварцевая капиллярная колонка, длиной 50 метров, внутренний диаметр 0,32 мм; неподвижная жидкая фаза - FFAP; температура инжектора хроматографа - 170°С; температура подогрева детектора ДИП - 170°С; входное давление на колонке - 60 кПа; температура термостата колонок 50°С, изотерма 7 мин, затем программирование температуры со скоростью 5°С/мин до 140°С, выдержка 20 мин, затем программирование температуры со скоростью 10°С/мин до 160°С и выдержка до конца анализа не менее 40 мин; испаритель с делением потока, коэффициент деления потока - 1: 33; поток газа-носителя через колонку - 1,21 см/мин; объем пробы - 2 мм; газ-носитель - азот; расход водорода - 25 см/минуту; расход воздуха - 250 см/мин; время анализа - 60 мин.
Для количественных расчетов содержания компонентов в пробах рыб применяют метод абсолютной калибровки. Модельную смесь ацетальдегида, сложных эфиров, метанола и сивушного масла готовят на 40%-ном водно-спиртовом растворе с использованием спирта «Экстра» и дистиллированной воды. Модель подбирают по составу с использованием аттестованных градуировочных смесей, близких к исследуемым объектам (рыба).
Порядок и время выхода (мин, сек) компонентов в указанном режиме анализа приведены в таблице 1.
Таблица 1
Порядок и время выхода летучих органических веществ в мышечной ткани рыб на капиллярной колонке FFAP
№
Компонент
Время выхода, мин
№
Компонент
Время выхода, мин
1
2
3
4
5
6
1
Уксусная
22,22
19
1,3-бутиленгликоль
31,06
2
Пропионовая
24,08
20
Ацетальдегид
5,48
3
Изомасляная
24,51
21
Метилацеталь
5,55
4
Масляная
26,30
22
Этилацеталь
7,17
5
Изовалериановая
27,34
23
Ацетоин
18,35
6
Валериановая
29,40
24
Фурфурол
23,07
7
Каприловая
46,19
25
Этилформиат
6,22
8
Метанол
7,31
26
Метилацетат
6,36
9
Этанол об.%
7,59
27
Этилацетат
7,20
10
2-бутанол
9,45
28
Изобутилацетат
9,34
11
1-пропанол
10,00
29
Этилбутират
10,15
12
Изобутанол
11,20
30
Изоамилацетат
12,31
13
1-бутанол
13,00
31
Метилкаприлат
21,21
14
Изоамиловый
15,18
32
Этилкаприлат
22,02
15
1-амилол
16,51
33
Этиллактат
22,57
16
1-гексанол
19,49
34
Лимонен
15,13
17
Фенилэтанол
37,18
35
Диацетил
8,58
18
2,3-бутиленгликоль
24,17
3
3
Установлены границы относительной погрешности (%) измерения массовой концентрации (мг/дм) летучих компонентов и нормативы оперативного контроля (%) измеряемых массовых концентраций (мг/дм) летучих компонентов, результаты которых показаны в таблице 2 и 3.
Таблица 2
Границы относительной погрешности измерения массовой концентрации летучих компонентов
Компоненты
Массовая концентрация (мг/дм<sup>3</sup>)
Границы относительной погрешности (%)
Сивушные масла:
2-пропанол
1-пропанол
2-бутанол
от 0,5 до 10,0
±12
изобутанол
свыше 10,0 до 5000
±3
1-бутанол
изоамилол
1-амилол
1-гексанол
Сложные эфиры
от 0,5 до 10,0
±8
свыше 10,0 до 5000
±4
Ацетальдегид
от 0,5 до 10,0
±10
свыше 10,0 до 5000
±3
от 1 до 10,0
±20
Метанол
свыше 10,0 до 100
±7
свыше 100 до 2000
±3
Результаты научных исследований для установления качества и безопасности различных видов рыб при поражении личинками Anisakis simplex и Ligula intestinalis
В процессе проведения ветеринарно-санитарной экспертизы нами были выявлены гельминтозные заболевания: анизакидоз у морских рыб из семейства тресковые - путассу северная (Micromesistius poutassou) и минтая (Theragra); из семейства сельдевые - сельди атлантической (Clupca barengus), из семейства анчоусовые (Engraulidae), отряда сельдеобразные - хамсы черноморской (Engraulis encrasicholus ponticus); семейства корюшковые (Osmeridae) - мойвы (Mallotus villosus) и лигулез у прудовых рыб из семейства карповые - белый амур (Ctenopharyngodon idella).
В зависимости от степени инвазии личинками Anisakis пробы рыб разделили на группы. Пробы путассу разделили на четыре группы: первая - при инвазии от одной до двух личинок Anisakis, вторая - от 9 до 13, третья - от 20 до 36, четвертая - от 44 до 63. Пробы минтая - на две группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от одной до двух, вторая - от 7 до 8. Пробы сельди - на три группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от 10 до 14, вторая - от 15 до 20 и третья - от 31 до 42. Пробы хамсы разделили на четыре группы: первая - неинвазированная, вторая - инвазированная от 1 до 4 личинок Anisakis, третья - от 15 до 20 и четвертая - от 21 до 27. Пробы мойвы разделили на две группы: первая - не инвазированная личинками Anisakis, вторая - от 4 до 8.
Пробы белого амура разделили на две группы: первая - контрольная (клинически здоровая), вторая - опытная (инвазированная плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis).
В результате проведенных исследований на газожидкостном хроматографе были зарегистрированы в вытяжке мышц путассу карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты (продукта распада пировиноградной кислоты) при этом была выше: у инвазированной путассу от 9 до 13 и от 20 до 36 личинок Anisakis - на 4%, при инвазии от 44 до 63 личинок - на 9%, чем при инвазии от одной до двух личинок. При инвазии от одной до двух личинок Anisakis масляная кислота не регистрировалась. С увеличением степени инвазии наблюдалось накопление масляной кислоты и, напротив, снижение концентрации изомасляной кислоты. Максимальное накопление изовалериановой и капроновой кислот наблюдалось при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis и было выше в 1,7 раза и 1,3 раза соответственно, а при инвазии от 20 до 36 личинок была ниже на 4% и 13% соответственно, и отсутствовала у инвазированной рыбы от 44 до 63 личинок по сравнению с путассу, инвазированной от одной до двух личинок (табл.4).
В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение. Так в вытяжке мышц путассу при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis фенилэтанол превышал в 1,7 раза, при инвазии от 20 до 36 личинок - в 2,2 раза, при инвазии от 44 до 63 личинок - в 2,6 раза относительно пораженной рыбы путассу от одной до двух личинок Anisakis. При инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis 2,3-бутиленгликоль превышал в 1,6 раза, при инвазии от 20 до 36 личинок - в 1,8 раза, при инвазии от 44 до 63 личинок - в 2,4 раза. Однако при инвазии от 20 до 36 личинок наблюдалось снижение концентрации 1-амилола в 1,6 раза, 1-гексанола - в 1,9 раза и 1-бутанола - в 1,2 раза относительно пораженной рыбы путассу от одной до двух личинок Anisakis (табл.4).
В рыбе (путассу), пораженной от одной до двух личинок Anisakis на хроматографе не был зарегистрирован этилбутират, тогда как при возрастании инвазии его концентрация увеличивалась: при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis она составила 0,62±0,05 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 20 до 36 личинок Anisakis - 3,27±0,15 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 44 до 63 личинок Anisakis - 4,95±0,09 мг/кг фарша рыбы. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц путассу при инвазии от 20 до 36 личинок Anisakis и составила 17,79±0,43 мг/кг фарша рыбы и 16,27±0,29 мг/кг фарша рыбы соответственно (табл.4).
У зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилкаприлата, ' этилацетата, этиллактата снижалась при увеличении степени инвазии. Так, при инвазии путассу от 9 до 13 личинок Anisakis метилкаприлат, этилацетат и этиллактат были ниже на 16%, 15% и 5%, при инвазии от 20 до 36 личинок - на 20%, 41% и 13% соответственно, по сравнению с инвазированной путассу от одной до двух личинок Anisakis.
При инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis диацетил (кетон) был выше на 8% и, напротив, при инвазии от 20 до 36 личинок - ниже на 5% по сравнению с инвазированной путассу от одной до двух личинок Anisakis.
При инвазии путассу от 44 до 63 личинок на газовом электрохроматографе не были зарегистрированы следующие летучие органические кислоты:
изовалериановая и каприловая карбоновые кислоты; среди спиртов -1-амилол, 1-гексанол, 1-бутанол, изобутанол и 1,3-бутиленгликоль; среди альдегидов - ацетальдегид, фурфурол; из сложных эфиров - метилкаприлат, этилацетат, что, по всей видимости, объясняется тем, что они распались до конечных продуктов (табл.4).
Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц путассу при максимальной зараженности (44-63 личинки Anisakis) была выше карбоновых кислот в 1,2 раза, альдегидов - в 1,3 раза, эфиров - в 2,8 раза, чем при минимальной инвазии (1-2 личинок Anisakis).
В вытяжке мышц минтая на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты (продукта распада пировиноградной кислоты) у инвазированного минтая от 7 до 8 личинок Anisakis была выше на 16%, чем при инвазии от одной до двух личинок. При инвазии минтая от 7 до 8 личинок Anisakis пировиноградная кислота составила 0,17±0,01 мг/кг фарша рыбы, изовалериановая - 0,77±0,03 мг/кг фарша рыбы, валериановая - 0,50±0,02 мг/кг фарша рыбы, в то время как при инвазии от одной до двух личинок они не были зарегистрированы (табл.5).
В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение, что способствовало образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в вытяжке мышц минтая. При инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis содержание метанола составило 1,73±0,03 мг/кг фарша рыбы, 2,3-бутиленгликоля - 5,45±0,22 мг/кг фарша рыбы, изоамилового спирта - 2,17±0,02 мг/кг фарша рыбы, в то время как при инвазии от одной до двух личинок они не были зарегистрированы. При инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis наблюдалось снижение 1-амилола в 1,4 раза по сравнению с рыбой, инвазированной от одной до двух личинок (табл.5).
Таблица 5
Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц минтая (M±m; n=10)
Органические летучие вещества, мг/кг
Количество личинок Anisakis на висцеро минтая
1-2
7-8
Уксусная
35,44±0,35
41,25±0,48***
Пропионовая
-
0,17±0,01***
Изовалериановая
-
0,77±0,03***
Валериановая
-
0,50±0,02***
Этанол об.%
0,01±0,00
-
Изоамиловый
-
2,17±0,02***
1-амилол
2,29±0,02
1,69±0,01***
1-гексанол
1,39±0,01
-
2,3-бутиленгликоль
-
5,45±0,22***
Метанол
-
1,73±0,03***
Ацетальдегид
2,78±0,03
3,78±0,12***
Фурфурол
3,88±0,13
5,03±0,19***
Ацетоин
10,20±0,31
11,03±0,27*
Этилацетат
-
2,02±0,04***
Метилкаприлат
2,09±0,01
1,51±0,05***
Этиллактат
0,06±0,01
0,32±0,03***
Этилбутират
-
2,16±0,01***
Метилацеталь
0,54±0,02
1,55±0,04***
***Р>0,001
В рыбе (минтай), пораженной от одной до двух личинок Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы этилбутират и этилацетат, тогда как при возрастании инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis их концентрация составила 2,16±0,01 и 2,02±0,04 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц минтая при инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis и составила 5,03±0,19 (мг/кг фарша рыбы) и 11,03±0,27 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Среди зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилкаприлата снижалась в 1,4 раза и, напротив, повышалась этиллактата - в 5,3 раза, метилацеталя - в 2,9 раза по сравнению с рыбой, инвазированной от одной до двух личинок (табл.5).
Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц минтая при максимальной зараженности (7-8 личинок Anisakis) была ниже альдегидов - в 16 раз, эфиров - в 1,5 раза и, напротив, выше карбоновых кислот в 1,1 раза, чем при минимальной инвазии (1-2 личинок Anisakis).
При изучении накопления летучих органических веществ в организме сельди, пораженной личинками Anisakis, на газовом хроматографе из карбоновый кислот нами была зарегистрирована высокая концентрация уксусной кислоты. Так, при инвазии сельди в количестве от 10 до 14 личинок Anisakis концентрация уксусной кислоты была выше в 1,6 раза, чем при инвазии от 15 до 20 и от 21 до 27 личинками. Концентрация пировиноградной кислоты при инвазии сельди от 21 до 27 личинок Anisakis была выше в 4 раза в сравнении с менее инвазированной рыбой.
В процессе жизнедеятельности личинок Anisakis происходило спиртовое брожение, что способствовало образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в вытяжке мышц сельди. При инвазии от 15 до 20 личинок концентрация метанола составила 15,16±0,98 мг/кг фарша рыбы. В зависимости от степени инвазии наблюдалось повышение концентрации 1-пропанола в 2 раза, изоамилового - в 1,9 раза, 1-амилового - в 25 раз, 1,3-бутиленгликоля - в 3 раза по сравнению с инвазированной рыбой от 10 до 14 личинок (табл.6).
В вытяжке мышц сельди не были зарегистрированы метилацеталь и этилацеталь в отличие от экстракта мышц хамсы, пораженной личинками Anisakis. С увеличением степени инвазии личинками Anisakis в вытяжке мышц сельди наблюдалось повышение концентрации ацетальдегида в 2 раза и, в то же время, снижение ацетоина в 1,8 раза по сравнению с инвазированной сельдью от 10 до 14 личинок (табл.6).
Таблица 6
Концентрация летучих органических кислот в вытяжке мышц сельди (M±m; n=10)
Органические летучие вещества, мг/кг
Количество личинок Anisakis на висцеро сельди
10-14
15-20
31-42
Уксусная
128,98±1,11
78,34±1,39***
71,76±0,56
Пропионовая
2,82±0,10
2,63±0,16
11,62±0,34***
Изомасляная
0,77±0,04
2,90±0,05***
-
Масляная
15,11±0,52
17,38±0,62**
13,83±0,30*
Валериановая
-
8,09±0,08
16,16±0,33
Изовалериановая
13,32±0,40
2,15±0,08
15,27±0,19***
Метанол
5,04±0,04
15,16±0,98***
-
Этанол об.%
0,05±0,01
0,02±0,01*
0,02±0,01*
Фенилэтанол
5,36±0,27
5,53±0,37
4,79±0,20
1-пропанол
26,77±0,98
48,04±2,06***
54,91±0,50***
Изоамиловый
5,04±5,04
5,64±0,38
9,49±0,22***
1-амилол
0,67±0,04
2,85±0,23***
16,87±12,53***
1-гексанол
11,64±0,29
3,92±0,17***
-
2-бутанол
-
10,93±0,20***
-
2,3-бутиленгликоль
46,33±0,92
9,32±0,62***
1,3-бутиленгликоль
5,78±0,16
17,08±0,26***
Метилацеталь
-
-
-
Этилацеталь
-
-
-
Ацетальдегид
8,72±0,53
17,99±0,52***
18,35±0,58***
Фурфурол
10,69±0,68
9,88±0,48
-
Ацетоин
10,48±0,5б
7,18±0,63***
5,93±0,19***
Каприновый
18,65±0,34
-
-
Лимонен
3,49±0,13
3,14±0,05*
-
Этилацетат
0,70±0,03
2,79±0,17***
-
Метилкаприлат
5,02±0,02
7,04±0,79*
4,37±0,06*
Метилацетат
4,94±0,05
5,55±0,38
47,95±0,89***
Этилформиат
6,01±0,04
5,97±0,06
-
Этилбутират
6,44±0,04
6,25±0,10
-
Этилкаприлат
1,88±0,04
2,62±0,06***
-
Этиллактат
2,12±0,02
2,85±0,23**
10,53±0,34***
Диацетил
2,99±0,03
4,46±0,11***
-
*Р<0,05; **Р>0,01; ***Р>0,001
Среди зарегистрированных сложных эфиров их концентрация возрастала в вытяжке мышц сельди в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis. Так, при инвазии сельди от 15 до 20 личинок Anisakis концетрация этилацетата была выше в 4 раза, концентрация метилкаприлата и этилкаприлата - в 1,4 раза, чем при инвазии от 10 до 14 личинок. При инвазии сельди от 31 до 42 от 10 до 14 личинок Anisakis концентрация метилацетата была выше в 10 раз, концентрация этиллактата - в 5 раз, чем при инвазии от 10 до 14 личинок.
Концентрация диацетила (кетон) при инвазии сельди от 15 до 20 личинок Anisakis была выше в 1,4 раза, чем при инвазии от 10 до 14 личинок (табл.6).
Общая концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц сельди при инвазии от 10 до 14 личинок Anisakis составила: карбоновых кислот - 161,00 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 52,03 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 27,11 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 2,99 мг/кг фарша рыбы.
При инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis концентрация карбоновых кислот составила 111,49 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 38,19 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 33,07 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 4,46 мг/кг фарша рыбы. При инвазии сельди от 31 до 42 личинок концентрация карбоновых кислот составила 128,64 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 24,28 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 62,85 мг/кг фарша рыбы (табл.6).
В вытяжке мышц хамсы на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты у инвазированной хамсы от одной до четырех личинок Anisakis была выше в 4,2 раза, при инвазии от 15-20 личинок - в 2 раза и, напротив, при инвазии от 21 до 27 личинок была ниже в 1,6 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками.
Накопление концентрации метанола в вытяжке мышц хамсы при инвазии от одной до четырех личинок Anisakis составила 7,96±0,21 мг/кг фарша рыбы. При инвазии от 15 до 20 личинок объемный процент этанола превышал в 1,6 раза, а при инвазии от 21 до 27 личинок - в 7,2 раза. Концентрация фенилэтанола при инвазии от 15 до 20 личинок была выше в 3,3 раза, при инвазии от 21 до 27 личинок - в 4 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками. При инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis концентрация 1-бутанола составила 3,02 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 15 до 20 личинок концентрация 1-бутанола - 3,79 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 21 до 27 личинок - 3,13 мг/кг фарша рыбы. В рыбе, не пораженной личинками, на газовом хроматографе 1-бутанол не был зарегистрирован (табл.7).
В рыбе (хамсе), не пораженной личинками Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы альдегиды, кроме ацетоина. При инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis концентрация метилацеталя составила 2,56±0,07 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis - 5,91±0,22 мг/кг фарша рыбы; при инвазии от 31 до 42 личинок Anisakis - 1,51±0,03 мг/кг фарша рыбы. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц хамсы при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis 23,88±0,52 мг/кг фарша рыбы и 33,12±0,76 мг/кг фарша рыбы соответственно (табл.7).
Среди зарегистрированных сложных эфиров концентрация метилацетата возрастала в зависимости от повышения степени инвазии. Так, при инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis она была выше в 1,4 раза, при инвазии от 15 до 20 личинок - в 1,6 раза, при инвазии от 21-27 личинок - в 2 раза, чем в рыбе, не пораженной личинками. У рыб, пораженных личинками Anisakis, были выявлены этилкаприлат и этиллактат, концентрация которых возрастала в зависимости от степени инвазии. В то же время этилбутират регистрировали лишь при инвазии хамсы от одной до четырех личинок Anisakis 10,55±0,27 мг/кг фарша рыбы и при инвазии от 15 до 20 личинок 12,78±0,51 мг/кг фарша рыбы.
Диацетил (кетон) был зарегистрирован только при инвазии одной до четырех личинок Anisakis 2,17±0,07 мг/кг фарша рыбы.
Общая концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц хамсы, не пораженной анизакидами, составила: карбоновых кислот - 55,52 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 32,26 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 27,14 мг/кг фарша рыбы. При инвазии от одной до четырех личинок Anisakis концентрация карбоновых кислот составила 136,78 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 59,18 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 62,27 мг/кг фарша рыбы, кетонов (диацетил) - 2,17 мг/кг фарша рыбы. При инвазии хамсы от 15 до 20 личинок концентрация карбоновых кислот составила 74,05 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 78,60 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 60,39 мг/кг фарша рыбы. При инвазии хамсы от 21 до 27 личинок концентрация карбоновых кислот составила 21,40 мг/кг фарша рыбы, альдегидов - 43,23 мг/кг фарша рыбы, эфиров - 88,41 мг/кг фарша рыбы (табл.7).
В вытяжке мышц мойвы на газовом хроматографе были зарегистрированы карбоновые кислоты, концентрация уксусной кислоты была ниже на 40% у инвазированной мойвы от 4 до 8 личинок Anisakis, пировиноградной кислоты - на 53% и, напротив, отмечено повышение валериановой кислоты в 4 раза, относительно неинвазированной рыбы. При инвазии мойвы от 4 до 8 личинок Anisakis масляная кислота составила 6,38±0,10 мг/кг фарша рыбы, в то время как у неинвазированной рыбы она не была зарегистрирована.
В вытяжке мышц мойвы при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis содержание метанола составило 8,80±0,19 мг/кг фарша рыбы, 1-пропанола - 2,41±0,02 мг/кг фарша рыбы, изоамилового спирта - 3,31±0,04 мг/кг фарша рыбы, 1-бутанола - 2,36±0,03 мг/кг фарша рыбы, в то время как у неинвазированной рыбы они не были зарегистрированы. Концентрация фенилэтанола при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis была выше в 3,8 раза, 1-амилола - в 1,2 раза и, напротив, отмечено снижение 2,3-бутиленгликоля 8 в 1,9 раза, относительно неинвазированной рыбы. Изобутанол у пораженной мойвы не был зарегистрирован, когда как у неинвазированной рыбы изобутанол составил 1,62±0,02 мг/кг фарша рыбы (табл.8).
В рыбе (мойва), не инвазированной личинками Anisakis, на хроматографе не были зарегистрированы этилбутират и метилацеталь, тогда как при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis концентрация их составила 2,04±0,02 и 1,49±0,10 (мг/кг фарша рыбы) соответственно. Высокая концентрация фурфурола и ацетоина была выявлена в вытяжке мышц мойвы при инвазии от 4 до 8 личинок Anisakis 8,72±0,23 мг/кг фарша рыбы и 3,27±0,04 мг/кг фарша рыбы соответственно, в то время как у неинвазированной рыбы они не были зарегистрированы. У инвазированной мойвы наблюдалось снижение этилацетата в 14 раз и, напротив, повышение этилкаприлата - в 1,5 раза, этиллактата - в 3 раза, этилацеталя - в 1,6 раза, относительно неинвазированной рыбы (табл.8).
Таблица 8
Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц мойвы, мг/кг ((M±m; n=10)
Наименование
Количество личинок Anisakis на висцеро мойвы
0
4-8
Уксусная
83,67±0,52
50,39±0,64***
Пропионовая
0,60±0,01
0,28±0,02***
Маслянная
-
6,38±0,10***
Валериановая
0,58±0,02
2,37±0,06***
Метанол
-
8,80±0,19***
Этанол об.%
0,01±0,00
0,02±0,01*
Фенилэтанол
1,79±0,03
6,88±0,14***
1-пропанол
-
2,41±0,02***
Изоамиловый
-
3,31±0,04***
1-амилол
1,73±0,04
1,99±0,04***
1-бутанол
-
2,36±0,03***
2-бутанол
0,50±0,02
-
2,3-бутиленгликоль
16,92±0,48
9,04±0,20***
1,3-бутиленгликоль
6,10+0,29
-
Изобутанол
1,б2±0,02
-
Ацетальдегид
5,79±0,06
4,30±0,04***
Фурфурол
-
8,72±0,23***
Ацетоин
-
3,27±0,04***
Этилацетат
7,02±0,10
0,50±0,02***
Метилкаприлат
-
1,41+0,03***
Этилкаприлат
0,47±0,03
0,71±0,04***
Этиллактат
0,44±0,04
1,33±0,02***
Этилбутират
-
2,04+0,02***
Этилформиат
1,09±0,01
-
Изобутилацетат
1,11±0,01
-
Изоамилацетат
0,58±0,02
-
Метилацетат
8,90±0,10
-
Метильацеталь
-
1,49±0,01***
Этильацеталь
0,34±0,02
0,54±0,03***
*Р<0,05; ***Р>0,001
У неинвазированной мойвы были зарегистрированы этилформиат (1,09±0,01 мг/кг фарша рыбы), изобутилацетат (1,11±0,01 мг/кг фарша рыбы), изоамилацетат (0,58±0,02 мг/кг фарша рыбы) и метилацетат (8,90±0,10 мг/кг фарша рыбы), в то время как у инвазированной рыбы они не были зарегистрированы (табл.8).
Концентрация летучих органических веществ в вытяжке мышц мойвы при максимальной инвазии (от 4 до 8 личинок Anisakis) была выше альдегидов - в 2,2 раза и, напротив, ниже карбоновых кислот в 1,4 раза, сложных эфиров - в 2,5 раза, чем у не пораженной личинками Anisakis.
У исследуемых рыб установлено разное количество летучих органических кислот. Так, из карбоновых кислот отсутствовала: валериановая кислота - у путассу; изовалериановая - у мойвы; масляная - у минтая; изомасляная - у минтая и мойвы. Каприловая кислота выявлена только в вытяжке мышечной ткани у сельди и путассу. Лимонен был выявлен в вытяжке сельди.
Среди спиртов наличие метанола было выше у сельди, чем у хамсы в 1,3 раза, минтая - в 5,8 раза и мойвы - в 1,1 раза. Кетонов (диацетил) у сельди выше, чем у путассу в 1,6 раза и хамсы - в 1,7 раза. Из сложных эфиров изобутилацетат и изоамилацетат выявлены у мойвы (табл.8).
Концентрация фурфурола в вытяжке мышц сельди была выше, чем у мойвы и минтая (в 1,2 раза) и, напротив, ниже, чем у путассу (в 1,2 раза), хамсы (в 1,3 раза). Концентрация ацетоина в вытяжке мышц сельди была ниже, чем у хамсы (в 3,6 раза), путассу (в 1,9 раза), минтая (в 1,4 раза) и, напротив, выше, чем у мойвы (в 2,4 раза).
Концентрация уксусной кислоты в вытяжке мышц сельди была выше, чем у минтая (в 2,4 раза), хамсы (в 1,7 раза), мойвы (в 1,4 раза) и путассу (в 1,3 раза). Концентрация масляной кислоты в вытяжке мышц сельди была выше, чем у путассу (в 7 раз), мойвы (в 2,4 раза) и хамсы (в 1,4 раза).
В результате проведенных исследований на газожидкостном хроматографе среди карбоновых кислот в вытяжке мышц у клинически здоровой рыбы (белый амур) были зарегистрированы: уксусная кислота (продукт распада пировиноградной кислоты), которая составила 24,91=1=0,10 мг/кг фарша рыбы, изовалериановая 0,62±0,02 мг/кг фарша рыбы, валериановая - 0,35=1=0,03 мг/кг фарша рыбы. Концентрация уксусной кислоты была выше в 71 раз, чем валериановой, в 41 раз - изовалериановой кислоты.
В вытяжке мышц у инвазированного белого амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация уксусной кислоты была выше в 2,4 раза, изовалериановой - в 2 раза, чем у клинически здоровой рыбы. Необходимо отметить, что валериановая кислота у инвазированной рыбы не была зарегистрирована в отличие от контрольной группы. В то же время в контрольной группе рыб не выявлены пропионовая, изомасляная и масляная карбоновые кислоты. У инвазированного амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinali пропионовая кислота составила 5,54 мг/кг фарша рыбы, изомасляная - 0,40 мг/кг фарша рыбы и масляная - 0,83 мг/кг фарша рыбы.
У инвазированной рыбы плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация уксусной кислоты была выше в 148 раз, чем изомасляной кислоты, в 71 раз - масляной, в 49 раз - изовалериановой, в 11 раз - пропионовой кислоты.
В процессе жизнедеятельности плероцеркоидов ремнецов Ligula intestinali происходило спиртовое брожение. Так в вытяжке мышц у инвазированной рыбы концентрация метанола была выше в 2,5 раза, фенилэтанола - в 3,8 раза, 1-гексанола - в 1,8 раза относительно клинически здоровой рыбы. Необходимо отметить, что у инвазированной рыбы зарегистрированы этанол в концентрации 0,02±0,01 об.%, изоамиловый спирт - 0,57±0,02 мг/кг фарша рыбы, 1-бутанол - 3,44±0,06 мг/кг фарша рыбы, 2,3-бутиленгликоль - 9,01=1=0,04 мг/кг фарша рыбы, изобутанол - 1,86±0,03 мг/кг фарша рыбы.
У инвазированной рыбы плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация ацетальдегида была выше в 3,9 раза, фурфурола - в 2,1 раза, ацетоина - в 1,4 раза, каприлового альдегида - в 1,9 раза относительно клинически здоровой рыбы. Концентрация метилкаприлата была выше в 2 раза и, напротив, ниже в 1,4 раза метилацетата, в 1,1 раза - этилкаприлата и метилкаприната относительно клинически здоровой рыбы.
В вытяжке мышц у инвазированного белого амура плероцеркоидами ремнецов Ligula intestinalis концентрация летучих органических веществ была выше: карбоновых кислот в 2,6 раза, альдегидов - в 2,4 раза, эфиров - в 1,1 раза, чем у клинически здоровой рыбы.
Таким образом, при метаболизме личинок Anisakis и плероцеркоидов ремнеца Ligula intestinalis в тканях рыб накапливается значительное количество уксусного альдегида и продуктов его реакции со спиртами - ацеталей. Уксусный альдегид является не только побочным продуктом спиртового брожения, но и продуктом окисления спирта, который образуется в процессе жизнедеятельности гельминтов. Содержание уксусного альдегида может служить критерием степени окисленности продукта, который позволяет достоверно определить качество рыбной продукции. Последнее объясняется тем, что при поражении рыб личинками Anisakis и плероцеркоидами ремнеца Ligula intestinalis мышечная ткань рыб характеризуется различной степенью окисленности, обусловленной инвазивностью и технологическим режимом их обработки.
Уксусный альдегид, образовавшийся в процессе жизнедеятельности гельминтов, взаимодействует, в первую очередь, с этиловым спиртом, образуя ацеталь. Продуктом реакции ацетальдегида является диацетил, относящийся к классу кетонов, представлен жидкостью желтого цвета, его наличие характеризует окисленность мышечной ткани рыб, особенно ухудшает органолептические показатели продукта. При окислении мышечной ткани рыб образуется избыточное количество ацетоина. Образовавшийся в больших концентрациях фурфурол придает запах перегретых отрубей, ухудшающий качество продукта.
При установлении летучих компонентов в вытяжке мышечной ткани рыб, инвазированных гельминтами, выявлены процессы окисления в связи с образованием альдегидов, эфиров, кетонов, карбоновых кислот, в частности масляной кислоты, придающей продукту запах прогорклого масла.
В процессе жизнедеятельности гельминтов в их организме происходит спиртовое брожение, что приводит к образованию метанола (продукт распада метилового альдегида) и накоплению его в мышечной ткани рыб.
По полученным результатам общей концентрации альдегидов 40-60 мг/кг и сложных эфиров 45-70 мг/кг и по образованию 1-бутанола, 1-амилола, метанола и накоплению спиртов в количестве 0,02-0,2 об.% в процессе жизнедеятельности гельминтов, ухудшающих физико-химические показатели рыбы, определяют их доброкачественность, при превышении общей концентрации альдегидов 40 мг/кг и сложных эфиров 45 мг/кг при интенсивной инвазии личинками Anisakis simplex и плероцеркоидами ремнеца Ligula inteestinalis рыбы, например путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7 относительно контрольного результата, относят к недоброкачественной и отправляют на техническую утилизацию для изготовления рыбной муки.