Способ исследования ротовой жидкости
ORAL FLUID EXAMINATION METHOD

Изобретение относится к области стоматологии, а точнее к способам исследования ротовой жидкости и может быть использовано для изготовления из нее гистологического препарата и его последующего исследования картиной.
Известен способ исследования ротовой жидкости, включающий ее сбор с использованием коллекторов, содержащих хлопковый тампон из стоматологической (хирургической) ваты. Хлопковый тампон помещают под язык на 10 минут без стимуляции слюноотделения. После того как тампон пропитается слюной, его помещают в коллектор, закрываемый герметично пластмассовой пробкой, коллектор опечатывают и направляют с сопроводительной документацией в лабораторию в сумке-холодильнике (см. Приказ Минздравсоцразвития РФ от 27 января 2006 г. № 40 «Об организации химико-токсикологических исследований при аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ»).
Недостаток этого технического решения - количество жидкости ограничено, клетки в мазках идентифицируются единичные, поэтому способ мало информативен, и не дает представление о состоянии ротовой полости.
Известен также способ исследования ротовой жидкости, включающий ее сбор и центрифугирование, приготовление препарата и последующее его исследование (см. RU № 2432620, МПК G09B 23/28, 2010). Забор жидкости осуществляют утром, натощак, до чистки зубов. Центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Для определения физико-химических параметров ротовой жидкости использовались методики, адаптированные в стоматологии для изучения ротовой жидкости (Питаева А.Н., Коршунов А.П., Дистель В.А. и др. «Физико-химические методы исследования смешанной слюны в клинической и экспериментальной стоматологии» (учебное пособие) - Омск, 2001).
В результате в препарате - клетки в поле зрения единичны, т.е. препараты малоинформативны. Таким образом, недостаток этого способа – не обеспечивается возможность формирования из ротовой жидкости гистологического препарата с обогащенной цитологической картиной.
Задача, на решение которой направлено изобретение, выражается в обеспечении возможности изучения гистологического препарата с обогащенной цитологической картиной, сформированного из ротовой жидкости.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности изучения гистологического препарата с обогащенной цитологической картиной, сформированного из ротовой жидкости.
Для решения поставленной задачи способ исследования ротовой жидкости, включающий ее сбор и центрифугирование, приготовление препарата и последующее его изучение, отличается тем, что кроме секрета слюнных желез отбирают микрофлору и продукты их жизнедеятельности, содержимое пародонтальных карманов, десневую жидкость, десквамированный эпителий, продукты распада мигрирующих в полость рта лейкоцитов, для чего в процессе отбора промывают межзубные промежутки, пародонтальные карманы посредством ирригатора полости рта с использованием соответствующих насадок для очистки и промывания объектов полости рта, при этом всю полученную жидкость от одного пациента отводят в отдельную стерильную емкость, затем центрифугируют 30 секунд при скорости 600 об/мин, отделяют осадок и размещают его ровным тонким слоем на предметном стекле, и немедленно изучают с помощью фазовоконтрастной микроскопии.
Кроме того, при наличии ортодонтических конструкций и/или искусственных коронок и/или мостовидных протезов и/или имплантатов, в процессе отбора ротовой жидкости используют соответствующие насадки для их очистки.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность формирования из ротовой жидкости гистологического препарата с обогащенной цитологической картиной, при этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признаки «…кроме секрета слюнных желез отбирают микрофлору и продукты их жизнедеятельности, содержимое пародонтальных карманов, десневую жидкость, десквамированный эпителий, продукты распада мигрирующих в полость рта лейкоцитов…» обеспечивают обогащение ротовой жидкости дополнительными компонентами, позволяющими, при необходимости, расширить набор диагностических признаков, не только в отношении ротовой полости, но и других систем организма.
Признаки «…в процессе отбора промывают межзубные промежутки, пародонтальные карманы посредством ирригатора полости рта с использованием соответствующих насадок для очистки и промывания объектов полости рта…» обеспечивают промывку тонкой струей воды под давлением и зачистку в ротовую жидкость материала с зубов и других объектов полости рта и, тем самым, обогащение ротовой жидкости.
Признак «…всю полученную жидкость от одного пациента отводят в отдельную стерильную емкость…» обеспечивает «привязку» отобранного материала ротовой полости к конкретному пациенту, что позволяет изучить динамику изменения состава ротовой жидкости.
Признак, указывающий, что материал ротовой жидкости «центрифугируют 30 секунд при скорости 600 об/мин», обеспечивает сохранность в исследуемом материале структуры клеток. Осадок при таких условиях центрифугирования представляют только живые клетки, которые в мазке наблюдаются в большом количестве. Морфология клеток соответствует реальной их прижизненной структуре в полости рта.
Признаки, указывающие, что «отделяют осадок и размещают его ровным тонким слоем на предметном стекле», обеспечивают подготовку препарата к исследованию.
Признаки, указывающие, что подготовленный препарат «немедленно изучают с помощью фазовоконтрастной микроскопии» обеспечивает возможность использования полученного материала для изучения состояния ротовой полости и анализа динамики реакции слизистой рта на установку брекетов, имплантатов, зубных протезов различного химического состава или лечения, что расширяет спектр диагностических возможностей и обеспечивает проведение своевременной профилактики реакций отторжения или аллергических проявлений.
Признаки, указывающие, что «при наличии ортодонтических конструкций и/или искусственных коронок и/или мостовидных протезов и/или имплантатов, в процессе отбора ротовой жидкости используют соответствующие насадки для их очистки», повышают эффективность зачистки ротовой полости и эффективность концентрирования материала с поверхности ротовой полости в ротовой жидкости.
На фиг.1 - фиг.4 показаны этапы сбора ротовой жидкости, при этом на фиг.1 процедура установки фиксирующего держателя; на фиг.2 показана промывка и зачистка ротовой полости; на фиг.3 показан отбор ротового материала из ротовой полости; на фиг.4 показано помещение материала в пробирку, для последующего центрифугирования; на фиг.5 – фиг.6 показаны соскоб со слизистой оболочки рта пациента группы исследования с посттравматическими дефектами челюстей, при этом на фиг.5 показан препарат без фиксации; на фиг.6 показан фазовый контраст после фиксации и центрифугирования; на фиг. 7 – фиг.12 показан соскоб со слизистой оболочки рта, при этом на фиг.7 показан митоз эпителиоцита; на фиг.8 и 9 показаны дендритные клетки; на фиг.10 и 11 показаны макрофаги; на фиг.12 показан эпителиоцит.
Для реализации способа используют известные средства: ирригатор полости рта (аппарат, формирующий тонкую струю воды, под давлением), насадки для очистки языка, для промывания пародонтальных карманов, насадки для очистки ортодонтических конструкций (брекетов), насадки для очистки искусственных коронок и мостовидных протезов, насадки для очистки имплантатов. Кроме того, используют другие известные средства: шпатель, слюноотсос, скребок, стерильные пробирки, фиксирующий держатель челюстей. Кроме того, для мягкого центрифугирования используют исследовательскую центрифугу, например, К1015. Для изучения препаратов и изготовления иллюстраций используют микроскоп, например, Olympus Bx51 c фотокамерой DP25.
1 этап - сбор ротовой жидкости. Техника забора материала для исследования из ротовой полости предусматривает:
- установку фиксирующего держателя, обеспечивающего не смыкание челюстей (фиг.1);
- промывку полости рта и объектов в нем посредством ирригатора полости рта, а также зачистку объектов в полости рта с использованием соответствующих, вышеупомянутых насадок (фиг.2);
- сбор материала из полости рта посредством слюноотсоса (фиг.3), также, для забора материала, используем шпатель и скребок;
- помещение материала в пробирку (фиг.4).
Материал забирают из ротовой полости с помощью ирригатора полости рта, формирующим тонкую струю воды, которая под давлением промывает межзубные промежутки от зубного налета, а также пародонтальные карманы, язык, очищают (если такие присутствуют) ортодонтические конструкции (брекеты), искусственные коронки, мостовидные протезы, имплантаты.
Центрифугирование материала производится на малых оборотах, без разрушения клеток - по нашим данным сохранность в исследуемом материале структуры клеток обеспечивается на скорости 600 об/мин в течение 30 секунд.
Всю полученную жидкость центрифугируют при названных режимах и, таким образом, в осадке получают обогащенный концентрат, состоящий из клеток эпителия, лейкоцитов и микроорганизмов. Осадок при таких условиях центрифугирования представляют только живые клетки, которые в мазке наблюдаются в большом количестве. Морфология клеток соответствует реальной их прижизненной структуре в полости рта, так как сохраняется целостность мембраны, органелл в цитоплазме, которые при больших оборотах образуют субклеточные фракции.
Полученный обогащенный осадок, состоящий из клеток эпителия и лейкоцитов, а также микроорганизмов, наносят на предметное стекло и шпателем, покровным стеклом, или предметным стеклом распределяют материал по предметному стеклу и немедленно изучают с помощью фазовоконтрастной микроскопии. Количество клеток в поле зрения превышает таковое при обычном изготовлении мазка. Для изготовления иллюстраций используют микроскоп Olympus Bx51 c фотокамерой DP25. Техника микроскопирования предусматривает анализ препарата без покровного стекла с предварительным высушиванием и нанесением иммерсионного масла для работы с наибольшим увеличением под иммерсионным объективом. В рассматриваемых объектах идентифицируются ядра, фигуры митоза, отростки клеток, содержимое цитоплазмы, включая везикулы и контаминированные организмы.
Комментарии к фотографиям (микрофото. Ув. Х400.1): на фиг.5 показана клетка живая, в цитоплазме идентифицируются микроорганизмы; на фиг.6 в поле зрения наблюдается большее количество клеток, идентифицируются ядерные эпителиоциты с контаминацией микроорганизмами; на фиг.7 показан митоз эпителиоцита; на фиг.8 и 9 показаны дендритные клетки; на фиг.10 и 11 показаны макрофаги; на фиг.12 показан эпителиоцит контаминированный микроорганизмами. Наличие контаминированных микроорганизмов позволяет оценить инфекционный процесс, уровень микробного обсеменения, барьерные свойства эпителиальных пластинок слизистой рта и клеточный состав. Количество слущенных клеток эпителия с микробами дает представление о защитных свойствах эпителия. Клетки мигранты и их количество могут дать представление об уровне защитных реакций и при больших количествах свидетельствуют о возможности отторжения имплантатов.
Достоинства способа:
- имеет низкую стоимость, доступен любой клинике с любым бюджетом;
- информативен, дает полное представление о состоянии ротовой полости;
- на основе данных содержимого осадка можно прогнозировать исход патологического процесса и своевременно влиять на ключевые события патогенеза и проводить профилактику осложнений;
- от момента забора материала для диагностики до результатов анализа затрачивается времени не более 10 минут;
- простота выполнения не требует специального обучения и приобретения навыков диагностических манипуляций;
- дает возможность многократного забора диагностического материала;
- неинвазивность и травмобезопасность как для пациента, так и врача (исключает инфицирование через кровь ВИЧ и гепатитом С), а также и другими социально значимыми инфекциями.