СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ БЫСТРЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СИГНАЛОВ ПРИ ПОМОЩИ ЛАЗЕРНОГО СКАНИРУЮЩЕГО КОНФОКАЛЬНОГО МИКРОСКОПА
FAST FLUORESCENT SIGNALS WITH THE CONFOCAL LASER SCANNING MICROSCOPE RECORDING METHOD

Предлагаемый способ относится к использованию лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при регистрации высокоскоростных флуоресцентных сигналов. В частности, в физиологических исследованиях, для регистрации интенсивности свечения кальциевых красителей в нервно-мышечном препарате при стимуляции двигательного нерва.
Известен способ сканирования флуоресцентных сигналов от биологических объектов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа (принцип впервые предложен М. Мински в 1957 г.), описанный в книге "Мухитова А.Р., Архиповой С.С, Никольского Е.Е., Современная световая микроскопия в биологических и медицинских исследованиях Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казанский гос. мед университет Росздрава. - М.: Наука, 2011. - 140 с. - ISBN 978-5-02-037483-6", в соответствие с которым препарат сканируют поточечно лазерным лучом и возбуждают флуоресцентный краситель, свет от которого через конфокальную диафрагму регистрируется фотоумножителем. Затем из зарегистрированных значений интенсивности света при помощи компьютера восстанавливается поточено изображение препарата. Для формирования серии изображений, циклы сканирования повторяются.
Смещения Стокса - разница длин волн максимумов спектров поглощения и испускания флуоресценции флуорохромом. Измеряется в обратных сантиметрах, реже нанометрах, в силу нелинейности зависимости энергии фотона от длинны волны. Назван в честь физика Джоджа Стокса.
Кальциевый транзиент - изменение интенсивности свечения кальциевого флуоресцентного красителя во времени в зависимости от концентрации ионов кальция в среде.
Вход кальция - вход в нервное окончание ионов кальция через кальциевые каналы, расположенные на мембране.
Кальциевый канал - семейство ионных каналов, избирательно проницаемых для ионов кальция.
Потенциал действия - волна возбуждения, перемещающаяся по мембране живой клетки в виде кратковременного изменения мембранного потенциала на небольшом участке возбудимой клетки, в результате которого наружная поверхность этого участка становится отрицательно заряженной по отношению к внутренней поверхности мембраны, в то время, как в покое она заряжена положительно. Потенциал действия является физиологической основой нервного импульса.
Конфокальная диафрагма - это диафрагма конфокального микроскопа, которая предназначена отсекать поток фонового рассеянного света. Диафрагма расположена после объективной линзы так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.
Недостатком имеющегося способа является низкая скорость сканирования. Ограничение скорости сканирования связано со временем, необходимым на механическое перемещение зеркал, которые позиционируют лазерный луч. Современные конфокальные микроскопы позволяют сканировать изображение с разверткой несколько десятков мс на кадр. Этого недостаточно для регистрации быстрых процессов. Возможно высокоскоростное сканирование одной линии изображения. Но при таком режиме сканирования, можно получить информацию только от ограниченной зоны объекта исследования.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, является улучшение временного разрешения при сканировании быстрых флуоресцентных сигналов в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на примере регистрации флуоресцентного кальциевого транзиента.
Технический результат предлагаемого способа регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа заключается в возможности достоверной оценки амплитудных и временных характеристик регистрируемых быстрых флуоресцентных сигналов.
Технический результат в предлагаемом способе регистрации быстрых флуоресцентных сигналов при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа, включающий в себя получение на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе временной серии изображений и построение графика зависимости интенсивности свечения флуоресцентного красителя от времени, достигается тем, что съемка происходит в несколько этапов, на каждом из которых сигнал от препарата смещается на некую константу времени при неизменных параметрах сканирования микроскопа, а полученные в ходе эксперимента серии изображений собираются в одну серию по определенному алгоритму.
Рассмотрим осуществление предлагаемого способа регистрации быстрого кальциевого флуоресцентного сигнала при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа на примере регистрации кальциевого транзиента.
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп - это микроскоп, получение изображения в котором осуществляется сканированием препарата, окрашенного флуоресцентным красителем, сфокусированным лазерным лучом определенной длины волны. Перемещение лазерного луча осуществляется за счет системы зеркал, которые осуществляют развертку лазерного луча при сканировании препарата. Во время сканирования препарата лазерный луч возбуждает флуоресцентный краситель, который согласно смещению Стокса испускает свет, длина волны которого выше длинны волны света от лазерного источника возбуждения. С помощью системы фильтров свет возбуждения задерживается, а свет эмиссии проходит через конфокальную диафрагму и регистрируется системой фотоумножителей. Из зарегистрированных интенсивностей свечения, соответствующих определенным точкам препарата, при помощи компьютера формируется интересующее нас видеоизображение.
В случае регистрации кальциевого транзиента одновременно со сканированием изображения осуществляется стимуляция препарата, которая вызывает изменение свечения флуоресцентного красителя. Регистрация входа кальция осуществляется при помощи флуоресцентных кальциевых красителей, которые меняют интенсивность своего свечения в зависимости от концентрации ионов кальция в среде (кальциевый транзиент). Вход ионов кальция в периферические нервные окончания является быстропротекающим биологическим процессом и для его регистрации необходимо высокоскоростное сканирование. Длительность кальциевого транзиента в зависимости от красителя и объекта исследования составляет 500-1000 мс а скорость нарастания переднего фронта кальциевого транзиента составляет около 6-12 мс. Соответственно для корректного анализа амплитуды флуоресцентного кальциевого транзиента необходимо временное разрешение системы регистрации порядка 1 миллисекунды на кадр. Существующие конфокальные сканирующие системы позволяют сканировать изображения размером 512 на 512 пикселей со скоростью 30-70 миллисекунд на кадр, что не позволяет оценивать корректно амплитудные и временные характеристики кальциевого транзиента.
Кальциевый транзиент инициируется входом кальция в нервное окончание через потенциал-чувствительные кальциевые каналы во время распространяющегося потенциала действия. Потенциал действия запускается раздражением двигательного нерва специализированным стимулятором биологических объектов. Стимулятор - это внешнее электронное устройство, которое выдает импульсы заданной амплитуды и длительности. Стимулятор синхронизируется с конфокальным сканирующим микроскопом через блок синхронизации, входящий в состав микроскопа.
Блок синхронизации осуществляет запуск стимулятора синхроимпульсом. В момент начала съемки видеоизображения блок синхронизации посылает импульсный сигнал на стимулятор, после чего стимулятор посылает импульсный сигнал на препарат. На стимуляторе можно настраивать задержку между синхроимпульсом от микроскопа и импульсом, стимулирующим препарат.
Разработанный способ позволяет зарегистрировать повторяющийся периодический флуоресцентный кальциевый сигнал с достаточным временным и пространственным разрешением посредством только программных операций, без конструктивного изменения существующей конфокальной системы. Суть метода заключается в том, что сигнал стимуляции можно смещать относительно начала процесса сканирования микроскопом. Это достигается посредством задержки этого сигнала стимулятором. Так как развертка микроскопа неизменна, то регистрировать сигнал при смещении микроскоп будет в других точках, отстоящих по времени от начала исходного сигнала на величину временной константы t. Величина t выбирается исходя из необходимого временного разрешения и зависит от временных параметров регистрируемого сигнала. Чтобы достичь необходимого результата, нужно смещать сигнал до тех пор, пока шаг времени смещения n*t не достигнет значения минимального времени между кадрами Т (n*t=Т), где n=1, 2, 3,.., N(Фигура 1). Длительность одной серии кадров k*T выбирается исходя из длительности интересующего сигнала флуоресценции и должна превышать его длительность на значение Т, где k - количество кадров одного регистрируемого сигнала. На фиг. 1 изображен сигнал без смещения и четыре смещенных сигнала. Так как микроскоп формирует кадры с периодом Т, то полученный сигнал будет далек от истинного. На изображении он представлен пятью соединенными между собой точками сигнала без смещения, попавшими в момент регистрации кадра. Таким образом, смещая сигнал по времени, можно собрать потерянные из-за низкой скорости сканирования кадры и соответственно потерянные точки сигнала. Восстановление флуоресцентного сигнала с высоким временным разрешением из зарегистрированных серий кадров осуществляется согласно следующему алгоритму (Фиг. 2): кадр из смещенной серии изображений вставляется за соответствующим кадром первой серии изображений в порядке смещения. Собранные кадры таким путем объединяются в порядке смещения в одно видеоизображение, которое будет обладать интересующей нас разверткой по времени. При этом развертка (время между кадрами) нового видеоизображения будет равна заданному шагу времени смещения сигнала t.