Набор для выявления антигенов возбудителей инфекционных заболеваний в формате дот-иммуноанализа "у постели больного"
KIT FOR DETECTING ANTIGENS OF INFECTIOUS DISEASE PATHOGENS IN DOT-IMMUNOASSAY NEAR THE PATIENT'S BED FORMAT

Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа и направлено на усовершенствование тест-систем для выявления специфических антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, в частности возбудителей карантинных (высоко контагиозных) инфекций, в клинических образцах и пробах окружающей среды и может быть использовано в медицине. Быстрая диагностика контагиозных заболеваний имеет большое значение, поскольку от нее зависит скорость принятия решений по предотвращению распространения болезни, а также эффективность профилактических и лечебных мероприятий. Часто подозрение на наличие таких заболеваний возникает при обнаружении температурящих больных в мобильных ситуациях, например на транспорте, прибывающем из зарубежных регионов с неэндемичными для России заболеваниями (завозные инфекции). Температурная реакция свидетельствует об острой фазе заболевания, при которой возбудитель циркулирует в организме заболевшего и может быть опасен для окружающих. Диагноз инфекции может быть подтвержден лабораторными методами, основанными на выявлении генетического материала или специфических белков - антигенов возбудителя. Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ее экспрессные варианты, позволяют выявлять сотни [1] копий ДНК микроорганизмов, однако выполнение ПЦР-анализа требует строго контролируемых лабораторных условий дорогостоящего оборудования и реагентов [2].
Иммунохимические тесты менее чувствительны, чем ПЦР, обычно они позволяют регистрировать специфические антигены в диапазоне концентраций от 10 до 0,1 нг/мл. Однако такая чувствительность может быть достаточна для регистрации возбудителя и постановки диагноза. При этом более низкая чувствительность иммунодиагностики в значительной степени компенсируются оперативностью получения результатов и меньшей, чем ПЦР, неприхотливостью к условиям выполнения анализа. Некоторые варианты иммуноанализа могут быть выполнены в пределах 1 ч во внелабораторных условиях [3].
Известны наборы для иммунохроматографического анализа для определения антигенов, в котором жидкий образец, содержащий антигены, наносят на пористую подложку, пропитанную сенсибилизированным коллоидным золотом [3, аналог 1]. Образовавшиеся комплексы антиген-коллоидное золото диффундируют по аналитической пористой мембране, связываются с антителами захвата, иммобилизованными на определенном участке мембраны и контрастируют этот участок за счет красно-бордовой окраски частиц золота. Тест может выполняться в течение 20-30 мин во внелабораторных условиях.
Недостатками таких наборов являются: необходимость использования пары моноклональных антител к разным антигенам (эпитопам антигена) возбудителя и относительно низкая чувствительность, обусловленная необходимостью накопления большого количества частиц золота для контрастирования тестового участка мембраны.
Известно устройство и способ анализа антигенов, описанный в патенте РФ №2296995 [4, аналог 2]. Устройство представляет собой непористую матрицу из синтетического материала с нанесенными антителами захвата, специфичными для выявляемых антигенов, и контроли. Способ анализа включает инкубацию матрицы в жидком образце, отмывку, инкубацию в растворе вторичных антител к определяемому антигену, отмывку, инкубацию в конъюгате меченых антивидовых (третичных) антител, отмывку, инкубацию в растворе субстрата для проявления метки, отмывку и учет результатов. В качестве вторичных антител применяют смесь поликлональных антител, специфичных ко всем определяемым антигенам и отличающихся по источнику получения от первичных антител, иммобилизованных на подложке. Для контроля работы конъюгата на матрицу наносят иммуноглобулины того вида животных, которое служит источником вторичных антител, а в качестве отрицательного контроля наносят асцитическую жидкость мыши. В качестве детекторной системы используют каталитически активные золи золота или серебра связанные с вторичными антителами к определяемым антигенам, а в качестве субстрата для проявления каталитической метки используют «физические проявители».
Недостатками аналога 2 являются: необходимость использования 3-х видов антител от различных животных, многостадийность и обусловленная ей сложность и длительность (около 1,5 ч) процедуры анализа.
Наиболее близким аналогом 3 (прототипом) являются наборы серии "ImmunoComb " фирмы «Orgenics», Израиль, в частности набор "ImmunoComb HBs Ag 90" [5], предназначенный для качественного выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag). Ее рабочее устройство представлено в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антитела к HBs Ag, а также биотинилированный бычий сывороточный альбумин - контроль для проверки работы конъюгата. Способ выявления антигена в этой тест-системе представляет собой один из вариантов дот - иммуноанализа на поверхности непористого носителя, включающего последовательные инкубации устройства в: предварительно разведенном образце; отмывочном растворе; растворе вторичного иммунореагента, меченного биотином; отмывочном растворе; растворе конъюгата стрептавидина со щелочной фосфатазой; отмывочном растворе; растворе субстрата для проявления щелочной фосфатазы; отмывочном растворе. После окончания анализа устройство высушивают на воздухе и визуально учитывают результаты по наличию синих пятен в местах нанесения антигенов и контроля. Такие устройство и способ анализа пригодны для выполнения исследований во внелабораторных условиях.
Однако время выполнения анализа устройством-прототипом составляет около 1,5 часов, что является недостаточно быстрым для экспресс-анализа.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание набора для осуществления более быстрого (в пределах 60 мин) выявления антигенов возбудителей инфекционных заболеваний с более высокой чувствительностью и визуальным учетом результатов, пригодного для рутинного использования в клинической практике «у постели больного» или в полевых условиях.
Указанный технический результат достигается тем, что в наборе для выявления антигенов возбудителей инфекционных заболеваний в формате дот-иммуноанализа «у постели больного», включающем устройство в виде подложки с нанесенными на ее поверхность специфичными к возбудителю инфекции антителами захвата, положительным контролем в виде антигенов искомого возбудителя, отрицательным контролем в виде антител из нормальной сыворотки и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; конъюгат меченных антител детекции; емкость для проведения анализа, выполненная в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения подложки в каждую ячейку ванны и содержащая в ячейках раствор для отмывок, раствор для рабочего разведения конъюгата и компоненты системы проявления оптического сигнала, согласно изобретения, в качестве антител захвата и антител детекции набор содержит одни и те же поликлональные антитела (Ат1) класса IgG, полученные из сыворотки крови животного, иммунизированного антигенами возбудителя инфекции для обеспечения одновременного связывания выявляемого возбудителя с антителами захвата (Ат1) на подложке и конъюгатом меченных антител детекции (Ат1) в одной стадии проведения реакции «антиген-антитело», а в качестве метки поликлональных антител детекции (Ат1) в конъюгате используют коллоидные частицы золота со средним размером 10-20 нм.
Система проявления для усиления оптического сигнала содержит «физический проявитель», включающий раствор 0,2% метола, 0,2% нитрата серебра и 0,3% лимонной кислоты и стабилизатор окраски, содержащий раствор 1% тиомочевины в 1%-м растворе NaOH на бидистиллированной воде. В качестве животного для получения поликлональных антител (Ат1) из гипериммунной сыворотки крови используют кролика.
Изобретение обеспечивает ускоренное выполнение анализа за счет одновременного осуществления связи выявляемого возбудителя с поликлональными антителами (Ат1) захвата на подложке и поликлональными антителами (Ат1) детекции в конъюгате, а также повышение чувствительности определения за счет образования крупных агрегатов частиц конъюгата на возбудителях и специфических суборганных структурах. Изобретение позволяет выполнять анализ, как в лаборатории, так и во внелабораторный условиях "у постели больного".
В отличие от аналога 1 в предлагаемом наборе используют один вид поликлональных антител (Ат1) как в качестве реагента захвата, так и в качестве реагента детекции. В отличие от аналога 2 и прототипа (аналог 3), где выделение искомых антигенов на подложке и выявление их конъюгатом проводится последовательно в три стадии с промежуточными отмывками от не связавшихся компонентов, в предлагаемом наборе для диагностики связывание антигенов с поликлональными антителами (Ат1) захвата на подложке и с поликлональными антителами (Ат1) детекции в конъюгате проводится в одну стадию.
Обычно одностадийные варианты иммунохимического анализа выполняют с использованием пары моноклональных антител против разных антигенных детерминант аналита (см. аналог 1). Один вид моноклональных антител служит реагентом захвата на подложке, а второй вид - реагентом детекции, связанным с иммунозолем. При использовании в таком варианте постановки анализа моноклональных антител связывание вирусных структур с антителами на иммунозоле и подложке матрицы происходит параллельно. При этом, поскольку иммунная реакция в растворе протекает быстрее, чем у поверхности плотной подложки, существует вероятность блокирования антигенных детерминант на поверхности вируса частицами иммунозоля, препятствующего связыванию комплексов «вирус-иммунозоль» на поверхности подложки и ограничивающего чувствительность.
Однако, на практике использования заявляемого набора (см. пример ниже) чувствительность одностадийного способа выявления антигенов с использованием реагентов захвата и детекции одного и того же вида поликлональных антител не снижается, а напротив, увеличивается в несколько раз за счет образования крупных агрегатов частиц золота на выявляемых микроорганизмах (фиг. 3А) и суборганных структурах (фиг. 3Б). При этом эффективность связывания таких меченных структур с антителами на подложке сохраняется.
Получение конъюгатов на основе коллоидного золота (средний диаметр частиц 10-20 нм) может быть осуществлено по известным методикам [6]. Для усиления оптического сигнала конъюгата в предлагаемом способе анализа предполагается использовать физический проявитель, содержащий растворимую соль серебра и восстанавливающий агент (предпочтительно, проявитель, содержащий: 0,2% метола, 0,2% нитрата серебра, и 0,3% лимонной кислоты). Проявитель готовят перед употреблением, время проявления 7 мин [7]. После выполнения анализа, при наличии в исследуемом образце определяемого возбудителя или его антигенов, в местах нанесения на подложку антител захвата образуются темные пятна, учитываемые визуально или путем компьютерного анализа оцифрованного изображения.
Одностадийному дот-анализу могут быть подвергнуты: клинические образцы мочи, сыворотки крови, мокроты, ликворов, трансудатов и эксудатов, экстрактов из тканевых образцов и кала, смывов и соскобов с кожи и слизистых оболочек и т.п.; пробы объектов окружающей среды, пищевых продуктов, предметов гигиены и т.п. Образцы, предназначенные для анализа, должны быть в жидкой фазе с нейтральным значением рН, не должны содержать грубых включений и мешающих проведению теста примесей.
Предлагаемый набор для иммуноанализа может использоваться как в оснащенных лабораториях (в том числе лабораториях с высоким уровнем защиты), так и у постели больного, в кабинете врача, для самодиагностики; в полевых условиях; в животноводческих хозяйствах и на личном подворье.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлены принципиальные схемы дот-иммуноанализа антигенов ортопоксвирусов с использованием золей золота, связанных с поликлональными антителами; серебряного проявления, а также стабилизации оптического сигнала щелочным раствором тиомочевины. А - двустадийная постановка, Б - одностадийная (экспрессная) постановка. На фиг. 2А представлена подложка 1 со схемой размещения иммунореагентов: специфических антител захвата Ат1 (тестовая зона), нормальных антител Ат2 (зона отрицательного контроля) и вируса ВОВ (зона положительного контроля). На фиг. 2Б изображен вид белковых матриц на подложке 1 после выявления ВОВ в одно- (I) и двустадийном (II) вариантах постановки дот-иммуноанализа. Кратность разведений вирусного материала приведена под избражениями матриц. На фиг. 3 представлены наиболее типичные виды под электронным микроскопом смеси суспензии вируса осповакцины с конъюгатом на основе коллоидного золота. Агрегация частиц коллоидного золота на вирусных частицах (А) и субвирусных структурах (Б).
Изобретение позволяет сократить временя анализа до 30-40 мин за счет совмещения стадий инкубации подложек в образце и конъюгате и сокращения числа отмывок (см. фиг.1), повысить чувствительность выявления за счет образования крупных агрегатов частиц золота на выявляемых микроорганизмах (фиг. 3А) и специфических суборганных структурах (фиг. 3Б). В случае выявления возбудителей контагиозных заболеваний применение предлагаемого способа позволяет ускорить принятие решений по прогнозированию эпидемиологической ситуации и выполнению неотложных карантинных и лечебных мероприятии.
Пример 1. Применение заявляемого набора для быстрого родоспецифического выявления поксвирусов.
Отмена обязательного оспопрививания населения привели в настоящее время практически к полному исчезновению популяционного иммунитета к данному возбудителю и создали возможность для преднамеренного высвобождения и использования вируса натуральной оспы или модифицированного вируса натуральной оспы в качестве биологического оружия или агента биотеррора [8]. Кроме того, наблюдается увеличение заболеваемости другими патогенными для человека ортопоксвирусами, такими как вирус оспы обезьян, не только в естественном ареале их циркуляции, но и в неэндемичных для них регионах, и специалисты не исключают возможности возникновения в природе других не менее патогенных ортопоксвирусов [9]. Ортопоксвирусы обладают родоспецифическими антителами, поэтому отработка метода выявления патогенных штаммов (натуральная оспа, оспа обезьян) может быть осуществлена на модели вируса осповакцины. В модельных экспериментах использовали:
ВОВ - вирус осповакцины, выращенный на перевиваемой культуре клеток почки африканской зеленой мартышки и сконцентрированный высокоскоростным центрифугированием (14000 об/мин в течение 2 ч при 4°С). Антиген вируса кори, штамм НовО/96, культивированный на монослое клеток Vero с последующей очисткой и концентрированием в градиенте плотности сахарозы, а также инактивацией вирусной активности прогреванием в течение 1 ч при 56°С.Антиген вируса краснухи, представленный композицией рекомбинантных белков E1, Е2 и С, закупленный у фирмы «Капель» (Москва). Антиген вируса ветряной оспы (Varicella native antigen кат. №FPZ0039), закупленый у фирмы Fapon Inc.(Китай).
Ат1 - поликлональные антитела класса IgG из гипериммунной по ВОВ сыворотки кролика, выделенные путем осаждения сульфатом аммония и используются в качестве реагентов захвата и детекции;
Ат2 - антитела класса IgG из нормальной сыворотки кролика, выделенные путем осаждением сульфатом аммония и используются в качестве отрицательного контроля.
Конъюгат - получение коллоидного золота (10-20 нм) восстановлением тетрахлорзолотой кислоты цитратом натрия, определение дозы нагрузки золя Ат1 в коагуляционном тесте и процедуру нагрузки поликлональными антителами проводили, как описано ранее [6].
Для электронномикроскопического изучения смесей вируса с конъюгатом, смеси наносили на медные сеточки, покрытые пленкой-подложкой из формвара и стабилизированные углеродом. Препараты дополнительно окрашивали 1 или 2% водным раствором уранилацетата по общепринятой методике. Образцы исследовали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотосъемка проводилась встроенной цифровой камерой Jeol и цифровой камерой бокового вывода Veleta (SIS, Германия). Анализ и обработка изображения осуществлялись с помощью программного пакета iTEM (SIS, Германия).
Подложки 1 вырубали с применением типографского пресса из синтетической бумаги «Pentaprint» марки PR-M480/09-07/8101-2D8 ( Германия), отмывали дистиллированной водой и высушивали. Иммунореагенты захвата (фиг. 2 А), разведенные на 0,005 М боратном буферном растворе (рН 6,0) наносили на подложку 1 аликвотами по 2 мкл. В верхней части белковой матрицы 2 подложки 1 (тестовая зона) наносили специфические антитела Ат1, в средней части (зона отрицательного контроля) - антитела нормальной сыворотки Ат2, а в нижней (зона положительного контроля) - вирусный препарат ВОВ. Рабочие разведения иммунореагентов подбирали эмпирически. Матрицы высушивали в течение 20 ч при 50°С, блокировали погружением на 2 ч в 0,2%-й раствор казеина на 0,01 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4), тщательно просушивали и использовали в работе.
Дот-иммуноанализ. Анализ выполняли в полипропиленовых аналитических ваннах [10], заполненных готовыми растворами, за исключением ячеек девятого ряда, содержащих по таблетке (4 мг) сухого компонента физического проявителя (смесь метола и лимонной кислоты в соотношении 2:5). Для отмывок использовали ФСБ-Т (0,02 М натий-фосфатный буферный раствор с 0,8% NaCl, 0,1% твин-20 и 0,1% азида натрия, рН 7,2) и дважды дистиллированную воду; для разведения образцов - ФСБ-Т с 0,02% казеина, рН 8,0; для разведения иммунозолей - ФСБ-Т с 0,02% ПЭГ-20000, рН 7,4. При получении проявителя в ячейки 9 ряда ванны добавляли по 200 мкл бидистиллированной воды для растворения таблеток сухой смеси и, непосредственно перед проявлением, вносили в ячейки по 200 мкл 0,4%-го раствора нитрата серебра. Для усиления и стабилизации окраски использовали раствор 1% тиомочевины в 1%-м растворе NaOH на бидистиллированной воде. Анализ выполняли при температуре от 20 до 25°С с объемом рабочих растворов в ячейках аналитической ванны 0,3-0,4 мл.
В двустадийной постановке (схема приведена на фиг. 1А) готовили серии разведений вирусов на растворе для разведения образцов, вносили их в первый ряд ячеек аналитической ванны, погружали в них белковые матрицы подложки 1 и инкубировали 25 мин; дважды отмывали ФСБ-Т; инкубировали 25 мин с рабочим разведением иммунозоля, дважды отмывали ФСБ-Т и дважды дистиллированной водой, проявляли серебряным проявителем, отмывали водой, усиливали оптический сигнал обработкой матрицы щелочным раствором тиомочевины, ополаскивали водой и визуально учитывали результаты. Положительным считали образец, формирующий ясно различимое темное пятно в тестовой зоне белковой матрицы при интенсивном окрашивании зоны положительного контроля и отсутствии или слабой окраски в зоне отрицательного контроля.
В одностадийной постановке (схема приведена на фиг. 1Б) готовили серии разведений вирусов на растворе для разведения образцов, смешивали каждое разведение с иммунозолем в соотношении 50/1, вносили их в 4-й ряд аналитической ванны, инкубировали матрицы 2 подложки 1 в течение 25 мин в полученной смеси и далее выполняли отмывки и проявление так, как описано для двустадийного метода.
Заявляемый набор предполагает быстрое и чувствительное иммунохимическое выявление в исследуемых образцах возбудителей инфекций или их специфических, антигенов (АГ) при индикации возбудителя в очаге инфекционного заболевания, а также для диагностики этиологии заболевания в медицине, ветеринарии и научных экспериментах.
Сущность такого выявления заключается в одновременном (одностадийном) специфическом связывании антигена из исследуемого образца с поликлональными антителами (Ат1), иммобилизованными на плотной подложке 1 (антитела захвата) и адсорбированными на частицах коллоидного золота (антитела детекции). В результате чего образуется комплекс «антиген-антитела детекции - на коллоидном золоте», связанный через антитела захвата с плотной подложкой. Связанное на подложке 1 коллоидное золото затем выявляется за счет каталитического осаждения серебра из раствора «физического проявителя» на частицах золота и усиления оптического сигнала путем перевода серебра в сульфид серебра за счет обработки щелочным раствором тиомочевины.
Результаты. Результаты выявления ВОВ в двустадийном и одностадийном дот-иммуноанализе приведены на фиг.2 и в таблице. Приведенные данные свидетельствуют о том, что чувствительность определения вирусных антигенов в одностадийном (быстром) варианте постановке дот-иммуноанализа в 4 раза выше, чем при двустадийном выполнении анализа, а время выполнения теста сокращено до 39 мин.
Механизм такого эффекта становится понятен при электонно-микроскопическом исследовании смесей вирусных препаратов с иммунозолем Au-Ат1. На снимках наиболее типичных видов таких смесей, приведенных на фиг. 3, видно, что частицы сенсибилизированного антителами коллоидного золота образуют крупные конгломераты на вирусных частицах (см. фиг. 3 А) и субвирусных структурах (см. фиг. 3 Б). Вероятно, усиление оптического сигнала и, соответственно, повышение эффективности выявления в анализе происходит именно за счет связывания на подложке крупных агрегатов частиц коллоидного золота, образующихся на вирусах и субвирусных структурах.
Для оценки специфичности экспрессного теста в отношении гетерогенных инфекций выполняли анализ с использованием антигенов других возбудителей эритроматозных заболеваний (кори, краснухи и ветряной оспы) в концентрации около 50 мкг/мл. Ни в одном анализе с гетерогенными инфекциями не было отмечено положительного срабатывания, что подтверждает специфичность способа.
Источники патентной и научно-технической информации:
1. Р.А. Максютов Комплексный подход к видоспецифичной детекции вируса оспы коров / Проблемы особо опасных инфекций, 2016, вып.4, с. 60-63. (R.A. Maksyutov Complex Approach to Species-Specific Detection of Cowpox Virus/ Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 4, p. 60-63. (InRuss.)). http://dx.doi: 10.21055/0370-1069-2016-4-60-63.
2. D. Pulford, H. Meyer, G. Brightwell, I. Damon, R. Kline, D. Ulaeto Amplification refractory mutation system PCR assays for the detection of variola and Orthopoxvirus / J. Virol. Meth., 2004. v. 117, p. 81-90. http://dx.doi:10.1016/j.jviromet.2004.01.001.
3. Y. Li, L. Hou, J. Ye, X. Liu, H. Dan, M. Jin, H. Chen, S. Cao Development of a convenient immunochromatographic strip for the diagnosis of infection with Japanese encephalitis virus in swine / Journal of Virological Methods 168 (2010) 51-56. doi:10.1016/j.jviromet.2010.04.015.
4. Патент РФ №2296995 «СПОСОБ МНОГОПРОФИЛЬНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ В ЖИДКИХ ОБРАЗЦАХ». G01N 33/53
0
0
0
0
0
0
5. http://ww.biograd.ru/menu/%D0%B8/oD0/oBC/oD0/oBC%Dl/o83/oD0%BD%D0%BE%D0%BA%D0%BE%D0%BC%D0%B1 (прототип).
6. Poltavchenko, В. Zaitsev, A. Ersh, D. Korneev, О. Taranov, P. Filatov, O. Nechitaylo
The selection and optimization of the detection system for self-contained multiplexed dot-immunoassay/ J. Immunoassay and Immunochemistry, 2016. - Vol.37 (5). - P. 540-554. doi: 10.1080/15321819.2016.1174134.
7. Полтавченко А.Г., Ерш A.B., Крупницкая Ю.А. Выбор системы детекции для мультиплексного дот-иммуноанализа антител // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - №4. - С. 229-233. doi:10.18821/0869-2084-2016-61-4-229-233.
8. W. Rimoina, В.S. Graham Whither monkeypox vaccination / Vaccine, 2011, v. 295, p. 60- 64. doi:10.1016/j.vaccine.2011.09.004.
9. В.П. Бондарев, А.И. Терентьев, С.А. Мельников, Т.А. Бондарева, Внедрение таблетированной оспенной вакцины «ТЭОВАК » в серийное производство для обеспечения биологической безопасности населения Российской Федерации / Проблемы особо опасных инфекций, 2010, вып. 104, с. 66-68.
10. Полтавченко А.Г., Снопков В.П., Филатов П.В., Нечитайло О.В. «Универсальная аналитическая ванна для выполнения мультиплексного иммуноанализа». - Патент РФ на полезную модель №184859, приоритет от 29.05.2018 г., опубл. 13.11.2018 г. Бюл. №32.