Способ получения слезной жидкости для химико-аналитического исследования
LACHRYMAL FLUID OBTAINING METHOD FOR CHEMICAL ANALYSIS

Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для получения слезной жидкости для химико-аналитического исследования.
В настоящее время исследование химического состава слезы является относительно распространенной диагностической методикой, использующейся как в научных исследовательских целях, так и для диагностики офтальмологических (например, синдром "сухого глаза", воспалительные заболевания переднего отрезка глаза), и не офтальмологических (например, сахарный диабет) состояний. Затруднения, возникающие при исследовании слезной жидкости, часто связаны со сложностями с забором образца для анализа, что объясняет потребность в разработке различных, предназначенных для этого систем, в том числе, не стандартизированных. Имеющиеся способы позволяют забрать различные фракции слезной жидкости, вследствие чего результаты, полученные известными способами, в значительной степени могут отличаться друг от друга.
+
-
Известен и распространен способ, при котором используют тонкие капилляры, изготовленные из различных материалов. Так, например, один из способов ( Aapola U,  Beuerman R,  Vaajanen A, Uusitalo H. Age-associated changes in human tear proteome. // Clin Proteomics. 2019; 16:11) предусматривает использование микрокапилляра объемом 3 мкл, другой (Small D, Hevy J and Tang-Liu D. Comparison of tear sampling techniques for pharmacokinetics analysis: ofloxacin concentrations in rabbit tears after sampling with schirmer tear strips, capillary tubes, or surgical sponges. J Ocul Pharmacol Ther 2000; 16: 439-446) - объемом 2 мкл и 3 мкл ( Aapola U,  Pinto-Fraga J,  Stern ME, Calonge M, Zhou L, Nykter M, Uusitalo H, Beuerman R. Topical fluorometholone treatment and desiccating stress change inflammatory protein expression in tears. Ocul Surf. 2018; 16(1):84-92). Аналогичный принцип обеспечивает забор слезной жидкости и автоматизированными системами, разработанными для самостоятельно забирающих у себя материал пациентов, страдающих сахарный диабетом (Патент СА2481501А1, Патент на полезную модель RU 125449 U1). Способ состоит в том, что отодвигают нижнее веко, к обнаженной поверхности бульбарной конъюнктивы прикасаются капиллярной трубкой, по которой осуществляется поступление слезной жидкости в специальный резервуар. Поскольку для проведения химического анализа слезной жидкости необходимо забрать объем жидкости, превышающий пороговые значения для химико-аналитического метода, который предполагается использовать, часто у лиц с недостаточностью слезной пленки, прибегают к инсталляции в конъюнктивальную полость физиологического раствора. Это увеличивает объем жидкости, но снижает концентрацию тех веществ, которые содержатся в слезной жидкости и могут являться объектом изучения, увеличивая содержание воды, а также ионов Na и Cl, что является недостатком этого способа. Также к недостаткам относится то, ч то этот способ предусматривает контакт жесткой трубки с глазной поверхностью, что не только вызывает дискомфортные ощущения и снижает комплаентность, но и приводит к раздражению глаза и, следовательно, к активации рефлекторной секреции слезной жидкости, что объясняет искажение взаимоотношений веществ, находящихся в составе забранного биологического материала. При низком уровне слезного мениска, что встречается у пациентов с синдром "сухого глаза" количество забранной слезной жидкости часто бывает недостаточным для проведения химического анализа, поэтому возникает необходимость проводить повторные заборы материала до получения необходимого объема жидкости, что также приводит к раздражению глаза и искажению результатов исследования. Полученные таким способом образцы слезной жидкости часто бывают нестандартными, что усложняет интерпретацию полученных результатов. Сложность проведения стандартного забора слезной жидкости еще больше увеличивается при использовании массивных устройств, как в приведенном выше способе (Патент СА2481501А1).
Вариацией указанных способов является способ, осуществляемый при помощи полезной модели (Патент RU 12962 U1). Способ подразумевает наличие устройства, представляющего собой пластиковый блефаростат, на внутренней поверхности которого нанесены радиальные желобки, выходящие в концентрический желобок, идущий по всей окружности и выходящий в сквозной канал, к которому на микроштуцере прикрепляется силиконовая трубка, оканчивающаяся насадкой на одноразовый шприц. После наложения блефаростата и создания при помощи шприца пониженного давления, слезная жидкость засасывается в шприц. Это позволяет проводить забор слезной жидкости с большей скоростью, чем при проведении забора с использованием микрокапилляра, однако этот способ имеет ряд недостатков, среди которых необходимость использовать не изготавливаемое серийно устройство, которое необходимо накладывать на глазную поверхность, что раздражает ее и также приводит к рефлекторной слезоподукции, что приводит к искажению взаимоотношений веществ в полученном образце слезной жидкости. Сложность применения способа, связанная с необходимостью наложения блефаростата, объясняет низкую приверженность офтальмологов к такому способу.
Также известен способ (Патент RU 2335233 С1), осуществляемый при помощи специального устройства, которое содержит флакон типа эппендорфф с колпачком. Устройство снабжено проводником, который выполнен из тонкой гибкой пленки, обеспечивающей плотное прилегание к нижнему веку, в форме усеченного конуса, верхнее основание которого имеет изгиб, повторяющий контур нижнего века. На его наружной стороне размещена двухсторонняя клейкая лента. По бокам выполнены бортики для стекания слезы. При этом проводник прикреплен к эппендорффу с помощью клейкой ленты за колпачок таким образом, что нижнее основание усеченного конуса входит в эппендорфф. Этот способ достаточно трудоемкий, поскольку связан со сложной методикой прикрепления устройства к веку, а продолжительность забора слезной жидкости в таком случае требует достаточно продолжительного вынужденного положения пациента.
К "прямым" способам забора слезной жидкости можно также отнести способ (Патент RU 2427324), заключающийся в том, что под контролем эндоназальной эндоскопии прикладывают микропипетку к области выхода носослезного протока, а затем собирают слезную жидкость в области выходного отверстия носослезного протока. К недостаткам этого способа относится необходимость наличия квалифицированных специалистов и дорогостоящего оборудования для проведения эндоназальной эндоскопии. Несмотря на то, что способ позиционируется как способ для изучения не стимулированной слезопродукции, при проведении эндоназальной эндоскопии механически раздражаются рефлекторные зоны слизистой оболочки полости носа, что усиливает рефлекторную слезопродукцию. Для снижения этого эффекта необходимо проводить анемизацию слизистой оболочки полости носа, что также влияет на секрецию слезной жидкости: таким образом, полученная слезная жидкость не отражает состава базальной слезной жидкости.
Помимо описанного способа прямого забора слезной жидкости, существуют "непрямые" способы, решающие эту задачу. Одним из наиболее распространенных является способ, заключающийся в использовании тестовых полосок для теста Schirmer. При этом способе (Hummert MW, Wurster U,  Schwenkenbecher P,  Alvermann S, Gingele S, Skripuletz T, Stangel M. Investigation of Oligoclonal IgG Bands in Tear Fluid of Multiple Sclerosis Patients. // Front Immunol. 2019; 10:1110) за нижнее веко закладывают специальную тестовую полоску, выполненную из фильтровальной бумаги. Кончик полоски отгибают, закрепляя между глазной поверхностью и ребром нижнего века. Слезная жидкость впитывается в материал полоски. Исследование проводят до наполнения полоски по всей длине или на протяжении 5 мин. К недостаткам этого способа можно отнести длительность его осуществления и связанный с этим окулярный дискомфорт пациента, а также стимуляцию выработки рефлекторной слезной жидкости, что вносит изменения в состав слезной жидкости, оставшейся на материале полоски. Кроме того, вещества, растворенные в слезной жидкости, неравномерно распределяются в материале тестовой полоски, а часть крупных молекул вообще не абсорбируется при таком способе. Объем жидкости, полученный таким образом, нестандартен, т.к. ее забор осуществляют до 5 мин или до полного смачивания полоски: это может привести к тому, что у пациентов с недостаточностью слезопродукции будет забран малый объем слезный жидкости, не адекватный в плане проведения химики-аналитических исследований.
Также известен способ (Патент US20120088258A1), заключающийся в том, что слезная жидкость при помощи капилляра перемещается с глазной поверхности в резервуар, заполненный абсорбентом - гидрогелем. Таким образом, указанный способ совмещает в себе "прямой" и "непрямой" способ забора слезной жидкости, и для него характерны недостатки обоих способов: массивная конструкция и необходимость контакта с глазной поверхностью твердым капилляром создает дискомфорт и раздражает глаз, вызывая рефлекторную слезопродукцию, а гидрогель не абсорбирует крупные молекулы. Кроме того, при таком способе гидрогель является расходным материалом, что делает такой способ забора слезной жидкости экономически обременительным.
Известен способ забора слезной жидкости (Small D, Hevy J, Tang-Liu D. Comparison of tear sampling techniques for pharmacokinetics analysis: ofloxacin concentrations in rabbit tears after sampling with schirmer tear strips, capillary tubes, or surgical sponges. J Ocul Pharmacol Ther 2000; 16: 439-446) при помощи хирургической губки. Хирургическую губку подносят к латеральной части глазной поверхности, и в нее впитывается слезная жидкость в течение того времени, пока губку удерживают в таком положении. Этот способ апробирован в экспериментальных исследованиях на животной модели. К недостаткам этого способа относится неудобство его осуществления и стимуляция рефлекторной слезопродукции, что связано с необходимостью на протяжении продолжительного времени прислонять массивную губку к глазной поверхности.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ того же назначения (Jones DT, Monroy D, Pflugfelder SC. A novel method of tear collection: comparison of glass capillary micropipettes with porous polyester rods. Cornea. 1997 16(4):450-8), заключающийся в том, что под биомикроскопическим контролем к области нижнего слезного мениска прижимают специально подготовленный тупфер, выполненный из полиэфира. Тупфер подготавливают, укорачивая непосредственно перед исследованием имеющиеся до 3-4 мм при диаметре 2 мм, а после этого проводят низкотемпературную газовую стерилизацию этилен оксидом. Тупфер удерживают до тех пор, пока он полностью не окажется смоченным слезной жидкостью. К недостаткам этого способа можно отнести необходимость его осуществления под биомикроскопическим контролем, что ограничивает область его применения, а также необходимость специальной подготовки тупферов, что трудозатратно. Способ предполагает длительное прижатие тупфера к области слезного мениска, что объясняет окулярный дискомфорт, необходимость длительного вынужденного положения пациента и способствует усилению рефлекторной слезоподукции, что влияет на химический состав забранного образца слезной жидкости.
Задача предлагаемого способа состояла в создании простого малотравматичного способа забора слезной жидкости для последующего химико-аналитического исследования.
Техническим результатом предлагаемого способа является минимизация стимуляции рефлекторной слезопродукции с получением базальной слезной жидкости, а также упрощение способа.
Технический результат достигается за счет снижения раздражения глазной поверхности при использовании трех дисков диаметром по 5.5 мм из целлюлозной фильтровальной бумаги с размером пор 0,45 мкм, размещаемых в нижнем конъюнктивальном своде и подвергаемых химико-аналитическому исследованию на основе масс-спектрометрии после изменения цвета дисков с белого на серый.
Использование трех дисков диаметром 5,5 мм, выполненных из целлюлозной фильтровальной бумаги с размером пор 0,45 мкм обеспечивает, с одной стороны, сокращение физических размеров абсорбирующего материала, что способствует меньшему раздражению глазной поверхности и, как следствие, снижению рефлекторной слезопродукции, с другой стороны, фильтровальная бумага с размером пор 0.45 мкм обеспечивает достаточно быстрое пропитывание слезной жидкостью, что позволяет сократить время для получения образца необходимого объема, что, в свою очередь, уменьшает выраженность окулярного дискомфорта и сокращает длительность процедуры, которая определяется по изменению цвета материала используемой фильтровальной бумаги по мере того, как слезная жидкость абсорбируется материалом. Результатом совокупности приемов является получение по существу базальной слезной жидкости, исследование которой дает возможность получения более прецизионных данных, касающихся состава слезы.
Способ также достаточно прост в использовании, не требует биомикроскопического контроля, как в ближайшем аналоге, что значительно расширяет возможную сферу его применения. При его осуществлении не требуется непосредственно перед исследованием специально подготавливать расходный материал, что сокращает время для подготовки к получению образца слезной жидкости. Предлагаемый способ характеризуется минимальным дискомфортом для пациента, а быстрота его осуществления позволяет минимизировать продолжительность вынужденного положения пациента. Это упрощает его применение и делает возможным его использование в рутинной практике.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента получают образец слезной жидкости в составе трех дисков диаметром по 5,5 мм, выполненных из целлюлозной фильтровальной бумаги с размером пор 0,45 мкм и размещенных в нижнем конъюнктивальном своде. Извлекают диски после изменения цве та с белого на серый. Подвергают диски химико-аналитическому исследованию на основе масс-спектрометрии.
Нами было проведено химико-аналитическое исследование с помощью масс-спектрометрии с забором слезной жидкости по указанному способу в 20 случаях. Во всех случаях объем полученного материала позволял идентифицировать искомые вещества. В 10 случаях нами было проведено повторное исследование у тех же пациентов. Результаты исследования слезной жидкости, полученные в различное время у одного и того же пациента, были сопоставимы, что подтверждает стандартность получаемого материала.
Пример 1.
Химико-аналитическое исследование липидного профиля слезной жидкости было проведено у больного с сахарным диабетом. Для этого в нижний конъюнктивальный свод при помощи пинцета были уложены три диска, полученных из целлюлозной бумаги фильтровальной бумаги с размером пор 0,45 мкм. В течение 15 сек слезная жидкость была абсорбирована всей поверхностью дисков, о чем свидетельствовало изменение цвета материала с белого на серый. При этом пациент не отмечал глазного дискомфорта, избыточной секреции слезной жидкости также отмечено не было. Образцы слезной жидкости в составе дисков были помещены в стерильный флакон, образец был заморожен. Через 12 часов в условиях химико-аналитической лаборатории были приготовлены смывы с дисков, в качестве растворителя был использован гексан. Для усиления экстракции пробу помещали в ультразвуковую ванну. После этого фильтровальную бумагу удаляли, а полученный смыв подвергали химико-аналитическому исследованию при помощи газового хроматографа с масс-спектрометрическим детектором. Выявленные количественные значения липидов, жирных кислот и триглицеридов соответствовали нормальным значениям, а также соответствовали показателям в плазме крови.
Пример 2.
Для исследования аминокислотного состава слезной жидкости был осуществлен забор слезной жидкости у пациента с дакриоциститом. Для этого на глазную поверхность в области нижнего конъюнктивального свода были уложены три диска, выполненных из целлюлозной фильтровальной бумаги с размером пор 0,45 мкм. По мере абсорбции слезной жидкости в течение 5 сек диски изменили цвет на серый. Диски были удалены с глазной поверхности при помощи пинцета, помещены в стеклянный флакон. Во время исследования не было отмечено рефлекторной слезопродукции, пациент жалоб на дискомфортные ощущения при проведении процедуры не предъявлял. В течение 1 часа они были подвергнуты химико-аналитическому исследованию. Смывы были проведены трехкратно при помощи ацетонитрила (по 2 мкл). После удаления фильтровальной бумаги был проведен анализ смывов с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. У этого пациента не выявлено отклонений в содержании аминокислот в слезной жидкости по сравнению с номограммами.
Таким образом, с помощью простого доступного способа, исключающего рефлекторный выброс слезы, что вносит количественную ошибку при анализе результатов, возможно получение образцов слезной жидкости для химического анализа.