СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ АЛКОГОЛЬ-ИНДУЦИРОВАННОЙ НЕФРОПАТИИ НА ФОНЕ АУТОИММУННОГО НЕФРИТА У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR MODELING ALCOHOL-INDUCED NEPHROPATHY AGAINST THE BACKGROUND OF AUTOIMMUNE NEPHRITIS IN RATS IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, токсикологии и может быть использовано для моделирования поражений, вызванных длительной алкогольной интоксикацией на фоне аутоиммунного нефрита у экспериментальных животных.
По оценкам ВОЗ, в Европейском регионе 10% общей смертности обусловлено потреблением алкоголя. (Всемирная Организация Здравоохранения [Электронный ресурс] // Потребление алкоголя и устойчивое развитие. - 2016. https://www.euro.who.int/_data/assets/pdf_file/0020/469100/Alcohol-consumption-and-sustainable-development-factsheet-rus.pdf). По заявлению демографов в нашей стране ежегодно наблюдается более 700 тысяч «дополнительных» случаев смерти, где 80% из них прямо или косвенно связаны с чрезмерным потреблением алкоголя. При этом смертность от алкоголя в основном обусловлена различной соматической патологией, часто протекающей под видом заболеваний напрямую не связанных с интоксикацией этанолом (пневмонии, нарушения мозгового кровообращения, желудочнокишечные кровотечения и т.д.). Наряду с известными органами мишенями этанола, почки также участвуют в обезвреживании 10% алкоголя (Северин С.Е. Биологическая химия с упражнениями и задачами. М.: Геотар-медиа, 2011. 624 с.). На данный момент отмечается высокая частота нефрологических патологий, протекающих зачастую латентно и поздние клинические проявления, в большинстве случаев, не позволяют оказать своевременную медицинскую помощь. Актуальность изучения действия этанола при наличии аутоиммунного нефрита обусловлена широкой распространенностью злоупотребления этанолом и малым количеством исследований нефропатий иммуноопосредованного генеза.
Известен способ моделирования хронического панкреатита [Патент на изобретение RU 2394280, 2010], осуществляемый путем деструкции ткани поджелудочной железы крыс 1%-ным раствором тритона Х-100 в объеме 0,1 мл., далее экспериментальным животным в течение трех месяцев для питья вместо воды дают 15%-ный водный раствор этанола.
Недостатком данного способа является длительность реализации модели (90 дней), а также преимущественное поражение поджелудочной железы, и невозможность адекватно оценить повреждение других внутренних органов.
Известен способ формирования хронической алкогольной интоксикации в эксперименте [Патент на изобретение RU 2727440, 2020], заключающийся в том, что в качестве источника питьевой жидкости в первый день эксперимента крысы получают 7% водный раствор этанола. Далее концентрацию водного раствора этанола увеличивают на 1% ежедневно в течение 14 дней. На 15 день определяют зависимость крыс от алкоголя путем проведения теста с двумя поилками, одна из которых содержит 20% водный раствор этанола, вторая -питьевую воду. При наличии предпочтения животного в течение одной минуты к содержимому поилки с водным раствором этанола животное считают предрасположенным к алкоголизации. Способ позволяет ускорить процесс выведения склонных к алкоголизации лабораторных животных для их дальнейшего изучения при снижении рисков стрессовых реакций экспериментальных животных и предотвращения их гибели.
Недостатком способа является сложность реализации модели, а также необходимость введения в эксперимент большего количества экспериментальных животных.
Известен способ моделирования алкогольной кардиомиопатии [Патент на изобретение RU 2646454, 2018], заключающийся в принудительной алкоголизации животных 10%-ным водным раствором этанола в течение 13-ти недель, последующем отборе животных с высоким предпочтением к алкоголю и продолжении алкоголизации до конца 24 недели от начала алкоголизации. К концу 24-й недели формируется дилатационная алкогольная кардиомиопатия, которая характеризуется значительным угнетением сократительной функции и статистически значимой дилатацией левого желудочка.
Недостатком способа является длительность реализации модели, а также преимущественное поражение сердечной ткани и невозможность адекватно оценить повреждение других внутренних органов.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ моделирования алкогольной висцеропатии, [Патент на изобретение SU №1628077, 1988] осуществляемый путем внутрижелудочного введения через зонд 48%-ного этанола на протяжении 60 дней в дозе 1 мл на 100 г. веса животного. Через каждые 4 дня дополнительно вводили суспензию тетурама на 48%-ном растворе этанола внутрижелудочным зондом в дозе 25 мг/кг.
Недостатком данного способа является длительность реализации модели (60 дней), а также свойства ингибитора - тетурама, способного вызывать гепатиты, невриты и кожные аллергические заболевания.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования хронической алкогольной интоксикации на фоне аутоиммунного нефрита.
Решение этой задачи позволяет более полно изучить патофизиологические механизмы развития алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита, создать способ моделирования алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способ моделирования алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита, включает следующие существенные признаки. Однократно вводится крысам в пять мест (подкожно в подмышечные и паховые области, внутрибрюшинно) по 0,1 мл равнодолевой смеси гомогената коркового вещества почки (на 100,0 мг ткани 1,0 мл физраствора) с полным адъювантом Фрейнда (водно-жировая эмульсия, содержащая вазелиновое масло, ланолин, БЦЖ или мурамилдипептид и эмульгатор, способный к депонированию антигена, усиливая его захват фагоцитами и оказывая активирующее влияние на макрофаги и Т-клетки). В качестве токсического вещества используют 40%-ый раствор этанола, вводимый через зонд в желудок один раз в сутки в течение 30 дней в дозе 3,0 г/кг. Одновременно вместе с этанолом вводится неконкурентный ингибитор алкогольдегидрогеназы - амид изовалериановой кислоты в дозе 500 мг/кг в течение месяца, где на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг вещества.
Данный способ отличается от прототипа использованием ингибитора алкогольдегидрогеназы - амида изовалериановой кислоты, нетоксичного, безопасного вещества, которое вводится через зонд в желудок, и моделированием экспериментального аутоиммунного нефрита.
Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: наличие аутоиммунного нефрита у экспериментальных животных и длительное введение ингибитора алкогольдегидрогеназы - амида изовалериановой кислоты в дозе 500 мг/кг у крыс совместно с 40%-ым этанолом в дозе 3,0 г/кг приводит к нарушению метаболизма этанола и развитию алкоголь-индуцированной нефропатии в более короткие сроки. Это является удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.
По имеющимся у авторов сведениям, совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита у крыс в эксперименте, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в более точном и легко воспроизводимом способе развития алкоголь-индуцированной нефропатии на фоне аутоиммунного нефрита, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость». Данный способ осуществляется следующим образом.
Для получения действующего раствора при моделировании аутоиммунного нефрита - в полном адъюванте Фрейнда растворяют равный объем смеси гомогената коркового вещества почки, предварительно разведенного физраствором, из расчета на 100,0 мг ткани - 1,0 мл физраствора. На каждые 100 г веса крысы вводят 0,5 мл действующего раствора. Полученный раствор однократно вводится экспериментальным животным подкожно в пяти местах: подмышечные и паховые области, внутрибрюшинно по 0,1 мл действующего раствора на 100 г веса животного.
Для получения действующего раствора при моделировании хронической алкогольной интоксикации- амид изовалериановой кислоты растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,9 мл, приходится 50 мг амида изовалериановой кислоты. На каждые 100 г веса крысы вводят 0,9 мл действующего раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.
Раствор амида изовалериановой кислоты вводится через зонд в желудок каждый день в течение 30 дней одновременно вместе с 40%-ным раствором этанола в дозе 3,0 г/кг веса животного.
По истечении времени эксперимента (30 дней) опытные животные забивались под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы крови и тканей. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных (1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗРФ №708 от 23.08.2010).
Функциональное состояние почек оценивается с применением общепринятых методов исследования (Наточин Ю.В. Физиология почки: формулы и расчеты. Л. «Наука». 1974. - 56 с.), с использованием биохимических наборов реагентов для исследования мочи и плазмы крови фирмы «Ольвекс» и «Агат-Мед», Россия на спектрофотометре «Solar» (Беларусь).
Для проведения гистологических исследований образцы тканей почки и печени фиксируют в 10% нейтральном формалине, после чего подвергают заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 микрон. Срезы окрашивают гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводят в проходящем свете при помощи микроскопа Zeiss Primo Star под увеличением 40×100×400.
Полученные результаты обрабатываются статистически с учетом распределения признаков в группах с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения изучаемых данных применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью стандартного пакета программ Microsoft Excel 2016 и Statistica 10.0. Различия считались достоверными при р<0,05.
Сущность способа подтверждена результатами исследования функционального состояния почек (нарушения электролито-водовыделительной функции почек, протеинурия) и морфологического исследования тканей почки и печени, демонстрирующих развитие токсической нефропатии и гепатопатии.
Фиг. 1. - Ткань почек при хронической алкогольной интоксикации.
Краткое описание чертежа: (а) - утолщение базальной мембраны клубочков (б) - расширение мочевых пространств, (в) - эритроцитарные столбики по типу сладж.
Фиг. 2. - Ткань печени при хронической алкогольной интоксикации.
Краткое описание чертежа: (а) - крупнокапельная жировая дистрофия, (б) - признаки холестаза.
Пример 1. Крысам-самцам линии Вистар массой 200-300 грамм вводили раствор полного адъюванта Фрейнда с равным объемом смеси гомогената коркового вещества почки, предварительно разведенного физраствором, из расчета на 100,0 мг ткани - 1,0 мл физраствора. Полученный раствор однократно вводится экспериментальным животным подкожно в пяти местах: подмышечные и паховые области, внутрибрюшинно по 0,1 мл действующего раствора на 100 г веса животного. Далее вводили раствор амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг совместно с 40%-ым этанолом в дозе 3,0 г/кг каждый день в течение 30 дней.
Контролем служили пять групп животных, содержащиеся в стандартных условиях вивария:
1. Интактные животные (10 крыс)
2. Крысы с изолированным внутрижелудочным введением 40%-го этанола в дозе 3,0 г/кг в течение месяца (10 крыс)
3. Животные с внутрижелудочным введением раствора амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг в течение месяца (10 крыс)
4. Крысы с внутрижелудочным введением 40%-го этанола в дозе 3,0 г/кг в течение месяца и амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг в течение месяца (10 крыс)
5. Крысы с подкожным введением раствора полного адъюванта Фрейнда с равным объемом смеси гомогената коркового вещества почки, предварительно разведенного физраствором, из расчета на 100,0 мг ткани - 1,0 мл физраствора. Раствор однократно вводился подкожно в пяти местах: подмышечные и паховые области, внутрибрюшинно по 0,1 мл действующего раствора на 100 г веса животного.
Изучение основных процессов мочеобразования, анализ содержания электролитов в крови (натрия и калия) и их почечной обработки проводили в условиях спонтанного диуреза через один месяц. Для изучения функции почек животные помещались в обменные клетки, где в течение 6 часов у них производился сбор мочи. Содержание натрия и калия в моче и плазме крови определяли ионоселективным методом на анализаторе электролитов «Кверти-Мед» Москва. Концентрацию креатинина в моче и плазме крови, общего белка в моче определяли спектрофотометрически.
Расчеты скорости клубочковой фильтрации, величины канальцевой реабсорбции воды, экскреции натрия и калия, фильтрационного заряда катионов и относительной канальцевой реабсорбции натрия производились по формулам Ю.В. Наточина (1974).
Опыты показали, что в контрольных группах №2 с изолированным введением этанола и №3 с введением только ингибитора алкогольдегидрогеназы в течение тридцати дней достоверных изменений морфофункционального состояния почек не выявлялось. Морфологическое исследование тканей печени также не выявило признаков алкогольного повреждения в эти сроки. В контрольной группе №4 с сочетанным введением 40%-го этанола в дозе 3,0 г/кг и раствора амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг каждый день в течение 30 дней было определено уменьшение объема 6-часового спонтанного диуреза (р≤0,01), снижение скорости клубочковой фильтрации (р≤0,01), несмотря на тенденцию к снижению канальцевой реабсорбции воды. Наблюдалось увеличение концентрации белка в моче (р≤0,01). В контрольной группе №5 наблюдалось снижение диуреза по сравнению с интактным уровнем (р≤0,05), также определялось снижение клубочковой фильтрации (р≤0,05). Было выявлено достоверное уменьшение канальцевой реабсорбции воды (р≤0,05).
В опытной группе с сочетанным введением однократно подкожно по 0,1 мл действующего раствора на 100 г веса животного в пяти местах, состоящего из раствора полного адъюванта Фрейнда с равным объемом смеси гомогената коркового вещества почки, предварительно разведенного физраствором, из расчета на 100,0 мг ткани - 1,0 мл физраствора и введении 40%-го этанола в дозе 3,0 г/кг с раствором амида изовалериановой кислоты через атравматичный зонд в желудок в дозе 500 мг/кг каждый день в течение 30 дней происходит развитие токсической алкогольной нефропатии. Выявлялось уменьшение объема 6-часового спонтанного диуреза (р≤0,001), связанное со снижением скорости клубочковой фильтрации (р≤0,001), вопреки снижению канальцевой реабсорбции воды (Таблица 1). Наблюдалось увеличение концентрации белка в моче (р≤0,001). Хроническая алкогольная интоксикация на фоне аутоиммунного нефрита демонстрировала более выраженное снижение объема 6-часового спонтанного диуреза. Увеличение концентрации белка в моче также было ярче выражено, чем при хронической алкогольной интоксикации без сопутствующей патологии (р≤0,001).
При изучении электролитовыделительной функции почек достоверных изменений в группах №2 и №3 не обнаруживалось. В контрольной группе №4 выявлялось увеличение экскреции натрия (р≤0,01) и калия (р≤0,001) с мочой. Наблюдался сниженный уровень натрия в крови (р≤0,05), что вероятно связано с потерями его с мочой и снижением канальцевой реабсорбции катиона (р≤0,001). В условиях гиперкалиемии (р≤0,05), экскреция катиона была выше контроля (р≤0,05). В контрольной группе №5 также выявлялось увеличение экскреции натрия (р≤0,05) и калия (р≤0,05) с мочой. В крови уровень натрий достоверно снижался (р≤0,05), а уровень калия был выше фоновых значений (p≤0,05).
В опытной группе с моделированием хронической алкогольной интоксикации на фоне аутоиммунного нефрита наблюдалось снижение уровня натрия (р≤0,01), что было связано с высокими потерями натрия с мочой, вследствие поражения канальцевого аппарата почек и снижения канальцевой реабсорбции катиона (р≤0,001). Фильтрационный заряд калия достоверно снижался (р≤0,01), вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации воды (р≤0,001), однако экскреция катиона все же была выше контроля (р≤0,001), вероятно вследствие изменения канальцевой обработки катиона в условиях гиперкалиемии (р≤0,001). Показатели водо- и электролитовыделительной функций, уровня содержания белка в моче при хронической алкогольной интоксикации на фоне аутоиммунного нефрита имели более ярко выраженные изменения, по сравнению с контрольными группами №4 и №5.
Морфологические изменения почек при хронической алкогольной интоксикации на фоне аутоиммунного нефрита подтверждались данными гистологических исследований, выявившими картину мембранопролиферативного гломерулонефрита. При этом в тканях почек определялись следующие изменения (Фиг. 1): мембранопролиферативный гломерулонефрит характеризовался утолщением базальной мембраны клубочков (вероятнее всего за счет отложения в ней иммунных комплексов), пролиферацией мезангия, расширением мочевых пространств и воспалительной инфильтрацией. Из-за пролиферации клеток часть клубочков имела псевдодольчатую структуру. В капиллярах клубочков определялись эритроцитарные столбики по типу сладж. В почечных канальцах отмечалась гиалиново-капельная дистрофия эпителия с частичным некрозом. В просветах некоторых канальцев определялись гиалиновые цилиндры.
Морфологические изменения в печени при хронической алкогольной интоксикации на фоне аутоиммунного нефрита носили выраженный альтеративный характер (Фиг. 2). Определялось застойное венозное полнокровие с диапедезными кровоизлияниями в строму. В гепатоцитах отмечались крупнокапельная жировая дистрофия и тельца Мэллори. В печеночных протоках признаки холестаза. В отдельных участках наблюдалось нарушение балочно-дольчатой гистоархитектоники печени с формированием регенератов в виде узелков, при этом количество соединительной ткани значительно возросло по сравнению с интактными животными.
Предлагаемый способ моделирования хронической алкогольной интоксикации является эффективным, позволяет подробно изучить функциональные изменения и патофизиологические механизмы токсического влияния этанола и аутоиммунного нефрита на функции почек и печени, также может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики хронической алкогольной интоксикации.