СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В МОЛОКЕ
METHOD FOR SPECIFIC SUBSTANCE DETECTION IN MILK

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к иммунохроматографическому способу и иммунохроматографическому устройству для детекции вещества в молоке с использованием взаимодействия антиген-антитело.
Предшествующий уровень техники
[0002] Молоко домашнего скота, характерными примерами которого являются корова, овца и коза, не является стерильным и может быть загрязнено определенными микроорганизмами вследствие заболеваний или факторов окружающей среды. В частности, известно, что животные с заболеванием, вызываемым инфекцией микроорганизмом, как правило, выделяют много микроорганизмов в молоко. Характерные заболевания домашнего скота, вызываемые инфекцией микроорганизмом, включают мастит.
[0003] Мастит представляет собой воспаление системы млечных сосудов или ткани молочной железы и вызывается преимущественно инвазией, эцезисом и размножением микроорганизмов в вымени. Несмотря на то, что многие виды животных заражаются маститом, считают, что главным образом касательно мастита коров у молочных коров от 15 до 40% всех молочных коров заражены маститом, и, таким образом, он является одним из чрезвычайно важных заболеваний для владельцев молочных ферм. Если молочная корова заражается маститом, ингибируется не только функция синтеза молока, что приводит к уменьшению количества выделенного молока или даже прекращению лактации соответственно, а также к значительным экономическим потерям, таким как стоимость медицинского лечения, и на владельцев молочных ферм налагаются штрафные санкции, касающиеся стоимости молока. Кроме того, также увеличивается количество работы владельцев молочных ферм, т.к., например, доение сосков, инфицированных маститом, необходимо проводить отдельно для предотвращения инфекции.
[0004] Мастит вызывает инфекция различными микроорганизмами, но антибиотики, для которых продемонстрирована эффективность против мастита, могут различаться в зависимости от типа вызывающего заболевание микроорганизма, и определенные типы микроорганизмов обладают различными характеристиками, например, по отношению к передаче другим соскам или индивидуумам, или отличается и постинфекционная обработка. Таким образом, крайне важно быстро и подходящим способом идентифицировать вызывающий заболевание микроорганизм, присутствующий в молоке.
[0005] В качестве способов идентификации микроорганизма, вызывающего инфекционное заболевание, существуют известный способ идентификации на основе культивирования, способ идентификации на основе генов и способ идентификации на основе взаимодействия антиген-антитело. Хотя в настоящее время основная направление способа идентификации микроорганизма, вызывающего мастит домашнего скота, сводится к способу идентификации на основе культивирования, его проведение является затруднительным, и, кроме того, для него существует проблема, заключающаяся в необходимости нескольких суток для получения результатов. Также был опубликован способ идентификации на основе детекции конкретного гена способом амплификации гена (способом ПЦР) (непатентный документ 1). Несмотря на то, что этим способом можно получать результаты приблизительно за одни сутки, для него все еще существует проблема необходимости специальных приборов и манипуляций. В последние годы был разработан прибор для детекции Staphylococcus aureus, который представляет собой один из микроорганизмов, вызывающих мастит, или Escherichia coli поверхностно плазмонным резонансом (SPR) на основе взаимодействия антиген-антитело (непатентный документ 2). Для этого прибора получают антитело против антигена, специфического для каждой бактерии, и это антитело фиксируют на чипе SPR и используют. Хотя этот способ обеспечивает быструю детекцию специфического вызывающего заболевание микроорганизма, для него необходим специальный прибор, и, таким образом, проведение измерении этим способом на практических мазках молока и т.д. вызывает затруднение.
[0006] Широко используются простые устройства измерения, которые обеспечивают быстрое и удобное измерение биообразцов, таких как кровь и моча, дома или в клинике с использованием иммунохроматографии (иммунохроматографического устройства) (например, см. патентный документ 1). В способе, проводимом в таких устройствах, используют тест-полоску, содержащую индикаторную бумагу, содержащую первое антитело, специфическое к целевому веществу измерения (антиген) и меченное окрашенными частицами, такими как коллоидное золото, и пористую мембрану, на которой иммобилизовано второе антитело для захвата целевого вещества измерения, где индикаторная бумага и пористая мембрана соединены вместе. Если тестируемый образец, содержащий целевое вещество измерения, капают на полоску, то целевое вещество измерения связывается с антителом, меченным окрашенными частицами, и/или антителом, иммобилизованным на пористой мембране, что приводит к визуально отличимой линии или т.п. на мембране. Таким образом, подтверждая наличие или отсутствие такой линии или т.п., можно детектировать наличие или отсутствие вещества, подлежащего измерению.
[0007] Хотя в патентном документе 1 указано, что указанный выше способ кроме крови (цельной крови), можно применять к плазме, сыворотке, моче, слюне, мокроте, поту и т.д., в нем не указано применение указанного выше способа к молоку домашнего скота, и в нем также абсолютно не указаны и не обозначены трудности, возникающие в момент такого применения. Кроме того, несмотря на то, что способы применения иммунохроматографического способа к биообразцам, таким как кровь (цельная кровь), в качестве тестируемого образца также описаны в патентных документах 2-4, в этих патентных документах также не указано и не обозначено применение иммунохроматографического способа к молоку домашнего скота.
[0008] Для простого устройства измерения, которое обеспечивает быстрое и удобное измерение, для молока домашнего скота в качестве тестируемого образца иммунохроматографическим способом на практических мазках молока в патентном документе 5 предложен способ применения иммунохроматографического способа для молока в качестве тестируемого образца с целью проверки на микроорганизмы, вызывающие мастит домашнего скота. В этом патентном документе указано, что шарики молочного жира и казеин, содержащиеся в молоке, ингибируют детекцию иммунохроматографическим способом, и предпочтительно их предварительно удалять перед проведением теста. Хотя в этом патентном документе описан способ удаления шариков молочного жира и казеина отстаиванием молока, снятием слоя сливок и проведением обработки поверхностно-активным веществом, в не указано удаление шариков молочного жира с использованием фильтра.
[0009] Кроме того, хотя в патентных документах 2-4 не указаны техники удаления загрязнителей с использованием физического фильтра или мембраны, обладающей химической аффинностью, для применения в иммунохроматографическом способе, способы, описанные в этих ссылках, представляют собой способы, в которых применяют иммунохроматографический способ к биообразцам, таким как цельная кровь, как описано выше, и они не являются способами, в которых его применяют к молоку домашнего скота. В патентных документах 1-4 также не указаны и не обозначены трудности, возникающие в момент применения иммунохроматографического способа к молоку домашнего скота, и совершенно не указаны какие-либо средства решения этих трудностей.
Ссылки на известный уровень техники
Патентные документы
[0010] Патентный документ 1: нерассмотренная патентная публикация Японии (KOKAI) № 1-244370.
Патентный документ 2: нерассмотренная патентная публикация Японии (KOHYO) № 2003-512624.
Патентный документ 3: нерассмотренная патентная публикация Японии (KOHYO) № 11-505327.
Патентный документ 4: нерассмотренная патентная публикация Японии (KOKAI) № 2002-214236.
Патентный документ 5: международная патентная публикация WO02/075310.
Непатентные документы
[0011] Непатентный документ 1: J. Dairy. Sci., 84:74-83.
Непатентный документ 2: JRA Advanced Livestock Management System Utilization Report (Heisei 18 to 20 fiscal years), pp.58-65.
Сущность изобретения
Цель изобретения
[0012] Целью настоящего изобретения является предоставление иммунохроматографического способа и иммунохроматографического устройства для детекции вещества в молоке домашнего скота с использованием взаимодействия антиген-антитело.
Средства достижения цели
[0013] Автор настоящего изобретения анализировал идентификацию микроорганизмов, вызывающих мастит, на основании взаимодействия антиген-антитело с использованием иммунохроматографического устройства. Однако когда автор настоящего изобретения анализировал возможность фактической детекции микроорганизма иммунохроматографическим способом с использованием молока в качестве образца, было выявлено, что взаимодействие антиген-антитело не может проходить на тест-полоске иммунохроматографического устройства. Автор настоящего изобретения исследовал причину неровного прохождения взаимодействия антиген-антитело на тест-полоске, и в результате пришел к выводу, что причина указанного выше явления может заключаться в забивании тест-полоски, связанной с пористой мембраной в иммунохроматографическом устройстве, большим числом шариков молочного жира, содержащегося в молоке, что приводит к недостаточному потоку проявляющего раствора. В иммунохроматографических устройствах, как правило, используют тест-полоску с диаметром пор от нескольких десятков до нескольких сотен нм для переноса проявляющим раствором и для получения подходящей скорости взаимодействия антиген-антитело. Молоко непосредственно после дойки содержит большое количество шариков молочного жира с диаметром приблизительно от 1 до десяти и нескольких микрометров (хотя в поставляемом на рынке молоке диаметр частиц шариков молочного жира или т.п. получают равным 1 мкм или меньше посредством гомогенизирующей обработки шариков молочного жира в свежем молоке, молоко, не подвергнутое гомогенизирующей обработке, содержит шарики молочного жира с размерами частиц в широком диапазоне), и считалось, что распределение размера частиц шариков молочного жира является значительно шире, чем распределение размера эритроцитов, и, таким образом, они вызывают забивание мембраны, что делает измерение затруднительным.
[0014] Автор настоящего изобретения проводил различные исследования для достижения указанной выше цели и в результате выявил, что измерение специфического вещества, содержащегося в молоке, иммунохроматографическим способом можно было обеспечивать посредством улавливания части шариков молочного жира, содержащегося в молоке, обработкой с разделением по размеру на верхней стороне тест-полоски, используемой в иммунохроматографическом способе, и осуществил настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение является таким, как указано ниже.
[0015] [1] Иммунохроматографический способ детекции специфического вещества в молоке, который включает:
(1) этап приведения в контакт молока с тест-полоской, содержащей первую часть, содержащую меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, или содержащей специфическое вещество, которое является меченым, вторую часть, расположенную ниже первой части, на которой иммобилизовано второе антитело, направленное на специфическое вещество, и третью часть, расположенную выше первой части или второй части и содержащую пустоты, обеспечивающие удаление шариков молочного жира, содержащегося в молоке, в третьей части или последующей расположенной выше части, и
(2) этап протекания молока до второй части или последующей расположенной ниже части для обеспечения детектируемого сигнала метки во второй части или последующей расположенной ниже части.
[0016] [2] Способ по [1], где иммунохроматографический способ представляет собой способ типа бокового потока.
[3] Способ по [1] или [2], где меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, находится в первой части.
[4] Способ по любому из [1]-[3], где специфическое вещество представляет собой компонент бактерии или вещество, секретируемое бактерией.
[5] Способ по любому из [1]-[4], где по меньшей мере одно или оба из первого антитела и второго антитела представляют собой моноклональные антитела.
[0017] [6] Способ по [5], где первое антитело и второе антитело представляют собой моноклональные антитела.
[0018] [7] Способ по любому из [1]-[6], где размер удерживаемых частиц пустот третьей части составляет от 1 до 3,5 мкм.
[8] Способ по любому из [1]-[7], где третья часть состоит из двух или более видов элементов, содержащих пустоты, которые могут удалять шарики молочного жира различных размеров частиц.
[9] Способ по [8], где третья часть состоит из первого элемента, расположенного ниже, и второго элемента, расположенного выше, и размер удерживаемых частиц второго элемента больше, чем размер удерживаемых частиц первого элемента.
[10] Способ по [9], где размер удерживаемых частиц первого элемента составляет от 1,0 до 2,0 мкм, и размер удерживаемых частиц второго элемента составляет от 3,0 до 3,5 мкм.
[0019] [11] Способ по любому из [1]-[10], который включает этап протекание молока, подвергнутого обработке литическим ферментом, во второй части или последующей расположенной ниже части.
[12] Способ по [11], где литический фермент представляет собой аутолизин.
[13] Способ по [11], где стафилококк, содержащийся в молоке, детектируют с использованием лизостафина в качестве литического фермента.
[14] Способ диагностики, является ли микроорганизм, вызывающий мастит домашнего скота, стафилококком или не является им, который включает: этап получения молока, содержащего вызывающий заболевание микроорганизм, от домашнего скота, страдающего маститом, этап перемешивания литического фермента в молоке, таким образом, чтобы специфическое вещество, существующее в клетках вызывающего заболевание микроорганизма, высвобождалось из клеток, и этап определения наличия или отсутствия специфического вещества или измерения имеющегося в наличии количества специфического вещества иммунологическим способом с использованием антитела, направленного на специфическое вещество, в качестве антигена.
[15] Способ по [14], где диагностику, является ли вызывающий заболевание микроорганизм стафилококком или не является, проводят с использованием лизостафина в качестве литического фермента.
[16] Иммунохроматографическое устройство для детекции специфического вещества, содержащегося в молоке, которое содержит тест-полоску, содержащую первую часть, содержащую меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, или содержащую специфическое вещество, которое является меченым, вторую часть, которая располагается ниже первой части, на котором иммобилизовано второе антитело, направленное на специфическое вещество, и третью часть, располагающуюся выше первой части или второй части, и содержащую пустоты, обеспечивающие удаление шариков молочного жира, содержащегося в молоке.
[17] Иммунохроматографическое устройство по [16], где первая часть или вторая часть содержит литический фермент или поверхностно-активное вещество.
[18] Набор для детекции, состоящий из добавочного раствора, содержащий литический фермент или поверхностно-активное вещество, и иммунохроматографического устройства по [16].
Эффект изобретения
[0020] По настоящему изобретению наличие или отсутствие специфического вещества в молоке можно быстро и подходящим способом детектировать на месте. В частности, когда желательно диагностировать мастит у коровы, если используют визуально распознаваемую метку, детекции можно проводить на молочных фермах без использования какого-либо прибора и т.д., и обработка для удаления слоя сливок также не является необходимой. Таким образом, можно быстро идентифицировать вызывающий заболевание микроорганизм до дальнейшего ухудшения состояния заболевания и на ранней стадии можно определять правильные лечебные тактики, такие как выбор подходящих антибиотиков, и меры для профилактики распространения инфекции.
Краткое описание чертежей
[0021] [Фиг. 1] на фиг. 1 представлен схематический разрез тест-полоски иммунохроматографического устройства, используемого в примере 1, которая содержит 1 элемент, пропитанный меченым антителом, (первая часть), 2 мембранный носитель для хроматографического проявления (вторая часть), 3 часть для захвата, 4 элемент для добавления образца, 5 элемент для абсорбции, 6 субстрат и 7 элемент для удаления шариков жира (третья часть).
[Фиг. 2] на фиг. 2 представлен схематический разрез другого примера тест-полоски иммунохроматографического устройства.
[Фиг. 3] на фиг. 3 представлен схематический разрез дополнительного другого примера тест-полоски иммунохроматографического устройства.
[Фиг. 4] на фиг. 4 представлена эффект, чувствительность детекции, в результате применения аутолизина.
[Фиг. 5] на фиг. 5 представлены результаты измерения Staphylococcus aureus, добавляемого в коровье молоко, на основе ELISA с использованием ахромопептидазы и лизостафина.
[Фиг. 6] на фиг. 6 представлен схематический разрез тест-полоски иммунохроматографического устройства, используемой в примере 6, которая содержит 1 элемент, пропитанный меченым антителом, (первая часть), 2 мембранный носитель для хроматографического проявления (вторая часть), 3 часть для захвата, 4 элемент для добавления образца, 6 элемент для абсорбции и 6 субстрат.
[Фиг. 7] на фиг. 7 представлены результаты детекции Staphylococcus aureus, содержащегося в молоке, иммунохроматографическим способом с использованием лизостафина в качестве литического фермента.
Способы осуществления изобретения
[0022] Далее настоящее изобретение будет более подробно описано.
Иммунохроматографическое устройство по настоящему изобретению представляет собой устройство для детекции специфического вещества, содержащегося в молоке, иммунохроматографическим способом, которое содержит тест-полоску, содержащую первую часть, содержащую меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, или специфическое вещество, которое является меченым, вторую часть, располагающуюся после первой части, на которой иммобилизовано второе антитело, направленное на специфическое вещество, и третью часть, располагающуюся выше первой части или второй части и содержащую пустоты, обеспечивающие удаление шариков молочного жира в молоке. Конкретные примеры структуры тест-полоски включают примеры тест-полосок, схематические разрезы которых представлены на фиг. 1, 2 и 3. На фиг. 1 элемент 4 для добавления образца и элемент 7 для удаления шариков жира (третья часть) совместно располагаются выше элемента 1, пропитанного меченым антителом, (первой части). На фиг. 2, элемент 7 для удаления шариков жира (третья часть) располагается ниже элемента 1, пропитанного меченым антителом, (первой части) и выше мембранного носителя 2 для хроматографического проявления (второй части). На фиг. 3 элемент 7 для удаления шариков жира (третья часть) располагается ниже элемента 4 для добавления образца и выше элемента 1, пропитанного меченым антителом, (первой части).
[0023] Иммунохроматографическое устройство можно получать известным способом с использованием коммерческих материалов.
[0024] Материал, используемый для первой части, конкретно не ограничен при условии, что выбирают материал, обеспечивающий иммунохроматографию, но предпочтительные примеры включают волокнистую матрицу производного целлюлозы и т.д., фильтровальную бумагу, стекловолокно, ткань, хлопок и т.д.
[0025] Материал, используемый для второй части, конкретно не ограничен при условии, что выбирают материал, обеспечивающий иммунохроматографию, но предпочтительные примеры включают нитрат целлюлозы, смешанный сложный эфир нитрата целлюлозы, поливинилиденфторид, нейлон и т.д.
[0026] Материал, используемый для третьей части, предпочтительно содержит пустоты, которые обеспечивают удаление шариков молочного жира, содержащегося в молоке, и имеют диаметр приблизительно от 1 до десяти и нескольких микрометров. Третья часть должна располагаться выше указанной выше второй части, состоящий из пористой мембраны с диаметром пор от нескольких десятков до нескольких сотен нм, и предпочтительно располагается выше указанной выше первой части, т.е. в положении, при котором образец раствора сначала контактирует с ней и проходит через тест-полоску.
[0027] Поры третьей части могут иметь размер, который обеспечивает удаление шариков молочного жира, и размер удерживаемых частиц предпочтительно составляет от 0,1 до 10 мкм, более предпочтительно от 1 до 3,5 мкм. Материал является конкретно не ограниченным при условии, что выбирают материал, содержащий пустоты с размером удерживаемых частиц в указанном выше диапазоне, но предпочтительные примеры включают матрицу волокон, таких как производное целлюлозы, фильтровальная бумага, стекловолокно, ткань, хлопок и т.д. Размер удерживаемых частиц означает такой размер частиц шариков молочного жира, что шарики молочного жира с размером частиц не меньше размера удерживаемых частиц не могут проходить через пустоты и удерживаются третьей частью, и по существу соответствует среднему размеру пор пустот третьей части, и 50% или более, предпочтительно 60% или более, более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 80% или более, особенно предпочтительно 90% или более, наиболее предпочтительно 98% или более, шариков молочного жира с размером частиц не меньше, чем размер удерживаемых частиц не могут проходить через пустоты и удерживаются третьей частью. Отношение шариков молочного жира, которые необходимо удерживать, можно измерять способом, хорошо известным специалистам в данной области. Например, описано, что размер удерживаемых частиц GF/B, предоставляемого GE Healthcare Bioscience, составляет 1,0 мкм в их каталоге (удержание частиц), и такой размер частиц, как указано выше, можно подтверждать способом, хорошо известным специалистам в данной области.
[0028] Указанная выше третья часть может состоять из одного типа материала с конкретным размером удерживаемых частиц или может состоять из слоистого пластика, содержащего материалы с различными размерами удерживаемых частиц и склеенными вместе, таким образом, чтобы размер удерживаемых частиц постепенно становился меньше для повышения эффективности отделения шариков молочного жира. Такая третья часть, как указано выше, состоящая из двух или более типов элементов, которые могут удалять шарики молочного жира различных размеров частиц, представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, и в более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения третья часть состоит из первого элемента, расположенного ниже, и второго элемента, расположенным выше, и размер удерживаемых частиц второго элемента является больше, чем размер удерживаемых частиц первого элемента. Когда третья часть состоит из двух типов элементов, предпочтительно, чтобы размер удерживаемых частиц первого элемента, расположенного ниже, составлял от 1,0 до 2,0 мкм, и размер удерживаемых частиц второго элемента, расположенного выше, составлял от 3,0 до 3,5 мкм. Для детекции с высокой чувствительностью специфического вещества в молоке, содержащем шарики молочного жира в высокой концентрации и с широким диапазоном распределения размера частиц, предпочтительно такое молоко, неразбавленное после дойки, предпочтительно, чтобы третья часть состояла из комбинации элемента с небольшим размером удерживаемых частиц и элемента с большим размером удерживаемых частиц.
[0029] Указанная выше первая часть содержит меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, или меченое специфическое вещество. Если первая часть содержит меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, специфическое вещество можно детектировать способом сэндвич-анализа. Кроме того, если первая часть содержат меченое специфическое вещество, специфическое вещество можно детектировать конкурентным способом. Вследствие того, что способ сэндвич-анализа обладает высокой чувствительностью детекции и в качестве положительного результата дает линию, указывающую на детекцию антитела, он является более предпочтительным для настоящего изобретения, и, таким образом, предпочтительно первая часть содержит меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество.
[0030] Когда первая часть выполнена с возможностью содержания меченого первого антитела, направленного на специфическое вещество, два типа антител, первое антитело, направленное на специфическое вещество, и второе антитело, направленное на специфическое вещество. Для обеспечения возможности детекции специфического вещества способом сэндвич-анализа, указанное выше первое антитело и второе антитело представляют собой антитела, которые могут одновременно связываться со специфическим веществом, и предпочтительно, чтобы эпитоп специфического вещества, подлежащий распознаванию указанным выше первым антителом, отличался от эпитопа специфического вещества, подлежащего распознаванию указанным выше вторым антителом.
[0031] В настоящем изобретении для получения детектируемого сигнала первое антитело или специфическое вещество, содержащееся в первой части, метят. Примеры метки, используемой для настоящего изобретения, включают окрашенную частицу, фермент, радиоактивный изотоп и т.д., и предпочтительно использовать окрашенную частицу, которую можно визуально детектировать без какого-либо специального оборудования. Примеры окрашенной частицы включают металлические микрочастицы, такие как микрочастицы золота и платины, неметаллические частицы, латексные частицы и т.д., но не ограничены ими. Окрашенная частица может иметь любой размер при условии, что окрашенная частица имеет такой размер, что она может быть перемещена в нижнюю часть внутри пустот тест-полоски, но предпочтительно размер диаметра составляет от 1 нм до 10 мкм, более предпочтительно от 5 нм до 1 мкм, еще более предпочтительно от 10 до 100 нм.
[0032] Специфическое вещество, измеряемое настоящим изобретением, может представлять собой любое вещество при условии, что оно представляет собой вещество, которое можно измерять иммунохроматографическим способом, но предпочтительно оно представляет собой компонент бактерии или вещество, которое секретирует бактерия. Более предпочтительно специфическое вещество представляет собой рибосомный белок L7/L12 бактерии. Для рибосомного белка L7/L12 можно получать высокую чувствительность детекции, т.к. он присутствует в клетках в большом числе копий. Кроме того, как продемонстрировано в примерах, указанных ниже, антитело, с использованием которого можно отличать конкретную бактерию как причину маститу, от других бактерий на уровне вида или рода, можно фактически получать известным способом. Тип бактерии не является конкретно ограниченным, и он может представлять собой грамположительную бактерию или грамотрицательную бактерию. Примеры включают, например, грамположительные бактерии, такие как стафилококки (бактерии, принадлежащие к роду Staphylococcus), предпочтительно Staphylococcus aureus и т.д., Escherichia coli, бактерии, принадлежащие к роду Klebsiella и т.д., но не ограничены ими.
[0033] Указанное выше антитело можно получать способом, описанным в международной патентной публикации WO00/06603. Когда бактериальный рибосомный белок L7/L12 является антигеном, антитело можно получать с использованием полноразмерного белка или неполного пептида бактериального рибосомного белка L7/L12 в качестве антигена, но предпочтительно получать с использованием в качестве антигена полноразмерного белка. Антисыворотку, содержащую антитело (поликлональное антитело), которое распознает рибосомный белок L7/L12, можно получать инокуляцией такого неполного пептида или полноразмерного белка, как указано выше, в его обычном виде или сшитым с белком-носителем, животному совместно с адъювантом при необходимости и сбором сыворотки у животного. Кроме того, из антисыворотки также можно выделять антитело и использовать. Примеры животного, используемого для инокуляции, включают овцу, лошадь, козу, кролика, мышь, крысу и т.д., и особенно предпочтительными для получения поликлональных антител являются овца, кролик и т.д. Кроме того, более предпочтительно использовать в качестве антитела моноклональное антитело, получаемое известным способом, в котором получают гибридомную клетку, и в таком случае в качество животного предпочтительной является мышь. Если моноклональное антитело, которое взаимодействует с рибосомным белком L7/L12 конкретной бактерии, которая вызывает мастит, но не взаимодействует с рибосомным белком L7/L12 бактерии, которая вызывает мастит, отличной от указанной выше конкретной бактерии, находят скринингом, моноклональное антитело само по себе можно использовать для диагностики, страдает ли животное инфекцией бактерией или не страдает.
[0034] Антитело, которое распознает вещество, отличное от рибосомного белка L7/L12, в качестве антигена, также можно использовать при условии, что антитело представляет собой моноклональное антитело, которое взаимодействует с компонентом конкретной бактерии, которая вызывает мастит, или веществом, секретируемым такой бактерией, но не взаимодействует с компонентом бактерии, которая вызывает мастит, отличной от указанной выше бактерии, или веществом, секретируемым такой бактерией.
[0035] Кроме того, в качестве моноклонального антитела предпочтительно использовать моноклональное антитело, взаимодействие антиген-антитело которого не ингибируется какими-либо загрязнителями, отличными от специфического вещества, содержащегося в молоке. Например, молоко содержит большое количество белков, таких как казеин, и они могут ингибировать взаимодействие специфического вещества и моноклонального антитела. В качестве моноклонального антитела, направленного на специфическое вещество, получаемого общепринятым способом можно предпочтительно выбирать и использовать, например, моноклональное антитело, взаимодействие антиген-антитело которого не ингибируется казеином или т.п., или моноклональное антитело, на взаимодействие антиген-антитело которого незначительно влияет казеин, или т.п. Такое моноклональное антитело можно легко получать путем получения моноклональных антител, которые специфически взаимодействуют с антигеном, общепринятым способом, а затем выбирать моноклональное антитело, взаимодействие антиген-антитело которого по существу не ингибируется загрязнителем, таким как казеин, анализируя, ингибируются или не ингибируется взаимодействие антиген-антитело в присутствии загрязнителя.
[0036] В настоящем изобретении в качестве иммунохроматографического устройства можно использовать описанную выше тест-полоску как она есть, или тест-полоску можно хранить в футляре, составляющем иммунохроматографическое устройство. В первом случае, если в качестве образца используют большой объем молока, иммунохроматографическое устройство предпочтительно использовать путем непосредственного погружения одного конца тест-полоски в образец, содержащийся в контейнере. В последнем случае, если объем молока в качестве образца, является небольшим, иммунохроматографическое устройство предпочтительно использовать путем измерения предопределенного объема образца пипеткой или т.п. и помещением капли образца на тест-полоску. В последнем случае, футляр может иметь любую форму при условии, что можно хранить тест-полоску. Футляр может быть выполнен из любого материала, и предпочтительные примеры включают полипропилен, поликарбонат и т.д.
[0037] Иммунохроматографическое устройство по настоящему изобретению также можно предоставлять в виде набора, содержащего контейнер, такой как микропробирка, и добавочный раствор, например, добавочный раствор, содержащий литический фермент или поверхностно-активное вещество для лизиса бактерии с выделением рибосомного белка L7/L12 в раствор.
[0038] Иммунохроматографический способ по настоящему изобретению представляет собой иммунохроматографический способ детекции специфического вещества, содержащегося в молоке, который включает:
(1) этап приведения в контакт молока с тест-полоской, содержащей первую часть, содержащую меченое первое антитело, направленное на специфическое вещество, или содержащей специфическое вещество, которое является меченым, вторую часть, располагаемую ниже первой части, на которой иммобилизовано второе антитело, направленное на специфическое вещество, и третью часть, располагаемую выше первой части и второй части и содержащую пустоты, обеспечивающие удаление шариков молочного жира, содержащегося в молоке, в третьей части или последующей расположенной выше части, и
(2) этап прохождения молока во вторую часть или дополнительную расположенную ниже часть с получением детектируемого сигнала метки во второй части или дополнительной расположенной ниже части.
[0039] Молоко приводят в контакт с указанной выше третьей частью или элементом для добавления образца, располагающимся в еще более высоком положении, само по себе или в виде смешанного раствора, содержащего добавочный раствор. Когда указанное выше специфическое вещество представляет собой вещество, присутствующее в клетках бактерии, бактерию можно лизировать непосредственным добавлением ингредиента поверхностно-активного вещества в молоко или указанного выше добавочного раствора, или обеспечивая удерживание ингредиента поверхностно-активного вещества в части, располагаемой выше указанной выше второй части, предпочтительно части, располагаемой выше указанной выше первой части (касательно лизирующий обработки клетки поверхностно-активным веществом см. нерассмотренную патентную публикацию Японии (KOKAI) № 61-111464). Эти техники можно соответствующим образом комбинировать. В качестве другого компонента добавочного раствора можно использовать подходящий буфер (например, MOPSO и т.д.), хотя компонент не является конкретно ограниченным при условии, что выбирают компонент, который не ингибирует взаимодействие антиген-антитело.
[0040] В качестве другого варианта осуществления путем непосредственного добавления литического фермента в молоко или его добавления в добавочный раствор, или иммобилизации литического фермента выше указанной выше второй части, предпочтительно выше указанной выше первой части, молоко, подвергаемое обработке литическим ферментом, при которой специфическое вещество, содержащееся в клетках, выходит из клеток, можно доставлять во вторую часть или последующую расположенную ниже часть, и таким образом, специфическое вещество, присутствующее в клетках бактерии, можно детектировать на высоком уровне чувствительности. Эти техники можно соответствующим образом комбинировать. В предпочтительном варианте осуществления литический фермент можно непосредственно добавлять в молоко, или он может содержаться в указанном выше добавочном растворе, и в особенно предпочтительном варианте осуществления указанный выше добавочный раствор, содержащий литический фермент, можно добавлять в молоко.
[0041] Тип литического фермента конкретно не ограничен, и также можно использовать два или более типов произвольно выбранных литических ферментов в комбинации. Вследствие того, что часто встречаются инфекции Escherichia coli, бактерий, принадлежащих роду Klebsiella, и Staphylococcus aureus, в качестве бактерий, являющихся этиологическим фактором мастита, также предпочтительно использовать один или несколько типов литических ферментов, которые могут проявлять бактериолитическое действие в отношении этих микроорганизмов в комбинации. Например, можно использовать один или два или более типа литических ферментов, выбранных из лизоцима, лизостафина, пепсина, глюкозидазы, галактозидазы, ахромопептидазы, β-N-ацетилглюкозаминидазы и т.д. Например, был предложен способ использования лизоцима и литического средства для клеточной мембраны в качестве литического фермента (нерассмотренная патентная публикация Японии (KOKAI) № 63-167799).
[0042] В качестве лизирующего фермента многие из аутолизинов обладают высоким литическим эффектом, и такие аутолизины являются предпочтительными (см. фиг. 4). Аутолизин относится к ферменту, который продуцируется самой бактерией и вызывает лизис самой бактерии. Хотя подробные банные о причине, почему возникает такой аутолиз остаются неизвестными, считается, что когда бактерия вытягивается и делится, он играет роль лизиса и расщепления бактериальной клетки. В качестве бактериальных аутолизинов известны лизостафин, ацетилглюкозаминидаза, ахромопептидаза и т.д.
[0043] В частности, когда наличие of Staphylococcus aureus предполагают в качестве бактерии, являющейся этиологическим фактором мастита, предпочтительным может являться использование лизостафина, который специфически проявляется бактериолитическое действие против Staphylococcus aureus независимо или в комбинации с другим литическим ферментом, т.к. скорость лизиса для Staphylococcus aureus, продемонстрированная для поверхностно-активного вещества, является ниже. В нерассмотренной патентной публикации Японии (KOKAI) № 11-28099 описан способ лизиса Staphylococcus aureus лизостафином, и специалисты в данной области могут легко получать лизостафин в качестве литического фермента. Полные описания указанного выше патентного документа включены в описания настоящего описания посредством ссылки.
[0044] Встречающегося в природе тип лизостафина представляет собой цинковую протеазу, продуцируемую Staphylocuccus simulans, и известно, что она гидролизует связи глицил-глицин в гликопептидных цепях клеточной стенки пептидогликанов Staphylococcus aureus или относящейся к тому же роду бактерии, вызывая лизис бактерии. В этом описании термин лизостафин наряду с встречающимся в природе типом лизостафина также означает мутантный лизостафин, содержащий аминокислотную последовательность типа встречающегося в природе лизостафина, но содержащей мутацию, такую как добавление, делеция и/или замена одного или нескольких аминокислотных остатков в такой степени, что указанная выше гидролитическая активность не утрачивается. Кроме того, термин лизостафин также означает модифицированный тип лизостафина, состоящий из встречающегося в природе типа лизостафина или мутантного лизостафина, связанного с другим соединением, например, сахаридом, полиэтиленгликолем или т.п. Такие лизостафины можно получать способом на основе культивирования или способом генетической инженерии, описанным в нерассмотренной патентной публикации Японии (KOKAI) № 11-28099, или посредством приобретения коммерческого продукта. Когда в качестве лизирующего фермента используют лизостафин, иммунохроматографическим способом можно детектировать, например, антиген, состоящий из рибосомного белка L7/L12 Staphylococcus aureus, или такой антиген, как указано выше, также можно детектировать в комбинации с иммунохроматографическим способом и другим способом иммунологического анализа или другим способом иммунологического анализа вместо иммунохроматографического способа. Примеры способа иммунологического анализа, отличные от иммунохроматографического способа, включают, например, способ на основе реакции агглютинации, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA), флуоресцентный иммунологический анализ (FIA) и т.д., но не ограничены ими.
[0045] Взаимодействие антиген-антитело можно детектировать способом сэндвич-анализа с использованием "меченого первого антитела, направленного на специфическое вещество", содержащееся в первой части, и "второе антитело, направленное на специфическое вещество", иммобилизованное на второй части. Альтернативно, взаимодействие антиген-антитело можно детектировать способом конкурентного анализа с использованием меченого специфического вещества, содержащегося в первой части, и антитела, направленного на специфическое вещество, иммобилизованного на второй части. Однако в настоящем изобретении предпочтительным является способ сэндвич-анализа, который обеспечивает высокую чувствительность детекции и дает линию, указывающую на детекцию антитела в качестве положительного результата.
[0046] Иммунохроматографические способы приблизительно классифицируют на способы типа бокового потока с использованием переноса жидкости капиллярной системой в тест-полоске, располагаемой в поперечном направлении, и способы проточного типа, в которых жидкость проходит через вертикально расположенную тест-полоску от ее верхней точки до дна в основном посредством гравитации. Хотя способы типа бокового потока и проточного типа можно использовать в настоящем изобретении, предпочтительными являются способы типа бокового потока.
[0047] Настоящее изобретение дополнительно описано со ссылкой на следующие ниже примеры. Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
Примеры
[0048] Пример 1: Подтверждение протекания жидкости образца молока в иммунохроматографическом способе
(1) Получение иммунохроматографического устройства
Получали иммунохроматографическое устройство, представленное на фиг. 1 в виде схематического разреза, как указано ниже.
(a) Получение антитела к рибосомному белку L7/L12
В качестве антитела для мечения коллоидным золотом использовали моноклональное антитело к рибосомному белку L7/L12 Staphylococcus aureus. Способом, описанным в международной патентной публикации WO00/06603, пример 5, получали рибосомный белок L7/L12 Staphylococcus aureus и получали моноклональное антитело с использованием этого белка. В качестве моноклонального антитела использовали комбинацию двух типов моноклональных антител (SA-1 и SA-2), которые могут одновременно связываться с различными участками указанного выше рибосомного белка L7/L12.
[0049] Было подтверждено, что комбинация моноклональных антител SA-1 и SA-2 взаимодействует с рибосомным белком L7/L12 Staphylococcus aureus, но не взаимодействует с рибосомным белком L7/L12 бактерий, которые вызывают мастит, отличных от Staphylococcus aureus, и они являются антителами, взаимодействия которых не ингибируются компонентами молока, как указано ниже.
8
[0050] Моноклональное антитело SA-1 (10 мкг/мл) и PBS (100 мкл) наливали в каждую лунку 96-луночного планшета ELISA (Maxsorp ELISA Plate, Nunc) и оставляли в течение ночи при 4°C для адсорбции антитела. Затем удаляли супернатант, добавляли 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (в PBS, 200 мкл) и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа для проведения блокирования. Затем удаляли супернатант, промывали каждую лунку несколько раз промывающим раствором (0,02% Tween 20, PBS), в лунку добавляли каждый вид из различных бактерий, представленных в таблице 1 (приблизительно 1×10 клеток/мл), разбавленных в 10 раз 0,5% Triton X-100, PBS (100 мкл), и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа. В дальнейшем удаляли супернатант, затем добавляли моноклональное антитело SA-2, меченное пероксидазой и разбавленное 0,02% Tween 20, PBS до конечной концентрации 1 мкг/мл (100 мкл), и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем удаляли супернатант, каждую лунку дополнительно промывали несколько раз промывающим раствором, затем в каждую лунку добавляли раствор TMB (KPL, 100 мкл) и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 1 моль/1 соляной кислоты (100 мкл) для остановки реакции, измеряли оптическую плотность при 450 нм и оценивали реактивность на основании разницы оптической плотности от сигнала отрицательного контроля (раствора, не содержащего бактерии). Результаты представлены в таблице 1. Положительные результаты (+) означают, что разница оптической плотности, получаемой после ELISA, и оптической плотности отрицательного контроля составляла по меньшей мере 0,5 или более, и отрицательные результаты (-) означали, что разница оптической плотности, получаемой после ELISA, и оптической плотности отрицательного контроля составляла не более 0,1.
[0051]
8
[0052] Моноклональное антитело SA-1 (10 мкг/мл) и PBS (100 мкл) наливали в каждую лунку 96-луночного планшета ELISA (Maxsorp ELISA Plate, Nunc) и оставляли в течение ночи при 4°C для адсорбции антитела. Затем удаляли супернатант, добавляли 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (в PBS, 200 мкл) и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа для проведения блокирования. Затем удаляли супернатант, каждую лунку промывали несколько раз промывающим раствором (0,02% Tween 20, PBS), в каждую лунку добавляли Staphylococcus aureus (приблизительно 1×10 клеток/мл), разбавленных в 10 раз 0,5% Triton X-100, PBS (20 мкл) и молоко (коммерческое коровье молоко для питья, 80 мкл) и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа. В дальнейшем удаляли супернатант, затем добавляли моноклональное антитело SA-2, меченное пероксидазой и разбавленное 0,02% Tween 20, PBS до конечной концентрации 1 нг/мл (100 мкл), и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем удаляли супернатант, каждую лунку дополнительно промывали несколько раз промывающим раствором, затем добавляли раствор TMB (KPL, 100 мкл) и оставляли реакционный раствор при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли 1 моль/1 соляной кислоты (100 мкл) для остановки реакции, затем измеряли оптическую плотность при 450 нм и оценивали реактивность на основании разницы оптической плотности от сигнала положительного контроля (раствора, не содержащего молока) для подтверждения того, что молоко не приводило к уменьшению реактивности.
[0053] (b) Элемент пропитанный антителом, меченным коллоидным золотом
Раствор коллоидного золота (размер частиц 60 нм, 0,9 мл, BB International) смешивали с 0,1 M фосфата калия, pH 7,5, к смеси добавляли моноклональное антитела SA-2, подлежащее мечению коллоидным золотом (100 нг/мл), и оставили смесь отстаиваться при комнатной температуре в течение 5 минут, таким образом, чтобы антитело связывалось с поверхностями частиц коллоидного золота. Затем в раствор коллоидного золота добавляли 10% водный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) в конечной концентрации 1% и блокировали оставшиеся поверхности частиц коллоидного золота BSA для получения раствора моноклонального антитела SA-2, меченного коллоидным золотом (в дальнейшем обозначаемого как "меченное коллоидным золотом антитело"). Этот раствор центрифугировали (при 15000× об./мин. в течение 5 минут) для осаждения меченного коллоидным золотом антитела и удаляли супернатант с получением меченного коллоидным золотом антитела. Это меченное коллоидным золотом антитело суспендировали в 20 мМ буфере Tris-соляная кислота (pH 8,2), содержащем 0,25% BSA, 2,5% сахарозы и 35 мМ NaCl, с получением раствора меченного коллоидным золотом антитела. Прокладку из стекловолокна в форме полоски (10 мм×300 мм) пропитывали раствором меченного коллоидным золотом антитела (2 мл) и сушили при комнатной температуре при пониженном давлении с получением элемента 1, пропитанного меченным коллоидным золотом антитела, (первой части).
[0054] (c) Часть для захвата комплекса антигена и меченного коллоидным золотом антитела
В качестве мембранного носителя 2 получали нитроцеллюлозную мембрану с шириной 25 мм и длиной 300 мм для хроматографического проявления хроматографической средой (вторая часть).
[0055] Раствор, содержащий моноклональное антитело SA-1 (1,5 мг/мл), наносили в форме линии в объеме 1 мкл/см на мембранный носитель 2 для хроматографического проявления в положении 10 мм от конца на стороне начальной точки хроматографического проявления и сушили при 50°C в течение 30 минут, а затем мембранный носитель погружали в 0,5% раствор сахарозы в течение 30 минут и сушили в течение ночи при комнатной температуре с получением 3 части для захвата комплекса антигена рибосомного белка L7/L12 Staphylococcus aureus и меченного коллоидным золотом антитела.
[0056] (d) Получение иммунохроматографического устройства
В дополнение к указанному выше пропитанному меченым антителом элементу 1 и мембранному носителю 2 для хроматографического проявления получали хлопковую ткань, служащую в качестве элемента 4 для добавления образца, и элемент 7 для удаления шариков жира (третья часть), и фильтровальную бумагу в качестве элемента 5 для абсорбции. Затем эти элементы приклеивали на субстрат 6 (толщина 254 мкм, выполненного из полистирола, с клеящим веществом для приклеивания элементов), субстрат нарезали по 5 мм с ширину с получением иммунохроматографического устройства, разрез которого представлен на фиг. 1. В качестве элемента 4 для добавления образца использовали элементы, представленные в таблице 2.
[0057]
[Таблица 2]
Элемент для добавления образца (производитель)
Размер удерживаемых частиц (мкм)
Материал
Толщина (мкм)
GF/B (GE Healthcare Bioscience)
1,0
Стекловолокно
980
GF/AVA (GE Healthcare Bioscience)
1,7
Стекловолокно
299
MF1 (GE Healthcare Bioscience)
2
Стекловолокно
357
VF1 (GE Healthcare Bioscience)
2,5
Стекловолокно
701
VF2 (GE Healthcare Bioscience)
3
Стекловолокно
764
GF/DVA (GE Healthcare Bioscience)
3,5
Стекловолокно
776
NE107 (Asahi Kasei Fibers)
от нескольких 10 до нескольких 100
Целлюлоза
410
UR601 (Asahi Kasei Fibers)
от нескольких 10 до нескольких 100
Целлюлоза
520
[0058] (2) Тест
Измерение коровьего молока с использованием иммунохроматографического устройства проводили, как указано ниже. Образец свежего молока (100 мкл), в котором детектировали Staphylococcus aureus, помещали в микропробирку, к образцу добавляли добавочный раствор (150 мкл, 1% Tween 20, 0,05 M NaCl, 0,1M MOPSO в конечных концентрациях, pH 7,5) и перемешивали. Иммунохроматографическое устройство, получаемое в указанном выше п. (1), погружали в указанный выше смешанный раствор из элемента 4 для добавления образца, проводили хроматографическое проявление способом на основе бокового потока, и исследовали, протекает ли проявляющий раствор в элемент 5 для абсорбции.
[0059] Результаты представлены в таблице 3. Символ "+" означает, что проявляющий раствор протекал в элемент 5 для абсорбции, и символ "-" означает, что проявляющий раствор останавливался на пути к элементу 5 для абсорбции. Только, когда использовали элемент с размером удерживаемых частиц не более 3,5 мкм, раствор протекал в элемент 5 для абсорбции. В других случаях поток жидкости останавливался посередине мембранного носителя 2 для хроматографического проявления.
[0060]
[Таблица 3]
Элемент для добавления образца (производитель)
Результат
GF/B (GE Healthcare Bioscience)
+
GF/AVA (GE Healthcare Bioscience)
+
MF1 (GE Healthcare Bioscience)
+
VF1 (GE Healthcare Bioscience)
+
VF2 (GE Healthcare Bioscience)
+
GF/DVA (GE Healthcare Bioscience)
+
NE107 (Asahi Kasei Fibers)
-
UR601 (Asahi Kasei Fibers)
-
[0061] Пример 2: Детекция Staphylococcus aureus в молоке иммунохроматографическим способом
(1) Получение иммунохроматографического устройства
Способом, описанным в примере 1, получали иммунохроматографическое устройство, представленное на фиг. 1. В качестве элемента, служащего в качестве элемента 4 для добавления образца и элемента 7 для удаления шариков жира (третья часть) использовали GF/DVA, указанные в таблице 2.
[0062] (2) Тест
Измерение коровьего молока с использованием иммунохроматографического устройства проводили, как указано ниже. Каждый из образцов свежего молока 1-6 (100 мкл) помещали в микропробирку, к образцу добавляли добавочный раствор (150 мкл, 1% Tween 20, 0,05 M NaCl, 0,1 M MOPSO в конечных концентрациях, pH 7,5) и перемешивали. Указанное выше иммунохроматографическое устройство погружали в указанный выше перемешанный раствор из элемента 4 для добавления образца, устройство оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 15 минут для проведения хроматографического проявления способом на основе бокового потока, а затем визуально определяли, захватывался ли комплекс антигена рибосомного белка L7/L12 и меченного коллоидным золотом антитела указанной выше 3 частью для захвата или не захватывался, на основании наличия или отсутствия красно-фиолетовой линии, которая становилась более или менее яркой пропорционально захваченному количеству.
[0063] Отдельно для подтверждения наличия или отсутствия Staphylococcus aureus в образцах молока также проводили детекцию способом на основе культивирования. Каждый образец молока (100 мкл) инокулировали в триптиказо-соевый агар II с 5% кровью овцы (Becton Dickinson Japan) или селективную среду для Staphylococcus aureus агаровую среду X-SA (Nissui), затем проводили инкубацию при 37°C в течение 24 часов и подтверждали появляющиеся колонии.
[0064] Результаты визуального определения и результаты способа на основе культивирования представлены в таблице 4. В результатах способа на основе культивирования символ "+" означает, что наблюдали колонию Staphylococcus aureus, и символ "-" означает, что не наблюдали колонию Staphylococcus aureus. В результатах, получаемых определением с использованием набора, символ "+" означает, что можно было визуально наблюдать красно-фиолетовую линию, и символ "-" означает, что такую линию было невозможно наблюдать.
[0065]
[Таблица 4]
№ образца
Результаты, получаемые способом на основе культивирования (детектируемая бактерия)
Результаты, получаемые определением с использованием набора
1
-
-
2
-
-
3
-(Streptococcus)
-
4
-(Streptococcus)
-
5
+(Staphylococcus aureus)
+
6
+(Staphylococcus aureus)
+
[0066] Для двух образцов молока, в которых не детектировали бактерий, не появлялось какой-либо линии. Также для двух образцов, в которых детектировали стрептококков, не появлялось какой-либо линии. С другой стороны, для образцов, в которых детектировали Staphylococcus aureus, появлялись линии, и, таким образом, можно было детектировать Staphylococcus aureus.
[0067] Как описано выше, использование иммунохроматографического устройства по настоящему изобретению обеспечивает возможность проявление образца молока, содержащего шарики молочного жира, без забивания мембраны и обеспечивает проведение точного измерения.
[0068] Пример 3: Измерение с использованием молока в высокой концентрации иммунохроматографическим способом
Иммунохроматографическое устройство, представленное на фиг. 1, получали способом, описанным в пример 1, и подтверждали протекание жидкости, изменяя отношение молока в образцах. В качестве элемента для добавления образца, использовали элемент для добавления образца, указанный в таблице 3. Образец свежего молока и добавочный раствор смешивали в различных отношениях (добавочный раствор, содержащий 1% Tween 20, 0,05 M NaCl, 0,1 M MOPSO в конечных концентрациях, pH 7,5, общий объем жидкости составлял 250 мкл), иммунохроматографическое устройство погружали в смесь из элемента для добавления образца, проводили хроматографическое проявление способом на основе бокового потока и исследовали, проявлялся общий объем смеси или не проявлялся.
[0069] Результаты представлены в таблице 5. Символ "+" означает, что проявляющий раствор протекал в элемент 5 для абсорбции, и символ "-" означает, что проявляющий раствор останавливался по пути в элемент 5 для абсорбции. Когда отношение молока составляло 50%, общий объем смеси протекал в элемент 5 для абсорбции с элементами для добавления образца, отличными от VF1. Когда отношение молока составляло 70%, для всех элементов для добавления образца протекание смеси блокировалось посередине мембранного носителя 2 для хроматографического проявления, или даже если смесь достигала элемент 5 для абсорбции, протекание смеси блокировалось, и, таким образом, в результате невозможно было проводить корректное измерение.
[0070]
[Таблица 5]
Элемент для добавления образца (производитель)
Результат(отношение молока, %)
50
70
GF/AVA (GE Healthcare Bioscience)
+
-
MF1 (GE Healthcare Bioscience)
+
-
VF1 (GE Healthcare Bioscience)
-
-
VF2 (GE Healthcare Bioscience)
+
-
GF/DVA (GE Healthcare Bioscience)
+
-
[0071] Затем два элемента для добавления образца укладывали друг на друга и использовали для проведения аналогичного теста, как указано выше. Два элемента для добавления образца укладывали друг на друга, как продемонстрировано на фиг. 3. В качестве элементов для добавления образца использовали GF/AVA и GF/DVA. GF/DVA располагали на верхней стороне (элемент 4 для добавления образца) и GF/AVA располагали на нижней стороне (элемент 7 для удаления шариков жира), и проводили тест с использованием различных длин элементов. Отношение молока составляло 80%, и объем образца составлял 250 мкл. Результаты представлены в таблице 6 (касательно "длины" и "перекрытия", указанных в таблице, см. фиг. 3). Символ "+" означает, что проявляющий раствор протекал в элемент 5 для абсорбции. Даже когда отношение молока составляло 80%, протекание жидкости не блокировалось, и можно было проводить корректное измерение. Кроме того, даже когда изменяли длины двух элементов для добавления образца, можно было проводить корректное измерение.
[0072]
[Таблица 6]
Элемент для добавления образца
Результат теста
Длина (мм)
Перекрытие (мм)
GF/DVA
GF/AVA
25
10
5
+
20
15
5
+
15
20
5
+
10
25
5
+
30
25
25
+
21
25
16
+
16
25
11
+
25
10
5
+
25
15
10
+
25
20
15
+
[0073] Как описано выше, с использованием в комбинации двух типов элементов для добавления образца с различными размерами удерживаемых частиц, возможно было удалять шарики молочного жира, образцы молока можно было проявлять без забивания мембраны, и, таким образом, возможным являлось высоко чувствительное и корректное измерение, даже когда использовали молоко в высокой концентрации.
[0074] Пример 4: Эффект литического фермента на детекцию Staphylococcus aureus твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA)
(a) Получение моноклонального антитела против рибосомного белка L7/L12
Использовали моноклональные антитела SA-1 и SA-2, указанные в примере 1.
(b) Подтверждение эффекта литического фермента в ELISA
Эффект литического фермента подтверждали, как указано ниже.
5
Staphylococcus aureus обрабатывали каждым из поверхностно-активного вещества и литических ферментов, представленных в таблице 7, при 37°C в течение 20 минут в 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), а затем использовали для ELISA, в котором измеряли оптическую плотность аналогичным образом, как измерение примера 1,(a). Staphylococcus aureus доводили до конечной концентрации 2,5×10 (клеток/мл) физиологическим раствором. В качестве отрицательного контроля использовали фосфатно-солевой буфер (PBS). Для положительного контроля использовали неионное поверхностно-активное вещество, Triton X-100. Конечная концентрация составляла 1%, и обработку проводили в течение ночи при комнатной температуре.
[0075]
[Таблица 7]
Поверхностно-активное веществоили литический фермент
Тип
Производитель
Концентрация (конечнаяконцентрация)
PBS
Буфер
Wako Pure Chemical Industries
-
Triton X-100
Поверхностно-активное вещество
SIGMA
1,0%
Лизоцим
Литический фермент
Wako Pure Chemical Industries
5 (мкг/мл)
Ахромопептидаза
Литический фермент
Wako Pure Chemical Industries
5 (мкг/мл)
Лизостафин
Литический фермент
Wako Pure Chemical Industries
5 (мкг/мл)
[0076] Результаты представлены на фиг. 4.
По сравнению с PBS, используемым в качестве отрицательного контроля, с использованием поверхностно-активного вещества и любых литических ферментов получали более высокую оптическую плотность. По сравнению с поверхностно-активным веществом Triton X-100, которое представляет собой широко используемое лизирующее средство, ахромопептидаза и лизостафин, которые представляют собой аутолизины, давали в два раза большие значения оптической плотности.
[0077] Пример 5: Эффект литического фермента в случае использования молока
5
С применением ахромопептидазы (Wako Pure Chemical Industries) и лизостафина (Wako Pure Chemical Industries), которые проявляли высокое лизирующее действие в примере 4, измеряли Staphylococcus aureus, добавляемый к коровьему молоку, ELISA. В качестве коровьего молока использовали коммерческое коровье молоко для питья в отношении от 0 до 80% (остальная часть представляла собой 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0)) и Staphylococcus aureus доводили до конечной концентрации 1×10 (клеток/мл) физиологическим раствором. Концентрации ахромопептидазы и лизостафина доводили с использованием 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), и смешивали их с образцами Staphylococcus aureus в конечной концентрации 5 мкг/мл. Измерение ELISA проводили аналогичным образом, как измерение примера 4.
[0078] Результаты представлены на фиг. 5. Когда использовали ахромопептидазу, оптическая плотность снижалась при повышении отношения молока. С другой стороны, когда использовали лизостафин, независимо от отношения молока наблюдали определенную оптическую плотность. Таким образом, результаты указывают, что ахромопептидаза не может оказывать достаточное действие в присутствии молока в высокой концентрации.
[0079] Пример 6: Детекция Staphylococcus aureus в молоке иммунохроматографическим способом
(1) Получение иммунохроматографического устройства
Иммунохроматографическое устройство получали, как указано ниже.
(a) Элемент, пропитанный меченными коллоидным золотом антителами
Использовали элемент, пропитанный меченными коллоидным золотом антителами, описанный в пример 1.
(b) Часть для захвата комплекса антигена и меченного коллоидным золотом антитела
Эту часть получали аналогичным образом, как часть примера 1.
[0080] (c) Получение иммунохроматографического устройства
В дополнение к указанному выше пропитанному меченым антителом элементу 1 и мембранному носителю 2 для хроматографического проявления получали GF/DVA (фильтрующий элемент, состоящий из стекловолокна толщиной 776 мкм и размером удерживаемых частиц 3,5 мкм, GE Healthcare Bioscience) в качестве элемента, служащего в качестве элемента 4 для добавления образца и элемента 7 для удаления шариков жира (третья часть), и фильтровальную бумагу в качестве элемента 5 для абсорбции. Затем эти элементы приклеивали на субстрат 6 (толщиной 254 мкм, выполненного из полистирола, содержащего клеящее вещество для приклеивания элементов), субстрат нарезали шириной по 5 мм с получением иммунохроматографического устройства, срез которого представлен на фиг. 6.
[0081] (2) Тест
Измерение коровьего молока с использованием иммунохроматографического устройства проводили, как указано ниже.
Образец молока (100 мкл), содержащий известное количество Staphylococcus aureus, помещали в микропробирку, к образцу добавляли добавочный раствор (150 мкл, 1% Triton X-100, 5 мкг/мл лизостафина, 0,1 M MOPSO в конечных концентрациях, pH 7,5) и перемешивали. В качестве молока использовали коммерческий продукт для питья. Для сравнения также проводили тест с добавочным раствором, не содержащим лизостафин (1% Triton X-100, 0,1 M MOPSO в конечных концентрациях, pH 7,5). Указанное выше иммунохроматографическое устройство погружали в указанный выше смешанный раствор из элемента 4 для добавления образца, устройство оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 30 минут для проведения хроматографического проявления способом на основе бокового потока, а затем определяли, захватывался ли комплекс антигена рибосомного белка L7/L12 и меченного коллоидным золотом антитела указанной выше частью 3 для захвата или не захватывался, количественной оценкой красно-фиолетовой линии, которая становилась более или менее яркой пропорционально захваченному количеству, с использованием устройства иммунохроматографического ридера FASTKIT DiaScan 20-A (Becton Dickinson Japan).
[0082] Результаты представлены на фиг. 7. Когда использовали добавочный раствор, содержащий лизостафин, выявляли, что кривая смещалась в сторону низкой концентрации из положения кривой, получаемой с использования добавочного раствора, содержащего Triton X-100, вместо лизостафина и в результате Staphylococcus aureus можно детектировать с чувствительностью приблизительно в 10 раз большей.
[0083] Пример 7: Измерение образца молока иммунохроматографическим способом
Иммунохроматографическое устройство получали аналогичным образом, как иммунохроматографическое устройство примера 6.
Образец свежего молока (100 мкл), в котором детектировали Staphylococcus aureus, помещали в микропробирку, к образцу добавляли добавочный раствор (150 мкл) и перемешивали при комнатной температуре. В качестве добавочного раствора использовали два типа добавочных растворов, описанных в пример 6. Измерение проводили аналогичным образом, как измерение примера 6, а затем визуально оценивали появившуюся красно-фиолетовую линию (положительная "+", отрицательная "-").
[0084] С другой стороны, для подтверждения числа Staphylococcus aureus в образцах молока проводили количественное определение способом на основе культивирования. Каждый образец молока (100 мкл) инокулировали в триптиказо-соевый агар II с 5% кровью овцы (Becton Dickinson Japan) или селективную среду для Staphylococcus aureus, агаровую среду X-SA (Nissui), затем проводили инкубацию при 37°C в течение 24 часов и подсчитывали появившиеся колонии.
4
3
[0085] Число Staphylococcus aureus, определяемое способом на основе культивирования, и результаты определения, получаемые иммунохроматографическим способом, представлены в таблице 8. Когда лизостафин не добавляли, невозможно было детектировать 1×10 (КОЕ/мл) или меньше Staphylococcus aureus, но когда добавляли лизостафин, становилось возможно детектировать до 5×10 Staphylococcus aureus.
[0086]
[Таблица 8]
№ образца
Число Staphylococcus aureus (КОЕ/мл)
Результаты измерения с использованием набора
С лизостафином
Без лизостафина
1
5×10<sup>3</sup>
+
-
2
1×10<sup>4</sup>
+
-
3
1×10<sup>4</sup>
+
-
4
1×10<sup>4</sup>
+
-
5
1×10<sup>4</sup>
+
-
6
1×10<sup>5</sup>
+
+
Применимость в промышленности
[0087] Настоящее изобретение можно использовать для диагностики инфекционных заболеваний домашнего скота.