СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ПИГМЕНТОВ ИЗ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛИ TETRASELMIS VIRIDIS
METHOD FOR EXTRACTION OF PIGMENTS FROM CELLS OF MICROALGAE TETRASELMIS VIRIDIS

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и аквакультуре и позволяет извлекать биологически активные вещества из биомассы одноклеточной водоросли рода Tetraselmis. Предлагаемый способ позволяет извлекать пигменты из микроводорослей с наименьшими потерями.
Область применения: для экспресс оценки качества кормового сырья в аквакультуре.
Виды Tetraselmis привлекательны как для исследований, так и для промышленности. Они прекрасный образец для изучения скорости роста планктона, а также эволюционных изменений многоклеточности на примере колоний клеток. Кроме того, многие виды в настоящее время представляют интерес в качестве биотоплива из-за высокого содержания в них липидов.
Tetraselmis viridis зеленая водоросль, представитель подтипа Chlorophytina, и принадлежит к небольшому классу Chlorodendrophyceae, который вместе с Pedinophyceae, Trebouxiophyceae, Ulvophyceae и Chlorophyceae образует ядро Chlorophyta. Клеточная оболочка представителей подтипа Chlorophytina состоит из целлюлозы и белков, однако отряд Chlorodendrales, к которому относится Tetraselmis viridis, характеризуется наличием жестких покровов типа теки, которая состоит из нескольких слоев чешуек объединенных между собой [1, 20]. Из-за особенностей строения, клеточная оболочка препятствует извлечению биологически ценных веществ из клетки. Учитывая разнообразие микроводорослей, принадлежащих к подтипу Chlorophytina, методы выделения пигментов из клеток тоже разнообразны. Так как их оболочки устойчивы к химическим воздействиям, то они являются основным препятствием для извлечения из клетки ценных биологически активных компонентов. Способы их разрушения разнообразны: от простых до комплексных. Они могут включать кипячение или замораживание биомассы, ферментативный гидролиз компонентов биомассы, позволяющий перевести биологически активные вещества в водорастворимое состояние, механическую мацерацию.
Известен способ получения хлорофиллов и каротиноидов из Tetraselmis chuii, культивируемых в различных средах [3]. Культуры водорослей оценивали по их росту, биохимическому составу и накоплению каротиноидов. Клетки собирали на стационарной фазе роста спомощью центрифугирования при 8000 об / мин в течение 10 минут, далее двукратно промывали стерильной дистиллированной водой. Затем образцы сушили вымораживанием и хранили при -20°С до использования. Для определения хлорофилла, навеску Tetraselmis chuii экстрагировали 10 мл 90% ацетоном. Продукцию хлорофилла Т. chuii анализировали по методу Бойда [4] путем измерения спектров поглощения экстрактов при 665 и 750 нм соответственно. Из недостатков заявленного способа можно отметить низкую эффективностью применения процесса замораживания биомассы, в качестве способа дезинтеграции клеточной оболочки микроводорослей.
Известны методы экстракции каротиноидов из клеток Tetraselmis [5] акклиматизированных при слабом освещении. Клетки Tetraselmis выращивали на питательной среде F/2, при низкой интенсивности света в течении 24 часов в сутки и температуре 13°С. В первом случае фильтры с лиофилизированными клетками Tetraselmis sp.экстрагировали смесью ацетон: фосфатный буфер (рН=7,2). Во время экстракции образцы были защищены от света. Во втором случае замороженные клетки Tetraselmis wettsteinii экстрагировали смесью ацетон: метанол в соотношении 7:3 и фильтровали через слой карбоната магния. Недостатком данных методов является нестабильность метанольного экстракта, что приводит к образованию продуктов деградации хлорофилла. Замораживание клеток Tetraselmis не сопровождается их разрушением, клеточная оболочка остается слабопроницаемой для органических растворителей.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, являются способы выделения пигментов водоросли Tetraselmis suecica с помощью ультразвука. В первом варианте клетки отбирали через 3 часа после завершения светового периода, чтобы исключить потенциальное воздействие недавнего света [6]. Клетки фильтровали через фильтры GF/F, а затем экстрагировали ультразвуком с 5 мл 90% ацетона и хранили в течение ночи при 5°С. Во время процедуры экстракции образцы были защищены от света. Экстракты фильтровали и анализировали методом химической ионизации при атмосферном давлении жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии ((APCI LC-MS). Во втором варианте образцы (3-5 мл) фильтровали через фильтры из стекловолокна (GF/F Whatman, 25 мм) при низком давлении вакуума и хранили при - 20°С до начала анализа [7]. Экстракцию пигмента проводили с использованием 100% ацетона. После добавления экстрагента биомассу водорослей подвергали холодной обработке ультразвуком (PRO250. Pro Scientific Inc. Оксфорд), разрушенные таким образом клетки сохраняли при - 20°С в течение 8-10 часов. Затем пробирки центрифугировали в роторной центрифуге (центрифуга 5804R, Эппендорф) при 3000 об. в мин. до 15 мин при 0 С. Супернатант фильтровали с использованием шприца Acrodisc через фильтры (лаборатория Гельмана). Вся процедура проводилась в тусклом свете, чтобы избежать деградации пигмента. Недостатками данных методов является необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и трудоемкость метода.
Техническим результатом изобретения Способ экстракции пигментов из клеток микроводоросли Tetraselmis viridis, является повышение выхода пигментов из сырой биомассы одноклеточной водоросли Tetraselmis viridis при сокращении времени и трудоемкости процесса, а также уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа.
Для достижения указанного результата предложен способ выделения пигментов из биомассы микроводоросли Tetraselmis viridis. Способ заключается в обработке сырой биомассы микроводоросли органическим растворителем, например ацетоном. Полученные пигменты отделяют, при этом указанные манипуляции проводят до полного обесцвечивания экстрагента, с последующим объединением целевого продукта. При этом влажную биомассу микроводоросли гомогенизируют измельчением, путем перетирания с кварцевым песком, заливают 100% ацетоном и, полученную суспензию биомассы, помещают на водяную баню при температуре 40-50°С.
Для достижения максимальной степени извлечения пигментной фракции предлагаемое нами изобретение предполагает проведение комплексного разрушения клеточной стенки микроводоросли с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем.
Согласно предлагаемому способу для извлечения пигментной фракции используют микроводоросли Tetraselmis viridis. На стационарной стадии роста клетки отделяют от культуральной среды путем центрифугирования. Влажную биомассу с влагосодержанием 100% гомогенизируют измельчением/мацерацией с помощью кварцевого песка и суспензируют в 3 мл органического растворителя, например, ацетоне. Для дальнейшего разрушения клеток, полученную суспензию водорослей и органического растворителя помещают на водяную баню, продолжая мацерацию клеток, и выдерживают 3-5 мин при температуре 40-50°С. Экстракт охлаждают, центрифугируют при 3000 об/мин. Супернатант сливают, к осадку приливают 2 мл растворителя. Нерастворимую часть подвергают повторной экстракции и разделяют. Манипуляцию повторяют до полного обесцвечивания осадка и надосадочной жидкости. Объединенный экстракт перемешивают и измеряют спектры поглощения пигментов.
При механической активации биомассы водорослей происходит: механическое разрушение клеток, растертых с абразивным ингредиентом; разупорядочение надмолекулярной структуры клеточных стенок; повышение их проницаемости по отношению к органическим растворителям.
Эффективность экстракции пигментов из клеток микроводорослей достигается путем сочетания механического и термического способов разрушения клеточных стенок, о чем свидетельствует меньшая затрата времени, необходимая для осуществления экстракции.
Разрушенные клеточные стенки, получаемые после механической активации с кварцевым песком, представляют собой плотную суспензию разрушенных клеток и кристаллов песка от светло- до темно-зеленого цвета, который может непосредственно использоваться для дальнейшей экстракции пигментного комплекса. После механической активации полупродукт суспендируют в органических растворителях и проводят экстракцию пигментного комплекса. Нагревание на водяной бане позволяет ускорить процесс. Экстракт разделяют фильтрацией на растворимую часть, содержащую пигментный комплекс, и нерастворимую часть.
Общим для прототипа и заявляемого способа является применение одного и того же органического растворителя. Основные отличия от прототипа заключаются в том, что в заявляемом способе сырые клетки растирают с абразивным ингредиентом, мацерация клеток продолжается в растворе органического растворителя и применена экстракция с подогревом на водяной бане, что способствует эффективной вытяжке пигментов из клеток.
Способ поясняется иллюстрациями на фиг. 1., где 1 - горячая ацетоновая экстракция; 2 - ацетоновая экстракция; 3 - ацетоновая экстракция (предварительное замораживание клеток при t -14°С, экспозиция 24 часа); 4 -спиртовая экстракция (при t -14°С, экспозиция 1 час).
Проведенный патентный поиск по международной классификации не выявил аналогичных способов извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Tetraselmis viridis, поэтому сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Совокупность существенных признаков заявляемого способа также не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого препарата и способа его получения критерию «изобретательский уровень».
Изобретение поясняется следующими примерами.
-1
-1
Пример 1. Микроводоросли Tetraselmis viridis выращивали накопительным методом в стеклянном культиваторе плоскопараллельного типа [8], с рабочим объемом 3 л при боковом поверхностном освещении 10 кЛк. Скорость продувки воздухом через распылители в культуре составляла 1л⋅мин⋅л. Температура среды автоматически поддерживалась на уровне 24°С. На стационарной стадии роста для определения пигментов отбирали пробы объемом по 5 м, клетки осаждали центрифугированием. Для этого использовали лабораторную центрифугу типа ОПН-3 ТУ 5-375-4261-76, частота вращения ротора составляла 3000 об/ми. Допускаемое приведенное отклонение заданной частоты вращения не более ±10%. Надосадочную жидкость сливали. К осадку добавляли кварцевый песок и мацерировали с целью разрушения клеточных оболочек, затем приливали экстрагент объемом 2 мл и продолжали растирать клетки микроводорослей. В качестве экстрагента использовали 100%-ый ацетон. Дальнейшую дезинтеграцию клеток проводили нагреванием на водяной бане в температурном диапазоне 40-50°С, продолжая размельчать клетки в течение 3-5 мин. Экстракт охлаждали, центрифугировали при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку приливали 2 мл растворителя. Нерастворимую часть подвергали повторной экстракции и разделению. Манипуляцию повторяли до полного обесцвечивания осадка и над осадочной жидкости. Извлечение пигментов проводили при освещенности 2 кЛк. Объем суммарного экстракта составил 7,1 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,7%, каротиноидов 0,29%.
Пример 2. То же, что в примере 1, но не использовали водяную баню. Объем суммарного экстракта составил 21,5 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,31%, каротиноидов 0,19%.
Пример 3. То же, что в примере 2, но клетки Т. viridis после отделения от культуральной среды помещали в морозильную камеру на 24 часа, при t -14°С). Объем суммарного экстракта составил 9,5 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,41%, каротиноидов 0,15%.
Пример 4. То же, что в примере 3, но к клеткам Т. viridis после отделения от культуральной приливали 2 мл этилового спирта и помещали в морозильную камеру при t -14°С, экспозиция 1 час. Объем суммарного экстракта составил 11,3 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,06%, каротиноидов 0,17%.
Содержание пигментов (% от сухой массы СМ) в зависимости от способа обработки биомассы с использованием различных растворителей показано в таблице 1.
Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемое техническое решение позволяет проще и с большим выходом извлекать пигментный комплекс из сырой биомассы одноклеточной водоросли Tetraselmis viridis. Применение в заявленном способе дополнительной механической обработки биомассы Tetraselmis viridis с абразивным веществом (кварцевым песком) и проведение экстракции на водяной бане позволяет разрушить клетки водоросли, а также разупорядочить структуру клеточных стенок. Это приводит к увеличению проницаемости клеточных стенок для органических растворителей, возрастанию их реакционной способности, позволяет сократить продолжительность операций экстракции и затраты органических растворителей. Одновременно с этим увеличивается выход пигментов из клеток водорослей. Перечисленные выше достоинства заявленного способа делают его более простым в исполнении и экономически эффективным, чем способ по прототипу.
Источники информации, принятые во внимание
1. Guiry M.D. in Guiry, M.D. & Guiry, G.M. 2020. AlgaeBase. Worldwide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org; searched on 29 September 2020;
2. Охапкин А.Г., Юлова Г.А. Основы альгологии: Учебное пособие. - Нижний Новгород: Издательство Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского, 2010. - 340 с).
3. Khatoon Н., Haris Н., Rahman N.A., Zakaria M.N., Begum Н., Mian S. Growth, Proximate Composition and Pigment Production of Tetraselmis chuii Cultured with Aquaculture Wastewater J. Ocean Univ. China (Oceanic and Coastal Sea Research) https://doi.org/10.1007/s11802-018-3428-7 ISSN 1672-5182, 2018 17 (3): 641-646 http://www.ouc.edu.cn/xbywb/ E-mail:xbywb@ouc.edu.cn
4. Boyd, С.E., 1979. Water Quality in Warm Water Fish Ponds. Auburn University Agriculture Experiment Station, Auburn, AL, 359pp.
5. Egeland E.S., Eikrem W., Throndsen J., Wilhelm C, Zapata M, Liaaen-Jensen S. Carotenoids from farther prasinophytes. Biochem. Syst. Ecol., 23 (1995), pp.747-755, 10.1016/0305-1978(95)00075-5
6. Borghinia F., Colacevicha A., Bergaminob N., Micarellic P., Dattilob A.M., Focardib S., Focardia S., Loiselleb S.A. The microalgae Tetraselmis suecica in mesocosms under different light regimes. Chemistry and Ecology Vol.25, No. 5, October 2009, 345-357. https://doi.org/10.1080/02757540903193148
7. Sangeeta Mahableshwar Naik, Arga Chandrashekar Anil Influence of darkness on pigments of Tetraselmis indica (Chlorodendrophyceae, Chlorophyta) Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 186, September 2018, Pages 17-22, https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2018.06.010).
8. Тренкеншу Р.П., Лелеков A.C., Боровков А.Б., Новикова Т.М. Унифицированная установка для лабораторных исследований микроводорослей // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/1097