Молекулярно-генетические основы устойчивости высших растений к кадмию и его аккумуляции

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ФАКТОРЫ СРЕДЫ

© О. А. Кулаева1, 2, В. Е. Цыганов1

1 ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

2 Санкт-Петербургский государственный университет

^ Кадмий (Cd) является одним из наиболее широко распространенных и опасных загрязняющих элементов для всех живых организмов, включая растения. В настоящее время ведутся интенсивные исследования механизмов накопления Cd в тканях растений и их устойчивости к его токсичному действию. Были получены данные о варьировании признаков устойчивости и накопления Cd в природных популяциях как видов-гипераккумуляторов, так и ценных сельскохозяйственных культур.

Получен ряд мутантов с измененной чувствительностью к данному тяжелому металлу. В последнее десятилетие выявлено несколько классов белков, участвующих в ответах клетки на действие ионов Cd. Недавно была показана важная роль микроРНК в адаптации растений к Cd. Исследования молекулярно-генетических механизмов аккумуляции Cd и устойчивости к нему растений служат теоретической базой для разработки методов фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами, а также селекции сортов сельскохозяйственных растений с пониженной аккумуляцией Cd.

^ Ключевые слова: генетический анализ устойчивости к кадмию; гипераккумуляция;переносчики металлов; металлотионеины; фитохелатины; микроРНК; фиторемедиация; транскриптомный анализ; сверхэкспрессия гена; РНК-интерференция.

Поступила в редакцию 09.12.2009. Принята к публикации 12.05.2010.

УДК 575.1/.2:574.2

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ УСТОЙЧИВОСТИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ К КАДМИЮ И ЕГО АККУМУЛЯЦИИ

Тяжелые металлы являются одними из основных загрязнителей окружающей среды, причем они поступают в почву, водоемы и атмосферу как в результате естественных процессов (выветривание горных пород, вулканическая деятельность), так и в результате хозяйственной деятельности человека (горнодобывающая, металлургическая, химическая промышленность, транспорт, внесение минеральных удобрений) (Титов и др., 2007). Cd является одним из наиболее опасных и широко распространенных загрязняющих элементов. За последние 50 лет в окружающую среду было выброшено 22 000 тонн Cd (Singh et al., 2003). Передача Cd по пищевым цепям может вызывать серьезные нарушения жизнедеятельности у многих живых организмов (Sanita di Toppi et al., 1999).

У растительных организмов выделяют два вида устойчивости: основная устойчивость, присущая большинству растений, и гиперустойчивость к определенным металлам (Clemens, 2001). Гиперустойчивость может быть опосредована, как за счет механизмов исключения Cd, так и за счет гипераккумуляции металлов в наземной части растения (Baker, 1981; Clemens, 2006). К растениям-гипераккумуляторам принято относить растительные организмы, способные накапливать металлы в надземной части в концентрации в 100—1000 раз превышающей таковую у обычных растений (Brooks, 1998). Гипераккумуляция Cd и гиперустойчивость к Cd были описаны только для четырех видов растений (Thlaspi caerulescens, Thlaspi praecox, Arabidopsis halleri и Sedum alfredii), которые также являются гипераккумуляторами цинка, некоторые исследователи относят к гипераккумуляторам Cd также и Brassica juncea (Verbruggen et al., 2009). Исследование механизмов гиперустойчивости к Cd и его гипераккумуляции вызывает огромный интерес как основа для разработки технологий фиторемедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами (Peer et al., 2005).

Многие аспекты устойчивости растений к Cd были подробно освещены в ряде обзоров (Серегин, 2001; Титов и др., 2007; Sanita di Toppi et al., 1999; Clemens, 2006; DalCorso et al., 2008; Grant et al., 2008; Verbruggen et al., 2009). В нашем обзоре мы уделим особое внимание последним достижениям в области исследований молекулярно-генетических механизмов устойчивости растений к Cd.

ВЛИЯНИЕ Cd НА РАСТИТЕЛЬНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Cd не является элементом, необходимым для роста большинства растений и животных и не участвует в каких-либо процессах клеточного метаболизма за редким исключением диатомовой водоросли Thalassiosira weissflogii, у которой он присутствует в молекуле карбоновой ангидразы вместо цинка (Lane et al., 2005). Другим возможным исключением являются некоторые популяции T. caerulescens с юга Франции, в которых Cd требуется растениям для оптимального роста (Roosens et al., 2003; Liu et al., 2008).

Cd поступает в живые организмы через переносчики металлов (цинка, железа) и кальциевые каналы. Довольно низкие концентрации Cd ингибируют основные физиологические процессы растений, такие как: рост, развитие, фотосинтез, дыхание, водный обмен, минеральное питание и продуктивность (Титов и др., 2007).

Показано, что большое сродство Cd к тиольным группам белков, замена ионом Cd иона цинка и других ионов в связывающих сайтах белков может вызывать ингибирование или изменение активности различных белков, вовлеченных в разнообразные процессы метаболизма, и также ингибировать репарацию ДНК (Clemens, 2006). Конкуренция Cd за сайты связывания с кальцием может изменять некоторые кальций-кальмодулин зависимые пути передачи сигнала (Rivetta et al., 1997). Cd также негативно влияет на функционирование элементов цитоскелета (Fusconi et al., 2007).

Также было описано негативное влияние Cd на развитие и функционирование симбиотических систем бобовых растений. Так, например, исследование влияния серии концентраций Cd на развитие симбиотических клубеньков и азотфиксирующую активность у сои показало, что хотя число клубеньков снижалось уже при самых низких концентрациях Cd (2 мг/кг почвы), в то же время наблюдалась некоторая стимуляция азотфиксирующей активности при концентрациях до 5 мг/кг почвы (Chen et al., 2003). Стимуляция азотфиксирующей активности при определенных невысоких концентрациях Cd наблюдалась нами для клубеньков модельного бобового Lotus japonicus (Цыганов и др., 2010).

В ряде исследований была показана роль микоризы в увеличении устойчивости растений к Cd. Так, при изучении нескольких генотипов гороха было показано, что инокуляция микоризным грибом Glomus intraradices увеличивает устойчивость растений к Cd (Rivera-Becerril et al., 2002). Тем не менее, механизмы такой устойчивости до конца не изучены (Rivera-Becerril et al., 2005).

МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К Cd И ЕГО АККУМУЛЯЦИИ

Обезвреживание поглощенных металлов может включать в себя разнообразные процессы, среди которых иммобилизация в клеточной стенке, образование комплексов с хелаторами, синтез стрессовых белков, синтез металлотионеинов и фитохелатинов, активное выведение ионов тяжелых металлов из клетки, ком-партментализация. Следует отметить, что в основном данные механизмы вовлечены в проявление как основной, так и гиперустойчивости к Cd. Тем не менее, имеются определенные различия. Основная устойчивость возникает в результате компартментализации Cd, связанного с фитохелатинами или другими хелаторами, в вакуоли. При этом большая его часть остается в корне,

и лишь незначительная часть Cd поступает в наземные органы. В возникновении гиперустойчивости синтез фитохелатинов не играет существенной роли (Ebbs et al., 2002), в то же время значительно усилен транспорт Cd в ксилему, по которой он поступает в наземные органы, в которых происходит его компартментализация (Hanikenne et al., 2008). В основном нами будут рассмотрены механизмы, вовлеченные в проявление растением основной устойчивости, на примере Arabidopsis thaliana (рис. 1).

Иммобилизация

Иммобилизация ионов Cd в клеточной стенке происходит как за счет необратимого связывания с ограниченным числом участков на поверхности клеточной стенки, так и с образованием комплексов с экстраклеточными углеводами (каллоза), гистидильными группами белков, а также с карбоксильными группами, размещенными на поверхности пектинов (рис. 1) (Zornoza et al., 2002).

Хелатирование органическими кислотами и аминокислотами

Органические кислоты (цитрат, малат) присутствуют в высоких концентрациях в растениях-гипераккумуляторах (Ueno et al., 2005), хотя их роль в феномене гиперустойчивости отвергается из-за их низких констант ассоциации с металлами (Callahan et al., 2006).

Недавно была показана важная роль триптофана в проявлении основной устойчивости растений к Cd (Sanjaya et al., 2008). Мутант A. thaliana trp5-1, характеризующийся сверхпродукцией триптофана, также характеризовался повышенной устойчивостью к Cd, в то время как ауксо-трофный по триптофану мутант trp2-1, напротив, — пониженной. Также была показана индукция экспрессии гена AtTSBl, кодирующего бета-субъединицу триптофан-синтазы, в ответ на воздействие Cd. Трансгенные растения со сверхэкспрессией AtTSB1 и повышенным уровнем триптофана проявляли повышенную устойчивость к Cd, но не его аккумуляцию. Предполагается, что триптофан может выполнять хелатирующую функцию по отношению к ионам Cd (рис. 1). Кроме того, было показано, что увеличенный уровень триптофана в трансгенных растениях A. thaliana может супрессировать экспрессию генов, кодирующих переносчики металлов. Полученные результаты открывают интересные перспективы для селекции сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к Cd, сниженным его накоплением и повышенным содержанием триптофана (Sanjaya et al., 2008).

Синтез стрессовых белков

Было установлено, что у различных растений Cd индуцирует синтез ряда стрессовых белков, в том числе, белков теплового шока (БТШ) и шаперонов (Clemens, 2001). У A. thaliana был выявлен металло-шаперон CdI 19, представляющий собой белок массой

Рис. 1. Пути транспорта кадмия в растительной клетке на примере A. thaliana. Представлено схематичное изображение клетки и ксилемы корня. Стрелками показано направление переноса кадмия. Из окружающей среды кадмий попадает в клетку через переносчики железа или цинка, относящиеся к ZIP семейству, а также через кальциевые каналы. Часть ионов кадмия связывается с элементами клеточной стенки клеток корня и короткими пептидами семейства CDT1. При попадании в цитоплазму кадмий связывается с фитохелатинами (ФХ) с образованием низкомолекулярных комплексов (НМК), которые переносятся в вакуоль через неидентифицированный ABC переносчик, где происходит формирование высокомолекулярных комплексов (ВМК). Также ионы кадмия могут транспортироваться в вакуоль посредством переносчиков HMA3 и MHX. Часть кадмия может транспортироваться из вакуоли обратно в цитоплазму через переносчик Nramp3. В ксилему кадмий попадает благодаря работе белков HMA2 и HMA4, по которой он транспортируется в надземные органы переносчиком Nramp. Предполагается, что в цитоплазме часть кадмия может быть переведена в неактивную форму посредством связывания с триптофаном (Trp). Металлошапероны (CdI19) играют важную роль в поддержании концентраций металлов в клетке на соответствующем уровне, связывая и доставляя их хелаторам металлов, например, фитохелатинам. PDR8, являющийся представителем АВС переносчиков, играет ключевую роль в выбросе кадмия из клетки. Другой представитель АВС переносчиков ATM3 вовлечен в поддержание гомеостаза Cd в митохондриях. Переносчик DTX1, локализованный на плазматической мембране, осуществляет транспорт различных токсичных веществ (алкалоидов, антибиотиков), в том числе и Cd, из цитоплазмы клетки.

42,2 кДа с двумя металл-связывающими мотивами СХХС, в которых два остатка цистеина ответственны за связывание с тяжелым металлом (Б^иЫ е! а1.,

2002). Наряду с Сё, данный белок способен связывать ртуть и медь. Для Сё119 характерно посттрансляцион-ное присоединение к его С-концу изопреноида, обеспечивающего прикрепление белка к плазматической мембране (рис. 1). Трансгенные растения со сверхэкспрессией С(И19 проявляли большую устойчивость к Сё по сравнению с исходными растениями. Предполагается, что металлошапероны играют важную роль в поддержании концентраций металлов в клетке на соответствующем уровне, связывая и доставляя их хелаторам металлов, например, фитохелатинам (Би2ик1 е! а1., 2002).

Цистеин-богатые пептиды и белки

В один из основных механизмов проявления основной устойчивости к Cd вовлечены гены, контролирующие уровень синтеза цистеина, а также кодирующие разнообразные семейства белков и пептидов, отличительной особенностью которых является высокое содержание цистеина в их составе.

Важная роль в устойчивости растений A. thaliana была показана для гена Atcys-3A, кодирующего фермент О-ацетилсерин(тиол)лиазу, который катализирует финальный шаг в синтезе цистеина (Dominguez—Solis et al., 2001). Нозерн-блоттинг показал, что Cd через 18 часов вызывает максимум индукции экспрессии данного гена. In situ гибридизация выявила быструю аккумуляцию мРНК в листовой пластинке, коре корня и стеб-

ля и проводящих тканях стебля после обработки Cd. Было показано, что трансгенные растения с 9-кратной сверхэкспрессией гена Atcys-3A характеризуются повышенной устойчивостью к Cd, подтверждая, что данная устойчивость обусловлена увеличенной доступностью цистеина. Фармакологический подход также показал, что экзогенный цистеин может частично улучшать рост растений на среде, содержащий Cd (Dominguez—Solís et al., 2001).

У A. thaliana было выявлено семейство AtPcr, состоящее из 10 цистеин-богатых белков, 4 из которых обеспечивают устойчивость растений к Cd, изменяя мембранный транспорт Cd и снижая его поступление в клетку (Song et al., 2004). Все белки этого семейства характеризуются наличием на N-конце гидрофобного домена, формирующего

2 трансмембранные спирали и гидрофильного C-конца. При этом гидрофобный N-конец обогащен остатками цистеина и содержит консервативный для всех членов семейства Pcr мотив CCXXXXCPC. Данные остатки цис-теина играют важную роль в детоксикации Cd, поскольку делеции этой области или мутации, приводящие к заменам цистеина, снижают способность AtPcrl поддерживать устойчивость к Cd у дрожжей, экспрессирующих гены AtPcr. Обработка растений A. thaliana Cd приводит к увеличению уровня экспрессии генов AtPcrl and AtPcr2, что соответствует их роли в обеспечении устойчивости к Cd. Предполагается, что белки семейства Pcr могут быть вовлечены в поддержание гомеостаза тяжелых металлов (Song et al., 2004). Тем не менее, возможно, что они могут иметь дополнительные функции, не связанные с устойчивостью к тяжелым металлам, поскольку гены AtPcr экспрессируются конститутивно в зрелых листьях. Более того, один из возможных гомологов данного семейства у петунии PGP/D12 индуцируется во время прорастания пыльцевой трубки (Guyon et al., 2000).

У Digitaria ciliaris был выявлен ген DcCDTl, который кодирует пептид, состоящий из 55 а. к., 15 из которых являются цистеином. У однодольных растений выявлены мультигенные семейства, гомологичные DcCDTl. В то же время, у двудольных растений выявлено только по единичному гомологу данного гена. Для DcCDTl показана локализация, как в клеточной стенке, так и на плазматической мембране. Трансгенные растения A. thaliana, с конститутивной экспрессией DcCDTl , более устойчивы к кадмию за счет снижения накопления кадмия в клетке (рис. 1) (Matsuda et al., 2009).

Синтез металлотионеинов

Металлотионеины — это небольшие (45—85 а. к.) богатые цистеином белки, которые считаются специфичными в отношении связывания ионов металлов и синтезируются в клетках животных и растений в ответ на воздействие тяжелых металлов. В отличие от животных у растений металлотионеины кодируются большими генными семействами (Palmiter, 1998). Примечательно,

что различия в нуклеотидных последовательностях между генами металлотионеинов различных видов растений меньше, чем различия между генами, представляющими разные классы металлотионеинов, что свидетельствует о том, что разные классы возникли до дивергенции на одно-и двудольные (Zimeri et al., 2005). Роль металлотионеинов в детоксикации Cd все еще остается практически неизученной (DalCorso et al., 2008). Так, было показано связывание PsMTa из гороха с различными металлами, в том числе и с Cd, при гетерологичной экспрессии этого гена в Escherichia coli (Tommey et al., 1991). Сверхэкспрессия мышиного металлотионеина в растениях табака увеличила устойчивость растений к Cd in vivo (Pan et al., 1994), в то время как эктопическая экспрессия гена MT2 B. júncea в A. thaliana привела к повышенной устойчивости к Cd и меди (Zhigang et al., 2006).

Синтез фитохелатинов

Одним из важнейших ответов растений на действие тяжелых металлов является индукция синтеза фитохе-латинов, синтезирующихся из трипептида глутатиона (Глу-Цис-Гли) фитохелатинсинтазой. В настоящее время первичная структура фитохелатинов определена для широкого спектра видов покрытосеменных растений из различных семейств. Они представляют собой небольшие богатые цистеином пептиды, состоящие из линейных цепей остатков глутаминовой кислоты и цистеина и способные связывать ионы тяжелых металлов через SH группы. Основная структура этих пептидов следующая: (уГлу (Цис)) n—Гли, где n = 2—11 (обычно не более 6-ти) (Серегин, 2001). Фитохелатины обладают высоким сродством к ионам Cd (Reese, Wagner, 1987). Cd стимулирует синтез фитохелатинов, которые быстро образуют низкомолекулярные комплексы (НМК) с ионами Cd и транспортируются через тонопласт в вакуоль. Предполагается, что у растений НМК транспортируются через неидентифицированный ABC переносчик (см. раздел ABC переносчики), гомологичный ABC переносчику HMT1 Schizospombe (Ortiz et al., 1992). Недавно было показано, что через такой переносчик в вакуоль могут поступать не только НМК, но и комплексы Cd с глутати-оном (Prévéral et al., 2009). В вакуоли, по всей видимости, образуется высокомолекулярный комплекс (ВМК), служащий для более эффективной изоляции металла. В условиях кислой среды вакуоли, ВМК диссоциируют, и Cd связывается органическими кислотами (цитратом, оксалатом, малатом) (Krotz et al., 1989). Сравнительный анализ уровня синтеза фитохелатинов у гипераккумулятора T. caerulescens и негипераккумулятора T. arvense, выявил более низкий их уровень у T. caerúlescens, что, по всей видимости, свидетельствует о том, что фитохела-тины вовлечены в поддержание основной устойчивости к Cd, но не играют заметной роли в гиперустойчивости (Ebbs et al., 2002). При этом следует отметить, что недавно гены, кодирующие фитохелатинсинтазу, а также

ABC переносчик комплексов фитохелатинов с Cd были выявлены у животных (Vatamaniuk et al., 2001, 2005), что свидетельствует о консервативности механизма устойчивости, опосредованного фитохелатинами. Поэтому представляется целесообразным проведение дальнейших исследований для выявления возможной роли фитохелатинов в проявлении устойчивости к Cd у растений-гипераккумуляторов.

Переносчики Cd

В последние годы достигнут большой прогресс в понимании молекулярных механизмов транспорта металлов через мембраны клетки. Это стало возможным благодаря активному использованию молекулярнобиологических методов с использованием S. cerevisiae и применению полученных результатов для других эукариот, в том числе — для A. thaliana (Hall, Williams,

2003). В результате было выявлено, что в растительных клетках присутствуют различные семейства бел-ков-переносчиков металлов, вовлеченных в поддержание гомеостаза металлов и играющих ключевую роль в возникновении устойчивости к ним. Также в настоящее время проводятся сравнительные исследования транскриптомов видов гипераккумуляторов и родственных им негипераккумулирующих видов, например, A. halleri и A. thaliana (Becher et al., 2004; Weber et al., 2004; Talke et al., 2006). Показано, что виды-гипераккумуляторы характеризуются повышенным уровнем транскрипции генов, кодирующих переносчики металлов. При этом установлено, что повышенный уровень транскрипции не связан с дивергенцией генов видов гипераккумуляторов и негипераккумуляторов, а обуславливается изменением на уровне регуляции генов, либо изменением количества их копий (Hanikenne et al., 2008; Oomen et al., 2009).

АТФ-азы тяжелых металлов

АТФ-азы тяжелых металлов являются членами большого суперсемейства АТФ-аз P-типа, характерного для всех царств живого мира. Подсемейство Р1В АТФаз делится на две группы: переносчики одно и двувалентных металлов (Hall, Williams et al., 2003). У A. thaliana подсемейство P1B включает в себя 8 различных белков (Mills et al., 2003). HMA2 и HMA4, расположенные в плазмаллеме, играют важную роль в ксилемном транспорте из корневой системы в наземную часть растения, как цинка, так и Cd (Kum et al., 2009) (рис. 1). Трансгенные растения со сверхэкспрессией гена HMA4 показали увеличенную устойчивость к Cd и аккумуляцию Cd в листьях (Verret et al., 2004). Недавние исследования показали, что белок HMA3, расположенный на вакуолярной мембране, принимает участие в транспорте Cd и цинка в вакуоль (рис. 1). Растения со сверхэкспрессией гена HMA3 характеризовались повышенной устойчивостью к Cd (Morel et al., 2009).

Недавно с использованием РНК-интерференции было показано, что белок HMA4 играет ведущую роль в гипераккумуляции цинка и устойчивости к цинку и Cd у A. halleri. Гипераккумуляция и гиперустойчивость к Cd у этого растения связаны с трипликацией гена AhHMA4, а также изменением цис-регуляции генов AhHMA4, в результате чего наблюдается их повышенная экспрессия у A. halleri по сравнению с A. thaliana (Hanikenne et al., 2008).

Nramp

Представители семейства белков Nramp участвуют в транспорте ряда двухвалентных металлов, включая железо и Cd. Nramp высококонсервативны, содержат 12 трансмембранных доменов с характерным «консенсусным транспортным мотивом» (Hall, Williams, 2003). Экспрессия генов AtNrampl, AtNramp3 и AtNramp4 в дрожжевых клетках вызывает повышенную чувствительность к Cd и накопление данного тяжелого металла. Показано, что дизрупция гена AtNramp3 вызывает небольшое увеличение устойчивости к Cd, но в тоже время сверхэкспрессия этого гена вызывает гиперчувствительность к Cd у A. thaliana (Thomine et al., 2000). У A. thaliana экспрессия генов AtNramp3 выявлена в проводящей системе корней, стеблей и листьев, что свидетельствует о том, что белок AtNramp3 может функционировать в переносе металлов на дальние расстояния. При этом показано, что он локализуется в вакуолярной мембране и может мобилизовать пул металлов из вакуоли (рис. 1) (Thomine et al., 2003). У гипераккумулятора T. caerulescens был выявлен повышенный уровень экспрессии генов TcNramp3 и TcNramp4 по сравнению с генами AtNramp3 и AtNramp4 у A. thaliana, хотя и те, и другие присутствуют в геноме в единичной копии (Oomen et al., 2009). В единичной копии эти гены также присутс-твовуют у родственных видов T. minimum и T. praecox, в то время как у T. perfoliatum — в двух копиях, а у T. japonicum были выявлено несколько копий этих генов. По всей видимости, повышенный уровень экспрессии генов TcNramp3 и TcNramp4 по сравнению с генами AtNramp3 и AtNramp4 A. thaliana связан с различиями в цис- или трансрегуляторных элементах (Oomen et al., 2009).

CDF

Семейство белков CDF участвует в транспорте цинка, кобальта и, по всей видимости, Cd. Белки данного семейства содержат 6 трансмембранных доменов, кати-он-связывающий домен на С-конце, а также гистидин-богатый домен, вероятно участвующий в связывании цинка между 4-м и 5-м трансмембранными доменами (Hall, Williams, 2003). У A. thaliana гены, кодирующие CDF белки, были названы ZAT генами, они вовлечены в перенос Zn в вакуоль, обеспечивая тем самым его гомеостаз (Van der Zaal et al., 1999). У гипераккумулятора

никеля T. goesingense был выявлен ортолог ZAT гена

A. thaliana — ген TgMTPl. Данный ген кодирует два транскрипта, один из которых — TgMTPltl подвергается сплайсингу, а второй — TgMTPlt2 — нет. Транскрипты различаются по последовательности гистидин-богатого домена, что, вероятно, обеспечивает специфичность этих переносчиков к разным металлам. Так, TgMTPltl, экспрессируясь в дрожжевых клетках, способствует их устойчивости к Cd, кобальту и цинку, а TgMTPlt2 к никелю (Persans et al., 2001).

ZIP

К настоящему моменту у A. thaliana выявлено около 15 белков ZIP семейства. ZIP белки содержат 8 трансмембранных доменов, при этом C и N концы расположены на внешней поверхности плазматической мембраны. Между 2-м и 3-м трансмембранными доменами располагается вариабельный участок, содержащий потенциальный металл-связывающий домен, обогащенный гистидином (Hall, Williams, 2003). У A. thaliana с использованием функциональной комплементации мутанта дрожжей, неспособного поглощать железо, был клонирован ген AtlRTl, кодирующий основной переносчик железа в корнях, при этом растения со сверхэкспрессией AtIRTl аккумулировали более высокие концентрации Cd и Zn по сравнению с растениями дикого типа (рис. 1) (Connolly et al., 2002; Vert et al., 2002). У T. caerulescens был клонирован ген переносчика ZNTl, гомолог ZIP генов, участвующий в транспорте цинка и Cd (Pence et al., 2000).

ABC переносчики

ABC переносчики представлены большим семейством мембранных белков, выполняющих различные транспортные функции. Для всех белков данного семейства характерны высокогидрофобный трансмембранный домен и цитоплазматический АТФ-связывающий домен (Hall, Williams et al., 2003). Ранее был упомянут гипотетический переносчик НМК и комплексов глутатиона в вакуоль — гомолог HMT1 S. pombe. Недавно были выявлены другие ABC переносчики, принимающие участие в детоксикации Cd в растительной клетке.

У A. thaliana путем анализа микрочипа, содержащего гены, кодирующие потенциальные ABC переносчики, было выявлено усиление экспрессии гена AtPDR8 под воздействием ионов Cd2+, Pb2+ или Cu2+. В случае воздействия Cd2+ наблюдалось усиление уровня экспрессии AtPDR8 в 1,5 раза в стеблях и в 1,8 раз в корнях. Трансгенные растения со сниженным уровнем экспрессии AtPDR8 характеризовались резким снижением устойчивости к Cd2+ и Pb2+. Напротив, трансгенные растения со сверхэкспрессией AtPDR8 характеризовались повышенной устойчивостью к Cd2+ и Pb2+. Устойчивость растений к тяжелым металлам коррелировала со снижением уровня Cd и свинца у растений со сверхэкспрессией AtPDR8. Анализ экспрессии репортерной конструкции

GFP:AtPDR8 показал локализацию AtPDR8 на плазматической мембране (рис. 1). Полученные данные свидетельствуют о действии AtPDR8 как важнейшего переносчика Cd из клетки (Kim et al., 2007).

Другой представитель ABC переносчиков — белок AtATM3, участвующий в поддержании гомеостаза железа в митохондриях (Kushnir et al., 2001). Было выявлено повышение уровня экспрессии гена AtATM3 в 2,5 раза в корнях A. thaliana после 24 ч обработки трехнедельных растений 50 мкМ CdCl2, сходные результаты наблюдались и при обработке растений 500 мкМ Pb(NO3)2 (Kim et al., 2006). Трансгенные растения со сверхэкспрессией гена AtATM3 показали повышенную устойчивость к Cd2+ и Pb2+. Предполагается, что AtATM3 участвует в экспорте коньюгатов Cd с глутатионом из митохондрии в цитоплазму (рис. 1).

Другие переносчики

У A. thaliana был выявлен переносчик AtDTX1, локализованный на плазматической мембране, который осуществляет транспорт различных токсичных веществ (алкалоидов, антибиотиков) из цитоплазмы клетки, в том числе и Cd (рис. 1). Ген AtDTXl является представителем большого мультигенного семейства, имеющего сходство с бактериальным семейством генов, кодирующих переносчики многих лекарственных препаратов (MATE — multidrug and toxic compound extrusion) (Li et al., 2002).

Белок AtMHX, транспортирующий Cd в вакуоль, представлен в геноме в единичной копии (рис. 1) (Shaul et al., 1999). Позднее было показано, что трансгенные растения табака со сверхэкспресией гена AtMHX, в отличие от контрольных растений, проявляют некротические повреждения листьев при росте при повышенных концентрациях Mg2+, Zn2+ и Cd2+, что свидетельствует о том, что переносчик AtMHX может переносить in vivo ионы тяжелых металлов, в том числе Cd2+ (Berezin et al., 2008).

Недавно были получены данные, свидетельствующие о том, что механизмы устойчивости к Cd могут различаться у однодольных и двудольных растений (Kim et al., 2008). С использованием скрининга кДНК библиотеки Triticum aestivum на функциональную комплементацию мутанта дрожжей Aycfl, чувствительного к Cd, был выявлен ген TaTM20, предположительно кодирующий переносчик Cd. Дрожжи, трансформированные TaTM20, аккумулируют меньше Cd и выводят его быстрее, по сравнению с контролем, что определяет повышенную устойчивость трансформантов к Cd. Интересно отметить, что уменьшение содержания Cd в клетках дрожжей не сопровождается изменением в гомеостазе других двухвалентных элементов. Гомологи TaTM20 были выявлены у других однодольных растений, но не были обнаружены у A. thaliana. Более того, эктопическая экспрессия TaTM20 у A. thaliana не влияла на устойчивость растений к Cd и его аккумуляцию, что подтверждает уникальность механизма устойчивости, опосредованного TaTM20, для однодольных.

Другие белки

Совсем недавно была проведена трансформация

S. pombe библиотекой кДНК B. juncea и отобран клон, проявляющий повышенную устойчивость к Cd, а также к другим металлам (мышьяку, меди и цинку) и окислителям (Blanvillain et al., 2009). Была предположена роль данного гена в адаптации растений к окислительному стрессу. Действительно, отобранный клон продуцировал меньшее количество супероксид радикалов, по сравнению с контролем. Выявленный ген BjOXS3 (B. juncea OXIDATIVE STRESS 3) кодирует белок из 175 а. к., который принадлежит к семейству, включающему в себя 22 В^ХБЗ-подобных белка, которые были найдены только у растений. Все эти белки характеризуются наличием консервативного каталитического домена, обладающего потенциальной N-ацетилтрансферазной или тиол-трансферазной активностью. Важность данного домена для проявления устойчивости к Cd и другим стрессовым факторам была установлена с помощью направленного мутагенеза. Белок BjOXS3 был ко-локализован в ядре с гистоном H4. Это позволило предположить, что BjOXS3 вовлечен в ацетилирование гистона H4, изменяя тем самым стабильность нуклеосомы. Таким образом, предполагается, что BjOXS3 запускает специфичную экспрессию генов в ответ на стресс посредством реорганизации структуры хроматина (Blanvillain et al., 2009).

МикроРНК

Недавно было выявлено, что микроРНК играют важную роль в возникновении устойчивости растений к Cd. У Medicago truncatula выявлено шесть микроРНК, уровень экспрессии которых менялся после воздействия Cd. При этом уровень экспрессии miR393, miR171, miR319, miR529 увеличивался, в то время как miR166 и miR398 — снижался. Снижение уровня экспрессии miR398 связано с необходимостью усиления экспрессии генов CSD1 и CSD2, кодирующих супероксиддисмутазы, вовлеченных в адаптацию растения к окислительному стрессу, вызванному Cd (Ding, Zhu, 2009). При исследованиях риса, M. truncatula и Brassica napus при действии Cd стресса были выявлены общие микроРНК: miR393 и miR171, ингибирующие действия генов-мишеней, участвующих в убикви-тиновом пути передачи сигнала и связанных с передачей ауксинового сигнала и развитием цветка. Это свидетельствует о том, что ряд микроРНК играют важную роль в ответах растения, как на абиотические стрессы, так и в регуляции развития (Ding, Zhu, 2009).

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К Cd И ЕГО АККУМУЛЯЦИИ

Для изучения генетического контроля устойчивости растений к тяжелым металлам были использованы два подхода: анализ варьирования данных признаков в природных популяциях и экспериментальный мутагенез.

Генетический анализ популяций ряда высших растений показал, что основная устойчивость к некоторым металлам (мышьяк, медь, цинк) скорее всего, определяется одним или двумя основными генами и работой генов-модификаторов, определяющих уровень устойчивости (Schat et al., 1993; Smith, Macnair, 1998). Устойчивость к определенному металлу обычно контролируется геном (или генами), отличными от генов, определяющих устойчивость к другому металлу (Tilstone et al., 1997). Исследования природных популяций арахиса, гороха, кукурузы, пшеницы, риса, сои, ячменя, и гипераккумуляторов

B. juncea и T. caerulescens выявили широкий полиморфизм по признакам основной и гиперустойчивости к Cd и его аккумуляции и гипераккумуляции (Arao, Ae, 2003; Bell et al., 1997; Belimov et al., 2003, 2007; Clarke et al., 1997; Liu et al., 2005; Roosens et al., 2003). Так, например, у гороха содержание Cd в сухой биомассе при выращивании растений в присутствии 5 мг Cd на кг-1 варьировало между различными генотипами от 35 мг Cd на кг-1 до 135 мг Cd на кг-1 , а индекс устойчивости варьировал от 54 до 100 % (Belimov et al., 2003).

Для твердой пшеницы было показано, что признак пониженного содержания Cd в зерне контролируется доминантной аллелью одного гена (Clarke et al., 1997), который локализован на хромосоме 5B (Grant et al., 2008). Линии с признаком пониженного содержания Cd характеризовались сниженным переносом Cd из корневой системы в наземную часть, что ограничивало его поступление в зерно (Chan, Hale, 2004). Было показано, что признак пониженного поглощения Cd не влияет на поглощение других элементов, хотя имеются указания, что он может быть связан с уменьшением аккумуляции в зерне цинка при дефиците цинка (Hart et al., 2005). Выполнение 10-летней программы по созданию сортов пшеницы с пониженным содержанием Cd в Канаде привело к регистрации новых сортов. Первый такого рода коммерческий сорт Strongfield начал возделываться в 2004 г. и в настоящее время занимает 25 % от площадей, занятых посевами твердой пшеницы в Канаде (Grant et al., 2008).

Однако до сих пор остается нерешенным вопрос, являются ли гиперустойчивость и гипераккумуляция Cd связанными событиями или независимыми. Для решения данной проблемы проводят исследование результатов направленных скрещиваний растений, различающихся по признакам устойчивости и аккумуляции тяжелых металлов, в том числе — межвидовых гибридов. Группой исследователей было получено поколение F1 от скрещивания растения-гипераккумулятора A. halleri и не аккумулирующего вида A. petraea (Macnair et al., 1999), которое затем было скрещено с родительскими видами. Поколение Fb сильно варьировало по признаку аккумуляции цинка: были выявлены индивидуальные растения, аккумулирующие также мало цинка как A. petraea, также много как A. halleri и промежуточные варианты. Ге-

нетический анализ признака устойчивости показал, что устойчивость к меди, цинку и Cd, по видимому, определяется одним геном (Schat et al., 1996). Анализ поколения F2, полученного от скрещивания A. halleri и A. petraea (Bert et al., 2003; Macnair et al., 1999), а также анализ поколений, полученных в результате скрещиваний различных популяций T. caerulescens (Zha et al., 2004), показали, что гипераккумуляция Cd и устойчивость к Cd не связаны между собой. Однако при исследовании Lombi с коллегами (Lombi et al., 2000) 4 различных популяций T. caerulescens были получены противоположные данные. В ходе исследований была выявлена разница между популяциями по способности накапливать Cd в побегах и по признаку устойчивости к данному тяжелому металлу. Растения из популяции, накапливающие наибольшее количество Cd, были также и наиболее устойчивыми к его токсическому действию. Таким образом, результаты данных исследования указывают на общий генетический контроль признаков гипераккумуляции Cd и гиперустойчивости к нему растений (Lombi et al., 2000).

Хотя экспериментальный мутагенез представляет собой эффективный метод изучения молекулярно-генетических механизмов, однако к настоящему времени описано только несколько мутантов растений с измененными чувствительностью к Cd или его аккумуляцией.

У растений мутанта cadl — 1 A. thaliana, в отличие от дикого типа, на питательной среде с 0,6 мкМ Cd замедлялся рост, наблюдались хлороз листьев и выработка корнями коричневого пигмента (Howden, Cobbett, 1992). Предполагается, что коричневый пигмент — это результат образования металл-сульфидных комплексов. Особенности фенотипа данного мутанта были использованы для идентификации трех других аллельных мутаций cadl. Генетический анализ полученных мутантов показал, что повышенная чувствительность к Cd наследуется как моногенный рецессивный признак. Мутант cadl—3 был получен с использованием химического мутагенеза ДЭБ (диэпоксибутан) (Dolezal, Cobbett, 1991). Мутанты cadl—4 и cadl — 5 были получены с использованием ЭМС (этилметан-сульфоната). При сравнении полученных мутантов по чувствительности к Cd было установлено, что мутанты cadl—3 и cadl—4 чувствительны к концентрации Cd 0,3 мкМ, в то время как мутанты cadl — l и cadl—5 — к 0,6 и 1,5 мкМ соответственно. С использованием высокоэффективной гель-фильтрации было показано, что у мутантов cadl — l и cadl—3 снижена способность образовывать Cd-связывающие комплексы. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии выявило снижение способности cadl мутантов запасать фитохелатины. Содержание фи-тохелатинов, у каждого мутанта коррелировало с уровнем его чувствительности к Cd. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что у мутантов по гену cadl снижена активность фитохелатинсинтазы (Howden et al., 1995а). Локус CADl был локализован на 5-й хро-

мосоме A. thaliana. Позиционное клонирование показало, что ген CAD1 является выявленным ранее в процессе секвенирования генома A. thaliana геном MRH10.11. Показано, что мутации cad1 — 1, cad1—4 и cad1—5 — это транзиции, а мутация cad1—3 — это трансверсия G—C ^ C—G. кДНК, полученная обратной транскрипцией данного участка, содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок массой 55 кДа, содержащий 485 а.к. Экспрессия кДНК CAD1 в клетках E. coli показала, что экстракты из этих клеток катализируют синтез фитохелатинов, активируемый тяжелыми металлами, что подтвердило, что ген CAD1 кодирует фитохелатин-синтазу (Ha et al., 1999).

Во время исследований cad1 мутантов, был выделен еще один мутант A. thaliana, чувствительный к Cd, — cad2. Генетический анализ показал, что чувствительность к Cd — моногенный рецессивный признак. В отсутствие Cd не было выявлено разницы в росте между мутантом cad1 — 1, cad2 и диким типом. При концентрации Cd 6 мкМ дикий тип продолжал расти, в то время как у мутанта cad1 — 1 наблюдалось снижение темпов роста уже при концентрации Cd 1 мкМ. Мутант cad2 проявил промежуточный фенотип: ингибирование роста наблюдалось при концентрации Cd

3 мкМ, и не было выявлено при концентрации, критичной для cad1 — 1 мутанта (Howden et al., 1995b).

У мутанта cad2 снижена способность изолировать Cd. Уровень Cd-связывающих комплексов, формирующихся in vivo, у растений cad2 был снижен по сравнению с диким типом. Аккумуляция фитохелатинов составляла порядка 10 % от их количества у дикого типа. Уровень глутатиона, субстрата для биосинтеза фитохелатинов, в тканях cad2 мутанта был снижен до 15—30 % по сравнению с диким типом. Также был снижен уровень у-глутамилцистеин-синтетазы. Уровень цистеина был вдвое выше, чем у растений дикого типа. Данные факты позволили предположить, что у мутанта был нарушен биосинтез глутатиона, а именно снижена активность у-глутамилцистеин-синтетазы. Данное предположение подтвердилось биохимическими исследованими in vitro, показавшими снижение активности данного фермента по сравнению с диким типом, в то время как активность глутатион-синтетазы не менялась (Howden et al., 1995b).

Локус CAD2 был локализован на 4-й хромосоме и показал тесное сцепление с локусом GSHA, который кодирует у-глутамилцистеин-синтетазу. Дальнейшими исследованиями было установлено, что ген CAD2 содержит 15 интронов, размер которых варьирует от 77 до 359 п. о. Размер экзонов варьирует от 69 до 340 п. о. Нуклеотидная последовательность гена GSHA cad2 мутанта содержит делецию 6 п. о. в 6-м экзоне (Cobbett et al., 1998).

Характеристика полученных мутаций показывает, что модификации в единичных генах существенно влияют на основную устойчивость к тяжелым металлам или на их накопление. Однако до недавнего времени не было описано

успешных экспериментов, в ходе которых был бы получен мутант с обеими измененными характеристиками.

Недавно у гороха был описан новый мутант, полученный после ЭМС мутагенеза исходной линии SGE, характеризующийся повышенным накоплением Сё и устойчивостью к токсичным концентрациям Сё (Тзу§апоу е! а1., 2007). Мутант SGECdt был охарактеризован как имеющий моногенное наследование и рецессивное проявление фенотипа. Мутантный локус был локализован в VI группе сцепления гороха (Тзу§апоу е! а1., 2008). Биохимический анализ маркеров стресса (хитиназа, пероксидаза и пролин) показали, что у данного мутанта снижен уровень стрессового ответа на действие Сё. Установлено, что устойчивость мутанта SGECdt к Сё не связана с процессами синтеза глутатиона и работой фитохелатинсинтазы. Таким образом, этот мутант одновременно аккумулирует Сё и является устойчивым к его токсическому действию и представляет собой новую и уникальную модель для изучения адаптаций растений к токсическим концентрациям тяжелых металлов (Тэу§апоу е! а1., 2007). Примечательно, что мутант способен как формировать клубеньки при более высоких концентрациях Сё, по сравнению с исходной линией, так и поддерживать их функциональную активность (Тзу§апоу е! а1., 2008).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние 10 лет наши представления о механизмах устойчивости растений к Сё и его аккумуляции значительно расширились. Исследовано распределение этих признаков между экотипами некоторых видов-гипераккумуляторов Сё и ценных для сельского хозяйства видов. Были выявлены различные классы белков, влияющие на проявление устойчивости к Сё. Было показано, что у растений-гипераккумуляторов Сё наблюдается повышенный уровень экспрессии генов, кодирующих переносчики металлов, который связан с изменением регуляции генов и количества их копий. Т. е., по всей видимости, при проявлении растением основной и гиперустойчивости к кадмию в основном используются одни и те же механизмы (за исключением синтеза фитохелатинов при основной устойчивости). Однако в случае гиперустойчивости ряд механизмов значительно активирован. Тем не менее, в этом направлении требуется проведение дальнейших исследований. Так, у растений до сих пор не выявлен АВС переносчик, вовлеченный в перенос комплексов Сё с фитохелатинами в вакуоль, хотя данный механизм рассматривается как главный в проявлении основной устойчивости. В то же время, было показано, что фитохелатины играют важную роль детоксикации Сё не только у растений, но и у животных. Достижения в генетике устойчивости растений к Сё позволили успешно реализовать в Канаде программу по селекции сортов твердой пшеницы с пониженным поглощением

Cd. В настоящее время такие программы проводятся для риса и сои. Активное использование экспериментального мутагенеза является перспективным методом, стимулирующим генетические исследования в данной области. Расширение наших знаний о молекулярно-генетических механизмах устойчивости растений к Cd будет способствовать решению другой важной практической задачи — разработки новых перспективных технологий, основанных на использовании фиторемедиации для очистки почв, загрязненных тяжелыми металлами.

БЛАГОДАРНОСТИ

Данная работа была финансово поддержана: Федеральным агентством по науке и инновациям (государственный контракт № 02.740.11.0276), Федеральным агентством по образованию (государственные контракты № П290, П1746), РФФИ (08-04-01565-а; 08-04-90051-Бел_а), грантом Президента РФ (НШ-5399.2008.4), Администрацией Санкт-Петербурга (договор 368/08).

Литература

1. Серегин И., 2001. Фитохелатины и их роль в детоксикации кадмия у высших растений // Усп. биол. химии. Т. 41. С. 283—300.

2. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М. и др.,

2007. Устойчивость растений к тяжелым металлам. — Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 172 с.

3. Цыганов В. Е., Заболотный A. И., Будкевич Т. А. и др., 2010. Влияние кадмия на развитие и функционирование клубеньков у лядвенца рогатого (Lotus corniculatus L.) и лядвенца японского (Lotusjaponi-cus (Regel.) K. Larsen) // Ботаника (Исследования). Выпуск 38. С. 343—354.

4. Arao T., Ae N., 2003. Genotypic variations in cadmium levels of rice grain // Soil Sci. Plant Nutr. Vol. 49. P. 473-479.

5. Baker A. J. M., 1981. Accumulators and excluders strategies in the response of plants to heavy metals // J. Plant Nutr. Vol. 3. P. 643-654.

6. Becher M., Talke I., Krall L., Kramer U., 2004. Crossspecies microarray transcript profiling reveals high constitutive expression of metal homeostasis genes in shoots of the zinc hyperaccumulator Arabidopsis hal-leri // Plant J. Vol. 37. P. 251-268.

7. Belimov A. A., Safronova V. I., Tsyganov V. E. et al., 2003. Genetic variability in tolerance to cadmium and accumulation of heavy metals in pea (Pisum sativum L.) // Euphytica. Vol. 131. P. 25-35.

8. Belimov A., Safronova V., Demchinskaya S., Dzyuba O., 2007. Intraspecific variability of cadmium tolerance in hydroponically grown Indian mustard (Brassica juncea (L.) Czern.) seedlings // Acta Physiol. Plant. Vol. 29. P. 473-478.

9. Bell M. J., McLaughlin M. J., Wright G. C., Cruick-shank J., 1997. Inter- and intra-specific variation in accumulation of cadmium by peanut, soybean, and navy bean // Aust. J. Agr. Res. Vol. 48. P. 1151-1160.

10. Berezin I., Mizrachy-Dagry T., Brook E., Mizrahi K., 2008. Overexpression of AtMHX in tobacco causes increased sensitivity to Mg2+, Zn2+, and Cd2+ ions, induction of V-ATPase expression, and a reduction in plant size // Plant Cell Rep. Vol. 27. P 939-949.

11. Bert V., Meerts P., Saumitou-Laprade P. et al., 2003. Genetic basis of Cd tolerance and hyperaccumulation in Arabidopsis halleri // Plant Soil. Vol. 249. P. 9-18.

12. Blanvillain R., Kim J., Wu S., Lima A., 2009. OXIDATIVE STRESS 3 is a chromatin-associated factor involved in tolerance to heavy metals and oxidative stress // Plant J. Vol. 57. P. 654-665.

13. BrooksR. R., 1998. Plants that hyperaccumulate heavy metals. Wallingfors: CAB Intl., 381 p.

14. Callahan D. L., Baker A. J. M., Kolev S. D., Wedd A. G., 2006. Metal ion ligands in hyperaccumulating plants // J. Biol. Inorg. Chem. Vol. 11. P. 2-12.

15. Chan D. Y., Hale B. A., 2004. Differential accumulation of Cd in durum wheat cultivars: uptake and retranslocation as sources of variation // J. Exp. Bot. Vol. 55 P. 2571-2579.

16. Chen Y., He Y., Yang Y., Yu Y., 2003. Effect of cadmium on nodulation and N2-fixation of soybean in contaminated soils // Chemosphere. Vol. 50. P781-787.

17. Clarke J. M., Leisle D., Kopytko G. L., 1997. Inheritance of cadmium concentration in five durum wheat crosses // Crop Sci. Vol. 37. P. 1722-1726.

18. Clemens S., 2001. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis // Planta. Vol. 212. P. 457-486.

19. Clemens S., 2006. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants // Biochimie. Vol. 88. P. 1707-1719.

20. Cobbett C. S., May M. J., Howden R., RollsB., 1998. The glutathione-deficient, cadmium-sensitive mutant, cad2-l, of Arabidopsis thaliana is deficient in y-glutamylcysteine synthetase // Plant J. Vol. 16. P. 73-78.

21. Connolly E. L., Fett J. P., Guerinot M. L., 2002. Expression of the IRT1 metal transporter is controlled by metals at the levels of transcript and protein accumulation // Plant Cell. Vol. 14. P. 1347-1357

22. DalCorso V., Farinati S., Maistri S., Furini A., 2008. How plants cope with cadmium: staking all on metabolism and gene expression // J. Integr. Plant Biol. Vol. 50. P. 1268-1280.

23. Ding Y., Zhu Ch., 2009. The role of microRNAs in copper and cadmium homeostasis // Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 386. P. 6-10.

24. Dolezal O., Cobbett C., 1991. Arabinose kinase-deficient mutant of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. Vol.96. P. 1255-1260.

25. Dominguez-Solis J., Gutierrez-Alcala G., Vega J., Romero L., 2001. The cytosolic O-acetylserine(thiol)lyase gene is regulated by heavy metals and can function in cadmium tolerance // J. Biol. Chem. Vol. 276. P 9297-9302.

26. Ebbs S., Lau I, Ahner B., Kochian L., 2002. Phyto-chelatin synthesis is not responsible for Cd tolerance in the Zn/Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // Planta. Vol. 214. P. 635-640.

27. Fusconi A., Gallo C., Camusso W., 2007. Effects of cadmium on root apical meristems of Pisum sativum L. Cell viability, cell proliferation and microtubule pattern as suitable markers for assessment of stress pollution // Mut. Res. Vol. 632. P. 9-19.

28. Grant C., Clarke J., Duguidcand S., Chaney R. L.,

2008. Selection and breeding of plant cultivars to minimize cadmium accumulation // Sci. Total Environ. Vol. 390. P. 301-310.

29. Guyon V., Astwood J., Garner E., Dunker A., 2000. Isolation and characterization of cDNAs expressed in the early stages of flavonol-induced pollen germination in petunia // Plant Physiol. Vol. 123. P. 699-710.

30. Ha S., Howden R., Dietrich W., Bugg S., 1999. Phyto-chelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast Schizosaccharomyces pombe // Plant Cell. Vol. 11. P. 1153-1163.

31. Hall J. L., Williams L. E., 2003. Transition metal transporters in plants. J. Exp. Bot. Vol. 54. P. 2601-2613.

32. Hanikenne M., Talke I. N., Haydon M. J. et al., 2008. Evolution of metal hyperaccumulation required cis-regulatory changes and triplication of HMA4 // Nature. Vol. 453. P. 391-395.

33. Hart J. J, Welch R. M., Norvell W. A. et al., 2005. Zinc effects on cadmium accumulation and partitioning in near-isogenic lines of durum wheat that differ in grain cadmium concentration // New Phytol. Vol. 167. P 391-401.

34. Howden R., Cobbett C. S., 1992. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. Vol. 100. P. 100-107.

35. Howden R., Andersen C. R., Goldsbrough P. B., Cobbett C. S., 1995a. A cadmium-sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. Vol. 107. P. 1067-1073.

36. Howden R., Goldsbrough P. B., Andersen C. R., Cobbett C. S., 1995b. Cadmium-sensitive, cadl mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin deficient // Plant Physiol. Vol. 107. P. 1059-1066.

37. Kim D., Bovet L., Kushnir S., Noh E., 2006. AtATM3 is involved in heavy metal resistance in Arabidopsis // Plant Physiol. Vol. 140. P. 922-932.

38. Kim D., Bovet L., Maeshima M., Martinoia E., 2007. The ABC transporter AtPDR8 is a cadmium extrusion pump conferring heavy metal resistance // Plant J. Vol. 50. P. 207-218.

39. Kim Y., KimD., ShimD., Song W., 2008. Expression of the novel wheat gene TM20 confers enhanced cadmium

tolerance to bakers' yeast // J. Biol. Chem. Vol. 283. P. 15893-15902.

40. Krotz R. M., Evangelou B. P., Wagner G. J., 1989. Relationships between cadmium, zinc, Cd-binding peptide, and organic acid in tobacco suspension cells // Plant Physiol. Vol. 91. P. 780-787.

41. Kum Ch., Wong E., Cobbett Ch., 2009. HMA P-type ATPases are the major mechanism for root-to-shoot Cd translocation in Arabidopsis thaliana // New Phytol. Vol. 181. P. 71-78.

42. Kushnir S., Babiychuk E., Storozhenko S., Davey M., 2001. A mutation of the mitochondrial ABC transporter Stal leads to dwarfism and chlorosis in the Arabidopsis mutant starik // Plant Cell. Vol. 13. P. 89-100.

43. Lane T. W., Saito M. A., George G. N. et al., 2005. A cadmium enzyme from a marine diatom // Nature. Vol. 435. P. 42.

44. Li L., He Z., Pandey G. K. et al., 2002. Functional cloning and characterization of a plant efflux carrier for multidrug and heavy metal detoxification // J. Biol. Chem. Vol. 277. P. 5360-5368.

45. Liu J., Zhu Q., Zhang Z. et al., 2005. Variations in cadmium accumulation among rice cultivars and types and the selection of cultivars for reducing cadmium in the diet // J. Sci. Food Agr. Vol. 85. P. 147-153.

46. Liu M. Q., Yanai J., Jiang R. F. et al., 2008. Does cadmium play a physiological role in the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens? // Chemosphere. Vol. 71. P. 1276-1283.

47. Lombi E., Zhao F. J., Dunham SJ., McGrath S. P.

2000. Cadmium accumulation in populations of Thlaspi caerulescens and Thlaspi goesingense // New Phytol. Vol. 145. P. 11-20.

48. MacnairM. R., Bert V., Huitson S. B. et al., 1999. Zinc tolerance and hyperaccumulatin are genetically independent characters // Proc. R. Soc. Lond. Biol. Sci. Vol. 266. P. 2175-2179.

49. Matsuda T., Kuramata M., Takahashi Y. et al., 2009. A novel plant cysteine-rich peptide family conferring cadmium tolerance to yeast and plants // Plant Sign. Behav. Vol. 4:5. P. 419-421.

50. Mills R., Krijger G., Baccarini P. et al., 2003. Functional expression of AtHMA4, a P1B-type ATPase of the Zn/Co/Cd/Pb subclass // Plant J. Vol. 35. P. 164-176.

51. Morel M., Crouzet J., Gravot A., 2009. AtHMA3, a P1B-ATPase allowing Cd/Zn/Co/Pb vacuolar storage in Arabidopsis // Plant Physiol. Vol. 149. P. 894-904.

52. Oomen R. J. F. J., Wu J., Lelievre F. et al., 2009. Functional characterization of NRAMP3 and NRAMP4 from the metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens // New Phytol. Vol. 181. P. 637-650.

53. Ortiz D. F., Kreppel L., Speiser D. M. et al., 1992. Heavy metal tolerance in the fission yeast requires an ATP-binding cassette-type vacuolar membrane transporter // EMBO J. Vol. 11. P. 3491-3499.

54. PalmiterR. D., 1998. The elusive function of metallothion-eins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95. P. 8428-8430.

55. Pan A., Yang M., Tie F. et al. 1994. Expression of mouse metallothionein-I gene confers cadmium resistance in transgenic tobacco plants // Plant Mol. Biol. Vol. 24. P. 341-351.

56. Peer W. A., Baxter I. R., Richards E. L., Freeman J. L., Murphy A. S., 2005. Phytoremediation and hyperaccumulator plants // Molecular Biology of Metal Homeostasis and Detoxification / Eds. M. J. Tamas, E. Marti-noia, Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. P. 299-340.

57. Pence N. S., Larsen P. B., Ebbs S. D., 2000. The molecular physiology of heavy metal transport in the Zn/ Cd hyperaccumulator // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 97. P. 4956-4960.

58. Persans M., Nieman K, Salt D., 2001. Functional activity and role of cation-efflux family members in Ni hyperaccumulation in Thlaspi goesingense // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 98. P. 9995-10000.

59. PreveralS., GayetL., Moldes C. et al., 2009. A common highly conserved cadmium detoxification mechanism from bacteria to humans. Heavy metal tolerance conferred by the ATP-binding cassette (ABC) transporter SpHMT1 requires glutathione but not metal-chelating phytochelatin peptides // J. Biol. Chem. Vol. 284. P. 4936-4943.

60. Reese R., Wagner G., 1987. Effects of buthionine sul-foximine on Cd-binding peptide levels in suspension-cultured tobacco cells treated with Cd, Zn, or Cu // Plant Physiol. Vol. 84. P. 574-577.

61. Rivera-Becerril F., Calantzis C., Turnau K. et al., 2002. Cadmium accumulation and buffering of cadmium-induced stress by arbuscular mycorrhiza in three Pisum sativum L. genotypes // J. Exp. Bot. Vol. 53. P 1177-1185.

62. Rivera-Becerril F., van Tuinen D., Martin-Laurent F. et al., 2005. Molecular changes in Pisum sativum L. roots during arbuscular mycorrhiza buffering of cadmium stress // Mycorrhiza. Vol. 16. P. 51-60.

63. Rivetta A., Negrini N., Cocucci M., 1997. Involvement of Ca2+-calmodulin in Cd2+ toxicity during the early phases of radish (Raphanus sativus L.) seed germination // Plant Cell Environ. Vol. 20. P. 600-608.

64. Roosens N., Verbruggen N., Meerts P. et al., 2003. Natural variation in cadmium tolerance and its relationship to metal hyperaccumulation for seven populations of Thlaspi caerulescens from Western Europe // Plant Cell Environ. Vol. 26. P. 1657-1672.

65. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R., 1999. Response to cadmium in higher plants // Environ. Exp. Bot. Vol. 41. P. 105-130.

66. Sanjaya P., Hsiao P., Su R., Ko S., 2008. Overexpression of Arabidopsis thaliana tryptophan synthase beta l (AtTSBl) in Arabidopsis and tomato confers tolerance to cadmium stress // Plant Cell Environ. Vol. 31. P. 1074-1085.

67. Schat H., Kuiper E., Ten Bookum W. M., Vooijs R., 1993. A general model for the genetic control of copper tolerance in Silene vulgaris: evidence from crosses between plants from different tolerant populations // Heredity. Vol. 70. P. 142-147.

68. Schat H., Vooijs R., Kuiper E., 1996. Identical major gene loci for heavy metal tolerances that have independently evolved in different local populations and subspecies of Silene vulgaris // Evolution. Vol. 50. P. 1888-1895.

69. Shaul O., Hilgemann D. W., de-Almeida-Engler J. et al., 1999. Cloning and characterization of a novel Mg2+/ H+ exchanger // EMBO J. Vol. 18. P. 3973-3980.

70. Singh O., Labana S., Pandey G. et al., 2003. Phytoremediation: an overview of metabolic ion decontamination from soil // Appl. Microb. Biotech. Vol. 61. P. 405-412.

71. Smith S. E., MacnairM. R., 1998. Hypostatic modifiers cause variation in degree of copper tolerance in Mimu-lus guttatus // Heredity. Vol. 80. P. 760-768.

72. Song W-Y., Martinoia E., Lee J. et al., 2004. A novel family Cys-rich membrane proteins mediates cadmium resistance in Arabidopsis // Plant Physiol. Vol. 135. P. 1027-1039.

73. Suzuki N., Yamaguchi Y., Koizumi N., Sano H., 2002. Functional characterization of a heavy metal binding protein Cdl 19 from Arabidopsis // Plant J. Vol. 32. P. 165-173.

74. Talke I. N., Hanikenne M., Krämer U., 2006. Zinc-dependent global transcriptional control, transcriptional deregulation, and higher gene copy number for genes in metal homeostasis of the hyperaccumulator Arabidopsis halleri // Plant Physiol. Vol. 142. P. 148-167.

75. Thomine S., LelieÄvre F., Debarbieux E. et al., 2003. AtNRAMP3, a multispecific vacuolar metal transporter involved in plant responses to iron deficiency // Plant J. Vol. 34. P. 685-695.

76. Thomine S., Wang R., Ward J. M. et al., 2000. Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nramp genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 97. P. 4991-4996.

77. Tilstone G., Macnair M., Smith S., 1997. Does copper tolerance give cadmium tolerance in Mimulus gutta-tus? // Heredity. Vol. 79. P. 445-452.

78. Tommey A. M., Shi J., Lindsay W. P. et al., 1991. Expression of the pea gene PsMTa in E. coli — metal binding properties of the expressed protein // FEBS Letters. Vol. 292. P. 48-52.

79. Tsyganov V., Belimov A., Borisov A. et al., 2007. A chemically induced new pea (Pisum sativum) mutant SGECdt with increased tolerance to, and accumulation of, cadmium // Ann. Bot. Vol. 99. P. 1-11.

80. Tsyganov V., Zhernakov A., Kulaeva O. et al., 2008. Cadmium influence on legume-Rhizobium symbioses. In: Proceedings of 8th European Nitrogen Fixation Conference. Gent, Belgium. August 30 - September 3, P. 201.

81. Ueno D., Ma J. F., Iwashita T. et al., 2005. Identification of the form of Cd in the leaves of a superior Cd accumulating ecotype of Thlaspi caerulescens using Cd-NMR // Planta. vol. 221. P. 928—936.

82. Van der Zaal B. J., Neuteboom L. W., Pinas J. E. et al., 1999. Over-expression of a novel Arabidopsis gene related to putative zinc-transporter genes from animals can lead to enhanced zinc resistance and accumulation // Plant Physiol. vol. 119. P. 1047—1055.

83. Verbruggen N., Hermans Ch., Schat H., 2009. Molecular mechanisms of metal hyperaccumulation in plants // New Phytol. vol. 181. P. 759—776

84. Verret F., Gravot A., Auroy P. et al. 2004. Overexpression of AtHMA4 enhances root-to-shoot translocation of zinc and cadmium and plant metal tolerance // FEBS Letters. vol. 576. P. 306—312.

85. Vert G., Grotz N., Dédaldéchamp F., 2002. IRT1, an Arabidopsis transporter essential for iron uptake from the soil and for plant growth // Plant Cell. vol. 14. P. 1223—1233.

86. Vatamaniuk O. K., Bucher E. A., Sundaram M. V., Rea P. A., 2005. CeHMT-1, a putative phytochela-tin transporter, is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans // J. Biol. Chem. vol. 280. P. 23684—23690.

87. Vatamaniuk O. K., Bucher E. A., Ward J. T., Rea P. A.,

2001. A new pathway for heavy metal detoxification in animals: phytochelatin synthase is required for cadmium tolerance in Caenorhabditis elegans // J. Biol. Chem. vol. 276. P. 20817—20820.

88. Weber M., Harada E., Vess C. et al., 2004. Comparative microarray analysis of Arabidopsis thaliana and Arabidopsis halleri roots identifies nicotinamine synthase, a zip transporter and other genes as potential metal hyperaccumulation factors // Plant J. vol. 37. P. 269—281.

89. Zha H. G., Jiang R. F., Zhao E. J. et al., 2004. Co-segregation analysis of cadmium and zinc accumulation in Thaspi caerulescens interecotypic crosses // New Phytol. vol. 163. P. 299—312.

90. Zhigang A., Cuijie L., Yuangang Z. et. al., 2006. Expression of BjMT2, a metallothionein 2 from Brassica juncea, increases copper and cadmium tolerance in Escherichia coli and Arabidopsis thaliana, but inhibits root elongation in Arabidopsis thaliana seedlings // J. Exp. Bot. vol. 57. P. 3575—3582.

91. Zimeri A. M., Dhankher O. P., McCaig B., Meagher R. B., 2005. The plant MT1 metallothioneins are stabilized by binding cadmium and are required for cadmium tolerance and accumulation // Plant Mol. Biol. vol. 58. P. 839—855.

92. Zornoza P., Vazquez S., Esteban E. et al., 2002. Cadmium-stress in nodulated white lupin: strategies to avoid toxicity // Plant Physiol. Biochem. vol. 40. P. 1003—1009.

MOLECULAR-GENETIC BASIS OF HIGHER PLANTS TOLERANCE TO, AND ACCUMULATION OF, CADMIUM

Kulaeva O. A., Tsyganov V. E.

# SUMMARY: Cadmium (Cd) is one of the most wide-ranged and dangerous pollutants for all living organisms, including plants. At present time the intensive studies of mechanisms of Cd accumulation in plant tissues and plant tolerance to its toxic influence are performed. Data about variation of Cd tolerance and accumulation traits in natural populations of hyperaccumulators species as well as important crops were obtained. A series of mutants with changed sensitivity to Cd was ob-

tained. In recent decade several classes of proteins involving in cell responses to Cd ions were revealed. An important role of microRNA in plant adaptation to Cd was recently demonstrated. Studies of molecular-genetic mechanisms of Cd accumulation and plant tolerance to it are theoretical basis for development of phytoremediation technologies of soil contaminated with heavy metals and breeding of crop varieties with decreased Cd accumulation.

# KEY WORDS: genetic analysis of cadmium tolerance; hyperaccumulation; metal transporters; metallothioneins; phytochelatins; microRNA; phytoremediation; transcriptomic analysis; gene overexpression; RNA intereference.

# Информация об авторах

Кулаева Ольга Алексеевна — инженер-исследователь.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, лаборатория молекулярной и клеточной биологии.

196608 Санкт-Петербург, Пушкин 8, шоссе Подбельского д. 3 E-mail: koa1983@yandex.ru.

Цыганов Виктор Евгеньевич — заведующий лабораторией молекулярной и клеточной биологии, кандидат биологических наук. Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, д. 3. E-mail: viktor_tsyganov@arriam.spb.ru.

Kulaeva Olga Aleksseevna — engineer.

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Podbelsky chausse 3, St.-Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia. E-mail: koa1983@yandex.ru.

Tsyganov ViktorEvgenevich — head of the laboratory. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology, Podbelsky chausse 3, St.-Petersburg, Pushkin 8, 196608, Russia. E-mail: Viktor_Tsyganov@arriam.spb.ru.