ПРИМЕНЕНИЕ АЛЬФА-КЕТОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПИТАНИЯ ИЛИ СОСТОЯНИЯ С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ГЛЮКОЗЫ В ПЛАЗМЕ
APPLICATION OF ALPHA-KETOGLUTARIC ACID FOR TREATMENT OF UNDERNUTRITION OR CONDITION WITH HIGH-GLUCOSE PLASMA LEVEL

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу улучшения всасывания аминокислот, а также к способу уменьшения всасывания глюкозы у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Также рассматривается изготовление композиции для улучшения всасывания аминокислот у указанного позвоночного.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сахарный диабет является серьезным метаболическим заболеванием, которое характеризуется наличием постоянно повышенных уровней глюкозы в плазме. Классическими симптомами сахарного диабета у взрослых являются полиурия, полидипсия, ацетонурия, быстрая потеря массы в сочетании с повышенными уровнями глюкозы в плазме.
Нормальные концентрации глюкозы в плазме натощак составляют менее 115 миллиграммов на децилитр. У пациентов с диабетом обнаруживают концентрации глюкозы в плазме натощак выше 140 миллиграммов на децилитр. Как правило, сахарный диабет развивается в ответ на повреждение бета-клеток поджелудочной железы. Это повреждение может быть вызвано первичным сахарным диабетом, при котором бета-клетки разрушаются аутоиммунной системой, или вторичным диабетическим ответом на другие первичные заболевания, такие как заболевание поджелудочной железы, гормональные нарушения, за исключением отсутствия действия инсулина, лекарственную или химическую индукцию, аномалии рецепторов инсулина, генетические синдромы или др.
Первичный сахарный диабет можно классифицировать как диабет типа I (также называемый инсулинозависимый сахарный диабет или IDDM) или сахарный диабет типа II (также называемый инсулиннезависимый сахарный диабет или NIDDM).
Диабет типа I, юношеский или инсулинозависимый диабет, является хорошо известным гормоно-дефицитным состоянием, при котором бета-клетки поджелудочной железы оказываются разрушенными посредством собственных механизмов иммунной защиты организма. У пациентов с сахарным диабетом типа I способность секретировать эндогенный инсулин слабая или отсутствует. У этих пациентов развивается сильная гипергликемия. Диабет типа I был смертельным до введения приблизительно 70 лет назад заместительной терапии инсулином - сначала с использованием инсулинов из животных источников, и совсем недавно с использованием человеческого инсулина, полученного с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время ясно, что разрушение бета-клеток при диабете типа I приводит к сочетанной недостаточности двух гормонов, инсулина и амилина. Когда клетки поджелудочной железы разрушаются, способность к секреции инсулина и амилина теряется.
Природа повреждения бета-клеток поджелудочной железы при диабете типа II неясна. В отличие от бета-клеток поджелудочной железы диабетиков типа I, бета-клетки диабетиков типа II сохраняют способность синтезировать и секретировать инсулин и амилин. Диабет типа II характеризуется резистентностью к инсулину, то есть недостаточностью нормального метаболического ответа периферических тканей на действие инсулина. Иными словами, резистентность к инсулину представляет собой состояние, при котором циркулирующий инсулин генерирует недостаточный биологический ответ. В клиническом выражении резистентность к инсулину присутствует, когда нормальные или повышенные уровни глюкозы в плазме сохраняются на фоне нормальных или повышенных уровней инсулина. Гипергликемию, ассоциированную с диабетом типа II, можно иногда реверсировать или ослабить с помощью диеты или снижения массы, достаточного для восстановления чувствительности периферических тканей к инсулину. В действительности диабет типа II часто характеризуется гипергликемией в присутствии повышенных, по сравнению с нормальными, уровней инсулина в плазме. Прогрессирование сахарного диабета типа II связано с повышенными концентрациями глюкозы в плазме и сопряжено с относительным снижением скорости секреции инсулина, индуцированной глюкозой. Так, например, на поздней стадии сахарного диабета типа II может присутствовать недостаточность инсулина.
Известное лечение и профилактика сахарного диабета
Первоочередная цель при лечении всех форм сахарного диабета одинакова, а именно: снижение концентраций глюкозы в плазме до значений, насколько возможно близких к нормальным, и за счет этого минимизация как краткосрочных, так и длительных осложнений этого заболевания (Tchobroutsky, Diabetologia 15: 143-152 (1978)).
Связь между степенью гипергликемии при диабете и результирующими длительными осложнениями была дополнительно подтверждена в недавно завершенном Клиническом испытании по контролю за диабетом и его осложнениями (DCCT, Diabetes Control and Complications Trial), предпринятом Национальными Институтами Здравоохранения (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, N. Eng. J. Med. 329:977 (1993)). DCCT проводилось в течение 10-летнего периода в 29 клинических центрах по всей территории США и Канады и показало, что снижение средних концентраций глюкозы в плазме при диабете типа I уменьшало рецепторные осложнения. Развитие ретинопатии снизилось на 76%, прогрессирование ретинопатии на 54%, также уменьшались признаки почечного заболевания (протеинурия, альбуминурия). Также снижалось развитие значительных невропатических изменений.
В лечение диабета типа I неизбежно вовлечено введение заместительных доз инсулина, вводимых парентеральным путем. В комбинации с правильной диетой и самостоятельным мониторингом глюкозы в плазме большинство диабетиков типа I могут достичь определенного уровня контроля глюкозы в плазме.
В противоположность диабету типа I лечение диабета типа II часто не требует применения инсулина. Система терапевтического лечения при диабете типа II обычно включает диетотерапию и изменение образа жизни, сначала обычно в течение 6-12 недель.
Особенности диабетической диеты включают адекватное, но не избыточное суммарное потребление калорий, регулярные приемы пищи, ограничение содержания насыщенного жира, сопутствующее повышение содержания полиненасыщенных жирных кислот и повышенное потребление пищевой клетчатки.
Изменения в образе жизни включают поддержание регулярной физической нагрузки, что способствует как регуляции массы, так и снижению степени резистентности к инсулину.
Если после адекватной диеты и изменений образа жизни гипергликемия натощак сохраняется, тогда может быть поставлен диагноз «первичное нарушение питания», и тогда для регуляции глюкозы в плазме и посредством этого минимизации осложнений заболевания будет необходима либо пероральная гипогликемическая терапия, либо непосредственно система инсулинотерапии. Диабет типа II, который не реагирует на диету и снижение массы, может реагировать на терапию пероральными гипогликемическими агентами, такими как сульфонилмочевины или бигуаниды. Инсулинотерапию, однако, используют для лечения других пациентов с диабетом типа II, особенно тех, кто претерпел неудачу при первичной диете и не страдает ожирением, или тех, кто претерпел неудачу как при первичной диете, так и при вторичной пероральной гипогликемической терапии.
Применение агонистов амилина в лечении сахарного диабета описано в патентах США №№5124314 и 5175145. Избыток амилинового действия имитирует основные признаки диабета типа II, и амилиновая блокада предложена в качестве новой терапевтической стратегии.
Известными терапевтическими средствами являются, например, диабетические пилюли, основанные, например, на сульфонилмочевинах, которые помогают поджелудочной железе производить больше инсулина и помогают организму лучше использовать инсулин. Возможные побочные эффекты: гипогликемия, расстройство желудка, кожная сыпь или зуд и прибавление массы.
Другие пилюли основаны на бигуанидах, которые ограничивают продуцирование глюкозы печенью, а также снижают количество инсулина в организме, улучшают показатели жира и холестерина в крови. Возможными побочными эффектами являются болезненное состояние в сочетании с алкоголем, ухудшение существующих проблем с почками, слабость, головокружение, затруднение дыхания, тошнота и диарея.
Другие пилюли основаны на ингибиторах альфа-глюкозидазы и блокируют ферменты, которые расщепляют крахмал. Возможными побочными эффектами являются проблемы с желудком.
Другие пилюли основаны на тиазолидиндионах, которые помогают клеткам стать более чувствительными к инсулину. Возможными побочными эффектами является то, что их не следует применять при сопутствующем заболевании печени (регулярные проверки), гипогликемия и применение только в комбинации с другой терапией, а также менее эффективное действие противозачаточных пилюль, прибавление массы, риск анемии, припухлости (отек).
Другие пилюли основаны на меглитинидах, которые помогают поджелудочной железе производить больше инсулина после еды. Возможными побочными эффектами являются гипогликемия и прибавление массы.
Кроме того, существует комбинация пероральных лекарств, основанная, например, на глибуриде (сульфонилуреазе) и метформине (бигуаниде), под названием, например, "Glucovance". Возможными побочными эффектами являются гипогликемия, невозможность применения при заболевании почек и нежелательность применения в сочетании с алкоголем.
В патенте США №5234906 раскрыты композиции, содержащие глюкагон и агонист амилина, и их применение для регуляции или лечения гипергликемических состояний.
В WO 93/10146 раскрыты агонисты амилина и их применение для лечения или предупреждения гипергликемических состояний, включая инсулинозависимые состояния, такие как сахарный диабет.
Почечная недостаточность и недостаточность питания
Почечная недостаточность или дисфункция почек представляет собой состояние, при котором почки не способны очищать кровь от отходов. Почечная недостаточность вызывает накопление токсичных отходов в крови. Почки в норме обладают избыточной очищающей способностью, и функция почек может составлять 50% от нормальной, прежде чем появляются симптомы. Симптомами являются зуд, усталость, тошнота, рвота, потеря аппетита, приводящая к недостаточности питания. Почечная недостаточность часто связана с диабетом и высоким кровяным давлением. Симптомы, упомянутые выше, то есть рвота и потеря аппетита, приводят к недостаточности питания у субъекта, страдающего почечной недостаточностью.
Процедура диализа уменьшает воздействие отходов на почки. Однако эта процедура занимает много времени, и пациент может нуждаться в ее проведении несколько раз в неделю. Пациент, проходящий процедуру диализа, нуждается в медицинском наблюдении, и эта процедура является как дорогостоящей, так и занимающей много времени.
Окисление глутамата
Благодаря исследованиям in situ на крысах Windmueller and Spaeth (1) известно, что глутамат и глутамин являются важным метаболическим топливом для тонкой кишки. Windmueller and Spaeth были первыми, кто сообщил о значительном частичном метаболизме глутамата (≈95%) и глутамина (≈70%) желудочно-кишечным трактом в процессе всасывания. Эти результаты с тех пор подтверждены in vivo как на поросятах (2), так и на людях (3).
В процессе окисления глутамата первой стадией является трансаминирование любым количеством ферментов, дезаминирование глутаматдегидрогеназами (GDH), многие из которых экспрессируются в желудочно-кишечном тракте (4, 5). Дезаминирование посредством GDH приводит к образованию AKG (альфа-кетоглутаровой кислоты) и свободного аммиака. В процессе трансаминирования аминотрансферазой разветвленных цепей (ВСАТ) глутамат передает аминогруппировку на разветвленную α-кетокислоту, образуя AKG и соответствующую разветвленную аминокислоту.
Альфа-кетоглутаровая кислота
Глутамин и его производные, например альфа-кетоглутаровая кислота (AKG), являются молекулами, которые играют центральную роль в системном и кишечном метаболизме посредством цикла Кребса. Однако механизмы до сих пор полностью не понятны (Pierzynowski, S. G. and Sjödin, A. (1998) J. Anim. a. Feed Sci. 7: 79-91; и Pierzynowski, S. G. et al. Eds: KBK Knutsen and J-E Lindberg, Uppsala 19-21 June, 2001).
AKG (2-оксо-пентандионовая кислота, 2-оксоглутаровая кислота, альфа-оксоглутаровая кислота, альфа-оксопентандионовая кислота, 2-кетоглутаровая кислота, 2-оксо-1,5-пентандионовая кислота, 2-оксопентандионовая кислота, 2-оксоглутаровая кислота) теоретически может являться продуктом распада глутамина, глутамата, глутаминовой кислоты в процессе метаболизма в организме. Она может также служить в качестве предшественника не только для глутамина и аргинина, но также для некоторых других аминокислот, и поэтому ее рассматривают как катаболический белковый протектор. Olin et al., 1992, показали, что, когда AKG добавляли в корм для рыб, выделение мочи уменьшалось. Аналогично у людей, когда AKG добавляют в растворы для общего парентерального питания (TPN) в смеси с другими аминокислотами, наблюдается хорошая защита от потери азота после операции (Pierzynowski, S. G. and Sjödin, A. (1998) J. Anim. a. Feed Sci. 7: 79-91). В случае людей AKG вероятно объединяется с распадом мышечных белков, чтобы служить потребностям кишечного тракта во время так называемого послеоперационного стресса, например катаболизма, голодания и т.д.
В Riedel E. et al., Nephron 1996, 74: 261-265, который является наиболее близким аналогом настоящего изобретения, показано, что введение α-кетоглутарата с карбонатом кальция эффективно улучшает метаболизм аминокислот у гемодиализных больных.
Потребности в метаболитах, относящихся к семейству глутамина для функционирования кишечника, недавно доказаны Reeds et al. (1996, Am. J. of Physiol. - Endocrinology and Metabolism 270: 413-418), которые сообщили почти о 100%-ной утилизации глутамата/глутамина при первом прохождении через тонкую кишку поросят.
AKG может быть важным донором энергии посредством нескольких путей превращения, например через орнитин и путресцин до GABA (гамма-аминомасляной килоты) или сукцината. Теоретически AKG может также действовать в качестве акцептора иона аммония, возможно через превращение в глутамат/глутамин.
Известно - но не было никогда опубликовано - что энтероциты во время их роста зависят от аммония.
Поэтому в свете вышеупомянутых проблем в высшей степени желательно разработать средства и способы лечения и предупреждения гипергликемических состояний, таких как сахарный диабет, а также недостаточности питания, часто ассоциированной с диабетом и, например, почечной недостаточностью, у млекопитающих, например кошек, собак или людей, при которых можно было бы избежать проблем или побочных эффектов, ассоциированных со средствами и способами из предшествующего уровня техники. Также существует необходимость в улучшении самочувствия в дополнение к состоянию питания как у почечных, так и у диабетических пациентов. В этом отношении настоящее изобретение направлено на эти нужды и интересы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
С точки зрения вышеуказанных недостатков, известных в области предупреждения, лечения и/или облегчения диабета, а также других родственных гипергликемических заболеваний, и высокой стоимости медицинского обслуживания при этом, а также для коррекции недостаточности питания, ассоциированной, например, с диабетом и почечной недостаточностью, в настоящем изобретении предложены новые и улучшенные способы и композиции для предупреждения, лечения и/или облегчения диабета и недостаточности питания.
Задачей настоящего изобретения является предложение способа улучшения всасывания аминокислот у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Этот способ включает введение позвоночному животному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смеси в количестве и/или с частотой, достаточными для того, чтобы обеспечить желаемый эффект в отношении всасывания аминокислот.
2
В одном воплощении этого способа AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси выбраны из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG), орнитин-AKG, аргинин-AKG, глутамин-AKG, глутамат-AKG, лейцин-AKG, хитозан-AKG и других солей AKG с аминокислотами и производными аминокислот; моно- и диметаллических солей AKG, таких как CaAKG, Ca(AKG) и NaAKG.
В еще одном воплощении позвоночное животное представляет собой грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или кролик; птицу, такую как индейка, курица, цыпленок или другие бройлеры; сельскохозяйственных животных, таких как корова, лошадь, свинья, поросенок или другие свободно передвигающиеся сельскохозяйственные животные; или домашнего животного, такого как собака или кошка.
В еще одном воплощении позвоночное животное представляет собой человека.
В еще одном воплощении аминокислота представляет собой любую эссенциальную аминокислоту.
В следующем воплощении эссенциальная аминокислота представляет собой изолейцин, лейцин, лизин и пролин.
Кроме того, изобретение включает способ уменьшения всасывания глюкозы у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Этот способ включает введение позвоночному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей в количестве и/или с частотой, достаточными для обеспечения желаемого эффекта в отношении всасывания глюкозы.
Кроме того, изобретение включает способ предупреждения, ингибирования или облегчения состояния с высоким уровнем глюкозы у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Этот способ включает введение позвоночному животному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей в количестве и/или с частотой, достаточными для обеспечения желаемого эффекта в отношении указанного состояния.
В одном воплощении состояние с высоким уровнем глюкозы представляет собой сахарный диабет типа I или типа II.
Кроме того, изобретение включает применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции для предупреждения, облегчения или лечения состояния с высоким уровнем глюкозы.
В одном воплощении состояние с высоким уровнем глюкозы в плазме представляет собой сахарный диабет типа I или типа II.
Изобретение также относится к применению AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции для предупреждения, облегчения или лечения недостаточности питания.
В одном воплощении применения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, возможно, с фармацевтически приемлемым носителем и/или добавками.
В другом воплощении применения композиция представляет собой пищу или пищевую добавку.
В еще одном воплощении пища или пищевая добавка представляет собой диетическую добавку и/или компонент в форме твердой пищи и/или напитка.
В еще одном воплощении AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси в изготовленной композиции находятся в терапевтически эффективном количестве.
В еще одном воплощении терапевтически эффективное количество составляет 0,01-0,2 г/кг массы тела на суточную дозу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На чертеже показана кинетика лейцина в целом организме у контрольных и инфузированных AKG свиней. Значения представляют собой среднее ±SEM (среднеквадратическая погрешность); n=9, каждая свинья получала как контроль, так и AKG. Значения для AKG не отличались от контроля при использовании дисперсионного анализа (ANOVA). AKG - α-кетоглутарат; NOLD - неокислительное удаление лейцина; Ra - скорость появления лейцина; Balance - Ra, вычтенное из NOLD, представляет собой белковый остаток в организме по лейцину.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В контексте настоящей заявки и изобретения используются следующие определения.
Термин «фармацевтическая композиция», при использовании здесь, относится к терапевтически эффективной композиции по изобретению.
Термин «терапевтически эффективное количество», или «эффективное количество» или «терапевтически эффективное», при использовании здесь, относится к такому количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. Это предварительно определенное количество активного вещества, рассчитанное так, чтобы производить нужный терапевтический эффект в сочетании с необходимой добавкой и разбавителем, то есть носителем или растворителем для введения. Кроме того, этот термин предназначен для обозначения количества, достаточного для снижения, и наиболее предпочтительно предупреждения, клинически значимого дефицита активности, функции и ответа хозяина. Альтернативно терапевтически эффективное количество является достаточным, чтобы вызвать улучшение клинически значимого состояния у хозяина. Специалистам в данной области техники очевидно, что количество соединения может варьироваться в зависимости от его специфической активности. Подходящие дозировки могут содержать предопределенное количество активной композиции, рассчитанное так, чтобы производить желаемый терапевтический эффект в сочетании с необходимым разбавителем, то есть носителем или добавкой. В способах и применении для изготовления композиций по изобретению обеспечено терапевтически эффективное количество активного компонента. Терапевтически эффективное количество может быть определено медицинским или ветеринарным работником средней квалификации на основании таких особенностей пациента, как возраст, масса, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.д., как хорошо известно в данной области техники.
Термин «производное» в данном описании предназначен для обозначения химического вещества, полученного из исходного вещества либо непосредственно, либо путем модификации или частичного замещения.
Термин «аналог» в данном описании предназначен для обозначения соединений, которые структурно подобны другим, но не обязательно являются изомерами. Аналоги обладают подобной(ыми) функцией(ями), но различаются по структуре или эволюционному происхождению.
При использовании в данном описании термин «лечение» относится к лечению с целью излечивания, которое может быть полным/окончательным или частичным излечиванием состояния или состояний.
Термин «облегчать» в данном описании предназначен для обозначения не только уменьшения интенсивности состояния или симптома, но также отсроченного начала состояния или симптома.
Термин «предупреждать» в данном описании предназначен для обозначения гарантии того, что какое-либо событие не случится, например состояние или симптом, относящееся к недоразвитому GIT (желудочно-кишечному тракту), не возникнет. В результате предупреждения определенного состояния или симптома начало такого состояния или симптома отсрочено.
Термин «повышенное всасывание аминокислот» в данном описании предназначен для обозначения изменения в общем всасывании аминокислот у позвоночного животного по сравнению с позвоночным животным, не получающим лечения или введения по изобретению. Изменения рассматривают как повышение, если общее всасывание количественно выше у указанного позвоночного животного по сравнению с позвоночным того же вида, не получающим указанного лечения.
Термин «кинетика» в данном описании предназначен для обозначения постоянного или частого мониторинга или измерения показателей всасывания аминокислот, а также глюкозы у позвоночного животного для определения скорости их всасывания.
Термин «натрий-AKG», при использовании здесь, используют взаимозаменяемо с терминами «AKG-Na», «Na-AKG», «Na-соль AKG», «AKG (Na-соль)».
Термин «хитозан-AKG», при использовании здесь, используют взаимозаменяемо с терминами «AKG-хитозан», «AKG (соль хитозана)».
Диагностика диабетов типа I и типа II
Диагностика пациентов, пораженных диабетом типа I и типа II, находится в рамках квалификации специалистов в данной области техники. Например, индивидуумов в возрасте старше 35 лет с симптомами полидипсии, полиурии, полифагии (с потерей массы или без потери массы) в сочетании с повышенными концентрациями глюкозы в плазме и без кетоацидоза в анамнезе обычно рассматривают в рамках диагноза сахарного диабета типа II. Наличие ожирения, положительной семейной истории в отношении диабета типа II и нормальных или повышенных концентраций инсулина и с-пептида в плазме натощак является дополнительными характеристиками большинства пациентов с сахарным диабетом типа II. Под «терапевтически эффективным количеством» подразумевается количество, которое либо в однократной, либо в многократных дозах благоприятно снижает концентрации глюкозы в плазме у субъекта, пораженного сахарным диабетом типа II.
Теперь авторы изобретения неожиданно обнаружили, что место инфузии оказывает воздействие на всасывание AKG. После дуоденальной инфузии AKG неожиданно наблюдалось повышенное всасывание аминокислот и пониженное всасывание глюкозы.
Следовательно, настоящее изобретение можно применять для снижения глюкозы в плазме у субъекта с инсулиннезависимым диабетом типа II.
Диагностика недостаточности питания
Диагностика пациентов с недостаточностью питания, то есть с плохим или недостаточным питанием или гипотрофией, находится в рамках квалификации специалиста в данной области техники. Обычно для оценки недостаточности питания проводят оценку общего состояния здоровья индивидуума.
Диагностика почечной недостаточности
Диагностика пациентов, пораженных почечной недостаточностью, находится в рамках квалификации специалиста в данной области техники.
Существует две формы почечной недостаточности, острая и хроническая почечная недостаточность (ACF и CRF). Острую почечную недостаточность обычно можно реверсировать, тогда как хроническая почечная недостаточность обычно прогрессирует. Лечение CRF делится на преддиализ и активное лечение уремии с использованием, например, диализа или трансплантации. Не существует точного определения преддиализа как начальной точки, но обычно преддиализ определяют как период времени между диагностикой почечной недостаточности и началом активного лечения. Диализ и трансплантацию рассматривают как активное лечение.
Способ улучшения всасывания аминокислот
Согласно изобретению раскрыт способ улучшения всасывания аминокислот у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Этот способ включает введение позвоночному животному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смеси в количестве и/или с частотой, достаточными для обеспечения желаемого эффекта в отношении всасывания аминокислот.
Всасывание аминокислот считают улучшенным при сравнении со всасыванием аминокислот у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу, не получающего указанных AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей.
2
В следующих воплощениях данного способа AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси выбраны из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG), орнитин-AKG, аргинин-AKG, глутамин-AKG, глутамат-AKG, лейцин-AKG, хитозан-AKG и других солей AKG с аминокислотами и производными аминокислот; моно- и диметаллических солей AKG, таких как CaAKG, Ca(AKG) и NaAKG.
В следующих воплощениях позвоночное животное представляет собой грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или кролик; птицу, такую как индейка, курица, цыпленок или другие бройлеры; сельскохозяйственных животных, таких как корова, лошадь, свинья, поросенок или другие свободно передвигающиеся сельскохозяйственные животные; или домашнего животного, такого как собака или кошка.
В следующем воплощении позвоночное животное представляет собой человека. Человек может быть пациентом, нуждающимся в лечении недостаточности питания вследствие, например, почечной недостаточности, сахарного диабета, спорта, возраста (дети и пожилые люди), беременности, нервной анорексии, нервной булимии, расстройства питания Бинга, компульсивного переедания или других неспецифических расстройств питания (EDNOS).
Позвоночное животное, такое как указанный человек, в следующих воплощениях может представлять собой любое позвоночное, нуждающееся в повышении доступности и утилизации аминокислот, например эссенциальных аминокислот или условно эссенциальных аминокислот, в частности изолейцина, лейцина, лизина и пролина.
Примерами эссенциальных аминокислот являются альфа-аминокислоты, такие как изолейцин (IIeu), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), треонин (Thr), триптофан (Try) и валин (Val) у людей. Эссенциальные аминокислоты различаются между видами. Крысам необходимы две другие аминокислоты, а именно аргинин (Arg) и гистидин (His).
Следующими воплощениями являются те, где аминокислота представляет собой любую аминокислоту, такую как аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, треонин, цистеин, тирозин, глутамин, гистидин, лизин, аргинин, аспартат, аспарагин, глутамат, глутамин, глицин и серин.
Следующими воплощениями являются те, где аминокислота представляет собой любую эссенциальную или условно эссенциальную аминокислоту. Примеры эссенциальных или условно эссенциальных аминокислот приведены в таблице 2.
В следующем воплощении эссенциальные или условно эссенциальные аминокислоты выбраны из группы, состоящей из изолейцина, лейцина, лизина и пролина.
Способ снижения всасывания глюкозы и способ предупреждения, ингибирования или облегчения повышения глюкозы в плазме
Уровень глюкозы в плазме представляет собой количество глюкозы (сахара) в крови. Он также известен как уровень глюкозы в сыворотке крови. Количество глюкозы в крови выражают в миллимолях на литр (ммоль/л) или в мг/дл.
В норме уровни глюкозы в плазме у человека в течение суток остаются в узких пределах, примерно от 4 до 8 ммоль/л. Уровни глюкозы в плазме выше после еды и обычно самые низкие утром. Уровни глюкозы натощак в норме составляют примерно 70-110 мг/дл (3,9-6,1 ммоль/л), а через 2 часа после еды уровни в норме составляют примерно 80-140 мг/дл (4,4-7,8 ммоль/л). Уровень глюкозы в плазме >180 мг/дл (>10,0 ммоль/л) через 2 часа после еды обычно считают высоким значением глюкозы в плазме. Это также верно в случае значения глюкозы в плазме >140 мг/дл натощак.
Если у человека имеется, например, диабет, его уровень глюкозы в плазме иногда сдвигается за рамки этих пределов. Основным недостатком у всех пациентов с диабетом является пониженная способность инсулина индуцировать удаления молекул глюкозы (сахара) клетками организма из крови. Независимо от того, является ли эта сниженная активность инсулина следствием уменьшенного количества продуцируемого инсулина (например диабет типа I) или нечувствительности клеток к нормальному количеству инсулина, результат одинаковый, то есть слишком высокие уровни глюкозы в плазме. Это называется «гипергликемией», что означает «высокая концентрация глюкозы в крови». Обычно гипергликемия диагностируется, когда глюкоза в плазме составляет более 240 мг/дл (>13,4 ммоль/л).
Согласно изобретению раскрыт способ снижения всасывания глюкозы в плазме у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Этот способ включает введение позвоночному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смеси в количестве и/или с частотой, достаточными для обеспечения желаемого эффекта в отношении всасывания глюкозы.
Снижение всасывания глюкозы после введения AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей может составлять 5-50%, например 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% от исходного значения глюкозы в плазме.
В следующем воплощении снижение всасывания составляет 20-40% от исходного значения глюкозы в плазме.
В следующем воплощении снижение составляет 30% от исходного значения глюкозы в плазме.
Кроме того, раскрыт способ предупреждения, ингибирования или облегчения состояния с высокой концентрацией глюкозы в плазме у позвоночного животного, включая млекопитающего и птицу. Указанный способ включает введение позвоночному, включая млекопитающего и птицу, AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей в количестве и/или с частотой, достаточными для обеспечения желаемого эффекта в отношении указанного состояния с высокой концентрацией глюкозы в плазме.
В следующем воплощении состояние с высокой концентрацией глюкозы в плазме представляет собой гипергликемическое состояние.
2
Указанные способы, относящиеся к состояниям с высокой концентрацией глюкозы в плазме или к гипергликемическим состояниям, включают следующие воплощения, где AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси выбраны из группы, состоящей из альфа-кетоглутаровой кислоты (AKG), орнитин-AKG, аргинин-AKG, глутамин-AKG, глутамат-AKG, лейцин-AKG, хитозан-AKG и других солей AKG с аминокислотами и производными аминокислот; моно- и диметаллических солей AKG, таких как CaAKG, Ca(AKG) и NaAKG.
Кроме того, следующими воплощениями являются те, где позвоночное животное представляет собой грызуна, такого как мышь, крыса, морская свинка или кролик; птицу, такую как индейка, курица, цыпленок или другие бройлеры; сельскохозяйственных животных, таких как корова, лошадь, свинья, поросенок или другие свободно передвигающиеся сельскохозяйственные животные; или домашнего животного, такого как собака или кошка.
Кроме того, следующими воплощениями являются те, где позвоночное животное представляет собой человека.
Кроме того, в следующих воплощениях указанные состояния с высокой концентрацией глюкозы в плазме являются следствием, например, акромегалии, синдрома Кушинга, гипертиреоза, рака поджелудочной железы, панкреатита, феохромоцитомы, недостаточного количества инсулина или избыточного приема пищи.
Кроме того, в следующих воплощениях указанные состояния с высокой концентрацией глюкозы в плазме являются следствием сахарного диабета типа I или типа II.
Применение AKG для сахарного диабета и для лечения недостаточности питания
Согласно изобретению раскрыто применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции для предупреждения, облегчения или лечения состояния с высокой концентрацией глюкозы в плазме.
Примеры состояний с высокой концентрацией глюкозы в плазме и гипергликемических состояний приведены в предыдущем параграфе.
Следующие воплощения включают те, в которых гипергликемическое состояние представляет собой сахарный диабет типа I или II.
Согласно изобретению раскрыто применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции для предупреждения, облегчения или лечения недостаточности питания.
В следующих воплощениях указанных применений указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию возможно с фармацевтически приемлемым носителем и/или добавками.
В следующих воплощениях композиция представляет собой пищу или пищевую добавку.
В следующих воплощениях пища или пищевая добавка представляет собой диетическую добавку и/или компонент в форме твердой пищи и/или напитка.
В следующих воплощениях AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси в изготовленной композиции находятся в терапевтически эффективном количестве.
В следующих воплощениях терапевтически эффективное количество составляет 0,01-0,2 г/кг массы тела на суточную дозу.
Введение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей
Согласно способам, раскрытым выше, AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси вводят позвоночному животному, включая млекопитающего и птицу; грызуну, такому как мышь, крыса, морская свинка или кролик; птице, такой как индейка, курица, цыпленок или другие бройлеры; сельскохозяйственным животным, таким как корова, лошадь, свинья, поросенок или другие свободно передвигающиеся сельскохозяйственные животные; или домашнему животному, такому как собака или кошка.
Введение можно осуществлять разными путями в зависимости от того, какой вид позвоночного подлежит лечению, от состояния позвоночного животного, нуждающегося в таких способах, и от конкретного показания к лечению.
В одном воплощении введение осуществляют в виде пищи или пищевой добавки, такой как диетическая добавка и/или компонент в форме твердой пищи и/или напитка. Следующие воплощения могут быть в форме суспензий или растворов, таких как напиток, описанный ниже.
Также лекарственные формы могут включать капсулы или таблетки, такие как жевательные или растворимые, например шипучие таблетки, а также порошок и другие сухие формы, известные специалисту в данной области, такие как пилюли, такие как микропилюли, гранулы и зерна.
Введение может происходить в форме парентерального, ректального или перорального питания или пищевой добавки, как показано выше.
Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла.
Пища и пищевая добавка могут также быть эмульгированы. Активный терапевтический ингредиент можно затем смешивать с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или тому подобное и их комбинации. Кроме того, если желательно, композиция может содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, pH-, буферные агенты, которые усиливают эффективность активного ингредиента.
Можно предложить различные формы парентеральной пищи или пищевых добавок, такие как твердая пища, жидкости или лиофильные или высушенные иным путем препараты. Они могут включать разбавители из различных буферов (например, Трис-HCl, ацетатный, фосфатный), для pH и ионной силы, добавки, такие как альбумин или желатин, для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, Твин 20, Твин 80, Pluronic F68, соли желчной кислоты), солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт, парабены), объемные вещества или модификаторы тоничности (например, лактозу, маннит), ковалентное присоединение полимеров, таких как полиэтиленгликоль, к композиции, комплексообразование с ионами металлов или включение вещества внутрь или на поверхность гранулированных препаратов полимерных соединений, таких как полиакриловая кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.д. или на липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, тени эритроцитов или сферопласты.
Напиток
В одном воплощении пищу или пищевую добавку вводят в форме напитка или его сухой композиции любым из способов по изобретению.
2
Напиток содержит эффективное количество AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей вместе с приемлемым для питания водорастворимым носителем, таким как минералы, витамины, углеводы, жир и белки. Примерами AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей являются альфа-кетоглуаровая кислота (AKG), орнитин-AKG, аргинин-AKG, глутамин-AKG, глутамат-AKG, лейцин-AKG, хитозан-AKG и другие соли AKG с аминокислотами и производными аминокислот; моно- и диметаллические соли AKG, такие как CaAKG, Са(AKG) и NaAKG.
Все эти компоненты поставляют в сухой форме, если напиток поставляют в сухой форме. Напиток, поставляемый в готовом к употреблению виде, дополнительно содержит воду. Готовый раствор напитка может также иметь регулируемую тоничность и кислотность, например как буферный раствор согласно общим предложениям в приведенном выше параграфе.
рН предпочтительно находится в интервале примерно 2-5 и, в частности, примерно 2-4, для предотвращения роста бактерий и грибов. Можно также использовать стерилизованный напиток с рН примерно 6-8.
Напиток может поставляться отдельно или в комбинации с одной или более терапевтически эффективными композициями.
Применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей
Согласно изобретению раскрыто применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции для предупреждения, облегчения или лечения гипергликемических состояний, таких как диабет типа I и типа II, а также для лечения недостаточности питания.
Следующие воплощения изобретения включают применение, где композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Эта фармацевтическая композиция может быть вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или добавками, такими как разбавители, консерванты, солюбилизирующие агенты, эмульгирующие агенты, адъюванты и/или носители, полезные в способах и в применении, раскрытых в настоящем изобретении.
Кроме того, при использовании здесь, «фармацевтически приемлемые носители» хорошо известны специалистам в данной области техники и могут включать 0,01-0,05 М фосфатный буфер или 0,8%-ный солевой раствор, но не ограничены ими. Кроме того, такие фармацевтически приемлемые носители могут представлять собой водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевую и буферную среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или жирные масла. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные агенты, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и тому подобное.
Следующие воплощения изобретения включают применение, где композиция представляет собой диетическую добавку и/или компонент в форме твердой пищи и/или напитка.
Такая изготовленная композиция, например фармацевтическая композиция, или пища, или пищевая добавка, содержит композицию по изобретению и может дополнительно содержать носитель и/или некоторое количество второго или дополнительного активного ингредиента, оказывающего влияние на любое гипергликемическое состояние, такое как диабет типа I и II, а также недостаточность питания.
Доза вводимой фармацевтической композиции
Согласно изобретению применение AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей для изготовления композиции по изобретению включает введение терапевтически эффективного количества позвоночному животному, такому как птица или млекопитающее, нуждающемуся в этом. Такое терапевтически эффективное количество составляет примерно 0,01-0,2 г/кг массы тела на суточную дозу.
AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси
2
Согласно изобретению включены AKG, производные или метаболиты AKG, аналоги AKG или их смеси. Примерами AKG, производных или метаболитов AKG, аналогов AKG или их смесей являются альфа-кетоглутаровая кислота (AKG), орнитин-AKG, аргинин-AKG, глутамин-AKG, глутамат-AKG, лейцин-AKG, хитозан-AKG и другие соли AKG с аминокислотами и производными аминокислот; моно- и диметаллические соли AKG, такие как CaAKG, Ca(AKG) и NaAKG.
Мишени для введения
Как может легко понять специалист в данной области техники, способы и фармацевтические композиции по настоящему изобретению особенно пригодны для введения любому позвоночному животному, нуждающемуся в этом, такому как птица, включая индейку, курицу или цыпленка и других бройлеров, но не ограничиваясь ими, и свободно передвигающиеся животные, или млекопитающие, включая домашних животных, таких как представители кошачьих или псовых, но не ограничиваясь ими, сельскохозяйственных животных, таких как представители коров, лошадей, коз, овец и свиней, но не ограничиваясь ими, диких животных, либо в природе, либо в зоологическом саду, подопытных животных, таких как мыши, крысы, кролики, козы, овцы, свиньи, собаки, кошки и т.д., то есть для ветеринарного применения.
Люди также включены как мишени для введения в лечении любых высоких уровней глюкозы в плазме или гипергликемического состояния, такого как диабет типа I и типа II, а также любого состояния, ассоциированного с недостаточностью питания, после, например, почечной недостаточности, диабета типа I и типа II.
Кроме того, мишенями для введения могут быть также любые позвоночные животные, такие как упомянутые выше, нуждающиеся в повышении доступности и утилизации аминокислот, например эссенциальных аминокислот или условно эссенциальных аминокислот, в частности изолейцина, лейцина, лизина и пролина. Человек может быть также пациентом, нуждающимся в лечении недостаточности питания или в повышении доступности и утилизации аминокислот вследствие, например, почечной недостаточности, хирургических вмешательств, например панкреоэктомии или трансплантации, гериатрических состояний, сахарного диабета, занятий спортом, возраста (дети и пожилые люди), беременности, нервной анорексии, нервной булимии, расстройства питания Бинга, компульсивного переедания, расстройств питания, нарушений обмена веществ или других неспецифических расстройств питания (EDNOS), пролежней, отсутствия у позвоночного животного аппетита или вследствие изнурительной болезни.
Ссылки
(Все ссылки, цитируемые здесь, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме)
1. Windmueller, H. G., & Spaeth, A. E. (1975) Intestinal metabolism of glutamine and glutamate from the lumen as compared to glutamine from blood, Arch. Biochem. Biophys. 171:662-672.
2. Stoll В., Bun-in, D. G., Henry, J, Hung, Y, Jahoor, F, & Reeds, P. J. (1999) Substrate oxidation by the portal drained viscera of fed piglets. Am. J. Physiol. 277:E168-E175.
3. Matthews, D. E., Marano, M. A., & Campbell, R. G. (1993) Splanchnic bed utilization of glutamine and glutamic acid in humans. Am. J. Physiol. 264:E848-E854.
4. Madej, M., Lundh, Т., & Lindberg J. E. (1999) Activities of enzymes involved in glutamine metabolism in connection with energy production in the gastrointestinal tract epithelium of newborn, suckling and weaned piglets. Biol. Neonate 75:250-258.
5. Suryawan, A., Hawes, J. W., Hards, R.A., Shimomura, Y., Jenkins, A. E., & Hutsun, S. M. (1998) A molecular model of human branched-chain amino acid metabolism. Am. J. Clin. Nutr. 68:72-81.
6. Lambert, В. D., Stoll, В., Niinikoski, H., Pierzynowski, S., & Bun-in, D.G. (2002) Net portal absorption of enterally fed alpha-ketoglutarate is limited in young pigs. J. Nutr. 132:3383-3386.
7. Kristensen, N. В., Jungvid, H., Femandez, J. A., & Pierzynowski, S. G. (2002) Absorption and metabolism of a-ketoglutarate in growing pigs. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 86:239-245.
8. Bergmeyer, H. U., & Bemt, E. (1974) 2-oxoglutarate. UV spectrophotometric determination. In: Methods of enzymatic analysis, 2nd Ed. (Bergmeyer, H. U., ed.). Academic Press, New York, NY.
9. Pajor, A. M. (1999) Sodium-coupled transporters for krebs cycle intermediates. Annu. Rev. Physiol. 61:663-682.
10. Murphy, J. M., Murch, J. M., and Ball, R. O. (1996) Proline is synthesized from glutamate during intragastric infusion but not during intravenous infusion in neonatal piglets. J. Nutr. 126:878-886.
ПРИМЕРЫ
Ниже изобретение проиллюстрировано рядом неограничивающих примеров.
Хотя изобретение описано в отношении конкретных раскрытых воплощений, специалист в данной области техники может предвидеть другие воплощения, варианты или комбинации, которые конкретно не упомянуты, но, тем не менее, входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Раздел материалы и методы для Примеров 1-2
Содержание животных
Содержание и уход за животными соответствовали руководству Министерства сельского хозяйства США.
Дизайн исследования
Поросят-самок (n=9) приобретали в Texas Department of Criminal Justice, Huntsville, TX.
Поросят (возраста 14 суток) привозили в Children's Nutrition Research Center и в течение 7-суточного периода адаптации содержали на диете из жидкого заменителя молока (Litter Life, Merrick, Middleton, WI) с нормой 50 г/(кг·сут).
Состав заменителя молока (на кг сухого вещества) был 500 г лактозы, 100 г жира и 250 г белка.
Через 7 суток в течение ночи поросят оставляли без пищи и готовили их к операции, как описано ранее (2).
Описывая кратко, под изофлурановой анестезией в асептических условиях поросятам имплантировали полиэтиленовый катетер (наружный диаметр 1,27 мм, Becton Dickinson, Sparks, MD) в общую воротную вену и силастиковые катетеры (наружный диаметр 1,78 мм) в яремную наружную вену и сонную артерию.
Ультразвуковой датчик потока (внутренний диаметр от 8 до 10 мм, Transonic, Ifhaca, NY) помещали вокруг воротной вены.
4
Силиконовый катетер (наружный диаметр 2,17 мм, Baxter Healthcare, McGaw Park, IL) имплантировали в просвет двенадцатиперстной кишки. Катетеры наполняли стерильным физиологическим раствором, содержащим гепарин (2,5×10 Ед/л), и выводили наружу либо на левом боку (сосуды воротного и дуоденального катетера, датчика потока), либо между лопатками (яремный катетер и катетер сонной артерии).
Непосредственно перед операцией животные получали внутримышечную инъекцию антибиотика (20 мг/кг энрофлоксацина, Bayer, Shawnee Mission, KS) и внутримышечную инъекцию анальгетика (0,1 мг/мг буторфенола тартрата. Fort Dodge Labs, Fort Dodge, IA).
-1
-1
Перед возобновлением энтерального питания после операции поросят держали на полностью парентеральном питании в течение 24 ч со скоростью 5 мл·кг·ч. Поросятам давали 7 суток на восстановление после операции. У всех поросят поглощение пищи и скорость прибавления массы вернулись к дооперационным уровням.
Приготовление образцов
Образцы крови немедленно помещали на лед и центрифугировали.
2
Плазму собирали, немедленно замораживали в жидком N и хранили при -80°С до анализа.
Аминокислотный анализ
Для аминокислотного анализа плазмы 0,2 мл аликвоту плазмы смешивали с равным объемом водного раствора метионинсульфона (4 ммоль/л) и центрифугировали при 10000×g в течение 120 мин через 10 кДа отсекающий фильтр.
Аликвоту фильтрата величиной 50 мкл сушили и аминокислоты анализировали посредством ВЭЖХ на обращенной фазе их фенилизотиоцианатных производных (Pico Tag, Waters, Wobum, MA).
AKG в плазме определяли способом Bergmeyer и Bemt (8) с незначительными модификациями.
Описывая кратко, анализ проводили в 0,5 мл рабочего раствора, состоящего из 100 ммоль/л фосфатного буфера (рН 7,6), 4 ммоль/л хлорида аммония и 50 мкмоль/л NADH.
К рабочему раствору добавляли соответствующее количество плазмы, содержащей 1-10 нмоль AKG.
Показание исходного поглощения получали при 340 нм.
После записи исходного поглощения в каждую пробирку добавляли ~6 единиц (в объеме 10 мкл) бычьей GDH (G2501; Sigma-Aldrich, St. Louis, МО).
После 10-минутной инкубации второе показание поглощения снимали при 340 нм.
Количество AKG в образце прямо пропорционально уменьшению поглощения между первым и вторым показанием.
Концентрацию AKG вычисляли путем использования стандартной кривой.
Определение аммиака в плазме
Аммиак в плазме определяли, используя набор для спектрофотометрического анализа (171-С, Sigma-Aldrich, St. Louis, МО).
Определение глюкозы в плазме
Глюкозу в плазме определяли, используя набор для спектрофотометрического анализа (315-100; Sigma-Aldrich, St. Louis, МО).
Определение бикарбоната в крови
Для оценки обогащения крови бикарбонатом аликвоту цельной крови (1,0 мл) помещали в 10 мл Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) и добавляли 0,5 мл перхлорной кислоты (10% мас./мас.).
Комнатный воздух (10 мл), профильтрованный через натровую известь (Sodasorb; Grace Container Products, Lexington, MA), инъецировали в Vacutainer, отбирали в газонепроницаемый шприц и переносили во второй Vacutainer.
Изотопное обогащение диоксида углерода в образце газа измеряли на непрерывном поточном масс-спектрометре для определения соотношения изотопов (ANCA; Europa Instruments, Crewe, U.K.).
Определение кетоизокапроновой кислоты в плазме
Кетоизокапроновую кислоту плазмы (KIC) выделяли посредством катионообменной хроматографии (смола AG-50V, Bio-Rad).
Элюенты обрабатывали гидроксидом натрия (100 мкл; 10 н.) и гидроксиламина HCl (200 мкл; 0,36 М) и нагревали (60°С; 30 мин). После охлаждения pH образцов доводили до значения <2.
Кетокислоты экстрагировали в 5 мл этилацетата и сушили в атмосфере азота при комнатной температуре.
Получение производных KIC осуществляли путем добавления 50 мкл смеси N-метил-N-трет-бутил-диметилсилил-трифторацетамид +1% трет-бутил-диметилхлорсилана.
Изотопное обогащение KIC определяли посредством El GC-MS (газовой хроматографии - масс-спектрометрии с ионизацией электронным ударом (GC-масс-спектрометр Hewlett Packard 5970 с Hewlett Packard 5890 Series II GC) путем мониторинга ионов при 316 m/z и 317 m/z.
Определение изотопного обогащения мочевины плазмы
Изотопные обогащения мочевины плазмы определяли посредством El GC-MC анализа. Белки осаждали из 50 мкл плазмы при помощи 200 мкл ледяного ацетона.
После встряхивания белок отделяли центрифугированием, и супернатант отбирали и сушили в атмосфере азота.
К высушенному супернатанту добавляли 250 мкл бис(диметилацеталь) малонового альдегида в разведении 1:20 и концентрированную HCl (30 мас.%), образец инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем выпаривали до сухости (Speedvac, Savant Instruments, Forma Scientific, Marietta, OH).
Производные мочевины получали при помощи 50 мкл смеси N-метил-N-трет-бутил-диметилсилил-трифторацетамида +1% трет-бутил-диметилхлорсилана, и изотопное обогащение в плазме определяли, используя El GS-MS анализ путем мониторинга ионов с m/z 153-155.
Вычисления
Чистый остаток метаболитов в воротной вене [мкмоль/(кг·ч)] вычисляли следующим образом:
где Conc. представляет собой концентрацию в крови (мкмоль/л), PORT и ART относятся к крови воротной вены и артериальной крови, и PBF представляет собой кровоток воротной вены [л/(кг·ч)].
Поток лейцина в целом организме [Q; мкмоль/(кг·ч)] вычисляли следующим образом:
где R представляет собой скорость инфузии меченого атома [мкмоль/(кг·ч)] и
infusate
plasma
IE и IE представляют собой изотопные обогащения (выраженные в мол. %) инфузированного меченого атома и KIC плазмы соответственно.
2
Продуцирование CO в организме вычисляли следующим образом:
infusate
3
arterial bicarbonate
13
-
где IE представляет собой обогащение НСО  в инфузате (избыточный мольный процент), IE представляет собой обогащение в артериальной крови (избыточный мольный процент) и скорость инфузии меченого атома [мкмоль/(кг·ч)] во время внутривенной инфузии бикарбоната, которую продолжали в каждый период обработки. Все уравнение делили на 0,82 для коррекции возмещения инфузированного меченого углерода в бикарбонате.
Окисление лейцина в целом организме [мкмоль/(кг·ч)] вычисляли следующим образом:
13
13
13
LEU
где  представляет собой изотопное обогащение бикарбоната во время инфузии 1-С-лейцина и IE представляет собой изотопное обогащение 1-C-KIC во время инфузии 1-С-лейцина.
Неокислительное удаление лейцина в целом организме (NOLD) является оценкой включения лейцина в мышцы. NOLD [мкмоль/(кг·ч)] вычисляли с помощью следующего уравнения:
Скорость появления лейцина в целом организме (Ra) [мкмоль/(кг·ч)] является оценкой белкового катаболизма, и ее вычисляли как:
Поток мочевины в целом организме вычисляли следующим образом:
где IE представляет собой обогащение инфузата, PE представляет собой обогащение плазмы в стабильном состоянии во время инфузии мочевины и IR представляет собой скорость инфузии.
Статистический анализ
Для всех статистических критериев считали, что значение р=0,05 представляет статистическую значимость.
В Примере 1 влияние AKG на кинетику, появление в артериях, в воротной вене и чистое появление в воротной вене отдельных аминокислот, AKG, глюкозы, аммиака и лейцина анализировали, используя метод общей линейной модели (Minitab. Inc., State College, PA). Эта модель включала в себя эффекты добавления AKG и свинью. Свинью включали как случайную переменную. Среднее по условиям испытаний рассчитывали на компьютере, используя функцию LSMEANS. Односторонний t-критерий Стьюдента использовали для проверки того, был ли чистый остаток AKG в воротной вене значимо выше нуля во время контрольных обработок.
Пример 1 - Измерения AKG, глюкозы, аммиака в плазме, кровотока и потока мочевины в целом организме
Цель
Целью данного примера является оценка влияния инфузии AKG на AKG, глюкозу, аммиак в плазме, кровоток и поток мочевины в целом организме.
Опыты на животных
Поросят лишали пищи на 15 ч перед началом эксперимента.
В сутки эксперимента, в момент времени 1 ч, с первичной дозой (7,75 мл/кг; 25%-ный мас./мас. водный раствор; перорально) непрерывную дуоденальную инфузию заменителя молока [Litter Life, Merrick, Middleton, WI; 7,75 мл/(кг·ч)] готовили в виде 25%-ного (мас./мас.) водного раствора, который обеспечивал ~920 кДж и 12,5 г белка/(кг·сут).
Либо физиологический раствор (контроль; 930 ммоль/л NaCl), либо натрий-AKG (Na-AKG), 930 ммоль/л, от Sigma-Aldrich, St. Louis, МО растворяли в заменителе молока.
Уровень AKG выбирали на основании предыдущих данных (6) из лаборатории, когда для наблюдения обнаруживаемого остатка AKG в воротной вене требовалось поступление более 2,5% сухого вещества пищи.
15
2
Поросята также получали внутривенную (200 мкмоль/кг) непрерывную 6-часовую инфузию N-мочевины [20 мкмоль/(кг·ч)] (98%; Cambridge Isotope Laboratories).
13
2
В момент времени 0 ч начинали с первичной дозой (15 мкмоль/кг) непрерывную 2-часовую инфузию NaHCO (15 мкмоль/(кг·ч); 99%; Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA).
13
2
2
Артериальные образцы получали через 0, 90, 105 и 120 минут после начала инфузии NaHCO для определения продуцирования СО в целом организме.
13
13
2
В момент времени 2 ч инфузию NaHCO останавливали и начинали с первичной дозой (40 мкмоль/кг) непрерывную 4-часовую инфузию 1-C-лейцина (40 мкмоль/(кг·ч); 99%; Cambridge Isotope Laboratories).
Артериальные образцы и образцы из воротной вены получали в момент времени 4, 5 и 6 ч для определения кинетики лейцина и мочевины, а также массового остатка аммиака, AKG, глюкозы и аминокислот.
Все свиньи получали обработку как контролем, так и AKG по полностью рандомизированной схеме с промежутками по меньшей мере 24 ч между периодами обработки.
Результаты
AKG, глюкоза, аммиак в плазме, кровоток и поток мочевины в целом организме представлены в таблице 1.
Таблица 1. Влияние инфузии AKG на концентрацию метаболитов, чистый остаток в воротной вене и кинетику 1-<sup>13</sup>С-лейцинаи <sup>15</sup>N<sub>2</sub>-мочевины в целом организме.
AKG<sup>1</sup> (% сухого вещества пищи)
0
3,75
Р
Скорость инфузии AKG мкмоль/(кг·ч)
0
930
-
Кровоток в воротной вене, л/(кг·ч)
3,21±0,28<sup>2</sup>
3,36±0,27
0,34
Артериальная AKG, мкмоль/л
13,8±1,7
27,4±3,6
<0,01
AKG в воротной вене, мкмоль/л
22,0±1,4
64,6±5,9
<0,001
Чистый остаток AKG в воротной вене, мкмоль/(кг·ч)
19,7±2,8
95,2±12
<0,001
Чистый остаток AKG воротной вены, % от инфузированной
-
10,23±0,57
-
Чистый остаток глюкозы в воротной вене, мкмоль/(кг·ч)
303,1±61
203,9±69
<0,05
Чистый остаток аммиака в воротной вене, мкмоль/(кг·ч)
520,1±66
561,1±53
0,91
Поток мочевины в целом организме, мкмоль/(кг·ч)
398,3±35
377,8±39
0,56
<sup>1</sup>AKG, α-кетоглутарат; <sup>2</sup>SEM (среднеквадратичная погрешность)
Инфузия AKG [930 мкмоль/(кг·ч)] повышала (Р<0,01) концентрацию AKG в артериях и воротной вене и чистый остаток AKG в воротной вене. Даже когда AKG не инфузировали в двенадцатиперстную кишку, чистое всасывание AKG в воротной вене [19,7±2,8 мкмоль/(кг·ч)] было значимо выше 0. Однако чистое всасывание AKG в воротной вене было повышено (Р<0,001) при обработке AKG по сравнению с контролем. Чистый остаток AKG в воротной вене составлял 95 мкмоль/(кг·ч), что составляет только 10,23% от инфузированного количества.
Чистый остаток в воротной вене 10,23% в действительности представляет собой некоторую переоценку всасывания инфузированной AKG, поскольку, когда инфузировали только физиологический раствор, происходило статистически значимое всасывание AKG. Если делать поправку на всасывание AKG из контрольной пищи, доля инфузированной AKG, появляющейся в дренаже воротной вены, снижается до 8,12%.
Интересно, что чистый остаток глюкозы в воротной вене был понижен (Р<0,05) при обработке AKG. Обработка AKG не оказывала влияния на кровоток в воротной вене, чистый остаток аммиака в воротной вене и поток мочевины в целом организме.
Концентрации пролина как в артериях, так и в воротной вене были повышены (Р<0,05), а лейцин в воротной вене имел тенденцию (Р<0,01) к повышению при обработке AKG (данные не представлены). Массовый остаток аминокислот в воротной вене представлен в таблице 2. Обработка AKG повышала (Р<0,05) массовый остаток лейцина, лизина и пролина в воротной вене и имела тенденцию к повышению массового остатка изолейцина (Р<0,10).
Таблица 2. Чистые остатки аминокислот в воротной вене у свиней, получающих дуоденальную инфузию 0 или 930 мкмоль/(кг·ч) AKG (n=5).
Аминокислота
Контроль
AKG<sup>1</sup>
Остаток в воротной вене
Остаток в воротной вене
мкмоль/(кг·ч)
% поступления
мкмоль/(кг·ч)
% поступления
Эссенциальные аминокислоты
Изолейцин
164,5±26
100,1
230,2<sup>б</sup>±28
140,0
Лейцин
294,9±44
76,3
438,6<sup>а</sup>±50
113,4
Фенилаланин
80,4±11
83,3
95,2±11
98,7
Валин
218,5±33
85,2
279,3±32
108,9
Гистидин
27,7±11
43,1
45,9±3,8
71,4
Треонин
185,0±40
66,4
210,9±18
75,7
Лизин
237,7±35
72,3
324,5<sup>а</sup>±37
98,8
Триптофан
38,6±6,4
-
47,2±4,3
-
Условно эссенциальные аминокислоты
Аргинин
95,2±24
85,8
109,0±19
98,3
Пролин
216,4±25
69,9
354,5<sup>а</sup>±32
114,5
Тирозин
85,7±12
100,6
115,8±17
135,9
Неэссенциальные аминокислоты
Аланин
539,6±61
182,9
557,8±48
189,0
Аспартат
28,2±4,6
9,2
29,7±6,0
9,6
Аспарагин
169,9±23
-
185,6±18
-
Глутамат
64,2±23
14,9
80,1±17
18,6
Глутамин
17,2±12
-
25,5±45
-
Глицин
167,0±27
109,4
177,2±20
116,0
Серин
213,3±89
94,4
244,7±64
108,3
<sup>а </sup>Отличается от контроля (Р≤0,05); <sup>б</sup> Отличается от контроля (Р<0,10)
<sup>1</sup> AKG, α-кетоглутарат; <sup>2</sup> Среднее ±SEM
Кинетика лейцина в целом организме показана на чертеже. Обработка AKG не оказывала влияния на поток в целом организме, NOLD, Ra и окисление.
Пример 2 - Измерение среднего исчезновения AKG в просвете
Цель
Целью данного примера является оценка среднего исчезновения инфузированного болюса AKG в просвете.
Опыты на животных
Свиньям (n=7) осуществляли дуоденальную болюсную инфузию (7,75 мл/кг; 25%-ный (мас./мас.) водный раствор) жидкого заменителя молока (Litter Life, Merrick), содержащего 25 мг/мл натрий-AKG (1040 мкмоль/кг BW).
Через 1 ч свиней умерщвляли.
Тонкий кишечник осторожно зажимали в проксимальной части двенадцатиперстной кишки и дистальной части подвздошной кишки, извлекали и промывали струей 2×50 мл физиологического раствора, чтобы промыть кишечник.
2
Смывы собирали, объединяли, и аликвоту 15 мл мгновенно замораживали в жидком N и хранили при -80°С для последующего анализа AKG.
Результаты
Инфузировали AKG болюсом 1040 мкмоль/кг. Среднее исчезновение в просвете составляло 663±38 мкмоль/кг за один час. Это значение представляет 63,8 из 1040 мкмоль/кг инфузированной AKG.
Обсуждение и общее заключение из эксперимента 1 и 2
В Примере 1 AKG непрерывно инфузировали в двенадцатиперстную кишку, и только 10% инфузированной AKG появилось в дренаже воротной вены.
Наблюдение, что только 10% инфузированной AKG появилось в плазме воротной вены, увеличивает вероятность некоторых вариантов судьбы AKG в просвете. Одним из возможных объяснений небольшого появления AKG в воротной вене является то, что транспорт AKG в просвете ограничен. Натрий/дикарбоксилатные со-транспортеры, способные транспортировать AKG, существуют на мембранах кисточковой каемки свиньи (9), поэтому кажется маловероятным, что AKG не будет захвачена энтероцитами. Чтобы проверить это, авторы изобретения инфузировали один дуоденальный болюс 1040 мкмоль/кг и обнаружили, что более 660 мкмоль/кг исчезает из тонкого кишечника поросят за 1 ч (Пример 2). Таким образом, примерно 64% болюса AKG исчезло из просвета двенадцатиперстной кишки только за 1 час.
Инфузия AKG не оказывала воздействия на чистое исчезновение глутамата и глутамина в воротной вене, как наблюдали ранее (6). Если поглощенная AKG превращалась в глутамат, она должна была либо высвобождаться в кровь воротной вены, либо превращаться в другие аминокислоты.
Можно было бы, однако, ожидать, что высвобождение глутамата и глутамина не будет повышаться посредством AKG, даже если происходит существенное превращение в эти аминокислоты, учитывая, что очень мало пищевого глутамата или глутамина высвобождается PDV (portal drain viscera, внутренней частью дренированной воротной вены) в условиях нормального питания (ссылки 1, 2). Показано (10), что пролин может синтезироваться из кишечного глутамата тканью кишечника. Учитывая, что повышение чистого остатка пролина в воротной вене составляло 138,1 мкмоль/(кг·ч) у свиней, обработанных AKG, и что более 800 мкмоль/(кг·ч) AKG не было учтено в остатке в воротной вене, возможно, что повышение чистого остатка пролина в воротной вене может быть полностью результатом превращения из AKG. Однако такое значительное превращение AKG в пролин в энтероците должно было привести к снижению остатка аммиака в воротной вене, но остаток аммиака в воротной вене оставался неизменным. Отсутствие эффекта в отношении остатка аммиака в воротной вене было также отражено в похожих скоростях синтеза мочевины в двух группах.
Трансаминаза разветвленных аминокислот (ВСАА) катализирует взаимодействие между AKG и разветвленными аминокислотами (лейцином, изолейцином и валином). ВСАА трансаминируется, образуя глутамат из AKG и соответствующую кетокислоту из каждой ВСАА. Дополнительная AKG может привести к снижению чистого высвобождения ВСАА из PDV посредством стимуляции трансаминирования ВСАА с образованием глутамата. Однако высвобождение лейцина в воротной вене было повышено посредством AKG, хотя это не оказывало воздействия на кинетику лейцина в целом организме. Чистый остаток лизина в воротной вене также повышался посредством AKG. В связи с тем, что чистый остаток многих аминокислот в воротной вене составлял около 100% для многих аминокислот при обработке AKG, неясно, экономила ли AKG аминокислоты или повышала высвобождение аминокислот вследствие протеолиза во внутренней части дренированной воротной вены.
2
2
2
Кроме того, вероятной судьбой AKG внутри энтероцита является окисление через цикл трикарбоновых кислот (ТСА). Если действительно весь углерод, инфузированный в виде AKG, окислялся до СО, следовало бы ожидать повышения выхода CO из PDV, тогда как продуцирование CO в целом организме при инфузии AKG не повышается. Интересно, что чистый остаток глюкозы в воротной вене снижался при обработке AKG.
В связи с тем, что значительные количества AKG исчезали из просвета тонкого кишечника, но это не может объясняться дренажом воротной вены ни в отношении AKG, ни в отношении чистого остатка аминокислотных продуктов метаболизма AKG, судьба AKG при энтеральном питании остается неясной. Однако, когда AKG инфузировали в двенадцатиперстную кишку, только 10% подачи в просвет появлялось в дренаже воротной вены, хотя этого количества AKG было достаточно для повышения остатка в воротной вене и концентрации этого соединения в кровообращении. Таким образом, несмотря на неопределенность в отношении точной метаболической судьбы AKG в просвете, эти результаты указывают на то, что доступность пищевой AKG из кишечника ограничена.
Полученное в результате повышение AKG в кровообращении не оказывало эффекта в отношении чистого появления в воротной вене глутамата, глутамина, аммиака, ВСАА.
Кроме того, повышенная системная AKG не оказывала эффекта на кинетику лейцина в PDV или в целом организме или на поток мочевины. Эти результаты согласуются с предыдущими данными, когда AKG доставляли внутрижелудочно.
Пример 3 - Сравнительное влияние Na-AKG и хитозан-AKG, введенных энтерально, на ресорбцию аминокислот и кетокислот в энтероцитах и плазме крови и их метаболизм
Цель
Целью данного примера является сравнение влияния Na-AKG (или Na-соли AKG) и хитозан-AKG, введенных энтерально, на ресорбцию аминокислот и кетокислот в энтероцитах и плазме крови и их метаболизм. Также измеряли влияние Na-AKG и хитозан-AKG на превращение кетокислот в аминокислоты путем мониторинга уровней аминокислот в плазме крови. Это исследование является проверкой гипотезы от том, что AKG влияет на превращение кетокислот в аминокислоты в кишечнике и улучшает синтез белка.
Опыты на животных
В данном эксперименте использовали всего три свиньи; эти свиньи имели массу тела примерно 20 кг. Свиней разделяли по клетям и кормили стандартной пищей в течение 4-5 суток для адаптации к новым приспособлениям. Затем свиньям хирургическим путем имплантировали катетеры и кишечные канюли и давали 3-7 суток на восстановление.
Используемые хирургические процедуры представляли собой процедуры, обычно используемые в данной области техники и известные специалистам в данной области техники.
После операции в данном случае обеспечивали 3-суточный восстановительный период, и свиней кормили один раз в сутки (в момент времени 10.00) стандартным кормом (3% от массы тела). После восстановительного периода измеряли уровень аминокислот в плазме крови в условиях введения Na-AKG (см. эксперимент (2)), введения хитозан-AKG (эксперимент (3)) и без введения AKG (эксперимент (1); контрольный эксперимент), дополнительные подробности которых приведены ниже.
Условия введения AKG.
Эксперимент (1).
Кетокислоты или аминокислоты (Амины) (суммарный объем 50 мл) инфузировали интрадуоденально (и.д.) в дозе *«эквивалента утреннего питания» в течение 1 часа.
10 порций давали за 1 ч (50 мл дозы +50 мл физиологического раствора).
Этот эксперимент представлял собой контрольный эксперимент
(*«эквивалент утреннего питания» означает, что животные получали примерно такое же количество аминокислот, какое обычно присутствует в корме, соответствующем утреннему питанию).
Отбирали образцы крови (на исходном** уровне, 0 ч) и через 1, 2, 4 часа.
(**Исходный уровень определяют как образец в момент времени 0 до инфузии аминокислот/кетокислот.)
Образцы крови (5 мл цельной крови для аминокислотного анализа из артерии, воротной, печеночной вены) собирали в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) с апротинином для остановки коагуляции и протеиназной активности.
(Обработка может включать использование 5 капель ЭДТА+тразилол, центрифугирование и замораживание плазмы при -20°С.)
Эксперимент (2).
Кетокислоты или аминокислоты (Амины), смешанные с Na-AKG (в суммарном объеме 50 мл), инфузировали интрадуоденально (и.д.) в дозе *«эквивалента утреннего питания» в течение 1 часа (10 порций давали за 1 ч, 50 мл дозы, возможно с физиологическим раствором).
Отбирали образцы крови (на исходном уровне, 0 ч) и через 1, 2, 4 часа.
Образцы крови (5 мл цельной крови для аминокислотного анализа из артерии, воротной, печеночной вены) собирали в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) с апротинином для остановки коагуляции и протеиназной активности.
Эксперимент (3).
Кетокислоты или аминокислоты (Амины), смешанные с хитозан-AKG (в суммарном объеме 50 мл), инфузировали интрадуоденально (и.д.) в дозе *«эквивалента утреннего питания» в течение 1 часа (10 порций давали за 1 ч, 50 мл дозы, возможно с физиологическим раствором).
Отбирали образцы крови (на исходном уровне, 0 ч) и через 1, 2, 4 часа.
Образцы крови (5 мл цельной крови для аминокислотного анализа из артерии, воротной, печеночной вены) собирали в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) с апротинином для остановки коагуляции и протеиназной активности.
Результаты
В приведенной ниже таблице 3 показаны результаты данного исследования.
Таблица 3. Инкрементное повышение свободных аминокислот в крови после введения аминокислот
Время (ч)
ΔI (ммоль/л)
ΔII (ммоль/л)
ΔI (ммоль/л)
ΔII (ммоль/л)
Артерия
Артерия
Печеночная
Печеночная
вена
вена
1
-0,5<sup>a</sup>
0,65<sup>в</sup>
0,43<sup>А</sup>
0,23<sup>А</sup>
1,5
0,04<sup>б</sup>
1,1<sup>г</sup>
1,6<sup>Б</sup>
1,85<sup>БВ</sup>
2,5
-0,48<sup>а</sup>
1,69<sup>г</sup>
1,59<sup>Б</sup>
1,94<sup>В</sup>
I представляет собой соль Na-AKG
II представляет собой соль хитозан-AKG
Δ-инкремент во времени = (аминокислоты в Δ-время 0 - уровень аминокислот через 1, 1,5 и 2,5 ч)
Различающиеся маленькие или заглавные буквы, приведеные с результатами, описывают статистические различия при р<0,05.
Обсуждение и общие заключения к Примеру 3
Этот пример показывает, что соль хитозан-AKG улучшает всасывание эссенциальных аминокислот. Это улучшение больше, чем достигнутое с использованием Na-AKG. Это наблюдение является важным и существенным для лучшей утилизации пищевых аминокислот для улучшения всасывания аминокислот в нарушенной ткани кишечника, обнаруживаемой, например, у пациентов-диабетиков или пожилых людей.
ПРИМЕРЫ ПИЩЕВОЙ (ДИЕТИЧЕСКОЙ) ДОБАВКИ И/ИЛИ КОМПОНЕНТА
AKG, моно- и диметаллические соли AKG или хитозан-AKG могут быть использованы в качестве активного агента.
Напиток
Состав напитка (на 1000 литров):
Активный агент
0,4%
Подсластитель
0,225%
Лимонная кислота
0,5%
Ванильный ароматизатор
0,01%
Аскорбиновая кислота
0,05%
Двуокись углерода
2,0%
Вода
до 100%
Напиток готовят с использованием стандартного способа. Ингредиенты, за исключением лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты и двуокиси углерода, смешивают в подходящем резервуаре, снабженном механической мешалкой. Затем добавляют лимонную кислоту и аскорбиновую кислоту и тщательно перемешивают в течение 15-20 мин. Добавляют оставшуюся воду. Полученную смесь насыщают двуокисью углерода и разливают в подходящие контейнеры.
Корм для домашних животных
Состав корма:
Активный агент
0,4%
Желатин
4,8%
Пшеничные отруби
5,7%
Витамины и минералы
7,7%
Кукурузный крахмал
25,4%
Сухое молоко
11,6%
Казеин
25,7%
Дрожжи
8,7%
Говяжий жир
9%
Подсолнечное масло
1%
Указанную композицию готовят простым смешиванием указанных компонентов в соответствии с традиционными технологиями и фасуют в стандартные упаковки весом по 0,25, 0,5 и 1 кг.