ВАКЦИНА ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ПРОДУКТИВНЫХ ЖИВОТНЫХ
POLYVALENT VACCINE AGAINST SALMONELLOSIS OF PRODUCTIVE ANIMALS

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и может быть использовано при промышленном производстве инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных.
Известен способ изготовления вакцины против паратифа поросят [1] и способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных [4].
Предложенные вакцины против сальмонеллеза обладают рядом недостатков: процесс культивирования довольно продолжителен (12-14 ч), не позволяет использовать современное оборудование, защитная среда для лиофильного высушивания не обеспечивает стабильности вакцины при длительном хранении.
Известен препарат на основе лизатантигенов сальмонелл против сальмонеллеза свиней [2, 3].
Изготовления указанного препарата имеет ряд недостатков: сальмонеллы выращиваются в неуправляемом режиме, инактивация проводится гидраксиламином, который более токсичен, чем формалин. Препарат изготавливается в сухом виде методом лиофильной сушки. Нами предлагается форма вакцины, в качестве адъюванта - гидроокись алюминия. Такая технология значительно снижает себестоимость вакцины.
Задача заявляемого изобретения - получение высокоиммуногенной инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины, обеспечивающей надежную защиту от желудочно-кишечных заболеваний продуктивных животных, вызываемых сальмонеллами, а также повышение качества и стандартности биологических свойств инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины.
Эта задача достигается введением в состав вакцины гидроокиси алюминия, а также осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и щадящих режимов инактивации сальмонелл.
В состав указанной вакцины входят 4 производственных штамма сальмонелл - Salmonella choleraesuis 370, Salmonella typhimurium 371, Salmonella abortusovis 372 и Salmonella dublin 373 [6].
Выращивание сальмонелл проводят следующим образом.
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками [6].
2
Питательную среду в ферментерах засевают раздельно матровыми расплодками сальмонелл, выращенными в питательной среде на основе перевара Хоттингера. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до (-100)-(-120) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до конца процесса культивирования с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20-30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости поддерживают на уровне 7,6-7,7 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,15)% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Полученную бактериальную культуру двух производственных штаммов сальмонелл с измеренной концентрацией бактерий перекачивают в четыре отдельных, заранее подготовленных реактора (или стеклянные баллоны) и добавляют при постоянном перемешивании дробно 37%-ный водный раствор формальдегида до его конечной концентрации 0,2-0,3%, доводят рН до 7,1-7,2 ед. добавлением 10%-ного раствора NaOH, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 37-41°С в течение 3-7 суток.
3
3
3
9
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию (15,0-25,0)×10 м.т./см.
После инактивации, адсорбции культур на гидроокиси алюминия и декантации надосадочной жидкости компоненты вакцины смешивают в равных объемах.
Вакцину расфасовывают с соблюдением условий асептики при постоянном перемешивании в стерильных условиях.
После перемешивания вакцину расфасовывают с соблюдением условий асептики при постоянном перемешивании в стерильные флаконы.
Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения резистентности организма животных к заболеванию сальмонеллезной этиологии. Заявляемая вакцина обладает высокой профилактической эффективностью.
3
3
3
3
9
3
2
Технический результат изобретения достигается в способе изготовления вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных путем включения в состав заявляемой вакцины в качестве микроорганизмов бактериальной массы четырех штаммов сальмонелл, их раздельное культивирование проводят до исходных концентрациях микроорганизмов 15,0-25,0 млрд.м.т./см в ферментерах при окислительно-восстановительном потенциале культуральной жидкости -100÷ -120 мВ, после чего до окончания культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 20-30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне 7,6-7,7, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,1-0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, инактивацию культур сальмонелл проводят формальдегидом при температуре 37-41°С в течение 3-7 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,2-0,3%. После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток, после отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости для получения в осадке заданной концентрации микробных тел каждого штамма сальмонелл (15,0-25,0)×10 м.т./см, затем проводят смешивание культур штаммов сальмонелл в вакцине в равных объемах.
В патентной научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа изготовления вакцины против сальмонеллеза продуктивных животных аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».
Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Эта цель достигнута подбором и введением в состав вакцины неконкурирующих между собой антигенов производственных штаммов и оптимальным количественным их соотношением, осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и щадящих режимов инактивации.
Пример 1. Способ изготовления вакцины с минимальными значениями параметров
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.
2
2
Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -120 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,10% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 37°С в течение 3 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,20%.
3
3
3
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 15,0 млрд. м.т./см.
3
Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см:
- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella Dublin №373 - 15,0.
Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.
2
2
Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -110 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 25% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,10% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 39°С в течение 5 суток, причем конечная концентрация формальдегида культуре составляет 0,25%.
3
3
3
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 20,0 млрд. м.т./см.
3
Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см:
- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 20,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 20,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 20,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 20,0.
Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.
2
2
Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -100 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,7 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,15% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 41°С в течение 7 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,30%.
3
3
3
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 25,0 млрд. м.т./см.
3
Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см:
- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 25,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 25,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 25,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 25,0.
Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.
2
2
Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -130 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,2 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,05% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 35°С в течение 1 суток, причем конечная концентрация формальдегида культуре составляет 0,15%.
3
3
3
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 15,0 млрд. м.т./см.
3
Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см:
- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 15,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 15,0.
Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями выше максимальных
Для культивирования сальмонелл используют жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера с ростовыми добавками.
2
2
Среду засевают раздельно матриксными культурами сальмонелл, выращенных в жидкой питательной среде аналогичного состава. Культивируют при (37±1)°С в течение 6-8 часов. После засева ферментеров окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости снижают до -90 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха, после чего до окончания процесса культивирования поддерживают pO в культуральной жидкости на уровне 30% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости на уровне 7,6 ед. с помощью подачи 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации 0,30% при лимитировании роста сальмонелл глюкозой, характеризующемся резким повышением pO при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Процесс инактивации культур штаммов сальмонелл проводят 37%-ным водным раствором формальдегида при 43°С в течение 9 суток, причем конечная концентрация формальдегида в культуре составляет 0,35%.
3
3
3
3
После проверки на стерильность и полноту инактивации к инактивированной формальдегидом культуре каждого штамма, содержащей известное количество микробных тел в 1 см, добавляют 4%-ную взвесь гидроокиси алюминия рН (7,2±0,1) ед. из расчета 130 см на каждый дм культуры, перемешивают 15-20 мин и выдерживают при температуре 18-20°С в течение 2-3 суток, ежедневно перемешивая 2-3 раза, а затем без перемешивания 2 суток. После отстоя адсорбированной на гидроокиси алюминия культуры проводят декантирование прозрачной надосадочной жидкости с таким расчетом, чтобы получить в осадке концентрацию 30,0 млрд. м.т./см.
3
Культуры штаммов сальмонелл смешивают в вакцине в равных объемах при следующих исходных концентрациях, млрд. м.т./см:
- бактериальная масса из штамма Salmonella choleraesuis №370 - 30,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella typhimurium №371 - 30,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella abortusovis №372 - 30,0;
- бактериальная масса из штамма Salmonella dublin №373 - 30,0.
Технологические параметры изготовления инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против сальмонеллеза свиней, указанные в примерах, приведены в таблице.
Вакцина, изготовленная по примерам 1-3, обладает высокой иммуногенной активностью и соответствует требованиям ТУ (СТО), тогда как вакцина, приготовленная по пункту 4, не обладает достаточной иммуногенной активностью, а вакцина, изготовленная по примеру 5, обладает повышенной реактогенностью.
Источники информации
1. «Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против паратифа поросят», утверждена Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 18 апреля 1985 г.
Паспорт - Salmonella choleraesuis №370 (ФГБНУ «ВГНКИ»)
Паспорт - Salmonella typhimurium №371 (ФГБНУ «ВГНКИ»)
Паспорт - Salmonella abortusovis №372 (ФГБНУ «ВГНКИ»)
Паспорт - Salmonella dublin №373 (ФГБНУ «ВГНКИ»)
2. Субботин В.В., Сидоров М.А. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококков. // Ветеринария, Москва. 1993.
3. Кудрявцев В.В. Иммуногенные свойства лизат-антигенов из сальмонелл, эшерихий и стафилококков. //Автореферат дис. канд. ветнаук, Москва. 1993.
4. Патент РФ №2129016 от 20 апреля 1999 г., А61К 39/112 «Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных».
5. Патент РФ №2191598 от 27 октября 2002 г. А61К 39/102 «Вакцина ассоциированная гидроокисьалюминиевая против инфекционных пневмоний свиней бактериальной этиологии и способ ее изготовления».
6. Павленко И.В. и др. Совершенствование технологии производства сухой живой вакцины против сальмонеллеза телят //Вестник Казанского технологического университета» - 2013. №8 - С. 226-232.