ОБЪЕКТ КУКУРУЗЫ MON 87411
CORN OBJECT MON 87411

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов Америки № 61/644368, поданной 8 мая 2012 года, которая включена в настоящее изобретение путем ссылки во всей полноте.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, находящийся в файле под наименованием "MONS308WO_ST25.txt", созданном 6 мая 2013 года, размер которого составляет 230 килобайт (размер измерен согласно Microsoft Windows), в настоящем изобретении представлен в электронном виде и включен в него путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к трансгенному объекту Zea mays MON 87411. Объект обладает двумя механизмами действия, представляющими собой устойчивость к поражению злаковыми корневыми червями и толерантность к гербициду глифосату. Настоящее изобретение также относится к растениям, частям растений, семенам растений, клеткам растений, сельскохозяйственным продуктам и способам, связанным с объектом MON 87411, и рассматривает получение нуклеотидных молекул, которые являются уникальными для упомянутого объекта и были созданы путем вставки трансгенной ДНК в геном растения Zea mays.
УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Во многих регионах мира кукуруза (Zea mays) является важной культурой, которую подвергают биотехнологическим разработкам с целью получения зерна с желательными признаками. Экспрессия в растении трансгена устойчивости к насекомым или толерантности к гербицидам может придавать растению желательные признаки устойчивости к насекомым и/или толерантности к гербицидам, но на экспрессию таких трансгенов может влиять множество различных факторов, включающих в себя ориентацию и композицию кассет, запускающих экспрессию отдельных генов, переносимых в хромосому растения, и хромосомная локализация и геномный результат вставки трансгена. Например, отдельные объекты могут иметь варианты по уровню и характеру экспрессии трансгена, которые в других отношениях идентичны, за исключением сайта хромосомной вставки трансгена. Некоторые объекты также могут иметь нежелательные фенотипические или агрономические различия. Поэтому часто приходится получать и анализировать большое количество отдельных трансформационных объектов растений с целью выбора объекта, имеющего улучшенные свойства по отношению к желаемому признаку и оптимальные фенотипические и сельскохозяйственные характеристики, необходимые для пригодности объекта для коммерческих целей. Для такой селекции часто требуется всестороннее определение молекулярных характеристик, а также исследования многочисленных объектов в тепличных и полевых условиях на протяжении ряда лет, в нескольких местоположениях и при различных условиях, чтобы получить возможность собрать значительное количество агрономических, фенотипических и молекулярных данных. Полученные данные и наблюдения должны быть проанализированы коллективом ученых и агрономов с целью селекции подходящего в коммерческом отношении объекта. После селекции такой объект можно использовать для интрогрессии желаемого признака в другие генетические среды с помощью способов селекции растений, и, таким образом, получать ряд различных сортов растений, которые содержат желаемый признак и соответствующим образом адаптированы к конкретным местным условиям роста.
0
0
0
Для создания трансгенного растения, содержащего один объект трансформации, часть конструкции рекомбинантной ДНК переносят в геном клетки кукурузы, и затем выращивают эту клетку кукурузы до растения. Клетку кукурузы, в которую изначально переносится объект, подвергают регенерации для получения поколения R. Растения R и потомство растений от растения R можно тестировать в отношении любого желаемого признака (признаков), но на эффективность объекта могут влиять факторы цис- и/или транс-ориентации, относящиеся к сайту интеграции в случае трансформации. На фенотип, придаваемый объектом, также может влиять размер и дизайн ДНК-конструкции, которые можно варьировать путем комбинации генетических элементов в экспрессионной кассете, количества трансгенов, количества кассет экспрессии и конфигурации таких элементов и таких кассет. Идентификация объекта с желаемыми признаками может дополнительно осложняться такими факторами, как параметры трансгенной экспрессии в ходе развития растения, в зависимости от времени суток, продолжительности или местоположения; или внешними факторами, такими как условия окружающей среды для роста растений, обеспеченность водой, наличие азота, тепла или стресса. Таким образом, невозможно легко прогнозировать получение объекта, придающего желаемый набор фенотипических признаков.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения идентифицировали трансгенный объект кукурузы MON 87411, проявляющий превосходные свойства и продуктивность, по сравнению с имеющимися в настоящее время трансгенными растениями кукурузы и с созданными параллельно новыми объектами. Объект кукурузы MON 87411 содержит три связанных кассеты экспрессии, которые в совокупности придают признаки устойчивости к злаковым корневым червям и толерантность к гербициду глифосату в клетках кукурузы, тканях кукурузы, семенах кукурузы и растениях кукурузы, содержащих трансгенный объект MON 87411. Объект кукурузы MON 87411 обладает двумя механизмами действия против видов вредителей кукурузы - злаковых корневых червей (включающих в себя виды Diabrotica, в частности, вредителей, представляющих собой Diabrotica virgifera virgifera (блошка длинноусая западная, WCR), Diabrotica barbery (блошка длинноусая северная, NCR), Diabrotica virgifera zeae (блошка длинноусая мексиканская, MCR), Diabrotica balteata (блошка длинноусая бразильская (BZR) или комплекс блошек длинноусых бразильских (BCR), состоящий из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa) и Diabrotica undecimpunctata howardii (блошка длинноусая южная, SCR)). Двойной механизм действия обеспечивает избыточность и значительно снижает вероятность развития резистентности к признакам борьбы с вредителями.
Объект MON 87411 характеризуется специфичными уникальными сегментами ДНК, которые являются полезными для обнаружения присутствия объекта в образце. Считается, что образец относится или к композиции, которая по существу не содержит ДНК кукурузы, или к композиции, которая содержит ДНК кукурузы. В любом случае, образец представляет собой биологический образец, то есть этот образец содержит биологические материалы, включающие в себя без ограничения ДНК, полученную или происходящую, прямым или опосредованным способом, из генома объекта кукурузы MON 87411. "Прямой способ" относится к тому, что специалист в данной области может получать ДНК непосредственно из генома кукурузы путем разрушения клеток кукурузы (или путем получения образцов кукурузы, которые содержат разрушенные клетки кукурузы) и проводить детекцию геномной ДНК. "Опосредованный способ" относится к тому, что специалист в данной области может получать в конкретном образце целевую ДНК или специфичную референс-ДНК, то есть новый и уникальный сочленяющий сегмент, предназначенный, согласно изобретению, для диагностики наличия объекта MON 87411, способами, отличными от прямого способа, путем разрушения клеток кукурузы или получения образца кукурузы, содержащего разрушенные клетки кукурузы. Такие опосредованные способы включают в себя без ограничения амплификацию сегмента ДНК, содержащего последовательность ДНК-мишени для конкретного зонда, предназначенного для специфичного связывания с последовательностью-мишенью, или амплификацию сегмента ДНК, который можно измерить и описать его характеристики, т.е. измерить путем отделения от других сегментов ДНК с помощью какой-либо эффективной матрицы, например, агарозного или акриламидного геля или подобной матрицы, или описать его характеристики путем анализа прямого секвенирования ампликона или клонирования ампликона в вектор и прямого секвенирования вставленного ампликона, расположенного в пределах такого вектора. Альтернативно, можно клонировать различными способами сегмент ДНК, соответствующий положению внутри хромосомы кукурузы, в который была встроена трансгенная ДНК в хромосому кукурузы и который можно использовать для определения объекта MON 87411, а также идентифицировать и описывать его присутствие в конкретном образце или в конкретном геноме кукурузы. Такие сегменты ДНК называют сочленяющими сегментами или последовательностями, и они могут иметь любую длину вставленной ДНК и примыкающей (фланкирующей) хромосомной ДНК кукурузы при условии, что точка сочленения между вставленной ДНК и геномом кукурузы входит в этот сегмент. Примерами таких сегментов являются SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 21 и их обратно комплементарные последовательности.
Конкретные последовательности, идентифицированные в изобретении, могут однозначно присутствовать в объекте MON 87411, или в содержащей этот объект конструкции, и определение этих последовательностей, как с помощью прямого анализа последовательностей, путем обнаружения зондов, связанных с этими последовательностями, так и путем установления размера и, возможно, композиции конкретных ампликонов, описанных в изобретении, если они присутствуют в конкретной зародышевой плазме кукурузы или в геноме и/или присутствуют в конкретном биологическом образце, содержащем ДНК кукурузы, является диагностическим на наличие в таком образце объекта MON 87411 или содержащей этот объект конструкции. Известно, что фланкирующие геномные сегменты (то есть геномные сегменты последовательности ДНК кукурузы, смежные по отношению к вставленной трансгенной ДНК) подвергаются небольшой изменчивости, и таким образом, существует ограничение идентичности по меньшей мере 99% или больше, в отношении таких аномалий или полиморфизмов от одного генома кукурузы до другого генома кукурузы. В объем настоящего изобретения входят нуклеотидные сегменты, которые являются полностью комплементарными по всей их длине, при сравнении с конкретными диагностическими последовательностями, упомянутыми в настоящем изобретении.
Положение нуклеотидных сегментов по настоящему изобретению по отношению друг к другу и в геноме кукурузы представлены на Фиг.  3, и нуклеотидная последовательность каждого из них показана в SEQ ID NO: 1. Нуклеотидные сегменты, которые характеризуют объект MON 87411 и которые являются диагностическими на присутствие в образце объекта MON 87411 или содержащей этот объект конструкции, включают в себя SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. Если упомянутый образец содержит ткани кукурузы и, следовательно, ДНК кукурузы, то наличие одной или двух, или нескольких из этих нуклеотидных последовательностей в образце является диагностическим на присутствие объекта MON 87411 или конструкции, содержащей этот объект.
Использование понятия "происходящий от" предполагает, что конкретная молекула ДНК находится в геноме растения кукурузы или может быть обнаружена в ДНК растения кукурузы. "Возможный для обнаружения" относится к возможности амплификации конкретного сегмента ДНК, и к определению или выяснению характеристик его размера и последовательности путем анализа последовательности ДНК, и может также относиться к способности зонда к специфичному связыванию с конкретным сегментом ДНК, то есть, с целевым сегментом ДНК, и к последующей способности обнаруживать связывание зонда с этой мишенью. Конкретный сегмент ДНК или целевой сегмент ДНК по настоящему изобретению присутствует в кукурузе, которая содержит вставку - объект MON 87411.
В отношении кукурузы предполагается, что клетки кукурузы, семена кукурузы, части растений кукурузы и растения кукурузы входят в объем настоящего изобретения при условии, что каждый их вариант осуществления содержит определяемое количество ДНК, соответствующее какому-либо из одного, двух или нескольких сегментов, которые описаны в настоящем изобретении как диагностические на присутствие ДНК объекта кукурузы MON 87411. Части растений кукурузы включают в себя клетки, пыльцу, семязачаток, цветки и части цветков, такие как початки, нити и кисти, ткань корня, ткань стебля и ткань листа. В объем настоящего изобретения входят товарные продукты, сделанные из кукурузы, которая имеет поддающееся обнаружению количество сегментов ДНК, описанных в изобретении в качестве диагностических на присутствие объекта MON 87411. Такие товарные продукты могут включать в себя цельные или обработанные семена кукурузы, корма для животных, содержащее зерно кукурузы или побочные кукурузные продукты, кукурузное масло, размолотую кукурузу, кукурузную муку, кукурузный крахмал, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, кукурузную биомассу и солому, и топливные продукты и вторичные топливные продукты, сделанные из кукурузного зерна или растений и частей растений кукурузы.
Обычно ДНК из объекта кукурузы MON 87411 присутствует в каждой клетке и в каждой хромосоме растения кукурузы, семян кукурузы и тканей кукурузы, содержащих упомянутый объект. Геном кукурузы передается потомству согласно менделевским принципам, поэтому, если растения кукурузы были гомозиготными, в потомстве каждое растение и клетка кукурузы будет содержать этот объект ДНК в каждой из родительских хромосом, полученных в наследство от родителя (родителей). При этом, если геном кукурузы, содержащей ДНК объекта MON 87411, принадлежит гетерозиготным или гибридным родителям, то только пятьдесят процентов пыльцы и пятьдесят процентов яйцеклеток, участвующих в спаривании от гибридных родителей, будут нести ДНК объекта кукурузы MON 87411, в результате чего будет получена смешанная популяция потомства, несущего ДНК объекта MON 87411, и процент этого потомства, возникающего в результате таких скрещиваний с гибридами, может варьироваться от пятидесяти до семидесяти пяти процентов, несущих ДНК объекта MON 87411, которая было передана такому потомству.
Молекулы ДНК согласно настоящему изобретению могут быть уникальными для вставленной ДНК в объекте кукурузы MON 87411 или для двух сочленений между трансгенной вставкой ДНК и геномной ДНК кукурузы, которая примыкает к какому-либо из концов вставленной ДНК. Если такие молекулы присутствуют в конкретном образце, который анализируют с помощью описанных в изобретении способов с использованием зондов, праймеров, и в некоторых случаях, с помощью анализа последовательности ДНК, то они могут быть диагностическими на присутствие в этом образце некоторого количества объекта кукурузы MON 87411. Такие молекулы ДНК, уникальные для ДНК объекта кукурузы MON 87411, могут быть идентифицированы и охарактеризованы несколькими способами, в том числе с использованием молекул нуклеиновых кислот, сконструированных для специфичного связывания с молекулами уникальных ДНК с последующим обнаружением связывания таких зондов с уникальной ДНК, и с помощью способов термической амплификации, в которых используют по меньшей мере две разных молекулы ДНК, действующих в качестве зондов, при этом последовательность таких молекул может быть несколько меньше, чем описанные выше зонды. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что контактирование специфичной целевой ДНК с зондом или праймером при подходящих условиях гибридизации приведет к связыванию этого зонда или праймера с целевым сегментом ДНК.
Молекулы ДНК по настоящему изобретению, которые представляют собой целевые сегменты ДНК, способны к амплификации и, если они определены в качестве одного или нескольких ампликонов представленной длины, полученных путем амплификации конкретного образца, эти молекулы могут быть диагностическими на присутствие в таком образце объекта MON 87411 или содержащей его конструкции. Такие молекулы ДНК или полинуклеотидные сегменты имеют нуклеотидные последовательности, указанные в каждой из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, и дополнительно описаны в данном разделе и в примерах ниже. Праймерные молекулы и/или зонды могут быть представлены в виде комплекта вместе с необходимыми реагентами, включающими в себя контрольные реагенты, и упакованы вместе с инструкцией по применению.
Молекулы рекомбинантных ДНК по настоящему изобретению считаются входящими в объем настоящего изобретения, если они находятся в микроорганизме или получены из микроорганизма. Микроорганизм должен включать в себя любую микроскопическую клетку, прокариотическую или эукариотическую, или клетку другого типа, которая содержит ДНК в геноме, или хромосоме или в экстра-хромосомной структуре ДНК, чаще называемой плазмидой или вектором. Микроскопические организмы включают в себя бактерии (прокариоты) и клетки, относящиеся к высшим формам жизни (эукариоты), размер которых ниже визуального уровня среднего человека, обычно меньше пятидесяти кубических микрон, и чаще меньше десяти кубических микрон. Бактерии являются распространенными микроскопическими микроорганизмами, которые, по всей вероятности, не могут содержать вектор или плазмиду, несущие один, или несколько, или все из новых сегментов ДНК по настоящему изобретению, в том числе каждую из соответствующих кассет экспрессии, присутствующих, как указано в SEQ ID NO: 1. Растительные клетки и, в частности, клетки растений кукурузы, входят в объем настоящего изобретения, если они содержат какой-либо из одного, двух или нескольких новых сегментов ДНК, или все из новых сегментов ДНК по настоящему изобретению.
Зонды, используемые в настоящем изобретении, обычно представляют собой молекулы ДНК или полинуклеотидные сегменты достаточной длины для функционирования в жестких условиях гибридизации, согласно изобретению, чтобы связываться с конкретным целевым сегментом ДНК, то есть с уникальным сегментом ДНК, присутствующим в ДНК объекта MON 87741, и служить для диагностики присутствия ДНК объекта MON 87741 в образце. Такой зонд может быть предназначен для связывания только с единственным сочленением или с другой новой последовательностью, присутствующей только в ДНК объекта кукурузы MON 87411, или с двумя или несколькими такими единичными сочленяющими сегментами. Обнаружение в каком-либо объекте связывания такого зонда с молекулой ДНК в конкретном образце, предположительно содержащем ДНК кукурузы, является диагностическим на присутствие в этом образце объекта кукурузы MON 87411.
Праймеры обычно представлены в виде пар разных олигонуклеотидов или полинуклеотидных сегментов для использования в реакции термической амплификации, с помощью которой амплифицируется конкретный целевой сегмент ДНК. Каждый праймер в паре предназначен для связывания с довольно специфичным сегментом ДНК в пределах или вблизи к сегменту ДНК, представляющим интерес для амплификации. Праймеры связываются таким образом, что затем они действуют как локализованные области полимеризации последовательностей нуклеиновых кислот, в результате чего получают один или несколько ампликонов (амплифицированные целевые сегменты ДНК). В настоящем изобретении применение праймеров, сконструированных для связывания с уникальными сегментами ДНК объекта кукурузы MON 87411 в конкретном биологическом образце, и упомянутая амплификация конкретных ампликонов, несущих один или несколько сочленяющих сегментов, описанных в изобретении, и детекция и определение характеристик этих ампликонов после завершения или прекращения полимеразной реакции, является диагностическим признаком наличия объекта кукурузы MON 87411 в конкретном образце. Специалисту в данной области хорошо известен этот способ амплификации, и нет необходимости приводить ссылки о подробностях амплификации в настоящем изобретении.
Растения кукурузы, клетки растений кукурузы, ткани растений кукурузы и семена кукурузы являются нечувствительными к обработкам гербицидом глифосатом благодаря экспрессии CP4 EPSPS - фермента нечувствительности к глифосату из промотора Rcc3 риса в экспрессионной кассете на дистальном 3'-конце, как показано в SEQ ID NO: 1. Такие семена можно высевать в поле. Через несколько дней после прорастания и появления всходов можно применять эффективное для контроля сорняков количество гербицида глифосата, который уничтожит по существу все сорняки в поле, но позволит продолжить рост и развитие растений кукурузы, содержащих ДНК объекта кукурузы MON 87411. Растения также устойчивы к поражению злаковыми корневыми червями всех известных видов корневых червей Diabrotica, включающих в себя без ограничения Diabrotica virgifera virgifera (блошка длинноусая западная, WCR), Diabrotica barbery (блошка длинноусая северная, NCR), Diabrotica virgifera zeae (блошка длинноусая мексиканская, MCR), Diabrotica balteata (блошка длинноусая бразильская (BZR) или комплекс блошек длинноусых бразильских (BCR), состоящий из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa) и Diabrotica undecimpunctata howardii (блошка длинноусая южная, SCR). Устойчивость к видам Diabrotica возникает в связи с экспрессией двух разных сегментов ДНК, которые функционально и ковалентно связаны в пределах вставленной трансгенной ДНК: двухцепочечная РНК (дцРНК) транскрибируется из кассеты экспрессии на 5' проксимальном конце вставленной трансгенной ДНК, как показано в SEQ ID NO: 1 и проиллюстрировано в Фиг. 1 в позиции [G] в SEQ ID NO: 12, и нацеливает супрессию жизненно важного гена у злаковых корневых червей; и белок Cry3Bb, токсичный для жесткокрылых насекомых, экспрессируется из кассеты экспрессии (примерно в центре в SEQ ID NO: 1, как показано на Фиг. 1 в позиции [H] в SEQ ID NO: 14) по центру между кассетой, экспрессирующей дцРНК [G], и кассетой на дистальном 3'-конце вставленной трансгенной ДНК, показанной в SEQ ID NO: 1 (кассета экспрессии толерантности к глифосату, показанная в Фиг. 1, позиция [I] в SEQ ID NO: 16). дцРНК нацеливает супрессию ортологичного гена дрожжей под наименованием snf7, и экспрессируется из промотора CАMV e35S, а белок Cry3Bb экспрессируется из промотора PIIG Zea mays. Упомянутые дцРНК и белок Cry3Bb являются токсичными агентами для видов злаковых корневых червей.
Промоторы, запускающие экспрессию токсичных агентов дцРНК и Cry3Bb, расположены дивергентно, таким образом, что экспрессия каждого из промоторов соответствующего токсичного агента происходит далеко от точки, находящейся в центре между двумя промоторами, т.е. транскрипция каждой кассеты экспрессии протекает в противоположных направлениях, без конвергенции. Кассета экспрессии CP4 EPSPS толерантности к глифосату расположена ниже по ходу транскрипции, т.е. проксимальнее 3'-конца, как показано в SEQ ID NO: 1, и дистальнее 3'-конца по отношению к кассете, запускающей экспрессию белка Cry3Bb. Кассеты, запускающие экспрессию Cry3Bb и EPSPS, продуцируют соответствующие белки с помощью тандемной ориентации транскрипции, Cry3Bb расположен выше по ходу транскрипции от EPSPS, и транскрибируется в той же ориентации, но каждый из своих отдельных соответствующих промоторов. Оставляя интактными кассету экспрессии дцРНК и кассету устойчивости к глифосату, и помещая на дистальных концах ДНК сегмент, предназначенный для вставки в геном кукурузы, получали другие варианты конструкции, в которых ориентация кассеты Cry3Bb была инвертированной или обратной по отношению к конструкции, присутствующей в ДНК объекта MON 87411. В этих вариантах конструкций для запуска экспрессии Cry3Bb использовали промотор PIIG Zea mays или промотор Rcc3 риса.
Трансгенные объекты, содержащие только упомянутые варианты конструкций/ориентации кассеты экспрессии Cry3Bb, сравнивали с объектом MON 87411 и с доступными в настоящее время коммерческими объектами: MON863 (содержащим только кассету экспрессии Cry3Bb), MON88017 (содержащим кассету экспрессии Cry3Bb, которая функционально связана с кассетой экспрессии CP4 EPSPS) и DAS-59122-7 (содержащим три функционально связанные кассеты экспрессии, две из которых тандемно экспрессируют двойные компоненты токсина Bt Cry34 и Cry35 вместе с геном, придающим толерантность к глюфозинату). Результаты, показанные ниже в разделе примеров, свидетельствуют, что объект MON 87411 демонстрирует превосходные свойства в отношении направленной в корни экспрессии белка Cry3Bb, и множество трансгенных объектов, полученные с помощью конструкции, которую использовали для создания объектов MON 87411, чаще проявляли эффективный контроль злаковых корневых червей, чем других объекты, полученные с другими конструкциями.
В объем настоящего изобретения входят растения кукурузы по настоящему изобретению и их части, в том числе семена, и каждая из частей растения содержит ДНК, соответствующую объекту MON 87411. Такие растения устойчивы к поражению злаковыми корневыми червями и нечувствительны к применению гербицида глифосата. Эти растения включают в себя гибриды, содержащие только один аллель MON 87411, то есть геном, отличающийся гетерозиготностью в отношении локуса, соответствующего объекту MON 87411 ДНК. Такие гибриды получают путем селекции с желаемой зародышевой плазмой для гарантии гибридной силы и других желательных в сельскохозяйственном плане свойств кукурузы. Гибриды можно получать любым из множества способов, но в предпочтительном способе используют преимущества первого инбредного (гомозиготного) родителя, который несет специфичный аллель объекта MON 87411 в обеих хромосомах в локусе, в который вставлена ДНК объекта MON 87411, и выводят первое инбредное растение вместе со вторым инбредным растением, которое не несет ДНК MON 87411. Оба варианта родительских инбредных растений будут иметь одно или несколько выгодных свойств, желательных для семян потомства, то есть, для гибридных семян.
Особенно желательным является трансгенное свойство или аллель, придающий некий дополнительный признак растению, содержащему ДНК объекта MON 87411. Такие трансгенные аллели включают в себя другие трансгенные объекты, придающие устойчивость к злаковым корневым червям, и включают в себя без ограничения такие объекты как DAS-59122-7, MIR604 и 5307. Каждый из этих объектов дает дополнительный агент, токсичный для злаковых корневых червей (DAS-59122-7 обеспечивает PS149B1 (Cry34/Cry35), обладающий свойствами токсичности для корневых червей и толерантности к гербициду глюфозинату; MIR604 обеспечивает модифицированный Cry3Aa, проявляющий свойства токсичности для корневых червей; объект 5307 обеспечивает ген FR8a, проявляющий свойства токсичности для корневых червей). Наличие дополнительных признаков устойчивости к злаковым корневым червям, например, наличие вышеперечисленных признаков, может снижать вероятность развития устойчивости к какому-либо представленному агенту, токсичному для злаковых корневых червей. Другие желательные признаки включают в себя признаки урожайности и устойчивости к стрессу или переносимости стресса, признаки фиксации азота, признаки, модулирующие использование воды, устойчивости к грибковому поражению, устойчивости к гербицидам, таким как дикамба (MON 87427), глюфозинат и т.п., а также признаки устойчивости к чешуекрылым вредителям. Признаки устойчивости к чешуекрылым вредителям были рассмотрены в данной области техники и включают в себя объекты трансгенной кукурузы (и соответствующие активные белки чешуекрылых) MON810 (Cry1Ab), MON 89034 (Cry1A.105 и Cry2Ab); TC1507 (Cry1Ac и Cry1Fa); DAS- 06275-8, также известный как TC-6275 (Cry1Fa и bar (придающий устойчивость к глюфозинату)); MIR162 (Vip3Aa), Bt176 (Cry1Ab) и BT11 (Cry1Ab). Альтернативой наличия в одном растении какой-либо комбинации или всех из перечисленных признаков, в частности, признаков устойчивости к насекомым, относящихся к объекту MON 87411, других перечисленных признаков устойчивости к злаковым корневым червям или признаков устойчивости к чешуекрылым, будет наличие упомянутых признаков в различные комбинациях смесей семян, в которых определенные семена в смеси содержат признаки MON 87411 и некую комбинацию исключительно из перечисленных признаков устойчивости к жесткокрылым, и совместно действуют под землей для предотвращения поражения злаковыми корневыми червями, в то время как другие семена в смеси содержат только признаки устойчивости к чешуекрылым и придают устойчивость к поражению кукурузы чешуекрылыми вредителями над землей. Таким образом, семена в смеси обеспечивают убежище для друга, то есть семена и растения с защитой от жесткокрылых действуют как убежище для растений, придающих устойчивость к чешуекрылым, и наоборот.
Вместе с тем, обычно эти признаки будут представлены в какой-либо комбинации или в пакете признаков, где признаки MON 87411 будут представлены совместно в одном растении с помощью выведения с одним или несколькими признаками устойчивости к чешуекрылым, для обеспечения полного пакета устойчивости к вредителям урожая в поле, и небольшой процент семян (возможно от 1 до 20 процентов, или любое количество, включающее в себя 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 процентов) будет иметь только признаки толерантности к гербициду и не будет иметь каких-либо признаков защиты от вредителей, и будут высажены в поле в рандомизированной смеси с семенами с признаками устойчивости к вредителям или в виде структурированного (отдельного) насаждения культур, и будут действовать в качестве убежища как от вредителей, которые поражают растения кукурузы над землей, так и от вредителей, которые поражают растения кукурузы под землей.
Конструкция, вставленная в объект MON 87411, дает особые преимущества по сравнению с кассетой экспрессии EPSPS. Во- первых, присутствие этой кассеты облегчает выведение трансгенных объектов, в которые была встроена эта конструкция. Во-вторых, кассета обеспечивает контроль сорняков в поле, на котором были посажены семена, соответствующие объекту MON 87411. Поле, содержащее эти растения MON 87411, можно обрабатывать путем распыления эффективного количества глифосата для контроля роста на этом поле сорняков, которые являются чувствительными к глифосату. Для сорняков, которые не чувствительны к глифосату, как отмечено выше, можно выводить другие трансгенные объекты, которые обеспечивают толерантность к другим гербицидам, таким как дикамба или глюфозинат, создавая единый гибрид вместе с объектом MON 87411, и таким образом получать эффективное средство для борьбы с сорняками в поле путем применения двух или нескольких гербицидов, таких как глифосат, дикамба или глюфозинат, поскольку маловероятно присутствие сорняков, обладающих устойчивостью к двум или нескольким из упомянутых гербицидов, и в этом случае урожай кукурузы будет состоять из гибридов, которые проявляют устойчивость к такому применению комбинаций гербицидов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 схематически изображает трансгенную вставку в геном объекта кукурузы MON 87411: [А] представляет собой SEQ ID NO: 1, которая является непрерывная последовательность трансгенной ДНК-вставки, интегрированной в геном кукурузы LH244, и 5' и 3' геномные ДНК, фланкирующие вставленную ДНК; [B] и [C] соответствуют относительным положениям SEQ ID NO: 2 и 3, которые образуют 5' и 3' сочленяющие последовательности трансгенной/геномной ДНК объекта MON 87411, соответственно; [D] показывает SEQ ID NO: 4, которая представляет собой последовательность трансгенной ДНК-вставки, интегрированной в геном, и в результате получают объект MON 87411; [E] соответствует относительным положениям SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, каждая из которых охватывает 5'-сочленение между терминальными концами трансгенной ДНК- вставки и фланкирующей геномной ДНК; [F] соответствует относительным положениям SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, каждая из которых охватывает 3'-сочленение между терминальными концами трансгенной ДНК-вставки и фланкирующей геномной ДНК; [G], [H] и [I], соответственно, представляют собой три разные экспрессионные кассеты, соответствующие трансгенной ДНК-конструкции, вставленной в геном растения кукурузы, результатом чего является объект MON 87411; [J] и [K] представляют собой олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды и ампликоны ДНК, соответствующие сочленениям в объекте MON 87411.
Фиг. 2 показывает одиннадцать разных конструкций ДНК (417, 416, 418, 419, 402, 403, 404, 423, 405, 406 и 890), сконструированных для экспрессии до трех различных кассет, включающих в себя две кассеты с инкорпорированными протектантами растений (PIP), нацеленными на блошек длинноусых западных (WCR), и одну кассету устойчивости к гербицидам. Две PIP кассеты включают в себя (а) кассету экспрессии для 240-мерного инвертированного повтора Dv_Snf7o, и (b) кассету экспрессии для белка Cry3Bb. Каждая из показанных конструкций содержит эти кассеты экспрессии в вариабельном порядке и ориентации. Конструкции 405 и 406 не содержат кассету устойчивости к гербицидам, и конструкция 890 содержит только одну кассету экспрессии для 240-мерного инвертированного повтора Dv_Snf7o. Эти три конструкции содержат в общей сложности шестнадцать генетических элементов от левой границы (LB) до правой границы (RB): [1] LB; [2] 3'-нетранслируемая область (UTR) Ps.RbcS2-Е9; [3] 240-мерный Dv_Snf7o инвертированный повторяемый ген; [4] кукурузный интрон DnaK; [5] лидер CaMV 35S; [6] промотор eCaMV 35S; [7] промотор кукурузы PIIG; [8] лидер пшеницы Lhcb1; [9] интрон риса Act1; [10] открытая рамка считывания (ORF) Cry3Bb; [11] 3'UTR пшеницы Hsp17; [12] TubA риса (промотор, лидер, интрон); [13] цитоплазматический пептид CTP; [14] CP4 EPSPS; [15] 3'UTR TubA риса; и [16] RB.
Фиг. 3. На схемах [A]-[N] и [aa]-[mm] показаны функционально связанные элементы и фланкирующий кукурузный геном и их положение относительно друг друга, согласно их расположению в позиции трансгенной вставки ДНК в геном объекта кукурузы MON87411. Следующие ниже описания определяют композицию, функции и положение для каждого из элементов, показанных в SEQ ID NO: 1.
[А] Положения нуклеотидов 1-500, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют геномной ДНК кукурузы, смежной с трансгенной вставленной ДНК в объекте кукурузы MON87411, которая в данном случае произвольно обозначена на 5'-конце от трансгенной вставленной ДНК.
[B] Положения нуклеотидов 807-1439, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплиментарной последовательности терминации транскрипции и сигнала полиаденилирования малой субъединицы Е9 3'-рибулозо-бис-фосфат карбоксилазы от Pisum sativum.
[C] Положения нуклеотидов 1469-2098, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплементарной последовательности, сконструированной для экспрессии в виде молекулы РНК, уложенной в 240-нуклеотидную дцРНК и 150-нуклеотидную шпилечную структуру, которая создана для нацеливания на супрессию ортолога гена дрожжей у видов Diabrotica, кодирующего белок Snf7, при его наличии в рационе видов Diabrotica. Первый 240-нуклеотидный сегмент, соответствующий части ортологичного гена snf7 от Diabrotica, присутствует в положениях нуклеотидов 1469-1708, как показано в SEQ ID NO: 1, второй 240-нуклеотидный сегмент, соответствующий в обратной комплементарности первому сегменту, расположен в позициях нуклеотидов 1850-2098, как указано в SEQ ID NO: 1, и первый и второй сегменты функционально связаны с помощью 150-нуклеотидного спейсера в положениях нуклеотидов 1709-1858, как указано в SEQ ID NO: 1.
[D] Положения нуклеотидов 2135-2938, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплиментарной последовательности интрона, происходящего из гена DnaK Zea mays.
[E] Положения нуклеотидов 2839-3298, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратной комплементарной расширенной последовательности 35S промотора вируса мозаики цветной капусты и нетранслируемой 5'-лидерной последовательности. Указанный промотор, ассоциированный нетранслируемый лидер, элемент [D] интрона и элемент [B] терминации транскрипции и полиаденилирования регулируют экспрессию элемента [C] в клетках растений кукурузы.
[F] Положения нуклеотидов 3586-4534, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют промоторной последовательности, полученной из индуцированного физическим импедансом гена белка Zea mays (Zm.PIIG). Указанный промотор, ассоциированный нетранслируемый лидер [G], элемент [Н] интрона и элемент [J] терминации транскрипции и полиаденилирования регулируют экспрессию элемента [I]. Этот промотор ориентирован относительно промотора [E] таким образом, что каждый из промоторов ([E] и [F]) будет запускать дивергентную экспрессию своих элементов ([C] и [I]) (смотрите стрелки на Фиг. 2, где эти стрелки обозначают соответствующие промоторы ([E] и [F]) в указанном направлении экспрессии из соответствующего промотора).
[G] Положения нуклеотидов 4541-4601, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют нетранслируемой 5' лидерной последовательности, полученной из гена b1 светоулавливающего комплекса (Ta.Lhcb1) от Triticum aestivum.
[Н] Положения нуклеотидов 4618-5097, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют последовательности интрона, полученного из гена Actin-1 от Oryza Sativa (Os.Act1).
[I] Положения нуклеотидов 5107-7068, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют нуклеотидной последовательности, кодирующей белок Cry3Bb, токсичный для злаковых корневых червей (Cry3Bb). Кодируемый белок Cry3Bb является пестицидным в случае его наличия в рационе видов Diabrotica (злаковых корневых червей).
[J] Положения нуклеотидов 7088-7297, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют последовательности терминации транскрипции и сигнала полиаденилирования в белке теплового шока 17 (HSP17) от Triticum aestivum.
[K] Положения нуклеотидов 7346-9526, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют непрерывной последовательности промотор-лидер-интрон, полученной из гена альфа-тубулин-3 (TubA-3) от Oryza sativa. Указанный промотор с ассоциированным лидером и интроном, и элемент [М] терминации транскрипции и полиаденилирования регулируют экспрессию элемента [L].
[L] Положения нуклеотидов 9531-11126, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют последовательности цитоплазматического нацеливающего пептида от Arabidopsis thaliana (CTP; из нуклеотидных положений 9531-9758), и последовательности EPSPS, полученной из CP4 Agrobacterium (из нуклеотидных положений 9759-11126). Когда эта последовательность транскрибируется и транслируется в белок в клетке растения кукурузы, CTP функционально связывается с EPSPS. При экспрессии в клетках растений кукурузы, содержащих объект MON 87411, упомянутый CTP-EPSPS обеспечивает устойчивость к гербициду глифосату.
[М] Положения нуклеотидов 11134-11715, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют последовательности гена альфа-тубулин-3 (TubA-3) терминации транскрипции и сигнала полиаденилирования от Oryza sativa.
[N] Положения нуклеотидов 11749-12248, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют геномной ДНК кукурузы, смежной с трансгенной вставленной ДНК в объекте кукурузы MON 87411, которые в данном случае произвольно обозначены как 3'-конец трансгенной вставки ДНК.
[аа] Положения нуклеотидов 501-806, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют части октопиновой последовательности левой границы от Agrobacterium tumefaciens из 417 конструкций, смежных с геномом, произвольно обозначенным как 5' конец трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411. 5'-конец [аа], показанный в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [А] для образования уникального сочленения - 5'-трансгенная вставка ДНК/геном кукурузы, охватываемого последовательностями SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 21. 3'-конец элемента [аа] присоединен к 5'-концу элемента [B] для образования уникального сочленения в трансгенной вставке ДНК, которая входит в SEQ ID NO: 41.
[bb] Положения нуклеотидов 1440-1468, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [B] и [C]. 5'-конец [bb], показанный в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [B], и 3'-конец элемента [bb] присоединен к 5'-концу элемента [С] с образованием уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 42, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[сс] Положения нуклеотидов 2099-2134, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [C] и [D]. 5'-конец [сс], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [C], и 3'-конец элемента [сс] присоединен к 5'-концу элемента [D] для образования уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 43, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[ее] Положения нуклеотидов 3299-3585, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [Е] и [F]. 5'-конец [ее], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [E], и 3'-конец элемента [ее] присоединен к 5'-концу элемента [F] для образования уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 44, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[ff] Положения нуклеотидов 4535-4540, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [F] и [G]. 5'-конец [ff], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [F], и 3'-конец элемента [ff] присоединен к 5'-концу элемента [G] для образования уникального сочленения, входящего SEQ ID NO: 45, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[gg] Положения нуклеотидов 4602-4617, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [G] и [H]. 5'-конец [gg], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [G], и 3'-конец элемента [gg] присоединен к 5'-концу элемента [Н], для образования сочленения, входящего в SEQ ID NO: 46, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411, но это сочленение не является уникальным для объекта MON 87411.
[hh] Положения нуклеотидов 5098-5106, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [H] и [I]. 5'-конец [hh], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [H], и 3'-конец элемента [hh] присоединен к 5'-концу элемента [I] для образования сочленения, входящего в SEQ ID NO: 47, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411, но это сочленение не является уникальным для объекта MON 87411.
[ii] Положения нуклеотидов 7069-7087, как показано в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [I] и [J]. 5'-конец [ii], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [I], и 3'-конец элемента [ii] присоединен к 5'-концу элемента [J] для образования сочленения, входящего в SEQ ID NO: 48, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы, для образования объекта MON 87411, но это сочленение не является уникальным для объекта MON 87411.
[jj] Положения нуклеотидов 7298-7345, как показано в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [J] и [K]. 5'-конец [jj], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [J], и 3'-конец элемента [jj] присоединен к 5'-концу элемента [K] для образования уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 49, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[kk] Положения нуклеотидов 9527-9530, как показано в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [K] и [L]. 5'-конец [kk], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [K], и 3'-конец элемента [kk] присоединен к 5'-концу элемента [L] для образования уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 50, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[ll] Положения нуклеотидов 11127-11133, как показано в SEQ ID NO: 1, соответствуют вставочной последовательности между элементами [L] и [М]. 5'-конец [ll], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [L], и 3'-конец элемента [ll] присоединен к 5'-концу элемента [М] для образования уникального сочленения, входящего в SEQ ID NO: 51, в пределах трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411.
[mm] Положения нуклеотидов 11716-11748, как показано в SEQ ID NO: 1, соответствует части правой границы последовательности нопалина от Agrobacterium tumefaciens из конструкции 417, смежной с геномом на произвольно обозначенном 3'-конце трансгенной ДНК, вставленной в геном кукурузы для образования объекта MON 87411. 5'-конец [mm], как показано в SEQ ID NO: 1, присоединен к 3'-концу элемента [M], и 3'-конец элемента [mm] присоединен к 5'-концу элемента [N], для образования уникального сочленения - трансгенная вставка ДНК/геном кукурузы, которое входит в SEQ ID NO: 52.
Фиг. 4 показывает ориентацию кассеты для векторов, проявивших в исследовании более высокую эффективность дивергентных промоторов, которые запускают экспрессию агентов, токсичных для злаковых корневых червей, по сравнению с векторами с тандемной ориентацией промоторов, запускающих экспрессию агентов, токсичных для злаковых корневых червей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент 5'-геномной ДНК, фланкирующий (смежный с) вставленной трансгенной ДНК (500 нуклеотидов), вставленную трансгенную ДНК (11248 нуклеотидов) и сегмент 3'-геномной ДНК, фланкирующий (смежный с) вставленной трансгенной ДНК (500 нуклеотидов) в объекте MON 87411.
SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент 5'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (500 нуклеотидов) и пограничный остаток вставленной трансгенной ДНК (263 нуклеотида) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу пограничный остаток вставленной трансгенной ДНК (15 нуклеотидов) и сегмент 3'-геномной ДНК, смежный со вставленной геномной ДНК (500 нуклеотидов) из объекта MON 87411.
Последовательность SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность объекта MON 87411, и показывает вставленную геномную ДНК (11248 нуклеотидов) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент 5'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (50 нуклеотидов), и пограничный остаток вставленной трансгенной ДНК (263 нуклеотида) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 6 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент 5'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (110 нуклеотидов), и пограничный остаток вставленной трансгенной ДНК (263 нуклеотида) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент 5'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (145 нуклеотидов), и пограничный остаток вставленной трансгенной ДНК (263 нуклеотидов) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 8 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент вставленной трансгенной ДНК (83 нуклеотидов), и сегмент 3'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (34 нуклеотида) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент вставленной трансгенной ДНК (83 нуклеотидов), и сегмент 3'-геномной ДНК, смежный с вставленной трансгенной ДНК (90 нуклеотидов) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную сочленяющую последовательность объекта MON 87411, и показывает в направлении от 5'- к 3'-концу сегмент вставленной трансгенной ДНК (83 нуклеотида), и сегмент 3'-геномной ДНК, смежный со вставленной трансгенной ДНК (255 нуклеотидов) из объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность из последовательности кДНК от Diabrotica virgifera virgifera (блошки длинноусой западной), кодирующую комплексную субъединицу ESCRT-III, которая ортологична по отношению к Snf7 дрожжей.
SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность, отображающую антисмысловую цепь кассеты экспрессии ДНК, которая включает в себя рекомбинантный ген, сконструированный для экспрессии инвертированных повторов молекулы РНК. Сегменты инвертированных повторов ДНК соответствуют позициям от 663 до 902, и позициям от 1292 до 1053. Последовательности инвертированных повторов ДНК соответствуют нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 11 в позиции нуклеотидов 151-390.
Последовательность SEQ ID NO: 13 представляет собой рибонуклеотидную последовательность, транскрибируемую от ДНК, как указано в SEQ ID NO: 12.
Последовательность SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность, отображающую смысловую цепь кассеты экспрессии ДНК, которая включает в себя рекомбинантный ген, сконструированный для кодирования и экспрессии белка Cry3Bb, токсичного для злаковых корневых червей.
Последовательность SEQ ID NO: 15 представляет собой трансляцию полинуклеотида в аминокислотную последовательность, соответствующую позициям 1522-3480 SEQ ID NO: 14, и представляющую собой белок Cry3Bb, токсичный для злаковых корневых червей.
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность, показывающую смысловую цепь кассеты экспрессии ДНК, которая включает в себя рекомбинантный ген, сконструированный для кодирования и экспрессии белка 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS).
Последовательность SEQ ID NO: 17 представляет собой трансляцию полинуклеотида в аминокислотную последовательность, соответствующую позициям от 2186 до 3781 SEQ ID NO: 16, и представляет собой белок EPSPS, который проявляет нечувствительность к гербициду глифосату.
Последовательность SEQ ID NO: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ27011, и идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 462-490 SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого PB3552, и идентична обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 502-515 SEQ ID ΝΟ:1. PB3552 может нести 5'-метку 6-карбоксифлуоресцеиновой группы (6-FAM™) и 3'-метку гасящей группы для применения в комбинации с парой праймеров термической амплификации, например, SQ27011 и SQ9085, которые можно использовать для амплификации ДНК способом TaqMan для обнаружения присутствия ДНК из объекта MON 87411 в биологическом образце, который содержит ДНК объекта кукурузы MON 87411.
Последовательность SEQ ID NO: 20 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ9085, и является идентичной обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 516-541 SEQ ID NO: 1.
Последовательность SEQ ID NO: 21 представляет собой нуклеотидную последовательность объекта MON 87411 и соответствует позициям 462-541 SEQ ID NO: 1. Ампликон, экспонирующий эту последовательность, можно получать с помощью пары праймеров термической амплификации, например, SQ27011 и SQ9085.
Последовательность SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ27066, и идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 11710-11728 SEQ ID NO: 1.
Последовательность SEQ ID NO: 23 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого PB11300, и идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 11731-11755 SEQ ID NO: 1. PB11300 может нести 5'-метку 6-карбоксифлуоресцеиновой группы (6-FAM™) и 3'-метку гасящей группы. С такими метками PB11300 может быть использован в комбинации с парой ПЦР-праймеров, например, SQ27066 и SQ26977, для обнаружения объекта MON 87411 в анализе TaqMan.
Последовательность SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ26977, и является идентичной обратно комплементарной нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям 11756-11784 SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность объекта MON 87411, и соответствует позициям 11710-11784 SEQ ID NO: 1. Ампликон, экспонирующий эту последовательность, можно амплифицировать с помощью пары праймеров, например, SQ27066 и SQ26977, и этот ампликон является диагностическим признаком для объекта MON 87411.
SEQ ID NO: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 417.
SEQ ID NO: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 416.
SEQ ID NO: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 418.
SEQ ID NO: 29 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 419.
SEQ ID NO: 30 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 402.
SEQ ID NO: 31 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 403.
SEQ ID NO: 32 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 404.
SEQ ID NO: 33 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 423.
SEQ ID NO: 34 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 405.
SEQ ID NO: 35 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 406.
SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность, представляющую конструкцию ДНК # 890.
SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность растения кукурузы LH244, представляющую аллель дикого типа из объекта MON 87411. Ампликон, экспонирующий эту нуклеотидную последовательность, может быть получен с помощью пары праймеров ПЦР, например, SQ27011 и SQ26977, и этот ампликон является диагностическим признаком для аллеля дикого типа из объекта MON 87411.
Последовательность SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ20221.
Последовательность SEQ ID NO: 39 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого PB10065. PB10065 может нести 5'-метку VIC™ и 3'-метку гасящей группы. С такими метками PB10065 можно использовать в анализе TaqMan в комбинации с парой ПЦР-праймеров, например, SQ10065 и SQ20222, для обнаружения присутствия сегмента эндогенного гена кукурузы.
Последовательность SEQ ID NO: 40 представляет собой нуклеотидную последовательность синтетического олигонуклеотида, именуемого SQ20222.
SEQ ID NO: 41-52 представляют собой нуклеотидные последовательности областей из SEQ ID NO: 1, где в каждую из SEQ ID NO:  входит сочленение, образованное последовательностью и элементами кассеты экспрессии, как указано в кратком описании Фиг. 3.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Авторы изобретения идентифицировали объект MON 87411 трансгенной кукурузы, проявляющий превосходные свойства и урожайность по сравнению с существующими трансгенными растениями кукурузы. Объект кукурузы MON 87411 содержит три функционально связанные кассеты экспрессии, которые в совокупности придают признаки устойчивости к злаковым корневым червям и толерантность к гербициду глифосату клеткам кукурузы, тканям кукурузы, семенам кукурузы и растениям кукурузы, содержащим трансгенный объект MON 87411. Объект кукурузы MON 87411 обладает двумя механизмами действия против видов вредителей кукурузы - злаковых корневых червей (включающих в себя виды Diabrotica, в частности, вредителей, представляющих собой Diabrotica virgifera virgifera (блошка длинноусая западная, WCR), Diabrotica barbery (блошка длинноусая северная, NCR), Diabrotica virgifera zeae (блошка длинноусая мексиканская, MCR), Diabrotica balteata (блошка длинноусая бразильская (BZR) или комплекс блошек длинноусых бразильских (BCR), состоящий из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa) или Diabrotica undecimpunctata howardii (блошка длинноусая южная, SCR). В данной области техники известны другие объекты трансгенной кукурузы, которые имеют различные варианты передачи признаков, например, единственного признака, например, объект MON863 (придает признак устойчивости к злаковым корневым червям путем экспрессии инсектицидного токсичного белка Cry3Bb), или объекты трансгенной кукурузы, придающие два или несколько признаков, такие как объект кукурузы MON88017 (придает признак устойчивости к злаковым корневым червям путем экспрессии инсектицидного токсичного белка Cry3Bb и признак устойчивости к гербициду глифосату путем экспрессии EPSPS, нечувствительного к глифосату) и объект кукурузы DAS 59122-7 (придает признак устойчивости к злаковым корневым червям путем экспрессии бинарного токсина PS149B1 Bacillus Thuringiensis, также называемого Cry34/Cry35, и признак толерантности к гербициду глюфозинату). В других источниках раскрыта комбинация, предусматривающая выведение признаков, придаваемых объектами кукурузы MON88017 или DAS 59122-7, с трансгенным объектом кукурузы, придающим признак устойчивости к злаковым корневым червям, и этот признак является результатом экспрессии дцРНК, нацеленной на супрессию гена злаковых корневых червей, жизненно важного для корневых червей (патент США 7943819). В основе таких комбинаций лежат проблемы, связанные с необходимостью совместного выведения упомянутых множественных признаков, расположенных в нескольких разных локусах и в нескольких хромосомах в геноме кукурузы в одном растении кукурузы, и сохранение этих признаков в качестве гибридов у десятков, если не сотен, различных вариантов зародышевой плазмы кукурузы. Эти проблемы можно решить путем совместного включения в один локус комбинации из этих признаков. Авторы настоящего изобретения представляют одно такое решение этой проблемы в виде объекта кукурузы MON 87411, в котором совместно комбинируют три ковалентно связанные кассеты экспрессии в одном локусе в геноме кукурузы, и эти кассеты экспрессии придают признаки устойчивости к злаковым корневым червям и признаки толерантности к гербициду глифосату в клетках кукурузы, тканях кукурузы, семенах кукурузы и растениях кукурузы, содержащих трансгенный объект MON87411. Использование объекта кукурузы MON 87411 дает производителям кукурузы большие преимущества: а) защиту от экономических потерь, возникающих из-за личинок злаковых корневых червей, посредством двух различных механизмов действия в отношении устойчивости к злаковым корневым червям, и b) возможность в широком масштабе применять на зерновых культурах сельскохозяйственные гербициды, содержащие глифосат, для борьбы с сорняками. Дополнительно, трансгены, кодирующие признаки устойчивости к злаковым корневым червям и признаки толерантности к глифосату, сцеплены в одном и том же сегменте ДНК и расположены в одном локусе в геноме MON 87411, что обеспечивает повышенную эффективность селекции и позволяет использовать молекулярные маркеры для отслеживания трансгенной вставки в популяции, предназначенной для разведения, и в ее потомстве.
Объект кукурузу MON 87411 получали способом трансформации посредством Agrobacterium инбредной линии кукурузы с помощью плазмидной конструкции pMON120417. Эта плазмидная конструкция содержит связанные кассеты экспрессии растений с регуляторными генетическими элементами, которые необходимы для экспрессии в растительных клетках кукурузы белка CP4 EPSPS, а также белка Cry3Bb и дцРНК, нацеленной на супрессию жизненно важного гена в клетках злаковых корневых червей, при этом в рацион этих злаковых корневых червей вводят клетки кукурузы, содержащие объект кукурузы MON 87411. Клетки кукурузы регенерировали в интактные растения кукурузы и проводили селекцию отдельных растений из популяции растений, в которых выявлена целостность кассет экспрессии, устойчивость к глифосату и нарушение питания личинки злаковых корневых червей. Растение кукурузы, которое содержит в своем геноме связанные растительные кассеты экспрессии, представленные в объекте кукурузы MON 87411, является одним из аспектов настоящего изобретения.
Плазмидную ДНК, вставленную в геном объекта кукурузы MON 87411, подвергали детальным молекулярным анализам. Эти анализы включали в себя определение: количества вставок (количества инсерционных сайтов в геноме кукурузы), количества копий (количества копий Т-ДНК в пределах одного локуса) и целостности трансгенных вставленных ДНК. Плазмидная конструкция, содержащая вставленные в геном кукурузы три связанных кассеты экспрессии, в результате чего был создан объект MON 87411, содержит несколько сегментов (сочленяющих последовательностей между элементами, которые используют для создания или конструирования нескольких кассет экспрессии), в отношении которых не известна возможность их естественного появления в геноме кукурузы, или в других векторах, или в трансгенных объектах кукурузы, или иным образом (например, последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52). Дополнительно, объект трансформации, вызывающий появление вставленной трансгенной ДНК в объекте MON 87411, представляет собой в настоящем изобретении вставку в единственный локус в геноме кукурузы, в результате чего возникают два новых локуса или сочленяющие последовательности между вставленной ДНК и ДНК генома кукурузы (дополнительные сочленяющие последовательности), которые имеют достаточную длину, чтобы быть уникальным только по отношению к геному кукурузы, содержащему объект MON 87411. Эти сочленяющие последовательности являются полезными для обнаружения присутствия ДНК объекта MON 87411 в клетках кукурузы, тканях, семенах и растениях кукурузы, или в растительных продуктах (товарной продукции). В изобретении описаны молекулярные зонды и пары праймеров ДНК, которые были разработаны для использования в целях идентификации присутствия этих различных сочленяющих сегментов в биологических образцах, содержащих или предположительно содержащих клетки кукурузы, семена, части растений или ткани растений, содержащие ДНК объекта MON 87411. Данные показывают, что объект MON 87411 содержит единственную вставку Т-ДНК с одной копией вставленной трансгенной ДНК. В объекте MON 87411 не были выявлены какие-либо дополнительные элементы из вектора трансформации pMON120714, кроме левого и правого пограничных участков Agrobacterium tumefaciens, которые используют для переноса трансгенной ДНК от трансформационной плазмиды растений в геном кукурузы. Наконец, проводили термическую амплификацию с получением специфичных ампликонов, которые представляют собой диагностический признак на присутствие упомянутой ДНК объекта MON 87411 в образце, и анализы последовательностей ДНК, для определения произвольно обозначенных 5'- и 3'-вставленных в геном растений сочленений, для подтверждения организации элементов внутри вставки, и для определения полной последовательности ДНК у вставленной трансгенной ДНК в объекте растения кукурузы MON 87411 (SEQ ID NO: 1).
Было получено множество трансгенных объектов с использованием конструкции, применяемой для получения трансгенного объекта MON 87411, и различные конструкции были созданы и использованы для получения многих десятков других объектов трансгенной кукурузы, которые затем сравнивали с объектом MON 87411 и подобными объектами. Все эти объекты были тестированы в биопробах с рационом злаковых корневых червей на эффективность их контроля, и в этих тестах в рационе личинок злаковых корневых червей присутствовали ткани трансгенных объектов растений кукурузы. Было установлено, что ориентация экспрессии двух разных кассет экспрессии, отвечающих за передачу различным объектам признаков устойчивости к злаковым корневым червям, имела решающее значение для эффективности объектов в отношении контроля злаковых корневых червей, если в рационе личинок злаковых корневых червей присутствовали клетки объекта кукурузы, экспрессирующие эти признаки устойчивости. Было выявлено, что два разных промотора, CAMV e35S и Zm.PIIG, придают неожиданную и высокую эффективность кукурузным объектам, содержащим кассеты экспрессии, экспрессирующие протектант от дцРНК злаковых корневых червей из промотора e35S и токсический для злаковых корневых червей белок Cry3Bb из промотора Zm.PIIG, который расположен смежно и в дивергентном направлении от промотора e35S. Если упомянутые промоторы находились в этой конкретной ориентации, были получены значительно улучшенные показатели трансгенных объектов, проявляющих эффективность.
Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их обычным применением рядовыми специалистами в данной области техники. Определения общепринятых терминов в области молекулярной биологии также можно найти в изданиях: Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5-е издание, Springer-Verlag: New York, 1991; и Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Используемый в изобретении термин "кукуруза" означает Zea mays и включает в себя все варианты растений, которые можно подвергать селекции с растениями кукурузы, содержащими MON 87411. Используемый в изобретении термин "содержащий" означает" включающий в себя без ограничения".
Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям, которые были трансформированы ДНК-конструкцией, содержащей по меньшей мере три кассеты экспрессии: первая кассета экспрессии экспрессирует дцРНК в количестве, токсичном для злаковых корневых червей, сконструированную для супрессии жизненно важного для злаковых корневых червей гена, ортологичного гену snf7 дрожжей, вторая кассета экспрессии экспрессирует дельта-эндотоксин Cry3Bb в количестве, токсичном для злаковых корневых червей, и третья кассета экспрессии экспрессирует фермент СР4 EPSPS устойчивости к глифосату, который является нечувствительным к глифосатному ингибированию. Растения кукурузы, трансформированные ДНК-конструкциями по изобретению и в соответствии со способами, раскрытыми в изобретении, являются устойчивыми к CRW и толерантными к обработкам гербицидом глифосатом. Сцепленность агрономических признаков легко обеспечивает совместное сохранение этих признаков в выводимой популяции, и демонстрирует более высокую эффективность против злаковых корневых червей, по сравнению с этими показателями у растений, несущих только единственный ингибирующий ген злаковых корневых червей или у растений, которые несут эти же самые ингибирующие гены для злаковых корневых червей (Cry3Bb и дцРНК), объединенные в селекционный пакет.
Трансгенное "растение" получают следующими способами: путем трансформации растительной клетки с гетерологичной ДНК, то есть с конструкцией полинуклеиновой кислоты, которая включает в себя рассматриваемый трансген; путем регенерации популяции растений, полученной после вставки трансгена в геном растительной клетки; и путем селекции конкретного растения, характеризующегося наличием вставки в геном в конкретной локализации. Термин "объект" относится к исходному трансформированному растению и к потомству трансформанта, которое включает в себя гетерологичную ДНК. Термин "объект" также включает в себя потомство, полученное половым ауткроссингом между объектом и другим растением, при этом потомство включает в себя гетерологичную ДНК. Вставленная ДНК и фланкирующая геномная ДНК из трансформированного родительского объекта присутствует в потомстве от этого скрещивания в той же хромосомной локализации даже после повторного обратного скрещивания с рекуррентным родителем. Термин "объект" также относится к ДНК из исходного трансформанта, которая содержит вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно примыкающую к вставленной ДНК, в отношении которых можно предполагать, что они передаются потомству, которое получает вставленную ДНК, включающую в себя рассматриваемый трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая несет вставленную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное самоопылением) и родительской линии, которая не содержит вставленной ДНК. Настоящее изобретение относится к трансгенным объектам растений кукурузы, содержащим MON 87411, к их потомству и к композициям ДНК, содержащимся в этих объектах.
"Зонд" представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой прикреплена обычная обнаруживаемая метка или репортерная молекула, например, радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд является комплементарным по отношению к цепи нуклеиновой кислоты-мишени, а именно, согласно настоящему изобретению, к цепи геномной ДНК из MON 87411, происходящей или из растения MON 87411 или из образца, который включает в себя ДНК MON 87411. Зонды согласно настоящему изобретению включают в себя не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы для зондов, которые специфично связываются с целевой последовательностью ДНК и могут быть использованы для обнаружения присутствия этой целевой последовательности ДНК.
ДНК-праймеры представляют собой выделенные полинуклеиновые кислоты, которые отжигают с комплементарной цепью целевой ДНК посредством гибридизации нуклеиновых кислот, с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, и затем наращивают по длине цепи ДНК-мишени с помощью полимеразы, например, ДНК-полимеразы. Пара ДНК-праймеров или набор ДНК-праймеров согласно настоящему изобретению относятся к двум ДНК-праймерам, которые используют для амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты, например, путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) или другими общепринятыми способами амплификации полинуклеиновых кислот.
ДНК-зонды и ДНК-праймеры обычно имеют длину в 11 полинуклеотидов или больше, часто 18 полинуклеотидов или больше, 24 полинуклеотида или больше, или 30 полинуклеотидов или больше. Эти зонды и праймеры выбирают таким образом, чтобы они имели достаточную длину для специфичной гибридизации с последовательностью-мишенью при гибридизации в условиях высокой жесткости. Предпочтительно, зонды и праймеры согласно настоящему изобретению имеют полное подобие последовательностей с последовательностью-мишенью, вместе с тем, по обычным методикам можно конструировать зонды, отличающиеся от последовательности-мишени, которые сохраняют способность к гибридизации с последовательностями-мишенями.
Праймеры и зонды на основе фланкирующей геномной ДНК и вставленных последовательностей, описанных в изобретении, можно использовать для верификации (и, при необходимости, для коррекции) раскрытых последовательностей ДНК с помощью общепринятых способов, например, путем повторного клонирования и секвенирования таких молекул ДНК.
Нуклеиновокислотные зонды и праймеры по настоящему изобретению гибридизуются с молекулой целевой ДНК при жестких условиях. Можно использовать любой общепринятый способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот для определения присутствия в образце ДНК из трансгенного растения. Молекулы полинуклеиновой кислоты, также называемые сегментами нуклеиновой кислоты или ее фрагментами, при определенных обстоятельствах способны к специфичной гибридизации с другими молекулами нуклеиновой кислоты. Считается, что используемые в изобретении две молекулы полинуклеиновой кислоты способны к специфичной гибридизации друг с другом, если эти две молекулы могут образовывать антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Считается, что молекула нуклеиновой кислоты является "комплементом" другой молекулы нуклеиновой кислоты, если эти молекулы демонстрируют полную комплементарность. Считается, что используемые в изобретении молекулы демонстрируют полную "комплементарность", если каждый нуклеотид одной из молекул является комплементарным нуклеотиду другой молекулы. Две молекулы считаются "минимально комплиментарными", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться ренатурированными по отношению друг к другу по меньшей мере при обычных условиях "низкой жесткости". Аналогично, молекулы считаются "комплиментарными", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться ренатурированными по отношению друг к другу по меньшей мере при обычных условиях "низкой жесткости". Общепринятые условия жесткости описаны в руководстве Sambrook et al., 1989, и авторами Haymes et al.: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Таким образом, допустимо отступать от полной комплиментарности, если такие отступления полностью не исключают возможность образования двухцепочечной структуры этими молекулами. Чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, она только должна иметь достаточную степень комплементарности в последовательности, чтобы иметь возможность образовать устойчивую двухцепочечную структуру при конкретных используемых значениях концентрации растворителей и солей.
Согласно изобретению, используемая по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая специфично гибридизуется с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которой сравнивают эту последовательность в условиях высокой жесткости. Подходящие условия жесткости, которые способствуют гибридизации ДНК, представляют собой, например, 6,0×хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при температуре приблизительно 45°С, с последующим промыванием 2,0×SSC при 50°C, и эти условия известны специалистам в данной области, или приведены в руководстве Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, можно выбирать концентрацию соли на этапе промывки при условиях низкой жесткости примерно 2,0×SSC при 50°С, и при условиях высокой жесткости примерно 0,2×SSC при 50°С. Дополнительно, температуру на этапе промывки можно повышать до комнатной температуры примерно 22°C при условиях низкой жесткости, и примерно до температуры 65°С при условиях высокой жесткости. Значения температуры и концентрации соли можно варьировать, или можно поддерживать постоянные значения как температуры, так и концентрации соли, и при этом варьировать другие переменные показатели. В предпочтительном варианте осуществления полинуклеиновая кислота по настоящему изобретению будет специфично гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, представляющими собой SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 21, 25, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 или 52, или с их комплементами или их фрагментами, при умеренно жестких условиях, например, приблизительно в 2,0×SSC и приблизительно при 65°С. В особенно предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению будет специфично гибридизоваться с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, указанными в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 21, 25, 41, 42, 43, 44, 45, 49, 50, 51 или 52, или с их комплементами или с их фрагментами, в условиях высокой жесткости. В одном из аспектов настоящего изобретения предпочтительная маркерная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 6, или SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8, или SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 10, или SEQ ID NO: 12, или SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 16, или SEQ ID NO: 21, или SEQ ID NO: 25, или SEQ ID NO: 41, или SEQ ID NO: 42, или SEQ ID NO: 43, или SEQ ID NO: 44, или SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 49, или SEQ ID NO: 50, или SEQ ID NO: 51, или SEQ ID NO: 52, или представляет собой их комплементы или их фрагменты. Гибридизацию зонда с целевой молекулой ДНК можно обнаружить любым количеством способов, известных специалистам в данной области, и эти способы могут включать в себя без ограничения флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антител и хемилюминесцентные метки.
В отношении амплификации целевой последовательности нуклеиновой кислоты (например, с помощью ПЦР) с использованием конкретной пары амплификационных праймеров, "жесткие условия" представляют собой условия, которые позволяют проводить гибридизацию пары праймеров только с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой будет связываться праймер, имеющий соответствующую последовательность дикого типа (или комплементарную ей последовательность) и предпочтительно путем реакции термической амплификации ДНК производить уникальный продукт амплификации - ампликон.
Термин "специфичный для (целевой последовательности)" указывает, что зонд или праймер гибридизуется в жестких условиях гибридизации только с целевой последовательностью в образце, который содержит эту целевую последовательность.
Используемые в изобретении термины "амплифицированная ДНК" или "ампликон" относятся к продукту, полученному способом амплификации полинуклеиновых кислот, нацеленному на молекулу-мишень полинуклеиновой кислоты, которая является частью полинуклеиновокислотной матрицы. Например, чтобы определить, содержит ли растение кукурузы, полученное половым скрещиванием, геномную ДНК трансгенного растения из растения кукурузы, содержащего MON 87411 согласно настоящему изобретению, ДНК, которую выделяют из образца ткани растения кукурузы, можно подвергать способу амплификации полинуклеиновых кислот с использованием пары праймеров, которая включает в себя праймер, полученный из последовательности ДНК в геноме MON 87411, содержащий растительную ДНК, смежную к сайту инсерции вставленной гетерологичной ДНК (трансгенной ДНК), и второй праймер, полученный из вставленной гетерологичной ДНК, с целью получения ампликона, который является диагностическим признаком наличия ДНК растений MON 87411. Длина и последовательность ДНК диагностического ампликона также являются диагностическими признаками геномной ДНК растений. Длина ампликона может варьироваться от суммарной длины пары праймеров плюс одна пара нуклеотидных оснований, предпочтительно плюс около пятидесяти пар нуклеотидных оснований, более предпочтительно, плюс примерно двести пятьдесят пар нуклеотидных оснований, и наиболее предпочтительно плюс примерно четыреста пятьдесят пар нуклеотидных оснований или больше. Альтернативно, пара праймеров может быть получена из геномной последовательности на обеих сторонах вставленной гетерологичной ДНК, таким образом, чтобы получить ампликон, который полностью включает в себя всю вставленную полинуклеотидную последовательность (например, прямой праймер, выделенный из геномной части SEQ ID NO: 1, и обратный праймер, выделенный из геномной части SEQ ID NO: 1, который амплифицирует молекулу ДНК, содержащую сочленяющую последовательность согласно изобретению в геноме объекта MON 87411). Элемент пары праймеров, полученных из геномной последовательности растения, смежной со вставленной трансгенной ДНК, расположен на расстоянии от вставленной последовательности ДНК, и это расстояние может составлять от одной пары нуклеотидных оснований до приблизительно двадцати тысяч нуклеотидных пар оснований. Использование термина "ампликон" конкретно исключает праймерные димеры, которые могут образоваться в реакции термической амплификации ДНК.
Амплификацию полинуклеиновых кислот можно осуществлять с помощью любого из различных способов амплификации полинуклеиновых кислот, известных в данной области техники, включающих в себя полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Способы амплификации хорошо известны в данной области техники и описаны, в частности, в патентах США №№ 4683195 и 4683202, и в руководстве PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Способы ПЦР-амплификации были разработаны для амплификации геномной ДНК до 22 кб (килобаз) и ДНК бактериофага до 42 кб (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699, 1994). Эти способы амплификации ДНК, а также другие способы, известные в данной области, можно использовать для осуществления настоящего изобретения. Последовательность вставленной гетерологичной ДНК или последовательность фланкирующей геномной ДНК из объекта MON 87411 можно верифицировать (и при необходимости корректировать) путем амплификации таких молекул ДНК из объекта MON 87411, содержащего семена или растения, выращенные из семян, которые депонированы в Американской коллекции типовых культур АТСС под номером доступа РТА-12669, с использованием праймеров, полученных из последовательностей согласно изобретению, с последующим стандартным ДНК-секвенированием ампликона из ПЦР, или клонированных фрагментов его ДНК.
Наборы для обнаружения ДНК, основанные на способах амплификации ДНК, содержат праймерные молекулы ДНК, которые специфично гибридизуются с целевой ДНК и амплифицируют диагностический ампликон при подходящих условиях реакции. Этот набор можно применять в способе обнаружения на основе агарозного геля или в любых других способах обнаружения диагностического ампликона, которые известны в данной области техники. Целью настоящего изобретения является набор, содержащий ДНК-праймеры, которые гомологичны или комплементарны к какому-либо участку геномной области кукурузы, как указано в SEQ ID NO: 1, и к какому-либо участку вставленной трансгенной ДНК, как указано в SEQ ID NO: 1. Специалисты в области амплификации ДНК могут выбирать молекулы ДНК, используемые в качестве ДНК-праймеров, из раскрытой в изобретении последовательности трансгенной/геномной ДНК из MON 87411 (SEQ ID NO: 1).
Диагностический ампликон, полученный упомянутыми способами, может быть обнаружен с помощью множества методик. Одним из таких способов является генетический бит-анализ (Nikiforov, et al., Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), в котором создается олигонуклеотид ДНК, перекрывающий и смежную фланкирующую геномной ДНК и вставленную последовательность ДНК. Олигонуклеотид иммобилизуют в лунках микротитровального планшета. После ПЦР представляющей интерес области (с использованием одного праймера во вставленной последовательности и одного праймера в смежной фланкирующей геномной последовательности), одноцепочечной ПЦР-продукт может подвергаться гибридизации с иммобилизованным олигонуклеотидом и служить в качестве матрицы для реакции удлинения на одно основание с помощью ДНК-полимеразы и меченых дидезоксинуклеотид-трифосфатов (ддНТФ), специфичных для предполагаемого следующего основания. Показания можно получать на основе люминесцентного анализа или иммуноферментного анализа ELISA. Сигнал указывает на присутствие трансгенной/геномной последовательности, обусловленное успешной амплификацией, гибридизацией и удлинением на одно основание.
Другим способом является технология пиросеквенирования, описанная Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). В этом способе конструируют олигонуклеотид, который перекрывает сочленение смежной геномной ДНК и вставленной ДНК. Олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом из представляющей интерес области (один праймер во вставленной последовательности и один праймер во фланкирующей геномной последовательности) и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозин-5'-фосфосульфата и люциферина. ДНТФ добавляют отдельно и измеряют результаты включения по световому сигналу. Световой сигнал указывает на присутствие трансгенной/геномной последовательности, обусловленное успешной амплификацией, гибридизацией и удлинением на одно основание.
Поляризации флуоресценции, описанная авторами Chen et al., (Genome Res. 9: 492-498, 1999) представляет собой способ, который можно использовать для обнаружения ампликона по настоящему изобретению. С помощью этого способа конструируют олигонуклеотид, перекрывающий сочленение геномной фланкирующей ДНК и вставленной ДНК. Олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом из представляющей интерес области (один праймер во вставленной ДНК и один праймер во фланкирующей геномной последовательности ДНК) и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы и флуоресцентно-меченного ддНТФ. Удлинение на одно основание приводит к включению ддНТФ. Включение можно измерять по изменению поляризации с помощью флуорометра. Изменение поляризации указывает на присутствие трансгенной/геномной последовательности, обусловленное успешной амплификацией, гибридизацией и удлинением на одно основание.
Анализ TaqMan (РЕ Applied Biosystems, Foster City, CA) рассматривается как способ обнаружения и количественного определения присутствия последовательности ДНК и полностью изложен в инструкциях, представленных производителем. Коротко, олигонуклеотидный зонд на основе переноса энергии с помощью флуоресцентного резонанса (FRET) конструируют таким образом, что он перекрывает сочленение геномной фланкирующей ДНК и вставленной ДНК. Зонд FRET и ПЦР-праймеры (один праймер во вставленной последовательности ДНК и один праймер во фланкирующей геномной последовательности) подвергают циклизации в присутствии термостабильной полимеразы и дНТФ. Гибридизация FRET зондов приводит к расщеплению и высвобождению флуоресцентной группы из гасящей группы на зонде FRET. Флуоресцентный сигнал указывает на присутствие трансгенной/геномной последовательности, обусловленное успешной амплификацией и гибридизацией.
Были описаны молекулярные маяки для применения в целях обнаружения последовательностей, как описано авторами Tyangi et al. (Nature Biotech.14: 303-308, 1996). Коротко, конструировали олигонуклеотидный зонд FRET, перекрывающий сочленение фланкирующей геномной ДНК и вставленной ДНК. Уникальная структура зонда FRET приводит к образованию содержащей его вторичной структуры, в которой флуоресцентная и гасящая группы расположены в непосредственной близости. Зонд FRET и ПЦР-праймеры (один праймер во вставленной последовательности ДНК и один праймер во фланкирующей геномной последовательности) подвергают циклизации в присутствии термостабильной полимеразы и дНТФ. После успешной ПЦР-амплификации, гибридизация зонда FRET с последовательностью-мишенью приводит к удалению вторичной структуры зонда и к пространственному разделению флуоресцентной и гасящей группы. Получают флуоресцентный сигнал. Флуоресцентный сигнал указывает на присутствие фланкирующей/трансгенной вставленной последовательности, обусловленное успешной амплификацией и гибридизацией.
Наборы для обнаружения ДНК могут быть разработаны с использованием композиций, описанных в изобретении, и способов, хорошо известных в области обнаружения ДНК. Наборы можно использовать для идентификации ДНК объекта кукурузы MON 87411 в образце и можно применять в способах выведения растений кукурузы, содержащих ДНК MON 87411. Набор содержит молекулы ДНК, которые полезны в качестве праймеров или зондов, и которые гомологичны или комплементарны по меньшей мере, к возможным для применения участкам SEQ ID NO: 1, согласно изобретению. Молекулы ДНК можно использовать в способах амплификации ДНК (ПЦР) или в качестве зондов в способе гибридизации полинуклеиновых кислот, т.е. для Саузерн-анализа и нозерн-анализа.
Сочленяющие последовательности могут представлять собой последовательность из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Например, сочленяющие последовательности могут быть произвольно представлены нуклеотидными последовательностями, представляющими собой SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 8. Альтернативно, сочленяющие последовательности могут быть произвольно представлены нуклеотидными последовательностями, представляющими собой SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 9. Альтернативно, сочленяющие последовательности могут быть произвольно представлены нуклеотидными последовательностями, представляющими собой SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10. Эти нуклеотиды соединены фосфодиэфирной связью и в объекте кукурузы MON 87411 присутствуют в качестве части генома рекомбинантной растительной клетки. Идентификация одной или нескольких последовательностей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52 в образце, полученном из растения кукурузы, семян или из части растения кукурузы, является определяющим, что ДНК происходит от объекта кукурузы MON 87411, и диагностическим признаком на присутствие в образце ДНК, содержащейся в объекте кукурузы MON 87411. Таким образом, настоящее изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей по меньшей мере одну из нуклеотидных последовательностей, которые представляют собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. В объем настоящего изобретения входит любой сегмент ДНК, полученный из трансгенного объекта кукурузы MON 87411, и является достаточным, чтобы такой сегмент включал в себя по меньшей мере одну из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. Дополнительно, любой полинуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную к любой из описанных в этом параграфе последовательностей, входит в объем настоящего изобретения.
Изобретение рассматривает иллюстративные молекулы ДНК, которые можно использовать или в качестве праймеров или зондов для обнаружения присутствия ДНК, происходящей из растения кукурузы, содержащей в образце ДНК объекта MON 87411. Такие праймеры или зонды являются специфичными для целевой последовательности нуклеиновой кислоты, и в качестве таковых являются полезными для идентификации последовательности нуклеиновой кислоты объекта кукурузы MON 87411 с помощью способов по изобретению, описанных в настоящем документе.
"Праймер" обычно представляет собой выделенный полинуклеотид высокой степени очистки, который сконструирован для использования в специфичных способах отжига или гибридизации, к которым относится термическая амплификация. Пара праймеров может быть использована с матричной ДНК, например, с образцом геномной ДНК кукурузы, для термической амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), для получения ампликона, при этом ампликон, полученный с помощью такой реакции, будет иметь последовательность ДНК, соответствующую последовательности матричной ДНК, расположенной между двумя сайтами, где праймеры гибридизуются с матрицей. Используемый в изобретении "ампликон" представляет собой часть или фрагмент ДНК, которая была синтезирована с помощью способов амплификации. Ампликон согласно изобретению содержит по меньшей мере одну из последовательностей, представляющих собой SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 25. Праймер обычно предназначен для гибридизации с комплементарной цепью ДНК-мишени для создания гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, и присутствие праймера является точкой распознавания полимеразы для старта удлинения праймера (т.е. для полимеризации дополнительных нуклеотидов в удлиняющую нуклеотидную молекулу), где в качестве матрицы используется цепь ДНК-мишени. Пара праймеров, используемая в изобретении, предназначена для обозначения использования двух праймеров, связывающих противоположные цепи из двухцепочечного нуклеотидного сегмента с целью линейной амплификации полинуклеотидного сегмента между позициями, представляющими собой мишень для связывания отдельных элементов праймерной пары, обычно в реакции термической амплификации или в других общепринятых способах амплификации нуклеиновых кислот. Полезная для данного применения пара праймеров должна содержать первую молекулу ДНК и вторую молекулу ДНК, которая отличается от первой молекулы ДНК, и при этом обе молекулы имеют достаточную длину смежных нуклеотидов в последовательности ДНК, чтобы действовать в качестве праймеров ДНК, при их совместном использовании в реакции термической амплификации с матричной ДНК, происходящей из объекта кукурузы MON 87411, для получения ампликона, который является диагностическим признаком для ДНК объекта кукурузы MON 87411 в образце. Примерные молекулы ДНК, используемые в качестве праймеров, представляют собой SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 24.
"Зонд" представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной по отношению к цепи нуклеиновой кислоты-мишени. Зонды включают в себя не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также и полиамиды и другие материалы зондов, которые специфично связываются с целевой последовательностью ДНК, и обнаружение такого связывания может быть полезно в целях диагностики, различения, определения, детекции или подтверждения присутствия этой целевой последовательности ДНК в конкретном образце. Зонд может быть присоединен к обычной обнаруживаемой метке или репортерной молекуле, например, к радиоактивному изотопу, лиганду, хемилюминесцентному агенту или ферменту. Примерные молекулы ДНК, используемые в качестве зондов, представляют собой SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 23.
Зонды и праймеры могут иметь последовательности, полностью идентичные целевой последовательности, вместе с тем, с помощью общепринятых способов можно создавать праймеры и зонды, отличающиеся от целевой последовательности, но сохраняющие способность к гибридизации предпочтительно с целевой последовательностью. Для того, чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, она должна иметь достаточную степень комплементарности последовательности, чтобы могла образоваться устойчивая двухцепочечная структура при конкретных концентрациях используемых растворителей и солей. Можно применять любой общепринятый способ гибридизации или амплификации нуклеиновых кислот для идентификации присутствия в образце трансгенной ДНК из объекта кукурузы MON 87411. Зонды и праймеры обычно имеют длину по меньшей мере приблизительно 11 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 18 нуклеотидов, по меньшей мере приблизительно 24 нуклеотидов, или по меньшей мере приблизительно 30 нуклеотидов или больше. Такие зонды и праймеры специфично гибридизуются с целевой последовательностью ДНК при жестких условиях гибридизации. Обычные жесткие условия описаны авторами Sambrook et al, 1989, и в руководстве Haymes et al.: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
Любое количество способов, хорошо известных специалистам в данной области, можно использовать для выделения и манипуляций с молекулой ДНК, или с ее фрагментом, согласно изобретении, в том числе способы термической амплификации. Молекулы ДНК или их фрагменты можно также получать другими способами, например, путем прямого синтеза фрагмента в химических реакциях, как это обычно практикуется с помощью автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов.
Таким образом, молекулы ДНК и соответствующие нуклеотидные последовательности, представленные в изобретении, полезны, среди прочего, для идентификации объекта кукурузы MON 87411, селекции сортов или гибридов растений, содержащих объект кукурузы MON 87411, для обнаружения присутствия в образце ДНК, происходящей из трансгенного объекта кукурузы MON 87411, и для отслеживания образцов на присутствие и/или отсутствие объекта кукурузы MON 87411 или частей растений, полученных из растений кукурузы, которые содержат объект MON 87411.
Изобретение относится к растениям кукурузы, их потомству, семенам, растительным клеткам, частям растений (таким как пыльца, яйцеклетка, ткани початка или нитей, ткани кисти, ткани корней, ткани стебля и ткани листьев) и к товарным продуктам. Эти растения, потомство, семена, клетки растений, части растений и товарные продукты содержат определяемое количество полинуклеотида по изобретению, т.е. полинуклеотида, который имеет по меньшей мере одну из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. Растения, потомство, семена, клетки растений и части растений по изобретению также могут содержать один или несколько дополнительных трансгенов. Такой дополнительный трансген может представлять собой любую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок или молекулу РНК, придающую желательный признак, включающий в себя без ограничения повышенную устойчивость к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную устойчивость к засухе, улучшенное качество семян, улучшенные питательные свойства и/или повышенную толерантность к гербицидам, при этом желательный признак измеряют по отношению к растениям кукурузы, не содержащим упомянутый дополнительный трансген.
Настоящее изобретение относится к растениям кукурузы, их потомству, семенам, клеткам растений и частям растений, таким как пыльца, яйцеклетки, ткани початка или нитей, ткани кисти, корня или ткани стебля и листьев, полученных из трансгенных растений кукурузы, содержащей объект MON 87411. Репрезентативный образец семян кукурузы, содержащих объект MON 87411, был депонирован в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур (АТСС). Депозитарий ATCC присвоил семенам, содержащим объект MON 87411, индекс Patent Deposit Designation PTA-12669.
Изобретение относится к микроорганизмам, содержащим молекулу ДНК, которые в своем геноме имеют по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Примером такого микроорганизма является трансгенная растительная клетка. Микроорганизмы, такие как растительная клетка по изобретению, являются полезными во многих промышленных применениях, включающих в себя без ограничения: (i) использование в качестве исследовательского инструмента для научного поиска или промышленных исследований; (ii) использование в культуре для получения эндогенных или рекомбинантных углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, или белковых продуктов или малых молекул, которые можно использовать для последующих научных исследований или в качестве промышленных продуктов; и (iii) использование в современных технологиях культивирования растительных тканей для получения трансгенных растений или культур растительных тканей, которые затем можно использовать для сельскохозяйственных исследований или производства. В производстве и применении микроорганизмов, таких как клетки трансгенных растений, используются современные микробиологические технологии и вмешательство человека для получения рукотворных уникальных микроорганизмов. При таком способе в геном растительной клетки вводят рекомбинантную ДНК для создания из природных растительных клеток трансгенной растительной клетки, которая является отдельной и уникальной клеткой. Такие трансгенные растительные клетки можно затем культивировать подобно бактериальным и дрожжевым клеткам, с использованием современных микробиологических технологий, и они могут существовать в недифференцированном, одноклеточном состоянии. Новая или измененная генетическая композиция и фенотип трансгенной растительной клетки представляет собой технический эффект, созданный путем интеграции гетерологичной ДНК в геном клетки. Микроорганизмы по изобретению, такие как трансгенные растительные клетки, включают в себя: (i) способы получения трансгенных клеток путем интеграции рекомбинантной ДНК в геном клетки, и последующее использование этой клетки для получения дополнительных клеток, обладающих этой же гетерологичной ДНК; (ii) способы культивирования клеток, которые содержат рекомбинантную ДНК, с использованием современных микробиологических технологий; (iii) способы получения и очистки эндогенных или рекомбинантных углеводов, липидов, нуклеиновых кислот или белка, продуктов из культивируемых клеток; и (iv) способы с использованием современных технологий культивирования растительных тканей с трансгенными клетками растений для получения трансгенных растений или тканевых культур трансгенных растений.
Растения по изобретению могут передавать потомству объект ДНК, включающий в себя трансген. Используемое в изобретении "потомство" включает в себя любое растение, семена, растительную клетку и/или регенерируемую часть растения, содержащего ДНК объекта, полученную от предка растений и/или содержащего молекулу ДНК, которая имеет по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Растения, потомство и семена могут быть гомозиготными или гетерозиготными по трансгену.
Потомство можно выращивать из семян, полученных от растений, содержащих объект кукурузы MON 87411, и/или из семян, полученных от растений, оплодотворенных пыльцой от растения, содержащего объект кукурузы MON 87411.
Потомство растений может быть самоопыляемым (также называемое "самооплодотворяемым") для создания чистых гомозиготных линий растений, т.е. растений, гомозиготных по трансгену. Самоопылением соответствующего потомства можно получать растения, которые будут гомозиготными по обоим добавленным экзогенным генам.
В качестве альтернативы, можно проводить ауткроссинг потомства растений, например, скрещиванием с другим, неродственным растением для получения сортовых или гибридных семян или растений. Другое неродственное растение может быть трансгенным или нетрансгенным. Таким образом, сортовые или гибридные семена или растения по изобретению можно получать путем скрещивания первого родителя, у которого отсутствует специфичная и уникальная ДНК объекта кукурузы MON 87411, со вторым родителем, содержащим объект кукурузы MON 87411, в результате чего получают гибрид, содержащий специфичную и уникальную ДНК объекта кукурузы MON 87411. Каждый родитель может представлять собой гибридное или инбредное/сортовое растение, при условии, что скрещивание или селекция дает в результате растения или семена по изобретению, то есть, семена, имеющие по меньшей мере один аллель, несущий ДНК объекта кукурузы MON 87411 и/или молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Таким образом, можно скрещивать два разных трансгенных растения для получения гибридного потомства, которое несет два независимо расщепляемых добавленных экзогенных гена. Например, объект кукурузы MON 87411, несущий признак устойчивости к поражению злаковыми корневыми червями и признак толерантности к глифосату, можно скрещивать с различными трансгенными растениями кукурузы, чтобы получить гибридное или инбредное растение, имеющее свойства обоих трансгенных родителей. Одним из таких примеров может быть скрещивание объекта MON 87411, несущего признак устойчивости к поражению злаковыми корневыми червями и признак толерантности к глифосату, с растением кукурузы, имеющим один или несколько дополнительных признаков, таких как толерантность к гербицидам и/или контроль насекомых, в результате чего получают потомство растений или семена, устойчивые к поражению злаковыми корневыми червями и толерантные к глифосату, и имеющие по меньшей мере один или несколько дополнительных признаков. В настоящем изобретении также рассматривается обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Описание других способов скрещивания, которые обычно используются для получения различных признаков и культур, можно найти в одной из нескольких работ, например, Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox, J. ed. American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
Изобретение относится к части растения, которое получают из растений кукурузы, содержащей объект MON 87411. Используемая в изобретении "часть растения" относится к любой части растения, которая состоит из материала, полученного из растения кукурузы, содержащего объект MON 87411. Части растения включают в себя без ограничения пыльцу, яйцеклетку, початок или нити, кисти, ткань корня или стебля, волокна и листья. Части растений, могут быть жизнеспособными, нежизнеспособными, регенерируемыми и/или нерегенерируемыми.
Изобретение относится к товарному продукту, который получают из растений кукурузы, содержащих объект MON 87411, и который содержит определяемое количество нуклеиновой кислоты, специфичной для объекта MON 87411. Используемый в изобретении "товарный продукт" относится к любой композиции или продукту, который содержит материал, полученный из растения кукурузы, цельного или обработанного кукурузного семени, одной или нескольких растительных клеток и/или частей растений, содержащих ДНК объекта кукурузы MON 87411. Товарные продукты могут продаваться потребителям и могут быть жизнеспособными или нежизнеспособными. Нежизнеспособные товарные продукты включают в себя без ограничения нежизнеспособные кукурузные семена; обработанные семена кукурузы, части кукурузных семян и части растений кукурузы, кукурузные семена и части растений кукурузы, обработанные для кормов или пищевых продуктов, масло, измельченные семена, муку, хлопья, отруби, биомассу и топливные продукты. Жизнеспособные товарные продукты включают в себя без ограничения семена кукурузы, растения кукурузы и клетки растений кукурузы. Таким образом, растения кукурузы, содержащие объект MON 87411, можно использовать для производства какой-либо товарной продукции, обычно получаемой из кукурузы. Изобретение рассматривает любой такой товарный продукт, который получен из растений кукурузы, содержащей ДНК объекта кукурузы MON 87411, которая имеет по меньшей мере определяемое количество одной или нескольких специфичных и уникальных молекул ДНК, присутствие которых является определяющим для объекта кукурузы MON 87411, и, в частности, может содержать обнаруживаемое количество полинуклеотида, несущего молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Можно применять любой стандартный способ обнаружения нуклеотидных молекул, в том числе способы обнаружения, раскрытые в настоящем изобретении. Товарный продукт входит в объем настоящего изобретения, если в этом товарном продукте имеется какое-либо обнаруживаемое количество молекулы ДНК, имеющей по меньшей мере одну диагностическую последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NО:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NО:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52.
Таким образом, растения, потомство, семена, растительные клетки, части растений (например, пыльца, яйцеклетки, початок или нити, кисти, ткани корня или стебля и листья) и товарные продукты по изобретению, являются полезными, среди прочего, для выращивания растений с целью получения семян и/или частей растений, содержащих объект кукурузы MON 87411 для сельскохозяйственных целей, для получения потомства, содержащего объект кукурузы MON 87411, для селекции растений и научных целей, для использования в микробиологических технологиях для промышленных и научно-исследовательских применений, и для продажи потребителям.
Изобретение относится к способам борьбы с сорняками и к способам производства растений с помощью гербицида глифосата и объекта кукурузы MON 87411. Рассмотрен способ контроля сорняков в поле, состоящий из посадки в поле объекта кукурузы MON 87411, содержащего сортовые или гибридные растения, и применения на этом поле гербицидно эффективной дозы глифосата в целях борьбы с сорняками в поле без повреждения растений, содержащих MON 87411. Такое применение гербицида глифосата можно проводить до появления всходов, то есть, в любое время после посадки семян, содержащих MON 87411, и до появления растений, содержащих MON 87411, или после появления всходов, то есть в любое время после появления растений, содержащих MON 87411. Также рассмотрен другой способ контроля сорняков в поле, который состоит в обработке поля эффективной дозой гербицида глифосата для борьбы с сорняками, и последующей посадке на этом поле растений кукурузы, содержащих объект MON 87411. Такое применение гербицида глифосата является предпосадочной обработкой, то есть до высаживания семян, содержащих MON 87411, и эту обработку можно проводить в любое перед посадкой, в том числе, и без ограничения, в срок примерно от 14 дней перед посадкой до 1 дня перед посадкой. Настоящее изобретение также относится к способу получения семян кукурузы, по существу не содержащих семян сорняков, и этот способ состоит в посадке в поле семян толерантных к глифосату растений кукурузы, содержащей MON 87411, обработке этого поля после появления всходов эффективной дозой гербицида глифосата, достаточной для уничтожения сорняков, и сборе семян с этого поля. Гербицидно эффективная доза глифосата для обработки поля должна находиться в диапазоне от приблизительно 0,125 фунта на акр до приблизительно 6,4 фунта глифосата на акр в течение периода вегетации. В одном варианте осуществления в течение всего вегетационного периода общее количество применяемого глифосата составляет приблизительно 1,5 фунта на акр. В течение вегетационного периода можно использовать несколько обработок глифосатом, например, применять глифосат два раза (например, применение перед посадкой и применение после появления всходов, или применение до появления всходов и применение после появления всходов) или применять глифосат три раза (например, применение перед посадкой, применение перед появлением всходов и применение после появления всходов).
В изобретении описаны способы получения растения кукурузы, толерантного к насекомым и гербицидам, содержащего последовательности ДНК, специфичные и уникальные для объекта MON 87411. Используемые в этих способах трансгенные растения могут быть гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Потомство растений, полученное с помощью этих способов, может представлять собой сортовые или гибридные растения, может быть выращено из семян, полученных от растения, содержащего объект кукурузы MON 87411, и/или из семян, полученных от растения, оплодотворенного пыльцой от растения, содержащего объект кукурузы MON 87411, и может быть гомозиготным или гетерозиготным по трансгену. Потомство растений впоследствии может быть самоопыляемым для создания чистых гомозиготных линий растений, т.е. растений, гомозиготных по трансгену, или, альтернативно, может быть ауткроссным, например, скрещенным с другим, неродственным растением для получения сортовых или гибридных семян или растений.
Изобретение относится к способам обнаружения присутствия в образце ДНК, полученной из клеток кукурузы, тканей, семян или растений кукурузы, содержащих объект MON 87411. Один из способов представляет собой (i) извлечение образца ДНК по меньшей мере из одной клетки, ткани, семени или растения кукурузы, (ii) контактирование образца ДНК по меньшей мере с одним праймером, который способен продуцировать последовательность ДНК, специфичную для ДНК объекта MON 87411, в условиях, подходящих для секвенирования ДНК, (iii) осуществление реакции секвенирования ДНК, и затем (iv) подтверждение того, что нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, специфичную для объекта MON 87411, или для содержащей его конструкции, например, последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. Другой способ представляет собой (i) извлечение образца ДНК по меньшей мере из одной клетки, ткани, семени или растения кукурузы, (ii) контактирование образца ДНК с праймером, который способен продуцировать ампликон из ДНК объекта MON 87411, в условиях, подходящих для амплификации ДНК, (iii) осуществление реакции амплификации ДНК, и затем (iv) детекцию молекулы ампликона и/или подтверждение того, что нуклеотидная последовательность ампликона содержит нуклеотидную последовательность, специфичную для объекта MON 87411, например, последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. Ампликон должен быть специфичным для объекта MON 87411, например, представлять собой ампликон, который содержит SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 25. Обнаружение в ампликоне нуклеотидной последовательности, специфичной для объекта MON 87411, является определяющим и/или диагностическим на присутствие в образце специфичной ДНК объекта кукурузы MON 87411. Представлен пример пары праймеров, которые могут производить ампликон из ДНК объекта MON 87411 при условиях, подходящих для амплификации ДНК, а именно SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 22. Специалист в данной области техники может легко создавать другие пары праймеров, которые будут производить ампликон, содержащей SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 25, при этом такая пара праймеров содержит по меньшей мере один праймер в пределах геномной области, фланкирующей вставку, и второй праймер в пределах вставки. Другой способ обнаружения в образце присутствия ДНК, полученной из клеток кукурузы, тканей, семян или растения кукурузы, содержащей объект MON 87411, представляет собой (i) извлечение образца ДНК по меньшей мере из одной клетки, ткани, семени или растения кукурузы, (ii) контактирование образца ДНК с ДНК-зондом, специфичным для ДНК объекта MON 87411, (iii), создание возможностей для гибридизации зонда и образца ДНК при жестких условиях гибридизации, и после этого (iv) детектирование гибридизации между зондом и образцом ДНК-мишени. Примеры последовательностей ДНК-зонда, который является специфичным для ДНК объекта MON 87411, представляют собой SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 23. Специалист в данной области техники может легко создавать другие зонды, которые будут содержать по меньшей мере один фрагмент геномной ДНК, фланкирующий вставку, и по меньшей мере один фрагмент ДНК-вставки, например, последовательности, представленные ниже, и без ограничения: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25. Обнаружение гибридизации зонда с образцом ДНК является диагностическим признаком присутствия в образце специфичной ДНК объекта кукурузы MON 87411. С другой стороны, отсутствие гибридизации является диагностическим признаком отсутствия в образце специфичной ДНК объекта кукурузы MON 87411.
В изобретении рассмотрены наборы для обнаружения ДНК, которые можно использовать для идентификации ДНК объекта кукурузы MON 87411 в образце, и также можно применять в способах выведения растений кукурузы, содержащих подходящий объект ДНК. Такие наборы содержат ДНК- праймеры и/или зонды, содержащие фрагменты последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. В одном из примеров такой комплект содержит по меньшей мере одну молекулу ДНК достаточной длины из смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, которая действует в качестве ДНК-зонда, полезного для обнаружения в образце присутствия и/или отсутствия ДНК, полученной из трансгенных растений кукурузы, содержащих объект MON 87411. ДНК, полученная из трансгенных растений кукурузы, содержащих объект MON 87411, будет содержать молекулу ДНК, имеющую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52. В изобретении рассмотрена молекула ДНК, подходящая для использования в качестве ДНК-зонда, которая является полезной для определения, обнаружения или диагностики наличия и/или отсутствия в образце ДНК объекта кукурузы MON 87411, представляющая собой SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 23. Специалист в данной области техники может легко создавать другие зонды, которые должны содержать достаточное количество смежных нуклеиновых кислот, включающих в себя по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере, 35, по меньшей мере, 36, по меньшей мере, 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39 или по меньшей мере 40 смежных нуклеотидов SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, и быть достаточно уникальными для ДНК объекта кукурузы MON 87411 с целью выявления ДНК, происходящей из этого объекта. Набор другого типа содержит пару праймеров, которую используют для получения ампликона, полезного для определения присутствия и/или отсутствия в образце ДНК, происходящей из трансгенного объекта кукурузы MON 87411. Такой набор необходимо использовать для способа, содержащего контактирование образца ДНК-мишени с парой праймеров, согласно изобретению, и после этого проводят реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, достаточную для получения ампликона, содержащего молекулу ДНК, которая имеет по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 25, и затем определяют присутствие и/или отсутствие ампликона. Такой способ может также включать в себя секвенирование ампликона или его фрагмента, что будет определяющим, то есть диагностическим признаком присутствия специфичной ДНК объекта кукурузы MON 87411 в образце ДНК-мишени. Специалист в данной области техники может легко создать другие пары праймеров, которые должны содержать достаточное количество смежных нуклеиновых кислот, включающих в себя по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов из последовательностей, представляющих собой, без ограничения: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, или SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, и быть достаточно уникальными для ДНК объекта кукурузы MON 87411 с целью выявления ДНК, происходящей из этого объекта.
Наборы и способы обнаружения согласно изобретению полезны, среди прочего, для выявление объекта кукурузы MON 87411, селекции сортов или гибридов растений, содержащих объект кукурузы MON 87411, обнаружения присутствия в образце ДНК, происходящей из трансгенных растений кукурузы, содержащей объект MON 87411, и отслеживание образцов на присутствие и/или отсутствие растений кукурузы, содержащих объект MON 87411, или частей растений, полученных из растений кукурузы, содержащих объект MON 87411.
Последовательность гетерологичной ДНК-вставки, сочленяющие последовательности, фланкирующие последовательности из объекта кукурузы MON 87411 можно верифицировать (и при необходимости корректировать) путем амплификации упомянутых последовательностей из объекта с помощью праймеров, полученных из последовательностей согласно изобретению, с последующим стандартным ДНК-секвенированием ампликона или клонированной ДНК.
Следующие примеры включены в изобретение для демонстрации примеров некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники следует понимать, что описанные в примерах технологии, в которых применяются разработанные авторами изобретения представленные подходы, хорошо работают при осуществлении настоящего изобретения, и, таким образом, могут считаться примерами предпочтительных способов для его осуществления. Вместе с тем, специалистам в данной области техники, в свете настоящего описания, следует понимать, что можно делать множество изменений в конкретных раскрытых вариантах осуществления, и получить тем не менее похожий или аналогичный результат без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения.
ИНФОРМАЦИЯ О ДЕПОНИРОВАНИИ
Депонирование репрезентативной выборки семян кукурузы, содержащих объект MON 87411, было проведено 14 марта 2012 года в соответствии с Будапештским договором с Американской коллекцией типовых культур (ATCC), расположенной по адресу: 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USA, почтовый индекс 20110, с присвоением номера доступа АТСС: РТА-12669. Доступ к депозитам на время рассмотрения заявки будет открыт для Комиссара по патентам и товарным знакам и для лиц, определенных комиссаром, как имеющих право такого доступа по запросу. При выдаче патента будут окончательно сняты все ограничения на доступ к нему общественности. Депозит будет храниться в депозитарии в течение 30 лет, или в течение 5 лет после последнего запроса, или в течение эффективного срока действия патента, в зависимости от того, что дольше, и будет заменяться по мере необходимости в течение этого периода.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Этот пример описывает создание и селекцию конструкции, обозначенной под номером 417, и конструирование и оценку различных конструкций ДНК. Таблица 1 классифицирует эти конструкции ДНК по тестовым критериям и результатам.
Были сконструированы ДНК-конструкции для экспрессии в кукурузе инкорпорированного протектанта растений (PIP) на основе РНК, нацеленного на блошку длинноусую западную (WCR). Были протестированы варианты РНК-транскрипта на различных генах-мишенях от WCR (группа 1), с разной длиной РНК (группа 2), с нейтральным носителем РНК или без этого носителя (группа 2), с разными вторичными структурами (группа 4) и с разными целевыми сегментами из Dv_Snf7o (группы 2 и 3). Также были протестированы варианты ряда трансгенов, например, РНК-транскрипт + WCR-активный белок (группы 3 и 5) и два РНК-транскрипта, нацеленные на две WCR-мишени (группы 1 и 4). Также протестировали варианты по количеству и конфигурации используемых кассет и элементов экспрессии (все группы).
Таблица 1Сорок пять конструкций ДНК были стабильно трансформированы в растения кукурузы. Оценивали потомство растений от нескольких объектов трансформации по отношению к конструкции ДНК
Конструкция
Группа
Критерии и результаты
043
1
- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих уложенные в векторы комбинации сегментов РНК, нацеленные на транскрипты 4 разных эндогенных генов WCR.- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих сегмент РНК, нацеленный на транскрипт гена Dv_Snf7o.
043
059
503
2
- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих РНК-сегмент разных размеров, нацеленных на транскрипт гена Dv_Snf7o (от 27-мерного до 429-мерного), сконструированных для экспрессии в виде инвертированной-повторяемой РНК (IR). Также тестировали 150-мерный нейтральный носитель IR, в который был вставлен 27-мерный, нацеленный на Dv_Snf7o, или такая вставка отсутствовала.- Оптимальная активность WCR наблюдалась на растениях, экспрессирующих целевые сегменты Dv_Snf7o, имеющие дину, равную или больше, чем 100 пар оснований.
475
970
474
477
306
476
713
868
3
- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих: (а) 240-мерный IR Dv_Snf7o, и (b) пару белков TIC809 и TIC810, обладающих WCR-ингибирующей активностью; оба под одной кассетой экспрессии в одной конструкции ДНК.- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих: (а) 240-мерный Dv_Snf7o IR, и (b) пару белков TIC809 и TIC810, обладающих WCR-ингибирующей активностью; каждый из которых независимо и функционально связан с отдельной кассетой экспрессии в одной конструкции ДНК.- Исследовали упомянутые комбинации IR + белок, используя разные комбинации разных промоторов и конфигурации кассет экспрессии.- Экспрессия 240-мерного Dv_Snf7o IR in planta ингибирует активность WCR на таких растениях, с экспрессией пары белков TIC809 и TIC810 или без их экспрессии.
870
871
875
310
311
330
331
950
890
867
946
878
823
879
880
401
354
4
- Исследовали потомство растений от гибридного скрещивания растений, содержащих объекты, несущие конструкцию ДНК # 503 (429-мерный Dv_Snf7o IR), и растений, содержащих объект MON 88017 (Cry3Bb).- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих 150-мерный или 240-мерный Dv_Snf7o IR.- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих: (а) Dv_Snf7o IR, и (b) vАТФазу А IR.- Исследовали IR по сравнению с не-IR вторичными структурами РНК для супрессии Dv_Snf7o, vАТФазы А и комбинации.- Экспрессия 240-мерного Dv_Snf7o IR in planta ингибирует активность WCR, с экспрессией сегмента vАТФазы А РНК или без экспрессии.- Ингибирование WCR было более сильным in planta, когда Dv_Snf7o IR экспрессировался вместе с Cry3Bb, при сравнении с экспрессией Dv_Snf7o IR единственного или Cry3Bb единственного.
253
254
255
256
892
365
416
5
- Исследовали ингибирование активности WCR на растениях, экспрессирующих и (а) 240-мерный Dv_Snf7o IR, и (b) белок Cry3Bb, обладающий пестицидной активностью против Diabrotica virgifera; каждый трансген расположен в отдельных кассетах экспрессии в конструкции ДНК.- Тестировали десять конструкций ДНК, имеющих комбинации различных промоторов и комбинаций различных конфигураций кассет экспрессии.- Была выбрана конструкция ДНК # 417.
417
418
419
423
402
403
404
405
406
Используя в качестве примера ДНК-конструкции группы 2, было создано 7 ДНК-конструкций с разной длиной (от 27 до 429 нуклеотидов в длину) для тестирования нацеливания на Dv_Snf7o. Была получена каждая из ДНК-конструкций, выполнена трансформация растительных клеток, получены растения, и инбредные растения тестировали в биопробах на эффективность в вегетационной камере. Результаты показали корреляцию между длиной инвертированного повтора РНК (IR) и WCR-активностью (таблица 2, столбцы (В) и (H)).
Таблица 2Соотношение длины IR и WCR-активности
(А) Конструкция ДНК
(В) Длина сегмента РНК Dv_Snf7o (нуклеотиды)
(С) Количество трансформированных зародышей
(D) Количество ростков у зародышей
(E) Количество R<sub>0</sub> растений в почве
(F) Количество R<sub>0</sub> растений, предположительно несущих единственный объект
(G) Количество объектов - предшественников для мульти-растительного биоанализа
(H) WCR-активность на растениях?
503
429
2085
433
308
233
78
+++++
475
150
230
57
45
39
23
+++++
970
27†
220
79
47
44
21
++
474
27
230
81
51
49
23
-
477
50
220
50
36
31
23
++
306
75
230
37
27
18
15
++
476
100
220
53
40
33
22
+++++
0
0
0
В столбце (B) показаны вариабельные значения длины целевой РНК Dv_Snf7o, сконструированной для экспрессии вторичной структуры инвертированного повтора РНК (IR) в растениях кукурузы. В столбце (C) показано количество зародышей кукурузы, которые были трансформированы. В столбце (D) отображено количество зародышей кукурузы, у которых развивались ростки. В столбце (E) показано количество регенерированных растений кукурузы (обозначенных как поколение R), жизнеспособных на почве. В столбце (F) показано количество R растений, предположительно несущих единственную копию ДНК-вставки в объекте трансформации. В столбце (G) показано количество R растений, которые предположительно несут единственный объект трансформации, и которые производят достаточное количество семян для биоанализа в мульти-растительной вегетационной камере. В столбце (H) показаны результаты исследований роста растений в вегетационной камере, проведенных для оценки активности WCR. Обозначение "+++++" указывает на среднюю степень повреждения корней (СПК) менее чем 0,5 СПК. Обозначение "++" указывает на среднее значение СПК от 0,5 СПК до 2,0 СПК. Обозначение "-" указывает на среднее значение СПК приблизительно 2,0 СПК, что сравнимо с показателями отрицательного контроля в исследованиях на эффективность в вегетационной камере.
† обозначает тот же 27-мерный сегмент, как в конструкции ДНК # 474, но вставленный в нейтральный 150-мерный IR. Для оценки WCR-активности у растений, выращенных в вегетационных камерах, в торфяных горшках выращивали от 6 до 8 растений для каждого из 10-20 объектов на конструкцию. Растения исследовали на присутствие вставки ДНК и экспрессии трансгена (трансгенов) в обеих тканях - и в листьях, и в корнях. Затем растения с подтвержденной экспрессией трансгена пересаживали в горшки большего размера, зараженные яйцами WCR. Линии LH59 и LH244 нетрансгенной кукурузы были включены в исследование в качестве отрицательного контроля. Растения, содержащие объект MON 88017 (экспрессирующие Cry3Bb) были включены в исследование в качестве положительного контроля. Повреждение корней растущих растений кукурузы оценивали через 4 недели. Степень повреждения корней (СПК) оценивали по трехбалльной шкале, где СПК = 0 означает отсутствие повреждения корней и СПК = 3 означает максимальное повреждение корней.
Результаты исследования определяли разработку конструкций ДНК из группы 5, которые содержали (a) кассету экспрессии для 240-мерного Dv_Snf7o IR, и (b) кассету экспрессии для белка Cry3Bb (Фиг. 2). Выбор 240-мерного Dv_Snf7o IR был обусловлен тем, что (а) растения, экспрессирующие идентичные 240-мерные Dv_Snf7o IR, показывали повторяемое успешное ингибирование активности CRW (группы 2-4), (b) сегменты, размер которых превышает 100 нт в длину, уменьшают вероятность развития устойчивости к WCR, и (с) будет более трудно осуществлять перенос в геном кукурузы сегментов размером более 240 нт, чтобы они оставались интактными. Конструкции ДНК были созданы для тестирования различных регуляторных генетических элементов в каждой кассете экспрессии и различных конфигураций каждой кассеты экспрессии в конструкции ДНК. Конструкции ДНК из группы 5 также включали в себя конструкции с кассетами экспрессии толерантности к глифосату и конструкции без этой кассеты, и контрольные конструкции из группы 3, которые экспрессировали только 240-мерный Dv_Snf7o IR. Создавали каждую конструкцию ДНК, осуществляли трансформацию растительных клеток, получали растения, и инбредные растения оценивали на эффективность в биоанализах в вегетационной камере (таблица 3 от (C) до (Н)).
Таблица 3Показатели полученных растений с трансформацией конструкций ДНК из группы 5
(А) № конструкции ДНК
(В) Композиция конструкции ДНК
(С) Количество трансформированных зародышей
(D) Количество ростков у зародышей
(E) Количество R<sub>0</sub> растений в почве
(F) Количество R<sub>0</sub> растений, предположительно несущих единственный объект
(G) Количество R<sub>0</sub> объектов - предшественников для мульти-растительного анализа в вегетационной камере
(H) Производительность инбредного и гибридного потомства растений
(1)
416
Dv_Snf7o IR + Cry3Bb + EPSPS
820
72
72
42
27
+++++
(2)
417
521
212
94
71
44
+++++
(3)
418
588
79
65
44
28
+++++
(4)
419
651
106
95
68
43
++++
(5)
423
754
93
84
66
41
++++
(6)
402
786
84
84
58
43
++++
(7)
403
714
199
84
46
40
++++
(8)
404
740
50
50
34
29
++++
(9)
405
Dv_Snf7o IR + Cry3Bb
21663
1586
1586
86
58
+++
(10)
406
21965
1539
1539
170
112
++++
(11)
890
Dv_Snf7o IR
3996
656
394
235
136
+++
В столбце (А) перечислены конструкции ДНК, исследованные на этапе 5 (также смотрите Фиг. 2 в отношении разрушения генетических элементов). В столбце (B) показана композиция трансгена. В столбце (C) показано количество зародышей кукурузы, которые были трансформированы. В столбце (D) показано количество зародышей кукурузы, у которых развивались ростки. В столбце (E) показано количество регенерированных растений кукурузы (обозначенных как поколение R<sub>0</sub>), жизнеспособных на почве. В столбце (F) показано количество R<sub>0</sub> растений, предположительно несущих единственный объект трансформации. В столбце (G) показано количество растений R<sub>0</sub>, предположительно несущих единственный объект трансформации, которые производили достаточное количество семян для последующего мульти-растительного тестирования. В столбце (H) показана производительность растений, пораженных WCR (смотрите подробное описание в следующем параграфе).
Как показано в таблице 3, столбец (H), обозначение "+++++" описывает ДНК-конструкции, которые в среднем дают наиболее высокую постоянную экспрессию гена у трансгенных растений на всем протяжении их развития, максимальное подавление WCR в период развития, и максимальное подавление WCR у само-оплодотворяемых и перекрестно-скрещенных поколений. Обозначение "++++" описывает конструкции ДНК, которые в среднем показывают подавление WCR у трансгенных растений, но проявляют более низкую экспрессию генов по сравнению с растениями "+++++". Обозначение "+++" описывает ДНК-конструкции, которые в среднем в меньшей степени подавляют WCR у трансгенных растений, по сравнению с растениями "++++" и "+++++". Таким образом, для дальнейшего анализа была выдвинута конструкция ДНК # 417. Эта конструкция имеет шестнадцать генетических элементов, расположенных в трех кассетах экспрессии от левой границы (LB) до правой границы (RB). Конструкция показана на Фиг. 2, и последовательность представлена в SEQ ID NO: 26. Элементы вектора представлены следующим образом:
[1] LB: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям с 1 по 442 SEQ ID NO: 26. Этот элемент представляет собой последовательность левой границы октопина из Agrobacterium tumefaciens.
[2] 3'UTR Ps.RbcS2-Е9: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям от 486 до 1118 SEQ ID NO: 26. Представляет собой нетранслируемую область 3'(UTR) транскрипта гена от малой субъединицы E9 (RbcS2-Е9) рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы от Pisum sativum (горох).
[3] 240-мерный Dv_Snf7o инвертированный генный повтор: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям от 1148 до 1777 SEQ ID NO: 26. Этот ген транскрибирует РНК, содержащую два 240-мерных рибонуклеотидных сегмента с идентичным выравниванием друг к другу по принципу обратной комплементарности, разделенных нейтральным сегментом длиной 150 рибонуклеотидов, и образующих инвертированный повтор РНК (IR). Последовательность сегмента из 240 п.о. выравнена по отношению к гену WCR, ортологичному к гену дрожжей Snf7.
[4] Интрон DnaK кукурузы: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям от 1814 до 2617 SEQ ID NO: 26. Этот элемент состоит из 10 нуклеотидов экзона 1, интрона 1 и 11 нуклеотидов из экзона 2, принадлежащих гену 70 белка теплового шока из Zea mays (кукурузы). 11 нуклеотидов из экзона 2 были модифицированы для удаления инициирующего остатка метионина.
[5] Лидер CaMV 35S: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям 2618-2626 SEQ ID NO: 26. Представляет собой 5'-нетранслируемую область (UTR) от 35S РНК-транскрипта вируса мозаики цветной капусты (CaMV), начинающуюся в позиции +1 от начала транскрипции гена мРНК.
[6] Промотор eCaMV 35S: Соответствует обратно комплементарной последовательности по отношению к позициям 2627-3238 SEQ ID NO: 26. Представляет собой промотор 35S РНК из вируса мозаики цветной капусты (CaMV), содержащий дупликацию участка от -90 до -350.
[7] Промотор кукурузы PIIG: Соответствует позициям 3265-4213 SEQ ID NO: 26. Этот генетический элемент представляет собой промотор индуцированного физическим импедансом гена белка (PIIG) от Zea mays.
[8] Лидер пшеницы Lhcb1: Соответствует позициям 4220-4280 SEQ ID NO: 26. Этот генетический элемент представляет собой нетранслируемую область 5'(UTR) гена светоулавливающего комплекса b1 (Lhcb1) от Triticum aestivum (пшеница).
[9] Интрон Act1 риса: Соответствует позициям 4297-4776 SEQ ID NO: 26. Состоит из непрерывной последовательности в 12 нуклеотидов из экзона 1, интрона 1 и из 7 нуклеотидов экзона 2 из гена актина 1 (Act1) Oryza sativa (рис).
[10] ORF Cry3Bb: Соответствует позициям 4786-6747 SEQ ID NO: 26. Представляет собой кодирующую область не встречающегося в природе пестицидного белка Cry3B, сконструированного для проявления модификации H231R, S311L, N313T, E317K и Q349R по сравнению с геном, кодирующим нативный белок Bt Cry3Bb. Последовательность нуклеотидов выравнивается к генной последовательности Cry3Bb, содержащейся в объекте MON 88017.
[11] 3'UTR Hsp17 пшеницы: Соответствует позициям 6767-6976 SEQ ID NO: 26. Этот генетический элемент представляет собой 3'-UTR из гена белка 17 теплового шока (HSP17) от Triticum aestivum (пшеница).
[12] TubA риса (промотор, лидер, интрон): Соответствует позициям 7025-9205 SEQ ID NO: 26. Представляет собой непрерывный промотор, лидер, интрон и 4 нуклеотида из экзона 2 из гена альфа-тубулина (TubA-3) из Oryza sativa (рис).
[13] CTP: Соответствует позициям 9210-9437 SEQ ID NO: 26. Представляет сконструированную кодирующую область, которая кодирует N-концевой CTP из 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS) из A. thaliana. Этот элемент отличается от нативного гена (GenBank, № доступа X06613) в последнем GAG-кодоне (глутаминовая кислота) по модификации TGC (цистеин).
[14] CP4 EPSPS: Соответствует позициям 9438-10805 SEQ ID NO: 26. Представляет собой сконструированную кодирующую область EPSPS из CP4 Agrobacterium. Отличается от нативного гена Agrobacterium во втором кодоне по модификации кодирующего серина на СТТ (лейцин) и по четырем молчащим заменам.
[15] 3'UTR TubA риса: Соответствует позициям 10813-11394 SEQ ID NO: 26. Представляет собой 3'-нетранслируемую область (UTR) гена, кодирующего альфа-тубулин (TubA-3) из Oryza sativa (рис).
[16] RB: Соответствует позициям 11413-11743 SEQ ID NO: 26. Представляет собой последовательность правой границы нопалина из A. tumefaciens.
Пример 2
Этот пример описывает трансформацию и выбор объектов MON 87411 из множества трансгенных объектов.
0
0
0
0
1
1
0
1
2
1
1
3,4,…N
Из ядер кукурузы линии LH244 вырезали зародыши и инокулировали их рекомбинантной Agrobacterium, несущей конструкцию ДНК # 417. Совместно культивируемые зародыши переносили на селекционные и ростовые среды для образования трансгенной каллусной ткани с развивающимися побегами. Развивающиеся побеги переносили в среду для укоренения для развития проростков. Проростки регенерировали в почве в полноценные R растения. Регенерированные таким образом R растения подвергали скринингу на единичную копию вставленной ДНК-конструкции. Как показано в таблице 3, предполагаемые однокопийные объекты были представлены в 71 уникальных трансформантах R. Каждый R трансформант переносили на доращивание в школку для получения семян потомства R. Были отмечены сорок четыре объекта. По меньшей мере, 8 R-семян, полученных от каждого из 44 R-растений, были высажены в почву, затем выращивали R-растения для получения R-семян. Для продолжения каждой линии выбирали единственное растение R на объект, каждое из которых содержало каждый отдельный объект, и семена от одного растения R откладывали для последующего тестирования путем (а) самооплодотворения (R), и путем (b) перекрестного опыления с другой линией кукурузы, например, с линией кукурузы 93IDI3. Растения, представляющие объекты из трансформации ДНК-конструкции # 890 (строка 11 таблицы 3), также были регенерированы в качестве сравнительного контроля для последующих полевых испытаний, описанных ниже в этом примере.
1
1-
Из 44 объектов были выбраны 25 объектов для дальнейшей работы, исходя из фенотипа, включающего в себя экспрессию Cry3Bb. Растения R, представляющие эти 25 объектов, дополнительно оценивали на ингибирование WCR в вегетационной камере в тестах на эффективность, описанных в примере 1, и на количество копий множественных генетических элементов ДНК-вставки. Для дальнейшей работы были взяты семнадцать объектов из этих 25 объектов, поскольку четыре объекта представляли более одной копии генетического элемента 3'UTR из Ps.RbcS2-Е9, и у Rрастений, представляющих 4 других объекта, выявлена степень повреждения корней выше 0,8 СПК.
Потомство растений, содержащее оставшиеся 17 объектов, а именно, "А", MON 87411 и от "C" до "Q", было дополнительно параллельно проанализировано в отношении молекулярных свойств и производительности в поле (смотрите таблицы 4 и 5).
Таблица 4Молекулярный анализ 17 трансгенных объектов кукурузы, несущих ДНК-вставки из вектора трансформации # 417 ДНК
Объект
(A) Отсутствие каркаса
(B) Число единичных вставок и единичных копий
(C) Интактная вставка
(D) Превышение порога экспрессии белка Cry3Bb
(E) Превышение порога экспрессии IR дцРНК Dv_Snf7o
(F) Нейтральный инсерционный сайт
(G) Предполагаемый размер транскрипта
A
+
+
+
+
+
+
+
MON 87411
+
+
+
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+
+
D
+
+
-
+
+
+
+
E
+
+
+
+
+
-
NA
F
+
+
+
+
+
-
NA
G
+
+
+
+
+
-
NA
H
+
+
NA
NA
NA
NA
NA
I
+
+
NA
NA
NA
NA
NA
J
+
+
NA
NA
NA
NA
NA
K
+
-
NA
NA
NA
NA
NA
L
-
-
NA
NA
NA
NA
NA
M
-
+
NA
NA
NA
NA
NA
N
-
-
NA
NA
NA
NA
NA
O
-
+
NA
NA
NA
NA
NA
P
-
-
NA
NA
NA
NA
NA
Q
-
-
NA
NA
NA
NA
NA
Обозначение "-" указывает на то, что объект не отвечает молекулярным критериям соответствующего молекулярного анализа. Обозначение "+" указывает на то, что объект отвечает молекулярным критериям соответствующего молекулярного анализа. "NA" обозначает, что данные не были доступны.
Объекты подвергали скринингу на сегменты каркасной ДНК из вектора трансформации Agrobacterium и на количество единичных копий всех участков ДНК, предназначенной для вставки (таблица 4, столбцы (А) и (В)). Семь объектов (MON 87411, A, C, D, E, F и G) анализировали на последовательность вставленной ДНК, которая была идентична вектору трансформации # 417, за исключением вариаций ник-сайта на левой и правой границах Agrobacterium, что происходит во время опосредованной Agrobacterium вставки, объект D не прошел этот анализ последовательности (таблица 4, столбец (C)). Эти 7 объектов также анализировали на устойчивую экспрессию в растениях белка Cry3Bb и Dv_Snf7o IR РНК на протяжении всего периода развития растений и в нескольких поколениях, и все 7 объектов отвечали критериям устойчивой экспрессии в растениях (таблица 4, столбец (D)). Каждый из 7 объектов был проанализирован в отношении геномных характеристик инсерционного сайта (т.е. нейтрального инсерционного сайта), таких как перестановки ДНК, дупликации и повторяемость, близость к эндогенному гену, разрывы в эндогенном гене и близость к локусу количественных признаков (QTL), и в отношении биотехнологических признаков, при этом объекты E, F и G не прошли этот анализ (таблица 4, столбец (F)). Нозерн-блоттинг проводили на ткани растений, содержащих объекты MON 87411, A, C и D, с целью определения наличия в РНК из этих объектов двух РНК-транскриптов предполагаемых размеров, которые кодируют Cry3Bb или продуцируют Dv_Snf7o IR РНК, и все проанализированные объекты соответствовали этому критерию (таблица 4, столбец (G)).
Проводили оценку этих 17 объектов в полевых испытаниях на агрономическую эффективность, эффективность в отношении насекомых и эффективность толерантности к глифосату, и результаты этих испытаний приведены в таблице 5. Заголовки столбцов в таблице 5 описывают тип полевых испытаний ("агрономическое", "насекомые", или "глифосат"), перечислены контрольные объекты, с которыми проводили сравнение/контрастирование объектов, и также указаны генетически инбредные элементы, используемые для генерации гибридных объектов. Результаты полевых испытаний, приведенных в столбцах от (А) до (С), относятся к посадкам за один календарный год до полевых испытаний, результаты которых приведены в столбцах (D) до (Н), и за два года до полевых испытаний, результаты которых приведены в столбце (I).
Таблица 5Результаты полевых испытаний объектов, созданных с вектором трансформации # 417: агрономических, тестов на эффективность в отношении насекомых и эффективность в отношении глифосата
Вид полевого испытания
(A) Агрономическое
(B) Агрономическое
(C) Эффективность в отношении к насекомым
(D) Агрономическое
(F) Эффективность в отношении к глифосату
(G) Эффективность в отношении к глифосату
(H) Эффективность в отношении к насекомым
(I) Агрономическое
Контроль, используемый для сравнения
LH244, #890
LH244×93IDI3, #890
LH244, MON 88017, #890
LH244, MON 88017
MON 88017
MON 88017
MON 88017, #890
LH244, #890
Инбредный или гибридный→
R3 инбредный
R3 инбредный
Инбредный R2×93IDI3
R5 инбредный
R5 инбредный
Инбредный R4×MON 89034
Инбредный R4×MON 89034
R5 инбредный
Тестовый объект
A
=
=
<0,10 СПК
=
=
=
~0,10 СПК
-
MON 87411
=
=
NA
=
=
=
~0,10 СПК
=
C
=
=
~0,10 СПК
=
-
NA
NA
NA
D
=
=
~0,10 СПК
+
=
=
~0,20 СПК
NA
E
=
=
NA
+
=
=
~0,15 СПК
=
F
=
=
NA
+
-
NA
NA
NA
G
=
=
NA
+
=
=
~0,15 СПК
=
H‡
-
=
~0,10 СПК
NA
NA
NA
NA
NA
I‡
-
=
NA
NA
NA
NA
NA
NA
J†
=
=
NA
NA
NA
NA
NA
NA
K
-
=
~0,15 СПК
=
NA
NA
NA
NA
L
=
=
NA
=
NA
NA
NA
NA
M
=
=
~0,20 СПК
+
NA
NA
NA
NA
N
-
=
NA
-
NA
NA
NA
NA
O
=
=
NA
NA
NA
NA
NA
NA
P
-
=
NA
NA
NA
NA
NA
NA
Q
=
=
NA
NA
NA
NA
NA
NA
СПК = степень повреждения корнейNA = данные не были доступны
N
Объекты сравнивали с контролем (контролями) в каждом полевом испытании. Данные для каждого полевого испытания усредняли с помощью дублирующих участков, расположенных в нескольких местах. LH244 представлял собой контроль трансформационной линии. ДНК-вектор "# 890" использовали для получения объектов, экспрессирующих только 240-мерный Dv_Snf7o IR. В качестве контроля использовали коммерческий объект MON 88017, который придавал растениям кукурузы устойчивость к жесткокрылым и толерантность к глифосату. "R инбредный" обозначает N-ное поколение потомства. Гибридные объекты, оцениваемые в полевых испытания, были выращены из семян, собранных от скрещивания с одним из родителей с оцениваемым объектом (MON 87411 или от А до Q), и с одним из родителей, указанных в таблице 5 (столбец C, G или Н). В частности, в таблице 5, в столбце, описывающем инбредный объект R2 х 93IDI3, указано, что R2 инбредный элемент из объекта в ходе исследования скрещивали с линией 93IDI3 инбредной кукурузы для получения гибридных семян. Аналогичным образом, в таблице 5, столбцах G и H, описывающих инбредный объект R4×MON 89034, указано, что R4 инбредное потомство из объекта в ходе исследования скрещивали с растением, содержащим объект MON 89034, для получения гибридных семян. "NA" обозначает, что данные для этого тестового объекта были недоступны. Обозначение "=" указывает на эквивалентность признака по сравнению с контрольной группой. Обозначение "-" указывает на попадание признака по сравнению с контрольной группой. Обозначение "+" указывает на повышение производительности по сравнению с контрольной группой. "СПК" означает степень повреждения корней. Знак "ǂ" обозначает, что в одновременных исследованиях в теплице было показано, что применимый объект проявляется в фенотипически нетипичных растениях, выращенных в школке. Знак "†" обозначает, что в одновременных исследованиях в теплице было показано, что применимый объект не обеспечивает эффективность против WCR.
Агрономические полевые испытания были проведены в нескольких районах Северной Америки и Южной Америки, полученные результаты представлены как средние данные по всем участком, что показано в таблице 5, столбцы А, В, D и I. В этих агрономических полевых испытаниях кукурузные зерна были посажены по схеме рандомизированного полного блока (RCB) в три ряда делянок на объект на участок. На каждый ряд делянки высаживали 100 зерен. Методика исследований была разработана для оптимизации производства зерна и устранения естественной нагрузки WCR. Были собраны один или несколько из следующих показателей стандартных агрономических полевых испытаний: единицы степени сбрасывания пыльцы до 50% (GDU), селекционная оценка (BR), мощность проростков (SDV), полегание стеблей (STLC), ломкость корней (RTLC), высота початка зрелых растений (EHT), высота растения взрослых растений (РНТ), влажность зерна (MST) и вес зерна при испытаниях (TWT), фенотипически нетипичные растения и урожайность зерна. Проводили оценку и инбредных и гибридных объектов, результаты приведены в таблице 5, столбцы А, В, D и I. Подходящие контроли были включены в три ряда делянок, на контроль на участок. Выводили средние результаты на делянку на всех участках. Данные проводили через анализ дисперсии, и средние значения разделяли по наименьшей существенной разнице при 5% уровне вероятности (LSD (0,05)).
Результаты полевых испытаний на эффективность против насекомых, которые включали в себя анализ повреждения WCR, усредненный по нескольким североамериканским участкам, приведены в таблице 5, столбцы C и H. Для этих полевых испытаний на эффективность кукурузные зерна были посажены по схеме RCB в три ряда делянок на объект на участок; на каждый ряд делянки высаживали 25 зерен. Тестовые объекты были представлены в гибридных растениях. Подходящие контроли были включены в три ряда делянок, на контроль на участок. Когда кукуруза на делянках достигала стадии роста V2, 5 растений на каждой делянке заражали яйцами WCR в количестве 3330 яиц на растение. Во время стадии роста V10 корни 5 зараженных растений на каждой делянке выкапывали, промывали и оценивали на наличие повреждений - объеданий по степени повреждения корней (СПК) от 0 до 3, где СПК = 0 означает отсутствие повреждения корней, и СПК=3 означает наличие максимального повреждения корней. Показатели СПК для тестовых объектов и контрольных растений были усреднены по показателям от растений со всех делянок на всех участках. Растения отрицательного контроля в каждом полевом испытании на эффективность против насекомых показывали соответствующие средние СПК, составляющие 1,7 и 1,5 СПК. Коммерческие проверочные образцы в каждом полевом испытании на эффективность против насекомых показывали соответствующие средние СПК 0,25 и СПК 0,20. Растения, содержащие объекты из конструкции ДНК # 890, показывали СПК в диапазоне от 0,35 до 0,50 СПК. Объекты из конструкции ДНК # 417 устойчиво давали растения со средним показателем СПК, который был ниже порога экономического ущерба 0,25 СПК.
Результаты полевых испытаний на эффективность, оценивающих толерантность растений к обработке гербицидом глифосатом, проведенных на нескольких участках в Северной Америке, приведены в таблице 5, столбцы F и G. Схемы применения глифосата, используемые для конкретного испытания в рамках этих полевых испытаний на эффективность, представлены в таблице 6 (в соответствии с таблицей 5, столбец F) и в таблице 7 (в соответствии с таблицей 5, столбец С).
Таблица 6Полевые испытания обработки гербицидами
Обработка
Концентрация (фунт к.э./А)
Схема (по стадии роста растения)
Глифосат
1,5
V2
Глифосат
1,5, 0,75, 0,75
V2, V8, V10
Глифосат
1,5, 1,125, 1,125
V2, V8, V10
"фунт к.э." означает фунт кислотного эквивалента. "А" означает акр
Таблица 7Полевые испытания обработки гербицидами
Обработка
Концентрация (фунт к.э./А)
Схема (по стадии роста растения)
Без обработки
0,0
Не оценивалось
Глифосат
1,5, 1.,5
V4, V8
Глифосат
3,0, 3.0
V4, V8
Глифосат
4,5, 4.,5
V4, V8
"фунт к.э." означает фунт кислотного эквивалента. "А" означает акр
Каждая делянка из 100 растений оценивалась по причиненному ущербу для урожая на 7-10 дней после последнего опрыскивания каждого лечения. Показатели повреждения урожая включали в себя хлороз, пороки развития и среднее снижение высоты растений, все из которых указывают на более низкую толерантность к гербициду глифосату. Каждую делянку также оценивали на РНТ, EHT, количество дней до 50% сбрасывания пыльцы (D50P), количество дней до 50% появления нитей (D50S), TWT, MST и урожайность. Представленными объектами были инбредные растения и гибридные растения, которые сравнивали с объектом MON 88017. Объекты "А", MON 87411, "D", "E" и "G" были эквивалентны объекту MON 88017 в отношении повреждения урожая, показателей РНТ, EHT, D50P, D50S, TWT|, MST и уровня урожайности. На основании этих результатов в сочетании со значительным преимуществом по показателю СПК у объекта MON87411 по сравнению с другими объектами и коммерческим объектом MON 88017, был выбран объект MON 87411.
Пример 3
0
Этот пример описывает молекулярную характеристику объекта MON 87411. Образец ткани листьев отбирали из растений (R) MON87411. Проводили секвенирование геномной ДНК, соответствующей трансгенному инсерционному сайту в объекте MON 87411, и не наблюдалось каких-либо различий по сравнению с последовательностью в векторе трансформации, соответствующем вектору # 417.
Фланкирующие последовательности были картированы на референс-последовательности генома кукурузы, включающие в себя референс-генома B73 кукурузы (Ref В73). Было установлено, что объект MON 87411 физически расположен на хромосоме 9. Фланкирующая последовательность, которая заканчивается на сочленении левый конец/ДНК-вставка, соответствует положению ZM_B73_CR09: 39261797. Фланкирующая последовательность, которая заканчивается на сочленении правый конец/ДНК-вставка, соответствует положению ZM_B73_CR09: 39261915. Фланкирующие последовательности для объектов MON 87411 были проанализированы на наличие геномных дупликаций, повторов и эндогенных генов. Не было обнаружено ничего из вышеперечисленного.
Анализ последовательности ДНК, вставленной в объект MON 87411, свидетельствует, что только 263 нуклеотидов на левой границе Agrobacterium (произвольно обозначенной как 5'-конец вставки), и только 15 нуклеотидов на правой границы Agrobacterium (произвольно обозначенной как 3'-конец вставки) были сохранены во вставленной ДНК в геномном инсерционном сайте объекта MON 87411.
Был проведен сравнительный анализ геномной последовательности, фланкирующей ДНК-вставку в объекте MON 87411, и соответствующей геномной области инсерционного сайта в аллеле дикого типа из LH244. В этом анализе было установлено, что в ходе конструирования объекта MON 87411 сегмент из 118 пар оснований из геномной ДНК LH244 был замещен вставленной ДНК из вектора трансформации # 417.
Пример 4
В этом примере описаны способы, которые полезны при идентификации присутствия ДНК, происходящей из объекта MON 87411 в образце кукурузы. Были созданы пара праймеров и зонд с целью идентификации уникального сочленения, образованного между геномной ДНК и произвольно назначенным 5'-концом вставленной ДНК из объекта MON 87411 (т.е. левое сочленение) и входящего в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 21. Последовательность олигонуклеотидного прямого праймера SQ27011 (SEQ ID NO: 18) идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 462 до 490 SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, позициям от 107 до 135 SEQ ID NO: 7, позициям от 72 до 100 SEQ ID NO: 6, позициям от 12 по 40 SEQ ID NO: 5, и позициям от 1 по 29 SEQ ID NO: 21. Последовательность олигонуклеотидного обратного праймера SQ9085 (SEQ ID NO: 20) идентична обратному комплементу нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 516 до 541 SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, позициям от 161 до 186 SEQ ID NO: 7, позициям от 126 до 151 SEQ ID NO: 6, позициям от 66 до 91 SEQ ID NO: 5, позициям от 16 до 41 SEQ ID NO: 4, и позициям от 55 до 80 SEQ ID NO: 21. Последовательность олигонуклеотидного зонда PB3552 (SEQ ID NO: 19) идентична обратному комплементу нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 502 до 515 SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, позициям от 147 до 160 SEQ ID NO: 7, позициям от 112 до 125 SEQ ID NO: 6, позициям от 52 до 65 SEQ ID NO: 5, позициям от 2 до 15 SEQ ID NO: 4, и позициям от 41 до 54 SEQ ID NO: 21. ПЦР-праймеры SQ27011 (SEQ ID NO: 18) и SQ9085 (SEQ ID NO: 20) амплифицируют 79-нуклеотидный ампликон из уникальной геномной/вставленной ДНК на левом сочленении объекта MON 87411. Эта же пара праймеров с зондом PB3552 (SEQ ID NO: 19), который несет флуоресцентную метку (а именно, 6FAM™ флуоресцентную метку), можно использовать в ПЦР-анализе конечных точек TaqMan для идентификации присутствия в образце ДНК, происходящей из объекта MON 87411.
Были сконструированы пара праймеров и зонд с целью выявления уникального сочленения, образованного между геномной ДНК и произвольно назначенным 3'-концом вставленной ДНК из объекта MON 87411 (то есть правого сочленения), входящей в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 25. Последовательность олигонуклеотидного прямого праймера SQ27066 (SEQ ID NO: 22) идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 11710 до 11728 SEQ ID NO: 1, позициям от 11210 до 11228 SEQ ID NO: 4, позициям от 45 до 63 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, и позициям от 1 до 19 SEQ ID NO: 25. Последовательность олигонуклеотидного обратного праймера SQ26977 (SEQ ID NO: 24) идентична обратному комплементу нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 11756 до 11784 SEQ ID NO: 1, позициям от 91 до 117 SEQ ID NO: 8, позициям от 91 до 119 SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, позициям от 23 до 51 SEQ ID NO: 3, и позициям от 47 до 75 SEQ ID NO: 25. Последовательность олигонуклеотидного зонда PB11300 (SEQ ID NO: 23) идентична нуклеотидной последовательности, соответствующей позициям от 11731 до 11755 SEQ ID NO: 1, позициям от 11231 до 11248 SEQ ID NO: 4, позициям от 66 до 90 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, позициям от 1 до 22 SEQ ID NO: 3 и позициям от 22 до 46 SEQ ID NO: 25. ПЦР-праймеры SQ27066 (SEQ ID NO: 22) и SQ26977 (SEQ ID NO: 24) амплифицируют 75-нуклеотидный ампликон из уникальной геномной/вставленной ДНК на правом сочленении объекта MON 87411. Эту же пару праймеров с зондом PB11300 (SEQ ID NO: 23), который несет флуоресцентную метку (а именно, флуоресцентную метку 6FAM™), можно использовать в ПЦР-анализе конечных точек TaqMan для идентификации присутствия в образце ДНК, происходящей из объекта MON 87411.
Специалистам в данной области следует понимать, что в дополнение к SQ27011, SQ9085, PB3552, SQ27066, SQ26977 и PB11300 можно создавать другие праймеры и/или зонды и для амплификации, и/или для гибридизации с последовательностями в пределах SEQ ID NO: 1, которые являются уникальными и полезными для обнаружения присутствия в образце ДНК, происходящей из объекта MON 87411.
Для объектов MON 87411 на основе молекулярного анализа и анализа последовательности были разработаны тесты ПЦР для идентификационных исследований объектов. В соответствии со стандартной лабораторной молекулярно-биологической практикой были оптимизированы параметры или стандартного анализа ПЦР или анализа TaqMan ПЦР с каждой парой праймеров и зондов (а именно, зондов, меченых флуоресцентной меткой, например, 6FAM™) используемых для обнаружения присутствия в образце ДНК, происходящей от объекта MON 87411 (SQ27011, SQ9085 и/или PB3552 или SQ27066, SQ26977 и/или PB11300). Обычно параметры, которые были оптимизированы, включали в себя концентрацию праймера и зонда, количество матричной ДНК и параметры циклов ПЦР- амплификации. Контроль для реакции ПЦР включал в себя праймеры (SQ20221 (SEQ ID NO: 38) и SQ20222 (SEQ ID NO: 40)) и/или зонды (PB10065 (SEQ ID NO: 39)) (зонд, меченный флуоресцентной меткой, например, VIC™), которые являются специфичными для внутреннего контроля, однокопийного гена в геноме кукурузы. Специалисту в данной области известно, как конструировать другие специфичные ПЦР-праймеры для однокопийного гена в геноме кукурузы, которые можно использовать для амплификации ампликона, предназначенного для использования в качестве внутреннего контрольного зонда, или в качестве внутреннего контроля в анализе ПЦР (например TaqMan). ДНК экстрагировали из ткани листа для каждой из следующих задач: [1] образец листа для анализа; [2] отрицательный контроль (ДНК не-трансгенной кукурузы); [3] отрицательный водный контроль (без матрицы); и [4] положительный контроль ДНК MON 87411. Обнаружение ампликонов в стандартном ПЦР-анализе можно было визуализировать с помощью гель-электрофореза ДНК, и в ПЦР-анализе TaqMan путем регистрации флуоресценции.
Анализ зиготности полезен для определения, является ли растение, содержащее объект, гомозиготным по этому объекту ДНК, то есть, содержит экзогенную ДНК в той же локализации на каждой хромосоме из пары хромосом; или является гетерозиготным по этому объекту ДНК, то есть содержит экзогенную ДНК только на одной хромосоме из пары хромосом; или является нулевым по объекту ДНК, то есть представляет собой дикий тип. Зиготность растения кукурузы, содержащего объект MON 87411, можно определить путем термической амплификации (ПЦР) или способами TaqMan с конечными точками. Например, при ПЦР-амплификации пара праймеров SQ27011 (SEQ ID NO: 18) и SQ26977 (SEQ ID NO: 22) гибридизуются в геномной ДНК, фланкирующей вставочный объект MON 87411. Это пара праймеров будет создавать ампликон, который имеет длину в 11323 нуклеотидов, если в образце присутствует ДНК, происходящая из объекта MON 87411. Эта же пара праймеров будет создавать ампликон, который имеет длину приблизительно только в 150 нуклеотидов, если ДНК кукурузы в образце не происходит от объекта MON 87411. На гель-электрофорезе ДНК одна полоса из 11323 пар оснований свидетельствует о том, что ДНК в этом образце происходит от гомозиготного объекта MON 87411, одна полоса примерно из 150 п.о. свидетельствует о том, что ДНК в образце не относится к объекту MON 87411, и присутствие и полосы в 11323 п.о., и полосы приблизительно в 150 пар оснований указывает на то, что ДНК в образце происходит из растения кукурузы, являющегося гетерозиготным по объекту MON 87411.
Анализ TaqMan может быть разработан для определения зиготности растения кукурузы, содержащей объект MON 87411. Для этого анализа создаются три или четыре праймера и два зонда, при этом [1] первая пара праймеров и первый зонд являются специфичными для обнаружения присутствия в образце ДНК объекта MON 87411, и [2] вторая пара праймеров, отличающаяся от первой пары праймеров, и второй зонд, отличающийся от первого зонда, являются специфичными для обнаружения присутствия ДНК кукурузы дикого типа (т.е. образца, не содержащего объект MON 87411). В анализе TaqMan или в подобном анализе наличие флуоресцентного сигнала только от первого зонда свидетельствует о том, что растение гомозиготно по объекту MON 87411 и является диагностическим на гомозиготность; флуоресцентный сигнал и от первого зонда и от второго зонда свидетельствует о том, что растение гетерозиготно по объекту MON 87411 и является диагностическим на гетерозиготность; и флуоресцентный сигнал только от второго зонда свидетельствует о том, что растение гомозиготно по аллелю дикого типа (то есть является нулевым для объекта MON 87411) и является диагностическим для этого признака.
Пример 5
Этот пример описывает превосходную защиту растения, содержащего объект MON 87411, от повреждения злаковыми корневыми червями, по сравнению с существующими коммерческими продуктами (MON 88017 и DAS-59122-7) и растениями отрицательного контроля. Были проведены полевые испытания на эффективность, в которых сравнивали по 135 растения каждого из объектов MON 87411, MON 88017, DAS-59122-7 и отрицательных контрольных объектов. Были собраны показатели степени повреждения корней (СПК), и в таблице 8 показан процент растений с СПК ниже уровня экономического ущерба (СПК=0,25).
В таблице 8 показано, что примерно только у 4% растений, содержащих объект MON 87411, выявлена СПК, превышающая экономический порог 0,25 СПК. В отличие от этого, 22% из коммерческих растений, содержащих MON 88017, показывают СПК, превышающую экономический порог 0,25 СПК. И 20% из коммерческих растений, содержащих DAS-59122-7, показывают СПК, превышающую экономический порог 0,25 СПК. И 96% растений отрицательного контроля показывают СПК, превышающую экономический порог 0,25 СПК. Из полученных данных сделан вывод, что объект MON 87411 явно показывает превосходные свойства по обеспечению защиты от повреждений злаковыми корневыми червями, по сравнению с коммерческими продуктами MON 88071 и DAS-59122-7, и отрицательным контролем.
Таблица 8Результаты полевых испытаний на эффективность с приблизительным процентом растений, показавших СПК≤0,25
Тестируемый объект
Приблизительный процент растений, показавших СПК≤0,25
Объект MON 87411
96
MON 88017
78
DAS-59122-7
80
Растения отрицательного контроля
4
В исследование включены 135 растений для каждого тестируемого объекта.
Испытания на эффективность в теплице были проведены для тестирования производительности объектов MON 87411 с экстремальной нагрузкой повреждением злаковыми корневыми червями. В этом испытании были протестированы следующие объекты: объект MON 87411, объект, полученный путем трансформации с ДНК вектором # 890, экспрессирующим только дцРНК; MON 88017, DAS- 59122-7 и отрицательный контроль. Для этих испытаний на эффективность при высокой нагрузке тестовые растения кукурузы выращивали в горшках в теплице. Экстремальная нагрузка повреждением достигалась путем последовательного заражения каждого горшечного растения яйцами WCR в количестве примерно 2000 яиц на один горшок в стадии роста V2, и дополнительного 4-кратного заражения, которое осуществляли с интервалами от 1 до 1-1/2 недели в количестве примерно 1000 яиц WCR на один горшок на одно заражение, при этом в общей сложности в каждый горшок было добавлено около 6000 яиц WCR. Корни растений извлекали, промывали и подсчитывали показатель СПК на стадии роста VT. Корни от всех тринадцати (N=13) растений отрицательного контроля показали максимальное повреждение корней, или абсолютное значение СПК=3. Эти результаты показывают, что объект MON 87411 значительно превосходит другие объекты кукурузы, доступные для контроля злаковых корневых червей (таблица 9).
Таблица 9Степень повреждения корней (СПК) под высокой нагрузкой повреждением злаковыми корневыми червями(N = количество тестовых растений)
Объект
Средний показатель СПК
Нижний и верхний 95% доверительные пределы
Отрицательный контроль (N=13)
3,0
Абсолютное значение
Только дцРНК (N=11)
0,36
0,17/0,54
MON 88017 (N=11)
2,1
1,8/2,4
DAS-59122-7 (N=16)
0,29
0,17/0,42
MON 87411 (N=13)
0,06
0,03/0,08
Одним из показателей эффективности трансгенных объектов против злаковых корневых червей является обнаружение выползания взрослых жуков из почвы в горшках с растениями, которые выращиваются в теплице. Чтобы определить появление взрослых жуков злаковых корневых червей из почвы в горшках, где выращивали растения объекта MON 87411, проращивали от 10 до 15 растений в горшках, содержащих почву, зараженную яйцами WCR, подобно примеру, описанному выше. В течение всего периода роста каждое растение кукурузы было накрыто сетчатым мешком для улавливания всех выползающих взрослых жуков.
Подсчет наземных взрослых жуков проводили на 6, 12 и 18 неделе после всхода растений, и в конце исследования корни оценивали на СПК. Растения, содержащие объект MON 87411, сравнивали с растениями отрицательного контроля и другими протективными трансгенными объектами против злаковых корневых червей. Результаты показали, что наблюдалось значительно меньшее количество выползающих жуков из почвы в тех горшках, в которых находились растения с объектом MON 87411, по сравнению с другими протективными трансгенными объектами против злаковых корневых червей, что свидетельствует о превосходных свойствах объекта MON 87411 для защиты от повреждений злаковыми корневыми червями.
Пример 6
Этот пример показывает, что ориентация экспрессии двух разных промоторов в клетке кукурузы, каждый из которых запускает экспрессию отдельного агента, токсичного для злаковых корневых червей, может в результате давать значительно улучшенные соотношения трансгенных объектов, проявляющих эффективность при введении их в рацион личинок злаковых корневых червей.
Клетки кукурузы были трансформированы одним из четырех различных векторов трансформации растений: pMON120417, pMON120434, pMON120416 или pMON120419, и были получены трансгенные объекты, которые регенерировали в трансгенные растения кукурузы.
В соответствии с Фиг. 4, все векторы трансформации растений содержат три кассеты экспрессии - 1, 2 и 3, ограниченные с одного конца посредством левой границы (LB) Agrobacterium, и с противоположного конца посредством правой границы (RB) Agrobacterium. Токсичная для злаковых корневых червей дцРНК экспрессируется из кассеты 1 во всех четырех векторах из усиленного промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (e35S). Белок Cry3Bb, токсичный для злаковых корневых червей, экспрессируется в векторы pMON120417, pMON120434 из кассеты 2 из промотора Zm.PIIG. Белок Cry3Bb, токсичный для злаковых корневых червей, экспрессируется в векторы pMON120416, pMON120419 из кассеты 2 из промотора Os.Rcc3. Во всех четырех векторах кассета 1 и кассета 3 находятся в одной и той же относительной ориентации. Согласно Фиг. 4, блок стрелок указывает направление экспрессии из промотора в каждой из соответствующих кассет.
Относительная ориентация кассеты 2 в векторах pMON120417 и pMON120434 является обратной, о чем свидетельствует блок стрелок (Фиг. 4), указывающие направление экспрессии от промотора. Экспрессия белка Cry3Bb, токсичного для злаковых корневых червей, в pMON120417 из кассеты 2, происходит дивергентно по отношению к направлению экспрессии дцРНК, токсичной для злаковых корневых червей, которая экспрессируется из кассеты 1. Экспрессия белка Cry3Bb, токсичного для злаковых корневых червей, в PMON 120434 из кассеты 2, происходит с той же ориентацией, что и экспрессия токсичной для злаковых корневых червей дцРНК из кассеты 1.
Относительная ориентация кассеты 2 в векторах pMON120416 и pMON120419 является обратной, о чем свидетельствуют блок стрелок (Фиг. 4), указывающих направление экспрессии от промотора. Экспрессия белка Cry3Bb, токсичного для злаковых корневых червей, в pMON120416 из кассеты 2, происходит дивергентно по отношению к направлению экспрессии дцРНК, токсичной для злаковых корневых червей, которая экспрессируется из кассеты 1. Экспрессия белка Cry3Bb, токсичного для злаковых корневых червей, в pMON120419 из кассеты 2, происходит в той же ориентации, что и экспрессия токсичной для злаковых корневых червей дцРНК из кассеты 1
Как показано в таблице 10, если в рационе злаковых корневых червей видов Diabrotica присутствует ткань из трансгенных растений кукурузы, то растения, полученные трансформацией с помощью или конструкции pMON120417 или pMON120416 (дивергентная экспрессия компонентов, токсичных для злаковых корневых червей) были более эффективны в отношении пестицидной активности, по сравнению с растениями, полученных путем трансформации с помощью или конструкции PMON 120434 или pMON120419 (с тандемной или одинаковой ориентацией экспрессии) (таблица 10). Соотношение эффективных объектов, созданных путем трансформации с использованием векторов pMON120417 и pMON120416, по сравнению с соотношением эффективных объектов из векторов pMON120416 и pMON120419, было значительно больше, о чем свидетельствуют данные из таблицы 10. Например, для объектов, созданных из вектора pMON120417 с запускаемой промотором дивергентной экспрессии компонентов, токсичных для злаковых корневых червей, 11 из 43 объектов, или почти 25% объектов проявляли эффективный контроль злаковых корневых червей. Напротив, не было получено каких-либо эффективных объектов среди объектов, созданных из вектора PMON 120434 с запускаемой промотором экспрессии с тандемной ориентацией компонентов, токсичных для злаковых корневых червей. Для объектов, созданных из вектора pMON120416 с запускаемой промотором дивергентной экспрессии компонентов, токсичных для злаковых корневых червей, 17 из 27 объектов, или около 63% объектов проявляли эффективным контроль злаковых корневых червей. Напротив, было получено только около 18,5% эффективных объектов среди объектов, созданных из вектора pMON120419 с запускаемой промотором экспрессии с тандемной ориентацией компонентов, токсичных для злаковых корневых червей. Эти данные демонстрируют значительно повышенное количество эффективных объектов, и улучшение соотношения трансгенных объектов, проявляющих эффективность, если трансгенные растения кукурузы создаются из вектора трансформации растений с двумя разными промоторами, каждый из которых запускает дивергентную экспрессию (в расходящихся направлениях) двух различных агентов, токсичных для злаковых корневых червей, и трансгенные растения кукурузы присутствуют в рационе личинок злаковых корневых червей.
Таблица 10Результаты, показывающие количество R<sub>0</sub> объектов и количество эффективных объектов, полученных из четырех векторов трансформации растений
Конструкция
Количество R<sub>0</sub> объектов
Количество эффективных объектов
pMON120417
43
11
pMON120434
8
0
pMON120416
27
17
pMON120419
43
8
Пример 7
Для производства растений кукурузы или частей растений, которые содержат улучшенные агрономические, инсектицидные или гербицидные свойства, можно скрещивать растения кукурузы, содержащие объект MON 87411, с растениями кукурузы, содержащими потенциально любой другой объект кукурузы или их комбинации и фенотипы, исследованные для определения получаемых свойств у потомства этих растений. В качестве не ограничивающего примера, MON 87411 можно скрещивать с растениями кукурузы, в том числе с одной или несколькими комбинациями, выбираемыми из следующего: DAS-59122-7, MIR604, MON 89034, MON 87411, MON 87427, TC1507, 5307, DAS-06275-8, Bt176, BT11 и MIR162.