Способ диагностики патологий печени у собак с использованием cfa-miRNAs
METHOD FOR DIAGNOSING HEPATIC PATHOLOGIES IN DOGS USING CFA-MIRNAS

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к молекулярной биологии печеночных патологий, и может быть использовано для точного отражения характера продолжающихся повреждений печени у собак с ВПСШ. Оно может быть полезно в будущем либо для разработки эффективных терапевтических средств с использованием анти-микроРНК или для принятия клинического решения о хирургическом вмешательстве перед окклюзией шунта или для мониторинга реакции после операции без текущей необходимости в инвазивной биопсии печени, которая имеет потенциальные осложнения.
Врожденные портосистемные шунты (ВПСШ) считаются наиболее частой сосудистой патологией гепатобилиарной системы у собак. ВПСШ соединяет воротную вену с нижней полой веной, позволяя крови из воротной системы кровообращения (вместе с токсинами, гепатотрофными факторами и питательными веществами) обходить печеночную ткань и течь непосредственно в систему кровообращения (Stalker MJ, Hayes MA. Developmental anomalies. Liver and biliary system. In: Jubb, Kennedy, and Palmer's Pathology of Domestic Animals. Elsevier: Philadelphia, 2007; 301-304). Соответственно, уменьшается количество кислорода и питание гепатоцитов, которые должны доставляться в паренхиму печени, что будет приводить к отсутствию или гипоплазии воротной вены. Это инициирует гипоксическое повреждение печени и приводит к дефекту метаболизма жирных кислот, а исходом будет микровезикулярный стеатоз (Parker JS, Monnet Е, Powers BE, Twedt DC. Histologic examination of hepatic biopsy samples as a prognostic indicator in dogs undergoing surgical correction of congenital portosystemic shunts: 64 cases (1997-2005). J Am Vet Med Assoc. 2008, 232, 1511-1514). Вакуализированные гепатоциты фагацитируются клетками Купфера и агрегируются в формы лило- и пигментных гранулем после накопления гемосидерина (Hunt GB, Luff JA, Daniel L, Bergh RVD. Evaluation of hepatic steatosis in dogs with congenital portosystemic shunts using Oil Red О staining. Vet Pathol. 2013, 50, 1109-1115).
Иногда гипоксия печени может усиливать пролиферацию печеночных артериол и гиперплазию печеночных протоков, тем самым обеспечивает поступление достаточное количество кислорода, факторов роста пролиферации клеток гепатоцитов, инсулина и питательных веществ для обогащения тканей печени (Lee KC, Winstanley A, House J V et al. Association between hepatic histopathologic lesions and clinical findings in dogs undergoing surgical attenuation of a congenital portosystemic shunt: 38 cases (2000-2004). J Am Vet Med Assoc. 2011, 239, 638-645). Артериолярная пролиферация не может компенсировать снижение портального кровотока у собаки с ВПСШ. Это приводит к хроническому повреждению печени и активации звездчатых клеток печени (HSC; Ито-клетки), которые являются важными продуцентами накопления перисинусоидального внеклеточного матрикса (ЕСМ) во время фиброгенеза, вызывая чрезмерное отложение коллагена (коллаген I и III типов) в портальной и паренхиматозной областях (BaadeS, Aupperle Н, Grevel V, Schoon НА. Histopathological and immunohistochemical investigations of hepatic lesions associated with congenital portosystemic shunt in dogs. J Comp Pathol. 2006, 134, 80-90).
Портосистемные шунты после проведения ультразвукового исследования и компьютерной томографической ангиографии (КТА) обычно классифицируют как внепеченочные или внутрипеченочные (Bertolini G. Anomalies of the Portal Venous System in Dogs and Cats as Seen on Multidetector-Row Computed Tomography: An Overview and Systematization Proposal. Vet Sci. 2019, 6, 10). Несмотря на это, предыдущие методы диагностической визуализации вместе со стандартными химическими тестами печени не совсем точно определяют тип продолжающихся патологий печени. Они не отражают способность ткани печени приспосабливаться к внезапному портальному кровотоку после шунтирования окклюзии, которая может быть определена гистологическим методом (Clavien PA, Emond J, Vauthey JN et al. Protection of the liver during hepatic surgery. J Gastro intest Surg. 2004, 8, 313-327). Биопсия печени обычно проводится во время хирургической окклюзии шунта и поэтому ее нельзя использовать для принятия основополагающего клинического решения перед хирургическим вмешательством в связи со сложными и длительными гистологическими исследованиями. Кроме того, результаты гистологического исследования могут не совпадать со степенью повреждения печени из-за не точного взятия биоматериала. Также не подходит для использования в плановом порядке, поскольку этот инвазивный инструмент несет в себе некоторые опасные для жизни риски (Greenhalgh SN, Dunning MD, McKinley TJ et al. Comparison of survival after surgical or medical treatment in dogs with a congenital portosystemic shunt. J Am Vet Med Assoc. 2010, 236, 1215-1220). Таким образом, разработка надежного неинвазивного сывороточного биомаркера позволяющего выявлять повреждений печени у собак с использованием cfa-miRNAs будет полезна для быстрого принятия клинических решений в ходе выполнения хирургических вмешательств и для мониторинга клинических случаев в течение длительного времени жизни собак.
Зрелые микроРНК (миРНК) представляют собой класс коротких (приблизительно 18-25 нуклеотидов в длину), некодирующих молекул РНК, которые действуют как важные регуляторы посттранскрипционной экспрессии генов в различных физиологических и патологических путях, связанных с окислительным стрессом печени, ангиогенезом, стеатозом, апоптозом, некрозом и фиброзом (Szabo G, Bala S. MicroRNAs in liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2013, 10, 542-552). Недавние исследования показали, что концентрации миРНК в сыворотке и тканях значительно коррелируют между собой. Таким образом, микроРНК представляют собой стабильные, чувствительные, неинвазивные диагностические биомаркеры крови, которые проявляются при повреждениях печени (Dirksen K, Verzijl Т, vandenlngh TS et al. Hepatocyte-derived microRNAs as sensitive serum biomarkers of hepatocellular injury in Labrador retrievers. Vet J. 2016, 211, 75-81). В настоящее время, исследования посвященные воспалительному поражению печени, согласуются с данными по стеатогепатиту у людей (Schueller F, Roy S, VucurMetal.The role of miRNAs in the pathophysiology of liver diseases and toxicity. Int J Mol Sci. 2018,19, 261) и гепатобилиарным заболеваниям у собак (Dirksen K, Verzijl Т, van den Ingh TS et al. Hepatocyte-derived microRNAs as sensitive serum biomarkers of hepatocellular injury in Labrador retrievers. Vet J. 2016, 211, 75-81) Было обнаружено, что профилирование сывороточной миРНК может использоваться в качестве ценного диагностического, и прогностического инструмента в отношении идентификации степени гистологических аномалий печени.
В настоящее время miRNA-122 составляет 70% всех miRNA в печени, и она играет точную роль в гомеостазе между жирными кислотами и биосинтезом холестерина в гепатоцитах. Следовательно, циркулирующая miRNA-122 может быть ранним специфическим и чувствительным биомаркером сыворотки в зависимости от степени простого стеатоза печени (Matsuzaki J, Ochiya Т. Extracellular microRNAs and oxidative stress in liver injury: asystematic mini review. J Clin Biochem Nutr. 2018, 63, 6-11). Действительно, miRNA-34a стал мощным регулятором прогрессирования стеатогепатита посредством репрессии гена SIRT1, который действует как регулятор энергетического метаболизма в гепатоцитах, контролируя активность киназы AMP. Репрессия гена SIRT1 приводит к снижению метаболизма гепатоцитов, увеличению окисления жиров, прогрессирование стеатоза печени и гибель клеток (Muangpaisarn Р, Jampoka K, Payungporn S. Serum microRNA-34a is potential biomarker for inflammation in nonalcoholic fatty liver disease. Asian Biomed. 2017, 10, 163-171). Недавние исследования определили miRNA-21, как одну из основных движущих сил для прогрессирования повреждения печени в фиброз, поскольку он косвенно активирует HSC для синтеза ЕСМ через активацию сигнальных путей TGF-β1 / Smads, ERK, PTEN / Akt и NF-κВ индукция фиброза (Нао XJ, Xu CZ, Wang JT et al. miR-21 promotes proliferation and inhibits apoptosis of hepatic stellate cells through targeting PTEN/PI3K/AKT pathway. J Recept Signal Transduct Res. 2018, 38, 455-461: Huang Q, Zhang X Bai F et al. Methyl helicterte ameliorates liver fibrosis by regulating miR-21-mediated ERK and TGF-β1/Smads pathways. Int Immuno pharmacol. 2019, 66, 41-51).Эндотелиально-специфическая микроРНК (miRNA-126) играет важную роль в ишемическом реперфузионном повреждении, способствуя неоваскуляризации (артериогенезу) в ответ на повреждение сосуда и/или тканевой гипоксии для улучшения выживаемости клеток через PI3K/eNOS/NO путь, подавляющий окислительный стресс, апоптоз и фиброз, который стабилизирует потенциал митохондриальной мембраны (Wang W, Zheng Y, Wang M et al. Exosomes derived miR-126 attenuates oxidative stress and apoptosis from ischemia and reperfusion injury by targeting ERRFI1. Gene. 2019, 690, 75-80).
Анализ патентных источников показал, что никакие предыдущие изобретения не были связаны с использованием cfa-miRNA в качестве сывороточных биомаркеров патологий печени у собак, в то время как следующие не запатентованные документы в некоторых вопросах аналогичны заявленным нами:
1- Способ дифференциальной диагностики гепатобилиарных заболеваний у собак с использованием сывороточных микроРНК в качестве нового биомаркера (Dirksen K, Verzijl Т, Grinwis, G С etal. Use of Serum MicroRNAs as Biomarker for Hepatobiliary Diseases in Dogs. J Vet Intern Med. 2016, 30, 1816-1823). Авторы предложили измерять сывороточные концентрации трех микроРНК (miRNA-122, miRNA-21 и miRNA-126) у собак с различными типами паренхиматозных, желчных, сосудистых или опухолевых гепатобилиарных заболеваний, а также у контрольных (здоровых) животных. Обратите внимание на то, что в данных исследованиях концентрации всех микроРНК были определены путем абсолютной количественной оценки с применением стандартной кривой. Все количества были нормализованы только для cel-miRNA-39-3р в качестве эталонных генов (экзогенный контроль с добавлением пика), выбранных из литературы без проверки. Это не согласуется с данными, изложенными в QiagenmiScript PGR Array Справочник и другими исследованиями (Hellemans J, Vandesompele J. Selection of reliable reference genes for RT-qPCR analysis. In Quantitative Real-Time PCR. Humana Press, New York, N. 2014, pp. 19-26; Wang X, Fu Y, Ban L, Wang Z, Feng G, Li J, Gao H. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time RT-PCR in alfalfa. Genes&geneticsystems. 2015. 90, 175-180): для получения точных и воспроизводимых результатов количественного определения miRNA применяется полимеразная цепная реакция (ПНР) в реальном времени. Также необходимо нормализовать количество целевой miRNA с помощью подходящей эндогенной и экзогенной эталонной РНК, для получения информации о точных концентраций микроРНК внутренней части ткани.
Следует отметить, что все протестированные микроРНК были оценены с использованием последовательностей праймеров, полученных из литературы, основанной на исследованиях на людях и не специфичных для собак (cfa-caninefamiliaris).
2- Способ раннего выявления субклинических гепатоцеллюлярных повреждений у лабрадоров-ретриверов с использованием сыворотки miR-122 в качестве высокочувствительного и многообещающего нового биомаркера (Dirksen K, Verzijl Т, vandenlngh TSG et al. Hepatocyte-derived microRNAs as sensitive serum biomarkers of hepatocellular injury in Labrador retrievers. Vet J. 2016, 211, 75-81). В ранее упомянутых методах miRNA-122 оценивалась только для диагностики двух форм патологий печени (острого и хронического гепатита) у отдельных видов собак (лабрадор-ретривер). Также в этом методе все количества были нормализованы только для cel-miRNA-39-3р в качестве эталонных генов (экзогенный дополнительный контроль).
3- Способ исследования ассоциации сывороточных miRNA-122 и mi-29a со стадией фиброза и прогрессированием хронического гепатита у лабрадоров-ретриверов (Sakai М, Spee В, Grinwis GC et al. Association of circulating microRNA-122 and microRNA-29a with stage of fibrosis and progression of chronic hepatitis in Labrador Retrievers. J Vet Intern Med. 2019, 33, 151-157). В ранее упомянутых методах miRNA-122 оценивалась только для диагностики двух форм патологий печени (острого и хронического гепатита) у отдельных видов собак (лабрадор-ретривер). Также в этом методе все количества были нормализованы только для cel-miRNA-39-3р в качестве эталонных генов (экзогенный дополнительный контроль).
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1- Способ основан на сравнении относительной экспрессии некоторых экспериментально выбранных cfa-miRNAS (122, 34а, 21 и 126), которые опосредуют различные гены и пути в гепатоцитах, а затем значительно повышаются в сыворотке в соответствии с типом поражения печени в собаки с ВПСШ. Это изобретение позволяет снизить стоимость, упростить и значительно ускорить процедуру тестирования, а также выявить наиболее частые повреждения печени и молекулярные события в гепатоцитах без необходимости проведения инвазивной биопсии печени.

2- В этом способе определение относительного уровня экспрессии cfa-miRNA в образцах сыворотки проводилось с помощью RT-PCR с использованием собачьих праймеров которыми измеряли cfa-miRNA и двух эталонных генов, включая cel-miRNA-39-3р. (экзогенный дополнительный контроль) и cfa-miRNA-16. В итоге был выбран и валидирован как наиболее подходящий ген внутреннего контроляна основе алгоритма анализа программ NormFinder и geNorm. Следовательно, повышается точность, специфичность и чувствительность тестирования.
3- В этом методе присутствие ВПСШ было идентифицировано и классифицировано у многих пород собак с использованием КТА. Затем нормальные ткани печени и различные патологии печени у здоровых собак, и те, у кого подтверждено наличие ВПСШ, были диагностированы путем гистологического исследования собранных биопсий печени с использованием стандартного окрашивания гематоксилином и эозином. Кроме того, краситель Perls'Prussianblue был использован для визуализации пигментов гемосидерина в липогранулемах ткани печени. А также, краситель Picro Sims Red использовался для выделения волокон соединительной ткани (коллаген типов I и III) в исследовательских биопсиях печени.
Предварительные исследования показали, что относительная экспрессия четырех протестированных cfa-miRNA оптимально дифференцировала тип гистологического повреждения печени с высокой чувствительностью и специфичностью у собак с ВПСШ.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание нового, эффективного, специфичного для печени неинвазивного диагностического биомаркера на основе генов, достоверно отражающего тип печеночных патологий и молекулярных событий, происходящих в печени при каждом типе шунта, с высокой чувствительностью и специфичностью. Это может быть полезно либо для принятия клинического решения, либо для мониторинга реакции на окклюзию шунта в дополнение к разработке эффективных терапевтических средств с использованием анти-miRNA.
-ΔΔCt
Технический результат достигается на основе анализа относительной экспрессии цфа-микроРНК в сыворотке крови путем выделения общей РНК из образцов сыворотки собак с подтвержденным ВПСШ (методом КТА) и различными патологиями печени (гистологическим исследованием), с последующей обратной транскрипцией, и амплификации в реальном времени ПЦР (RT-PCR) с использованием праймеров, специфичных для miRNA собак (cfa-miR-122-5р, cfa-miR-34a-5p, cfa-miR-21-5p и cfa-miR-126- 5р). Все анализы применяли в трех повторах для каждого образца. Полученный средний порог цикла (Ct) каждой тестируемой микроРНК был нормализован относительно среднего Ct cfa-miRNA-16 (стабильно экспрессируемый эндогенный контроль) и cel-miRNA-39-3р (экзогенный контроль всплеска), чтобы получить ΔCt, используя следующее уравнение: ΔCt = Ct cfa-miRNA интересующий - 0.5 * (Ct cel-miR-39 + Ct miR-16). Затем полученный ΔCt использовали для определения относительного кратного изменения каждой протестированной cfa-miRNA в группах ВПСШ по сравнению с соответствующими контрольными животными с использованием метода 2. Согласно наблюдаемым гистологическим критериям, тесты доказали, что: cfa-miR-122 при пороговом значении ≥ 1,32-1,45 является диагностическим средством для микровезикулярного стеатоза; cfa-miR-34a при пороговом значении ≥ 1,15-1,23 является диагностическим для вакуолизированных гепатоцитов с макровезикулярным стеатозом, а также липидной или пигментной гранулемы; cfa-miR-21 при пороговом значении ≥ 1,07-1,23 является диагностическим средством для портального и паренхиматозного фиброза; cfa-miR-126 при пороговом значении ≥ 1,14-1,16 является диагностическим средством для изменения кровоснабжения печени в форме пролиферации артериол и связанной с ней пролиферации протоков у собак с ВПСШ.
Заявленный способ включает следующие этапы:
8

-ΔΔCt

Перед хирургическим ослаблением шунта, образцы крови получали через головную вену от каждой собаки, а затем сыворотку отделяли и хранили при -80°С в отсутствие циклов замораживания-оттаивания до анализа микроРНК. Общая РНК, включая представляющие интерес miRNA, была выделена из каждого образца с использованием реагента QIAzol Lysis Reagent в составе набора miRNeasy для сыворотки/плазмы (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Для измерения эффективности выделения РНК 3,5 мкл синтетической miRNA-39 Caenorhabditis elegans (Qiagen, Германия) добавляли в качестве дополнительного контроля к каждому образцу денатурированной сыворотки в количестве 1,6×10 копий/мкл рабочего раствора. Концентрацию и чистоту выделенных образцов РНК оценивали путем измерения их оптической плотности при 280 нм с помощью NANOphotometerNP80 (Германия), и отношения РНК (А260:А280), превышающие и/или равные 1,6 были включены в изучение. Выделенную РНК из каждого образца подвергали обратной транскрипции с использованием набора miScript II RT (Qiagen, Германия) для получения комплементарной ДНК (кДНК) в соответствии с инструкциями производителя. Для определения относительной экспрессии выбранных cfa-miRNA и экзогенного cel-miR-39 была проведена ОТ-ПЦР на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX-96 (Bio-Rad, США) с использованием разбавленной кДНК и набор miScript SYBR Green PCR (Qiagen, Германия) согласно miScript-PCR-System-Справочник. Условия реакции амплификации ПНР были следующими: 1 цикл-начальной денатурации при 95°С в течение 15 минут и 45 циклов 3-этапной ПЦР, включая: 15 с денатурации при 94°С, отжиг при 55°С в течение 30 с и затем удлинение в течение 30 с при 70°С. Все исследования проводили в трех последовательностях для каждого образца, и средний пороговый цикл (Ct) был оценен и использован в последующем. Полученные из ПЦР значения Ct каждой выбранных cfa-miRNA были нормализованы против cfa-miR-16 в качестве эндогенного эталонного гена (из-за их относительно стабильной экспрессии) и cel-miR-39 в качестве экзогенного синтетического эталонного гена (добавлено во время выделения РНК), ΔCt = cfa-miRNA интересующий - 0.5 × (Ct cel-miR-39 + Ct miR-16). Все данные были относительно выражены как кратное изменение по сравнению с контролем с использованием сравнительного метода Ct (2 метод). Специфические прямые праймеры к интересующим cfa-микроРНК, а также эндогенному эталонному гену были разработаны и синтезированы компанией «Евроген» (Москва, Россия) с использованием баз данных MirBase, NCBI GenBank и программы праймеры-BLAST (http://www.mirbase.org/index.shtml) Как показано в таблице 1, специфический прямой праймер cel-miR-39 и универсальный обратный праймер были включены в наборы (Qiagen).
Диагностическая ценность каждой дифференциально-экспрессируемой cfa-miRNA для характеристики гистопатологических поражений у собак с ВПСШ была определена путем расчета площади под кривой ошибок (AUC-ROC) и пороговых значений для оценки оптимального процента чувствительности и специфичности. Было показано, что cfa-miR-122 был значительно повышен (р<0,0001) и дифференцировал все группы ВПСШ от контрольных групп при пороговом значении в диапазоне 1,32-1,60 с высокой чувствительностью (в диапазоне от 100% до 91,7%) и специфичность (от 100% до 91,7%) в зависимости от степени тяжести микровезикулярного стеатоза в каждой группе. Кроме того, cfa-miR-34a достоверно экспрессировался в сыворотке крови собак с различными формами ВПСШ (Р<0,0001) по сравнению с контролем, и при пороговом значении в диапазоне от 1,15 до 1,23 отражала значительную диагностическую чувствительность (от 91,7% до 83,3%) и специфичности (в диапазоне от 91,7% до 66,7), которые различаются в зависимости от частой распространенности вакуолизированных гепатоцитов с макровезикулярным стеатозом, а также липидных или пигментных гранулем в каждой группе. Cfa-miR-21 был заметно сверхэкспрессирован в сыворотке больных групп (Р<0,001) в соответствии с тяжестью портального и паренхиматозного фиброза, а также выражал диагностический потенциал в дифференциации больных групп от контрольной при пороговом значении в диапазоне от 1,07 до 1,23 с высокой чувствительностью (в диапазоне от 75% до 91,7%) и специфичностью (в диапазоне от 91,7% до 66,7%). В конце концов, мы наблюдали, что cfa-miR-126 значительно экспрессировался (Р<0,001) в сыворотке крови с кратным изменением, связанным с частотой измененного кровоснабжения печени в форме пролиферации артериол и связанной с ней пролиферации протоков в наших исследованных группах по сравнению с нормальным контролем группой. Кроме того, согласно анализу AUC-ROC, cfa-miR-126 в момент отсечения (в диапазоне от 1,14 до 1,16) продемонстрировал высокую диагностическую эффективность с высокой чувствительностью (в диапазоне от 100% до 75%) и специфичностью (в диапазоне от 91,7% до 75%), соответственно к частоте нарушения кровоснабжения печени в каждой группе больных.