Способ дифференцированной окраски эластических и коллагеновых волокон на гистологическом препарате
METHOD FOR DIFFERENTIATED STAINING OF ELASTIC AND COLLAGEN FIBRES ON HISTOLOGICAL PREPARATION

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, может быть применено в патологической анатомии и судебной медицине и предназначено для дифференцированной окраски эластических и коллагеновых волокон на гистологическом препарате.
При гистологическом исследовании соединительной ткани нередко возникает потребность в дифференцированной окраске эластических и коллагеновых волокон.
Способы окраски гистологических препаратов для выявления эластических и коллагеновых волокон известны из ряда источников [1,2,3].
Недостатками известных способов является то, что процесс изготовления препаратов продолжителен и требует большого количества реактивов.
В качестве прототипа - наиболее близкого аналога - выбран способ дифференцированной окраски эластических и коллагеновых волокон, описанный в руководстве Б. Ромейса [2]. Препарат после депарафинизации помещают в раствор резорцин-фуксина на 15 мин, промывают сначала в обычной, потом в дистиллированной воде, окрашивают железным гематоксилином Вейгерта 2 мин, промывают в проточной воде в течение 5 мин, окрашивают азофлоксином 5 мин, ополаскивают раствором 1% уксусной кислоты, дифференцируют в фосфорномолибденовой кислоте-оранжевом до обесцвечивания коллагеновых волокон, ополаскивают раствором 1% уксусной кислоты, подкрашивают световым зеленым 5 мин, промывают раствором 1% уксусной кислоты 5 мин, дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду, в результате чего эластические волокна окрашиваются в черный цвет, коллагеновые волокна в зеленый цвет.
Недостатки приведенного способа состоят в том, что процесс изготовления препарата продолжителен и требует большого количества реактивов.
Задача, на решение которой направлен патентуемый способ, состоит в получении объективных знаний в областях фундаментальной науки, изучающих закономерности строения соединительной ткани у человека и животных в норме и при патологических процессах.
Технический результат - снижение материальных и временных затрат; возможность дифференцировать эластические и коллагеновые волокна на одном и том же препарате на основании их различной окраски, что позволяет уточнить их пространственные взаимоотношения.
Заявляемый технический результат достигается за счет того, что препарат после депарафинизации в ксилоле помещают сначала в абсолютированный, а затем в 90% спирт, из которого его переносят в раствор резорцин-фуксина на 15 мин, после чего препарат быстро промывают последовательно: в водопроводной воде, в дистиллированной воде, а затем в 1% растворе уксусной кислоты, после чего осушают поверхность препарата фильтровальной бумагой и на 2 мин наносят на него раствор прочного зеленого F.C.F., затем препарат споласкивают 1% раствором уксусной кислоты и помещают его в 1% раствор уксусной кислоты на 5 мин, далее препарат дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду.
Последовательное окрашивание одного и того же препарата растворами резорцин-фуксина и прочного зеленого F.C.F. позволяет дифференцированно окрашивать эластические и коллагеновые волокна.
Авторами в научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений о применении последовательного окрашивания одного и того же препарата растворами резорцин-фуксина и прочного зеленого F.C.F. для дифференцированной окраски эластических и коллагеновых волокон, следовательно, патентуемый способ отличается новизной.
Авторами установлено, что последовательное окрашивание одного и того же препарата растворами резорцин-фуксина и прочного зеленого F.C.F. позволяет окрасить эластические волокна в фиолетовый цвет, а коллагеновые волокна в различные оттенки зеленого цвета, что позволяет, по сравнению с прототипом, быстро и при меньшем количестве реагентов получить препарат на котором легко дифференцировать эластические и коллагеновые волокна, следовательно, патентуемый способ соответствует критерию «изобретательский уровень».
Патентуемый способ не требует больших материальных затрат, он легко выполним в практике, следовательно, соответствует критерию «промышленная применимость».
Для изготовления препаратов берут материал, фиксированный в 10% растворе нейтрального формалина, проводку осуществляют по стандартной методике. После проводки кусочки заключают в парафин. Из парафиновых блоков изготавливают срезы толщиной 2 мкм. После депарафинизации в ксилоле препараты помещают в абсолютированный спирт, затем в 90% спирт. Из 90% спирта их переносят в раствор резорцин-фуксина на 15 мин. Раствор резорцин-фуксина готовят заранее для чего сначала смешивают 0,5 г фуксина и 1 г резорцина с 50 мл дистиллированной воды (раствор А). Затем смешивают 2 г хлористого железа с 10 мл дистиллированной воды (раствор Б). Раствор А доводят до кипения и прибавляют к нему раствор Б, кипятят 5 мин, после охлаждения раствора осадок собирают на фильтр, заливают его 100 мл 96% спирта, доводят до кипения, остужают, добавляют 0,7 мл концентрированной соляной кислоты. После выдержки в растворе резорцин-фуксина препараты быстро промывают сначала в водопроводной воде, затем в дистиллированной воде, затем в 1% растворе уксусной кислоты. Осушают поверхность среза фильтровальной бумагой и наносят на него раствор прочного зеленого F.C.F. Состав раствора: 0,1 г прочного зеленого F.C.F. смешивают с 1,2 мл ледяной уксусной кислоты и добавляют 600 мл дистиллированной воды. Через 2 мин препараты споласкивают 1% раствором уксусной кислоты и помещают их в 1% раствор уксусной кислоты на 5 мин. Препараты дегидратируют, просветляют и заключают в синтетическую монтирующую среду. На препаратах отчетливо видны эластические волокна, которые имеют фиолетовый цвет и коллагеновые волокна, окрашенные в различные оттенки зеленого.
Способ поясняется фотографиями гистологических препаратов:
На Фиг. 1 представлен поперечный срез стенки легочного ствола плода человека. Ув. Х 100.
На Фиг. 2 представлен срез стенки легочного ствола плода человека, сделанный во фронтальной плоскости. Ув. Х 100.
Пример использования.
Брали участки стенки легочного ствола плода человека, материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Проводка материала осуществлялась по стандартной методике. После проводки кусочки заключали в парафин. Из парафиновых блоков были изготовлены срезы толщиной 2 мкм. После депарафинизации в ксилоле препараты помещали в абсолютированный спирт. Из 90% спирта их переносили в раствор резорцин-фуксина на 15 мин. После чего препараты быстро промывали сначала в водопроводной воде, затем в дистиллированной воде, затем в 1% растворе уксусной кислоты. Осушали поверхность среза фильтровальной бумагой и наносили на него раствор прочного зеленого F.C.F. Через 2 мин препараты споласкивали 1% раствором уксусной кислоты и помещали их в 1% раствор уксусной кислоты на 5 мин. Препараты дегидратировали, просветляли и заключали в синтетическую монтирующую среду.
Заключение: на препаратах хорошо видны эластические волокна фиолетового цвета, а коллагеновые волокна - зеленого цвета.
Таким образом, применение патентуемого способа позволяет на основании различий окраски эластических и коллагеновых волокон дифференцировать эти волокна на одном и том же гистологическом препарате, при этом уменьшается время и количество используемых реактивов, необходимых для окраски. Способ обеспечивает возможность получения объективных знаний в областях фундаментальной науки, изучающих закономерности строения соединительной ткани у человека и животных в норме и при патологических процессах.
Используемая литература
1. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники //Л.: Медицина. - 1969. -С.189-190.
2. Ромейс Б. Гистологическая техника //Москва: Иностранная литература. - 1953. - С. 371-375.
3. Bancroft J.D., Layton С, Suvama S.K. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques. 7th (edn) //Churchill Livingstone, NY, USA. - 2013. - P. 199-214.