СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ИЗ РЕПЕЙНИЧКА АПТЕЧНОГО, ОБЛАДАЮЩЕГО ДИУРЕТИЧЕСКИМ, ПРОТИВОМИКРОБНЫМ, АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD OF OBTAINING MEDICATION FROM AGRIMONIA EUPATOR, POSSESSING DIURETIC, ANTIMICROBIAL, ANTIOXIDANT ACTION

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способов получения лекарственного средства из растительного сырья. Одной из актуальных проблем медицинской науки и практического здравоохранения является профилактика и лечение заболеваний мочевыводящих путей, которые по распространенности занимают второе место после ОРЗ в России. Течение таких заболеваний часто имеет хронический характер и требует длительного применения лекарственных препаратов. Социальная значимость этой проблемы обусловлена широким распространением и тяжестью заболеваний. В связи с этим, поиск и разработка новых эффективных и безопасных лекарственных средств и субстанций из растительного сырья, обладающих малой токсичностью, является актуальной задачей.
Известен способ получения отвара толокнянки обыкновенной, применяющегося в качестве мочегонного средства (ГФ XI, вып.2, С.147-148).
Известен способ получения средства, обладающего диуретической активностью, характеризующийся тем, что измельченные до 5 мм корневища с корнями сабельника болотного экстрагируют при температуре 55-65°С 40-45%-ным этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагента 1:(10-15) трехкратно по 2,5 ч, далее извлечения объединяют, фильтруют, упаривают, очищают сепарированием и высушивают в вакуумной сушилке с последующим измельчением, при этом конечный продукт содержит не менее 35% суммы полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин (Патент RU №2318531).
Известен способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью, включающий экстракцию растительного сырья - листьев земляники садовой, измельченного от 1,0 мм до 3,0 мм, методом дробной мацерации водой очищенной в соотношении сырье-экстрагент 1:10, в реакторе из нержавеющей стали с ложным дном вместимостью 100 л, снабженным якорной мешалкой, паровой рубашкой и гильзой для термометра, при времени настаивания 90 мин (трехкратное настаивание по 30 мин); объединение водных извлечений, фильтрацию, сепарирование, упаривание в циркуляционном вакуум-выпарном аппарате и высушивание на распылительной сушилке (патент RU №2342945).
Технической задачей предлагаемого изобретения является увеличение специфической активности и расширения спектра действия предлагаемого средства из травы репейничка аптечного.
Поставленная задача достигается способом получения средства из репейничка аптечного, который заключается в следующем:
Измельченную траву репейничка аптечного, собранную в фазе цветения, просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм, и измельченное лекарственное растительное сырье заливают водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения, в соответствующей емкости и настаивают на кипящей водяной бане при частом помешивании при соотношении сырье-экстрагент 1:(5-8) в течение 15 мин с добавлением твина 80 в количестве 0,3%. После чего выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят водой до первоначального объема и вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема, упаривают до получения сухого остатка.
Пример конкретного выполнения №1.
100 г измельченной травы репейника аптечного просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм и заливают водой при соотношении сырье-экстрагент 1:5 и с учетом коэффициента водопоглощения 650 мл воды, с добавлением 1,95 мл твина 80, настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при частом перемешивании.
Снимают, выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят до первоначального объема, затем вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема и упаривают до получения сухого остатка.
Пример конкретного выполнения №2
200 г измельченной травы репейника аптечного просеивают через сито с диаметром отверстий 5-7 мм и заливают 1560 мл воды при соотношении (1:6) с коэффициентом водопоглощения 1,3, с добавлением 4,68 мл твина 80, настаивают на кипящей водяной бане в течение 15 мин при частом перемешивании.
Снимают, выдерживают 6-8 часов, фильтруют и доводят до первоначального объема, затем вторично настаивают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают, доводят до первоначального объема и упаривают до получения сухого остатка.
После проведения цианидовой реакции извлечение приобретало оранжево-красное окрашивание с 5% раствором алюминия хлоридом, имело желто-зеленую флуоресценцию в УФ свете при длине волны 356 нм.
Анализ на содержание флавоноидов
Качественное обнаружение
К 0,5 мл раствора субстанции (раствор А), полученного для количественного определения, прибавляют 1 мл 5%-ного спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желтое окрашивание.
Ультрафиолетовый спектр раствора Б, приготовленного для количественного определения, в области от 380 до 450 нм имеет максимум поглощения при длине волны 405±2 нм (см. чертеж).
Количественное определение флавоноидов
Около 0,15 г (точная навеска) сухого экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 25 мл воды очищенной (70°С), доводят водой до метки и перемешивают (раствор А).
2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 5%-ного спиртового раствора алюминия хлорида, 1 мл 3%-ной уксусной кислоты и доводят 70%-ным спиртом до метки (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность раствора Б через 30 минут с помощью спектрофотометра при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2 мл раствора А и 1 мл 3%-ной уксусной кислоты, доведенных до метки 70%-ным спиртом в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно в тех же условиях измеряют оптическую плотность раствора, содержащего 1 мл 0,05%-ного раствора рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.
В качестве раствора сравнения при этом используют 1 мл 0,05%-ного раствора рутина и 1 мл 3%-ной уксусной кислоты, доведенных до метки 70%-ным спиртом в мерной колбе вместимостью 25 мл.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:
;
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца рутина;
0
m - точная масса рутина, взятого для приготовления раствора рабочего стандартного образца, г;
m - точная масса препарата, г;
W - потеря в массе при высушивании субстанции, %.
Найдено 5,62±0,13%.
В качестве оптимального экстрагента мы выбрали воду, так как в нее лучше переходят окисляемые вещества, кислота аскорбиновая и другие водорастворимые компоненты (гликозиды флавоноидов, полисахариды, микроэлементы, аминокислоты).
Определение фармакологической активности предлагаемого средства проводилось на белых беспородных крысах-самцах средней массой 170 г. Экстракт вводили однократно подкожно в дозе 20,0 мг/кг массы, а контрольным животным - физиологический раствор в соответствующем объеме (1,0 мл) предварительно, голодавшим до этого в течение 6 часов животным, давали через зонд 5% водную нагрузку. Крыс помещали в камеры с мочеприемниками. Мочу собирали в градуированные пробирки в течение 5 часов. Результаты эксперимента статистически обработаны и представлены в таблице.
В контрольной группе максимум интенсивности диуреза приходился на первые два часа опыта. В дальнейшем он резко снижался и конечный объем мочи за весь срок наблюдения составлял 78% всей водной нагрузки (8,5 мл). В экспериментальной группе диурез был выше во все сроки наблюдения, а конечный объем мочи 12,9 мл почти в два раза превышал величину контрольного показателя.
В контрольной группе максимум интенсивности диуреза приходился на первые два часа. В дальнейшем он резко снижался и конечный объем мочи за весь срок наблюдения составил 78% всей водной нагрузки (8,5 мл).
В экспериментальной группе диурез был выше во все сроки наблюдения, а конечный объем мочи почти в два раза превышал величину контрольного показателя. По сравнению с прототипом объем мочи предлагаемого средства увеличивался. (Табл.1)
Антиоксидантную активность определяли следующим образом:
В склянку с притертой пробкой объемом 200 мл вносили реакционную смесь следующего состава: 2 мл 1% раствора Твина 80; 0,2 мл 1 мМ раствора сульфата железа; 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 0,2 мл 1% раствора изучаемого объекта с конечным содержанием суммы веществ в пробе - 3 мг.
Смесь тщательно перемешивали, герметично закрывали крышкой и ставили в термостат при 40°С на 48 часов до максимального накопления продукта пероксидации - малонового диальдегината в инкубационной смеси. Затем реакционную смесь встряхивали и добавляли 1 мл 40% раствора ТХУ, смесь встряхивали вновь и выдерживали в течение 0,5 часа. После этого инкубат переносили в пробирки и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. Брали 2 мл центрифугата, добавляли 2 мл 0,25% раствора кислоты тиобарбитуровой, встряхивали и выдерживали при 100°С 15 мин, затем охлаждали и фотометрировали окрашенный в розовый цвет комплекс при 532 нм против контрольной пробы. В контрольных пробах вместо суммы веществ добавляли 0,2 мл воды.
Полученные данные при n=12 в каждом опыте обрабатывали статистически. Антиоксидантную активность в экспериментальных пробах оценивали по убыли МДА в процентах от контроля.
Результаты приведены в таблице №2
Противомикробное действие средства в жидкой питательной среде МПБ методом серийных разведений с последующим высевом на твердые селективные среды. Проявление противомикробной активности считают при полном отсутствии роста бактерий. Бактерицидная нагрузка составляла 250000 микробных тел в 1 мл.
Полное подавление роста золотистого стафилококка, синегнойной палочки и протея наблюдают у средства в чистом виде (таблица №3).
Острую токсичность суммы веществ исследовали на белых крысах-самцах линии Вистар со средней массой 170 г.
Водный раствор субстанции вводили животным внутрибрюшинно в дозах 500, 1000, 1500, 30000 и 60000 мг/кг по одной дозе в группе из 8 особей. За весь срок наблюдения у них отмечалось изменение в поведении, потребление корма и воды, реакции на различные раздражители.
Мышечный тонус и координация движений сохранены в полном объеме. Состояние волосяного, кожного покрова слизистых находилось в пределах нормы. Частота и глубина дыхания не изменялась.
Из за отсутствия гибели животных при максимально высокой дозе введения исследуемой субстанции сумма веществ из водного отвара травы репейничка аптечного относится к категории токсичности VI - относительно безвредных веществ.
Таким образом, предлагаемый способ получения по сравнению с известным позволяет получить препарат с увеличенной диуретической активностью и расширенным спектром действия
Таблица №1
Влияние суммы веществ из репейничка аптечного на диурез у крыс.
Исследуемое вещество, группы крыс
Количество мочи за 1 час(в мл)
Количество мочи за 2 часа (в мл)
Количество мочи за 3 часа
Количество мочи за 4 часа (в мл)
Количество мочи за 5 час(в мл)
Общее количество мочи за 5 часов (в мл)
контроль
2,6±0,5
2,0±0,3
0,9±0,2
0,6±0,07
0,5±0,04
6,6±0,2
Сумма веществ репейничка аптечного (20 мг/кг)
4,8±0,3
4,1±0,2
1,9±0,1
1,3±0,2
0,8±0,05
12,9±0,17
Прототип (20 мг/кг)
2,9±0,1
3,0±0,03
0,8±0,05
0,75±0,04
0,6±0,1
8,05±0,2
Таблица №2
Влияние суммы веществ из травы репейничка аптечного и эмоксипина на процесс пероксидации in vitro
Исследуемые объекты
Показатель экстинкции М±м
% подавления пероксидации к контролю
Контроль
0,36±0,004
100%
Эмоксипин (3 мг/проба)
0,082±0,003
77,2%
Сумма веществ из репейничка аптечного (3 мг/проба)
0,070±0,002
80,8%
Р<0,05 во всех опытах к контролю
Таблица №3
Противомикробные свойства отвара из репейничка аптечного.
Соотношение сырья и экстрагента в отваре
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Proteus vulgaris
Отвар 1:5
С
С
С
Отвар 1:6
С
С
С
Отвар 1:7
С
С
С
Отвар 1:8
С
К
К
С - стерильно
К - колония