Способ получения стерильных проростков семян мачка желтого
METHOD FOR OBTAINING STERILE SEED SPROUTS OF YELLOW HORN POPPY

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей и органов растений, и может быть использовано для получения каллусной и суспензионной ткани, как источника растительного сырья для фармацевтической и косметической промышленности, в садоводстве для получения оздоровленного посадочного материала, повышения эффективности клонального микроразмножения, селекционной практике для выведения новых сортов растений.
Известен способ стерилизации семян мачка желтого, состоящий из следующих операций: выдерживание семян в 70%-ном этиловом спирте в течение 1 минуты, а затем встряхивание в 50%-ном коммерческом растворе гипохлорита и 2 каплями раствора Твина-20 в течение 20 мин с последующей промывкой семян стерильной дистиллированной водой [М.Е. Mohamed Plant germination and production of callus from the yellow hornpoppy (Glaucium flavum): the first stage of micropropagation / M.E. Mohamed, A.M. Arafa, S.S. Soliman, S.I. Eldahmy // Pharmazie 69. - 2014 - 715-720.].
Недостатком способа является использование высокой концентрации 50% гипохлорита, что вредно отражается на здоровье работающего персонала (гипохлорит по уровню опасности для здоровья относится к 3 уровню из 4).
Известен способ стерилизации семян мачка желтого. Способ включает следующие операции: предварительное замачивание семян в стерильной дистиллированной воде в течение одного часа. После чего семена выдерживают 15 минут в растворе «Белизны». Для удаления стерилизующего агента семена промывают три раза в стерильной дистиллированной воде [Гумерова, Е.А. Получение каллусных культур Glaucium flavum Crantz (Papaveraceae) / Е.А. Гумерова, А.В. Плотникова, К.Р. Шкильменская, Р.Г. Тухбатуллина, Н.И. Румянцева // Биотехнология и общество в XXI ВЕКЕ. - 2015. -. - №1. - С. 26-31.].
Недостатком данного способа является длительный процесс стерилизации, занимающий минимум 75 минут, что нецелесообразно для проведения лабораторных работ.
Известен способ стерилизации семян, представляющий собой погружение семян на 30-60 минут в 1-6% раствор хлорамина с последующим промыванием семян в 3-х порциях стерильной дистиллированной воды [Широков А.И. Основы биотехнологии растений: электронное учебно-методическое пособие / Широков А.И., Крюков Л.А. - Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2012. - 49 с.].
Недостатком данного способа является то, что пары хлорамина представляют опасность для человека, особенно при длительном контакте для органов дыхательной системы, работа требует применения защитных средств органов дыхания. Также предлагаемый способ занимает продолжительное количество времени.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа стерилизации семян мачка желтого, позволяющего применять безопасное для здоровья человека антибактериального средства, способного обеспечить надежность стерилизации, сохранения целостности экспланта и в дальнейшем гарантию отсутствия роста микрофлоры на питательной среде при высеве объекта, снижение трудоемкости операции.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение надежности стерилизации, снижение трудоемкости операции, сохранение целостности семян и здоровья персонала, так как не включает в себя использование агрессивных по отношению к оболочке семени и кожным покровам и дыхательной системе человека компонентов, простота выполнения операции стерилизации.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что при стерилизации семян мачка желтого перед вводом их в культуру in vitro используется раствор антибактериального мыла, особенность заключается в том, что в качестве стерилизующего агента используется антибактериальное мыло «Защитное» промышленного производства в количестве 3-4 капли на 30-40 мл стерильной дистиллированной воды, при перемешивании при оборотах 300 об/мин с помощью магнитной мешалки размером 3×10 мм в течение 10-15 минут для обеспечения полного соприкосновения стерилизующего агента с поверхностью семян, с последующим промыванием семян в 3-х порциях стерильной дистиллированной воды и опять ставятся с дистиллированной стерильной водой на магнитную мешалку в течение 5 минут.
Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:
Фиг. 1 - семена мачка желтого после стерилизации предлагаемым способом и высадки на агаризованную питательную среду.
Фиг. 2 - проросшие семена мачка желтого, которые были простерилизованы предлагаемым способом.
Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является обеспечение качества стерилизации семян и целостность экспланта, что подтверждается отсутствием посторонней микрофлоры и прорастанием семян (фиг. 2). Большим преимуществом данного метода является использование антибактериального мыла промышленного производства в удобной упаковке с дозатором, что обеспечивает одинаковые условия при стерилизации. Также безопасность стерилизующего реагента для здоровья работающего персонала и биологического объекта. Данный метод обеспечивает экономию во времени-всего 15-20 минут.
Осуществление изобретения.
Для осуществления процесса стерилизации экспланта применяли раствор антибактериального мыла в стерильной дистилированной воде в соотношениях 3:30, 4:30, 3:40 и 4:40 мл. Для приготовления раствора использовали лабораторный химический стакан объемом 100 мл, куда отмеривали 30-40 мл стерильной дистиллированной воды и откапываем дозатором стандартной упаковки 3-4 капли стерилизующего агента.
В качестве стерилизующего агента было применено антибактериальное мыло «Защитное», рекомендованное населению для мытья рук, обладающее антибактериальным эффектом. Изготовитель - ООО «Русская косметика». Антибактериальное мыло имеет следующий состав: Вода, лаурилсульфат натрия, хлорид натрия, кокамидопропилбетаин, глицерет-2 кокоат, триклозан, масло чайного дерева, декспантенол, глицерин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, лимонная кислота, метилхлоризотиазолинон, парфюм, гексилкоричный альдегид, краситель "Бриллиантовый синий" (Е113, CI42090).
Далее 20 штук семян помещаем в химический стакан и заливаем стерильную дистиллированную воду рассчитанного объема, добавляем рассчитанное количество капель антибактериального жидкого мыла в соотношениях 3:30, 4:30, 3:40 и 4:40 мл и затем помещаем в стаканчик два магнитных мешальника (перемешивающий элемент) размером 3×10, стаканчик устанавливаем на платформу магнитной мешалки и производим регулировку оборотов 300 об/мин и проводим перемешивание в течении 10-15 минут.
Такое соотношение объема воды и количества капель антибактериального мыла установлено эмпирическим путем.
При выполнении операции использовали мешалку марки IKA topolino при допустимой температуре окружающей среды - 5-40°. Корпус мешалки изготовлен из полипропилена. Потребляемая мощность привода - 1 W, производимая мощность привода - 0,8 W. Мешалка проста и безопасна при использовании.
Такая комбинация стерилизующего агента и магнитной мешалки способствует контакту стерилизующего агента с поверхностью оболочки семян.
На следующем этапе этот раствор выливается на стерильное металлическое сито и производится промывание семян стерильной дистиллированной водой 3 раза. Затем семена вновь переносятся в стерильный химический стакан, отмеривается стерильная дистиллированная вода 30-40 мл и помещаем два магнитных мешальника размером 3×10, стаканчик устанавливаем на платформу магнитной мешалки с оборотом 300 об/мин для перемешивания в течение 5 минут. По истечению времени воду сливаем и семена готовы для высева на питательную среду (Фиг. 1).