КОНСОРЦИУМ БИФИДОБАКТЕРИЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ ОТ 3-Х ДО 14 ЛЕТ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МИКРОФЛОРЫ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ДЕТЕЙ ОТ 3-Х ДО 14 ЛЕТ И БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИСБИОТИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ДЕТЕЙ В ВОЗРАСТЕ ОТ 3-Х ДО 14 ЛЕТ
BIFIDOBACTERIAL CONSORTIUM FOR PREPARING BACTERIAL PREPARATIONS AND DIETARY SUPPLEMENTS FOR CORRECTING GASTROINTESTINAL MICROFLORA IN CHILDREN AGED FROM THREE TO FOURTEEN, AND METHOD FOR PREPARING IT, DIETARY SUPPLEMENT FOR CORRECTING GASTROINTESTINAL MICROFLORA IN CHILDREN AGED FROM THREE TO FOURTEEN AND BACTERIAL PREPARATION FOR TREATING DYSBIOTIC GASTROINTESTINAL CONDITIONS IN CHILDREN AGED FROM THREE TO FOURTEEN

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, предназначенных для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и поддержания ее колонизационной резистентности у детей в возрасте от 3-х до 14 лет. Средства для профилактики и лечения конструируются преимущественно на основе двух групп микроорганизмов - бифидобактерий и лактобацилл. Бифидобактерий являются наиболее значимыми представителями микрофлоры человеческого организма - как по удельному весу в составе микробиоценоза, так и по их многофункциональной роли в поддержании гомеостаза организма. У детей на грудном вскармливании они составляют практически 100% микрофлоры толстой кишки. Бифидобактерий оказывают положительное воздействие на становление систем пищеварения, иммунитета, кроветворения ребенка [1, 2, 3]. Бифидобактерий обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают иммуномодулирующим действием; синтезируют аминокислоты, витамины, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ; способствуют усвоению железа, кальция, поддержанию водно-солевого баланса [4, 5]. Частичная или полная элиминация бифидобактерий приводит к угнетению иммунных сил организма, развитию дисбиоза.
Многофакторное позитивное воздействие на организм ребенка позволяет рассматривать бифидобактерий как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих регулирующим и стимулирующим воздействием на организм.
В России традиционным подходом к бактериотерапии является назначение больным препаратов на основе культур штаммов бифидобактерий с доказанным пробиотическим действием преимущественно в виде монокультур штаммов Bifidobacterium bifidum 1, В. bifidum 791, B.bifidum ЛВА-3, B.longum В379М, B.adolescentis MC-42. Это, прежде всего, широко применяющийся лечебный препарат "Бифидумбактерин" [6].
При этом следует отметить, что в микробиоценозе кишечника человека бифидобактерий представлены одновременно многими видами - как отдельными, так и в ассоциациях [7]. Это позволяет предположить, что введение в состав пробиотических препаратов сразу нескольких видов бифидобактерий будет способствовать повышению их лечебной и профилактической эффективности.
Подобный подход предлагается в Российском патенте [8], касающемся консорциума на основе штаммов бифидобактерий для коррекции микрофлоры ЖКТ у детей в возрасте от 3-х до 12 лет, биопрепарат на его основе и БАД к пище.
Вместе с тем, указанный консорциум не учитывает, что рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен основываться на таком явлении, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [9, 10]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [11, 12].
Таким образом, препараты должны представлять собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу желудочно-кишечного тракта человека в определенный возрастной период. Это является обоснованным подходом, обеспечивающим индивидуализацию бактериотерапии и повышение ее эффективности, способствуя устойчивой локализации или новому заселению биотопа теми видами бифидобактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека.
В настоящее время для изучения таксономии представителей микробиоты, в том числе бифидобактерий и лактобацилл, разработаны и широко применяются различные молекулярно-генетические методы, включая секвенирование, мультилокусное генотипирование и другие, что существенно пополнило наши представления о видовом многообразии этих бактерий, позволило реклассифицировать известные и выявить новые виды [13, 14]. Это тесным образом связано с разработкой новых пробиотических препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, широким набором свойств, определяющих метаболическую и антагонистическую активность.
Так, изучение вышеперечисленных штаммов молекулярно-генетическими методами показало несоответствие в видовой принадлежности некоторых штаммов, идентифицированных ранее с помощью биохимических тестов. Так, штамм B.bifidum 1, широко используемый в производстве пробиотиков, оказался природным рекомбинантом, состоящим из двух клонов: B.bifidum и В.breve. Данная информация говорит о необходимости новых подходов к конструированию мультипробиотических препаратов.
Изучение видового состава бифидофлоры детей старше 3 лет на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal) показало, что вид B.infantis отсутствует в микробиоценозе ЖКТ детей. Вид В. breve присутствует в микробиоценозе данной возрастной группы, но при этом данные разных авторов варьируют от 17% до 70% [15, 16]. Виды B.bifidum и В. longum являются преобладающими в микробиоценозе ребенка [17]. Есть наблюдения о высокой частоте выделения видов B.catenulatum и B.pseudocatenulatum - от 72% [18] до 90%. Вместе с тем, по мнению ряда авторов, эти виды ассоциируются с атопической экземой у детей [19, 20]. Reiter [20] причисляет их к подвидам B.adolescentis, который нехарактерен для микробиоценоза детей. Такие виды нефизиологичны для детей и не могут быть использованы в составе средств коррекции микрофлоры данной возрастной группы.
Представленные данные убедительно показывают, что для эффективной коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза детей данной возрастной группы в состав препарата должны входить штаммы с доказанным пробиотическим эффектом и в видовом отношении комплементарных бифидофлоре детей. Важное значение имеет включение в состав средства коррекции микрофлоры штаммов, выделенных от здоровых детей в настоящий период времени, т.к. большинство производственных штаммов имеют происхождение 50-ти и более лет.
Это относится к всесторонне изученным и запатентованным штаммам бифидобактерий, выделенным от здоровых детей: штамм В. breve OV-12 [21], штамм В. bifidum OV-19 [22], штамм В. longum OV-20 [23]. Штамм В. breve OV-12 отличается более высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чем штаммы В. breve 79-88 и В. breve 79-119. Патент РФ №2373274 на штамм В. breve OV-12 отмечен дипломом, как вошедший в 100 лучших изобретений 2011 года под №39-Штамм В. longum OV-20 отличается широким спектром антибиотикорезистентности. Штамм В. bifidum OV-19 обладает устойчивым генотипом, в отличие от штамма В. bifidumi, который является природным рекомбинантом.
Задачей настоящего изобретения является создание консорциума бифидобактерий по составу максимально приближенного к микробиоценозу детей в возрасте от 3-х до 14 лет, а также разработкой способа его получения, учитывающего биосовместимость штаммов в процессе культивирования и при дальнейшем хранении. Техническим результатом настоящего изобретения является тот факт, что заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Синергидный эффект совместного использования штаммов в консорциуме проявляется в повышении всех перечисленных свойств по сравнению с отдельными штаммами.
Предлагаемый консорциум имеет следующий видовой состав.
Консорциум бифидобактерий для препаратов и БАД, предназначенных для для детей от 3-х до 14 лет:
1. Bifidobacterium bifidum OV-19 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского
№216, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка RU 2375444.
Bifidobacterium B.bifidum 791 - ВНИИгенетика в ЦМПМ №В-3300, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №80, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка.
2. Bifidobacterium longum B379M - ВНИИгенетика в ЦМПМ №..., ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №79, выделен из содержимого кишечника здорового человека.
3. B.longum OV-20 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №214, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. КП 2375445.
4. Bifidobacterium breve OV-12 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №217, выделен из кишечника здорового ребенка. RU 2373274.
Задачей настоящего изобретения является также разработка определенной схемы совместного культивирования отдельных культур для получения консорциума.
Техническим результатом предлагаемой схемы культивирования отдельных штаммов для получения консорциума является отсутствие взаимного ингибирования штаммов и расширение спектра ферментативной и антагонистической активности.
Способ получения консорциума основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них.
Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование входящих в него штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.
Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.
Посев каждой из культур в ферментер, по 2% к объему среды культивирования, проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. Очередность засева зависит от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов и в данном консорциуме является следующей:
1) В. bifidum OV-19 - 2%,
2) В. bifidum 791 - 2%,
3) В. longum OV-20 - 2%,
4) В. longum B379M - 2%,
5) В. breve OV-12-2%.
Процесс длится 10-12 часов; рН конечного продукта составляет 5,1-5,5.
Культурально-морфологические признаки консорциума.
Клетки представляют Грам+ полиморфные палочки, расположенные преимущественно в виде скоплений; в стационарной фазе роста часто отмечаются клетки с раздвоениями на концах или булавовидными утолщениями. При выращивании в ферментере в экспоненциальной фазе роста при микроскопии культура имеет вид ровных палочек, расположенных цепочками или скоплениями.
В полужидких питательных средах биомасса консорциума бифидобактерий растет по всему объему питательной среды, кроме зоны аэробиоза. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре.
Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.
Облигатные анаэробы. Оптимальная температура выращивания составляет 37,5-38°С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают, газообразование отсутствует. Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-5,1.
Сравнительные данные культивирования отдельных культур и их консорциума показывают, что при совместном культивировании при предложенной схеме внесения посевного материала не происходит взаимного ингибирования культур (таблица 1).
Таблица 1
Сравнительные данные культивирования монокультур и консорциума бифибактерий и лактобацилл
Наименование культуры
совместное культивирование
раздельное культивирование
Число КОЕ/ мл
°T
Число КОЕ/ мл
°T
В. bifidum OV-19
1,8±0,2×10<sup>9</sup>
-
1,9±0,2×10<sup>9</sup>
100°
В. bifidum 791
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
-
1,8±0,1×10<sup>9</sup>
100°
B.longum B379
1,4±0,2×10<sup>9</sup>
-
1,6±0,3×10<sup>9</sup>
120°
B.longum OV-20
1,5±0,3×10<sup>9</sup>
-
1,8±0,4×10<sup>9</sup>
120°
В. breve OV-12
1,6±0,4×10<sup>9</sup>
-
2,0±0,16×10<sup>9</sup>
110°
Консорциум
7,8±0,6×10<sup>9</sup>
160°
-
-
Консорциум культивируют при 37°С при периодическом перемешивании в течение 8-10 часов; рН культуральной жидкости после окончания процесса составляет 3,9-4,3.
Консорциум возможно культивировать на различных питательных средах со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот (таблица 2).
Таблица 2
Результаты культивирования консорциумов на разных питательных средах
Среда выращивания
Консорциум бифидобактерий и лактобацилл
Число КОЕ/мл
°T
Блаурокка
7,4±0,2×10<sup>9</sup>
180°
Гидролизатно-молочная
6,5±0,6×10<sup>9</sup>
160°
Среда для культивирования согласно изобретению
7,1±0,3×10<sup>9</sup>
180°
Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, не происходит взаимного ингибирования культур. При этом отмечается тенденция к синергидному эффекту.
Наиболее перспективной в производстве препаратов и БАД для детей является гидролизатно-молочная среда. В настоящее время среди детей широко распространена непереносимость коровьего молока. Данная среда гипоаллергенна, так как ее основой является гидролизат молока, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот, которые легко усваиваются детским организмом. Среда, изготовленная на основе гидролизата молока, имеет следующий состав (в расчете на 100 л):
Таблица 3
Состав гидролизатно-молочной среды
Гидролизат молока
50 л
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Среда проста в приготовлении, экономически выгодна; вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 2, по ростовым свойствам уступает остальным средам.
Для устранения данного недостатка в нее были дополнительно включены добавки, стимулирующие рост пробиотических микроорганизмов - пребиотики инулин и олигофруктоза и дрожжевой аутолизат, содержащий витамины группы В, необходимые для их развития и аскорбиновая кислота, как антиоксидант. Состав усовершенствованной таким образом среды представлен в таблице 4.
Таблица 4
Состав заявляемой среды (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
При изучении ростовых свойств заявляемой среды было показано, что они превосходят ростовые свойства гидролизатно-молочной среды, т.е. желаемый результат был достигнут. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Сравнительные результаты культивирования консорциумов на гидролизатно-молочной и заявляемой средах
Среда выращивания
Консорциум бифидобактерий
Число КОЕ/мл
°Т
Гидролизатно-молочная
7,2±0,6×10<sup>9</sup>
140°
Заявляемая среда
8,2±0,3×10<sup>9</sup>
180°
Таким образом, заявляемая среда является перспективной в производстве препаратов и БАД для детей данной возрастной группы.
Синергидный эффект, который был отмечен при культивировании консорциума, проявляется также при определении спектра биохимической активности.
В качестве иллюстрации в таблице 6 представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании - увеличивается число усвоенных субстратов.
Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с монокультурами, что повышает пробиотическую значимость препарата. Данный эффект можно наблюдать по зонам задержки роста тест-культур (табл.7).
Таблица 7
Зоны задержки роста тест-культур (в мм) в присутствии консорциума и отдельных штаммов бифидобактерий
Объект исследования
Sh. sonnel 5063
Sh. flexneri l70
E..coli 157
Staph. aureus 209
Proteus vulgaris 177
В. bifidum OV-19
19±2
16±1
17±3
14±2
18±2
В. bifidum 791
17±3
15±2
15±3
15±1
17±2
В. longum В379М
24±2
20±2
23±2
18±3
26±3
В. longum OV-20
25±2
23±1
25±2
24±3
25±2
B.breve OV-12
29±2
25±2
27±3
25±3
31±1
Консорциум бифидобакт
31±1
27±3
29±1
28±2
32±1
Как показывают данные, представленные в таблице 7, по антагонистической активности в отношении тест-штаммов патогенных микроорганизмов консорциум превосходит отдельные штаммы, входящие в его состав.
Таким образом, полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий, но и синергидном эффекте консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.
В предлагаемом консорциуме помимо определенного видового состава бифидобактерий, отмечается определенное количественное соотношение микробных культур после культивирования. Количественный учет долевого участия отдельных штаммов производится путем подсчета числа колоний, выросших в полужидкой среде. Культура каждого штамма имеет колонии определенной морфологии и размера, что позволяет их различать. Соотношение отдельных видов бифидобактерий в консорциуме представлено в таблице 8.
Таблица 8
Соотношение отдельных видов бифидобактрий в консорциуме
№ п/п
Штамм микроорганизма
Число КОЕ/г
Массовая доля микроорганизмов, %
1.
В. bifidum OV-19
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
18,0-20,0
2.
В. bifidum 791
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
20,0-18,0
3.
В. longum B379M
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
14,5-12,0
4.
В. longum OV-20
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
23,5-23,0
5.
В. breve OV-12
10<sup>9</sup>-10<sup>10</sup>
24,0-27,0
При составлении рецептуры препаратов для коррекции микрофлоры необходимо учитывался тот факт, что наиболее целесообразным является сочетанное использование консорциума пробиотических микроорганизмов совместно с пребиотиками инулином и олигофруктозой и яблочным пектином, стимулирующими рост как индигенной, так и микрофлоры, входящей в состав препарата. Кроме того, пребиотики, инкапсулируя микробные клетки, защищают их при прохождении желудочно-кишечного тракта от агрессивного действия окружающей среды. Техническим результатом данного изобретения является использование консорциума в качестве активного вещества в сочетании с пребиотиками - яблочным пектином, инулином и олигофруктозой. Присутствие питательных субстратов способствует эффективной колонизации биотопа. Сахаролитические микроорганизмы, увеличивая при этом продукцию органических кислот, способствуют лучшему усвоению кальция, железа, магния. Помимо этого, инулин ускоряется очищение организма от шлаков и непереваренной пищи вследствие стимулирования сократительной способности кишечной стенки, отмечается хороший слабительный эффект, он оказывает антитоксическое и защитное действие. Инулин обладает «обволакивающим действием», защищая слизистые оболочки желудка и частично кишечника от механического раздражения пищей. Использование диеты с добавлением инулина ингибирует развитие опухолей и уменьшает в кишечнике количество аммиака, повышенная концентрация которого способствует росту опухолей. Инулин улучшает углеводный и липидный метаболизм и нормализует уровень сахара в крови у больных сахарным диабетом. Олигофруктоза обладает выраженным желчегонным действием, которое усиливается в связи с облегчением оттока желчи из печени и желчного пузыря в двенадцатиперстную кишку, обусловленным улучшением опорожнения кишечника.
Помимо описанных эффектов, данные ингредиенты обладают высокой сорбционной емкостью. Пектин способен, образовывая комплексы, выводить из организма человека тяжелые металлы (свинец, ртуть, цинк, кобальт, молибден и пр.) и долгоживущие (с периодом полураспада в несколько десятков лет) изотопы цезия, стронция, иттрия и т.д. Кроме того, пектин может сорбировать и выводить из организма биогенные токсины, анаболики, ксенобиотики, продукты метаболизма и биологически вредные вещества, способные накапливаться в организме: холестерин, желчные кислоты, мочевину, продукты тучных клеток. Особо следует отметить многогранное действие пектинов при дисбактериозе. Они абсолютно естественно очищают кишечник, мягко обволакивают слизистую, защищают ее и способствуют ее быстрому восстановлению. Кроме того, пектины сдвигают рН толстого кишечника в более кислую сторону. Болезнетворные бактерии в такой среде погибают, а полезная микрофлора начинает, наоборот, активно размножаться. Эксперименты, сравнивающие сорбционную эффективности энтеросорбентов разных классов, проведенные с солями свинца и меди, показали, что самыми эффективными признаны низкоэтерифицированные пектины. Именно эти уникальные природные вещества признаны наиболее эффективными для очищения организма от вредных веществ, паразитов и продуктов их жизнедеятельности.
Еще одним вариантом рационального подхода к коррекции дисбиотических состояний является сочетанное применение микронутриентов и пробиотических микроорганизмов. При введении в организм человека такого комплекса происходит восполнение нарушенной индигенной микрофлоры. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов. Это, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболитного баланса в организме.
Примеры
4. Консорциум бифидобактерий для бактерийных препаратов и БАД, предназначенных для детей от 3-х до 14 лет, и способ его получения
7-8
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В. longum OV-20, В. breve OV-12 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 36 ч.
6-8
2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду заявляемого состава (30 мл) и культивируют 7 ч при 3 7,0-3 8°С.
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявляемую среду и выращивают в течение 16 ч при 37,0-38°С. Выращивание консорциума.
Консорциум бифидобактерий получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов на питательной среде, содержащей следующие ингредиенты (в расчете на 100 литров):
Гидролизат молока -
50 л
Аутолизат дрожжей -
500 г
Цистеин солянокислый -
20 г
Лактоза -
1000 г
Пептон ферментативный -
200 г
Агар-агар
100 г
микробиологический -
Хлористый натрий -
400 г
Аскорбиновая кислота -
250 г
Инулин -
500 г
Олигофруктоза -
500 г
Вода водопроводная очищенная -
до 100 л
Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.
Посев культур в ферментер по 2% каждой к объему засеваемой среды проводят последовательно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8: 1) В. bifidum OV-19 - 2%, 2) В. bifidum 7P7-2%,3) B. longum OV-20 -2%, 4) В. longum В379М - 2%, 5) В. breve OV-12 - 2%.
Процесс культивирования ведут при 37-38°С до достижения рН конечного продукта 5,1.
2. Биологически активная добавка к пище для нормализации микрофлоры детей в от 3-х до 14 лет и способ ее производства
7-8
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В. longum OV-20, В. breve OV-12 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.
6-8
2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 6-8 часов при 3 7,0-38°С. (маточные культуры).
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37,0-38°С.
Выращивание консорциума.
Консорциум бифидобактерий получают путем совместного культивирова-ния вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.
Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Процесс культивирования ведут 10 ч при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий и лиофильно высушивают.
Техническим результатом, достигаемым при получении биологически активной добавки к пище с использованием заявляемого консорциума, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры и функционального состояния ЖКТ детей в возрасте от 3-х до 14 лет. После помола биомасса бифидобактерий смешивается с яблочным пектином, инулином и олигофруктозой. Смесь фасуется в капсулы по 0, 25 г и укладывается по 20-60 штук в стерильные пластиковые баночки с герметично закрывающимися крышками, упаковывается в пенал, в который вкладывается инструкция по применению.
Рецептура препарата представлена в таблице 9 (а, б).
Таблица 9 (а, б)
Расход сырья на одну упаковку (30 капсул)
№ п/п
Наименование сырья (материала)
Масса, г (кол-во, шт.)
1.
2,4
2.
1,7
3.
1,6
4.
1,8
Одноразовая доза - капсула 0,25 г
Наименование сырья
Масса в г
Биомасса бифидобактерий
0,05
Пектин яблочный
0,1
Инулин и
0,05
Олигофруктоза
0,05
Итого:
0,25
* Содержание КОЕ/г бифидобактерий не менее 10<sup>8</sup>
Процентное соотношение компонентов:
Биомасса бифидобактерий
- 20%
Пектин яблочный
- 40%
Инулин
- 20%
Олигофруктоза
- 20%
3. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических нарушений ЖКТ у детей от 3-х до 14 лет и способ его производства
7-8
1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В. bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В. longum OV-20, В. breve OV-12 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.
6-8
2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 6 ч при 37,0-38°С (маточные культуры).
3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 3 7,0-38°С.
Выращивание консорциума.
Консорциум бифидобактерий получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):
Гидролизат молока
50 л
Аутолизат дрожжей
500 г
Цистеин солянокислый
20 г
Лактоза
1000 г
Пептон ферментативный
200 г
Агар-агар микробиологический
100 г
Хлористый натрий
400 г
Аскорбиновая кислота
250 г
Инулин
500 г
Олигофруктоза
500 г
Вода водопроводная очищенная
до 100 л
Процесс культивирования ведут 10 ч при при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий, разливают в асептических условиях по 5 мл в стеклянные пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.
Техническим результатом, достигаемым при получении бактерийного препарата с использованием заявляемого консорциума бифидобактерий, является более эффективная и быстрая коррекция нарушений ЖКТ детей в возрасте от 3-х до 14 лет.
8
*Содержание КОЕ/г бифидобактерий в готовом препарате не менее 10.
Список цитируемой литературы
1. L.Mitsuoka Т. Intestinal Flora and Host. // Asian. Med. J. - 1989 - V.31. - N7. - P.400-409.
2. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции. // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретической и практической медицине». - М. - 1987. - С.62.
3. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта - важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина. // Клиническое питание. - 2005. - №2. - С.2-5.
4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф.дис…д-рабиол..наук. - M. - 1982. - 48 С.
5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома // Москва: Дели принт. - 2008. - С.317.
6. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни. // Автореф.дисс…канд.биол.наук. - Москва. 1970. - С.15.
7. Mitsuoka Т., Hayakawa К., Kimura N.. The fecal Нога of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. - A 1974. - V.226 / - P.469-478.
8. Патент РФ №2180348.
9. Сукачев В.Н., Дылиса Н.В. Лесной биогеоценоз // М.: Наука. - 1964. - С.574.
10. Рыбальченко О.В., В.М.Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. // С-Петербург. - 2008. - С.109.
11. Бифидобактерий и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. // Сб. научных трудов. - М. - 1986. - С.208.
12. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово. // Журн. Микробиол. - 2001. - №3. - С.72-75.
13. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М. - 2006. - №5. - С.9-12.
14. Namba К., Hatano М. at all. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent. - Prior Publication data 14.12.2006. - 22 P.
15. Matsuki Т. et al. Use of 16S rRNA-genr-targeted group-specific primers for reai-time PCR analysis of predominant bacteria in human feses. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - 70 (12). - 7220-7228.
16. Жиленкова О.Г.Селекция производственно перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей // Автореф. дисс...канд.биол.наук, Москва, 2011, СЛ 6.
17. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С.и др. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста. // Вестник Российской АМН. - 2006. - №1. - С.45-50.
18. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis. Folia Microbiol (Praha) 2008. - 53(3). - P.255-258
19. Ezendam J., de Klerk A., Gremmer E.R., van Loveren H. Effects of Bifidobacterium animalis administered during lactaion on allergic and autoimmune responses in rodents. // Clinical and Experimental Immunology, - 2008. - V.154. - P.424 - 155.
20. Reuter G The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology 2001. - V.2(2). - P.43-53.
21. Патент РФ №2373274 от 20.11.2009 Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128539 от 15.07.2008.
22. Патент РФ №2375444 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128540 от 15.07.2008.
23. Патент РФ №2375445 от 10.12.2009 Штамм Bifidobacterium longum OV-20, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка №2008128542 от 15.07.2008.