Динамика сывороточного уровня ростовых факторов при терапии инфаркта миокарда стволовыми мезенхимальными клетками в эксперименте

Динамика сывороточного уровня ростовых факторов при терапии инфаркта миокарда стволовыми мезенхимальными клетками в эксперименте

А.С. Головкин 1, Е.А. Великанова 1, В.Г. Матвеева 1, Е.А. Савельева 1,

А.В. Еремеев 23‘4, Ю.И. Шеина 23, А.В. Светлаков 23

1 НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово

2 Красноярский центр репродуктивной медицины, Красноярск

3 Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

4 Институт биофизики СО РАН, Красноярск

Dynamics of a growth factors serum level in therapy of myocardial infarction with mesenchymal stem cells in an experiment

A.S. Golovkin 1, E.A. Velikanova 1, V.G. Matveeva 1, E.A. Savel’eva 1, A.V. Eremeeva34,

Yu.I. Sheina2’3 4, A.V. Svetlakov23

1 Kemerovo Cardiology Center, Siberian branch of the RAMS

2 Krasnoyarsk Center for Reproductive Medicine

3 Krasnoyarsk State Medical Institute

4 Institute of Biophysics, Siberian branch of the RAS, Krasnoyarsk

Проведена оценка содержания TGF-fi, VEGF-C и GM-CSF в сыворотке крови крыс после интрамиокардиальной инъекции мезенхимальных стволовых клеток в условиях экспериментального инфаркта миокарда. Инфаркт моделировали криоповреждением передней стенки левого желудочка. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга крыс, вводили в периинфарктную зону через 21 сут. после криодеструкции. Содержание TGF-fi, VEGF-C и GM-CSF измеряли на 3-и, 7-е, 14-е сут. Также оценивали синтетическую активность трансплантируемых клеток в отношении указанных ростовых факторов in vitro. Показано, что введение мезенхимальных клеток приводит к повышению TGF-в в периферической крови. При этом максимальная концентрация TGF-в отмечалась на 7-е сут. после трансплантации. Несмотря на интенсивный синтез мезенхимальными клетками VEGF-C и GM-CSF in vitro, при введении в организм они не оказывают заметного влияния на уровень изучаемых ростовых факторов в периферической крови.

Ключевые слова: инфаркт миокарда, крыса, мезенхимальные стволовые клетки, ростовые факторы.

The aim of the work was to assess TGF ß, VEGF-C and GM-CSF concentrations in the serum of rats after postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells. Myocardial infarction was simulated by the criodestruction of the left ventricular anterior wall. Mesenchymal stem cells were derived from rat bone marrow and injected into myocardium 21 days after the crioinjury. The levels of TGF ß, VEGF-C and GM-CSF were measured at 3, 7 and 14 days. The synthetic activity of the transplanted cells to these growth factors in vitro was also measured. It was shown that the administration of mesenchymal cells leads to an increased level of TGF ß in the peripheral blood. The maximum TGF ß concentration was observed on Day 7 after transplantation. Despite the intensive synthesis of VEGF-C and GM-CSF by mesenchymal cells in vitro, they do not demonstrate a significant effect on the level of the studied growth factors in the peripheral blood.

Key words: myocardial infarction, rat, mesenchymal stem cells, growth factors.

В настоящее время, оценивая механизмы терапевтического действия стволовых клеток, большое внимание уделяется их цитокинпродуцирующей активности. При этом особое значение приобретает оценка активности клеток in vivo [1, 2].

Причиной развития инфаркта миокарда является локальная ишемия. Все патогенетические изменения, происходящие в миокарде, связаны с ишемией и последующей реперфузией. Регенераторный потенциал напрямую связан с новообразованием сосудов, улучшением микроциркуляции [3]. Теоретической предпосылкой к введению мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в перирубцовую зону перенесенного инфаркта миокарда является необходимость в стимуляции неоангиогенеза в ишемизированном участке. При этом одним из основных механизмов запуска предполагается продукция вводимых стволовыми клетками ростовых факторов [4].

e-mail: goloas@cardio.kem.ru

В таком случае наибольший интерес представляет определение уровня трансформирующего фактора роста-ß (transforming growth factor-ß, TGF-ß) и сосудисто-эндотелиального ростового фактора (vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C) как наиболее мощных стимуляторов неоангиогенеза и регенеративных процессов [5], а также гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) как основного стимулятора продукции и функционирования гранулоцитов, эозинофилов, моноцитов [6]. Местное введение обеспечивает адресное действие в перирубцовой инфарктной зоне, а также возможность получения максимального эффекта при минимальном количестве вводимого клеточного материала. Высокие концентрации активных молекул в системном кровотоке косвенно могут подтвердить повышенную активность и в месте введения.

В этой связи, целью настоящей работы являлась оценка содержания TGF-ß, VEGF-C и GM-CSF в сыворотке крови крыс после интрамиокардиальной инъекции МСК в модельных условиях инфаркта миокарда.

Материал и методы

Эксперимент проводился на 35 самцах лабораторных крыс линии Wistar массой 300—380 г. Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа. Эксперимент выполнялся в соответствии с правилами гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства Здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755).

МСК выделяли из костного мозга бедренных и большеберцовых костей животных, культивировали во флаконах в питательной среде DMEM (Gibco, США), содержащей 1 мМ/мл HEPES буфера, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,1 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мкг/мл амфотерицина В (Sigma Aldrich, США) при 37°С и 5% СО2 в течении 14 сут. Культивирование проводили в 5 мл культуральной среды во флаконах 25 см3 до накопления клеточного материала в количестве 5х105 клеток. Адгези-рованную фракцию клеток снимали 0,5% раствором трипсина-ЭДТА (Sigma Aldrich, США) и ресуспенди-ровали в 0,9% растворе NaCl.

Фенотипирование проводилось на проточном лазерном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) антителами против клеток крыс CD90 FITC, CD45 PE (Becton Dickinson, США). Изотипический контроль по FITC и PE IgG1/IgG2.

Микроскопический анализ проводился с использованием инвертированного микроскопа «Axio Observer.Z1» (Carl Zeiss, Германия) методом фазового контраста.

Инфаркт миокарда моделировали под эфирным наркозом путем локальной криодеструкции в области левого желудочка сердца. Торакотомия грудной клетки слева выполнялась с пересечением двух ребер и выведением сердца в торакотомную рану. Повреждение наносилось в течении 10 с металлическим стержнем диаметром 5 мм, охлажденным в жидком азоте до температуры -190°С. Рана ушивалась послойно. Через 21 сут. в аналогичных условиях выполнялось повторное оперативное вмешательство с целью местного интрамиокардиального введения суспензии МСК. Введение клеток выполнялось в перирубцовую зону посредством 4 инъекций в количестве 1 х105—1,5х105. Животным контрольной группы вводился 0,9% раствор NaCl того же объема. Животные выводились из эксперимента на 3-и, 7-е, 14-е сут.

Методом твердофазного иммуноферментного анализа проводилось измерение уровня TGF-ß, GM-CSF и VEGF-C в сыворотке периферической крови наборами фирмы Bender MedSystems (США).

С целью определения базального уровня ростовых факторов в периферической крови проведено определение уровня TGF-ß, GM-CSF и VEGF-C у 5 животных, не подвергавшихся никаким манипуляциям.

Аутокринную синтетическую активность определяли по концентрации ростовых факторов (TGF-ß,

СМ-СБР и УЕСР-С) в надосадочной жидкости культур трансплантируемых клеток (после 14 сут. культивирования).

Полученные результаты обрабатывали при помощи пакета прикладных программ ЗЬай1БЬ1са 6.0. Вычисляли медиану (Ме) с указанием квартильного отклонения — 25—75% (Ме±Q). Достоверность различий между показателями выборок оценивали по непараметрическому критерию Манна — Уитни. Критический уровень значимости критериев принимался равным 0,05.

Результаты

Через 21 сут. после криодеструкции морфологическая структура миокарда имела характеристики инфаркта. При этом макроскопически визуализировалось поражение всей толщи миокарда левого желудочка, т.е. можно говорить о трансмуральном характере поражения. Микроскопически определялись очаговые кровоизлияния, под эпикардом выявлялась лимфо-гистоцитарная инфильтрация. Отмечалось фрагментирование кардиомиоцитов, полнокровие капилляров (рис. 1). Признаков рубцевания не было.

Рис.1. Миокард через 21 день после криодеструкции. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. х50

Перед введением проводилась визуальная оценка культуры клеток (рис. 2). Фенотипирование выделенных клеток проводили по 0090, 0045 (рис. 3). В результате вводились мезенхимальные клетки разной степени зрелости, с преобладанием молодых форм следующей фенотипической характеристики: 0090+ — 77,0%; 0045+ — 64,4%; 0090 + 0045+ - 44,3%; 0090 + 0045- - 32,8%.

В надосадочной жидкости культуры МСК была отмечена продуцирующая активность в отношении ростовых факторов, главным образом УЕ0Р-0 и ТСР-р, концентрация которых составила (Ме±Q) 61,13±18,78 пг/мл и 1,36±0,5 нг/мл соответственно. Активность в части секреции 0М-0БР была значительно меньшей и составила (Ме±Q) 9,93±4,29 пг/мл.

Операции по трансплантации клеток животные переносили удовлетворительно, поведение не изменялось, аппетит сохранялся. Послеоперационный период протекал без осложнений.

Рис. 2. Культура мезенхимальных стволовых клеток, 12 сут. культивирования. Ув. х200

CD90/Cd45 Log 2.019

FL1-H

Рис. 3. Иммунопрофиль культуры мезенхимальных

стволовых клеток в части экспрессии CD90 и CD45.

Проточная цитометрия

Через 3 сут. после введения МСК отмечалось отсутствие статистически значимой разницы содержания сывороточного TGF-ß, по сравнению с неопери-рованными животными. В то же время отмечалось двукратное (p<0,05) повышение исследуемого показателя в сравнении со значениями у контрольной группы.

В динамике в экспериментальной группе на 7-е сут. содержание TGF-ß достигло максимального уровня (Ме±Q) — 62,35±33,02 нг/мл, превышая значения данного показателя у неоперированных животных. Кроме того, отмечалось увеличение в 7 раз (р < 0,01) по сравнению со значениями в контрольной группе. В сыворотке крови животных, получавших интрамиокардиальную инъекцию физиологического раствора, на 7-е сут. уровень TGF-ß был в 4 раза ниже (р < 0,05), чем в группе неопери-рованных животных, у которых содержание данного показателя составило (Ме±Q) 37,9±23,75 нг/мл.

К 14-м сут. содержание TGF-ß в сыворотке крови животных, которым интрамиокардиально вводились

МСК, снижалось по сравнению с предыдущим изучаемым периодом, но было повышенным относительно значений в контрольной группе. При этом, так же как и ранее, у животных контрольной группы отмечалось сниженные значения TGF-ß, по сравнению с неопери-рованными животными (рис. 4).

При исследовании содержания VEGF-C в сыворотке крови животных с моделированным инфарктом были получены следующие результаты: концентрация изучаемого ростового фактора была на 30% выше, чем в контрольной группе на 3-и сут. после введения МСК в перирубцовую зону. В этот период отмечается максимальная концентрация VEGF-C в опытной группе (Ме±Q) — 132,2±18,94 пг/мл. Отличий в значениях с группой неоперированных животных выявлено не было.

К 7-м сут. значения сывороточного VEGF-C в группах животных с введением МСК и инъекцией физиологического раствора наблюдалась тенденция к снижению, по сравнению с предыдущим периодом. Отмечалось статистически значимое различие (p<0,05) в уровне VEGF в контрольной группе и у неоперированных животных. К 14-м сут. происходило повышение уровня VEGF-C в обеих группах животных. Однако достоверного отличия в значениях ростового фактора в двух группах не наблюдалось. В течение всего изучаемого периода уровень VEGF-C как в контрольной, так и в опытной группе оставался ниже значений данного показателя у неоперированных животных (Ме±Q) — 146,22±65,26 пг/мл (рис. 5).

При изучении уровня GM-CSF за весь период наблюдения не было выявлено достоверных различий в значениях у животных опытной и контрольной групп. В то же время концентрации GM-CSF оказались сниженными в сравнении с таковыми у группы неоперированных животных, но без статистической значимости (рис. 6).

90

80

70

60

с 50

2

1 40

30

20

10

0

Рис. 4. Динамика изменения концентрации TGF-ß [Me±Q] в сыворотке крови животных разных групп

1

1 . 1 . É -1

3 7 4

сутки

Физиологический раствор Мезенхимальные клетки Интактные животные

180

160

140

120

3 7 4

сутки

|—1 Физиологический раствор |—I Мезенхимальные клетки --- Интактные животные

Рис. 5. Динамика изменения концентрации VEGF-C [Ме±й) в сыворотке крови животных разных групп

20

3 I 4

сутки

|—1 Физиологический раствор |—I Мезенхимальные клетки --- Интактные животные

Рис. 6. Динамика изменения концентрации GM-CSF

(Ме±0] в сыворотке крови животных разных групп

Обсуждение

Полученные результаты позволяют анализировать динамику уровня ростовых факторов в кровотоке в раннем периоде трансплантации МСК костного мозга.

Несмотря на высокую продуцирующую активность МСК in vitro в отношении VEGF-C, в системном кровотоке после интрамиокардиального введения не выявляется значимого повышения концентрации в исследуемый период. Это может свидетельствовать либо о высокой местной активности ростового фактора без демонстрации системного действия, либо

о недостаточной аутокринной активности вводимых МСК in vivo. Нельзя слепо экстраполировать полученные результаты in vitro на процессы, происходящие в живом организме.

Закономерность продуцирующей активности TGF-p носила обратный характер. Невысокие концентрации ростового фактора в надосадочной жидкости указывали на невысокую аутокринную деятельность МСК, однако после трансплантации клеток и на 3-и, и на 7-е сут. отмечается значительное повышение его концентрации в системном кровотоке. По-видимому, имеет место не столько аутокринная, сколько пара-кринная активность трансплантированных клеток. Межклеточные взаимодействия приводили к изменению цитокинового профиля (в частности уровня ростовых факторов).

В целом, можно говорить об изменении профиля продукции ростовых факторов после трансплантации МСК. Третьи сутки после введения — этап приживления, адаптации и начала функционирования трансплантированных клеток. В этот период сложно ожидать активного синтеза и выброса в кровоток цитокинов трансплантированными клетками. Важнее говорить не столько о гиперпродукции TGF-p и VEGF-C в опытной группе, сколько об угнетении синтеза факторов у животных, которым проводилась инъекция физиологического раствора. Очевидно, что перенесенные вмешательства (анестезиологические пособия, операционный стресс, торакотомия, инфаркт миокарда) оказывают угнетающее влияние на аутокринную активность и, как следствие, на регенераторный потенциал. При этом механическое повреждение сердца — инъекция физиологического раствора — не оказывает стимулирующего влияния на продукцию ростовых факторов в организме, не подвергавшемся воздействию клеточной терапии.

На седьмые сутки закономерно отмечается положительная динамика уровня TGF-p, в то время как в контрольной группе наоборот имеет место снижение активности, вызванное самим оперативным вмешательством и механическим повреждением миокарда. Наиболее значима разница в концентрациях TGF-p, высокие значения которого активируют регенерацию, пролиферацию, снижают апоптоз [7]. Очевидно, что к 7-м сут. проявляется максимальная аутокринная и паракринная активность трансплантированных клеток в отношении продукции TGF-p.

К 14-м сут. синтетическая активность нивелируется, уровень ростовых факторов оказывается сопоставимым с уровнем у неоперированных животных. Объяснить это можно дифференцировкой или элиминацией введенного клеточного материала. Если в опытной группе в отношении TGF-p можно говорить о снижении активности введенных клеток, то в контрольной группе можно констатировать значительное угнетение его продукции на протяжении всего периода исследования. Реабилитации синтетической функции к 14-м сут. так и не наступает, что должно в итоге приводить к замедлению процессов репарации.

Однако, выявленная синтетическая активность в течение первой недели после трансплантации может иметь значимость для клинического применения изучаемого метода.

Представленные данные не указывают однозначно на то, какими именно клетками осуществлялась продукция ростовых факторов. Однако подтверж-

денная цитокинпродуцирующая активность МСК in vitro указывает на вероятность существенного вклада в изменение профиля ростовых факторов в периферической крови именно собственной активности трансплантируемых клеток. Возможно, что после хоуминга начиналась аутокринная продукция трансплантированными клетками. С другой стороны, возможно, имеет место паракринная продукция, спровоцированная введением зрелых и незрелых форм мезенхимальных клеток [8]. В любом случае, в результате трансплантации происходит повышение уровня ростовых факторов в перифери-

ЛИТЕРАТУРА

1. Bobis S., Jarocha D., Majka M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochem. Cytobiol. 2006; 44: 215030.

2. Парфенова Е.В., Ткачук В.А.. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы. Кардиологический вестник 2007; 2(2): 5-15.

3. Шумакова В.И., Онищенко Н.А., редакторы. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. М.: Лавр; 2009.

4. Amado L.C., Saliaris A.P., Schuleri K.H. et al. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells

ческой крови, что должно стимулировать неоангио-генез и репаративные процессы.

Выводы

Введение МСК интрамиокардиально в перируб-цовую зону моделированного посредством криодеструкции инфаркта миокарда стимулирует повышение уровня TGF-p в периферической крови крыс. Максимальная активность с повышением уровня TGF-p в крови отмечается на 7-е сут. При этом заметного изменения уровня VEGF-C и GM-CSF в периферической крови не отмечено.

after myocardial infarction. PNAS 2005; 102(32): 11474-9.

5. Hausenloy D.J., Yellon D.M. Cardioprotective growth factors. Cardiovasc. Res. 2009; 83:179-94.

6. Куртова А.В., Зуева Е.Е., Немков А.С. Постинфарктная клеточная регенерационная терапия сердечной мышцы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; (2): 35-43.

7. Bujak M., Frangogiannis N.G. The role of TGF-p signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling. Cardiovasc. Res. 2007; (74): 184-95

8. Burchfield, J.S. Dimmeler S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosi. Fibrog. Tiss. Repair. 2008. 1(4): 1-11.

Поступила 19.10.2010