СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОТИПА АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR DETERMINING ANTI-DRUG ANTIBODY ISOTYPE

Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящая заявка претендует на приоритет по Предварительной заявке США №61/394,269, поданной 18 октября 2010 г., содержание которой включено путем ссылки во всей полноте на все случаи.
Уровень техники
Аутоиммунные заболевания являются существенной и широко распространенной медицинской проблемой. Например, аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит (RA), которым страдают более двух миллионов человек в США. RA вызывает хроническое воспаление суставов и обычно является прогрессирующим заболеванием, которое способно вызвать разрушение суставов и функциональную инвалидность. Причина ревматоидного артрита неизвестна, хотя в этиологию заболевания входят и генетическая предрасположенность, и возбудители инфекции, и факторы окружающей среды. При активном RA симптомы могут включать усталость, отсутствие аппетита, повышенную температуру, мышечные и суставные боли и ригидность. Также во время обострения болезни суставы часто краснеют, опухают, становятся болезненными из-за воспаления синовиальной оболочки. Кроме того, поскольку RA является системным заболеванием, то воспаление может поражать и другие органы и участки тела, помимо суставов, включая железы глаз и ротовой полости, выстилку легких, перикард и кровеносные сосуды.
Традиционными средствами для лечения RA и других аутоиммунных заболеваний являются быстродействующие "препараты первого ряда" и более медленные "препараты второго ряда". Препараты первого ряда уменьшают боль и воспаление. Примеры таких препаратов первого ряда включают аспирин, напроксен, ибупрофен, этодолак и другие нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs), а также кортикостероиды, принимаемые внутрь или вводимые непосредственно в ткани и суставы. Препараты второго ряда способствуют ремиссии заболевания и предотвращают прогрессирующее разрушение суставов, поэтому их также называют модифицирующими заболевание антиревматоидными препаратами или DMARDs. Примеры препаратов второго ряда включают золото, гидрохлорохин, азульфидин и иммуносупрессирующие средства, такие как метотрексат, азатиоприн, циклофосфамид, хлорамбуцил и циклоспорин. Однако многие из этих препаратов могут иметь вредные побочные эффекты. Таким образом, имеется потребность в дополнительных средствах терапии для ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний.
α-Фактор некроза опухолей (TNFα) представляет собой цитокин, вырабатываемый многими типами клеток, включая моноциты и макрофаги, который первоначально был идентифицирован по его способности индуцировать некроз некоторых опухолей у мышей. После этого было показано, что фактор, именуемый кахектином и связанный с кахексией, идентичен TNFα. TNFα вовлечен в патофизиологию различных других заболеваний у человека, включая шок, сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, RA, болезнь Крона, отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина.
Из-за вредной роли TNFα человека (hTNFα) в различных заболеваниях у человека были разработаны терапевтические стратегии для ингибирования или противодействия активности hTNFα. В частности, в качестве средства для ингибирования активности hTNFα потребовались антитела, связывающие и нейтрализующие hTNFα. Одними из самых первых таких антител были мышиные моноклональные антитела (mAbs), секретируемые гибридомами, полученными из лимфоцитов мышей, иммунизированных hTNFα (например, см. U.S. Pat. No.5,231,024). Хотя эти мышиные антитела против hTNFα часто проявляли высокое сродство к hTNFα и были способны нейтрализовать активность hTNFα, однако их применение in vivo было ограниченным из-за проблем, связанных с введением мышиных антител человеку, таких как короткое время жизни в сыворотке, неспособность запускать определенные эффекторные функции у человека и возбуждение нежелательного иммунного ответа против мышиных антител у человека (реакция "антитела человека против мышиных антител" (HAMA)).
Совсем недавно стали применять биологические средства для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит. Например, для лечения ревматоидного артрита были одобрены FDA четыре ингибитора TNFα: REMICADE™ (инфликсимаб) - химерное mAb против TNFα, ENBREL™ (этанерцепт) - слитый белок TNFR-Fc Ig, HUMIRA™ (адалимумаб) - mAb человека против TNFα и CIMZIA (цертолизумаб-пегол) - ПЭГилированный Fab-фрагмент. CIMZIA также применяется для лечения умеренной или тяжелой болезни Крона (CD). Хотя такие биологические средства и оказались успешными при лечении ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний типа CD, однако не все проходившие лечение пациенты поддавались или хорошо поддавались такому лечению.
Кроме того, введение ингибиторов TNFα может индуцировать иммунный ответ к препарату и привести к образованию антител против препарата (ADA), как-то человеческих против химерных антител (HACA), человеческих против гуманизированных антител (HAHA) и человеческих против мышиных антител (HAMA). Такие иммунные ответы типа НАСА, HAHA или HAMA могут быть связаны с реакциями гиперчувствительности и резкими изменениями фармакокинетики и биораспределения иммунотерапевтического ингибитора TNFα, которые воспрепятствуют дальнейшему лечению этим препаратом. Кроме того, присутствие определенных изотипов HACA, HAHA или HAMA связано с различными клиническими результатами у субъектов, получающих лечение против TNFα.
Соответственно, существует потребность в способах выявления наличия или уровня определенного изотипа ADA или определенной комбинации изотипов ADA в образце. Также существует потребность в способах выбора соответствующего курса лечения против TNFα для мониторинга терапии против TNFα и/или для принятия решений по лечению. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности, а также обеспечивает связанные с этим преимущества.
Сущность изобретения
Настоящим изобретением предусмотрены способы анализа для определения одного или нескольких изотипов антител против лекарственных препаратов (ADA) в образце. В качестве неограничивающего примера способы настоящего изобретения особенно применимы для определения различных изотипов ADA в образцах от ADA-положительных пациентов, получающих препараты против TNFα типа REMICADE™ (инфликсимаб) или HUMIRA™ (адалимумаб). Настоящим изобретением также предусмотрены способы для оптимизации терапии и/или снижения токсичности у субъектов, получающих ингибиторы TNFα для лечения опосредованных TNFα заболеваний.
В одном аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного изотипа (например, нескольких изотипов) аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого препарата против TNFα с образцом, содержащим или предположительно содержащим по меньшей мере один изотип аутоантител к препарату против TNFα, для формирования меченых комплексов между меченым препаратом против TNFα и каждым изотипом аутоантител;
(b) подвергание меченых комплексов эксклюзионной хроматографии для разделения меченых комплексов, содержащих различные изотипы аутоантител, друг от друга и/или от свободного меченого препарата против TNFα; и
(c) детектирование меченых комплексов, тем самым определяется наличие (или отсутствие) либо уровень по меньшей мере одного изотипа аутоантител к препарату против TNFα.
В некоторых воплощениях препарат против TNFα выбирают из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), HUMIRA™ (адалимумаб), ENBREL™ (этанерцепт), CIMZIA (пертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В других воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα (например, антитело против препарата, т.е. "ADA") выбирают из группы, состоящей из человеческих против химерных антител (НАСА), человеческих против гуманизированных антител (HAHA), человеческих против мышиных антител (HAMA) и их комбинаций.
В некоторых воплощениях по меньшей мере один изотип содержит несколько из по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти или больше изотипов. В других воплощениях по меньшей мере один изотип выбран из группы, состоящей из изотипов IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их подклассов или их комбинаций. В некоторых случаях образец представлен цельной кровью, сывороткой или плазмой.
В некоторых воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα представляет собой HACA, а образец взят у субъекта, проходящего лечение препаратом REMICADE™ (инфликсимаб). В некоторых других воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα представляет собой HAHA, а образец взят у субъекта, проходящего лечение препаратом HUMIRA™ (адалимумаб).
В некоторых случаях меченый препарат против TNFα представлен препаратом против TNFα, помеченным флуорофором. В определенных воплощениях меченые комплексы выявляются с помощью флуоресцентной метки. В некоторых воплощениях каждый изотип аутоантитела характеризуется или идентифицируется или выявляется по времени удержания. В других воплощениях эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC).
В одном родственном аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного изотипа (например, нескольких изотипов) аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого препарата против TNFα и одного или нескольких меченых антител против Ig, специфичных к различным изотипам антител, с образцом, содержащим или предположительно содержащим по меньшей мере один изотип аутоантител к препарату против TNFα, для формирования меченых комплексов между меченым препаратом против TNFα, мечеными антителами против Ig и каждым изотипом аутоантител, причем меченый препарат против TNFα и меченые антитела против Ig содержат разные метки;
(b) подвергание меченых комплексов эксклюзионной хроматографии для разделения меченых комплексов, содержащих различные изотипы аутоантител, друг от друга, от свободного меченого препарата против TNFα и/или от свободных меченых антител против Ig; и
(c) детектирование меченых комплексов, тем самым определяется наличие (или отсутствие) либо уровень по меньшей мере одного изотипа аутоантител к препарату против TNFα.
В некоторых воплощениях препарат против TNFα выбирают из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), HUMIRA™ (адалимумаб), ENBREL™ (этанерцепт), CIMZIA (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В других воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα (например, антитело против препарата, т.е. "ADA") выбирают из группы, состоящей из человеческих против химерных антител (HACA), человеческих против гуманизированных антител (HAHA), человеческих против мышиных антител (HAMA) и их комбинаций.
В определенных воплощениях меченый препарат против TNFα и одно или несколько меченых антител против Ig связываются с различными эпитопами по меньшей мере одного изотипа. В качестве неограничивающего примера меченый препарат против TNFα и меченое антитело против Ig, специфичное к изотипу, связываются с различными эпитопами определенного изотипа аутоантител.
В некоторых воплощениях по меньшей мере один изотип включает несколько из по меньшей мере двух, трех, четырех, пяти или больше изотипов. В других воплощениях по меньшей мере один изотип выбран из группы, состоящей из изотипов IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их подклассов и их комбинаций.
В некоторых воплощениях несколько меченых антител против Ig включают по меньшей мере два, три, четыре, пять или больше меченых антител против Ig, специфичных к различным изотипам антител. В других воплощениях одно или несколько меченых антител против Ig выбраны из группы, состоящей из антител, специфичных к одному или нескольким изотипам IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их подклассам или их комбинациям. В некоторых случаях образец представлен цельной кровью, сывороткой или плазмой.
В некоторых воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα представляет собой HACA, а образец взят у субъекта, проходящего лечение препаратом REMICADE™ (инфликсимаб). В некоторых других воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα представляет собой HAHA, а образец взят у субъекта, проходящего лечение препаратом HUMIRA™ (адалимумаб).
В некоторых случаях меченый препарат против TNFα представлен препаратом против TNFα, меченным флуорофором. В некоторых других случаях меченые антитела против Ig представлены антителами против Ig, меченными флуорофором. Несколько меченых антител против Ig, специфичных к различными изотипам антител, могут все содержать одну и ту же метку или разные метки. В одном неограничивающем примере несколько меченых антител против Ig, специфичных к изотипу, все помечены Alexa-532, a меченый препарат против TNFα помечен Alexa-488.
В некоторых воплощениях меченые комплексы детектируются с помощью флуоресцентной метки. В определенных воплощениях меченые комплексы детектируются по сигналу, который генерируется при близко расположенном связывании меченого препарата против TNFα и меченых антител против Ig с изотипом аутоантител. В некоторых случаях сигнал составляет флуоресцентный сигнал, который детектируется методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В других воплощениях эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC). В некоторых воплощениях каждый изотип аутоантител характеризуется или идентифицируется или детектируется по времени удержания.
В следующем аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности у субъекта, проходящего курс терапии для лечения опосредованного TNFα заболевания, который включает:
(a) анализ образца, взятого у субъекта, для определения наличия, уровня или генотипа одного или нескольких маркеров в образце;
(b) применение статистического алгоритма к наличию, уровню или генотипу одного или нескольких маркеров, определенных на стадии (a); и
(c) определение последующей дозы курса терапии для субъекта или же того, что следует назначить другой курс терапии для субъекта на основании статистического алгоритма, примененного на стадии (b).
В качестве неограничивающего примера можно выявлять, измерять или определять наличие, уровень или генотип одного, двух, трех, четырех, пяти или всех шести из следующих классов биохимических маркеров, серологических маркеров и/или генетических маркеров в образцах пациентов (например, образцах сыворотки пациентов, проходящих терапию препаратом против TNF):
(1) уровень препарата против TNF (например, уровень свободного лечебного антитела против TNFα);
(2) уровень антител против препарата (ADA) (например, уровень аутоантител к препарату против TNF);
(3) уровень TNFα;
(4) уровень одного, двух, трех, четыре, пяти, шести, семи или больше дополнительных цитокинов (например, IL-6, IL-1β, IFN-γ, IL-10 и т.д.) и/или маркеров для других механизмов воспаления (например, таких маркеров воспаления, как CRP, SAA, ICAM-1 и/или VCAM-1);
(5) наличие или отсутствие одной или нескольких мутаций у одного или нескольких генетических маркеров типа генов воспалительного пути, например, наличие или отсутствие вариантов аллелей (например, SNPs) у одного или нескольких маркеров воспаления, таких, например, как NOD2/CARD15 (например, SNP 8, SNP 12 и/или SNP 13, описанных в патенте США No.7,592,437), ATG16L1 (например, SNP rs2241880 (T300A), описанного в Lakatos et al., Digestive and Liver Disease, 40 (2008) 867-873), SNP IL23R (например, rs11209026 (R381Q), описанного в Lakatos et al.), генов антигенов лейкоцитов человека (HLA) и/или генов цитокинов, описанных, например, в Gasche et al. (Eur. J. Gastroenterology & Hepatology, (2003) 15:599-606), и генов DLG5 и/или OCTN из локуса IBD5;
(6) уровень одного или нескольких биохимических маркеров и/или серологических маркеров в различные моменты времени (например, через 28 недель, 60 недель и т.д.); и
(7) их комбинации.
В определенных воплощениях можно затем применить один статистический алгоритм или комбинацию из двух или нескольких статистических алгоритмов к наличию, уровню (уровню концентрации) или генотипу одного или нескольких (например, комбинации из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или больше) маркеров, выявленных, измеренных или определенных в образце, чтобы тем самым оптимизировать терапию, уменьшить токсичность и/или проконтролировать эффективность терапевтического лечения препаратом против TNF. При этом способы настоящего изобретения найдут применение при определении лечения пациента путем определения иммунного статуса пациента.
Способы выявления препаратов против TNF (например, антител против TNFα) и антител к препаратам (ADA), таких как HACA и HAHA, дополнительно описаны в публикации РСТ No. WO 2011/056590, содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте на все случаи.
Другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения станут понятны специалистам в данной области из следующего подробного описания и фигур.
Краткое описание фигур
647
На фиг.1 представлено типичное воплощение способов настоящего изобретения, в котором для определения связывания между TNFα-Alexa и HUMIRA™ применяется эксклюзионная HPLC.
647
На фиг.2 представлены кривые доза-ответ для связывания HUMIRA™ с TNFα-А1еха.
На фиг.3 представлен современный метод на основе ELISA для измерения уровня HACA, известный как мостиковый метод (bridging assay).
На фиг.4 представлена типичная схема способов выявления аутоантител по настоящему изобретению для измерения концентрации HACA/HAHA, образовавшихся против REMICADE™.
647
На фиг.5 представлен анализ типа доза-ответ для связывания антител против IgG человека с REMICADE™-Alexa.
647
На фиг.6 представлен второй анализ доза-ответ для связывания антител против IgG человека с REMICADE™-Alexa.
647
На фиг.7 представлены кривые доза-ответ для связывания антител против IgG человека с REMICADE™-Alexa.
647
На фиг.8 представлено образование иммунокомплекса REMICADE™-Alexa в нормальной сыворотке человека и HACA-положительной сыворотке.
На фиг.9 приведена сводка по измерению HACA в образцах сыворотки от 20 пациентов, которые проводились с использованием мостикового метода или анализом изменения подвижности по настоящему изобретению.
На фиг.10 приведена сводка и сравнение текущих способов измерения концентрации HACA в сыворотке и нового способа анализа HACA по настоящему изобретению.
На фиг.11 представлены профили SE-HPLC меченного флуорофором (F1) IFX при инкубации с нормальной (NHS) или HACA-положительной (HPS) сывороткой. При добавлении в инкубационную смесь возрастающих количеств HACA-положительной сыворотки пик IFX-F1 смещается дозозависимым образом к более высокомолекулярным положениям элюции С1 и С2.
На фиг.12 представлены кривые доза-ответ связанного и свободного IFX-F1, образовавшегося при возрастающих разведениях HACA-положительной сыворотки, при определении анализом изменения подвижности. (А) Возрастающие разведения HACA-положительной сыворотки инкубировали с 37,5 нг IFX-F1. Чем больше разведение (меньше HACA), тем больше свободного IFX-F1 обнаруживается при SE-HPLC. (В) Возрастающие разведения HACA-положительной сыворотки инкубировали с 37,5 нг IFX-F1. Чем больше разведение (меньше HACA), тем меньше связанного с НАСА IFX-F1 обнаруживается при SE-HPLC.
На фиг.13 представлены профили SE-HPLC для TNFα-F1 при инкубации с нормальной (NHS) или сывороткой с добавлением IFX. При добавлении в инкубационную смесь возрастающих количеств сыворотки дополненной IFX, пик флуоресценции TNFα сдвигается дозозависимым образом к более высокомолекулярным положениям элюции.
На фиг.14 представлено кривые доза-ответ связанного и свободного TNFα, полученные при возрастающих разведениях сыворотки с IFX, при определении анализом изменения подвижности. При повышении концентрации IFX в инкубационной смеси снижается процент свободного TNFα, а процент связанного TNFα увеличивается.
На фиг.15 представлено измерение относительного уровня HACA и концентрации IFX у пациентов IBD, получавших IFX, в различные моменты времени анализом изменения подвижности.
На фиг.16 представлено лечение пациентов - измерение уровня HACA и концентрации IFX в сыворотке пациентов IBD, получавших IFX, в различные моменты времени.
На фиг.17 представлены типичные воплощения способов анализа по настоящему изобретению для выявления наличия (A) не нейтрализующих или (B) нейтрализующих аутоантител типа HACA.
На фиг.18 представлено альтернативное воплощение способов анализа по настоящему изобретению для выявления наличия (A) не нейтрализующих или (B) нейтрализующих аутоантител типа HACA.
На фиг.19 представлены профили изменения подвижности у F1-меченных ADL при инкубации с нормальной сывороткой человека (NHS) в присутствии различных количеств антител против IgG человека. При добавлении в инкубационную смесь возрастающих количеств антител против IgG человека пик свободного F1-ADL (FA) дозозависимым образом смещается к более высокомолекулярным положениям элюции С1 и С2, тогда как внутренний контроль (IC) не изменяется.
На фиг.20 представлена кривая доза-ответ антител против IgG человека на смещение свободного F1-ADL. Возрастающие количества антител против IgG человека инкубировали с 37,5 нг F1-ADL и внутреннего контроля. Чем больше антител добавляли в реакционную смесь, тем меньше было соотношение свободного F1-ADL к внутреннему контролю.
На фиг.21 представлены профили изменения подвижности у F1-меченного TNF-α при инкубации с нормальной сывороткой человека (NHS) в присутствии различных количеств ADL. Ex=494 нм; Em=519 нм. При добавлении в инкубационную смесь возрастающих количеств ADL пик свободного TNF-F1 (FT) дозозависимым образом смещается к более высокомолекулярным положениям элюции, тогда как пик внутреннего контроля (IC) не изменяется.
На фиг.22 представлена кривая доза-ответ ADL на смещение свободного TNF-α-F1. Возрастающие количества ADL инкубировали с 100 нг TNF-α-F1 и внутреннего контроля. Чем больше антител ADL добавляли в реакционную смесь, тем меньше было отношение свободного TNF-α-F1 к внутреннему контролю.
На фиг.23 представлено время элюирования различных изотипов ADA в HACA-положительной сыворотке пациентов.
На фиг.24 представлен усредненный график для 100 контрольных образцов, использовавшихся в исследовании, описанном в Примере 8.
На фиг.25 представлено усредненный график для 100 HACA-положительных образцов, использовавшихся в исследовании, описанном в Примере 8.
На фиг.26 представлено параллельное сравнение сигналов главного пика (т.е. соответствующих интенсивности сигнала меченого Remicade) для 100 контрольных образцов и 100 HACA-положительных образцов, использовавшихся в исследовании, описанном в Примере 8.
На фиг.27 представлена характеристическая кривая обнаружения (ROC) для данных по главному пику из фиг.26. Площадь под кривой (AUC) составила 0,986.
На фиг.28 представлен график второстепенных пиков на оси X (что соответствует сумме пиков IgG, IgA и IgM) относительно главного пика на оси Y для 100 HACA-положительных образцов, использовавшихся в исследовании, описанном в Примере 8.
На фиг.29 представлен график пиков IgG относительно IgA и IgM для всех 200 образцов, использовавшихся в исследовании, описанном в примере 8.
На фиг.30 представлена схема формата определения изотипа аутоантител методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
На фиг.31 представлены результаты определения изотипа аутоантител на основе FRET по настоящему изобретению.
Раскрытие сущности изобретения
Введение
TNFα участвует в воспалительных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях, вирусных, бактериальных и паразитических инфекциях, злокачественных опухолях и/или нейродегенеративных заболеваниях и является полезной мишенью для специфической биологической терапии при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит (RA) и болезнь Крона (CD). Ингибиторы TNFα, как-то антитела против TNFα, представляют собой важный класс терапевтических препаратов. Однако введение ингибиторов TNFα может вызвать иммунный ответ к препарату и привести к образованию антител против препарата (ADA), тем самым исключая дальнейшее лечение препаратом. Кроме того, присутствие определенных изотипов ADA может быть связано с различными клиническими результатами у субъектов, получающих терапию против TNFα.
Настоящее изобретение частично основывается на открытии того, что метод гомогенного изменения подвижности при помощи эксклюзионной хроматографии особенно предпочтителен для измерения наличия или уровня одного или нескольких изотипов ADA в образце. В качестве неограничивающего примера: способы настоящего изобретения особенно применимы для определения различных изотипов ADA в образцах от ADA-положительных пациентов, получающих препарат против TNFα типа REMICADE™ (инфликсимаб) или HUMIRA™ (адалимумаб).
В частности, настоящим изобретением предусмотрены способы определения изотипа ADA типа "смешать и измерить", которые не требуют никаких стадий отмывки. При этом образовавшие комплексы и некомплексированные реагенты легко отделяются друг от друга. Кроме того, при использовании способов настоящего изобретения сводятся к минимуму любые возможные помехи со стороны свободного препарата против TNFα. Напротив, типичный метод ELISA для измерения уровня аутоантител невозможно выполнять, пока ингибитор TNFα не будет удален из организма, что может занять до 3 месяцев. Более того, настоящее изобретение в общем приложимо к широкому спектру препаратов против TNFα наряду с антителами против TNFα. Способы настоящего изобретения также дают преимущество в том, что они не требуют прикрепления антигенов к твердой поверхности, устраняют неспецифическое связывание посторонних IgG, детектируют антитела со слабым сродством и проявляют повышенную чувствительность и специфичность перед доступными в настоящее время методами детектирования типа ферментного иммуноанализа.
Важность измерения концентрации биопрепаратов против TNFα (например, антител против TNFα) в сыворотке, а также аутоантител, вырабатываемых против них (например, изотипов ADA), иллюстрируется тем, что FDA требует проводить фармакокинетические исследования и исследования на толерантность (например, иммунный ответ) во время клинических испытаний. Настоящее изобретение также находит применение при мониторинге пациентов, получающих эти лекарства, чтобы удостовериться, что они получают правильную дозу, что препарат не выводится из организма слишком быстро и что у них не развивается иммунный ответ против препарата. Более того, настоящее изобретение применимо для назначения перехода на другие лекарства вследствие несостоятельности первоначального препарата.
Настоящим изобретением также предусмотрены способы оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности у субъектов, получающих ингибиторы TNFα для лечения опосредованных TNFα заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение особенно предпочтительно тем, что оно направлено на и преодолевает существующие ограничения, связанные с применением таких препаратов против TNF, как инфликсимаб или адалимумаб, в частности, оно обеспечивает информацию, полезную для принятия решений по лечению для тех пациентов, которые получают или будут получать лечение препаратом против TNF,
Определения
В настоящем изобретении следующие термины имеют приданные им значения, если не указано иначе.
Термин "TNFα" в настоящем изобретении служит для обозначения цитокина человека, существующего в виде секретируемой формы в 17 кД и мембраносвязанной формы в 26 кД, биологически активная форма которого состоит из тримера нековалентно связанных молекул в 17 кД. Структура TNFα описана более подробно, к примеру, в Jones et al. (1989) Nature, 338:225-228. Термин TNFα охватывает TNFα, рекомбинантный TNFα человека (rhTNFα) или полипептид, идентичный примерно на 80% белку TNFα человека. TNFα человека состоит из цитоплазматического домена из 35 аминокислот (а.к.), трансмембранного сегмента из 21 а.к. и внеклеточного домена из 177 а.к. (ECD) (Pennica et а1. (1984) Nature 312:724). В пределах ECD аминокислотная последовательность TNFα человека на 97% идентична TNFα макаки резус и на 71-92% TNFα быка, собаки, хлопкового хомяка, лошади, кошки, мыши, свиньи и крысы. TNFα можно получить стандартными методами рекомбинантной экспрессии или приобрести коммерческим путем (например, R&D Systems, кат. №210-ТА, Minneapolis, Minn.).
Термин "ингибитор TNFα" или "препарат против TNFα" охватывает средства, в том числе белки, антитела, фрагменты антител, слитые белки (например, слитые белки Ig или слитые белки Fc), мультивалентные связывающие белки (например, DVD-Ig), небольшие молекулы-антагонисты TNFα и подобные им природные или искусственные молекулы и/или их рекомбинантные и/или сконструированные формы, которые, прямо или косвенно, ингибируют активность TNF-α, как-то ингибируют взаимодействие TNFα с рецептором TNFα на клеточной поверхности, ингибируют вырабатывание белка TNFα, ингибируют экспрессию гена TNFα, ингибируют секрецию TNFα из клеток, ингибируют сигнализацию через рецептор TNFα или любым другим образом приводят к снижению активности TNFα у субъекта. Термин "ингибитор TNFα" или "препарат против TNFα" предпочтительно охватывает средства, которые нарушают активность TNFα. Примеры препаратов против TNFα включают этанерцепт (ENBREL™, Amgen), инфликсимаб (REMICADE™, Johnson and Johnson), моноклональное антитело человека против TNF адалимумаб (D2E7/HUMIRA™, Abbott Laboratories), CDP 571 (Celltech) и CDP 870 (Celltech), а также другие соединения, ингибирующие активность TNFα таким образом, что при введении субъекту, страдающему или подвергающемуся риску возникновения заболевания, при котором активность TNFα вредна (например, RA), происходит лечение заболевания.
Термин "изотип иммуноглобулина" или "изотип антитела" охватывает любых представителей семейства родственных антител, содержащих генетические вариации и/или различия в константных областях тяжелой и/или легкой цепи. Неограничивающие примеры изотипов антител включают: (1) изотипы тяжелой цепи, как-то α (например, IgA или его подкласс типа IgA1 и/или IgA2); δ (например, IgD); γ (например, IgG или его подкласс типа IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4); ε (например, IgE); µ (например, IgM); и (2) изотипы легкой цепи, как-то κ и λ.
Термин "эксклюзионная хроматография" (SEC) служит для обозначения метода хроматографии, при котором молекулы в растворе разделяются на основе их размера и/или гидродинамического объема. Он применяется к большим молекулам или макромолекулярным комплексам типа белков и их конъюгатов. Как правило, если для пропускания образца через колонку используется водный раствор, то метод называется гель-фильтрационная хроматография.
Термины "комплекс", "иммунокомплекс", "конъюгат" и "иммуноконъюгат" включают, без ограничения, TNFα, связанный (например, нековалентным образом) с препаратом против TNFα, препарат против TNFα, связанный (например, нековалентным образом) с аутоантителом к препарату против TNFα, препарат против TNFα, связанный (например, нековалентным образом) и с TNF-α, и с аутоантителом к препарату против TNFα, препарат против TNFα, связанный (например, нековалентным образом) с изотипом аутоантитела к препарату против TNFα, и препарат против TNFα и специфичное к изотипу Ig антитело, связанные (например, нековалентным образом) с изотипом аутоантитела к препарату против TNFα.
125
В настоящем изобретении то, что определяется термином "меченые", включает любые частицы, молекулы, белки, ферменты, антитела, фрагменты антител, цитокины и им подобные, конъюгированные с другой молекулой или химической частицей, которая поддается детектированию. Химические вещества, пригодные в качестве метки для меченых частиц, включают, без ограничения, флуоресцентные красители (например, красители Alexa Fluor типа Alexa Fluor 488, 532 или 647, квантовые точки, оптические красители, люминесцентные красители и радионуклиды, например, I.
Выражение "детектирование флуоресцентной метки" включает средство детектирования флуоресцентной метки. Средства детектирования включают, без ограничения, спектрометры, флуориметры, фотометры, детектирующие устройства, обычно встроенные в прибор для хроматографии, в том числе эксклюзионной или высокоэффективной жидкостной хроматографии, к примеру, установку Agilent-1200 HPLC System.
Термин "оптимизация терапии" или "оптимизировать терапию" включает оптимизацию дозы (например, эффективного количества или уровня) и/или типа определенной терапии. Например, оптимизация дозы препарата против TNFα включает увеличение или уменьшение количества препарата против TNFα, впоследствии вводимого пациенту. В некоторых случаях оптимизация типа препарата против TNFα включает замену одного вводимого препарата против TNFα на другой препарат (например, другой препарат против TNFα). В некоторых других случаях оптимизация терапии включает совместное введение дозы препарата против TNFα (например, в большей, меньшей или той же самой дозе, что и предыдущая доза) в комбинации с иммуносупрессорным препаратом.
Термин "курс терапии" включает любые терапевтические подходы, предпринимаемые для ослабления или предотвращения одного или нескольких симптомов, связанных с вызванным TNFα заболеванием. Термин охватывает назначение любого соединения, препарата, процедуры и/или режима, полезных для улучшения здоровья индивида с вызванным TNFα заболеванием, и включает любые описанные здесь терапевтические средства. Специалистам должно быть известно, что можно изменить сам курс лечения или дозу при текущем курсе лечения (например, увеличить или уменьшить), исходя из присутствия или уровня концентрации TNFα, препарата против TNFα и/или антител к препарату с использованием способов настоящего изобретения.
Термин "иммуносупрессорное средство" охватывает любые вещества, способные давать иммунодепрессивный эффект, например, предотвращение или уменьшение иммунного ответа, как-то при облучении или при введении таких лекарств, как антиметаболиты, антилимфоцитарная сыворотка, антитела и т.д. Примеры подходящих иммуносупрессорных средств включают, без ограничения, тиопуриновые препараты типа азатиоприна (AZA) и его метаболитов, антиметаболиты типа метотрексата (МТХ); сиролимус (рапамицин); темсиролимус; эверолимус; такролимус (FK-506); FK-778; антилимфоцитарные глобулиновые антитела, антитимоцитарные глобулиновые антитела, антитела против CD3, антитела против CD4 и конъюгаты типа антитело-токсин; циклоспорин; микофенолат; мизорибин монофосфат; скопарон; глатирамер ацетат; их метаболиты; их фармацевтически приемлемые соли; их производные; их пролекарственные формы; и их комбинации.
Термин "тиопуриновый препарат" охватывает азатиоприн (AZA), 6-меркаптопурин (6-МР) и любые их метаболиты, обладающие терапевтической эффективностью, в том числе 6-тиогуанин (6-TG), 6-метилмеркаптопурин-рибозид, 6-тиоинозиновые нуклеотиды (например, 6-тиоинозин монофосфат, 6-тиоинозин дифосфат, 6-тиоинозин трифосфат), 6-тиогуаниновые нуклеотиды (например, 6-тиогуанозин монофосфат, 6-тиогуанозин дифосфат, 6-тиогуанозин трифосфат), 6-тиоксантозиновые нуклеотиды (например, 6-тиоксантозин монофосфат, 6-тиоксантозин дифосфат, 6-тиоксантозин трифосфат), их производные, их аналоги и их комбинации.
Термин "образец" охватывает любые биологические образцы, взятые у индивида. Подходящими для применения в настоящем изобретении образцами являются, без ограничения, цельная кровь, плазма, сыворотка, слюна, моча, кал, слезы и другие жидкости организма, образцы тканей (например, биоптаты) и их клеточные экстракты (например, экстракт эритроцитов). В предпочтительном воплощении образец представлен образцом сыворотки. Специалистам должно быть известно, что образцы, как-то образцы сыворотки, можно разводить перед анализом. В некоторых случаях термин "образец" включает, без ограничения, кровь, ткань организма, сыворотку крови, лимфу, ткань лимфатических узлов, ткань селезенки, костный мозг или обогащенную иммуноглобулином фракцию из одной или нескольких этих тканей. В некоторых других случаях термин "образец" включает сыворотку крови или обогащенную иммуноглобулином фракцию, полученную из сыворотки крови или самой крови. В некоторых случаях термин "образец" включает жидкость организма.
Термин "прогнозирование восприимчивости к ингибитору TNFα" обозначает способность оценить вероятность того, что лечение субъекта ингибитором TNFα будет или не будет эффективным (например, принесет ощутимую пользу) для субъекта. В частности, такая способность оценить вероятность того, что лечение будет или не будет эффективным, как правило, применяется после того, как лечение уже началось и у субъекта наблюдался показатель эффективности (например, показатель ощутимой пользы). Особенно предпочтительными ингибиторами TNFα являются биологические препараты, одобренные FDA для применения на людях при лечении ревматоидного артрита (RA), которые описаны здесь и включают, без ограничения, адалимумаб (HUMIRA™), инфликсимаб (REMICADE™) и этанерцепт (ENBREL™).
Термин "субъект", "пациент" или "индивид" обычно относится к людям, но также и к другим животным, включая, например, других приматов, грызунов, собак, кошек, лошадей, овец, свиней и др.
Описание воплощений
Настоящим изобретением предусмотрены способы определения изотипа одного или нескольких антител против препарата (ADA) в образце. В качестве неограничивающего примера способы настоящего изобретения особенно полезны для определения различных изотипов ADA в образце от ADA-положительных пациентов, получающих препарат против TNFα типа REMICADE™ (инфликсимаб) или HUMIRA™ (адалимумаб). Настоящим изобретением также предусмотрены способы оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности у субъектов, получающих ингибиторы TNFα для лечения опосредованных TNFα заболеваний.
В одном аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного изотипа (например, нескольких изотипов) аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого препарата против TNFα (например, меченого антитела против TNFα) с образцом, содержащим или предположительно содержащим по меньшей мере один изотип аутоантител к препарату против TNFα (например, IgA, IgD, IgE, IgG и/или IgM), для формирования меченых комплексов (т.е. иммунокомплексов или конъюгатов) между меченым препаратом против TNFα и каждым изотипом аутоантител (при этом меченый препарат против TNFα и изотип аутоантитела соединены друг с другом не ковалентно);
(b) подвергание меченых комплексов эксклюзионной хроматографии для разделения меченых комплексов, содержащих различные изотипы аутоантител, друг от друга и/или от свободного меченого препарата против TNFα; и
(c) детектирование меченых комплексов, тем самым определяется наличие (или отсутствие) либо уровень по меньшей мере одного изотипа аутоантител к препарату против TNFα.
В одном родственном аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного изотипа (например, нескольких изотипов) аутоантител к препарату против TNFα в образце, который включает:
(a) контактирование меченого препарата против TNFα (например, меченого антитела против TNFα) и одного или нескольких меченых антител против Ig, специфичных к различным изотипам антител (например, изотипам IgA, IgD, IgE, IgG и/или IgM), с образцом, содержащим или предположительно содержащим по меньшей мере один изотип аутоантител к препарату против TNFα, для формирования меченых комплексов (т.е. иммунокомплексов или конъюгатов) между меченым препаратом против TNFα, мечеными антителами против Ig и каждым изотипом аутоантител (при этом компоненты меченых комплексов соединены друг с другом не ковалентно), причем меченый препарат против TNFα и меченые антитела против Ig содержат разные метки;
(b) подвергание меченых комплексов эксклюзионной хроматографии для разделения меченых комплексов, содержащих различные изотипы аутоантител, друг от друга, от свободного меченого препарата против TNFα и/или от свободных меченых антител против Ig; и
(c) детектирование меченых комплексов, тем самым определяется наличие (или отсутствие) либо уровень по меньшей мере одного изотипа аутоантител к препарату против TNFα.
В некоторых воплощениях препарат против TNFα выбирают из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), HUMIRA™ (адалимумаб), ENBREL™ (этанерцепт), CIMZIA (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций.
В некоторых воплощениях способы применимы для измерения уровня (концентрации) по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или больше изотипов антител в таком образце, как цельная кровь, сыворотка или образец плазмы от субъекта, получающего лечение препаратом против TNFα. В некоторых случаях способы применимы для определения различных изотипов антител к препарату (ADA), как-то различных изотипов ATI (т.е. антител к IFX; "HACA") у ADA-положительных пациентов, получающих лечение препаратом против TNFα типа инфликсимаба (IFX). В некоторых случаях способы применимы для определения различных изотипов ADA, как-то различных изотипов АТА (т.е. антител к адалимумабу; "HAHA") у ADA-положительных пациентов, получающих лечение препаратом против TNFα типа адалимумаба. Неограничивающие примеры изотипов антител включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В определенных воплощениях способы изобретения способствуют сопоставлению различных клинических результатов у пациентов, получающих лечение препаратом против TNFα, исходя из наличия или уровня определенного изотипа ADA или определенной комбинации изотипов ADA.
3
Препарат против TNFα или антитело против Ig, специфичное к изотипу антител, можно пометить различными детектируемыми группами. В определенных воплощениях препарат против TNFα и/или антитело против Ig, специфичное к изотипу антител, помечено флуорофором или флуоресцентным красителем. Неограничивающие примеры флуорофоров, подходящих для применения в качестве меток, которые можно присоединять к описанным здесь препаратам против TNFα и антителам против Ig, специфичным к изотипу антител, включают те, что перечислены в Molecular Probes Catalogue, который включен сюда путем ссылки во всей полноте на все случаи (см. R. Haugland, The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10 th Edition, Molecular Probes, Inc. (2005)). Такими типичными флуорофорами являются, без ограничения, красители Alexa Fluor, такие как Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 и/или Alexa Fluor 790, а также и другие флуорофоры, в том числе дансилхлорид (DNS-Cl), 5-(йодацетамид)флуоресцеин (5-IAF), флуоресцеин-5-изотиоцианат (FITC), тетраметилродамин-5- и 6-изотиоцианат (TRITC), 6-акрилоил-2-диметиламинонафталин (акрилодан), 7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол-4-ил хлорид (NBD-Cl), бромистый этидий, люцифер желтый, 5-карбоксиродамин 6G гидрохлорид, лиссамин-родамин В сульфонилхлорид, Texas Red™ сульфонилхлорид, BODIPY™, нафталаминсульфоновые кислоты (например, 1-анилинонафталин-8-сульфоновая кислота (ANS), 6-(пара-толуидинил)нафталин-2-сульфоновая кислота (TNS) и др.), антроил-жирные кислоты, DPH, паринаровая кислота, TMA-DPH, флуоренил-жирная кислота, флуоресцеин-фосфатидилэтаноламин, Texas Red-фосфатидилэтаноламин, пиренил-фосфатидилхолин, флуоренил-фосфатидилхолин, мероцианин 540, 1-(3-сульфонатопропил)-4-[β-[2[(ди-н-бутиламино)-6-нафтил]винил]пиридиний бетаин (нафтилстирил), 3,3′-дипропилтиадикарбоцианин (ди-S-C-(5)), 4-(n-дипентиламиностирил)-1-метилпиридиний (ди-5-ASP), Cy-3-йодацетамид, Cy-5-N-гидроксисукцинимид, Cy-7-изотиоцианат, родамин 800, IR-125, тиазол оранжевый, азур В, нильский голубой, Al-фталоцианин, оксаксин-1,4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, акридиноранж, этидий гомодимер, N-(этоксикарбонилметил)-6-метоксихинолин (MQAE), Fura-2, Calcium Green, Kap6oKCH-SNARF-6, BAPTA, кумарин, фитофлуоры, Coronene, комплексы металл-лиганд, IRDye 700DX, IRDye 700, IRDye 800RS, IRDye 800CW, IRDye 800, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY676, DY680, DY682, DY780 и их смеси. Дополнительными подходящими флуорофорами являются кофакторы ферментов, лантаниды, зеленый флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок или их мутанты и производные. В одном неограничивающем примере несколько специфичных к изотипу антител против Ig все помечены Alexa-532, a препарат против TNFα помечен Alexa-488.
Как правило, флуоресцентная группа представлена флуорофором, выбранным из категории красителей, включающей полиметины, фталоцианины, цианины, ксантины, флуорены, родамины, кумарины, флуоресцеины и BODIPY™.
В одном воплощении флуоресцентная группа представлена ближним инфракрасным (NIR) флуорофором, излучающим в диапазоне от 650 до 900 нм. Применение технологии ближней инфракрасной флуоресценции предпочтительно в биологических способах измерения, так как она в значительной степени исключает или снижает фон от аутофлуоресценции биосубстратов. Другим преимуществом технологии ближней ИК флуоресценции является то, что рассеянный свет от источника возбуждения значительно уменьшается, поскольку интенсивность рассеяния обратно пропорциональна четвертой степени длины волны. Низкая фоновая флуоресценция и низкое рассеивание приводят к высокому отношению сигнал-шум, что необходимо для высокочувствительного детектирования. Более того, окно оптической прозрачности в ближней ИК области (от 650 нм до 900 нм) в биологических тканях делает флуоресценцию NIR ценной технологией для методов интраскопии in vivo и субклеточного детектирования, требующих прохождения света через биологические компоненты. В некоторых аспектах этого воплощения ближний инфракрасный (NIR) флуорофор предпочтительно выбирается из группы, состоящей из IRDye 700DX, IRDye 700, IRDye 800RS, IRDye 800CW, IRDye 800, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680. Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, Alexa Fluor 790, Cy5, Cy5.5, Cy7, DY676, DY680, DY682 и DY780. В некоторых воплощениях ближняя инфракрасная группа представлена IRDye 800CW, IRDye 800, IRDye 700DX, IRDye 700 или Dynomic DY676.
Флуоресцентное мечение осуществляется с помощью химически реакционного производного флуорофора. Распространенные реакционные группы включают аминореактивные производные изотиоцианата, как-то FITC и TRITC (производные флуоресцеина и родамина), аминореактивные сукцинимидиловые эфиры типа NHS-флуоресцеина и реагирующие с сульфгидрилами активируемые малеимидами флуорофоры типа флуоресцеин-5-малеимида, многие из которых коммерчески доступны. При реакции любого из этих реакционных красителей с препаратом против TNFα или специфичным к изотипу антителом против Ig образуется устойчивая ковалентная связь между флуорофором и препаратом против TNFα или специфичным к изотипу антителом против Ig.
В некоторых случаях после реакции флуоресцентного мечения зачастую нужно удалить все непрореагировавшие флуорофоры из меченой молекулы-мишени. Часто это осуществляется методом эксклюзионной хроматографии, воспользовавшись различиями по размеру между флуорофором и меченым белком.
Реакционные флуоресцентные красители доступны из многих источников. Их можно получить с различными реакционными группами для присоединения к различным функциональным группам в молекуле мишени. Они также доступны в наборах для мечения, содержащих все компоненты для выполнения реакции введения метки. В одном предпочтительном воплощении применяется С2-малеимид Alexa Fluor 647 фирмы hivitrogen (кат. № А-20347).
125
2
Специфическое иммунологическое связывание препарата против TNFα с изотипом аутоантител либо препарата против TNFα и антитела против Ig с изотипом аутоантител можно детектировать прямо или косвенно. Прямые метки включают флуоресцентные или люминесцентные теги, металлы, красители, радионуклиды и др., присоединенные к антителу. В некоторых случаях для определения наличия или уровня концентрации одного или нескольких изотипов ADA в образце можно использовать препарат против TNFα или антитело против Ig, помеченные йодом-125 (I). В других случаях для чувствительного нерадиоактивного детектирования изотипов ADA в образце подходит хемилюминесцентный метод с использованием хемилюминесцентного препарата против или антитела против Ig. В определенных случаях для определения уровня концентрации одного или нескольких изотипов ADA в образце также подходит препарат против TNFα или антитело против Ig, меченные флуорохромом. Примеры флуорохромов включают, без ограничения, красители Alexa Fluor, DAPI, флуоресцеин, Hoechst 33258, R-фикоцианин, В-фикоэритрин, R-фикоэритрин, родамин, техасский красный и лиссамин. Вторичные антитела, соединенные с флуорохромами, можно приобрести коммерческим путем. В качестве неограничивающего примера козий F(ab′) против конъюгата IgG человека с FITC доступен от Tago Immunologicals (Burlingame, CA).
2
Непрямые метки включают различные ферменты, хорошо известные в данной области, как-то пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (АР), β-галактозидаза, уреаза и др. Детектирующая система с пероксидазой хрена может применяться, к примеру, с хромогенным субстратом тетраметилбензидином (ТМВ), который дает растворимый продукт в присутствии перекиси водорода, детектируемый при 450 нм. Детектирующая система со щелочной фосфатазой может применяться, к примеру, с хромогенным субстратом n-нитрофенилфосфатом, который дает растворимый продукт, хорошо детектируемый при 405 нм. Аналогичным образом детектирующая система с β-галактозидазой может применяться вместе с хромогенным субстратом о-нитрофенил-β-D-галактопиранозидом (ONPG), который дает растворимый продукт, детектируемый при 410 нм. Детектирующая система с уреазой может применяться вместе с таким субстратом, как мочевина-бромокрезол пурпурный (Sigma Immunochemicals; St. Louis, МО). Подходящие вторичные антитела, соединенные с ферментом, можно приобрести из ряда коммерческих источников, например, козий F(ab′) против конъюгата IgG человека со щелочной фосфатазой можно приобрести у Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).
125
Сигнал от прямой или непрямой метки можно анализировать, к примеру, при помощи спектрофотометра для детектирования окраски хромогенного субстрата; радиационного счетчика для детектирования радиации типа гамма-счетчика для определения I; или флуориметра для детектирования флуоресценции в присутствии света определенной длины волны. Для детектирования связанных с ферментом антител можно провести количественный анализ количества одного или нескольких изотипов ADA при помощи спектрофотометра типа ЕМАХ Microplate Reader (Molecular Devices; Menio Park, CA) в соответствии с инструкциями производителя. При желании, способы определения по настоящему изобретению можно автоматизировать или роботизировать, при этом можно одновременно детектировать сигналы от нескольких образцов.
В определенных воплощениях в способах определения по изобретению применяется эксклюзионная хроматография (SEC). Лежащий в основе SEC принцип состоит в том, что частицы различного размера будут проходить (фильтроваться) через неподвижную фазу с различной скоростью. Это приводит к разделению раствора частиц по размеру. При условии, что все частицы наносятся одновременно или почти одновременно, частицы одного размера будут элюироваться вместе. Каждая эксклюзионная колонка имеет свой диапазон молекулярных масс, которые можно разделить. Предел исключения задает молекулярная масса на верхнем конце этого диапазона и находится там, где молекулы слишком большие и не могут застревать в неподвижной фазе. Предел проникновения задает молекулярная масса на нижнем конце диапазона разделения и находится там, где молекулы достаточно малого размера могут полностью проникать в поры неподвижной фазы, а все молекулы меньше этой молекулярной массы настолько малы, что они элюируются как одна полоса.
В некоторых воплощениях элюент собирают в постоянных объемах или фракциях. Чем более близки частицы по размеру, тем вероятнее они попадут в одну и ту же фракцию и не будут детектироваться по отдельности. В предпочтительных воплощениях собранные фракции проверяют спектроскопическими методами для определения концентрации элюируемых частиц. Как правило, спектроскопические методы обнаружения, применимые в настоящем изобретении, включают, без ограничения, флуориметрию, показатель преломления (RI) и ультрафиолет (UV). В некоторых случаях объем элюирования уменьшается с почти линейной зависимостью от логарифма молекулярного гидродинамического объема (т.е. более тяжелые частицы выходят первыми).
В некоторых случаях уровень (концентрация) изотипа ADA, присутствующего в образце типа образца сыворотки, можно сравнивать со стандартной кривой и/или одним или несколькими контролями. В некоторых случаях меченый препарат против TNFα можно инкубировать с известным количеством специфичного к изотопу антитела против Ig при реакции в жидкой фазе для построения стандартной кривой.
В некоторых случаях методы определения изотипа аутоантител по настоящему изобретению основаны на сближении молекул таким образом, что в их основе лежат сигналы, которые генерируются при близко расположенном связывании и меченого препарата против TNFα, и меченого антитела - против Ig, специфичного к изотипу, с изотипом аутоантител. В определенных воплощениях сигнал, издаваемый при основанном на сближении анализе, представлен флуоресцентным сигналом, который детектируется методом резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). В других воплощениях сигнал детектируется другим основанном на сближении методом, как описано здесь или известно специалистам в данной области.
В некоторых случаях несколько меченых антител против Ig, специфичных к различным изотипам антител, все содержат одну и ту же метку. В других случаях несколько меченых антител против Ig, специфичных к различным изотипам антител, все содержат разные метки. Специалистам должно быть известно, что антитела против Ig, которые связываются с определенными классами или подклассами антител (например, изотипами IgA, IgD, IgE, IgG или IgM либо их подклассами Ig, такими как IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4), коммерчески доступны от таких поставщиков, как, к примеру, Miltenyi Biotec GmbH, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Santa Cruz Biotechnology, Inc., Abeam pie, и другие. В некоторых случаях антитело против Ig распознает определенный подкласс Ig (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). В некоторых других случаях антитело против Ig распознает все подклассы Ig (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Например, антитела против IgA (например, из клона IS11-8E10, которые распознают оба подкласса IgA человека), антитела против IgG (например, из клона IS11-3B2.2.3, которые распознают все подклассы изотипа IgG человека), и антитела против IgM (например, из клона PJ2-22H3, которые распознают изотип IgM) можно получить от Miltenyi Biotec GmbH и пометить с помощью детектируемой метки типа флуорофора, используя методы, описанные здесь и известные специалистам. В некоторых случаях можно использовать наборы молекулярных зондов от Life Technologies, такие как Alexa Fluor Protein Labeling Kits и Alexa Fluor Monoclonal Labeling Kits, которые включают реагирующие с аминами красители Alexa Fluor (например, сукцинимидиловые (NHS) эфиры Alexa Fluor и/или тетрафторфениловые (TFP) эфиры Alexa Fluor), для избирательного связывания красителей Alexa Fluor с доступными первичными аминогруппами на антителах.
Термин "сближение" в настоящем изобретении означает пространственную близость или соседство препарата против TNFα к специфичному к изотипу антителу против Ig, когда они оба связаны с тем же самым изотипом аутоантител (т.е. изотипом антител против препарата, такими как ATI типа IgA). В определенных воплощениях связывание препарата против TNFα с изотипом аутоантитела на близком расстоянии или рядом со связыванием специфичного к изотипу антитела против Ig с тем же самым изотипом аутоантитела достаточно для того, чтобы генерировать детектируемый сигнал. В некоторых воплощениях термин "сближение" охватывает такие расстояния между мечеными антителами, когда связывание с тем же самым изотипом аутоантитела достаточно, чтобы генерировать детектируемый сигнал. В некоторых других воплощениях термин "сближение" охватывает такие расстояния между детектируемыми метками (например, флуоресцентными метками), присоединенными к антителам, связанным с тем же самым изотипом аутоантитела, которые достаточны, чтобы генерировать детектируемый сигнал.
FRET означает механизм передачи энергии между двумя флуоресцентными молекулами. При возбуждении донора флуоресценции на свойственной ему длине волны возбуждения флуоресценции это возбужденное состояние безизлучательно переносится на вторую молекулу - акцептор, по механизму дальнодействующего диполь-дипольного сопряжения. Затем донор возвращается в свое основное электронное состояние. Например, см. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Publishing Corp., 2nd Ed. (1999). В контексте настоящего изобретения препарат против TNFα (например, IFX) можно пометить донором, составляющим первый флуоресцентный краситель, а специфичное к изотипу антитело против Ig (например, против IgA, против IgG) можно пометить акцептором, составляющим второй флуоресцентный краситель, который имеет другой спектр возбуждения и излучения, чем первый флуоресцентный краситель. Неограничивающие примеры флуоресцентных красителей, пригодных для применения в качестве детектируемых меток, описаны выше и включают такие флуорофоры, как красители Alexa Fluor (например, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 и/или Alexa Fluor 790) и другие флоурофоры, такие, к примеру, как флуоресцеин, FITC, родамин, техасский красный, TRITC, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, их производные и их комбинации.
В некоторых воплощениях образец типа образца сыворотки, который нужно проверить на наличие (или отсутствие) либо уровень изотипа аутоантител (т.е. изотипа аутоантител к препарату против TNFα) инкубируют и с меченым препаратом против TNFα, и с меченым антителом против Ig, специфичным к изотипу. Если в образце не присутствует тот изотип аутоантител (например, ADA типа IgA), который выявляется определенным специфичным к изотипу антителом против Ig (например, против IgA), то детектируется излучение донора при его возбуждении. С другой стороны, если в образце присутствует тот изотип аутоантител (например, ADA типа IgA), который выявляется определенным специфичным к изотипу антителом против Ig (например, против IgA), то флуорофоры донора и акцептора приходят в непосредственную близость (например, от 1 до 300 нм или от 1 до 200 нм друг от друга, как-то, к примеру, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 нм или в этих пределах, либо от 1 до 10 нм, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нм или в этих пределах) вследствие взаимодействия и меченого препарата против TNFα, и данного меченого антитела против Ig, специфичного к изотипу, с изотипом аутоантитела (например, ATI типа IgA). Межмолекулярный FRET от флуорофора донора на флуорофор акцептора приводит к тому, что преимущественно наблюдается излучение акцептора. Например, возбуждение Alexa-488 в качестве флуорофора донора на препарате против TNFα при 480 нм вызывает образование молекул синглетного кислорода, которые реагируют с производными тиоксена и вызывают хемилюминесценцию, которая в свою очередь возбуждает акцепторный флуорофор Alexa-532 на специфичном к изотипу антителе против Ig, который излучает при 575 нм.
В примере 9 описан типичный основанный на сближении способ определения изотипа по настоящему изобретению для определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или больше изотипов ATI, таких, например, как ATI типа IgA, ATI типа IgD, ATI типа IgE, ATI типа IgG и/или ATI типа IgM методом FRET. В качестве неограничивающего примера: IFX, помеченный первым флуорофором ("F1"), и антитело против IgA, помеченное вторым флуорофором ("F2"), инкубировали с образцом типа образца сыворотки, содержащего один или несколько изотипов ATI, таких как ATI типа IgA. В некоторых воплощениях F2 возбуждается F1 только тогда, когда оба флуорофора находятся в непосредственной близости, а наличие и/или уровень тройного комплекса F1-IFX, F2-анти-IgA и ATI типа IgA является показателем наличия и/или уровня ATI изотипа IgA, который присутствует в образце.
В других воплощениях сигнал, испускаемый при основанном на сближении определении изотипа аутоантител, представлен флуоресцентным сигналом, который можно детектировать методом электрофореза, как-то капиллярного электрофореза (СЕ). Анализ СЕ обычно проводится в кварцевом капилляре небольшого диаметра при высоком (на уровне киловольт) рабочем напряжении со временем разделения в несколько минут. В контексте настоящего изобретения препарат против TNFα (например, IFX) можно пометить фотоактивируемым расщепляющим ферментом, а специфичное к изотипу антитело против Ig (например, против IgA, против IgD, против IgE, против IgG и/или против IgM) можно пометить электрофоретической меткой-репортером типа семейства eTag™ небольших флуоресцентных молекул, описанных в патенте США No. 6,673,550. Связывание меченого препарата против TNFα с изотипом аутоантитела (например, ATI типа IgA) поблизости (например, от 1 до 300 нм или от 1 до 200 нм друг от друга, к примеру, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 нм или в этих пределах, либо от 1 до 10 нм, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нм или в этих пределах) от связывания меченого антитела против Ig, специфичного к изотопу, с тем же самым изотипом аутоантитела запускает отщепление электрофоретической метки-репортера фотоактивируемым расщепляющим ферментом. После фотоактивного отщепления отделившиеся молекулы электрофоретической метки-репортера анализируют путем разделения методом СЕ, как описано, например, в Chan-Hui et al., Clin. Immun., 111: 162-174 (2004). С другой стороны, препарат против TNFα можно пометить электрофоретической меткой-репортером, а специфичное к изотипу антитело против Ig можно пометить фотоактивируемым расщепляющим ферментом. В некоторых воплощениях можно присоединить несколько электрофоретических меток-репортеров к нескольким различным антителам против Ig, специфичным к изотипу, и использовать при мультиплексном анализе для определения наличия (или отсутствия) либо уровня нескольких представляющих интерес изотипов аутоантител.
В других воплощениях сигнал, испускаемый при основанном на сближении определении изотипа аутоантител, представлен сигналом амплификации ДНК, который можно детектировать таким методом амплификации нуклеиновых кислот, как полимеразная цепная реакция (PCR). Применение PCR для амплификации нуклеиновых кислот хорошо известно в данной области и описано, например, в Mullis et al., The Polymerase Chain Reaction, Birkhäuser, Boston (1994); и Innis et al., PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, 1 st Ed., Academic Press (1999). В контексте настоящего изобретения препарат против TNFα (например, IFX) можно пометить первым удлиняющим олигонуклеотидом, а специфичное к изотипу антитело против Ig (например, против IgA, против IgD, против IgE, против IgG и/или против IgM) можно пометить вторым удлиняющим олигонуклеотидом. Если в образце не присутствует тот изотип аутоантител (например, ATI типа IgA), который детектируется данным специфичным к изотипу антителом против Ig (например, против IgA), то соединительный олигонуклеотид (коннектор) гибридизируется независимо с каждым удлиняющим олигонуклеотидом, что не способствует их лигированию. С другой стороны, если в образце присутствует тот изотип аутоантител (например, ATI типа IgA), который детектируется данным специфичным к изотипу антителом против Ig (например, против IgA), то связывание меченого препарата против TNFα с изотипом аутоантитела (например, ATI типа IgA) поблизости (например, от 1 до 300 нм или от 1 до 200 нм друг от друга, к примеру, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 нм или в этих пределах, либо от 1 до 10 нм, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нм или в этих пределах) от связывания меченого антитела против Ig, специфического к изотипу, с тем же самым изотипом аутоантитела способствует гибридизации олигонуклеотида-коннектора одновременно с обоими удлиняющими олигонуклеотидами, тем самым запуская лигирование удлиняющих олигонуклеотидов ДНК-лигазой. Специалистам должно быть понятно, что близость препарата против TNFα к специфичному к изотипу антителу против Ig может варьировать в зависимости от длины удлиняющих олигонуклеотидов. Таким образом, создаются новые разновидности последовательности ДНК, которых раньше не было в реакции, которые можно амплифицировать стандартными методами амплификации ДНК типа PCR. Удлиняющие олигонуклеотиды и соединительные олигонуклеотиды обычно синтезируют химическим путем любыми известными методами, причем они независимо содержат последовательность нуклеотидов длиной по меньшей мере в 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 нуклеотидов.
2
2
2
2
2
2
2
В других воплощениях сигнал, испускаемый при основанном на сближении определении изотипа аутоантител, представлен хемилюминесцентным или флуоресцентным сигналом, который можно детектировать с помощью амплификации сигнала типа тирамидной амплификации сигнала. В контексте настоящего изобретения препарат против TNFα (например, IFX) можно пометить глюкозооксидазой (GO) или любым другим ферментом, катализирующим реакцию окисления/восстановления с участием молекулярного кислорода (O) в качестве акцептора электронов. Специфичное к изотипу антитело против Ig (например, против IgA, против IgD, против IgE, против IgG и/или против IgM) можно пометить пероксидазой типа пероксидазы хрена (HRP), например, прямо или косвенно через представителей связывающей пары типа биотина/стрептавидина. Другие примеры пероксидаз включают, без ограничения, каталазу, хлорпероксидазу, пероксидазу цитохрома С, пероксидазу эозинофилов, пероксидазу глутатиона, лактопероксидазу, миелопероксидазу, пероксидазу щитовидной железы, дейодиназу и др. При контакте GO с субстратом вырабатывается окислитель (т.е. перекись водорода (HO)). Если в образце присутствует тот изотип аутоантитела (например, ATI типа IgA), который детектируется данным специфичным к изотипу антителом против Ig (например, против IgA), то связывание меченого препарата против TNFα с изотипом аутоантитела (например, ATI типа IgA) поблизости (например, от 1 до 300 нм или от 1 до 200 нм друг от друга, к примеру, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300 нм или в этих пределах, либо от 1 до 10 нм, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нм или в этих пределах) от связывания меченого специфичного к изотипу антитела против Ig способствует тому, что HO, образовавшийся GO, канализируется и комплексуется с HRP, образуя комплекс HRP-HO, который в присутствии хемилюминесцентного субстрата (например, люминола, изолюминола) или флуорогенного субстрата (например, тирамида, биотин-тирамида, гомованилиновой кислоты, 4-гидроксифенилуксусной кислоты), издает амплифицированный сигнал.
2
2
Способы применения GO и HRP в основанных на сближении методах описаны, например, в патентном документе РСТ No. WO 2008/036802, содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте и на все случаи. При использовании биотина-тирамида в качестве флуорогенного субстрата комплекс HRP-HO окисляет тирамид с образованием реакционноспособного радикала тирамида, который ковалентно связывается с близлежащими нуклеофильными остатками. Активированный тирамид детектируется либо непосредственно, либо при добавлении детектирующего сигнал реагента, такого, к примеру, как меченный стрептавидином флуорофор или комбинация из меченной стрептавидином пероксидазы и хромогенного реагента. Примеры флуорофоров, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, без ограничения, любые из описанных здесь флуорофоров, включая красители Alexa Fluor (например, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660. Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750 и/или Alexa Fluor 790), флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), Oregon Green™, родамин, техасский красный, тетрародамин изотиоцианат (TRITC), флуорофоры CyDye™ (например, Cy2, Cy3, Cy5) и др. Стрептавидиновую метку можно присоединить прямо или косвенно к флуорофору или пероксидазе при помощи хорошо известных методов. Неограничивающие примеры хромогенных реагентов включают 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (ТМВ), 3,3′-диаминобензидин (DAB), 2,2′-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) (ABTS), 4-хлор-1-нафтол (4CN) и/или порфириноген.
Другие основанные на сближении методы, подходящие для применения в способах определения изотипа аутоантител по настоящему изобретению, описаны в патентном документе РСТ No. WO 2008/036802, содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте на все случаи.
Способы обнаружения антител против TNF и таких антител против препаратов, как HACA и HAHA, дополнительно описаны в патентном документе РСТ No. WO 2011/056590, содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте на все случаи.
В другом аспекте настоящим изобретением предусмотрен способ оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности у субъекта, получающего курс терапии для лечения опосредованных TNFα заболеваний, который включает:
(a) анализ образца, взятого у субъекта, для определения наличия, уровня или генотипа одного или нескольких маркеров в образце;
(b) применение статистического алгоритма к наличию, уровню или генотипу одного или нескольких маркеров, определенных на стадии (a); и
(c) определение последующей дозы курса терапии для субъекта или же того, что следует назначить другой курс терапии для субъекта на основании статистического алгоритма, примененного на стадии (b).
В некоторых воплощениях курс терапии включает препарат против TNFα типа антител против TNFα. В некоторых случаях антитело против TNFα выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций.
В некоторых воплощениях один или несколько (например, множество) маркеров включают препарат против TNFα (например, антитело против TNFα), аутоантитело к препарату против TNFα типа антитела против TNFα (например, HACA, HAHA, HAMA и/или их изотипы), цитокин, генетический маркер или их комбинации. В некоторых случаях цитокин выбран из группы, состоящей из TNFα, IL-6, IL-1β, IFN-γ, IL-10 и их комбинаций. В некоторых других случаях генетическим маркером является мутация у гена воспалительного пути. В предпочтительных воплощениях генетическим маркером является мутация у гена, выбранного из группы, состоящей из NOD2/CARD15, ATG16L1, IL23R, генов антигенов лейкоцитов человека (HLA), генов цитокинов, DLG5, OCTN и их комбинаций.
В других воплощениях стадия (a) способа оптимизации терапии и/или снижения токсичности включает определение наличия, уровня или генотипа двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или больше маркеров в образце. В некоторых воплощениях образец выбран из группы, состоящей из сыворотки, плазмы, цельной крови икала.
В следующих воплощениях статистический алгоритм включает обучающуюся систему статистических классификаторов. В некоторых случаях обучающаяся система статистических классификаторов выбирается из группы, состоящей из случайного леса, дерева классификации и регрессии, усиленного дерева, нейронных сетей, метода опорных векторов, общей модели автоматического детектора взаимодействий по закону хи-квадрат, интерактивного дерева, многомерного адаптивного регрессионного сплайна, классификаторов машинного обучения и их комбинаций. В некоторых воплощениях статистический алгоритм включает лишь одну обучающуюся систему статистических классификаторов. В других воплощениях статистический алгоритм включает комбинацию из по меньшей мере двух обучающихся систем статистических классификаторов. В некоторых случаях применяются параллельно по меньшей мере две обучающиеся системы статистических классификаторов.
В некоторых воплощениях способ оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности дополнительно включает отправление результатов определения из стадии (c) лечащему врачу. В других воплощениях стадия (b) способа оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности дополнительно включает применение статистического алгоритма к наличию, уровню или генотипу одного или нескольких маркеров, определенных в более раннее время в течение курса терапии.
В других воплощениях последующая доза в курсе терапии увеличивается, уменьшается или сохраняется на основании статистического алгоритма, примененного на стадии (b). В некоторых случаях другой курс терапии включает другой препарат против TNFα (например, антитело против TNFα). В других случаях другой курс терапии включает текущий курс терапии вместе с иммунодепрессивным средством.
В некоторых воплощениях препарат против TNFα (например, антитело против TNFα) определяется способом, включающим:
(a) контактирование меченого TNFα с образцом для формирования меченого комплекса с препаратом против TNFα;
(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса; и
(c) детектирование меченого комплекса, тем самым определяется препарат против TNFα.
В некоторых случаях препарат против TNFα (например, антитело против TNFα) выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций. В некоторых случаях меченый TNFα представлен меченным флуорофором TNFα. В других случаях препарат против TNFα (например, антитело против TNFα) определяется количественно. В некоторых воплощениях меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободный меченый TNFα. В других воплощениях эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-FIPLC).
В других воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα (например, антителу против TNFα) определяется способом, включающим:
(a) контактирование меченого препарата против TNFα с образцом для формирования меченого комплекса с аутоантителом;
(b) подвергание меченого комплекса эксклюзионной хроматографии для отделения меченого комплекса; и
(c) детектирование меченого комплекса, тем самым определяется аутоантитело. В некоторых случаях аутоантитело выбирается из группы, состоящей из человеческих против мышиных антител (HAMA), человеческих против химерных антител (HACA), человеческих против гуманизированных антител (HAHA) и их комбинаций. В некоторых других случаях меченый препарат против TNFα (например, антитело против TNFα) выбирается из группы, состоящей из REMICADE™ (инфликсимаб), ENBREL™ (этанерцепт), HUMIRA™ (адалимумаб), CIMZIA (цертолизумаб-пегол) и их комбинаций.
В некоторых воплощениях меченый препарат против TNFα представлен меченным флуорофором TNFα. В других случаях препарат против TNFα (например, антитело против TNFα) определяется количественно. В некоторых воплощениях меченый комплекс элюируется первым, а за ним следует свободный меченый TNFα. В других воплощениях эксклюзионная хроматография представлена эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографией (SE-HPLC).
В некоторых воплощениях аутоантитело к препарату против TNFα (например, антителу против TNFα) детектируется любым из описанных здесь способов определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного изотипа (например, нескольких изотипов) аутоантител к препарату против TNFα.
В других воплощениях в описанных здесь способах оптимизации терапии и/или уменьшения токсичности можно применять методы анализа, описанные в публикации РСТ No. WO 2011/056590 (содержание которого включено сюда путем ссылки во всей полноте и на все случаи) для обнаружения препаратов против TNFα (например, антител против TNFα) и аутоантител к препаратам против TNFα (например, HACA, HAHA, HAMA и др.).
В некоторых воплощениях способы настоящего изобретения обеспечивают информацию, полезную для направления решений по лечению пациентов, получающих терапию препаратом против TNF, например, определяя то, когда и как нужно скорректировать или изменить (например, увеличить или уменьшить) последующую дозу препарата против TNF, определяя то, когда и как нужно скомбинировать препарат против TNF (например, при повышенной, пониженной или такой же дозе) с одним или несколькими иммунодепрессивными средствами, такими как метотрексат (MTX) или азатиоприн (AZA), и/или определяя то, когда и как нужно изменить текущий курс терапии (например, перейти на другой препарат против TNF). Соответственно, настоящее изобретение находит применение тем, что оно способствует лечению пациентов путем определения иммунного статуса пациентов.
В других воплощениях описанные здесь способы определения можно использовать для прогнозирования переносимости (например, токсичности) препарата против TNF, особенно антител против TNFα у субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием (например, ревматоидным артритом, болезнью Крона и др.). В этом способе путем анализа субъекта на наличие (или отсутствие) либо уровень одного или нескольких изотипов ADA можно предсказать, будет ли субъект переносить терапию препаратом против TNF (например, не возникать или не испытывать такие побочные эффекты, как иммунный ответ к препарату против TNF).
В следующих воплощениях описанные здесь способы определения можно использовать для мониторинга аутоиммунного заболевания у субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, что включает анализ субъекта на наличие (или отсутствие) либо уровень одного или нескольких изотипов ADA по времени. В этом способе можно контролировать, будет ли субъект переносить терапию препаратом против TNF в течение заданного промежутка времени
Статистический анализ
В некоторых аспектах настоящим изобретением предусмотрены способы оптимизации терапии препаратом против TNF, уменьшения токсичности в связи с терапией препаратом против TNF и/или контролирования эффективности лечения препаратом против TNF путем применения статистического алгоритма к одному или нескольким (например, комбинации из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или больше) биохимическим маркерам, серологическим маркерам и/или генетическим маркерам. В предпочтительных воплощениях применяется квантильный анализ к наличию, уровню и/или генотипу одного или нескольких маркеров, чтобы направить решения по лечению для пациентов, получающих терапию препаратом против TNF. В других воплощениях лишь одна или комбинация из двух или нескольких обучающихся систем статистических классификаторов применяется к наличию, уровню и/или генотипу одного или нескольких маркеров, чтобы направить решения по лечению для пациентов, получающих терапию препаратом против TNF. Статистический анализ в способах настоящего изобретения преимущественно обеспечивает улучшение чувствительности, специфичности, отрицательной прогностической ценности, положительной прогностической ценности и/или общей точности при определения того, когда или как нужно скорректировать или изменить (например, увеличить или уменьшить) последующую дозу препарата против TNF, скомбинировать препарат против TNF (например, при повышенной, пониженной или такой же дозе) с одним или несколькими иммунодепрессивными средствами, такими как метотрексат (МТХ) или азатиоприн (AZA), и/или изменить текущий курс терапии (например, перейти на другой препарат против TNF).
Термин "статистический анализ" или "статистический алгоритм" или "статистический процесс" охватывает любые из целого ряда статистических методов и моделей, используемых для определения взаимоотношений между переменными. В настоящем изобретении переменными являются наличие, уровень или генотип по меньшей мере одного представляющего интерес маркера. Описанными здесь методами статистического анализа можно анализировать любое количество маркеров. Например, статистический анализ может включать наличие или уровень 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 или больше маркеров. В одном воплощении применяется логистическая регрессия. В другом воплощении применяется линейная регрессия. В некоторых предпочтительных воплощениях статистический анализ по настоящему изобретению включает квантильное измерение одного или нескольких маркеров, например, внутри данной популяции, в качестве переменного. Квантили представляют собой набор "точек отсечки", разделяющих выборку данных на группы, содержащие (насколько это возможно) равное количество наблюдений. Например, квартили - это значения, которые делят выборку данных на четыре группы, содержащие (насколько это возможно) равное количество наблюдений. Нижний квартиль - это значение, отсекающее четвертую часть упорядоченного набора данных снизу вверх, а верхний квартиль - это значение, отсекающее четвертую часть упорядоченного набора данных сверху вниз. Квинтили - это значения, которые делят выборку данных на пять групп, содержащих (насколько это возможно) равное количество наблюдений. Настоящее изобретение также может включать использование процентильных диапазонов уровня маркеров (например, тертилей, квартилей, квинтилей и т.д.) или их кумулятивных индексов (например, суммы квартилей уровня маркеров для получения показателя суммы квартилей (QSS) и т.д.) в качестве переменных при статистическом анализе (точно так же, как с непрерывными переменными).
В некоторых воплощениях настоящее изобретение включает обнаружение или определение наличия, уровня (например, величины) и/или генотипа одного или нескольких представляющих интерес маркеров при помощи квартального анализа. В этом типе статистического анализа уровень представляющего интерес маркера определяется как попадающий в первый квартиль (<25%), второй квартиль (25-50%), третий квартиль (51%-<75%) или четвертый квартиль (75-100%) относительно контрольной базы данных по образцам. Этим квартилям могут быть приписаны квартальные баллы: 1, 2, 3 и 4, соответственно. В некоторых случаях тем маркерам, которые не обнаруживаются в образце, присваивается квартальный балл 0 или 1, тогда как маркерам, которые обнаруживаются (например, присутствуют) в образце (т.е. образец положителен по данному маркеру), присваивается квартальный балл 4. В некоторых воплощениях квартиль 1 представляет образцы с наименьшими уровнями маркеров, тогда как квартиль 4 представляет образцы с наибольшими уровнями маркеров. В других воплощениях квартиль 1 представляет образцы с определенным генотипом маркера (например, аллель дикого типа), тогда как квартиль 4 представляет образцы с другим определенным генотипом маркера (например, аллельный вариант). Контрольная база данных по образцам может включать широкий спектр пациентов с такими опосредованными TNFα заболеваниями, как, например, IBD. Из такой базы данных могут быть установлены точки отсечки квартилей. Неограничивающий пример квартального анализа, подходящий для применения в настоящем изобретении, описан, например, в Mow et аl., Gastroenterology, 126: 414-24 (2004).
В некоторых воплощениях статистический анализ по настоящему изобретению включает одну или несколько обучающихся систем статистических классификаторов. Термин "обучающаяся система статистических классификаторов" в настоящем изобретении включает алгоритмический метод машинного обучения, который способен адаптироваться к сложным наборам данных (например, комплектам представляющих интерес маркеров) и принимать решения на основе таких наборов данных. В некоторых воплощениях используется лишь одна обучающаяся система статистических классификаторов, как-то дерево принятия решений/классификации (например, случайный лес (RF) или дерево классификации и регрессии (C&RT)). В других воплощениях используется комбинация из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше обучающихся систем статистических классификаторов, предпочтительно параллельно. Примеры обучающихся систем статистических классификаторов включают, без ограничения, такие системы, в которых используется индуктивное обучение (например, дерево принятия решений/классификации типа случайного леса, дерева классификации и регрессии (C&RT), усиленного дерева и др.), вероятно-приблизительно верное (PAC) обучение, коннекционное обучение (например, нейронные сети (NN), искусственные нейросети (ANN), нечеткие нейронные сети (NFN), сетевые структуры, перцептроны типа многослойных перцептронов, многослойные упреждающие сети, прикладные нейросети, байесовские сети и др.), стимулированное обучение (например, пассивное обучение в известной среде, как-то "наивное" обучение, адаптивное динамическое обучение и метод временных различий, пассивное обучение в неизвестной среде, активное обучение в неизвестной среде, целевое обучение, прикладное стимулированное обучение и др.), а также генетические алгоритмы и эволюционное программирование. Другие обучающиеся системы статистических классификаторов включают методы опорных векторов (например, ядерные методы), многомерные адаптивные регрессионные сплайны (MARS), алгоритмы Levenberg-Marquardt, алгоритмы Гаусса-Ньютона, смешанные гауссовы классификаторы, алгоритмы градиентного спуска и квантование обучающего вектора (LVQ).
Случайный лес - это такая обучающаяся система статистических классификаторов, которая строится по алгоритму, разработанному Leo Breiman и Adele Cutler. В случайном лесе используется большое число деревьев принятия решений, а класс устанавливается путем выбора значения моды (т.е. наиболее часто встречающегося) из всех классов, установленных по индивидуальным деревьям. Анализ методом случайного леса может осуществляться, например, с помощью программы RandomForests фирмы Salford Systems (San Diego, CA). Например, см. описание метода случайного леса в Breiman, Machine Learning, 45: 5-32 (2001); и http://stat-www.berkeley.edu/users/breimaiVRandomForests/cc_home.htm.
Дерево классификации и регрессии представляет компьютерную альтернативу аппроксимации в классических моделях регрессии и обычно применяется для определения наилучшей модели для категориальной или непрерывной характеристики, исходя из одного или нескольких прогнозирующих параметров (предикторов). Анализ методом дерева классификации и регрессии может осуществляться, например, с помощью программы C&RT фирмы Salford Systems или программы анализа данных Statistica фирмы StatSoft, Inc. (Tulsa, OK). Описание метода дерева классификации и регрессии приведено, например, в Breiman et al. "Classification and Regression Trees," Chapman and Hall, New York (1984); и Steinberg et al. "CART: Tree-Structured Non-Parametric Data Analysis," Salford Systems, San Diego (1995).
Нейронные сети - это взаимосвязанные группы искусственных нейронов, в которых для обработки информации применяются математические или вычислительные модели на основе коннекционного подхода к вычислениям. Как правило, нейронные сети представляют собой адаптивные системы, которые изменяют свою структуру, исходя из внешней или внутренней информации, проходящей через сеть. Конкретные примеры нейронных сетей включают упреждающие нейросети, как-то перцептроны, однослойные перцептроны, многослойные перцептроны, сети с обратным распространением (ошибок), сети ADALINE, сети MADALINE, сети Learnmatrix, сети с использованием радиальных базисных функций (RBF) и самоорганизующиеся карты или самоорганизующиеся сети Кохонена; рекуррентные нейросети, как-то простые рекуррентные сети и сети Хопфилда; стохастические нейросети типа "машины Больцмана"; модульные нейросети, как-то ансамбли (комитеты) машин и ассоциативные нейросети; и другие типы сетей, как-то нейронные сети с мгновенным обучением, спайковые нейросети, динамические нейросети и каскадные нейросети. Анализ методом нейронных сетей может осуществляться, например, с помощью программы анализа данных Statistica фирмы StatSoft, Inc. Описание нейронных сетей приведено, например, в Freeman et al., In "Neural Networks: Algorithms, Applications and Programming Techniques," Addison-Wesley Publishing Company (1991); Zadeh, Information and Control, 8: 338-353 (1965); Zadeh, "IEEE Trans. on Systems, Man and Cybernetics," 3: 28-44 (1973); Gersho et al., In "Vector Quantization and Signal Compression," Kluywer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, London (1992); и Hassoun, "Fundamentals of Artificial Neural Networks," MIT Press, Cambridge, Massachusetts, London (1995).
light
Метод опорных векторов представляет собой свод родственных методов контролируемого обучения, которые описаны, например, в Cristianini et al., "An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-Based Learning Methods," Cambridge University Press (2000). Анализ методом опорных векторов может осуществляться, например, с помощью программы SVM, разработанной Thorsten Joachims (Comell University), или с помощью программы LIBSVM, разработанной Chih-Chung Chang и Chih-Jen Lin (National Taiwan University).
Различные статистические методы и модели, описанные здесь, можно довести и проверить на образцах (например, серологических и/или геномных образцах) из когорты здоровых лиц и когорты больных опосредованным TNFα заболеванием, таким, например, как воспалительная болезнь кишечника (IBD) (например, болезнь Крона (CD) и/или язвенный колит (UC)). Например, для доводки и проверки статистических методов и моделей настоящего изобретения подходят образцы от пациентов, которым поставлен врачом, предпочтительно гастроэнтерологом, диагноз IBD или его клинического подтипа с использованием биопсии, колоноскопии или иммуноанализа, как описано, например, в патенте США No. 6,218,129. Образцы от пациентов с диагнозом IBD можно еще подразделить на болезнь Крона и язвенный колит с помощью иммуноанализа, как описано, например, в патентах США Nos. 5,750,355 и 5,830,675. Образцы от здоровых лиц могут включать те, которые не были идентифицированы как образцы при IBD. Специалистам должны быть известны и другие методы и критерии диагностики для получения образцов из когорты пациентов, которые можно использовать при доводке и проверке статистических методов и моделей настоящего изобретения.
В настоящем изобретении термин "чувствительность" означает вероятность того, что способ настоящего изобретения для оптимизации терапии препаратом против TNF, уменьшения токсичности в связи с терапией препаратом против TNF и/или контроля за эффективностью лечения препаратом против TNF дает положительный результат, если образец будет положительным, например, проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF. Чувствительность вычисляется как количество истинно положительных результатов, деленное на сумму истинно положительных и ложно отрицательных. Чувствительность по сути является мерой того, насколько правильно настоящее изобретение идентифицирует тех, кто проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF, от тех, кто не проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию или токсичность. Статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы чувствительность составляла по меньшей мере 60% или же, например, по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
Термин "специфичность" означает вероятность того, что способ настоящего изобретения для оптимизации терапии препаратом против TNF, уменьшения токсичности в связи с терапией препаратом против TNF и/или контроля за эффективностью лечения препаратом против TNF дает отрицательный результат, если образец не будет положительным, например, не проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF. Специфичность вычисляется как количество истинно отрицательных результатов, деленное на сумму истинно отрицательных и ложно положительных. Специфичность по сути является мерой того, насколько правильно настоящее изобретение исключает тех, кто не проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF, от тех, кто проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию или токсичность. Статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы специфичность составляла по меньшей мере 60% или же, например, по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
Термин "отрицательная прогностическая ценность" или "NPV" означает вероятность того, что лицо, идентифицированное как проявляющее ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF, на самом деле не проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию или токсичность. Отрицательная прогностическая ценность вычисляется как число истинно отрицательных результатов, деленное на сумму истинно отрицательных и ложно отрицательных. Отрицательная прогностическая ценность определяется характеристиками способов настоящего изобретения, а также распространенностью заболевания в анализируемой популяции. Статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы отрицательная прогностическая ценность в популяции с распространенным в ней заболеванием составляла от 70% до 99% или же, к примеру, по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%. 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
Термин "положительная прогностическая ценность" или "PPV" означает вероятность того, что лицо, идентифицированное как проявляющее ожидаемую терапевтическую реакцию на терапию препаратом против TNF или токсичность в связи с терапией препаратом против TNF, действительно проявляет ожидаемую терапевтическую реакцию или токсичность. Положительная прогностическая ценность вычисляется как число истинно положительных результатов, деленное на сумму истинно положительных и ложно положительных. Положительная прогностическая ценность определяется характеристиками способов настоящего изобретения, а также распространенностью заболевания в анализируемой популяции. Статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы положительная прогностическая ценность в популяции с распространенным в ней заболеванием составляла от 70% до 99% или же, к примеру, по меньшей мере 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
На прогностическую ценность, в том числе отрицательную и положительную прогностическую ценность, влияет распространенность заболевания в анализируемой популяции. В настоящем изобретении статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы получить требуемый клинический параметр для клинической популяции с определенной распространенностью опосредованного TNFα заболевания, такого, например, как IBD. В качестве неограничивающего примера: статистические методы и модели можно выбрать для распространенности IBD, составляющей до 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70%, что наблюдается, например, у лечащих врачей типа гастроэнтерологов или врачей общего профиля.
В настоящем изобретении термин "общая согласованность" или "общая точность" означает точность, с которой способ настоящего изобретения оптимизирует терапию препаратом против TNF, уменьшает токсичность в связи с терапией препаратом против TNF и/или контролирует эффективность лечения препаратом против TNF. Общая точность вычисляется как сумма истинно положительных и истинно отрицательных результатов, деленная на общее число результатов по образцам, и на нее влияет распространенность заболевания в анализируемой популяции. Например, статистические методы и модели можно выбрать таким образом, чтобы общая точность в популяции с распространенным в ней заболеванием составляла по меньшей мере 40% или же, например, по меньшей мере 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%. 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.
Маркеры воспаления
Различные маркеры воспаления, включая биологические маркеры, серологические маркеры, белковые маркеры, генетические маркеры и другие клинические или эхографические характеристики, подходят для применения в способах настоящего изобретения для оптимизации терапии, уменьшения токсичности и/или контроля за эффективностью терапевтического лечения такими лекарственными средствами, как биологические препараты (например, препараты против TNF). В некоторых аспектах в описанных здесь способах используются алгоритмы (например, статистический анализ), которые применяются к определению наличия, уровня концентрации и/или генотипа одного или нескольких маркеров воспаления, что способствует оптимизации терапии препаратом против TNF, уменьшению токсичности в связи с терапией препаратом против TNF или контролю за эффективностью терапевтического лечения препаратом против TNF.
Неограничивающие примеры маркеров воспаления включают: (i) биохимические, серологические и белковые маркеры, такие, например, как цитокины, белки острой фазы, молекулы клеточной адгезии и их комбинации; и (ii) генетические маркеры, такие, например, как любые из генов, приведенных в таблице 1 (например, NOD2).
А. Цитокины
Определение наличия или уровня по меньшей мере одного цитокина в образцах особенно полезно в настоящем изобретении. Термин "цитокин" в настоящем изобретении обозначает любые из множества полипептидов или белков, секретируемых иммунными клетками, которые регулируют ряд функций иммунной системы, и охватывает небольшие цитокины, как-то хемокины. Термин "цитокин" также включает адипоцитокины, составляющие группу цитокинов, секретируемых адипоцитами, которые участвуют, к примеру, в регуляции массы тела, кроветворении, ангиогенезе, заживлении ран, устойчивости к инсулину, иммунном ответе и воспалительных реакциях.
3
В некоторых аспектах в образце определяется наличие или уровень по меньшей мере одного цитокина, включая, без ограничения, TNF-α, родственный TNF слабый индуктор апоптоза (TWEAK), остеопротегерин (OPG), IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, антагонист рецептора EL-1 (IL-1Ra), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, растворимый рецептор IL-6 (sIL-6R), EL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-23 и DL-27. В некоторых других аспектах в образце определяется наличие или уровень по меньшей мере одного хемокина, такого, к примеру, как CXCL1/GRO1/GROα, CXCL2/GRO2, CXCL3/GRO3, CXCL4/PF-4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-1, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15, CXCL16, CXCL17/DMC, CCL1, CCL2/MCP-1, CCU/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/CCL10, CCL11/эотаксин, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/MIP-5, CCL16/LEC, CCL17/TARC, CCL18/MIP-4, CCL19/MIP-3β, CCL20/MIP-3α, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF1, CCL24/эотаксин-2, CCL25/TECK, CCL26/эотаксин-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CL1, CL2 и CXCL1. В некоторых других аспектах в образце определяется наличие или уровень по меньшей мере одного адипоцитокина, включая, без ограничения, лептин, адипонектин, резистин, активный или общий ингибитор-1 активатора плазминогена (PAI-1), висфатин и ретинол-связывающий белок 4 (RBP4). Предпочтительно определяется наличие или уровень TNFα, IL-6, IL-1β, IFN-γ и/или IL-10.
В некоторых случаях наличие или уровень конкретного цитокина определяется на уровне экспрессии мРНК таким методом, к примеру, как метод гибридизации или метод на основе амплификации. В некоторых других случаях наличие или уровень конкретного цитокина определяется на уровне экспрессии белка, к примеру, методом иммуноанализа (например, ELISA) или иммуногистохимическим методом. Подходящие наборы ELISA для определения наличия или уровня такого цитокина, как IL-6, IL-1β или TWEAK в образце сыворотки, плазмы, слюны или мочи доступны, например, от R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN), Neogen Corp.(Lexington, KY), Alpco Diagnostics (Salem, NH), Assay Designs Inc. (Ann Arbor, MI), BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), uivitrogen (Camarillo, CA), Calbiochem (San Diego, CA), Chemicon International Inc. (Temecula, CA), Antigenix America Inc. (Huntington Station, NY), Qiagen Inc. (Valencia, CA), Bio-Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA) и/или Bender MedSystems Inc. (Burlingame, CA).
Последовательность полипептида IL-6 человека приведена, например, в Genbank Accession No. NP_000591. Последовательность (кодирующая) мРНК IL-6 человека приведена, например, в Genbank Accession No. NM_000600. Специалистам должно быть известно, что IL-6 также известен как интерферон бета-2 (IFNB2), HGF, HSF и BSF2.
Последовательность полипептида IL-1(3 человека приведена, например, в Genbank Accession No. NP_000567. Последовательность (кодирующая) мРНК IL-1β человека приведена, например, в Genbank Accession No. NM_000576. Специалистам должно быть известно, что IL-1β также известен как IL1F2 и IL-1 бета.
Последовательность полипептида TWEAK человека приведена, например, в Genbank Accession Nos. NP_003800 and AAC51923. Последовательность (кодирующая) мРНК TWEAK человека приведена, например, в Genbank Accession Nos. NM_003809 и ВС 104420. Специалистам должно быть известно, что TWEAK также известен как 12-й представитель суперсемейства лигандов фактора некроза опухолей (TNFSF12), лиганд АРОЗ (AP03L), CD255, лиганд DR3, индуцируемый фактором роста лиганд 14 (Fn14) и UNQ181/PR0207.
B. Белки острой фазы
Определение наличия или уровня одного или нескольких белков острой фазы в образцах также полезно в настоящем изобретении. Белки острой фазы представляют собой класс белков, концентрация которых в плазме повышается (положительные белки острой фазы) или снижается (отрицательные белки острой фазы) в ответ на воспаление. Такая реакция называется реакцией острой фазы (также может называться ответ острой фазы). Примеры положительных белков острой фазы включают, без ограничения, C-реактивный белок (CRP), D-димерный белок, связывающий маннозу белок, альфа1-антитрипсин, альфа1-антихимотрипсин, альфа2-макроглобулин, фибриноген, протромбин, фактор VIII, фактор фон Виллебранда, плазминоген, факторы комплемента, ферритин, P-компонент сывороточных амилоидов, сывороточный амилоид A (SAA), орозомукоид (кислый альфа1-гликопротеин, AGP), церулоплазмин, гаптоглобин и их комбинации. Неограничивающие примеры отрицательных белков острой фазы включают альбумин, трансферрин, транстиретин, транскортин, ретинол-связывающий белок и их комбинации. Предпочтительно определяется наличие или уровень CRP и/или SAA.
В некоторых случаях наличие или уровень конкретного белка острой фазы определяется на уровне экспрессии мРНК таким методом, к примеру, как метод гибридизации или метод на основе амплификации. В некоторых других случаях наличие или уровень конкретного белка острой фазы определяется на уровне экспрессии белка, к примеру, методом иммуноанализа (например, ELISA) или иммуногистохимическим методом. Например, для определения уровня CRP в образцах сыворотки, плазмы, мочи или кала можно использовать колориметрический метод "сэндвич"-ELISA фирмы Alpco Diagnostics (Salem, NH). Также для определения уровня CRP в образцах можно использовать набор, для ELISA фирмы Biomeda Corporation (Foster City, CA). Другие методы определения уровня CRP в образцах описаны, например, в патентах США Nos. 6,838,250 и 6,406,862; и патентных документах США Nos. 20060024682 и 20060019410. Дополнительные методы определения уровня CRP включают, например, иммунотурбидиметрические методы, методы быстрой иммунодиффузии и визуальные методы агглютинации. Подходящие наборы ELISA для определения наличия или уровня SAA в таких образцах, как сыворотка, плазма, слюна, моча или кал, доступны, например, от Antigenix America Inc. (Huntington Station, NY), Abazyme (Needham, MA), USCN Life (Missouri City, TX) и/или U.S. Biological (Swampscott, MA).
C-реактивный белок (CRP) - это белок, который обнаруживается в крови в ответ на воспаление (белок острой фазы). Как правило, CRP вырабатывается в печени и тучных клетках (адипоцитах). Он является представителем семейства белков пентраксинов. Последовательность полипептида CRP человека приведена, например, в Genbank Accession No. NP_000558. Последовательность (кодирующая) мРНК CRP человека приведена, например, в Genbank Accession No. NM_000567. Специалистам должно быть известно, что CRP также известен как РТХ1, MGC88244 и MGC149895.
Белки сывороточного амилоида A (SAA) представляют собой семейство алолипопротеинов, связанных с липопротеинами высокой плотности (HDL) в плазме. Различные изоформы SAA экспрессируются конститутивно (конститутивные SAAs) на разных уровнях в ответ на воспалительные раздражители (SAAs острой фазы). Эти белки преимущественно вырабатываются в печени. Консервативность этих белков у всех беспозвоночных и позвоночных говорит о том, что SAAs играют очень важную роль у всех животных. Белки сывороточного амилоида А острой фазы (A-SAAs) секретируются во время острой фазы воспаления. Последовательность полипептида SAA человека приведена, например, в Genbank Accession No. NP_000322. Последовательность (кодирующая) мРНК SAA человека приведена, например, в Genbank Accession No. NM_000331. Специалистам должно быть известно, что SAA также известен как PIG4, TP53I4, MGC111216 и SAA1.
C. Молекулы клеточной адгезии (IgSF CAMs)
Определение наличия или уровня одной или нескольких молекул клеточной адгезии из суперсемейства иммуноглобулинов в образцах также полезно в настоящем изобретении. Термин "молекула клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов" (IgSF САМ) в настоящем изобретении включает любые из целого ряда полипептидов или белков, расположенных на поверхности клетки, которые содержат один или несколько подобных складке иммуноглобулина доменов и участвуют в межклеточной адгезии и/или передаче сигналов. Во многих случаях IgSF CAMs являются трансмембранными белками. Неограничивающие примеры IgSF CAMs включают нейрональные молекулы клеточной адгезии (NCAMs; например, NCAM-120, NCAM-125, NCAM-140, NCAM-145, NCAM-180, NCAM-185 и др.), молекулы межклеточной адгезии (ICAMs, например, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 и ICAM-5), сосудистую молекулу клеточной адгезии-1 (VCAM-1), тромбоцитарно-эндотелиальную молекулу клеточной адгезии-1 (РЕСАМ-1), молекулу клеточной адгезии LI (L1CAM), молекулу клеточной адгезии с гомологией к L1CAM (близкий гомолог L1) (CHL1), связывающие сиаловую кислоту Ig-подобные лектины (SIGLECs; например, SIGLEC-1, SIGLEC-2, SIGLEC-3, SIGLEC-4 и др.), нектины (например, нектин-1, нектин-2, нектин-3 и др.) и нектиноподобные молекулы (например, Necl-1, Necl-2, Necl-3, Necl-4 и Necl-5). Предпочтительно определяется наличие или уровень ICAM-1 и/или VCAM-1.
Молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1)
ICAM-1 представляет собой трансмембранный белок клеточной адгезии, который постоянно присутствует в низких концентрациях в мембранах лейкоцитов и эндотелиальных клеток. При стимуляции лейкоцитов его концентрация сильно возрастает. ICAM-1 может индуцироваться IL-1 и TNFα и экспрессируется в сосудистом эндотелии, макрофагах и лимфоцитах. При IBD провоспалительные цитокины вызывают воспаление путем усиления экспрессии таких молекул адгезии, как ICAM-1 и VCAM-1. Повышенная экспрессия молекул адгезии привлекает больше лимфоцитов к инфицированной ткани, что приводит к воспалению ткани (см. Goke et а1., J. Gastroenterol., 32:480 (1997); и Rijcken et а1., Gut, 51:529 (2002)). ICAM-1 кодируется геном молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1; Entrez GeneID: 3383; Genbank Accession No. NM_000201) и вырабатывается после процессинга полипептида-предшественника молекулы межклеточной адгезии 1 (Genbank Accession No. NP_000192).
Сосудистая молекула клеточной адгезии-1 (VCAM-1)
VCAM-1 представляет собой трансмембранный белок клеточной адгезии, который опосредует адгезию лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов к сосудистому эндотелию. Усиление экспрессии VCAM-1 в эндотелиальных клетках цитокинами происходит в результате повышения транскрипции гена (например, в ответ на фактор некроза опухолей-альфа (TNFα) и интерлейкин-1 (IL-1)). VCAM-1 кодируется геном сосудистой молекулы клеточной адгезии 1 (VCAM1; Entrez GeneID: 7412) и вырабатывается после дифференциального сплайсинга транскрипта (Genbank Accession No. NM_001078 (вариант 1) или NM_080682 (вариант 2)) и процессинга сплайс-изоформы полипептида предшественника (Genbank Accession No. NP_001069 (изоформа a) или NP_542413 (изоформа b)).
В некоторых случаях наличие или уровень IgSF CAM определяется на уровне экспрессии мРНК таким методом, к примеру, как метод гибридизации или метод на основе амплификации. В некоторых других случаях наличие или уровень IgSF САМ определяется на уровне экспрессии белка, к примеру, методом иммуноанализа (например, ELISA) или иммуногистохимическим методом. Подходящие антитела и/или наборы ELISA для определения наличия или уровня ICAM-1 и/или VCAM-1 в таких образцах, как образцы ткани, биопсии, сыворотки, плазмы, слюны, мочи или кала, доступны, например, от Invitrogen (Camarillo, CA), Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) и/или Abcam Inc. (Cambridge, MA).
D. Генетические маркеры
Определение наличия или отсутствия аллельных вариантов у одного или нескольких генетических маркеров в образце также полезно в настоящем изобретении. Неограничивающие примеры генетических маркеров включают, без ограничения, любые из генов воспалительного пути и соответствующие SNPs, которые можно генотипировать так, как изложено в таблице 1 (например, ген NOD2/CARD15, ген пути IL12/IL23 и т.д.). Предпочтительно определяется наличие или отсутствие по меньшей мере одного аллельного варианта, например, полиморфизма по одному нуклеотиду (SNP) у гена NOD2/CARD15 и/или одного или нескольких генов в пути IL12/IL23. Например, см. Barren et aL, Nat. Genet., 40:955-62 (2008); и Wang et al., Amer. J. Hum. Genet., 84: 399-405 (2009).
Таблица 1
Ген
SNP
NOD2 (R702W)-SNP8
rs2066844
NOD2(G908R)-SNP12
rs2066845
NOD2 (3020insC)-SNP13
rs5743293
ATG16L1 (T300A)
rs2241880
IL23R (R381Q)
rs11209026
DLG5
rs2165047
NOD2/CARD15
rs2066847
IL23R
rs11465804
ATG16L1
rs3828309
MST1
rs3197999
PTGER4
rs4613763
IRGM
rs11747270
TNFSF15
rs4263839
ZNF365
rs10995271
NKX2-3
rs11190140
PTPN2
rs2542151
PTPN22
rs2476601
ITLN1
rs2274910
IL12B
rs10045431
CDKAL1
rs6908425
CCR6
rs2301436
JAK2
rs10758669
C11 или f30
rs7927894
LRRK2, MUC19
rs11175593
ORMDL3
rs2872507
STAT3
rs744166
ICOSLG
rs762421
GCKR
rs780094
BTNL2, SLC26A3, HLA-DRB1, HLA-DQA1
rs3763313
PUS 10
rs13003464
CCL2, CCL7
rs991804
LYRM4
rs12529198
SLC22A23
rs17309827
IL18RAP
rs917997
Ген
SNP
IL12RB2
rs7546245
IL12RB1
rs374326
CD3D
rs3212262
CD3G
rs3212262
CD247
rs704853
JUN
rs6661505
CD3E
rs7937334
IL18R1
rs1035127
CCR5
MAPK14
rs2237093
IL18
rs11214108
IFNG
rs10878698
MAP2K6
rs2905443
STAT4
rs1584945
IL12A
rs6800657
TYK2
rs12720356
ETV5
rs9867846
MAPK8
rs17697885
IRGM
rs13361189
IRGM
rs4958847
IRGM
rs1000113
IRGM
rs11747270
TL1A/TNFSF15
rs6478109
TL1A/TNFSF15
rs6478108
TL1A/TNFSF15
rs4263839
PTN22
rs2476601
CCR6
rs1456893
CCR6
rs2301436
5p13/PTGER4
rs1373692
5p13/PTGER4
rs4495224
5p13/PTGER4
rs7720838
5p13/PTGER4
rs4613763
ITLN1
rs2274910
ITLN1
rs9286879
ITLN1
rs11584383
IBD5/5q31
rs2188962
EBD5/5q31
rs252057
IBD5/5q31
rs10067603
GCKR
rs780094
TNFRSF6B
rs1736135
ZNF365
rs224136
ZNF365
rs10995271
C11 или f30
rs7927894
LRRK2, MUC19
rs1175593
IL-27
rs8049439
TLR2
rs4696480
TLR2
rs3804099
TLR2
rs3804100
TLR2
rs5743704
Ген
SNP
TLR2
rs2405432
TLR4 (D299G)
rs4986790
TLR4 (T399I)
rs4986791
TLR4 (S360N)
rs4987233
TLR9
rs187084
TLR9
rs352140
NFC4
rs4821544
KIF21B
rs11584383
IKZF1
rs1456893
C11 или f30
rs7927894
CCL2, CCL7
rs991804
ICOSLG
rs762421
TNFAIP3
rs7753394
FLJ45139
rs2836754
PTGER4
rs4613763
ЕСМ1
rs7511649
ECM1 (T130M)
rs3737240
ЕСМ1 (G290S)
rs13294
GUI (G933D)
rs2228224
GLI1 (Q1100E)
rs2228226
MDR1 (3435C>T)
rs1045642
MDR1 (A893S/T)
rs2032582
MAGI2
rs6962966
MAGI2
rs2160322
IL26
rs12815372
IFNG, IL26
rs1558744
IFNG, IL26
rs971545
IL26
rs2870946
ARPC2
rs12612347
IL10, IL19
rs3024493
IL10, IL19
rs3024505
IL23R
rs1004819
IL23R
rs2201841
IL23R
rs11465804
IL23R
rs10889677
BTLN2
rs9268480
HLA-DRB1
rs660895
MEP1
rs6920863
MEP1
rs2274658
MEP1
rs4714952
MEP1
rs1059276
PUS10
rs13003464
PUS10
rs6706689
RNF186
rs3806308
RNF186
rs1317209
RNF186
rs6426833
FCGR2A, C
rs10800309
CEP72
rs4957048
DLD, LAMB1
rs4598195
Ген
SNP
CAPN10, KIF1A
rs4676410
IL23R
rs11805303
IL23R
rs7517847
IL12B/p40
rs1368438
IL12B/p40
rs10045431
IL12B/p40
rs6556416
IL12B/p40
rs6887695
IL12B/p40
rs3212227
STATS
rs744166
JAK2
rs10974914
JAK2
rs10758669
NKX2-3
rs6584283
NKX2-3
rs10883365
NKX2-3
rs11190140
IL18RAP
rs917997
LYRM4
rs12529198
CDKAL1
rs6908425
MAGI2
rs2160322
TNFRSF6B
rs2160322
TNFRSF6B
rs2315008
TNFRSF6B
rs4809330
PSMG1
rs2094871
PSMG1
rs2836878
PTPN2
rs2542151
MST1/3p21
rs9858542
MST1/3p21
rs3197999
SLC22A23
rs17309827
MHC
rs660895
XBP1
rs35873774
ICOSLG1
rs762421
BTLN2
rs3763313
BTLN2
rs2395185
BTLN2
rs9268480
ATG5
rs7746082
CUL2, CREM
rs17582416
CARD9
rs4077515
ORMDL3
rs2872507
ORMDL3
rs2305480
Дополнительные SNPs, полезные в настоящем изобретении, включают, например, rs2188962, rs9286879, rs11584383, rs7746082, rs1456893, rs1551398, rs17582416, rs3764147, rs1736135, rs4807569, rs7758080 и rs8098673. Например, см. Barrett et al., Nat. Genet., 40: 955-62 (2008).
NOD2/CARD15
Определение наличия или отсутствия таких аллельных вариантов, как SNPs у гена NOD2/CARD15 особенно полезно в настоящем изобретении. Термин "вариант NOD2/ CARD15" или "вариант NOD2" в настоящем изобретении означает, что нуклеотидная последовательность гена NOD2 содержит одно или несколько изменений по сравнению с геном NOD2 дикого типа или же что аминокислотная последовательность полипептида NOD2 содержит одно или несколько изменений по сравнению с последовательностью полипептида NOD2 дикого типа. Установлено, что NOD2, также известный как CARD15, располагается в локусе IBD1 хромосомы 16 методом позиционного клонирования (Hugot et al., Nature, 411: 599-603 (2001)) либо по положению гена-кандидата (Ogura et al., Nature, 411: 603-606 (2001); Натре et al., Lancet, 357: 1925-1928 (2001)). Локус IBD1 имеет высокий многопунктовый показатель сцепления (MLS) для воспалительной болезни кишечника (MLS=5,7 по маркеру D16S411 в 16q12). Например, см. Cho et al., Inflamm. Bowel Dis., 3:186-190 (1997); Akolkar et al., Am. J. Gastroenterol., 96:1127-1132 (2001); Ohmen et al., Hum. Mol. Genet., 5: 1679-1683 (1996); Parkes et al., Lancet, 348: 1588 (1996); Cavanaugh et al., Ann. Hum. Genet, 62: 291-8 (1998); Brant et al., Gastroenterology, 115: 1056-1061 (1998); Curran et al., Gastroenterology, 115: 1066-1071 (1998); Натре et al., Am. J. Hum. Genet., 64: 808-816 (1999); и Annese et al., Eur. J. Hum. Genet., 7: 567-573 (1999).
Последовательности мРНК (кодирующая) и полипептида NOD2 человека приведены, например, в Genbank Accession Nos. NM_022162 и NP_071445, соответственно. Кроме того, полная последовательность клона RP11-327F22 хромосомы 16 человека, которая включает NOD2, приведена, например, в Genbank Accession No. АС007728. Более того, в базе данных GenBank приведены и последовательности NOD2 из других видов.
Белок NOD2 содержит N-концевые домены привлечения каспаз (CARDs), которые могут активировать NF-каппа В (NF-kB), и несколько C-концевых доменов с богатыми лейцином повторами (Ogura et al., J. Biol. Chem., 276: 4812-4818 (2001)). NOD2 обладает структурной гомологией с регулятором апоптоза Apaf-1/CED-4 и классом генных продуктов, устойчивых к болезням растений (Ogura et al., supra). Как и устойчивые к болезням растений генные продукты, NOD2 содержит N-концевой эффекторный домен, нуклеотид-связывающий домен и богатые лейцином повторы (LRRs). NOD2 дикого типа активирует ядерный фактор NF-каппа В, делая его чувствительным к бактериальным липополисахаридам (LPS; Ogura et al., supra; mohara et al., J. Biol. Chem., 276: 2551-2554 (2001). NOD2 может функционировать в качестве межклеточного рецептора для LPS, при этом богатые лейцином повторы необходимы для чувствительности.
Ранее были описаны вариации - полиморфизмы по трем отдельным нуклеотидам в кодирующей области NOD2. Эти три SNPs, обозначаемые R702W ("SNP 8"), G908R ("SNP 12") и 1007fs ("SNP 13"), располагаются в C-концевом участке гена NOD2 (Hugot et al., supra). Дальнейшее описание SNP 8, SNP 12 и SNP 13, а также дополнительные SNPs у гена NOD2, подходящие для применения в изобретении, приведены, например, в патентах США Nos. 6,835,815; 6,858,391; и 7,592,437; а также патентных документах США Nos. 20030190639, 20050054021 и 20070072180.
В некоторых воплощениях вариант NOD2 располагается в кодирующей области локуса NOD2, к примеру, на участке, кодирующем несколько богатых лейцином повторов в C-концевой части полипептида NOD2. Такие варианты NOD2, расположенные в районе богатых лейцином повторов NOD2, включают, без ограничения, R702W ("SNP 8") и G908R ("SNP 12"). Вариант NOD2, применимый в изобретении, также может кодировать полипептид NOD2 с пониженной способностью к активации NF-каппа В по сравнению с активацией NF-каппа В полипептидом NOD2 дикого типа. В качестве неограничивающего примера: вариант NOD2 1007fs ("SNP 13") дает укороченный полипептид NOD2, который обладает пониженной способностью индуцировать NF-каппа B в ответ на стимуляцию LPS (Ogura et al., Nature, 411: 603-606 (2001)).
Вариантом NOD2, применимым в изобретении, может быть, к примеру, R702W, G908R или 1007fs. R702W, G908R и 1007fs располагаются в кодирующей области NOD2. В одном воплощении способ изобретения выполняется с вариантом R702W NOD2. Термин "R702W" в настоящем изобретении обозначает полиморфизм по одному нуклеотиду в экзоне 4 гена NOD2, который находится внутри триплета, кодирующего аминокислоту 702 белка NOD2. Аллель NOD2 дикого типа содержит остаток цитозина (с) в положении 138 991 последовательности АС007728, который находится внутри триплета, кодирующего аргинин по аминокислоте 702. Вариант R702W NOD2 содержит остаток тимина (t) в положении 138 991 последовательности АС007728, что приводит к замене аргинина (R) на триптофан (W) в положении аминокислоты 702 белка NOD2. Соответственно, этот вариант NOD2 обозначается как "R702W" или "702W" и также может обозначаться как "R675W" по более ранней системе нумерации Hugot et al., supra. Кроме того, вариант R702W также известен как аллель "SNP 8" или аллель "2" по SNP 8. Номер ID для SNP R702W или SNP 8 в NCBI - rs2066844. Наличие варианта R702W NOD2 или других вариантов NOD2 удобно определяется, к примеру, методом дискриминации аллелей или анализом последовательности.
Способ изобретения также может выполняться с вариантом G908R NOD2. Термин "G908R" в настоящем изобретении означает полиморфизм по одному нуклеотиду в экзоне 8 гена NOD2, который находится внутри триплета, кодирующего аминокислоту 908 белка NOD2. Аминокислота 908 располагается в районе богатых лейцином повторов гена NOD2. Аллель NOD2 дикого типа содержит остаток гуанина (g) в положении 128377 последовательности АС007728, который находится внутри триплета, кодирующего глицин по аминокислоте 908. Вариант G908R NOD2 содержит остаток цитозина (с) в положении 128 377 последовательности АС007728, что приводит к замене глицина (G) на аргинин (R) по аминокислоте 908 белка NOD2. Соответственно, этот вариант NOD2 обозначается как "G908R" или "908R" и также может обозначаться как "G881R" по более ранней системе нумерации Hugot et al., supra. Кроме того, вариант G908R также известен как аллель "SNP 12" или аллель "2" по SNP 12. Номер ID для SNP G908R или SNP 12 в NCBI-rs2066845.
Способ изобретения также может выполняться с вариантом 1007fs NOD2. Этот вариант представляет собой вставку одного нуклеотида, что приводит к сдвигу рамки считывания у десятого богатого лейцином повтора белка NOD2, за которым следует преждевременный стоп-кодон. При этом укорочение белка NOD2 явно предотвращает активацию NF-каппа В в ответ на бактериальные липополисахариды (Ogura et al., supra). Термин "1007fs" в настоящем изобретении означает полиморфизм по одному нуклеотиду в экзоне 11 гена NOD2, который находится в триплете, кодирующем аминокислоту 1007 белка NOD2. Вариант 1007fs содержит цитозин, добавленный в положении 121 139 последовательности АС007728, что приводит к мутации сдвига рамки считывания по аминокислоте 1007. Соответственно, этот вариант NOD2 обозначается как "1007fs" и также может обозначаться как "3020insC" или "980fs" по более ранней системе нумерации Hugot et al., supra. Кроме того, вариант 1007fs NOD2 также известен как аллель "SNP 13" или аллель "2" по SNP 13. Номер ID для SNP 1007fs или SNP 13 в NCBI - rs2066847.
Специалистам должно быть известно, что конкретный вариант аллеля NOD2 или другого полиморфного аллеля удобно определяется, к примеру, при сравнении с контрольным индивидом из Centre d′Etude du Polymorphisme Humain (CEPH), как-то индивидом с обозначением 1347-02 (Dib et al., Nature, 380: 152-154 (1996)), используя коммерчески доступную контрольную ДНК, к примеру, от фирмы РЕ Biosystems (Foster City, СА). Кроме того, конкретная информация по SNPs может быть получена из dbSNP от Национального центра информации по биотехнологии (NCBI).
Вариант NOD2 также может располагаться в некодирующем участке локуса NOD2. Некодирующие участки включают, к примеру, последовательности интронов, а также 5′- и 3′-нетранслируемые последовательности. Неограничивающим примером варианта аллеля NOD2, находящегося в некодирующем участке гена NOD2, является вариант JW1, который описан в Sugimura et al., Am. J. Hum. Genet., 72: 509-518 (2003) и патентном документе США No. 20070072180. Примеры вариантов аллелей NOD2, расположенных в 3′-нетранслируемом участке гена NOD, включают, без ограничения, варианты аллелей JW15 и JW16, которые описаны в патентном документе США No. 20070072180. Примеры вариантов аллелей NOD2, расположенных в 5′-нетранслируемом участке (например, участке промотора) гена NOD2, включают, без ограничения, варианты аллелей JW17 и JW18, которые описаны в патентном документе США No. 20070072180.
В настоящем изобретении термин "вариант аллеля JW1" означает генетическую вариацию по нуклеотиду 158 в промежуточной последовательности 8 (интроне 8) гена NOD2. Относительно последовательности АС007728 вариант аллеля JW1 находится в положении 128143. Генетическая вариация по нуклеотиду 158 интрона 8 может представлять собой, без ограничения, замену отдельного нуклеотида, замену нескольких нуклеотидов либо делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов. Последовательность интрона 8 дикого типа содержит цитозин в положении 158. В качестве неограничивающих примеров: вариант аллея JW1 может содержать замену цитозина (с) на аденин (а), цитозина (с) на гуанин (g) или цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 158 интрона 8. В одном воплощении вариант аллеля JW1 представляет собой замену цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 158 интрона 8 NOD2.
Термин "вариант аллеля JW15" означает генетическую вариацию в 3′-нетранслируемом участке NOD2 по нуклеотиду в положении 118790 последовательности АС007728. Генетическая вариация по нуклеотиду 118790 может представлять собой, без ограничения, замену отдельного нуклеотида, замену нескольких нуклеотидов либо делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов. Последовательность дикого типа содержит аденин (а) в положении 118790. В качестве неограничивающих примеров: вариант аллея JW15 может содержать замену аденина (а) на цитозин (с), аденина (а) на гуанин (g) или аденина (а) на тимин (t) по нуклеотиду 118790. В одном воплощении вариант аллеля JW15 представляет собой замену аденина (а) на цитозин (с) по нуклеотиду 118790.
В настоящем изобретении термин "вариант аллеля JW16" означает генетическую вариацию в 3′-нетранслируемом участке NOD2 по нуклеотиду в положении 118031 последовательности АС007728. Генетическая вариация по нуклеотиду 118031 может представлять собой, без ограничения, замену отдельного нуклеотида, замену нескольких нуклеотидов либо делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов. Последовательность дикого типа содержит гуанин (g) в положении 118031. В качестве неограничивающих примеров: вариант аллеля JW16 может содержать замену гуанина (g) на цитозин (с), гуанина (g) на аденин (а) или гуанина (g) на тимин (t) по нуклеотиду 118031. В одном воплощении вариант аллеля JW16 представляет собой замену гуанина (g) на аденин (а) по нуклеотиду 118031.
Термин "вариант аллеля JW17" означает генетическую вариацию в 5′-нетранслируемом участке NOD2 по нуклеотиду в положении 154688 последовательности АС007728. Генетическая вариация по нуклеотиду 154688 может представлять собой, без ограничения, замену отдельного нуклеотида, замену нескольких нуклеотидов либо делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов. Последовательность дикого типа содержит цитозин (с) в положении 154688. В качестве неограничивающих примеров: вариант аллеля JW17 может содержать замену цитозина (с) на гуанин (g), цитозина (с) на аденин (а) или цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 154688. В одном воплощении вариант аллеля JW17 представляет собой замену цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 154688.
В настоящем изобретении термин "вариант аллеля JW18" означает генетическую вариацию в 5′-нетранслируемом участке NOD2 по нуклеотиду в положении 154471 последовательности АС007728. Генетическая вариация по нуклеотиду 154471 может представлять собой, без ограничения, замену отдельного нуклеотида, замену нескольких нуклеотидов либо делецию или вставку одного или нескольких нуклеотидов. Последовательность дикого типа содержит цитозин (с) в положении 154471. В качестве неограничивающих примеров: вариант аллеля JW18 может содержать замену цитозина (с) на гуанин (g), цитозина (с) на аденин (а) или цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 154471. В одном воплощении вариант аллеля JW18 представляет собой замену цитозина (с) на тимин (t) по нуклеотиду 154471.
Следует иметь в виду, что способы изобретения могут выполняться с этими или другими вариантами аллелей NOD2, располагающимися в кодирующей области или в некодирующем участке (например, участке интрона или промотора) локуса NOD2. Кроме того, способы изобретения могут включать определение наличия одного, двух, трех, четырех или больше вариантов NOD2, включая, без ограничения, аллели SNP 8, SNP 12 и SNP 13 и другие варианты кодирующих либо некодирующих участков.
Примеры
Настоящее изобретение будет описано более подробно на конкретных примерах. Следующие примеры предлагаются в целях иллюстрации и не должны ограничивать изобретение никоим образом. Специалистам в данной области должны быть известны различные некритические параметры, которые можно изменять или модифицировать, получая практически те же результаты.
Пример 1. Новый анализ изменения подвижности для измерения уровня биопрепаратов против TNFα
В этом примере раскрывается новый гомогенный способ измерения концентрации препаратов против TNFα в образцах пациентов (например, сыворотке) с использованием эксклюзионной хроматографии для определения связывания препарата против TNFα с флуоресцентно меченым TNFα. Способ является выгодным, поскольку в нем исключается потребность в операциях отмывки, используются флуорофоры, которые обеспечивают определение в видимом и/или ИК-спектре, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышает способность выявления препаратов против TNFα у пациентов с низким титром вследствие высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки, а реакция протекает в жидкой фазе, при этом снижается вероятность каких-либо изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшетов для ELISA.
647
В одном типичном воплощении TNFα помечен флуорофором (например, Alexa), причем флуорофор можно детектировать как в видимом, так и в ИК спектре. Меченый TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, что способствует связыванию присутствующего в сыворотке препарата против TNFα. Меченый TNFα также можно инкубировать с известным количеством препарата против TNFα в жидкофазной реакции для построения стандартной кривой. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с одним только меченым TNFα. Концентрацию препарата против TNFα, присутствующего в образце сыворотки, можно затем сравнить со стандартной кривой и контролями.
647
647
647
На фиг.1 приведен пример способа настоящего изобретения, в котором для определения связывания между TNFα-Alexa и HUMIRA™ (адалимумаб) применяется эксклюзионная HPLC. Как видно из фиг.1, связывание HUMIRA™ с TNFα-Alexa вызывает сдвиг пика TNFα-Alexa влево.
647
647
647
647
На фиг.2 представлены кривые доза-ответ для связывания HUMIRA™ с TNFα-Alexa. В частности, из фиг.2А видно, что HUMIRA™ дозозависимым образом усиливает сдвиг TNFα-Alexa при анализе методом эксклюзионной хроматографии. Из фиг.2 В видно, что присутствие 1% сыворотки человека не оказывает значительного эффекта на сдвиг TNFα-Alexa при анализе методом эксклюзионной хроматографии. Из фиг.2С видно, что присутствие сборной RF-положительной сыворотки не оказывает значительного эффекта на сдвиг TNFα-Alexa при анализе методом эксклюзионной хроматографии.
Таким образом, этот пример демонстрирует полезность настоящего изобретения при мониторинге пациентов, получающих такой препарат против TNFα, как HUMIRA™: (1) для руководства при определении надлежащей дозировки препарата; (2) для оценки фармакокинетики препарата, например, для определения того, не выводится ли препарат из организма слишком быстро; и (3) для направления решений по лечению, например, нужно ли перейти из текущего препарата против TNFα на другой ингибитор TNFα или на другой тип лечения.
Пример 2. Новый анализ изменения подвижности для измерения уровня HACA и HAHA
В этом примере раскрывается новый гомогенный метод измерения концентрации аутоантител (например, HACA и/или HAHA) в образцах пациентов (например, сыворотке) с использованием эксклюзионной хроматографии для определения связывания этих аутоантител с флуоресцентно меченым препаратом против TNFα. Метод является выгодным, поскольку в нем устраняется потребность в операциях отмывки, удаляющих HACA и HAHA с низким сродством, используются флуорофоры, которые обеспечивают определение в видимом и/или ИК-спектре, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышает способность выявления HACA и HAHA у пациентов с низким титром вследствие высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки, а реакция протекает в жидкой фазе, при этом снижается вероятность любых изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшетов для ELISA.
Клиническая полезность измерения аутоантител (например, HACA, HAHA и т.д.), вырабатываемых против ингибиторов TNFα, засвидетельствована тем фактом, что HACAs обнаружены у 53%, 21% и 7% больных ревматоидным артритом, получавших 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг инфликсимаба. При комбинировании инфликсимаба с метотрексатом встречаемость антител снижалась до 15%, 7% и 0%, свидетельствуя о том, что сопутствующая иммуносупрессивная терапия эффективно уменьшает ответы против препарата, но также и то, что высокая доза антител против TNFα может привести к толерантности. При болезни Крона встречаемость оказалась еще выше: после пятой инфузии у 61% пациентов были НАСА. Клинический ответ сокращался при наличии HACAs. См. Rutgeerts, N. Engl. J. Med., 348: 601-608 (2003). Ретроспективное исследование уровней инфликсимаба и НАСА при измерении на протяжении 3 лет с 2005 до 2008 г. у 155 пациентов показало, что HACAs обнаруживаются у 22,6% (N=35) больных воспалительной болезнью кишечника. См. Afif et аl., "Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody levels in patients with inflammatory bowel disease"; paper presented at Digestive Disease Week; May 30-June 3, 2009; Chicago, IL. Авторы пришли к выводу, что изменение лечения на основании одних лишь клинических симптомов может привести к неправильному лечению.
Гомогенный анализ изменения подвижности предпочтителен перед существующими способами, такими как мостиковый метод, представленный на фиг.3 для измерения концентрации аутоантител (например, HACA и/или HAHA) в образцах пациентов, так как способом по изобретению можно измерять концентрацию таких аутоантител, как HACA, без неспецифического связывания и помех от твердой фазы типа планшетов для ELISA, без помех от препарата против TNFα (например, при мостиковом методе измерения HACA должны проводиться при минимальном уровне препарата против TNFα) и вне зависимости от мультивалентности антител (например, антитела к IgG4 не выявляются мостиковым методом, так как антитела к IgG4 биспецифичны и не могут перекрестно связываться с одним и тем же антигеном). Таким образом, настоящее изобретение обладает по меньшей мере следующими преимуществами по сравнению с существующими методами: исключается прикрепление антигенов к твердым поверхностям (устраняется денатурация); исключается эффект IgG4; преодолевается проблема минимального уровня лечебных антител; выявляются антитела со слабым сродством; исключается неспецифическое связывание посторонних IgGs; а также повышается чувствительность и специфичность детектирования.
647
В одном типичном воплощении препарат против TNFα (например, REMICADE™) помечен флуорофором (например, Alexa), причем флуорофор можно детектировать как в видимом, так и в ИК спектре. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, что способствует связыванию присутствующих в сыворотке HACA и HAHA. Меченый препарат против TNFα также можно инкубировать с известным количеством препарата против TNFα в жидкофазной реакции для построения стандартной кривой. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание аутоантител с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика влево по сравнению с одним только меченым препаратом. Концентрацию HACA и HAHA, присутствующих в образце сыворотки, можно затем сравнить со стандартной кривой и контролями. На фиг.4 приведена типичная схема способа обнаружения аутоантител по настоящему изобретению для измерения концентрации HACA/HAHA, вырабатываемых против REMICADE™. В некоторых случаях высокий уровень HACA/HAHA свидетельствует, что с текущей терапии REMICADE™ нужно перейти на другой препарат против TNFα, как-то HUMIRA™.
647
647
Принцип данного метода состоит в изменении подвижности антитела, связанного с комплексом Alexa-меченый Remicade, относительно свободного комплекса Alexa-меченый Remicade при эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие увеличения молекулярной массы комплекса.
Хроматография в этом примере проводилась на установке Agilent-1200 HPLC System с использованием колонки Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5000-700000 и подвижной фазы 1×PBS, pH 7,4, при скорости потока 0,5 мл/мин, с УФ-детектором при 650 нм. При каждом анализе на колонку наносится образец объемом 100 мкл.
647
647
Связанный с антителом комплекс Alexa-меченного Remicade образуется при инкубации известного количества антитела и Alexa-меченного Remicade в элюирующем буфере 1×PBS, pH 7,3, при комнатной температуре в течение 1 ч перед анализом SE-HPLC.
647
647
647
647
647
647
На фиг.5 представлен анализ типа доза-ответ связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению. Связывание антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa вызывало сдвиг пика REMICADE™-Alexa влево. На фиг.6 представлен второй анализ типа доза-ответ связывания антитела против IgG человека с REMICADE™-Alexa при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению. Повышение количества антитела против IgG приводило к дозозависимому увеличению образования комплексов анти-IgG/REMICADE™-Alexa, о чем свидетельствует сдвиг пика REMICADE™-Alexa647 влево. На фиг.7 представлены кривые доза-ответ для связывания антитела против IgG с REMICADE™-Alexa.
647
647
647
На фиг.8 представлено образование иммунокомплекса REMICADE™-Alexa в нормальной сыворотке человека и HACA-положительной сыворотке при детектировании методом эксклюзионной хроматографии по настоящему изобретению при введении 100 мкл образца. Как видно из фиг.8, связывание НАСА, присутствующего в образцах пациента, с REMICADE™-Alexa вызывает сдвиг пика REMICADE™-Alexa влево. Таким образом, метод эксклюзионной хроматографии по изобретению является особенно предпочтительным, поскольку в нем измеряются НАСА в присутствии REMICADE™, его можно использовать во время лечения пациентов, измеряется как слабое, так и сильное связывание НАСА, это анализ изменения подвижности типа "смешать и измерить", который может быть распространен на другие подходы, в которых применяется уравновешивание меченого REMICADE™ с HACA и REMICADE™.
На фиг.9 представлена сводка по измерению НАСА в образцах сыворотки от 20 пациентов, которые выполнялись мостиковым методом или анализом изменения подвижности по настоящему изобретению. Это сравнительное исследование показывает, что представленный способ обладает повышенной чувствительностью перед существующими способами, поскольку 3 образца, которые были отрицательными по HACA при измерении мостиковым методом, оказались HACA-положительными при измерении анализом изменения подвижности по настоящему изобретению (см. пациентов № SK07070305, SK07070595 и SK07110035).
Таким образом, этот пример свидетельствует о полезности настоящего изобретения при мониторинге пациентов, получающих препарат против TNFα (например, REMICADE™), для выявления присутствия или уровня аутоантител (например, HACA и/или HAHA) против препарата, поскольку такие иммунные ответы могут быть связаны с реакциями гиперчувствительности и резкими изменениями фармакокинетики и биораспределении препарата против TNFα, препятствующими дальнейшему лечению этим препаратом.
647
647
В заключение, примеры 1 и 2 показывают, что TNFα и антитела против TNFα можно эффективно пометить Alexa. При инкубации меченого TNFα-Alexa с антителами против TNFα время удержания меченого комплекса TNFα/антитело против TNFα изменяется, а количество антител против TNFα, вызывающих это изменение, можно измерить количественно при помощи HPLC. Более того, при инкубации меченого антитела против TNFα с антителом против IgG человека время удержания комплекса меченое антитело против TNFα/антитело против IgG изменяется, а количество антител против TNFα, вызывающих это изменение, можно измерить количественно при помощи HPLC. Кроме того, было показано, что низкое содержание сыворотки в системе анализа почти не влияет на анализ HPLC. Наконец, для анализа антител против TNFα и HACA/HAHA можно построить стандартную кривую и использовать ее для количественного измерения антител против TNFα или уровня HACA/HAHA в сыворотке пациентов. Предпочтительно настоящим изобретением в некоторых аспектах предусмотрен анализ изменения подвижности, как-то гомогенный метод типа "смешать и измерить", разработанный для измерения и препарата, и антител против препарата. Были построены стандартные кривые для биологических препаратов против TNFα Remicade и Humira, а также для антител HACA против Remicade. В формате анализа изменения подвижности, в отличие от ELISA, исключается фиксирование антигенов на твердых поверхностях и на него не влияет неспецифическое связывание посторонних IgG. Формат анализа прост, но очень чувствителен и может использоваться для обнаружения всех биологических препаратов против TNFα (например, Remicade, Humira, Enbrel и Cimzia), a также нейтрализующих антител (анти-Remicade™) в сыворотке пациентов.
Пример 3. Измерение уровня человеческих антител против химерных антител (HACA) и инфликсимаба (IFX) в сыворотке пациентов новым анализом изменения подвижности
РЕФЕРАТ
Введение. Инфликсимаб (IFX) представляет собой химерное моноклональное терапевтическое антител против TNFα, которое оказалось эффективным при лечении таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит (RA) и воспалительная болезнь кишечника (IBD). Однако у некоторых получавших IFX пациентов при обнаружении человеческих антител против химерных антител (HACA) были обнаружены антитела против IFX, которые могут снижать эффективность препарата или вызывать отрицательные эффекты. Мониторинг уровней HACA и IFX у индивидуальных пациентов может помочь оптимизировать дозировку и лечение IFX. Современные методы обнаружения HACA на основе твердофазных методов ограничены тем, что присутствие IFX в кровотоке может маскировать наличие HACA, поэтому измерения можно проводить только по меньшей мере через 8 недель после введения дозы IFX. Кроме того, это отставание во времени еще больше мешает определению из-за быстрого выведения высокомолекулярных иммунных комплексов из кровотока. Для преодоления этих недостатков мы разработали и проверили новый способ измерения уровней IFX и HACA в сыворотке пациентов, получавших IFX.
Методы. Был разработан новый нерадиоактивный жидкофазный анализ изменения подвижности на основе эксклюзивной (SE)-HPLC для измерения уровней HACA и IFX в сыворотке пациентов, получавших IFX. Иммунокомплексы (например, TNFα/IFX или IFX/HACA), свободный TNFα или IFX и соотношение связанного к свободному можно разрешить и рассчитать с высокой чувствительностью. Концентрации IFX или HACA в сыворотке определяли по стандартным кривым, построенным при инкубации с различными концентрациями IFX или сборной HACA-положительной сыворотки. Этим новым методом измеряли уровни IFX и HACA в образцах сыворотки, взятых у получавших IFX больных IBD с рецидивами, и сравнивали результаты с теми, что были получены традиционным мостиковым методом ELISA.
Результаты. Строили кривые доза-ответ при определении новым методом с высокой чувствительностью. Продемонстрировано обнаружение HACA в присутствии избытка IFX. Из 117 образцов сыворотки пациентов, получавших IFX, в 65 образцах уровень IFX оказался выше предела обнаружения и в среднем составил 11,0±6,9 мг/мл. По уровню HACA 33 образца (28,2%) оказались положительными, тогда как мостиковым методом ELISA было выявлено только 24 положительных образца. Мы также идентифицировали 9 ложно отрицательных и 9 ложно положительных образцов из числа тех, что определяли мостиковым методом. Уровни HACA оказались повышенными у 11 пациентов во время курса лечения IFX, тогда как уровни IFX оказались значительно сниженными.
Выводы. Разработан новый нерадиоактивный жидкофазный анализ изменения подвижности для измерения уровней IFX и HACA в сыворотке пациентов, получавших IFX. Метод обладает высокой чувствительностью и точностью, а полученные результаты были воспроизводимы. Этот новый метод можно с успехом использовать для измерения уровней HACA и IFX во время лечения пациентов.
ВВЕДЕНИЕ
Фактор некроза опухолей-альфа (TNFα) играет ключевую роль в патогенезе таких аутоиммунных заболеваний, как болезнь Крона (CD) и ревматоидный артрит (RA). Хорошо известно, что блокирование TNFα терапевтическими антителами, такими как инфликсимаб (химерное моноклональное антитело человека-мыши типа IgG1κ) или адалимумаб (полностью человеческое моноклональное антитело), снижает активность заболевания при CD и RA. Однако примерно 30-40% пациентов не реагируют на терапию против TNFα, а некоторым пациентам нужны более высокие дозы или корректировка частоты дозировки из-за отсутствия достаточной реакции. Различия по биодоступности и фармакокинетике препарата у индивидуальных пациентов могут способствовать неудаче лечения. Иммуногенность препаратов, которая вызывает появление HACA/HAHA у пациентов, может привести к целому ряду отрицательных реакций от легкой аллергии до анафилактического шока. Эти проблемы теперь признаются многими исследователями, контролирующими препараты агентствами, медицинскими страховыми компаниями и производителями лекарств. Кроме того, многие пациенты с вторичной невосприимчивостью к одному препарату против TNFα выигрывают от перехода на другие препараты против TNFα, что свидетельствует о роли нейтрализующих антител, направленных против конкретного белка, используемого для лечения (Radstake et al., Ann. Rheum. Dis., 68(11): 1739-45 (2009)). Поэтому вполне обоснован мониторинг пациентов на препарат и уровень HACA/HAHA с тем, чтобы можно было адаптировать введение препарата к конкретному пациенту и проводить длительное лечение эффективно и экономно почти или совсем без риска для пациентов (Bendtzen et al., Scand. J. Gastroenterol., 44(7): 774-81 (2009)).
Для оценки циркулирующих уровней препаратов и HACA/HAHA применялось несколько методов ферментного иммуноанализа. На фиг.10 представлена сводка текущих методов, доступных для измерения НАСА, в сравнении с новым методом определения HACA по настоящему изобретению. Одним из недостатков современных методологий является то, что уровень антител трудно измерить, когда в кровотоке имеется измеримое количество препарата. В отличие от текущих твердофазных методов определения HACA, при которых измерения могут выполняться только по меньшей мере через 8 недель после введения дозы IFX, новый метод настоящего изобретения представляет собой нерадиоактивный, жидкофазный метод эксклюзионной (SE)-HPLC, который позволяет измерять уровни HACA и IFX в сыворотке пациентов во время лечения IFX.
Далее приведено обоснование для измерения концентрации биологических препаратов против TNFα и антител к биологическим препаратам против TNFα в сыворотке у пациентов: (1) для изучения фармакокинетики при клинических испытаниях; (2) во время клинических испытаний PDA может потребовать отслеживать иммунные ответы пациентов на биологический препарат; (3) для мониторинга реакции пациентов на биологический препарат путем измерения HACA или HAHA при выборе дозировки препарата для каждого пациента; и (4) для использования в качестве руководства для перехода на другой биологический препарат, если первоначальный препарат не действует.
МЕТОДЫ
Анализ методом SE-HPLC уровня инфликсимаб (IFX) в сыворотке пациентов. Рекомбинантный TNFα человека метили флуорофором ("F1", таким, например, как Alexa Fluor 488) в соответствии с инструкциями производителя. Меченый TNFα инкубировали при различном количестве IFX или сыворотки пациентов в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного TNFα-F1 и связанного иммунокомплекса TNFα-F1 по времени удержания использовали детектор флуоресценции. Уровень IFX сыворотке рассчитывали по стандартной кривой.
Анализ методом SE-HPLC уровня HACA в сыворотке пациентов. Очищенный IFX метили с помощью F1. Меченый IFX инкубировали при различных разведениях сборной HACA-положительной сыворотки или разведенной сыворотки пациентов в течение 1 часа при комнатной температуре. Образцы объемом 100 мкл анализировали методом эксклюзионной хроматографии на установке для HPLC. Для мониторинга свободного IFX-F1 и связанного иммунокомплекса IFX-F1 по времени удержания использовали детектор флуоресценции. Для определения уровня HACA использовали соотношение связанного и свободного IFX-F1.
Процедура анализа изменения подвижности для измерения HACA в сыворотке. Принцип этого метода основывается на изменении подвижности HACA F1-меченного комплекса инфликсимаба (IFX) относительно свободного F1-меченного IFX при эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) вследствие увеличения молекулярной массы комплекса. Хроматографию проводили на установке Agilent-1200 HPLC System с использованием колонки Bio-Sep 300×7,8 мм SEC-3000 (Phenomenex) с диапазоном фракционирования молекулярных масс 5000-700000 и подвижной фазы 1×PBS, pH 7,4, при скорости потока 0,5-1,0 мл/мин, с детектором флуоресценции. При каждом анализе на колонку наносили образец объемом 100 мкл. Связанный с HACA F1-меченный комплекс IFX образуется при инкубации сыворотки от получавших IFX пациентов и F1-меченного IFX в элюирующем буфере 1×PBS, pH 7,4, при комнатной температуре в течение 1 часа перед анализом SE-HPLC. Определение также проводили в присутствии различных мешающих агентов, таких как ревматоидный фактор и TNFα, для проверки метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На фиг.11 представлено разделение связанного с НАСА комплекса IFX-F1 от свободного IFX-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из панелей end, время удержания пика флуоресценции изменяется с 21,8 мин до 15,5-19,0 мин. Чем больше HACA присутствует в реакционной смеси, тем меньше остается свободного IFX-F1 на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса. На фиг.12 представлены кривые доза-ответ для сдвига пика флуоресценции, вызванного добавлением HACA. Используя HACA-положительный образец, мы смогли детектировать сдвиг пика при разведении сыворотки 1:1000.
На фиг.13 представлено разделение связанного с IFX комплекса TNFα-F1 от свободного TNFα-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из панелей end, время удержания пика флуоресценции изменяется с 24 мин до 13-19,5 мин. Чем больше IFX присутствует в реакционной смеси, тем меньше остается свободного TNFα-F1 на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса. На фиг.14 представлены кривые доза-ответ для сдвига пика TNFα-F1, вызванного добавлением IFX. Исходя из добавленного IFX предел обнаружения составляет 10 нг/мл IFX в сыворотке.
Новый анализ изменения подвижности по настоящему изобретению проверяли путем тестирования образцов сыворотки от HACA-положительных и отрицательных пациентов, измеренных мостиковым методом (таблица 2). Этим методом проанализировали образцы сыворотки от 50 здоровых субъектов и 117 больных IBD, получавших IFX. Во всех 50 образцах от здоровых субъектов уровень IFX был ниже предела обнаружения, тогда как в 65 образцах от больных средняя концентрация IFX составила 11,0 мкг/мл. В табл.3 приведены уровни HACA в сыворотке здоровых контролей и больных IBD, получавших IFX, при измерении мостиковым методом и анализом изменения подвижности. Мостиковым методом выявлялось меньше HACA-положительных пациентов, чем анализом изменения подвижности, а также больше ложно отрицательных и больше ложно положительных.
Таблица 2
Корреляция относительных уровней HACA в сыворотке пациентов от сильно положительных и отрицательных между мостиковым методом и методом SE-HPLC
Мостиковый метод
Анализ изменения подвижности HPLC
Корреляция
Положительные
82
81
99%
Отрицательные
12
12
100%
Таблица 3
Анализ образцов пациентов на уровень HACA в сыворотке мостиковым методом (отсечение 1,69 мкг/мл) и анализом изменения при HPLC (отсечение 0,19 по соотношению связанного и свободного IPX)
Субъекты (n)
HACA-положительные
Мостиковый метод
Мостиковый метод
Метод HPLC
Ложноотриц.
Ложнополож.
Здоровые контроля
50
н/п
0
н/п
н/п
Пациенты, получавшие IFX
117
24 (20,5%)
33 (28,2%)
9 (высокий IFX)
9
Ложноотрицательные результаты вызваны тем, что сыворотка пациентов содержит высокий уровень IFX, что мешает определению НАСА мостиковым методом, но не влияет на метод SE-HPLC. Ложноположительные результаты вызваны тем, что сыворотка пациентов содержит высокий уровень неспецифических мешающих веществ, которые могут вызывать помехи при мостиковом методе.
На фиг.15 представлена взаимосвязь между уровнем HACA и концентрацией IFX у больных IBD во время курса лечения IFX. HACA обнаруживались уже в точке V10 (30 недель) и продолжали возрастать у некоторых пациентов во время лечения IFX. Из фиг.16 видно, что HACA выявляются методом настоящего изобретения в присутствии IFX. Более высокий уровень HACA в сыворотке связан с тем, что выявляется более низкий уровень IFX (например, с уменьшением биодоступности). Таким образом, раннее выявление HACA во время лечения IFX может привести врача и/или пациента к переходу на другие препараты против TNF или увеличению дозы IFX.
Методы проверяли с точки зрения точности внутри опытов и между опытами (на основании параметра CV) и чувствительности к мешающим веществам. Этот анализ представлен в следующих таблицах.
Определение инфликсимаба
Определение HACA
Параметр
CV%
Параметр
CV%
Точность внутри опытов
2,89
Точность внутри опытов
3,96
Точность между опытами
Точность между опытами
от запуска к запуску
4,57
от запуска к запуску
4,15
от лаборанта к лаборанту
6,06
от лаборанта к лаборанту
5,84
от прибора к прибору
2,73
от прибора к прибору
6,88
Определение инфликсимаба
Мешающее вещество
Типичный интервал
Исследованные концентрации
Помехи
IgG, IgA, IgM
0,4-16 мг/мл
10, 2,0, 1,5 мг/мл
н/п
ATI
3,71-150 Е/мл (0-60 мкг/мл)
100 Е/мл (~55 мкг/мл)
мешает определению при низких конц. IFX (<5 мкг/мл)
Ревматоидный фактор
>30 МЕ/мл (RA-положительные пациенты)
до 387 МЕ/мл
н/п
TNF-α
6,2-6,6 пг/мл
0,0125 нг/мл - 40 мкг/мл
100 нг/мл
TNFR1/TNFR2
1,9/4,5 нг/мл
0,1-1000 нг/мл
н/п
Гемолизованная сыворотка
>20HI
100-300 HI
н/п
Следующие вещества также тестировали и они не вызывали помех: азатиоприн, метотрексат, TNF-β, липемическая сыворотка, гемоглобин
Определение HACA
Мешающее вещество
Типичный интервал
Исследованные концентрации
Помехи
IgG, IgA, IgM
0,4-16 мг/мл
10, 2,0, 1,5 мг/мл
н/п
Инфликсимаб
0-100 мкг/мл
0,78-100 мкг/мл
н/п
Ревматоидный фактор
>30 МЕ/мл (RA-положительные пациенты)
до 774 МЕ/мл
н/п
TNF-α
6,2-6,6 пг/мл
0,0125 нг/мл - 40 мкг/мл
250 нг/мл
TNFR1/TNFR2
1,9/4,5 нг/мл
0,1-1000 нг/мл
н/п
Гемолизованная сыворотка
>20HI
100-300 HI
н/п
Следующие вещества также тестировали и они не вызывали помех: азатиоприн, метотрексат, TNF-β, липемическая сыворотка, гемоглобин
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Биологические препараты против TNFα можно легко пометить флуорофором ("F1"), а формат анализа изменения подвижности, используемого для измерения HACA/HAHA, представляет собой гомогенный анализ без покрытия антигеном твердой поверхности и многократных стадий отмывания и инкубации, как при типичном ELISA. Инкубация F1-меченного IFX с HACA-положительной сывороткой приводит к образованию иммунного комплекса, который элюируется в другом положении по сравнению со свободным F1-меченным IFX при SE-HPLC и при этом можно количественно измерить содержание НАСА. Присутствие других компонентов сыворотки мало влияет на анализ изменения подвижности. На формат анализа изменения подвижности, в отличие от ELISA, не влияет неспецифическое связывание посторонних IgGs и определяется изотип IgG4. Образцы здоровой сыворотки не вызывают изменения подвижности F1-меченного IFX, а у 28,2% пациентов, получающих IFX, методом настоящего изобретения были обнаружены НАСА. Таким образом, формат описанного здесь метода очень чувствителен и может применяться для обнаружения всех биологических препаратов (например, Remicade, Humira, Enbrel и Cimzia), а также антител к ним (например, против Remicade, против Humira, против Enbrel и против Cimzia) в сыворотке пациентов. Следует отметить, что поскольку анализом изменения подвижности по изобретению можно обнаружить НАСА в присутствии IFX, то раннее выявление HACA во время лечения IFX может привести врача и/или пациента к переходу на другие препараты против TNF или увеличению последующей дозы IFX.
Мы разработали новый нерадиоактивный, жидкофазный метод SE-HPLC для измерения уровней IFX и HACA в образцах сыворотки, взятых у пациентов, получающих EFX. Новый метод обладает высокой чувствительностью, надежностью и точностью, а результаты хорошо воспроизводятся, что делает этот метод пригодным для планового тестирования большого количества образцов сыворотки человека. В формате нового метода, в отличие от ELISA, исключается покрытие антигенами твердой поверхности и на него не влияет неспецифическое связывание посторонних IgGs. Эти преимущества описанного здесь формата анализа уменьшают количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов. По преимуществу формат анализа по настоящему изобретению очень чувствителен и может применяться для выявления всех биологических препаратов, а также антител к ним, присутствующих в сыворотке во время лечения пациентов.
Пример 4. Различение нейтрализующих и не-нейтрализующих человеческих антител против химерных антител (HACA) в сыворотке пациентов новым анализом изменения подвижности
В этом примере раскрывается новый гомогенный метод измерения концентрации аутоантител (например, HACA) в образцах пациентов (например, сыворотке) и определения того, что такие аутоантитела являются нейтрализующими или ненейтрализующими аутоантителами, используя эксклюзионную хроматографию для выявления связывания этих аутоантител с флуоресцентно меченым препаратом против TNFα в присутствии флуоресцентно меченого TNFα. Этот метод является выгодным, поскольку в нем устраняется потребность в операциях отмывки, удаляющих HACA с низким сродством, используются разные флуорофоры, обеспечивающие определение в видимом и/или ИК-спектре, что уменьшает фон и помехи со стороны сыворотки, повышает способность выявления нейтрализующих или не-нейтрализующих НАСА у пациентов с низким титром вследствие высокой чувствительности детектирования флуоресцентной метки, а реакция протекает в жидкой фазе, при этом снижается вероятность любых изменений эпитопа при прикреплении к твердой поверхности типа планшетов для ELISA.
В одном типичном воплощении препарат против TNFα (например, REMICADE™) помечен флуорофором "F1" (например, см. фиг.17А), причем флуорофор можно детектировать как в видимом, так и в ИК спектре. Аналогичным образом TNFα помечен флуорофором "F2" (например, см. фиг.17A), причем флуорофор тоже можно детектировать как в видимом, так и в ИК спектре, при этом "F1" и "F2" - разные флуорофоры. Меченый препарат против TNFα инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции и добавляют в реакцию меченый TNFα, что способствует образованию комплексов (т.е. иммунокомплексов) между меченым препаратом против TNFα, меченым TNFα и/или HACA, присутствующими в сыворотке. После инкубации образцы наносят прямо на эксклюзионную колонку. Связывание и аутоантитела (например, HACA), и меченого TNFα с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика (например, "иммунокомплекса 1" на фиг.17A) влево по сравнению с двойным комплексом между аутоантителом и меченым препаратом против TNFα (например, "иммунокомплексом 2" на фиг.17A), одним только меченым препаратом или одним только меченым TNFα. Присутствие этого тройного комплекса аутоантитела (например, HACA), меченого TNFα и меченого препарата против TNFα означает, что аутоантитело, присутствующее в образце сыворотки, не является нейтрализующей формой аутоантитела (например, HACA), так что оно не мешает связыванию между антителом против TNFα и TNFα. В одном предпочтительном воплощении, которое представлено на фиг.17A, если в сыворотке присутствует не-нейтрализующее HACA, то сдвиг будет наблюдаться и для F1-REMICADE™, и для F2-TNFα, что приведет к возрастанию пиков как иммунокомплекса 1, так и иммунокомплекса 2, и к уменьшению пиков свободного F1-REMICADE™ и свободного F2-TNFα. Однако присутствие двойного комплекса между аутоантителом (например, HACA) и меченым препаратом против TNFα (например, "иммунокомплексом 2" на фиг.17B) при отсутствии тройного комплекса аутоантитела (например, HACA), меченого TNFα и меченого препарата против TNFα означает, что аутоантитело, присутствующее в сыворотке, является нейтрализующей формой аутоантитела (например, HACA), так что оно мешает связыванию между антителом против TNFα и TNFα. В одном предпочтительном воплощении, которое представлено на фиг.17B, если в сыворотке присутствует нейтрализующее HACA, то сдвиг будет наблюдаться для F1-REMICADE™, что приведет к возрастанию пика иммунокомплекса 2, уменьшению пика свободного F1-REMICADE™ без каких-либо изменений пика свободного F2-TNFα. В определенных случаях присутствие нейтрализующего HACA указывает на то, что с текущей терапии REMICADE™ следует перейти на другой препарат против TNFα, как-то HUMIRA™.
В альтернативном воплощении меченый препарат против TNFα сначала инкубируют с сывороткой человека в жидкофазной реакции, что способствует образованию комплексов (т.е. иммунокомплексов) между меченым препаратом против TNFα и HACA, присутствующими в сыворотке. После инкубации образцы наносят прямо на первую эксклюзионную колонку. Связывание аутоантитела (например, HACA) с меченым препаратом против TNFα приводит к сдвигу пика (т.е. "иммунокомплекса 2" на фиг.18) влево по сравнению с одним только меченым препаратом. Затем в реакцию добавляют меченый TNFα, чтобы установить, способен ли он вытеснить (например, конкурировать с) аутоантитело (например, HACA) для связывания с меченым препаратом против TNFα и тем самым способствовать образованию комплексов (т.е. иммунокомплексов) между меченым препаратом против TNFα и меченым TNFα. После инкубации образцы наносят прямо на вторую эксклюзионную колонку. Связывание меченого препарата против TNFα с меченым TNFα приводит к сдвигу пика (т.е. "иммунокомплекса 3" на фиг.18) влево по сравнению с одним только меченым TNFα. Нарушение связывания между аутоантителом (например, HACA) и меченым препаратом против TNFα при добавлении меченого TNFα означает, что аутоантитело, присутствующее в образце сыворотки, является нейтрализующей формой аутоантитела (например, HACA), так что оно мешает связыванию между антителом против TNFα и TNFα. В определенных случаях присутствие нейтрализующего HACA указывает на то, что с текущей терапии REMICADE™ следует перейти на другой препарат против TNFα, как-то HUMIRA™.
Пример 5. Анализ человеческих антител против лекарственных препаратов (ADA) к адалимумабу в сыворотке пациентов новым анализом изменения подвижности
Введение. Моноклональные антитела против TNF-α, такие как инфликсимаб (IFX), адалимумаб (HUMIRA™) и цертолизумаб, оказались эффективными при лечении воспалительной болезни кишечника (DBD) и других воспалительных заболеваний. Антитела против лекарственных препаратов (ADA) могут уменьшить эффективность препарата и/или вызывать отрицательные эффекты. Однако ADAs были обнаружены не только у пациентов, получавших химерное антитело инфликсимаб, но также и у пациентов, получавших гуманизированное антитело адалимумаб. Мониторинг уровней ADA и препарата у индивидуальных пациентов может помочь оптимизировать лечение и дозировку у пациентов. Мы разработали нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности для точного измерения и HACA (человеческих антител против химерных антител), и IPX в сыворотке пациентов. Этот метод анализа преодолевает основные ограничения существующих твердофазных методов определения HACA, а именно то, что они не способны точно определять HACA в присутствии IFX в кровотоке. В настоящем исследовании мы апробировали этот новый метод измерения уровней ADA и препарата в сыворотке пациентов, получавших препарат гуманизированного антитела, адалимумаб.
Методы. Анализ изменения подвижности основывается на изменении времени удержания свободного антигена относительно иммунокомплекса антиген-антитело при эксклюзионном разделении. Меченный флуорофором адалимумаб или TNFα и внутренний контроль смешивали с образцами сыворотки для измерения изменения подвижности свободного адилимумаба и TNFα в присутствии ADA или препарата. Изменения в соотношении свободного адалимумаба или TNFα к внутреннему контролю указывают на образование иммунокомплекса. Концентрации ADA или адалимумаба в сыворотке определяли по стандартным кривым, построенным при инкубации при различных концентрациях антител против IgG человека или очищенного адалимумаба. Анализом изменения подвижности измеряли уровни адалимумаба и ADA в образцах сыворотки, взятых у больных IBD, получавших адалимумаб, которые оказались невосприимчивыми.
Результаты. Для измерения изменения подвижности меченого адалимумаба строили кривые доза-ответ с антителом против IgG человека. Предел обнаружения метода составил 1 нг антитела против IgG человека. Сыворотки от 50 здоровых контролей тестировали на ADA, и уровень ADA во всех образцах был ниже предела обнаружения (т.е. не было изменения подвижности свободного меченого адалимумаба). Обнаружение ADA также было продемонстрировано в присутствии экзогенного добавленного адалимумаба. Для измерения концентрации препарата у пациентов, получавших адалимумаб, строили стандартную кривую при различных количествах адалимумаба по изменению подвижности меченого TNFα, при этом предел обнаружения адалимумаба составил Юнг.
Выводы. Применяли нерадиоактивный жидкофазный анализ изменения подвижности по настоящему изобретению для измерения уровней ADA и адалимумаба в образцах сыворотки пациентов, получавших адалимумаб. Метод оказался воспроизводимым с высокой чувствительностью и точностью и может применяться для определения уровня ADA в образцах сыворотки пациентов, получающих адалимумаб.
Пример 6. Анализ антител против лекарственных препаратов (ADA) к адалимумабу в сыворотке пациентов новым собственным анализом изменения подвижности
РЕФЕРАТ
Введение. Препараты против TNFα, такие как инфликсимаб (IFX) и адалимумаб (ADL), оказались эффективными при лечении воспалительной болезни кишечника (IBD). Однако возникновение ADA при лечении пациентов может уменьшить эффективность препарата и/или вызвать отрицательные эффекты. Так, ADAs были обнаружены не только у пациентов, получавших IFX, но также и у пациентов, получавших ADL. Мониторинг уровней ADA и препарата у индивидуальных пациентов может помочь оптимизировать лечение и дозировку у пациентов. Мы разработали нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности для точного измерения и НАСА (человеческих антител против химерных антител), и IFX в сыворотке пациентов. Этот метод преодолевает основные ограничения существующих твердофазных методов определения HACA, а именно то, что они не способны точно определять HACA в присутствии IFX в кровотоке. В настоящем исследовании мы апробировали этот новый метод измерения уровней ADA и препарата в сыворотке пациентов, получавших препарат полностью человеческого антитела, ADL.
Методы. Анализ изменения подвижности основывается на изменении времени удержания иммунокомплекса антиген-антитело относительно свободного антигена при эксклюзионной хроматографии. Меченный флуорофором ADL или TNFα и внутренний контроль смешивали с образцами сыворотки для измерения изменения подвижности меченого ADL и TNFα в присутствии ADA или препарата. Изменения в соотношении свободного ADL или TNFα к внутреннему контролю указывают на образование иммунокомплекса. Концентрации ADA или ADL в сыворотке определяли по стандартным кривым, построенным при инкубации при различных концентрациях антител против IgG человека или очищенного ADL. Этим методом измеряли уровни ADL и ADA в образцах сыворотки, взятых у больных IBD, получавших ADL.
Результаты. Для измерения изменения подвижности меченого ADL строили кривые доза-ответ с антителом против IgG человека. Предел обнаружения метода составил 10 нг антитела против IgG человека. Сыворотки от 100 здоровых контролей тестировали на ADA, и во всех образцах уровень ADA был ниже предела обнаружения (не было изменения подвижности свободного меченого ADL). Обнаружение ADA было продемонстрировано в образцах 5 из 114 больных IBD, получавших ADL. Для измерения концентрации препарата у пациентов, получавших ADL, строили стандартную кривую при различных количествах ADL по изменению подвижности меченого TNFα, при этом предел обнаружения составил 10 нг.
Выводы. Применяли наш собственный нерадиоактивный жидкофазный гомогенный анализ изменения подвижности для измерения уровней ADA и ADL в сыворотке пациентов, получавших ADL. Метод оказался воспроизводимым с высокой чувствительностью и точностью и применим для определения уровня ADA в образцах сыворотки от пациентов, получающих адалимумаб.
ВВЕДЕНИЕ
Биологические препараты против Фактора некроза опухолей-альфа (TNFα), такие как инфликсимаб (IPX), этанерцепт, адалимумаб (ADL) и цертолизумаб-пегол, уменьшают активность заболевания при ряде аутоиммунных заболеваний, включая болезнь Крона (CD) и ревматоидный артрит (RA). Однако некоторые пациенты не реагируют на терапию против TNFα, тогда как другим нужны более высокие или более частые дозы в связи с отсутствием достаточного ответа или возникновением реакций на введение.
Иммуногенность терапевтических антител, которая вызывает у пациентов появление антител против препаратов, может способствовать несостоятельности лечения и реакциям на введение. Химерные антитела типа IFX обладают большей способностью вызывать появление антител, нем полностью гуманизированные антитела, как-то ADL. Распространенность антител к IFX (HACA) у больных RA составляет от 12% до 44% и обратно пропорциональна уровню IFX в сыворотке пациентов и терапевтическому ответу. Хотя полностью гуманизированный ADL и должен быть менее иммуногенным, чем мышиные или химерные антитела, но в некоторых исследованиях сообщалось о возникновении человеческих антител против гуманизированных антител (ПАВА), причем распространенность появления антител у больных RA и CD составляла от 1% до 87% (Aikawa et al., Immunogenicity of anti-TNF-alpha agents in autoimmune diseases. Clin. Rev. Allergy hnmunol., 38 (2-3): 82-9 (2010)).
Многие пациенты с вторичной невосприимчивостью к одному препарату против TNFα могут получить пользу от перехода на другой препарат против TNFα или увеличение дозы и/или ее частоты. Поэтому вполне обоснован мониторинг пациентов на уровень препарата и антител против препарата (ADA) с тем, чтобы введение препарата можно было адаптировать к конкретному пациенту. Такой подход позволяет провести коррекцию дозы, когда это оправдано, или прекратить лечение при наличии ADA (Bendtzen et al., Individual medicine in inflammatory bowel disease: monitoring bioavailability, pharmacokinetics and immunogenicity of anti-tumour necrosis factor-alpha antibodies. Scand. J. Gastroenterol., 44(7): 774-81 (2009); Afif et al., Clinical utility of measuring infliximab and human anti-chimeric antibody concentrations in patients with inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol., 105(5): 1133-9 (2010)).
Был разработан целый ряд методов измерения НАСА и НАЛА. Одним из ограничений существующих методик является то, что уровень ADA невозможно надежно измерить при высоком уровне лекарственных препаратов в кровотоке.
Мы разработали собственный нерадиоактивный жидкофазный анализ изменения подвижности для измерения уровней ADA и ADL в сыворотке пациентов, получающих ADL, на который не влияет присутствие препарата в сыворотке.
МЕТОДЫ
Меченный флуорофором (F1) ADL инкубировали с сывороткой пациентов для образования иммунокомплекса. В качестве внутреннего контроля в каждую реакцию включали F1-меченный небольшой пептид. Для построения стандартной кривой для определения уровня ADA в сыворотке использовали различные количества антител против IgG человека. Свободный F1-меченный ADL отделяли от связанного с антителом комплекса на основании молекулярной массы методом эксклюзионной хроматографии. Для экстраполяции концентрации НАНА по стандартной кривой использовали соотношение свободного F1-меченного ADL к внутреннему контролю из каждого образца. Аналогичная методология использовалась для измерения уровня ADL в образцах сыворотки пациентов с F1-меченным TNFα.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На фиг.19 представлено разделение связанного с антителом против IgG человека комплекса F1-ADL от свободного F1-ADL вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из панелей от с до h, время удержания пика флуоресценции изменялось с 10,1 мин до 7,3-9,5 мин.Чем больше антитела против IgG человека добавлено в реакционную смесь, тем меньше остается свободного ADL на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса (h-с). Время удержания для внутреннего контроля составляет 13,5 мин.
На фиг.20 представлена кривая доза-ответ для сдвига пика флуоресценции, вызванного добавлением антитела против IgG человека. При повышении концентрации антитела против IgG человека снижается соотношение свободного ADL к внутреннему контролю вследствие образования иммунокомплекса. Чувствительность метода составляет 10 нг/мл антител против IgG человека. Внутренний контроль "F1-BioCyt" соответствует Alexa Fluor 488-биоцитину (BioCyt), в котором дающий зеленую флуоресценцию флуорофор Alexa Fluor 488 сочетается с биотином и фиксируемым альдегидами первичным амином (лизином) (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA).
На фиг.21 представлено разделение связанного с ADL комплекса TNFα-F1 от свободного TNFα-F1 вследствие изменения подвижности высокомолекулярного комплекса. Как видно из панелей от c до j, время удержания пика флуоресценции изменяется с 11,9 мин до 6,5-10,5 мин. Чем больше ADL добавлено в реакционную смесь, тем меньше остается свободного TNF-α-F1 на хроматограмме и тем больше образуется иммунокомплекса.
На фиг.22 представлены кривые доза-ответ для сдвига пика TNFα-F1, вызванного добавлением ADL. Исходя из добавленного ADL, предел обнаружения составляет 10 нг/мл ADL в сыворотке.
Из таблицы 4 видно, что образцы сыворотки от 100 здоровых субъектов и 114 больных IBD, получавших ADL, анализировали на уровни ADA и ADL анализом изменения подвижности по настоящему изобретению. Во всех образцах от 100 здоровых субъектов уровень ADA был ниже предела обнаружения (не было изменения подвижности свободного F1-ADL), тогда как в образцах 5 из 114 больных концентрация ADA составляла от 0,012 до >20 мкг/мл. Средний уровень ADL в образцах от 100 здоровых субъектов составил 0,76±1,0 мкг/мл (диапазон от 0 до 9,4 мкг/мл). Средний уровень ADL в образцах от 114 больных, получавших ADL, составил 10,8±17,8 мкг/мл (диапазон от 0 до 139 мкг/мл). В четырех из пяти ADA-положительных образцов уровень ADL не обнаруживался.
Таблица 4
Уровни ADA и ADL в сыворотке пациентов при измерении анализом изменения подвижности
Субъекты (n)
Пол (м/ж)
Возраст (лет) (среднее)
ADA-положит.
Уровень ADL (мкг/мл)
Здоровый контроль
100
38/62
18-62 (37,1)
0
0,76±1,00
Больные DBD, получавшие ADL
114
51/63
20-69 (39,9)
5 (4,3%)
10,8±17,8
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Формат анализа изменения подвижности, используемого для измерения HACA/IFX, представляет собой гомогенный анализ без покрытия антигеном твердой поверхности и без многократных стадий отмывания и инкубации, как при типичном ELISA. Этот метод может применяться для измерения ADA и препаратов против TNF. Чувствительность метода (в диапазоне мкг/мл) при измерении и ADA, и ADL в сыворотке пациентов выше по сравнению с методами ELISA (в диапазоне мг/мл). Образцы сыворотки здоровых контролей не вызывали изменения подвижности F1-меченного ADL, a ADA обнаруживались этим методом у 4,3% пациентов, получавших ADL. Хотя образцы сыворотки здоровых контролей и вызывали изменение подвижности F1-меченного TNFα, что может быть вызвано присутствием растворимого свободного рецептора TNFα, однако средний уровень ADL у больных, получавших ADL, был значительно выше (10,8 против 0,76 мг/мл). Раннее выявление ADA и мониторинг уровня препарата ADL во время лечения пациентов ADL позволит врачам оптимизировать дозу ADL или перейти на другой препарат против TNFα при необходимости и тем самым оптимизировать общий ход лечения заболевания пациентов.
Таблица 5
Уровни ADA и ADL в сыворотке пациентов при измерении анализом изменения подвижности
Субъекты (n)
Пол (м/ж)
Возраст (среднее)
Уровень ADL (мкг/мл)
ADA-положит.
Здоровый контроль
100
38/62
18-62 (37,1)
0,76±1,00
0
Больные IBD, получавшие ADL
114
51/63
20-69 (39,9)
10,8±17,8
0-4 мкг/мл ADL: 4 из 42 (9,52%)
Этим анализом изменения подвижности анализировали образцы сыворотки от 100 здоровых субъектов и 114 больных IBD, получавших ADL, на уровни ADA и ADL. Во всех образцах от 100 здоровых субъектов уровень ADA был ниже предела обнаружения (не было изменения подвижности свободного F1-ADL), тогда как в образцах 4 из 42 больных с 0-4 мкг/мл ADL средняя концентрация ADA составляла от 0,012 до >20 мкг/мл. Средний уровень ADL в образцах от 100 здоровых субъектов составил 0,76±1,0 мкг/мл (диапазон от 0 до 9,4 мкг/мл). Средний уровень ADL в образцах от 114 больных, получавших ADL, составил 10,8±17,8 мкг/мл (диапазон от 0 до 139 мкг/мл). В четырех из 4 ADA-положительных образцов уровень ADL не обнаруживался. Для выявления ADA всех 114 больных IBD, получавших ADL, разделили на две категории: 0-4 мкг/мл ADL и >4 мкг/мл ADL. Больных с более 4 мкг/мл ADL нужно тестировать при большем количестве ADL-F1 с учетом конкуренции между циркулирующим ADL и ADL-F1.
В таблице 5 представлены образцы сыворотки здорового контроля которые как видно не вызывали изменения подвижности F1-меченного ADL. В предварительном исследовании у 9,52% больных с 0,4 мкг/мл ADL были обнаружены ADA этим методом. Будет проведено дальнейшее исследование нормальных образцов и образцов больных при более высоких концентрациях ADL-F1.
Пример 7. Комбинаторный алгоритм для оптимизации терапии препаратами против TNF
В этом примере описаны методы оптимизации терапии, снижения токсичности и/или контролирования эффективности терапевтического лечения путем применения статистического алгоритма, такого, например, как обучающаяся система статистических классификаторов, к одному или нескольким (например, комбинации из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи или больше) биохимическим маркерам, серологическим маркерам и/или генетическим маркерам. Соответственно, методы, изложенные в настоящем примере, обеспечивают информацию, полезную для направления решений по лечению пациентов, получающих терапию препаратами против TNF, например, путем определения того, когда или как нужно скорректировать или изменить (например, увеличить или уменьшить) последующую дозу препарата против TNF, когда или как нужно скомбинировать препарат против TNF (например, при повышенной, пониженной или такой же дозе) с одним или несколькими иммунодепрессивными средствами, такими как метотрексат (МТХ) или азатиоприн (AZA), и/или когда или как нужно изменить текущий курс терапии (например, перейти на другой препарат против TNF).
В качестве неограничивающего примера можно выявлять, измерять или определять наличие, уровень или генотип одного, двух, трех, четырех, пяти или всех шести из следующих классов биохимических маркеров, серологических маркеров и/или генетических маркеров в образцах пациентов (например, образцах сыворотки пациентов, проходящих терапию препаратом против TNF):
(1) уровень препарата против TNF (например, уровень свободного лечебного антитела против TNFα);
(2) уровень антител против препарата (ADA) (например, уровень аутоантител к препарату против TNF);
(3) уровень TNFα;
(4) уровень одного, двух, трех, четыре, пяти, шести, семи или больше дополнительных цитокинов (например, IL-6, IL-1β, IFN-γ, IL-10 и т.д.) и/или маркеров для других механизмов воспаления (например, таких маркеров воспаления, как CRP, SAA, ICAM-1 и/или VCAM-1);
(5) наличие или отсутствие одной или нескольких мутаций у одного или нескольких генетических маркеров типа генов воспалительного пути, например, наличие или отсутствие вариантов аллелей (например, SNPs) у одного или нескольких маркеров воспаления, таких, например, как NOD2/CARD15 (например, SNP 8, SNP 12 и/или SNP 13, описанных в патенте США No. 7,592,437), ATG16L1 (например, SNP rs2241880 (T300A), описанного в Lakatos et al., Digestive and Liver Disease, 40 (2008) 867-873), SNP IL23R (например, rsl 1209026 (R381Q), описанного в Lakatos et al.), генов антигенов лейкоцитов человека (HLA) и/или генов цитокинов, описанных, например, в Gasche et al. (Eur. J. Gastroenterology & Hepatology (2003) 15:599-606), и генов DLG5 и/или OCTN из локуса IBD5;
(6) уровень одного или нескольких биохимических маркеров и/или серологических маркеров в различные моменты времени (например, через 28 недель, 60 недель и т.д.); и
(7) их комбинации.
Затем можно применить один статистический алгоритм или комбинацию из двух или нескольких статистических алгоритмов, описанных здесь, к наличию, уровню концентрации или генотипу маркеров, выявленных, измеренных или определенных в образце, чтобы тем самым оптимизировать терапию, уменьшить токсичность и/или проконтролировать эффективность терапевтического лечения препаратом против TNF. При этом способы, описанные в данном примере, найдут применение при определении лечения пациента путем определения иммунного статуса пациента.
Ниже в таблице 6 приведена сводка по уровню цитокинов в нормальных образцах и образцах пациентов.
Таблица 6
Образцы
IFN-γ
IL-1β
IL-6
TNF-α
Нормальный контроль n=64
Среднее ± SD (пг/мл)
0,88±2,71
0,17±0,72
0,66±0,58
1,78±0,71
Интервал (пг/мл)
0,00-141,42
0,00-44,41
0,12-31,70
0,36-23,83
Среднее +2SD (пг/мл)
6,3
1,6
1,82
3,19
Положит./общее к-во
5/64
2/64
11/64
3/64
Образцы UC (получавших IFX) n=43
Среднее ± SD (пг/мл)
1,96±2,24
0,13±0,08
0,86±1,23
6,08±6,54
Интервал (пг/мл)
0,00-9,34
0,01-0,42
0,12-5,60
0,13-35,54
Положит./общее к-во
3/43 (7,0%)
0/43 (0,0%)
5/43 (11,6%)
34/43 (79,1%)
Образцы CD (получавших Humira) n=117
Среднее ± SD (пг/мл)
2,88±4,25
0,59±1,22
1,56±1,55
8,03±21,40
Интервал (пг/мл)
0,00-36,29
0,00-8,59
0,17-11,93
0,49-207,29
Положит./общее к-во
14/117 (12,0%)
11/117 (9,4%)
35/117 (29,9%)
67/117 (57,3%)
HACA-положительные образцы n=94
Среднее ± SD (пг/мл)
6,21±12,12
4,36±37,70
3,58±6,35
21,16±32,78
Интервал (пг/мл)
0,18-98,87
0-366,11
0,09-2302,4
0,09-176,12
Положит./общее к-во
25/94 (26,6%)
4/94 (4,3%)
39/94 (41,5%)
62/94 (66,0%)
Только в целях иллюстрации представлены следующие сценарии, показывающие, как способы настоящего изобретения позволяют правильно оптимизировать терапию и свести к минимуму или уменьшить токсичность (например, побочные эффекты) по наличию, уровню и/или генотипу одного или нескольких биохимических маркеров, серологических маркеров и/или генетических маркеров, как описано здесь. В каждом из следующих сценариев для оптимизации терапии и/или снижения токсичности в связи с препаратом против TNF можно применять один, два или несколько статистических алгоритмов.
Сценарий №1. Высокий уровень препарата против TNF при низком уровне антител против препарата (ADA) и низком уровне воспалительных цитокинов
Уровень препарата = 10-50 нг/10 мкл; уровень ADA = 0,1-2 нг/10 мкл; уровень TNFα=1-8 пг/мл; уровень IL-6=0,1-3 пг/мл; уровень IL-1β=0,0-2 пг/мл; уровень IFN-γ=0-6 пг/мл; антитела против IL-10 не обнаружены. Образцы пациентов с таким профилем маркеров включают образцы от пациентов ВАВ и JAA при 10-м посещении ("V10"). См. фиг.16b.
Пациентов, получающих лечение препаратом против TNF и имеющих данный профиль маркеров, следует лечить иммунодепрессивными препаратами типа азатиоприна вместе с препаратом против TNF (например, инфликсимаб).
Сценарий №2. Средний уровень препарата против TNF при низком уровне ADA и низком уровне воспалительных цитокинов
Уровень препарата = 5-20 нг/10 мкл; уровень ADA=0,1-2 нг/10 мкл; уровень TNFα=1-8 пг/мл; уровень IL-6=0,1-3 пг/мл; уровень IL-1β=0,0-2 пг/мл; уровень EFN-γ=0-6 пг/мл; антитела против IL-10 не обнаружены. Образцы пациентов с таким профилем маркеров включают образцы от пациентов DGO, JAG и JJH при 10-м посещении ("V10"). См. фиг.16b.
Пациентов, получающих лечение препаратом против TNF и имеющих данный профиль маркеров, следует лечить иммунодепрессивными препаратами типа азатиоприна вместе с более высокой дозой препарата против TNF (например, инфликсимаба). Специалистам должны быть известны подходящие более высокие или более низкие дозы, на которые следует перевести текущий курс терапии с тем, чтобы оптимизировать лечение препаратом, например, последующая доза должна быть по меньшей мере в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 100 раз больше или меньше текущей дозы.
Сценарий №3. Средний уровень препарата против TNF при среднем уровне ADA и низком уровне воспалительных цитокинов
Уровень препарата = 5-20 нг/10 мкл; уровень ADA=0,5-10 нг/10 мкл; уровень TNFα=1-8 пг/мл; уровень IL-6=0,1-3 пг/мл; уровень IL-1β=0,0-2 пг/мл; уровень IFN-γ=0-6 пг/мл; антитела против IL-10 не обнаружены. Образцы пациентов с таким профилем маркеров включают образцы от пациента JMM при 10-м посещении ("V10") и пациента J-L при 14-м посещении ("V14"). См. фиг.16b.
Пациентов, получающих лечение препаратом против TNF и имеющих данный профиль маркеров, следует лечить другим препаратом. В качестве неограничивающего примера: пациента, проходящего лечение инфликсимабом (IFX) и имеющего средние уровни IFX и ADA (т.е. HACA) при низком уровне воспалительных цитокинов, следует перевести на лечение адалимумабом (HUMIRA™).
Сценарий №4. Низкий уровень препарата против TNF при высоком уровне ADA и высоком уровне воспалительных цитокинов
Уровень препарата: 0-5 нг/10 мкл; уровень ADA=3,0-50 нг/10 мкл; уровень TNFα=10-60 пг/мл; уровень IL-6=0,1-50 пг/мл; уровень IL-1β=0,0-366 пг/мл; уровень IFN-γ=0,15-100 пг/мл; антитела против IL-10 не обнаружены. Образцы пациентов с таким профилем маркеров включают образцы от всех пациентов при 14-м посещении ("V14") на фиг.16b.
Пациентов, получающих лечение препаратом против TNF и имеющих данный профиль маркеров, следует лечить другим препаратом. В качестве неограничивающего примера: пациента, проходящего лечение инфликсимабом (IFX) и имеющего низкий уровень IFX при высоком уровне ADA (т.е. HACA) и воспалительных цитокинов, следует перевести на лечение адалимумабом (HUMIRA™).
Сценарий №5. Высокий уровень воспалительных цитокинов
Высокий уровень TNFα (например, 10-60 пг/мл); высокий уровень IL-6 (например, 0,1-50 пг/мл); высокий уровень IL-1β (например, 0,0-366 пг/мл); высокий уровень IFN-γ (например, 0,15-100 пг/мл); высокий уровень других воспалительных молекул; +/- антитела против противовоспалительных цитокинов (например, антитела против IL-10 либо обнаружены, либо не обнаружены).
Пациентов, получающих лечение препаратом против TNF и имеющих данный профиль маркеров, следует либо лечить другим препаратом, либо лечить иммунодепрессивными препаратами типа метотрексата (MTX) или азатиоприна (AZA) вместе с более высокой дозой препарата против TNF. В частности, такой профиль маркеров с высоким уровнем воспалительных цитокинов у пациента, проходящего лечение инфликсимабом (IFX), означает, что текущий курс лечения не работает и пациента следует перевести на лечение адалимумабом (HUMIRA™) либо лечить одним или несколькими иммунодепрессивными препаратами вместе с более высокой дозой IFX.
Пример 8. Определение различных изотипов антител против лекарственных препаратов (ADA)
В этом примере описано определение различных изотипов антител против лекарственных препаратов (ADA) у ADA-положительных пациентов, получающих лечение препаратами против TNF. Неограничивающие примеры изотипов антител включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых аспектах определение наличия или уровня определенного изотипа ADA или определенной комбинации изотипов ADA связано с различными клиническими результатами.
На фиг.23 представлено время элюирования различных изотипов ADA в HACA-положительной сыворотке пациентов. В предпочтительных воплощениях терапевтические последствия лечения препаратом против TNF можно установить на основании того, что ADA представлены изотипом IgM (время удержания: ~6,5-7,5 мин), изотипом IgA (7,5-8,5 мин) или изотипом IgG (8,5-9,5 мин), исходя из размера и соответствующих экспериментов с разведением. Время удержания для меченых препаратов против TNF типа Humira и Remicade составляет 10,8 минут, а время удержания для внутреннего контроля (IC) составляет 13,5 минут.
В одном исследовании способами настоящего изобретения анализировали образцы от 200 пациентов для обнаружения ADA методом эксклюзионной хроматографии. Образцы 1-100 были контрольными (например, образцы нормальных здоровых контролей), тогда как образцы 101-200 были получены от пациентов, получающих терапию Remicade, и оказались HACA-положительными по мостиковому методу. Для всех 200 образцов строили нескорректированные графики интенсивности сигнала (ось Y) относительно времени элюирования (ось X). Затем на графиках делали следующие три корректировки: (1) нормализацию Y (низких) по базовой линии слева; (2) нормализацию Y (высоких) по контрольному пику справа; и (3) нормализацию Х по контрольному пику справа.
Данные по всем 200 образцам разделяли на 100 контрольных образцов и 100 HACA-положительных образцов, а затем усредняли. На фиг.24 представлен график средних значений контрольных образцов. На фиг.25 представлен график средних значений положительных образцов. При сравнении графиков на фиг.24 и 25 отмечается снижение интенсивности сигнала для меченого Remicade ("главный пик") и появление пиков двух различных изотипов ADA, соответствующих HACA типа IgA ("пик А") и HACA типа IgG ("пик G").
На фиг.26 приведено сравнение сигналов главного пика (т.е. соответствующих интенсивности сигнала меченого Remicade) параллельно для 100 контрольных образцов и 100 положительных образцов. Представлены средние значения при времени элюирования от 9,71 до 12,23 мин. В частности, из фиг.26 видно снижение интенсивности сигнала меченого Remicade для 100 HACA-положительных образцов, что коррелирует с образованием комплексов между меченым Remicade и HACA. Из фиг.26 также видно, что у ряда положительных образцов был высокий уровень НАСА, о чем свидетельствуют слабые сигналы главного пика (например, между 0 и 0,2 на оси X). На фиг.27 представлена характеристическая кривая обнаружения (ROC) для данных по главному пику из фиг.26. Площадь под кривой (AUC) составила 0,986.
Далее строили графики средних значений для главного пика относительно суммы других пиков (IgG, IgA и IgM). На фиг.28 представлен график второстепенных пиков по оси Х (что соответствует сумме пиков IgG, IgA и IgM) относительно главного пика по оси Y для 100 HACA-положительных образцов. Линейная зависимость, приведенная на этом графике, может использоваться в качестве проверки метода (т.е. контроля метода). На фиг.29 представлен график пиков IgG относительно IgA относительно IgM для всех 200 образцов.
Пример 9. Определение различных изотипов ADA основанном на сближении методом
В этом примере описано типичное воплощение настоящего изобретения для определения различных изотипов антител против лекарственных препаратов (ADA), как-то различных изотипов ATI (т.е. антител к IFX; "HACA"), у ADA-положительных пациентов, получающих лечение таким препаратом против TNFα, как инфликсимаб (IFX). Неограничивающие примеры изотипов антител, как-то изотипов ATI, включают IgA, IgD, IgE, IgG и IgM (например, ATI типа IgA, типа IgD, типа IgE, типа IgG и типа IgM). В некоторых аспектах выявление наличия или уровня определенного изотипа ADA либо определенной комбинации изотипов ADA связано с различными клиническими результатами.
На фиг.30 и 31 представлены воплощения основанного на сближении способа определения изотипа по настоящему изобретению для определения наличия (или отсутствия) либо уровня по меньшей мере одного, двух, трех, четырех, пяти или больше изотипов ATI, таких, например, как ATI изотипов IgA, IgD, IgE, IgG и/или IgM, с использованием метода резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Так, на фиг.30 приведена схема, показывающая, что Alexa-532 (метка "F2" на антителе против Ig, как-то против IgA) возбуждается Alexa-488 (меткой "F1" на лечебном антителе типа IFX) только тогда, когда оба флуорофора находятся в непосредственной близости, тем самым указывая на наличие и/или уровень тройного комплекса между анти-Ig (например, анти-IgA), HACA (например, ATI типа IgA) и IFX. В предпочтительных воплощениях различные изотипы ATI и/или их подклассы определяются с помощью различных антител против Ig, помеченных одним и тем же или разными флуорофорами, такими, например, как Alexa-532. На фиг.31 представлены результаты основанного на FRET способа определения изотипа по настоящему изобретению.
Хотя настоящее изобретение и было описано весьма подробно посредством иллюстраций и примеров для ясности понимания, однако специалистам в данной области должно быть понятно, что в рамках прилагаемой формулы изобретения возможны определенные изменения и модификации. Кроме того, каждая ссылка, приведенная здесь, включена путем ссылки во всей полноте в той же степени, как если бы каждая ссылка была включена индивидуально путем ссылки.