СЕМЕЙСТВО ГЕНОВ (LBFL313), АССОЦИИРОВАННЫХ С ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМ РОСТОМ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
GENE (LBFL313) FAMILY ASSOCIATED WITH MALIGNANT GROWTH OF PANCREAS

Область техники
Изобретение относится к изменениям экспрессии генов в ткани злокачественного роста поджелудочной железы от пациентов с злокачественным ростом поджелудочной железы. Изобретение в частности относится к гену человека, который по-разному экспрессируется в тканях злокачественного роста поджелудочной железы и в соответствующей нормальной ткани поджелудочной железы, а также в других злокачественных новообразованиях.
Предшествующий уровень техники
Datamonitor
Pancreatology
Cancer Biol Therapy
Nature Rev Cancer
Lancet
Злокачественный рост поджелудочной железы - четвертая ведущая причина смертности от злокачественного роста у мужчин и женщин - является важной проблемой здравоохранения в развитых странах и ассоциирован с чрезвычайно плохим прогнозом (Faint et al. (2004)  DMHC2045; Garcea et al. (2005)  5:514-529; Kern et al. (2002)  1:607-613; Laheru and Jaffee (2005)  5:59-467; Li et al (2004)  363:1049-1057). Согласно оценкам, в год примерно у 30000 американцев развивается это заболевание, и они от него умирают. Несмотря на агрессивное хирургическое и медикаментозное лечение, средняя ожидаемая продолжительность жизни составляет около 15-18 месяцев для пациентов с локальным и ограниченным заболеванием и 3-6 месяцев для пациентов с метастазирующей опухолью. Почти у 100% пациентов с злокачественным ростом поджелудочной железы развиваются метастазы, и они умирают из-за ослабляющих метаболических эффектов неограниченного роста, и общая пятилетняя выживаемость для групп пациентов, которым не были проведены резекционные процедуры, составляет менее чем пять процентов. Оно является особенно агрессивным с неспецифическими начальными симптомами и трудной ранней диагностикой. Разрабатываются способы раннего определения злокачественного роста поджелудочной железы, но еще не используются на практике, и обычная противораковая терапия оказывает небольшое влияние на прогноз и исход болезни. Плохой прогноз злокачественного роста поджелудочной железы определяется его тенденцией к позднему проявлению, агрессивной местной инвазии, раннему метастазированию и плохой реакции на химиотерапию.
Clin Cancer Res
Cancer Biol Therapy
Lancet
Как и многие другие злокачественные заболевания, злокачественный рост поджелудочной железы возникает в результате накопления приобретенных мутаций. Множественные генетические и эпигенетические изменения, включая активацию протоонкогенов, инактивацию генов-супрессоров опухоли и нарушения поддерживающих генов, вовлечены в развитие, непрерывный рост и метастазирование злокачественного роста поджелудочной железы. Считают, что накопленные мутации в таких генах возникают в предсказуемый временной период в течение стадий «PanINs» (Интраэпителиальная Неоплазия Поджелудочной железы (Pancreatic Intraepithelial Neoplasia) (Hruban et al (2000)  6:2969-2972; Kern et al. (2002)  1:607-613; Li et al. (2004)  363:1049-1057). Мутация K-ras возникает в середине PanIN-1. Стадия PanIN-2 отмечена дополнительными изменениями и увеличением степени мутаций K-ras и появлением множества аномалий р16, и повышенной экспрессии белка р53, которая может указывать на присутствие мутаций р53, и возникает случайно на более поздних стадиях PanINs. Потеря генов-супрессоров опухолей ТР53, DPC4 и BRCA2, вероятно, возникает позднее в развитии неоплазии поджелудочной железы PanIN-3.
Lancet
Cancer Chem Pharm
Более чем 85% злокачественного роста протоков поджелудочной железы имеют активирующую точечную мутацию гена K-ras при развитии злокачественного роста поджелудочной железы (Li et al. (2004)  363:1049-1057; Xiong (2004)  54:S69-77). Мутация K-ras приводит к постоянной активации внутриклеточного сигнального пути, Ras-Raf-MEK-ERK, приводящего к пролиферации клеток, и, таким образом, придает трансформирующие свойства клеткам, содержащим точечные мутации в этом гене. Мутация Ras не ассоциирована со стадией или прогнозом опухоли, что свидетельствует о том, что онкоген K-ras может быть связан с развитием онкогенеза, но не связан со злокачественным потенциалом или развитием злокачественного роста поджелудочной железы человека. Одной из ключевых последующих целей семейства Ras является фосфоинозитол-3-киназа (PI3K). Активация PI3K вовлечена в устойчивость злокачественного роста поджелудочной железы к апоптозу, индуцированному химиотерапевтическими или молекулярными нацеливающимися веществами.
Cancer Biol Therapy
Best Pract Res Clin Gastroenterol
Инактивация гена-супрессора опухолей р16, вероятно, возникает немного позже. Ген р16 инактивируется практически во всех аденокарциномах протоков мутацией, гомозиготной делецией или транскрипционным отключением, ассоциированным с метилированием промотора (Kern et al. (2002)  1:607-613; Maitra et al. (2006) 20:211-226). Белок р16 регулирует клеточный цикл посредством пути р16/Rb, следовательно, генетическая инактивация гена р16 означает, что при злокачественном росте поджелудочной железы теряется критический регулятор клеточного цикла. Интересно, что наследственные мутации гена р16 являются причиной синдрома Семейной Атипичной Множественной Невусной Меланомы (FAMMM), и у пациентов с FAMMM имеется повышенный риск развития меланомы и злокачественного роста поджелудочной железы.
Best Pract Res Clin Gastroenterol
Инактивация гена ТР53 почти всегда возникает в результате внутригенной мутации в одном аллеле, связанной с потерей второго аллеля (Maitra et al. (2006)  20:211-226). Нарушение функции р53 означает, что в большинстве случаев злокачественного роста поджелудочной железы нарушены два критических регулятора количества клеток, контрольной точки клеточного цикла G1/S и поддержания остановки G2/M.
Best Pract Res Clin Gastroenterol
Am J Pathol
Ген DPC4, также известный как SMAD4, генетически инактивируется более чем в половине случаев злокачественного роста поджелудочной железы, в 35% посредством гомозиготной делеции и в 20% путем внутригенной мутации, связанной с потерей оставшегося аллеля (Maitra et al. (2006)  20:211-226; Wilentz et al. (2000)  156:37-43). Однако генетическая инактивация DPC4 только изредка возникает при других типах опухолей. Белок dpc4 играет критическую роль в сигнальном пути и контроле роста посредством пути TGF-B.
Best Pract Res Clin Gastroenterol
Cancer R
Ген BRCA, связанный с репарацией ДНК, поражается только в небольшом количестве случаев (~10%) злокачественного роста поджелудочной железы, но вызывает семейное накопление злокачественного роста поджелудочной железы (Maitra et al. (2006)  20:211-226; Murphy et al. (2002) es 62:3789-3793). Носители единственной пары оснований гена BRCA (называемой мутацией гена 6174delT BRCA) имеют в 10 раз больший риск развития злокачественного роста поджелудочной железы.
Pancreatology
Cancer Chem Pharm
Ядерный фактор кВ (NF-кВ), транскрипционный фактор, который преимущественно существует в виде гетеродимера р65(RelA)/p50, также рассматривается как один из генов, связанных с злокачественным ростом поджелудочной железы (Garcea et al. (2005)  5:514-529; Xiong (2004)  54:S69-77). RelA, субъединица р65 NF-кВ, постоянно активируется примерно около 67% аденокарцином поджелудочной железы, но не в здоровой ткани поджелудочной железы, и IкВб экспрессируется в повышенных количествах в опухолевых тканях поджелудочной железы и клеточных линиях человека. Конститутивная активация RelA, вероятно, коррелирует с вышестоящим сигнальным путем, таким как RAS, в клетках опухоли поджелудочной железы. Предполагают, что NF-кВ играет важную роль в устойчивости опухоли при злокачественном росте поджелудочной железы к апоптозу, индуцированному цитотоксическими агентами. Другие результаты также говорят о том, что основным механизмом, посредством которого NF-кВ, вероятно, запускает рост клеток поджелудочной железы, является ингибирование апоптоза.
В данной области все еще существует необходимость в материалах и методах более точной диагностики аденокарцином поджелудочной железы. Кроме того, в данной области остается необходимость в способах лечения и способах идентификации агентов, которые помогут эффективно лечить это заболевание. Настоящее изобретение соответствует этим и другим нуждам.
Описание
Техническая проблема
Настоящее изобретение обеспечивает материал и метод для точной диагностики аденокарциномы поджелудочной железы.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ эффективного лечения аденокарциномы поджелудочной железы.
Техническое решение
Настоящее изобретение основано на новом гене (далее называемом «LBFL313»), который дифференциально экспрессируется в ткани аденокарциномы поджелудочной железы по сравнению с тканью нормальной поджелудочной железы. Изобретение обеспечивает (а) выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую SEQ ID NO: 1, (b) выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO:2, (c) выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью последовательности нуклеотидов с SEQ ID NO: 1, и (d) выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую ее комплемент.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к молекулам нуклеиновой кислоты, оперативно связанным с одним или более элементами, контролирующими экспрессию, включая векторы, включающие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение, кроме того, относится к клеткам организма хозяина, трансформированным таким образом, что они содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, и способы получения белка, включающие стадию культивирования клеток-хозяев, трансформированных молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, в условиях, в которых экспрессируется белок.
Изобретение, кроме того, связано с выделенным полипептидом или белком, содержащии последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2 или проявляющим по меньшей мере 95% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Изобретение, кроме того, связано со способами идентификации агента, который модулирует экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, согласно изобретению.
Изобретение, кроме того, связано со способами идентификации агента, который модулирует уровень или по меньшей мере одну активность белка, согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, связано со способами модуляции экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, согласно изобретению.
Изобретение, кроме того, обеспечивает способы идентификации связывающих партнеров для белка согласно изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, связано со способами идентификации агентов, которые могут блокировать или модулировать ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером.
Настоящее изобретение, кроме того, связано со способами снижения или блокады ассоциации белка согласно изобретению с одним или более его связывающими партнерами.
Настоящее изобретение, кроме того, связано с трансгенными животными, отличными от человека, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, или отличными от человека трансгенными животными, модифицированными таким образом, что они содержат мутантные молекулы нуклеиновой кислоты, такие, что экспрессия кодируемых полипептидов согласно изобретению предотвращается.
Настоящее изобретение, кроме того, связано с отличными от человека трансгенными животными, у которых целиком или частично ген, включающий в себя полностью или частично последовательность SEQ ID NO: 1, нокаутирован или удален из генома животного.
Изобретение, кроме того, связано с композициями, включающими в себя разбавитель и полипептид или белок, где полипептид или белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или обладает по меньшей мере 95% идентичностью аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2.
Гены и белки согласно изобретению могут быть использованы в качестве диагностических агентов или маркеров для определения злокачественного роста поджелудочной железы или для дифференцировки в образце аденокарциномы поджелудочной железы от нормальных тканей. Они также могут служить в качестве мишени для агентов, которые модулируют экспрессию или активность гена. Например, могут быть идентифицированы агенты, которые модулируют биологические процессы, ассоциированные с ростом опухоли, включая гиперпластический процесс злокачественного роста поджелудочной железы.
А. Белки, ассоциированные с злокачественным ростом поджелудочной железы
Настоящее изобретение связано с выделенными белками, аллельными вариантами белков и консервативными аминокислотными заменами белков. В настоящем описании «белок» или «полипептид» относится отчасти к белку, который имеет аминокислотную последовательность человека, приведенную в SEQ ID NO: 2. Термины также относятся к естественным аллельным вариантам и белкам, которые имеют немного отличную аминокислотную последовательность, чем та, которая отдельно указана выше. Аллельные варианты, так как обладают немного отличной аминокислотной последовательностью, чем указанная выше, все еще будут иметь такие же или сходные биологические функции, ассоциированные с такими белками.
В настоящем описании семейство белков, родственных с человеческой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, относится к белкам, которые были выделены из других организмов помимо организма человека. Способы, используемые для идентификации и выделения других членов семейства белков, связанных с такими белками, описаны ниже.
Белки согласно настоящему изобретению предпочтительно находятся в выделенной форме. В настоящем описании белок называют выделенным, когда физические, механические или химические методы используют для выделения белка из составляющих клетки, которые обычно ассоциированы с белком. Специалист в данной области может легко использовать стандартные методы очистки для получения выделенного белка.
Белки согласно настоящему изобретению, кроме того, включают варианты SEQ ID NO: 2 с вставками, делециями или консервативными заменами аминокислот. В настоящем описании консервативный вариант относится к изменениям аминокислотной последовательности, которые отрицательным образом не влияют на биологические функции белка. Замена, вставка или делеция считаются отрицательным образом влияющими на белок, когда измененная последовательность нарушает биологическую функцию, ассоциированную с белком, предотвращает или препятствует ее реализации. Например, свойства общего заряда, структура или гидрофобные/гидрофильные свойства белка в определенных обстоятельствах могут быть изменены без ущерба для его биологической активности. Соответственно, аминокислотную последовательность можно изменить, например, придавая пептиду большую гидрофобность или гидрофильность без ущерба для биологической активности белка.
Обычно аллельные варианты, варианты консервативной замены и члены семейства белков имеют последовательность аминокислот, обладающую по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70% или 75% идентичностью аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 2, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80-90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92-94%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, 98% или 99% идентичностью последовательности. Идентичность или гомологию таких последовательностей определяют в настоящем описании как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны SEQ ID NO: 2 после выравнивания последовательностей и введения, если необходимо, пробелов, для достижения максимальной степени гомологии, и не расценивая какие-либо консервативные замены как часть идентичности последовательности (см. раздел В для релевантных параметров). Слитые белки, или N-концевые, С-концевые или внутренние удлинения, делеции или вставки в пептидную последовательность, не должны рассматриваться как влияющие на гомологию.
Следовательно, белки согласно настоящему изобретению включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 2; их фрагменты, имеющие последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более аминокислотных последовательных остатков этих белков; варианты последовательности аминокислот, где один или более аминокислотных остатков вставлены на N- или С-конце или внутри описанной кодирующей последовательности; и варианты аминокислотной последовательности описанной последовательности или ее фрагментов, как определено выше, в которых осуществлена замена по меньшей мере одного остатка. Такие фрагменты, называемые также пептидами или полипептидами, могут содержать антигенные участки, функциональные участки белков, идентифицируемые как участки аминокислотной последовательности, которые соответствуют известным белковым доменам, а также участки выраженной гидрофильности. Все участки легко определяются с использованием обычного программного обеспечения для анализа белковой последовательности, такого как MacVector (Oxford Molecular).
Предусматриваемые варианты, кроме того, включают в себя таковые, содержащие заранее определенные мутации посредством, например, гомологичной рекомбинации, сайт-направленного или ПЦР-мутагенеза и соответствующие белки других видов животных, включая, но ими не ограничиваясь, виды кроликов, мышей, крыс, свиней, быков, птиц, лошадей и нечеловекообразных приматов, и аллели или другие естественные варианты семейства белков; и производные, где белок ковалентно модифицирован путем замены химическим, ферментативным или другим путем компонентом, отличным от природной аминокислоты (например, детектируемым компонентом, таким как фермент или радиоизотоп).
Настоящее изобретение, кроме того, связано с композициями, содержащими белок или полипептид согласно изобретению и разбавитель. Подходящими разбавителями могут быть водные или неводные растворители или их комбинации и могут включать дополнительные компоненты, например, водорастворимые соли или глицерин, которые влияют на стабильность, растворимость, активность и/или хранение белка или полипептида.
Как описано ниже, члены семейства белков могут быть использованы (1) для идентификации агентов, которые модулируют уровень по меньшей мере одной активности белка, (2) для идентификации связывающих партнеров белка, (3) в качестве антигена для повышения уровня поликлональных или моноклональных антител, (4) в качестве лечебного средства или мишени и (5) в качестве диагностического агента или маркера злокачественного роста поджелудочной железы и других гиперпластических заболеваний.
В. Молекулы нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение, кроме того, связано с молекулами нуклеиновой кислоты, которые кодируют белок, имеющий SEQ ID NO: 2, и связанные белки, описанные в настоящем описании, предпочтительно в выделенной форме. Здесь «нуклеиновая кислота» определяется как РНК или ДНК, которая кодирует белок или пептид, как определено выше, комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей такие пептиды, гибридизуется с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO: 1 и остается стабильно связанной с ней в соответствующих жестких условиях, кодирует полипептид, обладающий по меньшей мере примерно 50%, 60%, 70% или 75%, предпочтительно примерно 80-90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 92-94% и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, 98%, 99% или большей степенью идентичности пептидной последовательности SEQ ID NO: 2, или проявляет по меньшей мере 50%, 60%, 70% или 75%, предпочтительно по меньшей мере примерно 80-90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 92-94%, и еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95%, 98%, 99% или большую степень идентичности нуклеотидной последовательности в открытых рамках считывания SEQ ID NO: 1.
Настоящее изобретение, кроме того, включает в себя выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые специфически гибридизуются с комплементарной SEQ ID NO: 1, в частности молекулы, которые специфически гибридизуются в открытых рамках считывания. Такие молекулы обычно специфически гибридизуются с комплементарными SEQ ID NO: 1, в жестких условиях гибридизации.
В частности, предусмотрены геномные ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые молекулы, а также нуклеиновые кислоты на основе альтернативного остова или содержащие альтернативные основания, либо полученные из природных источников, либо синтезированные. Такие гибридизующиеся или комплементарные нуклеиновые кислоты, однако, определяются далее как новые и неочевидные среди любых нуклеиновых кислот предшествующего уровня техники, включая такие, которые кодируют, гибридизуются в соответствующих жестких условиях или являются комплементарными нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, согласно изобретению.
Nucleic Acids Res
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Nat. Genet
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Гомология или идентичность на уровне нуклеотидов или аминокислотной последовательности определяют посредством анализа BLAST (Basic Local Alighnment Search Tool) с использованием алгоритма, используемого программами bpastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Altschul et al. (1997) . 25:3389-3402, и Karlin et al. (1990), 87: 2264-2268, оба эти источника полностью включены в виде ссылки), которые разработаны для поиска подобия последовательностей. Подход, используемый в программе BLAST, представляет собой сначала рассмотрение сходных сегментов, с пробелами или без них, между искомой последовательностью и последовательностью из базы данных, затем оценку статистической значимости всех соответствий, которые обнаружены, и, наконец, для суммирования только тех соответствий, которые удовлетворяют заранее выбранному порогу значимости. Для обсуждения основных проблем при поиске сходства в базе данных последовательностей, см. Altschul et al. (1994) . 6:119-129, который полностью включен в виде ссылки. Параметры поиска для гистограмм, описаний, выравнивания, ожидания (т.е. порог статистической значимости для указания соответствий относительно последовательностей из базы данных), ограничение, матрица и фильтр (низкая сложность) являются настройками по умолчанию. Матрица параметров по умолчанию, используемая bpastp, blastx, tblastn и tblastx, представляет собой матрицу BLOSUM62 (Henikoff et al (1992),  89: 10915-10919, полностью включено в виде ссылки), рекомендуются для искомых последовательностей длиной более 85 нуклеотидов или аминокислот.
Для blastn оценочная матрица устанавливается по соотношению М (т.е. прибавляемый балл для пары соответствующих остатков) к N (т.е. вычитаемый штраф для несоответствующих остатков), где установочные значения для M и N составляют 5 и -4, соответственно. Для blastn установлены следующие параметры: Q=10 (штраф за создание пропусков); R=10 (штраф за удлинение пропусков); wink=1 (создает попадания слов в каждом wink положении по запросу) и gapw=16 (устанавливает ширину окна, в котором создаются прерывистые выравнивания). Эквивалентные установки параметров Blastp представляют собой Q=9; R=2; wink=1 и gapw=32. Сравнение Bestfit между последовательностями, доступное в партии GCG, версия 10.0, использует параметры ДНК GAP=50 (штраф за создание пробелов) и LEN=3 (штраф за удлинение пробелов), и эквивалентные установки в сравнении белков представляют собой GAP=8 и LEN=2.
«Жесткие условия» представляют собой (1) низкую ионную силу и высокую температуру для промывания, например, 0,015 М NaCl/0,0015 M цитрат натрия/ 0,1% SDS при 50°С, или (2) используемые во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидон/ 50 мМ буферного раствора фосфата натрия при рН 6,5 с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия при 42°С. Другим примером является гибридизация в 50% формамиде, 5×SSC (0,75 М NaCl, 0,75 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5×раствора Денхардта, ДНК обработанной ультразвуком спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстрансульфата при 42°С с промывками при 42°С в 0,2×SSC и 0,1% SDS. Специалист в данной области может легко определить и варьировать жесткие условия соответствующим образом для получения чистого и определяемого сигнала гибридизации. Предпочтительными молекулами являются такие, которые гибридизуются в вышеуказанных условиях с комплементарной SEQ ID NO: 1 и которые кодируют функциональный или полноразмерный белок. Еще более предпочтительными гибридизующимися молекулами являются такие, которые гибридизуются в вышеуказанных условиях с комплементарной цепью открытой рамки считывания SEQ ID NO: 1.
В настоящем описании молекулу нуклеиновой кислоты называют «выделенной», когда молекула нуклеиновой кислоты является по существу отделенной от загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих другие полипептиды.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает фрагменты описанных молекул нуклеиновой кислоты. В настоящем описании фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты относится к небольшой части кодирующей или некодирующей последовательности. Размер фрагмента определяет предназначение. Например, если выбирают фрагмент, кодирующий активную часть белка, фрагмент должен быть достаточно большим для кодирования функционального участка(ов) белка. Например, могут быть использованы фрагменты, которые кодируют пептиды, соответствующие предсказуемым антигенным участкам. Если фрагмент будет использоваться в качестве зонда нуклеиновой кислоты или праймера ПЦР, тогда длину фрагмента выбирают так, чтобы получить относительно небольшое количество ложноположительных результатов при зондировании/примировании (см. обсуждение в Разделе G).
J. Am. Chem. Soc.
Фрагменты молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (т.е. синтетические олигонуклеотиды), которые используют в качестве зондов или специфических праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для синтеза последовательности гена, кодирующего белки согласно изобретению, могут быть легко синтезированы химическими методами, например, фосфорамидитным методом Matteucci et al., ((1981) 103: 3185-3191) или с использованием автоматизированных методик синтеза. Кроме того, более крупные сегменты ДНК легко могут быть получены хорошо известными способами, такими как синтез группы олигонуклеотидов, которые определяют различные блочные сегменты гена, с последующим связыванием олигонуклеотидов для построения полного модифицированного гена.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут далее быть модифицированы так, чтобы они содержали определяемую метку для диагностических целей и целей зондирования. Множество таких меток известны в данной области и могут быть легко использованы с кодирующими молекулами, описанными в настоящем описании. Подходящие метки включают в себя, но не ограничиваются ими, биотин, меченный радиоактивной меткой, или нуклеотиды, меченные флуоресцентной меткой, и пр. Специалист в данной области может легко использовать любую такую метку для получения меченых вариантов молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
С. Выделение других связанных молекул нуклеиновой кислоты
Как описано выше, идентификация и характеристика молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей SEQ ID NO: 1, позволяют специалисту выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые, помимо последовательностей, описанных в настоящем описании, кодируют другие члены семейства белков. Кроме того, описанные в настоящее время молекулы нуклеиновой кислоты позволяют специалисту выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют другие члены семейства белков, помимо белков, имеющих SEQ ID NO: 2.
Например, специалист легко может использовать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 для получения антител-зондов для исследования библиотек экспрессии, полученных из соответствующих клеток. Обычно поликлональная антисыворотка от млекопитающих, таких как кролики, иммунизированных очищенным белком (как описано ниже), или моноклональные антитела могут быть использованы для зондирования кДНК млекопитающих или геномной библиотеки экспрессии, такой как библиотека лямбда gtll, для получения соответствующей кодирующей последовательности для других членов семейства белков. Клонированная последовательность кДНК может быть экспрессирована в виде сшитого белка, экспрессирована непосредственно с использованием ее собственной контрольной последовательности, или экспрессирована путем конструкций с использованием контрольных последовательностей, соответствующих определенному организму хозяину, используемому для экспрессии фермента.
Альтернативно, часть кодирующей последовательности, описанной в настоящем изобретении, может быть синтезирована и использована в качестве зонда для поиска ДНК, кодирующей член семейства белков любого организма млекопитающего. Получали олигомеры, содержащие приблизительно 18-20 нуклеотидов (кодирующих отрезок примерно в 6-7 аминокислот), и использовали для скрининга библиотек геномной ДНК или кДНК для гибридизации в жестких условиях или условиях достаточной жесткости для исключения нежелательного уровня ложноположительных результатов.
Кроме того, пары олигонуклеотидных праймеров могут быть получены для использования в ПЦР для селективного клонирования кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Цикл ПЦР денатурации/отжига/удлинения для использования таких ПЦР-праймеров хорошо известны в данной области и может легко быть адаптирован для использования в выделении других кодирующих молекул нуклеиновой кислоты.
Nucl. Acids Res.
Nucl. Acids Res.
J. Mol. Biol.
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Nature
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие другие члены семейства белков, также могут быть идентифицированы в существующей геномной или другой информации о последовательностях с использованием любого доступного расчетного метода, включая, но не ограничиваясь ими, следующие: PSI-BLAST (Altschul et al. (1997)  25:3389-3402); PHI-BLAST (Zhang et al. (1998),  26: 3986-3990), 3D-PSSM (Kelly et al. (2000),  299: 499-520); и других методов компьютерного анализа (Shi et al. (1999), 262: 132-138 и Matsunami et al. (2000), 404: 601-604).
D. Молекулы рДНК, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Ed.
Настоящее изобретение, кроме того, связано с рекомбинантными молекулами ДНК (рДНК), которые содержат кодирующую последовательность. В настоящем описании рДНК представляет собой молекулу ДНК, которая была подвергнута молекулярным манипуляциям in situ. Способы создания молекул рДНК хорошо известны в данной области, например, см. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. В предпочтительных молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК оперативно связана с последовательностями, контролирующими экспрессию, и/или последовательностями векторов.
Выбор вектора и/или последовательностей, контролирующих экспрессию, с которыми одна из последовательностей, кодирующих семейство белков согласно настоящему изобретению, оперативно связаны, зависит непосредственно, как хорошо известно в данной области, от желаемых функциональных свойств, например, экспрессии белка и трансформируемой клетки-хозяина. Вектор, предусмотренный настоящим изобретением, способен по меньшей мере направлять репликацию или вставку в хромосомы хозяина, а предпочтительно также и экспрессию структурного гена, включенного в молекулу рДНК.
Элементы, контролирующие экспрессию, которые используют для регуляции экспрессии оперативно связанной последовательности, кодирующей белок, известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Предпочтительно, индуцируемый промотор является легко контролируемым, например, отвечающим на питательные вещества в среде клетки-хозяина.
В одном варианте осуществления изобретения вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, будет включать в себя прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, обладающую способностью направлять автономную репликацию и поддерживать рекомбинантную молекулу ДНК вне хромосомы в прокариотической клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка-хозяин, трансформированной с его помощью. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают в себя прокариотический репликон, также могут содержать ген, чья экспрессия дает определяемый маркер, такой как устойчивость к лекарственным средствам. Типичными генами бактериальной устойчивости к лекарственным средствам являются таковые, которые придают устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину.
Векторы, которые содержат прокариотический репликон, могут, кроме того, содержать промотор прокариот или бактериофагов, способный направлять экспрессию (транскрипцию и трансляцию) кодирующей последовательности гена в бактериальной клетке-хозяине, такой как E.coli. Промотор представляет собой элемент, регулирующий экспрессию, образованный последовательностью ДНК, которая допускает связывание РНК-полимеразы и транскрипцию. Последовательности промотора, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно обеспечивают в плазмидных векторах, содержащих удобные сайты рестрикции для вставки ДНК сегмента согласно настоящему изобретению. Типичными такими векторными плазмидами являются pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329, доступные от BioRad Laboratories (Richmond, CA), pPL и pKK223, доступные от Pharmacia (Piscataway, NJ).
Векторы экспрессии, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно совместимые с клетками позвоночных, также могут быть использованы для получения молекул ДНК, которые содержат кодирующую последовательность. Векторы экспрессии эукариотических клеток, включающих вирусные векторы, хорошо известны в данной области и доступны из нескольких коммерческих источников. Обычно обеспечивают такие векторы, содержащие удобные участки рестрикции для вставки желаемого сегмента ДНК. Такие типичные векторы представляют собой pSVL и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC #31255), вектор pCDM8, описанный в настоящем описании, и подобные эукариотические векторы экспрессии. Векторы могут быть модифицированы и включать тканеспецифичные промоторы, если необходимо.
Векторы экспрессии эукариотических клеток, используемые для создания молекул рДНК согласно настоящему изобретению, могут, кроме того, содержать селективный маркер, который эффективен в эукариотических клетках, предпочтительно, маркер устойчивости к лекарственным средствам. Предпочтительным маркером устойчивости к лекарственным средствам является ген, чья экспрессия приводит к устойчивости к неомицину, т.е. ген неомицинфосфотрансферазы (neo) (Southern et al. (1982) J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341). Альтернативно, селективный маркер может присутствовать на отдельной плазмиде, и два вектора вводят путем совместной трансфекции клетки-хозяина и отбирают путем культивирования в соответствующем лекарственном средстве в качестве селективного маркера.
Е. Клетки-хозяева, содержащие экзогенно вводимую молекулу кодирующей нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает клетки-хозяева, трансформированные молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической. Эукариотические клетки, применимые для экспрессии белка согласно изобретению, не ограничены, пока клеточная линия совместима с методами культуривирования клеток и совместима с репродукцией вектора экспрессии и экспрессией генного продукта. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, такие как клеточные линии мышей, крыс, обезьян и человека. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), доступные от ATCC как CCL61, клетки мышиных эмбрионов NIH Swiss (NIH/3T3), доступные от ATCC как CRL 1658, клетки почек детенышей хомяка (BHK) и пр. клеточные линии эукариотических тканевых культур.
Любой прокариотный организм-хозяин может быть использован для экспрессии молекулы рДНК, кодирующей белок согласно изобретению. Предпочтительным прокариотическим организмом-хозяином является E.coli.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Virol.
Proc. Natl. Sci. USA
Трансформация соответствующих клеток-хозяев с помощью молекулы рДНК согласно настоящему изобретению осуществляется хорошо известными способами, которые обычно зависят от типа используемого вектора и используемой системы организма-хозяина. В отношении трансформации прокариотических клеток-хозяев обычно используют способы электропорации и обработки солью (см., например, Cohen et al. (1972),  69:2110; и Sambrook et al. выше). В отношении трансформации клеток позвоночных векторами, содержащими рДНК, обычно используют электропорацию, обработку катионными липидами или солями, см., например, Graham et al. (1973),  52: 456; Wigler et al. (1979).  76: 1373-1376.
J. Mol. Biol.
Biotech.
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу рДНК согласно настоящему изобретению, могут быть идентифицированы хорошо известными методиками, включая поиск селективного маркера. Например, клетки, возникающие в результате введения рДНК согласно настоящему изобретению, могут быть клонированы для получения отдельных колоний. Клетки из таких колоний могут быть собраны, лизированы и их содержимое ДНК исследовано в отношении присутствия рДНК с использованием способа, такого как описанный Southern, (1975)  98: 503 или Berent et al., (1985)  3:208, или белков, продуцируемых клетками, оцененных посредством иммунологического метода. Авторы настоящего изобретения получили Escherichia coli  и депонировали ее в Корейской Коллекции типов культур Korea research Institute of Bioscience and Biotechnology 5 июня 2006 (№хранения KCTC 10954BP).
F. Получение рекомбинатных белков с использованием молекулы рДНК
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способы получения белка согласно изобретению с использованием молекул нуклеиновой кислоты, описанных в настоящем описании. В общих чертах, получение рекомбинантной формы белка обычно включает в себя следующие стадии:
Во-первых, получают молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок согласно изобретению так, что молекула нуклеиновой кислоты включает, состоит по существу или состоит из SEQ ID NO:1 или нуклеотидов 53-643 или 53-640 SEQ ID NO:1. Если кодирующая последовательность не прерывается интронами, как это обычно бывает в таких открытых рамках считывания, она непосредственно подходит для экспрессии в любом организме-хозяине.
Молекулу нуклеиновой кислоты затем предпочтительно оперативно связывают с подходящей контрольной последовательностью, как описано выше, для получения единицы экспрессии, содержащей открытую рамку считывания белка. Единицу экспрессии используют для трансформации подходящего организма-хозяина, и трансформированный организм-хозяин культивируют в условиях, которые допускают получение рекомбинантного белка. Необязательно, рекомбинантный белок выделяют из среды или из клеток; в тех случаях, когда некоторые загрязнения допустимы, восстановления или очистки белка может не потребоваться.
Каждая из следующих стадий может быть осуществлена множеством путей. Например, желаемые кодирующие последовательности могут быть получены из геномных фрагментов и использованы непосредственно в соответствующих организмах-хозяевах. Создание векторов экспрессии, которые работают во множестве организмов-хозяев, осуществляется с использованием соответствующих репликонов и контрольных последовательностей, как указано выше. Контрольные последовательности, векторы экспрессии и методы трансформации зависят от типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии гена, и обсуждаются более детально ранее. Подходящие сайты рестрикции могут, при нормальной доступности, быть добавлены к концам кодирующей последовательности так, чтобы обеспечить иссекаемый ген для вставки в такие векторы. Специалист в области техники может легко адаптировать любую систему организма-хозяина/экспрессии, известную в данной области, для применения с молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению для получения рекомбинантного белка.
G. Способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей гены, ассоциированные с злокачественным ростом поджелудочной железы
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способы идентификации агентов, которые модулируют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно изобретению, такой как белок, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO:2. В таких анализах могут быть использованы любые доступные средства мониторинга изменений уровня экспрессии нуклеиновых кислот согласно изобретению. В настоящем описании говорят, что агент модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты согласно изобретению, если он способен стимулировать или подавлять экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке.
Anal. Biochem.
В одном формате анализов клеточные линии содержат слияния между нуклеотидами при помощи гена-репортера в одной открытой рамке считывания, определяемой нуклеотидами 53-643 SEQ ID NO:1 и/или 5'- и/или 3'-регуляторными элементами, и может быть получен любой оценочный партнер слияния. Известны и легкодоступны многие оценочные партнеры слияния, включая ген люциферазы светлячка и ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу (Alam et al. (1990),  188: 245-254). Клеточные линии, содержащие слияния репортерного гена, затем подвергают воздействию исследуемого агента в соответствующих условиях и в подходящее время. Различная экспрессия гена-репортера между образцами, подвергнутыми воздействию агента, и контрольными образцами позволяет идентифицировать агенты, которые модулируют экспрессию нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Ed.
Дополнительные формы исследований могут быть использованы для исследования способности агента модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно изобретению, такой как белок, имеющий SEQ ID NO:2. Например, экспрессия мРНК может быть отслежена непосредственно путем гибридизации с нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Клеточные линии подвергают воздействию тестируемого агента в соответствующих условиях и в подходящее время, и общую РНК или мРНК выделяют стандартными методами, такими как описанные у Sambrook et al., , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
Предпочтительными клетками будут таковые, полученные из тканей человека, например, биопсийной ткани или культуральные клетки от пациентов с злокачественным ростом. Могут быть использованы клеточные линии, такие как клеточные линии карциномы протоков молочной железы АТСС (Каталожные №№CRL-2320, CRL-2338 и CRL-7345), АТСС клеточные линии колоректальной аденокарциномы (Каталожные №№CCL-222, CCL-224, CCL-225, CCL-234, CRL-7159 и CRL-7184), АТСС клеточные линии аденокарциномы легких (Каталожные №№CRL-5944, CRL-7380 и CRL-5907), АТСС клеточные линии аденокарциномы яичника (Каталожные №№HTB-161, HTB-75 и HTB-76), АТСС клеточные линии аденокарциномы поджелудочной железы (Каталожные №№HTB-79, HTB-80 и CRL-2547), АТСС клеточные линии аденокарциномы простаты (Каталожные №№CRL-1435, CRL-2422 и CRL-2220) и АТСС клеточные линии аденокарциномы желудка (Каталожные №№CRL-1739, CRL-1863 и CRL-1864). Альтернативно, могут быть использованы другие доступные клетки или клеточные линии.
Зонды для определения различий между уровнем экспрессии РНК между клетками, подвергаемыми воздействию агента, и контрольными клетками могут быть получены из нуклеиновых кислот согласно изобретению. Предпочтительно, но необязательно создавать зонды, которые гибридизуются только с целевой нуклеиновой кислотой в условиях высокой жесткости. Только высококомплементарные гибриды нуклеиновых кислот образуются в условиях высокой жесткости. Соответственно, жесткость условий анализа определяет степень комплементарности, которая должна быть между двумя цепочками нуклеиновой кислоты для осуществления гибридизации. Жесткость должна быть выбрана для выявления максимальных различий в стабильности между гибридом зонд:мишень и гибридами зонд:не-мишень.
Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Ed.
Зонды могут быть созданы из нуклеиновых кислот согласно изобретению посредством способов, известных в данной области. Например, содержание в зонде G+C и длина зонда могут влиять на связывание зонда с его целевой последовательностью. Способы оптимизации специфичности зондов обычно доступны в Sambrook et al., выше, или Ausubel et al., ,John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999.
Условия гибридизации модифицируют с использованием известных методов, таких как описанные Sambrook et al. и Ausubel et al., как требуется для каждого зонда. Гибридизация общей клеточной РНК или РНК, обогащенной полиА РНК, может быть осуществлена в любом доступном формате. Например, общая клеточная РНК или РНК, обогащенная полиА РНК, может быть присоединена к твердой подложке, и твердая подложка подвергнута воздействию по меньшей мере одного зонда, содержащего по меньшей мере одну или часть одной из последовательностей согласно изобретению в условиях, в которых зонд специфически гибридизуется. Альтернативно, фрагменты нуклеиновой кислоты, включающие по меньшей мере одну или часть последовательностей согласно изобретению, могут быть фиксированы на твердой подложке, такой как кремниевый кристалл, брикет пористого стекла или мембрана. Твердая подложка затем может быть подвергнута воздействию общей клеточной РНК или полиА РНК из образца в условиях, в которых фиксированные последовательности будут специфически гибридизоваться. Такие твердые подложки и методы гибридизации являются широко доступными, например, описанные Beattie (1995) WO 95/11755. Путем исследования способности заданного зонда специфически гибридизоватся с образцом РНК из необработанной популяции клеток и из популяции клеток, подвергнутой воздействию агента, определяют агенты, которые стимулируют или подавляют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий последовательность SEQ ID NO:2.
Methods
Гибридизация для качественного и количественного анализа мРНК также может проводиться с использованием анализа защиты РНазы (т.е. RPA, см. Ma et al. (1996) 10: 273-238). Коротко, носитель для экспрессии, содержащий кДНК, кодирующую генетический продукт и фагоспецифичный ДНК-зависимый промотор РНК-полимеразы (например, Т7, Т3 или SP6 РНК-полимеразу), линеаризовали на 3' конце молекулы кДНК, после промотора фага, где такую линеаризованную молекулу впоследствии использовали в качестве матрицы для синтеза меченого антисмыслового транскрипта кДНК путем транскрипции in vitro. Меченый транскрипт затем гибридизовали со смесью выделенной РНК (т.е. общей или фракционированной мРНК) путем инкубации при 45°С в течение ночи в буфере, включающем 80% формамида, 40 мМ Pipes, рН 6,4, 0,4 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Полученные гибриды затем расщепляли в буфере, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы А и 2 мкг/мл рибонуклеазы. После активации и экстракции инородных белков образцы загружали на мочевинно/полиакриламидные гели для анализа.
В другом анализе для идентификации агентов, которые влияют на экспрессию текущих продуктов генов, сначала идентифицировали клетки или клеточные линии, которые физиологически экспрессируют генные продукты согласно изобретению. Ожидают, что клетки и/или клеточные линии, определенные таким образом, включают клеточный аппарат, такой, что точность модуляции транскрипционного аппарата сохраняется в отношении экзогенного контакта агента с соответствующими механизмами поверхностной трансдукции и/или цитозольными каскадами. Кроме того, такие клетки или клеточные линии трансдуцируют или трансфицируют конструктом носителем экспрессии (например, плазмидным или вирусным вектором), включающим подвижный не-транслированный конец, содержащий 5' промотор структурного гена, кодирующего текущие генетические продукты, сшитые с одним или более антигенными фрагментами, которые свойственны текущим генным продуктам, где указанные фрагменты находятся под транскрипционным контролем указанного промотора и экспрессируются в виде полипептидов, чья молекулярная масса может быть отличной от естественных полипептидов или которые могут дополнительно включать иммунологически отдельный хвост или другой определяемый маркер. Такой процесс хорошо известен в данной области (см. Sambrook et al. выше).
Клетки или клеточные линии, преобразованные или трансфицированные, как указано выше, затем контактируют с агентами в соответствующих условиях. Например, агент в фармацевтически приемлемом вспомогательном веществе контактирует с клетками в водном физиологическом буфере, таком как фосфатный буферный раствор (PBS) при физиологической рН, сбалансированный солевой раствор Eagles (BSS) при физиологическом рН, PBS или BSS включают сыворотку, или кондиционированную среду, включающую PBS или BSS и/или сыворотку, инкубированную при 37°С. Такие условия могут быть смодулированы, если специалист в данной области считает необходимым. После контакта клеток с агентом указанные клетки разрушат, и фракционируют полипептиды лизатов, собирая полипептидную фракцию и приводя ее в контакт с антителом для последующего иммунологического анализа (например, ELISA, иммунопреципитации или вестерн-блоттинга). Пул белков, выделенный из «контактировавшего с агентом» образца, сравнивают с контрольным образцом, где с клетками контактировало только вспомогательное вещество, и увеличение или снижение иммунологически создаваемого сигнала от образца, «контактировавшего с агентом», по сравнению с контролем использовали для различения эффективности агента.
Н. Способы идентификации агентов, которые модулируют уровень или по меньшей мере одну активность белков, ассоциированных с злокачественным ростом поджелудочной железы
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способы идентификации агентов, которые модулируют уровень или по меньшей мере одну активность белка согласно изобретению, например белка, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2. Такие способы или анализы могут использовать любые средства мониторинга или определения желаемой активности и являются особенно применимыми для идентификации агентов, которыми лечат злокачественный рост поджелудочной железы.
В одном варианте может быть оценено относительное количество белка согласно изобретению в клеточной популяции, которую подвергали воздействию тестируемого агента по сравнению с популяцией клеток, на которую не оказывалось воздействия. В таком случае зонды, такие как специфические антитела, использовали для мониторинга дифференциальной экспрессии белка в различных популяциях клеток. Клеточные линии или популяции подвергали воздействию тестируемых агентов в соответствующих условиях и времени. Лизаты клеток могут быть получены из обработанной клеточной линии или популяции и контрольной, необработанной клеточной линии или популяции. Клеточные лизаты затем анализировали с помощью зонда.
Антитела-зонды получали путем иммунизации подходящих млекопитающих хозяев в соответствующих методах иммунизации с использованием пептидов, полипептидов или белков согласно изобретению, если они имели достаточную длину, или если это желательно или требуется, для усиления иммуногенности, конъюгированными с подходящими носителями. Способы получения иммуногенных конъюгатов с носителями, такими как BSA, KLH или другими белками-носителями, хорошо известны в данной области. В некоторых обстоятельствах может быть эффективной прямая конъюгация с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в других обстоятельствах для обеспечения приемлемости гаптена могут быть желательными связывающие реагенты, такие как поставляемые Pierce Chemical Co. (Rocford, IL). Гаптеновые пептиды могут быть удлинены на амино- или карбокси-конце с помощью цистеинового остатка или вставки цистеиновых остатков, например, для облегчения связывания с носителем. Введение иммуногенов проводят обычно путем инъекции в течение подходящего временного периода и с использованием подходящих адъювантов, как обычно понимают в данной области. Во время схемы иммунизации для определения адекватности образования антител получают титры антител.
Тогда как поликлональная антисыворотка, получаемая таким образом, может являться удовлетворительной для нескольких применений, для фармацевтических композиций предпочтительным является применение моноклональных препаратов. Бессмертные клеточные линии, которые секретируют желаемые моноклональные антитела, могут быть получены с использованием стандартного метода Kohler и Milstein ((1975) Nature 256:495-497) или модификаций, которые влияют на иммортализацию лимфоцитов или клеток селезенки, как обычно известно. Бессмертные клеточные линии, секретирующие желаемые антитела, скринируют посредством иммуноанализа, в котором антигеном является пептидный гаптен, полипептид или белок. Когда определяется соответствующая бессмертная клеточная культура, секретирующая желаемое антитело, клетки могут быть культивированы или in vitro, или путем продукции в асцитической жидкости.
2
Желаемые моноклональные антитела затем восстанавливают из надосадочной жидкости культуры или из асцитной надосадочной жидкости. В качестве антагонистов могут быть использованы фрагменты моноклональных антител или поликлональная антисыворотка, которая содержит иммунологически значимую (антигенсвязывающую) часть, а также интактные антитела. Часто предпочтительно применение иммунологически реакционно-способных (антигенсвязывающих) фрагментов антител, таких как фрагменты Fab, Fab' или F(ab'), особенно в терапевтическом контексте, так как такие фрагменты обычно менее иммуногенны, чем целый иммуноглобулин.
Антитела или фрагменты, связывающие антиген, также могут быть получены с использованием существующих технологий рекомбинантными средствами. Участки антител, которые специфически связываются с желаемыми участками белка, также могут быть получены в контексте химер, происходящих из множества видов, таких как гуманизированные антитела.
Агенты, которые оценивают в вышеуказанном методе, могут быть случайным или рациональным образом отобраны или созданы. В настоящем описании агент называют отобранным случайным образом, когда его выбирают случайно, не рассматривая специфические последовательности, ассоциированные с белком согласно изобретению отдельно или ассоциированными с ним субстратами, связывающими партнерами и др. Примером случайным образом отобранных агентов является применение химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки, или ростового «бульона» из организма.
В настоящем описании говорят, что агент выбран и создан рационально, когда агент выбирают на неслучайной основе, принимая во внимание последовательность целевого участка и/или его конформацию в связи с действием агента. Агенты могут быть рационально выбраны или рационально созданы путем использования пептидных последовательностей, которые составляют такие участки. Например, рационально выбранный пептидный агент может быть пептидом, чья аминокислотная последовательность идентична или является производным любого функционального обобщающего участка.
Molecular Biology and Biotechnology, Meyers, ed.,
Агентами согласно настоящему изобретению могут быть, в качестве примеров, пептиды, небольшие молекулы, производные витаминов, а также углеводы. Доминантные отрицательные белки, ДНК, кодирующие такие белки, антитела к таким белкам, пептидные фрагменты этих белков или имитаторы этих белков могут быть введены в клетки для воздействия на функцию. «Имитаторы», используемые в настоящем описании, относятся к модификации участка или нескольких участков пептидной молекулы для обеспечения структуры, химически отличающейся от родительского пептида, но топографически и функционально сходной с родительским пептидом (см. Grant в  pp.659-664, VCH Publishers, Inc., New York, 1995). Специалист в данной области может легко понять, что ограничения структурной природы агентов согласно настоящему изобретению не существует.
Пептидные агенты согласно изобретению могут быть получены с использованием стандартных твердофазных (или с растворенной фазой) методов пептидного синтеза, как известно в данной области. Кроме того, ДНК, кодирующая такие пептиды, может быть синтезирована с использованием коммерчески доступных приборов для синтеза олигонуклеотидов и получена рекомбинантным путем с использованием стандартных систем для рекомбинантного продуцирования. Продуцирование с использованием твердофазного пептидного синтеза необходимо в случаях, когда должны быть включены не кодируемые геном аминокислоты.
Другим классом агентов согласно настоящему изобретению являются антитела, имммунореактивные к критическим положениям белков согласно изобретению. Антитела-агенты получают путем иммунизации подходящих пациентов млекопитающих пептидами, содержащими в качестве антигенных участков такие части белков, предназначенные для нацеливания антител.
I. Применение агентов, которые модулируют экспрессию или по меньшей мере одну активность белков, ассоциированных с злокачественным ростом поджелудочной железы
Как представлено в Примерах, белки и нуклеиновые кислоты согласно изобретению, такие как белки, имеющие последовательность аминокислот SEQ ID NO: 2, дифференциально экспрессируются в ткани злокачественного роста поджелудочной железы. Агенты, которые стимулируют или подавляют или модулируют экспрессию белка или по меньшей мере одну активность белка, такие как агонисты или антагонисты, могут быть использованы для модуляции биологических и патологических процессов, ассоциированных с функцией и активностью белка. Они включают идентифицированные агенты, использующие гомологи и аналоги согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему описанию, пациентом может быть любое млекопитающее, которое нуждается в модуляции патологического или биологического процесса, опосредованного белком согласно изобретению. Термин «млекопитающее» определяют как индивид, принадлежащий к классу Mammalia. Изобретение применимо, в частности, в лечении человека.
Патологические процессы относятся к категории биологических процессов, которые оказывают вредоносный эффект. Например, экспрессия белка согласно изобретению может быть ассоциирована с ростом или гиперплазией клеток. В настоящем описании говорят, что агент модулирует патологический процесс, когда агент снижает степень или тяжесть процесса. Например, злокачественный рост можно предотвратить, или можно смоделировать прогрессирование заболевания путем введения агентов, которые стимулируют или подавляют или каким-либо образом модулируют экспрессию или по меньшей мере одну активность белка согласно изобретению.
Агенты согласно настоящему изобретению могут быть обеспечены отдельно или в комбинации с другими агентами, которые модулируют определенный патологический процесс. Например, агент согласно настоящему изобретению можно вводить в комбинации с другими известными лекарственными средствами. В настоящем описании говорят, что два агента вводят в комбинации, когда два агента вводят одновременно или вводят независимым образом, так что агенты действуют одновременно.
Агенты согласно настоящему изобретению можно вводить парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрескожным или буккальным путями. Альтернативно, или одновременно, введение можно осуществлять пероральным путем. Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы реципиента, типа сопутствующего лечения, если есть, частоты лечения и природы желаемого эффекта.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает композиции, содержащие один или более агентов, которые модулируют экспрессию или по меньшей мере одну активность белка согласно изобретению. Поскольку индивидуальные нужды пациента варьируют, оптимальный диапазон эффективного количества каждого компонента определяется специалистом. Обычно дозировки составляют от 0,1 до 100 мкг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки составляют от 0,1 до 10 мкг/кг массы тела. Наиболее предпочтительные дозировки составляют от 0,1 до 1 мкг/кг массы тела.
В добавление к фармакологически активному агенту, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие вспомогательные вещества и добавки, которые облегчают обработку активных соединений в препараты, которые могут быть использованы для доставки в место действия. Подходящие композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Кроме того, могут быть введены суспензии активных соединений в виде масляных суспензий для инъекции. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость включаемой суспензии, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Необязательно, суспензия может содержать также стабилизаторы. Липосомы также могут быть использованы для инкапсуляции агента для доставки в клетку.
Фармацевтическая композиция для системного введения согласно изобретению может быть составлена для энтерального, парентерального или местного введения. Действительно, все три типа композиций могут быть использованы одновременно для достижения системного введения активного ингредиента.
Подходящие композиции для перорального введения включают в себя твердые или мягкие желатиновые капсулы, пилюли, таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, эликсиры, суспензии, сиропы или ингаляции и их формы контролируемого высвобождения.
В осуществлении способов согласно настоящему изобретению соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом или с другими терапевтическими или диагностическими агентами. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены совместно с другими соединениями, обычно предписываемыми для таких состояний в соответствии с общепринятой медицинской практикой. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы in vivo, обычно у млекопитающих, таких как человек, овца, лошадь, крупный рогатый скот, свинья, собака, кошка, крыса и мышь, или in vitro.
J. Способ идентификации связывающих партнеров
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способы выделения и идентификации связывающих партнеров белков согласно изобретению. В общем, белок согласно изобретению смешивают с потенциальным связывающим партнером или экстрактом или фракцией клеток в условиях, которые допускают ассоциацию потенциальных связывающих партнеров с белком согласно изобретению. После смешивания пептиды, полипептиды, белки или другие молекулы, которые ассоциируются с белком согласно изобретению, выделяют из смеси. Связывающий партнер, который связывается с белком согласно изобретению, затем может быть удален и дополнительно подвергнут анализу. Для идентификации и выделения связывающего партнера может быть использован цельный белок, например белок, содержащий целую последовательность аминокислот SEQ ID NO:2. Альтернативно, может быть использован фрагмент белка.
В настоящем описании клеточный экстракт относится к препарату или фракции, которую получают из лизированных или разрушенных клеток. Предпочтительным источником клеточных экстрактов будут клетки, полученные из человеческих опухолей, или трансформированные клетки, например, биопсийная ткань или клетки культуры тканей из карцином. Альтернативно, клеточные экстракты могут быть получены из нормальной ткани или доступных клеточных линий.
Множество методов может быть использовано для получения экстракта клеток. Клетки могут быть разрушены с использованием либо физических, либо химических методов разрушения. Примеры методов физического разрушения включают в себя, но не ограничиваются ими, обработку ультразвуком и механическое измельчение. Примеры способов химического лизиса включают в себя, но не ограничиваются ими, лизис детергентами и ферментный лизис. Специалист в данной области может легко адаптировать методы получения экстрактов клеток с целью получения экстрактов для использования в настоящих методах.
При получении экстракта клеток его смешивают с белком согласно изобретению в условиях, допускающих ассоциацию белка со связывающим партнером. Можно использовать множество условий, наиболее предпочтительными являются условия, которые наиболее близки к условиям, обнаруживаемым в цитоплазме человеческой клетки. Характеристики, такие как осмолярность, рН, температура и концентрация используемого клеточного экстракта, могут варьироваться для оптимизации ассоциации белка со связывающим партнером.
После смешивания в соответствующих условиях связанный комплекс отделяют от смеси. Множество методик может быть использовано для разделения смеси. Например, антитела, специфичные в отношении к белку согласно изобретению, могут быть использованы для иммунопреципитации комплекса связывающего партнера. Альтернативно, могут быть использованы стандартные методики химического разделения, такие как хроматография и центрифугирование по плотности/осадку.
После удаления неассоциированных фрагментов клеток, обнаруживаемых в экстракте, связывающий партнер может быть диссоциирован от комплекса с помощью обычных методов. Например, диссоциация может быть осуществлена путем изменения концентрации соли или рН смеси.
Для облегчения выделения ассоциированных пар связывающего партнера из смешанного экстракта белок согласно изобретению может быть иммобилизован на твердой подложке. Например, белок может быть прикреплен к нитроцеллюлозной матрице или акриловым шарикам. Прикрепление белка к твердой подложке помогает выделению пар пептида/связывающего партнера из других составляющих, обнаруженных в экстракте. Идентифицированными связывающими партнерами могут быть отдельный белок или комплекс, состоящий из двух или более белков. Альтернативно, связывающие партнеры могут быть идентифицированы с использованием анализа Far-Western согласно Takayama et al (1997), Methods Mol. Biol. 69:171-184 или Sauder et al (1996), J.Gen.Virol. 77:991-996 или идентифицированы посредством применения белков, скрепленных с эпитопом или GST сшитых белков.
Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы в двухгибридной системе дрожжей или в других системах регистрации белок-белок in vivo. Двухгибридную систему дрожжей используют для идентификации других пар партнеров белка, и она легко может быть адаптирована для использования молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
К. Применение связывающих партнеров белков, ассоциированных с злокачественным ростом поджелудочной железы
При выделении связывающие партнеры белков согласно изобретению и их гомологи и аналоги, полученные с использованием вышеописанных методов, могут быть использованы для множества целей. Связывающие партнеры могут быть использованы для создания антител, которые связывают со связывающим партнером с помощью методик, известных в данной области. Антитела, которые связывают связывающий партнер, могут быть использованы для оценки активности белка согласно изобретению, в качестве терапевтического агента для модуляции биологического или патологического процесса, опосредованного белком согласно изобретению, или для очистки связывающего партнера. Такие применения описаны детально ниже.
I. Способы идентификации агентов, которые блокируют ассоциативные связи между связывающими партнерами и белками, ассоциированными с злокачественным ростом поджелудочной железы
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способы идентификации агентов, которые снижают или блокируют ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером. Специфически белок согласно изобретению смешивают со связывающим партнером в присутствии и в отсутствие тестируемого агента. После смешивания в условиях, которые допускают ассоциацию белков, две смеси анализировали и сравнивали для оценки того, снижает ли агент ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером или блокирует ее. Агенты, которые блокируют или снижают ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером, идентифицируются здесь как снижающие количество ассоциативных связей в образце, содержащем тестируемый агент.
В настоящем описании говорят, что агент снижает или блокирует ассоциацию между белком согласно изобретению и связывающим партнером, когда присутствие агента снижает степень ассоциации связывающего партнера с белком согласно изобретению или вовсе ее предотвращает. Один класс агентов будет снижать или блокировать ассоциацию путем связывания со связывающим партнером, тогда как другой класс агентов будет снижать или блокировать ассоциацию путем связывания с белком согласно изобретению.
Связывающий партнер, используемый в вышеуказанном анализе, может быть или выделенным и полностью охарактеризованным белком, или может быть частично характеризованным белком, который связывается с белком согласно изобретению, или связывающим партнером, который был идентифицирован как присутствующий в клеточном экстракте. Рядовому специалисту в данной области очевидно, что настоящий анализ может быть использован, пока связывающий партнер характеризуется идентифицируемыми свойствами, например, молекулярной массой.
Агенты, которые оценивали в вышеуказанном методе, могут быть случайным или рациональным образом выбраны или созданы. В настоящем описании говорят, что агент выбран случайно, когда агент выбирают случайным образом, без рассмотрения специфических последовательностей, вовлеченных в ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером. Примером случайным образом выбранных агентов является применение химической библиотеки или пептидной комбинаторной библиотеки, или питательной среды для роста организма.
В настоящем описании говорят, что агент выбран или создан на рациональной основе, когда агент выбирают на неслучайной основе, с учетом последовательности целевого участка и/или его структуры в связи с действием агента. Агенты могут быть рационально выбраны или рационально созданы путем использования пептидных последовательностей, которые создают контактные участки связывающего партнера с белком согласно изобретению. Например, рационально выбранный пептидный агент может быть пептидом, чья аминокислотная последовательность идентична контактному участку белка согласно изобретению на связывающем партнере. Такой агент может снижать или блокировать ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером путем связывания со связывающим партнером.
Агентами согласно настоящему изобретению могут быть, например, пептиды, малые молекулы, производные витаминов, а также углеводы. Специалист в данной области легко поймет, что не существует предела в плане структурной природы агентов согласно настоящему изобретению.
Одним классом агентов согласно изобретению являются пептидные агенты, чьи аминокислотные последовательности выбирают на основании последовательности аминокислот белка согласно изобретению. Пептидные агенты согласно изобретению могут быть получены с использованием стандартных методов твердофазного (или растворенной фазы) пептидного синтеза, как известно в данной области. Кроме того, ДНК, кодирующая эти пептиды, может быть синтезирована с использованием коммерчески доступных приборов для синтеза олигонуклеотидов и получены рекомбинантно с использованием стандартных систем рекомбинантной продукции. Продукция с использованием твердофазного пептидного синтеза необходима, когда должны включаться аминокислоты, не кодируемые геном.
Другим классом агентов согласно настоящему изобретению являются антитела, иммунореактивные с критическими положениями белка согласно изобретению или связывающего партнера. Как описано выше, антитела получают путем иммунизации подходящих млекопитающих пептидами, содержащими в качестве антигенных участков такие части белка согласно изобретению или связывающего партнера, на которые будут нацелены антитела. Критические участки содержат контактные участки, вовлеченные в ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером.
Как обсуждается ниже, важная минимальная последовательность остатков, вовлеченная в активность белка согласно изобретению, определяет функциональный линейный домен, который может быть эффективно использован в качестве затравки для скрининга двух гибридов и идентификации потенциально ассоциированных молекул. Применение таких фрагментов существенно увеличит специфичность скрининга в противоположность использования полномерной длины молекулы, и, следовательно, является предпочтительным. Подобным образом, такая линейная последовательность может быть использована также в качестве аффинной матрицы для выделения связывающих белков с использованием стратегии очистки биохимической афинности.
М. Применение агентов, которые блокируют ассоциации между связывающими партнерами и белками, ассоциированными с злокачественным ростом поджелудочной железы
Как представлено в примерах, белки и нуклеиновые кислоты согласно изобретению, такие как белки, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, дифференциально экспрессируются в ткани злокачественного роста поджелудочной железы. Агенты, которые снижают или блокируют взаимодействие белка согласно изобретению, включая агенты, идентифицируемые с помощью гомологов и аналогов белка со связывающим партнером, могут быть использованы для модуляции биологических и патологических процессов, ассоциированных с функцией и активностью белка.
В настоящем описании пациентом может быть любое млекопитающее, нуждающееся в модуляции патологического или биологического процесса, опосредованного белком согласно изобретению. Термин «млекопитающее» означает индивидуума, принадлежащего к классу млекопитающих. Изобретение применимо в, частности, для лечения человека.
Патологические процессы относятся к категории биологических процессов, которые оказывают вредоносный эффект. Например, экспрессия белка согласно изобретению может быть ассоциирована с ростом или гиперплазией клеток. В настоящем описании говорят, что агент модулирует патологический процесс, когда агент снижает степень тяжести процесса. Например, путем введения агентов, которые снижают или блокируют взаимодействия белка согласно изобретению со связывающим партнером, злокачественный рост поджелудочной железы может быть предотвращен или прогрессирование заболевания модулировано.
Агенты согласно настоящему изобретению могут быть введены парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрескожным или буккальным путями. Альтернативно или совместно, введение может осуществляться пероральным путем. Вводимая дозировка будет зависеть от возраста, состояния здоровья и массы пациента, сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты лечения и природы желаемого эффекта.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает композиции, содержащие один или более агентов, которые блокируют ассоциацию белка согласно изобретению со связывающим партнером. Когда нужды пациента варьируют, оптимальные диапазоны эффективного количества каждого компонента определяются специалистом в данной области. Типичные дозы составляют от 0,1 до 100 мкг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки составляют от 0,1 до 10 мкг/кг массы тела. Наиболее предпочтительные дозы составляют от 0,1 до 1 мкг/кг массы тела.
Вдобавок к фармакологически активному агенту, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие вспомогательные вещества и добавки, которые облегчают обработку активного соединения в препараты, которые могут быть фармацевтически использованы для доставки к месту действия. Подходящие композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например, водорастворимые соли. Кроме того, могут вводиться суспензии активных соединений, например, масляные суспензии для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, например, кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Необязательно, суспензия также может содержать стабилизаторы. Липосомы также могут быть использованы для инкапсуляции агента для введения в клетку.
Фармацевтическая композиция для системного введения согласно изобретению может быть составлена для энтерального, парентерального или местного введения. Действительно, все три типа композиций могут быть использованы одновременно для достижения системного введения активного ингредиента.
Подходящие композиции для перорального введения включают твердые или мягкие желатиновые капсулы, пилюли, таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, эликсиры, суспензии, сиропы или ингаляции и их формы с контролируемым высвобождением.
В осуществлении методов настоящего изобретения соединения согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в сочетании друг с другом или с другими терапевтическими или диагностическими агентами. В определенных предпочтительных вариантах осуществления соединения согласно изобретению могут вводиться совместно с другими соединениями, обычно предписываемыми для таких состояний в соответствии с общепринятой медицинской практикой. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы in vivo, обычно у млекопитающих, таких как человек, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки, крысы и мыши, или in vitro.
N. Рациональный дизайн лекарственных средств и комбинаторная химия
Bio. Technology
Настоящее изобретение, кроме того, охватывает рациональный дизайн лекарственных средств и комбинаторную химию. Специалисту известны соответствующие методы и разработки для применения аспектов настоящего изобретения в идентификации соединений для лечения злокачественного роста поджелудочной железы. Рациональный дизайн лекарственных средств, включая полипептиды, требует идентификации и определения первого пептида, с которым создаваемое лекарственное средство должно взаимодействовать, и применение первого целевого пептида для определения требований, предъявленных ко второму пептиду. Определив такие требования, специалист может обнаружить или получить соответствующий пептид или не-пептид, который отвечает всем или по существу всем определяемым требованиям. Следовательно, одной из целей рационального дизайна лекарственного средства является получение структурных или функциональных аналогов представляющих интерес биологически активных полипептидов или малых молекул, с которыми они взаимодействуют (например, агонисты, антагонисты, нулевые соединения) с целью создания лекарственных средств, которые, например, являются более или менее сильными формами лиганда (см., например, Hodgson (1991),  9:19-21). Комбинаторная химия является наукой синтеза и исследования соединений в отношении их биоактивности в совокупности, а не каждого в отдельности, с целью ускоренного и более дешевого, чем прежде, создания лекарственных средств. Рациональный дизайн лекарственных средств и комбинаторная химия стали в последние годы более тесно связаны из-за развития подходов к моделированию белков и созданию лекарственных средств с помощью компьютера (см., например, патент США №4908773; 5884230; 5873052; 5331573; и 5888738).
Chem. Eng. News
Genetic Engineering News
Применение молекулярного моделирования в качестве средства для рационального дизайна лекарственных средств и комбинаторной химии существенно увеличилось за счет появления компьютерной графики. Можно не только видеть молекулы на экране компьютера в трех измерениях, но также и изучать взаимодействия макромолекул, таких как ферменты и рецепторы, и рационально создавать производные молекулы для исследования (см. Boorman (1992),  70:18-26). В настоящее время доступно огромное количество удобного в использовании программного и аппаратного обеспечения, и практически все фармацевтические компании имеют группы компьютерного моделирования, занимающиеся рациональным дизайном лекарственных средств. Например, Molecular Simulations Inc. () продают несколько сложных программ, которые позволяют пользователю начать с последовательности нескольких аминокислот, построить двух- или трехмерную модель белка или полипептида, сравнить его с другими двух- или трехмерными моделями и анализировать взаимодействия соединений, лекарственных средств и пептидов с помощью трехмерной модели в реальном времени. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения программное обеспечение используют для сравнения участков белка согласно изобретению и молекул, которые взаимодействуют с ним (вместе называемых «связывающие партнеры» - например, анти-белковые антитела) и фрагментов или производных таких молекул с другими молекулами, такими как пептиды, пептидомиметики и химические вещества, так, чтобы предсказать и получить терапевтические взаимодействия (см. Schneider (1998), , December: page 20; Tempczyk et al. (1997), Molecular Simulations Inc. Solutions April; and Butenhof (1998), Molecular Simulations Inc. Case Notes (August 1998) для обсуждения молекулярного моделирования).
О. Генная терапия
В другом варианте осуществления изобретения генетическая терапия может быть использована в качестве средства для модулирования биологических и патологических процессов, ассоциированных с функцией и активностью белка. Они включают в себя введение в раковую клетку генетического конструкта, кодирующего белок, включающий в себя всю последовательность SEQ ID NO:2 или по меньшей мере часть ее, или, альтернативно, генетического конструкта, включающего в себя, полностью или частично, некодирующий участок SEQ ID NO:1, оперативно связанные с промотором или энхансерным элементом так, чтобы экспрессия указанного белка вызывала подавление указанного злокачественного роста, и где указанный промотор или энхансерный элемент является промотором или энхансерным элементом, модулирующим указанный генетический конструкт.
В описанных конструкциях экспрессия указанного белка может быть осуществлена под действием любого подходящего промотора (например, промотора человеческого цитомегаловируса (CMV), обезьяньего вируса 40 (SV40) или металлотионеина), и регулируется любым соответствующим регуляторным элементом млекопитающих. Например, при желании, для управления экспрессией могут быть использованы энхансеры, известные как предпочтительно направляющие экспрессию гена в нервных клетках, Т-клетках или В-клетках. Энхансеры могут включать в себя, без ограничения, таковые, которые характеризуются как ткане- или клеточно-специфические в их экспрессии. Альтернативно, если геномный клон LBFL313 используется в качестве терапевтического конструкта (например, после его выделения путем гибридизации с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению, описанной выше), регуляция может быть опосредована сходными регуляторными последовательностями или, при желании, регуляторными последовательностями, полученными из гетерологичного источника, включая любой из промоторов или регуляторных элементов, описанных выше.
Введение конструкта в раковую клетку осуществляется in vivo, например, с использованием вирусного или плазмидного вектора. Такие методы также могут быть использованы для применения in vitro. Следовательно, настоящее изобретение легко применимо к различным формам генной терапии либо когда клетки генетически модифицированы ex vivo и затем введены в организм хозяина, либо когда генетическую модификацию проводят in vivo с использованием любого количества подходящих методов с использованием векторов, особенно подходящих для такого лечения.
Prostate
Dtsch Med Wochenschr
Trends Genet
Curr. Gene Ther
Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.
Curr. Gene Ther
J.Biol. Chem
J. Biol. Chem.
Ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы или другие вирусные векторы с соответствующей тропностью к клеткам, возможно, вовлеченным в злокачественный рост (например, эпителиальным клеткам), могут быть использованы в качестве системы доставки для переноса гена для терапевтического генетического конструкта. Множество векторов, применимых для этой цели, в общем известны (Cozzi PJ, et al., (2002) , 53(2):95-100; Bitzer M., Lauer U., (2002) . 127(31-32): 1623-1624; Mezzina and Danos (2002), . 8:241-256; Loser et al. (2002) .2:161-171; Pfifer and Verma (2001),  2:177-211). Ретровирусные векторы особенно хорошо разработаны и используются в клинических условиях (Anderson et al. (1995), патент США №5399346). Не-вирусные подходы также могут быть использованы для введения терапевтической ДНК в клетки, иными словами, предсказываемые как подвергающиеся злокачественному росту (Jeschke et al. (2002) . 1:267-278; Wu et al. (1988), . 263:14621-14624; Wu et al. (1989), 264:16985-16987). Например, ген может быть введен в нейрон или Т-клетку липофекцией, конъюгацией азиалорозомукоида и полилизина или, менее предпочтительно, микроинъекцией в хирургических условиях.
Для любого из методов применения, описанных выше, терапевтический конструкт нуклеиновой кислоты предпочтительно применяется в месте развития злокачественного роста (например, путем инъекции). Однако он также может применяться в ткани, окружающей раковый участок, или в кровеносном сосуде, снабжающем клетки, которые могут подвергнуться злокачественному росту.
Р. Трансгенные животные
Трансгенные животные, содержащие мутантные, нокаутированные или модифицированные гены, соответствующие последовательности кДНК SEQ ID NO:1 или открытой рамке считывания, кодирующей последовательность полипептида SEQ ID NO:2, или их фрагментам, имеющим последующую последовательность по меньшей мере около 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более аминокислотных остатков, также включены в изобретение. Трансгенные животные представляют собой генетически модифицированных животных, которые экспериментально были трансфицированы экзогенным или клонированным генетическим материалом. Такой генетический материал часто называют «трансгеном». Последовательность нуклеиновых кислот трансгена в виде SEQ ID NO:1 может быть встроена или в качестве локуса генома, где такая определенная последовательность аминокислот иным образом в норме не обнаруживается, или в нормальном локусе для трансгена. Трансген может состоять из последовательностей аминокислот, полученных из генома того же вида или отличных видов, чем вид целевого животного.
В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть созданы трансгенные животные, у которых весь ген или часть гена, включающего SEQ ID NO:1, удалены. В таких случаях, где ген, соответствующий SEQ ID NO:1, содержит один или более интронов, могут быть удалены полный ген, все экзоны, интроны и регуляторные последовательности. Альтернативно, менее чем целый ген может быть удален. Например, может быть удален один экзон и/или интрон так, чтобы создать животное, экспрессирующее модифицированную версию белка согласно изобретению.
Термин «трансгенное животное эмбриональной клеточной линии» относится к трансгенному животному, которому генетическое изменение или генетическая информация была внесена в клетки эмбриональной ткани, таким образом придавая способность трансгенному животному передавать генетическую информацию потомству. Если такое потомство животных действительно обладает некоторыми или всеми изменениями или генетической информацией, тогда они тоже являются трансгенными животными.
Изменение или генетическая информация может быть инородной виду животного, к которому принадлежит реципиент, инородной только для определенного отдельного реципиента или может быть генетической информацией, уже носимой реципиентом. В последнем случае измененный или внесенный ген может экспрессироваться отличным от естественного гена образом.
Hypertension
Surg. Oncol
Recombinant Gene Expression Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 62)
Трансгенные животные могут быть получены множеством различных методов, включая трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, нацеливание генов в эмбриональных стволовых клетках и рекомбинантную вирусную и ретровирусную инфекцию (см., например, патент США №4736866; патент США №5602307; Mullins et al. (1993),  22: 630-633; Brenin et al. (1997), . 6: 99-110; , Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997).
Genetics
Lancet
Был получен ряд рекомбинантных или трансгенных мышей, включая таковых, которые экспрессируют последовательность активированного онкогена (патент США №4736866); экспрессируют обезьяний SV40 Т-антиген (патент США №5728915); не экспрессируют фактор, регулирующий интерферон 1 (IRF-1) (патент США №5731490); проявляют допаминергическую дисфункцию (патент США №5723719); экспрессируют по меньшей мере один человеческий ген, который участвует в контроле артериального давления (патент США №5731489); проявляют большое сходство с состояниями, существующими при естественной болезни Альцгеймера (патент США №5720936); обладают способностью опосредовать адгезию клеток (патент США №5602307); обладают геном гормона роста быка (Clutter et al (1996),  143: 1753-1760); или способны создавать полный человеческий ответ антител (McCarthy (1997),  349:405).
Mol. Reprod. Dev
Reprod. Nutr. Dev.
Reprod. Fertil. Dev
Science
J. Animal Sci
Тогда как мыши и крысы остаются животными, чаще всего выбираемыми для большинства трансгенных экспериментов, в некоторых обстоятельствах предпочтительно или даже необходимо использовать альтернативные виды животных. Трансгенные процедуры успешно используются, помимо мышей, у многих животных, включая овец, коз, свиней, собак, кошек, обезьян, шимпанзе, хомяков, кроликов, коров и морских свинок (см., например, Kim et al. (1997), . 46: 515-526; Houdebine (1995),  35:609-617; Petters (1994), .6: 643-645; Schnieke et al. (1997), 278:2130-2133; and Amoah (1997), . 75:578-585).
Способ введения фрагментов нуклеиновой кислоты в рекомбинантные компетентные клетки млекопитающих может осуществляться любым способом, который способствует совместной трансформации множества молекул нуклеиновой кислоты. Подробные методики для получения трансгенных животных легко доступны специалисту в данной области, включая описание патента США №5489743 и патента США №5602307.
Q. Диагностические методы
Так как гены и белки согласно изобретению дифференциально экспрессируются в ткани злокачественного роста поджелудочной железы относительно нераковой ткани поджелудочной железы, гены и белки согласно изобретению могут быть использованы для диагностики или мониторинга злокачественного роста поджелудочной железы, для отслеживания прогрессии заболевания или для того, чтобы отличить ткани поджелудочной железы от образцов нераковой ткани поджелудочной железы. Одно из средств диагностики злокачественного роста с использованием молекул нуклеиновой кислоты или белков согласно изобретению включает получение ткани от живых пациентов.
Antibodies - A Laboratory Manual
Исследования для определения молекул нуклеиновой кислоты или белка согласно изобретению могут быть проведены в любом доступном формате. Обычно исследования молекул нуклеиновой кислоты включают в себя гибридизацию или анализ на основе ПЦР. Обычно исследования для определения белков, полипептидов или пептидов согласно изобретению включают в себя использование зондов антител в любой доступной форме, такой как анализ связывания in situ и др. (см. Harlow & Lane, , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NJ, 1988). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения исследования проводят с соответствующим контролем.
Обычно диагностика согласно изобретению может быть классифицирована в соответствии с тем, является ли исследование вариантом на основе нуклеиновой кислоты или белка. В некоторых диагностических исследованиях определяют мутации или полиморфизмы в белках или нуклеиновых кислотах согласно изобретению, которые участвуют в раковых расстройствах. Другие диагностические исследования определяют и различают дефекты активности белка путем определения уровня РНК или белка согласно изобретению в исследуемом организме, которые отражают уровень РНК или белка согласно изобретению в организме, страдающем от заболевания, такого как злокачественный рост, или путем определения уровня РНК или белка в тестируемом организме, который отличается от организма, не страдающего от заболевания.
Кроме того, предусмотрено производство наборов, которые включают в себя реагенты и методы, описанные в следующих вариантах осуществления изобретения, так, чтобы позволить быстрое определение и идентификацию изменений активности или уровня белка. Диагностические наборы могут включать в себя зонд нуклеиновой кислоты или антитело или их комбинацию, которые специфически определяют мутантную форму белка согласно изобретению, или зонд нуклеиновой кислоты или антитело или их комбинацию, которые могут быть использованы для определения уровня экспрессии РНК или белка одного или более белков согласно изобретению. Определяющий компонент этих наборов обычно поставляется в комбинации с одним или более следующими реагентами. Часто поставляют подложку, способную абсорбировать или иным образом связывать ДНК, РНК или белок. Доступные подложки включают в себя мембраны из нитроцеллюлозы, нейлон или обработанный нейлон, который может быть охарактеризован как несущий ряд положительно заряженных заместителей. В таких наборах могут быть представлены одна или более рестриктаз, контрольных реагентов, буферов, ферментов амплификации и не-человеческих полинуклеотидов, таких как ДНК тимуса теленка или спермы лосося.
TM
Применимые диагностические методики на основе нуклеиновых кислот включают в себя, но не ограничиваются ими, прямое секвенирование ДНК, электрофорез в градиентном геле, Саузерн-блоттинг, анализ подтверждения одной цепочки (SSCA), анализ защиты РНКазы, дот-блоттинг-анализ, амплификация нуклеиновой кислоты, аллель-специфичная ПЦР и комбинации таких подходов. Начальной точкой для этих исследований является выделенная или очищенная нуклеиновая кислота из биологического образца. Предусматривается, что биопсии тканей обеспечивают хороший источник образцов. Нуклеиновую кислоту экстрагируют из образца, и она может быть амплифицирована методикой ДНК-амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), с использованием праймеров. Специалист в данной области легко представляет себе методы, доступные для подтверждения наличия полиморфизмов. Кроме того, любая направленная матричная методика, известная в данной области, может быть использована с этим аспектом изобретения. Один определенный вариант осуществления полинуклеотидных матриц известен как Genechips и в общем описан в патенте США 5143854; публикации РСТ WO 90/15070 и 92/10092.
Широкое множество меток и методик конъюгации известно специалисту в данной области и может быть использовано в различных исследованиях нуклеиновых кислот. Существует несколько способов получения меченых нуклеиновых кислот для гибридизации или ПЦР, включая, но не ограничиваясь ими, олигометку, ник-трансляцию, концевую метку или ПЦР-амплификацию с использованием меченого нуклеотида. Альтернативно, нуклеиновая кислота, кодирующая белок согласно изобретению, может быть клонирована в вектор для получения мРНК-зонда. Такие векторы, известные в данной области, коммерчески доступны и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vitro путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или SP6 и меченых нуклеотидов. Ряд компаний, такие как Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) и U.S. Biochemical Corp (Cleveland, OH), поставляют коммерческие наборы и протоколы для таких методик. Подходящие молекулы-репортеры или метки включают в себя радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные вещества, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и пр.
В предпочтительной диагностике на основе белка антитела согласно изобретению прикрепляются к подложке в определенном порядке, где множество антител прикреплено к отдельным участкам подложки, которые не перекрываются друг с другом. Специалист в данной области хорошо знаком с доступными анализами для диагностики на основе белка. Белки получают из биологических образцов и метят обычными способами (например, радиоактивно, колориметрически или флуоресцентно). Используя меченые стандарты известной концентрации белка согласно изобретению мутантного и/или дикого типа, исследователь может точно определить концентрацию белка согласно изобретению в образце, и по этой информации может оценить уровень экспрессии определенной формы белка. Обычные методы в денситометрии также могут быть использованы для более точного определения концентрации или уровня экспрессии такого летка. Такие подходы также легко автоматизировать с использованием методики, известной специалисту в данной области высокопроизводительного диагностического анализа. Как подробно указано выше, любая известная направленная матричная методика может быть использована с этим аспектом изобретения и отражать матрицы белка на кристаллах в попытке максимализировать варианты связывания антител и диагностическую информацию.
TM
Как обсуждается выше, присутствие или определение полиморфизма в гене или белке согласно изобретению может обеспечить диагностику злокачественного роста или сходной патологии в организме. Дополнительные варианты осуществления изобретения включают получение диагностических наборов, содержащих компоненты для определения, такие как антитела, специфические для определенного полиморфного варианта гена или белка согласно изобретению. Компонент для определения обычно поставляют в комбинации с одним или более из следующих реагентов. Часто поставляют подложку, способную абсорбировать или иным образом связывать РНК или белок. Доступные подложки для этой цели включают в себя, но не ограничиваются ими, мембраны нитроцеллюлозы, нейлон или обработанный нейлон, который может быть охарактеризован как несущий матрицу положительно заряженных заместителей, и Genechips или их эквиваленты. Один или более ферментов, таких как обратная транскриптаза и/или Taq-полимераза, могут быть представлены в наборе, например, dNTP, буферы или не-человеческие полинуклеотиды, также как ДНК тимуса телят или спермы лосося. Результаты исследования с помощью набора могут быть интерпретированы поставщиком медицинских услуг или диагностической лабораторией. Альтернативно, диагностические наборы производят и продают частным лицам для самодиагностики.
Вдобавок к диагностике заболевания в соответствии с наличием или отсутствием полиморфизма, некоторые заболевания, включая злокачественный рост, возникают в результате асимметричного уровня белка или гена согласно изобретению в определенных тканях или нарушенного типа экспрессии белка согласно изобретению. Путем мониторинга уровня экспрессии в различных тканях может быть, например, поставлен диагноз или может быть идентифицировано патологическое состояние. Сходным образом, путем определения соотношений уровня экспрессии различных белков согласно изобретению в специфических тканях (например, тип экспрессии) может быть осуществлено прогнозирование состояния здоровья или заболевания. Определяют уровень экспрессии белка согласно изобретению в различных тканях от здоровых пациентов, а также пациентов, страдающих от злокачественного роста. Такие значения могут быть записаны в базе данных, и их можно сравнить со значениями, полученными от исследуемых пациентов. Кроме того, соотношения или тип экспрессии в различных тканях от здоровых и больных людей записывают в базу данных. Такие анализы называют «профилями патологического состояния», и путем сравнения одного профиля патологического состояния (например, от здорового или больного человека) с профилем патологического состояния от исследуемого человека клиницист может быстро диагностировать наличие или отсутствие заболевания.
Методики на основе нуклеиновой кислоты и белка, описанные выше, могут быть использованы для определения уровня или количества или соотношения экспрессии генов или белков согласно изобретению в ткани. Посредством количественной Нозерн-гибридизации, анализа in situ, иммуногистохимии, ELISA, методике ДНК-чипов, ПЦР и Вестерн-блоттинга можно, например, быстро определить количество или уровень экспрессии РНК или определенного белка согласно изобретению (дикого типа или мутантного), и из этой информации можно получить предполагаемые соотношения экспрессии. Альтернативно, анализируемые белки согласно изобретению могут быть членами семейства, которые в настоящее время неизвестны, но которые определяют на основе наличия у них одного или более участков сходства, описанных выше.
Описание чертежей
Фиг.1. На фиг.1 показана предсказанная последовательность сигналов для секреции LBFL313 (SEQ ID NO:2). Анализ проводили с использованием Signal1IP 3.0 Server ().
Фиг.2. Фиг.2 представляет собой результат Вестерн-анализа, показывающий, что LBFL313 определяют в надосадочной жидкости культуры клеток.
Фиг.3. На фиг.3 показано влияние повышенной экспрессии LBFL313 в клетках СНО на пролиферацию (панель А), подвижность (панель В) и инвазивность (панель С) клеток.
Фиг.4. На фиг.4 показано влияние повышенной экспрессии LBFL313 у голых мышей на развитие опухоли (панель А) и образование микрососудов (панель В).
Фиг.5. На фиг.5 показаны характерные результаты иммуногистохимического анализа экспрессии LBFL313 с использованием образцов биопсии поджелудочной ткани и анти-LBFL313 антител.
Фиг.6. На фиг.6 изображены графики, показывающие влияние поликлонального анти-LBFL313-антитела на инвазивность клеточных линий злокачественного роста поджелудочной железы.
Наилучший способ осуществления
Без дополнительных подробностей считается, что рядовой специалист в данной области может, используя предшествующее описание и следующие иллюстративные примеры, создать и использовать соединения согласно изобретению и осуществлять заявленные способы. Следовательно, следующие рабочие примеры специфически указывают на предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и не должны расцениваться как каким-либо образом ограничивающие последующее описание.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Идентификация дифференциально экспрессируемой мРНК в аденокарциноме поджелудочной железы
Образцы ткани пациентов получали от пациентов-корейцев и классифицировали на две группы. Одна группа состояла из пациентов, которым был поставлен диагноз аденокарциномы поджелудочной железы. Пациенты в этой группе, шесть мужчин и три женщины, имели возраст от 51 до 70 лет. У второй группы пациентов была диагностирована нормальная поджелудочная железа. В этой группе из трех мужчин пациенты были в возрасте от 63 до 66 лет. Проводили гистологический анализ каждого из образцов ткани, и образцы разделяли на категории как не-раковые или раковые.
С минимальными модификациями протокол получения образцов соответсвовал руководству Affymetrix GeneChip Expression Analysis. Замороженные ткани сначала измельчали до порошка с использованием морозильной мельницы Spex Ceptiprep 6800. Затем экстрагировали общую РНК с использованием Тризола (Life Technologies). Затем выделяли мРНК с использованием набора Oligotex mRNA Midi (Qiagen). С использованием 1-5 мг мРНК создавали двухцепочечную кДНК с использованием системы SuperScript Choice (Gibco-BRL). Первую цепочку синтеза кДНК примировали олигонуклеотидом Т7-(dT24). Затем кДНК экстрагировали фенол-хлороформом и осаждали этанолом до конечной концентрации 1 мг/мл.
Из 2 мг кДНК синтезировали кРНК в соответствии со стандартными методиками. Для метки биотином кРНК к реакционной среде добавляли нуклеотиды Bio-11-CTP и Bio-16-UTP (Enzo Diagnostics). После инкубации при 37°С в течение шести часов меченую кРНК очищали в соответствии с протоколом набора Rneasy Mini (Qiagen). Затем кРНК фрагментировали (буфер 5' фрагментации: 200 мМ Трис-Ацетата (рН 8,1), 500 мМ КОАс, 150 мМ MgOAc) в течение тридцати пяти минут при 94°С.
Пятьдесят пять миллиграммов фрагментированной кРНК гибридизовали на установке матриц Affymetrix Human Genome U133 в течение двадцати четырех часов при 60 об/мин в 45°С печи для гибридизации. Чипы промывали и окрашивали Фикоэтрином стрептавидином (SAPE) (Molecular Probes) в струйной станции Affymetrix. Для умножения окрашивания раствор SAPE добавляли дважды с промежуточной стадией окрашивания анти-стрептавидин биотинилированным антителом (Vector Laboratories). Гибридизацию с матрицами зондов определяли флуорометрическим сканированием (Hewlett Packard Gene Array Scanner). После гибридизации и сканирования микроматричные изображения анализировали в отношении контроля качества в поисках крупных дефектов чипов или нарушений в сигнале гибридизации. После этого все чипы проходили QC, Affymetrix Microarray Suite (v5.0) и LIMS (v3.0).
Дифференциальную экспрессию генов между раковыми и нераковыми образцами поджелудочной железы определяли с использованием установок Affymetrix human GeneChip U133 со следующими статистическими методами. (1) Для каждого гена значения сигнала для U133 определяли Affymetrix Microarray Suite (v5.0), который также давал «отсутствие» (= не определяется), «присутствие» (= определяется) или «пограничный» (= не четко отсутствие или присутствие) сигнала для каждого элемента GeneChip. (2) С использованием критериев по меньшей мере 40% сигнала присутствия в группах раковых образцов поджелудочной железы, группы генов, выбранной для дальнейшего анализа. (3) Все значения сигналов трансформировали в логарифмическую шкалу. (4). Метод дисперсионного анализа (ANOVA) также использовали для анализа данных (Steel et al., Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach, Third Ed., McGraw-Hill, 1997).
Анализ данных чипов показал, что экспрессия маркера LBFL313 была существенно повышена (в 11,13 раз, р=0) в образцах аденокарциномы поджелудочной железы по сравнению с образцами из нормальной ткани поджелудочной железы. Такие данные показали, что стимуляция LBFL313 может быть диагностической для злокачественного роста поджелудочной железы.
TM
Уровень экспрессии LBFL313 (SEQ ID NO: 1) может быть измерен фрагментом последовательности чипа №228058_at на Affymetrix GeneChip U133. Посредством комбинированной разработки вышеуказанных данных с помощью GeneEzpress Oncology Datasuite Gene Logic, Inc. (Gaithersburg, MD), уровень экспрессии 228058_at в различных злокачественных образованиях, по сравнению с нормальными контрольными тканями, показан в Таблице, где также указаны кратность изменения и направление изменения (повышение или подавление). Кратность увеличения более чем 1,5 расценивали как значимую.
Результаты экспрессии GeneChip, определенные связыванием образца с фрагментом последовательности чипа №228058_at, оценивали количественной ОТ-ПЦР (Q-RT-PCR) с использованием анализа Taqman (Perkin-Elmer). В анализе использовали праймеры ПЦР, созданные из файла информации о последовательности специфического фрагмента Affymetrix (228058_at). Целевой ген в каждом образце РНК (десять нг общей РНК) оценивали относительно экзогенного пика контрольного гена. С этой целью в качестве экзогенно добавленного пика использовали ген устойчивости к тетрациклину. Такой подход обеспечивает относительную экспрессию, которую измеряют значением порога цикла (Ct) целевой мРНК относительно постоянного количества Ct значений пика Tet. Панель образцов включала тканевые РНК, которые анализировали на U133 GeneChips. Кроме того, несколько новых образцов, которые не были проанализированы на GeneChip, использовали для оценки экспрессии Q-RT-PCR. Данные Q-RT-PCR подтвердили стимуляцию LBFL313, наблюдаемую в аденокарциноме поджелудочной железы по сравнению с образцами биопсии нормальной поджелудочной железы.
Пример 2
Клонирование полноразмерной человеческой кДНК (LBFL313), соответствующей дифференциально экспрессируемым видам мРНК
Полноразмерную кДНК, имеющую SEQ ID NO: 1, получали методом олиго-вытягивания. Коротко, создавали ген-специфические олигонуклеотиды на основании последовательности LBFL313. Олигонуклеотиды метили биотином и использовали для гибридизации с 2 мкг одноцепочечной плазмидной ДНК (рекомбинантами кДНК) из библиотеки человеческой плаценты, следуя методикам Sambrook et al. Гибридизованные кДНК отделяли с помощью стрептавидин-связанных шариков и элюировали нагреванием. Элюированную кДНК преобразовывали в двухцепочечную плазмидную ДНК и использовали для трансформации клеток E.coli (DH10B) и скринировали самую длинную кДНК. После подтверждения положительного выбора ПЦР с использованием ген-специфических праймеров, клон кДНК подвергали ДНК секвенированию.
Нуклеотидная последовательность полноразмерный человеческой кДНК, соответствующей дифференциально регулируемой мРНК, определенной выше, указана в SEQ ID NO:1. КДНК включает 777 пар оснований.
Открытая рамка считывания в нуклеотидной последовательности кДНК SEQ ID NO:1, в нуклеотидах 53-640 (53-643, включая стоп-кодон), кодировала белок из 196 аминокислот. Последовательность аминокислот, соответствующая предсказываемому белку, кодируемому SEQ ID NO:1, указана в SEQ ID NO:2.
Glycobiology
SEQ ID NO:2 содержит Жакалино-подобный лектиновый домен: белки, содержащие этот домен, являются лектинами. Его обнаруживают в 1-6 копиях таких белков. Домен также обнаруживают в спермин-связывающем белке предстательной железы животных (Raval et al. (2004)  14:1247-1263). На фиг.1 показан результат анализа сигнальной последовательности с использованием SignalIP 3.0 Server (). Потенциальный участок отщепления сигнальной последовательности для секреции предсказывают между положениями аминокислот 40 (Ala) и 41 (Gly).
Проводили анализ Нозерн-блоттингом для определения размера транскриптов мРНК, которые соответствовали LBFL313. Использовали Нозерн-блот, содержащий общую РНК из различных человеческих тканей (Human 12-Lane MTN Blot, Clontech, Palo Alto, CA), и EST, содержащий последовательность 228058_at, радиоактивно метили методом случайных праймеров и использовали для зондирования блота. Блот гибридизовали в 50% формамиде, 5Х SSPE, 0,1% SDS, 5Х раствора Денхарта и 0,2 мг/мл ДНК спермы сельди при 42°С и промывали 0,2Х SSC, содержащем 0,1% SDS при комнатной температуре. Нозерн блоттинг показал единственный транскрипт для этого гена, который имел размер приблизительно 0,8 kb. Это соответствовало размеру клона LBFL313 (SEQ ID NO:1).
Пример 3
Получение клеточных линий, трансфицированных LBFL313
Кодирующий участок LBFL313 амплифицировали ПЦР с использованием прямого праймера (5'-TTGGGATCCGTATAAAGGCGATGTGGAGG-3'), включающего сайт BamHI, и обратного праймера (5'-ACCATCTAGAGCGACCCACGGGTGAGT-3'), включающего сайт XbaI. ПЦР проводили с использованием TaqPlus нацеленной ДНК полимеразы (Stratagene, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Циклы амплификации ПЦР включали исходную денатурацию при 94°С в течение 2 мин, в 27 циклов; 94°С в течение 30 сек, 50°С в течение 30 сек, 72°С в течение 1 мин, с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. ПЦР продукт клонировали в сайте BamHI и XbaI вектора экспрессии млекопитающих pcDNA3.1-mycHis (Invitrogen). Клонированную плазмиду (pLFG250) секвенировали через участок сайта клонирования для подтверждения его первичной структуры.
Почти слившиеся клетки СНО стабильно трансфицировали pLFG250 или вектором pcDNA3.1-mycHis отдельно с использованием реагента Lipofectamine PLUS (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 ч трансфицированные клетки культивировали в Ham's F12 (Invitrogen), содержащей 10% FBS и 400 мкг/мл G418 (Sigma) для селекции. Такую селекционную среду меняли каждые 2 дня и после 10-12 дней использовали клонзапирающие кольца для выделения положительных клонов. Затем культуры увеличивали и исследовали в отношении экспрессии LBFL313. Клетки лизировали в лизатном буфере, содержащем 50 мМ HEPES (рН7,2), 150 мМ NaCl, 25 мМ бета-глицерофосфата, 25 мМ NaF, 5 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 1 мМ ортованадата натрия, 0,1 мМ PMSF и ингибитора протеиназ Protease Inhibitors cocktail (Лейпептин, пепстатин, Апротинин и антипаин, каждый 5 мкг/мл). Культуральную среду концентрировали 10 k отсекающего пенетрометра (Amicon), создавая объем до 15 мкл. Белки восстанавливали инкубацией в течение 5 мин при 95°С в 4х SDS нагрузочном буфере. Полипептиды разделяли на 10 мА/геле на 12% гелях SDS-PAGE и электрофоретически трансфицировали на 0,45 мкм Р-переносную мембрану Immobilon (Millipore) в течение 2 ч при 200 мА/гель при 4°С. Мембраны блокировали в течение 1 ч в буфере TBST (25 мМ Tris, рН 7,5; 125 мМ NaCl, и 0,1% (об./об.) Tween-20), содержащим 5% (мас./об.) нежирного молока. Затем блоты зондировали в течение ночи антителом анти-His HRP (Santa Cruz). Иммунореактивное вещество затем визуализировали усиленной хемилюминесценцией (Elpis Biotech) в соответствии с инструкциями производителя. Как показано на фиг.2, белок LBFL313 определяли только в надосадочной жидкости, но не в экстракте клеток. Это подтверждало предсказание, что LBFL313 кодирует секретируемый белок.
Пример 4
Анализ эффекта повышенной экспрессии LBFL313 на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток
4
2
Для определения эффекта повышенной экспрессии LBFL313 на пролиферацию скорость роста клеток измеряли подсчетом клеток. В 12-луночных планшетах сеяли 4×10 клеток. Планшеты инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 12 дней, и количество клеток подсчитывали гемоцитометром каждый день. Результат представляет собой средние значения + стандартное отклонение из трех. Как показано на фиг.3А, в клетках СНО повышенная экспрессия LBFL313 индуцировала более быструю пролиферацию. Подобный эффект наблюдали с клеточными линиями злокачественного роста поджелудочной железы PANC-1 избыточно экспрессирующими LBFL313.
6
5
2,
Миграцию и инвазию исследовали анализом в камере Бойдена. Оба анализа проводили в 48-луночной камере Бойдена, 48-луночной микрокамере Neuro Probe (Neuroprobe). Клетки трипсинизировали и ресуспендировали в ингибиторе трипсина, растворе ингибитора трипсина соевых бобов (Sigma). Клетки осаждали и суспендировали до конечной концентрации по 2×10 клеток/мл в среде без сыворотки. Нижние ячейки камеры наполняли 30 мкл стандартной среды. Камеру собирали с использованием поликарбонатных фильтров (поликарбонат, размер диаметра отверстий 8 мкм, Neuroprobe). Для анализа инвазии клеток 1 мг/мл MatrigelTM Basement Membrane Matrix (BD Bioscience) наслаивали на каждый фильтр (500 мкг/фильтр) и сушили на воздухе. Пятьдесят мкл образца суспензии клеток (1х10 клеток/ячейку) добавляли в верхнюю камеру. Камеру инкубировали при 37°С и 5% СО и время инкубации варьировалось в зависимости от анализируемых типов клеток: в течение 24 ч в случае анализа миграции СНО, в течение 48 ч для анализа инвазии СНО и в течение 18 ч в случае анализа миграции и инвазии PANC-1. В конце инкубации клетки на верхней поверхности фильтров механически удаляли. Фильтры фиксировали в метаноле и окрашивали в Гимса глянцевом, модифицированном растворе (Sigma). Количество мигрировавших клеток на поле (100х) подсчитывали под световым микроскопом (Olympus). Каждый образец оценивали в трех экземплярах. Как показано на фиг.3В и фиг.3С, подвижность и инвазивность клеток СНО усиливалась повышенной экспрессией LBFL313. Сходные эффекты наблюдали с клеточными линиями злокачественного роста поджелудочной железы PANC-1, избыточно экспрессирующими LBFL313.
Пример 5
Эффекты повышенной экспрессии LBFL313 на онкогенез у голых мышей
7
2
Определяли биологические эффекты повышенной экспрессии LBFL313 на рост опухолей in vivo. Клетки СНО вводили подкожно в бок иммунодефицитных голых мышей. Слившиеся СНО клетки стабильно трансфицированные или вектором LBFL313 (pLFG250) или только вектором, трипсинизировали и ресуспендировали в PBS с плотностью 3,3×10 клеток/мл. Пять миллионов клеток СНО каждого типа вводили подкожно в бок пяти 8-недельным самкам мышей Balb/C (nu/nu). В процессе роста мышей измеряли длину и ширину опухолей. Объем опухолей рассчитывали по формуле Объем Опухоли = (длина) х (ширина)/2. Через 37 дней мышей умерщвляли и анализировали опухоли. Как показано на фиг.4А, размер опухолей, созданных клетками, трансфицированными LBFL313, был больше с более чем 5-кратным увеличением, по сравнению с ложными контрольными клетками.
Для определения степени индуцированного опухолью ангиогенеза, парафиновые сечения ксенотрансплантатов опухоли окрашивали моноклональным антителом к фактору VIII (Dako). Залитые парафином сечения тканей (толщиной 3-5 мкм), полученные из опухолей каждой группы мышей, депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в ряду градуированного этанола (100-90-80-70-50-30%) и промывали PCS. Эндогенную пероксидазу блокировали погружением стекла в 0,3% (об./об.) перекись водорода в метаноле в течение 15 мин при КТ. После промывания три раза PBS в течение 4 мин каждое сечения блокировали пропиткой в 10% (об./об.) нормальной ослиной сыворотке в PBS в течение 1 ч при КТ. После трех раз промывки PBS в течение 4 мин каждое, блокированные сечения инкубировали в моноклональных антителах к фактору VIII (фактор фон Виллебранда, разведение 1:50) (Dako) в течение 2 ч при КТ. Через 2 ч промывали три раза PBS в течение 4 мин каждое, стекла инкубировали в течение 30 мин с биотинилированной средой Link при КТ, промывали три раза в PBS в течение 4 мин каждое и инкубировали с конъюгированным стрептоавидином-HRP (Dako) в течение 15 мин при КТ. После трех раз промывки PBS сечения инкубировали с хромогеном и промывали в дистиллированной воде. Сечения фактора VIII не докрашивали.
Количество микрососудов определяли, как описано Padro (Padro et al. (2000) Blood 95:2637-2644). Число микрососудов одновременно оценивали два независимых опытных исследователя с использованием световой микроскопии. Исследователи не знали о клинико-патологическом состоянии. Целые сечения систематически сканировали, т.е. поле за полем, с х100 увеличением для обнаружения областей, показывающих наиболее интенсивную васкуляризацию. Затем увеличение увеличивали до х200 или до х400 и исследователям позволяли переустанавливать стекло, пока наибольшее количество сосудов не находилось в поле х400. Эту область определяли как горячую точку после достижения согласия между обоими исследователями, таким образом, снижая ошибку подсчета микрососудов между наблюдателями. В каждой горячей точке оба исследователя проводили отдельный подсчет микрососудов в поле х400. Как показано на фиг.4В, результаты выявили наибольшее количество микрососудов в опухолях от мышей, которым вводили клетки, трансфицированные LBFL313, чем ложные контрольные клетки. Эксперименты in vivo показали агрессивное образование опухоли и усиленный ангиогенез LBFL313.
Пример 6
Продукция поликлонального анти-LBFL313-антитела
Полноразмерную кДНК LBFL313 амплифицировали ПЦР с использованием прямого праймера (5'-CTAAGGCCCAGCCGGCCGGGAAGATGTATGGCCCTGGA-3') и обратного праймера (5'-CATAGGCCCCACCGGCCGAGCGACCCACGGGTGAGTT-3'). ПЦР проводили с использованием TaqPlus нацеленной ДНК-полимеразы (Stratagene, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Циклы ПЦР амплификации включали исходную денатурацию при 94°С в течение 5 мин и 30 циклов; 94°С в течение 30 сек, 58°С в течение 30 сек, 72°С в течение 30 сек с последующим конечным удлинением при 72°С в течение 10 мин. ПЦР продукт визуализировали на 1,5% ТАЕ геле, и гель очищали с использованием набора восстановления Zymoclean Gel DNA (Zymo Research, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Эту очищенную ДНК вставляли в сайт SfiI вектора pLFG106 для получения рекомбинантного сшитого белка LBFL313-Fc. pLFG106 является вектором экспрессии, содержащим сигнальную последовательность, Fc участок человеческого IgG и гены DHFR в основе pcDNA3.1 (Invitrogen). pLFG106 также содержит последовательность распознавания тромбина между сайтом клонирования и Fc участком. Плазмидой экспрессии LBFL313-Fc стабильно трансфицировали мутантные клеточные линии СНО с отсутствием DHFR с использованием реагентов ExGen 500 (Fermentas, Lithuania) в соответствии с инструкциями производителя. Стабильно трансфицированные клетки выбирали в нуклеотид-свободной МЕМ-б (Invitrogen, CA), содержащей 800 мкг/мл G418 (Invitrogen, CA) и 10% диализованной FBS в течение 2 недель. Стабильные трансфектанты затем адаптировали в концентрации 100 нМ метотрексата (Sigma, MO) в течение 2 недель. Рекомбинантный сшитый белок LBFL313-Fc, секретируемый в культуральную среду, идентифицировали вестерн-блоттинг анализом и ELISA с использованием анти-человеческого анти-Fc-антитела (Sigma, MO).
2
8
Крупномасштабную экспрессию рекомбинатного сшитого белка LBFL313-Fc проводили с использованием флаконов Roller (1750 см). Стабильные трансфектанты, экспрессирующие рекомбинатные сшитые белки LBFL313-Fc, выращивали в IMDM плюс 5% FBS. Культуру роллерного флакона инокулировали с 3×10 клетками, и устройство вращали в 5 об/мин в инкубаторе 37°С. Клетки культивировали в течение 5 дней и среду меняли на среду без сыворотки каждые три дня. Обломки клеток в собранной среде без сыворотки удаляли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Для очистки рекомбинантного сшитого белка LBFL313-Fc среду без клеток дополнительно обрабатывали концентрированием с использованием Концентратора, ProFlux M12 (Amicon) через мембрану 10К MWCO Pellicon 2 (Millipore). Концентрированную среду затем пропускали через 10 мл колонку белка А агарозы (Pierce), предварительно уравновешенную в 20 мМ фосфата натрия, рН 8,0. Несвязавшийся белок отмывали с колонки с помощью 20 мМ буфера фосфата натрия. Затем колонку элюировали 0,1 М цитратом, рН 3,0, собирая 4,5 мл фракции в пробирки, содержащие 500 мкл 1М Трис-HCl, рН 9,0. Фракции, содержащие рекомбинатный сшитый белок LBFL313-Fc, собирали и дополнительно очищали хроматографией, исключающей по размеру, с использованием смолы 200 HR сефарозы (Amersham, IL).
С-концевой Fc отщепляли от рекомбинантного сшитого белка LBFL313-Fc набором Thrombin Cleavage Capture (Novagen) и затем удаляли посредством ImmunoPureR Immobilized Protein A (Pierce). Коротко, рекомбинатный сшитый белок LBFL313-Fc инкубировали с биотинилированным тромбином при 20°С в течение ночи. После протеолиза биотинилированный тромбин удаляли стрептавидиновыми агарозными шариками. Полученный раствор, смесь рекомбинантного LBFL313 и Fc, разделяли пропусканием дважды через колонку ImmunoPureR Immobilized Protein A (Pierce). Чистоту рекомбинантного LBFL313 проверяли на геле SDS-PAGE.
R
Очищенный рекомбинантный LBFL313 использовали для иммунизации двух кроликов с использованием стандартных методик. Иммунизированную сыворотку собирали и затем очищали с использованием набора для очистки IgG ImmunoPureR (A Plus) (Pierce) в соответствии с инструкциями производителя. Последующую очистку проводили с использованием набора для иммобилизации AminoLink (A Plus) (Pierce), связанного с рекомбинантным человеческим Fc. Очищенное поликлональное антитело определяло белок приблизительно 21 кДа в Вестерн-блоттинге кондиционированной среды, полученной из клеток злокачественного роста поджелудочной железы, экспрессирующих LBFL313. Специфичность антитела дополнительно демонстрировали повышенным определением белка LBFL313, полученного из кондиционированной среды PANC-1 клеток, трансфицированных LBFL313, тогда как не было повышения такового PANC-1 клеток, трансфицированных только вектором.
Пример 7
Иммуногистохимический анализ экспрессии LBFL313
Стекла микросрезов тканей де-парафинизировали в ксилоле и регидратировали в градуированном спирте. Активность эндогенной пероксидазы блокировали метанолом, содержащим 0,3% перекиси водорода при комнатной температуре в течение 20 мин. Микроволновое извлечение антигена проводили в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0) в течение 4 мин. Затем стекла инкубировали с 10% раствором нормальной ослиной сыворотки в течение 1 ч для уменьшения фона неспецифического окрашивания.
Первичным антителом было поликлональное анти-LBFL313 антитело, в разведении 1:500. Блокированные сечения инкубировали в первичном антителе в течение ночи при 4°С. Последующую реакцию проводили с использованием набора LSAB+ (DakoCytomation, Carpinteria, CA,USA) и рекомендуемой методики. Наконец, стекла инкубировали с 3-амино-9-этилкарбазолом (DakoCytomation, Carpinteria, CA,USA) и докрашивали раствором гематоксилина Харриса, модифицированного (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA).
Во всех случаях наблюдали иммунореактивность в цитоплазме опухолевых клеток. Иммунореактивность оценивали методом Н-баллов. Интенсивность окрашивания оценивали как 0, 1, 2 и 3, соответственно присутствия отрицательного, слабого, промежуточного и сильного коричневого окрашивания, соответственно. Определяли процент окрашивания клеток с различной интенсивностью и применяли следующую формулу: Н-балл = (% клеток, окрашенных с баллом интенсивности 1) + 2 × (% клеток, окрашенных с баллом интенсивности 2) + 3 × % клеток, окрашенных с баллом интенсивности 3). Н-баллы опухолевой ткани и соседней неопухолевой ткани анализировали с использованием подписанного рангового критерия Вилкоксона. Как показано на фиг.5, опухолевые ткани имели достоверно более высокую экспрессию LBFL313, чем соседние неопухолевые ткани (14 из 16 случаев) (р<0,05).
Пример 8
Эффект анти-LBFL313 антитела на инвазивность клеток злокачественного роста поджелудочной железы
6
2
Для определения эффекта анти-LBFL313 антитела на инвазию клеточных линий человеческого злокачественного роста поджелудочной железы проводили исследование в камере Бойдена в присутствии анти-LBFL313 антитела или нормального IgG кролика. Коротко, пять типов клеточных линий злокачественного роста поджелудочной железы, CFPAC-1, MiaPaCa-2, PANC-1. AsPC-1 и BxPC-3 трипсинизировали и ресуспендировали в растворе ингибитора трипсина (Sigma). Клетки осаждали и суспендировали в среде без сыворотки в присутствии PBS, анти-LBFL313 антитела или нормального IgG кролика до конечной концентрации 1~5×10клеток/мл. Нижние ячейки камеры заполняли 30 мкл стандартной среды. Камеру собирали с использованием поликарбонатных фильтров с размером диаметра отверстий 8 мкм (Neuroprobe), покрытыми на верхней стороне 1 мг/мл матрицей базальной мембраны MatrigelTM (BD biosciences). Пятьдесят мкл суспензии клеток добавляли к верхней камере. Камеру инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 24 ч. В конце инкубации клетки на верхней поверхности фильтров механически удаляли. Фильтры фиксировали в метаноле и окрашивали в красителе Гимса, модифицированном растворе (Sigma). Количество мигрировавших клеток на поле (100х) подсчитывали под световым микроскопом (Olympus). Каждый образец оценивали в трех экземплярах. Как показано на фиг.6, анти-LBFL313 антитело эффективно ингибировало инвазивность клеточных линий человеческого злокачественного роста поджелудочной железы дозозависимым образом. Подобные эффекты наблюдали в клеточных линиях злокачественного роста желудка, AGS и N87.
Промышленная применимость
Хотя настоящее изобретение описано детально со ссылками на вышеуказанные примеры, следует понимать, что возможны различные модификации в рамках настоящего изобретения. Соответственно, изобретение ограничено только следующей формулой изобретения. Все указанные патенты, патентные заявки и публикации, относящиеся к настоящей заявке, в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылки.