СТИМУЛЯТОР ПРОЛИФЕРАЦИИ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ И СПОСОБ ИХ СТИМУЛЯЦИИ
PROMOTING AGENT OF PROLIFERATION OF REGULATORY T-LYMPHOCYTE, AND THEIR PROMOTION METHOD

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биопрепаратам медицинского назначения, предназначенных для воздействия на иммунную систему организма, а именно на активность Т-лимфоцитов, а именно к стимуляторам пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов.
Минорная субпопуляция Т-лимфоцитов, называемая регуляторными Т-лимфоцитами (Treg), способна, с помощью нескольких механизмов, ингибировать пролиферацию обычных Т-лимфоцитов, выполняя важную функцию подавления активности Т-клеток, направленной против собственных антигенов организма. Фенотипически регуляторные Т-лимфоциты отличаются наличием маркеров CD4+CD25+FoxP3+ [Aune Т.М. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. -v.2. - p.765-774].
Повышенное содержание регуляторных Т-лимфоцитов наблюдается в лимфоцитах опухолей и дренирующих лимфоузлов опухолей, что, возможно, является одной из причин подавления Т-клеточного иммунного ответа организма на антигены опухоли. В связи с этим повышение активности и/или содержания Treg в организме может стать способом лечения ряда аутоиммунных заболеваний, осложнений, связанных с пересадкой органов и тканей, включая пересадку костного мозга, например болезни «трансплантат против хозяина». В частности, в настоящее время предложен способ лечения аутоиммунных и аллоиммунных заболеваний путем забора у больного, нуждающегося в данном лечении, лейкоцитарной массы, выделении из нее клеток с фенотипом CD4+CD25+, последующем культивировании данных клеток in vitro продолжительностью до 4-х недель с целью их размножения и обратном введении полученных клеток больному (WO 2005086781, 2004).
В качестве агентов, стимулирующих пролиферацию регуляторных Т-клеток предлагается использовать азацитидин, фактор некроза опухоли-бета, ретиноевую кислоту, трихостатин А, анти-CD3, анти-CD28, окисленный АТФ, интерлейкин-2 (WO 2009126877, 2008; WO 2009114097, 2008).
Недостатком данных стимуляторов является то, что они не являются строго избирательными стимуляторами пролиферации регуляторных Т-лимфоцитов, что вызывает необходимость в поиске более специфичного активатора пролиферации таких клеток.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является использование в качестве стимулятора цитокинов, в частности, интерлейкина-2, который вводят в культуральную среду в дозе 100 Ед/мл (WO 2005086781, 2004). Недостатком этого стимулятора является недостаточная специфичность.
Задачей, стоящей перед авторами, являлось расширение арсенала стимуляторов пролиферации регуляторных Т-клеток на пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов.
1-21
Технический результат был достигнут в результате синтеза пептида, представляющего собой N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа (SIRS), последовательность аминокислот которого представлена в приложении 1 Seq ID NO: 1, который оказался обладающим избирательным стимулирующим влиянием на пролиферацию регуляторных Т-клеток (Treg) в популяциях лимфоцитов тимуса и селезенки.
Белок SIRS (soluble immune response suppressor), полная последовательность аминокислот которого до сих пор неизвестна, представляет собой полипептид с молекулярным весом около 10-14 кДа, который продуцируется CD8+ клетками, активированными митогенами, антигеном или интерферонами (US 4771125, 1984) и обладает способностью ингибировать продукцию антител и угнетать реакцию гиперчувствительности замедленного типа in vivo [Aune T.M. et al. // J. Immunol. - 1983. - v. 131. - p.2848-2852; Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - p.765-774]. Последовательность аминокислот N-концевого участка SIRS мыши, содержащего 21 аминокислотный остаток (SIRS 1-21), установлена [Webb D.R. et al. // International Immunology. - 1990. - v.2. - р.765-774]. Информация о возможности использования SIRS или его фрагментов в качестве стимуляторов пролиферации клеток Treg в просмотренной литературе не найдена.
В ходе проведенных исследований авторами было установлено, что пептид SIRS 1-21 при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+ клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток, что может быть связано с угнетением регуляторными Т-лимфоцитами пролиферации обычных лимфоцитов.
Стимуляция образования регуляторных Т-лимфоцитов осуществляется путем введения культуральную жидкость стимулятора SIRS 1-21 в концентрации 0,1-10 мкг/мл. При этом эффективность воздействия повышается при одновременном введении в систему интерлейкина-1-бета в дозе 100-300 пг/мл.
Сущность и преимущества заявляемой группы изобретений иллюстрируются следующими примерами.
1-21
Пример 1. Химический синтез N-концевого фрагмента SIRS (SIRS)
1-21
Синтез пептида SIRS проводили твёрдофазным способом на синтезаторе Vega Coupler 250 по методу in situ с использованием Nα-Boc-защищённых производных аминокислот. В работе были использованы следующие производные аминокислот Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asn(Trt)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH, Boc-Met-OH, Boc-Asp(OcHex)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH. Исходным аминоацил-полимером служил Boc-Ser(Bzl)-PAM с удельной емкостью 0,64 мМол/грамм.
Деблокирование временной трет-бутилоксикарбонильной защиты проводили 50% трифторуксусной кислотой (TFA) в хлористом метилене (DCM). Реакции конденсации проводили в диметилформамиде (DMF). Нейтрализацию при первой конденсации осуществляли путем добавления трехкратного избытка диизопропилэтиламина (DIPEA) непосредственно в реакционную смесь на стадии присоединения аминокислотного остатка; повторную конденсацию проводили после дополнительной промывки пептидил-полимера 10% раствором DIPEA в DMF. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом активированных эфиров, полученных из соответствующих производных аминокислот с помощью диизопропил-карбодиимида, используя 5-кратные избытки реагентов в DMF. Смесь производных аминокислот готовили непосредственно перед внесением в реакционный сосуд. Контроль полноты реакции конденсации проводили с помощью нингидринового и бромфенолового тестов.
После завершения наращивания пептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали 50% TFA два раза по 1 минуте, промывали DCM и диэтиловым эфиром, извлекали из реактора и сушили до постоянного веса.
Отщепление пептида от полимера и удаление боковых защитных группировок проводили с помощью жидкого фтористого водорода по Snl механизму в присутствии скавенджеров.
Выделенный грубый продукт подвергался очистке методом полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ на колонке Waters Prep Nova-Pak HR С-18, 6ц, 60Å, 19×300 mm (детекция при 220 нм).
Фракцию, соответствующую пику основного продукта, после лиофильной сушки подвергали масс-спектральному и ВЭЖХ-анализам.
+
По данным MALDI-TOF-спектрометрии молекулярная масса пептида (М+Н) - 2281. Теоретическая молекулярная масса в расчете на свободный пептид - 2280,38.
1-21
Содержание основного вещества, пептида SIRS составило более 95% по данным ВЭЖХ.
1-21
Пример 2. Влияние SIRS на пролиферацию спленоцитов
1-21
5
Пептид SIRS разводили в среде RPMI-1640 с 1% эмбриональной сыворотки теленка в концентрации 1 мг/мл, далее готовили последовательные разведения и вносили в лунки 96-лу ночного плоскодонного планшета по 50 мкл на лунку. Далее в лунки вносили суспензию спленоцитов в 100 мкл среды RPMI-1640, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ТЭС), по 3×10 клеток на лунку. Постановка теста осуществлялась не менее чем в 4 параллелях для каждой экспериментальной точки.
2
3
Платы помещали в СО-инкубатор и инкубировали при 37°С в условиях абсолютной влажности. Через 48 ч от начала инкубации в культуры клеток вносили H-тимидин (Изотоп, Санкт-Петербург) в конечной концентрации 5 мкКю/мл. Через сутки клетки переносили на стекловолоконные фильтры с помощью харвестера FilterMate 96 (Perkin-Elmer) и определяли интенсивность включения тимидина на планшетном β-счетчике MicroBeta TriLux 1450 (Perkin-Elmer).
Результаты, выраженные в количестве Н3-тимидина, включенного в кислотонерастворимый осадок (имп/мин) представлены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние пептида SIRS<sub>1-21</sub> на пролиферацию спленоцитов мыши in vitro
SIRS<sub>1-21</sub>, мкг/мл
Интенсивность пролиферации спленоцитов (имп/мин)
10
8319±387
1
7306±715
0,1
7019±386*
0,01
8416±1132
0 (контроль)
8305±1254
1-21
Анализ полученных результатов указывают на слабое угнетение пролиферации спленоцитов в присутствии 0,1 мкг/мл исследуемого пептида. Более низкие и более высокие концентрации SIRS в течение исследуемого периода времени (1 сутки) влияния на пролиферацию спленоцитов не оказывали.
1-21
Пример 3. Оценка влияния пептида SIRS на пролиферацию регуляторных Т-клеток in vitro.
В ходе эксперимента исходили из того, что цитофлюориметрически регуляторные Т-клетки могут быть идентифицированы так CD4+ CD25+ лимфоциты, экспрессирующие также транскрипционный фактор FoxP3.
1-21
Тимоциты или спленоциты мыши инкубировали с пептидом SIRS в присутствии 100-300 пг/мл рекомбинантного ИЛ-1β или без него в течение 3 суток. Для определения процента регуляторных Т-клеток в суспензии тимоцитов и спленоцитов клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8 и CD25, а также к внутриклеточному маркеру FoxP3. Использовали антитела к антигенам мыши производства eBioscience: анти-РохР3-FITC (клон FJK-16s), анти-CD4-РЕ (клон GK1.5), анти-CD25-РЕ-Cy5 (клон РС61.5), анти-CD8a-РЕ-Cy5 (клон 53-6.7). Для окрашивания антителами к FoxP3 пользовались набором Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience) по инструкции изготовителя. Анализ экспрессии соответсвующих маркеров проводили в трехцветном режиме на цитофлюориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние SIRS<sub>1-25</sub> на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток в культивируемых тимоцитах и спленоцитах мыши
SIRS<sub>1-21</sub>, мкг/мл
Содержание CD4+CD25+FoxP3+ клеток (%)
Тимоциты
Спленоциты
Без ИЛ-1β
С ИЛ-1β
3 пг/мл
Без ИЛ-1β
С ИЛ-1β
3 пг/мл
100
200
300
100
200
300
0
0,43
0,38
0,38
0,37
2,4
2,5
2,8
2,7
0,1
0,48
0,50
0,50
0,54
3,0
3,0
3,0
3,4
16,5
0,63
0,77
0,85
0,79
7,37
5,4
5,56
5,1
40
0,48
0,83
0,92
0,88
7,39
5,52
5,58
5,55
50
0,41
0,90
0,99
0,95
7,39
5,58
5,61
5,60
1-21
Из таблицы 2 видно, что лучшие результаты достигаются при инкубации клеток в присутствии 16,5 мкг/мл SIRS. При этом наблюдается 1,5-2-кратное увеличение содержания CD4+CD25+FoxP3+ в суспензии тимоцитов и 2-3-кратное увеличение содержания клеток этого фенотипа в суспензии спленоцитов.
1-21
1-21
Для тимоцитов эффект SIRS на содержание CD4+CD25+FoxP3+клеток более выражен на фоне ИЛ-1β, который сам на содержание данных клеток в популяции тимоцитов практически не влияет. Таким образом, SIRS стимулирует пролиферацию Treg в популяциях тимоцитов и спленоцитов, в том числе в присутствии в среде культивирования ИЛ-1β.
1-21
Из приведенных выше данных следует, что пептид SIRS при культивировании популяции клеток, содержащих Т-лимфоциты, избирательно стимулирует пролиферацию регуляторных Т-лимфоцитов (Treg, CD4+CD25+FoxP3+клеток), практически не оказывая влияния на пролиферацию общей популяции клеток.
Указанное свойство делает данный пептид перспективным для размножения ex vivo регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от больного, страдающего от аутоиммунного заболевания, связанного с хроническим воспалением, например, больного ревматоидным артритом, псориазом и псориатрическим артритом, диабетом 1-го типа, аутоиммунным тироидитом (болезнь Хашимото), язвенным колитом, болезнью Крона, грануломатозным васкулитом, саркоидозом, склеродермией, множественным склерозом, системным склерозом, гломерулонефритом аутоиммунной природы и другими подобными заболеваниями, при отторжении трансплантата, болезни «трансплантат против хозяина», с целью последующего введения полученных Т-регуляторных Т-лимфоцитов данному больному для лечения вышеперечисленных заболеваний и патологических состояний.