Влияние даларгина на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии

78

Известия ДГПУ, №2, 2010

• • •

ей меди в речной воде. Этим параметром является среднее значение, рассчитанное после зачистки массива от асимметрии, то есть именно тот параметр, который мы рекомендуем использовать в качестве фона при данном характере загрязнения акватории.

По нашему мнению, чем больше «свободы» свойственно динамике загрязнения, тем больше оно зависит от местных процессов и тем меньше - от внешних источников. Тогда, следуя определению фоновой концентрации, данному нами, для загрязнения, целиком определяемого внешними источниками, в качестве фона можно рекомендовать среднюю концентрацию. Соответственно для загрязнения, на уровень которого на-

Примечания

чинают влиять местные процессы, в качестве фона лучше подходит медиана. Для последнего типа динамики загрязнения, на наш взгляд, лучшим фоном было бы среднее значение, рассчитанное после зачистки массива от асимметрии.

Таковы вкратце результаты первого этапа наших исследований. Они убедили нас, что способы определения фоновой концентрации, объективно отражающей загрязнение акватории из внешних источников, можно найти, если к тому приложить усилия. А это значит, что научный подход может прийти на смену спекуляциям при нормировании сбросов загрязняющих веществ в морскую среду.

1. ГОСТ 17.2.1.03-84. Охрана природы. Атмосфера. Термины и определения контроля загрязнения. 2. Исидоров В. А. Введение в химическую экотоксикологию. СПб. : Химиздат, 1999. 144 с. 3. Опекунов А. Ю. Экологическое нормирование и оценка воздействия на окружающую среду: Учебное пособие. СПб. : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2006. 261 с. 4. РД 52.24.622-2001. Проведение расчетов фоновых концентраций химических веществ в воде водотоков. 5. Реймерс Н. Ф. Природопользование. Словарь-справочник. М. : Мысль, 1990. 639 с. 6. Современный толковый словарь русского языка // под ред. T. Н. Ефремовой. T. 3. М. : Изд-во «АСТ», 2006. 976 с.

Статья поступила в редакцию 23.04.2010 г.

Исследования выполнены в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. Государственный контракт № П1285.

УДК 577.352.3

ВЛИЯНИЕ ДАЛАРГИНА НА АКТИВНОСТЬ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ МЕМБРАН СИНАПТОСОМ ИЗ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ

©гою Мохаммед М.Т., Кличханов Н.К.

Дагестанский государственный университет

Исследовано влияние даларгина на активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии. Ишемия, вызванная путем окклюзии двух сонных артерий, приводит к ингибированию активности фермента. Степень снижения активности АХЭ зависела от длительности ишемии (30, 60, 90 мин). В период реперфузии (60 и

Естественные и точные науки

• • •

79

90 мин), после 60 мин ишемии, активность АХЭ возрастает относительно ишемического уровня. Внутрибрюшинное введение даларгина за 30 мин до ишемии в дозе 0, 5 мг/кг, но не в дозе 0, 1 мг/кг, частично предотвращает ингибирование фермента при ишемии.

The author of the article studied the dalargin influence upon the activity acetylcholinesterase (AChE) in the cerebral cortex synaptosomal membrane of rats with ischemia and reperfusion. Ischemia caused by the occlusion of the two carotid arteries, leads to the inhibition of the enzyme activity. The degree of decrease in the activity of AChE depends on the duration of ischemia (30, 60, 90 min). During the reperfusion (60 and 90 min), after 60 min of ischemia, the activity AChE increases relative to the ischemic level. The intraperitoneal introduction of the dalargin (30 min) before ischemia with the dose of 0,5 mg/kg, but not with the dose of 0,1 mg/kg, prevents the inhibition of the enzyme during ischemia.

Ключевые слова: мозг крысы, ишемия, синаптические мембраны, ацетилхолинэстераза, даларгин.

Keywords: rat brain, ischemia, synaptic membranes, acetylcholinesterase, dalargin.

Метаболические процессы в мозговой ткани отличаются высокой степенью зависимости от насыщения кислородом. Мозг использует для этих целей 1/5 часть поступающего в организм кислорода и из-за его строгого аэробного метаболизма глюкозы он полностью зависит от адекватного артериального кровотока [8]. Поэтому нарушение кровоснабжения мозга даже на короткий промежуток времени может привести к повреждению клеток или их смерти. Ишемия является одним из наиболее распространенных вариантов циркуляторной гипоксии головного мозга, которая развивается при нарушении проходимости сосудов вследствие их тромбоза, тромбоэмболии и других причин. При изменении мозгового кровообращения, потребление кислорода в зоне ишемии резко сокращается, что вызывает повреждение нейронов [14].

Ацетилхолинэстераза (АХЭ) является одним из основных компонентов холинергической системы в центральной и периферической нервной системе. АХЭ нейронов головного мозга расположена на внешней поверхности постсинаптической мембраны холинергических синапсов, где регулирует временной профиль

концентрации медиатора ацетилхолина в синаптической щели [19]. Установлено, что повреждение нейронов, связанное с ишемией, сопровождается изменениями в холинергической системе. Так, после окклюзии средней мозговой артерии, широко признанной модели для изучения ишемии мозга, происходит дисфункция холинергического пути между фронтальной корой и базальным ядром Мейнерта [12]. Однако нет единого мнения относительно того, как влияет ишемия на активность АХЭ в мозге. По данным различных авторов, уровень активности АХЭ в спинном мозге и различных областях головного мозга при ишемии уменьшался, увеличивался, либо оставался неизменным [13]. Поэтому представляет интерес исследование зависимости активности АХЭ мозга от длительности ишемии и последующей реперфузии.

D-Ala2, Leu5, Агд6-энкефалин (даларгин) является синтетическим аналогом лей-энкефалина. В экспериментах на животных с острой ишемией миокарда, вызванной окклюзией коронарной артерии, получены данные о благоприятном действии даларгина [5]. Даларгин оказывает противоишемическое действие

80

Известия ДГПУ, №2, 2010

при снижении перфузионного давления в системе кровоснабжения мозга при реконструктивных операциях на сонных и позвоночных артериях мозга [1]. В этой связи нами исследовано влияние ишемии различной длительности и последующей реперфузии на активность АХЭ мембран си-наптосом из коры головного мозга крыс, а также роль опиоидного нейропептида даларгина в защите фермента от ишемического повреждения.

Методика исследования

Опыты выполнены на 46 белых крысах-самцах Вистар, массой 200230 г. Экспериментальную ишемию головного мозга вызывали окклюзией двух сонных артерий в течение 30, 60 и 90 мин. У части животных после 60 минутной окклюзии двух сонных артерий моделировали реперфузию путем снятия лигатуры. Продолжительность реперфузии составила 60 и 90 минут. У животных контрольной группы воспроизводилась наркотизация, кожный разрез и выделение артерий без последующей перевязки сосудов. Все хирургические процедуры проводили под наркозом (внутрибрюшное введение тиопентала натрия в дозе 4-50 мг/кг). В период ишемии и реперфузии температура тела животного поддерживали на нормальном уровне (37°С).

Фармакопейный препарат далар-гин (НПО «Микроген») вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 и 0,5 мг/кг за 30 мин до наложения лигатуры на сонные артерии. Контрольным (ложнооперированным) животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Животных декапитировали. Извлекали мозг, на холоде отделяли кору мозга и готовили 10%-ый гомогенат в 0.32 М сахарозе, приготовленной на 50 мМ трис-HCI буфере, pH 7.4. Синаптосомы выделяли по методу Хайеша [11]. Для этого полученный гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 2°С и 1000 д. Супернатант центрифугировали в течение 20 мин при 2°С и 20000 д. Осадок ресуспендировали в 3 мл

среды выделения, наслаивали на 0.8 М раствор сахарозы и центрифугировали течение 20 мин при 2°С и 20000 g на центрифуге MR 23i, ротор AM 10.17. Суспензию синаптосом в 0.8 М сахарозе отбирали дозатором и разбавляли до концентрации сахарозы 0.32 М. Затем синаптосомы осаждали центрифугированием течение 30 мин при 2°С и 20000 д. Для получения синаптических мембран синаптосомы подвергали осмотическому шоку в дистиллированной воде в течение 1 часа. Синаптические мембраны осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 2°С и 20000 д. Осадок ресуспендировали в дистиллированной воде и хранили в замороженном состоянии. Определение фермента проводили на следующий день.

Активность АХЭ определяли методом Эллмана с сотр. [9] с ацетил-тиохолином (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата (концентрация 0.5 мМ) при температуре инкубации 37°С в 0.1 М фосфатном буфере pH 8.0. Белок во фракции синаптических мембран определяли по методу Лоури. Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с применением t критерия Стьюдента с помощью прикладных программ «Statistica». Данные в таблицах приведены в виде среднее ± ошибка среднего.

Результаты исследования

В таблице представлены данные по влиянию ишемии и реперфузии на активность АХЭ синаптических мембран мозга крыс. Как видно, ишемия снижает активность фермента, причем степень торможения активности АХЭ зависит от длительности окклюзии сонных артерий. Через 30 мин ишемии активность АХЭ снижается на 20,5%, через 60 мин - на 28,3%, через 90 мин - на 39,7% относительно контроля (ложнооперированные животные).

Таблица

Влияние ишемии и реперфузии на активность ацетилхолинэстеразы мембран синаптосом мозга крыс

Естественные и точные науки • • •

81

Условия эксперимента П родолжител ьность ишемии и реперфузии, мин Активность АХЭ, мкмоль/мг/ч

Контроль - 46,68±0,67

Ишемия 30 37,10±0,59*

60 33,45± 1,20*

90 28,14±0,86*

Реперфузия после 60 мин ишемии 60 38,14±0,53*#

90 40,95±0,47*#

Примечание: * - достоверные

(р<0.001) различия относительно контроля, # - (р<0.001) - относительно ишемии 60 мин.

Реперфузия мозга после 60 мин его ишемии сопровождается достоверным повышением активности АХЭ относительно значений в ишемизированном мозге без реперфузии. Активность фермента через 60 мин реперфузии выросла на 14%, а через 90 мин - на 22,4% по сравнению с его активностью при ишемии. Хотя активность АХЭ в ближайшем постишемическом периоде и увеличивается, но все же остается ниже контроля.

50 -45 --

мкмоль/мг/ч i

ИбО РбО Р90

Рис. Влияние даларгина на активность АХЭ (ось ординат) мембран головного мозга при ишемии (светлые столбики) и реперфузии (штрихованные столбики). И60 - ишемия 60 мин; Р60 и Р90 - реперфузия мозга в течение 60 и 90 мин после ишемии 60 мин

Данные по изучению защитного действия даларгина при ишемии приведены на рисунке. Введение да-

ларгина в дозе 0, 1 мг/кг за 30 мин до ишемии не оказало влияние на активность АХЭ после 60 мин ишемии. В дозе 0, 5 мг/кг активность фермента после 60 мин ишемии на 9,6% выше, чем при ишемии без введения пептида. В период реперфузии активность АХЭ на фоне даларгина выше по сравнению с реперфузией без введения пептида. Рост активности АХЭ при этом составляет через 60 мин реперфузии 8,5%, а через 90 мин реперфузии - 7,8% (р<0.01).

Таким образом, даларгин в дозе, проникающей в головной мозг, частично защищает АХЭ синаптических мембран от ишемического повреждения.

Обсуждение результатов

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что даже кратковременная ишемия (30 мин) сопровождается достоверным снижением активности АХЭ мембран синаптосом. Оказалось, что падение активности АХЭ прямо зависит от длительности ишемии.

Каковы же причины снижения активности фермента при ишемии?

Известно, что как глобальная, так и локальная ишемия мозга приводит к стимулированию процессов образования активных форм кислорода [7], которые участвуют в окислительной модификации липидов и белков мембран. При этом нейроны могут быть особенно уязвимы для свободных радикалов, так как они содержат низкий уровень восстановленного глутатиона [15]. Исходя из этих данных можно предположить, что ингибирование АХЭ, обнаруженное нами при ишемии, является результатом окислительной модификации фермента под действием активных форм кислорода. Это предположение кажется более вероятным, поскольку установлено, что 02 и ОН' ингибируют очищенную и связанную с мембраной АХЭ [18], а антиоксиданты защищают ее от окислительного повреждения [17].

Поскольку активность АХЭ в период реперфузии повышается, можно предположить, что ингибирование

82

Известия ДГПУ, №2, 2010

фермента при ишемии частично имеет обратимый характер.

Срочная регуляция активности фермента, скорее всего, осуществляется посредством химической модификации. Например, это могло бы быть изменение редокс-состояния тиоловых групп или фосфорилирование/ дефосфорилирование ферментного белка. Исследование показали, что фосфорилирование увеличивает активность АХЭ в несколько раз, при этом константа Михаэлиса (Кт) не изменяется [10].

Введение даларгина показало, что доза 0,5 мг/кг, в отличие от 0,1 мг/кг, предупреждает ингибирование АХЭ синаптических мембран как во время ишемии, так и в период реперфузии. Это согласуется с тем, что у крыс даларгин проникает в головной мозг в дозах, превышающих 0,5 мг/кг, а в дозе 0,1 мг/кг оказывает только периферические эффекты [3].

В связи с полученными нами результатами интерес представляют данные литературы о влиянии даларгина на сердечно-сосудистую систему. Так, внутривенное введение даларгина вызывало увеличение частоты сердечных сокращений как у человека (25-100 мкг/кг), так и у крыс (100 мкг/кг), снижение удельного периферического сопротивления, оказывало венодилятирующее действие, а также уменьшало потребление кислорода организмом [4]. Исходя из этих данных, можно предположить, что благоприятный эффект даларгина при ишемии связан как со снижением потребности клеток мозга в кислороде, так и с улучшением кровоснабжения мозга за счет интенсификации коллатерального кровотока благодаря сосудорасширяющему эффекту пептида. Благоприятный эффект даларгина

Примечания

• • •

при ишемии может быть связан также с влиянием пептида на свободнорадикальные процессы в мозге. Показано, что пептид при внутривенном введении способен снижать активность ксантиноксидазы мозга [2], катализирующей образование супероксидани-онрадикала и пероксида водорода.

Ранее нами было исследовано влияние введения даларгина на активность другого важнейшего фермента синаптических мембран - Na, К-АТФазу при ишемии и реперфузии мозга [6]. В отличие от АХЭ, даларгин более эффективно защищает Na, К-АТФазу от ингибирования при ишемии и реперфузии мозга. Эти два фермента различаются между собой характером локализации на мембране: Na, К-АТФаза является трансмембранным ферментом, а АХЭ -эктоферментом. Биологические эффекты даларгина опосредованы через ц и 8 опиатные рецепторы, относящиеся к семейству G-белок-сопряженных рецепторов и расположенные на пре- и постсинаптических мембранах нейронов [4]. Исходя из этого, можно предположить, что различия в степени защиты этих ферментов даларгином при ишемии связаны с особенностями их локализации на синаптической мембране и доступностью для процессов, запускаемых нейропептидом.

Таким образом, ишемия, в зависимости от ее длительности, приводит к ингибированию активности АХЭ мембран синаптосом. В период реперфузии активность фермента восстанавливается. Внутрибрюшинное введение даларгина до ишемии в дозе 0,5 мг/кг частично предотвращает ингибирование фермента при ишемии.

1. Казанцев В. В., АуцикА. А., Тюлькин О. Н. Сосудистые заболевания головного и спинного мозга / под ред. А. Ю. Савченко. Омск: Изд-во ОмГПУ, 2000. С. 30-34. 2. Короткина Р. Н., Шлозников Б. М., Донич С. Г., Гребенчиков О. А., Ситников А. В., Карелин А. А. Изучение активности ксантиноксидазы в ткани головного мозга на фоне миоплегии // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. T. 59. N° 2. С. 145146. 3. Лишманов Ю. Б., Маслов Л. Н., Райс К. Проницаемость гематоэнцефалического барьера для лигандов опиоидных рецепторов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002. T. 65. № 4. С. 71-77. 4. Маслов Л. В., Лишманов Ю. Б., Лопотухин Э. Ю. Даларгин - это пептидный агонист

Естественные и точные науки

• • •

83

[j- и 5-опиоидных рецепторов // Клинич. фармакол. и терапия. 2004. № 4. С. 47-52. 5. Маслов Л. М., Лишманов Ю. Б., Гросс Г. Дж., Стефано Дж. Феномен повышенной устойчивости сердца к аритмоген-ному действию ишемии и реперфузии при активации периферических опиатных рецепторов // Вестник аритмол. 2002. № 26. С. 77-90. 6. Мохаммед М. Т., Кличханов Н. К. Влияние даларгина на активность Na, К-АТФазы мембран синаптосом из коры головного мозга крыс при ишемии и реперфузии // «Биология - наука XXI века». Об. тез. 13-ой Междун. Пущинской школы-конф. молодых ученых. Пущино, 2009. С. 76. 7. Adibhatla R. М., Hatcher J. F. Phospholipase А2, reactive oxygen species, and lipid peroxidation in cerebral ischemia // Free Radical Biol. Med. 2006. V. 40. P. 376-387. 8. Ames A. CNS energy metabolism as related to function // Brain Research Rev. 2000. V. 34. P. 42-68. 9. Ellman Y. L., Courtney K. D., Andres V. J., Feathestone R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. V. 7. N. 1. P. 88-95. 10. Grifman M., Arbela A., Ginzberg D., Glick D., Elgavish S., Shaanan B., Soreq H. In vitro phosphorylation of acetylcholinesterase at non-consensus protein kinase A sites enhances the rate of acetylcholine hydrolysis // Molec. Brain Res. 1997. V. 51. P. 179-187. 11. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. V. 93. N. 3. P. 485-489.12. Kataoka K., Hayakawa T., Kuroda R., Yuguchi T., Yamada K. Cholinergic deafferentation after focal cerebral infarct in rats // Stroke. 1991. V. 22. P. 1291-1296. 13. Saez-Valero J., Gonzalez-Garcia С, Cena V. Acetylcholinesterase activity and molecular isoform distribution are altered after focal cerebral ischemia // Mol. Brain Res. 2003. V. 117. P. 240-244. 14. Sims N. R., Zaidan E. Biochemical changes associated with selective neuronal death following short-term cerebral ischemia // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1995. V. 27. P. 531-550. 15. Smith M. A.; Sayre L. M.; Monnie V. M.; Peiry G. Radical AGEing in Alzheimer's disease// Trends Neurosci. 1995. V. 18. P. 172-176. 16. Sugawara T., Chan P. H. Reactive oxygen radicals and pathogenesis of neuronal death after cerebral ischemia // Antioxid. Redox. Signal. 2003. V. 5. P. 597-607.17. Tsakiris S., Angelo-gianni P., Schulpis К. H., Stavridis J. C. Protective effect of L-phenylalanine on rat brain acetylcholinesterase inhibition induced by free radicals // Clin. Biochem. 2000. V. 33. P. 103-106. 18. Weiner L., Krei-mer D., Roth E., Silman I. Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a moltenglobule-like state // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 198. N. 3. P. 915-922. 19. Zimmerman G., Soreq H. Termination and beyond: acetylcholinesterase as a modulator of synaptic transmission // Cell Tissue Res. 2006. V. 326. P. 655-669.

Статья поступила в редакцию 27.04.2010 г.