Реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены, гуморальные факторы иммунитета и патоморфологическая характеристика операционного материала женщин со злокачественными новообразованиями и с дисплазией генитальной сферы

Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 4-5, стр. 513-518 © 2007, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

РЕАКЦИЯ

МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК НА ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫЕ АНТИГЕНЫ, ГУМОРАЛЬНЫЕ

факторы иммунитета и патоморфологическая характеристика операционного

МАТЕРИАЛА женщин

со злокачественными

новообразованиями

и с дисплазией генитальной

сфЕРЫ

Аутеншлюс А.И., Лыков А.П., Шкунов А.Н., Вараксин Н.А., Морозов Д.В., Прохожев В.Б., Михайлова Е.С.,

Кретинин Г.А., Красильников С.Э.

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск

Резюме. Изучен характер реакции мононуклеарных клеток крови у женщин с патологией генитальной сферы на фетальные протеины, проведено сопоставление значений реакции с уровнями про-и противовоспалительных факторов иммунитета и с патогистологической картиной злокачественных новообразований и дисплазий эпителия шейки матки. Показано, что в тех случаях, когда происходит увеличение не менее чем на 15% количества CD8+ лимфоцитов после инкубации мононуклеаров с фетальными протеинами (позитивная реакция) по сравнению с контролем и отмечаются более высокие уровни антител к TNFa и IFNy, опухоль характеризуется более низкой степенью злокачественности. Позитивная реакция мононуклеаров на фетальные протеины, сопряженная с повышенными уровнями IFNy и антител к TNFa, выявляется при II-III степенях дисплазии эпителия шейки матки. Делается заключение о возможности использования показателей реакции мононуклеаров на фетальные протеины для определения степени злокачественности опухоли генитальной сферы женщин и степени тяжести дисрегенераторных процессов в эпителии шейки матки.

Ключевые слова: мононуклеары, антигены, цитокины, антитела, рак, дисплазия.

Тел.: (383) 226-94-83, доп. 129.

Факс: (383) 278-18-75.

Адрес для переписки:

Аутеншлюс Александр Исаевич 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2,

ГУ НИИ МББ СО РАМН,

лаборатория физико-химической индикации

иммунных процессов.

513

Аутеншлюс А.И. и др.

Медицинская Иммунология

AutenshlusA.I., LykovA.P., ShcunovA.N., Varaksin N.A., Morozov D.V., Prohozhev V.B., MikhayllovaE.S., Kretinin G.А., Krasillnikov S.E.

RESPONSE OF MONONUCLEAR CELLS TO CANCER-ASSOCIATED ANTIGENS, HUMORAL FACTORS OF IMMUNITY, AND PATHOHISTOLOGICAL FINDINGS IN WOMEN WITH GENITAL MALIGNANCIES CERVICAL EpITHELIAL DISpLASIA

Abstract. In vitro response of blood mononuclear cells to cancer-associated antigens was studied in women with genital pathology, and these results were compared with serum levels of pro- and anti-inflammatory factors of immunity, like as with histological features of genital cancer and cervical epithelial dysplasia. In vitro cellular response was regarded as positive, if relative amounts of CD8-positive lymphocytes increased by > 15% following incubation of blood mononuclears with cancer-associated antigens. Positive reaction and elevated serum levels of anti-TNFa and anti-IFNy antibodies were associated with lesser malignancy of tumor, as proven by histological findings in the women with genital cancer. A positive cellular reaction was associated with increased serum levels of IFNy and anti-TNFa in women with grade II-III cervical epithelial dysplasia. It is concluded about potential applicability of testing mononuclears with fetal proteins, to determine a grade of malignancy for the female genital tumors, as well as a degree of regenerative disturbances of cervical epithelium.

Введение

Образование злокачественной опухоли сопровождается целым рядом структурных и функциональных изменений, которые отличают ее от нормальной ткани. Одним из признаков, характеризующих опухоль, является экспрессия опухолеассоциированных антигенов, к которым относят и фетальные протеины (ФП).

В исследованиях, проведенных у больных раком легкого и туберкулезом легких, раком молочной железы и фиброаденоматозом, показано увеличение относительного содержания клеток, экспрессирующих CD8-антиген после инкубации мононуклеаров (МНК) крови с ФП, которое зависело от патоморфологической картины опухоли, а также от наличия дисплазии в эпителиальной ткани при хроническом инфекционно-воспалительном процессе и было сопряжено с показателями гуморальных факторов иммунитета [1-4]. Повышенный фон провоспалительных цитокинов может способствовать возникновению метаморфоз в эпителии, а через них — злокачественных новообразований [5, 7].

В продолжение вышеуказанных работ целью настоящего исследования явилось изучение характера реакции МНК на ФП и показателей гуморальных факторов иммунитета в зависимости от патоморфологической картины злокачественных новообразований и от наличия дис-регенераторных процессов в генитальной сфере женщин.

Материалы и методы

Объектом исследования служила периферическая кровь 61 женщины (средний возраст 45±1,5 лет) и операционный материал от 31 женщины. Среди больных у 19 женщин диагностировали рак (у 12 — аденокарцинома шейки и тела матки, у 7 — плоскоклеточный рак). Больные со злокачественными новообразованиями,

составившие I группу, были разделены в зависимости от реакции МНК на ФП на две подгруппы !а и I6.

12 женщин, у которых была выявлена дисплазия эпителия шейки матки — II группа (дисплазия I степени — у 5, а II и III степени — у 7) были также разделены в зависимости от реакции МНК на ФП на две подгруппы — На и Нб. 34 женщины без признаков атипии и обострения каких-либо инфекционно-воспалительных заболеваний составили группу сравнения — III группа, которая в связи с отсутствием в ней реакции МНК на ФП не была разделена. Все женщины проходили обследование и, по показаниям, лечение в Новосибирском областном онкологическом диспансере в 2006 году.

Определение относительного содержания CD8+ лимфоцитов проводили методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител серии ИКО 31 (НПЦ «Медбиоспектр», Москва), согласно прилагаемой инструкции.

В качестве опухолеассоциированных антигенов применяли ФП в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащие раковоэмбриональный антиген — 84 МЕ/мл, хорионический гонадотропин человека — 170 МЕ/мл, нейроспецифическую энолазу — 1,35 МЕ/мл, углеводные антигены: СА-19-9 - 144 МЕ/мл и СА 125 - 512 МЕ/мл, альфа-фетопротеин — 172 МЕ/мл и микроглобулин человека - 4 МЕ/мл. Оценку реакции на ФП проводили в соответствии с патентом № 2118819 по изменению относительного содержания CD8+ клеток после инкубации МНК с ФП (100 мкл, исходная концентрация белка 2,5 мг/мл) in vitro в течение 1 ч по сравнению с контрольной пробой, содержащей вместо ФП 100 мкл изотонического раствора хлорида натрия. Для подтверждения специфичности реакции параллельно инкубировали МНК с раствором бычьего сывороточного

514

2007, Т. 9, № 4-5

Реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены

альбумина по указанной выше технологии и в той же концентрации по белку.

Позитивной считалась реакция, при которой относительное содержание CD8+ лимфоцитов повышалось после инкубации МНК с ФП на 15% и более по сравнению с соответствующей контрольной пробой [1]. Во всех остальных случаях реакция считалась негативной. Пороговое значение достоверности реакции, равное 15%, превышало допустимый предел ошибки [6].

В сыворотке крови определяли содержание про- и противовоспалительных цитокинов с использованием наборов: альфа-ФНО-ИФА-Бест, ИЛ-6-ИФА-Бест, ИЛ-8-ИФА-Бест, ИЛ-1бета-ИФА-Бест, гамма-Интерферон-ИФА-Бест, ИЛ-4-ИФА-Бест и рецепторного антагониста ИЛ-1-ИФА-Бест (ЗАО «Вектор-Бест», п. Кольцово Новосибирской области). Определение уровня АТ класса G к TNFa, к IFNa (смесь различных подтипов натурального IFNa из лейкоцитов крови человека) и к IFNy, проводили также с помощью твердофазного ИФА.

После хирургического вмешательства проводили гистологическое исследование удаленного материала. Патогистологическую картину злокачественного процесса характеризовали в баллах по следующим признакам:

— граница опухоли с окружающей тканью: четкие — 1 балл, наряду с четкими границами имеются крупные участки ответвления — 2 балла, наряду с четкими границами опухолевого узла имеются мелкие тонкие тяжи — 3 балла, четкость границ отсутствует, имеется диффузный рост опухоли — 4 балла;

— опухолевые клетки в сосудах: опухолевых клеток в сосудах нет — 1 балл, наличие опухолевых клеток в сосудах сомнительно — 2 балла, единичные клетки опухоли в сосудах — 3 балла, много клеток в сосудах — 4 балла;

— инфильтрация: отсутствует — 1 балл, слабая — 2 балла, умеренная — 3 балла, выраженная — 4 балла;

— митозы в поле зрения: отсутствуют — 1 балл, единичные — 2 балла, 2-3 митоза — 3 балла, 4-5 митозов — 4 балла, 6-10 митозов — 5 баллов, более

10 митозов — 6 баллов;

— патологические митозы в поле зрения: отсутствуют — 1 балл, единичные — 2 балла, в большом количестве — 3 балла;

— клеточные элементы различной степени диф-ференцировки в опухоли (в %): высокодифференцированные (ВД), умереннодифференцированные (УД) и низкодифференцированные (НД);

— степень злокачественности: I степень — 1 балл,

11 степень — 2 балла, III степень — 3 балла;

— метастазы в регионарные лимфоузлы: нет — 1 балл, есть — 2 балла.

Дисрегенераторный процесс также был охарактеризован в баллах: дисплазия легкая — I степень — 1 балл, дисплазия умеренная — II степень — 2 балла и дисплазия тяжелая — III степень — 3 балла.

Обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних величин (M) и ошибки средней (m). Статистическая значимость различий оценивалась с помощью критерия Стью-дента, критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и точного критерия Фишера. Ранговую корреляцию определяли по Спирмену, статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statgraphics Plus. Результаты представлены в таблицах и на рисунке.

Результаты и обсуждение

При анализе значений про- и противовоспалительных факторов иммунитета было установлено, что у женщин при раке генитальной сферы определяются достоверно более высокие уровни только IL-1 в, IFNy, IL-6 и IL-1RA по сравнению с аналогичными показателями женщин III группы (табл. 1).

Изучение ответа МНК на ФП показало его неоднозначный характер у женщин со злокачественными новообразованиями, который заключался как в позитивной, так и в негативной реакции клеток крови (табл. 1 и 2).

При позитивной реакции МНК на ФП патоморфологическая картина опухоли характеризовалась более низким количеством патологических митозов в поле зрения, низким относительным содержанием низкодифференцированных и высоким — высокодифференцированных клеток в опухоли, а также более низкой степенью злокачественности. Кроме того, при позитивной реакции уровни АТ к TNFa и АТ к IFNy были достоверно более высокими по сравнению с аналогичными показателями при негативной реакции МНК на ФП, причем уровень первых был также достоверно более высоким по сравнению с аналогичным показателем III группы. При негативной реакции МНК на ФП только уровень АТ к IFNy был достоверно более низким по сравнению с III группой.

По всем остальным изучаемым показателям не обнаружено достоверных различий между группами больных раком.

Следовательно, позитивная реакция МНК на ФП сопряжена как с более высоким уровнем АТ к провоспалительным цитокинам, хотя по содержанию самих цитокинов не было получено каких-либо различий в зависимости от характера реакции МНК на ФП при раке генитальной сферы, так и с меньшей степенью злокачественности новообразования.

515

Аутеншлюс А.И. и др.

Медицинская Иммунология

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА У ОБСЛЕДОВАННЫХ ГРУПП

Группы IL-1P

I. больные со злокачественными новообразованиями (n = 19) из них: 123,0±15,6 Pi-iii < 0,042 26,9±11,1 Pi-iii < 0,046 50,6±10,0 Pi-iii < 0,027 556,8±116,0 Р|-Ш < 0,007 0,69±0,06 0,49±0,04 Pi-iii < 0,05

!а. больные с позитивной реакцией МНК на ФП (n = 8) 138,6±30,9 16,5±6,3 Р1а-111 < 0,049 41,5±18,1 667,2±245,9 0,80±0,09 Р 1а-111 < 0,037 Р|а-1б < 0,034 0,56±0,06 Р1а-1б < 0,05

I6. больные с негативной реакцией МНК на ФП (n = 11) 109,2±17,4 34,4±19,8 58,7±50,3 458,6±108,9 0,59±0,07 0,43±0,04

III. группа сравнения (n = 34) 77,8±5,1 3,8±0,9 13,4±5,4 458,1±81,1 0,61±0,04 0,62±0,09

Корреляционный анализ показателей при раке генитальной сферы позволил установить следующие достоверные взаимосвязи: обратную корреляционную связь степени злокачественности с относительным содержанием клеток с фенотипом CD8, с процентом их прироста после инкубации МНК с ФП (г = —0,650; p < 0,004 и г = —0,708; p < 0,0015 соответственно), с относительным содержанием в опухоли высокодифференцированных клеток (г = —0,750; p < 0,001) и прямую корреляцию с патологическими митозами (г = 0,570; p < 0,015), с относительным содержанием в опухоли низкодифференцированных клеток (г = 0,72; p < 0,01), с содержанием в крови TNFa (г = 0,482; p < 0,05) и IFNy (г = 0,650; p < 0,005).

Анализируя результаты определения про-и противовоспалительных факторов иммунитета у женщин с дисрегенераторными процессами в эпителии шейки матки следует отметить сопря-

женность их значений с реакцией МНК на ФП (табл. 3).

Так, у женщин с дисплазией при позитивной реакции МНК на ФП уровень IFNy был значительно более высоким по сравнению с группой женщин МНК, которых дали негативную реакцию на ФП, что косвенно подтверждает связь дисрегенераторных процессов с хроническим воспалением. Уровень АТ к TNFa также был более высоким у женщин при позитивной реакции МНК на ФП, а уровень АТ к IFNa был достоверно более низким, чем при негативной реакции клеток.

Позитивная реакция МНК на ФП в подавляющем большинстве случаев встречалась у женщин с дисплазией эпителия шейки матки II и III степеней, а негативная реакция отмечалась в основном при дисплазии I степени (рис.).

Как указывалось в наших предыдущих работах [3, 4], продукция организмом АТ к про-

таблица 2. показатели патогистологической картины опухолей у женщин со злокачественными новообразованиями генитальной сферы в зависимости от характера реакциии мнк на фп

Группы Патологические митозы

1а. больные с позитивной реакцией МНК на ФП (n = 8) 1,6±0,2 Р1а-1б < 0,03 2,7±0,9 Р|а-1б < 0,01 39,9±9,9 Р|а-1б < 0,04 1,9±0,1 Р1а-1б < 0,05

1б. больные с негативной реакцией МНК на ФП (n = 11) 2,1±0,1 41,2±15,9 18,5±7,5 2,3±0,1

516

2007, Т. 9, № 4-5

Реакция мононуклеарных клеток на опухолеассоциированные антигены

ТАБЛИЦА 3. ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ ИММУНИТЕТА У ЖЕНЩИН С ДИСПЛАЗИЕЙ ЭПИТЕЛИЯ ШЕЙКИ

матки в зависимости от характера реакциии мнк на фп

Группы IFNy

II. больные с дисплазией (n = 12) из них: 30,50±16,12 Pii-iii < 0,03 0,60±0,06 0,60±0,09

Па. женщины с позитивной реакцией (n = 6) 57,25±25,00 P Иа-Иб < 0,03 0,71±0,06 P Иа-Иб < 0,05 0,46±0,10 риа-иб < 0,04

Иб. женщины с негативной реакцией (n = 6) 3,75±1,60 0,53±0,06 0,71±0,11

III. группа сравнения (n = 34) 9,04±2,77 0,61±0,04 0,61±0,05

воспалительному некротизирующему фактору может быть расценена как защитный механизм, направленный на нейтрализацию его действия на опухоль (особенно при высокодифференцированном варианте рака) и на нормальные ткани. Не исключено, что это предположение можно экстраполировать и на дисрегенераторные процессы различной степени тяжести, но при условии, что на ранних этапах формирования клеточного атипизма сохраняется его более высокая дифференцировка.

Что же касается взаимосвязи дисрегенера-торного процесса с показателями патоморфологической картины, то была выявлена прямая корреляция только между степенью дисплазии и количеством митозов в различных слоях плоского эпителия (г = 0,787; p < 0,002).

% 90 80 70

£ 60

0

1 50

03

§. 40

I—

20 10 0

СТЕПЕНЬ ДИСПЛАЗИИ

И позитивная реакция МНК на ФП  негативная реакция МНК на ФП

рисунок. встречаемость (в %) позитивной и негативной реакций мононуклеаров крови на фетальные протеины у женщин с различной степенью дисплазии эпителия шейки матки

Примечание: * - достоверность различия Fisher p < 0,001.

Таким образом, позитивная реакция МНК на ФП, свидетельствующая о потенциальной способности иммунокомпетентных клеток реагировать на ОАА экспрессией CD8 антигена, являющегося маркером цитотоксических Т-лимфоцитов, сопряженная с повышенными уровнями АТ к TNFa и АТ к IFNy, может служить критерием степени злокачественности опухоли, а при сопряженности только с АТ к TNFa — критерием атипии эпителия шейки матки.

Список литературы

1. Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Столярова В.М., Михайлова Е.С. Реакция лимфоцитов и гуморальный ответ на опухолеассоциированные антигены у онкологических больных // Бюл. СО РАМН. - 1999. - № 3-4. - С. 60-63.

2. Аутеншлюс А.И., Иванова Г.Г., Сидоров С.В. Ответ лимфоцитов больных фиброаде-номатозом и раком молочной железы на опухолеассоциированные антигены in vitro // Иммунология. - 2003. - № 1. - С. 26-28.

3. Аутеншлюс А.И., Шкунов А.Н., Иванова Г.Г., Проскура А.В., Михайлова Е.С., Седова Ю.В., Кузнецова Н.Б., Морозов Д.В., Клименков А.В., Сидоров С.В. Содержание цитокинов IL-1 в, TNFa и уровни антител к TNFa у больных с онкологическими и воспалительными заболеваниями // Цитокины и воспаление. - 2005. - № 3. -С. 11-15.

4. Аутеншлюс А.И., Шкунов А.Н., Морозов Д.В. Реакция мононуклеарных клеток на фетальные протеины при предраковых состояниях // Abstracts of the congress «Immune-mediated diseases: from Theory to Therapy». - M., 2005. - С. 168.

5. Белокриницкая ТЕ., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н., Мочалова М.Н., Ломнева Г.М. Фактор некроза опухоли a и трансформирующий

517

Аутеншлюс А.И. и др.

Медицинская Иммунология

фактор роста р в регуляции апоптоза и пролиферации клеток при дисплазии и раке шейки матки // Цитокины и воспаление. — 2006. — № 1. — С. 31-33.

6. Леонова Т.Я., Степанова Е.Г. Контроль качества лабораторных исследований: Методические рекомендации для врачей-лаборантов. — Новосибирск, 1993. — 23 с.

7. Шварцбурд П.М. Хроническое воспаление повышает риск развития эпителиальных

новообразований, индуцируя предраковое микроокружение: анализ механизмов дисрегуля-ции // Вопр. онкологии. — 2006. — Т. 52, № 2. — С.137-144.

поступила в редакцию 19.03.2007 принята к печати 30.05.2007

518