Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода

ЛБ. Буравкова, А.С. Капланский, Е.Р. Андреева, М.П. Валюшкина,

Г.Н. Цурнова, В.И. Логинов, ЕБ. Анохина

ГНЦ РФ-Институт медико-биологических проблем РАН, Москва

Bone callus formation after injection of multipotent mesenchymal stromal cells cultivated under various oxygen tensions in the region of bone fracture in rats

LB, Buravkova, AS. Kaplansky, E.R. Andreeva, M.P. Valyushkina,

G.N. Durnova, V.l. Loginov, E.B. Anokhina

Cell Physiology Group and Department of Morphology of State Scientific Center of Russian Federation -Institute for Biomedical problems RAS, Moscow

Исследовано влияние введения костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) на формирование костной мозоли после экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс. Протестированы клеточные препараты ММСК, предкультивированных в условиях нормок-сии (20% 02, 5% С02, 75% и пониженного содержания кислорода (5%0г, 5% С0г, 90% Лу. Работа выполнена на 32 крысах-самцах линии Вистар, которые были разделены на 4 группы по 8 животных в каждой в зависимости от воздействия после перелома: 1 — контроль, без каких-либо дополнительных воздействий, 2 — введение в зону повреждения культуральной среды без факторов роста, 3 — введение суспензии (0,25 мл, 5x105 ММСК] клеток, культивированных в стандартных условиях, 4 — введение такого же количества ММСК, культивированных при пониженном содержании кислорода. Гистоморфо-метрический анализ костной мозоли на 14 сут. после операции продемонстрировал достоверное увеличение коэффициента утолщения в 1,2—1,3 раза у животных, которым вводили клеточные препараты, по сравнению с контролем. При этом объём костной мозоли у крыс экспериментальных групп был также в 1,3—1,4 раза больше (р<0,05). Это происходило, главным образом, за счёт увеличения объёма хряща, более выраженного при введении ММСК, культивировавшихся в условиях пониженного содержания кислорода. Таким образом, введение ММСК способствовало увеличению объёма новообразованных тканей на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе трубчатой кости у крыс.

Ключевые слова: регенерация кости, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, пониженное содержание кислорода.

The effects of bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) injection on bone callus formation after fibula fracture in rats were investigated. MMSC preliminary cultivated under normoxic (20% 02, 5% C02, 75% N^ and hypoxic (5% 02, 5% C02, 90% NJ conditions were tested. 4 groups each containing 8 Wistar male rats were used: 1 — control (spontaneous fracture repair), 2 — repair after serum-free cultivation medium injection, 3 — repair after the injection of cells (5-10B cells in 0,25 ml) cultivated in normoxic conditions, 4 — repair after the injection of cells (5x10s cells in 0,25 ml) cultivated in reduced oxygen tension. Bone callus histology analysis at day 14 after the surgery showed statistically significant 1,2—1,3 time increase in thickening coefficient in both cases of cell suspension injection compared to control. Bone callus area was 1,3—1,4 time higher (p<0,05) in both experimental groups, mainly due to an increased amount of the cartilage mass, which was more apparent in case of hypoxic MMSC injection. Spongy bone formation revealed the similar trend although the differences between groups were not statistically significant.

Thus, MMSC injection resulted in bigger amounts of newly synthesized tissues at early stages of bone callus formation after long bone fracture in rats.

Key words: bone regeneration, multipotent mesenchymal stromal cells, reduced oxygen tension.

В настоящее время, в связи со стремительным развитием клеточных подходов в регенеративной и восстановительной медицине, все больший интерес привлекает возможность получения в короткий срок достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток in vitro. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть выделены из костного мозга, являются в настоящее время наиболее востребованными для репарации различных тканевых дефектов в связи с их высокой пролиферативной активностью в условиях in vitro и способностью к остеогенной, адипогенной, хондрогенной дифференцировке и, возможно, ангиогенной активностью [1—5]. Способность ММСК к дифференцировке в остеогенном направ-

e-mail: mapy@valushkina.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

лении дала основание предполагать, что их применение при лечении переломов и повреждений больших участков костей может улучшить процесс заживления, что и было продемонстрировано в ряде исследований [6—8].

Ранее мы показали, что культивирование ММСК из костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода приводит к увеличению их пролиферативной активности и повышению устойчивости к различным повреждающим факторам [5]. В настоящей работе мы исследовали влияние введения ММСК, культивируемых при различном содержании 02, на формирование костной мозоли в области экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс.

А

Оригинальные исследования

Материал и методы

В работе использовали среду роста: —-MEM (ICN, США] с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 10% фетальной коровьей сывороки (ФКС) (Hyclone, Новая Зеландия) для культивирования клеток; 20 тМ фосфатный буфер (ФБ) (Gibco, США) для отмывки клеток; 0,02% раствор трипсина с 0,05 % ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки.

Получение и культивирование ММСК из костного мозга. Клетки выделяли из костного мозга бедренной кости 1,5 месячной крысы-самца линии Вистар, по описанной ранее методике [5]. Культивирование выделенных ММСК проводили в С02-инкубаторе в газовой смеси — 20% 02, 5% С02, 75% N2. После первого пассажа часть клеток помещали в С02—инкубатор (N-MMCK), а другую часть — в мультигазовый инкубатор, в котором поддерживалась газовая среда гипоксического состава — 5% 02, 5% С02 и 90%. I\l2 (HYP-MMCK).

В экспериментах по изучению регенеративного потенциала ММСК были использованы клетки второго пассажа.

Для анализа прироста клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (объектив х10) (Leica, Germany), снабженного цифровой видеокамерой, изображение архивировали и впоследствии в каждом флаконе анализировали 10 стационарных полей зрения площадью 1,0 мм2 каждые 24 ч, начиная с первых сут. после посадки и до момента пассирования. Клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США). Количество клеточных удвоений рассчитывали по формуле:

л = 3,32 lg(x/x0).

Иммунофенотип ММСК на втором пассаже был охарактеризован с помощью моноклональных антител к следующим маркерным молекулам: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, США), а жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).

Клеточные препараты. Для приготовления клеточных препаратов ММСК отделяли от пластика трипси-низацией, инактивировали фермент добавлением среды роста, после чего клетки ресуспендировали в необходимом количестве культуральной среды, не содержащей сыворотку. Транспортировку и хранение клеточных препаратов осуществляли на льду в течение 2—4 ч при температуре +4°С. Перед введением клеточного препарата клетки ресуспендировали и отбирали необходимую аликвоту.

Экспериментальная модель операционного перелома малой берцовой кости у крыс. В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Вистар (32 особи весом около 300 г.). Программа исследования была одобрена Комиссией ГНЦ РФ-ИМБП РАН по биомедицинской этике. Наркотизация животных осуществлялась путём введения в левую икроножную мышцу 0,1% атропина в количестве, соответствующем весу животного (согласно инструкции производителя). Затем в эту же мышцу вводили «Золитил-100» в дозе 8 мг/кг (согласно инструкции производителя). После того, как животное переставало реагировать на раздражение, его фиксировали, выстригали шерсть в зоне планируемого операционного вмешательства и трижды обрабатывали 3%

спиртовым раствором йода и 96% спиртом и проводили рассечение кожи в средней части голени [9].

Далее экспериментальные животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы проводили операционный перелом (группа П) без каких-либо последующих дополнительных воздействий. Животным 2-й группы после перелома в зону повреждения и прилежащую мышечную ткань вводили 0,25 мл среды роста без ФКС (группа П + С). Животным 3-й группы — 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5x105 1М-ММСК (группа 1М-ММСК), крысам 4-й группы — 0,25 мл среды роста без ФКС, содержащей 5x105 НУР-ММСК (группа П + НУР-ММСК). После операции раны послойно зашивали. В пред- и послеоперационный период животные содержались в стандартных условиях вивария. В периоде реабилитации подвижность животных была в пределах нормы.

Гистологический анализ. Оценку состояния костной мозоли у животных проводили через 14 сут. после оперативного вмешательства. Наркотизированных крыс де-капитировали, выделяли оперированную кость и очищали её от «мягких тканей». Отделяли зону костной мозоли и фиксировали в 4% парафармальдегиде на 0,1 М ФБ (pH 7,0—7,2) с 2,5% сахарозы при +4°С. После фиксации в течение 10 сут. проводили декальцинацию в 10% ЗДТА (pH 7,0—7,2). Затем образцы обезвоживали, заливали в гистопласт и готовили срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, то-луидиновым синим, пикрофуксином. Далее на срезах определяли объем костных мозолей, объем хрящевой ткани и объем новообразованной кости при помощи программы «МОП-ВИДЕОПЛАН», после чего рассчитывали коэффициент утолщения по формуле: диаметр костной мозоли / диаметр нативной кости.

Статистический анализ. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием Г-кри-терия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Культивирование при пониженном содержании кислорода приводило к двукратному увеличению пролиферативной активности ММСК. На 6 сут. культивирования число клеточных удвоений при пониженном содержании кислорода (5%) составляло 4,02+0,9, а в обычных условиях (20% 02) — 1,9+0,3, что согласуется с ранее полученными данными [5].

Культивируемые 1М-ММСК и Нур-ММСК различались морфологически: в культурах 1М-ММСК на первом пассаже преобладали сильно распластанные клетки, а среди НУР-ММСК было больше мелких вытянутых клеток (рис. 1). Иммунофенотипирование клеток к маркерам, специфичным для ММСК: С090 (99,8—100%), С054 (99,5-98,9%), С073 (94,70-99,8%), С044 (96,397,0%), не выявило различий между 1М-ММСК и НУР-ММСК. Те и другие клетки были негативны по ге-мопоэтическим маркерам Сй11Ь (0,39—1,25%), С045 (0,35-1,43%). Жизнеспособность 1М-ММСК и НУР-ММСК в исследуемых культурах также не отличалась и +

3,98% некротических клеток).

Визуальный осмотр костей экспериментальных животных показал, что у крыс всех 4-х групп в месте перелома произошло образование веретенообразных костных мозолей различной величины, достаточно прочно скрепляющих проксимальный и дистальный отломки костей.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

11111

III

Оригинальные исследования

Рис. 1.

ММСК крысы, культивированныепри разном содержании кислорода:

А - клетки, культивированные при 5% Ог, 5% СОг, 90% Л!3; Б - клетки, культивированные при 20% Ог, 5% С03, 75% Ы3. Фазовый контраст.

Бар - 100 мкм

Гистологическое исследование области перелома у животных контрольной и экспериментальных групп позволило установить, что консолидация костных отломков во всех случаях шло по типу вторичного заживления. Костная мозоль состояла из эндостальной части, соединяющей костные отломки и представляющей собой фиброзную ткань, и периостальной части, включающей хрящевую ткань, балки ретикулофиброзной кости и фиброзную ткань. Во всех исследуемых группах в эндостальную часть были включены дистальные и/или проксимальные отломки малоберцовой кости. В большинстве случаев отломки были смещены друг относительно друга. Балки ретикулофиброзной костной ткани располагались проксимально и дистально относительно хряща. Поверхность трабекул

покрывали остеобласты. Таким образом, на срезах во всех исследуемых группах можно было видеть участки тканей, характерных для костной мозоли (рис. 2), соотношение которых было различным в сравниваемых группах.

В группе П периостальная часть костной мозоли состояла из массива хрящевых клеток и широкопетлистой ретикулофиброзной костной ткани. На границе ретикулофиброзной кости и хряща новообразованная кость содержала большое количество сосудов и остеокластов. В центре трабекул, на границе с хрящом, наблюдались мелкие изогенные группы хрящевых клеток. Пространство между некрозированными участками кости было заполнено фиброзной тканью, врастающей со стороны эндоста (см. рис. 2А).

Рис. 2. Костный регенерат через 14 сут. после экспериментального перелома малоберцовой кости крыс:

1 - хрящевая ткань; 2 - фиброзная ткань; 3 - костные отломки малоберцовой кости;

4 - новообразованная ретикулофиброзная костная ткань;

А (группа П) - животным проводили операционный перелом [без каких либо дополнительных воздействий);

Б (группа П+С) - животным после перелома в зону повреждения и прилежащую мышечную ткань вводили 0,25 мл среды роста; В [группа Ы-ММСК) - животным вводили 0,25 мл среды роста, содержащей 5x105 клеток;

Г [группа П+Н¥Р-ММСК) - животным вводили 0,25 мл среды роста, содержащей 5x105 клеток.

Окраска: гематоксилин и эозин. Бар - 500 мкм

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

Оригинальные исследования

55

У животных группы П + С, костная мозоль в качественном отношении не отличалась от группы П, но количественные различия были довольно значительными. Размеры костной мозоли у крыс группы П + С были больше, чем у группы П, в основном за счёт увеличения объёма хрящевой части периостальной мозоли. Сосудистая сеть в этой группе была слабо развита (см. рис. 2Б).

В группе П + НУР-ММСК размеры костной мозоли у крыс были наиболее крупными по сравнению с костной мозолью животных других групп. Увеличение размеров костной мозоли происходило за счёт разрастания хрящевой ткани, в которой определялись врастающие со стороны внутренних слоёв надкостницы пучки соединительной ткани (см. рис. 2В). Кроме того, соединительная ткань обнаруживалась в толще самого хряща в виде отдельных островков. Со стороны молодой костной ткани в хрящевую ткань внедрялись пальцевидные костные отростки, которые замещали разрушающийся хрящ. На поверхности отростков наблюдались остеобласты, а между отростками — многочисленные кровеносные сосуды. В трабекулах молодой кости часто находились единичные хондроциты. Эндостальная мозоль, в основном, состояла из клеток молодой костной ткани.

У животных группы П + 1М-ММСК объём хрящевой ткани был меньше, чем у крыс группы П + НУР-ММСК. В целом костная мозоль походила на таковую у крыс группы П + НУР-ММСК и отличалась только меньшими размерами (см. рис. 2Г).

Результаты количественного гистометрического анализа костных регенератов, которые подтвердили гистологические наблюдения, представлены в таблице.

Как следует из таблицы, объем хрящевой ткани у крыс в группах П + С, П + 1М-ММСК и П + НУР-ММСК по сравнению с контрольными животными (группа П) достоверно увеличивался, что хорошо совпадает с увеличением объема костных регенератов в этих же группах животных. В группах П + 1М-ММСК и П + НУР-ММСК коэффициент утолщения превышал значения такового как по сравнению с контрольной группой П, так и группой П + С. При этом коэффициент утолщения у крыс группы П + НУР-ММСК был больше, чем у животных П + 1М-ММСК, хотя это отличие и не было статистически значимым. Что же касается объема новообразованной костной ткани, заместившей хрящевую ткань периостальной костной мозоли, то различий в сравниваемых группах не наблюдалось.

Суммируя данные гистологических и гистоморфомет-рических исследований, следует констатировать, что у крыс с переломом малоберцовой кости, которым вводили ММСК, был увеличен размер развившейся костной

мозоли, причем это увеличение было несколько больше в группе животных, которым инъецировали ММСК, выращенные в гипоксической среде.

В настоящее время возможность использования технологий клеточной и тканевой инженерии для улучшения заживления и восстановления функциональной активности ткани при различных повреждениях опорнодвигательного аппарата привлекает все больший интерес [1, 4, 8]. Поиск в этой области ведется в основном по двум направлениям: совершенствование носителей для доставки клеточного материала в область повреждения и направленное изменение свойств самих клеток, вводимых в область дефекта. Изменение свойств клеток может осуществляться как с помощью введения дополнительного генетического материала [10], так и за счет модификации свойств клеток, вызванных изменением параметров окружающей их среды [11]. Улучшение регенерации костной ткани после введения в область дефекта ММСК было продемонстрировано в ряде исследований, результаты которых обобщены в обзорах [1, 2, 8].

В нашей работе основной задачей было выяснить будут ли ММСК, культивированные в условиях различного содержания кислорода, влиять на параметры заживления костных дефектов. В связи с этим мы выбрали хорошо охарактеризованную модель экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс [9], которым непосредственно в область перелома сразу после хирургического вмешательства вводили суспензию Ы- или НУР-ММСК в малом объеме культуральной среды.

Введение ММСК экспериментальным животным при различных повреждениях, таких как острая почечная недостаточность [12], блеомицин-индуцированное повреждение легких [13], дефекты хряща [14], костнохрящевые дефекты [15] и др. приводит к улучшению различных параметров регенерации тканей. Показано, что использование в таких случаях ММСК, предварительно культивированных в гипоксической среде, усиливает эффект, по сравнению с введением нормоксических ММСК. В частности, после введения НУР-ММСК более выражены ангиотропные и васкулотропные проявления в различных моделях ишемии (ишемия нижних конечностей у мышей [15] и др.).

Ранее мы показали, что культивирование ММСК в среде с пониженным содержанием кислорода стимулирует пролиферацию этих клеток и снижает способность к остеогенной дифференцировке, что позволяет получить большее количество малодифференцированных клеток за меньшее время [5]. Мы предположили, что введение таких клеток в область костного дефекта

Гистоморфометрический анализ костных мозолей у крыс с экспериментальным переломом малоберцовой кости

Экспериментальная группа Объем костной мозоли, мм3 Объём хрящевой ткани, мм3 Объём новообразованной костной ткани, мм3 Коэффициент утолщения

П 10,3+2,3 1,1 ±0,7 5,7±1,8 3,8±0,7

П+С 12,7±3,4* 1,9±0,7* 5,8±1,6 3,6±0,6

П+Ы-ММСК 14,6±2,7* 1,9±0,8* 6,5±2,1 4,5±0,7*  **

П+НУР-ММСК 13,7+2,0* 2,4±0,5*** 6,0±1,8 5,0±1,6*  **

Примечание: * статистически значимые различия по отношению к группе П; ** - статистически значимые различия по отношению к группе П + С.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009

Оригинальные исследования

малоберцовой кости может оказаться более эффективным для регенерации костного дефекта, чем введение ММСК, культивированных общепринятым методом при 20% 02. Такой эффект мог бы быть обусловлен более быстрым увеличением клеточной массы за счет пролиферации и более активного участия клеток в регенерации из-за того, что их коммитирование может быть замедлено. Однако, через 14 сут. после операции стимулирующее влияние на регенерацию малоберцовой кости крыс двух сравниваемых клеточных препаратов достоверно не различалось, хотя выявлена тенденция к более выраженным эффектам после введения НУР-ММСК.

Таким образом, проведенное нами исследование продемонстрировало эффективность введения суспензии ММСК, предварительная экспансия которых проведена in vitro в условиях различного содержания кислорода, для улучшения формирования костно-хрящевого регенерата на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе малоберцовой кости у крыс. Однако, вопрос о том, как повлияет введение ММСК на поздние этапы регенерации при переломе трубчатых костей, является предметом дальнейшего изучения.

Работа выполнена при поддержке контракта № 02.522.11.2006/05 с Роснаукой.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Prockop D.J. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. J. Cell Biol. 2003; 160(B): 807—809.

2. Bianco P., Riminucci М., Grothos S. et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential application. Stem Cells 2001; 19: 180-192.

3. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J. Cell Physiol. 2001; 187 [3]: 345— 55.

4. Davani S., Marandin A., Mersin N. et al. Mesenchymal progenitor cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density and improve heart function in a rat cellular cardiomyoplasty model. Circul. 2003; 108t10]: 253-8.

5. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2007; 143(41: 386-9.

6. Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др. Влияние сингенных мезенхимальных стволовых клеток на восстановление костной ткани у крыс при имплантации деминерализованного костного матрикса. Цитология 2005; 47Ш): 466—77.

7. Фатхудинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Пулин А.А. и др. Особенности репаративного остеогенеза при транстплантации мезенхимальных стволовых клеток. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005; 140С7]: 109-13.

8. Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю., Тихилов P.M. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2 [41: 18—30.

9. Дурнова Г.И., Логинов В.И., Капланский А.С. Заживление перелома малоберцовой кости у крыс при длительном вывешивании. Авиакосм, и эколог, мед. 2002; 36C3): 52—5.

10. Tsuchida Н., Hashimoto J., Crawford Е. et al. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Orthop. Res. 2003; 2(11: 44-53.

11. Hu X., Yu S.P., Fraser J.L. et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 135(41: 799—808.

12. Morigi I.M, Imberti B., Zoja C. et al. Mesenchymal stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 1794—804.

13. Rojas М., Xu J., Woods Ch. R. et al. Bone Marrow—Derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 33: 145-52.

14. Ponticiello M.S., Shingle R.M., Kadiyala S. et al. Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 52C2]: 246—55.

15. Im G.-I., Kim D.-Y., Shin J.-H. et al. Repair of cartilage defect in the rabbit with cultured mesenchymal stem cells from bone marrow. J. Bone Joint Surg. [Br] 2001; 83-B: 289—94.

Поступила 30.03.2009

КОММЕНТАРИЙ

П.В. Кругляков

кандидат биологических наук заместитель генерального директора ООО «Транс Технологии»

Сегодня необычайно актуальны вопросы, относящиеся к биотехнологическому аспекту клеточной терапии, в том числе к культивированию стволовых клеток (СК),

и, в частности, к возможности с помощью изменений условий культивирования повлиять на свойства клеток и на результаты их трансплантации при различных патологиях. Скорее всего, это связано с ограниченностью спектра «инструментов» клеточной терапии (несмотря на активное изучение СК, полученных как из фетальных, так и из самых разных тканей взрослого организма, следует признать, что наиболее перспективными с точки зрения клинического использования остаются гемопоэ-

тические стволовые клетки и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга) на фоне огромного разнообразия заболеваний, при которых пытаются с различной степенью успешности применять СК.

В настоящее время эти вопросы привлекают внимание сотен исследователей по всему миру. Должен отметить, что на протяжении последних десяти лет попытки предифференцировки клеток в культуре для улучшения результатов последующей трансплантации предпринимались в основном в отношении эмбриональных стволовых клеток [1, 2], и гораздо реже — при работе с другими типами СК [3].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009

I I I I I I I -ф- I   игл

Оригинальные исследования

В статьях Л.Б. Буравковой и соавт. «Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода» и А.П. Жамбаловой и соавт. «Влияние пониженного содержания кислорода на дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека in vitro», представлены материалы, посвященные аналогичным разработкам для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК). Давно известно, что, например, при нарушении или изменении стандартных условий культивирования стволовые клетки взрослого организма могут претерпевать процесс спонтанной дифференцировки, причем не всегда в направлении, характерном для них при нахождении в организме. Для ММСК это остеогенная, адипогенная и хондрогенная дифференцировки, а при культивировании в матригеле (Matrigel'“) в условиях гипоксии ММСК формируют капилляроподобные структуры [4, 5].

Влияние кислорода на процессы роста клеток и их дифференцировки — одна из наиболее обсуждаемых проблем в современной клеточной биологии. Доказано, что низкие концентрации кислорода способствуют как пролиферации клеток, так и их дифференцировке в некоторых направлениях. Активация пролиферации в условиях гипоксии часто реализуется через фактор HIF-1 (hypoxia inducible factor-1), дифференцировка — через сигнальные каскады, приводящие к активации транскрипционного фактора Notch [6].

Сегодня известно, что для нормального развития головного мозга млекопитающих, поджелудочной железы и некоторых других органов необходимы временные условия гипоксии [7—10]. Кратковременная гипоксия также необходима для более длительного, нежели в стандартных условиях, культивирования клеток. Следует отметить, что этот подход уже используется в некоторых закрытых системах культивирования клеток по стандартам GMP (good medical practice) для последующего применения в клинике. Компании BioSpherix Ltd. (США), Billups-Rothenberg Inc. (Канада), New Brunswick Scientific (США) и некоторые другие предлагают своим клиентам закрытые системы культивирования клеток в условиях умеренной гипоксии (5% 02) с целью увеличения скорости роста культур без потери их дифференцировочного потенциала. Их данные по большей части совпадают с данными, представленными в двух обсуждаемых статьях.

Эти статьи, дополняя друг друга, описывают изменения свойств ММСК, культивированных в гипокси-

ЛИТЕРАТУРА:

1.Trounson A. The production and directed differentiation of human embryonic stem cells. Endocr. Rev. 2006; 27: 208—19.

2. Никольский H.H., Габай И.А., Сомова H.B. Эмбриональные стволовые клетки человека. Проблемы и перспективы. Цитология 2007; 49: 529-38.

3.De Kok I.J., Hicok К.С., Padilla R.J. et al. Effect of vitamin D pretreatment of human mesenchymal stem cells on ectopic bone formation. J. Oral Implantol. 2006; 32: 103—9.

4. PittengerM.F., MackayA.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143—7.

5.Annabi B., Lee Y.T., Turcotte S. et al. Hypoxia promotes murine bone-marrow-derived stromal cell migration and tube formation. Stem Cells. 2003; 21: 337-47.

6. Ruas J.L., Lendahl U., Poellinger L. Modulation of vascular gene expression by hypoxia.Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18: 508—14.

ческих условиях, в сравнении со стандартными условиями культивирования при нормоксии (20% 02). Так, А.П. Жамбалова и соавт. показали, что умеренная гипоксия в культуре не нарушает способности ММСК дифференцироваться в остеогенном и эндотелиальном направлении, несколько снижая при этом способность к адипогенезу, в то время как «жесткая» гипоксия (1% 02) препятствует дифференцировке, способствуя, по-видимому, более длительному сохранению клетками своих морфологии и иммунофенотипа. Интересно было бы проверить, насколько обратимым является данный эффект, поскольку в случае его обратимости временное помещение клеток в условия жесткой гипоксии могло бы стать способом препятствия их спонтанной дифференцировке при длительном культивировании. Опыт работы с культурами ММСК человека показывает, что некоторые популяции склонны к подобной спонтанной дифференцировке в отсутствии каких-либо дифференцировочных стимулов на ранних (до шестого) пассажах.

Л.Б. Буравкова и соавт. продемонстрировали, что предварительное культивирование ММСК в условиях умеренной гипоксии увеличивает их способность к дифференцировке в хондрогенном направлении после трансплантации животным. Следует учесть, что в последней работе клетки дифференцировались уже in vivo, то есть после отмены гипоксических условий. На сегодняшний день, тем не менее, известно, что умеренная гипоксия стимулирует хондрогенную дифференцировку ММСК как in vivo, так и in vitro [11, 12], и данные российских исследователей полностью согласуются с полученными ранее.

Вынужден отметить, что А.П. Жамбалова и соавт., изучая дифференцировку ММСК in vitro, рассуждают об эндотелиальной дифференцировке ММСК, основываясь лишь на морфологических характеристиках клеток и не оценивая экспрессии ими маркеров эндотели-оцитов, что, на мой взгляд, несколько опрометчиво. Тем не менее, обе обсуждаемые работы представляют несомненный теоретический и практический интерес.

Сегодня уже никто не сомневается в том, что клеточные технологии будут внедрены в медицинскую практику. Однако перед тем, как это произойдет, должны быть разработаны воспроизводимые и четко регламентированные методики работы со стволовыми клетками. Данные публикации приближают момент, когда методы клеточной терапии станут частью рутинной клинической практики, частично отвечая на один из краеугольных вопросов современной биотехнологической науки: Как сохранить потенциал стволовых клеток in vitro и реализовать его in vivo?

7. Lasky J.L., Wu H. Notch signaling, brain development, and human disease. Pediatr. Res. 2005; 57: 104R—109R.

8. Zhu L.L., Wu L.Y., Yew D.T., Fan M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol. Neurobiol. 2005; 31: 231^12.

9. Panchision D.M. The role of oxygen in regulating neural stem cells in development and disease. J. Cell. Physiol. 2009; 220: 562—8.

10. Fraker C.A., Ricordi C., Inverardi L., DoniHnguez-Bendala J. Oxygen: a master regulator of pancreatic development? Biol. Cell. 2009; 101: 431-40.

11. Kanichai М., Ferguson D., Prendergast P.J., Campbell V.A. Hypoxia promotes chondrogenesis in rat mesenchymal stem cells: a role for АКТ and hypozia-inducible factor CHIF3-1 alpha. J. Cell. Physiol. 2008; 216: 708—15.

12. Khan W.S., Adesida A.B., Hardingham T.E. Hypoxic conditions increase hypoxia-inducible transcription factor 2alpha and enhance chondrogenesis in stem cells from the infrapatellar fat pad of osteoarthritis patients. Arthritis Res. Ther. 2007; 9: R55.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009