СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ РАСПРОСТРАНЕННЫМИ ДЕРМАТОЗАМИ (ПСОРИАЗ, АТОПИЧЕСКИЙ ДЕРМАТИТ, АКАНТОЛИТИЧЕСКАЯ ПУЗЫРЧАТКА) К ПРОВОДИМОЙ ТЕРАПИИ
METHOD FOR DETECTING TREATMENT-RESISTANT PATIENTS WITH CHRONIC ADVANCED DERMATOSES (PSORIASIS, ATOPIC DERMATITIS, ACANTHOLYTIC VESICULAR DERMATITIS)

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, и может применяться для выявления резистентности больных распространенными хроническими дерматозами (псориазом, атопическим дерматитом, вульгарной или акантолитической пузырчаткой) к проводимой терапии.
Устойчивость к лекарственным средствам (лекарственная адаптация, фармакорезистентность - ФР, терапевтическая резистентность) является серьезной проблемой современной фармакологии. Все чаще исследователи отмечают развитие у больных «лекарственного патоморфоза», выражающегося в увеличении числа больных, первично резистентных к лекарствам или приобретших устойчивость в ходе лечения, изменения клинической картины и течения заболевания.
По нашим данным у дерматологических больных часто наблюдается снижение эффективности лекарственных воздействий при многолетних хронических процессах [Химкина Л.Н. с соавт., 2005]. Это приводит к уменьшению сроков ремиссии заболевания и необходимости либо повышения дозы препаратов, либо назначения новых, далеко не безопасных средств.
Основные механизмы развития ФР на сегодняшний день связывают с нарушениями на уровне систем биотрансформации и транспорта лекарственных средств. Причем, эти нарушения, естественно, более выражены в случаях тяжелых, длительно протекающих заболеваний, к которым можно отнести и ряд дерматозов. Участниками системы биотрансформации и транспорта являются специализированные белки. Это ферменты биотрансформации, осуществляющие реакции 1 и 2 фаз метаболизма ксенобиотиков; гликопротеин Р - транспортный белок, основными функциями которого являются препятствие к всасыванию ксенобиотиков и лекарственных средств (ЛС) в кишечнике, предотвращение их проникновения через гисто-гематический барьер и скорейшее выведение печенью и почками; транспортеры органических ионов. Кроме этого, ряд исследователей считает, что проблема ФР может быть связана с блокированием рецепторного аппарата клеток вследствие сорбции эндогенных токсинов в виде молекул средней массы (МСМ) [Сидельникова В.И., Лифшиц В.М. 1998] или нарушением проницаемости мембран вследствие изменения соотношения фосфолипидов или модификаций белковолипидных взаимодействий за счет переокисления белков и липидов, так называемой окислительной модификации белков (ОМБ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Дубинина Е.Е, 2006].
Чаще всего ЛС влияют на ферменты 1-й фазы биотрансформации - система цитохрома Р450, затем на активность глутатионтрансферазы (ГТФ) и, в меньшей степени, на функционирование гликопротеина - Р. При этом считается, что главными причинами межиндивидуальных различий фармакологического ответа являются генетические особенности пациента и совместно применяемые ЛС. В настоящее время достаточно хорошо изучен генетический полиморфизм изоферментов системы Р450, ГТФ и активно изучается генетическая детерминированность гликопротеина Р. Однако, не смотря на то что все шире внедряются методы фармакогенетического тестирования, для того, чтобы в повседневной клинической практике можно было выяснить предрасположенность больного к тому или иному виду ответа на ЛС, такие подходы не всегда возможны.
В качестве ближайшего аналога изобретения выбран способ определения концентрации фексофенадина - продукта утилизации одного из субстратов гликопротеина Р - дигоксина [Колхир П.В., 2007]. Определяемая при этом гликозидная интоксикация сопоставлялась авторами с выявлением определенного генотипа человека (ТТ). Чувствительность данного исследования составила 62%, специфичность - 84%. Прогностическая ценность (PPV) положительного результата в случае выявления генотипа ТТ составила 57%. Прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) в случае выявления других генотипов составила 87%.
Определение концентрации фексофенадина в плазме крови испытуемых
Концентрацию фексофенадина в плазме крови животных и пациентов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Shimadzu» со спектрофотометрическим детектором (λ=220 нм). Состав подвижной фазы: кислота уксусная 0,03 М с содержанием триэтиламина 0,5%, подкисленная кислотой ортофосфорной до рН 4,0 и ацетонитрил в соотношении 68:32 по объему. Разделение проводили на колонке «µ-Bondapack Phenyl» 3,9×300 мм (10 мкм). Для экстракции фексофенадина из плазмы крови использовали смесь равных объемов дихлорметана, этилацетата и уксусноэтилового эфира. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков. В указанных условиях время выхода пика фексофенадина составляло 13 минут, предел обнаружения - 8,4 нг/мл.
Однако данный способ может быть осуществлен только при наличии в лаборатории комплекса для высокоэффективной газо-жидкостной хроматографии или поляризационного флуороиммуноанализа, что значительно усложняет определение резистентности.
Цель изобретения - повышение точности способа определения резистентности больных хроническими распространенными дерматозами (псориаз, атопический дерматит, акантолитическая пузырчатка) к проводимой терапии.
Поставленная цель достигается тем, что измеряют содержание молекул средней массы и карбонильных продуктов окислительной модификации белков и при значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии.
Способ осуществляется следующим образом.
У больного в процессе лечения утром натощак берут кровь из локтевой вены в количестве 3,0 мл в пробирку с гепарином и 5,0 мл в обычную пробирку. Для получения плазмы или сыворотки кровь центрифугируют в течение 15 мин при 1500 об/мин.
Определение содержания молекул средней массы проводят по методу М.Я.Малаховой (1995). Для этого к 1,0 мл плазмы крови (пробирка с гепарином) прибавляют 0,5 мл 15,0% раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения крупномолекулярных белков. Смесь центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин. В полученном супернатанте находятся молекулы средней массы (МСМпл). Определение количества МСМпл осуществляется спектрофотометрически, путем измерения оптической плотности супернатанта, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:9 против контроля, содержащего вместо исследуемого образца физиологический раствор. Оптическая плотность измеряется в диапазоне длин волн от 238 до 298 нм с шагом в 4 нм. Количество МСМпл рассчитывается как сумма (ОП238………ОП298)×4 усл. ед.
Содержание карбонильных продуктов окислительной модификации белков определяют по методу Е.Е.Дубининой (1995). При этом в качестве реактивов используются:
1. Фосфатный буфер (рН 7,4)
2. 2 N НСl (приготовлен из фиксанала)
3. 0,01М 2,4динитрофенилгидразина (ДНФГ) в 2 N НСl
4. 1 N хлорная кислота
5. 8М мочевина
6. С2Н5OН и СНСO2С2Н5 в соотношении 1:1 (этанол:этилацетат)
К 0,05 мл сыворотки крови прибавляют 0,95 мл фосфатного буфера (рН 7,4). Общий объем пробы составляет 1 мл. В опытные пробы приливают 1 мл раствора 2,4 ДНФГ, в - контрольные 1 мл 2 N НСl. Для осаждения белков в каждую пробу вносят 1 мл 1 N HClO4. Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой. Пробы инкубируют при комнатной температуре в течение часа, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают, добавляя 3 мл смеси этилацетат-этанол (1:1), не перемешивая, и ценрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. При этом происходит экстракция липидов и 2,4ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивают (в течение ночи в холодильнике), а затем растворяют в 8М растворе мочевины (3 мл в пробу). Для лучшего растворения осадка в пробу добавляют 1 каплю 2 N НСl. Полученные в результате окислительной модификации белков карбонильные производные взаимодействуют с 2,4ДНФГ с образованием 2,4динитрофенилгидразонов. Оптическую плотность (ОП) 2,4динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 370 нм.
Уровень карбонильных производных окисленных белков выражают в условных единицах:
ОМБпл=ОП×100 усл.ед.
Далее рассчитывают коэффициент К=МСМпл/ОМБпл и при значении их отношения <0,4 устанавливают отсутствие резистентности, при значении >0,4 - наличие резистентности к проводимой терапии.
Примеры конкретного исполнения
Пример 1. Больная М-ва, 50 лет. И/б-ни №693. Госпитализирована в НИКВИ 31.03.10 с жалобами на высыпания на коже туловища и конечностей, болями в межфаланговых суставах кистей и стоп, коленных суставов; отечность, утренняя скованность. Давность заболевания 12 лет. Диагноз: распространенный псориаз, прогрессирующая стадия, инфильтративно-бляшечная форма. Псориатический полиартрит. Сопутствующие заболевания - гипертоническая болезнь II ст., сахарный диабет 2-го типа. Периоды клинической ремиссии 4-5 мес.
Проведено лечение: раствор тиосульфата натрия 30% - 7,0 в/в; метотрексат по схеме Вайнштейн-Фроста 2 цикла, раствор гептрала 400 мг внутривенно капельно №10; липоевая кислота 25 мг×3 р/день; найз 100 мг 2 р/день; аевит 1 драже в день 28 дней; электрофорез с гепарином на суставы. Выписана со значительным улучшением.
3
Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 9 мм/час; Le - 5,1×10 ; Hb - 13,0 g/dl; C - 70, Э - 2,М - 2,Л - 26.
Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.
В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 23,12 усл.ед., и уровень ОМБпл, который составил 70 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,33. Несмотря на тяжелое клиническое состояние больной, сопровождающееся выраженной эндогенной интоксикацией организма по показателям МСМпл, олигопептидов и уровню 0МБ, в данном случае количество эффективного альбумина в норме, протеолитическая активность (по активности трипсина и α2-макроглобулина) в норме, активность фермента глутатион-трансферазы повышена, то есть активированы процессы биотрансформации эндотоксинов. Это свидетельствует о достаточной физиологической активности основных систем, отвечающих за усвоение ЛС и отсутствие резистентности.
Пример 2. Больная Б-ва, 62 лет. И/б-ни №376. Госпитализирована в НИКВИ 18.02.10 с жалобами на высыпания на коже, выраженный зуд. Давность заболевания 2 года. Причина заболевания - контакт с бытовой химией. Диагноз: атопический дерматит по типу нейродермита, распространенная форма.
Проведено лечение: раствор дипроспана 1,0 в/м №1; раствор преднизолона 30 мг в физиол. растворе в/м №7; преднизолон в таблетках 15 мг 10 дней; дифлюкан 150 мг 2 приема; каезал по 1 таб. в день 20 дней; аспаркам - 20 дней. Выписана со значительным улучшением.
Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 12 мм/час;
3
Le -4,1×10 ; Hb - 12,0 g/dl; C - 70, Э - 2,М - 2,Л - 26.
Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.
В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 11,2 усл. ед., и уровень 0МБ пл., который составил 44 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,25. Данный показатель свидетельствует об отсутствии резистентности.
Пример 3. Больная Х-ва М.М., 38 лет. И/б-ни №868. Поступила в НИКВИ 26.04.10 с жалобами на высыпания на коже, шелушение, зуд. Больна в течение 24 лет. В последние 10 лет отмечается выраженная торпидность к проводимой терапии с короткими периодами клинической ремиссии (1-1,5 мес). Диагноз: распространенный псориаз, прогрессирующая стадия, экссудативная форма. Сопутствующие заболевания: хр. гастрит, холецистит, пиелонефрит.
Проведено лечение: раствор ремикейда 300 мг в физиологическом растворе в/в капельно №2. Выписана со значительным улучшением кожного и суставного процесса.
Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 10 мм/час;
3
Le - 7,9×10 ; Hb - 13,7 g/dl; C - 61, Э - 1,М - 3,Л - 35.
Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.
В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 13,4 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 30 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,44. Данный показатель отражает состояние резистентности к проводимой терапии, о чем свидетельствует частота повторных госпитализаций и наличие эндогенной интоксикации организма по показателям МСМпл и олигопептидов, модифицированного альбумина, дисбалансу протеолитической активности.
Пример 4. Больная В-ва, 48 лет. № И/б-ни 38. Госпитализирована в НИКВИ 12.01.09 с жалобами на высыпания на коже туловища, конечностей и кожи головы: выраженное шелушение, боли в межфаланговых суставах кистей, стоп, коленных, локтевых суставах, деформация и ограничение подвижности суставов. Пациентка не переносит метотрексат, реамберин, витамин В 12, реополиглюкин, эссенциале, все группы антибиотиков. Больна в течение 30 лет, причина не ясна. Диагноз: псориаз распространенный прогрессирующая стадия экссудативная форма, псориатический полиартрит хронического течения, активность - II, недостаточность функции - II. Непереносимость ЛС выяснялась по мере их назначения. Периоды клинической ремиссии кожных проявлений 1 - 2 мес, суставных - без ремиссии, только улучшение.
Проведено лечение: преднизолон 10 мг внутрь, аспаркам 3,0 в сутки, ортофен 25 мг в день; сандиммун неорал 175 мг/сутки; раствор тавегила 2,0 в/м. Выписана с улучшением.
Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 25 мм/час;
3
Le - 9,7×10 ; Hb - 13,0 g/dl; С - 52 Э - 3,М - 4,Л - 42.
Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.
В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 15,54 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 27 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,57. Как видно из описания клинической картины, больная страдает тяжелой формой псориаза и псориатического полиартрита с высокой резистентностью к различным ЛС, о чем свидетельствует и высокое значение полученного отношения.
Пример 5. Больная Г-ва Г.Г., 32 лет. И/б-ни №174. Госпитализирована в НИКВИ 21.01.09 с жалобами на высыпания на коже, шелушение, выраженный зуд. Давность заболевания 17 лет. Причина - психоэмоциональный стресс. Диагноз: распространенный псориаз прогрессирующая стадия экссудативная форма. Периоды клинической ремиссии 2-3 мес.
Проведено лечение: метотрексат по схеме Вайнштейн-Фроста 4 цикла; раствор глюконата кальция 10,0% - 7,0 в/м №10; раствор тиамина бромида 5,0% 1,0 в/м №10; раствор пиридоксина гидрохлорида 5,0% 1,0 в/м №10; раствор тавегила 2,0 в/м №10; аевит по 1 капсуле в день; фенкарол по 1 таб. х 2 раза в день 10 дней. Выписана со значительным улучшением.
Лабораторное обследование: общеклинический анализ: СОЭ - 13 мм/час;
3
Le - 5,5×10 ; Hb - 14,0 g/dl; C - 62, Э - 1,М - 2,Л - 35.
Данные биохимического анализа сыворотки крови представлены в таблице.
В крови больной определили уровень МСМпл, который составил 16,63 усл. ед., и уровень ОМБпл, который составил 27 усл. ед. Отношение МСМпл/ОМБпл=0,62. Данный показатель отражает высокую степень резистентности, о чем свидетельствует частота рецидивов заболевания. Очевидно это связано с наличием эндогенной интоксикации организма по показателям МСМпл и олигопептидов, ЦИК, модифицированного альбумина, дисбалансу протеолитической активности.
По результатам клинико-лабораторного анализа 32 больных с обычным течением заболевания и хорошим эффектом после проведенной комплексной терапии значения отношения МСМпл/ОМБпл были меньше 0,4 у 62,5% обследованных, больше 0,5 - у 37,5%. В группе больных с тяжелым, резистентным течением заболевания, состоящей из 36 больных, значения отношения были больше 0,4 у 70,0% и меньше 0,4 - 30,0%.
В выбранном аналоге частота выявления положительных результатов теста на выявление резистентности у больных с определенным генотипом составила 57%.
При статистической обработке данных было показано высокодостоверное распределение по группам больных: Хи-квадрат=5,730 с одной степенью свободы; р=0,017. Точный критерий Фишера: р=0,012.
Таким образом, предлагаемый способ определения резистентности обладает следующими преимуществами:
1. Повышает точность определения показателя на 13%.
2. Используются более доступные методы исследования и менее дорогостоящие оборудование и реактивы.
3. Оценка резистентности у конкретного больного может быть произведена в лечебном учреждении в режиме реального времени.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. - СПб: Мед. пресса, 2006. - 397 с.
2. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительные модификации белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопросы медицинской химии. - 1995. - №1. - С.24-26.
3. Колхир П.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина - Р для оптимизации фармакотерапии. // Автореф. дисс. канд.мед.наук. - Москва, 2007.
4. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. // Эффер. терапия. - 1995.- №1. - С.38-40.
5. Сидельникова, В.И., Лифшиц В.М. Эндогенная интоксикация как одна из причин фармакорезистентности. Новые подходы лабораторной диагностики. // Клин. лаб. диагн. - 1998. - №8. - С.37.
6. Химкина Л.Н., Пантелеева Г.А., Копытова Т.В. Коррекция эндоинтоксикационного синдрома при дерматозах. // Эксп. и клиническая дерматокосметология. - 2005. - №6. - С.61-64.
Биохимические показатели сыворотки крови больных, представленных в виде клинических примеров
Показатели
Контроль
Клинические примеры
1
2
3
4
5
Общий белок, г/л
65-85
93,0
93,2
81,5
87,4
75,6
Альбумин, %
55,6±0,64
51,12
51,6
52,2
48,3
53,85
α<sub>1</sub>-глобулин, %
4,5±0,24
4,8
5,02
5,6
5,9
4,83
α<sub>2</sub>-глобулин, %
9,0±0,32
12,2
9,8
10,5
14,2
14,2
β-глобулин, %
11,0±0,28
11,5
13,2
15,0
13,8
11,3
γ-глобулин%
19,6±0,42
20,4
20,5
16,6
17,8
15,8
Крупные ЦИК, усл.ед.
37,2±5,4
40
72
50,0
46,0
60
Мелкие ЦИК, усл.ед.
219,2±12,2
397
394
295,0
242,0
326
МСМпл, усл.ед.
10,03±0,25
23,2
11,2
13,4
15,5
16,6
Олигопептиды, мг/л
28,7±1,14
59,0
41
45,0
42,0
45,5
ОМБпл, усл.ед.
19,0±1,7
70,0
25,0
30,0
27,0
27,0
ДК, мкмоль/л
6,4±0,5
6,0
3,1
5,9
13,7
6,2
МДА, мкмоль/л
2,48±0,09
3,72
3,84
3,3
4,2
3,3
Модифицированный альбумин, %
5,75±0,26
5,43
10,5
7,9
2,7
7,02
Эффективный альбумин, г/л
44,7±0,86
44,9
33,65
39,2
41,1
37,8
Трипсин, нмоль/с.л.
10,8±1,24
15,4
12,2
31,2
40,1
42,3
α<sub>2</sub>-макроглобулин, мкмоль/с.л.
0,56±0,026.
0,65
0,33
0,33
0,8
0,46
ГТФ, мкмоль/мин л
6,35±0,3
10,5
20,6
5,1
8,76
7,63
ЛСТ, мкмоль/мин л
6,2-18,5
16,0
4,0
7,3
2,0
2,8
АЛТ, мкмоль/мин л
3,7-25,9
19,4
3,6
5,3
5,8
1,0
Примечание:ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы;ДК - диеновые конъюгаты - первичные продукты перекисного окисления липидов;МДА - вторичные продукты перекисного окисления липидов;ГТФ - глютатионтрансфераза.