Влияние кинетина на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ____________________________________2007, том 50, №4_______________________________

БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

УДК: 577.175.1:633.511

М.А.Бабаджанова, А.К.Мирзорахимов, М.С.Нарзуллоев, Ш.А.Эсаналиева, Н.Ниматова,

А.К.Сайфудинов

ВЛИЯНИЕ КИНЕТИНА НА АКТИВНОСТЬ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗЫ В ЭКСТРАКТАХ ИЗ ЛИСТЬЕВ ХЛОПЧАТНИКА

Механизмы регуляции ферментативных реакций многообразны. Ферментативная реакция может подвергаться одновременно нескольким регуляторным воздействиям, неравноценным по направлению и силе действия на фермент [1].

Регуляторные факторы по своей природе разнообразны. Физические факторы - температура, свет, электромагнитное поле, электрические импульсы и другие оказывают менее специфическое действие, чем химические факторы.

Химические воздействия на ферменты условно делятся на «быстрые» или динамические и «медленные», связанные с регуляцией синтеза белка-фермента. Динамическая регуляция активности уже имеющегося в клетке фермента может осуществляться с участием разных механизмов. Действие химического агента (эффектора) может быть направлено либо на активный центр фермента [2], примером его является действие субстратов, кофакторов и конкурентных ингибиторов, либо на другой его центр - аллостерический, результатом чего также является изменение реакционной способности активного центра (аллостерическая регуляция).

Аллостерическими регуляторами действия фермента могут являться субстраты, продукты данной реакции, а также фитогормоны. Исследования многих авторов на листьях различных растений достаточно убедительно доказали стимулирующее действие кинетина на формирование структуры фотосинтетического аппарата и его функциональную активность, возрастание синтеза и активность многих ферментов, особенно ключевого фермента фотосинтеза - рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы [3-5].

В работе [6] получены данные о возрастании фиксации 14СО2 в присутствии рибозо-5-фосфата и АТФ экстрактами из листьев арабидопсиса и хлопчатника при добавлении кине-тина в реакционную смесь. Поскольку при фиксации 14СО2 в присутствии рибозо-5-фосфата и АТФ проявлялась суммарная активность трех ферментов - рибозофосфатизомеразы, фос-форибулокиназы и рибулозобисфосфаткарбоксилазы, то необходимо было исследование действия кинетина in vitro на активность каждого из этих ферментов в отдельности.

Целью данной работы являлось изучение влияния различных концентраций кинетина в реакционной среде на активность фосфорибулокиназы (КФ 2.7.1.19) в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф.

Материал и методы

Объектом для наших экспериментальных исследований были взяты листья хлопчатника Gossypium hirsutum L. сорта 108-Ф - 5-6 настоящих листьев.

Хлопчатник выращивали в полевых условиях с соблюдением всех агро-технических приемов на экспериментальном участке Института физиологии растений и генетики Академии наук Республики Таджикистан (г. Душанбе).

Получение экстракта из листьев. Листья были промыты дистиллированной водой, высушены фильтровальной бумагой, затем вырезались средние жилки. Листья охлаждали до 0°С и растирали в фарфоровой ступке с 0.1 М трис-HCl буфером, pH - 8.5, содержащим 0.01 М MgCl2, 0.0005 М ЭДТА, 0.01 М дитиотрейтола. Листья и буфер брали в соотношении 1:1.5. Полученный гомогенат отжимали через капроновую ткань, измеряли объем и рН, затем центрифугировали при 18000 об./мин на центрифуге марки К-24 на холоде в течение 40 мин. В 1 мл супернатанта определяли содержание белка и активность фосфорибулокиназы.

Количественное определение белка. Количественное содержание белка определяли по методу Лоури и др. [7] с небольшой модификацией. Для освобождения от Лоури-положительных веществ небелковой природы использовали осаждение белка 3% ТХУ

Калибровочная кривая построена по бычьему сывороточному альбумину

Определение активности фосфорибулокиназы. Об активности фосфорибулокиназы судили по скорости накопления щелочегидролизуемого фосфора рибулозо-1,5-бисфосфата.

В основу определения активности этого фермента взят метод Гурвитца (Hurwitz), описанный в работе [8].

1 мл стандартной ферментной смеси содержал 1 -200 мкг белка, по 10 мкмоль-АТФ, рибулозо-5-фосфат, MgCl2 и дитиотрейтола.

Ферментную смесь в пробирках инкубировали в течение одной минуты при температуре 37°С. Реакцию останавливали добавлением равного объема 6% ТХУ Активность фосфорибулокиназы выражали в мкмоль рибулозо-1,5-бисфосфата (РБФ), полученного за одну минуту в расчете на 1 мг белка, то есть Е/мг белка.

Результаты и обсуждение

Результаты, полученные при определении влияния различных концен-траций кинети-на в реакционной среде на активность фосфорибулокиназы в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф, представлены в таблице.

Таблица

Влияние различных концентраций кинетина в реакционной среде на активность фосфорибу-локиназы (ФРК) в экстрактах из листьев хлопчатника сорта 108-Ф

Кинетин, мкмоль/мл реакционной среды Активность ФРК, мкмоль РБФ/мин на 1 мг белка Активация, %

- 16.5 100%

0.5 19.5 118

1 20.0 121

2 20.5 124

3 28.0 170

4 28.6 173

5 20.1 122

10 15.7 -

15 12.5 -

Как видно из приведенных в таблице данных, кинетин оказывает различное влияние на активность фосфорибулокиназы в зависимости от его концентрации в реакционной среде. Концентрации кинетина от 0.5 до 5 мкмоль/мл реакционной среды оказывали активирующее действие на активность фермента. Концентрации кинетина выше 5 мкмоль/мл реакционной среды ингибировали активность фосфорибулокиназы. Наибольшее активирующее действие на активность фосфорибулокиназы кинетин оказывал в концентрации 3-4 мкмоль/мл реакционный среды.

Полученные данные дают основание полагать, что кинетин является, по-видимому, аллостерическим эффектором фермента фосфорибулокиназы. Для доказательства этого предположения необходимы дальнейшие эксперименты.

Таким образом, установлено, что кинетин in vitro оказывал различное влияние на активность фосфорибулокиназы. Влияние кинетина на активность фосфорибулокиназы зависело от его концентрации в реакционной среде.

Таджикский государственный национальный университет Поступило 11.05.2007 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Курганов Б.И., Любарев А.Е. -Биохимия. 1991, т.56, №1, с.19-32.

2. Курганов Б.И. Физико-химические механизмы регуляции активности ферментов. М.: Наука, 1992, 62 с.

3. Кулаева О.Н. Цитокнины, их структура и функция. М.: Наука, 1973, 264 с.

4. Мокроносов А.Т. Фотосинтетическая функция и целостность растительного организма. М.: Наука, 1983,64 с.

5. Кефели В.И. Фотоморфогенез, фотосинтез и рост как основа продуктивности растений. Пущино, 1991, 134 с.

6. Бабаджанова М.А. -Докл. АН Тадж.ССР, 1971, tXIV, №8, с.62-65.

7. Lowry O.H., Rosebrough N.I, Farr A.L., Randall K.L. - J. Biol. Chem., 1951, v.193, p.265-268.

8. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. М.: Наука, 1980, 158 с.

М.А.Бобочонова, А.К.Мирзорахимов, М.С.Нарзуллоев, Ш.А.Эсаналиева, Н.Ниматова,

А.К.Сайфудинов

ТАЪСИРИ КИНЕТИН БА ФАЪОЛНОКИИ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗА ДАР ЭКСТРАКТНОЙ АЗ БАРГИ ПАХТА ЧУДОКАРДАПІУДА

Таъсири фитогормони кинетин тарики илова намудани он ба мух,ити реаксионй ба фаъолнокии ферменти фосфорибулокиназа дар экстрактх,ои аз барги пахта чудокардашуда мавриди имузиш карор дода шудааст.

Муайян карда шудааст, ки вобаста ба микдори илова намудани кинетин ба мусити раексионй, он ба фаъолнокии фосфорибулокиназа таъсири фаъолгардонанда ё катъгардонанда зох,ир менамояд.

Натичах,ои бадастовардашуда аз он шах,одат медихднд, ки кинетин хдмчун пай-вастагии фаъолгардонандаи фаъолнокии фосфорибулокиназа баромад мекунад.

M.A.Babnadzhanova, A.K.Mirzorahimov, M.S.Narzulloev, Sh.A.Esanalieva, N.Nimatova,

A.K.Saifudinov

THE INFLUENCE OF KINETIN ON PHOSPHORIBULOKINESE ACTIVITY IN COTTON LEAVES EXTRACTS

The influence of phitohormone kinetin on activity of phosphoribulokinese from cotton leaves (108-F) extracts was investigated under adding it info the reaction mixture.

It was determined that kinetin make activated orinhibited effects on phosphoribulokinese activity.

The obtained data suggested that the kinetin is likely an allosteric effectors of the phospho-ribulokinese.