Особенности иммунного ответа у больных наружным генитальным эндометриозом

Особенности иммунного ответа у больных наружным генитальным эндометриозом

Гасанова Х.А.

Научно-исследовательский институте акушерства и гинекологии Министерства здравоохранения Азербайджанской Республики

Особенности иммунного ответа у больных наружным генитальным эндометриозом

Гасанова Х.А.

Целью исследования явилось изучение иммунного ответа у больных НГЭ. Обследовано 126 пациенток с НГЭ в возрасте от 22 до 44 лет, среди которых. Определены CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+, иммуноглобулинов класса А, М, G и ЦИК в периферической крови и перито-неальной жидкости. Использованы метод проточной цитофлоуриметрии, радиальной иммунодиффузии по Манчини и осаждения ЦИК 3,5% полиэтиленгликолем.

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета статистической программы «Statgraphics», фирмы STSC (США). Достоверность различий оценивалась с помощью вычисления непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни.

Выявлено угнетение клеточного и повышение гуморального звеньев иммунитета (ЦИК, IgG и IgA) в пери-тонеальной жидкости. Степень выраженности сдвигов иммунитета была связана с наличием воспалительных заболеваний, длительностью заболевания, локализацией патологического очага. В ПЖ изменения иммунитета касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания CD4+ клеток и относительного содержания CD8+ лимфоцитов у больных НГЭ III-IV степенью. Иммуноре-гуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости.

Актуальность проблемы

Несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения наружного генитального эндометриоза (НГЭ), это заболевание остается одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста [6]. Вопрос об этиологии и патогенезе эндометриоза, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза. У пациенток с эндометриозом выявляются значительные изменения как на системном (увеличение содержания Т-, естественных киллеров (ЕК-лимфоцитов) в периферической крови), так и на локальном (возрастание количества лимфоцитов, нарушение функциональной активности ЕК-клеток в пе-ритонеальной жидкости) уровнях [9]. При этом большинство авторов рассматривают смешанную группу больных эндометриозом, куда входят пациентки со всеми стадиями заболевания.

Известно, что эндометриоз относится к опухолевидным процессам дисгормональной природы, а главная роль в удалении из организма чужеродных эндогенных клеток принадлежит триаде: макрофаги-ЕК-клетки-антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты [5]. Изучению функциональной активности ЕК-клеток у

Features of the immune response in patients with external genital endometriosis

Hasanova Kh. A.

The aim of the investigation was to study the immune response in patients with EGE. The study involved 126 patients with EGE aged between 22 and 44, among which the CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+, immunoglobulin A, M, G and CIC in peripheral blood and peritoneal fluid were identified. The methods of running cytoflowmetery, radial immunodiffusion by Mancini and CIC sedimentation 3.5% by polyethylene glycol were used.

The statistical analysis of results was performed by means of statistical program "Statgraphics" produced by STSC company (USA). The significance of differences was assessed by calculating of nonparametric Wilcoxon-Mann- Whitney criterion.

The suppression of the cellular and increase of humoral component of immune system (CIC, IgG and IgA) in the peritoneal fluid was detected. The degree of intensity of changes in immunity is connected with inflammatory diseases, duration of the disease, localization of the pathological focus. In RV changes were mainly of immune T-cell component and became apparent with the increase in the total number of T-lymphocytes, the content of CD4 + cells and the relative content of CD8+ lymphocytes in patients with III-IV degrees of EGE. Immunoregulatory index was also increased. These results confirm the presence of inflammatory process in the peritoneal cavity.

пациенток с эндометриозом посвящено достаточно много работ, но вопрос о том, являются ли связанные с эндометриозом изменения в активности ЕК-клеток причиной или следствием заболевания, все еще остается открытым. Кроме того, согласно результатам ряда исследований, в развитии эндометриоза могут быть вовлечены оба звена иммунной системы: клеточный иммунитет, в котором определенные свободные клетки борятся с болезнью, и гуморальный - где антитела сформированы, чтобы напасть на антигены [7,8].

Комплекс иммунных факторов представляет собой систему, участвующую в интеграции организма как единого целого, обновлении, росте и развитии клеток, тканей, органов, защите организма от повреждающих факторов в процессе жизнедеятельности в норме и при патологии [5]. Из иммунных компонентов наиболее изучены субпопуляции лимфоцитов и циркулирующие антитела, но, тем не менее, при изучении фенотипического профиля лимфоцитов в крови больных НГЭ получены противоречивые результаты [3,4,7].

Целью

настоящего исследования явилось изучение иммунного ответа у больных наружного генитального эндометриоза (НГЭ).

Материал и методы исследования

Обследовано 126 пациенток с НГЭ в возрасте от 22 до 44 лет. Средний возраст больных составил 28,5±5,7 лет. Поражение яичников отмечено у 50,8% больных, труб - у 17,4%, влагалища - у 16,7% и шейки матки -у 15,1%. I степень распространения НГЭ обнаружена у 38, II степень - у 35, III степень - у 31 и IV степени - у 22 больных. у 72 (57,1%) больных. Эндометриозу сопутствовало бесплодие с превалированием первичного бесплодия (40 больных): соотношение первичного и вторичного бесплодия составило 1,8:1 (55,5 и 44,4% соответственно). Аборты имелись в анамнезе у 70 (55,5%) обследованных женщин. У 20 обследованных НГЭ протекал без симптомно, у остальных 106 - отмечались боли и кровянистые выделения. Наиболее часто больные предъявляли жалобы на ноющую боль внизу живота (75,4%), а также боль в области поясницы (36,8%). Выявлено сочетание НГЭ со спаечным процессом у 81 (64,3%) пациенток, воспалительными заболеваниями придатков у 73 (57,9%) и циститом у 37 (29,4%) больных. Контрольную группу составили 16 женщин с нормальной репродуктивной функцией.

Иммунологический статус оценивали путем определения показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета. При этом использовали иммунологические тесты 2 уровня: фенотипирование лейкоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+), исследование иммуноглобулинов класса А, М, G и ЦИК.

Исследование содержания иммунных компонентов проводили в периферической крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ), взятой во время лапароскопии. Выделение лейкоцитов из периферической крови и ПЖ проводили методом градиентного центрифугирования с помощью среды «Ficoll-Paque» плотностью 1,114 и 1,07. Субпопуляционный состав лейкоцитов ПК и ПЖ определяли методом проточной цитофлоуриметрии моноклональными антителами фирмы «Сорбент» (Россия) на цитофлоуриметре "Coulter Epix XL" фирмы "Beckman Coulter" (США). Иммуноглобулины: IgA, IgM и IgG определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1965). Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяли путем осаждения их из сыворотки 3,5% полиэтиленгликолем (м.м.6000) фирмы "Serva".

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета статистической программы «Stat-graphics», фирмы STSC (США). При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских и биологических исследований [1]. Достоверность различий оценивалась с помощью вычисления непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Клеточный состав иммунитета женщин с различной степенью НГЭ оценивали на основании определения мембранных маркеров. Полученные результаты исследования показали, что разницы в показателях у больных с I и II степенью практически не выявлялось, также как и у больных с III и IV степенью заболевания. Учитывая это, пациентки были разделены на две группы: в I группу вошли 73 женщины с I и II степенью распространенности эндометриоза, во II группу - 53 женщины с III и IV степенью распространенности.

Наиболее заметные изменения были в содержании Т-лимфоцитов и ЕК клетках. У больных НГЭ достоверно снижается количество Т-лимфоцитов (CD3+), а также отмечается выраженное повышение процентного содержания ЕК-клеток (CD16+). При этом у больных II группы, т.е. с III и IV степенями НГЭ, выявлено более значительное изменение этих показателей. Так, у пациенток I группы

уровень СО3+ в сравнении с контрольными показателями был снижен на 6,8%, у больных II группы - на 13,3%. При сравнении величин С016+ у больных I и II групп разница с контрольными значениями в среднем составила 14,9 и 52,8% соответственно. Хотя как в I, так и во II группе были больные, у которых уровень натуральных киллеров был ниже, чем в контроле. В частности, у 7 больных с малыми формами НГЭ количество С016+ составило 14,2% (контроль-14,8%), а у 6 больных II группы - 14,1%.

НГЭ характеризовался сниженным количеством С04+ и С08+ субпопуляций, Однако, это снижение в обследованных группах несколько различалось. У больных с М! степенями НГЭ разница относительного содержания хелперов с контролем была не столь значительной и составила 3,8%, у больных с ИМУ степенями содержание этих клеток было меньше контрольных на 9,4%, т.е. снижение уровня С04+ коррелировало со степенью заболевания. Коэффициент корреляции был равным соответственно г=0,341 и г=0,405. Относительное количество супрессоров (С08+) у женщин с ^И степенью НГЭ составило в среднем 20,1%, что на 9,5% было ниже, чем в контрольной группе, у женщин с ИМУ степенями заболевания - 21,3%, как видно разница с нормальными величинами была незначительной - 4,1%. Нужно отметить, что изменения в клеточном звене иммунитета у женщин с малыми формами эндометриоза выражались в снижении содержания клеток С08+ фенотипа. У этих больных отмечались самые низкие значения - 19,019,2%. Положительная корреляция выявлена также между изменением количества С03+ и распространенностью НГЭ: чем выше степень эндометриоза, тем ниже уровень Т-лимфоцитов (г=-0,385).

Известно, что величина индекса иммунорегуляции (С04+/С08+) является важным показателем гармоничной функции иммунной системы. У больных НГЭ ^И стадии отмечается тенденция к увеличению этого показателя, по-видимому, за счет снижения содержания клеток С08*. Снижение этого показателя наблюдалось в обеих группах, но более заметным оно было у пациенток I группы. Выявлено снижение активированных Т- и В клеток (С025+) у пациенток обеих групп: в I группе - на 9,7%, во II группе - на 19,9%.

В целом у больных I группы отмечалась тенденция к снижению количества С019+ клеток, но у больных с распространенными формами (II группа) содержание этих клеток достоверно увеличивалось и в среднем на 27,8% превышало таковые в контроле.

При сравнении содержания лимфоцитов в ПЖ пациенток II группы и здоровых женщин не выявлено различий в относительном количестве ЕК-лимфоцитов (С016+), тогда как обнаружено значительное увеличение как общего количества Т-лимфоцитов, оцениваемого по содержанию клеток С03+, так и повышение содержания клеток регу-ляторных субпопуляций - хелперов/индукторов (С04+) и супрессоров/ цитотоксинов (С08+) (табл.1).

Как следует из табл.1, различия в содержании общих Т-лимфоцитов оказались статистически достоверными при сравнении с результатами анализа в обеих группах. При этом в I группе исследования не отмечено заметных изменений содержания субпопуляций С04+ и С08+, за исключением ЕК-клеток. Уровень естественных киллеров превышал контрольные показатели на 55,5%. У женщин с ИМУ степенями НГЭ наряду с повышением С03+ лимфоцитов выявлен рост уровня С04+ на 36,4%, С08+ - на 19,4%. Изменение уровня С019+ лимфоцитов носило такой же характер, как и в ПК. У женщин I группы содержание этих субпопуляций несколько снижалось (на 25,0%), у больных II группы, напротив, количество В-клеток повышалось в 2,1 раза (р<0,05). Выявлено снижение С025+ в ПЖ при НГЭ в сравнении с контрольными показателями на 23,3%

Таблица 1. Относительное содержание (в %) основных клеточных популяций в ПЖ больных НГЭ разной степени и контрольной группы

Кластер дифференцировки

I группа

CD3+ 49,2

CD4+ 21,4

CD8+ 32,4

CD4+/CD8+ 0,66

CD16+ 8,1

CD19+ 1,2

CD25+ 3,0

1римечание: * - статистически достоверно с контрольными показателями

в обеих группах. При этом снижение не коррелировало со степенью эндометриоза.

В ходе исследования выявлены изменения также и в гуморальном звене иммунитета больных НГЭ. В частности, средний уровень ЦИК у больных обеих групп достоверно превышал контрольные величины. Кроме того, у больных НГЭ выявлено повышение содержания в сыворотке крови 1дА и 1дО на фоне нормального уровня 1дМ. У больных I группы содержание 1дА превышало контроль в среднем на 3,8%, 1дО - на 5,6%, у пациенток II группы - на 7,1 и 7,4% соответственно. Эти показатели позитивно коррелировали с распространенностью НГЭ (г=0,282). Положительно коррелировали со степенью заболевания и ЦИК. Так, у больных с 1-11 степенями НГЭ их количество в крови было выше на 19,4% (р<0,05, г=0,259), у больных с ИМУ степенью заболевания - на 28,3% (р<0,05, г=0,381). При этом отмечались изменения этих же показателей в ПЖ.

Таблица 2. Сравнительная характеристика компонентов иммунитета у больных НГЭ в периферической крови и перитонеальной жидкости

Показатели Больные НГЭ

ПК ПЖ

CD3+ 4 t

CD4+ 4 t

CD8+ N,t

CD4+/CD8+ t t

CD16+ t t, N

CD19+ 4t 4t

CD25+ 4 4

ЦИК t t

IgA t t

IgM N N

IgG t t

Изменение показателей гуморального звена в ПЖ в основном носило такой же характер, как и в ПК. Содержание ЦИК увеличивалось, коррелируя со степенью заболевания, в частности, у больных с 1-11 степенью уровень ЦИК в ПЖ был выше контрольных на 27,5%, у пациенток с ИМУ степенями - на 32,2%. Отмечалось также достоверное увеличение 1дА в обеих группах на 8,8 и 10,4% соответственно. Содержание 1дО у больных II группы превысило контрольные значения на 17,5%, у больных I группы - на 9,5%. Уровень !дМ также как в ПК находился в пределах нормы.

Как и ожидалось, изменения показателей иммунитета у женщин с воспалительными заболеваниями проявлялись более выраженно. Воспалительные заболевания имели 110 пациенток НГЭ, т.е. 87,3%, причем клиническому проявлению эндометриоза в 29,4% случаев предшествовала инфекция, передаваемая половым путем. Следует отметить у таких больных достоверное снижение 003+ и

повышение ЦИК в обеих биологических жидкостях, т.е. в ПК и ПЖ.

При сравнении содержания компонентов иммунитета в крови и перитонеальной жидкости выявленные изменения носили не однонаправленный характер (табл.2). Как видим, различий в сдвигах показателей гуморального иммунитета в ПК и ПЖ не отмечалось. В то же время, на фоне одинакового изменения ЦИК и иммуноглобулинов показатели клеточного звена в ПК и в ПЖ изменялись диаметрально противоположно, особенно это касалось субпопуляций CD3+, CD4+ и CD8+.

При фенотипировании лимфоцитов ПК пациенток с разной степенью эндометриоза выявлены следующие нарушения иммунитета в группах: при малых формах содержание супрессорно-цитотоксической субпопуляции Т-клеток (CD8+) изменялось в сторону снижения, вследствие чего имело место увеличение иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+, кроме того, отмечалось увеличение процента CD16+ клеток. При III-IV степени эндометриоза были обнаружены другие изменения - повышение содержания В-клеток и CD16+ лимфоцитов. Увеличение содержания CD16+-клеток, ответственных за уничтожение попавших в перитонеальную полость путем ретроградного заброса менструальной крови, может быть немаловажным фактором при данном заболевании. В то же время D.J. Oost-erlynk и соавт. [9] отмечают уменьшенную деятельность киллерных клеток, которые тем самым вносят свой вклад в сокращение клеточной неприкосновенности. Уменьшение относительного количества клеток фенотипа CD3+, зафиксированное при НГЭ и особенно в группе женщин с III-IV степенью эндометриоза, по-видимому, происходит вследствие снижения содержания обеих (CD4+ и CD8+) иммунорегуляторных субпопуляций, поэтому иммуноре-гуляторный индекс в их ПК не изменялся (1,68, контроль -1,67). Таким образом, результаты фенотипирования лимфоцитов ПК подтвердили ранее выявленные нарушения клеточного звена иммунитета у больных эндометриозом [2], которые различны по проявлениям у женщин с разной степенью заболевания.

Наряду с изменениями клеточного иммунитета у больных НГЭ в ПК отмечалось повышение уровня IgG и IgA. Иммуноглобулины класса G обеспечивают противоинфек-ционную защиту, IgA нейтрализуют токсины и вызывают агглютинацию микроорганизмов и вирусов.

Недостаточность клеточного иммунитета является важным этиологическим фактором развития эндометриоза. При НГЭ активируются CD16+ клетки, именно они способны выделять факторы, стимулирующие имплантацию и пролиферацию жизнеспособных фрагментов эндометрия, поддерживая тем самым развитие эндометриоза, В то же время клеточный иммунитет зависит от действия гуморальных факторов, выделяемых цитотоксическими лимфоцитами (Т-киллерами).

На современном этапе представляет интерес концепция, выдвинутая W.P. Dmowski и соавт. [7] и R.W. Shaw [11], согласно которой ретроградное перемещение эндо-метриоидных фрагментов при менструации бывает у всех женщин, отторжение или имплантация этих фрагментов зависит от функции иммунной системы, эндометриоз отражает недостаточность иммунной системы, которая передается по наследству, иммунная недостаточность может быть как качественной, так и количественной, приводящей к эндометриозу, выработка аутоантител - это реакция на эктопический эндометрий и она в свою очередь может

способствовать бесплодию при эндометриозе.

Данная гипотеза в сущности представляет комбинацию имплантационной и иммунологической теорий. Эта концепция утверждает, что эндометриоидные фрагменты перемещаются через маточные трубы у всех женщин. В брюшной полости они перераспределяются иммунной системой, представленной главным образом перитоне-альными макрофагами. Эндометриоз может развиваться тогда, когда брюшинная распределительная система переполняется из-за возрастающего ретроградного перемещения эндометриоидных элементов. Эндометриоз возникает и тогда, когда брюшинная распределительная система имеет дефект или несовершенна. Эктопическая эндоме-триальная пролиферация заканчивается образованием аутоантител.

Проведенное исследование свидетельствует, что клиническому проявлению эндометриоза в 29,8% случаев предшествовала инфекция, передающаяся половым путем, и нарушения влагалищного биоценоза, что указывает на их возможную роль в патогенезе заболевания.

Как и предполагалось, значительно более выраженные изменения в функционировании иммунной системы обнаруживались на локальном уровне, в непосредственной близости от имплантатов - в ПЖ. Последняя, представляющая микроокружение очагов эндометриоза, содержит как множество растворимых факторов, влияющих на процесс имплантации и роста эндометриоидных эктопий, так и большое количество клеточных элементов, продуцирующих эти факторы [4].

В-клетки представлены в ПЖ как больных эндометрио-зом, так и здоровых женщин в очень незначительном количестве. Выявленные изменения иммунитета на локальном уровне касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания клеток хелперной субпопуляции (CD4+) и относительного содержания CD8+ лимфоцитов у больных НГЭ III-IV степенью. Иммунорегуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости [4]. Увеличение при эндометриозе содержания Т-лимфоцитов, в активированном состоянии вырабатывающих спектр цитокинов и факторов роста, в свою очередь способных усиливать рост эндометриоидных клеток in vitro [12], предполагает нарушения в регуляции иммунного ответа. По-видимому, вслед за активацией иммунных процессов на начальных стадиях заболевания, на более поздних - воспалительный процесс, развивающийся в ответ на присутствие эндометриоидной ткани в перитонеальной полости и из-за невозможности удаления очагов эндометриоза, прогрессирует, в результате чего возникают инфильтрация, фиброз и инкапсуляция очагов эндометриоза [10]. Это под-

тверждается результатами проведенного исследования, в ходе которого были выявлены изменения в Т-клеточном звене иммунитета при III-IV степени эндометриоза.

Выводы

Таким образом, в процессе исследования выявлено, что у больных НГЭ отмечается угнетение клеточного и повышение гуморального звеньев иммунитета, повышение уровня ЦИК. Степень выраженности сдвигов иммунитета была связана с наличием воспалительных заболеваний, длительностью заболевания, локализацией патологического очага. Полученные результаты показали снижение параметров субпопуляций CD3+, CD4+, CD8+ в ПК и повышение их в ПЖ. Вместе с тем, как в ПК, так и в ПЖ у больных с малыми формами НГЭ увеличивалось относительное количество CD16+ лимфоцитов, в то время как у пациенток с III-IV степенями заболевания при значительном увеличении этих клеток в ПК отмечалось нормальное их количество в ПЖ.

Литература

1. Гланц Ст. Медико-биологическая статистика /Пер. с англ. Под ред. Н.Е. Бузикашвили и Д.В.Самойлова. М.: Практика, 1999, 200с.

2. Ищенко И.Г. Иммунологические аспекты эндометриоза // Акуш. и гинек, 1991, №3. с.8-12

3. Крамарева Н.Л. Значение компонентов иммунной системы и генетических факторов в патоге-незе и терапии наружного генитального эндометриоза / Автореф. дис. к.м.н., СПб, 2002, 24 с.

4. Куявская Д.В., Григорян К.В., Торубаров С.Ф., СухихГ.Т. Субпопуляции лимфоцитов перифе-рической крови и перито-неальной жидкости у женщин с эндометриозом // Проблемы репродук-ции, 1999, №2, с.62-64

5. Марчук С.А. Состояние общего и локального иммунитета у больных распространенными фор-мами генитального эндоме-триоза: Автореф. дисс... канд. мед. наук, М.,1992,24с.

6. Banbiery R.L. Etiology and epidemiology of endometriosis // Am. J. Obstet. Gynecol., 1990, v.162, p.565-567

7. Dmowski W.P. Immunological aspects of endometriosis // Int J Gynaecol Obstet, 1995, v.50, Suppl 1, p.3-10

8. Dmowski P.W., Braun D.P. Immunology of endometriosis. Best Pract Res// Clin Obstet Gynaecol., 2004, v.18, N2, p.245-263

9. Oosterlynck D.J., Lacquet F.A., Waer M. et al. Lymphokinactivated killer activity in women with endometriosis // Gynec. Obstet. Invest., 1994, v.37, N3, p. 185-190

10. Scotti S., Regidor P.A., Schindler A.E., Winterhager E. Reduced proliferation and cell adhesion in endometriosis // Molecular Human Reproduction, 2000, v.6. p.610-617

11. Shaw R.W. Endometriosis / Current Understanding and Management/Ed. R.W. Shaw, Gr. Brit, 1995, p.302

12. Westermann J., Pabst R. Lymphocyte subsets in the peripheral blood: diagnostic window on the lymphoid system? //Immunology Today, 1990, v.11, N11, p.406-409