СЕЛЕКТИВНАЯ МОДУЛЯЦИЯ ХЕМОКИНОВ
SELECTIVE CHEMOKINE MODULATION

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится, в общем, к селективной модуляции хемокина IP-10 и к лечению или предотвращению заболеваний и патогенных состояний, характеризующихся нежелательной экспрессией IP-10.
Уровень техники
Цитокины являются группой белковых передающих сигнал соединений, которые используются экстенсивно для межклеточной коммуникации. Эти соединения являются критическими для функционирования как врожденных, так и адаптивных иммунных реакций. Кроме их важности в развитии и функционировании иммунной системы, цитокины играют основную роль в различных иммунологических, воспалительных и инфекционных заболеваниях.
Цитокины продуцируются широким разнообразием типов клеток (как гемопоэтических, так и негемопоэтических) и могут действовать как на соседние клетки, так и на клетки по всему организму, иногда в сильной зависимости от других химических соединений и цитокинов.
Каждый цитокин обычно связывается со специфическим рецептором поверхности клетки. Затем последующие каскады внутриклеточной передачи сигналов изменяют функции клеток. Это может включать в себя повышающую регуляцию и/или понижающую регуляцию нескольких генов и их факторов транскрипции, приводящую, в свою очередь, к продуцированию других цитокинов, увеличению количества поверхностных рецепторов для других молекул или супрессии их собственного действия ингибированием по типу обратной связи.
Хемокинами называют специфический класс цитокинов, которые опосредуют хемоаттракцию (хемотаксис) между клетками. Эти хемокины являются провоспалительными индуцируемыми активацией цитокинами, которые обычно имеют молекулярную массу между 8 и 10 кДа. Их рецепторы являются в основном интегральными мембранными белками, содержащими семь простирающихся через мембрану спиралей, которые сопряжены с G-белками.
Хемокины высвобождаются из широкого разнообразия клеток в ответ на бактериальную инфекцию, вирусы и агенты, которые вызывают физическое повреждение. Они функционируют в основном в качестве хемоаттрактантов для лейкоцитов, рекрутируемых моноцитов, нейтрофилов и других эффекторных клеток из крови к местам инфекции или повреждения. Они могут высвобождаться многими различными типами клеток и служить для направления клеток, участвующих в природном иммунитете, а также лимфоцитов адаптивной иммунной системы. Некоторые хемокины играют также роль в развитии, миграции лимфоцитов и ангиогенезе.
Поскольку цитокины и хемокины участвуют во множестве различных заболеваний и патогенных или разрушительных состояниях, существует общая необходимость в возможности действия на экспрессию и/или высвобождение или модуляции экспрессии и/или высвобождения этих соединений. Кроме того, такая модуляция высвобождения/экспрессии должна быть селективной, в том смысле что действие производится только на ограниченное количество цитокинов- или хемокинов-мишеней.
Документ [1] исследует действие титановых поверхностей на активацию макрофагов и секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов. При присоединении к необработанным титановым поверхностям стимулируемые липополисахаридом (LPS) макрофаги увеличивали их секрецию цитокинов интерлейкина-1β (IL-1β), IL-6 и фактора-α некроза опухолей (TNF-α) и хемокинов, хемоаттрактантного белка-1 моноцитов (MIP-1) и воспалительного белка-1α (MCP-1α) макрофагов.
Документ [2] описывает, что частицы титана стимулируют селективную индукцию IL-8 и хемокинов МСР-1 в остеобласт-подобных клетках остеосаркомы человека.
Документ [3] исследует действие частиц титана на высвобождение цитокинов макрофаг-подобными клетками (MLC). Частицы титана значимо увеличивали высвобождение клетками MLC IL-1β, IL-8 и TNF-α.
Документ [4] обеспечивает обзор взаимодействий макрофагов с модифицированными поверхностями веществ. Этот документ раскрывает, что макрофаги, контактированные с модифицированными поверхностями, высвобождают IL-1β, IL-6, IL-10 и TNF-α.
Раскрытие изобретения
Данное изобретение преодолевает эти и другие недостатки решений предшествующего уровня техники.
Основной задачей данного изобретения является обеспечение селективной модуляции хемокина - белка IP-10 с молекулярной массой 10 кДа, индуцируемого интерфероном-γ.
Другой задачей этого изобретения является обеспечение композиции, которая может быть использована для очистки образца от IP-10.
Еще одной задачей этого изобретения является обеспечение композиции, которая может быть использована для уменьшения экспрессии IP-10.
Эти и другие задачи удовлетворяются этим изобретением, как определено сопутствующей формулой изобретения.
Вкратце, это изобретение включает в себя применение металла или оксида металла, способного селективно связывать IP-10 с его поверхностью. Этот металл (оксид) дополнительно оказывает понижающее регулирующее действие на IP-10, заключающееся в том, что контакт между поверхностью металла и IP-10-продуцирующей клеткой будет вызывать уменьшение продуцирования IP-10 этой клеткой.
Металлом или оксидом металла данного изобретения является металл группы 4 или 5 периодической таблицы элементов. Предпочтительно, такие металлы включают в себя титан, ванадий и тантал и их оксиды. Более предпочтительно, этим металлом является оксид титана, например диоксид титана.
Металлы и оксиды металлов данного изобретения могут быть использованы для приготовления лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания, характеризующегося нежелательной экспрессией и/или высвобождением IP-10. Такие заболевания включают в себя разрушительные воспалительные реакции, инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания, реакции трансплантат против хозяина и реакции на инородные тела. Во всех этих заболеваниях IP-10 является ключевым фактором в развитии этих заболеваний, и уменьшение IP-10 может быть использовано для лечения и/или предотвращения этих заболеваний.
Это изобретение включает в себя способы лечения заболевания, характеризующегося нежелательной экспрессией и/или высвобождением IP-10 в субъекте. Первый способ включает в себя введение лекарственного средства данного изобретения субъекту, страдающему от этого заболевания. Второй способ включает в себя обработку ex vivo биологической жидкости, экстрагированной из этого субъекта. В этом способе IP-10 удаляют фильтрацией ех vivo с использованием металлов или оксидов металлов этого изобретения и затем очищенную кровь возвращают этому конкретному субъекту.
Краткое описание фигур
Это изобретение, вместе с его дополнительными задачами и преимуществами, может быть наилучшим образом понято со ссылкой на следующее описание, взятое вместе с сопутствующими фигурами, на которых:
фиг.1 является диаграммой, иллюстрирующей действие серых гранул титана (GG) на высвобождение IP-10 в цельной крови человека;
фиг.2 является диаграммой, иллюстрирующей действие предварительной обработки (-1t) в сравнении с последующей обработкой (+1t) серыми гранулами титана (GG) на высвобождение IP-10 в цельной крови человека;
фиг.3 является диаграммой, иллюстрирующей относительную экспрессию гена IP-10 в общих лейкоцитах и моноцитах после инкубирования цельной крови с гранулами титана;
фиг.4 является диаграммой, иллюстрирующей действие серых гранул титана (GG) на экспрессию гена IP-10 в моноцитах после инкубирования цельной крови с гранулами титана;
фиг.5 является диаграммой, иллюстрирующей общую и дифференциальную лейкоцитарную формулу (WBC) после инкубирования с серыми гранулами или без серых гранул титана (GG);
фиг.6 является диаграммой, иллюстрирующей концентрацию IP-10 в системе петель, заполненных кровью, с необработанной и инфицированной (LPS) кровью с гранулами или без гранул титана;
фиг.7 является диаграммой, иллюстрирующей уровни IP-10 в системе петель, заполненных кровью с использованием серых гранул титана (GG), просеянных серых гранул титана (GP), белых гранул титана (WG) и измельченных белых гранул титана (WP);
фиг.8 является диаграммой, иллюстрирующей уровни IP-10 в системе петель, заполненных кровью, использующей различные количества добавленных измельченных белых гранул титана (WP);
фиг.9 является диаграммой, иллюстрирующей действие измельченных белых гранул титана (WP) на уровень IP-10 в синовиальной жидкости из пациентов с ревматоидным артритом;
фиг.10 является диаграммой, иллюстрирующей действие различных количеств измельченных белых гранул титана (WP) на уровень IP-10 в синовиальной жидкости (SF) из пациентов с ревматоидным артритом;
фиг.11 иллюстрирует микрофотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, показывающие серые (А, С, Е) и белые (В, D, F) гранулы титана (увеличение 250х, 2000х, 5000х);
фиг.12 иллюстрирует логарифмические дифференциальные кривые зависимости объема интрузии ртути от размера пор для серых (А) и белых (В) гранул титана;
фиг.13 является диаграммой, иллюстрирующей действие различных форм титана и других металлов на IP-10 в сыворотке с добавленным IP-10;
фиг.14 является диаграммой, иллюстрирующей действие различных форм титана и других металлов на IP-10 в синовиальной жидкости (SF);
фиг.15 является схематической иллюстрацией устройства, которое может быть использовано в соответствии с данным изобретением в удалении IP-10 из биологической жидкости; и
фиг.16 является схематической иллюстрацией другого устройства, которое может быть использовано в соответствии с данным изобретением в удалении IP-10 из биологической жидкости.
Осуществление изобретения
Во всем описании одни и те же ссылочные цифры (буквы) будут использоваться для соответствующих или одинаковых элементов.
Данное изобретение относится, в общем, к селективной модуляции конкретных цитокинов и хемокинов. Данное изобретение утверждает, что определенные металлы и оксиды металлов способны уменьшать экспрессию и высвобождение конкретного хемокина и действовать в качестве акцепторов хемокина. Это было совершенно неожиданным, так как прежний уровень техники, иллюстрируемый документами [1-4], показывает, что металл титан вызывает повышающую регуляцию в образовании цитокинов и хемокинов различными типами клеток.
Таким образом, данное изобретение может быть использовано для предотвращения и/или лечения патологических и медицинских состояний, характеризующихся нежелательной экспрессией или высвобождением конкретного хемокина.
Релевантным хемокином, который может быть уменьшен в соответствии с данным изобретением, является индуцируемый интерфероном-γ белок с массой 10 кДа (10000 Дальтон), IP-10. IP-10, также называемый в данной области лигандом 10 с мотивом С-Х-С (CXCL10) или Crg-2, принадлежит к семейству СХС хемокинов, которые имеют специфическую аминокислотную последовательность ELR (однобуквенный код аминокислот) непосредственно перед первым цистеином. Эти СХС-хемокины индуцируют миграцию нейтрофилов. Однако IP-10, по-видимому, отличается от большинства СХС-хемокинов тем, что он не имеет активности на нейтрофилах и нацелен специфически на лимфоциты. IP-10 действует на рецепторе CXCR3, а также на IP-10-специфическом рецепторе на эпителиальных и эндотелиальных клетках [5]. IP-10 секретируется несколькими типами клеток в ответ на интерферон-γ (IFN-γ). Эти типы клеток включают в себя моноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты.
Металлы и оксиды металлов в соответствии с данным изобретением, которые имеют уменьшающее IP-10 действие, являются металлами и оксидами металлов, выбранными из группы 4 или 5 периодической системы элементов. Таким образом, данное изобретение включает в себя металлы титан (Ti), цирконий (Zr), гафний (Hf), ванадий (V), ниобий (Nb) и тантал (Та) и различные оксиды этих металлов. Предпочтительные металлы включают в себя титан, тантал и ванадий и их оксиды, в частности титан и оксиды титана.
2
2
Титан имеет три окисленных состояния, Ti(II), Ti(III) и Ti(IV). Данное изобретение может использовать любой из этих оксидов титана, т.е. оксид Ti(II), оксид Ti(III) и оксид Ti(IV). Оксид Ti(IV) называют в данной области также диоксидом титана (TiO) или titania. Этот диоксид титана является предпочтительной формой оксида титана в соответствии с данным изобретением. TiO может присутствовать в разных минеральных или кристаллических формах, включающих в себя рутил, анатаз и брукит. Рутил является четырехугольным минералом, обычно призматического габитуса, анатаз или октаэдрит является четырехугольным минералом с дипирамидальным габитусом, тогда как брукит является орторомбическим минералом. Предпочтительный диоксид титана в соответствии с данным изобретением находится предпочтительно в форме рутила или смеси форм рутила и анатаза.
2
2
5
Предпочтительным оксидом циркония является оксид Zr(IV), и оксид Hf(IV) является предпочтительным оксидом гафния. Ванадий присутствует в окисленных состояниях V(II), V(III), V(IV) и V(V). Доступные оксиды ванадия включают в себя оксид V(IV) (диоксид ванадия VO) и оксид V(V) (пентоксид ванадия VO). Оксид ниобия может быть в форме оксида Ni(V) или оксида Ni(III), а тантал имеет окисленные состояния Та(II), Ta(IV) и Ta(V).
Уменьшающий или удаляющий IP-10 агент-металл в соответствии с данным изобретением содержит по меньшей мере один металл группы 4 или 5 и/или по меньшей мере один оксид металла группы 4 или 5. Этот агент-металл мог бы быть металлом или оксидом металла по существу в очищенной форме, такой как по меньшей мере приблизительно 95% металл или оксид металла, предпочтительно по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% металл или оксид металла. Этот металл необязательно должен быть в чистой форме, но может находиться в различных химических соединениях или композициях, кроме оксидов металла, с этим металлом. Могут быть также использованы сплавы, которые содержат по меньшей мере один металл и/или по меньшей мере один оксид металла, в соответствии с данным изобретением.
Эти металлы и оксиды металлов данного изобретения могут уменьшать IP-10 в соответствии с разными фундаментальными механизмами.
Во-первых, металлы и оксиды металлов действуют в качестве акцептора (поглотителя) IP-10, в том смысле что IP-10 в окружающей среде будет связываться специфически с поверхностью этих металлов и оксидов металлов. Таким образом, IP-10 будет становиться обогащенным на поверхности металла (оксида) и, следовательно, истощаться из окружающей среды. Это связывание IP-10 металлом (оксидом) является высоко специфическим, так как другие хемокины не связываются с этими металлами при уровнях связывания IP-10, в том числе структурно и химически близкородственный интерлейкин-8 (IL-8, также называемый CXCL8), который принадлежит к CXCL-группе хемокинов, и хемотаксический белок 1 моноцитов (МСР-1, также называемый CCL2), который имеет молекулярный размер в диапазоне IP-10 (эти два хемокина содержат 98 или 99 аминокислот). Блокирование поверхности металла (оксида) БСА или фетальной телячьей сывороткой не влияет на связывание IP-10 с этой поверхностью. Это связывание является также очень сильным, так как связанный IP-10 невозможно удалить с этой поверхности добавленными детергентами (Твин-20).
Эти металл и оксиды металлов данного изобретения действуют как высоко специфический акцептор IP-10 посредством селективного связывания IP-10 металлом (оксидом). В результате эти металлы и оксиды металлов могут быть использованы для очистки среды от нежелательного IP-10 и посредством этого удаления или по меньшей мере уменьшения концентрации и количества IP-10 в этой среде.
Во-вторых, при контактировании IP-10-продуцирующих клеток с металлом или оксидом металла данного изобретения взаимодействие клетка-металл вызывает понижающую регуляцию продуцирования IP-10, как определено из продуцирования уменьшенного количества мРНК IP-10. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению уровня вновь продуцируемого IP-10. Эксперименты показали, что металлы этого изобретения действительно способны связывать известные IP-10-продуцирующие клетки, такие как нейтрофилы и моноциты.
Таким образом, металлы и оксиды металлов данного изобретения могут уменьшать IP-10 удалением IP-10 из среды посредством связывания IP-10 и уменьшения величины экспрессии IP-10 вызыванием понижающей регуляции образования мРНК IP-10.
Поскольку металлы и оксиды металлов по этому изобретению вызывают уменьшение IP-10 по меньшей мере частично посредством связывания молекул IP-10 с поверхностью металла (оксида), эти металлы и оксиды металлов находятся предпочтительно в форме, которая имеет высокую удельную поверхность, т.е. поверхность на единицу массы.
2
2
2
2
Этот агент, металл (оксид) может, в первом варианте осуществления, находится в форме пористых гранул, зерен или гранулятов. Гранулы могут быть получены хорошо известными процессом Хантера или процессом Кролла. Полученные гранулы являются высокопористыми и имеют большую удельную поверхность. Эта удельная поверхность пористых гранул металлов равна предпочтительно по меньшей мере 0,005 м/г, например по меньшей мере приблизительно 0,01 м/г, более предпочтительно приблизительно или более 0,02 м/г, например приблизительно 0,055 м/г.
Предпочтительная пористость гранул подразумевает, что эти гранулы включают в себя множественные поры, в том числе микро- и макропоры, которые являются непрерывными через эти гранулы, и отверстия этих множественных пор и каналы и проходы, связывающие между собой по меньшей мере часть этих множественных пор. Пористость этого агента-металла (оксида металла) равна предпочтительно по меньшей мере 25%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, например по меньшей мере приблизительно 50%. Высокопористые металлические гранулы, имеющие пористость приблизительно или более 70%, могут быть приготовлены и использованы в соответствии с данным изобретением.
Вместо обеспечения высокопористых гранул металлов с размерами мм или ниже мм, могут быть использованы меньшие частицы металла (оксида), имеющие средний диаметр 100 мкм или менее, например в диапазоне несколько мкм или даже меньшие, в соответствии с данным изобретением. Такие малые частицы или порошок металлов будут обеспечивать большую площадь поверхности даже при малых количествах.
Первый аспект данного изобретения относится к применению металла или оксида металла в приготовлении лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания, характеризующегося нежелательной экспрессией и/или высвобождением IP-10 в субъекте. Металл выбирают по меньшей мере из одного металла группы 4 или 5 периодической таблицы элементов, по меньшей мере одного оксида металла группы 4 или 5 или смеси по меньшей мере одного металла группы 4 или 5 и по меньшей мере одного оксида металла группы 4 или 5.
Агент-металл (оксид) данного изобретения может быть использован для предотвращения заболеваний введением субъекту, предпочтительно субъекту-млекопитающему, и более предпочтительно субъекту-человеку с вероятностью страдания от заболевания, характеризуемого нежелательной экспрессией IP-10. В таком случае этот агент-металл будет вызывать уменьшение продуцирования IP-10 в этом субъекте уменьшением экспрессии мРНК IP-10. Кроме того, как только/если IP-10 будет продуцироваться при более высоких уровнях в этом субъекте, уже обеспеченный агент-металл будет связывать ГР-10 с его поверхностью, уменьшая посредством этого уровень свободно циркулирующего IP-10 и предотвращая нежелательное действие IP-10 этого заболевания. Таким образом, агент металл этого изобретения будет функционировать в качестве предохраняющего средства, которое может предотвращать начало развития IP-10-зависимого заболевания.
Пациент, уже страдающий от IP-10-зависимого заболевания, также получит пользу от лекарственного средства данного изобретения, так как агент-металл будет удалять уже продуцированный IP-10 посредством связывания металл-IP-10. Кроме того, IP-10-продуцирующие клетки будут стимулироваться к прекращению или по меньшей мере уменьшению продуцирования IP-10.
Заболевания или медицинские состояния, которые могут лечиться и/или предотвращаться в соответствии с данным изобретением, включают в себя IP-10-зависимые заболевания, характеризующиеся нежелательными (высокими) уровнями продукции IP-10 в субъекте. Данное изобретение применимо, в частности, для лечения или предупреждения нежелательных воспалительных реакций, где такая нежелательная воспалительная реакция может иметь очень разные причины, такие как инфекции, воспалительные заболевания, реакции на инородное тело и реакции трансплантат против хозяина.
Когда субъект становится инфицированным, IP-10 обычно повышается в виде части иммунной защиты против бактерий, вирусов, паразитов, грибков, прионов, вироидов или других патогенов. Однако в ситуациях, когда нормальная иммунная реакция нарушена, например, как в случае синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), эта нормальная иммунная реакция может быть изнуряющей при нарушении баланса. То есть иммунная система вызывает большее повреждение ткани/тела, чем инфекция. У пациентов со СПИДом, инфицированных криптоспородиозом, IP-10 специфически локализовался в эпителиальных клетках в участке инфекции, и, когда инфекция излечивалась, уровни IP-10 нормализовались. Эти результаты предполагают, что IP-10 является важным для элиминации инфекции при нормальной иммунной защите, тогда как у пациентов со СПИДом, лишенных эффекторных клеток, IP-10 мог способствовать иммунопатогенезу [6].
IP-10 может стимулировать ретровирусную инфекцию, такую как инфекция вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), непосредственно [7] или посредством рекрутинга активированных клеток-мишеней [8]. Уровень IP-10 в цереброспинальной жидкости (CSF) тесно ассоциирован с уровнем ВИЧ в этой CSF, что позволяет предположить, что IP-10 является как реакцией на локальную инфекцию, так и детерминантой локальной инфекцией.
Патогенез вирусной инфекционной желтой лихорадки (YF) в значительной степени усиливается цитокинами, и было обнаружено, что IP-10 образуется значимо в более высокой степени при фатальной YF, чем при нефатальной YF. Эти результаты предполагают, что вмешательство цитокинов является потенциальной терапевтической стратегией для лечения инфицированных пациентов [10].
Насморк часто индуцируется вирусной инфекцией, например риновирусом. Было показано, что после риновирусной инфекции эпителиальных клеток человека эти эпителиальные клетки продуцируют IP-10 как in vitro, так и in vivo. Уровень IP-10 коррелировал с тяжестью симптомов, и, следовательно, это позволяет предположить, что IP-10 играет роль в патогенезе индуцированного вирусом насморка [11].
Таким образом, данное изобретение может быть использовано для лечения или предотвращения различных инфекционных заболеваний, характеризующихся нежелательной экспрессией IP-10, в частности вирусных инфекционных заболеваний, включающих в себя СПИД, ВИЧ и желтую лихорадку.
Аутоиммунные заболевания являются конкретной формой воспалительных заболеваний, которые приводят к иммунной реакции против собственных клеток и тканей организма. IP-10 играет ключевую роль в иммунных реакциях, конкретно, в реакциях гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Такие реакции DTH включают в себя аутоиммунные заболевания. Таким образом, уменьшение IP-10, вызываемое металлами и оксидами металлов этого изобретения, могут быть эффективным лечением или превентивной мерой для различных аутоиммунных заболеваний. Примеры аутоиммунных заболеваний, которые могут лечиться или предупреждаться агентом-металлом данного изобретения, включают в себя острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, синдром антифосфолипидного антитела (APS), апластическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит, глютеновую энтеропатию, болезнь Крона, сахарный диабет типа 1, гестационный пемфигоид, синдром Гудпасчера, синдром Грейвса, синдром Гийена-Барре (GBS), болезнь Хашимото, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь Кавасаки, красную волчанку, рассеянный склероз (MS), тяжелую псевдопаралитическую миастению, синдром опсоклонуса/миоклонуса (OMS), ретробульбарный неврит, тиреоидит Ордта, пузырчатку обыкновенную, пернициозную анемию, первичный билиарный цирроз, ревматоидный артрит (RA), синдром Рейтера, синдром Шегрена, артериит Такаясу, темпоральный артериит (также известный как гигантоклеточный артериит), аутоиммунную гемолитическую анемию и гранулематоз Вегенера.
MS является аутоиммунным заболеванием, в котором организм продуцирует антитела против миелина, который защищает нервы в головном мозгу и спинном мозгу, приводя к потере нервов. У пациентов с MS спинальная жидкость содержит высокие уровни IP-10, и накопление Т-клеток в центральной нервной системе является очень важным в патогенезе этого заболевания. Таким образом, IP-10 является потенциальной мишенью в поиске терапий для MS [12]. Было показано, что IP-10 концентрируется в повреждениях пораженной нервной ткани [13-15]. Эксперименты показали, что тяжесть этого патологического состояния коррелирует с количеством экспрессируемого IP-10 [16], и блокирование IP-10 (обработкой антителом, ДНК-вакциной, антисмысловой терапией и IP-10-связанным иммунотоксином) приводило к клиническому улучшению в различных мышиных моделях [17, 18]. Таким образом, использование агента-металла в соответствии с данным изобретением может быть эффективным лекарственным средством для лечения или предупреждения MS, иным, чем известные блокирующие IP-10 агенты, которые имели положительные действия.
Было показано, что RA является аутоиммунным заболеванием, при котором IP-10 является активным. Детектировали увеличение, доходящее до 100-кратного увеличения, концентрации IP-10 в синовиальной жидкости (SF) от RA-пациентов [19]. Этот IP-10 мог селективно аттрагировать Т-клетки в SF и способствовать патогенезу RA [20]. IP-10 индуцируется в SF специфическими молекулами адгезии, и введение антител против этих молекул значимо ингибирует индукцию IP-10 [21]. Данные с IP-10 и другими хемокинами и данные по экспрессии рецепторов позволяют предположить, что система хемокинов играет непосредственную роль в деструктивной фазе RA [22]. Уменьшение продуцирования IP-10 и уровней ЕР-10, вызываемое данным изобретением, будет полезным в лечении и предупреждении RA.
При хроническом гепатите и аутоиммунных заболеваниях печени IP-10 является повышенным и уменьшается после успешного лечения IFN. IP-10 играет специфическую роль в накоплении и гибели гепатоцитов в хроническом гепатите [23]. Сходные результаты были получены у пациентов с аутоиммунным заболеванием печени [24].
IP-10 повышающим образом регулируется в кожных повреждениях у пациентов с хронической красной волчанкой [25], и пациенты с системной красной волчанкой (SLE) имеют увеличенный сывороточный уровень IP-10, и этот уровень коррелирует с уровнем активности заболевания [26]. Таким образом, содержащее металл (оксид) лекарственное средство этого изобретения может быть использовано также для лечения и/или предупреждения этих типов аутоиммунных заболеваний.
Воспалительная реакция, подлежащая лечению или предупреждению лекарственным средством этого изобретения, может быть обусловлена воспалительным заболеванием желудочно-кишечного тракта субъекта. Примеры таких воспалительных заболеваний включают в себя воспалительное заболевание кишечника (IBD), язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD, которая является аутоиммунным заболеванием, влияющим на желудочно-кишечный тракт). Эти заболевания являются тяжелыми хроническими нарушениями желудочно-кишечного тракта неясного происхождения. Все увеличивающиеся доказательства предполагают, что локально продуцируемые хемокины играют важную роль в прогрессировании этих заболеваний [21]. IBD [28], UC [29] и CD [30] характеризуются увеличением экспрессии белка IP-10 в воспаленном кишечнике, и обсуждалась терапевтическая причастность посредством ингибирования пути передачи сигнала IP-10 [31]. Блокада передачи сигнала ЕР-10 введением антител против IP-10 приводила к защите от острого колита [32], а также хронического колита [33]. Бутират ингибирует высвобождение IP-10 [34], и было показано, что он является эффективным в лечении UC-пациентов [35]. Мыши, дефектные в отношении IFN-γ, в которых путь IP-10 уничтожен, не способны к развитию колита в ответ на стимуляцию декстрансульфатом, который развивается в этом случае у мышей дикого типа [28]. Были индуцированы антитела против IP-10 для лечения воспалительных заболеваний кишечника [59]. Эти экспериментальные результаты указывают на то, что ингибирующее IP-10 лекарственное средство данного изобретения может быть использовано для лечения и/или предотвращения воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, в том числе IBD, UC и CD.
Лекарственное средство данного изобретения является также высокоэффективным в лечении и/или предотвращении воспалительных заболеваний. Например, IP-10 повышающим образом регулируется в кожных повреждениях у пациентов с лишаем (сильная экспрессия IP-10), хронической красной волчанкой (сильная экспрессия IP-10), аллергическим контактным дерматитом (сильная экспрессия IP-10) и псориазом (слабая экспрессия IP-10) [25]. В этих повреждениях присутствовало высокое количество инфильтрирующих активных Т-клеток, что позволяет предположить функциональное взаимодействие между локально продуцируемыми хемокинами и CXCR3-экспрессирующими Т-клетками. Таким образом, путь IP-10, по-видимому, играет важную роль в рекрутинге и поддержании инфильтратов Т-клеток в воспалительных кожных болезнях. Дополнительные нежелательные воспалительные реакции, которые могут лечиться и/или предупреждаться, включают в себя глаукому и воспалительные реакции, ассоциированные с глаукомой.
Недавно было показано, что IP-10 продуцируется и секретируется адипоцитами (жировыми клетками) [36], и ранее был обнаружен в атеросклеротических повреждениях вместе с активированными Т-клетками [37]. Экспериментальные исследования на мышах, чувствительных в отношении атеросклероза, показали, что IP-10 играет решающую ключевую роль в образовании повреждений локальной модуляцией иммунной системы. Эти результаты в IP-10-недостаточных мышах также показали, что посредством ингибирования пути IP-10 возникала тенденция к уменьшению количества провоспалительных Т-клеток и увеличению популяции защитных Т-клеток, что ингибирует атеросклеротический процесс [38]. Эти самые последние открытия в моделях животных предполагают, что блокирование взаимодействий хемокин/рецептор хемокина могут служить в качестве подходящего подхода к лечению атеросклероза. Подобным образом, антагонисты хемокина, которые ингибируют рекрутинг лейкоцитов, могли бы представлять особый интерес для лечения воспаления в реакции инфаркта миокарда, основном последствии атеросклероза [39]. Таким образом, лекарственное средство данного изобретения, которое приводит к уменьшенной экспрессии IP-10 и уменьшенным уровням IP-10 в субъекте, может быть эффективным для лечения и/или предупреждения атеросклероза.
Другой нежелательной воспалительной реакцией, которая характеризуется нежелательной экспрессией IP-10, является астма. В мышиной модели астмы было показано, что IP-10 способствует проблемной гиперреакции в дыхательных путях. IP-10-недостаточные мыши демонстрировали противоположные результаты в сравнении с животными дикого типа, что указывает на то, что путь IP-10 является мишенью терапии астмы [40, 41]. Хемокины и IP-10 оказывают также влияние на другие состояния, отрицательно воздействующие на дыхательные пути субъекта. Хроническая обструктивная болезнь легких (COPD, ХОБЛ) является состоянием, которое характеризуется необратимой обструкцией дыхательных путей вследствие сужения малых дыхательных путей и деструкции паренхимы легких. Это состояние вызывает воспаление дыхательных путей, вовлекающее в себя нейтрофилы, гранулоциты, макрофаги и лимфоциты. IP-10 повышающим образом регулируется в дыхательных путях пациентов с COPD [42]. Таким образом, лекарственное средство данного изобретения может быть использовано для лечения и/или предупреждения COPD и других воспалительных состояний, поражающих дыхательные пути.
При трансплантации имплантата в тело субъекта будет запускаться реакция организма на инородное тело. Эта реакция является особой формой нежелательной воспалительной реакции, вызываемой введением инородного материала, например имплантата, в субъекта. Такая воспалительная реакция характеризуется увеличением секреции IP-10, причем IP-10 может быть ключевой эффекторной молекулой в этой воспалительной реакции. Таким образом, уменьшение уровней IP-10 будет уменьшать воспалительную реакцию на инородный имплантат и посредством этого ингибировать реакцию на инородное тело.
Металлы и оксиды металлов данного изобретения могут быть также использованы для предотвращения или лечения реакций «трансплантат против хозяина». Таким образом, это изобретение может быть использовано в связи с трансплантацией трансплантатов для предупреждения или по меньшей мере уменьшения риска отторжения трансплантатов, в частности острой фазы отторжения трансплантата. Исход трансплантации основан в основном на реакции в хозяине на этот трансплантат, так как лечение отторжения органа, ткани или клеток является проблемой. В фазе острого отторжения трансплантата количество IP-10 увеличивается и может быть использовано в качестве диагностического маркера процесса отторжения, так как IP-10 коррелирует с тяжестью отторжения [43-46]. Эксперименты показали, что трансплантация трансплантата в присутствии антител, направленных против IP-10, или трансплантатов из IP-10-недостаточных мышей приводили к более продолжительному выживанию трансплантата и меньшей инфильтрации Т-клеток в этот трансплантат [47, 48]. Противоположные результаты, т.е. более продолжительное выживание, наблюдали в животных, не способных отвечать на IP-10 [49]. Были разработаны антагонисты к пути передачи сигнала IP-10, и была предложена терапия, которая могла бы улучшать исход трансплантаций [50]. Взятые вместе, эти результаты показывают, что акцептирующие и уменьшающие IP-10 агенты-металлы данного изобретения могут быть очень эффективными лекарственными средствами в лечении или предупреждении отторжения имплантатов трансплантированных тканей, имплантатов органов или имплантатов клеток, таких как островки Лангерганса.
Инфильтрация лейкоцитов участвует в нескольких типах рака (неоплазиях). Эти инфильтрирующие лейкоциты могут быть потенциальным источником факторов роста и ангиогенных факторов для эндотелиальных клеток. Было показано, что IP-10 является цитокином, участвующим в таких типах рака. Кроме того, поскольку хемокины являются важными медиаторами рекрутинга лейкоцитов и демонстрируют измененные характеристики экспрессии и активации в хронически воспаленной ткани, считается, что они участвуют в качестве ключевых регуляторов воспаления и ангиогенеза во время развития рака.
Хроническая активация природных иммунных клеток в участках роста предраковых опухолей может усиливать развитие опухоли. Было также очевидно, что ранние и стойкие воспалительные реакции, наблюдаемые во многих твердых опухолях или около многих солидных опухолей, играют важную роль в установлении среды, подходящей для неопластического прогрессирования обеспечением разнообразных факторов, которые изменяют гомеостаз ткани [51-53].
Таким образом, идеи данного изобретения могут быть использованы для лечения или предупреждения рака у субъекта.
Второй аспект данного изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания или нарушения, характеризующегося нежелательной экспрессией и/или высвобождением IP-10 в субъекте, предпочтительно субъекте-млекопитающем и более предпочтительно в субъекте-человеке. Этот способ предусматривает введение металла и/или оксида металла субъекту, страдающему от заболевания, где этот металл находится в группе 4 или 5 в периодической таблице элементов.
В соответствии с этим изобретением металлы или оксиды металлов могут быть обеспечены в виде фармацевтически приемлемых композиций с использованием способов приготовления, известных специалистам с обычной квалификацией в данной области. Эти композиции могут вводиться стандартными способами. Обычно эта композиция может вводиться внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, буккально, ректально, дермально, назально, перорально, трахеально, бронхиально, местным путем, любым парентеральным способом или ингаляцией, в форме фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент в фармацевтически приемлемой дозированной форме. Конкретный способ введения для применения будет зависеть, среди прочего, от подлежащего лечению нарушения или симптома и может быть определен врачом. Например, дермальное введение может быть применимо для лечения воспалительных кожных нарушений, тогда как пероральное или ректальное введение будет предпочтительным для субъектов с воспалительными реакциями в желудочно-кишечном тракте.
Во внутривенном введении фармацевтическая медицинская композиция содержит металл или оксид металла этого изобретения в растворе выбранного растворителя. В конкретном осуществлении введения этот содержащий металл или оксид металла раствор инъецируют один раз или предпочтительно в виде множественных введений лицу, нуждающемуся в лечении. Можно также использовать непрерывную или полунепрерывную подачу лекарственного средства, например, из медицинского насоса или другого оборудования для введения. Возможно также так называемое введение замедленного высвобождения, и оно находится в рамках данного изобретения.
В другом конкретном варианте осуществления может быть использовано локальное введение в участок воспаления или вблизи участка воспаления для создания относительно высокой локальной концентрации активного ингредиента. Это локальное введение может сопровождаться одним или несколькими системными введениями.
Обычно эти готовые формы готовят однородным и основательным внесением в препарат активного ингредиента предпочтительно с жидкими носителями или иногда мелкоизмельченными твердыми носителями или с обоими и затем, если необходимо, приданием формы этому продукту.
Готовые формы, подходящие для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают эту форму изотонической с кровью предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать в себя суспендирующие агенты и загущающие агенты. Эти готовые формы могут быть представлены в контейнерах со стандартной дозой или многодозовых контейнерах, например запаянных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии для добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Этой водной фазой может быть забуференный фосфатом солевой раствор или другой физиологический солевой раствор.
Готовые формы, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде капсул, крахмальных облаток или таблеток, каждая из которых содержит заданное количество активного ингредиента, в виде порошка или гранул; в виде раствора, или суспензии, или эмульсии в водной жидкости или неводной жидкости. Формы, подходящие для местного введения на кожу, могут быть представлены в виде мазей, кремов, гелей и паст, содержащих подлежащий введению ингредиент в фармацевтически приемлемом носителе. Готовые формы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящей основой, содержащей, например, какао-масло или салицилат. Готовые формы, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пенок или спреев, содержащих наряду с активным ингредиентом такие носители, которые являются подходящими, как известно в данной области.
Примерами стандартных лекарственных форм являются формы, содержащие суточную дозу или единицу, суточную субдозу, как указывалось здесь выше, или ее подходящую часть, вводимого ингредиента.
Максимальная допускаемая доза, которая может быть использована в соответствии с данным изобретением, зависит, среди прочего, от конкретного подлежащего лечению нарушения, конкретного пациента, тяжести воспалительной реакции и способа введения. Экспериментальные результаты показали, что обработанные нагреванием и измельченные гранулы титана имеют IP-10-связывающую способность более 2000 пг IP-10/мг частиц титана для ЗФР с добавленным IP-10, приблизительно 50 пг IP-10/мг частиц титана в сыворотке с добавленным IP-10 и более 3,5 пг IP-10/мг частиц титана в синовиальной жидкости. Эти числа могут быть использованы врачом в определении количества частиц металла (оксида) для введения, так как количество IP-10, присутствующего в биологической жидкости, для некоторых медицинских нарушений, пропорционально тяжести этого нарушения.
Агент-металл этого изобретения предпочтительно обеспечивают (трансплантируют, инъецируют или вводят другим образом) в участок или вблизи участка в пациенте, где желательна локальная экспрессия/контроль или модификация высвобождения IP-10. Это введение может выполняться трансплантацией гранул или частиц в участок-мишень или вблизи этого участка-мишени. Альтернативно, особенно при применении гранулятов и порошка, агент-металл (оксид) данного изобретения может инъецироваться в участок-мишень. Поскольку хемокины могут транспортироваться через кровеносную систему пациента, агент-металл данного изобретения может быть также использован для общей системы доставки и все еще быть способным влиять на экспрессию и высвобождение выбранного хемокина-мишени IP-10 из клеток в кровеносной системе и сосудах, в синовиальной жидкости, цереброспинальной жидкости, асцитической жидкости или в лимфе.
Альтернативный способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося нежелательной экспрессией/высвобождением IP-10, включает в себя обработку ex vivo биологической жидкости из пациента, страдающего от этого заболевания. Этот способ включает в себя экстракцию биологической жидкости из субъекта, страдающего от этого изобретения. Эта биологическая жидкость содержит нежелательные высокие уровни IP-10 и/или IP-10-продуцирующие клетки. Биологической жидкостью может быть кровь, плазма крови, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, асцитическая жидкость и/или синовиальная жидкость, в зависимости от конкретного лечения. Экстрагированную биологическую жидкость контактируют ех vivo с металлом или оксидом металла, где этот металл является металлом группы 4 или 5 периодической таблицы. В этом контакте металл-жидкость IP-10, присутствующий в этой биологической жидкости, будет связываться с поверхностью частиц металла (оксида) и тем самым удаляться из этой жидкости. Кроме того, любые IP-10-продуцирующие клетки, присутствующие в экстрагированной биологической жидкости, вследствие контакта клетка-поверхность металла будут прекращать или по меньшей мере уменьшать продуцирование ими IP-10. Затем эта очищенная биологическая жидкость может быть возвращена в субъекта. Этот способ похож на традиционный диализ, в котором биологическую жидкость экстрагируют и очищают, в данном случае от IP-10, перед возвратом в тело.
Контакт жидкость-металл может быть обычно очень коротким в виде связывания IP-10 с поверхностью частиц металла данного изобретения. Время контакта могло бы быть периодом от нескольких секунд до нескольких десятков минут.
Эта форма лечения может комбинироваться с другими схемами лечения, в которых биологическую жидкость экстрагируют из пациента и затем возвращают в тело. Например, традиционный диализ почек или печени может комбинироваться с дополнительной стадией очистки, в которой IP-10 удаляют из этой биологической жидкости, обычно крови. Пациенты, подсоединенные к аппаратам для сердца и/или легких, таких как аппараты экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЕСМО), могут получать пользу от дополнительной стадии очистки от IP-10 в соответствии с данным изобретением.
Эта форма лечения является, в частности, предпочтительной для пациентов, страдающих от септического шока после инфекции. Решающей стадией в спасении такого пациента является то, что септический шок и воспалительная реакция, которую он вызывает, следует устранить так быстро, как это только возможно. Такие пациенты могут быть подсоединены к непрерывному диализу IP-10 ex vivo в соответствии с данным изобретением. Затем уровень IP-10 в крови может поддерживаться при низком уровне, пока другие лекарственные средства не достигнут успеха в элиминации причины септического шока/инфекции.
Этот способ лечения имеет несколько преимуществ в сравнении с введением агента-металла (оксида) в тело субъекта. Во-первых, частицы металла (оксида) не будут вводиться в организм, и вследствие этого не будут возникать какие-либо побочные эффекты, ассоциированные с введением частиц металла. Во-вторых, могут использоваться более высокие количества частиц металлов и, следовательно, более высокая способность удаления IP-10 в сравнении с прямым введением в тело субъекта. В-третьих, частицы металла могут быть повторно использованы после подходящей обработки, в которой связанный IP-10 и другие молекулы были удалены с поверхностей этих частиц.
Фиг.15 и 16 схематически иллюстрируют два возможных устройства или два инструмента, которые могут быть использованы в связи с очисткой ех vivo экстрагированной биологической жидкости. На фиг.15 это устройство выполнено в основном в форме шприца 10, наполненного частицами 1 металла (оксида) данного изобретения, и снабжено фильтром 12 для предотвращения покидания этого шприца 10 частицами 1 металла. Во время обработки биологическую жидкость, такую как синовиальная жидкость, отбирают из тела субъекта в шприц 1. Эта жидкость проходит через фильтр 12 и приходит в контакт с частицами 1 металла. Любые молекулы IP-10, присутствующие в этой жидкости, становятся прикрепленными к поверхности этих частиц и тем самым удаляются из этой жидкости. После некоторого времени инкубирования эту жидкость вводят обратно в тело (в том же самом или другом участке относительно сайта оттягивания). Благодаря внимательному выбору пор фильтра, частицы 1 будут оставаться в шприце 10.
Размер пор фильтра может быть выбран таким образом, что клетки, присутствующие в экстрагированной биологической жидкости, не будут проходить через фильтр 12 и приходить в контакт с частицами 1 металла. Однако может быть выгодным позволение IP-10-продуцирующим клеткам в этой биологической жидкости контактировать с частицами 1 металла и тем самым подвергаться уменьшению продуцирования IP-10 вследствие контакта клетка-частица. В таком случае размер пор фильтра выбирают таким образом, чтобы позволить таким IP-10-продуцирующим клеткам, например моноцитам, эндотелиальным клеткам и фибробластам, но не частицам 1 металла, проходить через фильтр 12.
Фиг.16 иллюстрирует устройство 20, имеющее отдельный вход для жидкости и отдельный выход для жидкости. Устройство 20 образует камеру очистки, определяемую двумя фильтрами 22 и 24. Эта камера очистки наполнена частицами 1 металла (оксида) данного изобретения. Во время работы биологическую жидкость закачивают из пациента за первый фильтр 22. Здесь эта жидкость приходит в контакт с частицами 1 металла и любой IP-10, присутствующий в этой жидкости, будет связываться с поверхностью частицы. Затем, после инкубирования, эту очищенную жидкость закачивают за второй фильтр 24, и затем она может быть возвращена обратно в тело.
В данном изобретении предполагается, что фильтры 12, 22, 24, используемые в устройствах фигур 15 и 16, могут быть укреплены защитными слоями, которые предотвращают повреждение частицами 1 фильтров 12, 22, 24.
Вышеописанные устройства могут быть также использованы для обработки экстрагированной крови, которая не предназначена для возврата в того же самого субъекта. Таким образом, эти устройства могут быть использованы для уменьшения уровня IP-10, например крови или плазмы, продаваемой банком крови. Такой способ мог бы затем включать в себя контактирование образца организма, такого как жидкость тела, in vitro с металлом группы 4 или 5 или оксидом металла группы 4 или 5, удалением посредством этого IP-10 из образца тела, и предпочтительно также уменьшать уровень продуцирования IP-10 в этом образце организма.
ЭКСПЕРИМЕНТЫ
Селективное действие на цитокины и хемокины
После инфекции высвобождение экзогенных агентов, например LPS, и индукция эндогенных медиаторов, например хемокинов и цитокинов, способствует рекрутингу циркулирующих лейкоцитов к воспаленной ткани. Микробные продукты, подобные LPS, запускают высвобождение цитокинов множественными типами клеток, которые, в свою очередь, являются сильными индукторами хемокинов. Первичные цитокины действуют в качестве эндогенных активаторов иммунной реакции, в то время как индуцируемые хемокины действуют в качестве вторичных медиаторов для аттракции лейкоцитов [54]. Вследствие этого комплексного взаимодействия между цитокинами и хемокинами важно оценить действие гранул металла (оксида) не только на секрецию IP-10, но также на высвобождение других хемокинов и цитокинов, которое могло бы быть показателем синергического взаимодействия среди них в ответ на LPS и обработку гранулами титана.
Инкубирование цельной крови человека ex vivo с гранулами Ti
Модель цельной крови человека ех vivo использовали, как описано ранее [55]. Вкратце, к венозной крови из здоровых добровольцев (n=7) добавляли антикоагулянт гепарин (25 Е/мл крови; Leo, Ballerup, Denmark) и затем инкубировали в микроцентрифужных пробирках при 37°C с медленным вращением в присутствии липополисахарида (LPS) (10 нг/мл крови; LPS получали из Escherichia coli серотипа В6:026; Sigma, St. Louis, МО) и увеличивающихся доз серых гранул титана (0,015 г, 0,150 г, 0,300 г; Hereford Metal Powder Co Ltd, UK). Кровь, инкубированную только с LPS или солевым раствором, использовали в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.
Luminex-анализ
В разных временных точках (3, 6 и 24 часа) плазму получали центрифугированием при 7000 g в течение 3 минут и хранили при -20°C. Уровни двадцати пяти различных цитокинов в плазме (см. таблицу 1) анализировали с использованием способа твердофазного сэндвич-иммуноанализа с мультиплексными гранулами (Human cytokine 25-plex; Biosoutce International Inc., Camarillo, CA, USA) в соответствии с протоколом изготовителя. Вкратце, покрытые первичным антителом гранулы и инкубационный буфер пипетировали в 96-луночные фильтровальные планшеты. Стандарты и образцы инкубировали в присутствии гранул с первичным антителом в течение 2 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере. После этого лунки промывали и добавляли биотинилированные детектирующие антитела. После дополнительного инкубирования в течение 1 часа при комнатной температуре эти лунки промывали и в каждую лунку добавляли раствор стрептавидина-фикоэритрина и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Наконец, эти лунки тщательно промывали, добавляли покрывающую жидкость и считывали с использованием системы Luminex хМАР (Luminex Corporation, Austin, ТХ, USA).
Таблица 1
измеренные цитокины
IL-1β
IL-5
IL-12
INF-α
IP-10
IL-1Ra
IL-6
IL-13
IFN-γ
MIG
IL-2
IL-7
IL-15
GM-CSF
Эотаксин
IL-2R
IL-8
IL-17
MIP-1α
RANTES
IL-4
IL-10
TNF-α
MIP-1β
MCP-1
IL - интерлейкин
МСР - хемотаксический белок моноцитов
INF - интерферон
MIG - монокин, индуцируемый INF-γ
IP - индуцируемый интерфероном белок MIP - воспалительный белок макрофагов
GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
RANTES - регулируемый активацией, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками цитокин
Поразительным результатом этих экспериментов было то, что присутствие гранул титана оказывало значительное действие посредством почти полного прекращения экспрессии IP-10 зависимым от дозы образом.
Гранулы титана не оказывали эффекты или оказывали только минорные эффекты на другие цитокины, экспрессия которых индуцировалась LPS. Интересно, что после обработки гранулами титана не было такого же действия, которое наблюдали в отношении IP-10, на секрецию других хемокинов из того же самого семейства (СХС-хемокинов), что и IP-10, таких как IL-8.
Отрицательный контроль (солевой раствор) и положительный контроль (только LPS) обнаруживали предсказанные эффекты с нормальными уровнями цитокинов во всех образцах, инкубированных только с солевым раствором, и разительно увеличивающимися уровнями цитокинов в образцах, инкубированных с LPS, имитирующих появление острой инфекционной воспалительной реакции. В образцах, инкубированных с гранулами титана в отсутствие LPS, уровни цитокинов были вполне в пределах диапазона, наблюдаемого для отрицательного контроля, что указывает на то, что гранулы титана сами по себе не индуцируют воспалительную реакцию.
Действие Ti-гранул на секрецию IP-10 в цельной крови человека
Использовали модель цельной крови человека ex vivo, описанную ранее, выше и в [55]. Вкратце, свежую венозную кровь здоровых добровольцев (n=7) добавляли к разным количествам серых гранул титана (GG) и гранул с добавленными LPS (10 нг/мл). После 3, 6 и 24 часов плазму выделяли и анализировали на IP-10 анализом Luminex. Еще в одной серии экспериментов кровь подвергали предварительной обработке или последующей обработке введением гранул титана за 1 час до LPS одновременно с LPS или спустя 1 час после LPS.
Как показано на фиг.1, серые гранулы титана уменьшали продуцирование IP-10 в цельной крови человека здоровых добровольцев, стимулированных LPS, зависимым от дозы образом. Эти результаты являются значимыми во всех испытанных дозах и временных точках. Показаны средние величины ±SEM (стандартная ошибка среднего) 7 доноров, * указывает значимые различия в сравнении с вариантом «только LPS» (p<0,05).
Для определения, являются ли серые гранулы титана более эффективными в виде пре- или пост-обработки, гранулы титана вводили за 1 час до стимуляции LPS (-1t) одновременно с LPS (0t) или спустя 1 час после стимуляции LPS (+t) (n=3). Спустя шесть часов после добавления LPS, получали плазму, и уровни IP-10 анализировали анализом Luminex.
Фиг.2 показывает, что гранулы титана были равным образом эффективными в уменьшении IP-10 в крови, которую предварительно обрабатывали или обрабатывали одновременно и даже после LPS. Фоновые уровни IP-10 (без LPS) также значимо уменьшались в крови после различных периодов времени инкубирования с гранулами титана (GG) до той же самой степени, что и LPS-обработанные образцы с гранулами титана (GG+LPS). Показаны средние величины ±SEM 3 доноров, * указывает значимые различия GG в сравнении с фоном или «только LPS» соответственно (p<0,05).
Действие Ti-гранул на экспрессию гена IP-10 после инкубирования с кровью человека
Действие Ti-гранул на секрецию IP-10 было описано в представленных выше экспериментах. Затем исследовали, оказывали ли гранулы титана какое-либо действие на экспрессию гена IP-10.
Выделение РНК
Тотальную РНК выделяли из общих лейкоцитов или моноцитов после инкубирования цельной крови с гранулами титана в течение 2 часов с использованием мининабора RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) в соответствии с протоколом изготовителя. Для выделения моноцитов включали предварительную стадию обработки перед лизисом клеток для отделения моноцитов из цельной крови с использованием гранул Dynabeads CD 14, покрытых моноклональным анти-СШ4-антителом (Invitrogen/Dynal, Carlsbad, CA, USA). Количество тотальной РНК определяли при 260 нм с использованием спектрофотометра Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).
ОТ-ПЦР-анализ реального времени
Тотальную РНК (0,5 мкг), выделенную из общих лейкоцитов и моноцитов, подвергали обратной транскрипции с получением кДНК при 42°C в течение 60 минут с использованием набора для синтеза кДНК iScript (BioRad, Hercules, CA, USA), который содержит как oligo(dT), так и случайные гексамеры. Каждую кДНК замораживали (-20°C) в виде аликвот и хранили до проведения ПЦР-реакций.
ПЦР в реальном времени выполняли в iCycler (BioRad, Hercules, CA, USA) с использованием детектирования с помощью SYBR green. ПЦР в реальном времени выполняли для трех генов домашнего хозяйства: рибосомной РНК 18S (18S рРНК), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и β-актина, и четырех генов-мишеней: IP-10, IL-6, IL-10 и TNF-α. Таблица 2 дает перечни использованных праймеров и параметров ПЦР в реальном времени.
Таблица 2
Праймеры и параметры ПЦР
Ген
Последовательность праймера
SEQ ID NO:
T<sub>m</sub> ампликона (°C)
Размер ампликона
IP-10
S 5'-GCTACAATGAAAAAGAAGGGTGA-3'
1
84,5
185
A 5'-TAGGGAAGTGATGGGAGAGG-3'
2
IL-6
S 5'-AGGAGACTTGCCTGGTGAAA-3'
3
84,0
196
A 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCAG-3'
4
IL-10
S 5'-TTATCTTGTCTCTGGGCTTGG-3'
5
84,0
139
A 5'-ATGAAGTGGTTGGGGAATGA-3'
6
TNF-α
S 5'-CTATCTGGGAGGGGTCTTCC-3'
7
88,0
181
A 5'-GGGGGTAATAAAGGGATTGG-3'
8
β-актин
S 5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'
9
85,5
136
A 5'-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3'
10
18S pPHK
S 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'
11
86,0
151
A 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'
12
GAPDH
S 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'
13
85,0
87
A 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'
14
S: олигонуклеотидная последовательность смыслового праймера
А: олигонуклеотидная последовательность антисмыслового праймера
Каждая реакция содержала 5 мкл кДНК, 0,5 мкМ смыслового и антисмыслового специфических праймеров, 12,5 мкл 2Х IQ™ SYBR Green Supermix (BioRad, Hercules, CA, USA) в конечном объеме 25 мкл. Программа амплификации состояла из стадии предынкубации для денатурации матричной кДНК (3 мин, 95°C), с последующими 40 циклами, состоящими из стадии денатурации (15 с, 95°C), стадии отжига (15 с, 60°C) и стадии удлинения (30 с, 72°C). После каждого цикла измеряли флуоресценцию при 72°C. В каждом анализе обрабатывали отрицательный контроль без матрицы кДНК. Образцы испытывали в двух повторностях.
Эффективности реального времени рассчитывали из конкретных наклонов в программе iCycler с использованием серийных разведений, с получением степеней эффективности ПЦР в реальном времени всех исследованных транскриптов и высокой линейности (r>0,99) при использовании различных концентраций. ПЦР-продукты подвергали анализу кривых плавления на iCycler и затем электрофорезу на геле 2% агароза/ТАЕ для подтверждения специфичности амплификации, Tm и размера ампликона соответственно.
Для возможности относительного количественного определения после ПЦР строили калибровочные кривые на основании реакций стандартов для каждой мишени и генов домашнего хозяйства построением величин Ct (порога циклов), т.е. количества циклов, при котором сигнал флуоресценции превышает фон, в зависимости от log-разведения кДНК. Затем показатели Ct для каждого из неизвестных образцов использовали для расчета количества либо мишени, либо генов домашнего хозяйства относительно стандарта. Относительные уровни мРНК рассчитывали в виде отношения относительной концентрации для генов-мишеней к относительной концентрации для среднего между тремя генами домашнего хозяйства (18S рРНК, GAPDH и β-актина), для поправки на РНК. Величины выражали в виде процента от величин концентрации образцов отрицательного контроля (солевого раствора), которые принимали за 100%.
Экспрессию гена IP-10 подвергали мониторингу в а) общих лейкоцитах, которые оставались в суспензии после инкубирования с гранулами титана, b) общих лейкоцитах, которые присоединялись к гранулам титана после инкубации, и с) моноцитах, выделенных с гранулами, покрытыми моноклональным анти-CD14-антителом.
Фиг.3 иллюстрирует относительную экспрессию гена IP-10 в общих лейкоцитах и моноцитах после инкубирования цельной крови с гранулами титана в течение 2 часов. На фиг.3 видно, что моноциты имели наивысшую экспрессию гена IP-10. Лейкоциты, которые присоединялись к этим гранулам, обнаруживали более высокую экспрессию гена IP-10 (в 12 раз), чем лейкоциты, которые оставались в суспензии.
Моноциты человека выделяли для мониторинга экспрессии гена IP-10 с гранулами титана. Как видно на фиг.4, уровни мРНК IP-10 отрицательно регулировались в моноцитах после инкубации с гранулами титана (2 часа инкубации) и стимулировались LPS в двух тестируемых донорах.
Общая и дифференциальная лейкоцитарная формула
Проводили эксперименты для нахождения, какие типы лейкоцитов имеют способность присоединяться к поверхности гранул титана после инкубирования с цельной кровью человека.
После инкубирования крови с серыми гранулами титана в течение 2 часов, как описано выше, общую и дифференциальную лейкоцитарные формулы (WBC) определяли немедленно в гематологическом анализаторе (Cell-Dyn 4000, Abbott Diagnostics Division, Santa Clara, CA, USA).
Фиг.5 иллюстрирует общую и дифференциальную лейкоцитарную формулу WBC (т.е. нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы соответственно) после 2 часов инкубации с серыми гранулами титана или без серых гранул титана (GG). Гранулы титана обнаруживали способность связывать нейтрофилы и моноциты, которые, как известно, являются продуцентами IP-10.
Таблица 3 ниже дает список нормального диапазона для лейкоцитарной формулы WBC и дифференциальных лейкоцитов.
Таблица 3
Нормальный диапазон общей лейкоцитарной формулы (WBC) и дифференциальной WBC
Количество клеток на л
Процент общих WBC
WBC-формула
4,5-11×10<sup>9</sup>
Полиморфно-ядерные нейтрофилы
1,8-7,8×10<sup>7</sup>
50-70%
Палочкоядерные нейтрофилы
0-0,7×10<sup>9</sup>
0-10%
Базофилы
0-0,2×10<sup>9</sup>
0-2%
Эозинофилы
0-0,45×10<sup>9</sup>
0-6%
Лимфоциты
1-4,8×10<sup>9</sup>
15-45%
Моноциты
0-0,8×10<sup>9</sup>
0-10%
Статистика
Все данные представлены в виде средних величин ±SEM. Различия между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента при помощи программы SPSS для Windows, версии 14.0. Результаты считали статистически значимыми при уровне Р<0,05.
IP-10-связывающая способность Ti
Материалы
Рекомбинантный IP-10 человека покупали из R&D Systems и IP-10 анализировали при помощи способа сэндвич-ELISA в соответствии с протоколом изготовителя (R&D Systems). Действие различных форм титана на уровень хемокинов исследовали в трех различных системах: в модели петель, заполненных кровью, в сыворотке/ЗФР с добавленным IP-10 и в синовиальной жидкости. Таблица 4 дает список испытанных форм титана.
Таблица 4
Исследованные формы Ti
Металл
Аббревиатура
Состав
Размер частиц
Изготовитель
Ti-гранулы
GG
99,97%, >80% поропласта
⌀~1 мм
Hereford Metal Powder Co Ltd
Обработан-ныенагреванием
WG
99,97%
⌀~1 мм
Hereford Metal Powfer Co Ltd
Ti-гранулы 900°C, 3 ч
Просеянные GG
GP
99,97%, >80% поропласта
⌀~0,075 мм
Hereford Metal Powder Co Ltd
Измельчен-ные WG
WP
99,97%
*
Hereford Metal Powder Co Ltd
<sup>*</sup> Полученные Ti-частицы обычно имели размер в диапазоне от субмикрометров до 100 мкм, но со средним размером диаметра 100 мкм.
Система петель, заполненных кровью
IP-10 исследовали в системе петель, заполненных кровью (описанной ранее [56, 57]), за исключением того, что использовали полностью гепаринизированную ((20 Е/мл, Leo Pharma) кровь. Вкратце, свежую кровь человека из здоровых добровольцев собирали в поверхностно-гепаринизированные шприцы на 60 мл при помощи канюли (18-размера, Microlance; Becton Dickmson), которая была подсоединена к трубкам с гепаринизированной поверхностью. Во время взятия образцов этот шприц непрерывно вращается. Затем кровь (7-8 мл) добавляли в каждую петлю (PVC-пробирку, диаметр 6,3 мм, длина 39 см), оставляя объем воздуха ~4 мл. После заполнения этих трубок закрывали гепаринизированным коннектором из нержавеющей стали и помещали на устройство для покачивания при 37°C. Эти петли покачивали при установке амплитуды качания, которая предотвращала образование контакта крови с коннекторами. Для инициации продуцирования IP-10 добавляли LPS из Escherichia coli (10 нг/мл, Sigma). Титан в различных количествах и различных формах добавляли в эти петли для исследования действия на уровни IP-10. После 10, 30, 60, 120 и 180 минут образцы собирали и плазму хранили при -20°C до анализа на IP-10.
Сыворотка/ЗФР с добавленным IP-10
Сыворотку получали из донорской крови в соответствии со стандартным лабораторным протоколом. ЗФР дополняли 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) для предотвращения присоединения белка к пластиковым изделиям. К этой смеси сыворотка/ЗФР добавляли рекомбинантный IP-10 человека (200-2000 пг/мл) и образцы инкубировали с различными металлами/оксидами (20-200 мг) в течение 3 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере (~400 об/мин). После инкубации образцы центрифугировали в течение короткого периода времени (2 минуты при 10000 g) и супернатанты анализировали немедленно на содержание IP-10 или хранили в замороженном состоянии (-20°C) до анализа.
Синовиальная жидкость
Синовиальную жидкость (SF) получали из пациентов с ревматоидным артритом в Karolinska Hospital (Solna, Sweden) или из Oslo Rikshospital (Norway). В течение 3 часов 150 мкл SF инкубировали при комнатной температуре на орбитальном шейкере (~400 об/мин) с измельченными белыми гранулами (10-40 мг/образец) или без измельченных белых гранул (WP). При исследовании действия различных металлов/оксидов использовали образец 500 мкл и металлы/оксиды в количестве 20 мг. После инкубации образцы центрифугировали в течение короткого периода времени (2 минуты при 10000 g) и супернатанты анализировали немедленно на содержание IP-10 или хранили в замороженном состоянии (-20°C) до анализа.
Инфекцию крови имитировали добавлением LPS в петли, заполненные кровью, что приводило к увеличению продуцирования IP-10. После 2 часов уровень IP-10 в обработанной LPS крови повышался и дополнительно увеличивался спустя 3 часа. Добавлением необработанных пористых гранул титана (GG) уровни IP-10 уменьшались в инфицированной крови, см. фиг.6. Имелась реакция подобная реакции «доза-ответ» при добавлении различных количеств GG. После добавления только GG наблюдали нормальные уровни IP-10 в неинфицированной ткани. Два отрицательных контроля, ЗФР или ЗФР с 200 мг гранул титана не обнаруживали увеличения уровней IP-10.
Действие различных форм гранул титана на уровни IP-10 анализировали в системе петель, заполненных кровью. Было обнаружено, что как серые (GG), так и белые (WG) гранулы были одинаково эффективными в уменьшении IP-10. Порошковые формы этих гранул (WP) имели наивысшую уменьшающую IP-10 способность, как показано на фиг.7. Эта фигура иллюстрирует уровни IP-10 в крови спустя 180 минут после добавления LPS. Добавление 200 мг белого порошка (WP) к 7 мл инфицированной крови приводило к полностью элиминированной IP-10-реакции. Обработанную ЗР кровь использовали в качестве отрицательного контроля.
Для оценки способности измельченных белых гранул титана снижать IP-10 различные количества белого порошка (WP) добавляли к инфицированной (обработанной LPS) крови, и уровни IP-10 анализировали спустя 180 минут после этого добавления. Было обнаружено, что IP-10 регулируется в крови зависимым от дозы образом при добавлении WP, что иллюстрируется на фиг.8. Добавление 66 мг белого порошка к 7 мл инфицированной крови приводило к нормализованному уровню IP-10.
Исследовали временное связывание IP-10 с белым порошком в растворе ЗФР, и уже после 10 минут WP мог уменьшать уровни IP-10 до нуля (3 пг IP-10 на мл WP). Это уменьшение было необратимым и сохранялось на протяжении исследованного времени (24 часов). Это связывание было невозможно блокировать 5% БСА или 10% фетальной телячьей сывороткой, и оно не уменьшалось после добавления детергента (0,05% Твин-20).
Ранее было показано, что синовиальная жидкость из воспаленных суставов в пациентах с ревматоидным артритом содержит высокие уровни IP-10, которые могут влиять на патогенез этого заболевания [20, 58]. Уровень IP-10 в синовиальной жидкости из пяти разных пациентов сильно уменьшался после добавления белого порошка гранул (WP), см. фиг.9. Эту синовиальную жидкость инкубировали либо с 10, либо с 40 мг в течение 3 часов при комнатной температуре.
IP-10-связывающая способность измельченных белых гранул в синовиальной жидкости исследовали в системе, где увеличивающиеся количества WP добавляли к SF, см. фиг.10. В этих исследованиях наблюдали явную взаимосвязь доза-ответ.
Способность уменьшения связывания IP-10 измельченных белых гранул (WP) рассчитывали для различных исследованных здесь систем. В ЗФР с добавленным IP-10 удерживалось >2000 пг IP-10/мг WP, в сыворотке с добавленным IP-10 удерживалось приблизительно 50 пг IP-10/мг WP и в синовиальной жидкости >3,5 пг IP-10/мг WP.
Физическая характеристика гранул Ti
Сканирующий электронный микроскоп
Для испытания поверхности серых (GG) и белых (WG) гранул титана использовали сканирующий электронный микроскоп (SEM, Philips XL 30 ESEM, FEI Electron Optics, Eindhoven, Netherlands).
Порометрия с интрузией ртути
Измерения распределения размеров пор серых (GG) и белых (WG) гранул титана выполняли с использованием ртутной порометрии (Autopore IV 9500, Micromeritics, Norcross, GA, USA). Используемый угол контакта был равен 130°. Образцы откачивали в течение 10 минут при давлении откачки приблизительно 50 мкм Hg. Давление заполнения ртутью было равно приблизительно абсолютному давлению 0,22 фунта на квадратный дюйм.
Фиг.11 показывает поверхность необработанных гранул титана (серых гранул, GG), см. А, С и Е, и обработанных нагреванием (900°C, 3 ч) гранул титана (белых гранул, WG), см. В, D и Е, при увеличениях 250х, 2000х и 5000х. Из этих микрофотографий видно, что обработка нагреванием уменьшала количество пор в белых гранулах. Это согласуется с результатами, полученными с общей пористостью, которая была равна 73% и 57% для серых и белых гранул титана соответственно. Общий объем интрузии, общая поверхность интрузии, медианный диаметр пор, объемная плотность, кажущаяся плотность и процентная плотность для серых и белых гранул титана приведены в таблице 5.
Таблица 5
суммирование данных интрузии для серых и белых гранул Ti
Свойство
Серые гранулы Ti
Белые гранулы Ti
Общий объем интрузии (мл/г)
0,7394
0,4895
Общая площадь поверхности (м<sup>2</sup>/г)
0,055
0,021
Медианный диаметр пор (объем) (мкм)
180,0
328,7
Медианный диаметр пор (площадь) (мкм)
21,0
28,9
Кажущийся диаметр пор (4V/A) (мкм)
53,7
93,3
Объемная плотность при 0,22 фунта на квадратный дюйм (г/мл)
0,9913
1,1614
Кажущаяся (скелетная) плотность (г/мл)
3,7126
2,6916
Пористость (%)
73,3
56,9
Фиг.12 иллюстрирует логарифмический дифференциал объема интрузии ртути в зависимости от размера пор для серых (А) и белых (В) гранул Ti. Как показано на этой фигуре, микропоры (~40 мкм), присутствующие в серых гранулах, отсутствовали в белых гранулах, тогда как не было влияния нагревания на макропоры (~400 мкм).
IP-10-связывающая способность Ti и других металлов
Материалы
Для исследования IP-10-связывающей способности различных оксидов титана и других металлов использовали две различные системы: сыворотку с добавленным IP-10 и синовиальную жидкость. Таблица 6 дает перечень других металлов и оксидов, которые были исследованы, наряду с формами титана, приведенными в таблице 6.
Таблица 6
Исследованные металлы
Металл
Аббревиатура
Состав
Размер частиц
Изготовитель
TiO<sub>2</sub> (80% анатаз/20% рутил)
TiO<sub>2</sub>(80A/20R)
99,5%
~21 нм
Degussa
Ti(IV) оксид (рутил)
Ti(IV)Ox(R)
99,9%
<5 мкм
Aldrich
TiO<sub>2</sub> (анатаз)
TiO<sub>2</sub>(A)
-
-
Sachtleben
Карбид титана
TiCarb
-
<2 мкм
Roth
Ti(II) оксид
Ti(II)Ox
99,9%
<45 мкм
Aldrich
Ti порошок
Ti~325
99,9%
<45 мкм
Aldrich
Та порошок
Та~325
99,9%
<45 мкм
Aldrich
V порошок
V~325
99,5%
<45 мкм
Aldrich
Mn(II, III) оксид
Mn(II, IH)Ox
97%
-
Aldrich
Ni(II) оксид
Ni(II)Ox
76-77%
<10 мкм
Aldrich
Cu(II) оксид
Cu(II)Ox
97%
<5 мкм
Aldrich
Fe(III) оксид
Fe(III)Ox
98%
<5 мкм
Aldrich
Zn оксид
ZnOx
99%
-
Fluka
2
2
20 мг различных металлов добавляли к сыворотке с добавленным IP-10 (200 пг/мл). Фиг.13 показывает результаты из этих экспериментов. Среди различных форм титана можно сделать вывод, что белый титан (WP, Ti(IV)Ox(R), TiO(80A/20R), TiO(A)) является наиболее эффективной формой для снижения уровней IP-10 в крови. Как тантал, так и ванадий, которые являются близкородственными титану, были эффективными в снижении IP-10. Ни цинк, ни медь, ни марганец не влияли на уровни IP-10 в сыворотке с добавленным IP-10 в какой-либо степени.
Действие этих различных оксидов и металлов на уровни IP-10 исследовали также в синовиальной жидкости, см. фиг.14. Эти результаты в целом действительно подтвердили результаты, полученные для сыворотки с добавленным IP-10 за некоторыми исключениями. В SF Ti(II)оксид (черный столбец) и цинк были более эффективными, чем это наблюдали в исследованиях на сыворотке, в то время как другие металлы влияли на уровни IP-10 в той же самой степени.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что могут быть произведены различные модификации и изменения относительно данного изобретения без отклонения от его объема, который определен прилагаемой формулой изобретения.
Источники информации
[1] Refai et al., "Effect of titanium surface topography on macrophage activation and secretion of proinflammatory cytokines and chemokines". Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2004, 70(2): 194-205
[2] Fritz et al., "Chemokine gene activation in human bone marrow-derived osteoblasts following exposure to particulate wear debris", Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2006, 77(1): 192-201
[3] Rader et al., "Cytokine response of human macrophage-like cells after contact with polyethylene and pure titanium particles". The Journal of Arthroplasty, 1999, 14(7): 840-848
[4] Thomsen and Gretzer, "Macrophage interactions with modified material surfaces", Current Opinion in Solid State and Materials Science, 2001, 5: 163-176
[5] Soejima and Rollins, "A functional IFN-gamma-inducible protein-10/CXCL 10-specific receptor expressed by epithelial and endothelial cells that is neither CXCR3 nor glycosaminoglycan". The Journal of Immunology, 2001, 167(11): 6576-6582
[6] Wang et al., "High levels of CXCL10 are produced by intestinal epithelial cells in AIDS patients with active cryptosporidiosis but not after reconstitution of immunity". Infection and Immunity, 2007, 75(1): 481-487
[7] Lane et al., "The C-X-C chemokine IP-10 stimulates HIV-I replication", Virology, 2003, 307(1): 122-134
[8] Reinhart, "Chemokine induction by HIV-I: recruitment to the cause", Trends in Immunology, 2003, 24(7): 351-353
[9] Cinque et al., "Cerebrospinal fluid interferon-gamma-inducible protein 10 (IP-10, CXCL10) in HIV-I infection", Journal of Neuroimmunology, 2005, 168(1-2): 154-163
[10] ter Meulen et al., "Activation of the cytokine network and unfavorable outcome in patients with yellow fever". The Journal of Infectious Diseases, 2004, 190(10): 1821-1827
[11] Spurrell et al., "Human airway epithelial cells produce IP-10 (CXCL10) in vitro and in vivo upon rhinovirus infection", American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology, 2005, 289(1): L85-95
[12] Sorensen, "Targeting the chemokine receptor CXCR3 and its ligand CXCL10 in the central nervous system: potential therapy for inflammatory demyelinating disease?". Current Neurovascular Research, 2004, 1(2): 183-190
[13] Simpson et al., "Expression of the interferon-gamma-inducible chemokines IP-10 and Mig and their receptor, CXCR3, in multiple sclerosis lesions", Neuropathology and Applied Neurobiology, 2000, 26(2): 133-142
[14] Sorensen et al., "Multiple sclerosis: a study of CXCL10 and CXCR3 co-localization in the inflamed central nervous system". Journal of Neuroimmunoly, 2002, 127(1-2): 59-68
[15] Tanuma et al., "Chemokine expression by astrocytes plays a role in microglia/macrophage activation and subsequent neurodegeneration in secondary progressive multiple sclerosis", Acta Neuropathologica (Berlin), 2006, 112(2): 195-204
[16] Mahad et al., "Expression of chemokines in the CSF and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis", Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 2002, 72(4): 498-502
[17] Tsunoda et al., Distinct roles for IP-10/CXCL10 in three animal models, Theiler's virus infection, EAE, and MHV infection, for multiple sclerosis: implication of differing roles for IP-10", Multiple Sclerosis, 2004, 10(1): 26-34
[18] Chen et al., "In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis". Journal of Autoimmunity, 2007, 28(1): 30-40
[19] Patel et al., "CXCR3 and CCR5 ligands in rheumatoid arthritis synovium", Clinical Immunology, 2001, 98(1): 39-45
[20] Aggarwal et al., "Chemokine and chemokine receptor analysis reveals elevated interferon-inducible protein- 10 (IP) -10/ CXCL10 levels and increased number ofCCR5+and CXCR3+CD4 Т cells in synovial fluid of patients with enthesitis-related arthritis (ERA)", Clinical and Experimental Immunology 2007, 148(3): 515-519
[21] Hanaoka et al., "A novel mechanism for the regulation of IFN-gamma inducible protein-10 expression in rheumatoid arthritis". Arthritis Research & Therapy, 2003, 5(2): R74-81
[22] Garcia-Vicuna et al., "CC and CXC chemokine receptors mediate migration, proliferation, and matrix metalloproteinase production by fibroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients", Arthritis & Rheumatism, 2004, 50(12): 3866-3877
[23] Narumi et al., Expression of IFN-inducible protein-10 in chronic hepatitis". The Journal of Immunology, 1997, 158(11): 5536-5544
[24] Nishioji et al., "Increase of chemokine interferon-inducible protein-10 (IP-10) in the serum of patients with autoimmune liver diseases and increase of its mRNA expression in hepatocytes". Clinical and Experimental Immunology, 2001, 123(2): 271-279
[25] Flier et al., "Differential expression of CXCR3 targeting chemokines CXCL10, CXCL9, and CXCL11 in different types of skin inflammation". The Journal of Pathology, 2001, 194(4): 398-405
[26] Narumi et al., "Serum levels of IFN-inducible protein- 10 relating to the activity of systemic lupus erythematosus", Cytokine, 2000, 12(10): 1561-1565
[27] Danese and Gasbarrini, "Chemokines in inflammatory bowel disease". Journal of Clinical Pathology, 2005, 58(10): 1025-1027
[28] Ito et al., "Interferon-gamma is causatively involved in experimental inflammatory bowel disease in mice", Clinical and Experimental Immunology, 2006, 146(2): 330-338
[29] Uguccioni et al., "Increased expression of IP-10, IL-8, MCP-1, and MCP-3 in ulcerative colitis", The American Journal of Pathology, 1999, 155(2): 331-336.
[30] Singh et al., "IFN-gamma-inducible chemokines enhance adaptive immunity and colitis" Journal of Interferon and Cytokine Research, 2003, 23(10): 591-600
[31] Singh et al., "CXCR3 axis: role in inflammatory bowel disease and its therapeutic implication", Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets, 2007, 7(2): 111-123
[32] Sasaki et al., "Blockade of CXCL10 protects mice from acute colitis and enhances crypt cell survival", European Journal of Immunology, 2002, 32(11): 3197-3205
[33] Suzuki et al., "Blockade of interferon-gamma-inducible protein-10 attenuates chronic experimental colitis by blocking cellular trafficking and protecting intestinal epithelial cells", Pathology International, 2007, 57(7): 413-420
[34] Inatomi et al., "Butyrate blocks interferon-gamma-inducible protein-10 release in human intestinal subepithelial myofibroblasts". Journal of Gastroenterology, 2005, 40(5): 483-489
[35] Breuer et al., "Rectal irrigation with short-chain fatty acids for distal ulcerative colitis. Preliminary report," Digestive Diseases and Science, 1991, 36(2): 185-187
[36] Herder et al., "Constitutive and regulated expression and secretion of interferon-gamma-inducible protein 10 (IP-10/CXCL10) in human adipocytes", International Journal of Obesity (Lond), 2007, 31(3): 403-410
[37] Mach et al., "Differential expression of three Т lymphocyte-activating CXC chemokines by human atheroma-associated cells", The Journal of Clinical Investigation, 199, 104(8): 1041-1050
[38] Heller et al., "Chemokine CXCL10 promotes atherogenesis by modulating the local balance of effector and regulatory Т cells". Circulation, 2006, 113(19): 2301-2312
[39] Braunersreuther et al., "The specific role of chemokines in atherosclerosis", Thrombosis and Haemostasis, 2007, 97(5): 714-721
[40] Bisset and Schmid-Grendelmeier, "Chemokines and their receptors in the pathogenesis of allergic asthma: progress and perspective," Current Opinion in Pulmonary Medicine, 2005, 11(1): 35-42
[41] Medoff et al., "IFN-gamma-inducible protein 10 (CXCL10) contributes to airway hyperreactivity and airway inflammation in a mouse model of asthma". The Journal of Immunology, 2002, 168(10): 5278-5286
[42] Larsson, "Aspects on pathophysiological mechanism in COPD", Journal of Internal Medicine, 2007, 262: 311-340
[43] Hu et al., "Elevation of CXCR3-binding chemokines in urine indicates acute renal-allograft dysfunction", American Journal of Transplantation, 2004, 4(3): 432-437
[44] Kanmaz et al., "Surveillance of acute rejection in baboon renal transplantation by elevation of interferon- gamma inducible protein-10 and monokine induced by interferon-gamma in urine", Transplantation, 2004, 78(7): 1002-1007
[45] Zhu et al., "Changes of inducible protein-10 and regulated upon activation, normal Т cell expressed and secreted protein in acute rejection of pancreas transplantation in rats", World Journal of Gastroenterology, 2006, 12(26): 4156-4160
[46] Melter et al., "Expression of the chemokine receptor CXCR3 and its ligand IP-10 during human cardiac allograft rejection", Circulation, 2001, 104(21): 2558-2564
[47] Baker et al., "Genetic deletion of chemokine receptor CXCR3 or antibody blockade of its ligand IP-10 modulates posttransplantation graft-site lymphocytic infiltrates and prolongs functional graft survival in pancreatic islet allograft recipients", Surgery, 2003 134(2): 126-133
[48] Hancock et al., "Donor-derived IP-10 initiates development of acute allograft rejection", The Journal of Experimental Medicine, 2001, 193(8): 975-980
[49] Hancock et al., "Requirement of the chemokine receptor CXCR3 for acute allograft rejection". The Journal of Experimental Medicine, 2000, 192(10): 1515-1520
[50] Ondeykal et al., "Discovery of structurally diverse natural product antagonists of chemokine receptor CXCR3", Molecular Diversity, 2005, 9(1-3): 123-129
[51] Coussens and Werb, "Inflammation and cancer", Nature, 2002, 420(6917): 860-867
[52] van Kempen et al., "The tumor microenvironment: a critical determinant of neoplastic evolution", European Journal of Cell Biology, 2003, 82(11): 539-548
[53] Robinson et al., "Soluble mediators of inflammation during tumor development", Advances in Cancer Research, 2005, 93: 159-187
[54] Gouwym et al., "Synergy in cytokine and chemokine networks amplifies the inflammatory response", Cytokine & Growth Factor Reviews, 2005, 16(6): 561-580
[55] Wang et al., "Cytokine modulation in experimental endotoxemia: characterization of an ex vivo whole blood model", European Suigical Research, 2000, 32(2): 65-73
[56] Bennet et al., "Incompatibility between human blood and isolated islets of Langerhans: a finding with implications for clinical intraportal islet transplantation?". Diabetes, 1999, 48(10): 1907-1914
[57] Gong et al., "Tubing loops as a model for cardiopulmonary bypass circuits: both the biomaterial and the blood-gas phase interface induce complement activation in an in vitro model". Journal of Clinical Immunology, 1996,16(4): 222-229
[58] Patel et al., "CXCR3 and CCR5 ligands in rheumatoid arthritis synovium". Clinical Immunology, 2001, 98(1): 39-45
[59] WO 2005/060457