БИОДЕГРАДИРУЕМОЕ РАНЕВОЕ ПОКРЫТИЕ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО РАНЕВОГО ПОКРЫТИЯ
BIODEGRADABLE WOUND COATING AND METHOD FOR PREPARING BIODEGRADABLE WOUND COATING

Группа изобретений относится к медицине, биологии, ветеринарии, фармакологии. Данные технические решения могут быть использованы при изготовлении раневых покрытий для лечения ран кожных покровов различного генеза.
Известны раневые покрытия, выполненные в виде листов или пленок из смеси синтетических полимеров и полимеров биологического происхождения. Покрытия, выполненные только из синтетических полимеров монокомпонентные, например полиуретановые [патент СИТА № 2871218], или многокомпонентные, например из смеси полиуретана и полиаллилового эфира [патент ФРГ №34098558], обладают хорошими физико-механическими свойствами, достаточно прочные, водо- и паропроницаемые, но выполняют только защитную функцию и не обладают способностью стимулировать регенерационные процессы.
Известны также раневые покрытия в виде коллагеновых губок или повязок, на которые нанесены активные вещества. Известны, в частности, пористые губки для лечения ран из коллагена [авторское свидетельство СССР №561564]; смеси желатина, хитозана и формальдегида [патент КНР №1097980]; желатина и формальдегида с добавлением антибиотиков [патент РФ №2033149]; целлюлозы и хитозана [заявка Японии №0376029]; коллагена и хитозана [патент РСТ №8504413].
Основным недостатком данных губок является относительно невысокая ранозаживляющая активность, обусловленная залипанием губки на ране. Чисто коллагеновые губки обладают плохим подводом кислорода к зоне репарации.
Известно достаточно много образцов раневых покрытий, отличающихся по химическому составу. Из существующего в настоящее время широкого ассортимента полимерных раневых покрытий в наибольшей степени отвечают всем медико-биологическим требованиям биодеградируемые покрытия из полисахаридов, которые могут быть полезны как на ранних стадиях лечения ран, так и на более поздних. Общими свойствами биосовместимых материалов из полисахаридов, в том числе хитозана, являются их гидрофильность, обусловливающая высокую адсорбирующую способность (до 5000%), хорошая адгезия к ране, отсутствие токсичности и раздражающего действия, а также гемостатические свойства. Отмечено их стимулирующее действие на процессы заживления ран и ожогов, что способствует более быстрому развитию грануляционной ткани, ускорению эпителизации. Присутствие на ране полисахаридных материалов благоприятно сказывается на репарационных процессах на всех стадиях лечения раны. Основной проблемой получения покрытий из природных полисахаридов является достижение хорошей механической прочности покрытия и устойчивости на ране. Разработка биодеградируемых полимерных покрытий с высокой сорбирующей способностью и различными сроками рассасывания является в настоящее время наиболее актуальным направлением в области создания эффективных биологических повязок для лечения ран. Покрытия из хитозана воздухо- и паропроницаемы, препятствуют инвазии извне микроорганизмов, создают оптимальный микроклимат в ране, способствуют клеточному росту и пролиферации в ране. Хитозан, помимо стимулирования пролиферации на первых стадиях раневого процесса, очень полезен на завершающей фазе заживления - перестройке рубца. Его присутствие в ране помогает избежать образования грубых рубцов [патент РФ №2468129].
Известна повязка, один из вариантов которой содержит хитозан и выполнен в форме эластичной перфорированной пленки [заявка РФ №99100105].
Однако данная пленка многослойна и, как следствие, невозможны ее полная конгруэнтность с раневой поверхностью и удаление раневого отделяемого путем впитывания сорбирующим слоем повязки, что приводит к неизбежности частой смены повязок.
Известна также биологически активная полимерная сорбирующая пленка, созданная на основе хитозана [Кильдеева Н.Р., Вихорева Т.А., Ларионова А.С., Гальбрайх Л.С. // Современные подходы к разработке эффективных шовных материалов и полимерных имплантатов: Матер. III международ. конф. М., 1998, 130-131 с.], содержащая ферментативный препарат трипсин и модифицированная сшивающим реагентом - додецилсульфатом натрия, проявляющим, кроме того, антимикробные свойства.
Однако пленка плохо моделируема на ране. Низкая прочность повязки во влажном состоянии создает вероятность выброса раневого отделяемого из повязки в раневую зону. В составе пленки присутствует токсичный для организма человека реагент - додецилсульфат натрия.
Известна полимерная пленка на рану на основе хитозана, имеющая толщину 5-50 мкм, модифицированная сшивающим агентом эпихлоргидрином, которая также может содержать 0-20% поливинилового спирта или полиэтиленгликоля и антибактериальные или антисептические вещества [патент WO №2001/0141820].
Однако данная пленка имеет относительно невысокую адсорбирующую способность, быструю биодеградацию пленки в раневой среде, что затрудняет очищение раны, т.к. адсорбируемое пленкой раневое отделяемое и продукты биодеградации остаются в ране, полное удаление пленки возможно лишь при использовании на относительно сухих ранах.
2
Известна повязка, представляющая собой перфорированную пленку и содержащая хитозан в виде соли органической кислоты (уксусной, янтарной или гликолевой), глутаровый альдегид, поливиниловый спирт и биологически активную добавку в виде CO-экстрактов лекарственных растений [патент РФ №2219954].
2
Недостатки повязки: недостаточная конгруэнтность с раневой поверхностью, невысокая адсорбирующая способность, ограниченная паропроницаемость. В случае использования в качестве биологически активной добавки СО-экстрактов лекарственных растений, например тысячелистника, облепихи, подорожника, эвкалипта, полыни горькой, зверобоя, кориандра, повышается вероятность развития аллергических реакций. Недостатками являются также сложный состав повязки, включение в нее токсичного глутарового альдегида, низкие эластичные свойства из-за увеличения сшивок между глутаровым альдегидом, хитозаном и поливиниловым спиртом.
Известно также раневое покрытие на основе коллаген-хитозанового комплекса для восстановления дефектов кожи в виде губки, геля, коллоидного раствора, пленки. Хитозановая составляющая содержит хитозан со степенью деацетилирования 0,95-0,99 и молекулярной массой 100-1000 кДа в виде аскорбата хитозана при содержании аскорбиновой кислоты 1,8 г/л сухого хитозана, а также хондроитинсерную кислоту - 5-100 мг/г сухого хитозана, гиалуроновую кислоту - 10-100 мг/г сухого хитозана, гепарин - 2,5-5 мг/г сухого хитозана и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота - 11-220 мкг/г сухого хитозана [патент РФ №2254145].
Однако входящий в состав раневого покрытия сывороточный фактор роста крупного рогатого скота является белковым компонентом, оказывающим дополнительный аллергизирующий эффект.
Наиболее близким аналогом к заявляемому биодеградируемому раневому покрытию является биоразлагаемая пленка, которая содержит пектин, хитозан, воду, однонормальную соляную кислоту, пластификатор - глицерин и структурообразователь - трехпроцентный раствор метилцеллюлозы [патент РФ №2458077].
Однако данное раневое покрытие имеет свои недостатки. Как известно, добавление структурообразователя (3% раствор метилцеллюлозы) ограничивает возможность формирования пленок различной толщины, периметра и, таким образом, создает определенные препятствия для плотного прилегания пленки к поверхности раны, тем самым, понижая ее адгезию к раневой поверхности. Кроме того, метиллцеллюлоза может вызывать слабовыраженные аллергические реакции, что может привести к метаболическим нарушениям, замедляющим регенерацию поврежденных тканей.
Вторым заявляемым в данной заявке изобретением является способ получения биодеградируемого раневого покрытия.
Известен способ получения раневого покрытия «ХИТОСКИН», описанный в патенте РФ на полезную модель №8608. Навески хитозана и коллагена отдельно растворяют в уксусной кислоте, затем смешивают растворы, подвергают полученную смесь диализу против дистиллированной воды с периодической сменой воды до тех пор, пока pH диализуемой смеси не превысит 5.2, затем добавляют биологически активное вещество и структурообразователь. Полученный раствор замораживают в сублимационной камере до -35°С и далее подвергают сублимационной сушке.
Основной недостаток способа получения данного раневого покрытия - большой процент брака при промышленном производстве (до 70%). Он выражается в том, что в ходе лиофилизации часто наблюдается контракция губок, заключающаяся в сжатии губки (уменьшение площади губки в результате лиофилизации до 30% от исходной) с потерей пористой структуры, а также ее вспячивание и выгибание с потерей плоской формы. В результате этих явлений раневое покрытие получается жестким, плохо моделирует раневую поверхность. По-видимому на возникновение контракции губок сильное влияние оказывает скорость замораживания полимерного раствора (геля). На используемых в промышленности установках при скоростях замораживания больше 4°/час в материале возникают флуктуации температуры, что провоцирует формирование неравномерной структуры пор и неравновесное фазовое разделение, приводящее при дальнейшей сушке к деформации пластин материала и потере пористости.
Известен также способ получения пленки на основе хитозана, включающий приготовление формовочного раствора из воздушно-сухой навески хитозана и раствора органической кислоты, нанесение полученного раствора на подложку с последующим выдерживанием раствора на подложке до достижения пленочной структуры. Формовочный раствор включает хитозан в виде соли уксусной или янтарной кислоты. После выдерживания пленочную структуру обрабатывают парами воды или водного раствора 0,5 н. соляной кислоты до степени набухания пленки 70-190%, при этом обеспечивают величину относительного удлинения пленки при разрыве не менее 20%. Описан также способ, в котором пленку помещают в дистиллированную воду или физиологический раствор (0,9% NaCl) до степени набухания пленки не менее 90%, при этом обеспечивают величину относительного удлинения пленки при разрыве не менее 30% [патент РФ №2429022].
Однако данный способ трудоемкий, имеет множество последовательных действий, включающих приготовление формовочного раствора в течение 1 суток с периодическим встряхиванием. Получение пленки осуществляют в течение 2-3 суток.
Наиболее близким к заявляемому способу получения биодеградируемого раневого покрытия является способ получения биоразлагаемой пленки, описанный в патенте РФ №2458077. Пектин растворяют в дистиллированной воде. Затем для лучшего растворения компонентов раствор помещают в термостат на 1 минуту при температуре 37-38°С. Хитозан растворяют в 1 н. (однонормальной) соляной кислоте. Для лучшего растворения компонентов раствор также помещают в термостат на 1 минуту при температуре 37-38°С. Затем полученные растворы пектина и хитозана предпочтительно в равной пропорции сливают и перемешивают до полного растворения образующихся сгустков. Для того чтобы пленка была прочной и равномерно отделялась от подложки, после перемешивания сгустков в полученный раствор добавляют пластификатор и структурообразователь. Полученную массу осторожно выливают в чашку Петри. Пленку формируют на стеклянной подложке (в чашке Петри) в течение 20-24 часов при температуре от 0 до 25°С.
Однако растворение хитозана в однонормальной соляной кислоте не позволяет регулировать на этапе изготовления пленки уровень pH формовочного раствора. Как известно, именно физиологический уровень pH покрытия позволяет добиться оптимальных физиологических условий для процесса регенерации.
Задачей заявляемого изобретения по поводу раневого покрытия является повышение его антиоксидантных свойств с обеспечением физиологического уровня pH покрытия при простоте его использования и низкой себестоимости его компонентов.
Задачей заявляемого изобретения по поводу способа является упрощение процесса получения раневого покрытия, не требующего использования дорогостоящего оборудования, с обеспечением достижения максимального клинического эффекта при использовании покрытия.
Сущность заявляемого изобретения по поводу покрытия заключается в том, что биодеградируемое раневое покрытие, выполненное в виде пленки и содержащее хитозан, пластификатор в виде глицерина, растворитель, дополнительно содержит церулоплазмин и L-аспарагиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:
хитозан - 5,3÷5,7;
глицерин - 2,2÷2,8;
церулоплазмин - 0,06÷0,08;
L-аспарагиновая кислота - 0,04÷0,06;
растворитель - остальное,
2
при этом в качестве хитозана используют низкомолекулярный пищевой хитозан, а растворитель - с уровнем pH 5-7. Заявляется также биодеградируемое раневое покрытие с вышеописанными признаками, в котором в качестве растворителя используют физиологический раствор или дистиллированную воду. Кроме того, заявляется также биодеградируемое раневое покрытие с вышеописанными признаками, пленка которого имеет отверстия диаметром 0,2-0,5 мм и концентрацией их распределения в ней 10-15 шт. на 100 мм.
Сущность заявляемого изобретения по поводу способа заключается в том, что в способе получения биодеградируемого раневого покрытия, включающем: приготовление навески хитозана; разведение последней в растворителе путем добавления навески хитозана в растворитель, перемешивания полученной смеси и помещения ее в термостат; добавление в полученную смесь пластификатора в виде глицерина и помещение полученной биомассы в емкости с обеспечением формирования пленки путем высушивания биомассы в течение 18-24 часов, растворитель используют с уровнем pH 5-7, навеску хитозана приготавливают из пищевого низкомолекулярного хитозана и разводят ее в растворителе из расчета 1000 мг навески на 15 мл растворителя, при этом полученную смесь помещают в термостат при температуре 37-42°С на 1-2 часа, затем в смесь добавляют разведенный в растворителе церулоплазмин из расчета 1:10 с обеспечением образования гомогенного гидрогеля, после растворяют L-аспарагиновую кислоту в предварительно нагретом до 37-40°С растворителе, обеспечивая пропорцию 100 мг L-аспарагиновой кислоты на 10 мл растворителя, и добавляют в смесь до получения уровня pH смеси 5-7; пластификатор вводят в смесь в объеме 2,2-2,8% от общего объема полученной при этом биомассы, последнюю перемешивают со скоростью 100-150 об/мин в течение 30-60 секунд; помещение биомассы в емкости выполняют путем обеспечения образования равномерного слоя покрытия с высотой 3-5 мм; высушивание покрытия производят в термостате при температуре 37-40°С.
2
Заявляется также способ получения биодеградируемого раневого покрытия с вышеописанными признаками, в котором полученную пленку перфорируют с обеспечением диаметра отверстий 0,2-0,5 мм и концентрацией их распределения 10-15 шт. на 100 мм.
Технический результат заявляемого изобретения по поводу покрытия
Известно, что в ране, особенно инфицированной, отмечают существенные метаболические нарушения, в том числе активацию процессов свободнорадикального окисления, продукты которого дополнительно оказывают повреждающее действие на клеточные мембраны. Это ведет к замедлению регенераторных процессов. Данная проблема была исключена в заявляемом изобретении - раневом покрытии путем введения в его состав антиоксиданта, а именно церулоплазмина, который понижает уровень токсичных свободных кислородных радикалов, тем самым, способствуя ускорению регенеративных процессов.
Повреждения целостности кожного покрова приводят к развитию целого каскада патологических реакций, а это, в свою очередь, вызывает существенные изменения уровня pH биологических жидкостей. С целью восстановления физиологического уровня показателей pH и их стабилизации в состав раневого покрытия дополнительно включен забуферивающий агент в виде L-аспарагиновой кислоты, помимо того активно влияющий на синтез ДНК и РНК.
Использование заявляемой в данной заявке совокупности компонентов в разработанных авторами соотношениях позволяет получить биодеградируемое раневое покрытие, обладающее регенерирующими, антиоксидантными, достаточными антибактериальными свойствами, предупреждающими инфицирование ран, при этом раневое покрытие достаточно эластичное и обеспечивает необходимую адгезию к раневой поверхности.
Выполнение биодеградируемого эластичного покрытия в виде пленки, полностью и надежно закрывающей раневую поверхность, не требующей повторного нанесения, повторяющей пространственное расположение раневого повреждения, позволяет также использовать его в качестве носителя для дополнительных лечебных компонентов. Раневое покрытие с заявляемым составом и физическими характеристиками (в виде эластичной пленки) позволяет изолировать раневую поверхность от проникновения патогенной и условно патогенной микрофлоры, обеспечивает газообмен и водный баланс, что является важнейшими факторами для обеспечения протекания процесса регенерации. Использование в заявляемом биодеградируемом раневом покрытии в качестве основы хитозана исключает необходимость повторного нанесения покрытия, использования перевязочных материалов и каких-либо дополнительных воздействий на рану. Описанное в данной заявке покрытие может быть нанесено в бытовых условиях, поскольку хитозан и другие его компоненты при их местном применении не проявляют токсических и аллергических эффектов, вследствие чего покрытие может быть применимо во всех возрастных группах у пациентов с различными соматическими статусами как в стационарах, так и в домашних условиях. Одновременно хитозан проявляет антибактериальные и регенерирующие свойства на раневой поверхности, создавая оптимальные условия для действия других компонентов раневого покрытия, обеспечивая суммарный эффект, превышающий активность исходных компонентов.
В состав заявляемого покрытия входят дешевые компоненты, произведенные на территории РФ, имеющиеся в открытом, безрецептурном доступе.
Технический результат заявляемого изобретения по поводу способа
Изготовление раневого покрытия не требует использования дорогостоящего оборудования и создания специальных условий, а именно гомогенизация исходных компонентов осуществляется за счет воздействия температурного режима и равномерного перемешивания. Конечный результат достигается путем открытого высушивания при разработанных условиях, что позволяет получить готовое к применению раневое покрытие, обладающее максимальной адгезией к раневой поверхности, пластичностью и гидрофобностью. Получение пленок с заданной высотой и равномерным распределением активных компонентов за счет последовательности действий заявляемого способа, их температурных, временных характеристик, а также наличие физических факторов, таких как перемешивание, сливание компонентов в нормальных атмосферных условиях, позволяет добиться регенерирующих и профилактических антибактериальных свойств в отношении ран мягких тканей. Использование заявляемых покрытий не требует специальной квалификации и доступно широким слоям населения в быту.
Заявляемая группа изобретений поясняется с помощью Фиг.1-6, на которых изображены:
на Фиг.1 - общий вид биодеградируемого раневого покрытия со стороны ее шероховатой поверхности, контактирующей с раной;
на Фиг.2 - общий вид биодеградируемого раневого покрытия со стороны глянцевой поверхности;
на Фиг.3 - биодеградируемое раневое покрытие в согнутом виде с иллюстрированием его гибкости и пластичности;
на Фиг.4 - общий вид биодеградируемого раневого покрытия на биологическом объекте в 1-е сутки после его нанесения;
на Фиг.5 - общий вид биодеградируемого раневого покрытия на биологическом объекте в 6-е сутки после его нанесения;
на Фиг.6 - общий вид биодеградируемого раневого покрытия на биологическом объекте в 8-е сутки после его нанесения.
2
Биодеградируемое раневое покрытие выполнено в виде гибкой полупрозрачной пленки. В ее состав входят низкомолекулярный пищевой хитозан, пластификатор в виде глицерина, растворитель, церулоплазмин и L-аспарагиновая кислота. В качестве растворителя используют физиологический раствор или дистиллированную воду с уровнем pH 5-7. Соотношение компонентов в пленки распределено следующим образом, масс.%: хитозан - 5,3÷5,7; глицерин - 2,2÷2,8; церулоплазмин - 0,06÷0,08; L-аспарагиновая кислота - 0,04÷0,06; растворитель - остальное. В частных случаях пленка может иметь отверстия диаметром 0,2-0,5 мм с концентрацией их распределения в ней 10-15 шт. на 100 мм.
Способ получения раневого покрытия осуществляют следующим образом.
Приготавливают навеску пищевого низкомолекулярного хитозана. Разводят последнюю в растворителе, в частности физиологическом растворе или дистиллированной воде, для чего добавляют приготовленную ранее навеску хитозана в растворитель, размещенный в емкости, например стакане, выполненном из полипропилена, из расчета 1000 мл навески на 15 мл растворителя. Перемешивают полученную смесь и помещают ее в термостат при температуре 37-42°С на 1-2 часа до обеспечения полного растворения хитозана в растворителе с образованием полупрозрачной однородной гомогенной массы желто-коричневого цвета. Затем в отдельной емкости разводят церулоплазмин в растворителе из расчета 10 мл церулоплазмина на 1 мл растворителя. Разведенный церулоплазмин добавляют в полученную смесь с обеспечением образования гомогенного гидрогеля. Затем подготавливают растворитель порядка 10 мл, подогревая его в термостате до температуры 37-40°С. Растворяют в отдельной емкости в подогретом растворителе L-аспарагиновую кислоту, обеспечивая пропорцию - 100 мг L-аспарагиновой кислоты на 10 мл растворителя. Добавляют приготовленный раствор L-аспарагиновой кислоты в смесь до получения уровня pH смеси 5-7. После добавляют в смесь пластификатор в виде глицерина в объеме 2,2-2,8% от общего объема полученной впоследствии биомассы. Перемешивают последнюю, например, с помощью магнитной мешалки, со скоростью 100-150 об/мин в течение 30-60 секунд. Затем распределяют биомассу по продольно ориентированным емкостям, покрывая всю поверхность последних с образованием равномерного слоя покрытия высотой 3-5 мм. В большинстве случаев для этого в качестве емкостей используют чашки Петри, выполненные из полипропилена. Помещают данные емкости с помещенной в них биомассой в термостат при температуре 37-40°С на 18-24 часа до полного их высушивания и формирования раневых покрытий в виде пленок, имеющих с одной стороны глянцевую поверхность, с другой стороны шероховатую.
В дальнейшем придают пленкам форму ран и накладывают их на зону патологического очага, обращая шероховатую поверхность покрытия внутрь раны и изолируя всю раневую поверхность от внешней среды.
2
После завершения процесса эпителизации при наличии остатков раневого покрытия на поверхности кожи его аккуратно смывают водой. В случае обширных ран с обильной экссудацией для улучшения процесса газообмена и поддержания оптимального водного баланса поврежденной поверхности, необходимых для осуществления заживления, пленки перфорируют с обеспечением диаметра отверстий 0,2-0,5 мм и концентрацией их распределения 10-15 шт. на 100 мм.
Пример 1.
Заявляемый препарат был апробирован на 30 лабораторных белых крысах-самцах массой 160-220 г. Проведение исследований было осуществлено согласно Протоколу исследований, утвержденному Комитетом по этике ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава РФ» - протокол №13 от 10 апреля 2007 г. и не противоречащему Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных».
2
2
У всех животных моделировали полнослойную кожную рану размером 400 мм. Для чего после предварительной обработки кожи, в асептических условиях, под наркозом, на выбритой от шерсти в межлопаточной области у крыс иссекали кожу с подкожной клетчаткой в виде квадрата 2×2 см - 400 мм по контуру предварительно нанесенным трафаретом. Затем лабораторных животных разделили на две группы -опытную и сравнения по 15 крыс в каждой.
В группе сравнения обработку раны проводили путем однократного воздействия на раневую поверхность изотоническим раствором натрия хлорида и удаления некротических тканей. В опытной группе после той же процедуры на раневую поверхность наложили раневое покрытие, полностью покрывая рану, обращая его шероховатой поверхностью к раневой поверхности и слегка прижимая к ней.
В динамике изучали изменения суточной площади ран животных опытной группы и группы сравнения.
Суточное уменьшение площади ран у экспериментальных животных в процессе лечения составило, %:
Сутки исследования
Группа сравнения
Опытная группа
3-и
4,6±1,2
10,8±0,8p<0,001
5-е
12,4±2,1
33,1±0,5p<0,001
7-е
16,4±0,5
24,2±1,7p<0,001
При этом p - уровень достоверности различия показателей по отношению к группе сравнения.
Полное заживление ран отмечали к 10-м суткам у 7 животных опытной группы, к 14-м суткам - у оставшихся 8 крыс опытной группы.
На всем протяжении эксперимента у всех животных производили бактериологические исследования раневой поверхности. У всех крыс опытной группы посевы раневой поверхности оставались стерильными во все сроки наблюдения.
5
2
Заживление раны у 11 животных группы сравнения отмечали лишь на 14-е сутки. У 4 крыс группы сравнения из-за контакта открытой раневой поверхности с условно-патогенной флорой окружающей среды или собственной флорой животного отмечали инфицирование раны на 5-е сутки Е.coli - 2×10KOE. Из них у 2 животных наблюдали полное заживление раны на 21-е сутки. К 21-м суткам у 2 других животных группы сравнения сохранялась та же флора в количестве 2×10 КОЕ и рана была очищена от патогенов с завершением репарационного процесса только к 26-м суткам.
Для оценки состояния процессов свободнорадикального окисления определяли на 14-е сутки спектрофотометрически биохимические показатели крови экспериментальных животных: содержание малонового диальдегида и активность церулоплазмина. Содержание малонового диальдегида у животных опытной группы было статистически достоверно (p<0,05) ниже 2,83±0,1 мкмоль/л относительно полученных показателей животных группы сравнения 3,21±0,12 мкмоль/л.
В опытной группе животных активность церулоплазмина была статистически достоверно (p<0,001) выше 24,23±0,35 у.е. относительно группы сравнения 19,43±0,65 у.е.
Для оценки репаративных процессов у животных обеих групп с помощью цитологического исследования изучали динамическое изменение количества нейтрофильных лейкоцитов и клеток фибробластического ряда.
Полученные результаты по динамическому изменению среднего количества нейтрофильных лейкоцитов и клеток фибробластического ряда в мазках-отпечатках на изученных клетках с поверхностей экспериментальных ран животных обеих групп приведены ниже.
Сутки исследования
Количество нейтрофильных лейкоцитов
Группа сравнения
Опытная группа
3-и
95,45±0,32
92,40±0,75p<0,05
5-е
90,55±1,08
86,15±0,32p<0,001
7-е
85,50±0,32
58,25±3,34p<0,001
9-е
76,05±0,64p<0,01
34,20±1,4p<0,001
Сутки исследования
Количество клеток фибробластического ряда
Группа сравнения
Опытная группа
3-и
0,9±0,03
1,1±0,07
5-е
1,75±0,28
2,5±0,75p<0,001
7-е
6,9±0,64
30,20±4,75p<0,001
9-е
20,5±1,08p<0,01
63,35±2,05p<0,001
При этом p - уровень достоверности различий показателей по отношению к группе сравнения.
Экспериментальным животным проводили также гистологические исследования.
К 10-м суткам в опытной группе отмечали уже увеличение толщины эпидермиса на 42,3% по отношению к группе сравнения. В опытной группе количество и структура кровеносных сосудов, расположенных в эпидермальном слое, имели характеристики, близкие к нормальным, а именно упорядоченное положение, характерное для организованной грануляционной ткани с формированием сосудистых петель. В участках активного кровообращения отмечали активную пролиферацию фибробластами. Дерматоэпидермальное соединение было ярко выражено. Кожа была подвижная, не спаяна с подлежащей тканью. Отмечали также восстановление структуры сальных желез, а также наличие волосяных фолликулов различной степени зрелости и рост волос. Ориентация коллагеновых волокон была горизонтальная.
У крыс группы сравнения к 10-м суткам кожа плотно была спаяна с подлежащей тканью, сохранялся струп. Число волосяных луковиц и сальных желез на единицу площади среза в этой группе наблюдалось значительно меньше, чем в опытной группе. Незрелая грануляционная ткань в области раны была богата фибробластами, обильно пронизана вертикально идущими сосудами. Отмечали, что расположение коллагеновых волокон, в основном, хаотично, реже - вертикально по ходу сосудов.
В процессе заживления в опытной группе отмечали, что произошла постепенная биодеградация раневого покрытия, которая завершилась практически одновременно с окончанием эпителизации ран. Проведенные экспериментальные исследования подтвердили эффективность использования заявляемого раневого покрытия.
Пример 2. Способ получения биодеградируемого раневого покрытия
В стакан, выполненный из полипропилена, объемом 50 мл налили 15 мл дистиллированной воды. Подготовили навеску пищевого низкомолекулярного хитозана в количестве 1 г, произведенного ЗАО «Биопрогресс», г.Москва в соответствии с ТУ 9289-067-00472124-03. Добавили навеску хитозана в стакан с дистиллированной водой. Полученную смесь перемешали и поместили в термостат при температуре 37°С на 2 часа. Через 2 часа хитозан полностью растворился в дистиллированной воде, представляя собой полупрозрачную однородную гомогенную массу желто-коричневого цвета. Развели 10 мг лиофилизированного церулоплазмина, произведенного ФГУП «Микроген» Россия, г.Москва, в 1 мл дистиллированной воды, получив прозрачный раствор бледно-голубого цвета. Добавили данный раствор в полученную смесь. Нагрели 10 мл дистиллированной воды в термостате до 37°С и добавили в нее 100 мг L-аспарагиновой кислоты, произведенной ОАО «Биосинтез», г.Пенза. Подготовленный раствор L-аспарагиновой кислоты постепенно добавляли в смесь, после каждого добавления измеряя уровень pH раствора. При достижении pH 5 процедуру добавления раствора L-аспарагиновой кислоты в количестве 1 мл прекратили. Затем в смесь добавили 0,5 мл пластификатора - глицерина, произведенного ЗАО «Казанская фармацевтическая фабрика», что составило 2,8% от общего объема полученной биомассы. Последнюю перемешали с помощью магнитной мешалки со скоростью 100 об/мин в течение 60 секунд. С помощью Viscometer SV-10 измерили динамическую вязкость биомассы, которая составила 26,5 mPas×c. Полученную биомассу залили в чашку Петри, выполненную из полипропилена, покрывая весь диаметр и формируя равномерный слой толщиной 5 мм, и поместили на 24 часа в термостат при 37°С для высушивания.
В результате получили полупрозрачное покрытие желто-коричневого цвета в виде пленки, с одной стороны - глянцевой, с другой - шероховатой. Покрытие эластичное, легко сгибалось и повторяло рельеф горизонтальной поверхности, на которую ее размещали.
Экспериментальные исследования, подтверждающие применение данного раневого покрытия приведены выше в примере 1.