Способ дифференциальной и ранней диагностики заболеваний ЛОР-органов воспалительной и опухолевой этиологии с использованием раман-флюоресцентной спектрометрии
METHOD FOR DIFFERENTIAL AND EARLY DIAGNOSIS OF DISEASES OF ENT ORGANS OF INFLAMMATORY AND TUMOR AETIOLOGY USING RAMAN-FLUORESCENCE SPECTROMETRY

Изобретение относится к медицине: к оториноларингологии и онкологии, и может быть использовано при проведении дифференциальной диагностики заболеваний ЛОР-органов воспалительной и опухолевой этиологии и других органов головы и шеи. Способ экспресс-диагностики заболеваний опухолевой и воспалительной природы с использованием раман-флюоресцентной спектрометрии заключается в применении лазерного излучения различных длин волн (405 нм, 532 нм) для регистрации индивидуальных особенностей ткани на метаболическом, морфометрическом и функциональном уровнях. Эффект Рамана (комбинационного рассеяния света) позволяет регистрировать изменения, происходящие в ткани на молекулярном уровне и может применяться для проведения диагностики патологических изменений в ЛОР-органах и других органах головы и шеи. Данный эффект может быть использован для повышения эффективности диагностики воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи; для проведения ускоренной идентификации природы патологического процесса, в том числе дифференциальной и ранней диагностики рака.
Способ направлен на проведение качественной, высокочувствительной, высокоспецифичной, точной, малоинвазивной и быстрой диагностики заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи воспалительной и опухолевой этиологии, как in vitro, так и in vivo.
Способ по изобретению позволяет с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью (близкой к 100%) охарактеризовать физиологические изменения, происходящие в ткани при воспалении и зарегистрировать структурные ее особенности, а также наличие определенных метаболитов в ней с целью немедленной (быстрой) диагностики и ранней идентификации патологического процесса (для проведения профилактических мер, использования данного метода в качестве скринингового, а также проведения мониторинга лечения и его коррекции на различных этапах патологического процесса).
На сегодняшний день известно множество способов диагностики воспалительных и опухолевых заболеваний.
Известен способ диагностики компенсированной и декомпенсированной форм хронического тонзиллита на основе метода инфракрасной спектрометрии слюны (Портенко Г.М. и соавт., 2005, патент №2261048). Данный метод основан на применении вероятностно-логического обучающего алгоритма бинарного дерева решений CART по показателям инфракрасного спектра слюны. Данный способ относится к экспресс-методам идентификации и проведения дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита, в сочетании с вероятностной нейронной сетью по энергоинформационному показателю пробы слюны. Однако данный метод является косвенным в дифференциальной диагностике форм хронического тонзиллита, так как проводится исследование биологической жидкости- слюны, о биохимических изменениях, происходящих в организме, таким образом, можно судить лишь косвенно, то есть диагностика in situ биологического объекта, в данном случае, небных миндалин и других структур глотки, в данной работе не предусмотрена, что не может нести полную информацию об исследуемом объекте.
Известен способ диагностики рака легкого у человека, заключающийся в исследовании состава выдыхаемого воздуха; при наличии в последнем циклогексил изотиоцианата устанавливают диагноз рака. В основе исследования состава выдыхаемого воздуха лежит метод масс-спектрометрии с предварительным газохроматографическим разделением (Бахмутов Д.Н., 2014; G01N 33/497; А61В 5/08). Способ является ценным, однако при регистрации концентрации химического вещества в выдыхаемом воздухе на последний влияет множество дополнительных факторов, то есть способ осуществляется опосредованно, и является сложным в исполнении, в частности из-за того, что аппаратура занимает большую площадь (не является портативной).
Известен способ диагностики рака и потенциальной устойчивости злокачественных клеток к гипоксии, который заключается в том, что из образца биопсии готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, которым создают условия гипоксии, и проводят спектрофлуорометрическое исследование этих клеток в динамике развития процесса фотодеструкции NAD(P)H флуоресценции. По приросту интенсивности флуоресценции NAD(P)H в темновых условиях судят о наличии опухолевых клеток и их потенциальной устойчивости к гипоксии. Спектрофлуорометрическое исследование проводят в диапазоне 440-470 нм при длине волны возбуждения 365-370 нм. Данный способ позволяет диагностировать рак и потенциальную устойчивость злокачественных клеток к гипоксии (Шварцбурд П.М.; G01N 33/52; G01N 33/483; А61В 10/02), однако основным недостатком данного способа является то, что он применяется лишь in vitro.
Также в качестве аналога заявляемого способа можно отметить способ диагностики онкологических и соматических заболеваний, заключающийся в том, что проводят исследование поляризационных и спектральных характеристик биологических жидкостей, смешанных и конденсированных с другими веществами или в чистом виде, или среза тканей. Технический результат состоит в эффективности способа диагностики за счет применения эффекта оптической анизотропии путем визуализации анизотропии жидких оптических сред организма на мониторе с дальнейшей индикацией анизотропии через приборы и сенсоры, спектроскопию и оптическую поляризацию, а также повышение точности диагностики и сокращение времени проведения диагностики (Кутушов М.В., 2011; G01N 21/21). Способ достаточно информативен, однако также является опосредованным, то есть позволяет регистрировать происходящие в самой ткани морфо-функциональные и метаболические изменения в данный конкретный промежуток времени лишь через системные проявления.
Также известен способ эндоскопической флюоресцентной диагностики злокачественных опухолей полых органов (Соколов В.В.; RU (11) 2129273 (13) C1; G01N 33/48, G01N 33/52; 2014), который применяется с использованием экзогенной флюоресценции фотосенсибилизатора фотогема и эндогенной флюоресценции биотканей и отличается тем, что в процессе флюоресцентно-диагностического обследования определяют спектральный параметр, являющийся отношением интегральной интенсивности флюоресценции в красном диапазоне спектра (суперпозиции эндогенной и экзогенной флюоресценции биоткани) и интегральной интенсивности эндогенной флюоресценции в желто-зеленой области спектра, и при его значении 3 отн. ед. и выше диагностируют злокачественную опухоль. Способ достаточно сложен в исполнении, в том числе благодаря использованию дополнительных расходных материалов, таких как фотосенсибилизаторы.
Также известен способ ранней диагностики и мониторинга онкологических заболеваний (Лактионов П.П., 2005; G01N 33/53). Способ ранней диагностики рака путем определения концентрации нуклеиновой кислоты в крови больных, отличается тем, что определяют концентрацию внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови, и при нулевом значении этого показателя диагностируют рак. Концентрация нуклеиновых кислот в крови может меняться при различных заболеваниях, не только при раке, соответственно, метод является ценным, однако необходимо применение последнего в совокупности с другими параметрами.
Известен способ ранней диагностики злокачественных образований желудка. Сущность данного изобретения заключается в том, что при первом эндоскопическом визуальном осмотре берут биопсию из участков желудка с эндоскопическими признаками дисплазии, определяют координаты этих участков с использованием цилиндрической координатной сетки и заносят их в базу данных, а при выявлении гистологических признаков дисплазии или метаплазии повторные биопсии осуществляют из участков с установленными ранее координатами и при нарастании степени дисплазии диагносцируют злокачественное образование желудка. Способ позволяет повысить надежность диагностики ранних форм рака (2008791; А61В 5/00, А61В 1/00; Балалыкин А.С.), является информативным, однако более длителен по сравнению с заявляемым способом.
Все вышеперечисленные способы обладают значительными полезными свойствами и преимуществами, однако основной недостаток приводимых способов заключается в трудоемкости выполнения, длительности, в некоторых случаях, относительно невысокой чувствительности и специфичности, а также невозможности использовать метод in vivo (внутри организма, органа) неинвазивно и быстро (со «скоростью света»).
Прототипом заявляемого способа является способ инфракрасной рамановской спектроскопии в ближнем свете для in vivo- in vitro- ранней диагностики рака шейки матки (Rebecca Richards-Kortum; 1995; G01N 21/6486), который заключается в том, что на основании использования соответствующих индивидуальных спектральных пиков на различных длинах волн в комбинации с методами главных компонент и дискриминантного анализа Фишера, таким образом, что становится возможным дифференцировать интактную ткань и ткань, вовлеченную в воспалительный процесс, от предопухолевого (низко- и высокодифференцированного предрака), в том числе, на основании определения содержания коллагена, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и глюкозо-1-фосфата в тканях. Однако в данном случае используется инфракрасное излучение, а также используемая аппаратура занимает большую площадь, кроме того, измерения проводились лишь в одной локализации, не проводилось исследований ткани, вовлеченной в воспаление и тканей различных доброкачественных и злокачественных новообразований, что ограничивает применение метода в соответствующем клиническом направлении. Кроме того, данный способ не предусматривает регистрацию показателей ткани в динамике с оценкой эффективности проводимого лечения. Из недавних работ, посвященных диагностике рака в оториноларингологии с использованием спектрометрии, следует упомянуть способ инфракрасной спектрометрии в ближнем свете, используемой в качестве диагностического способа в отношении рака носоглотки (Ming L.C. 2017). Способ заключается в in vivo- дифференциации интактной ткани и ткани носоглотки при раке, однако в данном случае применяется инфракрасное излучение, однако в данной работе не приводится оценки параметров ткани в динамике с анализом не только морфологических и метаболических особенностей ткани, но и физиологических; не проводится расчета индексов, позволяющих оценивать функциональные особенности ткани.
В заявляемом способе используется аппаратно-программный комплекс, сертифицированный, разрешенный к использованию, однако необходима адаптация раман-флюоресцентных технологий в диагностике заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, в связи с чем и была разработана методика расчета специальных индексов для оценки морфометрических, метаболических и функциональных особенностей ткани в норме и при патологии. Проводится работа над совершенствованием специализированного аппаратно-программного комплекса (АПК) для экспресс-диагностики заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи с применением специальных насадок на оптоволоконный световод, предназначенных специально для анатомических структур глотки, гортани, околоносовых пазух, уха. Также проводится модернизация АПК на основе раман-флюоресцентной спектрометрии с использованием сочетанной методики эндоскопии-раман-флюоресцентной спектрометрии-компьютерной томографии и других методов исследования, позволяющих максимально точно ставить диагноз и проводить экспресс-диагностику заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, как in vivo, так и in vitro. Заявляемый способ осуществляется с использованием аппаратно-программных комплексов как для использования in vitro, так и для применения in vivo, что делает его более ценным и вариабельным при диагностике заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи. Также данный аппаратно-программный комплекс позволяет регистрировать изменения в ткани в данный конкретный промежуток времени с использованием специального оптоволоконного световода, программное обеспечение позволяет интерпретировать данные о биологическом объекте в режиме реального времени, быстро, с оценкой основных фаз-звеньев патогенеза заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, что позволяет использовать методику in vivo. Предлагаемый новый метод раман-флюоресцентной спектроскопии является высокочувствительным, высокоспецифичным и точным методом диагностики, так как позволяет регистрировать минимальные изменения в физиологии, морфометрических и метаболических показателях неинвазивно и быстро (в течение нескольких секунд). Кроме того, данный способ является наискорейшим по сравнению с остальными методами. Таким образом, используемая нами методика раман-флюоресцентной спектроскопии в диагностике воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, является универсальным, точным, малоинвазивным, высокочувствительным, высокоспецифичным, ускоренным методом диагностики, который характеризуется определением не только спектральных особенностей самой ткани, но и набором метаболических, структурных, а также функциональных изменений изучаемого биологического объекта (в данном случае, тканей ЛОР-органов и других органов головы и шеи). Применяемая нами методика раман-флюоресцентной спектроскопии на основе аппаратно-программных комплексов «EnSpectr М405» и «EnSpectr R532» (устройство и метод для раман-флюоресцентной идентификации вещества, И. Кукушкин и соавт., 2011; средство для измерения RU. С.37.003.А №44570) может быть использована для регистрации и интерпретации спектров рамановского рассеяния ткани ЛОР-органов при воспалительных и опухолевых (доброкачественных и злокачественных) заболеваниях, а также регистрации видов метаболитов в крови при соответствующих заболеваниях. Кроме того, с использованием методики in vitro могут быть зарегистрированы спектральные характеристики микроорганизмов и/или их ассоциатов при воспалительном процессе, что является дополнительным фактором, свидетельствующим о возможности применения данного метода в диагностике воспалительных заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи («Воспалительные заболевания глотки: руководство для врачей. В.Т. Пальчун и соавт., 2013).
Способ диагностики (дифференциальной и ранней диагностики) воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи с использованием раман-флюоресцентных медицинских технологий заключается в регистрации спектральных данных с поверхности ткани in vivo, так и in vitro при соответствующем патологическом процессе, а также спектральных характеристик плазмы крови пациентов с данными заболеваниями и особенностей микрофлоры изучаемого биологического объекта в норме и при патологии.
Проблемой, решаемой изобретением, является сложность установления точного диагноза своевременно, на ранних его стадиях, в том числе при проведении хирургического лечения (для определения границ распространения опухолевого процесса), а также определения показаний к хирургическому или консервативному лечению. С использованием предложенного нового способа представляется возможным обеспечить ускорение диагностики вида патологического процесса: воспалительного или опухолевого (или определения ткани, не вовлеченной в патологический процесс) при заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи, так как способ позволяет за минимальное время с высокой чувствительностью и специфичностью неинвазивно как in vivo, так и in vitro с использованием портативного аппаратно-программного комплекса раман-флюоресцентной спектроскопии осуществлять идентификацию природы процесса, а также его разновидность при некоторых заболеваниях.
Технический результат - осуществление способа дифференциальной диагностики воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, включая раннюю их диагностику, в совокупности с данными объективного осмотра, дополнительными методами исследования (цитологическим, гистологическим, ПЦР-методом, лучевыми и иммунологическими методами исследования и проч.), включая регистрацию спектральных характеристик ткани и биологических жидкостей при соответствующих заболеваниях, в ускоренном режиме (со «скоростью света»), с использованием высокочувствительного, высокоспецифичного и малоинвазивного экспресс-метода в динамике с оценкой специальных индексов, позволяющих анализировать изменения в ткани в данный конкретный промежуток времени.
Осуществление способа.
-1
T
beta
Установка для регистрации сигналов флюоресценции и рамановского рассеяния света включает в себя зеленый твердотельный лазер Nd:YAG (2w) с длиной волны 532 нм, оптическую систему фокусировки и фильтрации сигнала, спектрометр с дифракционной решеткой 1200 штрихов/мм со спектральным разрешением 4 см, CCD-матрицу, контроллер и компьютер с программным продуктом для записи спектров. Для проверки воспроизводимости спектральных особенностей проводились измерения в нескольких точках исследуемого образца. Для уменьшения ошибки измерения был выбран 10-кратный объектив, который фокусировал лазерный луч в достаточно широкое пятно (по размеру сравнимое с микроскопическими особенностями исследуемых тканей) диаметром 10 мкм. Мощность лазерного излучения составляла 10 мВт, запись спектров производилась за время экспозиции, равное 1 с. Число усреднений при записи каждого спектра выбиралось достаточно большим (для эффективного подавления шумов считывания) - оно составляло 20. В качестве индивидуального эталона (объекта сравнения) была выбрана точка, названная интактной -это непораженная область слизистой оболочки изучаемых анатомических областей. На удаленном материале проводилась экспресс-индикация патологического процесса последовательным измерением спектральных характеристик ткани в нескольких точках в каждом исследуемом образце и накапливалась база данных внутри каждого исследуемого класса. Регистрируемые данные, которые являются многомерными (волновой сдвиг рассеянного излучения, интенсивность флуоресценции и рамановского рассеяния) были проанализированы при помощи регрессионного метода проекций на латентные структуры (PLS-DA). Суть метода состоит в том, что дискриминационные правила для классов задаются линейными регрессионными уравнениями. Из регистрируемых данных, интенсивности раман-флуоресцентных спектров на определенных сдвигах волн, составляется матрица, где для каждого спектра от образца присваивается значение 0 или 1, в зависимости от принадлежности классу, например здоровая ткань и опухоль. Регрессионная задача решается методом проекций на латентные структуры, что позволяет в дальнейшем предсказывать принадлежность новых образцов. Также PLS-DA (метод проекции на латентные структуры и линейный дискриминантный анализ) позволяет выявить спектральные особенности для классов, которые определяют специфические колебания связей или молекул для каждого типа опухоли. Перед применением метода PLS-DA регистрируемые данные были избавлены от шума методом Савицкого-Голея [Ch. Ruffin, 1999] и фонового излучения методом коррекции опорной линии с использованием ассиметричных наименьших квадратов [S.-J. Baek, 2015]. Все методы предобработки и многомерный анализ данных были реализованы в онлайн программном обеспечении TPcloud.
Выбор метода раман-флюоресцентной спектроскопии и его программной реализации в приборе «EnSpectrR532» при патологии ЛОР-органов и других органов головы и шеи обоснован необходимостью повышения чувствительности и специфичности диагностики с последующей интерпретацией информативных критериев индивидуальных спектральных характеристик. Для выявления и подтверждения диагностической информативности раман-флюоресцентной спектроскопии при воспалительных и опухолевых заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи мы провели сравнительное исследование. Также удаленный материал направлялся на патогистологическое и микробиологическое исследование (для оценки специфичности метода). Программная обработка полученных спектральных данных производилась в совокупности с применением клинических, патогистологических и микробиологических данных изучаемых образцов ткани. Представленная медицинская технология, по-видимому, может объективно характеризовать функциональное состояние ЛОР-органов и других органов головы и шеи, что было доказано посредством подсчета специальных индексов (пояснения в тексте). Кроме того, с использованием лазерного излучения с длиной волны 405 нм, а также оптоволоконного световода представляется возможным регистрировать показатели ткани в in vivo in situ в динамике.
С использованием аппаратно-программного комплекса EnSpectr R532 представляется возможным анализировать в экспресс-режиме метаболические, морфометрические и функциональные особенности ткани, а также биологических жидкостей пациентов (крови) при воспалительных и опухолевых заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи in vitro.
4
5
Другая модификация способа заключается в подведении лазерного излучения с длиной волны 405 нм (использование данной длины волны основано на рамановском эффекте) к изучаемому биологическому объекту, в данном случае, тканям ЛОР-органов и других органов головы и шеи (небные и глоточная миндалины, околоносовые пазухи, ухо, гортань, язык, околоушные слюнные железы); регистрации как основного (зондирующего) сигнала, так и обратно отраженного сигнала за время экспозиции- 1-5 секунд, а затем в видеорегистрации спектра и проводении расчетов показателей интенсивности флюоресценции, спектральной полуширины, нормированного показателя флюоресценции (отношение различных длин волн друг к другу), индекса аэробности (отношение длины волны 665 нм к длине волны 670 нм), характерных особенностей пиков, регистрирующихся на определенных длинах волн- информативных параметров для идентификации вида ткани: здоровой, ткани либо ткани, пораженной воспалительным процессом, а также идентификация вида патологического процесса использованием специального программного обеспечения для расчета индексов. Анализируются характеристики самих пиков: их форма, амплитуда, ширина, длина волны, их количество в норме и при различных воспалительных и опухолевых заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи. С использованием данного способа проводится ускоренная дифференциальная диагностика заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи воспалительной и опухолевой этиологии. Способ осуществляется также с использованием метода главных компонент, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов, метода проекции на латентные структуры для выделения наиболее информативных рамановских линий на различных длинах волн у спектров интактной ткани, а также ткани, задействованной в воспалительный и опухолевый процесс при заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи. Был применен комбинированный способ анализа спектральных характеристик для описания различий в норме, при воспалении и опухолях ЛОР-органов и других органов головы и шеи. В данный способ входят все вышеперечисленные параметры, а также описание самого спектра в целом, флюоресцентной его составляющей, рамановских пиков, их высоты, ширины, полуширины, отношения длины волны, на величине которой выделяются одинаковые метаболиты при воспалении к величине, которая является строго индивидуальной в данных случаях, в том числе при различных формах хронического тонзиллита. Чувствительность и специфичность метода анализировались на основании классических методов диагностики: гистологического, цитологического, микробиологического и биохимического. Было выявлено, что в зависимости от различных метаболических, морфометрических, функциональных особенностей ткани можно провести дифференциальную диагностику вида опухолевого процесса: злокачественного, доброкачественного или метапластического с использованием раман-флюоресцентных медицинских технологий с высокой точностью, специфичностью, чувствительностью, неинвазивно и в экспресс-режиме. Существующие на сегодняшний день методы диагностики воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, несомненно, обладают многими преимуществами, однако являются либо длительными, либо дорогими, либо дают лишь косвенное представление о происходящих процессах в организме, не позволяя проводить диагностику in vivo in situ, либо могут быть сложными в исполнении, а также реализуются с использованием крупногабаритной техники. Также они не настолько чувствительные и специфичные, как применяемая нами раман-флюоресцентная спектроскопия, которая является не только высокочувствительной, высокоспецифичной, но и неинвазивной, быстрой. Кроме того, она позволяет регистрировать многочисленные параметры в режиме реального времени, то есть, осуществлять «диагностику по месту обследования и лечения». Для определения морфологических, функциональных и метаболических характеристик ткани в норме и при патологии, в том числе на основе регистрации раман-аутофлюоресцентных характеристик, необходимо выбрать наиболее оптимальный способ диагностики, к которому относится метод раман-флюоресцентной диагностики. Разработка и внедрение представленной технологии в широкую клиническую практику являются перспективными и клинически целесообразными и позволят в дальнейшем существенно повысить качество диагностики воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи и своевременно назначить рациональное лечение. Применение программно - аппаратного комплекса EnSpectr R532 также позволяет обеспечить достоверное, высокочувствительное (10 - 10 КОЕ/мл) обнаружение этиологического фактора при различных воспалительных заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи, так как помогает выявлять вид, концентрацию микроорганизма либо ассоциатов микроорганизмов.
Дифференциальная диагностика воспалительных и опухолевых заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи является одной из самых важных задач, стоящих перед оториноларингологами, онкологами и другими клиницистами. С использованием метода раман-флюоресцентной спектроскопии на изученной выборке гистологических и цитологических образцов удалось провести анализ спектральных данных. Разделение между данными классами было проведено со специфичностью, близкой к 100%, чувствительностью около 100%) и точностью приблизительно 100%. Однако следует понимать, что проведение дифференциальной диагностики в данном случае возможно при анализе совокупности данных, полученных в отношении различных заболеваний ЛОР-органов и других органов головы и шеи, то есть, это не только спектральные характеристики самой ткани, но и соответствующие метаболиты в плазме крови пациентов, микробный состав патологического очага, концентрация на грамм ткани микробных тел в данный промежуток времени на соответствующей стадии заболевания, клинические, цитологические и гистологические данные, а также данные осмотра. Системный подход с анализом вышеперечисленных показателей в динамике на различных стадиях заболевания позволит судить также о происходящих в тканях физиологических процессах, таких как кровоток и микроциркуляция, пролиферативная активность клеток, различие метаболитов и другие особенности. Также является ценным при проведении диагностики определение характерных особенностей с использованием метода главных компонент, линейного дискриминантного анализа, метода проекции на латентные структуры и др., так как они позволяют выделить наиболее информативные критерии при анализе спектральных данных.
Таким образом метод раман-флюоресцентной спектроскопии может быть использован в дополнение к существующим методам для проведения дифференциальной диагностики (в том числе ранней диагностики) различных воспалительных и опухолевых заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи. Раман-флюоресцентная спектрометрия основана на явлении аутофлюоресценции биологических тканей и эффекте рамановского рассеяния света, при котором при воздействии на ткань лазерного излучения в спектре рассеянного света регистрируются характерные молекулярные колебания веществ, входящих в ее состав. Известно, что воспалительные и опухолевые заболевания ЛОР-органов и других органов головы и шеи являются актуальной проблемой современного населения и занимают важное место в структуре заболеваний верхних отделов дыхательных путей (El-NaggarAK., 2009; 1:O9). Необходимо учитывать, что термин «диагностика», используемый в представленной работе, подразумевает не только установление диагноза заболевания, но и скрининг пациентов для выявления и дифференцировки различных патологических состояний, выявление этиологического фактора, выбор тактики и метода лечения, оценку его эффективности, выбор предпочтительного лечебного препарата, выявление показаний и противопоказаний для его применения, мониторинг процесса лечения, выявление осложнений и объективное определение сроков реабилитации пациентов.
При анализе спектральных данных разделение методом PLS-DA проводилось между классами опухоли и воспаления, также проводилось сравнение с нормой. За норму принимали интактную область, не пораженную воспалением или опухолевым процессом. Модель обработки и анализа данных включает в себя сглаживание, центрирование и нормирование данных и метод выделения сигнала на общем фоне (избавление от флюоресценции).
Результаты проведения экспресс-диагностики вида патологического процесса (воспалительного или опухолевого) представлены на соответствующих фигурах (рисунках), расположенных ниже.
Изобретение относится к области медицины, а именно оториноларингологии и онкологии, и может использоваться для диагностики воспалительного и опухолевого процесса при заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи.
Для выявления и подтверждения диагностической информативности раман-флюоресцентной спектроскопии было проведено сравнение нескольких групп тканей: интактной, ткани, вовлеченной в воспалительный процесс при хроническом тонзиллите, аденоидах, хроническом риносинусите, хроническом гнойном среднем отите, а также ткани, пораженной опухолевым процессом (как доброкачественным, так и злокачественным, включая переходные формы метаплазии) при плоскоклеточном раке, аденокарциноме, злокачественной меланоме различных локализаций, в том числе гортани, глотки, шеи, лимфатических узлов, околоушных слюнных желез, при плеоморфной аденоме, липоме и других заболеваниях ЛОР-органов и других органов головы и шеи. Всего было проанализировано свыше 1200 спектров. Полученные результаты частично представлены на рисунках, описание которых приведено ниже (см. приложение «Чертежи и рисунки»):
Краткое описание чертежей
На фиг. 1-60 представлены следующие условные обозначения на английском языке (поменять их невозможно), поскольку в использованном программном обеспечении заложены именно такие условные обозначения, какими они изображены на фиг. 1-60, а именно:
Tumor-опухоль, inflammation-воспаление; variables- переменные (фиг. 1); correct-правильные, false negative- ложно отрицательные, false positive-ложно положительные, excluded NMC-исключенные спектры, accuracy-точность, Spec.-специфичность, Sens.-чувствительность; Y Observed-наблюдаемые фактически; Y predicted- прогнозируемые значения (фиг. 2).
На фиг. 3 - Value-значение, variables- переменные, варианты- измеряются, в данном случае, в обратных сантиметрах (волновые числа).
На фиг. 4 OGPKK4, ПКК- плоскоклеточная карцинома глотки, F 1-хронический тонзиллит, компенсированная форма. XT КФ- хронический тонзиллит, компенсированная форма.
Условные обозначения, приведенные на фиг. 5, были представлены при описании фиг 1-4.
Условные обозначения на фиг. 7: OGPKK4, ПКК- плоскоклеточная карцинома глотки, F2; XT ДФ- хронический тонзиллит, декомпенсированная форма.
На фиг. 1-60 (за исключением фиг. 2, фиг. 5, фиг. 8) по оси абсцисс обозначены величины волновых чисел (единица измерения- обратные сантиметры-1/см), по оси ординат-относительные единицы интенсивности флюоресценции (ОЕ).
Определение наиболее важных спектральных полос на различных значениях волновых чисел является важной задачей для интерпретации морфометрических, метаболических и функциональных характеристик ткани, принадлежащих различных классам: воспаление, доброкачественная опухоль, злокачественный процесс. Данные рамановские линии характеризуют не только тип выделяемых метаболитов при различных диагнозах, но и структурные изменения ткани. С использованием метода рамановской спектроскопии в перспективе станет возможным малоинвазивным путем и ускоренно определять зону перехода доброкачественного процесса в злокачественный.
Также нами было проведено сравнительное исследование спектральных данных плоскоклеточной карциномы глотки и хронического тонзиллита, компенсированной формы (по классификации Солдатова И.Б., 1975 г.) для выявления наиболее значимых диагностических критериев.
На фиг. 4 показаны модель (сглаживание, выделение рамановского сигнала на общем фоне, нормирование, центрирование) и данные после предобработки при дифференциации плоскоклеточной карциномы глотки (ПКК глотки- обозначено стрелкой) и хронического тонзиллита, компенсированной формы (XT КФ; обозначено стрелкой). По оси абсцисс указаны величины волновых чисел, по оси ординат- относительные единицы интенсивности сигнала.
На фиг. 5 мы видим результат построения данной модели. Обозначения: 0 - хронический тонзиллит, компенсированная форма, 1 -плоскоклеточная карцинома глотки, NMC - non missed classified, то есть неправильно определенные спектры. Разделение проведено со специфичностью 100%, чувствительностью 100%, точностью 100%.
Обозначения на английском в правом верхнем углу «Correct»-правильно определенные, False positives и False Negatives-ложно положительные и ложно отрицательные, соответственно, значения, которые в данном случае были равны 0.
Таким образом, дифференцировка ткани при плоскоклеточной карциноме глотки (по результатам гистологического исследования ткани) от таковой при хроническом тонзиллите проводится с использованием заявленного способа со специфичностью 100%, чувствительностью 100%, точностью 100%, что является крайне важным в клинической практике, в частности, при проведении быстрой интраоперационной диагностики или скрининга во время обследования.
-1
На фиг. 6 отмечены наиболее информативные полосы (VIP показатели модели PLS-DA): 573, 1094, 1162, 1520, 2932 см
По оси абсцисс указаны величины волновых чисел, по оси ординат- относительные единицы интенсивности сигнала. Было отмечено разделение данных классов ткани со специфичностью 100%, чувствительностью 100% и точностью 100%, что говорит в пользу возможности применения данного метода (раман-флюоресцентной спектроскопии) в дифференциальной диагностике воспалительного процесса в глотке при хроническом тонзиллите, компенсированной форме и опухолевого процесса при плоскоклеточной карциноме глотки. При сравнении двух групп: ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите, декомпенсированной форме и плоскоклеточной карциноме глотки отмечалась воспроизводимость полученных результатов, однако с меньшей специфичностью, что говорит в пользу схожести воспалительного (при декомпенсации) и опухолевого процессов на некоторых стадиях патогенеза. Также были проанализированы спектры: плоскоклеточная карцинома глотки и хронический тонзиллит, декомпенсированная форма (по классификации Солдатова И.Б., 1975 г.)
На фиг. 7 отмечены модель (сглаживание, выделение рамановского сигнала на общем фоне, нормирование, центрирование) и данные после предобработки при дифференциации плоскоклеточной карциномы глотки (ПКК глотки- обозначено стрелкой) и хронического тонзиллита, декомпенсированной формы (XT ДФ; обозначено стрелкой). По оси абсцисс указаны величины волновых чисел, по оси ординат- относительные единицы интенсивности сигнала.
-1
А результат построения модели изображен на фиг. 8. Обозначения (фиг. 8): 0 - хронический тонзиллит, декомпенсированная форма, 1 - плоскоклеточная карцинома глотки, NMC - поп missed classified, то есть неправильно определенные спектры. Разделение было проведено со специфичностью 95,8%, чувствительностью 90%, точностью 94,1%. В данном случае, на фиг. 9, отмечены наиболее информативные полосы для дифференциации (VIP показатели модели PLS-DA): 488, 1149, 1358, 1516, 1575, 1627, 2861, 2931 см. По оси абсцисс указаны величины волновых чисел, по оси ординат- относительные единицы интенсивности сигнала.
На фиг. 10 изображен спектр новообразования глотки- плеоморфной аденомы (по результатам гистологического исследования). По оси абсцисс указаны величины волновых чисел (единица измерения- обратные сантиметры- 1/см, по оси ординат- относительные единицы интенсивности сигнала- ОЕ. Отмечаются характерные рамановские линии на величинах волновых чисел 1150, 1500, 2900/см, причем последний пик имеет трапециевидную форму. Подобных изменений не наблюдается в случае воспалительного или злокачественного процесса в глотке. Также спектр характеризуется зазубренностью кривой-мелкими пиками на всем протяжении в диапазоне от 900 до 3100/см.
На фиг. 11 отмечен спектр интактной ткани глотки, окружающей опухолевую ткань. Характерный пик на 2950/см, отсутствие дополнительных пиков позволяет отличить данную кривую от спектров при воспалении или опухолевом процессе.
На фиг. 12 изображен спектр ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите, компенсированной форме (классификация Солдатова И.Б., 1975 г.) отмечается гладкая кривая, высокий сигнал флюоресценции, за которым не визуализируются соответствующие пики, однако их можно легко вычислить, как это показано на рисунках выше, с использованием метода главных компонент, линейного дискриминантного анализа и принципа наименьших квадратов.
На данном рисунке- фиг. 13- изображен спектр небных миндалин при хроническом тонзиллите, декомпенсированной форме (гиперпластическом и фиброзирующем процессе). 1050, 1150, 1510, 2950/см, что отличает данную ткань от интактной и ткани, пораженной опухолевым процессом.
На фиг. 14 изображен спектр ткани небной миндалины при р16-позитивном типе высоко дифференцированной орофарингеальной карциномы. По сравнению со спектром ткани при хроническом тонзиллите, декомпенсированной форме отсутствует промежуточный подъем флюоресценции, интенсивность флюоресценции значительно ниже, некоторые пики, характерные для воспаления, в частности, пик на 1050/см не регистрируется.
На фиг. 15 изображен спектр низко дифференцированного низкоороговевающего плоскоклеточного р16-позитивного типа орофарингеальной карциномы. Регистрируется зазубренность кривой со множеством пиков на различных длинах волн, пики сливаются, не отчетливы, отсутствует промежуточный подъем сигнала флюоресценции, как это наблюдается при хроническом воспалении.
На фиг. 16 изображен спектр фрагмента опухоли основания языка (плоскоклеточной карциномы). В данном случае регистрируются мелкие отрицательные пики на 1400, 3250/см, отсутствуют пики, характерные для данного гистологического диагноза другой локализации (например, небной миндалины- фиг. 13), отмечается гладкая кривая, интенсивность флюоресценции намного выше по сравнению с ПКК глотки и достигает практически 35000 отн. ед.
На фиг. 17 изображен спектр ткани лимфатического узла с метастазами P-16-позитивного типа орофарингеальной карциномы. Отмечаются характерные пики на 1050, 1150, 1350, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2950/см, последний пик имеет трапециевидную форму, подобных изменений при ПКК другой локализации не отмечается. Соответственно, ПКК различной локализации отличают различные спектры в пределах изучаемого класса ткани, что можно также учитывать при проведении дифференциальной диагностики.
На фиг. 18 проиллюстрирован спектр аденоидной ткани, кривая имеет мелкую зазубренную форму с соответствующим «плато» от 2000 до 2950/см, которое отсутствует при хроническом тонзиллите или опухолях глотки.
На фиг. 19 изображен спектр опухоли шеи- низко дифференцированной плоскоклеточной карциномы. В данном случае также отмечаются соответствующие пики на 1050, 1150, 1510, 2950/см, однако они имеют большую интенсивность по сравнению с таковыми в случае других локализаций, также отмечается низкая интенсивность флюоресценции- около 1900 отн. ед., регистрируются дополнительные мелкие пики на 1300, 1650, 1700, 2700/см, пик на 1510/см - двузубый, а пик на 2950/см имеет трапециевидную зубчатую форму, что является также характерной особенностью.
На фиг. 20 изображен спектр опухоли глотки при интраэпителиальной неоплазии. Отмечается невысокая интенсивность флюоресценции- около 1250 отн. ед. И на 3450/см регистрируется высокий трапециевидный зубец, с интенсивностью флюоресценции около 2100 отн. ед, значительно превышающей основной сигнал флюоресценции, что и является характерной особенностью в данном случае и позволяет регистрировать ранние предопухолевые изменения по спектральным кривым.
На фиг. 21 изображен спектр липомы шеи, который имеет характерный вид: высокоамплитудные пики на 1000, 1200, 1500, 2950/см и низкоамплитудные на 900, 990, 1300, 1600, 2350, 2600/см, отмечается невысокая интенсивность флюоресценции- около 7000 отн. ед., на фоне высокой амплитуды основных пиков- около 15000 отн. ед. Однако несмотря на характерный вид кривых, следует использовать методы главных компонент, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов и метода проекции на латентные структуры для получения индивидуальных рамановских полос в соответствующем диапазоне, характеризующих конкретный вид ткани и ее состав.
На фиг. 22 изображен спектр опухоли пищевода- высокодифференцированной плоскоклеточной карциномы. На рис. видно, что кривая более гладкая по сравнению со спектрами ПКК другой локализации, имеет мелкозубристую поверхность низкоамплитудными пиками, трапециевидный пик, регистрировавшийся при ПКК других локализаций сдвинут вправо и имеет форму горба в диапазоне от 3100 до 3500/см.
На фиг. 23 проиллюстрированы индивидуальные спектральные особенности ткани гломусной опухоли среднего уха. Кривая имеет характерный вид: сначала повышение интенсивность флюоресценции до 9000 отн. ед., затем резкий спад. На 1050, 1150, 1500/см регистрируются низкоамплитудные пики, также пик на 2950/см сглажен и теряет трапециевидную форму. Исходя из полученных данных следует отметить, что сравнивать спектры нужно лишь в пределах одного класса ткани: то есть, опухоли уха- доброкачественные со злокачественными и интактными, а также с тканями, пораженными воспалительным процессом. Если мы изучаем спектральные особенности глотки, то, соответственно, нужно сравнивать вышеперечисленные виды патологического процесса в пределах тканей глотки, так как ткань также имеет свои особенности, которые вносят дополнительный вклад индивидуальные особенности спектральных кривых.
На фиг. 24 изображена спектральная кривая слизистой оболочки среднего уха при хроническом гнойном среднем отите. Кривая отличается резким подъемом интенсивности флюоресценции и, по сравнению со спектром интактной слизистой оболочки не имеет соответствующих пиков на различных длинах волн (см. рис. ниже).
На фиг. 25 отмечена спектральная кривая рубцовой ткани при адгезивном отите. В данном случае, по сравнению с хроническим воспалением, отмечается сначала повышение и плавное снижение интенсивности флюоресценции, также не отмечается пиков, характерных для нормальной слизистой оболочки среднего уха, на 2990/см отмечается соответствующий пик. Кривая имеет зазубренную форму и отрицательные пики.
Фиг. 26 иллюстрирует отличия спектральной кривой свежей грануляционной ткани в среднем ухе от спектров рубцовой ткани придлительном адгезивном процессе в среднем ухе. Снижение интенсивности флюоресценции имеет более крутой спад, положительных пиков не регистрируется.
На фиг. 27 продемонстрированы спектральные особенности хронического воспаления в среднем ухе с формированием полипов. Сначала отмечается постепенный подъем интенсивности флюоресценции свыше 9000 отн. ед., затем отмечается резкий ее спад и «плато» от 2400 до 3500/см с характерным пиком на 3000/см, который имеет сглаженную форму.
Фиг. 28 иллюстрирует, что в отличие от всех процессов в среднем ухе, отмеченных выше, при холестеатоме среднего уха регистрируется кривая, характеризующаяся высокой интенсивностью флюоресценции (свыше 70000 отн. ед.). Кривая относительно гладкая, не имеет положительных пиков.
На фиг. 29 отмечено, что в случае интактной слизистой оболочки среднего уха отмечаются пики на 1050, 1150, 1500, 2950/см, а также второй сигнал повышения интенсивности флюоресценции от 3000 до 3500/см. Интенсивность флюоресценции невысокая и равна приблизительно 1350 отн. ед. Как видно на рисунках, в норме с поверхности слизистой оболочки среднего уха регистриуются кривые с характерными пиками, при патологии такого не наблюдается. В случае же опухолей глотки картина противоположная: в норме данные пики не регистрируются, при опухолях- отмечаются. Данный факт еще раз подтверждает концепцию о том, что необходимо сравнивать норму-воспаление и опухоль лишь в пределах одного класса ткани, для исключения «ошибки» морфометрических характеристик самой ткани.
На фиг. 30 видим, что при склеротическом процессе в среднем ухе кривая напоминает кривую при холестеатоме, однако видно, что интенсивность флюоресценции значительно ниже: около 30000 отн. ед., максимальная интенсивность флюоресценции приходится на 1550/см, в отличие от таковой при холестеатоме (1700/см).
Фиг. 31 демонстрирует, что акустическая невринома имеет максимальный пик флюоресценции на 1510/см, интенсивность флюоресценции ниже, чем в случае холестеатомы и склеротического процесса (около 20000 отн. ед.). Снижение флюоресценции, начиная с 1510/см, имеет более крутой наклон и более стремительное; не имеет дополнительных небольших подъемов, то есть при снижении интенсивности флюоресценции, кривая приобретает более вогнутую форму.
На фиг. 32 видно, что в случае базально -клеточной карциномы наружного слухового прохода отмечается линейное повышение интенсивности флюоресценции приблизительно до 13000 отн. ед.; на величине 1750/см становится максимальным, затем следует резкий ее спад на 2100/см-минимальный, затем отмечается «плато» до 3000/см и постепенное снижение интенсивности флюоресценции. Похожие изменения прослеживались при регистрации спектров с поверхности полипов при хроническом воспалении в среднем ухе, однако в данном случае регистрация спектров проводится с поверхности структур наружного слухового прохода уха при злокачественном процессе в нем.
Фиг. 33 иллюстрирует спектральные особенности ткани околоушной слюнной железы при эпителиоидной злокачественной меланоме. Отмечаются основные пики на 1050, 1150, 1500/см, пик на 2950/см имеет низкую амплитуду, максимальная интенсивность флюоресценции 3250 отн. ед. Максимальная интенсивность флюоресценции приходится на величину 2050/см. Кривая имеет мелкозазубренную форму со множеством мелкоамплитудных пиков.
На фиг. 34 проиллюстрировано, что при плоскоклеточной карциноме околоушной слюнной железы отмечаются высокоамплитудные пики на 1010, 1150, 1500/см, низкоамплитудный пик на 2650/см, трапециевидный пик на 2950/см. Интенсивность флюоресценции около 3000/см, пиковая интенсивность флюоресценции около 4000 отн. ед., максимальное повышение интенсивности флюоресценции на величине 2050/см.
Согласно фиг. 35, в отличие от спектра при ПКК, при плеоморфной аденоме околоушной слюнной железы, пики становятся низкоамплитудными, регистрируются на 1000, 1100, 1300, 1490, 1510/см, далее следует резкий подъем интенсивности флюоресценции до 5100 отн. ед., затем снижение интенсивности флюоресценции, максимальное значение последней регистрируется на 2100/см, на величине 2950/см отмечается трапециевидный пик, который имеет более высокую амплитуду, по сравнению с таковым пиком при плоскоклеточной карциноме.
В соответствии с фиг. 36, при аденокарциноме околоушной слюнной железы отмечаются следующие особенности спектральной кривой: сначала отмечается постепенный подъем интенсивности флюоресценции, максимальное значение которого приходится на 2010/см, затем следует резкое снижение интенсивности флюоресценции до 2850/см; не регистрируется остроконечных высокоамплитудных пиков, как при плоскоклеточной карциноме околоушной слюнной железы, однако сохраняется трапециевидный пик на 2950/см.
На фиг. 37 отмечено, что при хроническом воспалении в области поднижнечелюстной слюнной железы отмечается постепенное повышение интенсивности флюоресценции до 30000 отн. ед., затем следует постепенное ее снижение до 2850/см, отмечается характерный трапециевидный пик, который имеет более низкую амплитуду по сравнению с подобным пиком при аденокарциноме околоушной слюнной железы. Интенсивность флюоресценции в данном случае также более высокая, кроме того, регистрируются отрицательные пики.
Фиг. 38 иллюстрирует, что при хроническом гиперпластическом риносинусите отмечается кривая без характерных пиков, интенсивность флюоресценции около 4500 отн. ед., максимальное ее значение приходится на 1990/см, кривая имеет мелкозубристую форму.
Согласно фиг. 39, при полипозном риносинусите отмечаются основные пики на 1200, 1510, 2950/см, максимальная интенсивность флюоресценции на 4100 отн. ед, также отмечается второй подъем интенсивности флюоресценции после регистрации пика на 2950/см. При формировании полипов отмечается появление соответствующих пиков, которые не наблюдаются при хроническом воспалении без формирования полипов.
В соответствии с фиг. 40, при дисплазии в случае хронического риносинусита отмечается снижение интенсивности флюоресценции, пики сдвигаются влево и регистрируются на 1050, 1150, 1500/см, пик после снижения интенсивности флюоресценции сдвигается немного вправо и регистрируется на величине 3000/см. Вместо постепенного снижения интенсивности флюоресценции наблюдается «плато» от 1900 до 2800/см, которое плавно переходит в пик на 3000/см. Второе повышение интенсивности флюоресценции имеет более высокую амплитуду по сравнению с последним пиком, чего не наблюдается при полипозном процессе и при хроническом воспалении без формирования полипов.
Фиг. 41 демонстрирует, что при папилломатозном процессе в верхнечелюстной пазухе отмечается характерный «двугорбый» вид спектральной кривой, интенсивность флюоресценции достигает 11000 отн. ед., затем снижается, второе повышение на 10500 отн. ед. Положительных пиков не регистрируется.
На фиг. 42 видно, что при переходном от хронического воспалительного процесса в плоскоклеточную карциному глотки при метастазах в лимфатические узлы отмечается спектральная кривая, изображенная на рис. Высокоамплитудные пики с пиковой интенсивностью 11800 отн. ед. регистрируются на 1150, 1500/см, также регистрируется пик на 1000/см и трапециевидный пик на 2950/см.
На фиг. 43 изображен спектр с поверхности метастазов в регионарный лимфатический узел при первичной локализации опухоли в околоушной слюнной железе (аденокарцинома). На 1100, 1500, 2950/см регистрируются соответствующие пики, 1650 отн. ед.- максимальная интенсивность флюоресценции, максимальная пиковая интенсивность флюоресценции достигает 1900/см, отмечается также второе повышение интенсивности флюоресценции в диапазоне 3050- 3400/см. Амплитуда пиков невысока, по сравнению с пиками при плоскоклеточной карциноме (при метастазировании в лимфатические узлы).
В соответствии с фиг. 44, при переходном от хронического воспалительного процесса в плоскоклеточную карциному глотки при метастазах в лимфатические узлы отмечается спектральная кривая, изображенная на рис. Высокоамплитудные пики с пиковой интенсивностью 11800 отн. ед. регистрируются на 1150, 1500/см, также регистрируется пик на 1000/см и трапециевидный пик на 2950/см.
Фиг. 45 иллюстрирует, что при злокачественной меланоме (при метастазировании в регионарные лимфатические узлы наблюдаются высокоамплитудные остроконечные пики на 1200, 1500/см, а также низкоамплитудные на 850, 990, 1000, 1300, 1450, 1650, 1750, 2300, 2700/см, также регистрируется трапециевидный пик на 2950/см. Интенсивность флюоресценции невысока и приближается к 6000 отн. ед. Пиковая интенсивность достигает 14000 отн. ед.
На фиг. 46 видно, что при плоскоклеточной карциноме языка отмечается гладкая спектральная кривая с максимальной интенсивностью флюоресценции около 24000 отн. ед. на 2100/см.
Фиг. 47 иллюстрирует, что в отличие от спектральной кривой при плоскоклеточной карциноме языка при отсутствии злокачественного процесса наблюдаются характерные пики на 1200, 1500, 2950 /см. Интенсивность флюоресценции в данном случае ниже и равна приблизительно 14000 отн. ед. Максимальная интенсивность флюоресценции приходится на величину волнового числа 1400/см.
В соответствии с фиг. 48, злокачественная меланома слизистой оболочки носа характеризуется спектральной кривой, представленной на рис. и отличается наличием пиков на 1200, 1500, 2950/см. Интенсивность флюоресценции около 4000 отн. ед., пиковая интенсивность флюоресценции немного выше, кривая имеет мелкозубристую форму.
На фиг. 49 видно, что при синоназальной карциноме отмечается гладкая спектральная кривая, однако, в отличие от спектров при хроническом гиперпластическом риносинусите отмечается интенсивность флюоресценции около 14000 отн. ед., максимальное ее значение приходится на 1990/см, кривая имеет мелкозубристую форму. При снижении интенсивности флюоресценции кривая имеет более выпуклую форму, отмечается положительный пик на 2990/см и отрицательный пик на 3250/см.
Согласно фиг. 50, спектральная кривая интактной слизистой оболочки гортани гладкая, не имеет положительных пиков, отличается максимальной интенсивностью флюоресценции свыше 20000 отн. ед на 1650/см.
На фиг. 51 отмечено, что при раке голосовых складок отмечается спектральная кривая, изображенная на рисунке и характеризующаяся максимальной интенсивностью флюоресценции свыше 5000 отн. ед. и с появлением высокоамплитудного широкого трапециевидного зубца со вторичным повышением интенсивности флюоресценции с 3000 до 3500/см, других положительных пиков не регистрируется.
На фиг. 52 отмечено, что при дисплазии в области голосовых складок наблюдается появление пика на 2950/см, а также сглаживание трапециевидного пика в диапазоне от 3000 до 3500/см, отчетливо визуализирующегося при раке голосовых складок, то есть, чем более злокачественный процесс в области голосовых складок в данном случае, тем более отчетливую форму приобретает данный трапециевидный пик.
Фиг. 53 иллюстрирует, что при плоскоклеточной карциноме гортани (низкодифференцированной, некератинизирующей) отмечается характерная двугорбая спектральная кривая без дополнительных пиков. На 1800/см отмечается вторичный подъем интенсивности флюоресценции, однако он менее выражен, по сравнению с первым.
На фиг. 54 проиллюстрировано, что средне-дифференцированная некератинизирующая плоскоклеточная карцинома с метастазированием в регионарные лимфатические узлы характеризуется гладкой кривой, без дополнительных пиков с максимальной интенсивностью флюоресценции 45000 отн. ед. на 1550/см.
Фиг. 55 демонстрирует, что при плоскоклеточной карциноме гортани (низкодифференцированной, некератинизирующей) отмечается характерная двугорбая спектральная кривая без дополнительных пиков. На 1800/см отмечается вторичный подъем интенсивности флюоресценции, однако он менее выражен, по сравнению с первым. В отличие от спектральной кривой, полученной из области лимфоузла с метастазами, отмечается двугорбый характер кривой.
На фиг. 56 изображены спектральные характеристики крови пациента, не страдающего никакими заболеваниями (здоровый доброволец). Отмечается гладкая кривая, без дополнительных пиков с максимальной интенсивностью флюоресценции 65000 отн. ед. на величине 2100/см.
В соответствии с фиг. 57, при хроническом тонзиллите отмечаются следующие особенности спектральной кривой, полученной от образца крови: кривая приобретает дополнительные пики на следующих величинах волновых чисел- 500, 1000, 1200, 1250, 1400, 1500, 1600, 1650, 1900/см, то есть имеет мелкозубристую форму; максимальная интенсивность флюоресценции значительно ниже и составляет около 12000 отн. ед., максимум приходится на величину 1150/см.
На фиг. 58 видно, что при хроническом тонзиллите, компенсированной форме (классификация Солдатова И.Б., 1975) при регистрации спектров крови отмечается сначала постепенный подъем интенсивности флюоресценции, как показано на фиг. 58, затем отмечается «плато» от 2000 до 2950/см, затем-постепенное снижение интенсивности флюоресценции, дополнительные пики не визуализируются из-за сильного сигнала флюоресценции.
Фиг. 59 демонстрирует, что при хроническом тонзиллите, декомпенсированной форме, как видно на рисунке, отмечается более резкое снижение интенсивности флюоресценции без формирования «плато», однако изменения между данными формами хронического тонзиллита видны лишь при использовании в совокупности методов главных компонент, линейного дискриминантного анализа, принципа наименьших квадратов, метода проекции на латентные структуры, так как сигнал флюоресценции при хроническом тонзиллите достаточно высокий, дополнительных пиков не видно на фоне мощного сигнала флюоресценции.
Фиг. 60 иллюстрирует, что при нейросенсорной тугоухости регистрируются множество пиков на всем протяжении, спектральная кривая, как видно на рисунке, имеет «частоколообразный вид», максимальная интенсивность флюоресценции приходится на 2000/см и равна около 1750 отн. ед., максимальная пиковая интенсивность флюоресценции равна 2000 отн. ед., после снижения интенсивности флюоресценции регистрируется 2 дополнительных пика, в отличие от спектров в норме при хроническом тонзиллите.
На фиг. 61 а изображены спектральные кривые, полученные с поверхности небных миндалин пациента с хроническим тонзиллитом, компенсированной формой, до проведения лечения-промывания лакун небных миндалин раствором антисептика- хлоргексидина 0,02%-ного.
На фиг. 61 а видно, что при воспалительных изменениях в миндалинах при XT на графике появляются дополнительные пики на величинах 6370, 7050  что говорит как о регистрации патогенной флоры, так и о повышении концентрации условно патогенной флоры, что может приводить к заболеванию.
Показатели спектральных характеристик ткани небных миндалин при XT в графическом виде изображены на фиг. 61 а; в цифровом виде представлены ниже:
ИА 3-1,05; ИФ 3-0,381; ИА 2-0,893; ИФ 2-1,29; ИА 1-1,46; ИФ 1-0,188; ИА интакт.- 1,84; ИФ интакт.- 5,63 Е+06, где ИФ=НПФ-нормированный показатель флюоресценции, И А- индекс аэробности в изучаемой точке (точки 1-4, включая интактную).
Фиг. 61 а иллюстрирует график спектральных характеристик ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите до проведенного лечения. Отмечается характерный пик на 6370  которого в норме никогда не наблюдается. Данный пик свидетельствует о наличии процесса хронической гипоксии в ткани и выделении протопорфирина IX; в норме подобных изменений не регистрируется (рис. 61 г- графики спектральных характеристик ткани небных миндалин здоровых добровольцев. Интенсивность флюоресценции интактных тканей миндалин, измеренная в разных точках практически одинакова и крайне низка по интенсивности, по сравнению с амплитудно- спектральными показателями области сравнения (кожные покровы)).
Величины индексов аэробности и нормированных показателей флюоресценции в исследуемых точках рассчитываются следующим образом:
Спектр будем задавать функцией интенсивности от длины волны: F=F(x)
Эти два индекса - интегральные индексы флюоресценции (по всему спектральному диапазону) для функций Intact и Fundus.
Intact- интактная точка, в данном случае-кожа внутренней поверхности предплечья, Fundus- измерения в точке 1 - у верхнего полюса небной миндалины, Middle-измерения в точке 2- на слизистой оболочке небной миндалины вблизи нижнего ее полюса, Internal-измерения в точке 3- в лакуне небной миндалины. В соответствующих формулах указаны описанные обозначения. Все функции заложены в программном обеспечении аппаратно-программных комплексов, использующихся в заявляемом способе.
Эти три индекса - нормированные (на интегральный индекс флюоресценции в интактной точке) индексы флюоресценции для функций Fundus, Middle, Internal.
Описанные индексы обозначены в описании как «нормированный показатель флюоресценции» (далее в тексте «НПФ» или «ИФ»).
Это четыре индекса аэробности для функций Intact, Fundus, Middle, Internal. Эти индексы обозначены на рисунках 61 а-г как «индекс аэробности» (далее в тексте «ИА»). Также можно рассчитать для каждой точки в динамике до и после проведенного лечения следующие индексы:
Это нормированный индекс отраженного лазерного излучения (центр лазерной линии 637 нм) - он представляет из себя отношение интегральной интенсивности обратно отраженного лазерного света (в диапазоне 630 - 642 нм) для интактной точки (в числителе) и изучаемой точки (в знаменателе). Он показывает, насколько больше отражает интактная ткань по сравнению с точкой 1. По этому индексу можно оценивать состояние ткани небной миндалины в точке 1.
Эта 2 индекса микробной обсемененности для интактной ткани и ткани небной миндалины. Они показывают отношение интегральной интенсивности флюоресценции протопорфирина IX (который является индикатором бактериальной обсемененности) к интегральной интенсивности флюоресценции тканей в спектральном интервале [665-675 нм], в котором эта линия не наблюдается.
Это два индекса оксигенации. Чем они выше, тем должна быть больше оксигенация (то есть тем больше в тканях должно содержаться окисленной формы гемоглобина).
Такие диапазоны интегрирования выбраны из следующих соображений: в точке 660 нм наблюдается наибольшая разница в спектрах поглощения окисленной и обычной форм гемоглобина, а в точке 820 нм их спектры поглощения пересекаются. Таким образом, чем больше будет окисленного гемоглобина в ткани (он поглощает слабее вблизи точки 660 нм), то тем больше будет индекс оксигенации.
Все вышеперечисленные индексы позволяют судить о физиологических, морфометрических, метаболических изменениях в ткани в норме и при воспалении или опухолевом  (доброкачественном и злокачественном процессе). Оценивая данные индексы с использованием специального программного обеспечения, становится возможным проводить моментальную диагностику патологического процесса в тканях ЛОР-органов при опухолях и воспалительном процессе, проводить мониторинг лечения, оценивать его эффективность, проводить дифференциацию тканей на ранних стадиях заболевания.
Фиг. 61 б иллюстрирует значительное изменение всех вышеперечисленных индексов, а также характера кривой после кратковременного воздействия (около нескольких секунд) антисептика-хлоргексидина 0,02%-ного при промывании лакун небных миндалин, то есть повышается интенсивность флюоресценции, что свидетельствует о гибели микроорганизмов и высвобождении протопорфиринов в массовом количестве. На фиг. 61 б изображены спектральные характеристики ткани небных миндалин в графическом виде, в цифровом виде они представлены ниже:
ИА 3-1,88; ИФ3-0,966; ИА2-2,35; ИФ 2- 0,549; ИА 1- 1,9; ИФ1-1,23; ИА интакт.-1,89; ИФ интакт.-7,6 Е+06, где ИА-индекс аэробности в изучаемой точке, ИФ- интенсивность флюоресценции, нормированная на интактную точку, или нормированный показатель флюоресценции (далее НПФ).
На фиг. 61в видно, что все спектральные характеристики после проведения полного курса консервативного лечения- промывания лакун небных миндалин раствором хлоргексидина 0,02%-ным, возвращаются к нормальных значениям, что свидетельствует об эффективности консервативной терапии: а именно, структура ткани, оксигенация, микроциркуляция нормализовались, индекс аэробности повысился, спектральных данных в пользу патогенной флоры не визуализируется, максимальный пик флюоресценции лежит в нижней трети кривой, зарегистрированной с поверхности интактной точки, интенсивность флюоресценции становится ниже, структурированность спектров восстанавливается, дополнительных пиков не регистрируется, интенсивность флюоресценции, измеренная во всех точках небных миндалин, находится в нижней трети площади под кривой, характеризующей спектральные особенности интактной точки- кожи внутренней поверхности предплечья. Также повышаются индексы аэробности, снижаются нормированные показатели флюоресценции, что говорит об увеличении оксигенации ткани и уменьшении микробной обсемененности и степени воспалительного процесса на фоне проводимой терапии, а также свидетельствует о клиническом улучшении и морфологическом восстановлении ткани небных миндалин.
На фиг. 61 в изображены спектральные характеристики ткани небных миндалин в графическом виде, в цифровом виде они представлены ниже:
ИА 3-1,74; ИФ 3-0,282; ИА 2-1,74; ИФ 2-0,278; ИА 1-1,8; ИФ 1-0,187; ИА интакт.- 1,85; ИФ интакт.- 9,05 Е+06
На графике (фиг. 61 в) видим, что структура ткани, оксигенация, микроциркуляция нормализовались, индекс аэробности повысился, спектральных данных в пользу патогенной флоры не визуализируется, максимальный пик флюоресценции лежит в нижней трети кривой, зарегистрированной с поверхности интактной точки, что свидетельствует о клиническом улучшении и морфологическом восстановлении ткани небных миндалин.
Фиг. 61 г иллюстрирует спектральные характеристики ткани небных миндалин здоровых добровольцев, которые значительно отличаются от таковых при хроническом тонзиллите: интенсивность флюоресценции невысока и находится в нижней трети площади под кривой, описывающей интенсивность флюоресценции в интактной точке- коже внутренней поверхности предплечья, дополнительных пиков не регистрируется, структурированность спектров в норме: в каждой точке спектры совпадают друг с другом, что говорит об отсутствии патологического процесса в ткани.
На фиг. 61 г изображены спектральные характеристики ткани небных миндалин в графическом виде, в цифровом виде они представлены ниже:
ИА 3-1,12; ИФ 3-0,137; ИА 2-1,26; ИФ 2-0,159; ИА 1-1,61; ИФ 1-0,0942; ИА интакт.- 1,97; ИФ интакт.- 4,85 Е+06
После определения чувствительности и специфичности метода были получены индивидуальные спектральные характеристики в цифровом и графическом виде пациентов с хроническим тонзиллитом до и после курса стандартного консервативного лечения (промывание лакун миндалин раствором хлоргексидина 0,02%-ным №8, ежедневная обработка миндалин раствором Люголя, физиотерапия). Индексы аэробности, нормированные показатели флюоресценции у данной группы пациентов до и после лечения значительно отличались - интенсивность флюоресценции стала в 2 раза меньше и практически стала приближаться к показателям интактной ткани небных миндалин и, по сравнению с исходными значениями, составила  площади под кривой интактной точки, структурированность спектров практически восстановилась, что говорит об эффективности проведенного лечения. Т.е. все исследуемые показатели качественно и количественно приближаются к показателям интактной ткани небных миндалин, не вовлеченной в воспалительный процесс.
Ниже представлены индексы аэробности (ИА) и нормированные показатели флюоресценции (НПФ) в исследуемых точках 2, 3, 4, а также в интактной точке больного хроническим тонзиллитом до и после стандартного курса консервативного лечения. 1 - те же показатели в интактной области.
Показатели до лечения:
ИА 3-1,05; НПФ3-0,38; ИА2-0,9; НПФ2-1.29; ИА1-1.46; НПФ1-0,19; ИА интакт.-1,84; ИФ интакт.-5,63 Е+06
Показатели после лечения:
ИА 3-1,5; НПФ3-0,21; ИА2-1,55; НПФ2-0,14; ИА1-1,79; НПФ1-0,08; ИА интакт.- 2,24; ИФ интакт.- 6,91 Е+06.
После проведенного курса лечения наблюдается повышение увеличение значений индексов аэробности в изучаемых точках, что говорит о том, что в ткани восстановилась микроциркуляция и повысился уровень оксигенации. Также можно наблюдать снижение НПФ (ИФ) в исследуемых точках, что говорит в пользу уменьшения воспалительного процесса (микробной обсемененности на грамм ткани) и восстановления прежней структуры ткани.
Таким образом, применение раман-флюоресцентной спектроскопии в сочетании с методом главным компонент, линейным дискриминантным анализом и принципом наименьших квадратов при проведении малоинвазивной ускоренной дифференциальной диагностики воспалительного и опухолевого процесса на различных стадиях патогенеза и при различных диагнозах является перспективным направлением клинической оториноларингологии и может служить в дальнейшем не только в качестве экспресс- интраоперационной диагностики, но и скринингового определения стадии патологического процесса в организме и проведения мониторинга и реабилитации пациента. Метод позволяет с высокой точностью, чувствительностью и специфичностью определять принадлежность ткани к интактной, воспаленной либо опухолевой при наличии соответствующей базы спектральных данных по качественной и количественной характеристике метаболитов образцов, а также их морфометрических показателей. Таким образом, подтвердилась концепция о том, что раман-флюоресцентная спектроскопия объективно отражает индивидуальные характеристики ткани в норме и при патологии, позволяет зарегистрировать изменения в ней, происходящие на молекулярном уровне в динамике с высокой чувствительностью и специфичностью. Таким образом, также можно заключить, что с использованием метода раман-флюоресцентной спектроскопии мы можем идентифицировать тип ткани как in vitro, так и in vivo и ускорить процесс диагностики для назначения соответствующего лечения в ранние сроки. Кроме того, после разработки специального алгоритма, данный метод может использоваться в качестве скринингового для регистрации ранних изменений ткани и проведения профилактических мер. Из представленных результатов следует, что выбор метода и его программной реализации в аппаратно-программных комплексах «EnSpectr R532» и ««EnSpectr L405» при патологии ЛОР-органов и других органов головы и шеи, на основе представленных данных, объективно обоснован его высокой чувствительностью и специфичностью. Анализ спектральных и цифровых данных ткани в норме и при патологии является важным аспектом в диагностике и позволяет проводить мониторинг течения патологического процесса как на местном, так и системном уровне. Оптические спектральные методы являются многообещающими в отношении in vivo- диагностики рака различной локализации. С использованием метода раман-флюоресцентной спектроскопиив будущем станет возможным неинвазивным способом определять границу опухоли, тип ткани, зоны проведения резекции при онкологическом процессе. В настоящее время продолжается набор базы данных рамановского рассеяния света и флюоресценции тканей ЛОР-органов и других органов головы и шеи при различных воспалительных и онкологических процессах, в том числе в динамике на фоне проводимого лечения. После доработки методики на репрезентативном клиническом материале с использованием аппаратно-программных комплексов EnSpectr с зондирующим излучением в широком спектральном диапазоне (от 405 нм до 1064 нм) и создании базы данных типичных спектров различных заболеваний ЛОР - органов и других органов головы и шеи, включая воспалительные и опухолевые заболевания, данный способ диагностики может быть использован в широкой клинической практике в интересах больного и врача.