Роль пуриновых рецепторов тромбоцитов в регуляции гемостаза (обзор литературы)

рецепторе ОРНЬ/Ша [10, 14], что обусловливает усиление агрегационной активности тромбоцитов. Именно низкие концентрации плазменного Са2+, по данным ряда авторов, обусловливают более выраженный эффект адреналина на а2-рецепторы тромбоцитов [9, 13]. В нашем исследовании были выявлены отрицательные слабые и средние корреляционные связи между уровнем Са2+ и кальция общего со степенью агрегации тромбоцитов при индукции АДР (г = -0,429 и г = -0,580). Таким образом, исходно низкий уровень Са2+ у пациентов с ХБП, возможно, способствует развитию состояния гиперагрегации тромбоцитов при индукции АДР.

Уровень неорганического фосфата был повышен у всех пациентов в исследуемой выборке ХБП за счет снижения его фильтрации в почечных клубочках, но в группе пациентов с состоянием гиперагрегации тромбоцитов его значение было достоверно выше, чем в других группах пациентов. Анализ доступной нам литературы не привел к объяснению данного факта. Возможно, гиперфосфатемия такой степени приводит к изменению синтеза макроэргических соединений (АТФ, АДФ) и таким образом влияет на агрегационную функцию тромбоцитов.

Вывод. В процессе исследования нами были выявлены зависимости: между усилением агрегационной функции тромбоцитов и наличием хронического гломерулонефрита в анамнезе как причина ХПН; между состоянием гиперагрегации тромбоцитов при индукции АДР и депрессией фибрино-литической активности плазмы; между состоянием гиперагрегации тромбоцитов при индукции АДР и низким уровнем

общего и ионизированного кальция; между высоким уровнем неорганического фосфора и усилением агрегационной

функции тромбоцитов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дзгоева Ф. У., Гатагонова Т. М. // Тер. арх. - 2010. - № 1. - С. 51.

2. Долгов В. В., Свирин П. В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. - М.: РМАПО, 2005. - С. 176-183.

3. Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П. Общая патофизиология с основами иммунопатохимии. - СПб., 2008. - С. 241-273.

4. Клиническая биохимия / Бочков В. Н., Добровольский А. Б., Куш-линский Н. Е. и др. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - С. 224-238.

5. Мовчан Е. А. // Бюл. сиб. мед. - 2008.

6. Морозова В. Т., АвдееваН. А. Коагулологические синдромы. Лабораторная диагностика. - М., 2006.

7. Папаян А. В. Патогенез геморрагического диатеза при почечной недостаточности: Сборник статей / Под ред. А. Ф. Тур. - Л., 1972.

8. Ставрова Т. С., ТовН. Л., Мовчан Е. А. // Тер. арх. - 2007. - № 6.

9. Шитикова А. С. Тромбоцитарный гемостаз. - СПб., 2000. - С. 36-40; 52-53; 80-90; 144-145.

10. KrollM. N, Schafer A. I. // Blood. - 1989.

11. PackhamM. A., Mustard J. F. // Progress in hemostasis and thrombosis. - New York, 1984. - P. 211-288.

12. Schneider W., SchumacherK., GrossR. // Thromb. Diath. Haemorrh. - 1969. - N 1. - P. 208-209.

13. Siess W. // Physiol. Rev. - 1989. - Vol. 69. - P. 58-178.

14. Horowitz H, Cohem В., Martinez P. // Blood. - 1967. - Vol. 30, N 3. - P. 331.

Поступила 13.03.12

© Э. Ф. БАРИНОв, О. Н. СУЛАЕвА, 2012 УДК 616.151.5-092:612.111.7

Э. Ф. Баринов, О. Н. Сулаева

роль пуриновых рецепторов тромбоцитов в регуляции гемостаза

Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

Обсуждается роль АДФ и АТФ и их рецепторов в регуляции функционального состояния тромбоцитов, поддержании гомео-стаза сосудистой стенки и координации воспалительно-репаративного процесса. На тромбоцитах представлены три варианта пуриновых рецепторов: P2X] - катионный канал, активируемый АТФ, и P2Y1 и P2Y]2- ассоциированные с G-белками и активируемые АДФ. Авторы рассматривают внутриклеточные механизмы реализации эффектов АДФ и АТФ в тромбоцитах, механизмы их десенситизации, связь с метаболизмом арахидоновой кислоты и тирозиновыми киназами, роль в регуляции внутриклеточного уровня Са2+. Приводятся данные о полиморфизме рецепторов P2Y, обсуждается роль этого феномена в нарушении тромбогенеза, развитии патологии сердечно-сосудистой системы и резистентности к антитромбо-цитарной терапии.

Ключевые слова: тромбоциты, пуриновыерецепторы

E.F. Barinov, O.N. Sulayeva

THE ROLE OF PURINE RECEPTORS OF THROMBOCYTES IN REGULATION OF HEMOSTASIS

The article discusses the role ofADP and ATP and their receptors in regulation of functional .state of thrombocytes, maintenance of vessel wall homeostasis and coordination of inflammatory reparative process. The thrombocytes carry three modes of purine receptors: P2X1 (cationic channel activated by ATP) P2Y1 and P2Y12 (associated with G-proteins and activated by ADP). The article considers intracellular mechanisms of implementation of effects of ADP and ATP in thrombocytesб mechanisms of their desensitization, relationship with metabolism of arachidonic acid and tyrosine kinase and role in regulation of intracellular concentration of Ca2+. The data concerning polymorphism of receptors P2Y is presented. The role of this phenomenon in thrombogenesis disorders, development of pathology of cardio-vascular system and resistance to anti-thrombocyte therapy is discussed.

Key words: thrombocytes, purine receptor

Одним из важнейших факторов альтернативных нарушений гемостаза является дисфункция тромбоцитов. Тромбоциты являются интегральной частью физиологического ответа на повреждение сосудистой стенки и вместе с продуктами каскада свертывания крови формируют "гемостатическую губку". В физиологических условиях существует баланс между активацией и ингибированием агрегации тромбоцитов (АТ), но при действии различных патогенных факторов этот баланс нарушается, что лежит в основе таких заболеваний, как нестабильная стенокардия, инфаркт миокарда, тромбоз периферических артерий, кровотечения различного генеза и пр. [20]. Важными активаторами тромбоцитов являются пурины, которые играют критическую роль в реализации полноценного ответа форменных элементов крови на повреждение сосудистой стенки, принимают участие в активации тромбоцитов, регуляции сосудистого тонуса и воспалительно-репаративного процесса [4].

Рецепторы для внеклеточных нуклеотидов относятся к семейству Р2, которое включает 2 класса рецепторов: Р2Х -лигандсвязывающие катионные каналы и Р2У - рецепторы, ассоциированные с О-белками. В 1990 г было клонировано 4 подтипа рецепторов Р1 к аденозину, 7 подтипов Р2Х-рецепторов - ионных каналов (Р2Х) и 8 подтипов Р2У-рецепторов, осуществляющих свое действие через О-белки (Р2У1 2 4 6 11-14). Рецепторы к пуринам широко представлены в клетках кровеносных сосудов, сердца, семенника, простаты и яичника [23]. Р2У1- и/или Р2У2-рецепторы широко представлены на гладких миоцитах внутренних органов. Все клонированные типы Р2У-рецепторов обнаружены в здоровом сердце и при развитии сердечной недостаточности, что подтверждает их роль в функционировании миокарда [28]. Обнаружены типы Р2У1 2 4 6 Р2-рецепторов на гладкомы-шечных клетках сосудистой стенки, однако доминирующими являются Р2Х1-рецепторы [11, 12].

Доказана роль пуринов и рецепторов к ним в прогресси-ровании атеротромбоза и ангиогенезе [2], так как пуринерги-ческие лиганд-рецепторные системы представлены во всех клетках, вовлеченных в воспаление и атеросклероз. Известно, что пурины стимулируют продукцию простагландинов и оказывают митогенное действие на тимоциты преимущественно через Р2У2- и Р2У1-рецепторы [20]. Р2У2-рецепторы являются доминирующим типом для фагоцитирующих макрофагов, тогда как типы Р2У1 4 участвуют в модуляции их регуля-торной функции. Активация Р2У1-рецепторов нейтрофилов вызывает усиление их адгезии к эндотелию [22]. Экспрессия Р2У1 2 4 6 11-рецепторов выявлена в эозинофилах и лимфоцитах.' Р2У1 2 4 6-рецепторы выявлены на моноцитах и могут модулировать их созревание в дендритные клетки, а также участвуют в регуляции цитокиновой продукции [27]. Действие АДФ через Р2У1- и Р2У2-рецепторы ведет к дегрануля-ции и высвобождению гистамина из тучных клеток, а также стимулирует их миграцию и хемоаттракцию. Р2У1- и/или Р2У2-рецепторы являются доминантными на эндотелиаль-ных клетках, где они ингибируют высвобождение N0 и последующую вазодилатацию, а также пролиферацию клеток и экспрессию адгезивных белков для моноцитов. Пурины и Р2-рецепторы вовлечены в регуляцию клеточного роста, пролиферации и гибели клеток, ангиогенез. Установлено, что антагонисты Р2У12-рецепторов уменьшают экспозицию Р-селектинов, ограничивая образование агрегатов тромбоцит - лейкоцит, а также экспозицию тканевого фактора [12]. Бло-

Для корреспонденции:

Баринов Эдуард Федорович, д-р мед. наук, проф., зав. каф. гистологии, цитологии и эмбриологии Адрес: 83003, Донецк, пр. Ильича, 16 Телефон: (0622)95-54-01 E-mail: barinoff@dsmu.edu.ua

када Р2У12-рецепторов сопровождается ингибированием экспозиции и высвобождения СБ40Ь, снижением уровня циркулирующего С-реактивного белка и уменьшением проявлений острого воспалительного ответа организма. Наиболее изучены пуриновые рецепторы и молекулярные механизмы реализации их эффектов на тромбоцитах. Именно исследования на тромбоцитах позволили установить роль рецепторов к АДФ и АТФ в реализации фазы прогрессирования тромбогенеза, что позволило определить новую стратегию антитромбоци-тарной терапии сердечно-сосудистых заболеваний [2, 27].

Пуриновые рецепторы тромбоцитов. На тромбоцитах представлено три варианта пуриновых рецепторов: Р2Х1 -катионный канал, активируемый АТФ, и Р2У1 и Р2У12 - активируемых АДФ 2 варианта рецепторов, ассоциированных с О-белками [23].

Для АДФ-индуцированной агрегации необходима совместная активация Р2У1- и Р2У12-рецепторов. Тем не менее изолированное ингибирование одного типа рецепторов ведет к значимому снижению АТ. Установлено, что эти типы рецепторов имеют разное функциональное значение, за исключением активации, вызванной коллагеном. Ряд авторов считают, что Р2У1-рецепторы играют минорную роль при активации тромбоцитов другими агонистами, тогда как Р2У12-рецепторы обеспечивают амплификацию этого ответа. При этом остается интригующий вопрос, почему АДФ является слабым агонистом по сравнению, например, с тромбоксаном А2 или тромбином, индицирует только обратимую агрегацию и не способен самостоятельно вызывать секрецию гранул тромбоцитов. Вероятно, эти особенности обусловлены очень низким уровнем экспрессии Р2У1-рецепторов на плазмолем-ме тромбоцитов по сравнению с другими рецепторами, ассоциированными с О-белком. Поскольку на тромбоцитах представлено около 150 Р2У-рецепторсвязывающих участков, что существенно ниже плотности рецепторов к коллагену или тромбину (соответственно от 1000 до 2000 мест на тромбоците) [21], суммация этих данных подтверждает, что низкий уровень экспрессии Р2У1-рецепторов может ограничивать ответ тромбоцитов. Р2У1- и Р2У12-рецепторы также дифференцированно вовлекаются в прокоагулянтную активацию тромбоцитов.

Избирательная активация Р2У1-рецепторов вызывает умеренную, временную и нестабильную агрегацию. Секреция плотных и а-гранул в ответ на воздействие АДФ инициируется через активацию Р2У1-рецепторов и усиливается при стимуляции пуриновых рецепторов подтипа Р2У12. Активация Р2У12-рецепторов под действием АДФ со стимуляцией О.-белка играет центральную роль в АТ при действии таких аго-нистов, как тромбин, коллаген, тромбоксан А2 [21]. В основном этот эффект связан с поддержанием активации ОРПЪ/Ша и обеспечивает стабильную агрегацию [14]. Параллельно этот процесс сопровождается секрецией гранул, увеличением экспрессии Р-селектина (который обеспечивает провоспалитель-ный эффект через активацию лейкоцитов), а также вызывает прокоагулянтные изменения на поверхности плазмолеммы тромбоцитов при стимуляции другими агонистами [13]. Инги-бирование Р2У12-рецепторов может ослаблять АТ, а также их прокоагулянтную и провоспалительную активацию (что имеет место при коронарном атеросклерозе).

Характеристика P2Y-рецепторов. Активация Р2У1-рецепторов обеспечивает слабый ответ тромбоцитов на воздействие АДФ, но играет важную роль в инициации тром-богенеза под действием коллагена и других стимуляторов адгезии [27]. Р2У1-рецепторы ассоциированы с Оq-белком и вызывают мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо, что ведет к изменению формы тромбоцитов и временной агрегации при действии АДФ. Более того, эти рецепторы абсолютно необходимы для АТ, индуцированной АДФ. При их фармакологическом выключении или генетическом дефиците отсутствует ответ тромбоцитов на АДФ. На внутриклеточном уровне это сопровождается нарушением Са2+-сигнализации

[26]. Р2У1-рецепторы играют ключевую роль в индуцированном коллагеном изменении формы даже в условиях ингиби-рования циклооксигеназы (ЦОГ) и продукции тромбоксана А2 [24]. Показано, что активация Р2У1-рецепторов также ведет к активации р160 Р1ю-киназы, которая вместе с повышением уровня Са2+ определяет изменение формы тромбоцитов при активации АДФ.

Исследование роли Р2У1-рецепторов тромбоцитов в контроле АТ и тромбогенезе подтверждают высокую эффективность блокады указанных рецепторов, однако ингибирова-ние Р2У1-рецепторов вызывает только умеренное пролонгирование времени кровотечения [22]. У Р2У1-дефицитных мышей и у животных, получавших селективный антагонист Р2У1, выявлена резистентность к системной тромбоэмболии, вызванной инфузией смеси коллагена и адреналина или инъекцией тканевого фактора. Роль Р2У1-рецепторов продемонстрирована при локальном тромбозе с использованием интравитальной микроскопии после повреждения мезентеральных артерий, вызванного хлоридом железа, или при волновом действии лазера. При условии дефицита Р2У1-рецепторов введение клопидогреля вызывает большую тром-борезистентность, чем при изолированном эффекте блокато-ров пуриновых рецепторов [3].

Кроме того, показана роль Р2У1-рецепторов в экспрессии Р-селектина, формировании тромбоцитарно-моноцитарных агрегатов и стимуляции экспозиции тканевого фактора при стимуляции АДФ, коллагеном или низкими концентрациями агонистов тромбиновых рецепторов [8, 9]. Обсуждается патогенетическая роль Р2У1-рецепторов в атеротромбозе, поскольку у Р2У1-дефицитных мышей, скрещенных с животными с дефектом гена аполипопротеина Е, наблюдали уменьшение размера атеросклеротических бляшек. Необходимо подчеркнуть, что сами по себе Р2У1-рецепторы не способны реализовать все указанные влияния АДФ на активацию тромбоцитов и ряд параметров зависит от участия Р2У12-рецепторов.

Характеристика Р2У¡-рецепторов. Задолго до молекулярного клонирования была доказана возможность лекарственной регуляции гемостаза и тромбоза препаратами, модулирующими ответ Р2У12-рецепторов. Этот эффект связан с мощным антитромботическим действием тиклопидина и клопидогреля, которые селективно и необратимо ингибиро-вали ответ тромбоцитов на действие АДФ, блокируя развитие тромбоза [1, 7].

Молекулярная идентификация Р2У12-рецепторов была проведена сравнительно недавно, ранее аналоги этих рецепторов называли Р2УДС, Р2Т или Р2СУС. Их тканевое представительство ограничено; доказано присутствие Р2У12 не только на тромбоцитах, но также в глиальных клетках мозга, на гладких миоцитах. Р2У12-рецепторы связаны с Оьбелком и ответственны за усиление и завершение агрегации тромбоцитов в ответ на инициированное с Р2У1-рецепторов [23]. Внутриклеточный путь, через который Р2У12-рецепторы усиливают ответ тромбоцитов, включает уменьшение продукции цАМФ вследствие ингибирования аденилатциклазы (АЦ) с последующим ограничением активности протеинкиназы А, дефосфорили-рованием вазодилататорстимулированного фосфопротеина, активацией фосфоинозитол-3-киназы (Р13К) и малых ГТФаз - Яар1В. Важную роль в реализации ответа тромбоцитов на действие АДФ играет опосредованная Р2У12-рецепторами активация Р13К, которая, модулируя рецепторы 1Р3Р, усиливает раскрытие кальциевых каналов саркоплазматического рети-кулума тромбоцитов и выход ионов Са2+ [16]. Этот механизм лежит в основе Са2+-ответа на активацию Р2У12-рецепторов, хотя реализация этого механизма оспаривается рядом авторов [26], которые считают, что активация указанных рецепторов не влияет опосредованно на уровень внутриклеточного Са2+. Разногласия в отношении эффектов Р2У12-рецепторов на уровень Са2+ могут быть связаны с разными условиями инкубации тромбоцитов. Ряд авторов изучали тромбоциты в услови-

ях отсутствия простагландина Е2 (ПГЕ2) или простациклина [24], тогда как другие исследователи использовали ПГЕ2 для анализа роли цАМФ в ингибировании Са2+-ответа, что могло влиять на работу Обвязанного потенциирования Са2+-ответа Р2У12-рецепторов [26]. В присутствии ПГЕ2 отмечена блокада Са2+-ответа на AR-C69931MX (агонист Р2У12-рецепторов), что может отчасти быть связано с ингибированием Р2У12-медиируемого G.-ответа вследствие стимулирующего эффекта ПГЕ2 на АЦ. При использовании ингибитора АЦ SQ22536 отмечено ограничение подъема Са2+ в ответ на AR-C69931МХ. При этом отмечался частичный подъем концентрации Са2+ при стимуляции Р2У12-рецепторов. Физиологическое ингиби-рование действия АДФ на тромбоциты связано с постоянным действием эндотелиального простациклина [26]. Доказан ин-гибирующий эффект цАМФ путем активации протеинкиназы А, контролирующий 1Р3Р-индуцированное высвобождение Са2+ из депо, а также за счет активации плазматической Са2+-АТФазы, откачивающей Са2+ из цитозоля. Кроме того, активация Р2У12-рецепторов введением АДФ или синтетических аналогов снижает апоптоз клеток сосудистой стенки, вызванный фактором некроза опухолей через ERK1/2-, Akt- и JNK-фосфорилирование [15].

Активация Р2У12-рецепторов под действием АДФ, сопровождающаяся активацией Gi-белка, играет центральную роль в амплификации ответа тромбоцитов на введение более мощных агонистов (тромбина, коллагена, тромбоксана А2). В основном этот эффект связан с поддержанием активации GPIIb/IIIa и стабильной AT [14]. Параллельно этот процесс сопровождается секрецией гранул, увеличением экспрессии Р-селектина. а также включает прокоагулянтные изменения на поверхности плазмолеммы тромбоцитов при стимуляции другими агонистами. Ингибирование Р2У12-рецепторов может ослаблять агрегацию тромбоцитов, а также их прокоагу-лянтную и провоспалительную активацию (что важно в терапии острого коронарного синдрома).

Генетический дефицит Р2У12-рецепторов или их фармакологическое ингибирование ведут к выраженному торможению агрегации, вызванной низкими или средними концентрациями агонистов. Это сделало Р2У12-рецепторы привлекательной молекулярной мишенью антитромбоцитар-ных препаратов, относящихся к производным тиенопириди-нов. Клопидогрель и тиклопидин вызывают дозозависимую блокаду связывания АДФ за счет ковалентных связей с ци-стеиновыми остатками Р2У12-рецепторов [10]. Кроме того, активные метаболиты клопидогреля могут "разбивать" го-модимеры Р2У12-рецепторов, экспрессируемые в липидных щелях [3]. За счет необратимого связывания стандартные дозы клопидогреля вызывают снижение АДФ-индуцированной АТ в течение нескольких дней (средняя продолжительность жизни тромбоцитов составляет 7-10 дней) [5]. Альтернативным вариантом является использование тикагрелора (AZD6140) - орального препарата, обратимо связывающего Р2У12-рецепторы [12]. В клинических исследованиях было показано, что тикагрелор вызывает более выраженное инги-бирование АДФ-стимулированной АТ по сравнению с клопи-догрелем [25]. При этом дефицит или ингибирование Р2У12-рецепторов значительно увеличивает время (длительность) кровотечения. На внутриклеточном уровне Р2У12-блокада ведет к уменьшению способности АДФ ингибировать продукцию цАМФ при сохранении Са2+-сигнализации. Важно отметить, что AT в ответ на действие других агентов также меняется за счет влияния на этап освобождения АДФ, который в физиологических условиях усиливает ответ на агре-ганты и стабилизирует образование агрегатов.

Характеристика Р2Х-рецепторов. Третий вариант Р2-рецепторов тромбоцитов - Р2Х1, АТФ-связанный катионный канал, отвечающий за быстрый вход ионов Са2+. При этом АДФ оказывает ингибиторное действие на рецептор. Хотя активация сама по себе не может вызвать АТ, Р2Х1-рецепторы вызывают временное изменение формы тромбоцитов и уча-

ствуют в коллаген- и shear-вызванной агрегации. Последний эффект связывают с активацией протеинкиназы С и ERK1/2-систем, которые также вовлечены в секрецию плотных гранул тромбоцитов. Основная роль Р2Х1-рецепторов заключается в амплификации сигналов, запускаемых с рецепторов, сопряженных с G-белками и коллагеном при их низких концентрациях [20, 27]. Кроме того, показано, что вход ионов Са2+ вызывает деполяризацию мембраны, активацию фосфолипазы С и 1Р3-рецепторов, вероятно, способствуя усилению сигналов через Gq/ФЛСр и GPVI/ФЛСу [26].

Поскольку Р2Х1-рецепторы играют важную роль в формировании тромба в условиях high-shear (механического напряжения в области пристеночного кровотока), то идеальным решением антитромбоцитарной терапии в крупных артериях может стать использование блокаторов этих рецепторов. При этом для мышей с дефицитом Р2Х1-рецепторов не характерно пролонгирование времени кровотечения, что свидетельствует о поддержании нормального гемостаза. В то же время у животных отмечена резистентность к тромбоэмболии, вызванной инъекцией смеси коллагена и адреналина, и при локальном лазерном повреждении мезентериальных сосудов [18]. И наоборот, усиление системного тромбоза наблюдается у мышей с повышением экспрессии Р2Х1-рецепторов. У мышей с дефицитом указанных рецепторов отмечено снижение секреции гранул в ответ на действие низких доз коллагена и гуморальных регуляторов, сопряженных с G-белками [23]. Агонист Р2Х1-рецепторов, у NF449 оказывает выраженное ингибирующее действие на активацию тромбоцитов ex vivo и in vivo при тромбозе. Приведенные факты свидетельствуют, что Р2Х1-рецепторы могут быть хорошими мишенями антитромбоцитарной терапии.

Десенситизация пуриновых рецепторов. Важную роль в контроле гемостаза играет десенситизация рецепторов, обеспечивающая адаптацию тромбоцитов к изменению условий функционирования.

При начальной активации АДФ тромбоциты временно утрачивают способность отвечать на вторичные стимулы подобных агонистов. В физиологических условиях АТ в ответ на действие АДФ полностью обратима, и в течение 15-30 мин развивается дезагрегация. Этот феномен связан с селективной десенситизацией Р2У1-рецепторов. При этом Р2У12-рецепторы остаются функционально активными и сохраняют способность усиливать АТ, вызванную другими агонистами [28]. Этот факт доказывает, что два вида пуриновых рецепторов регулируются при активации разными путями, однако неясно, в чем физиологический смысл данного феномена. Ряд исследователей считают, что тромбоциты имеют систему для саморегуляции ответа, что важно в условиях ишемии, когда высвобождение АДФ из эритроцитов приводит к повышению уровня АДФ в плазме [20]. В этой ситуации десенситизация Р2У1-рецепторов играет саногенетическую роль, ограничивая агрегацию тромбоцитов. Вместе с тем даже в рефрактерных тромбоцитах при стимуляции АДФ Р2У12-рецепторы остаются способными к включению реактивности в зонах повреждения, где могут присутствовать различные агонисты. Этот феномен предотвращает утрату гемостатической функции тромбоцитов. Особое внимание привлекает вопрос о дефиците или нарушении функционирования Р2У12-рецепторов при развитии кровотечений.

Р2Х1-рецепторы также подвергаются десенситизации, и это происходит при низкой концентрации нуклеотидов в отличие от метаботропных Р2У1-рецепторов. Физиологическое значение десенситизации Р2Х1-рецепторов пока полностью не ясно; вероятно, такая реакция предотвращает неконтролируемое вовлечение тромбоцитов в агрегацию.

Необходимо отметить, что взаимоотношения между сен-ситивностью разных пуриновых рецепторов тромбоцитов весьма динамичны. Например, в условиях локальной ишемии и альтерации АТФ, секретируемый путем экзоцитоза из поврежденных эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов,

превращается в АДФ с помощью экто-АТФазы [15]. При этом АДФ взаимодействует с Р2У1 и Р2У12-рецепторами, индуцируя АТ. Последующая десенситизация Р2У1-рецепторов, индуцированная агонистами, вызывает их интернализацию в тромбоцитах. Регуляция Р2У12-рецепторов осуществляется несколькими механизмами - путем десенситизации и изменения плотности (перемещения). Хотя Р2У12-рецепторы интер-нализируются быстро и временно, большая часть рецепторов остается на поверхности плазмолеммы. Дифференциальная регуляция сенсетивности Р2У-рецепторов свидетельствует о том, что Р2У12-рецепторы могут играть жизненно важную роль, обеспечивая поддержание гемостатического потенциала крови при утрате ответа тромбоцитов на стимулы. В ряде наблюдений показана рефрактерность тромбоцитов к действию АДФ in vitro.

Полиморфизм Р2У-рецепторов. Р2У1- и Р2У12-рецепторы характеризуются генетической вариабельностью экспрессии, с чем связывают разнообразие ответа тромбоцитов на действие АДФ. Изучение молекулярной биологии пуриновых рецепторов показало, что Р2У1-рецепторы обладают слабым полиморфизмом в позиции 1622 (A/G), как следствие усиливается АТ при низких концентрациях АДФ (0,1 мкмоль) у субъектов, несущих G-аллель [20]. Более важное прикладное значение имеет факт полиморфизма Р2У12-рецепторов [10]. В клинической кардиологии этот феномен сопряжен с вариабельностью эффективности антитромбоцитарной терапии при остром коронарном синдроме, что привело к появлению термина "резистентность к клопидогрелю" [1, 11, 26]. Отсутствие эффекта блокатора Р2У12-рецепторов наблюдается у 5-10% пациентов после лечения острого или подострого тромбоза после коронарного синдрома или имплантации стента. По данным исследователей, у 30% пациентов, получающих клопидогрель, не изменяются параметры АТ [22]. Клинические исследования показали, что эти пациенты относятся к группе риска повторных ишемических событий и требуют существенной коррекции программы лечения. Механизмы, ответственные за вариабельность эффектов и резистентность к клопидогрелю, многофакторны. Это может быть связано с приемом различных групп препаратов и межлекарственными взаимодействиями, генетическим полиморфизмом Р2У12-рецепторов, превалированием механизма Р2У1-зависимой АТ или иррегуляцией других путей регуляции. В недавних работах обсуждается полиморфизм СУР2С19 и СУР3А4, СУР3А5 и СУР2С9, вовлеченных в метаболизм клопидогреля [27].

Полиморфизм Р2У12-рецепторов сопряжен с интронной частью гена и не связан с дефектом кодирующей последовательности. Описаны два варианта генетического полиморфизма тромбоцитарных Р2У12-рецепторов (гаплотипы Н2 и 340С Т), с которыми связаны повышение АТ в ответ на действие АДФ и риск развития атеротромбоза, в частности, коронарной системы сердца. Редким вариантом полиморфизма гена рецепторов к АДФ считается Н2-гаплотип, а более частым является полиморфизм 340С Т. Н2-гаплотип связан с повышением АДФ-индуцированной АТ [24]. Повышение АТ у гомо- и гетерозигот, несущих Н2-аллель, напрямую связано с выраженностью мутации. У пациентов с Н2-гаплотипом часто имеют место заболевания периферических артерий. Клопидогрель у таких пациентов в меньшей мере влиял на активность Р2У12-рецепторов. Интересно, что с такой же частотой отмечается резистентность пациентов к аспирину. В связи с этим возникает логичный вопрос, влияют ли мутации Р2У12 на эффективность лечения аспирином. В ряде исследований показано, что АТ у пациентов с коронарной патологией, получающих аспирин (100 мг/сут), не была значимо связана с 52G Т-полиморфизмом Р2У12-рецепторов к АДФ (Н2-гаплотип). Более того, ответ на аспирин не зависит от полиморфизма Р2У12-рецепторов у больных со стабильной коронарной патологией и при первом инфаркте миокарда [5, 6]. В то же время доказано, что у больных с нестабильной

стенокардией резистентность к тиенопиридинам часто сопряжена с неэффективностью лечения аспирином.

Для объяснения данного феномена была выдвинута гипотеза, которая базируется на теории механимов тромбогенеза, основным постулатом которой является участие как АДФ, так и тромбоксана в фазе прогрессирования тромбогенеза [6, 24]. Предполагается, что в ответ на инициацию тромбогенеза со стороны коллагена или фактора Виллебранда происходит стимуляция ЦОГ-зависимого образования тромбоксана и секреция гранул, содержащих АДФ. Оба пути ведут к активации GPIIb/IIIa-рецепторов, вызывая стабилизацию агрегата тромбоцитов. При лечении аспирином выключается медиируемый тромбоксаном А2 путь, тогда как АДФ-ассоциированная сигнализация часто остается незатронутой [13, 19]. В условиях полиморфизма Р2У12-рецепторов (Н2-гаплотип или 340С Т) лечение аспирином может быть неэффективным вследствие доминирования АДФ-инициируемого пути.

Кроме того, нельзя забывать о том, что назначение ингибиторов ЦОГ выключает образование негативных регуляторов тромбогенеза - ПГЕ2 и простациклина, продуцируемых эндотелием [24]. Мишенями указанных метаболитов арахидоновой кислоты являются не только гладкие миоциты, но и тромбоциты, в которых через ЕР2- и IP3-рецепторы простаноиды повышают продукцию цАМФ и снижают уровень цитозольного Са2+. Не менее отрицательным следствием назначения ингибиторов ЦОГ является усиление эндотелиальной дисфункции, связанной с ограничением цАМФ-зависимой стимуляции eNOS и продукции NO. Выключение ЦОГ эндотелия и продукции про-станоидов приводит к снижению их стимулирующих эффектов на АЦ тромбоцитов, что может дополнительно потенцировать эффекты Р2У12-рецепторов к АДФ, однако полное понимание вопроса о взаимосвязи разных модуляторов тромбогенеза возможно лишь при анализе их межрецепторных связей и перекрестов на уровне внутриклеточной сигнализации.

Внутриклеточные механизмы связи пуриновых рецепторов с другими агонистами. Связанные с G-белком рецепторы разных классов могут регулировать активность друг друга посредством механизмов cross-talk, а также посредством связей на уровне сигнальных путей, например с вовлечением тирозинкиназ [26]. Одним из ярких проявлений таких взаимодействий является суммация эффектов и альтернативная взаиморегуляция Р2У1- и Р2У12-рецепторов на тромбоцитах человека. Показано, что Р2У12 модулируют Р2У1-связаный Са2+-ответ через 2 сигнальных пути: активацию PI3K и ингибирование АЦ [16]. В свою очередь Р2У1 формируют обратную связь в отношении P^K-компонента этого ответа, которая реализуется путем активации Src-киназы.

Разные результаты модуляции сенситивности рецепторов АДФ могут быть связаны с тем, что ассоциированные с G-белком системы сигнализации регулируют другие поверхностные рецепторные системы тромбоцитов, включая GPIba, GPIIb/Ша, GPVI PAR-1, которые отвечают за адгезию, агрегацию и активацию коллагеном и тромбином соответственно [17, 23, 24]. Кроме того, АТ вызывает высвобождение АДФ из секреторных гранул, обеспечивая таким образом биологическую обратную связь в процессе рекрутирования тромбоцитов и их активации. Прояснение этого вопроса, однако, требует отдельного рассмотрения межрецепторных взаимодействий на поверхности и межсигнальных связей внутри тромбоцита.

Важно подчеркнуть, что на поверхности тромбоцитов представлено широкое разнообразие рецепторов, включая многочисленные интегрины (aIIbß3, a2ß1, a5ß1, a6ß1, aVß3), рецепторы, богатые лейцином (LRR), гликопротеины (Gp Ib/IX/V, Toll-like receptors), ассоциированные с G-белком рецепторы (PAR-1- и PAR-4-рецепторы к тромбину, Р2У1- и Р2У12-рецепторы к АДФ, адренорецепторы и рецепторы к АнгП, TPa- и TPß-рецепторы к тромбоксану, рецепторы из семейства иммуноглобулинов (GP VI, FcyRIIA), С-типа лек-тиновый рецептор (P-selectin), тирозинкиназные рецепторы

(рецепторы к тромбопоэтину, Gas-6, эфрины и Eph-киназы), а также смешанные типы рецепторов (CD63, CD36, P-selectin ligand 1, TNF-рецепторы и пр.) [16].

При всем многообразии рецепторов в отсутствие ядра все сигналы при АТ сводятся к повышению внутриклеточного уровня Са2+. Источником Са2+ для АТ являются как внутриклеточные, так и внеклеточные компартменты. Внутриклеточное высвобождение ионов Са2+ из саркоплазматического ретикулу-ма происходит при участии IP3P, обнаруженного при активации ФЛ С [18]. Ключевой механизм входа внеклеточного Са2+ заключается в активации депозависимого Са2+-входа (store-operated Са entry - SOCE), контролируемого запасом Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме. Снижение концентрации Са2+ в саркоплазматическом ретикулуме является триггером для активации Са2+-каналов, активируемых при высвобождении Са2+ в плазмолемме [26].

Ключевыми регуляторами освобождения внутриклеточного Са2+ из депо и активации кальциевых каналов плазмолеммы являются ФЛ С-зависимый и тирозинкиназные пути. На сегодня в тромбоцитах описано 2 типа ФЛ С: ФЛ Сß и ФЛ Су. Первый из них через систему сигналосом (комплексы мембранно-связанных и цитозольных тирозинкиназ) сопряжен с работой интегринов и GP, тогда как ФЛ Су активируются при стимуляции ассоциированных с Gq-белком рецепторов к гуморальным факторам, включая АТ1-рецепторы к ангиотензину, Р2У1-рецепторы, ФАТ-рецепторы, рецепторы к тромбоксану [25].

Различные типы рецепторов к пуринам на поверхности тромбоцитов находятся в тесных и специфических межре-цепторных отношениях. Показано, что Р2У1-рецепторы потенцируют АТ в ответ на стимуляцию разных рецепторов, включая Ga -связанные Р2У1- и PAR-1-рецепторы, а также гликопротеин VI - рецептор к коллагену. Иными словами, Р2У12-рецепторы являются позитивными модуляторами Р2У1-зависимого Са2+-ответа [20].

В отличие от этого Р2У1-рецепторы негативно модулируют Р2У12-путем активации Src-тирозинкиназы, которая ингибирует PI3K-зависимую сигнализацию и открытие кальциевых каналов саркоплазматического ретикулума [16]. При этом только совместная активация Р2У-рецепторов обеспечивает оптимальный ответ тромбоцитов на действие АДФ, что обусловило особенности связи Р2У - и Р2У12-рецепторов с эффекторными молекулами тромбоцитов. Так, Р2У1-рецепторы вызывают изменение формы тромбоцитов, тогда как Р2У12-связанные G.-сигнальные пути вовлечены в секрецию плотных гранул и синтез тромбоксана А2. В то же время вызванное АДФ усиление продукции тромбоксана А2 и активация рецепторов к фибриногену требуют одновременной активации Р2У1- и Р2У12-рецепторов.

Возвращаясь к вопросу о взаимосвязи эффектов стимуляции рецепторов к АДФ и синтеза тромбоксана А2, следует отметить, что этот вопрос интересен неслучайно. Известно, что тромбоксан А2 не только регулирует AT, но и является мощным вазоконстриктором. Повышение продукции тромбоксана А2 считается одним из ключевых механизмов развития тромботических заболеваний, включая инфаркт миокарда, нестабильную стенокардию, эмболию легочной артерии, атеросклероз [24]. Установлено, что тромбоксан A2 вызывает изменение формы, гидролиз фосфоинозитида, мобилизацию Са2+, фосфорилирование белков, секрецию гранул и агрегацию. Кроме этого, синтезированный тромбоксан А2 диффундирует через мембрану тромбоцитов и активирует рекрутирование других кровяных пластинок, вызывая рост тромба. Рецепторы к тромбоксану А2 представлены двумя вариантами - ТРа и TPß, которые различаются только по С-терминальному цитоплазматическому домену и кодируются одним геном на 19p13.3. Рецепторы к тромбоксану A2 ассоциированы с Gq-белком и отличаются паттерном сигнализации, сопряжены с активаторами ферментов. Активация Gq вызывает нарушение образования IP3 и мобилизации Са2+, т. е. развиваются события, аналогичные активации Р2У1-

рецепторов, однако эффект стимуляции G12/13 обусловливает активацию Rho ГТФаз и изменение формы тромбоцитов. Совместная блокада Gq и G13 определяет выключение ответа на действие тромбоксана А2 [4, 14].

Следует отметить, что многие рецепторы и трансдукто-ры вовлечены в регуляцию активности фосфолипазы А2, а следовательно, и образование тромбоксана А2, включая РКС, МАР^ и Са2+. Ключевым фактором сопряжения при этом является процесс фосфорилирования ФЛ А2, в котором доказана важная роль ряда киназ - ERK, Src, р38-МАРК [26].

Важную роль в АДФ-ассоциированной продукции тром-боксана А2 играет ERK, ERK1/2 (extracellular-signalregulated kinase 1/2) относится к семейству тромбоцитарных МАР-киназ и активируется под действием различных агонистов, наиболее известными среди которых являются тромбин и convulxin. Вместе с тем РАГ-ассоциированное фосфорилирование ERK2 регулируется пуриновыми рецепторами тромбоцитов. АДФ активирует ERK2 при стимуляции Р2У-рецепторов за счет механизма, сопряженного с активацией Src-семейства киназ [23]. При этом активация ERK требует включения обоих типов рецепторов - Р2У1 и Р2У12 - и зависит от механизмов активации извне. Помимо этого, показана активация ERK2 при стимуляции Р2Х-рецепторов, что, вероятно, связано с повышением входа Са2+, тогда как внеклеточный Са2+ негативно регулирует генерацию тромбоксана А2 тромбоцитами, т. е. снижение уровня внеклеточного Са2+ ведет к повышению агонистсти-мулированного синтеза тромбоксана А2. Закономерно, что ингибиторы сигнальных событий, ведущих к активации через Gq-белок ФЛ Ср и кальция, блокируют как фосфорилирование ERK2, так и генерацию тромбоксана [24]. Ингибирование всех изоформ РКС потенцирует фосфорилирование ERK2, что отражает роль ПКС в негативной регуляции активации ERK-пути [16]. Известна аналогичная регуляция Gq-пути со стороны изоформ ПКС. Например, PKCa негативно регулирует PLCP1 в Swiss-ЗТЗ-клетках, а ингибиторы PKC вызывают критическое увеличение продукции тромбоксана.

Известно, что семейство тирозиновых киназ регулирует сигнальную трансдукцию в разных гемопоэтических клетках. Многие члены семейства Src-киназ присутствуют в тромбоцитах. Стимуляция связанных с G-белком рецепторов индуцирует активацию Src-киназ. Ранние исследования показали, что семейство Src-киназ играет важную роль в генерации тромбоксана А2 и является частью нисходящего сигнального потока при активации ингибиторного типа G-белков, к которым относятся Gai и Gaz [23], однако функциональная роль семейства Src-киназ в индуцированной АДФ АТ неясна. Показано, что Src-киназы активируются первично при стимуляции Gq-связанных Р2У1-рецепторов тромбоцитов [20]. Как Gi-, так и Gz-сигнальные пути могут вызывать активацию Src-киназ. Ингибитор Src-киназы РР2 ингибирует индуцированное АДФ фосфорилирование ERK2 и генерацию тромбоксана А2. Показано, что Src-киназы не модулируют ингибирование АЦ, индуцированное Р2У12, поскольку использование ингибитора указанной киназы РР1 не влияло на этот ответ. Вместе с тем ингибитор Src-киназы РР1 потенцировал изменение активности Р^-компонента Р2У12-кальциевого ответа, причем это усиление прерывалось использованием специфического ингибитора PI3K - LY294002. Модуляция активности PI3K со стороны АДФ вызывает также слабое фосфорилирование ПкВ.

Учитывая сопряженность высвобождения и эффектов пуринов и тромбоксана, логично рассмотреть последствия их суммарного слияния на тромбоциты, которое заключается в следующем:

• в стимуляции PLC p-изоформы через Gq Р2У1, что вызывает повышение уровня цитозольного Са2+ и активацию ПКС;

• в реорганизации актинового цитоскелета через G12a и G13a, что способствует изменению кольца микротрубочек и формированию филоподий и ламеллоподий;

• в снижении активности АЦ и образования цАМФ через Gi-семейство Г2У12-рецепторов.

Таким образом, активация тромбоцитов под действием пуринов включает реакции, которые определяют не только изменение функционального состояния тромбоцитов и про-грессирование тромбогенеза, но также активацию секреторной и прокоагуляционной активности тромбоцитов, экспрессию адгезионных молекул, способных изменять функциональную активность лейкоцитов, модулировать воспаление и репаративные процессы в тканях при повреждении. Понимание механизмов участия пуриновых рецепторов и разработка способов эффективного управления тромбогенезом требуют дальнейшего изучения межрецепторных и внутрисигналь-ных отношений в тромбоцитах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Айнетдинова Д. X., Удовиченко А. Е., Сулимов В. А. // Кардиология. - 2008. - № 6. - С. 35-39.

2. ГрацианскийН. А. // Кардиология. - 2010. - № 6. - С. 4-21.

3. Дупляков Д. В. // Кардиология. - 2008. - № 2. - С. 65-66.

4. Загидуллин Н. Ш., Валеева К. Ф., Гассанов Н. // Кардиология. -2010. - № 5. - С. 54-60.

5. Клопидогрел в лечении мерцания предсердий: сравнение с вар-фарином. Результаты исследования ACTIVE W // Кардиология.

- 2009. - № 5. - С. 78.

6. Мазаев А. А., Наймушин Я. А., Хаспекова С. Г. и др. // Кардиология. - 2007. - № 6. - С. 4-9.

7. Преображенский Д. В., Сидоренко Б. А., Батыравиев Т. А. и др. // Кардиология. - 2009. - № 12. - С. 63-67.

8. Преображенский Д. В., Сидоренко Б. А., Батыравиев Т. А. и др. // Кардиология. - 2009. - № 10. - С. 88-96.

9. Преображенский Д. В., Сидоренко Б. А., Батыравиев Т. А. и др. // Кардиология. - 2009. - № 12. - С. 68-74.

10. Серебряный В. Л., Малинин А. П., Макаров Л. М. // Кардиология.

- 2007. - № 10. - С. 69-72.

11. Шимохина Н. Ю., Петрова М. М., Савченко А. А. // Кардиология.

- 2010. - № 8. - С. 21-24.

12. AngiolilloD. J., UenoМ. // J. Am. Coll. Cardiol. Intv. - 2011. - Vol. 4. - p. 411-414.

13. Bergmeier W., Piffath C. L., Goerge T. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. - P. 16900-16905.

14. Chiras Т., PapadakisE. D., Katopodi A., Chatzianesti E. // In vivo. -

2009. - Vol. 23. - P. 177-181.

15. Corsetti J. P., Ryan D., Moss A. J. et al. // Diabetes. - 2007. - Vol. 56. - P. 1429-1435.

16. Cosemans J. M. E. M., Munnix I. C. A., Wetzker R. et al. // Thromb. Haemost. - 2006. - Vol. 108. - P. 3045-3052.

17. Dubois C., Panicot-Dubois L., Gainor J. F. et al. // J. Clin. Invest. -

2007. - Vol. 117. - P. 953-960.

18. HaddockR. E., Hill С. E. // J. Physiol. - Vol. 545. - P. -615-627.

19. Kunicki T. J., Federici А. В., Salomon D. R. et al. // Blood. - 2004. -Vol. 104. - P. 2359-2367.

20. Maloney S. F., Brass L. F., DiamondS. L. // Integr. Biol. (Camb.). -

2010. - Vol. 2. - P. 183-192.

21. McGavigan A. D., Maxwell P. R., Dunn F. G. // Cardiol. - 2006. -Vol. 111. - P. 267-274.

22. O'DonoghueM., Morrow D. A., Cannon С. P. et al. // Eur. Heart J. -

2008. - Vol. 29. - P. 984-991.

23. OffermannsS. // Circ. Res. - 2006. - Vol. 99. - P. 1293-1304.

24. SantilliF., RoccaВ., De CristofaroR. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2009.

- Vol. 53. - P. 667-677.

25. SibbingD., Braun S., Morath T. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2009. - Vol. 53. - P. 849-856.

26. Varga-Szabo D., Braun A., Nieswandt B. // J. Thromb. Haemost. -

2009. - Vol. 7. - P. 1057-1066.

27. Villarreal F., Omens J. et al. // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2004. - Vol. 36. - P. 597-601.

28. Wiviott S. D., Braunwald E., McCabe С. H. // N. Engl. J. Med. -2007. - Vol. 357. - P. 2001-2015.

29. WuD., VanhoorelbekeK., CauwenberghsN. et al. // Blood. - 2002. -Vol. 99. - P. 3623-3628.

Поступила 04.07.11