Полипептиды актинии Heteractis crispa: фармакологический потенциал

Научная смена

Вестник ДВО РАН. 2015. № 5

Калина Римма Сергеевна

Аспирант лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова. В 2014 г. с отличием окончила Дальневосточный федеральный университет по специальности «химия». В период обучения получала стипендию Губернатора Приморского края и академическую государственную стипендию. Заняла второе место на международной студенческой интернет-олимпиаде по дисциплине «химия», первое место в конкурсе НОЦ «Морская био-та» на лучшую научную работу студентов Школы естественных наук ДВФУ, принимала участие в летней школе «Морская биота» для углубленного изучения английского языка. Начиная с третьего курса занимается научной работой в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН под руководством к.х.н. И.Н. Гладких и д.х.н. М.М. Монастырной. Тема ее научного исследования — изучение структурно-функциональных взаимосвязей токсичных полипептидов актиний. Р.С. Калина принимала участие в исследованиях в рамках государственного контракта № 16.512.11.2196 по теме «Структурно-функциональные исследования новых компонентов ядов морских беспозвоночных, пригодных для регуляции активности ионотропных рецепторов и функций нервной клетки по приему, обработке и передаче сигналов», гранта ДВО РАН № 13-III-B-05-008 «Новые токсины ASICs-каналов из актинии Heteractis crispa», гранта РНФ № 14-25-00037. Результаты работы были доложены ею на международных, российских и региональных конференциях.

УДК 577.2 Р.С. КАЛИНА

Полипептиды актинии Heteractis crispa: фармакологический потенциал

Описана частичная хроматографическая очистка, идентификация и определение токсической и анальге-тической активности суммарных фракций нейротоксинов, продуцируемых тропической актинией Heteractis crispa.

Ключевые слова: актинии, нейротоксины, ионные каналы.

Sea anemone Heteractis crispa polypeptides: pharmacological potential. R S. KALINA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

This article describes the partial chromatographic purification, identification and determination of toxic and analgesic activities of the total fractions of neurotoxins produced by the tropical sea anemone Heteractis crispa. Key words: sea anemones, neurotoxins, ion channels.

КАЛИНА Римма Сергеевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). E-mail: kalinarimma@gmail.com

Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 14-25-00037).

Установлено, что развитие наследственных заболеваний, таких как сердечная аритмия, диабет, периодические параличи, эпилепсия, хронические боли и др., связано с нарушением работы ионных каналов и ионотропных рецепторов [7, 8] - сложно организованных трансмембранных белков, общей функцией которых является транспорт ионов, что позволяет клеткам генерировать электрические импульсы, передавать и обрабатывать их в центральной нервной системе или поддерживать потенциал действия на мембранах. Огромное число публикаций посвящено изучению роли ионных каналов различных типов в физиологических и патофизиологических процессах организма человека, а также веществам-лигандам, регулирующим их функциональную активность. Общепризнанными инструментами исследования ионных каналов и рецепторов являются как белковые, так и небелковые компоненты ядов, продуцируемых наземными и морскими организмами (змеи, пауки, скорпионы, моллюски конусы и морские кишечнополостные) [9]. Такие вещества обладают способностью избирательно модифицировать (активировать или блокировать) ионные каналы определенных типов и подтипов, что позволяет исследовать их молекулярную организацию, механизмы функционирования, а в случае нарушений функциональной активности (подобные состояния называют каналопатиями) оказывать терапевтическое воздействие [9].

Развитие представлений о роли и механизмах работы ионных каналов тесно связано с открытием новых молекул-лигандов, к числу которых в первую очередь относят пептиды и полипептиды ядовитых организмов - эволюционно отобранные молекулы, характеризующиеся высокой аффинностью, удивительной специфичностью и уникальным разнообразием структур. Выделение и характеристика отдельных компонентов, способных послужить основой нового лекарственного препарата, - весьма сложная и актуальная задача современной биоорганической химии. Распространенным подходом при решении данной проблемы является скрининг различных продуцентов (с применением ряда моделей in vivo) с целью поиска наиболее перспективных с точки зрения современной фармакологии. Большой интерес для исследования представляет тропическая актиния Heteractis crispa. Ранее из этой актинии были выделены актинопорины RTX-A, -G, -S, -SII и восемь ингибиторов протеиназ Кунитц-типа, включая полипептиды APHC1-APHC3, которые блокируют болевой ваниллоидный рецептор TRPV1 и оказывают анальгетическое действие in vivo в моделях тепловой стимуляции боли [6], пептид п-AnmTX Hcr 1b-1, способный в микромолярной концентрации ингибировать протончувствительный ASIC3 канал [5], а также пять нейротоксинов, RTX-I - RTX-V, принадлежащих к структурному типу II токсинов - модуляторов потенциалзависимых натриевых каналов (Nay) [1-4]. Подобное разнообразие видов биологической активности и структур токсинов, продуцируемых этой актинией, делает их перспективной основой для дизайна специфичных фармакологических агентов нового поколения.

Для разделения пептидов и полипептидов, содержащихся в 70%-ном этанольном экстракте актинии H. crispa, использовали гидрофобную хроматографию на носителе полих-ром-1 (рис. 1А) и катионообменную хроматографию на целлюлозе КМ-32 (рис. 2), в результате чего были получены 22 суммарные белковые фракции, затем обессоленные на колонке с полихромом-1.

MALDI-TOF MS анализ показал (рис. 1Б), что белковые фракции 1-15 содержат пептиды с молекулярными массами в диапазоне 4500-5400 Да, характерными для гомологов пептидного токсина п-AnmTX Hcr 1b-1 (4537 Да) [5] и нейротоксинов RTX-I - RTX-IV (5177-5202 Да) [1-4], ингибирующих ASICs и Nav каналы соответственно. При этом в состав фракций 4-9 входили полипептиды с молекулярной массой выше 6000 Да, которые, вероятно, представляют собой изоформы ингибиторов протеиназ Кунитц-типа, которые, согласно нашим исследованиям [6], присутствуют в экстрактах актинии H. crispa в больших количествах. По данным масс-спектрометрии, молекулярные массы пептидов, содержащихся во фракциях 16-22, составляли от 4500 до 4700 Да, что свидетельствовало о наличии в этих фракциях гомологов токсина п-AnmTX Hcr 1b-1 [5].

20 40 ISO 250 350 450 4500 4750 5000 5250 5500 5750 6000 mte

Номер фрамш»

Рис. 1. А - профиль элюции, полученный при гидрофобной хроматографии пептидов/полипептидов этанольного экстракта H. crispa на колонке (4,8 х 95 см) с полихромом-1. Скорость элюции - 120 мл/ч, объем фракций -20 мл. Отмечены границы объединения фракций, пики 1-6. Б - масс-спектр пептидов, присутствовавших во фракциях пика 4

Все хроматографически очищенные белковые фракции (рис. 2) первоначально тестировали на наличие токсической активности в отношении млекопитающих (белые беспородные мыши линии CD-1) и ракообразных (прибрежные крабы Hemigrapsus sp.) (см. таблицу). Было установлено, что наиболее токсичными как для млекопитающих, так и для ракообразных являются белковые компоненты фракций 3-11, наименее токсичными -фракций 16, 19-22. Интересно, что компоненты фракций 16, 20 и 22 даже в дозе 5 мг/кг не

Токсическая и анальгетическая активность фракций 1—22, полученных в результате ионообменной хроматографии

№ фракции LD1oc мг/кг (краб) Доза, мг/кг* (краб) ld№ мг/кг (мышь) Доза, мг/кг* (мышь) Число корчей**

1 0,295 0,15 5,00 0,50 45 ± 3

2 0,11 0,08 5,95 0,73 -

3 - - 0,25 0,05 24 ± 5

4 0,04 0,03 0,13 0,05 28 ± 3

5 0,08 0,04 0,50 0,05 34 ± 9

6 0,12 0,03 2,73 0,17 25 ± 8

7 0,13 0,11 0,17 0,05 36 ± 2

8 - - 0,50 0,17 31 ± 1

9 0,14 0,13 0,05 0,01 39 ± 1

10 - - 0,17 0,05 4 ± 2

11 - - 0,17 0,01 -

12 0,80 0,56 0,50 0,05 -

13 0,97 0,79 0,50 0,17 -

14 - - 5,00 0,50 6 ± 4

15 2,475 2,47 2,50 0,50 -

16 12,97 10,94 - 5,00 26 ± 5

17 1,57 1,04 1,25 0,50 25 ± 9

18 - - 5,00 0,50 12 ± 5

19 12,72 10,97 5,00 2,50 -

20 4,87 3,1 - 5,00 21 ± 8

21 5,26 4,25 5,00 0,50 13 ± 7

22 - - - 5,00 5 ± 2

Контроль: анальгин СН3СООН 50 0,05 15 ± 5 50 ± 3

* Доза, не вызвавшая в течение 1 ч заметных изменений в поведении прибрежных крабов и мышей.

** Среднее значение ± s.d. числа корчей, вызванных внутрибрюшинным введением экспериментальным животным 100 мкл 1%-ной СН3СООН (р < 0,2; n = 3). Прочерк - нет данных.

Номер фракции

Рис. 2. А - профиль элюции, полученный при хроматографии пептидов/полипептидов 20%-ной этанольной фракции на колонке (2 х 20 см) с целлюлозой КМ-32, рН 6,0. Элюцию пептидов осуществляли в линейном градиенте концентрации N0 (0-0,5 М) в аммонийно-ацетатном буфере, рН 6.0. Скорость элюции - 0,3 мл/мин, объем фракций - 4,5 мл. Отмечены границы объединения фракций, пики 1-22

оказывали заметного негативного влияния на самочувствие мышей в течение часа, а фракций 16 и 19 в дозе до 11 мг/кг не вызывали изменений в поведении прибрежных крабов. Концентрации, превышающие приведенные нетоксичные дозы, вызывали судороги, отказ конечностей, паралич и смерть как мышей, так и прибрежных крабов, что свидетельствовало о наличии в них нейротоксинов, способных взаимодействовать с различными типами ионных каналов центральной и периферической нервной системы.

Для тестирования анальгетической активности белковых компонентов фракций 1-22 in vivo использовали «кислотную модель» стимуляции боли у белых беспородных мышей (линия CD-1) 1%-ной уксусной кислотой. Согласно проведенным испытаниям, наибольший обезболивающий эффект оказывали пептиды фракций 10, 14 и 22 в дозе 0,05; 0,5 и 5 мг/кг соответственно (см. таблицу).

Высокоэффективная жидкостная хроматография этих фракций на колонке с обращенной фазой носителя Nucleosil C18 показала, что в каждой из них содержится несколько пептидных компонентов.

В дальнейшем планируется получить данные пептидные токсины в индивидуальном состоянии с целью последующего установления их первичной структуры, молекулярного механизма действия in vitro (на различных субтипах Nav каналов) и использования в качестве основы для дизайна лекарственных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Аминокислотная последовательность нейротоксина I из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 10. С. 1301-1306.

2. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. Т. 11, № 3. С. 302-310.

3. Зыкова Т.А., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксинов IV и V из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1988. Т. 14, № 11. С. 1489-1494.

4. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора II из Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. T. 11, № 3. C. 293-301.

5. Козлов С.А., Осмаков Д.И., Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Полипептидный токсин из морской анемоны, ингибирующий протончувствительный канал ASIC3 // Биоорган. химия. 2012. Т. 38, вып. 6. С. 653-659.

6. Andreev Y. A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1) // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, N 35. P. 23914-23921.

7. Black J.E., Waxman S.G. Non-canonical roles of voltage-gated sodium channels // Neuron. 2013. Vol. 80, N 2. P. 280-291.

8. Deval E., Gasull X., Noel J., Salinas M., Baron A., Diochot S., Lingueglia E. Acid-Sensing Ion Channels (ASICs): Pharmacology and implication in pain // Pharmacology & Therapeutics. 2010. Vol. 128, N 3. P. 549-558.

9. Waszkielewic A.M., Gunia A., Szkaradek N., Sloczynska K., Krupinska S., Marona Н. Ion channels as drug targets in central nervous system disorders // Curr. Med. Chem. 2013. Vol. 20, N 10. P. 1241-1285.