Хромато-масс-спектрометрия: использование для идентификации лекарственных субстанций и примесей

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ И ПРИМЕСЕЙ

А.А. Кутин, Т.В. Мастеркова, В.А. Яшкир, В.А. Меркулов, О.А. Ваганова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерациин, Москва

kutin@expmed.ru

Резюме: В статье показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для комплексного и надежного определения основных показателей качества лекарственных субстанций — подлинности и контроля примесей. Высокая избирательность, универсальность и информативность масс-спектрометрического метода проиллюстрирована на примере анализа лекарственных субстанций различной химической природы. Показаны различные подходы к структурной интерпретации масс-спектров.

Ключевые слова: структурная интерпретация масс-спектров, подлинность лекарственных субстанций, примеси, качественное определение.

UPLC/MS/MS METHOD FOR IDENTIFICATION OF DRUG SUBSTANCES AND IMPURITIES A.A. Kutin, T.V. Masterkova, V.A. Yashkir, V.A. Merkulov, O.A. Vaganova

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow

Abstract: The article shows the possibility of using chromatography-mass spectrometry for comprehensive and reliable determination of the basic drug substance quality indicators notably identification and control of impurities. High selectivity, flexibility and informality of mass spectrometry are illustrated by the analysis of drug substances ofdifferent chemical nature. Various approaches to structural interpretation of mass spectra are described.

Key words: structural interpretation of mass spectra, the identity of pharmaceutical substances, impurities, qualitative analysis.

Одним из основных направлений совершенствования методологии фармацевтической (фармакопейной) экспертизы лекарственных субстанций (ЛСб) в нашей стране является разработка и внедрение новых аналитических методов контроля качества ЛСб, основанных на современных технологиях. Предпочтение отдается прямым методам анализа, отвечающим требованиям информативности, экспрессности и достоверности, которые позволяют исследовать химические превращения и устанавливать структуры побочных и промежуточных продуктов на всех стадиях аналитического контроля.

Более других таким требованиям соответствуют различные варианты хромато-масс-спектрометрии. Широкое применение масс-спектрометрии для решения аналитических задач началось в начале 50-х годов прошлого века с разработкой времяпролетного анализатора (1948—52 гг.). За разработку квадрупольного (1955 г.) анализатора Вольфгангу Пауэлу в 1989 году присуждена Нобелевская премия. Бурное развитие биохимии, в том числе протеомных исследований и работ по изучению генома, в конце прошлого и начале нынешнего века напрямую связано с изобретением ионизации в электроспрее. Первоначально метод был разработан под руководством Лидии Николаевны Галль (1984 г.). В 2002 г. Нобелевская премия по химии за электроспрей была вручена Джону Фенну.

В настоящее время масс-спектрометрия как метод анализа описана в ведущих фармакопеях мира (Европейской и США [1—2]), где она рекомендована для

установления подлинности и количественного определения как лекарственных субстанций, так и примесей. Для определения других показателей качества ЛСб (идентификация примесей и остаточных растворителей, исследование стабильности) по-прежнему применяют традиционные физико-химические методы анализа, в первую очередь различные варианты хроматографии. Хроматографические методы (ВЭЖХ, ГХ, тонкослойная хроматография) чаще других включаются в технологические регламенты, фармакопейные статьи и другую нормативную документацию. Незначительный объем фармацевтических задач, решаемых методом масс-спектрометрии, до недавнего времени был обусловлен малой распространенностью масс-спектральных приборов и их относительно высокой стоимостью. Однако за последние десятилетия ситуация кардинально изменилась. Появление достаточного количества масс-спектрометров в исследовательских лабораториях, снижение стоимости серийной аппаратуры, внедрение новых технических усовершенствований и приемов превратили масс-спектрометрический метод в рутинный инструмент для решения широкого круга прикладных медико-фармацевтических задач. Так, например, известная исследовательская компания Lambda Therapeutic Research Ltd. применяет более 650 валидированных масс-спектрометрических методик, используя в своих лабораториях более 40 LC/MS/ MS приборов. В настоящее время масс-спектрометрия не только дополняет традиционные методы аналитиче-

Ежеквартальный рецензируемый научно-практический журнал

№ 2, 2013

ского контроля ЛСб, но и с успехом может их заменять, решая те же задачи более эффективно, позволяя более надежно идентифицировать субстанции и примеси без использования стандартных образцов. Благодаря высочайшей чувствительности и уникальной избирательности масс-спектрометров появляется возможность определять компоненты ЛС в сложных смесях на уровнях пределов обнаружения, недоступных ранее.

Цель данной работы — показать эффективность метода при идентификации компонентов ЛС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали субстанции: пиразинамид сер. PZ/20100922, пираце-там сер. 20100520, тенофовир сер. 021212 и стемокин сер. 11212.

Хромато-масс-спектрометрические эксперименты были проведены на приборах:

• ультравысокоэффективный жидкостной хроматограф с тандемным квадруполь-времяпролет-ным масс-спектрометром Waters ACQITY XEVO G2 Q TOF, использовалась колонка Acquity UPLC@BEH C18 1,7 мкм 2,1 х 50 мм;

• газо-жидкостной хроматограф с квадруполь-ным масс-селективным детектором Agilent MSD 5975/6890, колонка HP-5MS 30 м х 0,22 мм;

• ультравысокоэффективный жидкостной хроматограф Agilent 1260 Infinity с квадрупольным масс-селективным детектором Singlequad 6130, колонка Porashell 120 EC-C18 2,7 мкм, 4,6 х 50 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Метод хромато-масс-спектрометрии имеет ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими методами:

• не требует использования эталонов и внутренних стандартов при установлении подлинности, так как решает задачу идентификации соединения напрямую, путем определения состава и строения соединения;

• отличается высокой производительностью при небольшом расходе реактивов.

Подтверждение подлинности ЛСб (как и идентификацию возможных примесных компонентов) можно осуществлять тремя способами:

• сравнением спектров исследуемого образца и стандартного образца ЛСб;

• сравнением спектров исследуемого образца ЛСб с литературными данными (фармстатьи, спектральные базы данных, научные публикации);

• самостоятельной структурной интерпретацией полученных спектральных данных, подтверждающей наличие и последовательность структурных фрагментов в молекуле исследуемого образца ЛСб.

В рутинной практике, как правило, используют первые два способа. На рисунке 1 приведен при-

мер идентификации образца ЛСб при помощи базы данных.

Если сравниваемые соединения характеризуют конкретной структурной формулой, то вывод об идентичности их строения делают на основе полного совпадения спектров по величинам m/z (на приборах высокого разрешения вплоть до точной массы) молекулярного (квазимолекулярного) и фрагментных ионов. Допустимы различия в интенсивности фраг-ментных ионов в пределах 15—20%, обусловленные особенностями работы ионных источников разных моделей приборов.

Верхний спектр на рисунке 1 — спектр субстанции «пиразинамид сер. PZ/20100922», полученный на нашем приборе GC/MS Agilent MSD5975/6890, нижний — спектр пиразинамида из базы данных NIST, средний — результат наложения спектров, первая строка в нижней таблице — расчет похожести двух спектров, в данном примере 90,3%.

На рисунке 2 приведены масс-спектр и схема фрагментации молекулы пирацетама. Интерпретация спектра настолько проста, что вместо комментариев мы позволили себе привести на схеме распад молекулы с образованием характеристических ионов.

Очень наглядно возможности масс-спектромет-рии, особенно уникальную избирательность, можно проиллюстрировать на примере идентификации родственных примесей тенофовира. На рисунке 3 приведена масс-хроматограмма субстанции тено-фовира в режиме сканирования полного спектра в четырехкратном увеличении. На рисунке 4 — реконструированная масс-хроматограмма, полученная суммированием хроматограмм по избранным ионам, характеристичным для родственных примесей.

При самостоятельной структурной интерпретации спектральных данных учитывают существующие корреляции между предполагаемой структурой исследуемого соединения, схемами распада, характерными для данного класса соединений и фрагментами молекулы, идентифицируемыми по массе ионов и нейтральных потерь, наблюдаемыми в спектре. Схемы распада для разных классов соединений подробно описаны в литературе [3—5].

Подлинность стемокина (рис. 5) устанавливали на основе наличия в масс-спектрах положительных m/z = 447 [M+H]+, m/z = 469 [M+Na]+ (рис. 7), отрицательных квазимолекулярных ионов: m/z = 445 [M-H]-, характерных для натриевой соли изо-лейцил-глутамил-триптофана и присутствия в спектре фрагментов, согласующихся со схемой распада, характерной для полипептидов (рис. 6) [5], что однозначно подтверждает состав и аминокислотную последовательность в молекуле стемокина.

На рисунке 7 приведен масс-спектр стемокина с отнесением фрагментов в соответствии с общей схемой фрагментации полипептидов.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Ведомости НЦЭСМП

Рис. 1. Идентификация пиразинамида по масс-спектру базы данных NIST

полному ионному току

Рис. 5. Структурная формула синтетического трипепти-да — стемокина

Рис. 6. Общая схема распада квазимолекулярного иона в спектрах полипептидных молекул

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Учитывая динамику развития масс-спектрометрической техники, следует ожидать более широкого применения данного метода в фармакопейном анализе. Высокая информативность, селективность, универсальность и чувствительность делают его крайне привлекательным при выборе метода проведения

ЛИТЕРАТУРА

Рис. 2. Масс-спектр и схема фрагментации молекулы пира-цетама «субстанция сер. 20100520»

Рис. 4. Реконструированная ион-хроматограмма родственных примесей тенофовира

Рис. 7. Масс-спектр положительных ионов образца препарата «стемокин, образец стандартный сер. 11212»

аналитического контроля качества ЛС. Особенно целесообразно применять масс-спектрометрию для установления подлинности ЛС и идентификации родственных примесей, постепенно вытесняя широко распространенные в настоящий момент недостаточно характеристичные и надежные ТСХ и УФ-спектроскопию.

1. Европейская фармакопея 7.0, раздел 2.2.43 Масс-спектрометрия, с. 84-88.

2. United States Pharmacopeia 30-National Formulary 25. 736 Mass spectrometry, p. 2562-2566.

3. Масс-спектрометрия органических соединений / Н.С. Вульфсон, В.Г. Заикин, А. И. Микая. - М.: Химия, 1986. - 312 с.

4. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. - 493 с.

5. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 1996, V. 7, N3, p. 233.