Генная терапия на основе трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с использованием сайт-специфического редактирования генома

генная терапия на основе трансплантации гемопоэтичевдих стволовых клеток с использованием сайт-специфического редактирования генома

КВ. Лепик1,М.О. Попова1, А.И. Шакирова1, В.С. Сергеев1, А.Я. Поттер 1, И.М. Бархатов1, Б. Фезе 12, Б.В. Афанасьев 1

1 Научно-Исследовательский институт детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой, Санкт-Петербург, Россия

2 Гамбургский Университет, Гамбург, Германия

Site-specific genome editing for hematopoetic stem cells transplantation-based gene therapy approaches

K.V. Lepik 1, M.O. Popova 1, A.I. Shakirova 1, V.S. Sergeev \ A.Y. Potter \ I.M. Barkhatov 1, B. Fehse 12, B.V. Afanasyev1

1 R.M. Gorbacheva Research Institute for Pediatric Oncology, Hematology and Transplantation, Saint-Petersburg, Russia

2 University Medical Center (UKE] Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) остается единственным универсальным методом, позволяющим добиться излечения ряда наследственных заболеваний, таких как первичные иммунодефициты (ПИД), в том числе тяжелые комбинированные иммунодефициты (ТКИН), гемоглобинопатии и другие гематологические и моногенные заболевания. Однако процедура алло-ТГСК сопряжена с высоким риском развития тяжелых осложнений, особенно в случае отсутствия Н1_А-совместимого родственного донора и снижения соматического статуса больного на момент трансплантации. Альтернативным подходом является исправление генетического дефекта в аутогенных ГСК пациента при помощи методов генной терапии. Существующая парадигма генной терапии ГСК включает использование вирусного переноса функциональной копии гена, что сопряжено с риском тяжелых осложнений, связанных с инсерцион-ным мутагенезом. В последние годы были разработаны технологии сайт-специфического редактирования генома с использованием рекомбинантных эндонуклеаз, таких как ZFN, ТА1_ЕП и CRiSPR/Cas9, способных инициировать двух-цепочечные разрывы ДНК и интеграцию функциональной копии гена в строго определенном целевом локусе генома. Данный обзор посвящен достижениям и проблемам подходов генной терапии с использованием инструментов сайт-специфического редактирования генома на основе трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Ключевые слова: аллогенная трансплантация ге-мопоэтических стволовых клеток, ТГСК, генная терапия, сайт-специфическое редактирование генома, ZFN, ТА1_ЕП CRiSPR/Cas9.

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) remains the sole universal curative approach for a number of hereditary diseases, such as severe combined immunodeficiency (SCiD), severe non-SCiD primary immunodeficiencies (non-SCiD PiD), hematologic diseases and part of lysosomal storage disorders. Unfortunately, to date, HSCT remains a high-risk procedure, especially in cases of poor performance status of the patient and lack of HLA-matched related donors. in those cases the correction of the patients autologous HSCs with gene therapy could be a promising alternative. Current paradigm of HSCT-based gene therapy approaches is based on the utilization of viral vectors, which may lead to the severe complications due to insertion mutagenesis. Throughout the last several years, new technologies of site-specific genome editing with endonucleases such as ZFNs, TALENs, and CRiSPR/Cas9 were introduced. These enzymes may induce a DNA double-stranded break, homology-directed repair and insertion of functional copy of gene in precisely targeted locus. This review focuses on the advantages and disadvantages of the genome editing tools utilization that carries the great potential of changing the paradigm of gene therapy in the setting of HSCT.

Keywords: hematopoietic stem cells transplantation, HSCT, gene editing, gene therapy, HSC, ZFN, TALEN, CRiSPR/ Cas9.

Введение

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является эффективным методом лечения злокачественных и наследственных заболеваний крови. Данная процедура получила широкое распространение. По данным европейской организации по трансплантации крови и костного мозга (European Society for Blood and Marrow Transplantation, EBMT) в 2014 г. в Европе проведено 23883 аутогенных трансплантаций ГСК (ауто-ТГСК) и 16943 аллоген-ных трансплантаций ГСК (алло-ТГСК) [1]. Протоколы получения ГСК путем миелоэксфузии, мобилизации стволовых клеток периферической крови (ПСКК) или сбора пуповинной крови оптимизированы и хорошо отработаны. Манипуляции с ГСК: сепарация чистой популяции стволовых клеток и клеток-предшественниц, криоконсервация с сохранением их

жизнеспособности, разморозка и введение посредством внутривенной инфузии — широко применяются в рутинной практике. После трансплантации ГСК самостоятельно занимают необходимые ниши ввиду наличия хоуминг-эффекта и становятся родоначальниками ростков кроветворения, обеспечивая продукцию всех клеточных элементов крови на протяжении жизни пациента.

Ввиду этих биологических свойств, а также обширного клинического опыта применения трансплантации ГСК являются наиболее популярной и перспективной мишенью в протоколах генной терапии, успехи которых могут привести к значительному прогрессу в современной медицине. Данный обзор посвящен новым подходам генной терапии на основе редактирования генома в контексте трансплантации ГСК.

e-mail: marina.popova.spb@gmail.com

Аллогенная ТГСК для лечения наследственных

заболеваний

Алло-ТГСК на сегодняшний день является единственным этиологическим методом лечения, позволяющим обеспечить длительное полное или частичное восполнение функции дефектного гена и коррекцию фенотипа. Алло-ТГСК является стандартом лечения угрожающих жизни первичных иммуно-дефицитов, в частности тяжелых комбинированных иммунодефицитов (ТКИН), течение которых неизменно заканчивается летальным исходом без проведения трансплантации. Алло-ТГСК от совместимого родственного донора, без предшествующего кондиционирования, начала применяться у данной группы пациентов с конца 1960-х гг., с более чем 90% долговременной выживаемостью в большинстве современных центров [2]. Помимо ТКИН, подходы с внедрением алло-ТГСК являются стандартом или апробируются при ряде других заболеваний группы гемоглобинопатий, патологии лимфоцитов и нейтро-филов, стволовых кроветворных клеток, болезнях накопления и ряде злокачественных новообразований [3] (табл.).

Несмотря на доказанную эффективность, алло-ТГСК несет в себе значительный риск для пациента, степень которого зависит от множества факторов. Более чем 40-летний опыт применения аллогенной трансплантации ГСК демонстрирует, что оптимальные результаты трансплантации достигаются при наличии совместимого родственного донора. Тем не менее, Н1_А-совместимые доноры зачастую недоступны. В зависимости от характеристик донора, источника трансплантата и варианта заболевания, режимы кондиционирования различной интенсивности проводятся для элиминации гемопоэза реципиента и приживления трансплантата, что сопровождается длительным периодом глубокой иммуносупрессии [4]. Хотя результаты ТГСК значительно улучшились за последние годы, в отсутствии Н1_А-совместимого донора, тяжелой коморбидности пациента или активно текущей инфекции, риск неблагоприятного исхода процедуры остается высоким [5—12]. Это связано с токсичностью проводимого химиотерапевтическо-го режима кондиционирования, а также с риском тяжелых инфекционных осложнений, первичного неприживления, отторжения трансплантата, развития реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) и гипофункции трансплатата, что приводит к снижению показателей выживаемости пациентов и качества

жизни в посттрансплантационном периоде. Вследствие описанных проблем, связанных с проведением алло-ТГСК, генная терапия, при которой генетический дефект устраняется в аутогенных (собственных) ГСК с их последующей трансплантацией, представляется крайне перспективной благодаря потенциалу радикального излечения заболевания, отсутствию необходимости поиска донора, уменьшению риска проведения процедуры по сравнению с алло-ТГСК, меньшей значимостью проблем безопасности и селективности модификации и риска иммунизации по сравнению с технологиями генной терапии in vivo. С другой стороны, технологические этапы генетической модификации клеток значительно повторяют ставшие уже классическими стандартизованные и достоверно воспроизводимые протоколы получения и подготовки трансплантата на основе ГСК. В связи с этими факторами, основное количество протоколов генной терапии наследственных заболеваний реализовывалось именно на базе технологии трансплантации ГСК.

Стратегии генной терапии ГСК

Поскольку ГСК реализуют свои функции в рядах поколений дочерних клеток, существовавшие ранее методы транзиентного переноса генов были не применимы в отношении данной популяции в виду того, что функция трансдуцированного гена угасала при повторном делении клеток.

По этой причине классические подходы генной модификации ГСК основаны на ретровирусной трансдукции. Ретровирусный вектор позволяет интегрировать терапевтический трансген непосредственно в геном ГСК, что является важнейшим аспектом, в связи с необходимостью сохранения функции трансгена во всех рядах поколений дочерних клеток. Число успешно трансдуцированных ГСК, необходимое для получения оптимального эффекта, зависит от селективного преимущества откорректированных ГСК над нативными клетками без нормальной копии гена [13]. В первых испытаниях генной терапии, ориентированных на лечение ТКИН, были использованы ретровирусные векторы, в которых экспрессия трансгена контролировалась регуляторными элементами длинного концевого повтора (LTR) ретровируса. При таком подходе успешное и долгосрочное восстановление Т-клеточного звена было достигнуто у пациентов с Х-сцепленным ТКИН (Х-ТКИН) [14, 15],

Таблица. Основные формы наследственных заболеваний, при которых используется метод аллогенной ТГСК

Тип Заболевание

Гемоглобинопатии Бета-талассемия, серповидно-клеточная анемия

Патология лейкоцитов ТКИН, синдром Вискотта - Олдрича, дефицит адгезии лейкоцитов, гипер-1дМ

синдром, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, 1РЕХ-синдром, хроническая

гранулематозная болезнь, синдром Чедиака - Хигаси, синдром Швахмана -

Даймонда

Патология тромбоцитов Амегакариоцитоз, тромбастения Гланцмана

Патология стволовых/ Анемия Фанкони, анемия Блекфена - Даймонда, циклическая нейтропения,

прогениторных клеток синдром Костмана

Болезни накопления Адренолейкодистрофия, метахроматическая лейкодистрофия,

мукополисахаридоз I и II типа, болезнь Гоше

дефицитом аденозиндезаминазы (АДА-ТКИН) [16— 20] и синдромом Вискота — Олдрича [21, 22].

Первые успехи генной терапии Х-ТКИН были омрачены проявлениями инсерционного мутагенеза, в результате которого клоны, несущие генотоксич-ные вставки, получили эволюционное преимущество, что привело к развитию миелодиспластиче-ского синдрома (МДС), и, в ряде случаев, острого лейкоза. В частности, у четырех пациентов, участвующих в исследовании лечения Х-ТКИН, развился острый лейкоз после трансплантации генетически модифицированных клеток. Эти серьезные неблагоприятные события были вызваны селективной интеграцией ретровирусных векторов, несущих ген iL2RG, в непосредственной близости от участков инициации транскрипции протоонкогенов и сильной энхансерной активностью вирусных LTR [23]. Эти побочные эффекты подчеркивают сложность системы внутренней регуляции экспрессии генов, что делает последствия, связанные с введением ретровирусной генной конструкции, непредсказуемыми.

Исследовательскими группами были приложены значительные усилия для обеспечения безопасности метода. Клинические испытания подходов генной терапии для коррекции X-ТКИН с использованием са-моинактивирующегося ретроверусного вектора (SiN-RV), в котором U3 промотор был удален из LTR и заменен менее активным эукариотическим промотором фактора элонгации 1 альфа (EF1a), в настоящее время проводятся в Европе и США (NCT01175239, NCT01129544). В дополнение к более безопасным векторам типа SiN-RV, лидирующим направлением является использование SiN лентивирусных векторов (SiN-LV). В ряде исследований in vitro [24, 25] и in vivo [26, 27] продемонстрировано, что интеграция лентивирусных векторов происходит в активно транскрибирующиеся гены, без каких-либо предпочтений для сайтов инициации транскрипции и регу-ляторных элементов, что делает данные конструкции потенциально более безопасными [28].

Векторы на основе гамма-ретро- и лентивирусов являются современным общепризнанно эффективным инструментом генной модификации ГСК, однако обладают рядом существенных недостатков: неоднородность генетической модификации мишеней, инсерционный мутагенез, мутация трансгена, иммунизация вирусными антигенами. Важным аспектом новых векторных систем с встроенными системами безопасности является то, что SiN-RV и SiN-LV векторы, хотя и демонстрируют более безопасный профиль интеграции, не решают проблему необходимости контроля сайта интеграции.

Принципы редактирования генома

Инструментами нового поколения стали системы редактирования генома (genome editing), самыми популярными из которых на сегодняшний день являются нуклеазы цинковых пальцев (Zinc-finger nuclease, ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (transcription activatorlike effector nucleases, TALEN), а также CRiSPR/Cas9 (clustered regulatory interspaced short palindromic repeats; короткие кластерные палиндромные повторы, равномерно удаленные друг от друга). Данные системы объединяет общий принцип структурной организации, включающей специфический ДНК-связывающий компартмент и нуклеазный домен.

Основным принципом методов редактирования генома является основанная на нуклеотидной последовательности специфичность в отношении сайтов узнавания, а также эндонуклеазная активность белков, обеспечивающая стойкое, наследуемое в ряду поколений клеток изменение последовательности и/или экспрессии целевого гена при временной трансфекции гена, кодирующего собственно нукле-азу. В результате активации нуклеазного домена, в геномную ДНК клетки-мишени вносится двухцепо-чечный разрыв (ДР) в области, соседние с сайтом узнавания ДНК-связывающего домена. В отсутствии гомологичной донорской ДНК, клеточные механизмы репарации восстанавливают ДР посредством негомологичного сшивания концов ДНК (NHEJ), экстренного репаративного механизма, ведущего к включению в первичную последовательность гена мутаций по типу коротких инсерций и делеций. Альтернативным путем репарации ДР является вариант гомологичной рекомбинации (homologic recombination, HR) — т.н. механизм HDR (homology-directed repair), при котором точно копируется гомологичный шаблон сестринских хроматид или экзогенной двухцепо-чечной/одноцепочечной ДНК-матрицы, после чего скопированный участок встраивается в ДР за счет плечей гомологии. Механизм HDR может быть использован для интеграции трансгена в относительно безопасный локус генома или замены дефектного гена в соответствующем ему положении.

Системы редактирования генома ZFNs,

TALEN, и CRISPR/Cas9

В настоящее время разрабатывается ряд технологий редактирования генома, однако три типа реком-бинантных нуклеаз уже получили широкое распространение в исследованиях в области биомедицины.

ZFN — представляют собой химерные белки, состоящие из двух модулей: ДНК-связывающего (на основе нескольких доменов «цинковых пальцев») и нуклеазного — на основе каталитической субъединицы эндонуклеазы Foki. После образования комплекса ДНК и ДНК-связывающих доменов, эндону-клеазные Foki домены димеризуются и создают ДР [29]. Исторически созданная первой, система ZFN является наиболее исследованной и продемонстрировала свою эффективность, в том числе в редактировании генома ГСК человека. К сожалению, даже после создания общедоступных библиотек с исходными кодами для конструкции ZFN [30, 31], создание ZFN для конкретных участков до сих пор является трудной задачей. В зависимости от используемой архитектуры ZFN, только определенные участки ДНК могут быть использованы в качестве целевых, что составляет проблему при исправлении ряда специфических мутаций [32—35].

TALEN — также являются искусственными белками, принципиально схожими с ZFN. Основные различия заключаются в строении их ДНК-связывающего домена. ДНК связывающий домен TALEN содержит повторяющуюся консервативную 33-34 аминокислотную последовательность, включающую два высоковариабельных (Repeat Variable Diresidue, RVD) аминокислотных остатка, которые опосредуют специфическое распознавание нуклеотида. Взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и распознаванием ДНК позволяет конструировать повторные сегменты с соответствующей специфичностью,

что методически проще по сравнению с технологией ZFN [36]. Cхoжим образом сайт-распознающий домен соединен с доменом Fokl эндонуклеазы, создавая химерный белок, структурно схожий с ZFN. После связывания двух TALE c фланкирующей мишень последовательностью ДНК, Fokl домены диме-ризуются и вводят ДР в сайте-мишени.

Помимо большей простоты дизайна ДНК-распознающего домена TALEN в сравнении с ZNF, важным фактором является то, что длина распознаваемой последовательности геномной ДНК у TALEN больше по сравнению с ZFN и CRlSPR/Cas9, что означает более высокую специфичность. Кроме того, в отношении этого инструмента меньше ограничений при выборе последовательностей ДНК, чем для ZFN.

CRlSPR/Cas9 — новый инструмент редактирования генома. Cas9 представляет собой нуклеазу, образующую комплекс с искусственной молекулой guide-РНК (gRNA), используемой в качестве матрицы для узнавания целевой последовательности. Этот комплекс может связывать двухцепочечную ДНК, комплементарную gRNA и содержащую специфичный мотив, прилежащий к протоспейсеру (protospacer-adjacent motif, PAM), важный для связывания фермента Cas9. После формирования комплекса, фермент Cas9 вводит ДР на 3 п.н. выше РАМ. Преимуществами CRlSPR/Cas9 являются высокая эффективность введения ДР в геном клеток млекопитающих и простота конструкции. ^руктура нуклеазы Cas9 универсальна; специфичность комплекса в отношении любой другой области генома обеспечивается структурой протоспейсерной последовательности в gRNA и может быть легко изменена. Как и в других системах редактирования генома, главной проблемой в отношении использования CRlSPR/Cas9 является внецелевой мутагенез.

Для уменьшения выраженности внецелевого мутагенеза в настоящее время разрабатываются различные модификации CRlSPR/Cas9 c улучшенным профилем специфичности, такие как сокращение длины протоспейсерной последовательности gRNA, чтобы сделать комплекс более чувствительным к наличию мисматчей во внецелевых мишенях и снизить вероятность внецелевого мутагенеза [37], использование Cas9 «никаз», представляющих собой модификацию нуклеазы Cas9, способную вносить одноцепочечный разрыв (так называемый ник) и требующий димеризации двух независимых комплексов для внесения ДР [38]. Группой H Zhang в 2016 г. также была предложена модификация фермента Cas9 c увеличенной специфичностью «enhanced specificity» SpCas9 (eSpCas9). В исследовании демонстрируется эффективная корекция целевых последовательностей при помощи модифицированного фермента и в то же время внецелевая активность не определялась доступными методами [39].

Результаты редактирования генома

в гемопоэтических стволовых клетках

человека

По данным ВОЗ в настоящее время известно более 10000 моногенных заболеваний. Несмотря на то, что конкретные нозологические единицы этой группы являются редкими патологиями, суммарная заболеваемость моногенными заболеваниями при рождении составляет до 1%, что означает сотни тысяч новых случаев ежегодно. Единственным су-

ществующим радикальным методом лечения ряда заболеваний из данной группы является трансплантация ГСК. Именно в рамках этого метода возможна органичная интеграция методов генетической модификации (рис.). В настоящем разделе резюмированы результаты наиболее значимых исследований в данной области.

В связи со сложностью редактирования генома ГСК, большинство протоколов сайт-специфического редактирования генома находятся на этапе ранних преклинических и экспериментальных исследований, в том числе на клеточных и животных моделях, которые в перспективе должны привести к увеличению эффективности редактирования до необходимого для клинического применения уровня и созданию безопасного метода радикального излечения наследственных заболеваний человека.

Первичные иммунодефициты

Среди первичных иммунодефицитов (ПИД) самой тяжелой группой заболеваний являются ТКИН. Наиболее распространенная форма ТКИН, X-ТКИН, вызывается мутациями в гене, кодирующем рецептор интерлейкина 2 гамма (iL2RG). Несколько групп успешно использовали ZFN для индукции HDR в iL2RG локусе в различных типах клеток человека, в том числе ГСК и эмбриональных стволовых клетках [40, 41]. В одном из исследований, используя систему ZFN, функциональная копия iL2RG была интегрирована в геном ГСК в регионе AAVS1 in situ. Эффективность интеграции кассеты с геном iLRG2 составила около 6%, при этом доля внецелевых модификаций была незначительна. После трансплантации модифицированных клеток в мышиной NSG модели отмечалось восстановление гемопоэза с мульти-линейной дифференцировкой в различные типы иммунных клеток. Несмотря на низкую эффективность интеграции кассеты с функциональным геном, исследователи указывают на эволюционное преимущество предшественников с восстановлением функции iL2RG, и отсутствие необходимости в проведении химиотерапевтического кондиционирования у этой группы пациентов, что делает методику значительно безопаснее и открывает реальные перспективы клинического применения технологии [41].

В другом исследовании перенос iL2RG осуществлялся в полученные из клеток пациентов индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) при помощи системы TALEN с общей эффективностью около 2.6%, без определяемой внецелевой активности и восстановлением способности предшественников, подвергнувшихся редактированию, к Т-клеточной и NK клеточной дифференцировке [42].

Другая важная патология из группы ПИД — хроническая гранулематозная болезнь, характеризующаяся дефектом образования реактивных форм кислорода в фагоцитах в связи с мутацией в локусе N0X2. Успех в коррекции данного дефекта в подходах ретровирусной генной терапии был омрачен активацией протоонкогенов с клональной селекцией. Была предпринята попытка контролируемой интеграции трансгена gp91phox в безопасный регион AAVS1 [43], в иПСК, полученные из ГСК больного. Было обнаружено повышение уровня мРНК gp91phox в иПСК, подвергнутых редакции генома,

с последующей дифференцировкой в функциональные гранулоциты, с восстановлением продукции реактивных форм кислорода. Среди модифицированных клонов практически все (около 100%) содержали кассету gp91phox в локусе AAVS1, при этом около 50% из них имели и другие сайты интеграции. Исследование продемонстрировало несколько большую общую эффективность модификации и эффективность биаллельной модификации TALEN (60%) по сравнению с ZFN (48%) [43].

Еще одной патологией из группы ПИД является гипер-/дМ синдром. В недавнем сообщении группой исследователей выполнена HDR вставка CD40L in situ при помощи системы TALEN в лимфоцитах человека, что может быть первым шагом к коррекции гена в ГСК человека [44]. Важным моментом работы явилась демонстрация сохранения естественных регуляторных элементов, профиля и кинетики экспрессии трансдуцируемого гена и восстановление функции B клеток [44].

Рис. Общая схема генной терапии на основе трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с использованием сайт-специфического редактирования генома

Гемоглобинопатии

Бета-талассемия — группа наследственных заболеваний крови, связанных с дефектом гена HBB и характеризующихся снижением или отсутствием синтеза бета цепей гемоглобина. В настоящий момент единственным доступным методом радикального лечения заболеваний этой группы является аллогенная трансплантация ГСК. Проведенные работы демонстрируют, что геномный локус HBB может быть специфично и эффективно модифицирован при помощи ZFN [45] и CRiSPR/Cas9 [46]. С использованием полученных из нативных клеток пациента иПСК и системы TALEN была выполнена коррекция гена HBB in situ. Эффективность HDR для разработанной системы была невелика, однако полученные клоны с успешной интеграцией гена HBB демонстрировали нормальный кариотип, сохранение плюрипотентно-сти и после индукции дифференцировки в гематопо-этические предшественники показали способность к эритропоэзу с нормальной экспрессией бета-глобина. При модификации клеток не было выявлено нецелевой активности используемых TALEN [47]. В недавнем исследовании также была доказана эффективность системы CRiSPR/Cas9 для коррекции гена HBB в иПСК — в одной из групп до 57% клонов имели модификацию хотя бы одного аллеля гена HBB. Кроме того, была обнаружена минимальная внецелевая активность системы [48].

Серповидноклеточная анемия (СКА) — распространенная наследственная гемоглобинопатия, связанная со структурным нарушением белка гемоглобина, в результате мутации гена HBB, вследствие чего синтезируется аномальный гемоглобин S. Коррекция специфической мутации при помощи иструментов редактирования генома была успешно продемонстрирована [45], включая сообщения о её коррекции в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши [49—52]. В другом недавнем исследовании система ZFN была использована для коррекции специфической мутации в CD34+-клетках пациентов [53]. Были получены обнадеживающие результаты — эффективность HDR составила до 18% в CD34+-клетках, полученных от пациентов со СКА. Было продемонстрировано восстановление нормального синтеза гемоглобина в модифицированных клетках. Поскольку лишь 10-30% клеток требуется для образования достаточного эри-тропоэза, эффективность редактирования генома в данной работе приближается к необходимой для клинического применения [53] и, вероятно, подобное клиническое исследование вскоре будет инициировано.

Патология стволовых клеток

Анемия Фанкони возникает при наличии дефекта в кластере белков, отвечающих за репарацию ДНК. В одной из недавних работ была показана успешная коррекция гена FANCC in situ в первичной культуре фибробластов больного с использованием систем CRiSPR/Cas9 нуклеаз и CRiSPR/Cas9 никаз, с дальнейшим образованием иПСК из модифицированных клеток [54]. Интересным наблюдением стало значимое преимущество системы никаз в отношении HDR, тогда как для классических нуклеаз преобладал механизм NHEJ. При этом внецелевые модификации генов не были выявлены, что говорит о высокой

специфичности системы в отношении гена РАШСС. В целом активность СП8РГ/СаБ9 нуклеаз в отношении модификации клеток составила около 5%, среди которых еще меньшее число составляют клетки с успешным НШ. Данная эффективность безусловно ниже той, которая необходима для клинических подходов и требует селекции клонов с успешно интегрированным геном.

ВИЧ-инфекция

Терапия ВИЧ инфекции является лидирующим направлением развития методов редактирования генома, с 6 зарегистрированными на сегодняшний день клиническими испытаниями ШСТ02388594, ПСТ00842634, ПСТ01044654, ПСТ02500849, ПСТ01543152б ПСТ02225665, все они основаны на технологии ZFN) и многочисленными пре-клиническими и экспериментальными исследованиями. Точкой отсчета стал клинический случай «берлинского» пациента: выполненная по поводу лейкоза ВИЧ-инфицированному пациенту аллоген-ная трансплантация от донора, гомозиготного по мутации CCR5delta32, привела к излечению от злокачественного новообразования и ВИЧ инфекции. К сожалению гомозиготы по CCR5delta32 в европеоидной популяции составляют только около 1%, что резко снижает шансы обнаружения полностью Н1_А-совместимого донора с дефектом рецептора. Помимо этого, в связи с рисками процедуры, алло-ТГСК не является показанием для лечения ВИЧ-инфекции, а только лишь для определенной группы осложнений. В то же время, успех трансплантации подтвердил критическую важность ССГ5 для заражения и развития ВИЧ инфекции, дав начало новой научной области. Лидерами в области редактирования генома Т-лимфоцитов и ГСК с использованием системы ZFN является компания Эапдато Вюэ^епсеэ. В ходе преклинического исследования нокаута ССГ5 в ГСК была продемонстрирована относительно высокая (более 50%) эффективность и низкий риск внецелевой модификации. Модифицированные клетки были трансплантированы гуманизированным NSG мышам, и показали способность к нормальному восстановлению кроветворения. Более того, когда производилось заражение трансплантированных животных ВИЧ, отмечалось селективное преимущество выживания модифицированных клеток, резистентность популяций Т-клеток, а также снижение вирусной нагрузки [55].

Компания Эапдато инициировала несколько клинических исследований разрабатываемой технологии, в том числе с включением трансплантации ГСК после режима кондиционирования.

Другие системы также активно внедряются для осуществления нокаута ССГ5. Высокоэффективное редактирование ССГ5 при помощи системы CCR5-Uco-ТАLEN было продемонстрировано для Т-лимфоцитов человека [56, 57]. По предварительным результатам работ совместной группы ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова и Гамбургского Университета с использованием системы ССГ5-исо-ТА1Е^ общая эффективность модификации ССГ5 в ГСК человека составляет около 40%

при помощи системы CRiSPR/Cas9 с сохранением жизнеспособности, пролиферативной и диффе-ренцировочной активности клеток. Интересно, что предварительно проведенный биоинформатический анализ выявил значимое число гомологичных CCR5 сайтов с высоким риском внецелевой модификации (n = 126), однако на практике ее частота оказалась невелика (0,6%) [58].

Проблемы

Резюмируя результаты преклинических исследований с включением систем сайт-специфического редактирования генома, на первый план встает вопрос эффективности. Проблемой при модификации ГСК является низкая эффективность HDR и риск потери мультилинейного потенциала при манипулировании и экспансии клеток с коррекцией гена in vitro. Активность механизма HDR максимально выражена в S и G2 фазах клеточного цикла, в то время как большая часть популяции ГСК находится в покоящемся состоянии, где гораздо более выражен механизм NHEJ. Увеличение срока культивирования ГСК для повышения эффективности трансфекции приводит к возрастанию риска индукции дифференцировки и потери клетками свойств стволовости. В связи с этим исследователи прибегают к усовершенствованию культуральных условий и добавлению ряда ростовых факторов и малых молекул, призванных поддержать стволовое состояние ГСК. В связи с низкой эффективностью HDR, в настоящий момент получить необходимое количество модифицированных ГСК удается лишь в контексте генного нокаута, что транслируется в стремительный переход технологии от лаборатории в клиническую практику (протоколы лечения ВИЧ). Другим возможным подходом является создание культуральных систем для обеспечения экспансии ГСК ex vivo. Над разработкой данной технологии работает большое количество международных научных групп, однако необходимо констатировать, что технически эта задача пока не решена. Другим перспективным направлением является внедрение в клиническую практику методов генной и клеточной терапии, основанных на использовании иПСК. Несколько типов клеток, таких как Т-клетки, ГСК и фибробласты, могут быть дедифференцированы в иПСК путем трансдукции в эти клетки векторов, несущих гены плюрипотентности 0ct4, Sox2, KLF4, C-Myc [59—61]. Исследования демонстрируют перспективность подхода коррекции желаемого гена в иПСК для лечения гематологических заболеваний, таких как серповидно-клеточная анемия, с использованием ZFNs [62, 63] или TALEN [64] в работах in vitro. В настоящий момент получено значительное

ЛИТЕРАТУРА:

1. Passweg J.R., Baldomero H., Bader P. et al. Hematopoietic stem cell transplantation in Europe 2014: more than 40000 transplants annually. Bone Marrow Transplantation 2016 10.1038/ bmt.2016.20 [Epub ahead of print].

2. Pai S.Y., Cowan M.J. Stem cell transplantation for primary immunodeficiency diseases: the North American experience. Curr. Opin. Allergy Clin. immunol. 2014; 14(6): 521-6.

3. Steward C.G., Jarisch A. Haemopoietic stem cell transplantation for genetic disorders. Arch. Dis. Child. 2005; 90: 1259-63.

4. Pingali S.R., Champlin R.E. Pushing the envelope-nonmyeloablative and reduced intensity preparative regimens for allogeneic hematopoietic transplantation. Bone Marrow Transplant. 2015; 50(9): 1157-67.

количество иПСК из материала больных с различными иммунодефицитами [65—68]. Коррекция интересующего гена может быть произведена в этих иПСК с последующей селекцией оптимального клона и его экспансией. Альтернативным подходом может быть исправление гена в исходном соматическом типе клеток, с дальнейшим репрограмиро-ванием их в иПСК. Сообщения об успешной in vitro дифференцировке человеческих иПСК в Т-клетки [69—71] открывает перспективы исследования возможности редактирования генома для восстановления дифференциации Т-клеток из иПСК пациентов с ТКИН. Тем не менее, использование отредактированных иПСК in vivo находится на доклинических стадиях исследований. Для перехода в клинику необходимо решение ряда вопросов, связанных с безопасностью технологии, возможного онкоген-ного потенциала иПСК и проблемами в получении ГСК из иПСК человека, эффективностью и экономической целесообразностью технологии. Тем не менее, последние достижения в области in vitro дифференцировки иПСК человека имеют большую ценность, поскольку открывают поле для доклинических исследований эффективности и безопасности редактирования генома, которое в конечном итоге может быть применено к ГСК человека.

Заключение

В течение последних лет область редактирования генома стремительно развивается. В настоящее время существует несколько общепризнанных инструментов редактирования генома на основе сайт-специфичных нуклеаз. Большое число исследовательских групп работает над увеличением эффективности и безопасности, упрощением конструкции данных инструментов. Для клинического применения редактирования генома ГСК, необходимо дальнейшее снижение внецелевого мутагенеза и повышение эффективности методики для получения большего числа отредактированных клеток, достаточного для трансплантации и успешного приживления. Несмотря на существующие проблемы, успехи преклинических исследований редактирования генома выводят медицинскую науку на новый уровень, а внедрение методов редактирования генома на основе трансплантации ГСК в клиническую практику имеет значительный потенциал успеха.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Федору Урно-ву за помощь и ценные замечания при подготовке материала, а также сотрудникам НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой, ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова.

5. Buckley R.H. Transplantation of hematopoietic stem cells in human severe combined immunodeficiency: long term outcomes. Immunol. Res. 2011; 49(1-3): 25-43.

6. Pai S.Y., Logan B.R., Griffith L.M. et al. Transplantation outcomes for severe combined immunodeficiency, 2000-2009. N. Engl. J. Med. 2014; 371(5): 434-46.

7. Schuetz C., Neven B., Dvorak C.C. et al. SCiD patients with ARTEMiS vs RAG deficiencies following HCT: increased risk of late toxicity in ARTEMiS-deficient SCiD. Blood 2014; 123(2): 281-9.

8. Gennery A.R., Slatter M.A., Grandin L. et al. Transplantation of hematopoietic stem cells and long-term survival for primary immunodeficiencies in Europe: entering a new century, do we do better? J. Allergy Clin. immunol. 2010; 126(3): e1-11.

9. Antoine C., Muller S., Cant A. et al. Long-term survival and transplantation of haemopoietic stem cells for immunodeficiencies: report of the European experience 1968-99. Lancet 2003; 361(9357): 553-60.

10. Buckley R.H., Schiff S.E., Schiff R.I. et al. Hematopoietic stem-cell transplantation for the treatment of severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med. 1999; 340(7): 508-16.

11. Horn B., Cowan M.J. Unresolved issues in hematopoietic stem cell transplantation for severe combined immunodeficiency: need for safer conditioning and reduced late effects. J. Allergy Clin. Immunol. 2013; 131(5): 1306-11.

12. Dvorak C.C., Hassan A., Slatter M.A. et al. Comparison of outcomes of hematopoietic stem cell transplantation without chemotherapy conditioning by using matched sibling and unrelated donors for treatment of severe combined immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol. 2014; 134(4): 935.e-43.e.

13. Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S., de Saint Basile G. et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 2000; 88(5466): 669-72.

14. Hacein-Bey-Abina S., Hauer J., Lim A. et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N. Engl. J. Med. 2010; 363(4): 355-64.

15. Gaspar H.B., Cooray S., Gilmour K.C. et al. Long-term persistence of a polyclonal T cell repertoire after gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. Sci. Transl. Med. 2011; 3(97): 97-79.

16. Blaese R.M., Culver K.W., Miller A.D. et al. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science 1995; 270(5235): 475-80.

17. Aiuti A., Cattaneo F., Galimberti S. et al. Gene therapy for immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency. N. Engl. J. Med. 2009; 360(5): 447-58.

18. Aiuti A., Slavin S., Aker M. et al. Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning. Science 2002; 296(5577): 2410-3.

19. Kohn D.B., Weinberg K.I., Nolta J.A. et al. Engraftment of gene-modified umbilical cord blood cells in neonates with adenosine deaminase deficiency. Nat. Med. 1995; 1(10):1017-23.

20. Gaspar H.B., Cooray S., Gilmour K.C. et al. Hematopoietic stem cell gene therapy for adenosine deaminase-deficient severe combined immunodeficiency leads to long-term immunological recovery and metabolic correction. Sci. Transl. Med. 2011; 3(97): 97ra80.

21. Moratto D., Giliani S., Bonfim C. et al. Long-term outcome and lineage-specific chimerism in 194 patients with Wiskott-Aldrich syndrome treated by hematopoietic cell transplantation in the period 1980-2009: an international collaborative study. Blood 2011; 118(6): 1675-84.

22. Boztug K., Schmidt M., Schwarzer A. et al. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med 2010; 363(20): 1918-27.

23. Hacein-Bey-Abina S., Garrigue A., Wang G.P. et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J. Clin. Invest. 2008; 118: 3132-42.

24. Mitchell R.S., Beitzel B.F., Schroder A.R. et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2004; 2(8): E234.

25. Montini E., Cesana D., Schmidt M. et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 2006; 24(6): 687-96.

26. Montini E., Cesana D., Schmidt M. et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 2009; 119(4): 964-75.

27. Biffi A., Bartolomae C.C., Cesana D. et al. Lentiviral vector common integration sites in preclinical models and a clinical trial reflect a benign integration bias and not oncogenic selection. Blood 2011; 117(20): 5332-9.

28. Naldini L. Ex vivo gene transfer and correction for cell-based therapies. Nat. Rev. Genet. 2011; 12(5): 301-15.

29. Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 2010; 11(9): 636-46.

30. Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Sander J.D. Oligomerized pool engineering (OPEN): an 'open-source' protocol for making customized zinc-finger arrays. Nat. Protoc. 2009; 4(10): 1471-501.

31. Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Osiak A. et al. Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol. Cell 2008; 31(2): 294-301.

32. Gaj T., Guo J., Kato Y. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods 2012; 9(8): 805-7.

33. Gabriel R., Lombardo A., Arens A. et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat. Biotechnol. 2011; 29(9): 816-23.

34. Pattanayak V., Ramirez C.L., Joung J.K. et al. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nat. Methods 2011; 8(9): 765-70.

35. Gaj T., Guo J., Kato Y. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods 2012; 9(8): 805-7.

36. Bogdanove A.J., Voytas D.F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 2011; 333(6051): 1843-6.

37. Fu Y., Sander J.D., Reyon D. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol. 2014 32(3): 279-84.

38. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell (2013) 154(6): 1380-9.

39. Slaymaker I.M., Gao L., Zetsche B. et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 2016; 1; 351(6268): 84-8.

40. Lombardo A., Genovese P., Beausejour C.M. et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 2007; 25(11): 1298-306.

41. Genovese P., Schiroli G., Escobar G. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature 2014; 510(7504): 235-40.

42. Menon T., Firth A.L., Scripture-Adams D.D. et al. Lymphoid regeneration from gene-corrected SCID-X1 subject-derived iPSCs. Cell Stem Cell 2015; 16(4): 367-72.

43. Dreyer A.K., Hoffmann D., Lachmann N. TALEN-mediated functional correction of X-linked chronic granulomatous disease in patient-derived induced pluripotent stem cells. Biomaterials 2015; 69: 191-200.

44. Hubbard N., Hagin D., Sommer K. et al. Targeted gene editing restores regulated CD40L expression and function in X-HIGM T cells. Blood 2016 [Epub ahead of print].

45. Voit R.A., Hendel A., Pruett-Miller S.M. Nuclease-mediated gene editing by homologous recombination of the human globin locus. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 1365-78.

46. Cradick T.J., Fine E.J., Antico C.J. CRISPR/Cas9 systems targeting ß-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res. 2013; 41: 9584-92.

47. Ma N., Liao B., Zhang H. et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated gene correction in integrationfree beta-thalassemia induced pluripotent stem cells. J. Biol. Chem. 2013; 288: 34671-9.

48. Yang Y., Zhang X., Yi L. et al. Naive Induced Pluripotent Stem Cells Generated From ß-Thalassemia Fibroblasts Allow Efficient Gene Correction With CRISPR/Cas9. Stem Cells Transl. Med. 2016; 5(1): 8-19.

49. Sun N., Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol. Bioeng. 2014; 111(5): 1048-53.

50. Sebastiano V., Maeder M.L., Angstman J.F. et al. In situ genetic correction of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripotent stem cells using engineered zinc finger nucleases. Stem Cells 2011; 29(11): 1717-26.

51. Zou J., Mali P., Huang X. Site-specific gene correction of a point mutation in human iPS cells derived from an adult patient with sickle cell disease. Blood 2011; 118(17): 4599-608.

52. Hanna J., Wernig M., Markoulaki S. et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science 2007; 318(5858): 1920-3.

53. Hoban M.D., Cost G.J., Mendel M.C. et al. Correction of the sickle cell disease mutation in human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood 2015; 125(17): 2597-604.

54. Osborn M.J., Gabriel R., Webber B.R. et al. Fanconi Anemia Gene Editing by the CRISPR/Cas9 System. Human Gene Therapy 2015; 26(2): 114-26.

55. Holt N., Wang J., Kim K. et al. Human hematopoietic stem/ progenitor cells modified by zinc-finger nucleases targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo. Nat. Biotechnol. 2010; 28(8): 839-47.

56. Mock U., Machowicz R., Hauber I. et al. mRNA transfection of a novel TAL effector nuclease (TALEN) facilitates efficient knockout of HIV co-receptor CCR5. Nucleic Acids Res. 2015; 43(11): 5560-71.

57. Mock U., Hauber I., Fehse B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies mediated by designer nucleases. Nature Protocols 2016; 11: 598-615.

58. Mandal P.K., Ferreira L.M., Collins R. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/ Cas9. Cell Stem Cell 2014; 15(5): 643-52.

59. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.

60. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-72.

61. Warlich E., Kuehle J., Cantz T. et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol. Ther. 2011; 19(4): 782-9.

62. Sebastiano v., Maeder M.L., Angstman J.F. et al. In situ genetic correction of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripotent stem cells using engineered zinc finger nucleases. Stem Cells 2011; 29(11): 1717-26.

63. Zou J., Mali P., Huang X. Site-specific gene correction of a point mutation in human iPS cells derived from an adult patient with sickle cell disease. Blood 2011; 118(17): 4599-608.

64. Sun N., Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol. Bioeng. 2014; 111(5): 1048-53.

65. Merling R.K., Sweeney C.L., Chu J. et al. An AAVS1-targeted minigene platform for correction of iPSCs from all five types of chronic granulomatous disease. Mol. Ther. 2014; 23(1): 147-57.

66. Zou J., Sweeney C.L., Chou B.K. et al. Oxidase-deficient neutrophils from X-linked chronic granulomatous disease iPS cells:

functional correction by zinc finger nuclease-mediated safe harbor targeting. Blood 2011; 117(21): 5561-72.

67. Pessach I.M., Ordovas-Montanes J., Zhang S.Y. et al. Induced pluripotent stem cells: a novel frontier in the study of human primary immunodeficiencies. J. Allergy Clin. Immunol. 2011; 127(6): 1400-7.

68. Park I.H., Arora N., Huo H. et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell 2008; 134(5): 877-86.

69. Kennedy M., Awong G., Sturgeon C.M. et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2012; 2(6): 1722-35.

70. Chang C.W., Lai Y.S., Lamb L.S. Broad T-cell receptor repertoire in T-lymphocytes derived from human induced pluripotent stem cells. PLoS One 2014; 9(5): e97335.

71. Themeli M., Kloss C.C., Ciriello G. et al. Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nat. Biotechnol. 2013; 31(10): 928-33.

Поступила: 05.04.2016

Moscow Life Sciences Investment Day

Moscow Life Sciences Investment Day — первая в России международная конференция в области биоэкономики, целью которой является оценка инвестиционной привлекательности компаний, реализующих инновационные решения в сфере здравоохранения, медицины и биотехнологий.

В МЕРОПРИЯТИЕ ОРГАНИЗУЕТ

Российская публичная биотехнологическая компания -Институт Стволовых Клеток Человека

ф ПРИ ПОДДЕРЖКЕ

а минпромторг

/1 россии

Ш МИНИСТЕРСТВО Щ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

Г РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Sk

Skolkovo

МОСКОВСКАЯ БИРЖА

VPSK J

Важной особенностью Л/ИБЮ являются выступления руководителей с презентациями своих компаний перед инвесторами.

А СПИКЕРЫ МЕРОПРИЯТИЯ

АРТУР ИСАЕВ ГЕННАДИЙ МАРГОЛИТ РИЧАРД БЭНДИС

Генеральный директор Вице-президент Основатель,

Институт Стволовых Московская Биржа генеральный директор

Клеток Человека (ИСКЧ) BioHealth Innovation Inc

ОЛЬГА КОЛОТИЛОВА

Директор Департамент развития фармацевтической и медицинской промышленности

ИГОРЬЛАНСКОЙ

Советник министра

Министерство здравоохранения Российской Федерации

КИРИЛЛ КАЕМ

Исполнительный директор Кластер биологических и медицинских технологий Фонда «Сколково»

АЛЕКСАНДР ПОТАПОВ

Исполнительный директор ОАО «РВК»

ДЖЕФФ РЭМСОН

Основатель, генеральный директор PCG Advisory Group

СКОТТ МАКГВАИР

Генеральный директор Xenetic Biosciences