Ассоциация гена коллагена и рецептора витамина d с остеопеническим синдромом при ювенильных артритах у детей

© Коллектив авторов, 2006

Т.Г. Васильева, Е.А. Кочеткова, Ф.Ф. Антоненко

АССОЦИАЦИЯ ГЕНА КОЛЛАГЕНА И РЕЦЕПТОРА ВИТАМИНА D С ОСТЕОПЕНИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ ПРИ ЮВЕНИЛЬНЫХ АРТРИТАХ У ДЕТЕЙ

Владивостокский филиал НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, Краевой клинический центр охраны материнства и детства (глав. врач — член-корр. РАМН, д. м. н. Ф.Ф. Антоненко), г. Владивосток, РФ

В работе исследована распространенность полиморфизма гена рецептора витамина Dз (VDRз) Ввш1 и коллагена а 1-го типа (COL1A1) Яр1 среди больных ювенильными артритами (ЮА). Изучена их связь с биохимическими маркерами костного метаболизма (остеокальцин, Р-СгоББ1арв). Объектом исследования стали 90 детей с различными вариантами ЮА. Выявлена вариабельность генов-предшественников остеопороза при различных вариантах ЮА. Установлено, что реализация эффектов Взт1 полиморфизма гена рецептора витамина Dз, вероятно, происходит преимущественно через механизмы, лежащие в основе костного формирования, а Яр1 (COL1A1) — через процессы резорбции кости.

Incidence of polymorphism in vitamin D3 receptor (VDR3) gene Bsml and in a 1- collagen type (COL1A1) gene Spl and correlation with biochemical markers of bone metabolism (osteocalcine, P+ crosslaps) was studied in 90 children with different variants of juvenile arthritis (JA). Authors detected variability of genes-precursors of osteoporosis in different variants of JA and showed that effects of VDR3 gene Bsml polymorphism were realized trough mechanisms of bone formation, and effects of Spl (COL1A1) polymorphism-through processes of bone resorption.

Остеопороз (ОП) является классическим муль-тифакториальным заболеванием, генетическая составляющая которого формируется за счет взаимодействия многих генов [1-3]. Существенный вклад в изучение наследственных факторов ОП внесли работы по идентификации генов, вовлеченных в процесс остеогенеза [4-6]. Среди многих генов-кандидатов, участвующих в регуляции костного метаболизма и детерминирующих минеральную плотность костной ткани (МПКТ), важная роль принадлежит гену рецептора витамина Dз (VDRз) и гену коллагена а 1-го типа (COL1A1). Несмотря на то, что изучению их роли в реализации ОП посвящено большое количество работ, взаимосвязь VDRз и COL1A1 с костным обменом обсуждается только в единичных исследованиях [7]. На основе литературных данных были определены две наиболее значимые мутации для предрасположенности к ОП: это нуклеотидные замены в генах COL1A1 (Яр1) и VDRз (Ввш1). Интерес к их изучению не случаен. Так, на сегодняшний день установлено, что витамин D и его активные метаболиты являются главными компонентами системы, регулирующей кальций-фосфорный обмен, нарушение которого лежит в основе остеопеничес-кого синдрома у детей. А VDRз, как ядерный рецептор, выступает в роли посредника в передаче биологического действия 1,25-дигидрооксивита-мина D3 на экспрессию различных генов-мишеней [5, 8, 9]. Напротив, коллаген 1-го типа является основным белком костной ткани, аминокислотная структура которого кодируется генами СOL1A1 и СOL1A2. Полиморфизм в регуляторной области гена СOL1A1 приводит к изменению соотношения а1- и а2- цепей белка и, как следствие, к нарушениям структуры коллагена кости [4, 6, 10]. Таким образом, оба гена непосредственно вовлечены в процесс остеогенеза, несмотря на определенные различия в молекулярных механизмах их действия. Определение полиморфизмов в гене коллагена 1-го типа и рецептора витамина D3 представляет интерес не только для выявления ассоциации различных генотипов и ОП, но и для выбора адекватной терапии. Необходимо отметить, что вопросу о детерминации генов-кандидатов предрасположенности к развитию остеопеничес-кого синдрома у больных ювенильными артритами (ЮА ) посвящены единичные работы [11, 12].

Целью нашего исследования было изучение распространенности полиморфизма гена рецептора витамина D3 (VDR3) Ввш1 и коллагена а 1-го типа (COL1A1) Яр1 и проведение анализа их связи с биохимическими маркерами костного ремодели-рования при ЮА.

Материалы и методы исследования

Нами было обследовано 55 детей с ЮА, из них 20 пациентов с ювенильным ревматоидным артритом (ЮРА) и 35 детей с ювенильным хроническим

(недифференцированным) артритом (ЮХА). В качестве групп сравнения обследованы 35 больных реактивным артритом (РеА) и 50 здоровых детей.

Нормальные и патологические аллели геномной ДНК лимфоцитов периферической крови обследованных детей идентифицировали при помощи полимераз-ной цепной реакции и капиллярного электрофореза на автоматическом анализаторе ДНК «MultiGene» с последующим секвенированием ДНК по Сэнгеру [13]. Определяли частоту «нормальных» (мутация отсутствует в обеих аллелях) - В, s и функционально «неполноценных» (мутация содержится в обеих аллелях) - b, S аллелей VDR3, COL1A1. При этом изучали частоту аллелей Bsml (генотипы BB, Bb и bb) и Sp1 (генотипы SS, Ss и ss) при различных вариантах ЮА. Исследование МПКТ проведено методом дихроматической рентгеновской аб-сорбциометрии на аппарате «Prodigy» (General Electrics Medical Systems «Lunar», США). Уровень в крови маркеров костного формирования (остеокальцин) и резорбции (ß-Crosslaps) изучен при помощи иммунофермент-ного метода на аппарате «ELECSIS» фирмы «HOFFMANN LA ROCHE» (Швейцария).

Результаты и их обсуждение

В результате проведенного анализа полученных данных установлена вариабельность частоты генотипов в зависимости от нозологической формы ЮА. Среди больных ЮРА и РеА носителей генотипа BB полиморфизма Bsm1 гена рецептора витамина D3 было достоверно меньше, чем в группе здоровых детей (21,82%, 11,43% и 36% соответственно; p<0,01). При этом гетерозиготы Bb при РеА выявлялись чаще, а при ЮРА - реже относительно контроля (71,43%, 32,73% и 50% соответственно; p<0,05). Примечательно, что рецессивных гомозигот среди здоровых детей было в 3,25 раза меньше, чем при ЮА (14% и 45,5% соответственно, p<0,001), но их количество в контрольной группе не отличалось относительно РеА (17,14%). Распределение частоты «нормального» (В) и «неполноценного» (b) аллелей гена полиморфизма Bsm1 (VDR3) в сравниваемых группах составило соответственно 38,18% при ЮРА, 47,14% при РеА и 61% в контроле (В) и 61,82%, 52,86% и 39% (b), с достоверным различием признака между группами пациентов с ЮА и здоровых детей (p<0,01).

Примечательно, что у больных ЮА также были выявлены различия показателей частоты генотипов Bsm1 в зависимости от клинического варианта заболевания. Так, большинство детей с ЮРА имели генотип bb (65%), что достоверно отличалось от здоровых (p<0,001) и больных другими вариантами артрита (p<0,001 и p<0,05 соответственно). А распределение частоты «нормального» (В) и «неполноценного» (b) аллелей соответствовало у данного контингента больных 22,5% и 78,5% (p<0,001). У детей с ЮХА эти частоты составили 47,92% и 52,08% (соответственно В и b аллелям),

Т.Г. Васильева, Е.А. Кочеткова, Ф.Ф. Антоненко

43

что достоверно отличалось от группы ЮРА (р<0,05).

Среди больных ЮА детей с генотипом ЯЯ (COL1A1) было больше, чем у здоровых (р<0,05), с максимальным различием признака между группами ЮХА и контроля (75% и 52% соответственно, р<0,01). Частота других генотипов Яр1 (COL1A1) в группах сравнения распределилась следующим образом: для Яв - 33,33%, 16,67%, 17,14% и 34% и вв - 0%, 8,33%, 17,15% и 14% соответственно ЮРА, ЮХА, РеА и контроль. Необходимо отметить, что при ЮРА детей с генотипом вв не выявлено, а достоверность различия показателей была установлена только для Яв между ЮХА, РеА и контролем (р<0,05). Также не выявлена достоверность различия распределения частоты «нормального» (в) и «неполноценного» (Я) аллелей полиморфизма (Яр1) гена COL1A1 в вышеуказанных группах сравнения. Однако при изучении показателей у больных ЮА (объединенная группа детей с ЮРА и ЮХА) достоверность аналогичных показателей была установлена (84,23% - Я и 15,77% - в, р<0,05).

При проведении анализа сочетания генотипов по генам рецептора витамина Dз и COL1A1, связанных с повышенным риском ОП, выявлено, что носителей «неполноценных» генов ЬЬЯЯ среди больных ЮРА было 40% (р<0,01 относительно контроля), а при ЮХА - 22,84% (р<0,05). Среди здоровых детей и пациентов с РеА данный суммарный генотип встречался значительно реже (4% и 8,57% соответственно). Но необходимо отметить, что удельный вес сочетания «полноценных» аллелей (ВВвв) в группах сравнения был небольшой и составлял от 2,86% при ЮХА до 9% в контроле (р>0,05). Мы не выявили детей с аналогичным генотипом в группе ЮРА. Гетерозиготные носители мутаций в гене (ВЬЯв) у пациентов с хроническими вариантами ЮА диагностировались достоверно реже, чем у здоровых детей и больных РеА (р<0,01).

Мы исследовали взаимосвязи аллелей Ввт1 полиморфизма гена VDRз и Яр1 полиморфизма гена COL1A1 с маркерами формирования и резорбции костной ткани. Установлено, что у больных ЮА детей обнаружены достоверные различия между средними значениями остеокальцина и генотипами ВВ и ЬЬ (168,22±15,29 и 116,14±12,89 ^/т1 соответственно; р<0,01), что указывает на связь Ввт1 (VDRз) с уровнем маркера костного формирования в изученной выборке пациентов. Динамика Р-Сговв1арв в зависимости от генотипа носила аналогичный характер. Так, более высокий уровень маркера резорбции кости был в группе детей с генотипами ВЬ (1,52±0,10 ^/т1) и ВВ (1,44±0,09 ^/т1), а у гомозигот по рецессивному признаку (ЬЬ) его уровень был ниже (1,18±0,08 ^/т1) (р<0,05).

Таким образом, аллель Ь в гомозиготном состоянии ассоциируется с более низкими средними

показателями концентрации остеокальцина и Р-Сговв1арв, что свидетельствуют о синхронном снижении процессов остеосинтеза и костной резорбции, активности остеогенеза у носителей ЬЬ-ге-нотипа. Соотношение остеокальцина и р-Сговв1арв (К1) достоверно различалось у детей с ВВ- и ЬЬ-ге-нотипами (р<0,05). Это, вероятно, доказывает преимущественное воздействие аллеля Ь на биохимические процессы, лежащие в основе остеосинтеза.

Достоверных различий между показателями костного формирования в зависимости от генотипов ЯЯ, Яв и вв и их сочетаний с Ввт1 (VDRз) в изученной выборке пациентов не выявлено. Однако при изучении взаимосвязи носительства «неполноценного» аллеля Я (ЯЯ) гена коллагена 1-го типа с маркерами костного ремоделирования диагностировано повышение уровня р-Сговв1арв относительно показателя при вв-генотипе (р<0,05). Этому соответствуют значения К1, который был достоверно ниже при генотипе вв по сравнению с противоположным гаплотипом (р<0,05).

При исследовании показателей денситометрии установлено, что генотип ВВ у больных ЮА сопровождается более высокой минеральной плотностью костной ткани поясничных позвонков по

сравнению с ЬЬ-генотипом (р<0,001). При этом зарегистрированы более низкие значения стандартного отклонения от ее возрастной нормы.

Градация Z-score по генотипам была следующая: -0,29±0,07 SD для ВВ, -0,64±0,12 SD для ВЬ (р<0,05) и -1,18±0,13 SD для ЬЬ (р<0,001). Содержание минерала в костной ткани также было более высоким у гомозигот по «полноценному» В-алле-лю. Необходимо отметить, что у 82% больных ЮА с остеопеническим синдромом были зарегистрированы суммарные генотипы ЬЬЯЯ, ВЬЯЯ и ЬЬЯв.

Таким образом, полиморфизм генов VDR3 (Ввт1) и COL1A1 (Яр1) играет важную роль в процессе остеогенеза, ассоциирован с маркерами костного обмена, что свидетельствует о его функциональной значимости в развитии остеопенического синдрома. При этом реализация эффектов Ввт1 полиморфизма гена рецептора витамина D3, вероятно, происходит преимущественно через механизмы, лежащие в основе формирования, а Яр1 (COL1A1) - через процессы резорбции кости. Высокая распространенность функционально неполноценных (Ь и Я) аллелей доказывает, что в основе патогенеза костных изменений при ЮА, вероятно, лежат генетически детерминированные нарушения регуляции костного метаболизма, синтеза коллагена, которые реализуются под воздействием инфекционных и иммунопатологических факторов, ятрогении. Определение факторов риска развития остеопенического синдрома, генов предрасположенности к ОП позволит выделять группы риска, прогнозировать течение заболевания, производить индивидуальный подбор комплекса профилактических и лечебных мероприятий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зазерская И.Е., Асеев М.В., Кузнецова Л.В. Анализ ассоциации генов VDR3 и COL1A1 с постменопаузальным остеопорозом. Остеопороз и остеопатии. 2002; 2: 2-6.

2. Беневоленская Л.И., Финогенова СА. Генетика остеопороза: II. Изучение роли гена рецептора витамина D (обзор литературы). Остеопороз и остеопатии. 1999; 3: 21-25.

3. Ralston SH. The genetic of osteoporosis. Bone. 1999; 25(1): 85-86.

4. Dawson PA, Kelly TE, Marini JC. J. Extension of pheno-type associated with structural mutation in type I collagen: siblings with juvenile osteoporosis have an alpha 2 (I) gly 436 arg substitution. Bone Miner. Res. 1999; 14: 449-455.

5. Morrison NA Vitamin D receptor gene variants and osteoporosis: a contributor to the polygenic control of bone density. In: Vitamin D. Eds. D. Feldman, FN. Glorieux, JW. Pike. San Diego: Academic Press, 1997: 713-731.

6. Harris SS, Pettel MS, Cole DEC. Association of collagen type 1a 1 Sp1 polymorphism with five-year rates of bone loss in older adults. Calcif. Tissue Int. 2000; 66: 268-271.

7. Eisman JA. Genetic of osteoporosis. Endocrine Rev. 1999; 20: 788-804.

8. Gong G, Stern HS, Cheng SC. The association of bone mineral density with vitamin D receptor gene polymorphisms. Osteoporosis Int. 1999; 9: 55-64.

9. Короткова ТА. Влияние генетических и внешнесредо-вых факторов на формирование пика костной массы у подростков. Остеопороз и остеопатии. 2004; 3: 34-37.

10. Mann V, Ralston SH. Meta-analysis of COL1A1Sp1 polymorphism in relation to bone mineral density and osteoporotic fracture. Bone. 2003; 32(6): 711-717.

11. Костик М.М., Баранов Д.Н., Масалова В.В. и др. Влияние полиморфизма гена рецептора витамина D на степень воспалительной активности и характер течения хронических артритов у детей. Вопр. совр. пед. 2006; 5(1): 283-284.

12. Васильева Т.Г. Медико-биологические аспекты муль-тифакториальной патологии. Материалы Российской научной конференции с межд. участием. В 2-х томах. Т.1. Курск: КГМУ, 2006: 452-456.

13. Ванюшева О.В. Разработка технологии детекции точечных мутаций на основе аллель-специфической ПЦР с применением автоматических анализаторов ДНК: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2005.

РЕФЕРАТЫ

КОРРЕЛЯЦИЯ КЛИНИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ ДАННЫХ У ДЕТЕЙ С ОТЕКОМ МОЗГА, ОБУСЛОВЛЕННЫМ ДИАБЕТИЧЕСКИМ КЕТОАЦИДОЗОМ, ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МАГНИТНОЙ РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ

Цель исследования: определить клинические и биохимические параметры, влияющие на развитие отека мозга при диабетическом кетоацидозе (ДКА) у детей. Для определения степени отека мозга мы использовали магнитно-резонансную томографию. У 26 детей был определен видимый коэффициент диффузии (ВКД) воды в головном мозге до и после коррекции кетоацидоза и рассчитаны корреляции изменения ВКД с клиническими и биохимическими параметрами. Средняя величина ВКД после коррекции ДКА увеличивалась по сравнению с его исходными значениями (8,13 ±0,47 ив 7,74 ±0,49'10-4 мм2/с, разница средних значений 0,40, 95% ДИ: 0,25 до 0,55, р < 0,01). У детей с нарушениями сознания во время ДКА увеличение ВКД было более значительным. Увеличение ВКД во время ДКА имело положительную корреляцию с исходной концентрацией мочевины в сыворотке крови (коэффициент корреляции 0,41, р =0,03) и с исходной частотой дыхания (коэффициент корреляции 0,61,р<0,001). Не было достоверной корре-

ляции увеличения ВКД с исходным уровнем глюкозы в сыворотке, с уровнем натрия или с эффективной осмоляр-ностью, а также со степенью изменения этих параметров в процессе лечения. Многовариантный анализ показал, что исходный уровень мочевины в сыворотке и исходная частота дыхания независимо коррелировали с увеличением ВКД. Таким образом, степень отека мозга при ДКА у детей коррелирует со степенью дегидратации и гипервентиляции, но не с факторами, зависящими от исходной осмолярности или от изменений осмолярности в процессе лечения. Эти данные подтверждают гипотезу, что отек мозга при ДКА зависит от гипоперфузии, а колебания осмолярности во время коррекции ДКА не играют значимой роли.

Glaser NS, Marcin JP, Wootton-Gorges SL, Buonocore MH, Rewers A, Strain J, Dicarlo J, Neely EK, Barnes P, Kuppermann N. J. Pediatr. 2008; 25.