РАСТИТЕЛЬНЫЙ ЭКСТРАКТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВЫПАДЕНИЯ ВОЛОС
PLANT EXTRACT FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HAIR LOSS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей растительный экстракт, полезный для профилактики и лечения выпадения волос.
Настоящее изобретение относится к области препаратов растительного происхождения и продуктов для трихологического применения.
В частности, настоящее изобретение относится к применению растительного экстракта избранного растения для стимуляции роста волос, увеличения полноты стержня волоса и стимуляции увеличения густоты волос на участках кожи головы с редкими волосами.
Предшествующий уровень техники
Изучение физиологии волосистых структур человеческого тела и тропизма волос - предмет многочисленных научных исследований. Общеизвестно, что в жизненном цикле волосяной луковицы следуют друг за другом фазы анагена (роста), катагена (инволюции) и телогена (покоя). За периодом роста волос следует фаза регрессии, во время которой наиболее глубокая часть фолликула переходит к запрограммированной гибели клеток. В конце этой фазы цикл начинается снова. В основе цикла роста лежит способность стволовых клеток волосяной луковицы попеременно выходить из состояния покоя.
Во время фазы роста луковицы и производства волос преобладают пролиферация, дифференцировка и выживание, регулируемые факторами роста. Вместо этого фаза регрессии характеризуется активацией молекулярных путей, которые индуцируют апоптоз в клетках луковицы. Однако физиологический механизм роста волос с определенной частотой подвержен дисбалансу. Значительная часть населения, особенно мужчины, фактически страдает от проблем поредения или даже преждевременного выпадения волос. Из имеющихся исследований выяснилось, что явления раннего выпадения волос обусловлены множеством причин, включая недостаток питательных веществ, витаминов и минералов, гормональный дисбаланс, нарушение регуляции местных ферментативных систем и стрессовые условия организма.
В попытке исправить и предотвратить условия, которые ускоряют выпадение волос, были разработаны трихологические препараты, которые, воздействуя на кожу головы, питание, насыщение кислородом и микроциркуляцию, имеют тенденцию к улучшению условий, которые способствуют физиологическому росту волос.
Среди продуктов, которые в настоящее время являются коммерческими в области трихологии, некоторые основаны на активных веществах природного происхождения, которые действуют локально, стимулируя тропизм волосяных луковиц и кожные покровы.
Автор настоящей заявки, занимаясь приготовлением продуктов для профилактики выпадения волос, недавно разработал препарат для трихологического применения на основе растительного экстракта, полученного из растения Galeopsis segetum Necker (Пикульника посевного). Препарат является предметом Европейской патентной заявки EP3062636A0. В этой Европейской патентной заявке описано, как экстракт растения, принадлежащего к виду Galeopsis segetum Necker, оказывает удовлетворительное стимулирующее воздействие на клетки волосяного фолликула и нормализует фазы жизненного цикла волосистых структур.
Трихологическая активность этого растительного экстракта, по-видимому, связана, по крайней мере частично, с некоторыми биологически активными веществами, присутствующими в экстракте из Galeopsis segetum Necker, включая флавоноиды, гиполаетин 4'-метиловый эфир 7-(2''-аллозил)-глюкозид моноацетилированный, гиполаэтин 4'-метиловый эфир 7-(2''-аллозил)-ацетилированный глюкозид, изоскутелларин 7-(2''-аллозил) моноацетилированный глюкозид, гиполаетин 4'-метиловый эфир 7-(2''-аллозил) глюкозид, гиполаетин 7-(2''-аллозил) моноацетилированный глюкозид, изоскутелларин 7-(2''-аллозил) глюкозид и гиполаетин 7-(2''- аллозил) глюкозид диацетилированный.
В рамках своей экспериментальной деятельности автор настоящей заявки в настоящее время совершенно неожиданно обнаружил, что некоторые образцы, содержащие экстракты видов, отличных от вида Galeopsis segetum Necker, в то же время содержащие ранее упомянутые флавоноиды в минимальных количествах, однако, обладают биологической и клеточной антиоксидантной активностью, неожиданно превышающей ожидаемую.
Таким образом, заявитель обнаружил, что эта повышенная биологическая активность и клеточная антиоксидантная активность присутствуют в экстракте случайного растения, не принадлежащего к виду Galeopsis segetum Necker, который является предметом предыдущей Европейской заявки на патент.
Таким образом, одна из целей изобретения состоит в обеспечении экстракта растения, отличного от уже известного экстракта Galeopsis segetum Necker, который обладает повышенной стимулирующей активностью в отношении пролиферации клеток волосяных луковиц и поэтому находит конкретное применение в области трихологии. Еще одной целью изобретения является обеспечение композиции для стимуляции роста волос на основе экстрактов из растения, альтернативного виду Galeopsis segetum Necker, применение которого по существу не связано с побочными эффектами.
Другая цель изобретения состоит в обеспечении композиции для трихологического применения, которую можно наносить локально или применять перорально, активные ингредиенты которой происходят из растения, альтернативного виду Galeopsis segetum Necker.
Краткое изложение сущности изобретения
В контексте экспериментальной деятельности, проведенной в своих лабораториях, автор настоящей заявки неожиданно обнаружил, что растительный экстракт, полученный из Galeopsis tetrahit (Пикульника обыкновенного), травянистого растения, принадлежащего к роду Galeopsis, обладает антиоксидантной и стимулирующей пролиферацию клеток активностью, превышающей ожидаемую активность для других видов Galeopsis. таких как Galeopsis segetum Necker.
Благодаря этой повышенной активности экстракт из Galeopsis tetrahit приводит к улучшению пролиферации клеток волосяной луковицы и росту волос по сравнению с экстрактом Galeopsis segetum Necker.
Улучшение трихологической активности экстракта из Galeopsis tetrahit по сравнению с экстрактом Galeopsis segetum Necker является неожиданным, поскольку оба вида принадлежат к одному и тому же роду растений, и ожидалось, что оба вида имеют одинаковый или очень сходный фитохимический состав.
Таким образом, согласно первому аспекту изобретения, косметическое использование растительного экстракта из отобранного вида Galeopsis tetrahit обеспечивается согласно пункту 1 формулы изобретения. В частности, настоящее изобретение обеспечивает нетерапевтическое или косметическое применение композиции, содержащей растительный экстракт Galeopsis tetrahit и физиологически приемлемый носитель для стимуляции физиологического роста волос, увеличения густоты волос или повышения объема волос у индивидуума.
В соответствии со вторым аспектом изобретение относится к применению в области медицинской трихологии растительного экстракта Galeopsis tetrahit, в частности, для лечения или профилактики андрогенной алопеции или телогеновой алопеции.
Таким образом, изобретение обеспечивает применение как в области косметологии, так и в области терапии-трихологии экстракта из Galeopsis tetrahit или композиции, содержащей этот экстракт.
Как правило, экстракт Galeopsis tetrahit или композиция, содержащая экстракт, пригодный как для местного применения, так и для перорального применения.
Следовательно, настоящее изобретение исходит из неожиданного наблюдения того, как Galeopsis tetrahit, избранный вид, принадлежащий к роду Galeopsis, обладает биологически активными компонентами, некоторые из которых не идентифицированы, которые стимулируют пролиферацию клеток волосяных луковиц, обеспечивая использование в области трихологии, для местного применения или перорального применения экстракта.
Как правило, композиция по изобретению содержит косметически или трихологически активное количество одного или нескольких биологически активных компонентов, доступных в экстракте Galeopsis tetrahit.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к косметическому применению комбинации экстракта из Galeopsis tetrahit и экстракта из Galeopsis segetum Necker для стимуляции физиологического роста волос и/или повышения густоты волос и/или увеличения объема волос у индивидуума.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к комбинации экстракта из Galeopsis tetrahit и экстракта из Galeopsis segetum Necker для использования при лечении андрогенной алопеции или телогеновой алопеции.
Краткое описание чертежей
Особенности и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из прилагаемых чертежей, на которых:
Фигура 1 демонстрирует гистограмму, относящуюся к 24-часовому МТТ анализу, которая иллюстрирует процент жизнеспособности клеток по отношению к контролю, определенный обработкой растительными экстрактами, содержащими увеличивающиеся количества Galeopsis tetrahit в соответствии с примером 7;
Фигура 2 демонстрирует гистограмму, представляющую сравнительные данные антиоксидантной активности, выраженные в процентах АФК экстрактов Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit, как описано в примере 7;
2
2
Фигура 3 демонстрирует гистограмму, представляющую активность защиты клеток от окислительного стресса, вызванного HO;
Фигура 4 демонстрирует гистограмму, отражающую влияние на активность 5-альфа-редуктазы изоформы 2 образцов финастерида и водно-спиртовых экстрактов Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit по изобретению, как описано в Примере 7;
Фигура 5 демонстрирует схематическое представление принципа анализа с дихлорфлуоресцеином из примера 7;
1
Фигура 6 демонстрирует H-ЯМР спектр экстракта надземных частей Galeopsis sp.;
1
Фигура 7 демонстрирует H-ЯМР спектры исследуемых образцов, полученных в примере 8;
1
Фигура 8 демонстрирует проекции PC1 в сравнении с PC2 H-ЯМР спектров растительных материалов из Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit и экстрактов из Galeopsis tetrahit, как показано в примере 8;
Фигура 9 демонстрирует сумму РС1 и РС2, составляющую примерно 63% от общей дисперсии;
Фигура 10 демонстрирует график нагрузки РС1, как описано в примере 8;
Фигура 11 иллюстрирует сравнение профиля ЯМР с нагрузкой 1, как показано в примере 8, для идентификации сигналов ЯМР, ответственных за разделение кластеров PCA (анализа главных компонент);
Фигура 12 демонстрирует данные, полученные из статистического анализа PLS (метода частных наименьших квадратов), сообщенного в примере 8.
Подробное описание изобретения
Автор настоящей заявки обнаружил, что растительный экстракт из рода Galeopsis, вида Galeopsis tetrahit содержит биологически активные компоненты, еще не полностью идентифицированные, которые стимулируют пролиферацию клеток на уровне волосяного фолликула более интенсивно, чем другие виды Galeopsis.
Настоящее изобретение включает применение как в косметической области, так и в области медицинской трихологии экстракта из выбранных видов Galeopsis согласно изобретению.
Согласно первому аспекту изобретение относится к косметическому, нетерапевтическому применению растительного экстракта из рода Galeopsis, вида tetrahit для стимуляции роста волос.
В частности, изобретение относится к косметическому, нетерапевтическому применению растительного экстракта из рода Galeopsis вида Galeopsis tetrahit для улучшения внешнего вида волос и/или для увеличения объема волосяного стержня.
В соответствии со вторым аспектом изобретение относится к растительному экстракту Galeopsis tetrahit для применения при лечении или профилактике андрогенной алопеции или телогеновой алопеции.
Согласно другим аспектам изобретение относится к косметическому или терапевтическому применению в области трихологии комбинации растительных экстрактов из Galeopsis tetrahit и из Galeopsis segetum Necker.
Как правило, экстракт растения Galeopsis tetrahit согласно изобретению может быть включен или составлен в виде композиции как для косметического, так и для терапевтического применения.
Композиция по изобретению может быть составлена для местного применения или для перорального применения.
Galeopsis tetrahit, растение, из которого получают экстракт на основе изобретения, представляет собой избранный вид рода Galeopsis.
В рамках изобретения растительный экстракт может быть получен из любой части растения Galeopsis tetrahit, такой как корни, листья, плоды или даже цветы. Для применения по изобретению экстракт предпочтительно получают из надземной части, обычно из листьев растения Galeopsis tetrahit.
Согласно некоторым вариантам осуществления экстракт растения по изобретению получают экстракцией из части растения или из его ткани с использованием физиологически приемлемого растворителя в качестве экстракционной среды.
Под термином «физиологически приемлемый растворитель» подразумевается растворитель, который не вызывает значительных побочных реакций при введении в организм человека или нанесении на тело человека.
Подходящим растворителем для получения растительного экстракта является физиологически приемлемая жидкость, в которой по меньшей мере некоторые из биологически активных компонентов выбранного растения растворимы, и в которой они не подвергаются изменению, которое лишает их активности.
В некоторых вариантах осуществления физиологически приемлемый растворитель выбран из воды, этанола, этилацетата и их смесей. Обычно растворитель представляет собой водно-спиртовой раствор из воды и этанола.
Для получения растительного экстракта Galeopsis tetrahit могут быть использованы методики экстракции твердого вещества жидкостью для отделения/ экстракции одного или нескольких биологически активных компонентов из растительных тканей.
В некоторых вариантах осуществления экстракцию одного или нескольких биологически активных компонентов осуществляют путем вымачивания растительной части или матрикса Galeopsis tetrahit в подходящем растворителе, например, водно-спиртовой смеси.
Например, подходящий экстракт может быть получен путем погружения или вымачивания части надземных частей растения Galeopsis tetrahit в смеси вода-этанол в течение подходящего времени для обогащения растворителя одним или несколькими биологически активными компонентами. В этих условиях экстракция биологически активных компонентов из тканей выбранного растения происходит, по существу, путем диффузии и/или осмоса. Время вымачивания частей растения в растворителе является вариабельным, например, от 1 до 48 часов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления получение подходящего экстракта Galeopsis tetrahit включает следующие стадии:
- измельчение высушенных надземных частей растения;
- добавление экстракционного растворителя, такого как смесь воды и этанола, для получения отношения водно-спиртовое лекарство/ растворитель примерно от 1:10 до 1:50 по массе;
- вымачивание надземных частей;
- экстракция биологически активных компонентов;
- фильтрация;
- концентрирование фильтрата, например, при пониженном давлении путем выпаривания водно-спиртового растворителя;
- необязательное продолжение выпаривания до удаления растворителя;
- необязательная сушка экстракта.
В некоторых вариантах осуществления стадия экстракции может быть повторена два или три раза.
На заключительном этапе удаления растворителя выпариванием может быть при необходимости добавлен твердый носитель, такой как, в качестве неограничивающего примера, крахмалы или мальтодекстрины, для получения экстракта в форме сухого порошка.
В соответствии с другим вариантом осуществления способ экстракции Galeopsis tetrahit включает следующие стадии:
- измельчение, например, надземных частей растения;
- перенос полученного порошка в подходящий перколятор;
- перколяция, например, с количеством экстракционного растворителя для обеспечения массового отношения лекарства/ растворителя примерно от 1:20 до 1:100;
- рециркуляция перколятной части до истощения экстрагируемого материала;
- отжим экстрагированного растительного слоя для извлечения всего экстракционного растворителя;
- фильтрация отделенного экстракта;
- концентрирование фильтрата, например, при пониженном давлении путем выпаривания растворителя;
- необязательное продолжение выпаривания до удаления растворителя;
- необязательная сушка экстракта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления на заключительном этапе удаления растворителя путем выпаривания добавляют твердый носитель, например, крахмал или мальтодекстрин, для получения экстракта в форме сухого порошка.
Как правило, экстракт, полученный из Galeopsis tetrahit, может быть жидким, полутвердым или сухим.
Например:
- в жидком экстракте 1 мл экстракта содержит биологически активные компоненты, растворимые в 1 г растительного препарата;
- в полутвердом экстракте растворитель частично выпаривают, в частности, до тех пор, пока экстракт не смачивает фильтровальную бумагу;
- в сухом экстракте растворитель почти полностью выпаривают до получения порошка.
Можно приготовить экстракты Galeopsis tetrahit различной полярности.
2
Например, можно получить экстракт с высокой полярностью, используя полярный растворитель, такой как водно-спиртовой раствор, экстракт с промежуточной полярностью, используя менее полярный растворитель, такой как этилацетат, или неполярный экстракт с использованием сверхкритического CO, с помощью которого можно экстрагировать фракции фитокомплексов, которые осуществляют ингибирующую активность в отношении фермента 5-альфа-редуктазы 2 типа.
В определенных вариантах осуществления экстракцию проводят с использованием массового отношения между растворителем и растительным матриксом в диапазоне от 1:10 до 10:1.
Биологически активные растительные компоненты Galeopsis tetrahit можно экстрагировать, используя альтернативные методики экстракции, такие как, например, расщепление, настаивание, отжим, отваривание, перколяция, противоточная экстракция, экстракция методом Сокслета, экстракция сверхкритическими газами или ультразвуком.
Биологически активные компоненты, экстрагированные из Galeopsis tetrahit, не были идентифицированы, однако было обнаружено с помощью тестов in vitro, что они воздействуют на пролиферацию клеток в большей степени, чем это было обнаружено для экстрактов из Galeopsis segetum Necker, при тех же условиях экстракции.
Биологически активные компоненты, содержащиеся в растительном экстракте по настоящему изобретению, реактивируют жизненный цикл волосяных фолликулов, также покоящихся в коже головы. Эта активность была также обнаружена в областях кожи головы, где луковицы волос частично атрофированы, как в областях, где есть редеющие волосы.
Экстракт растения из рода Galeopsis вида Galeopsis tetrahit может содержаться в композиции.
Таким образом, в соответствии с этими аспектами настоящее изобретение обеспечивает косметическое применение композиции, содержащей экстракт растения, принадлежащего к роду Galeopsis, виду Galeopsis tetrahit, и физиологически приемлемый носитель для лечения и/или профилактики выпадения волос или для стимуляции физиологического роста волос или поддержки физиологического тропизма волос.
Автор настоящей заявки также отметил, что экстракт Galeopsis tetrahit обладает эффектом, ингибирующим фермент 5-альфа-редуктазу, в частности, 2 типа, что делает его полезным для применения в области медицинской трихологии, такого как лечение или профилактика андрогенной алопеции и/или телогеновой алопеции.
В соответствии с четвертым аспектом изобретение относится к композиции, содержащей экстракт растения Galeopsis tetrahit и физиологически приемлемый носитель для использования при лечении или профилактике андрогенной алопеции и/или телогеновой алопеции. Композиция по изобретению является эффективной в профилактике и/или лечении форм облысения или поредения волос, телогеновой алопеции или андрогенной алопеции.
Композиция по изобретению может быть составлена в форме для местного применения или в форме для перорального применения. Как правило, композиция по изобретению содержит физиологически и/или фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель.
Физиологически или фармацевтически пригодный носитель, разбавитель или наполнитель может быть выбран на основе пути введения, для которого предназначена полученная фармацевтическая композиция. Любой носитель и/или наполнитель, подходящий для необходимой формы введения препарата, подразумевается в применениях растительного экстракта или его активных ингредиентов, описанных в настоящей заявке.
В рамках настоящего изобретения термин «носитель» относится к наполнителю, растворителю, разбавителю или адъюванту, которые присутствуют или могут присутствовать в композиции по изобретению.
В некоторых вариантах осуществления способ применения композиции по изобретению является местным способом. В этих случаях композицию по изобретению можно наносить в эффективном количестве непосредственно на кожу головы.
Например, при лечении выпадения или поредения волос косметически/ физиологически активное количество композиции можно наносить непосредственно на кожу головы, один или несколько раз в день, для удобства циклами продолжительностью 2-3 месяца, чередующимися с периодами отсутствия лечения.
В соответствии с этими аспектами изобретение также относится к способу косметического лечения, включающему нанесение на кожу головы или ее части эффективного количества композиции в соответствии с одним или несколькими вариантами осуществления, описанными и/или заявленными в данной заявке.
Композиция для местного применения может быть в твердой, полутвердой или жидкой форме. Подходящие составы в твердой форме включают в себя кремы, гели, притирания, пасты, мази.
В других вариантах осуществления композиция для местного применения находится в жидкой форме, например, в форме лосьонов, гелей, шампуней, суспензий, эмульсий.
В случае жидких или полутвердых форм составов растительный экстракт может быть разбавлен в носителе в физиологически приемлемой жидкой форме, таком как вода, спирт, водно-спиртовой или глицериновый раствор, или смешан с другими жидкостями, подходящими для местного применения.
Например, композиции по изобретению в жидкой форме могут быть приготовлены путем растворения биологически активных компонентов экстракта в воде и/или спирте. Жидкая композиция может быть забуферена для достижения диапазона pH, который для удобства составляет от 5 до 7, чтобы он был совместим с pH кожи головы, а затем может быть профильтрована и упакована в подходящие контейнеры, такие как бутылки или флаконы.
В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению могут содержать вспомогательные вещества, обычно используемые в составе косметических или фармацевтических препаратов для местного применения, такие как консерванты, бактерицидные агенты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы, увлажнители, красители и другие вспомогательные вещества, обычно используемые в способах приготовления.
В одном варианте осуществления композиция для местного применения находится в форме эмульсии, содержащей экстракт, переносимый в подходящем наполнителе. В некоторых вариантах осуществления композиция для местного применения содержит наполнитель типа гидроксиметилцеллюлозы и/или гелеобразующий агент с ГЛБ, подходящим для состава и веществ.
В соответствии с другими вариантами осуществления композиция по изобретению находится в форме для перорального применения. В этих случаях композиция содержит экстракт Galeopsis tetrahit, как определено ранее, и один или несколько растворителей или наполнителей, подходящих для перорального применения.
В качестве примера, подходящие наполнители для перорального применения включают производные целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, целлюлозы ацетат бутират, целлюлозы ацетат фталат и их смеси.
Дополнительные примеры подходящих наполнителей включают полимеры, принадлежащие к семейству лактамов, такие как пирролидон и его производные, например, поливинилпирролидон, поливинилполипирролидон и их смеси, неорганические соли, такие как фосфат кальция или дикальция, любриканты, такие как стеарат магния, триацилглицерины и их смеси.
Композиции для перорального применения могут быть в твердой или жидкой форме. Типичные композиции в твердой форме включают таблетки, капсулы, порошки, гранулы, пилюли. Примеры композиций в жидкой форме включают растворы, эмульсии, суспензии, сиропы. Композиции также могут находиться в форме с контролируемым высвобождением содержащихся в них активных компонентов.
Таблетки обычно содержат подходящий носитель или наполнитель, в котором диспергирован растительный экстракт, обычно в сухой форме.
Растительный экстракт, содержащий биологически активные компоненты композиции по изобретению, может присутствовать в различном количестве, например, от 0,0001 до 10 масс.%, обычно от 0,1 до 5 масс.%.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиция по изобретению дополнительно содержит одно или несколько активных веществ, таких как витамины, минералы, микроэлементы и другие вещества, способные стимулировать активность волосяного фолликула.
Композиция по изобретению в форме для перорального применения может представлять собой медицинское устройство, фармацевтическую композицию, или диетическую или пищевую добавку.
Нутрацевтический продукт представляет собой пищевой продукт, который может оказывать физиологическое действие или обеспечивает защиту от недостатка или физиологического расстройства.
Диетическая или пищевая добавка означает продукт, который может содержать, помимо прочего, витамин, минерал, растительный экстракт, аминокислоту, метаболит, экстракт, концентрат или смеси этих ингредиентов.
Применяемое количество и частота применения композиции будут зависеть от природы и тяжести трихологического заболевания, подлежащего лечению.
Настоящее изобретение далее будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые предоставлены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1
Таблетка для перорального применения
Количество компонентов
Сухой экстракт Galeopsis tetrahit 5 - 100 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 200 - 300 мг
Диоксид кремния (коллоидный кварц) 2,5 - 10 мг
Стеарат магния 2,5 - 10 мг
Полиэтиленгликоль 0,5-2,5 мг
Альгинат натрия 0,025 - 0,5 мг
Гидроксипропилметилцеллюлоза 100 - 200 мг
Поливинилпирролидон 0,5 - 1 мг
Сополимер метакриловой кислоты 3,5 - 8,5 мг
Триэтилцитрат 0,5 - 1 мг
Пример 2
Гранулы для перорального применения
Количество компонентов
Эритритол 20 – 30 масс.%
Galeopsis tetrahit 0,2 - 3,5 масс.%
Маннитол 39,7 - 6,2 масс.%
Ароматизаторы 5 – 10 масс.%
Сукралоза 0,1 - 0,3 масс.%
Крахмал 35 – 50 масс.%
Пример 3
Таблетки для перорального применения
Количество компонентов
Ультрамелкий сахар 50 - 90 мг
Густой экстракт Galeopsis tetrahit 5 - 100 мг
Микрокристаллическая целлюлоза 10 - 50 мг
Тальк 10 - 20 мг
Кукурузный крахмал 5 - 25 мг
Сахарная пудра 5 - 15 мг
70% сорбитол не кристаллизуемый 5 - 10 мг
Стеарат магния 1 - 3 мг
Аравийская камедь 2 - 3 мг
Диоксид титана 1 - 2,5 мг
Желатин 1 - 3 мг
Сополимер метакриловой кислоты тип А 1 - 2,5 мг.
Легкий карбонат магния 0,5 - 1 мг
Полиэтиленгликоль 0,1 - 0,3 мг
Дибутилфталат 0,1 - 0,25 мг
Триэтилцитрат 0,002 - 0,05 мг
Метилпараксибензоат 0,01-0,03 мг
Пример 4
Лосьон для нанесения на волосы и кожу головы
Компонент (название или торговая марка по INCI (Международной номенклатуре косметических ингредиентов). Количество
Гидроксипропилтримоний гиалуронат 0,05 - 0,1%
Денатурированный этиловый спирт, тип С 5 - 20%
Молочная кислота 0,1 - 0,3%
Meditanox H-10 0,001 - 0,002%
ПЭГ-40 гидрогенизированное касторовое масло 0,5 - 1,5%
Октадецил-ди-трет-бутил-4-гидроксигидроциннамат 0,02-0,06%
Лецитин NAT 8539 0,02 - 0,06%
Липобель соягликон 0,05 - 0,1%
Ароматизатор Agrumes 2807/03 MOD.3 / HICC FREE 0,1 - 0,2%
Сухой экстракт Galeopsis tetrahit 0,05 - 1%
Fomblin HC/PU-CAT5 0,005 - 0,02%
Вода дост.кол. до 100%
Пример 5
Лечебный шампунь
Компонент (название или торговая марка INCI). Количество
Sulfetal LA B-E 2 - 4%
Пентавитин 0,5 - 1,5%
UCARE™ полимер JR-400 0,5 - 1,5%
Amphotensid GB 2009 0,5 - 1,5%
MiruStyle™ MFP PE - LQ - (WD) 0,25 - 0,75%
Тетранатрий этилендиаминтетраацетат 0,2 - 0,6%
Antil 127 0,1 - 0,3%
Oxetal VD 92 0,05 - 0,3%
Лимонной кислоты моногидрат 0,25 - 1%
Гидроксиметилглицинат натрия 0,4 - 1,6%
ПЭГ-8 каприловые/ каприновые глицериды 0,25 - 1%
Сухой экстракт Galeopsis tetrahit 0,0025 - 1%
Бутилгидроксианизол 0,005 - 0,02%
Ди-ППГ-2 Мирет-10 Адипат 1,25 - 5%
Диметикон ПЭГ-7 изостеарат 0,25 - 1%
Вода дост.кол. до 100%
Пример 6
Эмульсия для кожи
Количество компонентов
Пропиленгликоль 6 - 8%
Глицерилстеарат пальмитат 3 - 5%
Кокосовое масло 2 - 4%
Цетостеариловый спирт 1 - 3%
Эмульгирующий воск 1 - 3%
Бензиловый спирт 0,5 - 1,5%
Густой экстракт Galeopsis tetrahit 0,5 - 2%
Цетиловый спирт 0,25 - 1%
Вода дост.кол. до 100%
Пример 7
Сравнительный анализ
Сравнительное исследование in vitro Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit
Цель анализа
Экспериментальная методика, описанная ниже, касается сравнительного изучения активности in vitro растительных экстрактов Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit, чтобы охарактеризовать их антиоксидантную активность как функцию стимулирующей активности в отношении роста волос.
Материалы
Исследуемые образцы
Внутреннее наименование
GB
GE
TB
TE
Идентификатор уникального наименования
Растительная биомассаGaleopsis segetum
Сухой водно-спиртовой экстрактGaleopsis segetum
Растительная биомассаGaleopsis tetrahit
Сухой водно-спиртовой экстрактGaleopsis tetrahit
Серия
Серия C/181286
Серия 921/30/D
Серия C/203285
Серия 994/39/A
Хранение
Комн. темп.
Комн. темп.
Комн. темп.
Комн. темп.
Все экстракты разбавляли до 50 мг/мл в ДМСО и подвергали стерилизующей фильтрации.
Исходные растворы хранили при -20°C.
Показатели растворимости образцов
• РАСТИТЕЛЬНАЯ БИОМАССА (Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit). Мелко измельченная с пестиком и мельницей. При разбавлении в 100% ДМСО не достигала полной растворимости. Обработана ультразвуком 15 минут при комнатной температуре, для большей дисперсии. Раствор 5 мг/мл в DMEM является диспергируемым. Раствор 1 мг/мл полностью растворим, и его фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
• СУХОЙ ВОДНО-СПИРТОВОЙ ОБРАЗЕЦ (Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit): при разведении в 100% ДМСО достигал полной растворимости. Обработан ультразвуком 15 мин при комнатной температуре. Раствор 5 мг/мл в DMEM является диспергируемым. Раствор 1 мг/мл полностью растворим, и его фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Используемые реагенты и оборудование
РЕАГЕНТЫ
ПОСТАВЩИК
Перекись водорода 30%
SIGMA, 216763
Агароза (для рутинного применения)
SIGMA, A9539-100G
Эмбриональная телячья сыворотка
ATCC, 30-2030
2',7'-дихлоро-флуоресцеина ацетат
SIGMA, 35845
Диметилсульфоксид
SIGMA, D2438-50ML
Среда Игла в модификации Дульбекко
ATCC, 30-2002-500ml
Фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко
SIGMA, D8537
Краситель для нуклеиновых кислот в геле GelRed 10000x в воде-0,5 мл
Гелевый загрузочный буфер, не содержащий выявляемой РНКазы
SIGMA, G2526
Набор реагентов PRIME SCRIPT RT (Perfect Real time) на 200 реакций
TAKARA, RR037A
MTT
SIGMA- Aldrich, M2128
Пенициллин-стрептомицин
SIGMA, P0781
PreMix Ex Taq™
TAKARA, RR039A
TaqMan Анализ экспрессии генов для SRD5A1Mm00614213ml
APPLIED BYOSISTEMS, 4331182
TaqMan Анализ экспрессии генов для SRD5A2Mm00446421ml
APPLIED BYOSISTEMS, 4331182
TaqMan Анализ экспресси генов для β-актина Mm00466519ml
APPLIED BYOSISTEMS, 4331182
Тестостерон
SIGMA, 86500
Раствор Трипсин-ЭДТА
SIGMA, T3924
α-Токоферол
SIGMA, T3251
TRI Reagent раствор
Thermo Fisher, AM9738
Хлороформ
SIGMA, 366919-1л
Изопропанол
SIGMA, I9516-500 мл
CelLytic™ M
SIGMA, C2978
Коктейль ингибиторов протеаз
SIGMA, T1500
ОБОРУДОВАНИЕ
ПОСТАВЩИК
Спектрофотометр (Модель: 6715, BS-6715B0)
Jenway UV/VIS
15 л цифровая водяная баня, от +5°C до +100°C (Модель: Swbd1, BS-SWB2D)
Stuart
Весы (Модель XS204)
Mettler Toledo
Ламинарно-потоковый бокс (Модель: Gemini)+ УФ лампа с противоотражающим оборудованием
SterilManifacturingDivision
HeraCell CO<sub>2</sub> инкубатор (Модель:150 ADV)
ThermoScientific
85°C горизонтальный морозильник ULT130, 120 литров(Модель: Labfrost, MME-TE21140)
Elcold
Гемоцитометр Бюркера с w/зажимами (DI-DA-443/3)
Carlo Erba
Ридер микропланшетов (EL 808)
Biotek
Вихревая мешалка
Arhos160-PBI International
FluoroskanAscent FLФлуоресцентный ридер микропланшетов
Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс
Используемые биологические модели
Культуры эмбриональных фибробластов
- Иммортализованная линия мышиных эмбриональных фибробластов BALB/c3T3, клон A31 (ATCC, Манассас, Вирджиния, США) была получена из Национального института исследований рака (Генова, Италия).
3
2
- Клетки культивировали в стерильных флаконах вместимостью 25 см и инкубировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO. DMEM использовали в качестве культуральной среды (Среда Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix). Все эти последние реагенты были получены от компании Lonza Inc. (Барселона, Испания).
- Во время культивирования разделение 1:3 проводили каждые 2 дня при слиянии 80% путем промывания 1x ФБР (Лонца, Барселона, Испания) и разделения клеток раствором трипсина-ЭДТА (Lonza, Барселона, Испания) при 37°С в течение 2 минут.
Контроль
МТТ-АНАЛИЗ (BALB3T3)
2
2
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ: Необработанные клетки в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix), выдержанные в культуральных планшетах (96 лунок) от 25 см при 37°C и 5% CO.
ТЕСТ DCFH-DA и АНАЛИЗ MTD-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА (BALB3T3)
2
2
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ: Необработанные клетки в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США) с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix), поддерживаемые в культуральных планшетах (96 лунок) с 25 см при 37°C и 5% CO (в темноте).
2
2
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ: Клетки, обработанные в течение 2 ч 1 мМ перекисью водорода в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США), с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix), и поддерживаемые в культуральных планшетах (96 лунок) с 25 см при 37°C и 5% CO (в темноте).
ИССЛЕДОВАНИЕ МОДУЛЯЦИИ 5-АЛЬФА-РЕДУКТАЗЫ (BALB3T3)
2
2
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ: необработанные клетки в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix) и тестостерона 10 нг/мл, поддерживаемые в культуральных планшетах (12 лунок) с 25 см при 37°C и 5% CO.
2
2
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ: Клетки, обработанные в течение 24 часов финастеридом (0,05 мг/мл) в среде DMEM (среде Игла в модификации Дульбекко, ATCC, Манассас, Вирджиния, США), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix) и тестостерона 10 нг/мл, и поддерживаемые в культуральных планшетах (12 лунок) с 25 см при 37°C и 5% CO.
Методы
Предварительный тест на цитотоксичность (МТТ анализ) - BALB3T3
Принципы метода
МТТ-анализ с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом представляет собой колориметрический анализ, используемый для оценки пролиферации клеток in vitro, поскольку он позволяет измерять пролиферацию и жизнеспособность клеток посредством оценки митохондриальной активности.
Этот метод очень полезен для измерения роста клеток после обработки митогенными агентами, антигенными стимулами, факторами роста, и для исследований цитотоксичности.
18
16
5
Испытание включает использование хромогенного окислителя, МТТ, состоящего из полициклической системы (CHBrNS), снабженной тетразолиевым кольцом, которое может быть легко восстановлено митохондриальными дегидрогеназами или другими электронными транспортными системами, образующими для раскрытия тетразолиевого кольца азотистое хромогенное соединение, известное как формазан.
Формазан образует нерастворимые кристаллы во внутриклеточной среде, для которой мембраны, по существу, непроницаемы; поэтому допускается вход молекулы в клетку, но не выход продукта, если он был правильно метаболизирован, то есть если электронное транспортные цепи все еще метаболически активны.
Кристаллы формазана впоследствии растворяются в диметилсульфоксиде (ДМСО), что определяет изменение цвета раствора с желтого на темный сине-фиолетовый.
Методика эксперимента
4
Анализ проводили по методу Mosmann (1983) с некоторыми незначительными изменениями. Клетки BALB3T3 высевали с плотностью 5×10 клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Через 24 часа, достигнув слияния около 80%, клетки обрабатывали 6 возрастающими концентрациями экстрактов Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit (растительная биомасса и сухой водно-спиртовой образец) 10-20-50-100-200 мг/мл в полной среде. Контрольные клетки вместо этого хранили в культуре в полной среде.
2
Планшеты инкубировали при 37°С, при 5% СО в течение 24, 48 и 72 часов. В конце всех обработок среду собирали и заменяли 100 мкл раствора МТТ (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) 0,5 мг/мл в полной культуральной среде.
После 3 часов инкубации при 37°С среду отбирали и кристаллы формазана растворяли в 100 мкл на лунку ДМСО (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Планшет, покрытый алюминием, помещали на механическую мешалку (Arhos 160 - PBI International, Милан, Италия) при 120 об./мин в течение 15 минут при комнатной температуре.
Поглощение окрашенного раствора измеряли с помощью спектрофотометрического ридера для микропланшетов (BioTek Instruments Inc., Бад-Фридрихсхалл, Германия) при длине волны 570 нм (эталонная длина волны 630 нм).
Данные выражали как процент жизнеспособности клеток по отношению к контрольным клеткам (контроль) согласно следующей формуле:
% жизнеспособности клеток/ контроль = (Погл. образца/ Погл. контроля) * 100
Все анализы были выполнены по меньшей мере дважды с использованием дубликатов образцов.
МТТ с индуцированным окислительным стрессом - BALB3T3
Принципы метода
Фибробласты мышей BALB3T3 являются одной из проверенных моделей для исследования окислительного стресса in vitro (Subiradeet al., 1995; Kutuk et al., 2004).
Исследования, проведенные в 2005 году Rajapakse et al. (2005), выявили возможность применения широко используемого и универсального метода, такого как метод МТТ, для исследования антиоксидантной активности активных соединений in vitro. В частности, с помощью этого метода можно изучить защитные эффекты этих соединений на клетках, которые впоследствии подвергаются окислительному стрессу. Индукцию окислительного стресса осуществляют путем инкубации с перекисью водорода, агентом, который вызывает образование окислительного повреждения в клетках посредством формирования АФК. Возможные защитные эффекты могут быть определены посредством оценки жизнеспособности клеток после окислительного стресса клеток, предварительно обработанных/ предварительно подвергнутых воздействию испытуемых активных соединений? по сравнению с клетками, подвергшимися такому же окислительному стрессу. Большая жизнеспособность клеток будет соответствовать защитному эффекту тестируемых соединений.
Методика эксперимента
Анализ проводили в соответствии с методом, описанным Coda и соавторами (Coda et al., 2012), с некоторыми модификациями.
4
2
Мышиные фибробласты BALB3T3 высевали в 96-луночный планшет с плотностью 5×10 клеток/лунку и инкубировали при 37°C, при 5% CO, до слияния примерно 80%.
Затем клетки инкубировали в течение 16 часов с Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit (растительная биомасса и сухой водно-спиртовой образец) в концентрации 50 мкг/мл.
Разведения готовили из 1000-кратных исходных растворов в ДМСО, подвергали стерилизующей фильтрации, и использовали среду DMEM с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep) Mix).
2
2
Клетки, обработанные 1 мМ HO, использовали в качестве положительного контроля; клетки, которые содержались только в культуральной среде (DMEM 2,5% ЭТС), вместо этого использовали в качестве отрицательного контроля.
2
2
2
В конце 16-часовой предварительной обработки клетки промывали ФБР 1X и инкубировали в течение 90 минут с 1 мМ раствором HO (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в среде без сыворотки, в темноте, при 37°С и 5% СО.
После завершения фазы индукции окислительного стресса оценивали жизнеспособность клеток из различных образцов в соответствии с методом, описанным в пункте 4.1.2 (анализ с МТТ).
Данные выражали как процент жизнеспособности клеток по сравнению с контрольными клетками без стресса (контроль) согласно следующей формуле:
% жизнеспособности клеток/ контроль = (Погл. образца/ Погл. контроля) * 100
Все анализы были выполнены по меньшей мере дважды с использованием дубликатов образцов.
Изучение влияния Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit на продукцию АФК с использованием анализа DCFH-DA-BALB3T3
Принципы метода
Продукцию АФК в клеточной линии мышиных фибробластов BALB3T3 оценивали с помощью спектрофотометра с использованием анализа с 2,7-дихлорфлуоресцеин-диацетатом (DCFH-DA), как описано Tobi et al. (Tobi et al., 2000).
DCFH-DA представляет собой нефлуоресцентное соединение в липофильной форме, способное проникать через клеточную мембрану. Оказавшись внутри клетки, он деацетилируется внутриклеточными эстеразами до восстановленного 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCFH), который также не флуоресцентен. DCFH, неспособный снова пересекать клеточную мембрану, в конечном итоге накапливается в клетках (Curtin et al., 2002). Внутриклеточная реакция АФК приводит к окислению DCFH до 2,7-дихлорфлуоресцеина (DCF), высоко флуоресцентного соединения. Эту интенсивность флуоресценции можно определить с помощью флуориметра, позволяющего оценить количество АФК, продуцируемых в клетках.
На фигуре 5 показано схематическое представление принципа анализа с дихлорфлуоресцеином: нефлуоресцентный предшественник DCF поступает в клетку, деацетилируется и впоследствии окисляется, в случае повышенного присутствия АФК в клетке, с образованием флуорофора DCF. Он может быть возбужден при 538 нм спектрофлуориметром и испускает флуоресценцию при 485 нм.
Методика эксперимента
Протокол, используемый для этого эксперимента, представляет собой модифицированную версию протокола, описанного в работе Tobi et al (Tobi et al., 2000).
4
Фибробласты мышей BALB3T3 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5×10 клеток/лунку и инкубировали до достижения слияния около 80%.
Затем клетки инкубировали в течение 16 часов с Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit (растительная биомасса и сухой водно-спиртовой образец) в концентрации 20 мкг/мл.
Разведения готовили из 1000-кратного исходного раствора в ДМСО, подвергали стерилизующей фильтрации и использовали среду DMEM с добавлением 2,5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep) Mix).
2
2
Клетки, обработанные 1 мМ HO, использовали в качестве положительного контроля; клетки, которые содержались только в культуральной среде (DMEM 2,5% ЭТС), использовали вместо этого в качестве отрицательного контроля.
Альфа-токоферол испытывали в концентрации 25-50-250-500 мкМ.
2
2
2
В конце инкубации окислительный стресс индуцировали путем обработки в течение 90 минут 1 мМ раствором HO в темноте при 37°C и 5% CO.
После завершения обработки клетки дважды промывали 1X ФБР и лизировали с помощью литического буфера CelLytic™ (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с протоколом поставщика.
Затем лизаты переносили в 96-луночный черный планшет, и флуоресценцию DCF считывали спектрофлуориметрически с использованием флуоресцентного ридера микропланшетов FluoroskanAscent FL (Thermo Fisher ScientificInc., Уолтем, Массачусетс, США) с длинами волн возбуждения и эмиссии 485 и 538 нм, соответственно.
2
2
Значения эмиссии (относительные единицы флуоресценции), полученные для каждого образца, связанные с продукцией внутриклеточных АФК, сравнивали со значением эмиссии, полученным для отрицательного контроля (контроль, клетки, обработанные 1 мМ HO) и выражали в процентах от АФК, полученных в соответствии со следующим уравнением:
% АФК продукции/ контроль = (Поглощение образца при 538 нм/ Поглощение контроля при 538 нм) * 100
Все анализы были выполнены по меньшей мере дважды с использованием дублированных образцов.
Изучение влияния Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit на активность 5-альфа-редуктазы (изоформы 2) - BALB3T3
Методика эксперимента
Экспрессию гена изоформы 2 5-альфа-редуктазы (SRD5A2) в клетках BALB3T3 оценивали с помощью относительной количественной ПЦР-РВ (количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой в режиме реального времени – кПЦР-РВ).
Этот анализ предусматривал 3 последовательных этапа:
• Экстракция всей РНК;
• Обратная транскрипция в кДНК;
• кПЦР-РВ.
6
Мышиные фибробласты BALB3T3 высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 0,5×10 клеток/ лунку и инкубировали до достижения слияния около 80%.
Затем клетки инкубировали в течение 24 часов с Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit (растительная биомасса и сухой водно-спиртовой образец) в следующих концентрациях: 20-50 и 100 мкг/мл.
Разведения готовили из 1000-кратных исходных растворов в ДМСО, подвергали стерилизующей фильтрации, и использовали среду DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 1% неэссенциальных аминокислот (НЭАК), 1% смеси пенициллина и стрептомицина (Pen-Strep Mix).
Клетки, содержащиеся только в культуральной среде (DMEM 2,5% ЭТС), использовали в качестве отрицательного контроля.
Финастерид, селективный ингибитор 5-альфа-редуктазы изоформы 2 (SRD5A2), был протестирован в концентрации 0,05 мг/мл.
В конце инкубации экстрагировали РНК.
Общую РНК экстрагировали из клеток BALB3T3 с использованием TriReagent (Sigma Aldrich) в соответствии с процедурой, описанной Chomczynski and Mackey (1995).
В конце инкубации с интересующими активными соединениями клетки промывали ФБР (1X) и, наконец, подвергали процедуре экстракции РНК. В конце экстракции с использованием спектрофотометра (Jenway UV/VIS MOD:6715, BS-6715B0) рассчитывали концентрации в мкг/мл общей экстрагированной РНК при длине волны 260 нм.
Наконец, оценивали целостность РНК (2 мкг/мл) путем электрофореза на 1% агарозном геле.
Общую РНК превращали в кДНК (комплементарную ДНК) с использованием фермента, способного синтезировать молекулу ДНК, с использованием цепи РНК в качестве матрицы; этот ДНК-полимеразозависимый РНК-фермент называется обратной транскриптазой.
Он связывается с 3'-концом одной цепи РНК и через случайные праймеры и дезоксинуклеотидтрифосфаты (DNTP) синтезирует цепь кДНК.
2
Для этой цели был использован коммерческий набор «PrimeScriptTM RT Reagent Kit (perfect Real Time)» (TakaraBioInc., Япония), содержащий 5X PrimeScript буфер (для реального времени); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer; случайные экзамеры; не содержащую РНКазы dHO.
Экстрагированную и количественно определенную РНК разводили до концентрации 2 мкг/мл и транскрибировали в кДНК. Готовили 10 мкл мастер-смеси (содержащей 5X буферов PrimeScript (для реального времени), PrimeScript RT Enzyme Mix1, OligodTPrimer 50 мкМ, случайные экзамеры 100 мкМ), к которой добавляли 10 мкл РНК (2 мкг/мл).
Образцы помещали в термоциклер (система ПЦР в реальном времени Stratagene Mx3000P, Agilent Technologies Italy S.p.A., Милан, Италия) и подвергали обратной транскрипции в следующих условиях:
37°С в течение 15 минут;
85°С в течение 5 секунд;
4°C выдержка.
В конце обратной транскрипции к образцам добавляли 30 мкл воды DEPC до получения конечной концентрации кДНК 40 нг/мкл.
кПЦР-РВ представляет собой метод амплификации и количественного определения в реальном времени амплификаторов, полученных путем мониторинга флуоресценции, испускаемой во время реакции.
Для амплификации кПЦР-РВ использовали систему зондов TaqMan (AppliedBiosystems). Были использованы следующие зонды TaqMan: Mm00446421ml (SDR5A2) и Mm00466519ml (β-актин). β-актин использовали в качестве контрольного гена (конститутивного).
Зонд Taqman представляет собой тип зонда, который позволяет развивать флуоресценцию во время амплификации. На 5'-конце репортер (флуорофор FAM™), а на 3'-конце гаситель являются связанными. Близость между репортером и гасителем отменяет излучение флуоресцентного сигнала. Только с 5'-экзонуклеазной активностью термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимеразы) обнаруживается флуоресценция, и накопление продуктов амплификации можно оценить, увеличив флуоресценцию репортера, которая возрастает с каждым циклом.
Для кПЦР-РВ мастер-смесь была настроена следующим образом:
- 10 мкл «2X Premix Ex Taq»;
- 1 мкл «20X TaqMan Gene ExpressionAssays» (содержит 2 праймера и флуоресцентный зонд, меченый флуорофором FAM™);
- 0,4 мкл пассивного эталона Rox II;
- 5 мкл DEPC воды.
В мастер-смесь добавляли 4 мкл кДНК для гена-мишени и 1 мкл кДНК для конститутивного гена.
Амплификацию проводили в течение 40 циклов в следующих условиях:
95°C, 30 секунд (активация AmpliTaq);
95°C, 5 секунд (денатурация)
60°С, 20 секунд (отжиг - удлинение);
Каждый анализ проводили в двух экземплярах.
-ΔΔCt
Полученные данные были проанализированы в соответствии с методом 2, и таким образом стало возможным рассчитать значения относительной экспрессии представляющего интерес гена, нормированные по отношению к конститутивному гену и откалиброванные на контрольном образце (необработанных клетках):
мишени – конститутивного гена
мишени – конститутивного гена
ΔΔCt = ΔC  (контроль) – ΔC  (обработанные клетки)
-ΔΔCt
Исходя из 100% эффективности амплификации, рассчитывали 2.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Предварительный анализ цитотоксичности (анализ МТТ) - BALB3T3
Таблица 1
Вещества
% жизнеспособности – среднее значение за 24 часа
Стандартная ошибка
Контроль
100
1,58
Galeopsis tetrahit 10 мкг/мл
144,70
0,05
Galeopsis tetrahit 20 мкг/мл
131,02
15,04
Galeopsis tetrahit 50 мкг/мл
128,33
3,12
Galeopsis tetrahit 100 мкг/мл
115,94
5,19
Galeopsis tetrahit 200 мкг/мл
125,07
8,12
Фигура 1 демонстрирует данные, полученные из анализа MTT (среднее значение ± стандартная ошибка).
Результаты показывают, как Galeopsis tetrahit оказывает значительное стимулирующее воздействие на пролиферативную активность клеток при всех изученных концентрациях, приведенных в таблице 1 выше. Это необходимый эффект в рамках действия на физиологию волос.
Внутриклеточная продукция АФК (анализ DCFH-DA) - BALB3T3
Таблица 2
Вещества
% АФК
Стандартная ошибка
Контроль + H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
100
25,26
α-токоферол 25 мкМ
39,67
4,38
Galeopsis segetum 20 мкг/мл
42,37
0,84
Galeopsis tetrahit 20 мкг/мл
28,26
3,95
Фигура 2, приложенная к настоящей заявке, демонстрирует антиоксидантную активность Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit. В приведенной выше таблице 2 показаны данные об акцепторной активности.
Результаты показывают, что экстракты проявляют сильную антиоксидантную активность, также по сравнению с 25 мкМ α-токоферолом.
В то время как Galeopsis segetum обладает сравнимой активностью с альфа-токоферолом, используемым в качестве эталонного стандарта для антиоксидантной активности, Galeopsis tetrahit обладает значительно лучшей активностью, чем альфа-токоферол.
Galeopsis tetrahit также продемонстрировал при той же концентрации почти удвоенную активность по сравнению с Galeopsis segetum.
Изучение влияния экстрактов Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit на индуцированный окислительный стресс-BALB3T3
Таблица 3
Вещества
% жизнеспособности клеток
Стандартная ошибка
Контроль
100
3,66
Контроль + H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
58,43
4,08
α-токоферол 50 мкМ
78,37
1,02
Galeopsis segetum 50 мкг/мл
75,95
7,02
Galeopsis tetrahit 50 мкг/мл
91,57
4,08
2
2
Фигура 3, приведенная в настоящей заявке, демонстрирует данные по защитной активности клеток от окислительного стресса, вызванного HO.
Индуцированный окислительный стресс создает состояние повреждения клеток, которое приводит к значительной потере клеточной популяции. Лечение с помощью Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit демонстрирует защитную способность против апоптотического процесса, вызванного окислительным стрессом.
Также в этом эксперименте альфа-токоферол использовали в качестве эталонного стандарта для защиты от окислительного стресса.
Galeopsis segetum продемонстрировал активность, сравнимую с альфа-токоферолом, тогда как Galeopsis tetrahit продемонстрировал значительно лучшую активность, чем альфа-токоферол и Galeopsis segetum.
Исследование влияния Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit на активность 5-альфа-редуктазы (изоформы 2) - BALB3T3
Вещества
мРНК SERD5A2
Стандартная ошибка
Контроль
1
0,1
Финастерид 0,05 мг/мл
0,31
0,041
Galeopsis segetum 50 мкг/мл
0,52
0,038
Galeopsis tetrahit 50 мкг/мл
0,58
0,108
Фигура 4 иллюстрирует данные по экспрессии гена изоформы 2 5-альфа-редуктазы, мишени для препарата финастерида, который был использован для сравнения. В этом случае также использовали водно-спиртовой экстракт обоих растений.
Пример 8
Метаболомический анализ Galeopsis segetum Necker и Galeopsis tetrahit.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
В настоящем исследовании описывается фитохимическое исследование растительных материалов и экстрактов Galeopsis segetum Necker и Galeopsis tetrahit L. с использованием методики ЯМР-фингерпринтинга.
Также описано сравнение метаболомики двух видов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
Исследуемые образцы Galeopsis sp.
ID номер
Ботанический ID
211973
G. segetum (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
211974
G. segetum (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
211975
G. segetum (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
211976
G. segetum (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
202517
G. tetrahit (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
202518
G. tetrahit (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
202519
G. tetrahit (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
203285
G. tetrahit (Эталонный растительный материал)
Растительное сырье
994/39/A
-
Экстракт
1029/41/А
-
Экстракт
1029/42/А
-
Экстракт
Процедура экстракции растительного сырья:
Размолотое сырье экстрагировали в 40% этаноле в течение 6 часов при 50°С в горячей бане при механическом перемешивании.
Затем каждый экстракт фильтровали, и растворитель выпаривали путем лиофилизации.
Подготовка образца к анализу:
Готовили навеску приблизительно 10 мг каждого образца и растворяли в 1 мл 40/60 MeOD 99,8% / забуференного D2O (по объему, фосфатный буфер, 100 мкМ).
Спектры регистрировали на приборе NMR Varian 400 МГц, и затем подвергали метаболомическому анализу с использованием программного обеспечения Matlab (Mathworks).
Параметры эксперимента приведены ниже:
Параметры ЯМР:
Параметр
Значение
Время экспозиции (сек)
3,9999
Частота (МГц)
399,7839
Ядро
1Н
Число переходов
32
Исходное число точек
24752
Число точек
32768
Импульсный режим
wet1D
Усиление приемника
42,00
Ширина спектра (циклическая) (ГЦ)
6188,12
Растворитель
Забуференный раствор D<sub>2</sub>O/метанол 9,8%
Температура (градусы)
30ºС
Предварительная обработка данных Matlab:
Нормализация до 100
Центрирование путем вычитания среднего значения
Коррекция базовой линии до 0
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1
Спектры Н-ЯМР были зарегистрированы и обработаны с помощью VNMRJ 4.0 rev. Spectrus Platform от ACD/labs, использованной для преобразования Фурье и оценки набора данных.
Необработанные данные, полученные в результате анализа ЯМР, были преобразованы в матрицу, представленную точками данных «n x m», где «n» - номер каждого спектра, а «m» - значение каждой переменной. Обычно число переменных состоит из более чем 15000 точек данных.
Матрица данных была обработана с использованием анализа главных компонент (PCA), запрограммированного на программном обеспечении MATLAB от The MathWorks (Натик, США). Исходные спектры были предварительно выровнены с использованием алгоритма COW (Correlation Optimized Warping) [Tomasi et al., J. Chemom. Vol. 8 (2004) 231-241]. Алгоритмы COW доступны в Интернете по адресу http://www.models.life.ku.dk/algorithms. Сигналы подвергали центрированию данных, нормализации по проценту от общих откликов сигнала в каждом спектре и корректированной базовой линии. В качестве альтернативы их также подвергали автоматическому масштабированию до единицы дисперсии, чтобы сделать каждый сигнал из набора данных напрямую сопоставимым среди всех спектров и придать одинаковую важность каждому пику спектра: результирующий анализ был сопоставим с не- автомасштабированными результатами [Van den Berg et al. BMC Genomics vol. 7 (2006), 142].
1
Типичный H-ЯМР спектр экстракта надземной части Galeopsis sp. показан на фигуре 6.
1
Выровненные и нормированные спектры H-ЯМР относительно исследуемых образцов были лишены пиков, относящихся к растворителям и сахарам, которые бесполезны для сравнения сырья и экстрактов.
Полученные спектры приведены фигуре 7.
1
Спектры H-ЯМР были представлены матрицей данных с 11 образцами x 16501 точками интенсивности химических сдвигов (переменных) и поданы для многомерной оценки с использованием анализа главных компонентов.
1
Неконтролируемая проекция PC1 в сравнении с PC2 спектров H-ЯМР, относящихся к растительным материалам Galeopsis segetum и tetrahit (зеленые квадраты: эталонное сырье Galeopsis segetum, голубые ромбы: эталонное сырье Galeopsis tetrahit) и экстрактам Galeopsis tetrahit (светлые кружки), приведена на фигуре 8.
Сумма РС1 и РС2 составляет около 63% от общей дисперсии (фигура 9).
Как показано на фигуре 8, два кластера Galeopsis segetum и tetrahit оказались разделены вдоль PC1, что представляет большую часть дисперсии набора данных (41%). Экстракты 1029/41/A, 1029/42/A и 994/39/A располагаются в пространстве, где находится эталонное сырье G. tetrahit, что указывает на сходство фитохимического состава с видом Galeopsis tetrahit.
Для дальнейшего изучения полученных результатов был оценен график нагрузок РС1. Нагрузка 1 для РС1 помогает назначать переменные (пики), которые в основном отвечают за разделение в пространстве РС1 против РС2. Нагрузка 1 показана на фигуре 10.
Нагрузка 1 подтверждает разделение вдоль PC1: правая половина области PCA (положительная часть) соответствует верхней части нагрузки 1, тогда как левая зона PCA (отрицательная часть) соответствует нижней части нагрузки.
Таким образом, сравнение профиля ЯМР с нагрузкой 1 позволяет определить сигналы ЯМР, ответственные за разделение кластеров PCA, как показано на фигуре 11.
Пики 1 и 2 можно условно отнести к ацетатному фрагменту группы флавоноидов, типичному для вида G.segetum [Tomàs-Barberàn et al. BMC Genomics vol. 7 (2006), 142]. Пики 3, 4, 5 и 6 перекрываются, что затрудняет их идентификацию. Вероятно, эти сигналы относятся к кофеиновой или кофеилхинной кислотам.
Кроме того, набор данных ЯМР был подвергнут контролируемому статистическому анализу (PLS, метод частных наименьших квадратов), который позволяет классифицировать неизвестные образцы с использованием эталонного стандартного сырья: эта функция позволяет назначать неизвестные образцы (в данном случае сами экстракты) в один класс из двух эталонных кластеров.
Полученные данные этой оценки показаны на фигуре 12 (график PLS) и в следующей таблице 1 (прогнозируемые значения).
Таблица 1
ID образца
Прогнозируемое значение
211973
1,0
211974
1,0
211975
1,2
211976
0,9
211976-2
1,1
202517
2,1
202518
1,9
202519
2,1
203285
1,9
994/39/А
1,8
1029/41/А
1,6
1029/42/А
1,7
В таблице 1 перечислены прогнозируемые значения для каждого образца из набора данных: поскольку кластерам G. segetum и tetrahit, использованным в качестве обучающего набора, были присвоены значения соответственно 1 и 2, значения, близкие к 1, позволяют назначить образец в класс segetum. в то время как значения, близкие к 2, позволяют назначить образец в кластер tetrahit.
Полученные результаты показывают, что все три экстракта относятся к виду tetrahit.
В заключение, как контролируемые, так и неконтролируемые статистические методы, используемые в этом отчете, подтверждают следующее:
- ЯМР анализ пригоден для выявления различий в фитохимическом составе между видами Galeopsis segetum и Galeopsis tetrahit, обусловленных различием структуры вторичных метаболитов.
- Экстракты, полученные из растительного материала Galeopsis tetrahit, показывают эквивалентный характер вторичных метаболитов в качестве видов исходного растительного материала, а именно Galeopsis tetrahit.
Ссылки
- Subirade I, Fernandez Y, Periquet A, Mitjavila S, 1995. Catechin protection of 3T3 Swiss fibroblasts in culture under oxidative stress. Biol Trace Elem Res 47(1-3), 313-319.
- Kutuk O, Adli M, Poli G, Basaga H, 2004. Resveratrol protects against 4-HNE induced oxidative stress and apoptosis in Swiss 3T3 fibroblasts. Biofactors 20(1), 1-10.
- Mosmann T, 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J Immunol Methods 65(1-2), 55-63.
- Rajapakse N, Mendis E, Byun HG, Kim SK, 2005. Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems. J NutrBiochem 16(9), 562-569.
- Coda R, Rizzello CG, Pinto D, Gobbetti M, 2012. Selected Lactic Acid Bacteria Synthesize Antioxidant Peptides during Sourdough Fermentation of Cereal Flours. Appl Environ Microbiol 78(4), 1087-1096.
- Tobi SE, Paul N, McMillan TJ, 2000. Glutathione modulates the level of free radicals produced in UVA-irradiated cells. J PhotochPhotobio B 57(2-3), 102-112
- Chomczynski P, Mackey K. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNAfrom polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques 1995;19:942–5.