Использование метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения подлинности и оценки качества субстанций азитромицина

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Т

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ И ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА СУБСТАНЦИЙ АЗИТРОМИЦИНА

Н.Е. Кузьмина, С.В. Моисеев, В.А. Яшкир, В.А. Меркулов

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: В статье показана возможность применения метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса для количественного определения относительного содержания остаточных растворителей в различных субстанциях азитромицина и усовершенствована методика подтверждения подлинности азитромицина на основе этого метода.

Ключевые слова: азитромицин, определение строения, структурная интерпретация спектров ЯМР 1Н и 13С, остаточные растворители.

USE OF NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPYMETHOD FOR THE IDENTIFICATION AND QUALITY

EVALUATION OF AZITHROMYCIN SUBSTANCE N.E. Kuzmina, S.V Moiseev, V.A. Yashkir

Abstract: The article describes a possibility of application of nuclear magnetic resonance spectroscopy method for assay of the residual solvents proportion in various azithromycin substances as well as the improvement of the method for azithromycin identification on the basis of this methodology.

Key words: azithromycin, structure identification, structural interpretation of 1H and 13С NMR spectra, residual solvents.

Планомерное повышение требований к качеству лекарственных средств предусматривает совершенствование методик анализа и стандартизации лекарственных форм за счет внедрения современных инструментальных методов анализа, в том числе метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Метод ЯМР является надежным средством установления строения вещества. Идентификация соединения в рамках этого метода основана на регистрации индуцированных радиочастотным полем переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, помещенного в постоянное магнитное поле. Существуют определенные корреляции между спектральными характеристиками ядра (химическим сдвигом, мультиплетно-стью, константой спин-спинового взаимодействия) и

1 Ч 1 " I I м м I I м I I м м I Ч М I М М I М М I М М I М М I I М I I I I М I I М I I I М I I П I I | I II I | II I I | I II I | Ч I I

180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

его химическим окружением [1]. В фармакологии метод ЯМР-спектроскопии активно используется для решения целого комплекса задач: определения подлинности вещества; наличия посторонних примесей; количественнoго определения относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси, остаточных растворителей) в анализируемом лекарственном средстве [2].

При проведении фармацевтической экспертизы субстанции азитромимцина в рамках ВФС 42-2963-97 ЯМР-спектроскопия используется исключительно для подтверждения подлинности, то есть для опреде-

Рис. 1. Спектр 13С азитромицина

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

Рис. 2. ПМР спектр азитромицина

т

ления строения основного компонента субстанции. При этом применяется метод ЯМР 13С, поскольку углеродный спектр, снятый в режиме полного подавления спин-спинового взаимодействия протонов с ядрами углерода, представляет собой набор синглет-ных сигналов, который более легко поддается структурной интерпретации, чем спектр ПМР (протонного магнитного резонанса). Сложность протонного спектра обусловлена частичным перекрыванием мульти-плетных сигналов магнитно не эквивалентных протонов. Спектры 13С и ПМР азитромицина приведены на рис. 1 и 2 соответственно.

Представленная в ВФС 42-2963-97 структурная интерпретация углеродного спектра азитромицина не совпадает с опубликованной ранее в литературе [3]. В связи с этим необходимо установление истинного соответствия между спектральными параметрами и конкретными структурными фрагментами азитромицина, поскольку правильность такого соотнесения определяет надежность подтверждения подлинности азитромицина в рамках метода ЯМР-спектроскопии. Целью данной работы является структурная интерпретация углеродного и протонного спектров субстанции азитромицина и определение возможностей использования ЯМР-спектроскопии для проведения оценки качества различных субстанций азитромицина.

материалы и методы

В качестве объектов исследования мы использовали 8 субстанций азитромицина различных производителей: серия 10311 производства ОАО «Синтез» (стандартный образец), серии №№ 10108, 20108, 30108, 70310 производства ЗАО «Активный компонент», серия 080103 производства «Ченгде Миракл Фарм. Ко., Лтд.», Китай, серия AZI/01/0190210 производства «Мехта АПИ Пвт. Лтд.», Индия, серия AZD/08010029 производства «Джубилант Органолис Лимитид» Индия.

Съемку спектров проводили на ЯМР-спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 40 °С по стандартным методикам 1D и 2D

экспериментов [4]. Использовали растворы субстанций азитромицина в дейтерированном хлороформе с концентрацией 120 мг/мл (рекомендуется ВФС 422963-97 при съемке спектра 13С). Калибровку шкалы химических сдвигов осуществляли по отношению к сигналу хлороформа. Структурная интерпретация спектров 13С и 1Н проведена на основе данных проведенных нами экспериментов DEPT (Distortion Enhanced by Polarisation Transfer), COSY (Correlation Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Singl Quantum Correlation) и с учетом значений химических сдвигов сигналов и их мультиплетности. В спектре DEPT сигналы метильных, метиленовых, метиновых групп и четвертичных атомов С разнесены друг относительно друга (рис. 3). Спектр COSY позволил выявить системы спин-взаимодействующих ядер Н и идентифицировать сигналы перекрывающихся протонных мультиплетов (рис. 4). На основе данных HSQC проведено точное взаимное соотнесение сигналов 1Н и 13С конкретных углеводородных фрагментов (рис. 5).

Рис. 4. COSY спектр азитромицина

180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm

Рис. 3. DEPT спектр азитромицина

Ч ' ' ' Ч ' ' ' Ч 1 ' ' Ч ' ' ' Ч ' ' ' Ч ' ' ' 1 I ' ' 1 ' I 1 1 1 ..1

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

F2

Рис. 5. Спектр HSQC азитромицина

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами значения химических сдвигов спектров 13С различных субстанций азитромицина совпадают (расхождение не превышает 0,01 м.д.) и практически идентичны данным ВФС 42-2963-97 (расхождение в рамках погрешности метода 0,1 м.д.). Наблюдается несущественное различие с данными [3], обусловленное различным температурным режимом проведения эксперимента. Таким образом,

структурная интерпретация углеродного спектра ази-тромицина во всех случаях проводилась на основе одного и того же набора спектральных линий.

Сравнение проведенной нами и представленной в литературе ([3] и ВФС 42-2963-97 структурной интерпретации спектра 13С приведено в табл. 1. Нумерация атомов в молекуле азитромицина (рис. 6) дана в соответствии с таблицей значений химических сдвигов 13С ВФС 42-2963-97.

СООТНЕСЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ДАННЫХ 13С СТРУКТУРЕ АЗИТРОМИЦИНА

Таблица 1

№ атома С 5, м.д. № атома С 5, м.д.

Наши данные* [3]** ВФС 42-2963-97 Наши данные* [3]** ВФС 42-2963-97

1 178,89 178,5 178,90 2’’ 34,61 34,8 34,68

2 45,37 45,1 45,35 3’’ 72,95 72,9 72,95

3 78,06 78,1 78,14 4’’ 77,63 78,1 77,68

4 42,43 41,7 42,41 5’’ 65,83 65,5 65,84

5 83,32 83,6 83,27 2^є 16,27 15,0 -

6 73,66 74,3 73,72 4^є 8,91 9,2 7,04

7 42,18 42,4 42,29 6-Ме 27,50 27,6 27,51

8 26,67 26,7 26,70 8-^є 21,93 22,0 16,18

9 69,98 70,1 70,10 Щ10)-Ме 36,08 36,4 36,04

11 62,60 62,2 62,51 11-^є 7,11 7,5 11,07

12 73,39 74,2 73,55 13-Ме 14,47 14,3 14,38

13 74,14 73,6 74,18 14-СН2 21,26 21,2 21,26

14 77,43 77,4 77,46 14^ 11,15 11,3 8,84

1’ 102,75 102,9 102,94 ЩМе)2 40,35 40,4 40,27

2’ 70,77 70,9 70,92 5’-Ме 21,25 21,4 21,87

3’ 65,62 65,7 65,57 3’’-ОМе 49,42 49,4 49,36

4’ 29,17 28,8 28,84 3’’-Ме 21,53 21,6 21,50

5’ 68,57 68,6 68,69 е -Ме 5’ 18,11 18,3 18,10

1’’ 94,45 94,8 94,48

* Приведены усредненные значения химических сдвигов по 8-и субстанциям азитромицина ** Данные получены на спектрометре GEM-300 (СDСl3, 20°С).

Данные табл. 1 свидетельствуют, что осуществленная нами структурная интерпретация спектральных данных 13С соответствует литературной [3] и не совпадает с представленной в ВФС 42-2963-97. Структурные фрагменты, для которых наблюдается расхождение в соотнесении спектральных данных, выделены курсивом. Таким образом, проведенное нами исследование свидетельствует о необходимости внесения следующих поправок в ВФС 42-2963-97 в части подтверждения подлинности субстанции ази-тромицина методом ЯМР-спектроскопии:

• введение отсутствующего значения химического сдвига метильного заместителя во 2-м положении макроцикла;

• исправление значения химических сдвигов ме-тильных заместителей в положениях 4, 8, 11, 14 макроцикла.

Следует отметить, что углеродные спектры изученных субстанций азитромицина содержат, главным образом, сигналы основного компонента (рис. 1). В рамках наших исследований установлено, что даже при значительном накоплении сигнала (число сканирований более 15000) интенсивность (I) сигналов примесных соединений, концентрация которых не превышает 3 мольных процента по отношению к основному веществу, сопоставима с шириной базовой линии, то есть не соблюдается условие I > 25 (где 5 - интенсивность фона), при котором сигнал

т

может считаться надежно идентифицированным. Поэтому 13С-ЯМР спектроскопия малоэффективна при оценке качества субстанции азитромицина. Очевидно, что определение наличия микропримесей в субстанции азитромицина и их количественную оценку необходимо проводить в рамках метода ПМР, который в 100 раз чувствительнее метода 13С.

Идентификации примесей в субстанции азитромицина на основе протонного спектра предшествует соотнесение спектральных сигналов структурным фрагментам основного компонента. Полученные нами данные спектра ПМР азитромицина и его структурная интерпретация представлены в табл. 2. Следует отметить, что протонные спектры 8-и различных субстанций азитромицина идентичны в области сигналов углеводородных фрагментов (расхождение не

Рис. 6. Молекула азитромицина

Таблица 2

СООТНЕСЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ДАННЫХ *Н СТРУКТУРЕ АЗИТРОМИЦИНА

№ углеводород. фрагмента 5, м.д. № углеводород. фрагмента 5, м.д.

Наши данные* [3]** Наши данные* [3]**

2 2,68 д-к 1=3,5; 7,6* 2,73 4’’ 3,03 д-д 1=9,4; 10,0 3,04

3 4,22 д-д 1=1,8; 3,5 4,27 5’’ 4,04 д-к 1=6,5; 9,4 4,09

4 1,92 м 2,00 2-Ме 1,16 д 1=7,6 1,20

5 3,62 уш. с 3,64 4-Ме 0,99 д 1=7,6 1,06

7eq 7 ах 1,71 д-д 1=1,0; 14,7 1,24 д-д 1=11,0; 14,7 1,81 1,25 6-Ме 16,27 15,0

8 2,00 м 2,03 8-Ме 0,86 д 1=6,5 0,91

9 eq 9 ах 2,50 д 1=11,2 2,03 м 55 1П О, сі сі Мек(10>- 2,27 с 0,32

11 2,65 д-к 1=1,0; 7,0 2,69 Ме11- 1,03 д 1=7,0 1,09

12 3,59 д-д 1=1,0; 7,6 3,69 Ме13- 1,05 с 1,10

14 4,66 д-д 1=2,4; 9,9 4,70 СН2 ах14-СН2 eq14- 1,41 д-д-к 1=2,9; 7,6; 9,9 1,88 д-д-к 1=2,4; 2,9; 7,6 1,46 1,89

1’ 4,40 д 1=7,6 4,44 Ме14- 0,84 т 1=7,6 0,88

2’ 3,22 д-д 1=7,6; 10,0 3,24 ЩМе)2 2,30 с 2,29

3’ 2,48 д-д-д 1=3,5; 10,0; 11,0 2,44 Ме5’- 1,18 д 1=6,0 1,24

4’ ах 4’ eq 1,22 д-д-д 1=7,6; 11,0; 11,0 1,69 д-д-д 1=1,8; 3,5; 7,6 1,23 1,68 ОМе3’’- 3,30 с 3,35

5’ 3,50 д-д-к 1=1,8; 6,0; 11,0 3,51 Ме3’’- 1,20 с 1,25

1’’ 5,13д 1=4,7 5,19 Ме5’’- 1,28 д 1=6,5 1,34

2’’ ах 2’’ eq 1,54 д-д 1=4,7; 10,6 2,16 д 1=10,6 1,62 2,37

! Значения I приведены в Гц.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Таблица 3

ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ АЦЕТОНА В РАЗЛИЧНЫХ СУБСТАНЦИЯХ АЗИТРОМИЦИНА

№ серии 10311 10108 20108 30108

Ацетон, вес. % 0,22 0,10 0,10 0,10

№ серии 08013 AZD/0801029 70310 AZI/01/0190210

Ацетон, вес. % 0,20 0,06 0,07 0,13

более 0,01 м.д.), хотя и различаются степенью разрешенности мультиплетов. При этом наблюдается отличие в положении сигналов гидроксильных групп, связанное с разницей в pH субстанций.

Полученная нами структурная интерпретация ПМР спектра совпадает с представленной в литературе [3] (табл. 2), что свидетельствует о ее достоверности. Таким образом, данные протонного спектра можно использовать в качестве дополнительного средства для подтверждения подлинности субстанции азитромицина.

Следует отметить, что характерной особенностью спектра ПМР азитромицина является значительное уширение спектральных линий. По-видимому, это вызвано динамическими конформационными процессами. Как было показано в [5], конформация молекулы азитромицина в кристалле существенно отличается от ее конформации в растворе, при этом в конформационной перестройке участвуют как атомы макроцикла, так и атомы пиранозных фрагментов. Уширение сигналов основного компонента субстанции азитромицина существенно осложняет задачу идентификации сигналов микропримесных родственных соединений (азитромицинов В, С, F и т.д.), поскольку эти сигналы перекрываются сигналами основного вещества. Поэтому мы рекомендуем идентификацию микропримесей родственных структур и их количественную оценку проводить другими инструментальными методами, например, методом ВЭЖХ-МС.

Методом ПМР мы смогли идентифицировать и количественно оценить остаточный растворитель (ацетон). В табл. 3 представлено относительное содержание ацетона в различных субстанциях

азитромицина. Согласно данным табл. 3, наибольшее количество ацетона содержится в стандартном образце субстанции азитромицина (серия 10311 производства ОАО «Синтез»), наименьшее в серии AZD/08010029 производства «Джубилант Органолис Лимитид» Индия. В целом, все рассмотренные субстанции азитромицина удовлетворяют требованиям ВФС 422963-97 по данному критерию.

Следует отметить, что метод ВЭЖХ-МС малоэффективен при анализе содержания ацетона в субстанции азитромицина вследствие своей низкой молекулярной массы. Поэтому при оценке качества различных образцов субстанций азитромицина необходимо комбинированное использование методов ЯМР спектроскопии и жидкостной хроматомасс-спектрометрии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное комплексное ЯМР-исследование позволило повысить достоверность идентификации основного компонента субстанции азитромицина методом ЯМР-спектроскопии и показало возможность использования ПМР для количественного определения относительного содержания остаточных растворителей в субстанциях азитроми-цина.

Спектральные характеристики протонного и углеродного спектров азитромицина и их структурная интерпретация представляют собой важный информационный материал, который необходимо включить в создаваемую электронную базу данных аналитического контроля в рамках информационной системы для организации экспертизы лекарственных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гюнтер Х . Введение в курс спектроскопии ЯМР. М . : Мир, 1984, 478 с .

2 . Государственная фармакопея Российской федерации . XII изд . , перераб . и доп . М . : Научный центр экспертизы средств медицинского применения . 2008 . С . 73-78 ,

3 . Kobrehel G . , Lazarevski G . , Dokic S . , Kolacny-babic L . Synthesis and antibacterial activity of O-methylazitromycin derivatives //

J . Of Antibiotics . 1992, 45(4) . P. 527-534 .

4 . Дероум Э . Современные методы ЯМР для химических исследований . М . : Мир, 1992,

403 c .

5 . Lazarevski G . , Vinkovic M . , Kobrehel G . , Dokic S . Conformational analysis of azitromycin by nuclear magnetic resonance spectroscopy and molecular modeling // Tetrahedron . 1993, 49(3) . P. 721-730 .