НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОЦИТАРНОГО ЭРЛИХИОЗА Ehrlichia spp. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ "В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ"
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE KIT FOR IDENTIFYING HUMAN MONOCYTIC EHRLICHIOSIS Ehrlichia spp AGENT DNA BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

1. Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для диагностических целей выявления моноцитарного эрлихиоза Ehrlichia spp. методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени», а также для решения научно-исследовательских задач по изучению возбудителя моноцитарного эрлихиоза. Получены высокоспецифичные праймеры, позволяющие выявлять ДНК Ehrlichia spp. при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени из различных клинических образцов. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК Ehrlichia spp.
2. Уровень техники
Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения:
Известно изобретение по заявке №2003121605 (опубликована 27.01.2005), представляющее набор для идентификации энтерогеморрагических Escherihia coli. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации E.coli серотипов О157:Н7, О26:Н11, О55:Н7, О111:Н8, О113:Н21, О117:Н14. Набор состоит из иммуномагнитной разделительной тест-системы и тест-системы для постановки мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Иммуномагнитная разделительная тест-система содержит носитель - магнитные латексные частицы и сенситин - белок А, ковалентно связанный со специфическими иммуноглобулинами кролика к полисахаридным фракциям ЛПС О157, О26, О55, О113, О111, О117 и белковым жгутиковым антигенам Н7, Н11, Н8, Н21, Н14. Набор представляет собой шесть групп 0,5% взвеси частиц магнитного латексного белково-полисахаридного комплекса. Тест-система для постановки ПЦР содержит буфер "мастер-микс" со специфическими праймерами для идентификации генов stx1, stx2, rfb, fliC энтерогеморрагических E.coli. Набор может быть использован для лабораторной диагностики геморрагического колита, гемолитико-уремического синдрома, а также для идентификации энтерогеморрагических E.coli в пищевых продуктах. Это изобретение предполагает проведение ПЦР реакции с участием реагентов, входящих в этот набор. В частности, используются следующие праймеры, специфичные искомым бактериям, которые позволяют обнаружить ДНК этой бактерии при ПЦР:
Rfb for 5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG-3'
Rfb rev 5'-GAGTACATTGGCATGGTGTGG-3'
stx2 for 5'-ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG-3'
stx2 rev 5'-CTGAGCACTTTGCAGTAACGG-3'.
В результате обнаруживаются энтерогеморрагические Escherihia coli.
Также известны аналогичные изобретения «Способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания лаймского боррелиоза - borrelia burqdorferi» (заявка №2004105688 опубликована 10.08.2005). Способ обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза-Воrrеliа burgdorferi, включающий выделение ДНК из биологического материала, синтез праймеров и постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, отличающийся тем, что при постановке полимеразной цепной реакции используют для обнаружения ДНК бактерии в культуре клеток, пробах периферической крови человека и клещах два праймера:
BBs14.F/BBs14.R
-5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3',
5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3',
кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы. Способ, отличающийся тем, что отжиг праймеров производят при температуре 51-52°С в течение 10-30 с.
Способ, отличающийся тем, что число циклов амплификации равно 35-42 П.
Набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, включающий термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена флагелина бактерии, и масло для полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что он содержит праймеры BBs14.F/BBs14.R
-5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3',
5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, и 5-кратный буфер для постановки реакции.
Также из уровня техники известен «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции» (заявка №2005136997, опубликована 10.06.2007). Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Предложенный набор для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции включает комплект реагентов для подготовки пробы, комплект для амплификации, содержащий праймеры, специфичные к ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia sensu stricto, положительный и отрицательный контрольные образцы, и комплект для анализа продуктов. Применение изобретения обеспечивает одновременное, быстрое, простое и точное обнаружение 5 видов пародонтопатогенов в одной пробе.
Также из уровня техники известен следующий аналоги данного изобретения: патент № US 2002192672 «Определение новой разновидности ehlrichia spp. от пациента, зараженного моноцитарным эрлихиозом».
Была получена новая разновидность Ehrlichia spp. от пациента, зараженного моноцитарным эрлихиозом. Новая найденная разновидность должна была быть подобной Е.canis, но отчетливо отличалась от Е. canis. Данное изобретение описывает методы и диагностический набор для выявления моноцитарного эрлихиоза в биологическом материале человека, а также описан препарат, с помощью которого можно будет лечить новую разновидность Ehrlichia spp.
Человеческий моноцитарный эрлихиоз - это новое заболевание, характеризующееся такими симптомами как лихорадка, головная боль, недомогание и т.д.
Данное изобретение «Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя человеческого моноцитарного элрихиоза Ehrlichia spp. методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени»» представляет собой набор специфических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативной области генома бактерий Ehrlichia spp. - гену 16S РНК и использующихся для выявления ДНК бактерий Ehrlichia spp. методом ПЦР «в реальном времени». Использование набора синтетических олигонуклеотидов для амплификации участка генома бактерий Ehrlichia spp. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени позволяет достигнуть максимальной чувствительности и специфичности анализа, т.е. способности выявлять единичные копии ДНК возбудителей эрлихиоза человека в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина. Набор предназначен для использования в клинической диагностике и медицинской практике, его применение обеспечивает быстрое простое и точное обнаружение возбудителя в биологическом материале (иксодовые клещи, образцы плазмы крови человека).
Задача
Создание синтетических олигонуклеотидв для выявления ДНК возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза EHRICHIA SPP. методом полимеразной цепной реакции «в режиме реального времени».
3. Раскрытие изобретения
Бактерии рода Ehrlichia - мелкие грамотрицательные полиморфные бактерии, отличающиеся облигатным паразитизмом.
Эрлихиоз человека - природно-очаговая, трансмиссивная инфекция, которая вызывается внутриклеточными микроорганизмами рода Ehrlichia и протекает в виде острого лихорадочного заболевания.
Данный набор предназначен для использования в медицинской диагностике для выявления ДНК возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза (МЭЧ) - патогенных представителей рода Ehrlichia.
Предмет изобретения составляют специфические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативной области генома бактерий Ehrlichia spp. - гену 16S РНК и использующиеся для проведения ПЦР. Их применение в составе набора реагентов для проведения ПЦР обеспечивает быстрое простое и точное обнаружение возбудителя в биологическом материале (иксодовые клещи, образцы плазмы крови человека).
Набор представляет собой комплект синтетических олигонуклеотидов для амплификации участка генома бактерий Ehrlichia spp. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.
Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).
2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (часто 2 праймера и проба).
На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответствует требуемому расположению праймеров.
Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих организмов друг с другом, поиск уникальных для нужного микроорганизма участков, не имеющих аналогов у других микроорганизмов.
Поиск соответствия между числом мутаций и расположению праймеров означает, что мутации, возможные в данном микроогранизме, не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.
3) Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.
4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).
Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза (МЭЧ) - патогенных представителей рода Ehrlichia.
Аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этой бактерии неизвестны.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале (иксодовые клещи, плазма крови человека).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза (МЭЧ) - патогенных представителей рода Ehrlichia, включающего в себя праймеры:
5'- GGG GAA AGA TTT АТС GCT ATT AG -3'
5'- CGG CAT AGC TGG АТС AGG CT -3'
и пробу: (BHQ1)-5'- CCC ACT GCT GCC (FdT)CC CGT AGG AGT CTG G -3'P, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:
2
1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК бактерий рода Ehrlichia - гену 16S РНК, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl), внутренний контрольный образец (ВК).
И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что в свою очередь зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, проба - проявку ее результатов.
Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.
2) Раствор фермента Taq-полимеразы.
3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 198 п.н. генома бактерий рода Ehrlichia. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках, с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.
4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Предлагаемый набор отличается тем, что синтетические праймеры и флуоресцентно-меченая проба, специфичные к маркерному для данного возбудителя участку ДНК, имеют следующий нуклеотидный состав:
5'- GGG GAA AGA TTT АТС GCT ATT AG -3'
5'- CGG CAT AGC TGG АТС AGG CT -3'
(BHQ1)-5'- CCC ACT GCT GCC (FdT)CC CGT AGG AGT CTG G -3'P
BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, FdT - означает флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.
2
Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченая проба входят в состав реакционной смеси, которая кроме того включает в себя смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MGCl), внутренний контрольный образец (ВК) и фермент Taq-полимеразу (2,5 ед на пробу).
В данную реакционную смесь добавляют образец ДНК и проводят ПЦР. В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами.
Внутренний контрольный образец (ВК) вносится в реакционную смесь для оценки эффективности протекания ПЦР. Пробы, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации специфического ПНР-продукта и ВК.
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во время амплификации.
4. Осуществление изобретения
1) Биологический материал (иксодовые клещи, образцы плазмы крови человека) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР;
2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;
3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;
4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК;
5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец;
6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец;
7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").
Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.
В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими амплификаторами.