КАПЕЛЬНЫЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ, ОСНОВАННЫЕ НА СИСТЕМЕ CRISPR

1. Способ выявления целевых молекул, включающий:
комбинирование первого набора и второго набора капель в пул капель, при этом первый набор капель содержит CRISPR-систему выявления, содержащую белок Cas и одну или более направляющих РНК, сконструированных для связывания с соответствующими целевыми молекулами, маскирующую конструкцию и оптический штрих-код; и второй набор капель содержит образец и необязательно оптический штрих-код;
подачу пула капель на микроструйное устройство, содержащее массив микролунок и по меньшей мере один проточный канал под микролунками, причем микролунки имеют такой размер, чтобы захватывать по меньшей мере две капли;
выявление оптических штрих-кодов капель, захваченных в каждой микролунке;
слияние капель, захваченных в каждой микролунке, с образованием слитых капель в каждой микролунке, при этом по меньшей мере одна выборка слитых капель содержит CRISPR-систему выявления и целевую последовательность;
инициирование реакции выявления; и
измерение выявляемого сигнала из каждой слитой капли за один или более временных периодов, необязательно непрерывно.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию амплификации целевых молекул.
3. Способ по п. 2, в котором амплификация включает в себя амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA), рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA), петлеопосредованную изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением цепей (SDA), хеликазо-зависимую амплификацию (HDA), реакцию амплификации с ферментом, создающим одноцепочечный разрыв (NEAR), ПЦР, амплификацию с множественным замещением (MDA), амплификацию по типу «катящегося кольца» (RCA), лигазную цепную реакцию (LCR) или рамификационный метод амплификации (RAM).
4. Способ по п. 2, в котором амплификация выполняется с помощью RPA или ПЦР.
5. Способ по п. 1, в котором целевые молекулы содержатся в биологическом образце или образце окружающей среды.
6. Способ по п. 5, в котором образец получают от человека.
7. Способ по п. 5, в котором биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, кал, мокроту, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асциты, плевральный выпот, серому, слюну, цереброспинальную жидкость, внутриглазную жидкость или жидкость стекловидного тела или любые выделения организма, транссудат, экссудат или жидкость, полученную из сустава, или мазок с поверхности кожи или поверхности слизистой мембраны.
8. Способ по п. 1, в котором одна или более направляющих РНК, сконструированых для связывания с соответствующими целевыми молекулами, включают (синтетическое) несовпадение оснований.
9. Способ по п. 8, в котором указанное несовпадение находится выше или ниже SNP или другой однонуклеотидной вариации в указанной целевой молекуле.
10. Способ по п. 1, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для выявления однонуклеотидного полиморфизма в целевой РНК, или ДНК, или сплайс-варианта РНК-транскрипта.
11. Способ по п. 10, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для выявления SNP резистентности к лекарственным средствам при вирусной инфекции.
12. Способ по п. 1, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для связывания с одной или более целевыми молекулами, которые являются диагностическими в отношении болезненного состояния.
13. Способ по п. 12, в котором болезненное состояние характеризуется наличием или отсутствием гена, или транскрипта, или полипептида резистентности или чувствительности к лекарственному средству.
14. Способ по п. 1, в котором одна или более направляющих РНК сконструированы для различения между одним или более микробными штаммами.
15. Способ по п. 12, в котором болезненное состояние представляет собой инфекцию.
16. Способ по п. 15, в котором инфекция вызвана вирусом, бактерией, грибком, простейшим организмом или паразитом.
17. Способ по п. 15, в котором одна или более направляющих РНК включают в себя по меньшей мере 90 направляющих РНК.
18. Способ по п. 1, в котором белок CRISPR представляет собой РНК-нацеливающий белок, ДНК-нацеливающий белок или их комбинацию.
19. Способ по п. 18, в котором РНК-нацеливающий белок содержит один или более доменов HEPN.
20. Способ по п. 19, в котором один или более доменов HEPN содержат последовательность мотива RxxxxH.
1
2
3
21. Способ по п. 20, в котором мотив RxxxH содержит последовательность R{N/H/K]XXXH.
1
2
3
22. Способ по п. 21, в котором X представляет собой R, S, D, E, Q, N, G или Y, и X представляет собой независимо I, S, T, V или L, и Х представляет собой независимо L, F, N, Y, V, I, S, D, E или A.
23. Способ по п. 1, в котором РНК-нацеливающий белок CRISPR представляет собой C2c2.
24. Способ по п. 18, в котором белок CRISPR представляет собой ДНК-нацеливающий белок.
25. Способ по п. 24, в котором белок CRISPR содержит RuvC-подобный домен.
26. Способ по п. 24,  в котором ДНК-нацеливающий белок представляет собой белок типа V.
27. Способ по п. 24,  в котором ДНК-нацеливающий белок представляет собой Cas12.
28. Способ по п. 25, в котором Cas12 представляет собой Cpf1, C2c3, C2c1 или их комбинацию.
29. Способ по п. 1, в котором маскирующая конструкция основана на РНК и подавляет генерацию выявляемого положительного сигнала.
30. Способ по п. 29, в котором маскирующая конструкция на основе РНК подавляет генерацию выявляемого положительного сигнала путем маскировки выявляемого положительного сигнала или, вместо этого, генерирования выявляемого отрицательного сигнала.
31. Способ по п. 29, в котором маскирующая конструкция на основе РНК содержит сайленсинговую РНК, которая подавляет генерацию генного продукта, кодируемого репортерной конструкцией, причем генный продукт, при экспрессии, генерирует выявляемый положительный сигнал.
32. Способ по п. 29, в котором маскирующая конструкция на основе РНК представляет собой рибозим, который генерирует отрицательный выявляемый сигнал, и при этом положительный выявляемый сигнал генерируется, когда рибозим деактивирован.
33. Способ по п. 32, в котором рибозим превращает субстрат в первый окрашенный продукт, и при этом субстрат превращается во второй окрашенный продукт, когда рибозим деактивирован.
34. Способ по п. 29, в котором маскирующий агент на основе РНК представляет собой РНК-аптамер и/или содержит РНК-привязанный ингибитор.
35. Способ по п. 34, в котором аптамер и/или РНК-привязанный ингибитор блокирует фермент, причем фермент генерирует выявляемый сигнал при высвобождении от аптамера или РНК-привязанного ингибитора путем воздействия на субстрат.
36. Способ по п. 34, в котором аптамер представляет собой ингибирующий аптамер, который ингибирует фермент и предотвращает катализируемую ферментом генерацию выявляемого сигнала из субстрата, или в котором РНК-привязанный ингибитор ингибирует фермент и предотвращает катализируемую ферментом генерацию выявляемого сигнала из субстрата.
37. Способ по п. 36, в котором фермент представляет собой тромбин, протеин C, нейтрофил-эластазу, субтилизин, пероксидазу хрена, бета-галактозидазу или щелочную фосфатазу теленка.
38. Способ по п. 37, в котором фермент представляет собой тромбин, и субстрат представляет собой пара-нитроанилид, ковалентно связанный с пептидным субстратом для тромбина, или 7-амино-4-метилкумарин, ковалентно связанный с пептидным субстратом для тромбина.
39. Способ по п. 34, в котором аптамер блокирует пару агентов, которые при высвобождении от аптамеров комбинируют с генерацией выявляемого сигнала.
40. Способ по п. 29, в котором маскирующая конструкция на основе РНК содержит олигонуклеотид РНК, к которому присоединены выявляемый лиганд и маскирующий компонент.
41. Способ по п. 29, в котором маскирующая конструкция на основе РНК содержит наночастицу, удерживаемую в агрегате мостиковыми молекулами, причем по меньшей мере часть мостиковых молекул содержит РНК, и при этом раствор претерпевает изменение цвета, когда наночастица выбрасывается в раствор.
42. Способ по п. 41, в котором наночастица представляет собой коллоидный металл.
43. Способ по п. 42, в котором коллоидный металл представляет собой коллоидное золото.
44. Способ по п. 22, в котором маскирующая конструкция на основе РНК содержит квантовую точку, связанную с одной или более молекулами-гасителями связывающей молекулой, причем по меньшей мере часть связывающей молекулы содержит РНК.
45. Способ по п. 22, в котором маскирующая конструкция на основе РНК содержит РНК в комплексе с интеркалирующим агентом, причем интеркалирующий агент изменяет поглощение при расщеплении РНК.
46. Способ по п. 45, в котором интеркалирующий агент представляет собой пиронин-Y или метиленовый синий.
47. Способ по п. 22, в котором выявляемый лиганд представляет собой флуорофор, и маскирующий компонент представляет собой молекулу-гаситель.
48. Способ по п. 1, в котором выявляемые оптические штрих-коды включают выполнение оптических оценок капель в каждой микролунке.
49. Способ по п. 48, в котором выполнение оптических оценок включает в себя захватывание изображения каждой микролунки.
50. Способ по п. 1, в котором оптический штрих-код содержит частицу конкретного размера, формы, показателя преломления, цвета или их комбинации.
51. Способ по п. 50, в котором частица включает в себя частицы коллоидных металлов, нанооболочки, нанотрубки, наностержни, квантовые точки, гидрогелевые частицы, липосомы, дендримеры или металл-липосомные частицы.
52. Способ по п. 48, в котором оптический штрих-код выявляют c использованием световой микроскопии, флуоресцентной микроскопии, рамановской спектроскопии или их комбинации.
53. Способ по п. 1, в котором каждый оптический штрих-код содержит один или более флуоресцентных красителей.
54. Способ по п. 53, в котором каждый оптический штрих-код содержит отличающееся соотношение флуоресцентных красителей.
55. Способ по п. 1, в котором выявляемый сигнал представляет собой уровень флуоресценции.
56. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию применения процесса решения с покрытием множества.
57. Способ по п. 1, в котором микроструйное устройство содержит массив из по меньшей мере 40000 микролунок.
58. Способ по п. 57, в котором микроструйное устройство содержит массив из по меньшей мере 190000 микролунок.
59. Мультиплексная система выявления, содержащая:
CRISPR-систему выявления, содержащую белок Cas и одну или более направляющих РНК, сконструированных для связывания с соответствующими целевыми молекулами, маскирующую конструкцию на основе РНК и оптический штрих-код;
необязательные оптические штрих-коды для одной или более целевых молекул;
и микроструйное устройство, содержащее массив микролунок и по меньшей мере один проточный канал под микролунками, причем микролунки имеют такой размер, чтобы захватывать по меньшей мере две капли.
60. Набор, содержащий мультиплексную систему выявления по п. 59.
61. Способ по любому из пп. 1-58, в котором второй набор капель содержит оптический штрих-код.
62. Мультиплексная система выявления по п. 59, причем система содержит оптические штрих-коды для одной или более целевых молекул.