Изучение биологических свойств L-форм микобактерий, выделенных из бронхиальных и средостенных лимфатических узлов от КРС, реагировавшего на ППД туберкулин

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БРОНХИАЛЬНЫХ И СРЕДОСТЕННЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ОТ КРС, РЕАГИРОВАВШЕГО НА ППД - ТУБЕРКУЛИН

Е.В. Тарасова, A.M. Коваленко, В.Ю. Жабина

Аннотация. Представлены результаты изучения биологических свойств Ь-форм микобактерий, которые были выделены из бронхиальных и средостенных лимфатических узлов от крупного рогатого скота, реагировавшего на ППД -туберкулин. Исследование проводили на клинически здоровых морских свинках, которые до начала опыта не реагировали на туберкулин (ППД) - туберкулин для млекопитающих. Животных заражали стабильными и нестабильными культурами Ь-форм микобактерий, выращенных на среде Школьни-ковой, с последующим проведением аллергических, патологоанатомических и бактериологических исследований.

Ключевые слова: Ь-форм микобактерий, биологические свойства, туберкулин, морские свинки.

Туберкулез является антропозоонозом, поэтому представляет мировую проблему, несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных областях биологических наук. Для прижизненной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных в данное время основным, массовым методом в ветеринарной практике является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД - туберкулин для млекопитающих. Однако не редко выявляют положительно реагирующих на туберкулин животных в благополучных по туберкулезу хозяйствах - это так называемые неспецифические или параалергические реакции на туберкулин. Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год; так, в настоящее время в благополучных хозяйствах выявляется в 5,3 раза больше реагировавших животных, чем в благополучных по туберкулезу хозяйствах [А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, 2003]. Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения достоверности туберкулиново диагностической пробы. Известно, что причиной неспецифических реакций на

туберкулин у крупного рогатого скота является не только микобактерий туберкулеза, но и многие условно патогенные и сапрофитные микобактерии. Рецидивы возникновения туберкулеза у людей связывают с пер-систированием в организме возбудителя в L-форме [Келимжанова Б.Ф., 1991 - 1998гг., Дорожкова И.Р., Голышевская, 1995 г.].

Вместе с тем, выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них — медленный рост на питательных средах и способность к L-трансформации. Исследования ряда авторов [Урбан В.П.1990, Федосеев B.C., 1985, Герман М.И., 1988] дают основание предположить, что одной из причин длительного неблагополучия хозяйств по туберкулёзу крупного рогатого скота может быть латентный микро-бизм, обусловленный персистенцией микобактерий туберкулёза в L-форме [3].

Длительная персистенция возбудителя в измененной деструктивной по клеточной стенке форме, а также L-трансформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды[1], длительное применение антибактериальных препаратов и воздействие на клеточную стенку мико-бактерий. (В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2003 и др.). В то же время отсутствие достаточных знаний об условиях образования L-форм и методов выделения не позволяет оценить их значение в течение эпизоотического процесса при туберкулезе КРС.

Целью наших исследований было изучить биологические свойства L-форм возбудителя туберкулеза в опытах на морских свинках.

Биологические свойства изолированных из патологического материала выделенных от крупного рогатого скота L-форм микобактерий изучали в опытах на клинически здоровых морских свинках, которые до начала эксперимента не реагировали на внутрикожное введение ППД - туберкулина для млекопитающих.

Заражение животных проводили стабильными и нестабильными культурами в Ь-форм, выращенных на среде Школьниковой. Приготовленную взвесь Ь-форме на стерильном физиологическом растворе вводили во выстриженную область бедра задней конечности морским свинкам внутримышечно в дозе 1 см3. Опытных животных трехкратно с интервалом 30 дней исследовали аллергическим методом на туберкулез. Через 90 дней после начала эксперимента всех животных подвергали эвтаназии и патологоанатомическому исследованию на туберкулез. Отобранный биологический материал от морских свинок исследовали культуральным методом на наличие Я, Б и Ь-форм микобактерий.

Предпосевную обработку патологического материала с целью выделения Ь-форм микобактерий проводили по методу Аликаевой (1940 г.) с применением 3% р-р серной кислоты. Полученную взвесь фильтровали через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм и высевали на среду Школьниковой. Для выделения бактериальных форм (Я, Б) полученную взвесь высевали на плотную яичную среду Левенштейна - Нильсена. Пробирки с посевами помещали в термостате при температуре (37±0,5°С). Учет роста колоний из патологического материала проводили через каждые 5-7 суток на протяжении 3-х месяцев.

Из выросших колоний микобактерий готовили мазки, которые окрашивали по методу Циля - Нильсена и подвергали световой микроскопии. Выросшие на среде Школьниковой в толще среды облакоподобные помутнения исследовали методом фазово - контрастной микроскопии.

Результаты изучения сенсибилизирующих свойств изолированных из патологического материала от крупного рогатого скота Ь-форм микобактерий в опытах на морских свинках представлены в таблице 1.

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что при аллергическом исследовании морских свинок, зараженных культурой № 4 и № 7, на 30 день реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих была выявлена только в четырёх животных. Через 60, 90 день с начала эксперимента реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих была выявлена в 13 морских свинок из 18 зараженных культурами № 1, 2, 3, 7, 8, 10.

Характер реакции был различным, от незначительного воспалительного отека. 13 морских свинок, зараженных культурами стабильных Ь-форм микобактерий, положительную реакцию на туберкулин (ППД) для млекопитающих вызывала культура № 4 и №5 у троих животных из шести, а на 90 день от начала эксперимента у 7 морских свинок.

Животные контрольной группы, зараженные референтным штаммом Уа11ее, морские свинки реагировали во все сроки исследования. При этом реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих характеризовалась ярко выраженными воспалительными отеками.

Патогенные свойства Ь-форм микобактерий испытывали на тех же морских свинках и кроликах, на которых изучали их сенсибилизирующие свойства. Результаты патологоанатомического исследования представлены в таблице 2.

Таблица 1 - Результаты сенсибилизирующих свойств лабораторных животных, зараженных Ь-формами микобактерий, выделенными от крупного рогатого скота

№ Количество Реакция на туберкулин через дней

п/п животных (гол) 30 60 90

Нестабильные Ь-формы микобактерий

1 № 1 10 Морские свинки 7,4±0,9 9,5±0,8 13,3±0,4

2 №2 10 Морские свинки - 8,7±0,3 12,5±0,8

3 № 3 10 Морские свинки - 9,5±0,8 10,3±0,6

4 № 7 10 Морские свинки 6,8±0,5 7,8±0,2 12,5±0,8

5 № 8 10 Морские свинки - 8,7±0,3 14,6±0,2

6 № 10 10 Морские свинки - 8,7±0,3 10,3±0,6

Стабильные Ь-формы микобактерий

7 №4 10 Морские свинки - 4,5±0,3 9,7±0,2

8 № 5 10 Морские свинки - - 8,6±0,4

9 № 6 10 Морские свинки - 6,4±0,6 10,3±0,7

10 №9 10 Морские свинки - - -

Контроль

11 шт.Уа11ее 10 Морские свинки 14±0,7 21,8±0,5 19,5±0,6

Таблица 2 - Изучение патогенных свойств, выделенных Ь-форм микобактерий от крупного рогатого скота

№ п/п Культуры Ь-форм Лабораторные животные Результаты патологоанатомического исследования

Нестабильные Ь-формы микобактерий

1 № 1 Морские свинки Увеличение паховых л/у, в печени и селезенке единичные сероватые узелки

2 №2 Морские свинки Увеличение паховых л/у, в печени и селезенке единичные сероватые узелки

№3 Морские свинки Увеличение паховых л/у, в печени и селезенке единичные сероватые узелки

4 №7 Морские свинки Увеличение паховых л/у, в печени и селезенке единичные сероватые узелки

5 № 8 Морские свинки Увеличение паховых лимфатических узлов

6 № 10 Морские свинки Увеличение паховых лимфатических узлов

Стабильные Ь-формы микобактерий

7 № 5 Морские свинки Увеличение паховых лимфатических узлов

8 №4 Морские свинки Патологических изменений, характерных для туберкулеза, не обнаружено

9 №6 Морские свинки Увеличение паховых лимфатических узлов

10 №9 Морские свинки Патологических изменений, характерных для туберкулеза, не обнаружено

Контроль

11 шт. Уа11ее Морские свинки Множественные сероватые узелки в печени, селезенке, л /у: паховые и заглоточные увеличены в 3-5 раз, на месте введений - язва.

Как свидетельствуют материалы, приведенные в таблице 2, что при патологоанатомическом исследовании через 90 дней после начала эксперимента характерные для туберкулеза изменения в лимфатических узлах и единичные туберкулы в печени были выявлены у 12 морских свинок, зараженных нестабильными L-формами микобактерий № 1, 2, 3, 7. Из 18 морских свинок, зараженных нестабильными L-формами микобактерий, пало пять животных на 75 день. В морских свинках, которые были заражены стабильными L-формами микобактерий (№ 4, 5, 6, 9), при вскрытии только у четырех голов было выявлено увеличение левого пахового лимфатического узла в 2-3 раза, а в остальных 11 животных изменений, характерных для туберкулеза не выявлено.

Однако патологические изменения у морских свинок были менее выражены в сравнении с контрольной группой животных, зараженных культурой референтного штамма Vallee.

При культуральном исследовании отобранного патологического материала от морских свинок, зараженных нестабильными L-формами микобактерий, выделено четыре культуры в бактериальной форме (R -форме), а также девять культур в L-форме микобактерий. Первичный рост колоний в R-форме на яичной питательной среде для культивирования микобактерий отмечали на 28±1,8 сутки после посева, при этом интенсивность роста была не одинаковой. При микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль- Нильсена, в поле зрения обнаруживали короткие кислотоустойчивые палочки. На основании биохимических и биологических свойств изолированные культуры были отнесены от морских свинок к М. bovis.

В морских свинках, которые были заражены стабильными L-формами культуры в бактериальной форме, не было выделено, тогда как первичный рост на среде Школьниковой был отмечен на 18±0,3 день в L-форме от экспериментально зараженных животных культурой № 4, 5, 6. При фазово-контрастной микроскопии мазков из выросших культур были обнаружены шаровидные образования различной величины.

Вывод. Культуры в L - форме микобактерий обладали сенсибилизирующими и патогенными свойствами для лабораторных животных.

Список использованных источников

1 Козлов B.C. Биологические свойства микобактерий различных видов, выделенных из почвы // Проблемы туберкулёза. - 1982. - № 3. - С. 65-68.

2 Рубцова И.Н. Измененные формы микобактерий в организме животных и их значение в бактериологической диагностике туберкулеза // Бюллетень ВИЭВ. - 1983. - Вып. 51. -С. 32.

3 Герман М.И. Биологические свойства L-форм Mycobacterium bovis : автореф. дис... канд. вет. наук: 16.00.03. - М., 1988. - 20 с.

4 Драбкина P.O. Микробиология туберкулёза. - М.: Медгиз, 1963. - 254.

Информация об авторах

Тарасова Елена Владимировна, ассистент кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА», тел. 8-915-520-92-80, Elena.tarasova.82@bk.ru

Коваленко Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».

Жабина В.Ю., ассистент ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».