СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
VISUALISATION TECHNIQUE

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу визуализации in vivo и, в частности, к новому применению некоторых известных агентов визуализации in vivo. Предпочтительными способами визуализации in vivo по изобретению являются однофотонная эмиссионная компьютерная томография (SPECT) и позитронная эмиссионная томография (PET).
Предшествующий уровень техники
Повреждающие факторы, которые могут вызвать фиброз печени, среди них хронический вирусный гепатит, неалкогольный стеатогепатит (NASH), паразитемия, врожденные нарушения обмена веществ и токсическое поражение вследствие употребления алкоголя, имеют высокий показатель распространения на обширной территории. Все эти факторы означают, что фиброз, приводящий к циррозу и возможному раку печени, остается главной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. Только в Великобритании болезнь печени является в настоящее время пятой наиболее распространенной причиной смертности, и распространенность этого заболевания повышается (Iredale, 2003, BMJ, Vol.327, pp.143-147).
Существуют два типа жировой дистрофии печени: неалкогольная жировая дистрофия печени (NAFLD) и NASH. Полагают, что около 24% населения США имеют NAFLD, которая прогрессирует в NASH с низкой частотой. NAFLD ассоциирована с метаболическим синдромом, который связывают с ожирением, гиперлипидемией, гипертензией и диабетом II типа. Полагают, что около 47 миллионов граждан США имеют метаболический синдром. Считается установленным, что 8,6 миллиона человек населения США имеют NASH, который может быть ассоциирован с фиброзом и циррозом, при этом у 20-28% пациентов с NASH цирроз развивается в течение одного десятилетия. В силу вышесказанного NAFLD имеет очень широкое распространение и представляет менее тяжелый исход в спектре NAFLD, которая может прогрессировать в NASH и, в конечном счете, в цирроз печени. Фиброз печени является индикатором риска прогрессирования от NASH к циррозу.
Современные подходы детекции фиброза печени имеют некоторые ощутимые недостатки. Биопсия печени с гистологическим анализом структуры отложения коллагена считается "золотым стандартом" для оценки стадии болезни печени и фиброза печени. Однако данная процедура является в некоторой степени болезненной, эпизодически заканчивается летальным исходом, связана с высокой стоимостью, ошибками при отборе проб и высокой вариабельностью результатов у разных специалистов в гепатопатологии при классификации степени фиброза. В результате отбора образцов печени при биопсии оценивают только 1/50000 часть печени, что может приводить к ошибкам при постановке диагноза. Кроме того, так как маркером фиброзной ткани служит коллаген, то он не является идеальной мишенью активного заболевания, поскольку может быть обнаружен на поздних стадиях активного фиброза, а также когда процесс заболевания разрешен. В настоящее время не существует никакого способа, которым можно эффективно характеризовать и регистрировать фиброз печени с использованием неинвазивной процедуры. Это негативно влияет на возможность раннего терапевтического вмешательства, которое могло бы замедлить или остановить развитие фиброза печени. Кроме того, с целью осуществления мониторинга прогрессирования болезни во времени рекомендуется проводить повторные биопсии каждые 3-5 лет. Существует ограниченное количество доступных тестов крови для детекции фиброза печени, поскольку они не могут быть использованы для оценки степени фиброза или для различения фиброза и цирроза. Следовательно, в настоящее время не существует никакого доступного способа, которым можно отличить NAFLD от NASH или удовлетворительно определить в количественном выражении и охарактеризовать фиброз при NASH.
Звездчатые клетки печени (HSC) по праву считаются основными фиброкомпетентными клетками печени. При прогрессирующем фиброзе печени HSC активируются и пролиферируют, но в процессе разрешения фиброза наблюдается обширный апоптоз HSC, который сопровождается разрушением рубцовой ткани печени. Прогрессирующая стадия процесса фиброза называется фиброгенезом. Имеется сообщение о положительной регуляции экспрессии интегрина активированными HSC (Zhou et al., J. Biol. Chem. 2004; 279(23): 23996-24006). Активация HSC критична для инициации и развития фиброгенеза и последующего фиброза печени. Поэтому маркеры активации HSC представляются возможными мишенями для визуализации фиброгенеза. В связи с этим, маркерами данного процесса, которые недавно стали известными, являются интегрины (Zhou et al., 2004, J. Biol. Chem., 279: 23996-24006; Patsenker et al., 2007, J. Hepatol., 46(5):878-887; Zhou et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:39757-39765; Carloni etal., 1996, Gastroenterology, 110:1127-36).
Использование соответственно меченных, связывающихся с интегринами соединений для применений в визуализации in vivo описано ранее.
у
В WO 2004/020435 описаны интегрин-связывающие пиперидинильные соединения, полезные в лечении заболеваний, ассоциированных с патологической положительной регуляцией или дисрегуляцией клеточной пролиферации, обусловленной экспрессией а-интегрина или его подтипа. В WO 2004/020435 также описано, что соединения по изобретению можно конъюгировать с группировкой, подходящей для визуализации in vivo, и использовать в качестве неинвазивного опухолевизуализирующего агента.
v
1
В WO 2007/088041 описан класс низкомолекулярных интегрин-связывающих соединений, полезных в лечении и/или предупреждении заболевания, предпочтительно представляющего собой заболевание, опосредованное αβ-интегрином. Фиброз печени включен в качестве конкретного заболевания, при котором находят применение соединения из WO 2007/088041. В дополнение к лечению и предупреждению в WO 2007/0880041 указано, что описанные там соединения могут включать визуализирующую in vivo группировку и использоваться для визуализации in vivo.
WO 2003/006491, WO 2005/012335 и WO 2005/123767 относятся к соединениям на основе RGD-пептида (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), связывающимся с рецепторами, ассоциированными с ангиогенезом, где указанные рецепторы включают интегрины. Описанные соединения включают либо антинеопластический агент, либо визуализирующую in vivo группировку, и отмечаются как полезные в лечении и визуализации in vivo заболеваний, ассоциированных с ангиогенезом.
В WO 2006/054904 описано применение RGD-пептидов, меченных визуализирующей in vivo группировкой в качестве контрастных агентов, мишенью для которых является внеклеточный матрикс (ЕСМ). Указано, что данные контрастные агенты полезны в диагностике и мониторинге заболеваний, связанных с избыточным образованием коллагена, включая фиброз печени. Однако имеется препятствие при использовании RGD-пептидов для визуализации in vivo фиброза печени, поскольку известно, что экскреция меченных радиоактивной меткой интегрин-связывающих RGD-пептидов осуществляется главным образом через гепатобилиарную систему (Haubner 1999, J. Nuc. Med.; 40:1061-71). К тому же, как упомянуто выше, коллаген не является идеальным маркером активного фиброза, поскольку может быть обнаружен, когда процесс заболевания разрешен, а также на поздних стадиях активного заболевания. Будет более благоприятным выявление ранней, активной стадии, когда применение схемы лечения, вероятно, более адекватно и, также вероятно, более клинически эффективно, например, ранних стадий фиброза при NASH до развития цирроза печени. Следовательно, существует необходимость в способе идентификации ранних стадий фиброза печени (также называемых "фиброгенезом") и тем самым во вмешательстве в процесс заболевания на стадии, когда лечение может быть наиболее эффективным.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способу, полезному в облегчении идентификации фиброгенеза в печени субъекта. Согласно изобретению также предложено соединение для применения в способе идентификации фиброгенеза в печени субъекта. Другой аспект изобретения относится к соединению для применения в изготовлении лекарственного средства для применения в способе идентификации фиброгенеза в печени субъекта. Настоящее изобретение демонстрирует, что соединения на основе RGD-пептида можно эффективно использовать для детекции активированных звездчатых клеток печени (HSC), тем самым предложен способ, полезный в ранней диагностике фиброза печени.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.1 и Фиг.2 показано специфическое связывание Соединения 6 как с активированными звездчатыми клетками печени человека, так и с мембранами ЕА-Ну926. Величина Ki была определена равной ~10 нМ в анализе с использованием мембран ЕА-Ну926, а величина ЕС50 как ~1 нМ в анализе с использованием LX-2-клеток. Специфичность связывания в LX-2-анализе была показана на основании специфического ингибирования связывания Соединения 6 нерадиоактивным Соединением 6. Низкоаффинное соединение с "перестановленной" структурой, взятое в качестве отрицательного контроля, не связывается с интегринами или активированными звездчатыми клетками.
На Фиг.3 продемонстрировано специфическое поглощение Соединения 8 печенью крыс с лигированными желчными протоками (BDL) в сравнении с RGD-пептидом с "испорченной" структурой, взятым в качестве отрицательного контроля, для которого не наблюдали никакого поглощения печенью. Кроме того, поглощение печенью при BDL было пропорционально степени фиброгенеза, причем максимальное поглощение наблюдали на 10-е и 15-е сутки после операции, когда фиброгенез находится на своем максимальном уровне.
v
v
На Фиг.4 показана значительная положительная регуляция альфа-интегрина при BDL на 15-е сутки после операции. В совокупности с Фиг.4, Фиг.5 демонстрирует корреляцию между экспрессией альфа-интегрина и поглощением соединения в печени животных с BDL в каждый момент времени после операции.
Подробное описание изобретения
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к соединению формулы I для применения в способе определения наличия, локализации и/или степени фиброгенеза в печени субъекта, включающем следующие стадии:
(1) предоставление субъекта, которому введено детектируемое количество соединения формулы I;
(2) предоставление возможности соединению формулы I связаться с любой тканью, характеризующейся фиброгенезом, в указанной печени;
(3) детекция сигналов, испускаемых указанным соединением формулы I, способом визуализации in vivo; и
(4) генерирование изображения, отображающего локализацию и/или величину указанных сигналов;
где указанное соединение формулы I определено следующим образом:
где:
G представляет собой глицин;
D представляет собой аспарагиновую кислоту;
1
3-6
X представляет собой аминокислоту, выбранную из аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, лизина, гомолизина или С диаминоалкановой кислоты или их производных;
2
4
Х и Х независимо представляют собой аминокислотные остатки, боковые цепи которых соединены вместе с образованием циклизующего мостика, такие как остатки цистеина или гомоцистеина, образующие дисульфидные или простые тиоэфирные связи, либо других аминокислот, способных к образованию циклизующего мостика, таких как аспарагиновая кислота и лизин;
3
Х представляет собой аргинин, N-метиларгинин или миметик аргинина;
5
4-6
Х представляет собой тирозин, фенилаланин, 3-йод-тирозин, Сциклоалкилаланин или нафтилаланин или их производные;
6
6
Х представляет собой тиол-содержащую аминокислоту, которая образует либо простую тиоэфирую связь, либо тиоацетальную связь, соединяющую Х с группой С(=О);
1
2
1
1
2
6
W и W независимо представляют собой возможную линкерную группировку, где W, когда присутствует, соединен с группировкой боковой цепи аминокислоты X, и W, когда присутствует, соединен с карбоксигруппой в Х; и
1
2
1
2
Z и Z независимо представляют собой визуализирующую группировку, группировку сахара и группировку органического красителя или водород, при условии, что по меньшей мере один из Z и Z представляет собой визуализирующую группировку.
Для указанного соединения формулы I:
1
X предпочтительно представляет собой лизин;
2
4
Х и Х предпочтительно независимо представляют собой цистеин или гомоцистеин и наиболее предпочтительно оба представляют собой цистеин;
3
Х предпочтительно представляет собой аргинин;
5
Х предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, фенилаланин или 3-йод-тирозин и наиболее предпочтительно фенилаланин;
6
Х предпочтительно представляет собой цистеин или гомоцистеин и наиболее предпочтительно цистеин.
В предпочтительном воплощении соединения формулы I:
1
X представляет собой лизин;
2
4
Х и Х независимо представляют собой цистеин или гомоцистеин;
3
Х представляет собой аргинин;
5
Х представляет собой фенилаланин или 3-йод-тирозин; и
6
Х представляет собой цистеин или гомоцистеин.
В наиболее предпочтительном воплощении соединения формулы I:
1
X представляет собой лизин;
2
4
Х и Х оба предстаавляют собой цистеин;
3
Х представляет собой аргинин;
5
Х представляет собой фенилаланин; и
6
Х представляет собой цистеин.
В соответствии с настоящим изобретением термин "фиброгенез" относится, в частности, к активной, прогрессирующей стадии фиброза, когда, среди других событий, звездчатые клетки печени (HSC) активированы и экспрессируют интегрины. HSC по праву считаются основными фиброкомпетентными клетками печени. При фиброгенезе HSC активируются и пролиферируют, но при разрешении фиброза наблюдается обширный апоптоз HSC, который сопровождается разрушением рубцовой ткани печени. Кроме того, при фиброгенезе отложения компонентов внеклеточного матрикса (ЕСМ), таких как коллаген, пока не происходит.Следовательно, присутствие компонентов ЕСМ является характеристикой более поздних стадий фиброза и разрешения фиброза. Поэтому выявление процесса заболевания во время фиброгенеза обеспечивает лучшее указание на активную форму заболевания, при которой применение лечения будет наиболее адекватно.
В настоящем изобретении "аминокислота" состоит из аминогруппы, карбоксильной группы, атома водорода и группировки боковой цепи аминокислоты, при этом все они соединены (в случае альфа-аминокислоты) с одним атомом углерода, обозначаемым как альфа-углерод. Аминокислоты включают природные аминокислоты, но этим не ограничиваются. Природными аминокислотами являются такие аминокислоты, из остатков которых образованы природные белки, и они хорошо известны специалистам в области, соответствующей настоящему изобретению. Термин "ее производные", когда его используют в данном описании применительно к аминокислоте, означает аминокислоту, боковая цепь которой представляет собой производное по боковой цепи природной аминокислоты (см. "Amino Acid Derivatives", 1999, Oxford University Press, Barrett, Ed.).
Под термином "миметик аминокислоты" понимают синтетические аналоги природных аминокислот, которые представляют собой изостеры, то есть разработаны с целью имитации пространственной и электронной структуры природного соединения. Такие изостеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают депсипептиды, ретроинверсопептиды, тиоамиды, циклоалканы или 1,5-дизамещенные тетразолы (см. М. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)), но не ограничиваются ими.
2
0
2
0
6
4
2
4
2
Термин "циклизующий мостик" относится к любой комбинации аминокислот или аминокислот и групп -(СН)- или -(СН)-СН- с функциональными группами, позволяющими введение мостика (где о представляет собой положительное целое число от 1 до 10). Предпочтительными примерами являются дисульфиды, дисульфидные миметики, такие как карбамостик -(СН)-, тиоацеталь, мостики на основе простого тиоэфира (цистатион или лантионин), мостики, содержащие сложные эфиры и простые эфиры, и амидные мостики. Предпочтительно, чтобы один мостик образовывал дисульфидную связь, а второй мостик содержал простую тиоэфирную (сульфидную) связь. Если циклизующий мостик образован двумя аминокислотами, как в случае Х и Хд, например, то боковая цепь одного из цистеинов или гомоцистеинов присоединена к боковой цепи одной из аминокислот цистеина, гомоцистеина, серина, треонина или альдегид-содержащей аминокислоты с образованием циклизующего мостика.
"Миметиком аргинина" является синтетический аналог природного аргинина, который представляет собой изостер, подобно тому, как определено выше для аминокислотного миметика.
Пептидная часть соединения формулы I может быть синтезирована с использованием всех известных способов химического синтеза, но особенно полезной является методология твердофазного синтеза Меррифилда, в которой применяют автоматический пептидный синтезатор (J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1964)). Стандартные процедуры стратегии синтеза описаны в Е. Atherton & R.C. Sheppard, "Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach", 1989, IRL Press, Oxford.
Для синтеза используют смолу с кислотолабильной линкерной группой, к которой посредством образования амидной связи присоединен остаток желаемой, защищенной с С-конца аминокислоты. Например, может быть использована так называемая высвобождающая амидную группу АМ-смола Ринка (Rink amide AM resin) с линкером (диметоксифенил-аминометил)-фенокси- (Rink, Н. (1987), Tetrahedron Lett. 30, p.3787). В результате отщепления пептида от этой смолы под действием кислоты будет образовываться амид пептида. Альтернативно, можно использовать О-бис-(аминоэтил)этиленгликоль-тритил-смолу (K. Barlos et al. (1988), Liebigs Ann. Chem., p.1079), в результате отщепления от которой под действием кислоты образуется пептид с первичным амином в виде "ручки".
Мечение визуализирующей группировкой может быть соответственно осуществлено посредством "соединения-предшественника", которое является производным указанного соединения формулы I, разработанным таким образом, чтобы химическая реакция с подходящей химической формой желаемой визуализирующей группировки/группировок для получения желаемого соединения формулы I протекала сайт-специфическим образом; могла быть проведена за минимальное число стадий (в идеальном случае за одну стадию); и без необходимости существенной очистки (в идеальном случае без какой-либо дополнительной очистки). Такие соединения-предшественники являются синтетическими и соответственно могут быть получены с хорошей степенью химической чистоты. Соединение-предшественник возможно может содержать одну или более защитных групп для конкретных функциональных групп соединения формулы I.
з
Под термином "ащитная группа" понимают группу, которая ингибирует или подавляет нежелательные химические реакции, но которая разработана таким образом, что оказывается весьма реакционноспособной для возможного отщепления ее от рассматриваемой функциональной группы в достаточно мягких условиях, при которых остальная часть молекулы не модифицируется. После удаления защиты получают желаемый продукт. Защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники и соответственно выбраны, для аминогрупп, из: Вое (где Вое представляет собой трет-бутилоксикарбонил), Fmoc (где Fmoc представляет собой флуоренилметоксикарбонил), трифторацетила, аллилоксикарбонила, Dde (то есть 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этила) или Npys (то есть 3-нитро-2-пиридин-сульфенила); и для карбоксильных групп: из метилового сложного эфира, трет-бутилового сложного эфира или бензилового сложного эфира. Для гидроксильных групп подходящими защитными группами являются: метил, этил или трет-бутил; алкоксиметил или алкоксиэтил; бензил; ацетил; бензоил; тритил (Trt) или триалкилсилил, такой как тетрабутилдиметилсилил. Для тиоловых групп подходящими защитными группами являются: тритил и 4-метоксибензил. Использование дополнительных защитных групп описано в "Protective Groups in Organic Synthesis", Theorodora W. Greene and Peter G.M. Wuts (3-е издание, John Wiley & Sons, 1999).
n
"Линкерная группировка" по настоящему изобретению представляет собой радикал формулы -(L)-, где:
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4-8
4-8
5-12
3-12
каждый L независимо представляет собой -С(=О)-, -CR′-, -CR′=CR′-, -ОС-, -CR′CO-, -COCR′-, -NR′-, -NR′CO-, -CONR′-, -NR′(C=O)NR′-, -NR′(C=S)NR′-, -SONR′-, -NR′SO-, -CR′OCR′-, -CR′SCR′-, -CR′NR′CR′-, С циклогетероалкиленовую группу, С циклоалкиленовую группу, С ариленовую группу, Сгетероариленовую группу, группировку аминокислоты, полиалкиленгликоля, полимолочной кислоты или полигликолевой кислоты;
n представляет собой целое число от 1 до 15;
1-10
3-10
2-10
1-10
1-10
каждая группа R′ независимо представляет собой Н или Салкил, Салкиларил, Салкоксиалкил, Сгидроксиалкил, Сфторалкил, либо 2 или более групп R′ вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют карбоциклическое гетероциклическое насыщенное или ненасыщенное кольцо;
2
2
2
при условии, что указанная линкерная группировка представляет собой цепь, состоящую не более чем из 100 атомов, предпочтительно не более чем из 50 атомов. Линкерная группировка наиболее предпочтительно представляет собой цепь из 10-50 атомов и особенно предпочтительно цепь из 10-30 атомов. Предпочтительными группами L являются -С(=О)-, -СН-, -NH-, -NHC(=O)-, -C(=O)NH-, -CH-O-CH- и аминокислоты.
Предпочтительно, чтобы линкер действовал как группировка-биомодификатор. "Группировка-биомодификатор" функционирует в качестве группировки, модифицирующей фармакокинетику и скорости клиренса из крови соединения формулы I. Примером подходящей группировки-биомодификатора является группировка на основе монодисперсного полиэтиленгликолевого (ПЭГ) структурного звена, содержащего 1-10 единиц указанного структурного звена. В дополнение к этому, указанная группировка-биомодификатор также может быть представлена 1-10 аминокислотными остатками. Предпочтительными аминокислотными остатками для указанной группировки-биомодификатора являются остатки заряженных аминокислот, таких как лизин и глутаминовая кислота, или заряженных неприродных аминокислот, таких как цистеиновая кислота и фосфоноаланин. Кроме этого, могут быть включены аминокислоты глицин, аспарагиновая кислота и серии. В предпочтительном воплощении группировка-биомодификатор содержит монодисперсную ПЭГ-подобную структуру 17-амино-5-оксо-6-аза-3,9,12,15-тетраоксагептадекановую кислоту формулы II:
где m представляет собой целое число от 1 до 10 и где С-концевое звено представляет собой амидную группировку. Такая группировка-биомодификатор действует, модифицируя фармакокинетику и скорости клиренса соединений из крови. Функция группировки-биомодификатора в настоящем изобретении заключается в снижении поглощения в тканях и увеличении экскреции через почки, приводя в результате к уменьшению фоновых помех и получению лучшего изображения in vivo. Кроме того, группировка-биомодификатор может представлять собой группировку, предпочтительно являющуюся производным глутаровой и/или янтарной кислоты, и/или звеном на основе полиэтиленгликоля, и/или звеном соединения формулы II, которое проиллюстрировано выше. Природа линкерной группировки не должна препятствовать аффинности соединения формулы I к своим рецепторам-мишеням. К тому же, линкерная группировка не должна увеличивать фоновое поглощение печенью соединения формулы I, как это может происходить, например, если были использованы чрезмерно большие звенья на основе полиэтиленгликоля.
1
2
Когда либо Z, либо Z представляет собой группировку сахара, то она тоже может действовать как группировка-биомодификатор. "Группировка сахара" представляет собой углеводную группу, обычно являющуюся альдегидным или кетоновым производным многоатомного спирта. Она может представлять собой мономер (моносахарид), такой как фруктоза или глюкоза, или два сахара, соединенные вместе с образованием дисахарида. Дисахариды включают такие сахара, как сахароза, которая состоит из глюкозы и фруктозы. Термин "сахар" включает как замещенные, так и незамещенные сахара и производные Сахаров. Предпочтительно, сахар выбран из глюкозы, глюкозамина, галактозы, галактоза ми на, маннозы, лактозы, фукозы и их производных, таких как сиаловая кислота, производное глюкозамина. Сахар предпочтительно представляет собой α- или β-аномер. В частности, сахар может быть манно- или галакто-пиранозидом. Гидроксильные группы в молекуле сахара могут быть защищены, например одной или более чем одной ацетильной группой. Группировка сахара предпочтительно N-ацетилирована. Предпочтительные примеры таких Сахаров включают N-ацетил-галактозамин, сиаловую кислоту, нейраминовую кислоту, N-ацетилгалактозу и N-ацетил-глюкозамин.
"Группировкой органического красителя" может быть любой органический краситель, который взаимодействует со светом в диапазоне длин волн в электромагнитном спектре от ультрафиолетового света до ближнего инфракрасного. Предпочтительные группировки органического красителя включают группы, имеющие пространственно делокализованную электронную систему. Наиболее предпочтительной группировкой органического красителя является цианиновый краситель (CyDye™). Цианиновые красители представляют собой соединения, определяемые полиеновой цепью, содержащей нечетное количество атомов углерода, связанных чередующимися одиночными и множественными, предпочтительно двойными, углерод-углеродными связями, заканчивающейся на каждом из двух концов аминогруппой, одна из которых кватернизирована. Цианиновые и аналогичные арил-линкер-арил-содержащие хромофоры возможно несут боковые или конденсированные кольцевые заместители. Общее описание цианиновых красителей и их синтез описаны в US 6048982, US 5268486 и ЕР 1037947. Цианиновые красители для настоящего изобретения предпочтительно выбраны из группы, содержащей карбоцианины, оксацианины, тиацианины и азацианины.
Стадия "детекции" изложенного в данном описании способа включает детекцию сигналов, испускаемых "визуализирующейгруппировкой" соединения формулы I, с помощью детектора, чувствительного к указанным сигналам. Данную стадию детекции также можно понимать как сбор данных сигнала. Примерами сигналов, испускаемых визуализирующей группировкой, подходящих для применения в настоящем изобретении, являются любые, которые могут быть подвергнуты детекции: (1) вне организма человека, такие как гамма-излучение; или (2) посредством использования детекторов, разработанных для применения in vivo, таких как радиационные детекторы, разработанные для использования во время проведения операции. Стадию "генерирования" изложенного в данном описании способа осуществляют, используя компьютер с применением алгоритма реконструкции к полученным данным сигнала с получением на выходе набора данных. Этот набор данных затем обрабатывают, генерируя изображения, показывающие интересуемые области внутри субъекта.
Визуализирующая группировка соединения по изобретению предпочтительно выбрана из:
(1) иона радиоактивного металла;
(2) гамма-испускающего радиоактивного галогена;
(3) позитрон-испускающего радиоактивного вещества, не являющегося металлом; и
(4) иона парамагнитного металла.
64
48
52
55
94m
68
99m
111
113m
67
99m
64
68
111
99m
Когда визуализирующая группировка представляет собой ион радиоактивного металла, то есть радиоактивный металл, подходящие радиоактивные металлы могут быть либо позитрон-испускающими, такими как Cu, V, Fe, Co, Tc или Ga; либо γ-испускающими, такими как Tc, In In или Ga. Предпочтительными радиоактивными металлами являются Tc, Cu, Ga и In. Наиболее предпочтительные радиоактивные металлы являются у-испускающими, особенно Tc.
Когда визуализирующая группировка представляет собой ион парамагнитного металла, такие подходящие ионы металлов включают: Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) или Dy(III). Предпочтительными ионами парамагнитных металлов являются ионы Gd(III), Mn(II) и Fe(III), причем особенно предпочтителен Gd(III).
Когда визуализирующая группировка соединения формулы I представляет собой ион металла, он предпочтительно присутствует в виде металлического комплекса иона металла с синтетическим лигандом. Под термином "металлический комплекс" понимают координационный комплекс иона металла с одним или более чем одним лигандом. Строго предпочтительно, чтобы металлический комплекс был "устойчив к транс-хелатированию", то есть не подвергался легко обмену лиганда на другие лиганды, потенциально конкурирующие за центры координации металла. Потенциально конкурирующие лиганды включают другие эксципиенты в композиции in vitro (например, радиопротекторы или антимикробные консерванты, используемые в такой композиции) или эндогенные соединения in vivo (например, глутатион, трансферрин или белки плазмы). Термин "синтетический" имеет общепринятое значение, то есть искусственный, в противоположность выделенному из природных источников, например, из организма млекопитающего. Преимущество таких соединений заключается в том, что их получение и состав примесей можно полностью контролировать.
Лиганды, подходящие для применения в настоящем изобретении, которые образуют металлические комплексы, устойчивые к транс-хелатированию, включают: хелатирующие агенты, где 2-6, предпочтительно 2-4 донорных (для металла) атома организованы таким образом, что в результате образуются 5- или 6-членные хелатные кольца (имеющие при этом не образующий координационных связей остов, составленный или из атомов углерода, или из не образующих координационных связей гетероатомов, соединенных с донорными для металла атомами); или монодентатные лиганды, содержащие донорные атомы, которые образуют прочную связь с ионом металла, такие как изонитрилы, фосфины или диазениды. Примерами типов донорных атомов, которые хорошо связываются с металлами, как части хелатирующих агентов являются: амины, тиолы, амиды, оксимы и фосфины. Фосфины образуют такие прочные металлические комплексы, что даже монодентатные или бидентатные фосфины образуют подходящие металлические комплексы. Линейная геометрия изонитрилов и диазенидов такова, что она не позволяет им легко инкорпорировать в хелатирующие агенты, и поэтому их обычно используют в качестве монодентатных лигандов. Примеры подходящих изонитрилов включают простые алкилизонитрилы, такие как трет-бутилизонитрил, и эфир-замещенные изонитрилы, такие как MIBI (то есть 1-изоциано-2-метокси-2-метилпропан). Примеры подходящих фосфинов включают тетрофосмин и монодентатные фосфины, такие как трис(3-метоксипропил)фосфин. Примеры подходящих диазенидов включают лиганды серии HYNIC (гидразиноникотинамидов), то есть гидразин-замещенные пиридины или никотинамиды.
Когда ионом металла является ион технеция, подходящие хелатирующие агенты, образующие металлические комплексы, устойчивые к транс-хелатированию, включают, но этим не ограничиваются:
(1) диоксимы диаминов;
3
3
(2) NS-лиганды, имеющие тиолтриамидный набор донорных атомов, такие как MAG (меркаптоацетилтриглицин), и родственные лиганды; или имеющие диамидпиридинтиоловый набор донорных атомов, такие как Pica (пиколинамид);
2
2
(3) NS-лиганды, имеющие диаминдитиоловый набор донорных атомов, такие как ВАТ (бисаминоэтантиол) или ECD (то есть димер этилцистеината), или амидаминдитиоловый набор донорных атомов, такие как МАМА (моноаминмоноамид);
4
(4) N-лиганды с открытой цепью или макроциклические лиганды, имеющие тетраминовый, амидтриаминовый или диамиддиаминовый набор донорных атомов, такие как циклам (1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан), монооксоциклам, диоксоциклам; и
2
2
(5) NO-лиганды, имеющие диаминдифенольный набор донорных атомов.
Предпочтительными хелатирующими агентами по изобретению, когда визуализирующая группировка представляет собой технеций, являются диоксимы диаминов и тетраамины, предпочтительные варианты которых теперь будут описаны более подробно.
Предпочтительными диоксимами диаминов являются соединения формулы VII:
1
6
*
где каждый из Е-Е независимо представляет собой группу R;
*
*
*
1-10
3-10
2-10
1-10
1-10
2-10
1-10
каждый R представляет собой Н или Салкил, Салкиларил, Салкоксиалкил, Сгидроксиалкил, Сфторалкил, Скарбоксиалкил или Cаминоалкил, или две или более групп R вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют карбоциклическое гетероциклическое насыщенное или ненасыщенное кольцо, и где одна или более групп R конъюгирована с СВР;
e
и Q′ представляет собой мостиковую группу формулы -(J′)-;
*
*
*
2
e
где е равно 3, 4 или 5, и каждый J′ независимо представляет собой -О-, -NR- или -C(R)-, при условии что -(J′)- содержит максимально одну группу J′, представляющую собой -О- или -NR-.
Предпочтительные группы Q′ приведены ниже:
2
2
*
Q′ представляет собой -(CH)(CHR)(CH)-, то есть оксим пропиленамина или производные PnAO;
2
2
2
2
*
Q′ представляет собой -(CH)(CHR)(CH)-, то есть оксим пентиленамина или производные PentAO;
2
2
2
2
*
Q′ представляет собой -(CH)NR(CH)-.
1
6
1
6
1-3
3
Е-Е предпочтительно выбраны из: Cалкила, алкиларила, алкоксиалкила, гидроксиалкила, фторалкила, карбоксиалкила или аминоалкила. Наиболее предпочтительно, каждая группа Е-Е представляет собой СН.
*
1
6
*
*
*
*
*
*
*
*
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Диоксим диамина предпочтительно конъюгирован либо с группой R в Еили Е, либо с группой R группировки Q′. Наиболее предпочтительно, чтобы он был конъюгирован с группой R группировки Q′. Если он конъюгирован с группой R группировки Q′, то группа R предпочтительно находится в положении головы мостика. В таком случае Q′ предпочтительно представляет собой -(CH)(CHR)(CH)-, -(CH)(CHR)(CH)- или -(CH)NR(CH)-, наиболее предпочтительно -(CH)(CHR)(CH)-. Особенно предпочтительный диоксим диамина имеет формулу VIIa:
где:
7
20
*
каждый из Е-Е независимо представляет собой группу R, которая определена выше;
*
G представляет собой N или CR; и
Y′ представляет собой место присоединения к пептидной части соединения формулы I.
Предпочтительным хелатором формулы VIIa является соединение формулы VIIb:
где G является таким, как определено выше, и предпочтительно представляет собой СН. Способ получения Хелата I описан в WO 03/006070.
Предпочтительными тетрааминными хелаторами являются соединения формулы VIII:
где:
Y′′ представляет собой точку присоединения к остатку соединения формулы I; и
21
26
*
Е-Е представляют собой группы R, которые определены ранее.
Наиболее предпочтительный тетрааминный хелатор имеет формулу VIIIa:
где Y" является таким, как определено выше. Способ синтеза хелатора формулы VIIIa описан в WO 06/008496.
94m
99m
64
67
48
52
55
Вышеописанные лиганды особенно подходят для образования комплексов с технецием, например, Tc или Tc, и более полно описаны Jurisson и соавт.(Chem.Rev., 99, 2205-2218 (1999)). Данные лиганды также полезны для других металлов, таких как медь (Cu или Cu), ванадий (например, V), железо (например, Fe) или кобальт (например, Со).
Другие подходящие лиганды описаны в WO 91/01144 (Sandoz), где включены лиганды, которые особенно подходят для индия, иттрия и гадолиния, особенно лиганды на основе макроциклических аминокарбоксилата и аминофосфоновой кислоты. Лиганды, образующие неионные (то есть нейтральные) металлические комплексы с гадолинием, известны и описаны в US 4885363. Особенно предпочтительными для гадолиния являются хелаторы, включая DTPA (диэтилентриамин-пентауксусную кислоту), этилендиамин-тетрауксусную кислоту (EDTA), триэтилентетраамин-гексауксусную кислоту (ТТНА), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA), 10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусную кислоту (DO3A) и их производные.
В тех случаях, когда визуализирующая группировка представляет собой ион металла, присутствующий как часть металлического комплекса, предпочтительно присутствует присоединенная к ней линкерная группировка. Роль линкерной группировки в этом случае заключается в дистанцировании относительно объемного металлического комплекса, образующегося в результате координации металла, от активного сайта пептида с тем чтобы, например, не ухудшить связывания с субстратом. Этого можно достичь, используя комбинацию гибкости (например, простых алкильных цепей), чтобы объемная группа обладала степенью подвижности для размещения в стороне от активного сайта, и/или жесткости, как например, у циклоалкильного или арильного спейсера, который ориентирует металлический комплекс в стороне от активного сайта. Предпочтительные линкерные группировки в контексте этих хелаторов имеют остов с цепью, содержащей 2-10 атомов, наиболее предпочтительно 2-5 атомов, причем особенно предпочтительны 2 или 3 атома. Минимальная, состоящая из 2 атомов, цепь остова линкерной группы дает то преимущество, что хелатор оказывается хорошо отделенным от пептида, так что любое взаимодействие сведено к минимуму. Кроме того, маловероятно, что пептид будет эффективно конкурировать с хелатором за координацию иона металла. Таким образом поддерживаются как биологические целевые характеристики пептида, так и способность хелатора к комплексообразованию с металлом. Строго предпочтительно, чтобы металлический комплекс был связан с пептидом таким образом, чтобы данная связь не подвергалась быстрому метаболизму в крови. Это связано с тем, что подобный метаболизм будет приводить к отщеплению используемого для визуализации металлического комплекса до того, как меченый пептид достигнет желаемого сайта-мишени in vivo. Поэтому пептид предпочтительно является связанным ковалентной связью с металлическим комплексом через линкерные группировки, включая связи, не подверженные быстрому метаболизму. Такими подходящими связями являются углерод-углеродные связи, амидные связи, мочевинные или тиомочевинные связи или простые эфирные связи.
2
q
Преимущество непептидных линкерных групп, таких как алкиленовые группы или ариленовые группы, заключается в том, что они не образуют в значительной мере водородных связей с пептидной частью соединения формулы I, так что линкер не взаимодействует с пептидом. Предпочтительными алкиленовыми спейсерными группами являются -(CH)-, где q представляет собой целое число величиной от 2 до 5. Предпочтительно, q равно 2 или 3. Предпочтительные ариленовые спейсеры имеют формулу IX:
где: каждый из а и b независимо равен 0, 1 или 2.
2
2
р
р
p
2
2
2
3
Таким образом, предпочтительной линкерной группировкой в данном описании является -СНСН-(L)-, где L такой, как он определен выше, и р представляет собой целое число от 0 до 3. Наиболее предпочтительно, -(L)- представляет собой -СО- или -NR-. Что касается соединения формулы VIIb, где G представляет собой N, и -(L)- представляет собой -NH-, то дополнительное преимущество этой группировки, заключается в том, что она происходит из имеющегося в продаже симметричного промежуточного соединения N(CHCHNH).
4
-
Если визуализирующий металл представляет собой технеций, то обычным исходным веществом для технеция является пертехнетат, то есть ТсО , в котором технеций находится в окисленном состоянии Tc(VII). Сам пертехнетат не образует легко металлические комплексы, поэтому получение комплексов на основе технеция обычно требует добавления подходящего восстанавливающего агента, такого как ион двухвалентного олова, для ускорения комплексообразования в результате уменьшения степени окисления технеция до более низких значений, обычно от Тс(I) до Tc(V). Растворитель может быть органическим или водным либо представлять собой их смеси. Если растворитель содержит органический растворитель, то он предпочтительно представляет собой биосовместимый растворитель, такой как этанол или DMSO. Предпочтительно, чтобы растворитель был водным и наиболее предпочтительно представлял собой изотонический физиологический раствор.
123
131
77
125
123
Если визуализирующей группировкой является гамма-испускающий радиоактивный галоген, то этот радиоактивный галоген соответственно выбран из I, I или Br. I исключен специально, поскольку не подходит для применения в качестве визуализирующей группировки для визуализации in vivo вне объекта. Предпочтительным гамма-испускающим радиоактивным галогеном для визуализации in vivo является I.
Если визуализирующей группировкой является радиоактивный йод, то соединение формулы I может быть получено с использованием соединения-предшественника, включая производное, которое либо подвергается электрофильному или нуклеофильному иодированию, либо подвергается конденсации с меченым альдегидом или кетоном. Примерами первой категории являются:
(а) металлоорганические производные, такие как триалкилолово (например, триметилстаннил или трибутилстаннил) или триалкилсилан (например, триметилсилил) или бороорганическое соединение (например, сложные боронатные эфиры или органические соединения трифторборатов);
(б) нерадиоактивный алкилбромид для галогенного обмена или алкилтозилат, -мезилат или -трифлат для нуклеофильного иодирования;
(в) ароматические кольца, активированные для нуклеофильного иодирования (например, соль арил-иодония, соли арилдиазония, арилтриалкиламмония или нитроарильные производные).
Такие предпочтительные соединения-предшественники включают: нерадиоактивный атом галогена, как например в арилиодиде или -бромиде (для возможного обмена радиоактивного йода); металлоорганическое соединение-предшественник (например, триалкилолово, триалкилсилил или бороорганическое соединение); или органический предшественник, такой как триазены, или хорошую уходящую группу для нуклеофильного замещения, как например в соли иодония. Для радиоиодирования предпочтительно, чтобы соединение-предшественник являлось металлоорганическим соединением-предшественником, наиболее предпочтительно триалкилоловом.
Соединения-предшественники и способы введения радиоактивного йода в органические молекулы описаны Bolton (J. Lab. Comp. Radiopharm., 45, 485-528 (2002)). Подходящие бороорганические соединения сложных боронатных эфиров и их получение описаны Kabalka и соавт. (Nucl. Med. Biol., 29, 841-843 (2002) и 30, 369-373(2003)). Подходящие органические соединения трифторборатов и их получение описаны Kabalka и соавт.(Nucl. Med. Biol., 31, 935-938 (2004)).
Примеры арильных групп, к которым может быть присоединен радиоактивный йод, приведены ниже:
Оба они содержат заместители, которые позволяют легко проводить замещение радиоактивного йода в ароматическом кольце. Тирозиновый остаток позволяет осуществлять радиоиодирование с использованием собственной фенольной группы.
Альтернативные заместители, содержащие радиоактивный йод, могут быть синтезированы путем прямого иодирования посредством обмена радиоактивного галогена, например:
Радиоактивный атом йода предпочтительно присоединен посредством прямой ковалентной связи к ароматическому кольцу, такому как бензольное кольцо, или винильной группе, поскольку известно, что атомы йода, связанные с насыщенными алифатическими системами, склонны к метаболизму in vivo и поэтому потере радиоактивного йода.
11
13
15
17
18
75
76
124
11
13
18
124
11
18
18
Когда визуализирующая группировка представляет собой позитрон-испускающее радиоактивное вещество, не являющееся металлом, в состав таких подходящих позитрон-испускающих веществ входят: С, N, O, F, F, Br, Br или I. В состав предпочтительных позитрон-испускающих радиоактивных веществ, не являющихся металлами, входят С, N, F и I, в частности С и F, особенно F.
18
18
18
18
18
18
2
3
2
2
3
Радиофторирование может быть осуществлено посредством прямого введения метки с использованием взаимодействия F-фторида с подходящей химической группой в соединении-предшественнике, содержащем хорошую уходящую группу, такую как алкилбромид, алкилмезилат или алкилтозилат. F также может быть ввведен путем алкилирования N-галогеноацетильных групп реагентом F(CH)OH с получением производных - NH(CO)CHO(CH) F. Для арильных систем одним из подходящих способов получения арил-F-содержащих производных является нуклеофильное замещение на F-фторид с использованием соли арилдиазония, арилнитросоединения или арил-содержащей соли четвертичного аммония.
18
18
18
3
F-меченны соединение по изобретению может быть получено посредством образования F-фтордиалкиламинов и последующего образования амида, когда F-фтордиалкиламин приводят во взаимодействие с предшественником, содержащим, например, хлор, P(O)Ph или активированный сложный эфир.
Другой подход для радиофторирования, который особенно подходит для получения радиофторированных пептидов, описан в WO 03/080544, и в нем используют сочетание через тиоловое соединение (thiol coupling). Соединение-предшественник, содержащее один из следующих заместителей:
приводят во взаимодействие с соединением формулы X:
X
Y
Y
y
где Y представляет собой линкерную группировку формулы -(L)-, где L является таким, как определено ранее для L, y равно 1-10, и возможно включает 1-6 гетероатомов;
X
X
X
x
X представляет собой линкер формулы -(L)-, где L является таким, как определено ранее для L, х равно 1-30, и возможно включает 1-10 гетероатомов; и
* определяет место присоединения к остальной части соединения;
с получением радиофторированных визуализирующих агентов формулы (Ха) или (Xb), соответственно:
X
X
где X, Y и * являются такими, как определено выше.
Дополнительный подход, который особенно подходит для радиофторирования пептидов, описан в WO 04/080492, и в нем используется сочетание через аминокси-соединение (aminoxy coupling). Радиофторирование осуществляют путем взаимодействия соединения-предшественника формулы (XI) с соединением формулы (XIa):
или
путем взаимодействия соединения-предшественника формулы (XII) с соединением формулы (XIIa):
,
где:
XI
XII
XI
XI
Z
X и X представляют собой линкерные группы -(L)-, где L является таким, как определено ранее для L, z равно 1-10, и возможно включает 1-6 гетероатомов;
1
R представляет собой альдегидную группировку, кетонную группировку, защищенный альдегид, такой как ацеталь, защищенный кетон, такой как кеталь, или функциональную группу, такую как диол или N-концевой остаток серина, который быстро и эффективно может быть окислен до альдегида или кетона с использованием окисляющего агента;
2
1
2
R представляет собой функциональную группу, которая в мягких условиях, таких как водный буфер, сайт-специфически взаимодействует с R с образованием стабильного конъюгата. R может представлять собой производные аммиака, такие как первичный амин, вторичный амин, гидроксиламин, гидразин, гидразид, аминокси, фенилгидразин, семикарбазид или тиосемикарбазид и предпочтительно представляет собой гидразин, гидразид или группу аминокси;
3
4
3
R представляет собой функциональную группу, которая сайт-специфически взаимодействует с R. R может представлять собой производные аммиака, такие как первичный амин, вторичный амин, гидроксиламин, гидразин, гидразид, аминокси, фенилгидразин, семикарбазид или тиосемикарбазид и предпочтительно представляет собой гидразин, гидразид или группу аминокси;
4
R представляет собой альдегидную группировку, кетонную группировку, защищенный альдегид, такой как ацеталь, защищенный кетон, такой как кеталь, или функциональную группу, такую как диол или N-концевой остаток серина, который быстро и эффективно может быть окислен до альдегида или кетона с использованием окисляющего агента;
с получением конъюгата формулы (XIII) или (XIV), соответственно:
1-6
5-6
XI
XII
где W представляет собой -CO-NH-, -NH-, -О-, -NHCONH- или -NHCSNH- и предпочтительно представляет собой -CO-NH-, -NH- или -О-; Y представляет собой Н, Cалкильные или Cарильные заместители, и где X, X и * являются такими, как определено ранее.
18
Дополнительные подробности путей синтеза F-меченных производных описаны в Bolton, J. Lab. Сотр. Radiopharm., 45, 485-528 (2002).
99m
123
11
18
Предпочтительными визуализирующими группировками являются такие, которые могут быть задетектированы вне объекта, неинвазивным способом после введения in vivo, как например посредством однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT), позитронной эмиссионной томографии (PET) и магнитно-резонансной визуализации (MRI). Наиболее предпочтительные визуализирующие группировки являются радиоактивными, в особенности представляют собой ионы радиоактивных металлов, гамма-испускающие радиоактивные галогены и позитрон-испускающие радиоактивные вещества, не являющиеся металлами, в частности подходящие для визуализации с использованием SPECT или PET, например Tc, I, С и F.
1
2
1
2
2
В одном из предпочтительных воплощений W и W оба представляют собой линкерные группировки, Z представляет собой группировку органического красителя, и Z представляет собой визуализирующую группировку. Эти соединения и способы их получения представлены в WO 2006/054904. Наиболее предпочтительно, Z представляет собой радиоактивную визуализирующую группировку. Примеры таких предпочтительных соединений включают следующее:
Способы получения Соединений 1-4 подробно описаны в WO 2006/054904.
1
1
2
2
В альтернативном предпочтительном воплощении W представляет собой линкерную группировку, Z представляет собой визуализирующую группировку, W представляет собой возможную линкерную группировку, и Zпредставляет собой водород. Такие соединения и способы их получения представлены в WO 2005/012335. Примеры таких предпочтительных соединений включают следующее:
Способы получения Соединений 1а-10а аналогичны способам для Соединений 1-10 за исключением того, что для Соединений 1а-10а используют тетрааминную хелатную группировку вместо хелатной группировки в виде диоксима диамина в случае Соединений 1-10. Конъюгирования с тетрааминной хелатной группировкой достигают, используя обычную реакцию пептидного сочетания с Вос-защищенными структурами.
Ряд следующих модифицированных соединений синтезировали с целью улучшения биораспределения, то есть главным образом с целью снижения фонового поглощения в печени. Подробности синтеза Соединений 11-15 приведены ниже в Примерах 8-10. Соединение 11 было разработано для оценки эффекта замены хелатной группировки в виде диоксима диамина на тетрааминную хелатную группировку. В Соединение 12 добавляли группы цистеиновой кислоты. Соединение 13 имеет дополнительную группировку ПЭГ с N-концевой стороны пептида. Соединение 14 имеет дополнительную группировку ПЭГ с С-концевой стороны пептида. В Соединении 15 использовали тетрааминную хелатную группировку в дополнение к ряду остатков глутаминовой кислоты.
Способ, изложенный в данном описании, начинается с "предоставления" субъекта, которому введено детектируемое количество соединения формулы I. Задача способа по изобретению заключается в обеспечении диагностически полезного изображения. Ввиду этого, введение субъекту соединения формулы I может рассматриваться как предварительный шаг, необходимый для облегчения генерирования указанного изображения. Предпочтительно, указанным субъектом является млекопитающее и наиболее предпочтительно человек. Наиболее предпочтительно, указанным субъектом является интактный организм млекопитающего in vivo. Следовательно, в предпочтительном воплощении соединение формулы I введено в виде фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение вместе с биосовместимым носителем, в форме, подходящей для введения млекопитающему. Предпочтительным способом введения является внутрисосудистое введение. В альтернативном воплощении введение детектируемого количества соединения формулы I осуществляют как часть данного способа.
После стадии предоставления и перед стадией детекции соединению формулы I дают возможность связаться с любой тканью, характеризующейся фиброгенезом, у указанного субъекта. Например, если субъектом является интактное млекопитающее, соединение формулы I будет динамично перемещаться по организму млекопитающего, контактируя в нем с различными тканями. Как только соединение придет в контакт с какой-либо тканью, характеризующейся фиброгенезом, произойдет специфическое взаимодействие, таким образом, клиренс соединения из ткани, характеризующейся фиброгенезом, будет происходить дольше, чем из ткани без фиброгенеза. Будет достигнут некоторый момент времени, когда будет возможна детекция соединения, специфически связавшегося с тканью, характеризующейся фиброгенезом, обусловленная соотношением между связыванием соединения с тканью, характеризующейся фиброгенезом, и связыванием с тканью без фиброгенеза. В идеальном случае такое соотношение составляет по меньшей мере 2:1.
"Биосовместимый носитель" представляет собой текучую среду, особенно жидкость, в которой соединение формулы I суспендируют или растворяют таким образом, чтобы композиция была физиологически приемлемой, то есть ее можно было вводить в организм млекопитающего без токсичности или чрезмерного дискомфорта. Биосовместимой средой-носителем является подходящим образом инъецируемая жидкость-носитель, такая как стерильная, апирогенная вода для инъекций; водный раствор, такой как физиологический раствор (который предпочтительно может быть сбалансирован таким образом, чтобы конечный продукт для инъекции был либо изотоническим, либо не гипотоническим); водный раствор одного или более регулирующих тоничность веществ (например, солей катионов плазмы крови с биосовместимыми противоионами), Сахаров (например, глюкозы или сахарозы), спиртов Сахаров (например, сорбита или маннита), гликолей (например, глицерина) или других неионных высокомолекулярных спиртов (например, полиэтиленгликолей, пропиленгликолей и тому подобного). Биосовместимая среда-носитель также может содержать биосовместимые органические растворители, такие как этанол. Такие органические растворители полезны для солюбилизации более липофильных соединений или композиций. Предпочтительно, биосовместимой средой-носителем является апирогенная вода для инъекций, изотонический физиологический раствор или водный раствор этанола. Величина рН биосовместимой среды-носителя для внутривенной инъекции находится соответственно в диапазоне от 4,0 до 10,5.
3
Для удобства такие фармацевтические композиции по настоящему изобретению поставляются в контейнере, который снабжен герметичным уплотнителем, подходящим для однократного или многократного прокалывания иглой для подкожных инъекций (например, обжатой крышкой с герметизирующей прокладкой) с поддержанием при этом стерильной чистоты. Такие контейнеры могут содержать однократные или многократные дозы для пациентов. Предпочтительные контейнеры для многократных доз включают единый флакон (например, объемом 10-30 см), который содержит многократные предназначенные для пациента дозы, с помощью которого однократные предназначенные для пациента дозы могут, таким образом, быть отобраны в шприцы для клинического применения с различными интервалами времени в течение срока годности препарата в соответствии с клинической ситуацией. Предварительно заполненные шприцы сконструированы для включения однократной дозы для человека или "стандартной дозы" и поэтому предпочтительно представляют собой шприц одноразового применения или другой шприц, подходящий для клинического применения. В том случае, когда фармацевтическая композиция представляет собой радиофармацевтическую композицию, предварительно заполненный шприц возможно может быть снабжен предохранительным кожухом для шприца для защиты оператора от дозы радиоактивного излучения. Такие подходящие кожухи для шприцев с радиофармацевтическими веществами известны в данной области техники и предпочтительно содержат либо свинец, либо вольфрам.
Фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме набора. Альтернативно, она может быть изготовлена в асептических условиях производства с получением желаемого стерильного продукта. Фармацевтическая композиция также может быть изготовлена в нестерильных условиях с последующей окончательной стерилизацией с использованием, например, гамма-облучения, автоклавирования, обработки сухим жаром или химической обработки (например, этиленоксидом).
В следующем аспекте изобретения соединение формулы I может быть использовано для применения в изготовлении лекарственного средства для определения наличия, локализации и/или степени фиброгенеза в органе или области организма субъекта. Предпочтительные и наиболее предпочтительные воплощения соединения формулы I, органа или области организма, субъекта и способа введения такие, как они определены выше.
Изобретение полезно для установления наличия, локализации и/или количества активированных HSC, являющихся индикатором фиброгенеза. Это имеет особенное преимущество, поскольку ткань, характеризующаяся фиброгенезом, является лучшим маркером ранней стадии активного заболевания, чем фиброзная ткань, при этом последняя также присутствует, когда процесс заболевания разрешается. Поэтому идентификация процесса заболевания может быть выполнена на той стадии, когда проведение лечения может быть наиболее эффективным.
Эти преимущества продемонстрированы в следующих далее неограничивающих примерах.
Краткое описание примеров
В примере 1 продемонстрировано, что Соединение 6 специфически связывается с активированными HSC человека in vitro.
В примере 2 описаны способы, использованные для создания модели лигирования желчных протоков крысы и связанной с ней модели ложного оперирования, а также гистопатологическое подтверждение.
В примере 3 продемонстрирована корреляция между поглощением Соединения 8 и фиброгенезом. Отмечается высокий уровень маркеров фиброгенеза в модели лигирования желчных протоков (BDL) у крысы (описанной в примере 2) на 15-е сутки после операции, и наиболее высокая степень поглощения Соединения 8 в печени, характеризующейся фиброгенезом, в модели BDL у крысы на 15-е сутки после операции.
В примере 4 показано, что связывание Соединения 8 в печени, характеризующейся фиброгенезом, при BDL специфически ингибируется нерадиоактивным Соединением 8.
v
В примере 5 продемонстрирована корреляция между экспрессией α-интегрина и поглощением Соединения 8.
В примерах 6-10 описан синтез Соединений 11-15.
Сокращения, использованные в примерах
ВСА
Анализ с использованием бицинхониновой кислоты
BDL
Лигирование желчных протоков
Boc
трет-Бутилоксикарбонил
BSA
Бычий сывороточный альбумин
DIEA
Диизопропилэтиламин
DMF
Диметилформамид
EA-Hy966
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека
EGTA
Этиленгликоль-тетрауксусная кислота
ESI-MS
Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением
FBS
Фетальная сыворотка теленка
Fmoc
9Н-Флуорен-9-ил-метоксикарбонил
MBHA
пара-Метил бензгидриламин
DCC
1,3-Дициклогексилкарбодиимид
DMSO
Диметилсульфоксид
HATU
Гексафторфосфат N-оксида(N-[(диметиламино)-1H-1,2,3-триазоло-[4,5-b]пиридин-1-илметилен]-N-метилметанаминия
HPLC
Высокоэффективная жидкостная хроматография
HOAt
1-Гидрокси-7-азабензотриазол
HSC
Звездчатые клетки печени
в.д.
Введенная доза
в.в.
Внутривенно
ITLC
"Мгновенная" тонкослойная хроматография
K<sub>d</sub>
Константа диссоциации
LC-MS
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия
NMM
N-Метилморфолин
NMP
1-Метил-2-пирролидинон
NPP
пара-Нитрофенилфосфат
PBS
Забуференный фосфатом физиологический раствор
ПЭГ
Полиэтиленгликоль
PEI
Полиэтиленимин
PMSF
Фенилметилсульфонилфторид
PyAOP
Гексафторфосфат (7-азабензотриазол-1-илокси)-трипирролидинофосфония
RIPA
Радиоиммуннопреципитационный анализ
п.к.
Подкожно
SUV
Стандартизированный уровень поглощения
TFA
Трифторуксусная кислота
UV
Ультрафиолет
Примеры
Пример 1. Связывание Соединения 6 с активированными HSC человека
1(1) Связывание с мембранами, полученными из клеток ЕА-Hy926
Константу ингибирования Соединения 6 измеряли, используя описанный ранее анализ связывания с мембранами (Indrevoll et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett, 2006, 16,6190-6193).
d
125
Кратко, получали мембраны из клеточной линии эндотелиальных клеток аденокарциномы человека ЕА-Hy926 и рассчитывали K для очищенной мембранной фракции. Далее осуществляли анализ конкурентного ингибирования для нерадиоактивного Соединения 6 с целью измерения констант ингибирования. В качестве меченого лиганда использовали I-эхистатин, а нерадиоактивный эхистатин - в качестве стандарта сравнения.
125
Готовили в общей сложности шестнадцать разведений нерадиоактивного тестируемого соединения (или нерадиоактивного эхистатина или нерадиоактивного Соединения 6) и смешивали с комбинацией I-эхистатина и мембран перед инкубацией в течение 1 часа при 37°C. После нескольких промывок связавшийся материал собирали на фильтре, используя микрохарвестер Skatron. В заключение области фильтрования вырезали и просчитывали на γ-счетчике Packard.
125
На Фиг.1 показано связывание I-эхистатина в сравнении со связыванием нерадиоактивного Соединения 6 и эхистатина на мембранах ЕА-Ну926.
1(2) Связывание с активированными звездчатыми клетками печени человека
2
2
125
125
Активированные звездчатые клетки печени человека LX-2 (предоставленные проф. Scott L. Friedman, Mount Sinai School of Medicine, New York) культивировали в 12-луночных планшетах (Nunc) до конфлюентности в модифицированной Дульбекко среде Игла, содержащей 10% FBS, пенициллин, стрептомицин и глутамин. Клетки дважды промывали в холодном буфере, содержащем 50 мМ трис, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MnCl, 1 мМ CaCl и 0,01% BSA. Затем клетки инкубировали в буфере, содержащем следовое количество меченого соединения (или 0,1 нМ I-Соединение 6, или 0,1 нМ I-эхистатин) вместе с нерадиоактивным соединением в различных концентрациях в течение 60 мин при 4°C со встряхиванием. После инкубации несвязавшийся материал удаляли, промывая клетки 3 раза холодным буфером. Клетки открепляли от лунок, добавляя 0,1 М NaOH, и переносили в пробирку для подсчета на гамма-счетчике (Packard). На Фиг.2 показаны наблюдаемые значения активности.
Пример 2. Животные с лигированными желчными протоками (BDL) и ложнооперированные животные
2(1) Создание животной модели
Беспородных самцов крыс Sprague Dawley (180-200 г; Charles River) использовали во всех исследованиях, связанных с лигированием желчных протоков (BDL) и ложными операциями. После акклиматизации в течение 6 суток крыс разделяли на 2 группы (группа с BDL и ложнооперируемая группа).
Животным с BDL брили брюшную область и протирали раствором бетадина с последующим подкожным введением (п.к.) карпрофена (5 мг/кг) и бупронорфина (5 мг/кг) и под анестезией изофлураном производили вскрытие в середине брюшной полости и локализовали общие желчные протоки. Желчные протоки дважды лигировали, первое лигирование делали между соединением печеночных протоков, а второе выше входного отверстия панкреатических протоков.
Второй группе (ложнооперируемые животные) брили брюшную область и протирали раствором бетадина с последующим п.к. введением карпрофена (5 мг/кг) и бупронорфина (5 мг/кг). Животных подвергали ложной хирургической операции, при которой производили манипуляции с желчными протоками и шовный материал пропускали выше желчных протоков.
Перед зашиванием в брюшную полость каждого животного вводили по 2-3 мл физиологического раствора. Фасцию и кожу зашивали и животным вводили п.к. 2 мг/кг метаклопромида, п.к. 5 мг/кг байтрила и п.к. ~2 мл физиологического раствора. В течение следующих двух суток давали карпрофен (5 мг/кг), как было необходимо. За животными внимательно наблюдали на протяжении эксперимента.
2(2) Введение тестируемого соединения и биораспределение
На соответствующий день после операции животных с BDL и ложнооперированных животных извлекали и производили анестезию изофлураном, затем каждому животному посредством внутривенной инъекции (в.в.) через хвостовую вену вводили по 0,3 мл соединения (~3 МБк). Через соответствующий промежуток времени после инъекции тестируемого соединения каждое животное подвергали повторной анестезии изофлураном, умерщвляли посредством смещения шейных позвонков и регистрировали вес, используя систему сканирования штрихкодов. Каждое животное вскрывали, извлекали приведенные далее органы и ткани и подсчитывали, используя протокол счета BASIL 40, или подсчитывали в ручном режиме.
Кость*
Мышца*
Кровь*
Почки
Мочевой пузырь и моча (B/U)
Легкое
Печень*
Селезенка
Желудок и содержимое
Тонкий и толстый кишечник (SI и LI)
Сердце
Щитовидная железа
Кожа*
Скелет
Место инъекции
*взвешенные образцы
Зарегистрированную радиоактивность в целом органе (например, печени) корректировали с учетом фоновой радиоактивности и радиоактивного распада и биораспределение радиоактивного вещества рассчитывали в соответствии с формулой 1:
где:
А означает число импульсов в секунду, измеренное для органа;
В означает общее число импульсов в секунду, измеренное для всех образцов (за исключением места инъекции).
Процент введенной посредством инъекции радиоактивности во взвешенных образцах ткани (например в крови) рассчитывали, получая % введенной дозы во всей ткани в соответствии с формулой 2:
где:
s
Z означает число импульсов в секунду в образце;
s
W означает вес образца в граммах;
b
W означает вес животного в граммах сразу после умерщвления;
В означает общее число импульсов в секунду, измеренное для всех образцов (за исключением места инъекции);
F означает тканеспецифический фактор, представляющий собой отношение массы ткани к общей массе тела животного.
Ткань
F
Кость
0,05
Мышца
0,43
Кровь
0,058
Кожа
0,18
Жир
0,07
2(3) Гистопатологическое подтверждение
Срезы печени каждого животного фиксировали в 10%-ном забуференном до нейтрального значения растворе формалина при комнатной температуре, заливали парафином и готовили срезы толщиной 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином (Н&Е) для оценки гиперплазии желчных протоков, некроза и воспаления, и трихромом по Гомори для оценки фиброза (окраска коллагена), используя стандартные протоколы окрашивания, описанные ранее (Gomori, 1950, Am. J. Clin. Pathol. 20: 661-663).
Гистологическую классификацию повреждения печени проводили полуколичественно по степени и тяжести каждого из поражений, затем давали количественную оценку поражения в баллах от 0 до 5 следующим образом: нет поражения = 0, минимальное = 1, среднее = 2, умеренное = 3, заметное = 4, тяжелое = 5. Гистологическую оценку тканей проводили "вслепую" как в отношении суток после операции, так и процедуры (то есть ложной операции в сравнении с лигированием желчных протоков). Все данные направляли дополнительно на экспертную оценку патологоанатому. Гистологический анализ проводили с использованием световой микроскопии. Срезы рассматривали с освещением методом светлого поля, используя объективы 40Х, 100Х или 400Х.
В Таблице 4 суммированы данные гистопатологической оценки.
Таблица 4
Обработка
Патология
Сутки 3
Сутки 5
Сутки 10
Сутки 15
Сутки 28
Ложная операция
Все виды
0
0
0
0
0
BDL
Гиперплазия желчных протоков
1
1
2
3
3
Воспаление
0/1
0/1
0/1
0/1
0/1
Некроз
1
0/1
0/1
0/1
0/1
Фиброз
1
2
4
4
2
Представленные данные свидетельствуют в поддержку использования этой модели, в особенности на 15-е сутки, как подходящей модели фиброза печени, в которой идентифицируют молекулы, демонстрирующие специфическое поглощение, ассоциированное с фиброгенезом.
Пример 3. Соединение 8. поглощенное в печени, характеризующейся фиброгенезом. в модели крысы с BDL (на 15-е сутки, когда маркеры фиброгенеза находятся на высоком уровне) в сравнении с ложнооперированными животными
Животные модели с BDL и ложным оперированием создавали, как описано в примере 2. Поглощение Соединения 8 рассчитывали в виде стандартизированного уровня поглощения следующим образом:
s
Z означает число импульсов в секунду в образце;
s
W означает вес образца в граммах;
t
Z означает общее число импульсов в секунду, измеренное для всех образцов (за исключением места инъекции);
t
W означает вес животного в граммах.
Процент радиоактивности в скелете рассчитывали, сравнивая число импульсов в секунду в оставшемся скелете после иссечения, и корректировали с учетом оставшихся на скелете тканей после отбора тканей. Биологическая вариабельность в составе тканей тела может приводить к небольшим неточностям в определении уровней для тканей и, следовательно, возможной завышенной или недостаточной коррекции уровня для скелета. В случаях завышенной коррекции уровня для скелета это обычно приводит к получению отрицательных величин.
На Фиг.3 суммированы данные по удерживанию радиоактивного соединения, выраженные в виде SUV, в печени животных с BDL и ложнооперированных животных через 1 час после инъекции в хвостовую вену Соединения 8 на 2-е, 5-е, 10-е, 15-е, 28-е сутки после операции и соединения с "перестановленной" структурой в качестве отрицательного контроля (структура ниже) на 2-е сутки после операции.
Результаты демонстрируют значительное удерживание радиоактивного соединения у животных с BDL по сравнению с ложнооперированными животными для всех протестированных временных точек, причем максимальное удерживание радиоактивного соединения наблюдалось в печени у животных с BDL на 10-е и 15-е сутки после операции. У ложнооперированных животных не было никакой существенной разницы в поглощении печенью для любых временных точек после операции.
Пример 4. Связывание Соединения 8 с печенью, характеризующейся фиброгенезом, при BDL специфически ингибируется нерадиоактивным Соединением 8
Биораспределение радиоактивного соединения исследовали на 15-е сутки после операции у самцов крыс с BDL и у ложнооперированных самцов крыс Sprague Dawley (процедуры описаны в примере 2) через 1 час после внутривенной инъекции в хвостовую вену ~3 МБк Соединения 8 как до, так и после добавления нерадиоактивного Соединения 8 в соотношении (в избытке) 1:100 и 1:10000. В соответствующий момент времени после инъекции тестируемого соединения каждое животное подвергали повторной анестезии изофлураном, умерщвляли посредством смещения шейных позвонков и взвешивали. Каждое животное вскрывали, органы и ткани (см. Таблицы 5 и 6, ниже) извлекали и подсчитывали, используя протокол счета BASIL 40, или подсчитывали в ручном режиме.
Главные области аккумулирования радиоактивного соединения (в % в.д.) через один час после инъекции животным с BDL суммированы ниже в Таблице 5.
Таблица 5
BDL, через 60 минут
Соединение 8
100-кратный избыток
10000-кратный избыток
Средн.
SD±
Средн.
SD±
Средн.
SD±
Кость
3,02
0,53
2,97
0,16
3,18
0,40
Мышца
10,76
2,37
8,76
0,19
9,61
1,40
Кровь
1,47
0,15
1,61
0,09
1,60
0,13
Почки
3,78
0,08
4,20
0,26
3,61
0,29
Мочевой пузырь и моча
40,98
0,37
38,27
0,70
41,58
6,57
Легкое
0,43
0,02
0,50
0,01
0,50
0,08
Печень
12,73
7,10
16,10
3,33
9,81
2,08
Селезенка
0,51
0,00
0,57
0,04
0,52
0,10
Желудок
0,89
0,07
0,96
0,12
1,69
0,72
Тонкий и толстый кишечник
8,32
1,50
7,41
0,48
8,58
1,73
Сердце
0,13
0,00
0,13
0,01
0,14
0,01
Щитовидная железа
0,04
0,02
0,04
0,02
0,06
0,01
Кожа
12,58
2,02
12,02
0,41
12,99
0,63
Скелет
4,36
0,88
6,47
1,83
6,14
0,60
Место инъекции
1,32
0,26
1,75
0,35
1,68
0,07
SD - стандартное отклонение
Главные области аккумулирования радиоактивного соединения (в % в.д.) через один час после инъекции ложнооперированным животным суммированы ниже в Таблице 6.
Таблица 6
BDL, через 60 минут
Соединение 8
+100-кратный избыток
+10000-кратный избыток
Средн.
SD±
Средн.
SD±
Средн.
SD±
Кость
3,10
0,19
3,06
0,63
2,42
0,10
Мышца
10,43
0,82
10,92
0,40
8,41
1,02
Кровь
1,55
0,14
1,37
0,09
1,40
0,16
Почки
4,07
0,13
4,13
0,11
3,65
0,52
Мочевой пузырь и моча
44,65
2,79
43,25
2,87
46,52
4,68
Легкое
0,46
0,07
0,38
0,04
0,39
0,05
Печень
3,71
0,66
3,52
0,39
3,03
0,31
Селезенка
0,29
0,02
0,29
0,06
0,27
0,02
Желудок
0,90
0,11
1,21
0,15
1,92
1,07
Тонкий и толстый кишечник
7,86
0,12
8,42
0,60
7,54
1,01
Сердце
0,12
0,02
0,10
0,01
0,10
0,01
Щитовидная железа
0,05
0,02
0,05
0,00
0,04
0,01
Кожа
14,37
0,71
13,97
0,93
12,69
1,37
Скелет
8,45
0,67
9,32
1,01
11,63
1,90
Место инъекции
1,66
0,12
1,44
0,06
1,71
0,15
SD - стандартное отклонение
Пример 5. Поглощение Соединения 8 и положительная регуляция альфа-γ-интегрина при BDL на 15-е сутки
Животные модели с BDL и ложным оперированием создавали, как описано в примере 2. В каждые 2-е, 15-е и 28-е сутки после операции животным вводили -3 МБк Соединения 8 и поглощение печенью оценивали, как описано в примере 2.
у
Экспрессию α-интегрина в печени животных измеряли на образцах гомогенизированной печени животных с BDL и ложнооперированных животных. В каждые 2-е, 15-е и 28-е сутки после операции животных умерщвляли, печени извлекали и хранили при -70°C.
Предварительно взвешенную печень извлекали из морозильника (-70°С) и помещали в предварительно охлажденную ступку с пестиком в присутствии небольшого количества жидкого азота. Печень измельчали почти до гомогенного порошка (во время измельчения печени добавляли небольшое количество жидкого азота для постоянного поддержания ткани в замороженном состоянии). Измельченную печень помещали в предварительно охлажденную мерную посуду для лекарственных средств и помещали в морозильник на -70°C до дальнейшего использования. 1 г замороженной измельченной ткани добавляли непосредственно в 10 мл охлажденного во льду буфера для RIPA (Sigma; 150 мМ NaCl; 1,0% игепала (изооктил-феноксиполиэтиленоксиэтанола) СА-630 (детергента); 0,5% дезоксихолата натрия (анионного детергента); 0,1% SDS (додецилсульфата натрия); 50 мМ трис, рН 8,0), содержащего 1 мМ EDTA, 0,25 М сахарозу и свежедобавленный коктейль протеазных ингибиторов (Sigma) (10 мкл коктейля/мл лизирующего буфера). Данную смесь подвергали гомогенизации, используя гомогенизатор с острыми лезвиями, при 4°C и выдерживали на влажном льду в течение 30 минут.
Гомогенат переносили в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Доунса для тканей и производили три хода пестика вверх и вниз при 4°C. Затем гомогенат ткани переносили в предварительно охлажденные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 30 минут при 30000 об/мин и 4°C. Супернатанты извлекали (суммарный клеточный лизат) и помещали на влажный лед.
2
В каждом образце определяли относительную концентрацию белка, используя имеющийся в продаже набор для анализа белка со стандартами BSA в соответствии с инструкцией производителя (Pierce, USA) (аликвоты BSA следует готовить в модифицированном буфере для RIPA, который использовали для гомогенизации). Далее делали разведения супернатанта от каждого образца в диапазоне от 1:50 до 1:200 в НО и концентрацию белка определяли, используя многолуночный (99-луночный) планшетный ридер (iEMS). Каждый образец разделяли на аликвоты по 1 мл и хранили при -70°C до дальнейшего использования.
Готовили разведения предназначенных для иммобилизации антител против альфа-γ-интегрина (BD; номер по каталогу 611013) в соответствующей концентрации в растворе для связывания (0,05 М трис; 0,138 М NaCl и 0,0027 М KCl) и добавляли или по 50, или по 100 мкл в каждую лунку планшета для ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) с увеличенной прочностью связывания белка (96-луночные планшеты Nunc-Immuno™, MaxiSorp). Антитела использовали в количестве 200 нг/лунка. Планшеты герметично закрывали и инкубировали либо в течение 1 часа при 37°C, либо в течение ночи при 4°C. Планшеты опорожняли и оставшиеся сайты связывания белка на микротитрационном планшете насыщали путем инкубации с блокирующим буфером (3% BSA/TBS (забуференный Трисом физиологический раствор) с 0,02% азида натрия, приблизительно 300 мкл на лунку). Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение 1 часа при 37°C, затем 3 раза промывали смесью TBS/0,01% Твин-20. Неразбавленный супернатант гомогената печени и/или стандарты очищенного альфа-γ-интегрина в различных концентрациях готовили в блокирующем буфере и добавляли в трех повторах (100 мкл на лунку) в сенсибилизированные планшеты, затем герметично закрывали и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Планшеты промывали 4 раза смесью TBS/0,05% Твин-20 и в лунки добавляли вторые детектирующие антитела против интегрина (Chemicon AB1930), разведенные в блокирующем буфере, и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Планшеты 4 раза промывали смесью TBS/0,05% Твин-20 и в лунки добавляли конъюгированные со щелочной фосфатазой вторичные антитела (Sigma; номер по каталогу А7539), специфичные к данному детектирующему антителу, и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Планшеты промывали 4 раза смесью TBS/0,05% Твин-20 и в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора субстрата NPP и инкубировали либо в течение 2 ч при комнатной температуре, либо в течение ночи при 4°C. За ходом гидролиза следили качественно посредством визуальной оценки или количественно с применением ридера для микротитрационных планшетов. В тех случаях, когда в результате гидролиза NPP появлялось желтое окрашивание по истечении рекомендуемого времени инкубации, измеряли оптические плотности на заданных длинах волн (405 нм) на планшетном ридере для ELISA (Spectra-Max Plus). Гидролиз останавливали, добавляя 50 мкл 5 М гидроксида натрия (NaOH).
Для получения количественных результатов сравнивали сигнал от исследуемых образцов с сигналом для кривой для стандартов. Статистические анализы проводили, используя GraphPad PRISM, версию 4.0. Различия между группами анализировали, применяя непараметрический однофакторный ANOVA (дисперсионный анализ). Во всех статистических анализах вероятность менее 0,05 (Р<0,05) считалась статистически значимой.
v
v
На Фиг.4 и Фиг.5 проиллюстрирована экспрессия α-интегрина у животных с BDL по сравнению с ложнооперированными животными и продемонстрирована корреляция экспрессии α-интегрина с поглощением Соединения 8.
2
2
R
+
Сложный Вос-тетраамин-Ы-гидроксисукцинимидный эфир (WO 2006/008496) (36 мг; 0,050 ммоль) предварительно активировали, используя HOAt (1,4 мг; 0,010 ммоль) и NMM (17 мкл; 0,15 ммоль) в DMF (0,5 мл), в течение 10 мин и затем добавляли к раствору Cys2-6(c[CHCO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-ПЭГ(4)-дишоиколоил-NH (WO 03/006491)) (12,6 мг; 0,010 ммоль) в DMF (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 суток, затем концентрировали в вакууме. Защитные группы Вое удаляли путем добавления раствора TFA/вода/триизопропилсилан (95:2,5:2,5; 10 мл) в течение 90 мин. Смесь концентрировали, неочищенный продукт осаждали из эфира и очищали препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-20% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 нм и 254 нм) с получением после лиофилизации 10,4 мг соединения. Структуру подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-20% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t (время удерживания) = 2,02 мин; m/z 1458,7 (МН).
99m
-
99m
2
3
3
4
2
2
2
Введение метки Tc осуществляли путем добавления в продутый азотом Р46-флакон следующего: 100 мкг IGF-предшественника 1 или 2 в МеОН; 0,5 мл NaCO/NaHCO-буфера (рН 9,2); 0,5 мл ТсО  из генератора Tc Drytec™; 0,1 мл раствора комплекса SnCl/MDP (содержащего 10,2 мг SnCl и 101 мг метилендифосфоновой кислоты в 100 мл продутого Nфизиологического раствора).
Пример 7. Синтез соединения 12
R
+
Синтез выполняли на высвобождающей амидную группу АМ-смоле Ринка в масштабе 0,3 ммоль (0,432 г; нагрузка 0,71 ммоль/г). Первые три стадии сочетания проводили в аппарате с ручным барботированием азотом. Группы Fmoc на смоле отщепляли в соответствии со стандартным протоколом (20%- ный пиперидин в DMF). Проводили сочетание Fmoc-Суз(тритил)-ОН (702 мг; 1,20 ммоль) со смолой в DMF, используя стандартные агенты сочетания HATU и D1EA. Завершение реакции сочетания проверяли, используя стандартный тест Кайзера. После отщепления Fmoc реакцию сочетания повторяли, вводя второй цистеин. Смолу суспендировали в растворе дихлорметанЛТА/триизопропилсилан (94:5:1; 10 мл). Через 3 мин желтый раствор сливали. Данную стадию повторяли 6 раз, гарантируя полное удаление защиты с функциональных тиоловых групп бокововых цепей. Смолу промывали дихлорметаном и сушили (в токе азота в течение 30 мин). Смесь 20%-ной муравьиной кислоты (18 мл) и 35%-ной перекиси водорода (2 мл) оставляли на 1 ч при комнатной температуре и затем охлаждали до 0°C. Смолу промывали аликвотой раствора пермуравьиной кислоты (2×4 мл) и затем выдерживали в растворе пермуравьиной кислоты (5 мл) в течение 12 ч при 5°C со слабым встряхиванием. Проводили отщепление, используя аликвоту смолы (TFA/вода/триизопропилсилан; 95:2,5:2,5), и анализировали посредством LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 50×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 5-50% В в течение 5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм; ESI-MS), подтверждая структуру: t=2,48 мин; m/z 564,3 (MNa).
R
+
После удаления Fmoc (стандартный протокол) с указанной выше смолы проводили сочетание Fmoc-амино-ПЭГ(4)-дигликолевой кислоты (796 мг; 1,50 ммоль) со смолой в DMF, используя стандартные агенты сочетания (HATU и DIEA). Через 6 ч проводили отщепление, используя аликвоту смолы (описано в предыдущем разделе), и анализировали посредством LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 50×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 5-50% В в течение 5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм; ESI-MS), подтверждая полное превращение: t=3,28 мин; m/z 832,3 (МН).
Сочетание всех последующих аминокислот осуществляли, применяя автоматический пептидный синтезатор ABI433A с использованием протокола сочетания SlowMoc для ~0,25 ммоль указанной выше смолы, получая Н-Lys(Boc)-Cys(tBu)-Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-ПЭГ(4)-дигликолоил-CyA-CyA-(высвобождающая амидную группу смола Ринка) (CyA представляет собой цистеамид, Рте представляет собой 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил).
R
+
Раствор хлоруксусной кислоты (142 мг; 1,50 ммоль) и DCC (155 мг; 0,75 ммоль) в дихлорметане (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем фильтровали и концентрировали. Остаток переносили в DMF и добавляли к указанной выше смоле с пептидом. Пептид отщепляли от смолы, используя раствор TFA/вода/триизопропилсилан (95:2,5:2,5; 10 мл), в течение 2 ч. Раствор концентрировали и неочищенный пептид осаждали из эфира и сушили в вакууме, получая 340 мг. Наличие хлорацетилированного пептида подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 50×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 0-50% В в течение 5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=3,09 мин; m/z 1710,6 (МН).
R
+
К раствору пептида (68 мг) в 50%-ном ацетонитриле (64 мл) добавляли 2,5%-ный аммиак до рН 8,5. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Полноту циклизации тиоэфира подтверждали посредством анализа LC-MS. Ацетонитрил удаляли при пониженном давлении и водный раствор лиофилизировали. Выделенное вещество переносили в 5%-ный раствор DMSO в TFA (100 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 60 мин. Смесь концентрировали и неочищенный продукт выделяли осаждением из эфира с последующей очисткой препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2); 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В=ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 5-20% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм), получая 48 мг твердого вещества. Образование дисульфидного мостика подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 50×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 0-30% В в течение 5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=3,18 мин; m/z 1560,5 (МН).
R
2
2+
Частично растворенную смесь пептида (5 мг), (Хелат 1)-глутарил-тетрафтортиофенолового эфира (WO 03/006491) (5 мг) и DIEA (2,7 мкл) в NMP (1,5 мл) нагревали при 40°C в течение ночи. Смесь очищали препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2); 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 0-30% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 2,9 мг чистого продукта. Структуру подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 0-30% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=3,83 мин; m/z 1000,7 (МН).
99m
Введение метки Tc осуществляли, как описано в WO 2003/006491.
Пример 8. Синтез соединения 13
2
2
R
+
Проводили сочетание Вос-ПЭГ(6)-дигликолевой кислоты (50 мг; 0,10 ммоль) с Cys2-6(c[CHCO-Lys-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-ПЭГ(4)-дигликолоил-NH (WO 03/006491)) (25,2 мг; 0,020 ммоль) в DMF, используя стандартные агенты сочетания (HATU и NMM). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и концентрировали в вакууме. Защитные группы Вое удаляли, добавляя раствор TFA/вода/триизопропилсилан (95:2,5:2,5; 10 мл) в течение 45 мин при комнатной температуре. Смесь концентрировали с последующим осаждением неочищенного продукта из эфира. Продукт очищали препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-30% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 5,5 мг соединения. Наличие продукта подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-25% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=3,01 мин; m/z 1636,0 (МН).
R
2
2+
Проводили сочетание (Хелат 1)-глутаровой кислоты (WO 03/006491) (15,6 мг; 0,034 ммоль) с пептидом (5,5 мг; 0,0034 ммоль) в DMF, используя стандартные агенты сочетания (PyAOP (гексафторфосфат 7-азабензотриазол-1-илокси-трис-(пирролидино)фосфония) и NMM). Через 4 ч смесь очищали препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В=ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 15-30% В в течение 40 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 3,8 мг соединения. Структуру подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 15-30% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=2,13 мин; m/z 1039,0 (МН).
99m
Введение метки Tc осуществляли, как описано в WO 2003/006491.
Пример 9. Синтез соединения 14
Синтез выполняли в аппарате с ручным барботированием азотом на высвобождающей амидную группу АМ-смоле Ринка (нагрузка 0,72 ммоль/г) в масштабе 0,80 ммоль. Группу Fmoc на смоле отщепляли в соответствии со стандартным протоколом. Проводили сочетание Fmoc-ПЭГ(4)-дигликолевой кислоты (850 мг; 1,6 ммоль) со смолой, используя стандартные агенты сочетания (PyAOP и DIEA) в DMF. Реакцию конъюгирования с последующим удалением Fmoc-защиты повторяли до тех пор, пока на смолу не было введено 5 ПЭГ(4)-дигликолоильных групп.
R
+
Проводили сочетание Fmoc-Cys(Trt)-OH (1,0 ммоль) с указанной выше смолой (0,2 ммоль), используя стандартные агенты сочетания (PyAOP и NMM) в смеси DMF/дихлорметан (1:1; 6 мл). Через 2,5 ч проводили отщепление, используя аликвоту смолы (описано выше), и анализировали посредством LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-80% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм; ESI-MS): t=2,3 мин; m/z 1794,1 (МН), демонстрируя полное превращение.
5
Сочетание всех последующих аминокислот осуществляли, применяя автоматический пептидный синтезатор ABI433A с использованием протокола сочетания SlowMoc для приблизительно 0,1 ммоль указанной выше смолы, получая H-Lys(Boc)-Cys(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-(ПЭГ(4)-дигликолоил)-(высвобождающая амидную связь смола Ринка) (Pbf представляет собой 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил).
Ангидрид хлоруксусной кислоты (2,00 ммоль) синтезировали, перемешивая раствор хлоруксусной кислоты (378 мг; 4,00 ммоль) и DCC (412 мг; 2,00 ммоль) в дихлорметане (10 мл) в течение 1 ч с последующей фильтрацией. Раствор концентрировали, остаток переносили в DMF (3 мл) и добавляли к указанной выше смоле с пептидом. Добавляли NMM (220 мкл; 2,00 ммоль) и смесь оставляли на 3 ч. Проводили отщепление, используя аликвоту смолы (описано выше), и анализировали посредством LC-MS, подтверждая полное превращение. Пептид отщепляли от смолы, добавляя раствор TFA/вода/триизопропилсилан (95:2,5:2,5; 10 мл), в течение 3 ч. Раствор концентрировали.
Вышеупомянутый остаток переносили в воду (100 мл) и экстрагировали эфиром. К водному раствору добавляли ацетонитрил (100 мл) и рН подводили до 8, добавляя разбавленный аммиак. Реакционную смесь оставляли на ночь. Ацетонитрил выпаривали и неочищенный продукт извлекали лиофилизацией, получая 154 мг. Полноту циклизации тиоэфира подтверждали посредством анализа LC-MS.
Вышеупомянутое выделенное вещество переносили в 5%-ный раствор DMSO в TFA (80 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 60 мин. Смесь концентрировали и неочищенный продукт выделяли осаждением из эфира с последующей очисткой препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 15-25% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 5 мг чистого вещества. Образование дисульфидного мостика подтверждали посредством анализа LC-MS.
R
2
2+
Проводили сочетание (Хелат I)-глутаровой кислоты (WO 03/006491) (9 мг; 0,02 ммоль) с указанным выше пептидом, используя стандартные агенты сочетания (PyAOP и DIEA), в DMF в течение ночи. Продукт очищали препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-30% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 1,3 мг соединения. Структуру подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-60% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=1,8 мин, m/z 1430,1 (МН).
99m
Введение метки Tc осуществляли, как описано в WO 2003/006491.
Пример 10. Синтез соединения 15
5
2
Пептидную последовательность H-Lys(Boc)-Cys(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Cys(tBu)-Phe-Cys(Trt)-Gly-[Glu(OtBu)]-NH собирали, используя автоматический пептидный синтезатор ABI 433A, на высвобождающей амидную группу МВНА-смоле Ринка (0,1 ммоль) с использованием способа сочетания SlowMoc.
R
R
+
+
Раствор хлоруксусной кислоты (378 мг; 4,00 ммоль) и DCC (412 мг; 2,00 ммоль) в дихлорметане (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем фильтровали и концентрировали. Остаток переносили в DMF и добавляли к описанной выше смоле с пептидом. Добавляли NMM (220 мкл; 2,00 ммоль) и реакционную смесь оставляли на 2 ч. Проводили отщепление, используя аликвоту смолы (описано выше), и анализировали посредством LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 20-30% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм; ESI-MS): t=2,2 мин; m/z 1820,7 (МН), подтверждая полное превращение. Пептид отщепляли от смолы путем добавления раствора TFA/вода/триизопропилсилан (95:2,5:2,5; 10 мл) в течение 2 ч. Раствор концентрировали и неочищенный продукт выделяли осаждением эфиром с последующей очисткой препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna С18(2); 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 20-40% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм). Наполовину очищенный продукт извлекали лиофилизацией и переносили в смесь 50% ацетонитрила/вода (6 мл). рН подводили до 8, добавляя разбавленный аммиак, и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Ацетонитрил выпаривали при пониженном давлении и продукт извлекали лиофилизацией, получая 14,8 мг. Циклизацию тиоэфира подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-60% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=2,0 мин; m/z 1785,0 (МН).
R
+
Вышеупомянутый выделенный пептид переносили в 5%-ный раствор DMSO в TFA (8 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Смесь концентрировали и неочищенный продукт осаждали из эфира с последующей очисткой HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2), 250×10 мм; 10 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-20% В в течение 60 мин; скорость потока 5 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм) с получением 2 мг чистого вещества. Наличие пептида подтверждали анализом с использованием LC-MS (колонка Phenomenex Luna С18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 10-60% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=1,0 мин, m/z 1670,8 (МН).
R
2
2+
К раствору полученного выше пептида (2 мг, 1 мкмоль) и сложного Вос-тетраамин-N-гидроксисукцинимидного эфира (WO 2006/008496) (8,6 мг; 0,012 ммоль) в DMF добавляли DIEA (3 мкл; 0,02 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и подвергали очистке препаративной HPLC (колонка Phenomenex Luna C18(2); 250×21,2 мм; 5 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 20-80% В в течение 60 мин; скорость потока 10 мл/мин, УФ-детекция при 214 и 254 нм). Чистый продукт лиофилизировали и растворяли в смеси TFA и дихлорметана (1:1, 2 мл). Через 2 ч растворитель выпаривали и остаток переносили в смесь ацетонитрил/вода и лиофилизировали с получением 1,0 мг чистого продукта. Структуру подтверждали анализом посредством LC-MS (колонка Phenomenex Luna C18(2); 20×2 мм; 3 мкм; растворители: А = вода/0,1% TFA и В = ацетонитрил/0,1% TFA; градиент 0-20% В в течение 5 мин; скорость потока 0,6 мл/мин; УФ-детекция при 214 и 254 нм, ESI-MS): t=4,2 мин, m/z 935,5 (МН).
99m
Введение метки Tc осуществляли, как описано выше для Соединения 11 в примере 6.