МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ ИВЕРМЕКТИНА В ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЙ ПАСТЕ - ЭКВИВЕРМ

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ ИВЕРМЕКТИНА В ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЙ ПАСТЕ - ЭКВИВЕРМ

Мусаев М.Б.*, Шумакович И.Е.*, Емельянова Н.Б.*, Кочетков П.П.**, Абрамов В.Е.** ВНИИП - филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН

Введение. Разработанный нами препарат для лечения однокопытных животных при паразитозах, представляет союбой стойкую пасту липкой консистенции светло-бежевого цвета, где содержится 2,0% раствора субстанции ивермектина в виде межмолекулярного комплекса с полимерами и 98,0% формирующих пасту компонентов, под условным названием эквиверм. Для дозированного введения животным паста расфасована в приспособленные одноразовые шприцы ёмкостью 10-20 мл, рассчитанные на обработку животного массой 500-800 кг. Препарат назначают против нематод и личинок оводов пищеварительного тракта, однократно перорально с помощью шприца-дозатора по беззубому краю на корень языка, в терапевтической дозе 0,2 мг/кг по ДВ или 1 мл пасты на 100 кг массы животного. Эквиверм успешно прошел доклинические и клинические испытания [1, 2, 3, 4, 5]. Для внедрения его в ветеринарную практику необходимо было разработать нормативные документы: технические условия (ТУ), опытно-промышленный регламент на производство препарата (ОПР), инструкцию по применению препарата, в которых необходимо описать, как проводить контроль качества препарата.

Объектом исследования является противопаразитарная паста для лошадей на основе ивермектина.

Цель исследования. Разработать методику для контроля качества и определения массовой доли субстанции ивермектина в противопаразитарной пасте - эквиверм.

Материалы и методы. Внешний вид и цвет препарата определяют визуально в стеклянном стаканчике ГОСТ 25336 при дневном освещении. Окраску препарата определяют по ГФ XI вып.1, стр. 197. Подлинность -методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Время выхода пика исследуемой пробы должно совпадать со временем выхода пика в растворе стандартного образца.

Определение массовой доли ивермектина в пасте

Материалы реактивы посуда и оборудование:

-ивермектин-стандартный образец;

-жидкостной хроматограф высокого давления с УФ детектором; хроматографическая колонка «КгоуавП Е1егпИе ХТ 5-С18», 250X4,6 мм, размер частиц 5 мкм, либо аналогичная обращённофазная колонка;

- предколонка Kromasil С18 3.0x4.0 или аналогичная;

фильтровальная установка для получения деионизированной воды (класс Milli-Q) с удельным сопротивлением 18 МОм*см (Millipore Integral 5) или аналогичная

- весы лабораторные по ГОСТ Р 53228;

- колбы мерные по ГОСТ 1770;

- стеклянные пипетки по ГОСТ 29169;

- ацетонитрил для ВЖХ;

- спирт метиловый по ГОСТ 6995:

- центрифуга;

- УЗ-ванна.

Подготовка стандартного образца ивермектина

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают около 25 мг (точная навеска) с учётом чистоты СО (стандартного образца) ивермектина.

Растворяют навеску в ацетонитриле и доводят объём раствора тем же растворителем до метки, перемешивают. Примерная концентрация полученного раствора 1 мг/мл. Из полученного раствора методом разбавления готовят растворы концентрацией ивермектина 250, 300, 400, 500, и 550 мкг/мл. Подготовка раствора испытуемого образца. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают около 2,0 г (точная навеска до третьего знака после запятой) исследуемого препарата. Добавляют 50 мл ацетонитрила и обрабатывают в УЗ ванне в течение 10 минут. Затем доводят раствор до метки ацетонитрилом и тщательно перемешивают. 1 мл полученного раствора переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 6000 об./мин. Супернатант переносят в виолу автосемплера. Концентрация ивермектина в полученном растворе должна составлять около 400 мкг/мл.

Подготовка раствора элюента Элюэнт готовят смешением деионизированной воды с метанолом в соотношении 5:95. Смесь тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ ванне в течение 15 минут.

Проведение испытания

В устройство ввода (инжектор) жидкостного хроматографа вводят последовательно равные объёмы испытуемого и стандартного растворов (концентрации раствора стандартного образца 250, 300, 400, 500 и 550 мкг/мл). Количество инжекций для каждого образца не менее трёх. Относительное стандартное отклонение в серии последовательных вколов не должно превышать 2%.

Условия хроматографирования:

- элюэнт: 95 % метанола— 5% деионезированной воды;

- длина волны детектора— 254 нм;

- расход элюэнта — 1,2 мл/мин;

- объём вкола 10 мкл;

- температура термостатирования колонки -30°С;

- время выхода пиков ивермектина при данных условиях:-5,8 и - 6,5 мин.

Результаты. Обработка результатов проводится после проведения процедуры хроматографирования, сумма площадей пиков двух форм ивермектина усредняют, находя среднее арифметическое для каждого уровня концентрации стандартного образца. По полученным данным строят калибровочный график зависимости отклика сигнала детектора от концентрации ивермектина. По оси абсцисс откладывают концентрации инжектированных стандартных растворов (с учётом чистоты стандарта и массы навески в мкг/мл), а по оси ординат — площадь пика. Методом линейной регрессии по уравнению «у=ах» определяют значение калибровочного коэффициента «а», а также коэффициента корреляции II2.

Калибровка признаётся удовлетворительной, если соблюдается следующее условие: И2> 0,99.

Содержание ивермектина (суммарное содержание ивермектина В1а и В1в) в препарате в % вычисляют по формуле: 81ум*Ук*100

Х= -

а* Ш1ум*Ю00

Где: Бгум - средняя площадь ивермектина в трёх параллельных инжекциях раствора испытуемого образца; Ук- объём колбы с испытуемым препаратом (100мл); М^ум - масса навески препарата в мг; а - калибровочный коэффициент; 1000 - коэффициент пересчёта мкг в мг

За окончательный результат принимают среднее арифметическое из трёх параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать ± 5%.

Заключение. В результате проведённых исследований были разработаны, испытаны и провалидированы методы количественного определения массовой доли субстанции ивермектина в новой отечественной противопаразитарной пасте эквиверм, необходимые для контроля качества препарата при производстве препарата.

Литература: 1.Емельянова Н.Б., Самойловская Н.А.//С6. мат. докл. научн. конф. "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями".-М.-2014,-Вып.15. - С. 95-99. 2.Емельянова Н.Б.//С6. мат. докл. научн. конф. "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями".- М.-2015.-Вып.16. - С. 132-134. З.Емельянова Н.Б.//Сб.мат. докл. научн. конф. "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями" вып.16, М.2015- С. 134-137. 4.Мусаев М.Б., Берсанова Х.И. и др.//Сб. мат. докл. научн. конф. "Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями".-М.- 2017.-Вьш.18.-С.289-292. 5.Мусаев М.Б., Вацаев Ш.В. Берсанова Х.И. и др.//Сб. мат. докл. научн. конф."Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями".- М.-2017.-Вып.18.- С. 285-288.

Methods determination of the mass fraction of ivermectin antiparasitic in post - aquiver. Musaev M.B., Shumakovich I.E., Emelyanova N.B., , Kochetkov P.P., Abramov V.E. All-Russian K. I. Skryabin Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants. International research center for the protection of human health, animals and the environment (LLC mnits "OZOS").

Summary. The result of the research was developed, tested and validated using past methods of quantitative determination of mass fraction of substance ivermectin in new domestic antiparasitic pasta aquifer required for quality control of the drug in the manufacture of the drug.