Вещества из пиролизованных тканей тушек пресмыкающихся различным образом модулируют иммунитет млекопитающих разного пола

Вещества из пиролизованных тканей тушек пресмыкающихся различным образом модулируют иммунитет млекопитающих разного пола

Д. Г. МАЛЬДОВ', А. П. БЕЛЬКОВ', А. В. ИЛЬИЧЕВ', Е. И. АСТАШКИН2, С. С. ГРИГОРЯН3, В. Л. АНДРОНОВА4, Г. А. ГАЛЕГОВ4

' ЗАО «Скай ЛТД»

2 Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова, Москва

3 Институт микробиологии, эпидемиологии и иммунологии им. Н. Ф. Гамалеи, Москва

4 Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского, Москва

Substances from Pyrolised Tissues of Reptile Carcases Differently Modulate Immunity of Mammals of Both Sexes

D. G. MALDOV, A. P. BELKOV, A. V. ILYICHEV, E. I. ASTASHKIN, S. S. GRIGORYAN, V. L. ANDRONOVA, G. A. GALEGOV Sky Co., Ltd., Moscow

I. M. Sechenov 1st Moscow State Medical University, Moscow

N. F. Gamaleya Institute of Microbiology, Epidemiology and Immunology, Moscow

D. I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow

В водорастворимом пиролизованном материале из тушек пресмыкающихся были обнаружены вещества, обладающие тендерным действием на иммунную систему. Гендерные различия были показаны на выделенных нейтрофилах крови, цельной крови и in vivo по противовирусной активности на экспериментальных животных, инфицированных тремя видами вирусов: вирусом простого герпеса типа I, вирусом энцефаломиокардита и вирусом гепатита мышей. Вероятный механизм действия, ингибирующий иммунную защиту самцов, связан с протеинкиназным каскадом, включающим протеинкиназу С, активируемым форболмиристатом в клетках иммунной системы.

Ключевые слова: иммунная система, гендерноеразличие, экспериментальные животные, вирусы.

Substances with gender action on immunity were detected in water soluble hydrolised matter from reptile carcases. The gender action was shown on isolated blood neutrophils, whole blood and in vivo by the antiviral activity on experimental animals, contaminated with three types of viruses: Herpes simplex type 1, the virus of encephalomyocarditis and the virus of hepatitis of mice. The possible mechanism of the inhibitory action on the male immunity was associated with the protein kinase cascade, including protein kinase C, activated by phorbolmyristate in the cells of the immune system.

Key words: immune system, gender difference, experimental animals, viruses.

Введение их протекание проходит у мужчин и женщин раз-

В системе регуляции иммунной системы у самок и самцов, по крайней мере, у млекопитающих имеются существенные отличия. Большая часть показанных в настоящее время отличий связана с влиянием на иммунную систему половых гормонов [1, 2]. В частности, у человека иммунная система женщин более реактивна, чем мужчин, поэтому первые лучше защищены от инфекций, но чаще страдают от аутоиммунных заболеваний [3]. Отличия наблюдаются не только в разной концентрации половых гормонов, но и различной концентрации клеток иммунной системы в крови, так как в крови женщин больше лимфоцитов [1]. Для целого ряда заболеваний было отмечено, что

лично именно из-за реакций иммунной системы [4, 5]. Таким образом, существование гендерных различий в иммунной системе млекопитающих мужского и женского пола очевидно. Однако веществ, по-разному взаимодействующих с клетками, отвечающими за иммунный ответ у людей и животных разного пола, не обнаружено. Задачей данной работы являлось исследовать ряд веществ, различно модулирующих реакции иммунитета в препаратах крови людей и экспериментальных животных разного пола.

Адрес для корреспонденции: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16. Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского

© Коллектив авторов, 2014

Препараты. Препарат 8.7 представляет собой экстракт из пиролизованных тканей пресмыкающихся, обработанный хлороформом для удаления гидрофобных примесей. Экстракт был разделен гель-фильтрацией на G-15 (рис. 1, а), а затем на DEAE Сефарозе (рис. 1, б). На отдельные вещества разделение производилось на колонке Silica (рис. 1, в).

Рис. 1. Выделение фракции 8.7 и содержащихся в ней веществ.

а - Гель-фильтрация препарата из пресмыкающихся на G-15. Стрелкой выделен пик фракции 8. Пунктирной линией - обозначен профиль, регистрируемый при длине волны 254 нм, сплошной линией - 280 нм; б- Ионообменная хроматография на DEAE-Сефарозе. Стрелкой выделен пик фракции 8.7; в - Разделение фракции 8.7 на отдельные вещества на ВШса.

Коммерческие реактивы и среды: форболовый эфир — 12-О-тетрадеканолилфорбол-13-ацетат (Sigma), люцигенин (Sigma), среда Хенкса (Институт полиомиелита и вирусныгх энцефалитов им. М.П.Чумакова).

Активность в пробах цельной крови и во фракции нейтрофи-лов. Метод регистрации биологической активности изучаемый фракций — хемилюминесценция образцов цельной крови в присутствии люминофора — люцигенина, как описано ранее [6]. Биологическая активность количественно выражается в условных единицах хемилюминесценции — у.е.

Выделение нейтрофилов. Гепаринизированную кровь мужчин и женщин получали из локтевой вены. Нейтрофилы выделяли с помощью центрифугирования на двухступенчатом градиенте плотности Фиколл-Гипак (1,119 и 1,078 г/мл). Образование радикалов кислорода регистрировали на хеми-люминометре «Биотокс» (Россия) в имп/сек.

В качестве растворителя для образцов препарата 8.7 использовалась среда Хенкса, в ней же проводилось тестирование активности нейтрофилов.

Вирусы. Вирус герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) получен из Государственной коллекции музея вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В мортальныгх опытах использовалась заражающая доза вируса, обеспечивающая при внутрибрюшинном (в/б) введении 60% гибель животных в контрольной нелеченой группе. Препарат 8.7 вводили в/б в разовой дозе 100 мкг/мышь в объёме 0,2 мл двукратно: первое введение через два часа после заражения, второе — через 72 ч после заражения.

Вирус гепатита мышей. В исследовании использован сухой, лиофилизированный вирус гепатита мышей (ВГМ), штамм Мещерина (семейство коронавирусов), полученный из Государственной коллекции музея вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

В/б заражение экспериментальным: мышей проводили в дозе 100 LD50 на мышь в объёме 200 мкл. В первый день препарат 8.7 вводили через 2 ч после заражения и второе введение — через 72 ч после заражения.

Вирус энцефаломиокардита мышей. В исследовании использован вирус энцефаломиокардита мышей (EMC), штамм «Колумбия SK-Col-SK», из Государственной коллекции музея вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН с инфекционной активностью в культуре фиброблас-тов мышей L-929 107 ТЦД50.

В/б заражение экспериментальным мышей проводили в дозе 100 LD50 на мышь в объёме 200 мкл. В первый день препарат 8.7 вводили через 2 ч после заражения и затем через 72 ч после заражения.

Животные. В работе использовано 240 белыгх беспородный: (б/п) мышей массой 16—18 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН (самок и самцов). Из них по 60 особей обоего пола (n=60) бышо использовано для предварительного титрования инфекционной активности вирусов, остальные — для проведения экспериментальных исследований.

Для оценки противовирусной активности препарата in vivo для каждой из исследуемых групп вычисляли:

— % гибели животныгх;

— среднюю продолжительность жизни животных (СПЖ);

— % защиты препарата;

— коэффициент защиты препарата (КЗ).

По окончании срока наблюдения вытживших мышей забивали, вскрывали и проводили визуальное исследование ос-новныгх органов-мишеней ВГМ-инфекции — печени, жёлчного пузыря, кишечника.

Величину инфекционного титра ВПГ-1 в органном материале определяли с использованием метода бляшкообразова-ния [7], как описано нами ранее [8].

Увеличение средней продолжительность жизни животных вычисляли по формуле:

УСПЖ= СПЖК - СПЖп,

где СПЖК — средняя продолжительность жизни (СПЖ) в контрольной группе; СПЖп — средняя продолжительность жизни в группе, где применяли исследуемый препарат.

Результаты исследований

НАДФН-оксидаза является одним из наиболее характерных ферментов иммунной системы, на активность которых влияют практически все иммуномодуляторы, действующие непосредственно на нейтрофилы и моноциты.

Вещества, выделенные из фракции 8.7, по-разному действовали на способность экскретировать супероксид радикал НАДФН-оксидазой цельной крови доноров разного пола. В пробах цельной крови доноров-женщин закономерность действия различных веществ в дозе 10 мкг/мл выражалась разным количеством экскретируемого супероксида 8.7.1<8.7.2<8.7.3 при значительном различии его общего содержания у разных доноров. У доноров-мужчин закономерность индукции НАДФН-окси-дазы была несколько иной: 8.7.1<8.7.2>8.7.3 (рис. 2, а). При использовании в опыте суспензии выделенных нейтрофилов из крови женщин основное соотношение индуцированной активности для разных веществ из фракции 8.7 в концентрации 10 мкг/мл, было то же самое, что и для цельной крови — 8.7.1<8.7.2<8.7.3 (рис. 2, б). У доноров-мужчин НАДФН-оксидаза выделенных нейтрофилов обладала едва различимой активностью в ответ на добавление в среду 10 мкг/мл 8.7.1, и вообще не реагировала на добавление 8.7.2, и только при введении 8.7.3 эффект был сравним с таковым у женщин, хотя и ниже в 2—2,7 раза (рис. 2, б).

Действие вещества 8.7.1 в препаратах цельной крови мужчин и женщин описывалось различными концентрационными кривыми.

В крови мужчин наблюдалось увеличение продукции активного кислорода при концентрации вещества 5 мкг и спад при 20 мкг 8.7.1; в препарате крови женщин в данном диапазоне концентраций действие препарата описывалось фактически прямой паралельной оси абсцисс (рис. 3). Кроме того, в крови доноров-мужчин (п=6) в присутствии любого из веществ фракции 8.7 (8.7.1, 8.7.2, 8.7.3 и 8.7.4) в концентрации 20 мкг/мл полностью блокировался эффект форбо-лового эфира на НАДФН-оксидазу нейтрофилов. В пробах крови доноров-женщин (п=8) этого эффекта не наблюдалось.

Все остальные полученные вещества действовали по очень сходным с 8.7.1 концентрационным закономерностям, хотя и с различной индуцирующей способностью. Наиболее активны были фракции 8.7.2 и 8.7.3 (у отдельных доноров до 2200 условных единиц люминесценции), наименее активной была фракция 8.7.4. Смесь фракций превосходила по активности индукции все фракции (до 4500 условных единиц люминесценции).

r. ÜOÜO

§ ÍOÍIO ÍJ

= 1500 к

3 юга

J 3<Ж>

S 1500

I 1000

I -

К О

—

1____

1 14VDO i tioi'i ' ' гш

t,f.¿ООО z«

000 | [ G00 1 jjj

6° о

I 1 3 а

Вещсстю В,7,1  Вещество 8.7.2  Вешсетви 8.7.3

Рис. 2. Действие веществ из фракции 8.7 (по 10 мкг/мл) на пробы крови (а) и пробы нейтрофилов (б) мужчин (1, 2) и женщин (3, 4).

Рис. 3. Действие различных концентраций 8.7.1 на продукцию активного кислорода препаратами цельной крови доноров разного пола.

Серия 1 - препараты крови доноров мужчин (n=4); серия 2 - препараты крови доноров женщин (n=3).

Действие фракции 8.7 на выживаемость экспериментальных животных при летальной вирусной инфекции.

Исходя из всех вышеперечисленных результатов, для определения противовирусного эффекта in vivo взяли саму фракцию 8.7, как смесь веществ, действующих однонаправлено, обладающей значительно более высокой индуцирующей способностью по отношению к иммунной системе, чем отдельные вещества.

Вирус простого герпеса. Из данных, приведённых в табл. 1, следует, что введение препарата 8.7 инфицированным мышам не оказывает значимого влияния на смертность животных, как в группе

Таблица 1. Действие фракции 8.7 на выживание экспериментальных животных при инфекции вирусами разных групп

Вариант опыта Смертность Отношение числа погибших % живот ных к общему числу Защита, % СПЖ, сутки

Группа — вирус простого герпеса

Самцы, контроль 11/20 55 — 11,7+1,94

Самцы, препарат ! 8.7 12 /20 60 0 10,8+2,18

Самки, контролы 10/20 50 — 12,6+1,92

Самки, препарат 8 >.7 8/20 40 10 14,6*+1,79

Группа — вирус гепатита мышей

Самцы контролы 7/10 70 — 14,8+2,4

Самцы, препарат 8.7 9/10 90 -20 12,4*+2,2

Самки, контролы 7/10 70 — 16,1+4,9

Самки, препарат 8 >.7 7/10 70 0 15,1+1,6

Группа — вирус энцефаломиокардита

Самцы, контролы 7/10 70 — 6,21+ 2,5

Самцы, препарат 8.7 9/10 90 - 20 4,99*+2,0

Самки, контролы 9/10 90 — 5,55+1,5

Самки, препарат 8 .7 9/10 90 0 6,10+1,4

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * - различия достоверны.

Таблица 2. Влияние препарата 8.7 на репродукцию вируса герпеса простого типа 1 в различных органах и тканях белых мышей BALB/c

Инфекционный титр ВПГ-1, ^ БОЕ/мл

Головной мозг Лёгкие Кровь

Самцы, контролы Самцы, опыт Самки, контролы Самки, опыт Тср=3,27+0,20 Тср=3,53+0,11 Тср=3,01+0,13 Тср=2,08+0,12* Тср=1,98+0,03 Тср=1,95+0,15 4f 7 7 Тср=1,63+0,03 Тср=1,40+0,25 Тср=1,43+0,09 Тср=1,50+0,12 Тср=1,37+0,04 Тср=1,20+0,34

самцов, так и в группе самок. СПЖ в группе самцов, получавших препарат, была на 0,9 суток меньше, чем в контрольной группе, что указывает на тенденцию к снижению продолжительности жизни . В группе леченых самок наблюдалось достоверное увеличение СПЖ: разница по сравнению с контролем составила 2 суток (16%).

Вирус гепатита мышей. Данные, представленные в табл. 1, показывают, что в группах контроля для мышей-самцов и мышей-самок количество павших животных было одинаковым. В контроле для самцов и самок смертность живот-ныгх составляла 70% при практически сопоставимой интенсивности течения ВГМ-инфекции и гибели мышей обоего пола в указанный группах.

В этих условиях в/б введения препарата 8.7 у мышей-самцов усугублялось течение инфекционного процесса с 9-го по 14-й дни после заражения, что, вероятно, и способствовало увеличению количества павших мышей по сравнению с группой контроля вируса на 20%.

В группе же мышей-самок, хотя препарат 8.7 и вызывал некоторую незначительную стимуляцию репродукции вируса у отдельных особей на начальных этапах развития заболевания, общее количество павших животных по сравнению с контролем не изменялось.

Вирус энцефаломиокардита. По совокупности полученных результатов можно отметить, что у

мышей-самцов, заражённых вирусом EMC, 2-кратное применение препарата 8.7 усугубляет течение инфекционного процесса и повышает уро-вены смертности животныгх.

У мышей-самок, заражённых вирусом EMC, 2-кратное применение препарата 8.7 не влияет на течение инфекционного процесса и не повышает уро-вены их смертности. Более того, наблюдается тенденция к увеличению продолжителыности жизни.

Инфекционность ВПГ-1. Резулытаты изучения влияния препаратов на величину инфекционного титра вируса в различных органах мышей представлены в табл. 2.

Из данных, представленных в табл. 2, следует, что инфекционным титр ВПГ-1 в головном мозге, лёгких и крови в опытной группе самцов, получавших препарат, не был изменен по сравнению с контролыной группой самцов.

Инфекционный титр ВПГ в головном мозге в опытной группе самок, получавших препарат, снижался приблизителыно на 1,0 lg БОЕ /мл по сравнению с контролыной группой. Такое различие между величинами Тср является статистически достоверным при уровне значимости 95% (вероят-носты ошибки 1=0,05, число степеней свободы — 4). В осталыном материале (лёгкие, кровы) статистически значимого снижения величины инфекционного титра вируса в опыте по сравнению с контролем не обнаружено.

Таблица 3. Влияние препарата 8.7 на размеры печени мышей при заражении ВГМ

Вариант опыта

Контроль Заражённые ВГМ Заражённые +8.7.

Таким образом, представленные в табл. 1 результаты согласуются с данными табл. 2: препарат 8.7 увеличивает среднюю продолжительность жизни самок на 2 суток и обеспечивает ингибиро-вание репродукции ВПГ-1 в головном мозге самок (на 1,0 ^ БОЕ/мл) по сравнению с контролем (см. табл. 2). Статистически значимых изменений СПЖ и величин инфекционного титра в органном материале в группе самцов по сравнению с контролем не обнаружено.

Изменение состояния органов мышей при заражении ВГМ. У здоровых незаражённых мышей-самцов (п=2) средний размер печени составил 26x22x1,5 мм (длина, ширина, толщина), у мышей-самок (п=2) — 21x16x1,2 мм (табл. 3). Печень у мышей обоего пола морфологически не изменена, имеет розовую окраску, гладкую поверхность и однородную структуру. Жёлчный пузырь менее 1 мм в диаметре, кишечник без видимых патологических изменений.

В контрольных группах животных, инфицированных ВГМ, как у самцов (п=3), так и самок (п=3) печень увеличена в размерах до 31x23x2,2 мм и 26x21x1,5 мм соответственно, с очаговыми некротическими поражениями (п=2 у самцов и самок) и застойными сосудистыми тяжами (п=1 у самцов и самок). Структура печени рыхлая (п=3 у самцов и самок). Жёлчный пузырь увеличен до размеров 1—1,5 мм в диаметре (п=2 у самцов и самок) или 2—2,5 мм (п=1 у самцов и самок). В кишечнике определяется умеренная гиперемия (п=2 у самцов и самок) или выраженная гиперемия и узловатость (п=1 у самцов и самок).

В группах животных, инфицированных ВГМ и получавших препарат 8.7 (самцов п=1, самок п=3), увеличен размер печени и достигает в среднем 35x26x2,5 мм у самцов и 26x21x1,8 мм у самок, что на 4x3x0,3 мм больше, чем в контроле вируса у самцов и практически не отличается от размеров печени у самок в группе контроля вируса. У самцов печень утолщена, гиперемирована, имеются застойные тяжи сосудов. У самок гиперемия печени, очаговые поражения и тяжи сосудов менее выражены (п=2), но структура печеночной ткани рыхлая (п=2).

Жёлчный пузырь у оставшихся в живых самца и самок данной группы увеличен до 2—2,5 мм в диаметре.

Кишечник самца выражено гиперемирован, имеется узловатость. У самок преобладает незначительная гиперемия кишечника без других патологических изменений.

Самцы Самки

21x16x1,2 мм

Таким образом, наихудшие и выраженные признаки ВГМ-инфекции в печени, жёлчном пузыре и кишечнике определялись в группе мышей-самцов, получавших препарат 8.7. У мышей-самок, получавших препарат 8.7, признаки гепатита мышей по сравнению с таковыми у самцов оказались менее выраженными. Суммируя результаты проведённых исследований, можно отметить, что препарат 8.7 усугубляет течение ВГМ-инфекции у мышей-самцов и повышает уровень их смертности. Применение препарата 8.7 у мышей-самок, заражённых ВГМ, не изменяет уровень их смертности по сравнению с группой контроля вируса и достоверно не влияет на физиологическое состояние органов по сравнению с группой заражённых вирусом мышей.

Таким образом, влияние фракции 8.7 на величину инфекционного титра ВПГ в органах заражённых мышей и сравнительное изучение органов ЖКТ, поражённых ВГМ, у мышей, не леченых (контроль) и получавших препарат, подтверждают данные о гендерной зависимости этого препарата на вирусные инфекции.

Обсуждение результатов

У группы веществ, объединённых во фракцию 8.7, не обнаружено непосредственного противовирусного и собственного вирус-стимулирующе-го действия в культуре клеток Vero для ВПГ-1. Вместе с тем в препаратах крови мужчин и женщин обнаружено разнонаправленное действие этих веществ на клетки иммунной системы. Следовательно, все изменения в репликации вирусов под действием 8.7 in vivo, носящие гендерный характер, по-видимому, связаны с различными реакциями на эту группу веществ в иммунной системе животных разного пола. Действие на иммунную систему не может быть связано с наличием в препарате половых гормонов, которые модифицируют сигналы иммуномодуляторов на стадии рецепции [9], или опосредованным влиянием через воздействие на щитовидную железу и экскрецию её гормонов. Фракция не содержит ни стероидных, ни тиреоидных гормонов, так как прошла обработку хлороформом (см. Материал и методы), с помощью которой удалены все гидрофобные вещества. Следовательно, получены вещества, которые имеют различное сродство к рецепторам на мужских и женских нейтрофилах или различное количество этих рецепторов. При этом активация клеток иммунной системы влияет на противовирусную защиту организма in vivo.

26x22x1,5 мм (858 мм3) 31x23x2,2 мм (1568 мм3) 35x26x2,5 мм (2275 мм3)*

Одним из наиболее интересных моментов является блокирование активации НАДФН-окси-дазы в нейтрофилах из крови мужчин форболо-вым эфиром. Это вещество является одним из самых сильных активаторов НАДФН-оксидазы [10], причем активация осуществляется при участии протеинкиназы С. Следовательно, под действием веществ из фракции 8.7 у мужчин и самцов животных перекрывается именно этот путь активации иммунной системы. Так как вещества гидрофильные, прямое их действие на какую-нибудь протеинкиназу или протеинфосфатазу, как в слу-

ЛИТЕРАТУРА

1. Татарчук Т.Ф., Чернышов В.П., Исламова А.О. Половые стероидные гормоны и иммунная система. Эндокринная гинекология. Киев: Запови 2003; 181-199.

2. Bouman A., Heineman M.J., Faas M.M.Sex hormones and the immune response in humans. Human Reproduction Update 2005; 11: 4: 411—423.

3. Fairweather D, Cihakova D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. J Autoimmun 2009; 33: 3—4: 222—230.

4. Cutoto M, Seriolo B, Villaggio B, Pizzorni C, Craviotto C, Sulli A. Androgens and estrogens modulate the immune and inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Ann N YAcad Sci 2002; 966: 131—142.

5. Reddy J., Waldner H, Zhang X., Illes Z, Wucherpfennig K.W., Sobel R.A., Kuchroo KK.Cutting edge: CD4+CD25+ regulatory T cells contribute to gender differences in susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2005; 175: 9: 5591—5595.

6. Мальдов Д.Г., Бельков А.П., Ильичев А.В., Асташкин Е. И. Влияние комплексного гидрофильного низкомолекулярного препарата «Стимфорте» на функциональную активность фагоцитов крови человека. Иммунология 2009; 2: 95—97.

чае водорослевого яда — окадаевой кислоты [11], можно не рассматривать. Наиболее вероятной является возможность воздействия на какой-то из клеточных рецепторов. Наличие его у самцов и отсутствие или инактивация у самок и может быть причиной гендерных различий действия веществ фракции 8.7. Сами вещества из фракции 8.7 обладают низкой противовирусной активностью, однако открытие и изучение данного феномена может привести к открытию препаратов, например, для борьбы с вирусными инфекциями при беременности.

7. Rubtsova K, Marrack P., Rubtsov A.V. Age-associated B cells: are they the key to understanding why autoimmune diseases are more prevalent in women? Expert Rev Clin Immunol 2012; 8: 1: 5—7.

8. Андронова В.Л., Гроховский С.Л., Суровая A.H., Гурский Г.В., Гале-гов Г.А. Действие димерных производных нетропсина и их комбинаций с ацикловиром на герпесвирусную инфекцию мышей. Доклады Академии Наук, 2007; 413: 6: 1—5.

9. Calippe B., Douin-Echinard V., Delpy L, Laffargue M, Lelu K, Krust A., Pipy B, Bayard F, Arnal J.F., Guery J.C., Gourdy P. 17-Beta-estra-diol promotes TLR4-triggered proinflammatory mediator production through direct estrogen receptor alpha signalling in macrophages in vivo. J Immunol 2010; 185: 2: 1169—1176.

10. Rubtsov A.V., Rubtsova K, Kappler J.W., Marrack P. Genetic and hormonal factors in female-biased autoimmunity. Autoimmun Rev 2010; 9: 7: 494—498.

11. Newell S.W., Perchellet E.M, Gao X.M., Chen G, Perchellet J.P. Ability of okadaic acid and other protein phosphatase inhibitors to mimic the stimulatory effects of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate on hydroperoxide production in mouse epidermis in vivo. Cancer Lett 1996; 98: 2: 241—251.