Способ получения каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.)
METHOD FOR OBTAINING OF CALLUS CULTURE OF ACONITUM BARBATUM PATR. ex PERS.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.
Борец бородатый – растение семейства Лютиковые (Ranunculaceae), богат дитерпеновыми алкалоидами, такими как аконитин, делькозин, ликоктонин, зонгорин и батаконин и др., кумаринами, флавоноидами, проазуленами. В народной медицине используется для лечения заболеваний ревматического происхождения и воспалений. Обладает болеутоляющим, противоопухолевым свойствами.
Известен способ получения каллусной культуры Pulsatilla taurica (статья Сидякин А.И., Мустафаева У.Ю.  Получение каллусных культур Pulsatilla taurica и их цитологический анализ // Инновации в науке / Сб. ст. по материалам XLV междунар. науч.-практ. конф. № 5 (42). Новосибирск: Изд. «СибАК», 2015, с. 43-53.) из высечек листьев проростков и ювенильных растений, полученных в культуре in vitro из семян, и высечек листьев от растений в фазу плодоношения. Способ включает ступенчатую стерилизацию исходного материала: 1 % KMnO4 (40 минут); 70% этанол (1 минута) и 3% H2O2 (5 минут), и культивирование эксплантов на питательной среде Мурасиге и Скуга со следующими вариантами добавления гормонов 0,1 мг/л 2,4-Д (2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,01 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин), и 3 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л 6-БАП. Экспланты культивируют на свету или в темноте при температуре 20—24°С. Цикл выращивания культур составляет 70—90 суток.
Недостатком аналога является выбор экспланта для получения каллуса, так как известно, что для получения клеточной культуры алкалоидоносных растений, таких как борец бородатый, рационально использовать наиболее ранние ткани, в которых нет накопления алкалоидов. Несмотря на то что растение Pulsatilla taurica также относится к семейству лютиковые, как и борец бородатый, оно не содержит тех же алкалоидов, а значит, что вышеописанный способ получения каллусной культуры не подходит. Кроме того, в данном способе используется более высокая концентрация стимулятора роста, что приводит к увеличению стоимости процесса.
2
Известен способ получения каллусной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.) (Патент РФ 2590586, опубл.  10.07.2016, МПК C12N5/04), включающий посадку семян в стерильный грунт, выращивание интактных растений в течение 1-2 месяцев с интенсивностью освещения 150 мкМ квантов/мс, отбор эксплантов 3-4-недельного возраста, стерилизацию последовательно в 70% спирте 30 с и в 0,1% сулеме 4 мин, помещение кусочков стебля длиной 1,5-2 см на агаризованную среду Мурасиге-Скуга без добавления гормонов на 7-10 дней для контроля стерильности, выделение каллуса и посадка в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста НУК и 6-БАП в условиях ламинарного бокса, при этом каллус высаживают в возрасте 30 суток, а культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности 70% в темноте, после чего проростки переносят на 6 недель на агаризованную среду Мурасиге-Скуга с добавлением 1,5–2,5 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса.
Недостатками известного способа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимыми этапами являются как проращивание семян в грунте, так и проведение контроля стерильности в течение 10 дней, для чего необходимы дополнительные затраты на приготовление питательных сред. Также в данном способе используются растения 3-4-недельного возраста, а для получения культуры Aconitum barbatum Patr. ex Pers рационально использовать более ранние ткани.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ получения каллусной культуры аконита байкальского (Еникеев А. Г., Семенов А. А., Горшков А. Г., Максимова Л. А., Копытина Т. В., Гаманец Л. В., Швецов С. Г., Пермяков А. В., Шафикова Т. Н. Культура клеток Aconitum baicalense Turcz. ex Rapaics 1907 перспективный источник биологически активных соединений // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. 2011. №3-1 (98).). Способ включает стерилизацию семян в 3% растворе перекиси водорода, перенос их в пенициллиновые флаконы с агаризованной средой (соли 1/2MS, без сахарозы) и помещение флаконов в холодильник (4°С) на 2,5 месяца. По истечении указанного срока флаконы с семенами переносят в темновой термостат на 26°С. Каллусную культуру получают из этиолированных проростков на солевой среде В5 с добавлением тиамина 1мг/л, пиридоксина 0,5 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, инозита 100 мг/л, 2,4-Д 1 мг/л, 2% сахарозы, агар-агар 0,8%, pH среды 5,8. Описанный способ принят за прототип изобретения.
Недостатками прототипа является более сложная технология получения культуры, при которой необходимым этапом является проращивание семян в темновом термостате, для чего необходимо определенное оборудование. Также в среду для получения каллусной культуры дополнительно добавляют инозит, что увеличивает ее стоимость.
В литературных источниках способов получения каллусной ткани Aconitum barbatum Patr. ex Pers. не было найдено.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования каллусной ткани Aconitum barbatum, перспективной в качестве возможного источника алкалоидов терапевтического действия.
Поставленная задача решается тем, что культивирование каллусной ткани Aconitum barbatum включает в себя стерилизацию семян, помещение их в холодильник при температуре 5±1ºС на 2,5 месяца для стратификации и получение каллусной культуры из этиолированных проростков. При этом недозрелые семена до стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, отмывают стерильной дистиллированной водой, после стратификации последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты и также отмывают стерильной дистиллированной водой, затем помещают семена в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения этиолированных проростков в темноту на 3-4 недели, от полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для получения каллуса, культивирование проводится при температуре 26±1ºС, влажности 70% в темноте.
После образования каллуса проводят его отделение и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.
Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.
Таблица 1 – Состав питательной среды Мурасиге-Скуга, мг/л
Полученный каллус рассаживают в культуральные сосуды с питательной средой MS с добавлением стимуляторов роста – 2,4-D и 6-БАП. Пересадку осуществляют каждые 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводят при 26±1ºС влажности – 70% в темноте.
Технический результат  - получение каллусной культуры борца бородатого (Aconitum barbatum Patr. ex Pers.).
Пример 1
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5–1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (1,8 мг/л) и 6-БАП (0,3 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.
Недозрелые семена борца бородатого в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.
Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.
Пример 2.
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO3 - 1900 мг/л, NH4NO3 - 1650 мг/л, MgSO4 × 7H2O 370 мг/л, KH2PO4 - 170 мг/л), при этом каждую из макросолей растворяют последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводили до 1 л. Аналогично готовят концентраты микросолей (H3BO3 - 6,2 мг/л, MnSO4 × 4H2O - 32,3 мг/л, ZnSO4 × 7H2O - 8,6 мг/л, Na2MoO4 × 2H2O - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO4 × 5H2O - 0,025 мг/л, CoCl2 × 6H2O - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO4 × 7H2O - 37,3 мг/л, Na2EDTA × 2H2O - 27,8 мг/л), CaCl2 × 2H2O, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 – 1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl2 × 2H2O, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, среду разливают по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют 2,4 – D (2,2 мг/л) и 6-БАП (0,8 мг/л), и размещают ее по культуральным сосудам.
Недозрелые семена борца бородатого, в условиях ламинарного бокса стерилизуют последовательно в растворе спирта (70%) 40 с и сулемы (0,1%) 3-4 минуты, затем отмывают стерильной дистиллированной водой. Далее семена помещают в чашки Петри со стерильным, увлажненным песком, и убирают в холодильник на 2-2,5 месяца при температуре 5±1ºС для стратификации. Через 2-2,5 месяца семена извлекают из чашек Петри, последовательно стерилизуют в растворе спирта (70%) 30 с и сулемы (0,1%) 1-2 минуты. Далее семена отмывают стерильной дистиллированной водой и помещают их в пробирки на агаризованную среду МС без добавления стимуляторов роста для получения проростков и помещают в темноту на 3-4 недели. От полученных этиолированных проростков отделяют побеги и помещают в пробирки на агаризованную среду МС добавлением 1,8–2,2 мг/л 2-4 D (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 0,3–0,8 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин) для каллусообразования. Пробирки помещают на стеллажи при температуре 26±1ºС, влажности – 70% в темноту. После образования каллуса проводят его отделение, и рассадку в культуральные сосуды со свежей питательной средой, того же состава.
Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности – 70%, в темноте.