КАПСИДЫ ВАРИАНТОВ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ И МЕТОДЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CAPSIDS OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS VARIANTS AND METHODS OF THEIR APPLICATION

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По этой заявке испрашивается приоритет в соответствии с временной заявкой на патент США № 62/560901, поданной 20 сентября 2017 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Уровень техники
Изобретение, раскрытое в настоящей заявке, в целом относится к области вирионов аденоассоциированных вирусов (AAV), содержащих варианты капсидных белков, и к получению таких вариантов капсидов методами направленной эволюции.
Введение
Мышечная ткань подвержена ряду серьезных генетических нарушений. Мышечная ткань является целевой тканью в генной терапии многих заболеваний, вызывающих мышечную дистрофию, а также может использована как биофабрика для производства секреторных факторов для лечения системных заболеваний. Доставка терапевтических генов в мышечную ткань человека, возможно, является наиболее актуальной неудовлетворенной потребностью в лечении заболеваний мышечной ткани.
Одним из подходов к мышечно-направленной доставки генов является терапия, базирующаяся на доставке генов аденоассоциированными вирусами (AAV), при которой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) используется для доставки гена в одну или более мышечных клеток, например, для замены отсутствующего гена, исправления доминантного дефектного гена или предоставления матрицы для непрерывной белковой терапии. Хотя клиническая генная терапия на основе AAV становится все более успешной, она все еще обладает недостатками в отношении свойств вирусных векторов, включая, например, нацеливание на желаемые клетки мышц с высокой эффективностью. Соответственно, в данной области существует потребность в новых вариантах AAV с улучшенными возможностями трансдукции, обеспечивающими более эффективную доставку генов в клетки мышц для лечения заболевания. В данной области существует потребность в именно тех вариантах AAV, которые обладают повышенной эффективностью мышечной трансдукции - в некоторых случаях неспецифичной (всеохватывающей), а в других случаях предпочтительный для определенных типов мышечных клеток - по сравнению с AAV дикого типа и вариантами AAV, известными в данной области техники.
rep, cap
aap
rep
cap
Дикий тип AAV представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус, содержащий три открытые рамки считывания:  и . Первый ген, , кодирует четыре белка, необходимых для репликации генома (Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40), второй, , экспрессирует три структурных белка (VP1-3), участвующих в сборке и формировании вирусного капсида, а третий экспрессирует белок, активирующий сборку капсида (AAP), необходимый для сборки капсида. AAV зависит от присутствия вируса-помощника, такого как аденовирус или вирус герпеса, для активной репликации. В отсутствие вируса-помощника AAV находится в латентном состоянии, в котором его геном поддерживается эписомально или интегрируется в хромосому хозяина в локусе AAVS1.
in vitro
in vivo
cap
Методы направленной эволюции  и  могут быть использованы для отбора вариантов AAV, демонстрирующих улучшенную доставку генов на основе AAV по сравнению с существующими векторами. Такие методы направленной эволюции уже известны в данной области техники и описаны, например, в публикации РСТ WO 2014/194132 и статье Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, опубликовано в сети 20 мая 2014 г.; doi: 10.1038/nrg3742), включенные в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки. Направленная эволюция - это метод капсидной биоинженерии, имитирующий естественную эволюцию посредством итеративных (повторяющихся) циклов процессов генетической диверсификации и отбора, что позволяет накапливать полезные мутации, постепенно улучшающие функцию биомолекулы, такой как вирион на основе AAV. При этом подходе гены  AAV дикого типа диверсифицируются для создания больших генетических библиотек, которые упаковываются с целью создания библиотек вирусных частиц, и к которым применяется направленная селекция для выделения уникальных вариантов с наилучшими фенотипами, нацеленными на преодоление барьеров, препятствующих доставке генов.
Варианты AAV были раскрыты, например, в заявках на патент США 9,193,956; 9; 186; 419; 8632764; 8663624; 8927514; 8628966; 8263396; 8734809; 8889641; 8632764; 8691948; 8299295; 8802440; 8445267; 8906307; 8574583; 8067015; 7588772; 7867484; 8163543; 8283151; 8999678; 7892809; 7906111; 7259151; 7629322; 7220577; 8802080; 7198951; 8318480; 8962332; 7790449; 7282199; 8906675; 8524446; 7712893; 6491907; 8637255; 7186522; 7105345; 6759237; 6984517; 6962815; 7749492; 7259151; и 6,156,303; публикациях США 2013/0295614; 2015/0065562; 2014/0364338; 2013/0323226; 2014/0359799; 2013/0059732; 2014/0037585; 2014/0056854; 2013/0296409; 2014/0335054 2013/0195801; 2012/0070899; 2011/0275529; 2011/0171262; 2009/0215879; 2010/0297177; 2010/0203083; 2009/0317417; 2009/0202490; 2012/0220492; 2006/0292117; и 2004/0002159; Европейских публикациях 2692731 A1; 2383346 В1; 2359865 В1; 2359866 В1; 2359867 В1; и 2357010 B1; 1791858 В1; 1668143 B1; 1660678 В1; 1664314 B1; 1496944 В1; 1456383 В1; 2341068 В1; 2338900 В1; 1456419 В1; 1310571 B1; 14563 83 В1; 1633772 B1; и 1135468 B1; и международных (РСТ) публикациях WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; WO 2014/103957; WO 2014/052789; WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; и WO 2008/124015; WO 2003/054197; однако ни в одной из этих ссылок не раскрыты варианты осуществления и/или признаки и/или композицию значащих компонентов вариантов AAV, раскрытых в настоящем описании.
Все документы и ссылки, цитируемые в настоящем описании и в патентных документах, упоминаемых в настоящем описании, тем самым включены в настоящее описание посредством ссылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к вариантам капсидных белков аденоассоциированного вируса (AAV), имеющим одну или более модификаций аминокислотной последовательности относительно родительского капсидного белка AAV, которые, будучи представлены в вирионе AAV, придают повышенную инфекционность в отношении одного или нескольких типов мышечных клеток по сравнению с инфекционностью вириона AAV, содержащего немодифицированный родительский капсидный белок AAV. Изобретение также относится к рекомбинантным вирионам AAV и их фармацевтическим композициям, содержащим вариант капсидного белка AAV, как описано здесь; способам получения вариантов капсидных белков и вирионов rAAV и способам применения этих капсидных белков и вирионов rAAV в исследованиях и в клинической практике, например, в доставке последовательностей нуклеиновых кислот в одну или более мышечных клеток для лечения расстройств и заболеваний.
В некоторых аспектах раскрытия изобретение относится к вариантам капсидных белков аденоассоциированного вируса (AAV), причем эти варианты капсидных белков AAV несут одну или более модификаций аминокислотной последовательности относительно родительского капсида AAV, причем их присутствие в вирионе AAV придает повышенную инфекционность по отношению к одному или более типов мышечных клеток (например, клеток скелетных мышц и/или клеток сердечной мышцы) по сравнению с инфекционностью вирионов AAV, содержащих родительский капсидный белок AAV, не содержащих модификаций аминокислотной последовательности. В связанных аспектах изобретения варианты капсидных белков AAV, если они присутствуют в вирионе AAV, также придают повышенную устойчивость к нейтрализации антителами против AAV.
В некоторых аспектах раскрытия изобретение относится к рекомбинантным вирионам AAV (rAAV), содержащим варианты капсидного белка, как описано здесь, причем эти вирионы rAAV демонстрируют повышенную инфекционность по отношению к одному или более типов мышечных клеток (например, скелетных мышц и/или сердечной мышцы) по сравнению с инфекционностью мышечных клеток, проявляемую вирионом AAV, содержащим соответствующий немодифицированный родительский белок капсида AAV. В некоторых вариантах осуществления вирион rAAV проявляет повышенную инфекционность всех мышечных клеток по сравнению с вирионом AAV, содержащим родительский капсидный белок AAV. В других вариантах осуществления вирион rAAV проявляет повышенную инфекционность определенных типов именно мышечных клеток, но не других, по сравнению с вирионом AAV, содержащим родительский капсидный белок AAV. Другими словами, вирион rAAV проявляет повышенную инфекционность для определенных типов мышечных клеток, но не для других, например, rAAV преимущественно демонстрируют повышенную инфекционность в отношении одного или нескольких типов клеток, выбранных из списка: фибробласты скелетных мышц, сателлитные клетки скелетных мышц, фибробласты сердечных мышц, клетки-предшественники сердечной мышцы, клетки гладких мышц и/или клетки мышц диафрагмы, но не демонстрирует повышенную инфекционность всех типов клеток без исключения.
В некоторых вариантах осуществления вирион rAAV содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В некоторых таких вариантах осуществления гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует РНК, кодирующую полипептид. В других таких вариантах осуществления гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует РНК, которая не кодирует полипептид, например гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой РНК-интерференционный агент, направляющую РНК для нуклеазы и т.д.
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим инфекционные вирионы rAAV и фармацевтически приемлемый носитель.
in vivo
in vitro
Изобретение также относится к применению вириона rAAV, содержащего вариант капсидного белка, как описано здесь, в способе доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень (такую как кардиомиоцит) посредством контакта клетки-мишени с вирионом rAAV. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень находится , например, в сердце индивидуума, нуждающегося в лечении сердечно-сосудистого расстройства. В других вариантах осуществления клетка-мишень находится .
Изобретение также относится к способам лечения и/или профилактики заболевания (например, нарушения сердечной или скелетной мускулатуры) путем введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества вирионов rAAV, содержащих вариантный белок капсида, как описано здесь, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество вирионов rAAV.
Изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано здесь, и клетке-хозяину, содержащей эту выделенную нуклеиновую кислоту. Также в других вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота и/или отдельная клетка-хозяин содержит rAAV.
В некоторых аспектах вариант капсидного белка AAV содержит вставку от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот («гетерологичный пептид» или «вставка пептида») в GH-петлю капсидного белка, по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV, причем вариантный капсидный белок, если он присутствует в вирионе AAV, придает повышенную инфекционность по отношению к мышечной клетке по сравнению с инфекционностью мышечной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский капсидный белок AAV. В некоторых вариантах осуществления пептид содержит или состоит по существу из последовательности, выбранной из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), ASNITKA (SEQ ID NO: 19), DNTVTRS (SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO: 25), ASDSTKA (SEQ ID NO: 26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO : 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34), LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 42). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пептид содержит или состоит по существу из последовательности, выбранной из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) и LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37).
В некоторых аспектах вариантный капсидный белок AAV содержит одну или более аминокислотных замен относительно соответствующего родительского капсидного белка AAV, причем вариантный капсидный белок, если он присутствует в вирионе AAV, обеспечивает повышенную инфекционность мышечной клетки по сравнению с инфекционностью мышечной клетки вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский белок капсида AAV,.
В некоторых вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий замену P363L относительно AAV2 и, необязательно, дополнительно содержащий замену E347K и/или V708I относительно AAV2.
В сходных аспектах вариантный капсидный белок AAV содержит вставку пептида и одну или более аминокислотных замен относительно соответствующего родительского капсидного белка AAV, при этом вариантный капсидный белок, если представлен в вирионе AAV, придает повышенную инфекционность в отношении мышечных клеток по сравнению с инфекционностью мышечных клеток вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский белок капсида AAV. В нескольких вариантах осуществления предоставляется вариант капсидного белка AAV, содержащий вставку пептида и замену V708I относительно AAV2, где вставка пептида необязательно выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), АСНИТКА (SEQ ID NO: 19), DNTVTRS ( SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO: 25 ), ASDSTKA (SEQ ID NO: 26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34), LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36) , LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 41) ID №: 42); предпочтительно из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) , LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) и LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37). В нескольких вариантах осуществления предоставляется вариант капсидного белка AAV, содержащий вставку пептида и замену P363L относительно AAV2, где вставка пептида необязательно выбрана из группы, состоящей из GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), QADTTKN (SEQ ID NO: 23) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39).
В некоторых вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, включающий гетерологичный пептид LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) и замену V708I относительно AAV2 и, необязательно, дополнительно содержащий A593E и/или S109T и/или T330A и/или R588M замены относительно AAV2. В других вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) и A35P замену относительно AAV2. В других вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, включающий гетерологичный пептид LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) и аминокислотные замены N312K, N449D, N551S, I698V и L735Q относительно AAV2 и, необязательно, дополнительно, содержащий замену V708I относительно AAV2.
В некоторых вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) и замену V708I относительно AAV2, и необязательно, дополнительно включающий замены S109T и/или W694C и/или W606C относительно AAV2. В других вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) и замену I698V относительно AAV2. В других вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) и аминокислотные замены N312K, N449D, N551S, I698V и L735Q относительно AAV2 и, необязательно, дополнительно, содержащий замену V708I относительно AAV2.
В некоторых вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) и замену V708I относительно AAV2, и необязательно, дополнительно включающий замену N449K и/или G222S относительно AAV2. В других вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, содержащий гетерологичный пептид LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) и аминокислотные замены N312K, N449D, N551S, I698V и L735Q относительно AAV2 и, необязательно, дополнительно содержащий замену V708I относительно AAV2.
В некоторых вариантах осуществления раскрыт вариант капсидного белка AAV, включающий гетерологичный пептид, как описано здесь, и замену P363L относительно AAV2.
В настоящем описании также раскрыты способы получения и/или доставки rAAV, включающего вариант капсида AAV, как описано здесь. Кроме того, изобретение относится к наборам, содержащим rAAV, содержащий вариант капсида AAV, как описано здесь, для применения в способах, описанных здесь.
В других вариантах осуществления вирион AAV, содержащий вариант капсидного белка, описанный в предыдущих абзацах, может представлять собой любой из предыдущих или последующих раскрытых вариантов осуществления. Действительно, должно быть понятно, что определенные признаки изобретения, описанные для ясности в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления. И, наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть представлены по-отдельности или в любой подходящей комбинации. Все комбинации вариантов осуществления, относящихся к изобретению, охватываются объемом изобретения и считаются раскрытыми в настоящем описании так же, как если бы каждая комбинация была раскрыта индивидуально и детально. Кроме того, все частичные комбинации различных вариантов осуществления и их элементов также считаются охваченными в объеме изобретения и считаются раскрытыми в настоящем описании так же, как если бы каждое каждая такая частичная комбинация была бы индивидуально и детально раскрыта в настоящем описании.
Краткое описание изобретения не должно быть использовано для ограничения Формулы Изобретения, а также не предназначено для ограничения объема изобретения каким-либо образом.
Другие признаки и преимущества изобретения, раскрытого в настоящем описании, будут очевидны из следующих фигур, подробного описания и Формулы Изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР/ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение может быть лучше понято, если представленное ниже подробное описание было прочитано в сочетании с прилагаемыми чертежами. Файл патента или заявки содержит как минимум один чертеж, выполненный в цвете. Копии этого патента или публикации патентной заявки с цветными фигурами/чертежами могут быть предоставлены по запросу, сопровождаемому уплатой необходимой пошлины. Мы обращаем Ваше внимание на то, что, согласно общепринятой практике, различные аспекты фигур выполнены не в масштабе. Наоборот, размеры различных элементов произвольно увеличены или уменьшены для ясности. В чертежи включены следующие фигуры.
Фигура 1
cap
cap
in vitro
in vivo
cap
cap
иллюстрирует варианты осуществления при использовании методологию направленной эволюции. На Стадии (а) показано создание библиотеки вирусных капсидов, содержащей комбинации мутаций ДНК и генов . Стадия (b) изображает упаковку вирусов таким образом, что каждая вирусная частица состоит из мутантного капсида, собранного вокруг гена , кодирующего этот капсид, и последующую стадию очистки. Затем капсидную библиотеку подвергали селективному давлению  или . В этом аспекте технологии направленной эволюции ткани или клеточный материал, представляющие интерес, собирали для выделения вариантов AAV, успешно инфицирующих конкретную мишень, таким образом получая «успешные» вирусы. Стадия (c) показывает обогащение «успешных» клонов, отобранных на Стадии 1, проведением повторного отбора. Стадия (d) показывает обогащение выбранных на Стадии 2  генов, подвергающихся повторной диверсификации и дальнейшим этапам отбора для повышения конкурентоспособности вируса повторным процессом отбора. На этапе (e) показаны варианты, идентифицированные как наиболее удачные на Стадиях отбора векторов 1 и 2, которые будут созданы как рекомбинантные векторы AAV и охарактеризованы по уровню трансдукции различных типов клеток и тканей-мишеней. Так как варианты, раскрытые в настоящем описании, были получены на основе процесса направленной эволюции AAV, то они считаются уже продемонстрировавшими способность трансдуцировать клетки мышц и доставлять геном (геном, кодирующий вариант гена ) во время самого процесса отбора.
Фигура 2
показывает ПЦР-амплификацию вирусных геномов из ткани сердечных и скелетных мышц репрезентативного раунда селекции. Полосы внутри красных прямоугольников представляют успешную амплификацию вирусных геномов.
Фигуры 3А-3С
показывают частоту паттернов последовательностей (мотивов) при анализе секвенированием. На Фиг.3А представлен анализ секвенированием 4-го раунда направленной селекции при внутривенной доставке к сердечной ткани. На Фиг.3В представлен анализ последовательности 2-го раунда направленной селекции при внутривенной доставке к сердечной ткани в присутствии нейтрализующих антител. На Фиг.3С представлен анализ последовательности 3-го раунда направленной селекции при внутривенной доставке к тканям скелетных мышц. На фигуре 3А показаны следующие паттерны последовательностей (мотивы): 57,40% LANKIQRTDA, 16,96% LANKTTNKDA, 7,32% A593E, 7,32% другие, 4,88% V708I и 4,88% LASNTVKAIA. На Фигуре 3В показаны следующие паттерны последовательностей: 21,14% «другие чем», 20,33% LAQADTTKNA, 15,45% LANKTTNKDA, 15,45% LAASNITKAA, 15,45% химера AAV6/AAV5 и 12,20% LANTVKLSTA. На Фигуре 3C показаны мотивы: 43,21% A593E, 41,98% P363L и 14,81% «другие».
Фигуры 4А-4С.
Фиг. 4А - репрезентативная трехмерная модель AAV2, содержащая случайный гептамер, следующий за аминокислотой 587 и заменой V708I. На Фиг.4В представлена типичная трехмерная модель химеры AAV6/AAV5, содержащей замены V229I, A490T и A581T (соответствующие аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 62). На Фиг.4С представлена типичная трехмерная модель AAV2, содержащая замену P363L.
Фигуре 5
На  представлено выравнивание последовательности дикого типа AAV SEQ ID NO: 1-11, показывающее сравнительные положении аминокислот среди серотипов дикого типа (встречающихся в природе) AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV4-10.
Фигурах 6А-6Е
Фигура 6А
Фигура 6В:
Фигуры 6C-6D
Фигура 6E
На  представлены данные о трансдукции кардиомиоцитов человека in vitro рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида AAV LANKTTNKDA+V708I и новый вариант капсида AAV LATNKIGVTA+V708I, причем каждый вариант экспрессирует трансген GFP под контролем промотора CAG. : Клетки, которые дифференцировались в кардиомиоциты из линии плюрипотентных стволовых клеток человека, были инфицированы новым вариантом AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом AAV LATNKIGVTA+V708I.CAG. GFP или контролями дикого типа AAV1.CAG.GFP, AAV2.CAG.GFP и AAV9.CAG.GFP при MOI 20, 100, 500 и 2500. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур через 6 дней после инфицирования при всех MOI демонстрирует, что новые варианты капсидов AAV трансдуцируют кардиомиоциты лучше, чем капсиды дикого типа AAV1, AAV2 или AAV9.  Количественная оценка процента GFP-позитивных кардиомиоцитов в каждой культуре с помощью проточной цитометрии показывает, что новые капсиды варианта AAV обеспечивают значительное дозозависимое увеличение числа трансдуцированных клеток по сравнению с трансдукцией капсидами AAV1, AAV2 или AAV9 дикого типа. * p <0,05. : количественное определение количества GFP в каждой культуре с помощью вестерн-блоттинга показывает, что новые варианты капсидов AAV обеспечивают значительное улучшение экспрессии трансгена по сравнению с капсидами AAV1, AAV2 или AAV9 дикого типа. NT=не трансдуцировано. : Клетки, которые дифференцировались в кардиомиоциты из линии плюрипотентных стволовых клеток человека, были инфицированы новым вариантом AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом AAV LATNKIGVTA+V708I.CAG. или контролями дикого типа AAV1.CAG.GFP, AAV2.CAG.GFP и AAV9.CAG.GFP. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур в дни 1, 2, 3 и 5 после инфицирования при MOI 500 демонстрирует, что новые капсиды варианта AAV лучше трансдуцируют кардиомиоциты и начинают экспрессировать трансген GFP раньше, чем капсиды AAV1, AAV2 или AAV9 дикого типа.
На фигурах 7A-E
Фигура 7А
Фигура 7В
Фигуры 7C-7D
Фигура 7E
кардиомиоцитов in vitro
представлены данные о трансдукции человеческих  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант AAV, представляющий собой вариант химерного капсида AAV6/AAV5 SEQ ID NO: 62, экспрессирующий трансген GFP под контролем промотора CAG. : Клетки, которые дифференцировались в кардиомиоциты из линии плюрипотентных стволовых клеток человека, были инфицированы новым капсидом AAV, таким как химерным капсидом AAV6/AAV5 или контролями дикого типа AAV1.CAG.GFP, AAV8.CAG.GFP и AAV9.CAG.GFP при MOI 100, 500 и 2500. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур через 6 дней после инфицирования при всех MOI демонстрирует, что новый капсидный вариант AAV трансдуцирует кардиомиоциты лучше, чем капсиды AAV1, AAV8 или AAV9 дикого типа. : Количественная оценка процента GFP-позитивных кардиомиоцитов в каждой культуре с помощью проточной цитометрии показывает, что новый вариант капсида AAV обеспечивает значительное дозозависимое увеличение количества трансдуцированных клеток по сравнению с трансдукцией капсидами AAV1, AAV8 или AAV9 дикого типа. * p <0,05. : Определение количества GFP в каждой культуре с помощью вестерн-блоттинга показывает, что новый вариант AAV обеспечивает значительное улучшение экспрессии трансгена по сравнению с капсидами AAV1, AAV8 или AAV9 дикого типа. Вектор=не трансдуцировано. : Клетки, которые дифференцировались в кардиомиоциты из линии плюрипотентных стволовых клеток человека, были инфицированы новым вариантом капсида AAV, представляющим собой химерный капсид AAV6/AAV5 или контролем AAV8.CAG.GFP дикого типа. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур на 3, 4, 5 и 6 дни после инфицирования при MOI 2500 демонстрирует, что новый вариант капсида варианта AAV лучше трансдуцирует кардиомиоциты и начинает экспрессировать трансген GFP раньше, чем капсид AAV8 дикого типа.
Фигурах 8A-C
Фигура 8А
Фигура 8В
Фигура 8C
in vitro
На  представлены данные о трансдукции скелетных миофибрилл человека  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида AAV LANKTTNKDA+V708I и новый вариант химерного капсида AAV AAV6/AAV5, причем каждый вариант экспрессировал трансген GFP под контролем промотора CAG. : Клетки, которые дифференцировались в скелетные миофибриллы из первичных миобластов человека, были инфицированы новым вариантом капсида AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом капсида AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, новым химерным вариантом капсида AAV AAV6/AAV5.CAG.GFP или контролями дикого типа AAV8.CAG.GFP и AAV9.CAG.GFP при MOI 100, 500 и 2500. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур через 7 дней после заражения при всех MOI демонстрирует, что новые варианты капсидов AAV трансдуцируют скелетные миофибрилы лучше, чем капсиды дикого типа AAV8 или AAV9. : Количественная оценка процента GFP-положительных скелетных миофибрилл в каждой культуре с помощью проточной цитометрии показывает, что новые варианты капсидов AAV обеспечивают значительное дозозависимое увеличение количества трансдуцированных клеток по сравнению с трансдукцией капсидами AAV8 или AAV9 дикого типа. * p <0,05. : Клетки, которые дифференцировались в скелетные миофибрилы из первичных миобластов человека, были инфицированы новым вариантом AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, новым химерным вариантом AAV AAV6/AAV5.CAG.GFP или контролями дикого типа AAV8.CAG.GFP и AAV9.CAG.GFP. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур на 2-7 дни после инфицирования при MOI 2500 демонстрирует, что новые капсидные варианты AAV лучше трансдуцируют скелетные миофибрилы и начинают экспрессировать трансген GFP раньше, чем капсиды дикого типа AAV8 или AAV9.
Фигурах 9A-B
Фигура 9А
Фигура 9В
in vitro
На  представлены данные о трансдукции клеток-предшественников мышечной ткани человека  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида AAV LANKTTNKDA+V708I и новый химерный вариант капсида AAV AAV6/AAV5, каждый из которых экспрессирует трансген GFP под контролем промотора CAG. : Клетки, которые дифференцировались в клетки мышечных предшественников из линии плюрипотентных стволовых клеток человека, были инфицированы новым вариантом капсида AAV LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP, новым вариантом капсида AAV LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP, новым химерным вариантом капсида AAV AAV6/AAV5.CAG.GFP или контролями AAV9.CAG.GFP дикого типа при MOI 500. Иммунофлуоресцентная визуализация клеточных культур через 6 дней после инфицирования при всех MOI демонстрирует, что новые капсидные варианты AAV трансдуцируют клетки-предшественники мышц лучше, чем AAV9 дикого типа. : Количественный анализ процента GFP-положительных клеток-предшественников мышц в каждой культуре с помощью проточной цитометрии показывает, что новые капсидные варианты AAV обеспечивают значительное увеличение количества трансдуцированных клеток по сравнению с трансдукцией AAV9 дикого типа. * р <0,05
Фигурах 10A-B
Фигура 10А
Фигура 10В
in vitro
На  представлены данные о степени увеличения трансдукции кардиомиоцитов человека и скелетных миофибрилл человека  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида AAV LANKTTNKDA+V708I и новый вариант химерного капсида AAV AAV6/AAV5, каждый из которых экспрессировал трансген GFP под контролем промотора CAG. : кратное увеличение трансдукции человеческих кардиомиоцитов новыми вариантами капсида AAV по сравнению с дикими типами AAV8 и AAV9, т.е. серотипами, наиболее широко используемыми в клинических применениях при мышечных заболеваниях. : кратное увеличение трансдукции скелетных миофибриол человека новыми вариантами капсида AAV по сравнению с капсидами AAV8 и AAV9 дикого типа.
Фигурах 11A-B
Фигура 11А
Фигура 11В
in vivo
in vivo
11
На  представлены данные о трансдукции ткани мыши  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, экспрессирующем трансген люциферазы под контролем промотора CAG. Мышам вводили одну внутривенную инъекцию через хвостовую вену в количестве 2×10 вирусных геномов на животное. : Визуализацией люциферазы в живой мыши на 14-й (слева) и 28-й (справа) дни после введения продемонстрировано, что новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать клетки мыши in vivo. : активность люциферазы в сердце, диафрагме и четырехглавой мышце через 56 дней после введения демонстрирует, что новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать сердечную и скелетную мышцу мышей .
Фигурах 12A-B
Фигура 12А
Фигура 12В
in vivo
vastus lateralis
in vivo
in vivo
11
На  представлены данные о трансдукции скелетных мышц приматов, отличных от человека,  рекомбинантным вирусом AAV, содержащим новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I, экспрессирующий трансген GFP под контролем промотора CAG. Примату, не являющемуся человеком, вводили 3 внутримышечных инъекции количеством 10 вирусных геномов каждая в левую мышцу  и затем мышечную ткань анализировали через 4 недели после введения. : Репрезентативные изображения окрашивания гемотоксилином и эозином (H&E) и антителом против GFP поперечных сечений проксимального участка биопсии с увеличением 2x, 4x и 20x демонстрируют, что новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать клетки скелетной мышцы примата . : Репрезентативные изображения окрашивания гемотоксилином и эозином (H&E) и антителом против GFP продольных срезов дистального участка биопсии с увеличением 2x, 4x и 20x демонстрируют, что новый вариант капсида AAV LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать клетки скелетных мышц примата .
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Прежде чем настоящие способы и композиции будут описаны, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретным описанным способом или композицией и, как таковое, может включать вариации. Также следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения изобретения, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой Формулой изобретения.
Раскрытое здесь изобретение иллюстрируется фигурами и описанием. Тем не менее, хотя конкретные варианты осуществления и показаны на чертежах, не предполагается ограничивать изобретение конкретными вариантами осуществления или вариантами осуществления, проиллюстрированными и/или раскрытыми тем или иным образом. Напротив, раскрытое здесь изобретение предназначено для охвата всех модификаций, альтернативных конструкций и эквивалентов, соответствующих сущности и объему изобретения. Как таковые, фигуры имеют иллюстративную, а не ограничительную функцию.
При предоставлении диапазона значений подразумевается, что каждое промежуточное значение, находящееся между верхним и нижним пределами этого диапазона, с точностью до десятой доли нижнего предела, если контекст явно не обозначает иное, также считается раскрытым. Каждый меньший диапазон между любым заявленным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим заявленным или промежуточным значением в указанном диапазоне входит в объем изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться или исключаться из диапазона, и каждый диапазон, где либо меньшие, либо оба предела включены в меньшие диапазоны, также включен в изобретение при условии любого специально исключенного предела в заявленном диапазоне значений. Если указанный диапазон включает один или оба из пределов, диапазоны, исключающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в изобретение.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистами в той области техники, к которой относится это изобретение. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут использоваться при практическом применении или испытании настоящего изобретения, некоторые потенциальные и предпочтительные способы и материалы описаны в настоящее время. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в него посредством ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Должно быть понятно, что если наблюдается противоречие, настоящее раскрытие имеет приоритет перед любым раскрытием включенной публикации в той степени, в которой наблюдается противоречие.
Как будет понятно специалистам в данной области техники после прочтения этого раскрытия, каждый из отдельных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в настоящем описании, имеет отдельные компоненты и признаки, которые могут быть легко отделены или объединены с признаками любого из нескольких других вариантов осуществления без отступления от объема или сущности настоящего изобретения. Любой изложенный метод может быть выполнен в порядке перечисленных событий или в любом другом логически возможном порядке.
Следует отметить, что, в рамках изобретения и в прилагаемой Формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «рекомбинантный вирион AAV» включает множество таких вирионов, а ссылка на «клетку мышечной ткани» включает ссылку на одну или более клеток мышечной ткани и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и так далее. Кроме того, следует отметить, что Формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключить любой необязательный элемент. Как таковое, это утверждение предназначено для того, чтобы служить юридической основой для использования такой «исключающей» терминологии, как «единственно/исключительно», «только» и т.п., в связи с перечислением элементов Формулы изобретения или использованием «отрицательного» ограничения.
Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, представлены исключительно из-за их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящем описании не должно быть истолковано в пользу того, что настоящее изобретение не имеет права предшествовать по времени такой публикации как изобретение, сделанное ранее. Кроме того, указанные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые, возможно, потребуется подтвердить независимо.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Rep
cap
cap
Аденоассоциированный вирус представляет собой непатогенный парвовирус, состоящий из генома одноцепочечной ДНК размером 4,7 т.п.н. заключенном в безоболочечном икосаэдрическом капсиде. Геном содержит три открытые рамки считывания (ORF), окруженные инвертированными концевыми повторами (ITR), служащих для инициации раунда репликации и сигнала упаковки.  ORF кодирует четыре неструктурных белка, которые играют роль в репликации вируса, регуляции транскрипции, сайт-специфической интеграции и сборке вириона.  ORF кодирует три структурных белка (VP 1-3), которые участвуют в сборке капсида, образуя 60-мерный вирусный капсид. Наконец, ORF, присутствующий в качестве альтернативной рамки считывания в гене , продуцирует белок, активирующий сборку (AAP), т.е. вирусный белок, который локализует капсидные белки AAV в ядрышке и функционально участвует в процессе сборки капсида.
Существует несколько встречающихся в природе («дикий тип») серотипов и более 100 известных вариантов AAV, каждый из которых отличается аминокислотной последовательностью, особенно в пределах гипервариабельных областей капсидных белков, и, как следствие, отличается по своим свойствам доставки генов. Так как ни один AAV не связан с каким-либо заболеванием человека, рекомбинантные AAV целесообразны для клинических применений.
В настоящем описании в целях раскрытия термин «AAV» является аббревиатурой для аденоассоциированного вируса, включая, без ограничения, сам вирус и его производные. Если не указано иное, термин относится ко всем подтипам или серотипам, а также к способным к репликации и рекомбинантным формам. Термин «AAV» включает, без ограничения, тип AAV 1 (AAV-1 или AAV1), тип AAV 2 (AAV-2 или AAV2), тип AAV 3A (AAV-3A или AAV3A), тип AAV 3B (AAV-3B) или AAV3B), тип AAV 4 (AAV-4 или AAV4), тип AAV 5 (AAV-5 или AAV5), тип AAV 6 (AAV-6 или AAV6), тип AAV 7 (AAV-7 или AAV7), тип AAV 8 (AAV-8 или AAV8), тип AAV 9 (AAV-9 или AAV9), тип AAV 10 (AAV-10 или AAV10 или AAVrh10), птичий AAV, бычий AAV, собачий AAV, AAV коз, AAV лошади, AAV приматов и не-приматов AAV и AAV овец. «AAV приматов» относится к AAV, инфицирующему приматов, «AAV не-приматов» относится к AAV, инфицирующему млекопитающих, не являющихся приматами, «AAV быков» относится к AAV, инфицирующему крупный рогатый скот и т.д.
Геномные последовательности различных серотипов AAV, а также последовательности нативных концевых повторов (TRs), белков Rep и субъединиц капсида известны в данной области. Такие последовательности можно найти в литературе или в открытых базах данных, таких как GenBank. См., например, регистрационные номера GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152.1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) и AAO88208 (AAVrh10); описания которых включены в настоящее описание посредством ссылки для описания последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислот AAV. См. также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et. al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; и патент США 6,156,303.
cap
Последовательности существующих в природе белков  (capsid), ассоциированных с серотипами AAV, известны в данной области техники и включают последовательности, раскрытые в настоящем описании как AAV1 (SEQ ID NO: 1), AAV2 (SEQ ID NO: 2), AAV3A (SEQ ID NO: 3), AAV3B (SEQ ID NO: 4), AAV4 (SEQ ID NO: 5), AAV5 (SEQ ID NO: 6), AAV6 (SEQ ID NO: 7), AAV7 (SEQ ID NO: 8), AAV8 (SEQ ID NO: 9), AAV9 (SEQ ID NO: 10), AAV10 (SEQ ID NO: 11) и AAVrh10 (SEQ ID NO: 12). Термины «вариант капсидного белка AAV» или «вариант AAV» относятся к капсидному белку AAV, содержащему аминокислотную последовательность, которая включает по меньшей мере  по меньшей мере одну модификацию или замену (включая делецию, вставку, точечную мутацию и т. д.) по сравнению с природно существующими последовательностями (или последовательностями дикого типа) капсидного белка AAV, например как указано в SEQ ID NO: 1-12 настоящей заявки. Вариант капсидного белка AAV может иметь приблизительно 80% идентичности или более с аминокислотной последовательностью капсидного белка дикого типа, например, 85% идентичности или более, 90% идентичности или более или 95% идентичности или более по отношению к аминокислотной последовательности капсидного белка дикого типа, например 98% или 99% идентичности капсидному белку дикого типа. Вариант капсидного белка AAV может не представлять собой капсидный белок дикого типа.
В настоящем описании в целях раскрытия термин «вирион AAV» или «вирусная частица AAV» относится к вирусной частице, состоящей по меньшей мере из одного капсидного белка AAV и инкапсулированного полинуклеотида AAV.
В настоящем описании в целях раскрытия термин «rAAV» представляет собой сокращение, которое относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу. «Рекомбинантный» применительно к полинуклеотиду означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций методов клонирования, рестрикции или лигирования и других процедур, в результате которых получается конструкция, отличная от полинуклеотида, встречающегося в природе. Рекомбинантный вирус представляет собой вирусную частицу, содержащую рекомбинантный полинуклеотид. Термины, соответственно, включают репликаты исходной полинуклеотидной конструкции и потомство исходной вирусной конструкции.
Термин «вектор rAAV» охватывает вирионы rAAV (то есть вирусные частицы rAAV) (например, инфекционный вирион rAAV), которые по определению включают полинуклеотид rAAV; и также охватывает полинуклеотиды, кодирующие rAAV (например, одноцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (ss-rAAV); двухцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (ds-rAAV), например плазмиды, кодирующие rAAV и т.п.).
Если вирион AAV содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, например, трансген, который должен быть доставлен в клетку-мишень, агент RNAi или агент CRISPR, которые должны быть доставлены в клетку-мишень, и т.д.), то такой вирион обычно называют «рекомбинантный вирион AAV (rAAV)» или «вирусная частица rAAV». Как правило, гетерологичный полинуклеотид фланкирован по меньшей мере одной, но, как правило, двумя последовательностями, инвертированными концевыми повторами AAV (ITR).
rep
cap
rep
cap
Термин «упаковка» относится к серии внутриклеточных событий, приводящих к сборке и капсидированию частицы AAV. Гены «» и «» AAV относятся к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим белки репликации и капсидирования аденоассоциированного вируса. AAV  и  упоминаются здесь как AAV «упаковочные гены/гены упаковки».
Термин «вирус-помощник» AAV относится к вирусу, который позволяет AAV (например, AAV дикого типа) реплицироваться и упаковываться в клетке млекопитающего. В данной области известно множество таких вирусов-помощников AAV, включая аденовирусы, герпесвирусы и поксвирусы, такие как виус коровьей оспы. Аденовирусы охватывают ряд различных подгрупп, хотя наиболее часто используется аденовирусы типа 5 из подгруппы C. Многочисленные аденовирусы человека, млекопитающих, не относящихся к человеку, и птиц известны и доступны в таких хранилищах, как АТСС. Вирусы семейства герпесов включают, например, вирус простого герпеса (HSV) и вирус Эпштейна-Барра (EBV), а также цитомегаловирусы (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV), которые также доступны в депозитариях, таких как ATCC.
in trans
Терминология «функция(и) вируса-помощника» относится к функции (функциям), кодируемой геномом вируса-помощника, которые обеспечивают репликацию и упаковку AAV (в сочетании с другими требованиями к репликации и упаковке, описанными здесь). Как описано в настоящем описании, «функция вируса-помощника» может обеспечиваться несколькими способами, в том числе путем предоставления вируса-помощника или предоставления, например, полинуклеотидных последовательностей, кодирующих требуемую функцию(и), в клетке-продуценте . Например, плазмида или другой вектор экспрессии, содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие один или несколько аденовирусных белков, трансфицируется в клетку-продуцент вместе с вектором rAAV.
Термин «инфекционный(ая)» вирус/вирусная частица - это термин, который обозначает правильно собранный вирусный капсид и который(ая) способен доставлять полинуклеотидный компонент в клетку, к которой вирусный вид проявляет тропизм. Термин не обязательно подразумевает какую-либо способность вируса к репликации. Способы подсчета инфекционных вирусных частиц описаны в других частях этого описания и в данной области техники. Инфекционность вируса может быть выражена как отношение количества инфекционных вирусных частиц к общему количеству вирусных частиц. Способы определения отношения инфекционных вирусных частицы к общему количеству вирусных частиц известны в данной области. См., например, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (describing a TCID50 infectious titer assay); и Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. См. также примеры.
Используемый здесь термин «тропизм» относится к предпочтительному нацеливанию вирусом (например, AAV) на клетки-хозяева определенного вида или определенные типы клеток в пределах вида хозяина. Например, вирус, который может инфицировать клетки сердца, легких, печени и мышц, имеет более широкий (то есть повышенный) тропизм по сравнению с вирусом, который может инфицировать только клетки легких и мышц. Тропизм также может включать зависимость вируса от определенных типов молекул клеточной поверхности хозяина. Например, некоторые вирусы могут инфицировать только клетки с гликозаминогликанами на поверхности, в то время как другие вирусы могут инфицировать только клетки с сиаловой кислотой на поверхности (такие зависимости могут быть проверены при использовании различных клеточных линий, в которых отсутствует определенный класс молекул, в качестве потенциальных клеток-хозяев для вирусной инфекции). В некоторых случаях тропизм вируса описывает относительные предпочтения вируса. Например, первый вирус может быть способен инфицировать все типы клеток, но быть гораздо успешнее при инфицировании клеток с поверхностными гликозаминогликанами. Второй вирус может считаться имеющим сходный (или идентичный) тропизм с первым вирусом, если второй вирус также предпочитает те же самые характеристики клеток (например, второй вирус также более успешен в инфицировании клеток с поверхностными гликозаминогликанами), даже если абсолютные величины эффективности трансдукции не сходны между собой. Например, второй вирус может быть более эффективен, чем первый вирус, при заражении каждого тестируемого типа клеток, но если относительные предпочтения схожи (или идентичны), второй вирус все же можно считать имеющим аналогичный (или идентичный) тропизм с первым вирусом. В некоторых вариантах осуществления тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, не изменяется относительно нативного вириона. В некоторых вариантах осуществления тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, является увеличенным (то есть расширенным) по сравнению с тропизмом вириона, встречающегося в природе. В некоторых вариантах осуществления тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, снижается по сравнению с тропизмом вириона, встречающегося в природе.
2
4
12
Термин «способный к репликации» вирус (например, способный к репликации AAV) относится к фенотипу вируса дикого типа, который инфективен и в то же время способен реплицироваться в инфицированной клетке (то есть в присутствии вируса-помощника (хелпера) или функций вируса-помощника). В случае AAV, способность эффективно реплицироваться обычно требует наличия функциональных генов упаковки AAV. Как правило, векторы rAAV, как описано здесь, являются неспособными к репликации в клетках млекопитающих (особенно в клетках человека) из-за отсутствия одного или нескольких генов упаковки AAV. Как правило, в таких векторах rAAV отсутствуют какие-либо последовательности генов упаковки AAV для минимизации вероятности того, что способные к репликации AAV могут быть образованы путем рекомбинации между генами упаковки AAV и входящим вектором rAAV. Во многих вариантах осуществления препараты вектора rAAV, как описано в настоящем описании, представляют собой те, которые содержат мало, если вообще содержат, способных к репликации AAV (rcAAV, также называемые RCA) (например, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 rAAV частиц, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV или полностью без rcAAV).
Термин «полинуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды или их аналоги. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, и может прерываться ненуклеотидными компонентами. Если таковые присутствуют, модификации нуклеотидной структуры могут быть введены до или после сборки полимера. Используемый здесь термин «полинуклеотид» употребляется взаимозаменяемо к двухцепочечным и одноцепочечным молекулам. Если иное не указано или не требуется, любой вариант осуществления, включающий в себя полинуклеотид, охватывает как двухцепочечную форму, так и каждую из обеих комплементарных одноцепочечных форм, известных или предсказанных для формирования двухцепочечной формы.
Если полинуклеотид или полипептид имеет определенный процент «идентичности последовательности» с другим полинуклеотидом или полипептидом, то это означает, что при выравнивании последовательностей этот процент оснований или аминокислот показывает количество одинаковых оснований/аминокислот при сравнении двух последовательностей. Сходство последовательности может быть определено различными способами. Для определения идентичности последовательностей, последовательности могут быть выровнены при использовании различных методов и компьютерных программ, включая BLAST, доступных онлайн ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Другим алгоритмом выравнивания является FASTA, доступный в пакете программ от Genetics Computing Group (GCG), от Madison, Wisconsin, USA, дочерней компании Oxford Molecular Group, Inc., находящейся в полной собственности. Другие способы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. Особый интерес представляют программы выравнивания, позволяющие пропуски в последовательности. Smith-Waterman - это один из типов алгоритма, допускающего пропуски в выравнивании последовательностей. См. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Кроме того, программа GAP, использующая метод выравнивания Needleman и Wunsch, может использоваться для выравнивания последовательностей. См. J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).
Термин «ген» относится к полинуклеотиду, выполняющему какую-либо функцию в клетке. Например, ген может содержать открытую рамку считывания, способную кодировать продукт гена. Одним из примеров генного продукта является белок, который транскрибируется и транслируется с этого гена. Другим примером генного продукта является РНК, например, функциональный продукт РНК, например аптамер, интерферирующая РНК, рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК), некодирующая РНК (нкРНК), направляющая РНК для нуклеаз и т. д., которая транскрибируется с гена, но не транслируется.
Термин «продукт экспрессии гена» или «продукт гена» представляет собой молекулу, полученную в результате экспрессии определенного гена, как определено выше. Продукты генной экспрессии включают, например, полипептид, аптамер, интерферирующую РНК, РНК-мессенджер (мРНК), рРНК, тРНК, некодирующую РНК (нкРНК) и тому подобное.
Термин «агент siРНК» («малая интерферирующая» или «короткая интерферирующая РНК» (или миРНК)) представляет собой РНК-дуплекс нуклеотидов, нацеленный на интересующий ген («целевой ген»). «РНК-дуплекс» относится к структуре, образованной комплементарным спариванием между двумя областями молекулы РНК, образующими область двухцепочечной РНК (дцРНК). миРНК "нацелена" на ген таким образом, что нуклеотидная последовательность дуплексного участка миРНК является комплементарной нуклеотидной последовательности целевого гена. В некоторых вариантах осуществления длина дуплекса миРНК составляет менее 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления дуплекс может иметь длину 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нуклеотидов. , В некоторых вариантах осуществления длина дуплекса составляет 19-25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, нацеливание на ген, осуществляемое с помощью siRNA, достигается посредством использования ДНК-направленной РНК-интерференции (ddRNAi), представляющей собой метод подавления экспрессии гена, в котором используются ДНК-конструкции для активации путей эндогенной РНК-интерференции (RNAi) в клетках животных. Такие конструкции ДНК предназначены для экспрессии самокомплементарных двухцепочечных РНК, обычно РНК с короткой шпилькой (shRNA), которые, будучи процессированы, подавляют экспрессию целевого гена или генов. Экспрессия любой РНК, включая эндогенные мРНК или вирусные РНК, может быть подавлена с помощью конструкции, созданных для экспрессии двухцепочечной РНК, комплементарной желаемой целевой мРНК. Как таковая, дуплексная часть РНК агента siRNA может быть частью структуры с короткой шпилькой, обозначаемой shRNA. В дополнение к дуплексной части, структура шпильки может содержать петлевую часть, расположенную между двумя последовательностями, образующими дуплекс. Петлевая структура может варьироваться по длине. В некоторых вариантах осуществления длина петли составляет 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 нуклеотидов. Структура шпильки может также содержать 3' или 5' выступающие части. В некоторых вариантах осуществления выступ является 3' или 5' выступом с длиной 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов. Как правило, уровень экспрессии продукта гена-мишени (например, мРНК, полипептида и т. д.) снижается с помощью агента siRNA (например, siRNA, shRNA и т. д.), который содержит специфические двухцепочечные нуклеотидные последовательности, являющиеся комплементарными по меньшей мере сегменту длиной 19-25 нуклеотидов (например, нуклеотидной последовательностью длиной 20-21) транскрипта гена-мишени, включая 5'-нетранслируемую (UT) область, ORF или 3' UT-область. В некоторых вариантах осуществления короткие интерферирующие РНК имеют длину приблизительно 19-25 нуклеотидов. См., например, заявки РСТ WO 00/44895, WO 99/32619, WO 01/75164, WO 01/92513, WO 01/29058, WO 01/89304, WO 02/16620 и WO 02/29858; и публикацию патента США № 2004/0023390 для описания siRNA технологий. siRNA и/или shRNA могут кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, и последовательность нуклеиновой кислоты также может включать промотор. Последовательность нуклеиновой кислоты также может включать сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой синтетический минимальный сигнал полиаденилирования.
Терминология «антисмысловая РНК» охватывает РНК, комплементарную продукту экспрессии гена. Например, антисмысловая РНК, нацеленная на конкретную мРНК, представляет собой агент на основе РНК (или может быть модифицированной РНК), комплементарный мРНК, причем гибридизация антисмысловой РНК с мРНК изменяет экспрессию мРНК (например, путем изменения стабильности РНК, изменения трансляции РНК и т. д.). Также в «антисмысловую РНК» включаются нуклеиновые кислоты, кодирующие антисмысловую РНК.
Что касается «агентов CRISPR/Cas9», термин «CRISPR» охватывает короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)/CRISPR-ассоциированные (Cas) системы, которые появились в процессе эволюции для обеспечения адаптивного иммунитета у бактерий и архей против вирусов и плазмид с использованием CRISPR РНК (crRNA, crРНК) для регуляции подавления экспрессии инвазивных нуклеиновых кислот. Белок Cas9 (или его функциональный эквивалент и/или вариант, то есть Cas9-подобный белок), в норме обладает активностью эндонуклеазы ДНК, зависящей от ассоциации белка с двумя природными или синтетическими молекулами РНК, обозначаемыми как crРНК и trakrРНК (также называемой направляющими РНК). В некоторых случаях обе молекулы ковалентно связаны с образованием одной молекулы (обозначаемой «одиночной направляющей РНК» («sgRNA», single guide RNA)). Таким образом, Cas9 или Cas9-подобный белок связывается с ДНК-нацеливающей РНК (этот термин включает как двухмолекулярную конфигурацию направляющей РНК, так и конфигурацию одно-молекулярной направляющей РНК), которая активирует Cas9 или Cas9-подобный белок и нацеливает белок на последовательность нуклеиновой кислоты-мишени.
Если Cas9 или Cas9-подобный белок сохраняет свою естественную ферментативную функцию, он расщепляет ДНК-мишень с образованием двухцепочечного разрыва, который может привести к модификации генома (т.е. редактированию: появлению делеции, инсерции (в присутствие донорного полинуклеотида), замене и т. д.), тем самым приводя к изменению экспрессии гена. Некоторые варианты Cas9 (которые охватываются термином Cas9-подобные) были изменены таким образом, чтобы они обладали сниженной активностью расщепления ДНК (в некоторых случаях они расщепляют одну цепь вместо обеих цепей целевой ДНК, тогда как в других случаях, наблюдается полное исчезновении активности расщепления ДНК). Cas9-подобные белки с пониженной ДНК-расщепляющей активностью (и даже без ДНК-расщепляющей активности) все же могут быть направлены к целевой ДНК для блокирования активности РНК-полимеразы. Альтернативно, Cas9 или Cas9-подобный белок могут быть модифицированы путем слияния домена активации транскрипции VP64 с белком Cas9 и совместной доставки слитого белка с хелперным белком MS2-P65-HSF1 и одиночной направляющей РНК, содержащей аптамеры РНК MS2 на тетра-петле и стволовой петле для формирования синергического комплекса медиатора активации (Cas9-SAM), активирующего транскрипцию в клетке. Таким образом, ферментативно неактивные Cas9-подобные белки могут быть нацелены на определенное место в ДНК-мишени посредством ДНК-нацеливающей РНК для блокировки или активации транскрипции ДНК-мишени. Используемый здесь термин «агенты CRISPR/Cas9» охватывает все формы CRISPR/Cas9, как описано выше или как известно в данной области техники.
Подробную информацию относительно агентов CRISPR можно найти, например, в (a) Jinek et. al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21: "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity"; (b) Qi et al., Cell. 2013 Feb 28; 152(5): 1173-83: "Repurposing CRISPR as an RNA- guided platform for sequence- specific control of gene expression", и в (c) заявке на патент США № 13/842 859 и в заявке PCT/US13/32589; все из которых таким образом включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте. Таким образом, термин «агент CRISPR», используемый в настоящем описании, включает любой агент (или нуклеиновую кислоту, кодирующую такой агент), встречающиеся в природе и/или синтетические последовательности, которые могут быть использованы в системе на основе Cas9 (например, Cas9 или Cas9 подобные белки; любой компонент ДНК-нацеленной РНК, например crРНК-подобная РНК, trakrРНК-подобная РНК, одиночная направляющая РНК и т. д .; донорный полинуклеотид, и тому подобное).
Под «нуклеазами цинкового пальца» (также обозначенные как ZFNs) понимаются искусственные эндонуклеазы ДНК, полученные путем слияния ДНК-связывающего домена цинкового пальца с доменом расщепления ДНК. ZFNs могут быть сконструированы для нацеливания на желаемые последовательности ДНК, что позволяет нуклеазам цинкового пальца расщеплять уникальные последовательности-мишени. При введении в клетку, ZFNs могут быть использованы для редактирования целевой ДНК в клетке (например, при редактировании генома клетки) путем индукции двойных разрывов цепи. Для получения дополнительной информации об использовании ZFNs см., например: Asuri et al., Mol. Ther. 2012 Feb; 20(2):329-38; Bibikova et al. Science. 2003 May 2;300(5620):764; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 Aug; 15(8):875-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 Oct; 40(10):759-65; Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2): 121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 26;108(17):7052-7; Goldberg et al, Cell. 2010 Mar 5;140(5):678-91; Geurts et al, Science. 2009 Jul 24;325(5939):433; Flisikowska et al, PLoS One. 2011;6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun 13; Hauschild et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 19;108(29): 12013-7; и Yu et al, Cell Res. 2011 Nov; 21(l 1): 1638-40; все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки в отношении материала, связанного с ZFNs. Термин «агент ZFN» охватывает нуклеазу(ы) цинкового пальца и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу цинкового пальца.
Терминология «эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции» или «TALEN» относится к эффекторным нуклеазам, подобным активатору транскрипции (TALEN). TALEN представляют собой искусственные эндонуклеазы ДНК, полученные путем слияния TAL (Transcription activator-like) эффекторного ДНК-связывающего домена с доменом расщепления ДНК. TALEN могут быть быстро сконструированы таким образом, чтобы связывать практически любую желаемую последовательность ДНК, и, при введении в клетку, TALEN могут использоваться для редактирования целевой ДНК в клетке (например, при редактировании генома клетки) путем индукции двойных разрывов цепи. Для получения дополнительной информации об использовании TALEN см., например: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul 7;29(8):731-4; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):695-6; и Huang et. al., Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):699-700; все из которых включены в настоящее описание посредством ссылки в отношении материала, связанного с TALEN. Термин «агент TALEN» охватывает TALEN и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую TALEN.
Термин «контролирующий элемент» или «контролирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, вовлеченной во взаимодействие молекул и способствующее функциональной регуляции полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или деградацию полинуклеотида. Регуляция может влиять на частоту, скорость или специфичность процесса и может быть усиливающим или тормозящим фактором по своей природе. Контролирующие элементы, известные в данной области, включают, например, регуляторные последовательности транскрипции, такие как промоторы и энхансеры. Промотор представляет собой область ДНК, способную в определенных условиях связывать РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию кодирующей области, обычно расположенной ниже по течению (в 3'-направлении) от промотора. Промоторы могут быть повсеместно действующими, то есть активными во многих типах клеток, как, например, промоторы CAG или CMV; или быть специфичными для ткани или клетки, например промотор может быть тканеспецифичным для экспрессии в кардиомиоцитах.
Термин «функционально связанный» или «оперативно связанный» относится к такому взаиморасположению генетических элементов, при котором элементы находятся в взаимосвязи, позволяющей им работать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор помогает инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут присутствовать промежуточные нуклеотидные основания при условии сохранения этой функциональной взаимосвязи.
Термин «экспрессионный вектор (также: вектор экспрессии)» охватывает вектор, содержащий полинуклеотидную область, кодирующую представляющий интерес полипептид, который используется для осуществления экспрессии белка в предполагаемой клетке-мишени. Вектор экспрессии также может содержать контролирующие элементы, функционально связанные с кодирующей областью для облегчения экспрессии белка в клетке-мишени. Комбинация контролирующих элементов с геном или генами, с которыми они функционально связаны для обеспечения экспрессии, иногда упоминается как «кассета экспрессии», большое количество которых известно и доступно в данной области техники или может быть легко сконструировано из компонентов, доступными в данной области техники.
Термин «гетерологичный» означает производное от генотипически отличного объекта, другого, чем остальные объекты, с которыми он сравнивается. Например, полинуклеотид, введенный методами генной инженерии в плазмиду или вектор, полученный из другого вида представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не был связан естественным образом, является гетерологичным промотором. Таким образом, например, rAAV, который включает гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный генный продукт, представляет собой rAAV, включающий полинуклеотид, обычно не содержащийся во встречающемся в норме AAV дикого типа, а кодируемый гетерологичный генный продукт представляет собой такой генный продукт, который обычно не кодируется природным AAV дикого типа.
Термины «генетическое изменение» и «генетическая модификация» (и их грамматические варианты) используются здесь взаимозаменяемо для обозначения процесса, в котором генетический элемент (например, полинуклеотид) вводится в клетку способом, отличным от митоза или мейоза. Элемент может быть гетерологичным для клетки, или может являться дополнительной копией или улучшенной версией элемента, уже присутствующего в клетке. Генетическое изменение может быть осуществлено, например, путем трансфекции клетки рекомбинантной плазмидой или другим полинуклеотидом с помощью любого процесса, известного в данной области, такого как электропорация, осаждение фосфатом кальция или контактом с полинуклеотид-липосомным комплексом. Генетическое изменение также может быть осуществлено, например, путем трансдукции или заражения ДНК- или РНК-содержащим вирусом или вектором на основе вируса. Как правило, генетический элемент вводится в хромосому или мини-хромосому в клетке; однако любая модификация, изменяющая фенотип и/или генотип клетки и ее потомства, включается в этот термин.
in vitro
Что касается модификации клеток, термины «генетически модифицированный» или «трансформированный» или «трансфицированный» или «трансдуцированный» экзогенной ДНК (например, с помощью рекомбинантного вируса) относятся к моменту, когда такая ДНК была введена внутрь клетки. Присутствие экзогенной ДНК приводит к постоянным или временным генетическим изменениям. Трансформирующая ДНК может быть или не быть интегрирована (ковалентно связана) в геном клетки. «Клон» представляет собой популяцию клеток, полученных из одной клетки или общего предка посредством митоза. «Клеточная линия» представляет собой клон первичной клетки, способный стабильно расти  в течение многих поколений.
in vitro
in vivo
В рамках изобретения, клетка считается «стабильно» измененной, трансдуцированой, генетически модифицированной или трансформированный генетической последовательностью, если эта последовательность выполняет свою функции при культивирования культуры клеток  и/или в течение длительного периода времени . Как правило, такая клетка «наследственно» изменена (генетически модифицирована) тем, что вводится такое генетическое изменение, которое наследуется потомством измененной клетки.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который подвергся изменениям, таким, как, например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидирование, фосфорилирование или конъюгация с метящим компонентом. Полипептиды, такие как антиангиогенные полипептиды, нейропротекторные полипептиды и тому подобное, если они обсуждаются в контексте доставки генного продукта субъекту-млекопитающему, а также композиции таковых, относятся к соответствующему интактному полипептиду или любому его фрагменту или его генно-инженерному производному, которые сохраняют желаемую биохимическую функцию интактного белка. Аналогичным образом, ссылки на нуклеиновые кислоты, кодирующие антиангиогенные полипептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие нейропротекторные полипептиды, и другие такие нуклеиновые кислоты используемые при доставке продукта гена млекопитающему субъекту (которые могут называться «трансгенами» для доставки в клетки реципиента), включают полинуклеотиды, кодирующие интактный полипептид или любой фрагмент или генно-инженерное производное, обладающие желаемой биохимической функцией.
Используемый здесь термин «выделенная/изолированная» плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, вирион, клетка-хозяин, белок или другое вещество относится к препарату вещества, лишенного по меньшей мере некоторых других компонентов, которые также могут присутствуют там, где вещество или вещество, подобное таковому, встречается в природе или материале, из которого оно изначально получено. Так, например, выделенное вещество может быть приготовлено с использованием методики очистки для обогащения его из исходной смеси. Обогащение может быть измерено на абсолютной основе, такой как масса на объем раствора, или оно может быть измерено по отношению ко второму, потенциально мешающему веществу, присутствующему в исходной смеси. Увеличение степени обогащения в вариантах осуществления этого раскрытия способствует улучшению степени очистки элемента. Выделенная плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, клетка-хозяин или другое вещество в некоторых вариантах осуществления очищается, например, от приблизительно 80% до приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, по меньшей мере приблизительно 98% чистоты или, по меньшей мере приблизительно 99% чистоты или более.
31
Используемые здесь термины «лечение», «применение лечения» и тому подобное относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или неблагоприятного эффекта, связанного с заболеванием. Термин «лечение», как используется в настоящем описании, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, особенно у человека, и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания (и/или симптомов, вызываемых заболеванием) у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию или подвержен риску заболевания, но еще не был диагностирован как заболевший; (б) подавление заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), то есть прекращение его развития; и (c) ослабление заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), то есть индукция регрессии заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), то есть ослабление заболевания и/или одного или нескольких симптомов заболевания. болезни. Например, предлагаемые композиции и способы могут быть направлены на лечение мышечного заболевания. Неограничивающие методы для оценки мышечных заболеваний и их лечения включают измерение выработки терапевтического белка (например, при проведении биопсии мышц с последующим иммуногистохимическим анализом или отбором сыворотки с последующим тестом ELISA или анализом активности ферментов), измерение симптомов сердечной недостаточности (например, используя функциональную классификацию Нью-Йоркской ассоциации кардиологов или опросник Minnesota Living With Heart Failure), оценку функционального статуса сердца (например, 6-минутный тест ходьбы или пиковое максимальное потребление кислорода), анализ биомаркеров (например, N-терминальный прогормонового мозгового натрийуретического пептида), оценку функции/ремоделирования левого желудочка (например, оценка фракции выброса левого желудочка или конечного систолического объема левого желудочка), оценку мышечной силы (например, по тестам Medical Research Council Scales Clinical Investigation of Duchenne Dystrophy, ручной динамометрии или максимального подъема веса), оценку мышечной функции (например, по шкале Виньоса, временных функциональных тестов, шкале Motor Function Measure Scale, шкале, соответствующей North Star Ambulatory Assessment, тесты на время подъем объектов с пола (9 Hole Peg Test), тест нервно-мышечных расстройств младенцев разработанный в детской больнице Филадельфии (Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders), оценку симптомов мышечных заболеваний (например, оценку нервно-мышечных симптомов или общий клинический анамнез), оценку митохондриальная функция (например, методом магнитно-резонансной спектроскопии P), оценку качества жизни на основе опросника, результаты, сообщаемые пациентами, или анализ ежедневных действий.
Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к млекопитающим, включая, но не ограничиваясь человеком, приматами, не являющиеся людьми, включая обезьян; спортивные животные (млекопитающие), например, лошади; сельскохозяйственные животные (млекопитающие), например, овцы, козы и т. д.); домашние животные (млекопитающие), например собаки, кошки и т. д.; и грызуны, например, мыши, крысы и т. д.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека, который ранее подвергался естественному воздействию ААV и в результате обладает анти-AAV-антитела (т.е. нейтрализующими AAV-антителами). В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека, которому ранее вводили вектор AAV (и, как следствие, он может обладать антителами против AAV) и который нуждается в повторном введении вектора для лечения другого состояния или для дальнейшего лечения того же самого состояния. На основании положительных результатов клинических испытаний, связанных с доставкой гена AAV, например, в печень, мышцы и сетчатку - во все ткани, пораженные нейтрализующими антителами против этого вектора - существует множество таких терапевтических применений/мишеней заболевания.
Используемый здесь термин «эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для достижения позитивных или желаемых клинических результатов. Эффективное количество может быть введено за одно или несколько введений. Для целей настоящего раскрытия эффективное количество соединения (например, инфекционного вириона rAAV) представляет собой количество, являющееся достаточным для смягчения, улучшения, стабилизации, реверсии, предотвращения, замедления или задержки прогрессирования конкретного заболевание (например, заболевания мышц) и/или симптомов, связанных с ним. Соответственно, эффективное количество инфекционного вириона rAAV представляет собой количество инфекционного вириона rAAV, способное эффективно доставлять гетерологичную нуклеиновую кислоту в клетку-мишень (или клетки-мишени) индивидуума. Эффективные количества могут быть определены доклинически, например, путем обнаружения в клетке или ткани генного продукта (РНК, белка), который кодируется гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, с использованием методик, хорошо известных в данной области техники, например, ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинг, ELISA (ИФА), флуоресцентные или другие репортерные показания и тому подобное. Эффективные количества могут быть определены клинически, например, при обнаружении изменения в самом начале или при прогрессировании заболевания с использованием способов, известных в данной области, например, 6-минутного теста ходьбы, анализа фракции выброса левого желудочка, ручной динамометрии, применения шкала Виньоса и тому подобного, как описано здесь и как известно в данной области.
in vivo
Термин «мышечная клетка» или «мышечная ткань» относится здесь к клетке или группе клеток, полученных из мышц любого типа, включая, без ограничения, скелетную мышцу, сердечную мышцу, гладкую мышцу (например, из пищеварительного тракта, мочевого пузыря и кровеносных сосудов) и мышцы диафрагмы. Такие мышечные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными, такими как миобласты, миоциты, миотубы, кардиомиоциты и кардиомиобласты. Поскольку мышечная ткань является легко доступной для системы кровообращения, белок, продуцируемый и секретируемый мышечными клетками и тканями , будет логически поступать в кровоток, обеспечивая системный эффект, обеспечивая тем самым устойчивые терапевтические уровни секреции белка из мышечной ткани.
in vitro
in vivo
in vivo
Термин «направленная эволюция» относится к методологии, применяемой в инженерии капсидов  и/или , которая имитирует естественную эволюцию посредством повторяющихся циклов генетической диверсификации и селекции, тем самым накапливая полезные мутации, постепенно улучшающие функцию биомолекулы. Направленная эволюция часто включает метод , называемый «биопэннинг» (“biopanning”), для отбора таких вариантов AAV из библиотеки, которые обладают более эффективным уровнем инфекционности интересующего типа клетки или ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
rep
cap
cap
Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой семейство парвовирусов с геномом одноцепочечной ДНК размером 4,7 т.п.н., содержащимся в безоболочечном капсиде. Вирусный геном встречающегося в природе AAV имеет 2 инвертированных концевых повтора (ITR), функционирующих как вирусный сайт инициации репликации и сигнала упаковки - фланкирующие 2 первичные открытые рамки считывания (ORF):  (кодирующую белки, функционирующие при репликации вируса, регуляции транскрипции, сайт-специфической интеграции и сборке вирионов) и .  ORF кодирует 3 структурных белка, которые участвуют в сборке с образованием 60-мерного вирусного капсида. Были получены многие варианты и серотипы AAV, встречающиеся в природе, но ни один из них не связан с заболеваниями человека.
rep
cap
in vitro
in vivo
Fields’ Virology
Proc Natl Acad Sci U S A
Science
Proc Natl Acad Sci U S A
Proc Natl Acad Sci U S A
Virology
Nature
Virology
Gene Ther
99
149
55
58
134
210
330
Рекомбинантные версии AAV можно использовать в качестве векторов доставки генов, где маркер или терапевтический ген, представляющий интерес, встраивается между ITR, замещая  и . Было показано, что эти векторы трансдуцируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки  и  и могут приводить к стабильной экспрессии трансгена в течение нескольких лет в постмитотической ткани. Смотри, например, Knipe DM, Howley PM. . Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2007; Gao G-P, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.  2002; : 11854-9;Atchison RW, Casto BC, Hammon WM. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.  1965; : 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics.  1966; : 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man.  1967; : 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.  1984; : 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group).  1966; : 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. 2004; : 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors.  2004; 11: 805-10.
cap
Рекомбинантный AAV (называемый здесь просто «AAV») показал многообещающие результаты в растущем числе клинических испытаний. Однако существуют препятствия для доставки генов, которые могут ограничивать полезность AAV, такие как иммунные ответы на капсид, низкая трансдукция определенных тканей, неспособность осуществлять целенаправленную доставку к определенным типам клеток и относительно низкая несущая способность. Во многих ситуациях не хватает механистических знаний для эффективного расширения возможностей рационального дизайна, направленного на улучшение AAV. В качестве альтернативы, направленная эволюция возникла как стратегия для создания новых вариантов AAV, отвечающих определенным биомедицинским потребностям. Стратегии направленной эволюции используют процессы генетической диверсификации и селекции для того, чтобы накопить полезные мутации, постепенно улучшающие функцию биомолекулы. В данном процессе гены  AAV дикого типа диверсифицируются несколькими методами с целью создания больших генетических библиотек, которые упаковываются для создания библиотек вирусных частиц, и затем применяется селективное давление для выделения новых вариантов, способных преодолеть барьеры доставки генов. Важно, что механистическую основу, лежащую в основе проблемы доставки генов, даже не нужно знать чтобы осуществить направленную эволюции функции, что может, таким образом, ускорить разработку улучшенных векторов.
cap
in vitro
in vivo
cap
cap
cap
th
Как правило, варианты, раскрытые в настоящем описании, были получены посредством использования библиотеки и/или библиотек AAV. Такую библиотеку или библиотеки AAV генерируют, мутируя ген , ген, кодирующий структурные белки капсида AAV, с помощью ряда методов направленной эволюции, известных и легко доступных специалисту, работающему в области инженерии вирусных геномов. См., например, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15 Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J. T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); и Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Такими методами, без ограничения, являются следующие: i) мутагенез с помощью ПЦР (error-prone PCR) для введения случайных точечных мутаций в открытую рамку считывания (ORF) AAV с заданной изменяемой скоростью; ii) вирусная рекомбинация  или  или ДНК-шаффлинг (также: перетасовка ДНК) для создания случайных химер генов  AAV с целью получения библиотеки генов с несколькими серотипами AAV (shuffled library); iii) случайные пептидные вставки в определенных местах капсида путем лигирования вырожденных олигонуклеотидов в ORF; iv) определенные вставки пептид-кодирующих последовательностей в случайные места  ORF AAV с использованием транспозонного мутагенеза; v) замена поверхностных петель капсидов AAV библиотеками пептидных последовательностей, спроектированных с помощью биоинформатики с учетом степени консервации каждой аминокислотной положении среди природных серотипов и вариантов AAV, для создания библиотек «с заменой петель» (“loop-swap” libraries); vi) случайная аминокислотная замена в вырожденных положениях между серотипами AAV для создания библиотек вариантов вирусных предшественников (Santiago-Ortiz et al., 2015); и комбинация таких методов.
ДНК-шаффлинг генерирует химеры, комбинирующие свойства родителей в уникальной и часто выгодной манере; однако некоторые из них могут быть неспособны к упаковке, что, по сути, уменьшает разнообразие библиотеки. Концентрация разнообразия библиотеки в специфической области(ях) капсида достигается с помощью методов вставки пептида, таких как, без ограничения, iii-iv) выше. Разнообразие библиотеки обеспечивается на разнообразием конкретной области (областях) капсида, достигаемого в описанных выше методиках (таких как v) ), и такая концентрация разнообразия приходится на множество гипервариабельных областей, расположенных на экспонированных петлях поверхности капсида AAV. В то время как многие из методов генерируют вариантные капсиды с мутацией только небольшого участка капсида, эти методы могут сочетаться с дополнительными стратегиями мутагенеза для модификации всего капсида.
cap
in vitro
in vivo
После того как библиотека или библиотеки AAV создана(ы), вирусы затем упаковываются так, что каждая частица AAV состоит из мутантного капсида, заключающего внутри ген , кодирующий этот капсид, и очищается. Варианты библиотеки затем подвергаются обработке методом селективного давления  и/или . Методы селективного давления известны специалисту в области AAV и легко доступны. См., например, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); and Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Например, без ограничения, варианты AAV могут быть выбраны с использованием i) аффинных колонок, в которых элюирование различных фракций дает варианты с измененными свойствами связывания; ii) первичных клеток - выделенных из образцов тканей или бессмертных клеточных линий, имитирующих поведение клеток в организме человека - которые дают варианты AAV с повышенной эффективностью и/или тканевой специфичностью; iii) моделей животных, имитирующих клиническую среду генной терапии - которые дают варианты AAV, успешно инфицирующих целевую ткань; iv) моделей ксенотрансплантата человека, которые дают варианты AAV, инфицирующие привитые клетки человека; и/или сочетание таких методов отбора.
cap,
После того как вирусы выбраны, они могут быть выделены известными способами, такими как, без ограничения, аденовирус-опосредованная репликация, амплификация методом ПЦР, методом секвенирования и клонирования следующего поколения (NGS, Next Generation sequencing and cloning)- и тому подобных. Вирусные клоны затем обогащают с помощью повторяющихся циклов методов отбора, и ДНК AAV выделяют для восстановления выбранных вариантов генов представляющих интерес. Такие выбранные варианты могут быть подвергнуты дальнейшей модификации или мутагенезу и, как таковые, служат новой отправной точкой для дальнейших этапов отбора для итеративного повышения эффективности вирусов AAV. Однако в некоторых случаях успешные капсиды были созданы без внесения дополнительных мутаций.
in vivo
Варианты AAV, раскрытые в настоящем описании, были получены, по меньшей мере частично, посредством использования методологии направленной эволюции , в соответствии с методиками, описанными выше, включающие использование скрининга сердечных и скелетных мышц приматов после внутривенного введения. По существу, капсиды варианта AAV, раскрытые в настоящем описании, содержат одну или более модификаций аминокислотной последовательности, обеспечивающих более эффективную трансдукцию мышечных клеток приматов, чем соответствующий родительский белок капсида AAV. Используемый здесь термин «соответствующий родительский белок капсида AAV» относится к белку капсида AAV того же серотипа AAV дикого типа или, в случае варианта, к тому типу, что и вариантный капсидный белок AAV объекта, но не содержит одну или более модификаций аминокислотной последовательности обсуждаемого варианта капсидного белка AAV. В конкретных вариантах осуществления AAV, включающий вариант капсидного белка AAV, как описано здесь, обладает системным тропизмом к сердечной мышце и/или множественным группам скелетных мышц всего организма, демонстрируемому после системного или ткане-направленного введения.
Mol. Ther.
J. Virol.
Mol. Ther.
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит гетерологичный пептид от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот, встроенный ковалентно в петлю GH капсидного белка AAV или петлю IV, по сравнению с соответствующим родительским капсидным белком AAV. Под «петлей GH» или петлей IV капсидного белка AAV подразумевается доступная для растворителя часть, называемая в данной области техники петлей GH или петлей IV капсидного белка AAV. Что касается петли GH/петли IV капсида AAV, см., например, van Vliet et al. (2006) 14:809; Padron et al. (2005) 79:5047; and Shen et al. (2007) 15:1955. Таким образом, например, сайт инсерции может находиться в пределах аминокислот 411-650 капсидного белка AAV VP1. Например, сайт инсерции может находиться в аминокислотах 571-612 AAV1 VP1, в аминокислотах 570-611 AAV2 VP1, в аминокислотах 571-612 AAV3A VP1, в аминокислотах 571-612 AAV3B VP1, в аминокислотах 569-610 AAV4 VP1, в аминокислотах 560-601 AAV5 VP1, в аминокислотах 571-612 AAV6 VP1, в аминокислотах 572-613 AAV7 VP1, в аминокислотах 573-614 AAV8 VP1, в аминокислотах 571-612 AAV9 VP1 или в аминокислотах 573-614 AAV10 VP1 или соответствующих по положении аминокислотах любого их варианта. Специалистам в данной области должно быть известно, на основе сравнения аминокислотных последовательностей капсидных белков различных серотипов AAV, что сайт инсерции, «соответствующий аминокислотам AAV2», будет находится в капсидном белке любого конкретного серотипа AAV. См. также Фигуру 6, где изображено выравнивание AAV SEQ ID NO: 1-11 дикого типа, и показаны положении аминокислот серотипов дикого типа AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3A и AAV4.
В некоторых вариантах осуществления сайт инсерции представляет собой сайт с одной инсерцией между двумя соседними аминокислотами, расположенными между аминокислотами 570-614 VP1 любого серотипа AAV дикого типа или варианта AAV, например, сайт инсерции находится между двумя соседними аминокислотами, расположенными в пределах аминокислот 570-610, аминокислот 580-600, аминокислот 570-575, аминокислот 575-580, аминокислот 580-585, аминокислот 585-590, аминокислот 590-600 или аминокислот 600- 614, принадлежащими к VP1 любого серотипа или варианта AAV. Например, сайт инсерции может находиться между аминокислотами 580 и 581, аминокислотами 581 и 582, аминокислотами 583 и 584, аминокислотами 584 и 585, аминокислотами 585 и 586, аминокислотами 586 и 587, аминокислотами 587 и 588. аминокислотами 588 и 589 или аминокислотами 589 и 590. Сайт инсерции может находиться между аминокислотами 575 и 576, аминокислотами 576 и 577, аминокислотами 577 и 578, аминокислотами 578 и 579 или аминокислотами 579 и 580. Сайт вставки может находиться между аминокислотами 590 и 591, аминокислотами 591 и 592, аминокислотами 592 и 593, аминокислотами 593 и 594, аминокислотами 594 и 595, аминокислотами 595 и 596, аминокислотами 596 и 597, аминокислотами 597 и 598, аминокислотами 598 и 599 или аминокислотами 599 и 600. Например, сайт инсерции может находиться между аминокислотами 587 и 588 AAV2, между аминокислотами 590 и 591 AAV1, между аминокислотами 588 и 589 AAV3A, между аминокислотами 588 и 589 AAV3B, между аминокислотами 584 и 585 AAV4, между аминокислотами 575 и 576 AAV5, между аминокислотами 590 и 591 AAV6, между аминокислотами 589 и 590 AAV7, между аминокислотами 590 и 591 AAV8, между аминокислотами 588 и 589 AAV9 или между аминокислотами 588 и 589 AAV10.
В некоторых вариантах осуществления раскрытая здесь пептидная вставка имеет длину в 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот, 11 аминокислот, 12 аминокислот, 13 аминокислот, 14 аминокислот, 15 аминокислот, 16 аминокислот, 17 аминокислот, 18 аминокислот, 19 аминокислот или 20 аминокислот. В другом варианте осуществления пептидная вставка, раскрытая в настоящем описании, содержит от 1 до 4 спейсерных аминокислот на аминоконце (N-конце) и/или на карбоксильном конце (С-конце) любой из пептидных инсерций, раскрытых здесь. Типичные спейсерные аминокислоты включают, без ограничения, лейцин (L), аланин (A), глицин (G), серин (S), треонин (T) и пролин (P). В некоторых вариантах осуществления пептидная вставка содержит 2 спейсерные аминокислоты на N-конце и 2 спейсерные аминокислоты на C-конце. В других вариантах осуществления пептидная вставка содержит 2 спейсерные аминокислоты на N-конце и 1 спейсерную аминокислоту на C-конце.
Раскрытые здесь пептидные инсерции ранее не были описаны и/или не были встроены в капсид AAV. Не будучи ограниченными какой-либо теорией, присутствие любой из раскрытых пептидных инсерций может снижать сродство варианта капсида к сульфату гепарина, что может изменить внеклеточные или внутриклеточные стадии в каскаде реакций вирусной трансдукции. Кроме того, раскрытые здесь инсерции пептида могут вызывать повышенную трансдукцию мышечных клеток (например, кардиомиоцитов) при добавлении домена, связывающего рецептор клеточной поверхности.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пептид инсерции содержит аминокислотную последовательность любой из приведенных ниже формул.
В некоторых аспектах пептид инсерции может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот Формулы 1a:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
где каждый из Y1-Y3, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Ala, Asn, Thr, Gly, Ser, Ala, Gln и Asp
2
X выбран из Lys, Asn, Thr, Ser, Ala и Gln.
3
X выбран из Ile, Thr, Lys, Leu, Val, Asn, Asp и Arg.
4
Xвыбран из Gln, Thr, Ile, Lys, Val, Ser и Tyr.
5
X выбран из Arg, Asn, Gly, Lys, Leu, Thr, Ala, Ser и Gln.
6
X выбран из Thr, Lys, Val, Gly, Ser, Ala, Arg и Pro
7
Xвыбран из Asp, Thr, Asn, Ile, Ala и Ser.
В некоторых вариантах осуществления встроенный пептид Формулы 1a содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25) и ASDSTKA (SEQ ID NO:26). В других вариантах осуществления встроенный пептид Формулы 1a не содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKTTNKD (SEQ ID NO:14), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24) and NQDYTKT (SEQ ID NO:22).
В других аспектах встроенный пептид может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот Формулы 1b:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, то независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Thr и Asn
2
X выбран из Asn и Lys
3
X выбран из Lys, Ile и Thr
4
X выбран из Ile, Gln и Thr
5
X выбран из Gly, Arg и Asn
6
X выбран из Val, Thr и Lys
7
X выбран из Thr и Asp
В некоторых вариантах осуществления встроенный пептид Формулы 1b содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14) и TNKIGVT (SEQ ID NO:15). В других вариантах осуществления встроенный пептид Формулы 1a не содержит аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14).
В других аспектах встроенный (инсерционный) пептид может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот Формулы 1c:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, то независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
Xвыбран из Thr и Asn
2
Xвыбран из Asn и Lys
3
Xвыбран из Lys и Ile
4
X выбран из Иль и Глн
5
Xвыбран из Gly и Arg
6
Xвыбран из Val и Thr
7
X выбран из Thr и Asp
В определенных вариантах осуществления, встроенный пептид Формулы 1c содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13) и TNKIGVT (SEQ ID NO:15).
В других аспектах встроенный пептид может представлять собой пептид длиной от 7 до 10 аминокислот Формулы 1d:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, то независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Asn и Thr
2
X выбран из Asn и Lys
3
Xвыбран из Lys и Thr
4
Xвыбран из Ile и Thr
5
X выбран из Gly, Lys и Thr
6
Xвыбран из Lys, Arg и Val
7
X выбран из Asp, Thr и Asn
В некоторых вариантах осуществления встроенный пептид Формулы 1d содержит аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15).
В других вариантах осуществления, встроенный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14) и TNKIGVT (SEQ ID NO:15). В связанных вариантах осуществления встроенный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) и TNKIGVT (SEQ ID NO: 15).
В некоторых вариантах осуществления встроенный пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25) и ASDSTKA (SEQ ID NO:26).
1
3
В других предпочтительных вариантах осуществления встроенный пептид содержит от 1 до 3 спейсерных аминокислот (Y-Y) на амино- и/или карбоксильном конце аминокислотной последовательности, выбранной из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD ( SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), АСНИТКА (SEQ ID NO: 19 ), DNTVTRS (SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO: 25) и ASDSTKA (SEQ ID NO: 26). В некоторых таких вариантах осуществления встроенный пептид выбран из группы, состоящей из: LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30). ), LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34), LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 42).
В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый вариант капсидного белка AAV не содержит каких-либо других модификаций аминокислотной последовательности, кроме пептидной инсерции от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот в петле GH или петле IV. Например, в некоторых вариантах осуществления рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), ASNITKA (SEQ ID NO: 19), DNTVTRS (SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO: 25), ASDSTKA (SEQ ID NO : 26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34), LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 42), и этот вариант капсида AAV не содержит аминокислотных замен, инсерций или делеций (то есть вариант капсидного белка AAV содержит указанную вставку, а в остальном идентичен соответствующему капсидному белку AAV). Другими словами, вариант капсидного белка AAV, содержащий указанную вставку, в остальном идентичен родительскому капсидному белку AAV, в который был встроен пептид. В качестве другого примера, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), NKTTNKD (SEQ ID NO: 14), TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), GNLTKGN ( SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), АСНИТКА (SEQ ID NO: 19), DNTVTRS (SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO: 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO : 25), ASDSTKA (SEQ ID NO: 26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34), LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO: 40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 42), где пептидная вставка расположена между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2; между аминокислотами 588 и 589 VP1 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10; между аминокислотами 589 и 590 VP1 капсида AAV7; между аминокислотами 590-591 VP1 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, между аминокислотами 584 и 585 VP1 капсида AAV4 или между аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5, при этом последовательность варианта белка капсида AAV в остальном идентична соответствующей последовательности родительского белка капсида AAV, например, любой из SEQ ID NO: 1-12.
В других вариантах осуществления рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, помимо включения пептидной инсерции в петле GH, например, как описано здесь, или как известно в данной области техники, содержит от приблизительно 1 до приблизительно 100 аминокислотных замен или делеций, например от 1 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 15 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 25, от приблизительно 25 -50, от приблизительно 50-100 аминокислотных замен или делеций по сравнению с исходным (родительским) капсидным белком AAV. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения капсидный белок варианта содержит аминокислотную последовательность, имеющую 85% или более, 90% или более, 95% или более или 98% или более, например, или 99% идентичности последовательности с соответствующим родительским капсидом AAV, например, с капсидным белком дикого типа, последовательности которого представлены SEQ ID NO: 1-12.
В следующем варианте осуществления одна или несколько аминокислотных замен расположены в положениях аминокислотного остатка(ов) 35, 109, 195, 213, 222, 229, 312, 319, 330, 333, 347, 363, 427, 447, 449, 453, 490, 527, 551, 581, 585, 588, 593, 606, 649, 651, 694, 698, 708 и/или 735 капсидного белка AAV2 VP1, пронумерованных до введения инсерции пептида, или соответствующих аминокислотных остатков другого капсидного белка AAV. В некоторых таких вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, включающей A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449 , G453R, A490T, K527Q, N551S, A581T, Y585S, R588M, A593E, W606C, K649E, R651H, W694C, I698V, V708I и L735Q VP1 капсидного белка AAV2, пронумерованных до введения инсерции пептида, или соответствующих аминокислотных остатков другого капсидного белка AAV.
В предпочтительном варианте осуществления представлен вариант капсидного белка AAV, содержащий а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) , NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) и TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или подобную замену в другом родительском серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в природе в соответствующих положениях: A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449K, G453R, A490T, K527Q, N551S, A581T, Y585S, R588M, A593E, W606C, K649E, R651H, W694C, I698V, V708I, L735Q, или комбинации таковых. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из: V708I, V708I+A593E, V708I+S109T, V708I+T330A, A35P, V708I+R588M, V708I+W606C, V708I+W694C, I698V, N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q, N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q, V708I+N449K, и V708I+G222S. Предпочтительно, сайт инсерции пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, между аминокислотами 588 и 589 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10, между аминокислотами 589 и 590 капсида AAV7, между аминокислотами 590-591 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, между аминокислотами 584 и 585 капсида AAV4 или между аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5.
В особенно предпочтительном варианте вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или включающую, состоящую по существу из или состоящую из аминокислотной последовательности LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV, и дополнительно содержит аминокислотную замену V708I в остатке 708 относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) и дополнительно необязательно содержит замену A593E и/или S109T, и/или T330A, и/или R588M относительно капсида AAV2, или соответствующие замены в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) в норме не встречается в соответствующем положении. В другом, особенно предпочтительном варианте, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или содержащую, включающую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и дополнительно содержит аминокислотную замену A35P в остатке 35 относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или подобную замену в другом родительском серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, или с последовательностью соответствующего родительского AAV-капсида. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или которая на 100% идентична) к следующей аминокислотной последовательности:
LANKIQRTDA
I
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:43)
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или включающую, состоящую по существу из, или содержащую аминокислотную последовательность LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27) между аминокислотами 587 и 588 капсидного белка AAV2 или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV и содержит аминокислотную замену N312K по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или подобную замену в другом родительском серотипе AAV и, необязательно, дополнительно содержит (i) аминокислотные замены N449D, N551S, I698V и L735Q или (ii) аминокислотные замены N449D, N551S, I698V, L735Q и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или подобные, соответствующие замены в другом родительском серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №: 2. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или которая на 100% идентична) следующей аминокислотной последовательностью:
K
D
S
LANKIQRTDA
V
Q
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRN (SEQ ID NO:44)
В другом варианте осуществления представлен вариант капсидного белка AAV, включающий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10, между аминокислотами 589 и 590 капсида AAV7, между аминокислотами 590 и 591 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, между аминокислотами 584 и 585 капсида AAV4 или между аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5, причем пептидная инсеция включает аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) и LANKIQRTDA ( SEQ ID NO: 27) и b) замену валина на изолейцин в аминокислоте 709 капсида AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин положениив положении 709 капсида AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в аминокислоте 707 капсида AAV4 или в аминокислоте 709 капсида AAV9 или замену треонина на изолейцин в аминокислоте 710 капсида AAV7 или в аминокислоте 711 капсидов AAV8 или AAV10, или замену глютамина на изолейцин в аминокислоте 697 капсида AAV5, причем, за исключением этих замен, этот вариант капсидного белка необязательно идентичен любой из SEQ ID NO: 1 и 3-12. В предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или включающую, состоящую по существу из, или содержащую аминокислотную последовательность LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), расположенную между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, причем вариантный белок капсида содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен.
В еще одном варианте осуществления вариантный капсидный белок содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или включающую, состоящую по существу из или содержащую аминокислотную последовательности LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
В еще одном варианте осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) или включающую, состоящую по существу из, или содержащую аминокислотную последовательность LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LANKIQRTDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:45)
В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) или включающую, состоящую по существу из, или содержащую аминокислотную последовательность LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) или LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV и содержит аминокислотную замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую ей замену в другом родительском серотипе AAV, и необязательно дополнительно включает замену N449K и/или G222S по сравнению с AAV2 или соответствующую замену в капсидном белке другого родительского серотипа AAV, где замещенная аминокислота не встречается в норме в соответствующем положении. В другом предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) или LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV и содержит N312K, N449D, N551S, I698V и L735Q и, необязательно, аминокислотные замену V708I по сравнению с аминокислотой последовательностью капсида AAV2 или соответствующие замены в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в природе в соответствующем положении. Вариант капсида AAV может иметь, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID №:2. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или на 100% идентичную) следующей аминокислотной последовательности:
LATNKIGVTA
I
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:46)
В другом варианте осуществления представлен вариант капсидного белка AAV, включающий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10, между аминокислотами 589 и 590 капсида AAV7, между аминокислотами 590 по 591 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, между аминокислотами 584 и 585 капсида AAV4 или между аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5, причем пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), LATNKIGVTA ( SEQ ID NO: 29) и LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37), и b) замему валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 капсида AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 капсида AAV4 или в положении аминокислоты 709 капсида AAV9 или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 капсида AAV7 или в положении аминокислоты 711 капсидов AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 капсида AAV5. В предпочтительных вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, включающую аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 29) или LATNKIGVTS ( SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в аминокислоте 708 (V708I) по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, где вариантный белок капсида содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен и предпочтительно демонстрирует, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или больше идентичности аминокислотной последовательности (по всей длине) аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.
В еще одном варианте осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) или включающую, состоящую по существу из, или состоящую из аминокислотной последовательности LATNKIGVTA (SEQ ID NO) : 29) или LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, а в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
В еще одном варианте осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LATNKIGVTA (SEQ ID NO) : 29) или LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 37) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LATNKIGVTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:47)
В другом предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и дополнительно содержит аминокислотную замену V708I в положении 708 относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и необязательно дополнительно включают аминокислотную замену S109T и/или W694C и/или W606C по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, причем замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в норме в соответствующем положении. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и дополнительно содержит аминокислотную замену I698V в положении 698 относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого капсида AAV. Вариант капсида AAV может иметь, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности или большую идентичность аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2 или соответствующему родительскому капсиду AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или на 100% идентичную) следующей аминокислотной последовательности:
LANKTTNKDA
I
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:48)
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) между аминокислотами 587 и 588 капсидного белка AAV2 или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV и содержит аминокислотную замену N312K по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, и, необязательно, дополнительно содержит аминокислотные замены N449D, N551S, I698V и L735Q и, необязательно, V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующие замены в другом родительском серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или более идентичности аминокислотной последовательности (по всей длине) аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID №:2. В особенно предпочтительном варианте осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или на 100% идентичную) следующей аминокислотной последовательности:
K
D
S
LANKTTNKDA
V
Q
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRN (SEQ ID NO:49)
В другом варианте осуществления представлен вариант капсидного белка AAV, включающий а) пептидную вставку, расположенную между аминокислотами 588 и 589 VP1 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10, между аминокислотами 589 и 590 капсида AAV7, между аминокислотами 590 и 591 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, между аминокислотами 584 и 585 капсида AAV4, или между аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5, причем пептидная вставка, содержащая аминокислотную последовательность, выбрана из NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) и LANKTTNKDA ( SEQ ID NO: 28) и b) замену валина на изолейцин в аминокислоте 709 капсида AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 капсидов AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 капсида AAV4 или в положении аминокислоты 709 капсида AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 капсида AAV7 или в положении 711 капсида AAV8 или AAV10, или замена глутамина на изолейцин в положении 697 капсида AAV5 и где, необязательно, в остальном вставка идентична любой из SEQ ID NO: 1 и 3-12. В предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, причем белок варианта капсида включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен.
В еще одном варианте осуществления вариант капсидного белка содержит а) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, а в остальном я идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO: 28), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LANKTTNKDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:50)
В других вариантах осуществления предоставляется вариант капсидного белка AAV, включающий а) пептидную вставку в GH-петлю капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из GNLTKGN (SEQ ID NO: 16), NTVKLST (SEQ ID NO: 17), SNTVKAI (SEQ ID NO: 18), ASNITKA (SEQ ID NO: 19), DNTVTRS (SEQ ID NO: 20), NKISAKD (SEQ ID NO: 21), NQDYTKT (SEQ ID NO : 22), QADTTKN (SEQ ID NO: 23), TNRTSPD (SEQ ID NO: 24), SNTTQKT (SEQ ID NO: 25) и ASDSTKA (SEQ ID NO: 26), и b) одну или более следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующих замен в другом родительском серотипе капсида AAV (т.е. отличном от AAV2), где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в норме в соответствующих положениях: A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449K, G453R, A490T, K527Q, A585, N605 K649E, R651H, W694C, I698V, V708I, L 735Q или комбинации таковых. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из: V708I, S109T, R651H, A319T, P195L, P363L, I698V, D213N, G453R или являются комбинацией таковых. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен включают по меньшей мере аминокислотную замену V708I и/или P363L или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV. Предпочтительно сайт инсерции пептида расположен между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении капсидного белка другого серотипа AAV.
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность GNLTKGN (SEQ ID NO: 16) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30), расположенную между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и дополнительно содержит одну или более следующих аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в природе в соответствующих положениях: V708I, V708I+S109T, R651H, A319T+P195L, P363L, P363L+V708I. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность GNLTKGN (SEQ ID NO: 16) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30) между аминокислотами 587 и 588 VP1 AAV2 или соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующего остатка другого капсида AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, и в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность GNLTKGN (SEQ ID NO: 16) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30) между аминокислотами 587 и 588 VP1 AAV2 или соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену P363L относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующего остатка другого капсида AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность GNLTKGN (SEQ ID NO: 16) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30) между аминокислотами 587 и 588 VP1 AAV2 или соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену R651H относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующего остатка другого капсида AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность GNLTKGN (SEQ ID NO: 16) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAGNLTKGNA (SEQ ID NO: 30) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LAGNLTKGNA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:51)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NTVKLST (SEQ ID NO: 17) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANTVKLSTA (SEQ ID NO) : 31) между аминокислотами 587 и 588 VP1 Капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в природе в соответствующих положениях, и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных заме, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NTVKLST (SEQ ID NO: 17) или включающую, состоящую по существу или состоящую из аминокислотной последовательности LANTVKLSTA (SEQ ID NO: 31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LANTVKLSTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:52)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность SNTVKAI (SEQ ID NO: 18) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей последовательности родительского капсида AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность SNTVKAI (SEQ ID NO: 18) или включающую, состоящую по существу или состоящую из аминокислотной последовательности LASNTVKAIA (SEQ ID NO: 32), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LASNTVKAIA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:53)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASNITKA (SEQ ID NO: 19) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAASNITKAA (SEQ ID NO:33) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном является идентичным аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или соответствующей белковой последовательности родительского капсида AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASNITKA (SEQ ID NO: 19) или включающую, состоящую по существу или состоящую из аминокислотной последовательности LAASNITKAA (SEQ ID NO: 33), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LAASNITKAA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:54)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность DNTVTRS (SEQ ID NO: 20) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, и включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность DNTVTRS (SEQ ID NO: 20) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену I698V относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность DNTVTRS (SEQ ID NO: 20) или включающую, состоящую по существу или содержащую аминокислотную последовательность LADNTVTRSA (SEQ ID NO: 34) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности или является на 100% идентичным следующей аминокислотной последовательности:
LADNTVTRSA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:55)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKISAKD (SEQ ID NO: 21) или включающую, состоящую по существу или состоящую из аминокислотной последовательности LANKISAKDA (SEQ ID NO:35) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей белковой последовательности родительского капсида AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKISAKD (SEQ ID NO: 21) или включающую, состоящую по существу, или состоящую из аминокислотной последовательности LANKISAKDA (SEQ ID NO: 35), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LANKISAKDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:56)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 22) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном иденичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 22) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену I698V относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV (т. е. отличного от AAV2), в котором замещенная аминокислота не встречается в естественных условиях в соответствующем положении и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO: 22) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO: 36) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LANQDYTKTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:57)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и дополнительно содержит одну или более следующих аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующие замены в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в природе в соответствующих положениях: V708I, D213N, P363L, G453R. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену P363L относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену D213N относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В других вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) замену G453R относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO: 23) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO: 39) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LAQADTTKNA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:58)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNRTSPD (SEQ ID NO: 24) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV и включает от 2 до 5, от 5 до 10, или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности последовательности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LATNRTSPDA
I
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:59)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность SNTTQKT (SEQ ID NO: 25) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LASNTTQKTA (SEQ ID NO: 41) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности белка капсида AAV. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LASNTTQKTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:60)
В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV включает (i) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASDSTKA (SEQ ID NO: 26) или включающую, содержащую, или состоящую по существу из аминокислотной последовательности LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42) между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или между соответствующими аминокислотами другого капсида AAV и (ii) аминокислотную замену V708I относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV, где замещенная аминокислота (аминокислоты) не встречается в естественных условиях в соответствующем положении и содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном является идентичным аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV. В другом варианте осуществления вариант капсида включает пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASDSTKA (SEQ ID NO: 26) или включающую, состоящую по существу или состоящую из аминокислотной последовательности LAASDSTKAA (SEQ ID NO: 42) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
LAASDSTKAA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:61).
В нескольких аспектах предложен вариант капсидного белка AAV, включающий одну или более аминокислотных замен относительно соответствующего родительского капсидного белка AAV, где вариантный капсидный белок, если он присутствует в вирионе AAV, придает тому повышенную инфекционность в отношении мышечных клеток (например, клеток скелетной или сердечной мышцы) по сравнению с инфекционностью вириона AAV, содержащим соответствующий родительский белок капсида AAV, по отношению к мышечным клеткам.
В некоторых вариантах осуществления вариантный белок капсида AAV содержит аминокислотную замену аминокислоты 363 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или замену в соответствующем положении в другом родительском серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO 2, и включает аминокислотную замену в аминокислоте 363 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариантный белок капсида AAV содержит аминокислотную замену P363L по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2), капсида AAV3A (SEQ ID NO: 3) или капсида AAV3B (SEQ ID NO: 4); или аминокислотную замену P364L по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV1 (SEQ ID NO: 1) или капсида AAV6 (SEQ ID NO: 7); или аминокислотную замену P354L по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV4 (SEQ ID NO:5) или капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6); или аминокислотную замену P365L по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV7 (SEQ ID NO: 8) или капсида AAV9 (SEQ ID NO: 10); или аминокислотную замену P366L по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV8 (SEQ ID NO: 9) или капсида AAV10 (SEQ ID NO: 11). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит замену P363L по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или соответствующую замену по сравнению с любой из SEQ ID NO:1 и 3-12 и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, или любой из SEQ ID NO:1 и 3-12. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену P363L, по сравнению с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. В соответствующих вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену P363L по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или соответствующую замену в другом родительском серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где вариантный капсидный белок содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO: 2, или по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка другого родительского серотипа AAV. В другом предпочтительном варианте осуществления вариант капсида включает аминокислотную замену P363L и дополнительно содержит аминокислотную замену(ы) E347K и/или V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или соответствующие заменамы в капсиде другого родительского серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2). В другом предпочтительном варианте вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену P363L по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или соответствующую замену в капсиде другого родительского серотипа AAV и дополнительно содержит пептидную вставку, предпочтительно расположенную между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2, аминокислотами 588 и 589 капсидов AAV3A, AAV3B, AAV9 или AAV10, аминокислотами 589 и 590 VP1 капсида AAV7, аминокислотами 590 и 591 VP1 капсидов AAV1, AAV6 или AAV8, аминокислотами 584 и 585 VP1 капсида AAV4, или аминокислотами 575 и 576 капсида AAV5, где пептидная вставка предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25), ASDSTKA (SEQ ID NO:26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO:31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32), LAASNITKAA (SEQ ID NO:33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34), LANKISAKDA (SEQ ID NO:35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO:37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO:41), и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42), более предпочтительно выбранную из GNLTKGN (SEQ ID NO:16), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), QADTTKN (SEQ ID NO:23) and LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), и необязательно включает от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или соответствующей родительской последовательности капсидного белка AAV.
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в аминокислоте 593 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении в другом родительском серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2). ). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 593 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену глицина на глутамат в положении аминокислоты 594 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидов AAV1, AAV3A, AAV6 или AAV9 или в положении аминокислоты 583 капсида AAV5 или аминокислоты 596 капсидов AAV8 или AAV10, или аминокислотную замену аргинина на глутамат в положении аминокислоты 594 капсида AAV3B, или аминокислотную замену аспартата на глутамат в положении аминокислоты 592 капсида AAV4 или аминокислотную замену глутамина на глутамат в положении 595 капсида AAV7. В других вариантах осуществления капсидный белок варианта содержит аминокислотную замену A593E по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и не содержит одну или более из следующих аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A и S196P. В соответствующих вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены A593E и V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или при по меньшей мере приблизительно 99% идентичности всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. В связанных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены A593E и S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или, по меньшей мере приблизительно 99% идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. В соответствующих вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены A593E, V708I и S109T по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или, по меньшей мере приблизительно 99% идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления вариант капсида включает аминокислотные замены A593E, V708I и N551S по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления вариант капсида включает аминокислотные замены A593E, V708I и K649E по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или, по меньшей мере приблизительно 99% идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO 2, а остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления вариант капсида включает аминокислотные замены A593E, V708I, S109T и K527Q по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или, по меньшей мере приблизительно 99% идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.
В других вариантах осуществления вариант белка капсида AAV содержит аминокислотную замену аминокислоты в положении 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) или в соответствующем положении в другом родительском серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), причем замещенная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. Предпочтительно, вирион rAAV не содержит замены пролина на серин в положении аминокислоты 250 по сравнению с AAV2 или в положении соответствующей аминокислоты в другом родительском серотипе AAV. В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO: 2) и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности по всей длине с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен SEQ ID NO: 2. В предпочтительных вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин (V708I) в положении аминокислоты 708 по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 и имеет, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где вариантный белок капсида не содержит аминокислотную замену P250S. В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 капсидов AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 капсидов AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 капсида AAV4 или аминокислоты 709 капсида AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 капсида AAV7 или аминокислоты 711 капсидов AAV8 или AAV10, или замены глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 капсида AAV5. В соответствующих вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен и где вариант капсидного белка не содержит аминокислотную замену P250S. В других вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I и также содержит аминокислотную замену A333S и/или S721L по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других связанных вариантах осуществления вариант капсида включает аминокислотную замену V708I, а также аминокислотную замену A333S и/или S721L по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или, по меньшей мере приблизительно 99% или более идентичности аминокислотной последовательности по всей длине с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2, а в остальном идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или, по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью капсида AAV дикого типа, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 и 12, а также содержит i) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из A35P, D213N, A319T+P195L, P363L, P363L+V708I, G453R, R651H, I698V, V708I, V708I+A593, V708I+S109T, V708I+T330A, V708I+R588M, V708I+W694C, V708I+W606C, V708I+N449K, V708I+G222S, N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q, N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q, и/или (ii) пептидную вставку, выбранную из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25), ASDSTKA (SEQ ID NO:26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO:31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32), LAASNITKAA (SEQ ID NO:33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34), LANKISAKDA (SEQ ID NO:35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO:37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO:41), и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42). В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV содержит указанные одну или более аминокислотных замен и/или пептидных инсерций, а в остальном идентичен последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-12.
in silico
В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV представляет собой родовой капсидный белок, содержащий одну или более пептидных инсерций и/или аминокислотных замен, как описано здесь. Под родовым капсидным белком подразумевается эволюционный предок капсидного белка, который встречается в природе сегодня, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, и который может генерироваться  путем случайного аминокислотного замещения в вырожденных положениях капсидных белков AAV, встречающихся в природе в настоящее время.
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV представляет собой химеру, содержащую аминокислоты 130-725 капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6) или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или, по меньшей мере на 98% идентичную таковой.
В некоторых аспектах вариант капсидного белка AAV представляет собой химеру, содержащую (i) аминокислоты 1-129 капсида AAV6 (SEQ ID NO:7) или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или, по меньшей мере 98% идентичную таковой и (ii) аминокислоты 130-725 AAV5 (SEQ ID NO: 6) или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или, по меньшей мере на 98% идентичную таковой и дополнительно включающую аминокислотные замены V229I, A490T и A581T и, необязательно, V447F или Y585S относительно последовательности капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
I
T
T
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFTTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO:62)
В других аспектах вариант капсидного белка AAV представляет собой химеру, содержащую (i) аминокислоты 1-61 AAV2 (SEQ ID NO: 2) или аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере 98% идентичную таковой, (ii) аминокислоты 62-129 AAV6 (SEQ ID NO: 7) или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или, по меньшей мере на 98% идентичную таковой, и (iii) аминокислоты 130-725 капсида AAV5 (SEQ ID NO: 6) и дополнительно содержит аминокислотные замены V229I, A490T и A581T относительно последовательности AAV5 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности (или которая является на 100% идентичной) следующей аминокислотной последовательности:
I
A
T
T
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLNPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFTTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL (SEQ ID NO:63)
in vivo
in vitro
in vivo
Варианты AAV, раскрытые в настоящем описании, были получены с помощью направленной эволюции , включающей скрининг сердечных и скелетных мышц приматов после внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления варианты капсидных белков, раскрытых в настоящем описании, если они присутствуют в вирионе AAV, демонстрируют повышенную трансдукцию мышечных клеток по сравнению с трансдукцией мышечных клеток вирионом AAV, содержащим соответствующий родительский белок капсида AAV или AAV дикого типа. Например, в некоторых вариантах раскрытые здесь варианты капсидных белков, если они присутствуют в вирионе AAV, обеспечивают более эффективную трансдукцию мышечных клеток приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий родительский капсидный белок AAV или капсидный белок AAV дикого типа, то есть, мышечные клетки захватывают больше вирионов AAV, содержащих вариантный капсидный белок AAV, чем вирионов AAV, содержащих капсидный белок родительского AAV или AAV дикого типа. В некоторых таких вариантах осуществления вариант AAV вириона или варианта rAAV демонстрирует увеличение трансдукции мышечной клетки, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз или даже более чем в 50 раз по сравнению с трансдукцией мышечной клетки вирионом AAV дикого типа или rAAV, содержащими соответствующий родительский капсидный белок AAV. В предпочтительных вариантах осуществления вариант вириона AAV или варианта rAAV демонстрирует, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, при по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 1000 раз или более, чем в 1000 раз, повышение трансдукции мышечной клетки по сравнению с трансдукцией мышечной клетки вирионом AAV8 или AAV9 дикого типа. В некоторых таких вариантах осуществления варианты капсидных белков, раскрытых в настоящем описании, если они присутствуют в вирионе AAV, обеспечивают более широкую трансдукцию мышечных клеток приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий родительский капсидный белок AAV или капсидный белок AAV дикого типа. Другими словами, вариантный вирион AAV трансдуцирует типы клеток, не трансдуцированные вирионами, содержащими соответствующий родительский капсидный белок AAV, и, следовательно, большее количество типов клеток в мышцах, чем соответствующий родительский вирион AAV. В некоторых вариантах осуществления вирион варианта AAV преимущественно трансдуцирует мышечные клетки, например, вирион rAAV инфицирует мышечную клетку с 2-кратной, 5-кратной, 10-кратной, 15-кратной, 20-кратной, 25-кратной, 50-кратной или более чем 50-кратной специфичностью по сравнению с другой мышечной или немышечной клеткой. В некоторых вариантах осуществления трансдуцированная мышечная клетка представляет собой клетку сердечной мышцы (например, кардиомиоцит, сердечный фибробласт или клетку-предшественник сердечной мышцы). В некоторых вариантах осуществления мышечная клетка представляет собой клетку скелетных мышц (например, миобласт, миотуба или сателлитная клетка). Увеличение трансдукции мышечных клеток, например, повышенную эффективность трансдукции, более широкую трансдукцию, более предпочтительную трансдукцию и т. д. можно легко оценить  или  с помощью любого количества методов в данной области для измерения экспрессии генов. Например, AAV может быть упакован вместе с геномом, содержащим кассету экспрессии, содержащей репортерный ген, например, флуоресцентный белок под контролем универсального или тканеспецифичного промотора и степень трансдукции может быть оценена путем обнаружения флуоресцентного белка с помощью, например, флуоресцентной микроскопии. В качестве другого примера, AAV может быть упакован вместе с геномом, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты со штрих-кодом, и степень трансдукции может быть оценена путем обнаружения последовательности нуклеиновой кислоты с помощью, например, ПЦР. В качестве другого примера, AAV может быть упакован вместе с геномом, содержащим кассету экспрессии, содержащую терапевтический ген для лечения мышечного заболевания, и степень трансдукции может быть оценена путем выявления улучшения состояния при мышечном заболевании у пациента, которому ввели AAV.
Заболевания, которые можно лечить с использованием варианта вектора или вириона rAAV и/или способа, раскрытого в настоящем описании, включают, но не ограничиваются таковыми, моногенные заболевания, сложные заболевания и травматические повреждения. Примеры моногенных заболеваний включают, но не ограничиваются таковыми, мышечные дистрофии, такие как мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера, врожденные (включая, но не ограничиваясь этим, миопатию Бетлема, мышечную дистрофию Уллриха, мышечную дистрофию тип Фукуяма, дефицит интегрина, мышечную дистрофию с дефицитом мерозина и Синдром Уокера-Варбурга), дистальные дистрофии (включая, но не ограничиваясь этим, дистрофии Гауэрса-Лайнга, Миеши и Нонака), дистрофии Эмери-Дрейфуса, фасцио-капуло-плечевую, дистрофию конечностей, миотоническую и мышечную дистрофию; врожденную миотонию и врожденную парамиотонию; миотубулярную миопатию; центроядерную миопатию; миофибриллярную миопатию, связанную с десмином; анемию; синдром Андерсена-Тавила; немалиновую миопатию; Болезнь Броди; лизосомные болезни накопления, такие как альфа-маннозидоз, аспартилглюкозаминурия, бета-маннозидоз, цистиноз, болезнь Фарбера, фукозидоз, болезнь Гоше, галактозиалидоз, ганглиозидозы (включая, но не ограничиваясь такими, как вариант АБ, дефицит активатора, дефицит бета-галактозидазы, болезнь Сандоффри, болезнь Фабри болезнь и болезнь Шиндлера), нарушения накопления гликогена (включая, помимо прочего, болезнь Андерсена, болезнь Кори, болезнь Данона, болезнь Форбса, дефицит глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (глюкозо-6-фосфатный дефект), болезнь Херса, дефицит лактатдегидрогеназы А, болезнь Помпе, болезнь Таруи и болезнь фон Гирке), инфантильную болезнь накопления свободной сиаловой кислоты, дефицит липазы лизосомной кислоты, болезнь Краббе, метахроматическую лейкодистрофию, мукополисахаридозы (включая, но не ограничиваясь этим, дефицит гиалуронидазы, синдром Хантера, синдром Херлера, синдром Херлера-Шейе, синдром Марото-Ламе, синдром Моркио, синдром Сан-Филиппо, синдром Шейе и синдром Слая), муколипидоз (включая, но не ограничиваясь этим: Сиалидоз, I-клеточную болезнь, дефицит муколипидина 1 и псевдо-Хурлер полидистрофию, также называемую муколипидозом III), множественный сульфазный дефицит, болезнь Ниманна-Пика, нейрональные цероидные липофусцинозы (включая, но не ограничиваясь такими, как: болезнь Баттена-Шпильмейера-Фогта, врожденный дефицит катепсина D, немецко-сербский поздний инфантильный липофусциноз, болезнь Янского-Бельщовского, болезнь Куфса (поздний инфантильный вариант), северную эпилепсию, болезнь Сантавуори-Халтиа и турецкий поздний инфантильный вариант), пикнодизостоз, болезнь Саллы, дефицит сапозина В, болезнь Тай-Саха и Болезнь Вольмана; метаболические расстройства, такие как дефицит деаминазы аденозина монофосфата, алкаптонурия, дефицит карнитина, недостаточность карнитин пальмитил трансферазы, расстройства Хартнапа, гомоцистинурию, болезнь кленового сиропа (лейциноз), недостаточность миофосфорилазы, дефицит фосфофруктокиназы, дефицит фосфоглицераткиназы, дефицит фосфоглицератмутазы, дефицит фосфорилазы, и болезнь Танжера; атаксию Фридрейха; атаксию телеангиэктазию; атаксию с дефицитом витамина Е; периодический паралич, такой как болезнь Гамсторпа и гипокалиемический периодический паралич; митохондриальные заболевания, такие как синдром Барта, синдром Кирнса-Сэйра, митохондриальная миопатия, митохондриальная энцефалопатия, лактоацидоз и эпизоды, подобные инсульту, миоклоническая эпилепсия с рваными мышечными волокнами и синдром Пирсона; семейные гипертрофические кардиомиопатии; дилатационные кардиомиопатии; врожденные пороки сердца в семейной системе, такие как семейное заболевание аортального клапана и несжатие левого желудочка с врожденными пороками сердца; семейные аритмии, такие как кардиодисритмический периодический паралич Андерсона, дефекты межпредсердной перегородки с дефектами АВ проводимости, синдром Бругада, дефект проводимости сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия и врожденная блокада сердца; семейные сосудистые расстройства, такие как синдром артериальной извилистости, церебральная аутосомно-доминантная артериопатия с субкортикальными инфекциями и лейкоэнцефалопатия, церебральная рецессивно-доминантная артериопатия с субкортикальными инфекциями и лейкоэнцефалопатия, аневризма аорты семейного типа, синдром Марфана, синдром Элерса-Данлоса, врожденная арахнодактилия Билса, синдром Лоис-Дитца и псевдоксантома эластическая; аритмогенную правожелудочковую кардиомиопатию; семейную аритмогенную дисплазию правого желудочка; Болезнь Наксоса; несжатие левого желудочка; семейную фибрилляцию предсердий; семейную желудочковую тахикардию; семейный синдром Вольфа-Паркинсона-Уайта; синдром длинного интервала QT; синдром короткого интервала QT; синдромы слабости синусового узла; расстройства липидного обмена, такие как абеталипопротеинемия и дефицит липопротеинлипазы; дефицит антитрипсина альфа-1; дефицит фактора свертывания крови VIII (гемофилия A) или дефицит фактора свертывания крови IX (гемофилия B); талассемии; прогрессирующую оссифицирующую фибродисплазию; ламинопатии; Болезнь Хантингтона; врожденные миастенические синдромы; синдром Хатчинсона-Гилфорда прогерии; синдром Нунана; врожденную структурную миопатию с диспропорцией мышечных волокон; врожденный фиброз экстраокулярных мышц; мини-стержневая миопатию; гиперчувствительность мышц к движению (кавеолинопатию); синдром Шварца-Ямпеля; тубулярную агрегатную миопатию; и миопатию с накоплением зебра-телец. Примеры сложных заболеваний включают, но не ограничиваются такими, как сердечно-сосудистые заболевания (например, застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, стенокардия, расстройства тонуса коронарных артерий, ишемическая болезнь сердца, кардиомиопатия); рак; сахарный диабет; и инфекции. Примеры травматических повреждений включают, но не ограничиваются таковыми, вирусную инфекцию мышц, разрыв мышц; ушиб мышц. В предпочтительных вариантах осуществления вариантный вектор rAAV или вирион и/или способ, раскрытые в настоящем описании, применяются для лечения болезни Фабри, атаксии Фридрейха, мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной дистрофии Беккера, болезни Помпе, дефицита миофосфорилазы, мышечной дистрофии плечевого пояса (facioscapulohumeral muscular dystrophy), дистрофии плечевого и тазобедренного поясов и миотонической дистрофии.
HH
В другом варианте осуществления вариант капсида, раскрытый в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена, такой как перечисленные здесь, но не ограничивающийся таковыми: интерферирующая РНК, длинная некодирующая РНК, короткая некодирующая РНК, антисмысловая РНК, аптамер, полипептид, секретируемое антитело, одноцепочечное антитело, домен V, растворимый рецептор, аффибоди, кноттин, дарпин (DARPin), центурин (a centurin), шаперон, сайт-специфическая нуклеаза, обеспечивающая сайт-специфический нокдаун функции гена или модифицированная сайт-специфическая нуклеаза, обеспечивающая ген-специфичную активацию транскрипции.
HH
Вариант rAAV-варианта вириона, раскрытый в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой антисмысловую РНК, микроРНК (миРНК, miRNA), РНК с короткой шпилькой (шРНК, shRNA) или небольшую интерферирующую РНК (siРНК, siRNA) или ее предшественника или имитатора. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой длинную некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой короткую некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой антисмысловую РНК. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой аптамер. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой секретируемое антитело. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой домен V. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой растворимый рецептор. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой аффибоди. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой кноттин. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой дарпин (DARPin). В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой центурин (a centurin). В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой шаперон. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой сайт-специфическую нуклеазу, обеспечивающую сайт-специфический нокдаун функции гена.
Целевое использование генного продукта включает такие цели, но не ограничивается таковыми, как: повышение уровня фактора в клетке, повышение уровня фактора в соседней или удаленной клетке посредством секреции фактора, снижение уровня фактора в клетке, или снижение уровня фактора в соседней или удаленной клетке путем секреции фактора. Генный продукт может быть сконструирован так, чтобы дополнять уровень дефектного или отсутствующего продукта гена, уменьшать уровень дефектного или отсутствующего продукта гена, вводить новый поддерживающий продукт гена, дополнять уровень поддерживающего продукта гена, уменьшать уровень препятствующего продукта гена, или одновременно уменьшать уровень препятствующего продукта гена и вводить или дополнять уровень поддерживающего продукта гена.
in trans
cap
++
Генные продукты, доставляемые обсуждаемыми вариантами AAV, можно использовать для изменения уровня генных продуктов или активности генных продуктов, прямо или косвенно связанных с мышечными заболеваниями и травмами. Скелетные, сердечные или гладкие мышцы, трансдуцированные обсуждаемыми вариантами AAV, также могут быть использованы в качестве биофабрики для производства и выделения терапевтических белков для лечения заболеваний  в отдаленных органах. Гены, чьи генные продукты прямо или косвенно связаны с генетическими заболеваниями, включают, например, гены, кодирующие любой из следующих генных продуктов: дистрофин, включая мини- и микродистрофины (DMD; e.g. GenBank Accession Number NP_003997.1; SEQ ID NO:64); титин (ТТН); титин-кэп (titin , (TCAP), α-саркогликан (SGCA), β-саркогликан (SGCB), γ-саркогликан (SGCG) или δ-саркогликан (SGCD); альфа-1-антитрипсин (А1-АТ); тяжелая цепь миозина 6 (MYH6); тяжелая цепь миозина 7 (MYH7); тяжелая цепь миозина 11 (MYH11); легкая цепь миозина 2 (ML2); легкая цепь миозина 3 (ML3); киназа легкой цепи миозина 2 (MYLK2); миозин-связывающий белок С (MYBPC3); десмин (DES); динамин 2 (DNM2); ламинин α2 (LAMA2); ламин A/C (LMNA); ламин B (LMNB); рецептор ламина В (LBR); дисферлин (DYSF); эмерин (EMD); инсулин; факторы свертывания крови, включая, но не ограничиваясь таковыми: фактор VIII и фактор IX; эритропоэтин (ЭПО, EPO); липопротеинлипазы (LPL); саркоплазматический ретикулум Ca2 - АТФаза (SERCA2A), кальций-связывающий белок S100 A1 (S100A1); миотубуляр (МТМ); протеинкиназа DM1 (DMPK; e.g. GenBank Accession Number NG_009784.1; SEQ ID NO:65); гликогенфосфорилаза L (PYGL); гликогенфосфорилаза, связанная с мышцами (PYGM; e.g. GenBank Accession Number NP_005600.1; SEQ ID NO:66); гликогенсинтаза 1 (GYS1); гликогенсинтаза 2 (GYS2); α-галактозидаза A (GLA; e.g. GenBank Accession Number NP_000160.1; SEQ ID NO:67); α-N-ацетилгалактозаминидаза (NAGA); кислая α-глюкозидаза (GAA; e.g. GenBank Accession Number NP_000143.2; SEQ ID NO:68), сфингомиелиназа-фосфодиэстераза 1 (SMPD1); лизосомно-кислая липаза (LIPA); цепь коллагена типа I α1 (COL1A1); цепь коллагена типа I α2 (COL1A2); цепь коллагена типа III α1 (COL3A1); цепь коллагена типа V α1 (COL5A1); цепь коллагена типа V α2 (COL5A2); цепь коллагена типа VI α1 (COL6A1); цепь коллагена типа VI α2 (COL6A2 ); цепь коллагена типа VI α3 (COL6A3); проколлаген-лизин-2-оксоглутарат-5-диоксигеназа (PLOD1); лизосомно-кислая липаза (LIPA); фратаксин (FXN; e.g. GenBank Accession Number NP_000135.2; SEQ ID NO:69); миостатин (МСТН); β-N-ацетилгексозаминидаза A (HEXA); β-N-ацетилгексозаминидаза B (HEXB); β-глюкоцереброзидаза (GBA); аденозинмонофосфат-деаминаза 1 (AMPD1); β-глобин (HBB); идуронидаза (IDUA); идуронат-2-сульфат (IDS); тропонин 1 (TNNI3); тропонин Т2 (TNNT2); тропонин С (TNNC1); тропомиозин 1 (ТРМ1); тропомиозин 3 (ТРМ3); N-ацетил-α-глюкозаминидаза (NAGLU); N-сульфоглюкозаминсульфогидролаза (SGSH); гепаран-α-глюкозаминид N-ацетилтрансфераза (HGSNAT); интегрин α 7 (IGTA7); интегрин α 9 (IGTA9); глюкозамин (N-ацетил) -6-сульфатаза (GNS); галактозамин (N-ацетил) -6-сульфатаза (GALNS); β-галактозидаза (GLB1); β-глюкуронидаза (GUSB); гиалуроноглюкозаминидаза 1 (HYAL1); кислая церамидаза (ASAH1); галактозилцермидаза (GALC); катепсин А (CTSA); катепсин D (CTSA); катепсин К (CTSK); GM2 ганглиозидный активатор (GM2A); арилсульфатаза А (ARSA); арилсульфатаза B (ARSB); формилглицин-генерирующий фермент (SUMF1); нейраминидаза 1 (NEU1); N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансфераза α (GNPTA); N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансфераза β (GNPTB); N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансфераза γ (GNPTG); муколипин-1 (MCOLN1); NPC внутриклеточный транспортер 1 (NPC1); NPC внутриклеточный транспортер 2 (NPC2); цероидный липофусциноз 5 (CLN5); цероидный липофусциноз 6 (CLN6); цероидный липофусциноз 8 (CLN8); пальмитоил протеинтиоэстераза 1 (PPT1); трипептидилпептидаза 1 (TPP1); баттенин (CLN3); DNAJ-белок семейства белков теплового шока 40 член C5 (DNAJC5); белок 8, содержащий домен суперсемейства основных посредников (ген MFSD8); маннозидаза α класс 2B член 1 (MAN2B1); маннозидаза β (MANBA); аспартилглюкозаминидаза (AGA); α-L-фукозидаза (FUCA1); цистинозин, лизосомный транспортер цистеина (CTNS); сиалин; семейство растворимых носителей 2, член 10 (SLC2A10); семейство растворимых носителей 17, член 5 (SLC17A5); семейство растворимых носителей 6, член 19 (SLC6A19); семейство растворимых носителей 22, член 5 (SLC22A5); семейство растворимых носителей 37, член 4 (SLC37A4); связанный с лизосомами мембранный белок 2 (LAMP2); потенциал-управляемый натриевый канал, α субъединица 4 (SCN4A); потенциал-управляемый натриевый канал, β субъединица 4 (SCN4B); потенциал-управляемый натриевый канал, α субъединица 5 (SCN5A); потенциал-управляемый натриевый канал, α субъединица 4 (SCN4A); потенциал-управляемый кальциевый канал, субъединица α1c (CACNA1C); потенциал-управляемый кальциевый канал, субъединица α1s (CACNA1S); фосфоглицераткиназа 1 (PGK1); фосфоглицерат мутаза 2 (PGAM2); амило-α-глюкозидаза, 4-α-глюканотрансфераза (AGL); потенциал-управляемый калиевый канал, ISK-ассоциированное подсемейство, член 1 (KCNE1); потенциал-управляемый калиевый канал, ISK-ассоциированное подсемейство, член 2 (KCNE2); потенциал-управляемый калиевый канал, подсемейство J, член 2 (KCNJ2); потенциал-управляемый калиевый канал, подсемейство J, член 5 (KCNJ5); потенциал-управляемый калиевый канал, подсемейство H, член 2 (KCNH2); потенциал-управляемый калиевый канал, KQT-подобное подсемейство, член 1 (KCNQ1); управляемый циклическими нуклеотидами гиперполяризационно-активируемый канал 4 (HCN4); потенциал-управляемый хлоридом канал 1 (CLCN1); карнитин пальмитоилтрансфераза 1А (СРТ1А); рианодиновый рецептор 1 (RYR1); рианодиновый рецептор 2 (RYR2); мостовой интегратор 1 (BIN1); LARGE ксилозил- и глюкуронилтрансфераза 1 (LARGE1); стыковочный белок 7 (DOK7); фукутин (FKTN); фукутин-связанный белок (FKRP); селенопротеин N (SELENON); белок O-маннозилтрансферазы 1 (POMT1); белок O-маннозилтрансферазы 2 (POMT2); протеин О-связанная манноза N-ацетилглюкозаминилтрансфераза 1 (POMGNT1); протеин О-связанная манноза N-ацетилглюкозаминилтрансфераза 2 (POMGNT2); протеин-О-маннозо-киназа (POMK); содержащий изопреноидсинтазу домен (ISPD); плектин (PLEC); холинергический рецептор, никотиновая эпсилон-субъединица (CHRNE); холин O-ацетилтрансфераза (CHAT); холинкиназа β (CHKB); коллагеноподобная «хвостовая» субъединица асимметричной ацетилхолинэстеразы (COLQ); связанный с рецептором белок синапса (RAPSN); белок 1 «four and a half LIM domains» (FHL1); β-1,4-глюкуронилтрансфераза 1 (B4GAT1); β-1,3-N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 2 (B3GALNT2); дистрогликан 1 (DAG1); трансмембранный белок 5 (TMEM5); трансмембранный белок 43 (TMEM43); SECIS-связывающий белок 2 (SECISBP2); глюкозамин (UDP-N-ацетил) -2-эпимераза/N-ацетилманнозаминакиназа (GNE); аноктамин 5 (ANO5); белок 1, содержащий гибкий шарнирный домен структурной поддержки хромосом (SMCHD1); лактатдегидрогеназа A (LDHA); лактатдегидрогеназа B (LHDB); кальпаин 3 (CAPN3); кавеолин 3 (CAV3); белок 32, содержащий трехсторонний мотив 32 (TRIM32); белок цинкового пальца типа CCHC, связывающий нуклеиновую кислоту (CNBP); небулин (NEB); актин, α1, скелетных мышц (ACTA1); актин, α1, сердечных мышц (ACTC1); актинин α2 (ACTN2); поли (А) -связывающий ядерный белок 1 (PABPN1); белок 3, содержащий домен LEM (LEMD3); цинковая металлопротеиназа STE24 (ZMPSTE24); белок переноса микросомального триглицерида (MTTP); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α1 (CHRNA1); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α2 (CHRNA2); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α3 (CHRNA3); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α4 (CHRNA4); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α5 (CHRNA5); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α6(CHRNA6); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α7 (CHRNA7); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α8 (CHRNA8); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α9 (CHRNA9); холинергический никотиновый рецептор, субъединица α10 (CHRNA10); холинергический никотиновый рецептор, субъединица β1 (CHRNB1); холинергический никотиновый рецептор, субъединица β2 (CHRNB2); холинергический никотиновый рецептор, субъединица β3 (CHRNB3); холинергический никотиновый рецептор, субъединица β4 (CHRNB4); холинергический никотиновый рецептор, субъединица γ (CHRNG1); холинергический никотиновый рецептор, субъединица ∂ (CHRND); холинергический никотиновый рецептор, субъединица 𝜀 (CHRNE1); подсемейство А кассеты связывания АТФ, член 1 (ABCA1); подсемейство С кассеты связывания АТФ, член 6 (ABCC6); подсемейство А кассеты связывания АТФ, член 9 (ABCC9); подсемейство D кассеты связывания АТФ, член 1 (ABCD1); АТФаза 1, транспортирующая Ca2+саркоплазматического/эндоплазматического ретикулума (ATP2A1); ATM серин-треонин киназа (ATM); белок α-токоферолтрансферазы (TTPA); семейство кинезинов, член 21А (KIF21A); белок paired-like homeobox 2a (PHOX2A); гепарансульфат протеогликан 2 (HSPG2); молекула стромального взаимодействия 1 (STIM1); белок notch 1 (NOTCH1); белок notch 3 (NOTCH3); дистробревин α (ДТНА); протеинкиназа AMP-активированная, некаталитическая γ2 (PRKAG2); богатый цистеином и глицином белок 3 (CSRP3); виникулин (VCL); миозенин 2 (MyoZ2); миопалладин (MYPN); джанктофилин, (junctophilin) 2 (JPH2); фосфоламбан (PLN); кальретикулин 3 (CALR3); нексилин F-актин-связывающий белок (NEXN); белок 3, связывание домена LIM 3 (LDB3); белок отсутствия глаз 4 (eyes absent 4 (EYA4)); хантингтин (HTT); рецептор андрогена (AR); белок тирозинфосфат нерецепторного типа 11 (protein tyrosine phosphate non-receptor type 11 (PTPN11); соединительный плакоглобин (JUP); десмоплакин (DSP); плакофилин 2 (PKP2); десмоглеин 2 (DSG2); десмоколлин 2 (DSC2); катенин α3 (CTNNA3); NK2 гомеобокс, белок 5 (NKX2-5); анкорный белок A-киназы 9 (AKAP9); анкорный белок A-киназы 10 (AKAP10); полипептид 2 ингибирования активности белка, связывающего гуанин-нуклеотид (guanine nucleotide-binding protein α-inhibiting activity polypeptide 2 (GNAI2)); анкирин 2 (ANK2); синтрофин α-1 (SNTA1); кальмодулин 1 (CALM1); кальмодулин 2 (CALM2); HTRA сериновая пептидаза 1 (HTRA1); фибриллин 1 (FBN1); фибриллин 2 (FBN2); ксилозилтрансфераза 1 (XYLT1); ксилозилтрансфераза 2 (XYLT2); тафаззин (ТАЗ); гомогентизат 1,2-диоксигеназы (HGD); глюкозо-6-фосфатазная каталитическая субъединица (G6PC); 1,4-альфа-глюкановый фермент 1 (GBE1); фосфофруктокиназа, мышцы (PFKM); регуляторная субъединица фосфорилазной киназы альфа 1 (PHKA1); регуляторная субъединица фосфорилазной киназы альфа 2 (PHKA2); регуляторная субъединица бета фосфорилазной киназы (PHKB); каталитическая субъединица фосфорилазной киназы гамма 2 (PHKG2); фосфоглицерат мутаза 2 (PGAM2); цистатион-бета-синтаза (CBS); метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR); 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансфераза (MTR); 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансфераза-редуктаза (MTRR); метилмалоновая ацидурия и гомоцистинурия типа cblD (MMADHC); митохондриальная ДНК, включая, но не ограничиваясь такими как: митохондриально кодируемую NADH: центральную субъединицу 1 убихиноноксидоредуктазы (MT-ND1); митохондриально кодируемую NADH: основную субъединицу 5 убихинон-оксидоредуктазы (MT-ND5); митохондриально кодируемую тРНК глутаминовой кислоты (MT-TE); митохондриально кодируемую тРНК гистадина (MT-TH); митохондриально кодируемую тРНК лейцина 1 (MT-TL1); митохондриально кодируемую тРНК лизина (MT-TK); митохондриально кодируемую тРНК серина 1 (MT-TS1); митохондриально кодируемую тРНК валина (MT-TV); активируемую митогеном протеинкиназу киназу 1 (MAP2K1); протоонкоген B-Raf связанную серин/треонинкиназу (BRAF); протоонкоген raf-1 связанную серин/треонинкиназу (RAF1); факторы роста, включая, но не ограничиваясь таковыми: фактор роста инсулина 1 (IGF-1); трансформирующий фактор роста β3 (TGFβ3); рецептор трансформирующего фактора роста β, тип I (TGFβR1); рецептор трансформирующего фактора роста β, тип II (TGFβR2), фактор роста фибробластов 2 (FGF2), фактор роста фибробластов 4 (FGF4), фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), фактор роста эндотелия сосудов B (VEGF-B); фактор роста эндотелия сосудов C (VEGF-C), фактор роста эндотелия сосудов D (VEGF-D), рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1) и рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); интерлейкины; иммуноадгезины; цитокины; и антитела.
В предпочтительных вариантах осуществления генные продукты, доставляемые обсуждаемыми вариантами AAV, выбирают из альфа-галактозидазы A (GLA), фратаксина (FXN), дистрофина (DMD), кислой альфа-глюкозидазы (GAA) и гликогенфосфорилазы мышц (PYGM). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления рассматриваемый вариант AAV содержит сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую (i) полипептид GLA, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 67; (ii) полипептид FXN, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 69; (iii) полипептид DMD, включающий или состоящий из функционального фрагмента (например, мини- или микро-дистрофина, предпочтительно содержащий интактный актин-связывающий домен, а также по крайней мере 4 из 24 спектрин-подобных повторов и дистрогликан-связывающий домен) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 64; (iv) полипептид GAA, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 68, (v) полипептид PYGM, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:66, причем (vi) или (v) аминокислотные последовательности, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или, по меньшей мере 95% идентичны любому из SEQ ID NO: 64 и 66-69.
В другом предпочтительном варианте осуществления рассматриваемый вариант AAV содержит трансген, кодирующий интерферирующую РНК, например, антисмысловую РНК, miРНК, shРНК или siРНК, снижающие экспрессию DMPK. В некоторых аспектах интерферирующая РНК снижает экспрессию DMPK, кодируемого нуклеиновой кислотой, имеющей нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 65, или последовательность, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, или при минимум на 95% идентичную SEQ ID NO: 65.
Гены, продукты которых индуцируют или способствуют апоптозу, называются здесь «проапоптотическими генами», а продукты этих генов (мРНК; белок) называются «проапоптотическими генными продуктами». Проапоптотические мишени включают, например, продукты гена Bax; продукты гена Bid; продукты гена Bak; продукты гена Bak; продукты гена Bad; Bcl-2; Bcl-X1. Антиапоптотические генные продукты включают Х-связанный ингибитор апоптоза.
sonic hedgehog
Гены, генные продукты которых индуцируют или стимулируют ангиогенез, называются здесь «проангиогенными генами», а продукты этих генов (мРНК; белок) называются «проангиогенными генными продуктами». Проангиогенные мишени включают, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1); рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста 2 (VEGFR2); cвязанную с Fms тирозинкиназу 1 (Flt1); фактор роста плаценты (PGF); полученный из тромбоцитов фактор роста (PDGF); ангиопоэтины; . Гены, генные продукты которых ингибируют ангиогенез, называются здесь «антиангиогенными генами», а продукты этих генов (мРНК; белок) называются «антиангиогенными генными продуктами». Антиангиогенные генные продукты включают эндостатин; тумстатин (tumstatin); ангиостатин; фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), и слитые белки или антитела, специфичные для проангиогенных мишеней и/или их рецепторов, например, VEGF-специфическое антитело AvastinTM и др.
TM
lampamizumab
Гены, генные продукты которых функционируют как иммуномодуляторы, например, факторы комплемента, toll-подобные рецепторы, называются «иммуномодулирующими генами». Типичные иммуномодулирующие гены включают цитокины, хемокины и слитые белки или антитела, специфичные для таковых и/или их рецепторов, например, слитый белок анти-IL-6 Rilonacept, специфичный к фактору комплемента H, антитело  и др. гены, генные продукты которых функционируют в качестве факторов защиты мышц, например, инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-1); трансформирующий ростовой фактор β (TGFβ); фактор роста фибробластов (FGF).
В некоторых случаях представляющий интерес генный продукт представляет собой сайт-специфическую эндонуклеазу, обеспечивающую сайт-специфический нокдаун функции гена, например, эндонуклеазу, выбивающую аллель, связанный с заболеванием мышц. Например, в случае, если доминантный аллель кодирует дефектную копию гена, который, будучи геном дикого типа, представляет собой мышечный структурный белок и/или обеспечивает нормальную функцию мышц, то такая сайт-специфическая эндонуклеаза может быть нацелена на дефектный аллель и, таким образом, выбивать дефектный аллель.
В дополнение к выбиванию/нейтрализации дефектного аллеля, сайт-специфическая нуклеаза также может быть использована для стимуляции гомологичной рекомбинации с донорной ДНК, кодирующей функциональную копию белка, того, который кодируется дефектным аллелем. Таким образом, например, предложенный вирион rAAV может использоваться для доставки как сайт-специфической эндонуклеазы, выбивающей дефектный аллель, так и для доставки функциональной копии дефектного аллеля, что приводит к восстановлению работы дефектного аллеля, тем самым обеспечивая производство функционального мышечного белка (такого, как, например, функциональный ламин A/C, функциональный фибриллин, функциональный коллаген типа VI и т. д.). В некоторых вариантах осуществления вирион rAAV, раскрытый в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую эндонуклеазу; и гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональную копию дефектного аллеля, где функциональная копия кодирует функциональный мышечный белок. Функциональные мышечные белки включают, например, ламин A/C, фибриллин 1, COL6A1, COL6A2, COL6A3 и тому подобные.
Сайт-специфические эндонуклеазы, подходящие для использования, включают, например, мегануклеазы; нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN); активатор-подобные эффекторные нуклеазы транскрипции (TALEN); и кластеризованные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы/CRISPR-ассоциированные (Cas), причем такие сайт-специфические эндонуклеазы не встречаются в дикой природе и являются модифицированными для нацеливания на специфический ген. Такие сайт-специфические нуклеазы могут быть сконструированы для внесения разреза в определенных местах генома с последующем восстановлением разрыва путем негомологичной рекомбинации с инсерцией или делецией нескольких нуклеотидов. Такие сайт-специфические эндонуклеазы (также называемые «инделами», “INDELs») изменяют рамку считывания белка, эффективно выбивая ген. См., например, патентную публикацию США № 2011/0301073.
International Journal of Molecular Medicine
В некоторых вариантах раскрытого здесь варианта вектора rAAV нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт, представляющий интерес, функционально связана с конститутивным промотором. Подходящие конститутивные промоторы включают, например, цитомегаловирусный промотор (CMV) (Stinski et al. (1985) Journal of Virology 55 (2): 431-441), ранний энхансер CMV/промотор β-актина курицы (CBA)/интрон β-глобина кролика (CAG) (Miyazaki et al. et al. (1989) Gene 79 (2): 269-277, CBSB (Jacobson et al. (2006) Molecular Therapy 13 (6): 1074-1084), промотор фактора элонгации 1α человека (EF1α) (Kim et al. ( 1990) Gene 91 (2): 217-223), промотор фосфоглицераткиназы (PGK) человека (Singer-Sam et al. (1984) Gene 32 (3): 409-417, митохондриальный промотор тяжелой цепи (Loderio et al. (2012) PNAS 109 (17): 6513-6518), промотор убиквитина (Wulff et al. (1990) FEBS Letters 261: 101-105). В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт, представляющий интерес, функционально связана с индуцибельным промотором. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт, представляющий интерес, функционально связана с регуляторным элементом, специфичным для ткани или типа клетки. Например, в некоторых случаях нуклеотидная последовательность, кодирующая генный продукт, представляющий интерес, функционально связана с мышечно-специфичным регуляторным элементом (например, специфичным для сердца промотором или специфичным для скелетных мышц промотором), например, регуляторным элементом, обеспечивающим селективную экспрессию функционально связанного гена в мышечной клетке. Подходящие специфичные для мышц регуляторные элементы включают, например, промотор α-актина скелетных мышц (Muscat and Kedes (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 4089-4099); α-актиновый промотор сердечной мышцы (Minty and Kedes (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 2125-2136); α-актиновый промотор гладких мышц (Nakano et al. (1991) Gene 99: 285-289); α-актиновый промотор гладких мышц сосудов (Keogh et al. (1999) Gene Therapy 6 (4): 616-628); промотор мышечной креатинкиназы (Bartlett et al. (1996) Cell Transplantation 5 (3): 411-419); промоторы легкой цепи миозина 1 и легкой цепи миозина 3 (Seidel и Arnold (1989) J. Biol. Chem. 264 (27): 16109-16117); промотор легкой цепи миозина 2v (MLC2v) (Su et al. (2004) PNAS 101 (46): 16280-16285); промотор миогенного фактора 5 (Myf5) (Fujimaki et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 289 (11): 7399-7412); промотор миогенной дифференцировки 1 (Myod1) (Zingg et al. (1994) Nucleic Acids Research 22 (12): 2234-2241); промотор миогенина (Myog) (Salminen et al. (1991) Journal of Cell Biology 115 (4): 905-917); промотор paired box gene 7 (Pax7) (Murmann et al. (2000) Biol Chem. 381 (4): 331-335); промотор paired like homeodomain 3 (Pitx3) (Coulon et al. (2007) Journal of Biological Chemistry 282: 33192-33200); промотор MHCK7 (Salva et al. (2007) Mol. Ther. 15 (2): 320-329); промотор MCK/SV40 (Takeshita et al. (2007) Takeshita et al. (2007)  19:309-315); промотор С5-12 (Li et al. (1999) Nature Biotechnology 17: 241-245); энхансеры/промоторы двойного и тройного тандема MCK (Wang et al. (2008) Gene Therapy 15: 1489-1499); промотор тяжелой цепи миозина 7 (MYH7); (Иваки и др. (2104) PLOS ONE 9 (4): e88610); промотор тяжелой цепи миозина 6 (MYH6) (Pacak et al. (2008) Genet. Vaccines Ther. 6:13); промотор сердечного тропонина T (TNNT2) (Farza et al. (1998) J. Mol. Cell Cardiol. 30 (6): 1247-53); промотор α-тропомиозина (Helfman et al. (1986), Molecular and Cellular Biology 6 (11): 3582-3595); промотор сердечного тропонина C (TNNC1) (Scheier et al. (1990) Journal of Biological Chemistry 34 (5): 21247-21253); промотор сердечного миозин-связывающего белка C (Lin et al. (2013) PLoS ONE 8 (7) : e69671); промотор сердечного тропонина I (TNNI3) (Bhavsar et al. (1996) Genomics 35 (1): 11-23); промотор десмина (Li et al. (1991) Journal of Biological Chemistry 10 (5): 6562-6570); промотор натриево-кальциевого обменника (NCX1) (Scheller et al. (1997) Journal of Biological Chemistry 273 (13): 7643-7649); промотор атриального натрийуретического фактора (Durocher et al. (1996), Molecular and Cellular Biology 16 (9): 4648-4655); и промотор SM22α (Kemp et al. (1995) Biochemical Journal 310 (3): 1037-1043.
В целях раскрытия изобретения, раскрытие в настоящем описании предоставляет изолированные нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие варианты капсидных белков AAV, как описано выше. Изолированная нуклеиновая кислота может представлять собой вектор AAV, например, рекомбинантный вектор AAV.
Раскрытие в настоящем описании также предоставляет способ лечения мышечного заболевания, включающий введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества варианта вириона rAAV, содержащего представляющий интерес трансген, как описано и раскрыто выше в настоящем описании. Специалист в данной области техники сможет легко определить эффективное количество обсуждаемого вириона rAAV и то, что при лечении расстройства применяестся тестирование изменения одного или несколько функциональных или анатомических параметров, такое, как, например, биопсия мышц с последующей иммуногистохимией, отбор проб сыворотки с последующим тестированием ИФА/ELISA или анализом активности ферментов, тест ходьбы, тест на максимальное потребление кислорода, анализ биомаркеров фракции выброса левого желудочка, учитывается конечный систолический объем левого желудочка, ручная динамометрия, максимальный подъем веса, временные функциональные тесты, показатель двигательной моторики Хаммерсмита (the Hammersmith Motor Ability Score), расчет времени подъема с пола или 9 Hole Peg Test.
Неограничивающие способы оценки мышечной функции и ее изменений включают оценку теста ходьбы, пикового максимального потребления кислорода, анализа биомаркеров, фракции выброса левого желудочка, конечного систолического объема левого желудочка, оценки по шкале Виньоса, тестов временной функции, показателя двигательной моторики Хаммерсмита, расчет времени подъема с пола, шкалы измерения двигательной функции (Motor Function Measure Scale), амбулаторную оценку North Star (North Star Ambulatory Assessment), результаты теста на 9 лунок (9 Hole Peg Test) или теста детской нервно-мышечной недостаточности детской больницы Филадельфии (Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders).
8
16
8
16
11
15
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество обсуждаемого вириона rAAV приводит к снижению скорости потери мышечной функции, анатомической целостности мышц или мышечной массы, например, к 2-кратному, 3- кратному, 4- кратному или 5- кратному или более снижению скорости потери и, таким образом, снижению скорости прогрессирования заболевания, например, к 10ти-кратному снижению скорости потери и, таким образом, 10ти-кратному уменьшению в скорости прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество вириона rAAV субъекта приводит к увеличению мышечной функции, увеличению мышечной силы, увеличению мышечной массы и/или улучшению анатомической целостности мышц или показаний биомаркеров, например, вызывает 2-кратное, 3-кратное, 4-кратное или 5-кратное улучшение или более мышечной функции, мышечной силы, мышечной массы и/или улучшение анатомической целостности мышц или биомаркеров, например, 10-кратное улучшение мышечной функции, мышечной силы, мышечной массы и/или улучшение анатомической целостности мышц или биомаркеров. Как будет понятно специалисту в данной области техники, доза, необходимая для достижения желаемого эффекта лечения, обычно находится в диапазоне от 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 рекомбинантных вирионов, обычно называемых специалистом в данной области техники как 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 «векторных геномов» и предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 рекомбинантных вирионов.
Обсуждаемый вирион rAAV может быть доставлен в скелетную мышцу путем внутрисосудистого (внутривенного или внутриартериального) введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечностей и/или прямой внутримышечной инъекции или любым другим удобным способом или путем введения, приводящим к доставке вириона rAAV в скелетную мышцу. Вирион rAAV может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутрисосудистого (внутривенного или внутриартериального) введения, прямой инъекции в сердце (в левое предсердие, правое предсердие, правый желудочек и/или перегородку), антеградной или ретроградной инфузии в коронарную артерию (через левую переднюю нисходящую или левостороннюю коронарную артерию), рециркуляцией, интраперикардиальной инъекцией, трансэндокардиальной инъекцией или любым другим удобным способом или путем введения, приводящим к доставке вириона rAAV в сердечную мышцу. В предпочтительном варианте осуществления изобретения обсуждаемый вирион rAAV доставляется в скелетную и/или сердечную мышцу путем системного внутривенного введения. При введении посредством внутривенной инъекции обсуждаемый вирион rAAV способен перемещаться по кровеносной системе и более эффективно трансдуцировать мышечные клетки по сравнению со способностью вириона AAV дикого типа или вириона AAV, содержащего соответствующий родительский капсидный белок AAV.
in vivo
ex vivo
Вариант капсидного белка, раскрытый в данном описании, изолируют, например, очищают. В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка, раскрытого в настоящем описании, включен в вектор AAV или в рекомбинантный вирион AAV (rAAV). В других вариантах осуществления такие векторы варианта AAV и/или вирионы варианта AAV используются в способе лечения мышечного заболевания сердечных или скелетных мышц приматов  или .
in vitro
rep
Раскрытие в настоящем описании дополнительно предоставляет клетки-хозяева, такие как, без ограничения таковыми, изолированные (генетически модифицированные) клетки-хозяева, содержащие указанную нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин, согласно изобретению, раскрытая в настоящем описании, может быть изолированной клеткой, такой как клетка, полученная из культуры клеток . Такая клетка-хозяин применима для получения обсуждаемого варианта вириона rAAV, как описано здесь. В одном варианте осуществления такая клетка-хозяин стабильно генетически модифицирована нуклеиновой кислотой. В других вариантах осуществления клетка-хозяин временно генетически модифицирована нуклеиновой кислотой. Такую нуклеиновую кислоту стабильно или временно вводят в клетку-хозяин, используя уже известные методы, включающие, но таковыми не ограниченные, методы из списка: электропорация, осаждение фосфатом кальция, липосом-опосредованную трансфекция и тому подобное. Для стабильной трансформации нуклеиновая кислота обычно дополнительно включает селектируемый маркер, например, любой из нескольких хорошо известных селектируемых маркеров, таких как устойчивость к неомицину и тому подобное. Такую клетку-хозяина получают введением нуклеиновой кислоты в любую из множества клеток, например, из клеток млекопитающих, включая, например, мышиные клетки и клетки приматов (например, клетки человека). Типичные клетки млекопитающих включают, но не ограничиваются таковыми, первичные клетки и клеточные линии, где иллюстративные клеточные линии включают, но не ограничиваются таковыми, клетки HEK293, клетки HEK293T, клетки COS, клетки HeLa, клетки Vero, фибробласты мыши 3T3, C3H10T1/2 фибробласта, клетки СНО и тому подобные. Типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются таковыми, клетки HeLa (например, American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), клетки CHO (например, ATCC № CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, ATCC No. CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3T3 (например, ATCC № CRL-1658), клетки Huh-7, клетки BHK (например, ATCC № CCL10), клетки PC12 (ATCC № CRL1721), клетки COS, Клетки COS-7 (ATCC № CRL1651), клетки RAT1, L-клетки мыши (ATCC № CCLI.3), клетки эмбриональной почки человека (HEK293) (ATCC № CRL1573), клетки HLHepG2 и тому подобное. Клетка-хозяин также может быть получена с использованием бакуловируса, инфицирующего клетки насекомых, (таких как клетки Sf9), продуцирующих AAV (см., например, патент США № 7 271 002; заявка на патент США № 12/297 958). В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированная клетка-хозяин включает, помимо нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано выше, также нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько -белков AAV. В других вариантах осуществления клетка-хозяин дополнительно содержит вектор варианта rAAV. Вариант вириона rAAV может быть получен с использованием таких клеток-хозяев. Способы получения вириона rAAV описаны, например, в патентной публикации США № 2005/0053922 и патентной публикации США № 2009/0202490.
th
rd
Раскрытие в настоящем описании дополнительно предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую: a) вариант вириона rAAV, как описано выше и раскрыто в настоящем описании; и b) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель/эксципиент или буфер. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или буфер являются подходящими для применения пациенту, являющемуся или не являющемуся человеком. Такие эксципиенты, носители, разбавители и буферы включают любой фармацевтический агент, который можно вводить без создания чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но не ограничиваются таковыми, жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Фармацевтически приемлемые соли могут быть также включены, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и тому подобное; а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие, как смачивающие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, рН-буферные вещества и тому подобные. Широкое разнообразие фармацевтически приемлемых наполнителей существует и известно в данной области техники и не нуждается в подробном обсуждении в настоящем описании. Фармацевтически приемлемые наполнители подробно описаны в различных публикациях, включая, например, A. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.
8
16
8
16
В некоторых аспектах настоящего изобретения настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую от приблизительно 1 х 10 до приблизительно 1 х 10рекомбинантных вирусов или от 1 х 10 до приблизительно 1 х 10векторных геномов, где каждый указанный рекомбинантный вирус содержит геном, кодирующий один или более генных продуктов.
Некоторые варианты осуществления изобретения иллюстрируются в следующих пунктах 1-54:
1. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где вставка находится в AAV2 или соответствующем положении в капсидной части серотипа AAV дикого типа, отличного от AAV2 или варианта AAV, и где пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25), ASDSTKA (SEQ ID NO:26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO:31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32), LAASNITKAA (SEQ ID NO:33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34), LANKISAKDA (SEQ ID NO:35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO:37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO:41), и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42).
2. Вариант AAV по п.1, в котором капсидный белок включает одну или более точечных мутаций относительно AAV2 или одну или более соответствующих точечных мутаций относительно других серотипов AAV дикого типа или вариантов AAV.
3. Вариант AAV по п.2, в котором одна или несколько точечных мутаций выбрана из группы, состоящей из A35P, S109T, P195L, D213N, G222S, V229I, N312K, A319T, T330A, A333S, E347K, P363L, A427D, V447F, N449D, N449K, G453R, A490T, K527Q, N551S, A581T, Y585S, R588M, A593E, W606C, K649E, R651H, W694C, I698V, V708I, и L735Q, и предпочтительно выбрана из группы, состоящей из V708I, V708I+A593E, V708I+S109T, V708I+T330A, A35P, V708I+R588M, V708I+W606C, V708I+W694C, I698V, N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q, N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q, V708I+N449K, и V708I+G222S.
4. Вариант AAV по п.1, где пептидная вставка расположена после любой из аминокислот в положениях 570-671 в VP1 капсида AAV2 или в соответствующем положении другого серотипа AAV дикого типа или варианта AAV.
5. Вариант AAV по п.4, где пептидная вставка встроена после аминокислоты 587 в VP1 капсида AAV2 или в соответствующем положении другого серотипа AAV.
6. Вирион инфекционного рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий: (а) вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-5 и гетерологичную нуклеиновую кислоту.
7. rAAV по п.6, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-интерферирующий агент или полипептид.
8. Способ доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетки-мишени, включающий контактирование клетки-мишени с вирионом rAAV по п.7.
9. Способ по п.8, в котором клетка-мишень представляет собой клетку сердечной и/или скелетной мышцы.
in vitro
10. Способ по п.8, в котором клетка-мишень находится .
in vivo
11. Способ по п.8, в котором клетка-мишень находится .
12. Изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащего пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где эта вставка находится в AAV2 или в соответствующем положении фрагмента капсидного белка серотипа AAV дикого типа, отличного от AAV2 или варианта AAV, и где пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25), ASDSTKA (SEQ ID NO:26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO:31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32), LAASNITKAA (SEQ ID NO:33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34), LANKISAKDA (SEQ ID NO:35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO:37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO:41), и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42).
13. Изолированная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.12.
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3,
1
2
3
4
5
6
7
14. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку относительно родительского капсидного белка AAV, расположенную между двумя смежными аминокислотами, в положении между аминокислотами 570 и 611 VP1 в AAV2, где вставка содержит амино кислотную последовательность YYXXXXXXXYи где X выбран из Т и N; X выбран из N и K; Xвыбран из К, I и Т; X выбран из I, Q и T; X выбран из G, R и N; X выбран из V, T и K; и Xвыбран из Т и D.
15. Вариант AAV по п.14, в котором пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14) и TNKIGVT (SEQ ID NO:15).
16. Вариант AAV по п.15, отличающийся тем, что пептидная вставка фланкирована N-концевой аминокислотой LA и C-концевой аминокислотой A.
17. Вариант AAV по п.15, где пептидная вставка находится между аминокислотами 587 и 588 VP1 капсида AAV2 или в соответствующем положении в другом серотипе AAV дикого типа или варианте AAV.
18. Вирион инфекционного рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий: (a) вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 14-17 и гетерологичную нуклеиновую кислоту.
19. rAAV по п. 18, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит РНК-интерферирующий агент или нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид.
20. Способ доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, включающий контактирование клетки-мишени с вирионом rAAV по п. 18.
21. Способ по п.20, в котором клетка-мишень представляет собой клетку сердечной и/или скелетной мышцы.
in vitro
in vivo
22. Способ по п.21, в котором клетка-мишень находится  или .
23. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), включающий i) аминокислотную последовательность AAV, по меньшей мере на 90% идентичную AAV дикого типа, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-10 и 11; и ii) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P363L, P363L+V708I, P363L+E347K, V708I+A593E, V708I+A333S, V708I+S721L, V708I+A593E+N551S, V708I+A593E+K649E, V708I+A593E+S109T, V708I+A593E+S109T+K527Q, A593E+S109T, и где одна или несколько замен представляют собой замены относительно AAV2, или где одна или несколько соответствующих замен сделаны относительно других серотипов AAV.
24. Вариант AAV по п.23, в котором капсидный белок содержит пептидную вставку.
25. Вариант AAV по п.24, где пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID NO:13), NKTTNKD (SEQ ID NO:14), TNKIGVT (SEQ ID NO:15), GNLTKGN (SEQ ID NO:16), NTVKLST (SEQ ID NO:17), SNTVKAI (SEQ ID NO:18), ASNITKA (SEQ ID NO:19), DNTVTRS (SEQ ID NO:20), NKISAKD (SEQ ID NO:21), NQDYTKT (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), SNTTQKT (SEQ ID NO:25), ASDSTKA (SEQ ID NO:26), LANKIQRTDA (SEQ ID NO:27), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:29), LAGNLTKGNA (SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA (SEQ ID NO:31), LASNTVKAIA (SEQ ID NO:32), LAASNITKAA (SEQ ID NO:33), LADNTVTRSA (SEQ ID NO:34), LANKISAKDA (SEQ ID NO:35), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:36), LATNKIGVTS (SEQ ID NO:37), LATNKIGVTA (SEQ ID NO:38), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40), LASNTTQKTA (SEQ ID NO:41), и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:42).
26. Вариант AAV по п.23, в котором аминокислотная последовательность AAV, по меньшей мере на 95% идентична AAV дикого типа.
27. Вариант AAV по п.23, в котором аминокислотная последовательность AAV по меньшей мере на 99% идентична AAV дикого типа.
28. Вариант AAV по п.23, в котором капсидный белок представляет собой химерный капсидный белок или представляет собой родовой капсидный белок.
29. Вирион инфекционного рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), содержащий: (а) вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 23-28 и гетерологичную нуклеиновую кислоту.
30. rAAV по п.29, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-интерферирующий агент или полипептид.
31. Способ доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, включающий контактирование клетки-мишени с вирионом rAAV по п.29.
32. Способ по п.31, в котором клетка-мишень представляет собой клетку сердечной и/или скелетной мышцы.
33. Способ по п.32, в котором клетка сердечной мышцы выбрана из группы, состоящей из кардиомиоцитов, кардиомиобластов, сердечных фибробластов и клеток-предшественников сердечной мышцы.
in vitro
34. Способ по п.31, в котором клетка-мишень находится .
in vivo
35. Способ по п.31, в котором клетка-мишень находится .
36. Изолированная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую капсидный белок варианта аденоассоциированного вируса (AAV), содержащая аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную AAV дикого типа, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1- 12 или варианта AAV; и ii) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P363L, P363L+V708I, P363L+E347K, V708I+A593E, V708I+A333S, V708I+S721L, V708I+A593E+N551S, V708I+A593E+K649E, V708I+A593E+S109T, V708I+A593E+S109T+K527Q, A593E+S109T.
37. Изолированная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.36.
38. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка и необязательно включающую одну или более точечных мутаций, и где пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKIQRTD (SEQ ID № 13) и LANKIQRTDA (SEQ ID № 26).
39. Вариант капсидного белка AAV по п.38, включающий аминокислотную замену V708I.
40. Вариант капсидного белка AAV по п.39, включающий аминокислотную замены V708I+A593E, V708I+S109T, V708I+T330A, V708I+R588M or V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
41. Вариант капсидного белка AAV по п.38, содержащий аминокислотную замену A35P.
42. Вариант капсидного белка AAV по п.38, содержащий аминокислотную замену N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
43. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка и необязательно включающий одну или более точечных мутаций, причем пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из NKTTNKD (SEQ ID NO:14) и LANKTTNKDA (SEQ ID NO:27).
44. Вариант капсидного белка AAV по п.43, содержащий аминокислотную замену V708I.
45. Вариант капсидного белка AAV по п.44, содержащий аминокислотную замены V708I+S109T, V708I+W694C, V708I+W606C, или замену V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
46. Вариант капсидного белка AAV по п.43, содержащий аминокислотную замену I698V.
47. Вариант капсидного белка AAV по п.46, содержащий аминокислотную замену N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
48. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка и необязательно включающий одну или более точечных мутаций, и где пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из TNKIGVT (SEQ ID NO: 15), LATNKIGVTA (SEQ ID NO: 28) и LATNKIGVTS (SEQ ID NO: 36).
49. Вариант капсидного белка AAV по п.48, включающий аминокислотную замену V708I.
50. Вариант капсидного белка AAV по п.49, включающий аминокислотные замены V708I+N449K, V708I+G222S или V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
51. Вариант капсидного белка AAV по п.48, содержащий аминокислотную замену N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q.
52. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий последовательность SEQ ID NO: 62 или последовательность, идентичную таковой, по меньшей мере на 90%, где вариантный капсидный белок AAV содержит следующие аминокислотные замены относительно капсида AAV5: V229I+A490T+A581T.
53. Вариант капсидного белка AAV по п.52, дополнительно включающий аминокислотную замену Y585S или V447F относительно капсида AA5.
54. Вариантный капсидный белок аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий последовательность SEQ ID NO: 63 или последовательность, идентичную таковой, по меньшей мере на 90%, и где вариантный капсидный белок AAV содержит следующие аминокислотные замены относительно капсида AAV5: V229I+A427D+A490T+A581T.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры предоставлены с целью предоставления специалистам в данной области техники полного раскрытия и описания того, как создать и использовать настоящее изобретение, но не предназначены для ограничения объема сущности того, что авторы изобретения рассматривают как собственное изобретение; примеры не предназначены для обозначения того, что приведенные ниже эксперименты являются целиком и полностью единственными проведенными экспериментами. Хотя были приняты меры по обеспечению точности в отношении используемых чисел (например, количества, температуры и т. д.), следует учитывать возможные экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, проценты/части представляют собой части по массе, при этом молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура измерена в градусах Цельсия, а давление равно атмосферному или близко к нему.
Общие методы молекулярной и клеточной биохимии можно найти в таких стандартных учебниках, как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), раскрытие которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Реагенты, векторы клонирования и наборы для генетических манипуляций, упомянутые в этом раскрытии, доступны от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich и ClonTech.
Пример 1
macaca flavicularis)
Внутривенная инъекция и сбор тканей. Одному самцу макаки Cynomolgus ( в возрасте 3-10 лет весом не менее 3 кг вводили внутривенную инъекцию через подкожную вену для каждого раунда отбора. Животному проводилась анестезия с последующим введением 1-5 мл библиотеки, в некоторых случаях предварительно инкубированной с IVIG человека в течение 30 минут при 37°С (в первом раунде библиотека состояла из вариантов, сгенерированных с использованием всех методов мутагенеза, описанных на Фиг.1А; в каждом последующем раунде отбора использовались варианты, выделенные на основе предыдущего раунда).
Эвтаназия была выполнена обученным ветеринарным персоналом, внутривенной инъекцией 100 мг/кг пентобарбитала натрия в день 14 ± 3 или в день 21 ± 3, в зависимости от необходимости. Сердечная и/или скелетная мышечная ткань из четырехглавой мышцы была удалена, и ДНК была изолирована из ткани. В некоторых случаях сердечная ткань разделялась на несколько частей: предсердие, желудочковая перегородка, левая папиллярная мышца, правая папиллярная мышца, левый желудочек и правый желудочек.
cap
in vivo
cap
Направленная эволюция. Процесс направленной эволюции показан на Фигурах 1А-1Е. Вкратце, была создана библиотека вирусных капсидов, содержащая более 20 запатентованных комбинаций мутаций ДНК и генов  (Фиг. 1А). Затем вирусы упаковывали (Фиг. 1В), таким образом, чтобы каждая частица состояла из мутантного капсида, заключающего ген cap, кодирующий этот капсид, и очищали. Капсидную библиотеку помещали в систему селективного давления . Представляющие интерес ткани или клеточный материал собирали для выделения вариантов AAV, успешно инфицировавших данную мишень, и такие «успешные» вирусы извлекали. Успешные клоны обогащали путем повторного отбора (Стадия I - Фигура 1D). Затем выбранные -гены подвергли повторной диверсификации (запатентовано) и обогащали проводя дальнейшие этапы отбора, повышая вирусную эффективность с каждым циклом (Стадия 2 - Фигура 1D). Варианты, выявленные на Стадиях 1 и 2 отбора векторов, демонстрировали способность трансдуцировать мышечные клетки приматов (Фиг. 1Е).
Результативное восстановление капсидных геномов AAV. Капсиды, полученные после каждого раунда отбора, использовали для упаковки библиотеки, инъецированной в последующем раунде отбора. Восстановление капсидных генов из ткани обеспечивает получение тех библиотечных векторов, которые способны успешно внедряться в ткань, представляющую интерес. Восстановление вирусных геномов из тканей сердечной и скелетной мышц после проведения репрезентативного раунда отбора показано на Фигуре 2. Полосы внутри прямоугольников обозначают успешное восстановление вирусных геномов.
Анализ секвенированием. Во время 3-4 раундов отбора, включающих селективное давление путем внутривенной доставки к сердечной ткани или тканям скелетных мышц, и раундов 1-2 отбора, включающих селективное давление путем внутривенной доставки в присутствии нейтрализующих антител к сердечной ткани, проводили секвенирование отдельных клонов библиотеки с целью определения частоты вариантов в популяции. Варианты были оценены на присутствие мотивов (определенных паттернов последовательности) по данным секвенирования. Варианты были сгруппированы по мотивам, базирующимся на наличии объединяющей вариации (например, специфической точечной мутации или специфической последовательности пептидной инсерции в постоянно повторяющейся положении в пределах белка капсида), которые встречались в нескольких последовательностях. Мотивы, представляющие по меньшей мере 5% секвенированной популяции в двух или более раундах отбора или по меньшей мере 10% секвенированной популяции в одном или нескольких раундах отбора, представлены на Фиг. 3А (Анализ последовательности раунда 4 селективного давления при внутривенной доставке к сердечной ткани), Фиг. 3B (Анализ последовательности раунда 2 селективного давления при внутривенной доставке в присутствии нейтрализующих антител к сердечной ткани) и Фиг. 3C (предоставлен анализ последовательности секвенированием раунда 3 селективного давления при внутривенной доставке к скелетной мышечной ткани).
Несколько репрезентативных клонов, которые были идентифицированы как обеспечивающие повышенную инфекционность клеток сердца и/или скелетных мышц, перечислены в Таблице 1 ниже (каждый клон содержит идентифицированную замену(ы) и/или пептидную вставку, а в остальном идентичен SEQ ID NO : 2; раунд отбора, количество последовательностей и частота (в скобках) указаны для каждого клона):
Таблица 1. Модификации аминокислотной последовательности капсидного белка AAV VP1, обеспечивающие повышенную инфекционность клеток мышечной ткани сердца и/или скелетных мышц. Замены, перечисленные в колонке 2, показаны относительно аминокислотной последовательности AAV2 дикого типа, то есть в отсутствие встроенного пептида. «Сердечная+NAb» в колонке 5 указывает, что модификации аминокислотной последовательности обеспечивают повышенную устойчивость к нейтрализации антителами против AAV в дополнение к повышенной инфекционности клеток сердечной мышцы.
<b>Вставка</b>
<b>Замена</b>
<b>Сердечная мышца</b>
<b>Сердечная+NAb</b>
<b>Скелетная мышца</b>
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
Нет
Раунд 3: 6 (9.68%) Раунд 4: 11 (26.83%)
Раунд 1: 2 (1.41%) Раунд 2: 1 (0.81%)
Раунд 3: 1 (1.23%)
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
+A35P
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
+S109T+V708I
Раунд 3: 1 (1.61%) Раунд 4: 2 (4.88%)
--
--
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
+R588M+V708I
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
+A593E+V708I
Раунд 3: 1 (1.61%)
--
--
588~LANKIQRTDA~ (SEQ ID NO:27)
+V708I
Раунд 3: 13 (20.97%) Раунд 4: 10 (23.26%)
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
Нет
Раунд 4: 2 (4.88%)
Раунд 1: 10 (7.04%) Раунд 2: 8 (6.50%)
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
+S109T+V708I
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
+W694C+V708I
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
+I698V
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
+W606C+V708I
--
Раунд 2: 1 (0.81%)
--
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:28)
+V708I
Раунд 3: 6 (9.68%) Раунд 4: 3 (7.32%)
Раунд 1: 4 (2.82%) Раунд 2: 10 (8.13%)
--
588~LATNKIGVTA~ (SEQ ID NO:29)
+V708I
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:39)
Нет
--
Раунд 1: 23 (16.02%) Раунд 2: 21 (17.07%)
--
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:39)
+D213N
--
Раунд 2: 1 (0.81%)
--
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:39)
+G453R
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:39)
+V708I
Раунд 4: 1 (2.44%)
Раунд 1: 3 (2.11%) Раунд 2: 3 (2.44%)
--
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:39)
+P363L
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:36)
Нет
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:36)
+I698V
--
Раунд 2: 2 (1.63%)
--
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:36)
+V708I
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LATNRTSPDA~ (SEQ ID NO:40)
+V708I
--
Раунд 2: 1 (0.81%)
--
588~LAASDSTKAA~ (SEQ ID NO:42)
Нет
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
588~LAASDSTKAA~ (SEQ ID NO:42)
+V708I
Раунд 3: 2 (3.23%)
--
--
588~LAASNITKAA~ (SEQ ID NO:33)
Нет
--
Раунд 1: 2 (1.41%) Раунд 2: 8 (6.50%)
--
588~LAASNITKAA~ (SEQ ID NO:33)
+V708I
--
Раунд 1: 6 (4.23%) Раунд 2: 11 (8.94%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
Нет
Раунд 3: 4 (6.44%)
Раунд 1: 6 (4.23%) Раунд 2: 3 (2.44%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+S109T+V708I
Раунд 3: 2 (3.23%)
--
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+A139T+P195L
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+P363L+V708I
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+R651H
--
Раунд 2: 1 (0.81%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+V708I
Раунд 3: 2 (3.23%)
Раунд 1: 1 (0.70%) Раунд 2: 2 (1.63%)
--
588~LAGNLTKGNA~ (SEQ ID NO:30)
+P363L
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
588~LADNTVTRSA~ (SEQ ID NO:34)
Нет
--
Раунд 1: 9 (6.34%) Раунд 2: 6 (4.88%)
--
588~LADNTVTRSA~ (SEQ ID NO:34)
+I698V
--
Раунд 2: 1 (0.81%)
--
588~LADNTVTRSA~ (SEQ ID NO:34)
+V708I
--
Раунд 1: 1 (0.70%) Раунд 2: 2 (1.63%)
--
588~LANTVKLSTA~ (SEQ ID NO:31)
Нет
--
Раунд 1: 3 (2.11%) Раунд 2: 7 (5.69%)
--
588~LANTVKLSTA~ (SEQ ID NO:31)
+V708I
--
Раунд 2: 8 (6.50%)
--
588~LASNTVKAIA~ (SEQ ID NO:32)
Нет
Раунд 3: 2 (3.23%) Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LASNTVKAIA~ (SEQ ID NO:32)
+V708I
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LATNKIGVTS~ (SEQ ID NO:37)
Нет
Раунд 4: 1 (2.44%)
--
--
588~LASNTTQKTA~ (SEQ ID NO:41)
Нет
--
--
Раунд 3: 2 (2.46%)
588~LANKISAKDA~ (SEQ ID NO:35)
Нет
--
Раунд 2: 3 (2.44%)
--
588~LANKISAKDA~ (SEQ ID NO:35)
+V708I
--
Раунд 2: 2 (1.63%)
--
Нет
P34A
--
--
Раунд 4: 2 (10%)
Нет
P34S
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
Нет
P64S
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
S109T+P235S
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
Q120R
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
A193V
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
T277N
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
P351L
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
P363L
--
Раунд 1: 13 (9.15%)
Раунд 3: 34 (41.98%) Раунд 4: 4 (20.00%)
Нет
P363L+E347K
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
P363L+V708I
--
Раунд 1: 2 (1.41%)
--
Нет
S427T+I698V
--
Раунд 1: 1 (0.70%)
--
Нет
Q440K
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
Y444F
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
N449D
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
T568N
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
A593E
Раунд 4: 3 (7.32%)
Раунд 1: 1 (0.70%)
Раунд 3: 31 (38.27%) Раунд 4: 2 (10%)
Нет
S109T+A593E
--
--
Раунд 3: 2 (2.47%)
Нет
S109T+K527Q+A593E+V708I
Раунд 3: 1 (1.61%)
--
--
Нет
S109T+A593E+V708I
Раунд 3: 1 (1.61%)
--
--
Нет
A593E+N551S+V708I
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
A593E+K649E+V708I
Раунд 3: 1 (1.61%)
--
--
Нет
A593E+V708I
Раунд 3: 12 (19.35%)
Раунд 1: 5 (3.52%)
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
I698V
--
--
Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
V708I
Раунд 3: 6 (9.68%) Раунд 4: 2 (4.88%)
Раунд 1: 10 (7.04%)
Раунд 3: 1 (1.23%) Раунд 4: 1 (5.00%)
Нет
V708I+A333S
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Нет
V708I+S721L
Раунд 3: 1 (1.61%)
--
--
Нет
V708I+L735V
--
--
Раунд 3: 1 (1.23%)
Также были идентифицированы как капсиды, обладающие повышенной инфекционностью по отношению к клеткам сердечной мышцы и повышенной устойчивостью к нейтрализации антителами против AAV, следующие химеры:
Химера с (i) аминокислотами 1-129 AAV6 и (ii) аминокислотами 130-725 AAV5 и имеющая следующие аминокислотные замены относительно AAV5: V229I+A490T+A581T (последовательность SEQ ID NO: 62).
Химера с (i) аминокислотами 1-61 AAV2, (ii) аминокислотами 62-129 AAV6 и (iii) аминокислотами 130-725 AAV5 и имеющая следующие аминокислотные замены относительно AAV5: V229I+A490T+A581T (последовательность SEQ ID NO: 63).
Химера с (i) аминокислотами 1-129 AAV6 и (ii) аминокислотами 130-725 AAV5 и имеющая следующие аминокислотные замены относительно AAV5: V229I+A490T+A581T+Y585S
Химера с (i) аминокислотами 1-129 AAV6 и (ii) аминокислотами 130-725 AAV5 и имеющая следующие аминокислотные замены относительно AAV5: V229I+A447F+A490T+A581T
Вирионы варианта AAV, раскрытые в настоящем описании, могут включать в себя разумные рациональные конструктивные параметры, особенности, модификации, преимущества и вариации, очевидные для специалистов в данной области техники, в области конструирования вирусных векторов AAV.
Пример 2
in vitro
Клеточный тропизм рекомбинантных вирионов AAV, содержащих новые варианты AAV LANKIQRTDA+V708I (SEQ ID NO: 43), LANKTTNKDA+V708I (SEQ ID NO: 48) и LATNKIGVTA+V708I (SEQ ID NO: 46) для кардиомиоцитов оценивали  с использованием кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (ESC).
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV1, либо капсид AAV2, либо капсид AAV9, либо новый вариант капсида LANKIQRTDA+V708I, либо новый вариант капсида LANKTTNKDA+V708I, либо новый вариант капсида LATNKIGVTA+V708 и геном, содержащий трансген флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанный с промотором CAG (AAV1.CAG.EGFP, AAV2.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP, и LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP, соответственно) были изготовлены с использованием стандартных методов. Кардиомиоциты были получены из линии эмбриональных стволовых клеток человека, ESI-017, путем модуляции передачи сигналов Wnt при использовании малых молекул. После 14 дней индукции сердечной мезодермы, культуры были дополнительно обогащены по кардиомиоцитам с помощью депривации глюкозы. Приблизительно через 24 дня дифференцировки большинство клеток экспрессировали маркер сердечного миоцита, сердечный тропонин Т (cTnT) и желудочко-специфический маркер, MLC-2V. Полученные кардиомиоциты оценивали по экспрессии белка щелевого соединения Connexin 43, флуктуации мембранного потенциала, метеболизму кальция и сократительной функции, чтобы убедиться, что полученные кардиомиоциты достигли зрелого состояния до начала этапа векторной характеристики.
По сравнению с AAV1, AAV2 и AAV9, варианты LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и LATNKIGVTA+V708I обеспечивали значительно более высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгена в культурах кардиомиоцитов человека через шесть дней после заражения (как определено методами иммунофлюоресценции, Фигура 6А), проточной цитометрии (Фигура 6В) и Вестерн-блот анализа (Фигуры 6С-D). Кроме того, по сравнению с AAV1, AAV2 и AAV9, LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и LATNKIGVTA+V708I обеспечивали более быстрое начало экспрессии генов в культурах человеческих кардиомиоцитов, что определялось иммунофлуоресценцией (фигура 6E). По сравнению с AAV8 и AAV9, проявляющих тропизм к клеткам сердца и скелетных мышц, количество инфекционных единиц на введенный вирусный геном было на несколько порядков выше для LANKIQRTDA+V708I и LANKTTNKDA+V708I (Фиг. 10А). Это исследование иллюстрирует превосходящую способность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) -, NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) - и TNKIGVT (SEQ ID NO: 15) - содержащих капсидные варианты AAV доставлять гены в клетки сердечной мышцы.
Пример 3
in vitro
Тропизм клеток рекомбинантных вирионов AAV, включающих новую версию AAV химеры AAV6/AAV5 для кардиомиоцитов, оценивали  с использованием кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека (ESC).
[00198] Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV1, капсид AAV8, капсид AAV9, либо новый вариант капсида AAV6/AAV5 химера (с SEQ ID NO: 62) и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанные с промотором CAG (AAV1.CAG.EGFP, AAV8.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, AAV6/AAV5 chimera.CAG.EGFP, соответственно) были изготовлены с использованием стандартных методов. Кардиомиоциты были получены из линии эмбриональных стволовых клеток человека, ESI-017, путем модуляции передачи сигналов Wnt с использованием малых молекул. Через 14 дней после индукции сердечной мезодермы культуры были дополнительно обогащены по кардиомиоцитам путем депривации глюкозы. Приблизительно через 24 дня дифференцировки большинство клеток экспрессировали маркер сердечного миоцита, сердечный тропонин Т (cTnT) и желудочко-специфический маркер, MLC-2V. Сформированные кардиомиоциты оценивали на экспрессию белка щелевого соединения Connexin 43, флуктуацию мембранного потенциала, обработку кальцием и сократительную функцию, чтобы убедиться, что сгенерированные кардиомиоциты достигли зрелого состояния до начала этапа характеристики векторов.
По сравнению с AAV1, AAV8 и AAV9 химера AAV6/AAV5 обеспечивала значительно более высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгена в культурах человеческих кардиомиоцитов через шесть дней после инфицирования, что было определено с помощью иммунофлуоресценции (фиг.7А), проточной цитометрии (фиг.7В). ) и Вестерн-блот анализ (фигуры 7C-D). Кроме того, по отношению к AAV8 химера AAV6/AAV5 обеспечивала более быстрое начало экспрессии генов в культурах кардиомиоцитов человека, что определялось по иммунофлуоресценции (Фиг.7E). По сравнению с AAV8 и AAV9 число инфекционных единиц на введенный вирусный геном было на несколько порядков выше для химеры AAV6/AAV5 (рис. 10А). Это исследование иллюстрирует превосходяшую способность SEQ ID NO: 62-содержащих капсидных вариантов AAV доставлять гены в клетки сердечной мышцы.
Пример 4
in vitro
Тропизм клеток рекомбинантных вирионов AAV, содержащих новые варианты AAV LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и химеру AAV6/AAV5 для скелетных миофибрилл, оценивали  с использованием скелетных миофибрилл, полученных из первичных миобластов человека.
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV8, капсид AAV9, новый вариант капсида LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида LANKTTNKDA+V708I или новый вариант капсидной химеры AAV6/AAV5 и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанный с промотором CAG (AAV8.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP, и AAV6/AAV5 chimera.CAG.GFP,, соответственно) были получены стандартными методами. Скелетные миофибрилы были получены из первичных человеческих скелетных миобластов, полученных от здорового 51-летнего мужчины (Cook Myosites). Миобласты дифференцировались в течение 30 дней с образованием зрелых многоядерных волокон скелетных мышц. Полученные скелетные миофибриллы были оценены на экспрессию тяжелой цепи миозина (MHC) и дистрофина, чтобы убедиться, что большинство полученных скелетных миофибрилл достигло зрелого состояния до начала этапа характеристики векторов.
По сравнению с AAV8 и AAV9, химеры LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и AAV6/AAV5 обеспечивали значительно более высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгена в культурах миофибрил скелетной мышцы человека через семь дней после инфицирования, что было определено с помощью иммунофлюоресценции (Фигура 8A) и проточной цитометрии (Фиг. 8В). Кроме того, по сравнению с AAV8 и AAV9, LANKIQRTDA+V708I и LANKTTNKDA+V708I обеспечивали более быстрое начало экспрессии генов в культурах миофибрилл скелетной мышцы человека, что было определено методами иммунофлуоресценции (Фиг. 8C). По сравнению с AAV8 и AAV9, число инфекционных единиц на каждый введенный вирусный геном было в несколько раз выше для LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и химеры AAV6/5 (Фиг. 10B). Это исследование иллюстрирует превосходящую способность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) -, NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) - и SEQ ID NO:62-содержащих вариантов доставлять гены к миофибриллам скелетных мышц.
Пример 5
in vitro
Тропизм клеток рекомбинантных вирионов AAV, включающих новые варианты AAV LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и AAV6/AAV5, в отношении клеток-предшественников скелетных мышц оценивали  с использованием клеток-предшественников скелетных мышц, полученных из индуцированных фибробластами плюральных клеток человека, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток фибробластов (FB-iPSC) или эмбриональных стволовых клеток человека (ESC).
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV9, новый вариант капсида LANKIQRTDA+V708I, новый вариант капсида LANKTTNKDA+V708I, либо новый вариант капсида AAV6/AAV5 химеры и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанный с промотором CAG (AAV8.CAG.EGFP, AAV9.CAG.EGFP, LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP, LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP и AAV6/AAV5 chimera.CAG.GFP, соответственно) были получены с использованием стандартных методов. Предшественники скелетных мышц были получены из линии эмбриональных стволовых клеток человека ESI-017 (ESI-BIO) в соответствии со стратегией дифференцировки, описанной в Shelton et al. Methods, 2016 с небольшими изменениями. После приблизительно 40 дней дифференцировки, сужение линии до предшественников скелетных мышц было подтверждено экспрессией PAX7 и MyoD в большинстве клеток перед использованием культур для характеристики вектора.
По сравнению с AAV9, химеры LANKIQRTDA+V708I, LANKTTNKDA+V708I и AAV6/AAV5 обеспечивали значительно более высокую эффективность трансдукции и экспрессию трансгена в культурах предшественников скелетных мышц человека через шесть дней после инфицирования, что было определено с помощью методов иммунофлюоресценции (Фигура 9А) и проточной цитометрии (Фиг. 9В). Это исследование иллюстрирует превосходящую способность NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) -, NKTTNKD (SEQ ID NO: 14) - и SEQ ID NO: 62, содержащих варианты капсида AAV, доставлять гены в предшественники скелетных мышц.
Пример 6
in vivo
Метод направленной эволюции использовали для обнаружения новых вариантов аденоассоциированного вируса (AAV), обладающих превосходящей эффективностью доставки генов в клетки сердечных и скелетных мышц после внутривенного (IV) введения, которое обладает значительными преимуществами по сравнению с другими способами доставки генов в сердечные и скелетные мышцы человека (Пример 1). Тропизм клеток после внутримышечного введения рекомбинантных вирионов AAV, включающих новый вариант AAV, содержащий замену V708I, и пептид LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), встроенный между аминокислотами 587 и 588 (LANKIQRTDA+V708I; SEQ ID NO: 43) оценивался  у мышей как типичный пример способности вирионов rAAV, содержащих NKIQRTD (SEQ ID NO: 13) варианты капсида AAV, трансдуцировать мышечные клетки.
12
post-mortem
in vivo
in vivo
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие новый вариант капсида LANKIQRTDA+V708I и геном, содержащий трансген люциферазы, функционально связанный с промотором CAG (LANKIQRTDA+V708I.CAG.luciferase), получали с использованием стандартных способов. Мышам B6 Albino (C57BL/6) проводили внутривенную инъекцию в хвостовую вену 2х10 vg, и трансдукцию оценивали при жизни с помощью визуализации люциферазы и  по активности тканевой люциферазы. Визуализация люциферазы при жизни на 14 день (слева) и 28 день (справа) после инъекции показала, что новый вариант AAV капсида LANKIQRTDA+V708I может трансдуцировать клетки мыши  (Фигура 11A). Активность люциферазы в сердечной мышце, диафрагме и четырехглавой мышце через 56 дней после введения демонстрирует, что новый вариант AAV капсида LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать сердечную и скелетную мышцу мыши  (Фигура 11B).
Это исследование иллюстрирует доставку генов вариантом, содержащим NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), в соответствии с одним из нескольких клинически приемлемых путей введения. Подобная эффективность достижима при использовании других вариантов, включающих данный мотив пептидной инсерции. Аналогично, подобная эффективность достижима при использовании других вариантов, раскрытых в настоящем описании, идентифицированных с использованием того же подхода направленной эволюции.
Пример 7
in vivo
Метод направленной эволюции использовали для обнаружения новых вариантов аденоассоциированного вируса (AAV) с превосходящей эффективностью доставки генов в клетки сердечных и скелетных мышц после внутривенного (IV) введения, которое обладает значительными преимуществами по сравнению с другими способами доставки генов в сердечные и скелетные мышцы человека (Пример 1). Тропизм клеток после внутримышечного введения рекомбинантных вирионов AAV, содержащих новый вариант AAV, содержащий замену V708I и пептид LANKIQRTDA (SEQ ID NO: 27), встроенный между аминокислотами 587 и 588 (LANKIQRTDA+V708I; SEQ ID NO: 43), оценивался  у примата, не являющегося человеком (NHP), в качестве типичного примера способности вариантов rAAV, содержащих NKIQRTD (SEQ ID NO: 13)- капсидные варианты AAV трансдуцировать мышечные клетки.
11
in vivo
in vivo
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие новый вариант капсида LANKIQRTDA+V708I и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (GFP), функционально связанный с промотором CAG (LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP), получали с использованием стандартных способов. Макаки Cynomolgus были инъецированы внутримышечно тремя дозами вектора в участки vastus lateralis 1×10 вирусных геномов (vg), и степень трансдукции клеток скелетных мышц была оценена посмертно методом иммунофлуоресценции. Репрезентативные изображения окрашивания гемотоксилином и эозином (H&E) и антителами против GFP поперечных срезов проксимального участка биопсии с увеличением 2x, 4x и 20x демонстрируют, что новый вариант AAV капсида LANKIQRTDA+V708I может трансдуцировать клетки скелетных мышц примата  (Фигура 12А). Репрезентативные изображения окрашивания гемотоксилином и эозином (H&E) и антителами против GFP продольных срезов дистального участка биопсии с увеличением 2x, 4x и 20x демонстрируют, что новый вариант AAV капсида LANKIQRTDA+V708I способен трансдуцировать клетки скелетных мышц примата  ( Фигура 12B).
Это исследование иллюстрирует доставку генов вариантом, содержащим NKIQRTD (SEQ ID NO: 13), в соответствии с одним из нескольких клинически приемлемых путей введения. Подобная эффективность достижима при использовании других вариантов, включающих данный мотив пептидной инсерции. Аналогично, подобная эффективность достижима при использовании других вариантов, раскрытых в настоящем описании, идентифицированных с использованием того же подхода направленной эволюции.
Предшествующее главным образом просто иллюстрирует принципы изобретения. Понятно, что специалисты в данной области техники смогут разработать различные аранжировки, которые, хотя и не описаны и не показаны здесь явно, все же воплощают принципы изобретения и включаются в сущность и объем изобретения. Кроме того, все примеры и условные формулировки, приведенные в настоящем описании, в основном предназначены для того, чтобы помочь читателю понять принципы изобретения и концепции, внесенные изобретателями в развитие техники, и должны рассматриваться как неограничивающие конкретные примеры и условия.
Кроме того, все утверждения, в которых приводятся принципы, аспекты и варианты осуществления изобретения, а также его конкретные примеры, предназначены для охвата как его структурных, так и функциональных эквивалентов. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты включают как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые могут быть разработаны в будущем, то есть любые разработанные эквиваленты, выполняющие ту же функцию, независимо от структуры. Следовательно, объем настоящего изобретения не должен быть ограничен иллюстративными вариантами осуществления изобретения, показанными и описанными здесь. Наоборот, объем и сущность настоящего изобретения должны определятся прилагаемой Формулой изобретения.