Влияние L-аргинина и L-карнитина на окислительную модификацию лизосомальных белков печени крыс

УДК 577.152:615.27.015.44

А.М. Кудлаева, М.А. Фомина, С.А. Исаков

ВЛИЯНИЕ L-АРГИНИНА И L-КАРНИТИНА НА ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ МОДИФИКАЦИЮ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ ПЕЧЕНИ КРЫС

Целью данного исследования явилось изучение in vitro воздействия 5 мМ L-аргинина и 5 мМ L-карнитина на окислительную модификацию лизосомальных белков печени половозрелых интактных крыс-самок линии Wistar массой 280-330 г. В контрольных группах проводилась in vitro инкубация выделенных лизосом в среде выделения в течение 1, 2 и 4 час. Опытные группы инкубировали аналогичным образом в растворах 5 мМ L-аргинина и 5 мМ L-карнитина. Окислительную модификацию белков измеряли в седиментируемой лизосо-мальной фракции по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой. Обнаружено, что in vitro инкубация суспензии лизосом в среде 5 мМ L-карнитина приводит к накоплению окислительно-модифицированных производных белков при 4 часовом воздействии, не влияя на резервно-адаптационный потенциал и долю первичных и вторичных маркеров оксидативного стресса. При 1 часовой in vitro инкубации суспензии лизосом в растворе 5 мМ L-аргинина наблюдается значительное снижение всех типов динитрофенилгидразонов по сравнению с контролем, а также рост резервно-адаптационного потенциала. Увеличение времени инкубации в 5 мМ L-аргинине до 2 и 4 час. приводит к росту уровня карбонильных производных в изучаемых пробах по сравнению с контролем, а также по сравнению с 1 часовой инкубацией, сопровождающейся снижением резервно-адаптационного потенциала относительно 1 часа инкубации.

Ключевые слова: окислительная модификация белков, L-аргинин, L-карнитин, лизосомы, резервно-адаптационный потенциал.

В последние годы накоплен большой фактический материал о роли белков как основных мишеней активных форм кислорода и азота. Было установлено, что окислительная модификация белка (ОМБ) осуществляется либо путем прямого окисления аминокислотных остатков, либо через формирование активных карбонильных производных, образующихся в ходе перекисного окисления липи-дов и способных реагировать с остатками лизина, цистеина и гистидина. Также возможен вариант ОМБ через глиоксидацию и гликирование лизиновых и аспарагиновых остатков [1; 2]. Изучено множество обратимых и необратимых посттрансляционных модификаций белковой молекулы, которые способны значительно влиять на свойства и функции окисленного протеина [3]. Чаще всего необратимую модификацию протеинов под действием окислительного стресса связывают с возникновением ряда заболеваний, таких как сахарный диабет 2 типа, атеросклероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инсульт, различные виды рака. Подробное изучение механизмов окислитель-ной/нитрозативной модификации протеинов способствует установлению взаимосвязи между патологическими проявлениями болезни и структурно-функциональными изменениями белковых молекул [4]. Особый интерес исследователей вызывает обратимая модификация белков, которую связывают с клеточной редокс-регуляцией, протекающей в нормальных физиологических условиях [3]. Было обнаружено, что обратимые посттрансляционные ОМБ (в частности, остатков цистеина) лежат в основе устойчивости клеток к ишемии. Возможно, поиск мишеней для действия обратимой ОМБ поможет получить представление о новых методах профилактики данной патологии [5].

В связи с широким участием ОМБ в ряде патологических и физиологических процессов актуальным является поиск соединений, обладающих прооксидантной и антиоксидантной активностью в отношении белковых молекул, а также подробное изучение механизмов их действия.

Целью нашего исследования явилось изучение in vitro влияния L-аргинина и L-карнитина на окислительную модификацию белков лизосом печени крысы.

Материалы и методы исследований

Выделение лизосом. За 12 час. до забоя половозрелых интактных крыс-самок линии Wistar массой 280-330 г лишали пищи для стандартизации условий опытов. Эвтаназия животных осуществлялась под медикаментозным наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении. Печень извлекали сразу после обескровливания и помещали в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы (среда выделения). Орган промывали от остатков крови средой выделения, после чего готовили точные навески

участков печени в пределах 740-760 мг на электронных весах (AJH-220 CE, Япония). Полученный материал измельчали ножницами и помещали в стеклянный стакан гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия), добавляя холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1:9 и гомогенизировали в течение 35 сек. тефлоновым пестиком 900 об/мин и зазоре в пределах 0.16-0.24 мм. Данные процедуры проводили при температуре не выше 4 °С. Полученные гомогенаты центрифугировали 15 мин. при 800g (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой в отдельные гильзы и центрифугировали 15 мин. при 14000g для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 20000g в течение 30 мин (центрифуга рефрижераторная К 24 Д, ГДР). Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспендировали в 2 мл среды инкубации и использовали для in vitro исследования.

Инкубация. Полученные суспензии лизосом в 0,25 М сахарозе разделяли на 3 серии по 6 проб в каждой:

Серия 1 (серия сравнения): 2 мл 0,25 М сахарозы.

Серия 2: 1,9 мл 0,25 М сахарозы с добавлением раствора 0,1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ.

Серия 3: 1,9 мл 0,25 М сахарозы с добавлением раствора 0,1 мл аргинина с конечной концентрацией 5 мМ.

Каждая серия воспроизводилась трижды; инкубация проводилась на водяной бане в течение 1, 2 и 4 часов при t=37 °С. После инкубации лизосомы повторно осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 20000g. Затем осадок (седиментируемая фракция, СФ) ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1 % и использовали для исследования.

Окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [6]. По полученным данным строили спектр поглощения продуктов ОМБ и считали площадь под кривой [7], выраженной в условных единицах на грамм белка (у.е./г белка).

Содержание белка определяли по методу Лоури коммерческим набором Научно-практического центра «Эко-сервис» (Санкт- Петербург).

Резервно-адаптационный потенциал рассчитывали как разность между общей площадью под кривой карбонильных производных протеинов при металл-катализируемом окислении (принималась за 100 %) и при спонтанном окислении, выраженном в процентном соотношении [7].

Результаты предоставлялись в виде медианы Me верхнего и нижнего квартилей [Q1; Q3]. Для проверки статистической значимости отличий значений в контрольной и опытной группах при парных сравнениях использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни, а при тройных сравнениях - непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Было обнаружено, что 5 мМ L-карнитин статистически значимо увеличивает уровень карбонильных производных в суспензии лизосом при 4-часовой in vitro инкубации по сравнению с группой контроля (рис. 1, табл. 1).

230 254 270 280 356 363 370 42В 430 434 520 535

Рис. 1. Спектр окислительной модификации белков групп контроля и 5 мМ L-карнитина при 4 часовой in vitro инкубации (у.е./г белка), Ме^1^3]

Таблица 1

Значения площадей под кривыми групп контроля и 5 мМ L-карнитина при 4 часовой in vitro

инкубации (у.е./г белка), Ме[01;03]

Группа/Показатель S АДНФГ н. S КДНФГ н. S АДНФГ о. S КДНФГ о. S общ.

5 мМ L-карнитин 5,23* [3,69;6,27] 1,90* [0,88;2,29] 1,70* [0,79;2,74] 0,26* [0,13;0,39] 9,93* [5,71;10,83]

сахароза 1,07 [0,62; 1,18] 0,31 [0,30;0,51] 0,24 [0,22;0,56] 0,08 [0,05;0,10] 1,77 [1,62;1,82]

Значение P p=0,0081 p=0,0081 p=0,0225 p=0,0225 p=0,0081

Примечание. Здесь и далее на рисунках * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).

Данная тенденция прослеживается в видимой и ультрафиолетовой частях спектра как для аль-дегид-динитрофенилгидразонов, так и для кетон-динитрофенилгидразонов. Можно предположить, что 5 мМ L-карнитин при данной продолжительности инкубации приводит к накоплению карбонильных производных белков как за счет окисления нейтральных, так и основных аминокислот, то есть показывает общий прооксидантный эффект в отношении белков лизосом. Считается, что окислительная модификация белка играет основополагающую роль в повреждении клеточной мембраны [8]. Не исключено, что данное предположение применимо и в отношении лизосомальных мембран. Так, ранее нами уже были получены данные о дестабилизации лизосомальной мембраны при 4-часовой in vitro инкубации в среде 5 мМ L-карнитина [9]. Возможно, данный эффект осуществляется за счет окислительной модификации протеинов мембраны лизосом.

Принято считать сумму альдегид-динитрофенилгидразонов ранними показателями окислительной деструкции белка, а сумму кетон-динитрофенилгидразонов - поздними маркерами, отражающими степень повреждения молекулы протеина [8]. В отношении карнитина доля первичных маркеров окисления (АДНФГ) значительно преобладает над вторичными (КДНФГ). Данное соотношение статистически значимо не меняется по сравнению с контролем на всех изучаемых временных интервалах, что может указывать на относительно постоянный уровень окислительных процессов без его усугубления (табл. 2).

Параллельно со спонтанной окислительной модификацией белков проводилось определение металл-катализируемой модификацией для оценки резервно-адаптационного потенциала [7]. Статистически значимых изменений по данному показателю для 5 мМ L-карнитина выявлено не было.

В отношении 5 мМ L-аргинина наблюдалось статистически значимое снижение уровня ОМБ при 1 часовой in vitro инкубации по сравнению с контрольной группой. Данный эффект сохранялся для всех исследуемых спектров ОМБ (рис. 2, табл. 3).

Таблица 2

Доля первичных и вторичных маркеров относительно общего содержания карбонильных

производных белков

Группа Продолжительность инкубации 5АДНФГМУ.:Н-ЗДДНФ^. ЖДНФГ uv.+ ЖДНФГ vs.

сахароза(контроль) 1 час 0,87 0,13

2 часа 0,82 0,18

4 часа 0,79 0,21

5 мМ L-карнитин 1 час 0,80 0,20

2 часа 0,83 0,17

4 часа 0,78 0,22

5 мМ L-аргинин 1 час 0,85 0,15

2 часа 0,83 0,17

4 часа 0,91 0,09

0,02

0,01

IIчас сахароза 1час аргинин

230 254 270 230 356 3S3 370 428 430 434 520 535

Рис. 2. Спектр окислительной модификации белков групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 1 часовой

in vitro инкубации (у.е./г белка), Ме[01;03]

Таблица 3

Значения площадей под кривыми групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 1 часовой in vitro

инкубации (у.е./г белка), Ме[01;03]

Группа/Показатель S АДНФГ н. S КДНФГ н. S АДНФГ о. S КДНФГ о. S общ.

5 мМ L-аргинин 0,19* [0,01;0,22] 0,06* [0,00;0,12] 0,09* [0,00;0,53] 0,01* [0,00;0,11] 0,55* [0,01;0,57]

сахароза 4,65 [4,29;4,79] 0,75 [0,45;1,05] 0,61 [0,43;0,81] 0,12 [0,09;0,13] 6,32 [5,62;6,45]

Значение P 0,012186 0,011926 0,036146 0,036146 0,012186

Кроме того, было выявлено статистически значимое увеличение РАП по сравнению с контролем при 1 часовой инкубации (рис. 3).

100,000 90,000 30,000 70,000 60,000 50,000 40,000 30,000 20,000 10,000 0,000

1ч ас

2 часа

4 часа

сжарсза сжарма сжарсза S общач

1ч ас

¿часа

4 часа

карнитинкарнити ni арнитин 5 общая

1ч ас аргинин

2 часа аргинин

4 часа аргинин

S общая

Спонтанная ОМЕ ИРАП

Рис. 3. Оценка резервно-адаптационного потенциала суспензии лизосом контроль/ L-карнитин / L-аргинин на исследуемых интервалах времени, %

При увеличении времени инкубации до 2 час. наблюдается тенденция к росту уровня карбонильных производных. Статистически значимо по сравнению с сахарозой увеличивается содержание кетон-динитрофенилгидразонов основного характера (рис. 4, табл. 4). Возможно, мишенью окислительной модификации в данном случае являются преимущественно остатки основных аминокислот.

Также было установлено, что 4 часовое воздействие 5 мМ L-аргинина приводит к росту общей площади под кривой спектра окислительной модификации белков в основном за счет резкого увеличения уровня АДНФГ нейтрального характера (рис. 5, табл. 5).

|2часа аргинин 2 часа сахароза

230 254 270 2В0 356 363 370 42В 430 434 520 535

Рис. 4. Спектр окислительной модификации белков групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 2 часовой

in vitro инкубации (у.е./г белка), Ме^1^3]

Таблица 4

Значения площадей под кривыми групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 2 часовой in vitro

инкубации (у.е./г белка), Ме[01;03]

Группа/Показатель S АДНФГ н. S КДНФГ н. S АДНФГ о. S КДНФГ о. S общ.

5 мМ L-аргинин 1,53 [2,60;4,04] 0,74 [0,38;0,991 1,07 [0,68;1,39] 0,20* [0,15;0,261 5,32 [4,82;5,901

сахароза 1,78 П,45;2,561 0,40 [0,29;0,77] 0,44 [0,39;0,81] 0,10 [0,07;0,14] 2,90 [2,52;3,29]

Значение P 0,092697 0,471171 0,128206 0,045328 0,128206

Рис. 5. Спектр окислительной модификации белков групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 4 часовой

in vitro инкубации (у.е./г белка), Ме^1^3]

Таблица 5

Значения площадей под кривыми групп контроля и 5 мМ L-аргинина при 4 часовой in vitro

инкубации (у.е./г белка), Ме[01;03]

Группа/Показатель S АДНФГ н. S КДНФГ н. S АДНФГ о. S КДНФГ о. S общ.

5 мМ L-аргинин 3,83 [1,55;8,081 0,40 [0,32;0,781 0,53 [0,52;0,611 0,09 [0,09;0,141 5,89* [2,92;8,881

сахароза 1,07 [0,62;1,181 0,31 [0,30;0,511 0,24 [0,22;0,561 0,08 [0,05;0,101 1,77 [1,62;1,821

Значение P 0,060104 0,403396 0,296271 0,296271 0,021572

При проведении тройных сравнений групп 5 мМ L-аргинина в зависимости от продолжительности инкубации было обнаружено, что уровень карбонильных производных при 1-часовом воздействии значительно меньше, чем при 2- и 4-часовом, которые статистически не отличаются друг от друга (табл. 6).

Таблица 6

Значения площадей под кривыми групп контроля и 5 мМ L-аргинина во временной динамике

(у.е./г белка), Ме[01;03]

Группа/Показатель S АДНФГ н. S КДНФГ н. S АДНФГ о. S КДНФГ о. S общ.

1 час L-аргинин 0,19*° [0,01;0,22] 0,06*° [0,00;0,12] 0,09* [0,00;0,53] 0,01* [0,00;0,11] 0,55*° [0,01;0,57]

2 часа L-аргинин 1,53 [2,60;4,04] 0,74 [0,38;0,99] 1,07 [0,68;1,39] 0,20 [0,15;0,26] 5,32 [4,82;5,90]

4 часа L-аргинин 3,83 [1,55;8,08] 0,40 [0,32;0,78] 0,53 [0,52;0,61] 0,09 [0,09;0,14] 5,89 [2,92;8,88]

Примечание.* - статистически значимые отличия 1 часа инкубации от 2 часов инкубации (р<0,05) - статистически значимые отличия 1 часа инкубации от 4 часов инкубации (р<0,05).

Аналогичные изменения наблюдались и при оценке резервно-адаптационного потенциала (рис. 3). Что касается доли первичных и вторичных маркеров, то статистически значимых отличий в случае с 5 мМ L-аргинином не было обнаружено (табл. 2).

Выводы

1. In vitro инкубация суспензии лизосом в среде 5 мМ L-карнитина приводит к накоплению окислительно-модифицированных производных белков: как альдегид-динитрофенилгидразонов, так и кетон-динитрофенилгидразонов при 4 часовом воздействии, при этом не влияет на резервно-адаптационный потенциал и долю первичных и вторичных маркеров оксидативного стресса.

2. При 1 часовой in vitro инкубации суспензии лизосом в растворе 5 мМ L-аргинина наблюдается значительное снижение всех типов динитрофенилгидразонов по сравнению с контролем, а также рост резервно-адаптационного потенциала.

3. Увеличение времени инкубации в 5 мМ L-аргинине до 2 и 4 часов приводит к росту окислительной модификации белков в изучаемых пробах по сравнению с контролем, а также по сравнению с 1 часовой инкубацией, сопровождающемуся снижением резервно-адаптационного потенциала относительно 1 часа инкубации.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Butterfield D.A., Dalle-Donne I. Redox Proteomics // Antioxidants & Redox Signaling. 2012. Vol. 17. № 11. Р. 1487-1489. DOI: 10.1089/ars.2012.4742.

2. Муравлева Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Бакенова Р.А., Култанов Б.Ж., Танкибаева Н.А., Койков В.В., Омарова Г.А. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования // Фундаментальные исследования. 2010. №1. С. 74-78.

3. Wall S.B., Oh J.Y, Diers AR, Landar A. Oxidative Modification of Proteins: An Emerging Mechanism of Cell Signaling // Front Physiol. 2012. №3. Р. 369. DOI: 10.3389/fphys.2012.00369.

4. Dalle-Donne I., Scaloni A., Giustarini D., Cavarra E., Tell G., Lungarella G., Colombo R., Rossi R., Milzani A. Proteins as Biomarkers of Oxidative/Nitrosative Stress in Diseases: The Contribution of Redox Proteomics // Mass Spectrometry Reviews. 2005. Vol. 24 (1). Р. 55-99.

5. Zhiyou C., Liang-Jun Y. Protein Oxidative Modifications: Beneficial Roles in Disease and Health // Journal of Biochemical and Pharmacological Research. 2013. Vol. 1(1). P. 15-26.

6. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод её определения // Вопр. медицинской химии. 1995. Т. 41. № 1. С. 2-26.

7. Фомина М.А., Абаленихина Ю.В., Фомина Н.В., Терентьев А.А. «Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях» заявка на патент № 2013 102618 (003624) от 21.01.13.

8. Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Левицкий Е.Л., Коваленко С.И., Павлов С.В., Ганчева О.В., Марченко А.Н. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях (обзор литературы) // Современные проблемы токсикологии. 2005. Т. 8, № 3. С. 20-27.

9. Фомина М.А., Кудлаева А.М., Рябков А.Н. Влияние L-карнитина in vitro на активность лизосомальных цис-теиновых протеиназ и состояние лизосомальной мембраны // Российский медико-биологический вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2017. Т. 25, № 1. С. 14-20. DOI:10.23888/PAVLOVJ2017114-20.

Поступила в редакцию 07.07.17

A.M. Kudlaeva, M.A. Fomina, S.A. Isakov

THE EFFECT OF L-ARGININE AND L-CARNITINE ON OXIDATIVE MODIFICATION OF LYSOSOMAL PROTEINS OF RAT LIVER

The aim of this study was to investigate in vitro effects of 5 mM L-arginine and 5 mM L-carnitine on oxidative modification of lysosomal proteins in liver of intact mature female rats of Wistar line weighing 280-330 g. In the control groups in vitro incubation of selected lysosomes was carried out in a medium of isolating solution during 1, 2 and 4 hours. Experimental groups were incubated similarly in solutions of 5 mM L-arginine and 5 mM L-carnitine. Oxidative modification of proteins was measured in sedimentaries lysosomal fractions according to the method of R.L. Levine in modification of E.E. Dubinina. It was discovered that in vitro incubation of a suspension of lysosomes in the medium of 5 mM L-carnitine leads to the accumulation of oxidative-modified derivatives of proteins at 4 hours exposure without affecting reserve-adaptive capacity, and the proportion of the primary and secondary markers of oxidative stress. 1 hour in vitro incubation of a suspension of lysosomes in a solution of 5 mM L-arginine showed a significant decrease in all types of dinitrophenylhedrazones compared with control and the growth of reserve-adaptive capacity. The increase in time of incubation in 5 mM L-arginine to 2 and 4 hours leads to an increase in the level of carbonyl derivatives in the studied samples compared to control and compared to 1 hour incubation, accompanied by a reduction in reserve-adaptive capacity relative to 1 hour incubation.

Keywords: oxidative modification of proteins, L-arginine , L-carnitine, lysosomes, reserve-adaptive potential.

REFERENCE

1. Butterfield D.A. and Dalle-Donne I. Redox Proteomics, in Antioxidants & Redox Signaling, 2012, vol. 17, no 11, pp. 1487-1489. DOI: 10.1089/ars.2012.4742.

2. Muravleva L.Ye., Molotov-Luchansky V.B., Kluyev D.A., Bekenova R.A., Kultanov B.Zh., Tankibaeva N.A. Koikov V.V. and Omarova A. [Oxidative modification of proteins: problems and research prospects], in Fundamental'nye issledovaniya, 2010, no. 1, pp. 74-78 (in Russ.).

3. Wall S.B., Oh J.Y, Diers AR. and Landar A. Oxidative Modification of Proteins: An Emerging Mechanism of Cell Signaling, in Front Physiol., 2012, no 3, pp. 369. DOI: 10.3389/fphys.2012.00369.

4. Dalle-Donne I., Scaloni A., Giustarini D., Cavarra E., Tell G., Lungarella G., Colombo R., Rossi R. and Milzani A. Proteins as Biomarkers of Oxidative/Nitrosative Stress in Diseases: The Contribution of Redox Proteomics, in Mass Spectrometry Reviews, 2005, vol. 24, no 1, pp. 55-99.

5. Zhiyou C. and Liang-Jun Y. Protein Oxidative Modifications: Beneficial Roles in Disease and Health, in Journal of Biochemical and Pharmacological Research, 2013, vol. 1, no 1, pp. 15-26.

6. Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Khodov D. A. and Porotov I. G. [Oxidative modification of proteins of human serum, the method of its determination], in Voprosy medicinskoj himii, 1995, vol. 41, no. 1, pp. 2-26 (in Russ.).

7. Fomina M.A., Abalenihina Y.V., Fomina N.V. and Terent'ev A.A. Sposob kompleksnoj ocenki soderzhaniya produktov OMB v tkanyah i biologicheskih zhidkostyah [Method of complex assessment of the content of POM products in tissues and biological fluids], Pat. 2524667 RF. MPK G01N 33/52 (in Russ.).

8. Gubsky Yu.I., Belenichev I.F., Levitsky E.L., Kovalenko S.I., Pavlov S.V., Ganchev O.V. and Marchenko A.N. [Toxicological consequences of oxidative protein modifications in different pathological conditions (literature review)], in Sovremennyeproblemy toksikologii, 2005, vol. 8, no. 3, pp. 20-27 (in Russ.).

9. Fomina M.A., Kudlaeva A.M. and Ryabkov A.N. [In vitro effect of L-carnitine on the activity of lysosomal cysteine proteases and the state of lysosomal membrane], in Rossijskij mediko-biologicheskij vestnik imeni akademika I.P. Pavlova [I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald], 2017, vol. 25, no. 1, pp. 14-20, DOI: 10.23888/ PAVLOVJ2017114-20 (in Russ.).

Кудлаева Анна Михайловна, аассистент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО Е-таП: anyakudlaeva@mail.ru

Фомина Мария Алексеевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО Е-mail: marya.fom@yandex.ru

Исаков Сергей Алексеевич,

доктор медицинских наук, профессор кафедры

дерматовенерологии

Е-mail: isakov11@icloud.com

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» 390026, Россия, г. Рязань, ул. Высоковольтная, 9

Kudlaeva A.M., Assistant at Department of Biological chemistry w/course of CLD FAPE Е-mail: anyakudlaeva@mail.ru

Fomina M.A.,

Candidate of Medicine, Associate Professor at Department of Biological chemistry w/course of CLD FAPE Е-mail: marya.fom@yandex.ru

Isakov S.A. ,

Doctor of Medicine, Professor at Department of dermatovenerology Е-mail: isakov11@icloud.com

Ryazan State Medical University Vysokovoltnaya st., 9, Ryazan, Russia, 390026