ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ L-ФОРМ БРУЦЕЛЛ
NUTRIENT MEDIUM FOR BRUCELLA L-FORMS RECOVERY AND CULTIVATION

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выделения и культивирования L-форм бруцелл.
Бруцеллы, как и другие микроорганизмы, способны переходить в L-формы, выделение и культивирование которых требует использования специальных питательных сред.
Совершенствование лабораторной диагностики бруцеллеза связано с применением различных питательных сред для выделения и культивирования измененных форм бруцелл.
Известна питательная среда для выделения и культивирования L-культур бруцелл, предложенная лабораторией бруцеллеза НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Данная среда содержит печеночный настой или мясную воду, в которые добавляют печеночный бульон или мясной бульон соответственно основе, пептон, хлорид натрия, агар-агар, глицерин, глюкозу, нормальную лошадиную сыворотку, пенициллин, водопроводную воду («Профилактика инфекционных болезней. Инфекции, общие для человека и животных, профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» Методические указания МУ 3.1.7.1189-03, Минздрав России, М., 2003 г., С.56.).
Однако данная среда недостаточно подавляет рост S-форм бруцелл, что затрудняет выделение L-форм при исследовании материала, содержащего обе формы возбудителя; приготовление питательной среды достаточно трудоемко - необходимо фильтрование и автоклавирование.
Наиболее близкой к предлагаемой является питательная среда, содержащая печеночный настой, сахарозу, глицерин, натрия хлорид, магния сульфат, нормальную лошадиную сыворотку, агар - агар и бициллин-3 (RU 2263142 С2, опубл. 27.10.2005 г.).
Однако данная среда неудобна в работе, так как непрозрачна. А это затрудняет визуализацию результатов в проходящем свете и делает неудобным отбор колоний бруцелл. Кроме того, приготовление питательной среды достаточно трудоемко - требуется фильтрование и автоклавирование.
Целью изобретения является повышение удобства работы и упрощение приготовления питательной среды.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл содержит гидролизат речной рыбы панкреатический с содержанием аминного азота 500-560 мг%, глюкозу, цистеин, тиамина хлорид, крахмал, магния сульфат, налидиксовую кислоту, линкомицин, агар-агар, гидроокись натрия, нормальную лошадиную сыворотку, воду дистиллированную при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический с
содержанием аминного азота 500-560 мг%
12,0-12,5
глюкоза
10,0-10,5
цистеин
1,0-1,3
тиамина хлорид
0,03-0,05
крахмал
3,0-3,5
магния сульфат
0,2-0,25
налидиксовая кислота
0,04-0,05
линкомицин
0,05-0,06
агар-агар
9-9,5
гидроокись натрия
0,18-0,2
нормальная лошадиная сыворотка
50,0-200,0 мл
вода дистиллированная
до 1 л
Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что она дополнительно содержит цистеин, тиамина хлорид, налидиксовую кислоту, гидроокись натрия и дистиллированную воду, а качестве питательной основы она содержит гидролизат речной рыбы панкреатический с содержанием аминного азота 500-560 мг%, в качестве углеводов - глюкозу и крахмал, в качестве антибиотика - линкомицин в предлагаемых количествах.
Таким образом, данная питательная среда соответствует критерию изобретения "новизна".
Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемое техническое решение отличается не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных отраслях. Так, авторами не найдена питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл, которая содержала бы предлагаемые компоненты в предлагаемом количественном соотношении.
А именно данный состав среды позволяет подавить рост S-форм бруцелл, выделять L-формы микроба из инфицированного материала и культивировать их. Среда обеспечивает при посеве 10 микробных клеток тест-штамма B.abortus И-206 в L-форме через 5 суток инкубации при температуре 37°С рост 5-7 колоний. При посеве 100 микробных клеток тест-штамма B.abortus И-206 в S-форме через 5-7 суток инкубации при температуре 37°С рост отсутствует. Кроме того, среда проста в приготовлении - не требуется фильтрование и автоклавирование, также возможно приготовление среды в сухом виде, и поэтому она может применяться в полевых условиях. Предлагаемая среда прозрачна, что повышает удобство работы, т.к. улучшается визуализация результатов и упрощается отбор колоний бруцелл.
Данная среда может быть использована в микробиологии для выделения и культивирования L-форм бруцелл в порядке осуществления санитарно-эпидемиологического надзора согласно МУ 3.1.7.1189-03.
Таким образом, предлагаемая питательная среда соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".
Питательную среду готовят смешиванием компонентов в следующем количественном соотношении, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический с
содержанием аминного азота 500-560 мг%
12,0-12,5
глюкоза
10,0-10,5
цистеин
1,0-1,3
тиамина хлорид
0,03-0,05
крахмал
3,0-3,5
магния сульфат
0,2-0,25
налидиксовая кислота
0,04-0,05
линкомицин
0,05-0,06
агар-агар
9,0-9,5
гидроокись натрия
0,18-0,2
нормальная лошадиная сыворотка
50,0-200,0 мл
вода дистиллированная
до 1 л
Среду готовят следующим образом: навеску, содержащую в указанных выше количествах гидролизат речной рыбы (сороги) панкреатический, глюкозу, цистеин, тиамина хлорид, крахмал, магния сульфат, налидиксовую кислоту, линкомицин, агар-агар, гидроокись натрия растворяют в 800-950 мл дистиллированной воды, доводят до кипения при помешивании, кипятят в течение 2-3 мин, охлаждают до температуры (40±5)°С, добавляют 50-200 мл нормальной лошадиной сыворотки, доводят дистиллированной водой до 1 л, тщательно взбалтывают и разливают в стерильные чашки Петри. Для удаления конденсата чашки Петри со средой приоткрывают и выдерживают в течение (40±5) мин при температуре (21±2)°С.
При этом гидролизат речной рыбы панкреатический получают следующим образом: в качестве субстрата используют речную рыбу (сорогу), в качестве источника протеолитических ферментов - поджелудочную железу крупного рогатого скота при соотношении фермент - субстрат 1:10. Гидролиз рыбы проводят реакторным способом при периодическом или постоянном перемешивании при температуре 45°С, рН - 8,0, в течение 7-10 суток. Для консервации добавляют один процент хлороформа (по объему). Содержание аминного азота в полученном гидролизате - 500-560 мг%.
Ростовые свойства предлагаемой питательной среды (чувствительность среды, селективность среды в отношении L-форм бруцелл, ингибирующие свойства среды в отношении S-форм бруцелл) оценивали путем посева 10 и 100 микробных клеток агаровой культуры штамма В. abortus И-206 в L-форме и S-форме.
Выросшие колонии подсчитывали через 5-7 суток инкубации при температуре (37±1)°С.
Пример 1. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический с
содержанием аминного азота 500 мг%
12,0
глюкоза
10,0
цистеин
1,0
хлорид тиамина
0,05
крахмал
3,0
сульфат магния
0,2
налидиксовая кислота
0,04
линкомицин
0,05
агар-агар
9,0
гидроокись натрия
0,18
нормальная лошадиная сыворотка
50,0 мл
вода дистиллированная
до 1 л
Через 5 суток инкубации на предлагаемой среде при посеве 10 микробных клеток агаровой культуры штамма В. abortus И-206 в L-форме сформировалось 7 колоний, при посеве 100 микробных клеток - 50 колоний. При фазово-контрастной микроскопии препаратов из выросшей на среде культуры бруцелл наблюдалась характерная для L-форм картина полиморфизма. В реакции агглютинации - положительная реакция со специфической бруцеллезной сывороткой против бруцелл в L-форме и отсутствие реакции с сывороткой против бруцелл в S-форме.
Через 5 суток инкубации на предлагаемой среде при посеве 10 и 100 микробных клеток агаровой культуры штамма В. abortus И-206 в S -форме на предлагаемой среде не сформировалось ни одной колонии.
На предлагаемую среду от экспериментально инфицированных животных S -, L- и смесь SL-вариантами бруцелл высевали кровь, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, костный мозг. Выделенные культуры по комплексу культурально-морфологических, серологических тестов и ПЦР идентифицированы как бруцеллы в L-форме, роста бруцелл в S-форме не обнаружено.
Пример 2. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:
гидролизат речной рыбы панкреатический с
содержанием аминного азота 560 мг%
12,5
глюкоза
10,5
цистеин
1,3
тиамина хлорид
0,03
крахмал
3,5
сульфат магния
0,25
налидиксовая кислота
0,05
линкомицин
0,06
агар-агар
9,5
гидроокись натрия
0,2
нормальная лошадиная сыворотка
200,0 мл
вода дистиллированная
до 1 л
Через 5 суток инкубации на предлагаемой среде при посеве 10 микробных клеток агаровой культуры штамма В. abortus И-206 в L-форме сформировалось 6 колоний, при посеве 100 микробных клеток - 53 колонии. При фазово-контрастной микроскопии препаратов из выросшей на среде культуры бруцелл наблюдалась характерная для L-форм картина полиморфизма. В реакции агглютинации - положительная реакция со специфической бруцеллезной сывороткой против бруцелл в L-форме и отсутствие реакции с сывороткой против бруцелл в S-форме.
При посеве 10 и 100 микробных клеток агаровой культуры штамма В. abortus И-206 в S-форме на предлагаемой среде через 7 суток инкубации не сформировалось ни одной колонии.
На предлагаемую среду от экспериментально инфицированных животных S -, L- и смесь SL-вариантами бруцелл высевали кровь, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, костный мозг. Выделенные культуры по комплексу культурально-морфологических, серологических тестов и ПЦР идентифицированы как бруцеллы в L-форме, роста бруцелл в S-форме не обнаружено.
Проведено испытание ростовых свойств предлагаемой среды в лабораторных условиях в сравнении со средой-аналогом, т.к. среда-аналог имеет достаточно широкое распространение и рекомендована Минздравом России как питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл (среда - аналог описана в методических указаниях МУ 3.1.7.1189-03). Было взято по 30 чашек Петри с каждой средой (среда - аналог и предлагаемая среда) по каждой дозе (всего 120 чашек).
Ростовые свойства питательных сред приведены в таблице.
Ростовые свойства питательных сред для L- и S-форм В. abortus И-206
Штаммы
Питательная среда
аналог
предлагаемая
Посевная доза (микробные клетки)
10
100
10
100
Количество выросших КОЕ
В. abortus И-206 (S-форма)
Роста нет
7±2
Роста нет
Роста нет
В. abortus И-206 (L-форма)
2±1
27±3
6±1
52±2
Как видно из данных таблицы, предлагаемая питательная среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл имеет существенное преимущество по сравнению со средой-аналогом, так как позволяет обнаружить L-формы бруцелл через 5 суток инкубации до 7 КОЕ при посеве 10 микробных клеток, и до 54 КОЕ при посеве 100 микробных клеток. При этом предлагаемая среда полностью подавляет рост культур в S-форме.
Предлагаемая среда была испытана в экспериментальных и клинических условиях для выделения бруцелл в L-форме из инфицированного материала.
На предлагаемую среду от экспериментально инфицированных животных S -, L- и смесь SL-вариантами бруцелл высевали кровь, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, костный мозг. Выделенные культуры по комплексу культурально-морфологических, серологических тестов и ПЦР идентифицированы как бруцеллы в L-форме, роста бруцелл в S-форме не обнаружено.
От больных хроническим бруцеллезом людей изолированы две гемокультуры бруцелл. Изолированные культуры по комплексу культурально-морфологических, серологических тестов и ПЦР идентифицированы как бруцеллы в L-форме.
Таким образом, предлагаемая среда имеет высокую чувствительность и селективность в отношении L-форм бруцелл, обладает высокими ингибирующими свойствами в отношении S-форм бруцелл, позволяет выделять L-формы бруцелл из инфицированного материала.
Кроме того, среда более удобна в работе: предлагаемая питательная среда прозрачна, что улучшает визуализацию результатов и упрощает отбор колоний бруцелл, менее трудоемка в приготовлении, так как не требуется фильтрование и автоклавирование, может использоваться в полевых условиях.