(4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения
(4-(3-HYDROXYPHENYL)PIPERAZINE-1-YL)(5-NITROFURAN-2-YL)METHANON, WHICH HAS ANTITUBERCULAR ACTIVITY AGAINST THE CAUSATIVE AGENT OF MULTIDRUG-RESISTANT TUBERCULOSIS, AND THE METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному пиперазиновому производному 5-нитрофуран карбоксиловой кислоты: (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1, обладающему противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способу его получения.
Туберкулез, вызванный Mycobacterium tuberculosis, является древней болезнью человечества на протяжении всей его истории и предыстории (Daniel, 2006). В настоящее время туберкулез (ТБ) является своего рода эпидемией, и ВОЗ оценивает количество новых случаев ТБ в 9,2 миллиона и количество умерших от ТБ в 1,5 миллиона. Несмотря на наличие достаточно эффективных схем лечения, профилактики и контроля туберкулеза, имеет место активная передача и широкая распространенность резистентных штаммов М. tuberculosis, которые устойчивы к применяемым противотуберкулезным препаратам. Эта ситуация по-прежнему представляет серьезную проблему здравоохранения как развитых, так и развивающихся стран.
Современная эпидемиологическая ситуация по заболеваемости туберкулезом в России и во всем мире характеризуется распространением штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ). Основными движущими силами глобальной эпидемии туберкулеза являются миграция, социально-экономические условия, увеличение бремени ВИЧ и лекарственной устойчивости, особенно МЛУ/ШЛУ ТБ.
Появление и распространение МЛУ-ТБ и ШЛУ-ТБ ставит под угрозу глобальные усилия по прекращению распространения туберкулеза и накладывает экономическое бремя на системы здравоохранения во всем мире. Стоимость лечения МЛУ-ТБ может быть в 200 раз выше, чем у лекарственно-чувствительного туберкулеза. В 27 странах с высоким бременем МЛУ-ТБ затраты на лечение превышают валовой национальный доход на душу населения. Ежегодная стоимость лечения МЛУ-ТБ по всей России оценивается в 350 миллионов евро (http://www.aeras.org/pages/beyond-a-health-crisis).
Проблема резистентности (более того, широкой лекарственной устойчивости) имеет жизненно важное значение для России и всего мира. Пациенты, инфицированные лекарственно-устойчивыми штаммами М. tuberculosis, трудно или невозможно вылечить, а их лечение более токсично и дорого.
В недавних работах были обобщены результаты исследований наиболее активных синтезированных соединений и состояние их доклинических и клинических испытаний с точки зрения различий их химической структуры - амины, аминоспирты, гидразиды, мочевины, тиомочевины, гетероциклы и т.д. [Beena et al., 2013; Kuldipsinh et al., 2013; Chetty et al., 2017]. Природные продукты или их полусинтетические производные также представляют интересный вариант поиска новых противотуберкулезных препаратов [Shu, 1998; Balunas et al., 2005]. Примеры таких соединений включают антибиотики стрептомицин и канамицин (выделенные из Streptomyces griseus), капреомицин (из S. capreolus) [Shu et al., 1998]. Рифампицин является полусинтетическим препаратом, который был получен из рифамицина, продукта Amycolatopsis mediterranei [Tribuddharat et al., 1999]).
Насущная необходимость новых антимикобактериальных препаратов и методов их разработки и дизайна становится все более очевидной. При разработке новых антибиотиков против М. tuberculosis важно отметить, что эта бактерия имеет сложную и химически устойчивую клеточную стенку. Поэтому противотуберкулезные соединения специфичны и не действуют на другие патогенные бактерии, и наоборот - огромное количество доступных антибиотиков не действует (за некоторыми исключениями) на микобактерии. Все это требует разработки новых эффективных противотуберкулезных соединений. Во фтизиатрической практике в последние десятилетия появились лишь четыре новых или перенацеленных препарата, рекомендованных к использованию в режимах лечения больных МЛУ ТБ - Бедаквилин, Деламанид, Линезолид и Клофазимин. Таким образом, поиск новых более эффективных препаратов для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью является актуальным.
Отсутствие принципиально новых соединений, нацеленных на М. tuberculosis, побуждает исследователей обращаться к известным противомикробным соединениям и оптимизировать их структуру для применения их в качестве противотуберкулезных препаратов. В частности, нитрофураны известны как эффективные соединения против различных грамположительных, а также грамотрицательных бактерий [Goldman, 2010; Krasavin et al., 2019].
Известны производные 5-нитрофуранил-пиперазинамида, у которых второй пиперазиновый атом азота замещен различными ариловыми и акриловыми остатками и для которых показана антитуберкулезная активность (Patent-US-2005-0222408-A1, Patent-WO-2005-007625-А2).
Однако синтезированное авторами соединение (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон является новым, его фармакологические свойства и способ получения в литературе не описаны.
Задача изобретения - синтез нового соединения, обладающего противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения.
Техническими результатами является разработка простого способа синтеза соединения формулы 1; выявленная противотуберкулезная активность in vitro соединения формулы 1, которая может позволить использовать его в разработке лекарственных средств для терапии туберкулеза.
Поставленная задача решается способом получения соединения (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1, который заключается во взаимодействии хлорида 5-нитрофуран карбоксиловой кислоты (формулы 1.1) и арилпиперазинового производного (формулы 1.2) в сухом дихлорометане при температуре 5°С.
Задача решается также тем, что соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью в отношении стандартного штамма H37RV и клинических лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis.
Изобретение поясняется чертежами, где
Фиг. 1. МИК (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 в отношении стандартного штамма H37Rv. По оси абсцисс - концентрация соединения (1), по оси ординат - интенсивность флуоресценции резазурина (индикатора роста М. tuberculosis) в усл. ед. График построен по флуоресценции резазурина в усл. ед. по средним значениям ± доверительный интервал (М±I, при α=0,05). Значение МИК=0,16 мкг/мл.
Фиг. 2. МИК (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 в отношении клинического штамма М. tuberculosis 474 генотипа Beijing с множественной лекарственной устойчивостью, где МИК=0,31 мкг/мл.
Фиг. 3. МИК (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 в отношении клинического штамма М. tuberculosis 2176 генотипа Beijing с широкой лекарственной устойчивостью, где МИК=0,16 мкг/мл.
Фиг. 4. МИК (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 в отношении клинического штамма М. tuberculosis 4542 генотипа LAM с множественной лекарственной устойчивостью, где МИК=0,16 мкг/мл.
Фиг. 5. МИК DO-166 в отношении клинического штамма М. tuberculosis 6691 генотипа Beijing с множественной лекарственной устойчивостью, где МИК=0,031 мкг/мл.
Примеры практического осуществления.
Пример 1. Получение (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон формулы 1.
2
4
1
Раствор соединения 1.2 (0.705 г, 3.76 ммол) в 25 мл сухого дихлорометана охлаждали до 5°С, потом добавляли соединение 1.1 (0.300 г, 1.71 ммол) в твердом виде. Смесь перемешивали при комнатой температуре в течение 48 часов. Органическую фазу вымывали водой, сушили с помощью NaSO и выпаривали. Продукт получается в чистом виде посредством колоночной хроматографии (дихлорометан : метил-трет-бутиловый эфир = 20:1 до 10:1). Продукт получается в виде желтого порошка (0.135 г, 25%). Чистота >99% по данным Н-ЯМР.
1
6
Н
Н-ЯМР (600 МГц, DMSO-d, 333K): δ=8.99 (s, 1Н, О), 7.72 (d, 1Н, J=3.9 Hz), 7.27 (d, 1Н, J=3.9 Hz), 7.01 (t, 1H, J=8.0 Hz), 6.41 (m, 1H), 6.35 (m, 1H), 6.26 (ddd, 1H, J=8.0, 2.2, 0.7 Hz), 3.81 (m, 4H), 3.20 (m, 4H).
13
6
С-ЯМР (150 МГц, DMSO-d, 333K): δ=157.94 (1С), 156.44 (1С), 151.62 (1С), 150.95 (1С), 147.52 (1С), 129.30 (1С), 116.68 (1С), 112.44 (1С), 106.68 (1С), 106.56 (1С), 102.74 (1С), 48.14 (2С), 40.05 (2С).
Способ получения соединения (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 реализован в лабораторных условиях. Преимущество способа состоит в том, что используется только одностадийный простой синтез, в котором желаемое соединение получают из двух исходных и коммерчески доступных продуктов.
Пример 2. Противотуберкулезная активность соединения (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1. Исследование in vitro.
Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. № М0178) с 10% добавкой OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, Becton Dickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат. № R7017) (метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; Palomino et al., 2002) и регистрацией роста с помощью планшетного флуориметра FLUO Star Optima (длина волны возбуждения - 530 нм, излучения - 590 нм).
В качестве тест-штаммов использовали:
1) чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России);
2) 11 клинических штаммов М. tuberculosis из коллекции ФГБУ "Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии" Минздрава России с различным типом лекарственной устойчивости (множественная лекарственная устойчивость, широкая лекарственная устойчивость). На основании генотипирования штаммы были отнесены к основным генетическим семействам российской популяции М. tuberculosis - Beijing и LAM (Latin American Mediterranean - Латиноамериканско-Средиземноморский генотип). Гентипирование проводили на основе комплексной стратегии: (1) выявление генотипа Beijing на основе определения характерной инсерции IS6110 методом ПЦР в реальном времени (Mokrousov et al., 2014), (2) сполиготипирования штаммов генотипов не-Beijing и в частности, выявления штаммов и сполиготипов генотипа LAM, (3) выявления эпидемически значимых субтипов внутри генотипа Beijing - B0/W148, 1071-32, 14717-15, Central Asian Russian - с использованием VNTR-типирования или на основании выявления специфических молекулярных маркеров, как описано ранее (Mokrousov et al., 2012, 2018). Штаммы генотипа LAM относили к определенным сполиготипам на основании сравнения с международной базой сполиготипов SITVIT2 (Couvin et al., 2018; http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2/).
Скрининг исследуемого соединения (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 первоначально проводили для музейного штамма H37Rv, затем исследовали его активность в отношении лекарственно чувствительных и устойчивых штаммов.
Расчет МИК (минимальной ингибирующей концентрации)
Вычисляли средние значения интенсивности свечения индикатора роста (резаруфина, в который превращается резазурин при воздействии комплекса редуктаз микроорганизмов) и доверительный интервал (при р=0,05) в 8 лунках планшета: 1) контроля роста рабочей суспензии, 2) 1% контроля (рабочая суспензия, разведенная в 100 раз), 3) каждой концентрации исследуемого вещества. По полученным данным строили график. Минимальной ингибирующей концентрацией считали концентрацию препарата, в которой среднее значение флуоресценции значимо не превышало среднего значения 1% контроля роста и/или точку выхода кривой на «плато». Для оценки различий использовали t-критерий. Вычисления проводили с помощью программы, составленной Заявителями в формате Excel специально для определения МИК.
МИК соединения формулы 1 для стандартного штамма М. tuberculosis H37Rv равна 0,16 мкг/мл (Фиг. 1).
Примеры определения МИК соединения формулы 1 для клинических штаммов M.tuberculosis представлены в таблице 1 и Фигурах 2-5.
Преимуществом соединения (4-(3-гидроксифенил)пиперазин-1-ил)(5-нитрофуран-2-ил)метанон Формулы 1 является то, что оно обладает антимикобактериальной активностью как в отношении чувствительного, так и лекарственно устойчивых штаммов в том числе обладающих множественной и широкой лекарственной устойчивостью, и разнообразных как генотипически так и географически.
Литература
Beena, D.S. Rawat, Antituberculosis Drug Research: A Critical Overview, Medicinal Research Reviews, 33 (2013) 693-764.
Couvin D, David A, Zozio T, Rastogi N. Macro-geographical specificities of the prevailing tuberculosis epidemic as seen through SITVIT2, an updated version of the Mycobacterium tuberculosis genotyping database. Infect Genet Evol. 2019 Aug; 72: 31-43.
Goldman R.C. Maximizing bactericidal activity with combinations of bioreduced drugs. Future Med. Chem. 2(2010) 1253e1271.
Krasavin M, Lukin A, Vedekhina T, Manicheva O, Dogonadze M, Vinogradova T, Zabolotnykh N, Rogacheva E, Kraeva L, Sharoyko V, Tennikova ТВ, Dar'in D, Sokolovich E. Attachment of a 5-nitrofuroyl moiety to spirocyclic piperidines produces non-toxic nitrofurans that are efficacious in vitro against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Eur J Med Chem. 2019 Mar 15; 166: 125-135. doi: 10.1016/j.ejmech.2019.01.050.
Kuldipsinh P.В., N. Stoyanka, I. Illiyan, D.G. Manjunath, Antitubercular Drug Development: Current Status and Research Strategies, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 13 (2013) 1664-1684.
Mokrousov I. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 2013 Apr; 26(2): 342-60.
Mokrousov I, Vyazovaya A, Zhuravlev V, Otten T, Millet J, Jiao WW, Shen AD, Rastogi N, Vishnevsky B, Narvskaya O. Real-time PCR assay for rapid detection of epidemiologically and clinically significant Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype isolates. J Clin Microbiol. 2014 May; 52(5): 1691-3.
Mokrousov I, Chernyaeva E, Vyazovaya A, Skiba Y, Solovieva N, Valcheva V, Levina K, Malakhova N, Jiao WW, Gomes LL, Suffys PN,  M, Aitkhozhina N, Shen AD, Narvskaya O, Zhuravlev V. Rapid Assay for Detection of the Epidemiologically Important Central Asian/Russian Strain of the Mycobacterium tuberculosis Beijing Genotype. J Clin Microbiol. 2018 Jan 24; 56(2): e01551-17.
Mokrousov I, Vyazovaya A, Pasechnik O, Gerasimova A, Dymova M, Chernyaeva E, Tatarintseva M, Stasenko V. Early ancient sublineages of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: unexpected clues from phylogenomics of the pathogen and human history. Clin Microbiol Infect. 2019 Aug; 25(8): 1039.e1-1039.e6.
Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. ResazurinMicrotitre Assay Plate Simple and Inexpensive method for Detection of Dgug Resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemotherap.- 2002. - Vol. 46. - №8. - P. 2720-2722 Balunas M.J., A.D. Kinghorn, Drug discovery from medicinal plants, Life Sciences, 78 (2005) 431-441. Shu Y.-Z., Recent Natural Products Based Drug Development: A Pharmaceutical Industry Perspective, Journal of Natural Products, 61 (1998) 1053-1071.
Tribuddharat C, Fennewald M. Integron-Mediated Rifampin Resistance inPseudomonas aeruginosa, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43 (1999) 960-962.