Способ прогнозирования тяжелой степени сухого керататоконъюнктивита при синдроме Шегрена, ассоциированном с ревматоидным артритом
METHOD OF PREDICTION SEVERE FORM OF DRY EYE SYNDROME IN SJÖGREN SYNDROME ASSOCIATED WITH RHEUMATOID ARTHRITIS

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для прогнозирования тяжелой степени сухого керататоконъюнктивита при синдроме Шегрена, ассоциированном с ревматоидным артритом.
Ревматоидный артрит (РА) - хроническое, прогрессирующее, воспалительное системное заболевание. На долю РА приходится 10% от общего числа ревматических болезней, а ежегодный прирост новых случаев заболевания составляет около 0,02%. РА является одним из наиболее распространенных хронических воспалительных заболеваний человека, частота которого в популяции, согласно данным ВОЗ, составляет от 0,6 до 1,3%, а у близких родственников она достигает 3-5%. Женщины болеют значительно чаще по сравнению с мужчинами (соотношение 3:1). [М. Feldmann, F.М. Brennan, R.N. Maini. Rheumatoid arthritis. 1996; 85(3): 307-310). Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria: An American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism collaborative initiative. Arthritis Rheum. 2010; 62(9): 2569-258].
При PA возникают патологические изменения иммунного ответа с дисбалансом количественного и качественного состава иммунокомпетентных клеток, с нарушением их функциональной активности и клеточной кооперации. Результатом взаимодействия макрофагов, Т- и В-лимфоцитов является выработка AT, которые при соединении с АГ образуют иммунные комплексы, запускающие каскад иммуновоспалительных реакций. Это приводит к быстрой трансформации острой воспалительной реакции в хроническое прогрессирующее воспаление, которое является неотъемлемой частью РА. Клинически РА характеризуется суставными и внесуставными проявлениями, такими как перекардит, плеврит, синдром Фелти, невропатии, поражение органа зрения, гломерулонефрит, различные типы васкулитов, например, кожный [Fujita М, Igarashi Т, Kurai Т, et al. Correlation between dry eye and rheumatoid arthritis activity. Am J Ophthalmol. 2005; 140(5): 808-813]. Изменения офтальмологического статуса при РА встречается у 27,2% больных, в 13% - периферический язвенный кератит, в 5,06% - эписклерит, в 2,06% - склерит, в 0,45% - васкулит сосудов сетчатки [ G.,  D.,  S.,  М.,  J.,  М. Ocular manifestation of rheumatoid arthritis-diff erent forms and frequency. Bosn Basic J Med Sci. 2010; 10(4): 323-327].
He установлено связи между офтальмологическими проявлениями стадией и/или прогрессированием PA [Markovitz Е, Perry ZH, Tsumi Е, Abu-Shakra M. Ocular involvement and  manifestations in rheumatoid arthritis patients. Harefuah. 2011; 150(9): 713-75].
Риск возникновения PA приблизительно в 16 раз выше у кровных родственников больных. По данным генеалогических исследований среди родственников 1-й степени родства, примерно 10% страдают РА, а появление ревматоидного фактора и других аутоантител, распространенность тяжелых форм заболевания в 4 раза выше, чем среди населения в целом. У однояйцовых близнецов конкордантность по данному заболеванию также в 4 раза выше, чем у двуяйцовых близнецов или родных братьев и сестер. У однояйцовых близнецов она составляет всего 15-20%. Эти данные свидетельствует о том, что в патогенезе заболевания играют важную роль не только генетические факторы, но и носительство мутаций [Raychaudhuri S., Sandor С., Stahl Е.А., Freudenberg J., Lee H.S., Jia X., Alfredsson L., Padyukov L., Klareskog L., Worthington J., Siminovitch K.A., Bae S.C., Plenge R.M., Gregersen P.K., de Bakker P.I. Five amino acids in three HLA proteins explain most of the association between MHC and seropositive rheumatoid arthritis. Nat. Genet. 2012; 44(3): 291-296. https://doi.org/10.1038/ng.1076]. Для изучения этиологии и патогенеза СШ, ассоциированном с РА проводят молекулярно-генетические, иммуногенетические, популяционно-генетические, близнецовые и генеалогические методы исследования. В 11,6% - 50% случаев при РА развивается сухой кератоконъюнктивит, при котором патологические изменения затрагивают эпителий роговицы и конъюнктивы с трансформацией в плоскоклеточную метаплазию и потерю бокаловидных клеток. [Бржеский В.В., Сомов Е.Е. Синдром «сухого глаза»]. У 15-25% больных РА ассоциирован с синдромом Шегрена, что повышает риск вовлечения в патологический процесс роговицы с высоким риском развития осложнений (перфорации роговицы) [Сафонова Т.Н.. Васильев В.И., Лихванцева В.Г. Синдром Шегрена. Руководство для врачей. М:. 2013. 600 с].
Учитывая иммуноопосредованный характер поражения глазной поверхности при СШ, ассоциированном с РА, представляет интерес исследование гена-кандидата TRIM21, для прогноза течения СКК, так как мутации в этом гене, встречаются наиболее часто и коррелируют со степенью тяжести основного заболевания [Lee AYS. A review of the role and clinical utility of anti-Ro52/TRIM21 in systemic autoimmunity. Rheumatol Int. 2017; 37(8): 1323-1333]. Трехсторонний мотив-содержащий белок 21, также известный как Е3 убиквитин-белковая лигаза TRIM21, представляет собой белок, который у человека кодируется геном TRIM21. TRIM21 является эффектором внутриклеточного антитела во внутриклеточном антитело-опосредованном пути протеолиза. Он распознает Fc домен и связывается с иммуноглобулином G и М на антителах. TRIM21 является частью рибонуклеопротеина Ro/SSA, который включает в себя один полипептид и одну из четырех небольших молекул РНК. Частица Ro/SSA локализуется как в цитоплазме, так и в ядре. Ro/SSA взаимодействует с аутоантигенами у пациентов с СШ, ассоциированном с PA [Kamiyama R, Yoshimi R, Takeno M, Iribe Y, Tsukahara T, Kishimoto D, Kunishita Y, Sugiyama Y, Tsuchida N, Nakano H, Minegishi K, Tamura M, Asami Y, Kirino Y, Ishigatsubo Y, Ozato K, Nakajima H. Dysfunction of TRIM21 in interferon signature of systemic lupus erythematosus. Mod Rheumatol. 2018; 23: 1-11]. Недавние исследования выявили перекрестную реакцию TRIM21 с TRIM38-реактивными аутоантителами. Обнаружение Anti-TRIM38 коррелировало с наличием анти-Ro60, анти-Ro52, анти-La, ревматоидного фактора и гипергаммаглобулинемией. Аффинно очищенные антитела к доменам TRIM38-CortBP-2 и TRIM38-B30.2/SPRY подвергаются взаимодействию с TRIM21. Определение анти-TRIM38 специфично для пациентов с БШ, и коррелирует со степенью тяжести заболевания. Клинически, наличие анти-TRIM38 ассоциировано с более выраженной эпителиопатией глазной поверхности, гиполакримией и уменьшением количества малых слюнных желез. [Wolska N, Rybakowska Р, Rasmussen А, Brown М, Montgomery С, Klopocki A, Grundahl K, Scofield RH, Radfar L, Stone DU, Anaya JM, Ice JA, Lessard CJ, Lewis DM, Rhodus NL, Gopalakrishnan R, Huang AJ, Hughes PJ, Rohrer MD, Weisman MH, Venuturupalli S, Guthridge JM, James JA, Sivils KL, Bagavant H, Deshmukh US. Brief Report: Patients With Primary  Syndrome Who Are Positive for Autoantibodies to Tripartite Motif-Containing Protein 38 Show Greater Disease Severity. Arthritis Rheumatol. 2016; 68(3): 724-9].
Известен способ прогнозирования течения синдрома «сухого глаза» по повышению концентрации биохимических маркеров оксидативного стресса, в частности класса гидропероксидов в бульбарной конъюнктиве и слезной жидкости больных с синдромом Шегрена. Способ характеризуется тем, что проводят тест Schirmer, измерение времени разрыва слезной пленки, пробы с витальными касителями, конфокальную микроскопию конъюнктивы, количественное определения гексаноил-лизина в слезе (HEL), иммунохимический метод ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) и цитологию конъюнктивы с окрашиванием иммуногистохимическим методом (IHC).
Однако способ требует высокотехнологичного оборудования для проведения количественное определения гексаноил-лизина в слезе (HEL), процесс сбора которой трудоемок из-за отсутствия секреции при тяжелой степени сухого кератоконъюнктивита, иммунохимический метод ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) и цитологию конъюнктивы с окрашиванием иммуногистохимическим методом (IHC). [Wakamatsu ТН, Dogru М, Matsumoto Y, Kojima Т, Kaido М, Ibrahim ОМ, Sato ЕА, Igarashi A, Ichihashi Y, Satake Y, Shimazaki J, Tsubota K. Evaluation of lipid oxidative stress status in  syndrome patients. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013 Jan 7; 54(1): 201-10. doi: 10.1167/iovs.12-10325].
Нами не обнаружены источники информации, содержащие сведения о прогнозировании степени тяжести СКК при синдроме Шегрена, ассоциированного с РА.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка молекулярно-генетического способа прогнозирования степени тяжести СКК при синдроме Шегрена, ассоциированного с РА.
Технический результат предлагаемого изобретения состоит в прогнозировании тяжелой степени СКК при синдроме Шегрена, ассоциированного с РА для возможности выбора адекватного способа профилактики сухого кератоконъюнктивита, а также формирования групп риска.
Технический результат достигается за счет идентификации предрасполагающих генотипов ТТ и АА полиморфных маркеров rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21, соответственно. Аллели полиморфного маркера rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21 выявляли с помощью анализа кривых плавления ДНК (High Resolution Melting Point Analysis (HRM). При работе использовали набор qPCRmix-HS SYBR, предназначенный для ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I, в соответствии с протоколом производителя (Евроген, Россия). В состав qPCRmix-HS SYBR входят следующие компоненты: HS Taq ДНК полимераза, краситель SYBR Green I, смесь нуклеотидтрифосфатов, Mg2+, реакционный буфер. Реакционный буфер оптимизирован для специфичной работы HS Taq ДНК полимеразы, а также для длительного хранения и многократного замораживания-размораживания смеси. Концентрация ионов магния в 1× реакционной смеси - 3 мМ, концентрация каждого нуклеотидтрифосфата - 0,2 мМ. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1× qPCRmix-HS SYBR, по 0.4 мкМ каждого праймера TRIM21-6030-F: ТССС AGAAACCTCAACCACCTACCT, TRIM21-6030-R: AAGCTTTGGG AATGGAGGTATTGGTAC, TRIM21-9448-F: CCCCTCTAACCCTCTGTCCACTGAAT, TRIM21-9448-R: GCTAAAGCTCGCTTGCTGGGATC, 50-100 нг ДНК матрицы; в 96-луночных планшетах «Optical Reaction Plate» на амплификаторе BioRad CFX96 qPCR System (Bio-Rad, США) по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 95°С, 5 мин; ПЦР: 40 циклов (95°С - 30 с; 58°С - 30 с; 72°С - 30 с). Плавление продуктов амплификации проводили в диапазоне 55-95°С с увеличением температуры на 0.5°С каждые 10с (рис 2). Обработку полученных данных проводили в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad).
При проведении исследований было проанализировано распределение частот генотипов полиморфных маркеров rs7947461 (C/T), rs4144331 (С/А) гена TRIM21 у больных СКК (37 пациентов) и контрольной группы (35 человек), найдены статистически значимые различия. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs4144331 (С/А) и rs7947461 (C/T) гена TRIM21 в контрольной группе и группе больных с СКК представлено на рисунке 1.
2
2
95%
95%
Для предрасполагающего генотипа (ТТ) полиморфного маркера rs7947461 гена TRIM21 выявлена ассоциация с риском развития СКК. Его частота в исследуемой группе в 2,6 раза превышала показатели в группе контроля (χ=6.34), а относительный риск развития СКК был повышен в 3,6 раза (OR=3.65, CI=(1.15-11.61), p=0.04). Частота предрасполагающего аллеля в группе больных с СКК была статистически выше, чем в группе контрольной (χ=7.27; OR=2.5, CI=(1.27-4.89), p=0.007).
2
2
95%
95%
Выявлена ассоциация полиморфного маркера rs4144331 этого гена с риском развития СКК. В исследуемой группе, частота предрасполагающего аллеля оказалась выше в 3,0 раза, по сравнению с группой контроля (χ=8.71), относительный риск развития СКК оказался повышен в 3,81 раза (OR=3.81, CI=(1.51-9.62), p=0.003). Предрасполагающий генотип АА полиморфного маркера rs4144331 гена TRIM21 был обнаружен только в исследуемой группе пациентов с СКК (χ=7.74; OR=17.46, CI=(1.96-318.38), р=0.02).
Способ осуществляют следующим образом. У пациента производят забор венозной крови в пробирку с ЭДТА, кровь замораживают при температуре не выше -20 С. Идентифицируют предрасполагающие генотипы ТТ и АА полиморфных маркеров rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21, соответственно, и при их обнаружении прогнозируют тяжелую степень СКК тяжести при синдроме Шегрена, ассоциированного с РА.
Пример 1.
Пациентка Б., 1947 г.р. впервые обратилась в НИИ глазных болезней в 2008 г. с жалобами на боли в глазах, выраженную светобоязнь, блефароспазм, покраснение глаз. Из анамнеза известно, что с 2005 г. наблюдается в НИИ ревматологии им. В.А. Насоновой, где был поставлен диагноз: Синдром Шегрена. Серопозитивный ревматоидный артрит, поздняя стадия, активность умеренная. Ксеростомия III ст. Рекомендовано лечение: Метипред - 4 мг/день, Циклофосфан - 5 мг. через день. В 2008 г. офтальмологом был диагностирован сухой кератоконъюнктивит на фоне синдрома Шегрена. В качестве локальной терапии применяла слезозаменительные препараты. Процесс характеризовался медленно-прогрессирующим течением с периодическими обострениями.
При обращении в НИИ глазных болезней пациенту были проведены стандартное (визометрия, тонометрия, периметрия, биомикроскопия) и дополнительное офтальмологическое обследование: тест Ширмера I, II, проба Норна, определение осмолярности слезы («Tearlab Osmolality system», USA), тесты с витальными красителями, которые оценивали по Оксфордской шкале, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (HRT III RCM, Germany), ОСТ с менискометрией (RTVue 100-2/СА «Optovue», USA), посев с конъюнктивы на микрофлору.
В результате обследования установлено: острота зрения ОД составила 0,3 с коррекцией 0,5-0.6; OS - 0,6 с коррекцией 0,9-1,0. ВГД 17,0; 17,1 мм рт.ст. соответственно. При биомикроскопии отмечали выраженную смешанную инъекцию, эпителиопатию по всей поверхности роговицы, которая окрашивалась флюоресцеином. Снижение слезопродукции по тесту Ширмера: ОД = базальная 2,0 мм, рефлекторная 3,0 мм, суммарная 5,0 мм; OS = базальная 1,0 мм, рефлекторная 4,0 мм, суммарная 5,0 мм. Показатель пробы Норна OU составил 4,0 с. Осмолярность слезы ОД=318 мОсм/л OS=323 мОсм/л
Анализ данных IIRT показал, уменьшение плотности и извитости суббазальных нервных сплетений, наличие клеток Лангерганса. По данным ОСТ с менискометрией, отмечено уменьшение высоты слезного мениска OU до 123 мкм.
На основании проведенного обследования был поставлен диагноз: OU - Сухой кераконъюнктивит (нитчатый кератит). Гиполакримия III степени.
У пациента произвели забор венозной крови 7 мл. в пробирку с ЭДТА, кровь была заморажена при температуре -20 С. С помощью метода анализа кривых плавления идентифицировали аллели ТТ и АА полиморфных маркеров rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21, соответственно (Таб. 1). Выявлена ассоциация этих полиморфных маркеров с риском развития тяжелой степени СКК. На фоне системной терапии, слезозамещающей терапии и кератопротекторов субъективные ощущения стали менее выраженными, появилась зеркальность роговицы, исчезли эпителиальные нити. За период наблюдения до июня 2018 г. происходили периодические обострения РА с эрозированием роговицы. Пациентке рекомендовано постоянное наблюдение офтальмолога, ношение лечебных контактных линз на фоне инсталляций Рестасиса 2 раза в день, слезозаместительиые и репаративные препараты, применение системной терапии.
Пример 2.
Пациентка З., 1968 г.р. направлена в НИИ глазных болезней в 2017 г. Офтальмологических жалоб не предъявляет. Из анамнеза известно, что с 2014 г. наблюдается в ЛИИ ревматологии им. В.А. Насоновой, где был поставлен диагноз: Болезнь Шегрена. Рекомендовано лечение: Метипред - 4 мг/день. Наблюдается у офтальмолога с периодичностью раз в 6 месяцев. Офтальмологических проявлений заболевания не выявлено.
При обращении в НИИ глазных болезней пациенту были проведены стандартное (визометрия, тонометрия, периметрия, биомикроскопия) и дополнительное офтальмологическое обследование: тест Ширмера I, II, проба Норна, определение осмолярности слезы («Tearlab Osmolality system», USA), тесты с витальными красителями, которые оценивали по Оксфордской шкале, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (HRT III RCM, Germany), ОСТ с менискометрией (RTVue 100-2/СА «Optovue», USA), посев с конъюнктивы на микрофлору.
В результате обследования установлено: острота зрения ОД составила 0,8 с коррекцией 1,0; OS - 0,7 с коррекцией 1,0. ВГД 16,0; 15,0 мм рт.ст. соответственно. При биомикроскопии роговица прозрачная, влажная, сферичная, конъюнктива спокойна, тесты с витальными красителями отрицательные. Слезопродукция по тесту Ширмера: ОД = базальная 14,0 мм, рефлекторная 9,0 мм, суммарная 23,0 мм; OS = базальная 15,0 мм, рефлекторная 9,0 мм, суммарная 24,0 мм. Показатель пробы Норна OU составил 12,0 с. Осмолярность слезы ОД=285 мОсм/л OS=301 мОсм/л.
Анализ данных HRT показал, что плотность и извитость суббазальных нервных сплетений в пределах нормы, наличие единичных клеток Лангерганса. По данным ОСТ с менискометрией, высоты слезного мениска в пределах нормы OU до 298 мкм.
На основании проведенного обследования, данных за сухой кераконъюнктивит не выявлено.
У пациента произвели забор венозной крови 7 мл в пробирку с ЭДТА, кровь была заморожена при температуре -20 С. С помощью метода анализа кривых плавления идентифицировали аллели СС и СС полиморфных маркеров rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21, соответственно (Таб. 2), которые являются диким типом (норма). Выявлено, что у пациентов с отсутствием проявлений СКК предрасполагающие полиморфные маркеры не определяются. Т.о. можно предположить отсутствие прогрессирования офтальмологических проявлений заболевания. Пациенту рекомендовано динамическое наблюдение офтальмолога, продолжение системной терапии.
Пример 3.
Пациентка С., 1968 г.р. наблюдается в НИИ глазных болезней с 2014 г. Офтальмологических жалоб не предъявляет. Из анамнеза известно, что с 20014 г. наблюдается в НИИ ревматологии им. В.А. Насоновой, где был поставлен диагноз: Синдром Шегрена. Ксеростомия I ст. Рекомендовано лечение: Метипред - 3,5 мг/день. Наблюдается у офтальмолога по поводу гиполакримии I ст. В качестве локальной терапии применяла слезозаменительпые препараты.
При обращении в НИИ глазных болезней пациенту были проведены стандартное (ви юметрия, тонометрия, периметрия, биомикроскопия) и дополнительное офтальмологическое обследование: тест Ширмера I, И, проба Норна, определение осмолярности слезы («Tearlab Osmolarity system», USA), тесты с витальными красителями, которые оценивали по Оксфордской шкале, лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (HRT III RCM, Germany), ОСТ с менискометрией (RTVue 100-2/СА «Optovue», USA), посев с конъюнктивы на микрофлору.
В результате обследования установлено: острота зрения ОД составила 0,6 с коррекцией 1,0; OS - 0,7 с коррекцией 1,0. ВГД 14,0; 13,0 мм рт.ст. соответственно. При биомпкроскопии роговица прозрачная, влажная, сферичная, конъюнктива спокойна, тесты с витальными красителями отрицательные. Слезопродукция по тесту Ширмера: ОД = базальная 9,0 мм, рефлекторная 5,0 мм, суммарная 14,0 мм; OS = базальная 10,0 мм, рефлекторная 4,0 мм, суммарная 14,0 мм. Показатель пробы Норна ОД=8,0 с. OS=9,0. Осмолярность слезы ОД=275 мОсм/л, OS=289 мОсм/л.
Анализ данных HRT показал, уменьшение плотности, извитости и увеличение сечения суббазальных нервных сплетений, наличие единичных лейкоцитов и клеток Лангсрганса. По данным ОСТ с менискометрией, отмечено уменьшение высоты слезного мениска OU до 186 мкм.
На основании проведенного обследования был поставлен диагноз: OU-Гиполакримия I степени.
У пациента произвели забор венозной крови 7 мл. в пробирку с ЭДТА, кровь была заморожена при температуре -20 С. С помощью метода анализа кривых плавления идентифицировали аллели ТТ и СС полиморфных маркеров rs7947461 (С/Т) и rs4144331 (С/А) гена TRIM21, соответственно (Таб. 3). Выявлена ассоциация полиморфного маркера ТТ с возможным прогрессированисм гиполакримии, что подтверждено данными функциональных методов и развитием тяжелой степени СКК. Аллель СС является диким типом (вариант нормы). Пациенту рекомендована слезозаместителыгая терапия, динамическое наблюдение офтальмолога, применение системной терапии.
Таким образом, предложенный способ позволяет с помощью генетических методов прогнозировать тяжелое течение сухого кератоконъюнктивита при болезни Шегрена для определения необходимости адекватных профилактических мероприятий и включения таких пациентов в группу риска.
Таблица 1
Таб. 2
Таб. 3