АНТИТЕЛО ДВОЙНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ В НОВОЙ ФОРМЕ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
DOUBLE-TARGETED ANTIBODY IN NEW FORM AND USING IT

Область Техники
Настоящее изобретение относится антителу двойной направленности в новой форме, содержащему водорастворимый лиганд, слитый с N-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела, ДНК, кодирующей антитело двойной направленности, рекомбинантному экспрессионному вектору, содержащему такую ДНК, клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным экспрессионным вектором, способу получения антитела двойной направленности путем культивирования указанной клетки-хозяина и фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело двойной направленности.
Уровень Техники
Термин «ангиогенез» относится к механизму, по которому новые кровеносные сосуды образуются из ранее существующих кровеносных сосудов путем роста, дифференцировки и миграции клеток эндотелия. Известно, что ангиогенез играет важную роль в процессе нормального роста, включая заживление ран и менструальный цикл у женщин (Risau, Nature, 386: 671, 1997), a аномально повышенный ангиогенез играет критическую роль в процессах роста и метастазирования опухолей и обострениях болезней, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, псориаз, ревматоидный артрит и хроническое воспаление (Carmeliet and Jain, Nature, 407: 249,2000).
В 1971 др. Дж. Фолкман (J. Folkman) предложил гипотезу, согласно которой рост и метастазирование опухоли зависят от ангиогенеза, и, таким образом, стратегия терапии, направленная против ангиогенеза, может включать новый терапевтический агент против солидных раковых опухолей. В дальнейшем, многие исследователи проявляли растущий интерес к многочисленным исследованиям, связанным с ингибированием механизма ангиогенеза (Ferrara and Kerbel, Nature, 435: 967, 2005). Характер прогрессирования ангиогенеза определяется общим балансом между факторами, стимулирующими ангиогенез, и факторами, ингибирующими ангиогенез, и включает сложные и последовательные многостадийные процессы. В отношении этого процесса следует упомянуть, что, во-первых, различные факторы, стимулирующие ангиогенез, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), секретируемый тканями с опухолью или повреждениями, связываются с соответствующими рецепторами на периферии уже существующих сосудистых клеток эндотелия, активируя клетки эндотелия сосудов и таким образом увеличивая проницаемость сосудистых клеток эндотелия. Кроме того, секреция протеаз, таких как металлопротеиназа матрикса (ММР), обеспечивает расщепление базальной мембраны и внеклеточного матрикса вокруг клеток эндотелия сосудов, в результате чего клетки эндотелия сосудов выходят из существующего капиллярного сосуда и мигрируют/пролиферируют по направлению к тканям, секретирующим фактор, стимулирующий ангиогенез. Мигрирующие и пролиферирующие клетки эндотелия сосудов образуют трубчатую структуру в кровеносном сосуде, и в итоге, когда перициты, являющиеся структурной поддержкой для клеток эндотелия сосудов, попадают в эту трубчатую структуру, образуется стабильный и зрелый кровеносный сосуд. В этом случае известно, что ангиопоэтин 1 (Ang1), секретируемый клетками эндотелия сосудов, играет важную роль в притоке перицитов и стабилизации кровеносных сосудов, связываясь со своим рецептором Tie-2 (Suri et al., Cell, 87:1171,1996). В то же время, ангиопоэтин 2 (Ang2), который, как известно, ингибирует взаимодействие Ang1 и Tie-2, демонстрирует сродство к Tie-2, близкое к сродству Ang1, и, таким образом, Ang2 может служить для конкурентного ингибирования процесса фосфорилирования, индуцируемого Ang1 (Maisonpierre et al., Science, 277:55, 1997). Однако сообщалось, что фосфорилирование Tie-2, индуцируемое Ang2, зависит от формы клеток и методики эксперимента (Кim et al., Oncogene, 19:4549, 2000). Кроме того, сообщали, кровеносные сосуды становятся нестабильными, а клетки эндотелия сосудов становятся чувствительными к стимулам, таким как VEGF, в результате ингибирования взаимодействия между клетками эндотелия сосудов и перицитом на ранней стадии ангиогенеза (Klagsbrun and Moses, Chem. Biol., 6:R217, 1999; Veikkola and Alitalo, Semin Cancer Biol., 9:211, 1999; Carmeliet and Jain, Nature, 407:249, 2000). В частности, Ang1 относительно широко экспрессируется в нормальных тканях (Maisonpierre et al., Science, 277:55, 1997), но слабо экспрессируется в опухолевых тканях (Hayes et al., Br. J. Cancer, 83:1154, 2000). С другой стороны, из того факта, что сверхэкспрессируется Ang2 в раковых тканях, обладающих высоким ангиогенным потенциалом, или нормальных тканях, таких как плацента, матка и яичники, у которых наблюдается активная перестройка кровеносных сосудов (Kong et al., Cancer Res., 61:6248, 2001; Ahmad et al., Cancer, 92:1138, 2001), можно заключить, что начало ангиогенеза в опухоли происходит, когда содержание Ang2 превышает содержание Ang1. Поэтому предполагают, что Ang2 выступает в качестве агониста в сигнальном механизме Tie-2. В целом, поскольку сигнальные механизмы ангиопоэтина и Tie-2 однозначно не идентифицированы, для идентификации сигнальных механизмов требуются дополнительные исследования. Однако полагают, что Ang1 и Ang2 играют важные и различающиеся роли в ангиогенезе.
Ангиопоэтин содержит N-концевой домен (N-домен), состоящий приблизительно из 50 аминокислот, биспиральный домен (С-домен), состоящий из 215 аминокислот, и фибриноген-подобный домен (F-домен), состоящий приблизительно из 215 аминокислот. Среди перечисленных, N- и С-домены связаны с полимеризацией ангиопоэтина, а F-домен ассоциирован со связыванием рецептора Tie-2 (Davis et al., Nat. Strut. Biol., 10:38, 2003). Фосфорилирование, необходимое для индукции сигналов Tie-2, достигается путем димеризации рецепторов, как и у других тирозинкиназных рецепторов. На основании того факта, что ангиопоэтин должен быть для этого мультимеризирован (Procopio et al., J. Biol. Chem., 274:30196, 1999; Schlessinger, Cell, 103:211, 2000), предполагают, что эти лиганды можно использовать в качестве мишеней для разработки новых лекарственных средств, задействующих ингибирование ангиогенеза. В частности, Дэвис и др. утверждали, что согласно измерениям, выполненным с использованием методов генной инженерии, минимальный модуль ангиопоэтина для фосфорилирования Tie-2 представляет собой тетрамер и может использоваться в качестве антагониста, если этот модуль состоит из димеров (Davis et al., Nat. Strut. Biol., 10:38, 2003). В другом исследовании сообщалось, что димерный вариант Ang1 не обеспечивает эффективной передачи сигнала Tie-2 (Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:5547, 2004). Таким образом, несмотря на то, что не сообщалось о роли Ang1 в качестве антагониста, ингибирование передачи сигнала Tie-2 в результате изменения олигомерной структуры этой молекулы указывает на возможность использования стратегии предотвращения мультимеризации ангиопоэтина для подавления механизма передачи сигнала Tie-2. Из описанной структуры связанных ангиопоэтина и Tie-2 видно, что участок связывания
Tie-2 присутствует у ангиопоэтина и структура, обеспечивающая связывание между Ang1 и Tie-2, сходна со структурой, обеспечивающей связывание между Ang2 и Tie-2 (Barton W.A. et al., Nat. Struct. Biol., 13:524, 2006). Поэтому авторы настоящего исследования попытались эффективно ингибировать ангиогенез путем создания антитела двойной направленности, в котором сайт связывания ангиопоэтина, в частности, Ang2, согласно настоящему изобретению, из Tie-2 слит с существующим антителом.
В то же время, в настоящем изобретении внимание было уделено механизму передачи сигнала VEGF/VEGFR в качестве другой мишени для ингибирования ангиогенеза. VEGF, который, как известно, оказывает существенное влияние на большинство этапов ангиогенеза, широко секретируется в участке гипоксии области опухоли. В 1989 др. Н.Феррара и др. из компании Genentech идентифицировали VEGF путем выделения и очистки белка и клонирования кДНК (Leung et al., Science, 246:1306, 1989). Известно, что VEGF, обозначенный как VEGF-A, представлен четырьмя изотипами (VEGF121, VEGF165, VEGF189 и VEGF206). Среди них, как сообщалось, VEGF 165 присутствует в большом количестве во всех тканях человека, за исключением плаценты (Tisher et al., J. Biol. Chem., 266:11947, 1991). Известно, что VEGF связывается со своими рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2 с очень высокой аффинностью, но стимулирует механизмы, ассоциированные с ангиогенезом, такие как пролиферация и миграция клеток эндотелия сосудов, путем передачи своих сигналов через VEGFR-2. Поэтому VEGF и VEGFR-2, главным образом, использовали для ингибирования механизмов ангиогенеза, индуцируемых VEGF, что было описано во множестве статей (Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al., Clin. Cancer Res., 13:5544s, 2007). Например, Avastin компании Genentech представляет собой гуманизированное антитело к VEGF-A (Ferrara et al., Biochem. Biophy. Res. Comm., 333:328, 2005) и был одобрен Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для метастатического рака толстой кишки в 2004, немелкоклеточного рака легких в 2006 и Her-2-отрицательного метастатического рака молочной железы в 2008, соответственно, и был выпущен на рынок. В последние годы были проведены обширные клинические исследования на различных солидных опухолях для расширения спектра показаний к применению. Кроме того, Lucentis, выпускаемый той же компанией, является антителом, полученным путем выделения Fab-фрагмента из Avastin с целью повышения проницаемости при инъецировании Lucentis в сетчатку для ингибирования избыточного ангиогенеза под желтым пятном, что является главным нарушением при возрастной макулярной дегенерации (Eter et al., Biodrgus, 20:167, 2006). Lucentis был одобрен в 2006 FDA США в качестве терапевтического агента для лечения влажной формы возрастной макулярной дегенерации (влажной ВМД). Другим терапевтическим антителом, мишенью которого является VEGF, является VEGF-trap компании Regeneron (Holash et al., PNAS, 99:11393, 2002). Этот водорастворимый "рецептор-приманка", полученный путем слияния второго иммуноглобулинового домена VEGFR-1 и третьего иммуноглобулинового домена VEGFR-2 с человеческим Fc, еще не получил одобрения FDA США, и в настоящее время он проходит испытания фазы III в отношении метастатического рака молочной железы, метастатического рака легких, метастатического рака толстой кишки и гормонорезистентного рака простаты.
Ингибирующие ангиогенез антитела, мишенью которых является рецептор фактора роста эндотелия сосудов VEGFR-2, включают IMC-1121B (ЕР 1916001А2) компании Imclone, CDP-791 (PCT/GB02/04619) компании UCB и ТТАС-0001 (PCT7KR07/003077), разработанный авторами настоящего изобретения. IMC-1121B представляет собой моноклональное антитело, идентифицированное в результате скрининга полной библиотеки Fab человека, в настоящий момент оно проходит испытание фазы III в отношении метастатического рака молочной железы проводятся, а проведение испытаний фазы III в отношении рака желудка планируется в 2009 году. CDP-791 компании UCB представляет собой гуманизированное антитело, и в настоящий момент оно проходит испытания фазы II в отношении немелкоклеточного рака легких в форме пегилированного двойного Fab. Поскольку это антитело не содержит участок Fc, нельзя ожидаеть антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности. Наконец, ТТАС-0001, разработанный авторами настоящего изобретения и прошедший испытания доклинической стадии, является моноклональным антителом, идентифицированным в результате скрининга полной библиотеки ScFv человека. Это антитело является единственным, демонстрирующим реактивность в отношении flk-1 (гомолог VEGFR-2), полученного из мыши или крысы, притом что его мишенью является VEGFR-2, что представляет собой одну из важных особенностей, отличающих его от IMC-1121B компании Imclone (PCT/KR07/003077). В частности, межвидовая перекрестная реактивность ТТАС-0001 позволяет проводить испытания в модели заболевания на животных, что облегчает разработку противоракового агента для лечения определенных опухолей в будущем и завершение связанных с этим исследований.
Таким образом, исследования VEGF и VEGFR-2 значительно продвинулись за последние 5 лет, и были разработаны различные терапевтические агенты путем изучения рынка и проведения клинических исследований. В дополнение к разработке терапевтического антитела, ингибирующего ангиогенез, множество терапевтических агентов на основе антител, имеющих единственную мишень для каждого заболевания, были одобрены FDA и вышли на рынок. Например, основные терапевтические агенты на основе антител, являющиеся лидерами на мировом рынке моноклональных антител, включают Eribitux (Imclone), мишенью которого является рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и который позиционируется как терапевтический агент для лечения метастатического рака толстой кишки, Herceptin (Genentech), мишенью которого является Her-2/neu и который позиционируется как терапевтический агент для лечения метастатического рака молочной железы, и ТМ Rituxan, мишенью которого является CD-20 и который позиционируется как терапевтический агент для лечения неходжкинской лимфомы.
При этом, согласно последним тенденциям на рынке антител, в дополнение к разработке антител, действие которых направлено на единственную мишень, активно проводятся обширные исследования по разработке так называемых антител двойной направленности (биспецифических антител) или антител множественной специфичности (мультиспецифичных антител), которые могут иметь две или более мишеней одновременно (Van Spriel et al., Immunol. Today, 21:391, 2000; Kufer et al., Trend in Biotechnol., 22:238, 2004; Marvin and Zhu, Curr. Opin. Drug Discovery Dev., 9:184, 2006). Среди этих антител, принадлежащих к этому классу, нет ни одного антитела, которое было бы одобрено FDA и производилось бы в коммерческом масштабе. Однако эти антитела постоянно изучают на лабораторном и клиническом уровнях ввиду непрерывного интереса к ним и их потенциала. Антитела, принадлежащие этому классу, делят в основном на (1) антитела на основе ScFv, (2) антитела на основе Fab и (3) антитела на основе IgG и т.д.
Во-первых, в случае антител множественной специфичности на основе ScFv, это антитело представляет собой диатело, полученное совмещением VL и VH разных ScFv и имеющее гибридный ScFv в форме гетеродимера (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444, 1993). Однако у такого антитела есть недостаток, заключающийся в низкой стабильности из-за аффинности связывания с гетеродимерами. Кроме того, были опубликованы данные о тандемных ScFv, полученных путем связывания различных ScFv друг с другом (Kipriyanov et al., J. Mol. Biol., 293:41, 1999; Robinson et al., Brit. J. Cancer, 99:1415, 2008), гетеродимерных ScFv, полученных в результате экспрессии Jun и Fos, обладающих потенциалом связывания с концами различных ScFv (De Kruif and Logtenberg, J. Biol. Chem., 271:7630, 1996), гетеромерных мини-антителах, полученных при экспрессии СН1 и CL из Fab концов ScFv, соответственно (Muller et al., FEBS lett., 432:45,1998), и способ конструирования мини-антител в гетеромерной форме ScFv (Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998). В этом случае способ конструирования мини-антител включает замену некоторых аминокислот домена СН3, который является гомодимерным доменом Fc, для изменения гетеродимерной структуры в форме "выступ-во-впадину" и, соответственно, экспрессию этих модифицированных доменов СН3 с концов ScFv. Кроме того, в научной литературе сообщалось о ряде аналогов на основе ScFv (Kipriyanov and Le Gall, Curr. Opin. Drug Discovery Dev., 7:233, 2004); также в научной литературе сообщалось о ScFv тройной специфичности на основе триатела и о ScFv с четверной специфичностью на основе тетратела (Hudson and Kortt, J. Immunol. Methods, 231:177, 1999).
Во-вторых, антитела множественной специфичности на основе Fab, представленные главным образом в форме гетеродимерных Fab, полученных путем комбинации отдельных Fab к конкретным антигенам, связанных друг с другом дисульфидными связями или через медиатор (Brennan et al., Science, 229:81, 1985; Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547, 1992). В то же время существуют сообщения о получении антитела двойной направленности, с валентностью к двум антигенам, путем экспрессии ScFvs к различным антигенам на основе конца тяжелой цепи или легкой цепи специфичного Fab (Schoonjans et al., J. Immunol., 165:7050, 2000; Lu et al., J. Immunol. Methods, 267:213, 2002), и антитела двойной направленности в форме гомодимера с валентностью к четырем антигенам путем встраивания шарнирной области между Fab и ScFv (Coloma and Morrison, Nat. Biotechnol., 15:159, 1997). Также в научной литературе имеются публикации о получении битела двойной направленности, с тремя валентностями к антигенам, путем присоединения ScFvs к различным антигенам к концам легкой цепи и тяжелой цепи Fab, и получении битела тройной специфичности, с тремя валентностями к антигенам, путем присоединения различных ScFvs к концам легкой цепи и тяжелой цепи Fab (Schoonjans et al., J. Immunol., 165:7050, 2000). Также имеются данные об антителе тройной специфичности F(ab′)3, которое получают путем химической конъюгации трех различных Fab (Tutt et al., J. hnmunol., 147:60,1991).
В-третьих, в случае антител множественной специфичности на основе IgG, в компании Trion Pharma была получена гибридная гибридома, продуцирующая антитело двойной направленности, так называемая квадрома, путем гибридизации гибридом мыши и крысы. Данная компания производит антитела двойной направленности Ertumaxomab (антигены: Her-2/neu, CD3), находящееся на II-й фазе испытаний для лечения метастатического рака молочной железы (Kiewe and Thiel, Expert Opin. Investig. Drugs, 17:1553, 2008), и Catumaxomab (антигены: ЕрСАМ, CD3), находящееся на II-й фазе испытаний для лечения рака желудка и рака яичников, и на III-й фазе испытаний для лечения злокачественных асцитов (Shen and Zhu, Curr. Opin. Mol. Ther., 10:273, 2008). Однако для данных антител не удается избежать реакций антител человека с мышиными (НАМА-ответ) или крысиными (HARA-ответ) антителами, которые возникают при их продолжительном введении. В то же время известно об антителе двойной направленности, разработанном по принципу "knobs-into-holes", получаемом в форме гетеродимера путем замены некоторых аминокислот в одном из гомодимерных СН3-доменов Fc на соответствующие другим тяжелым цепям при идентичности доменов легкой цепи (Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998). Кроме антител двойной направленности в форме гетеродимеров, имеются сведения об антителе (ScFv)4-IgG (антигены: EGFR, IGF-1R), которое экспрессируется в форме гомодимера в результате слияния двух различных ScFvs с константными, а не вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей IgG (Lu et al., J. Biol. Chem., 279:2856, 2004). Однако недостатком данного антитела является невысокая продуктивность, но ученные из этой же исследовательской группы получили ди-диатело с улучшенной продуктивностью к тем же мишеням, путем устранения недостатка антитела (ScFv)4-IgG, и подтвердили его эффективность (Lu et al., J. Biol. Chem., 280:19665, 2005). Однако для подобных антител еще не решена проблема низкой стабильности, которая характерна для диатиел. Шен с коллегами из Imclone получили также антитело двойной направленности путем соединения одиночного вариабельного домена к α-рецептору тромбоцитарного фактора роста мыши (PDGFR-α) с N-концом легкой цепи химерного моноклонального антитела к человеческому VEGFR-2, IMC-1C11, и показали его эффективность (Shen et а1., J. Biol. Chem., 281:10706, 2006; Shen et al., J. Immunol. Methods, 318:65, 2007). Недавно Росси с коллегами предложили антитело с множественной валентностью к CD20, полученное с использованием так называемого метода "dock and lock (DNL)" ("док и замок"), использующего "димеризующий/принимающий" домен (dimerization and docking domain, ДПД) регуляторной субъединицы R протеинкиназы А (РКА) и заякоривающий домен РКА (Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841, 2006; Rossi et al., Cancer Res., 68:8384, 2008), также эта исследовательская группа сообщила об антителе двойной направленности, полученном с использованием данного метода (Chang et al., Clin. Cancer Res., 13:5586, 2007). Известно, что антитела, полученные с использованием метода DNL, имеют ряд преимуществ, они просты в применении, их можно комбинировать, так как их они производятся по модульному принципу и они демонстрируют хорошую стабильность in vivo, но их недостатком является то, что они могут разрушаться под действием протеиназ in vivo, а также вызывают проблемы, связанные с иммуногенностью.
В научной литературе имеется много сведений об антителах двойной или множественной специфичности, и эти антитела, с функциональной точки зрения, имеют достоинства и недостатки в зависимости от морфологических особенностей ввиду предполагаемого использования. В частности, активно продолжаются исследования, направленные на разработку терапевтических антител двойной или множественной специфичности для лечения рака. Однако очень важно выбрать антигены, на которые нацелены антитела, получаемые в ходе таких исследований, таким образом, чтобы антитела выполняли свои функции.
Описание изобретения
Техническая Задача
Таким образом, для создания антитела двойной специфичности для лечения рака путем ингибирования ангиогенеза авторы настоящего изобретения разработали антитело двойной направленности, способное нейтрализовать два рецептора, VEGFR-2 и Tie-2, тесно ассоциированных с механизмом ангиогенеза, в новой форме, которая до настоящего момента не упоминалась в литературе, подтвердили демонстрируемый данным антителом противораковый эффект как in vivo, так и на клеточном уровне, сравнимый или превосходящий эффект антитела, специфичного только к VEGFR-2 или Tie-2, что стало основой настоящего изобретения.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение антитела двойной направленности в новой форме, содержащего водорастворимый лиганд, слитый с N-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение ДНК, кодирующей указанное антитело двойной направленности.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего указанную ДНК.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение клетки-хозяина, трансформированной указанным рекомбинантным экспрессионным вектором.
Еще одной задачей настоящего изобретения является способ получения антитела двойной направленности путем инкубации указанной клетки-хозяина.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело двойной направленности.
Техническое Решение
В настоящем изобретении предложена новая форма антитела двойной направленности, содержащего водорастворимый лиганд, слитый с N-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела.
В описании настоящего изобретения термин "антитело" относится к белковой молекуле, которую продуцируют В-лимфоциты, которая специфично распознает различные типы антигенов и которая используется лимфоцитами как рецептор к антигену. Данная молекула имеет Y-образную форму и состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Все легкие цепи и тяжелые цепи содержат вариабельные и константные области. Указанные четыре цепи скреплены дисульфидными связями в гибких областях тяжелых цепей, и данный район обозначается как шарнирная область. Вариабельные области всех тяжелых цепей и всех легких цепей связаны друг с другом с образованием двух идентичных антиген-связывающих сайтов. По строению константной области тяжелой цепи антитела различают пять классов антител: A(IgA), D(IgD), E(IgE), G(IgG) и M(IgM). Каждый класс называется изотипом и обладает уникальными структурными характеристиками и отличается от других по биологическим свойствам. Настоящее изобретение включает антитела всех изотипов, предпочтительным для использования является IgG.
Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению включает антитело к антигенам, которые специфично экспрессируются в неопластической клетке, стромальной клетке раковой опухоли, опухоль-ассоциированной клетке эпителия, предшественника опухоль-ассоциированной клетки эпителия, циркулирующей опухоль-ассоциированной клетке эндотелия, циркулирующей клетке опухоли, стволовой клетке раковой опухоли и т.д., но не ограничивается упомянутыми типами.
Более конкретно, антитела согласно настоящему изобретению включают антитело к белку, экспрессируемому на поверхности клетки, такому как: рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-2), рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-3), FMS-подобная тирозинкиназа 3(FLT3), рецептор к c-FMS / колониестимулирующему фактору 1 (CSF1R), перестраиваемый в ходе трансфекции (RET), фактор мезенхимально-эпителиального перехода (c-Met), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Her2/neu, HER3, HER4, рецепторы фактора роста фибробластов (FGFR), рецепторы инсулин-подобного фактора роста (IGFR), рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFRs), рецепторы факторов стволовых клеток (с-КIТ), область разрыва кластеров (BCR), интегрин, металлопротеиназа матрикса(ММП) и т.д., но не ограничивается перечисленным.
Согласно настоящему изобретению, антитело может быть "поликлональным" или "моноклональным" антителом, и, более предпочтительно, моноклональным антителом. Моноклональным антителом называется антитело, полученное из по существу гомогенной популяции антител. То есть, конкретные антитела, составляющие такую популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольшом количестве. Моноклональное антитело высоко специфично к одному антигенному участку. Кроме того, в отличие от поликлональных антител, включающих различные антитела к различным эпитопам, каждое моноклональное антитело нацелено на один эпитоп, присутствующий на антигене. Данное определение не следует понимать в том смысле, что моноклон обязательно продуцирует антитело каким-либо конкретным образом. Например, пригодное в рамках настоящего изобретения антитело, может быть получено методом гибридом, описанным в Kohler et al., Nature, 256:495(1975), или методом рекомбинантной ДНК (см. Патент США №4816567). Также моноклональное антитело может быть, например, выделено из библиотеки фаговых антител способом, описанным в Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991).
Антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой "гуманизированное антитело". Термин "гуманизированное антитело" относится к аминокислотной последовательности, которая частично или полностью получена из зародышевой линии человека путем замены последовательности антитела, содержащей гипервариабельный участок (CDR), на последовательность, не принадлежащую человеку. Осуществление замен - наиболее простой способ полностью заменить мышиную константную область на константную область антитела человека. Таким образом может быть получена химера человек/мышь, которая может значительно снизить иммуногенность, до уровня, приемлемого для фармацевтического применения. Однако предпочтительно, чтобы вариабельный участок и даже CDR-область антитела были гумманизированы одним из способов, известных в данной области. Каркасный участок вариабельной области заменяют на соответствующий каркасный участок человека, а участок CDR, не принадлежащий человеку, оставляют по существу без изменений (интактным) или заменяют на последовательность, полученную из генома человека. Интактные человеческие антитела получают в генетически модифицированных мышах, иммунная система которых модифицирована таким образом, чтобы соответствовать иммунной системе человека.
В особенно предпочтительном случае антитело согласно настоящему изобретению представляет собой "антитело человека". Антитело человека представляет собой антитело, содержащее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, полученного любым способом, обеспечивающим получение антитела, продуцируемого человеком, или антитела человека. Антитело человека может быть получено с помощью различных технологий, известных в данной области. Согласно одному из вариантов реализации проводят скрининг антитела человека из фаговой библиотеки, в которой экспрессируются антитела человека. Nature Biotechnology 14:309-314(1996): Sheets et al. PNAS (США) 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter. J. Mol. Biol. 227:381(1991); Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). Антитела человека могут быть получены путем введения иммуноглобулинового локуса человека трансформированному животному, например мыши, эндогенные гены иммуноглобулинов которого частично или полностью инактивированы. В ходе обработки антигеном было обнаружено, что полученное антитело человека было в высокой степени схоже с антителами, вырабатываемыми у человека, во всех аспектах перестройки, сборки и репертуара антител. Такие методы описаны, например, в Патентах США №5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016 и в Marks et al. Biotechnology 10:779-783 (1992); Lonberg et al. Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). В другом способе антитела человека могут быть получены путем иммортализации В-лимфоцитов человека (например, В-лимфоциты можно выделять из популяции или иммунизировать in vitro), которые продуцируют антитело к антигену-мишени (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, p.77 (1985); Boerner et al. J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); и патента США №5750373).
В описании настоящего изобретения термин "водорастворимый лиганд" означает часть белка или белок целиком, который специфично связывается с рецептором в клетке, в частности на поверхности клетке, и демонстрирует свойство водорастворимости, благодаря чему может быть растворен в воде. Например, к водорастворимым лигандам относятся, без ограничений: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста эпидермы (EGF), фактор роста плаценты (PIGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулин-подобный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), ангиопоэтин и т.д.
В антителе двойной направленности в новой форме согласно настоящему изобретению каждая часть, антитело и лиганд, играют свою уникальную роль.
Однако антитело двойной направленности может подавлять или усиливать два сигнала одновременно и, таким образом, может быть более эффективным по сравнению со случаем, когда ингибируется или усиливается только один сигнал. По сравнению со случаем, когда на каждый сигнал воздействует свой ингибитор, в данном случае вводимая доза может быть уменьшена и два сигнала будут ингибированы или усилены одновременно и в одном участке.
Согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антитело было слито с водорастворимым лигандом посредством линкера. Согласно настоящему изобретению термин "линкер" относится к пептидному фрагменту, соединяющему две части слитого белка. Согласно настоящему изобретению приемлемые линкеры включают пептиды, содержащие от 5 до 25 аминокислот, предпочтительно, от 10 до 20 аминокислот, более предпочтительно, от 10 до 15 аминокислот.
Для получения антитела двойной направленности согласно настоящему изобретению получают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело двойной направленности. Такая последовательность нуклеиновой кислоты может быть получена путем соединения 3′-конца последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей водорастворимый лиганд, с 5′-концом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь антитела. Согласно одном аспекту, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело двойной направленности, слитое через линкер, может быть получено путем создания последовательности нуклеиновой кислоты линкера в праймере и проведения ПНР.
Ген, кодирующий такое антитело двойной направленности, полученный таким образом, лигируют в вектор с получением рекомбинантной экспрессионной плазмиды, плазмиду вводят в клетку-хозяин с получением клетки-трансфектанта или клетки-трансформанта, клетку-хозяин размножают, выделяют и очищают антитело двойной направленности, в результате чего получают целевое антитело двойной направленности.
Согласно настоящему изобретению используемая для экспрессии антитела двойной направленности клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Обычно используют клетку-хозяин, в которую можно ввести молекулу ДНК с высокой эффективностью и в которой экспрессия введенной ДНК также происходит с высокой эффективностью. Примеры такой клетки-хозяина включают: известные эукариотические и прокариотические клетки, такие как Е. coli, Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., бакетрии и дрожжи, клетки таких насекомых, как Spodoptera Frugiperda 9 (SF9), клетки животных, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки мыши, COS1, COS7, клетки печени зародыша человека 293, клетки африканской зеленой обезьяны, такие как BSC 1, BSC 40 и ВМТ 10 и тканевые культуры клеток человека.
Согласно настоящему изобретению для экспрессии антитела двойной направленности можно использовать различные комбинации хозяин для экспрессии / экспрессионный вектор. Например, к экспрессионным векторам, подходящим для эукариотических хозяев, относятся SV40, вирус папиломы крупного рогатого скота, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, цитомегаловирус и ретровирус. К экспрессионным векторам, которые можно применять в бактериальных хозяевах, относятся бактериальные плазмиды, такие как pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды наподобие RP4, характеризующиеся широким списком возможных хозяев, λgtl0 и λ11, фаговая ДИК, представленная различными производными фага лямбда, такими как NM989, и другие фаговые ДНК, такие как М13 и нитевидный фаг с одноцепочной ДНК. Экспрессионные векторы, которые можно использовать с дрожжевыми клетками, включают плазмиду 2µ и ее производные. Вектор, который можно применять в клетках насекомых, - pVL941.
Для трансформации клетки-хозяина рекомбинантным экспрессионным вектором применимы, например, трансфекция с помощью DEAE-декстрана, электропарация, трансдукция, кальций-фосфатная трансфекция, трансфекция с помощью катионных липидов, «scrape-loading» (соскоб-нагрузка) и инфицирование.
Согласно настоящему изобретению клетку-хозяин можно инкубировать в подходящей питательной среде, в условиях, позволяющих осуществлять экспрессию и выделять антитела двойной направленности при использовании мелкомасштабного или крупномасштабного ферментера и при инкубации в колбах, на качалке в лабораторном или промышленном ферментере. Инкубацию осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, одним из известных способов. Подходящие среды коммерчески доступны, или, например, ее можно приготовить с использованием компонентов и их определенных композиций, описанных в каталоге Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС).
Антитело двойной направленности может быть выделено из культуральной жидкости способами, известными в данной области. Например, антитело двойной направленности может быть выделено из культуральной жидкости стандартными способами, включающими, без ограничений, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, сушку распылением, выпаривание или осаждение. Антитело двойной направленности может быть дополнительно очищено с применением различных технологий, известных в данной области, включая хроматографию (например, ионообменную, аффинную, гидрофобную или эксклюзионную), электрофорез, разделение (например, осаждение сульфатом аммония), ДСН-ПААГ или экстракцию.
Композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена к конкретным молекулам любым подходящим путем. Композицию согласно настоящему изобретению можно применять у животных, в том числе и человека, напрямую (например, локально в виде инъекций, подкожных инъекций или путем локального введение непосредственно в ткань) или систематически (например парентерально или орально), при помощи любых подходящих средств. Если композицию, согласно настоящему изобретению, вводят парентерально, например внутривенно, подкожно, окулярно, внутрибрюшинно, внутримышечно, буккально, ректально, вагинально, интраорбитально, интрацеребрально, интраспинально, интравентрикулярно, интратекально, интрацеребрально, внутрипузырно, интраназально или путем распыления, то композиция предпочтительно включает часть водной или физиологически совместимой жидкой суспензии или раствора. Соответственно, поскольку носитель или наполнитель является физиологически доступным, он не должен оказывать негативного влияния на баланс электролитов и/или жидкостей у пациентов при доставке пациентам целевой композиции.
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению, может быть приготовлена в форме для перорального введения, такой как порошок, гранулы, таблетки, капсулы, суспензия, эмульсия, сироп или аэрозоль, стерильный раствор для инъекций, суппозитарий и в форме препарата для перкутантного введения согласно стандартным способам, и применена позже. Носитель, наполнитель и разбавитель, которые могут входить в состав композиции, могут содержать: лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, камедь акации, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метил гидроксибензоат, пропил гидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Композиция при необходимости может содержать разбавитель или наполнитель, такой как уплотнитель, разжижающий агент, связующий агент, смачивающий агент, дезинтегрирующий агент или ПАВ.
Согласно одному аспекту, антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению можно приготовить в форме твердого препарата для перорального введения. К твердым препаратам для перорального введения относятся: таблетка, пилюля, порошок, гранула, капсула и т.п. Твердый препарат для перорального введения можно приготовить путем смешивания по меньшей мере одного наполнителя, например крахмала, карбоната кальция, сахарозы, лактозы или желатина, с экстрактом. В дополнение к простому наполнителю также можно применять лубриканты, такие как стеарат магния и тальк.
Согласно другому аспекту, фармацевтическую композицию, включающую антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению, также можно приготовить в форме жидкости для перорального введения. К жидким формам для перорального введения относятся: суспензия, жидкость для внутреннего применения, эмульсия, сироп и т.д. Такие жидкие препараты могут в дополнение к основным инертным разбавителям (например, дистиллированной воде, этанолу, жидкому парафину) содержать различные наполнители, такие как, например, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п.
Согласно еще одному аспекту, фармацевтическую композицию, включающую антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению, также можно приготовить в виде формы для парентерального введения, предпочтительно для внутрибрюшинного введения. К формам для парентерального введения относятся: стерильный водный раствор, безводный растворитель, суспензия, эмульсия, лиофилизированный препарат, суппозиторий. К стерильному водному раствору, который может быть использован в данном случае, относятся: раствор Хэнка, раствор Рингера или подходящий буферный раствор, например физиологический буферный раствор, и суспензия, в которой пригодный для использования безводный растворитель может представлять собой растительное масло, такое как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или оливковое масло или сложный эфир, пригодный для инъекций, такой как этилолеат. При необходимости можно использовать антисептик, стабилизирующий агент, увлажнитель или соли или буферы для регуляции осмотического давления. В то же время, в случае суппозитория, можно использовать распространенные основы, такие как Витепсол, Макрогол, Твин 61, какао-масло, лауриновое масло или обработанный глицерином желатин.
Антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительно представляет собой DIG 0001, полученное согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения.
На основе ТТАС0001, описанного в публикации международной заявки № PCT/KR 07/003077, получение антитела двойной направленности DIG 000 согласно настоящему изобретению осуществили путем соединения (слияния) связывающего домена Ang2, который связывается с Tie-2, через специфичный линкер с N-концевым участком легкой цепи антитела (Примеры 1 и 2).
Полученное таким способом антитело двойной направленности DIG 0001 проверяли на иммобилизацию такими способами, как ДСН-ПААГ и белковый блоттинг, и в последующем более детальном анализе (Пример 3) использовали антитело, которое было очищено, по меньше мере, до уровня 95%, методом жидкостной экспресс-хромагографии белков (ЖЭХБ) с использованием колонки с аффинным белком А, колонки SP-sepharose, колонки для эксклюзионной хроматографии.
Способность антитела двойной направленности DIG 0001, очищенного, как описано выше, к связыванию с VEGFR-2 от D1 до D3-Fc и Tie-2-Fc подтвердили в анализе связывания с использованием методов твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Также осуществили анализ конкурентного связывания с VEGF165 и Ang2 методом ELISA с целью подтвердить функциональность антитела как антитела двойной специфичности.
Согласно настоящему изобретению, по результатам оценки жизнеспособности клеток в первичной культуре клеток эндотелия пупочной вены (HUVEC) подтвердили, что антитело двойной направленности DIG 0001 способно подавлять жизнеспособность клеток HUVEC, индуцированных отдельно VEGF или Ang1, а также способно эффективно подавлять жизнеспособность клеток HUVEC, индуцированных совместно VEGF и Ang1 (Пример 5).
Путем оценки миграции клеток подтвердили, что антитело двойной направленности DIG 0001 согласно настоящему изобретению способно подавлять подвижность клеток HUVEC, индуцированных отдельно VEGF или Ang1, а также способно эффективно подавлять подвижность клеток HUVEC, индуцированных совместно VEGF и Ang1 (Пример 6).
Анализ методом Вестерн-блоттинга подтвердил, что антитело двойной направленности DIG 0001 согласно настоящему изобретению способно ингибировать сигнальный механизм Tie-2, индуцированный Ang1, и сигнальный механизм VEGFR-2, индуцированный VEGF. Анализ методом вестерн-блот также подтвердил, что антитело двойной направленности DIG 0001 способно одновременно ингибировать сигнальные механизмы, индуцированные Ang1 и VEGF (Пример 7).
Более конкретно, подтвердили, что при введении в модельную глиобластому у животного антитела двойной направленности DIG 0001 согласно настоящему изобретению опухоль значительно уменьшалась в объеме (Пример 8).
Указанное выше антитело получали следующим образом. Вначале последовательность ДНК, кодирующую домен Ang2, ответственный за связывание с Tie2, который может действовать антагонист Tie-2, амплифицировали путем ПЦР. В данном случае антитело сконструировали таким образом, чтобы линкерная ДНК была соединена с 3′-концом амплифицированного фрагмента ДНК. Получение антитела двойной направленности, которое может специфично связываться с VEGFR-2 и Tie-2, осуществляли путем гибридизации (слияния) данного фрагмента ДНК с 5′-концом последовательности легкой цепи ДНК ТТАС0001, содержащей ДНК линкера.
Антитело двойной направленности DIG 0001 согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения ангиогенез-опосредуемых заболеваний за счет ингибирования ангиогенеза.
Согласно настоящему изобретению термин "связанное с ангиогенезом заболевание" включает перечисленные заболевания, но не ограничивается ими: рак, возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию, псориаз, ревматоидный артрит и хроническое воспаление.
Согласно настоящему изобретению рак включает, но не ограничивается перечисленным: рак желудка, рак печени, рак легких, рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак предстательной железы, рак почки, меланома, метастатическое поражение костей при раке предстательной железы, рак яичников и рак крови.
Антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению можно вводить в количестве, достаточном для предотвращения, подавления или уменьшения прогрессирования опухоли, например роста, инвазии, метастазирования и/или рецидива опухоли, с целью терапевтического лечения пациентов, больных раком. Для достижения данной цели определяют подходящее количество, которое называется терапевтически эффективным количеством. Эффективное количество в рамках данной заявки будет зависеть от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента.
Предпочтительное количество, согласно настоящему изобретению, находится в интервале от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг и, более предпочтительно, от 0,1 мг/м2 до 10 мг/м2.
Однако оптимальная доза варьирует в зависимости от заболевания, которое вылечат, и наличия побочных эффектов, и ее можно определить с использованием известных методик. Введение антитела можно осуществлять в виде периодических инъекций разбавленных твердых лекарственных форм или длительных внутривенных или внутрибрюшинных инъекций из внешней емкости для хранения (например, мешок для инъекций в вену) или внутренней емкости для хранения (например, биоразлагаемый имплант). Кроме того, белок антитела согласно настоящему изобретению также можно вводить в комбинации с различными биологически-активными молекулами. В любом случае оптимальную комбинацию белка антитела и других молекул, способ введения и дозу можно определить путем обычных экспериментов, доступных средним специалистам в данной области.
Композицию согласно настоящему изобретению можно применять в комбинации с другими терапевтическими агентами или смешивать с другими терапевтическими агентами.
В случае, когда опухоли, включая опухоли у человека, лечат антителом двойной направленности, согласно настоящему изобретению в комбинации с химиотерапевтическими агентами, облучением или дополнительными антагонистами рецепторов или их комбинацией, может быть достигнут синергетический эффект. Другими словами, ингибирование роста опухоли, обеспечиваемое антителом двойной направленности согласно настоящему изобретению может неожиданно усилиться при применении совместно с химиотерапевтическим агентом, облучением или дополнительным антагонистам рецептора или их комбинацией. Для примера, синергетический эффект может проявиться в виде более высоких показателей подавления роста опухоли при лечении в комбинации, чем можно ожидать при лечении антителом двойной направленности согласно настоящему изобретению и химиотерапевтическим агентом, облучением или дополнительным антагонистом рецептора или их комбинацией. Предпочтительно, синергетический эффект может проявляется в снижении степени ракового заболевания, для которого не ожидали, что он будет ослаблен при лечении антителом двойной направленности согласно настоящему изобретению совместно с химиотерапевтическим агентом или дополнительным антагонистом рецептора.
Антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению вводят до начала химиотерапии или радиотерапии, после начала этих способов лечения и до и в течение их комбинации, то есть химиотерапии и/или радиотерапии, до и после начала этих способов лечения, в течение и после начала этих способов лечения или до, в течение и после начала этих способов лечения. Например, антитело DIG 0001 обычно вводят в течение 1-30 дней, предпочтительно 3-20 дней и более предпочтительно 5-12 дней до начала радиотерапии и/или химиотерапии.
Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению можно применять in vivo и in vitro с целью осуществления научных исследований, профилактики или лечения широко известных в данной области. Разумеется, очевидно, что раскрытое в настоящей заявке изобретение может быть изменено и модифицировано специалистом в данной области, и такие изменения и модификации могут не выходить за рамки объема настоящего изобретения.
Полезные результаты
В настоящем изобретении предложено антитело двойной направленности на основе моноклонального антитела человека, которое может эффективно ингибировать связанный с ангиогенезом сигнальный механизм за счет одновременной нейтрализации рецепторов VEGFR-2 и Tie-2, ассоциированных с ангиогенезом, и предложена композиция, включающая антитело двойной направленности, для ингибирования ангиогеназа и лечения рака. Антитело двойной направленности согласно настоящему изобретению демонстрирует прекрасную эффективность нейтрализации рецепторов и также является эффективным в лечении рака, при сравнении с существующими в настоящее время антителами с одинарной специфичностью, за счет одновременной нейтрализации двух мишеней, ассоциированных с ангиогенезом. В случае двух мишеней, каждая из которых связана с другой, при конструировании антитела двойной направленности в новой форме, созданного авторами настоящего изобретения, можно ожидать более благоприятных эффектов, по сравнению с реальной пользой,  получаемой при лечении антителами с одинарной специфичностью.
Описание Чертежей
Эти и другие признаки, аспекты и преимущества предпочтительного варианта реализации настоящего изобретения будут более полно описаны в приведенном ниже подробном описании изобретения, сопровождающегося графическими материалами. На графических материалах:
На ФИГ.1 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO:6) и функции генов, которые были встроены в вектор pIgGLD-mAng2-TTAC0001 lgt.
На ФИГ.2 схематически представлен способ конструирования вектора pIgGLD-mAng2-TTAC0001 lgt согласно настоящему изобретению.
На ФИГ.3 представлены результаты, полученные при анализе экспрессии вектора согласно настоящему изобретению в клетках CHO-DG44 и определении уровня продукции антитела двойной направленности методом вестерн-блоттинга.
На ФИГ.4 представлены результаты скрининга клона с высокой продуктивностью при повторной обработке МТХ (вплоть до 700 нМ) с целью получить клеточную линию с высокой продуктивностью согласно настоящему изобретению.
На ФИГ.5 представлены данные ДСН-ПААГ-анализа очищенного DIG 0001.
На ФИГ.6 представлены результаты конкурентного анализа VEGF и Ang-2-Fc с DIG 0001 с использованием метода ИФА.
На ФИГ.7 представлены результаты анализа выживаемости, демонстрирующие жизнеспособность клеток HUVEC при обработке DIG 0001 согласно настоящему изобретению.
На ФИГ.8 представлены результаты анализа миграции, демонстрирующие подвижность клеток HUVEC под действием DIG 0001 согласно настоящему изобретению.
На ФИГ.9 представлены результаты, демонстрирующие активность ингибирования фосфорилирования VEGFR-2 и ERK, вызываемого VEGF, под действием антитела двойной направленности DIG 0001 согласно настоящему изобретению, и активность ингибирования фосфорилирования Tie-2, ERK и АКТ, вызываемого Ang1, под действием указанного антитела.
На ФИГ.10 представлено влияние DIG 0001 согласно настоящему изобретению на ингибирование роста опухоли на модели глиобластомы у мышей.
Пример реализации изобретения
Нижеизложенные Примеры представлены исключительно для более подробного раскрытия настоящего изобретения, и специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение, будет очевидно, что, исходя из целей настоящего изобретения, суть изобретения не ограничивается Примерами.
СС AGC GGT GTG G
Пример 1: Конструирование экспрессионного вектора для получения DIG 0001 Фрагмент ДНК, соответствующий домену Ang2, ответственному за связывание с Tie-2, амплифицировали методом ПЦР. Для этого доктор Димитар Б. Николов (Dimitar В. Nikolov) из Мемориального онкологического центра Слоуна-Кеттеринга, США любезно предоставил клеточную линию НЕК293, продуцирующую человеческий Ang2-RBD (Barton et al., Structure, 13:825, 2005), из которой выделяли геномую ДНК, которую использовали в качестве матрицы. Для амплификации связывающего домена Ang2 (F281-F496) на основе выделенной ДНК проводили ПЦР по следующей схеме: Один цикл -94°С в течение 4 минут, 30 циклов (94°С в течение 45 секунд / 50°С в течение 45 секунд / 72°С в течение 1 минуты), один цикл - 72°С в течение 7 минут и 4°С до выемки проб. Для проведения реакции использовали смесь следующих реагентов: 2 мкл (10 пмоль/мкл) праймера F-ksw001, содержащего сайт рестрикции, распознаваемый рестриктазой BstXI (5′-САС ТGT ТСС ТТС AGA GAC TGT GCT GAA GTA TTC, SEQ ID NO:1), 2 мкл (10 пмоль/мкл) обратного праймера R′-ksw001 (5′-АСТ АСС ТСС GCC ТСС TGA GAA АТС TGC TGG TCG GAT CAT CAT GGT TG, SEQ ID NO:2), 1 мкл (100 нг/мкл) геномной ДНК, используемой в качестве ДНК-матрицы, 2,5 ед. i-Max™II Taq (Intron#25261, Корея), используемой в качестве полимеразы, 5 мкл 10Х буфера, 2 мкл (каждого основания 2,5 мМ) смеси дНТФ и 37,5 мкл дистиллированной воды. Для полученного в результате ПНР продукта проводили электрофорез в 1%-ном агарозном геле и затем выделяли слабую полоску, находящуюся ниже уровня 700 п.о., при помощи набора для выделения ДНК Продукт ПЦРов HiYield™ (Gel/PCR DNA extraction kit) (RBC Bioscience #YDF300, Тайвань). Проводили повторную ПЦР с использованием выделенного фрагмента ДНК в качестве матрицы, в результате чего получали фрагмент связывающего домена Ang2, содержащий слитый с ним линкер (обозначенный как "mAng2"). Использовали такие же условия ПЦР, что и в предыдущем случае, за исключением того, что в качестве обратного праймера использовали R-ksw001 (5′-GGA GCC TCC TCC GCC ACT ACC TCC GCC TCC TGA GAA ATC TGC TGG TCG GAT CAT CAT GGT TG, SEQ ID NO:3).
ССА CGA GGC TGG
Параллельно амплифицировали участок легкой цепи ТТАС0001, для последующего связывания со связывающим доменом Ang2, путем проведения ПЦР в следующих условиях: Один цикл - 94°С в течение 4 минут, 30 циклов (94°С в течение 30 секунд / 50°С в течение 30 секунд / 72°С в течение 30 секунд), один цикл - 72°C в течение 5 минут и 4°С до выемки проб. Для проведения ПЦР использовали смесь следующих реагентов: 2 мкл (10 пмоль/мкл) праймера F-ksw002, к которыму был пришит один из вариантов линкера (5′-AGT GGC GGA GGA GGC TCC GGT TCC ААТ ТТТ ATG CTG ACT CAG, SEQ ID NO:4), 2 мкл (10 пмоль/мкл) праймера R-ksw002, содержащего сайт рестрикции, распознаваемый рестриктазой BstXI (5′-CAG АТС ТТТ  СТС СТС, SEQ ID NO:5), 10 нг pIgGLD-TTAC0001 Lgt (PCT/KR07/003077), используемой в качестве ДНК-матрицы, 2,5 ед. i-Max™ II Taq (Intron #25261, Корея), используемой в качестве полимеразы, 5 мкл 10Х буфера, 2 мкл смеси дНТФ (каждого основания 2,5 мМ) и 37,5 мкл дистиллированной воды. Полученный в результате ПЦР продукт подвергали анализу методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле и затем выделяли фрагмент легкой цепи ТТАС0001, соответствующий размеру приблизительно 350 п.о., при помощи набора для выделения ДНК-продуктов ПЦР HiYield™ (Gel/PCR DNA extraction kit) (RBC Bioscience #YDF300, Тайвань)(обозначенный как "ТТАС0001 lgt").
Для связывания полученного методом ПЦР участка легкой цепи ТТАС0001 (ТТАС0001_lgt) с фрагментом региона Ang2 (mAng2) проводили ПНР с перекрывающимися областями (SOE-PCR). Для проведения ПЦР применяли следующие условия: Один цикл - 94°С в течение 4 минут, 30 циклов (94°С в течение 45 секунд / 50°С в течение 45 секунд / 72°С в течение 1 минуты), один цикл -72°С в течение 7 минут и 4°С до выемки проб. Также в этом случае для проведения ПНР использовали смесь следующих реагентов: 2 мкл (10 пмоль/мкл) праймера F-ksw001, содержащего сайт рестрикции, распознаваемый рестриктазой BstXI, 2 мкл (10 пмоль/мкл) праймера R-ksw002, по 10 нг каждого фрагмента mAng2 и ТТАС0001 Lgt, используемых в качестве ДНК-матриц, 2,5 ед. i-МахТМ II Taq (Intron #25261, Корея), используемой в качестве полимеразы, 5 мкл 10Х буфера, 2 мкл смеси дНТФ (каждого основания 2,5 мМ) и 37,5 мкл дистиллированной воды. Для полученного в результате ПЦР продукта проводили электрофорез в 1%-ном агарозном геле и затем выделяли Продукт ПЦР слияния mAng2-TTAC0001 lgt, соответствующий размеру приблизительно 1 т.н., при помощи набора для выделения ДНК Продукт ПЦРов HiYield™ (Gel/PCR DNA extraction kit) (RBC Bioscience #YDF300, Тайвань) (обозначенный как "mAng2-TTAC0001 lgt"). Выделенный продукт ПЦР встраивали в Т-вектор с использованием набора для клонирования TOPcloner ТА cloning kit (Enzymonics #EZ111, Корея) и трансформировали этим вектором Escherichia coli DH5α. Затем трансформированные Е. coli подвергали процедуре Минипреп и обрабатывали рестриктазой BstXI. После этого вектор, содержащий необходимую вставку, имеющую размер приблизительно 1 т.н., выделяли и секвенировали для проверки его ДНК-последовательности (Фиг.1 и SEQ ID NO:6).
Конструировали экспрессионный вектор, содержащий легкую цепь для экспрессии антитела двойной направленности DIG 0001, следующим способом (ФИГ. 2). Сначала имеющийся в распоряжении исследователей экспрессионный вектор pIgGLD-TTAC0001 Lgt, содержащий легкую цепь ТТАС0001, разрезали при помощи рестрикатазы BstXI, и при помощи электрофоретического разделения из 1%-ного агарозного геля выделяли фрагмент, который можно было использовать в качестве вектора. Параллельно, при помощи рестриктазы BstXI разрезали Т-вектор, содержащий вставку mAng2-TTAC0001 lgt, и при помощи электрофоретического разделения из 1%-ного агарозного геля выделяли разрезанный фрагмент. После, для получения одного интактного вектора, выделенные фрагменты выдерживали в присутствии Т4 DNA ligase (Errzynomics #M001S, Корея) при 4°С в течение приблизительно 12 часов. Затем, сконструированным вектором трансформировали Е. coli, подвергали их процедуре Минипреп, и затем, для подтверждения того, что произошла вставка mAng2-TTAC0001 lgt в сконструированный вектор, разрезали его при помощи рестрикатазы BstXI. Рекомбинантный вектор, для которого была подтверждена вставка, обозначали как "pIgGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt".
Пример 2: Получение и идентификация DIG 0001
5
2
2
Клетки CHO-DG44 (dhfr - дефицитные клетки СНО) трансдуцировали совместно сконструированным вектором для экспрессии легкой цепи, pIgGLD-mAng2-TTAC0001, и существующим вектором для экспрессии тяжелой цепи, pIgGHD-TTAC0001 Hvy (PCT/KR07/003077), для индукции их спонтанной экспрессии. Экспрессию подтверждали с помощью ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинга. Трансдукцию проводили с использованием липофектамина 2000 (lipofectamine™) (Invitrogen #11668-019, США) в соответствии с инструкциями производителя. Коротко: 5×10 клеток CHO-DG44 засевали в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего питательную среду αМЕМ (Welgene, Корея), и инкубировали при высокой плотности до тех пор, пока плотность клеток не достигала 80-90%, при температуре 37°С в течение 24 часов, при концентрации СO (5%), в инкубаторе с увлажнением. 3 мкг рекомбинантного вектора (1,5 мкг pIgGHD-TTAC0001 Hvy и 1,5 мкг pIgGLD-mAng2-TTAC0001 Lgt) и 6 мкл липофектамина 2000 (lipofectamin™) отдельно разводили в 250 мкл бессывороточной питательной среды αМЕМ и выдерживали в течение 5 минут при комнатной температуре. Разведенную ДНК и разведенный липофектамин 2000 (lipofectamin™) смешивали и оставляли в течение 20 минут при комнатной температуре для прохождения реакции, в ходе которой образовывался комплекс ДНК-липофектамин 2000 (lipofectamin™). От культивируемых клеток удаляли старую питательную среду, вносили 500 мкл раствора комплекса ДНК-липофектамин 2000 (lipofectamin™) и 500 мкл бессывороточной питательной среды αМЕМ и инкубировали при 37°С в течение 6 часов в инкубаторе с СO. Добавляли 1 мл среды αМЕМ, содержащей 20% диализированной эмбриональной бычьей сыворотки, и инкубировали далее от 48 до 72 часов. После отделяли супернатант и проверяли наличие экспрессии антител с использованием методов ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинг. 3). ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинг проводили согласно способам, широко используемым в данной области, с использованием следующих материалов: 12% ДСН-полиакриламидный гель, ПВДФ-мембрану (Millipore #EPVH00010, США), конъюгированное с ПХ антитело козы к IgG (каппа) человека и конъюгированное с ПХ антитело козы к IgG (Fc) человека (Pierce, США).
Пример 3: Получение клеточной линии для продуцирования DIG 0001 и выделение и очистка антитела
2
4
2
Клеточную линию для продуцирования DIG 0001 получали на основе клеток CHO-DG44 (dhfr-дефицитные СНО). Трансдукцию для получения рекомбинантной, экспрессирующей антитела клеточной линии на основе CHO-DG44 проводили таким же образом, как описано выше. Для проведения скрининга трансдуцированных клеток CHO-DG44 (dhfr-положительный фенотип) использовали питательную среду аМЕМ, не содержащую гипоксантина и тимидина, в качестве селективных маркеров в первичном скрининге трансдуцированных клеток CHO-DG44 использовали 500 мкг/мл G418 (Sigma-aldrich, США) и 400 мкг/мл зеоцина (Invitrogen, США). Для получения моноклональной колонии для экспрессии рекомбинантных антител клетки, выделенные в ходе первичного скрининга, разводили до плотности 10 клеток/мл и засевали в 96-луночный планшет (Nunc, США). Затем разведенные клетки инкубировали в течение 2 недель и выделяли одиночные колонии, произошедшие из одной клетки, и получали из них материнские клеточные клоны. Для получения клеточной линии с высоким уровнем экспрессии материнский клеточный клон последовательно пересевали от 3 до 5 раз в среде, содержащей метатрексат (МТ) в различных концентрациях (40 нМ, 80 нМ, 160 нМ, 320 нМ и 700 нМ), и затем оценивали уровень экспрессии с использованием ИФА. С этой целью в 96-луночный планшет вносили 100 мкл 2 мкг/мл первичного антитела, антитела козы к IgG (Fc) человека (Pierce, США), и выдерживали при 4°С в течение 12 часов для образования покрытия из антител. Затем из каждой лунки удаляли остатки раствора, добавляли 200 мкл блокирующего раствора, содержащего 2% обезжиренного молока в 1х ФБР, и выдерживали при 37°С в течение 1 часа. Каждую лунку три раза промывали промывочным буфером, содержащим 0,05% Твин-20 в 1х ФБР, и вносили туда культуральную жидкость от клеточной линии CHO-DG44, экспрессирующую антитело, реакцию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку повторно три раза промывали промывочным буфером и затем в промывочном буфере разводили в соотношении 1:5000 вторичное антитело, конъюгированное с ПХ антитело козы к IgG (каппа) человека, для реакции добавляли 100 мкл полученного раствора антител, реакцию проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую лунку повторно три раза промывали промывочным буфером и вносили туда 100 мкл реагента-субстрата ТМВ (BD biosciences, США), реакцию проводили в течение 5-10 минут. Затем, для остановки хромогенной реакции, добавляли 50 мкл 2Н раствора серной кислоты (HSO). Измеряли оптическую плотность (ОП) (в диапазоне) от 450 до 650 нм с использованием считывателя для микропланшетов (Тесап, Швейцария). Для подтверждения достоверности полученных результатов проводили ИФА анализ по аналогичной схеме, как описано выше, с использованием VEGFR-2 и Tie-2 в качестве первичных антител и конъюгированным с ПХ антителом козы к IgG (каппа) человека в качестве вторичного антитела. В результате клон, который демонстрировал высокий уровень экспрессии при концентрации МТХ 700 нМ, выделяли как клеточную линию с высоким уровнем экспрессии (ФИГ.4). Инкубацию клеточной линии с высоким уровнем экспрессии проводили в питательной среде αМЕМ (Welgene, Корея), содержащей 10% диализированной эмбриональной бычьей сыворотки (KDR, Корея), 100 единиц/мл пенициллина (Hyclone, США) и 100 мкг/мл стрептомицина (Hyclone, США), культивирование проводили в инкубаторе при 37°С, в атмосфере увлаженной воздушной смеси, содержащей 5% СO.
Антитело двойной направленности DIG 0001, полученное при инкубации клеточной линии с высоким уровнем экспрессии, подвергали очистке методом ЖЭХБ с использованием аффинной колонки с белком А, колонки с SP-сефарозой, колонки для эксклюзионной хроматографии и таким образом очищали его до уровня по меньше мере 95% и использовали в дальнейших детальных исследованиях (ФИГ. 5). Сначала культуральную жидкость центрифугировали с целью разделить среду и остатки клеток и затем DIG 0001, содержащееся в отделенной питательной среде, концентрировали с использованием UF-мембраны (Millipore, США) с пределом пропускания 10000 Да или менее. Фильтрованную через UF-мембрану среду предварительно очищали методом аффиной хроматографии с использованием белка А. Краткое описание этой процедуры приведено ниже. Профильтрованную через UF-мембрану среду вносили на колонку с белком А, содержащую 0,1 М NaCl, стабилизированную 20 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,0), этим же буфером вымывали несвязанный белок. Затем белок, который неспецифично связывался со смолой, содержащей белок А, вымывали 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCl. Белок, который специфично связывался с белком А, элюировали 0,1 М глицин-Сl буфером (рН 3,5), содержащим 0,1 М NaCl, после чего выделенный образец нейтрализовали 1 М раствором Трис до рН 6,0. Для предотвращения загрязнения образца ДНК, эндотоксином, белком А, которые могут оставаться в образце, выделенном при пропускании через аффинную колонку, проводили катион-обменную хроматографическую очистку по следующей схеме. Сначала образец, элюированный из колонки с белком А, смешивали с равным объемом 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,0). Затем колонку с SP-сефарозой (5 мл, GE healthcare) стабилизировали 10 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 6,0), содержащим 50 мМ NaCl, и вносили на нее образец и таким образом вымывали несвязанную ДНК и эндотоксины. Связавшиеся со смолой молекулы антитела элюировали, используя измененное значения рН и градиент соли (50 мМ натрий фосфатный буфер (рН 7,0), 1 М NaCl). В завершение, для удаления мультимерных антител образец вносили на колонку Superdex 200 (16 мм × 60 см, GE healthcare), стабилизированную ФБР, и проводили его очистку методом эксклюзионной хроматографии. Такие антитела, подвергнутые очистке, использовали для проведения анализов на клетках и in vivo.
Пример 4; Конкурентный анализ DIG 0001
2
4
Конкурентный анализ методом ИФА использовали для проверки того, конкурирует ли антитело двойной направленности DIG 0001 с VEGF и Ang2 за связывание с VEGFR-2 и Tie-2. Для этого отдельно VEGF 165 и Ang2-RBD распределяли по 200 нг по лункам 96-луночного планшета и для образования покрытия из антител 96-луночный планшет оставляли при комнатной температуре на день. Затем проводили реакцию с 2% обезжиренным молоком в ФБР при 37°С в течение 2 часов. После завершения реакции 96-луночный планшет промывали ФБР и в лунки с иммобилизованным VEGF165 вносили смеси из группы А (смеси данной группы готовили путем смешивания различных концентраций DIG 0001 (0-250 нМ) с VEGFR-2(ECD1-3)), содержащего 100 нг Fc), которые предварительно инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, саму реакция проводили при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем смеси из группы В (смеси данной группы готовили путем смешивания различных концентраций DIG 0001 (0-250 нМ) с 500 нг Tie-2-Fc), которые предварительно инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, вносили в лунки с иммобилизованным Ang2-RBD аналогично тому, как описано выше, саму реакцию проводили при комнатной температуре в течение 2 часов. По прошествии двух часов реакции 96-луночный планшет промывали ФБР и в каждую лунку, содержащую VEGF165, вносили 5 мкг/мл первичного антитела, антитела мыши к VEGFR-2 (Reliatech, Германия), реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа. После промывки лунок, содержащих Ang2-RBD, фосфатным буфером в каждую из лунок вносили 5 мкг/мл первичного антитела, антитела мыши к Tie-2 (Abeam, Великобритания), реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа аналогично тому, как описано выше. После этого во все лунки, содержащие как VEGF165, так и Ang2-RBD, вносили вторичное антитело, разведенное до уровня 1:5000, конъюгированное с ПХ антитело козы к IgG мыши (Abeam, Великобритания), реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа. Затем для инициирования хромогенной реакции использовали реагент-субстрат ТМВ (BD biosciences, США) и для остановки реакции добавляли 50 мкл 2Н раствора серной кислоты (HSO). Оценку прохождения хромогенной реакции проводили по спектральной поглощающей способности при 450 нм и 650 нм с использованием считывателя для микропланшетов (Tecan, Швейцария) (ФИГ.6).
Пример 5: Анализ выживаемости клеток HUVEC после воздействия DIG 0001
2
Для определения изменения жизнеспособности клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) после воздействия DIG 0001 проводили оценку их выживаемости. Инкубацию клеток HUVEC проводили в питательной среде M199 (Invitrogen, США), не содержащей фенолового красного и содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone, США), 100 единиц/мл пенициллина (Hyclone, США), 100 мкг/мл стрептомицина (Hyclone, США), 3 нг/мл фактора роста фибробластов (pstate Biotechnology, США) и 5 единиц/мл гепарина (Sigma-Aldrich, США), культивирование проводили в инкубаторе при 37°С, в атмосфере увлаженной воздушной смеси, содержащей 5% СO. Для оценки выживаемости клеток эндотелия сосудов данные клетки вносили в 24-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов до тех пор, пока плотность клеток не достигала 2×10 клеток на лунку. После этого 24-луночный планшет дважды промывали питательной средой M199 и в течение следующих 6 часов клетки инкубировали в питательной среде М199 с низким содержанием сыворотки (1% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone, США)). Клетки сначала обрабатывали различными концентрациями антитела в течение 30 минут и затем обрабатывали 10 нг/мл VEGF (R&D systems, США) и 100 нг/мл Ang1 (R&D systems, США). После инкубации в течение 48 часов клетки в течение 2 часов обрабатывали WST-8 (Dojindo, Япония) и измеряли поглощение при длине волны 450 нм. Затем сравнивали полученные данные о жизнеспособности клеток при различных условиях (ФИГ.7).
Пример 6: Анализ миграции клеток HUVEC после воздействия DIG 0001
Для определения ингибирования подвижности (хемотаксиса) Клеток HUVEC после воздействия DIG 0001 осуществляли оценку их миграции. Для оценки миграции клеток HUVEC использовали Трансвел - поликарбонатные вкладыши-фильтры в планшеты с размером пор 8 мкм (Coming, США). Перед использованием дно фильтров покрывали 10 мг желатина и высушивали. 10 нг/мл VEGF и 100 нг/мл Ang1 вносили в нижнюю лунку, содержащую питательную среду М199, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки эндотелия сосудов, которые предварительно инкубировали в питательной среде с низким содержанием сыворотки в течение 6 часов, разделяли трипсином и разводили в питательной среде М199, содержащей 1% эмбриональной бычьей сыворотки, до уровня плотности клеток 1×10 клеток/мл. Клетки эндотелия сосудов, предварительно обработанные различными концентрациями антитела в течение 30 минут, распределяли по 100 мкл по поверхности вкладыша Трансвел и инкубировали при 37°С в течение 3,5 часов в клеточном инкубаторе. Культивируемые клетки окрашивали гематоксилином и эозином (Sigma, СИТА) или кристаллическим фиолетовым (Sigma, США), клетки, которые не мигрировали и остались на внешней поверхности фильтра, удаляли при помощи щеточки, клетки, которые мигрировали и оказались на внутренней стороне фильтра, оставляли. Для сравнения числа мигрировавших клеток данные клетки фотографировали при 100-кратном увеличении с помощью микроскопа (Olympus, IХ71, Япония) с цифровой камерой, подсчет и анализ проводили по результатам 10 фотографий, полученных для каждого варианта условий анализа (ФИГ.8).
Пример 7: Анализ ингибирования фосфорилирования VEGFR-2 и Tie-2 в клетках с использованием методов иммунопреципитации и вестерн-блоттинга
Для оценки ингибирования фосфорилирования VEGFR-2 и Tie-2 при воздействии DIG 0001 проводили анализ методом иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Клетки эндотелия сосудов после культивации в течение 24 часов инкубировали в течение 6 часов в питательной среде M199, содержащей 1% эмбриональной бычьей сыворотки, а затем подвергали предварительной обработке антителом DIG 0001 26,7 мкг/мл в течение 30 минут. После этого клетки эндотелия сосудов обрабатывали VEGF в концентрации 10 нг/мл и Ang1 в концентрации 100 нг/мл в течение 15 минут. Для анализа методом иммунопреципитации клетки эндотелия сосудов промывали холодным ФБР и обрабатывали 500 мкл буферного раствора для иммунопреципитации (1% Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40, 50 мМ Tris/HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 2 мМ оргованадата натрия, 2 мМ ЭГТА, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 1 мМ фторида натрия). Раствор собирали с помощью скребка, пропускали несколько раз через шприц (калибр иглы 26), добивались достаточной степени гомогенизации и центрифугировали в течение 10 минут при 12000g с последующим сбором супернатанта. К 300 мкг раствора добавляли 2 мкг иммунопреципитирующих антител к Tie-2 (R&D systems, США), реакцию проводили в течение 8 часов. Затем добавляли иммобилизованный на агарозе белок A/G (Santa Cruz Biotechnology, США), который связывался с иммунопреципитирующим антителом. Полученный в результате иммунный комплекс, связанный с иммобилизованном на агарозе белком A/G, центрифугировали и 3-5 раз промывали буферным раствором. Затем, для удаления агарозных преципитатов, добавляли буфер для образцов на основе ДСН, кипятили и центрифугировали.
Для анализа методом вестерн-блоттинга клетки эндотелия сосудов обрабатывали лизирующим буферным раствором (1% (мас./об.) ДСН, 10 мМ Tris (pH 7,4), 2 мМ оргованадата натрия, 2 мМ ЭГТА, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 1 мМ фторида натрия) с получением раствора, который, для удаления нерастворимых преципитатов, кипятили и центрифугировали при 4°С при 10000 g в течение 5 минут. Супернатант смешивали с буфером для образцов на основе ДСН и кипятили в течение 10 минут. ДСН-ПААГ и вестерн-блоттинг проводили согласно способам, широко используемым в данной области, с использованием следующих материалов: 12% ДСН-полиакриламидный гель, ПВДФ-мембрану (Millipore #IPVH00010, США), антитело к Tie-2 (abeam, Великобритания) и в качестве первичного антитела для анализа активности ингибирования фосфорилирования Tie-2 антитело к фосфорирозину (Upstate Biotechnology, США); антитело к р44/42 (Cell Signaling technology, США) и антитело к фосфо р44/42 (Cell Signaling technology, США); антитело к АКТ (Cell Signaling technology, США) и антитело к фосфо-АКТ (Cell Signaling technology, США); антитело к VEGFR-2 (Cell Signaling technology, США) и в качестве первичного антитела для анализа активности ингибирования VEGFR-2 антитело к фосфо-VEGFR-2 (Cell Signaling technology, США); антитело к АКТ (Cell Signaling technology, США) и антитело к фосфо-АКТ (Cell Signaling technology, США); и в качестве вторичных антител, связывающихся с первичными антителами для хемилюминисценции, конъюгированное с ПХ антитело козы к мышиному IgG (Santa Cruze Biotechnology, США) и конъюгированное с ПХ антитело козы к кроличьему IgG (Santa Cruze Biotechnology, США) 9).
Пример 8: Ингибирование роста опухоли под действием DIG-0001 в модели глиобластомы у животного
5
2
В качестве носителей ортотопической глиобластомы использовали самцов мышей линии Balb/c-nu (Япония SLC), свободных от конкретных патогенов. Согласно известным методам провели интрацеребральную трансплантацию глиобластомы U-87MG (2×10 клеток, из Американской Коллекции Типовых Культур). На следующий день после интрацеребральной трансплантации глиобластомы мышей разделили на две группы (n=4) и животным вводили следующее: (а) внутрибрюшинную инъекцию ФБР и (б) внутрибрюшинную инъекцию 0,5 мг/кг DIG-0001. Все инъекции повторяли 5 раз (на 15, 18, 21, 24 и 27 день после внесения неопластических клеток). На 29 день после трансплантации неопластических клеток мышей умерщвляли, мозг извлекали и делали фронтальные срезы. Один фрагмент фиксировали в забуференном растворе 10%-ного формалина и фиксировали в формалине, оставшиеся срезы заключали в оптимальную среду для замороженных срезов (ОСТ). Объем опухоли определяли путем измерения объема фрагмента, наиболее пораженного опухолью, и вычисляя объем по следующей формуле: Ширина × Длина × 0,5 (ФИГ 10).
Промышленная Применимость
Композицию согласно настоящему изобретению можно использовать для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний, в частности рака.
Не смотря на то что был проиллюстрирован предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что могут быть сделаны изменения и модификации, которые не будут выходить за рамки настоящего изобретения в его самых широких аспектах. Различные признаки настоящего изобретения приведены в нижеизложенной Формуле Изобретения.