СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК Coxiella burnetii
METHOD OF PREPARING BIOLOGICAL MATERIAL FOR ISOLATION OF Coxiella burnetii DNA

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, инфекционным болезням, и может быть использовано для подготовки биологического материала для выделения ДНК Coxiella burnetii из тромбоцитов.
Для постановки диагноза лихорадки КУ в практическом здравоохранении продолжают использовать серологические тесты (реакция связывания комплемента, метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный анализ), в основу которых заложено обнаружение и рос титра антител на антиген Coxiella burnetii. Однако, как правило, антитела появляются в крови пациентов в конце второй, в начале третьей недели заболевания, что, безусловно, затрудняет диагностику данного риккетсиоза, для которого характерен полиморфизм клинической картины, длительность течения заболевания и специфичность лечения.
В настоящее время во всем мире широкое распространение получил метод выявления генома возбудителей инфекционных заболеваний в виде полимеразной цепной реакции, который обладает высокой специфичностью, чувствительностью и визуализацией результатов (Angelakis E, Raoult D. Q fever. // Vet Microbiol. - 2009. - №7. - Vol.8). При этом выделение генома инфекционного агента из исследуемого биологического материала позволяет утверждать о тропности возбудителя к данным клеткам органов и систем.
На сегодняшний день считается, что Coxiella burnetii паразитируют клетки соединительной ткани и ретикулоэндотелиальной системы, при этом гистиоциты и макрофаги используются как плацдарм для их размножения и, в свою очередь, лейкоциты являются носителями генома возбудителя. Это утверждение основывается на анализе многих клинических наблюдений и патоморфологических данных модели лихорадки КУ на животных (Лобан К.М. Важнейшие риккетсиозы человека (руководство для врачей). - Л.: Медицина, 1980. - 376 с., ил.; Хавкин Т.Н. Патологоанатомическое и экспериментальное изучение морфологии Куриккетсиоза // Архив патологии. - 1977. - №2. - Т.39. - Вып.2. - С.75-83; Балаева Н.М. Взаимодействие риккетсий с клетками - эукариотами // ЖМЭИ. - 1990. - №2. - С.80-86). Поэтому известный метод-прототип подготовки биологического материала для идентификации ДНК Coxiella burnetii в полимеразной цепной реакции основывается на получении лейкоцитарного осадка (Инструкция по применению тест-системы «АмплиСенс»). Он заключается в проведении двух этапов центрифугирования плазмы, полученной из цельной периферической крови с 6% раствором ЭДТА в соотношении 1:20. Для исследования лейкоцитарной фракции 1,5 мл крови с раствором ЭДТА переносят в пробирку типа эппендорф и центрифугируют на микроцентрифуге при 700 g в течение 10 минут. Затем отбирают 500-600 мкл плазмы и центрифугируют при 12000 g в течение 10 минут. После чего оставляют для выделения ДНК осадок клеток, состоящий преимущественно из лейкоцитов и 200 мкл надосадочной плазмы над клетками.
Однако недостатком данного метода является то, что в биологическом материале присутствуют примеси - ингибиторы полимеразной цепной реакции. Известно, что гемоглобин, высвобожденный из контаменированных эритроцитов, снижает активность ДНК-полимераз либо через связывание с ней, либо через нарушение ее пространственной структуры с последующей утратой активности (Костюк С.А., Кулага O.K., Хворик Д.Ф. Новые аспекты клинического применения полимеразной цепной реакции // Журнал «Медицинские новости». - 2006. - №5. - С.14-18). В результате существенно снижается качество реакции и возможны отрицательные результаты в диагностике лихорадки КУ.
Задачей предлагаемого способа подготовки биологического материала является выделение тромбоцитов как носителей геномной ДНК Coxiella burnetii для постановки полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Изобретение направлено на повышение качества выделения генома ДНК Coxiella burnetii для диагностики лихорадки КУ.
Указанный технический результат достигается тем, что 4-5 мл крови из кубитальной вены набирают в стандартные пробирки для полимеразной цепной реакции с напылением на стенках динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, которую отстаивают в течение трех часов для выпадения эритроцитов в осадок, а затем отбирают 700-800 мкл плазмы и разводят 0,11% фосфатным буфером, содержащим 20 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, в соотношении 1:1, после чего центрифугируют в течение 10 минут при 700g на микроцентрифуге «miniSpin» и получают верхние слои плазмы, содержащие тромбоциты, для выделения которых 800 мкл надосадочной плазмы соединяют с ACD-буфером в соотношении 8:1 и вновь центрифугируют на микроцентрифуге «miniSpin» в течение 10 минут при 12000 g, при этом получают осадок тромбоцитов, пригодных для выявления ДНК Coxiella burnetii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.
Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что авторы впервые для выявления ДНК Coxiella burnetii использовали осадок тромбоцитов как носителей генома возбудителя, ссылаясь на данные клинических наблюдений с констатацией фактов патологических изменений в системе гемостаза в виде тромбоцитопении, кровотечений, геморрагической сыпи (Лобан К.М. Важнейшие риккетсиозы человека (руководство для врачей). - Л.: Медицина, 1980. - 376 с., ил.; Пашанина Т.П., Рыбкина Р.А., Смелянский В.П. Ку-лихорадка: Этиология, эпидемиология, клиника, лабораторная диагностика, лечение: Методические рекомендации. - Волгоград: Изд-во ВолГУ, 2004. - 28 с.).
Предлагаемый способ позволяет рассматривать тромбоциты как мишень паразитирования Coxiella burnetii и определяет новую биологическую среды для выделения возбудителя, в результате чего увеличивается процент регистрации лихорадки КУ среди больных инфекционного профиля с недифференцированными диагнозами.
Для исследования использовали венозную кровь 41 больного в возрасте 39,9±0,75 лет, у которых регистрировали характерные клинические симптомы лихорадки КУ. Забор крови производили в среднем на 5,7±0,38 день болезни.
Для улучшения диагностики лихорадки КУ в полимеразной цепной реакции необходимо блокировать ингибиторы ДНК-полимераз. В предлагаемом способе это достигается более длительным по времени осаждением эритроцитов и истощением активности контаминантных ферментов плазмы ACD- и фосфатным буферами. Исключить разрушение тромбоцитов возможно соблюдением предлагаемого режима центрифугирования.
3

Способ осуществлялся следующим образом: из локтевой вены 4-5 мл крови набирают в стандартные пробирки для полимеразной цепной реакции с напылением на стенках динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-К). Далее отстаивают кровь в течение трех часов для выпадения эритроцитов в осадок. Затем отбирают 700-800 мкл плазмы и разводят фосфатным буфером (0,11%), содержащим 20 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, в соотношении 1:1. Далее центрифугируют в течение 10 минут при 700g на микроцентрифуге «miniSpin». В результате этого этапа осаждаются лейкоциты, а верхние слои плазмы содержат тромбоциты. Для их выделения отбирают 800 мкл надосадочной плазмы и соединяют с ACD-буфером в соотношении 8:1 и вновь центрифугируют на микроцентрифуге «miniSpin» в течение 10 минут при 12000 g. В состав ACD-буфера входят: лимонная кислота (0,8%), цитрат натрия (2,2%), глюкоза (2,4%). В результате второго этапа получают осадок тромбоцитов, который и является биологическим материалом для выявления ДНК Coxiella burnetii методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, изложенного в инструкции по применению тест-системы «АмплиСенс С. burnetii» - FRT.
С целью контроля чистоты выделения тромбоцитов из осадка мы делали мазки, окрашенные по Романовскому. Частота выделения их составляла 99%.
Предлагаемый способ апробирован на базе Государственного учреждения здравоохранения «Областной инфекционной клинической больницы им.A.M.Ничоги» г.Астрахани, кафедры инфекционных болезней Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия», Федерального государственного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример №1.
3
Кровь из вены больного П., в возрасте 27 лет, медицинская карта №3535., на пятый день болезни набирали в две стандартные пробирки для полимеразной цепной реакции с напыление на стенках динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА-К) в количестве 4 мл. Для исследования лейкоцитарной фракции из первой пробирки 1,5 мл крови переносили в пробирку типа эппендорф и центрифугировали на микроцентрифуге «miniSpin» при 700g в течение 10 минут. Затем отбирали приблизительно 600 мкл плазмы и центрифугировали при 12000 g в течение 10 минут. После чего проводили выделение ДНК из данного материала методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени согласно Инструкции по применению тест-системы «АмплиСенс».
Кровь во второй пробирке отстаивали в течение трех часов для выпадения эритроцитов в осадок. Затем отбирали 800 мкл плазмы и разводили фосфатным буфером, содержащим 20 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, в соотношении 1:1. Далее центрифугировали в течение 10 минут при 700 g на микроцентрифуге «miniSpin». Затем отбирали 800 мкл надосадочной плазмы и соединяли с ACD-буфером в соотношении 8:1 и вновь центрифугировали на микроцентрифуге «miniSpin» в течение 10 минут при 12000 g. Из полученного осадка проводили выделение ДНК методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени согласно Инструкции по применению тест-системы «АмплиСенс».
На рисунке 1а представлены кривые флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля (ВКО) тромбоцитов и лейкоцитов, а на рисунке 1б - амплификации Coxiella burnetii из них. В данном случае амплификация ДНК в лейкоцитах произошла раньше на 0,57, чем в тромбоцитах, так как уровень порогового цикла у тромбоцитов составлял «Ct» - 19,06, а лейкоцитов «Ct» - 18,49, но, тем не менее, ДНК Coxiella burnetii была выделена из обеих сред.
Пример №2
Кровь больного Д., в возрасте 25 лет, медицинская карта №3573, обрабатывали, как в примере 1. На рисунке 2а представлены кривые флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля тромбоцитов и лейкоцитов. В отличие от первого рисунка на 2б уровень порогового цикла тромбоцитов ниже, чем у лейкоцитов на 5,82, те самым подтверждает более высокую чувствительность определения генома возбудителя из тромбоцитов.
Пример №3
Кровь больного А., в возрасте 26 лет, медицинская карта №3589, обрабатывали, как в примере 1. На рисунке 3а представлены кривые флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля тромбоцитов и лейкоцитов. На рисунке 3б подобно предыдущему примеру отображена более ранняя амплификации Coxiella burnetii в тромбоцитах, чем в лейкоцитах, при этом разница в уровнях порогового цикла составляет 1,05, подтверждая более высокую чувствительность определения генома возбудителя из тромбоцитов.
Пример №4
Кровь больного Б., в возрасте 50 лет, медицинская карта №4352, обрабатывали, как в примере 1. На рисунке 4а представлена кривая флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля из лейкоцитов, а на рисунке 4б его нет. На основании этого можно утверждать об отсутствии ДНК Coxiella burnetii в выделенном осадке лейкоцитов, что позволит в клинической практике в данном случае снять диагноз лихорадка КУ. Однако из осадка тромбоцитов, выделенных предлагаемым методом, удалось детектировать флуоресцентный сигнал в режиме реального времени в «Ct» равном 26,36 (рис.4г), при их внутреннем контроле «Ct» - 16,56 (рис.4в). Таким образом, подтвердив клинический диагноз.
Пример №5
Кровь больного М., в возрасте 57 лет, медицинская карта №4723, обрабатывали, как в примере 1.
На рисунке 5а представлена кривая флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля из лейкоцитов. В данном случае подобно предыдущему был получен отрицательный результат амплификации ДНК Coxiella burnetii из лейкоцитов (рис.5б). Однако из осадка тромбоцитов была осуществлена детекция флуоресцентного сигнал в режиме реального времени в «Ct» равном 22,94 (рис.5г) при внутреннем контроле «Ct» - 15,8 (рис.5в)
Пример №6
Кровь больной Е., в возрасте 30 лет, медицинская карта №4539, обрабатывали, как в примере 1. В данном примере геном возбудителя был выделен только из лейкоцитов. На рисунке 6а представлена кривая флуоресцентного сигнала в режиме реального времени внутреннего контроля из осадка лейкоцитов, а на рисунке 6б - результат амплификации ДНК Coxiella burnetii. В данном случае из осадка тромбоцитов геном возбудителя лихорадки Ку был не выделен, что подтверждает отсутствие кривой флуоресцентного сигнала на рисунке 6 г, при внутреннем контроле «Ct» - 16,58 (рис.6в).
Сравнительное изучение эффективности выделения ДНК Coxiella burnetii из тромбоцитов и лейкоцитарного осадка выявило, что наибольшее число положительных результатов ПЦР наблюдалось в апробируемом варианте, так как в 18% случаев диагноз лихорадка КУ был снят из-за того, что возбудитель не был выделен из лейкоцитов (рис.7).
Таким образом, предлагаемый способ подготовки биологического материала для проведения выделения ДНК Coxiella burnetii улучшает качество выделения генома ДНК Coxiella burnetii, увеличивая результат диагностики лихорадки КУ в практическом здравоохранении и, особенно в период эпидемиологического подъема заболеваемости данного риккетсиоза.