Штаммы-деструкторы хлорфеноксикислот гамма подкласса протеобактерий

Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13, № 5

УДК 579.222:547.36

ШТАММЫ-ДЕСТРУКТОРЫ ХЛОРФЕНОКСИКИСЛОТ ГАММА - ПОДКЛАССА ПРОТЕОБАКТЕРИЙ

©2011 Т.В. Маркушева, Е.Ю. Журенко, Н.В. Жарикова, В.В. Коробов, Т.Р. Ясаков, Л.Г. Анисимова

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа

Поступила 27.08.2011

В работе описываются новые штаммы -деструкторы хлорфеноксикислот, относящиеся к гамма-подклассу протеобактерий родов Agrobacterium, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas vi Xanthomonas.

Ключевые слова: бактерии-деструкторы, хлорфеноксиуксусные кислоты

Известно, что прокариоты играют существенную роль в ассимиляции синтетических органических соединений.

Вместе с тем, обнаруживается недостаточное понимание участия представителей отдельных филогенетических групп бактерий в процессах конверсии стойких токсичных производных ароматического ряда.

Указанное обстоятельство является сдерживающим фактором развития выгодных технологий рационального использования природных ресурсов.

Целью настоящей работы являлось выявление роли представителей гамма - подкласса протеобактерий в конверсии хлорфеноксикислот.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектами исследования являлись культуры бактерий, выделенные из образцов микробных популяций почвенной биоты Северного промузла города Уфы.

Чистые культуры выделяли по методу Коха с небольшими модификациями [2, 4]. При идентификации изолятов использовали 9-е издание руководства «Определитель бактерий Берджи» [3], а также применяли методы молекулярного типирования по последовательности 16S рРНК. Визуализацию микробных клеток осуществляли путем атомно-силовой микроскопии на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия).

Рост культур производили в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Анализ содержания хлорфеноксикислот в культу-ральной жидкости проводили согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» [1].

Маркушева Татьяна Вячеславовна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru., Журенко Евгения Юрьевна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Жарикова Наталья Владимировна, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Коробов Владислав Викторович, канд. биол. наук, e-mail: tvmark@anrb.ru; Ясаков Тимур Рамилевич, канд. биол. наук, e-mail: yasakovt@gmail.com; Анисимова Лилия Георгиевна, e-mail: anisimovalilya@gmail.com

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С применением селективных сред из образцов смешанных популяций почвенных микроорганизмов, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства были выделены культуры деструкторов хлорфеноксикислот, включая, 4-хлорфеноксиуксусную (4-ХФУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусную (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную (2,4,5-Т) кислоты.

Изоляты были идентифицированы согласно совокупности морфометрических, культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, а также в соответствии с принципами молекулярного типирования по последовательности генов 16S рРНК как штаммы Agrobacterium tumefaciens 21SG, Brenneria salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Pantoea agglomerans 36P, Pseudomonas fluorescens 39D, Raoultella planticola 33 4CPA, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ иXanthomonas sp. 33DCP.

Результаты таксономического определения вновь выделенных культур позволили увидеть, что в составе биоты техногенной экосистемы присутствовали деструкторы нескольких филогенетических групп протеобактерий, а именно, бактерий родов: Agrobacterium, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas

и Xanthomonas.

В модельной системе проведен анализ деградации хлорфеноксикислот в условиях использования ксенобиотиков в качестве источников углерода и энергии (табл. 1).

Из данных таблицы 1 видно, что штаммы имеют различия в уровнях утилизации 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т. Существенное снижение 4-ХФУК - до 90%, наблюдалось для культуры Р. agglomerans 36Р.

Меньший уровень использования данного субстрата был обнаружен для Xanthomonas sp. 33DCP (примерно 78%) и Р. fluorescens 39D (81%).

Штаммы Р. fluorescens 39D и Stenotrophomonas sp. ЗЗТ утилизировали 82% - 88% 2,4-Д от начальной концентрации.

Наиболее активной по отношению к 2,4,5-Т являлась культура А. tumefaciens 21SG, утилизировавшая 82% субстрата. Высокий уровень конверсии 2,4,5-Т также показал Citrobacter sp. 36 4СРА (около 76%).

Проблемы прикладной экологии

Таблица 1. Остаточное содержание субстратов в среде культивирования периодических культур вновь выделенных штаммов-деструкторов

ШТАММ ОСТАТОЧНОЕ СОДЕРЖАНИЕ СУБСТРАТОВ, %

4-ХФУК 2,4-Д 2,4,5-Т

Agrobacterium tumefaciens 21SG 37,6 34,1 18,0

Brenneria salcis 38P 53,3 62,7 -

Citrobacter sp. 36 4CPA 26,9 34,0 24,2

Enterobacter asburia 33D 38,2 30,3 37,0

Pantoea agglomerans 36P 10,1 62,0 26,6

Pseudomonas fluorescens 39D 19,0 18,4 34,6

Raoultella planticola 33 4CPA 11,0 62,7 50,9

Stenotrophomonas sp. 33T 58,1 16,3 27,0

Xanthomonas sp. 33DCP 21,4 40,1 35,3

Следует отметить, что ранее в исследованиях ряда авторов были описаны представители родов Citrobacter [8, 9] и Pseudomonas [5-7, 10], способные к деградации хлорированных производных феноксиуксусной кислоты.

Принимая во внимание то, что среди деструкторов не были описаны представители родов Agrobacterium, Brenneria, Enterobacter, Pantoea, Raoultella, Stenotrophomonas и Xanthomonas, следует сделать вывод о том, что на примере вновь выделенных культур были впервые обнаружены способности микроорганизмов указанных таксонов гамма-подкласса протеобактерий вовлекать хлор-феноксикислоты в обмен веществ и энергии.

Работа выполнена при поддержке гранта Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов».

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Методы определения микроколичеств пестицидов / под ред. Клисенко М.А. М.: Медицина, 1984. 256 с.

2. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. проф. Звягинцева Д.Г. М.: МГУ, 1980. 224 с.

3. Определитель бактерий Берджи / под ред. Хоулта Дж. и

др. 9-е изд. М.: Мир, 1997. 799 с.

4. Практикум по микробиологии. М.: МГУ, 1976. 307 с.

5. BhatM.A., TsudaM., Horiike К., Nozaki М., Vaidyanathan C.S., Nakazawa Т. Identification and characterization of a new plasmid earring genes for degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetate from Pseudomonas cepacia CSV90 //Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60. №1. P. 307-312.

6. Friedrich В., Meyer M., Schlegel H.G. Transfer and expression of the herbicide-degrading plasmid pJP4 in aerobic autotrophic bacteria//Arch. Microbiol. 1983. V. 134. P. 9297.

7. Herrmann H., Muller C., Schmidt I., Mahnke J., Petruchka L., Hahnke К Tocalization and organization of phenol degradation genes of Pseudomonas putida strain H // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 247. № 2. P. 240-246.

8. Martinez M, BaezaJ., Freer J., Rodriguez J. Chlorophenol tolerant and degradative bacteria isolated from a river receiving pulp mill discharges // Toxicological and Environmental Chemistry. 2000. V. 77. P. 159-170.

9. Narde K, Kapley A., Purohit J. Isolation and characterization of Citrobacter strain HPC255 for broad-range substrate specificity for chlorophenols //Current Microbiology. 2004. V. 48. P. 419-423.

10. Radjendirane V., Bhat M.A., Vaidyanathan C.S. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia II Archives of Biochemistry and Biophysics. 1991. V. 288, №1. P.169-176.

CHLOROPHENOXYACETIC ACIDS BACTERIA-DESTRUCTORS OF PROTEOBACTERIA GAMMA - SUBCLASS

©2011 T.V. Markusheva, E.Y. Zhurenko, N.V. Zharikova, V.V. Korobov, T.R. Yasakov, L.G. Anisimova.

Institute of Biology, Ufa Sei. Centre of RAS, Ufa

New chlorophenoxyacetic acids bacteria - destructors of Agrobacterium, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas and Xanthomonas genera of Proteobacteria gamma-subclass have been investigated in this work.

Key words: bacteria-destructors, chlorophenoxyacetic acid.

Markusheva Tatiana Vyacheslavovna, Candidate of Biology, email: tvmark@anrb.ru.; Zhurenko Eugene Yur'evna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Zharikova Natalia Vladi-mirovna, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Korobov Vladislav Viktorovich, Candidate of Biology, e-mail: tvmark@anrb.ru; Yasakov Timur Ramilevich, Candidate of Biology, e-mail: yasakovt@gmail.com; Anisimova Lilya Geor-gievna, e-mail: anisimovalilya@gmail.com