СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ КОРОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ПОЛИМОРФИЗМУ В ГЕНЕ LEP
METHOD FOR DETERMINING PRODUCTIVITY OF COWS OF CATTLE BY POLYMORPHISM IN LEP GENE

Изобретение относится к селекции и генетике крупного рогатого скота и предназначено для раннего отбора животных с целью увеличения массы тела в популяциях скота крупного рогатого скота.
Согласно литературным данным существует много данных относительно использования маркеров для оценки генетического потенциала коров молочного направления, в частности, на основе анализа ДНК-полиморфизма гена гормона роста (MspI-полиморфизм). Известен способ оценки генетического потенциала коров на жирномолочность на основе анализа ДНК-полиморфизма гена гормона роста (MspI-полиморфизм), который заключается в поиске MspI(-)-аллели, коррелирующей с высоким содержанием жира в молоке [1].
Известен способ определения генетически обусловленного уровня белка и жира в молоке коров на основе Rsal-полиморфизма гена пролактина и AluI-полиморфизма гена гормона роста [2].
Относительно мясного направления, то данных в этой области не так много.
Известен способ отбора крупного рогатого скота по мясной продуктивности, основанный на выявлении наличия эритроцитарных антигенов-маркеров двух видов: антигенов повышенной энергии роста и антигенов пониженной энергии роста [3]. Недостатком этого способа является низкая точность прогнозирования и использование сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, также не учитываются генетические аспекты.
Известен способ отбора молодняка крупного рогатого скота по скорости роста, основанный на выявлении животных, имеющих однонуклеотидный полиморфизм гена фактора некроза опухолей [4]. Недостатком этого способа является то, что этот ген используется как молекулярно-генетический маркер наследственных аномалий, продуктивности, устойчивости к болезням. Точных данных по влиянию на продуктивность крупного рогатого скота нет.
Предлагаемый способ основан на использовании однонуклеотидных полиморфизмов гена LEP в позициях 528 экзона 2 промотора бычьего лептина, связанного с повышенной продуктивностью, к использованию такого способа в прогнозировании формирования хозяйственно-полезных признаков. Генетический потенциал КРС оценивают путем ДНК-тестирования (ПЦР-метод) генотипов животных по ДНК-маркеру гена LEP, определяющих повышенное или пониженное содержание жира в мясе, в двух позициях SNP согласно разработанному перечню генотипов. Способ позволяет проводить ранний отбор перспективных животных для мясного животноводства и принимать решение о целесообразности использования особей с желательными генотипами для осуществления селекционного процесса.
Данный способ включает в себя включает выделение ДНК из крови с дальнейшим генотипированием коров с помощью полимеразной цепной реакции с использованием праймеров на основе SNP в позиции 528 экзона 2 промотора бычьего лептина и отбор животных гетерозиготных С/Т матерей по гену LEP.
Материалы и методы
1.1 Выделение ДНК
Для исследований были отобраны пробы венозной крови у коров абердино-ангусской породы, разводимых в хозяйстве СПК «Кирзинский» в Новосибирской области. Эти животные исследованы по SNPs LEP 528 С/Т. Полученные данные позволили разделить животных по генотипу. Были проанализированы показатели живой массы у генотипированных животных.
ДНК из цельной крови животных (n=79) изолировали с помощью коммерческого набора Проба-ГС (ДНК-технология, Россия) согласно инструкции.
Качество выделенной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле.
1.2 Генотипирование
Количественную полимеразную цепную реакцию проводили на Bio-Rad CFX 96 (Bio-rad, USA). Смешивали в пробирке 0,2 мл следующие компоненты: готовая смесь для ПЦР qPCRmix-HS (Евроген, Россия) - 5 мкл, 5 мкМ прямой праймер - 1 мкл; 5 мкМ обратный праймер - 1 мкл; 5 мкМ каждого из двух зондов - 1 мкл; ДНК матрица - 2 мкл; деионизованная вода - до 25 мкл. ПЦР проводили по следующему протоколу: первоначальный прогрев 37°С в течение 5 мин; денатурация при 94°С в течение 5 мин; далее 40 циклов: 94°С - 15 сек; 60°С - 1 мин.
Для генотипирования SNP использовали как известные последовательности праймеров и зондов, опубликованные ранее, так и разработанные нами праймеры и зонды:
Для идентификации SNP в позиции 528 экзона 2 промотора бычьего лептина (Nkrumah, 2005) использовали разработанные ранее нуклеотидные последовательности праймеров и зондов:
Прямой: AGGTGCCCAGGGACTCA;
Обратный: CAACAAAGGCCGTGTGACA;
Зонд 1: FAM-CAAGCTCTAGAGCCTGTGT-BHQ1.
Зонд 2: HEX-AAGCTCTAGAGCCTATGT-BHQ1.
Совпадение последовательности зонда и целевой последовательности ДНК приводит к амплификации, во время которой происходит расщепление и высвобождение репортерного красителя. Существенное увеличение сигнала флуоресценции для одного или другого из двух красителей указывает на гомозиготность по определенному аллелю, тогда как увеличение флуоресценции обоих красителей указывает на гетерозиготность аллеля.
Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:
p=n/N,
где р - частота определения генотипа,
n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.
Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:
РА=(2nAA+nAB): 2N qB=(2nBB+nAB): 2N,
где РА - частота аллеля A, qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.
По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции. Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием стандартных программ.
Результаты были обработаны с использование методов вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica V10 (StatSoft Inc., USA).
При обработке результатов рассчитывали стандартную отклонения (Sx) и ошибку среднего значения (S).
Результаты
Анализ результатов оценки частоты встречаемости желательного аллеля Т полиморфизма гена LEP 528 С/Т среди образцов ДНК крупного рогатого скота показал, что 43% животных имеют данную форму, соответственно аллель С распространена у 56% животных (таблица 1).
Поскольку данных по встречаемости аллелей недостаточно для оценки степени распространения полиморфизма гена LEP 528 С/Т, далее был проведен анализ встречаемости желательных генотипов в исследуемой микропопуляции. Так, в ходе исследования выявлено, что частота встречаемости желательного генотипа ТТ гена LEP 528 С/Т составляет 19%, на долю остальных генотипов приходится 81%, 30% из которых составляет гомозиготное состояние (СС), а 51% гетерозиготное его проявление (СТ).
Оценивая взаимосвязь наличия полиморфизма гена LEP 528 С/Т с показателями живой массы можно отметить, что максимальная живая масса характерна для животных с генотипом СТ (589,6 кг), что на 0,3%) больше, чем в контрольной группе и на 5,6% в группе, имеющих полиморфизм гена LEP 528 С/Т (Фиг. 1).
Обобщая вышеизложенное можно сделать вывод о том, что животные, имеющие гетерозиготное проявление полиморфизма гена LEP 528 С/Т позволяют получить максимальную живую массу и могут быть использованы для отбора для откорма и селекционного процесса.
Список литературы
1. Falaki М., Gengler N., Prandi A. et al. Relationships of polymorphism for growth hormon and growth hormone reseptor genes with milk production for Italian Holstein-Friesian bulls // Journal of Dairy Science. 1993. V.76, p.149
2. Chrenek P., Huba J., Hetenyi L., Peskovieova D., Bulla J. Genotypes of bGH and bPRL genes in relationships to milk production // Proceedings of the 50™ Annual Meeting of the EAAP. Zuerich. Book of Abstracts. 1999, p. 40; Dybus A. Assaciations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes polymorphisms with milk production traits in Plish Black-and-White cattle // Animal Skiense Papers and Reports. 2002. V.20. N.4, p. 203-212
3. Zheltikov A.I. Immunogenetic structure in a population of Black and White cattle in West Siberia / A.I. Zheltikov, V.G. Marenkov, V.L. Petukhov // XXVth International Conference on Animal Genetics, 1996. - P. 61-62
4. Tong B. Association of the expression levels in the skeletal muscle and a SNP in the CDC 10 gene with grownh-relates traits in Japanese black beef cattle / B. Tong, G.P. Li, S. Sasaki et.al. // Animal genetics. - 2015. - V. 46. - №2. - P. 200-204.