Модифицированный метод исследования аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 в сперме быков-производителей

УДК 577.21:636.23.082.2

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА BOLA-DRB3 В СПЕРМЕ БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ

* Е. М. ЧЕРНИКОВА, И. Е. ЗАЙЦЕВА, ** Н. И. ГАВРИЧЕНКО

*УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», г. Горки, Могилевская обл., Республика Беларусь, 213407

** УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины», г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Резюме. В результате исследований модифицирован и апробирован метод ПЦР-ПДРФ исследования аллельного полиморфизма гена Bola-DRB3. Метод пригоден для массового типирования животных и позволяет точно идентифицировать аллели гена BoLA DRB 3. Метод рекомендуется для определения аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 в сперме быков-производителей.

Ключевые слова: быки-производители, сперма, ген, полиморфизм, амплификация.

Summary. The result of this research modified and tested a PCR-RFLP study of the allelic polymorphism of Bola-DRB3. The method is suitable for mass typing of animals and allows you to accurately identify alleles of BoLA DRB 3 gene. Recommended method to determine the allelic polymorphism ofgene BoLA-DRB3 in the semen of bulls.

Key words: bulls, semen, gene, polymorphism, amplification.

Введение. Опыт зарубежных стран показывает, что рентабельность молочного скотоводства зависит, прежде всего, от способности к расширенному воспроизводству, продуктивности и длительности периода хозяйственного использования животных. Темпы генетического улучшения молочного скота на 85-90 % определяется племенной ценностью быков-производителей. Поэтому, оценка их генетических качеств является одним из главных звеньев племенной работы. Однако в нашей республике работа, связанная с оценкой быков-производителей по группам признаков, связанных с воспроизводством и продуктивным долголетием, практически не ведется. Следовательно, крайне необходим дополнительный критерий подбора производителей по данным признакам.

Анализ источников. Развитие современной молекулярной биологии, в частности, молекулярной генетики, привело к изменениям во многих представлениях о путях и методах, позволяющих тщательно регулировать фенотипическое проявление хозяйственно-полезных признаков животных на основе их генетических детерминант, а также прогноза и лечения заболеваний [6]. Основной частью современной технологии селекции сельскохозяйственных животных является применение молекулярно-генети-

ческих маркеров, позволяющее оптимизировать селекционный процесс на основе изучения генетической индивидуальности особей.

С появлением совершенно новых высокоэффективных методов генетического анализа специфики полиморфизма генов на уровне ДНК, участвующих в формировании хозяйственно-полезных признаков, либо близко сцепленных с ними, открываются широкие перспективы для проведения генной (gene assisted selection - GAS) или маркер-зависимой (marker assisted selection - MAS) селекции. Современные ДНК-технологии маркирования геномов имеют преимущества и позволяют идентифицировать генотипы животных одновременно по десяткам тысяч локусов [4].

Проведя анализ литературы, мы выбрали в качестве гена-маркера высоко полиморфный ген крупного рогатого скота (BoLA-DRB3), связанный с воспроизводительной способностью, продуктивностью, иммунной компетентностью и продуктивным долголетием животных [3, 5, 7]. Из трех генов DRB II класса главного комплекса гистосовместимости, присутствующих в геноме крупного рогатого скота, оказывается, что только ген DRB3 функционально выражен [6]. Высокий уровень полиморфизма гена BoLA-DRB3 позволяет использовать его как высокоинформативный маркер для изучения генетического разнообразия. Ген BoLA-DRB3 может быть использован в качестве маркера уровня полиморфизма генома животных и являться важным показателем в целом для всей популяции, а полученные данные по аллельному полиморфизму гена BoLA-DRB3 могут стать фундаментальной основой для разработки селекционно -генетических подходов в животноводстве.

Цель работы - совершенствование метода ПЦР-ПДРФ исследования аллельного полиморфизма гена Bola-DRB3 в сперме быков.

Материал и методика исследований. Выбор метода выделения ядерной ДНК определяется в зависимости от исходного материала, а также цели исследования и необходимого времени хранения выделенной ДНК. Структура хроматина стабилизирована дополнительно дисульфидными связями, которые разрушаются под воздействием тиовосстановителей. В связи с этим возникает необходимость дополнительного применения 2-меркалтоэтанола или дитиотрейтола [2]. Наиболее оптимальным способом выделения ДНК из спермы сельскохозяйственного животного является использование перхлоратного метода [1]. Данный метод позволяет получить чистый препарат ДНК и хранить его в течение длительного времени.

Материалом для исследований служила сперма быков-производителей Могилевского ГПП. Изучение аллельного полиморфизма гена Bola-DRB3 exon 2 проводили ПЦР-ПДРФ анализом с использованием олигонуклео-тидных праймеров, указанных в работах van Eijk и др. [8]. Амплификацию проводили в 2 стадии. На первой стадии использовали праймеры HL030 и HL031, а на второй стадии - HL030 и HL032 (табл. 1). Вторая пара прай-

меров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Праймер ИЬ032 содержит все нуклеотиды 3' конца экзона 2 гена Во1а-БИВЗ и 8 нуклеотидов, перекрывающих 3' конец праймера ИЬ031. Использование этих праймеров уменьшает число побочных продуктов реакции и увеличивает специфичность амплификации ДНК.

Т а б л и ц а 1. Нуклеотидные последовательности праймеров

Название праймера Нуклеотидная последовательность

^030 5'-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3'

HL031 5'-TTTAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3'

HL032 5'-TCGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC-3'

На первом этапе осуществлялась амплификация геномной ДНК с прай-мерами HL030 и HL031. Реакционная смесь для ПЦР включала 50-100 нг ДНК в конечном объеме 15 мкл PCR буфера, 300 нМ каждого праймера,

0.2 тМ каждого dNTP, 2xPCR буфер, 0,6 ед. Tornado полимеразы (Прайм-тех, Беларусь). Реакцию проводили в амплификаторе MiniOptical CFB-3120 (Bio-RAD). Температурный профиль для анализа полиморфизма гена Bola-DRB3 exon 2 включает 15 циклов. Циклы программы амплификации следующие: 1 цикл - 95оС 15 минут, 2-15 цикл - 4 секунды при 99оС, 30 секунд при 60оС и 30 секунд при 72оС, финальная элонгация при 72оС в течение 2 минут, охлаждение 16 оС 10 секунд.

Вторая реакция амплификации состояла из 25 циклов: 1 цикл 95оС 15 минут, 2-25 цикл - 4 секунды при 99оС, 30 секунд при 65оС и 30 секунд при 72оС, финальная элонгация при 72 оС в течение 2 минут, охлаждение 16оС 10 секунд с использованием 2 мкл ПЦР продукта первой реакции в качестве матрицы в конечном объеме 50 мкл. Каждая ПЦР содержала 300 нМ праймера HL030, 300 нМ праймера HL032, 0,2 тМ каждого dNTP, 2xPCR буфер, 0,6 ед. Tornado полимеразы. Продукты амплификации разделяли в 1,5 % агарозном геле, визуализировали в ультрафиолете после окрашивания бромистым этидием с целью обнаружения продуктов нужного размера.

Продукты амплификации подвергались обработке эндонуклеазами Rsa

1, Psu, Hae III, Rsa I/Psu (Fermtas/Thermo Fisher Scientific). Конечный объем для рестрикции составлял 20 мкл, ПЦР продукта - 10 мкл. Для гидролиза ДНК использовали 1-2 ед. активности фермента. Реакцию проводили в течение часа при 370С по стандартной методике.

Продукты рестрикции анализировали в 10 % полиакриламидном геле, где соотношение акриламида и бисакриламида составляло 30:1. В лунки для проведения вертикального электрофореза помещали по 6 мкл исходного образца. Напряжение электрического поля составляло 100-150 В. Длительность электрофореза 4-5 часов. ДНК визуализировали прокрашиваем в растворе этидия бромида. Генотипы определяли на основании ре-

стрикционной карты, на основе рестрикционного анализа, разработанной van Eijk и др. в 1992 году [4].

Результаты исследований и их обсуждение. Ряд авторов [1-3] для определении аллельного полиморфизма гена Bola-DRB3 exon 2 рекомендуют использовать амплификацию с применением одного этапа. С учетом рекомендаций авторов нами была апробирована данная методика. В наших многократных исследованиях после проведения амплификация только с одной парой праймеров образовывались продукты, имеющие неспецифические фрагменты, мешающие дальнейшему проведению анализа. Следовательно, данная методика при использовании для исследования спермы на практике не показала желаемого результата. Поэтому мы модифицировали указанный метод и применили второй этап амплификации, что позволило сократить количество неспецифичных фрагментов. После проведения второго этапа амплификации, образовался фрагмент равный 281, 284 п.н. (рис. 1). Дорожки 2-9, 11-17 образцы, содержащие фрагмент 281, 284 п.н. 1,10 - маркер молекулярного веса (100-1500 п.н.).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК с праймерами к гену Bola-DRB3 exon 2 HL030, HL031, HL032

Для проведения рестрикционного анализа фрагмента гена BoLa-DRB3 exon 2 длинной 281 или 284 п.н. были использованы ферменты эндо-нуклеазы рестрикции RsaI, Psu, Hae III. Установлено, что распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз Rsa I, Psu, Hae III в экзоне 2 гена BoLA-DRB3 у разных аллельных вариантов гена BoLA-DRB3 различно, что приводит к образованию после обработки продуктов амплификации эндо-нуклеазами специфического спектра фрагментов ДНК, которые отличаются друг от друга по количеству и длине (ДНК-паттерны). Сопоставление ДНК-паттернов, полученных с использованием 3 указанных рестри-цирующих эндонуклеаз, позволяет идентифицировать 54 аллеля гена BoLA-DRB3. Распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз Rsa I, Psu, Hae III в экзоне 2 гена BoLA-DRB3 представлено на рис. 2.

Рис.

2. Распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз Rsa I, Psu, Hae III в экзоне 2 гена BoLA-DRB3

Заключение. Модифицированный и апробированный нами ПЦР-ПДРФ метод пригоден для массового типирования животных и позволяет точно идентифицировать аллели гена BoLA DRB 3. Метод рекомендуется для определения аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3 в сперме быков-производителей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Глазко, В. И. Внутрипородная генетическая дифференциация и наличие мутации BLAD у крупного рогатого скота голштинской породы / В. И. Глазко, В. В. Лавровский, А. Н. Филенко // Сельскохозяйственная биология. - 2000. - № 4. - С. 45-47.

2. Иванов, П. Л. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства / П. Л. Иванов // Методические указания. Минздрав РФ, 1999. - 38 с.

3. Ковалюк, Н. В. Использование генетического маркера BoLA - DRB 3 для получения помесей F1 пород КРС молочного направления / Н. В. Ковалюк, В. Ф. Сацук // Вестник РАСХН. - 2010. - № 4. - С. 65-68.

4. Копилов, К. В. ДНК-технологи у селекцп тварин / К. В. Копилов, Л. В. Вишневський // Геномна селекщя у твариннищга: стан та перспективи розвитку: матер1али творчо1 дискусп (Чубинське, 19 квггня 2011 р.). - Кшв: Аграрна наука, 2011. - С. 5-8.

5. Смазнова, И. А. Анализ генетического потенциала племенных быков Брянской области по гену BoLA-DRB3 / И. А. Смазнова, К. Н. Немцова, В. В. Заякин // Факторы экспериментальной эволюции организмов: сб. науч. трудов. - Киев: Логос, 2013. - Т. 13. - С. 99-105.

6. Столповский, Ю. А. Состояние «культурного» биоразнообразия (сельскохозяйственные животные) / Ю. А. Столповский, Г. Е. Сулимова // Ветеринарная патология. - 2007. -№ 1. - С. 30-32.

7. Якушева, Л. Н. Способ подбора быков-производителей с использованием маркера BoLA - DRB 3 / Л. Н. Якушева // Сб. науч. трудов Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства. - Краснодар, - 2012. - Т. 1. - № 1. - С. 57-62.

8. Van Eijk, M. J. Extensive polymorphism of the BoLA-DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP / M. J. Van Eijk, J. A. Stewart-Haynes, H. A. Lewin // Anim Genet. 1992. V. 23(6). P. 483^96.