Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови у больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью

Краткие сообщения

Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови у больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью

Чурина Е.Г., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В., Колобовникова Ю.В.

Subpopulation structure of regulatory Т-cells of blood in patients with multiple drugresistant pulmonary tuberculosis

Churina Ye.G., Novitsky V. V., Urazova O.I., Voronkova O.V., Kolobovnikova Yu.V.

Проанализирован субпопуляционный состав Т-регуляторных клеток (T-reg) периферической крови у больных с впервые выявленным туберкулезом легких в зависимости от клинической формы заболевания и чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам. Показано, что ведущую роль в формировании иммуносупрессии при инфильтративном, диссеминированном и фиброзно-кавернозном туберкулезе легких играют T-reg c иммунофенотипом CD4+CD25+Foxр3+. При этом их количество в крови повышено как при лекарственно-резистентном, так и при лекарственно-чувствительном туберкулезе легких. Продемонстрировано увеличение количества CD4+CD25-Foxр3+-T-reg при лекарственно-резистентных вариантах инфильтративного и фиброзно-кавернозного туберкулеза легких.

Ключевые слова: регуляторные Т-клетки, иммуносупрессия, туберкулез легких, лекарственная устойчивость.

Subpopulation structure of regulatory T-cells of peripheral blood in patients with newly diagnosed pulmonary tuberculosis depending on the clinical form of disease and sensitivity of Mycobacterium tuberculosis to anti-tuberculosis drugs have been analyzed in this work. It has been shown that in formation immune suppression at infiltrative, dissemination and fibrosis-cavity pulmonary tuberculosis the leading part play natural regulatory CD4+CD25+Foxр3+-T-lymphocytes. Thus increase of their number in blood at drug-resistance and drug-susceptible patients. It has been demonstrated that in patients with fibro-cavernous and infiltrative form of the disease and drug-resistance pulmonary tuberculosis the number of CD4+CD25-Foxр3+-regulatory T-cells were increasing.

Key words: regulatory T-cells, immune suppression, pulmonary tuberculosis, drug resistance.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Чурина Е.Г., Новицкий В.В., Уразова О.И. и др.

УДК 616.24-002.5:615.015.6:577.27

Введение

ные их функции заключаются в способности обеспечивать периферическую иммунологическую толерантность к аутоантигенам и супрессировать пролиферацию различных клонов Т-хелперов (!Ъ), — ТЫ, ТЬ2, ТЪ17, ТШ [5, 7]. Основными последствиями дефицита регуляторных Т-клеток являются формирование аутоиммунной патологии, развитие аллергических заболеваний, нарушение нормального течения беременности и невынашивание плода. Вместе с тем, избыточная активность Т-1^ связана с повышением риска возникновения онкологических заболеваний и ослаблением противоинфекционной защиты организма с формиро-

Несмотря на то что с момента открытия регуляторных Т-клеток (T-reg) в 1995 г. японским иммунологом 8. Sakaguchi прошло уже больше 15 лет, они по-прежнему находятся под пристальным вниманием исследователей во всех ведущих иммунологических центрах мира. Такой интерес ученых к проблеме регу-ляторных Т-клеток обусловлен не только важностью их функциональных особенностей, но и широким кругом практически значимых проблем клинической иммунологии, с которыми связаны T-reg. Роль T-reg в иммунном ответе переоценить невозможно, но глав-

Чурина Е.Г., Новицкий В.В., Уразова О.И. и др.

ванием вторичной иммунологической недостаточности [6, 10].

Цель работы — оценить особенности субпопуля-ционного состава регуляторных Т-клеток в крови больных с впервые выявленным туберкулезом легких в зависимости от клинической формы заболевания и лекарственной чувствительности возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам.

Материал и методы

Проведено обследование 75 пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких (53 мужчины и 22 женщины в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст (44 ± 12) лет). Диагноз «туберкулез легких» (ТБ) устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Все обследованные были разделены на три группы по клинической форме заболевания: группу с инфильтративным туберкулезом легких (ИТБ) составили 46 человек, группу с диссемини-рованным туберкулезом легких (ДТБ) — 19 пациентов, с фиброзно-кавернозным туберкулезом легких (ФКТБ) — 10 больных. При делении больных ТБ на группы учитывали также лекарственную чувствительность возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП): группу пациентов, выделяющих ми-кобактерии туберкулеза (МБТ), чувствительные к основным ПТП, составили 46 человек, во вторую группу были включены 29 больных, выделяющих МБТ, устойчивые к ПТП основного ряда. Контрольная группа была сформирована из 18 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (12 мужчин и 6 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст (41 ± 7) лет).

Материалом исследования являлась периферическая венозная кровь. Забор крови проводили утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл.

Для определения сочетанной экспрессии поверхностных CD4- и СБ25-маркеров на лимфоцитах периферической крови и внутриклеточного маркера БохрЗ применяли метод проточной лазерной трехцветной цито-метрии с использованием специфических моноклональных антител (МАТ), меченных флуоресцентными метками (FITC, РЕ и РЕ-Су5 Becton Dickinson (BD), США). Анализ образцов клеточных суспензий

Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови...

проводили на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с аргоновым лазером на основе определения пяти параметров: малого углового (FSC, характеризующего размер клетки), бокового (SSC, характеризующего цитоплазматические и мембранные особенности клетки) светорассеяния и трех показателей флуоресценции — зеленой (FITC — 530 нм), оранжевой (PE — 585 нм) и малиновой (РЕ — Cу5 — 610 нм) в гейте мононуклеарных клеток, выявляемых на FL1-, FL2-, FL3-каналах. Использовали автоматическое программное обеспечение, методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала).

Результаты исследования обрабатывали с использованием стандартного пакета программ SPSS 11.0. Так как распределение выборок отличалось от нормального, рассчитывали медиану Ме, первый и третий квартили (Qb Q3). Для оценки достоверности различий выборочных данных, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали U-критерий Манна—Уитни для независимых выборок. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05.

Результаты и обсуждение

На сегодняшний день репертуар идентифицированных T-reg весьма разнообразен, при этом выделяют, как минимум, две основные разновидности регу-ляторных Т-клеток: естественные тимические регуля-торные Т-клетки (yST, NKT, T-reg) и индуцированные на периферии (T-reg, Tr1, Th3, CD8+CD28-) [7, 11]. Предполагается, что естественные T-reg-клетки имеют фенотип CD4+CD25+Foxp3H , в то время как к индуцированным CD4+ регуляторным Т-клеткам относятся лимфоциты с иммунофенотипом CD4+CD25-Foxp3+, а также CD4+CD25+Foxp3--гетерогенная субпопуляция Т-лимфоцитов, включающая в себя как регуляторные T-клетки, так и активированные CD4+ Т-хелперы. Следует отметить, что субпопуляция Тч^-клеток, имеющая иммунофенотип CD4+CD25+Foxp3+, отнесена как к естественным, так и к индуцированным T-reg, поскольку кроме антигеннезависимой дифференцировки в тимусе в процессе нормального развития организма установлена возможность конверсии Т-хелперов в T-reg на периферии при реализации адаптивного иммунного ответа

[6, 7]. При этом доказано, что супрессорной активно-

Краткие сообщения

стью обладают только РохрЗ-экспрессирующие T-reg-клетки, т.е. СВ4+СБ25+Рохр3+- и СБ4+СВ25Рохр3+-Т-лимфоциты, в то время как транскрипционный фактор БохрЗ является самым точным маркером идентификации T-reg [8].

При изучении субпопуляционного состава регуля-торных Т-клеток периферической крови у больных ИТБ и ДТБ в острый период заболевания было выявлено достоверное снижение по сравнению с нормой числа СВ4+СБ25+Рохр3 -клеток вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя (таблица). Данный факт можно рассматривать как проявление Т-кле-точного иммунодефицита, связанного либо с угнетением пролиферации СБ4+-Т лимфоцитов, либо с их быстрой элиминацией из периферической крови посредством индукции апоптоза лимфоцитов антигенами МВТ. Ранее проведенными исследованиями показано, что потеря равновесия между пролиферацией Т-клеток и индуцированным рецепторным апоптозом приводит к массовой гибели антиген-специфических клонов Th-лимфоцитов. Это является одним из факторов длительной персистенции инфекции в организме с развитием тяжелых форм вторичного иммунодефицита [3, 4, 9].

Анализ количества CD4+CD25+Foxp3+-T-reg в крови выявил его увеличение у больных ИТВ и ДТБ вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя, что может способствовать формированию супрессии ТЫ-ответа с целью предотвращения развития гиперергической иммунной реакции и повреждения ткани легких. Интересно, что при лекарственно-устойчивом (ЛУ) ФКТВ данный параметр был статистически выше не только в сравнении с контрольными значениями, но и относительно группы больных с лекарственно-чувствительным (ЛЧ) ТВ этой клинической формы (таблица). Столь значительное увеличение количества T-reg при резистентном к лечению ФКТВ позволяет предполагать глубокое угнетение иммунного ответа с формированием функциональной несостоятельности всех клеток, участвующих в нем. Следует отметить, что штаммы микобактерий, устойчивые к стандартной химиотерапии, обладают определенными свойствами в отношении реализации механизмов иммуносупрессии, возможно, посредством активации образования на периферии анергичных Т-клеток с супрессорной активностью [1, 2]. Интересно, что достоверное увеличение количества регуляторных ^лимфоцитов с иммунофенотипом CD4+CD25-Foxp3+

было обнаружено только в группах пациентов, страдающих ЛУТБ, а именно у больных с ИТВ и ФКТВ. При этом у больных с фиброзно-кавернозным ЛУТВ данный параметр был более чем в 3 раза выше, чем при лекарственно-чувствительной форме заболевания (таблица).

Вполне вероятно, что при лекарственно-резистентном ТВ, с одной стороны, происходит активная пролиферация и увеличение общего пула регуляторных Т-клеток как за счет естественных, так и за счет индуцированных T-reg, с другой стороны, как указывалось выше, лекарственно-устойчивые штаммы МВТ могут способствовать угнетению иммунного ответа посредством индукции T-reg-клеток [2]. В свете показанных изменений с учетом данных литературы можно предположить, что поддержание эффективного иммунного ответа в такой ситуации становится невозможным. Очевидно, что в дальнейшем ^т^-опосредованная иммуносупрес-сия неизбежно приведет к утяжелению течения патологического процесса у больных ТВ в случае как изначально диагностированной лекарственной устойчивости (первичной), так и вторично сформировавшейся на фоне проведения химиотерапии.

Содержание регуляторных Т-лимфоцитов в крови больных

туберкулезом легких в зависимости от чувствительности возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам

Группа обследованных CD4+CD25+ CD4+CD25+ CD4+CD25-

лиц FoxP3-, % FoxP3+, % FoxP3+, %

Здоровые доноры 25,45 2,63 5,00

10,00

Р1 = 0,002

13,50

Р1 = 0,006

19,50 (11,00— 32,50) Р3 = 0,013

4,00 (4,00—8,00) Р1 = 0,006

5,21 (2,75—9,50) Р1 = 0,017

2,80

Р3 = 0,010

6,00

5,50

3,00 (2,00—6,00) Р2 = 0,011

Фиброзно-кавернозный ТЛ

16,00

5,00 (2,00—8,00) Р1 = 0,042

4,00 (3,00—7,00) р1 = 0,031 7,00 (2,00—10,00) Р1 = 0,002

9,00 (5,00—13,00) Р1 = 0,005 р4 = 0,043

7,00

11,00

Р1 = 0,012

Чурина Е.Г., Новицкий В.В., Уразова О.И. и др.

| | р4 = 0,032 р4 = 0,007

Примечание. р1 — уровень статистической значимости различий по сравнению с параметрами у здоровых доноров; р2 — по сравнению с параметрами у больных ИТБ; р3 — по сравнению с параметрами у больных ДТБ; р4 - по сравнению с параметрами при ЛЧТБ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007—2013 гг.» (ГК№ 16.512.11.2046 от 14 февраля 2011 г.).

Литература

1. Воронкова О.В, Уразова О.И., Новицкий В.В., Стре-лис А.К. Иммунопатология туберкулеза легких. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007. 194 с.

2. Сахно Л.В., ТихоноваМ.А., Курганова Е.В. и др. Т-кле-точная анергия в патогенезе иммунной недостаточности при туберкулезе легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2004. № 11. С. 23-28.

3. Сахно Л.В., ТихоноваМ.А., Никонов С.Д и др. Дисфункции макрофагов, генерированных из моноцитов крови больных туберкулезом легких // Бюл. СО РАМН. 2010.

Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови.

Т. 30, № 2. С. 101—108.

4. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю. и др. Роль PD-1/В7-Н1-опосредованного пути в нарушении антиген-специфического ответа у больных туберкулезом легких // Иммунология. 2011. Т. 32, № 2. С. 89—93.

5. Симбирцев А. С. Интерлейкин-1. Физиология. Патология. Клиника. СПб.: Изд-во «Фолиант», 2011. 480 с.

6. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 352 с.

7. Хаитов Р.М., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология: атлас. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 624 с.

8.Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Цитометрический анализ субпопуляций Т-хелперов (Th1, Th2, Treg, Th17, Т-хелперы активированные) // Мед. иммунология. 2011. Т. 13, № 1. С. 7—16.

9. Чурина Е.Г., Уразова О.И., Воронкова О.В. и др. Роль Т-лимфоцитов в иммунопатогенезе туберкулезной инфекции // Туберкулез и болезни легких. 2011. № 3. С. 3—7.

10.Lee D.C., Barker J.A., Tregoning J.S. et al. CD25+ natural regulatory T cells are critical in limiting innate and adaptive immunity and resolving disease following respiratory syncytial virus infection // J. Virol. 2010. V. 84, № 17. P. 8790-8798.

11.Liston A., Lu L.-F., O'Carroll D. et al. Dicer-dependent mi-croRNA pathway safeguards regulatory T cell function // J. Exp. Med. 2009. V. 205, № 9. Р. 1993—2004.

Поступила в редакцию 10.06.2011 г. Утверждена к печати 11.07.2011 г.

Сведения об авторах

Е.Г. Чурина — канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

В.В. Новицкий — заслуженный деятель науки РФ, д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, зав. кафедрой патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

О.И. Уразова — д-р мед. наук, профессор кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

О.В. Воронкова — д-р мед. наук, профессор кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Ю.В. Колобовникова — канд. мед. наук, докторант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск).

Для корреспонденции

Чурина Елена Георгиевна, тел.: 8 (382-2) 52-63-25; 8-913-806-0700; e-mail: lena1236@yandex.ru