Особенности иммунологической реактивности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови при хронических гломерулонефритах у детей

УДК 616.611-002 © Л. Р. Кальметьева, 2011

Л.Р. Кальметьева

ОСОБЕННОСТИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ РЕАКТИВНОСТИ И КИНЕТИКИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТАХ У ДЕТЕЙ

ГУЗ «Республиканская детская клиническая больница», г. Уфа

Статья посвящена обсуждению результатов исследования показателей системы иммунитета и ДНК-цитометрии клеток периферической крови детей с хроническим гломерулонефритом, получающих комплексную иммуносупрессивную терапию. Анализ полученных данных позволил выявить особенности иммунологической реактивности, плоидности клеток и кинетики клеточного цикла, которые позволяют оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессивной терапии.

Ключевые слова: ДНК-цитометрия периферической крови, хронический гломерулонефрит, дети, иммуносупрессивная терапия.

L.R. Kalmetyeva

FEATURES OF IMMUNOLOGICAL RESPONSIVENESS AND CELLULAR CYCLE KINETICS IN PERIPHERAL BLOOD IN CHILDREN WITH CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS

This article is related to the discussion of the results of the studies on immunal system indeces and peripheral blood cells DNA-cytometry on the children with chronic glomerulonephritis under complex immunosuppression therapy. The performed data analysis has helped to particularize the peculiarities of immunologic reactivity, cell ploidy and cellular cycle kinetics which have allowed to evaluate the process activity and immunocuppressive therapy effectiveness.

Key words: blood cells DNA-cytometry, chronic glomerulonephritis, children, immunosuppressive therapy.

За последние 10-15 лет увеличилась частота латентных и хронических форм гло-мерулонефрита, протекающих с ранним нарушением почечных функций [3, 5]. Результативность лечения хронических гломеруло-нефритов (ХГН) во многом зависит от максимально раннего выявления патологии и своевременного проведения адекватной терапии. Дифференциальная диагностика осложняется тем, что в настоящее время относительно редко наблюдается яркая манифестация заболеваний почек и органов мочевыделения. Больные с патологией органов мочевой системы обращаются к врачу, как правило, со случайно выявленными изменениями в анализах мочи. Основными клиническими симптомами, указывающими на заболевание органов мочевой системы, являются: нарушение мочеотделения (изменение частоты и ритма мочеиспусканий) и объема выделенной мочи, изменения состава мочи, наличие болевого и отечного синдромов [6]. Основа диагностического процесса и его полноценность связаны с целенаправленным и оптимальным использованием современных методов исследования. До недавнего времени верификация формы хронических гломерулонефритов основывалась на клинических, рутинных общелабораторных методах исследования, таких как общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови. Однако с помощью этих методов невозможно определить индивидуальный прогноз заболевания и выявить этиопатогенетические

механизмы развития гломерулонефритов. Так, по мнению ряда исследователей, общепринятые клинико-лабораторные критерии - про-теинурия, гематурия, маркеры нарушения функции почек, особенно на фоне длительной предшествующей гормональной терапии, -могут имитировать обострение заболевания

[4].

В связи с отсутствием достоверных маркеров активности процесса большие трудности представляет оценка эффективности патогенетически обоснованной при ХГН иммуносупрессивной терапии. Многолетний опыт применения стероидных препаратов выявил проблемы, связанные со снижением кор-тикостероидчувствительности, а в некоторых случаях - с развитием кортикостероидрези-стентности, обусловливающих необходимость проведения цитостатической терапии [2, 6, 7]. С этой целью в клинической практике последних лет широко используются хлорбутин, циклофосфан, циклоспорин А, азатиоприн, но при этом до сих пор не отработан универсальный протокол ведения больных с гломерулонефритами [2, 6, 7].

При назначении базисной иммуносупрессивной терапии у больных с ХГН проводится пункционная чрескожная биопсия почки с последующим патоморфологическим исследованием биоптата. Однако использование гистоморфологического метода исследования биоптатов почек ограничено инвазивностью, риском развития осложнений, наличием ши-

рокого перечня противопоказаний, а также невозможностью мониторирования почечного процесса [2, 6]. В связи с этим весьма актуальным является определение адекватных, достоверных, доступных, легковоспроизводимых критериев активности при обострении ХГН.

Учитывая непосредственную роль иммунных механизмов в развитии гломеруло-нефритов, такими маркерами могут быть показатели, определяемые иммунологическими методами. Немаловажным является выявление взаимосвязей этих показателей с общепринятыми клинико-лабораторными критериями (протеинурия, гематурия и др.).

Наряду с изучением состояния системы иммунитета все большую роль играет определение функциональных показателей иммуно-компетентных клеток при ХГН методом проточной ДНК-цитометрии [11]. Особый интерес представляют плоидность и кинетика клеточного цикла, позволяющие оценить процессы пролиферации клеток периферической крови. Данные литературы об изменениях этих показателей под влиянием различных факторов малочисленны и разрозненны. В связи с этим актуальным является изучение функционального состояния клеток на фоне применения иммуносупрессивных препаратов, которые, как известно, обладают анти-пролиферативным эффектом [2, 8, 9].

В настоящее время используются несколько групп лекарственных средств, обладающих антимитотическим действием. В первую группу входят алкилирующие агенты (циклофосфан, хлорбутин), подавляющие клеточное деление. В молекуле ДНК алкили-рующая группа связывается с гуанином, что ведёт или к разрушению молекулы, или её деспирализации, в результате чего прерывается необходимая для клеточного деления репликация ДНК. Алкилирующие соединения действуют на клетку в любой фазе клеточного цикла, а также в состоянии покоя. Ко второй группе соединений относятся антиметаболиты (азатиоприн). Механизм иммуносупрессивно-го действия связан с влиянием на пролиферативную фазу иммунного ответа лимфоцитов после поступления антигена. Под влиянием азатиоприна наблюдаются повышение толерантности при повторном введении антигена, угнетение гуморального и клеточного иммунных ответов, влияние на неспецифические воспалительные проявления [8]. В доступной нам литературе отсутствуют данные о влиянии иммуносупрессивной терапии на плоид-

ность и кинетику клеточного цикла клеток периферической крови у детей с ХГН.

Таким образом, не утратила своей актуальности проблема прогрессирования хронических заболеваний почек, выявления маркеров активности воспалительного процесса, оценки эффективности иммуносупрессии как необходимого элемента базисной терапии [2, 3, 4, 5, 6]. В работах ведущих специалистов в области нефрологии [2, 6, 7] отмечается необходимость разработки комплексного подхода к оценке активности воспалительного процесса и подбору патогенетической терапии, введения в клиническую практику универсального протокола лечения больных гломерулонефритом.

Целью исследования явилась оценка диагностических и прогностических маркеров активности почечного процесса по данным комплексного исследования иммунного статуса и функционального состояния клеток периферической крови у детей с ХГН.

Материал и методы

Работа выполнена на базе иммунологической лаборатории с отделением клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы г. Уфы.

Нами обследовано 46 детей с различными формами ХГН в возрасте от 6 до 17 лет: 27 больных с гормонозависимым нефротическим синдромом (НС) и 19 - с гематуриче-ской формой ХГН. Все пациенты с ХГН поступили в клинику в стадии обострения основного заболевания.

Для пациентов с НС были характерны протеинурия, гипопротеинемия с преимущественным снижением альбуминовой фракции, гиперхолестеринемия, гиперфибриногенемия. Основными причинами возникновения рецидивов при гормонозависимой форме НС были: снижение дозы глюкокортикоидов, острые респираторные инфекции, а также обострения сопутствующих заболеваний, как правило, аллергической природы. У больных данной группы проводилась комбинированная имму-носупрессивная терапия, включавшая кортикостероидные препараты и цитостатики (циклоспорин А, циклофосфан).

У детей с гематурической формой ХГН отмечались гематурия, минимальная протеи-нурия, непостоянная лейкоцитурия. У пациентов данной группы рецидивы основного заболевания возникали, как правило, на фоне острых респираторных инфекций, а также обострения хронических заболеваний (тонзиллит, гастродуоденит). Больные получали

азатиоприн в течение 3-6 месяцев в сочетании с небольшими дозами преднизолона (1 мг/кг).

Контрольную группу составили 30 здоровых детей, которые на момент осмотра не предъявляли жалоб на состояние здоровья, в анамнезе отсутствовали аллергические заболевания и хроническая патология органов и систем. Допускалось наличие острых респираторных вирусных заболеваний не более 2-х раз в течение года.

Комплексное обследование больных включало: сбор анамнеза, анализ клинических данных, проведение лабораторных исследований. Иммунологическое обследование проводилось с использованием комплекса стандартизированных тестов, включающих оценку: клеточного звена иммунитета на проточном цитофлуориметре FACSCalibur с программным обеспечением SimulSet с использованием моноклональных антител фирмы Bec-ton Dickinson и определением относительного содержания основных популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток (CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+56+, CD19+, CD25+, CD95+, HLA-DR+); плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови методом проточной ДНК - цитометрии, основанным на связывании ДНК с флуоресцентным зондом (пропидиум йодида), который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 000 клеток) анализировали на проточном цитофлуоримет-ре, оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit. При этом учитывалось значение коэффициента вариации (CV%) пика G1/0, отражающего точность измерения: концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G (Ig A, Ig М, Ig G), определяемых методом радиальной имму-

нодиффузии в геле по Манчини; уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) осаждением полиэтиленгликолем;

Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде «Windows-XP» с использованием современных пакетов прикладных программ «STATISTICA 6.0». Исследования проводились выборочным методом. Для установления взаимосвязей между изучаемыми параметрами полученные данные подвергались корреляционно-регрессионному анализу. При значительных отклонениях закона распределения от нормального использовались непараметрические методы анализа взаимосвязи показателей и достоверности различий (ранговый коэффициент корреляции Спирмена и Mann Whitney Test). В ходе исследования нами было установлено ненормальное внутригрупповое распределение признака у больных с заболеваниями почек, вследствие чего для описания групп мы использовали медиану и ин-терквартильный размах (25 - 75-й) [1].

Результаты и обсуждение

При сравнительном анализе иммунологических показателей здоровых детей и больных ХГН (табл. 1) были выявлены особенности гуморального звена системы иммунитета, патогномоничные для различных нозологических форм заболевания. Так, при НС установлены статистически достоверное снижение концентрации Ig G до 5,20 г/л (колебания изучаемого показателя составили 2,4 - 8,4 г/л), а также тенденция к повышению уровня Ig М. При гематурической форме ХГН отмечалось достоверное повышение концентрации ^А в крови. При этом медиана показателя в этой группе составила 1,98 (1,45 - 2,86) г/л, уровень ^А колебался от 1,02 до 3,97 г/л.

Таблица 1

Иммунологические показатели обследованных детей____________________________________

Показатели Контрольная группа

Ig A, г/л 0,86 (0,75-1,09) 1,13 (0,86-1,55) 1,98 (1,45-2,86)и

Ig M, г/л 0,91

Ig G, г/л 10,00 (9,00-12,50) 5,20 (2,87-7,60)' 9,80 (6,20-13,80)2

ЦИК, у. е. 31,00

CD3+, % 62,00 (58,00-67,00) 70,00 (63,00-78,00)“ 72,00 (69,00-76,00)“

CD4+, % 38,00

CD8+, % 37,00

CD19+, % 15,00

CD16+56+, % 22,00 (18,00-28,00) 16,00 (7,00-18,00)“ 14 (6,00-18,00)1

HLA-DR+, % 9,00

CD25+, % 17,00 (15,00-20,00) 25,00 (18,00-36,00)“ 28,00 (19,00-39,0)1

CD95+, % 32,50

CD4+/CD8+ 1,00

- при сравнении с показателями контрольной группы; Различие статистически достоверно при р<0,01.

1 - при сравнении показателей детей с НС и гематурической формой ХГН.

Клеточное звено системы иммунитета ченных в исследование, характеризовалось при всех клинических вариантах ХГН, вклю- достоверным повышением по сравнению с

контролем процентного содержания общих Т-лимфоцитов (СБ3 -клеток). Так, при НС медиана СБ3 -клеток составила 70,00%, а при гематурической форме ХГН - 72%. Выявлен высокий уровень растворимых рецепторов к ИЛ-2 (СБ25), отмечалось возрастание медианы СБ25+ до 25% и 28% соответственно. Обращало на себя внимание подавление активности одного из маркеров противовирусного иммунитета - ЕКК (СБ16 56 -клеток) (табл. 1).

Таким образом, выявленные особенности иммунного статуса на фоне базисной иммуносупрессии укладываются в клиниколабораторную картину обострения ХГН, что, по нашему мнению, характеризует отсутствие адекватного ответа на проводимую терапию.

По данным ДНК-цитометрии показатели клеточного цикла клеток периферической крови здоровых детей отличались высокой стабильностью и варьировали в сравнительно узких пределах. В 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причём основная масса клеток (99,86%) находилась в 01-фазе клеточного цикла, доля клеток в стадии синтеза ДНК составляла 0,1%, в фазе 02 -0,02%. Коэффициент вариации составил 2,57% (табл.2). Как известно, лимфоциты периферической крови животных и человека в отсутствие митогенов и чужеродных антигенов представляют собой неделящуюся попу-

ляцию [9], в 99,9% случаев находятся в интерфазе, что подтверждается и нашими исследованиями. Выход клетки из митотического цикла может быть необратимым (гранулоци-ты крови), поэтому даже под действием чужеродных антигенов гранулоциты находятся в 00/1-фазе клеточного цикла [9].

При анализе результатов ДНК-цитометрии больных с ХГН в 100% случаев, как и в контрольной группе, клетки периферической крови имели диплоидный набор хромосом (табл.2). Достоверные различия касались лишь распределения клеток по фазам клеточного цикла. Так, при ХГН отмечалось увеличение доли клеток в фазах пролиферации (02 и 8), и при этом особенно выраженным было изменение показателей кинетики клеточного цикла у больных гематурической формой ХГН. В частности, у пациентов с НС медиана содержания клеток периферической крови в 02-фазе составила 0,09%, в 8-фазе -0,15%, а при гематурической форме 0,04% и

0,31% соответственно. Полученные данные свидетельствуют о повышении пролиферативной активности клеток у больных с ХГН, что патогномонично активной стадии воспалительного процесса. Значительное возрастание данного показателя при гематурической форме ХГН является неблагоприятным признаком, отражающим выраженность почечного процесса.

Таблица 2

Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей с ХГН и в контрольной группе

Плоидность и кинетика клеточного цикла Контрольная группа

Диплоидность, % 100 100 100

01, % 99,89 (99,83-99,90) 99,77(99,32-99,83)** 99,57(99,25-99,72)**

02, % 0,02

8, % 0,10 (0,09-0,11) 0,15 (0,09-0,37) * 0,31 (0,20 - 0,75) **

СУ 2,57 (2,29-2,83) 3,06 (2,38-3,84) ** 3,15 (2,34 -3,92) **

Различие с контролем статистически значимо *- при р<0,05;**- при р<0,01.

Выводы

1. Выявленные особенности иммунологической реактивности и ДНК-цитометрии клеток периферической крови отражают реакцию организма на базисную терапию. Комплексный подход, объединяющий клиническую картину заболевания, иммунологические показатели, кинетику клеточного цикла, позволяет всесторонне оценить активность процесса и эффективность иммуносупрессив-ной терапии.

2. На основании анализа результатов проведенных исследований, включающих ди-

намическое наблюдение в различные стадии заболевания, мы считаем возможным рекомендовать мониторинг показателей кинетики клеточного цикла в качестве маркера активности процесса и эффективности иммуносу-прессивной терапии при ХГН.

3. Возможности, предоставляемые

ДНК-цитометрией, с точки зрения оценки пролиферативной активности клеток, делают это метод ценным диагностическим и прогностическим инструментом при подборе имму-носупрессивной терапии.

Сведения об авторах статьи:

Л.Р. Кальметьева — к.м.н., врач-клинический иммунолог иммунологической лаборатории с отделением иммунологии ГУЗ «Республиканская детская клиническая больница», г. Уфа. Адрес: ул. Степана Кувыкина 98, раб. тел. 8(347)2557344.

lS

ЛИТЕРАТУРА

1. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц.- М.:Практика, 1999.- 495 с.

2. Игнатова, М.С. Диагностика и лечение нефротического синдрома у детей / М.С. Игнатова, О.В. Шатохина. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2009. - C.104-112.

3. Картамышева, Н.Н. Некоторые механизмы формирования тубулоинтерстициального компонента при хронических заболеваниях почек / Н.Н.Картамышева, О.В.Чумакова, А.Г. Кучеренко // Медицинский научный и учебнометодический журнал. - 2002.- № 6. - С. 176-1S7.

4. Мухин, Н.А. Признаки, имитирующие активность хронического гломерулонефрита / Н.А. Мухин // Клиническая нефрология. - 2009. - №2. - C.10-16.

5. Панова, Л.Д. Распространенность инвалидности вследствие заболеваний органов мочевой системы у детей Республики Башкортостан / Л. Д. Панова, Л.И. Вахитова, Д.Ф. Зиятдинова [и др.] // Нефрология и диализ. - 2005. - Т. 7, № 1. - C.92-93.

6. Папаян, А.В. Клиническая нефрология детского возраста / А.В. Папаян, Н.Д. Савенкова. - СПб.: Левша. Санкт-Петербург, 200S. - 600 с.

7. Пономарева, Н.В. Оптимизация иммуносупрессивной терапии нефротического синдрома первичного гломерулонефрита у детей: дис.. ..кан.мед.наук. - Екатеринбург, 2004.

S. Стефании, Д.В. Клиническая иммунология и иммунопатология детского возраста: рук-во для врачей / Д.В. Стефании, Ю.В. Вельтищев. - М.: Медицина, 1996. - 239 с.

9. Фёдоров, Н.А. Структура ДНК и трансформация клеток / Н.А. Фёдоров. - М.: Медицина, 19S3. - С. 1S1-193.

10. Шмаров, Д.А. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови / Д.А. Шмаров, Г.И. Козинец. - M.: МИА, 2004. - Ш с.

11. Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid / I. Saha, P. Dey, H. Vhora, R. Nijhawan // Diagn. Cytopathol. - 2000. - Vol. 22, N 2. - P. S1-S5.