Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний

Вестник ДВО РАН. 2004. № 3

О.Ю.ПОРТНЯГИНА, О.Д.НОВИКОВА, О.П.ВОСТРИКОВА, В.А.ХОМЕНКО, Т.Ф. СОЛОВЬЕВА

Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний

В процессе эволюции патогенные микроорганизмы создали значительное количество различных механизмов взаимодействия с иммунной системой организма—хозяина, благодаря которым патогены способны успешно преодолевать защитный барьер теплокровного организма. В настоящее время существует достаточно экспериментальных доказательств того, что эти механизмы осуществляются не только экстрацеллюлярными антигенами и поверхностными антигенами углеводной природы, но и экспонированными на поверхности клетки белками наружной мембраны бактерий, в частности поринами.

Во взаимоотношениях патогена с иммунной системой организма—хозяина порины играют двойственную роль. С одной стороны, они представляют собой молекулы—мишени для системы врожденного иммунитета макроорганизма, активируя факторы немедленной защиты и участвуя в формирование специфического иммунного ответа, направленного на освобождение от патогена. С другой стороны, порины являются факторами патогенности, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макроорганизме.

Bacterial porins as promising antigens for diagnostics and vaccine prophylaxis of infectious diseases.

O.Yu.PORTNYAGINA, O.D.NOVIKOVA, O.P.VOSTRIKOVA, VA.KHOMENKO, T.F.SOLOVYEVA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

In the process of evolution the pathogenic microorganisms formed a great number of different mechanisms of interaction with an immune system of a host. Because of them, the pathogens are capable of successfully overcoming the shielding barrier of a warm-blooded organism. At present, there are enough experimental proofs that these mechanisms are realized not only by the extracellular antigens and surface antigens of the carbohydrate nature, but also by proteins of the outer bacterial membrane, in particular porins, which are exposed on the cell surface.

Porins play a dual role in the interrelations of a pathogen with the host immune system. On the one hand, porins activating the factors of immediate protection and taking part in forming the specific immune response directed to release from the pathogen are the target molecules for the innate immunity system of a macroorganism. On the other hand, porins are the factors of pathogenicity since they suppress the separate stages of the host immune protection and ensure the survival of the pathogen in the macroоrganism.

ПОРТНЯГИНА Ольга Юрьевна — кандидат биологических наук, НОВИКОВА Ольга Данииловна — кандидат химических наук, ВОСТРИКОВА Ольга Павловна, ХОМЕНКО Валентина Александровна — кандидат химических наук, СОЛОВЬЕВА Тамара Федоровна — доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).

Мембраны патогенных микроорганизмов, наряду с другими функциями, эффективно защищают клетки от неблагоприятного влияния внешней среды. Проницаемость наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий обеспечивается системой водонаполненных каналов, образованных порообразующими белками, или поринами. Эти белки представляют собой специфическую группу интегральных мембранных белков с необычной пространственной структурой. Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обусловливают участие поринов в осуществлении динамической связи между бактериями и окружающей средой. В процессе проявления своей мультифункциональной активности эти белки включаются в поддержание структурной целостности клетки, связывание различных веществ, адгезию к другим клеткам и регуляцию транспорта как питательных веществ, так и бактерицидных агентов. С одной стороны, как поверхностные антигены порины представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета макроорганизма, активируя факторы немедленной защиты и включаясь в формирование специфического иммунного ответа, направленного на освобождение от патогена. С другой стороны, они выступают как эффекторы патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макроорганизме. В связи с вышесказанным, исследование структуры и биологической функции поринов не только представляет теоретический интерес, но и является важным для решения целого ряда прикладных вопросов, таких как создание эффективных вакцинных препаратов и усовершенствование диагностики заболеваний.

Структурные особенности поринов

Порины принадлежат к p-структурированным интегральным мембранным белкам, образующим в нативной мембране олигомерные структуры (чаще всего тримеры). По своим физико-химическим свойствам порины представляют собой слабокислые белки, имеющие необычайно большое для интегральных белков количество полярных аминокислотных остатков. В стабилизации пространственной структуры поринов как в НМ, так и в изолированном состоянии помимо гидрофобных взаимодействий существенную роль играют водородные и ионные связи. Именно этим обусловлена необычайная устойчивость этих белков к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам [11].

Среди белков НМ бактерий доминируют так называемые неспецифические по-рины, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул с молекулярной массой не более 600 Да. В случае Escherichia coli, например, они представлены тремя типами белков: OmpF, OmpC, а также PhoE порином, который появляется в НМ микроорганизма при дефиците фосфатов в культуральной среде. Неспецифические порины имеют, как правило, молекулярную массу 30—50 кДа и высокую степень гомологии (60—80 %) первичной структуры. Основной структурной особенностью поринов является отсутствие в их полипептидной цепи достаточно протяженной последовательности, состоящей из гидрофобных аминокислотных остатков, подобной той, что «прошивает» мембранный бислой в случае а-спирализованных мембранных белков [15].

Следует отметить, что изучением бактериальных поринов из различных источников занято большое число исследователей, в связи с чем в литературе встречаются самые разнообразные обозначения для вновь выделенных белков, однако при определении типа порина используют, как правило, классификацию, принятую для поринов E. coli (например, OmpF- или OmpC-подобные порины).

По данным рентгеноструктурного анализа каждый мономер порина представляет собой образованный антипараллельными р—гяжами цилиндр, который окружает водонаполненный канал. Как правило, цилиндр диаметром 6 А состоит из

8—16 р-тяжей различной длины, пересекающих мембрану под углом от 35 до 50°. Соединяющие р-тяжи участки полипептидной цепи белка, так называемые петли, достаточно коротки, если расположены со стороны периплазмы; значительно более длинные петли, расположенные с внешней стороны мембраны, свернуты в сложные структуры. С внешней стороны мембраны доступ в пору (канал) ограничен одной из наружных петель Ь2 за счет своеобразного «козырька» над входом в канал. Другая, самая длинная, петля Ь3 погружена в полость поры до середины, ограничивая ее размер и образуя сужение — «глазок» канала. Заряженные остатки, локализованные в области «глазка», существенно влияют на ионоселектив-ность и проницаемость канала. Кроме того, по мнению ряда исследователей, изменение конформации петель Ь3, Ь5, Ь7, Ь8 в значительной степени определяет эффективность диффузии через пору [15]. В интактной мембране бактерий могут быть обнаружены гексамеры и наномеры поринов [29]. Однако тример порина рассматривают как основную функциональную единицу в структуре НМ микроорганизмов [13, 35].

В литературе имеется достаточное количество сведений, касающихся молекулярных механизмов функционирования и модуляции пориновых каналов. С помощью электрофизиологических методов обнаружено, что бактериальные порины образуют не статические, постоянно открытые поры, а являются более сложными комплексами с динамичным поведением. В связи с этим роль поринов по осуществлению контроля за проницаемостью НМ бактерий не ограничивается функцией «молекулярного сита». В современной литературе она трактуется значительно шире и связана с конформационной пластичностью этих белков, т. е. способностью образовывать множество конформационных состояний (интермедиатов). Эти свойства поринов используются клеткой для адаптации бактерий к изменению условий окружающей среды. Как правило, в клетке существуют различные популяции поринов с высокой степенью гомологии на уровне первичной структуры, но с различным диаметром пор. Клетка регулирует проницаемость НМ посредством экспрессии поринов с меньшим или большим диаметром пор в ответ на изменение условий и воздействие различных факторов внешней среды [15]. К изменяющимся факторам внешней среды относится и сообщество макроорганизмов, персистен-ция бактериальных клеток внутри такого сообщества приводит к мутациям в генах, отвечающих за синтез пориновых белков. Анализ последовательности пори-новых генов подтвердил существование «горизонтальных» генетических изменений и точечных мутаций в экспонированных на поверхности клетки участках поринов в результате попадания микроорганизма в макроорганизм. К такому выводу пришли исследователи, проводя молекулярное типирование нейссерий, вызывающих повторные инфекции [20].

Антигенные детерминанты поринов

На сегодняшний день не существует единого мнения о том, какой тип антигенных детерминант, характерный для белковых молекул, наиболее часто встречается у порообразующих белков. Тем не менее существование у поринов двух типов антигенных детерминант подтверждается в экспериментах многих исследователей: линейных, обусловленных первичной аминокислотной последовательностью белка, и конформационных, формирующихся на более высоких уров-

нях структурной организации белковой молекулы. Некоторые авторы считают, что большинство антигенных детерминант поринов являются «прерывистыми» и приходятся преимущественно на участки петель с неупорядоченной структурой [31]. Например, поликлональная сыворотка, полученная к OprF порину из Pseudomonas aeruginosa, обнаруживала слабую реактивность при связывании с отдельными участками аминокислотной последовательности этого белка, подтверждая предположение о том, что антитела вырабатываются в основном на конформационные детерминанты, расположенные на двух соседних петлях порина [31]. Моноклональные антитела, специфичные к мономерам ОmpC порина из P. aeruginosa, и антитела, специфичные к мономерам OmpF порина из E. coli, не реагируют с тримерами этих белков [25].

Анализ распределения специфических эпитопов у поринов грамотрицательных энтеробактерий, выполненный с помощью моноклональных антител, показал, что наибольшей вариабельностью обладают антигенные детерминанты, расположенные на поверхности бактериальной клетки. Напротив, антигенные эпитопы, расположенные на трансмембранных участках белка, очень консервативны и имеют высокую степень родства с поринами других энтеробактерий [3, 33].

При исследовании OmpC порина из Salmonella typhimurium было установлено, что антитела, реагирующие с «петельными» эпитопами, не реагируют перекрестно с OmpC белком из E. шИ. Сравнение аминокислотной последовательности гидрофобных и гидрофильных участков молекул поринов PorA и PorB из Neisseria meningitidis показал, что области наибольших структурных различий между ними находятся в гидрофильных максимумах. Именно эти области ответственны за различие антигенных свойств этих поринов. Оказалось, что два из восьми гидрофильных вариабельных участков, выступающих за пределы НМ и образующих петли различной длины, являются носителями серологических субтиповых детерминант [3, 16]. Предполагается, что данные участки молекулы непосредственно контактируют с иммунными клетками хозяина и способствуют формированию субтипово-го специфического иммунного ответа как после вакцинации, так и после менинго-кокковой инфекции [3, 16].

Моноклональные антитела к высококонсервативному домену Po I порина из E. coli 055 обнаруживали высокий уровень перекрестных реакций как с другими энтеробактериями, так и с патогенными и непатогенными нейссериями [19]. Эти результаты свидетельствуют об определенной иммунобиологической роли гидрофобных консервативных эпитопов поринов в проявлении иммуногенных свойств этих белков.

Одним из методов изучения антигенной структуры белков является постепенное разрушение присущей данному белку нативной структуры (четвертичной, третичной, вторичной) и сравнительный иммунохимический анализ образующихся при этом конформационных интермедиатов белка. Использование такого подхода позволило выявить изменения в антигенной структуре порообразующего белка из НМ Yersinia pseudotuberculosis при его денатурации [6]. Первая стадия этого процесса — диссоциация тримера порина на мономеры — приводила к потере части антигенных детерминант, которые формируются на уровне четвертичной структуры белка (конформационные детерминанты). Вторая стадия, переход моно-мер^-денатурированный мономер в результате термоденатурации, не вызывала качественных изменений в антигенной структуре белка. Авторы предположили, что для мономеров характерен только один тип антигенных детерминант — термостабильных, соответствующих линейным участкам аминокислотной последовательности и/или сближенных в процессе формирования вторичной структуры белка.

Существование конформационных детерминант у порина псевдотуберкулезного микроба было продемонстрировано при иммунохимическом исследовании антигенной структуры двух образцов изолированных тримеров белка, отличающихся способом выделения. В одном случае перевод порина из мембраносвязанного состояния в раствор осуществляли в жестких условиях с помощью ионного детергента, в другом тример порина был получен ферментативным расщеплением пеп-тидогликанового (ПГ) слоя, с которым белок ассоциирован в нативной мембране. Полученные тримеры одинаково эффективно взаимодействовали с антисывороткой к мономеру порина, но обнаруживали низкий уровень перекреста между собой. Эти результаты свидетельствуют о том, что в зависимости от процедуры выделения белка в антигенной структуре соответствующих сайтов, формирующихся на уровне четвертичной структуры тримеров порина, возникают существенные различия. Они отражают различия в пространственной структуре двух видов три-меров. Данное предположение было подтверждено результатами физико-химического исследования тримеров порина с помощью методов оптической спектроскопии, ультрацентрифугирования и сканирующей микрокалориметрии [5].

Протективные свойства поринов и антител к ним

На современном этапе развития иммунологии и вакцинопрофилактики основным критерием при выборе антигена для вакцинации стало обеспечение возможности получения видоспецифического иммунитета, а также эффективной защиты от аэрогенного инфицирования [10]. Белки НМ бактерий в качестве компонентов вакцинных препаратов имеют значительные преимущества по сравнению с липополисахаридом. Во-первых, они не токсичны, во-вторых, они, как правило, являются видоспецифическими антигенами [4, 8, 32]. В связи с этим препараты, созданные на основе белков НМ бактерий, и прежде всего поринов, могут защищать от инфекции, вызываемой всеми типами данного вида микроорганизма.

Кроме того, порины часто являются родоспецифическими антигенами: внутри семейства Enterobacteriaceae наблюдаются перекрестные реакции между основными белками НМ микроорганизмов, входящих в его состав. В связи с этим создание вакцин на основе поринов перспективно и для защиты от родственных инфекций. Кроме того, очищенные порины могут оказывать стимулирующее действие на гуморальный и клеточный иммунный ответ по отношению к неродственным антигенам и вакцинам на основе убитых клеток Micobacterium vacae [12].

Порины показали себя как эффективные компоненты вакцинных препаратов для защиты человека, различных животных от заболеваний, вызываемых бактериями Neisseria, Salmonella, Pseudomonas, Yersinia, Pasteurella, Aeromonas, Chlamidia [2, 7, 9, 10, 14, 17, 24, 26]. Введение пориновых белков вместе с адъювантом существенно увеличивает уровень специфических антител в крови иммунизированных животных и людей [36].

Порины сами обладают высокой иммуномодулирующей активностью, что позволяет применять их в качестве адъювантов для основных компонентов вакцин: различных пептидов, фрагментов антител, токсинов, фимбрий [10]. Использование поринов в качестве белкового носителя в полисахаридных вакцинах способствует развитию специфического иммунитета, а также формированию иммунологической памяти к N. meningitidis у детей и молодых обезьян [3]. Механизм иммуностимулирующего действия заключается в том, что порин индуцирует образование В-клетками костимулятора В-7, который наряду со специфическим сигналом от антигена необходим для дифференцировки Т-клеток в активные эффекторы,

т. е. для полноценного развития гуморального иммунитета. В литературе есть сообщения о высоком адъювантном потенциале поринов из различных типов нейс-серий, а также об использовании в качестве адъювантов различных типов порооб-разующих белков: OmpA, OmpC, LamB, PhoE из E. coli, OmpC из Salmonella typhi, OmpF из P. aeruginosa [23, 28, 37].

Порины могут быть использованы как исходный материал для получения ДНК-вакцин. Для защиты мышей от хронической легочной инфекции используют плазмидную вакцину, содержащую клонированный ген порина OprF из P. aeruginosa. В ткани легких иммунизированных мышей обнаруживается значительно меньше микроскопических повреждений и значительно меньшее количество бактерий по сравнению с контролем. Сыворотка от ДНК вакцинированных мышей имеет значительную опсонизирующую активность в отношении фагоцитов, в ней преобладают иммуноглобулины класса G [30].

Нежелательные эффекты, которые могут появиться при иммунизации порина-ми, такие как образование отека в месте введения порина, устраняются путем создания вакцин нового поколения на основе синтетических пептидов, имитирующих антигенные эпитопы поринов [10, 17].

Иммунный ответ на белки НМ бактерий, в том числе порины, имеет ряд особенностей, к ним относятся высокий уровень антител, полученных как в результате иммунизации, так и при развитии инфекции, а также продолжительность циркуляции специфических антител в крови животных и людей. Интересно также, что антитела к поринам обнаруживаются в сыворотках крови экспериментальных животных (мышей, кроликов, крыс, обезьян) вне зависимости от формы вводимого антигена, т. е. при иммунизации целыми клетками, фрагментами клеточной стенки бактерий, изолированными белками [1, 18, 22].

Показано, что антитела, полученные к белковым компонентам НМ бактериальных клеток, в том числе к поринам, также обладают протективным эффектом [21, 24, 27, 34]. Пассивная иммунизация антителами к белкам НМ оказывается особенно полезной в случае инфицирования микроорганизмами, проявляющими особую устойчивость к антибиотикам.

Антитела к порину не только обеспечивают защиту мышей от 10—50-кратной дозы высоковирулентного штамма S. typhimurium, вызывающей 50 %-ную смертность (LD50), но и увеличивают продолжительность жизни животных при эндоток-симии [34]. Моноспецифическая антисыворотка к пориновому белку из Pasteurella multocida UT-1, полученная при иммунизации мышей препаратом белка, включенным в липосомы, защищает животных не только от заражения гомологичным штаммом возбудителя, но и от заражения другими штаммами этого микроорганизма [24].

Иммуногенные свойства порина из псевдотуберкулезного микроба

В лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН проводятся исследования различных биологических свойств белков-поринов НМ микроорганизмов рода Yersinia. Интерес к роду Yersinia обусловлен тем, что в состав его входят возбудители таких социально значимых заболеваний, как чума (Y. pestis), кишечный иерсиниоз (Y. enterocolitica) и псевдотуберкулез (Y. pseudotuberculosis).

Псевдотуберкулез, или экстраинтестинальный иерсиниоз, относится к числу широкораспространенных инфекций, что, в первую очередь, обусловлено выра-

женной адаптационной способностью возбудителя. Исследования последнего десятилетия позволяют говорить о практически повсеместном распространении этой инфекции в России. Очаги заболевания псевдотуберкулезом чаще всего выявляются на Дальнем Востоке, в Сибири, Санкт-Петербурге и Ленинградской области. Следует особо подчеркнуть, что основная часть болеющих псевдотуберкулезом — дети в возрасте до 14 лет (более 65 % от общего числа заболевших).

Ранее из НМ бактерий Y. pseudotuberculosis (штамм 512, 1-й серовар) был выделен белок-порин, названный иерсинином, относящийся к термозависимым по-рообразующим белкам НМ бактерий, ассоциированным с ПГ (пептидоглика-ном) [6]. В зависимости от способа выделения порин может быть получен в виде различных молекулярных форм (тримерной и мономерной). Образование специфических антител в высоких титрах наблюдалось у экспериментальных животных при иммунизации обеими молекулярными формами антигена.

Обнаружено, что иерсинин в ряду поверхностных белков принадлежит к числу иммунодоминантных антигенов НМ псевдотуберкулезного микроба. При иммунизации как мелких, так и крупных лабораторных животных бактериями псевдотуберкулеза в сыворотках крови обнаружены антитела к иерсинину. В случае экспериментальной инфекции у обезьян и при естественном развитии заболевания у людей антитела к порину преобладают.

Получены сведения о различной степени иммуногенной активности различных молекулярных форм порина из псевдотуберкулезного микроба. При экспериментальном псевдотуберкулезе у павианов-гамадрилов через три недели после заражения в сыворотках крови обнаруживались антитела к тримерной и мономерной формам иерсинина [1]. Антитела к тримеру преобладали в первые две недели от начала иммунизации мышей, максимальное их количество приходилось на

9—10-й день [7]. В сыворотках крови людей, переболевших псевдотуберкулезом, в эти же сроки заболевания выявлялись антитела только к мономерной форме белка, а антитела к тримерной форме порина обнаруживались только в первую неделю от начала заболевания, в данном случае можно говорить об изменении специфичности антител, вырабатываемых в процессе развития инфекции [1, 7]. Кроме того, для иммунного ответа к различным молекулярным формам порина из Y. pseudotuberculosis характерна дозозависимость. При увеличении дозы антигена наблюдается не только увеличение интенсивности иммунного ответа мышей, но и изменение формы кривой антителообразования. Вероятно, различные антигенные детерминанты тримерной и мономерной форм белка распознаются независимо, и ответ к ним формируется в разное время [7].

Обнаружено, что порин из псевдотуберкулезного микроба является видо- и родоспецифическим антигеном. Иерсинин реагирует не только с антисыворотками к бактериям 6 сероваров Y. pseudotuberculosis, но и с антисыворотками к бактериям других видов иерсиний. Однако при исследовании взаимодействия иерсинина с антителами к некоторым микроорганизмам семейств Enterobacteriaceae и Brucellaceae обнаружен значительно более низкий уровень перекрестных реакций. Эти результаты явились предпосылкой для разработки метода диагностики псевдотуберкулеза с использованием иерсинина в качестве диагностического антигена. В результате на основе иммуноферментного анализа (ИФА) нами была сконструирована диагностическая тест-система, которая в отличие от используемого в клинической практике коммерческого типоспецифического диагностикума позволяет определять в сыворотках больных антитела ко всем вариантам возбудителя псевдотуберкулеза. Это особенно важно для Дальневосточного региона России, где циркулируют возбудители 1-го, 3-го и 5-го сероваров. Преимуществом разрабо-

танной нами ИФА тест-системы является также возможность диагностики заболевания на ранних стадиях развития инфекционного процесса (7—10 дней от начала проявления клинических признаков). Сыворотки больных иерсиниозом и сальмонеллезом взаимодействуют с порином в диагностических разведениях, но в этом случае оптическая плотность исследуемых образцов была в среднем в 3 раза ниже. Это позволяет эффективно и достоверно осуществлять дифференциальную диагностику псевдотуберкулеза.

Одним из важнейших направлений исследований псевдотуберкулеза является разработка средств специфической профилактики этого заболевания.

Предварительное определение острой токсичности показало, что 100 %-ная выживаемость животных отмечена при введении 1250 мкг антигена. LD50 порина составила для мышей 1577,6 (995,4—3147,7) мкг. Иммунизированные иерсинином животные, так же как и неиммунизированные из контрольной группы, в течение всего срока наблюдения прибавляли в весе. У препарата не было обнаружено пи-рогенного действия*.

Протективная активность иерсинина продемонстрирована в тесте активной защиты мышей и морских свинок. Исследования показали, что при заражении двукратно иммунизированных мышей бактериями 1-го серовара Y. pseudotuberculosis (10—30 LD50) защитная доза (ED50) порина оказалась равной в среднем

0,13 мкг/кг, а при заражении такой же дозой бактерий 3-го серовара Y. pseudotuberculosis среднее значение ED50 составило 6,3 мкг/кг. LD50 при заражении мышей, иммунизированных двукратно 10—100 мкг порина микроба 1-го серовара, превышала LD50 неиммунных мышей в 10—1000 раз. Тример порина по сравнению с

мономерной молекулярной формой белка оказался менее эффективным при защите от экспериментальной инфекции у мышей и морских свинок. Введение мономера иерсинина в смеси с неполным адъювантом Фрейнда увеличивало протектив-ную активность белка в 50—150 раз.

В связи с тем, что иерсинин является родоспецифическим антигеном, представляло интерес проверить его защитные свойства при заражении животных культурой другого представителя рода Yersinia — Y. pestis. Однако двукратная иммунизация белых мышей и морских свинок препаратами иерсинина оказалась неэффективной при заражении животных возбудителем чумы**.

Заключение

Порообразующие белки давно привлекают внимание исследователей как мультифункциональные компоненты НМ бактериальных клеток, играющие важную роль во взаимоотношениях паразита с организмом хозяина. Способность поринов индуцировать образование протективных, бактерицидных и опсонизиру-ющих антител может быть использована при конструировании вакцинных препаратов и при диагностике инфекционных заболеваний.

Работа, проведенная коллективом авторов в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, позволила выделить и охарактеризовать основной порообразующий белок из НМ псевдотуберкулезного микроба (иерсинин). Были получены убедительные доказательства того, что

* Работа выполнена в соавторстве с доктором биологических наук Н.Ф.Тимченко (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток).

** Работа была проведена в НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров.

этот белок относится к высокоиммуногенным компонентам НМ возбудителя псевдотуберкулеза. Иммунизация препаратами порина вызывает развитие у животных иммунитета против инфекции, вызываемой различными сероварами Y. pseudotuberculosis. Тримерная и мономерная молекулярные формы иерсинина с успехом могут использоваться в качестве диагностических антигенов при верификации заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Дробков В.И., Дармов И.В., Маракулин И.В., Соловьева Т.Ф. Иммунный ответ к основному порообразующему белку наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis у людей и экспериментальных животных // ВИНИТИ. 2000. № 795-ВОО.

2. Дармов И.В., Маракулин И.В., Погорельский И.П., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф. Профилактика экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции с помощью иммунизации пори-ном из Yersinia pseudotuberculosis // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1999. Т. 127, № 2. С. 221—223.

3. Дельвиг А. А., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. № 6. С. 92—96.

4. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1996. № 6. С. 657—660.

5. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.И., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган. химия. 1993. № 19. С. 536—547.

6. Новикова О.Д., Фролова Г.М., Вакорина Т.Н., Таранкова З.А., Глазунов В.П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Конформационная стабильность и иммунохимические свойства иерсинина — основного белка внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба // Биоорган. химия. 1989. Т. 15. С. 763—772.

7. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999. Т. 128, № 10. С. 437—440.

8. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий // Успехи соврем. биологии. 1980. Т. 90, вып. 1(4). С. 62—79.

9. Супотницкий М.В., Левчук Б.А., Бакулин М.К. Новикова О.Д. Патент на изобретение «Способ профилактики сапа». № 504. 24.06.94.

10. Супотницкий М. В. Эффективное патентование средств специфической профилактики инфекционных заболеваний // Биотехнология. 1997. № 9—10. C. 56—79.

11. Achouak W., Heulin T., Pages J.-M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. Vol. 199. P 1—7.

12. Alurkar V., Kamat R. Immunomodulatory properties of some members of the family Enterobacteriacea // Infect. Immun. 1997. Vol. 65. P. 2382—2388.

13. Benson S.A., Occi J.L.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K-12 // J. Mol. ВЫ. 1988. Vol. 203, N 4. P. 961-970.

14. Cartwright K.A.V., Morris P, Rumke H., Fox R., Borrow R., Begg N., Richmond P. Immunogenicity and reactogenicity in UK infants of a novel meningococcal vesicle vaccine containing multiple class 1 (PorA) outer membrane proteins // Vaccine. 1999. Vol. 17, N 20—21. P 2612—2619.

15. Delcour A. Functon and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology // FEMS Microbiol. Lett. 1997. Vol. 151. P. 115—125.

16. Delvig A.A., Wedege E., Michaelsen T.E., Hoiby E.A., Brandtzaeg P., Rosenqvist E. Immune responses to linear epitopes on the PorB protein of Neisseria meningitidis in patients with systemic meningococcal disease // Microbiol. 1996. Vol. 142, рt 9. P. 2491—2498.

17. Hassett D.E., Whitton J.T. DNA immunization // Trends Microbiol. 1996. Vol. 4, N 9. Р. 307—312.

18. Hedstrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway R. Antibody response of infected mice to outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1984. Vol. 41. P. 49—53.

19. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Immunogenicity expressed in patients with bacteraemia of an epitope shared by enterobacterial and neisserial porin proteins // APMIS. 1995. Vol. 103, N 5. P. 388—394.

20. Hobbs M.M., Alcorn T.M., Davis R.H., Fischer W., Thomas J.C., Martin I., Ison C., Sparling PF., Cohen M.S. Molecular typing of Neisseria gonorrhoeae causing repeated infection: evolution of porin during passage within a community // J. Infect. Dis. 1999. Vol. 179, N 2. P. 371—381.

21. Kubo A., Stephens R.S. Characterization and functional analysis of PorB, a Chlamydia porin and neutralizing target // Mol. Microbiol. 2000. Vol. 38, N 4. P 772—780.

22. Kuusi M., Nunninen M., Saxon H., Valtoneri M., Makela PH. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonelesis in mice // Infect. Immun. 1979. Vol. 25. P. 857—862.

23. Lang H. Outer membrane proteins as surface display systems // Int. J. Med. Microbiol. 2000. N 290. P 579—585.

24. Lu Y.—S., Gerrity L.W., Afendis S., Walkins L., Pakes S.P Distribution of a monoclonal antibody-recognized protective protein immunogen on the outer membranes of Pasteurella multocida rabbit isolates // J. Clin. Microbiol. 1988. Vol. 26, N 7. P. 1326—1330.

25. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucari S., Pages J.-M. Immunological analysis of porin polymorphism in Escherichia coli B and K-12 // Mol. Immunol. 1989. Vol. 26, N 11. P 1027—1036.

26. Lutwiche P., Exner M.M., Hancock R.E.W., Trust T.J. A conserved Aeromonas-porin provides protective immunity to rainbow-trout // Infect. Immun. 1995. Vol. 63, N 58. P 3137—3142.

27. Marandi M.V., Mittal K.R. Role of outer membrane protein H (OmpH)- and OmpA — specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida // Infect. Immun. 1997. Vol. 65, N 11. P. 4502—4508.

28. Massari P., Ho Y., Wetzler L.M. Neisseria meningitidis porin PorB interacts with mitochondria and protects cells from apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 9070—9075.

29. Palva E.T., Randall L.L. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a major outer membrane protein of Escherichia coli // J. Bacteriol. 1979. Vol. 138, N 1. P. 254—256.

30. Price B.M., Galloway D.R., Baker N.R., Gilleland L.B., Staczek J., Gilleland H.E. Protection against Pseudomonas aeruginosa chronic lung infection in mice by genetic immunization against outer membrane protein F (OprF) of Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 2001. Vol. 69, N 5. P 3510—3515.

31. Ranling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF // Infect. Immun. 1995. Vol. 63, N 1. P. 38—42.

32. Schweizer M., Hindennach I., Garten W., Henning U. Major proteins of Escherichia coli outer cell envelop membrane. Interaction of protein II with lipopolisaccharide // Eur. J. Biochem. 1978. Vol. 82, N 1. P. 211—217.

33. Singh S.P, Singh S.R., Williams Y.U., Jonnes L., Abdullah T. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium // Infect. Immun. 1995. Vol. 63, N 12. P. 4600—4605.

34. Singh S.P., Williams Y.U., Benjamin W.H., Klebba PE., Boyd D. Immunoprotection by monoclonal antibodies to the porins and lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium // Microbial Pathogenesis. 1996. Vol. 21, N 4. P. 249—263.

35. Steven A.C., Ten Heggeler B., Muller R., Risten J., Rosenbusch J.P Ultrastructure of a periodic protein layer in the outer membrane of Escherichia coli // J. Cell. Biol. 1977. Vol. 72, N 2. P. 292—301.

36. Vonspecht B.U., Lucking H.C., Blum B., Schmitt A., Hungerer K.D., Domdey H. Safety and immuno-genity of a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein I vaccine in human volunteers // Vaccine. 1996. Vol. 14, N 12. P. 1111—1117.

37. Wyllie S., Longbottom D., Herring A.J., Ashley R.H. Single channel analysis of recombinant major outer membrane protein porins from Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae // FEBS Lett. 1999. Vol. 445, N 1. P. 192—196.