ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ЧЕТЫРЕХУГЛЕРОДНЫХ СПИРТОВ

1. Рекомбинантная микробная клетка-хозяин, включающая по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в изобутиральдегид (стадия d пути) и
v) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину и где указанная микробная клетка-хозяин продуцирует изобутанол.
2. Рекомбинантная микробная клетка-хозяин, включающая по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в изобутирил-KoA (стадия f пути);
v) изобутирил-КоА в изобутиральдегид (стадия g пути) и
vi) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину и где указанная микробная клетка-хозяин продуцирует изобутанол.
3. Рекомбинантная микробная клетка-хозяин, включающая по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в валин (стадия h пути);
v) валина в изобутиламин (стадия i пути);
vi) изобутиламина в изобутиральдегид (стадия j пути) и
vii) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину и где указанная микробная клетка-хозяин продуцирует изобутанол.
4. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, пирувата в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу.
5. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат, представляет собой изомероредуктазу ацетогидроксикислоты.
6. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат, представляет собой дегидратазу ацетогидроксикислоты.
7. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутиральдегида в изобутанол, представляет собой дегидрогеназу спиртов с разветвленной цепью.
8. Клетка-хозяин по п.1, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в изобутиральдегид, представляет собой декарбоксилазу α-кетокислот с разветвленной цепью.
9. Клетка-хозяин по п.2, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в изобутирил-KoA, представляет собой дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью.
10. Клетка-хозяин по п.2, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутирил-KoA в изобутиральдегид, представляет собой ацилирующую альдегиддегидрогеназу.
11. Клетка-хозяин по п.3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в валин, представляет собой трансаминазу.
12. Клетка-хозяин по п.3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в валин, представляет собой валиндегидрогеназу.
13. Клетка-хозяин по п.3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, валина в изобутиламин, представляет собой валиндекарбоксилазу.
14. Клетка-хозяин по п.3, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутиламина в изобутиральдегид, представляет собой омега-трансаминазу.
15. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где клетка выбрана из группы, состоящей из бактерии, цианобактерии, нитчатого гриба и дрожжей.
16. Клетка-хозяин по п.15, где клетка является членом рода, выбранного из группы, состоящей из Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula и Saccharomyces.
17. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Escherichia coli.
18. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Alcaligenes eutrophus.
19. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Bacillus licheniformis.
20. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Paenibacillus macerans.
21. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Rhodococcus erythropolis.
22. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Pseudomonas putida.
23. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Bacillus subtilis.
24. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Lactobacillus plantarum.
25. Клетка-хозяин по п.16, где клетка выбрана из группы, состоящей из Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium и Enterococcus faecalis.
26. Клетка-хозяин по п.16, где клетка представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
27. Клетка-хозяин по п.4, где ацетолактатсинтаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:178 и SEQ ID NO:180.
28. Клетка-хозяин по п.5, где изомероредуктаза ацетогидроксикислоты имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183 и SEQ ID NO:185.
29. Клетка-хозяин по п.6, где дегидратаза ацетогидроксикислоты имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 и SEQ ID NO:190.
30. Клетка-хозяин по п.7, где дегидрогеназа спиртов с разветвленной цепью имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:203 и SEQ ID NO:204.
31. Клетка-хозяин по п.8, где декарбоксилаза α-кетокислот с разветвленной цепью имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195 и SEQ ID NO:197.
32. Клетка-хозяин по п.9, где дегидрогеназа кетокислот с разветвленной цепью включает четыре субъединицы, и аминокислотные последовательности указанных субъединиц выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:206 и SEQ ID NO:212.
33. Клетка-хозяин по п.10, где ацилирующая альдегиддегидрогеназа имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228 и SEQ ID NO:230.
34. Клетка-хозяин по п.11, где трансаминаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238 и SEQ ID NO:240.
35. Клетка-хозяин по п.12, где валиндегидрогеназа имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:242 и SEQ ID NO:244.
36. Клетка-хозяин по п.13, где валиндекарбоксилаза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:246.
37. Клетка-хозяин по п.14, где омега-трансаминаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:252 и SEQ ID NO:254.
38. Клетка-хозяин по любому из пп.1, 2 или 3, где клетка-хозяин представляет собой факультативный анаэроб.
39. Способ получения изобутанола, включающий
1) получение рекомбинантной микробной клетки-хозяина, включающей по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в изобутиральдегид (стадия d пути) и
v) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину; и
2) контактирование клетки-хозяина (1) с ферментируемым углеродным субстратом в среде ферментации в условиях, при которых продуцируется изобутанол.
40. Способ получения изобутанола, включающий
1) получение рекомбинантной микробной клетки-хозяина, включающей по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в изобутирил-KoA (стадия f пути);
v) изобутирил-KoA в изобутиральдегид (стадия g пути) и
vi) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину; и
2) контактирование клетки-хозяина (1) с ферментируемым углеродным субстратом в среде ферментации в условиях, при которых продуцируется изобутанол.
41. Способ получения изобутанола, включающий
1) получение рекомбинантной микробной клетки-хозяина, включающей по меньшей мере одну молекулу ДНК, кодирующую полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, выбранное из группы, состоящей из
i) пирувата в ацетолактат (стадия a пути);
ii) ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат (стадия b пути);
iii) 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат (стадия c пути);
iv) α-кетоизовалерата в валин (стадия h пути);
v) валина в изобутиламин (стадия i пути);
vi) изобутиламина в изобутиральдегид (стадия j пути) и
vii) изобутиральдегида в изобутанол (стадия e пути),
где по меньшей мере одна молекула ДНК гетерологична указанной микробной клетке-хозяину; и
2) контактирование клетки-хозяина (1) с ферментируемым углеродным субстратом в среде ферментации в условиях, при которых продуцируется изобутанол.
42. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где ферментируемый углеродный субстрат выбран из группы, состоящей из моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов.
43. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где углеродный субстрат выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы и фруктозы.
44. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где условия, при которых продуцируется изобутанол, являются анаэробными.
45. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где условия, при которых продуцируется изобутанол, являются микроаэробными.
46. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где клетка-хозяин контактирует с углеродным субстратом в минимальной среде.
47. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, пирувата в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу.
48. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, ацетолактата в 2,3-дигидроксиизовалерат, представляет собой изомероредуктазу ацетогидроксикислоты.
49. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, 2,3-дигидроксиизовалерата в α-кетоизовалерат, представляет собой дегидратазу ацетогидроксикислоты.
50. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутиральдегида в изобутанол, представляет собой дегидрогеназу спиртов с разветвленной цепью.
51. Способ по п.39, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в изобутиральдегид, представляет собой декарбоксилазу α-кетокислот с разветвленной цепью.
52. Способ по п.40, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в изобутирил-KoA, представляет собой дегидрогеназу кетокислот с разветвленной цепью.
53. Способ по п.40, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутирил-KoA в изобутиральдегид, представляет собой ацилирующую альдегиддегидрогеназу.
54. Способ по п.41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в валин, представляет собой трансаминазу.
55. Способ по п.41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, α-кетоизовалерата в валин, представляет собой валиндегидрогеназу.
56. Способ по п.41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, валина в изобутиламин, представляет собой валиндекарбоксилазу.
57. Способ по п.41, где полипептид, который катализирует превращение субстрата в продукт, изобутиламина в изобутиральдегид, представляет собой омега-трансаминазу.
58. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактерии, цианобактерии, нитчатого гриба и дрожжей.
59. Способ по п.55, где клетка-хозяин является членом рода, выбранного из группы, состоящей из Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula и Saccharomyces.
60. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Escherichia coli.
61. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Alcaligenes eutrophus.
62. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Bacillus licheniformis.
63. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Paenibacillus macerans.
64. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Rhodococcus erythropolis.
65. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Pseudomonas putida.
66. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Bacillus subtilis.
67. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Lactobacillus plantarum.
68. Способ по п.59, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium и Enterococcus faecalis.
69. Способ по п.59, где клетка-хозяин представляет собой Saccharomyces cerevisiae.
70. Способ по п.47, где ацетолактатсинтаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:178 и SEQ ID NO:180.
71. Способ по п.48, где изомероредуктаза ацетогидроксикислоты имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:183 и SEQ ID NO:185.
72. Способ по п.49, где дегидратаза ацетогидроксикислоты имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:188 и SEQ ID NO:190.
73. Способ по п.50, где дегидрогеназа спиртов с разветвленной цепью имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:203 и SEQ ID NO:204.
74. Способ по п.51, где декарбоксилаза α-кетокислот с разветвленной цепью имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:195 и SEQ ID NO:197.
75. Способ по п.52, где дегидрогеназа кетокислот с разветвленной цепью включает четыре субъединицы, и аминокислотные последовательности указанных субъединиц выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:206 и SEQ ID NO:212.
76. Способ по п.53, где ацилирующая альдегиддегидрогеназа имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:222, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:228 и SEQ ID NO:230.
77. Способ по п.54, где трансаминаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:238 и SEQ ID NO:240.
78. Способ по п.55, где валиндегидрогеназа имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:242 и SEQ ID NO:244.
79. Способ по п.56, где валиндекарбоксилаза имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:246.
80. Способ по п.57, где омега-трансаминаза имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:252 и SEQ ID NO:254.
81. Способ по любому из пп.39, 40 или 41, где клетка-хозяин представляет собой факультативный анаэроб.
82. Содержащая изобутанол среда ферментации, полученная способом по любому из пп.39, 40 или 41.