СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИЗБИРАТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ, АКТИВИРУЮЩЕЕ ИХ АПОПТОЗ И ПРЕПЯТСТВУЮЩЕЕ ФОРМИРОВАНИЮ ИХ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
AGENT HAVING SELECTIVE ACTION ON TUMOR CELLS, ACTIVATING APOPTOSIS THEREOF AND PREVENTING FORMATION OF RESISTANCE THEREOF

Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности, а именно к созданию лекарственных средств на основе новогаленового препарата, содержащего биофлавоноиды и обладающего одновременно избирательным действием на опухолевые клетки, активирующее их апоптоз и препятствующее формированию их резистентности.
Средство может быть использовано как самостоятельное - для профилактики и лечения злокачественных новообразований в терапии злокачественных новообразований, так и при создании комбинированных химиопрепаратов. Предложен упаренный экстракт листьев аврана лекарственного, получаемый путем экстрагирования 95% этиловым спиртом листьев аврана лекарственного, при определенных условиях, с очисткой хлороформом от ядовитых веществ и последующей отгонкой растворителя и упаривания.
В настоящее время поиск новых лекарственных препаратов для борьбы со злокачественными новообразованиями является приоритетным направлением современной медицины. При этом фундаментальной проблемой практической онкологии является высокая токсичность и низкая избирательность действия противоопухолевых препаратов известных классов.
Особое значение имеют препараты на основе растительного сырья, содержащего флавоноиды, с низким токсическим действием. Экстракт лекарственного растительного сырья (ЛРС) представляет собой многокомпонентную композицию биологически активных веществ с поливалентным действием, формирующую ее так называемый «шрапнельный» эффект (Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов. Самара: ООО «ОФОРТ» САМГМУ, 2004. 1180 с.). Низкая токсичность и большая биодоступность таких композиций, представляющих собой продукты жизнедеятельности живых организмов, объясняется их принципиально большим «родством» человеческому организму, по сравнению с синтетическими препаратами. Поливалентность лечебного действия и взаимное потенцирование эффектов действующих веществ у препаратов из ЛРС служит их несомненным достоинством при комплексной и комбинированной химиотерапии (Гольдберг Е.Д., Зуева Е.П. «Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных новообразований» Томск, 2000).
Важной задачей терапии опухолевых заболеваний, как известно, является максимальное сохранение нормальных, неопухолевых клеток при максимальном негативном воздействии на опухолевые клетки. Значительные преимущества будут иметь лекарственные средства, избирательно воздействующие на опухолевые клетки и не оказывающие повреждающего действия на здоровые клетки.
Преимущества также будут иметь противоопухолевые средства, запускающие программированную клеточную гибель (ПКГ), такую, как апоптоз (восстановление внутреннего механизма саморазрушения раковой клетки), в результате которого противовоспалительного последствия некротического распада опухоли для здоровых клеток будет существенно меньше или совсем исключено.
Кроме того, после Нобелевской премии 2016 г., полученной Ёсинори Осуми, исследовавшим аутофагию в дрожжевых клетках с помощью генетического подхода, и выяснения молекулярных механизмов индукции, протекания и регуляции аутофагии, стало очевидно, что индукцию аутофагии можно генетически контролировать, что открыло другой подход к созданию эффективных противоопухолевых средств, а именно: разработка лекарственных средств, ингибирующих аутофагию.
Как известно, аутофагия (как один из возможных путей ПКГ) - это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь ее лизосом или вакуолей и подвергаются в них деградации. Если в неопухолевых клетках макроаутофагия инициируется токсическим стрессом, в условиях обеднения среды питательными веществами и т.п.и направлена на избавление клеток от ненужных органелл, а также и организма от ненужных клеток (Farrugia G, Balzan R. Oxidative Stress And Programmed Cell Death In Yeast (Front Oncol). - 2012. - T. 2, вып. 64. - DOI:10.3389/fonc.2012.00064), то в опухолевых клетках макроаутофагия может способствовать их резистентности химиотерапии за счет деградации поврежденных в результате воздействия органелл и других компонентов клетки, что приводит к быстрой прогрессии заболевания. Поэтому необходим поиск лекарственных средств, способныхпреодолевать формирование резистентности опухолевых клеток.
Известно противоопухолевое действие кураксина CBL0137, продемонстрированное в системах in vitro и in vivo (на мышах линии BALB/c) в отношении аденокарциномы толстой кишки (Акатол) (Фетисов Т.И., Тилов Л.Р., Лесовая Е.А., Антошина Е.Е., Горькова Т.Г., Труханова Л.С., Морозова О.В., Шипаева Е.В., Иванов Р.В., Пурмаль А.А., Белицкий Г.А., Якубовская М.Г., Гудков А.В., Гурова К.В., Кирсанов К.И. Противоопухолевое действие кураксина CBL0137 на моделях аденокарциномы толстой кишки // Успехи молекулярной онкологии. 2016. Т. 3, вып. 3. С. 67-72). Кураксины представляют собой низкомолекулярные карбазольные производные, обладающие афинностью к ДНК, способные одновременно активировать р53-зависимый апоптоз и ингибировать NF-kB-зависимый сигнальный путь. Наблюдалось значительное тормозящее действие CBL0137 на рост данной аллографтной опухоли: на 37-е сутки после перевивки опухоли при пероральном введении препарата в дозах5, 10, 15 и 20 мг/кг в день торможение роста опухоли составило 53, 50, 56 и 74% соответственно. Значимое увеличение продолжительности жизни наблюдалось во всех группах животных, получавших CBL0137. Максимальный эффект (81,7%) был получен при введении препарата в дозе 20 мг/кг в день. В экспериментах in vitro при обработке клеток аденокарциномы толстой кишки человекаНТС116 наблюдался значительный цитотоксический эффект.CBL0137 проявил способность ингибировать экспрессию генаСОХ2, обладающего антиапоптотическим действием и способностью стимулировать неоангиогенез и метастазирование.
Недостатком средства является наличие у него только апоптотического действия и отсутствие избирательной активности к опухолевым клеткам. Кроме того, для кураксина CBL0137 не известна способность препятствовать формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования аутофагии.
Известно противоопухолевое действие фталоцианинов, антрациклиновых антибиотиков, растительных алкалоидов и векторных белков: эпидермального фактора роста и альфа-фетопротеина человека (Фельдман Н. Б. Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов. 03.01.04 - Биохимия. Автореф. дисс. насоиск. уч. степ. докт. биол. наук. Москва-2007. 50 с.). Разработанные схемы избирательного транспорта путем рецептор опосредованного эндоцитоза в опухолевые клетки в составе конъюгатов с векторными полипептидами, позволяющие существенно снижать негативное воздействие на неопухолевые здоровые клетки человека значительно увеличивают терапевтическую активность противоопухолевых препаратов.
Недостатком данных средств служит, прежде всего, повышенная затратность при создании конъюгатов с векторными полипептидами, а также отсутствие способности препятствовать формированию резистентности опухолевых клеток за счет ингибирования аутофагии.
Наиболее близкими к заявленному средству относятся противоопухолевые средства из низкомолекулярных соединений, выделенных из морских беспозвоночных, проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток, таких, как морской тритепеновый гликозид Фрондозид А, агликон ризохалина Ризохалинин и Алкалоид монанхоцидин А (Дышловой С.А. Изучение аспектов механизмов противоопухолевого действия некоторых низкомолекулярных соединений, выделенных из морских беспозвоночных. 03.01.04 - Биохимия. Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. докт. биол. наук. Владивосток - 2017. 50 с.). Для данных соединений был описан новый механизм реализации противоопухолевой активности экстракта - за счет подавления аутофагической активности в опухолевой клетке. Механизмы действия Фрондозида А и Ризохалинина, активных в моделях лекарственно-устойчивого рака простаты человека in vitro и in vivo, включают в себя ингибирование цитопротекторной аутофагии с одновременной активацией апоптоза опухолевых клеток за счет индукции каспаза- и р53-независимого апоптоза клеток уротелиальной карциномы человека in vitro и способен усиливать цитотоксические эффекты цисплатина и гемцитабина. Алкалоид монанхоцидин А индуцирует цитотоксическую аутофагию и пермеабилизацию лизосомных мембран опухолевых клеток, подавляет миграцию, а также способен преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток.
Недостатком данных средств является отсутствие избирательной активности к опухолевым клеткам, что в отношении средств, содержащих алкалоиды и гликозиды, является важным, так как они, как правило, токсичны. Отсутствие избирательного действия в отношении опухолевых клеток делает данные средства недостаточно эффективными для противоопухолевой терапии.
Нами впервые получено средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием (Патент на изобретение RUS 2519769 21.03.2013. Средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б.), нетоксичное, обладающее избирательным действием по отношению к опухолевым клеткам, активирующее их апоптоз и препятствующее формированию их резистентности, представляющее собой упаренный экстракт листьев аврана лекарственного путем измельчения, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°С, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°С, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее.
Всесторонние испытания, направленные на определение путей и механизмов, за счет которых реализуется противоопухолевый эффект экстракта аврана привели к открытию у него способности избирательно действовать на опухолевые клетки, одновременно активировать их апоптоз и препятствовать формированию их резистентности.
Сравнительная реакция неопухолевых (SPEV) и опухолевых клеток (Hela) в тесте «живые и мертвые»
Для исследования противоопухолевой активности экстракта аврана выбраны культуры неопухолевых (SPEV) и опухолевых клеток рака шейки матки Hela в тесте «живые и мертвые» при двойном окрашивании флуоресцентными красителями: акридинового оранжевого (окрашивающий в зеленый цвет только живые клетки) и йодистого пропидия (интеркалирующий через разрушенную мембрану ядра погибающих или уже погибших клеток и окрашивающий их в красно-оранжевый цвет). Применение одновременно двух красителей позволяет выявлять количество погибших (окрашивание в красный цвет) и живых клеток (окрашивание в зеленый цвет) с аутофагосомами и клеток, в которых запустился апоптоз. Были выбраны следующие концентрации экстракта: 0,375 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,5 мг/мл, 3 мг/мл, 6 мг/мл, 12 мг/мл, 24 мг/мл.
Под действием экстракта на клети SPEV наблюдали нелинейную зависимость: среднее количество клеток (СКК) при концентрациях от 0,375 мг/мл до 1,5 мг/мл было ниже, чем в контроле, а, начиная с концентрации 3 мг/мл, было выше, чем в контроле (табл. 1). В отношении клеток Hela, наоборот, наблюдалась линейная зависимость: с увеличением концентрации экстракта СКК становилось меньше, и возрастало количество мертвых клеток (табл. 1).
На фиг. 1 представлена клеточная культура Hela под действием экстракта аврана в двух концентрациях: 0,75 мг/мл (А) и 3 мг/мл (Б); в концентрации 0,75 мг/мл экстракт обладает выраженной апоптотической активностью, а в концентрации 3 мг/мл большая часть клеток погибла и окрашена в красный цвет. На фиг. 2 представлено сравнение процентного содержания мертвых клеток SPEV и Hela под действием экстракта аврана: по вертикали отмечен процент мертвых клеток, по горизонтали - исследованные концентрации. Видно, что при воздействии на SPEV концентрации до 1,5 мг/мл мертвые клетки отсутствовали, в то время, как при воздействии на Hela гибель клеток наблюдалась даже при минимальных концентрациях. Следовательно, опухолевые клетки оказались более чувствительными действию даже небольших концентраций экстракта аврана.
В экспериментах мы наблюдали эффекты каропикноза и кариорексиса. Эффект кариопикноза мы рассматривали, как один из этапов апоптоза или некробиоза клетки, предшествующих кариорексису и кариолизису. В результате кариопикноза ядро клетки уменьшалось в объеме, ядро таких клеток интенсивнее окрашивалось красителем, и эффект легко идентифицировался. В результате кариорексиса оболочка ядра клетки разрушалась и проникающие в цитоплазму клетки нуклеиновые кислоты образовывали отдельные глыбки или т.н. апоптотические тельца. По этим двум эффектам можно было устанавливать количество клеток, погибающих апоптозом.
Примечание: * достоверные отличия при р<0.05 и Т > между экспериментальной группой и контролем с помощью критерия Крамера-Уэлча.
Цитотоксичность экстракта аврана в культурах SPEV и Hela была отмечена при разных концентрациях: у клеток SPEV только при концентрации 4 мг/мл, у Hela уже при 0,375 мг/мл (табл. 1), что также свидетельствует об избирательной активности экстракта в отношении к опухолевым клеткам. При этом подавляющее большинство погибших опухолевых клеток при 0,375-1,5 мг/мл находилась на стадии пикноза, что свидетельствовало также и о высокой апоптотической активности экстракта.
50
Методом пробит анализа (Коросов А.В., Калинкина Н.М. Количественные методы экологической токсикологии Учебно-методическое пособие. - Петрозаводск: ПетрГУ, КНЦ, 2003. - 56 с.), учитывая все изученные концентрации экстракта на клеточные культуры SPEV и Hela, были рассчитаны концентрации, при которых в течение 24 ч после инкубации с экстрактом мертвых клеток оказывалось 50% (табл. 2). LC экстракта аврана в культуре Hela=0,375 мг/мл, а в культуре SPEV=2,5 мг/мл. Опухолевые клетки в шесть раз чувствительнее к действию экстракта, чем неопухолевые, что согласуется с данными по его цитотоксичности.
Таким образом, под действием экстракта аврана на культуру SPEV наблюдали нелинейную зависимость: малые концентрации вызывали уменьшение СКК. Чувствительность опухолевых клеток к экстракту была значительно выше, чем к неопухолевым, и была обусловлена концентрацией: с ее увеличением уменьшалось СКК и возрастало количество мертвых клеток. При этом экстракт уже при минимальной из исследованных концентраций (0,375 мг/мл) оказывал и цитостатическую, и цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток, обладая также и выраженным апоптотическим действием.
Далее для выявления общих тенденций клеточной гибели, в т.ч. и ПГК (апоптоза и аутофагии) под действием экстракта аврана нами были исследованы морфофункциональные изменения только в опухолевых клетках Неla через 24 ч в следующем диапазоне концентраций: 0,0937 мг/мл; 0,1875 мг/мл; 0,375 мг/мл; 0,75 мг/мл; 1,5 мг/мл; 3 мг/мл; 6 мг/мл.
Морфофункциональные изменения в опухолевых клетках рака шейки матки человека (Hela) при разных экспозициях экстрактов
Описание клеток в контроле. На фигуре 3 представлены клетки Hela через 24 ч в контроле при двойном флюоресцентном окрашивании акридиновым оранжевым и йодистым пропидием. Видно, что культура клеток Hela представлена неполным ровным монослоем клеток плотно прилегающих друг к другу и занимающих большую часть поверхности. В основном клетки прикреплены к подложке, открепленными от подложки определяли только единичные клетки. Форма клеток веретеновидная, грушевидная или полигональная. Встречали единичные клетки по типу синцития или симпласта. Клетки с гомогенной цитоплазмой и четко оформленным ядром, при окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием в цитоплазме клеток в приядерной области определяли мелкие оранжевые гранулы лизосомы. Появление мертвых клеток единично. СКК=108,7 (табл. 3).
Примечание: * указаны достоверные отличия с контролем при Т>1.96 и р<0.05
На фиг. 4 А видно, что количество ядрышек варьировало от одного до четырех, чаще два - три, что свидетельствовало об активном синтезе рРНК в ядрышко образующих зонах хромосом. На фиг. 4 Б в единичных клетках были встречены одиночные аутофагосомы, не соединенные с лизосомами. На фигуре 4 В представлена единичная клетка с двумя крупными аутофагосомами, округлой формы и со смещенным к периферии ядром. Апоптотических телец в контроле не выявлено.
После инкубации с экстрактом аврана. На фиг. 5 представлены клетки Hela через 24 ч при концентрации 0,1875 мг/мл: выявлены клетки в основном полигональной формы, фрагментарно представлен монослой, стрелками обозначены аутофагосомы. Активность ядрышковых организаторов сохранялась, количество ядрышек в ядре чаще от двух до трех. СКК по сравнению с контролем при воздействии экстракта при концентрациях от 0,0937 ло 3 мг/мл сократилось в два раза, а при концентрации 6 мг/мл - в три раза, что свидетельствовало о высокой цитостатической активности экстракта. Процент мертвых клеток прямо пропорционально увеличивался, начиная от концентрации 0,1875 мг/мл (табл. 3), т.е. экстракт обладал и значительной цитотоксической активностью. При этом большинство погибших клеток находилась на стадии пикноза, что свидетельствовало о высокой апоптотической активности экстракта.
Максимальная аутофагическая активность экстракта наблюдалась при концентрациях 0,0937 и 0,1875 мг/мл (табл. 3). Образование аутофагосом при концентрации 0,0937 мг/мл свидетельствовало об активном действии экстракта на опухолевые клетки, с помощью аутофагии клетки не только пытались выживать, но и образовывать конгломераты с выраженными цитоплазматическими контактами. При большей концентрации - 0,1875 мг/мл агломерации клеток и цитоплазматические контакты уже не образовывались. Выявлена достаточно четкая тенденция - при резком падении количества клеток с аутофагосомами, резко увеличивается количество мертвых клеток Hela (табл. 3), что подтверждает роль аутофагии при выживании опухолевой клетки в условиях токсического стресса и в т.ч. и противоопухолевой терапии.
На фиг. 6 А видно, что при концентрациях экстракта, начиная с концентрации 0,375 мг/мл форма клеток Hela через 24 ч резко поменялась на овальную, что свидетельствовало об уменьшении связи клеток с подложкой, их откреплении от подложки, клетки лежали отдельными группами, не образуя монослоя. При этом резко сократилось число клеток с аутофагосомами, при концентрации 0,75 мг/мл аутофагосомы не образовывались. Количество ядрышек в ядре сократилось до одного, при этом наблюдалась их более слабая окраска, что свидетельствовало о снижении активности ядрышковых организаторов. На фигуре 6 Б представлены клетки с ярким свечением ядра, что свидетельствовало о конденсации хроматина и запуске апоптоза, но апоптотических телец было немного (табл. 3). На фигуре 6 В представлены единичные клетки с аутофагосомами.
При концентрации 1,5 мг/мл количество мертвых клеток было более 40%. (табл. 3) Непогибшие клетки были открепленными от подложки. Активность ядрышковых организаторов отсутствовала.
На фиг. 7 видно, что при концентрации 3 мг/мл практически все клетки Hela были погибшими; аутофагическая активность отсутствовала. В небольшом количестве выявлены апоптотические тельца.
В результате экстракт аврана уже в первые сутки воздействия обладал цитостатической и цитотоксической активностью. Кроме того, даже минимальные концентрации экстракта способствовали максимальному образованию аутофагосом, что свидетельствовало о его высокой активности в отношении опухолевых клеток. Полученные нами данные в эксперименте in vitro вполне согласуются с данными экспериментов in vivo, проведенных на крысах с перевиваемыми опухолями (Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова Н.В., Тычина С.А., Байтман Т.П., Корчаков Н.В., Воронков М.О., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Сравнение противоопухолевой и антикахексической активности флавоноидсодержащих экстрактов в эксперименте на животных с перевитой саркомой 45 // Российский биотерапевтический журнал. 2016. Т. 15. №1. С. 72-73; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова К.В., Бучарская А.Б., Тычина С.А., Корчаков Н.В., Маслякова Г.Н. Патоморфоз перевитого рака почки (РА) у лабораторных крыс при введении флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (Gratiolaofficinalis L.) // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2017. Т. 80. №6. С. 19-23; Наволокин НА., Мудрак Д.А., Полуконова Н.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Влияние экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) на пролиферативную активность и запуск апоптоза в клетках перевиваемой саркомы 45 лабораторных крыс // В книге: Актуальные вопросы фундаментальной, экспериментальной и клинической морфологии. Материалы Всероссийской конференции молодых специалистов. 2017. С. 85-87; Navolokin N.A., Mudrak D.A., Bucharskaya А.В., Matveeva О. V., Tychina S.A., Polukonova N. V., Maslyakova G.N. Effect of flavonoid-containing extracts on the growth of transplanted sarcoma 45, peripheral blood and bone marrow condition after oral and intramuscular administration in rats // Russian Open Medical Journal. 2017. T. 6. №3. C. 304.) и свидетельствуют о выраженной противоопухолевой активности экстракта.
На фигуре 8А представлена зависимость между процентом клеток с аутофагосомами и концентрацией экстракта аврана, а также между процентом мертвых клеток в культуре Hela и концентрацией экстракта. Для выявления взаимосвязи между процентом клеток с аутофагосомами и концентрацией экстракта аврана был проведен корреляционный анализ методом Спирмана; для оценки взаимосвязи показателей был использован непараметрический критерий Спирмана. В результате анализа была выявлена обратная двусторонняя взаимосвязь средней силы (r=-0.56) высокой статистической значимости (р=0.004) уже в первые 24 ч. эксперимента. На фиг. 8А видно, что при концентрации 0,75 мг/мл экстракт ингибирует процесс образования аутофагосом и начинается резкая гибель опухолевых клеток, следовательно, эта концентрация эффективна в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток.
В то время, как на фиг 8 Б видно, что при действии противоопухолевого экстракта бессмертника {Ивличев А.В., Мудрак Д.А., Наволокин Н.А., Афанасьева Г.А., Тычина С.А., Корчаков М.О., Полуконова Н.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Активность перекисного окисления липидов при пероральном введении флавоноидсодержащего экстракта бессмертника песчаного на фоне перевиваемого рака печени РС-1 // Российский биотерапевтический журнал. 2016. Т. 15. №1. С. 42-43; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова Н.В., Тычина С.А., Канаева Т.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Антикахексическая и противоопухолевая активность флавоноидсодержащего экстракта бессмертника песчаного (Helichnysum arenarium) при пероральном введении крысам с перевитой саркомой-45 // Злокачественные опухоли. 2016. №4-S1 (20). С. 329-330) на культуру клеток Hela обратной зависимости между процентом клеток с аутофагосомами и концентрации экстракта не выявлено, что свидетельствует об отсутствии способности этого экстракта препятствовать формированию резистентности опухолевых клеток за счет блокирования на высоких концентрациях аутофагии.
Таким образом, экстракт аврана обладает одновременно избирательным действием на опухолевые клетки, активирует их апоптоз и препятствует формированию их резистентности за счет блокирования на высоких концентрациях аутофагии.
Пример 1
Брали культуры неопухолевых (SPEV) и опухолевых клеток рака шейки матки Hela в тесте «живые и мертвые» при двойном окрашивании флуоресцентными красителями: акридинового оранжевого (окрашивающий в зеленый цвет живые клетки) и йодистого пропидия (интеркалирующий через разрушенную мембрану ядра погибающих или уже погибших клеток и окрашивающий их в красно-оранжевый цвет)и противоопухолевый растительный экстракт аврана лекарственного (экстракт получали способом, указанным в Патенте на изобретение RUS 2482863 15.02.2012. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью Полуконова КВ., Наволокин НА., Дурнова Н.А., Маслякова Г.К, Бучарская А.Б.).
Опухолевые и неопухолевые клетки были получены из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (г. Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах в среде RPMI4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин).
Эксперименты проводили в 96 луночных культуральных планшетах - одна контрольная и пять экспериментальных. Контролем служили клетки в питательной среде без добавления экстракта, выросших в течение суток. В 21 лунку внесли водный раствор экстракта аврана по три лунки каждой концентрации и три лунки были контрольными. Анализировались следующие концентрации: 0,375 мг/мл, 0,75 мг/мл, 1,5 мг/мл, 3 мг/мл, 6 мг/мл, 12 мг/мл, 24 мг/мл.
2
Клетки культивировали в CO-инкубаторе при 37°С в течение 24 часов, после чего окрашивали. В качестве красителя использовали йодистый пропидий, проникающий в нежизнеспособные клетки за счет разрушения их мембраны.
Для визуализации клеток использовали режим регистрации флюоресценции. Световой микроскоп Leica DM 2500 с дополнительным галогеновым осветителем Leica CLS 150, позволяющим освещать объект с двух сторон сбоку, для реализации режима темного поля. Захват и анализ изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры LeicaDFC 420 С и программного обеспечения LeicaApplicationSuite V 3.1. Конфокальный микроскоп LeicaLSM SP-5 (LeicaMicrosistems, Германия) в режиме регистрации флюоресценции со спектральным сдвигом соответствующим используемым флюорофорам. Для обсчета клеток использовали программное обеспечение ImageJ.
Для анализа клеток в контрольной и экспериментальной культурах были использованы следующие показатели: среднее количество клеток (СКК), процент количество мертвых клеток в результате такого воздействия от количества всех клеток, процент клеток с аутофагосомами от количества только живых клеток, после чего устанавливали корреляцию между двумя последними показателями.
Под действием экстракта на клети SPEV наблюдали нелинейную зависимость: среднее количество клеток (СКК) при концентрациях от 0,375 мг/мл до 1,5 мг/мл было ниже, чем в контроле, а, начиная с концентрации 3 мг/мл, было выше, чем в контроле (табл. 1). В отношении клеток Hela, наоборот, наблюдалась линейная зависимость: с увеличением концентрации экстракта СКК становилось меньше, и возрастало количество мертвых клеток (табл. 1).
На фигуре 1 представлена клеточная культура Hela под действием экстракта аврана в двух концентрациях: 0,75 мг/мл (А) и 3 мг/мл (Б); в концентрации 0,75 мг/мл экстракт обладает выраженной апоптотической активностью, а в концентрации 3 мг/мл большая часть клеток погибла и окрашена в красный цвет. На фигуре 2 представлено сравнение процентного содержания мертвых клеток SPEV и Hela под действием экстракта аврана: по вертикали отмечен процент мертвых клеток, по горизонтали - исследованные концентрации. Видно, что при воздействии на SPEV до концентрации 1,5 мг/мл мертвые клетки отсутствовали, в то время, как при воздействии на Hela гибель клеток наблюдалась даже при минимальных концентрациях. Следовательно, опухолевые клетки оказались более чувствительными действию даже небольших концентраций экстракта аврана.
Цитотоксичность экстракта аврана в культурах SPEV и Hela была отмечена при разных концентрациях: у клеток SPEV только при концентрации 4 мг/мл, у Hela уже при концентрации 0,375 мг/мл (табл. 1), что также свидетельствует об избирательной активности экстракта в отношении к опухолевым клеткам. При этом подавляющее большинство погибших опухолевых клеток при концентрациях от 0,375 до 1,5 мг/мл находилась на стадии пикноза, что свидетельствовало также и о высокой апоптотической активности экстракта.
Методом пробит анализа (Коросов А.В., Калинкина Н.М. Количественные методы экологической токсикологии Учебно-методическое пособие. - Петрозаводск: ПетрГУ, КНЦ, 2003. - 56 с.), учитывая все изученные концентрации экстракта на клеточные культуры SPEV и Hela, были рассчитаны концентрации, при которых в течение 24 ч после инкубации с экстрактом мертвых клеток оказывалось 50% (табл. 2). LC50 экстракта аврана в культуре Hela=0,375 мг/мл, а в культуре SPEV=2,5 мг/мл. Опухолевые клетки в шесть раз чувствительнее к действию экстракта, чем неопухолевые, что согласуется с данными по его цитотоксичности.
Таким образом, чувствительность опухолевых клеток к экстракту аврана была значительно выше, чем к неопухолевым, и была обусловлена концентрацией: с ее увеличением уменьшалось СКК и возрастало количество мертвых клеток. При этом экстракт уже при минимальной из исследованных концентраций (0,375 мг/мл) оказывал и цитостатическую, и цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток, обладая также и выраженным апоптотическим действием.
Пример 2
Брали культуру опухолевых клеток рака шейки матки Hela в тесте «живые и мертвые» при двойном окрашивании флуоресцентными красителями: акридинового оранжевого (окрашивающий в зеленый цвет только живые клетки) и йодистого пропидия (интеркалирующий через разрушенную мембрану ядра погибающих или уже погибших клеток и окрашивающий их в красно-оранжевый цвет) и противоопухолевый растительный экстракт аврана лекарственного (экстракт получали способом, указанным в Патенте на изобретение RUS 2482863 15.02.2012. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н, Бучарская А.Б.).
Опухолевые клетки рака шейки матки HELA были получены из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (г. Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах в среде RPMI 4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин).
Эксперименты проводили в 96 луночных культуральных планшетах - одна контрольная и пять экспериментальных. Контролем служили клетки в питательной среде без добавления экстракта, выросших в течение суток. В 21 лунку внесли водный раствор экстракта аврана по три лунки каждой концентрации и три лунки были контрольными. Анализировались следующие концентрации: 0,0937, 0,1875, 0,375, 0,75, 1,5, 3,6 мг/мл.
2
Клетки культивировали в CO-инкубаторе при 37°С в течение 24 часов, после чего окрашивали. В качестве красителя использовали йодистый пропидий, проникающий в нежизнеспособные клетки за счет разрушения их мембраны.
Для визуализации клеток использовали режим регистрации флюоресценции. Световой микроскоп LeicaDM 2500 с дополнительным галогеновым осветителем Leica CLS 150, позволяющим освещать объект с двух сторон сбоку, для реализации режима темного поля. Захват и анализ изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры Leica DFC 420 С и программного обеспечения Leica Applications uite V 3.1. Конфокальный микроскоп Leica LSM SP-5 (Leica Microsistems, Германия) в режиме регистрации флюоресценции со спектральным сдвигом соответствующим используемым флюорофорам. Для обсчета клеток использовали программное обеспечение ImageJ.
Для анализа клеток в контрольной и экспериментальной культурах были использованы следующие показатели: среднее количество клеток (СКК), процент количество мертвых клеток в результате такого воздействия от количества всех клеток, процент клеток с аутофагосомами от количества только живых клеток, после чего устанавливали корреляцию между двумя последними показателями.
Описание клеток в контроле. На фиг. 3 представлены клетки Hela через 24 ч в контроле при двойном флюоресцентном окрашивании акридиновым оранжевым и йодистым пропидием. Видно, что культура клеток Hela представлена неполным ровным монослоем клеток, плотно прилегающих друг к другу и занимающих большую часть поверхности. В основном клетки прикреплены к подложке, открепленными от подложки определяли только единичные клетки. Форма клеток веретеновидная, грушевидная или полигональная. Встречали единичные клетки по типу синцития или симпласта. Клетки с гомогенной цитоплазмой и четко оформленным ядром, при окраске акридиновым оранжевым и йодистым пропидием в цитоплазме клеток в приядерной области определяли мелкие оранжевые гранулы лизосомы. Появление мертвых клеток единично. СКК=108,7 (табл. 3). На фигуре 4 А видно, что количество ядрышек варьировало от одного до четырех, чаще два - три, что свидетельствовало об активном синтезе рРНК в ядрышкообразующих зонах хромосом. На фигуре 4 Б в единичных клетках были встречены одиночные аутофагосомы, не соединенные с лизосомами. На фигуре 4 В представлена единичная клетка с двумя крупными аутофагосомами, округлой формы и со смещенным к периферии ядром. Апоптотических телец в контроле не выявлено.
После инкубации с экстрактом аврана. На фиг. 5 представлены клетки Hela через 24 ч при концентрации 0,1875 мг/мл: выявлены клетки в основном полигональной формы, фрагментарно представлен монослой, стрелками обозначены аутофагосомы. Активность ядрышковых организаторов сохранялась, количество ядрышек в ядре чаще от двух до трех. СКК по сравнению с контролем при воздействии экстракта при 0,0937-3 мг/мл сократилось в два раза, а при 6 мг/мл - в три раза, что свидетельствовало о высокой цитостатической активности экстракта. % мертвых клеток прямо пропорционально увеличивался, начиная от концентрации 0,1875 мг/мл (табл. 3), т.е. экстракт обладал и значительной цитотоксической активностью. При этом большинство погибших клеток находилась на стадии пикноза, что свидетельствовало о высокой апоптотической активности экстракта. В диапазоне концентраций от 3 до 6 мг/мл при максимальной гибели клеток установить, каким именно образом происходила гибель, было невозможно.
Максимальная аутофагическая активность экстракта наблюдалась при концентрации 0,0937 и концентрации 0,1875 мг/мл (табл. 3). Образование аутофагосом при концентрации 0,0937 мг/мл свидетельствовало об активном действии экстракта на опухолевые клетки, с помощью аутофагии клетки не только пытались выживать, но и образовывать конгломераты с выраженными цитоплазматическими контактами. При большей концентрации - 0,1875 мг/мл агломерации клеток и цитоплазматические контакты уже не образовывались. Выявлена достаточно четкая тенденция - при резком падении количества клеток с аутофагосомами, резко увеличивается количество мертвых клеток Hela (табл. 3), что подтверждает роль аутофагии при выживании опухолевой клетки в условиях токсического стресса и в т.ч. и противоопухолевой терапии.
На фигуре 6 А видно, что при концентрациях экстракта, начиная с концентрации 0,375 мг/мл форма клеток Hela через 24 ч резко поменялась на овальную, что свидетельствовало об уменьшении связи клеток с подложкой, их откреплении от подложки, клетки лежали отдельными группами, не образуя монослоя. При этом резко сократилось число клеток с аутофагосомами, при концентрации 0,75 мг/мл аутофагосомы не образовывались. Количество ядрышек в ядре сократилось до одного, при этом наблюдалась их более слабая окраска, что свидетельствовало о снижении активности ядрышковых организаторов. На фигуре 6 Б представлены клетки с ярким свечением ядра, что свидетельствовало о конденсации хроматина и запуске апоптоза, но апоптотических телец было немного (табл. 3). На фигуре 6 В представлены единичные клетки с аутофагосомами.
При концентрации 1,5 мг/мл количество мертвых клеток было более 40%. Не погибшие клетки были открепленными от подложки. Активность ядрышковых организаторов отсутствовала.
На фиг. 7 видно, что при концентрации 3 мг/мл практически все клетки Hela были погибшими; аутофагическая активность отсутствовала. В небольшом количестве выявлены апоптотические тельца.
На фигуре 8 А представлена зависимость между процентом клеток с аутофагосомами и концентрацией экстракта аврана, а также между процентом мертвых клеток в культуре Hela и концентрацией экстракта. Для выявления взаимосвязи между процентом клеток с аутофагосомами и концентрацией экстракта аврана был проведен корреляционный анализ методом Спирмана; для оценки взаимосвязи показателей был использован непараметрический критерий Спирмана. В результате анализа была выявлена обратная двусторонняя взаимосвязь средней силы (r=-0.56) высокой статистической значимости (р=0.004) уже в первые 24 ч. эксперимента. На фиг. 8 А видно, что при концентрации 0,75 мг/мл экстракт ингибирует процесс образования аутофагосом и начинается резкая гибель опухолевых клеток, следовательно, эта концентрация эффективна в преодолении формирования резистентности опухолевых клеток.
Таким образом, экстракт аврана уже в первые сутки воздействия обладал цитостатической и цитотоксической активностью. Кроме того, в первые сутки даже минимальные концентрации экстракта способствовали максимальному образованию аутофагосом, что свидетельствовало о его высокой активности в отношении опухолевых клеток. Установлено, что экстракт аврана препятствует формированию резистентности опухолевых клеток за счет блокирования на высоких концентрациях аутофагии.
Пример 3.
Брали культуру опухолевых клеток карциномы почки (Сакi-1), полученной из банка РОНЦ им. Н.Н. Блохина при окрашивании флуоресцентным красителем Хёхст 33258: (окрашивающим в голубой цвет только живые клетки) и противоопухолевый растительный экстракт аврана лекарственного (экстракт получали способом, указанным в Патенте на изобретение RUS 2482863 15.02.2012. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью Полуконова К.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б.).Культивирование проводилось в пластиковых флаконах в среде RPMI 4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин).
2
Контролем служили клетки в питательной среде без добавления экстракта, выросших в течение суток. Анализировались следующие концентрации: 0,0352 мг/мл; 0,176 мг/мл; 0,88 мг/мл. Клетки культивировали в CO-инкубаторе при 37°С в течение 24 часов, после чего окрашивали.
Для визуализации клеток использовали режим регистрации флюоресценции. Световой микроскоп LeicaDM 2500 с дополнительным галогеновым осветителем Leica CLS 150,. Захват и анализ изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры LeicaDFC 420 С и программного обеспечения LeicaApplicationSuite V 3.1. Конфокальный микроскоп LeicaLSM SP-5 (LeicaMicrosistems, Германия) в режиме регистрации флюоресценции со спектральным сдвигом соответствующим используемым флюорофорам. Для обсчета клеток использовали программное обеспечение ImageJ.
Для анализа клеток в контрольной и экспериментальной культурах были использованы следующие показатели: среднее количество живых клеток (СКЖК), процент клеток с апоптозом от количества живых клеток, а также процент клеток в пикнозе и процент клеток с апоптотическими тельцами от количества клеток в апоптозе.
В контроле в клеточной культуре Caki через 24 ч. На фигуре 9 представлены Клетки линии CakiB контроле через 24 часа (А) и через 48 ч (Б) в режиме флюоресценции (при 435-485 нм), окраска красителем Хекст 33258, ув. 200. Признаков апоптоза в клетках не отмечали, СКЖК увеличивалось на 8% (табл. 4).
Различия достоверно отличаются при сравнении значений опытных и контрольной группах при * - P0.05, **-P<0.005, *** - P0.001
Влияние экстрактом аврана. Через 24 ч в культуре клеток Caki под воздействием экстрактом аврана в концентрации 0,0352 мг/мл (табл. 4) наблюдали отсутствие изменения СКЖК, увеличение количества клеток в апоптозе, находящихся преимущественно на стадии пикноза (на 31,5% больше). При действии экстрактом 0,176 мг/мл отмечали отсутствие изменения СКЖК и резкое увеличение количества клеток в апоптозе - на 11,2% (табл. 4), в основном за счет клеток на стадии пикноза (80,7%).
На фигуре 10 А представлены клетки линии Caki под действием экстракта аврана при концентрации 0,88 мг/мл через 24 ч (стрелкой обозначены апоптотические тельца): наблюдали резкое уменьшение на 63,3% СКЖК и резкое увеличение количества клеток в апоптозе на 17,6%, по сравнению с контролем, в основном за счет клеток на стадии пикноза (на 47,5% больше), индекс пролиферации 0,36, а отсутствие клеток на стадиях метафазы, анафазы и телофазы митоза.
Через 48 ч в культуре клеток Caki при действии экстрактом аврана при концентрациях 0,0352, 0,176 и 0,88 мг/мл наблюдали резкое снижение СКЖК на 97%, 99% и 99%, соответственно На фигуре 10 Б представлены клетки линии Caki под действием экстракта аврана при концентрации 0,88 мг/мл через 48 ч (стрелкой обозначен клеточный дебрис), режим флюоресценции при 435-485 нм, окраска красителем Хекст 33258. Ув. 200: отмечали резкое увеличение количества клеток, находящихся в апоптозе, на 22,9% (по 50% в стадии пикноза и апотозных телец) и клеточный дебрис, возникший при полной деградации клеток.
В результате установлена выраженная апоптотическая активность экстракта аврана в отношении культуры опухолевых клеток Caki; показана динамика развития клеточной гибели в результате апоптоза: пикноз ядра, образование апоптотических телец и возникновение клеточного дебриса в результате полной деградации опухолевых клеток.
Таким образом, противоопухолевый экстракт аврана, полученный определенным способом, обладает сразу тремя свойствами: избирательным действием на опухолевые клетки, активирующие их апоптоз и препятствующие формированию их резистентности.
Средство может быть использовано как самостоятельное для лечения злокачественных новообразований, так и при создании комбинированных химиопрепаратов.