БИОПОЛИМЕРНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНЫХ И/ИЛИ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
BIOPOLYMER MATERIAL FOR CELLULAR ENGINEERING AND/OR TISSUE ENGINEERING CONSTRUCTS AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Предлагаемое изобретение имеет междисциплинарный характер и относится к химии и технологии высокомолекулярных соединений, а именно к полимерным материалам биомедицинского назначения, к биотехнологии и регенеративной медицине, а также к способам получения таких материалов. Более конкретно изобретение касается криогенно-структурированных макропористых гелевых материалов на основе уксуснокислого экстракта тканей животных [Л.В. Кухарева, И.И. Шамолина, Е.В. Полевая. Метод получения коллагена из телячьей шкуры для тканевой инженерии и клеточного культивирования. // Цитология, 2010, Т. 52, №7, С. 597-602]. Наиболее эффективно заявляемые материалы могут быть использованы в качестве биосовместимых носителей для трехмерного (объемного) культивирования клеток животных или человека при создании клеточно-инженерных и тканеинженерных конструкций (КИК и ТИК, соответственно).
В связи с интенсивным развитием клеточных технологий и тканевой инженерии активно разрабатываются специальные полимерные материалы с целью их использования в качестве носителей (подложек; англоязычное название - scaffolds) для культивирования клеток, предназначенных к включению в КИК и ТИК [R. Langer, N.A. Peppas. Advances in biomaterials, drug delivery and bionanotechnology. // AICHE Journal, 2003, V. 49, P. 2990-3006; Биосовместимые материалы. Под ред. Севастьянова В.И., Кирпичникова М.П. // М.: Из-во «МИА», 2011. 544 с; S. Van Vlierberghe, P. Dubruel, E. Schacht. Biopolymer-based hydrogels for tissue engineering applications. // Biomacromolecules, 2011, V.12, P. 1387-1408; A.Wubneh, E.K. Tsekoura, CAyranci, H.Uludag. Current state of fabrication technologies and materials for bone tissue engineering. // Acta Biomater., 2018, V.80, Р. 1-30]. Сами же такие КИК и ТИК представляют собой функционально активные клетки, иммобилизованные на трехмерном полимерном носителе в культуральной среде, включающей все необходимые биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста) [S. Caddeo, M. Boffito, S. Sartori.Tissue engineering approaches in the design of healthy and pathological in vitro tissue models. // Front. Bioeng. Biotechnol. 2017; V.5, article #40]. Клеточными носителями чаще всего служат резорбируемые биосовместимые биологические и синтетические полимерные материалы [J. Jagur-Grodzinski. Polymers for tissue engineering, medical devices, and regenerative medicine. // Polym. Adv. Technol., 2006, V.17, P.395-418; Биосовместимые материалы. Под ред. Севастьянова В.И., Кирпичникова М.П. // М.: Из-во «МИА», 2011. 544 с.]. При этом технология их изготовления должна обеспечивать сохранение биосовместимости как самих носителей, так и продуктов их возможной деградации в организме пациентов. В этом аспекте предпочтительнее в качестве исходных компонентов использовать биополимеры белковой природы (например, коллаген, желатин, фиброин и др.) [L. Elowsson, H. Kirsebom, V. Carmignac, M. Durbeej, B. Mattiasson. Porous protein-based scaffolds prepared through freezing as potential scaffolds for tissue engineering. // J. Mater. Sci.: Mater. Med., 2012, V. 23, P. 2489-2498; V.I. Lozinsky, V.K. Kulakova, R.V. Ivanov, A.Yu. Petrenko, O.Yu. Rogulska, Yu. A. Petrenko. Cryostructuring of polymer systems. 47. Preparation of wide porous gelatin-based cryostructurates in sterilizing organic media and assessment of the suitability of thus formed matrices as spongy scaffolds for 3D cell culturing. // e-Polymers, 2018, V.18, P. 175-186] и/или полисахариды (альгинаты, хитозан, хондроитин сульфат, гиалуронаты и др.) [R.A.A. Muzzarelli, F. Greco, A. Busilacchi, V. Sollazzo, A. Gigante. Chitosan, hyaluronan and chondroitin sulfate in tissue engineering for cartilage regeneration: a review. // Carbohydr. Polym., 2012, V. 89, P.723-739; O. Catanzano, A. Soriente, A. La Gatta, M. Cammarota, G. Ricci, I. Fasolino, C. Schiraldi, L. Ambrosio, M. Malinconico, P. Laurienzo. Macroporous alginate foams crosslinked with strontium for bone tissue engineering. // Carbohydr. Polym., 2018, V.202, Р.72-83].
В плане эффективности рассматриваемых здесь КИК и ТИК существенным недостатком таких, как правило, однокомпонентных носителей является то, что создаваемое ими микроокружение для клеток сильно отличается от такового, свойственного природному внеклеточному матриксу (ВКМ) [L.T. Saldin, M.C. Cramer, S.S. Velankar, L.J. White, S.F. Badylak. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. // Acta Biomater. 2017, V.49, P. l-15]. Определенный интерес также представляют многокомпонентные носители на основе конъюгатов нескольких биополимеров, сшитых ковалентно [Yu.A. Petrenko, R.V. Ivanov, A.Yu. Petrenko, V.I. Lozinsky. Coupling of gelatin to inner surfaces of pore walls in spongy alginate-based scaffolds facilitates the adhesion, growth and differentiation of human bone marrow mesenchymal stromal cells. // J. Mater. Sci., Mater. in Med., 2011, V.22, P. 1529-1540] или их механических смесей [E.J. Bealer, S. Onissema-Karimu, A. Rivera-Galletti, M. Francis, J. Wilkowski, D.S. de la Cruz, X. Hu. Protein-polysaccharide composite materials: fabrication and applications. // Polymers, 2020, V.12, article #464]. Однако их широкое применение ограничивается как значительной стоимостью используемых высокоочищенных белков и полисахаридов, так и тем, что состав таких носителей все же далек от состава ВКМ.
Например, известны пористые носители на основе искусственных смесей коллагена из рыбьей чешуи, альгината и олигомерного хитозана, предложенные для инженерии тканей кожи [P. Chandika, S.C. Ko, G.W. Oh, S.Y. Heo, V.T. Nguyen, Y.J. Jeon, B. Lee, C.H. Jang, G.H. Kim, Park W.S., W. Chang, I.W. Choi, W.K. Jung. Fish collagen / alginate / chitooligosaccharides integrated scaffold for skin tissue regeneration application. // Int. J. Biol. Macromol., 2015, V.81, 504-513]. Поскольку ни один из перечисленных биополимеров не содержится в ВКМ кожи млекопитающих, то, хотя такой носитель имеет низкую цитотоксичность, вполне возможны отдаленные нежелательные последствия использования его в качестве имплантируемого материала при создании КИК и ТИК, например, проявления кальциноза, иммуногенности, генотоксичности и др.
Очень важным качеством, которым должны обладать носители для КИК и ТИК, является наличие крупных взаимосвязанных пор в материале полимерной подложки, чтобы обеспечить стерически незатрудненное проникновение клеток, их пролиферацию в объеме полимерной матрицы, включая поддержание метаболизма клеток [M.S. Shoichet, Polymer scaffolds for biomaterials applications. // Macromolecules, 2010, V.43, Р. 581-591].
Одним из подходов к формированию макропористой структуры для таких гетерофазных носителей является криогенное структурирование, при котором трехмерная полимерная сетка полимерной фазы (т.е. стенок макропор) формируется в неглубоко замороженной среде, а кристаллы замороженного растворителя выполняют функцию порогена [В.И. Лозинский. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Усп. химии, 2002, Т. 71, С. 559-585; V.I. Lozinsky, O. Okay. Basic principles of cryotropic gelation. // Adv. Polym. Sci., 2014, V-263, Р. 49-101]. Если в замороженной системе происходит формирование сшитой трехмерной сетки, в результате получаются материалы, называемые криогелями, если криотропного гелеобразования нет, то после удаления замороженного растворителя без его оттаивания получаются пористые криоструктураты [V.I.Lozinsky. Cryostructuring of polymer systems. 50. Cryogels and cryotropic gel-formation: terms and definitions. // Gels, 2018, 4, article #77].
Например, известен криогелевый носитель, предназначенный для трехмерного культивирования фибробластов и миобластов [L. Elowsson, H. Kirsebom, V. Carmignae, M. Durbeej, D. Mattiasson, Porous protein-based scaffolds prepared through freezing as potential scaffolds for tissue engineering // J. Mater. Sci., Mater. Med., 2012, V.23, P. 2489-2498]. Этот макропористый материал получают замораживанием (-12°С в течение 16 ч) смеси 5 мл 4%-ного водного раствора желатина и 0.01 мл 50%-ного водного раствора глутарового альдегида. После оттаивания при комнатной температуре полученный криогель промывают водой для удаления растворимых примесей, обрабатывают 0.05М раствором боргидрида натрия в 0.1М карбонатном буфере (рН 9.2) для восстановления альдиминных группировок в узлах сшивки и далее промывают образцы водой до нейтрального значения рН. При использовании полученного криогеля в качестве носителя культивируемых клеток его диски (толщина 1 мм) стерилизуют в изопропаноле, промывают, а затем инокулируют суспензией клеток и сверху наносят 1%-ный раствор агарозы, которая образует слой геля, удерживающего клетки в носителе. Анализ клеток на жизнеспособность и пролиферативную активность показывает, что результаты, которые получаются при культивировании миоцитов, заметно лучше, чем результаты при культивировании фибробластов в таких же носителях. К недостаткам данного технического решения относятся экспериментальные трудности получения таких желатиновых криогелей с воспроизводимыми свойствами, что связано с гелеобразованием смеси желатина и сшивающего агента (глутаровый альдегид) уже при низких положительных температурах - хорошо известный факт желирования растворов желатины с концентрацией белка более 3-5 мас. % при их охлаждении, еще более ускоряющийся в присутствии химического сшивателя. В этом случае, если сшитый желатиновый гель образуется до замерзания образца, кристаллы замерзающего растворителя будут разрушать уже сформированную первичную сетку. Именно поэтому, данное техническое решение пригодно для формирования препаратов желатиновых криогелей только малого объема (0.5 мл), которые в известных условиях замерзают быстро, т.е. раньше, чем успевает образоваться сетка первичного криогеля. Проверка данного известного способа для получения более объемных образцов выявила указанные выше его недостатки: уже при объеме замораживаемой композиции более 1.5 мл воспроизводимость методики резко падает, большинство сформированных гелей имеют неоднородную морфологию и механически непрочные.
Известны криогенно-структурированные полимерные материалы для использования в КИК и ТИК, когда в качестве исходных компонентов применяются смеси разных белков, например, желатин и фибриноген [M.B. Daniak, I.U.Allan, I.N. Savina, L. Cornelio, E.S. James, S.L. James, S.V. Mikhalovsky, H. Jungvid, I.Y. Galaev, Gelatin-fibrinogen cryogel dermal matrices for wound repair: preparation, optimization and in vitro study. Biomaterials, 2010, V.31, P. 67-76], или желатин в смеси с ламинином [M. Jugra, M.B. Dainiak, A. Saenowska, A. Sablonska, A. Tripathi, F.M. Plieva, I.N. Savina, L. Strojek, H. Jungvid, A. Kumar, B. Lukomska, K. Domanska-Janik, N. Forraz, C.P. McGuckin, The performance of laminin-containing cryogel scaffolds in neural tissue regeneration. Biomaterials, 2011, V.32, Р. 3423-3434]. Эти материалы формируют из растворов смесей, соответственно, 4.3%-ного желатина и 0.03%-ного фибриногена с добавками 0.05-0.5 об. % глутарового альдегида, или 4.4%-ного желатина и 0.01%-ного ламинина тоже с добавками 0.1-0.5 об. % глутарового альдегида. Раствор таких смесей порциями по 0.25 мл замораживают при -12°С в течение ночи, затем оттаивают при комнатной температуре, промывают образовавшийся губчатый криогель водой от золь-фракции и далее обрабатывают раствором боргидрида натрия, промывают, стерилизуют спиртом и т.д. аналогично предыдущему техническому решению. Показано, что введение в состав носителя добавок фибриногена улучшает адгезию фибробластов и обеспечивает пролиферацию клеток, а введение ламинина в состав матрицы желатинового криогеля способствует направленной дифференцировке стволовых клеток. Однако эти технические решения имеют тот же основной недостаток, что и предыдущее, а именно, возможность воспроизводимо получать носители только малого размера из-за быстрого гелеобразования реакционной смеси еще до ее замораживания, если объем исходной композиции превышает 1-2 мл. Таким образом, эти способы получения биополимерных материалов, предназначенных для использования в качестве носителей для культивирования клеток животных и человека, характеризуются низкой технологичностью и трудны в масштабировании.
Наиболее близким к заявляемому изобретению в плане последовательности операций по получению криогенно-структурированных биополимерных материалов для их последующего использования в КИК и ТИК является принимаемый нами за прототип макропористый гелевый носитель для трехмерного культивирования клеток животных или человека и способ получения этого биополимерного материала [В.И. Лозинский, В.К. Кулакова, А.Ю. Петренко, Ю.А. Петренко, А.Г. Ершов, Ю.В. Суханов. Композиция для формирования макропористого носителя, используемого при трехмерном культивировании клеток животных или человека, и способ получения указанного носителя. // Пат РФ №2594427 (2015); Б.И. №23 (2016)].
Согласно прототипу макропористый носитель формируют из раствора исходных компонентов в диметилсульфоксиде (ДМСО), содержащего 5-10 мас. % желатина или его смесь с 0.1-5 мас. % полимерной добавки, выбранной из группы, включающей гиалуроновую кислоту, хондроитинсульфат, агарозу, поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон). Такой раствор предшественников замораживают в течение 1-24 ч при температуре на 15…40°С ниже точки кристаллизации ДМСО (т.е. при +3.4…-21.6°С).
Затем замерзший растворитель без оттаивания удаляют экстракцией холодным этанолом при -15…-30°С. Сформированную таким образом криогенно-структурированную полимерную матрицу в течение 6-36 ч при 0…30°С обрабатывают 1-10 мас. % этанольным раствором дубителя, выбранного из группы, включающей глутаровый альдегид, формальдегид, дженипин, гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида, N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, а затем полученный макропористый желатиновый носитель промывают этанолом. Таким образом, способ-прототип включает следующие стадии:
а) приготовление раствора исходных компонентов в ДМСО;
б) замораживание приготовленного раствора;
в) удаление (в данном случае - криоэкстракцией) твердой фазы закристаллизованного растворителя, т.е. ДМСО;
г) дубление полученного криоструктурата с помощью химического сшивающего агента;
в) финальную промывку криогенно-структурированного макропористого полимерного материала.
В результате данной последовательности операций получаются биосовместимые губчатые носители с порами сечением порядка 100-300 мкм. Когда эти материалы формируют из смеси такого белка, как желатин, т.е. из денатурированного коллагена, и полисахарида (гиалуроновая кислота или хондроитин сульфат), входящего в состав ВКМ ряда тканей млекопитающих, то микроокружение культивируемых затем в носителе клеток по своим свойствам приближается к природному микроокружению.
Однако, хотя способ-прототип позволяет получать биосовместимые носители, а также дает возможность в достаточно широких пределах варьировать их физико-химические свойства и пористую морфологию, сами такие биополимерные материалы и способ их получения не лишены ряда недостатков:
1. Поскольку материалы по прототипу формируют из искусственных смесей желатина и полисахарида (гиалуроновая кислота или хондроитин сульфат), то состав получаемого в результате носителя сильно обеднен по сравнению с набором биологически активных компонентов, свойственных ВКМ, так как факторы роста и другие сигнальные молекулы, входящие в его состав, необходимы для адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток. Этот фактор существенно ограничивает возможности получения широкого круга КИК и ТИК.
2. Формирование макропористых носителей по прототипу осуществляется с использованием дорогих высокоочищенных марок желатина и полисахаридов, что повышает затраты на получение целевого материала.
3. В качестве растворителя, используемого согласно прототипу при приготовлении исходного многокомпонентного раствора (стадия «а»), применяется высокоочищенный диметилсульфоксид, что значительно удорожает целевой материал по сравнению с использованием водных систем.
4. Удаление поликристаллов ДМСО из замороженных растворов биополимеров с помощью приемов криоэкстракции (стадия «в») является длительным процессом и требует большого расхода этанола, что также повышает затраты на получение готового продукта.
5. Такие задубливающие вещества, как формальдегид и глутаровый альдегид, наряду с рядом других соединений, предусмотренные в способе-прототипе для использования в качестве сшивающих агентов, являются высокотоксичными веществами, это ухудшает безопасность способа и снижает его технологичность.
Задачей заявляемого изобретения является разработка нового, максимально приближенного по своему составу к межклеточному матриксу, биополимерного материала для КИК и ТИК, а также разработка способа получения такого материала.
Данная задача решается тем, что биополимерный материал для КИК и ТИК представляет собой химически сшитый макропористый криоструктурат на основе уксуснокислого экстракта тканей животного (исключая человека), содержащего белковые и полисахаридные компоненты в массовом соотношении, соответственно, от 10-90% до 90-10%. Способ получения указанного биополимерного материала включает приготовление водного раствора такого экстракта с рН 5.0-7.0 и содержанием сухих веществ 2-4 мас. %, замораживание этого раствора при -10…-40°С в течение 2-24 ч с последующей лиофилизацией замороженного образца, обработку образовавшегося макропористого криоструктурата 0.05-0.10М этанольным раствором карбодимиида при 6-36°С в течение 12-36 ч, промывание химически сшитого криоструктурата этанолом и хранение полученного биополимерного материала в среде 70-96%-ного этанола до использования в качестве носителя для культивирования клеток при создании КИК и ТИК. При этом для обработки лиофильно-сухого макропористого криоструктурата используют спирторастворимый карбодиимид, выбранный из группы, включающей N,N'-диизопропилкарбодимиид, N,N'-дициклогексилкарбодимиид, N-(3-диметиламино-пропил)-N'-этилкарбодиимид, N-циклогексил-N'-(2-морфолиноэтил)карбодиимид.
Заявляемый макропористый биополимерный материал может быть приготовлен любой геометрической формы: в виде блоков, пластин, дисков, гранул, частиц неправильной формы (получаются измельчением блока), трубок и др.
Конкретные параметры заявляемого биополимерного материала и способа его получения определяются следующими факторами:
1). Исходный многокомпонентный раствор
В качестве многокомпонентного раствора для получения целевого биополимерного материала, т.е. готового продукта, в заявляемом техническом решении применяется экстракт ткани животного, содержащий белковые и полисахаридные компоненты в массовом соотношении, соответственно, от 10-90% до 90-10%. Указанный состав экстракта определен экспериментально, причем ранее из уровня техники не было известно использование такой, близкой по составу к ВКМ, природной смеси белковых и полисахаридных компонентов с целью получения макропористых носителей, предназначенных для включения в КИК и ТИК, т.е. это является одним из элементов «новизны» предлагаемого изобретения. Заявляемый диапазон концентраций сухих веществ в водном растворе экстракта, используемом для получения конечного биополимерного материала, составляет 2-4 мас. %, значение рН этого раствора равно 5.0-7.0. Данные параметры определены экспериментально, поскольку ниже 2%-ного содержания сухих веществ в исходном растворе получаются механически слабые криогенно-структурированные носители, операционные показатели которых не подходят для использования в КИК и ТИК, а при концентрации указанных компонентов выше 4% очень сильно возрастает вязкость исходного раствора смеси биополимеров, что создает технические трудности для манипуляций с ним и может приводить к образованию структурных неоднородностей в конечном материале.
2) Режимы осуществления заявляемого технического решения
Способ получения заявляемого биополимерного материала включает те же основные этапы, что и способ-прототип, а именно, приготовление раствора биополимеров; замораживание этого раствора; удаление твердой фазы закристаллизованного растворителя; дубление (химическое сшивание) полученного криоструктурата; финальную промывку криогенно-структурированной макропористой губки. Однако, в отличие от прототипа, где в качестве исходного растворителя используется ДМСО, в предлагаемом изобретении жидкая среда раствора - водная. Температурные режимы замораживания этого раствора определены экспериментально, они определяются концентрацией компонентов, объемом замораживаемой жидкости и геометрией образца. Согласно предлагаемому техническому решению замораживание осуществляют при -10…-40°С в течение 2-24 ч. Верхний предел указанного температурного диапазона обусловлен тем, что при более высокой минусовой температуре из-за эффектов переохлаждения биополимерный раствор (особенно в случае более концентрированных образцов) часто не замерзает, а ниже -40°С образуются очень мелкие кристаллы льда, которые формируют недостаточно крупные поры в целевом полимерном материале. Дальнейшее удаление закристаллизованного растворителя (льда) из замороженных образцов, согласно заявляемому изобретению, проводят известными приемами лиофилизации (сублимационной сушки). Температурный режим и продолжительность этой стадии обычно зависят от размеров замороженных образцов и от операционных возможностей используемого технологического оборудования. По окончании лиофилизации для придания полученному криоструктурату водонерастворимости и фиксации его макропористой морфологии проводится дубление материала химическим сшиванием при 6-36°С в течение 12-36 ч с помощью 0.05-1.0М этанольного раствора спирторастворимого карбодимиида. Такие условия обработки также найдены экспериментально. Они определяются объемом и геометрией образца, концентрацией конкретного дубителя и, в определенной степени, его реакционной способностью. После завершения химического дубления полученный материал промывают этанолом от избытка сшивающего агента и далее хранят в среде 70-96%-ного этанола, что обеспечивает стерильность целевого материала. При последующем его использовании для трехмерного культивирования клеток требуется просто заместить спиртовую среду на водную в асептических условиях и далее внести клетки в макропористую матрицу носителя.
Заявляемые состав макропористых носителей для использования КИК и ТИК, сами такие носители и способ их получения, а также заявляемое сочетание признаков, ранее известны не были, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».
Далее описываются типичные примеры реализации заявляемого технического решения, а приводимые ниже рисунки содержат следующую информацию:
Фиг. 1. Структура верхней поверхности биополимерного материала (сканирующая электронная микроскопия с использованием лантаноидного контрастирования BioREE; размер масштабной линейки 20 мкм).
Фиг. 2. Структура нижней поверхности биополимерного материала (сканирующая электронная микроскопия с использованием лантаноидного контрастирования BioREE; размер масштабной линейки 20 мкм).
Фиг. 3. Жизнеспособность мезенхимальных стромальньгх клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч) на верхней поверхности биополимерного материала. Срок культивирования 14 суток (оптическая микроскопия; окрашивание флуоресцентным красителем Calcein AM. Ув. х100).
Фиг. 4. Жизнеспособность МСК ЖТч на нижней поверхности биополимерного материала. Срок культивирования 14 суток (оптическая микроскопия; окрашивание флуоресцентным красителем Calcein AM. Ув. х100).
Фиг. 5. Метаболическая активность МСК ЖТч на биополимерном материале.
Фиг. 6. Динамика суточной наработки МСК ЖТч гликозаминогликанов (ГАГ) в процессе дифференцировки в хондрогенном направлении.
Фиг. 7. Жизнеспособность клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 на верхней поверхности биополимерного материала. Срок культивирования 14 суток.
Фиг. 8. Жизнеспособность клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 на нижней поверхности биополимерного материала. Срок культивирования 14 суток (оптическая микроскопия; окрашивание флуоресцентным красителем Calcein AM; размер масштабной линейки 100 мкм).
Фиг. 9. Верхняя поверхность КИК, содержащей клетки EA.hy926. Срок культивирования 10 суток (комбинированное изображение - фазовый контраст и флуоресцентное окрашивание NucBlue™; размер масштабной линейки - 100 мкм).
Фиг. 10. Распределение клеток EA.hy926 на нижней поверхности КИК. Срок культивирования 10 суток (флуоресцентное окрашивание NucBlue™; размер масштабной линейки - 100 мкм).
Пример 1. Биополимерный материал для получения клеточно-инженерной конструкции (КИК) адгезией и пролиферацией мезенхимальных стромальньгх клеток жировой ткани человека (МСК ЖТч).
а) Получение макропористого носителя
Из уксуснокислого экстракта ткани животного готовят водный раствор (рН 6), содержащий в сухом остатке 3 мас. % белковых и полисахаридных компонентов при их массовом отношении, соответственно, 90% и 10%. Раствор замораживают в течение 12 ч при -25°С с последующей лиофилизацией замороженного образца и затем обрабатывают высушенный макропористый криоструктурат 0.075М раствором N,N'-диизопропил-карбодимиида в этаноле при 20°С в течение 24 ч. Далее задубленный таким образом биополимерный материал промывают этанолом от избытка карбодиимида и хранят в среде 70%-ного этанола до использовании в качестве носителя для культивирования клеток при создании КИК.
Морфологию биополимерного материала (фиг. 1 и 2) исследуют с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с использованием лантаноидного контрастирования препарата раствором BioREE (ООО «Глаукон», Россия), что позволяет наблюдать нефиксированные биологические образцы в режиме низкого вакуума после выдержки их в насыщенном растворе редкоземельного металла. При этом сохраняется максимально интактное состояние исследуемого объекта, а изображение, полученное в режиме детекции обратнорассеянных электронов, несет расширенную информацию о исследуемых структурах. Установлено, что сечение макропор верхней поверхности этого биополимерного материала находится в диапазоне 80-150 мкм, нижней поверхности - 20-110 мкм.
2
6
2
2
б) Клеточно-инженерная конструкция с использованием МСК ЖТч В качестве источника МСК ЖТч используют подкожную жировую клетчатку здорового донора. Образец подкожной жировой ткани подвергают двукратной промывке холодным (4-6°С) физиологическим раствором, а затем инкубируют в 0.1%-ном растворе коллагеназы I типа (Gibco, США) при 37°С в течение 20 мин. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 2 мМ L-глутамина (все - Gibco, США) и культивируют до формирования монослоя, меняя среду 2 раза в неделю. Перевод клеток в суспензию осуществляют инкубацией в 0.25%-ном растворе трипсина в смеси с раствором Версена (1:1) при 37°С в течение 5 мин. Далее используют клетки 3-го пассажа, которые вносят в макропористый носитель, полученный согласно п. 1а. Для этого на поверхность фрагмента носителя площадью 1 см и толщиной 2 мм наносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток. После чего пробирку с образцом помещают на лабораторный шейкер и обрабатывают в орбитальном режиме вращения при 60 оборотах в минуту в течение 30 минут. Далее в пробирку вносят 5 мл ростовой культуральной среды, закрывают вентилируемой крышкой и помещают в СО инкубатор, где культивируют клетки при стандартных условиях (5% СО, 37°С). Срок культивирования составляет 14 суток.
Для оценки жизнеспособности клеток при их культивировании в составе КИК клетки окрашивают флуоресцентным красителем Calcein AM (Invitrogen, США). Зеленая флуоресценция, регистрируемая при 515 нм, позволяет определить живые клетки в макропористом носителе. Далее образцы изучают с помощью инвертированного микроскопа Nikon Ti (фиг. 3 и 4).
Установлено, что клетки имеют нормальную для данной клеточной культуры фибробластоподобную морфологию без признаков токсического стресса, а также тот факт, что жизнеспособные МСК ЖТч детектируются с обеих сторон биополимерного носителя, свидетельствует о миграции клеток и пролиферации во всем объеме КИК.
Пример 2. Использование биополимерного материала на основе уксуснокислого экстракта животных тканей для определения динамики изменения метаболической активности МСК ЖТч в составе КИК.
а) Получение макропористого макропористого носителя
Из уксуснокислого экстракта животных тканей готовят водный раствор (рН 7), содержащий в сухом остатке 2 мас. % белковых и полисахаридных компонентов при их массовом отношении, соответственно, 50% и 50%. Раствор замораживают в течение 18 ч при -15°С с последующей лиофилизацией замороженного образца и затем обрабатывают высушенный макропористый криоструктурат 0.05М этанольньгм раствором N,N'-дициклогексилкарбодимиида при 6°С в течение 36 ч. Далее задубленный таким образом биополимерный материал (сечение макропор в его верхней части согласно данным сканирующей электронной микроскопии составляет 120-270 мкм, в нижней части - 35-130 мкм) промывают этанолом от избытка карбодиимида и хранят в среде 85%-ного этанола до использовании в качестве носителя для культивирования клеток при создании КИК.
б) Формирование КИК и динамика изменения метаболической активности МСК ЖТч в ее составе
2
Суспензию, содержащую 50000 МСК ЖТч, наносят на поверхность макропористого биополимерного материала (фрагмент площадью 1 см и толщиной 2 мм), полученного согласно п. 3а. Культивирование осуществляют в течение 12 суток. Образцы сравнения - КИК, исходно содержащий аналогичное количество клеток, внесенных в макропористый биополимерный носитель на основе желатина, полученный согласно прототипу [В.И. Лозинский, В.К. Кулакова, А.Ю. Петренко, Ю.А. Петренко, А.Г. Ершов, Ю.В. Суханов. Композиция для формирования макропористого носителя, используемого при трехмерном культивировании клеток животных или человека, и способ получения указанного носителя. // Пат. РФ №2594427 (2015); Б.И. №23 (2016)]. Пролиферативную активность клеток оценивают путем определения "коэффициента метаболической активности" при инкубировании с реагентом Presto Blue™. Часть КИК выводят из эксперимента на 6 и 12 сутки. Спектрофотометрический анализ продуктов реакции реактива с клетками проводят на планшетном ридере Tecan Spark 10 (Австрия). Данные измерения оптического поглощения используют для расчета коэффициента метаболической активности (К) по формуле:
где Abs570 - оптической поглощение при 570 нм, Abs600 - оптическое поглощение при 600 нм.
Полученные результаты изменения метаболического коэффициента МСК ЖТч на 6 и 12 сутки культивирования в составе КИК при культивировании клеток, адгезированных на стенках макропор носителя, полученного по п. 3а, в сравнении с КИК на базе желатинового носителя, показывают (фиг. 5), что на 6 сутки уровень пролиферативной активности КИК с использованием заявляемого носителя выше, чем в контрольной системе. Эта тенденция сохраняется и на 12 сутки культвирования клеток.
Пример 3. Биополимерный материал для получения тканеинженерной конструкции (ТИК) хондрогенной дифференцировкой клеток МСК ЖТч, культивированных в объеме носителя.
а) Получение макропористого носителя
Из уксуснокислого экстракта ткани животного готовят водный раствор (рН 5), содержащий в сухом остатке 4 мас. % белковых и полисахаридных компонентов при их массовом отношении, соответственно, 10% и 90%. Раствор замораживают в течение 2 ч при -40°С с последующей лиофилизацией замороженного образца и затем обрабатывают высушенный макропористый криоструктурат 0.10М раствором гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида в этаноле при 36°С в течение 12 ч. Далее задубленный таким образом биополимерный материал (согласно данным сканирующей электронной микроскопии сечение макропор в его верхней части составляет 60-90 мкм, в нижней части - 10-70 мкм) промывают этанолом от избытка карбодиимида и хранят в среде 96%-ного этанола до использовании в качестве носителя для культивирования клеток.
б) Клеточно-инженерная конструкция
КИК получают по методике п. 16 культивированием МСК ЖТч в носителе, приготовленном согласно п. 3а.
в) Тканеинженерная конструкция
Хондрогенную дифференцировку клеток, адгезированных на стенках макропор носителя, проводят в среде, включающей DMEM с высоким содержанием глюкозы и добавкой GlutaMAX™ (Gibco, США), содержащей 10% ITS+ (Corning, США), 1% пируват натрия (Gibco, США), 0.25% аскорбат-2-фосфата (Sigma-Aldrich, США), 0.0001% дексаметазона (Sigma-Aldrich, США), 0.002% TGF-pl (PeproTech, США) и 1% культурального антибиотика-антимикотика (Gibco, США). Замену культуральной среды производят ежедневно. Срок культивирования составляет 21 суток.
В ходе хондрогенной дифференцировки МСК ЖТч превращаются в хондробласты и начинают синтезировать протеогликаны, которые стимулируют дифференцировку хондроцитов и обеспечивают упругость ВКМ. Для количественной оценки содержания сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) в культуральной среде применяют краситель DMMB (1,9-диметил-метиленовый синий). Для построения калибровочной кривой (0-50 мкг/мл) используют хондроитин сульфат (Sigma). Оптическую плотность образцов определяют при 525 нм на планшетном ридере Tecan Spark 10 (Австрия).
Измерения показывают (фиг. 6), что суточная наработка клетками ГАГ значительно возрастает к 21 суткам культивирования, что свидетельствует о вступлении клеток в дифференцировку в хондрогенном направлении и, соответственно, формировании ТИК хряща.
Пример 4. Биополимерный материал для получения тканеинженерной конструкции (ТИК), включающей клеточную линию гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.
а) Получение макропористого носителя
Из уксуснокислого экстракта ткани животного готовят водный раствор (рН 6.8), содержащий в сухом остатке 2.7 мас. % белковых и полисахаридных компонентов при их массовом отношении, соответственно, 30% и 70%. Раствор замораживают в течение 24 ч при -10°С с последующей лиофилизацией замороженного образца и затем обрабатывают высушенный макропористый криоструктурат 0.06М этанольным раствором N-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимида при 15°С в течение 30 ч. Далее задубленный таким образом биополимерный материал (согласно данным сканирующей электронной микроскопии сечение макропор в его верхней части составляет 140-310 мкм, в нижней части - 40-150 мкм) промывают этанолом от избытка карбодиимида и хранят в среде 70%-ного этанола до использовании в качестве носителя для культивирования клеток.
б) Тканеинженерная конструкция
2
6
2
2
Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 вносят в макропористый носитель, полученный согласно п. 4а. Для этого на поверхность фрагмента биополимерного материала площадью 1 см и толщиной 2 мм наносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток. После чего пробирку с образцом помещают на лабораторный шейкер и обрабатывают в орбитальном режиме вращения при 60 оборотах в минуту в течение 30 минут. Далее добавляют в пробирку 5 мл культуральной среды, закрывают вентилируемой крышкой и помещают в СО инкубатор, где культивируют клетки при стандартных условиях (5% СО, 37°С). Срок культивирования - 14 суток. Культивирование клеток проводят в культуральной среде Вильямса (Williams Е, «Invitrogen», США) с добавлением 5% ЭТС и 1% антимикотика-антибиотика («Invitrogen», США). В качестве положительного контроля используют децеллюляризованную печень человека, полученную известным способом [С. В. Готье, В.И. Севастьянов, М.Ю. Шагидулин, Е.А. Немец, Ю.Б. Басок. Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения. // Патент РФ №2693432, 02.07.2019. Б.И. №19 (2019)].
Для оценки жизнеспособности клеток на 14 день культивирования их окрашивают флуоресцентным красителем Calcein AM (Invitrogen, США). Зеленая флуоресценция, регистрируемая при 515 нм, позволяет определить живые клетки на поверхности носителя, что детектируют с помощью инвертированного микроскопа Nikon Ti. Микрофотография на Фиг. 7 - изображение верхней поверхности образца КИК, содержащей клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 после 14-суточного Культивирования. Микрофотография на Фиг. 8 - изображение нижней поверхности КИК, включающей клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.
Установлено, что клетки имеют характерную для гепатоцитов неправильную многоугольную форму, а также тот факт, что жизнеспособные клетки HepG2 детектируются с обеих сторон биополимерного носителя, свидетельствует о миграции клеток и пролиферации во всем объеме ТИК.
В образцах культуральной среды, полученных на 7 сутки культивирования, определяют концентрацию мочевины на биохимическом анализаторе Konelab Prime 60i (Thermo Fisher Scientific, Финляндия). К 7-м суткам содержание мочевины в культуральной среде составляет 1,5±0,1 ммоль/л, что свидетельствует о наличии специфической именно для гепатоцитов метаболической активности. При этом содержание мочевины в положительном контроле к 7-м суткам значимо ниже и составляет 1,1±0,1 ммоль/л.
Также в пробах культуральной среды определяют концентрацию альбумина методом иммуноферментного анализа с использованием набора Albumin Human ELISA Kit (Invitrogen, США). В образцах, полученных на 10 сутки культивирования, содержание альбумина составляет 5,1±0,7 мкг/106 клеток/сутки, что подтверждает секреторную активность клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 в составе ТИК.
Полученные данные, свидетельствующие о заселении клетками гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 макропористого носителя и наличие у образовавшейся конструкции секреторной (синтез альбумина) и метаболической активности (образование мочевины), характерной для печени, подтверждают факт формирования ТИК.
Пример 5. Биополимерный материал для получения клеточно-инженерной конструкции (КИК), включающей клеточную линию эндотелиальных клеток линии EA.hy926 пупочной вены человека.
а) Получение макропористого носителя
Из уксуснокислого экстракта животных тканей готовят водный раствор (рН 6.8), содержащий в сухом остатке 3.3 мас. % белковых и полисахаридных компонентов при их массовом отношении, соответственно, 60% и 40%. Раствор замораживают в течение 15 ч при -33°С с последующей лиофилизацией замороженного образца и затем обрабатывают высушенный макропористый криоструктурат 0.08М этанольным раствором гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N'этилкарбодиимида при 8°С в течение 15 ч. Далее задубленный таким образом биополимерный материал (согласно данным оптической стереомикроскопии сечение макропор в его верхней части составляет 75-180 мкм, в нижней части - 15-120 мкм) промывают этанолом от избытка карбодиимида и хранят в среде 70%-ного этанола до использовании в качестве носителя для культивирования клеток.
б) Клеточно-инженерная конструкция
2
5
2
2
Эндотелиальные клетки линии EA.hy926 пупочной вены человека вносят в макропористый носитель, полученный согласно п. 5а. Для этого на поверхность фрагмента носителя площадью 1 см и толщиной 2 мм наносят 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5*10 клеток. После чего пробирку с образцом помещают на лабораторный шейкер и обрабатывают в орбитальном режиме вращения при 60 оборотах в минуту в течение 30 минут.Далее добавляют в пробирку 5 мл ростовой культуральной среды, закрывают вентилируемой крышкой и помещают в СО инкубатор, где культивируют клетки при стандартных условиях (5% СO, 37°С). Срок культивирования составляет 10 суток. Культивирование клеток проводят в ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 2 мМ L-глутамина (все - Gibco, США).
Для оценки распределения клеток в объеме КИК на 10 сутки культивирования образцы окрашивают флуоресцентным красителем NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent (Hoechst 33342) (Invitrogen, США). Синюю флуоресценцию, регистрируемую при 460 нм, визуализирующую ядра клеток на поверхности носителя, детектируют с помощью инвертированного микроскопа Leica DMi8.
Микрофотографии на Фиг. 9 и Фиг. 10 подтверждают адгезию и равномерное распределение клеток на поверхностях носителя, что указывает на формирование КИК.
Заявляемое изобретение имеет следующие преимущества перед аналогами:
1. В противоположность аналогам, где при формировании макропористых носителей для последующего их применения в КИК и ТИК используются сильно отличающиеся по составу от ВКМ искусственные смеси белковых и полисахаридных компонентов, в предлагаемом изобретении в качестве биополимерного предшественника используется природная смесь таких компонентов, близкая по составу и соотношению белков и полисахаридов к внеклеточному матриксу. Показано, что заявляемый биополимерный материал обеспечивает лучшую по сравнению с криогелем из желатина и децеллюляризованной тканью печени человека адгезию и функционирование различных типов клеток (примеры 1-5), а также пролиферацию и дифференцировку мезенхимальных стромальньгх клеток (примеры 1-3), распределенных по всему объему КИК и ТИК. Таким образом, при применении заявляемого биополимерного материала в качестве носителя в КИК и ТИК обеспечивается значительный уровень универсальности таких носителей в отношении самых разных клеток животных и человека.
2. Используемая в заявляемом изобретении смесь биополимерных Предшественников существенно дешевле, чем применяемые в аналогах высокоочищенные препараты белков и полисахаридов, что снижает затраты на получение целевого материала.
3. Кроме того, снижению затрат в заявляемом изобретении способствует применение водной среды при приготовлении исходного раствора биополимерных предшественников в противоположность применению высокоочищенного ДМСО по прототипу.
4. Удаление льда из замороженного раствора биополимерных предшественников в заявляемом изобретении с помощью лиофильной сушки технологически более простая операция по сравнению с криоэкстракцией, используемой в прототипе. В ходе удаления поликристаллов замороженного растворителя лиофилизацией после помещения образцов в сублимационную установку и подключения вакуума фактически не требуется какого-либо участия персонала, тогда как в ходе операций по криоэкстракции замороженного растворителя необходима многократная смена экстрагента, что проводится вручную, т.е. требует постоянного участия персонала.
5. В заявляемом техническом решении в качестве задубливающих агентов не используются высокотоксичные вещества, что улучшает безопасность предлагаемого способа и повышает его технологичность.
Технический результат
Новый биополимерный материал для использования в качестве носителя при создании КИК и ТИК, а также удобный и экономичный способ получения такого материала.
Наиболее эффективно заявляемое техническое решение и получаемые согласно ему макропористые носители могут быть использованы в клеточной и тканевой инженерии, а также при разработке биоконструкций для создания искусственных органов. Изобретение относится к медицине, а именно к области биотехнологии и регенеративной медицины, и может быть использовано для восстановления повреждений органов и тканей как отдельно, так и в составе длительно функционирующих высокоэффективных биомедицинских продуктов в виде КИК и ТИК. Заявляемый материал может быть применен в специализированных отделениях, занимающихся реконструктивной хирургией и/или стимулированием in situ процессов регенерации поврежденных органов и тканей, а также в научных лабораториях при исследованиях КИК и ТИК.