Определение активности рибавирина в опытах in vitro на модели вируса Батаи

УДК 615.281.8.015.4:578.8

Определение активности рибавирина в опытах in vitro на модели вируса Батаи

С.А. Терехин, И.С. Клименко, А.М. Бутенко, Т.В. Гребенникова, В.Ф. Ларичев

НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва, Россия

Данное исследование проводилось с целью изучения способности рибавирина подавлять in vitro репродукцию вируса Батаи. В исследовании использовался рибавирин производства ICN Switzerland AG (Швейцария). Препарат и иммунную асцитическую жидкость (ИАЖ) вносили через 1 час после контакта вируса с клетками

при 37 °С. Рибавирин также вносили за 1 час до контакта вируса с клетками и через 2, 4, 6 и 18 часов после их инфицирования. В этой работе было впервые показано, что рибавирин активно подавляет in vitro репликацию вируса Батаи.

Ключевые слова: рибавирин, вирус Батаи, ингибирование.

In Vitro Activity of Ribavirin in Experimental Model of Batai Virus

S.A. Terekhin, I.S. Klimenko, A.M. Butenko, T.V. Grebennikova, V.F. Larichev

Research Institute of Virology named after D.I. Ivanovskiy, Moscow, Russia

This study was performed to evaluate a potential of ribavirin for inhibiting Batai virus replication in vitro. Ribavirin manufactured by ICN Switzerland AG (Switzerland) was used for the study. The drug and specific immune ascitic fluid were added to a cell culture (Vero E6)1 hour after the

virus-to-cell contact at 37 °C. Ribavirin was also added 1 hour before and 2, 4, 6 and 18 hours after the virus-cell contact. This study first showed that ribavirin significantly inhibited Batai virus replication in vitro.

Key words: ribavirin, Batai virus, inhibition.

Введение

Рибавирин - 1-3^-рибофуранозил-1,2,4-триа-зол-3-карбоксамид [1, 2]. Это нуклеозидное производное характеризуется уникально широким спектром противовирусного действия и эффективностью при заболеваниях, вызываемых ДНК- и РНК-содер-жащими вирусами, а именно: при аденовирусных, герпетических инфекциях, гепатитах А, В и С, гриппе А и В, парагриппозных инфекциях, эпидемичес-

Контактный адрес: Сергей Анатольевич Терехин Эл. почта: hjcnjd1@yandex.ru Тел.: (499) 190-3053

ком паротите, геморрагических лихорадках (Ласса, аргентинская, боливийская, крымская - КГЛ, долины Рифт - ЛДР и геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - ГЛПС) [1, 3-5].

Механизм действия рибавирина заключается в ингибировании образования кэп-структур на 5'-конце вирусных мРНК и ингибировании активности фермента инозинмонофосфатдегидрогеназы [4].

Представитель семейства Випуаютйае - вирус Батаи (род Orthobunyavirus) - является патогенным для человека. Вирус Батаи вызывает гриппоподоб-ные заболевания, сопровождающиеся лихорадкой, миалгией, анорексией и иногда симптомами бронхопневмонии, менингита и другими симптомами поражения ЦНС.

Таблица 1. Определение активности рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов Батаи

Вирус

Титр вируса

Контрольное титрование вируса

Индекс нейтрализации вирусов с гомологичной ИАЖ

№ИД5о

Батаи

500/0,5 250/7,5 125/7,0 62,5/8,5

7,8

3,0

Наша работа посвящена изучению способности рибавирина подавлять репродукцию in vitro вируса Батаи.

Материал и методы_

Вирус. В работе был использован штамм вируса Батаи (ММ 2222) из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов. Вирус был пассирован на новорождённых белых мышах 2 раза и идентифицирован в серологических реакциях с использованием специфических антисывороток.

Для заражения культуры клеток использовали вируссодержащие суспензии мозговой ткани инфицированных новорождённых белых мышей, приготовленные на среде Игла МЕМ с 1% эмбриональной телячьей сыворотки (High Clone, США).

Культуры клеток. Эксперименты были выполнены в перевиваемой культуре клеток почек зелёных мартышек (Vero E6). В качестве ростовой и поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ, содержащую 5% эмбриональной телячьей сыворотки.

Исследуемый препарат. Противовирусную активность рибавирина (Швейцария) оценивали при его концентрациях, составляющих 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл.

Проведение эксперимента. Десятикратными разведениями вируса Батаи (от 10-4 до 10-9) в объёме 100 мкл на лунку заражали культуру клеток Vero E6, выращенную в 96-луночных планшетах. Контрольное титрование вирусов выполняли в трёх рядах лунок. Титрование вируса проводили в присутствии различных концентраций препаратов и специфических иммунных сывороток (ИАЖ) [6] в двух повторностях (рядах). Препарат и ИАЖ (в разведении 1:50) вносили через 1 час контакта вируса с клетками при 37 °С. Также рибавирин вносили за 1 час до контакта вируса с клетками, через 2, 4, 6 и 18 ч после их инфицирования.

Каждое разведение препаратов контролировали на наличие их возможного цитотоксического действия на клетки Vero E6.

Инфицированные культуры клеток наблюдали от 3 до 14 дней инкубации планшетов при 37 °С в термостате с СО2, просматривая лунки планшетов под инвертированным микроскопом (Leitz, Германия).

Результаты и обсуждение

В культуре клеток Vero E6, инфицированных вирусом Батаи, рибавирин в концентрации 500 мкг/мл подавлял развитие цитопатогенного действия (ЦПД) на 2,8 lg, снижая цитопатоген-ную активность с 7,8 до 5,0 lg ЦПД50/ОД мл. При концентрации препарата 250 и 125 мкг/мл цито-патогенная активность вируса снижалась до 7,5 и 7,0 lg ЦПД50/0,1 мл. При концентрации рибавирина 62,5 мкг/мл снижения цитопатогенной активности вируса не происходило. Титр вируса Батаи в контроле составлял 7,8 lg ЦПД50/0,1 мл.

Снижение инфекционного титра вируса Батаи в присутствии гомологичной ИАЖ (индекс нейтрализации) составило 3,0 lg ЦПД50 Эффективность препарата возрастала пропорционально его концентрации, при этом он не обладал цитотоксическим действием (табл. 1).

Нами выявлено, что рибавирин за 1 час до контакта клеток с вирусом не оказывает защитного действия. Также он не защищает клетки через 18 часов после заражения монослоя. В то же время он оказывает заметный противовирусный эффект спустя 2, 4 и 6 часов после заражения, снижая цито-патогенную активность (табл. 2).

В этой работе нами впервые было показано, что рибавирин активно подавляет репликацию вируса Батаи.

Таблица 2. Определение активности рибавирина в динамике внесения препарата в опытах in vitro на модели вируса Батаи

Время внесения препарата до и после заражения клеток Vero E6

Титр вируса Титр вируса в присутствии Батаи

рибавирина в контроле

lg ЦПД50/0Д мл

За 1 ч 7,5

Через 1 ч 5,0

Через 2 ч 5,5 7,8

Через 4 ч 5,5

Через 6 ч 5,5

Через 18 ч 8,0

Литература

1. Белов А.В., Ларичев В.Ф., Галкина И.В., Хуторецкая Н.В., Бутенко А.М. и др. Активность отечественного рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов крымской геморрагической лихорадки, лихорадки долины Рифт, Тягиня и Дхори. Вопр вирусол 2008; (1):34-5.

2. Константинова И.Д., Есипов Р.С., Муравьёва Т.И. и др. Способ получения 1-/3^-рибофуранозил-1,2,4-триа-зол-3-карбоксамида (рибавирин). Пат. РФ № 2230118 от 21.08.2002 г.

3. Enria V.A., Maiztegui S.L. Antiviral treatment of Argentine hemorrhagic fever. Antiviral Res 1994; 23:2331.

4. Huggins J.W., Cosgriff T.M., Smith J.I. Interruption study of viremia of patients with hemorrhagic fever with renal syndrome in the febrile phase. Chin Med J 1991; 104:149-53.

5. Sidwell R.W., Huffman J.H., Barnett B.B., Pifat D.Y. In vitro and in vivo phlebovirus inhibition by ribavirin. Antimicrob Agents Chemother 1988; 32:331-6.