СПОСОБ НЕПРЕРЫВНОГО СОКРАЩАЮЩЕГО МИКРООРГАНИЗМЫ ПОЛУЧЕНИЯ И/ИЛИ ОБРАБОТКИ ПРОДУКТА
METHOD FOR CONTINUOUS MICROORGANISM-REDUCING PRODUCTION AND/OR TREATMENT OF PRODUCT

Настоящее изобретение относится к модульной системе и способу непрерывного сокращающего микроорганизмы получения и/или обработки продукта из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды.
При биотехнологическом получении белки очищают партиями. Это означает, что отдельные производственные циклы обслуживаются периодически, прерывисто, и после завершения производственного цикла продукт берется из целого. Для нового производства новый цикл или партия продукта должны запускаться отдельно.
В последние годы становится все более очевидным, что непрерывная процедура может также использоваться при биотехнологическом получении, причем процесс может работать без перерывов в отличие от периодического процесса.
Жестко регулируемое фармацевтическое производство требует больших затрат по времени, технологии и персоналу для подготовки очищенных и стерилизованных биореакторов и гарантии стерильного продукта. Чтобы надежно предотвратить перекрестную контаминацию при замене продукта в многоцелевой установке или между двумя партиями продукта, кроме очистки, требуется очень дорогостоящее квалификационное испытание, которое при адаптации процесса при необходимости должно повторяться.
Это справедливо как для технологического процесса наращивания биомассы (USP), то есть, получения биологических продуктов в ферментерах, так и для технологического процесса выделения и очистки продукта (DSP), то есть, очистки продуктов ферментации.
Именно в случае ферментации незаменимой для благоприятного культивирования является стерильная окружающая обстановка. Для стерилизации ферментеров периодического действия или подпитываемых ферментеров, как правило, применяется технология стерилизации на месте (SIP=sterilization-in-place).
Время простоя реакторов, обусловленное процедурами подготовки, в частности, при коротких периодах использования и частой смене продукта, может лежать в области величин времени готовности реактора к использованию. От этого страдают в процессе наращивания массы биотехнологической продукции (USP), например, стадии процесса приготовления среды и ферментации, а в процессе выделения и очистки (DSP) - солюбилизации, замораживания, оттаивания, регулирования значений рН, выделения продукта, такого как, например, с помощью хроматографии, осаждения или кристаллизации, замены буферного раствора и вирусной инактивации.
Нормативными требованиями для процесса выделения и очистки является управление сокращающего микроорганизмы процесса. Поэтому стерильная процедура в случае периодического действия не требуется. Однако при непрерывном процессе очистку белка проводят как можно дольше без стадий очистки. Это предпочтительно проводить без стерилизации во время очистки. Однако риск заражения во много раз выше, чем в случае простой периодической работы.
Международная заявка WO 2012/078677 описывают способ и установку для непрерывной подготовки биофармацевтических продуктов при помощи хроматографии и ее интеграции в производственную установку, в частности, в одноразовой установке. Несмотря на то, что международная заявка WO 2012/078677 предоставляет подходы для непрерывного производства биофармацевтических и биологических продуктов, раскрытое решение на практике не является достаточным. В WO 2012/078677 также не раскрывается применение стерилизованной хроматографической колонки.
В US 2014/0255994 A1 раскрыт интегрированный непрерывный процесс получения терапевтических белков. Однако в US 2014/0255994 A1 не раскрывается особенность, что стерилизованная хроматографическая колонка могла бы использоваться в таком процессе.
В ЕР 2 182 990 А1 раскрыт способ стерилизации хроматографических колонок с использованием горячего водяного пара.
Прежде всего некоторые термины определены более подробно.
Непрерывный способ в контексте настоящего изобретения означает любой способ для проведения по меньшей мере двух стадий способа последовательно, в котором выходной поток стадии, предшествующей в технологическом процессе, передается на следующую стадию. Последующая стадия начинает обработку потока продукта до завершения стадии, предшествующей в технологическом процессе. Обычно в непрерывном процессе часть потока продукта всегда переносится на производственную установку и называется «непрерывным потоком продукта». Соответственно, непрерывный перенос или передача потока продукта из блока выше по ходу потока в блок ниже по ходу потока означает, что блок ниже по ходу потока уже работает до того, как блок выше по ходу потока выходит из эксплуатации, т.е. что два последовательных блока одновременно обрабатывают поток продукта, который протекает через них.
Термин «сокращающий микроорганизмы» в контексте настоящего изобретения означает состояние уменьшенного количества микроорганизмов, то есть количество микроорганизмов на единицу площади или единицу объема почти равное нулю, что может быть достигнуто подходящим способом сокращения микроорганизмов, этот способ сокращения микроорганизмов может быть выбран из гамма-излучения, бета- излучения, автоклавирования, обработки этиленоксидом (ЕТО) и обработки паром на месте (SIP).
В контексте настоящего изобретения термин «одноразовое изделие» означает, что рассматриваемые изделия, которые входят в контакт с продуктом, в частности устройства, контейнеры, фильтры и соединительные элементы, являются подходящими для одноразового применения с последующей ликвидацией, причем эти контейнеры могут быть сделаны как из пластмассы, так и из металла. В контексте настоящего изобретения этот термин также включает многоразовые изделия, например, из стали, которые используются только один раз в способе согласно настоящему изобретению и в этом случае больше не используются. Эти повторно используемые изделия, например, изготовленные из стали, далее упоминаются в контексте изобретения как «используемых как одноразовые изделия». Такие используемые одноразовые изделия могут также упоминаться как «одноразовые» или «однократно используемые» изделия («технология SU»), соответственно, в способе согласно настоящему изобретению. В результате улучшается состояние сокращения микроорганизмов способа согласно настоящему изобретению и блочной системы.
Термин «поток продукта» в контексте настоящего изобретения означает текучую среду, свободную от частиц, из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, содержащей продукт, а также результат любых других стадий способа согласно настоящему изобретению, то есть поток продукта после фильтрации, после хроматографии, после истощения вируса, после ультрафильтрации, после диафильтрации или после дальнейших стадий способа согласно настоящему изобретению эти потоки продукта могут затем иметь разные концентрации и степени чистоты.
В контексте настоящего изобретения термин «истощение вируса» означает уменьшение концентрации активных вирусов на единицу объема обрабатываемой жидкости вплоть до полной инактивации и/или удаления вирусов, содержащихся в текучей среде, подлежащей обработке.
Термин «микробицид» в контексте настоящего изобретения означает вещество, которое может замедлять или полностью ингибировать рост микроорганизмов, причем этот микробицид можно использовать в форме микробицид-содержащего буфера, в частности, в рамках способа согласно изобретению во время ультрафильтрации.
Термин «ловушка для улавливания газа» в контексте изобретения означает устройство для сбора пузырьков газа, в котором соответствующая текучая среда дегазируется.
Термин «блочный» означает в рамках объема настоящего изобретения, что отдельные стадии способа в соответствии с изобретением могут выполняться в отдельных взаимосвязанных блоках, где блоки предварительно сконфигурированы и подвергнуты сокращению микроорганизмов и могут быть соединены вместе в разных комбинациях.
Термин «блочная система» в контексте настоящего изобретения означает серию взаимосвязанных блоков («узлов») для выполнения по меньшей мере двух стадий ниже по ходу потока и/или выше по ходу потока, в которых может переноситься текучая среда («поток продукта»). Согласно настоящему изобретению блоки подходят для непрерывного осуществления одной стадии и могут работать с непрерывным потоком текучей среды («поток продукта»). Отдельные блоки «блочной системы» могут быть объединены в любую комбинацию. Примерами блоков в контексте изобретения являются блок фильтрации 2, блок хроматографии 3, блок ультрафильтрации 6, блок диафильтрации 7 и блок диализа 8.
В контексте настоящего изобретения термин «закрытый» означает режим осуществления способа в соответствии с изобретением и блочную систему в соответствии с изобретением, которые работают таким образом, что продукт, который получен и/или приготовлен с использованием этого способа, и эта блочная система не подвергаются воздействию окружающей среды помещения. В закрытом способе согласно настоящему изобретению и соответствующей закрытой блочной системе в соответствии с изобретением могут добавляться внешние материалы, предметы, буферы и тому подобное, но это добавление осуществляется таким образом, чтобы исключить воздействие на полученный и/или обработанный продукт окружающей среды помещения.
Обычные способы, известные в данной области техники, имеют ряд недостатков, которые будут рассмотрены ниже.
Известные способ получения биофармацевтических и биологических продуктов, как правило, включает следующие стадии получения, которые объединяются друг с другом:
1. Перфузионное культивирование
2. Систему задерживания клеток, альтернативой стадиям 1 и 2 является культивирование с подпиткой
3. Отделение клеток
4. Замена буферного раствора или соответственно среды, предпочтительно с концентрированием
5. Осветляющая фильтрация микроорганизмов, предпочтительно при помощи стерилизующего фильтрования
6. Хроматография с задерживанием
Обычно для дальнейшей очистки потока продукта проводятся дополнительные стадии, в частности:
7. Вирусная инактивация
8. Нейтрализация
9. При желании дополнительная осветляющая фильтрация микроорганизмов (стерилизующее фильтрование.
Ввиду высоких стандартов качества при получении биофармацевтических продуктов, кроме этого, обычно далее идут следующие стадии:
10. Хроматографическая промежуточная и тонкая очистка
11. Осветляющая фильтрация микроорганизмов, например, стерилизующее фильтрование
12. Фильтрация вирусов
13. Замена буферного раствора и предпочтительно концентрирование
14. Стерилизующее фильтрование
При описанном выше получении клетки в ферментере с питательным раствором продуцируют биологический продукт, такой как белок, например, терапевтический белок. Питательный раствор также является идеальной средой для выращивания микроорганизмов, таких как бактерии и споры, что приводит к проблеме нежелательного роста таких микроорганизмов. Этот нежелательный рост микроорганизмов становится проблемой, особенно при более длительным сроком хранения, поскольку питательный раствор становится все более и более загрязненным с увеличением времени выполнения процесса до экспоненциального роста микроорганизмов и, следовательно, полной потери соответствующей партии биологического продукта.
Чтобы отвечать требованиям быстрой и гибкой новой загрузки производственной установки при соблюдении максимальной чистоты и стерильности, на рынке постоянно возрастающим интересом пользуются концепции непрерывного производства, предпочтительно, имеющие одноразовую технологию.
Однако для более длительных периодов времени осуществления такого процесса, от нескольких часов в течение нескольких дней до нескольких недель, обычных санитарных мер недостаточно, таких как обычные меры «чистки на месте» (CIP), таких как, например, обеззараживание посредством 1 М NaOH. В случае осуществления процесса в течение нескольких часов такие обычные процессы и системы имеют тот недостаток, что они очень восприимчивы к возможному загрязнению и/или возможному росту микробов.
Поэтому существует потребность в способе непрерывной очистки продукта из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, что позволяет обеспечить непрерывную работу в течение нескольких недель благодаря сокращению микроорганизмов.
Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка способа и соответствующей системы, с помощью которой продукт, например белок, может непрерывно очищаться в течение от нескольких часов до нескольких недель.
Настоящее изобретение решает данную задачу, обеспечивая способ непрерывного получения и/или обработки биофармацевтического биологического макромолекулярного продукта из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, включающий стадии:
(a) предоставление свободной от частиц текучей среды из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, содержащей продукт в виде потока продукта,
(b) по меньшей мере одна фильтрация, причем получают фильтрат,
(c) по меньшей мере две стадии хроматографии для очистки продукта,
(d) по меньшей мере одно истощение вируса,
(е) по меньшей мере одна ультрафильтрация и/или по меньшей мере одна диафильтрация потока продукта со стадий (b), (с) и/или (d),
отличающийся тем, что по меньшей мере две стадии хроматографии (с) содержат очистку по меньшей мере двумя хроматографическими колонками и/или мембранными адсорберами, и тем, что способ осуществляют закрытым и блочным способом.
Основные принципы способа в соответствии с изобретением основаны на его четырех основных принципах и, следовательно, основных признаках:
1. непрерывный
2. сокращающий микроорганизмы
3. закрытый и
4. блочное получение биофармацевтического, биологического макромолекулярного продукта.
Вместе эти четыре признака резко уменьшают часто встречающуюся проблему нежелательного роста микроорганизмов, обеспечивая время выполнения способа по настоящему изобретению продолжительностью до 8 недель.
Свободная от частиц текучая среда из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, представленная на стадии а), может предпочтительно происходить из непрерывного процесса перфузии и ферментации, как например клеточная культура или тканевая культура, или перфузионного реактора. В этом случае параллельно может работать даже более одного перфузионного реактора, например, два перфузионных реактора.
Сначала текучая среда может постоянно удаляться подходящими системами удерживания клеток, такими как отстойник с наклонными пластинами, посредством которого можно удерживать большую часть клеток. Последующие стадии фильтрации и/или центрифугирования или другие подходящие способы разделения могут затем освобождать текучую среду от частиц, содержащихся в текучей среде, таким образом получая жидкость без частиц, содержащую биофармацевтический биологический макромолекулярный продукт.
Стадией фильтрации (b) может быть, например, фильтрация свободной от частиц текучей среды, полученной после стадии (а), посредством чего получают фильтрат. Однако способ согласно настоящему изобретению может также содержать дополнительные стадии фильтрации в подходящих точках процесса.
Стадию фильтрации b) можно проводить с помощью подходящих способов фильтрации, например, фильтра 0,2 мкм или несколько фильтров, работающих параллельно. Подходящим фильтром для стадии фильтрации является, например, фильтр 0,2 мкм Sartoguard NF, некоторые из которых могут работать параллельно.
В следующем варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению стадия (b) фильтрации включает глубинный фильтр с дополнительной возможностью истощения загрязняющих веществ, таких как ДНК, ProtA, НСР. Это могут быть глубинные фильтры с достаточным дзета-потенциалом (Zetapor 3M, Posidyne, Pall) или глубинные фильтры с активированным углем (Millistak Merck Millipore).
По меньшей мере две стадии хроматографии для очистки продукта на стадии с) включают очистку по меньшей мере двумя хроматографическими колонками и/или мембранными адсорберами. Хроматографические колонки и/или мембранные адсорберы могут иметь любой подходящий принцип связывания, такой как сродство продукта к лиганду, ионные взаимодействия, металл-хелатное связывание, гидрофобные взаимодействия или силы Ван-дер-Ваальса. Например, первая стадия хроматографии по меньшей мере двух стадий хроматографии может быть аффинной хроматографией (например, лиганд, имеющий сродство к продукту, как например, белок А, белок G, белок L, IgM, IgG, и рекомбинантный белок, отличный от белка А, белка G и белка L, IgM, IgG, который имеет сродство к продукту). Затем следует другая (вторая) стадия хроматографии, такая как хроматография на основе ионных взаимодействий.
Способ согласно настоящему изобретению является гибким и может содержать на стадии с) любой подходящий принцип хроматографии в любом порядке в зависимости от степени чистоты и концентрации продукта, которые должны быть достигнуты.
Технический результат использования по меньшей мере двух стадий хроматографии по меньшей мере на двух хроматографических колонках и/или мембранных адсорберах в соответствии со стадией с) состоит в том, что обычно одной стадии хроматографии не обеспечивается достаточная очистка загрязняющих веществ, например, примесей клеток-хозяев, агрегатов, ДНК, белка А и т.д.
Кроме того, это обеспечивает непрерывное получение на одной стадии хроматографии, поскольку по меньшей мере одну хроматографическую колонку и/или мембранный адсорбер можно загружать неочищенным продуктом, тогда как по меньшей мере одна другая хроматографическая колонка и/или мембранный адсорбер могут быть регенерированы или элюированы, тем самым обеспечивая непрерывный и эффективный способ работы.
В следующем варианте выполнения способа согласно изобретению осуществляют одну или более дополнительных стадий регулирования значения рН, и/или регулирования проводимости, и/или стадии фильтрации, и/или концентрации, и/или обмена буфера между указанными по меньшей мере двумя стадиями хроматографии на с и/или после инактивации вируса на стадии (d).
По меньшей мере одно истощение вируса на стадии d) может быть осуществлено, в частности, путем регулирования значений рН свободной от частиц текучей среды, предпочтительно до рН≤4,0. Регулирование значения рН свободной от частиц текучей среды, подлежащей инактивации, до ≤4.0, может быть осуществлено, например, путем добавления раствора HCl. Добавление обычно предшествует устройству для истощения вируса. Обычно значение рН доводят до > 4 основанием, например раствором гидроксида натрия (NaOH), чтобы завершить истощение вируса.
Однако по меньшей мере одно истощение вируса на стадии d) также может быть проведено посредством стадии растворителя-детергента, на которой достигается истощение вируса растворителем/детергентом.
В еще одном варианте выполнения настоящего изобретения истощение вируса также может быть достигнуто путем УФ-обработки и/или термической обработки.
По меньшей мере одно истощение вируса на стадии d) может, в частности, проходить в зоне пребывания, в которую может быть введен сегментированный поток продукта.
В следующем варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению все элементы, контактирующие с продуктом, используемые на стадиях (а)-(е), подвергаются сокращению микроорганизмов подходящим способом сокращения микроорганизмов.
3
2
2
Предпочтительно способ сокращения микроорганизмов может быть выбран из группы, включающей гамма-облучение, бета-облучение, автоклавирование, обработку этиленоксидом (ЕТО), обработку озоном (О), обработку пероксидов (НО) и обработку паром на месте (SIP).
3
2
2
Соответственно, изделия и элементы блоков, используемых в способе согласно настоящему изобретению, которые вступают в контакт с потоком продукта, предпочтительно подвергаются сокращению микроорганизмов и/или могут быть стерилизованы, предпочтительно автоклавированы, гамма-облучены, могут быть продуты этиленоксидов (ЕТО), могут быть обработаны озоном (О), могут быть обработаны пероксидом водорода (HO) или могут быть обработаны паром на месте. (SIP), что обеспечивает возможность сокращения микроорганизмов или даже асептического осуществления способа согласно настоящему изобретению.
В следующем варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению все контактирующие с продуктом элементы, используемые на стадии фильтрации (b), являются одноразовыми изделиями или используются в качестве одноразовых изделий. Такие используемые одноразовые изделия затем могут также упоминаться как «одноразовые» или «однократно используемые» изделия в способе согласно настоящему изобретению («технология SU»). Это улучшает состояние сокращения микроорганизмов способа.
В следующем варианте выполнения способа в соответствии с изобретением все входящие текучие среды фильтруют через фильтр для сокращения микроорганизмов, такой как фильтр Sartorius Sartoguard NF.
В этом случае предпочтительно все выходы могут быть защищены микробным барьером, который предотвращает повторный рост микроорганизмов. Например, фильтр Sartorius NF от Sartorius можно также использовать в контексте настоящего изобретения в качестве микробного барьера. Дополнительная защита микробным барьером 11 может быть достигнута посредством переключения фильтров и/или линии отходов. Еще одна мера, обеспечивающая условия, благоприятные для сокращения микроорганизмов, может быть достигнута путем периодической дезинфекции линии отходов, предпочтительно после фильтрации, например, раствором NaOH. Другими методами могут быть УФ-облучение и термообработка.
В другом варианте выполнения настоящего изобретения стадии блочного процесса способа согласно настоящему изобретению предпочтительно выполняются в блоках, где блоки взаимосвязаны.
В этом случае блоки предпочтительно могут быть соединены друг с другом посредством сварки или асептическими соединителями. Для сварки блоков, например, используется устройство «ТС Welder» компании Sartorius.
В следующем варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению все жидкости, газы и твердые вещества, используемые на стадиях (а)-(е), подвергаются сокращению микроорганизмов. Сокращение микроорганизмов предпочтительно осуществляется путем фильтрации через фильтр, имеющий размер пор предпочтительно ≤0,45 мкм. В этом случае в ходе способа предпочтительно не проводят стерилизацию в процессе. В других вариантах выполнения настоящего изобретения сокращение микроорганизмов также может быть проведено фильтрованием через фильтр, имеющий размер пор предпочтительно 0,20 мкм.
В еще одном предпочтительном варианте выполнения способа согласно изобретению проводят дегазацию всех текучих сред перед стадией хроматографии(с), которые поступают на по меньшей мере две хроматографические колонки, причем дегазацию предпочтительно осуществляют посредством по меньшей мере одной ловушки для улавливания газа и/или по меньшей мере одной гидрофобной мембраны для микрофильтрации под вакуумом и/или посредством обработки ультразвуком и/или посредством барботирования плохо растворимого газом, таким как гелий.
Использование гидрофобной мембраны для микрофильтрации под вакуумом для поддержания стерильности при непрерывном проведении способа согласно настоящему изобретению и системы согласно настоящему изобретению является предпочтительным, поскольку она оказалась особенно предпочтительным по сравнению с ловушкой для улавливания газа. Используемой гидрофобной мембраной для микрофильтрации может быть, в частности, MicroModule от Membrana.
В особенно предпочтительном варианте выполнения способа согласно изобретению свободная от частиц текучая среда со стадии а) подвергается по меньшей мере одной ультрафильтрации против буфера, содержащего микробицид. В результате ультрафильтрации питательные вещества, содержащиеся в текучей среде, замещаются на буфер, содержащий микробицид, чтобы лишить микроорганизмы/микробы условий для роста в текучей среде. Это еще больше улучшает сокращение микроорганизмов в процессе.
Используемый в настоящем изобретении микробицид или один или более микробицидов предпочтительно могут быть выбраны из группы, состоящей из имидазола, бензойной кислоты, сорбиновой кислоты, сложных эфиров парагидроксибензойной кислоты, сульфитов, дисульфитов, азидов, ортофенилфенола, низина, натамицина, гексаметилентетрамина, диметилдикарбоната, нитритов, нитратов, уксусной кислоты, аскорбиновая кислота, изоаскорбиновой кислоты, L-молочной кислоты, пропионовой кислоты, борной кислоты и лизозима.
Микробициды, содержащиеся в буфере, содержащем микробицид, могут дополнительно представлять собой один или более микробицидов, выбранных из группы, состоящей из:
Е210-Е213 бензойная кислота и ее соли, 0,05-0,1% в растворителе в кислой среде, 2-3 г/кг в растворителе;
Е200-Е203: Сорбиновая кислота и ее соли, 300-2000 мг/кг;
Е214-Е219: РНВ сложные эфиры (сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты, парабены), бутил- и пропилпарабен
Е220-Е228: сульфиты и дисульфиты,
Е231 и Е232: ортофенилфенол, 12 мг/кг;
Е234: низин,
Е235: натамицин,
Е239: гексаметилентатрамин, 25 мг/кг;
Е242: диметилдикарбонат;
Е249-Е252: нитрит и нитрат, 300 мг/кг;
Е260: уксусная кислота, 0,5-3%;
Е300-Е302: аскорбиновая кислота, 300 мг/кг;
Е315-Е316: изоаскорбиновая кислота, 1500 мг/кг;
Е261-Е263: ацетат;
Е270 L-молочная кислота;
Е280-Е283: пропионовая кислота и ее соли, 1-3 г/кг;
Е284 и Е285: борная кислота, макс. 4 г/кг;
Е1105 лизозим; и
азид.
В предпочтительном варианте выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением биофармацевтический биологический макромолекулярный продукт представляет собой белок или пептид, выбранный из группы, состоящей из моноклональных антител, поликлональных антител, рекомбинантных белков и вакцин, предпочтительно ДНК и РНК-вакцин.
Хроматографические колонки и/или мембранные адсорберы, используемые на стадии с), могут иметь любой подходящий принцип связывания, такой как сродство продукта к лиганду, ионные взаимодействия, металл-хелатное связывание, гидрофобные взаимодействия или силы Ван-дер-Ваальса. Например, первая стадия хроматографии по меньшей мере двух стадий хроматографии может быть аффинной хроматографией (например, лиганд, имеющий сродство к продукту, как например, белок А, белок G, белок L, IgM, IgG, и рекомбинантный белок, отличный от белка А, белка G и белка L, IgM, IgG, который имеет сродство к продукту). Затем следует другая (вторая) стадия хроматографии, такая как хроматография на основе ионных взаимодействий.
На этой стадии способ согласно настоящему изобретению является гибким и может содержать на стадии с) любой подходящий принцип хроматографии в любом порядке в зависимости от степени чистоты и концентрации продукта, которые должны быть достигнуты.
В особенно предпочтительном варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению по меньшей мере две хроматографические колонки и/или по меньшей мере два мембранных адсорбера на стадии (с) содержат лиганд, который предпочтительно выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G, белка L, IgM, IgG и рекомбинантного белка, отличного от белка А, белка G, белка L, IgM и IgG, и который имеет сродство к продукту.
В предпочтительном варианте выполнения способа согласно изобретению стадии (а)-(е) способа имеют продолжительность, составляющую по меньшей мере 4 часов, предпочтительно по меньшей мере 8 часов, предпочтительно по меньшей мере 12 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часа, более предпочтительно по меньшей мере 48 часов, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, более предпочтительно по меньшей мере 4 недели и наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 недель. Такое длительное время в течение нескольких недель непрерывной работы стало возможным только благодаря закрытому, блочному и, прежде всего сокращающему микроорганизмы образу осуществления способа.
В предпочтительном варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению проводят по меньшей мере одну стадию фильтрации, включающую по меньшей мере один фильтр, между стадиями а)-е) и/или после них.
В особенно предпочтительном варианте выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением фильтр автоматически заменяется в условиях сокращения микроорганизмов, причем автоматическая замена фильтра предпочтительно включает следующие стадии:
(i) переключение пути потока на новый фильтр, при превышении порогового значения на датчике давления на стороне нефильтрата, закрывая путь потока, причем продукт в отработанном фильтре предпочтительно прессуется газом или жидкостью в сторону фильтрата, или при превышении максимального времени отработанного фильтра в пути потока, или при превышении максимального объема фильтрата через отработанный фильтр,
(ii) вентиляция нового фильтра через воздушный фильтр с размером пор предпочтительно ≤ 0,25 мкм, при вентиляционном клапане нового фильтра, предпочтительно с передачей продукта на новый фильтр с помощью питающего насоса или в закрытый мешок, соединенный сокращающим микроорганизмы образом,
(iii) определение завершения вентиляции нового фильтра на стороне нефильтрата датчиком давления или датчиком уровня заполнения или весами или датчиком жидкости,
(iv) открытие выхода фильтрата и закрытие пути потока между вентиляционным клапаном и воздушным фильтром посредством клапана, и
(v) замена отработанного фильтра на новый фильтр.
Одновременная или последующая передач продукта в новый фильтр может, например, осуществляться питающим насосом.
Это означает, что в следующем варианте выполнения способа согласно настоящему изобретению замена фильтра (переключение от использованного к новому фильтрующему элементу) может происходить автоматически. В этом случае вентиляция фильтра оказывается проблематичной, но она необходима и должна выполняться вручную в случае фильтров, доступных в настоящее время. Во-первых, фильтр подвергается способу сокращения микроорганизмов посредством, если является подходящим, ЕТО, автоклавирования или гамма-облучения, а затем соединение с процессом. После этого фильтр со стороны нефильтрата может быть заполнен, пока вентиляционный клапан открыт, который должен быть закрыт после успешного вентилирования, чтобы можно было выполнить фактическую фильтрацию. В периодическом процессе сильное сокращение микроорганизмов на стороне нефильтрата не требуется, так как в случае периодического процесса это протекает в короткие периоды времени. Таким образом, важно именно получить фильтрат насколько возможно максимально свободный от микроорганизмов. Однако в непрерывном процессе для предотвращения загрязнения микроорганизмами процесса требуется сильно свободный от микроорганизмов режим работы стороны нефильтрата. В предшествующем уровне техники вентиляционный клапан должен быть закрыт вручную вращательным движением после заполнения фильтра, чтобы можно было выполнить фактическую фильтрацию. Это вращательное движение очень дорого для автоматизации, поскольку оно также требует осевого перемещения вращающегося тела. Осевое перемещения вращающегося тела вместе с установленными на нем уплотнениями сдвигает предел. Если до указанного закрытия вентиляционного клапана вручную было проведено сокращение микроорганизмов при закрытом вентиляционном клапане, микробный предел сдвигается при открытии вентиляционного клапана. В этом случае область, содержащая микроорганизмы, вводится в область с сокращением микрооргаизмов, и тем самым аннулируя сокращение микроорганизмов. Сокращение микроорганизмов с открытым клапаном фильтра не рекомендуется, так как открытое положение не имеет фиксированного положения, что может легко повредить клапан. Кроме того, открытое положение обычно шаткое, так что она может произойти сдвиг микробного предела при нормальной обработке фильтра.
3
2
2
Для автоматической вентиляции фильтра целесообразно избегать вращательного движения вентиляционного клапана во время ввода в эксплуатацию, так что вентиляция может быть выполнена только с помощью простых мер. Вентиляционный клапан затем может быть модифицирован так, чтобы он был проницаемым даже в закрытом состоянии, но все же надежно уплотнен от окружающей среды. В результате клапан является «закрытым» в безопасном состоянии, которое характеризуется плотной посадкой. Состояние «открытый» обычно четко не определено, так как корпус клапана в ходе работы сильно встряхивается, что позволяет сдвигать предел. На сопле вращающегося тела прикреплен шланг, который заканчивается гидрофобным воздушным фильтром ≤0,2 мкм. Эта конструкция затем предпочтительно подвергается сокращению микроорганизмов посредством обработки ЕТО, гамма-облучения, автоклавирования или обработки озоном (О) или пероксидом водорода (НО). Таким образом, вся сторона нефильтрата до воздушного фильтра на вентиляционном клапане является сокращенной по микроорганизмам или немикробной. Между вентиляционным клапаном и воздушным фильтром в клапан с зажимом, который способен надежно сжать шланг, вставляются шланги. Вентиляция может быть выполнена полностью автоматически и с минимальным содержанием бактерий. Фильтр заполняется до тех пор, пока жидкость не попадет в воздушный фильтр через выпускной клапан и шланг. Гидрофобный вентиляционный фильтр блокирует жидкость. В то же время технологическая установка блокирует поток продукта посредством клапана со стороны фильтрата, что приводит к увеличению давления перед фильтром. Это определяется подходящим датчиком. Если превышен определенный порог давления, клапан с зажимом вентиляционного шланга закрывается, и клапан со стороны фильтрата открывается. В этой процедуре фильтр может быть заменен автоматически без ручного вмешательства с использованием модифицированного вентиляционного клапана.
Эта автоматическая замена фильтра показана в качестве примера на фиг. 2, где схематически проиллюстрирован принцип работы стадии фильтрации способа и установки с заменой отработанного фильтра 17 посредством вварки нового фильтра 16.
2
В конце процесса конечный очищенный биофармацевтический биологический макромолекулярный продукт из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды может быть отфильтрован в последний раз путем окончательной фильтрации, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Окончательная фильтрация может быть осуществлена, например, через гамма-облученные капсулы Sartopore 2 (размер Midicap 7, 0,05 м) в гамма-облученный мешок GE ReadCircuit, объемом 5 л. Если уровень заполнения конечного мешка достаточен, этот мешок можно отсоединить и вварить новый мешок.
Задача настоящего изобретения также решается посредством блочной системы для непрерывного сокращающего микроорганизмы получения и/или обработки биофармацевтического биологического макромолекулярного продукта из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды, включающей следующие блоки:
а) по меньшей мере один блок фильтрации,
(b) по меньшей мере один блок хроматографии, содержащий по меньшей мере в каждом случае две хроматографические колонки и/или мембранных адсорбера,
(c) по меньшей мере один блок ультрафильтрации и/или по меньшей мере один блок диафильтрации и/или по меньшей мере один блок диализа и
(d) по меньшей мере один блок непрерывного истощения вируса,
отличающаяся тем, что блочная система является закрытой и с сокращенным содержанием микроорганизмов.
Однако по меньшей мере один блок хроматографии может также содержать более двух хроматографических колонок и/или мембранных адсорберов, например, три или четыре хроматографических колонки и/или мембранных адсорбера.
3
2
2
В еще одном варианте выполнения блочной системы в соответствии с настоящим изобретением все элементы, используемые в блоках (а)-(d), которые вступают в контакт с продуктом, подвергаются сокращению микроорганизмов посредством способа сокращения микроорганизмов, причем способ сокращения микроорганизмов предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гамма-облучения, бета-облучения, автоклавирования, обработки этиленоксидом (ЕТО), обработки озоном (О), обработки пероксидом водорода (НО) или обработки паром на месте (SIP).
3
2
2
Предпочтительно, блочная система сама по себе, а также элементы блоков, которые входят в контакт с потоком продукта, которые вступают в контакт с потоком продукта, могут быть подвергнуты сокращению микроорганизмов и/или могут быть стерилизованы, предпочтительно автоклавированы, гамма-облучены, могут быть продуты этиленоксидов (ЕТО), могут быть обработаны озоном (О), могут быть обработаны пероксидом водорода (НО) или могут быть обработаны паром на месте (SIP), что обеспечивает возможность сокращения микроорганизмов или даже асептического осуществления способа согласно настоящему изобретению.
В еще одном варианте выполнения блочной системы согласно настоящему изобретению все изделия, используемые в блоках (а)-(d), которые вступают в контакт с продуктом, являются одноразовыми изделиями или используются в качестве одноразовых изделий. В этом случае блоки предпочтительно соединены друг с другом посредством сварки или асептическими соединителями. Например, асептические соединители «ReadyMate» от GE представляют собой асептические соединители, предпочтительно используемые в блочной системе в соответствии с настоящим изобретением.
Готовые одноразовые изделия («одноразовые», «готовые к применению») предпочтительно используются в виде гамма-облученных элементов.
В предпочтительном варианте выполнения блочной системы в соответствии с настоящим изобретением все входные жидкости проходят через фильтр сокращения микроорганизмов, причем предпочтительно все выходы защищены от микроорганизмов барьером, который предотвращает повторный рост микроорганизмов.
2
В конце процесса конечный очищенный биофармацевтический биологический макромолекулярный продукт из гетерогенной смеси клеточной культуры и текучей среды может быть отфильтрован в последний раз путем окончательной фильтрации, предпочтительно через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Окончательная фильтрация может быть осуществлена, например, через гамма-облученные капсулы Sartopore 2 (размер Midicap 7, 0,05 м) в гамма-облученный мешок GE ReadCircuit, объемом 5 л. Если уровень заполнения конечного мешка достаточен, этот мешок можно отсоединить и вварить новый мешок.
Настоящее изобретение, включая его предпочтительные варианты выполнения, проиллюстрировано в сочетании со следующими чертежами и примерами, но не ограничивается ими. Варианты выполнения могут быть объединены друг с другом, если иное не следует из контекста.
Далее показаны:
На фиг. 1 схематично показана технологическая схема варианта выполнения способа в соответствии с настоящим изобретением. Цифры в скобках являются ссылками на материальный баланс, как указано в примере 1 и таблице 1.
На фиг. 2 схематично показан принцип работы стадии фильтрации способа и установки с заменой отработанного фильтра 17 посредством вварки нового фильтра 16.
На фиг. 3 показаны в качестве примера две стадии способа инактивации и нейтрализации вируса - два узла, которые имеют модульную конструкцию, где рН-зонды рН0501 и рН0502 автоклавируются, а остальные подвергаются гамма-облучению. Затем рН-зонды рН0501 и рН0502 свариваются в конструкцию. Мешки подключаются через асептические соединители GE ReadyMate. Соединение с Prot-A и узлом фильтрации сначала сварено, а затем приварено к соответствующим узлам.
На фиг. 4 показан пример блочной структуры системы, в которой все входные потоки и выходные потоки соединены с окружающей средой через микробный барьер 10,13. Примерная блочная система 1 состоит из трех блоков фильтрации 2, каждый из которых имеет два взаимно управляемых фильтра 13, двух блоков хроматографии 3 с двумя хроматографическими колонками 4 и двумя мембранными адсорберами 5, стадии истощения вируса, например, инактивации вирусов 9, блока ультрафильтрации 6 и блока диафильтрации 7. Буферы освобождаются от пузырьков газа через гидрофобный фильтр 15 или ловушку для улавливания газа 14.
В таблице 1 показаны средние скорости потока и концентрации антител в положениях, показанных на фиг. 1.
Используемые ссылочные номера:
1 = Блочная система
2 = блок фильтрации
3 = блок хроматографии
4 = хроматографическая колонка
5 = Мембранный адсорбер
6 = Блок ультрафильтрации
7 = Блок диафильтрации
8 = Блок диализа
9 = Истощение вируса
10 = Фильтр сокращения микроорганизмов
11 = Микробный барьер
12 = асептический соединитель
13 = фильтр, имеющий размер пор предпочтительно ≤0,45 мкм
14 = ловушка для улавливания газа
15 = гидрофобная мембрана для микрофильтрации
16 = новый фильтр
17 = отработанный фильтр
18 = датчик давления
19 = воздушный фильтр, размер пор предпочтительно ≤0,25 мкм
20 = вентиляционный клапан нового фильтра 16,
21 = питающий насос
22 = датчик уровня заполнения
23 = весы
24 = клапан
25 = поток отходов
26 = поток продукта
27 = буфер
28 = датчик жидкости
29 = мешок
Пример 1
Чтобы очистить белок непрерывно и сокращающим микроорганизмы образом из гетерогенной смеси клеточной культуры с текучей средой, был изготовлен миниплант со следующими блоками и связанными с ними стадиями способа:
Если не указано иное, в этом способе использовались перистальтические насосы MasterFlex с головкой насоса EasyLoad-II. Использовались шланги Masterflex LS16 или Cflex или Sanipure. Все использованные компоненты, входящие в контакт, были гамма-облучены с 25 кГр. В исключительных случаях, когда гамма-облучение не допускалось с точки зрения материалов, компоненты подвергали автоклавированию при 121°С в течение 20 минут, например, субблоки, имеющие рН-зонды, или вирусные фильтры. Там, где это возможно, готовые к использованию одноразовые изделия («одноразовые», «готовые к использованию») использовались в виде гамма-облученных блоков. Эти без исключения относится ко всем мешкам. Эти мешки обычно соединялись с блоками с помощью соединителей ReadyMate от General Electric (GE). Между каждым блоком помещался одноразовый гамма-облученный мешок (ReadyCircuit 1L, GE) в качестве компенсационного бака между выходным потоком блока n-1 и входным потоком блока n. Как правило, в каждый момент времени в каждом блоке был входной и выходной поток. Когда вентиляция жидкого продукта была полезной, контейнеры были герметизированы от окружающей среды посредством гидрофобного фильтра 0,2 мкм.
A. Процесс наращивания массы биотехнологической продукции
i) Перфузионный реактор
Для непрерывного получения IgG моноклональных антител использовали перфузионный реактор, объемом 10 л. Плотность жизнеспособных клеток в стационарном состоянии составляла 60-70 миллионов клеток/мл. Титр составлял ~115 мг/л. Получение осуществляли с двумя параллельными перфузионными реакторами в течение 28 дней.
ii) Система удерживания клеток
Продукт непрерывно удаляли через сепаратор с наклонными пластинами (отстойник), который удерживал большую часть клеток.
B. Процесс выделения и очистки DSP-1
i) Осветление клеток
2
Осветление проводили с использованием фильтров Sartoguard NF 0,2 мкм, работающих параллельно (T-style, MaxiCap, 0,65 м). На Фиг. 2 показано, как здесь реализован закрытый низкомикробный способ. Как фильтры, так и узел шланга были гамма-облучены. Входные и выходные линии были подключены через асептические соединители к гамма-облученным мешкам (GE ReadyCircuit, 1 л), которые служили в качестве компенсационных объемов для колебаний скорости потока. Для вентилирования фильтры были связаны с гидрофобным воздушным фильтром 0,2 мкм, в результате чего блок был закрыт в контексте настоящего изобретения (Фиг. 2). Воздушным фильтром был либо Emflon II от Pall Corp., либо Midisart2000 от компании Sartorius Stedim. Вентиляционные клапаны были модифицированы таким образом, чтобы они были проницаемыми даже в закрытом состоянии, но все еще надежно герметизированы от окружающей среды. Для этой цели на Sartoguard NF было удалено внутреннее уплотнительное кольцо вентиляционного клапана, и клапан был закрыт перед гамма-облучением. Этот клапан дополнительно был защищен от открытия. В результате клапан находился в «закрытом» безопасном состоянии, которое характеризовалось плотной посадкой. Вентиляционный клапан соединялся с воздушным фильтром через шланг. Между вентиляционным клапаном и воздушным фильтром шланг был вставлен в клапан с зажимом. Фильтр заполняли до тех пор, пока жидкость не попала в воздушный фильтр через вентиляционный клапан и шланг. Затем гидрофобный вентиляционный фильтр заблокировал жидкость. В то же время технологическая установка блокировала поток продукта через клапан со стороны фильтрата, вызывая повышение давления перед фильтром. Это повышение давления было обнаружено датчиком давления Pendotech. Если был достигнут порог в 0,5 бар, клапан с зажимом вентиляционного шланга был закрыт, и клапан на стороне фильтрата был открыт.
ii) Концентрация и перебуферизация
2
Фильтрат после осветления клеток i) первоначально непрерывно концентрировали в 10 раз посредством ультрафильтрационной половолоконной мембраны (GE Healthcare ReadytoProcess, 0,2 м, гамма-облучение). Циркуляционным насосом был одноразовый насос QuattroFlow 1200 SU, головка насоса которого была встроена в узел шланга перед гамма-излучением.
Затем компоненты среды концентрированного продукта обменивали на 50 мМ буфера имидазол/NaCl на мембране для диализа Gambro Revaclear 300. Блок поставляется стерильно упакованным производителем и подключается к узлу гамма-облучения в стерильной кабине. Пермеат из процесса концентрации и поток отходов, содержащий среду, подавали в гамма-облученный Sartorius Flexboy, объемом 200 л. Замена Flexboys проводилась сваркой сварочным аппаратом Sartorius.
Фильтрация 0,2 мкм
Продукт непрерывно фильтровали с помощью гамма-облученных фильтров Sartoguard NF (MaxiCap Size 8) в Flexboy, объемом 200 л, перед наполнением. Конструкция и эксплуатация были аналогичны В. Процесс выделения и очистки DSP-1 i) фильтрация осветления клеток.
С.Процесс выделения и очистки DSP-II
Фильтрация 0,2 мкм
После хранения продукт из DSP-I снова фильтровали, чтобы защитить колонны хроматографии ниже по ходу потоку от частиц.
1. Захватная хроматография
Mabselect Sure (GE) использовали в качестве Prot-A смолы для выделения IgG. IgG концентрировали в 10 раз, и большинство загрязняющих веществ удаляли. Непрерывная система BioSMB от Tarpon Biosystems, Inc. использовалась с 12 колонками (ID 16 мм, L 80 мм), причем 8 колонок находятся в зоне загрузки (2 колонки последовательно и 4 параллельные серии). Весь путь потока, включая колонки, был подвергнут сокращению микроорганизмов путем дезинфекции или гамма-облучения. Загрузка за цикл составляла 32 объема колонки на колонку. В качестве буферов применяли ацетатные буферы с разной молярностью, значением рН и проводимостью. Все буферы отфильтровывали в гамма-облученный мешок, применяя гамма-облученный или автоклавированный фильтр 0,2 мкм. Выходные шланги буферных мешков были приварены к входам системы BioSMB. Указанная система имела в каждом из ее входов гамма-облученную мембрану дегазации (Liquicell Micro Module, Membrana). Точно так же линия продукта была приварена через такой дегазатор к входу системы BioSMB. Затем все входные потоки дегазировали с помощью вакуумного насоса мощностью 50 мбар.
1. Инактивация и нейтрализация вируса
Инактивация и нейтрализация вируса состояла из трех блоков и находилась между захватной хроматографией и фильтрацией 0,2 мкм: (а) контур гомогенизации с перистальтическим насосом М0502; (b) контур удерживания, схематически показанный как гибкий шланг; (с) мешок для нейтрализации, в котором значение рН можно довести до 7,5. Блоки были индивидуально изготовлены и гамма-облучены в соответствии со сварными швами на Фиг. 3, причем концы были плотно приварены в каждом случае.
Линейные сегменты с рН-зондами, здесь рН0501 и рН0502, была автоклавирована. Затем сегменты рН-зонда приваривали к узлам.
Мешки были подключены через асептические соединители GE ReadyMate, как показано. Соединения с линией элюата Prot-A белка и блоком фильтрации были первоначально герметизированы и затем приварены к соответствующим блокам.
Фильтрация 0,2 мкм
Белки могли осаждаться после сдвига рН, осажденный белок отфильтровывали.
Промежуточная и полирующая хроматография
Продукт вышеописанной фильтрации 0,2 мкм очищали с помощью двух стадий хроматографии с использованием четырех последовательных (4-РСС) с 2,5 мл Capto Adhere (2,5 мл GE), а затем двух альтернативных анионообменников с 20 мл (Pall Hypercel StarAX). В этой очистке выщелачиваемые Prot-A, ДНК, НСР и агрегаты удалялись. Две стадии хроматографии соединяли друг с другом посредством гамма-облученного мешка (GE ReadyCircuit 1 л), в котором путем добавления воды проводимость была доведена до 7,5 мСм/см в соответствии с требованием анионообменника.
Весь путь потока, включая колонки, подвергался дезинфекции или гамма-облучению. Загрузка за цикл составляла 50 объемов колонки на колонку. В качестве буферов применяли ацетатные буферы с разной молярностью, значением рН и проводимостью. Все буферы отфильтровывали в гамма-облученный мешок, применяя гамма-облученный или автоклавизованный фильтр 0,2 мкм. Выходные шланги буферных мешков были приварены к входам системы BioSMB. Указанная система имела в каждом из ее входов гамма-облученную мембрану дегазации (Liquicell Micro Module, Membrana). Точно так же линия продукта была приварена через такой дегазатор к входу системы BioSMB. Затем все входные потоки дегазировали с помощью вакуумного насоса мощностью 50 мбар. Поток отходов был направлен на гамма-облученный Sartorius Flexboy, 200 л. Замена Flexboys проводилась посредством повторной сварки сварочным аппаратом Sartorius.
Поток продукта снова собирали в гамма-облученном мешке продукта (GE ReadyCircuit, 1 л).
Префильтрация
2
Раствор продукта из мешка для продуктов полировочной хроматографии сначала предварительно фильтровали через капсулу 0,1 мкм (Sartopore2, размер MidiCap 9, 0,2 м). Методика и установка были аналогичны «В. Процесс выделения и очистки DSP-1 - i) осветление клеток».
Вирусная фильтрация
2
Выходная линия от префильтрации была подключена непосредственно через перистальтический насос к входу вирусной фильтрации из «С. Процесс выделения и очистки DSP-II» посредством сварки. В противном случае установка и работа вирусной фильтрации из «С. Процесс выделения и очистки DSP-П» была аналогична «С. Процесс выделения и очистки DSP-II - фильтрация 0,2 мкм». Тем не менее, используемым вирусным фильтром был фильтр Virosart CPV (размер MidiCap 9, 0,2 м), который промывали и автоклавировали в соответствии с инструкциями производителя. Фильтры снова были сварены в сборку. Поток продукта снова закачивали в гамма-облученный мешок продукта (GE ReadyCircuit, 1 л).
Конечная концентрация и перебуферизация
Конечная концентрация и перебуферизация были аналогичны приведенной выше «В. DSP-I ii) концентрации и перебуферизация» и отличались только тем, что автоклавированная УФ-ячейка участвовала в мониторинге концентрации продукта в контуре концентрации. Перебуферизация также проводилось аналогично описанной выше «В. DSP-I ii) концентрации и перебуферизация», с 50 мМ фосфатным буфером, причем в этом случае применяли рН 7,5. Поток продукта снова закачивали в гамма-облученный мешок продукта (GE ReadyCircuit 1L).
Фильтрация 0,2 мкм
2
Окончательная фильтрация проводилась, как описано выше, в «В. DSP-1 i)» через гамма-облученные капсулы Sartopore 2 (размер Midicap 7, 0,05 м) в гамма-облученный мешок GE ReadCircuit, объемом 5 л. Когда уровень заполнения конечного мешка был достаточным, этот мешок отсоединили и приварили новый мешок.
Регулярное время выполнения способа согласно изобретению, как описано в примере 1, составляло 3 дня без роста микроорганизмов, причем хроматографические колонки дезинфицировали с помощью 40% изопропанола +0,5 М NaOH. Во время выполнения способа согласно настоящему изобретению более 3 дней хроматографические колонки подвергались гамма-облучению.
Усредненные скорости потока и концентрации антител в положениях, показанных на Фиг. 1, приведены в Таблице 1.
Работа, проведенная для этих результатов, финансировалась по грантовому соглашению «Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich» в рамках Европейского фонда регионального развития (ERDF).