Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки
METHOD FOR PREDICTING METASTASIS IN COLON CANCER

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в прогнозировании течения опухолевого процесса при раке ободочной кишки без отдаленных метастазов для индивидуализации и выбора оптимальной тактики лечения.
Вопросы прогнозирования течения опухолевого процесса при злокачественных опухолях вообще, и при раке ободочной кишки в частности, в последние годы приобретают все большую актуальность. Это связано в первую очередь с ростом заболеваемости злокачественными новообразованиями во всех экономически развитых странах мира и затруднением в своевременной диагностике данной патологии (Щепотин И.Б., Зотов А.С., Костюченко Е.А. Роль пролактина в физиологии и патологии молочной железы. Вопр. онкологии. - 2007. - т. 53, №2. - С. 131-139). На момент установления диагноза у каждого третьего больного отмечается генерализация опухоли (Егоренков В.В. - Скрининг рака толстой кишки // Практическая онкология. - 2010.- Т. №11. - С. 81-88).
При диагностике онкопатологии толстой кишки выполняется определение концентрации раково-эмбрионального антигена (РЭА) в крови, хотя он не является веществом специфичным только для рака толстой кишки (Пророков В.В., Малихов А.Г., Кныш В.И. Современные принципы диагностики и скрининга рака прямой кишки // Практическая онкология. - 2002. - Т. 3, №2. - С. 77-81; Егоренков В.В. - Скрининг рака толстой кишки // Практическая онкология. - 2010. - Т. №11. - С. 81-88). РЭА обнаруживается в повышенных концентрациях у 62% больных, причем его уровень коррелирует со стадией опухолевого процесса, а концентрация считается важным прогностическим признаком. Высокий уровень РЭА после операции является неблагоприятным признаком нерадикальности операции, возможного рецидива, плохого прогноза, короткой выживаемости, либо развития метахронной опухоли (Пророков В.В., Малихов А.Г., Кныш В.И. Современные принципы диагностики и скрининга рака прямой кишки // Практическая онкология. - 2002. - Т. 3, №2. - С. 77-81; 20. Вашакмадзе Л.А. Рак толстой кишки при первично-множественных злокачественных опухолях // Российский онкологический журнал. - 2002. - №6. - С. 44-49; 103; Чиссов В.И., Онкология. М.: Гэотар-Медиа, 2007. - 560 с.).
Известен способ определения раково-эмбрионального антигена (РЭА) в тканях удаленной злокачественной опухоли у больных одиночным и метахронным раком толстой кишки (патент RU 2447447, опубл. 10.04.2012 г., Бюл. №10). При содержании РЭА в тканях одиночного рака толстой кишки 1186±50,2 нг/г ткани и выше прогнозировали возможность развития у больных раком толстой кишки метахронной опухоли толстой кишки. Однако способ не позволяет прогнозировать развития отдаленных метастазов при раке ободочной кишки, его возможно использовать только для прогнозирования возникновения метахронной опухоли толстой кишки.
В настоящее время при колоректальном раке важное значение приобрело исследование гена KRAS в опухолевых клетках. Состояние гена KRAS играет важную роль в определении показаний к проведению таргетной терапии. В настоящее время проводятся исследования по определению эпидемиологического и клинического значения состояния гена KRAS при колоректальном раке (Беляева А.В. Мутации в гене K-ras у больных колоректальным раком: эпидемиология и клиническое значение. Автореф. дис … канд. мед. наук. Санкт-Петербург. 2012), однако его роль в прогнозировании метастазирования колоректального рака не определена.
В последние годы появилась возможность определения циркулирующих опухолевых клеток в крови. Проведенные исследования показали, что при метастатическом процессе опухолевые клетки обнаруживаются в периферической крови примерно у 70% больных, при местно-распространенном раке с поражением регионарных лимфоузлов - у 35%, без поражения регионарных лимфоузлов - у 30% больных.
Установлено, что циркулирующие опухолевые клетки в периферической крови могут использоваться в виде динамичного онкомаркера как для прогноза течения заболевания и тем самым определять «интенсивность» адъювантной терапии, так и для мониторинга больных, получающих системное лечение. Это отражено в рекомендациях ASCO и FDA.
Количество циркулирующих клеток изменяется в зависимости от эффективности проводимого лечения. Так, если после завершения адъювантной химиотерапии в крови больных определяются циркулирующие цитокератинпрезентирующие клетки (СК19+), таких больных примерно 30%, риск рецидива возрастает в 3,8 раза, а безрецидивный интервал оказывается короче. Ожидаемая частота рецидива у этих больных составляет 70% (Ковалев А.А. Онкохирургия в постгеномную эру. Журнал онкологии. Хирургия №3. 2012).
Техническим результатом предлагаемого нами изобретения является прогнозирование развития отдаленных метастазов после хирургического лечения рака ободочной кишки без отдаленных метастазов для индивидуализации тактики и улучшения результатов лечения больных.
Технический результат достигается тем, что до операции определяют наличие мутации гена KRAS в опухоли, затем проводят гемиколэктомию и после нее выполняют исследование циркулирующих опухолевых клеток крови, при отсутствии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более десяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев, при наличии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более пяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев.
Изобретение «Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки» является новым, так как оно неизвестно в области медицины при хирургическом лечении рака ободочной кишки без отдаленных метастазов, прогнозировании течения опухолевого процесса.
Новизна изобретения заключается в том, что до операции определяют наличие мутации гена KRAS в опухоли; после гемиколэктомии выполняют исследование циркулирующих опухолевых клеток крови; при отсутствии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более десяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев; при наличии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более пяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев.
Таким образом, прогнозирование течения опухолевого процесса после оперативного вмешательства способствует индивидуализации тактики лечения, что позволит уменьшить частоту развития отдаленных метастазов рака ободочной кишки.
Способ осуществляется следующим образом. До операции больным выполняли фиброколоноскопию с биопсией опухоли ободочной кишки. Из фиксированных в 10% забуференном формалине и залитых в парафин образцов тканей опухолей получали срезы толщиной 8-10 мкм. Процедура экстракции ДНК включала в себя стандартную депарафинизацию срезов. Затем образцы обрабатывали набором реагентов QIAamp DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенной из образцов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0 с использованием набора Quant-iT™ dsDNAHigh-Sensitivity (HS) AssayKit (Invitrogen, США). Концентрация ДНК нормализовывалась до величины 1 нг/мкл. При помощи набора реагентов «Real-Time-PCR-KRAS-7М» («Биолинк», Россия) проводили определение 7 SNP-мутаций (SingleNucleotidePolymorphism) в 12 и 13 кодонах гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США).
После проведения гемиколэктомии, производили забор крови больных в пробирки CellSavePreservativeTube, содержащие антикоагулянт ЭДТА, а также реагент для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток.
Детекцию циркулирующих опухолевых клеток проводили с использованием системы CellSearch™Veridex, Johnson&Jonnson, США. Для отделения клеток крови и опухолевых от плазмы кровь смешивалась с рабочим буфером из набора реагентов CellSearch CTCkit и центрифугировалась при ускорении 800g в течение 10 минут. После этого образцы переносились в аппарат CellTracks AutoPrep System, который в автоматическом режиме, удаляя плазму крови и форменные элементы, иммуномагнитно обогащал образец микрочастицами железа, покрытыми антителами к маркерам адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ, CD45 и цитокератинами 8, 18, 19. Качество работы системы оценивали с использованием стандартного контроля СТС controlkit. Материал сканировался в анализатооре CellTracks AnalyzerII. С учетом морфологических характеристик и экспрессии маркеров регистрировались циркулирующие опухолевые клетки. Общее число выявленных опухолевых клеток являлось конечным результатом.
При отсутствии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более десяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев; при наличии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более пяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев.
Изобретение «Способ прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки» является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицинских учреждениях онкологического профиля, диспансерах, научно-исследовательских онкологических институтах.
Приводим клинические примеры применения «Способа прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки».
Пример №1
Больная Т., 1930 г. р., поступила в отделение общей онкологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России 12.05.2013 г. с жалобами на запоры, примесь крови в кале, похудание, слабость.
При обследовании: ФКС 5.05.2013 - опухоль нисходящей ободочной кишки на 54 см от ануса. Гистоанализ №32327-32 умеренно дифференцированная аденокарцинома. Исследование мутации гена KRAS - мутации не обнаружено.
СРКТ 27.04.2013 в нисходящей ободочной кишке опухоль 8×6,7 см в диаметре.
Установлен диагноз: рак нисходящей ободочной кишки, T3-4NxM0 ст. 2-3, гр 2.
После предоперационной подготовки 15.05.13 г. выполнена операция: гемиколэктомия слева. Верификация процесса: гистоанализ №36862-81 - G2 аденокарцинома с прорастанием всех слоев стенки кишки, инвазией в клетчатку, некрозы. В лимфоузлах метастазов нет.
Во время операции, после удаления левой половины ободочной кишки, больной выполнено исследование циркулирующих опухолевых клеток крови, получен результат - 2 клетки в 7,5 мл крови.
Послеоперационный диагноз: рак нисходящей ободочной кишки T4N0M0, стадия 2. Больной курсы химиотерапии не проводились. Находится под наблюдением более 2 лет, при УЗИ и СРКТ - контроле метастатического поражения отдаленных органов не выявлено.
Пример №2
Больной У., 1962 г. р., поступил в отделение общей онкологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России 12.05.2013 с жалобами на похудание, слабость, периодические боли в правой половине живота.
При обследовании: СРКТ 5.05.2013: опухоль слепой кишки до 7 см, с инфильтрацией окружающей клетчатки. ФКС 7.05.2013 опухоль слепой кишки. Гистоанализ 32447: аденокарцинома.
Установлен диагноз: Рак слепой кишки T3-4NxM0 стадия 2-3, кл. группа 2. После предоперационной подготовки 13.05.2013 выполнена операция гемиколэктомия справа. Исследование мутации гена KRAS - обнаружена мутация.
Верификация процесса: гистоанализ 35843-54/13 в слепой кишке - G3 аденокарцинома, инвазия всех слоев стенки кишки, жировой клетчатки, в лимфоузлах метастазов нет. Послеоперационный период протекал гладко.
13.05.13 больному выполнено исследование циркулирующих опухолевых клеток крови, получен результат - 10 клеток в 7,5 мл крови.
Послеоперационный диагноз: рак слепой кишки T4N0M0, стадия 2. Учитывая стадию заболевания, курсы химиотерапии больному не проводились. При контрольном СРКТ - обследовании через год после операции у больного выявлено метастатическое поражение печени. Затем больному проводилась многокурсовая химиотерапия.
Под нашим наблюдением находилось 40 больных раком ободочной кишки без отдаленных метастазов. Диагноз был верифицирован во всех случаях. Всем больным выполнена операция: резекция толстой кишки. Всем больным до операции проводилось исследование мутации гена KRAS в опухолевых клетках, а во время оперативного вмешательства исследование циркулирующих опухолевых клеток в крови больных.
Из 40 больных в возрасте от 42 до 75 лет раком ободочной кишки без отдаленных метастазов, пролеченных в клинике ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ, у 7 больных с отсутствием мутации гена KRAS уровень циркулирующих опухолевых клеток составил более 10 в 7,5 мл крови, у 18 больных с отсутствием мутации гена KRAS уровень циркулирующих опухолевых клеток составил менее 10 в 7,5 мл крови, у 6 больных с наличием мутации гена KRAS уровень циркулирующих опухолевых клеток составил более 5 в 7,5 мл крови, у 9 больных с отсутствием мутации гена KRAS уровень циркулирующих опухолевых клеток составил менее 5 в 7,5 мл крови. За больными проводилось интенсивное наблюдение. Каждые 3 месяца им проводили углубленное клиническое обследование, УЗИ органов брюшной полости, СРКТ или МРТ органов брюшной полости, рентгенографию или СРКТ органов грудной клетки.
При динамическом наблюдении за этими больными в течение двух лет во 2 и 4 подгруппах больных развития отдаленных метастазов не было выявлено, в 1 и 3 подгруппах у всех больных за время наблюдения выявили развитие отдаленных метастазов в 100% случаев.
Полученные результаты позволили нам прийти к выводу, что при отсутствии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более десяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев; при наличии мутации гена KRAS и содержании циркулирующих опухолевых клеток более пяти в 7,5 мл крови прогнозируют метастазирование в 100% случаев.
Технико-экономическая эффективность «Способа прогнозирования метастазирования при раке ободочной кишки» заключается в том, что использование способа позволяет прогнозировать течение опухолевого процесса, развитие отдаленных метастазов при раке ободочной кишки, индивидуализировать тактику лечения, проводить при необходимости химиотерапию и уменьшить частоту развития отдаленных метастазов, прост в исполнении. Способ позволит снизить затраты на лечение метастатического поражения при раке ободочной кишки.