Способ лечения пролиферативной витреоретинопатии с помощью мелфалана, ассоциированного с липосомами, в эксперименте
METHOD FOR TREATING PROLIFERATIVE VITREORETINOPATHY USING LIPOSOME-ASSOCIATED MELPHALAN IN AN EXPERIMENT

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения пролиферативной витреоретинопатии препаратом, содержащим антипролиферативный препарат Алкеран (Мелфалан), ассоциированный с липосомами, вводимый однократно инравитреально.
Уровень техники. Лечение заболеваний заднего отрезка глаза крайне затруднено в связи с наличием гематоретинального барьера, тормозящего проникновение лекарственных препаратов к патологическому очагу в задних отделах глаза. Интравитреальное введение требует частых инъекций, что является небезопасным для глаз. Использование субконьюнктивального и ретробульбарного метода введения является недостаточно эффективным.
Среди многочисленных заболеваний, локализующихся в заднем отделе глаза, особую трудность для лечения представляет интраокулярное пролиферативное нарушение - пролиферативная витреоретинопатия (ПВР). Развитие ПВР отмечается в 40% случаев при дистрофических отслойках сетчатки и до 100% случаев при травматических отслойках сетчатки. В основе ПВР лежит феномен, вызванный пролиферирующими клетками, формирующими эпиретинальную мембрану. Основным методом лечения ПВР является витреоретинальная хирургия с удалением новообразованных эпиретинальных мембран, тем не менее, рецидивирование ПВР является причиной неприлегания отслойки сетчатки и необходимостью использовать многократные хирургические подходы. Pastor J.C. de la Rua ER, Martin F.
Proliferative vitreoretinnopathy: risk factors and pathobiology. Prog Retin eye Res. 2002; 21(1): 127-144. https://doi.org/10.1016/s1350-9462(01)00023-4
Необходимость воздействовать на ПВР медикаментозно для повышения эффективности хирургического лечения является одной из актуальных задач в офтальмологии.
Направленность медикаментозного воздействия связана со стадийностью ПВР. Многочисленные препараты, протестированные на моделях животных и клеточных культурах, демонстрируют свою эффективность. Pastor J.C, Rodriguez Е., Marcos М. et all. Combined pharmacologic therapy in a rabbit model of proliferative vitreoretinopathy (PVR).// Ophthalmic Res. 2000. - 32. - P. 25-29. https://doi.org/10.1159/000055583. Однако многие из них имеют тяжелые побочные эффекты, и лишь некоторые используются в клинической практике. Сложность заключается и в достижении терапевтической концентрации при введении их системно. Ведение препаратов инравитреально не используется в клинической практике, так как существует концепция о токсичном влиянии в отношении сетчатки и недостаток информации об интраокулярной фармакокинетике. Asaria R.H., Kon С.Н., Випсе С, Charteris D.G., Wong D., et all. How to predict proliferative vitreoretinopathy. A prospective study.// Ophthalmology. 2001. - 108. - P. 1184-1186. https://doi.Org/10.1016/s0161-6420(01)00553-x. Jonas J.B., Hayler J.K., Panda-Jonas S. Intravitreal inlection of crystalline cortisone as adjunctive treatment of proliferative vitreoretinopathy// Br. J. Ophthalmol. 2000.-84.-P. 1064-1067. https://doi.org/10.1136/bio.84.9.1064.
Сведения о цитопатогенезе ПВР ориентируют на использование патогенетической терапии в различные стадии заболевания: стадию воспаления-альтерации, пролиферативную стадию и стадию рубцевания.
Были тестированы многочисленные препараты ориентированного патогенетически медикаментозного лечения ПВР: противовоспалительные агенты, антипролиферативные препараты, антиоксиданты. На стадии пролиферации заболевания широко изучается применение и эффективность использования антипролиферативных препаратов, ингибирующих клеточный цикл и клеточную пролиферацию: 5-фторурацил, даунорубицин, таксол, колхицин, ретиноевая кислота, рибозимы, этопозид и др. Sundaram V, Barsam A, Vergili G. Intravitral low molecular weight heparin and 5-fluorouracil for the prevention of proliferative vitreoretinopathy following retinal reattachment surgery. Cochrane Database Syst Rev. 2010, 7: CD006421. https://d0i.0rg/10.1002/14651858.cd006421.pub2. Kumar A, Nainiwal S, Choudbary I, Tewari HK, Verma LK. Role of daunorubicin in inhibiting proliferative vitreoretinopathy after retinal detachment surgery. Clin Experiment Ophthalmol.2002; 30(5): 348-351. Schiff Wm, Hwang Jc, Ober MD, et al. Safety and efficacy assessment of chimeric ribozyme to proliferating cell nuclear antigen to prevent recurrence of proliferative vitreoretinopathy. Arch Ophthalmol. 2007; 125(9): 1161-1167. https://doi.Org/10.1001/archopht.125.9.1161. Kuo HK, Wu PC, Yang PM, Chen YH, Wu YC, HuDN. Effects of topoisomerase II inhibitors on retinal pigment epithelium and experimental proliferative vitreoretonopathy. J Ocul Pharmacol Ther. 2007; 23(1): 14-20. https://doi.org/10.1089/iop.2006.0059
Проведенные экспериментальные и клинические исследования по применению антипролиферативных препаратов в качестве местной и системной терапии при развитии ПВР показали наличие токсических свойств препаратов и недостаточную ингибицию пролиферативных процессов, что вызвало необходимость поиска новых лекарственных средств. Другой проблемой в лечении ПВР является способ доставки антипролиферативного препарата к патологическому очагу в заднем отрезке глаза. Наиболее адекватным способом, учитывая наличие гематоретинального барьера, является интравитреальный способ введения, позволяющий создавать терапевтическую концентрацию лекарственного вещества в заднем отрезке глаза, минимизируя системные побочные эффекты, наблюдаемые при парентеральном и пероральном введении.
Актуальным явилось использование этого препарата при лечении пролиферативных процессов глаза неонкологического генеза. Однако, учитывая токсические свойства Мелфалана, необходимо было определить безопасную терапевтическую концентрацию препарата. Нами была изучена эффективность препарата Мелфалан в качестве антипролиферативного средства при лечении пролиферативного процесса неонкологичекого генеза -экспериментальной ПВР [патент RU 2684927, 16.04.2019}.
Резюмируя полученные в эксперименте результаты, было сделано заключение, что Мелфалан является эффективным антипролиферативным препаратом, способствующим ингибиции пролиферативного процесса при лечении ПВР. Вместе с тем препарат обладает токсическими свойствами. Выраженность токсических осложнений зависит от концентрации препарата. В основе токсического действия, как показал анализ морфологического исследования, лежит атрофия преимущественно наружных слоев сетчатки: слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и наружного плексиформного слоев, то есть поражается фоторецепторный слой сетчатки. Известно, что функция фоторецепторного слоя тесно связана с метаболизмом ретинального пигментного эпителия (РПЭ), структура которого значительно изменяется при интравитреальном введении Мелфалана. Отмечалась диссоциация клеток в пласте, их миграция с оголением мембраны Бруха. Фармакокинетические исследования показали, что Мелфалан накапливался в РПЭ в большей концентрации, чем в сетчатке. Francis J., Marr В., Brodie S. Anterior ocular toxicity of intravitreous melphalan for retinoblastoma. JAMA Ophthalmol. 2015; 133(12); 1459-1463. https://doi.Org/10.1001/iamaophthalmol.2015.3119 Shaiquevich P., Buitrago E., Taich A. Pharmacokinetic analysis of melphalan after superselective ophthalmic artery infusion in preclinic models and retinoblastoma patients. Invest Ophthalmol Vis Sci 53 (7): 4205-12, 2012. https://doi.Org/10.1167/iovs.12-9501. Такая «тропность» Мелфалана к РПЭ объясняет возникновение осложнений, связанных с изменением РПЭ и последующих нарушений функций фоторецепторов, ведущих к развитию атрофического процесса сетчатки. То есть РПЭ является мишенью токсического действия Мелфалана, выраженность которого зависела от концентрации препарата. Применение в эксперименте концентрации Мелфалана 0.005 мг вызывало положительный лечебный антипролиферативный эффект на модели ПВР: не происходило образование новообразованных эпиретинальных мембран на внутренней поверхности сетчатки, отсутствовало развитие тракционной отслойки сетчатки. Изменения РПЭ носили ограниченный характер с небольшой диссоциацией клеток, а атрофические процессы в сетчатке имели начальный характер и могут быть обратимыми.
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования доказали эффективность антипролиферативного действия препарата Мелфалан при однократном интравитреальном введении в концентрации 0.005 мг в 0.1 мл при лечении экспериментальной ПВР.
Далее нами было установлено, что в результате накопления Мелфалана в РПЭ, использование меньшей концентрации - 0.0025 мг в отдаленные сроки наблюдения имело эффективный антипролиферативный эффект: образования эпиретинальных мембран на поверхности сетчатки не наблюдалось. Также использование меньшей концентрации Мелфалана привело к единичным атрофическим изменениям (фокусам) в наружных слоях сетчатки в зонах введения препарата в сравнении с ограниченными атрофическими очагами при использовании 0.005 мг Мелфалана Использование монопрепарата Мелфалан в концентрации 0,0025 мг в 0,1 мл для лечения экспериментальной ПВР принято за ближайший аналог изобретения (Хорошилова-Маслова И.П., Лепарская Н.Л., Е.В., Алпеева, Е.А. Воротеляк. Мелфалан при лечении пролиферативной витреоретинопатии (экспериментальное исследование).
Вестник офтальмологии 2020, Т. 136, №4; с. 19-25. http://dx.doi.org/10.17116/oftalma202013604119
Задачей изобретения явилась дальнейшая разработка способа лечения ПВР с помощью липосомальной формы Мелфалана.
Техническим результатом предлагаемого способа является минимизация ретинотоксического действия Мелфалана.
Технический результат достигается за счет интравитреального введения Мелфалана в виде липофильного пролекарства - диглицеридного сложноэфирного конъюгата в составе липосомальной формы stealth -пегилированная форма с модифицированным размером наночастиц около 500 нм.
Липосомы представляют собой продукт нано-биотехнологии и являются сферическими наночастицами, сформированными из фосфолипидного бислоя. В связи с тем, что получают липосомы из природных липидов, липосомы являются с точки зрения биологической совместимости идеальными переносчиками лекарственных препаратов. Они нетоксичны, не вызывают иммунологических реакций и разрушаются под воздействием ферментов, присутствующих в организме. Однако липосомы недостаточно стабильны в крови и быстро разрушаются макрофагами. Простота изготовления, несмотря на отсутствие длительной стабильности в водной форме, универсальность физических характеристик сделали липосомы уникальными в качестве системы доставки.
Липосомальные препараты эффективно разрабатывались и исследовались в офтальмологии для интравитреального введения препаратов при заболеваниях сетчатки: вирусном ретините, эндофтальмите, возрастной макулярной дегенерации сетчатки.
Несмотря на то, что исследователи отмечают перспективность исследований по использованию липосомальных форм антипролиферативных препаратов для лечения ПВР, наблюдалась закономерная избыточная воспалительная реакция в стекловидном теле на введение липосомальных частиц.
Нами впервые проведено изучение биосовместимости липосом stealth при интравитрелаьном введении. Stealth липосомы называют стерически стабилизированными липосомами за счет включения в фосфолипидный слой полиэтиленгликоля (ПЭГ), который в свою очередь, обладает низкой иммуногенностью, создает избыточное осмотическое давление в мембранной области везикул, а также препятствует процессу «опсонизации» липосом. Включение ПЭГ в мембрану липосом блокирует механизмы поглощения липосом макрофагальными клетками. Препараты, заключенные в подобные липосомы, на порядок увеличивают время полувыведения. Особенность данной липосомальной системы заключается в том, что в липидный бислой (мембрану липосом) встроено липофильное пролекарство мелфалана ~ его диглицеридный сложноэфирный конъюгат, 1,2-диолеоилглицерид мелфалана, который ранее был испытан на противоопухолевую эффективность при внутривенном введении в липосомах другого липидного состава, без ПЭГ. Vodovozova, E.L.; Kuznetsova, N.R.; Kadykov, V.A.; Khutsyan, S.S.; Gaenko, G.P.; Molotkovsky, Y.G. Liposomes as nanocarriers of lipid conjugated antitumor drugs melphalan and methotrexate. Nanotechnol. Russ., 2008, 3, 228-239.http://dx.doi.org/10.1134/S1995078008030105; Tretiakova, D.; Svirshchevskaya, E.; Onishchenko, N.; Alekseeva, A.; Boldyrev, I.; Kamyshinsky, R.; Natykan, A.; Lokhmotov, A.; Arantseva, D.; Shobolov, D.; Vodovozova, E. Liposomal formulation of a melphalan lipophilic prodrug: studies of acute toxicity, tolerability, and antitumor efficacy. Curr. Drug Deliv. 2020, 17, 312- 323. http://dx.doi.Org/l0.2174/1567201817666200214105357)
Для возможного уменьшения «опсонизации» липосомальные частицы в предлагаемом способе были увеличены до размера 500 нм. Проведенные нами экспериментальные исследования показали, что липосомы типа stealth -пегилированная форма, модифицированные размером 500 нм, обладают большим преимуществом по сравнению с другими исследованными липосомальными частицами (более мелкими).
Такая локализация лекарственного начала в липидном окружении позволяет длительное время сохранять активный алкилирующий радикал мелфалана (2-хлорэтильные группы), который в водной среде подвергается быстрому гидролизу и дезактивируется. После слияния липосом с клеточными мембранами липофильное пролекарство расщепляется неспецифическими внутриклеточными эстеразами с высвобождением исходного мелфалана. Для поглощения липосом клетками (эндоцитоза) и дальнейшего внутриклеточного метаболизма с высвобождением пролекарства/лекарства требуется время. До момента эндоцитоза лекарственное начало в виде пролекарства в липосомах не деградирует, в отличие от мелфалана в виде водного раствора. Таким образом, данная липосомальная форма обеспечивает пролонгирование действие мелфалана.
Нами было изучено антипролиферативное действие Мелфалана на модели экспериментальной ПВР, ранее разработанной нами (И.П. Хорошилова-Маслова, Н.Л. Лепарская, Е.А. Воротеляк, А.В. Васильева «Роль фибробластов в моделировании пролиферативной витреоретинопатии. Вестник офтальмологии. №5 2017 Том 133. стр 4-10»). Материалом для исследования модели явились 20 кроликов (40 глаз) породы Шиншилла весом 2.5-3.0 кг, у которых моделировали ПВР на обоих глазах путем интравитреального введения через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G культуры клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл.
Развитие ПВР происходило в 100% случаях и было подтверждено клинико-морфологическими исследованиями. Через 30 дней моделирования ПВР наблюдалось появление эпиретинальных мембран ЭРМ в виде волокнистых структур на внутренней поверхности сетчатки. Через 90 дней наблюдалось утолщение новообразованных ЭРМ за счет преобладания в них волокнистых компонентов и накопления экстрацеллюлярного матрикса, нарушение гистоструктуры сетчатки, исчезновение слоистости сетчатки (слоя палочек и колбочек, плексиформного слоя). Появлялись тракционные свойства ЭРМ - складчатость и тракционная отслойка сетчатки. Данная экспериментальная модель ПВР отражала заключительную фиброзную стадию ПВР и может быть использована для объективной оценки эффективности антипролиферативных препаратов.
Лечение экспериментальной ПВР проводили через 1 день после моделирования процесса с целью патогенетического воздействия на активно пролиферирующие клетки в начальной стадии ПВР. В первой группе животных (10 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили Мелфалан в концентрации 0.0025 мг в 0,1 мл. Во второй группе животных (10 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили мелфалан в виде липофильного пролекарства - диглицеридного сложноэфирного конъюгата в составе липосомальной формы stealth - пегилированная форма с
модифицированным размером наночастиц 500 нм. Липосомальные частицы, используемые в работе, получены в лаборатории Водовозовой Е.Л Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Липосомы-stealth размером 500 нм. имели состав: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), холестерин (Chol), полиэтиленгликоль фосфатидилэтаноламин (PEGPE)+Mlph в виде пролекарства (MlphDG) 0,0025 мг/100 мкл; мольное соотношение компонентов липосом: DSPC-Chol-PEGPE-MlphDG, 5:3:1:1.
Животных наблюдали в течение 6 месяцев с использованием методов офтальмологического исследования: биомикроскопии и офтальмоскопии. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопичесокй системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении х200-х600.
В первой группе, в которой интравитреально вводили Мелфалан в дозе 0,0025 мг через 6 месяцев во всех 10 опытных глазах отсутствовала эпиретинальная мембрана. В 3-х глазах из 10 диагностировалась тотальная тракционная отслойка сетчатки с выраженной атрофией ее ткани I-II типа. В 7-х глазах из 10 сетчатка сохраняла свою нормальную структуру, лишь единичные очаги III типа вокруг зрительного нерва. Субатрофия глазного яблока диагностирована в 3 глазах.
Изменения сетчатки под воздействием Мелфалана, характеризовались появлением атрофических очагов 3-х видов:
I - очаги первого типа - поражение всех слоев сетчатки с глиальным ее замещением. Сетчатка превращалась в глиальную ткань, спаянную с атрофичной хориоидеей.
II - очаги второго типа - истончение сетчатки с исчезновением фоторецепторного слоя (слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и плексиформного слоев), сохранялся лишь редуцированный внутренний ядерный слой.
III - очаги третьего типа - уменьшение объема наружного ядерного слоя, укорочением палочек и колбочек при полном сохранении внутренних слоев сетчатки. Изменения имеют обратимый характер.
Во второй группе, в которой интравитреально вводили Мелфалан (в виде пролекарства), ассоциированный с липосомами stealth размером 500 нм. в дозе 0,0025 мг., во всех глазах отмечалась общая редукция ЭРМ с единичными остаточными очагами. Особенностью морфологии являлось отсутствие клеточных элементов в этих очагах. Сохранялся лишь каркас из полупрозрачных фибрилл с признаками фрагментации. Атрофические изменения в прилежащей сетчатке были минимальными и наблюдались лишь в 2-х глазах в виде ограниченных очагов III типа вокруг ДЗН. В 8-х глазах сетчатка сохраняла свою нормальную структуру. Все глаза сохраняли свою нормальную форму и размер.
Сравнительный анализ морфологического исследования в первой группе экспериментальных глаз показал, что на поздних сроках в дозе 0,0025 мг Мелфалан оказывал ингибирующее действие на пролиферативный процесс, отмечалось отсутствие новообразованной эпиретинальной мембраны по сравнению с контролем, в которой лечение не проводилось. В основе ингибирующего действия Мелфалана лежала не только ингибиция пролиферации фибробластов, но и частичное разрушение уже новообразованных фибробластических эпиретинальных мембран. Возможно, разрушение мембран над зоной тракционных складок сетчатки может содействовать ее уплощению.
Вместе с тем, наряду с положительным действием выявлено побочное действие препарата в виде ретинотоксических изменений. Атрофические изменения сетчатки при анализе 1 группы показали их наличие на поздних сроках наблюдения через 6 мес.
Таким образом, исследование на поздних сроках показало, что атрофический процесс в сетчатке может длительно прогрессировать в результате накопления препарата в ретинальном пигментом эпителии.
Сравнивая изменения сетчатки после воздействия Мелфалана ассоциированного с stealth-липосомами в концентрации 0,0025 мг, можно отметить, что его воздействие сопровождалось полным сохранением нормальной структуры сетчатки. В основе механизма этого эффекта была способность липосом медленно высвобождать Мелфалан в полость СТ, что обеспечивает более слабое его воздействие на окружающие ткани, в том числе и на РПЭ.
Учитывая полученные данные, Мелфалан в дозе 0,0025 мг.ассоциированный с липосомами stealth 500 нм. является более предпочтительным, как в отношении ингибирующего действия на пролиферативный процесс, так и минимизации побочного эффекта в виде атрофических изменений фоторецепторного слоя сетчатки. Способ осуществляют следующим образом.
Однократно интравитреально вводят препарат Мелфалан 0.0025 мг в объеме 0.1 мл. При этом Мелфалан используют в виде липофильного пролекарства - диглицеридного сложноэфирного конъюгата в составе липосомальной формы stealth - пегилированная форма с модифицированным размером наночастиц 500 нм.
Пример 1. Кролик №3.
Кролику породы Шиншилла №3 в правый глаз после инсталляции в коньюнктивальную полость местного анестетика Проксиметакаина 0.5% интравитреально через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введена культура клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл. Через 24 часа после однократной инсталляции в коньюнктивальную полость Проксиметакаина 0.5% через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введено 0.1 мл раствора Мелфалана, ассоциированного с липосомами stealth размером 500 нм в дозе 0,0025 мг.Через 6 месяцев кролик выведен из эксперимента, глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопичесокй системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении х200-х600.
При гистологическом исследовании отмечалась редукция новообразованных эпиретинальных мембран на поверхности сетчатки, отсутствовала складчатость сетчатки и тракционная отслойка сетчатки. Сетчатка сохраняла свою гистоструктуру - Фиг. 1. (Фиг. 1)
Пример 2. Кролик №5.
Кролику породы Шиншилла №5 в правый глаз после инсталляции в коньюнктивальную полость местного анестетика Проксиметакаина 0.5% интравитреально через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введена культура клеток гетерогенных активированных фибробластов 200000 клеток в 0.1 мл. Через 24 часа после однократной инсталляции в коньюнктивальную полость Проксиметакаина 0.5% через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G введено 0.1 мл раствора Мелфалана, ассоциированного с липосомами stealth размером 500 нм. в дозе 0,0025 мг.Через 6 месяцев кролик выведен из эксперимента, глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопичесокй системы «Leica» с встроенной цифровой камерой при увеличении х200-х600.
При гистологическом исследовании отмечалась редукция новообразованных эпиретинальных мембран на поверхности сетчатки, отсутствовала складчатость сетчатки и тракционная отслойка сетчатки. Сетчатка сохраняла свою гистоструктуру - Фиг. 2.
Таким образом, интравитреальное ведение Мелфалана в дозе 0,0025 мг в виде липосом stealth размером 500 нм способствовало более медленному захвату липосо
мальных частиц макрофагами и пролонгированному высвобождению препарата, что снижало ретинотоксическое действие Мелфалана и повышало эффективность терапевтической дозы.