КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ RMP И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
RMP-BASED COMPOSITION AND METHODS OF USING SAME

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/428155, поданной 30 ноября 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полученные из эритроцитов микрочастицы (RMP), и способам ее применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Чрезмерное кровотечение является одним из наиболее распространенных опасных для жизни осложнений при травме и геморрагических осложнениях. Переливание крови является основой лечения чрезмерной кровопотери. Методы лечения, нацеленные на первопричины нарушений гемостаза, различаются в зависимости от этиологии. Переливание тромбоцитов или вмешательства, которые увеличивают количество тромбоцитов, используют для остановки кровотечения вследствие низкого количества тромбоцитов (тромбоцитопения). В случае нарушений коагуляции обычно вводят замену фактора крови. При гемофилии А субъекту вводят фактор VIII, тогда как гемофилия В требует лечения фактором IX.
Существующие способы лечения имеют существенные недостатки. Например, донорская кровь для переливания становится все более дефицитной и дорогой вследствие растущего спроса, ограниченного предложения и более строгих правил. По данным Американского Красного Креста, только в США ежедневно требуется примерно 36000 единиц эритроцитов. См. www.redcrossblood.org/learn-about-blood/blood-facts-and-statistics. Стоимость госпитализации вследствие побочных эффектов, связанных с переливанием крови, превышает 10 миллиардов долларов в год. Hannon & Gjerde: The contemporary economics of transfusions. In Perioperative Transfusion Medicine; Speiss R D, Spence R K, Shander A (eds.), Lippincott Williams and Wilkins, p. 13 (2006). Переливания также связаны со многими краткосрочными и долгосрочными осложнениями, включая анафилаксию, гемолитические реакции, иммуносупрессию, вызванную переливанием крови, болезнь «трансплантант против хозяина» и синдром острого посттрансфузионного повреждения легких (TRALI). Микрочастицы тромбоцитов (PMP) и лиофилизированные целые тромбоциты (LyoPLT) имеют недостатки, такие как, например, высокая стоимость, недостаток тромбоцитов, риск тромбообразования и иммунореактивность. Тромбоциты являются высокоиммуногенными благодаря HLA, ABO, Rh и тромбоцит-специфичным антигенам, перекрестная совместимость которых встречается редко, поэтому часто возникают побочные реакции. Кроме того, известно, что тромбоциты имеют тканевый фактор (TF), который является тромбогенным.
В данной области техники сохраняется потребность в агентах, которые можно вводить безопасно и немедленно после обнаружения чрезмерного кровотечения при приемлемых затратах.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
6
6
В настоящем описании предложена композиция, содержащая полученные из эритроцитов микрочастицы (RMP), которые демонстрируют ацетилхолинэстеразную (AchE) активность менее 350 пмоль/мин/10 частиц (например, менее 200 пмоль/мин/10 частиц). В различных аспектах 20-50% RMP в композиции содержат фосфатидилсерин. Необязательно композиция сокращает время до образования начального сгустка, что измерено с помощью тромбоэластографии (ТЭГ) в цельной крови и плазме, например, по меньшей мере, на две минуты. Также, необязательно, средний диаметр RMP составляет примерно 0,40-0,6 мкм. Кроме того, предложен способ лечения чрезмерного кровотечения у субъекта, включающий введение субъекту композиции RMP, описанной в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
6
Фигура 1 представляет собой гистограмму, демонстрирующую сравнение ацетилхолинэстеразной активности (AChE) (мкМ/мин/10 RMP; ось Y), выраженной в RMP-1, RMP-2 и RMP-3, описанных в примерах.
Фигура 2 представляет собой гистограмму, демонстрирующую сравнение сокращения времени свертывания (минуты; ось Y), опосредованное 5 мкМ (левый столбец) или 10 мкМ (правый столбец) RMP-1, RMP-2 и RMP-3, описанных в примерах.
Фигура 3 представляет собой гистограмму, демонстрирующую сравнение прочности сгустка (увеличение ТЭГ MA; ось Y), опосредованной RMP-1, RMP-2 и RMP-3, описанных в примерах.
Фигура 4 представляет собой гистограмму, демонстрирующую сравнение анти-ТАП-опосредованного фибринолиза (повышение TG относительно контроля (мм/мин); ось Y), индуцированного RMP-1, RMP-2 и RMP-3, описанных в примерах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе предложены улучшенные композиции полученных из эритроцитов микрочастиц (RMP) и способы применения для уменьшения кровотечения у субъекта. RMP имеют множество преимуществ в качестве гемостатических агентов, включая (но не ограничиваясь ими) простоту и экономичность получения и минимальную иммуногенность. Эритроциты (RBC) являются наиболее распространенным типом клеток крови, обеспечивая практически неограниченный и экономичный источник для получения RMP. RMP имеют неограниченный срок годности при хранении при комнатной температуре и не требуют хранения в банках крови, что делает их особенно предпочтительными в чрезвычайных ситуациях. Кроме того, RMP, полученный из Rh-отрицательных эритроцитов типа O (универсальные RMP), можно вводить немедленно без учета перекрестной совместимости.
Настоящее описание основано, по меньшей мере частично, на неожиданном определении субпопуляции RMP с характеристиками, которые в особенности предпочтительны для терапевтического применения. Конкретная субпопуляция, демонстрирующая характеристики, описанные в настоящем документе, является новой и обеспечивает технические преимущества перед ранее описанными популяциями RMP с точки зрения, например, эффективности и пониженной токсичности. Продукты разрушения эритроцитов, включая RMP, связывали с провоспалительными реакциями, токсичностью и серьезными побочными эффектами. См., например, Danesh et al., Blood. 2014;123(5):687-696; and Zwicker et al., Br J Haematol. 2013; 160(4): 530-537. В самом деле, повышенный уровень микрочастиц связан с различными тромбофильными состояниями, такими как серповидноклеточная анемия (Camus et al., Blood. 2012; 120(25):5050) и тромботическая тромбоцитопения (TTP) (Galli et al., Thromb Haemost 1996. 75(3):427-31) и связан с токсическими явлениями после переливания крови (Donadee et al., Circulation 2011; 124:465-476). Описанные ранее композиции RMP несут риск побочных эффектов. Примечательно, что описанная в настоящем документе субпопуляция RMP эффективно уменьшает кровотечение, в то же время значительно минимизируя токсичность и побочные эффекты.
В описании согласно настоящему документу описаны различные аспекты субпопуляции RMP, представленных в композиции. Композиции, содержащие RMP, отображающие одну любую комбинацию или все признаки, описанные в настоящем документе, рассматриваются и охватываются настоящим изобретением.
in vivo
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полученные из эритроцитов RMP, демонстрирующие значительно сниженную ацетилхолинэстеразную активность (AchE). Снижение AchE активности коррелирует со снижением токсичности RMP . В различных вариантах реализации RMP в композиции демонстрируют AchE активность, составляющую менее 20000 пмоль/мин/10 частиц (например, от 20000 пмоль/мин/10 частиц до 50 пмоль/мин/10 частиц, где 50 пмоль/мин/10 частиц или 25 пмоль/мин/10 частиц является необязательным нижним пределом для любого из диапазонов, описанных в настоящем документе). В предпочтительных вариантах реализации RMP демонстрируют AchE активность, составляющую менее 10000 пмоль/мин/10 частиц, менее 5000 пмоль/мин/10 частиц, менее 2500 пмоль/мин/10 частиц, менее 1000 пмоль/мин/10 частиц, менее 500 пмоль/мин/10 частиц, менее 350 пмоль/мин/10 частиц, менее 250 пмоль/мин/10 частиц, менее 200 пмоль/мин/10 частиц или менее 150 пмоль/мин/10 частиц. В иллюстративном аспекте RMP демонстрируют AchE активность, составляющую менее 350 пмоль/мин/10 частиц. Способы обнаружения AchE активности известны в данной области (см., например, Ellman et al., Biochemical Pharmacology 1961; 7(2):88-95; Xie et al., J. Biol. Chem. 2007; 282:11765-11775; Wolkmer et al., Experimental Parasitology 2014; 132(4):546-549) и описаны в примере, приведенном настоящем документе.
В качестве альтернативы или в дополнение, RMP содержат значительно сниженный уровень липидных рафтов или их компонентов по сравнению с ранее описанными популяциями RMP. Липидные рафты, также называемые «устойчивыми к детергентам мембранами» (DRM), представляют собой мембранные микродомены, богатые холестерином и сфинголипидами. По существу все природные клеточные микрочастицы (MP) состоят в основном из липидных рафтов. Примечательно, что композиция согласно настоящему изобретению в различных вариантах реализации содержит меньшее количество липидных рафтов (которое не ограничивается неповрежденными липидными рафтами, но включает компоненты липидных рафтов), чем достигнуто ранее. Просто для удобства в описании этого аспекта настоящего описания содержание липидных рафтов в RMP можно сравнивать с содержанием липидных рафтов в цельных (т.е. не фрагментированных) эритроцитах. В различных аспектах содержание липидных рафтов в RMP в композиции составляет 10% или менее (например, 5% или менее, 3% или менее, 2% или менее, 1% или менее, 0,5% или менее (например, как 0,1% или 0,05%)), чем содержание липидов в цельных эритроцитах. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, AChE может служить суррогатной мерой липидных рафтов, поскольку белок закрепляется в клеточных мембранах с помощью трансмембранного белка PRiMA (богатого пролином мембранного якоря) и внедряется в микродомены липидных рафтов. См., например, Xie at al., J. Biol. Chem. 2010; 285(15): 11537-11546, в котором также представлены материалы и способы определения содержания липидных рафтов в биологическом образце. Альтернативные маркеры липидного рафта включают, но не ограничиваются ими, стоматин, флотиллин и кавеолы. Липидные рафты также можно охарактеризовать с применением способов протеомики. См., например, Foster and Chan, Subcell Biochem. 2007;43:35-47.
В качестве альтернативы или дополнительно, 20%-50% RMP в композиции содержат фосфатидилсерин. Например, необязательно, 30%-45% RMP в композиции содержат фосфатидилсерин. В этом отношении композиция обеспечивает субпопуляцию RMP с оптимальным уровнем фосфатидилсериновой активности для стимуляции гемостаза (например, стимуляции коагуляции, уменьшения кровотечений) при минимизации тромбогенного потенциала. Фосфатидилсерин можно определять различными способами. Например, суррогатная мера фосфатидилсерина включает обнаружение связывания аннексина V с помощью проточной цитометрии. См., например, Koopman et al., «Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis». Blood 1994; 84(5):1415-20. В одном иллюстративном способе определяют соотношение клеток, связывающих аннексин V+, к CD235a+ (общий маркер RMP). В различных аспектах соотношение AnV+/CD235a+ составляет 0,2-0,5, например, 0,3-0,4.
in vivo
Необязательно внутренняя плотность RMP в композиции составляет менее 3,5% от внутренней плотности интактных эритроцитов. В некоторых аспектах RMP имеют внутреннюю плотность примерно 0,1%-3,5% (например, примерно 0,5%-3%, примерно 0,5%-2,5% или примерно 1%-2%) от внутренней плотности цельных эритроцитов. Внутренняя плотность RMP может быть определена с применением различных способов, включая, но не ограничиваясь ими, сигнал бокового рассеяния проточной цитометрии, как описано в настоящем документе. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что снижение внутренней плотности связано с пониженным содержанием гемоглобина. Свободный гемоглобин может быть токсичным , приводя, например, к почечной недостаточности. См., например, Gladwin et al., J Clin Invest. 2012;122(4):1205-1208. RMP композиции согласно настоящему изобретению демонстрируют пониженную токсичность.
В различных вариантах реализации композиция сокращает время до образования начального сгустка, что определяют с помощью тромбоэластографии (ТЭГ) в цельной крови и плазме. В этом отношении композиция необязательно сокращает время до образования начального сгустка, что определяют с помощью тромбоэластографии, по меньшей мере на две минуты (например, по меньшей мере на три минуты или по меньшей мере на четыре минуты). В различных вариантах реализации композиция сокращает время до образования начального сгустка, что определяют с помощью тромбоэластографии (ТЭГ) в цельной крови и плазме, на примерно от двух до примерно пяти минут. Действительно, в различных вариантах реализации композиция восстанавливает нормальное свертывание, на что указывает более короткое время образования сгустка, более быстрое образование сгустка или более стабильное развитие сгустка, что определяют с помощью ТЭГ или ротационной тромбоэластометрии (ROTEM) в цельной крови и плазме.
В качестве альтернативы или в дополнение, RMP в композиции имеют средний диаметр примерно 0,40-0,70 мкм, например, примерно 0,40-0,60 мкм или примерно 0,40-0,50 мкм. Необязательно средний диаметр RMP составляет примерно 0,45-0,50 мкм. Размер RMP можно определять с применением любого из множества рутинных лабораторных методов, включая методы, описанные в примере.
RMP представляют собой продукты разложения эритроцитов. RMP могут быть получены из свежих эритроцитов (то есть эритроцитов, выделенных из образцов крови в течение 24 часов для получения RMP) или из хранящихся эритроцитов. В связи с этим эритроциты необязательно замораживают до получения RMP. Например, в различных аспектах эритроциты замораживали на срок не более одного месяца, не более двух месяцев, не более трех месяцев, не более четырех месяцев или дольше. RMP могут быть получены с применением любого из ряда способов разрушения мембран эритроцитов, включая обработку ультразвуком, центрифугирование, нагревание и обработку ионофорами. В различных вариантах реализации RMP получают путем проталкивания эритроцитов через отверстие для получения разрушенных эритроцитов и последующей фрагментации разрушенных эритроцитов путем бомбардировки на твердой поверхности. Напряжение сдвига, создаваемое при проталкивании эритроцитов через отверстие под давлением, например, по меньшей мере, 25000 psi (например, давление примерно 35000 psi), разрезает эритроциты, и последующая стадия бомбардировки дополнительно фрагментирует эритроциты для получения популяции RMP с характеристикой(ами), описанной в настоящем документе. RMP в композиции могут быть свежими (то есть полученными из эритроцитов в течение 24 часов для введения субъекту) или находящимися на хранении. Поскольку RMP имеют увеличенный срок годности, композицию можно хранить в течение продолжительных периодов времени. RMP, полученные из крови с истекшим сроком годности, так же эффективны, как RMP из очень свежей крови; таким образом, настоящее описание обеспечивает средство для применения донорской крови, которая в противном случае может быть непригодной для клинического применения.
6
Также предложен способ лечения чрезмерного кровотечения у субъекта. Способ включает введение субъекту композиции, содержащей RMP, описанной в настоящем документе. Например, способ включает введение композиции, содержащей RMP, демонстрирующие ацетилхолинэстеразную активность (AchE) менее 350 пмоль/мин/10 частиц и/или имеющие средний диаметр примерно 0,40-0,6 мкм, и/или при этом 20%-50% RMP в композиции содержат фосфатидилсерин, и/или при этом композиция сокращает время до образования начального сгустка, что определяют с применением тромбоэластографии (ТЭГ) в цельной крови и плазме (например, по меньшей мере на две минуты).
В настоящем документе термин «лечить» и «лечение» относится к любому снижению кровотечения у субъекта. «Лечить» и «лечение» включает терапевтические и профилактические меры. Специалисту в данной области техники будет понятно, что любая степень защиты или ослабления чрезмерного кровотечения является благоприятной для субъекта, такого как пациент-человек. Соответственно, в одном аспекте способ осуществляют как можно быстрее после определения риска возникновения аномальной кровопотери у субъекта (например, перед операцией у субъекта, страдающего или подверженного риску возникновения коагуляции или нарушения тромбоцитов) или как можно быстрее после возникновения кровотечения.
Чрезмерное кровотечение может быть вызвано различными расстройствами или состояниями и может быть врожденным или приобретенным (например, вызванным другими терапевтическими агентами). Субъект может страдать (то есть, чрезмерное кровотечение вызвано), например, нарушением тромбоцитов или нарушением свертываемости крови. Нарушения свертываемости крови включают нарушения гемостаза, вызванные недостаточной активностью фактора свертывания крови. Факторы свертывания крови включают, но не ограничиваются ими, фактор V (FV), FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, FII (ответственный за гипопротромбинемию) и фактор фон Виллебранда. Субъект может страдать хроническим заболеванием печени. Расстройства тромбоцитов вызваны недостаточной функцией тромбоцитов или аномально низким числом тромбоцитов в токе крови. Низкое количество тромбоцитов может быть вызвано, например, недостаточной выработкой, секвестрацией тромбоцитов или неконтролируемым разрушением. Тромбоцитопения (дефицит тромбоцитов) может присутствовать по различным причинам, включая химиотерапию и другую лекарственную терапию, лучевую терапию, хирургическое вмешательство, случайную кровопотерю и другие заболевания. Например, тромбоцитопения необязательно связана с недостаточностью костного мозга, апластической анемией, миелодиспластическим синдромом или лейкемией. Расстройства тромбоцитов также включают, но не ограничиваются ими, болезнь фон Виллебранда, паранеопластическую дисфункцию тромбоцитов, тромбастению Гланцмана и болезнь Бернарда-Сулье. Чрезмерное кровотечение также может быть вызвано геморрагическими состояниями, вызванными травмой; дефицитом одного или более контактных факторов, таких как FXI, FXII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген (HMWK); дефицит витамина К; нарушение фибриногена, включая афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию; и дефицит альфа2-антиплазмина. В различных вариантах реализации чрезмерное кровотечение вызвано хирургическим вмешательством, травмой, внутримозговым кровоизлиянием, заболеванием печени, заболеванием почек, тромбоцитопенией, дисфункцией тромбоцитов, гематомами, внутренним кровоизлиянием, гемартрозами, гипотермией, менструацией, беременностью и геморрагической лихорадкой Денге.
Необязательно чрезмерное кровотечение вызвано медикаментозным лечением. Например, в различных вариантах реализации чрезмерное кровотечение вызвано антикоагулянтом, таким как разжижающие кровь средства, такие как кумадин (варфарин, который также является антагонистом витамина К), гепарин (например, гепарин с низкой молекулярной массой, такой как эноксапарин или дальтепарин), ингибитор комплекса протромбиназы (например, фондапаринукс или ривароксабан), ингибитор FXa (например, апиксабан (Eliquis)) или ингибитор тромбина (например, дабигатран). Чрезмерное кровотечение также может быть вызвано аспирином (который ингибирует функцию тромбоцитов и может привести к серьезному кровотечению, особенно в сочетании с другими расстройствами или лекарствами), клопидогрелем (PLAVIX) и тому подобным. Эти антикоагулянты не имеют антидотов, и геморрагические осложнения, вызванные этими антикоагулянтами, опасны для пациентов. Композиция согласно настоящему изобретению эффективна для лечения и/или предотвращения чрезмерного кровотечения в этих условиях.
В различных вариантах реализации субъект проходит терапию разжижающим кровь средством (или лечение разжижающим кровь средством прекращают в течение некоторого периода времени, таким образом, биологические эффекты разжижающего кровь средства сохраняются). Одним из преимуществ композиции согласно настоящему изобретению является то, что RMP данной композиции корректируют гемостатические нарушения, вызванные разжижающими кровь средствами, даже в присутствии разжижающих кровь средств. Композиция согласно настоящему изобретению демонстрирует универсальную гемостатическую активность и, как таковая, подходит для лечения кровотечений у пациентов, которые страдают множественными гемостатическими нарушениями.
Композицию (например, фармацевтическую композицию) готовят с применением физиологически приемлемого (то есть фармакологически приемлемого) носителя, буфера, вспомогательного вещества или разбавителя. Конкретный применяемый носитель ограничен только химико-физическими факторами, такими как растворимость и отсутствие реакционной способности с RMP, и путем введения. Физиологически приемлемые носители хорошо известны в данной области техники. Иллюстративные фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают, без ограничения, стерильные водные растворы или дисперсии. Инъецируемые составы дополнительно описаны, например, в Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers. eds., pages 238-250 (1982), and ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)). Фармацевтическую композицию, содержащую RMP, предложенные в настоящем документе, необязательно помещают в емкости вместе с упаковочным материалом, который содержит инструкции по применению таких фармацевтических композиций. В целом такие инструкции содержат конкретные формулировки, описывающие концентрацию реагента, а также, в некоторых вариантах реализации, относительные количества вспомогательных ингредиентов или разбавителей, которые могут быть необходимы для разбавления фармацевтической композиции.
Если это необходимо, композиция содержит один или более дополнительных фармацевтически эффективных агентов. В качестве альтернативы или в дополнение композиция предложена в качестве терапевтического режима, включающего введение других фармацевтически эффективных агентов (одновременно или раздельно во времени). Композицию можно вводить в комбинации с другими веществами и/или другими терапевтическими способами для достижения дополнительного или усиленного биологического эффекта. Совместное лечение включает, но не ограничивается ими, полученные из плазмы или рекомбинантные факторы свертывания, средства для профилактики гемофилии, иммунодепрессанты, антагонисты антител, ингибирующих плазменный фактор (т.е. антиингибиторы), антифибринолитики, антибиотики, гормональную терапию, противовоспалительные средства (например, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) или стероидные противовоспалительные вещества), прокоагулянты, препараты для разжижения крови и обезболивающие. В одном аспекте введение композиции позволяет снизить дозу совместного лечения, необходимую для достижения необходимого биологического ответа.
Таким образом, настоящее изобретение включает введение субъекту композиции согласно настоящему изобретению в сочетании с одним или более дополнительно подходящими веществами, каждое из которых вводят в соответствии с режимом, подходящим для этого лекарственного средства. Способы введения включают параллельное введение (то есть, по существу, одновременное введение) и последовательное введение (то есть введение в разное время, в любом порядке, с наложением или без него) композиции RMP и одного или более дополнительного подходящего агента(ов). Следует понимать, что разные компоненты необязательно вводят в одной и той же или в отдельных композициях и одинаковыми или разными путями введения.
10
11
10
11
Конкретный режим введения для конкретного субъекта будет зависеть, отчасти, от количества вводимой композиции, пути введения, конкретного заболевания, подлежащего лечению, факторов, относящихся к реципиенту, а также причины и степени любых побочных эффектов. Количество композиции, вводимой субъекту (например, млекопитающему, такому как человек), и условия введения (например, время введения, способ введения, режим дозирования) являются достаточными для воздействия на необходимый биологический ответ в течение приемлемого времени. Только в качестве иллюстрации, в одном аспекте способ включает введение субъекту, например, от примерно 1·10 RMP/кг до примерно 3·10 RMP/кг (например, от примерно 5·10 RMP/кг до примерно 2·10 RMP/кг).
В различных аспектах способ включает введение композиции для лечения острого состояния (например, кровотечения, вызванного хирургическим вмешательством или травмой) в течение относительно короткого периода лечения, например, от одного до 14 дней. Также предполагается, что композицию можно вводить в течение более длительного курса лечения (например, продолжительностью в несколько недель или месяцев), если природа состояния пациента требует длительного лечения. В различных вариантах реализации способ включает многократное введение композиции субъекту (например, один раз в день, два раза в день, три раза в день, четыре раза в день или более).
Подходящие способы введения физиологически приемлемой композиции, такой как композиция, содержащая RMP, как описано в настоящем документе, хорошо известны в данной области техники. Хотя для введения композиции можно применять более одного пути, конкретный путь может обеспечить немедленную и более эффективную реакцию, чем другой путь. В одном аспекте композицию согласно настоящему изобретению для введения RMP в кровоток вводят внутривенно, внутриартериально или внутрибрюшинно. Не внутривенное введение также является подходящим, особенно в отношении низкомолекулярных терапевтических средств. В определенных обстоятельствах необходимо доставлять фармацевтическую композицию, содержащую RMP, как описано в настоящем документе, вагинально, ректально, легочно; путем инъекции интрацеребральным (внутрипаренхиматозным), интрацеребровентрикулярным, внутримышечным, внутриглазным, интрапортальным, внутриочаговым, интрамедуллярным, интратекальным, интравентрикулярным, трансдермальным, подкожным, интраназальным, уретральным или энтеральным способами; с помощью систем замедленного высвобождения; или с помощью имплантационных устройств. Если необходимо, композицию вводят регионарно посредством внутриартериального или внутривенного введения, питая представляющую интерес область, например, через бедренную артерию для доставки к ноге. При применении имплантационного устройства, в одном аспекте устройство имплантируют в любую подходящую ткань, и в различных аспектах доставку композиции осуществляют посредством диффузии, болюса с замедленным высвобождением или непрерывного введения. В других аспектах композицию вводят непосредственно в открытые ткани во время хирургических процедур или лечения травмы или вводят посредством переливания крови.
Ввиду вышеизложенного в настоящем изобретении предложена композиция, описанная в настоящем документе, для применения в способе лечения субъекта, таком как способ лечения расстройства, при котором RMP являются благоприятными. В одном аспекте в настоящем изобретении раскрыта композиция, описанная в настоящем документе, для применения для лечения чрезмерного кровотечения или кровопотери у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту композиции согласно настоящему изобретению в количестве и в условиях, эффективных для лечения или предотвращения, полностью или частично, чрезмерной кровопотери. В настоящем изобретении, кроме того, предложены RMP, имеющие одну или более (или все) характеристик, описанных в настоящем документе, для применения для получения лекарственного средства. Например, RMP можно применять для получения лекарственного средства (например, композиции) для лечения чрезмерного кровотечения или кровопотери у субъекта, нуждающегося в этом.
ПРИМЕРЫ
Полученные из клеток микрочастицы (МР), представляют собой небольшие пузырьки (менее 1 мкм), высвобождаемые при активации или апоптозе клеток. В зависимости от стимула, MP могут быть гетерогенными по фенотипу и функциональным активностям, таким как гемостатическая или тромбогенная или провоспалительная. В данном исследовании были получены три популяции RMP, которые демонстрировали различные комбинации структурных и функциональных характеристик. Изученные характеристики включают PCA (приблизительный показатель гемостатической активности), ацетилхолинэстеразную активность (AchE) и токсичность.
Идентифицировали субпопуляцию RMP, которая продемонстрировала особенно предпочтительные характеристики, связанные с улучшенной эффективностью и сниженной токсичностью, которые демонстрируют нежелательные значения в других композициях RMP.
Одну популяцию RMP получали путем трехкратного продавливания эритроцитов через отверстие (35000 psi) (с применением устройства Constant System Cell Disruptor) для получения разрушенных эритроцитов и дальнейшей фрагментации разрушенных эритроцитов путем бомбардировки на твердой поверхности (RMP-1). Полученные RMP промывали и собирали центрифугированием. Вторую популяцию RMP получали обработкой эритроцитов ионофором кальция (RMP-2). Супернатанты свежих эритроцитов, подвергнутых воздействию Ca 2+/ионофор (A23187) (10 мкМ) в течение 30 минут, центрифугировали для сбора RMP. Третью популяцию освобождали от эритроцитарной массы (PC) после хранения не более 42 дней (RMP-3); эритроциты отбирали из хранящейся PC с интервалами не более 42 дней (хранение при 4°С), затем центрифугировали для восстановления RMP.
2
Показатели проточной цитометрии определяли по связыванию CD235a (гликофорин A) и аннексина V (AnV). Мечение RMP посредством CD235a проводили путем добавления 20 мкл образца RMP к 4 мкл меченного флуоресценцией mAb и инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре при орбитальном встряхивании. Затем смеси разбавляли посредством 1000 мкл холодного HEPES/физиологического раствора (рН 7,4) и хранили на льду до готовности к проточной цитометрии. Для маркера аннексина V 20 мкл образца RMP инкубировали с 3 мкл 0,2 М раствора CaCl с добавлением 2 мкл аннексина V-FITC (10 мкг/мл) в течение 20 мин, затем 500 мкл HEPES/физиологический раствор, затем обрабатывали, как указано выше. Затем образцы анализировали на определение MP на проточном цитометре Beckman Coulter FC-500, калибровали с помощью шариков Megamix, чтобы установить подходящее усиливающее напряжение для FS, SS, FL1 и FL2 и подходящее гейтирование для MP. Время выполнения составляло 30 секунд, и скорость потока калибровали, как описано ранее (Jy et al., Thromb Haemost. 2013;110(4):751-60). Подсчет событий был обусловлен флуоресцентным сигналом (FL1 или FL2), а не прямым рассеянием (FS), что обеспечило улучшенную эффективность обнаружения. MP ворота были установлены для размера менее 1 мкм. Неспецифическое связывание mAb оценивали по меченному флуоресценцией изотипическому IgG.
R
MA
TTG
9
Функциональные тесты включали тромбоэластографию (ТЭГ); сравнивали равные количества образцов каждого типа на основании CD235a, и по мере необходимости их разбавляли объединенной плазмой, не содержащей частиц (PFP). ТЭГ определяет развитие сгустка путем контроля увеличения крутящего момента, передаваемого на центральный штифт, погруженный в чашку с образцом; чашка колеблется периодически на ± 4,5°. Параметры, зарегистрированные в настоящем исследовании, представляли собой следующие: (отставание относительно образования фибрина),  (максимальная амплитуда, отражающая функцию тромбоцитов) и  (общее образование тромба). Для каждого теста 330 мкл PFP смешивали с 5 или 10 мкл RMP (2·10 частиц/мл) в течение 5 минут, затем добавляли 20 мкл кальция (100 мМ), чтобы инициировать коагуляцию.
Ацетилхолинэстеразную активность (AchE), маркер липидных плотов эритроцитарной плазматической мембраны, анализировали колориметрическим методом (адаптированная версия анализа Ellman AChE). RMP разбавляли с применением фосфатного буфера (pH 7,5, 0,1M). Добавляли 10,6 мкл 0,01 М DTNB и 10,6 мкл 12,5 мМ иодида ацетилтиохолина, и смешивали с 150 мкл разбавленного RMP. Образцы считывали при 405 нм с интервалами 1 мин, 3 мин и 6 мин.
2
2
Токсичность RMP оценивали у самцов новозеландских белых кроликов (в среднем 3,8 кг) и самцов крыс линии Спраг-Доули (в среднем 280 г). Все были анестезированы 2% изофлураном. Бедренную артерию и вену канюлировали, а физиологический раствор вводили со скоростью 3 мл/час. Образцы RMP вводили в канюлированную бедренную вену, и кровь отбирали через канюлированную бедренную артерию через различные промежутки времени. Жизненно важные показатели, включая артериальное давление, частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, уровни O и CO в крови, постоянно контролировали. Некоторых животных умерщвляли через 4 часа после инъекции RMP для получения основных органов для патологического исследования. Некоторым животным накладывали швы и возвращали в учреждение по уходу за животными для длительного наблюдения. Их поведение, подвижность, потребление пищи и воды, температуру тела и т.д. контролировали ежедневно в течение первой недели, а затем еженедельно в течение оставшихся 5 недель.
RMP-1 был связан с самым высоким выходом терапевтического продукта, за которым следовал RMP-2, который обеспечивал примерно в 3 раза больше терапевтического продукта, чем RMP-3.
Связывание с AnV выражали как соотношение AnV+/CD235+, и оно является маркером прокоагулянта фосфолипида. Это соотношение было наименьшим для RMP-1 (0,28), затем следовали RMP-2 (0,48) и RMP-3 (0,98).
Размер (средний диаметр) RMP, определяемый с помощью прямого рассеяния (FS), составлял 0,57 мкм для RMP-3. Данное значение было несколько выше, чем у RMP-1 (0,42 мкм) и RMP-2 (0,45 мкм). Процентная внутренняя плотность RMP к эритроциту, измеренная по боковому рассеянию, была наименьшей для RMP-1 (1,5%), затем для RMP-2 (4,8%) и RMP-3 (10,3%).
6
6
6
6
6
6
Ацетилхолинэстеразная активность (AChE) для RMP-3 (15643 пмоль/мин на 10 частиц) была намного выше по сравнению с 3362 пмоль/мин на 10 частиц для RMP-2 и 149 пмоль/мин на 10 частиц для RMP -3. Представляя данные альтернативным способом, активность AChE для RMP-1 (149 пмоль/мин на 10 частиц) была наименьшей, что в 22 и 104 раза ниже, чем у RMP-2 (3362 пмоль/мин на 10 частиц) и RMP-3 (15643 пмоль/мин, на 10 частиц), соответственно.
Прокоагулянтную активность оценивали с применением ТЭГ. Было продемонстрировано наибольшее снижение времени свертывания (время R) для RMP-3 (10,2 мин), затем для RMP-2 (6,7 мин) и RMP-1 (3,6 мин).
Антифибринолитическую активность тестировали в присутствии 0,4 мкг/мл тканевого активатора плазминогена (ТАП). Все три вида RMP эффективно ингибировали ТАП-опосредованный фибринолиз, измеренный по параметрам ТЭГ, включая MA, Ly30 и TTG (общее образование тромба). Наиболее эффективным является RMP-3, за которым следуют RMP-2 и RMP-1.
10
12
12
Введение RMP-1 кроликам и крысам в дозах от 1·10 до 1,2·10 RMP/кг не вызывало каких-либо нежелательных явлений в течение шести недель последующего наблюдения после введения. Жизненные признаки, включая частоту сердечных сокращений, артериальное давление, частоту дыхания, уровень кислорода в крови и температуру тела, оставались нормальными в течение одного часа после инфузии RMP. Долгосрочное наблюдение (6 недель) показало нормальное поведение, аппетит и подвижность. При самой высокой дозировке (1,2·10 RMP/кг) все протестированные крысы оставались живыми и прибавляли массу в течение и в конце шестинедельного периода наблюдения. При этих дозировках время кровотечения было значительно сокращено, а общая кровопотеря в трех различных моделях кровотечения у животных была снижена.
Общее описание характеристик различных субпопуляций RMP, описанных в настоящем документе, приведено в таблице 1. Первая строка представляет собой выход RMP на мл PC. Вторая строка представляет собой соотношение между количеством RMP, обнаруженным с помощью антигликофорина (CD235a), и количеством RMP, обнаруженным посредством связывания аннексина V в проточном цитометре. Третья строка представляет собой размер RMP, рассчитанный по прямым рассеяниям в проточном цитометрическом анализе, откалиброванном с применением шариков трех разных размеров. Последняя строка представляет собой процент внутренней плотности RMP к эритроциту, рассчитанный из бокового рассеивания (SS) анализа проточной цитометрии. Все значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
ТАБЛИЦА 1: СВОЙСТВА ПОПУЛЯЦИЙ RMP
Характеристики
RMP-1 (n=10)
RMP-2 (n=2)
RMP-3(Неделя 6) (n=10)
p-величина
Выход (x10<sup>7</sup> RMP/мл RBC)
1525±64
325±15
4,4±0,6
1 против 2: 0,0141 против 3: <0,0012 против 3: 0,030
Соотношение (Аннексин V<sup>+</sup> MP:CD235a<sup>+</sup> MP)
0,28±0,03
0,48±0,05
0,99±0,02(n=20)
1 против 2: 0,00161 против 3: <0,0012 против 3: <0,001
Средний диаметр (мкм)
0,42±0,009
0,45±0,003
0,57±0,001
1 против 2: NS1 против 3: <0,0012 против 3: <0,001
% Внутренняя плотность относительно эритроцита
1,5±0,07
4,8±0,03
10,3±0,52
1 против 2: <0,0011 против 3: <0,0012 против 3: 0,039
Результаты в настоящем документе демонстрируют преимущества определенного типа RMP, охарактеризованного в настоящем документе. Этот тип RMP демонстрирует отличительные поверхностные характеристики и функциональные активности. Результаты демонстрируют четкие и очевидные различия в функциональных, фенотипических и токсикологических свойствах трех сравниваемых видов. RMP-2 и RMP-3 имеют больший размер, более высокий уровень связывания AnnV и экспрессии AChE по сравнению с RMP-1. RMP-2 и RMP-3 продемонстрировали более высокую прокоагулянтную активность, чем RMP-1, но RMP-1 продемонстрировал прокоагулянтную активность; активность RMP-2 и RMP-3 была выше в этом отношении. RMP-1 связывали с большим количеством терапевтического продукта, полученного на мл эритроцитарной массы.
Из всех сравниваемых параметров наиболее ярким отличием среди данных трех видов RMP является активность AchE. Активность AchE у RMP-1 примерно в 25 и 150 раз ниже, чем у RMP-2 и RMP-3, соответственно. Считается, что AchE ковалентно связан с липидными рафтами и, таким образом, служит суррогатным маркером липидных рафтов. Основываясь на данных AchE, RMP-3 практически лишены липидных рафтов, которые состоят из многих провоспалительных медиаторов, таких как адгезины и лиганды для активации клеток, провоспалительные липиды и цитокины, комплементы, иммунные комплексы и т.д.
До настоящего описания считалось, что гемостатическая эффективность и токсичность неразрывно связаны. Описанные выше результаты демонстрируют, что определенный тип RMP, идентифицированный в настоящем документе, неожиданно не демонстрирует заметной токсичности, но сохраняет высокую гемостатическую эффективность.
Также были изучены характеристики RMP, полученных из ранее замороженных эритроцитов. O+ эритроцитарная масса со сниженным количеством лейкоцитов была приобретена у OneBlood.org. Каждый пакет с эритроцитарной массой разделяли на четыре равные части (70-75 мл). Одну часть эритроцитов хранили при 4°C и применяли для получения RMP в течение семи дней после получения груза. Оставшиеся три части замораживали при -20°С, и размораживали через 1, 2 или 3 месяца после первоначального замораживания для получения RMP. RMP получали путем экструзии под высоким давлением, как описано в настоящем документе, с применением устройства Constant System Cell Disruptor при внутреннем давлении 35000 psi. Количество RMP (выход) измеряли проточной цитометрией с применением PE-меченого моноклонального антитела к гликофорину А в качестве маркера. Прокогаулянтную активность RMP определяли по тромбоэластограмме (ТЭГ). Как показано в таблице 2, полученные композиции RMP, полученные из незамороженных и замороженных эритроцитов, существенно не отличались с точки зрения выхода, прокоагулянтной активности и связывания аннексина V. Применение ранее замороженных эритроцитов позволяет увеличить получение RMP.
<b>ТАБЛИЦА 2: Получение RMP из замороженных эритроцитов относительно незамороженных</b>
Источник эритроцитов
Выход RMP (подсчеты/мл крови)
Прокоагулянтная активность/7×10<sup>7</sup> RMP
Связывание аннексина V (% от общих RMP)
Незамороженные эритроциты (Контроль)
7,0 x10<sup>9</sup>
100%
38%
Эритроциты, замороженные в течение 1 месяца
7,2×10<sup>9</sup>
106%
40%
Эритроциты, замороженные в течение 2 месяцев
7,3×10<sup>9</sup>
113%
42%
Эритроциты, замороженные в течение 3 месяцев
6,9 x10<sup>9</sup>
111%
43%
Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, процитированные в данном документе, тем самым включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана для включения в качестве ссылки и была изложена в настоящем документе во всей ее полноте.
Применение артиклей определенной и неопределенной формы и аналогичных объектов в контексте описания заявки (особенно в контексте следующей формулы изобретения) следует толковать как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «состоящий из» следует истолковывать как открытые термины (то есть означающие «включающий, но не ограничивающийся»), если не указано иное. Во всем описании, где составы описаны как включающие компоненты или материалы, предполагается, что составы могут также состоять по существу или состоять из любой комбинации перечисленных компонентов или материалов, если не указано иное. Аналогичным образом, когда способы описаны как включающие конкретные стадии, предполагается, что способы также могут по существу состоять или состоять из любой комбинации перечисленных стадий, если не указано иное. Настоящее изобретение, иллюстративно раскрытое в настоящем документе, соответствующим образом может быть осуществлено на практике в отсутствие какого-либо элемента или стадии, которые конкретно не описаны в настоящем документе. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариациях охватывается настоящим описанием, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту.
Перечисление диапазонов значений в настоящем документе предназначено лишь для применения в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, и каждую конечную точку, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение и конечная точка включены в заявку как если бы это было отдельно указано в настоящем документе. Применение любых и всех примеров или примерных формулировок (например, «таких как»), представленных в настоящем документе, предназначено лишь для лучшего освещения описания и не налагает ограничений на объем раскрытия, если не заявлено иное. Ни одну формулировку в спецификации не следует толковать как указывающую на любой не заявленный элемент, как существенный для практики описания.