1
СИНТЕТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ АУТОАНТИТЕЛА К β-АДРЕНОРЕЦЕПТОРУ
1
SYNTHETIC ANTIGEN ABILITY TO BIND β-ADRENORECEPTOR AUTOANTIBODIES

1
Изобретение относится к биохимии и медицине, в частности к иммунологии, и служит для связывания аутоантител специфичных, к β-адренорецептору из плазмы и сыворотки человека.
1
Кардиомиопатия - группа заболеваний сердечной мышцы неизвестной этиологии, среди них наиболее угрожающей является дилатационная кардиомиопатия. Как правило, ей страдают мужчины молодого и среднего возраста. Дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) является одной из главных причин тяжелой сердечной недостаточности и наиболее частой причиной пересадки сердца. Несмотря на успехи в терапии ДКМП смертность пациентов, страдающих этим заболеванием, очень велика. В течение 10 лет 70% таких больных погибают. Патогенез этого заболевания до конца не изучен - рассматриваются гипотезы хронической вирусной инфекции и генетической детерминированности, однако последние литературные данные однозначно указывают на аутоиммунную природу этого тяжелейшего заболевания [1, 2]. Также есть литературные данные о том, что проведение процедур терапевтического афереза приводит к существенному улучшению состояния больных ДКМП [3-5]. Аутоантитела, обнаруженные в сыворотке больных ДКМП, являются антителами против собственных антигенов, таких как: миозин, адениннуклеотидный транслокатор, сарколемальный ламинин, β-адренорецептор, белок мускаринового М2-рецептора и др. [6]. Большинство аутоантител относятся к IgG классу иммуноглобулинов с молекулярной массой около 150 кДа.
1
1
1
Уровень аутоантител к β-адренорецептору у больных с ДКМП варьирует у разных авторов, однако литературные данные однозначно говорят о том, что именно эти аутоантитела наиболее часто встречаются у больных с ДКМП [7]. На животных моделях показано, что введение синтетического пептида, соответствующего последовательности второй петли β-адренорецептора, приводит к развитию ДКМП у кроликов [8], следовательно, присутствие антител данной специфичности играет решающую роль в патогенезе этого заболевания. Кроме того, показано, что наличие аутоантител к β-адренорецептору может быть одним из факторов развития тахиаритмий и острой сердечной недостаточности [9, 10].
1
Поэтому определение уровня аутоантител к β-адренорецептору черезвычайно важно для возможной диагностики дилатационной кардиомиопатии.
1
1
1
Известен пептид, использующийся для определения уровня аутоантител к β-адренорецептору, представляющий собой участок 197-222 [7, 11] 2-ой петли β-адренорецептора. Наиболее подробный анализ ИФА с использованием пептида 2-ой петли β-адренорецептора дан в статье [7]. Уровень положительного сигнала при разведении тестируемых сывороток 1/40 у больных ДКМП составлял в среднем 0,2 о.е. При этом только у 13 пациентов из 43 (31%) больных ДКМП был обнаружен достоверный положительный ответ (превышение сигнала в ИФА в 2 и более раз относительно фона здоровых доноров с отрицательным ответом). На популяции здоровых доноров доля положительных ответов составляла 12% [7].
1
1
Основным недостатком используемого пептида является ограниченная специфичность, так как с данным пептидом могут взаимодействовать только аутоантитела к антигенной детерминанте 2-ой петли β-адренорецептора, представленной последовательностью данного пептида. Тогда как у больных ДКМП аутоантитела могут быть представлены шире - как к 1-ой, так и ко 2-ой петлям, так и к комплексу двух петель, связанных в природной молекуле β-адренорецептора дисульфидной связью. Таким образом, ограниченная антигенная специфичность данного пептида может, в свою очередь, объяснять заниженную чувствительность (количество положительных ответов) у больных ДКМП.
1
1
1
Прототипом заявляемого синтетического антигена является сочетание двух индивидуальных пептидов последовательности 125-133 Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu (прототип I), соответствующий 1-ой петле β-адренорецептора, и последовательности 206-218 Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe (прототип II) из 2-ой петли β-адренорецептора. Пептиды иммобилизованы на агарозную матрицу, активированную BrCN, полученный сорбент является активным ингредиентом колонки «Coraffin», используемой для удаления аутоантител к β-адренорецептору у больных ДКМП [3]. Упомянутый сорбент представляет собой механическую смесь двух сорбентов с иммобилизованными индивидуальными пептидами, что указано в патенте [12].
1
1
Существенным недостатком данного сорбента является, во-первых, то, что механическая смесь двух сорбентов с двумя индивидуальными пептидами позволяет связывать аутоантитела, специфичные к антигенным детерминантам, расположенным либо только на 1-ой, либо только на 2-ой внеклеточной петле β-адренорецептора. Тогда как в природной молекуле эти две внеклеточные петли связаны дисульфидной связью и, следовательно, образуют дополнительную антигенную детерминанту, к которой могут образовываться аутоантитела другой специфичности. Следовательно, аффинность такого сорбента неизбежно будет не достаточной для удаления всех аутоантител к β-адренорецептору, что доказано в собственных экспериментах авторов.
1
Исходя из вышесказанного актуальной является задача создания синтетического антигена, наиболее близко повторяющего антигенные свойства природного антигена - β-адренорецептора, который, следовательно, обладал бы более высокой аффинностью.
1
1
1
1
Поставленная задача решается синтезом антигена, представляющего собой индивидуальное химическое соединение, в котором пептиды последовательности 125-133 и 206-218 β-адренорецептора соединены дисульфидной связью, в отличие от смеси (сочетания) данных пептидов (прототип). Способность такого синтетического антигена связывать аутоантитела к β адренорецетору неочевидна, так как заявляемый антиген - искусственная конструкция, не являющаяся линейным эпитопом (в случае линейних эпитопов антигенность можно предсказать, используя компьютерные программы для анализа аминокислотной последовательности белка [13]), включающая 2 фрагмента β-адренорецептора (125-133 и 206-218), далеко отстоящие друг от друга и соединенные в одну молекулу спонтанным окислением сульфгидрильных групп фрагментов 125-133 и 206-218 β-адренорецептора с помощью перекиси водорода [14].
Синтез заявляемого синтетического антигена осуществляли окислением перекисью водорода эквимолекулярной смеси предшественников - нонапептида (125-133) и тридекапептида (208-218).
1
1
Синтез пептидов последовательности 125-133 1-ой внеклеточной петли β-адренорецептора (нонапептид) и последовательности 206-218 2-ой петли β-адренорецептора (тридекапептид) осуществляли по стандартной технологии синтеза на твердой фазе [15] с использованием Fmoc* - методологии на полимере Ванга. В работе использованы производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DIC, HOBT, TIBS фирмы Fluka (Швейцария). Для синтеза применяли N-метилпирролидон, дихлорметан, пиперидин, метанол и трифторуксусную кислоту (Applied Biosystems, США). DMF очищали перегонкой над нингидрином и окисью бария. Для блокирования функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли следующие защиты: трет-бутильную для карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильной функции серина и тирозина; трет-бутилоксикарбонильную (Boc) - защиту для ε-аминогруппы лизина; тритильную (Trt) - группу для карбоксамидной функции аспарагина и Pmc - для гуанидиновой функции аргинина. О защите цистеиновых остатков см. примеры 1 и 2. Аминокислотную цепь наращивали по одной аминокислоте, начиная с С-конца, с использованием карбодиимидного метода с добавкой 1-гидроксибензотриазола.
Синтез проводили на автоматическом пептидном синтезаторе Applied Biosystems, модель 431 А по стандартной программе для однократной конденсации Fmoc-аминокислот. В каждом случае исходили из 0.25 ммоль Fmoc-аминоацилполимера (Bachem, Швейцария). Для твердофазного синтеза использовали сополимер стирола с 1% дивинилбензола с гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой, с размером частиц 200-400 меш фирмы Bachem (Швейцария).
Стандартный протокол твердофазного синтеза включает следующие стадии:
Протокол твердофазного синтеза
№
Операция
Реагент
Время обработки
1
Промывка
5×NMP
3 мин
2
Деблокирование α-аминогрупп
20% Pip/NMP
10 мин
3
Промывка
5×NMP
3 мин
4
Активация
1 ммоль Fmoc-аминокислоты + 1 ммоль HOBt + 1 ммоль DIC в NMP
20 мин
5
Конденсация
1 ммоль активированного производного Fmoc-аминокислоты в NMP
90 мин
6
Промывка
5×NMP
3 мин
Список сокращений: Boc - трет-бутилоксикарбонил; Acm - ацетамидометильная; АсОН - уксусная кислота; Bu<sup>t</sup> - трет-бутил; DIC - N,N<sup>1</sup>-диизопропилкарбодиимид; DCM - дихлорметан; DMF - N,N-диметилформамид; DMSO - d6 - дейтерированный диметилсульфоксид; Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил; HOBT - 1-гидроксибензотриазол; NMP - N-метилпирролидон; Pmc - 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил; Pip - пиперидин; TIBS - триизобутилсилан; TFA - трифторуксусная кислота; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТФС - твердофазный синтез пептидов
Отщепление и деблокирование пептидов осуществляли действием трифторуксусной кислоты со специальными добавками, предотвращающими побочные реакции. Деблокирование сульфгидрильных групп цистеиновых остатков осуществляли действием ацетата ртути. Линейные нонапептид и тридекапептид очищали с помощью препаративной ВЭЖХ до 97-98% чистоты. Препаративную ВЭЖХ проводили на приборе Beckman (США), пептиды детектировали при 226 нм. Пептиды элюировали градиентом концентрации ацетонитрила в 0.1% TFA. Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы Technopharm (РФ). Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонках Ultrasphere ODS (Beckman, США), (5 мкм, 4,6×250 мм); на хроматографе фирмы Gilson (Франция). В качестве элюентов использовали буфер А - 0,1% TFA, рН 2.0, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А, элюция градиентом концентрации буфера Б в буфере А со скоростью потока 1 мл/мин.
1
1
Синтезированные пептиды характеризовали данными H-ЯМР - спектроскопии (Н-ЯМР - спектры снимали на спектрометре WH-500 Bruker 500МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 К, концентрация пептидов составляла 2-3 мг/мл. Химические сдвиги измерялись относительно тетраметилсилана), масс-спектрометрии (масс-спектры регистрировали на приборе PC-Kompact MALDI, Kratos, Англия).
1
Пример 1. Синтез нонапептида последовательности 125-133 1-ой петли β-адренорецептора H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)
Acm
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (предшественник I) проводили исходя из 0,34 г Fmoc-Leu-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильную группу остатка цистеина защищали ацетамидометильной защитой.
Acm
2
Acm
Заключительное деблокирование и отщепление нонапептида (I) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего нонапептидилполимера смесью 10 мл TFA и 0.5 мл HO в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получено 0.25 г сырого продукта (I), содержащего по данным ВЭЖХ 94% целевого пептида.
Acm
1
Очистку пептида проводили с помощью препаративной ВЭЖХ на приборе Beckman (США), используя колонку Диасорб-С16 130Т (25×250 мм), размер частиц сорбента - 10 мкм. В качестве элюентов использовали: буфер А - 0,1% водный раствор TFA и буфер Б - 80% ацетонитрила в воде, элюцию проводили градиентом 0.5% в минуту буфера Б от 100% буфера А, скорость потока 10 мл/мин. Пептиды детектировали при длине волны 226 нм. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили и лиофилизировали. В итоге получено 0.15 г (51% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (I). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляет 98%. Аминокислотный состав по данным Н-ЯМР - спектроскопии: Glu 2, Ser 1, Gly 1, Leu 1, Phe 2, Туг 1, Cys 1.
+
54
72
10
17
1
Масс-спектр, m/z: 1165.5 [М+Н], вычислено 1164.7, для CHNОS.
Стадия 2. Получение нонапептида H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys-Glu-Leu-OH (предшественник I)
Acm
51
67
9
16
+
0.05 г (0.043 ммоль) H-Glu-Tyr-Gly-Ser-Phe-Phe-Cys(Acm)-Glu-Leu-OH (I) растворяли в 5 мл 30% АсОН, добавляли 0.03 г (0.09 ммоль) ацетата ртути в 1.5 мл 30% АсОН, так как пептид плохо растворим, доводили концентрацию раствора до 50% АсОН и перемешивали 1.5 ч при 20°С, затем пропускали ток сероводорода в течение 30 мин. Осадок отфильтровывали, промывали 2×5 мл 30% АсОН. Фильтрат упаривали до объема ~2 мл и хроматографировали на колонке (25×250 мм) с Диасорбом. Элюирование проводили градиентом буфера Б (0.5% в мин, от 20 до 80%) в буфере А со скоростью потока 10 мл/мин. Фракции, соответствующие целевому продукту, объединяли, упаривали, остаток растворяли в воде и лиофилизовали. Выход 0.038 г (80.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1095.2 ([М+Н]), вычислено 1094.2 для CHNOS.
1
Пример 2. Синтез тридекапептида последовательности 206-218 2-ой петли β-адренорецептора H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)
Acm
4
10
11
Стадия 1. Твердофазный синтез H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (предшественник II) проводили исходя из 0,37 г Fmoc-Phe-полимера, содержащего 0.25 ммоль стартовой аминокислоты, в соответствии с вышеприведенным стандартным протоколом. Сульфгидрильные группы остатков Cys и Cys цистеина защищали тритильной защитой, а Cys - ацетамидометильной.
Acm
2
Acm
Заключительное деблокирование и отщепление тридекапептида (II) от полимера проводили в одну стадию путем обработки соответствующего тридекапептидилполимера смесью 10 мл TFA, 0.25 мл НO и 0.25 мл TIBS в течение 2 ч. Затем полимер отфильтровывали, промывали 2×2 мл деблокирующей смеси, фильтрат упаривали и к остатку прибавляли сухой эфир. Осадок отфильтровывали, промывали дихлорметаном (3×3 мл), эфиром (3×5 мл), сушили в вакуум-эксикаторе. Получали 0.42 г сырого продукта (II), содержащего по данным ВЭЖХ 60% целевого пептида.
Acm
1
После этого проводили очистку пептида с помощью препаративной ВЭЖХ так же, как в примере 1. В итоге получали 0.13 г (32% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимерному носителю) трифторацетата пептида (II). Гомогенность продукта, определенная с помощью аналитической ВЭЖХ, составляла 98%. Аминокислотный состав Н-ЯМР-спектроскопии: Asn 1, Asp 2, Ala 1, Phe 1, Tyr 1, Lys 1, Arg 2, Pro 1, Cys 3.
+
68
104
22
21
3
Масс-спектр, m/z: 1661.2 [М+Н], вычислено 1661.9 для СНNOS.
Стадия 2. Получение тридекапептида H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-OH (предшественник II)
11
Acm
Деблокирование остатка цистеина Cys в тридекапептиде H-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys(Acm)-Asp-Phe-OH (II) проводили действием ацетата ртути, как описано в примере 1.
+
65
99
21
20
3
Выход тридекапептида 0.027 г (90.0%). Масс-спектр (MALDI-MS): найдено m/z - 1591.9 ([М+Н]), вычислено 1590.8 для CHNOS.
1
Пример 3. Синтетический антиген, включающий в себя нонапептид (125-133) и тридекапептид (208-218) последовательности β-адренорецептора, соединенные дисульфидной связью
1
1
116
162
30
36
4
+
0.007 г (0.006 ммоль) нонапептида (участок 125-133 β-адренорецептора) и тридекапептида (208-218 β-адренорецептора) 0.009 г (0.006 ммоль) растворяли в 20 мл 10% водного диоксана, добавляли 1 мл 5% водного аммиака до рН 8.0. Вносили в смесь 0.1 мл 3% водной перекиси водорода и перемешивали в течение 10 мин. Полноту окисления SH-групп контролировали с помощью реагента Эллмана (бесцветный раствор). По окончании реакции целевой продукт хроматографировали на колонке 25×600 мм с Sephadex G-25, уравновешенной 2% раствором уксусной кислоты, с целью удаления низкомолекулярных примесей. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяли и лиофилизировали. Получено 0.013 г синтетического антигена (81%). Масс-спектр: 2679.8 ([М+Н]), вычислено 2680.9 для СНNОS.
1
Иммуноферментный анализ аутоантител к β-адренорецептору на синтетическом антигене
1
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом, представляющим собой 2-ую внеклеточную петлю β-адренорецептора, проводили в одинаковых условиях постановки непрямого твердофазного ИФА. Методика и условия постановки ИФА были аналогичными описанным в литературе [7].
1
В состав набора реагентов для определения аутоантител входили следующие компоненты: 96-луночный планшет для иммуноанализа, фирма «Costar», кат. №9018; синтетический антиген (см. пример 3) и пептид 197-222 2-ой внеклеточной петли β-адренорецептора; 0,1 М Na-карбонатный буфер; раствор для разведения образцов, конъюгатов, блокирующий раствор и раствор для отмывки планшетов - 0,01М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 8 г/л М NaCl, 0,1% Твин-20, 3% обезжиренное сухое молоко и бактериостатик катон CG 2,0 мл/л (ФСБМ-Т); раствор для отмывки планшетов - 0,01 М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20 (ФСБ-Т); конъюгат - реагент для анализа: мышиные моноклональные антитела против IgG человека, меченые биотином; конъюгат стрептавидин-пероксидаза; раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 1 мМ/л в диметилформамиде; субстратный буферный раствор - натрий цитрат 5,5-водный, 26 г/л; лимонная кислота 6,92 г/л, натрия перборат 1,1 г/л и катон CG 2,0 мл/л; стоп-реагент - фосфорная кислота 5%.
Протокол анализа
2
3
3
Перед проведением анализа компоненты набора выдерживали при температуре +20°С в течение 60 мин. Для иммобилизации антигена на планшетах для проведения ИФА препараты пептидов разводили до концентрации 5 мкг/мл в 0,1 М NaCO-NaHCO рН 9,6. Вносили в лунки планшетов по 100 мкл и инкубировали 20 часов при +20°С. Для исключения неспецифических взаимодействий в лунки планшета вносили по 100 мкл ФСБМ-Т и инкубировали 3 часа при +20°С со встряхиванием. Для удаления несвязанных антигенов лунки планшета промывали 3 раза ФСБМ-Т. Образцы, разведенные в ФСБМ-Т в 20 и 100 раз, вносили пипеткой в соответствующие лунки по 100 мкл, инкубировали при температуре +4°С в течение 12 часов. Промывали планшет ФСБМ-Т не менее 3-х раз. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора реагента для анализа в ФСБМ-Т, инкубировали при температуре +20°С в течение 60 мин со встряхиванием. Промывали планшет раствором ФСБМ-Т три раза. Вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора конъюгата в ФСБМ-Т, инкубировали планшет при температуре +20°С в течение 30 мин со встряхиванием. Промывали раствором ФСБ-Т четыре раза, затем немедленно вносили в лунки по 100 мкл рабочего раствора свежеприготовленной субстратной смеси (7 объемов субстратного буферного и 1 объем раствора ТМБ). Закрывали планшет крышкой и инкубировали при температуре +20°С без перемешивания в течение 15 мин, затем вносили по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности и тем же методом, каким вносили субстратную смесь. В течение 5 мин после добавления стоп-реагента регистрировали оптическую плотность в планшете при длине волны 450 нм.
Определение связывания сорбента с иммобилизованным синтетическим антигеном и характеристика специфичности
1
Иммобилизацию заявляемого синтетического антигена и сопоставляемого с ним сочетания пептидов последовательности 125-133 и 206-218 молекулы β-адренорецептора по прототипу на бромцианактивированную Sepharose 4 FF проводили в соответствии со стандартной методикой иммобилизации белковых лигандов на агарозную матрицу.
Пептиды растворяли до концентрации 0,3-2,5 мг/мл и иммобилизовали на агарозную матрицу, для чего растворы пептидов в 0,2 М боратном буфере с рН 8,0 инкубировали в течение 10 часов с предварительно активированной бромцианом агарозной матрицей.
Концентрацию иммобилизованного лиганда оценивали по разнице в количестве пептида, использованного для проведения реакции иммобилизации и оставшегося в растворе после окончания инкубации с матрицей. Концентрацию пептида в растворе измеряли по оптическому поглощению при 280 нм. По окончании иммобилизации сорбент промывали 10 объемами дистиллированной воды. Затем к полученному сорбенту (2 мл суспензии, содержащий 1 мл осевшего геля) добавляли по 0,5 мл 1М раствора этаноламина, подкисленного HCl до значения рН 8. Смесь перемешивали при 20°С в течение 30 минут, затем сорбент промывали 20 объемами воды.
2
4
Для определения количества адсорбированных антител на сорбенте с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном и прототипом проводили аффинную хроматографию плазмы крови пациентов больных ДКМП и здорового донора. Соотношение объема сорбента к объему плазмы составлял 2:1, время инкубации - 1 час. После окончания инкубации сорбенты промывали 50-кратным объемом буферной смеси 0.01 М KHPO-NaOH с рН 7.0, связавшийся белок элюировали 20-кратным объемом буферной смеси 0,2М глицин-HCl рН 2,5.
Результаты
1
Чувствительность и специфичность выявления аутоантител к β-адренорецептору
1
Сравнение специфичности заявляемого синтетического антигена с описанным в литературе пептидом участка 197-222 2-ой внеклеточной петли β-адренорецептора, проводили в опыте с унифицированными условиями. Условия постановки ИФА соответствовали условиям ИФА, описанным для прототипа [7]. Определение аутоантител проводили в группе больных ДКМП (группа 1, n=9), в смешанной группе больных с пониженной фракцией выброса левого желудочка (как с ДКМП, так и с тахиаритмиями) (группа 2, n=16) и в группе здоровых доноров (группа 3, n=24).
1
Результаты чувствительности ИФА для определения аутоантител к β-адренорецептору в образцах плазмы/сыворотки крови пациентов исследуемых групп и здоровых доноров приведены в таблице.
Таблица.
Сравнение среднего сигнала в ИФА между различными группами
Образец
Пациенты
Здоровые доноры
группа 1, n=6
группа 2, n=16
группа 3, n=24
Заявляемый синтетический антиген
0,32±0,12*
0,36±0,08**
0,22±0,04
пептид 197-222 последовательности β<sub>1</sub>-адренорецептора
1,1±0,9
1,2±0,7
0,8±0,2
Данные представлены как среднее ± отклонение для доверительной вероятности по критерию Стьюдента, уровень статистической значимости результатов **p<0,005, *p<0,1.
1
Приемлемый уровень статистической значимости (p<0,05) между группой здоровых доноров и группами больных в собственных экспериментах авторов наблюдался только для ИФА с использованием синтетического антигена, что свидетельствовало о большей специфичности взаимодействия заявляемого синтетического антигена с аутоантителами к β-адренорецептору, чем пептида 197-222.
1
1
Согласно литературным данным частота выявления аутоантител к β-адренопецептору у больных ДКМП на пептиде 197-222 последовательности β-адренорецептора составляет 13 положительных ответов из 42, что составляет 30%
1
1
1
[7]. В наших собственных экспериментах при использовании заявляемого синтетического антигена частота выявления аутоантител к β-адренорецептору у больных ДКМП составило 44% (4 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП), тогда как на пептиде 197-122 последовательности β-адренорецептора - 33% (3 положительных ответа из 9 пациентов ДКМП) (данные не приведены). Положительным ответом считали сигнал, в два раза превышавший значение среднего уровня фона. Полученные данные свидетельствуют о большей чувствительности метода выявления аутоантител к β-адренорецептору при использовании заявляемого синтетического антигена.
1
Связывание аутоантител к β-адренорецептору на сорбентах
Нужно отметить, что в литературе отсутствуют данные, позволяющие сравнить по сорбционным характеристикам заявляемый синтетический антиген с прототипом. Поэтому сорбционные свойства сорбента, содержащего синтетический антиген, и сорбента с прототипом проверяли методом аффинной хроматографии с плазмой крови человека в одинаковых условиях в экспериментах in vitro. Для этого использовали плазму крови пациентов ДКМП (пациент 1 и 2), пациента с тахиаритмией (пациент 3) и здорового донора. Количество связавшихся с тестируемыми сорбентами иммуноглобулинов класса G при проведении аффинной хроматографии индивидуальных плазм больных ДКМП и плазмы здорового донора приведены на чертеже.
1
На чертеже - Количество связанных аутоантител к β-адренорецептору из плазмы пациентов и плазмы здоровых доноров на сорбентах с иммобилизованным прототипом и заявляемым синтетическим антигеном.
По результатам собственных исследований авторов среднее количество сорбированных антител для сорбента с иммобилизованным заявляемым синтетическим антигеном (количество IgG в элюате с 1 мл сорбента) в опытах тремя образцами плазмы крови больных ДКМП составляло 227±35 мкг, тогда как на прототипе 70±65 мкг (p<0,05).
1
Таким образом, заявляемый синтетический антиген позволяет со значительно большей чувствительностью и аффинностью связывать аутоантитела из плазмы/сыворотки больных с наличием аутоантител к β-адренорецептору по сравнению с прототипом.
Литература
1. San Martin M.A. et al. Dilated cardiomyopathy and autoimmunity: an overview of current knowledge and perspectives. // Rev Esp Cardiol. - 2002. - V.55 (5) P.514-524.
2. Fu M. et al. Is cardiomyopathy an autoimmune disease? // 2002. - V.51 (4). - P.208-212.
3. Rönspeck W. et al. Peptide based adsorbers for therapeutic immunoadsorption. // Ther Apher Dial. - 2003. -. V.7 (1). - P.91-97.
4. Staudt A. et al. Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subsequent immunoglobulin substitution. // Circulation. - 2001. - V.103 (22). - P.2681-2686.
5. Коновалов Г.А. и др. Аферез иммуноглобулинов - новый подход к лечению тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии. // Кардиология. - 2002 - №6 - С.123-127
6. Matoba Y. et al. Therapeutic Left Ventricular Assist Device and Apheresis on Dilated Cardiomyopathy. // Artificial Organs. - 2004. - V.28 (2). - P.171-181.
7. Magnusson Y. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. // Circulation. - 1994. - V.89 (6). - P.2760-2767.
8. Matsui S. et al. Active immunization of combined betal-adrenoceptor and M2-muscarinic receptor peptides induces cardiac hypertrophy in rabbits. // J Card Fail. - 1999. - V.5 (3). - P.246-254.
9. Zhang L et. al. Autoantibodies against the myocardial betal-adrenergic and M2-muscarinic receptors in patients with congestive heart failure Chin Med J (Engl). 2002; 115 (8): 1127-31.
10. Chiale PA, et. al. Differential profile and biochemical effects of antiautonomic membrane receptor antibodies in ventricular arrhythmias and sinus node dysfunction. // Circulation. 2001; 103 (13): 1765-71.
1
11. Iwata M. Et al, Autoimmunity Against the Second Extracellular Loop of β-Adrenergic Receptors Induces β-Adrenergic Receptor Desensitization and Myocardial Hypertrophy In Vivo. // Circulation Research. - 2001 - V.88. - P.578-586.
12. Rönspeck W. Peptides for combating the autoantibodies that are responsible for dilatative cardiomyopathy (DCM). // EP 1214350.
13. Hopp N., Woods К. Prediction of antigenic determinants from amino acid sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V.72. 72. P.3824-3828.
14. M.B.Сидорова, А.С.Молокоедов, А.А.Азьмуко, Е.В.Кудрявцева, Е.Краузе, М.В.Овчинников, Ж.Д.Беспалова. Применение перекиси водорода для замыкания дисульфидных мостиков в пептидах. // Биоорганическая химия, 2004, том 30, №2, с.115-125.
15. Barany G., Merrifild R.B. Solid phase synthesis. // The Peptide. Analysis, Synthesis, Biology. V2. Special Methods in Peptide Synthesis. Part. A. / Ed. Е.Gross, J.Meienhofer. - New York; Academic Press, 1980, P.3-254.