Новая поливалентная вакцина против лептоспироза человека и способ её получения
NEW MULTIVALENT VACCINE AGAINST HUMAN LEPTOSPIROSIS AND A METHOD FOR ITS PRODUCTION

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается получения усовершенствованной поливалентной вакцины против лептоспироза человека.
Лептоспироз относится к числу природно-очаговых инфекций, вызываемых лептоспирами, насчитывающими около 250 сероваров. (Lev(ett PN. "Systematics of leptospiraceae." Leptospira and Leptospirosis. Springer, Berlin, Heidelberg, 2015. 11-20.). При этом происходит постоянная смена возбудителей в разных регионах мира, в том числе в Российской Федерации. В связи с этим, качество вакцины и ее противоэпидемические показатели во многом определяются соответствием состава входящих в нее штаммов штаммам, циркулирующим в природе. В настоящее время в России и в мире увеличивается количество заболеваний лептоспирозом, вызываемым L. interrogans серогруппы Canicola, что требует введения в состав выпускаемой в России лептоспирозной вакцины для людей штамма L. interrogans серогруппы Canicola. Особую опасность для людей представляют домашние собаки, которые являются резервуаром каникулезного лептоспироза. (Lelu М, Muftoz-Zanzi С, Higgins В Galloway R. Seroepidemiology of leptospirosis in dogs from rural and slum communities of Los Rios Region, Chile. BMC Vet. Res. 2015; 11(31).).
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является поливалентная вакцина против лептоспироза человека и способ ее получения. Вакцина содержит в качестве антигенов штаммы 4-х серогрупп: Leptospira Icterohaemorrhagiae Copenhageni НИИЭМ 466, Leptospira Grippotyphosa grippotyphosa НИИЭМ 30/469, Leptospira Pomona mozdok НИИЭМ 48B/470 и Leptospira Sejroe sejroe НИИЭМ 751/471. Способ получения вакцины включает выращивание биомассы лептоспир на полусинтетической среде с белками крови человека, инактивирование ее формальдегидом, концентрацию микробной массы методом ультрафильтрации на полых полиамидных волокнах, очистку биомассы от компонентов среды культивирования путем двукратного отмывания физиологическим раствором, стандартизацию микробной массы по оптическому кишечному стандарту мутности 10 единиц и консервирование формальдегидом.
(См. патент России №2184775, МГЖ C12N1/20; опубл. 10.07.2002) Однако, известная лептоспирозная вакцина не способна бороться с новым видом лептоспироза человека, вызываемым L. interrogans серогруппы Canicola
Технический результат изобретения заключается в создании новой поливалентной усовершенствованной лептоспирозной вакцины концентрированной инактивированной жидкой для людей с повышенной эпидемиологической эффективностью.
Технический результат достигается тем, что новая поливалентная вакцина против лептоспироза человека содержит в качестве антигенов штаммы четырех серогрупп лептоспир, Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni, Крыса 2/466; L. interrogans Grippotyphosa grippotyphosa, Microtus arvalis 30/469), L. interrogans Pomona mozdok, 48В/470, L. interrogans Sejroe sejroe,Mus musculus 751/471*
* (Примечание: эти известные штаммы четырех серогрупп лептоспир в прототипе указаны по собственными протокольными наименованиями (см. выше в описании прототипа)).
В соответствии с изобретением группа антигенов снабжена дополнительным пятым штаммом L. interrogans Canicola, №480 Удалое, при этом в результате проведенных исследований установили, что данный дополнительный штамм в составе экспериментальной вакцины вызывает образование антител в защитных титрах не менее 1:100, что соответствует требованиям, применяемым к вакцине лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой.
Технический результат достигается также тем, что способ получения новой поливалентной вакцины против лептоспироза человека включает выращивание биомассы лептоспир на жидкой полусинтетической накопительной среде с белками крови человека, инактивирование формальдегидом, концентрацию микробной массы методом ультрафильтрации на полых полиамидных волокнах, очистку биомассы от компонентов среды культивирования путем двукратного отмывания физиологическим раствором.
В соответствии с изобретением, стандартизацию микробной биомассы проводили методом подсчета микробных клеток, при этом расчет проводили по формуле (1):
6
где К - число лептоспир в 1 мл; 3570,4 - коэффициент, указывающий во сколько раз площадь распределения культуры под стеклом превышает площадь поля зрения; 50 - коэффициент, указывающий во сколько раз объем 1 мл превышает объем исследуемой культуры; М - среднее число лептоспир в поле зрения; анализировали пять ампул экспериментальной вакцины по 0,02 мл и просматривали в поле зрения темнопольного микроскопа при увеличении ×200; рассчитанный по формуле результат делили на 2, с учетом дозировки экспериментальной вакцины и при определении в дозе 0,5 мл вакцины среднеарифметического значения, составляющего не менее (20±2)×10 микробных клеток, делали вывод о соответствии новой экспериментальной вакцины против лептоспироза требованиям, применяемым к вакцине лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, используемой для профилактики заболевания.
Целью изобретения являлось изучение биологических свойств штамма Leptospira interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) для обоснования их включения в вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую для людей.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1) изучить вирулентные свойства штамма L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов);
2) получить серии экспериментальной вакцины в соответствии с производственным регламентом на вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую для людей, применяемой для профилактики заболевания;
3) провести сравнительное изучение образования специфических антител к лептоспирам в экспериментальной вакцине и в вакцине, применяемой для профилактики лептоспироза;
4) подтвердить соответствие экспериментальной вакцины требованиям ФС 3.3.1.0014.15 Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая по показателям «Специфическая безопасность» и «Аномальная токсичность».
Испытания полученных серий экспериментальной вакцины показали, что включение в состав производимой лептоспирозной вакцины для людей штамма-кандидата L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) не проводит к изменению свойств выпускаемой вакцины и при этом является более эффективной и безопасной.
В качестве исходных штаммов лептоспир используют смесь инактивированных концентрированных культур лептоспир четырех серогрупп: (Leptospira interrogans Icterohaemorrhagiae copenhageni (Крыса 2/466), L. interrogans Grippotyphosa grippotyphosa (Microtus arvalis 30/469), L. interrogans Pomona mozdok (48B/470), L. interrogans Sejroe sejroe (Mus musculus 751/471)), которые входят в состав выпускаемой в гражданский оборот вакцины с добавлением штамма-кандидата L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов). (Фармакопейная статья 3.3.1.0014. 15 «Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая». Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 4; 2018.).
Штамм Leptospira interrogans серогруппы Canicola №480 Удалов, был получен от больного лептоспирозом человека. Вышеуказанный штамм-кандидат находился в коллекции лептоспир в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России и был получен сотрудниками ФБУН «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора. Разрешение на использование штамма-кандидата для проведения работ по внедрению в применяемую вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую было получено от ФБУН «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора.
Экспериментальные серии вакцины были произведены в период с 2018 по 2020 г. в лаборатории по научной разработке, внедрению и выпуску микробиологических и вирусологических препаратов ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора. Форма выпуска - суспензия 0,5 мл/доза. В течение срока исследования экспериментальную вакцину хранили в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами 3.3.2.3332-16 при температуре от 2 до 8°С. Показатель «Специфическая активность» контролировали с учетом проверки антигенности штамма L. interrogans Canicola (№480 Удалов). Серии экспериментальной вакцины были проверены по показателям «Аномальная токсичность», «Специфическая безопасность» согласно ФС 3.3.1.0014.15 Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая Государственной Фармакопеи Российской Федерации XIV изд. Т.4.
После контроля каждой серии экспериментальной вакцины данные по показателю «Специфическая активность» сравнивали с протоколами испытаний серий вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, выпущенной ранее в гражданский оборот.
Предлагаемое изобретение поясняется иллюстративным материалом.
На фиг. 1 представлена таблица 1, где показаны результаты подсчета клеток лептоспир пяти серий экспериментальной вакцины.
На фиг. 2 - таблица 2, где приведена сравнительная характеристика образования специфических антител к лептоспирам, входящим в состав экспериментальной вакцины и вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, применяемой для профилактики лептоспироза (согласно прототипу). Отметка * показывает, что в состав вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, применяемой для профилактики заболевания, отсутствует штамм L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов).
Исследование серий экспериментальной вакцины по показателю «Специфическая активность» выполняли на аутбредных сирийских золотистых хомячках в возрасте 3-4 недели (массой 22±3 г).
Исследование серий экспериментальной вакцины по показателю «Аномальная токсичность» проводили на белых нелинейных мышах обоего пола (массой 19-21 г) и на морских свинках (массой 250-300 г).
Лабораторные животные были выращены в условиях конвенционального вивария ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора. В период проведения исследования животных содержали в изолированном помещении конвенционального вивария при температуре (22-24)°С и относительной влажности воздуха не выше 60% в условиях свободного доступа к корму и воде на стандартном рационе кормления. При проведении экспериментов соблюдали общепринятые этические нормы обращения с животными, на основе стандартных операционных процедур, которые соответствуют правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей, и в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».
Вирулентные свойства штамма-кандидата L. interrogans серогруппы Canicola изучали на экспериментальных животных (золотистые хомячки).
В опыте использовали две группы животных по три особи в каждой группе. Первую группу заражали внутрибрюшинной культурой L. interrogans серогруппы Canicola штамм №480 Удалов с содержанием 180×190 клеток лептоспир в дозе 1,0 мл в поле зрения темнопольного микроскопа при увеличении ×200. Во вторую группу (контрольная) вводили внутрибрюшинно раствор натрия хлорида 0,9%, в количестве 1,0 мл.
Оценку вирулентных свойств штамма-кандидата проводили на пятые сутки после заражения экспериментальных животных культурой лептоспир, основываясь на результатах, полученных при вскрытии золотистых хомячков и посева коркового слоя почек этих животных в бактериологические пробирки со средой Терских. Посевы инкубировали в течение 7 сут в термостате при температуре (28±1)°С. Затем отбирали 0,02 мл микробной взвеси и просматривали не менее 30 полей зрения в темном поле микроскопа при увеличении ×200.
Экспериментальные серии вакцины получали в соответствии с производственным регламентом на вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую, выпускаемую в гражданский оборот.
Инактивацию лептоспир проводили 30% раствором формальдегида, добавляя его в культуральную жидкость до концентрации 0,35%, и выдерживали 24 ч при комнатной температуре. Через указанный промежуток времени делали мазки и микроскопировали в темном поле зрения при увеличении ×200. Просматривали не менее 30 полей зрения. Критерием того, что инактивация прошла в полном объеме, являлось отсутствие активных движений лептоспир при сохранении морфологии клеток.
Идентификацию штаммов лептоспир, входящих в состав экспериментальной вакцины, проводили с помощью перекрестной реакции микроагглютинации с эталонными контрольными штаммами лептоспир, входящими в состав диагностического набора Сыворотки групповые агглютинирующие лептоспирозные (ФКП «Армавирская биофабрика») в соответствии с инструкцией по применению.
Подсчет количества клеток лептоспир в экспериментальной вакцине осуществляли по методу А.П. Власовой, А.С. Фоменко (Власова Н.П.., Фоменко А.С. «К определению количества лептоспир в жидких питательных средах» В кн.: «Актуальные проблемы лептоспироза» М. 1979 гю, с. 3), который основан на выявлении соотношения между площадью поля зрения и площадью, занимаемой исследуемой культурой, распределенной под покровным стеклом 18×18 мм, с учетом кратности увеличения оптической системы микроскопа, объема взятой культуры, среднего числа лептоспир в поле зрения микроскопа и кратности разведения культуры. Расчет проводили по формуле (1):
где К - число лептоспир в 1 мл; 3570,4 - коэффициент, указывающий во сколько раз площадь распределения культуры под стеклом превышает площадь поля зрения; 50 - коэффициент, указывающий во сколько раз объем 1 мл превышает объем исследуемой культуры; М - среднее число лептоспир в поле зрения [8]. Анализировали пять ампул экспериментальной вакцины по 0,02 мл и просматривали в поле зрения темнопольного микроскопа при увеличении ×200. Рассчитанный по формуле результат делили на 2, с учетом дозировки экспериментальной вакцины.
Образование специфических антител в защитных титрах к лептоспирам, входящим в состав экспериментальной вакцины, изучали по показателю «Специфическая активность» согласно ФС 3.3.1.0014.15 Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая, где отмечено, что препарат должен вызывать у золотистых хомячков образование специфических антител, выявляемых в реакции микроагглютинации со штаммами лептоспир в титре не менее чем 1:100, защищать не менее 3 из 4 животных от заражения вирулентной культурой. В эксперименте на каждую серию вакцины использовалось по 3 золотистых хомячка для иммунизации экспериментальной вакциной и по две группы золотистых хомячков по 4 особи в каждой (4 иммунизированных и 4 неиммунизированных) для проведения теста активной защиты.
Золотистым хомячкам массой (22±3) г однократно внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл экспериментальной вакцины. Через 20 сут после иммунизации у животных забирали кровь, собирали ее во флаконы (пробирки) и инкубировали в термостате в течение 30-40 мин при температуре (37±1)°С, затем выдерживали в холодильнике при температуре (6±2)°С в течение 24 ч. Для выявления специфических антител полученную иммунную сыворотку крови отбирали в стерильные пробирки и проводили реакцию микроагглютинации, где в качестве антигенов использовали штаммы лептоспир, входящие в состав экспериментальной вакцины. Учет результатов реакции проводили визуально по условной системе оценок трех крестов. Для определения защитных свойств экспериментальной вакцины 4 золотистым хомячкам массой (22±3) г однократно внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл вакцины. Через 20 сут 4 иммунизированных и 4 неиммунизированных животных заражали внутрибрюшинно культурой L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) с содержанием 180×190 клеток лептоспир в темном поле зрения при увеличении ×200 в объеме 1 мл. Наблюдение за животными вели в течение 7 сут. Отбор образцов экспериментальной вакцины для данного эксперимента осуществляли методом случайного отбора.
Оценку серий экспериментальной вакцины по показателю «Специфическая безопасность» проводили микробиологическим методом (метод прямого посева) на среду Терских. По 0,2 мл экспериментальной вакцины засевали в 3 бактериологические пробирки с 7 мл фосфатно-сывороточной среды Терских. Пробирки помещали в термостат и выдерживали при температуре (28±1)°С в течение 20 сут. Через указанный промежуток времени делали мазки и микроскопировали в темном поле зрения при увеличении ×200. Просматривали не менее 30 полей зрения. Критерием оценки теста на специфическую безопасность являлось отсутствие в посевах живых лептоспир.
Оценку серий экспериментальной вакцины по показателю «Аномальная токсичность» проводили биологическим методом в соответствии с ОФС 1.2.4.0004.15 Аномальная токсичность в тесте для иммунобиологических лекарственных препаратов Государственной Фармакопеи Российской Федерации XIV изд. Т.4..
Статистическая обработка данных. Результаты обрабатывали с помощью программы Microsoft Office Excel. Определяли среднее геометрическое значение титров антител.
При подсчете количества клеток лептоспир в экспериментальной вакцине проводили статистическую обработку данных с помощью программы Microsoft Office Excel. Определяли среднее арифметическое значение (М) и стандартное отклонение (SD).
На первом этапе работы проводили исследования по оценке вирулентных свойств изучаемого штамма. Золотистые хомячки первой группы, зараженные штаммом. L interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов), пали на пятые сутки. У погибших животных при вскрытии была отмечена выраженная желтушность и многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках и в подкожной клетчатке, наиболее интенсивные в области скелетных мышц, почек, печени, желудка, селезенки. Наблюдался выраженный отек почечной и печеночной ткани, деструктивные и некротические изменения паренхимы органов. Почки были увеличены и имели размеры 11,3×6 мм, при норме 7,5×4 мм у хомячков в возрасте 3 недель. При посеве коркового слоя почек на среду Терских выделялась культура лептоспир. Идентификация лептоспир, выделенных при посеве на среде Терских, показала, что культура соответствует серогруппе Canicola.
Животные контрольной группы, (не зараженные) на пятые сутки клинических признаков заболевания не проявляли, при внешнем осмотре степень физической активности находилась в пределах физиологической нормы, поедаемость корма была нормальной, при взвешивании потери массы тела отмечено не было. При вскрытии животных отмечены чистые слизистые покровы, положение внутренних органов брюшной полости без изменений. Печень и почки красно-коричневого темного цвета, консистенция - плотная, эластичная; имели характерный рисунок на разрезе. Серозная оболочка кишечника гладкая, блестящая, без видимых изменений. Серозная оболочка желудка без очаговых поражений, некрозов, кровоизлияний, язв. Желтушность внутренних органов отсутствовала. Макроскопических изменений внутренних органов не выявлено. При посеве коркового слоя почек животных на среду Терских не выделялась культура лептоспир. Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что штамм-кандидат L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) является вирулентным.
Следующим этапом работы было получение серий экспериментальной вакцины, которые производили в соответствии с производственным регламентом на вакцину лептоспирозную концентрированную инактивированную жидкую, выпускаемую в гражданский оборот.
Для стандартизации смеси лептоспир, входящих в состав экспериментальной вакцины, был проведен подсчет микробных клеток. В таблице 1 представлены результаты подсчета клеток лептоспир пяти серий экспериментальной вакцины.
6
6
Количество клеток лептоспир в дозе 0,5 мл в экспериментальной вакцине (табл. 1) составляла (20,9±2,5)×10, что соответствует требованиям предъявляемым к применяемой для профилактики заболевания вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, то есть не менее (20±2)×10 микробных клеток.
Далее были проведены исследования серий экспериментальной вакцины по показателю «Специфическая активность», а именно проведена сравнительная оценка образования специфических антител к лептоспирам, входящим в состав экспериментальной вакцины, и лептоспирам, входящим в состав вакцины лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой, применяемой для профилактики заболевания (табл. 2).
Образование специфических антител у лабораторных животных после иммунизации экспериментальной вакциной (табл. 2) не изменяется при введении в ее состав штамма L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов), также отсутствует отрицательная конкуренция, приводящая к изменению антигенных свойств выпускаемой вакцины.
Были проведены исследования оценки защитных свойств экспериментальной вакцины (по показателю «Специфическая активность»), в результате были получены следующие данные:
- золотистые хомячки, входящие в группу животных, иммунизированных экспериментальной вакциной, после заражения культурой L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) на седьмые сутки клинических признаков заболевания не проявляли;
- золотистые хомячки, входящие в группу животных, неиммунизированных экспериментальной вакциной, пали на пятые сутки.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штамм L. interrogans Canicola (№480 Удалов) в составе экспериментальной вакцины вызывает образование антител в защитных титрах не менее 1:100, что соответствует требованиям применяемыми к вакцине лептоспирозной концентрированной инактивированной жидкой
В результате проверки экспериментальных вакцин, полученных с использованием L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов), по показателю «Специфическая безопасность» было установлено, что препарат не содержит живых лептоспир.
В ходе исследования серий экспериментальных вакцин, полученных с использованием L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов), по показателю «Аномальная токсичность» было выявлено, что у лабораторных животных (белые мыши и морские свинки) в течение 7 сут не наблюдалось изменений в области введения вакцин, падения массы тела, гибели животных, что свидетельствует о его нетоксичности и безопасности.
Заключение
Испытания полученной экспериментальной вакцины показали, что включение в ее состав штамма L. interrogans серогруппы Canicola (№480 Удалов) не приводит к изменению свойств вакцины; вакцина соответствует требованиям, представленным в ФС 3.3.1.0014.15 Вакцина лептоспирозная концентрированная инактивированная жидкая по показателям «Аномальная токсичность», «Специфическая безопасность».
Введенный в состав вакцины штамм L. interrogans серогруппы Canicola вызвал образование антител в защитных титрах не менее 1:100, что свидетельствует о достаточной антигенности экспериментальной вакцины и подтверждает целесообразность его включения в выпускаемую отечественную лептоспирозную вакцину для повышения ее эпидемиологической эффективности.
Вакцина с обновленным составом штаммов микроорганизмов будет наиболее актуальна для регионов, в которых присутствуют природные и антропургические резервуары L. interrogans серогруппы Canicola.