СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7,3'-ДИСУЛЬФАТА ЛЮТЕОЛИНА
METHOD OF OBTAINING LUTEOLYN 7,3'-DISULPHATE

Изобретение относится к фармакологическому производству и может быть использовано для получения биологически активных веществ из морских трав семейства Zosteracea, в частности для получения 7,3'-дисульфата лютеолина.
Структурная формула 7,3'-дисульфата лютеолина:
Сульфаты лютеолина широко распространены в высших наземных растениях. В то же время среди морских растений они обнаружены только в морских травах семейства Zosteraceae (Zostera marina и Z. Asiatica) [Harborne J.B. // Phytochemistry 1975, vol.14, p.1147-1155] и в морской траве Thalassia testudinum [Jensen P.R., Jenkins K.M. et al. // Applied and Environmental Microbiology, 1998, vol.64, №4, p.1490-1496]. Известно, что водонерастворимый лютеолин, поступающий с пищей в организм человека, проходит ряд модификаций как эпителиальными клетками кишечника, так и клетками печени, где они превращаются в такие водорастворимые метаболиты, как глюкоурониды, сульфаты и гликозиды [Gradolatto A. et al // Drag, Metabolism and Disposition, 2004, vol. 32, p.58-64]. В виде этих производных лютеолин циркулирует в плазме крови и проникает в различные клетки тканей человека, где выполняет ряд функций.
Медико-биологическая активность сульфопроизводных лютеолина достаточно обширна. В отличие от лютеолина они наиболее полно и легко усваиваются организмом.
Известна антиоксидантная активность производных лютеолина [Lopez-Lazaro М. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009, vol.9, p.31-59. Т.], обусловливающая солнцезащитные и противоожоговые свойства экстрактов зостеры [Kim J.H., Cho Y.H. et al. // Arch. Pharm. Res., 2004, vol. 27, №2, p.177-183], антибиотическая и противовирусная активность [Jensen P.R., Jenkins K.M. et al. // Applied and Environmental Microbiology, 1998, vol.64, №4, p.1490-1496, Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009, vol.9, p.31-59. Т.], противоопухолевая [Lopez-Lazaro M. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009, vol.9, p.31-59. Т.], кардиоваскулярная, противодиабетическая, антиаллергическая, противовоспалительная и иммуномодулирующая активности [Lopez-Lazaro М. // Mini-Reviews in Medical Chemistry, 2009, vol.9, p.31-59. Т.].
Дисульфат лютеолина - это природная водорастворимая форма лютеолина, способная проникать в плазму крови человека через кишечник, минуя стадии модификации клетками кишечника и печени. Это позволяет создавать наивысшую концентрацию лютеолина в крови человека, повышая эффективность ее физиологического действия.
Известны способы получения лютеолина и его производных, в том числе сульфопроизводных, из высших растений и их частей.
Известен способ получения лютеолина из морской травы Zostera marina L. путем экстракции высушенных листьев морской травы 70% водным этиловым спиртом, упаривания, суспендирования сухого остатка в воде, фракционирования суспензии гексаном, дихлорэтаном, этилацетатом и бутанолом последовательно, хроматографирования этилацетатного экстракта на сефадексе LH-20 градиентом 40-100% метанола с последующим упариванием элюата и кристаллизацией лютеолина из метанола [Kim J.H., Cho Y.H. et al. // Arch. Pharm. Res., 2004, vol.27, №2, p.177-183]. При выделении лютеолина используется много пожароопасных (гексан, этилацетат, бутанол) и токсичных (метанол, дихлорэтан) растворителей.
2
Известен способ получения лютеолин 7-O-β-D-глоюкопиранозил-2”-сульфата из морской травы Thalassia testudinum путем экстракции зеленой массы, разбавления экстракта водой, гомогенизирования, упаривания, растворения сухого остатка в метаноле, упаривания, распределения сухого остатка между водой и этилацетатом, высушивания водной фракции, растворения сухого остатка в метаноле, хроматографирования на сефадексе LH-20 в метаноле и последующей ВЭЖХ (в системе 40% МеОН - HO - 0,1% трифторуксусная кислота) [Jensen P.R., Jenkins К.М. et al. // Applied and Environmental Microbiology, 1998, vol.64, №4, p.1490-1496]. Способ разработан для лабораторных исследований методом ВЭЖХ и для производственных целей непригоден.
f
Известен способ получения лютеолин 3'-сульфата из листьев Lahenallia unifolia путем экстракции сырья горячим 80% метанолом и выделения сульфатов флавонов на Watman №3 (ватмане) с последующей идентификацией по R, УФ-спектральному анализу и электрофорезу [Williams С.А., Harborne J.B. // Phytochemistry, 1976, vol.15, p.349-350]. Способ разработан для наземных растений; при выделении целевого продукта используется высокотоксичный кипящий метанол; способ лабораторный, с выделением целевого продукта методом бумажной хроматографии.
Известен способ получения флавоноидных гликозидов (диосметин, диосметин-7-О-глюкозид и лютеолин-7-О-глюкозид) из морской травы Z. marina путем трехкратной экстракции этанолом, концентрирования, разбавления водой, последовательной экстракции гексаном, дихлорэтаном и бутанолом, обработки этилацететного экстракта на силикагельной колонке градиентом метанола в дихлорэтане с последующим исследованием полученных флавоноидных гликозидов методом масс-спектрометрии и газовой хроматографии [Т.Milkova, R.Petkova, et al. // Botanica Marina, 1995, vol.38, p.99-101]. Способ разработан для выделения глюкозидов флавоноидов, при выделении которых используются пожароопасные экстрагенты (этилацетеат, бутанол).
Известны лабораторные методы обнаружения и идентификации сульфатов флавоноидов, в том числе и 7,3'-дисульфата лютеолина посредством двумерной тонкослойной хроматографии на целлюлозе и электрофореза на бумаге в кислых условиях [Harborne J.В. // Phytochemistry, 1975, vol.14, p.1147-1155].
В доступной научно-технической и патентной литературе способы получения 7,3'-дисульфата лютеолина из морских трав или других видов растений не обнаружены.
Задачей изобретения является разработка способа получения 7,3'-дисульфата лютеолина из морских трав семейства Zosteraceae.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра биологически активных веществ из доступного, широко распространенного морского сырья.
Заявляемый способ получения 7,3'-дисульфата лютеолина заключается в следующем.
Свежескошенную зеленую морскую траву семейства Zosteraceae или зеленые штормовые выбросы этой травы опресняют питьевой водой, удаляют механические примеси, водоросли и другие виды морских растений. Зостеру промывают трижды, затем помещают на сетчатый фильтр до полного стекания воды. После этого зостеру загружают в реактор под гнетом во избежание всплытия травы и заливают «под зеркало» 96% этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент 1:(1-2), экстракцию осуществляют в течение 12-24 часов. Спиртовый экстракт сливают, фильтруют через тканевый, бумажный или ватный фильтр. Процесс повторяют трехкратно. Спиртовые экстракты объединяют и упаривают в вакууме. Полученный концентрат растворяют в воде. Раствор центрифугируют или фильтруют. Осадок удаляют. Фильтрат подкисляют 15-20% соляной кислотой до pH 1-2 и оставляют на сутки при температуре 2-4°C для образования кислотонерастворимого осадка лигнина. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием.
Кислый раствор фенольных соединений наносят на колонку с полихромом-1, уравновешенным дистиллированной водой. Полифенольные соединения связываются с полихромом-1. Минеральные соли и соляную кислоту удаляют путем промывания дистиллированной водой. Элюирование полифенольных соединений осуществляют градиентом этилового спирта. Наиболее полярный полифенол 7,3'-дисульфат лютеолина элюируют 5% водным раствором этанола. Водно-спиртовый элюат упаривают в вакууме при 60°C до полного удаления спирта и высушивают водный остаток на лиофильной или распылительной сушке.
Для подтверждения чистоты продукта проведен анализ образцов 7,3'-дисульфата лютеолина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
ВЭЖХ проводили на хроматографе "LaChrom" (Merck Hitachi), снабженном УФ детектором L-7400, насосом L-7100, термостатом L-7300, интегратором D-7500 и колонкой Agilent Technologies Zorbax Eclipse XDB-C18, 3.5 µт (75 мм×4.6 мм) с защитной колонкой Hypersil ODS, 5 µт (4.0 мм×4.0 мм). Колонку термостатировали при 30°C. Разделение примесей проводили смесью растворителей: А (вода+1% ледяной уксусной кислоты) и B (ацетонитрил+1% ледяной уксусной кислоты) в следующем режиме: 0-5 мин - изократический, 90% A, 10% B; 5-35 мин градиентный, 90-10% A, 10-90% B. Скорость подачи растворителей 1 мл/мин. Детектирование проводили при 270 нм.
На чертеже представлена ВЭЖ хроматограмма 7,3'-дисульфата лютеолина, выделенного из Zostera marina.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Сырье - свежескошенную траву зостеру (Z. marina) в количестве 10 кг очищают от посторонних примесей (других растений, водорослей, механических примесей) и опресняют питьевой водой. Промывку травы водой производят трижды (по 10 л), причем последний раз траву замачивают в воде на 8 часов. Затем сырье помещают на сетчатый фильтр до полного стекания воды.
После этого зостеру загружают в реактор, прижимают решеткой из нержавеющей стали во избежание всплывания и заливают «под зеркало» 10 л 96% этилового спирта. Экстракцию осуществляют в течение 12 часов при температуре окружающей среды (20-23°C). После этого этанольный экстракт сливают и фильтруют через бумажный фильтр. Процесс повторяют трижды. Полученные экстракты объединяют и упаривают в вакууме при 60°C.
Концентрат в количестве 0,56 кг растворяют в 2 л дистиллированной воды. Полученный раствор центрифугируют, осадок удаляют. Супернатант подкисляют 15% соляной кислотой до pH 1-2. Кислый раствор оставляют на сутки при температуре 2°C для образования кислотонерастворимого осадка. Затем осадок отделяют центрифугированием.
Кислый раствор фенольных соединений пропускают через колонку с 0,3 кг сорбента полихром-1, уравновешенного дистиллированной водой. Промывают колонку 1,5 л дистиллированной воды для удаления минеральных солей и соляной кислоты. Элюирование адсорбированного 7,3'-дисульфата лютеолина осуществляют 0,5 л 5% водного раствора этилового спирта. Элюат упаривают в вакууме до полного удаления спирта при 60°C. Водный остаток лиофилизуют. Получают 4,0 г 7,3'-дисульфата лютеолина.
Пример 2
Свежесобранные выбросы морской травы зостеры (Zostera sp.) в количестве 100 кг очищают от водорослей и механических примесей и трижды промывают питьевой водой, причем последний раз трава замачивается на 12 часов. Затем сырье помещают на сетчатый фильтр до полного стекания воды.
После этого сырье загружают в реактор, предварительно измельчив траву на траворезке. Траву прижимают инертным грузом во избежание всплывания и заливают «под зеркало» 150 л 96% этилового спирта. Экстракцию осуществляют в течение 24 часов при температуре (18-25°C). После этого этанольный экстракт сливают и фильтруют через тканевый фильтр. Процесс повторяют трижды. Экстракты объединяют и упаривают при 60°C под вакуумом.
Полученный концентрат в количестве 5,06 кг растворяют в 20 л дистиллированной воды. Раствор отфильтровывают. Фильтрат подкисляют 130 мл 20% соляной кислотой до pH 1 -2 и оставляют на сутки при температуре 4°C для образования кислотонерастворимого осадка. Выпавший осадок отделяют на фильтре.
Кислый раствор фенольных соединений пропускают через колонку с 3 кг сорбента полихром-1, уравновешенного дистиллированной водой. Колонку с адсорбированными полифенольными соединениями отмывают от минеральных солей и соляной кислоты 12 л дистиллированной воды. Целевой продукт элюируют 3 л 5% водного раствора этилового спирта. Элюат упаривают до полного удаления спирта при 60°C. Водный остаток сушат на распылительной сушилке. Получают 38,0 г 7,3'-дисульфата лютеолина.