ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ НИТРОГЕНАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

1. Растительная клетка, содержащая митохондрии и слитый полипептид, содержащий
(i) митохондриальный нацеливающий пептид (МНП), который имеет C–конец,
(ii) полипептид NifD (ND), который имеет N–конец и C–конец,
(iii) олигопептидный линкер и
(iv) полипептид NifK (NK), который имеет N–конец,
при этом C–конец МНП трансляционно слит с N–концом ND, а
линкер трансляционно слит с C–концом ND и N–концом NK.
2. Растительная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что C–конец слитого полипептида представляет собой C–конец NK, необязательно при этом C–конец NK представляет собой С–конец NifK дикого типа.
3. Растительная клетка по п. 2 или 3, отличающаяся тем, что олигопептидный линкер имеет длину от 8 до 50 аминокислот.
4. Растительная клетка по любому из пп. 1–3, отличающаяся тем, что полипептид NifD и полипептид NifK в слитом полипептиде имеют такую же функцию, как и полипептид NifD и полипептид NifK, когда они представлены в виде двух отдельных полипептидов.
5. Растительная клетка, содержащая митохондрии и слитый полипептид, содержащий
(i) митохондриальный нацеливающий пептид (МНП), который имеет C–конец,
(ii) полипептид NifE (NE), который имеет N–конец и C–конец,
(iii) олигопептидный линкер и
(iv) полипептид NifN (NN), который имеет N–конец,
при этом C–конец МНП трансляционно слит с N–концом NE, а
линкер трансляционно слит с C–концом NE и N–концом NN.
6. Растительная клетка по п. 5, отличающаяся тем, что олигопептидный линкер имеет длину, по меньшей мере, около 20 аминокислот, или, по меньшей мере, около 30 аминокислот, или, по меньшей мере, около 40 аминокислот, или от около 20 аминокислот до около 70 аминокислот, или от около 30 аминокислот до около 70 аминокислот, или от около 30 аминокислот до около 60 аминокислот, или от около 30 аминокислот до около 50 аминокислот, или около 25 аминокислот, или около 30 аминокислот, или около 35 аминокислот, или около 40 аминокислот, или около 45 аминокислот, или около 46 аминокислот, или около 50 аминокислот, или около 55 аминокислот.
7. Растительная клетка по п. 5 или 6, отличающаяся тем, что полипептид NifE и полипептид NifN в слитом полипептиде имеют такую же функцию, как и полипептид NifE и полипептид NifN, когда они представлены в виде двух отдельных полипептидов, предпочтительно имеют такую же функцию, как и полипептид NifE дикого типа и полипептид NifN дикого типа, соответственно.
8. Растительная клетка по любому из пп. 1–7, отличающаяся тем, что МНП содержит сайт расщепления протеазой для матриксной процессирующей протеазы (МПП) так, чтобы слитый полипептид мог расщепляться МПП с получением N–концевого отщепленного пептида и процессированного слитого полипептида (CF), содержащего от (ii) до (iv).
9. Растительная клетка по п. 8, отличающаяся тем, что CF содержит некоторые, но не все C–концевые аминокислоты МНП, предпочтительно от 5 до 45 аминокислот из С–концевых аминокислот МНП.
10. Растительная клетка по любому из пп. 1–9, отличающаяся тем, что МНП содержит около 51 аминокислоты F1–АТФазной γ–субъединицы МНП.
11. Растительная клетка по любому из пп. 1–10, дополнительно содержащая один или более слитых полипептидов NF (NF), причем каждый NF содержит (i) митохондриальный нацеливающий пептид (МНП), который имеет C–конец, и (ii) полипептид Nif (NP), который имеет N–конец, при этом C–конец МНП трансляционно слит с N–концом NP, при этом каждый МНП независимо является одинаковым или отличным, а каждый NP независимо является одинаковым или отличным, и при этом митохондрии содержат один или более NF и/или их процессированный продукт (CF), и при этом каждый CF, в случае присутствия, получен посредством расщепления соответствующего NF в пределах его МНП.
12. Растительная клетка по п. 11, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, один из полипептидов NF представляет собой NifH.
13. Растительная клетка по любому из пп. 1–12, отличающаяся тем, что митохондрии содержат один, по меньшей мере, два, по меньшей мере, три, по меньшей мере, четыре или все полипептиды Nif, выбранные из группы, состоящей из (i) NifD, NifH, NifK, NifB, NifE и NifN, или (ii) NifD, NifH, NifK и NifS.
14. Растительная клетка по любому из пп. 1–13, отличающаяся тем, что МНП содержит, по меньшей мере, 10 аминокислот, предпочтительно от 10 до 80 аминокислот.
15. Растительная клетка по любому из пп. 1–14, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, один или более, или все МНП содержат МНП митохондриального белка–предшественника или его вариант, предпочтительно МНП растения.
16. Растительная клетка по любому из пп. 1–15, отличающаяся тем, что экзогенный(е) полинуклеотид(ы), кодирующий(е) слитый(е) полипептид(ы), интегрирован(ы) в ядерный геном клетки.
Arabidopsis thaliana
17. Растительная клетка по любому из пп. 1–16, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку, отличную от протопласта .
18. Трансгенное растение, содержащее клетки по любому из пп. 1–17, отличающееся тем, что трансгенное растение является трансгенным в отношении одного или более экзогенных полинуклеотидов, кодирующих слитые полипептиды.
19. Трансгенное растение по п. 18, отличающееся тем, что один или более, или все экзогенные полинуклеотиды экспрессируются в корнях растения, предпочтительно экспрессируются на большем уровне в корнях растения, чем в листьях растения.
20. Трансгенное растение по п. 18 или 19, которое представляет собой зерновое растение, такое как пшеница, рис, кукуруза, тритикале, овес или ячмень, предпочтительно пшеница.
21. Трансгенное растение по любому из пп. 18–20, которое является гомозиготным или гетерозиготным в отношении экзогенного(ых) полинуклеотида(ов).
22. Трансгенное растение по любому из пп. 19–21, которое растет в поле.
23. Популяция из, по меньшей мере, 100 растений по любому из пп. 18–22, растущих в поле.
24. Слитый полипептид, содержащий
(i) митохондриальный нацеливающий пептид (МНП), который имеет C–конец,
(ii) полипептид NifD (ND), который имеет N–конец и C–конец,
(iii) олигопептидный линкер и
(iv) полипептид NifK (NK), который имеет N–конец,
при этом C–конец МНП трансляционно слит с N–концом ND, а
линкер трансляционно слит с C–концом ND и N–концом NK.
25. Слитый полипептид по п. 24, отличающийся тем, что C–конец слитого полипептида представляет собой C–конец NK, необязательно при этом C–конец NK представляет собой С–конец NifK дикого типа.
26. Слитый полипептид, содержащий
(i) митохондриальный нацеливающий пептид (МНП), который имеет C–конец,
(ii) полипептид NifE (NE), который имеет N–конец и C–конец,
(iii) олигопептидный линкер и
(iv) полипептид NifN (NN), который имеет N–конец,
при этом C–конец МНП трансляционно слит с N–концом NE, а
линкер трансляционно слит с C–концом NE и N–концом NN.
27. Слитый полипептид по п. 26, отличающийся тем, что олигопептидный линкер имеет длину около 46 аминокислот.
28. Слитый(е) полипептид(ы) по любому из пп. 24–27, отличающийся(еся) тем, что слитый(е) полипептид(ы) может(могут) расщепляться матриксной процессирующей протеазой (МПП) с получением одного или более процессированных продуктов полипептида Nif, содержащих от (ii) до (iv).
29. Слитый(е) полипептид(ы) по любому из пп. 24–28, который(е) присутствует(ют) в растительной клетке или в бактериальной клетке, предпочтительно в митохондрии растительной клетки.
30. Процессированный полипептид Nif, который был получен из слитого(ых) полипептида(ов) по любому из пп. 24–29 посредством расщепления в пределах МНП слитого(ых) полипептида(ов).
31. Процессированный полипептид Nif по п. 30, который был получен посредством расщепления слитого полипептида МПП в митохондриальном матриксе растительной клетки.
32. Процессированный полипептид Nif по п. 30 или 31, который присутствует в растительной клетке или в бактериальной клетке, предпочтительно в митохондрии растения, более предпочтительно в митохондриальном матриксе (ММ) митохондрии растительной клетки.
33. Слитый(е) полипептид(ы) по любому из пп. 24–29 или процессированный полипептид Nif по любому из пп. 30–32, которые имеют такую же биохимическую активность, как и соответствующий полипептид Nif дикого типа, предпочтительно имеют приблизительно такой же уровень биохимической активности, как и соответствующий полипептид Nif дикого типа, необязательно, согласно определению в бактериальной клетке.
34. Полинуклеотид, кодирующий один или более слитых полипептидов по любому из пп. 24–29.
35. Полинуклеотид по п. 34, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид был кодон–модифицирован для экспрессии в растительной клетке по сравнению с полинуклеотидом природного происхождения, который кодирует соответствующий белок Nif в бактериях.
36. Полинуклеотид по п. 34 или 35, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
37. Полинуклеотид по любому из пп. 34–36, который присутствует в растительной клетке или в бактериальной клетке, предпочтительно интегрированный в ядерный геном растительной клетки.
38. Химерный вектор, содержащий или кодирующий полинуклеотид по любому из пп. 34–37.
39. Способ получения трансгенного растения по любому из пп. 18–22, включающий этапы
i) внесения полинуклеотида по любому из пп. 34–37 и/или вектора по п. 38 в клетку растения,
ii) регенерации трансгенного растения из клетки и
iii) необязательно, сбора семян с растения и/или
iv) необязательно, получения одного или более дочерних растений от трансгенного растения,
с получением, таким образом, трансгенного растения.
40. Растительная часть растения по любому из пп. 18–22.
41. Растительная часть по п. 40, которая представляет собой семя, которое сдержит полинуклеотид по любому из пп. 34–37.
42. Способ получения муки, цельнозерновой муки, крахмала, масла, жмыховой муки или другого продукта, получаемого из семян, включающий:
a) получение семян по п. 41 и
b) получение муки, цельнозерновой муки, крахмала, масла или другого продукта или получение жмыховой муки.
43. Продукт, получаемый из растения по любому из пп. 18–22 и/или растительной части по п. 40 или 41.
44. Способ получения пищевого продукта, включающий смешивание семян по п. 41 или муки, цельнозерновой муки или крахмала из указанных семян с другим пищевым ингредиентом.