МОДИФИЦИРОВАННЫЙ АНТИВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ МАКРОФАГ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
MODIFIED ANTI-INFLAMMATORY MACROPHAGE, A METHOD FOR PRODUCTION AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно, к получению макрофагов c фенотипом переключения, посредством репрограммирования макрофагов на новый антивоспалительный фенотип, способный продуцировать антивоспалительные медиаторы в условиях провоспалительного микроокружения. Модифицированные макрофаги могут быть использованы для лечения одного или более одного связанного с воспалением состояния, или для ограничения воспаления в различных органах и тканях, вызванного разными факторами и условиями.
Уровень техники
К числу связанных с воспалением состояний и заболеваний относятся аутовоспалительные заболевания, включая микрокристаллические артриты при подагре и хондрокальцинозе; ревматоидный артрит и другие ревматологические заболевания; острые респираторные инфекции, включая различные разновидности гриппа и коронавируса; атеросклероз и многие другие воспалительные заболевания.
Макрофаги играют ключевую роль в воспалительной реакции. В ходе воспаления они последовательно репрограммируются в провоспалительный М1 и затем в антивоспалительный М2 фенотипы.
М2 макрофаги обладают способностью к ограничению воспаления, ремоделированию и репарации поврежденной ткани. Исходя из стимулов и происходящих в результате стимулирования транскрипционных изменений, макрофаги фенотипа M2 разделяют на четыре подтипа: альтернативные активированные макрофаги (M2a, активируемые IL-4 или IL-13), макрофаги типа 2 (M2b, активируемые иммунными комплексами и LPS), дезактивированные макрофаги (M2c, активированные глюкокортикоидами или IL-10) и M2-подобные макрофаги (M2d, активируемые аденозинами или IL-6) (Huang X. et al. Polarizing macrophages in vitro // Methods in Molecular Biology. 2018. Vol. 1784. P. 119–126).
Поэтому современные технологии управления воспалительной реакцией основываются на сдвиге М1/М2 баланса макрофагов в сторону увеличения количества М2 макрофагов в зоне воспаления. Основной проблемой, которая препятствует использованию М2 макрофагов для ограничения воспаления, является их неспособность удерживать антивоспалительный фенотип в условиях агрессивного провоспалительного микроокружения и их быстрое репрограммирование на провоспалительный М1 фенотип.Поэтомусуществует необходимостьв разработке нового антивоспалительного фенотипа макрофагов, лишенного указанного недостатка и способного продуцировать антивоспалительные медиаторы в условиях провоспалительного микроокружения.
Одним из значительных достижений в терапии воспалительных заболеваний различной этиологии является появление так называемых био(техно)логических препаратов (агентов)[Cavagna L., Taylor W.J. The Emerging Role of Biotechnological Drugs in the Treatment of Gout // Biomed Res. Int. 2014. Vol. 2014. P. 1–9.]. К таким био(техно)логическим агентам относятся, в первую очередь, блокаторы IL-1β, а также TNFα и IL-6 [So A. et al. Canakinumab for the treatment of acute flares in difficult-to-treat gouty arthritis: Results of a multicenter, phase II, dose-ranging study // Arthritis Rheum. John Wiley and Sons Inc., 2010. Vol. 62, № 10. P. 3064–3076.; Schlesinger N. et al. Canakinumab relieves symptoms of acute flares and improves health-related quality of life in patients with difficult-to-treat Gouty Arthritis by suppressing inflammation: Results of a randomized, dose-ranging study // Arthritis Res. Ther. 2011. Vol. 13, № 2. P. R53.; So A. et al. Canakinumab for the treatment of acute flares in difficult-to-treat gouty arthritis: Results of a multicenter, phase II, dose-ranging study // Arthritis Rheum. JohnWileyandSonsInc., 2010. Vol. 62, № 10. P. 3064–3076].
Еще одной антивоспалительной био(техно)логической стратегией в терапии воспалительных заболеваний является клеточная терапия с использованием мезенхимальных стволовых клеток и макрофагов[Regmi S. et al. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of inflammatory diseases: Challenges, opportunities, and future perspectives // Eur. J. Cell Biol. Elsevier, 2019. № April. P. 0–1.; Chan M.W.Y., Viswanathan S. Recent progress on developing exogenous monocyte/macrophage-based therapies for inflammatory and degenerative diseases // Cytotherapy. Elsevier, 2019. Vol. 21, № 4. P. 393–415.].
CD11b (Mac-1), CD14, c-fms, Lysozyme M и Scavenger Receptor Class A (SRA)
Из уровня техники известно использование для лечения одного или нескольких связанных с воспалением состояний или заболеваний генно-модифицированных макрофагов, полученных из моноцитов в области воспаления и экспрессирующих, в частности, трансген TGFβ под управлением одного из промоторов специфических генов макрофагов, таких как  для подавления воспалительной реакции, описанное в патенте EP2753365 B1, опубл. 22.03.2017. Активация промотора в результате дифференцировки моноцитов в макрофагии, следовательно, увеличение продукции TGFβ в месте воспаления происходит автоматически без дополнительных воздействий за счет введенного в клетки трансгена. По окончании лечения такие макрофаги удаляются в результате апоптоза.
Однако, получение таких макрофагов связано с использованием технологии генной модификации. Кроме того, известные макрофаги не способны к автоматическому снижению секреции TGFβ или другого антивоспалительного фактора при исчезновении провоспалительных стимулов при завершении воспаления. Кроме того, известные макрофаги не блокируют продукцию провоспалительных факторов, например, IL-1β, в зоне воспаления. Стабильная продукция антивоспалительного цитокина TGFβ макрофагами в условиях, когда воспаление уже закончилось, может привести к снижению бактерицидных и антивирусных свойств иммунитета. Кроме того, продолжающаяся секреция провоспалительных факторов снижает антивоспалительный эффект известных макрофагов. В заявляемом изобретении предусмотрен механизм, обеспечивающийблокаду секреции провоспалительного медиатора IL-1β, который является основным патогенетическим фактором при многих формах воспаления, а также автоматическое снижение продукции антивоспалительных факторов при уменьшении интенсивности провоспалительной стимуляции. Все вместе это может привести к повышению безопасности и эффективности антивоспалительной терапии с использованием заявляемых макрофагов по сравнению с известными макрофагами.
Из уровня техники известны модифицированный антивоспалительный макрофаг и фармацевтическая композиция на его основе для лечения воспаления и связанных с ним заболеваний/состояний (WO2015081253 A1, опубл. 04.06.2015).Макрофаг характеризуется способностью продуцировать антивоспалительные факторы, т.е. проявляет фенотип М2, и является аутологичным для пациента. Способ получения модифицированного макрофага включает стимуляцию макрофагов средой, приемлемой для поддержания жизнеспособности и функционирования макрофагов, и содержащей цитокины IL-4, IL-10 и TGFβ, блокирующие поляризацию макрофагов М1 (провоспалительных) и стимулирующих поляризацию М2 (антивоспалительных), где макрофаги получают, в частности, в результате дифференцировки моноцитов. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительных заболеваний содержит вышеуказанные макрофаги, а способ подавления воспалительной реакции, в том числе при ревматоидном артрите, включает введение такой композиции.
Однако в публикации описан известныйспособ поляризации макрофагов (получения М2 макрофагов) при помощи известных антивоспалительных стимулов, которые при попадании в провоспалительную среду будут быстро перепрограммированы на М1 фенотип под влиянием провоспалительных факторов в месте воспаления и утратят свою антивоспалительную функцию. В заявляемом изобретении именно провоспалительные стимулы индуцируют М2 фенотип, что вызывает секрецию антивоспалительных цитокинов в условиях провоспалительной микросреды.
PloSone
Из уровня техники известен также модифицированный макрофаг, трансфицированный плазмидой, содержащей химерный трансген, кодирующий IL-10 (Xie, Linglin, etal. "Overexpression of IL-10 in C2D macrophages promotes a macrophage phenotypic switch in adipose tissue environments."  9.1 (2014), стр.14983). Авторами описаны макрофаги, стабильно сверхэкспрессирующие IL-10 (C2D-IL10), и проанализированы клетки C2D-IL10, по сравнению с клетками C2D, трансфицированными пустым (без IL-10) вектором C2D-вектором. Макрофаги C2D-IL10 экспрессировали больше CD206 при совместном культивировании с адипоцитами, чем клетки C2D-вектора; совместно культивированная клеточная смесь также экспрессировала более высокие уровни IL-4, IL-10, IL-1β и TNF. Клетки C2D-IL10, выделенные из жировой ткани, увеличили процент CD206+, CD301+, CD11c-CD206+(M2) и CD11c +CD206 + (M2b) на их клеточной поверхности, по сравнению с клетками C2D-вектора. Эти данные предполагают, что экспрессия IL-10 остается стабильной, изменяет фенотип клеточной поверхности макрофагов C2D-IL10 и может играть роль в регуляции взаимодействия макрофагов с жировой тканью.
Однако представленные в публикации C2D-IL-10 макрофаги благодаря гену IL-10 (введенному с плазмидой) постоянно и избыточно продуцируют IL-10 и в воспалительной, и анти-воспалительной, и нормальной среде. Стабильная продукция анти-воспалительного цитокина IL-10 C2D-IL-10 макрофагами в условиях, когда воспаления нет или воспаление уже закончилось может привести к вымыванию IL-10 в системную циркуляцию и потенциально опасным побочным эффектам, в частности, к снижению бактерицидных и антивирусных свойств иммунитета.
По сравнению с известным макрофагом заявляемый макрофаг усиленно продуцирует антивоспалительные цитокины только в провоспалительной среде. Заявляемый макрофаг, в отличие от C2D-IL-10 макрофага, обладает уникальной способностью взаимодействия с внешней средой: когда воспалительные факторы действуют на макрофаг – он продуцирует анти-воспалительные цитокины больше, чем обычные макрофаги. В отсутствии воспаления заявляемый макрофаг не продуцирует анти-воспалительных цитокинов больше, чем нормальные макрофаги, в связи с отсутствием действия воспалительных факторов, стимулирующих анти-воспалительную ветвь дихотомического сигналинга в макрофаге.
Таким образом, макрофаги, описанные в перечисленных выше публикациях, не обладают способностью активировать продукцию анти-воспалительных цитокинов в про-воспалительной среде и не продуцировать анти-воспалительные цитокины, если воспаления нет.
Наиболее близким к заявляемому являются толерантные макрофаги (Мтол) (Porta C. et al. Tolerance and M2 (alternative) macrophage polarization are related processes orchestrated by p50 nuclear factor B // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106. P. 14978-14983), которые продуцируют антивоспалительные цитокины в ответ на провоспалительный стимул липополисахаридов. В данной публикации представлен фенотип макрофагов, который получается естественным путем в результате множественной стимуляции моноцитов/макрофагов липополисахаридами, и представлены результаты исследования механизмов развития толерантности макрофагов при сепсисе, механизмов негативной регуляции иммунных ответов на стимуляцию толл-подобных рецепторов и механизмов толерантности макрофагов при длительной стимуляции липополисахаридами.
Однако толерантность макрофагов достигается не за счет блокирования внутриклеточных сигнальных путей, а за счет изменения субъединичного состава NFkB. NFkB остается по-прежнему активен, но начинает стимулировать антивоспалительные гены.
В заявляемом изобретении происходит блокирование инфламмасомы химическими ингибиторами. Кроме того, в заявляемом изобретении наблюдается усиление эффекта от использования одновременно блокаторов провоспалительной ветви и стимуляторов антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути.
Технической проблемой, решаемой заявляемым изобретением, является получение модифицированного антивоспалительного макрофага «М2-подобного» фенотипа, способного удерживать антивоспалительный фенотип в условиях агрессивного провоспалительного микроокружения и не репрограммироваться на провоспалительный М1 фенотип, что обеспечивает повышение эффективности антивоспалительной терапии.
Раскрытие изобретения
Технический результат изобретения заключаетсяв получении модифицированного антивоспалительного фенотипа макрофага (АВ-М3; М3), который (1) значительно меньше (не менее, чем в 10 раз) продуцирует IL-1β и (2) значительно усиливает продукцию цитокина TGFβ(не менее, чем в 1,5 раза)по сравнению с неактивированными макрофагами М0 фенотипа в ответ на воздействие провоспалительного стимула при снижении побочных эффектов за счет автоматического снижения секреции TGFβ при исчезновении провоспалительных стимулов при завершении воспаления.
Технический результат достигается при использовании модифицированного антивоспалительного макрофага для лечения одного или более одного связанного с воспалением состояния или заболевания, который характеризуется способностью продуцировать антивоспалительные факторы в ответ на провоспалительные стимулы с сохранением своей антивоспалительной активности в провоспалительной микросреде (устойчивостью к воздействию провоспалительных стимулов), и снижать продукцию антивоспалительных факторов в ответ на снижении провоспалительных стимулов.
Таким образом, заявляемый макрофаг отличается от известных тем, что инициируют автоматический запуск секреции антивоспалительного фактора, например, TGFβ, в месте воспаления под воздействием провоспалительного микроокружения. Кроме того, получаемый макрофаг способен блокировать продукцию провоспалительных факторов, например, IL-1β в зоне воспаления и автоматически снижать секрецию TGFβ или другого антивоспалительного фактора при исчезновении провоспалительных стимулов при завершении воспаления, а также поляризовать предсуществующие макрофаги в области воспаления в сторону антивоспалительного М2 фенотипа.
Модифицированный макрофаг может быть получен с помощью малых молекул- органических соединений с молекулярной массой менее 900 Дальтон.
По сравнению с неактивированными макрофагами М0 фенотипа в ответ на воздействие провоспалительного стимула заявляемый макрофаг обеспечивает значительное(не менее 10 раз) ослабление продукции IL-1β и значительное (не менее 1,5 раза) усиление продукции цитокина TGFβ, что повышает эффективность антивоспалительной терапии.
Предпочтительный вариант осуществления изобретения включает модифицированный антивоспалительный макрофаг, подходящий для лечения одного или более одного связанного с воспалением состояния или заболевания, характеризующийся способностью продуцировать антивоспалительные факторы в ответ на провоспалительные стимулы, где  модифицированный антивоспалительный макрофаг характеризуется минимальным значением базовой секреции IL-1β и секреции IL-1β в ответ на провоспалительные стимулы – не более 20 пг/мл,  а также значительным ростом продукции TGFβ – до уровня не менее 1100 пг/мл в ответ на провоспалительные стимулы в условиях провопалительной микросреды и получен модификацией ex vivo путем блокады провоспалительной ветви и стимуляции интактной антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными стимулами окружающей микросреды.
Модифицированный антивоспалительный макрофаг может быть получен фармакологическим путем при помощи малых молекул и содержит:
заблокированную провоспалительную ветвь и интактную антивоспалительную ветвь внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными стимулами окружающей микросреды, при этом блокировка провоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути реализована посредством фармакологической блокады NLRP3 инфламмасомы, или IL-1R/NF-kB/МАРК-связанных киназ, или провоспалительных факторов транскрипции NF-kB и STAT1, а интактная антивоспалительная ветвь внутриклеточного сигнального пути дополнительно стимулирована посредством использования цитокинов IL-4, или IL-10, или TGFβ.
Для блокировки провоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути используют ингибитор NLRP3-инфламмасомы МСС950 в количестве 1 – 10 мкмоль, а для стимуляции интактной антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути используют IL-4 в количестве 20-80 нг/мл на один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов.
Наиболее предпочтительный вариант воплощения заключается в получении модифицированного антивоспалительного макрофага путем модификации макрофага ex vivo посредством культивирования в инкубационной среде с 5 мкмоль/мл МСС950 в сочетании с 40 нг/мл IL-4 на один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов.
Модифицированный антивоспалительный макрофаг может быть представлен макрофагом млекопитающего, в том числе аутологичным макрофагом.
Предпочтительный вариант способа получения указанного антивоспалительного макрофага включает получение аутологичных макрофагов и их модификацию ex vivo фармакологическим путем посредством культивирования в инкубационной среде малых молекул, оказывающих блокирующее действие провоспалительной ветви и стимулирующее действие антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными стимулами в области воспаления.
Малые молекулы, блокирующие провоспалительную ветвь и стимулирующие антивоспалительную ветвь внутриклеточного сигнального пути, могут быть добавлены в инкубационную среду одновременно или последовательно.
При этом в качестве молекулы, блокирующей провоспалительную ветвь внутриклеточного сигнала используют:
- ингибитор NLRP3-инфламмасомы MCC950, или ингибитор фермента ТАК1 или ингибитор фактора транскрипции NFkB,
а в качестве малой молекулы, оказывающей стимулирующее действие антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, используют:
- цитокин IL-4, или IL-10, или TGFβ.
Ингибитор NLRP3-инфламмасомы используют в количестве 1 – 10 мкмоль на один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов на один мл инкубационной среды.
Цитокин используют в количестве от 20 до 80 нг на один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов на один мл инкубационной среды.
В качестве инкубационной среды используют среды RPMI-1640 или DMEM/F12 или среду, приемлемую для поддержания жизнеспособности и функционирования макрофагов.
При этом указанные аутологичные макрофаги получают из биологической жидкости или ткани млекопитающего или в результате транс-дифференцировки клеток предшественников, включая моноциты периферической крови и клетки костного мозга, ex vivo.
Наиболее предпочтительное воплощение способа получения антивоспалительного макрофага заключается в использовании МСС950 в сочетании с IL-4, т.е. в качестве малой молекулы, оказывающей блокирующее действие провоспалительной ветви, используют ингибитор NLRP3-инфламмасомы МСС950 в количестве 1 – 10 мкмоль, конкретно 5 мкмоль/млна один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов, а в качестве малой молекулы, оказывающей стимулирующее действие на антивоспалительную ветвь внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными стимулами в области воспаления, используют IL-4 в количестве 20-80 нг/мл, конкретно40 нг/мл на один мл инкубационной среды, содержащей 1-2 млн макрофагов.
Предпочтительный вариант осуществления фармацевтической композиции, пригодной для лечения одного или более одного связанного с воспалением состояния или заболевания, заключается в получении состава композиции, содержащейуказанные модифицированные антивоспалительные макрофаги, полученные указанным способом, в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательный агент, консервант, стабилизатор и/или наполнитель.
В качестве фармацевтически приемлемого носителя используют культуральную или гидрогелевую среду.
Фармацевтическая композиция может быть выполнена в форме капсулы или геля.
Состав фармацевтической композициипри необходимости может быть дополнен одним или несколькими веществами, выбранными из группы, включающей вспомогательный антивоспалительный агент, консерванты, стабилизаторы, наполнители.
В наиболее предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция предназначена для терапии аутовоспалительных заболеваний, включая микрокристаллические артриты при подагре и хондрокальцинозе; ревматологических заболеваний, включая ревматоидный артрит; острых респираторных заболеваний, включая вирусные инфекции, такие какгрипп и коронавирус; атеросклероз; дерматит; воспалительные заболевания легких и других органов и тканей.
Предпочтительный вариант осуществления способа подавления воспалительной реакции заключается впримененииуказанной фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.
При этом применение осуществляют инъекционно непосредственно в область воспаления, соседнюю область и/или кровоток; либо с помощью эндоскопа; либо посредством наложения гелей с фармацевтической композицией на воспаленную поверхность кожи.
5
9
В наиболее предпочтительном воплощении способ подавления воспалительной реакции заключается в том, что суточная доза фармацевтической композиции содержит 10- 10 модифицированных макрофагов, которые вводят до достижения терапевтического эффекта.
Предложенный модифицированный антивоспалительный макрофаг может быть использован для подавления воспалительной реакции.
Также предложенный модифицированный антивоспалительный макрофаг за счет подавления воспалительной реакции может быть пригоден в лечении одного или более одного связанного с воспалением состояния или заболевания.
В наиболее предпочтительном воплощениимодифицированный антивоспалительный макрофаг применяют в лечении одного или более одного связанного с воспалением состояния или заболевания, которое выбрано из аутовоспалительного заболевания, включая микрокристаллические артриты при подагре и хондрокальцинозе; ревматологического заболевания, включая ревматоидный артрит; острого респираторного заболевания, включая грипп и коронавирус; атеросклероза; дерматита; воспалительного заболевания легких или других органов и тканей.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется иллюстративным материалом.
На фиг. 1 представлена схема переключения внутриклеточного сигнала от кристаллов на формирование антивоспалительного фенотипа переключения с помощью ингибитора NLRP3 и IL-4;
in vitro
На фиг. 2 представлена схема экспериментов .
2
Перитонеальные макрофаги разделены на три пула, каждый из которых разделен на 4 группы, соответствующие четырем фенотипам макрофагов: М0, М2а, толерантные макрофаги (Мтол) и М3. Перепрограммирование макрофагов на фенотипы М2а, Мтол и М3 проводили в течение 18 часов путем добавления в инкубационную среду следующих веществ: для получения М2а фенотипа – IL-4 (20 нг/мл), для получения Мтол – ЛПС (100 нг/мл) и для получения М3 фенотипа – МСС950 (1, 5 и 10 мкмоль/мл) в сочетании с IL-4 (20, 40 и 80 нг/мл). Фенотип М0 рассматривали как исходный, наблюдающийся при культивировании макрофагов в стандартных условиях (среда RPMI-1640 c 10% FBS, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 5% О) без добавления каких-либо дополнительных веществ.
По окончании перепрограммирования, то есть через 18 часов после начала эксперимента, к макрофагам пулов 2 и 3 были добавлены кристаллы MSU (200 нг/мл) и культивирование с кристаллами продолжалось в течение последующих 24 часов. Макрофаги пула 1 культивировались без добавления кристаллов в течение последующих 24 часов.
Через 24 часа после добавления кристаллов макрофаги пула 3 были отмыты от кристаллов и культивирование было продолжено в течение последующих 24 часов. Макрофаги пула 2 продолжали культивироваться с кристаллами, а макрофаги пула 1 – без кристаллов в течение последующих 24 часов.
Через 24 часа после отмывки кристаллов эксперимент завершился забором среды во всех группах всех пулов и анализом концентраций IL-1β и TGFβ.
М0, М2а, Мтол и М3 – макрофаги различных фенотипов, культивируемые без кристаллов; М0+К, М2а+К, Мтол+К и М3+К – макрофаги различных фенотипов, культивируемые с кристаллами; М0-К, М2а-К, Мтол-К и М3-К – макрофаги различных фенотипов, отмытые от кристаллов. Количество экспериментов n=3.
На фиг. 3 представлены графики, демонстрирующие уровень IL-1β (А) и TGFβ (Б) в среде культивирования макрофагов различных фенотипов без кристаллов и после добавления кристаллов.
На фиг. 4 представлен график разницы температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап мышина различном сроке после инъекции кристаллов MSU в подушечку экспериментальной лапы относительно разницы температур до инъекции (день 0, Д0).
На фиг. 5 представлен график разниц температур на поверхности экспериментальной и контрольной лапмыши на различном сроке после инъекции кристаллов MSU в подушечку экспериментальной лапы в одной экспериментальной группе относительно двух других экспериментальных групп.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение включает макрофаги с антивоспалительным фенотипом переключения со способностью сохранять антивоспалительную активность в форме секреции TGFβ и других антивоспалительных цитокинов в условиях воспаления, фармакологический препарат, пригодный для терапии воспаления, и метод использования макрофагов с антивоспалительным фенотипом переключения для ограничения воспаления различной этиологии.
ex vivo
Макрофаги с антивоспалительным фенотипом переключения получают из готовых макрофагов или моноцитов , предпочтительно аутологичных,которые содержат заблокированную провоспалительную ветвь внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительным стимулом. Блокада провоспалительной ветви достигается путем фармакологической блокады NLRP3 инфламмасомы, или TLRs/IL-1Rs-связанных киназ, или провоспалительных факторов транскрипции NF-kB иSTAT1.
per se
invitro,
Заявляемое репрограммирование макрофагов с использованием ингибитора инфламмасомы NLRP3 основано на данных, демонстрирующих участие кристаллов моноурата натрия (и других провоспалительных стимулов) в процессе активации инфламмасомы NLRP3 и каспазы-1 макрофагов с последующим преобразованием pro-IL-1β в провоспалительный цитокин IL-1β[So A.K., Martinon F. Inflammation in gout: Mechanisms and therapeutic targets // Nature Reviews Rheumatology. 2017. Vol. 13, № 11. P. 639–647].Далее, IL-1β связывается с рецепторами IL-1R, которые широко представлены на клетках различных типов, включая макрофаги, и запускает мощный провоспалительный каскад реакций[Arthur J.S.C., Ley S.C. Mitogen-activated protein kinases in innate immunity // Nat. Rev. Immunol. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 13, № 9. P. 679–692].Кроме того, полагают, что кристаллы моноурата натрия способны к IL-1β-подобной активации воспалительного каскада [Singh A.K. et al. Suppression of monosodium urate crystal-induced inflammation by inhibiting TGFβ-activated kinase 1-dependent signaling: role of the ubiquitin proteasome system // Cell. Mol. Immunol. ChineseSocImmunology, 2019. https://doi.org/10.1038/s41423-019-0284-3]. Эффект блокады различных звеньев этого каскада на кристалл-индуцированное воспаление в настоящий момент исследован недостаточно. Имеются единичные данные, показывающие, что блокада, например, TGFβ-активируемой киназы 1 (TAK1) приводила к полной остановке кристалл-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов THP-1 макрофагами  а также к значительному ослаблению кристалл-индуцированного воспаления в лапе мышей линии C57Bl/6 при пероральном введении ингибитора ТАК1[Singh A.K. et al. Suppression of monosodium urate crystal-induced inflammation by inhibiting TGF-β-activated kinase 1-dependent signaling: role of the ubiquitin proteasome system // Cell. Mol. Immunol. ChineseSocImmunology, 2019. https://doi.org/10.1038/s41423-019-0284-3]. Следует отметить, что ингибиторы IRAK1/4 или TRAF6 такого результата не вызывали.
Макрофаги с антивоспалительным фенотипом переключения содержат интактную антивоспалительную ветвь внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительным стимулом, которая дополнительно стимулируется. Стимуляция антивоспалительной ветви достигается при помощи цитокинов IL-4, или IL-10, или TGFβ.
В уровне техники не описан эффект блокады ТАК1 (и других элементов провоспалительных внутриклеточных сигнальных путей, включая факторы транскрипции NF-kB и STAT1) макрофагов на продукцию антивоспалительных цитокинов в условиях провоспалительной стимуляции кристаллами (и другими провоспалительными стимулами) на фоне дополнительной стимуляции антивоспалительных внутриклеточных сигнальных путей, что схематично показано на фиг.1.
exvivo
Аутологичные макрофаги могут быть получены различными способами, например, путем транс-дифференцировки из аутологичных моноцитов  или путем выделения готовых макрофагов из жидкостей и тканей пациента.Аутологичные моноциты могут быть выделены различными способами, например: венозный забор крови с последующим выделением моноцитов из венозной крови, адсорбционный аферезис, выделение предшественников моноцитов из костного мозга, выделение моноцитов из замороженной пуповинной крови пациента, получение моноцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациента и другие способы, дающие возможность получить достаточное количество моноцитов. Предполагается, что, какая-то часть выделенных клетокбудет заморожена для обеспечения возможности множественных инфузий.
ex vivo
Способ включает транс-дифференцировку макрофагов из аутологичных моноцитов  любым из стандартных способов.
ex vivo
Способ включает репрограммирование аутологичных макрофагов  на антивоспалительный фенотип переключения путем добавления в инкубационную среду – одновременно или последовательно – блокаторов провоспалительной ветви и стимуляторов антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными факторами микроокружения. Могут быть использованы один или несколько блокаторов провоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительным стимулом, и один или несколько стимуляторов антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительным стимулом.
2
2
В одном из вариантов осуществления изобретения для репрограммирования противовоспалительного фенотипа переключения макрофагов были использованы: (1) MCC950 – ингибитор инфламмасомы NLRP3 [SoA.K., MartinonF. Inflammationingout: Mechanismsandtherapeutictargets // NatureReviewsRheumatology. 2017. Vol. 13, № 11. P. 639–647; Primiano M.J. et al. Efficacy and Pharmacology of the NLRP3 Inflammasome Inhibitor CP-456,773 (CRID3) in Murine Models of Dermal and Pulmonary Inflammation // J. Immunol. AmericanAssociationofImmunologists, 2016. Vol. 197, № 6. P. 2421–2433] в концентрации 1-10 мкмоль/мл, предпочтительно 5 мкмоль/мл, и (2) IL-4 в концентрации 20-80 нг/мл, предпочтительно 40 нг/мл. Репрограммирование выполнялось на макрофагах, полученных из перитонеальной жидкости мышей. Готовили суспензию клетокв среде RPMI-1640 или любой другой стандартной культуральной среде для макрофагов без FBS. Для отделения макрофагов от других клеток суспензию помещали в лунки 48-луночного планшета по 0,5 мл в каждую лунку. Плашки убирали в CO-инкубатор (5% СО, 37°С). Через 1 час среду вместе с неприкрепившимися клетками удаляли и заменяли на 0,5 мл среды RPMI-1640 c 10% FBS, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Количество прикрепившихся ко дну лунки макрофагов может варьировать от 500 тыс. до 1 млн. После этого в среду одновременно или последовательно с интервалом до 6 часов добавляли MCC950 и IL-4. Общий период культивированиясоставлял 18-48 часов. После этого среду заменяли на новую и макрофаги снимали с лунки любым из общепринятых способом.
Настоящее изобретение включает фармакологический препарат, пригодный для терапии воспаления различной этиологии. Этот препарат содержит макрофаги с антивоспалительным фенотипом переключения, культуральную среду или гидрогелевую среду, консерванты.
Дополнительно фармакологический препарат может содержать одно или несколько веществ, выбранных из группы, включающей антивоспалительный агент (например, 5-аминосалицилат или кортикостероид), консерванты, стабилизаторы, наполнители (например, 0.9% NaClc 0.5% сывороточным альбумином).
Препарат может использоваться в комбинированной терапии со стероидными и нестероидными антивоспалительными препаратами, иммуносупрессорами и другими био(техно)логическими препаратами.
Настоящее изобретение включает способ лечения воспаления различной этиологии с использованием макрофагов с антивоспалительным фенотипом переключения. Способ лечения воспаления макрофагами с антивоспалительным фенотипом переключения предполагает идентификацию пациента. Этот пациент является человеком или животным. У этого пациента наблюдается одно или несколько заболеваний из следующего списка: аутовоспалительные заболевания, включая микрокристаллические артриты при подагре и хондрокальцинозе; ревматоидный артрит и другие ревматологические заболевания; острые респираторные заболевания, такие как вирусные инфекции, включая различные разновидности гриппа и коронавируса; атеросклероз и многие другие воспалительные заболевания.
in vivo
5
9
Способ включает репрограммирование макрофагов  на антивоспалительный фенотип переключения путем инъекционного введения макрофагов с противовоспалительным фенотипом переключения пациенту непосредственно в область воспаления, соседнюю область и/или кровоток, а также с помощью эндоскопа или дыхательной смеси – одновременно или последовательно – блокаторов провоспалительной и стимуляторов антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительными факторами окружающей микросреды. Могут быть использованы один или несколько блокаторов провоспалительной ветви и один или несколько стимуляторов антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути, активируемого провоспалительным стимулом. Количество одноразово введенных макрофагов может быть в диапазоне 10÷ 10на одного пациента.Данный диапазон значений был определен по результатам проведенных экспериментов.
Далее, способ предполагает накопление макрофагов с антивоспалительным фенотипом переключения в области воспаления и активацию внутриклеточного сигнального пути под воздействием провоспалительных факторов окружающей микросреды. Результатом активации внутриклеточного сигнального пути макрофагов с антивоспалительным фенотипом переключения при действии провоспалительных факторов окружающей микросреды будет локальная секреция антивоспалительного цитокина TGFβ или другого антивоспалительного фактора, приводящая к подавлению воспаления при отсутствии значимых побочных эффектов, в особенности, системного подавления иммунитета. Другим результатом секреции TGFβ или другого антивоспалительного фактора будет «М2-подобная» поляризации предсуществующих макрофагов в области воспаления, что приведет к синергии и повышению эффективности терапии. Важно отметить, что запуск секреции TGFβ или другого антивоспалительного фактора при попадании макрофагов с антивоспалительным фенотипом переключения в зону воспаления происходит автоматически, без дополнительного воздействия. По окончании лечения секреция TGFβ или другого антивоспалительного фактора макрофагами с антивоспалительным фенотипом переключения прекращается точно так же, автоматически, без дополнительного воздействия – в результате прекращения действия провоспалительных факторов окружающей микросреды, а сами макрофаги подвергаются апоптозу и не вызывают долгосрочных побочных эффектов.
Получение модифицированного макрофага с заявляемыми свойствами обеспечивается путем блокады провоспалительной ветви и стимуляции антивоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути макрофагов, активируемогопровоспалительным стимулом. Такое репрограммирование приводит к переключению внутриклеточного сигнала от провоспалительного стимула на продукцию антивоспалительных факторов. Получившийся фенотип макрофагов авторами настоящего изобретения названантивоспалительным фенотипом переключения. Блокада провоспалительной ветви в конкретном варианте осуществления изобретения достигалась при помощи блокатора NLRP3 инфламмасомы MCC950. Антивоспалительная ветвь внутриклеточного сигнала оставалась интактной и дополнительно стимулировалась цитокином IL-4. Для оценки эффективности применяемой технологии репрограммирования использовалась модель кристаллиндуцированного воспаления, вызванного кристаллами моноурата натрия (фиг.2).
Настоящее изобретение достаточно детально описывает разные аспекты заявляемой биотехнологии, возможны так же другие варианты решения задач настоящего изобретения, так что содержание данного изобретения не ограничивается перечисленными ниже примерами.
Пример 1
Для достижения оптимального результата в предлагаемой клеточной биотехнологии репрограммирования противовоспалительного фенотипа переключения макрофагов были использованы два вещества: (1)MCC950 – ингибитор инфламмасомы NLRP3 [SoA.K., MartinonF. Inflammationingout: Mechanismsandtherapeutictargets // NatureReviewsRheumatology. 2017. Vol. 13, № 11. P. 639–647; Primiano M.J. et al. Efficacy and Pharmacology of the NLRP3 Inflammasome Inhibitor CP-456,773 (CRID3) in Murine Models of Dermal and Pulmonary Inflammation // J. Immunol. AmericanAssociationofImmunologists, 2016. Vol. 197, № 6. P. 2421–2433] в концентрациях 1, 5и 10 мкмоль/мл – для блокады провоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути макрофагов, активируемого кристаллами моноурата натрия (MSU), и (2)IL-4 в концентрациях 20, 40и 80 нг/мл – для дополнительной стимуляции противовоспалительной ветви внутриклеточного сигнального пути макрофагов, активируемого кристаллами MSU.
В качестве аналогов использовали макрофаги фенотипа М2а [Huang X. et al. Polarizingmacrophagesinvitro // MethodsinMolecularBiology. 2018. Vol. 1784. P. 119–126] итолерантныемакрофаги (Мтол)[PortaC. etal. Tolerance and M2 (alternative) macrophage polarization are related processes orchestrated by p50 nuclear factor B // Proc. Natl. Acad. Sci. 2009. Vol. 106, № 35. P. 14978–14983].
Фенотип М0 рассматривали как исходный (resting, не-активированный), наблюдающийся при культивировании макрофагов в стандартных условиях[Zhao Y. et al. Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow // J. Zhejiang Univ. B. 2017. Vol. 18, № 12. P. 1055–1063; Huang X. et al. Polarizing macrophages in vitro // Methods in Molecular Biology. 2018. Vol. 1784. P. 119–126].
Суспензия кристаллов была приготовлена из сухих кристаллов MSU с концентрацией 5мкг/мкл. Суспензия была автоклавирована при 120°С в течение 20 мин.
in vitro
in vivo
Моделирование кристалл-индуцированного воспаления  и  проводили с использованием самцов мышей линии C57/BL6J весом 23,8±1,8 г. Из вивария Андреевка (Москва, Россия, http://andreevka.msk.ru/index.htm). Эксперименты проводили в соответствии с руководством ВОЗ по биомедицинским исследованиям (http://www.cioms.ch/publications/guidelines/1985_texts_of_guidelines.htm). Протокол экспериментов был утвержден Комитетом по этике ФГБНУ НИИОПП. Животные содержались в условиях аккредитованного вивария ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России в стандартных условиях, не допускающих попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище согласно Приказу № 63 МЗ СССР от 10.03.1966 «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за № 1045-73, утвержденному Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с положениями Приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с соблюдением правил Надлежащей Лабораторной Практики РФ, ГОСТ Р-53434-2009. Группы животных были сопоставимы по возрасту, весу, полу.
2
2
Эксперименты были выполнены на макрофагах, полученных из перитонеальной жидкости мышей. За 48 часов до выделения макрофагов мышам вводили 1,5 мл 5% раствора пептонного бульона (37°С, внутрибрюшинно). Выделение макрофагов проводили из перитонеального смыва. Перитонеальный смыв центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при 4°С и проводили четырехкратную отмывку клеточного осадка раствором PBS (4°С). Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI-1640 без FBS. В камере Горяева подсчитывали количество клеток и определяли их жизнеспособность с помощью трипанового синего (http://www.hyclone.com/pdf/procedure_assay.pdf). Процент живых клеток был во всех случаях не менее 95%. После этого готовили суспензию клеток 1,2млн/мл в среде RPMI-1640 без FBS. Для отделения макрофагов от других клеток суспензию помещали в лунки 48-луночного планшета по 0,5 мл в каждую лунку. Плашки убирали в CO-инкубатор (5% СО, 37°С). Через 1 час среду вместе с неприкрепившимися клетками (около 100 тыс. клеток на лунку) удаляли и заменяли на 0,5 мл среды RPMI-1640 c 10% FBS, 2 ммоль/л L-глутамина, 100Ед/мл пенициллина и 100мкг/мл стрептомицина. В лунках оставалось по 500 тыс. прикрепившихся ко дну макрофагов.
in vitro
2
Схема (дизайн) экспериментов  представлен на фиг. 2.Перитонеальные макрофаги, выделенные из нескольких мышей, были тщательно перемешаны, отцентрифугированы, отмыты и разделены на три пула, каждый из которых разделен на 4 группы, соответствующие четырем фенотипам макрофагов: М0, М2а, Мтол и М3. Перепрограммирование макрофагов на фенотипы М2а, Мтол и М3 проводили в течение 18 часов путем добавления в инкубационную среду следующих веществ: для получения М2а фенотипа – IL-4 (20 нг/мл), для получения Мтол – ЛПС (100 нг/мл) и для получения М3 фенотипа – МСС950 (1, 5 и 10 мкмоль/мл) в сочетании с IL-4 (20, 40 и 80 нг/мл). Фенотип М0 рассматривали как исходный, наблюдающийся при культивировании макрофагов в стандартных условиях (среда RPMI-1640 c 10% FBS, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 5% О) без добавления каких-либо дополнительных веществ.
По окончании перепрограммирования, то есть через 18 часов после начала эксперимента, к макрофагам пулов 2 и 3 были добавлены кристаллы MSU (200 нг/мл) и культивирование с кристаллами продолжалось в течение последующих 24 часов. Макрофаги пула 1 культивировались без добавления кристаллов в течение последующих 24 часов.
Через 24 часа после добавления кристаллов макрофаги пула 3 были отмыты от кристаллов и культивирование было продолжено в течение последующих 24 часов. Макрофаги пула 2 продолжали культивироваться с кристаллами, а макрофаги пула 1 – без кристаллов в течение последующих 24 часов.
Через 24 часа после отмывки кристаллов эксперимент завершился забором среды во всех группах всех пулов и анализом концентраций IL-1β и TGFβ.
М0, М2а, Мтол и М3 – макрофаги различных фенотипов, культивируемые без кристаллов; М0+К, М2а+К, Мтол+К и М3+К – макрофаги различных фенотипов, культивируемые с кристаллами; М0-К, М2а-К, Мтол-К и М3-К – макрофаги различных фенотипов, отмытые от кристаллов. Количество экспериментов n=3.
in vitro
Моделирование подагрического воспаления  проводили с помощью добавления к культуре макрофагов 200 нг/мл кристаллов MSU[SilP. Etal. Macrophage-derived IL-1β enhances monosodium urate crystal-triggered NET formation // Inflamm. Res. BirkhauserVerlagAG, 2017. Vol. 66, № 3. P. 227–237]. Такая концентрация сопоставима с содержанием солей мочевой кислоты в синовиальной жидкости суставов пациентов с подагрой. В клинике максимально выраженное кристалл-индуцированное воспаление развивается в первые сутки от начала приступа. Поэтому антивоспалительная клеточная терапия должна проводиться именно в это время, в этой связи мы оценили влияние М3 макрофагов на кристалл-индуцированное воспаление также в первые сутки после добавления кристаллов.
Интенсивность воспалительной реакции макрофагов оценивали по продукции провоспалительного цитокина IL-1β и антивоспалительного цитокина TGFβ. Концентрации цитокинов IL-1β и TGFβ определяли в среде культивирования макрофагов с помощью Mouse IL-1β ELISA kit (Invitrogen, BenderMedSystems, BMS6002, Lot 184937033) и Mouse TGFβ ELISA kit (Invitrogen, BenderMedSystems, BMS608-4, Lot 189457029) методом ELISA на ридере Bio-Rad Model 680 в соответствии с инструкцией производителя.
in vitro
Статистическая обработка данных проведена с использованием RealStatisticsDataAnalysisTool (http://www.real-statistics.com). Нормальность распределения проверяли по тесту Шапиро-Уилка. Данные  представлены как М ± m и проанализированы с использованием TwoFactorANOVA и TukeyHSDpost-hoc тест. При р<0,05 различия рассматривали как статистически достоверные.
Были получены следующие данные:
invitro
1. культивирование М0 макрофагов с кристаллами MSU  воспроизводит острое подагрическое воспаление в форме увеличения секреции провоспалительного цитокина IL-1β через 24 часа после добавления кристаллов MSU (фиг. 3A), при этом продукция противовоспалительного цитокина TGFβна этом сроке практически не изменяется (фиг. 3Б);
2. культивирование макрофагов фенотипа М2а с кристаллами привело к сопоставимому с фенотипом М0 росту секреции IL-1β и сходному, практически неизменному выбросу TGFβ (фиг. 3), что подтверждает предположение о неэффективности применения макрофагов с фенотипом М2а для подавления кристалл-индуцированного воспаления;
3. Мтол, главной характеристикой которых является сниженная секреция провоспалительных цитокинов и повышенная продукция противовоспалительных цитокинов в ответ на провоспалительные стимулы, такие как, например, ЛПС, показали
повышенный базовый уровень секреции IL-1β по сравнению со всеми остальными фенотипами (фиг.3А);
отсутствие роста секреции IL-1β на фоне инкубации с кристаллами MSU, что резко отличает Мтол от фенотипов М0 и М2а, показывающих многократный рост продукции IL-1β в ответ на добавление кристаллов, и сближает с фенотипом М3, у которого также не наблюдается никакого повышения секреции IL-1β после добавления кристаллов (фиг.3А);
секреция противовоспалительного цитокина TGFβ практически не изменялась и находилась на уровне макрофагов с фенотипами М0 и М2а как до, так и после инкубации с кристаллами MSU (фиг. 3Б);
4. фенотип переключения макрофагов М3 резко отличался от всех других изученных фенотипов:
a. М3 макрофаги имели практически заблокированную как базовую, так и кристалл-индуцированную секрецию провоспалительного цитокина IL-1β (фиг. 3А);
b. базовая продукция противовоспалительного цитокина TGFβ была сопоставима во всех исследованных фенотипах, но М3 макрофаги – единственные из всех исследованных в настоящей работе – продемонстрировали значительный рост секреции TGFβ в ответ на добавление кристаллов MSU (фиг. 3Б).
Таким образом, результаты настоящего исследования продемонстрировали, что М3 макрофаги обладают ярко выраженным противовоспалительным действием и способны эффективно подавлять кристалл-индуцированную воспалительную реакцию за счет практически полного отсутствия секреции - не более 20 пг/мл главного провоспалительного цитокина IL-1β и благодаря массированному выбросу - не менее 1100 пг/мл противовоспалительного цитокина TGFβ в ответ на действие кристаллов MSU.
Что касается аналогов (фенотипов М2а и Мтол), то было подтверждено, что макрофаги с фенотипом М2а не способны к противовоспалительной активности в условиях провоспалительной окружающей микросреды. Мтол также бесперспективны в плане противовоспалительной активности в ответ на кристаллы MSU. Действительно, у Мтол, несмотря на отсутствие роста секреции IL-1b в ответ на добавление кристаллов, не обнаружено активизации продукции противовоспалительного цитокина TGFβ, к тому же базовая секреции провоспалительного IL-1β достаточно высока и фактически сопоставима с кристалл-индуцированным уровнем фенотипов М0 и М2а.
Пример 2
in vivo
in vivo
in vitro
5
6
7
8
9
Эксперименты  выполнены на мышах. Моделирование кристалл-индуцированного артрита проводили путем введения кристаллов MSU (1 мг в 40 мкл PBS) в подушечку левой лапы мыши, занаркотизированной при помощи хлоралгидрата (5%раствор, 200мг/кг, внутрибрюшинно) [YangQ. Etal. miR-155 isdispensableinmonosodiumurate-inducedgoutyinflammationinmice. // ArthritisRes. Ther. BioMedCentral, 2018. Vol. 20, № 1. P. 144]. Одновременно, такой же объем стерильного PBS вводили в подушечку правой лапы в качестве контроля. Воспалительную реакцию характеризовали по разнице температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап через 1, 2, 3, 6, 7 и 8 суток после инъекций. Температуру на поверхности лапы измеряли при помощи тепловизора TiS10(FLUKE). Макрофаги готовили так же, как и для  экспериментов (подробное описание процедуры приведено в примере 1)и вводили в количествах 2,5х10, 2,5х10, 2,5х10, 2,5х10 и 2,5х10 на одно животное вместе с кристаллами MSU.
Все животные были разделены на три группы:
«PBS» - инъекция кристаллов MSU в растворе PBS;
«М0» - инъекция кристаллов MSU вместе с макрофагами фенотипа М0 в растворе PBS;
«М3» - инъекция кристаллов MSU вместе с макрофагами фенотипа М3 в растворе PBS.
Также были приготовлены инъекции MSU с макрофагами фенотипа М3 в растворе 0.9% NaClc 0.5% сывороточным альбумином и включающей 5-аминосалицилат, циклоспорин.
in vivo
Статистическая обработка данных проведена с использованием RealStatisticsDataAnalysisTool (http://www.real-statistics.com). Нормальность распределения проверяли по тесту Шапиро-Уилка. Данные  представлены как среднее ± стандартная ошибка измерения и проанализированы с использованием TwoFactorANOVA и post-hoc критерия Тьюки. При р<0,05 различия рассматривали как статистически достоверные.
Были получены следующие данные:
1. Введение кристаллов MSU в подушечку лапы мыши воспроизводит остроеподагрическое воспаление.
Разница температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап мыши через 1, 2, 3, 6, 7 и 8 суток после инъекции кристаллов MSU и стерильного PBS, соответственно, представлена на фиг.4 и 5.
В группе PBS (без макрофагов) наблюдалась типичная картина острого кристалл-индуцированного воспаления. Максимальная разница температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап наблюдалась через сутки после инъекции с постепенным затуханием к шестому дню. Как видно на фиг.4, достоверное увеличение разницы температур по сравнению со значением до инъекции зарегистрировано на 1, 2 и 3 сутки после инъекции.
in vivo
2. М3 макрофаги предупреждают развитие острого кристалл-индуцированного воспаления .
В группе «М3» достоверного изменения разницы температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап не было зарегистрировано ни на одном из исследованных сроков. Некоторое увеличение показателя отмечается через 2 суток после инъекции, но это изменение не является статистически достоверным (фиг.4).
3. М0макрофаги способствуют увеличению длительности кристалл-индуцированного воспаления, вероятно, в результате репрограммирования на провоспалительный М1 фенотип под воздействием провоспалительных факторов окружающей микросреды.
В группе «М0» отмечено увеличение разницы температур в первые трое суток после инъекции. Однако, в этом случае наблюдался более плавный рост показателя по сравнению с группой «PBS» и достоверные различия были зарегистрированы только на 2 и 3 сутки после инъекции (фиг.4). Интересно отметить, что воспалительная реакция в группе «М0» продержалась дольше, чем в группе «PBS», так как через 6 суток после инъекции разница температур экспериментальной и контрольной лап все еще достоверно отличалась от значения до инъекции.
4. Интенсивность воспалительной реакции, оцениваемая по абсолютной величине разницы температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап, была максимальной в группе «PBS» и минимальной в группе «М3».
in vivo
5. Инъекции макрофагов фенотипа М3 в растворе 0.9% NaClc 0.5% сывороточным альбумином и включающей 5-аминосалицилат, циклоспорин демонстрировали сходную активность с группой М3 макрофагов, а именно предупреждают развитие острого кристалл-индуцированного воспаления .
Как видно на фиг.5, через сутки после инъекции увеличение разницы температур в группе «PBS» было достоверно выше, чем в любой из групп с макрофагами. На 2 и 3 сутки после инъекции разница температур на поверхности экспериментальной и контрольной лап в группах «PBS» и «М0» была несколько выше, чем в группе «М3», но достоверные различия наблюдались только на 3 сутки. На 6 сутки после инъекции разница температур была достоверно выше в группе «М0» относительно группы «М3». На 7 и 8 сутки никаких достоверных отличий зарегистрировано не было.
Спустя неделю после инъекции температура на поверхности лап во всех экспериментальных группах вернулась к норме (фиг.4).
Исследования были проведены на экспериментальных животных моделях, однако изначально предназначаются для применения у человека. При этом для специалиста не составит труда рассчитать начальную эффективную дозу препарата для человека на основании дозы, применяемой у животных, при необходимости она может быть скорректирована в последующем в процессе клинических испытаний (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. Часть 1. - М., 2012).
Пример 3
Эксперименты были выполнены на макрофагах, полученных из перитонеальной жидкости мышей по методике подробно описанной в примере 1. Макрофаги были разделены на 3 группы. Первая группаперепрограмированных макрофаговМ3 была отмыта от кристаллов через 24 часа после добавления кристаллов и культивирование было продолжено в течение последующих 24 часов. Втораягруппамакрофагов М3 была отмыта от кристаллов через 30 часов после добавления кристаллов и культивирование было продолжено в течение последующих 24 часов. Третьягруппа М3 макрофагов была отмыта от кристаллов через 36 часов после добавления кристаллов и культивирование было продолжено в течение последующих 24 часов.Интенсивность воспалительной реакции макрофагов оценивали по продукции антивоспалительного цитокина TGFβ. Концентрацию цитокина и статистическую обработку результатов проводили аналогично примеру 1.
Были получены следующие данные:
- фенотип макрофагов М3 сохраняет секрецию противоспалительного цитокина TGFβ на протяжении всего периода воздействия провоспалительного стимула;
-поляризует предсуществующие макрофаги в области воспаления в сторону антивоспалительного М2 фенотипа;
- снижает продукцию антивоспалительного фактора TGFβ в ответ на завершение воздействия провоспалительного стимула.
Таким образом, результаты настоящего исследования продемонстрировали, что М3 макрофаги сохраняют противовоспалительное действиеи индуцируют поляризацию макрофагов в области воспаления в сторону антивоспалительного М2 фенотипана протяжении всего периода воздействия провоспалительного стимула, апри исчезновении провоспалительных стимулов при завершении воспаленияснижают продукцию (секрецию) антивоспалительных факторов.