Способ оценки антибактериального действия антисептиков на микробные биопленки
METHOD OF ESTIMATION OF ANTIBACTERIAL ACTION OF ANTISEPTICS ON MICROBIAL FILMS

Изобретение относится к области медицины, а именно комбустиологии, гнойной хирургии, клинической микробиологии, и может быть использовано для оценки антибактериального действия антисептика на микробные биопленки, сформированные несколькими бактериями. Известен количественный суспензионный метод изучения противомикробной активности антисептиков (Гудкова Е.И., Красильников А.П., Адарченко, А.А. Методы испытания противомикробной активности антисептиков профилактического назначения: методические указания №11-13-197, утв. МЗРБ 16.01.97, Минск, 1997. 8 с.), в котором оценку эффективности антисептиков проводят в отношении только моновидовых планктонных культур бактерий. Для испытания на устойчивость к антисептикам используют чистые культуры бактерий, выделенные с помощью стандартных методик.
Недостатки прототипа: определение антибактериальной активности антисептика согласно прототипу осуществляется в отношении только моновидовой культуры (одного штамма) бактерий, тогда как в материале хирургических, в том числе ожоговых больных, чаще обнаруживаются полимикробные ассоциации бактерий.
Технический результат: повышение точности и объективности способа за счет оценки антибактериального действия антисептика на полимикробные биопленки.
Сущность метода заключается в том, что оценивают влияние антисептического препарата на биопленку, образованную смешанной культурой бактерий, представленной возбудителями инфекционных осложнений. Для этого полимикробные биопленки, сформированные in vitro, подвергают кратковременному воздействию антисептика, после чего оценивают и сравнивают с контролем (без воздействия антисептика) два показателя: массивность биопленки и жизнеспособность входящих в ее состав бактерий.
580
Способ осуществляют следующим образом согласно O'Toole G.F. и KolterR. (1998): суточные культуры двух штаммов бактерий, например Pseudomonas aeruginosa и Staphylicoccus aureus, стандартизуют до 2,0 по McFarland и разводят 1:100 в бульоне Луриа Бертани (LB-бульоне). В лунки полистиролового 96-ти луночного плоскодонного планшета (Медполимер, Россия) вносят по 0,1 мл бульонных культур обоих видов бактерий и закрытые планшеты выдерживают статически в термостате при 37°С в течение 20 часов для формирования биопленок. После удаления планктонной культуры и 3-кратной отмывки биопленки фосфатно-буферной средой (ФБС) в опытную часть лунок вносят 200 мкл антисептика, в контрольные лунки - 0,89% NaCl, выдерживают 1 час и 3-кратно отмывают ФБС. Затем вносят 200 мкл 0,1% водного раствора генцианвиолета и выдерживают 30 мин. Биомассу биопленки оценивают по уровню экстракции этанолом красителя, который измеряют на микропланшетном ридере Benchmark Plus (Bio-Rad, США) при длине волны 580 нм в единицах оптической плотности (Ед, ОП). Для оценки жизнеспособности клеток в биопленках последние 3-кратно отмывают, вносят в лунки 100 мкл ФБС и 5-кратно обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшеты в ультразвуковую ванну Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия). Жизнеспособность клеток оценивают по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) после высева из последовательных децимальных разведений бактериальных суспензий на селективные среды. Далее сравнивают усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок, обработанных антисептиком, с аналогичным в контроле. Если показатель, характеризующий массивность биопленки (в Ед ОП) после экспозиции с антисептиком снизился на 70%) от контроля, регистрируют высокую эффективность антисептика, снижение на 30-70% - среднюю, менее 30% - низкую. Кроме того, оценивают количество жизнеспособных клеток (по числу КОЕ) в составе биопленки, обработанной антисептиком, и сравнивают его с контрольным. Если жизнеспособные клетки не обнаружены, то регистрируют высокую эффективность антисептика, если число клеток снизилось на 4 порядка и более - среднюю эффективность, менее чем на 4 порядка - низкую эффективность.
Примеры конкретного применения

Пример 1: Оценено влияние «Пронтосана» на бинарную биопленку с использованием клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa и Staphylicoccus aureus, изолированных из раневого отделяемого пациента, находящегося на лечении в ожоговом центре, с помощью предлагаемого способа. Для этого в лунках полистиролового планшета формировали 20-часовую смешанную биопленку, после чего удаляли планктонные клетки и питательную среду, биопленки 3-кратно отмывали. Сформированные биопленки выдерживали с «Пронтосаном» в течение 1 ч и оценивали массивность биопленки и жизнеспособность клеток в ее составе. Результат: Ед ОП снизился на 70% и КОЕ не обнаружены, антисептик высокоэффективный (см. табл. 1).
Пример 2: Оценено влияние 0,05% раствора хлоргексидина на бинарную биопленку с использованием клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa и Staphylicoccus aureus, изолированных из раневого отделяемого пациента, находящегося на лечении в ожоговом центре, методика выполнена аналогичным образом. Результат: Ед ОП снизился на 60% и число КОЕ снизилось на 4 порядка, антисептик среднеэффективный (см. табл. 1).
Пример 3: Оценено влияние 0,02% раствора фурацилина на бинарную биопленку с использованием клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa и Staphylicoccus aureus, изолированных из раневого отделяемого пациента, находящегося на лечении в ожоговом центре, методика выполнена аналогичным образом. Результат: Ед ОП снизился на 20% и число КОЕ снизилось менее 4 порядков, антисептик низкоэффективный (см. табл. 1).
Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ позволяет оценить эффективность применения антисептика для подавления жизнеспособности бактериальных клеток в смешанных биопленках, а также обеспечивает объективность получаемых результатов.