Морфо-функциональные аспекты регенерации печени при стимуляции биоматериалом Аллоплант

Высокие научнопрактические достижения в фундаментальной медицине

УДК 616.36-003.93-089.844

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ БИОМАТЕРИАЛОМ «АЛЛОПЛАНТ»

Э.Р. Мулдашев, С.А. Муслимов, Л.А. Мусина, Р.С. Мингазов,

ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии», г. Уфа

и

Известно, что цирротическая трансформация печени является итогом развития фибропластических процессов, вышедших из под контроля звездчатых макрофагоцитов (ЗМФ) в результате уменьшения их количества и снижения функциональной активности (Маянский Д. Н., 1988; Мусина Л.А., 2007; Xidakis С. еt а1., 2005). Поэтому очевидно, что без восстановления численности и активности ЗМФ обратного развития цирро-тических изменений паренхимы печени ожидать трудно. С другой стороны, анализ процесса замещения в различных тканях, применяемых в хирургии аллогенных биоматериалов, показал, что в первую очередь в зону имплантации мигрируют и активизируются макрофаги и их предшественники моноциты

(Муслимов С.А., 2000; Мусина Л.А., 2007). Целью нашего исследования было изучение влияния аллогенного биоматериала на активность звездчатых макрофагоцитов и регенерацию гепатоцитов при экспериментальном циррозе.

Материалы и методы исследований. Эксперимент проведен на 47 кроликах обоего пола породы «шиншилла», массой 2,5-3,0 кг. Цирроз печени моделировали путем подкожного введения 50%-го тетрахлорметана (четыреххлористого углерода) на оливковом масле в течение 3 месяцев (Рубецкой Л.С., Короткина Р.Н., 1962). Операцию лапаротомии проводили под тиопенталовым наркозом. 20 кроликам после осмотра печени и забора биопсии зашивали рану (контрольная группа).

Остальным в каждую долю печени безигольным инъектором вводили по 0,1-0,2 мл суспензии диспергированного биоматериала «Аллоплант» (ДБМА) на физиологическом растворе. 3-ю группу составляли 6 интактных кроликов. Животных выводили из опыта на 2-, 7-, 14-, 30-, 90-, 180-е сутки. Кусочки печени фиксировали в 10%-ом нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (по Ван-Гизону, по Маллори). Считали среднее количество ЗМФ в поле зрения. Регенерацию печени оценивали по среднему количеству гепатоцитов, экспрессирующих PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток (фирмы Santa Cruz Biotechnology). Для выявления апоптоза клеток использовали антитела FAS-L той же фирмы. Достоверность подсчетов определяли по критерию Стьюдента. Для электронной микроскопии кусочки печени фиксировали в 2%-ом р-ре глютарового альдегида на какодилатном буфере (рН=7,2-7,4), постфиксировали в 1%-ом р-ре четырехокиси осмия на том же буфере. Заливали в эпон-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III 8800 (Швеция), контрастировали 2%-ым водным раствором урани-лацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу и изучали в электронном микроскопе «JEM-7A» и «JEM-СХ II» (Япония).

Результаты исследования и их обсуждение. При циррозе печени резко уменьшалось относительное количество ЗМФ, которое не восстанавливалось и после прекращения токсического воздействия на кроликов. Ультраструктурно печеночные макрофаги были с признаками функционального истощения в виде накопления остаточных телец и деструкции органелл в плотной цитоплазме. Клетки приобретали округлую форму без типичных для них клеточных выростов и псевдоподий. После прекращения токсического воздействия через месяц в печени кроликов контрольной группы, хотя признаки воспалительных и некротических процессов несколько уменьшались, и в течение полгода появлялись регенераторные узлы, но широкие и узкие прослойки зрелой соединительной ткани вокруг ложных долек и портальных трактов не исчезали, а структура печени не восстанавливалась.

В первые дни после введения ДБМА в цирротически измененную печень кроликов вокруг частиц биоматериала несколько расширялись сосуды. Выявлялось множество моноцитов с бобовидным ядром, которые дифференцировались в юные моноци-тоидные макрофаги с первичными лизосомами и большим количеством рибосом и полисом в цитоплазме и зрелые макрофаги, активно фагоцитирующие биоматериал. Последние в дальнейшем во множестве определялись в синусоидах, вдоль коллагеновых волокон соединительнотканных прослоек печени. Это были отростчатые клетки крупных размеров, содержащие в цитоплазме большое количество лизосом и фаголизосом, вакуолей, остаточных телец. В синусоидах, в межклеточных пространствах на протяжении всего эксперимента наряду с признаками разрушения фибробластов выявлялись признаки фрагментации и лизиса коллагеновых фибрилл, потери ими поперечной исчер-ченности, особенно вблизи выростов макрофагов.

Введение аллогенного биоматериала в цирротически измененную печень кроликов способствовало восстановлению количества и фенотипа звездчатых макрофагоцитов и их стимуляции. Уже через месяц в паренхиме печени определялось

Высокие научнопрактические достижения в фундаментальной медицине

выраженное истончение фиброзных прослоек, а через полгода соединительная ткань между цирротическими дольками и вокруг портальных трактов не выявлялась, она полностью подвергалась инволюции. Приток «зрелой» функционально активной популяции макрофагов создает условия для нормализации стромально-паренхиматозных взаимоотношений в печени. Пролиферативная активность гепатоцитов после введения ДБМА в печень возрастала прямо пропорционально количеству активных макрофагов. Одновременно протекающие в паренхиме печени процессы усиленной резорбции соединительной ткани макрофагами и регенерации гепатоци-тов в конечном итоге приводили к восстановлению структуры органа. Мы выявили, что при стимуляции ЗМФ аллогенным биоматериалом процесс пролиферации гепатоцитов в паренхиме печени происходит вокруг портальных трактов, а морфологические признаки апоптоза (программированной клеточной смерти) выявляются в зоне, окружающей центральные вены. Аналогичный процесс зафиксирован исследователями в нормальной печени при росте паренхимы (Bursch W. С., et al., 1990; Volk A., Michalopoulos G., 1995).

Таким образом, при стимуляции регенерации печени алло-генным биоматериалом восстанавливается главное звено в нарушенной цепочке механизма ауторегуляции тканевого гомеостаза цирротически измененной печени - фенотипическая популяция ЗМФ. Вероятно поэтому процесс регенерации гепатоцитов приобретает физиологические очертания, в отличие от других методов стимуляции регенерации, когда репа-ративные процессы осуществляются за счет гипертрофии гепатоцитов и органа, приводящих к быстрому, но временному улучшению функциональных показателей (Ахунджа-нов Б.А., 1991; Hwang T.L. et al., 1995; Ogura Y., 2001).

Ш

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахунджанов Б.А. Медикаментозное стимулирование процессов регенерации резецированной здоровой и цирротически измененной печени // Хирургическое лечение цирроза печени с использованием стимуляторов регенерации. - Ташкент: изд. им. Ибн Сины, 1991. - С.32-38.

2.Маянский Д. Н., Шварц Я. Ш., Цырендоржиев Д. Д., Кутина С. Н. Функциональные перестройки системы мононуклеарных фагоцитов при экспериментальном циррозе печени // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1988. - № 2. - С. 214-216.

3.Муслимов С.А. Морфологические аспекты регенеративной хирургии. -Уфа: Башкортостан, 2000. - 168 с.

4. Рубецкой Л. С., Короткина Р.Н. Экспериментальное исследование обратимости цирротических изменений печени// Исследование обратимости цирротических изменений внутренних органов. - М.: Медицина. - 1962. - В. 1. - 123 с.

5.Мусина Л.А. Функциональная морфология макрофагов при регенерации тканей, индуцированной аллогенными биоматериалами. Автореф. докт. дисс.... Саранск, 2007. - 49 с.

6. Bursch W. С., Paff B., Putz G., Schulte-Hermann R. Determination of the lenght of the histological stages of apoptosis in normal liver and altered hepatic foci of rats // Carcinogenesis. - 1990. - Vol. 11. - P. 847.

7. Hwang T. L., Yu H. C., Chen P. C., Chen M. F. Liver regeneration following partial hepatectomy and stimulation by cirrhotic and non-cirhotic rats // Res. Exp. Med. (Berl). - 1995. - Vol. 195. - № 4. - P. 201-208.

8. Ogura Y. // Hepatosite growth factor promotes liver regeneration and protein sintesis after hepatectomy in cirrotic rats / Y. Ogura, M. Havanoue J. Tanabe et al. //Hepatogastroenterology. - 2001. - Vol. 48. - № 38. - P. 545-549.

9. Volk A., Michalopoulos G., Weidner M., Gebhardt R. Different proliferative responses of periportal and pericentral rat hepatocytes to hepatocyte growth factor // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1995. - Vol. 207. - № 2. - P. 578-584.

10. Xidakis C., Ljumovic D., Manousou P. et al. Production of pro- and antifi-brotic agents by rat Kupffer cells; the effect of octreotide. Dig. Dis. Sci. 2005. -May; 50 (5). P. 935-941.