ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕРАПИИ СТЕРИЛЬНОГО ВОДНОГО ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА
USE IN THERAPY OF A STERILE AQUEOUS OPHTHALMIC SOLUTION

Настоящее изобретение относится к применению в терапии стерильного офтальмологического раствора, включающего N-(N-ацетилцистеинил)хитозан или его фармацевтически приемлемую соль в растворе в носителе.
Механические повреждения роговицы являются самыми офтальмологическими поражениями. Они часто вызваны действием внешних физических сил (например, веток, ногтей пальцев, апликаторов макияжа), которые приводят к повреждениям небольших или больших частей поверхности роговицы. Связанные с инородными телами истирания обычно вызваны частицами, переносимыми воздухом (такими как кусочки металла, дерева, стекла и т.п.), которые внедряются в роговицу. После удаления инородного тела остаются дефекты в эпителии роговицы. Связанные с контактными линзами истирания представляют собой дефекты в эпителии роговицы, которые вызваны слишком долгим использованием контактной линзы или истиранием при неправильном подборе, или неправильной очисткой контактной линзы.
Химические повреждения роговицы являются другой причиной травмы роговицы. Воздействие щелочных или кислых веществ может привести к сильному поражению поверхности роговицы.
Повреждение эпителия роговицы также происходит в результате воздействия ультрафиолетового излучения (фотокератит) вследствие отсутствия надлежащей защиты глаз (например, снежная слепота).
rd
Раны роговицы также возникают вследствие операции, такой как операция катаракты, трансплантация роговицы, операция глаукомы фильтрующего типа и рефрактивной операции глаза, такой как фоторефракционная кератектомия (PRK) и лазерно-стимулированный кератомилез in situ (LASIK); или вследствие осложнений для роговицы после внутриглазной операции, такой как витректомия (Hammil, M. Bowes, 2011, Mechanical Injury. In Krachmer, Mannis et al. (editors): Cornea [3 edition] Elsevier Inc.:1169-1185).
Рецидивирующие эрозии роговицы характеризуются повторяющимися случаями разрушения эпителия роговицы. Они могут быть вызваны дистрофиями роговицы, такими как дистрофия эпителиальной базальной мембраны или они могут быть следствием небольшой травмы или истирания роговицы (Steele, Chris, 1999, The role of therapeutic contact lenses in corneal wound healing, Optometry today (October 8): 36-40). Нарушение или утрата слоя эпителия приводит к нарушениям целостности поверхности роговицы. Таким образом, раны роговицы, связанные с эрозиями роговицы, в основном представляют собой повреждения эпителия. Эпителиальные дефекты, которые не излечиваются в течение одной или двух недель или повторно излечиваются и нарушаются, представляют собой, например, неизлечимые эпителиальные дефекты роговицы, стойкие эпителиальные дефекты роговицы, медленно излечивающиеся эпителиальные дефекты роговицы и невропатические (нейротрофические) эпителиальные дефекты.
Другой эпителиальный дефект с типичным рассеянным, мелким, точечным повреждением или утратой эпителия роговицы представляет собой так называемый точечный поверхностный кератит (SPK). Это воспаление роговицы может быть вызвано разными причинами, такими как вирусный конъюнктивит (чаще всего вызванный аденовирусом), блефарит, сухой кератоконъюнктивит, трахома, химические ожоги, воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения (например, сварочных дуг, ламп солнечного света, блеска снега), чрезмерно длительное ношение контактных линз, токсичность системных лекарственных средств (например, аденинарабинозид), местных лекарственных средств или противозачаточных- средств и паралич периферийного черепного нерва (включая паралич Белла). таким образом, SPK может быть вызван инфекциями и неинфекционными причинами.
Лечение неинфекционных ран роговицы решает три задачи: ослабление симптомов у пациента путем системного и/или местного введения болеутоляющих средств; предупреждение инфекций (если это представляется необходимым) путем местной инстилляции антибиотиков; и защита эпителия роговицы. Для хирургических процедур, таких как трансплантация роговицы, обычно необходимо дополнительное лечение после операции; однако глазные капли для защиты и смазывания поверхности роговицы являются частью терапии.
Защита эпителия роговицы является первичной задачей лечения после повреждений эпителия роговицы для обеспечения регенерации эпителия и восстановления неповрежденной поверхности глаза. Современные методики лечения включают использование глазных смазок, терапевтических мягких контактных линз (бандажных линз) или повязок на глаза. И контактные линзы, и повязки на глаза могут привести к дискомфорту в глазах пациента и могут увеличить время излечивания и привести к опасности возникновения микробного кератита. Поэтому за их использованием должен внимательно следить практикующий офтальмолог. В контексте повязок для глаз также рассмотрена тканевая инженерия. Сообщали, что искусственные смешанные мембраны, содержащие гидроксиэтилхитозан, желатин и хондроитинсульфат, засеянные эпителиальными клетками роговицы и трансплантированные в механически поврежденный эпителий роговицы, уменьшает размер поврежденного участка у кроликов через 2-4 дня после операции (Liang et al., 2014, Tissue-engineered membrane based on chitosan for repair of mechanically damaged corneal epithelium, Journal of Materials Science: Materials in Medcine (25): 2163-2171). Препараты, содержащие гиалуроновую кислоту, обычно используются в качестве глазных смазок. Сообщали, что они ускоряют излечивание эпителия роговицы при нанесении 4 раза в сутки на острой фазе лечения (Stiebel-Kalish et al., 1998, A comparison of the effect of hyaluronic acid versus gentamicin on corneal epithelial healing, Eye (12): 829-833). В случае рецидивирующих эрозий роговицы лечение смазкой следует продолжать после излечивания царапины в качестве профилактического средства в течение не менее 6 месяцев (Steele, Chris, 1999, The role of therapeutic contact lenses in corneal wound healing, Optometry today (October 8): 36-40).
Хитозан широко использовали в качестве местной повязки при лечении ран кожи (Dai, Tanaka et al., 2011, Chitosan preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing effects, Expert Rev Anti Infect Ther (9): 857-879). Для изготовления повязок на раны также предлагали использовать тиолированные углеводы (включая тиолированный хитозан) (EP1487508 Johnson&Johnson "Therapeutic compositions comprising modified polysaccharides").
Было установлено, что глазные капли, содержащие 1,5% хитозан.HCl, оказывают воздействие на стимулирование лечения эпителия роговицы в модели на кроликах, аналогичное воздействию глазных капель, содержащих основной фактор роста фибробластов крупного рогатого скота. Глазные капли, вводимые три раза в сутки и содержащие 0,5% хитозан.HCl, характеризовались этим стимулирующим воздействием в значительно меньшей степени и были лишь ненамного лучше, чем отрицательный контроль (Yonghon Xu et al. 2009, Promotive Effects of CH-HCL Chitosan Solution on Epithelial Corneal Abrasion in Rabbits, Wuhan University Journal Medical Section 30(2):173-176). Однако сообщения о влиянии хитозана на заживление раны роговицы противоречивы. 1% раствор хитозана не привел к улучшению заживления раны роговицы при введении три раза в сутки в течение 3 недель при исследовании в модели на кроликах (Sall, Kreter et al., 1987, The effect of chitosan on corneal wound healing, Ann Ophthalmol (19): 31-33). Другая группа исследователей сообщила, что 0,5% растворы хитозана стимулировали заживление раны роговицы после инкубации в течение 24 ч роговицы кролика в органной культуре (Cui et al., 2014, Chitosan promoted the corneal epithelial wound healing via activation of ERK MAPK Pathway, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55(13):499).
В WO2011/127144 раскрыто применение производных хитозанов для применения при некоторых случаях заживления раны, включая применение полимера хитозан-аргинин для лечения ран роговицы. В модели щелочного ожога роговицы кролика введение 4 раза в сутки препарата, содержащего производное хитозан-аргинина, в течение 9 дней уменьшало воспаление и ускоряло заживление раны. Сообщали, что другой мукоадгезивный полимер, арабиногалактан лиственницы, значительно ускоряет степень заживления ран роговицы по сравнению с контролем (растворитель) при введении в виде 5% раствора 3 раза в сутки в течение 3 дней (Burgalassi, Nicosia et al., 2011, Arabinogalactan as active compound in the management ран роговицы: in vitro toxicity and in vivo investigations on rabbits, Curr Eye Res (36): 21-28).
Показано, что тиолирование полимеров дополнительно улучшает их мукоадгезивную способность. В EP 1126881 B1 раскрыт мукоадгезивный полимер, содержащий по меньшей мере одну неконцевую тиольную группу. Применение тиолированных полисахаридов для изготовления имплантата для наращивания ткани раскрыто в WO 2008/077172, в котором указанные тиолированные полимеры характеризуются образованием дисульфидных связей, что приводит к стабилизации полимерной сетки. В приоритетной заявке WO 2008/077172, A 2136/2006, раскрыты другие области применения тиолированных полимеров.
Раскрыта модификация хитозана путем ковалентного присоединения содержащих тиольную группу лигандов (т. е. тиолирование). Также раскрыто, что тиолирование усиливает мукоадгезивную способность хитозана (Kast and Bernkop-Schnurch, 2001, Thiolated polymers--thiomers: development and in vitro evaluation of chitosan-thioglycolic acid conjugates, Biomaterials (22): 2345-2352; Bernkop-Schnurch, Hornof et al., 2004, Thiolated chitosans, Eur J Pharm Biopharm (57): 9-17; Bernkop-Schnurch, 2005, Thiomers: a new generation of mucoadhesive polymers, Adv Drug Deliv Rev (57): 1569-1582; Schmitz, Grabovac et al., 2008, Synthesis and characterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate, Int J Pharm (347): 79-85). Также исследована противомикробная эффективность некоторых тиолированных хитозанов (WO2009132226 A1 ; WO2009132227 A1 ; WO2009132228 A1 ; Geisberger, Gyenge et al., 2013, Chitosan-thioglycolic acid as a versatile antimicrobial agent, Biomacromolecules (14): 1010-1017)
N-Ацетилцистеин (NAC) является содержащим тиольную группу производным аминокислоты L-цистеина. NAC является восстановительным реагентом с антиокислительной активностью. Также хорошо известна его способность снижать вязкость слизи путем уменьшения количества дисульфидных связей в муцине. Вследствие этой муколитической способности NAC широко используют для снижения вязкости слизи при бронхолегочных нарушениях с избыточным продуцированием слизи. Местные офтальмологические препараты, содержащие муколитический и антиоксидантный NAC используют для лечения заболеваний роговицы, таких как дисфункция мейбомовой железы и DES (Lemp, 2008, Management of dry eye disease, Am J Manag Care (14): S88-101; Akyol-Salman, Azizi et al., 2010, Efficacy of topical N-acetyl cysteine in the treatment of meibomian gland dysfunction, J Ocul Pharmacol Ther (26): 329-333). В EP 0551848 B1 раскрыта офтальмологическая фармацевтическая композиция для лечения DES, содержащая NAC в концентрации от 3% до 5% (мас./об.) и поливиниловый спирт.
124
Установлено, что тиолирование хитозана с помощью NAC увеличивает его время пребывания в глазах кроликов по сравнению с нетиолированным хитозаном (Dangl, Hornof et al., 2009, In vivo Evaluation of Ocular Residence Time of I-labelled Thiolated Chitosan in Rabbits Using MicroPET Technology, ARVO Meeting Abstracts (50): 3689).
Установлено, что N-(N-ацетилцистеинил)хитозан.HCl оказывает некоторое благоприятное воздействие на поверхность глаз мыши в моделях сухого кератита на мышах (Hongyok, Chae et al., 2009, Effect of chitosan-N-acetyl cysteine conjugate in a mouse model of botulinum toxin B-induced dry eye, Arch Ophthalmol (127): 525-532; Hornof, Goyal et al., 2009, Thiolated Chitosan for the Treatment of Dry Eye - Evaluation in Mice Using the Controlled-Environment Chamber Model, ARVO Meeting Abstracts (50): 3663; Hoeller et al., 2011, Safety And Tolerability Of Chitosan-N-acetylcysteine Eye Drops In Healthy Young Volunteers, arvo annual meeting abstract search and program planner; Garhöfer et al., 2011 Chitosan-N-Acetylcaxteine Eye Drops, Cataract & Refractive Surgery Today Europe, 49-50).
Другие публикации, в которых приведены обзоры и обсуждения различных случаев применения тиолированных полимеров, приведены ниже.
Hornof et al., Mucoadhesive ocular insert based on thiolated poly(acrylic acid): development and in vivo evaluation in humans; Journal of Controlled Release 89 (2003) 419-428; Hornof, M., In vitro and in vivo evaluation of novel polymeric excipients in the ophthalmic field, Thesis, University of Vienna, 2003; Bernkop-Schnurch et al., Permeation enhancing polymers in oral delivery of hydrophilic macromolecules: Thiomer/GSH systems, J. Contr. Release 93(2003) 95-103; M. Hornof et al., In Vitro Evaluation of the Permeation Enhancing Effect of Polycarbophil-Cystein Conjugates on the Cornea of Rabbits, J. Pharm. Sci. 91 (12) 2002, 2588-2592; and Clausen et al., The Role of Glutathione in the Permeation Enhancing Effect of Thiolated Polymers, Pharm. Res. 19 (5) 2002, 602-608; Yamashita et al., Synthesis and Evaluation of Thiol Polymers, J. Macromol.Sc. 26 (1989), 9, 1291-1304; Zheng et al., Disulfide Cross-Linked Hyaluronan Hydrogels, Biomacromolecules 3 (6) 2002, 1304-1311; Wang et al., Chitosan-NAC Nanoparticles as a Vehicle for Nasal Absorption Enhancement of Insulin, J. Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 88B: 150-161, 2009; WO 2008/094675 A2; US 5412076 A.
В WO 2015/169728 раскрыт стерильный водный офтальмологический раствор, включающий от примерно 0,05% до примерно 0,5% (мас./мас.) N-(N-ацетилцистеинил)хитозана или его фармацевтически приемлемой соли в растворе в носителе, в котором N-(N-ацетилцистеинил)хитозан обладает содержанием свободных тиольных групп, равным от 80 мкмоль/г полимера до 280 мкмоль/г полимера, и применение указанного раствора для лечения сухого кератита.
Задачей настоящего изобретения является получение фармацевтического препарата, пригодного для лечения ран роговицы.
Эта задача решена с помощью стерильного водного офтальмологического раствора, включающего N-(N-ацетилцистеинил)хитозан или его фармацевтически приемлемую соль в растворе в носителе,
в котором N-(N-ацетилцистеинил)хитозан обладает содержанием свободных тиольных групп, равным от 80 мкмоль/г полимера до 280 мкмоль/г полимера,
для применения для лечения ран роговицы.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 приведены результаты исследования раствора, содержащего 0,1% N-(N-ацетилцистеинил)хитозан, в модели заживления раны роговицы.
На фиг. 2 приведены данные сканирующей электронной микроскопии клеток лимбального эпителия роговицы человека, инкубированных с 0,1% хитозан-HCl (B) или 0,1% N-(N-ацетилцистеинил)хитозан (C). Для сравнения приведены необработанные слитые контрольные клетки (A).
Подробное описание изобретения
Неожиданно установлено, что стерильный водный офтальмологический раствор, включающий N-(N-ацетилцистеинил)хитозан или его фармацевтически приемлемую соль в растворе в носителе, в котором N-(N-ацетилцистеинил)хитозан обладает содержанием свободных тиольных групп, равным от 80 мкмоль/г полимера до 280 мкмоль/г полимера, эффективен для лечения ран роговицы.
В предпочтительном варианте осуществления указанная рана роговицы может быть неинфекционной раной.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанная рана роговицы также может быть связана с эрозиями роговицы.
Офтальмологические растворы, применяющиеся в соответствии с настоящим изобретением, являются особенно подходящими для лечения эрозий роговицы. Наряду с другими факторами, рецидивирующие эрозии роговицы могут быть вызваны дистрофиями, такими как дистрофия базальной мембраны эпителия (дистрофия Когана), которые влияют на целостность эпителия роговицы.
Кроме того, указанная рана роговицы также может представлять собой эпителиальный дефект. Например, эпителиальный дефект можно выбрать из группы, включающей неизлечимые эпителиальные дефекты роговицы, стойкие эпителиальные дефекты роговицы, медленно излечивающиеся эпителиальные дефекты роговицы и невропатические (нейротрофические) эпителиальные дефекты.
В другом варианте осуществления рана роговицы может быть связана с точечным поверхностным кератитом (SPK).
Ниже термин "хитозан-NAC" означает N-(N-ацетилцистеинил)хитозан и его фармацевтически приемлемые соли.
Если не ограничиваться теорией, то можно полагать, что благоприятное воздействие хитозан-NAC может быть обусловлено его улучшенной мукоадгезивной способностью и поэтому увеличенным временем пребывания в глазе и его способностью образовывать защитное покрытие на поверхности глаза.
Установлено, что применение хитозан-NAC для лечения раны роговицы дополнительно благоприятно тем, что его необходимо применять реже, только один или два раза в сутки.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация N-(N-ацетилцистеинил)хитозана или указанной его фармацевтически приемлемой соли в указанном офтальмологическом растворе равна от 0,05 до 0,3% (мас./мас.), предпочтительно от 0,05 до 0,2% (мас./мас.), более предпочтительно 0,08-0,16% (мас./мас.).
2
4
Кроме того, указанная фармацевтически приемлемая соль предпочтительно выбрана из группы, включающей соли органических кислот, таких как уксусная, лимонная, муравьиная и винная кислота, и соли неорганических кислот, таких как HCl и HSO.
N-(N-Ацетилцистеинил)хитозан предпочтительно обладает содержанием свободных тиольных групп, равным от 105 мкмоль/г полимера до 250 мкмоль/г полимера, предпочтительно от 110 мкмоль/г полимера до 250 мкмоль/г полимера, наиболее предпочтительно от 140 до 250 мкмоль/г полимера.
Содержание сшитых тиольных групп в N-(N-ацетилцистеинил)хитозане может составлять 30% или менее в пересчете на полное количество содержащихся в нем тиольных групп, предпочтительно 25% или менее, наиболее предпочтительно 15% или менее.
Количество свободных тиольных групп, иммобилизованных на хитозан-NAC в водном офтальмологическом растворе, специалист в данной области техники может определить известным образом, например, с помощью реагента Элмана.
В дополнение к тому, что является важным высокое содержание свободных тиольных групп в полимере хитозан-NAC в водном офтальмологическом растворе, также является предпочтительным низкое содержание сшитых тиолов (дисульфидов) в полимере хитозан-NAC в раствор предлагаемом в настоящем изобретении. Во время приготовления и хранения водного офтальмологического раствора может происходить сшивка тиольных групп, иммобилизованных на хитозан-NAC. Низкое содержание сшитых тиолов в препарате является предпочтительным для препарата полимера хитозан-NAC, предлагаемого в настоящем изобретении.
Поэтому в предпочтительном варианте осуществления содержание сшитых тиольных групп в N-(N-ацетилцистеинил)хитозане составляет 30% или менее в пересчете на полное количество содержащихся в нем тиольных групп, предпочтительно 25% или менее, наиболее предпочтительно 15% или менее.
Предпочтительно, если в этом предпочтительном варианте осуществления содержание сшитых тиольных групп в N-(N-ацетилцистеинил)хитозане после хранения раствора в течение не менее 12 месяцев при комнатной температуре составляет 30% или менее в пересчете на полное количество содержащихся в нем тиольных групп, более предпочтительно 25% или менее, наиболее предпочтительно 20% или менее.
Если содержание сшитых тиольных групп в препарате слишком велико, то характеристики водного офтальмологического раствора могут меняться за пределами желательных параметров, например, вязкость водного офтальмологического раствора может стать слишком большой, чтобы быть подходящей для глазных капель.
Как более подробно указано ниже, установлено, что можно получить хитозан-NAC тиольные группы, которые несшиты или в минимальной степени сшиты, так что содержание сшитых тиольных групп равно менее 5%, предпочтительно 4% или менее в пересчете на полное количество тиольных групп. В частности, если такой хитозан-NAC используют для изготовления офтальмологического раствора, применяющегося в соответствии с настоящим изобретением, свободные тиольные группы склонны быть стабильными в течение всего срока службы раствора.
Таким образом, было установлено, что при использовании такого хитозан-NAC для изготовления препарата увеличение содержания сшитых тиольных групп составляет < 10% от количества свободных тиольных групп, первоначально содержащихся в сырье хитозан-NAC. Кроме того, при хранении раствора в течение более 12 месяцев или даже 18 месяцев увеличение содержания сшитых тиольных групп составляет < 15% от количества свободных тиольных групп, первоначально содержащихся в препарате. Кроме того, даже если второй контейнер с раствором (как определено ниже), который образует барьер для кислорода, открыт, через 30 дней после вскрытия увеличение содержания сшитых тиольных групп составляет < 15% от количества свободных тиольных групп, первоначально содержащихся в препарате до вскрытия.
В принципе, содержащий тиолированный хитозан офтальмологический препарат, применяющийся в соответствии с настоящим изобретением, получают с помощью следующих стадий:
1. Хитин выделяют из панцирей ракообразных, таких как панцири креветок или крабов Теннера,
2. Хитозан получают из хитина с помощью химической технологии, которая хорошо известна в данной области техники, например, щелочного деацетилирования;
3. Хитозан тиолируют путем ковалентного присоединения содержащего тиольную группу лиганда, например, с использованием N-ацетилцистеина, как указано в настоящем изобретении;
4. Затем хитозан-NAC готовят в виде водного офтальмологического раствора, как указано в настоящем изобретении; и
5. Затем водный офтальмологический раствор, содержащий хитозан-NAC, помещают в подходящий контейнер, который обеспечивает его стабильность, как указано в настоящем изобретении.
2
4
Хитозан-NAC, применяющийся в настоящем изобретении, должен быть растворим вводе в диапазоне концентраций, подходящем для получения водного офтальмологического раствора и полученные растворы должны быть прозрачными и бесцветными. Образование соли хитозан-NAC с органическими или неорганическими кислотами увеличивает растворимость хитозана в воде. Подходящие соли тиолированного хитозана, предлагаемые в настоящем изобретении, включают любые фармацевтически приемлемые соли с органическими кислотами, такими как уксусная, лимонная, муравьиная и винная кислота, а также неорганическими кислотами, такими как HCl и HSO. Применение гидрохлорида хитозан-NAC является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения.
Важно использовать такие пути реакции и условия проведения реакций, чтобы после синтеза и очистки практически все тиольные группы, иммобилизованные на основной цепи хитозана, содержались в свободной форме, а не в сшитой форме, как дисульфиды, т. е. были лишь в минимальной степени сшиты. Практически все присоединенные тиолы в тиолированном хитозане, предлагаемом в настоящем изобретении, находятся в виде свободных тиольных групп, т. е. они не сшиты. Минимальная степень сшивки при синтезе приемлема только если вязкость тиолированного хитозана остается в указанных границах и его растворимость в воде достаточна для получения водного офтальмологического раствора.
4
4
Установлено, что можно получить хитозан-NAC с очень небольшой или нулевой степенью сшивки тиольных групп путем обработки хитозан-NAC восстановительным реагентом после синтеза, например, после щелочного гидролиза тиоацетильных фрагментов. Восстановительный реагент можно выбрать из группы, включающей DTT, TCEP или NaBH, NaBH является предпочтительным. Кроме того, установлено, что стадию восстановления следует проводить при повышенной температуре, такой как равная 30°C или более высокой, или, предпочтительно 40°C или более высокой. Кроме того, необходимо использовать большие количества восстановительных реагентов, так чтобы отношение количества восстановительного реагента к количеству полимера с хитозановой основной цепью составляло 2:1 или более.
В этом варианте осуществления можно синтезировать полимеры хитозан-NAC со степенью сшивки тиольных групп, составляющей менее 5%, предпочтительно 4% или менее в пересчете на полное количество тиольных групп.
2
2
Предпочтительно, если вязкость в водном растворе конечного хитозан-NAC, применяющегося в соответствии с настоящим изобретением, находится в некотором диапазоне, и установлено, что вязкость хитозан-NAC находится в этом предпочтительном диапазоне только если при получении хитозан-NAC его обрабатывают при некоторых условиях и с использованием некоторых параметров, в особенности при условиях восстановления, указанных выше, когда получают полимеры, которые сшиты лишь в минимальной степени. Вязкость полученного продукта предпочтительно находится в приемлемом диапазоне, так чтобы хитозан-NAC был в наибольшей степени подходящим для использования в полученных глазных каплях. Таким образом, кинематическая вязкость (0,5% в воде при 25°C) полимера хитозан-NAC предпочтительно находится в диапазоне примерно от 1 до 15 мм/с, более предпочтительно в диапазоне примерно от 2 до 10 мм/с. Если вязкость слишком высока, то подходящий раствор глазных капель невозможно приготовить в предпочтительном диапазоне концентрации хитозан-NAC, поскольку полимер останется в контейнере в виде нерастворимой вязкой массы.
Хитозан-NAC необходимо очищать, чтобы он был применим для использования в препарате, применяемом в соответствии с настоящим изобретением (таком как после указанной выше стадии 3 и, в особенности после обработки хитозан-NAC восстановительным реагентом). Хитозан-NAC необходимо промывать таким образом, чтобы полученный продукт был чистым. Одна известная методика раскрыта в публикации Kast and Bernkop-Schnurch, 2001, Thiolated polymers - thiomers: development and in vitro evaluation of chitosan-thioglycolic acid conjugates, Biomaterials (22): 2345-2352.
Другой методикой является промывка хитозан-NAC полярными растворителями с последующей сушкой для удаления растворителей. Одним предпочтительным растворителем является изопропиловый спирт, поскольку он нетоксичен, доступен и экономичен, однако являются подходящими другие растворители и другие спирты кроме изопропилового спирта. При необходимости эту промывку можно повторять в зависимости от объема использующегося в каждом случае растворителя. Предпочтительно, если стадию промывки и сушки повторяют по меньшей мере один раз.
Стадию сушки можно проводить при комнатной температуре и нормальной влажности, но эта процедура может быть очень длительной. Поэтому процедуру сушки предпочтительно проводят при повышенной температуре и/или при пониженном давлении. Сушку хитозан-NAC предпочтительно проводят при повышенной температуре, равной от не ниже примерно 40°C до примерно 70°C и предпочтительно в течение не менее примерно 5 ч. Более предпочтительную процедуру сушки проводят при температурах от не ниже примерно 50°C до примерно 60°C в течение примерно от 10 до 24 ч. Одной предпочтительной процедурой многостадийной очистки является трехкратная промывка полимера хитозан-NAC изопропиловым спиртом и выделение твердого вещества центрифугированием с последующей сушкой примерно при 60°C в течение примерно от 15 до 20 ч.
Водный офтальмологический раствор, применяющийся в соответствии с настоящим изобретением, может содержать по меньшей мере один офтальмологически приемлемый инертный наполнитель. Можно использовать любой подходящий инертный наполнитель, например, для регулирования тоничности, вязкости раствора или стабилизации pH, увеличения растворимости активного ингредиента, улучшения комфорта для глаз после введения или стабилизации препарата в целом.
Значение pH водного офтальмологического раствора регулируют путем добавления любых физиологически и офтальмологически приемлемых регулирующих pH кислот, оснований или буферов с обеспечением значения pH в диапазоне от примерно 5,5 до примерно 7. Значение pH, которое намного ниже примерно 5,5 выходит за пределы физиологически приемлемых параметров (раствор должен вызывать чувство сильного нагрева или жжения в глазу). При pH намного выше 7 затруднительно получить стабильный раствор хитозан-NAC, не осаждающегося из раствора. Таким образом, вследствие легкости приготовления стабильного раствора, значение pH меньше 7 является предпочтительным. Предпочтительное значение pH водного офтальмологического раствора, применяющегося в соответствии с настоящим изобретением, равно от примерно 5,8 до примерно 6,8, а значение pH, равное от 6,0 до 6,6 является наиболее предпочтительным.
Примеры подходящих кислот, использующихся в препарате, предлагаемом в настоящем изобретении, включают уксусную, борную, лимонную, молочную, фосфорную, хлористоводородную и т.п., и примеры оснований включают гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия, лактат натрия, трометамин, THAM (трисгидроксиметиламинометан) и т.п. Предпочтительным вариантом осуществления является буферная система из борной кислоты и бората натрия, которая также содержит полиол, такой как маннит, для увеличения буферной способности в наиболее предпочтительном диапазоне pH, составляющем от 6,0 до 6,6.
2
Примеры подходящих инертных наполнители, использующихся в препарате для повышения стабильности препарата, включают динатрийэтилендиаминтетраацетат (Na-EDTA), метабисульфит натрия, маннит, полиэтиленгликоль и т.п.
Осмоляльность местного офтальмологического препарата, применяющегося в настоящем изобретении, обычно равна от примерно 150 до примерно 400 миллиосмол (мОсМ), более предпочтительно от примерно 200 до примерно 350 мОсМ и осмоляльность, равная от примерно 250 до примерно 330 мОсМ является наиболее предпочтительной. Осмоляльность можно регулировать путем использования подходящих количеств физиологически и офтальмологически приемлемых ионных или неионных агентов. Хлорид натрия является обычным осмотическим агентом. Эквивалентные количества одной или большего количества солей, состоящих из катионов, таких как калий, аммоний и т.п., и анионов, таких как хлорид, цитрат, аскорбат, борат, фосфат, бикарбонат, сульфат, тиосульфат, бисульфат и т.п., можно использовать в дополнение к хлориду натрия или вместо него для обеспечения осмоляльности в указанном выше диапазоне. Кроме того, неионные агенты, такие как маннит, декстроза, сорбит, глицерин, глюкоза и т.п., также можно использовать для регулирования осмоляльности. Хлорид натрия и маннит являются предпочтительными агентами для регулирования осмотического давления.
Офтальмологический препарат может содержать смазывающие вещества для обеспечения высокого уровня комфорта для глаз, подходящего для регулярного применения, необходимого для лечения DES. Имеется много типов смазывающих агентов, такие как поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, жидкие полиолы, гиалуроновая кислота и ее фармацевтически приемлемые соли, лубрицин и производные целлюлозы; однако предпочтительными агентами являются полиэтиленгликоль и гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC).
В предпочтительном варианте осуществления офтальмологический раствор, применяющийся в соответствии с настоящим изобретением, содержит следующие инертные наполнители в дополнение к N-(N-ацетилцистеинил)хитозангидрохлориду:
Борную кислоту в количестве, равном от 1,0 до 16,0 мг/мл, предпочтительно от 8 до 16 мг/мл;
Полиэтиленгликоль 400 в количестве, равном от 0,01 до 5,0 мг/мл, предпочтительно от 1 до 5 мг/мл;
2
Na-EDTA в количестве, равном от 0,01 до 0,5 мг/мл;
Маннит в количестве, равном от 0,01 до 5,5 мг/мл, предпочтительно от 0,1 до 4 мг/мл;
Хлорид натрия в количестве, равном от 0,01 до 9 мг/мл, предпочтительно от 1 до 3 мг/мл; и
Гидроксипропилметилцеллюлозу в количестве, равном от 0,01 до 20 мг/мл, предпочтительно от 1 до 3 мг/мл.
Офтальмологический раствор, применяющийся в соответствии с настоящим изобретением, должен быть стерильным и его можно стерилизовать любым подходящим образом. Одной особенно предпочтительной методикой стерилизации является стерильное фильтрование. Офтальмологический раствор, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать консерванты, такие как бензалконийхлорид, хотя он является менее предпочтительным.
Водный офтальмологический раствор, содержащий хитозан-NAC, можно вводить в глаза пациента с помощью любых средств, подходящих для местного введения. Ими предпочтительно является форма водного раствора в виде глазных капель. Этот раствор может находиться в одноразовом контейнере, который стерилен до вскрытия и не должен содержать консервант, или должен быть в форме многоразового контейнера, который остается стерильным после вскрытия, или в форме многоразового контейнера, который содержит препарат, включающий консервант.
Тиольные группы полимеров хитозана-NAC склонны образовывать дисульфидные связи в водных растворах, что ухудшает мукоадгезивную способность хитозан-NAC. Установлено, что эта склонность зависит от присутствия кислорода в водном офтальмологическом растворе.
Установлено, что можно стабилизировать свободные тиольные группы хитозан-NAC, использующегося в соответствии с настоящим изобретением, в водном растворе даже в большей степени, чем при хранении раствора в бескислородной среде, или в практически бескислородной среде. Бескислородная атмосфера может представлять собой атмосферу азота, вакуум или атмосферу, состоящую из инертных газов.
Таким образом, когда раствор помещают в контейнер, это следует делать при отсутствии кислорода. Кроме того, после заполнения контейнера водным офтальмологическим раствором, предлагаемым в настоящем изобретении, он не должен содержать кислород. Поэтому в объем настоящего изобретения также входит применение контейнера, который при хранении содержит водный офтальмологический раствор без кислорода.
Соответственно, в настоящем изобретении предпочтительно использовать в основном не содержащий кислород контейнер, содержащий водный офтальмологический раствор. Выражение "в основном не содержащая кислород" следует понимать, как атмосферу, содержащую 1,5% кислорода или менее. Концентрация растворенного кислорода в растворе во время приготовления препарата и помещения в контейнер равна менее 1,0 мг/л, более предпочтительно менее 0,5 мг/л, еще более предпочтительно в диапазоне от 0,1 мг/л.
2
В предпочтительном варианте осуществления контейнер изготовлен из материала, который непроницаем для кислорода, так что после заполнения офтальмологический раствор в основном не содержит кислород в течение длительного периода времени. Такие контейнеры должны быть изготовлены из стекла или покрытых стеклом полимеров, металла или покрытых металлом полимеров. В другом предпочтительном варианте осуществления контейнер изготовлен из полимера, который содержит поглотитель кислорода, который должен предотвращать поступление кислорода через стенки контейнера. Такие поглотители кислорода включают соли железа, сульфиты, аскорбиновую кислоту, соли ненасыщенных жирных кислот, комплексы металл-полиамид или системы на основе палладий/H. Например, в WO 09/32526 раскрыта пленка, содержащая активный барьерный слой для кислорода, содержащий поглощающую кислород композицию, смешанную с термопластичной смолой, содержащей двойные связи углерод-углерод в основном в ее главной цепи, соль переходного металла и барьерный для кислорода полимер, обладающий барьерными характеристиками для кислорода.
Кроме того, сам контейнер можно изготовить из газонепроницаемого материала с включенным поглотителем кислорода и вакуумной системой укупорки.
Предпочтительный вариант осуществления относится к первому контейнеру, содержащему офтальмологический раствор, и второму контейнеру, содержащему указанный первый контейнер.
Так, например, контейнер, который содержит офтальмологический раствор, предлагаемый в настоящем изобретении, сам находится внутри газонепроницаемого пакета-саше или мешка. В частности, пакет-саше или мешок, изготовленный из алюминия или алюминиевого ламината, или алюминиевой композиции, может содержать внутри один или большее количество субконтейнеров (т. е. "первых контейнеров"), содержащих офтальмологический раствор, предлагаемый в настоящем изобретении. Второй контейнер, т. е. пакет-саше или мешок, также может содержать дополнительный поглотитель кислорода (например, PKT KH-20 Pharmakeep или Stabilox Oxygen Scavenger), как это используется в некоторых стандартных упаковках. Даже если пакет-саше герметизирован в вакууме или в инертной атмосфере, добавление поглотителя кислорода может потребоваться для удаления остаточного кислорода из субконтейнера. Пакет-саше может содержать один или большее количество однодозовых контейнеров или многодозовых контейнеров, например, 5 однодозовых контейнеров в одном пакете-саше. В случае многодозового контейнера необходимо сохранять офтальмологический раствор, предлагаемый в настоящем изобретении, в стерильном состоянии и в основном без кислорода.
Хитозан-NAC, содержащийся в контейнере, предпочтительно использующемся в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно обладает содержанием свободных тиольных групп, равным от 80 мкмоль/г полимера до 250 мкмоль/г полимера, предпочтительно 105 мкмоль/г полимера до 250 мкмоль/г полимера, после хранения в течение не менее 12 месяцев при комнатной температуре. Это означает, что свободные тиольные группы остаются на хитозан-NAC и что полученный препарат стабилен в течение длительного периода времени. Этот период времени предпочтительно составляет не менее примерно 12 месяцев, более предпочтительно не менее 18 месяцев и еще более предпочтительно не менее примерно 24 месяцев. Эта длительная стабильность является предпочтительной, поскольку некоторые продукты, обладающие длительными временами хранения, задерживаются в коммерческих цепях доставки и поставки, что может привести к менее стабильному продукту, параметры которого выходят за пределы приемлемых значений.
Кроме того, предпочтительно, если содержание сшитых тиольных групп в хитозан-NAC, содержащемся в контейнере составляет 30% или менее в пересчете на полное количество содержащихся в нем тиольных групп, предпочтительно 25% или менее, наиболее предпочтительно 20% или менее после хранения в течение не менее 12 месяцев, более предпочтительно не менее 18 месяцев. Как отмечено выше, стабильность свободных тиольных групп в растворе является особенно высокой, если для приготовления раствора используют хитозан-NAC лишь с минимальной степенью сшивки тиольных групп.
В описанном выше варианте осуществления, в котором имеется второй контейнер, например, газонепроницаемый пакет-саше, содержащий один или большее количество первых контейнеров, например, одноразовые контейнеры, изготовленные из LDPE (полиэтилен низкой плотности), содержание свободных тиольных групп в растворе предпочтительно остается в диапазоне, определенном в настоящем изобретении, после вскрытия первого контейнера в течение не менее 30 дней. Время использования для лечения, необходимое, например, для 5 контейнеров, равно 5 дней, таким образом, срок стабильности является более, чем достаточным.
Как отмечено выше, установлено, что в особенности, если для изготовления офтальмологического раствора, предлагаемого в настоящем изобретении, используется хитозан-NAC лишь с минимальной степенью сшивки тиольных групп, свободные тиольные группы остаются стабильными даже после вскрытия второго контейнера, который обеспечивает кислородный барьер, т. е. установлено, что через 30 дней после вскрытия второго контейнера увеличение содержания сшитых тиольных групп составляет <15% в пересчете на содержание тиольных групп, изначально содержащихся в растворе до вскрытия.
В другом предпочтительном варианте осуществления офтальмологический раствор наносят на рану роговицы два или три раза в сутки.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения неинфекционной раны роговицы, в котором стерильный водный офтальмологический раствор, включающий N-(N-ацетилцистеинил)хитозан, определенный выше, наносят на указанную рану.
Примеры:
Пример 1: Модель заживления раны роговицы
Задачей настоящего эксперимента являлось исследование того, может ли водный офтальмологический раствор, содержащий 0,1% хитозан-NAC (степень модификации: 209 мкМ свободных тиольных групп/г полимера) ускорять заживление раны по сравнению с контрольным веществом, содержащим забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Водный офтальмологический раствор, содержащий 0,1% (мас./мас.) хитозан-NAC, готовили в инертной среде путем растворения хитозан-NAC в содержащем борную кислоту буфере, дополнительно содержащем маннит, полиэтиленгликоль 40 и гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC). Конечное значение pH раствора равнялось 6,4. В эксперименте использовали самок белых кроликов New Zealand (Charles River, Ekrath, Germany) с массой тела, равной от 1,7 кг до 2,5 кг. Животных содержали парами в контролируемой среде: искусственное освещение день-ночь 12/12 ч, 20°C комнатная температура, 60% влажность. Воду и стандартный корм для кроликов давали без ограничений. Животных обследовали через не менее 2 недель после доставки, чтобы обеспечить адаптацию к среде.
Всего у 16 животных образовывали определенное поражение роговицы. Центральный эпителий роговицы осторожно удаляли с помощью офтальмологического скальпеля, избегая повреждения боуменовского слоя. Целевой дефект обладал диаметром, равным 6 мм. Размер поражения роговицы характеризовали с помощью ОКТ сверхвысокого разрешения и фотографирования со щелевой лампой после инстилляции флуоресцеина. Измерения проводили в исходном состоянии (до разреза) и через 6, 12, 24, 36, 48 и 72 ч после образования поражения роговицы. Введение глазных капель проводили каждые 12 ч в течение всего эксперимента. Все эксперименты проводили при анестезии, которую обеспечивали путем внутримышечной инъекции 25 мг/кг кетамина и 2 мг/кг ксилазина. В качестве анальгетиков вводили метамизол-натрий и 0,025 мг фентанила.
Результаты этого исследования представлены на фиг. 1, на котором показано изменение во времени заживления раны после введения хитозан-NAC (белые отметки) или PBS (плацебо, черные отметки). По оси y отложена площадь дефекта. Данные оценены по фотографии со щелевой лампой после окрашивания флуоресцеином поражений роговицы (A) или по изображениям ОКТ (B). Данные представлены в виде средних значений +/- стандартное отклонение. При использовании глазных капель, содержащих N-ацетилцистеинхитозан, наблюдали значительно более быстрое излечение, чем в случае плацебо (p < 0,05 в каждом случае, повторные измерения с помощью ANOVA). Обнаружено хорошее согласие данных, полученных по двум разным методикам.
Пример 2: Образование полимерной сетки на поверхности глаза
2
2
2
Клетки лимбального эпителия роговицы человека (HCLE) держали в бессывороточной среде для выращивания кератиноцитов (Thermo Fisher Scientific) при 37°C и 5% CO и высевали по 1×105 клеток/лунка в 24-луночные планшеты, накрытые покровными стеклами 11 мм ACLAR. После слияния клеток их обрабатывали в течение 15 мин с помощью 0,1% (мас./мас.) хитозан-HCl или 0,1% (мас./мас.) хитозан-NAC (степень модификации: 219 мкМ свободных тиольных групп/г полимера), разведенных в 100 мМ содержащем борную кислоту буфере. Содержащий борную кислоту буфер также помещали в контрольные лунки. Затем растворы полимера удаляли и клетки сразу фиксировали для исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) путем добавления 2,5% глутарового альдегида в буфере 0,06×PHEM (буфер 1×PHEM содержал 60 мМ PIPES, 25 мМ HEPES, 10 мМ EGTA и 2 мМ MgCl). Затем монослои клеток дополнительно фиксировали в 1% водном растворе тетраоксид осмия (Agar Scientific, Stansted, UK), дегидратировали в чистом ацетоне, сушили при критической температуре в жидком CO (Leica CPD300, Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria), закрепляли на 12 мм алюминиевых стержнях для SEM с C-вкладышами и затем покрывали золотом путем напыления (100 мс) с вращением (Leica sputter coater, Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria), и исследовали на приборе JEOL IT300 SEM при 15 кВ. Все изображения получали с помощью вторичного электронного детектора с увеличением 300×.
Результаты приведены на фиг. 2 и показаны полученные с помощью представляют собой полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии изображения клеток лимбального эпителия роговицы человека, инкубированных в 0,1% (мас./мас.) хитозан-HCl (B) или 0,1% (мас./мас.) хитозан-NAC (C). Для сопоставления представлены необработанные слитые контрольные клетки (A). На фиг. 2C ясно видно образование полимерной сетки на поверхности клеток после нанесения растворов хитозан-NAC. Этот эффект не наблюдается для контрольных клеток (фиг. 2A) и клеток, обработанных с помощью хитозан-HCl (фиг. 2B).
Пример 3: Исследование конкретного случая
Пациенту-мужчине (в возрасте 57 лет), страдающему от чрезвычайно тяжелого атопического дерматита и многократного рецидивирующего герпетического кератита, вследствие перфорации проведена неотложная перфорационная кератопластика. У него возникла послеоперационная инфекция трансплантата, которую можно было устранить с помощью антибиотиков. Однако у него имелся стойкий эпителиальный дефект, который не излечивался в течение месяцев несмотря на применение различных лекарственных средств (местные лекарственные средства: Vigamox 4 раза в сутки, Dexa EDO 2 раза в сутки и Vismed через час; пероральные лекарственные средства: Valtrex 1-0-1, Myfortic 360 мг 2-0-2, Decortin H 12,5 мг/сутки).
После дополнительного введения в глаза водного офтальмологического раствора, содержащего 0,1% хитозан-NAC (степень модификации: 212 мкМ свободных тиольных групп/г полимера) один раз в сутки в течение 7 дней дефект эпителия роговицы был излечен.
Пример 4: Исследование конкретного случая
У пациента-мужчины (31 год, носитель контактных линз) с покрасневшими и болезненными глазами диагностирован двусторонний точечный поверхностный кератит (SPK) и слабая цилиарная инъекция. Начальное лечение глазными каплями с левофлоксацином привело у смягчению симптомов в течение следующих 3 недель, но SPK сохранился. К лекарственным средствам добавляли глазные капли предзол 0,5% 3 раза в сутки. Клинические показатели не менялись в течение следующей недели и к лекарственным средствам дополнительно добавляли глазные капли целлювиск 0,5% каждые 2 ч и доксициклин 100 мг. Через месяц клинические показатели не улучшались. Повторное лечение глазными каплями азитер также не привело к сколько-нибудь значительному улучшению SPK. После лечения глазными каплями целлювиск и маслом чайного дерева для обеспечения гигиены век в течение месяца симптомы у пациента повторно ухудшились. Лечение всеми указанными выше препаратами прекратили.
После лечения водным офтальмологическим раствором, содержащим 0,1% хитозан-NAC (степень модификации: 212 мкМ свободных тиольных групп/г полимера) один раз в сутки в течение 5 дней симптомы у пациента заметно ослабились и оставшийся SPK был лишь минимальным.