СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИГОДНОСТИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КАК ИСТОЧНИКА ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ
METHOD OF DETERMINING PANCREAS ELIGIBILITY AS SOURCE OF PANCREATIC ISLETS

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к повышению качественного и количественного выхода островков. Островки находятся в поджелудочной железе животных, и изобретение относится к методам определения того, обеспечивает ли поджелудочная железа хороший выход островков.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время установлено, что заместительная терапия островков является перспективным подходом к лечению пациентов от различных нарушений.
Они включают пациентов больных раком, подвергающихся экзентерации верхнего отдела брюшной полости (Tzakis, et al., Lancet, 336: 402-405 (1990)); поджелудочной железы (Clayton, et al., Transplantation, 76: 92-98 (2003); Famey, et al., Surgery, 110: 427-437 (1991); Fontes, et al., Transplant. Proc., 24: 2809 (1992); Obenholzer, et al., Transplantation, 69: 1115-1123 (2000); Robertson, et al., Diabetes, 50: 47-50 (2001)), и инсулинзависимых пациентов, когда трансплантация островков является терапевтической возможностью (Goss, et al., Transplantation, 74: 1761 - 1766 (2002); Ricordi, et al., Transplantation, 75: 1524-1527 (2003); Ryan, et al., Diabetes, 50: 710-719 (2001); Shapiro, et al., N. Engl. J. Med., 343: 230-238 (2000)).
Благодаря пригодности островков в терапии, как показано supra, безусловно есть интерес в развитии способов их выделения. Хотя есть много сообщений о выделении островков автоматическим методом (Brandhorst, et al., Exp.Clin. Endocrinol. Diabetes, 103 Suppl. 2: 3-14 (1995); Cui, et al., Cell Transplant., 6: 48-54 (2001); Marchetti, et al., Transplantation, 52: 209-213 (1991); Miyamoto, et al., Cell Transplant., 7: 397-402 (1998); Nielsen, et al., Comp. Med., 52: 127-135 (2002); Swanson, et al., Hum. Inmunnol., 62: 739-749 (2001); Toomey, et al., Brit. J. Surg., 80: 240-243 (1993); Toso, et al., Cell Transplant., 9: 297-305 (2000); Wennberg, et al., Transplant. Proc., 33: 2537 (2001)), выделение островков по-прежнему остается затруднительным. Например, в Bosta, et al., J. Investig. Med., 43: 555-566 (1995); Krickhahn, et al., Cell Transplant., 11: 827-838 (2002); Krickhahn, et al., Ann Transplant, 6: 48-54 (2001), O'Neil, et al., Cell Transplant., 10: 235-246 (2001), и White, et al., Honn. Metab. Res, 31: 579-524 (1999), обсуждаются проблемы, связанные с этим.
Данное изобретение, которое описано ниже, относится к методу максимизации возможности достижения достаточного выхода островков. Было определено, что при помощи применения системы оценки, представленной ниже, можно очень значительно повысить возможность достижения хорошего выхода островков по любому данному способу выделения панкреатических островков.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На чертеже,1А представлена микрофотография поджелудочной железы, которая по методу по изобретению, оценивается в +3 балла и квалифицируется при этом как пригодная поджелудочная железа, а на чертеже, 1В показана микрофотография поджелудочной железы, оцениваемая по шкале в -1, которая не может быть использована.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРИМЕР 1
Животные, использованные в примерах, которые следуют ниже, представляли собой свиноматок в возрасте более 2 лет со способностью к многократному деторождению. Животные были оглушены электрическим током и обескровлены. Затем были удалены внутренние органы для извлечения поджелудочной железы. Промежуток времени между моментом оглушения электрическим током и моментом помещения поджелудочной железы в холодный раствор Hank's Balanced Salt Solution ("HBSS") обычно был равен 10-15 мин. Время продолжения холодного местного малокровия (холодной ишемии) составляло 15-20 мин.
При проведении этой процедуры была извлечена целиком поджелудочная железа, затем было вырезано кольцевидное тело вокруг воротной вены на пересечении правой и левой долей с целью получения образца ткани для биопсии толщиной около 2-5 мм.
Срезы ткани для биопсии были разрезаны пополам и помещены или в HBSS или в раствор дитизона ("DTZ") в соответствии с Ricordi, et al., in Ricordi, et al., ed. Pancreatic islet Cell Transplantation (Austin: R.G.Landes Company, 1992), 132-142.
Затем поджелудочную железу помещали в HBSS, к которому добавляли 2% и инактивированной при нагревании свиной сыворотки ("PS") и затем передавали в лабораторию для выделения островков.
Проверяли биопсию образцов поджелудочной железы с целью определения их пригодности для выделения островков. Оценивали пять переменных величин. В каждом случае образцам присваивали баллы +1 или -1, как это объяснено ниже.
Во-первых, было определено время тепловой ишемии. Оно определяется как промежуток времени между началом обескровливания и помещением поджелудочной железы в холодный консервирующий раствор. Если эта величина равна 15 мин или менее, присваивается балл +1. Если проходит более 15 мин, присваивается балл -1. Хотя тепловая ишемия до 20 мин иногда позволяет получить хороший выход островков, шансы на успех уменьшаются после времени тепловой ишемии, равного 15 мин.
Вторым критерием был цвет поджелудочной железы. Различный цвет образцов поджелудочной железы может объясняться несколькими факторами. Например, если в поджелудочной железе был венозный застой в результате, например, электротравмы животных или стрессового ответа, тогда эта поджелудочная железа не обладает качествами, позволяющими применять ее в качестве донора островков. Оба условия могут привести к тому, что кровь разольется в поджелудочной железе, высвободится гемоглобин и диффундирует во внеклеточное пространство. В свою очередь это приводит к изменению окраски органа, обычно это коричневый или пурпурный цвет.
Окраска поджелудочной железы может быть субъективной, и специалист может отличить поджелудочную железу с темной окраской (которая является нежелательной, балл равен -1) и светлоокрашенную поджелудочную железу (которая желательна, балл составляет +1); однако более объективный тест проводится с применением колориметра, который обнаруживает цвет на основе отношения отраженного и падающего света, отношения "отражения". Если оно меньше примерно 60, то присваивается балл равный -1, а если больше примерно 60, присваивается балл равный +1.
Третьим критерием, используемым для оценки органов, является содержание жира. Для определения этого показателя образец для биопсии размером 2×2×2,5 см толщины погружали в DTZ примерно на 5 мин. После окрашивания ткань осматривали под микроскопом при 10х увеличении. Островки имеют красную окраску, а липидная ткань - зеленую. Выбирается поле зрения, и определяется в процентах общая площадь зеленого цвета. Если общее содержание жира выше примерно 25%, то органу присваивается балл - 1, а если содержание жира меньше примерно 25%, этот балл равен +1.
Следует иметь в виду, что для определения содержания жира в органе доступны и другие методы, и все они могут быть применены.
Четвертый применяемый критерий представлял собой отграничение островков. Для определения этого параметра применяли тот же метод окрашивания и наблюдения. Те островки, которые имели диаметр более 50 мкм, оценивались на отграничение. Если две или более из групп островковых клеток, окрашенных DTZ, выступали радиально из центра островков, что обычно представляет собой ровную четко обозначенную внешнюю границу / плоскость островка, это приводит к наличию плохого отграничения. Если были четко отграничены более 50% островков, то этому показателю присваивали балл, равный +1, а если меньше - то балл, равный -1.
Последним критерием является размер островков, который характеризуют диаметром по отношению к среднему диаметру островков для данного вида рассматриваемых животных. Решающим для оценки является определение того, превышает ли средний диаметр островков в рассматриваемом органе среднюю величину. Для многих видов средний диаметр островков равен примерно 100 мк. Это имеет место в случае островков у грызунов, свиней и людей, а также других видов. Если большинство исследуемых островков, как описано выше, имели диаметр более 100 мкм, присваивался балл, равный +1, в других случаях присваивали балл, равный -1. Если, с другой стороны, средний диаметр островков отличается от величины диаметра островков свиньи, тогда этот показатель будет применяться как эталон для сравнения. Например, хорошо известно, у тилапии, разновидности рыбы, имеются островки большого размера, в среднем имеющие диаметр около 5 мм. Если поджелудочная железа тилапии будет исследоваться, тогда точкой отсчета будет величина диаметра, равная 5 мм, и положительные баллы будут присваиваться, если величина среднего диаметра островков будет больше 5 мм.
Баллы, присуждаемые по всем этим пяти критериям для каждого образца поджелудочной железы, были сведены в таблицу. Если общий балл составлял +1 или более, орган рассматривался как подходящий донор островков.
В таблице 1 показаны результаты исследования десяти органов, которым был присвоен общий балл, равный +1 или более.
Таблица 1
Баллы, присвоенные биопсийным образцам отдельных донорных поджелудочных желез
Номер
WIT
Цвет
Содержание жира
Размер островков
Граница
Балл
W1561
1
1
1
1
-1
3
O2109
1
1
1
1
1
5
Y8641
1
1
1
1
-1
3
O37360
1
1
1
1
-1
3
0786
1
1
1
1
-1
3
Y8587
1
1
1
-1
-1
1
W1102
1
1
1
-1
-1
1
W1524
1
1
1
-1
1
3
O39820
1
1
-1
-1
1
1
R2027
1
1
1
-1
1
3
На чертеже, 1А и 1В представлены микрофотографии образцов поджелудочной железы с баллом +3 (чертеж, 1А) и поджелудочной железы с баллом -1 с целью сравнения. На чертеже, 1А отчетливо видны большие островки (>100 мкм), а также их четкая граница. В противоположность этому поджелудочная железа, показанная на чертеже, 1В, имеет небольшие островки с нечеткими границами. С учетом стандартов используемых протоколов, описанных в данной заявке, поджелудочная железа, изображенная на чертеже, 1В, не может считаться донором, однако ее применяют для целей сравнения, что показано в следующих примерах.
ПРИМЕР 2
С учетом оценок, приведенных в примере 1, поджелудочные железы с баллом, равным +1 или больше, а также сравнительные поджелудочные железы с баллом, равным -1, обрабатывали далее. Железы были освобождены от жира и соединительной ткани, затем проводили канюлирование основного протока поджелудочной железы иглой из нержавеющей стали с тупым концом (16 г). Осуществляли перфузию раствора HBSS, содержащего коллагеназу Р, с концентрацией 1,5-2,0 г/л со скоростью 50 мл/мин при температуре 30°С с получением 2 мл раствора на грамм веса поджелудочной железы.
3
Затем поджелудочную железу погружали в 500 мл HBSS и 2% PS вместе с 200 мл раствора коллагеназы при температуре 30°С. Внешняя циркуляция воды с температурой 39°С медленно нагревала орган до 37°С и позволяла поддерживать температуру перевариваемого органа равной 36-37°С. Когда органы распались и не оказывали сопротивления давлению рукой (общее время составляло около 10-20 мин, а время после достижения температуры, равной 37°С, равнялось 5-10 мин), ферментацию прекращали. Переваренный образец затем центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали и полученный осадок суспендировали в 10% PS и в растворе для консервации органов. Потом островки очищали с применением Ficoll при градиентах плотности, равных 1,105, 1,095, 1,085 и 1,05 г/см, HBSS плюс 2% PS, в пробирках объемом 50 мл. Пробирки подвергали центрифугированию при 650 г и при температуре 4°С, собирали слои, содержащие островки, и промывали три раза при помощи HBSS с 10% PS, после чего их очищали вручную от неостровковой ткани при помощи электронного микроскопа. Островки затем суспендировали и применяли образцы объемом 0,5 мл для определения выхода островков.
Для поджелудочных желез, показанных на чертеже, 1А и 1В, выход островков для поджелудочных желез с баллом, равным +3, составлял примерно 105000 BIN (эквивалентное число островков, см. определение у Ricordi et al., выше) при степени чистоты, равной 98,8%. По контрасту выход островков для органа, показанного на чертеже, 1В, был равен 44000 EIN.
Средняя величина выхода островков для десяти образцов поджелудочных желез в таблице 1 в действительности была равна 130000 BIN при средней величине 1-101 EIN на г переваренной ткани. Степень чистоты во всех случаях составляла более 90%. Для девяти органов жизнеспособность островков была более 89%. Метод этих определений описан ниже.
ПРИМЕР 3
После выделения островков определяли различные параметры, включая степень чистоты и жизнеспособность.
Степень чистоты определяли путем окрашивания примерно 500 EIN DTZ в течение 10 мин и затем проведения стандартного анализа визуализации с применением электронного микроскопа и цифровой камеры.
Жизнеспособность определяли путем окрашивания образца диацетатом флуоресцеина (FDA) и этидийбромидом (ЕВ). Для этого примерно 500 EIN добавляли к 1 мл RPMI, 10% PS и 1% антибиотика / антимиотического средства ("А/А"). Затем добавляли 20 мкл окрашенного FDA вещества, полученного с применением 10 мг FDA и 1 мл ацетона, и 200 мкл ЕВ, полученного с применением 30 мкл ЕВ и 1 мл PBS. Островки были окрашены в темноте в течение 7 мин и затем рандомизированные образцы 10-50 островков рассматривали при помощи флуоресцентного микроскопа и фотографировали для определения жизнеспособности стандартным методом визуализации.
Определяли также содержание инсулина в островках путем помещения примерно 500 EIN в экстракционный раствор подкисленного спирта (7,2 мл 1 N HCl, 400 мл 100%-ного денатурированного этанола). Образцы хранили при температуре -20°С и затем проводили RIA (радиоиммуноанализ) инсулина.
Таблица 2
Номер образца
Содержание инсулина (mu / 500 BIN)
W1561
338,66
O2109
1288,69
Y8641
775,37
037360
402,59
O786
184,40
Y8587
669,92
W1102
590,05
W1524
НО
O39820
НО
R2027
474,55
ПРИМЕР 4
Этот и следующие примеры касаются вопроса, были ли островки, идентифицированные как пригодные и выделенные, как описано, подходящими для получения макрогранул.
Очищенные островки суспендировали в RPMI 1640+10% PS+1% А/А до получения объема 2000 EIN/мл. Островки были равномерно распределены в пробирках, так что каждая пробирка содержала 1 мл суспензии с 2000 EESL
После оседания островков надосадочные жидкости удаляли и к каждому образцу добавляли 0,5 мл 1,5%-ной агарозы при 50°С, которая была приготовлена в минимальной поддерживающей среде плюс 2,5% буфера HEPES, затем эту среду перемешивали. Затем суспензию помещали в стерильное минеральное масло, получая четыре гранулы с ровными поверхностями и равномерным распределением островков.
2
Макрогранулы удаляли и дважды промывали (RPMI+5% PS+1% А/А). Эти макрогранулы культивировали в том же растворе в атмосфере с 5% CO в течение 5-7 дней, после чего их промывали три раза в RPMI+1% А/А, затем наносили слой второго покрытия на основе агарозы. Для этого 0,5 мл 5%-ной агарозы в MEM (минимальной поддерживающей среде) плюс буфер HEPES при 60°С помещали пипеткой в стерильную пластиковую ложку и каждую макрогранулу перекатывали 3-5 раз для получения второго однородного покрытия на основе агарозы.
2
После подачи стерильного минерального масла для получения ровной поверхности, макрогранулы удаляли, дважды промывали в RPMI+2,5% PS+1% А/А и выдерживали при температуре 37°С в увлажненной среде воздух плюс 5% CO.
Макрогранулы, содержащие инкапсулированные островки, оставались жизнеспособными в течение более 6 мес, радиоиммуноанализ показал, что они продолжали продуцировать достаточное количество инсулина.
ПРИМЕР 5
Этот пример описывает опыт по определению, будут ли островки, выделенные, как описано выше, функционировать in vivo.
Использовали самцов мышей CD17-PrKdc <scid>/ J с диабетом без ожирения возрастом 7-9 нед. После недели акклиматизации животные получали 275 мг/кг стрептозотоцина, вызывающего диабет. Через 9 дн, когда уровень глюкозы в крови в среднем был выше 480 мг/дл, начали проводить инсулиновую терапию.
На 34-35 день после введения стрептозотоцина животные получили примерно 1000 EIN островков свиньи, которые помещали в сгусток крови согласно статье Bowen et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 58: 441-447 (1980), включенной в качестве ссылки. Вкратце, островки выделяли из суспензии и среду отсасывали. Затем у животного брали 5-10 мкл крови, добавляли к островкам и давали скоагулировать. Животных анестезировали равными объемами кетамина (167 мг/дл), ксилазина (33 мг/мл) и физиологического раствора. Смесь вводили подкожно с дозой 0,5 мл / 100 г. На левом боку делали маленький надрез для обнажения почки, применяли электронный микроскоп, чтобы сделать маленький надрез в капсуле почки. Затем капсулу отделяли от почки и островки/сгусток крови помещали под капсулу, надрез закрывали и животным давали вернуться в норму.
Затем осуществляли удаление почки (нефрэктомию) через 38-39 дней после трансплантации. После анестезии почка с трансплантатом была обнажена, почечные кровеносные сосуды были лигированы и у каждого животного была удалена почка. Через пять дней животных умерщвляли и поджелудочные железы направляли на гистологическое исследование для определения полного разрушения островковых бета-клеток.
Образцы ткани помещали в 10%-ный нейтральный буфер на 24 ч и затем помещали их в 70%-ный этиловый спирт.
Затем ткани погружали в парафин и участки 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Поджелудочную железу и имплантированные участки почки окрашивали для выявления клеток, содержащих инсулин и глюкаген, применяя стандартные методы, и затем исследовали.
У всех мышей после введения островков был нормальный гликемический индекс. После удаления почек у всех мышей гликемический индекс повысился в течение 4 дн.
Следующие примеры используют признаки изобретения, предусматривающие способ оценки поджелудочной железы для определения пригодности островковых клеток для применения в терапии. Способ включает определение по меньшей мере трех из пяти определенных критериев и назначение балла каждому показателю. Величины выбирают, как указано выше, из +1 или -1.
Если после определения трех критериев орган имеет общий балл, равный+3, тогда исследование можно закончить, так как даже если остальным двум критериям будут присвоены баллы, равные -1, орган не может иметь общий балл менее +1.
Если определены три критерия из пяти и орган имеет балл, равный +1, проводят четвертый тест, так как величина +1 для трех критериев не гарантирует, что конечный балл будет равен +1 или больше. Если четвертому критерию присваивается балл, равный +1, тогда тест может считаться завершенным, так как опять-таки орган не может характеризоваться баллом меньшим, чем +1, если ему присвоен общий балл равный +2 после четырех тестов.
Если после проведения четырех тестов общий балл, присвоенный органу, равен 0, тогда надо осуществить пятый тест, чтобы получить нужный результат.
Напротив, если орган имеет балл, равный -3 после трех тестов, продолжать исследование не имеет смысла, и если балл, равный -2, получен после четырех тестов, продолжать определение также не имеет смысла. (Следует обратить внимание на то, что в соответствии с данным изобретением единственно возможными баллами после трех тестов являются величины равные +3, +1, -1 или -3, а после четырех тестов - величины, равные +4, +2, 0 -2 и -4, однако баллы, равные +4 и -4, устраняют необходимость проведения дальнейших тестов. Следовательно, хотя продолжение определений может быть желательным, оно не требуется).
Выбор, какой из трех критериев следует определять первым, принадлежит специалисту в данной области, однако время тепловой ишемии является показателем, который может контролировать исследователь, и его может быть предпочтительно определять первым из трех показателей. Остальные из трех критериев выбирает специалист.
Методы, описанные выше, могут быть применены для исследования поджелудочной железы любого вида, включая, но без ограничения, железы телят, свиней, овец, грызунов, примата, людей, рыб или других видов.
Островки, которые получены из поджелудочных желез, которые выбраны в соответствии с данным изобретением, могут быть применены "как таковые", как показано в примерах, или могут быть использованы, например, в инкапсулированной форме в макрогранулах, как описано в патентах США №5643569 и Re 38027.
Другие аспекты данного изобретения очевидны для специалиста в данной области и не нуждаются в описании.
Термины и выражения, которые были использованы в описании, являются неограничивающими и поэтому применение таких терминов и выражений не рассматривается как исключающее любые эквиваленты описанных признаков или их частей, следует иметь в виду, что в объеме данного изобретения возможны различные модификации.