УСТРОЙСТВО МОНИТОРИНГА ОБРАЗОВАНИЯ ТРОМБА И СПОСОБ МОНИТОРИНГА ОБРАЗОВАНИЯ ТРОМБА
THROMBOSIS MONITOR AND METHOD OF THROMBOSIS MONITORING

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности антитромботического лекарственного средства, введенного пациенту или подобному индивидууму, и, в частности, к устройству и способу общей оценки свертываемости крови и образования тромбоцитарного тромба в среде, эквивалентной кровотоку, с цельной кровью или плазмой, содержащей тромбоциты.
Предшествующий уровень техники
Например, атеротромбоз (такой как при инфаркте миокарда) вызывает серьезное образование тромба, так что атероматозная бляшка разрушается на участке артериосклероза, тромбоциты сцепляются с коллагеном, включающим тканевые факторы, контактирующие с кровотоком. Далее происходят сложные процессы агрегации тромбоцитов, активации системы свертывания крови и им подобные, приводя к образованию тромба, вызывающего серьезную обструкцию сосуда. Сердечное заболевание, такое как инфаркт миокарда, представляет собой тяжелое заболевание, и оно является второй по частоте ведущей причиной общей смертности в Японии.
Однако образование тромба происходит только в атеросклеротической области, приводя к инфаркту миокарда, а выраженная тенденция к образованию тромбов во всем организме не наблюдается. Исследования in vitro не подходят для оценки тенденции к образованию тромбов и мониторинга антитромботического эффекта при антитромботической терапии. Таким образом, важно производить общую оценку свертывания крови и состояния тромбоцитов (сцепления и агглютинации) в присутствии кровотока.
До настоящего времени, свертываемость крови оценивали определением частичного активированного тромбопластинового времени (АРТТ), тромбопластинового времени (РТ) с использованием плазмы. АРТТ главным образом отражает эндогенное свертывание, а РТ главным образом отражает экзогенное свертывание. Исследование тромбоцитов крови проводится путем использования обогащенной тромбоцитами плазмы и добавления активирующего тромбоциты вещества, такого как ADP (аденозиндифосфат) или коллаген, для оценки посредством этого свертываемости тромбоцитов в результате изменения их скорости проникновения или подобных явлений. Кроме того, время свертывания цельной крови можно определить по времени образования сгустка цельной крови, времени образования сгустка цельной крови после повторного добавления кальция и тому подобного.
Далее, в устройствах обследования, использующих цельную кровь, применяется тромбокластограмма, которая контролирует активацию факторов свертывания, агглютинацию тромбоцитов и им подобные показатели.
Однако тромб растет в крови in vivo. Напротив, указанный выше способ исследования или ему подобные производит определение in vitro, т.е. в состоянии, закрытом для кровотока. Таким образом, нельзя наблюдать рост тромба in vivo.
В качестве предложений по решению указанных выше проблем в патентом документе JP 2004-251630 А и непатентных документах Blood 1990; 75, стр.390-398; Blood, 1999; август, 1:94(3), стр.968-75, раскрыт способ, включающий пропускание крови с введенным в нее антитромботическим лекарственным средством через коллаген и мониторинг с помощью конфокального микроскопа сцепления или агглютинации тромбоцитов, меченных флюоресцентной меткой.
Однако в способе, описанном в указанном патентном документе, наблюдение проводится в присутствии противосвертывающего лекарственного средства. Таким образом, мониторингом морфологического изменения в тромбоцитах оценивается тот факт, что в системе свертывания крови не происходит образования тромба, вызванного сцеплением или агглютинацией тромбоцитов, или способность генерирования тромба уменьшена. Следовательно, такая оценка не отражает связь активации тромбоцитов с системой свертывания крови. Поэтому указанное изобретение приемлемо для оценки эффективности антитромбоцитарного лекарственного средства, но оно не способно контролировать сам тромб и весь процесс формирования тромба. Кроме того, флюоресцентный микроскоп является дорогостоящим, поэтому его едва ли можно использовать для общих исследований.
Кроме того, в патентном документе JP 2006-145345 А, текучесть крови после введения антикоагулянта определяется пропусканием крови через силиконовую камеру, подобную мелкой расческе. Аналогичным образом в этом способе также используется кровь после введения антикоагулянта, так что влияние системы свертывания определить невозможно. Кроме того, вязкость в данном способе имеет большую индивидуальную вариабельность, так что трудно оценить воздействие медикаментозной терапии, используя указанную систему.
Тромбоцит активируется системой свертывания, в то время как система свертывания стимулируется активированными тромбоцитами. Другими словами, введение антикоагулянтов также ингибирует активацию тромбоцитов, так что нельзя наблюдать эффективность антитромботического лекарственного средства. Кроме того, если не проводится какая-либо антикоагуляционная терапия, то кровь быстро сворачивается, так что ее нельзя использовать при исследовании.
Краткое изложение существа изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание устройства и способа общей оценки образования тромбов из-за свертывания крови и образования тромбоцитарного тромба в условиях среды, эквивалентной кровотоку, при потоке цельной крови или плазмы, содержащей тромбоциты (в описании настоящего изобретения они могут совместно именоваться «кровью»), при мониторинге эффективности антитромботического лекарственного средства, введенного пациенту или подобному индивидууму.
Для решения указанной выше задачи согласно настоящему изобретению предложено устройство для мониторинга образования тромба, которое контролирует образование тромба путем пропускания крови после введения антикоагулянта через канал, который имитирует кровеносный сосуд, в то же время проводя антикоагуляционную обработку, или стимулируя свертывание крови, причем устройство содержит: камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал; впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба; и трубку для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, которое стимулирует свертываемость крови (далее именуемое «стимулятором свертывания»), или лекарственное средство, которое осуществляет антикоагуляционное действие. В настоящем изобретении термин «мониторинг» означает не только визуальную оценку образования тромба, визуализацию, но также оценку степени образования тромба в переводе на цифровую характеристику путем определения давления или подобного показателя.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено устройство для мониторинга образования тромба, которое содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и впускную трубку для ингибитора образования тромба, которая соединена с камерой образования тромба, и где происходит смешивание ингибитора образования тромба с кровью после пропускания через камеру образования тромба.
В этом случае устройство мониторинга образования тромба предпочтительно размещено на подложке.
Устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит насос для создания избыточного давления во впускной трубке и/или трубке для лекарственного средства или насос для аспирации содержимого выпускной трубки, которая соединена с камерой образования тромба и предназначена для удаления крови из камеры образования тромба.
Устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит устройство измерения давления и камеру для получения изображений, а также камеру образования тромба.
Кроме того, вызывающий образование тромба материал содержит тканевой фактор (тканевой тромбопластин).
Далее, согласно настоящему изобретению предложен способ мониторинга образования тромба, содержащий следующие этапы: направление крови после введения антикоагулянта в камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, и обеспечивающий одновременно антикоагуляционную обработку или стимулирование свертывания крови, для контроля, посредством этого, образования тромба. В настоящем изобретении признак «направление крови» и «обеспечение одновременно антикоагуляционной обработки или стимулирование свертывания крови» может представлять собой состояние, при котором в канале происходит реакция, обеспечивающая антикоагуляцию, или реакция, стимулирующая свертывание, и включает состояние, при котором обеспечивается протекание препарата, высвобождающего средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, или средства, стимулирующего свертывание, при смешивании с кровью в канале, или состояние, при котором обеспечивается быстрое протекание препарата, высвобождающего средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, или средства, стимулирующего свертывание, после смешивания с кровью.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антикоагуляционная обработка представляла собой обработку веществами, образующими хелаты кальция, такие как лимонная кислота, и антикоагуляционная обработка осуществлялась донором свободного кальция.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антикоагуляционная обработка представляла собой обработку аптамером тромбина, и антикоагуляционная обработка осуществлялась антисмысловой ДНК аптамера тромбина.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно контролировать образование тромба подачей обработанной антикоагулянтом крови в камеру образования тромба, в то же время стимулируя свертывание крови без осуществления антикоагуляционной обработки. В этом случае средство для стимуляции свертывания крови предпочтительно представляет собой добавление тканевого тромбопластина.
Кроме того, в способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению кровь, свертываемость которой была снижена одним или более антикоагуляционными средствами, предпочтительно перестают подвергать антикоагуляционной обработке, по меньшей мере, одним видом средства, осуществляющего антикоагулционную обработку, которая соответствует использованному средству антикоагуляционной обработки. В этом случае предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, и вещество, образующее хелат кальция, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой донор свободного кальция. Далее, также предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, и гепарин, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой гепариназу. Также предпочтительно, чтобы средства антикоагуляционной обработки представляли собой фактор, ингибирующий фазу контакта, такой как фактор свертываемости крови XII, калликреин или ему подобный, и аптамер тромбина, а средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, представляло собой антисмысловую ДНК аптамера тромбина. Ингибитор фактора свертываемости крови XII представляет собой предпочтительно ингибитор трипсина, полученный из маиса.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению предпочтительно определить давление во время притока и/или оттока крови из камеры образования тромба.
В способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению вызывающий образование тромба материал предпочтительно включает коллаген и тканевой фактор.
Устройство мониторинга образования тромба по п.1 формулы настоящего изобретения содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубку для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, или лекарственное средство, которое стимулирует свертываемость крови. Поэтому кровь, которая обработана антикоагулянтом для предотвращения свертывания крови, взятой у пациента после введения ему антикоагулянта, в канале, проходящем в камеру образования тромба, можно контролировать путем преднамеренного образования тромба в камере образования тромба. Таким образом, эффективность антитромботического средства можно специально контролировать в среде, аналогичной внутренней среде тела человека. Кроме того, средство антикоагуляционной обработки можно применять во время взятия проб крови. Поэтому преимущество состоит в том, что образцы после взятия образцов крови можно хранить в течение определенного периода времени, а время исследования можно выбирать случайным образом.
В соответствии с п.2 устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, впускную трубку, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и впуск для ингибитора образования тромба, который соединен с камерой образования тромба и смешивает ингибитор образования тромба с кровью после пропускания через камеру образования тромба. Поэтому можно проводить наблюдение за тромбом так, как описано выше. Кроме того, свертывание крови не происходит ниже по потоку в камере образования тромба, и поэтому можно предотвратить влияние на определение давления и более тонко контролировать изменения давления.
Небольшое количество крови можно контролировать, когда устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению сформировано на подложке. Кроме того, устройство снабжено насосом для создания избыточного давления во впускной трубке и/или трубке лекарственного средства, или насосом для аспирации (отсоса) содержимого выпускной трубки, которая соединена с камерой образования тромба и предназначена для удаления крови из камеры образования тромба. Поэтому кровь и лекарственное средство для стимуляции свертывания крови могут стабильно течь в течение заданного периода времени при заданном давлении или заданной скорости потока.
Если устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит устройство для измерения давления, то степень образования тромба можно переводить в цифры, так что можно выполнять количественную оценку.
Устройство можно легко установить, когда материал, вызывающий образование тромба, содержит коллаген. Образование тромба можно эффективно вызвать, когда вызывающий образование тромба материал дополнительно содержит тканевой фактор, такой как тканевой тромбопластин, вместе с коллагеном.
Если устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению содержит камеру для получения изображения камеры образования тромба, то появление тромба можно наблюдать в виде изображения, и затем изображение может храниться.
Далее, в соответствии с п.9 формулы настоящего изобретения способ мониторинга образования тромба содержит этапы: направление крови после введения антикоагулянта в камеру образования тромба, по меньшей мере, в части которой размещен вызывающий образование тромба материал, проводя при этом антикоагуляционную обработку или стимулируя свертывание крови. Таким образом, образование тромба на вызывающем образование тромба материале можно контролировать при стимуляции свертывания крови путем пропускания крови, которая была получена антикоагуляционной обработкой крови, взятой после введения пациенту антитромботического лекарственного средства для предотвращения свертывания. Поэтому эффективность антитромботического лекарственного средства можно точно контролировать в среде, аналогичной внутренней среде тела человека. Кроме того, антикоагуляционное средство можно применять для взятия проб крови. Поэтому имеется преимущество в том, что образцы после взятия проб крови можно хранить в течение определенного периода времени, и время исследования можно выбрать случайным образом. Если антикоагуляционная обработка представляет собой обработку веществом, образующим хелат кальция, таким как лимонная кислота, и антикоагуляционная обработка осуществляется донором свободного кальция, то легко можно получить реагент, и, таким образом, оно предпочтительно. Если антикоагуляционная обработка представляет собой обработку аптамером тромбина, и антикоагуляционная обработка осуществляется антисмысловой ДНК аптамера тромбина, то можно проводить исследование, в то же время отражая физиологическую концентрацию ионов кальция в крови.
Кроме того, в соответствии с п.12 формулы настоящего изобретения можно также контролировать образование тромба пропусканием крови после антикоагуляционной обработки в камеру образования тромба без проведения антикоагуляционной обработки, в то же время стимулируя свертываемость крови. Поэтому образование тромба можно наблюдать при небольшом количестве крови и можно уменьшить дискомфорт пациента. Кроме того, в этом случае не всегда требуется трубка для лекарственного средства, так что устройство мониторинга образования тромба можно упростить. В случае, если тканевой тромбопластин используется в качестве средства, стимулирующего свертываемость крови, то свертываемость крови можно стимулировать активацией свертывающей системы альтернативным путем, который избегает активацию фактора XII и активацию калликреина для контроля образования тромба в камере образования тромба.
Кроме того, образование тромба можно контролировать простой операцией воздействия на кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке с использованием одного или нескольких видов антикоагуляционных средств, по меньшей мере, одним видом осуществляющего антикоагуляционную обработку средства, соответствующего использованному средству антикоагуляционной обработки. В этом случае, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы и агентом, образующим хелат кальция, и антикоагуляционная обработка осуществляется донором свободного кальция, или когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы и гепарином, и антикоагуляционная обработка проводится гепариназой, то антикоагуляционнная обработка, оказывающая эффект во время мониторинга формирования тромба, представляет собой антикоагуяционную обработку ингибитором фактора контактной фазы, поэтому мониторинг образования тромба можно осуществлять в более физиологичных условиях, в частности отражая двухвалентный ион металла, связанный с тромбом, такого как кальция или магния. В этом случае, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором фактора контактной фазы, таким как фактор XII свертывания крови или калликреин и аптамер тромбина, а затем антикоагуляционная обработка проводится антисмысловой ДНК аптамера ингибирования тромбина, то кровь можно хранить в течение длительного периода. Кроме того, антикоагуляционную обработку можно эффективно проводить, когда в качестве ингибитора фактора XII свертывания крови используется ингибитор трипсина, полученный из маиса.
Если в способе мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению выполняется измерение давления во время притока и/или выпуска крови из камеры образования тромба, то степень образования тромба можно переводить в цифры, так что можно легко выполнять количественную оценку с использованием очень простого устройства.
Кроме того, если материал, вызывающий образование тромба, содержит коллаген и тканевой фактор, то устройство можно легко установить и можно эффективно вызвать образование тромба.
Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопроводительные чертежи, на которых:
фиг.1 изображает схему устройства мониторинга образования тромба согласно первому варианту осуществления изобретения;
фиг.2(а) - схему установки вызывающего образование тромба материала 15 в примерах 3, 5 и 6 согласно изобретению;
фиг.2(b) - схему образования тромба в примерах 3, 5 и 6 согласно изобретению;
фиг.3(а) - схему установки вызывающего образование тромба материала 15 в примере 4 согласно изобретению;
фиг.3(b) - схему образования тромба в примере 4 согласно изобретению;
фиг.4 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (основной корпус микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;
фиг.5 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (крышка микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;
фиг.6 - схему образования тромба в примере 7 согласно второму варианту осуществления изобретения;
фиг.7 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (основной корпус микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;
фиг.8 - схему основной части устройства мониторинга образования тромба (крышка микрочипа) согласно второму варианту осуществления изобретения;
фиг.9 - схемы основных частей устройства мониторинга образования тромба согласно третьему варианту осуществления изобретения; фиг.9(А) - вся схема, фиг.9(В) - основной корпус микрочипа, и фиг.9(С) - крышка микрочипа согласно изобретению;
фиг.10 - схему системы мониторинга образования тромба, содержащей устройство для мониторинга образования тромба согласно изобретению;
фиг.11(А) - форму волн тромбоэластограммы свертывания при добавлении 10 мкМ каждого из аптамеров к экзоциту I и экзоциту II в кровь после выдержки при комнатной температуре в течение 15 мин и добавлении 40 мкМ каждого из антисмысловых ДНК обоих аптамеров согласно изобретению;
фиг.11(В) - форму волн тромбоэластограммы крови непосредственно после взятия проб крови согласно изобретению;
фиг.12 - схему устройства согласно четвертому варианту осуществления настоящего изобретения; фиг.12(А) - полный чертеж, фиг.12(В) - крышка микрочипа, и фиг.12(С) - подложку микрочипа согласно изобретению;
фиг.13 - диаграммы измерений давлений примера 17 (контроль), примера 18 (гепарин) и примера 19 (Reopro) согласно изобретению;
фиг.14 - диаграммы измерений давлений при добавлении гепарина в количестве 0 (контроль), 0,2, 0,5 и 1 ЕД/мл гепарина согласно изобретению;
фиг.15 - диаграммы измерений давлений при добавлении гепарина в количестве 0 (контроль), 2, 5 и 10 мкг/мл согласно изобретению.
Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
На фиг.1 представлена схема первого варианта осуществления устройства мониторинга образования тромба по настоящему изобретению.
Устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему варианту осуществления содержит камеру 10 образования тромба; впускную трубку 11, которая соединена с камерой образования тромба и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубку для лекарственного средства 12, которая соединена с выпускной трубкой и через которую подается лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку или стимулирующее свертывание крови.
Камера 10 образования тромба имеет по существу цилиндрическую форму и содержит материал, который вызывает образование тромба в части ее внутренней полости. Камера может быть изготовлена из прозрачного стекла, термопластической смолы или подобного материала. Примеры материала, который вызывает образование тромба, включают коллаген, vWF (фактор фон Виллебранда), ранее полученный тромб и материалы на волокнистой основе из шелка, хлопка или им подобной ткани. Эти материалы можно использовать отдельно или в комбинации двух или более из них. Коллаген особенно предпочтителен, потому что его можно легко получить, с ним легко манипулировать, и он может быть предоставлен в виде модели, аналогичной кровеносному сосуду. Коллаген может включать тканевой фактор. Материал, вызывающий образование тромба, из коллагена или vWF предпочтительно представлен в виде покрытия внутренней поверхности камеры образования тромба 10 для предотвращения вытекания вызывающего образование тромба материала вместе с потоком крови. Покрытие можно легко нанести, например как описано в документе JP 05-260950 A или в документе Blood 1995 April 1; 85(7): 1826-35, растворением коллагена в кислотном растворе и погружением в него подложки, имеющей гидрофильность, такую же, как у стекла или полистирола, с последующим промыванием и сушкой для покрытия поверхности материала.
Далее, предпочтительно, чтобы материал, вызывающий образование тромба, в виде волокнистого материала или ранее полученного тромба мог быть в состоянии, пригодном для фиксации внутри камеры образования тромба 10. Далее, путем импрегнации коллагеном гигроскопичного тонкого волокнистого материала, такого как хлопок, неплетеная ткань или трикотажная ткань, и их сушки можно получить вызывающий образование тромба материал с более высокой способностью вызывать образование тромба. Кроме того, подложка может погружаться в раствор коллагена, содержащий тканевой тромбопластин, и затем сушиться для дополнительного усиления ее способности вызывать образование тромба.
Вызывающий образование тромба материал можно выбрать в зависимости от внутреннего диаметра камеры образования тромба 10 и объекта мониторинга. Если в качестве модели представлен атероматоз, вызывающий инфаркт миокарда, то предпочтительно, чтобы содержался один коллаген, или содержался и коллаген, и тканевой тромбопластин. Кроме того, предпочтительнее, чтобы в канале можно было сформировать суженную часть в камере образования тромба для воздействия напряжения сдвига на камеру образования тромба. Далее, в случае изучения образования тромба при инфаркте миокарда и инфаркте мозга сердечного происхождения или тому подобного состояния, при котором тромб может переноситься из другой части тела с кровотоком и прикрепляться, вызывая окклюзию кровеносного сосуда, в другой части тела, предпочтительно, чтобы предварительно произошло сцепление небольшой части тромба с камерой образования тромба 10, представленной в виде материала, вызывающего образование тромба, с последующим мониторингом роста тромба, образованного на нем. В случае изучения тромбоза кровеносного капилляра, внутренний просвет канала в камере образования тромба может быть разделен на множество каналов, каждый из которых имеет диаметр от 10 до 30 мкм. Если камера образования тромба 10 имеет суженную часть диаметром 100 мкм или менее, то канал может подвергаться окклюзии небольшим тромбом, образованным в такой суженной части. Поэтому нет необходимости в использовании дополнительного материала, вызывающего образование тромба, так что образование тромба можно контролировать средством, стимулирующим свертывание крови, или антикоагулянтом. Поэтому настоящее изобретение содержит эту суженную часть в качестве материала, вызывающего образование тромба.
Материал, вызывающий образование тромба, может представлять собой только покрытие коллагеном или vWF. Камера 10 образования тромба в части покрытия может быть предпочтительно сужена и представлена для части 14, так что можно контролировать агрегацию тромбоцитов, вызванную напряжением сдвига. В случае покрытия коллагеном в качестве материала, вызывающего образования тромба, предпочтительно, чтобы для получения высокой способности сцепления с поверхностью, по меньшей мере, часть подложки была изготовлена из стекла или пластика. Кроме того, часть, на которой предстоит поместить камеру 10 образования тромба, или часть камеры 10 образования тромба, где находится материал, вызывающий образование тромба, может быть изготовлена в виде съемной кассеты. Этот вариант предпочтительнее, потому что полученный тромб можно легко отмыть или наблюдать, или материал, вызывающий образование тромба, можно легко заменить новым материалом. В этом случае кассета может образовывать герметичное для жидкости соединение кольцевым уплотнителем из силиконовой резины или подобного материала. Предпочтительно, конец кассеты, противоположный ее концу, соединенному с впускной трубкой 11 камеры 10 образования тромба, может быть соединен с выпускной трубкой 13, которая обеспечивает возможность выпуска крови. Предпочтительно, выпускная трубка 13 может быть разделена цилиндрической бобиной, и ее наконечник может быть снабжен манометром 41, например манометром диафрагмального типа. С другой стороны, наконечник выпускной трубки 13 предпочтительно соединен с контейнером для хранения (не показан).
Впускная трубка 11, соединенная с камерой 10 образования тромба, может быть изготовлена с использованием прозрачного стекла, термопластичной смолы или подобного материала. Конец впускной трубки 11, противоположный ее другому концу, соединяющемуся с камерой 10 образования тромба, соединен со шприцем 20, который подает кровь. Шприц 20 соединен с насосом 30 и сдавливающим средством (не показано), так что поршень шприца 20 надавливается при заданном давлении. Насос может представлять собой обычный насос, имеющийся в продаже. Альтернативно, насос может представлять собой шприцевый насос, изготовленный экструзией шприца воздухом при постоянном давлении, или переворачиванием шприца, так что поршень находится сверху, и воздействуя на поршень своим весом.
Впускная трубка 11 может быть предпочтительно разделена цилиндрической бобиной, и ее конец предпочтительно снабжен манометром 40, таким как манометр диафрагмального типа, в части впускной трубки 11 около камеры 10 образования тромба.
Кровь в шприце 20 подвергается антикоагуляционной обработке. Примеры средства антикоагуляционной обработки включают цитрат натрия или цитрат калия, оксалат натрия или оксалат калия, цитратно-декстрозный раствор (ACD) и этилендиаминтетраацетат (EDTA). Такое средство антикоагуляционной обработки можно использовать в форме порошка, лиофилизированного продукта или раствора, такого как водный раствор. Среди этих антикоагуляционных средств в целом предпочтителен 3,2% цитрат натрия, потому что он доступен. В этом случае один объем средства антикоагуляционной обработки предпочтительно смешивается с 9 объемами крови.
Цельная кровь или плазма без средства антикоагуляционной обработки сворачивается в пределах нескольких минут. Свертывание можно уменьшить или устранить добавлением вещества, образующего хелат кальция, такого как цитрат. В частности, сообщалось, что цитрат может ингибировать агглютинацию и функции протромбиназы и экзогенной и эндогенной теназы.
Обработанную цитратом кровь можно хранить в жидкой форме в течение заданного периода времени (например, от нескольких часов до нескольких дней) и перерабатывать в препараты крови, такие как продукт цитофереза, плазму, обогащенную тромбоцитами, и плазму с низким содержанием тромбоцитов. Содержащую цитрат плазму можно хранить примерно при -70°С или ниже в течение длительного периода времени (от нескольких месяцев до нескольких лет). В настоящем изобретении можно также использовать цельную кровь и плазму и, в этом случае, можно предпочтительно снова добавлять кальций или подобные вещества.
Однако цельная кровь или плазма с вновь добавленным кальцием спонтанно сворачивается ввиду контактной активации в любом из большинства контейнеров для хранения. В этом случае контактная активация может происходить в пределах около 2-4 мин. С учетом этого в настоящем изобретении антикоагуляционное средство, такое как кальций, можно добавить непосредственно после мониторинга образования тромба во вновь приготовленную обработкой цитратом кровь после взятия пробы крови и замораживания для хранения и последующего размораживания, или в содержащую тромбоциты плазму.
Другие антикоагуляционные средства могут включать гепарин, гирудин, гирулог (пептид С-концевой области гирудина), апротинин, антитромбиновое антитело, аптамер тромбина, ингибитор трипсина, полученный из маиса (1977, J. Biol. Chem 252, 8105). Эти материалы ингибируют свертывание крови путем ингибирования каскада свертывания в результате ингибирования фактора свертываемости крови и поэтому иногда в описании настоящего изобретения будут именоваться как «ингибиторы факторов свертывания».
Образец крови для мониторинга можно взять любым способом, таким как способ, при котором ингибитор факторов свертывания предварительно помещается в шприц или вакуумный сосуд для взятия крови, и затем набирается кровь, или способ, при котором ингибитор факторов свертывания быстро добавляется в кровь непосредственно после взятия пробы крови для получения посредством этого крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке.
Далее, кровь собирается в вакуумный сосуд для взятия крови, содержащий ингибитор факторов свертывания, такой как гепарин, и затем для разрушения гепарина добавляются гепариназа и средство антикоагуляционной обработки, подходящее для мониторинга, так что гепарин замещается средством антикоагуляционной обработки, подходящим для цели мониторинга. Кроме того, кровь собирается в вакуумный сосуд для взятия крови, содержащий лимонную кислоту, и затем добавляют хлорид кальция и ингибитор фактора свертывания, подходящий для цели мониторинга, такой как ингибитор трипсина, полученный из маиса, или аптамер тромбина. Поэтому кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке, можно собирать в зависимости от цели мониторинга.
Трубка для лекарственного средства 12, соединенная с камерой 10 образования тромба, может быть изготовлена из прозрачного стекла, термопластичной смолы или подобных материалов. Конец трубки для лекарственного средства 12, который противоположен ее другой стороне, соединяющейся с камерой 10 образования тромба, соединен со шприцем 21 для подачи лекарственного средства, осуществляющего антикоагуляционную обработку, или лекарственного средства, стимулирующего свертывание крови. Шприц 21 может быть соединен с насосом 31 и сдавливающим средством (не показано), так что поршень шприца 21 может надавливаться при заданном давлении. Насос может представлять собой обычный насос, имеющийся в продаже. Альтернативно, насос может представлять собой шприцевый насос, изготовленный экструзией шприца воздухом при заданном давлении, или переворачиванием шприца, так что поршень находится сверху, и воздействуя на поршень грузом. Трубка для лекарственного средства 12 заполняется средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, или средством, стимулирующим свертывание крови, как описано ниже.
Для проведения мониторинга тромба устройством мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению шприц 20 заполняют цельной кровью или плазмой, содержащей тромбоциты, и подвергают антикоагуляционной обработке цитратом натрия (раствором А). Шприц 21 заполнят лекарственным средством, которое обеспечивает антикоагуляционную обработку, таким как раствор хлорида кальция (раствор В). Раствор А и раствор В подают во впускную трубку 11 насосами 30 и 31 соответственно так, чтобы раствор В мог достичь концентрации от 5 до 20 ммоль, при которой можно инициировать каскад свертывания раствора А. В последующем, раствор А и раствор В смешиваются во впускной трубке 11, так что смесь направляется в камеру 10 образования тромба. Затем коллаген или подобное вещество, способное вызвать образование тромба, предварительно наносится на часть внутренней поверхности камеры 10 образования тромба для формирования материала, вызывающего образование тромба. Камера образования тромба может быть изготовлена из прозрачной пластиковой трубки. Образование тромба можно легко контролировать устройством мониторинга крови, проходящей через такую просматриваемую ввиду прозрачности камеру 10 образования тромба.
Мониторинг образования тромба можно осуществлять визуальной оценкой крови, протекающей в течение заданного периода времени через камеру (камеру 10 образования тромба), обработанную коллагеном, а затем удалением крови из нее. Когда насос для подачи раствора А и раствора В засасывает воздух, то раствор А и раствор В можно подавать под постоянным давлением. Поэтому образование тромба на коллагене можно контролировать по уменьшению скорости потока крови, вытекающей из выпускной трубки 13. Альтернативно, когда манометр устанавливается около камеры 10 образования тромба на части впускной трубки 11 и выпускной трубки 13, образование тромба на коллагене можно контролировать наблюдением изменения внутреннего давления в камере 10 образования тромба. Альтернативно, образование тромба на коллагене можно наблюдать под микроскопом при изготовлении камеры 10 образования тромба толщиной 500 мкм или менее. В частности, можно легко наблюдать тромб в обогащенной тромбоцитами плазме, потому что он хорошо виден, и образование тромба можно также наблюдать невооруженным глазом. Далее, можно также флюоресцентно метить тромбоциты крови и контролировать их флюоресценцию флюоресцентным микроскопом.
Примеры лекарственного средства для осуществления антикоагуляционной обработки образующим хелаты агентом, таким как лимонная кислота, содержат: галиды кальция, такие как хлорид кальция, бромид кальция и йодид кальция; неорганические соли кальция, такие как фосфат кальция, сульфат кальция, нитрат кальция и бикарбонат кальция; и кальциевые соли органических кислот, такие как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, альгиновая кислота, молочная кислота, глюконовая кислота, глицериновая кислота и глицерофосфорная кислота, которые представляют собой соединения кальция, предоставленные в виде доноров свободного кальция.
Средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, можно выбрать и использовать в зависимости от ингибитора факторов свертывания, когда антикоагуляционная обработка проводится ингибитором факторов свертывания (средство антикоагуляционной обработки). Например, в качестве средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционная обработка проводится гепарином, можно использовать протамин, гепариназу или антитело против гепарина. В качестве средства, имеющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционные обработки проводятся гирудином, гирулогом и апротинином, можно использовать средство, осуществляющее антикоагуляционное действие, такое как соответственно антитело против гирудина, антитело против гирулога и антитело против апротинина.
Примеры средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, когда антикоагуляционная обработка проводится с использованием антитела против тромбина в качестве ингибитора фактора свертывания, включают: полностью инактивированный тромбин, такой как РРАСК-тромбин (D-Phe-Pro-Arg-хлорметилкетон)-тромбин; фрагмент разрушения тромбина и синтетический полипептид, содержащий распознающий антитело эпитоп тромбина.
Антитела, используемые при антикоагуляционной обработке или осуществлении антикоагуляции, предпочтительно включают антитела, из которых домены Fc удалены папаиназой или подобными веществами, для минимизации их эффекта на систему комплемента, или такие антитела как антитела куриных яиц, неспособных активировать систему комплемента человека.
Когда аптамер тромбина (Blood. 1993 Jun 15; 81(12): 3271-6 или J Mol Biol. 1997 Oct 10; 272(5): 688-98), который представляет собой однонитевую олиго ДНК, используется в качестве средства для антикоагуляционной обработки, вещество, которое связывается с аптамером тромбина и ингибирует его функции, такое как антисмысловая ДНК или антисмысловая РНК, можно использовать в качестве средства, осуществляющего антикоагуляционное действие. Когда два вида аптамеров тромбина, один, распознающий экзоцит I, и другой, распознающий экзоцит II, используются в комбинации, то можно получить очень высокий эффект антикоагуляционной обработки, по сравнению со случаем, в котором каждый из них используется отдельно. Антисмысловая ДНК, используемая в этом случае, может представлять собой антисмысловую ДНК против части аптамера тромбина, пока она существенно инактивирует антитромбиновую функцию аптамера тромбина.
Кроме того, аптамер тромбина и его антисмысловая ДНК эффективны соответственно в качестве средства антикоагуляционной обработки и средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, что описано со ссылкой на представленные ниже справочные примеры.
Систему свертывания нельзя активировать в пределах нескольких часов, когда антикоагуляционная обработка проводится гепарином. Таким образом, кровь можно хранить в течение длительного периода времени при мониторинге образования тромба. Однако, например, бывает случай, когда антикоагуляционная обработка не подходит для исследования крови, взятой у пациента, которому вводили гепарин.
С другой стороны, гирудин, гирулог и антитромбиновое антитело представляют собой ингибиторы для ингибирования превращения фибриногена в фибрин ингибированием тромбина, который действует на конечную стадию системы свертывания. Однако фактор фазы контакта (такой как пре-калликреин или фактор XII) каскада свертывания постепенно активируется даже в случае полного ингибирования тромбина, так что может происходить активация выше по каскаду свертывания. Поэтому существует случай, который не подходит для длительного хранения крови.
Апротинин также ингибирует активность калликреина на фазе контакта для задержки эндогенного каскада свертывания крови. Однако каскад свертывания постепенно активируется даже в условиях ингибирования активности калликреина, так что кровь сворачивается через несколько часов даже в присутствии апротинина.
Поэтому при мониторинге образования тромба крови примерно через несколько десятков минут можно контролировать образование тромба антикоагуляционной обработкой ингибитором тромбина и/или апротинином. Однако это может не быть предпочтительным в случае требуемого длительного времени для начала мониторинга или требуемого длительного времени для мониторинга.
Когда образование тромба контролируется через 1 час или более от момента взятия пробы крови, антикоагуляционную обработку можно проводить с использованием аптамера тромбина в комбинации с полученным из маиса ингибитором трипсина, гирудина и апротинина. Альтернативно, небольшое количество гепарина, например менее чем 1 ЕД/мл, которое представляет собой уровень, который не оказывает большого влияния на время свертывания, можно использовать в комбинации с ингибитором фактора фазы контакта или ингибитором тромбина.
Намного более выраженный эффект антикоагуляционной обработки можно получить, когда аптамер тромбина используется в комбинации с двумя видами аптамеров для экзоцита I и экзоцита II. Далее, антисмысловая ДНК соответствующих аптамеров может немедленно осуществить антикоагуляционную обработку.
В образец крови также заранее добавляют ингибитор фактора фазы контакта или ингибитор тромбина, такой как ингибитор, полученный из маиса (ингибитор фактора XII), или апротинин (ингибитор калликреина), и ингибитор тромбина, такой как аптамер тромбина, а затем добавляют антисмысловую ДНК аптамера тромбина (ингибитор ДНК) или подобное вещество. Таким образом, функция одного ингибитора тромбина ингибируется для осуществления функционального ингибирования тромбина с последующим быстрым направлением потока образца в камеру образования тромба. В результате, например, экзогенный каскад свертывания можно активировать тканевым фактором (тканевым тромбопластином) или ему подобным, так что стимулируется свертывание крови, и можно контролировать физиологическое образование тромба.
Альтернативно, антикоагуляционную обработку можно проводить и ингибитором средства антикоагуляционной обработки, и полученным из маиса трипсином, которые способны осуществлять антикоагуляционную обработку, таким как вещества, образующие хелаты (лимонная кислота), гепарин или им подобные; и донор свободного кальция, такой как хлорид кальция; или гепариназе можно затем дать возможность осуществить соответствующую антикоагуляционную обработку с последующим предоставлением возможности крови течь в камеру образования тромба для стимуляции свертывания крови активацией экзогенного каскада свертывания.
В этом случае вызывающий образование тромба материал может предпочтительно содержать соответствующее количество тканевого фактора (тканевого тромбопластина). В частности, предпочтительно, чтобы вызывающий образование тромба материал мог покрываться смесью, полученной смешиванием коллагена с тканевым тромбопластином с последующей сушкой, потому что образование тромба стимулируется только в камере образования тромба. Когда используется вызывающий образование тромба материал, покрытый раствором коллагена, содержащим тканевой фактор (тканевой тромбопластин) в качестве атероматозной модели, то можно проводить мониторинг, который отражает патологический механизм.
Кроме того, образование тромба можно контролировать добавлением донора свободного кальция и ингибитором трипсина к крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке соединением, образующим хелаты кальция, таким как лимонная кислота, и обеспечением быстрого тока крови в камеру образования тромба, или добавлением гепариназы и ингибитора трипсина к крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке гепарином, и затем обеспечением быстрого потока крови в камеру образования тромба. В описанном выше способе, при котором образование тромба контролируется смешиванием подвергнутой антикоагуляционной обработке крови, полученной с использованием одного или более видов средств для антикоагуляционной обработки, по меньшей мере, с одним средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, соответствующим используемому средству, и затем обеспечением быстрого потока крови в камеру образования тромба, можно использовать устройство мониторинга образования тромба (фиг.9).
Указанные выше ингибиторы тромбина, такие как гирудин и аптамеры тромбина, синтезированные низкомолекулярные ингибиторы фактора фазы контакта, и средства антикоагуляционной обработки из белка дорогостоящи, по сравнению с любыми из средств антикоагуляционной обработки, таких как лимонная кислота и EDTA, которые образуют хелаты с кальцием и им подобные. Однако они не изменяют концентрацию двухвалентных ионов металлов, таких как кальций, магний и цинк, так что образование тромба при первоначальных концентрациях этих ионов в крови пациента может отражаться при мониторинге. Поэтому становится возможным мониторинг, который больше отражает клиническое состояние пациента.
Свертывание крови можно подавить ингибированием фактора фазы контакта, такого как активированный фактор XII или калликреин. Однако сообщалось, что активация XIIа и калликреин не вносит большого вклада в действительное физиологическое образование тромба или гемостаз. В действительности, вообще нет данных о кровотечении или подобном явлении даже у пациента с врожденной недостаточностью фактора XII, пре-калликреина или им подобных. В частности, при атеротромбозе, таком как инфаркт миокарда, широко известно, что система свертывания активируется тканевым фактором благодаря бляшке, вызванной артериосклерозом. Фактор XII может активироваться главным образом тромбином на активированном тромбоците. Поэтому при выполнении антикоагуляционной обработки, когда ингибитор для ингибирования активации фактора XII, или прекалликреина, или ингибитора для ингибирования активированного фактора XII, или калликреина используется в качестве антикоагуляционного средства, нет необходимости добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие. Путем добавления в кровь любого вещества, которое активирует экзогенное свертывание, такого как тканевой фактор (например, тканевой тромбопластин), или материала, вызывающего образование тромба, вместо средства антикоагуляционной обработки, или добавлением вещества в материал, вызывающий образование тромба, система свертывания активируется альтернативным путем, который избегает активации фактора XII и активации калликреина для стимуляции свертывания крови, так что образование тромба можно контролировать в камере образования тромба.
В качестве средств антикоагуляционной обработки, которые можно использовать при мониторинге образования тромба, после стимуляции свертывания крови добавлением вещества, которое активирует экзогенное свертывание, такого как тканевой фактор, без добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, иллюстрируются синтезированные низкомолекулярные ингибиторы, такие как ингибитор калликреина PKSI-527 (Thromb Res 57: 889, 1990) и D-Phe-Arg-CK, который представляет собой ингибитор активированного фактора XII (Cal Biochem. Co., Ltd.). Кроме того, белковые ингибиторы включают антитела против протеазы контактной фазы в каскаде свертывания, такие как антитело против калликреина, антитело против прекалликреина, антитело против фактора свертывания XII, антитело против активированного фактора свертывания XII, и ингибитор трипсина, полученный из маиса.
Для мониторинга образования тромба после стимуляции свертывания крови добавлением вещества, которое активирует экзогенное свертывание, без добавления средства, осуществляющего антикоагуляционное действие, в частности, с точки зрения доступности и антикоагуляционной способности, предпочтительно, чтобы кровь была однократно подвергнута антикоагуляционной обработке комбинацией лимонной кислоты и полученным из маиса ингибитором трипсина или комбинацией аптамера тромбина и полученного из маиса ингибитора трипсина, и кровь затем хранилась, потому что можно повысить степень свободы операции мониторинга. Далее, непосредственно перед мониторингом образования тромба, продолжается антикоагуляционная обработка полученным из маиса ингибитором трипсина, в то время как другая антикоагуляционная обработка частично осуществляется донором свободного кальция или антисмысловой ДНК аптамера тромбина. В этом случае в качестве модели атероматозного тромба предпочтительно активировать экзогенное свертывание использованием материала, вызывающего образование тромба, покрытого коллагеном, или содержащим коллаген тканевым тромбопластином, для стимуляции свертывания.
Контейнеры, используемые при мониторинге образования тромба, такие как шприц для подачи крови и вакуумный сосуд для сбора крови, предпочтительно покрыты гепарином или материалом, обладающим антитромботической способностью и совместимостью с кровью, таким как поливиниллактоамид (PVLA) или поли-2-метоксиэтилакрилат (РМЕА).
В устройстве мониторинга образования тромба в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения трубка и камера образования тромба могут быть объединены друг с другом на подложке тонким каналом, таким как микрочип.
На фиг.4 показан вид в плане основной части устройства мониторинга образования тромба в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения. На фиг.4 в подложке 100 образована канавка, и на ней сформирован контур. Этот вариант осуществления сконфигурирован следующим образом. На небольшом куске подложки выполнены камера образования тромба в качестве основной части устройства мониторинга образования тромба, впускная трубка, которая соединена с камерой образования тромба, и через которую кровь течет в камеру образования тромба, и трубка для лекарственного средства, которая соединена с впускной трубкой и через которую в камеру образования тромба вводится лекарственное средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку, или лекарственное средство, стимулирующее свертывание крови, все элементы объединены в единое целое друг с другом и представлены в виде контура микрочипа. В этом варианте осуществления части, кроме основной части, объединены в единое целое на подложке, аналогичны первому варианту осуществления.
На фиг.4 подложка 100 представляет собой основной корпус микрочипа, и ее материалы могут представлять собой любые из группы, состоящей из металла, стекла, пластика, силикона и им подобным. При наблюдении тромба предпочтителен прозрачный материал. Для формирования контура предпочтителен пластиковый материал. Поэтому особенно предпочтителен прозрачный пластиковый материал. Когда он выбран из силиконовой смолы, такой как полидиметилсилоксан (PDMS), его способность сцепления очень высока. Таким образом, контур может быть образован контактным связыванием с крышкой без клея или ему подобного. Когда используется подложка из полистирола, то канал можно легко покрыть PVLA и подвергнуть антитромботической обработке. Далее РМЕА может также обеспечить возможность простой, эффективной антитромботической обработки (см. справочный пример 4).
На фиг.5 представлен вид в плане подложки, которая служит крышкой микрочипа, которая наложена поверх и связана с подложкой 100 (фиг.4). Подложка 200 (фиг.5) представляет собой прозрачное предметное стекло или пластину или листок, которые изготовлены из пластика или подобного материала. Подложка 200 в виде крышки наложена поверх и связана с подложкой 100, так что контур подложки может быть сформирован из камеры 110 образования тромба, впускной трубки 111 и трубки для лекарственного средства 112.
Для обеспечения внутренней поверхности камеры 110 образования тромба материалом, вызывающим развитие тромба 115, например, коллаген или ему подобный материал можно наносить на заданное положение установки подложки 200. Устройство для мониторинга образования тромба можно получить, когда подложка 100 и подложка 200 связываются друг с другом соединением или подгонкой при направлении внутрь поверхности с нанесенным коллагеном подложки 200. Ввиду простого нанесения коллаген можно предпочтительно наносить на плоскую подложку 200, не имеющую канавки. Кроме того, тканевой тромбопластин предпочтительно наносится после смешивания с коллагеном, потому что можно получить вызывающий образование тромба материал, имеющий более высокую способность вызывать образование тромба. Далее для легкого образования тромба нанесенным коллагеном стекло, имеющее часть с нанесенным коллагеном, может подвергаться дополнительной обработке, такой как замещение стекла матовым стеклом или подобным материалом, так что площадь поверхности можно увеличить.
Соединительная часть 100А, соединительная часть 100В и соединительная часть 100С подложки 100 соединены с трубками (не показаны), которые образуют соответственно части впускной трубки, трубки для лекарственного средства и выпускной трубки. Таким образом, каждая из соединительной части 100А и соединительной части 100В соединена с насосами (не показаны) через трубки. Подвергнутая антикоагуляционной обработке кровь инжектируется из соединительной части 100А, а антикоагуляционное средство, соответствующее средству антикоагуляционной обработки, инжектируется из соединительной части 100В.
В соответствии с этим вариантом осуществления образование тромба можно контролировать крайне небольшим количеством крови, так что можно уменьшить дискомфорт для пациента. Кроме того, тромбоциты, сцепленные с подложкой 200 со стороны подложки 200, можно контролировать мечением тромбоцитов флюоресцентным реагентом, таким как мепакрин.
Далее, контур 100D имеет герметизируемый конец, в котором блокируется воздух. Таким образом, контур 100D предоставлен в виде манометра. Конец контура 100D может быть предпочтительно предоставлен с регулирующим клапаном 100Е для снятия давления или увеличения чувствительности, когда контур 100D предоставлен в виде манометра. Регулирующий клапан 100Е может быть закрыт колпачком или липкой лентой, и его объем можно изменить наполнением, таким как смола, в зависимости от требуемой чувствительности. Контур 100D образован низким с тем, чтобы предотвратить смешивание крови с воздухом и предотвратить утечку воздуха. Толщина контура 100D зависит от материала подложки 100, но составляет примерно от 0,1 до 0,5 мм. Внутренне давление впускной трубки 111 устройства мониторинга образования тромба увеличивается образованием тромба, воздух в контуре 100D сжимается кровью, так что подвергнутую антикоагуляционной обработке кровь можно ввести в контур 100D именно в таком количестве. Внутреннее давление можно контролировать перемещением крови в контуре 100D в любое время.
Сцепление тромбоцитов с коллагеном, активацию системы свертывания на активированных тромбоцитах и накопление активированных тромбоцитов агглютинацией тромбоцитов можно контролировать соответственно устройством мониторинга образования тромба и/или способом мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению.
Далее, для воспроизведения образования тромба при атеротромбозе, суженные части 14 и 114 сформированы соответственно на камерах 10 и 110 образования тромба. Поэтому можно осуществлять мониторинг, который также отражает напряжение сдвига, создающее агглютинацию тромбоцитов.
На фиг.9 показана основная часть устройства мониторинга образования тромба в соответствии с третьим вариантом осуществления настоящего изобретения. На фиг.9 изображены впускная трубка 322 для ингибитора свертывания крови и впускная трубка 317 для подачи давления, которая смешивает ингибитор свертывания крови с кровью, находящейся ниже по потоку от камеры образования тромба. В этом варианте осуществления трубка для лекарственного средства не предоставлена выше по потоку от камеры образования тромба.
В соответствии с третьим вариантом осуществления в кровь, собранную после добавления средства антикоагуляционной обработки (например, лимонной кислоты и полученного из маиса ингибитора трипсина), кроме того, добавляется средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку (например, донор свободного кальция), непосредственно перед измерением и затем вводится в шприц 320. В последующем, жидкость для заполнения под давлением крови, такая как минеральное масло, вдавливается в шприц из впускной трубки 317 для подачи давления, соединенной со шприцем 320, выдавливая посредством этого кровь в микрочип 300.
Увеличение давления, оказываемого на шприц 320 с образцом, показывает состояние окклюзии канала образованным тромбом, так что мониторинг образования тромба по изменению давления особенно подходит для мониторинга модели прочного атероматозного тромба, в котором образуется обструктивный тромб. Вызывающий образование тромба материал может без определенного ограничения представлять собой материал, полученный из коллагена и тканевого фактора. Например, вызывающий образование тромба материал эффективен для мониторинга образования тромба, когда свертывание крови стимулируется активацией экзогенного свертывания.
Во время измерения давления, для более точного измерения давления в канале при образовании тромба, ингибитор свертывания крови вводится через впускную трубку 322 для ингибитора свертывания крови и смешивается с кровью, находящейся ниже по потоку от камеры образования тромба, через канал, сформированный в микрочипе 300. Таким образом, можно предотвратить образование тромба в крови, находящейся в канале, следующем за камерой образования тромба. Поэтому такая конфигурация предпочтительна, потому что можно определенно и точно измерить изменение давления в канале, которое вызвано сужением или закрытием канала образованием тромба в камере образования тромба.
Ингибитор свертывания крови может предпочтительно без определенного ограничения представлять собой средство антикоагуляционной обработки, используемое в настоящем изобретении. При учете эффективности затрат и возможности манипулирования предпочтительно выбрать любое из тех средств, которые предотвращают свертывание крови альбуминоидной деформацией, включающие щелочной или кислотный раствор, спирт, мочевину и додецилсульфат натрия.
В описанном варианте осуществления устройство мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению включает засасывающий насос на выпускной трубке 313, вместо впускной трубки 317 подачи давления, чтобы устройство могло определить степень образования тромба на основании изменения засасывающего давления (отрицательное давление). Такая конфигурация может привести к более эффективному измерению, в то же время предотвращая возникновение ситуации, когда жидкость для подачи давления минерального масла или ей подобная смешивается с кровью в области контакта, и смесь подается, когда количество небольшое, в случае использования насоса, который производит непрямое выталкивание крови через жидкость, отделенную в виде слоя, как описано ниже.
Далее, нет необходимости в использовании закрытого контейнера, такого как шприц, в качестве контейнера (емкости для образца) для подачи крови в устройство мониторинга образования тромба по настоящему изобретению. Таким образом, контейнер может не иметь крышки и может быть открытым для воздуха. В результате, можно упростить устройство мониторинга образования тромба. Далее, в устройстве мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению внутреннее давление в канале отрицательное. Таким образом, когда устройство для мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению изготавливают в виде микрочипа, например, даже в случае неполного сцепления между основным корпусом микрочипа и крышкой микрочипа, вообще нет утечки крови. В некоторых случаях его можно использовать в качестве устройства мониторинга образования тромба путем подгонки основного корпуса микрочипа и крышки микрочипа вместе, когда подгонка является точной.
На фиг.10 показано дополнительно систематизированное устройство А мониторинга образования тромба.
Устройство А мониторинга образования тромба заполняет микронасос 330 подачи жидкостью, имеющей плотность, меньшую чем кровь. Затем жидкость вдавливается в шприц для образца 320, в который кровь поступает через впускную трубку 317 подачи давления, и затем наслаивается на кровь, посредством этого выдавливая кровь в микрочип 300. Выдавленная кровь смешивается со средством, осуществляющим антикоагуляционную обработку, инжектированным из трубки для лекарственного средства 312, с последующим поступлением в камеру 311 образования тромба. Жидкость для накачивания крови в микронасос 330 подачи может представлять собой любое из масел и жиров, такое как жидкий парафин, минеральное масло и силиконовое масло, и физиологический раствор. Таким образом, становится возможным предотвращение загрязнения и микронасоса 330 подачи, и датчика давления 340 кровью непрямым выталкиванием крови.
Такой насос для непрямой экструзии крови жидкостью, отделенной слоем от крови, можно использовать в устройстве мониторинга образования тромба в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения.
Датчик 340 давления может определить давление, подаваемое на шприц образца 320 микронасосом 330 подачи.
В этом устройстве А мониторинга образования тромба состояние образования тромба можно распознать более детально анализом изображения. В частности, в случае мечения тромбоцитов и лейкоцитов хинакрином и затем мониторинга их сцепления и агглютинации с коллагеном, освещенность на единицу площади вследствие проявления флюоресцентного цвета контролируется анализом изображения. Таким образом, результаты мониторинга можно оценить и хранить в виде данных. Анализ изображения можно проводить обработкой изображения, захваченного флюоресцентным стереоскопическим микроскопом 308, камерой, управляемой компьютером 307, и представлением изображения на дисплее.
Поэтому в устройстве А мониторинга образования тромба можно всесторонне определить состояние образования тромба по результатам анализа изображения и изменению давления, подаваемого на поршень с образцом 320.
Устройство мониторинга образования тромба можно систематизировать, используя устройство мониторинга образования тромба по любому из вариантов осуществления согласно настоящему изобретению.
На фиг.12 представлена схема устройства мониторинга образования тромба четвертого варианта осуществления настоящего изобретения. Устройство мониторинга образования тромба снабжено камерой для наблюдения образования тромба.
Например, в устройстве мониторинга образования тромба в кровь, подвергнутую антикоагуляционной обработке лимонной кислотой и полученным из маиса ингибитором трипсина, добавляется средство, осуществляющее антикоагуляционную обработку (например, донор свободного кальция), и производится быстрое заполнение ею шприца 420. Шприц 420 аспирируется насосом 414, соединенным с выпускной трубкой 413, для предоставления возможности крови проходить через камеру образования тромба 411, образуя посредством этого тромб. Степень образования тромба можно определить изменением засасывающего давления (отрицательного давления).
Для предотвращения свертывания крови после прохождения через камеру образования тромба с закупоркой вследствие этого выпускной трубки 413 или воздействия на измерение давления, во впускной трубке для ингибитора образования тромба 422 происходит смешивание ингибитора образования тромба с кровью после прохождения через камеру образования тромба.
Камера 430 (например, камера, управляемая компьютером) расположена под микрочипом 400 для получения изображения камеры образования тромба, так что можно эффективно использовать пространство над микрочипом. По направляющим 433 камера 430 может передвигаться вперед и назад и вокруг места образования тромба. Путем использования камеры 430, которая имеет функцию сохранения ее положения вдоль оси Х и оси Y, она может получать изображения, в то же время регулярно двигаясь вокруг множества определенных точек. При указанной выше конфигурации можно контролировать процесс образования тромба во времени по широкой площади камеры образования тромба 411, даже если увеличение камеры 430 установлено на высокий уровень. Далее, оптический источник 432 (например, светоизлучающий диод) предпочтительно расположен вокруг камеры 430, поскольку оптический источник 432 может одновременно передвигаться, в то же время поддерживая свое позиционное взаимоотношение с камерой 430. Предпочтительно, чтобы оптический источник 432 был способен излучать свет при длине волн, которые могут возбуждать определенное флюоресцентное вещество вместе с белым светом, в зависимости от флюоресцентного материала, который служит в виде мишени визуализации, обеспечивая возможность возбуждения различных флюоресцентных материалов.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет детально пояснено определенными примерами. Однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
Пример 1
2
Устройство мониторинга образования тромба (фиг.1) используется для заполнения шприца 20 50 мл обработанной цитратом крови (раствором А), содержащей 9 частей по объему крови сразу после смешивания образца крови с 1 частью по объему 3,2% цитрата натрия, и для заполнения шприца 21 10 мл 0,2 М CaCl (раствор В). Шприцы 20 и 21 соединены с прозрачной нейлоновой трубкой (впускной трубкой 11 и трубкой 12 для лекарственного средства) с внутренним диаметром 3 мм. Обе трубки соединены вместе у Т-образного соединения (цилиндрической бобины) и затем соединены с поликарбонатной камерой 10 образования тромба с внутренним диаметром 3 мм и длиной 1 см через одиночную нейлоновую трубку (впускную трубку 11) с внутренним диаметром 3 мм и длиной 3 см. Сама камера 10 образования тромба сконструирована в виде съемной кассеты. Соединительная часть между кассетой и нейлоновой трубкой (впускной трубкой 11) изготовлена герметичной для жидкости посредством кольцевого уплотнителя, изготовленного из силиконовой резины. Стеклянный элемент фиксирован на внутренней стороне кассеты клеем на эпоксидной основе, образуя посредством этого суженную часть 14. Суженная часть 14 сконструирована так, что самый суженный участок суженной части 14 может иметь внутренний диаметр (максимальный зазор между суженной частью 14 и внутренней стенкой) 1,5 мм. Кроме того, камера 10 образования тромба соединена герметично для жидкости с трубкой, такой как выпускная трубка 13, имеющая такой же диаметр и изготовленная из того же материала, посредством кольцевого уплотнителя, изготовленного из силиконовой резины, и, таким образом, изготавливается устройство 1 мониторинга тромба (фиг.1). Следует отметить, что манометры 40 и 41 фланцевого типа установлены соответственно на частях впускной трубки 11 и выпускной трубки 13 около камеры 10 образования тромба посредством соединений (цилиндрических бобин). Кроме того, стеклянный материал суженной части на внутренней поверхности камеры 10 образования тромба получают так, что коллаген наносится в виде покрытия в качестве вызывающего образование тромба материала 15 на стеклянную суженную часть на внутренней поверхности погружением в 0,1N раствор уксусной кислоты, содержащий 1% нерастворимый коллаген типа I (изготавливаемый Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и затем сушкой. Шприцы 20 и 21 перевернуты так, что поршни находятся на верхней стороне, и затем на поршни воздействуют силы тяжести с тем, чтобы дать возможность раствору А и раствору В течь в шприцевые насосы со скоростью соответственно 5 мл/мин и со скоростью 0,5 мл/мин.
Когда раствор А и раствор В текут в течение 10 мин, через несколько минут возникает разница между показаниями манометров 40 и 41 во впускной трубке 11 и выпускной трубке 13, и затем такая разность со временем увеличивается. Одновременно подтверждается, что кровь, вытекающая из выпускной трубки 13, также постепенно уменьшается. Когда поток всех растворов завершается, в устройство 1 мониторинга образования тромба течет физиологический солевой раствор для промывания камеры 10 образования тромба. Таким образом, образование тромба можно обнаружить в камере 10 образования тромба визуальным наблюдением.
Пример 2
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 1, за исключением того, что в раствор А примера 1, кроме того, добавляли нефракционированный гепарин (полученный из слизистой оболочки свиней) в концентрации 1 мг/мл.
В этом случае нет разности давления, и не происходит уменьшения потока крови, и тромб нельзя найти в камере 10 образования тромба визуальным наблюдением после промывания физиологическим солевым раствором.
Пример 3
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 1, за исключением того, что стеклянная трубка диаметром 3 мм и длиной 5 см была использована в виде камеры 10 образования тромба кассетного типа, каждый из шприцев 20 и 21 был соединен со шприцевыми насосами, приводимыми в действие электрическими моторчиками, а вместо суженной части 14 и коллагена, нанесенного в виде покрытия в качестве материала, вызывающего образование тромба 15, на суженную часть 14 (фиг.2а) прикрепляли клеем кусок шелка длиной 1,5 см, погруженный в коллаген примера 1 и высушенный при 4°С, в качестве материала, вызывающего образование тромба 15, на внутреннюю поверхность камеры 10 образования тромба, которая имеет размер 5 см внутрь от соединительной части стеклянной трубки и впускной трубки 11.
После течения раствора А в шприц 20 со скоростью 3 мл/мин и раствора В в шприц 21 со скоростью 0,3 мл/мин в течение 15 мин, камеру 10 образования тромба отсоединяли и ее внутреннюю поверхность затем промывали физиологическим солевым раствором. В результате, визуальное наблюдение подтвердило, что тромб 16 длиной около 1 см и толщиной около 1 мм в форме кометы (фиг.2b), который, как представляется, образовался с находящейся ниже по потоку стороны шелка в качестве начальной точки и распространился вниз по потоку, был прикреплен к внутренней поверхности стеклянной трубки. Считают, что влияние потока крови может вызвать образование тромба в форме кометы.
Самая широкая часть тромба имела ширину около 3 мм.
Пример 4
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что вместо шелка (фиг.3а) 50 мкл крови без антикоагуляционной обработки закапывали на внутреннюю поверхность стеклянной трубки пастеровской пипеткой и затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 15 мин, посредством этого получая тромб в форме диска диаметром около 2 мм в качестве вызывающего образование тромба материала 15.
Способом, аналогичным примеру 3, после протекания раствора А и раствора В, камеру 10 образования тромба удаляли и затем ее внутреннюю поверхность промывали физиологическим солевым раствором. В результате, визуальное наблюдение подтвердило, что к внутренней поверхности стеклянной трубки был прикреплен тромб 16 длиной около 1 см и толщиной около 1 мм в форме кометы (фиг.3b), проходящий в направлении ниже по потоку, в то же самое время оборачивающий тромб в качестве вызывающего образование материала 15. Считают, что влияние потока крови может вызвать образование тромба в форме кометы.
Самая широкая часть тромба имела ширину около 3 мм.
Пример 5
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что в раствор А, кроме того, добавляли Argаtroban (зарегистрированная марка, изготавливаемая Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.) в качестве средства антикоагуляционной обработки в концентрации 0,1 мг/мл относительно раствора А примера 3.
В результате, визуальное наблюдение не подтвердило присутствия тромба в стеклянной трубке после промывания физиологическим солевым раствором.
Пример 6
Устройство 1 мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 3, за исключением того, что подвергнутую антикоагуляционной обработке кровь получали добавлением гирудина в концентрации 1 мкг/мл относительно цельной крови и использовали в качестве раствора А, а поликлональное антитело против гирудина (изготовленное COSMO BIO CO., LTD.), растворенное в концентрации 1 мг/мл в физиологическом солевом растворе, относительно крови, использовали в качестве раствора В.
В этом случае было подтверждено почти такое же образование тромба, как в примере 3.
Пример 7
Получали 10 мл цельной крови (раствора А), которую подвергали антикоагуляционной обработке добавлением в кровь сразу после взятия образца крови 10 мг/мл апротинина и 1 мкг/мл рекомбинантного гирудина (изготовленного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); и 1 мл раствора (раствора В), который получали добавлением поликлонального антитела против гирудина (изготовленного COSMO BIO CO., LTD.), из которого был удален домен Fc иммобилизованной папаином смолой до 1000-кратно разбавленного физиологического солевого раствора 1 флакона/мл тромбопластинового реагента (изготовленного Sysmex Corporation) в качестве лекарственного средства для стимуляции свертывания крови.
Для изготовления устройства мониторинга образования тромба использовали подложку 100 (фиг.4), которая изготовлена из полидиметилсилоксана шириной 40 мм, длиной 70 мм и толщиной 1,5 мм, и подложку 200, показанную на фиг.5, которая имеет толщину 1 мм и изготовлена из стекла таких же размеров.
Контур, содержащий камеру образования тромба 110, формировали вырезанием канавки глубиной 0,5 мм на поверхности подложки 100 (фиг.4). Глубина части канавки, которая подлежит предоставлению в виде впускной трубки 111, составляет 1 мм. Длина контура 100D составляет 30 мм. Сквозное отверстие диаметром 1 мм образовано на конце канавки и представлено в виде регулирующего клапана 100Е, который закрывается приводимым в действие и закрываемым колпачком. Камера 110 образования тромба имеет длину 30 мм и ширину 2,5 мм в более широкой части и суженную часть 114, имеющую ширину 0,5 мм. Затем предоставлено сквозное отверстие диаметром 1 мм в качестве каждой из соединительных частей 100А и 100В. Кроме того, сквозное отверстие диаметром 2,5 мм предоставлено в виде соединительной части 100С.
Коллаген в форме ленты шириной 10 мм наносили в качестве вызывающего образование тромба материала 115 на подложку 200 в положение, покрывающее суженную часть 114 подложки 100 (фиг.5). Нанесение коллагена проводится так, что прикрепляется прямоугольная маскировочная лента, соответствующая суженной части 114 подложки 200, и затем она покрывается десорбирующим агентом на основе силикона SRX-211 (Dow Corning Toray Co., Ltd.). В последующем, маскирующая лента отслаивается. Затем производили закапывание раствор коллагена типа 1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), растворенного в 0,1 N уксусной кислоте так, чтобы 1% его был свободен от десорбирующего агента, и затем оставляли стоять в течение 1 ч при 25°С. После этого коллаген на слое десорбирующего агента промывали очищенной водой и коллаген наносили только на прямоугольную стеклянную область, соответствующую суженной части 114, где десорбирующий агент не был нанесен.
В последующем, поверхность подложки 200 с нанесенным коллагеном и поверхность подложки 100 с сформированным контуром соединяли вместе лицом к лицу.
Соединительные части 100А и 100В соединены с силиконовыми трубками, имеющим внутренний диаметр 1 мм от задней поверхности (свободная от контура сторона) подложки 100, и затем соединены соответственно с 10-мл шприцем, заполненным раствором А, и 1-мл шприцем, заполненным раствором В. Каждый из этих шприцев соответственно соединен с шприцевыми насосами. Следует отметить, что другая соединительная часть 100С соединена с силиконовой трубкой, имеющей внутренний диаметр 2,5 мм, которая предоставлена в качестве выпускной трубки.
Раствор А инжектируется из соединительной части 100А при скорости потока 0,3 мл/мин. Раствор В инжектируется из соединительной части 100В при скорости потока 0,03 мл/мин.
Раствору А и раствору В предоставляли возможность течь соответственно из соединительной части 100А и соединительной части 100В в течение 5 мин. Физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для отмывания крови. В результате, образование тромба подтверждается главным образом на области а и области b (фиг.6) на обработанной коллагеном поверхности подложки 200.
Пример 8
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями: раствор А получали так, что в кровь сразу после взятия образца крови добавляли поликлональное антитело против фактора XII (изготовленное COSMO BIO CO., LTD.), из которого папаином был иссечен домен Fc, в концентрации 0,3 мг/мл и нефракционированный гепарин свиного происхождения (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в дозе 0,3; раствор В получали разведением тромбопластинового реагента (изготовленного Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) в 50 раз; нанесение коллагена проводили на предварительно обработанную область прозрачной полистирольной подложки 200 (толщиной 1 мм) с нанесенным коллагеном (фиг.8) капанием раствора, полученного растворением перманганата калия в концентрированной серной кислоте. В концентрации 2 г/л, подвергая взаимодействию при 25°С в течение 10 мин с последующим быстрым промыванием очищенной водой, коллаген наносили капанием раствора, в котором коллаген типа 1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), растворенный в 0,1 N уксусной кислоте, растворяли в концентрации 1% на предварительно обработанную область и оставляли стоять при 25°С в течение 1 ч с последующим вымыванием очищенной водой, а подложку 100 без суженной части использовали для камеры 110 образования тромба (фиг.7). Следует отметить, что соединительная часть 100С подложки 100 имеет сквозное отверстие диаметром 1 мм, соединенное с силиконовой трубкой с внутренним диаметром 1 мм в качестве выпускной трубки.
После протекания раствора А и раствора В в течение 10 мин физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для вымывания крови, посредством этого, подтверждая сцепление красного тромба с канальной частью области подложки 200 с нанесенным коллагеном.
Пример 9
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, за исключением того, что:
раствор А получали так, что кровь сразу после взятия образца крови подвергали антикоагуляционной обработке добавлением апротинина в концентрации 0,05 мг/мл и рекомбинантного гирудина (изготовленного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) в концентрации 1 мкг/мл и затем добавляли хинакрин (Sigma Co., Ltd.);
соединительную часть 100В закрывали колпачком и только раствор А затем инжектировали из соединительной части 100А со скоростью потока 1 мл/мин.
При наблюдении флюоресцентным стереоскопическим микроскопом, сфокусированным на поверхность предметного стекла подложки 200 с нанесенным коллагеном, проявление флюоресцентного света зеленого хинкрина было подтверждено на части поверхности с нанесенным коллагеном, и такая область распространялась со временем в виде пятнистой области. Через 10 мин проявление зеленого флюоресцентного света, которое могло быть вызвано сцеплением тромбоцитов, было подтверждено на большей части поверхности с нанесенным коллагеном.
Пример 10
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 9, за исключением того, что раствор А получали без добавления хиналина.
Кровь инжектировали из соединительной части 100А со скоростью потока 1 мл/мин. Когда трубку соединительной части 100С сжимали для ее перекрытия на 2 с во время инжекции, кровь сразу перемещалась на 20 мм от точки разветвления в контуре 100D, что сопровождалось увеличением внутреннего давления. Даже после открытия соединительной части 100С кровь не перемещалась от 20-мм точки, так что можно было подтвердить увеличение давления.
Пример 11
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 8, за исключением того, что:
добавляли поликлональное антитело против тромбина (COSMO BIO CO., LTD.), из которого был удален домен Fc папаином, до концентрации 30 мкг/мл вместо гепарина раствора А примера 8;
и далее добавляли раствор В примера 8 с тромбином РРАСК в концентрации 5 мг/мл.
После протекания раствора А и раствора В течение 15 мин физиологический солевой раствор инжектировали из соединительной части 100А для вымывания крови. В результате, было подтверждено, что красный тромб был прикреплен на части канала области подложки 200, обработанной коллагеном.
Пример 12
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба затем контролировали способом, аналогичным примеру 7, за исключением того, что:
раствор А получали так, что 50 мл крови, в которую сразу после взятия пробы крови добавляли 0,5 ЕД/мл гепарина и 10 мкг/мл апротинина, центрифугировали при 800 об/мин и обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) получали из супернатанта, таким образом, получая раствор А; и
раствор, в котором тромбопластиновый реагент в концентрации 1 флакон/мл (Sysmex Corporation) разбавляли в 30 раз физиологическим солевым раствором, использовали в качестве раствора В.
Образование тромба в суженной части 114 контролировали в течение 15 мин, используя стереоскопический микроскоп. Подтверждали наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Также наблюдалось, что количество сгустков увеличивалось, и их размер также увеличивался, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.
Пример 13
Образование тромба контролировали пропусканием раствора А и раствора В способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:
раствор А получали добавлением 500 мкг эритроцитов, собранных из отцентрифугированного осадка в 20 мл PRР раствора А примера 12;
раствор, в котором тромбопластиновый реагент в концентрации 1 флакон/мл (Sysmex Corporation) разбавляли в 30 раз физиологическим солевым раствором, использовали в качестве раствора В;
предметное стекло получали покрытием всей поверхности подложки 200 десорбирующим агентом SRX-211 (Dow Corning Toray Co., Ltd.) на основе силикона; и
приблизительно 1 мкл цельной крови сцеплялся с поверхностью около концевой точки расширения расширяющейся части, в последующем распространяясь до ширины 2,5 мм, которая прилегает к находящейся выше по потоку от суженной части 114 части камеры образования тромба 110 на подложке 100, затем цельную кровь оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 10 мин для того, чтобы вызвать ее свертывание, и образовывался предварительный тромб, предназначенный для использования в качестве материала, вызывающего образование тромба.
Область прикрепления тромба контролировали стереоскопическим микроскопом в течение 15 мин. Образование нового красного тромба, который располагался ниже по потоку от предварительного тромба в качестве исходной точки, было подтверждено примерно через 5 мин, он в целом распространялся вниз по потоку в течение периода до 15 мин, и его ширина увеличивалась до 2,5 мм. Было подтверждено, что кровь текла вдоль образованного тромба или текла через зазоры между образованным тромбом.
Пример 14
Образование тромба контролировали пропусканием раствора А и раствора В способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:
в 50 мл крови сразу после взятия образца крови добавляли аптамер тромбина экзоцита I (GGTTGGTGTGGTTGG: SEQ ID № 1) в конечной концентрации 5 мкМ и полученный из маиса ингибитор трипсина (COSMO BIO CO., LTD.) в конечной концентрации 30 мкг/мл и центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин, и из супернатанта формировали обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) и предоставляли в качестве раствора А;
антисмысловую ДНК (CCAACCACACCAACC: SEQ ID № 2) растворяли в физиологическом солевом растворе так, чтобы ее концентрация была 150 мкМ, и предоставляли в виде раствора В; и
во время нанесения на предметное стекло ингибитора образования тромба 115 раствор, который получали смешиванием раствора коллагена примера 7 с раствором, полученным растворением 1 флакона тромбопластинового реагента (Sysmex Corporation) в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в соотношении 5:1, накапывали на область без нанесенного силикона и сушили воздухом при 4°С.
Образование тромба в суженной части 114 контролировали в течение 5 мин, используя стереоскопический микроскоп. Было подтверждено наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Мониторинг также показал, что количество сгустков увеличивалось с одновременным увеличением их размеров, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.
Пример 15
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали и образование тромба контролировали способом, аналогичным примеру 14, со следующими исключениями:
после получения PRP такой же процедурой, как в примере 14, непосредственно перед измерением добавляли антисмысловую ДНК (CCAACCACACCAACC: SEQ ID № 2), чтобы ее концентрация была 15 мкМ, посредством этого осуществляя антитромбиновую обработку, и полученный раствор предоставляли в качестве раствора А;
инжекционное отверстие соединительной части 100В закрывали способом, аналогичным примеру 9;
коллаген типа I (коллагеновый реагент для покрытия чашки для клеточной культуры коллагеном, маточный раствор типа I-А, Cellmatrix Co., Ltd.) использовали вместо раствора коллагена примера 14; и
только раствор А пропускали со скоростью потока 0,2 мл/мин в течение 5 мин.
Образование тромба в суженной части 114 контролировали, используя стереоскопический микроскоп. Было подтверждено наличие множества тромбоцитарных сгустков, прикрепленных вокруг суженной части 114. Мониторинг также показал, что количество сгустков увеличивалось с одновременным увеличением их размеров, причем тромбоцитарные сгустки повторно прикреплялись и отсоединялись.
Пример 16
Устройство мониторинга образования тромба изготавливали способом, аналогичным примеру 7, со следующими исключениями:
на поверхности подложки формировали канавку глубиной 0,1 мм врезанием контура (фиг.7), в то же время оставляя разделительные стенки так, что были получены вогнутые ряды, каждый длиной 1 мм и шириной 40 мкм, проходящие по всей поверхности нижней части вокруг центра камеры образования тромба 110 с интервалами между ними 40 мкм;
инжекционное отверстие соединительной части 100В закрывали способом, аналогичным примеру 9; и
подложка 200 представляла собой предметное стекло без обработки поверхности. Зазор (канал) между разделительными стенками имитирует кровяной капилляр.
Цельную кровь сразу после взятия пробы подвергали антикоагуляционной обработке добавлением полученного из маиса ингибитора трипсина при конечной концентрации 30 мкг/мл и экзоцита I аптамера тромбина при конечной концентрации 10 мкМ. Непосредственно перед мониторингом добавляли антисмысловую ДНК экзоцита I аптамера тромбина так, чтобы ее концентрация была 30 мкМ, с последующей инжекцией из 100А при скорости потока 0,05 мл/мин в течение 5 мин.
Образование тромба в зазоре между разделительными стенками контролирвали, используя стереоскопический микроскоп. В результате, каналы последовательно закрывались во время мониторинга в течение 5 мин. Мониторинг выявил, что примерно половина каналов была закрыта образованным тромбом.
Пример 17
Использовали устройство подачи жидкости шприцевого типа (фиг.9). Микрочип 300, где подложка и крышка микрочипа (фиг.9(В) и фиг.9(С)) были изготовлены из тех же материалов, как материалы примера 7, соединяли сдавливанием. Микрочип 300 содержит впускную трубку 322 для ингибитора свертывания крови и выпускную трубку 313, которые были присоединены к подложке 100, как в случае выпускной трубки примера 7. Однако все канавки микрочипа 300 (фиг.9) были сформированы глубиной 200 мкм. Также был сформирован канал так, чтобы кровь могла вводиться в канал из шприца для образцов 320, при этом канал имел ширину 1 мм и длину 40 мм и был соединен с камерой образования тромба 311, состоящей из узкого канала, имеющего ширину 200 мкм и длину 10 мм, и впускной трубки для ингибитора свертывания крови 322. Раствор готовили так, что содержимое 1 флакона реагента РТ Sysmex Corporation (тканевой тромбопластин) растворяли в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в очищенной воде. Диализированный продукт в очищенной воде смешивали с коллагеном типа I (изготовленным Nitta Gelatin Inc.) в соотношении 1:1. Раствор наносили на поверхность материала, вызывающего образование тромба 315. После этого часть с нанесенным раствором сушили при 4°С на воздухе и камеру 311 образования тромба покрывали и использовали в качестве материала, вызывающего образование тромба 315. Кровь брали после добавления средства антикоагуляционной обработки, так что конечные концентрации соответствующих компонентов в шприце составили 25 мкг/мл для полученного из маиса ингибитора трипсина, 10 мкМ для экзоцита I аптамера тромбина и 10 мкМ для экзоцита II аптамера тромбина (5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3': seq id № 3). Непосредственно перед мониторингом в собранную таким образом кровь добавляли антисмысловые ДНК в отношении аптамеров тромбина экзоцита I и II так, чтобы каждая из них достигла концентрации 40 мкМ. Затем шприц (шприц емкостью 1 мл, изготовленный Terumo Corporation) заполняли кровью и предоставляли в качестве шприца для образца 320, показанного на фиг.9. Устройство My Flow (изготовленное Arbiotec Co., Ltd.), которое представляет собой насос микроподачи, способный контролировать внутреннее давление подающего жидкость наноса, было соединено с трубкой для подачи давления 317. Минеральное масло вдавливали в микрочип 300 из верхней части шприца 320, и кровь выталкивалась в микрочип 300 со скоростью потока 50 мкл/мин при одновременном контроле давления, оказываемого на шприц для образца 320.
В качестве ингибитора свертывания из впускной трубки 322 для ингибитора свертываемости крови подавали 1 М Tris-HCl (рН 10) со скоростью потока 50 мкл/мин. Давление начинало расти через 6 мин после начала измерения давления.
Давление, повторяющее его изменения в сторону повышения и понижения вследствие движения тромба («контроль», показанный на фиг.13), поднялось до 80 кПа.
Пример 18
Взятие образцов крови проводили при добавлении средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 17. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 17, за исключением того, что нефракционированный гепарин добавляли в концентрации 1 ЕД/мл. Затем проводили измерение давления. Давление возрастало примерно до 10 кПа («Гепарин», показанный на фиг.13).
Пример 19
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 17. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 17, за исключением того, что добавляли ReoPro (LILLY Co., Ltd.) в концентрации 50 мкг/мл. Затем проводили измерение давления. При измерении в течение 18 мин невозможно было подтвердить увеличение давления («ReoPro», показанный на фиг.13).
Пример 20
Взятие образца крови проводили с добавлением 3,2% лимонной кислоты, так что соотношение между лимонной кислотой и кровью составляло 1:9. Затем добавляли кровь с полученным из маиса ингибитором трипсина в концентрации 25 мкг/мл для проведения антикоагуляционной обработки. Сразу после добавления хлорида кальция в кровь, подвергнутую антикоагуляционнной обработке, так, чтобы его концентрация достигла 15 мМ относительно крови, подвергнутой антикоагуляционнной обработке во время мониторинга образования тромба, кровь добавляли в шприц (шприц емкостью 1 мл, изготовленный Terumo Corporation) с последующим втеканием крови в такой же микрочип, как микрочип в примере 17, при скорости потока 40 мкл/мин. Затем изменение давления измеряли, используя то же устройство, что в примере 17. Давление начинало возрастать через 15 мин после начала измерения давления, и оно возрастало примерно до 60 кПа.
Пример 21
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 20. Затем, проводили такую же процедуру, как процедура примера 20, за исключением того, что гепарин добавляли соответственно в концентрациях 0,2 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл и 1 ЕД/мл. Затем проводили измерение давления. Результаты показаны на фиг.14.
Пример 22
Взятие образца крови проводили с добавлением средства антикоагуляционной обработки способом, аналогичным примеру 20. Затем проводили такую же процедуру, как процедура примера 20, за исключением того, что добавляли ReoPro (LILLY Co., Ltd.) в концентрации 2 мкг/мл. Затем проводили измерение давления. Давление начинало расти через 20 мин после начала измерения давления, и оно росло примерно до 15 кПа через 25 мин (фиг.15).
Пример 23
Использовали устройство подачи жидкости шприцевого типа, показанное на фиг.12. Кроме того, микрочип 400, где подложка 200 и крышка микрочипа и подложка 100 в виде корпуса микрочипа, показанного на фиг.12(В) и фиг.12(С), были соединены сдавливанием. Выпускную трубку 413, изготовленную из тефлона (зарегистрированной торговой марки), заполняли минеральным маслом и один ее конец соединяли с микрочипом 400 через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины, а другой ее конец соединяли с засасывающим насосом 414, в который был вставлен датчик давления. Впускную трубку, образующую канал микрочипа 400, соединяли со шприцем 420 через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины. Один конец впускной трубки для ингибитора свертываемости крови 422, изготовленной из тефлона (зарегистрированной торговой марки), соединяли с насосом подачи жидкости 423, другой конец которой соединяли с концом камеры образования тромба через соединительную трубку 412, изготовленную из силиконовой резины. Таким образом, микрочип 400 соединяли с выпускной трубкой 413, шприцем 420 и впускной трубкой для ингибитора свертываемости крови 422, получали устройство В мониторинга образования тромба. Управляемую компьютером камеру 430, снабженную оптическим источником освещения 432 (испускающим свет диодом), которая была установлена и могла перемещаться на направляющей 433, устанавливали под камеру образования тромба.
Все канавки на микрочипах имели глубину 120 мкм.
Канал, в который была введена кровь, имел ширину 800 мкм и длину 7 мм. Суженный канал имел ширину 200 мкм и длину 10 мм.
Раствор получали так, что содержимое 1 флакона реагента РТ (тканевого тромбопластина, Sysmex Corporation) растворяли в 1 мл очищенной воды и затем диализировали в очищенной воде, диализированный продукт в очищенной воде смешивали с коллагеном типа I (изготовленным Nitta Gelatin Inc.) в соотношении 1:1. Затем раствор наносили на область подложки 200 микрочипа, обращенную к каналу суженной части на поверхности, подлежащей соединению сдавливанием с подложкой 100 микрочипа. После этого часть с нанесенной жидкостью подвергали вакуумной сушке при 4°С, и затем подложку 100 и подложку 200 соединяли сдавливанием друг с другом, обеспечивая получение микрочипа 400, имеющего камеру 411 образования тромба.
Взятие проб крови проводили, используя вакуумный сосуд для сбора крови, в который был заключен цитрат натрия в качестве антикоагуляционного средства. Непосредственно перед введением в шприц 420 в кровь добавляли хлорид кальция в конечной концентрации 12,5 мМ и полученный из маиса ингибитор трипсина в конечной концентрации 25 мкг/мл.
Устройство My Flow (изготовленное Arbiotec Co., Ltd.), которое представляет собой насос микроподачи, способный контролировать внутреннее давление подающего жидкость наноса, было соединено с выпускной трубкой 413 в качестве насоса 414. Таким образом, всасывание выполняли со скоростью 15 мкл/мин при одновременном контроле внутреннего давления в канале.
В качестве ингибитора свертывания 1 М Tris-HCl (рН 10) пропускали из впускной трубки для ингибитора свертывания крови 422 при скорости потока 8 мкл/мин. Образование главным образом белого тромба наблюдали через 4 мин от начала измерения давления, в то время как было подтверждено снижение внутреннего давления. Кроме того, было подтверждено, что внутреннее давление снизилось до 30 кПа через 10 мин от начала.
Далее, образование тромба наблюдали получением изображений при движении камеры 430 вокруг области образования тромба в канале. Положение, в котором наблюдалось образование тромба, запоминалось, и камера 430 получала изображения при регулярном перемещении вокруг множества определенных точек. В результате, в динамике во времени регистрировался рост и разрушение множества больших тромбов.
Далее будут описаны выполненные справочные эксперименты для демонстрации эффективности аптамеров тромбина и их антисмысловых ДНК в качестве соответственно средств антикоагуляционной обработки и средств, осуществляющих антикоагуляционное действие.
Контрольный эксперимент 1
Была предоставлена кровь немедленно после ее взятия, а также кровь, полученная добавлением одной десятой объема 300 мкг/мл полученного из маиса ингибитора трипсина в первую порцию крови, и кровь, полученная добавлением аптамера тромбина, который распознает экзоцит I, во вторую порцию крови, чтобы была получена концентрация 5 мкМ. Затем для этих трех видов крови в пробирках Эппендорфа (изготовленных из полипропилена) измеряли время, затрачиваемое на свертывание. Пробирку с образцом переворачивали кверху дном через каждую минуту, и подтверждали его текучесть. Кровь без добавок показала время свертывания 9 мин. Напротив, кровь с добавлением ингибитора трипсина показала время свертывания 22 мин. Далее, кровь после добавления аптамера тромбина, показала время свертывания 62 мин.
Далее, когда 5 мкМ аптамера тромбина, который распознает экзоцит I, и 5 мкМ аптамера тромбина, который распознает экзоцит II, использовали в комбинации, свертывание крови не было подтверждено даже через 3 ч даже в случае отсутствия в крови ингибитора трипсина.
Аптамер тромбина, распознающий экзоцит I: 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3' SEQ ID № 1,
Аптамер тромбина, распознающий экзоцит II: 5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3' SEQ ID № 3).
Контрольный эксперимент 2
Измерение АРТТ проводили на 200 мкМ плазмы относительно каждого из образца А с добавлением 10 мкМ физиологического солевого раствора, образца В с добавлением 10 мкМ 500 мкМ аптамера тромбина, распознающего экзоцит I, и образца С с добавлением 10 мкл раствора, содержащего 500 мкМ аптамера тромбина, распознающего экзоцит I, и 1500 мкМ антисмысловой ДНК аптамера тромбина, распознающего экзоцит I. АРТТ образца А составило 44 с, образца В 2 мин или более и образца С 45 с.
Контрольный эксперимент 3
Фиг.11(А) представляет собой анализ формы волны свертывания по тромбоэластограмме при хранении крови с добавлением 10 мкл аптамеров к экзоциту I и экзоциту II при комнатной температуре в течение 15 мин, и затем добавлении 40 мкМ антисмысловых ДНК обоих аптамеров. Фиг.11(В) представляет форму волны тромбоэластограммы крови сразу после взятия образца крови.
Как очевидно по результатам, представленным на фиг.11(А) и 11(В), было обнаружено, что добавление двух видов аптамеров тромбина обеспечивает возможность хранения крови, и антисмысловая ДНК может осуществить ее антикоагуляционную обработку.
По результатам контрольных экспериментов 1-3 очевидно, что комбинация полученного из маиса ингибитора трипсина и аптамера тромбина может эффективно ингибировать свертывание цельной крови, и что антикоагуляционный эффект аптамера тромбина можно инактивировать антисмысловой ДНК к аптамеру тромбина.
Контрольный эксперимент 4
Далее будет описана эффективность воздействий покрытия РМЕА при хранении крови и сцепление тромбоцитов с подложкой.
(1) Раствор метанола, содержащий 1% РМЕА, полученный в соответствии с JP 04-152952 A, наносили на 2,5-мл контейнер из акриловой смолы (внутренние размеры: 1 см × 1 см × 4,5 см) и затем сушили при 90°С в течение 10 мин. В последующем, 760 мкл крови, подвергнутой антикоагуляционной обработке 2% лимонной кислотой, добавляли в каждый не покрытый контейнер и контейнер, покрытый РМЕА, с последующей аспирацией пипеткой через каждые 5 мин для подтверждения свертывания крови.
Следовательно, непокрытый контейнер проявил очевидное увеличение вязкости через 30 мин и свертывание через 60 мин. В отличие от этого контейнер, покрытый РМЕА, проявил очевидное увеличение вязкости через 35 мин, но время наступления свертывания удлинилось до 90 мин.
(2) Указанный РМЕА плоским слоем наносили на прозрачную акриловую пластину. Ее использовали вместо покрытой коллагеном пластины примера 9 (фиг.8), и эксперимент по адгезии меченных хинакрином тромбоцитов и лейкоцитов в крови проводили способом, аналогичным примеру 9.
В результате, очевидная адгезия или агглютинация тромбоцитов и лейкоцитов наблюдалась через 10 мин от начала течения крови. Напротив, адгезия или агглютинация тромбоцитов и лейкоцитов на акриловой пластине, покрытой РМЕА, не наблюдалась даже через 30 мин.
По приведенным выше результатам в устройстве мониторинга образования тромба по настоящему изобретению путем покрытия РМЕА шприцев для хранения крови, трубки, подложки и подобных поверхностей можно подавить образование тромба на месте, отличном от камеры образования тромба. Поэтому предполагается, что может быть достигнут мониторинг образования тромба, специфичный для камеры мониторинга образования тромба.
В представленном выше описании настоящее изобретение было описано со ссылкой на предпочтительные варианты осуществления. Однако настоящее изобретение не ограничивается примерами и вариантами осуществления, описанными выше, и можно применять различные модификации, не отходя от сущности настоящего изобретения. Например, можно устанавливать высокое давление, создаваемое насосом, и устанавливать небольшой диаметр выпускной трубки. В этом случае во впускной трубке и в выпускной трубке может создаваться противодавление, так что можно осуществлять мониторинг образования тромба, в то же время контролируя объемный кровоток в условиях нагрузки внутренним давлением, соответствующим давлению крови. Далее, скорость потока крови в это время можно свободно контролировать посредством давления, создаваемого насосом, и степенью дросселирования выпускной трубки.
Промышленная применимость
Устройство мониторинга образования тромба и способ мониторинга образования тромба согласно настоящему изобретению можно с успехом использовать при всесторонней оценке свертывания крови и образования тромбоцитарного тромба в среде, эквивалентной кровотоку, с использованием цельной крови или плазмы, содержащей тромбоциты, для оценки эффективности антитромботического лекарственного средства, вводимого пациенту, или тому подобного.