НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОБИОТИКОВ
NEW APPLICATION OF PROBIOTICS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области метаболомики. Более конкретно, оно относится к идентификации патологического метаболомического профиля и к применению пробиотиков для нормализации патологического профиля.
Предшествующий уровень техники
Метаболомика является наукой, которая систематически исследует и интегрирует динамическое взаимодействие между множественными низкомолекулярными биомаркерами, которые являются уникально характеристическими для сложных биологических функций при здоровом состоянии и заболеваниях. Метаболомика, таким образом, предоставляет интересную платформу для исследования патофизиологии сложных физиологических синдромов на молекулярном уровне, которые, в свою очередь, могут приводить к прорывам в понимании и лечении нарушений и заболеваний, основанных на метаболизме.
В последнее время, метаболомику использовали в исследовании патофизиологии воспалительного заболевания кишечника (IBD) (Marchesi, J. R., Holmes, E., Khan, F., Kochhar, S., Scanlan, P., Shahahan, F., Wilson, I.D., Wang, Y., Rapid and noninvasive metabonomic characterization of inflammatory bowel disease, J Proteome Res, 2007, 6:546-51), ожирения и рака. Marchesi et al. характеризовали фекальные экстракты пациентов с болезнью Крона (CD) и язвенным колитом (UC) по сниженным уровням жирных кислот с короткой цепью, таких как бутират и ацетат, метиламина и триметиламина, предполагая очевидные изменения в микробной популяции кишечника вследствие воспаления.
Метаболомика, ограниченная исследованием только липидов, называется липидомикой и может использоваться для идентификации и выяснения механизмов, лежащих в основе заболеваний, основанных на липидах. Липидомический анализ, между прочим, применяли для характеризации жирового гепатоза у генетически страдающих ожирением инсулин-резистентных мышей (Yetukuri, L., Katajamaa, M., Medina-Gomez, G., Seppanen-Laakso, T., Vidal-Puig, A., Oresic, M., Bioinformatics strategies for lipidomics analysis: characterization of obesity related hepatic steatosis, BMC Systems Biol., 2007, 1:12).
Появляется все большее число данных указывающих, что некоторые липиды, такие как эйкозаноиды, диацилглицерины, лизофосфатидные кислоты и сфинголипиды, особенно, церамиды, обладают способностью усиливать восприятие боли. Многие из этих липидов являются вторичными мессенджерами в сигнальных путях, которые ассоциированы с увеличением чувствительности сенсорных нейронов, в то время как другие представляют собой предполагаемые воспалительные медиаторы, которые активируют любые поверхностные рецепторы ионных каналов в этих нейронах. Они предоставляют возможные мишени для терапевтических средств для лечения воспаления и хронических болезненных состояний (Park, K.A., Vasko, M. R. Lipid mediators of sensitivity in sensory neurons, trends in Pharmacological Science, 2005, 26(11):571 -577).
Malan et al. провели обзор вклада липидных мессенджеров в регуляцию специфических физиологических функций, передачу болевой сенсорной информации (боли) в нервной системе. Они обнаружили, что липидные молекулы играют основные роли в модуляции болевой чувствительности. Было показано, что шесть типов липидных молекул (простаноиды, фосфатидилинозитолбифосфат, церамид, липоксигеназные метаболиты арахидоновой кислоты, жирнокислотные ацилдопамины и ацилэтаноламиды) модулируют системы, важные для регуляции болевых ответов. Простагландин представляет собой простаноид важный для боли, что иллюстрируется тем фактом, что нестероидные противовоспалительные лекарства, ингибирующие образование простагландинов, являются наиболее широко используемыми лекарствами для смягчения боли. Было обнаружено, что эффекты церамида или С2-церамида ингибируются глутатионом, ингибитором нейтральной сфингомиелиназы, которая высвобождает церамид из нейтральных сфингомиелинов. Было обнаружено, что блокирующие антитела против рецептора, опосредующего высвобождение церамида, ингибируют эффекты фактора роста нервов (NGF) на клеточную возбудимость и на калиевые каналы задержанного выпрямления. (Malan, T.P., Porreca, F. Lipid mediators regulating pain sensitivity, Prostaglandins & other Lipid Mediators, 2005, 77:123-130).
Таким образом, в целом признано, что метаболиты, такие как липидные метаболиты, могут обладать воздействием на ряд заболеваний и нарушений, включая восприятие боли. Все еще недостаточными являются идентификация заболеваний, ассоциированных с патологическим метаболическим профилем и понимание патофизиологии таких заболеваний. Еще меньше известно о возможностях влияния на патологический метаболический профиль для профилактики или лечения заболевания. Настоящее изобретение вносит вклад в решение этих задач.
Пробиотические микроорганизмы являются микроорганизмами, известными, как обладающие оздоровительным эффектом. Многие из пробиотиков являются бактериями, особенно, молочно-кислыми бактериями. Yan et al. предоставили молекулярный базис для терапевтического применения пробиотиков для опосредованных воспалением кишечных нарушений. Они очистили два новых белка р75 и р40 из Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), которые, как было продемонстрировано, активизируют гомеостаз кишечного эпителия через специфические сигнальные пути. Эти открытия позволяют предположить, что пробиотики могут быть применимыми для цитокин-опосредованных желудочно-кишечных заболеваний, так как они ингибировали цитокин-индуцируемый апоптоз клеточного эпителия, и значительно снижали TNF-индуцированное повреждение эпителия толстой кишки. (Yan, F., Cao, H., Cover, T.L., Whitehead, R., Washington, M. K., Polk, D.B., Soluble proteins produced by probiotic bacteria regulate intestinal epithelial cell survival and growth. Gastroenterology, 2007, 132(2):562-75).
2
2
2
Lam et al. показали, что Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) защищает клетки слизистой оболочки от апоптоза в желудке. Они обнаружили, что предварительная обработка LGG существенно увеличивала уровень простагландина Е (PGE) в базальной слизистой, и предположили, что защитное действие LGG на повреждения слизистой желудка происходит вследствие повышающей регуляции PGE, которая могла бы стимулировать секрецию слизи и увеличивать трансмукозальную сопротивляемость в слизистой желудка (Lam, E. K., Tai, E.K., Koo, M.W., Wong, H.P., Wu, W.K., Yu, L So, W.H., Woo, P.C., Cho, CH., Enhancement of gastric mucosal integrity by Lactobacillus rhamnosus GG, Life Sci, 2007, 80(23):2128-36).
1
Кроме того, Schultz et al. показали влияние перорального введения L. rhamnosus GG здоровым добровольцам на профиль секреции цитокинов. Они продемонстрировали, что профиль цитокинов сдвигается в сторону усиленного противовоспалительного ответа посредством повышенной секреции супрессивных цитокинов (IL-10, IL-4) и сниженной секреции провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6, IFN-γ) (Schultz, M., Linde, H.J., Lehn, N., Zimmermann, K., Grossmann, J., FaIk, W., Schόlmerich, J, Immunomodulatory consequences of oral administration of Lactobacillus rhamnosus strain GG in healthy volunteers, J Dairy Res, 2003,70:165-173).
Дополнительно, кроме того, было сделано предположение, что пробиотические бактерии, такие как молочно-кислые бактерии, бифидобактерии и лактококки, смягчают симптомы синдрома раздраженного кишечника IBS (общая балльная оценка синдрома, метеоризм, вспучивание). В обзоре Camilleri и Gorman сделан вывод, что по видимому, существует по меньшей мере одна подгруппа IBS с увеличенной проницаемостью кишечника, хотя роль дефектов проницаемости при IBS полностью не выяснена. Исследования модуляторов кишечной проницаемости включают пробиотики, рецептор, активируемый протеиназой (PAR), IFN-γ и глутамин, но данные считаются слишком предварительными, чтобы на основании их прийти к каким-либо заключениям. Кроме того, повышенное количество воспалительных клеток в биопсийных пробах слизистой и патологическое соотношение интерлейкинов (IL)-10/IL-12 позволяет предположить присутствие воспаления степени слабое/низкое у некоторых пациентов с IBS (Camilleri, M., Gorman H., Intestinal permeability and irritable bowel syndrome, Neurogastroenterol Motil, 2007, 19: 545-52).
Все еще мало известно про действительные механизмы, которые регулируют благоприятные эффекты пробиотических бактерий на уровень клеток хозяина целого организма. В обзоре Verdu et al. упоминается о ряде предполагаемых механизмов. Было обнаружено, что пробиотики снижают продолжительность инфекционной диареи у детей, модулируют воспалительный ответ на инфекцию посредством снижения патологического системного отношения интерлейкина 10 к интерлейкину 12 у пациентов с IBS, стабилизируют барьерную функцию кишечника у детей с атопическим дерматитом, улучшают мышечную функцию при послеинфекционном IBS, снижают патологическую ферментацию в кишечнике и возможно воздействуют на нейропередачу и модулируют висцеральное восприятие при IBS. Были получены противоречивые результаты, касающиеся снижающего воздействия конкретных пробиотиков на боль. (Verdu, E.F., Collins, S. M., Irritable bowel syndrome and probiotics: from rationale to clinical use, Current Opinion in Gastroenterology, 2005, 21:697-701 ).
Kajander et al., обнаружили смягчающий эффект пробиотиков на симптомы IBS и предполагают, что основополагающие механизмы, индуцированные пробиотиками, могут включать, например, противовоспалительные эффекты, балансирующие микробиоту или эффекты, относящиеся к сократительной способности (Kajander, K., Hatakka, K., Poussa, T., Frakkila, M., Korpela, R., A probiotic mixture alleviates symptoms in irritable bowel syndrome patients: a controlled 6-month intervention, Aliment Pharmacol Ther., 2005, 22: 387-394; Kajander, K., Korpela, R., Clinical studies on alleviating the symptoms of irritable bowel syndrome with a probiotic combination, Asia Pac J Clin Nutr, 2006, 15(4):576-580).
В WO 2007/36230 описан готовый к применению продукт, содержащий определенные количества ферментированных злаков, непатогенные микроорганизмы и, необязательно, фосфолипиды, предпочтительно фосфатидилхолин, для лечения воспалительных желудочно-кишечных заболеваний, например, воспалительного заболевания кишечника (IBD) и синдрома воспаленного кишечника (IBS). Утверждается, что такая композиция значительно улучшает лечение пробиотиками IBD, IBS и других желудочно-кишечные нарушения.
Настоящее изобретение теперь предоставляет новое показание для пробиотиков.
Краткое описание изобретения
Одна цель настоящего изобретения состояла в исследовании метаболических профилей и их связи с нарушениями и заболеваниями. Еще одна цель изобретения состояла в нахождении средств, улучшающих метаболический профиль, особенно, липидный профиль.
Цели изобретения были достигнуты посредством способа и применения, изложенных в независимых пунктах формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления описаны в зависимых пунктах формулы изобретения.
Изобретение заключает в себе неожиданное открытие, что пробиотики обладают способностью улучшать метаболический профиль.
Изобретение, таким образом, относится к применению пробиотика в получении композиции для улучшения метаболического профиля у пациента.
Также описан способ улучшения метаболического профиля у пациента, где пробиотик вводят указанному пациенту в количестве, достаточном для достижения желаемого эффекта.
Другие цели, детали и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующих чертежей, подробного описания и примера.
Краткое описание чертежей
+
Фиг.1 показывает концентрации (средняя  СО) выбранных липидов в биопсийных пробах слизистой от пациентов с IBS (n=15) и здоровых контролей (n=9), по данным измерений с помощью UPLC-MS. (А) показывает лизофосфолипиды; ЛизоФЭ = лизофосфатидилэтаноламин; ЛизоФХ = лизофосфатидилхолин и (В) показывает диацилглицерин (ДГ) и церамиды (Цер). Пациенты и контроли существенно отличались друг от друга по всем представленным фосфолипидам, а также по диацилглицерину и церамидам. ** указывает p<0,01 и *** p<0,001, где значения Р основаны на тесте с критериями суммы рангов Уилкоксона.
Фиг.2 показывает эффект Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) и Lactobacillus rhamnosusLC705 (LC705) на лизофосфатидилхолин (ЛизоФХ) in vitro. Стимуляция при 6 ч показана на (А) и при 24 ч на (В). Отношение <1 показывает, что бактериальный штамм способен снижать концентрацию рассматриваемого липида.
in vitro
Фиг.3 показывает эффект Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) и Lactobacillus rhamnosusLC705 (LC705) на церамид (Цер) . Стимуляция при 6 ч. с А отношением <1 показывает, что бактериальный штамм способен снижать концентрацию рассматриваемого липида.
Фиг.4 показывает результаты дискриминантного анализа с использованием метода частных наименьших квадратов (PLS/DA) на профили нелипидных метаболитов для пациентов с IBS (n=15; ) и здоровых контролей (n=9; ◊). Применяли две скрытых переменных (LVs) (Q2=61%).
Подробное описание изобретения
Недавнее технологическое развитие аналитических инструментов в сочетании с быстрым прогрессом в биоинформатике открыло новые возможности для быстрого и одновременного измерения и моделирования огромного числа молекулярных метаболитов в биологических образцах. Этот метаболомический подход рассматривают в качестве мощного инструмента для характеризации комплексных фенотипов и для развития биологических маркеров для специфических физиологических состояний. Установление метаболомического профиля, характеристического для специфического физиологического состояния, также облегчает поиск средств, способных к изменению профиля, и, посредством этого, оказывающих воздействие на физиологическое состояние.
Настоящее изобретение относится к применению пробиотика для улучшения метаболического профиля, предпочтительно липидного профиля у пациента. Метаболический профиль пациента можно определить из образца, взятого из организма пациента. Образец может представлять собой биопсийный образец из слизистой, особенно, из кишечника. Альтернативно, образец забирают из неинвазивных тканей, таких как кровь или фекальный материал.
Метаболомическое профилирование представляет собой крупномасштабное исследование водонерастворимых метаболитов (на практике липидов) и водорастворимых, т.е. нелипидных метаболитов, получаемое, например, посредством технологий, включающих масс-спектрометрию с электрораспылительной ионизацией (ESI(+/-)), жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией (LC/MS) и полную двухмерную газовую хроматографию в сочетании с высокоскоростной времяпролетной масс-спектрометрией (GCxGC-TOF). “Водорастворимые” имеет широкое значение в данном контексте, означая растворимость в полярном растворителе. Взаимодействия между метаболитами могут быть охарактеризованы посредством многофакторных методов. Это позволяет проводить анализ нескольких или даже огромного числа метаболитов из единственного образца с получением “метаболического профиля”, такого как “липидный профиль”, “профиль нелипидных метаболитов” или “метаболомический профиль” (т.е. сочетание липидных и нелипидных метаболитов). Эти результаты могут далее использоваться для идентификации метаболического профиля, типичного для конкретных физиологических состояний, с использованием методов статистического моделирования.
“Метаболит” представляет собой интермедиат или продукт метаболизма, обычно ограниченный до малых молекул. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, метаболит представляет собой “первичный метаболит”, который представляет собой метаболит, непосредственно включенный в нормальный рост, развитие и репродукцию. Предпочтительно, первичный метаболит является метаболитом, который включен в каскад энергетического метаболизма, такой как цикл лимонной кислоты (ТСА), пентозофосфатный каскад или липидный метаболизм.
Липиды удобно анализировать посредством жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (LC/MS; LC-MS/MS). Альтернативно можно применять газовую хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией. Предпочтительно, обращено-фазовую жидкостную хроматографию применяют для разделения липидов, которые затем идентифицируют посредством гибридного квадрупольного времяпролетного (Q/ToF) масс-спектрометра с возможностью проведения тандемной масс-спектрометрии (MS/MS).
Нелипидные метаболиты удобно анализировать посредством газовой хроматографии (GC), особенно полной двухмерной газовой хроматографии в сочетании с высокоскоростной времяпролетной масс-спектрометрией (GCxGC-TOF).
Липиды в общих чертах определены как биологические вещества, которые в целом являются гидрофобными по природе и во многих случаях растворимыми в органических растворителях. Липиды являются важными составными элементами в клеточных мембранах и митохондриях, и они играют значительную роль в транспорте и хранении энергии. Ацилглицерины составляют большинство липидов в организме. Диацилглицерины, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин являются важными веществами, включенными в основные пути биосинтеза триацилглицеринов и фосфоглицеринов и в метаболизм глицерофосфолипидов. Церамид синтезируется из серина и он является сочетанием сложного аминоспирта сфингозина и жирной кислоты. Когда церамиды взаимодействуют с фосфатидилхолином, они образуют сфингомиелин плюс диацилглицерин. Церамиды могут также взаимодействовать с сахарами с образованием гликосфинголипидов.
in vivo
in vitro
Предполагают, что высокая концентрация лизофосфатидилхолинов (ЛизоФХ) нарушает барьерную функцию слизистой и увеличивает желудочно-кишечную проницаемость  и . Кроме того, ЛизоФХ также ассоциировали с сосудистым воспалением, эндотелиальной дисфункцией и коронарным атеросклерозом, предполагая, что ЛизоФХ может также играть роль в воспалении слизистой трудно различимого типа.
В целях всесторонней классификации, “липиды” можно определить как гидрофобные или амфифатические небольшие молекулы, которые могут образовываться полностью или частично в результате карбанион-основанных конденсаций сложных тиоэфиров (жирные кислоты, поликетиды и т.д., и/или посредством карбанион-основанных конденсаций изопреновых единиц (пренолы, стерины и т.д.). Они могут быть дополнительно разделены на следующие восемь категорий: жирные кислоты, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стериновые липиды, фенольные липиды, липидосахара и поликетиды (Fahy, E., Subramaniam, S.,Brown, H.A, Glass, C.K., Merrill Jr., A.H., Murphy, R.C., Raetz, C.R.H., Russell, D.W., Seyama, Y., Shaw, W., Shimizu, T., Spener, F., van Meer, G., Van Nieuwenhze, M.S., White, S., Witztum, J.L., Dennis, E.A., A comprehensive classification system for lipids, Journal of Lipid Research, 2005 46:839-861).
Предпочтительно, пробиотики используют для улучшения липидного профиля, включающего глицеролипиды, глицерофосфолипиды и/или сфинголипиды. Глицеролипиды предпочтительно представляют собой триацилглицерины (ТГ) и диацилглицерины (ДГ), а глицерофосфолипиды предпочтительно представляют собой лизофосфолипиды, такие как лизофосфатидилхолин (ЛизоФХ) и лизофосфатидилэтаноламин (ЛизоФЭ). Сфинголипиды предпочтительно представляют собой те, которые принимают участие в пути церамид/сфингомиелин, такие как церамиды (Цер) и гликосфинголипиды (ГликоСЛ). Липидный профиль предпочтительно содержит по меньшей мере один из указанных липидов.
Когда обнаружено, что нарушение или заболевание ассоциировано с патологическим метаболическим профилем, таким как патологический липидный профиль, нарушение или заболевание могут подвергаться лечению или профилактике посредством введения соответствующих пробиотиков в количестве, достаточном для нормализации профиля. Нарушения или заболевания предпочтительно выбирают из группы, состоящей из воспаления слизистой оболочки, нарушений проницаемости кишечника, воспалительного заболевания кишечника (IBD), синдрома раздраженного кишечника (IBS), окислительного стресса, боли в брюшной полости и других желудочно-кишечных нарушений.
В настоящем исследовании было обнаружено, что уровни липидов увеличиваются у пациентов с IBS. Наиболее значительную повышенную регуляцию наблюдали для провоспалительных лизофосфатидилхолинов. Другими липидными группами, которые значительно повышенно регулировались у пациентов с IBS являлись гликосфинголипиды, ди- и триацилглицерины и липотоксические церамиды. Таким образом, можно сделать вывод, что слизистая при IBS характеризуется выраженным провоспалительным и липотоксическим метаболическим профилем, особенно, с возрастанием некоторых липидных видов, таких как лизофосфолипиды и церамиды. Пробиотики являются особенно пригодными для пониженной регуляции количества ЛизоФХ и церамида.
В дополнение к различиям, обнаруженным в липидных уровнях между образцами от пациентов с IBS и контролями, глобальный анализ нелипидных метаболитов показал дополнительные различия между двумя тестируемыми группами. Эти дополнительные различия наблюдали по основным метаболитам, таким как 2(3Н)-фуранон (также известный как лактон), рибитол, гептан, L-манноза, креатинин, додекан, декановая кислота (также известная как каприновая кислота), додекановая кислота (также известная как лауриновая кислота), н-бутиламин, D-рибоза, глюкопираноза, азелаиновая кислота и адипиновая кислота, все из которых участвуют в общих биохимических каскадах реакций в клетках.
Микроорганизм может именоваться как “пробиотик”, если он по существу удовлетворяет следующим требованиям: он остается жизнеспособным в предъявляемых условиях, преобладающих в пищеварительном тракте (низкое pH желудка, кислоты пищеварительной системы, и т.д.); он прикрепляется к стенкам кишечника; он метаболизирует в кишечнике; он является технологически применимым (выдерживает обработку); он проявляет клинически протестированные и изложенные оздоравливающие эффекты; и он является безопасным для потребления (Lee, Y- K and Salminen, S., The coming of age of probiotics, Trends Food Sci Tech-nol, 1995, 6: 241-245). Пробиотики включают как эукариотические, так и прокариотические организмы. Наиболее известными пробиотиками являются бактерии, особенно, молочно-кислые бактерии. Пробиотики для применения в изобретении предпочтительно выбирают из группы, состоящей из молочно-кислых бактерий, пропионибактерий, бифидобактерий, лактококков, энтерококков, стрептококков, дрожжей и их любых сочетаний. В особенности, пробиотик принадлежит к роду Lactobacillus, предпочтительно к виду Lactobacillus rhamnosus, и наиболее предпочтительно он представляет собой Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (АТСС 53103), который описан, например, в патенте США 5032399 или Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061), который описан, например, в патенте США 5378458.
Пробиотики предпочтительно вводят в виде композиции для перорального приема, содержащей метаболически активные, т.е. живые и/или лиофилизированные или нежизнеспособные убитые нагреванием, облученные или лизированные пробиотические организмы.
Пробиотическая композиция, описанная здесь, может быть введена перорально как таковая, т.е. в форме таблетки, капсулы или порошка. Дополнительно, пробиотическая композиция может быть введена перорально как пища или питательный продукт, такой как молоко или ферментированный молочный продукт на основе сыворотки или в виде фармацевтического продукта. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения, композиция представляет собой съедобный продукт, такой как молочный продукт, напиток, сок, суп или детское питание.
Пробиотик может необязательно быть объединен с по меньшей мере одним пригодным пребиотическим соединением. “Пребиотик” обычно представляет собой неусваиваемый углевод, такой как олиго- или полисахарид или спиртосахар, который не разрушается или всасывается в верхней части пищеварительного тракта. Известные промышленно применяемые пребиотики включают инулин, фрукто-олигосахариды, олигофруктозу или галакто-олигосахариды.
Подразумевается, что термин “съедобный продукт” охватывает все потребляемые продукты, особенно пищевые продукты, и он может быть твердым, желеобразным или жидким. Этот термин охватывает как готовые продукты, так и продукты, которые производят посредством применения пробиотической композиции в качестве только закваски или в сочетании с общепринятыми заквасками или другими пробиотиками. Пищевые продукты могут, например, являться продуктами молочной промышленности или промышленности по производству напитков. Альтернативно, он может представлять собой природный продукт.
В настоящем изобретении “молочный продукт” означает любой жидкий или полужидкий молочный или на основе сыворотки продукт, имеющий переменное содержание жира. Молочный продукт может представлять собой, например, коровье молоко, козье молоко, овечье молоко, обезжиренное молоко, цельное молоко, молоко, рекомбинированное из порошкового молока, и сыворотку без какой-либо переработки или переработанный продукт, такой как йогурт, простокваша, творог, кислое молоко, кислое цельное молоко, кефир, другой кисло-молочный продукт, такой как вили (кислое молоко), заполнение пищевых батончиков и т.д. Еще одна важная группа включает молочные напитки, такие как напитки из сыворотки, ферментированные молочные смеси, сгущенное молоко, детское молочко или молочная смесь для младенцев; мороженое; молокосодержащая пища, такая как конфеты.
В одном варианте осуществления изобретения пробиотическая композиция по изобретению представляет собой ферментированный молочный продукт, или ее применяют при получении ферментированного молочного продукта. Пробиотическая композиция по изобретению и закваска, если она присутствует, используют в сбалансированной пропорции по отношению друг к другу для получения желательного эффекта на полный метаболический профиль.
Продукты на основе молока, описанные выше, могут применяться как таковые для достижения желательного эффекта. Указанные продукты могут также быть сконцентрированы и использованы в качестве ингредиентов. Дополнительно, продукты могут также быть высушены и использованы в виде порошка или лиофилизатов. Продукты могут также использоваться в виде капсул, пилюль или таблеток. Продукты могут также использоваться при получении функциональных пищевых продуктов, оздоравливающих и профилактических съедобных продуктов, или других соответствующих продуктов. Они могут также являться кормом для животных. Возможные формы представляют собой капсулы, пилюли или таблетки, например, производимые в общепринятых процессах, применяемых для получения такого продукта, например, в фармацевтической промышленности. Таким образом, форма каждого пищевого продукта, пищевого материала и/или фармацевтических продуктов и корма для животных не ограничены конкретно.
Пробиотическая композиция и продукты, описанные здесь, главным образом, являются пригодными для применения на взрослых людях и детях. Положительные эффекты продуктов являются также благоприятными для животных, особенно, домашних животных и продуктивных животных. Примеры таких животных включают собак, кошек, кроликов, лошадей, коров, свиней, коз, овец и домашнюю птицу. Термин “пациент”, как использован здесь, таким образом, включает как людей, так и животных.
Пробиотики вводят в количестве, достаточном для улучшения метаболического профиля у пациента. Биологически эффективные количества пробиотиков были ранее описаны. “Патологический метаболический профиль”, такой как “патологический липидный профиль” представляет собой профиль, который существенно отличается от профиля для здоровых контролей. Патологический метаболический профиль может содержать повышенное или пониженное количество одного или нескольких метаболитов, например, липидов, по сравнению с контролями. Эффективное количество пробиотика представляет собой количество, которое нормализует метаболический профиль посредством повышающей или понижающей регуляции патологического метаболита, например, липидных уровней. Пробиотики особенно эффективны при понижающей регуляции ЛизоФХ и церамида, посредством чего они контролируют, сдерживают, нормализуют, предотвращают, облегчают и/или смягчают генерацию симптома при IBS, который ассоциирован с патологическим липидным профилем.
Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Примеры не должны рассматриваться как ограничивающие формулу изобретения каким бы ни было образом.
Пример 1
Метаболомическое профилирование биопсийных проб слизистых оболочек
Шестнадцать взрослых пациентов с IBS (средний возраст 42 года, СО 15; 6 мужчин), соответствующие римским критериям II (Thompson, W.G., Longstreth, G.F., Drossman, D.A., Heaton, K. W., Irvine, EJ, Mϋller-Lissner, S.A., Gut, 1999,45 Suppl 2:43-7), и не страдающие органическими заболеваниями кишечника были набраны для участия в исследовании. Девять здоровых пациентов (средний возраст 49 лет, СО 14; 4 мужчин), не страдающие органическими заболеваниями кишечника или лишенные желудочно-кишечных симптомов, соответствующих IBS, и подвергнутые колоноскопии по клиническим причинам были набраны в качестве контролей. Критериями включения для всех пациентов являлись: возраст между 20 и 65 годами; нормальный анализ крови (эритроциты, гемоглобин, гематокрит, MCV, MCH, MCHC, тромбоциты, лейкоциты), в пределах интервала эталонных значений для сывороточного креатинина, ALT и ALP и нормальная гистология кишечника, по оценке опытного патоморфолога. Пациентов исключали, если в их истории болезни были основная или осложненная желудочно-кишечная хирургическая операция, тяжелый эндометриоз, осложненные спайки брюшной полости, злокачественные опухоли, беременность или период лактации или они принимали антимикробные вещества во время предыдущего месяца. Пациенты с непереносимостью лактозы были допущены для участия, если они следовали непрерывной диете с низким содержанием лактозы или безлактозной диете.
Сбор и приготовление образцов
3
Биопсийные пробы слизистой (средняя масса 5,2 мг/образец; СО 1,5) из восходящей ободочной кишки получали от каждого пациента во время колоноскопии после очистки кишечника. Образцы немедленно замораживали и переносили в -20°C. Образцы далее перемещали в -70°C до востребования на анализ. Для липидомики образцы взвешивали в пробирках Эппендорфа и добавляли к ним 10 мкл 0,9% хлорида натрия и 10 мкл смеси внутренних стандартов (11 липидных компонентов, 0,1 мкг каждый). Образцы экстрагировали 100 мкл смеси хлороформ:метанол (2:1; 2 мин перемешивания при встряхивании, время экстракции 2 ч) и центрифугировали (10000 об/мин, 3 мин). Из нижней органической фазы в пузырьки отбирали аликвоты по 60 мкл и добавляли 10 мкл стандартной смеси, содержащей 3 меченых липидных компонента. Для нелипидных соединений, образцы взвешивали в пробирках Эппендорфа и добавляли к ним 10 мкл 1000 чнм (мг/мл) меченой пальмитиновой кислоты (16:0-16,16,16d) в качестве внутреннего стандарта. Образцы экстрагировали 500 мкл метанола (2 мин перемешивания при встряхивании, время экстракции 0,5 ч) и центрифугировали (10000 об/мин, 3 мин). Отделенные супернатанты упаривали досуха в атмосфере азота и остатки дериватизировали 2% метоксиамина HCl в пиридине (MOX; 25 мкл, 90 мин при 30°C) N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамидом (MSTFA; 50 мкл, 30 мин при 37°С). Все образцы дублировали для анализа.
Анализ липидов посредством UPLC/MS.
4
4
Характеризацию липидных молекулярных видов в слизистой толстой кишки осуществляли посредством липидомической стратегии, используя жидкостную хроматографию сверхвысокого разрешения в сочетании с масс-спектрометрией (UPLC/MS). Колонка (50°С) представляла собой Acquity UPLC™ BEH C18 10 × 50 мм с частицами 1,7 мкм. Система растворителей включала А. особо чистая вода (1% 1М NHAc, 0,1% НСООН) и В. Смесь ацетонитрил/изопропанол (5:2, 1% 1М NHAc, 0,1% НСООН) категории чистоты LC/MS. Градиент стартовал от 65% А/35% В, достигал 100% В за 6 мин и оставался там в течение следующих 7 мин. Перед следующим запуском была стадия переуравновешивания в течение 5 мин. Скорость потока составляла 0,200 мл/мин и вводимое количество равнялось 1,0 мкл. Профилирование липидов осуществляли, используя режим ESI+ и данные собирали в диапазоне масс, составляющем 300-2000 m/z при продолжительности сканирования, равной 0,08 с.
Липиды идентифицировали, используя библиотеку внутренних стандартов или тандемную масс-спектрометрию. Нормализацию данных липидомики осуществляли следующим образом: все моноацильные липиды за исключением сложных эфиров холестерина, такие как моноацилглицерины и моноацил-глицерофосфолипиды, калибровали с внутренним стандартом лизофосфатидилхолина (Лизо ФХ) (17:0/0:0), все диацильные липиды за исключением этаноламиновых фосфолипидов нормализовали с фосфатидилхолином (ЛизоФХ) (17:0/17:0), диацильные этаноламиновые фосфолипиды калибровали с фосфатидилэтаноламином (ЛизоФЭ) (17:0/17:0) и триацилглицерины и сложные эфиры холестерина с триацилглицерином ТГ (17:0/17:0/17:0). Другие молекулярные виды нормализовали посредством (ЛизоФХ) (17:0/0:0) для времени удерживания <310 с, (ЛизоФХ) (17:0/17:0) для времени удерживания между 310 с и 450 с, и ТГ (17:0/17:0/17:0) для более высоких времен удерживания. Данные обрабатывали, используя программное обеспечение MZmine версия 0.60 (Katajamaa, M., and Oresic, M., 2005, Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data, BMC Bioinformatics 2005: 6:179), и метаболиты идентифицировали, используя внутреннюю спектральную библиотеку или тандемную масс-спектрометрию.
Анализ нелипидных метаболитов посредством GCxGC-TOF
Широкий скрининг нелипидных метаболитов проводили посредством полной двухмерной газовой хроматографии в сочетании с высокоскоростной времяпролетной масс-спектрометрией (GCxGC-TOF). Используемый прибор представлял собой Lego Pegasus 4D GCxGC-TOF c Agilent 6890N GC и автоматическим дозатором CombiPAL. GC (газовую хроматографию) проводили в сплит-режиме (1:20), применяя гелий в качестве газа-носителя при постоянном потоке 1,5 мл/мин. Первая GC колонка представляла собой относительно неполярную колонку RTX-5, 10 м × 0,18 мм × 0,20 мкм, а вторая колонка представляла собой полярную BPX-50 1,10 м × 0,10 мм × 0,10 мкм. Температурная программа была следующей: начальная 50°C, 1 мин → 280°С, 7°С/мин, 1 мин. Вторичный термостат был установлен на +30°C выше температуры первичного термостата. Время разделения второго измерения было установлено на 3 секунды. Используемый массовый интервал составлял 40-600 аем и скорость сбора дана составляла 100 спектров/секунду. Коммерческую масс-спектральную библиотеку, Palisade Complete 600K применяли для идентификации метаболитов.
Статистика
Дискриминантный анализ с использованием частных наименьших квадратов (PLS/DA) применяли в качестве метода контролируемого моделирования с использованием алгоритма SIMPLS для расчета модели. Для разработки моделей применяли метод перекрестной проверки с примыкающими блоками и Q баллы. Были представлены отчеты по верхним загрузкам для скрытых переменных, ассоциированных с лекарственно-специфическими эффектами. Значения VIP (значение переменной в проекции) рассчитывали для идентификации наиболее важных молекулярных видов для выделения кластеров специфических групп. Многофакторный анализ осуществляли, используя Matlab version 7.2 (Mathworks, Inc.) и пакет PLS Toolbox version 4.0 Matlab (Eigenvector Research, Inc.). Один пациент с IBS, с резким статистическим отклонением был исключен из анализов после первоначальной проверки качества результатов. Однофакторные сравнения для индивидуальных метаболитов между группами проводили, применяя тест с критериями суммы рангов Уилкоксона.
Липидомный анализ
Применяя UPLC-MS, было обнаружено всего 651 липидный пик и 75 из них были идентифицированы, используя внутреннюю спектральную библиотеку, как описано Yetukuri et al. (Yetukuri, L., Katajamaa, M., Medina-Gomez, G., Seppanen-Laakso, T., Vidal-Puig, A., Oresic, M., Bioinformatics strategies for lipidomics analysis: characterization of obesity related hepatic steatosis, BMC Systems Biol., 2007, 1:12), или тандемную масс-спектрометрию с использованием UPLC/MS/MS.
PSD-DA анализ липидомных данных показал значительные различия в липидных профилях слизистой между пациентами с IBS и здоровыми контролями. В целом, липидные виды регулировались повышающим образом в биопсийных пробах от пациентов с IBS по сравнению с пробами от здоровых пациентов. Находящиеся в числе первых 15, липиды с наибольшими различиями между группами по кратному изменению представлены в Таблице 1. Существенная повышенная регуляция концентраций типичных метаболитов клеточной мембраны, лизофосфолипидов, у пациентов с IBS находится среди наиболее очевидных результатов. (Фиг.1А). Другими липидными группами, вносящими значительный вклад в разделение между пациентами с IBS и здоровыми контролями, были церамиды (Фиг.1В), гликосфинголипиды, а также ди- и триацилглицерины, которые все показали повышающую регуляцию в группе IBS.
Таблица 1. Находящиеся в числе первых 15, липиды с наибольшими и наиболее значительными различиями между пациентами с IBS и здоровыми контролями по концентрациям в слизистой оболочке, как измерено по Р-значению в тесте Уилкоксона (IBS/здоровые контроли). ЛизоФХ=лизофосфатидилхолин. ЛизоФЭ=лизофосфатидил-этаноламин; ТГ=триацилглицерин; ГликоСЛ=гликосфинголипид; ДГ=диацилглицерин; Цер=церамид.
Таблица 1
Наименование липида
Кратность (IBS/здоровый контроль)
p значение*
Цер (d18:1/24:1)
1,30
0,0013
Цер (d18:1/24:2)
1,37
0,000038
ДГ (36:2)
1,93
0,00000097
ГликоСЛ (m/z=1199,805)
1,88
0,00097
ГликоСЛ (m/z=1195,851)
1,95
0,00027
ЛизоФХ (16:0)
2,13
0,0058
ЛизоФХ (18:0)
1,87
0,00016
ЛизоФХ (18:1)
2,79
0,000023
ЛизоФЭ (18:1е)
2,41
0,000018
ТГ (46:5)
1,37
0,039
ТГ (48:5)
1,63
0,028
ТГ (48:6)
1,67
0,032
ТГ (49:3)
2,10
0,0089
ТГ (51:4)
1,55
0,037
ТГ (51:5)
1,80
0,016
* тест с критериями суммы рангов Уилкоксона
Метаболомический анализ
Широкий скрининг метаболитов посредством GCxGC-TOF привел в результате к нескольким сотням метаболитов слизистой, из которых 107 были идентифицированы и содержались в анализах. На основе анализа PLS/DA было неожиданно получено четкое разделение случаев IBS и контролей (Фигура 4). Как повышающую, так и понижающую регуляцию метаболитов наблюдали у пациентов с IBS по сравнению с контролями. Ведущие метаболиты, вносящие вклад в разделение между группами, представлены в Таблице 2.
Таблица 2. Основные нелипидные метаболиты, вносящие вклад в различение между пациентами с IBS (n=15) и здоровыми контролями (n=9). Разделение основано на анализе проекции важности переменной (VIP) с пороговым значением, равным 2.
Таблица 2
Метаболит
Кратность(IBS/здоровый контроль)
p значение*
2(3Н)-Фуранон
13,73
0,03
Рибитол
3,63
нс.
Гептан
2,87
0,02
L-Манноза
2,75
нс.
Креатинин
1,70
0,04
Додекан
1,47
нс.
Декановая кислота
1,26
нс.
Додекановая кислота
-1,46
нс.
н-Бутиламин
-1,47
0,01
d-Рибоза
-1,51
нс.
Глюкопираноза
-1,58
нс.
Азелаиновая кислота
-1,77
0,02
Адипиновая кислота
-2,69
0,0008
* тест с критериями суммы рангов Уилкоксона.нс. = несущественно
Метаболитом, вносящим наибольший вклад в разделение, был 2(3Н)-фуранон, циклический сложный эфир, обычно продуцируемый в биохимических каскадах реакций, который почти 14-кратно повышающе регулировался у пациентов с IBS по сравнению со здоровыми пациентами (p<0,05). Изменение кратности для других ведущих метаболитов было отчетливо ниже (изменение кратности от 3,7 до -2,7). Также другие основные метаболиты, часто обнаруживаемые в биохимических каскадах реакций, такие как вторичный мессенджер d-рибоза, находились среди основных факторов, вносящих вклад в разделение между случаями и контролями на основании анализа PLS/DA, несмотря на то, что результат в тесте с критериями суммы рангов Уилкоксона был несущественным. По сравнению со здоровыми контролями, было обнаружено, что органические, карбоновые кислоты подвергаются как незначительной понижающей регуляции (додекановая, азелаиновая и адипиновая кислоты), так и незначительной повышающей регуляции (декановая кислота) у пациентов с IBS.
Пример 2
Стимуляция in vitro
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (АТСС 53103) и Lactobacillus rhamnosus LC705 (DSM 7061) хранили в обезжиренном молоке при -70°C и пересевали три раза перед применением в экспериментах по стимуляции. Для экспериментов по стимуляции бактерии выращивали в MRS-среде до фазы логарифмического роста, и число бактериальных клеток определяли подсчетом в камере для подсчета Петрова-Хаузера.
Культура клеток
Человеческие макрофаги культивировали, как описано ранее (Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, L, Matikainen, S. (1999) Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway J. Immunol. 162, 7322-7329). Кратко, свежесобранные, с высоким содержанием лейкоцитов, лейкотромбоцитарные слои от здоровых доноров крови были получены от Службы по переливанию крови финского Красного Креста (Хельсинки). Человеческие периферические кровяные моноядерные клетки (РВМС) выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности над градиентом Фиколл-Пака (Pharmacia, Uppsala, Sweden). После промывки, клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), дополненной 0,6 мкг/мл пеницилина, 60 мкг/мл стептомицина, 2 мМ L-глутамина и 20 мМ HEPES. Для дифференциации моноцитов клеткам дали возможность прилипать в пластиковых шести-луночных плашках (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) в течение 1 ч при 37°С в RPMI (10 х 106 клеток/плашку). После инкубации, неприлипшие клетки удаляли, и лунки промывали дважды физиологическим раствором, забуференным фосфатом (PBS). Прилипшие клетки выращивали в течение 7 дней в среде для макрофагов без сыворотки (Life Technologies, Grand Island, NY), дополненной антибиотиками и рекомбинантным человеческим гранулоцитарным макрофаг-колониестимулирующим фактором (10 нг/мл; Leucomax, Schering-Plough, Innishannon, Ireland). Культивированные клетки показали типичную морфологию макрофагов и были свыше, чем на 90% CD14-положительными, как показал анализ методом проточной цитометрии.
Эксперименты по стимуляции
Стимуляции осуществляли с клетками, полученными от шести доноров крови. Эксперименты по стимуляции проводили в среде RPMI-1640 с живыми бактериями при соотношении макрофаг:клетка хозяина, равном 1:1. Клетки стимулировали бактериями от 6 до 24 часов. После 6 или 24 часов стимуляции, клетки собирали в метанол при -40°С, образцы 6 доноров отбирали и хранили при -70°С для дальнейшего анализа.
Образцы
Применяли UPLC/MS липидомическую платформу. Образцы кипятили в течение 3 минут при +80°С и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 5 мин при +4°С. Супернатант собирали и добавляли к нему четыре мл особо чистой воды для замораживания образцов для лиофилизации. Сухие образцы восстанавливали 50 мкл особо чистой воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 3 минут.
Подготовка образцов для липидомики.
В сгустки клеток в метаноле (600 мкл) вводили иглой 20 мкл внутреннего стандарта (10 липидных компонентов) и экстрагировали хлороформом (600 мкл, для получения соотношения хлороформ:метанол 1:1). Раствор хлорида натрия (0,9%, 100 мкл) применяли для разделения органической фазы. Отделенные липидные экстракты (3 мин, 1000 RPM) упаривали досуха и растворяли в 35 мкл смеси хлороформ:метанол (2:1) и добавляли аликвоты по 20 мкл еще одной стандартной смеси (3 меченых липидных соединения) перед метаболомическим профилированием.
Анализ липидов посредством UPLC/MS.
Характеризацию липидных молекулярных видов экстрактов бактериально-клеточных сгустков осуществляли посредством UPLC/MS, как описано в Примере 1, с исключением данных, собранных в массовом интервале m/z 300-1200 с продолжительностью сканирования, равной 0,2 с для липидного профилирования, используя режим ESI+.
Липидомический анализ
Посредством применения UPLC/MS всего было обнаружено 516 липидных пиков и большую степень изменений наблюдали у стимулированных клеток.
Эффект тестируемых бактериальных штаммов на ЛизоФХ после 6 или 24 ч стимуляции показан на Фигуре 2. Можно видеть, что оба штамма обладали способностью понижающе регулировать используемые количества ЛизоФХ и, что эффект усиливался, когда время стимуляции было увеличено.
Эффект тех же бактериальных штаммов на церамиды показан на Фиг.3. Оба штамма повышающе регулировали уровни тестируемых церамидов.