ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ТЕСТ-ПОЛОСКА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПРЕСС-МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧЕТЫРЕХ ГРУПП АНТИБИОТИКОВ В МОЛОКЕ С ИСКЛЮЧЕНИЕМ ВОЗМОЖНОЙ ФАЛЬСИФИКАЦИИ ОБРАЗЦА

Область техники
Полезная модель относится к биотехнологии, аналитической биохимии и биохимии пищевых продуктов, конкретно к тест-полоске для иммуноанализа антибиотиков в молоке или молочных продуктах и может быть использована для контроля качества продуктов животноводства.
Уровень техники
В настоящее время антибиотики широко используются не только для борьбы с инфекционными заболеваниями человека, но и как средство профилактики и лечения заболеваний животных. В связи с этим существенным фактором риска становится поступление антибиотиков в организм человека с продуктами питания, которое может вызывать ряд нежелательных эффектов: дисбактериозы, развитие устойчивых форм микроорганизмов, аллергические реакции, подавление активности некоторых ферментов и т.д.
Для контроля содержания антибиотиков в продуктах питания предложены и используются различные аналитические методы как микробиологические, так и химические, иммунохимические. Так, в частности иммунохроматографический анализ нашел широкое распространение для контроля качества пищевых и кормовых продуктов (тест-системы на микотоксины, антибиотики, пестициды), в том числе для анализа антибиотиков в молоке и молочных продуктах. Поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора.
Из уровня техники известны способы определения отдельных групп антибиотиков в молоке (Berlina AN et al/ Quantum dot-based lateral flow immunoassay for detection of chloramphenicol in milk/ Anal Bioanal Chem. 2013.405(14):4997-5000. doi: 10.1007/s00216-013-6876-3; N. A. Taranova et al/ Highly Sensitive Immunochromatographic Identification of Tetracycline Antibiotics in Milk/ Int J Anal Chem. 2015; 2015: 347621. doi: 10.1155/2015/347621; Byzova NA/ Immunochromatographic technique for express determination of ampicillin in milk and dairy products/ Prikl Biokhim Mikrobiol. 2011.47(6):685-93.).
Из уровня техники известен тест "4sensor" (экспресс-тест «4SENSOR KIT060», Бельгия) для определения содержания четырёх групп антибиотиков в молоке. Данный экспресс-тест позволяет определить наличие хлорамфеникола, стрептомицина, тетрациклинов и бета-лактамов в молоке. Каждая испытательная линия соответствует одному из антибиотиков. Одна упаковка содержит 96 тест-полосок. Процедура измерения занимает 10 минут. Основными недостатками теста являются необходимость предварительной подготовки проб молока и смеси антител, инкубации в термостате, потребность в расходных материалах и специальных условиях для проведения исследования.
Из уровня техники также известна тест-полоска для определения антибиотиков и способ иммунохроматографического определения антибиотиков в молоке и молочных продуктов RU2406090 (дата публикации 10.12.2010). Тест-полоска согласно данному изобретению позволяет определить лишь один тип антибиотика за один эксперимент, а способ, описанный в данном документе, предназначен для определения лишь трёх групп антибиотиков их четырёх регламентированных ГОСТом для молочных продуктов, причем одна тест-полоска определяет только одну группу антибиотиков, т.е. для трех групп антибиотиков требуется три разные тест-полоски.
Раскрытие полезной модели
Задачей заявленной полезной модели является разработка иммунохроматографической тест-полоски для одновременного определения четырех групп антибиотиков, а также позволяющей проводить определение наличия или отсутствия казеина в анализируемом образце молока или молочных продуктах.
Техническим результатом заявленной полезной модели является сокращение времени (в течение 5-10 минут) одновременного определения четырех групп антибиотиков - β-лактамы, тетрациклины, стрептомицины и производные левомицетина, а также выявление специфического белка молока – казеина, в одном экспресс-анализе при комнатной температуре без какой-либо предварительной пробоподготовки исследуемого образца для проведения анализа или использования какого бы то ни было дополнительного оборудования во внелабораторных условиях.
Указанный технический результат достигается за счет иммунохроматографической тест-полоски для одновременного определения четырех групп антибиотиков и казеина в молоке или молочных продуктах, представляющая собой конструкцию, выполненную из подложки с последовательно закрепленными на её поверхности поочередно в ряд четырьмя мембранами,
первая из который фильтрующая мембрана для нанесения исследуемого образца,
вторая из которых конъюгатная мембрана с нанесенными на её поверхность компонентами, специфично связывающие антибиотики или казеин,
третья из которых рабочая мембрана, поверхность которой включает контрольную область, тест-область для определения антибиотика группы β-лактамов, тест-область для определения антибиотика группы тетрациклинов, тест-область для определения антибиотика группы стрептомицинов, тест-область для определения антибиотика группы производных левомицетина, тест-область для определения казеина,
четвертая из которых адсорбирующая мембрана.
В частных вариантах полезной модели подложка выполнена из нитроцеллюлозы.
-9
В частных вариантах полезной модели специфические компоненты, нанесенные на конъюгатную мембрану, характеризуются аффинностью не менее 10 М к четырем группам антибиотиков и казеину.
В частных вариантах воплощения полезной модели специфический компонент конъюгирован с меткой.
В частных вариантах воплощения полезной модели метка представляет собой частицы коллоидного золота или квантовые точки с флуоресцентной индикацией, ферментативные метки.
В частных вариантах воплощения полезной модели специфический компонент представляет собой моно- или поликлональное антитело, компонент регулируемой системы экспрессии, активный фрагмент бактериальной рибосомы, продукт, полученный в результате фагового дисплея, аптамер на основе ДНК.
В частных вариантах воплощения полезной модели закрепление мембран на поверхности подложки осуществляется посредством склейки.
Таким образом, указанная тест-полоска позволяет реализовать широкий скрининг молока или молочных продуктов непосредственно на месте отбора проб с минимальной трудоемкостью.
Краткое описание чертежей
Полезная модель будет более понятной из описания, не имеющего ограничительного характера и приводимого со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых изображено:
Фигура 1. Блок-схема тест-полоски для иммунохроматографического анализа:
1 – подложка;
2 – образец для исследования;
3 – тестовая (рабочая) мембрана;
4- тест-области (тест-линии) для определения антибиотиков (всего 4 шт.);
5 – контрольная область (контрольная линия);
6 – конъюгатная мембрана;
7 – фильтрующая мембрана;
8 – адсорбирующая мембрана;
9 – тест область (тест-линия) для регистрации казеина.
Осуществление полезной модели
Термины и определения
Для лучшего понимания настоящей полезной модели ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем документе.
включает
включающий
В данном документе термины «» и «» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Тест-область/линия представляет собой область/линию на поверхности рабочей мембраны, в пределах которой иммобилизованы растворы конъюгата белка-носителя (БСА (бычий сывороточный альбумин) или белок А) с определяемым антигеном (антибиотики (4 группы) и казеин).
Контрольная область/линия представляет собой область/линию на поверхности рабочей мембраны, в пределах которой иммобилизованы из раствора антивидовые антитела овцы против мыши или белок А.
В настоящем документе неограничивающие примеры маркера, используемого для настоящей полезной модели, включают окрашенную частицу, фермент, радиоактивный изотоп и т.д., и предпочтительно использовать окрашенную частицу, которую можно визуально детектировать без какого-либо специального оборудования. Примеры окрашенной частицы включают металлические микрочастицы, такие как микрочастицы золота и платины, неметаллические частицы, латексные частицы и т.д., но не ограничены ими. Окрашенная частица может иметь любой размер при условии, что окрашенная частица имеет такой размер, что она может быть перемещена в нижнюю часть внутри пустот тест - полоски, но предпочтительно размер диаметра составляет от 1 нм до 10 мкм, более предпочтительно от 5 нм до 1 мкм, еще более предпочтительно от 10 до 100 нм.
В настоящем документе неограничивающие примеры материала, из которого может быть выполнена мембрана, включают нитроцеллюлозу, фильтровальную бумагу, стекловолокно, ткань, хлопок, смешанный сложный эфир нитрата целлюлозы, поливинилиденфторид, нейлон и другие.
Примеры реализации полезной модели.
Иммунохроматографическую тест-полоску согласно данной полезной модели можно получать известным способом с использованием коммерческих материалов. Так, в частности, для получения тест-полоски может быть использован набор мембран mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий мембраны для нанесения пробы FR1(0.6), а также мембрану под конъюгат PT-R5, рабочую мембрану CNPH90, адсорбирующую мембрану AP045. Склеивание тест-полоски может быть произведено последовательно: на нитроцеллюлозную подложку наклеивают поочередно четыре мембраны.
Иммунохроматографическая тест-полоска для одновременного определения четырех групп антибиотиков и казеина в молоке или молочных продуктах, представляет собой конструкцию (фигура 1), выполненную из подложки (1) с последовательно закрепленными на её поверхности поочередно в ряд четырьмя мембранами (7,6,3,8),
первая из который фильтрующая мембрана для нанесения исследуемого образца (7),
вторая из которых конъюгатная мембрана (6) с нанесенными на её поверхность компонентами, специфично связывающие антибиотики и казеин,
третья из которых рабочая мембрана (3), поверхность которой включает контрольную область (5), тест-область для определения антибиотика группы β-лактамов, тест-область для определения антибиотика группы тетрациклинов, тест-область для определения антибиотика группы стрептомицинов, тест-область для определения антибиотика группы производных левомицетина (4), тест-область для определения казеина (9),
четвертая из которых адсорбирующая мембрана (8).
Заявляемая полезная модель работает следующим образом. В исследуемый образец молока или молочного продукта (вид емкости с указанным образцом не имеет значения) погружают тест-полоску со стороны фильтрующей мембраны (нижний край) на 1-2 минуты не глубину не более, чем длина фильтрующей мембраны (альтернативно образец может быть нанесен с помощью пипетки на поверхность фильтрующей мембраны). Затем полоска укладывается в горизонтальное положение на любую поверхность. Через 5 минут проводится визуальная или фотометрическая (в том числе спектрофлуориметрическая) индикация результата исследования: в случае окрашивания 4 тестовых областей (линий) антибиотиков и контрольной области (линии) – делают вывод о том, что в исследуемом образце антибиотиков нет (в допустимой ГОСТом концентрации), при отсутствии окраски определенной тест-линии и наличии окраски контрольной линии - имеется примесь определенной группы антибиотиков в концентрации, превышающий допустимый уровень ГОСТом, при отсутствии окраски четырех тестовых линий для определения антибиотиков и наличии окраски контрольной линии - имеется примесь антибиотиков четырех разных групп в концентрациях, превышающих допустимый уровень ГОСТом. При сохранении окраски тест области (линии) на казеин можно утверждать о фальсификации образца (не является молоком или молочным продуктом), исчезновение окраски данной тест области (линии) говорит о молочном характере исследуемого образца. Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия антибиотиков и/или казеина в исследуемом образце. Контрольная линия является внутренним контролем работоспособности теста. Отсутствие контрольной полосы показывает, что тест-система неработоспособна. Для проведения описанного тестирования с помощью тест-полоски согласно данной полезной модели не требуется использование предварительного нагревания исследуемой пробы, поэтому тест может быть проведен при комнатной температуре.
Исследуемый образец (проба), потенциально содержащий антибиотики четырех групп, таких как β-лактамы, тетрациклины, стрептомицины и производных левомицетина в пределах концентраций, предусмотренных ГОСТ-32219-2013 и Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии N 28 от 13.02.2018, и/или казеин, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски (мультимембранный композит). При этом вначале происходит взаимодействие с частицами маркера (в частности, частицы коллоидного золота или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован специфический компонент, предназначенный для связывания с антибиотиками или казеином (конъюгатная мембрана). Затем фронт жидкости преодолевает рабочую (тестовую) зону, которая представляет собой рабочую мембраны с четырьмя тест-линиями для связывания антибиотиков, одной контрольной линией и линией для индикации казеина. Степень связывания маркера в тестовой зоне и, соответственно, интенсивность окрашивания тест-линии определяются концентрацией анализируемых соединений в пробе. Конкретные специфические компоненты для связывания антибиотиков и казеина, размерные характеристики мембран и маркеры, а также вид маркера подбираются отдельно в каждом случае (например, исходя из особенностей исследуемого образца) так, чтобы при их использовании пороговая концентрация антибиотика в пробе, при которой исчезает окрашивание аналитической полосы тест-линии, соответствовала контролируемой предельно допустимой концентрации данного антибиотика в пищевой продукции. На все исследование уходит 5-10 минут. В результате такого исследования одновременно можно определить, как наличие антибиотиков четырех групп, так и определить возможную фальсификацию молока или молочных продуктов – выявление специфического белка молока казеина. Не требуется специальная подготовка образца, дополнительное оборудование и специальная подготовка персонала.
Полезная модель была раскрыта выше со ссылкой на конкретные варианты её осуществления. Для специалистов могут быть очевидны и иные варианты осуществления полезной модели, не меняющие его сущности, как она раскрыта в настоящем описании. Соответственно, полезную модель следует считать ограниченным по объему только ниже следующей формулой полезной модели.