ИНЪЕЦИРУЕМАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВЫПАДЕНИЯ ВОЛОС ИЛИ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ВОЛОС
INJECTABLE COMPOSITION FOR PREVENTING HAIR LOSS OR STIMULATING HAIR GROWTH

Область техники
[1]   Настоящая заявка испрашивает приоритет и право пользования по заявке на выдачу патента Республики Корея № 10-2017-0014047, поданной в патентное ведомство Республики Корея 31 января 2017 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
[2]   Настоящее изобретение относится к инъецируемой композиции, содержащей кератин, для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
Уровень техники
[3]   Выпадение волос относится к состоянию, при котором в том месте, где обычно должны присутствовать волосы, волосы отсутствуют, при этом известно, что основной причиной служат генетические факторы. В недавнее время, вследствие загрязнения окружающей среды, европеизированных пищевых привычек, таких как прием пищевых продуктов быстрого приготовления, частое применение химической завивки и крашения, и неправильного ухода за кожей головы, а также повышение социального стресса, популяция с выпадением волос постепенно растет. Однако конкретная причина выпадения волос до сих пор не была определена. В недавнее время все больше и больше людей страдают от алопеции, а возрастная группа снижается.
[4]   Даже при лечении алопеции по-прежнему отсутствует явный эффект, существует несколько предписаний по приему, относящиеся к выпадению волос, таких как Синеунгьянгджиндан (Sineungyangjindan) в книге Донгуибогам (Donguibogam), и существуют способы массажа с помощью сезамового масла (сезама) в области выпадения волос, нанесения специального предписанного растительного лекарственного средства путем первичного осаждения, а также стимуляция конкретной акупунктурной точки, однако известно о наличии большого количества индивидуальных отличий при эффекте. В дополнение, по-прежнему отсутствуют сведения о новом лекарственном веществе, которое могло бы применяться в целом.
[5]   В качестве способа лечения алопеции из связанного уровня техники известен препарат, в котором используется женский гормон в качестве основного материала в отношении теории гормонов, однако было сообщено о возникновении воспалении кожи и побочных эффектах вследствие введения гормона, и в настоящее время его применение было прекращено. В качестве применяемого в настоящее время примера агента для роста волос имеется миноксидил (6-амино-1,2-дигидро-1-гидрокси-2-имино-4-феноксипиримидин) из патента США под регистрационным № 3,382,247 и финастерид от Merck, указанный в патенте США под регистрационным № 5,215,894, которые были впервые разработаны и применены для стимуляции кровотока, были известны пациентам, применяющим агент для роста волос, для того, чтобы обеспечить рост волос в качестве побочного эффекта, и затем были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в качестве сырьевого материала для роста волос, предназначенного для применения в качестве вспомогательного агента для роста волос.
[6]   Однако было сообщено, что миноксидил обеспечивает ощущение липкости кожи и имеет побочные эффекты, которые вызывают раздражение кожи, а финастерид в настоящее время использовался в качестве препарата для перорального введения, однако было сообщено о таких побочных эффектах, как сексуальная дисфункция, зависящих от его употребления, а также имеется побочный эффект, который следует рассматривать в точности относительно выпадения волос.
[7]   Таким образом, необходимо разработать новый терапевтический агент, который мог бы заменить существующий агент для роста волос и имел бы превосходный эффект профилактики выпадения волос и стимуляции роста волос.
[8]   Документы уровня техники
[9]   Патентный документ
[10]   Патентный документ 1 Патент США № 3,382,247
[11]   Патентный документ 2 Патент США № 5,215,894
Техническая проблема
[12]   Для решения проблем, авторами настоящего изобретения было подтверждено, что кератин может стимулировать рост волос и обеспечивать профилактику выпадения волос, при этом они продолжали поиски нового терапевтического агента, который мог быть заменить существующие агенты для роста волос, и, кроме того, было подтверждено, что при инъецировании кератина в кожную ткань, он был более эффективен при стимуляции роста волос или профилактики выпадения волос, чем при нанесении кератина на кожу, и, следовательно, авторы настоящего изобретения представили настоящее изобретение.
[13]   Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в представлении инъецируемой фармацевтической композиции, содержащей кератин, для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
Техническое решение
[14]   Для достижения цели, в соответствии с аспектом настоящего изобретения, представлена инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
[15]   В одном варианте реализации настоящего изобретения, кератин может представлять собой гидролизованный кератин или кератин, связанный с водорастворимым полимером.
[16]   Молекулярный вес гидролизованного кератина может составлять от 500 до 10000 дальтон.
[17]   Водорастворимым полимером может быть по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, полиэтиленгликоля (PEG), альгиновой кислоты, пектина, каррагенана, хондроитин сульфата, декстран сульфата, хитозана, полилизина, коллагена, желатина, карбоксиметил хитина, фибрина, декстрана, агароза, пуллулана, полиакриламида (PAAm), поли(N-изопропилакриламида) (P(NIPAAm-co-AAc)), поли(N-изопропилакриламид-ко-этилметакрилата) (P(NIPAAm-co-EMA)), поливинилацетата/поливинилового спирта (PVAc/PVA), поли(N-винилпирролидона) (PVP), поли(метил метакрилат-ко-гидроксиэтил метакрилата) (P(MMA-co-HEMA)), поли(полиэтиленгликоль-ко-пептида (P(PEG-со-пептид)), альгинат-g-(полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид) (альгинат-g-(PEOPPO-PEO)), поли(полимолочная кислота-ко-гликолевая кислота)-кo-серина) (P(PLGA-co-серин)), коллагенакрилата, альгинат-акрилата, поли(гидроксипропилметакриламид-g-пептида) (P (HPMA-g-пептид)), поли(гидроксиэтилметакрилата/матригеля) (P(HEMA/Матригель)), гиалуроновая кислота-g-N-изопропилакриламида (HA-g-NIPAAm), полиэтиленоксида (PEO), сополимера полиэтиленоксида-полипропилена (PEO-PPO, серии Плюроники), сополимера полиэтиленоксида-полимолочной кислоты (PEO-PLA), сополимера полиэтиленоксида-полимолочной гликолевой кислоты (PEO-PLGA), сополимера полиэтиленоксида-поликапролактона (PEO-PCL), простых алкиловых эфиров (серии Бридж), производных полиоксиэтиленового касторового масла (Кремофоры), простых полиоксиэтиленовых эфиров сорбита и жирной кислоты (серии Твин) и полиоксиэтилен стеаратов.
[18]   Кератин может стимулировать восстановление волос.
[19]   Фармацевтическая композиция может повышать уровень экспрессии по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из бета-катенина, Sox-9, Sox-2, щелочной фосфатазы, CD133, FGF7, FGF10, BMP6, P-кадгерина, E-кадгерина, MSX2, FOXN1 и CD10.
[20]   Фармацевтическая композиция может быть введена в дермальный слой или в подкожную ткань.
[21]   Фармацевтическая композиция может дополнительно включать усилитель проникновения.
[22]   Усилитель проникновения может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из сульфоксида, азона, пирролидона, жирных кислот, низших спиртов, имеющих от 1 до 4 атомов углерода, высших жирных спиртов, имеющих 6 или более атомов углерода, гликолей, мочевины, терпена, терпеноида и фосфолипида.
[23]   Гидролизованный кератин может быть приготовлен способом приготовления гидролизованного кератина, включающим S1) введение кератина в реакцию с гидролазой; и S2) удаление гидролазы.
[24]   Гидролазой может быть протеиназа-К.
[25]   Гидролаза может быть иммобилизована на гранулах.
[26]   Способ приготовления гидролизованного кератина может дополнительно включать S3) удаление активности гидролазы после этапа S2).
[Полезные эффекты]
[27]   Инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, в соответствии с настоящим изобретением, стимулирует рост волос и образование волосяных фолликулов.
[28]   Кроме того, когда инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, в соответствии с настоящим изобретением, инъецирована в кожную ткань, она является более эффективной для стимуляции роста волос или профилактики выпадения волосы, нежели при нанесении фармацевтической композиции на кожу.
[29]   Таким образом, фармацевтическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, может быть применена в качестве терапевтического агента для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
[Описание чертежей]
[30]   На фиг. 1 изображены данные, полученные ЯМР-анализом PEGилированного кератина.
[31]   На фиг. 2 представлена диаграмма, на которой изображен эффект роста волос по прошествии 2 недель после инъекции Примеров 1-6 мышам, которым удалили волосы.
[32]   На фиг. 3 представлена фотография, на которой изображена степень образования волосяных фолликулов путем инъекции Примеров 1-6 мышам, которым удалили волосы, и затем окрашивания мышей, которым произвели инъекцию, гематоксилином-эозином по прошествии 2 недель.
[33]   На фиг. 4 представлен график, на котором изображено количество волосяных фолликулов, образовавшихся на каждой стадии роста волос по прошествии 2 недель после инъекции Примеров 1-6 мышам, которым удалили волосы.
[34]   На фиг. 5 представлен график, на котором изображены размеры волосяных фолликулов, образовавшихся по прошествии 2 недель после инъекции Примеров 1-6 мышам, которым удалили волосы.
[35]   На фиг. 6 представлена фотография результата анализа SDS-PAGE для подтверждения возможности приготовления гидролизованного кератина, молекулярный вес которого отличается от натурального кератина.
[36]   На фиг. 7 представлена диаграмма подтверждения того, что клеточная пролиферация ингибируется, когда клетки дермального гребня человека обработаны кератином.
[37]   На фиг. 8 представлена фотография, подтверждающая то, что кератин прикреплен к клеточной поверхности, путем анализа взаимодействия с клетками, а затем то, что образование клеточного агрегата индуцируется кератином, когда клетки дермального гребня человека обработаны кератином.
[38]   На фиг. 9 представлена диаграмма, на которой изображено, что экспрессия мРНК, ассоциированная с клеточной пролиферацией, подавляется, а экспрессия мРНК, ассоциированная с миграцией клеток, индукция клеточных агрегатов и синтез внешнеклеточной матрицы увеличиваются, когда клетки дермального гребня человека обработаны кератином.
[39]   На фиг. 10 представлена диаграмма, на которой изображено, что молекулярная экспрессия FGF7, FGF10 и BMP6, которые известны в качестве факторов, индуцирующих рост волос, увеличивается, когда клетки дермального гребня человека обработаны кератином.
[40]   На фиг. 11 представлен график, подтверждающий то, что экспрессия бета-катенина и P-кадгерина в качестве факторов, связанных с миграцией клеток и дифференциацией в клетки матрицы, увеличивается, а экспрессия CD34 в качестве молекулы, снижающей экспрессию при дифференциации, уменьшается, когда клетки наружного корневого влагалища человека обработаны кератином.
[41]   На фиг. 12 представлен график, подтверждающий то, что генная экспрессия MSX2, FOXN1 и CD10 в качестве факторов, связанных с дифференциацией в клетки матрицы, увеличивается, а генная экспрессия KRT5 и ITGA6 в качестве молекул со сниженной экспрессией при дифференциации уменьшается, когда клетки наружного корневого влагалища человека обработаны кератином.
[42]   На фиг. 13 представлена диаграмма, подтверждающая то, что экспрессия молекулы бета-катенина в качестве фактора, связанного с миграцией клеток и активностью клона, а также молекулы Sox-9, вовлеченной в стволовость, увеличивается, когда клетки наружного корневого влагалища человека обработаны гидролизованным кератином.
[43]   На фиг. 14 представлен график, на котором изображено, что экспрессия гена Sox-9 и гена бета-катенина, вовлеченных в стволовость, увеличивается, когда клетки наружного корневого влагалища человека обработаны гидролизованным кератином.
[44]   На фиг. 15 представлен график, подтверждающий то, что молекула бета-катенина экспрессируется в четыре или более раз, когда клетки наружного корневого влагалища человека обработаны гидролизованным кератином.
[45]   На фиг. 16 представлена диаграмма, подтверждающая то, что образование клеточных агрегатов, вовлеченных в восстановление волос и стволовость, увеличивается в пять или более раз, когда клетки дермального гребня человека обработаны гидролизованным кератином.
[46]   На фиг. 17 представлена фотография, подтверждающая то, что активность гидролазы (щелочной фосфатазы), посредством которой экспрессируются клетки щелочной фосфатазы, увеличивается, когда клетки дермального гребня человека обработаны гидролизованным кератином.
[47]   На фиг. 18 представлена фотография, подтверждающая то, что экспрессия молекул бета-катенина, Sox-2, гидролазы (щелочной фосфатазы, ALPase), а также CD133, FGF-7 и FGF-10, в качестве факторов восстановления волос и стволовости увеличивается, когда клетки дермального гребня человека обработаны гидролизованным кератином.
[Вариант реализации изобретения]
[48]   В настоящем изобретении представлена инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
[49]   Кератин может быть натуральным кератином, входящим в состав волос, шерсти, перьев, рога, ногтей, подковы или подобного, а также он может быть кератином, находящимся в коже, нервной ткани или подобном.
[50]   В дополнение, кератин включает аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, аргинин и цистин, и, в частности, может иметь высокое содержание цистина.
[51]   Кератин может быть любым коммерчески доступным кератином, может быть обработан для обеспечения растворимости в воде или водорастворимом растворителе, и, предпочтительно, может представлять собой кератин, полученный из волос человека, а его молекулярный вес может составлять от 40000 до 70000 дальтон.
[52]   Кератин может представлять собой гидролизованный кератин или кератин, связанный с водорастворимым полимером.
[53]   Гидролизованнйы кератин представляет собой белок, который проявляет растворимость в воде путем разложения нерастворимого натурального кератина, при этом сохраняя свойства кератина, и может быть использован в комбинации с полученными из кератина пептидами. Гидролизованный кератин может быть приготовлен путем гидролиза кератина с кислотой, щелочью, кислородом или гидролазой, но без ограничения ими, и может быть получен общим способом приготовления гидролизованного кератина с молекулярным весом от 500 до 10000 дальтон из натурального кератина.
[54]   Гидролизованный кератин может быть приготовлен способом приготовления гидролизованного кератина, включающим S1) введение кератина в реакцию с гидролазой; и S2) удаление гидролазы.
[55]   Этап S1) представляет собой этап приготовления гидролизованного кератина из кератина с использованием гидролазы.
[56]   Здесь, гидролаза классифицируется на 9 групп по их целевым воздействиям, поскольку группы классифицированы на ферменты, которые катализируют реакции гидролиза, когда ферменты классифицированы систематически.
[57]   Гидролаза представляет собой фермент, который может гидролизовать натуральный кератин, поскольку кератин является белком, и, предпочтительно, фермент, который воздействует на пептидные связи. В частности, фермент, который воздействует на пептидные связи, может представлять собой любой, выбранный из протеаз, включающих лейциламинопептидазу, карбоксипептидазу, пепсин, трипсин и химотрипсин. Более предпочтительно, фермент представляет собой протеиназу-К, но не ограничен ею.
[58]   В способе приготовления гидролизованного кератина, если этап S1) отсутствует или не выполняется должным образом, выход гидролизованного кератина, проявляющего эффект профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос, может быть недостаточен.
[59]   Затем, этап S2) представляет собой этап получения только гидролизованного кератина из смеси гидролазы и гидролизованного кератина. Гидролаза может быть иммобилизована на гранулах. Гидролаза может быть отделена от гидролизованного кератина по физическим/химическим свойствам гранулы с использованием разницы магнетизма гранулы, разницы веса, разницы адсорбции или подобного.
[60]   Гранулы могут быть по меньшей мере одним выбранным из группы, состоящей из поли-L-молочной кислоты (PLLA), сополимера полимолочной кислоты-гликолевой кислоты (PLGA), погликолевой кислоты (PGA), полиуретана (PU), полиметилметакрилата (PMMA), полиэтилена (PE) и ферромагнетита, однако настоящее изобретение ими не ограничено. В частности, гранулы могут представлять собой гранулы агарозы.
[61]   В способе приготовления гидролизованного кератина, если этап S2) отсутствует или не выполняется должным образом, чистота только гидролизованного кератина, проявляющего эффект профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос, может быть понижена.
[62]   В дополнение, способ приготовления гидролизованного кератина может дополнительно включать S3) удаление активности гидролазы после этапа S2).
[63]   Этап S3) предназначен для остановки реакции гидролиза кератина путем удаления активности гидролазы и может быть оставлен при высокой температуре на несколько часов, так что гидролаза не вступает в реакцию с кератином.
[64]   В способе приготовления гидролизованного кератина, если этап S3) включен, чистота гидролизованного кератина может быть увеличена и может быть получен гидролизованный кератин с равномерным молекулярным весом.
[65]   Например, гидролизованный кератин может быть получен путем смешивания волос человека со смесью хлороформа и метанола в соотношении 2:1 для удаления липида, перемешивания смеси в 2% растворе перуксусной кислоты на протяжении 12 часов и последующего добавления 5% 2-меркапроэтанола, 5 моль мочевины, 2,6 моль тиомочевины и 25 ммоль трис-HCl (pH 8,5), а также реакции в течение от 50 до 72 часов, однако настоящее изобретение этим не ограничено.
[66]   В настоящем изобретении водорастворимым полимером может быть по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из гиалуроновой кислоты, полиэтиленгликоля (PEG), альгиновой кислоты, пектина, каррагенана, хондроитин сульфата, декстран сульфата, хитозана, полилизина, коллагена, желатина, карбоксиметил хитина, фибрина, декстрана, агароза, пуллулана, полиакриламида (PAAm), поли(N-изопропилакриламида) (P(NIPAAm-co-AAc)), поли(N-изопропилакриламид-ко-этилметакрилата) (P(NIPAAm-co-EMA)), поливинилацетата/поливинилового спирта (PVAc/PVA), поли(N-винилпирролидона) (PVP), поли(метил метакрилат-ко-гидроксиэтил метакрилата) (P(MMA-co-HEMA)), поли(полиэтиленгликоль-ко-пептида (P(PEG-со-пептид)), альгинат-g-(полиэтиленоксид-полипропиленоксид-полиэтиленоксид) (альгинат-g-(PEOPPO-PEO)), поли(полимолочная кислота-ко-гликолевая кислота)-кo-серина) (P(PLGA-co-серин)), коллагенакрилата, альгинат-акрилата, поли(гидроксипропилметакриламид-g-пептида) (P (HPMA-g-пептид)), поли(гидроксиэтилметакрилата/матригеля) (P(HEMA/Матригель)), гиалуроновая кислота-g-N-изопропилакриламида (HA-g-NIPAAm), полиэтиленоксида (PEO), сополимера полиэтиленоксида-полипропилена (PEO-PPO, серии Плюроники), сополимера полиэтиленоксида-полимолочной кислоты (PEO-PLA), сополимера полиэтиленоксида-полимолочной гликолевой кислоты (PEO-PLGA), сополимера полиэтиленоксида-поликапролактона (PEO-PCL), простых алкиловых эфиров (серии Бридж), производных полиоксиэтиленового касторового масла (Кремофоры), простых полиоксиэтиленовых эфиров сорбита и жирной кислоты (серии Твин) и полиоксиэтилен стеаратов. Предпочтительно, водорастворимым полимером может быть полиэтиленгликоль или гиалуроновая кислота, однако настоящее изобретение этим не ограничено.
[67]   В настоящем изобретении полиэтиленгликоль может представлять собой, например, O-метил-O’-сукцинил полиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль с двухосновной кислотой, α,ω-бис(2-карбоксиэтил-полиэтиленгликоль, O,O’-бис(2-бромэтил) полиэтиленгликоль, O,O’-бис(2-хлорэтил) полиэтиленгликоль, полиэтиленгликоль диметилат, метоксиполиэтиленгликоль с уксусной кислотой, O-[2-(3-сукциниламино)этил]-O’-метил-полиэтиленгликоль, O-(2-бромэтил)-O’-метилполиэтиленгликоль, O-(2-хлорэтил)-O’-метилполиэтиленгликоль, мезилат монометилового простого эфира полиэтиленгликоля, альдегид-функционализированный полиэтиленгликоль, функционализированный глицидиловым эфиром полиэтиленгликоль, нитрофенилкарбонат-функционализированный полиэтиленгликоль, мезил-функционализированный полиэтиленгликоль или тозил-функционализированный полиэтиленгликоль, и, предпочтительно, O-метил-O’-сукцинил полиэтиленгликоль.
[68]   Молекулярный вес водорастворимого полимера может составлять от 1000 Да до 4000 Да, предпочтительно, от 2000 Да до 3000 Да. В качестве предпочтительного примера, может быть использована гиалуроновая кислота с молекулярным весом от 1000 Да до 4000 Да и полиэтиленгликоль с молекулярным весом от 1000 Да до 2000 Да.
[69]   Кератин может стимулировать восстановление волос.
[70]   В частности, кератин может индуцировать рост клеток наружного корневого влагалища или клеток дермального гребня человека, а также агрегацию клеток, для стимуляции восстановления волос.
[71]   «Стимуляция роста волос», указанная в настоящем изобретении, означает стимуляцию «роста волоса» и/или «восстановления волос», «восстановление волос» означает индуцирование роста клеток наружного корневого влагалища или клеток дермального гребня человека, или агрегацию клеток, для окончательного предотвращения простого выпадения волос, и означает индуцирование образования волосяных фолликулов путем стимуляции образования волосяных фолликулов на стадии анагена, которая является начальной стадией роста волос, для восстановления волос. Кроме того, «стимуляция роста волос» включает увеличение факторов экспрессии, вовлеченных в миграцию клеток наружного корневого влагалища человека и активность клонов или стволовость.
[72]   В дополнение, фармацевтическая композиция, в соответствии с настоящим изобретением, может увеличивать уровни экспрессии генов для индуцирования восстановления волос и роста волос, содержащихся в клетках наружного корневого влагалища и клетках дермального гребня человека.
[73]   Ген может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из бета-катенина, Sox-9, Sox-2, щелочной фосфатазы, CD133, FGF7, FGF10, BMP6, P-кадгерина, E-кадгерина, MSX2, FOXN1 и CD10.
[74]   Бета-катенин означает вещество для сигналинга, которое принимает сигнал от Wnt-белка на миграцию в ядро клетки и регулирует экспрессию гена-мишени, вовлеченного в клеточную пролиферацию и дифференциацию, вещество, которое содержится в стволовых клетках, которые выростают в волосы, и вещество, связанное с миграцией клеток и клональной активностью.
[75]   Sox-9 представляет собой вещество, вовлеченное в стволовость, и которое означает ген, экспрессируемый в ядре клеток наружного корневого влагалища (ORS) и сальных желез волос.
[76]   Sox-2 означает вещество, которое экспрессируется на высоком уровне в эмбриональных стволовых клетках, играет важную роль не только в поддержании плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток, но также в обеспечении индуцирования плюрипотентных стволовых клеток, а также обладает важной функцией для поддержания характеристик стволовой клетки.
[77]   Щелочная фосфатаза, будучи видом фермента, представляет собой вещество, которое имеется в различных частях организма в качестве нескольких изоферментов, вещество, вовлеченное в ангиогенез в волосяной матрице во время роста волос, и означает вещество, активность которого повышается при росте волос.
[78]   CD133 известен как белок, который имеется во внеклеточной мембране и индуцируется для экспрессии при росте клеток, соответствует белку, основанному на кластере дифференциации (CD), и означает вещество, которое может обладать иммунологическими свойствами стволовых клеток волосяного фолликула.
[79]   FGF7 представляет собой фактор роста кератиноцита и означает вещество, которое проникает в дермис под эпидермисом для уверенной стимуляции роста и пролиферации кератиноцитов.
[80]   FGF10 представляет собой фактор роста фибробласта и означает вещество, которое проникает в дермис под эпидермисом для уверенной стимуляции роста и пролиферации фибробластов.
[81]   BMP6 представляет собой белок, который регулирует биологическую активность в различных типах клеток, в том числе в нервных клетках, и означает фактор для индуцирования образования агрегатов клеток дермального гребня человека для индуцирования роста волос.
[82]   P-кадгерин и E-кадгерин, в качестве белков на основе кадгерина, означают белки, которые используются для прикрепления клеток, связаны с актиновым цитоскелетом для обеспечения функции помощи при сборке белков, а также действуют в качестве молекул сигналинга, которые изменяют экспрессию генов в клетках, и означают факторы, вовлеченные в миграцию клеток наружного корневого влагалища человека и дифференциацию в клетки матрицы.
[83]   MSX2, FOXN1 и CD10 означают факторы, вовлеченные в дифференциацию клеток наружного корневого влагалища человека в клетки матрицы.
[84]   Фармацевтическая композиция может повышать бета-катенин или Sox-9 в клетках наружного корневого влагалища человека для индуцирования миграции клеток наружного корневого влагалища и активности клонов.
[85]   Фармацевтическая композиция может стимулировать образование клеточных агрегатов из клеток дермального гребня человека и увеличивать образование клеточных агрегатов для индуцирования роста волос и улучшения эффекта восстановления волос.
[86]   Фармацевтическая композиция мжет повышать экспрессию бета-катенина, Sox-2, щелочной фосфатазы, CD133, FGF7 и FGF10 в клетках дермального гребня человека, тем самым повышая стволовость клеток дермального гребня человека.
[87]   В одном конкретном варианте реализации настоящего изобретения, волосы дорзальной части состарившейся мыши с ослабленными физическими функциями сбривали и затем в дорзальную часть инъецировали кератиновый раствор для анализа плотности роста волос и образования волосяных фолликулов. В результате было подтверждено, что кератин стимулировал образование волосяных фолликулов и восстановление волос. Таким образом, можно увидеть, что кератин может быть использован в инъецируемой фармацевтической композиции для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
[88]   В настоящем изобретении термин «инъекция» относится к инъекции раствора лекарственного средства внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутриартериально с использованием шприца. В частности, поскольку фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обладает действием по профилактике выпадения волос или стимуляции роста волос, инъекция может представлять собой подкожную инъекцию, но не ограничена ею. Шприц может быть использован не только в качестве общего шприца, который может вводить раствор лекарственного средства через иглу, но также в качестве шприца, используемого для подкожного введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
[89]   В настоящем изобретении инъецируемая фармацевтическая композиция может находиться в форме жидкости или сухого порошка. Сухой порошок для инъекции может быть разведен по меньшей мере в одном, выбранном из группы, состоящей из воды для инъекций, физиологического солевого раствора, раствора глюкозы и раствора аминокислоты, подлежащего введению субъекту.
[90]   Количество активного ингредиента, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, зависит от состояния субъекта, который нуждается в введении, желаемой степени лечения и подобного. В частности, кератин по настоящему изобретению может содержаться в концентрации от 0,001 до 10 (масса/объем)%, в частности, от 0,01 (масса/объем)% до 5 (масса/объем)%, и более конкретно, от 0,05 до 2 (масса/объем)% относительно инъецируемой фармацевтической композиции.
[91]   Когда концентрация кератина составляет меньше 0,001 (масса/объем)%, действие по профилактике выпадения волос или стимуляции роста волос может быть недостаточным, а если концентрация кератина составляет больше 10 (масса/объем)%, то будет иметь место проблема, заключающаяся в возможном наблюдении побочных эффектов в организме.
[92]   В настоящем изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно включать усилитель проникновения.
[93]   Фармацевтическая композиция может вводиться локально в месте выпадения волос или в месте, где необходима стимуляция роста волос, предпочтительно, она может вводиться в дермальный слой или подкожную ткань. В это же время, дермальный слой является наиболее толстым слоем под эпидермисом, что означает слой, где сердечно-сосудистая система, нервная система, лимфатическая система и т.д. тесно переплетаются, вырабатываются и растут волосяные фолликулы и содержатся волосяные фолликулы.
[94]   Подкожная ткань представляет собой часть между мышцей и костью под дермальным слоем, которая содержит клетки жира, которые содержат большое количество жира для придания телу мягкости, имеют контур и используются в качестве энергии.  Это также означает, что артерии и лимфа циркулируют.
[95]   Усилитель проникновения может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из сульфоксида, азона, пирролидона, жирных кислот, низших спиртов, имеющих от 1 до 4 атомов углерода, высших жирных спиртов, имеющих 6 или более атомов углерода, гликолей, мочевины, терпена, терпеноида и фосфолипида. Однако усилитель проникновения не ограчен ими и может включать общие стимуляторы, которые используются в инъецируемой фармацевтической композиции для стимуляции трансдермального проникновения активного ингредиента.
[96]   Сульфоксид может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из диметилсульфоксида (ДМСО), диметилацетамида (ДМА), диметилформамида (ДМФ) и децилметилсульфоксида (ДЦМС), но не ограничен ими.
[97]   Пирролидон может быть по меньшей мере одним, выбранным из группы, состоящей из N-метил-2-пирролидона (NMP) и 2-пирролидона (2P), но не ограничен ими.
[98]   Азон может быть 1-додецилазациклогептан-2-оном или лаурокапрамом.
[99]   Усилитель проникновения может содержаться в общепринятом количестве для инъецируемой композиции в зависимости от используемого типа.
[100]   Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована отдельно или в комбинации с гормональной терапией, химиотерапией и способами, в которых используется модификатор биологического отклика, для профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос.
[101]   В настоящем изобретении представлен способ профилактики выпадения волос или стимуляции роста волос, включающий приготовление инъецируемой фармацевтической композиции, содержащей кератин; и введение инъецируемой фармацевтической композиции субъекту.
[102]   «Введение» означает введение желаемого вещества субъекту подходящим путем. В настоящем изобретении композиция может вводиться в дермальный слой или подкожную ткань ввиду ее характеристик по профилактике выпадения волос или стимуляции роста волос путем инъекции субъекту.
[103]   Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению варьируется в зависимости от различных факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, вес, общее состояние здоровья, пол, режим питания, время введения, путь введения, скорость экскреции, комбинацию лекарственных препаратов и степень тяжести конкретного заболевания, которое подлежит профилактике или лечению. Доза фармацевтической композиции может варьироваться в зависимости от состояния пациента, массы тела, степени тяжести заболевания, типа лекарственного препарата, а также пути и периода введения, но может быть подходящим образом выбрана специалистом в данной области техники, и может вводиться в количестве от 0,0001 до 100 мг/кг или от 0,001 до 100 мг/кг. Введение может осуществляться раз в сутки или несколько раз в сутки. Доза не ограничивает объем настоящего изобретения в каком-либо аспекте. В дополнение, доза и концентрация могут варьироваться в зависимости от области роста волос человека, и концентрация композиции составляет, предпочтительно, от 0,1 до 100 мг/мл, но не ограничена этим.
[104]   Под «субъектом» следует понимать всех животных, таких как мыши, крысы и домашний скот, а также людей, у которых наблюдаются или могут развиваться симптомы выпадения волос. В частности, субъектом могут быть млекопитающие, в том числе люди.
[105]   Далее, для обеспечения помощи в понимании настоящего изобретения, в настоящем документе представлены предпочтительные примеры приготовления или примеры. Однако нижеследующие примеры приготовления или примеры представлены лишь для обеспечения простоты понимания настоящего изобретения и содержание настоящего изобретения не ограничивается вариантом реализации.
[106]   Пример приготовления 1: Получение кератина
[107]   Волосы человека промывали начисто жидким моющим средством и полоскали несколько раз дистиллированной водой. Для удаления липидов, волосы помещали в химический стакан и туда добавляли смесь хлороформа и метанола в соотношении 2:1 до погружения волос. По прошествии 24 часов, раствор, использованный для удаления липидов, несколько раз вымывали дистиллированной водой до тех пор, пока в волосах не остался раствор, и затем волосы сушили воздухом. 20 г волос, которые были высушены воздухом, добавляли в 800 мл 2% уксусной кислоты (от «Sigma aldrich»), и смесь перемешивали при 37 °C в течение 12 часов при 300 об/мин. По прошествии 12 часов, волосы отсеивали и промывали дистиллированной водой для удаления оставшихся оксидов. Волосы добавляли в 400 мл раствора Шиндай (Shindai) (5% 2-меркаптоэтанола, 5 моль мочевины, 2,6 моль тиомочевины (от «Sigma aldrich») и 25 ммоль трис-HCl (pH 8,5)) и вводили в реакцию в течение 72 часов в условиях 50 °C и 400 об/мин. После этого, раствор с волосами добавляли в 50 мл трубку и центрифугировали при 3500 об/мин в течение 20 минут. Супернатант собирали и подвергали диализу с использованием 12-14 кДа отделяющей диализной мембраны Spectra/Por  4 (от «Spectrum»).  Диализированный образец жидкого кератина лиофилизировали для приготовления кератинового порошка.
[108]   Пример приготовления 2: Приготовление гидролизованного кератина
2
[109]   Сперва добавляли dHO в коричневый сосуд (10 мл, 22 * 48), изготовленный из полиэтилентерефталата, имеющий закручивающуюся крышку, и добавляли 20 мг протеиназы К, полученной из Tritirachium album (иммобилизованной до Eupergit, от «Sigma-Aldrich»), и растворяли при концентрации 2 мг/мл. Протеиназу-К полностью растворяли и затем 400 мг кератинового порошка, приготовленного в соответствии с примером приготовления 1, взвешивали с использованием электронных весов для измерения количества единиц мелких частей (от 0,001 г до 620 г, AJ-620E) и добавляли в сосуд. Сосуд помещали в цифровую сушильную камеру и затем перемешивали при 37 °C при скорости 300 об/мин в течение 1 часа с использованием яичного белка, 5 х 2 мм магнитной мешалки (B00C3ME4ZA, 1572500 IKAFLON 40, IKA) и портативного 10-канального магнитного перемешивающего устройства MS-H-S10. Раствор полностью гидролизованного кератина помещали в центрифугу и обрабатывали при 250 г в течение 10 мин для осаждения протеиназы-К, иммобилизованной с помощью Eupergit C, и осадок затем удаляли. Получали только супернатант и добавляли в трубку для ПЦР Eppendorf по 10 мкл. Трубку нагревали в течение 1 часа при 99 °C в оборудовании системы обнаружения ПЦР в режиме реального времени CFX96 Touch™ для удаления активности протеиназы-К. Жидкий образец гидролизованного кератина лиофилизировали для приготовления порошка гидролизованного кератина.
[110]   Пример приготовления 3: Приготовление PEGилированного кератина
[111]   Пример приготовления 3-1: Синтез PEGилированного кератина
[112]   Сперва, 0,5 г кератинового порошка, полученного в примере приготовления 1, взвешивали с использованием электронных весов (от 0,001 г до 620 г, AJ-620E) для измерения количества единиц мелких частей и помещали в 500 мл стакан Pyrex (ISOLAB, YLS, Германия). В стакан добавляли 100 мл третичной воды и перемешивали при скорости 300 об/мин в течение 24 часов с использованием 40 х 8 мм магнитной мешалки (B00C3ME4ZA, 1572500 IKAFLON 40, IKA) и 10-канального магнитного перемешивающего устройства MS-H-S10.
[113]   300 мг O-метил-O’-сукцинил полиэтиленгликоля 5000 (mPEG, 17929-5G-F, Партия № R063737/2V от «Sigma aldrich»), модифицированного метоксиполиэтиленгликолем, растворяли в 20 мл третичной воды в течение 1 часа. 16 мг 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метокси морфолин хлорид (DMTMM) н-гидрата (327-53752, от «Wako chemical») добавляли в раствор mPEG и затем перемешивали в течение 1 часа.  Раствор кератина и раствор связующего из mPEG и DMTMM помещали в 500 мл стакан и перемешивали при скорости 500 об/мин при комнатной температуре в течение 3 суток с использованием 40 х 8 мм магнитной мешалки (1572500 IKAFLON 40, IKA) и 10-канального магнитного перемешивающего устройства MS-H-S10.
[114]   Пример приготовления 3-2: Очитка PEGилированного кератина
[115]   После завершения реакции из примера приготовления 3-1, раствор PEGилированного кератина добавляли в проницаемую мембранную трубку Spectra/Por (диаметром 16 мм, шириной плоскости 25 мм, MW10000, Spectrum) по 100 мл на трубку и герметизировали с использованием крышки диализной трубки Spectra/Por RC (максимальной ширины 55 мм, Orange, Spectrum). Пластиковый стакан 5 л (диаметром 197 мм, высотой 265 мм) наполняли 4 л третичной воды, в него помещали трубку, содержащую раствор PEGилированного кератина, добавляли магнитную мешалку и перемешивали для выполнения диализа. Во время этого, новую третичную воду меняли каждые 12 часов и диализ выполняли при смене третичной воды в общей сложности 6 раз при комнатной температуре в течение 3 суток. Окончательный раствор PEGилированного кератина помещали в 59 мл центрифужную пробирку (17 × 120 мм, BD Falcon) для разделения на 40 мл, а затем полностью замораживали при -70 °C в течение 24 часов в криогенной холодильной машине (морозильная камера Nihon, вертикального типа, единичного замораживания, 542l). Крышку центрифужной пробирки открывали и раствор PEGилированного кератина помещали в сублимационную сушилку (ALPHA 2-4 LSC PLUS, Лабораторные сублимационные сушилки, от «Christ») и сушили в течение 3 суток в состоянии вакуума при -85 °C до полного превращения в порошок. Затем, PEGилированный кератин анализировали с помощью ЯМР. В результате, как изображено на фиг. 1, было подтверждено, что PEGилированный кератин обладал пиками в одно и то же время, которые были явно выражены у кератина и PEG соответственно.
[116]   Пример приготовления 3-3: Приготовление раствора PEGилированного кератина, содержащего перекись водорода
2
2
2
2
2
2
2
2
[117]   20 мг PEGилированного кератина, полученного в примере приготовления 3-2, измеряли с использованием электронных весов ((от 0,001 г до 620 г), AJ-620E) для измерения количества единиц мелких частей. 102 мкл HO (перекись водорода 30%, молекулярный вес 34,01, от «JUNSEI CHEMICAL», 7722-84-1) добавляли в 898 мкл третичной дистиллированной воды для получения 1 мл с концентрацией 1 моль, а затем выполняли серийное разведение с дистиллированной водой 100 раз и 20 раз для приготовления окончательных 500 мкмоль раствора HO. В приготовленные 500 мкмоль раствора HO добавляли 20 мг PEGилированного кератина и встряхивали в течение 5 минут для приготовления раствора PEGилированного кератина, содержащего 500 мкмоль HO. Стеклянную бутылку, содержащую приготовленный раствор, герметизировали с помощью нейлоновой вакуум-упаковочной машины 150 × 200 мм (NY / PELLDPE) (80 мкм) с использованием пневматической вакуум-упаковочной машины и затем оставляли на хранение.
[118]   Экспериментальный пример 1: Действие на рост волос в эксперименте на животных
[119]   Экспериментальный пример 1-1: Подготовка животной модели
[120]   В качестве животной модели использовали двадцать четыре взрослых мыши C57BL/6J (от «Charles River Corp. Inc.», Барселона, Испания) весом от 20 до 25 г, возрастом 12 недель, для проверки действия кератина на рост волос. После анестезии мышей с помощью изофлурана, дорзальные части мышей брили с помощью стригальной машины, при этом волосы и корни сбривали, оставляя корень волос на стадии терогена.   Кожу дезинфицировали с помощью раствора повидона-йода и затем вытирали с помощью 60% спирта.
[121]   Экспериментальный пример 1-2: Действие кератина на рост волос
[122]   Дорзальные части мышей, подготовленные в соответствии с экспериментальным примером 1-1, подвергали введению и подготавливали так, как изображено в таблице 1 ниже. Группой нормального контроля была мышь, которая не подвергалась какому-либо лечению после стрижки волос. Все мыши были выведены в течение 2 недель и на 2 неделе за областями со срезанными волосами следили с помощью стереомикроскопа (SZX16, от «Olympus»). Результаты изображены на фиг. 2.
[123]   [Таблица 1]
Классификация
Ингредиент
Способ введения
Группа нормального контроля
-
-
Группа положительного контроля
3% миноксидила
Нанесение на кожу ежедневно в течение 2 недель (количество для нанесения 100 мкл/см<sup>2</sup>)
Пример 1
0,5 масса/объем% содержащего кератин раствора, полученного из примера приготовления 1
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Пример 2
1 масса/объем% содержащего кератин раствора, полученного из примера приготовления 1
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Пример 3
0,5 масса/объем% раствора, содержащего гидролизованный кератин, полученного из примера приготовления 2
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Пример 4
1 масса/объем% раствора, содержащего гидролизованный кератин, полученного из примера приготовления 2
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Пример 5
0,5 масса/объем% раствора, содержащего PEGилированный кератин, полученного из примера приготовления 3 -2
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Пример 6
0,5 масса/объем% раствора, содержащего PEGилированный кератин, полученного из примера приготовления 3 -2
Подкожная единичная инъекция (300 мкл)
Сравнительный пример 1
1 масса/объем% содержащего кератин раствора, полученного из примера приготовления 1
Нанесение на кожу (количество для нанесения 100 мкл/см<sup>2</sup>)
[124]   В результате, было показано, что в примерах 1-6 действие на рост волос было удивительно превосходным по сравнению с таковым в группе нормального контроля, при этом в примерах 1-6 волосы росли равномерно, а в примерах 1, 2 и 4 волосы росли очень густо. Следовательно, было подтверждено, что, когда кератин был введен подкожно, действие на рост волос было лучше, чем, когда кератин был нанесен на кожу, было подтверждено, что инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, в соответствии с настоящим изобретением, имела действия по профилактике выпадения волосы и стимуляции роста волос, а также было подтверждено, что действия по профилактике выпадения волос и стимуляции роста волос были быстрыми.
[125]   В дополнение, инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, в соответствии с настоящим изобретением, имела удивительно сильное действие по профилактике выпадения волос и стимуляции роста волос, чем, когда состав был нанесен на кожу, как обычное наружное средство для кожи, и подкожная инъекция с использованием состава в качестве инъецируемого продукта имела высокую степень биодоступности.
[126]   С другой стороны, когда состав был преобразован в инъекцию, отличную от наружного средства для кожи, побочные эффекты, такие как токсичность, также увеличивались вследствие увеличения биодоступности при использовании в качестве инъекции по сравнению с использованием в качестве наружного средства для кожи, и, таким образом, также важно устранить побочные эффекты. Таким образом, на фиг. 2 было подтверждено, что инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая кератин, в соответствии с настоящим изобретением, не имела токсичности во время подкожной инъекции инъецируемой фармацевтической композиции, содержащей кератин, и после подкожной инъекции инъецируемой фармацевтической композиции, содержащей кератин, побочные эффекты, которые происходили за счет реакции с кровью или влаги в теле, отсутствовали.
[127]   Экспериментальный пример 1-3: Гистологический анализ действия кератина на рост волос
[128]   После завершения экспериментального примера 1-2, образцы ткани получали путем умерщвления мышей, которым были введены растворы из примеров 1-6, нормального контроля и положительного контроля, соответственно. Образцы ткани окрашивали гематоксилином и эозином (Г и Э), за ними наблюдали и их анализировали, и результаты изображены на фиг. 3-5.
[129]   В результате, было подтверждено, что образование волосяных фолликулов имело место у мышей, которым ввели растворы кератина из примеров 1-6, с намного большей частотой чем у нормального контроля (фиг. 3). В частности, было подтверждено, что у мышей, которым ввели растворы кератина и гидролизованного кератина из примеров 1-4, размер волосяного фолликула был увеличен по сравнению с мышами, которым были введены растворы PEGилированного кератина из примеров 5-6. В частности, как изображено на фиг. 4, в результате анализа каждой стадии роста волос, было подтверждено, что образование волосяных фолликулов было стимулировано на стадии анагена, которая является ранней стадией роста волос, и в результате, образование новых волосяных фолликулов было индуцировано (фиг. 4). В дополнение, поскольку концентрация раствора кератина, введенного мышам, увеличивалась, диаметр волосяных фолликулов имел тенденцию к увеличению (фиг. 5).
[130]   Экспериментальный пример 2: Идентификация гидролизованного кератина
[131]   Был ли гидролизованный кератин приготовлен в соответствии с примером пример приготовления 2, идентифицировали посредством SDS-PAGE и это изображено на фиг. 6.
[132]   В частности, маркер размера SeeBlue plus 2 Pre-Stained Standard (от «Novex») отбирали при комнатной температуре и раствор встряхивали для полного смешивания. Общее количество 40 мкл образца, полученного путем смешивания 10 мкл Bolt™ LDS буфера для образца (4×), 4 мкл Bolt™ LDS восстанавливающего агента (10×) и 26 мкл 4% гидролизованного кератина встряхивали. Образец гидролизованного кератина готовили путем установки температуры нагревательного блока (HYSC_Introduction_Heating Block_2014) на 100 °C и нагревания в течение 10 минут. После удаления части гребня Bolt бис-трис 4-12% градиент мини геля (от «Invitrogen»), лунки промывали 1x MES подвижным буфером и покрывающую ленту на конце кассеты удаляли. Перед загрузкой образца, камеру кассеты заполняли 1x MES подвижным буфером и блокировали с помощью защелки кассеты для предотвращения выхода буфера. Лунки, предназначенные для загрузки буфера, заполняли 1x MES подвижным буфером. 30 мкл 4% образца гидролизованного кератина и 10 мкл маркера размера SeeBlue plus 2 Pre-Stained Standard (от «Novex»), соответственно, загружали. 0,012, 0,015 и 0,020 мг/600 мкл образцов кератина PAA использовали в качестве контроля. Кассету заполняли 1x MES подвижным буфером по наружной шкале, загружали в нее маркер размера и 4% образца гидролизованного кератина, а затем запускали при 165 В в течение 40 минут с помощью базового источника питания PowerPac™ (от «Bio-rad»). После запуска, защелку кассеты отпускали, а также получали только загруженный гель и окрашивали в кумассии бриллиантовый голубой G-250 (от «Sigma») в течение 24 часов. Маркер размера и белок идентифицировали после промывания обесцвечивающим раствором (10 %(об/об) уксусной кислоты, 40 %(об/об) метанола) до тех пор, пока полоса не стала видимой.
[133]   В результате, как изображено на фиг. 6, было подтверждено, что в случае натурального кератина, экстрагированного из результата анализа SDS-PAGE, полоса белка показывалась на уровне молекулярного веса приблизительно 50 кило-дальтон, однако в случае гидролизованного кератина, полоса неявно показывалась на уровне молекулярного веса от 3 до 6 кило-дальтон. В результате, можно увидеть, что гидролизованный кератин составлен различными значениями молекулярного веса разложившихся пептидов.
[134]   Экспериментальный пример 3: Индуцирование клеточных агрегатов и индуцирование экспрессии факторов кератина, связанных с ростом волос, для клеток дермального гребня человека in vitro
[135]   Для подтверждения действия кератина по восстановлению волос, подтверждали экспрессию факторов, связанных с ростом волос, и индуцирование агрегации и роста волос.
[136]   Было подтверждено, показывал ли раствор кератина, приготовленный с использованием клеток дермального гребня человека, эффективность при клеточной пролиферации.
4
[137]   В частности, клетки дермального гребня человека инокулировали на 24-луночном планшете 2 × 10 клеток и по прошествии 24 часов, среду заменяли на нормальную среду DMEM при высокой концентрации или нормальную среду DMEM, содержащую 1 %(масса/объем) кератина при высокой концентрации.  По прошествии 1, 3 и 5 суток культивирования выполняли анализ клеточной пролиферации. После того, как лунки промыли DPBS, в каждую лунку добавляли раствор «Cell Counting Kit-8» (от лаборатории «Dojindo»), который в 10-ти кратном размере разбавлен нормальной средой DMEM с высокой концентрацией, свет загораживали с помощью алюминиевой фольги, а затем клетки инкубировали в течение 1 часа 30 минут при °C. После инкубации, 100 мкл из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет и измеряли поглощаемость при длине волны 450 нм (O.D 450 нм) с использованием считывателя с форматом для 96-луночного планшета (универсальный считыватель микропланшета ELX 800, от «BioTek, Inc.»). Результаты изображены на фиг. 7.
[138]   В результате, было обнаружено, что пролиферация клеток дермального гребня человека ингибировалась во время обработки кератином (фиг. 7). В дополнение, после обработки кератином, взятого в комплексе с флуоресцентным веществом, в результате анализа взаимодействия с клетками было подтверждено, что кератин прилипал к клеточной поверхности, а образование клеточных агрегатов, в соответствии с миграцией клеток, индуцировалось кератином с течением времени (фиг. 8).
5
[139]   Для дополнительного подтверждения этих результатов путем анализа экспрессии мРНК, сначала клетки дермального гребня человека инокулировали в 6-луночном планшете 2 × 10 клеток и по прошествии 24 часов, среду заменяли на нормальную среду DMEM при высокой концентрации или нормальную среду DMEM, содержащую 1 %(масса/объем) кератина при высокой концентрации. После обработки кератином в течение 24 часов, для анализа секвенирования РНК, культуральную среду клеток, культивированую на 6-луночном планшете, удаляли и промывали с помощью DPBS. Набор hybrid-R (от «Gene All») использовали для извлечения РНК, и извлеченную РНК подвергали количественному анализа с использованием устройства nano drop (спектрофотометр в УФ и видимой областях спектра MICROP M600). Анализ секвенирования РНК проводили путем запроса 1 мкг РНК в Macrogen.
[140]   В результате, было подтверждено, что экспрессия мРНК, связанная с синтезом внеклеточной матрицы и взаимодействий клеток, вовлеченных в миграцию клеток и индуцирование клеточных агрегатов в обработанных кератином клетках дермального гребня человека, существенно повышалась, а экспрессия мРНК, связанная с клеточной пролиферацией, ингибировалась (фиг. 9).
5
[141]   Кроме того, клетки дермального гребня человека инокулировали на 6-луночном планшете 2 × 10 клеток и по прошествии 24 часов, среду заменяли на нормальную среду DMEM при высокой концентрации или нормальную среду DMEM, содержащую 1 %(масса/объем) кератина при высокой концентрации. По прошествии 3 и 5 суток культивирования, уровень экспрессии факторов для индуцирования роста волос измеряли путем иммунохимического окрашивания.
[142]   После того, как клетки дермального гребня человека были культивированы, как описано выше, среду удаляли и клетки промывали с помощью DPBS. Клетки иммобилизовали путем обработки 4% параформальдегида в течение 10 минут и затем промывали снова с помощью DPBS. После иммобилизации, 0,1% тритона Х-100 обрабатывали в течение 30 минут для пермеабилизации и 10 % (масса/объем) нормальной сыворотки козы (NGS) обрабатывали в течение 1 часа. После этого, кроличье антитело против бета-катенина человека, разбавленное в 1:200, мышиное антитело против FGF7 человека, кроличье антитело против FGF7 человека, кроличье антитело против FGF10 человека и кроличье антитело против BMP6 человека обрабатывали и вводили в реакцию при 4 °C в течение 24 часов. По прошествии 24 часов реакции, клетки промывали три раза с помощью DPBS, и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 546 антитело и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело обрабатывали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого, клетки промывали три раза с помощью DPBS и обрабатывали с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). За окрашенными клетками затем наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus I x 71). В результате, образование клеточных агрегатов индуцировалось в клетках дермального гребня человека, обработанных кератином, и молекулярная экспрессия FGF7, FGF10 и BMP6, которые были известны в качестве факторов, индуцирующих рост волос, существенно повышалась (фиг. 10).
[143]   Экспериментальный пример 4: Индуцирование экспрессии факторов кератина, связанных с ростом волос, для наружного корневого влагалища (ORS) человека in vitro
[144]   Для подтверждения действия кератина по восстановлению волос, подтверждали экспрессию факторов, связанных с ростом волос и индуцированием роста волос.
[145]   Подтверждали то, демонстрировал ли раствор кератина, приготовленный с использованием клеток наружного корневого влагалища человека, экспрессию факторов, связанных с ростом волос и индукцией роста волос.
4
[146]   В частности, клетки наружного корневого влагалища человека инокулировали на 6-луночном планшете 5 × 10 клеток и по прошествии 24 часов, среду заменяли на среду ORS или среду ORS, или 1 %(масса/объем) среду ORS, содержащую кератин. По прошествии 3 суток инкубации, уровни экспрессии бета-катенина, CD34, Р-кадгерина и Е-кадгерина, а также уровни экспрессии для факторов транскрипции, измеряли путем иммунохимического окрашивания и анализа ПЦР в режиме реального времени.
[147]   После того, как клетки наружного корневого влагалища (ORS) человека были культивированы, как описано выше, среду удаляли и клетки промывали с помощью DPBS. Клетки иммобилизовали путем обработки 4% параформальдегида в течение 10 минут и затем промывали снова с помощью DPBS. После иммобилизации, 0,1% тритона Х-100 обрабатывали в течение 30 минут для пермеабилизации и 10 % (масса/объем) нормальной сыворотки коза (NGS) обрабатывали в течение 1 часа. После этого, кроличье антитело против бета-катенина человека, разбавленное в 1:200, кроличье антитело против CD34 человека, кроличье антитело против Р-кадгерина человека, кроличье антитело против Е-кадгерина человека и мышиное антитело против интегрина бета1 человека обрабатывали и вводили в реакцию при 4 °C в течение 24 часов. По прошествии 24 часов реакции, клетки промывали три раза с помощью DPBS, и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 546 антитело, вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело и конъюгированное с ФЭ антитело фаллоидина обрабатывали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого, клетки промывали три раза с помощью DPBS и обрабатывали с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). За окрашенными клетками затем наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus I x 71). Для анализа ПЦР в режиме реального времени, культуральную среду клеток, культивированных в 6-луночном планшете, удаляли, а летки промывали с помощью DPBS. Набор hybrid-R (от «Gene All») использовали для извлечения РНК, и извлеченную РНК подвергали количественному анализа с использованием устройства nano drop (спектрофотометр в УФ и видимой областях спектра MICROP M600). 1 мкг РНК добавляли в устройство AccuPower Cycle Script RT Premix (от «Bioneer», Тэджон, Республика Корея) и кДНК приготавливали с использованием термоциклера (T106, от «Bio-Rad»). Использованные последовательности праймеров изображены в таблице 2 ниже.
[148]   [Таблица 2]
Смысловая(5’-3’)
Антисмысловая(5’-3’)
бета-катенин
TGCAGTTCGCCTTCACTATG(SEQ ID NO: 1)
CTGCACAAACAATGGAATGG(SEQ ID NO: 2)
KRT5
ACCAGTACCCGCATCTGCA(SEQ ID NO: 3)
TGTTCCGTGGCCTCTTCG(SEQ ID NO: 4)
MSX2
CCGCCAAGACATATGAGCCC(SEQ ID NO: 5)
ACCTGGGTCTCTGTGAGGTT(SEQ ID NO: 6)
ITGA6
AGCTGTGCTTGCTCTACCTG(SEQ ID NO: 7)
CCGGGGTCTCCATATTTCCG(SEQ ID NO: 8)
FOXN1
AGTGGTGCTGGGATGTTCTG(SEQ ID NO: 9)
ATAGTGTGAGGAGCCCAGGT(SEQ ID NO: 10)
CD10
CTTTAGTGCCCAGCAGTCCA(SEQ ID NO: 11)
GAGTCCACCAGTCAACGAGG(SEQ ID NO: 12)
бета-актин
GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT(SEQ ID NO: 13)
TCGTGCGTGACATTAAGGAG(SEQ ID NO: 14)
ΔΔCt
[149]   В каждую реакцию добавляли 10 мкл SYBR Green PCR Mix, 0,5 пм праймеров (смысловых и антисмысловых) и 50 нм образца. ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием инструмента RG6000 5plex HRM (от «Corbett Research»), а также устанавливали 40 циклов при 95 °C в течение 15 секунд и температуру отжига 57 °C в течение 45 секунд. Для измерения порогового значения цикла (Ct) использовали метод сравнительной количественной оценки (Ct(2-)).
[150]   В результате, в случае клеток наружного корневого влагалища (ORS) человека, при обработке кератином было подтверждено, что экспрессия бета-катенина и Р-кадгерина, которые были факторами, вовлеченными в миграцию клеток наружного корневого влагалища и дифференциацию в клетки матрицы в отношении восстановления волос, повышалась, а экспрессия CD34, который известен как молекула, экспрессия которой понижалась при дифференциации, снижалась (фиг. 11).
[151]   В дополнение, было подтверждено, что экспрессия генов MSX2, FOXN1 и CD10, ассоциированных с дифференциацией клеток наружного корневого влагалища (ORS) человека в клетки матрицы во время обработки кератином, повышалась (фиг. 12), а экспрессия генов KRT5 и ITGA6, которые известны понижением своей экспрессии после дифференциации, понижалась (фиг. 12).
[152]   Экспериментальный пример 5: Индуцирование экспрессии факторов гидролизованного кератина, связанных с ростом волос, для клеток наружного корневого влагалища человека in vitro
[153]   Для подтверждения действия гидролизованного кератина по восстановлению волос, подтверждали экспрессию факторов, связанных с ростом волос и стволовостью.
4
[154]   Клетки наружного корневого влагалища (ORS) человека инокулировали на 6-луночном планшете 5 × 10 клеток и по прошествии 24 часов, среду заменяли на среду ORS или среду ORS, или 1 %(масса/объем) среду содержащую гидролизованный кератин. По прошествии 1, 3 и 5 суток культивирования измеряли уровни экспрессии бета-катенина, Sox-9 и CD44 путем иммунохимического окрашивания и анализа ПЦР в режиме реального времени.
[155]   После того, как клетки наружного корневого влагалища (ORS) человека были культивированы, как описано выше, среду удаляли и клетки промывали с помощью DPBS. Клетки иммобилизовали путем обработки 4% параформальдегида в течение 10 минут и затем промывали снова с помощью DPBS. После иммобилизации, 0,1% тритона Х-100 обрабатывали в течение 30 минут для пермеабилизации и 10 % (масса/объем) нормальной сыворотки коза (NGS) обрабатывали в течение 1 часа. После этого, кроличье антитело против бета-катенина человека, разбавленное в 1:200, кроличье антитело против Sox-9 человека и кроличье антитело против CD44 человека обрабатывали и вводили в реакцию при 4 °C в течение 24 часов. По прошествии 24 часов реакции, клетки промывали три раза с помощью DPBS, и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 546 антитело и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело обрабатывали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого, клетки промывали три раза с помощью DPBS и обрабатывали с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). За окрашенными клетками затем наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus I x 71). Для анализа ПЦР в режиме реального времени, культуральную среду клеток, культивированных в 6-луночном планшете, удаляли, а летки промывали с помощью DPBS. Набор hybrid-R (от «Gene All») использовали для извлечения РНК, и извлеченную РНК подвергали количественному анализа с использованием устройства nano drop (спектрофотометр в УФ и видимой областях спектра MICROP M600). 1 мкг РНК добавляли в устройство AccuPower Cycle Script RT Premix (от «Bioneer», Тэджон, Республика Корея) и кДНК приготавливали с использованием термоциклера (T106, от «Bio-Rad»). Использованные последовательности праймеров изображены в таблице 3 ниже.
[156]   [Таблица 3]
Смысловая(5’-3’)
Антисмысловая(5’-3’)
бета-катенин
TGCAGTTCGCCTTCACTATG(SEQ ID NO: 1)
CTGCACAAACAATGGAATGG(SEQ ID NO: 2)
Sox-9
ACCAGTACCCGCATCTGCASEQ ID NO: 15)
TGTTCCGTGGCCTCTTCG(SEQ ID NO: 16)
бета-актин
GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT(SEQ ID NO: 13)
TCGTGCGTGACATTAAGGAG(SEQ ID NO: 14)
[157]   В каждую реакцию добавляли 10 мкл SYBR Green PCR Mix, 0,5 пм праймеров (смысловых и антисмысловых) и 50 нм образца.
ΔΔCt
[158]   ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием инструмента RG6000 5plex HRM (от «Corbett Research»), а также устанавливали 40 циклов при 95 °C в течение 15 секунд и температуру отжига 57 °C в течение 45 секунд. Для измерения порогового значения цикла (Ct) использовали метод сравнительной количественной оценки (Ct(2-)).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[159]   После того, как клетки наружного корневого влагалища (ORS) человека были культивированы, как описано выше, среду удаляли и клетки промывали с помощью DPBS. Добавляли от 0,3 до 1 мл буфера для лизиса белка (Буфер для лизиса клеток (10X): буфер RiPA (biorad-89901) и коктейль ингибитора фосфатазы (от «Thermofisher» (100Х), 78440), и клетки собирали с помощью скребка и переносили в эзофагостомический зонд. Супернатант, содержащий белок, получали путем центрифугирования клеток при 4 °C в течение 30 минут с использованием центрифуги (Центифуги 5427 R, от «Еffendorf» 10,000xg). Количественную оценку белка проводили с использованием реагента Bio Rad Protein Assay. В 30 мкг образца белка добавляли 6×красителя образца (DTT, sigma 43815, сигма бромфеноловый синий, BR0222, Glycerl, bioshop, GLY001) и смешивали для получения 1х, и образец добавляли в нагревательный блок (HYSC_Introduction_Heating Block_2014) и нагревали при 95 °C в течение 10 минут. PROTEAN Tetra Handcast Systems (от «Bio-rad») готовили путем легкого осаждения и встряхивания (вихревая мешалка Stuart Scientific SA8 с входным переменным током 90/230 В, 50-60 Гц) образца, а затем оставляя образец на льду. Для приготовления геля, короткое стекло и длинное стекло собирали в пластины для ручной отливки, и стеклянную пластину промывали 70% этанола (от «merk») и дистиллированной водой, а затем помещали в рамку, и на дно пластины наносили смазку, которая отверждала гель для предотвращения вытекания геля. Конечные 22 мл отделяющего геля (содержащего 6 мл 30% акриламида (раствор 30% Акриламид/Бис, 19:1 #1610154), 5 мл dHO, 3,75 мл 1,5 моль Трис-HCl (Sigma, T1503), 150 мкл SDS (sigma, додецилсульфит натрия, L3771), 7,5 мкл TEMED (USB, 76230) и 75 мкл 10% аммоний персульфата (sigma, 215589)) готовили и помещали в стеклянную пластину, а затем туда добавляли 70% этанол для уравнивания. По прошествии приблизительно 30 минут, стеклянную пластину наклоняли для удаления этанола, а затем готовили окончательные 10 мл концентрирующего геля (содержащего 1,3 мл 30% акриламида (раствор 30% Акриламид/Бис, 19:1 #1610154), 6,1 мл dHO, 2,5 мл 1,0 моль Трис-HCl (Sigma, T1503), 100 мкл HCl (sigma, T1503), 10 мкл TEMED (USB, 76230) и 60 мкл 10% аммоний персульфата (sigma, 215589)). Концентрирующий гель добавляли, вставляли 1,0 мм гребень, а затем пластину с гелем устанавливали в электрофорезный бак. Образец загружали в каждую лунку, а также добавляли 5 мкл маркера размера (маркер длины) (маркер молекулярного веса белка от 10 до 245 кДа ab116028-Abcam). Минигель вводили в реакцию при 50 В в течение 20 минут и подвергали электрофорезу в течение от 1 часа до 1,5 часа, при этом повышая до 100 В при прохождении через концентрирующий гель.  После завершения электрофореза, гель отделяли от пластины с гелем и помещали в буфер для блоттинга. Между тем, буфер для блоттинга готовили с использованием 14,4 г глицина (от «Sigma»), 3 г основания Trizma (от «Sigma», T1503), 200 мл метанола и 800 мл dHO. Блоттинг-мембрану из ПВДФ (millipore кат. № ISEQ 10100 10 см x 10 см ПВДФ) погружали в метанол на 5 минут, в третичную HO на 3 минуты и в буфер для блоттинга на 3 минуты, а также взбалтывали, а затем сэндвич-кассету делали в следующем порядке: (-) Черная пластина - Губка - 3M бумага - Устройство для переноса прозрачной пластины (от «Bio-rad»). Кассету помещали в водяную баню и переносили при 200 В на 90 минут на мешалку. После завершения переноса, полосу подтверждали путем сушки геля и мембраны. 2,5 г пунцового S и 5 мл уксусной кислоты добавляли в dHO для приготовления раствора реагента с объемом 500 мл, а затем всю мембрану встряхивали в растворе реагента в течение примерно 5 минут, а затем промывали с помощью HO от 2 до 3 раз, и, в результате, полосу подтверждали и отображали размер длины. Блокирующий раствор готовили с помощью 10 г снятого латекса (BD, 2322100) и 200 мл TBS (Трис 12 г, NaCl 9 г в dHO), мембрану помещали в пластиковую чашу, а затем клетки инкубировали в 10 мл блокирующего раствора в течение 1 часа. Первичное антитело В-катенина (антитело В-катенина [E247] (ab32572)) и первичное антитело В-актина (антитело β-актина (C4)), разбавленные в 1:1000, добавляли в 10 мл блокирующего раствора и инкубировали в инкубаторе Santa Cruz при 4 °C в течение 24 часов. Клетки промывали три раза по 5 мин каждую с помощью TBST (Трис 12 г, NaCl 9 г в dHO, 1% твин 20), и вторичное антитело В-катенина (козье антитело к кроличьему IgG-HRP: sc-2004) и вторичное антитело В-катенина (мышиное антитело к кроличьему IgG-HRP), разбавленные в 1:10000, инкубировали в 10 мл блокирующего раствора в течение 2 часов.  Клетки промывали три раза по 5 мин каждую с помощью TBST (Трис 12 г, NaCl 9 г в dHO, 1% твин 20), а затем добавляли подложку ECL (от «Daemyung Science») и инкубировали в течение 5 минут. В темном помещении мембрану помещали на проявочную кассету (высокочувствительный экран, от «Daemyung Science»), рентгенопленку (8 х 10 дюймов, от «Daemyung Science») инкубировали на 5 минут, и пленку извлекали и проявляли на автоматической проявочной машине (SAEKI, P & C, ATL-1500).
[160]   В результате, было подтверждено, что в случае клеток наружного корневого влагалища (ORS) человека, экспрессия молекулы бета-катенина, которая является фактором, связанным с миграцией клеток наружного корневого влагалища и активностью клона, и молекулы Sox-9, вовлеченной в стволовость, повысилась в отношении восстановления волос при обработке гидролизованным кератином (фиг. 13). В дополнение, было подтверждено, что экспрессия гена Sox-9 и гена бета-катенина, вовлеченных в стволовость, была повышена (фиг. 14). В частности, было подтверждено, что бета-катенин был экспрессирован четыре раза или более при обработке гидролизованным кератином (фиг. 15).
[161]   Экспериментальный пример 6: Индуцирование экспрессии факторов гидролизованного кератина, связанных с ростом волос, для клеток дермального гребня человека in vitro
5
[162]   Клетки дермального гребня (DP) человека инокулировали 2 x 10 клеток в 6-луночном планшете без какой-либо обработки. По прошествии 24 часов, среду заменяли средой DP или средой DP, содержащей 1 %(масса/объем) гидролизованного кератина. По прошествии 1, 2 и 3 суток инкубации анализировали степень образования клеточных агрегатов и степень активности щелочной фосфатазы, а также измеряли уровни экспрессии бета-катенина, Sox-2, CD133, щелочной фосфатазы, FGF7 и FGF10 посредством иммуногистохимического окрашивания.
[163]   Во время культивирования клеток дермального гребня (DP), как описано выше, количество клеточных агрегатов, продуцируемых во время обработки гидролизованным кератином, измеряли с помощью оптического микроскопа.
[164]   В дополнение, после культивирования клеток дермального гребня (DP), как описано выше, клетки иммобилизовали путем обработки 4% параформальдегида в течение от 1 до 2 минут, промывали с помощью ополаскивающего буфера, содержащегося в наборе для выявления щелочной фосфатазы (Merk Millipore SCR004), туда добавляли 1 мл реакционного раствора, в котором фосфатный раствор нафтола AS-BI: раствор красного быстрого и фиолетового: дистиллированный были перемешаны при 2:1:1, а затем вводили в реакцию при комнатной температуре в условиях темноты в течение 15 минут. После реакции, за клетками, окрашенными за счет активности гидролазы (щелочной фосфатазы), экспрессированной клетками щелочной фосфатазы, наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus I x 71).
[165]   После того, как клетки дермального гребня (DP) человека были культивированы, как описано выше, среду удаляли и клетки промывали с помощью DPBS. Клетки иммобилизовали путем обработки 4% параформальдегида в течение 10 минут и затем промывали снова с помощью DPBS. После иммобилизации, 0,1% тритона Х-100 обрабатывали в течение 30 минут для пермеабилизации и 10 % (масса/объем) нормальной сыворотки козы обрабатывали в течение 1 часа. После этого, кроличье антитело против бета-катенина человека, разбавленное в 1:200, мышиное антитело против Sox-2 человека, мышиное антитело против ALPase человека, кроличье антитело против CD133 человека, мышиное антитело против FGF-7 человека и кроличье антитело против FGF-10 человека обрабатывали и вводили в реакцию при 4 °C в течение 24 часов. По прошествии 24 часов реакции, клетки промывали три раза с помощью DPBS, и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 546 антитело и вторичное конъюгированное с Alexa Fluor 488 антитело обрабатывали при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого, клетки промывали три раза с помощью DPBS и обрабатывали с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). За окрашенными клетками наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus I x 71).
[166]   В результате, было подтверждено, что в случае клеток дермального гребня (DP), при обработке гидролизованным кератином, образование клеточных агрегатов, вовлеченных в восстановление волос клеток дермального гребня и стволовость, увеличивалось в 5 или более раз (фиг. 16), а активность гидролазы, экспрессированная клетками щелочной фосфатазы, повышалась (фиг. 17). Кроме того, было подтверждено, что экспрессия молекул бета-катенина, Sox-2, щелочной фосфатазы, CD133, FGF-7 и FGF-10, в качестве факторов восстановления волос клеток дермального гребня и стволовости, повышалась (фиг. 18).
[167]   Посредством экспериментальных примеров 1 и 6 было обнаружено, что кератин повышал стволовость стволовых клеток, вовлеченных в восстановление волос, и индуцировал миграцию и дифференциацию клеток для вырабатывания клеточных агрегатов, тем самым эффективно индуцируя восстановление волос.