СПОСОБ ПОЛЕВОЙ ПОДГОТОВКИ И СОХРАНЕНИЯ ПЫЛЬЦЫ
METHOD OF FIELD PREPARATION AND PRESERVATION OF POLLEN

Настоящее изобретение было разработано в рамках I Фазы Программы поддержки малого бизнеса в области инновационных исследований (SBIR) Министерства сельского хозяйства США (USDA) №2016-33610-25366 под названием «Развитие точных и надежных способов сохранения кукурузной пыльцы». Правительству принадлежат определенные права на это изобретение.
Настоящая заявка является частичным продолжением патентной заявки США №15/192,519, поданной 24 июня 2016 года, под названием "Производство зерна", которая заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №62/184,596, поданной 25 июня 2015 года под названием «Производство семян», и предварительной заявки США №62/269,496, поданной 18 декабря 2015 года под названием «Производство семян», и предварительной патентной заявки США №62/269,531, поданной 18 декабря 2015 года под названием «Производство зерна», и предварительной патентной заявки США №62/269,514, поданной 18 декабря 2015 года под названием «Производство зерна». Содержание патентной заявки США №15/192,519 и предварительных патентных заявок США №№62/184,596; 62/269,496; 62/269,531 и 62/269,514 является, таким образом, включенным в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом относится к новому способу полевой подготовки и сохранения пыльцы для повышения общей жизнеспособности и фертильности пыльцы для применения при опылении с использованием как свежей, так и сохраненной пыльцы.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение может применяться в области долговечности сохранения и жизнеспособности пыльцы. Долговечность сохранения пыльцы существенно различается между видами растений и существенно зависит от условий окружающей среды, в особенности от температуры и относительной влажности. Для пыльцы, которая в естественных условиях распространяется от цветов или цветковых структур ангиоспермов, характерна быстрая потеря жизнеспособности после отделения от растения. Жизнеспособность пыльцы в зависимости от вида растения и условий окружающей среды может быть утрачена в течение минут или часов. Воздействие сухого воздуха и высокой температуры особенно неблагоприятно для жизнеспособности и долговечности сохранения пыльцы после того, как она покинула растение. Таким образом, в природных полевых условиях срок, в течение которого пыльца остается жизнеспособной, является ограниченным, и в настоящем изобретении называется "окном жизнеспособности". В частности, пыльца семейства злаковых (Poaeceae (Gramineae)), обычно называемых злаками, является особенно уязвимой и недолговечной (Barnabas & Kovacs (1997) In: Pollen Biotechnology For Crop Production And Improvement. (1997). Sawhney, V.K., and K.R. Shivanna (eds). Cambridge University Press, pp. 293-314). Это семейство растений включает много экономически значимых зерновых культур, в том числе кукурузу. Способы улучшения жизнеспособности пыльцы и увеличения продолжительности периода ее жизнеспособности имеют важное значение для сельскохозяйственной промышленности.
В частности, если пыльцу, собранную с растений, можно сохранить в жизнеспособном состоянии в течение определенного периода времени, то эту пыльцу можно использовать для опыления цветков женских растений различными эффективными способами. Применение сохраненной пыльцы позволяет производить опыление, не зависящее от осыпания активной пыльцы, временной синхронизации с восприимчивостью пестиков (женских растений), мужской стерильности и/или физической изоляции от других источников пыльцы. В настоящее время многие виды зависят от самоопыления или перекрестного опыления соседними растениями для производства фертильных семян или зерен. Обычно в отрасли, связанной с гибридными семенами сельскохозяйственных культур, необходимо механическое, физическое и/или генетическое вмешательство для обеспечения перекрестного опыления женских растений (а не самоопыления) для получения гибридных семян с помощью пыльцы определенной генетической структуры. Такие способы, например, стандартно применяются для получения гибридных семян кукурузы и риса. Однако, у некоторых зерновых культур даже такие меры являются неэффективными для обеспечения экономичного перекрестного опыления с использованием желаемого источника пыльцы. В настоящее время невозможно, или же крайне трудно, производить такие зерновые культуры в виде гибридов в коммерческом масштабе. Неограничивающие примеры таких культур включают пшеницу и сою.
Предпринималось немало попыток сохранения пыльцы и продления ее жизнеспособности сверх того времени, в течение которого пыльца остается жизнеспособной, будучи оставлена в неконтролируемых условиях окружающей среды. Среди всех исследований зерновых культур, исследования, посвященные кукурузе, касающиеся успехов в сохранении пыльцы, являются иллюстративным. Различные виды обработок проверялись на предмет сохранения или продления жизнеспособности и/или фертильности кукурузной пыльцы. Среди них наиболее часто сообщалось о предпочтительном хранении и/или обработке кукурузной пыльцы в условиях высокой влажности и/или низкой температуры.
В ранних работах по сохранению кукурузной пыльцы (Andronescu, Demetrius I., The physiology of the pollen of Zea mays with special regard to vitality. Thesis for degree of Ph.D. University of Illinois. 1915) сообщалось, что в отсутствие контролируемых внешних условий хранения, пыльца погибает в течение периода времени от двух до четырех часов. При повышении относительной влажности среды хранения, жизнеспособность пыльцы сохранялась в течение 48 часов. Более того, хранение при низкой температуре (например, 8-14°С) обладает стимулирующим эффектом на жизнеспособность пыльцы.
Даже если относительная влажность во время хранения не контролируется, кукурузная пыльца, сохраняемая при низкой температуре (например, 2-7°С в течение 3-120 часов), может более чем удвоить свою прорастаемость in vitro в сравнении с начальной жизнеспособностью до хранения или в сравнении с хранением при 35°С (Pfahler, P.L. and Linskens, H.F., (1973) Planta, 111(3), pp. 253-259; Frova, C.B. and Feder, W.A., (1979) Ann Bot, 43(1), pp. 75-79). Если при хранении пыльцы поддерживаются условия высокой влажности (относительная влажность 90%) и низкой температуры (4°С), прорастаемость кукурузной пыльцы на искусственной среде остается на хорошем либо удовлетворительном уровне на протяжении восьми дней (Sartoris, G.B., (1942) Am J Bot, pp. 395-400). Хранение кукурузной пыльцы в таких условиях в течение восьми дней также позволяет пыльце оставаться фертильной, хотя и на пониженном уровне, и способной образовывать зерна на колосьях после опыления (Jones, M.D. and Newell, L.C., (1948) J Amer Soc Agron 40:195-204).
Полевая подготовка кукурузной пыльцы при высокой влажности и низкой температуре обычно помогает регенерировать пыльцу с низкой жизнеспособностью и/или продлить ее живучесть, в результате чего после опыления колосьев происходит по меньшей мере частичное образование семян. Однако стимулирующее влияние низкотемпературного хранения на фертильность наблюдается не всегда (Walden, D.B., (1967) Crop Science, 7(5), рр. 441-444), и если обезвоживание пыльцы достигает определенного уровня, образование пыльцевой трубки на искусственной среде и кистях нитей рыльца существенно снижается (Hoekstra, FA. (1986) In: Membranes, Metabolism and Dry Organisms. (Ed., AC Leopold), pp. 102-122, Comstock Publishing Associates, Ithaca, NY; Barnabas, В. and Fridvalszky, L., (1984) Acta Bot Hung 30:329-332).
Хотя высокая влажность и низкая температура замедляют ухудшение жизнеспособности при хранении пыльцы зерновых культур, оптимизация этих внешних условий хранения всего лишь откладывает момент полной потери жизнеспособности и фертильности. Для дальнейшего повышения живучести сохраняемой пыльцы с тем, чтобы ее можно было использовать в коммерческих целях для дополнительного опыления с получением улучшенных семян и зерен, требуются иные способы в дополнение к регулированию влажности и температуры.
В некоторых случаях является желательным обработать пыльцу таким образом, чтобы обезводить ее до определенной степени. Обезвоживания можно добиться с помощью сушки при пониженном давлении, или подвергая пыльцу действию такой относительной влажности и температуры (т.е. дефициту давления пара), которые вызывают диффузию воды из пыльцы. Дефицита давления пара, благоприятного для сушки пыльцы, можно достичь разными способами, например с помощью осушителей, механического оборудования, предназначенного для контроля температуры и относительной влажности в закрытой камере, и с насыщенным солевым раствором, содержащимся в закрытом пространстве (Jackson, М.А. and Payne, A.R. (2007) Biocontrol Sci Techn, 17(7), pp. 709-719), Greenspan, L., (1977) J Res Nat Bur Stand, 81(1), pp. 89-96).
2
С целью обезвоживания и сохранения пыльцы сахарного тростника, ее хранили при низкой температуре при пониженном давлении в присутствии небольшого количества CaCl в качестве осушителя (Sartoris, G.B. (1942) Am J Bot, pp. 395-400). Пыльца оставалась сухой в ходе хранения, как и задумывалось, но применение пониженного давления оказалось не таким полезным, как хранение при нормальном атмосферном давлении. Поведение кукурузной пыльцы было очень схоже с пыльцой сахарного тростника. В ходе других прямых попыток обезвоживания пыльцу инкубировали в условиях установленной или зафиксированной относительной влажности и температуры. Эти примеры показывают, что кукурузную пыльцу можно осушить до очень низкого уровня (например, 7-10% содержания воды в пыльце) и при этом она все еще сохраняет способность, хоть и пониженную, к эффективному образованию семян после опыления колосьев (Barnabas, В., et al. (1988) Euphytica, 39(3), рр. 221-225; патент США 5,596,838).
Обезвоживание пыльцы обычно производят перед ее замораживанием и хранением при очень низкой температуре. По отношению к кукурузе практикуют обезвоживание свежей пыльцы в вакуумной камере, инкубаторе влажности или путем простого высушивания воздухом или при небольшом нагревании (патент США 5,596,838; Barnabas, В. and Rajki, Е. (1981). Ann Bot, 48(6), рр. 861-864; Connor, K.F. and Towill, L.E. (1993) Euphytica, 68(1), pp. 77-84). После размораживания после кратковременного или длительного хранения, криосохраненная пыльца может быть жизнеспособной и фертильной, но фертильность сохраняется не всегда, и некоторые представители зерновых культур, такие как кукуруза, сорго, овес и пшеница, зачастую трудно поддаются криосохранению (Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp. 493-494). Одним их объяснений, предложенных для этой резистентности, является избыточное высушивание или старение пыльцы (Collins, F.C., et al. (1973) Crop Sci, 13(4), pp. 493-494). Очевидно, что качество пыльцы может зависеть от преобладающих внешних факторов во время развития цветков, созревания пыльцы и периода цветения (Shivanna, K.R., et al. (1991) Theor Appl Genet 81(1), pp. 38-42; Schoper, J.B., et al. (1987) Crop Sci, 27(1), pp. 27-31; Herrero, M.P. and Johnson, R.R. (1980) Crop Sci, 20(6), pp. 796-800). Пыльца, пережившая подобное воздействие, может демонстрировать пониженную склонность к устойчивости к испытанию высушиванием и замораживанием при криосохранении. Существует потребность в преодолении этой проблемы и в том, чтобы сделать криосохранение пыльцы зерновых культур более достижимым и общеприменимым, а также более предсказуемым и применимым к этому виду пыльцы в коммерческом масштабе.
Известно, что высушивание напрямую влияет на жизнеспособность пыльцы. Было показано (Barnabas (1985) Ann Bot 55:201-204 and Fonseca and Westgate (2005) Field Crops Research 94: 114-125), что свежесобранная кукурузная пыльца может пережить уменьшение изначального влагосодержания на приблизительно 50%, но немногие виды пыльцы демонстрировали жизнеспособность или способность к образованию нормальных пыльцевых трубок после дополнительной потери воды ниже этого уровня. В ранних работах Barnabas и Rajki ((1976), Euphytica 25: 747-752) продемонстрировали что пыльца с пониженным влагосодержанием может сохранять жизнеспособность при криосохранении при -196°С. В последующих работах (Barnabas & Rajki (1981) Ann Bot 48: 861-864) было показано, что такая частично обезвоженная кукурузная пыльца, сохраняемая при -76°С или -196°С также может влиять на фертильность принимающих женских цветков. В данной области техники также известны другие способы хранения пыльцы в течение различных периодов времени, включая лиофилизацию, вакуумное высушивание и хранение в неполярных органических растворителях. Однако ограничения этих технологий сохранения пыльцы вкупе со сложным нетранспортабельным оборудованием, делает невозможным применение этих технологий в отношении больших объемов пыльцы в полевом масштабе.
В патенте США №5,596,838 авторства Greaves, et al., описывается способ хранения пыльцы, включающий уменьшение уровня влажности путем обработки пыльцы пониженным атмосферным давлением перед хранением. По этой технологии готовят небольшие количества пыльцы, такие как количество, собранное с одного растения, для последующего хранения при температуре ниже нуля градусов. Метод по Greaves et al. обладает недостатками. Например, методология и требования механической системы не предоставляют возможности производить пыльцу для хранения в объемах, достаточно больших для коммерческого производства семян или промышленного производства зерна. Эти требования делают объективно невозможной любую перспективу улучшения этой технологии свыше уровня научного исследования. Например, необходимость создания вакуумной камеры, достаточно большой для сохранения пыльцы в производственных полевых масштабах потребует огромной вакуумной камеры, способной быстро изменять уровень давления. Поля производственного уровня обычно имеют размер в акр (0,4 гектара) и более, тогда как поля гибридной продукции обычно имеют размер в 10 акров (4 гектара) и более. Такие поля требуют значительного количества пыльцы и, таким образом, потребуется вакуумная камера большого размера. От камеры по Greaves, et al. потребуется способность создавать давление в 5 Торр (0,67 кПа) или менее, с возможностью быстрого достижения и сброса этого давления. С увеличением физического размера образцов, способность к эффективному циклическому созданию давления в 5 Торр (0,67 кПа) превосходит механические возможности насосов. Кроме того, хранение пыльцы в органических растворителях создает потребность в экологически небезопасных химикатах.
Доступность сохраняемой, жизнеспособной пыльцы позволит преодолеть многие производственные трудности, которые встречаются в индустрии гибридных семян. Как подробно показано в заявке США №15/192,485, принадлежащей заявителю, содержание которой является включенной в настоящую заявку посредством ссылки, в отношении гибридных семян, доступность сохраняемой пыльцы для доставки к женским растениям может избавить от многих стандартных и затратных технологий семенного производства, включая, но не ограничиваясь этим, посадку мужских растений вблизи женских растений для создания возможности гибридизации, изоляцию женских растений от нежелательных источников пыльцы, и применение генетической или механической мужской стерильности женских растений. Эти технологии приводят к чрезвычайному увеличению размеров полей и ресурсов, необходимых для женских растений, производящих семена или зерно. Сокращение или устранение любой из этих технологий приведет к снижению стоимости производства гибридных семян. Более того, сохраняемую пыльцу можно использовать в любое время. В случаях, когда сброс пыльцы с мужских растений и восприимчивость к пыльце женских растений не совпадает с запланированным (вследствие ошибок менеджмента, условий окружающей среды, генетических изменений), применение сохраненной жизнеспособной пыльцы может обеспечить опыление женских растений в оптимальный момент времени. Опыление из нежелательных источников (случайное опыление) или нежелательное самоопыление женских цветков также может быть уменьшено или исключено при условии применения сохраняемой пыльцы необходимого вида в нужное время. В наши дни генетический состав конкретных гибридных семян определяют в начале вегетационного сезона по генотипу производящих пыльцу мужских растений и принимающих пыльцу женских растений, находящихся на одном поле. Однако, с помощью вариантов реализации настоящего изобретения, производитель гибридных семян, в ответ на изменяющиеся требования рынка, может принять решение использовать при опылении другую мужскую пыльцу (т.е. другой генетический материал) для получения более ценных гибридных семян. Кроме того, сохраняемую пыльцу можно применять для привнесения уникальных генетических особенностей или генов, которые улучшают характеристики качества семян до высокопродуктивных женских инбредных гибридов. Например, могут быть привнесены особенности для устойчивости к определенным насекомым-вредителям. Важно отметить, что варианты реализации настоящего изобретения также обеспечивают высокий уровень генетической чистоты гибридных семян. Таким образом, способы улучшения жизнеспособности пыльцы многих видов растений и увеличение продолжительности этой жизнеспособности имеет важное значение для сельскохозяйственной промышленности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 изображено влияние лабораторных условий окружающей среды с температурой 21°С и относительной влажностью 30% на жизнеспособность свежесобранной пыльцы с течением времени.
На Фиг. 2 показано различное влагосодержания свежесобранной с поля пыльцы.
На Фиг. 3 продемонстрирован эффект полевой подготовки пыльцы путем сравнения скорости in vitro прорастания пыльцы сразу после сбора и спустя два часа после периода полевой подготовки.
На Фиг. 4 продемонстрирована средняя процентная доля прорастания четырех генотипов кукурузы после хранения пыльцы в условиях высокой влажности в течение 1 часа при 4°С или 22°С.
На Фиг. 5 показано влияние полевой подготовки на восстановление жизнеспособности пыльцы различных генотипов. Для каждого генотипа показан эффект восстановления в ответ на воздействие высокой влажности и преимущество, которое обеспечивает полевая подготовка при низкой температуре.
На Фиг. 6 показано изменение уровня влагосодержания пыльцы различных генотипов в зависимости от времени суток, когда происходил сбор пыльцы.
На Фиг. 7 изображен уровень влагосодержания пыльцы при условии хранения свежесобранной пыльцы в течение 6 дней при двух различных уровнях давления в условиях высокой влажности.
На Фиг. 8 показано изменение средней процентной доли прорастания пыльцы после хранения свежесобранной пыльцы в течение 6 дней при двух различных уровнях давления в условиях высокой влажности.
На Фиг. 9 продемонстрировано изменение уровня влагосодержания пыльцы среди шести различных генотипов в момент времени ноль и через шесть дней хранения при различных уровнях давления.
На Фиг. 10 изображено изменение средней процентной доли прорастания пыльцы среди шести различных генотипов в момент времени ноль, через 1 день полевой подготовки при нормальном атмосферном давлении, и через шесть дней хранения при различных уровнях давления.
На Фиг. 11 демонстрируется жизнеспособность пыльцы восьми различных генотипов после полевой подготовки при высокой влажности и низкой температуре в момент времени ноль и через 3, 5 и 8 дней хранения при давлении воздуха 101,3 кПа или 67,4 кПа.
На Фиг. 12 изображены графики, демонстрирующие обезвоживающий эффект газообразного азота на уровень влагосодержания кукурузной пыльцы во время четырехчасового периода воздействия, и показано, как обезвоживание пыльцы в различной степени влияет на ее жизнеспособность при хранении в течение 17 дней.
На Фиг. 13А и 13В демонстрируется уровень влагосодержания пыльцы, хранимой при различных уровнях относительной влажности в течение 11 дней.
На Фиг. 14А и 14В демонстрируется жизнеспособность кукурузной пыльцы, хранимой при различных уровнях относительной влажности в течение 11 дней.
На Фиг. 15 изображена рисовая пыльца, хранимая при 4°С и 100% относительной влажности, прорастающая на культуре после 20 часов сохранения.
На Фиг. 16 изображена рисовая пыльца, хранимая при 4°С без контроля относительной влажности, прорастающая на культуре после 20 часов сохранения. Общее прорастание для этой обработки было измерено на уровне 1%.
На Фиг. 17А, 17В и 17С продемонстрированы результаты опыления, проведенного с применением сохраненной пыльцы после периода хранения продолжительностью от 4 часов до 38 дней как указано в Примере 10 и Таблице 3.
На Фиг. 18 изображены окончательные результаты прорастания на среде быстро замороженной и быстро размороженной кукурузной пыльцы. Общее прорастание было оценено как менее 0,5%.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предложен способ сохранения пыльцы нескольких видов растений, включающий сбор свежей пыльцы и помещение ее в контролируемые условия окружающей среды с температурой в интервале от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С и регулируемым давлением воздуха. Такой способ приводит к обезвоживанию пыльцы в контролируемых условиях окружающей среды с достижением уровня влагосодержания пыльцы от приблизительно 15% до приблизительно 35%, после чего с помощью температуры и относительной влажности в контролируемых условиях окружающей среды влагосодержание пыльцы поддерживается на уровне от приблизительно 15% до приблизительно 35%. При необходимости, контролируемые условия по данному способу могут включать поток одного или нескольких постоянно регенерируемых газов, при этом упомянутый газ замещает собой кислород.
Предложен второй способ сохранения пыльцы нескольких видов растений, включающий сбор свежей пыльцы и помещение ее в контролируемые условия окружающей среды с относительной влажностью в интервале от приблизительно 50% до приблизительно 100%, температурой в интервале от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С и давлением воздуха в интервале от приблизительно 15 кПа до приблизительно 150 кПа. Такой способ приводит к обезвоживанию пыльцы в контролируемых условиях окружающей среды с достижением уровня влагосодержания пыльцы от приблизительно 40% до приблизительно 58%, после чего температуру и относительную влажность в контролируемых условиях окружающей среды регулируют как это необходимо для максимизации жизнеспособности и фертильности пыльцы и поддержки влагосодержания пыльцы на уровне от приблизительно 40% до приблизительно 58%. При необходимости, контролируемые условия окружающей среды согласно второму способу могут включать поток одного или нескольких постоянно регенерируемых выбранных газов, при этом упомянутый газ замещает собой кислород в контролируемых условиях окружающей среды и уменьшает влажность.
Варианты осуществления способов по настоящему изобретению включают использование свежей пыльцы, собранной с активно сбрасывающих пыльцу растений или собранной из пыльников путем их размельчения, перемалывания и иного разрушения с целью извлечения пыльцы.
Обезвоживание пыльцы согласно способам по настоящему изобретению может быть достигнуто разными путями, включая, но не ограничиваясь этим, горячую сушку, осушение с помощью насыщенного солевого раствора, сушку силикагелем, сушку с помощью солнца, сушку с помощью микроволн, вакуумную сушку и сушку с применением комбинации из контролируемой влажности и вентиляции.
Контролируемыми условиями окружающей среды согласно вариантам реализации способов по настоящему изобретению, может быть запечатанный контейнер или вентилируемый контейнер. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, контролируемые условия окружающей среды могут быть помещением с контролируемой атмосферой.
Уровень относительной влажности контролируемых условий окружающей среды можно контролировать различными способами, включая применение насыщенного солевого раствора, процесса с двумя давлениями, двухтемпературного процесса, или аппарата, включая генератор температуры конденсации, атомайзер, генератор смешанного потока или ультразвуковой аппарат.
В некоторых вариантах реализации способов настоящего изобретения газ, применяемый для замещения кислорода, является азотом, и концентрация азота в контролируемой атмосфере составляет от приблизительно 78% до приблизительно 100%.
В некоторых вариантах реализации способов настоящего изобретения постоянный, регулируемый, положительный или отрицательный поток воздуха позволяет заменять воздух в контролируемых условиях окружающей среды от 1 до 10 раз в час.
В некоторых вариантах реализации способов настоящего изобретения, перед стадией обезвоживания пыльцы проводится дополнительная стадия ее полевой подготовки. Полевая подготовка пыльцы включает помещение пыльцы в контролируемые условия окружающей среды с относительной влажностью в интервале от приблизительно 50% до приблизительно 100%, температурой в интервале от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С и давлением воздуха в интервале от приблизительно 15 кПа до приблизительно 150 кПа. В процессе этой полевой подготовки начальное влагосодержание пыльцы увеличивается или уменьшается относительно количества влаги в момент ее сбора, до достижения целевого уровня от приблизительно 40% до приблизительно 58%. При необходимости, контролируемые условия полевой подготовки могут включать поток одного или нескольких постоянно регенерируемых выбранных газов, при этом упомянутый газ замещает кислород.
В других вариантах реализации способов настоящего изобретения до стадии обезвоживания пыльцы проводится дополнительная стадия ее полевой подготовки. Полевая подготовка пыльцы включает помещение пыльцы в контролируемые условия окружающей среды с относительной влажностью в интервале от приблизительно 50% до приблизительно 100%, температурой в интервале от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С, давлением воздуха в интервале от приблизительно 15 кПа до приблизительно 150 кПа, и поток одного или нескольких постоянно регенерируемых выбранных газов, при этом упомянутый газ замещает кислород. В процессе этой полевой подготовки, начальное влагосодержание пыльцы увеличивается или уменьшается относительно количества влаги в момент ее сбора, до достижения целевого уровня от приблизительно 50% до приблизительно 57%.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее следует подробное описание варианта реализации технологии и способов по данному изобретению, обеспечивающих улучшенную и продолжительную жизнеспособность собранной пыльцы, включая технологии полевой подготовки пыльцы и применение к ней специализированной технологии сохранения. Пыльца может быть собрана с активно сбрасывающих пыльцу растений или, альтернативным образом, пыльца для полевой подготовки может быть заранее собрана и сохранена согласно одному из многих способов, известных в данной области, для поддержки жизнеспособности пыльцы в течение некоторого времени. Такие способы включают, например, заморозку, лиофилизацию, хранение в жидком азоте и т.д.
С целью полевой подготовки пыльцы для улучшения и продления ее жизнеспособности, пыльцу содержат или переносят в камеру хранения, позволяющую изменение и/или поддержку изменений одного или нескольких следующих параметров: относительной влажности, температуры, атмосферного давления и концентраций газообразных компонентов атмосферы в камере. Для целей данного изобретения, термин "камера" при его употреблении обозначает замкнутое пространство, подходящее для содержания и хранения пыльцы. Камеры могут отличаться размером и материалом изготовления. Камера может быть любого размера, подходящего для содержания определенного количества пыльцы, и может являться любым контейнером, сосудом, закрытым пространством или областью, в которой хранится пыльца, если это место служит в качестве камеры для хранения больших объемов пыльцы. Во всех случаях камера должна быть такой, чтобы в ней можно было регулировать выбранные параметры окружающей среды, такие как, не ограничиваясь этим, температуру, относительную влажность, газовый состав и давление. Камера может быть оборудована вентиляционным отверстием или другими средствами, позволяющими сброс давления из системы и удаления из камеры влаги, удаленной из пыльцы.
Для целей данного изобретения, термин "жизнеспособный" или "жизнеспособность" используется для описания пыльцы, способной прорасти и вырастить пыльцевую трубку длиной по меньшей мере в два диаметра зерна пыльцы. Кроме того, пыльцу можно считать жизнеспособной, если возможно продемонстрировать, что клеточная природа материала не нарушена, и считается целостной, если возможны нормальные процессы метаболизма и внутриклеточного функционирования. Жизнеспособность пыльцы можно оценить рядом способов, включая, но не ограничиваясь этим, оценку роста пыльцевой трубки на искусственной среде или на отделенных рыльцах и пестиках, оценку клеточной целостности по прижизненному окрашиванию ряда сортов, отсутствию утечки электролита (например, калия), и импедансной проточной цитометрии. Жизнеспособная пыльца может успешно прорастать и в целом обладает ярко выраженной необходимостью способствовать оплодотворению и инициации развития семян. Не вся жизнеспособная пыльца является одновременно способной к оплодотворению. В некоторых случаях, даже если зерно пыльцы жизнеспособно и способно к росту пыльцевой трубки, у него может отсутствовать ярко выраженная необходимость достичь семязачатка и способствовать оплодотворению. Нежизнеспособная пыльца не может успешно прорастать. Термин жизнеспособности может относиться к отдельному зерну пыльцы или к популяции зерен пыльцы. Если для описания жизнеспособности пыльцы используют процентное значение, то оно обычно относится к популяции пыльцы.
Другим термином, используемым для описания способности пыльцы к прорастанию и образованию пыльцевой трубки, является «прорастаемость». Таким образом, пыльца с хорошей жизнеспособностью является той, которую желательно применять в соответствии со способами по настоящему изобретению. Термин "окно жизнеспособности" обозначает ограниченный период сохранения жизнеспособности, в течение которого пыльца остается жизнеспособной.
Для целей данного изобретения, термины "плодотворный" или "оплодотворение" используются для описания способности пыльцы доставлять ядра спермия к семязачатку, тем самым вызывая двойное оплодотворение. У цветковых растений термин "двойное оплодотворение" относится к процессу, при котором один из спермиев оплодотворяет яйцеклетку, а другой оплодотворяет центральное ядро зародышевого мешка, в результате первого процесса образуется диплоидная зигота, а в результате второго - эндосперм.
Для целей данного изобретения, термины "потеря жизнеспособности" и "потеря плодотворности" также используются для описания пыльцы. Эти термины соответственно означают, что жизнеспособность и плодотворность пыльцы понизились ниже уровня, необходимого для успешной инициации развития семян. Уровень жизнеспособности и плодотворности, необходимый для успешного опыления, обычно определяется как в среднем 4 зерна свежей пыльцы на семязачаток, или от 4 до 8 зерен сохраненной пыльцы, которая была сохранена согласно способам по настоящему изобретению.
Для целей данного изобретения, термин "живучесть" применяется для описания продолжительности времени, в течение которого пыльца остается как жизнеспособной, так и плодотворной.
Для целей данного изобретения, термин "полевая подготовка пыльцы" или "полевая подготовка" используется для описания процесса, описанного в данной заявке, для обработки свежесобранной пыльцы на поле для поддержания или улучшения ее жизнеспособности, обеспечивая более успешное хранение пыльцы. Успех хранения измеряется в процентах от популяции пыльцы, сохраняющей как жизнеспособность, так и плодотворность в течение периода хранения. Полевая подготовка обычно проводится на поле, где собирают пыльцу, и таким образом полевую подготовку проводят до транспортировки пыльцы в лабораторию или другое место. Это процесс, который производят немедленно после сбора пыльцы. Полевую подготовку можно также проводить в других местах, где выращивают растения и собирают пыльцу, таких как камера роста, теплица, оранжерея, пергола, арочная теплица, вертикальная ферма, гидропонная ферма или на любом другом объекте, где производится выращивание культивированных соцветий, как описано ниже. Полевая подготовка включает намеренное регулирование условий окружающей среды (например, относительной влажности, температуры, газового состава, давления, освещенности, и т.д.) в определенном месте, в котором свежесобранная пыльца содержится сразу же после ее сбора и до транспортировки в любое другое место. Период полевой подготовки может быть кратким, в пределах минут или часов, или же продолжительностью до нескольких дней. Термины "регенерировать" или "регенерация" используются для описания природы пыльцы в течение процесса полевой подготовки. Например, "регенерация" пыльцы в ходе процесса полевой подготовки может включать улучшение одного или нескольких из следующих параметров: жизнеспособность, прорастаемость, или плодотворность пыльцы.
Для целей данного изобретения, термин "хранение" означает любой период содержания пыльцы с целью использования этой пыльцы в будущем. Термин "сохранение" означает любое хранение пыльцы, имеющее результатом такой уровень ее жизнеспособности и/или плодотворности, который отличается от уровня ее жизнеспособности и/или плодотворности, которым она бы обладала при хранении в нерегулируемых условиях окружающей среды. Пыльцу можно при необходимости подвергать полевой подготовке перед хранением или сохранением.
Для целей данного изобретения, термин "женское растение" при его употреблении обозначает растение, которое используется как получатель пыльцы, и которое имеет цветки для оплодотворения. В случае кукурузы и многих других видов растений, растение является однодомным и содержит мужские и женские соцветия на одном и том же растении. В практике разведения, опыления, перекрестного опыления и гибридизации, некоторые растения служат в качестве "мужских растений", с которых собирают пыльцу для использования при опылении, и некоторые растения служат в качестве "женских растений", то есть получателей пыльцы. В случае самоопыления, одно и то же растение служит как "мужским растением", так и "женским растением", поскольку женские цветки оплодотворяются пыльцой из мужских цветков того же растения.
Для целей данного изобретения, термин "свежая" применительно к пыльце означает пыльцу, высвобождаемую из пыльников цветка, который, следуя естественному порядку роста и развития, высвобождает пыльцу путем вскрытия в ответ на соответствующие условия окружающей среды.
Сбор свежей пыльцы можно производить способами, хорошо известными в данной области. Например, пыльцу можно собирать со сбрасывающих пыльцу цветков или структур мужских цветков, полученных различными способами. В случае кукурузы, например, пыльцу собирают с свежесбрасывающих пыльцу мужских цветков, выросших на соцветиях, которые могут находиться на растениях или быть отделенными от них. Пыльца может быть собрана с растений, выращенных в любых условиях внешней среды, подходящих для роста растений. Такие условия среды включают, не ограничиваясь этим, поле, камеру роста, теплицу, оранжерею, перголу, арочную теплицу, вертикальную ферму или гидропонную ферму. Альтернативным образом, пыльца может быть собрана напрямую из пыльников путем размельчения или перемалывания пыльников, тем самым высвобождая пыльцу с целю ее сбора. Кроме того, пыльца может быть собрана в месте культивации соцветий (Pareddy DR, Greyson RI, Walden DB (1989) Production of normal, germinable and viable pollen from in vitro-cultured maize tassels. Theor Appl Genet 77: 521-526.). Культивированные соцветия могут быть взрослыми соцветиями, удаленными с растений в любом месте их выращивания и в любой среде, включая поле и другие типы условий выращивания, и помещенными в воду в контролируемых условиях окружающей среды для сбора пыльцы, или культивированные соцветия могут быть тканью, собранной с цветковых структур на стадии незрелости и затем культивированной для развития в полностью взрослую цветковую структуру или соцветие.
Полевая подготовка и хранение пыльцы могут быть достигнуты при помещении материала в камеру с регулируемыми условиями окружающей среды. Например, для полевой подготовки и/или сохранения собранной пыльцы можно использовать рефрижераторную камеру с контролируемой температурой и возможностью контролировать относительную влажность. Устройство должно также иметь возможность впуска в камеру различных газов или газовых смесей, таких как азот, двуокись углерода и/или кислород. Подобным образом, камерой может являться помещение для хранения больших объемов пыльцы, снабженное механизмом для увлажнения (ультразвуковым, ионизирующим и др.), осушения, регулировки температуры, и позволяющее взятие образцов, наблюдение и регулировку газов и газовых смесей в подаваемом воздухе.
2
2
Пыльцу, предназначенную для полевой подготовки и последующего сохранения и хранения, помещают в условия с высокой относительной влажностью, как указано в различных примерах, включая, но не ограничиваясь этим, пример 4, в котором оценивается влияние относительной влажности на пыльцу. Относительная влажность, например, может иметь любое значение в интервале от приблизительно 75% влажности до приблизительно 100% влажности, включая приблизительно 75%, приблизительно 76%, приблизительно 77%, приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, и приблизительно 100% влажности. В то же самое время, окружающая среда должна иметь относительно низкую температуру, как указано в примерах включая, но не ограничиваясь этим, Пример 4. Относительно низкая температура может иметь, например, любое значение в интервале от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С, включая приблизительно -10°С, приблизительно -9°С, приблизительно -8°С, приблизительно -7°С, приблизительно -6°С, приблизительно -5°С, приблизительно -4°С, приблизительно -3°С, приблизительно -2°С, приблизительно -1°С, приблизительно 0°С, приблизительно 1°С, приблизительно 2°С, приблизительно 3°С, приблизительно 4°С, приблизительно 5°С, приблизительно 6°С, приблизительно 7°С, приблизительно 8°С, приблизительно 9°С и приблизительно 10°С. Полевую подготовку проводят при давлении воздуха в интервале от приблизительно 15 кПа до приблизительно 150 кПа, включая приблизительно 15 кПа, приблизительно 20 кПа, приблизительно 25 кПа, приблизительно 30 кПа, приблизительно 35 кПа, приблизительно 40 кПа, приблизительно 45 кПа, приблизительно 50 кПа, приблизительно 55 кПа, приблизительно 60 кПа, приблизительно 65 кПа, приблизительно 70 кПа, приблизительно 75 кПа, приблизительно 80 кПа, приблизительно 85 кПа, приблизительно 90 кПа, приблизительно 95 кПа, приблизительно 100 кПа, приблизительно 105 кПа, приблизительно 110 кПа, приблизительно 115 кПа, приблизительно 120 кПа, приблизительно 125 кПа, приблизительно 130 кПа, приблизительно 135 кПа, приблизительно 140 кПа, приблизительно 145 кПа, или приблизительно 150 кПа. Окружающие условия полевой подготовки могут включать поток одного или нескольких постоянно регенерируемых, выбранных газов, при этом этот газ замещает собой кислород. Примеры таких условий окружающей среды при полевой подготовке можно найти в Примере 11 и Примере 12. Предполагается, что для этой цели можно использовать много различных газов, включая, но не ограничиваясь этим, инертные газы. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, можно использовать газы, включая азот, диоксид углерода, или их комбинации. В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, можно использовать азот. Более того, концентрация азота (газообразного N) в камере может варьироваться от приблизительно обычного атмосферного содержания до приблизительно 100%, включая приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, и приблизительно 100% азота. Концентрация кислорода (газообразного О) в камере может варьироваться от приблизительно обычного атмосферного содержания до приблизительно 0%, включая приблизительно 21%, приблизительно 20%, приблизительно 19%, приблизительно 18%, приблизительно 17%, приблизительно 16%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1%, и приблизительно 0% кислорода.
Когда пыльца находится в таких условиях окружающей среды с высокой относительной влажностью и относительно низкой температурой, она подвергается полевой подготовке. Период полевой подготовки улучшает здоровье и жизнеспособность пыльцы. После полевой подготовки, пыльцу можно направить на дополнительную обработку для улучшения сохранения, или же отправить на хранение.
С целью достижения определенного уровня относительной влажности, можно использовать ряд средств, известных в данной области техники. Они включают, не ограничиваясь этим, применение таких аппаратов, как генератор температуры конденсации, атомайзер, генератор смешанного потока, ультразвуковой аппарат, или любой другой аппарат для увеличения относительной влажности. Это также может быть достигнуто с помощью процесса с двумя давлениями, двухтемпературного процесса, или с применением насыщенного солевого раствора. Процесс создания влажности с применением двух давлений включает насыщенный водными парам воздух или азот при известной температуре и давлении. Насыщенный воздух высокого давления подается из сатуратора через понижающий давление клапан, где давление воздуха изотермически понижают до нужного давления при нужной температуре. Подобным образом, при двухтемпературном способе воздух циркулирует через сатуратор с точно регулируемой температурой (с водораспылительной или пузырьковой колонной). Воздух насыщается при температуре воды. При выходе из сатуратора воздух проходит через устройство, улавливающее туман, чтобы не допустить выхода из сатуратора воды в жидкой форме. После этого воздух снова нагревается до необходимой температуры сухого термометра. Температура сатуратора должна соответствовать температуре конденсации. Относительную влажность вычисляют по температуре конденсации и температуре сухого термометра (двухтемпературный способ).
Как показано в Примере 1, свежесобранная кукурузная пыльца из восьми различных генетических источников демонстрирует существенную разницу в жизнеспособности, даже будучи собранной в один и тот же день в одинаковых условиях. Пыльца, происходящая из различных генетических источников, отличается способностью переносить температурную нагрузку и дефицит давления паров. Дальнейшие эксперименты с пыльцой, собранной из двух генетически различных источников (см. Пример 2) показали, что свежесобранная пыльца быстро теряет способность успешно прорастать, будучи помещенной в лабораторные условия окружающей среды.
Потеря влаги влияет на жизнеспособность пыльцы, при этом большая потеря влаги вызывает большую потерю жизнеспособности, и иногда даже гибель пыльцы. Скорость потери влаги зависит от ряда факторов, включая, но не ограничиваясь этим, температуру среды, относительную влажность и силу ветра. Гибель пыльцы быстрее всего происходит в горячих и сухих условиях, таких какие бывают при засухе. Помещение пыльцы, теряющей влагу, во внешние условия с высокой относительной влажностью и относительно низкой температурой позволяет пыльце восстановить влагосодержание почти до начального уровня до ее сбора, однако, не приводит к полной остановке метаболической активности пыльцы, сопровождающейся потреблением жизненных ресурсов. Это демонстрируется в Примере 3, где показано улучшение скорости прорастания пыльцы после полевой подготовки при высокой влажности и низкой температуре. Дальнейшие эксперименты продемонстрировали, что полевая подготовка пыльцы при высокой влажности приводит к повышению низкой жизнеспособности в течение одного часа, и особенно полезной была полевая подготовка при низкой температуре.
Скорость удаления влаги из пыльцы прямо влияет на успех сохранения. Описываемый способ позволяет проводить удаление влаги со скоростью, превышающей возможности пониженного давления, который ранее являлся основным способом удаления влаги из пыльцы. Описываемый новый процесс также позволяет менять скорость обезвоживания. Например, вначале можно проводить осушение с высокой скоростью, и затем уровень относительной влажности можно изменить так, чтобы достигнуть целевых 15-30% влагосодержания пыльцы более постепенно. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что обезвоживание ниже уровня 15% влагосодержания пыльцы приводит к намного меньшей жизнеспособности сохраненной пыльцы.
Настоящее изобретение демонстрирует, что жизнеспособность пыльцы может быть сохранена и даже улучшена в результате ее полевой подготовки после сбора. Несмотря на то, что ранее уже было известно, что свежесобранная пыльца зерновых культур поддается хранению, не была продемонстрировано, что последующая за сбором полевая подготовка пыльцы с использованием температуры и влажности может в крупных масштабах улучшить жизнеспособность пыльцы и ее хранение. Крупномасштабность определяется количеством пыльцы в приблизительно 5 граммов и более, включая количества пыльцы, измеряемые в килограммах. Как показано в Примере 4, пыльца в условиях дефицитного давления паров, собранная от ряда инбредных гибридов кукурузы, показала существенное улучшение процентной доли прорастания после краткой полевой подготовки. Обработка в ходе полевой подготовки служит для «спасения» испытывающих стресс, обезвоженных зерен пыльцы, тем самым поворачивая вспять процесс потери жизнеспособности и улучшая способность к прорастанию. Как описано в Примере 4, полевая подготовка испытывающих стресс зерен пыльцы при 100% относительной влажности улучшает прорастание в среднем на 21%. С добавлением холодной обработки при 4°С синергетический эффект приводит к повышению прорастания на 33%. Эффект от полевой подготовки был заметен в течение часа. Горячие, сухие условия, типичные для сброса пыльцы на полях, способствуют более быстрой потере воды и гибели пыльцы. Комбинированная обработка высокой относительной влажностью при низкой температуре замедляет метаболизм пыльцы при сохранении уровня влагосодержания, тем самым продлевая ее жизнеспособность.
После того, как был установлен способ полевой подготовки пыльцы, дальнейшие эксперименты были направлены на определение оптимальных условий для хранения пыльцы, прошедшей полевую подготовку.
После полевой подготовки, пыльцу можно направить на дополнительную обработку для улучшения сохранения, или же отправить на хранение. При необходимости, пыльцу можно подвергнуть полевой подготовке и после этого использовать для опыления.
Пыльцу можно подвергнуть дополнительным процедурам обработки для улучшения сохранения с целью повышения ее способности к сохранению жизнеспособности и плодотворности в период хранения. Для максимального улучшения здоровья и жизнеспособности пыльцы, предпочтительно проводить полевую подготовку пыльцы, как было описано ранее, перед такими дополнительными процедурами по улучшению сохранения или хранения. Подготовка пыльцы к хранению требует точного соблюдения процесса, включая создание окружающей среды с известной относительной влажностью, а также определенной температурой и атмосферным давлением. Кроме того, максимально успешному хранению помогает присутствие соответствующих газов.
Для начала из пыльцы необходимо удалить некоторое количество влаги, чтобы максимально способствовать жизнеспособности и плодотворности пыльцы, как показано в Примере 8, и это особенно важно перед долговременным криогенным хранением. Установление условий окружающей среды с известной относительной влажностью служит постепенному удалению воды их пыльцы, то есть действует как осушающий агент. В идеальном случае, относительная влажность в условиях осушения должна иметь значение в интервале от приблизительно 0% до приблизительно 30% относительной влажности, включая приблизительно 0%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7%, приблизительно 8%, приблизительно 9%, приблизительно 10%, приблизительно 11%, приблизительно 12%, приблизительно 13%, приблизительно 14%, приблизительно 15%, приблизительно 16%, приблизительно 17%, приблизительно 18%, приблизительно 19%, приблизительно 20%, приблизительно 21%, приблизительно 22%, приблизительно 23%, приблизительно 24%, приблизительно 25% приблизительно 26%, приблизительно 27%, приблизительно 28%, приблизительно 29%, и приблизительно 30% влажности. Чем ниже уровень относительной влажности, тем быстрее происходит удаление влаги из пыльцы. Влагосодержание полностью гидратированной пыльцы обычно составляет приблизительно 60%. Целевое влагосодержание пыльцы перед криогенным хранением находится в интервале от приблизительно 15% до приблизительно 35%, включая приблизительно 35%, приблизительно 34%, приблизительно 33%, приблизительно 32%, приблизительно 32%, приблизительно 30%, приблизительно 29%, приблизительно 28%, приблизительно 27%, приблизительно 26%, приблизительно 25%, приблизительно 24%, приблизительно 23%, приблизительно 22%, приблизительно 21%, приблизительно 20%, приблизительно 19%, приблизительно 18%, приблизительно 17%, приблизительно 16% и приблизительно 15%. Относительную влажность можно регулировать с течением времени, тем самым ускоряя или замедляя процесс сушки. В полевых условиях пыльца, теряющая влагу ниже уровня 30%, полностью теряет жизнеспособность в отношении in vitro прорастания (Fonseca and Westgate (2005) Field Crops Research 94: 114-125). В противоположность этому, в соответствии с настоящим изобретением, плодотворность и жизнеспособность пыльцы поддерживается при понижении влагосодержания пыльцы в холодных условиях, в такой окружающей среде, которая позволяет достичь целевого уровня влагосодержания пыльцы. Критическим фактором является очень тщательно контролируемый процесс высушивания, который невозможно провести в полевых условиях.
Процесс снижения влагосодержания пыльцы можно проводить при различных температурах в интервале от -10 до 25°С.
Добавление обработки определенным давлением показало, что жизнеспособность пыльцы при хранении с высокой влажностью при низкой температуре можно улучшить при использовании определенного давления, которое в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ниже атмосферного давления. Эта концепция продемонстрирована на Примерах 5, 6, и 7. В частности, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, использование пониженного давления приводит к уменьшению и/или предотвращению окислительного стресса пыльцы и, таким образом, повышению ее жизнеспособности. Примеры 5-7 ниже показывают, что жизнеспособность пыльцы при хранении при высокой влажности и низкой температуре иногда улучшается, если пыльца к тому же хранится при давлении ниже атмосферного. Как понятно специалистам в данной области, оптимальное давление (отрицательное или положительное) может быть различным в зависимости от вида пыльцы и ее генетических видовых особенностей. Более того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения оптимальным может быть использование пониженного давления, тогда как в других вариантах реализации настоящего изобретения оптимальным может быть давление на уровне атмосферного или выше. Эксперименты на основе примеров, приведенных ниже, позволят оптимизировать давление для максимальной жизнеспособности сохраняемой пыльцы.
В случае кукурузы, например, оптимальным является хранение при давлении от приблизительно 15 кПа до 150 кПа, как показано в Примере 6. Более того, хранение при пониженном давлении на уровне приблизительно от 67 кПа до 94 кПа может быть наиболее оптимальным, включая давления приблизительно 67 кПа, 68 кПа, 69 кПа, 70 кПа, 71 кПа, 72 кПа, 73 кПа, 74 кПа, 75 кПа, 76 кПа, 77 кПа, 78 кПа, 79 кПа, 80 кПа, 81 кПа, 82 кПа, 83 кПа, 84 кПа, 85 кПа, 86 кПа, 87 кПа, 88 кПа, 89 кПа, 90 кПа, 91 кПа, 92 кПа, 93 кПа, и 94 кПа. В некоторых экспериментах, включая Пример 6 ниже, пониженное давление приблизительно 84,3 кПа способствует жизнеспособности пыльцы, которая приблизительно вдвое превышает жизнеспособность при хранении при атмосферном давлении. Соответственно, хранение при пониженном давлении, в сочетании с повышенной влажностью и низкой температурой, улучшает жизнеспособность пыльцы. Более того, хранение при пониженном давлении может сохранить повышенную жизнеспособность на всем протяжении сохранения и хранения, и позволяет хранить пыльцу длительное время для последующего использования. Конечно, оптимальные условия давления и улучшение жизнеспособности пыльцы могут различаться между видами растений, и между различными генотипами внутри одного вида.
Также, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, регулировка начального влагосодержания пыльцы может предоставить преимущество, как показано ниже в Примере 8. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения, обезвоживание пыльцы перед хранением улучшает жизнеспособность хранимой пыльцы. Типичное влагосодержание свежей пыльцы составляет приблизительно 60%. Более того, обезвоживание пыльцы во время полевой подготовки, комбинированное со специфической относительной влажностью во время хранения, может обеспечить оптимальные условия хранения пыльцы для предотвращения и/или уменьшения потери ее жизнеспособности. Равновесное влагосодержание хранимой пыльцы может быть оптимизировано для поддержки жизнеспособности и/или ее замедленной потери. В некоторых примерах с кукурузной пыльцой, равновесное влагосодержание на уровне приблизительно 45%, приблизительно 46%, приблизительно 47%, приблизительно 48%, приблизительно 49%, приблизительно 50%, приблизительно 51%, приблизительно 52%, приблизительно 53%, приблизительно 54%, приблизительно 55%, приблизительно 56%, приблизительно 57%, и/или приблизительно 58% может поддерживать жизнеспособность и/или замедлять ее потерю. Более того, было показано, что стремление к оптимизированному равновесному влагосодержанию обеспечивает лучшие результаты по сравнению с простым хранением пыльцы в условиях высокой влажности.
2
2
Добавление газов, таких как азот (N) или диоксид углерода (СО), служит нескольким целям при подготовке пыльцы для хранения, как показано в Примерах 10, 11, и 12 ниже. Во-первых, газы служат в качестве осушающих агентов. Влагосодержание этих газов обычно ниже 1,0%. Постоянный поток газа в камеру хранения пыльцы обеспечивает удаление из системы влаги, высвобождаемой из пыльцы. Также газы служат для замещения кислорода в камере. Кислород необходим для метаболической активности пыльцы и способствует накоплению активных форм кислорода (АФК). Понижение метаболической активности помогает полевой обработке пыльцы и подготовке к ее хранению.
Камера, содержащая пыльцу, предназначенную для хранения, подвергается положительному давлению, или потоку обработанного воздуха в камеру. Это давление можно устанавливать посредством нагнетания обработанного воздуха в камеру, как показано в Примерах 10, 11, и 12. Положительное давление потока обработанного газа может понизить, повысить или поддержать влагосодержание пыльцы, и в дальнейшем может понизить, повысить или поддерживать влажность в камере, обеспечивая тщательный контроль уровня относительной влажности (OB). ОВ и температуру воздуха можно устанавливать с помощью любой комбинации осушителей, солевых растворов, подогрева, или другими способами для максимизации эффективности контроля осушения пыльцы.
На стадии осушения пыльцы с 15 до 35% влагосодержания, температура воздуха в камере хранения пыльцы поддерживалась на уровне от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С, включая приблизительно -10°С, приблизительно -°С, приблизительно -8°С, приблизительно -7°С, приблизительно -6°С, приблизительно -5°С, приблизительно -4°С, приблизительно -3°С, приблизительно -2°С, приблизительно -1°С, приблизительно 0°С, приблизительно 1°С, приблизительно 2°С, приблизительно 3°С, приблизительно 4°С, приблизительно 5°С, приблизительно 6°С, приблизительно 7°С, приблизительно 8°С, приблизительно 9°С и приблизительно 10°С. Этого можно достигнуть, помещая камеру в охлажденную комнату или впуская в камеру охлажденный различными способами воздух.
При необходимости, в течение периода осушения пыльцу в камере можно механически перемешивать. Перемешивание обеспечивает максимальный контакт поверхности пыльцы с воздухом в камере, тем самым обеспечивая более равномерное осушение пыльцы и предотвращая ее слипание. Это можно осуществить разными способами, включая вибрацию, поток воздуха, вращение и т.д.
По достижении оптимального влагосодержания от 15 до 35%, пыльцу можно отправлять на хранение. Хранение можно осуществить помещением камеры с пыльцой в жидкий азот, заморозив до температуры в интервале от -80°С до 0°С, в холодильнике, или при атмосферных условиях. Выбор условий для хранения пыльцы может зависеть от того, как скоро ее планируется использовать.
Как было подробно объяснено в предыдущих параграфах, максимизация и продление жизнеспособности пыльцы согласно описанным способам требует тщательного регулирования ряда факторов в определенных интервалах. Данные лабораторных исследований кукурузной пыльцы в качестве образца показали, что условия для улучшения жизнеспособности пыльцы, включая изменения одного или нескольких условий в камере, попадают в интервалы, указанные ниже.
Относительная влажность в камере, содержащей пыльцу, может поддерживаться на любом уровне в интервале от приблизительно 75% влажности до приблизительно 100% влажности, включая приблизительно 75%, приблизительно 76%, приблизительно 77%, приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, и приблизительно 100% влажности.
Температура в камере, содержащей пыльцу, может поддерживаться на уровне от приблизительно -10°С до приблизительно 10°С, включая приблизительно -10°С, приблизительно -9°С, приблизительно -8°С, приблизительно -°°С, приблизительно -6°С, приблизительно -5°С, приблизительно -4°С, приблизительно -3°С, приблизительно -2°С, приблизительно -1°С, приблизительно 0°С, приблизительно 1°С, приблизительно 2°С, приблизительно 3°С, приблизительно 4°С, приблизительно 5°С, приблизительно 6°С, приблизительно 7°С, приблизительно 8°С, приблизительно 9°С и приблизительно 10°С.
2
Концентрация кислорода (газообразного О) в камере может изменяться от приблизительно нормального атмосферного содержания до приблизительно 0%, включая приблизительно 21%, приблизительно 20%, приблизительно 19%, приблизительно 18%, приблизительно 17%, приблизительно 16%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2%, приблизительно 1%, и приблизительно 0% кислорода.
2
Концентрация азота (газообразного N) в камере может изменяться от приблизительно атмосферного содержания до приблизительно 100%, включая приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, и приблизительно 100% азота.
2
Также, атмосферное давление и концентрация диоксида углерода (газообразного СО) в камере может изменяться для улучшения жизнеспособности, как указано ниже. Атмосферное давление в камере может изменяться таким образом, чтобы поддерживать строгий контроль уровня влажности. Также, изменение давления воздуха позволяет предотвращать окисление пыльцы. Соответствующее атмосферное давление находится в интервале от приблизительно 15 кПа до приблизительно 150 кПа, включая приблизительно 15 кПа, приблизительно 20 кПа, приблизительно 25 кПа, приблизительно 30 кПа, приблизительно 35 кПа, приблизительно 40 кПа, приблизительно 45 кПа, приблизительно 50 кПа, приблизительно 55 кПа, приблизительно 60 кПа, приблизительно 65 кПа, приблизительно 70 кПа, приблизительно 75 кПа, приблизительно 80 кПа, приблизительно 85 кПа, приблизительно 90 кПа, приблизительно 95 кПа, приблизительно 100 кПа, приблизительно 105 кПа, приблизительно ПО кПа, приблизительно 115 кПа, приблизительно 120 кПа, приблизительно 125 кПа, приблизительно 130 кПа, приблизительно 135 кПа, приблизительно 140 кПа, приблизительно 145 кПа, или приблизительно 150 кПа.
2
2
Концентрация СО в камере может изменяться от приблизительно атмосферного содержания (приблизительно 0,04%) до приблизительно 100%, включая приблизительно 1%, приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, и приблизительно 100% CO.
Следуя изменениям условий внутри камеры, пыльцу в течение некоторого времени содержат в определенных условиях для улучшения ее жизнеспособности, и как результат, продления ее жизнеспособности. Даже короткая полевая подготовка продолжительностью, включая, но не ограничиваясь этим, 60 минут, может улучшить жизнеспособность пыльцы и увеличить окно жизнеспособности. Первые лабораторные результаты продемонстрировали значительное улучшение общей жизнеспособности кукурузной пыльцы более чем в четыре раза для многих генотипов после 24 часов в условиях полевой подготовки (см. Пример 3). Кроме того, с применением полевой подготовки увеличилось окно жизнеспособности кукурузной пыльцы. Лабораторные результаты показали, что у кукурузной пыльцы, обычно обладающей окном жизнеспособности продолжительностью менее 2 часов, после обработки согласно способам по настоящему изобретению окно жизнеспособности увеличилось до приблизительно 17 дней (Пример 8).
Соответственно, в одном оптимальном варианте реализации настоящего изобретения, пыльцу можно собирать с активно сбрасывающих пыльцу растений и помещать в камеру хранения. В камере хранения может быть постоянный поток газообразного азота. В камере хранения регулируется целевое влагосодержание пыльцы, например приблизительно 30%. По мере снижения влагосодержания пыльцы, температуру в камере можно медленно понижать, например до приблизительно -5°С. Предпочтительным образом регулирование температуры производят без заморозки пыльцы. Подобным образом, уровень относительной влажности в камере также может быть отрегулирован для повышения или понижения скорости обезвоживания пыльцы. Если необходимо стабилизировать конечное влагосодержание пыльцы на уровне приблизительно 30%, то относительную влажность в камере можно повысить. В оптимальном случае этот процесс завершается приблизительно за 100 минут, однако без выхода за рамки настоящего изобретения успешно могут использоваться и другие периоды времени.
Пыльцу, подвергнутую обработке таким способом, можно использовать для любого назначения, при котором пыльца является коммерческим или экспериментальным объектом. В одном примере, пыльцу, подвергнутую полевой подготовке и сохранению, можно использовать для получения гибридных, исходных или других семян в любых условиях, включая, но не ограничиваясь этим, лабораторию, теплицу, или полевые условия. В другом примере, пыльцу, подвергнутую полевой подготовке и сохранению можно использовать для получения зерна, гибридного или любого другого, в любых условиях, включая, но не ограничиваясь этим, лабораторию, теплицу, или полевые условия. Более того, как было описано выше, такой способ можно применять к пыльце растений семейства злаковых (Gramineae) так же, как и многих других видов растений, если есть необходимость в полевой подготовке и сохранении их пыльцы.
Технология полевой подготовки и сохранения, описанная в этом изобретении, предназначена для успешной обработки и сохранения пыльцы с тем, чтобы пыльца, прошедшая полевую подготовку и/или сохранение, сохраняла свою жизнеспособность до такой степени, чтобы от приблизительно 4 до приблизительно 20 зерен пыльцы было достаточно для успешного опыления и развития эмбриона.
Как было указано выше, хотя настоящее изобретение применимо к кукурузе, оно также применимо к хранению и сохранению всех типов пыльцы. В другом примере реализации было показано успешное сохранение рисовой пыльцы, как описано в Примере 9 ниже. В частности, в приведенном Примере, рисовую пыльцу сохраняли при 4°С и 100% относительной влажности в течение 20 часов. Сохраненная пыльца показала степень прорастания в 25%, что доказывает, что способы по настоящему изобретению применимы к другим видам растений. Более того, с использованием экспериментальных способов, описанных в настоящем изобретении, специалист в данной области может оптимизировать их применительно к необходимому виду пыльцы. Нижеследующие примеры подробно иллюстрируют настоящее изобретение и показывают, как описанное изобретение можно применять к кукурузе.
Пример 1. Влияние генотипа на здоровье пыльцы
3
3
2
2
Эксперимент был проведен для определения влияния генотипа растения на жизнеспособность и общее здоровье свежесобранной пыльцы. Свежую пыльцу собрали с выращенной на поле кукурузы восьми различных генотипов в Grimes, IA приблизительно в 11:30 14 августа 2016 года. Генотипы были выбраны таким образом, чтобы представлять широкий набор гетерозисных групп кукурузы, известных в области селекции кукурузы. Соцветия растений энергично вычистили от прилипших пыльников и пыльцы в 9:00 того же дня. Пыльцу из соцветий приблизительно 10 растений разных генотипов собрали каждую в отдельный бумажный мешок. Пыльцу очистили от мусора просеиванием через сито (пористостью 150 микрон) и немедленно подвергли полевой подготовке при 4°С в течение 80 минут. Полевая подготовка включала распределение тонкого слоя пыльцы на дно 15 см чашки Петри, предварительно охлажденной с помощью увлажненной водой промокательной бумаги в верхней половине чашки. После полевой подготовки, пыльцу в каждой чашке Петри осторожно перемешали для придания гомогенности, и небольшую часть взяли для анализа на жизнеспособность. Для оценки жизнеспособности использовали in vitro прорастание путем инкубации пыльцы на искусственной среде (438 mM сахарозы, 1,6 mM НВО, 3,0 mM CaCl-HO) в течение часа при 22°С. Анализ проводили дважды. Прорастание оценили с помощью микроскопа как количество зерен пыльцы с пыльцевыми трубками длиной более диаметра самого зерна из случайного образца, содержащего обычно 200 зерен.
На жизнеспособность пыльцы могут влиять много факторов, включая генотип. Как показано в Таблице 1, жизнеспособность пыльцы среди восьми различных генотипов кукурузы существенно отличается, приблизительно в два раза, при взятии образцов в один и тот же день. По сообщениям, генетические линии кукурузы демонстрируют большую разницу в переносимости пыльцой стресса, особенно стресса от нагревания и дефицита давления паров, что приводит к обезвоживанию. По этим причинам при оценке способов сохранения пыльцы, важно разграничивать колебания жизнеспособности из-за генетических различий и те, которые вызваны другими факторами, такими как способы обращения и условия хранения. Не менее важно оценивать более одного генотипа при определении наилучшего способа хранения пыльцы.
Пример 2. Влияние лабораторных условий на здоровье пыльцы
Эксперимент был проведен для определения влияния лабораторных условий окружающей среды на жизнеспособность свежесобранной пыльцы. Свежую пыльцу собрали с соцветий растений, выращенных в теплице, и поместили в естественные условия окружающей среды в лаборатории. Пыльца представляла два несвязанных генотипа кукурузы, Yukon Chief и Silver Choice, для предотвращения преждевременных выводов на основе только генетического материала. Сразу после сбора пыльцу отделили от мусора путем просеивания через сито (пористость 150 микрон) и тонким слоем поместили на лист бумаги на лабораторном столе. Пыльцу оставили в этих условиях, не принимая никаких мер по контролю температуры и относительной влажности среды в лаборатории, которые составляли 21-23°С и 30-34%, соответственно, в течение всего эксперимента. Пыльцу перемешали для гомогенности и брали образцы для измерения жизнеспособности через 0, 1, 2, 3 и 23 часа после начала эксперимента. In vitro измерения проводили, как было описано в Примере 1, используя случайный образец размером приблизительно 100 зерен на одно измерение. Результаты показаны на Фиг. 1.
Доля прорастания Yukon Chief быстро уменьшалась по мере нахождения в лабораторных условиях окружающей среды, начиная с 88% и снижаясь до 4% в течение 3 часов. Через 23 часа среди зерен пыльцы наблюдались лишь следовые количества прорастания. Пыльца Silver Choice следовала той же схеме, с той разницей, что в момент времени 0 значение прорастания было ниже, чем жизнеспособность через час после начала эксперимента. Значение жизнеспособности в начальный момент времени предположительно является недостоверным.
Лабораторные условия окружающей среды были очень неблагоприятны для поддержки жизнеспособности пыльцы двух проверенных генотипов. Известно, что температурный стресс у кукурузной пыльцы обычно наблюдается при превышении температуры 35°С и, так как температура в лаборатории составляла 21-23°С, наиболее вероятно, что быстрая потеря жизнеспособности этими образцами была вызвана относительной влажностью, вызвавшей быстрое обезвоживание пыльцы в течение трех часов. Известно, что обезвоживание негативно влияет на жизнеспособность, и иногда на плодотворность кукурузной пыльцы.
Пример 3. Полевая подготовка пыльцы: холод и высокая относительная влажность
Эксперимент был проведен для определения того, может ли жизнеспособность собранной на поле пыльцы быть улучшена путем компенсации негативного влияния обезвоживания, вызванного стрессом дефицита давления паров. Свежую пыльцу собрали с выращенных на поле растений восьми генотипов в Grimes, IA, приблизительно в 13:45 10 августа 2016 года. Температура и относительная влажность окружающей среды во время сбора составляли 31,7°С и 72%, соответственно. Генотипы были выбраны таким образом, чтобы представлять широкий набор гетерозисных групп, известных в области селекции кукурузы, и включали гибридные и инбредные линии. Время сбора после полудня было выбрано намеренно, поскольку в это время при повышенной температуре и пониженной относительной влажности дефицит давления паров обычно более неблагоприятен для здоровья пыльцы по сравнению с более ранним временем суток. Соцветия растений энергично вычистили от слабо держащихся пыльников и пыльцы в 9:00 того же дня и каждое последовательно накрыли бумажным мешком. Накрыли по меньшей мере шесть растений каждого генотипа. При сборе соцветия стряхивали в мешки, и собранный в мешках материал каждого генотипа просеивали через сито (пористость 150 микрон) для сбора пыльцы. Каждый генетический образец тщательно перемешивали для достижения гомогенности. Анализ на in vitro прорастание провели незамедлительно на поле путем взятия образцов пыльцы каждого генотипа (анализ описан в Примере 1). Кроме того, каждый генотип проанализировали на влагосодержание пыльцы (ВСП), которое было вычислено после взвешивания 50-100 мг пыльцы до и после сушки при 104°С в течение 24 часов. Собранную пыльцу быстро направили на полевую подготовку и выдерживали в течение 120 минут, после чего снова провели анализ на in vitro прорастание, как было описано в Примере 1. Для каждого генотипа провели каждый раз по одному анализу с использованием приблизительно 335 зерен пыльцы в каждом анализе.
Свежая кукурузная пыльца обычно имеет значение ВСП приблизительно 60%, но в этом эксперименте значения ВСП свежесобранной пыльцы колебались в пределах 22,8 -46,9%, со средним значением 35,4% (Фиг. 2). Условия окружающей среды во время сбора пыльцы, 31,7°С и 72% относительной влажности, привели к дефициту давления паров, вызвавшему ослабление связи пыльцы с соцветиями и дегидратацию. Различия ВСП из-за генетических различий свежесобранной пыльцы были очевидны, и подобным образом сообщались другими исследователями.
Пыльцу всех генотипов проверили на in vitro прорастание сразу после сбора и еще раз после двухчасовой полевой подготовки при приблизительно 4°С и 100% относительной влажности. На Фиг. 3 показано, что в момент времени 0, до полевой подготовки, прорастание пыльцы было на уровне менее 10% для всех генотипов, но через два часа инкубирования при высокой влажности и низкой температуре жизнеспособность пыльцы для многих генотипов увеличилась более чем в четыре раза. Жизнеспособность обезвоженной пыльцы некоторых генотипов была восстановлена в большей степени, чем других, но как правило полевая подготовка пыльцы, испытывающей стресс, улучшила ее способность к прорастанию и формированию пыльцевых трубок, необходимых для оплодотворения семязачатков и формирования семян. Компенсация негативного влияния стресса и дегидратации на жизнеспособность и плодотворность пыльцы с помощью полевой подготовки может играть важную роль при хранении пыльцы и подготовке к ее применению для опыления с целью улучшения чистоты и выхода семян в соответствующей области сельского хозяйства.
Пример 4. Полевая подготовка пыльцы: сравнение влияния температуры и относительной влажности
Эксперимент был проведен для определения влияния охлаждения и высокой относительной влажности на восстановительный эффект, описанный в Примере 3, и для определения скорости наступления этого эффекта. Свежую пыльцу собрали с выросших на поле растений кукурузы четырех различных генотипов (Мо17, С103, ААТН1, ААТН3) в Slater, IA 27 июля 2016 года. Генотипы были выбраны таким образом, чтобы представлять различные идиоплазмы кукурузы, и включали гибридные и инбредные линии. Соцветия растений энергично вычистили от слабо держащейся пыльцы, закрыли мешками, собрали пыльцу как было описано в Примере 3. Анализы на in vitro прорастание немедленно провели на поле и взяли образцы на ВСП как было описано в Примере 3. Сразу после сбора, пыльцу подвергли полевой подготовке, используя тонкие слои пыльцы на гидратированных 6 см чашках Петри, как было описано в Примере 1. Образцы подвергали полевой подготовке на поле при 4°С или 22°С в течение двух часов. Каждый час брали образцы пыльцы для анализа на in vitro прорастание, как было описано в Примере 1. Каждый раз для одного генотипа делали один анализ, в котором использовали приблизительно 206 зерен пыльцы.
Полевую подготовку пыльцы проводили с одной высокой относительной влажностью (приблизительно 100%) и при двух температурах инкубации. Факториальная схема обработки с уровнем относительной влажности при полевой подготовке была невозможна в месте проведения эксперимента. Поэтому в ходе эксперимента изучали, как полевая подготовка при высокой влажности влияет на жизнеспособность пыльцы по сравнению с ее начальным уровнем (т.е. в момент сбора пыльцы) и имеет ли место преимущество при комбинации высокой влажности и низкой температуры.
ВСП в момент сбора находилось в пределах от 51,9% до 59,2%, то есть ни один из гибридов или инбредных гибридов не демонстрировал сильной дегидратации или стресса. Средняя жизнеспособность пыльцы четырех генотипов в ходе обработки показана на Фиг. 4. При начале полевой подготовки гидратация пыльцы была на уровне от хорошего до отличного, но жизнеспособность была немного понижена, что видно по средней доле прорастания пыльцы in vitro на уровне 39%. Через 60 минут или менее, при «нормальной» температуре (22°С), в результате гидратации свежей пыльцы прорастание повысилось в среднем на 21%. Гидратация с холодной обработкой (4°С) повысила прорастание в среднем на 33%. В целом, полевая подготовка пыльцы повысила ее низкую жизнеспособность в течение часа, в первую очередь благодаря высокой влажности, но также дополнительное преимущество принесло хранение при низкой температуре.
Подробности влияния полевой подготовки на восстановление жизнеспособности пыльцы показано для каждого генотипа на Фиг. 5. В целом, снова очевидна важность проверки нескольких генотипов пыльцы с тем, чтобы получить более полную картину влияния процессов полевой подготовки и хранения на кукурузную пыльцу. Генотипические различия наблюдались в отношении (а) жизнеспособности в момент сбора пыльцы (например, С103 vs. ААТН1), (б) восстановления при воздействии высокой влажности (например, Mo 17 vs. С103) и (в) преимущества, полученного в результате полевой подготовки при низкой температуре (например, Мо17 vs. С103). Несмотря на генетическое различие, почти во всех случаях жизнеспособность свежей пыльцы возможно улучшить при кратковременном хранении при высокой влажности и низкой температуре.
Пример 5. Полевая подготовка пыльцы: вакуумная обработка
Проведенные эксперименты показали, что существует возможность сбора пыльцы в неблагоприятных условиях окружающей среды и улучшения ее жизнеспособности путем полевой подготовки в условиях специфической температуры и относительной влажности. Было теоретически предположено, что окислительный стресс может быть ответственным за ухудшение прорастаемости при хранении пыльцы в течение нескольких дней. Были проведены эксперименты по удалению кислорода из окружающей среды при хранении пыльцы, с целью определения влияния этого фактора на увеличение продолжительности срока хранения жизнеспособной пыльцы. Бескислородные условия были получены с помощью пониженного давления.
Свежую пыльцу собрали с выращенных на поле растений кукурузы девяти разных генотипов (В14, С103, SQ, В37, 207, LH162, ААТН1, ААТН3) в промежутке времени между 9:45 и 13:10 в Slater, IA 22 июля 2016 года. Генотипы были выбраны таким образом, чтобы представлять широкий набор гетерозисных групп, известных в области селекции кукурузы, и включали гибридные и инбредные линии. Пыльца гибрида ААТН1 была собрана с растений, росших на двух различных участках поля. Соцветия растений энергично вычистили от слабо держащейся пыльцы и накрыли мешками в предыдущий вечер перед днем использования. Пыльцу собрали как было описано в Примере 3.
Образец каждого генотипа проанализировали на ВСП сразу после сбора. ВСП измеряли как было описано в Примере 3. Образец каждого генотипа затем разделили на две части и быстро поместили тонким слоем на нижнюю половину 6 см чашки Петри. Каждую чашку свободно накрыли промокательной бумагой (Kimwipe). Накрытые чашки поместили на полку 3,78-литровой стальной вакуумной камеры. На дне каждой камеры находилось 200 мл предварительно охлажденной воды. Каждая камера был накрыта акриловой крышкой, плотно закрепленной резиновыми полосками или пониженным давлением. Одну половину каждого образца пыльцы поместили в камеру с атмосферным давлением (101,3 кПа) или в условия пониженного давления (давление 50,5 кПа). Камеры были окружены льдом в охлаждающих емкостях, в то время как образцы были собраны в поле и перенесены в инкубаторы с температурой 5°С в лаборатории. После хранения в течение шести дней камеры открыли, образцы пыльцы перемешали до гомогенности и взяли образцы для определения ВСП и анализов на in vitro прорастание, как было описано в Примере 1. Для каждого генотипа делали один анализ, в котором использовали приблизительно 298 зерен пыльцы.
Пыльца была сильнее обезвожена, так как ее собирали в более позднее время суток (Фиг. 6). Этот эффект наблюдался как в экспериментах авторов изобретения, так и у других исследователей (Kaefer, К.А.С., et al. (2016) Afr J Agr Res, 11(12), pp. 1040-104). При хранении в течение шести дней при высокой влажности, большинство образцов не смогли гидратироваться до значительной степени, особенно те, которые были сильно обезвожены в момент времени 0 (см. Фиг 6 и 7). Таким образом, пыльца некоторых генотипов (например, В37, ААТН1, ААТН3) испытывала стресс до и во время хранения, и не продемонстрировала прорастания вне зависимости от давления при хранении. Для других генотипов ВСП после хранения находилось в пределах 45-55% и пыльца оставалась жизнеспособный в течение 6 дней (Фиг. 7, 8). Хранение при низком давлении делает пыльцу в среднем немного суше. Наблюдается значительная разница во влиянии давления на ВСП в зависимости от генотипа и начального ВСП. Среди образцов, жизнеспособных после 6 дней хранения, прорастание пыльцы было немного выше в случае хранения при пониженном давлении и уровне кислорода (Фиг. 8). И снова влияние обработки отличалось в зависимости от генотипа, но данные показали, что жизнеспособность при хранении с высокой влажностью и при низкой температуре в целом улучшается, если давление при хранении ниже атмосферного.
Пример 6. Полевая подготовка пыльцы: титрование пониженного давления
После однозначного установления преимущества хранения пыльцы под пониженным давлением, были проведены эксперименты по определению уровня пониженного давления, необходимого для максимального сохранения жизнеспособности пыльцы.
Свежую пыльцу собрали с выращенных на поле растений кукурузы шести различных генотипов (ОН43, Мо17, С103, Н99, LH162, OQ101) между 10:30 и 13:10 в Slater, IA 20 июля 2016 года. Генотипы представляли инбредные гибриды кукурузы различных гетерозисных групп. Соцветия растений энергично вычистили от слабо держащейся пыльцы и накрыли мешками в предыдущий вечер перед денем использования. Пыльцу собрали и немедленно (т.е. в момент времени 0) взяли образцы для определения ВСП и in vitro прорастания, как было описано в Примере 3. Затем пыльцу каждого генотипа разделили на шесть частей равного размера. Каждую часть поместили тонким слоем на дно 6 см чашки Петри, и накрыли промокательной бумагой. Одну чашку с пыльцой каждого генотипа поместили на полку одной из семи 3,78 л стальной вакуумной камеры. На дне каждой камеры находилось 200 мл предварительно охлажденной воды. Каждая камера была накрыта акриловой крышкой и содержалась при нормальном атмосферном давлении (101,3 кПа) и 5°С в течение 24 часов. Через 2 дня полевой подготовки, одну из камер коротко открыли и взяли образец для анализа на in vitro прорастание. Затем из камер откачали воздух до давления 84,3, 67,4, 50,5, 33,5, 16,6, и 8,5 кПа. Одну камеру оставили под давлением 101,3 кПа. После этого все камеры инкубировали при 5°С в течение 6 дней перед окончательным анализом ВСП и in vitro прорастания. Каждый раз для одного генотипа делали один анализ на прорастание, в котором использовали приблизительно 285 зерен пыльцы.
В момент времени 0, когда пыльца была собрана на поле, большая часть пыльцы была вполне хорошо гидратирована, что видно по среднему значению ВСП равному 49,8% (Фиг. 9). Обезвоживание наблюдалось только у инбредного гибрида OQ101 со значением ВСП равным 34,1%. Несмотря на эти уровни гидратации, жизнеспособность всей пыльцы была на низком уровне и среднее прорастание in vitro составило 7,4% (Фиг. 10). Днем позже, после полевой подготовки при высокой влажности в низкотемпературных условиях, жизнеспособность значительно улучшилась и in vitro прорастание достигло среднего значения 42,4%. Этот результат очень схож с продемонстрированным в Примере 3 (Фиг. 3). После восстановления в течение 24 часов полевой подготовки, образцы были готовы к дальнейшей инкубации при высокой влажности и низкой температуре, но при низком уровне давления и кислорода.
Хранение в течение шести дней при высокой влажности и низкой температуре не изменило среднее значение ВСП пыльцы, хранимой при атмосферном давлении (101,3 кПа) или при 84,3 кПа, но по мере понижения уровней давления и кислорода при хранении, пыльца становилась все более обезвоженной. Среднее значение ВСП через 6 дней хранения снизилось с 50,1% при атмосферном давлении до 37,1% при давлении 33,5 кПа и ниже. Профили всех генотипов были схожими - ВСП понижалось по мере понижения давления при хранении.
У двух инбредных гибридов, Н99 и OQ101, жизнеспособность не сохранилась ни в одном случае вакуумного хранения в течение 6 дней (Фиг. 10). Инбредный гибрид С103 потерял в жизнеспособности при понижении уровней давления и кислорода, очень схожим образом с С103 в Примере 5 (Фиг. 8). Три других инбредных гибрида, проверенных в этом примере, продемонстрировали улучшение жизнеспособности при хранении при небольшом пониженном давлении 67-84 кПа (Фиг. 10). В среднем, лучшим уровнем пониженного давления для хранения оказался уровень 84,3 кПа, при котором жизнеспособность приблизительно удвоилась по сравнению с хранением при атмосферном давлении. Генотипы различались в том, насколько хранение под небольшим пониженным давлением улучшило живучесть пыльцы, но как правило, кукурузная пыльца может сохранять свою жизнеспособность лучше при хранении в небольшом вакууме с высокой влажностью и низкой температурой. Это первое сообщение, демонстрирующее преимущество и возможность оптимизации сохранения жизнеспособности пыльцы зерновых культур при пониженном уровне давления и/или кислорода.
Пример 7. Полевая подготовка пыльцы: изучение влияния продолжительности вакуумного хранения
Были проведены эксперименты для выяснения динамики вакуумного хранения пыльцы путем изучения влияния времени вакуумного хранения на сохранение жизнеспособности пыльцы.
Пыльцу собрали с выращенной на поле кукурузы восьми различных генотипов, как было описано ранее (Пример 1). После полевой подготовки при высокой влажности и низкой температуре в течение 80 минут, измерили долю in vitro прорастания и ВСП (как было описано в Примерах 1 и 3). Затем образец каждого генотипа разделили на две части и каждую половину поместили тонким слоем на 6 см чашки Петри, накрыв промокательной бумагой. Чашки поместили на полку одной из двух 3,78 л стальных вакуумных камер. В каждую камеру поместили образец каждого из генотипов и закрепили акриловые крышки. Одну камеру оставили при атмосферном давлении (101,3 кПа), из другой откачали воздух до давления величиной 67,4 кПа. Камеры инкубировали при 5°С и очень ненадолго открывали после 3, 5, и 8 дней хранения для взятия образцов пыльцы для анализа на in vitro прорастание. Измерения in vitro прорастания проводили дважды в нулевой день хранения, и по одному разу во все остальные дни. В среднем 254 зерен пыльцы анализировали на in vitro прорастание.
После сбора пыльцы из соцветий и полевой подготовки в течение 80 минут, ВСП для всех генотипов находилось в интервале от 50,0 до 60,8%. Таким образом, степень гидратации свежесобранной пыльцы была хорошей. Жизнеспособность этих образцов пыльцы в день 0 указана в Таблице 1. Пыльца пяти из восьми генотипов продемонстрировала значение 50% или выше.
В целом, жизнеспособность пыльцы понижалась в течение восьми дней хранения (Фиг. 11). Ухудшение жизнеспособности происходило быстрее для некоторых генотипов (например, генотипа «207»), чем для других, но в целом хранение под пониженным давлением (67,4 кПа) позволило поддерживать более высокую жизнеспособность в каждом периоде сохранения. Таблица 2 показывает, что среднее значение жизнеспособности среди 8 генотипов, даже после только 3 дней хранения, было на 48% лучше у пыльцы, хранившейся при пониженном давлении. Через 8 дней хранения преимущество вакуумного сохранения составляло 82% в сравнении с хранением при атмосферном давлении. Этим снова демонстрируется, что продолжительность жизнеспособности кукурузной пыльцы, и тем самым плодотворность, увеличивается в случае сохранения при пониженном давлении и/или уровне кислорода.
Таблица 2: Средняя жизнеспособность пыльцы восьми различных генотипов, сохраняемых при атмосферном давлении (101,3 кПа) или под небольшим пониженным давлением (67,5 кПа).
Было доказано, что хранение кукурузной пыльцы улучшается под пониженным давлением. Жизнеспособность кукурузной пыльцы, члена семейства злаковых, сохраняется на более высоком уровне при вакуумном хранении по сравнению с хранением при нормальном атмосферном давлении, и этот механизм является быстродействующим, с заметной разницей в течение 3 дней или менее. Лучше всего сочетать сохранение пыльцы зерновых под пониженным давлением с хранением при высокой влажности и низкой температуре, что является двумя другими параметрами окружающей среды, доказавшими свое благотворное влияние на жизнеспособность пыльцы и замедление ее ухудшения при хранении не при пониженной температуре. Так как жизнеспособность кукурузной пыльцы остается более высокой при хранении под пониженным давлением, можно ожидать что хранимую при пониженном давлении пыльцу можно содержать дольше до начала потери ее жизнеспособности. Не любое пониженное давление способствует продлению жизнеспособности пыльцы при хранении, и в случае кукурузы оптимальными условиями является давление приблизительно 67-84 кПа. Также, не все генотипные формы кукурузной пыльцы реагируют одинаковым образом на хранение при пониженном давлении, и некоторые генотипы демонстрируют большее или меньшее преимущество при подобном хранении. Эксперименты авторов изобретения на различных генотипах кукурузы, благоприятно реагирующих на хранение при пониженном давлении, показали, что можно предположить, что большинство, если не все, формы кукурузы могут продемонстрировать улучшение хранения пыльцы при давлении приблизительно 67-94 кПа. Эта технология позволяет дальнейшее развитие коммерческих сервисов, включающих сбор больших количеств пыльцы, содержание ее в контролируемых условиях окружающей среды в течение продолжительного времени, и последующее использование для дополнительного опыления с целью получения семян или зерновых культур для улучшения их выхода и/или чистоты.
Пример 8. Полевая подготовка пыльцы: обезвоживание перед хранением
Этот пример описывает эксперименты по обезвоживанию пыльцы перед хранением.
Свежесобранная кукурузная пыльца обычно характеризуется ВСП приблизительно 60% (Fonseca и Westgate (2005) Field Crops Research 94: 114-125). ВСП может быть ниже и пыльца может быть частично обезвоженной в случае сбора во время периода стресса, например при неблагоприятном дефиците давления паров (Пример 3). Стресс обычно ухудшает жизнеспособность пыльцы. В таких обстоятельствах, степень гидратации пыльцы часто можно улучшить и восстановить ее жизнеспособность, частично или полностью, посредством полевой подготовки (Пример 4, Фиг. 5). Однако полного восстановления ВСП и жизнеспособности до «нормального» уровня не всегда возможно достичь, и поэтому представляет интерес выяснить, как обезвоживание перед хранением влияет на жизнеспособность пыльцы.
Пыльца, использованная в этих экспериментах, происходила от соцветий, собранных с выращенной на поле или в теплице кукурузы. Соцветия отделили от растений и транспортировали в лабораторию, где от каждого соцветия отрезали и удалили 4 см стебля. Свежие срезы соцветий поместили в стакан с водой. Соцветия содержали в инкубаторе, запрограммированном на температуру 25°/15°С днем/ночью и относительную влажность 65%/80% днем/ночью, а также освещение в дневное время. Соцветия акклиматизировали к среде инкубатора по меньшей мере в течение 24 часов до сбора пыльцы. После акклиматизации, пыльцу стряхнули с соцветий приблизительно через 2-4 часа после начала дневного периода. Соцветия представляли собой смесь нескольких инбредных генотипов кукурузы и одной разновидности сладкой кукурузы. Хотя генетическая принадлежность некоторых использованных растений была в большинстве случаев известна, при сборе пыльцы не производилось попыток определения пропорций каждого генотипа. Собранную пыльцу отделили от мусора просеиванием (пористость 150 микрон), и немедленно поместили на полевую подготовку (Пример 1), продолжавшуюся 2-24 часа.
В эксперименте А пыльцу, подвергнутую полевой подготовке, обезвоживали до различной степени путем продувания над ней сухого газообразного азота при 9°С. Пыльцу содержали на сите (пористость 45 микрон) в маленьком (1,0 л) эксикаторе и пропускали через эксикатор азот описанным в литературе способом (Barnabas, В. and Rajki, Е. (1981). Ann Bot, 48(6), рр. 861-864). Образцы пыльцы из эксикатора брали каждые 30 минут, проводя анализ на жизнеспособность, и загружая в незакрытые 0,5 мл полиэтиленовые пробирки для микроцентрифуги до заполнения пробирки приблизительно на 20%. Эти пробирки поместили в 3,78 л стальную запечатанную камеру с давлением 67,4 кПа (т.е. вакуумом) и хранили при 5°С. Образцы брали через 6, 9, и 17 дней хранения для проверки жизнеспособности.
В эксперименте В, пыльцу, подвергнутую полевой подготовке, подвергли анализу на ВСП и жизнеспособность до начала обработки различными условиями относительной влажности. Пыльцу нанесли тонким слоем на алюминиевую пластинку (диаметр 4,3 см), которую поместили на возвышенную платформу в 0,5 л стеклянном герметично запечатанном контейнере. В стеклянном контейнере содержалось приблизительно 200 мл воды или насыщенного раствора (ACS степени чистоты) сульфата калия, нитрата калия или нитрата стронция которые, соответственно, обеспечивали расчетную относительную влажность 100%, 98,5%, 96,5% или 92,4% в замкнутом контейнере при 5°С (Greenspan, L., (1977) J Res Nat Bur Stand, 81(1), pp. 89-96). Стеклянные контейнеры содержали при 5°С и открывали менее чем на 20 секунд после 6 и 11 дней инкубирования для взятия образцов пыльцы для проверки ВСП и жизнеспособности.
Жизнеспособность в экспериментах А и В измеряли методом импедансной проточной цитометрии (ИПЦ) с помощью аппарата AmphZ30 производства Amphasys AG (Lucerne, Швейцария). В этом аппарате зерна пыльцы разделяются по мере протекания через микрофлюидный чип, снабженный микроэлектродами. Изменение электрического сопротивления жидкой среды измеряется при прохождении клеток через приложенное электрическое поле и производится разделение погибших и живых клеток пыльцы по изменению фазового угла определяемого сигнала сопротивления (Heidmann, I., Schade-Kampmann, G., Lambalk, J., Ottiger, M. and Di Berardino, M., 2016. Impedance Flow Cytometry: A Novel Technique in Pollen Analysis. PloS one, 11(11), p.e0165531). В каждом анализе было измерено приблизительно 3000 зерен пыльцы. Измерение ВСП образцов проводили согласно описанию в Примере 3.
Обезвоживание пыльцы газообразным азотом в эксперименте А вызвало устойчивое снижение ВСП в течение четырехчасового периода (Фиг. 12). ВСП составляло 59,2% перед началом обезвоживания и 13,1% по окончанию обработки. В середине обезвоживания азотом, ВСП снизилось до 45,6%.
Образцы пыльцы на каждой стадии обезвоживание помещали на низкотемпературное хранение при пониженном давлении в запечатанную камеру и содержали там 17 дней. Так как попыток контролировать уровень водяных паров в камере во время хранения не производилось, возможно, что образцы пыльцы во время хранения далее гидратировались или теряли влагу. Относительная влажность в запечатанной камере в основном определялась лабораторной атмосферой в момент закрытия камеры. Лабораторная атмосфера на момент проведения эксперимента А обычно имела относительную влажность приблизительно 30%.
Скорость, с которой образцы пыльцы при хранении в камере во время эксперимента А могли далее гидратироваться или терять влагу могла также зависеть от способа нахождения пыльцы в камере. Образцы хранились в нижней части пластиковой конической пробирки, так что поверхность пыльцы неодинаково контактировала с водными парами в камере, в отличие от того, как если бы образцы были нанесены тонким слоем.
В эксперименте А жизнеспособность пыльцы ухудшилась в течение 17-дневного периода хранения независимо от начального ВСП (Фиг. 12). Но было неожиданно выяснено, что жизнеспособность пыльцы, обезвоженной до 50-55% ВСП перед хранением, ухудшалась медленнее, чем у пыльцы, не обезвоженной перед хранением, или у пыльцы, обезвоженной до уровней ВСП менее чем приблизительно 45%. Фактически, пыльца, только слегка обезвоженная перед хранением, с уровня ВСП 59,2% у пыльцы, подвергнутой полевой подготовке, до 55,0% после 30 минут обезвоживания, все еще сохраняла 19,1% жизнеспособности после 17 дней сохранения.
Уровень гидратации пыльцы обычно приходит к «равновесному влагосодержанию» (РВС), контролируемому температурой и относительной влажностью условий окружающей среды (Connor, K.F. and Towill, L.E. (1993) Euphytica, 68(1), pp. 77-84). Так как скорость потери жизнеспособности хранимой кукурузной пыльцы в эксперименте А была медленнее чем обычно, разумно предположить, что хранимая пыльца не достигла РВС с сухим воздухом (30% ОВ) в камере. Возможно причиной послужило то, что пыльца находилась в конической пластиковой пробирке. Гипотеза о том, что для лучшего сохранения жизнеспособности необходимо только легкое обезвоживание свежей пыльцы была проверена в эксперименте В.
Кукурузную пыльцу в эксперименте В хранили с тем намерением, чтобы ВСП по достижению РВС составило приблизительно 45-55%. Это приблизительно соответствует уровням ВСП пыльцы, оставшейся наиболее жизнеспособной во время хранения в эксперименте А. Уровни контролируемой относительной влажности в камерах хранения в эксперименте В поддерживались очень тщательно с использованием насыщенных растворов сульфата калия, нитрата калия, и нитрата стронция (а также чистой воды). Так, интервал относительной влажности, использованной для обработки, составлял 92,4-100%. В прошлом, в течение более чем 100 лет, исследователи хранили свежую кукурузную пыльцу при различных уровнях влажности и оценивали значение такой обработки на продолжительность жизнеспособности (т.е. сохраняемости) при хранении (Andronescu, Demetrius I., The physiology of the pollen of Zea mays with special regard to vitality. Thesis for degree of Ph.D. University of Illinois. 1915); (Knowlton, H.E., 1922. Studies in pollen with special reference to longevity.. (Vol.52). Cornell University); (Sartoris, G.B., (1942) Am J Bot, pp. 395-400); (Jones, M.D. and Newell, L.C., (1948) J Amer Soc Agron 40: 195-204). Из их работ следовало, что хранение при высокой влажности, обычно оцениваемой в 90 или 100% влажности, сохраняет жизнеспособность пыльцы лучше, чем хранение при низкой влажности. Но даже при хранении при 90 или 100% влажности, жизнеспособность или плодотворность пыльцы сохранялась только в течение нескольких, до 10, дней, и жизнеспособность образцов резко снижалась после периода эксперимента. Никогда ранее не сообщалось и не было известно, что хранение и сохранение кукурузной пыльцы при относительной влажности (например, 95-98%) приводящей к РВС приблизительно 45-55%, является по сути уникальным состоянием пыльцы и таким, которое обеспечивает безусловно лучшее сохранение жизнеспособности при хранении, чем хранение, приводящее к меньшему или большему ВСП.
ВСП пыльцы, хранившейся при различной относительной влажности в эксперименте В, снижалось строго линейным образом по мере снижения влажности хранения (Фиг. 13А и 13В). Небольшое изменение ВСП произошло через 6 дней хранения, означая примерное достижение РВС за это время. Хранение при относительной влажности 96,5 и 98,5% привело к равновесию ВСП (т.е. РВС) при 43,8 и 53,5% соответственно, как и было намечено. На Фиг. 14А и 14В показано, что кукурузная пыльца, хранившаяся в условиях относительной влажности, приведших к равновесию ВСП при 44 или 54%, сохранила почти полную жизнеспособность на протяжении 11-дневного периода сохранения. Пыльца, хранившаяся при 100% или 92,4% относительной влажности, потеряла 78 и 91% своей жизнеспособности соответственно, после 11 дней.
Логично предположить, что примененные способы и результаты, полученные в эксперименте В, приводят к пониманию того, как продлить жизнеспособность кукурузной пыльцы без замораживания, на продолжительные периоды времени, бывшие до сих пор недостижимыми. Даже в работе Nath и Anderson (Nath, J., & Anderson, J.О. (1975). Effect of freezing and freeze-drying on the viability and storage of Lilium longiflorum L. and Zea mays L. pollen. Cryobiology, 12(1), 81-88) не удалось предотвратить ухудшение жизнеспособности незамороженной пыльцы, и не совсем понятно, основывались ли наблюдения этих авторов на прорастании пыльцы in vitro, а не на псевдо-прорастании (Andronescu, Demetrius I., The physiology of the pollen of Zea mays with special regard to vitality. Thesis for degree of Ph.D. University of Illinois. 1915). Способность поддерживать жизнеспособность незамороженной пыльцы способом, аналогичным продемонстрированному в Примере 8, создает возможность дальнейшей практики по сохранению пыльцы растений семейства злаковых с тем, чтобы ее можно было использовать для опыления и оплодотворения семязачатков вне обычных периодов восприимчивости женских соцветий сельскохозяйственных растений. Этим также предоставляется гибкость практики криосохранения и повышения качества пыльцы, предназначенной для такого использования.
Пример 9. Сохранение рисовой пыльцы
С целью убедиться, что протокол сохранения, разработанный для кукурузы, совместим с пыльцой других видов растений, был проведен эксперимент с пыльцой риса.
Для этого эксперимента, пыльцу двух различных генотипов риса, одного из Азии и другого из южной части США, собрали с активно сбрасывающих пыльцу растений риса и соединили вместе. После этого пыльцу разделили в два сосуда разного типа. В сосуде первого типа тонкий слой пыльцы нанесли на дно двух чашек Петри производства VWR шириной 100 мм и глубиной 15 мм. Крышки чашек Петри намеренно оставили открытыми, чтобы пыльца взаимодействовала с окружающей средой. В сосуде второго типа в пробирку с накладываемой крышечкой объемом 0,5 мл поместили ровно столько рисовой пыльцы, чтобы покрыть закругленную часть возле дна пробирки. Этот объем пыльцы оценили в 5 мкл в каждой пробирке. После добавления пыльцы крышечки пробирок закрыли. При закрытой крышке можно менять температура в пробирке, но нельзя менять относительную влажность.
Каждый сосуд с пыльцой поместили в 887 мл контейнер Rubbermaid с герметичной крышкой. Перед запечатыванием контейнеров, в каждый добавили столько воды, чтобы покрыть его дно.
Каждый запечатанный контейнер Rubbermaid поместили в среду с температурой 4°С на сохранение в течение 20 часов. Сосуды с пыльцой обрабатывали одним из двух способов. Согласно способу 1, чашки Петри содержали при 4°С и 100% относительной влажности в течение 20 часов. Согласно способу 2, пробирки 0,5 мл содержали при 4°С в течение 20 часов. Через 20 часов хранения, каждый образец пыльцы поместили в среду для прорастания, позволяющей рост пыльцевой трубки, если пыльца является жизнеспособной. Через 60 минут содержания в среде сделали снимки. На каждом изображении подсчитали количество пыльцевых трубок относительно общего количества присутствующих зерен пыльцы.
Результаты: рисовая пыльца, хранившаяся в чашках Петри, продемонстрировала общую долю прорастания 25% и 1% соответственно после 20 часов хранения при 4°С и 100% относительной влажности. Авторы изобретения предполагают, что один из сосудов Rubbermaid, в котором наблюдалось 1% прорастания, не был закрыт должным образом. Отсутствие герметичности могло привести к падению влажности в сосуде намного ниже 100%.
Рисовая пыльца, хранившаяся в пробирках, продемонстрировала общую долю прорастания менее 1% после 20 часов хранения при 4°С без контроля относительной влажности. Необходимо отметить, что эта доля прорастания находится в соответствии с образцом из чашки Петри, хранившимся при 4°С и 100% относительной влажности, и продемонстрировавшим после 20 часов сохранения 1% прорастания, так как оба сценария отражают ситуацию, при которой в окружающей среде не поддерживалась влажность около 100%. На Фиг. 15 представлено изображение пророщенной рисовой пыльцы из чашки Петри, продемонстрировавшей прорастание 25%, тогда как на Фиг. 16 представлено изображение рисовой пыльцы, хранившейся при 4°С без контроля относительной влажности.
Пример 10. Сохранение кукурузной пыльцы при 75% влажности и положительном потоке воздуха
Этот пример описывает эксперименты по подготовке пыльцы к сохранению. Пыльца для этих экспериментов была получена из соцветий кукурузы, выращенной на поле и в теплице. Соцветия отделили от растений и транспортировали в лабораторию, где от каждого соцветия отрезали и удалили 4 см стебля. Свежие срезы соцветий поместили в стакан с водой. Соцветия содержали в инкубаторе, запрограммированном на температуру 25°/15°С днем/ночью и относительную влажность 65%/80% днем/ночью, а также освещение в дневное время. Соцветия акклиматизировали к среде инкубатора по меньшей мере в течение 24 часов до сбора пыльцы. После акклиматизации, пыльцу стряхнули с соцветий приблизительно через 2-4 часа после начала дневного периода. Во всех экспериментах соцветия представляли 21 различный генотип гибридов и инбредных гибридов кукурузы (всего 21 генотип). Собранную пыльцу каждого генотипа содержали и идентифицировали по генотипу как отдельные образцы. Каждый образец пыльцы отделили от мусора просеиванием (пористость 150 микрон).
После сбора для каждого образца пыльцы незамедлительно измерили (в момент времени 0) жизнеспособность по методике, детально описанной выше. Начальная жизнеспособность всех образцов пыльцы была высокой, более 60%. Затем все образцы пыльцы поместили в аппарат принудительного воздушного осушения с приблизительно 75% влажностью (обеспеченной насыщенным раствором NaCl) и температурой 5°С и сушили приблизительно 20 часов. Образцы содержали при -80°С в течение времени от 4 часов до 38 дней и более. Такая большая разница в сроке хранения образцов была вызвана тем, что в теплице было ограниченное количество женских растений, доступных для перекрестного опыления сохраняемой пыльцой в каждый конкретный день, и несколько образцов пришлось хранить при -80°С до момента доступности женского растения.
Образцы переместили из условий хранения при -80°Сна сухой лед и транспортировали в теплицу для опыления. Только правильным образом накрытые початки использовались в качестве женских, чтобы избежать риска потерь. Через две-три недели после опыления, початки исследовали на предмет образования зерен, как признака жизнеспособности пыльцы после вышеописанной обработки. Пыльца 18-ти из 21-та проверенных генотипов вызвала формирование зерен, что свидетельствует о сохранении жизнеспособности пыльцы после хранения при -80°С.
На Фиг. 17А, 17В, и 17С представлены примеры подтвержденной жизнеспособности сохраненной пыльцы, хранившейся при -80°С. В частности, фотографии, показанные на Фиг. 17А, 17В, и 17С отражают результаты опыления, проведенного с использованием сохраненной пыльцы, после ее хранения в течение периода от 4 часов до 38 дней. Присутствие развившихся зерен оценивали через два-три недели после опыления или при вызревании зерна, как показано в Таблица 3 ниже.
Таблица 3: Присутствие развившихся зерен для примера 10, где генотип обозначает источник пыльцы, а женская особь означает инбредный гибрид, опыленный сохраненной пыльцой.
Пример 11: Сохранение кукурузной пыльцы с применением газообразного азота и положительного давления
В этом примере демонстрируется эксперимент, проведенный для подготовки пыльцы к сохранению. Пыльца, использованная в этом эксперименте, происходит от соцветий растений, выросших на поле. Соцветия от одного гибрида сладкой кукурузы были отделены от растений и транспортированы в лабораторию где от каждого соцветия отрезали и удалили 4 см стебля. Свежие срезы соцветий поместили в стакан с водой. Соцветия содержали в инкубаторе, запрограммированном на температуру 25°/15°С днем/ночью и относительную влажность 65%/80% днем/ночью, а также освещение в дневное время. Соцветия акклиматизировали к среде инкубатора по меньшей мере в течение 24 часов до сбора пыльцы. После акклиматизации, пыльцу стряхнули с соцветий приблизительно через 2-4 часа после начала дневного периода. Образцы пыльцы отделили от мусора просеиванием (пористость 150 микрон).
После сбора пыльцы (момент времени 0) была измерена жизнеспособность образцов по методике, детально описанной выше, которая оказалась высокой, более 95%. Затем образцы пыльцы поместили в аппарат принудительного азотного осушения при температуре 5-10°С (температура менялась). Газообразный азот служил двум целям - освобождению окружающей среды от кислорода, и понижению влажности. Относительная влажность в ходе сушки менялась от 40% в момент времени 0 до 12% через 110 минут. Три образца пыльцы были взяты через 80, 85, 90, 95, 100, и 110 минут. Первый образец использовали для измерения влагосодержания пыльцы (ВСП). Данные ВСП показаны в Таблице 4. Второй образец использовали для измерения жизнеспособности пыльцы перед замораживанием. Третий образец хранили при температуре -80°С в течение 120 минут и использовали для измерения жизнеспособности пыльцы после замораживания. В Таблице 4 показаны процентные доли жизнеспособности пыльцы, использованной в этом эксперименте. Результаты показали, что в интервале РМС от 15 до 35 пыльца более стабильна и может храниться более эффективно с минимальной потерей жизнеспособности.
Пример 12. Сохранение кукурузной пыльцы в газообразном азоте, при положительном давлении, и регулируемой влажности и температуре.
Пыльцу собрали с активно сбрасывающих пыльцу растений и поместили в камеру хранения. В камере создали постоянный поток газообразного азота. Газообразный азот служил двум целям - освобождению окружающей среды от кислорода, необходимого для метаболизма, и также понижению влажности, в соответствии с чем понижал влагосодержание пыльцы до низкого уровня, такого как целевой уровень в приблизительно 30%. По мере снижения влагосодержания пыльцы температуру в камере медленно понижали ниже 0°С (до -5°С, например) без замораживания пыльцы. Подобным образом, уровень относительной влажности в камере можно регулировать для повышения или понижения скорости обезвоживания пыльцы. Одновременно с этим влажность в камере также можно регулировать для стабилизации конечного влагосодержания пыльцы на уровне приблизительно 30%. С применением закономерности PV=nRT, конечное значение влажности можно высчитать для сохранения равновесного влагосодержания пыльцы на уровне 30%. Этот процесс завершился приблизительно через 100 минут.
Пример 13. Сохранение кукурузной пыльцы в жидком азоте
Для проверки возможности использования быстрозамороженной кукурузной пыльцы в качестве источника сохраненной пыльцы, провели эксперимент по определению того, какой процент кукурузной пыльцы выживает после мгновенной заморозки в жидком азоте. По сообщению Nath и Anderson (Nath, J., & Anderson, J.О. (1975). Effect of freezing and freeze-drying on the viability and storage of Lilium longiflorum L. and Zea mays L. pollen. Cryobiology, 12(1), 81-88), «при быстром замораживании пыльцы со скоростью приблизительно 200°С в минуту, в комбинации с быстрой разморозкой со скоростью 218°С в минуту, сохраняется наивысшая степень жизнеспособности пыльцы». Быстрая заморозка и медленная разморозка приводят к существенному снижению жизнеспособности пыльцы. Это может свидетельствовать о том, что внутриклеточные кристаллы льда, образованные при быстрой заморозке, возможно вырастают в крупные ледяные массы при медленно оттаивании или хранении при температурах выше -50°С."
Кукурузную пыльцу для этого эксперимента собрали с растений нескольких различных генотипов и поместили в одну общую емкость. Для быстрой заморозки пыльцы, 50 мл жидкого азота налили в 100 мл боросиликатный стакан. Затем для быстрой заморозки свежую пыльцу поместили в жидкий азот. Пыльца оставалась в жидком азоте до полного выкипания всех 50 мл азота из стакана. Быстрозамороженную пыльцу немедленно поместили в среду для прорастания кукурузной пыльцы, имеющей комнатную температуру, для быстрого размораживания пыльцы.
Результаты прорастания сфотографировали и подсчитали на снимках количество пыльцевых трубок относительно общего количества присутствующих зерен пыльцы. В ходе анализа прорастания пыльцы подавляющее большинство пыльцы быстро погибло. В ходе процесса прорастания в среде было констатирована существенная утечка клеточного содержимого в виде большого количества мусора. Конечное прорастание было оценено в 1/221 зерен пыльцы, или менее чем 0,5%. На Фиг. 18 изображены конечные результаты прорастания в среде вышеописанной быстрозамороженной и быстроразмороженной кукурузной пыльцы. Общее прорастание было оценено в менее чем 0,5%.
Соответственно, как было сказано выше, способы по настоящему изобретению обеспечивают ряд преимуществ, до этого момента неизвестных в данной области. Настоящее изобретение описывает способы крупномасштабного сохранения пыльцы. Способы по настоящему изобретению позволяют поддерживать и повышать жизнеспособность пыльцы во время ее сбора, а также во время ее сохранения. Более того, способы по настоящему изобретению применимы, не ограничиваясь этим, к двум специфическим ситуациям. Во-первых, упомянутый способ применим к ситуации, в которой пыльца будет использована в течение 30 дней с момента сбора, в поддержку текущего цикла роста на момент сбора. Во-вторых, настоящее изобретение позволяет осуществлять хранение пыльцы на протяжении безгранично долгого времени, например позволяет хранить пыльцу годами перед моментом ее доставки к женским растениям.
Также, большинство ранее известных способов сохранения пыльцы основывалось на замораживании и последующей лиофилизации пыльцы (включая, но не ограничиваясь этим, способы, описанные Greaves, et al. и Nath и Anderson, описанные выше) для обезвоживания пыльцы до состояния, позволяющего хранение пыльцы. Однако время, необходимое для лиофилизации пыльцы, уменьшает количество времени, в течение которого пыльцу можно использовать по назначению. Далее, ранее известные способы не предусматривали контроль влагосодержания пыльцы, которое в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения может быть важно для сохранения пыльцы. Неспособность поддержать влагосодержание пыльцы в требуемом для хранения пыльцы диапазоне приводит к существенному снижению ее жизнеспособности. Более того, требования к давлению по настоящему изобретению позволяют облегчить масштабирование и транспортабельность по сравнению с ранее известными способами, требовавшими более экстремальных показателей давления. Способы по настоящему изобретению позволяют проводить быстрое обезвоживание пыльцы и также позволяют хранить пыльцу при ее оптимальном влагосодержании.
Несмотря на то, что различные варианты реализации настоящего изобретения были описаны выше с высоким уровнем детализации, специалист в данной области сможет привнести в такие варианты значительное количество изменений без выхода за рамки объема настоящего изобретения, определенного описанием и формулой изобретения. В некоторых случаях прямо или косвенная описанная методика включает различные стадии и операции, производимые в определенном порядке, но специалист в данной области может поменять порядок таких стадий или операций, заменить или пропустить их без обязательного выхода за рамки объема настоящего изобретения. Предполагается, что любая информация, содержащаяся в вышеприведенном описании и прилагающихся чертежах, должна быть интерпретирована только как иллюстративная и не ограничивающая. В деталях и структуре изобретения могут быть произведены изменения без выхода за рамки объема настоящего изобретения, определенного формулой изобретения.
Несмотря на то, что настоящее изобретение описано со ссылками на конкретные примеры его реализации, приведенные выше, различные изменения, модификации, улучшения и/или существенные эквивалентные замены, будучи известными или предсказуемыми, могут являться очевидными для специалистов с по меньшей мере обычными навыками в данной области. Перечисление стадий способа в определенном порядке не ограничивает порядок следования стадий этого способа. Соответственно, варианты реализации настоящего изобретения, описанные выше, являются иллюстративными, не ограничивающими. Специалистам в данной области будут очевидны изменения, которые можно сделать без выхода за рамки объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение подразумевается включающим все известные или ранее разработанные альтернативы, модификации, вариации, улучшения и/или существенные эквиваленты.