Использование наноалмазных композитов в качестве матриц для культивирования фибробластов кожи человека

использование НАНОАЛМАЗНых КОМПОЗИТОВ в качестве матриц для культивирования фибробластов кожи

ЧЕЛОВЕКА

Ю.А. Нащекина 1, Б.А. Маргулис 1, С.К. Гордеев 2, М.И. Блинова 1, И.В. Гужова 1

1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

2 Центральный научно-исследовательский институт материалов, Санкт-Петербург, Россия

Nanodiamond composite scaffolds for human skin fibroblasts cultivation

YuA. Nashchekina 1, B.A. Margulis 1, S.K. Gordeev2, M.I. Blinova 1, I.V. Guzhova 1 11nstitute of Cytology of RAS, Saint-Peterburg, Russia 2 Central Research Institute of Materials, Saint-Peterburg, Russia

Углеродные материалы в настоящее время исследуются в качестве матрицы для культивируемых клеток в рамках «регенеративной хирургии» костей скелета . В работе оценивали взаимодействие фибробластов кожи человека с углеродными матрицами, изготовленными из композиционного материала на основе алмаз-углерода . Диаметр пор матриц, которые получали из дисперсных порошков алмаза с размером частиц от 5 нм до 2 мкм, находился в диапазоне 10—100 нм . Показано, что все матрицы не оказывали токсического воздействия на культивируемые клетки . Наибольшее количество клеток адгезировались к поверхности матриц со средним размером пор 50 нм . Такие носители способствуют параллельному ориентированию фибробла-стов, культивируемых на их поверхности

Ключевые слова: наноалмазные композиты, фибро-бласты кожи человека, цитотоксичность

Carbon materials are widely evaluated as scaffolds for cultured cells in "regenerative" bone surgery . In this research we investigated the interaction of human skin fibroblasts with diamond carbon composites scaffolds . Scaffolds with 10-100 nm pore diameter were obtained from the dispersed powders of diamond with particle size — from 2 nm to 5 microns . It was shown that all scaffolds were not toxic for cultured cells . The highest number of cells adhered on the scaffolds with average pore size of 50-100 nm Scaffold with a pore size of 50 nm contribute to the fibroblasts parallel orientation of their surfaces

Keywords: nanodiamond composite, human skin fibroblasts, cytotoxicity .

Введение

В последние годы наблюдается повышенный интерес к применению углеродных наноматериалов в качестве катализаторов, электродов, хроматографи-ческих, сепарирующих элементов, а также матриц для культивирования и трансплантации клеток [1, 2]. Применение находят различные виды углеродных материалов, в том числе фуллерены, углеродные нанотрубки, наноалмазы [3, 4]. Перспективность использования углеродных наноматериалов в регенеративной медицине обусловлена широким диапазоном их физических, механических и химических свойств . Так, например, обладая высокой прочностью, углеродные наноматериалы имеют небольшую плотность, что делает их более перспективными материалами для восстановления костной ткани по сравнению с металлами [5].

Среди углеродных материалов особое внимание уделяется использованию нанотрубок в качестве носителей для культивирования клеток, чем обусловлено появление в современной литературе большого количества работ по данной теме, которые весьма противоречивы [6, 7]. Несколькими научными коллективами было продемонстрировано, что субстраты на основе углеродных нанотрубок снижают пролифе-ративную активность таких клеток как кератиноциты [8], клетки нейроглиальной ткани [9], человеческие эмбриональные клетки почек HEK293 [10]. Однако модификация углеродных нанотрубок путем введения дополнительных функциональных групп на поверхность матриц позволяет существенно улучшить их совместимость с биологическим материалом . Положительные результаты культивирования нервных клеток на модифицированных углеродных нанотруб-ках представлены в ряде работ [11, 12]. Модифи-

e-mail: yuliya . shved@gmail . com

кация углеродных нанотрубок может быть осуществлена путем нанесения на их поверхность коллагена [13]. Такая обработка матриц способствует повышению жизнеспособности культивируемых на них клеток по сравнению с немодифицированными поверхностями [14].

Одну из важнейших ролей в любых биоматериалах, в том числе и углеродных, играет размер пор . Макропоры, размер которых больше 100 мкм, способствуют прорастанию ткани, васкуляризации матрицы, а также свободному прохождению питательных веществ к клеткам и отводу продуктов метаболизма [15]. Матрицы с микропорами, размер которых находится в области 10 мкм, благоприятны для образования внутри них капилляров . И, наконец, нанопористые материалы обеспечивают диффузию молекул для питания клеток и передачи сигналов [16], а также адсорбции белков, способствующих прикреплению клеток к поверхностям матриц [17]. Для лучшего функционирования матрицы поры должны быть связаны между собой, что обеспечивает лучшее распределение клеток и их миграцию, а также прорастание сосудов in vivo после трансплантации конструкции

В настоящее время главным ограничением при использовании углеродных материалов является тот факт, что большинство из них находится в высокодисперсном состоянии . Кроме того, один из наиболее часто используемых углеродных материалов — нанотрубки, получают осаждением из раствора, поэтому их сложно откалибровать по размеру, что затрудняет получение достоверно воспроизводимых результатов Решением вышеназванных проблем может стать создание композиционных материалов, которые содержат поры наноразмерного диапазона [18].

Такие материалы имеют пористую графитоподоб-ную структуру . Изменяя условия синтеза и варьируя размер гранул, можно получать материалы с необходимой пористостью, проводимостью и гидрофиль-ностью. Одной из особенностей композитного материала является возможность получения изделий требуемой формы, обладающих конструкционной прочностью и износостойкостью, что представляет интерес с точки зрения их использования в качестве матриц для культивирования клеток

Цель настоящей работы — исследование биологической совместимости наноалмазных композитов (НАК) с различными структурными характеристиками с фибробластами кожи человека для дальнейшего использования матриц в регенеративной хирургии костной ткани

Материал и методы

В качестве матриц для культивирования клеток использовали композитные нанопористые углеродные материалы на основе алмаз-углерода, которые были получены из дисперсных порошков алмаза с размерами частиц от 5 нм до 2 мкм . Из порошка алмаза формовали требуемую заготовку — диск диаметром 20 мм и толщиной 1 мм, а затем связывали отдельные частицы в ней пироуглеродной матрицей . Пироуглерод получали путем гетерогенной химической реакции разложения метана на всей внутренней поверхности предварительно сформованной заготовки . Условия реакции выбирали так, чтобы обеспечить образование пироуглерода на всей глубине заготовки и при условии обеспечения неизменности исходной формы заготовки

Были получены НАК из алмазных зерен размером 5 нм и композиты АСМ 0,25/1, АСМ 1/0 из порошков алмаза с размером частиц 0,25 и 1 мкм, соответственно

Синтезированные материалы характеризовали по следующим параметрам:

1) плотность материала — отношение массы образца к его объему, определенному гидростатическим взвешиванием;

2) пористость материала — отношение объема пор материала, определенного по водопоглощению, к объему образца;

3) удельная поверхность материала, определяемая методом БЭТ по назкотемпературной адсорбции азота;

4) средний объем пор — отношение удельного объема пор к удельной поверхности материала в модели цилиндрических пор (х = V/4S);

5) геометрический размер пор — соотношение d = 2/3 П/(1-П), где П — текстурные константы пористого тела .

Полученные матрицы стерилизовали УФ-облу-чением в течение 8 ч .

Фибробласты человека получали из биоптатов кожи, взятых от здоровых доноров в ходе эстетических операций после подписания ими добровольного информированного согласия . Клетки культивировали в среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США) в атмосфере 5% СО2 при температуре 37°С . Для исследования использовали клетки 4—6 пассажей .

Одним из критериев возможного токсического влияния на клетки углеродных матриц служит мор-

фология фибробластов . За изменением формы клеток в процессе их культивирования в чашке Петри в присутствии углеродных матриц наблюдали под инвертированным микроскопом

Способность фибробластов к адгезии на поверхности полистирольной чашки в присутствии углеродных матриц оценивали по окраске клеток генцианви-олетом

Для оценки жизнеспособности фибробластов, культивируемых в присутствии матриц, использовали окраску клеток трипановым синим . Фибробласты кожи человека в количестве Ю4 клеток высевали на лунки 24-луночной платы Образцы материалов площадью см2 помещали в лунки с клетками .

После 72 ч матрицы извлекали из лунок, среду удаляли. Для открепления фибробластов от поверхности культурального пластика клетки обрабатывали раствором трипсин-версена (3:7) (Биолот, Россия) . Жизнеспособность клеток после инкубирования с матрицами оценивали по окраске мертвых клеток Ю% раствором трипанового синего, подсчитывая их в камере Горяева .

Пролиферативную активность клеток в присутствии углеродных матриц оценивали с помощью МТТ-теста . Фибробласты кожи человека в количестве 1хЮ4 клеток высевали на лунки 96-луночной платы . Образцы материалов площадью см2 помещали в лунки с клетками . Через 72 ч . культивирования матрицы извлекали из лунок, среду удаляли, а в лунки вносили раствор МТТ (Sigma, США) в среде DMEM . После 2 ч . инкубирования при 37°С раствор МТТ заменяли на ДМСО (Merck, США) . Оптическую плотность растворов измеряли при 07^ нм .

Для каждого метода в качестве контроля использовали фибробласты, культивируемые на полисти-рольном пластике без матриц

Особенности взаимодействия фибробластов с углеродными материалами оценивали методами флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопий

Подготовка препаратов для флуоресцентной микроскопии: 1ВД мкл суспензии клеток в среде DMEM (Биолот, Россия) с Ю% FBS (Gibco, США) в концентрации 3хЮ кл/мл наносили на приготовленные субстраты — углеродные матрицы в чашках Петри и оставляли в СО2-инкубаторе (37°С, ö% СО2) . Через 2 ч неприкрепившиеся клетки удаляли, а адгезированные к субстрату клетки промывали PBS, фиксировали 4% раствором формалина в течение Ю мин . , трижды промывали PBS, затем обрабатывали  ,1% тритоном Х-1ВД в течение 1ö мин . , промывали PBS, наносили Родамин-Фаллоидин (Molecular Probes, США) и инкубировали в течение 1ö мин . при комнатной температуре в темноте Идентификацию окрашенных клеток проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Karl Zeiss Axioscop (X = Ö32 нм) .

Подготовка препаратов для сканирующей электронной микроскопии: суспензию клеток в концентрации 3х105 кл/мл в среде йМЕМ (Биолот, Россия) с 10% FBS ^Ьсо, США) объемом 100 мкл наносили на углеродные матрицы в чашках Петри и оставляли в СО2-инкубаторе (37°С, 5% СО2). Через 2 ч . в чашки Петри доливали среду йМЕМ с 10% сыворотки и оставляли при 37°С в атмосфере 5% СО2 на 2 сут . По истечении указанного времени образцы матриц с клетками последовательно обрабатывали растворами глутарового альдегида (2,5%), этанола и эфира . На лиофильно высушенные образцы наносили слой золота толщиной 5 нм . В работе использовали электронный микроскоп марки Jeol JSM-35C (Япония).

Результаты и обсуждение

Термодинамическая метастабильность алмаза при нормальных условиях и высокая температура его плавления указывают на невозможность спекания алмазных зерен без приложения высокого (соответствующих области стабильного алмаза >3 ГПа) давления Поэтому получение компактного материала относительно больших размеров может быть осуществлено лишь сращиванием отдельных зерен алмаза с различными матрицами, то есть посредством создания композиционных компактных материалов

Отдельные частицы алмаза связаны пироуглеро-дом Следует отметить, что пироуглеродная матрица имеет графитоподобное строение — большинство составляющих ее атомов находится в гибридизации sp2 . Малая толщина пироуглеродной матрицы позволяет рассматривать ее как двумерную в наномасшта-бе, однако в макромасштабе она образует трехмерный остов, придавая композиту достаточную прочность для сохранения им заданной формы В материале сохраняется большая открытая пористость

Структура полученных матриц, исследованная методом просвечивающей электронной микроскопии, представлена на рис 1 В структуре можно выделить упорядоченные углеродные фрагменты, соответствующие частицам алмаза, которые связаны между собой менее упорядоченной фазой графито-подобного углерода

Как видно из рис . 1, частицы алмаза выглядят как кластеры с параллельными плоскостями, которые представляют собой плоскости алмаза Покрывающие алмазные частицы графитоподобные слои углерода имеют достаточно большое межслоевое расстояние

Рис. 1. Композит НАК. Электронная микроскопия

Из представленной таблицы видно, что синтезированные материалы обладают каркасным строением и удовлетворительной прочностью, а также характеризуются высокоразвитой пористой структурой, включающей два типа пор: макропоры (с размерами в несколько микрон) и нанопоры с узким распределением по размерам

Новые разрабатываемые материалы, показанные для восстановления костной ткани, необходимо проверять на токсичность и биологическую совместимость с клетками Исследуемые в данной работе носители синтезированы впервые, поэтому они были протестированы по этим параметрам

Токсическое влияние углеродных материалов на клетки определяли по морфологии фибробластов . Поскольку матрицы являются непрозрачными, то прижизненное наблюдение за поведением клеток непосредственно на самих матрицах провести невозможно . Морфологические особенности фибробластов на поверхности чашки Петри оценивали в присутствии углеродных материалов методом сканирующей электронной микроскопии

После 2 сут . культивирования фибробластов в присутствии носителей морфология клеток не изменилась, они имели вытянутую веретеновидную форму

Адгезионную способность фибробластов к куль-туральному пластику в присутствии углеродных материалов оценивали подсчетом клеток, окрашенных генцианвиолетом (рис. 3).

Таблица. характеристика углеродных матриц

Материал Плотность, г/см3 Пористость, % Удельная поверхность, м2/г Средний размер (пор S/V), нм Размер пор геометрич., нм

НАК-30 0,85 65 280 12 13

АСМ 0,25/1 2,16 33 28 22 95

АСМ 1/0 2,26 30 11 48 125

НАК — наноалмазный композит, АСМ — алмазный композит из порошка алмаза .

£ fll -vi i*- гш

л. жЛШШ.- г

Рис. 2. Фибробласты кожи человека после 2 сут. культивирования в присутствии углеродных материалов (черное поле — углеродный материал): А — контроль (фибробласты на культуральном пластике); Б — в присутствии НАК; В — в присутствии АСМ 0.25/1; Г — в присутствии АСМ 1/0. Световая микроскопия. Ув. х10

Рис. 4. Жизнеспособность фибробластов на образцах НАК, АСМ 0,25/1 и АСМ 1/0 через 3 сут. культивирования

Аналогичную зависимость обнаружили при исследовании пролиферативной активности фибробластов, культивируемых в присутствии углеродных материалов, с помощью МТТ-теста (рис . 5) . При увеличении диаметра пор матриц АСМ 0,25/1 и АСМ 1/0 значительно увеличивалась пролифера-тивная активность клеток, по сравнению с таковой в группах с НАК и даже контролем .

Рис. 3. Адгезия фибробластов к культуральному пластику через 1 сут. после посева клеток в присутствии образцов НАК, АСМ 0,25/1 и АСМ 1/0

Рис. 5. Пролиферативная активность фибробластов, культивируемых в течение 72 ч. в присутствии углеродных материалов

Как видно на диаграмме, наименьшее количество клеток прикрепилось к поверхности культурального пластика в присутствии образцов НАК и АСМ 0,25/1. Для того, чтобы понять, является ли это причиной токсического воздействия самих матриц или снижением питательной способности культуральной среды, обусловленной высокой сорбционной активностью матриц, были проведены дополнительные исследования по изучению жизнеспособности клеток методом окраски трипановым синим

Данные по оценке жизнеспособности фибробла-стов при совместном культивировании клеток с углеродными материалами представлены на рис . 4 .

Как видно из диаграммы, наименьшее количество живых клеток после 3 сут . культивирования определяли в чашке в присутствии НАК . Возможно, что это является не следствием токсического воздействия материала, а недостатком питательных веществ, которые активно сорбируются из культуральной среды в присутствии НАК. Важно отметить, что чем меньше размер пор матриц (табл . ), тем лучше происходит сорбция компонентов Способность композитных материалов, содержащих в своем составе наноал-мазные компоненты, сорбировать белки была неоднократно продемонстрирована в литературе [19, 20].

При более длительном культивировании фи-бробластов в присутствии исследуемых матриц (2,5 нед . ) количество клеток на культуральном пластике в присутствии образца НАК было меньше, чем в присутствии образцов АСМ 0,25/1 и АСМ 1/0 (рис . 6) . Также следует отметить, что фибробласты в присутствии образцов АСМ 0,25/1 и АСМ 1/0 имеют характерную для них веретеновидную вытянутую форму, но морфология фибробластов в присутствии образца НАК при длительном культивировании изменилась .

Оценку непосредственного взаимодействия фи-бробластов с углеродными материалами проводили с помощью методов флуоресцентной и сканирующей электронной микроскопий

По данным флюоресцентной микроскопии после 2 ч культивирования наибольшее количество клеток адгезировалось к образцу АСМ 1/0, морфология фи-бробластов не изменялась и они были параллельно ориентированы (рис. 7Г) . Количество фибробластов, прикрепившихся к образцам НАК и АСМ 0,25/1, было значительно меньшим, по сравнению с образцом АСМ 1/0 (рис . 7Б . В) . Кроме того, если на образце АСМ 0,25/1 фибробласты имели характерную для них веретеновидную форму (рис . 8В), то на материале НАК клетки выглядели поврежденными (рис . 7Б) .

Состоянии фибробластов при культивировании их в течение 2 сут . в присутствии углеродных материалов определяли методом сканирующей электронной микроскопии (рис. 8) .

Рис. 6. Фибробласты кожи человека после

2,5 нед. культивирования в присутствии

исследуемых материалов

(черное поле — углеродная матрица):

А — контроль (фибробласты на культуральном

пластике); Б — в присутствии НАК;

В — в присутствии АСМ 0.25/1;

Г — в присутствии АСМ 1/0.

Световая микроскопия. Ув. х10

Рис. 7. Фибробласты кожи человека после 2 ч.

культивирования на углеродных матрицах:

А — контроль (фибробласты на покровном стекле);

Б — в присутствии НАК;

В — в присутствии АСМ 0.25/1;

Г — в присутствии АСМ 1/0.

Флуоресцентная микроскопия. Ув. х40

Б .V ' • •

, • f-: ; .

¿Я

', \ ' У . :* • - . -дЦидя' 4wmmä ^Ю?

Г

ш . .

'¿i

'Ш 1

ц

\

ß. -- fei',/*

Ш ш Ш

19 Ч и К2 Г : о и г j .coli.

Рис. 8. Фибробласты после 2 сут. культивирования на углеродных матрицах:

А — контроль (фибробласты на покровном стекле);

Б — в присутствии НАК;

В — в присутствии АСМ 0,25/1;

Г — в присутствии АСМ 1/0.

Сканирующая электронная микроскопия.

Ув. х10

Результаты сканирующей электронной микроскопии коррелируют с результатами флуоресцентной микроскопии . После 2 сут . культивирования наибольшее количество параллельно ориентированных клеток наблюдали на образце АСМ 1/0 (рис . 8Г) . Особенность распределения фибробластов, возможно, обусловлена топологией поверхности данного образца, которая позволяет выстраиваться клеткам параллельно

Выводы

1. Небольшой токсический эффект на фибробласты при культивировании in vitro оказал только материал НАК .

2 . Данные МТТ-анализа свидетельствуют, что присутствие углеродных матриц влияет на проли-феративную активность фибробластов . Чем меньше диаметр пор скаффолда, тем меньше пролифера-тивная активность клеток, культивируемых в его присутствии

3 . Увеличение удельной поверхности углеродных материалов и уменьшение размера пор до 10—20 нм снижает уровень адгезии фибробластов к исследуемым матрицам

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-50-00068) и при финансовой поддержке Федерального агентства научных организаций (ФАНО России).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Kim I . С . S ., YangT . K ., Lee J . С . Radiological changes in the bone fusion site after posterior lumbar interbody fusion using carbon cages impacted with laminar bone chips: Eollow-up study over more than 4 years . Spine 2005; 30(6): 655-60 .

2 . Bansal R . С . , Goyal M . Activated carbon adsorption . Boca Raton: Taylor & Francis; 2005 .

3 . Mooney E . , Drockery P ., Greiser U . et al . Carbon nanotubes and mesenchimal stem cells: biocompatibility, proliferation and differentiation . Nanoletters 2008; 8(8): 2137-43 .

4 . Yongbin Z ., Syed Ali F . , Dervishi E . et al . Cytotoxicity effects of graphen and single-wall carbon nanotubes in neural phaechromacytoma-derived PC12 cells . ACS NANO 2010; 4(6): 3181-6 .

5 . Qiu Y. S ., Shahgaldi B . F ., Revell W . J. et al . Evaluation of Gateshead carbon fibre rod as an implant material for repair of osteochondral defects: A morphological and mechanical study in the rabbit knee . Biomaterials 2002; 23: 3943-55 .

6 .Yu M . F ., Files B . S ., Arepalli S . et al . Tensile loading of ropes of single wall carbon nanotubes and their mechanical properties Phys Rev . Letters 2000; 84(24): 5552-5 .

7 . Harrison B . S . , Atala A . Carbon nanotube applications for tissue engineering . Biomaterials 2007; 28(11): 344-53 .

8 . Shvedova A .A. , Castranova V. , Kisin E . R . et al . Exposure to carbon nanotube material: assessment of nanotube cytotoxicity using human keratinocyte cells . J . Tox . Env . Health A 2003; 66(20): 1909-26 .

9 . McKenzie J . L ., Waid M . C ., Shi R . et al . Decreased functions of astrocytes on carbon nanofiber materials J Biomaterials 2004; 25(7-8): 1309-17 .

10 . Cui D . , Tian F ., Ozkan C . S . et al . Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells . Toxicol . Lett . 2005; 155(1): 7385

11. Mattson M . P ., Haddon R . C ., Rao A . Molecular functionalization of carbon nanotubes and use as substrates for neuronal growth J Mol . Neurosci . 2000; 14(3): 175-82 .

12 . Hu H . , Ni Y., Montana V . et al . Chemically Functionalized Carbon Nanotubes as Substrates for Neuronal Growth . Nano Lett . 2004; 4(3): 507-11.

13 Hu H , Ni Y , Mandal S K et al Polyethyleneimine functionalized single-walled carbon nanotubes as a substrate for neuronal growth J Phys . Chem . B 2005; 109: 4285-9 .

14 . Macdonald R .A. ; Laurenzi, B . F.; Viswanathan G . et al . Collagen—carbon nanotube composite materials as scaffolds in tissue engineering . J . Biomed . Mater . Res . A 2005; 74: 489 .

15 . Wang J . H . C . , Grood E . S . , Florer J . et al . Alignment and proliferation of MC3T3-E1 osteoblasts in microgrooved silicone substrata subjected to cyclic stretching J . Biomech . 2000; 33: 729-35 .

16 . Ratner B . D . Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine . 2nd ed . London: Elsevier Academic Press; 2004

17 . Karageorgiou V ., Kaplan D . Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis . Biomaterials 2005; 26: 5474-91.

18 . Гордеев С . К . Трехмерные углеродные наноматериалы . Вопросы материаловедения 2008; 2: 163-74 .

19 . Севостьянова А.А., Меленевский А. Т., Демин А.А. и др . Наноалмазы, импрегнированные в целлюлозную матрицу, для хро-матографической очистки белков . Сорбционные и хроматографиче-ские процессы 2011; 11(6):742-53 .

20 Vinante M , Digregorio G , Lunelli L et al Human plasma protein adsorption on carbon-based materials . J . Nanosci . Nanotechnol . 2009; 9(6): 3785-91.

Поступила: 15.01.2015