СОСТАВ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ РНК
COMPOSITION FOR RNA ADMINISTRATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается композиций, содержащих полиплексные составы для доставки РНК в органы мишени или клетки мишени после парентерального введения, в частности, после внутримышечного введения. Более точно настоящее изобретение касается составов для введения РНК типа самореплицирующейся РНК, в частности, путем внутримышечной инъекции. Более конкретно, полиплексные частицы содержат одноцепочечную РНК, предпочтительно самореплицирующуюся или самоамплифицирующуюся РНК, и полиалкиленимин. РНК может кодировать представляющий интерес белок типа фармацевтически активного белка. РНК поглощается клеткой, причем РНК предпочтительно транслируется в пептид или белок, который может проявлять физиологическую активность. Композиции по изобретению применимы для индуцирования или усиления иммунного ответа. Они также применимы для профилактического и/или терапевтического лечения заболеваний с участием антигенов типа белков. Кроме того, настоящее изобретение касается способов получения стабильных композиций, содержащих РНК-полиплексные составы, причем данные РНК-полиплексные составы включают одноцепочечную РНК и полиалкиленимин. Составы РНК-полиплексных частиц, описанные здесь, можно замораживать и оттаивать либо дегидратировать и регидратировать без потери качества продукта, в частности, без существенной потери активности РНК. В частности, описанные здесь составы РНК-полиплексных частиц можно замораживать или обезвоживать методами замораживания-высушивания, распылительной сушки или аналогичными методами, позволяющими увеличить сроки хранения продуктов в сравнении с хранением в жидком состоянии. Кроме того, описанные здесь составы РНК-полиплексных частиц могут удовлетворять требованиям к фармацевтическим продуктам, более конкретно, в отношении требований к GMP-производству и требований к качеству фармацевтических продуктов для парентерального применения. Описанные здесь РНК-полиплексные составы особенно применимы для вакцинации людей или животных, напр., от инфекционных заболеваний.
Уровень техники
Введение чужеродных нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько полипептидов в профилактических и терапевтических целях, было целью биомедицинских исследований в течение многих лет. Общим для подходов предшествующего уровня техники была доставка молекул нуклеиновой кислоты в клетки мишени или организмы мишени, но они различаются по типу молекул нуклеиновой кислоты и/или системы доставки: под влиянием проблем безопасности, связанных с применением молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), все большее внимание в последние годы привлекают молекулы рибонуклеиновой кислоты (РНК). Предлагались различные подходы, включая введение одноцепочечной или двухцепочечной РНК в виде голой РНК или в виде комплекса либо в упакованном виде, напр., в невирусных или вирусных средствах доставки. Нуклеиновая кислота у вирусов и вирусных средств доставки обычно инкапсулирована белками и/или липидами (вирусные частицы). Например, в качестве средства доставки для обработки растений (WO 2000/053780 A2) или для вакцинации млекопитающих (Tubulekas et al., 1997, Gene, vol. 190, pp. 191-195) предлагались генно-инженерные РНК-вирусные частицы, полученные из РНК-вирусов. Ввиду проблем с безопасностью медицинское и ветеринарное сообщество с неохотой относится к введению РНК-вирусных частиц людям или животным. Для разработки терапевтических средств на основе доставки генов проводились обширные исследования невирусных средств доставки, которые могут быть применимы к РНК. Однако по разным причинам внедрение способов невирусной доставки генов в клиническую практику было не очень успешным. Причины могут быть связаны с неудовлетворительным уровнем экспрессии генов, технологическими и регуляторными проблемами, связанными с фармацевтической разработкой таких сложных продуктов, и соображениями безопасности.
Таким образом, существует потребность в фармацевтических продуктах для безопасной и эффективной доставки пациентам и животным РНК, кодирующей белки, имеющие терапевтическое значение типа вакцин. Как описано здесь, аспекты и воплощения настоящего изобретения направлены на удовлетворение этой потребности.
Cущность изобретения
Иммунотерапевтические стратегии составляют перспективные подходы к профилактике и терапии, напр., инфекционных заболеваний и раковых заболеваний. Выявление все возрастающего количества патогенов и опухолевых антигенов привело к накоплению подходящих мишеней для иммунотерапии. Настоящее изобретение охватывает улучшенные средства и способы, подходящие для эффективной экспрессии антигенов, подходящих для иммунотерапевтического лечения при профилактике и терапии заболеваний.
В одном аспекте изобретение касается фармацевтических композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин.
В другом аспекте изобретение касается композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин,
для применения в качестве лекарственных препаратов.
В одном воплощении всех аспектов изобретения молярное отношение числа атомов азота (N) в полиалкиленимине к числу атомов фосфора (P) в одноцепочечной РНК (соотношение N:P) составляет от 1,0 до 30, предпочтительно от 2,0 до 15,0, более предпочтительно от 6,0 до 12,0.
В следующем аспекте изобретение касается композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин,
причем молярное отношение числа атомов азота (N) в полиалкиленимине к числу атомов фосфора (P) в одноцепочечной РНК (соотношение N:P) составляет от 1,0 до 30,0, предпочтительно от 2,0 до 15,0, более предпочтительно от 6,0 до 12,0.
В одном из воплощений всех аспектов изобретения ионная сила композиции составляет 50 мМ или меньше, предпочтительно концентрация положительно заряженных одновалентных ионов составляет 25 мМ или меньше, а концентрация свободных положительно заряженных двухвалентных катионных ионов составляет 20 мкМ или меньше.
В следующем аспекте изобретение касается композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин,
причем ионная сила составляет 50 мМ или меньше.
В одном воплощении концентрация положительно заряженных одновалентных ионов составляет 25 мМ или меньше, а концентрация положительно заряженных двухвалентных катионных ионов составляет 20 мкМ или меньше.
В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции предназначены для внутримышечного введения типа внутримышечной инъекции.
В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК и полиалкиленимин находятся в полиплексных частицах.
В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК и полиалкиленимин присутствуют в виде полиплексных частиц.
В одном воплощении всех аспектов изобретения полиалкиленимин имеет следующую общую формулу (I):
,
где R означает Н, ацил или группу по следующей общей формуле (II):
,
1
где R означает Н или группу по следующей общей формуле (III):
,
n, m и l выбраны независимо из целых чисел от 2 до 10; а
2
7
5
p, q и r – целые числа, причем сумма p, q и r такова, что средняя молекулярная масса полимера составляет от 1,5×10 до 10 Да, предпочтительно от 5000 до 10 Да, более предпочтительно от 10 000 до 40 000 Да, более предпочтительно от 15 000 до 30 000 Да, еще более предпочтительно от 20 000 до 25 000 Да.
1
В одном воплощении n, m и l выбирают независимо из 2, 3, 4 и 5, предпочтительно из 2 и 3. В одном воплощении R означает H. В одном воплощении R означает H или ацил.
В одном воплощении всех аспектов изобретения полиалкиленимин включает полиэтиленимин и/или полипропиленимин, предпочтительно полиэтиленимин.
В одном воплощении всех аспектов изобретения по меньшей мере 92% атомов N в полиалкиленимине являются протонируемыми.
В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции по изобретению содержат одну или несколько добавок. В одном воплощении одна или несколько добавок выбираются из группы, состоящей из буферных веществ, сахаридов, стабилизаторов, криопротекторов, лиопротекторов и хелатирующих средств. В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции по изобретению содержат один или несколько полимеров. В одном воплощении буферные вещества включают по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), 3-морфолино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты (MOPSO), буферных систем на основе уксусной кислоты и их аналогов, буферных систем на основе фосфорной кислоты или буферных систем на основе лимонной кислоты. В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции по изобретению содержат буферы для забуферивания в диапазоне рН от 4 до 8, предпочтительно от 5 до 7,5. Примерами таких буферных систем являются ацетатные буферы или буферы HEPES или фосфатные буферы или буферы на основе уксусной кислоты. В одном воплощении сахариды включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, предпочтительно из глюкозы, трегалозы, сахарозы и декстрана. В одном воплощении добавка представляет собой декстран со средней молярной массой от 1 кДа до 100 кДа. В одном воплощении криопротекторы включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из таких гликолей, как этиленгликоль, пропиленгликоль и глицерин. В одном воплощении хелатирующее средство включает ЭДТА. В одном воплощении липиды включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из катионных липидов, нейтральных липидов и анионных липидов. В одном воплощении композиции по изобретению содержат один или несколько блок-сополимеров, включающих строительные блоки этиленоксида и пропиленоксида. В одном воплощении композиции по изобретению содержат сополимеры, содержащие этилендиаминовые группы. В одном воплощении композиции по изобретению содержат амфифильный блок-сополимер, предпочтительно содержащий строительные блоки из этиленоксида и пропиленоксида, необязательно также содержат этилендиаминовые группы.
В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции содержат забуференную HEPES глюкозу (HBG или HBGx1), забуференную MES глюкозу (MBG или MBGx1) или забуференную HEPES трегалозу (HBT или HBTx1). В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции содержат глюкозу или трегалозу или сахарозу в буфере на основе уксусной кислоты с концентрацией в диапазоне от 0,1 мМ до 10 мМ. В одном воплощении всех аспектов изобретения композиции содержат глюкозу или трегалозу или сахарозу в фосфатном буфере с концентрацией в диапазоне от 0,1 мМ до 10 мМ.
В одном воплощении всех аспектов изобретения z-средний размер частиц составляет менее 200 нм, предпочтительно менее 150 нм и более предпочтительно менее 100 нм. В одном воплощении z-средний размер частиц составляет от 50 нм до 200 нм. В одном воплощении всех аспектов изобретения ζ-потенциал частиц составляет 20 мВ или больше, предпочтительно от 25 до 40 мВ. В одном воплощении всех аспектов изобретения электрофоретическая подвижность (µ) частиц составляет от 1,6 мкм×см/V×S. В одном воплощении всех аспектов изобретения z-средний размер частиц и/или ζ-потенциал и/или электрофоретическая подвижность определяются в суспензии, содержащей частицы полиплекса и забуференную HEPES глюкозу (HBG) или забуференную HEPES трегалозу (HBT). В одном воплощении HBG содержит 5% глюкозы (вес/объем) и 10 мМ HEPES, pH 7,1, а HBT содержит 10% трегалозы (вес/объем) и 10 мМ HEPES, pH 7.1. В одном воплощении z-средний размер частиц определяется методом динамического рассеяния света с анализом данных по кумулянтному алгоритму. В одном воплощении коэффициент поступательной диффузии измеряется методом динамического рассеяния света. Затем для вычисления z-среднего значения применяется уравнение Стокса-Эйнштейна. В одном воплощении электрофоретическая подвижность измеряется методом лазерно-доплеровского электрофореза. Затем для расчета ζ-потенциала применяется уравнение Генри или уравнение Смолуховского.
В одном воплощении всех аспектов изобретения частицы являются нейтральными или положительно заряженными, предпочтительно при физиологическом рН или при рН между 4,5 и 7,5.
В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК представляет собой молекулу от 6000 до 15000 оснований, предпочтительно от 9000 до 12000 оснований. В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК кодирует по меньшей мере один представляющий интерес белок. В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК представляет собой репликон, предпочтительно самореплицирующуюся или самоамплифицирующуюся РНК. В одном воплощении репликон может реплицироваться репликазой из альфавируса, причем репликон предпочтительно содержит 5′-последовательность распознавания репликации из альфавируса или её вариант и 3′-последовательность распознавания репликации из альфавируса или её вариант. В одном воплощении всех аспектов изобретения одноцепочечная РНК содержит открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес пептид или белок, как-то фармацевтически активный пептид или белок.
В одном воплощении всех аспектов изобретения описанные здесь композиции предназначены для применения в терапии. В одном воплощении всех аспектов изобретения описанные здесь композиции представляет собой вакцинные композиции.
В следующем аспекте изобретение касается применения описанных здесь композиций для введения РНК в клетки, в частности, для экспрессии РНК в клетках. В одном воплощении клетки представлены мышечными клетками.
В следующем аспекте изобретение касается применения описанных здесь композиций для внутримышечного введения РНК.
В следующем аспекте изобретение касается способа внутримышечного введения РНК, включающего стадию внутримышечного введения описанных здесь композиций.
В следующем аспекте изобретение касается замороженных, лиофилизованных или высушенных распылением композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин,
причем композиции содержат криопротектор и/или лиопротектор, предпочтительно дисахарид типа трегалозы или полисахарид типа декстрана.
В одном воплощении композиции дополнительно содержат хелатирующее средство типа ЭДТА.
В одном воплощении композиции получают из водных композиций, содержащих дисахарид в количестве 5-20% (вес/объем) и необязательно хелатирующее средство в концентрации от 20 мкМ до 10 мМ, как-то от 80 мкМ до 5 мМ. В одном воплощении водные композиции содержат трегалозу, HEPES и EDTA, как-то 10% трегалозы (вес/объем), 2,8 мМ HEPES, 80 мкМ EDTA, pH 7,1.
В следующем аспекте изобретение касается водных композиций, получаемых путем оттаивания описанных здесь замороженных композиций либо восстановления описанных здесь лиофилизованных или высушенных распылением композиций.
В следующем аспекте изобретение касается способа получения замороженных, лиофилизованных или высушенных распылением композиций, включающего:
(i) приготовление водной композиции, содержащей одноцепочечную РНК, полиалкиленимин и криопротектор и/или лиопротектор, предпочтительно дисахарид типа трегалозы или полисахарид типа декстрана, и
(ii) замораживание, лиофилизацию или распылительную сушку композиции.
В одном воплощении водные композиции дополнительно содержат хелатирующее средство типа ЭДТА. В одном воплощении водные композиции содержат дисахарид в количестве 5-20% (вес/объем) и необязательно хелатирующее средство в концентрации от 20 мкМ до 10 мМ, как-то от 80 мкМ до 5 мМ. В одном воплощении водные композиции содержат трегалозу, HEPES и EDTA, как-то 10% трегалозы (вес/объем), 2,8 мМ HEPES, 80 мкМ EDTA, pH 7,1.
В следующем аспекте изобретение касается применения криопротекторов и/или лиопротекторов, предпочтительно дисахаридов типа трегалозы или полисахаридов типа декстрана, для получения замороженных, лиофилизованных или высушенных распылением композиций, включающих:
(a) одноцепочечную РНК; и
(b) полиалкиленимин.
В одном воплощении дисахарид используется в сочетании с хелатирующим средством типа ЭДТА.
Замороженные или лиофилизованные или высушенные распылением композиции либо водные композиции для получения замороженных или лиофилизованных или высушенных распылением композиций могут содержать одно или несколько из следующего:
(i) неводные растворители типа этиленгликоля, глицерина, диметилсульфоксида и диметилформамида;
(ii) поверхностно-активные вещества типа Tween 80, Brij 35, Brij 30, Lubrol-PX, Triton X-10, Pluronic F127 (сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена), также известного как полоксамер, полоксамина и додецилсульфата натрия;
(iii) дисахариды типа трегалозы, сахарозы, лактозы и мальтозы;
(iv) полимеры (которые могут иметь различные молекулярные массы) типа полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта, гидроксипропилметилцеллюлозы, желатина, поливинилпирролидона, гидроксиэтилцеллюлозы, фиколла и альбумина;
(v) аминокислоты типа глицина, пролина, 4-гидроксипролина, L-серина, глутамата, аланина, лизина, саркозина и гамма-аминомасляной кислоты.
В следующем аспекте изобретение касается способа поточного производства РНК-полиплексных составов при помощи насосов непрерывного действия и смесительного устройства, в котором две водные жидкости смешиваются по каналам в миллиметровом или микрометровом диапазоне.
Краткое описание фигур
50
50
Фиг. 1. A. Токсичность свободного чистого PEI на клетках HEK-293 in vitro. IC = 77 мкМ азота (свободного). B. Токсичность полипеплексов PEI/РНК-репликон на клетках HEK-293 in vitro. IC = 542 мкМ азота (полиплексного состава).
Фиг. 2. Относительная люминесценция мышечных клеток C2C12 после инкубации с полиплексами PEI/РНК-репликон при N/P = 11,6 при различных условиях хранения после 1-недельного хранения.
Фиг. 3. Относительная целостность РНК в полиплексах PEI/РНК-репликон при N/P = 11,6 при различных условиях хранения после 2-недельного хранения.
Фиг. 4. Получение поли(2-этил-2-оксазолина) путем изомеризационной полимеризации 2-этил-2-оксазолина с размыканием цикла в присутствии инициаторов.
Фиг. 5. Синтез полностью деацилированных линейных PEI22, PEI87 и PEI217 путем кислотного гидролиза PEOZ. Условия: (i) 24% (вес/объем) HCl, 110°C, 96 ч; n = 504 для PEOZ в 50 кДа, 2,018 для PEOZ в 200 кДа и 5044 для PEOZ в 500 кДа.
Фиг. 6. Кинетика агрегации полиплексов IVT (A) и полиплексов с репликоном (B) при повышении концентрации соли.
4
Фиг. 7. Физико-химические параметры полиплексов до (начало) и после (конец) фильтрования. А и В. Диаметр и полидисперсность полиплексов измеряли методом DLS. C. Высвобождение РНК из полиплексов под действием гепарина при измерении по УФ-поглощению при 260 нм. D. Концентрацию PEI измеряли методом с CuSO.
2
2
Фиг. 8. Сравнение химической структуры PEI высокой чистоты и PEI обычной чистоты. n = 58 для PEI в 25 кДа. Среднее число мономеров -CHCHNH- в PEI 25 кДа составляет 581, что также является длиной непрерывного отрезка потенциально протонируемых атомов азота. В предположении равномерного распределения N-пропионильных фрагментов в обычном PEI25, непрерывный отрезок протонируемых азотов в нем составляет всего лишь 64.
Фиг. 9. Трансфекция мышечных клеток C2C12 in vitro полиплексами РНК-репликона, полученными с использованием PEI различного уровня чистоты при различных соотношениях N/P.
Фиг. 10. Получали полиплексы РНК-репликона при соотношениях N/P = 1 (-) и 11,6 (+) с PEI высокой чистоты (jetPEI) и PEI обычной чистоты (25 кДа). В качестве контроля использовали свободную РНК. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3). Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Фиг. 11. Получали полиплексы РНК-репликона при соотношениях N/P = 7,7 и 11,6 с PEI высокой чистоты: jetPEI (фирмы Polyplus), PEI-Max 40000 (фирмы Polyscience) и Exgen 500 (фирмы Euromedex). Все составы готовили в буфере HBGx1, кроме лиофилизованного состава, который готовили в буфере HBTx1. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3). Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Фиг. 12. Лиофилизованные осадки полипеплексов jetPEI/РНК-репликон при N/P = 11,6 получали с различными буферами.
Фиг. 13. Мышечные клетки C2C12 трансфецировали in vitro с помощью IVT-РНК, кодирующей люциферазу. РНК представляла собой комплексы с jetPEI при различных соотношениях N/P в буфере HBGx1. Через 24 ч после трансфекции измеряли сигналы люминесценции.
Фиг. 14. Получали полиплексы IVT-РНК при соотношениях N/P = 5,8 и 11,6 с чистым PEI в буфере HBGx1. В качестве контроля использовали свободную IVT-РНК в буфере HBGx1. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3) в дозах 2-8 мкг РНК на инъекцию. Через 6 ч после инъекции регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Фиг. 15. Получали полиплексы РНК-репликона и jetPEI при различных концентрациях РНК при соотношении N/P = 11,6 в буфере HBGx1. Для измерения размеров методом DLS полиплексы разбавляли до концентрации РНК в 10 мг/л.
Фиг. 16. Мышечные клетки C2C12 трансфецировали in vitro полиплексами из фиг. 16. Через 24 ч после трансфекции измеряли сигналы люминесценции.
Фиг. 17. Получали полиплексы РНК-репликона при соотношении N/P = 11,6 с очищенным PEI в буфере HBGx1 при различных концентрациях РНК, как на фиг. 16. Составы вводили в/м в задние конечности мышей (n = 3) в дозах 2-8 мкг РНК на инъекцию. Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Фиг. 18. Исследования in vitro с полиплексами PEI/РНК-репликон на дендритных клетках человека (DC) и мышечных клетках мыши (C2C12) A. Токсичность (выражали в % жизнеспособных клеток после обработки полиплексами). B. Трансфекция (выражали в виде уровня люминесценции после обработки полиплексами). Результаты трансфекции представлены только для клеток C2C12.
Фиг. 19. Получали полиплексы РНК-репликона при соотношении N/P = 11,6 или 15,8 с PEI фирмы Polyplus или Polytheragene в буфере HBGx1 или 10 мМ Hepes. Перед введением мышам полиплексы разводили в буфере HBGx1 или Opti-MEM. Составы вводили в/м в задние конечности мышей (n = 3) в дозе 2 мкг РНК на инъекцию. Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Фиг. 20. A. Через 4, 7 и 11 дней после внутримышечного (i.m.) введения в задние части обеих musculus tibialis у мышей Balb/c по 2 мкг безрецептурного (буферный раствор) или рецептурного состава с РНК-репликоном, кодирующим люциферазу, животных подвергали неинвазивной биолюминесцентной томографии in vivo. Регистрировали фотоны, исходящие из белка люциферазы, в течение 1 мин, что представлено в виде наложения на фотографии исследуемых мышей. B. Графическое представление измеренных фотонов за 1 сек (p/s) на месте инъекции.
Фиг. 21. A. Через 7 дней после интрадермального (id) введения в два места инъекции в заднюю часть спины у мышей Balb/c по 2 мкг безрецептурного (буферный раствор) или рецептурного состава с РНК-репликоном, кодирующим люциферазу, животных подвергали неинвазивной биолюминесцентной томографии in vivo. Регистрировали фотоны, исходящие из белка люциферазы, в течение 1 мин, что представлено в виде наложения на фотографии исследуемых мышей. Черными стрелками обозначены места инъекции. B. Графическое представление измеренных фотонов за 1 сек (p/s) на месте инъекции.
Фиг. 22. Положительный эффект состава с РНК-репликоном в качестве вакцины.
Фиг. 23. Положительный эффект состава с РНК-репликоном в качестве вакцины.
Фиг. 24. Результаты по распылительной сушке состава РНК-репликона с PEI в 10% (вес/об.) растворе трегалозы.
Фиг. 25. Нормированная люминесценция из мышечных клеток C2C12 после инкубации с полиплексами PEI/РНК-репликон при различных соотношениях N/P до (свежеприготовленные) и после (стерилизованные) стерилизации фильтрованием.
Фиг. 26. Влияние комбинаций с короткими и длинными PEI на эффективность трансфекции in vitro в соответствии с примером 16. Фиг. 26A. Эффективность трансфекции полиплексов с короткими линейными PEI и длинными PEI при 250 нг РНК на лунку. Фиг. 26B. Эффективность трансфекции полиплексов с короткими разветвленными PEI и длинными PEI при 250 нг РНК на лунку. По сравнению с эталоном JetPEI in vivo при таком же общем соотношении NP отмечались более высокие уровни экспрессии в различных временных интервалах у комбинаций с короткими PEI (фиг. 26A: линейные; фиг. 26B: разветвленные) и длинными PEI (напр., jetPEI in vivo).
Фиг. 27. Эффективность трансфекции РНК-репликона у полиплексов с длинными jetPEI + короткими PEI в сравнении с эталоном (т.е. jetPEI NP12 in vivo) в соответствии с примером 17: короткие PEI (разветвленные в 1,8 кДа) и длинные PEI в различных комбинациях (NP4 + NP8 или NP1,15 + NP11) при общем NP = 12.
Фиг. 28. Влияние вариаций соли (напр., NaCl) на эффективность трансфекции РНК-репликона (saRNA) in vivo в соответствии с примером 18. Регистрировали сигналы биолюминесценции на 3-й (фиг. 28A), 6-й (фиг. 28B), 9-й (фиг. 28C) и 13-й день (фиг. 28D). Уровень сигналов сравнивали на фиг. 28E. Наиболее интенсивный сигнал в области мышц у мышей отмечался на 6-й день после i.m. инъекции у мышей, получавших полиплексы PEI/РНК-репликон (напр., длинный PEI при N/P = 12) с добавлением соли при низких концентрациях (от 5 до 10 мМ).
Фиг. 29. Влияние доведения pH на эффективность трансфекции у составов PEI/РНК-репликон (saRNA) в соответствии с примером 18. Хорошие результаты получали с составами полиплексов saRNA-PEI со значениями pH между 6,5 и 7,1. Наиболее интенсивный сигнал отмечался у состава saRNA с длинным PEI NP12, доведенного до pH 6,5. В качестве эталона использовали полиплексы saRNA-JetPEI NP12 без доведения pH (BM) или с HBG (20 мМ Hepes, pH 7,4, 5% масс. глюкозы).
Фиг. 30. Электрофоретическая подвижность полиплексов jetPEI/РНК-репликон in vivo (N/P = 4), доведенных до различных значений pH в соответствии с примером 19.
Фиг. 31. Нормированная люминесценция от мышечных клеток C2C12 после инкубации с различными дозами полиплексов jetPEI/РНК-репликон in vivo при соотношении N/P = 4 и различных значениях pH (pH 6,5 - pH 8,5) в соответствии с примером 19.
Фиг. 32. Экспрессия люциферазы после трансфекции различными количествами PEI с избытком положительных зарядов в составах PEI в соответствии с примером 20.
Фиг. 33. Оптимизация трансфекции полиплексов при помощи 2-стадийного комплексообразования в соответствии с примером 21.
Фиг. 34. Эксперимент по иммунизации согласно примеру 22, представляющий превосходное действие saRNA-полиплексов, составленных с забуференной MES глюкозой (MBG), по сравнению с забуференной HEPES глюкозой (HBG).
Раскрытие сущности изобретения
Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, однако следует иметь в виду, что данное изобретение не ограничивается конкретными методиками, протоколами и реагентами, описанными здесь, так как они могут варьироваться. Также следует иметь в виду, что используемая здесь терминология предназначается только для описания определенных воплощений и не должна ограничивать объем настоящего изобретения, который должен ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области.
Предпочтительно используемые здесь термины определяются так, как описано в “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland (1995).
При практическом применении настоящего изобретения следует использовать, если не указано иначе, общепринятые методы химии, биохимии, клеточной биологии, иммунологии и методы рекомбинантной ДНК, которые изложены в литературе по данной области (напр., см. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).
Далее будут описаны все элементы настоящего изобретения. Эти элементы приводятся с конкретными воплощениями, однако следует иметь в виду, что они могут комбинироваться любым образом и в любом количестве для создания дополнительных воплощений. Описанные по-разному примеры и предпочтительные воплощения не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение лишь явно описанными воплощениями. Следует понимать, что данное описание раскрывает и охватывает воплощения, в которых явно описанные воплощения сочетаются с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке следует рассматривать как раскрытые данным описанием, если из контекста не следует иное.
Термин “примерно” означает приблизительно или почти, а в контексте приведенных здесь числовых значений или диапазонов предпочтительно означает ± 10% от указанного или заявленного числового значения или диапазона.
Формы единственного числа и аналогичные ссылки, используемые в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения), следует рассматривать как охватывающие значения как единственного, так и множественного числа, если не указано иначе или же явно противоречит контексту. Приведенные здесь диапазоны значений просто служат удобным способом индивидуального обозначения каждого отдельного значения, попадающего в этот диапазон. Если не указано иначе, каждое индивидуальное значение включается в описание, как если бы оно было отдельно приведено здесь. Все описанные здесь способы могут выполняться в любом подходящем порядке, если не указано иначе или же явно противоречит контексту. Использование приведенных здесь всевозможных примеров или приблизительных выражений (напр., “как-то”) служит просто для лучшей иллюстрации изобретения и не налагает никаких ограничений на объем данного заявленного изобретения. Никакие выражения в описании не следует истолковывать как означающие какой-нибудь не заявленный элемент, существенный для практического применения изобретения.
Если прямо не указано иначе, термин “включающий” применяется в контексте настоящего документа для указания того, что необязательно могут присутствовать и дополнительные элементы в дополнение к тем элементам списка, перед которыми стоит “включающий”. Однако в качестве конкретного воплощения настоящего изобретения предусматривается, что термин “включающий” охватывает и возможность отсутствия дополнительных элементов, то есть в целях данного воплощения “включающий” следует понимать как имеющий значение “состоящий из”.
По всему тексту настоящего описания цитируется несколько документов. Каждый из цитируемых здесь документов (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), будь то выше или ниже, включается сюда путем ссылки во всей полноте. При этом ничто не должно истолковываться как признание того, будто настоящее изобретение не может предвосхищать такое раскрытие.
Далее будут представлены определения, которые применимы ко всем аспектам настоящего изобретения.
Такие термины, как “уменьшить” или “ингибировать” в настоящем изобретении означают способность вызывать общее снижение уровня на 5% или больше, предпочтительно на 10% или больше, на 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше и наиболее предпочтительно на 75% или больше. Термин “ингибировать” или подобные фразы включают полное или почти полное ингибирование, то есть снижение до нуля или практически до нуля.
Такие термины, как “увеличение” или “усиление” предпочтительно означают повышение или усиление по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100%.
“Фрагмент” в отношении последовательности нуклеиновой кислоты означает часть последовательности нуклеиновой кислоты, то есть последовательность, которая представляет последовательность нуклеиновой кислоты, укороченную на 5′- и/или 3′-конце. Предпочтительно фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных остатков из указанной последовательности нуклеиновой кислоты. В настоящем изобретении предпочтительными являются такие фрагменты молекул РНК, которые сохраняют стабильность РНК и/или эффективность трансляции.
“Фрагмент” в отношении аминокислотной последовательности (пептида или белка) означает часть аминокислотной последовательности, то есть последовательность, которая представляет аминокислотную последовательность, укороченную на N-конце и/или C-конце. Фрагмент, укороченный на C-конце (N-концевой фрагмент), можно получить, напр., при трансляции усеченной открытой рамки считывания, в которой отсутствует 3′-конец открытой рамки считывания. Фрагмент, укороченный на N-конце (C-концевой фрагмент), можно получить, напр., при трансляции усеченной открытой рамки считывания, в которой отсутствует 5′-конец открытой рамки считывания, если только усеченная открытая рамка считывания содержит старт-кодон, служащий для инициации трансляции. Фрагмент аминокислотной последовательности включает, напр., по меньшей мере 1%, по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности.
Термин “ионная сила” относится к математической взаимозависимости между количеством различных видов ионных частиц в определенном растворе и соответствующими им зарядами. Так, ионная сила I математически выражается формулой:
где c – молярная концентрация определенного вида ионов, а z – абсолютная величина его заряда. Сумма Σ берется по всем различным видам ионов (i) в растворе.
Предпочтительно ионная сила описанных здесь композиций составляет 50 мМ или меньше, предпочтительно 25 мМ или меньше, предпочтительно 20 мМ или меньше, 19 мМ или меньше, 18 мМ или меньше, 17 мМ или меньше, 16 мМ или меньше, 15 мМ или меньше, 10 мМ или меньше либо 5 мМ или меньше. Предпочтительно ионная сила описанных здесь композиций является достаточно низкой с тем, чтобы предотвратить агрегацию полиплексных частиц.
Согласно изобретению, термин “ионная сила” предпочтительно относится к присутствию одновалентных ионов. Что касается присутствия двухвалентных ионов, в частности двухвалентных катионов, то их концентрация или эффективная концентрация (наличие свободных ионов) из-за присутствия хелатирующих агентов предпочтительно является достаточно низкой, чтобы предотвратить деградацию РНК. В одном особенно предпочтительном варианте концентрация или эффективная концентрация двухвалентных ионов ниже каталитического уровня для гидролиза фосфодиэфирных связей между нуклеотидами РНК. В одном особенно предпочтительном воплощении концентрация свободных двухвалентных ионов составляет 20 мкМ или меньше, предпочтительно свободные двухвалентные ионы отсутствуют или практически отсутствуют.
Предпочтительно значение рН описанных здесь композиций составляет от 4 до 8, более предпочтительно от 5,5 до 8, как-то от 6 до 7,5, напр., от 6,5 до 7,1, от 6,5 до 7 или от 6,5 до 6,9.
Термин “дисахарид” относится к углеводам, состоящим из двух моносахаридных остатков, связанных гликозидными связями. Типичные примеры дисахаридов включают трегалозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, лактулозу, целлобиозу, изомальтозу, гентибиозу, дисахарид ламинарин (ламинарабиозу), хитобиозу, ксилобиозу, дисахарид инулин и маннобиозу. Предпочтительно содержание дисахаридов в описанных здесь композициях составляет 5-20% (вес/объем), как-то 5-15% (вес/объем), 7-15% (вес/объем) или 8-12% (вес/объем). Предпочтительными дисахаридами по изобретению являются дисахариды с высокой температурой стеклования.
Термин “хелатообразующий реагент” означает соединение, которое образует хелаты с ионами металлов, предпочтительно с ионами двухвалентных или поливалентных металлов. Хелаторы содержат несколько групп, напр., OH, -COOH, способных образовывать кольцевую структуру с ионами металлов. Примерами хелатообразующих агентов являются: этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA), транс-1,2-диаминциклогексантрауксусная кислота моногидрат, N-гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусная кислота (HEDTA), лимонная кислота и хелаторы на основе фосфорной кислоты (напр., Dequest 2000). Предпочтительной по изобретению является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Предпочтительно хелатообразующий реагент присутствует в описанных здесь композициях в концентрации по меньшей мере 20 мкМ, по меньшей мере 40 мкМ, по меньшей мере 60 мкМ или по меньшей мере 80 мкМ. Предпочтительно хелатообразующий реагент присутствует в описанных здесь композициях в концентрации вплоть до 10 мМ, до 5 мМ, до 2 мМ, до 1 мМ, до 0,5 мМ, до 0,2 мМ или до 0,1 мМ.
Термин “замораживание” относится к затвердеванию жидкости, обычно с отводом тепла.
Термин “лиофилизация” относится к сушке веществ вымораживанием путем их замораживания, а затем снижения окружающего давления, что позволяет замерзшей среде в веществе сублимироваться непосредственно из твердой фазы в газовую фазу.
Термин “распылительная сушка” относится к сушке веществ распылением путем смешивания (нагретого) газа с жидкостью, которая пульверизуется (распыляется) в сосуде (распылительной сушке), где из образовавшихся капель испаряется растворитель, образуя сухой порошок.
Термин “криопротектор” относится к веществам, которые добавляют в состав для защиты активных ингредиентов на стадиях замораживания.
Термин “лиопротектор” относится к веществам, которые добавляют в состав для защиты активных ингредиентов на стадиях сушки.
Термин “восстановление” относится к добавлению растворителя типа воды к высушенному продукту, чтобы вернуть его в жидкое состояние типа исходного жидкого состояния.
Термин “аутологичный” применяется для описания всего, что происходит от одного и того же субъекта. Например, “аутологичные клетки” означают клетки, полученные от одного и того же субъекта. Введение аутологичных клеток субъекту выгодно, потому что эти клетки преодолевают иммунологический барьер, который в противном случае приводит к отторжению.
Термин “аллогенный” применяется для описания всего, что происходит от разных особей одного и того же вида. Говорят, что два или несколько индивидов аллогены друг другу, когда гены в одном или нескольких локусах не идентичны.
Термин “сингенный” применяется для описания всего, что происходит от особей или тканей с идентичными генотипами, то есть идентичных близнецов или животных одной и той же инбредной линии либо их тканей или клеток.
Термин “гетерологичный” применяется для описания чего-либо, состоящего из множества различных элементов. Например, введение клеток одного индивида другому индивиду составляет гетерологичный трансплантат. Гетерологичный ген – это ген, полученный из источника, отличного от субъекта.
Согласно изобретению, вследствие нестабильности незащищенной РНК выгодно представлять молекулы РНК в комплексной форме. В частности, в некоторых воплощениях композиции настоящего изобретения включают частицы, содержащие РНК и полиалкиленимин.
Когда система по настоящему изобретению составлена в виде частиц, то каждый вид РНК (напр., репликон, репликазная конструкция и необязательные дополнительные виды РНК типа РНК, кодирующей белок, пригодный для ингибирования IFN) может быть сформулирован отдельно в виде индивидуального состава из частиц. В этом случае каждый индивидуальный состав в виде частиц будет содержать один вид РНК. Индивидуальные составы в виде частиц могут присутствовать в виде отдельных объектов, напр., в отдельных контейнерах. Такие составы могут быть получены путем получения каждого вида РНК по отдельности (обычно каждый в виде раствора, содержащего РНК) вместе с образующим частицы реагентом, способствующим образованию частиц. Соответствующие частицы будут содержать исключительно те конкретные виды РНК, которые представлены при образовании частиц (индивидуальных составов в виде частиц).
В одном воплощении композиция по изобретению содержит более одного индивидуального состава в виде частиц. Соответствующие композиции именуются смешанными дисперсными составами. Смешанные дисперсные составы по изобретению могут быть получены путем составления по отдельности индивидуальных дисперсных составов, как описано выше, с последующей стадией смешивания индивидуальных дисперсных составов. На стадии смешивания получается состав, содержащий смешанную популяцию РНК-содержащих частиц (к примеру, первая популяция частиц может содержать репликон, а вторая композиция частиц может содержать репликазную конструкцию). Индивидуальные популяции частиц могут находиться вместе в одном контейнере, содержащем смешанную популяцию индивидуальных дисперсных составов.
С другой стороны, все виды РНК в композиции (напр., репликон, репликазная конструкция и необязательные дополнительные виды типа РНК, кодирующей белок, пригодный для ингибирования IFN) могут быть составлены вместе в виде комбинированного состава в виде частиц. Такие составы можно получить путем получения комбинированного состава (обычно комбинированного раствора) всех видов РНК вместе с образующим частицы реагентом, способствующим образованию частиц. В отличие от смешанного дисперсного состава, комбинированный дисперсный состав будет обычно включать частицы, содержащие более одного вида РНК. В комбинированной дисперсной композиции различные виды РНК обычно присутствуют вместе в одних частицах.
В одном воплощении составы в виде частиц по настоящему изобретению представляют собой составы из наночастиц. В этом воплощении композиции по настоящему изобретению содержат РНК в виде наночастиц.
В общем определении термин “наночастица” относится к любым частицам диаметром от 1 до 1000 нанометров (нм).
В контексте настоящего изобретения термин “частица” относится к структурированным объектам, состоящим из молекул или комплексов молекул. В одном воплощении термин “частица” относится к микро- или наноразмерным структурам типа микро- или наноразмерных компактных структур.
Термины “in vivo-jetPEI™”, “in vivo jetPEI™”, “in vivo jetPEI”, “jetPEI”, “jet PEI” и “JetPEI” все относятся к коммерчески доступному реагенту In vivo-jetPEI™, кат. № 201-50G фирмы Polyplus-Transfection SA (Illkirch, Франция).
Термин “полиплекс” в настоящем изобретении относится к комплексам полимера и нуклеиновой кислоты типа РНК, которые образуются при электростатических взаимодействиях. В тех случаях, когда полиплекс содержит РНК, его также можно называть “комплекс РНК” или “РНК-полиплекс”.
Настоящее изобретение касается полиплексных частиц, состоящих из по меньшей мере одной одноцепочечной РНК и по меньшей мере одного полиалкиленимина.
В одном воплощении описанные здесь частицы имеют средний диаметр менее 200 нм, предпочтительно менее 150 нм и более предпочтительно менее 100 нм. В одном воплощении описанные здесь частицы имеют средний диаметр по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм или по меньшей мере 100 нм.
average
average
Термин “средний диаметр” относится к среднему гидродинамическому диаметру частиц при измерении методом динамического рассеяния света с анализом данных по так называемому кумулянтному алгоритму, который выдает результаты в виде так называемого Z с размерностью длины и индекса полидисперсности (PI), который является безразмерным (Koppel D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321). При этом “средний диаметр”, “диаметр” или “размер” применяется для частиц синонимично с этим значением Z.
Термин “результирующий заряд” относится к общей сумме зарядов типа положительных и отрицательных зарядов. Например, если частица содержит большее количество отрицательных зарядов, чем положительных, то результирующий заряд частицы будет отрицательным. Если частица содержит больше положительных зарядов, чем отрицательных, то результирующий заряд частицы будет положительным. Если частица содержит одинаковое количество положительных и отрицательных зарядов, то результирующий заряд частицы будет нейтральным, в частности электронейтральным. Таким образом, результирующий заряд частицы по настоящему изобретению может быть отрицательным, положительным или нейтральным. В одном воплощении результирующий заряд частицы положителен. В одном воплощении результирующий заряд частицы отрицателен.
Термины типа “заряженный”, “результирующий заряд”, “отрицательно заряженный” или “положительно заряженный” относятся к суммарному электрическому заряду данного соединения или частицы при растворении или суспендировании в водном буфере при соответствующем значении рН (напр., 7,1).
Согласно настоящему изобретению, термины “соотношение N/P”, “соотношение NP”, “соотношение N:P”, “N/P” и “NP” относятся к молярному соотношению атомов азота (N) в полиэтиленимине к атомам фосфора (P) в РНК.
Согласно изобретению, молярное соотношение числа атомов азота (N) в полиалкиленимине к числу атомов фосфора (P) в РНК (соотношение N/P) предпочтительно составляет от 2,0 до 15,0, предпочтительно от 8,0 до 12,0, от 6,0 до 14,0 или от 6,0 до 12,0.
Согласно изобретению, описанные здесь композиции предпочтительно доводят до конечного соотношения N/P более чем за 1 стадию, как-то за 2, 3, 4 или несколько раз. Например, композицию можно довести до первого соотношения N/P, которое будет ниже, чем конечное соотношение N/P, на первой стадии, напр., используя длинный полиалкиленимин. При добавлении дополнительного полиалкиленимина, напр., короткого полиалкиленимина или длинного полиалкиленимина типа длинного полиалкиленимина, используемого на первой стадии, соотношение N/P можно довести до конечного отношения N/P. В одном воплощении конечное отношение N/P составляет от 8 до 16, как-то от 9 до 14, напр., от 10 до 12. В одном воплощении соотношение N/P, полученное на первой стадии, составляет от 1 до 6, как-то от 2 до 5 типа 3 или 4.
Полиалкиленимины
Используемые здесь полиалкиленимины предпочтительно имеют следующую общую формулу (I):
,
где R означает Н, ацил или группу по следующей общей формуле (II):
,
1
где R означает Н или группу по следующей общей формуле (III):
,
n, m и l выбраны независимо из целых чисел от 2 до 10; а
2
7
5
p, q и r – целые числа, причем сумма p, q и r такова, что средняя молекулярная масса полимера составляет от 1,5×10 до 10 Да, предпочтительно от 5000 до 10 Да, более предпочтительно от 10 000 до 40 000 Да, более предпочтительно от 15 000 до 30 000 Да, еще более предпочтительно от 20 000 до 25 000 Да.
1
В одном воплощении n, m и l выбирают независимо из 2, 3, 4 и 5, предпочтительно из 2 и 3, а более предпочтительно они равны 2. В одном воплощении R означает H. В одном воплощении R означает H или ацил.
2
7
5
В одном воплощении полиалкиленимин включает полиэтиленимин и/или полипропиленимин, предпочтительно полиэтиленимин. Предпочтительным полиалкиленимином является полиэтиленимин (PEI). Средняя молекулярная масса PEI предпочтительно составляет от 1,5×10 до 10 Да, предпочтительно от 5000 до 10 Да, более предпочтительно от 10 000 до 40 000 Да, более предпочтительно от 15 000 до 30 000 Да, еще более предпочтительно от 20 000 до 25 000 Да.
Предпочтительным согласно изобретению является линейный полиалкиленимин типа линейного полиэтиленимина (PEI). В одном воплощении линейный PEI получают путем изомеризационной полимеризации 2-этил-2-оксазолина с размыканием цикла, получая поли(2-этил-2-оксазолин) (PEOX; N-пропионил-PEI), который затем подвергают гидролизу кислотой для отщепления N-пропионильных групп, получая PEI.
Согласно изобретению, предпочтительно линейный PEI получают путем полного или практически полного деацилирования PEOX. Например, PEOX с молекулярной массой 50 кДа дает линейный PEI с молекулярной массой 22 кДа. Предпочтительно по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или почти 100% заместителей у атомов азота в полиалкиленимине типа полиэтиленимина представляют собой водород (т.е. R в приведенной выше формуле означает H). Так, предпочтительно по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или почти 100% атомов азота в полиалкиленимине типа полиэтиленимина являются протонируемыми.
Предпочтительным полиалкиленимином по изобретению является полиэтиленимин (PEI), в особенности линейный полиэтиленимин. Такой линейный полиэтиленимин предпочтительно имеет молярную массу от 15 кДа до 30 кДа и предпочтительно используется в сочетании с самореплицирующейся или самоамплифицирующейся РНК, причем соотношение N/P предпочтительно составляет от 6 до 15, а линейный полиэтиленимин и самореплицирующаяся или самоамплифицирующаяся РНК предпочтительно находятся в полиплексных частицах размером менее 200 нм, предпочтительно менее 150 нм и еще более предпочтительно менее 100 нм.
В одном воплощении изобретения полиалкиленимин представляет собой комбинацию из короткого полиалкиленимина типа короткого полиэтиленимина массой от 0,6 до 11 кДа, предпочтительно от 1 до 6 кДа или от 1 до 4 кДа, как-то от 1 до 3 кДа (линейного и/или разветвленного) и длинного полиалкиленимина типа длинного полиэтиленимина массой от 20 до 40 кДа (линейного и/или разветвленного), причем общее соотношение N/P предпочтительно составляет от 8 до 16, как-то от 9 до 14, напр., между 10 и 12. В одном воплощении соотношение N/P между длинным полиалкиленимином и РНК составляет от 1 до 6, как-то от 2 до 5 типа 3 или 4.
Полиэтиленимин (PEI) – это органическая макромолекула с высокой плотностью катионного заряда. PEI может сжимать нуклеиновые кислоты в положительно заряженные частицы, способные взаимодействовать с анионными протеогликанами на поверхности клетки и облегчать проникновение частиц посредством эндоцитоза.
Существует несколько способов получения PEI. Согласно изобретению, линейный полиэтиленимин предпочтительно синтезируют и получают способом, включающим, исходя из определенного количества мономера 2-этил-2-оксазолина с чистотой более 99%, стадии тщательного высушивания данного количества мономера и полимеризации данного количества мономера для получения поли(2-этил-2-оксазолина) (PEOX) путем:
– после тщательного обезвоживания заданного количества ацетонитрила, используя данный ацетонитрил в качестве растворителя при данном количестве высушенного мономера, добавления заданного количества тщательно высушенного инициатора реакции полимеризации и смешивания их вместе,
– очистки полученного PEOX выпариванием для удаления растворителя при одновременном выполнении по меньшей мере трех последовательных операций промывки/осаждения метанолом и диэтиловым эфиром и соответствующего фильтрования,
1
w
w
n
причем данные операции сушки, полимеризации и очистки организованы так, чтобы получить (i) правильную идентификацию данного полимера PEOX при проведении испытаний методом H-ЯМР, подтверждение отсутствия мономера на уровне <1,0% и подтверждение отсутствия растворителя на уровне <5,0% и (ii) среднюю молекулярную массу (M) >23 000 Да и полидисперсность (M/M) данного PEOX <1,5 методом гель-проникающей хроматографии,
1
– гидролиза данного PEOX соляной кислотой для достаточно эффективного получения PEI с тем, чтобы при проведении испытаний методом H-ЯМР количество остаточных боковых цепей или пропионовой кислоты составляло <5%, а PEI идентифицировался в виде одного пика.
Под тщательным высушиванием определенного количества мономера, ацетонитрила или инициатора следует понимать то, что непосредственно перед использованием достигается снижение влажности до менее 10 миллионных долей (ppm) воды, что можно получить высушиванием над гидридом кальция в течение 48 ч, а затем дистилляцией и сбором мономера при температуре выше 129°C.
Согласно изобретению, одна или несколько из следующих характеристик являются предпочтительными:
w
w
(i) средняя молекулярная масса (M) PEOX порядка 40 000 Да <M <60 000 Да;
(ii) соотношение мономер/инициатор составляет примерно 500 (под примерно следует понимать ± 5%);
(iii) соотношение мономер/инициатор составляет 480;
(iv) мономер имеет чистоту выше 99,95%;
(v) инициатор смешивают с ацетонитрилом перед добавлением к мономеру;
(vi) полимеризация проводится более 20 часов при температуре выше 85°C;
(vii) температура при полимеризации выше или равна 105°C;
(viii) после первого фильтрования остаток щедро промывают растворителем типа MeOH, а после добавления диэтилового эфира поли(2-этил-2-оксазолин) естественным образом отделяется от раствора в виде масла, тогда весь растворитель декантируют и повторяют указанную промывку и разделение по меньшей мере 4 раза перед сушкой под вакуумом;
1
(ix) стадия гидролиза включает удаление из реакционной смеси выделившейся пропионовой кислоты путем азеотропной перегонки регулярно и в течение по меньшей мере одного дня, при этом отслеживая протекание реакции методом Н-ЯМР-спектроскопии;
(x) остаток, полученный по окончании реакции, разбавляют в воде и упаривают по меньшей мере три раза для удаления следов пропионовой кислоты, а затем остаток опять растворяют в воде и фильтруют перед лиофилизацией;
(xi) фильтрование проводится через стерильную мембрану с размером ячеек от 0,20 до 0,25 мкм, предпочтительно через стерильную мембрану из ацетата целлюлозы.
w
w
Предпочтительно линейный PEI для применения по изобретению характеризуется тем, что промежуточный PEOX имеет молекулярную массу M порядка 40 000 <M <60 000 Да.
Степень полимеризации контролируется по соотношению мономер/инициатор и по выходу при синтезе. Определение молекулярной массы может проводиться методом гель-проникающей хроматографии (GPC).
Термин “нуклеиновая кислота” согласно изобретению включает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК) и блокированную нуклеиновую кислоту (LNA). Согласно изобретению, нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК, мРНК, вирусную РНК, полученные рекомбинантно и химически синтезированные молекулы. Согласно изобретению, нуклеиновая кислота может быть в виде одноцепочечной или двухцепочечной и линейной или ковалентно замкнутой кольцевой молекулы. Термин “нуклеиновая кислота” согласно изобретению также включает химическую дериватизацию нуклеиновой кислоты по основаниям нуклеотидов, по сахаридам или по фосфатам, а также нуклеиновые кислоты, содержащие неприродные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Описанные нуклеиновые кислоты могут быть выделенными и/или рекомбинантными.
Термин “выделенный” в настоящем изобретении служит для обозначения молекул, которые практически не содержат других молекул типа другого клеточного материала. Термин “выделенная нуклеиновая кислота” согласно изобретению означает, что эта нуклеиновая кислота была (i) амплифицирована in vitro, к примеру, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) получена рекомбинантно путем клонирования, (iii) очищена, к примеру, путем расщепления и фракционирования методом гель-электрофореза или (iv) синтезирована, к примеру, путем химического синтеза. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, доступную для манипулирования рекомбинантными методами.
Термин “рекомбинантный” в контексте настоящего изобретения означает “полученный посредством генной инженерии”. Предпочтительно “рекомбинантный объект” в контексте настоящего изобретения не встречается в природе.
Термин “встречающийся в природе” в настоящем изобретении означает то, что объект может встречаться в природе. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из природного источника и которые не были преднамеренно модифицированы человеком в лаборатории, встречаются в природе. Термин “встречается в природе” означает “присутствует в природе” и включает известные объекты, а также объекты, которые еще не были открыты и/или выделены из природы, но которые могут быть открыты и/или выделены в будущем из природного источника.
Согласно изобретению, “последовательность нуклеиновой кислоты” означает последовательность нуклеотидов в нуклеиновой кислоте, напр., рибонуклеиновой кислоте (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК). Термин может относиться ко всей молекуле нуклеиновой кислоты (как-то к одной нити всей молекулы нуклеиновой кислоты) или к её части (напр., фрагменту).
“3′-Конец нуклеиновой кислоты” согласно изобретению означает тот конец, который содержит свободную гидроксигруппу. При схематическом представлении двухцепочечных нуклеиновых кислот, в частности ДНК, 3′-конец всегда находится с правой стороны. “5′-Конец нуклеиновой кислоты” согласно изобретению означает тот конец, который содержит свободную фосфатную группу. При схематическом представлении двухцепочечных нуклеиновых кислот, в частности ДНК, 5′-конец всегда находится с левой стороны.
5′-конец 5′-P-NNNNNNN-OH-3′ 3′-конец
3′-HO-NNNNNNN-P-5′
“Вышележащий” (upstream) описывает относительное расположение первого элемента молекулы нуклеиновой кислоты по отношению ко второму элементу этой молекулы нуклеиновой кислоты, причем оба элемента содержатся в одной молекуле нуклеиновой кислоты, при этом первый элемент располагается ближе к 5′-концу молекулы нуклеиновой кислоты, чем второй элемент этой молекулы нуклеиновой кислоты. А второй элемент, как говорят, является “нижележащим” (downstream) от первого элемента этой молекулы нуклеиновой кислоты. Элемент, который располагается “выше” от второго элемента, в качестве синонима может называться расположенным “5′” от этого второго элемента. Для двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты такие указания, как “вышележащий” и “ нижележащий” приводятся относительно (+)-цепи.
Согласно изобретению, термин “ген” относится к определенной последовательности нуклеиновой кислоты, которая отвечает за вырабатывание одного или нескольких клеточных продуктов и/или за осуществление одной или нескольких межклеточных или внутриклеточных функций. Более конкретно, данный термин относится к такому отрезку нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую определенный белок либо функциональную или структурную молекулу РНК.
Термин “вектор” применяется здесь в самом общем значении и включает любые промежуточные носители для нуклеиновой кислоты, которые, к примеру, позволяют вводить данную нуклеиновую кислоту в прокариотические и/или эукариотические клетки хозяина и, если это уместно, встраивать в геном. Такие векторы предпочтительно реплицируются и/или экспрессируются в клетке. Векторы включают плазмиды, фагемиды, вирусные геномы и их части.
В контексте настоящего изобретения термин “РНК” относится к молекулам, которые содержат рибонуклеотидные остатки и предпочтительно полностью или в основном состоят из рибонуклеотидных остатков, и включает все типы РНК, описанные здесь. Термин “рибонуклеотид” относится к нуклеотидам с гидроксильной группой в 2′-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин “РНК” включает двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК типа частично или полностью очищенной РНК, практически чистую РНК, синтетическую РНК и полученную рекомбинантно РНК типа модифицированной РНК, которая отличается от природной РНК добавлением, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление ненуклеотидного материала к концам РНК или внутри РНК, к примеру, по одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды в молекулах РНК также могут содержать нестандартные нуклеотиды, как-то не встречающиеся в природе нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Такая измененная РНК может называться аналогом, в частности, аналогом встречающейся в природе РНК. Используемая согласно настоящему изобретению РНК может иметь известный состав или же состав РНК может быть частично или полностью неизвестен.
Термин “стабильность” РНК относится к “периоду полураспада” РНК. “Период полураспада” означает такой период времени, который необходим для устранения половины активности, содержания или количества молекул. В контексте настоящего изобретения период полураспада РНК является показателем стабильности данной РНК. Период полураспада РНК может влиять на “продолжительность экспрессии” РНК. Можно ожидать, что РНК с длительным периодом полураспада будет экспрессироваться в течение продолжительного времени.
Термин “эффективность трансляции” относится к количеству продукта трансляции, вырабатываемого молекулой РНК в течение определенного времени.
Согласно изобретению, “двухцепочечная РНК” или “дцРНК” означает РНК с двумя частично или полностью комплементарными нитями.
Согласно изобретению, РНК предпочтительно представлена одноцепочечной РНК (оцРНК). Термин “одноцепочечная РНК” обычно относится к таким молекулам РНК, с которыми не связаны никакие комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты (как правило, никакие комплементарные молекулы РНК). Одноцепочечная РНК может содержать аутокомплементарные последовательности, которые позволяют частям РНК сворачиваться и образовывать вторичные структурные мотивы, в том числе, без ограничения, пары оснований, стебли, шпильки и выпячивания. Одноцепочечная РНК может существовать в виде минус-нити [(−)-нити] или в виде плюс-нити [(+)-нити]. (+)-Нить – это нить, которая содержит или кодирует генетическую информацию. Генетическая информация может представлять собой, к примеру, последовательность полинуклеотида, кодирующего белок. Когда (+)-нить РНК кодирует белок, то (+)-нить может служить непосредственно матрицей для трансляции (синтеза белка). (−)-Нить комплементарна (+)-нити. В случае двухцепочечной РНК (+)-нить и (−)-нить представляют собой две отдельные молекулы РНК, и обе эти молекулы РНК связываются друг с другом, образуя двухцепочечную РНК (“дуплекс РНК”).
Особенно предпочтительной одноцепочечной РНК по изобретению является мРНК и РНК-репликон типа самореплицирующейся РНК. Согласно настоящему изобретению, РНК может быть кодирующей РНК, то есть это РНК, кодирующая пептид или белок. Предпочтительно РНК представлена фармацевтически активной РНК.
“Фармацевтически активная РНК” – это такая РНК, которая кодирует фармацевтически активный пептид или белок типа антигена либо иммунологически активное соединение (которое не кодирует антиген) или же является фармацевтически активной сама по себе, напр., обладает одной или несколькими фармацевтическими активностями типа тех, что описаны для фармацевтически активных белков.
Согласно изобретению, термин “РНК, кодирующая пептид или белок” означает, что РНК, если она находится в соответствующей среде, предпочтительно в клетке, может направлять сборку аминокислот для получения пептида или белка в процессе трансляции. Предпочтительно кодирующая РНК по изобретению способна взаимодействовать с механизмом клеточной трансляции, что способствует трансляции кодирующей РНК с образованием пептида или белка.
Согласно изобретению, термин “мРНК” означает “матричная РНК” и относится к транскриптам, которые обычно вырабатываются при помощи ДНК-матрицы и кодируют пептиды или белки. Как правило, мРНК содержит 5′-UTR, кодирующую белок область, 3′-UTR и последовательность поли(A). мРНК может быть получена путем транскрипции in vitro из ДНК-матрицы. Методология транскрипции in vitro известна специалистам в данной области. Например, имеются различные коммерчески доступные наборы для транскрипции in vitro. Согласно изобретению, мРНК может быть модифицирована при помощи стабилизирующих модификаций и кэппинга.
Термин “нетранслируемый участок” или “UTR” относится к таким участкам в молекулах ДНК, которые транскрибируются, но не транслируются в аминокислотные последовательности, или же к соответствующим участкам в молекулах РНК типа молекул мРНК. Нетранслируемый участок (UTR) может находиться с 5′-стороны (выше) от открытой рамки считывания (5′-UTR) и/или с 3′-стороны (ниже) от открытой рамки считывания (3′-UTR).
3′-UTR, если он есть, располагается на 3′-конце гена, ниже от терминирующего кодона кодирующей белок области, но термин “3′-UTR” предпочтительно не включает хвост поли(A). Таким образом, 3′-UTR находится выше от хвоста поли(A) (если он есть), напр., непосредственно примыкает к хвосту поли(A). 5′-UTR, если он есть, располагается на 5′-конце гена, выше от старт-кодона кодирующей белок области. 5′-UTR находится ниже от 5′-кэпа (если он есть), напр., непосредственно примыкает к 5′-кэпу. Согласно изобретению, 5′- и/или 3′-нетранслируемые участки могут быть функционально связаны с открытой рамкой считывания с тем, чтобы эти участки были связаны с открытой рамкой считывания таким образом, чтобы повышалась стабильность и/или эффективность трансляции РНК, содержащей данную открытую рамку считывания.
Согласно изобретению, термины “последовательность поли(A)” или “хвост поли(A)” относятся к непрерывной или прерывистой последовательности остатков аденилата, которая обычно располагается на 3′-конце молекулы РНК. Непрерывная последовательность характеризуется последовательными остатками аденилата. В природе типичной является непрерывная последовательность поли(A). Хотя последовательность поли(A) обычно не кодируется в эукариотической ДНК, а присоединяется при эукариотической транскрипции в ядре клетки к свободному 3′-концу РНК под действием независимой от матрицы РНК-полимеразы после транскрипции, однако настоящее изобретение охватывает последовательности поли(A), кодируемые ДНК.
Термины типа “5′-кэп”, “кэп”, “структура 5′-кэпа” или “кэп-структура” применяются как синонимы для обозначения динуклеотида, который находится на 5′-конце некоторых эукариотических первичных транскриптов типа предшественников матричной РНК. 5′-Кэп представляет собой такую структуру, в которой (необязательно модифицированный) гуанозин связан с первым нуклеотидом молекулы мРНК через 5′–5′-трифосфатную связь (или модифицированную трифосфатную связь в случае некоторых аналогов кэпа). Термины могут относиться к стандартным кэпам или к аналогам кэпов.
Молекулы РНК по изобретению могут характеризоваться 5′-кэпом, 5′-UTR, 3′-UTR, последовательностью поли(A) и/или адаптацией употребления кодонов.
Молекулы РНК для применения по изобретению предпочтительно имеют размеры более чем 2000 оснований, предпочтительно более 3000 оснований, более 4000 оснований, более 5000 оснований, более 6000 оснований, более 7000 оснований, более 8000 оснований, более 9000 оснований или более 10 000 оснований. Молекулы РНК для применения по изобретению предпочтительно имеют размеры от 6000 до 20 000 оснований, предпочтительно от 6000 до 15 000 оснований, предпочтительно от 9000 до 12 000 оснований.
Согласно изобретению, термин “экспрессия” применяется в самом общем значении и включает вырабатывание РНК и/или белка. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Кроме того, экспрессия может быть краткосрочной или стабильной. В отношении РНК термин “экспрессия” или “трансляция” относится к процессу в рибосомах клетки, при котором нить кодирующей РНК (напр., матричной РНК) направляет сборку последовательности аминокислот для получения пептида или белка.
Термины “транскрипция” и “транскрибирование” относятся к процессу, при котором молекула нуклеиновой кислоты с определенной последовательностью нуклеотидов (“матрица из нуклеиновой кислоты”) считывается РНК-полимеразой с тем, что РНК-полимераза вырабатывает одноцепочечную молекулу РНК. Во время транскрипции транскрибируется генетическая информация в матрице из нуклеиновой кислоты. Матрица из нуклеиновой кислоты может быть ДНК; однако, напр., в случае транскрипции с матрицы нуклеиновой кислоты альфавируса эта матрица обычно представлена РНК. Впоследствии транскрибированная РНК может транслироваться в белок. Согласно настоящему изобретению, термин “транскрипция” включает и “транскрипцию in vitro”, причем термин “транскрипция in vitro” относится к процессу, при котором РНК, в частности мРНК, синтезируется in vitro в бесклеточной системе. Предпочтительно для вырабатывания транскриптов применяются клонирующие векторы. Эти клонирующие векторы обычно обозначаются как векторы транскрипции и согласно настоящему изобретению охватываются термином “вектор”. Клонирующие векторы предпочтительно представлены плазмидами. Согласно настоящему изобретению, РНК предпочтительно представляет собой транскрибированную in vitro РНК (IVT-РНК) и может быть получена путем транскрипции in vitro соответствующей матрицы ДНК. Промотором для контролирования транскрипции может быть любой промотор для любой РНК-полимеразы. ДНК-матрица для транскрипции in vitro может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, в частности кДНК, и введения ее в подходящий вектор для транскрипции in vitro. кДНК может быть получена путем обратной транскрипции РНК.
Молекула одноцепочечной нуклеиновой кислоты, произведенная во время транскрипции, обычно имеет последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности матрицы.
Согласно изобретению, термины “матрица” или “матрица нуклеиновой кислоты” или “матричная нуклеиновая кислота” обычно означают последовательность нуклеиновой кислоты, которая может реплицироваться или транскрибироваться.
Термин “контролирующая экспрессию последовательность” согласно изобретению включает промоторы, рибосом-связывающие последовательности и другие контрольные элементы, которые контролируют транскрипцию гена или трансляцию полученной РНК. В определенных воплощениях изобретения контролирующие экспрессию последовательности могут регулироваться. Точная структура контролирующих экспрессию последовательностей может варьироваться в зависимости от вида или типа клеток, но обычно она включает 5′-нетранскрибируемые и 5′- и 3′-нетранслируемые последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, соответственно. Более конкретно, 5′-нетранскрибируемые контролирующие экспрессию последовательности включают участки промоторов, которые охватывают последовательность промотора для контроля транскрипции функционально связанного гена. Контролирующие экспрессию последовательности также могут включать последовательности энхансеров или последовательности вышележащих активаторов. Контролирующие экспрессию последовательности молекул ДНК обычно включают такие 5′-нетранскрибируемые и 5′- и 3′-нетранслируемые последовательности, как TATA-бокс, кэппирующая последовательность, последовательность CAAT и др. Контролирующая экспрессию последовательность РНК альфавируса может включать субгеномный промотор и/или один или несколько элементов консервативной последовательности. Специфическая контролирующая экспрессию последовательность по настоящему изобретению представлена субгеномным промотором альфавируса, как описано здесь.
Термин “промотор” или “промоторный участок” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая контролирует синтез транскрипта, напр., транскрипта, содержащего кодирующую последовательность, предоставляя сайт распознавания и связывания для РНК-полимеразы. Промоторный участок может включать дополнительные сайты распознавания или связывания для других факторов, участвующих в регуляции транскрипции данного гена. Промотор может контролировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Промотор может быть “индуцибельным” и запускать транскрипцию в ответ на индуктор или же “конститутивным”, если транскрипция не контролируется индуктором. Индуцибельный промотор экспрессируется лишь в очень небольшой степени или вообще не экспрессируется в отсутствие индуктора. В присутствии индуктора ген “включается” или повышается уровень транскрипции. Это обычно опосредуется связыванием специфического транскрипционного фактора. Специфический промотор по настоящему изобретению представлен субгеномным промотором альфавируса, как описано здесь. Другими специфическими промоторами являются геномные промоторы плюс-нити или минус-нити альфавируса.
Термин “ядро промотора” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, из которой состоит промотор. Ядро промотора обычно представляет собой минимальную часть промотора, необходимую для правильной инициации транскрипции. Ядро промотора обычно включает сайт запуска транскрипции и сайт связывания РНК-полимеразы.
Приведенные здесь последовательности нуклеиновых кислот, в частности, транскрибируемые и кодирующие последовательности нуклеиновых кислот, могут комбинироваться с любыми контролирующими экспрессию последовательностями, которые могут быть гомологичными или гетерологичными данным последовательностям нуклеиновых кислот, при этом термин “гомологичная” означает то, что последовательность нуклеиновой кислоты также функционально связана естественным образом с контролирующей экспрессию последовательностью, а термин “гетерологичная” означает то, что последовательность нуклеиновой кислоты не связана функционально естественным образом с контролирующей экспрессию последовательностью.
Последовательность нуклеиновой кислоты, в частности, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид или белок, и контролирующая экспрессию последовательность “функционально” связаны друг с другом, если они ковалентно связаны друг с другом таким образом, что транскрипция или экспрессия транскрибируемой и/или кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты находится под контролем или под влиянием контролирующей экспрессию последовательности.
Согласно изобретению, “функциональная связь” или “функционально связанная” относится к связям в рамках функциональных отношений. Нуклеиновая кислота является “функционально связанной”, если она функционально связана с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной кодирующей последовательности. Функционально связанные нуклеиновые кислоты обычно соседствуют друг с другом, а когда это уместно, они отделены другими последовательностями нуклеиновых кислот.
В определенных воплощениях нуклеиновая кислота функционально связана согласно изобретению с контролирующими экспрессию последовательностями, которые могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к нуклеиновой кислоте.
“Полимераза” в общем означает молекулярный объект, способный катализировать синтез полимерной молекулы из мономерных строительных блоков. “РНК-полимераза” – молекулярный объект, способный катализировать синтез молекул РНК из строительных блоков-рибонуклеотидов. “ДНК-полимераза” – молекулярный объект, способный катализировать синтез молекул ДНК из строительных блоков-дезоксирибонуклеотидов. В случае ДНК-полимераз и РНК-полимераз молекулярный объект обычно означает белок или комплект или комплекс из нескольких белков. Как правило, ДНК-полимераза синтезирует молекулы ДНК на основе матричной нуклеиновой кислоты, которая обычно является молекулой ДНК. Как правило, РНК-полимераза синтезирует молекулы РНК на основе матричной нуклеиновой кислоты, которая представлена молекулой ДНК (в этом случае РНК-полимераза является ДНК-зависимой РНК-полимеразой, DdRP) либо молекулой РНК (в этом случае РНК-полимераза является РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP).
“РНК-зависимая РНК-полимераза” или “RdRP” – это фермент, который катализирует транскрипцию РНК с матрицы РНК. В случае альфавирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы последовательный синтез комплементарной (−)-нити геномной РНК и (+)-нити геномной РНК приводит к репликации РНК. Поэтому альфавирусная РНК-зависимая РНК-полимераза в качестве синонима именуется “РНК-репликазой”. В природе РНК-зависимые РНК-полимеразы обычно кодируются у всех РНК-вирусов, кроме ретровирусов. Типичными представителями вирусов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, являются альфавирусы.
Согласно настоящему изобретению, “репликация РНК” обычно означает синтез молекул РНК на основе последовательности нуклеотидов данной молекулы РНК (матричной молекулы РНК). Молекулы РНК, которые синтезируются, могут быть, напр., идентичны или комплементарны молекуле матричной РНК. Как правило, репликация РНК может происходить путем синтеза промежуточного соединения ДНК или же непосредственно путем РНК-зависимой репликации РНК, опосредованной РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP). В случае альфавирусов репликация РНК происходит не через промежуточную ДНК, а опосредуется РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP): матричная нить РНК (первая нить РНК) – или её часть – служит матрицей для синтеза второй нити РНК, которая комплементарна первой нити РНК или её части. Вторая нить РНК или её часть, в свою очередь, может необязательно служить матрицей для синтеза третьей нити РНК, которая комплементарна второй нити РНК или её части. Таким образом, третья нить РНК идентична первой нити РНК или её части. Так, РНК-зависимая РНК-полимераза способна непосредственно синтезировать комплементарную матрице нить РНК и косвенным образом синтезировать идентичную нить РНК (через комплементарную промежуточную нить).
Согласно изобретению, термин “матричная РНК” означает такую РНК, которая может транскрибироваться или реплицироваться РНК-зависимой РНК-полимеразой.
В предпочтительном воплощении изобретения РНК, используемая согласно изобретению, представляет собой РНК-репликон или просто “репликон”, в частности самореплицирующуюся РНК. В одном особенно предпочтительном воплощении репликон или самореплицирующаяся РНК происходит из или содержит элементы, происходящие из вируса с оцРНК, в частности, вируса с положительной нитью оцРНК типа альфавируса.
В общем, РНК-вирусы составляют разнообразную группу инфекционных частиц с РНК-геномом. РНК-вирусы подразделяются на вирусы с одноцепочечной РНК (оцРНК) и с двухцепочечной РНК (дцРНК), а вирусы с оцРНК обычно еще подразделяются на вирусы с положительной нитью [(+)-нитью] и/или с отрицательной нитью [(−)-нитью]. Вирусы с положительной нитью РНК прежде всего привлекательны в качестве системы доставки в биомедицине, так как их РНК может служить непосредственно в качестве матрицы для трансляции в клетках хозяина.
Альфавирусы являются типичными представителями вирусов с положительной нитью РНК. Хозяева альфавирусов включают широкий спектр организмов, в том числе насекомых, рыб и млекопитающих, как-то домашних животных и людей. Альфавирусы реплицируются в цитоплазме инфицированных клеток (см. обзор по жизненному циклу альфавирусов в José et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856). Общая длина генома у многих альфавирусов обычно составляет от 11 000 до 12 000 нуклеотидов, а геномная РНК обычно содержит 5′-кэп и 3′-хвост поли(A). Геном альфавирусов кодирует неструктурные белки (участвующие в транскрипции, модификации и репликации вирусной РНК и в модификации белков) и структурные белки (образующие вирусные частицы). Обычно в геноме есть две открытые рамки считывания (ORF). Четыре неструктурных белка (nsP1–nsP4) обычно кодируются вместе первой ORF, начинающейся возле 5′-конца генома, а структурные белки альфавируса кодируются вместе второй ORF, которая находится ниже от первой ORF и доходит почти до 3′-конца генома. Как правило, первая ORF больше, чем вторая ORF, а соотношение составляет примерно 2:1.
В клетках, инфицированных альфавирусом, из геномной РНК транслируется только последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая неструктурные белки, тогда как генетическая информация, кодирующая структурные белки, транслируется из субгеномного транскрипта, который представляет собой молекулу РНК, напоминающую эукариотическую матричную РНК (мРНК; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124). После инфицирования, то есть на ранних стадиях жизненного цикла вируса, (+)-нить геномной РНК действует непосредственно в качестве матричной РНК для трансляции открытой рамки считывания, кодирующей неструктурный полипротеин (nsP1234). У некоторых альфавирусов имеется стоп-кодон opal между кодирующими последовательностями nsP3 и nsP4: полипротеин P123, содержащий nsP1, nsP2 и nsP3, вырабатывается тогда, когда трансляция заканчивается на стоп-кодоне opal, а полипротеин P1234, дополнительно содержащий nsP4, вырабатывается после прохождения этого кодона opal (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500). nsP1234 автопротеолитически расщепляется на фрагменты nsP123 и nsP4. Полипептиды nsP123 и nsP4 связываются с образованием комплекса репликазы (−)-нити, которая транскрибирует РНК (−)-нити, используя в качестве матрицы (+)-нить геномной РНК. Обычно на более поздних стадиях фрагмент nsP123 полностью расщепляется на отдельные белки nsP1, nsP2 и nsP3 (Shirako & Strauss, 1994, J. Virol., Vol. 68, pp. 1874-1885). Все четыре белка образуют комплекс репликазы (+)-нити, которая синтезирует новые (+)-нити генома, используя в качестве матрицы комплементарную (−)-нить геномной РНК (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163; Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem., vol. 278, pp. 41636-41645).
В инфицированных клетках субгеномная РНК, а также новая геномная РНК снабжается 5'-кэпом под действием nsP1 (Pettersson et al., 1980, Eur. J. Biochem. 105, 435-443; Rozanov et al., 1992, J. Gen. Virology, vol. 73, pp. 2129-2134) и полиаденилатным хвостом [поли(A)] под действием nsP4 (Rubach et al., Virology, 2009, vol. 384, pp. 201-208). Таким образом, и субгеномная РНК, и геномная РНК похожа на матричную РНК (мРНК).
Как правило, структурные белки альфавирусов кодируются одной открытой рамкой считывания под контролем субгеномного промотора (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562). Субгеномный промотор распознается неструктурными белками альфавирусов, действующими в цис-положении. В частности, альфавирусная репликаза синтезирует (+)-нить субгеномного транскрипта, используя в качестве матрицы комплементарную (−)-нить геномной РНК. (+)-Нить субгеномного транскрипта кодирует структурные белки альфавируса (Kim et al., 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163, Vasiljeva et al., 2003, J. Biol. Chem. Vol. 278, pp. 41636-41645). Субгеномный РНК-транскрипт служит матрицей для трансляции открытой рамки считывания, кодирующей структурные белки в виде одного полипротеина, а этот полипротеин расщепляется, давая структурные белки. На поздней стадии альфавирусной инфекции в клетках хозяина сигнал упаковки, который находится внутри кодирующей последовательности nsP2, обеспечивает селективную упаковку геномной РНК в отпочковывающиеся вирионы, которую производят структурные белки (White et al., 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326).
В инфицированных клетках синтез (−)-нитей РНК обычно наблюдается только в первые 3-4 ч после инфицирования и не наблюдается на поздних стадиях, на которых наблюдается только синтез (+)-нитей РНК (как геномной, так и субгеномной). Согласно Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651, преобладающая модель регуляции синтеза РНК предполагает зависимость от процессинга неструктурного полипротеина: первоначальное расщепление неструктурного полипротеина nsP1234 дает nsP123 и nsP4; а nsP4 действует как РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), которая активна при синтезе (−)-нити, но неэффективна для получения (+)-нитей РНК. Дальнейший процессинг полипротеина nsP123, включающий расщепление на стыке nsP2/nsP3, изменяет матричную специфичность репликазы на усиление синтеза (+)-нити РНК и уменьшение или прекращение синтеза (−)-нити РНК.
Синтез альфавирусной РНК также регулируется цис-действующими элементами РНК, включая четыре консервативных элемента последовательности (CSEs; Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; Frolov, 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651).
В общем, 5′-последовательность распознавания репликации генома альфавируса характеризуется в целом низкой гомологией между различными альфавирусами, но имеет консервативную предсказанную вторичную структуру. 5′-Последовательность распознавания репликации генома альфавируса не только участвует в инициации трансляции, но также включает 5′-последовательность распознавания репликации, содержащую два консервативных элемента последовательности, участвующих в синтезе вирусной РНК, CSE 1 и CSE 2. Для функционирования CSE 1 и 2 вторичная структура считается более важной, чем линейная последовательность (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
Напротив, 3′-концевая последовательность генома альфавируса, то есть последовательность непосредственно перед последовательностью поли(A), отличается консервативной первичной структурой, в особенности консервативным элементом 4 последовательности (CSE 4), который также называют “консервативная последовательность из 19 нт”, которая важна для инициации синтеза (−)-нити.
CSE 3, который также называют “стыковочная последовательность”, является консервативным элементом последовательности на (+)-нити альфавирусной геномной РНК, а комплементарный CSE 3 на (−)-нити действует в качестве промотора для транскрипции субгеномной РНК (Strauss & Strauss, Microbiol Rev., 1994, vol.58, pp. 491-562; Frolov et al., 2001, RNA, vol.7, pp. 1638-1651). CSE 3 обычно перекрывается с участком, кодирующим C-концевой фрагмент nsP4.
Наряду с альфавирусными белками, с консервативными элементами последовательности также могут связываться факторы клеток хозяина, предположительно белки (Strauss & Strauss, supra).
Альфавирусные векторы уже предлагались для доставки чужеродной генетической информации в клетки-мишени или организмы-мишени. В упрощенном виде открытая рамка считывания, кодирующая структурные белки альфавируса, заменяется открытой рамкой считывания, кодирующей представляющий интерес белок. Системы транс-репликации на основе альфавирусов зависят от элементов последовательности нуклеотидов альфавируса на двух отдельных молекулах нуклеиновой кислоты: одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует вирусную репликазу (обычно в виде полипротеина nsP1234), а другая молекула нуклеиновой кислоты способна реплицироваться данной репликазой в транс-положении (отсюда и обозначение системы транс-репликации). Транс-репликация требует присутствия обеих этих молекул нуклеиновой кислоты в данной клетке хозяина. Молекула нуклеиновой кислоты, способная реплицироваться репликазой в транс-положении, должна содержать определенные элементы последовательности альфавируса, способствующие распознаванию и синтезу РНК альфавирусной репликазой.
Согласно изобретению, термин “альфавирус” следует понимать в широком смысле и включает любые вирусные частицы, которые имеют характеристики альфавирусов. Характеристики альфавирусов включают наличие (+)-нити РНК, кодирующей генетическую информацию, подходящую для репликации в клетках хозяина, включая активность РНК-полимеразы. Другие характеристики многих альфавирусов описаны, напр., в Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562. Термин “альфавирус” включает альфавирусы, встречающиеся в природе, а также любые их варианты или производные. В некоторых воплощениях варианты или производные не встречаются в природе.
В одном воплощении альфавирус представлен альфавирусом, встречающимся в природе. Как правило, встречающийся в природе альфавирус является инфекционным для какого-либо одного или нескольких эукариотических организмов типа животных (включая позвоночных типа человека и членистоногих типа насекомых).
Встречающиеся в природе альфавирусы предпочтительно выбирают из группы, состоящей из следующего: комплекс вирусов Barmah Forest (включающий вирус Barmah Forest); комплекс восточного энцефалита лошадей (включает семь антигенных типов вируса восточного энцефалита лошадей); комплекс вирусов Middelburg (включающий вирус Middelburg); комплекс вирусов Ndumu (включающий вирус Ndumu); комплекс вирусов Semliki Forest (включающий вирус Bebaru, вирус Chikungunya, вирус Mayaro и его подтип вирус Una, вирус O’Nyong Nyong и его подтип вирус Igbo-Ora, вирус Ross River и его подтипы вирус Bebaru, вирус Getah, вирус Sagiyama, вирус Semliki Forest и его подтип вирус Me Tri); комплекс венесуэльского энцефалита лошадей (включающий вирус Cabassou, вирус Everglades, вирус Mosso das Pedras, вирус Mucambo, вирус Paramana, вирус Pixuna, вирус Rio Negro, вирус Trocara и его подтип вирус Bijou Bridge, вирус венесуэльского энцефалита лошадей); комплекс западного энцефалита лошадей (включающий вирус Aura, вирус Babanki, вирус Kyzylagach, вирус Sindbis, вирус Ockelbo, вирус Whataroa, вирус Buggy Creek, вирус Fort Morgan, вирус Highlands J, вирус западного энцефалита лошадей); и некоторые неклассифицированные вирусы, в том числе вирус болезни поджелудочной железы лосося; вирус сонной болезни; южный вирус морского слона; вирус Tonate. Более предпочтительно альфавирус выбирают из группы, состоящей из комплекса вирусов Semliki Forest (включающего типы вирусов, приведенные выше, в том числе вирус Semliki Forest), комплекса западного энцефалита лошадей (включающего типы вирусов, приведенные выше, в том числе вирус Sindbis), вируса восточного энцефалита лошадей (включающего типы вируса, приведенные выше), комплекса венесуэльского энцефалита лошадей (включающего типы вирусов, приведенные выше, в том числе вирус венесуэльского энцефалита лошадей).
В следующем предпочтительном воплощении альфавирус представлен вирусом Semliki Forest. В другом предпочтительном воплощении альфавирус представлен вирусом Sindbis. В альтернативном другом предпочтительном воплощении альфавирус представлен вирусом венесуэльского энцефалита лошадей.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения альфавирус не является альфавирусом, встречающимся в природе. Как правило, альфавирус, не встречающийся в природе, представляет собой вариант или производное альфавируса, встречающегося в природе, который отличается от альфавируса, встречающегося в природе, по меньшей мере одной мутацией в последовательности нуклеотидов, то есть в геномной РНК. Мутация в последовательности нуклеотидов может быть выбрана из вставки, замены или делеции одного или нескольких нуклеотидов по сравнению с альфавирусом, встречающимся в природе. Мутация в последовательности нуклеотидов может и не быть связанас мутацией в полипептиде или белке, кодируемом последовательностью нуклеотидов. Например, альфавирус, не встречающийся в природе, может быть аттенуированным альфавирусом. Аттенуированный альфавирус, не встречающийся в природе, представляет собой альфавирус, который обычно содержит по меньшей мере одну мутацию в своей последовательности нуклеотидов, по которой он отличается от альфавируса, встречающегося в природе, и либо вообще не является инфекционным, либо является инфекционным, но имеет меньшую болезнетворную способность или отсутствие болезнетворной способности вообще. В качестве типичного примера аттенуированного альфавируса можно привести TC83, который отличается от вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), встречающегося в природе (McKinney et al., 1963, Am. J. Trop. Med. Hyg., 1963, vol. 12, pp. 597-603).
Представителей рода альфавирусов также можно классифицировать на основании их относительных клинических признаков у людей: альфавирусы, связанные главным образом с энцефалитом, и альфавирусы, связанные главным образом с лихорадкой, сыпью и полиартритом.
Термин “альфавирусный” означает встречающийся у альфавирусов или происходящий из альфавируса или полученный из альфавируса, напр., посредством генной инженерии.
Согласно изобретению, “SFV” означает вирус Semliki Forest. Согласно изобретению, “SIN” или “SINV” означает вирус Sindbis. Согласно изобретению, “VEE” или “VEEV” означает вирус венесуэльского энцефалита лошадей.
Согласно изобретению, термин “альфавирус” или “полученный из альфавируса” относится к объектам, происходящим из альфавирусов. Для иллюстрации, белок альфавируса может означать белок, который встречается у альфавируса, и/или белок, который кодируется альфавирусом; а последовательность нуклеиновой кислоты альфавируса означать последовательность нуклеиновой кислоты, которая встречается у альфавируса, и/или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодируется альфавирусом. Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты “альфавируса” означает последовательность нуклеиновой кислоты “из генома альфавируса” и/или “из геномной РНК альфавируса”.
Согласно изобретению, термин “альфавирусная РНК” относится к какой-либо одной или нескольким из альфавирусных геномных РНК (т.е. (+)-нити) или комплементарной альфавирусной геномной РНК (т.е. (−)-нити) или субгеномным транскриптам (т.е. (+)-нити) или фрагментам любых из них.
Согласно изобретению, “геном альфавируса” означает (+)-нить геномной РНК альфавируса.
Согласно изобретению, термин “нативная последовательность альфавируса” и подобные термины обычно относятся к последовательности (напр., нуклеиновой кислоты) природного альфавируса (альфавируса, встречающегося в природе). В некоторых воплощениях термин “нативная последовательность альфавируса” также включает и последовательность аттенуированного альфавируса.
Согласно изобретению, термин “5′-последовательность распознавания репликации” предпочтительно относится к непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательности рибонуклеиновой кислоты, которая идентична или гомологична 5′-фрагменту генома альфавируса. “5′-Последовательность распознавания репликации” представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая может распознаваться альфавирусной репликазой. Термин 5′-последовательность распознавания репликации включает нативные 5′-последовательности распознавания репликации, а также их функциональные эквиваленты, такие, напр., как функциональные варианты 5′-последовательности распознавания репликации альфавируса, встречающегося в природе. 5′-Последовательность распознавания репликации необходима для синтеза комплементарной (−)-нити геномной РНК альфавируса и необходима для синтеза (+)-нити вирусной геномной РНК на основе матрицы из (−)-нити. Нативная 5′-последовательность распознавания репликации обычно кодирует как минимум N-концевой фрагмент nsP1; но содержит не всю открытую рамку считывания, кодирующую nsP1234. Ввиду того, что нативная 5′-последовательность распознавания репликации обычно кодирует по меньшей мере N-концевой фрагмент nsP1, нативная 5′-последовательность распознавания репликации обычно содержит по меньшей мере один инициирующий кодон, обычно AUG. В одном воплощении 5′-последовательность распознавания репликации содержит консервативный элемент-1 последовательности генома альфавируса (CSE 1) или его вариант и консервативный элемент-2 последовательности генома альфавируса (CSE 2) или его вариант. 5′-Последовательность распознавания репликации обычно способна образовывать четыре шпильки (stem-loops) (SL), то есть SL1, SL2, SL3, SL4. Нумерация этих шпилек начинается с 5′-конца 5′-последовательности распознавания репликации.
Согласно изобретению, термин “3′-последовательность распознавания репликации” предпочтительно относится к непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательности рибонуклеиновой кислоты, которая идентична или гомологична 3′-фрагменту генома альфавируса. “3′-Последовательность распознавания репликации” представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая может распознаваться альфавирусной репликазой. Термин 3′-последовательность распознавания репликации включает нативные 3′-последовательности распознавания репликации, а также их функциональные эквиваленты, такие, напр., как функциональные варианты 3′-последовательности распознавания репликации альфавируса, встречающегося в природе. 3′-Последовательность распознавания репликации необходима для синтеза комплементарной (−)-нити геномной РНК альфавируса. В одном воплощении 3′-последовательность распознавания репликации содержит консервативный элемент-4 последовательности из генома альфавируса (CSE 4) или его вариант и необязательно хвост поли(A) из генома альфавируса.
Термин “консервативный элемент последовательности” или “CSE” относится к последовательности нуклеотидов, встречающейся в РНК альфавирусов. Эти элементы последовательности называются “консервативными”, потому что их ортологи присутствуют в геноме различных альфавирусов, а ортологичные CSE различных альфавирусов предпочтительно имеют высокую степень идентичности последовательности и/или одинаковую вторичную или третичную структуру. Термин CSE включает в себя CSE 1, CSE 2, CSE 3 и CSE 4.
Согласно изобретению, термины “CSE 1” или “CSE из 44 нт” синонимически относятся к последовательности нуклеотидов, которая необходима для синтеза (+)-нити из (−)-нити матрицы. Термин “CSE 1” относится к последовательности на (+)-нити; а комплементарная последовательность CSE 1 (на (−)-нити) действует в качестве промотора для синтеза (+)-нити. Предпочтительно термин CSE 1 включает самые 5′-нуклеотиды в геноме альфавируса. CSE 1 обычно образует консервативную структуру шпильки. Не придерживаясь какой-либо определенной теории, полагаем, что для CSE 1 более важна вторичная структура, чем первичная структура, т.е. линейная последовательность. В геномной РНК модельного альфавируса Sindbis CSE 1 состоит из непрерывной последовательности в 44 нуклеотида, которая образована 44 наиболее 5′-нуклеотидами геномной РНК (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
Согласно изобретению, термины “CSE 2” или “CSE из 51 нт” синонимически относятся к последовательности нуклеотидов, которая необходима для синтеза (−)-нити из (+)-нити матрицы. (+)-Нить матрицы, как правило, представляет собой геномную РНК альфавируса или РНК-репликон (отметим, что транскрипт субгеномной РНК, который не содержит CSE 2, не функционирует в качестве матрицы для синтеза (−)-нити). В геномной РНК альфавируса CSE 2 обычно локализуется в кодирующей последовательности для nsP1. В геномной РНК модельного альфавируса Sindbis CSE из 51 нт располагается в положениях нуклеотидов 155-205 геномной РНК (Frolov et al., 2001, RNA, vol. 7, pp. 1638-1651). CSE 2 обычно образует две консервативные структуры типа шпильки (stem-loop). Эти структуры типа шпильки обозначаются как шпилька 3 (SL3) и шпилька 4 (SL4), так как они составляют третью и четвертую консервативную шпильку, соответственно, в геномной РНК альфавируса, считая от 5′-конца геномной РНК альфавируса. Не придерживаясь какой-либо определенной теории, полагаем, что для CSE 2 более важна вторичная структура, чем первичная структура, т.е. линейная последовательность.
Согласно изобретению, термины “CSE 3” или “стыковочная последовательность” синонимически относятся к последовательности нуклеотидов, которая происходит из геномной РНК альфавирусов и содержит начальный сайт субгеномной РНК. Комплементарная ей последовательность в (−)-нити стимулирует транскрипцию субгеномной РНК. В геномной РНК альфавирусов CSE 3 обычно перекрывается с участком, кодирующим С-концевой фрагмент nsP4, и простирается до короткой некодирующей области, расположенной выше открытой рамки считывания, кодирующей структурные белки.
Согласно изобретению, термины “CSE 4” или “консервативная последовательность из 19 нт” или “CSE в 19 нт” синонимически относятся к последовательности нуклеотидов из геномной РНК альфавирусов непосредственно перед последовательностью поли(A) в 3′-нетранслируемой области генома альфавирусов. Обычно CSE 4 состоит из 19 последовательных нуклеотидов. Не придерживаясь какой-либо определенной теории, полагаем, что CSE 4 функционирует в качестве основного промотора для инициирования синтеза (−)-нити (José et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837–856) и/или CSE 4 и хвост поли(A) в геномной РНК альфавируса функционируют вместе для эффективного синтеза (−)-нити (Hardy & Rice, J. Virol., 2005, vol. 79, pp. 4630-4639).
Согласно изобретению, термин “субгеномный промотор” или “SGP” относится к последовательности нуклеиновой кислоты выше (5′) от последовательности нуклеиновой кислоты (напр., кодирующей последовательности), которая контролирует транскрипцию данной последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивая сайт распознавания и связывания для РНК-полимеразы, обычно РНК-зависимой РНК-полимеразы, в частности, функционального неструктурного белка альфавируса. SGP может включать в себя и другие сайты распознавания или связывания для дополнительных факторов. Субгеномный промотор, как правило, представляет собой генетический элемент положительной нити РНК-вирусов типа альфавируса. Субгеномный промотор альфавируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной геномной РНК. Субгеномный промотор обычно характеризуется тем, что он способствует инициации транскрипции (синтеза РНК) в присутствии РНК-зависимой РНК-полимеразы, напр., функционального неструктурного белка альфавируса. (−)-Нить РНК, т.е. комплементарная геномной РНК альфавируса, служит матрицей для синтеза (+)-нити субгеномного транскрипта, а синтез (+)-нити субгеномного транскрипта обычно инициируется на или поблизости от субгеномного промотора. Термин “субгеномный промотор” в настоящем изобретении не ограничивается какой-либо конкретной локализацией в нуклеиновой кислоте, содержащей такой субгеномный промотор. В некоторых воплощениях SGP идентичен CSE 3 или перекрывается с CSE 3 или включает в себя CSE 3.
Термины “субгеномный транскрипт” или “субгеномная РНК” синонимически относятся к молекуле РНК, которая получается в результате транскрипции с использованием молекулы РНК в качестве матрицы (“матричной РНК”), причем матричная РНК содержит субгеномный промотор, контролирующий транскрипцию субгеномного транскрипта. Субгеномный транскрипт получается в присутствии РНК-зависимой РНК-полимеразы, в частности, функционального неструктурного белка альфавируса. Например, термин “субгеномный транскрипт” может относиться к РНК-транскрипту, который получен в клетке, инфицированной альфавирусом, с использованием комплементарной (−)-нити геномной РНК альфавируса в качестве матрицы. Однако термин “субгеномный транскрипт” в настоящем изобретении не ограничивается этим и также включает транскрипты, получаемые с использованием гетерологичной РНК в качестве матрицы. Например, субгеномные транскрипты также получаются при использовании в качестве матрицы комплементарной (−)-нити SGP-содержащих репликонов по настоящему изобретению. Таким образом, термин “субгеномный транскрипт” может относиться к молекуле РНК, которая получается при транскрипции фрагмента геномной РНК альфавируса, а также к молекуле РНК, которая получается при транскрипции фрагмента репликона по настоящему изобретению.
Согласно изобретению, конструкция из нуклеиновой кислоты, которая способна реплицироваться репликазой, предпочтительно альфавирусной репликазой, именуется репликоном. Согласно изобретению, термин “репликон” определяется как молекула РНК, которая может реплицироваться РНК-зависимой РНК-полимеразой, давая – без промежуточной ДНК – одну или несколько идентичных или практически идентичных копий РНК-репликона. “Без промежуточной ДНК” означает то, что в процессе образования копий РНК-репликона не образуется никаких копий дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или комплементарного репликона и/или что в процесс образования копий РНК-репликона или комплементарных репликонов в качестве матрицы не используются молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Функция репликазы обычно обеспечивается функциональным неструктурным белком альфавируса.
Согласно изобретению, термины “могут реплицироваться” и “способны реплицироваться” обычно означают то, что можно получить одну или несколько идентичных или практически идентичных копий нуклеиновой кислоты. При использовании вместе с термином “репликаза” типа “способны реплицироваться репликазой” термины “могут реплицироваться” и “способны реплицироваться” описывают функциональные характеристики молекулы нуклеиновой кислоты, напр., РНК-репликона, по отношению к репликазе. Эти функциональные характеристики включают по меньшей мере одно из: (i) репликаза способна распознавать репликон и (ii) репликаза способна действовать как РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRP). Предпочтительно репликаза способна и (i) распознавать репликон, и (ii) действовать в качестве РНК-зависимой РНК-полимеразы.
Выражение “способна распознавать” означает, что репликаза способна физически ассоциироваться с репликоном и, предпочтительно, что репликаза способна связываться с репликоном, как правило, нековалентно. Термин “связываться” может означать, что репликаза обладает способностью связываться с любым одним или несколькими из консервативного элемента-1 последовательности (CSE 1) или комплементарной ему последовательности (если она содержится в репликоне), консервативного элемента-2 последовательности (CSE 2) или комплементарной ему последовательности (если она содержится в репликоне), консервативного элемента-3 последовательности (CSE 3) или комплементарной ему последовательности (если она содержится в репликоне), консервативного элемента-4 последовательности (CSE 4) или комплементарной ему последовательности (если она содержится в репликоне). Предпочтительно репликаза способна связываться с CSE 2 [т.е. с (+)-нитью] и/или с CSE 4 [т.е. с (+)-нитью] или связываться с комплементарной нитью CSE 1 [т.е. с (−)-нитью] и/или с комплементарной нитью CSE 3 [т.е. с (−)-нитью].
Выражение “способна действовать в качестве RdRP” означает то, что репликаза способна катализировать синтез (−)-нити, комплементарной (+)-нити геномной РНК альфавируса, причем (+)-нить РНК обладает функцией матрицы, и/или что репликаза способна катализировать синтез (+)-нити геномной РНК альфавируса, причем (−)-нить РНК обладает функцией матрицы. В общем, выражение “способна действовать в качестве RdRP” также может означать то, что репликаза способна катализировать синтез (+)-нити субгеномного транскрипта, причем (−)-нить РНК обладает функцией матрицы, при этом синтез (+)-нити субгеномного транскрипта обычно инициируется субгеномным промотором альфавируса.
Выражения “способна связываться” и “способна действовать в качестве RdRP” относятся к способности в нормальных физиологических условиях. В частности, они относятся к условиям внутри клеток, которые экспрессируют функциональный неструктурный белок альфавируса или были трансфецированы нуклеиновой кислотой, кодирующей функциональный неструктурный белок альфавируса. Клетки предпочтительно являются эукариотическими клетками. Способность связываться и/или способность действовать в качестве RdRP может быть проверена экспериментально, напр., в бесклеточной системе in vitro или в эукариотических клетках. Необязательно данные эукариотические клетки происходят из вида, для которого конкретный альфавирус, из которого происходит репликаза, является инфекционным. Например, при использовании альфавирусной репликазы из определенного альфавируса, который является инфекционным для человека, нормальные физиологические условия означают условия в человеческих клетках. Более предпочтительно эукариотические клетки (в одном примере клетки человека) происходят из той же ткани или органа, для которого данный альфавирус, из которого происходит репликаза, является инфекционным.
Согласно изобретению, “по сравнению с нативной последовательностью альфавируса” и подобные термины относятся к последовательности, которая является вариантом нативной последовательности альфавируса. Как правило, вариант сам по себе не является нативной последовательностью альфавируса.
В одном воплощении РНК-репликон содержит последовательность распознавания репликации типа 5′-последовательности распознавания репликации и 3′-последовательности распознавания репликации. Последовательность распознавания репликации – такая последовательность нуклеиновой кислоты, которая может распознаваться функциональным неструктурным белком альфавируса. Иными словами, функциональный неструктурный белок альфавируса способен распознавать последовательность распознавания репликации. Предпочтительно 5′-последовательность распознавания репликации располагается на 5′-конце репликона. В одном воплощении 5′-последовательность распознавания репликации состоит из или содержит CSE 1 и 2. Предпочтительно 3′-последовательность распознавания репликации располагается на 3′-конце репликона (если репликон не содержит хвоста поли(A)) или непосредственно перед хвостом поли(A) (если репликон содержит хвост поли(A)). В одном воплощении 3′-последовательность распознавания репликации состоит из или содержит CSE 4.
В одном воплощении 5′-последовательность распознавания репликации и 3′-последовательность распознавания репликации способны направлять репликацию РНК-репликона в присутствии функционального неструктурного белка альфавируса. Таким образом, когда они присутствуют по отдельности или предпочтительно вместе, эти последовательности распознавания направляют репликацию РНК-репликона в присутствии функционального неструктурного белка альфавируса.
Предпочтительно функциональный неструктурный белок альфавируса представлен в цис-положении (кодируется в виде представляющего интерес белка открытой рамкой считывания на репликоне) или в транс-положении (кодируется в виде представляющего интерес белка открытой рамкой считывания на отдельной репликазной конструкции), причем он способен распознавать и 5′-последовательность распознавания репликации, и 3′-последовательность распознавания репликации репликона. В одном воплощении это происходит, когда 5′- и 3′-последовательности распознавания репликации являются нативными для альфавируса, из которого происходит функциональный неструктурный белок альфавируса. Нативный означает то, что источником этих последовательностей является один и тот же альфавирус. В альтернативном воплощении 5′-последовательность распознавания репликации и/или 3′-последовательность распознавания репликации не является нативной для альфавируса, из которого происходит функциональный неструктурный белок альфавируса, при условии, что функциональный неструктурный белок альфавируса способен распознавать и 5′-последовательность распознавания репликации, и 3′-последовательность распознавания репликации этого репликона. Иными словами, функциональный неструктурный белок альфавируса совместим с 5′-последовательностью распознавания репликации и 3′-последовательностью распознавания репликации. Если ненативный функциональный неструктурный белок альфавируса способен распознавать соответствующую последовательность или элемент последовательности, то этот функциональный неструктурный белок альфавируса считается совместимым (перекрестная совместимость с вирусами). Возможны любые комбинации (3′/5′)-последовательностей распознавания репликации и CSE, соответственно, с функциональным неструктурным белком альфавируса, если существует перекрестная вирусная совместимость. Перекрестная вирусная совместимость легко проверяется специалистом, работающим с настоящим изобретением, путем инкубации тестируемого функционального неструктурного белка альфавируса вместе с РНК, причем РНК содержит тестируемые 3′- и 5′-последовательности распознавания репликации, в условиях, подходящих для репликации РНК, напр., в подходящих клетках хозяина. Если происходит репликация, то (3′/5′)-последовательности распознавания репликации определяются как совместимые с функциональным неструктурным белком альфавируса.
В одном воплощении изобретения репликон является частью системы транс-репликации, поэтому репликон является транс-репликоном. В этом воплощении предпочтительно РНК-репликон не содержит открытой рамки считывания, кодирующей функциональный неструктурный белок альфавируса. Так, в этом воплощении настоящего изобретения предусмотрена система, включающая две молекулы нуклеиновой кислоты: первая РНК-конструкция для экспрессии функционального неструктурного белка альфавируса (т.е. кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса); и вторая молекула РНК – РНК-репликон. РНК-конструкция для экспрессии функционального неструктурного белка альфавируса синонимически именуется здесь как “РНК-конструкция для экспрессии функционального неструктурного белка альфавируса” или “репликазная конструкция”. Функциональный неструктурный белок альфавируса является таким, как определено выше, и обычно кодируется открытой рамкой считывания, содержащейся в репликазной конструкции. Функциональный неструктурный белок альфавируса, кодируемый репликазной конструкцией, может быть любым функциональным неструктурным белком альфавируса, который способен реплицировать репликон. Согласно изобретению, репликазная конструкция может присутствовать вместе с репликоном в одной и той же композиции, напр., в виде смешанного состава частиц или комбинированного состава частиц, или же в отдельных композициях, напр., в виде индивидуальных составов частиц. При введении системы настоящего изобретения в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки, может транслироваться открытая рамка считывания, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса. После трансляции функциональный неструктурный белок альфавируса способен реплицировать отдельные молекулы РНК (РНК-репликоны) in trans.
При этом транс (напр., в контексте транс-действия, транс-регуляции), в общем, означает “действовать из другой молекулы” (т.е. межмолекулярно). В противоположность этому цис (напр., в контексте цис-действия, цис-регуляции), в общем, означает “действовать из одной и той же молекулы” (т.е. внутримолекулярно). В контексте синтеза РНК (включая транскрипцию и репликацию РНК) транс-действующий элемент включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит ген, кодирующий фермент, способный к синтезу РНК (РНК-полимеразу). РНК-полимераза использует вторую молекулу нуклеиновой кислоты, то есть другую молекулу нуклеиновой кислоты, чем та, которой она кодируется, в качестве матрицы для синтеза РНК. Говорят, что РНК-полимераза и последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит ген, кодирующий РНК-полимеразу, “действуют in trans” на вторую молекулу нуклеиновой кислоты. В контексте настоящего изобретения РНК-полимеразой, кодируемой транс-действующей РНК, может быть функциональный неструктурный белок альфавируса. Функциональный неструктурный белок альфавируса способен использовать вторую молекулу нуклеиновой кислоты, то есть РНК-репликон, в качестве матрицы для синтеза РНК, включая репликацию РНК-репликона. РНК-репликон, который может реплицироваться репликазой in trans в соответствии с настоящим изобретением, синонимически именуют здесь “транс-репликоном”.
Согласно настоящему изобретению, роль функционального неструктурного белка альфавируса заключается в амплификации репликона и получении субгеномного транскрипта, если на репликоне находится субгеномный промотор. Если репликон кодирует ген, представляющий интерес для экспрессии, то уровень экспрессии данного гена и/или продолжительность экспрессии можно регулировать in trans путем модификации уровня функционального неструктурного белка альфавируса.
Система транс-репликации по настоящему изобретению включает по меньшей мере две молекулы нуклеиновой кислоты. В предпочтительном воплощении система состоит именно из двух молекул РНК, репликона и репликазной конструкции. В альтернативных предпочтительных воплощениях система содержит более одного репликона, причем каждый предпочтительно кодирует по меньшей мере один представляющий интерес белок, а также содержит репликазную конструкцию. В этих воплощениях функциональный неструктурный белок альфавируса, кодируемый репликазной конструкцией, может действовать на каждый репликон, вызывая репликацию и, необязательно, выработку субгеномных транскриптов, соответственно. Например, каждый репликон может кодировать фармацевтически активный пептид или белок. Это выгодно, напр., если требуется вакцинация субъекта против нескольких разных антигенов.
Предпочтительно в репликазной конструкции отсутствует по меньшей мере один консервативный элемент последовательности (CSE), который необходим для синтеза (−)-нити на основе (+)-нити матрицы и/или для синтеза (+)-нити на основе (−)-нити матрицы. Более предпочтительно репликазная конструкция не содержит никаких консервативных элементов последовательности (CSE) альфавируса. В частности, из четырех CSE альфавирусов (Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562; José et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856) в репликазной конструкции предпочтительно не присутствует какой-либо один или несколько из следующих CSE: CSE 1; CSE 2; CSE 3; CSE 4. В частности, в отсутствие какого-либо одного или нескольких альфавирусных CSE репликазная конструкция по настоящему изобретению гораздо больше похожа на типичную эукариотическую мРНК, чем на геномную РНК альфавируса.
Репликазная конструкция по настоящему изобретению предпочтительно отличается от альфавирусной геномной РНК по меньшей мере тем, что она не способна к саморепликации и/или что она не содержит открытой рамки считывания под контролем субгеномного промотора. Когда репликазная конструкция неспособна к саморепликации, её также можно назвать “суицидной конструкцией”.
Репликазная конструкция по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой одноцепочечную молекулу РНК. Репликазная конструкция по настоящему изобретению обычно представляет собой (+)-нить молекулы РНК. В одном воплощении репликазная конструкция по настоящему изобретению является выделенной молекулой нуклеиновой кислоты.
В одном воплощении РНК типа репликона по настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес пептид или белок. В различных воплощениях представляющий интерес пептид или белок кодируется гетерологической последовательностью нуклеиновой кислоты. Согласно настоящему изобретению, термин “гетерологичный” означает то, что последовательность нуклеиновой кислоты по природе не связана функционально или структурно с последовательностью нуклеотидов типа последовательности нуклеиновой кислоты альфавируса.
РНК по настоящему изобретению может кодировать один полипептид или несколько полипептидов. Несколько полипептидов могут кодироваться в виде одного полипептида (слитого полипептида) или в виде отдельных полипептидов. В некоторых воплощениях РНК по настоящему изобретению может содержать более одной открытой рамки считывания, каждая из которых в случае репликона может независимо быть под контролем субгеномного промотора или нет. В качестве альтернативы полипротеин или слитый полипептид содержит индивидуальные полипептиды, разделенные необязательно аутокаталитическим сайтом расщепления протеазой (напр., белком 2А вируса ящура) либо интеином.
Представляющие интерес белки, напр., можно выбирать из группы, состоящей из репортерных белков, фармацевтически активных пептидов или белков, ингибиторов внутриклеточной сигнализации интерферона (IFN) и функционального неструктурного белка альфавируса.
Согласно изобретению, термин “пептид” включает олиго- и полипептиды и обозначает вещества, содержащие два или несколько, предпочтительно 3 или больше, предпочтительно 4 или больше, предпочтительно 6 или больше, предпочтительно 8 или больше, предпочтительно 10 или больше, предпочтительно 13 или больше, предпочтительно 16 или больше, предпочтительно 20 или больше и предпочтительно вплоть до 50, предпочтительно 100 или предпочтительно 150 последовательных аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Термин “белок” относится к крупным пептидам, предпочтительно к пептидам, содержащим по меньшей мере 151 аминокислоту, но термины “пептид” и “белок” обычно применяются здесь в качестве синонимов.
Согласно изобретению, термины “пептид” и “белок” включают вещества, которые содержат не только аминокислотные компоненты, но также и неаминокислотные компоненты типа сахаров и фосфатных структур, а также включают вещества, содержащие связи типа сложноэфирных, тиоэфирных или дисульфидных связей.
Термин “вариант” в отношении, к примеру, нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей по изобретению охватывает любые варианты, в частности мутанты, варианты вирусных штаммов, сплайс-варианты, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в особенности те, которые присутствуют в природе. Аллельные варианты означают изменения нормальной последовательности гена, значение которых не всегда ясно. Полное секвенирование генов часто выявляет многочисленные аллельные варианты у данного гена. В отношении молекул нуклеиновых кислот термин “вариант” охватывает вырожденные последовательности нуклеиновых кислот, причем вырожденная нуклеиновая кислота согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, которая отличается от эталонной нуклеиновой кислоты в последовательности кодонов вследствие вырожденности генетического кода (напр., вследствие адаптации употребления кодонов). Видовые гомологи – это нуклеотидные или аминокислотные последовательности, происходящие из другого вида, чем данная нуклеотидная или аминокислотная последовательность. Вирусные гомологи – это нуклеотидные или аминокислотные последовательности, происходящие из другого вируса, чем данная нуклеотидная или аминокислотная последовательность.
Согласно изобретению, варианты нуклеиновой кислоты включают одиночные или множественные делеции, добавления, мутации, замены и/или вставки нуклеотидов по сравнению с эталонной нуклеиновой кислотой. Делеции включают удаление одного или нескольких нуклеотидов из эталонной нуклеиновой кислоты. Варианты с добавлениями включают 5′- и/или 3′-концевые слияния одного или нескольких нуклеотидов, как-то 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или больше нуклеотидов. В случае замены из последовательности удаляется по меньшей мере один нуклеотид, а на его место вставляется по меньшей мере один другой нуклеотид (типа трансверсии и транзиции). Мутации включают абазические сайты, прошитые сайты и химически измененные или модифицированные основания. Вставки включают добавление по меньшей мере одного нуклеотида в эталонную нуклеиновую кислоту.
Согласно изобретению, “изменение нуклеотидов” может означать единичные или множественные делеции, добавления, мутации, замены и/или вставки нуклеотидов по сравнению с эталонной нуклеиновой кислотой. В некоторых воплощениях “изменение нуклеотидов” выбирают из группы, состоящей из делеции одного нуклеотида, добавления одного нуклеотида, мутации одного нуклеотида, замены одного нуклеотида и/или вставки одного нуклеотида по сравнению с эталонной нуклеиновой кислотой. Согласно изобретению, вариант нуклеиновой кислоты может содержать одно или несколько изменений нуклеотидов по сравнению с эталонной нуклеиновой кислотой.
Варианты конкретных последовательностей нуклеиновых кислот предпочтительно обладают по меньшей мере одним функциональным свойством данных конкретных последовательностей и предпочтительно являются функционально эквивалентными данным конкретным последовательностям, напр., последовательности нуклеиновых кислот проявляют свойства, идентичные или близкие свойствам определенных последовательностей нуклеиновых кислот.
Предпочтительно степень идентичности между данной последовательностью нуклеиновой кислоты и последовательностью нуклеиновой кислоты, которая является вариантом данной последовательности нуклеиновой кислоты, должна составлять по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Степень идентичности предпочтительно приводится для участка из по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 70, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300 или по меньшей мере 400 нуклеотидов. В предпочтительных воплощениях степень идентичности приводится для всей длины эталонной последовательности нуклеиновой кислоты.
“Сходство последовательностей” означает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют консервативные замены аминокислот. “Идентичность последовательности” между двумя последовательностями полипептида или нуклеиновой кислоты означает процент аминокислот или нуклеотидов, которые идентичны между последовательностями.
Термин “% идентичности” служит для обозначения, в частности, содержания таких нуклеотидов, которые являются идентичными при оптимальном совмещении между двумя сравниваемыми последовательностями, причем данный процент является чисто статистическим, а различия между двумя последовательностями могут быть случайными по всей длине последовательности, а сравниваемая последовательность может содержать добавления или делеции по сравнению с эталонной последовательностью с тем, чтобы получить оптимальное совмещение между двумя последовательностями. Сравнение двух последовательностей обычно проводится путем сравнения данных последовательностей после оптимального совмещения в отношении сегмента или “окна сравнения” с тем, чтобы идентифицировать локальные участки соответствующих последовательностей. Оптимальное совмещение для сравнения может проводиться вручную или с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, с помощью алгоритма локальной гомологии Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, и с помощью алгоритма поиска сходства Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, или с помощью компьютерных программ, использующих указанные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
Процент идентичности получается путем определения количества идентичных положения, в которых сравниваемые последовательности совпадают, деления этого числа на количество сравниваемых положений и умножения этого результата на 100.
Например, можно использовать программу BLAST “BLAST 2 sequences”, которая доступна на веб-сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi.
2
4
Нуклеиновая кислота “способна гибридизироваться” или “гибридизуется” с другой нуклеиновой кислотой, если две последовательности комплементарны друг другу. Нуклеиновая кислота “комплементарна” другой нуклеиновой кислоте, если две последовательности способны образовывать стабильный дуплекс друг с другом. Согласно изобретению, гибридизация предпочтительно проводится в условиях, способствующих специфической гибридизации между полинуклеотидами (строгих условиях). Строгие условия описаны, к примеру, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York; и означают, к примеру, гибридизацию при 65°C в буфере для гибридизации (3,5×, 0,02% Ficoll, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина 2,5 мМ NaHPO (рН 7), 0,5% SDS, 2 мМ ЭДТА). SSC представляет собой 0,15 М хлорид натрия/0,15 М цитрат натрия, рН 7. После гибридизации мембрану, на которую была перенесена ДНК, промывают, к примеру, в 2×SSC при комнатной температуре, а затем в 0,1-0,5×SSC/0,1×SDS при температуре вплоть до 68°C.
Степень комплементарности означает процент смежных остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут образовывать водородные связи (напр., спаривание оснований Уотсона-Крика) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (напр., 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 означает комплементарность на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100%). “Совершенно комплементарные” или “полностью комплементарные” означает, что все смежные остатки в последовательности одной нуклеиновой кислоты будут образовывать водородные связи с таким же количеством смежных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. Предпочтительно степень комплементарности по изобретению составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Наиболее предпочтительно степень комплементарности по изобретению составляет 100%.
Термин “производное” включает любые химические производные нуклеиновой кислоты по основаниям нуклеотидов, по сахарам или по фосфатам. Термин “производное” также включает нуклеиновые кислоты, которые содержат нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, не встречающиеся в природе. Предпочтительно дериватизация нуклеиновой кислоты повышает её стабильность.
Согласно изобретению, “последовательность нуклеиновой кислоты, которая получена из последовательности нуклеиновой кислоты” относится к такой нуклеиновой кислоте, которая может быть вариантом той нуклеиновой кислоты, из которой она получена.
В одном воплощении открытая рамка считывания кодирует репортерный белок. В этом воплощении открытая рамка считывания содержит репортерный ген. В качестве репортеров можно выбирать определенные гены, потому что характеристики, которые они придают экспрессирующим их клеткам или организмам, можно легко идентифицировать и измерить, или потому что они являются отборочными маркерами. Репортерные гены часто применяются как показатели того, что определенный ген захватывается или экспрессируется в популяции клеток или организмов. Предпочтительно продукт экспрессии репортерного гена детектируется визуально. Распространенные визуально детектируемые репортерные белки обычно содержат флуоресцентные или люминесцентные белки. Примеры специфических репортерных генов включают ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок медузы (GFP), который заставляет экспрессирующие его клетки светиться зеленым при голубом освещении, фермент люцифераза, который катализирует реакцию с люциферином с испусканием света, и красный флуоресцентный белок (RFP). Возможны варианты любого из этих специфических репортерных генов при условии, что варианты обладают визуально детектируемыми свойствами. Например, eGFP является вариантом GFP типа точечного мутанта.
Согласно изобретению, в одном воплощении РНК содержит или состоит из фармацевтически активной РНК. “Фармацевтически активная РНК” может представлять собой такую РНК, которая кодирует фармацевтически активный пептид или белок. Предпочтительно РНК по настоящему изобретению кодирует фармацевтически активный пептид или белок. Предпочтительно открытая рамка считывания кодирует фармацевтически активный пептид или белок. Предпочтительно, РНК содержит открытую рамку считывания, которая кодирует фармацевтически активный пептид или белок, в случае РНК-репликона необязательно под контролем субгеномного промотора.
“Фармацевтически активный пептид или белок” оказывает положительное или благотворное действие на состояние или заболевание у субъекта при введении субъекту в терапевтически эффективном количестве. Предпочтительно фармацевтически активный пептид или белок обладает лечебными или паллиативными свойствами и может вводиться для улучшения, ослабления, облегчения, регрессии, замедления возникновения или уменьшения тяжести одного или нескольких симптомов заболевания или расстройства. Фармацевтически активный пептид или белок может обладать профилактическими свойствами и может применяться для замедления возникновения заболевания или для уменьшения тяжести такого заболевания или патологического состояния. Термин “фармацевтически активный пептид или белок” охватывает целые белки или полипептиды и также может относиться к их фармацевтически активным фрагментам. Он также может включать фармацевтически активные аналоги пептида или белка. Термин “фармацевтически активный пептид или белок” включает пептиды и белки, которые являются антигенами, то есть пептид или белок вызывает иммунный ответ у субъекта, который может быть терапевтическим либо частично или полностью защитным.
В одном воплощении фармацевтически активный пептид или белок представляет собой или содержит иммунологически активное соединение либо антиген или эпитоп.
Согласно изобретению, термин “иммунологически активное соединение” относится к любым соединениям, изменяющим иммунный ответ, предпочтительно путем индукции и/или подавления созревания иммунных клеток, индукции и/или подавления биосинтеза цитокинов и/или изменения гуморального иммунитета путем стимуляции продукции антител B-клетками. В одном воплощении иммунный ответ включает стимуляцию антительного ответа (обычно включающего иммуноглобулин G (IgG)) и/или клеточного ответа типа Т-клеточного ответа. Иммунологически активные соединения могут обладать сильной иммуностимулирующей активностью, включая, без ограничения, противовирусную и противоопухолевую активность, а также могут подавлять другие аспекты иммунного ответа, к примеру, подавлять иммунный ответ типа Th2, что полезно для лечения широкого спектра заболеваний, опосредованных Th2.
Согласно изобретению, термин “антиген” или “иммуноген” охватывает любые вещества, которые вызывают иммунный ответ. В частности, “антиген” означает такое вещество, которое реагирует специфически с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). Согласно настоящему изобретению, термин “антиген” включает любые молекулы, которые содержат по меньшей мере один эпитоп. Предпочтительно антиген в контексте настоящего изобретения означает молекулу, которая, необязательно после обработки, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно специфична для антигена. Согласно настоящему изобретению, можно использовать любой подходящий антиген, который является кандидатом для иммунной реакции, причем иммунная реакция может быть как гуморальной, так и клеточной. В контексте воплощений настоящего изобретения антиген предпочтительно презентируется клетками, предпочтительно антиген-презентирующими клетками, в контексте молекул MHC, что приводит к иммунной реакции против антигена. Антиген предпочтительно представляет собой продукт, который соответствует природному антигену или получен из него. Такие природные антигены могут включать или могут быть получены из аллергенов, вирусов, бактерий, грибков, паразитов и других возбудителей инфекций и патогенов или же антиген также может быть опухолевым антигеном. Согласно настоящему изобретению, антиген может соответствовать встречающемуся в природе продукту, к примеру, вирусному белку или его части. В предпочтительных воплощениях антиген является поверхностным полипептидом, то есть это полипептид, в природе проявляющийся на поверхности клетки, патогена, бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли. Антиген может вызывать иммунный ответ против клетки, патогена, бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли.
Термин “связанный с заболеванием антиген” применяется в самом широком смысле для обозначения любых антигенов, связанных с заболеваниями. Связанный с заболеванием антиген – это молекула, которая содержит эпитопы, которые должны стимулировать иммунную систему хозяина к выработке клеточного антиген-специфичного иммунного ответа и/или гуморального антительного ответа против заболевания. Поэтому связанные с заболеваниями антигены могут применяться в терапевтических целях. Связанные с заболеванием антигены предпочтительно связаны с инфекциями, вызванными микробами, как правило, это микробные антигены, или же связаны с раком, как правило, с опухолями.
Термин “патоген” относится к патогенному биологическому материалу, способному вызывать заболевания у организмов, предпочтительно у организмов позвоночных. Патогены включают микроорганизмы, как-то бактерии, одноклеточные эукариотические организмы (простейшие), грибки, а также вирусы.
Термины “эпитоп”, “антигенный пептид”, “антигенный эпитоп”, “иммуногенный пептид” и “MHC-связывающий пептид” применяются здесь взаимозаменяемо и относятся к антигенным детерминантам в молекулах типа антигенов, т.е. к частям или фрагментам иммунологически активных соединений, которые распознаются иммунной системой, к примеру, распознаются Т-клетками, в частности, когда они презентированы в контексте молекул МНС. Эпитоп белка предпочтительно содержит непрерывную или прерывистую часть данного белка длиной предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот, к примеру, эпитоп может предпочтительно быть длиной в 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот. Согласно изобретению, эпитоп может связываться с молекулами MHC типа молекул MHC на поверхности клетки и поэтому это может быть “пептид, связывающий MHC” или “антигенный пептид”. Термин “главный комплекс гистосовместимости” и аббревиатура “MHC” включают молекулы MHC класса I и MHC класса II и относятся к комплексу генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антиген-презентирующими клетками или пораженными болезнью клетками в иммунных реакциях, причем белки или молекулы МНС связывают пептиды и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые MHC, экспрессируются на поверхности клеток и представляют Т-клеткам как аутоантигены (пептидные фрагменты самой клетки), так и неаутоантигены (напр., фрагменты вторгающихся микроорганизмов). Предпочтительно такие иммуногенные участки связываются с молекулами МНС класса I или класса II. В настоящем изобретении “иммуногенный участок”, как говорят, “связывается” с молекулой МНС класса I или класса II, если такое связывание детектируется каким-либо методом, известным в данной области. Термин “MHC-связывающий пептид” относится к пептидам, которые связываются с молекулой MHC класса I и/или MHC класса II. В случае комплексов MHC класса I/пептид связывающие пептиды обычно имеют длину 8-10 аминокислот, хотя эффективными могут быть и более длинные или короткие пептиды. В случае комплексов MHC класса II/пептид связывающие пептиды обычно имеют длину 10-25 аминокислот, в особенности 13-18 аминокислот, хотя могут быть эффективными и более длинные и короткие пептиды.
В одном воплощении представляющий интерес белок по настоящему изобретению содержит эпитоп, пригодный для вакцинации организма-мишени. Специалистам в данной области должно быть известно, что один из принципов иммунобиологии и вакцинации состоит в том, что иммунопротекторная реакция на заболевание возникает при иммунизации организма антигеном, который является иммунологически релевантным в отношении подлежащего лечению заболевания. Согласно настоящему изобретению, антиген выбирают из группы, включающей аутоантигены и неаутоантигены. Неаутоантигены – это предпочтительно бактериальные антигены, вирусные антигены, грибковые антигены, аллергены или паразитарные антигены. Предпочтительно антигены содержат эпитопы, которые способны вызывать иммунный ответ в организме мишени. Например, эпитоп может вызвать иммунный ответ против бактерии, вируса, грибка, паразита, аллергена или опухоли.
В некоторых воплощениях неаутоантиген представлен бактериальным антигеном. В некоторых воплощениях антиген вызывает иммунный ответ против бактерии, которая поражает животных, включая птиц, рыб и млекопитающих, в том числе одомашненных животных. Предпочтительно бактерия, против которой возникает иммунный ответ, является патогенной бактерией.
В некоторых воплощениях неаутоантиген представлен вирусным антигеном. Вирусным антигеном, к примеру, может быть белок, полипептид или пептид из поверхностного белка вируса, напр., связанный с мембраной гликопротеин, капсидный белок или полипептид либо зубцовый белок или полипептид. В некоторых воплощениях антиген вызывает иммунный ответ против вируса, который поражает животных, включая птиц, рыб и млекопитающих, в том числе одомашненных животных. Предпочтительно вирус, против которого возникает иммунный ответ, является патогенным вирусом.
В некоторых воплощениях неаутоантиген представлен полипептидом или белком из грибка. В некоторых воплощениях антиген вызывает иммунный ответ против грибка, который поражает животных, включая птиц, рыб и млекопитающих, в том числе одомашненных животных. Предпочтительно грибок, против которого возникает иммунный ответ, является патогенным грибком.
В некоторых воплощениях неаутоантиген представлен полипептидом или белком из одноклеточного эукариотического паразита. В некоторых воплощениях антиген вызывает иммунный ответ против одноклеточного эукариотического паразита, предпочтительно патогенного одноклеточного эукариотического паразита. Патогенные одноклеточные эукариотические паразиты, напр., могут быть из рода Plasmodium, напр., P. falciparum, P. vivax, P. malariae или P. ovale, из рода Leishmania либо из рода Trypanosoma, напр., T. cruzi или T. brucei.
В некоторых воплощениях неаутоантиген представлен аллергенным полипептидом или аллергенным белком. Аллергенный белок или аллергенный полипептид подходит для аллергеновой иммунотерапии, также известной как гипосенсибилизация.
В некоторых воплощениях антиген представлен аутоантигеном, в особенности опухолевым антигеном. Опухолевые антигены и их определение известны специалистам.
В контексте настоящего изобретения термин “опухолевый антиген” или “ассоциированный с опухолью антиген” относится к белкам, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в ограниченном количестве тканей и/или органов либо на определенных стадиях развития, к примеру, опухолевый антиген может в нормальных условиях специфически экспрессироваться в ткани желудка, предпочтительно в слизистой желудка, в репродуктивных органах, напр., в яичках, в трофобластной ткани, напр., в плаценте, или же в гаметных клетках, а также экспрессируются или аномально экспрессируются в одной или нескольких опухолевых или раковых тканях. В этом контексте “ограниченное количество” предпочтительно означает не более 3, более предпочтительно не более 2. Опухолевые антигены в контексте настоящего изобретения включают, к примеру, дифференцировочные антигены, предпочтительно дифференцировочные антигены, специфичные для типа клеток, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в определенном типе клеток на определенной стадии дифференцировки, раковые/яичковые антигены, т.е. белки, которые в нормальных условиях специфически экспрессируются в яичках и иногда в плаценте, и специфические гаметные антигены. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген предпочтительно связан с клеточной поверхностью раковой клетки и предпочтительно не экспрессируется или редко встречается в нормальных тканях. Предпочтительно опухолевый антиген или аномальная экспрессия опухолевого антигена идентифицирует раковые клетки. В контексте настоящего изобретения опухолевый антиген, который экспрессируется в раковых клетках у субъекта, напр., у пациента, страдающего раковым заболеванием, предпочтительно является собственным белком у данного субъекта. В предпочтительных воплощениях опухолевый антиген в контексте настоящего изобретения в нормальных условиях экспрессируется специфически в ткани или органе, которые не являются необходимыми, т.е. в тканях или органах, которые при повреждении иммунной системой не приводят к гибели субъекта, или же в органах или структурах организма, которые недоступны или труднодоступны для иммунной системы. Предпочтительно аминокислотная последовательность опухолевого антигена идентична у опухолевого антигена, который экспрессируется в нормальных тканях, и опухолевого антигена, который экспрессируется в раковых тканях.
Примеры опухолевых антигенов, которые могут быть полезными в настоящем изобретении: p53, ART-4, BAGE, β-катенин/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, белки клеточной поверхности из семейства клаудина типа CLAUDIN-6, CLAUDIN-18.2 и CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (или hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, предпочтительно MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 или MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, миозин/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, протеиназа 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 или RU2, SAGE, SART-1 или SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE и WT. Особенно предпочтительными опухолевыми антигенами являются CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2) и CLAUDIN-6 (CLDN6). В некоторых воплощениях не требуется, чтобы фармацевтически активным пептидом или белком был антиген, вызывающий иммунный ответ. Подходящие фармацевтически активные белки или пептиды могут быть выбраны из группы, состоящей из цитокинов и таких белков иммунной системы, как иммунологически активные соединения (напр., интерлейкины, колониестимулирующий фактор (CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), эритропоэтин, фактор некроза опухолей (TNF), интерфероны, интегрины, адрессины, селетины, хоминг-рецепторы, Т-клеточные рецепторы, иммуноглобулины), гормоны (инсулин, тиреоидный гормон, катехоламины, гонадотропины, трофические гормоны, пролактин, окситоцин, дофамин, бычий соматотропин, лептины и др.), гормоны роста (напр., гормон роста человека), факторы роста (напр., эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, инсулиноподобный фактор роста и др.), рецепторы факторов роста, ферменты (тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа, ферменты биосинтеза или деградации холестерина, стероидогенные ферменты, киназы, фосфодиэстеразы, метилазы, деметилазы, дегидрогеназы, целлюлазы, протеазы, липазы, фосфолипазы, ароматазы, цитохромы, аденилат- или гуанилатциклазы, нейраминидазы и др.), рецепторы (рецепторы стероидных гормонов, пептидные рецепторы), связывающие белки (белки, связывающие гормоны роста или факторы роста и т.п.), факторы транскрипции и трансляции, белки, подавляющие рост опухолей (напр., белки, которые ингибируют ангиогенез), структурные белки (как-то коллаген, фиброин, фибриноген, эластин, тубулин, актин и миозин), белки крови (тромбин, сывороточный альбумин, фактор VII, фактор VIII, инсулин, фактор IX, фактор X, тканевой активатор плазминогена, белок C, фактор фон Виллебранда, антитромбин III, глюкоцереброзидаза, колониестимулирующий фактор эритропоэтин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов (GCSF) или модифицированный фактор VIII, антикоагулянты и др. В одном воплощении фармацевтически активный белок по изобретению представлен цитокином, который участвует в регуляции лимфоидного гомеостаза, предпочтительно цитокин, который участвует и предпочтительно индуцирует или усиливает развитие, примирование, размножение, дифференцировку и/или выживание Т-клеток. В одном воплощении цитокин представлен интерлейкином, напр., IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 или IL-21.
Другим подходящим и представляющим интерес белком, кодируемым открытой рамкой считывания, является ингибитор сигнализации интерферона (IFN). Хотя и сообщалось, что жизнеспособность клеток, в которые была введена РНК для экспрессии, может снижаться, в частности, если клетки многократно трансфецируются РНК, однако оказалось, что ингибиторы IFN усиливают жизнеспособность клеток, в которых должна экспрессироваться РНК (WO 2014/071963 A1). Предпочтительно ингибитор является ингибитором сигнального пути IFN типа I. Предотвращение занятости рецептора IFN внеклеточным IFN и ингибирование внутриклеточной сигнализации IFN в клетках обеспечивает стабильную экспрессию РНК в клетках. С другой стороны, предотвращение занятости рецептора IFN внеклеточным IFN и ингибирование внутриклеточной сигнализации IFN повышает выживаемость клеток, в частности, если клетки повторно трансфецируются РНК. Не придерживаясь какой-либо теории, предполагаем, что внутриклеточная сигнализация IFN может приводить к ингибированию трансляции и/или деградации РНК. Эту проблему можно решить путем ингибирования одного или нескольких индуцируемых IFN активных противовирусных эффекторных белков. Индуцируемый IFN активный противовирусный эффекторный белок может быть выбран из группы, состоящей из РНК-зависимой протеинкиназы (PKR), 2′,5′-олигоаденилатсинтетазы (OAS) и РНКазы L. Ингибирование внутриклеточной сигнализации IFN может включать ингибирование PKR-зависимого пути и/или OAS-зависимого пути. Подходящим представляющим интерес белком является белок, который способен ингибировать PKR-зависимый путь и/или OAS-зависимый путь. Ингибирование PKR-зависимого пути может включать ингибирование фосфорилирования eIF2-альфа. Ингибирование PKR может включать обработку клеток по меньшей мере одним ингибитором PKR. Ингибитор PKR может быть вирусным ингибитором PKR. Предпочтительным вирусным ингибитором PKR является E3 вируса коровьей оспы. Если пептид или белок (напр., E3, K3) должен ингибировать внутриклеточную сигнализацию IFN, то предпочтительной будет внутриклеточная экспрессия пептида или белка. E3 вируса коровьей оспы представляет собой дцРНК-связывающий белок в 25 кДа (кодируемый геном E3L), который связывает и захватывает дцРНК, предотвращая активацию PKR и OAS. E3 может связываться непосредственно с PKR и ингибировать её активность, что приводит к снижению фосфорилирования eIF2-альфа. Другими подходящими ингибиторами сигнализации IFN являются ICP34.5 вируса Herpes simplex, NSs вируса Toscana, PK2 нуклеополиэдровируса Bombyx mori и NS34A HCV.
В одном воплощении ингибитор внутриклеточной или внеклеточной сигнализации IFN кодируется репликоном. Репликон содержит элементы последовательности нуклеиновой кислоты, которые способствуют репликации альфавирусной репликазой, обычно CSE 1, CSE 2 и CSE 4; а предпочтительно также элементы последовательности нуклеиновой кислоты, которые способствуют вырабатыванию субгеномного транскрипта, т.е. субгеномный промотор, обычно включающий CSE 3. Кроме того, репликон может содержать одну или несколько модификаций, не модифицирующих последовательность полипептида, как описано здесь, напр., кэп, последовательность поли(A), адаптацию употребительности кодонов. Если на репликоне присутствуют несколько открытых рамок считывания, то ингибитор внутриклеточной сигнализации IFN может кодироваться любой из них, необязательно под контролем субгеномного промотора или нет. В предпочтительном воплощении ингибитор внутриклеточной сигнализации IFN кодируется самой верхней открытой рамкой считывания РНК-репликона. Когда ингибитор внутриклеточной передачи сигналов IFN кодируется самой верхней открытой рамкой считывания РНК-репликона, генетическая информация, кодирующая ингибитор внутриклеточной сигнализации IFN, будет транслироваться вскоре после введения РНК-репликона в клетки хозяина, а полученный белок может впоследствии ингибировать внутриклеточную сигнализацию IFN.
Еще одним подходящим представляющим интерес белком, кодируемым открытой рамкой считывания, является функциональный неструктурный белок альфавируса. Термин “неструктурный белок альфавируса” охватывает всевозможные ко- или посттрансляционно модифицированные формы, включая модифицированные углеводами (как-то гликозилированные) и модифицированные липидами формы неструктурного белка альфавируса.
В некоторых воплощениях термин “неструктурный белок альфавируса” относится к любому одному или нескольким из отдельных неструктурных белков альфавирусного происхождения (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) или же к полипротеинам, содержащим полипептидную последовательность более чем одного неструктурного белка альфавирусного происхождения. В некоторых воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает nsP123 и/или nsP4. В других воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает nsP1234. В одном воплощении представляющий интерес белок, кодируемый открытой рамкой считывания, состоит из всех nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4 в виде одного, необязательно расщепляемого полипротеина: nsP1234. В одном воплощении представляющий интерес белок, кодируемый открытой рамкой считывания, состоит из nsP1, nsP2 и nsP3 в виде одного, необязательно расщепляемого полипротеина: nsP123. В этом воплощении nsP4 может быть дополнительным белком, представляющим интерес, и может кодироваться дополнительной открытой рамкой считывания.
В некоторых воплощениях неструктурный белок альфавируса способен образовывать комплекс или ассоциацию, напр., в клетках хозяина. В некоторых воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает комплекс или ассоциацию nsP123 (синоним P123) и nsP4. В некоторых воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает комплекс или ассоциацию nsP1, nsP2 и nsP3. В некоторых воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает комплекс или ассоциацию nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4. В некоторых воплощениях “неструктурный белок альфавируса” означает комплекс или ассоциацию любого одного или нескольких, выбранных из группы, состоящей из nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4. В некоторых воплощениях неструктурный белок альфавируса включает по меньшей мере nsP4.
Термины “комплекс” или “ассоциация” относятся к двум или нескольким одинаковым или различным белковым молекулам, которые находятся в пространственной близости. Белки комплекса предпочтительно находятся в прямом или косвенном физическом или физико-химическом контакте друг с другом. Комплекс или ассоциация может состоять из нескольких разных белков (гетеромультимер) и/или нескольких копий одного определенного белка (гомомультимер). В контексте неструктурного белка альфавируса термин “комплекс или ассоциация” означает множество из по меньшей мере двух белковых молекул, из которых по меньшей мере одна представляет собой неструктурный белок альфавируса. Комплекс или ассоциация может состоять из нескольких копий одного определенного белка (гомомультимер) и/или из нескольких разных белков (гетеромультимер). В контексте мультимеров “мульти” означает более одного, как-то два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более десяти.
Термин “функциональный неструктурный белок альфавируса” охватывает неструктурные белки альфавируса, имеющие функцию репликазы. Таким образом, “функциональный неструктурный белок альфавируса” включает альфавирусные репликазы. “Функция репликазы” включает функцию РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), т.е. фермента, который способен катализировать синтез (−)-нити РНК на основе (+)-нити РНК матрицы и/или способен катализировать синтез (+)-нити РНК на основе (−)-нити РНК матрицы. Таким образом, термин “функциональный неструктурный белок альфавируса” может относиться к белку или комплексу, который синтезирует (−)-нить РНК, используя в качестве матрицы (+)-нить (напр., геномную) РНК, к белку или комплексу, который синтезирует новую (+)-нить РНК, используя в качестве матрицы комплементарную (−)-нить геномной РНК, и/или к белку или комплексу, который синтезирует субгеномный транскрипт, используя в качестве матрицы фрагмент комплементарной (−)-нити геномной РНК. Кроме того, функциональный неструктурный белок альфавируса может иметь одну или несколько дополнительных функций, таких, напр., как функция протеазы (для ауторасщепления), геликазы, терминальной аденилилтрансферазы (для добавления хвоста поли(A)), метилтрансферазы и гуанилилтрансферазы (для получения нуклеиновой кислоты с 5′-кэпом), сайтов ядерной локализации, трифосфатазы (Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87, pp. 111-124; Rupp et al., 2015, J. Gen. Virol., vol. 96, pp. 2483-500).
Согласно изобретению, термин “альфавирусная репликаза” относится к альфавирусной РНК-зависимой РНК-полимеразе, включая РНК-зависимую РНК-полимеразу из природного альфавируса (встречающегося в природе альфавируса) и РНК-зависимую РНК-полимеразу из варианта или производного альфавируса типа аттенуированного альфавируса. В контексте настоящего изобретения термины “репликаза” и “альфавирусная репликаза” применяются взаимозаменяемо, если контекст не предписывает, что какая-нибудь конкретная репликаза не является альфавирусной репликазой.
Термин “репликаза” включает все варианты, в частности, посттрансляционно модифицированные варианты, конформации, изоформы и гомологи альфавирусной репликазы, которые экспрессируются в клетках, инфицированных альфавирусом, или экспрессируются в клетках, которые были трансфецированы нуклеиновой кислотой, кодирующей альфавирусную репликазу. Кроме того, термин “репликаза” включает все формы репликазы, которые были получены и могут быть получены рекомбинантными методами. Например, рекомбинантными методами может быть получена репликаза, содержащая метку, которая облегчает детектирование и/или очистку репликазы в лаборатории, напр., метку myc, метку HA или олигогистидиновый тег (His-тег).
Необязательно альфавирусная репликаза также функционально определяется по способности связываться с любым одним или несколькими из консервативного элемента-1 последовательности (CSE 1) альфавируса или комплементарной ему последовательности, консервативного элемента-2 последовательности (CSE 2) альфавируса или комплементарной ему последовательности, консервативного элемента-3 последовательности (CSE 3) альфавируса или комплементарной ему последовательности, консервативного элемента-4 последовательности (CSE 4) альфавируса или комплементарной ему последовательности. Предпочтительно репликаза способна связываться с CSE 2 [т.е. с (+)-нитью] и/или с CSE 4 [т.е. с (+)-нитью] или связываться с комплементарной нитью CSE 1 [т.е. с (−)-нитью] и/или с комплементарной нитью CSE 3 [т.е. с (−)-нитью].
Происхождение репликазы не ограничивается каким-либо конкретным альфавирусом. В одном предпочтительном воплощении альфавирусная репликаза содержит неструктурный белок из вируса Semliki Forest, включая встречающийся в природе вирус Semliki Forest и варианты или производные вируса Semliki Forest, типа аттенуированного вируса Semliki Forest. В другом предпочтительном воплощении альфавирусная репликаза содержит неструктурный белок из вируса Sindbis, включая встречающийся в природе вирус Sindbis и варианты или производные вируса Sindbis типа аттенуированного вируса Sindbis. В одном альтернативном предпочтительном воплощении альфавирусная репликаза содержит неструктурный белок из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV), включая встречающийся в природе VEEV и варианты или производные VEEV типа аттенуированного вируса VEEV. В другом альтернативном предпочтительном воплощении альфавирусная репликаза содержит неструктурный белок из вируса Chikungunya (CHIKV),включая встречающийся в природе CHIKV и варианты или производные CHIKV типа аттенуированного вируса CHIKV.
Репликаза также может содержать неструктурные белки из более чем одного альфавируса. Так, гетерологичные комплексы или ассоциации, включающие неструктурный белок альфавируса и обладающие функцией репликазы, равным образом тоже включены в настоящее изобретение. В качестве иллюстрации: репликаза может содержать один или несколько неструктурных белков (напр., nsP1, nsP2) из первого альфавируса и один или несколько неструктурных белков (nsP3, nsP4) из второго альфавируса. Неструктурные белки из более чем одного другого альфавируса могут кодироваться отдельными открытыми рамками считывания или же одной открытой рамкой считывания в виде полипротеина, напр., nsP1234.
В некоторых воплощениях функциональный неструктурный белок альфавируса способен образовывать мембранные репликационные комплексы и/или вакуоли в клетках, в которых экспрессируется функциональный неструктурный белок альфавируса.
Если функциональный неструктурный белок альфавируса, то есть неструктурный белок альфавируса с функцией репликазы, кодируется молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, то предпочтительно, чтобы субгеномный промотор репликона, если он есть, был совместим с данной репликазой. Совместимость в этом контексте означает, что альфавирусная репликаза способна распознавать субгеномный промотор, если он есть. В одном воплощении это достигается, когда субгеномный промотор нативен по отношению к альфавирусу, из которого происходит репликаза, то есть природным источником этих последовательностей является один и тот же альфавирус. В другом воплощении субгеномный промотор не является нативным для альфавируса, из которого происходит альфавирусная репликаза, при условии, что репликаза альфавируса способна распознавать субгеномный промотор. Иными словами, репликаза совместима с субгеномным промотором (перекрестная совместимость с вирусами). Примеры перекрестной вирусной совместимости в отношении субгеномного промотора и репликазы, происходящих из разных альфавирусов, известны в данной области. Возможны любые комбинации субгеномного промотора и репликазы, если только существует перекрестная совместимость с вирусами. Перекрестная вирусная совместимость легко проверяется специалистами, работающими с настоящим изобретением, путем инкубации тестируемой репликазы вместе с РНК, причем РНК содержит тестируемый субгеномный промотор, в условиях, подходящих для синтеза РНК из субгеномного промотора. Если вырабатывается субгеномный транскрипт, то субгеномный промотор и репликаза считаются совместимыми. Известны различные примеры перекрестной вирусной совместимости (см. обзор Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562).
В настоящем изобретении открытая рамка считывания, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса, может может быть представлена на РНК-репликоне или же может быть представлена в виде отдельной молекулы нуклеиновой кислоты, напр., в виде молекулы мРНК. Отдельная молекула мРНК может необязательно содержать, напр., кэп, 5′-UTR, 3′-UTR, последовательность поли(A) и/или адаптацию употребления кодонов. Отдельная молекула мРНК может быть представлена in trans, как описано здесь.
Если открытая рамка считывания, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса, представлена на РНК-репликоне, то репликон предпочтительно может реплицироваться функциональным неструктурным белком альфавируса. В частности, РНК-репликон, кодирующий функциональный неструктурный белок альфавируса, может реплицироваться тем же функциональным неструктурным белком альфавируса, который кодируется репликоном. Это воплощение очень предпочтительно тогда, когда не предусмотрено никаких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих функциональный неструктурный белок альфавируса in trans. В этом воплощении предусмотрена цис-репликация репликона. В предпочтительном воплощении РНК-репликон содержит открытую рамку считывания, кодирующую функциональный неструктурный белок альфавируса, а также по меньшей мере еще одну открытую рамку считывания, кодирующую представляющий интерес белок, и может реплицироваться функциональным неструктурным белком альфавируса.
Если на репликоне присутствует несколько открытых рамок считывания, то функциональный неструктурный белок альфавируса может кодироваться любым из них, необязательно под контролем субгеномного промотора или нет, предпочтительно не под контролем субгеномного промотора. В предпочтительном воплощении функциональный неструктурный белок альфавируса кодируется самой верхней открытой рамкой считывания РНК-репликона. Когда функциональный неструктурный белок альфавируса кодируется самой верхней открытой рамкой считывания РНК-репликона, то генетическая информация, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса, будет транслироваться вскоре после введения РНК-репликона в клетки хозяина, а полученный белок может впоследствии запускать репликацию и необязательно вырабатывание субгеномного транскрипта в клетках хозяина.
Наличие открытой рамки считывания, кодирующей функциональный неструктурный белок альфавируса, либо на репликоне, либо на отдельной молекуле нуклеиновой кислоты, представленной in trans, позволяет реплицироваться репликону, поэтому представляющий интерес ген, кодируемый репликоном, необязательно под контролем субгеномного промотора, будет экспрессироваться на высоком уровне.
РНК-репликон подходит для экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих представляющий интерес пептид или белок, необязательно под контролем субгеномного промотора. Возможны различные воплощения. На РНК-репликоне может быть одна или несколько открытых рамок считывания, каждая из которых кодирует представляющий интерес пептид или белок. Самая верхняя открытая рамка считывания РНК-репликона именуется как “первая открытая рамка считывания”. В некоторых воплощениях “первая открытая рамка считывания” является единственной открытой рамкой считывания РНК-репликона. Необязательно после первой открытой рамки считывания может находиться одна или несколько дополнительных открытых рамок считывания. Одна или несколько дополнительных открытых рамок считывания после первой открытой рамки считывания могут именоваться как “вторая открытая рамка считывания”, “третья открытая рамка считывания” и т.д. в том порядке (от 5′ до 3′), в котором они находятся вниз от первой открытой рамки считывания. Предпочтительно каждая открытая рамка считывания содержит старт-кодон (триплет оснований), обычно AUG (в молекуле РНК), соответствующий ATG (в соответствующей молекуле ДНК).
Если репликон содержит 3′-последовательность распознавания репликации, то предпочтительно все открытые рамки считывания располагаются выше от 3′-последовательности распознавания репликации.
При введении РНК-репликона, содержащего одну или несколько открытых рамок считывания, в клетки хозяина репликон может прямо служить матрицей для трансляции первой открытой рамки считывания. Предпочтительно репликон содержит 5′-кэп. Это полезно для экспрессии гена, кодируемого первой открытой рамкой считывания, прямо из репликона.
В некоторых воплощениях по меньшей мере одна открытая рамка считывания репликона находится под контролем субгеномного промотора, предпочтительно субгеномного промотора альфавируса. Субгеномный промотор альфавируса очень эффективен, поэтому он подходит для экспрессии гетерологических генов на высоком уровне. Предпочтительно субгеномный промотор является промотором для субгеномного транскрипта у альфавирусов. Это значит, что субгеномный промотор является таким, который нативен для альфавируса и предпочтительно контролирует транскрипцию открытой рамки считывания, кодирующей один или несколько структурных белков у данного альфавируса. В качестве альтернативы субгеномный промотор является вариантом субгеномного промотора альфавируса; подходит любой вариант, который функционирует в качестве промотора для транскрипции субгеномной РНК в клетках хозяина. Если репликон содержит субгеномный промотор, то предпочтительно он содержит консервативный элемент-3 последовательности (CSE 3) или его вариант.
Предпочтительно по меньшей мере одна открытая рамка считывания под контролем субгеномного промотора располагается ниже от субгеномного промотора. Предпочтительно субгеномный промотор контролирует продукцию субгеномной РНК, содержащей транскрипт открытой рамки считывания.
В некоторых воплощениях первая открытая рамка считывания находится под контролем субгеномного промотора. Когда первая открытая рамка считывания находится под контролем субгеномного промотора, то её локализация похожа на локализацию открытой рамки считывания, кодирующей структурные белки в геноме альфавируса. Когда первая открытая рамка считывания находится под контролем субгеномного промотора, то предпочтительно ген, кодируемый первой открытой рамкой считывания, может экспрессироваться как из репликона, так и из его субгеномного транскрипта (последнее в присутствии функционального неструктурного белка альфавируса). Ниже от первой открытой рамки считывания, находящейся под контролем субгеномного промотора, может находиться одна или несколько дополнительных открытых рамок считывания, каждая из которых находится под контролем субгеномного промотора. Гены, кодируемые одной или несколькими дополнительными открытыми рамками считывания, напр., второй открытой рамкой считывания, могут транслироваться с одного или нескольких субгеномных транскриптов, каждый из которых находится под контролем субгеномного промотора. Например, РНК-репликон может содержать субгеномный промотор, контролирующий продукцию транскрипта, кодирующего второй представляющий интерес белок.
В других воплощениях первая открытая рамка считывания не находится под контролем субгеномного промотора. Когда первая открытая рамка считывания не находится под контролем субгеномного промотора, то ген, кодируемый первой открытой рамкой считывания, может экспрессироваться из репликона. Ниже от первой открытой рамки считывания может находиться одна или несколько дополнительных открытых рамок считывания, каждая из которых находится под контролем субгеномного промотора. Гены, кодируемые одной или несколькими дополнительными открытыми рамками считывания, могут экспрессироваться из субгеномных транскриптов.
В клетках, которые содержат репликон по настоящему изобретению, репликон может амплифицироваться функциональным неструктурным белком альфавируса. Кроме того, если репликон содержит одну или несколько открытых рамок считывания под контролем субгеномного промотора, то следует ожидать, что функциональным неструктурным белком альфавируса будет вырабатываться один или несколько субгеномных транскриптов. Функциональный неструктурный белок альфавируса может быть представлен in trans или же может кодироваться открытой рамкой считывания репликона.
Если репликон содержит более одной открытой рамки считывания, кодирующей представляющий интерес белок, то предпочтительно каждая открытая рамка считывания кодирует отдельный белок, напр., другой фармацевтически активный пептид или белок. Например, белок, кодируемый второй открытой рамкой считывания, будет отличаться от белка, кодируемого первой открытой рамкой считывания.
В некоторых воплощениях представляющий интерес белок, кодируемый первой и/или другой открытой рамкой считывания, предпочтительно первой открытой рамкой считывания, представлен функциональным неструктурным белком альфавируса или ингибитором сигнализации IFN, напр., E3. В некоторых воплощениях представляющий интерес белок, кодируемый первой и/или другой открытой рамкой считывания, напр., второй открытой рамкой считывания, является фармацевтически активным пептидом или белком либо репортерным белком.
В одном воплощении представляющий интерес белок, кодируемый первой открытой рамкой считывания, представлен функциональным неструктурным белком альфавируса. В этом воплощении репликон предпочтительно содержит 5′-кэп. В частности, когда представляющий интерес белок, кодируемый первой открытой рамкой считывания, представлен функциональным неструктурным белком альфавируса, а репликон предпочтительно содержит 5′-кэп, то последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса, может эффективно транслироваться из репликона, а полученный белок впоследствии может запускать репликацию репликона и синтез субгеномного транскрипта. Это воплощение может быть предпочтительным, когда вместе с репликоном не используется или не присутствует никакая дополнительная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный неструктурный белок альфавируса. В этом воплощении происходит цис-репликация репликона.
Композиции, описанные здесь, могут вводиться для лечения заболеваний типа тех, что описаны здесь, напр., заболеваний, связанных с тем антигеном, который кодируется вводимой РНК.
Термин “заболевание” означает ненормальное состояние, которое поражает организм человека. Заболевание часто понимается как медицинское состояние, связанное со специфическими симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими из внешнего источника, типа инфекционных заболеваний, или же может быть вызвано внутренними дисфункциями, типа аутоиммунных заболеваний. У людей “заболевание” часто применяется в более широком смысле для обозначения любых состояний, вызывающих боль, дисфункцию, страдания, социальные проблемы или смерть пораженного лица, или же аналогичных проблем для тех, кто находится в контакте с этим лицом. В этом более широком смысле оно иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, синдромы, инфекции, отдельные симптомы, отклоняющееся поведение и нетипичные изменения структуры и функции, тогда как в других контекстах и для других целей их можно считать отдельными категориями. Заболевания обычно поражают людей не только физически, но и эмоционально, так как их появление и жизнь со многими заболеваниями могут изменить их взгляды на жизнь и их личность.
Термин “заболевание, связанное с антигеном” или “заболевание с участием антигена” относится к таким заболеваниям, в которых задействованы антигены, напр., заболеваниям, которые характеризуются присутствием антигена. Заболевание с участием антигена может представлять собой инфекционное заболевание, аутоиммунное заболевание или раковое заболевание или просто рак. Как упомянуто выше, антиген может быть связанным с заболеванием антигеном типа ассоциированного с опухолью антигена, вирусного антигена или бактериального антигена.
Термин “инфекционное заболевание” относится к таким заболеваниям, которые могут передаваться от одного лица к другому или от организма к организму и вызываются микробными агентами (напр., простуда). Инфекционные заболевания известны в данной области и включают, к примеру, вирусные заболевания, бактериальные заболевания или паразитарные заболевание, причем эти заболевания вызываются вирусами, бактериями и паразитами, соответственно. В этой связи инфекционным заболеванием может быть, к примеру, гепатит, заболевания, передаваемые половым путем (напр., хламидиоз или гонорея), туберкулез, ВИЧ/синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), дифтерия, гепатит B, гепатит C, холера, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), птичий грипп, грипп, болезни животных типа ящура, чумы мелких жвачных животных, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней или паразитарные заболевания типа болезни Чагаса, малярия и др.
Термин “аутоиммунное заболевание” относится к таким заболеваниям, при которых организм (т.е. иммунная система) вырабатывает иммуногенный ответ на некоторые составляющие своих собственных тканей. Иными словами, иммунная система теряет способность распознавать какую-то ткань или систему в организме как собственную и нацеливается и атакует её, как если бы она была чужеродной. Аутоиммунные заболевания можно классифицировать как те, при которых поражается преимущественно один орган (напр., гемолитическая анемия и антииммунный тиреоидит), и те, при которых процесс аутоиммунного заболевания распространяется на многие ткани (напр., системная красная волчанка). К примеру, считается, что рассеянный склероз вызван тем, что Т-клетки атакуют оболочки, окружающие нервные волокна головного и спинного мозга. Это приводит к потере координации, слабости и помутнению зрения. Аутоиммунные заболевания известны в данной области и включают, к примеру, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, волчанку, рассеянный склероз, ревматический артрит, гемолитическую анемию, антииммунный тиреоидит, системную красную волчанку, целиакию, болезнь Крона, колит, диабет, склеродермию, псориаз и др.
Термины “раковое заболевание” или “рак” относятся к или описывают такое физиологическое состояние индивидуума, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры раковых заболеваний включают, без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретно, примеры таких видов рака включают рак костей, рак крови, рак легких, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анального канала, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак простаты, рак матки, карциному половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почек, почечно-клеточную карциному, карциному почечной лоханки, неоплазии центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак, опухоли позвоночника, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин “рак” согласно изобретению также включает метастазы рака.
Термин “иммунный ответ” относится к реакции иммунной системы типа на иммуногенные организмы, как-то бактерии или вирусы, клетки или вещества. Термин “иммунный ответ” включает в себя врожденный иммунитет и адаптивный иммунитет. Предпочтительно иммунный ответ связан с активацией иммунных клеток, индукцией биосинтеза цитокинов и/или вырабатыванием антител.
Предпочтительно иммунный ответ, индуцируемый композициями по настоящему изобретению, включает стадии активации антиген-презентирующих клеток типа дендритных клеток и/или макрофагов, презентации антигена или его фрагмента данными антиген-презентирующими клетками и активации цитотоксических Т-клеток вследствие этой презентации.
Термин “иммунные клетки” относится к клеткам иммунной системы, участвующим в защите организма индивида. Термин “иммунные клетки” охватывает специфические типы иммунных клеток и их предшественников, включая лейкоциты, в том числе макрофаги, моноциты (предшественники макрофагов), гранулоциты типа нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, дендритные клетки, тучные клетки и лимфоциты типа В-клеток, Т-клеток и клеток природных киллеров (NK). Макрофаги, моноциты (предшественники макрофагов), нейтрофилы, дендритные клетки и тучные клетки являются фагоцитарными клетками.
Термин “иммунотерапия” относится к лечению заболеваний путем индуцирования, усиления или подавления иммунного ответа. Иммунотерапия, предназначенная для выработки или усиления иммунного ответа, классифицируется как активационная иммунотерапия, тогда как иммунотерапия, которая снижает или подавляет иммунный ответ, классифицируется как супрессивная иммунотерапия. Термин “иммунотерапия” включает иммунизацию антигеном или вакцинацию антигеном либо иммунизацию опухоли или вакцинацию опухоли. Термин “иммунотерапия” также относится к манипулированию иммунными реакциями с тем, чтобы неадекватные иммунные реакции модулировать в более подходящие в контексте аутоиммунных заболеваний, таких как ревматический артрит, аллергия, диабет или рассеянный склероз.
Термины “иммунизация” или “вакцинация” означают процесс введения антигена индивидам с целью индуцирования иммунного ответа, к примеру, по терапевтическим или профилактическим причинам.
Термин “терапевтическое лечение” или просто “лечение” означает такое лечение, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни индивида. Такое лечение может устранить заболевание у индивидуума, приостановить или замедлить развитие заболевания у индивида, подавить или замедлить развитие заболевания у индивида, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у индивида и/или уменьшить рецидивы у индивида, у которого в настоящее время есть или раньше было заболевание.
Термин “профилактическое лечение” или “превентивное лечение” означает такое лечение, которое предназначено для предотвращения возникновения заболевания у индивида. Термины “профилактическое лечение” или “превентивное лечение” применяются здесь взаимозаменяемым образом.
Термины “защищать”, “предотвращать”, “профилактический”, “превентивный” или “защитный” относятся к предотвращению и/или лечению возникновения и/или распространения заболевания, напр., опухоли, у индивида. К примеру, профилактическое проведение иммунотерапии, напр., путем введения композиции настоящего изобретения, может защитить принимающего индивида от возникновения опухоли. К примеру, терапевтическое проведение иммунотерапии, напр., путем введения композиции настоящего изобретения, может остановить развитие заболевания, напр., привести к торможению прогрессирования/роста опухоли. Это включает замедление развития/роста опухоли, в частности, прекращение прогрессирования опухоли, которое предпочтительно приводит к устранению опухоли. Терапевтическое проведение иммунотерапии может защитить индивида, к примеру, от распространения или метастазирования существующих опухолей.
Термин “индивид” или “субъект” относится к позвоночным, в особенности к млекопитающим. Например, млекопитающими в контексте настоящего изобретения являются люди, другие приматы, домашние млекопитающие, как-то собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторные животные, как-то мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также животные в неволе типа животных в зоопарках. Термин “субъект” также относится к позвоночным, не относящимся к млекопитающим, таким как птицы (особенно домашние птицы, как-то куры, утки, гуси, индейки), и к рыбам (особенно выращиваемым рыбам, напр., лососю или сому). Термин “животное” в настоящем изобретении также включает людей.
Такие средства, как описанные здесь полиплексные частицы, могут вводиться в виде любой подходящей фармацевтической композиции. Термин “фармацевтическая композиция” относится к составам, содержащим терапевтически эффективное средство или его соль, предпочтительно вместе с такими фармацевтическими наполнителями, как буферы, консерванты и модификаторы тоничности. Такие фармацевтические композиции применимы для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства при введении данной фармацевтической композиции индивиду. Фармацевтические композиции также известны в данной области как лекарственные формы. Фармацевтические композиции могут вводиться локально или системно. В контексте настоящего изобретения фармацевтические композиции содержат описанные здесь частицы.
Термин “системное введение” означает введение терапевтически эффективного средства так, чтобы оно широко распространилось в организме индивида в значительном количестве и проявляло биологический эффект. Согласно настоящему изобретению, введение предпочтительно проводится парентерально.
Термин “парентеральное введение” означает введение терапевтически эффективного средства так, чтобы оно не проходило через кишечник. Термин “парентеральное введение” включает внутривенное введение, подкожное введение, внутрикожное введение или внутриартериальное введение, но не ограничивается этим.
В одном особенно предпочтительном воплощении композиции по настоящему изобретению вводят в мышечные ткани типа скелетных мышц. Таким образом, внутримышечное введение типа внутримышечной инъекции является предпочтительным способом введения.
Введение может осуществляться различным образом. В одном воплощении композиции по настоящему изобретению вводятся посредством инъекции. В предпочтительном воплощении инъекции осуществляются через иглу. В качестве альтернативы может применяться безигольная инъекция.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один адъювант. Термин “адъювант” относится к соединениям, которые при введении индивиду в сочетании с антигеном или антигенным пептидом пролонгируют или усиливают либо ускоряют иммунный ответ. Предполагается, что адъюванты проявляют свою биологическую активность по одному или нескольким механизмам, включая увеличение поверхности антигена, продление удержания антигена в организме, замедление высвобождения антигена, нацеливание макрофагов на антиген, увеличение поглощения антигена, усиление процессинга антигена, стимуляцию высвобождения цитокинов, стимуляцию и активацию иммунных клеток типа В-клеток, макрофагов, дендритных клеток, Т-клеток и неспецифическую активацию иммунных клеток. Адъюванты составляют гетерогенную группу соединений типа масляных эмульсий (напр., адъюванты Фрейнда), минеральных соединений (типа квасцов), бактериальных продуктов (типа токсина Bordetella pertussis) или иммуностимулирующих комплексов. Примеры адъювантов включают сапонины, неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, токоферол или квасцы, но не ограничиваются этим.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению обычно применяются в “фармацевтически эффективном количестве” и в виде “фармацевтически приемлемых препаратов”.
Термин “фармацевтически эффективное количество” означает такое количество, при котором достигается требуемая реакция или желательный эффект по отдельности или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания требуемая реакция предпочтительно означает торможение течения заболевания. Это включает замедление развития заболевания, в частности, прерывание или обращение хода заболевания. Требуемой реакцией при лечении заболеваний также может быть замедление возникновения или предотвращение возникновения данного заболевания или данного состояния. Эффективное количество описанных здесь композиций будет зависеть от подлежащего лечению заболевания, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и вес, продолжительности лечения, типа сопровождающей терапии (если имеется), конкретного способа введения и аналогичных факторов. Соответственно, вводимые дозы описанных здесь композиций могут зависеть от различных таких параметров. В том случае, если реакция у пациента недостаточна при начальной дозе, можно использовать более высокие дозы (или же эффективно более высокие дозы при другом, более локализованном способе введения).
Термин “фармацевтически приемлемый” означает нетоксичность материала, который не мешает действию активного компонента фармацевтической композиции.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать соли, буферы, консерванты, носители и необязательно другие терапевтические средства. Предпочтительно фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или наполнителей.
Термин “эксципиент” служит для обозначения таких веществ в фармацевтической композиции, которые не являются активными ингредиентами, типа связующих веществ, смазывающих веществ, загустителей, поверхностно-активных веществ, консервантов, эмульгаторов, буферов, ароматизаторов или красителей.
Термин “разбавитель” относится к разбавителям и/или разжижителям. Кроме того, термин “разбавитель” включает что-либо одно или несколько из текучих, жидких или твердых суспензий и/или смесительных сред.
Термин “носитель” относится к таким совместимым твердым или жидким наполнителям или разбавителям, которые пригодны для введения людям. Термин “носитель” относится к таким природным или синтетическим органическим или неорганическим компонентам, который объединяют с активным компонентом, чтобы облегчить нанесение активного компонента. Предпочтительно компонентами носителя являются стерильные жидкости типа воды или масла, включая полученные из минерального масла, животных или растений, как-то арахисовое масло, соевое масло, кунжутное масло, подсолнечное масло и т.д. Также в качестве водных соединений-носителей можно использовать солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина.
Фармацевтически приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, к примеру, в Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro, edit., 1985). Примеры подходящих носителей включают, к примеру, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натриевую карбоксиметилцеллюлозу, легкоплавкий воск, масло какао и др. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.
Фармацевтические носители, наполнители или разбавители можно выбирать с учетом предполагаемого способа введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать в качестве носителей, эксципиентов или разбавителей либо в дополнение к ним любые подходящие связующие, смазывающие вещества, суспендирующие средства, покрытия и/или солюбилизирующие средства. Примеры подходящих связующих включают крахмал, желатин, природные сахара типа глюкозы, безводной лактозы, сыпучей лактозы, β-лактозы, кукурузные подсластители, природные и синтетические камеди типа гуммиарабика, трагаканта или альгината натрия, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль. Примеры подходящих смазывающих веществ включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и др. В фармацевтические композиции могут входить консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты. Также можно использовать антиоксиданты и суспендирующие средства.
В одном воплощении композиции представляют собой водные композиции. Водные композиции необязательно могут содержать растворенные вещества, напр., соли. В одном воплощении композиции имеют вид лиофилизованной композиции. Лиофилизованные композиции могут быть получены путем замораживания-высушивания соответствующих водных композиций.
Приведенные здесь средства и композиции могут применяться по отдельности или в комбинации с другими схемами лечения типа хирургии, облучения, химиотерапии и/или трансплантации костного мозга (аутологичного, сингенного, аллогенного или постороннего).
Настоящее изобретение описано подробно и раскрывается на фигурах и примерах, которые приводятся только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения. Благодаря описанию и примерам, квалифицированным специалистам доступны дополнительные воплощения, которые также включены в изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Токсичность полиплексов in vitro
Материалы и методы
Реагент in vivo-jetPEI™, кат. № 201-50G, приобретали у фирмы Polyplus-Transfection (Illkirch, Франция). In vivo-jetPEI™ поступает в виде 150 мМ раствора (по концентрации азотных остатков) в стерильной апирогенной воде. JetPEI разбавляли в буфере 10 мМ HEPES, pH 7,1, 5% глюкозы (HBGx1) до требуемых концентраций (выраженных по концентрации азотных остатков).
Анализ цитотоксичности in vitro
4
2
Клетки HEK-293 высеивали в 96-луночный планшет (плоскодонный) в концентрации 2×10 клеток на лунку. Клетки содержали при 37°C и 7,5% CO. Через 24 часа супернатант отбрасывали и заменяли 50 мкл среды DMEM (+ 10% FCS). PEI разбавляли (1:5) в среде RPMI с 10% FCS и преинкубировали в течение ~ 15 мин. Затем к клеткам добавляли 50 мкл раствора PEI до конечного объема среды в 100 мкл. После дополнительных 18 ч проводили XTT-анализ (XTT Cell Viability Kit #9095, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Данные по гибели клеток в зависимости от концентрации PEI аппроксимировали по сигмоидальному уравнению:
50
50
На фиг. 1А представлена токсичность свободного чистого PEI на клетках HEK-293 in vitro. IC = 77 мкМ азота (свободного). На фиг. 1B представлена токсичность полиплексов PEI/РНК-репликон на клетках HEK-293 in vitro. IC= 542 мкМ азота (полиплексного состава).
Результаты и выводы
Свободный PEI вызывает гибель клеток при концентрации азота выше 18 мкМ (фиг. 1А). Конечная концентрация свободного PEI в клеточной среде должна быть ниже вышеуказанного предела, чтобы избежать проблем с токсичностью.
Полиплексы вызывают меньшую гибель клеток, чем свободный PEI, но их токсичность также возрастает при повышении концентрации PEI (фиг. 1B). Гибель клеток после добавления полиплексов можно рассчитать по уравнению:
Гибель клеток (%) = 21,13 + 78,59/(1+10^((-0,27-log(концентрации))×3,13)).
Для полиплексов с N/P = 11,6 (концентрация РНК 10 мг/л, PEI = 348 мкМ) гибель клеток составляла 36,8%, тогда как для полиплексов с N/P = 15,8 гибель клеток составляла 52,3%.
Пример 2. Исследование устойчивости полиплексов
Материалы и методы
Использовали реагент in vivo-jetPEI™ из примера 1. РНК, кодирующая люциферазу, в виде конструкции D1-824 Replicon, ID R076 1, была предоставлена Отделением биохимии РНК (BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH, Mainz, Германия).
Получение полиплексов
Перед получением уравновешивали in vivo-jetPEI™ и растворы сахаров при комнатной температуре. Получение комплексов in vivo-jetPEI™/РНК проводили в ламинарном вытяжном шкафу, используя стерильные растворы сахаров (табл. 1). Конечная концентрация сахара в составе составляла 5-10% масс./об.
Все составы готовили при концентрации РНК 250 мг/л и соотношении N/P = 11,6.
Стадии получения
1. Разбавляли РНК с помощью концентрированного сахарного буфера (HBGx2, MBGx2 или HBTx2), получая раствор в ½ от конечного объема. Осторожно перемешивали на вибромешалке.
2. Разбавляли реагент in vivo-jetPEI™ с помощью того же сахарного буфера и стерильной воды, получая раствор в 3/5 от конечного объема. Осторожно перемешивали на вибромешалке.
3. В разбавленную РНК быстро вносили половину объема разбавленного in vivo-jetPEI™ за один раз и осторожно перемешивали на вибромешалке.
4. Полиплексы инкубировали в течение 15-20 мин при комнатной температуре, а затем переносили в соответствующие условия хранения.
Таблица 1. Среды для приготовления и хранения полиплексов
№
Среда
Обозначение
1
Глюкоза 5% с 10 мМ HEPES, pH 7,1
HBGx1
2
Трегалоза 10% с 10 мМ HEPES, pH 7,1
HBTx1
3
Трегалоза 10% с 2,8 мМ HEPES и 80 мкМ EDTA, pH 7,1
HBTx1+EDTA
4
Глюкоза 10% с 20 мМ HEPES, pH 7,1
HBGx2
5
Трегалоза 20% с HEPES 20 мМ, pH 7,1
HBTx2
Лиофилизация полиплексов
Составы помещали в настольную множественную сублимационную сушку Epsilon 2-4 LSCplus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Германия).
Образцы замораживали до -40°C (~2°C/мин) при 1 атм. Это занимало 60-90 мин.
Снижали давление до 0,2 атм в течение 10 мин при -40°C.
Образцы сушили в течение 4 ч при 0,2 атм и -40°C.
Образцы нагревали до -16°C при 0,2 атм в течение 2 ч (линейно).
Образцы продолжали сушить в течение 4 ч при -16°C и 0,2 атм.
Снижали давление до 0,01 атм в течение 10 мин при -16°C.
Образцы продолжали сушить в течение 4 ч при -16°C и 0,01 атм.
Образцы нагревали до 20°C при 0,01 атм в течение 2 ч (линейно).
Образцы высушивали в течение 8 ч при 20°C и 0,01 атм.
Высвобождение РНК из полиплексов
Готовили 12 пробирок с образцами по 90 мкл в соответствии с табл. 2.
Таблица 2. Подготовка образцов для измерения целостности и концентрации РНК
№
Описание
1
Полиплексы в HBG хранили при комнатной температуре
2
Полиплексы в HBG хранили при 4°C
3
Полиплексы в HBG хранили при -20°C
4
Полиплексы в HBT хранили при комнатной температуре
5
Полиплексы в HBT хранили при 4°C
6
Полиплексы в HBT хранили при -20°C
7
Лиофилизованные полиплексы в HBT хранили при 4°C
8
Свободная РНК 250 мг/л в HBGx1
9
Свободная РНК 125 мг/л в HBGx1
10
Свободная РНК 63 мг/л в HBGx1
11
Свободная РНК 31 мг/л в HBGx1
12
HBGx1
В каждую пробирку добавляли 10 мкл гепарина 50 г/л в 500 мМ NaCl. Смесь инкубировали в течение 20 мин при 30°C на вибромешалке при 300 об/мин.
Целостность РНК
2
Использовали 5 мкл высвобожденной РНК для измерения в биоанализаторе. РНК смешивали с 5 мкл формамида. Определение целостности РНК проводили на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer. Набор Agilent RNA 6000 Nano Kit уравновешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Центрифугировали “Nano Gel Matrix” 400 мкл при 1500 g в течение 10 мин. Смешивали 65 мкл супернатанта с 1 мкл хорошо перемешанного “Nano Dye Concentrate” и центрифугировали при 15000 g в течение 10 мин, получая “Gel-Dye-Mix”. Подготовленные образцы денатурировали нагреванием в течение 10 мин при 70°C, а также нагревали “Nano Ladder” в течение 2 мин при такой же температуре. Чип заполняли с помощью “Priming Station”, добавляя 9 мкл “Gel-Dye-Mix” в положение с отметкой G и нагнетая давление на чип в течение 30 сек. Затем 9 мкл смеси “Gel-Dye-Mix” вносили в две другие позиции G. В позицию для лестницы вносили 7,5 мкл “Маркера” и по 5 мкл в каждое положение для образца. В позицию для лестницы добавляли денатурированную “Nano Ladder” (1,5 мкл), а затем во все 12 лунок для образцов добавляли 1 мкл образца (в неиспользуемые лунки добавляли 1 мкл HO). Чип ставили на вибромешалку IKA Vortex и перемешивали в течение 1 мин при 2000 об/мин. Этот чип измеряли на приборе, а пик РНК-репликона появлялся через 47-57 сек. Целостность РНК рассчитывали с помощью программы Expert 2100 в режиме Smear analysis с опцией Replicon RNA.
Относительную целостность РНК в % рассчитывали по следующему уравнению:
Анализ трансфекции in vitro
4
2
Клетки C2C12 высеивали в 96-луночный планшет (плоскодонный) в концентрации 2×10 клеток на лунку. Клетки содержали при 37°C и 7,5% CO. Через 24 часа супернатант отбрасывали и заменяли 50 мкл среды DMEM (+ 10% FCS). Полиплексы разбавляли (1:5) в среде DMEM с 10% FCS и преинкубировали в течение ~ 15 мин. Затем к клеткам добавляли 50 мкл раствора полиплекса до конечного объема среды в 100 мкл. После дополнительных 48 ч проводили анализ люциферазы Bright-Glo™ (кат. № E2610, Promega GmbH, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.
Рассчитывали относительную люминесценцию в % по следующему уравнению:
На фиг. 2 представлена относительная люминесценция из мышечных клеток C2C12 после инкубации с полиплексами PEI/РНК-репликон при N/P = 11,6 при различных условиях хранения после 1 недели хранения.
На фиг. 3 представлена относительная целостность РНК в полиплексах PEI/РНК-репликон при N/P = 11,6 при различных условиях хранения после 2 недель хранения.
Результаты и выводы
Полиплексы имеют слабую стабильность при хранении в жидком состоянии (4 и 25°C). Стабильность полиплексов значительно улучшается в твердом состоянии (замороженном или лиофилизованном), чем в жидком состоянии. Стабильность при хранении полиплексов в буфере HBT+EDTA в твердом состоянии значительно лучше, чем стабильность при хранении в буфере HBGx1.
Для полиплексов в HBT+EDTA возможна стабильность при длительном хранении в твердом состоянии, тогда как для полиплексов в HBGx1 стабильность при длительном хранении в жидком состоянии очень маловероятна.
Составы полиплексов с РНК-репликоном можно стабилизировать добавлением: 5-20% трегалозы (вес/объем), 80 мкМ – 5 мМ EDTA.
Пример 3. Описание расчета мол. массы линейных PEI
Линейные PEI синтезировали из 2-этил-2-оксазолина в две стадии. Сначала получали поли(2-этил-2-оксазолин) при изомеризационной полимеризации с размыканием цикла 2-этил-2-оксазолина в присутствии инициаторов (фиг. 4). Затем PEOX (N-пропионил-PEI) подвергали гидролизу кислотой с отщеплением N-пропионильных групп, получая PEI (фиг. 5).
Полное деацилирование PEOX (N-пропионил-PEI) с молекулярной массой 50 кДа дает линейный PEI с молекулярной массой в 22 кДа. Определение молекулярной массы промежуточного продукта (PEOX) проводили методом гель-проникающей хроматографии с детектором показателя преломления или детектором многоуглового рассеяния света. Все технические подробности описаны в: Adib, Abdennaji, Fabrice Stock, and Patrick Erbacher. “Method for Manufacturing Linear Polyethylenimine (PEI) for Transfection Purpose and Linear PEI Obtained with Such Method”. U.S. Patent Application No. 12/671,312.
Согласно настоящему изобретению, PEI, синтезированные из PEOX в диапазоне молекулярных масс 40-60 кДа, являются сильными реагентами для трансфекции РНК-репликонов.
PEI для применения по изобретению можно приобрести в виде in vivo-JetPEI у Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, Франция), PEI MAX 40000 у Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Германия) и Exgen 500 у фирмы Euromedex (Souffelweyersheim, Франция).
Пример 4. Кинетика агрегации полиплексов
Материалы и методы
Полиплексы получали в HBGx1 при концентрации РНК 200 мг/л, как описано выше в примере 2. Их разбавляли в HBGx1 и фосфатно-солевом буфере pH 7,4 (PBS) до концентрации РНК в 10 мг/л. PBS использовали для повышения ионной силы раствора. Перед добавлением разбавленных полиплексов в 96-луночный планшет его очищали профильтрованным воздухом. Размеры измеряли на считывающем устройстве DynaPro II фирмы WYATT Technology GmbH (Dernbach, Германия). Для расчета размеров мономодальных образцов использовали кумулянтный метод, а для мультимодальных образцов – метод регуляризации.
На фиг. 6 представлена кинетика агрегации полиплексов IVT (A) и репликона (B) с JetPEI при возрастающих концентрациях соли.
Результаты и выводы
Высокая ионная сила приводит к увеличению размеров полиплексов (фиг. 6). Ионная сила в составах полиплексов должна составлять ≤20 мМ, чтобы предотвратить агрегацию полиплексов.
Пример 5. Стерилизация полиплексов фильтрованием
Материалы и методы
Полиплексы получали при концентрации РНК 100 мг/л и соотношениях N/P = 11,5, 13,5 и 15,5, как описано выше в разделе «Исследование стабильности полиплексов».
Концентрация и целостность РНК
РНК высвобождали из полиплексов путем инкубации с гепарином. Смешивали 90 мкл свободной РНК (100 мг/л) или полиплексов с 10 мкл гепарина 20 г/л в 10 мМ Hepes, pH 7,4, 1 мМ EDTA. Смесь инкубировали в течение 20 мин при 30°C на вибромешалке. По 5 мкл этой смеси смешивали с 5 мкл формамида. Затем измеряли целостность РНК на биоанализаторе с пикочипами. Целостность РНК рассчитывали, как описано в примере 2. Концентрацию РНК измеряли методом анализа Ribogreen с помощью набора Quant-iT RiboGreen RNA Reagent and Kit (кат. № R11490, Thermo Fischer Scientific) в соответствии с инструкциями производителя для метода с высокой чувствительностью. Вкратце, смесь полиплексов с гепарином инкубировали с флуорофором Ribogreen в буфере 10 мМ трис, рН 7,5, 1 мМ EDTA. Флуоресценцию Ribogreen измеряли при длине волны возбуждения 485 нм и эмиссии 535 нм.
Концентрация PEI
4
Готовили раствор 23 мг CuSO (безводного) в 100 мл 0,1М Na-ацетата, pH 5,4 (реагент CSS). Смешивали 600 мкл реагента CSS с полиплексами и инкубировали в течение 5 мин при окружающей температуре. Поглощение каждого раствора измеряли при 285 нм на УФ-спектрофотометре против холостой пробы, используя кюветы на 1 см. Составляли калибровочную кривую по известным концентрациям PEI (0-1,55 мМ) и использовали для расчета концентрации PEI в неизвестных образцах. Из всех образцов вычитали фоновое поглощение от свободной РНК.
Измерение электрофоретической подвижности (µ)
Полиплексы разбавляли до концентрации РНК в 20 мг/л в 3,1 мл HBGx1. Затем их центрифугировали при 600 g в течение 2 мин. Готовили по три образца в 1,05 мл для каждого состава в пластиковых кюветах. Электрофоретическую подвижность полиплексов измеряли методом лазерного доплеровского электрофореза на приборе ζ-Wallis (Corduan Technologies, France). Для каждого образца использовали измерения при среднем разрешении с 1 серией в 10 прогонов. Измерения с низким отношением сигнал/шум или с экстремальными значениями µ (>3 или <-3 мкм×см/V×S) исключали из окончательного анализа. Все составы измеряли в трех повторах.
Фильтрование полиплексов
Готовили три пробирки с 2,68 мл полиплексов при трех различных соотношениях N/P. Полиплексы (1,34 мл) фильтровали через стерильные шприц-фильтры Millex-GP Med с порами в 220 нм (кат. № SLMPL25SS, Merck Millipore). Физико-химические параметры измеряли до и после фильтрования.
4
На фиг. 7 представлены физико-химические параметры полиплексов до (свежеполученные) и после (отфильтрованные) фильтрования. А и В. Высвобождали РНК из полиплексов с помощью гепарина. Затем измеряли целостность РНК-репликона (A) методом капиллярного электрофореза на приборе Bioanalyzer. Концентрацию РНК репликона (В) измеряли по флуоресценции Ribogreen. Концентрацию PEI измеряли методом с CuSO. D. Электрофоретическую подвижность (µ) измеряли методом лазерно-доплеровского электрофореза.
Результаты и выводы
Шприц-фильтры являются подходящим методом для стерилизации полиплексов. Полиплексы должны быть небольшими <120 нм, чтобы стерилизовать их фильтрованием. При соотношении N/P = 11,6 физико-химические свойства полиплексов не меняются при фильтровании. При возрастании соотношения N/P выше 11,6 происходит потеря РНК при фильтровании.
Пример 6. Влияние чистоты PEI на трансфекцию составов PEI/РНК-репликон
Материалы и методы
Приобретали следующие высокочистые PEI: in vivo-JetPEI у Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, Франция) и PEI MAX 40000 у фирмы Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Германия).
Приобретали следующий PEI обычной чистоты: PEI 25000 у фирмы Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Германия).
Полиплексы получали в HBGx1 при концентрации РНК 100 мг/л, как описано выше в примере 2.
Трансфекция in vivo
Мышей анестезировали изофлураном, брили заднюю сторону задних конечностей и дезинфицировали 70% раствором EtOH. Вводили по 20 мкл исследуемых составов в заднюю часть musculus tibialis с помощью инсулинового шприца, заранее снабженного канюлей размером 30G. Мышей наблюдали до прихода в сознание на признаки боли, страдания и дистресса.

В день измерения мышам вводили внутрибрюшинно раствор люциферина. После этого мышей анестезировали изофлураном и помещали на нагревательный мат (37°C) внутри камеры томографа IVIS Spectrum (Perkin Elmer) с постоянной подачей изофлурана/кислорода через индивидуальные маски для анестезии. Через 5 мин после введения люциферина проводили детектирование свечения биолюминесценции в течение 1 мин с помощью камеры. Полученные снимки анализировали с помощью программы LivingImage (Perkin Elmer).
2
2
На фиг. 8 представлено сравнение химической структуры PEI высокой чистоты и обычной чистоты. n = 58 для PEI в 25 кДа. Среднее число мономеров -CHCHNH- в PEI 25 кДа составляет 581, что также является длиной непрерывного отрезка потенциально протонируемых атомов азота. Предполагая равномерное распределение N-пропионильных фрагментов в обычном PEI25, непрерывный участок протонируемых азотов в нем составляет всего лишь 64.
На фиг. 9 представлена трансфекция мышечных клеток C2C12 in vitro с помощью полиплексов РНК-репликона, полученных с использованием PEI с различным уровнем чистоты при различных соотношениях N/P.
Согласно фиг. 10, получали полиплексы РНК-репликона при соотношениях N/P = 1 (-) и 11,6 (+)с высокочистым PEI (jetPEI) и обычным PEI (25 кДа). В качестве контроля использовали свободную РНК. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3). Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Результаты и выводы
Полиплексы, полученные с использованием высокочистого PEI, трансфецировали мышечные клетки in vitro лучше, чем с PEI обычной чистоты. Полиплексы проявляли наибольшую эффективность трансфекции in vivo при N/P = 11,6 после в/м инъекции.
Катионные полиплексы с высокочистым PEI при N/P = 11,6 могут трансфецировать мышечную ткань in vivo значительно лучше (разница в 4-5 раз), чем свободная РНК репликона.
Анионные полиплексы с высокочистым PEI при N/P = 1, полиплексы с PEI обычной чистоты при N/P = 1 и катионные полиплексы с PEI обычной чистоты при N/P = 11,6 трансфецируют мышечную ткань хуже, чем свободная РНК репликона.
Пример 7. Высокая эффективность трансфекции РНК-репликона очищенными PEI от разных поставщиков и лиофилизованными полиплексами
Материалы и методы
Приобретали следующие высокочистые PEI: in vivo-JetPEI у Polyplus-Transfection SA (Illkirch-Graffenstaden, Франция), Exgen 500 у фирмы Euromedex (Souffelweyersheim, Франция) и PEI MAX 40000 у Polysciences Europe GmbH (Eppelheim, Германия).
Полиплексы получали в HBGx1 при концентрации РНК 100 мг/л, как описано выше в примере 2. Все составы готовили в буфере HBGx1, кроме лиофилизованного состава, который готовили в буфере HBTx1. Лиофилизацию полиплексов в буфере HBTx1 проводили, как описано выше в примере 2. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3) и регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей, как описано выше в примере 6.
Для эксперимента, приведенного на фиг. 11, полиплексы РНК-репликона получали при соотношении N/P = 7,7 и 11,6 с высокочистыми PEI: jetPEI (фирмы Polyplus), PEI-Max 40000 (фирмы Polyscience) и Exgen 500 (фирмы Euromedex).
Таблица 3. Критерий Mann-Whitney, двусторонний, для статистической значимости (значения p) отличий между составами на фиг. 11
Гипотеза
День
Значение p
Свежий JetPEI отличается от PEI MAX 40000 при N/P 11,6
4
0,474
Свежий JetPEI отличается от Exgen при N/P 7,7
4
0,065
Свежий JetPEI отличается от лиофилизованного JetPEI
4
0,387
Свежий JetPEI отличается от PEI MAX 40000 при N/P 11,6
7
0,180
Свежий JetPEI отличается от Exgen при N/P 7,7
7
0,009*
Свежий JetPEI отличается от лиофилизованного JetPEI
7
0,065
Свежий JetPEI отличается от PEI MAX 40000 при N/P 11,6
10
0,132
Свежий JetPEI отличается от Exgen при N/P 7,7
10
0,788
Свежий JetPEI отличается от лиофилизованного JetPEI
10
0,093
Свежий JetPEI отличается от PEI MAX 40000 при N/P 11,6
4-10
0,700
Свежий JetPEI отличается от Exgen при N/P 7,7
4-10
0,700
Свежий JetPEI отличается от лиофилизованного JetPEI
4-10
0,700
На фиг. 12 представлены лиофилизированные осадки полиплексов JetPEI/РНК-репликон при N/P = 11,6, полученные с использованием различных буферов.
Результаты и выводы
Полиплексы РНК-репликона эффективно трансфецируют мышечную ткань после внутримышечной (i.m.) инъекции (фиг. 11). Для получения полиплексов можно использовать PEI высокой чистоты: jetPEI (фирмы Polyplus), PEI-Max 40000 (фирмы Polyscience) и Exgen 500 (фирмы Euromedex). Полиплексы Exgen-500 трансфецируются лучше при N/P = 7,7, чем при 11,6.
Лиофилизаты полиплексов в трегалозе имеют морфологию, похожую на лепешки, тогда как лиофилизаты в глюкозе разрушаются и с трудом растворяются в воде (фиг. 12).
Трегалоза предпочтительнее глюкозы для лиофилизации полиплексов. Лиофилизованные полиплексы действуют in vivo аналогично свежеприготовленным жидким полиплексам.
Пример 8. Трансфекция IVT-РНК в мышечные клетки полиплексами с очищенным PEI
Реагент in vivo-jetPEI™, кат. № 201-50G, приобретали у фирмы Polyplus-Transfection (Illkirch, Франция). Транскрибированная in vitro (IVT) мРНК, кодирующая люциферазу, в виде конструкции pST1-475 была предоставлена Отделением биохимии РНК (BioNTech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Германия).
Полиплексы с IVT-РНК и PEI получали, как описано выше в примере 2. Различные соотношения N/P получали, поддерживая постоянную концентрацию РНК и повышая концентрацию PEI.
Трансфекцию мышечных клеток in vitro проводили, как описано выше в примере 2. Исследование трансфекции in vivo проводили, как описано выше в примере 6.
Согласно фиг. 13, мышечные клетки C2C12 трансфецировали in vitro с помощью IVT-РНК, кодирующей люциферазу. РНК представляла собой комплексы с JetPEI при различных соотношениях N/P в буфере HBGx1. Измеряли сигналы люминесценции через 24 ч после трансфекции.
Согласно фиг. 14, полиплексы IVT-РНК получали при соотношениях N/P = 5,8 и 11,6 с очищенным PEI в буфере HBGx1. В качестве контроля использовали свободную IVT-РНК в буфере HBGx1. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3) в дозах РНК 2-8 мкг на инъекцию. Через 6 ч после инъекции регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Результаты и выводы
Полиплексы из IVT-РНК и высокочистого PEI могут эффективно трансфецировать мышечные клетки in vitro. Имеется положительная корреляция между эффективностью трансфекции и соотношением N/P (фиг. 13). Свободная IVT-РНК не трансфецирует клетки in vitro.
Полиплексы с высокочистым PEI при соотношении N/P 5,8 и 11,6 трансфецируют мышечную ткань in vivo значительно хуже, чем свободная IVT-РНК (фиг. 14).
Пример 9. Влияние размера частиц и условий получения на трансфекцию с помощью полиплексов РНК-репликона
Материалы и методы
Полиплексы из РНК-репликона и PEI получали, как описано выше в примере 2. Полиплексы получали при 5 различных концентрациях РНК: 100, 250, 500, 750, 1000 мг/л. Концентрацию PEI повышали соответствующим образом с тем, чтобы поддерживать соотношение N/P = 11,6 для всех составов.
Размеры полиплексов измеряли, как описано выше в примере 4.
Трансфекцию мышечных клеток in vitro проводили, как описано выше в примере 2. Исследования трансфекции in vivo проводили, как описано выше в примере 6.
Согласно фиг. 15, полиплексы из РНК-репликона и jetPEI получали при различной концентрации РНК при соотношении N/P = 11,6 в буфере HBGx1. Для измерения размера методом DLS полиплексы разбавляли до концентрации РНК 10 мг/л
Согласно фиг. 16, мышечные клетки C2C12 трансфецировали in vitro полиплексами из фиг.16. Через 24 ч после трансфекции измеряли сигналы люминесценции.
Согласно фиг. 17, полиплексы РНК-репликона с отношением N/P = 11,6 получали с очищенным PEI в буфере HBGx1 при различных концентрациях РНК, как показано на фиг. 16. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3) в дозах 2-8 мкг РНК на инъекцию. Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Результаты и выводы
Полиплексы являются хорошими средствами для трансфекции РНК-репликона. На биоактивность полиплексов в плане эффективности трансляции РНК в мышечной ткани не влияет концентрация РНК (0,1-1 г/л) во время образования полиплекса.
Размер полиплексов в диапазоне 60-200 нм не оказывает влияния на эффективность трансфекции полиплексов in vitro и in vivo (при в/м введении).
Пример 10. Различные полиплексы работают по-разному после п/к или в/м введения мышам
Реагент in vivo-jetPEI™, кат. № 201-50G, приобретали у фирмы Polyplus-Transfection (Illkirch, Франция). Линейный PEI в 22 кДа был предоставлен проф. Cheradame (Polytheragene, EVRY cedex, Франция). РНК, кодирующая люциферазу, в виде конструкции D1-824 Replicon, ID 1600801, была предоставлена Отделением биохимии РНК (BioNTech RNA Pharmaceuticals, Mainz, Германия).
Полиплексы с JetPEI получали в HBGx1 при концентрации РНК 500 мг/л, как описано выше в примере 2.
Полиплексы с Polytheragene-PEI получали аналогично процедуре с JetPEI, но с двумя модификациями:
1) для получения полиплексов вместо HBGx1 использовали буфер 10 мМ HEPES, pH 7,4,
2) вместо 11,6 использовали соотношение N/P = 15,8.
Получение полиплексов с Polytheragene-PEI проводили в соответствии со следующей статьей: Démoulins, Thomas, et al. “Polyethylenimine-based polyplex delivery of self-replicating RNA vaccines”. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine (2015).
Полиплексы разбавляли в буфере HBGx1 или Opti-MEM (кат. № 31985062, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Германия) до конечной концентрации 5 мг/л РНК для исследований in vitro и 100 мг/л для исследований in vivo.
Исследования in vitro проводили, как описано выше в примерах 1 и 2. Исследования in vivo проводили, как описано выше в примере 6.
Результаты и выводы
На фиг. 18 представлены исследования in vitro с полиплексами PEI/РНК-репликон на дендритных клетках (DC) человека и мышечных клетках мыши (C2C12). A. Токсичность (выраженная в % жизнеспособных клеток после обработки полиплексами). B. Трансфекция (выраженная в виде излучения люминесценции после обработки полиплексами). Результаты по трансфекции представлены только для клеток C2C12.
Для результатов, представленных на фиг. 19, полиплексы РНК-репликона получали при соотношении N/P = 11,6 или 15,8 с PEI фирмы Polyplus или Polytheragene в буфере 10 мМ HBGx1 или Hepes. Перед инъекцией мышам полиплексы разводили в буфере HBGx1 или Opti-MEM. Составы вводили внутримышечно в задние конечности мышей (n = 3) в дозах по 2 мкг РНК на инъекцию. Регистрировали сигналы люминесценции из мышц у мышей.
Таблица 4. Сравнение размеров между различными полиплексами
№
ИзготовительPEI
N/P
Буфер приполучении
Буфер при разведении
Диаметр(нм)
PDI
1
Polyplus
11,6
10 мМ HEPES, pH 7,1
HBGx1
112
0,277
2
Polyplus
15,8
HBGx1
HBGx1
107
0,239
3
Polytheragene
15,8
10 мМ HEPES, pH 7,4
Opti-MEM
>1000
мультимодальный
4
Polytheragene
15,8
10 мМ HEPES, pH 7,4
HBGx1
94
0,237
Opti-MEM имеет ионную силу более 20 мМ. В Opti-MEM полиплексы быстро агрегируют (табл. 4), поэтому этот состав не подходит для фармацевтической разработки.
Описанные здесь полиплексы (PEI фирмы Polyplus, N/P = 11,6, HBGx1) имеют совсем другие характеристики, чем описанные ранее полиплексы (PEI от Polytheragene, N/P = 15,8, Opti-MEM). В Opti-MEM полиплексы имеют диаметр >1000 нм и мультимодальное распределение по размерам. Описанные здесь полиплексы имеют диаметр ~ 100 нм и низкую полидисперсность.
In vitro все полиплексы были более токсичными для дендритных клеток, чем для мышечных клеток. Вероятно, дендритные клетки захватывают полиплексы после п/к введения, тогда как мышечные клетки трансфецируются полиплексами после в/м введения.
Трансфекция мышечных клеток in vitro описанными здесь полипеплексами и ранее описанными полиплексами была аналогичной.
Трансфекция in vivo описанными здесь полиплексами и ранее описанными полиплексами отличается и зависит от способа введения. Описанные здесь полиплексы трансфецируются хорошо после в/м введения и хуже после п/к введения. Описанные ранее полиплексы вообще не трансфецируются после в/м введения, тогда как после п/к введения наблюдался слабый сигнал.
Пример 11. Введение РНК-репликона мышам в/м инъекции в сравнении с интрадермальным введением
РНК-репликон, кодирующий фермент люциферазу, растворяли в буфере HBGx1 или составляли в виде полиплекса, как описано в примере 2. Эти составы вводили в/м в заднюю часть musculus tibialis мышей Balb/c в дозах 2 мкг РНК. Через 4, 7 и 10 дней после введения мышей анастезировали изофлураном. Затем им вводили субстрат люциферин и регистрировали излучение люминесценции из мышц с помощью CCD-камеры.
Фотоны, исходящие из белка люциферазы, регистрировали в течение 1 минуты, что представлено в виде наложения на фотографии визуализируемых мышей (фиг. 20А). На фиг. 20B представлено графическое отображение измеренных фотонов за секунду (p/s) в месте инъекции.
Через 7 дней после интрадермального (i.d.) введения в два места инъекции на дорсальной коже мышей Balb/c по 2 мкг безрецептурного HBGx1 или рецептурного состава с РНК-репликоном, кодирующим люциферазу, животных подвергали неинвазивной биолюминесцентной томографии in vivo. Фотоны, исходящие из белка люциферазы, регистрировали в течение 1 минуты, что представлено в виде наложения на фотографии визуализируемых мышей. Черными стрелками обозначены места инъекции (фиг. 21А). На фиг. 21В представлено графическое отображение измеренных фотонов за 1 сек (p/s) на месте инъекции.
Пример 12. Положительный эффект состава с РНК в качестве вакцины
Мышей иммунизировали дважды в дни испытания 0 и 21 композицией с одноцепочечным РНК-репликоном, кодирующим гемагглютинин (HA) вируса гриппа H1N1 штамма A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8), в составе с PEI при соотношении N/P = 11,6 или же безрецептурной одноцепочечной РНК. Все животные получали дозу в 1,25 мкг РНК. Третья группа получала только физраствор в качестве контрольной группы. Как видно из фиг. 22A, через 19 дней после первой иммунизации и незадолго до второй иммунизацииу всех животных, получавших рецептурный состав с РНК, развивался иммунный ответ против HA при анализе методом нейтрализации вируса (VNT, предел обнаружения 1280). Напротив, только у 5 из 8 животных, получавших безрецептурную РНК, проявлялась сероконверсия против HA. Как видно из фиг. 22B, через 35 дней после первой иммунизации все животные, получавшие РНК, были положительными по специфичным к HA антителам, причем титры антител против HA повышались. У животных в группе рецептурного состава с РНК, но не в группе безрецептурной РНК, титры стали значительно выше по сравнению с контрольной группой физраствора. Как видно из фиг.22C, через 54 дня после иммунизации у мышей, получавших рецептурный состав с 1,25 мкг РНК, кодирующей H1N1/PR8-HA, развивался значительно более высокий титр антител по сравнению с животными, получавшими 1,25 мкг безрецептурной РНК, кодирующей H1N1/PR8-HA (значимость рассчитывали односторонним методом ANOVA; * p≤0,001).
50
Мышей иммунизировали один раз в день испытания 0 композицией с одноцепочечным РНК-репликоном, кодирующим гемагглютинин (HA) вируса гриппа H1N1 штамма A/PuertoRico/8/1934 (H1N1/PR8), в рецептурном составе с PEI при соотношении N/P = 11,6 или же безрецептурной одноцепочечной РНК. Все животные получали 0,25 мкг РНК. Третья группа получала только физраствор в качестве контрольной группы. Как видно из фиг. 23A, через 54 дня после иммунизации все животные, получавшие РНК, были положительными по специфичным к HA антителам, причем в группе рецептурного состава с РНК титры стали значительно выше по сравнению с контрольной группой физраствора и с животными, получавшими 0,25 мкг безрецептурной РНК, кодирующей H1N1/PR8-HA (значимость рассчитывали односторонним методом ANOVA; ** p≤0,001, * p≤0,05). Через 55 дней после иммунизации всех мышей инфицировали 10-кратной медианной летальной дозой (MLD) H1N1/PR8. Наблюдалось выживание. Как видно из фиг. 23B, все контрольные животные погибли в пределах 8 дней. А 4 из 5 животных, получавших безрецептурную РНК, кодирующую H1N1/PR8-HA, выжили после провоцирующего заражения. Напротив, все мыши, получавшие рецептурный состав с РНК, кодирующей H1N1/PR8-HA, выжили после провоцирующего заражения, свидетельствуя о положительном эффекте композиции РНК/полиалкиленимин.
Пример 13. Распылительная сушка состава РНК-репликона с PEI
Готовили состав при соотношении N:P = 12, дважды следуя схеме пипетирования, приведенной в табл. 1, с последующим объединением полученного материала. При этом получили 5,0 мл полиплексов РНК-репликона с концентрацией РНК 0,1 мг/мл.
Смесь для полимера
Смесь для РНК
HBT2X [мкл]
wfi [мкл]
jetPEI [мкл]
Исходная РНК [мкл]
HBT2X [мкл]
250
940
60
250
1000
Подвергали распылительной сушке 3,5 мл этой композиции и получали 533 мг материала (выход: 76,1%). Размер частиц свежеприготовленных полиплексов РНК-репликона не определяли, так как материал был выгружен в демонстрационной лаборатории Büchi. После восстановления водой (смесь: 20 мг высушенных распылением полиплексов и 200 мкл воды для инъекций (wfi), что дает 10 мМ трегалозы и концентрацию РНК в 0,1 мг/мл) размер частиц (z-среднее) составлял 289 нм, а PDI составлял 0,238 (Nicomp, 15 мин). На фиг. 24А представлено исследование in vitro экспрессии люциферазы в полиплексах saRNA до и после распылительной сушки. Люциферазная активность saRNA не теряется в процессе распылительной сушки. Различия в абсолютной высоте сигналов обусловлены изменчивостью метода.
В дополнительном эксперименте подвергали распылительной сушке некомплексированную мРНК в 10% (вес/об.) трегалозе и исследовали целостность мРНК после распылительной сушки методом капиллярного электрофореза.
Смешивали 2,50 мл матричной РНК (R36-05.2-DP; конц. РНК = 0,5 мг/мл; 10 мМ Hepes; 0,1 мМ ЭДТА; pH 7,0) с 2,50 мл 20% (вес/об.) раствора трегалозы (объемное соотношение 1:1), получая следующую композицию: конц. РНК = 0,25 мг/мл; 10% (вес/об.) трегалозы; 5 мМ Hepes; 0,05 мМ ЭДТА. Во время распылительной сушки материал образца держали на льду. Всего подвергали распылительной сушке 2,5 мл этого раствора. При распылительной сушке температура на выходе повышалась с 33 до 37°C за 10 минут. Чтобы уменьшить повышение температуры, поток газа был увеличен с 98 до 101 л/мин. При распылительной сушке температура еще повышалась до 41°C в течение следующих 60 мин. После полного распыления получали 165 мг высушенного материала (выход: 66,0%). Для анализа целостности РНК материал растворяли в воде для инъекций (wfi) (смесь: 20 мг высушенной распылением РНК и 200 мкл wfi, что дает содержание трегалозы в 10% и концентрацию РНК в 0,25 мг/мл). Растворенную РНК анализировали на биоанализаторе Agilent 2100. Результаты этих анализов представлены на фиг. 24В в виде электрофореграммы высушенной распылением РНК.
Было показано, что целостность некомплексированной РНК сохранялась, а распылительная сушка не приводила к измеримой деградации РНК.
Эксперименты по распылительной сушке проводили следующим образом.
Для распылительной сушки содержащих РНК составов использовали Nano Spray Dryer B-90 фирмы Büchi. Для получения этих составов использовали следующие соединения:
• матричная РНК (R36-05.2-DP, конц. РНК = 0,5 мг/мл; 10 мМ Hepes; 0,1 мМ EDTA; pH 7,0)
• РНК-репликон, кодирующий люциферазу (D2 RNA-A1310 29-01 pST1-SFV4-TRON-I2m2-A30L70, wfi, конц. РНК = 1 мг/мл)
• вода для инъекций (wfi)
• NaCl (1,5 М в wfi)
• трегалоза 20% (вес/об.) в wfi (Pfanstiehl, серия № 35261A)
• трегалоза 20% (вес/об.) с буфером 2xHepes в wfi (Pfanstiehl, серия № 35261A, 20 мМ Hepes)
• JetPEI (Polyplus; серия № 13081A1S; 150 мМ азота)
Для распылительной сушки были выбраны следующие параметры процесса:
• форсунка: 4 мкм
• температура на входе: 80°C
• температура на выходе: 30°C
• расход газа: 98 мл/мин
• приложенный ток: 15.000 В; 350 мкА
Перед всеми экспериментами прибор очищали с помощью РНКазы Zapp и протирали этанолом, а крышку чистили в ультразвуковой ванне.
Пример 14. Микрожидкости для изготовления полиплексов
Использовали NanoAssemblr™ (Precision Nanosystems, BC, Vancouver, Канада) с микрожидкостным чипом, предоставленным производителем (1029-036). Для РНК использовали РНК-репликон собственного производства (партия № R071_1_2). Полиэтиленимин (Max PEI 40) – фирмы Polysciences (Eppelheim, Германия). В качестве шприцов использовали шприцы BD Plastipak 1 ml; 1508006, BD Biosciences (Heidelberg, Германия). Два компонента смешивали в соотношении 1:1, используя скорость потока 12 мл/мин. Образцы готовили при двух разных концентрациях, а именно 50 мг/л и 250 мг/л.
Для измерения размера частиц методом динамического рассеяния света использовали анализатор субмикронных частиц/ζ-потенциала 380 ZLS фирмы Nicomp (PSS Nicomp, Santa Barbara, CA).
Готовили по 1,5 мл для каждого условия. Для измерения размеров образцы разбавляли буфером HBG.
Схема пипетирования была следующей:
Параметры препарата
Исходные растворы
Пробирка с РНК
Пробирка с PEI
Конечный объем (мкл)
N/P
Конечная конц. РНК (мг/л)
РНК (г/л)
JetPEI (мМ)
РНК (мкл)
HBGx2 (мкл)
JetPEI (мкл)
HBGx2 (мкл)
Вода (мкл)
2000
12
50
2,6
106,9
38
962
33,6
38
927,9
2000
12
250
2,6
106,9
192
808
201,9
231
567,4
Эксперименты по микрожидкостному смешиванию проводили с использованием устройства, содержащего микрофлюидный смеситель Y-типа, в котором смешиваются два компонента, которые поставляются в стандартных шприцах. Два компонента смешивали в соотношении 1:1, используя постоянную скорость потока 12 мл/мин. Образцы готовили при двух разных концентрациях, а именно 50 мг/л и 250 мг/л, и измеряли размеры частиц полученных полиплексов.
Полиплексы получали с помощью микрофлюидных устройств, что свидетельствует о возможности поточного производства для масштабирования и GMP-производства. Образование частиц было возможным без проблем, и не наблюдалось никаких признаков образования агрегатов или закупоривания. Размеры частиц измеряли по динамическому рассеянию света. Для полиплексов, изготовленных при 0,05 мг/л, размер составлял около 123 нм, а для частиц, изготовленных при 0,25 мг/мл, размер составлял примерно 314 нм. Детали полученных результатов приведены ниже в таблице.
Концентрация (мг/мл)
Размер (нм)
PDI
ND
Ширинаканала
0,05
122,8
0,31
167
17
0,25
314,2
0,247
116
45
Все образцы измеряли при концентрации РНК в 0,02 мг/мл (разбавляли HBGx1)
Была продемонстрирована возможность изготовления полиплексов с помощью микрофлюидных устройств. Изготовление проводилось с помощью простого смесителяY-типа, а для обеспечения бесперебойного производства не требовалось никаких особых процедур типа гидродинамической фокусировки. При подходящих условиях можно получать частицы размером менее 200 нм, что позволит проводить окончательную стерилизацию фильтрованием с помощью общепринятых и соответствующих GMP стерильных фильтров. Поскольку никаких признаков агрегации или закупоривания не отмечалось, сделан вывод о том, что масштабирование до более крупных производственных партий будет возможным без проблем. Другие варианты масштабирования включают запараллеливание нескольких идентичных устройств. Резюмируя, результаты можно принимать в качестве свидетельства об общей осуществимости GMP-совместимого микрожидкостного производства полиплексов PEI/РНК.
Пример 15. Стерилизация полиплексов фильтрованием
Полиплексы готовили при концентрации РНК-репликона 100 мг/л и соотношении N/P = 11,5, 13,5 и 15,5, как описано выше в разделе «Исследование стабильности полиплексов».
Готовили три пробирки с 2,68 мл полиплексов при трех различных соотношениях N/P. Полиплексы (1,34 мл) фильтровали через стерильные шприц-фильтры Millex-GP Med с порами 220 нм (кат. № SLMPL25SS, Merck Millipore).
Полиплексы разбавляли до концентрации РНК 10 мг/л в HBGx1. Затем их разводили до концентрации РНК 5 мг/л в 0,9% NaCl за 30 мин перед добавлением к клеткам.
4
2
Клетки C2C12 высеивали в 96-луночный планшет (плоскодонный) в концентрации 2×10 клеток на лунку. Клетки содержали при 37°C и 7,5% CO. Через 24 часа супернатант отбрасывали и заменяли 50 мкл среды DMEM (+ 10% FCS). Полиплексы разбавляли (1:5) в среде DMEM с 10% FCS и преинкубировали в течение ~ 15 мин. Затем к клеткам добавляли 50 мкл раствора полиплекса до конечного объема среды в 100 мкл. После дополнительных 48 ч проводили анализ Bright-Glo™ на люциферазу (кат. № E2610, Promega GmbH, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкцией.
Параллельно с трансфекцией также измеряли количество клеток с помощью набора для пролиферации клеток II (XTT, Roche, № 11465015001). При обоих анализах каждый образец полиплекса тестировали в трех биологических повторах. В качестве отрицательного контроля клетки высеивали без обработки (“необработанные”). Для XTT-анализа также высеивали среду без клеток, эквивалентную фону (BG), опять же в трех повторах. Наконец, измеряли люминесценцию (Bright-Glo™), а также поглощение (XTT) на считывающем устройстве Infinite 200pro (Tecan). Нормированную люминесценцию рассчитывали путем деления сигнала люминесценции на поглощение (что пропорционально количеству клеток).
На фиг. 25 представлена нормированная люминесценция мышечных клеток C2C12 после инкубации с полиплексами PEI/РНК-репликон при различных соотношениях N/P, до (свежеполученные) и после (стерилизованные) стерилизации фильтрованием.
Можно сделать вывод, что шприц-фильтры подходят для стерилизации полиплексов. Эффективность трансфекции полиплексов не меняется в процессе стерилизации.
Пример 16. Оптимизация трансфекции полиплеков путем комбинирования коротких и длинных PEI
Проводили комплексообразование кодирующего люциферазу РНК-репликона с настоящей комбинацией короткого PEI между 0,6 и 11 кДа (напр., линейный короткий PEI в 2,5 кДа либо разветвленный короткий PEI в 1,8 кДа) и длинного PEI между 20 и 40 кДа (напр., in vivo-jetPEI в 22 кДа) в различных сочетаниях при общем N/P = 10 или 12 в буфере MBG (конечная концентрация 5% вес/об. глюкозы, 10 мМ MES, pH 6,1). Отдельно использовали in vivo-jetPEI NP12 в качестве эталона. Комплексообразование полиплексов с короткими и длинными PEI происходило в две стадии. На первой стадии полиплексы РНК-репликона доводили до требуемого N/P с помощью in vivo-jetPEI. На второй стадии к составу добавляли избыток короткого PEI для получения требуемого общего соотношения N/P; т.е. первое число определяет N/P длинного PEI, а второе число – короткого PEI (напр., NP4+8 = NP4 длинного PEI и NP8 короткого PEI). Анализ на люциферазу проводили, как описано выше в примере 15.
Результаты представлены на фиг. 26. На фиг. 26A представлена эффективность трансфекции полиплексов с коротким линейным PEI и длинным in vivo-jetPEI при 250 нг РНК на лунку. На фиг. 27B представлена эффективность трансфекции полиплексов с коротким разветвленным PEI и длинным in vivo-jetPEI при 250 нг РНК на лунку.
Вывод. По сравнению с результатами у эталона только с длинным PEI (напр., in vivo-jetPEI) эффективность трансфекции может значительно улучшиться при использовании комбинаций длинного PEI и короткого PEI.
Интересно, что в отношении комбинаций с линейным коротким PEI сигнал экспрессии люциферазы выходил на пик в первые 24 часа после трансфекции, тогда как в отношении комбинаций с разветвленным коротким PEI сигнал экспрессии люциферазы выходил на пик в первые 48 часов после трансфекции. Таким образом, в ситуациях, когда желательна экспрессия в определенном временном интервале, будет разумным тщательльный выбор правильной комбинации короткого PEI и длинного PEI.
Пример 17. Оптимизация трансфекции полиплексов путем снижения количества длинного PEI
Проводили комплексообразование кодирующего секретируемую люциферазу РНК-репликона с настоящей комбинацией короткого PEI (напр., разветвленного в 1,8 кДа) и длинного PEI (напр., in vivo-jetPEI) в различных сочетаниях при общем N/P = 12 в буфере MBG (конечная концентрация 5% вес/об. глюкозы, 10 мМ MES, pH 6,1). Отдельно использовали in vivo-jetPEI NP12 в качестве эталона. Комплексообразование полиплексов с коротким + длинным PEI происходило в две стадии. На первой стадии полиплексы РНК-репликона доводили до требуемого N/P с помощью in vivo-jetPEI. На второй стадии к составу добавляли избыток короткого PEI для получения требуемого общего соотношения N/P; т.е. первое число определяет N/P длинного PEI, а второе число – короткого PEI (напр., NP4+8 = NP4 длинного PEI и NP8 короткого PEI). Секрецию люциферазы измеряли согласно методике производителя (Nano-GLO, Promega, США) при 125 нг РНК на лунку. Анализ жизнеспособности клеток проводили, как описано выше в примере 15.
Результаты представлены на фиг. 27. По сравнению с эталоном и при таком же общем соотношении N/P более высокий уровень экспрессии достигался с помощью комбинаций, напр., NP4+8 и NP1.15+11. Таким образом, эффективность трансфекции может значительно возрасти при снижении концентрации длинного PEI в составе и повышении концентрации менее токсичного короткого PEI (напр., разветвленного в 1,8 кДа).
Пример 18. Влияние вариаций соли и/или рН на эффективность трансфекции in vivo

Мышей BALB/c приобретали у Janvier Laboratories и использовали в эксперименте в 8-недельном возрасте. Перед введением указанных тест-препаратов мышей анестезировали изофлураном и удаляли шерсть с задних лап с помощью электрической бритвы. После этого вводили внутримышечно полиплексы РНК-репликона (saRNA) с PEI (напр., полиплексы saRNA с in vivo-jetPEI NP12) в дозе 2 мкг РНК в общем объеме 20 мкл в задние части каждой musculus tibialis по 3 мыши на группу. Составы варьировались в отношении pH и/или концентрации соли (напр., NaCl). В указанные моменты времени мышам внутрибрюшинно вводили раствор D-люциферина (100 мг/кг массы тела) и неинвазивно регистрировали биолюминесценцию у анестезированных изофлураном мышей в течение 1 мин на приборе IVIS Spectrum Device (Perkin Elmer). На графиках представлены сигналы биолюминесценции в фотонах за 1 секунду [p/s], полученные с помощью программы Living Image (Perkin Elmer) в определенном вручную участке (ROI) мышцы у мышей (места инъекции) на этих снимках, в общей сложности по 6 значений на группу.
Влияние вариаций соли (напр., NaCl) на эффективность трансфекции представлено на фиг. 28. Внутримышечное введение полиплексов РНК-репликона с PEI при различных соотношениях N/P приводило к продолжительным сигналам биолюминесценции в районе мышц у мышей при измерении в дни 3, 6, 9 и 13. Сила детектируемого сигнала возрастала с 3 дня до дня 6 (пик) после введения, но детектировалась даже в день 13. Наиболее интенсивный сигнал в районе мышц у мышей детектировался в день 6 после введения у мышей, получавших полиплексы РНК-репликона с PEI (напр., длинным PEI с N/P = 12) с добавлением низких концентраций соли (от 5 до 10 мМ).
Влияние вариаций pH на эффективность трансфекции представлено на фиг. 29. Хорошие результаты получали с составами полиплексов РНК-репликона (saRNA) с PEI со значениями pH от 6,5 до 7,1, предпочтительно от 6,5 до 6,9. Наиболее интенсивный сигнал детектировался при составе РНК-репликона с длинным PEI NP12, доведенном до pH 6,5. В качестве эталона использовали полиплексы РНК-репликона с jetPEI NP12 без доведения pH (BM) или в HBG (20 мМ HEPES, pH 7,4, 5% масс. глюкозы).
Пример 19. рН-зависимые эффекты на электрофоретическую подвижность и эффективность трансфекции PEI-полиплексов in vitro
Проводили комплексообразование кодирующего люциферазу РНК-репликона с длинным PEI (напр., in vivo-jetPEI) при сотношении N/P = 4 в буфере HBG (конечная концентрация 4,5% вес/об. глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7,1) при комнатной температуре в течение 15 мин и отбирали 11 образцов. Значения pH образцов доводили добавлением HCl или NaOH в зависимости от конечного общего рН при тестировании. Измерение электрофоретической подвижности (µ) проводили, как описано в примере 5. Анализы трансфекции in vitro мышечных клеток C2C12 мыши, люциферазы и жизнеспособности клеток проводили, как описано выше в примере 15.
рН-зависимые эффекты на электрофоретическую подвижность и эффективность трансфекции PEI-полиплексов in vitro представлены на фиг. 30 и 31. На фиг. 30 представлена электрофоретическая подвижность полиплексов in vivo-jetPEI/РНК-репликон (N/P = 4), доведенных до различных значений pH. На фиг. 31 представлена нормированная люминесценция мышечных клеток C2C12 после инкубации с различными дозами полиплексов in vivo-jetPEI/РНК-репликон при соотношении N/P = 4 и различных значениях pH (pH 6,5 – pH 8,5).
Электрофоретическая подвижность полиплексов отрицательно коррелирует с рН. Нейтральные полиплексы получаются примерно при рН 8,9. Повышение плотности положительных зарядов на PEI-полиплексах путем снижения общего pH у полиплекса, предпочтительно до значений pH от 6,5 до 7,1, приводило к повышению эффективности трансфекции клеток C2C12, но не влияло на жизнеспособность клеток. Полимеры PEI содержат первичные и вторичные амины, состояние протонирования которых зависит от общего рН. Таким образом, полученные результаты предполагают эффективный способ контролирования заряда полиплексов и эффективности их трансфекции путем доведения и оптимизации общего рН.
Пример 20. Влияние избытка положительных зарядов в составах с длинным PEI
Проводили комплексообразование кодирующего секретируемую люциферазу РНК-репликона при различных соотношениях N/P от 2 до 12 в буфере MBG (конечная концентрация 5% вес/об. глюкозы, 10 мМ MES, pH 6,1). Секрецию люциферазы измеряли в соответствии с методикой производителя (Nano-GLO, Promega, США) при 125 нг РНК на лунку. Избыток положительных зарядов рассчитывали на основе соотношения N/P у РНК-репликона с длинным PEI (т.е. in vivo-jetPEI) и точного соотношения N/P, при котором происходит полное комплексообразование этого РНК-репликона с in vivo-jetPEI. Разность между используемым соотношением N/P и известным соотношением N/P для полного комплексообразования позволяет рассчитать избыток положительных зарядов у состава.
В качестве примера на фиг. 32 представлены результаты по трансфекции полиплексов с in vivo-jetPEI при 250 нг РНК. В целом, повышение концентрации положительных зарядов в составах экспоненциально пропорционально уровню экспрессии люциферазы. Избыток положительных зарядов вплоть до 30 нМ при повышении количества PEI оказался полезным.
Пример 21. Оптимизация трансфекции полиплексов с одним компонентом PEI при помощи 2-стадийного комплексообразования
При использовании только одного варианта PEI (такого, напр., как длинный PEI) эффективность трансфекции можно повысить при помощи 2-стадийного метода комплексообразования. Проводили комплексообразование кодирующего секретируемую люциферазу РНК-репликона в две стадии при общем N/P = 12 в буфере MBG (конечная концентрация 5% вес/об. глюкозы, 10 мМ MES, pH 6,1). В качестве эталона использовали 1-стадийное комплексообразование с in vivo-jetPEI NP12. К примеру, комплексообразование в 2 стадии с использованием in vivo-jetPEI происходило следующим образом. На первой стадии полиплексы РНК-репликона доводили до требуемого первоначального N/P. На второй стадии к составу добавляли избыток in vivo-jetPEI для получения требуемого общего соотношения N/P; т.е. первое число определяет N/P первоначального PEI, а второе число – избыток in vivo-jetPEI на 2-й стадии (напр., NP4+8 = NP4 по jetPEI на 1-й стадии и NP8 по jetPEI на 2-й стадии). Секрецию люциферазы измеряли согласно методике производителя (Nano-GLO, Promega, США) при 125 нг РНК на лунку. Анализ жизнеспособности клеток проводили, как описано выше в примере 15.
Результаты по 2-стадийному комплексообразованию представлены на фиг. 33. По сравнению с эталоном 1-стадийного комплексообразования с in vivo-jetPEI NP12 и при таком же общем соотношении N/P более высокие уровни экспрессии достигались при 2-стадийном комплексообразовании.
Пример 22. Влияние буфера в составе полиплексов на эффективность иммунизации
Из saRNA составляли полиплексы с использованием in vivo-jetPEI. Полиплексы получали с использованием забуференной Hepes глюкозы (HBG) или забуференной MES глюкозы (MBG) (5% D-глюкозы, 10 мМ MES, pH 6,1). В день 0 мышей иммунизировали в/м за один прием. На 45-й день после иммунизации собирали сыворотку и определяли содержание специфичных к Cf07-HA антител в сыворотке HA-специфичным методом ELISA. Проводили титрование разведений сыворотки до конечных точек и определяли площадь под кривой (AUC). Рассчитывали процентное увеличение площади под кривой у полученных в MBG полиплексов по сравнению с полученными в HBG полиплексами, которые принимали за 100%.
Результаты представлены на фиг. 34. По сравнению с полиплексами, полученными в HBG, полиплексы, полученные с использованием забуференной MES глюкозы, давали гораздо больший сигнал ELISA после однократной вакцинации мышей.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ
Атм атмосферное давление
C концентрация
4
CSS раствор 23 мг CuSO в 100 мл 0,1M Na-ацетата, pH 5,4
DLS динамическое рассеяние света
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
FCS фетальная телячья сыворотка
ч час
HBGx1 забуференная 10 мМ HEPES (pH 7,1) глюкоза 5%
HBGx2 забуференная 20 мМ HEPES (pH 7,1) глюкоза 10%
HBTx1 забуференная 10 мМ HEPES (pH 7,1) трегалоза 10%
HBTx2 забуференная 20 мМ HEPES (pH 7,1) трегалоза 20%
HBTx1 + EDTA забуференная 2,8 мМ HEPES (pH 7,1) трегалоза 10% с 80 мкМ EDTA
HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота
IVI Институт вирусологии и иммунологии, Миттельхойзерн, Швейцария
IVT транскрибированная in vitro мРНК
кДа 1000 дальтон
Лио лиофилизация
мин минута
MBGx1 5% D-глюкоза, 10 мМ MES, pH 6,1
MES 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота
N/P соотношение между числом аминогрупп в PEI и фосфатных групп в РНК
PEI полиэтиленимин
РНК рибонуклеиновая кислота
UV ультрафиолетовый