ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ СЕКРЕТАГОГОВ ГОРМОНА РОСТА
PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF LIGANDS OF RECEPTORS OF SECRETAGOGUES OF GROWTH HORMONE

Предшествующий уровень техники
2
Настоящее изобретение относится к усовершенствованиям композиций, содержащих пептиды, которые являются лигандами рецепторов секретагогов гормона роста (GHS), или их фармацевтически приемлемые соли, способам получения подобных композиций и способам применения подобных композиций для лечения млекопитающих. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей памоатную соль H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH, являющуюся лигандом рецептора GHS, и в которой после подкожного или внутримышечного введения субъекту белок образует при физиологическом значении рН in situ депо, которое медленно растворяется и высвобождается в жидкость тела и кровоток. Кроме того, настоящее изобретение может также включать в себя органический компонент, такой как диметилацетамид (ДМА) или полиэтиленгликоль средней молекулярной массы менее 1000.
Пульсирующее высвобождение гормона роста из гипофизарных соматотрофных клеток регулируется двумя гипоталамическими нейропептидами: гормоном, высвобождающим гормон роста, и соматостатином. Гормон, высвобождающий гормон роста, стимулирует высвобождение гормона роста, тогда как соматостатин подавляет секрецию гормона роста. (Frohman et al., Endocr. Rev. 1986, 7,
223-253, and Strobi et al., Pharmacol. Rev. 1994, 46, 1-34.)
Высвобождение гормона роста из гипофизарных соматотрофных клеток может также регулироваться пептидами, высвобождающими гормон роста (GHRP's). Было найдено, что гексапептид His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-амид (GHRP-6) высвобождает гормон роста из гипофизарных соматотрофных клеток зависимым от дозы способом у нескольких видов, включая человека. (Bowers et al., Endocrinology 1984, 114, 1537-1545). Последующие химические исследования GHRP-6 привели к идентификации других эффективных секретагогов гормонов роста, таких как GHRP-1, GHRP-2 и гексарелина(Cheng et al., Endocrinology 1989, 124, 2791-2798, Bowers, C. Y. Novel GH-Releasing Peptides. In: Molecular and Clinical Advances in Pituitary Disorders. Ed: Melmed, S.; Endocrine Research and Education, Inc., Los Angeles, CA, USA 1993, 153-157, and Deghenghi et al. Life Sci. 1994, 54, 1321-1328):
GHRP-1
Ala-His-D-(2')-Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
GHRP-2
D-Ala-D-(2')-Nal-Ala-Trp-D-Nal-Lys-NH<sub>2</sub>
Гексарелин
His-D-2-MeTrp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6 и гексарелин представляют собой синтетические секретагоги гормона роста (GHS's). GHS's стимулируют секрецию гормона роста по механизму, который отличается от механизма в случае гормона, высвобождающего гормон роста. (Bowers et al.. Endocrinology 1984, 114, 1537-1545, Cheng et al. Endocrinology 1989, 124, 2791-2798, Bowers, C. Y. Novel GH-Releasing Peptides. In: Molecular and Clinical Advances in Pituitary Disorders. Ed: Melmed, S.; Endocrine Research and Education, Inc., Los Angeles, CA, USA 1993, 153-157, and Deghenghi et al., Life Sci. 1994, 54, 1321-1328).
Низкая пероральная биодоступность (<1%) пептидильных секретагогов гормона роста стимулирует поиск не-пептидных соединений, миметирующих действие GHRP-6 в гипофизе. Сообщалось, что несколько бензолактамов и спироинданов стимулируют высвобождение гормона роста у различных видов животных и у человека. (Smith et al.. Science 1993, 260, 1640-1643, Patchett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92, 7001-7005, and Chen et al., Bioorg. Mod. Chem. Lett. 1996, 6, 2163-2169.) Конкретным примером малого спироиндана является МК-0677 (Patchett et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92, 7001-7005).
По-видимому, действие упомянутых выше GHS's (как пептидных, так и не-пептидных) опосредуется определенным рецептором секретагогов гормона роста (рецептором GHS). (Howard et al., Science 1996, 273, 974-977, and Pong et al., Molecular Endocrinology 1996, 10, 57-61.) Данный рецептор присутствует в гипофизе и гипоталамусе различных видов млекопитающих (GHSR1a) и отличается от рецептора гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH). Рецептор GHS был также обнаружен в других областях центральной нервной системы и в периферических тканях, например, в надпочечной и щитовидной железах, сердце, легких, почках и скелетных мышцах. (Chen et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 2163-2169, Howard et al., Science 1996, 273, 974-977, Pong et al, Molecular Endocrinology 1996, 10, 57-61, Guan et al., Mol. Brain Res. 1997, 48, 23-29, and McKee et al., Genomics 1997, 46, 426-434.) Сообщалось о процессированном варианте GHSR1a (Howard et al., Science 1996, 273, 974-977).
Рецептор GHS представляет собой рецептор, связанный с G-белком. Эффекты активации рецепторов GHS включают в себя деполяризацию и ингибирование калиевых каналов, повышение межклеточных концентраций трифосфата инозитола (IP3) и кратковременное повышение концентрации внутриклеточного кальция. (Pong et al., Molecular Endocrinology 1996, 10, 57-61, Guan et al., Mol. Brain Res. 1997, 48, 23-29, and McKee et al., Genomics 1997, 46, 426-434.)
Грелин представляет собой существующий в природе пептид, который, предположительно, является эндогенным лигандом для рецептора GHS (Kojima et al., Nature 1999, 402, 656-660). Известны природные структуры грелинов нескольких видов млекопитающих и не млекопитающих животных. (Kaiya et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 40441-40448; International Patent Application PCT/JP00/04907 (WO 01/07475). Было найдено, что область ядра, имеющаяся в грелине, обеспечивает активность для рецептора GHS. Данная область ядра включает в себя четыре N-терминальные аминокислоты, где серин в 3 положении нормальным образом модифицирован н-октановой кислотой. Кроме того, было замечено, что, помимо ацилирования н-октановой кислотой, нативный грелин ацилируется н-декановой кислотой (Kaiya et al., J. Biol. Chem. 2001, 276, 40441-40448). Аналоги грелина имеют ряд различных терапевтических применений, а также применения в качестве инструментов исследований.
Сущность изобретения
2
В настоящем изобретении предоставлен состав фармацевтической композиции, содержащей памоатную соль пептида, действующего в качестве лиганда рецептора GHS. Особенно предпочтителен следующий пептид, называемый далее «Пример 1»: H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH, который является лигандом рецептора GHS, в случае которого после подкожного или внутримышечного введения субъекту данный пептид образует осадок при физиологическом значении рН, медленно растворяющийся и высвобождающийся в жидкость тела и кровоток, приводя, таким образом, к сниженным побочным действиям и повышенной эффективности.
Данное изобретение можно резюмировать в виде следующих, приведенных далее пунктов, а также формулой изобретения.
(1) В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию, имеющую вид прозрачного раствора, геля, или полутвердого вещества, или суспензии, содержащую пептид, который действует в качестве лиганда рецептора GHS, или его фармацевтическую соль, в которой данный пептид образует осадок после подкожного или внутримышечного введения субъекту.
(2) Фармацевтическая композиция по пункту 1, в которой указанный пептид в указанном прозрачном растворе осаждается in vivo, образуя in situ депо, которое медленно растворяется и высвобождается в жидкость тела и кровоток, и в которой указанный прозрачный раствор представляет собой исключительно водный раствор или водный раствор, содержащий органический компонент.
2
(3) Фармацевтическая композиция по пункту 1 или пункту 2, в которой указанный пептид представляет собой пример 1, то есть H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH.
(4) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой указанный пептид находится в виде памоатной соли.
(5) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая также органический компонент, повышающий растворимость указанного пептида в водном растворе или снижающий вязкость геля или полутвердого вещества.
(6) Фармацевтическая композиция по пункту 5, в которой указанный органический компонент представляет собой органический полимер, спирт, ДМСО, ДМФА или ДМА.
(7) Фармацевтическая композиция по пункту 6, в которой указанный органический полимер представляет собой ПЭГ.
(8) Фармацевтическая композиция по пункту 7, в которой указанный ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу от около 200 до около 10000.
(9) Фармацевтическая композиция по пункту 8, в которой указанный пептид растворяют в водном растворе ПЭГ200 или ПЭГ400, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ и воды составляет от около 1:99 до около 99:1.
(10) Фармацевтическая композиция по пункту 9, в которой указанный пептид растворяют в водном растворе ПЭГ200 или ПЭГ400, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ и воды составляет от около 1:9 до около 1:1.
(11) Фармацевтическая композиция по пункту 6, в которой указанный спирт представляет собой этанол или изопропиловый спирт.
(12) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой концентрация масса-к-объему указанного пептида находится в интервале от около 0,1 мг/мл до около 600 мг/мл.
(13) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой рН указанной композиции находится в интервале от около 3,0 до около 8,0.
2
(14) Фармацевтическая композиция по пункту 13, в которой указанную памоатную соль Н-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH растворяют в водном растворе ПЭГ400, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ400 и воды составляет примерно 1:1 и в котором концентрация масса-к-объему данного пептида составляет примерно 200 мг/мл.
2
(15) Фармацевтическая композиция по пункту 13, в которой указанную памоатную соль Н-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH растворяют в водном растворе ПЭГ200, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ200 и воды составляет примерно 1:1 и в котором концентрация масса-к-объему данного пептида составляет примерно 200 мг/мл.
2
(16) Фармацевтическая композиция по пункту 13, в которой указанную памоатную соль Н-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH растворяют в растворе ПЭГ400/PBS, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ400 и PBS составляет примерно 1:1 и в котором концентрация масса-к-объему данного пептида составляет примерно 300 мг/мл.
2
(17) Фармацевтическая композиция по пункту 13, в которой указанную памоатную соль Н-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH растворяют в солевом растворе ПЭГ400, в котором соотношение объем-к-объему ПЭГ400 и солевого раствора составляет примерно 1:1 и в котором концентрация масса-к-объему данного пептида составляет примерно 300 мг/мл.
(18) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая также консервант.
(19) Фармацевтическая композиция по пункту 18, в которой указанный консервант выбирают из группы, включающей м-крезол, фенол, бензиловый спирт и метилпарабен.
(20) Фармацевтическая композиция по пункту 19, в которой указанный консервант присутствует в концентрации, составляющей от около 0,01 мг/мл до около 100 мг/мл.
(21) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая также изотонический агент.
(22) Фармацевтическая композиция по пункту 21, в которой указанный изотонический агент присутствует в концентрации, составляющей от около 0,01 мг/мл до около 100 мг/мл.
(23) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая стабилизатор.
(24) Фармацевтическая композиция по пункту 23, в которой указанный стабилизатор выбирают из группы, включающей имидазол, аргинин и гистидин.
(25) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.
(26) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая хелатирующий агент.
(27) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая буферный раствор.
(28) Фармацевтическая композиция по пункту 27, в которой указанный буферный раствор выбирают из группы, включающей Tris, ацетат аммония, ацетат натрия, глицин, аспарагиновую кислоту и Bis-Tris.
(29) Фармацевтическая композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая двухвалентный металл.
(30) Фармацевтическая композиция по пункту 29, в которой указанный двухвалентный металл представляет собой цинк.
2
Несмотря на то что предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения направлен на пример 1, то есть Н-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH, который является лигандом рецептора GHS, настоящее изобретение никоим образом не ограничено примером 1. Пептиды настоящего изобретения включают в себя, например, все те пептиды, которые действуют в качестве лигандов рецептора GHS, как описано в собственной предыдущей международной публикации заявителей, опубликованной как WO2004/014415, содержание которой включено в настоящее описание ссылкой во всей ее полноте.
Для составления фармацевтических композиций настоящего изобретения можно также преимущественно использовать следующие соединения из данных публикаций:
2
Пример 2:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH;
2
Пример 3:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-Lys-NH;
2
Пример 4:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Orn-Lys-NH;
2
Пример 5:  H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 6:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-Lys-NH;
2
Пример 7:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-Lys-NH;
2
Пример 8:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH;
2
Пример 9:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH;
2
Пример 10:  H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 11:  H-Inp-D-Bpa-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 12:  H-Inp-D-2Nal-D-Bpa-Phe-Lys-NH;
2
Пример 13:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-NH;
2
Пример 14:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-NH;
2
Пример 15:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-NH;
2
Пример 16:  H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-NH;
2
Пример 17:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-NH;
2
Пример 18:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-NH;
2
Пример 19:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH;
2
Пример 20:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH;
2
Пример 21:  H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-NH;
2
Пример 22:  H-Inp-D-2Nal-D-Dip-Phe-NH;
2
Пример 23:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-NH;
2
Пример 24:  H-Inp-D-2Nal-D-Bal-Phe-NH;
2
Пример 25:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH;
2
Пример 26:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH;
2
Пример 27:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 28:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH;
2
Пример 29:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH;
2
Пример 30:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH;
2
Пример 31:  H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 32:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH;
2
Пример 33:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH;
2
Пример 34:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-NH;
2
Пример 35:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH;
2
Пример 36:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH;
2
Пример 37:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH;
2
Пример 38:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH;
2
Пример 39:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH;
2
Пример 40:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH;
2
Пример 41:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH;
2
Пример 42:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH;
2
Пример 43:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH;
2
Пример 44:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 45:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH;
2
Пример 46:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH;
2
Пример 47:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH;
2
Пример 48:  H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Apc-NH;
2
Пример 49:  H-Apc-D-1Nal-D-2Nal-Phe-Apc-NH;
2
Пример 50:  H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Lys-NH;
2
Пример 51:  H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Apc-NH;
2
Пример 52:  H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Apc-NH;
2
Пример 53:  H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Lys-NH;
2
Пример 54:  H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Lys-NH;
2
Пример 55:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH;
2
Пример 56:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-NH;
2
Пример 57:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-NH;
2
Пример 58:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-NH;
2
Пример 59:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-NH;
2
Пример 60:  H-Apc-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH;
2
Пример 61:  H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH;
2
Пример 62:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH;
2
Пример 63:  H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH;
2
Пример 64:  H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH;
2
Пример 65:  H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH;
Пример 66:  H-Inp-D-2Nal-D-Trp(Ψ)-Pim;
Пример 67:  H-Inp-D-1Nal-D-Trp(Ψ)-Pim;
Пример 68:  H-Inp-D-Bal-D-Trp(Ψ)-Pim;
Пример 69:  H-Aib-D-Ser(Bzl)-D-Trp(Ψ)-Pim; and
Пример 70:  H-Inp-D-Trp-D-2Nal(Ψ)-Pim.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А и фиг. 1В приведены графики фармакокинетических кривых (средних значений) в течение всего временного интервала, полученных после однократного подкожного введения крысам Sprague-Dawley при дозе 2,5 мг/кг массы тела, препарата, содержащего 200 мг/мл (20% масс./об.) памоатной соли примера 1, растворенной в растворителе, состоящем из 50% ПЭГ200 и 50% воды (об./об.), в нормальной шкале и логарифмической шкале соответственно.
На фиг. 2 приведен график сравнения различных составов примера 1, дозированных путем подкожных инъекций.
Подробное описание изобретения
Номенклатура, использованная для определения пептидов в настоящем изобретении, представляет собой номенклатуру, которую обычно используют в данной области, где аминогруппа в N-конце присутствует слева, а карбоксильная группа в С-конце присутствует справа. В случае, когда аминокислота имеет изомерные формы, представлена L-форма аминокислоты, если ясно не указано иначе. Если они не определены иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют те же значения, что и обычно понимаемые специалистом стандартной квалификации в области, к которой относится данное изобретение.
В настоящем описании использованы следующие сокращения:
Apc
аминопиперидинилкарбоновая кислота, то есть <img file="00000002.tif" he="24" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
Bal
3-бензотиенилаланин, то есть <img file="00000003.tif" he="27" wi="33" img-content="undefined" img-format="tif" />
Bip
4,4'-дифенилаланин, то есть <img file="00000004.tif" he="27" wi="44" img-content="undefined" img-format="tif" />
Bpa
4-бензоилфенилаланин, то есть <img file="00000005.tif" he="34" wi="48" img-content="undefined" img-format="tif" />
Dip
β,β-дифенилаланин, то есть <img file="00000006.tif" he="29" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
Inp
изонипекотиновая кислота, то есть <img file="00000007.tif" he="17" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
Lys или K
Лизин
1Nal
β-(1-нафтил)аланин,
2Nal
β-(2-нафтил)аланин,
Orn
Орнитин
3Pal
β-(3-пиридил)аланин, то есть <img file="00000008.tif" he="26" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
4Pal
β-(4-пиридил)аланин, то есть <img file="00000009.tif" he="25" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
Pff
пентафторфенилаланин, то есть <img file="00000010.tif" he="32" wi="30" img-content="undefined" img-format="tif" />
Phe или F
Фенилаланин
Pim
2'-(4-фенил)имидазолил, то есть <img file="00000011.tif" he="17" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
Ser или S
Серин
Taz
β-(4-тиазолил)аланин, то есть <img file="00000012.tif" he="31" wi="31" img-content="undefined" img-format="tif" />
2Thi
β-(2-тиенил)аланин, то есть <img file="00000013.tif" he="30" wi="32" img-content="undefined" img-format="tif" />
Thr или T
Треонин
Trp или W
Триптофан
Некоторые другие сокращения, использованные в настоящем описании, определены следующим образом:
BSA:
альбумин бычьей сыворотки
ДМФА:
Диметилформамид
ВЭЖХ:
высокоэффективная жидкостная хроматография
Памоат натрия:
динатриевая соль памовой кислоты, имеющая структуру <img file="00000014.tif" he="46" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
ЖХ-МС:
жидкостная хромато-масс-спектрометрия
LOQ:
предел определения
MRM:
многократный мониторинг реакции
ПЭГ:
поли(этиленгликоль), имеющий структуру <img file="00000015.tif" he="10" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />, в которой n является целым числом от 1 до 2000
ПЭГ200:
поли(этиленгликоль) со средней молекулярной массой примерно 200 Да
ПЭГ400:
поли(этиленгликоль) со средней молекулярной массой примерно 400 Да
Tris-HCl:
гидрохлорид трис(гидроксиметил)аминометана
3
Если это не очевидно другим образом, сокращения (например, Ala) аминокислот в данном описании обозначают структуру -NH-C(R)(R')-CO-, в которой каждый из R и R' независимо представляет собой водород, или боковую цепь аминокислоты (например, R=CH, а R'=H в случае Ala), или R и R' можно объединить с получением циклической системы.
Если в С-конце соединения данного изобретения присутствует не-аминокислотная имидазольная группа (например, определенный выше Pim), понятно, что данная имидазольная группа связана с соседней аминокислотой посредством псевдо-пептидной связи, где связь образуется между 2 положениями имидазольного цикла и альфа-углеродом аминокислоты. Например, в случае, когда соседняя аминокислота представляет собой D-триптофан (D-Trp), а имидазольная группа представляет собой Pim, С-терминальный конец данного пептида выглядел бы следующим образом:
Для ясности, в написанной формуле для подобного соединения наличие данной связи указывается одной буквой греческого алфавита «Ψ» в скобках. Например, написанная формула H-Inp-D-Trp-S-2Nal(Ψ)-Pim обозначает структуру:
Синтез
nd
.
Пептиды данного изобретения можно получить при использовании методик, описанных в WO2004/014415 на страницах 34-42, содержание которого включено в настоящее описание ссылкой во всей полноте. Кроме того, примеры методик биохимических синтезов, включающих в себя введение нуклеиновой кислоты в клетку и экспрессию нуклеиновых кислот, приведены у Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998, and Sambrook et al., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.Методики химического синтеза полипептидов также хорошо известны в данной области (Смотри, например, Vincent in Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Dekker, 1990). Например, пептиды данного изобретения можно получить стандартным твердофазным пептидным синтезом. (Смотри, например, Stewart, J.M., et al., Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co., 2d ed. 1984))Физические данные для иллюстративных пептидов приведены в таблице 1.
Таблица 1
Прим. №
Последовательность
Мол. масса (вычисл.)
Мол. масса (МС-ES)
Чистота (%)
1
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
790,99
790,4
97
2
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
787,96
787,4
96
3
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
787,96
787,4
99
4
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Orn-Lys-NH<sub>2</sub>
753,94
753,4
98
5
H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
813,01
812,4
99
6
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-Lys-NH<sub>2</sub>
831,03
830,4
98
7
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-Lys-NH<sub>2</sub>
876,92
876,3
98
8
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
793,00
792,4
98
9
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
793,99
793,4
97
10
H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
813,01
812,4
98
11
H-Inp-D-Bpa-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
841,02
840,4
95
12
H-Inp-D-2Nal-D-Bpa-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
852,04
851,3
99
13
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-NH<sub>2</sub>
659,79
659,3
99
14
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-NH<sub>2</sub>
659,79
659,3
98
15
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-NH<sub>2</sub>
659,79
659,3
98
16
H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
684,84
684,3
99
17
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-NH<sub>2</sub>
702,85
702,3
99
18
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-NH<sub>2</sub>
748,75
748,2
99
19
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
664,83
664,2
99
20
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
665,82
665,3
98
21
H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
684,84
684,3
98
22
H-Inp-D-2Nal-D-Dip-Phe-NH<sub>2</sub>
695,86
695,3
99
23
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
664,83
664,3
97
24
H-Inp-D-2Nal-D-Bal-Phe-NH<sub>2</sub>
675,85
675,2
99
25
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
787,96
787,5
97
26
H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
799,03
798,4
99
27
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
793,00
792,4
99
28
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
793,00
792,4
99
29
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
784,96
784,4
98
30
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
784,96
784,4
98
31
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
801,99
801,4
98
32
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
808,02
807,4
99
33
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
664,83
664,2
98
34
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
673,81
673,3
99
35
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
793,99
793,5
99
36
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
800,02
799,4
99
37
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
809,00
808,5
99
38
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
815,03
814,4
99
39
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
814,04
813,4
98
40
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
790,99
790,5
97
41
H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
797,01
796,4
97
42
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
806,00
805,5
97
43
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
812,03
811,4
98
44
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
801,99
801,5
98
45
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
808,02
807,5
99
46
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
799,97
799,5
98
47
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
806,00
805,5
98
48
H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
811,00
810,5
95
49
H-Apc-D-1Nal-D-2Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
811,00
810,5
96
50
H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
813,01
812,5
99
51
H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
817,02
816,5
96
52
H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
817,02
816,5
94
53
H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
819,04
818,5
99
54
H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
819,04
818,5
98
55
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
679,84
679,2
98
56
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
679,84
679,3
99
57
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
680,83
680,3
99
58
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
685,87
685,2
97
59
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
686,86
686,2
99
60
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
679,84
679,2
95
61
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
680,83
680,2
97
62
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
791,97
791,5
98
63
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
798,00
797,4
99
64
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
806,99
806,5
99
65
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
813,02
812,4
98
66
H-Inp-D-2Nal-D-Trp(Ψ)-Pim
610,77
611,4
99
67
H-Inp-D-1Nal-D-Trp(Ψ)-Pim
610,77
611,3
99
68
H-Inp-D-Bal-D-Trp(Ψ)-Pim
616,79
617,3
99
69
H-Aib-D-Ser(Bzl)-D-Trp(Ψ)-Pim
564,69
565,3
99
70
H-Inp-D-Trp-D-2Nal(Ψ)-Pim
610,77
611,4
99
Получение памоатной соли примера 1
-
Ацетатную соль примера 1 (200 мг, 0,22 ммоль) растворяли в 10 мл воды. Памоат натрия (190 мг, 0,44 ммоль) растворяли в 10 мл воды. Два раствора объединяли и хорошо перемешивали. Осадки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут, три раза промывали водой и сушили лиофилизацией.
Исследования in vitro
Соединения настоящего изобретения могут и были протестированы на предмет активности в качестве лигандов рецептора GHS согласно следующим методикам. Специалисту в данной области было бы понятно, что методики, аналогичные методикам, описанным здесь, можно использовать для анализа связывающей способности соединений данного изобретения с молекулами меланокортинового рецептора.
Анализы на связывание радиолигандов
-
2
125
125
125
125
Клеточные мембраны, использованные для анализа на связывание рецепторов in vitro, получали из трансгенных клеток СНО-К1, стабильно экспрессирующих человеческий рекомбинантный рецептор GHS. Клетки СНО-К1, стабильно экспрессирующие человеческий рекомбинантный рецептор GHS, гомогенизировали в 20 мл ледяного 50 мМ Tris-HCl в Polytron Brinkman (Westbury, NY, США) (настройка 6, 15 секунд). Гомогенаты дважды промывали центрифугированием (39000 g/10 мин), а конечные гранулы повторно суспендировали в 50 мМ Tris-HCl, содержащем 2,5 мМ MgCl и 0,1% BSA. Для анализа аликвоты (0,4 мл) инкубировали с 0,05 нМ (I)грелина (~2000 Ки/моль, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, США) в присутствии или в отсутствие 0,05 мл немеченых тестируемых соединений сравнения данного изобретения. После 60 мин инкубирования (4°С) связанный (I)грелин отделяли от свободного путем быстрого фильтрования через фильтры GF/C (Brandel, Gaithersburg, MD, США), которые предварительно вымачивали в смеси 0,5% полиэтиленимин/0,1% BSA. Затем фильтры три раза промывали аликвотами по 5 мл ледяного 50 мМ Tris-HCl и 0,1% альбумина бычьей сыворотки и производили подсчет захваченной на фильтрах связанной радиоактивности методом гамма-спектроскопии (Wallac LKB, Gaithersburg, MD, США). Удельное связывание определяли как общий связанный (I)грелин минус (I)грелин, связанный в присутствии 1000 нМ грелина (Bachem, Torrence, CA, США). Данные по удельному связыванию для иллюстративных пептидов приведены в таблице 2.
Таблица 2
Прим. №
Последовательность
hGHS Ки (нМ)
1
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
0,42
2
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
1,05
3
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
7,35
4
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Orn-Lys-NH<sub>2</sub>
243,00
5
H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
1,35
6
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-Lys-NH<sub>2</sub>
1,55
7
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-Lys-NH<sub>2</sub>
25,43
8
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
0,45
9
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
0,80
10
H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
46,78
11
H-Inp-D-Bpa-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
93,75
12
H-Inp-D-2Nal-D-Bpa-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
419,00
13
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-NH<sub>2</sub>
11,35
14
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-4Pal-NH<sub>2</sub>
113,50
15
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-3Pal-NH<sub>2</sub>
16,10
16
H-Inp-D-Bip-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
20,00
17
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Thr(Bzl)-NH<sub>2</sub>
4,46
18
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Pff-NH<sub>2</sub>
36,31
19
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
4,11
20
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
6,17
21
H-Inp-D-Dip-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
104,83
22
H-Inp-D-2Nal-D-Dip-Phe-NH<sub>2</sub>
104,80
23
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
2,30
24
H-Inp-D-2Nal-D-Bal-Phe-NH<sub>2</sub>
27,40
25
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-3Pal-Lys-NH<sub>2</sub>
1,58
26
H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
0,42
27
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
0,33
28
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
0,31
29
H-Inp-D-2Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
0,64
30
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
0,36
31
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
0,42
32
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
0,29
33
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
0,87
34
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
0,70
35
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
1,11
36
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
0,52
37
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
0,45
38
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Lys-NH<sub>2</sub>
0,50
39
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Lys-NH<sub>2</sub>
0,36
40
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
0,53
41
H-Inp-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
0,40
42
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
0,46
43
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-Apc-NH<sub>2</sub>
0,51
44
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
0,42
45
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
0,32
46
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
0,46
47
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
0,71
48
H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
1,99
49
H-Apc-D-1Nal-D-2Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
1,71
50
H-Apc-D-1Nal-D-1Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
1,32
51
H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
3,48
52
H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Apc-NH<sub>2</sub>
1,49
53
H-Apc-D-Bal-D-1Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
1,46
54
H-Apc-D-Bal-D-2Nal-Phe-Lys-NH<sub>2</sub>
0,68
55
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
0,73
56
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Phe-NH<sub>2</sub>
0,89
57
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
1,41
58
H-Apc-D-Bal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
0,98
59
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
1,62
60
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-2Thi-NH<sub>2</sub>
0,95
61
H-Apc-D-2Nal-D-Trp-Taz-NH<sub>2</sub>
2,11
62
H-Inp-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
1,19
63
H-Inp-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
0,83
64
H-Apc-D-1Nal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
0,98
65
H-Apc-D-Bal-D-Trp-Taz-Apc-NH<sub>2</sub>
1,13
66
H-Inp-D-2Nal-D-Trp(Ψ)-Pim
116,68
67
H-Inp-D-1Nal-D-Trp(Ψ)-Pim
50,55
68
H-Inp-D-Bal-D-Trp(Ψ)-Pim
48,73
69
H-Aib-D-Ser(Bzl)-D-Trp(Ψ)-Pim
753,33
70
H-Inp-D-Trp-D-2Nal(Ψ)-Pim
182,00
Исследование растворимости
-
Памоатную соль примера 1 (50 мг) взвешивали в пробирке для микроцентрифуги и добавляли после этого 125 мкл ПЭГ200 и 125 мкл воды. Смесь подвергали действию ультразвукового излучения для облегчения растворения. Получали прозрачный раствор.
Растворимость памоатной соли примера 1 определяли, смешивая пептид в воде или PBS, с последующим определением концентрации в надосадочной жидкости методом ВЭЖХ, и результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Растворимость
Вода, рН 7,0
PBS, рН 7,4
Памоатная соль примера 1
0,06 мг/мл
0,07 мг/мл
Памоатная соль примера 1 с Zn
0,14 мг/мл
0,08 мг/мл
Фармакокинетические исследования препаратов примера 1
-
«Препарат 1» примера 1 получали, растворяя памоатную соль примера 1 в растворе 50% ПЭГ200 и 50% воды (об./об.), при концентрации 200 мг/мл (20% масс./об.).
«Препарат 2» примера 1 получали, растворяя ацетатную соль примера 1 в смеси солевой раствор/2% инактивированная нагреванием мышиная сыворотка/5% ДМА/2% tween-80.
Дозировка
-
В случае препарата 1 крысам Sprague-Dawley вводили дозу путем подкожной инъекции при фиксированном количестве либо 5 мкл/крыса или 1,0 мг/крыса либо переменном количестве примерно 2,5 мг/кг массы тела.
В случае препарата 2 крысам Sprague-Dawley вводили дозу путем подкожной инъекции при переменном количестве 2,1 мг/кг массы тела.
Получение образцов
-
В случае препаратов 1 и 2, 50 мкл плазмы подкисляли 2,5 мкл муравьиной кислоты и осаждали 150 мкл ацетонитрила. Надосадочную жидкость собирали центрифугированием. 50 мкл данного препарата вводили для анализа методом ЖХ-МС/МС.
Анализ методом ЖХ-МС/МС
-
В случае препаратов 1 и 2 анализ методом ЖХ-МС/МС осуществляли с использованием масс-спектрометрической системы API4000, снабженной зондом Turbo Ionspray. Использовали MRM режим детектирования молекулярных ионов с ионной парой 396,5/112,3. Разделение методом ВЭЖХ проводили на 3 мк колонке Luna C8(2) 2×30 мм, эксплуатируемой от 0% В до 80% В в течение 10 минут при скорости потока 0,3 мл/минуту. Буферный раствор А представляет собой 1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде, а буферный раствор В представляет собой 1%-ный раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. LOQ составлял 5 нг/мл.
Результаты и краткое описание
-
Концентрацию в плазме примера 1 при дозе препарата 1 рассчитывали по ее стандартному калибровочному графику, и результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4
Время
Концентрация в плазме(нг/мл) примера 1, при дозировании с препаратом 1
Концентрация в плазме(нг/мл) примера 1, при дозировании с препаратом 2
5 минут
47,0
520
10 минут
62,4
N/A
15 минут
85,4
860
30 минут
162,5
990
1 час
312,5
820
2 часа
485,0
560
3 часа
N/A
480
4 часа
509,5
330
6 часов
N/A
130
8 часов
396,0
0
12 часов
334,0
0
16 часов
132,7
0
20 часов
121,0
0
24 часа
84,0
0
Графики зависимости фармакокинетических профилей препарата 1 от прохождения всего временного интервала представлены в нормальной шкале на фиг. 1А и в логарифмической шкале на фиг. 1В.
Некоторые фармакокинетические параметры примера 1, при дозировании с препаратом 1, приведены в таблице 5.
Таблица 5
Пример 1, при дозировании с препаратом 1
Пример 1, при дозировании с препаратом 2
Т<sub>макс </sub>(часов)
4
0,5
С<sub>макс</sub> (нг/мл)
543
990
AUC (нг-ч/мл)
7493
3239
CL (мл/час)
333
725
Т<sub>1/2 </sub>(часов)
6,7
1,8
макс
макс
1/2
Данные результаты свидетельствуют о том, что описанные здесь препараты примера 1 согласно настоящему изобретению обеспечивают приемлемые препараты длительного высвобождения с улучшенными фармакокинетическими параметрами и более плоскими профилями высвобождения, что может привести к ослабленным побочным эффектам и повышенной эффективности. Например, показано, что препарат 1 имеет профиль высвобождения, превышающий 24 часа после однократной подкожной инъекции, при значительно низкой С и значительно высоком Т. Кроме того, показано, что препарат памоатной соли примера 1, то есть препарат 1, обладает значительно повышенным Т по сравнению с препаратом ацетатной соли примера 1, то есть препаратом 2.
Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения будут ясны из предшествующего описания, и подразумевается, что они входят в данное изобретение, полностью описанное здесь и определенное в следующей формуле изобретения.