ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛА К PCSK-9, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ANTIBODIES TO PCSK-9, AND ITS USE

Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Китая № CN201710519829.6, поданной 30 июня 2017 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение принадлежит к области составления фармацевтических препаратов, в частности относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к PCSK-9 и его антигенсвязывающий фрагмент, и их применению в качестве лекарственного препарата.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Гиперхолестеринемия является заболеванием с аномальным метаболизмом липидов, характеризующимся повышенным уровнем холестерина в сыворотке крови. Ее основным проявлением является повышенный уровень холестерина в сыворотке крови, который вызывает агрегацию холестерина в кровеносных сосудах и, следовательно, приводит к возникновению атеросклероза. Многочисленные результаты клинических и экспериментальных исследований доказали, что аномальный метаболизм липидов тесно связан с возникновением и развитием ишемической болезни сердца. Следовательно, снижение концентрации холестерина в крови стало основным средством лечения и предупреждения атеросклероза.
С быстрым улучшением уровня жизни, дислипидемия также стала основным фактором, угрожающим жителям городов и деревень в Китае. В соответствии со статистикой 2012, приблизительно 40% смертей в год в Китае были связаны с сердечно-сосудистыми заболеваниями. В настоящее время смертность от дислипидемии среди взрослых в Китае составляет 18,6%, при этом согласно оценкам от дислипидемии страдают 160 миллионов человек. Значения заболеваемости для разных типов дислипидемии являются следующими: 2,9% для гиперхолестеринемии, 11,9% для гипертриглицеридемии, 7,4% для липопротеинемии, обусловленной нехваткой липопротеинов высокой плотности, и 3,9% для незначительно повышенного уровня холестерина в крови. В «Консенсусе китайских экспертов по предупреждению и борьбе с хроническими заболеваниями», достигнутом Отраслевым комитетом по профилактике и контролю хронических заболеваний, Комитет экспертов по профилактике и контролю заболеваний, Министерство здравоохранения, 2012, было указано, что в Китае 33 миллиона человек страдают от гиперхолестеринемии, однако с точки зрения локальных областей заболеваемость дислипидемией гораздо серьезнее, чем вышеприведенные данные.
В настоящее время лекарственные препараты, применяемые в клинических условиях для контроля уровней липидов, главным образом направлены на статины. Lipitor, являющийся наиболее широко применяемым и наиболее продаваемым лекарственным препаратом для снижения уровня холестерина, снижает уровень выработки холестерина путем блокирования эффекта фермента, обеспечивающего выработку холестерина в печени, и повышает уровень поглощения холестерина из крови печенью, тем самым снижая концентрацию холестерина в крови. Однако, для Lipitor характерны свои недостатки. Во-первых, из данных будет понятно, что Lipitor может снижать уровни липопротеинов низкой плотности на 30-40%, но у многих пациентов по-прежнему не удается достичь эффективного снижения уровней липидов в крови (концентрации липопротеинов низкой плотности < 50 мг/дл). Во-вторых, имеется отличие в проценте положительных клинических ответов на Lipitor среди пациентов разных рас. По этим причинам пациентам по-прежнему нужно более эффективное лекарство для снижения уровня липидов в крови.
Как аутосомно-доминантное моногенное наследственное заболевание, наследственная гиперхолестеринемия (FM) клинически характеризуется значительным повышением уровня общего холестерина (TC) и холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-c) в крови, наличием ксантелазм, роговичной дуги и развитием преждевременного сердечно-сосудистого заболевания. Мутации гена рецептора липопротеинов низкой плотности (рецептор LDL, LDLR) вызывают дефицит LDLR или его отсутствие. Следовательно, LDL-c не транспортируется в печень для деградации, что приводит к повышению уровня LDL-c в крови. В настоящее время определено, что с возникновением FM коррелируют три гена: ген LDLR, ген аполипопротеина B100 и ген пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9).
Как пропротеиновая конвертаза, пропротеиновая конвертаза субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9), принадлежит к подсемейству протеазы K в секреторном семействе Bacillus subtilis. Кодируемый белок синтезируется в виде растворимого профермента и подвергается внутримолекулярному процессингу в эндоплазматическом ретикулуме путем автокатализа. В соответствии с результатами экспериментов, PCSK9 может способствовать деградации рецептора LDL и таким образом повышать содержание холестерина LDL в плазме крови. Рецептор LDL опосредует процесс эндоцитоза LDL в печени, который представляет собой основной путь удаления LDL из циркуляционной системы. Было обнаружено, что мутации гена PCSK9 определили у 12,5% пациентов с гиперхолестеринемией (ADH). Существуют различные типы мутаций PCSK9. В соответствии с разными воздействиями мутаций на уровень LDL-c, регулируемый посредством PCSK9, мутации можно разделить на два типа: тип с потерей функции и тип с приобретением функции. Среди них мутации с потерей функции связаны с низким уровнем холестерина в крови и предотвращают возникновение атеросклеротической болезни сердца. Частота возникновения мутаций PCSK9, связанных с низким уровнем холестерина, выше в африканских популяциях, чем в других расах. Мутации PCSK9, являющиеся мутациями с приобретением функции, обеспечивают повышение уровня холестерина в плазме крови путем повышения функции PCSK9 и снижения экспрессии LDLR, что может приводить к тяжелой гиперхолестеринемии и преждевременной ишемической атеросклеротической болезни сердца. В настоящее время обнаружено, что мутации PCSK9, являющиеся мутациями с приобретением функции, включают D374Y, S127R, F216L, N157K, R306S и т.д. По сравнению с PCSK9 дикого типа, у мутантов с D374Y содержание LDLR на клеточной поверхности снижалось на 36%, а у мутантов с S127R - снижалось на 10%.
Однако, антитела становятся нестабильными из-за их больших молекулярных масс, сложных структур и подверженности деградации, полимеризации или нежелательной химической модификации. Для создания антител, которые пригодны для введения, сохраняют свою стабильность во время хранения и последующего применения и оказывают лучшие эффекты, особенно важным является изучение стабильных составов на основе антител.
В настоящее время несколько компаний занимаются разработкой антител к PCSK-9 и фармацевтических составов, таких как составы на основе CN 103717237 A, CN 104364266 A и т.д. Однако, для новых антител к PCSK-9 по-прежнему остается необходимым разработать фармацевтическую композицию (состав) содержащую антитело к PCSK-9, которое является более подходящим для введения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к PCSK9 или его антигенсвязывающий фрагмент, и буфер, где буфер предпочтительно представляет собой гистидиновый буфер или сукцинатный буфер, или фосфатный буфер, или цитратный буфер, более предпочтительно гистидиновый буфер, наиболее предпочтительно буфер на основе гистидина гидрохлорида.
В альтернативном варианте осуществления, где концентрация антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 1 мг/мл до 150 мг/мл, предпочтительно от 30 мг/мл до 100 мг/мл, более предпочтительно от 50 мг/мл до 60 мг/мл, наиболее предпочтительно 50 мг/мл. Неограничивающие примеры таких концентраций антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента включают 45 мг/мл, 46 мг/мл, 47 мг/мл, 48 мг/мл, 49 мг/мл, 50 мг/мл, 51 мг/мл, 52 мг/мл, 53 мг/мл, 54 мг/мл, 55 мг/мл, 56 мг/мл, 57 мг/мл, 58 мг/мл, 59 мг/мл или 60 мг/мл.
В альтернативном варианте осуществления концентрация буфера составляет от приблизительно 5 мМ до 50 мМ, предпочтительно от 5 мМ до 30 мМ, неограничивающие примеры концентраций буфера включают 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, 22 мМ, 24 мМ, 26 мМ, 28 мМ и 30 мМ, более предпочтительно от 10 мМ до 15 мМ, наиболее предпочтительно 10 мМ.
В альтернативном варианте осуществления значение pH буфера в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 5,5 до 6,5, предпочтительно от приблизительно 6,0 до 6,5, неограничивающие примеры значения pH буфера включают приблизительно 6,0, приблизительно 6,1, приблизительно 6,2, приблизительно 6,3, приблизительно 6,4 или приблизительно 6,5.
2
Более того, в альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит сахарид. «Сахарид» в данном документе включает общепринятое соединение (CHO)n и его производные, в том числе моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахарные спирты, восстанавливающие сахара, невосстанавливающие сахара и т.д. Примеры сахаридов в данном документе включают глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, декстран, глицерин, эритрит, глицерин, арабит, силит, сорбит, маннит, мелибиозу, мелезитозу, рафинозу, маннотриозу, стахиозу, мальтозу, лактулозу, мальтулозу, сорбит, мальтит, лактит, изо-мальтулозу и т.д. Предпочтительным сахаридом в данном документе является невосстанавливающий дисахарид, более предпочтительно трегалоза или сахароза.
В альтернативном варианте осуществления, где концентрация сахарида в фармацевтическом препарате составляет от приблизительно 10 мг/мл до 75 мг/мл, предпочтительно от 20 мг/мл до 60 мг/мл, более предпочтительно от приблизительно 20 мг/мл до 40 мг/мл, наиболее предпочтительно 25 мг/мл. Неограничивающие примеры концентрации сахарида включают 20 мг/мл, 21 мг/мл, 22 мг/мл, 23 мг/мл, 24 мг/мл, 25 мг/мл, 26 мг/мл, 27 мг/мл, 28 мг/мл, 29 мг/мл, 30 мг/мл, 31 мг/мл, 32 мг/мл, 33 мг/мл, 34 мг/мл, 35 мг/мл, 36 мг/мл, 37 мг/мл, 38 мг/мл, 39 мг/мл или 40 мг/мл.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В данном документе «поверхностно-активное вещество» может быть выбрано из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 80, полоксамера, Triton, додецилсульфата натрия, лаурилсульфата натрия, октилгликозида натрия, лаурилсульфобетаина, миристилсульфобетаина, линолеилсульфобетаина, стеарилсульфобетаина, лаурилсаркозина, миристилсаркозина, линолеилсаркозина, стеарилсаркозина, линолеилбетаина, миристилбетаина, цетилбетаина, лаурамидопропилбетаина, кокамидопропилбетаина, линолеамидопропилбетаина, миристамидопропилбетаина, пальмидопропилбетаина, изостеарамидопропилбетаина, миристамидопропилдиметиламина, пальмидопропилдиметиламина, изостеарамидопропилдиметиламина, метил-кокоил таурата натрия, метил-олеилтаурата натрия, полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля и сополимеров этилена и пропиленгликоля и т.д. Предпочтительным поверхностно-активным веществом в данном документе является полисорбат 20 или полисорбат 80, более предпочтительно полисорбат 80.
В альтернативном варианте осуществления концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,05 мг/мл до 1,0 мг/мл, предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,4 мг/мл, неограничивающие примеры концентрации поверхностно-активного вещества включают 0,1 мг/мл, 0,15 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,35 мг/мл, 0,4 мг/мл, еще более предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,3 мг/мл, более предпочтительно от 0,1 мг/мл до 0,2 мг/мл, наиболее предпочтительно 0,2 мг/мл.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 5-30 мМ гистидинового буфера, pH приблизительно 5,5-6,5, более предпочтительно приблизительно 6,0-6,5;
(c) 10-75 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,05-0,6 мг/мл полисорбата 80.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 5-20 мМ гистидинового буфера;
(c) 25 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,1-0,3 мг/мл полисорбата 80.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента и
(b) 5-30 мМ гистидинового буфера; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 1-150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 5-30 мМ гистидинового буфера;
(c) 10-75 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,05-0,6 мг/мл полисорбата 80; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, а гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента,
(b) 5-20 мМ гистидинового буфера,
(c) 25 мг/мл сахарозы и
(d) 0,1-0,3 мг/мл полисорбата 80; и pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, и гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 10 мМ гистидинового буфера;
(c) 25 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80, и pH фармацевтической композиции составляет 6,3±0,1, и гистидиновый буфер предпочтительно представляет собой буфер на основе гистидина гидрохлорида.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида;
(c) 75 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,6 мг/мл полисорбата 80; конечное значение pH фармацевтической композиции составляет 6,3.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(c) 25 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5; и
(c) 70 мг/мл сахарозы.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 150 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5; и
(c) 70 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(c) 25 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.
В альтернативном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(a) 50 мг/мл антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;
(c) 25 мг/мл сахарозы; и
(d) 0,2 мг/мл полисорбата 80.
В альтернативном варианте осуществления антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержат HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности под SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, и
LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности под SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17 соответственно.
В альтернативном варианте осуществления антитело к PCSK-9 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции выбраны из группы, состоящей из антитела мыши, химерного антитела и гуманизированного антитела, предпочтительным является гуманизированное антитело.
В альтернативном варианте осуществления легкая цепь антитела к PCSK-9 в фармацевтической композиции характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи антитела h001-4-YTE, при этом тяжелая цепь антитела к PCSK-9 в фармацевтической композиции характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела h001-4-YTE. Легкая цепь антитела h001-4-YTE имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30, а тяжелая цепь антитела h001-4-YTE имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, включающий стадию замены исходного раствора для антитела к PCSK-9 или его антигенсвязывающего фрагмента буфером. Предпочтительно буфер представлен гистидиновым буфером, более предпочтительно буфером на основе гистидина гидрохлорида. Концентрация буфера предпочтительно составляет от приблизительно 5 мМ до 30 мМ, и неограничивающие примеры концентрации буфера включают 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ, 22 мМ, 24 мМ, 26 мМ, 28 мМ и 30 мМ, более предпочтительно от 10 мМ до 15 мМ; при этом pH буфера составляет от приблизительно 6,0 до 6,5, неограничивающие примеры включают 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 и 6,5.
Кроме того, способ получения фармацевтической композиции, описанной выше, дополнительно включает стадию добавления сахарозы и полисорбата 80 к раствору, полученному на стадии замены, а затем доведения до конечного объема буфером, где концентрация буфера составляет предпочтительно от 10 мМ до 20 мМ, неограничивающие примеры концентрации буфера включают 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ и 20 мМ; при этом pH буфера составляет приблизительно 6,0-6,5, неограничивающие примеры pH буфера включают 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 и 6,5.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, который включает стадию лиофилизации фармацевтической композиции, описанной выше.
В альтернативном варианте осуществления способ получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, включает последовательные стадии предварительного замораживания, первичного высушивания и вторичного высушивания, при этом предварительное замораживание представляет собой замораживание от 5°C до -40°C - -50°C, наиболее предпочтительно -45°C, без требования в отношении поддержания вакуума. Температура первичного высушивания составляет от -14°C до 0°C, наиболее предпочтительно -5°C; давление вакуума составляет от 0,1 мБар до 0,5 мБар, наиболее предпочтительно 0,3 мБар. Температура вторичного высушивания составляет от 20°C до 30°C, предпочтительно 25°C, давление вакуума составляет от 0,1 мБар 0,5 мБар, наиболее предпочтительно 0,3 мБар, и давление вакуума снижают до значения от 0,005 мБар до 0,02 мБар, наиболее предпочтительно 0,01 мБар.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает лиофилизированный состав, содержащий антитело к PCSK-9, полученный способом получения лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK9, описанное выше.
В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав стабилен при 2-8°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный состав стабилен при 40°C в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, который включает стадию восстановления лиофилизированной композиции, описанной выше, при этом растворитель для восстановления выбран без ограничения из воды для инъекций, физиологического раствора или раствора глюкозы.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает раствор, восстановленный из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, полученный способом получения раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, содержащего антитело к PCSK-9, описанное выше.
В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, содержит этот компонент, в концентрации, в 2-5 раз превышающей концентрацию этого компонента в фармацевтической композиции до лиофилизации, предпочтительно в 3 раза.
В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор содержит антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, где концентрация антитела к PCSK9 или антигенсвязывающего фрагмента составляет от приблизительно 120 мг/мл до 200 мг/мл, наиболее предпочтительно 150 мг/мл.
В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, pH фармацевтической композиции составляет приблизительно 6,0-6,5, предпочтительно 6,4. Значение pH восстановленного раствора зависит от значения pH буфера, применяемого при составлении лекарственного средства. Если pH лекарственного средства составляет 6,0, конечное значение pH восстановленного раствора составляет 6,3±1.
В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация буфера составляет от приблизительно 15 мМ до 45 мМ, предпочтительно 30 мМ.
В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, дополнительно содержит дисахарид, где дисахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из трегалозы и сахарозы, наиболее предпочтительно сахарозу.
В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация дисахарида составляет от приблизительно 55 мг/мл до95 мг/мл, предпочтительно приблизительно 75 мг/мл.
В альтернативном варианте осуществления восстановленный раствор, содержащий антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество представляет собой предпочтительно полисорбат, более предпочтительно полисорбат 80.
В альтернативном варианте осуществления в случае восстановленного раствора, содержащего антитело к PCSK-9 по настоящему изобретению, концентрация поверхностно-активного вещества составляет от приблизительно 0,4 мг/мл до 0,8 мг/мл, предпочтительно 0,6 мг/мл.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает продукт или набор, содержащий контейнер, содержащий любую из стабильных фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления это стеклянный флакон.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение фармацевтической композиции, или лиофилизированного состава, или раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, описанных выше, при составлении лекарственного препарата для лечения опосредованного PCSK9 заболевания или нарушения, где заболевание или нарушение предпочтительно представляет собой заболевание, связанное с холестерином; более предпочтительно выбрано из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, заболевания сердца, метаболического синдрома, диабета, ишемической болезни сердца, апоплексии, сердечно-сосудистого заболевания, болезни Альцгеймера и общей дислипидемии; наиболее предпочтительно гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, CVD или ишемической болезни сердца.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения и предупреждения связанных с PCSK-9 заболевания или нарушения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, или лиофилизированного состава, или раствора, восстановленного из лиофилизированного состава, описанных выше, где заболевание или нарушение предпочтительно представляет собой заболевание, связанное с холестерином; более предпочтительно выбрано из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, заболевания сердца, метаболического синдрома, диабета, ишемической болезни сердца, апоплексии, сердечно-сосудистого заболевания, болезни Альцгеймера и общей дислипидемии; наиболее предпочтительно гиперхолестеринемии, дислипидемии, атеросклероза, CVD или ишемической болезни сердца.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает продукт, содержащий контейнер, содержащий фармацевтическую композицию, или лиофилизированный состав, или раствор, восстановленный из лиофилизированного состава, описанные выше.
Следует понимать, что одно, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, могут быть объединены с образованием других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидными для специалиста в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны в подробном описании, приведенном ниже.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Терминология
Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, некоторые технические и научные термины специально определены ниже. Кроме терминов, конкретно определенных в других местах в данном документе, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, должны рассматриваться как имеющие то же значение, которое обычно известно специалисту в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Применяемый в данном документе термин «буфер» относится к буферному раствору, который противостоит изменениям рН благодаря действию его компонентов, являющихся кислотами и сопряженными с ними основаниями. Примеры буферов, которые контролируют рН в подходящем диапазоне, включают ацетатный буфер, сукцинатный буфер, глюконатный буфер, гистидиновый буфер, оксалатный буфер, лактатный буфер, фосфатный буфер, цитратный буфер, тартратный буфер, фумаратный буфер, глицилглициновый буфер и другие буферы на основе органических кислот.
«Гистидиновый буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры гистидиновых буферов включают буфер на основе гистидина гидрохлорида, буфер на основе гистидина ацетата, буфер на основе гистидина фосфата и буфер на основе гистидина сульфата и т.д., предпочтительно буфер на основе гистидина гидрохлорида. Буфер на основе гистидина гидрохлорида получают с помощью гистидина и хлористоводородной кислоты или гистидина и гистидина гидрохлорида.
«Цитратный буфер» представляет собой буфер, который содержит цитрат-ионы. Примеры цитратного буфера включают буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, буфер на основе лимонной кислоты и цитрата калия, буфер на основе лимонной кислоты и цитрата кальция и буфер на основе лимонной кислоты и цитрата магния и т.д. Предпочтительным цитратным буфером является буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия.
«Сукцинатный буфер» представляет собой буфер, который содержит сукцинат-ионы. Примеры сукцинатного буфера включают буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината калия, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината кальция и т.д. Предпочтительным сукцинатным буфером является буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия.
«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, который содержит фосфат-ионы. Примеры раствора фосфатного буфера включают буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата натрия и буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата калия, и т.д. Предпочтительным фосфатным буфером является буфер на основе динатрия гидрофосфата и дигидрофосфата натрия.
«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, который содержит ацетат-ионы. Примеры ацетатного буфера включают буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, буфер на основе уксусной кислоты и гистидина, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата калия, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата кальция и буфер на основе уксусной кислоты и ацетата магния и т.д. Предпочтительным ацетатным буфером является буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия.
«Фармацевтическая композиция» относится к фармацевтической композиции, содержащей смесь одного или более соединений в соответствии с настоящим изобретением или их физиологически/фармацевтически приемлемой соли или продукта с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Фармацевтическая композиция предназначена для поддержания стабильности активного ингредиента, представляющего собой антитело, и обеспечения введения в организм за счет способствования поглощению активного ингредиента и тем самым осуществлению биологического эффекта. Применяемые в данном документе термины «фармацевтическая композиция» и «состав» не являются взаимоисключающими.
«Лиофилизированный состав» означает состав или фармацевтическую композицию, полученные с помощью стадии вакуумного сублимационного высушивания из фармацевтической композиции в форме жидкости или раствора или состава в виде жидкости или раствора.
Лиофилизация настоящего изобретения включает предварительное замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание. Целью предварительного замораживания является замораживание продукта с получением кристаллического твердого вещества. Температура предварительного замораживания и скорость предварительного замораживания являются двумя важными технологическими параметрами. В настоящем изобретении температуру предварительного замораживания устанавливают на -45°C, а скорость предварительного замораживания устанавливают на 1°C/мин. Первичное высушивание также известно как сублимация, что является основной стадией лиофилизации. Ее целью является поддержание формы продукта при удалении льда из продукта, и сведение к минимуму повреждения продукта. Если температура и степень вакуумирования первого высушивания не являются подходящими, это приведет к разрушению продукта. Более высокая температура и степень вакуумирования увеличивают эффективность лиофилизации, но в то же время повышают риск разрушения продукта. Температура первичного высушивания по настоящему изобретению может являться стандартной температурой в данной области техники, например от -27°C до 0°C, предпочтительно от -14°C до -5°C. Вторичное высушивание также известно как десорбция, которая является основной стадией для удаления связанной воды из продукта путем создания глубокого вакуума (0,01 мБар) и повышения температуры (20-40°C). Поскольку большинство биологических продуктов являются чувствительными к температуре, температуру вторичного высушивания устанавливают на уровне нижней точки температурного диапазона, т.е. 25°C. Время лиофилизации зависит от морозильной камеры, дозы лиофилизированного состава и контейнера с лиофилизированной композицией. Такая регулировка времени лиофилизации хорошо известна специалистам в данной области техники.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению способна обеспечивать стабильный эффект: антитело в составе фармацевтической композиции по сути сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении, предпочтительно, фармацевтическая композиция по сути сохраняет свою физическую стабильность, химическую стабильность и биологическую активность при хранении. Время хранения в большинстве случаев выбирают на основе предварительно определенного срока годности фармацевтической композиции. В настоящее время существует ряд аналитических методик измерения стабильности белков, с помощью которых измеряют стабильность после хранения в течение выбранного периода времени при выбранной температуре.
«Стабильный» фармацевтический состав на основе антитела представляет собой фармацевтический состав на основе антитела, в котором не наблюдается каких-либо значительных изменений при хранении при температуре охлаждения (2-8°C) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно 6 месяцев, и более предпочтительно 1 года, и даже более предпочтительно вплоть до 2 лет. Дополнительно, «стабильный» жидкий состав предусматривает таковой, проявляющий требуемые свойства после хранения в течение периодов, включающих 1 месяц, 3 месяца или 6 месяцев, при значениях температуры, включающих 25°C и 40°C. Типичными критериями приемлемости при определении стабильности являются следующие: деградация мономера антитела, измеренная посредством SEC-HPLC, как правило составляет не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%. Фармацевтический состав на основе антитела при визуальном анализе является бесцветным или от прозрачного до слегка опалесцирующего. Концентрация, pH и осмоляльность состава характеризуются погрешностью не более +/-10%. Как правило, наблюдается отсечение, составляющее не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%. Как правило, агрегации подвергается не более чем приблизительно 10%, предпочтительно приблизительно 5%.
Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не проявляет значительного повышения агрегации, осаждения и/или денатурации при визуальной оценке цвета и/или прозрачности, или при измерении с помощью светорассеяния в УФ диапазоне, эксклюзионной хроматографии (SEC) и динамического светорассеяния (DLS). Изменения конформации белка можно оценить с помощью флуоресцентной спектроскопии, с помощью которой определяют третичную структуру белка, и с помощью FTIR-спектроскопии, с помощью которой определяет вторичную структуру белка.
Антитело «сохраняет химическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не проявляет значительных химических изменений. Химическую стабильность можно оценить путем выявления и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы деградации, которые часто изменяют химическую структуру белка, включают гидролиз или отсечение (оцениваемые такими способами, как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE и т.д.), окисление (оцениваемое такими способами, как пептидное картирование в сочетании с масс-спектроскопией или MALDI/TOF/MS и т.д.), дезамидирование (оцениваемое такими способами, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, пептидное картирование, измерение содержания изоаспарагиновой кислоты и т.д.) и изомеризацию (оцениваемую с помощью измерения содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидного картирования, и т.д.).
Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом составе, если значение биологической активности антитела в рассматриваемый момент времени находится в предварительно определенном диапазоне значений биологической активности, демонстрируемом на момент получения фармацевтического состава. Биологическая активность антитела может быть определена, например, с помощью анализа связывания антигена.
Применяемый в данном документе однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) p. 3558.
Применяемый в данном документе термин «антитело» относится к иммуноглобулину, структуре, состоящей из четырех пептидных цепей, в которой две идентичные тяжелые цепи соединены дисульфидными связями с двумя идентичными легкими цепями.
В настоящем изобретении легкая цепь антитела, упомянутая в данном документе, также содержит константную область легкой цепи, которая предусматривает κ-, λ-цепь человека или мыши или их вариант.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела, упомянутая в данном документе, также содержит константную область тяжелой цепи, которая предусматривает IgG1, 2, 3, 4 человека или мыши или их вариант.
Вариабельная область (Fv-область) содержит приблизительно 110 аминокислот вблизи N-конца тяжелой и легкой цепи антитела. Константная область (C-область), содержащая оставшиеся аминокислоты вблизи С-конца антитела, является относительно стабильной. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также называют областями, определяющими комплементарность (CDR). Каждая из вариабельных областей легкой цепи (LCVR) и вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех CDR-областей и четырех FR-областей, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи обозначаются как LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR тяжелой цепи обозначаются как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и расположение аминокислотных остатков CDR в LCVR- и HCVR-областях антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствуют известным критериям нумерации по Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) или соответствуют критериям нумерации по Kabat и Chothia (HCDR1).
Антитело по настоящему изобретению включает антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело.
Термин «антитело мыши» в настоящем изобретении относится к моноклональному антителу к PCSK9 человека, полученному в соответствии со знаниями и навыками в уровне техники. При получении подвергающемуся испытанию объекту инъецируют антиген PCSK9, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, которое обладает необходимыми последовательностями или функциональными характеристиками.
Термин «химерное антитело» обозначает антитело, образованное путем слияния вариабельной области антитела мыши с константной областью антитела человека, что может обеспечивать ослабление иммунного ответа, вызываемого антителами мыши. Чтобы сконструировать химерное антитело, сначала создают гибридому, которая секретирует специфические моноклональные антитела мыши, затем ген вариабельной области клонируют из клеток гибридомы мыши. Затем при необходимости клонируют ген константной области антитела человека. Ген вариабельной области мыши лигируют с геном константной области человека с образованием химерного гена, который затем встраивают в вектор для экспрессии человеческих последовательностей, и, наконец, молекулу химерного антитела экспрессируют в эукариотической или прокариотической промышленной системе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела к PCSK9 дополнительно содержит константные области легкой цепи из κ-, λ- цепей человека или их варианта. Тяжелая цепь химерного антитела к PCSK9 дополнительно содержит константные области тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариантов. Константная область антитела человека может быть выбрана из константной области тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариантов, при этом предпочтительно предусматривается константная область тяжелой цепи из IgG2, или IgG4 человека, или IgG4 человека, лишенная ADCC-токсичности (антителозависимой клеточной цитотоксичности) в результате мутации аминокислоты.
Термин «гуманизированное антитело», также известный как CDR-привитое антитело, относится к антителу, полученному путем прививания последовательностей CDR мыши в каркас вариабельной области антитела человека, а именно к антителу, полученному из разных типов каркасных последовательностей антител человека. Гуманизированное антитело позволяет преодолеть недостаток, состоящий в сильном опосредованном антителами ответе, индуцируемом химерным антителом, которое несет большое количество компонентов белка мыши. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступной базы данных ДНК, охватывающей последовательности генов антител зародышевой линии или опубликованные ссылки. Например, последовательности ДНК генов тяжелой и легкой цепи зародышевой линии человека можно найти в базе данных последовательностей генов зародышевой линии человека «VBase» (доступной на сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также в Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Чтобы избежать снижения активности при уменьшении иммуногенности, каркасные последовательности в вариабельной области антитела человека подвергают минимальным обратным мутациям для поддержания активности. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению также включает гуманизированное антитело, для которого созревание аффинности CDR обеспечивали с применением фагового дисплея.
«Антитело к PCSK-9» представляет собой антитело, которое специфически связывается с PCSK-9, в том числе без ограничения серию h001 гуманизированных антител к PCSK-9 из PCT/CN2016/111053. При этом в случае серии h001 гуманизированных антител к PCSK-9 скрининг проводили на мышах, иммунизированных с помощью PCSK-9 человека, и осуществляли преобразование путем гуманизации.
«Антигенсвязывающий фрагмент» в настоящем изобретении относится к Fab-фрагменту, Fab'-фрагменту или F(ab')2-фрагменту, обладающему антигенсвязывающей активностью, а также scFv-фрагменту, связывающимся с PCSK9 человека, и другим фрагментами, способными к связыванию с PCSK9, которые образованы VH- и VL-областями антител, связывающих PCSK9; он содержит одну или более CDR-областей, выбранных из группы, состоящей из антител под SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 17, описанных в настоящем изобретении. Не имея константной области, Fv-фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, что представляет собой минимальный фрагмент антитела, обладающий всеми антигенсвязывающими сайтами. Обычно Fv антитела дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно к образованию структуры, необходимой для связывания антигена. Также, разные линкеры могут применяться для соединения вариабельных областей из двух антител с образованием полипептидной цепи, называемой одноцепочечным антителом или одноцепочечным Fv (scFv). Термин «связывающийся с PCSK-9» в данном изобретении означает способность к взаимодействию с PCSK-9 человека. Термин «антигенсвязывающие сайты» в настоящем изобретении относится к непрерывным или прерывающимся, трехмерным сайтам на антигене, распознаваемым антителом или антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению.
Способы получения и осуществления очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны из уровня техники и могут быть найдены, например, в Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, разделы 5-8 и 15. Антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению подвергают конструированию методами генной инженерии с введением одной или более каркасных областей (FR) человека в CDR-область, полученную от организма, отличного от человека. Последовательности FR зародышевой линии человека можно получить из базы данных генов вариабельных областей зародышевой линии человека ImMunoGeneTics (IMGT) с помощью программного обеспечения MOE от IMGT на их веб-сайте или из The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351.
Сконструированное антитело или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены и очищены с применением общепринятых способов. Например, последовательности cDNA, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь, могут быть клонированы в вектор экспрессии GS и подвергнуты рекомбинации. Вектор экспрессии рекомбинантного иммуноглобулина может быть стабильно трансфицирован в клетку линии CHO. В качестве более рекомендованного способа, хорошо известного из уровня техники, экспрессирующие системы на основе клеток млекопитающих обеспечивают гликозилирование антител, обычно на высококонсервативном N-конце в Fc-области. Могут быть получены клоны, стабильно экспрессирующие антитела, специфически связывающиеся с PCSK-9. Положительные клоны могут быть размножены в бессывороточной культуральной среде для продукции антител в биореакторах. Культуральную среду, в которую было секретировано антитело, можно подвергать очистке с помощью общепринятых методик. Например, очистку можно осуществлять с помощью FF-колонки, заполненной сефарозой с белком A или G, которая была уравновешена соответствующим буфером. Колонку промывают для удаления компонентов с неспецифическим связыванием. Связанное антитело элюируют градиентом pH и затем объединяют, и фрагменты антитела определяют с помощью SDS-PAGE. Антитело может быть отфильтровано и концентрировано с применением общепринятых методик. Растворимый агрегат и мультимеры могут быть эффективно удалены с помощью общепринятых методик, в том числе эксклюзионной или ионообменной хроматографии. Полученный продукт может быть подвергнут немедленному замораживанию, например при -70°C, или может быть лиофилизирован.
th
«Консервативные модификации» или «консервативная замена или замещение» относятся к замещению аминокислот в белке на другие аминокислоты, имеющие аналогичные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость каркаса и т.д.), вследствие чего изменения часто могут быть выполнены без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, замещение одной аминокислоты в несущественных областях полипептида по сути не изменяет биологическую активность полипептида (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4 Ed.)). Кроме того, замещение структурно или функционально аналогичных аминокислот с меньшей вероятностью нарушают биологическую активность.
«Идентичность» аминокислот относится к сходству последовательностей между двумя белковыми последовательностями или между двумя полипептидными последовательностями. Если положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает один и тот же аминокислотный остаток, тогда молекулы являются одинаковыми в этом положении. Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, которые описаны в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 и Altschul et al,  (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST доступно в Национальном центре биотехнологической информации (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
«Введение» и «обработка», в случае применения по отношению к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относится к приведению в контакт экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции с организмом животного, человека, субъекта, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Введение» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где жидкость находится в контакте с клетками. «Введение» и «обработка» также означают обработку in vitro и ex vivo, например, клетки, реагентом, диагностическим средством, связывающим соединением или другой клеткой. «Лечение» при применении к человеку, ветеринарному или исследовательскому субъекту, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим путям применения.
«Лечить» означает осуществлять введение терапевтического средства, такого как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутренне или наружно пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Как правило, терапевтическое средство вводят в количестве, эффективном для ослабления одного или более симптомов заболевания у подвергаемых лечению субъекта или популяции, с тем, чтобы вызвать регрессию или подавить прогрессирование такого(-их) симптома(-ов) до любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для ослабления любого конкретного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством») может варьировать в зависимости от множества факторов, таких как стадия заболевания, возраст, вес пациента, а также способность лекарственного средства вызывать требуемый ответ у пациента. Произошло ли ослабление симптома заболевания, можно оценить с помощью любого клинического измерения, обычно применяемого врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками для оценки тяжести или статуса прогрессирования этого симптома. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способ лечения или изделия промышленного производства) могут не быть эффективным в отношении ослабления представляющего(-их) интерес симптома(-ов) заболевания у каждого пациента, он должен ослаблять представляющий(-е) интерес целевой(-ые) симптом(-ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов, что определяется с помощью любого статистического теста, известного из уровня техники, такого как критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.
«Эффективное количество» охватывает количество, достаточное для обеспечения улучшения в отношении симптома или признака заболевания или для их предупреждения. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностики. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или протокол введения доз, позволяющие избегать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.
"Значение Tm" относится к температуре тепловой денатурации белка, а именно к температуре, при которой половина белка разворачивается, и пространственная структура белка в это время разрушается, следовательно, чем выше значение Tm, тем выше термостабильность белка.
«Замена» относится к замене системы растворителя, которая растворяет белки антител. Например, буферную систему стабильного состава применяют для замены системы растворителей с высоким содержанием соли или гипертонической системы растворителя, содержащей белок антитела, в физических режимах работы. При этом физические режимы работы включают без ограничения ультрафильтрацию, диализ или восстановление после центрифугирования.
ПРИМЕРЫ И ИСПЫТАНИЯ
Далее настоящее изобретение дополнительно подробно описано со ссылкой на следующие примеры, однако эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
В примерах настоящего изобретения, где не описаны конкретные условия, эксперименты обычно проводят в стандартных условиях, или в условиях, предложенных производителями материалов или продуктов. Если источник реагентов конкретно не указан, реагенты являются коммерчески доступными стандартными реагентами.
ПРИМЕРЫ
Получение антигена PCSK-9 и антитела к PCSK-9
Пример 1. Получение антигена PCSK9 и испытуемого белка
Разработка белка и его экспрессия
Пропротеиновую конвертазу субтилизин/кексинового типа 9 UniProt (PCSK9 человека, номер Uniprot: Q8MBP7) применяли в качестве шаблона при разработке аминокислотных последовательностей антигена и испытуемого белка PCSK9 по настоящему изобретению. Белки PCSK9 подвергали слиянию с разными метками, такими как His-метка или иммуностимулирующий пептид, такой как пептид PADRE, затем подвергали клонированию в векторах pTT5 (Biovector, № по кат.: 102762) или векторах pTargeT (Promega, A1410) соответственно. Затем белки PCSK9 транзиентно экспрессировали в клетках линии 293 или стабильно экспрессировали в клетках линии CHO-S и подвергали очистке. Наконец, получали антиген и испытуемый белок по настоящему изобретению.
PCSK9 с His-меткой, PCSK9-His6, применяемый в качестве иммуногена для иммунизации мышей или реагента для выявления:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 1
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, а часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность His-метки (His6-метка).
PCSK9 с пептидом PADRE и His-меткой, PCSK9-PADRE-His6, который применяют в качестве иммуногена, содержащего пептид PADRE, который может вызывать иммунизацию:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
GSGAKFVAAWTLKAAA
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 2
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой линкер, последовательность, выделенная пунктирной линией, представляет собой пептид PADRE, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
Слитый белок на основе His-метки и PCSK9 с сайтом расщепления с помощью TEV, PCSK9-TEV-His6, N-PCSK9 (N-концевой домен PCSK9), может быть получен путем расщепления с помощью TEV и может применяться в качестве иммуногена:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
ENLYFQ
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 3
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой сайт расщепления с помощью TEV, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
Мутантный белок PCSK9-D374Y с His-меткой, PCSK9-D374Y-His6, который применяют в качестве испытуемого реагента:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 4
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
Белок PCSK9, слитый с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-BP15-His6, в качестве испытуемого реагента; пептид BP15 может подвергаться биотинилированию во время экспрессии, что позволяет избежать необходимости мечения биотином in vitro и возможных конформационных изменений.
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
GSTSGSGLNDIFEAQKIEWHE
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 5
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой пептид, являющийся акцептором биотина, а часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
PCSK9-Y является аббревиатурой мутантного белка PCSK9 D374Y, слитого с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-D374Y-BP15-His6, который применяют в качестве испытуемого белка:
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARA
GSTSGSGLNDIFEAQKIEWHE
QEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSYCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQHHHHHH
SEQ ID NO: 6
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой пептид, являющийся акцептором биотина, и часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
Внеклеточный домен белка LDLR, представляющего собой рецептор PCSK9, с Flag-меткой и His-меткой, LDLR-ECD-Flag-His6, применяемый в качестве испытуемого реагента:
MGPWGWKLRWTVALLLAAAGTAVG
DYKDDDDK
DRCERNEFQCQDGKCISYKWVCDGSAECQDGSDESQETCLSVTCKSGDFSCGGRVNRCIPQFWRCDGQVDCDNGSDEQGCPPKTCSQDEFRCHDGKCISRQFVCDSDRDCLDGSDEASCPVLTCGPASFQCNSSTCIPQLWACDNDPDCEDGSDEWPQRCRGLYVFQGDSSPCSAFEFHCLSGECIHSSWRCDGGPDCKDKSDEENCAVATCRPDEFQCSDGNCIHGSRQCDREYDCKDMSDEVGCVNVTLCEGPNKFKCHSGECITLDKVCNMARDCRDWSDEPIKECGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACKAVGSIAYLFFTNRHEVRKMTLDRSEYTSLIPNLRNVVALDTEVASNRIYWSDLSQRMICSTQLDRAHGVSSYDTVISRDIQAPDGLAVDWIHSNIYWTDSVLGTVSVADTKGVKRKTLFRENGSKPRAIVVDPVHGFMYWTDWGTPAKIKKGGLNGVDIYSLVTENIQWPNGITLDLLSGRLYWVDSKLHSISSIDVNGGNRKTILEDEKRLAHPFSLAVFEDKVFWTDIINEAIFSANRLTGSDVNLLAENLLSPEDMVLFHNLTQPRGVNWCERTTLSNGGCQYLCLPAPQINPHSPKFTCACPDGMLLARDMRSCLTEAEAAVATQETSTVRLKVSSTAVRTQHTTTRPVPDTSRLPGATPGLTTVEIVTMSHQALGDVAGRGNEKKPSSVRHHHHHH
SEQ ID NO: 7
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой Flag-метку, и часть, выделенная курсивом, представляет собой His6-метку.
LCDR-Fc, слитый белок на основе усеченного внеклеточного домена LDLR с Fc hIgG1(с активностью связывания PCSK9), LDLR-sECD -Fc (hIgG1), применяемый в качестве испытуемого реагента:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDIDECQDPDTCSQLCVNLEGGYKCQCEEGFQLDPHTKACK
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 8
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой усеченный внеклеточный домен LDLR с активностью связывания PCSK9 (LDLR-sECD), а часть, выделенная курсивом, представляет собой hIgG1-Fc.
Слитый белок в большей степени усеченного внеклеточного домена LDLR с Fc-фрагментом hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR-ssECD -Fc (hIgG1), применяемый в качестве испытуемого реагента:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCGTNECLDNNGGCSHVCNDLKIGYECLCPDGFQLVAQRRCEDID
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 9
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой сигнальный пептид, последовательность, выделенная двойным подчеркиванием, представляет собой в большей степени усеченный внеклеточный домен LDLR с активностью связывания PCSK9 (LDLR-ssECD), а часть, выделенная курсивом, представляет собой hIgG1-Fc.
Пример 2. Очистка рекомбинантных белков на основе PCSK9 и рекомбинантных белков на основе LDLR, и очистка гибридомных рекомбинантных антител
1. Стадии очистки рекомбинантных белков с His-меткой:
280
Образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, центрифугировали при высокой скорости центрифугирования и удаляли примеси. Буфер заменяли на PBS и добавляли имидазол до конечной концентрации 5 мМ. Никелевую колонку уравновешивали с помощью 2-5 колоночных объемов раствора PBS, содержащего 5 мМ имидазола. После замены буфера образец супернатанта загружали в колонку для аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металла (IMAC). Колонка промывали раствором PBS, содержащим 5 мМ имидазола до тех пор, пока показания при A не снижались до базового уровня. Затем хроматографическую колонку промывали с помощью PBS+ 10 мM имидазола для удаления неспецифически связывающихся белков и собирали элюат. Целевой белок элюировали с помощью раствора PBS, содержащего 300 мМ имидазола, и собирали элюируемые фракции, соответствующие его пику. Собранный элюат концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии на Superdex 200 (GE) с применением PBS в качестве подвижной фазы. Фракции, соответствующие пику мультимера, отбрасывали, а элюируемые фракции, соответствующие пику целевого белка, собирали. Полученные белки идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования и LC-MS. Получили PCSK9-His6 (SEQ ID NO:1), PCSK9-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 2), PCSK9-TEV-His6 (SEQ ID NO: 3), PCSK9-D374Y-His6 (SEQ ID NO: 4), PCSK9-BP15-His6 (SEQ ID NO: 5) и PCSK9-D374Y-BP15-His6 (SEQ ID NO: 6) и их применяли в качестве иммуногенов или испытуемого белка по настоящему изобретению. PCSK9-TEV-His6 подвергали очистке и расщеплению ферментом TEV. Фермент TEV, неполностью расщепленный PCSK9-TEV-His6 или фрагмент C-концевого домена с His-меткой удаляли из полученного продукта на колонке IMAC. Элюат с IMAC концентрировали с получением сегмента PCSK9 только с N-концевым доменом (сокращенно N-PCSK9) и использовали его в качестве иммуногена для иммунизации мышей.
2. Стадии очистки рекомбинантного белка LDLR-ECD-Flag-His6 (SEQ ID NO: 7) с His-меткой и Flag-меткой
280
Образцы центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей и затем концентрировали до необходимого объема. Колонку для аффинной хроматографии с антителами к Flag уравновешивали с помощью 2-5 колоночных объемов буфера 0,5×PBS. После удаления примесей образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, загружали в колонку. Колонку промывали с помощью 0,5×PBS до тех пор, пока показатель при A не снижался до базового уровня. Колонку промывали с помощью PBS, содержащего 0,3 M NaCl, и примесные белки элюировали и собирали. Целевые белки элюировали с помощью 0,1 M уксусной кислоты (pH 3,5-4,0) и собирали с последующим доведением pH до нейтрального. Собранный элюат концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-хроматографии на Superdex 200 (GE) с применением PBS в качестве подвижной фазы. Фракцию, соответствующую пику мультимера, удаляли, а элюируемые фракции, соответствующие пику целевого белка, собирали. Полученные белки идентифицировали с помощью электрофореза, пептидного картирования и LC-MS, и разливали на аликвоты для последующего применения. LDLR-ECD-Flag-His6 (SEQ ID NO: 7) с FLAG/His6-метками получали и применяли для испытания эффективности функционирования антитела по настоящему изобретению.
3. Стадии очистки слитого белка на основе Fc и LDLR
280
Образцы супернатанта с клеток, осуществляющих экспрессию, центрифугировали при высокой скорости для удаления примесей, и затем образцы концентрировали до необходимого объема и загружали в колонку с белком A. Колонку промывали с помощью PBS до тех пор, пока показатель при A не снижался до базового уровня. Целевые белки элюировали с помощью 100 мМ ацетата натрия, pH 3,0, и затем нейтрализовали с помощью 1 M Tris-HCl. Элюируемые образцы надлежащим образом концентрировали и подвергали дополнительной очистке с помощью гель-хроматографии на Superdex 200 (GE), предварительно уравновешенной с помощью PBS. Собирали фракции, соответствующие пикам без мультимеров. Данный способ применяли для очистки LDLR-sECD -Fc (hIgG1) (SEQ ID NO: 8) и LDLR-ssECD -Fc (hIgG1) (SEQ ID NO: 9), оба из которых могут применяться для испытания эффективности функционирования антител к PCSK9.
Пример 3. Получение гибридомных моноклональных антител к PCSK9 человека
1. Иммунизация
Моноклональные антитела человека к PCSK9 получали путем иммунизации мышей. Самок белых мышей линии SJL возрастом 6 недель (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., номер лицензии на животноводство: SCXK (Пекин) 2012-0001) применяли в данном эксперименте и выращивали в лаборатории SPF. После покупки мышей содержали в лаборатории в течение 1 недели с применением цикла свет/темнота 12/12 часов при температуре 20-25°C и влажности 40-60%. Мышей, которые адаптировались к окружающей среде, иммунизировали в соответствии с двумя следующими схемами, по 6-10 особей на группу. Иммуногены представляли собой PCSK9-His6 (SEQ ID NO: 1) с меткой His, PCSK9-PADRE-His6 (SEQ ID NO: 2) и N-PCSK9 (SEQ ID NO: 3) человека.
Схема A: эмульгирование с адъювантом Фрейнда (номер серии Sigma: F5881/F5506). Полный адъювант Фрейнда (CFA) применяли для первичной иммунизации, а неполный адъювант Фрейнда (IFA) применяли для бустерной иммунизации. Соотношение антигена к адъюванту составляло 1:1, 100 мкг/мышь при первичной иммунизации, и 50 мкг/мышь при бустерной иммунизации. На день 0 каждой мыши внутрибрюшинно (IP) вводили 100 мкг эмульгированных антигенов, после первичной иммунизации один раз в две недели, в общей сложности в течение 6-8 недель.
Схема B. Мышей подвергали перекрестной иммунизации с помощью Titermax (номер серии Sigma: T2684) и квасцов (номер партии Thremo: 77161). Соотношение антигена и адъюванта (Titermax) составляло 1:1, и соотношение антигена и адъюванта (квасцы) составляло 3:1, 10-20 мкг/мышь при первичной иммунизации, и 5 мкг/мышь при бустерной иммунизации. На день 0 каждой мыши внутрибрюшинно (IP) вводили 20/10 мкг эмульгированных антигенов, после первичной иммунизации раз в неделю, с попеременным применением Titermax и квасцов в общей сложности в течение 6-11 недель. Спустя четыре недели после иммунизации антиген вводили в дорсальную часть или внутрибрюшинно, в соответствии с состоянием набухания дорсальной и брюшной области.
2. Слияние клеток
5
2
2
2
Для слияния спленоцитов выбирали мышей с высокими титрами антител в сыворотке (см. испытания 1 и 2, метод ELISA для выявления связывания с PCSK9) и с титрами антител, проявляющими тенденцию к стабильному уровню. За 72 часа до слияния, выбранных мышей иммунизировали путем внутрибрюшинной инъекции PCSK9-His6 из расчета 10 мкг/мышь. Для получения клеток гибридомы лимфоциты селезенки и клетки миеломы Sp2/0 (ATCC CRL-8287™) подвергали слиянию с помощью оптимизированной PEG-опосредованной процедуры слияния. Слитые клетки гибридомы ресуспендировали в полной среде HAT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HAT и 1×OPI) и затем вносили аликвоты в 96-луночные планшеты для культивирования клеток (1×10/150 мкл/лунка) с последующей инкубацией при 37°C и 5% CO. На день 5 после слияния добавляли полную среду HAT по 50 мкл/лунка и инкубировали при 37°C и 5% CO. В период со дня 7 по день 8 после слияния, в зависимости от плотности роста клеток, всю среду заменяли на полную среду HT (среда RPMI-1640, содержащая 20% FBS, 1×HT и 1×OPI), по 200 мкл/лунка, и инкубировали при 37 C и 5% CO.
3. Скрининг клеток гибридомы
В период со дня 10 по день 11 после слияния, в зависимости от плотности роста клеток, проводили анализы ELISA для выявления связывания с PCSK9 или PCSK9-Y (см. испытания 1 и 2). Положительные клетки при испытании с помощью ELISA выявляли как те, которые обеспечивали блокирование связывания PCSK9 или PCSK9-Y с LDLR при ELISA (см. испытания 3 и 4). Среду в положительных лунках заменяли, и клетки распределяли по 24-луночным планшетам в соответствии с плотностью роста клеток. После повторного испытания штаммы клеток, перенесенные в 24-луночный планшет, сохраняли и осуществляли их первое субклонирование. Положительные клетки, определенные с помощью скрининга после первого субклонирования (см. испытания 1 и 2), сохраняли и осуществляли их второе субклонирование. Положительные клетки, определенные с помощью скрининга после второго субклонирования (см. испытания 1 и 2), сохраняли и обеспечивали осуществление ими экспрессии белка. После нескольких слияний получали клетки гибридомы, способные к блокированию связывания PCSK9 или PCSK9-Y с LDLR.
Клон гибридомы mAb-001 получали путем скрининга на основании анализа блокирования и анализа связывания. Антитела дополнительно получали посредством способа культивирования клеток в бессывороточной среде, и антитело очищали в соответствии с примером очистки для применения в примере испытания.
Последовательность вариабельной области антитела мыши из клона гибридомы mAb-001 была следующей:
> mAb-001 VH
DYWMH
YINPSSGFTKYHQNFKD
QYDYDEDWYFDV
QVHLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFNWVKERPGQGLEWIGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYDDSAVYYCARWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO: 10
> mAb-001VL
KSSQSLLNSRTRKNFLA
WASTRES
KQSFNLFT
DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCWYQQKPGQSPKLLIYGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCFGSGTKLEIK
SEQ ID NO: 11
Примечание: порядок расположения FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность FR, а выделенная подчеркиванием представляет собой последовательность CDR.
Таблица 1. Последовательности CDR-области тяжелой цепи и легкой цепи антитела к PCSK-9 mAb-001
Пример 4. Гуманизация гибридомного моноклонального антитела к PCSK9 человека
1. Выбор каркаса, подлежащего гуманизации, для гибридомного клона mAb-001
Путем выравнивания по базе данных генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии человека IMGT с помощью программного обеспечения MOE от IMGT в качестве матриц были отобраны гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепи с высокой гомологией с mAb-001 соответственно. CDR таких двух антител мыши были соответственно привиты в соответствующие матрицы антител человека с образованием последовательностей вариабельной области с порядком расположения FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. При этом аминокислотные остатки были пронумерованы и аннотированы в соответствии с системой нумерации по Kabat.
Матрицами гуманизированной легкой цепи антитела мыши mAb-001 являются IGKV1-39*01 и hjk2.1, а матрицами гуманизированной тяжелой цепи являются IGHV1-2*02 и hjh2. Последовательность вариабельной области гуманизированного антитела h001-1, полученного в результате гуманизации, является следующей:
> h001-1 VH
DYWMH
YINPSSGFTKYHQNFKD
QYDYDEDWYFDV
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTWVRQAPGQGLEWMGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 18
> h001-1 VL
KSSQSLLNSRTRKNFLA
WASTRES
KQSFNLFT
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWYQQKPGKAPKLLIYGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 24
Примечание: порядок расположения в вариабельной области FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, где часть, выделенная курсивом, представляет собой последовательность FR, а выделенная подчеркиванием представляет собой последовательность CDR.
2. Выбор матрицы и разработка обратной мутации для клона гибридомы mAb-001 показаны в таблице 2. Комбинации гуманизированных последовательностей из клонов гибридомы после обратной мутации показаны в таблице 4.
Таблица 2. Выбор матрицы и разработка обратной мутации
Примечание: например, в соответствии с системой нумерации по Kabat, S66D означает, что в результате обратной мутации S в положении 66 подвергалось замене на D.
«Привиты» означает, что CDR из антитела мыши были привиты в последовательности FR-области зародышевой линии человека, и специфические последовательности мутантных вариабельных областей показаны в таблице 3.
Таблица 3. Последовательности вариабельной области каждого мутанта
Примечание: части последовательностей, выделенные подчеркиванием, представляют собой CDR-области.
Таблица 4. Комбинации гуманизированных последовательностей антител мыши mAb-001
Примечание: в вышеприведенной таблице показаны комбинации вариабельных областей гуманизированного антитела, полученные путем объединения различных последовательностей и мутированных последовательностей на их основе. Например, h001-1 обозначает, что вариабельная область гуманизированного антитела h001-1 состоит из легкой цепи h001_VL1 и тяжелой цепи h001_VH.1A, и т.д.
3. Вышеприведенные гуманизированные последовательности объединяли с образованием антитела, где константная область тяжелой цепи получена из IgG1 человека, а константная область легкой цепи получена из каппа-цепи человека. Получали соответствующее гуманизированное антитело, и полученные антитела к PCSK9 по настоящему изобретению характеризовались относительно высокой активностью связывания с PCSK9 и PCSK9-, а также могли эффективно блокировать связывание PCSK9/PCSK9-Y с LDLR.
Пример 5. Конструирование и экспрессия гуманизированных антител к PCSK9 человека в форматах IgG1 и IgG1-YTE
Способ конструирования и экспрессии гуманизированных антител к PCSK9 человека включает следующее.
1. Разработка праймеров. Несколько праймеров были разработаны с применением доступного онлайн программного обеспечения DNAWorks (v3.2.2, http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) для синтеза фрагментов генов, содержащих VH/VK, необходимых для рекомбинации: 5'-сигнальный пептид длиной -30 п.о. + VH/VK +CH1/CL длиной 30 п.о.- 3'. Принцип разработки праймеров является следующим: если целевой ген 2 отличается от целевого гена 1 на 2 аминокислоты, разрабатывают другой праймер, специфичный к сайту мутации, как показано на фиг. 1.
2. Сплайсинг фрагментов: в соответствии с инструкциями по эксплуатации ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL компании TaKaRa проводили двухстадийную ПЦР-амплификацию с несколькими праймерами, разработанными выше, и получали фрагменты генов, содержащие VH/VK, необходимые для рекомбинации.
3. Конструкция вектора экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) и ферментативное расщепление с помощью рестриктаз.
Вектор экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) разрабатывали и конструировали с применением свойств определенных сайт-специфических рестрикционных ферментов, таких как BsmBI, у которых последовательность распознавания отличается от сайта расщепления, как показано на фиг. 2. Вектор расщепляли с применением BsmBI и липкие концы восстанавливали для последующего применения.
4. Конструкция рекомбинантного вектора экспрессии VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr.
VH/VK, содержащие фрагменты гена, необходимые для рекомбинации, и восстановленный вектор экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)) подвергали расщеплению ферментом BsmBI, добавляли к компетентным клеткам DH5 альфа в соотношении 3:1, инкубировали на ледяной бане при 0°C в течение 30 мин., и подвергали тепловому шоку в течение 90 секунд при 42°C. Затем добавляли 5-кратный объем среды LB, инкубировали при 37°C в течение 45 мин., вносили в планшет LB-Amp, и культивировали при 37°C в течение ночи. Отдельные клоны отбирали и отправляли для секвенирования с получением целевых клонов.
Антитело по данному изобретению может быть разработано и сконструировано в соответствии с вышеуказанным способом, но не ограничивается им. Принимая h001-4 в качестве примера, антитело и его варианты были разработаны для получения: 1) h001-4-WT: h001-4 в формате IgG, т.е. комбинация гуманизированной последовательности h001-4, объединяющая константную область тяжелой цепи, полученную из IgG1 человека, с константной областью легкой цепи, полученной из каппа-цепи человека; 2) h001-4-YTE: h001-4 в формате IgG1-YTE, т.е. комбинация гуманизированной последовательности h001-4, объединяющая константную область тяжелой цепи мутантного IgG1 человека (мутация YTE) с константной областью легкой цепи, полученной из каппа-цепи человека. Мутантный IgG1 человека также может предусматривать формы с другими мутациями.
Последовательности сконструированных и экспрессируемых гуманизированных антител к PCSK9 человека (в их форматах IgG1 и IgG1-YTE) являются следующими.
H001-4 в формате IgG1, константная область его тяжелой цепи получена из IgG1 человека, а константная область легкой цепи получена из легкой каппа-цепи человека.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (IgG1 человека) являются следующей:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 28
Последовательность ДНК тяжелой цепи являются следующей:
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO: 29
h001-4-каппа
Аминокислотная последовательность легкой цепи является следующей:
DIVMSQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSRTRKNFLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSFNLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 30
Последовательность ДНК легкой цепи является следующей:
ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC
GACATCGTGATGTCTCAGAGCCCATCTAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTAACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAAAGCCTGCTGAACAGCAGGACCCGCAAGAACTTCCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGtctCCCAAGTTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCTAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCAAGCAGAGCTTCAATCTGTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
SEQ ID NO: 31
Легкая цепь h001-4-IgG1-YTE представляет собой h001-4-каппа: SEQ ID NO: 30)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи IgG1-YTE является следующей:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSSGFTKYHQNFKDRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARQYDYDEDWYFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 32
Последовательность ДНК тяжелой цепи является следующей:
ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTCTTAAGGGTGTCCAGTGC
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCGAGCGTAAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCGACTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTTTACCAAGTATCACCAGAACTTCAAAGACAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGGAGCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCAATACGACTACGACGAGGACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAAGGAACCACCGTGACTGTGAGCAGCGCTTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAGCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO: 33
Примечание: последовательность, выделенная подчеркиванием, представляет собой последовательность ДНК сигнального пептида.
Типичный процесс получения фармацевтической композиция (состава) на основе антитела
Стадия 1. Брали некоторое количество образца очищенного антитела к PCSK-9 (такого как h001-4-YTE) и растворитель заменяли (предпочтительно с помощью ультрафильтрации) 6-кратным объемом буфера, не содержащего антитело (такого как 10 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0), с помощью ультрафильтрационной мембраны до тех пор, пока белок не был сконцентрирован до 60 мг/мл (±2 мг/мл). Добавляли некоторый объем исходного раствора сахарозы и перемешивали до достижения конечной концентрации сахарозы 25 мг/мл. Добавляли некоторый объем исходного раствора Tween-80 и перемешивали до достижения конечной концентрации Tween-80 0,2 мг/мл. Добавляли 10 мМ гистидинового буфера (pH 6,0) для доведения белка до концентрации 50 мг/мл (±5 мг/мл). Значение pH конечного продукта составляло приблизительно 6,3 ± 0,1 (другие составы, подлежащие испытанию, или стабильные составы следует готовить аналогичным образом).
После того, как продукт был отфильтрован, отбирали образцы контроля в процессе производства, чтобы определить его стерильность. Лекарственное средство пропускали через фильтрующий элемент на основе PVDF с размером пор 0,22 мкм и собирали фильтрат.
Стадия 2. Объем загрузки регулировали до 3,6 мл, фильтрат вносили во флаконы вместимостью 6 мл, прикрытые пробкой, определяли разницу загрузки с помощью отбора образцов для контроля в процессе производства в начале, середине и конце стадии заполнения соответственно.
Стадия 3. После розлива и укупорки раствор помещали в камеру для лиофилизации и лиофилизировали. Процесс лиофилизации включал предварительное замораживание, первичное высушивание и вторичное высушивание. После завершения процесса лиофилизации лиофилизированный порошок укупоривали под вакуумом.
Время лиофилизации можно регулировать в зависимости от конкретной ситуации. Tип лиофилизатора, объем загрузки лиофилизированного лекарственного препарата и контейнер, в котором содержится лиофилизированный лекарственный препарат, будут влиять на время лиофилизации. Такое регулирование времени широко известно специалистам в данной области техники.
Стадия 4. Включали укупорочную машину, добавляли алюминиевые крышки и таким образом выполняли укупорку.
Стадия 5. Визуальный осмотр применяли для подтверждения того, что продукт не имел таких дефектов, как разрушение и неточный объем загрузка. Распечатывали и наклеивали этикетку на флакон; распечатывали этикетку на коробку, коробку складывали, упаковывали и на коробку наклеивали этикетку.
Пример 6. Скрининг буферной системы
Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 1 мг/мл со следующими буферными растворами:
1) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 4,0;
2) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 4,5;
3) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 5,0;
4) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 5,5;
5) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,0;
6) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,0;
7) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,5;
8) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 7,0;
9) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 7,5;
10) 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5;
11) 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0;
12) 20 мМ Tris-HCl, pH 8,5.
Термическую стабильность антитела к PCSK9 в каждом образце состава определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Анализ средней температуры термической денатурации (Tm) антитела к PCSK-9 показал, что оно проявляло большую термическую стабильность при pH ≥ 6,0. Результаты показаны в таблице 5. Следовательно, для последующих исследований выбрали буферы со значениями pH 6,0-6,5, такие как буфер на основе гистидина гидрохлорида, буфер на основе дигидрофосфата натрия и динатрия гидрофосфата, буфер на основе янтарной кислоты и сукцината натрия и буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия.
Таблица 5. Результаты скрининга с использованием DSC антитела H001-4-YTE в разных буферных системах и при разных значениях pH
Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.
Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 1 мг/мл со следующими буферными растворами:
1) 20 мМ гистидина гидрохлорид, pH 6,0;
2) 20 мМ гистидина гидрохлорид, pH 6,5;
3) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,0;
4) 20 мМ дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, pH 6,5;
5) 20 мМ янтарная кислота-сукцинат натрия, pH 6,0;
6) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,0;
7) 20 мМ лимонная кислота-цитрат натрия, pH 6,5.
Термическую стабильность антитела к PCSK9 в каждом образце состава определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Анализ средней температуры термической денатурации (Tm) антитела к PCSK-9 показал (см. таблицу 6), что антитело к PCSK-9 характеризовалось несколько более высокой стабильностью в гистидиновой, фосфатной и сукцинатной буферных системах по сравнению с таковой в цитратной буферной системе.
Таблица 6. Результаты скрининга с использованием DSC антитела H001-4-YTE в разных буферных системах и при разных значениях pH
Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.
Пример 7. Скрининг сахаров в составе
Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:
1) 20 мМ гистидина гидрохлорид, 70 мг/мл сахарозы, pH 6,5;
2) 20 мМ гистидина гидрохлорид, 70 мг/мл дигидрата α,α-трегалозы, pH 6,5.
Каждый состав фильтровали и разливали во флаконы вместимостью 2 мл по 0,5 мл на флакон и флакон укупоривали пробкой. Образцы поочередно подвергали воздействию высокой температуры 40°С, низкой температуры, света и циклов замораживания-оттаивания (образцы помещали в условия с температурой -20°С на 24 ч., а затем извлекали и помещали в условия с комнатной температурой до полного оттаивания и перемешивали образец, что составляло один цикл). Результаты показали, что сахароза и трегалоза оказывают аналогичное воздействие на стабильность антитела к PCSK-9. Сахарозу выбрали в качестве стабилизатора для антитела к PCSK-9, результаты приведены в таблице 7.
Таблица 7. Результаты ускоренного эксперимента для H001-4-YTE с разными сахарами
Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:
1) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0 мг/мл сахарозы, pH 6,5;
2) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 10 мг/мл сахарозы, pH 6,5;
3) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 40 мг/мл сахарозы, pH 6,5;
4) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 70 мг/мл сахарозы, pH 6,5.
Значение осмотического давления указывает на то, что осмотическое давление соответствует минимальному требованию в отношении подкожных инъекций, если концентрация сахарозы составляет ≥70 мг/мл.  Состав на основе антитела к PCSK-9 по настоящему изобретению получали способом, предусматривающим лиофилизацию при низкой концентрации и восстановление при высокой концентрации (лиофилизации подвергали трехкратный объем исходного раствора, для восстановления применяли один объем воды для инъекций, и если не указано иное, в настоящем изобретении вышеуказанное соотношение является принятым для выполнения лиофилизации). Если концентрация сахарозы в конечном составе (восстановленном составе) составляет 75 мг/мл, это не только соответствует требованию в отношении осмотического давления при инъекции, но также облегчает получение такой концентрации сахарозы из концентрации исходного раствора, которая составляет 25 мг/мл, и при этом концентрация сахарозы 25 мг/мл легко подвергается лиофилизации.
Таблица 8. Результаты определения соотношения концентрации сахарида и осмотического давления для состава на основе H001-4-YTE
Примечание: н.п. означает, что ингредиент не добавляли.
Пример 8. Скрининг поверхностно-активных веществ в составах
Получали образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией белка 150 мг/мл со следующими буферными растворами:
1) 20 мМ гистидина гидрохлорида, pH 6,5;
2) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 20, pH 6,5;
3) 20 мМ гистидина гидрохлорида, 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5.
Образец каждого состава фильтровали и вносили во флаконы вместимостью 2 мл по 0,5 мл на флакон, и флакон укупоривали пробкой. Образцы помещали во встряхиватель, поддерживающий постоянную температуру 25°C, и встряхивали при 300 об./мин. Результаты анализа внешнего вида показали, что поверхностно-активные вещества эффективно предотвращали агрегацию антител к PCSK-9. В отношении H001-4-YTE между полисорбатом 20 и полисорбатом 80 значительных отличий не наблюдали. Полисорбат 80 выбрали в качестве стабилизатора состава на основе антитела к PCSK-9.
Таблица 9. Влияние поверхностно-активного вещества на агрегацию H001-4-YTE при встряхивании при 300 об./мин., 25°C
Пример 9. Скрининг и подтверждение буферной системы в составе
Образцы состава, содержащие 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 50 мг/мл антитела, получали с применением буферного раствора, содержащего 20 мМ гистидина гидрохлорид или 20 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия при pH 6,0 или 6,5. Каждый состав фильтровали и разливали во флаконы из нейтрального боросиликатного стекла вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон для лиофилизации, и флакон укупоривали пробкой из галогенированного бутилкаучука, который применяли для лиофилизированного стерильного порошка. Лиофилизированный продукт хранили при 2-8°С, 25°С и 40°С, и затем восстанавливали водой для инъекций для анализа стабильности. Результаты показали, что антитело к PCSK9 было очень стабильным при 2-8°С и 25°С. Однако, внешний вид восстановленной композиции в день 0 показал, что буфер с янтарной кислотой при рН 6,0 характеризовался значительным уровнем опалесценции по сравнению с системой на основе His (не указано в таблице), поэтому гистидиновую систему выбрали в качестве буферной системы для антитела к PCSK-9.
Таблица 10. Стабильность лиофилизированного порошка H001-4-YTE при различных температурах
Пример 10. Комплексный скрининг компонентов состава
Образцы состава на основе антитела к PCSK-9, содержащие 50 мг/мл антитела к PCSK-9 и 25 мг/мл сахарозы, получали со следующими буферами с разными значениями рН, разной ионной силой и содержащими разные концентрации поверхностно-активных веществ:
1) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5;
2) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;
3) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;
4) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;
5) 10 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;
6) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5;
7) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;
8) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,3 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;
9) 15 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5;
10) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,1 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0;
11) 5 мМ гистидина гидрохлорида, 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,5.
Образец каждого состава фильтровали и разливали во флаконы из нейтрального боросиликатного стекла вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон для лиофилизации, и флакон укупоривали пробкой из галогенированного бутилкаучука, который применяли для лиофилизированного стерильного порошка. Лиофилизированный продукт хранили при 40°С для анализа на стабильность. Данные анализа, основанного на определении отличий мономерного состава с помощью SEC, показали, что антитело к PCSK-9 в составе, содержащем 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида с pH 6,0, 0,2 мг/мл полисорбата 80, было более стабильным при концентрации белка 50 мг/мл и концентрации сахарозы 25 мг/мл. После лиофилизации и восстановления, концентрацию каждого компонента конечного состава (150 мг/мл белка, 75 мг/мл сахарозы, 30 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида и 0,6 мг/мл полисорбата 80) определяли как трехкратную концентрацию лекарственного средства перед лиофилизацией, pH 6,3 ± 0,1.
Таблица 11. Результаты эксперимента с воздействием на H001-4-YTE высокой температуры
Пример 11. Оптимизация температуры первичного высушивания
Образцы состава на основе антитела к PCSK9 с концентрацией антитела к PCSK9, составляющей 50 мг/мл, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 получали с использованием 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида при pH 6,0. Антитело вносили во флакон вместимостью 6 мл по 3,6 мл на флакон и лиофилизировали при температуре первичного высушивания, составляющей -14°С и -5°С соответственно, и флакон укупоривали пробкой для лиофилизации. Сравнивали восстановленные образцы до и после лиофилизации. Результаты показали, что температура -5°C является предпочтительной для первичного высушивания при лиофилизации.
Таблица12. Сравнение образцов H001-4-YTE, полученных с применением разных способов высушивания, до и после лиофилизации.
Пример 12. Определение совместимости между составом и контейнерами из различных материалов
Получали H001-4-YTE в концентрации 50 мг/мл в растворе, содержащем 10 мМ гистидина гидрохлорида, pH 6,0, с 25 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Образцы состава разливали в стеклянные колбы, пакеты для хранения жидкостей и контейнеры из нержавеющей стали вместимостью 316 л и оставляли при 2-8°C на 24 часа. Анализ содержания и чистоты белка показал, что H001-4-YTE является стабильным на протяжении 24 часов. Состав являлся совместимым с контейнером из нержавеющей стали вместимостью 316 л, стеклянной колбой и пакетом для хранения жидкостей.
Таблица 13. Стабильность H001-4-YTE при контакте с разными материалами
Пример 13. Определение совместимости состава с различными фильтрами
Получали H001-4-YTE в концентрации 50 мг/мл в растворе, содержащем 10 мМ буфер на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0, с 25 мг/мл сахарозы и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Образец состава пропускали через PES-фильтры и PVDF-фильтры с размером пор 0,22 мкм, и образцы собирали через 30 мин. и через 1 ч. для испытания. Анализ содержания белка, внешнего вида и чистоты показал, что H001-4-YTE являлся стабильным в течение 1 часа с момента контакта с фильтром. Состав является совместимым как с PES-, так и с PVDF-фильтрами.
Таблица 14. Стабильность H001-4-YTE при применении разных материалов фильтрующих мембран
Пример 14. Другие составы, являющиеся альтернативными по отношению к данному составу
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве исходного раствора для получения фармацевтического состава или непосредственно в качестве раствора для инъекций. Если фармацевтическую композицию по настоящему изобретению применяют в качестве исходного раствора для получения фармацевтического препарата, лиофилизированный состав получают посредством способа лиофилизации и восстанавливают в растворе для инъекций для клинического применения. Лиофилизированный состав по настоящему изобретению получают в соответствии со способом, предусматривающим лиофилизацию при низкой концентрации и восстановление при высокой концентрации, то есть раствор фармацевтического состава с низкой концентрацией лиофилизируют с получением лиофилизированного состава, и лиофилизированный состав восстанавливают с получением фармацевтической композиции с более высокой концентрацией для клинического применения. Лиофилизированный состав обладает большей стабильностью при хранении, чем жидкий состав. Чем выше концентрация каждого компонента исходного раствора для получения фармацевтического состава, используемого для получения лиофилизированного препарата, тем дольше время лиофилизации. При комплексном рассмотрении показателей процесса лиофилизации, концентрация каждого компонента исходного раствора для получения фармацевтического состава после восстановления обычно в 2-5 раз превышает концентрацию компонента в растворе для инъекций до восстановления, и в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения превышение является 3-кратным.
Стабильный фармацевтический состав, предусмотренный настоящим изобретением, содержит белок, представляющий собой антитело к PCSK-9 (неограничивающий вариант осуществления, такой как h001-4-YTE), в комбинации с любым из следующих стабильных буферов:
(1) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;
(2) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;
(3) 150 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;
(4) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;
(5) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;
(6) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;
(7) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, конечное значение pH 6,1;
(8) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(9) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;
(10) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;
(11) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;
(12) 50 мг/мл антитела h001-4, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4;
(13) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3;
(14) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2;
(15) 50 мг/мл антитела h001-4-YTE, 25 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,4.
(16) 30 мг/мл антитела h001-4-YTE, 10 мг/мл сахарозы, 0,05 мг/мл полисорбата 80 и 5 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 5,5;
(17) 70 мг/мл антитела h001-4-YTE, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5;
(18) 45 мг/мл антитела h001-4-YTE, 20 мг/мл сахарозы, 0,1 мг/мл полисорбата 80 и 8 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(19) 55 мг/мл антитела h001-4-YTE, 40 мг/мл сахарозы, 0,3 мг/мл полисорбата 80 и 15 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,2.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть получена в форме соответствующего лиофилизированного состава с помощью процесса лиофилизации, и лиофилизированный состав может быть восстановлен водой для инъекций с получением следующей фармацевтической композиции для клинического применения:
(1) 150 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 75 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 20 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,3 ± 0,1;
(2) 120 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 55 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(3) 200 мг/мл белка, представляющего собой антитело к PCSK-9, 95 мг/мл сахарозы, 0,8 мг/мл полисорбата 80 и 30 мМ буфера на основе гистидина гидрохлорида, pH 6,5.
Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше, специалисты в данной области техники поймут, что они являются только иллюстративными. Многие изменения или модификации можно вносить в эти варианты осуществления без отступления от принципа и сути настоящего изобретения. Следовательно, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД; ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ
ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД
<120>  Фармацевтическая композиция, содержащая антитела к PCSK-9, и ее
применение
<130>  P19413698RU
<150>  CN201710519829.6
<151>  2017-06-30
<160>  33
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  698
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  PCSK9 с His-меткой, PCSK9-His6, применяемый в качестве иммуногена для
иммунизации мышей или применяемый в качестве испытуемого реагента
<400>  1
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450                 455                 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465                 470                 475                 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485                 490                 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500                 505                 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515                 520                 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530                 535                 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545                 550                 555                 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565                 570                 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580                 585                 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595                 600                 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610                 615                 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645                 650                 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660                 665                 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675                 680                 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690                 695
<210>  2
<211>  714
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  PCSK9 с пептидом PADRE и His-меткой, PCSK9-PADRE-His6, применяемый
в качестве иммуногена, где содержащийся в нем пептид PADRE может
вызывать иммунизацию
<400>  2
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450                 455                 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465                 470                 475                 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485                 490                 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500                 505                 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515                 520                 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530                 535                 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545                 550                 555                 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565                 570                 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580                 585                 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595                 600                 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610                 615                 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645                 650                 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660                 665                 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675                 680                 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu
690                 695                 700
Lys Ala Ala Ala His His His His His His
705                 710
<210>  3
<211>  704
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Слитый белок на основе PCSK9 с сайтом расщепления с помощью TEV и
His-меткой, PCSK9-TEV-His6, N-PCSK9 (N-концевой домен PCSK9),
применяемый в качестве иммуногена, который можно получить путем
расщепления с помощью TEV
<400>  3
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg
450                 455                 460
Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val
465                 470                 475                 480
Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser
485                 490                 495
Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys
500                 505                 510
Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala
515                 520                 525
Ile Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr
530                 535                 540
Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln
545                 550                 555                 560
Gln Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp
565                 570                 575
Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn
580                 585                 590
Gln Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His
595                 600                 605
Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro
610                 615                 620
Gln Glu Gln Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly
625                 630                 635                 640
Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val
645                 650                 655
Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser
660                 665                 670
Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg
675                 680                 685
His Leu Ala Gln Ala Ser Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690                 695                 700
<210>  4
<211>  698
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный белок PCSK9-D374Y с His-меткой, PCSK9-D374Y-His6,
применяемый в качестве испытуемого реагента
<400>  4
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450                 455                 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465                 470                 475                 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485                 490                 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500                 505                 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515                 520                 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530                 535                 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545                 550                 555                 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565                 570                 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580                 585                 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595                 600                 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610                 615                 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645                 650                 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660                 665                 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675                 680                 685
Gln Glu Leu Gln His His His His His His
690                 695
<210>  5
<211>  719
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  белок PCSK9, слитый с пептидом BP15, являющимся акцептором биотина,
и His-меткой
<400>  5
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450                 455                 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465                 470                 475                 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485                 490                 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500                 505                 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515                 520                 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530                 535                 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545                 550                 555                 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565                 570                 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580                 585                 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595                 600                 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610                 615                 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645                 650                 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660                 665                 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675                 680                 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690                 695                 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705                 710                 715
<210>  6
<211>  719
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Мутантный белок PCSK9 D374Y, слитый с пептидом BP15,
являющимся акцептором биотина, и His-меткой, PCSK9-D374Y-BP15-His6,
в качестве испытуемого белка
<400>  6
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20                  25                  30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35                  40                  45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50                  55                  60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85                  90                  95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100                 105                 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115                 120                 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130                 135                 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165                 170                 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180                 185                 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195                 200                 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210                 215                 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245                 250                 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260                 265                 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275                 280                 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290                 295                 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325                 330                 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340                 345                 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355                 360                 365
Ile Gly Ala Ser Ser Tyr Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370                 375                 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385                 390                 395                 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405                 410                 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420                 425                 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435                 440                 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450                 455                 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465                 470                 475                 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485                 490                 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500                 505                 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515                 520                 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530                 535                 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545                 550                 555                 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565                 570                 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580                 585                 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595                 600                 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610                 615                 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625                 630                 635                 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645                 650                 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val
660                 665                 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675                 680                 685
Gln Glu Leu Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe
690                 695                 700
Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His His
705                 710                 715
<210>  7
<211>  802
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Внеклеточный домен белка LDLR, представляющего собой рецептор PCSK9,
с Flag-меткой и His-меткой, LDLR-ECD-Flag-His6, в качестве
испытуемого реагента
<400>  7
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20                  25                  30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35                  40                  45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50                  55                  60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65                  70                  75                  80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85                  90                  95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100                 105                 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115                 120                 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130                 135                 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145                 150                 155                 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165                 170                 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180                 185                 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195                 200                 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210                 215                 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225                 230                 235                 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245                 250                 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260                 265                 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275                 280                 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290                 295                 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325                 330                 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340                 345                 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355                 360                 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370                 375                 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405                 410                 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420                 425                 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435                 440                 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450                 455                 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465                 470                 475                 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485                 490                 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500                 505                 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515                 520                 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530                 535                 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545                 550                 555                 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565                 570                 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580                 585                 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595                 600                 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610                 615                 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625                 630                 635                 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645                 650                 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660                 665                 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675                 680                 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690                 695                 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705                 710                 715                 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725                 730                 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740                 745                 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755                 760                 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770                 775                 780
Ser Ser Val Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His His His
785                 790                 795                 800
His His
<210>  8
<211>  331
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR-Fc, слитый белок на основе усеченного внеклеточного домена LDLR
с Fc hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR -sECD CFc
(hIgG1), в качестве испытуемого реагента
<400>  8
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20                  25                  30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35                  40                  45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys
50                  55                  60
Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys Val Asn Leu Glu Gly Gly
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln Leu Asp Pro His Thr Lys
85                  90                  95
Ala Cys Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
100                 105                 110
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
115                 120                 125
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
130                 135                 140
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
145                 150                 155                 160
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
165                 170                 175
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
180                 185                 190
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
195                 200                 205
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
210                 215                 220
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
225                 230                 235                 240
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
245                 250                 255
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
260                 265                 270
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
275                 280                 285
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
290                 295                 300
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  9
<211>  294
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Слитый белок на основе еще более усеченного внеклеточного домена LDLR
с Fc hIgG1 (с активностью связывания PCSK9), LDLR-ssECD CFc
(hIgG1), в качестве испытуемого реагента
<400>  9
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp Asn Asn Gly Gly Cys Ser
20                  25                  30
His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr Glu Cys Leu Cys Pro Asp
35                  40                  45
Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys Glu Asp Ile Asp Glu Pro
50                  55                  60
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
65                  70                  75                  80
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
85                  90                  95
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
100                 105                 110
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
115                 120                 125
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
130                 135                 140
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
145                 150                 155                 160
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
165                 170                 175
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
180                 185                 190
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
195                 200                 205
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
210                 215                 220
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
225                 230                 235                 240
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
245                 250                 255
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
260                 265                 270
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
275                 280                 285
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290
<210>  10
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  11
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  11
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  12
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
Asp Tyr Trp Met His
1               5
<210>  13
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  13
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  14
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  14
Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1               5                   10
<210>  15
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  15
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>  16
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  16
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>  17
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  17
Lys Gln Ser Phe Asn Leu Phe Thr
1               5
<210>  18
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ch-001
<400>  18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  19
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VH.1A
<400>  19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  20
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VH.1B
<400>  20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  21
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VH.1C
<400>  21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  22
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VH.1D
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  23
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VH.1E
<400>  23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  24
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ch-001 hVL.1 (с привитыми CDR)
<400>  24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  25
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VL.1A
<400>  25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  26
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VL.1B
<400>  26
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  27
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-VL.1C
<400>  27
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  28
<211>  451
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-4-IgG1
<400>  28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Lys
450
<210>  29
<211>  1413
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-4-IgG1
<400>  29
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag       60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc      120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca      180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac      240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg      300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac      360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc      420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg      480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc      660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc      720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga      780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct      840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg      900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac      960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag     1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc     1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag     1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc     1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg     1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg     1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg     1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                  1413
<210>  30
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-4-каппа
<400>  30
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Arg Thr Arg Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln
85                  90                  95
Ser Phe Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  31
<211>  726
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h001-4-каппа
<400>  31
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggctcg       60
cgatgcgaca tcgtgatgtc tcagagccca tctagcctga gcgccagcgt gggcgacagg      120
gtaaccatca cctgcaagag cagccaaagc ctgctgaaca gcaggacccg caagaacttc      180
ctggcttggt atcagcagaa gcccggcaag tctcccaagt tgctgatcta ctgggccagc      240
accagggaga gcggcgtgcc cgacaggttc agcggctccg gcagcggcac cgacttcacc      300
ctgaccatct ctagtctgca gcccgaggac ttcgccacct actactgcaa gcagagcttc      360
aatctgttca ccttcggcca gggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggctgcacca      420
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg      480
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc      540
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac      600
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc      660
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag      720
tgttga                                                                 726
<210>  32
<211>  451
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь h001-4-IgG1-YTE
<400>  32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Phe Thr Lys Tyr His Gln Asn Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr Asp Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215                 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr
245                 250                 255
Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275                 280                 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290                 295                 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305                 310                 315                 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325                 330                 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340                 345                 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355                 360                 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370                 375                 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385                 390                 395                 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405                 410                 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420                 425                 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435                 440                 445
Pro Gly Lys
450
<210>  33
<211>  1413
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь h001-4-IgG1-YTE
<400>  33
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt ccagtgccag       60
gtgcagctgg tgcagagcgg cgctgaggtg aagaagcccg gagcgagcgt aaaggtgagc      120
tgcaaggcca gcggatacac cttcaccgac tactggatgc actgggtgag gcaggcccca      180
ggacagggcc tggagtggat gggctacatc aaccccagca gcggctttac caagtatcac      240
cagaacttca aagacagggt gaccatgacc agggacacca gcatcagcac cgcctacatg      300
gagctgagca ggctgaggag cgacgacacc gccgtgtact actgcgccag gcaatacgac      360
tacgacgagg actggtactt cgacgtgtgg ggccaaggaa ccaccgtgac tgtgagcagc      420
gcttcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg      480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg      540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca      600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc      660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc      720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga      780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tctacatcac ccgggagcct      840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg      900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac      960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag     1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc     1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag     1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc     1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg     1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg     1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg     1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga                                  1413
<---