БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ
BIOLUMINESCENT METHOD FOR DETECTION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HUMIC SUBSTANCES

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в экологии и медицине, для количественной оценки ремедиационной способности природного детоксиканта - гуминовых веществ.
Известен способ мониторинга токсичности среды, основанный на определении концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей альдегид и НАДН в насыщающих концентрациях, люциферазу, НАДН: ФМН-оксидоредуктазу и ФМН и определение концентрации по величине интенсивности свечения [а.с. №1204639, МПК C12Q 1/26, опуб. 15.01.86 г., бюл. №2].
Известен способ определения концентрации ингибиторов биологической активности, включающий обработку анализируемой пробы реакционной смесью, содержащей люциферазу и ее субстраты, измерение времени достижения максимума биолюминесценции, по величине которого определяют концентрацию ингибитора [а.с. №865904, МПК C12Q 1/26, опубл. 23.09.81 г., бюл. №35 (прототип)].
Недостатками этих способов является отсутствие избирательности и количественной оценки детоксицирующего фактора.
Техническим результатом изобретения является разработка способа определения антиоксидантной активности гуминовых веществ, избирательного к группе оксидантов.
-6
-5
0
ГВ
Указанный технический результат достигается тем, что в биолюминесцентном способе определения антиоксидантной активности гуминовых веществ, включающем приготовление рабочей и контрольной биолюминесцентных проб на основе ферментов, при приготовлении контрольной пробы используют стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, при приготовлении рабочей пробы - стандартный биолюминесцентный раствор с добавлением оксиданта, содержащий гуминовые вещества, а в качестве оксиданта используют феррицианид калия в концентрациях от 5·10 M до 3·10 М и регистрируют индукционный период биолюминесценции обеих проб, при отношении Т/Т<1 гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью.
Заявляемый способ использует избирательность биолюминесцентного ферментативного анализа к группе оксидантов, что позволяет количественно определять антиоксидантную активность природных детоксикантов - гуминовых веществ и оценивать их реамедиационные свойства.
Признаки заявляемого технического решения, не выявлены в других технических решениях при изучении данной области и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется чертежами.
0
-6
-6
-5
-5
-5
На фиг.1 представлена зависимость интенсивности биолюминесценции (I/I) от времени в растворах феррицианида калия: 1-C=3·10 M, 2-С=5·10 М, 3-С=10 М, 4-C=3·10 M, 5-C=5·10 М.
-5
На фиг.2 дана зависимость индукционного периода (Т) биолюминесценции от концентрации гуминовых веществ в растворе феррицианида калия, С=10 М.
Заявляемый биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ осуществляется следующим образом:
-4
Предварительно, при комнатной температуре определяют воздействие оксиданта на биолюминесцентную систему, для этого в раствор, содержащий 5 мкл раствора Комплекта Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБа), 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл
-4
4·10 М раствора NADH, вносят раствор, содержащий оксиданты различных концентрации. Примеры оксидантов: перекисные соединения, хиноны, соли металлов переменной валентности и т.д. (т.е. соединения характеризующиеся окислительной активностью). Выбирают концентрацию раствора оксиданта, дающую индукционный период биолюминесценции 3-6 минут. Этот раствор затем используют для приготовления контрольной и рабочей проб.
-4
-4
Состав контрольной пробы: 5 мкл раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл 4·10 М раствора NADH и 50 мкл раствора оксиданта выбранной концентрации.
-4
-4
0
0
0
ГВ
ГВ
ГВ
Состав рабочей пробы: 5 мкл, раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл 4·10 М раствора NADH, 50 мкл раствора оксиданта выбранной концентрации и 0,2 г/л раствора гуминовых веществ. С помощью биолюминометра измеряют интенсивность биолюминесценции, определяют зависимость интенсивности биолюминесценции от времени для рабочей и контрольной проб, измеряют индукционный период (Т) биолюминесценции. Характеристикой антиоксидантной активности гуминовых веществ является отношение величин Т в присутствии гуминовых веществ концентрации 0,002 г/л (Т) и в отсутствии гуминовых веществ (Т). Если Т/Т<1, то гуминовые вещества обладают антиоксидантной активностью. Если Т/Т>1, то гуминовые вещества увеличивают оксидантную токсичность раствора.
Пример: Проведено определение антиоксидантной активности гуминовых веществ (Препарат Гумат-80, Иркутск) в растворах неорганического окислителя - феррицианида калия. Для этого сравнивали времена задержки свечения в растворах феррицианида в присутствии гуминовых веществ и без. Предварительно определяли концентрацию феррицианида, при которой Т=4 мин. Для этого варьировали концентрацию феррицианида в растворах, состав которых описан ниже.
-4
Для приготовления растворов использовали 0,05 М калий-фосфатный буфер (рН 6,9). Во флакон Комплекта Реактивов Аналитической Биолюминесценции (КРАБ) вносили 1 мл калий-фосфатного буфера с ДТТ 0,05 М. Интенсивность биолюминесценции измеряли в растворах следующего состава: 5 мкл раствора КРАБа, 50 мкл 0,0025% раствора миристинового альдегида, 50 мкл 5·10 М раствора флавинмононуклеотида, 150 мкл 0,05 М калий-фосфатного буфера рН 6,9, 200 мкл
-4
-4
4·10 М раствора NADH, 50 мкл раствора феррицианида калия различных концентраций (0-5·10 M).
0
-5
Строили зависимость интенсивности биолюминесценции (I/I) от времени (фиг.1). Выбрали концентрацию ферриципнида 10 М, при которой Т=4 мин. (контрольная проба). В выбранный раствор добавляли 5 мкл раствора гуминовых веществ различных концентраций (0÷0,002 г/л) и таким образом готовили рабочие пробы. Снова регистрировали зависимость интенсивности биолюминесценции от времени, а затем определяли Т. Строили зависимости Т от концентрации гуминовых веществ (фиг.2).
ГВ
ГВ
0
0
Антиоксидантную активность гуминовых веществ в растворе феррицианида оценивали по отношению величин Т в присутствии гуминовых веществ концентрации 0,002 г/л (Т) и в их отсутствии (Т). В нашем случае Т/Т=2,7, что свидетельствует об увеличении оксидантной токсичности раствора в присутствии гуминовых веществ.
Преимущества заявляемого способа заключаются в том, что он определяет антиоксидантную активность гуминовых веществ по изменению интегральной токсичности всех окислителей присутствующих в растворе, прост, не требует сложного оборудования и дорогостоящих реактивов и является чувствительным и экспрессным (10-30 мин).