Способ оценки степени анаплазии клеток в культуре глиомы
METHOD FOR ESTIMATING THE DEGREE OF CELL ANAPLASIA IN THE GLIOMA CULTURE

Изобретение относится к области молекулярной биологии и нейрогенетики, конкретно к способам оценки степени анаплазии клеточных культур глиом. Культуры клеток глиом используют для испытания лекарственных средств, схем лечения, подбором препаратов при персонализированной медицине. При этом актуальна задача стратификации культур по признакам степени злокачественности глиомы. На уровне опухолевой ткани эта задача решается гистологическими методами, оценивая морфологическое состояние клеток (1). Степень анаплазии клеток связана со степенью злокачественности глиомы, что иллюстрирует таблица 1.
Ранее гистологический метод для большинства опухолей был основным инструментом диагноза, позволяющим сделать долгосрочный прогноз. Однако при верификации патоморфологического диагноза и определении степени злокачественности глиальных опухолей возникают диагностические ошибки, достигающие от 38 до 64% в ведущих клиниках.
Существует способ оценки степени анаплазии клеток глиомы по плоидности ДНК опухоли, содержанию клеточной ДНК и проценту фракции S-фазы с использованием фиксированных формалином, залитых в парафин образцов (3). Однако материал исследования предполагал изначальную неоднородность, а результаты способа не коррелировали со степенью злокачественности опухоли.
Известен способ проточной ДНК цитометрии, описанный при раках различных локализаций. Методом ДНК проточной цитометрии изучалось содержание ДНК в опухолевых клетках. Данный метод позволяет определить плоидность опухолевых клеток, количество анеуплоидных клеток в опухоли, распределение по фазам клеточного цикла, а также определить индекс пролиферации, но не отличается точностью и воспроизводимостью (4).
Прототип
Известен способ дифференциальной диагностики глиом на основании анализа экспрессии генов и микро-РНК, включающий выделение тотальной РНК из тканевых проб глиом и перифокальной зоны, обратную транскрипцию, с последующей амплификацией в режиме реального времени RT-PCR, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO, и микро-РНК hsa-miR-92-1-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии Е с использованием трех высокоспецифичных референсных генов: PSMC4, ТВР, RPLO и двух референсных высокоспецифичных микро-РНК: hsa-miR-126-5p, hsa-miR-7-5p, сравнивают полученные значения Е в опухолевой ткани с контрольными и при значениях EEGFR<0,5 или EEGFR>1,5, EMSIK0.5 или EMSI1>1,5, Ehsa-miR-92a-1-5p<0,5 или Ehsa-miR-92a-1-5р>1,5 хотя бы по одному локусу у пациента диагностируется глиома высокой степени злокачественности III, IV; отсутствие изменений экспрессии указанных локусов относительно контроля свидетельствует о соответствии опухоли II степени злокачественности (5). Этот аналог выбран нами в качестве прототипа. К недостаткам прототипа можно отнести сложность осуществления. Анализируются пять генетических локусов EGFR, MSI1, PSMC4, ТВР, RPLO (два таргетных гена и три референсных) и три микро-РНК. Кроме того, прототип не позволяет различать глиомы высоких грейдов, III и IV.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является упрощение и повышение точности способа.
Предлагаемый способ решения данной задачи заключается в следующем. Из культуры клеток выделяют тотальную РНК одним из общедоступных методов. Осуществляют синтез первой цепи кДНК в реакции обратной транскрипции. С полученной матрицей осуществляют реакцию ПЦР в реальном времени и определяют уровни экспрессии генов Sox2 и CDK6. Затем рассчитывают соотношение экспрессий генов Sox2/CDK6 и по его значению судят о степени анаплазии клеток.
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
1. В исследуемом образце определяют значение соотношения экспрессии двух генов Sox2/CDK6 вместо определения экспрессии пяти генов и трех микро-РНК по прототипу, что упрощает осуществление способа.
2. Заявленный способ позволяет различать глиомы III и IV степеней злокачественности, а прототип нет, что делает заявленный способ более точным.
Нами были проведены исследования, направленные на выявление наиболее перспективных маркеров для оценки степени анаплазии культур клеток глиом. Были выделены первичные культуры из тканей глиом человека различной степени злокачественности. Степень злокачественности определяли согласно рекомендациям WHO 2016 г. Определяли уровни экспрессии генов в культурах при помощи количественной РТ-ПЦР. После чего, используя корреляционный анализ, выявили группу генов, экспрессия которых имела наиболее сильную связь со степенью злокачественности культур. В качестве наиболее подходящих маркеров мы отобрали гены Sox2 и CDK6.
CDK6. Белок, кодируемый этим геном, является членом семейства сериновых / треониновых протеинкиназ CMGC. Эта киназа является каталитической субъединицей комплекса протеинкиназ, который важен для прохождения фазы G1 клеточного цикла и перехода G1/S. Измененная экспрессия этого гена наблюдалась при множественных раковых заболеваниях человека.
Sox2. Этот ген кодирует члена семейства транскрипционных факторов SRY-related HMG-box (SOX), участвующих в регуляции эмбрионального развития и в определении судьбы клеток. Продукт этого гена необходим для поддержания стволовых клеток в центральной нервной системе.
Объединение двух показателей, отражающих разные стороны одного процесса, в один зачастую бывает весьма продуктивным. Мы рассчитали соотношение экспрессий генов Sox2/CDK6 в группах культур клеток глиом разной степени анаплазии. Результаты представлены в таблице 2.
Мы выбрали граничные значения соотношения экспрессии генов Sox2/CDK6. При его значении ≤0,11 степень анаплазии клеток соответствует II грейду, при значении большем 0,11, но меньше 0,7 степень анаплазии клеток соответствует III грейду, а при значении ≥0,7 наблюдается анаплазия клеток IV грейда.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1
6
Больной Ч., 46 лет, проведена операция по удалению внутримозговой опухоли левой височной доли. Из биоптата опухоли выделена первичная культура клеток. Клетки в количестве 10 снимали скребком с поверхности культурального флакона и переносили в чистую пробирку. Дважды отмывали буфером PBS и суспендировали в 0,1 мл PBS. Тотальную РНК выделяли реагентом TRI REAGENT (MRC, США) в соответствии с протоколом производителя. Полученную РНК растворяли в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC) и измерили концентрацию РНК на спектрофотометре.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли готовыми наборами «MMLV RT kit» (Евроген, Россия) по прилагаемому протоколу. На общий объем 20 мкл инкубационной смеси использовали 2 мкг тотальной и 2 мкл олиго(dT)16 праймера. Длительность инкубации 40 минут при 41°. Полученный образец кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР в реальном времени. Уровни экспрессии генов определяли на амплификаторе CFX96 Touch (BioRad,CIIIA). Для проведения реакции использовали «Набор реагентов для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии SYBR Green I R-402» (Синтол, Россия). Параметры реакции: предварительный прогрев при 95°С - 5 мин; 40 циклов (денатурация при 95°С - 10 сек, отжиг и элонгация при 60°С - 30 сек). К каждому из выбранных генов были подобраны праймеры для проведения количественного ПЦР в реальном времени. Нуклеотидная последовательность прямого и обратного праймеров, 5'-3', CDK6 (CTGAATGCTCTTGCTCCTTT; AAAGTTTTGGTGGTCCTTGA), Sox2 (ACACCAATCCCATCCACACT; CCTCCCCAGGTTTTCTCTGT). Экспрессию генов определяли относительно нуля и расчитывали, используя программное обеспечение, поставляемое с прибором.
Значение отношения экспрессии генов Sox2/CDK6 составило 0,0295. Следовательно, степень анаплазии клеток соответствует II грейду. В дальнейшем больному Ч. на основании клинических, морфологических и молекулярно-генетических исследований был поставлен диагноз диффузная астроцитома, относящаяся к II грейду злокачественности.
Пример 2
Больная А., 26 лет. Удалена опухоль правой теменной доли. Предварительный диагноз - глиобластома, IV грейд злокачественности. Из биоптата выделена первичная культура клеток и исследована заявленным способом. Значение отношения экспрессии генов Sox2/CDK6 составило 45,07. Это значение превышает граничное значение 0,7. На основании этого мы сделали вывод, что наблюдается анаплазия клеток IV грейда. Через несколько дней первичный диагноз А. подтвердился.
Заявленный способ может служить быстрым, простым и точным дополнительным способом оценки степени анаплазии культур клеток глиом.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Daumas-Duport С. et al. Oligodendrogliomas. Part II: A new grading system based on morphological and imaging criteria // Journal of neuro-oncology. - 1997. - T. 34. - №. 1. - C. 61-78.
2. Рецидив нейроэпителиальных опухолей головного мозга у детей, Ким Александр Вонгиевич, АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук.
3. El-Rayes В.F. et al. Cellular DNA content parameters as prognostic indicators in human astrocytomas // Journal of neuro-oncology. - 2005. - T. 71. - №. 2. - C. 85-89.
4. Неродо Г.А. и др. Днк-цитометрические показатели у пациентов с раком яичников // Казанский медицинский журнал. - 2017. - Т. 98. - №. 4.
5. Патент РФ №2709651, Кит О.И. и др. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЛИОМ НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И МИКРО-РНК. - 2019.