Устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo
DEVICE FOR QUANTITATIVE ESTIMATION OF FLUORESCENCE AND OPTICAL CHARACTERISTICS OF TISSUE IN VIVO

Изобретение относится к медицине и медицинской технике и предназначено для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo.
Известно много способов и устройств для определения концентраций интересующих биохимических составляющих ткани. Известно устройство для прямого определения количественных параметров клеточных структур (патент RU 2152023, G01N 21/59, опубл. 27.06.2000 г.), выполненное в виде цитофотометрический окуляр-приставки к серийному микроскопу, измерение на которой осуществляется по принципу сравнения и уравнивания интенсивности светового пучка, прошедшего через выделенный из организма измеряемый объект (ядро, клетку, часть микроструктуры клеточной ткани) и эталон.
Также известно устройство для определения концентрации органического вещества в ткани (патент RU 2016540, A61N 5/00, опубл. 30.07.1994 г.), которое после введения подкожной иглы в ткань нагнетает несколько микролитров перфузата в анализатор, измеряющий, например, электрическую проводимость перфузата и рассчитывающий концентрацию биологического вещества по данной величине.
Главным недостатком данных устройств и соответствующих методик проведения исследований является их инвазивность. Устройства предполагают измерения in vitro, а следовательно, время получения результатов слишком велико и ограничивает сферу применения данных методов.
Также широко известно о таких физико-химических способах определения концентрации веществ в биологических жидкостях, как хроматографические методы (например, патент RU 2044317, G01N 30/06, опубл. 20.09.1995 г.) или способы определения концентрации веществ, например серотонина и гистамина, при помощи химических реакций и/или регистрации флюоресценции биожидкостей, например слюны (патент RU 2244307, G01N 33/52, опубл. 10.01.2005 г.). Методы предполагают экстрагирование в данном случае серотонина и гистамина из слюны, проведение ряда химических реакций и регистрацию спектров флюоресценции продуктов этих реакций. По интенсивности флюоресценции проводятся расчеты концентраций интересующих составляющих исследуемой биожидкости.
Для таких способов к недостаткам вышеперечисленных устройств можно добавить еще и необходимость использования расходных материалов.
Известны также системы, в которых содержание флюоресцирующих веществ в исследуемом объекте проводится путем визуальной оценки флюоресценции биологического объекта in vivo. Например, в статье (Булгакова Н.Н., Волков Е.А., Позднякова Т.И. Аутофлуоресцентная стоматоскопия как метод онкоскрининга заболеваний слизистой оболочки рта. Российский стоматологический журнал, 2015, 19 (1), с. 27-30) используется метод аутофлуоресцентной визуализации. Для его реализации пользователь использует специальные очки, позволяющие наблюдать возникающее эндогенное свечение флюорофора.
Однако визуальный количественный контроль содержания флюорофора в тканях порождает большие ошибки и неточности, вызванные субъективностью восприятия зрительным анализатором оптического излучения различных длин волн.
К устройствам, способным in vivo измерять количественное содержание флюоресцирующих веществ в тканях и слизистых оболочках, следует отнести ряд приборов, использующихся для контроля фотодинамической терапии (ФДТ). Известно, что ФДТ предполагает введение в организм пациента экзогенных фотосенсибилизаторов (ФС), селективно накапливающихся в опухоли. Для определения границ опухоли, а также для контроля динамики накопления и выведения ФС используют флюоресцентные методы измерения содержания ФС в области патологии и в здоровых (интактных) тканях. Среди отечественных приборов для этих целей можно упомянуть ряд лазерных установок для флюоресцентной диагностики и контроля фотодинамической терапии. В статье (Линьков Г.К., Березин А.Н., Лощенов В.Б. Аппаратура для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии. Российский биотерапевтический журнал, 2005, 4 (4), с. 114-119) описан принцип действия одной из таких систем (ЛЭСА-01-Биоспек). Установка состоит из спектрометра, лазера с фильтрами и системой ввода излучения в оптическое волокно в качестве источника света для возбуждения флюоресценции, а также волоконно-оптического диагностического зонда. Зонд включает в себя приемные и облучающие волокна, конструктивно объединенные в дистальной части. Дистальный конец зонда может быть введен в биопсийный канал эндоскопа для диагностики внутренних органов или в пункционную иглу для проведения измерений внутри ткани. Использование компьютерной программы, обрабатывающей сигнал со спектрометра, позволяет в реальном масштабе времени определять в относительных единицах степень накопления фотосенсибилизатора в исследуемой ткани, наблюдать спектры, измерять их параметры, а также производить вычисления площадей под спектральными кривыми и определять другие параметры спектров.
Известен также диагностический комплекс для измерения медико-биологических параметров кожи и слизистых оболочек in vivo компании ООО «ЛАЗМА» (патент RU 2337608, G01N 21/47, опубл. 10.11.2008 г.). В этом комплексе излучение с определенной длиной волны от блока источников первичного оптического излучения доставляется к поверхности ткани при помощи жгута оптических волокон, дистальный конец которого контактирует с поверхностью исследуемой ткани. Вторичное излучение по приемным волокнам жгута транспортируется в блок оптико-электронной системы регистрации и устройство сбора и трансляции данных. Блок обработки результатов диагностики выводит на экран монитора зависимость интенсивности излучения от длины волны, дополнительными алгоритмами обработки данных прибор не оснащен.
В этих двух устройствах при количественном анализе спектров вторичного излучения и флюоресценции, выведенных на монитор прибора или персонального компьютера (ПК), также возникает ряд затруднений и неточностей. Известно, что величина интенсивности флюоресценции любого объекта зависит от мощности зондируемого излучения, геометрии измерения, а также, что немаловажно, от рассеивающих и поглощающих свойств самого объекта. Попытки учесть данные особенности привели к возникновению различных алгоритмов нормировки и появлению различных неуинфицированных диагностических критериев (Рогаткин Д.А., Приснякова О.А., Моисеева Л.Г., Черкасов А.С. Анализ точности лазерной клинической флюоресцентной диагностики. // Измерительная техника, 1998, №7, С. 58-61; Лощенов В.Б., Волкова А.И., Прохоров A.M., Стратонников А.А. Портативная спектроскопическая система для флюоресцентной диагностики опухолей и контроля за фотодинамической терапией. // Росс. Химический журнал, 1998, XLII, №5, С. 50-53; Рогаткин Д.А. Физические основы лазерной клинической флюоресцентной спектроскопии in vivo. Лекция // Медицинская физика, 2014, №4, с. 78-96).
Кроме того, большинство таких критериев, скорее, связаны с оптическими, но не биологическими свойствами среды. Поэтому крайне важно осуществить переход от физических величин к медико-биологическим параметрам ткани или слизистых, в частности к количественной интерпретации результатов в уровнях накопления или концентрации флюорофоров в ткани. В связи с этим к основному недостатку вышеописанных приборов следует отнести отсутствие физически обоснованного преобразования измеренных оптических величин в концентрации флюоресцирующих веществ и отсутствие, соответственно, необходимых аппаратных и программных средств для этого.
Обобщая сказанное, все известные диагностические системы и методы, предназначенные для оценки содержания флюорофоров в тканях, как правило, представляют собой комбинацию аппаратной части - узлов и блоков, необходимых для проведения спектроскопических измерений, в частности: волоконно-оптический датчик, спектрометр, источник света, система управления и вычислительная техника, и программного обеспечения, то есть алгоритмов обработки исходных данных для восстановления количественного спектра флюоресценции и вычисления концентрации флюорофоров. Программная часть, как правило, включает алгоритм расчета оптических свойств ткани, которые в дальнейшем используются для вычисления концентрации флюорофоров. Для определения оптических свойств (коэффициентов отражения, рассеяния, поглощения и др.) в широком диапазоне спектра такие устройства, помимо лазеров, обычно снабжены дополнительным источником белого света. В этом случае известна методика, когда до или после зондирования поверхности исследуемой ткани лазерным излучением, возбуждающим флюоресценцию, и снятия вторичного спектра происходит воздействие на эту же область белым светом с целью получения спектров диффузного отражения (патенты СА 2576264 A1, US 20110042580 A1 и др.).
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей (заявка РСТ WO 2011088571 А1, опубл. 28.07.2011 г.). Данное устройство предназначено для количественного определения концентрации флюоресценции и оптических свойств мутной среды, такой как биологическая ткань, и используется для получения количественного спектра флюоресценции (то есть скорректированного спектра флюоресценции с учетом оптических параметров ткани) и концентрации флюорофоров. Устройство включает в себя оптический зонд, на дистальном коне которого находится наконечник, обеспечивающий возможность непосредственного контакта зонда с поверхностью ткани, а на приборном конце расположены разъемы для его соединения с источниками и приемниками излучения, при этом зонд включает в себя четыре и более отдельных оптических волокна, выполненных с возможностью соединения при помощи наконечников-разъемов к системе управления; по меньшей мере три светодиода, по меньшей мере один из которых выполнен с возможностью возбуждения флюоресценции, а по меньшей мере два других светодиода выполнены с возможностью обеспечения измерения спектров диффузного отражения; спектрометр, взаимодействующий с устройством обработки; детектор вторичного излучения, по меньшей мере, два источника белого света для снятия спектров диффузного отражения; систему контроля первичного и вторичного излучений, содержащую блок вывода данных, управляемую устройством обработки (например, компьютером) через порт вывода данных; блок вывода данных выполнен с возможностью управления по меньшей мере тремя светодиодами; по меньшей мере, четыре порта подключения, выполненных с возможностью соединения с системой контроля первичного и вторичного излучений, при этом по меньшей мере три из них выполнены с возможностью соединения оптических волокон с источниками первичного излучения, а один выполнен с возможностью соединения приемного волокна с детектором посредством разъема, расположенного на конце волокна, подключаемого к спектрометру с соответствующим фильтром; и источник питания.
Оптоволоконный зонд включает в себя четыре и более отдельных оптических волокна, оформленных в отдельные жгуты, которые при помощи наконечников-разъемов присоединяются к системе управления. Волокна на дистальном конце основного жгута выстроены в линейный массив с различными известными расстояниями (d) друг от друга. Одна пара источник-детектор используется для измерения спектра флюоресценции тканей. Другие пары волокон используются для измерения диффузных спектров отражения на разных расстояниях.
Обработка данных осуществляется программно на ПК. ПК может включать в себя программное обеспечение для сбора данных с устройства, в частности, в нем программно задается последовательность измерений.
Пример минимально необходимых измерений для этого устройства:
1
1. Белый свет: спектр отражения на расстоянии d=260 мкм
2
2. Белый свет: спектр отражения на расстоянии d=520 мкм
3
3. Спектр флюоресценции (405 нм возбуждение) на расстоянии d=260 мкм
4. Сигнал фона.
В этом примере последовательность измерений занимает приблизительно 0.5 секунд. Смена источников воздействия происходит при помощи сверхскоростного затвора.
Одним из существенных недостатков данного устройства является несоответствие диагностических объемов при проведении измерений на шагах 1-3. Из-за предложенной геометрии расположения оптических волокон область освещения источником возбуждения флюоресценции не совпадает с областью воздействия белого света, что заведомо приводит к неточности вычислений. Кроме того, при таком взаимном расположении осветительных и приемных волокон поворот наконечника зонда на незначительный угол вокруг своей оси приведет к смещению диагностического объема, т.е. к прохождению света через другие структуры ткани, а следовательно, сравнение повторных измерений может оказаться некорректным.
r
s
Использование в данном устройстве нескольких волоконно-оптических расстояний для измерения диффузного отражения связано с методами измерения оптических свойств ткани. Авторами был предложен спектрально-ограниченный диффузный метод отражения, который позволяет использовать одну пару приемных и осветительных волокон, расположенных на расстоянии d. Поскольку выполняется только одно измерение спектра отражения при длине волны λ, решение для коэффициентов отражения (μ) и рассеяния (μ) опирается на спектральные ограничения, то есть на априорно постулированную взаимосвязь данных коэффициентов, которая затем может быть использована для нахождения абсолютных значений коэффициентов.
r
s
Недостатком предложенного алгоритма является сравнительно ограниченный диапазон значений оптических коэффициентов μ и μ, которые могут быть получены с помощью однократного измерения спектра диффузного отражения. Таким образом, одной из целей использования нескольких расстояний источник-детектор для измерения диффузного отражения в устройстве-прототипе является охват большего динамического диапазона оптических свойств.
xm
m
В прототипе оптическое излучение на длине волны возбуждения с помощью оптоволоконного зонда доставляется к ткани, в которой происходит рассеяние и поглощение в соответствии с оптическими свойствами ткани. Когда фотоны первичного излучения поглощаются флюорофорами, некоторые из фотонов переизлучаются на длине волны флюоресценции в соответствии с квантовым выходом. Попадая в приемное волокно, расположенное на расстоянии d от освещающего, данные фотоны регистрируются детектором. Далее полагая, что измеренный поток флюоресценции (F) линейно зависит от коэффициента диффузного отражения на длине волны эмиссии (R) в рамках предложенного спектрально-ограниченного диффузного приближения выражение для измеренного (нескорректированного) потока флюоресценции принимает вид:
t,x
x
x,m
a
ƒ,x
а
,х
a
Здесь R - коэффициент общего диффузного отражения, обозначающий долю фотонов возбуждения, которые диффузно отразились, зависящий от внутреннего параметра отражения k, а также от альбедо (λ), которые определяются диффузионным приближением. Q - квантовый выход флюоресценции, μ - коэффициент поглощения флюорофора на длине волны возбуждения, μ - общий коэффициент поглощения, x - произвольная длина волны флюоресценции.
aƒ,x
а
,x
Если вклад поглощения флюорофора пренебрежимо мал по сравнению с поглощением ткани, т.е. μ<<μ, то уравнение для количественной флюоресценции принимает вид
а
,х
x,m
а
ƒ,x
а
,x
Очевидно, что если μ стремится к нулю, скорректированная, количественная флюоресценция ƒ не должна стремиться к нулю. Однако, основное ограничение, при котором верно уравнение (2), есть μ<<μ, то есть при малом коэффициенте поглощения это уравнение будет недействительным.
а
,х
s,x
а
,m
s,m
Вычисление спектра количественной флюоресценции по уравнению (2) требует знания оптических свойств ткани μ и μ'. Авторы используют волоконно-оптическую пару источник-коллектор для измерения спектра диффузного отражения и метод спектрально-ограниченного диффузного отражения. В качестве широкополосного источника возбуждения выступает белый свет со спектральным диапазоном 450-850 нм. Оптические свойства здесь обозначаются как μ и μ', где длина волны m - одна любая длина волны в диапазоне возбуждения.
а
s
а
s
а
s
Спектр отражения измеряют с помощью приемного оптического волокна, расположенного на расстоянии d от осветительного волокна. Сигнал флюоресценции здесь считается пренебрежимо малым по сравнению с уровнем сигнала отражения. Поскольку существует только одно измерение коэффициента отражения на каждую длину волны, решение для μ(λ) и μ'(λ) опирается на априорно принятые формы спектров поглощения и рассеяния в диапазоне возбуждения. Таким образом, ставится задача определения μ(λ) и μ'(λ) по всему спектральному диапазону 450-850 нм, затем μ(λ) и μ'(λ) извлекаются путем экстраполяции на нужную длину волны. Спектр поглощения моделируются в виде линейной комбинации вкладов отдельных оксигемоглобина и дезоксигемоглобина:
а
a
Hb
2
oxyHb
deoxyHb
где μ(λ) и μ(λ) - коэффициенты поглощения окси- и дезоксигемоглобина, соответственно, при концентрации 1 г/л. С - общая концентрация гемоглобина и StO - уровень оксигенации.
Также в данных алгоритмах используется простая степенная зависимость спектра коэффициента рассеяния от длины волны:
где А и b - константы.
s
Использование таких априорных спектров может быть справедливо лишь в определенном диапазоне значений коэффициентов μ'(λ), зависящем от d.
Используя априорно известные спектры, диффузионное приближение и алгоритм Левенберга-Марквардта, авторы прототипа находят значение коэффициента отражения по формуле
а
s
Здесь , μ(λ) и μ'(λ) определяются из уравнений (3) и (4), в приближениях данной задачи
x,m
x,m
Таким образом, снимая значение флюоресценции F на определенной длине волны x, по формуле (3), вычисляя коэффициент отражения для реперной области, используя спектр отражения белого света по формуле (5), вычислив R для длин волн возбуждения и флюоресценции по формуле (2), можно получить количественный параметр флюоресценции. Количественный спектр излучения f далее может быть использован для количественной оценки концентрации флюорофора С, с учетом априорного базисного спектра флюоресценции δ(λ), эквивалентного одной единице измерения концентрации [мг/мл]. Исходя из этого ƒ(λ)=δ(λ)с, следовательно, применяя псевдоинверсию, получают:
Алгоритм сложный и очень неточный, т.к. опирается на априорно принятые зависимости и справедлив лишь в определенном диапазоне значений оптических свойств.
Еще одним недостатком прототипа устройства является то, что в нем не предусмотрена коррекция влияния передаточной функции на показания измерений. Дело в том, что даже среди серии приборов, выпущенных одной компанией, измеренные спектры вторичного излучения одного и того же объекта могут не совпадать друг с другом (Рогаткин Д.А. и др. Метрологическое обеспечение методов и приборов неинвазивной медицинской спектрофотометрии // Мед. техника, №2, 2010. - с. 31-36). Для исключения таких ошибок необходимо иметь механизм калибровки, регулирующий отношение регистрируемых сигналов рассеяния и флюоресценции.
Таким образом, существует потребность в устройстве, лишенном вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом изобретения является устранение указанных выше недостатков устройства-прототипа и создание конструкции более точного и чувствительного спектрального устройства для in vivo измерения содержания фотосенсибилизаторов и других флюоресцирующих веществ в биологических тканях, которое позволит не только контролировать ход ФДТ, но и прогнозировать развитие и течение регенеративных процессов в тканях, определять их жизнеспособностей и отслеживать процессы резорбции устанавливаемых биодеградируемых имплантатов (матриксов) путем отслеживания содержания природных флюорофоров в тканях.
Для достижения данного технического результата предлагаемое устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo, содержащее оптический зонд, на дистальном конце которого находится наконечник, обеспечивающий возможность непосредственного контакта зонда с поверхностью ткани, а на проксимальном конце расположены наконечники-разъемы для его соединения с системой контроля, при этом зонд включает в себя систему транспортировки первичного излучения от блока источников к биологической ткани и вторичного излучения от биологической ткани к блоку фильтра, представленную несколькими отдельными оптическими волокнами, по меньшей мере одно из которых представляет собой приемное волокно и несколько осветительных волокон, и объединенными в общий жгут, разветвляющийся на проксимальном конце по меньшей мере на два осветительных и один приемный жгуты, выполненные с возможностью соединения при помощи наконечника-разъема с оптическими разъемами; систему контроля, включающую в себя блок источников первичного излучения, включающего в себя по меньшей мере один узкополосный источник излучения для возбуждения флуоресценции и по меньшей мере один источник белого света, блок фильтра, спектрометр, блок управления и входных данных, выполненный с возможностью соединения со всеми источниками первичного излучения и спектрометром, и блок питания; соответствующее количеству источников излучения количество оптических разъемов, выполненных с возможностью соединения с системой контроля и наконечниками-разъемами, при этом по меньшей мере один оптический разъем выполнен с возможностью соединения приемного жгута с блоком фильтра посредством наконечника-разъема, расположенного на конце приемного жгута, а остальные оптические разъемы выполнены с возможностью соединения оптических волокон осветительных жгутов с источниками первичного излучения; разъем данных, выполненный с возможностью подключения к компьютеру, и кабель питания, при этом выход блока управления и входных данных выполнен с возможностью соединения со входами источников первичного излучения, выходы которых выполнены с возможностью через оптические разъемы и наконечники-разъемы соединения со входом системы транспортировки излучения, выход системы транспортировки излучения выполнен с возможностью соединения со входом блока фильтра, выход блока фильтра выполнен с возможностью соединения со входом спектрометра, выход которого выполнен с возможностью соединения со входом блока управления и входных данных, выход которого выполнен с возможностью соединения через разъем данных с компьютером, отличается тем, что система транспортировки выполнена таким образом, что в дистальной части оптического зонда, обращенной к биологической ткани, по центру жгута оптических волокон расположено приемное оптическое волокно, выполненное с возможностью соединения с блоком фильтра, а вокруг приемного волокна по радиусу равномерно расположено по меньшей мере двадцать оптических волокон с возможностью соединения по меньшей мере с двумя источниками первичного излучения; блок фильтра, включающий в себя коллимирующую систему из двух фокусирующих линз, первая из которых является рассеивающей, а вторая собирающей, ослабляющий оптический фильтр, помещенный между линзами, и передвижное устройство, выполненное с возможностью перемещения фильтра перпендикулярно главной оптической оси линз.
На фиг. 1 представлена общая схема устройства.
На фиг. 2 представлена схема общего жгута.
На фиг. 3 представлена схема блока фильтра.
В основу принципа действия предлагаемого устройства для in vivo определения содержания фотосенсибилизаторов и других флюорофоров в тканях легли известные принципы лазерной флюоресцентной и абсорбционной спектроскопии. Оптическое излучение, доставленное к биологической ткани, возбуждает флюоресценцию различных природных (порфирины, коллаген, эластин, NADH и т.д.) или искусственно введенных флюорофоров, а также поглощается и рассеивается в ткани. По характерным максимумам спектра флюоресценции может устанавливаться наличие тех или иных флюоресцирующих веществ в исследуемой области, однако, на спектр флюоресценции, помимо содержания флюорофоров, значительно влияют как оптические параметры среды, так и приборные характеристики (мощность зондируемого излучения, геометрия измерения). Поэтому для определения количества интересуемых флюорофоров в тканях или слизистых необходимо учесть влияние всех вышеописанных факторов.
Предлагаемое новое устройство (Фиг. 1) для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo содержит оптический зонд (1), на дистальном конце которого находится наконечник (2), обеспечивающий возможность непосредственного контакта зонда с поверхностью биологической ткани (3). На проксимальном конце расположены наконечники-разъемы (4) для его соединения с системой контроля (5). Зонд включает в себя систему транспортировки (6) первичного излучения от блока источников (7) к биологической ткани (3) и вторичного излучения от биологической ткани (3) к блоку фильтра (8). Система транспортировки (6) представлена несколькими отдельными оптическими волокнами, по меньшей мере одно из которых представляет собой приемное волокно (9') и по меньшей мере двадцать - осветительные волокна (9'') (Фиг. 2), объединенными в общий жгут (10), разветвляющийся на проксимальном конце по меньшей мере на один приемный (10') и по меньшей мере два осветительных жгута (10''), выполненных с возможностью соединения при помощи наконечника-разъема (4) с оптическими разъемами (11).
Устройство включает в себя систему контроля (5), включающую в себя блок источников первичного излучения (7), включающий в себя по меньшей мере один узкополосный источник излучения (12) для возбуждения флуоресценции и по меньшей мере один источник белого света (13), выполненный с возможностью обеспечения измерения спектров диффузного отражения.
Устройство также включает в себя блок фильтра (8), спектрометр (14), блок управления и входных данных (15), выполненный с возможностью соединения со всеми источниками первичного излучения (12), (13) и спектрометром (14), и блок питания (16), а также соответствующее количеству источников излучения количество оптических разъемов (11), выполненных с возможностью соединения с системой контроля (5) и наконечниками-разъемами (4), выполненных с возможностью соединения осветительных оптических волокон (9'), (9'') осветительных жгутов (10') с блоком источников (7) первичного излучения, и, по меньшей мере, один дополнительный оптический разъем (11), выполненный с возможностью соединения приемного жгута (10') с блоком фильтра (8) посредством наконечника-разъема (4), расположенного на конце приемного жгута (10'). Разъем данных (17), выполненный с возможностью подключения к компьютеру, и кабель питания (18), при этом выход блока управления и входных данных (15) выполнен с возможностью соединения со входами блока источников первичного излучения (7), выходы которых выполнены с возможностью через оптические разъемы (11) и наконечники-разъемы (4) соединения со входом системы транспортировки излучения (6), выход системы транспортировки излучения (6) выполнен с возможностью соединения со входом блока фильтра (8), выход блока фильтра (8) выполнен с возможностью соединения со входом спектрометра (14), выход которого выполнен с возможностью соединения со входом блока управления и входных данных (15), выход которого выполнен с возможностью соединения через разъем данных (17) с компьютером.
Система транспортировки (6) выполнена таким образом, что в дистальной части оптического зонда (1), обращенной к биологической ткани (3), по центру общего жгута (10) оптических волокон расположено приемное оптическое волокно (9'), выполненное с возможностью соединения с блоком фильтра (8), а вокруг приемного оптического волокна (9') по радиусу равномерно расположены по меньшей мере двадцать оптических осветительных волокон (9''), выполненных с возможностью соединения по меньшей мере с одним узкополосным источником (12) и одним источником белого света (13). Блок фильтра (8), включающий в себя коллимирующую систему (19), состоящую из двух фокусирующих линз, первая из которых является рассеивающей (19'), а вторая собирающей (19''), ослабляющий оптический фильтр (20), помещенный между линзами (19'), (19''), и передвижное устройство (21), выполненное с возможностью перемещения фильтра (20) перпендикулярно главной оптической оси линз (19'), (19'') (Фиг. 3).
Для практических медицинских задач используется по меньшей мере 1, а обычно 3-4 узкополосных лазерных источника (12) излучения, генерирующих излучение, например, на длинах волн 365 нм, 405 нм, 532 нм и 632 нм. Но для целей пояснения конструкции устройства и принципа ее работы достаточно рассмотреть один узкополосный лазерный источник, поэтому далее рассматривается вариант устройства с одним источником. В качестве источника белого света (13) может использоваться стандартный ксеноновый источник белого света на основе ксеноновой лампы. Блок управления и входных данных (15) через разъем данных (17) подключается к стандартному персональному компьютеру с необходимым программным обеспечением, которое позволяет на основе регистрируемых оптических сигналов вычислять искомые значения уровней накопления или концентрации флюорофоров в ткани.
Отличительными особенностями конструкции являются следующие элементы:
1. Система транспортировки (6), доставляющая первичное оптическое излучение от блока источника (7) к поверхности биологической ткани (3), а также вторичное обратно рассеянное излучение и излучение флюоресценции в блок фильтра устройства (8), выполненный в виде коллимирующей системы (19) из двух фокусирующих линз, первая из которых является рассеивающей (19'), а вторая собирающей (19''), ослабляющего оптического фильтра (20), помещенного между линзами (19'), (19''), и передвижного устройства (21), перемещающего оптический фильтр (20) перпендикулярно главной оптической оси линз (19'), (19''); выполнена в виде стандартного оптоволоконного жгута с разветвленной приборной и единой рабочей частью - дистальной частью жгута, а в дистальной части жгута, обращенной к биологической ткани, в центе располагается приемное оптическое волокно (9') с диаметром сердцевины d, например d=400 мкм, которое на приборной части соединяется с блоком фильтра (8), а вокруг приемного волокна (9') по радиусу r, превышающему диаметр сердцевины приемного оптического волокна d, равномерно расположено по меньшей мере 20 и до 100 освещающих волокон (9'') меньшего диаметра, например 100 мкм (Фиг. 2). Эти освещающие волокна на приборном конце основного жгута (10) собраны в отдельные осветительные жгуты (10''), которые подключаются к блоку источников излучения (7), каждое разветвление к своему источнику. За счет большого количества освещающих волокон к каждому источнику может подходить от 10 до 35 волокон. Такое их число в дистальной части позволяет их расположить и «перемешать» равномерно по окружности, таким образом формируя единый диагностический объем для всех длин волн.
В качестве примера может быть рассмотрен жгут, который состоит из 76 освещающих волокон. Из этих 76 волокон 7 доставляют излучение к биологической ткани от источника красного излучения (635 нм), 7 - от зеленого (515 нм), 31 волокно - от источника синего излучения (405 нм), и 31 волокно доставляет белый свет. При такой геометрии измерения вклад сигнала от различных освещающих волокон в диагностический объем одинаков, освещение диагностического объема происходит равномерно всеми длинами волн, а поворот дистального конца оптоволокна вокруг своей оси не влияет на расположение диагностического объема и, как следствие, на результаты измерений.
2. Блок фильтра (8) устройства включает в себя коллимирующую систему (19) из двух фокусирующих линз, первая из которых является рассеивающей (19'), а вторая собирающей (19'') (Фиг. 3), формирующих между ними пучок большого диаметра (примерно 1-2 см), содержит непосредственно ослабляющий оптический фильтр (20), помещенный в широкий пучок между линзами (19'), (19'') и ослабляющий излучение источника на выбранной длине волны в заданное число раз, и передвижное устройство (21), регулирующее площадь перекрытия фильтром этого пучка. Разная площадь перекрытия фильтром пучка позволяет регулировать соотношение пиков обратного рассеяния и флюоресценции, что позволяет корректировать передаточную функцию прибора и, соответственно, настраивать все приборы идентичным образом перед проведением измерений. В случае использования N источников узкополосного лазерного излучения в устройстве должно быть предусмотрено N соответствующих фильтров, перекрывающих пучок света между линзами. Передвижное устройство (21) представляет собой систему регулировочных винтов, позволяющих передвигать фильтр (20) в широком пучке между линзами перпендикулярно главной оптической оси линз, регулируя площадь перекрытия фильтром пучка для возможности калибровки прибора, что позволит сравнивать результаты измерений, полученных на разных устройствах, что важно ввиду наличия расхождений в показаниях современных устройств даже среди приборов одного производителя.
Работа устройства осуществляется следующим образом.
Блок управления и входных данных (15) выполнен таким образом, что он может формировать, принимать и обрабатывать две основные управляющие команды: «наблюдение» и «измерение» таким образом, что по команде «наблюдение» включается выбранный узкополосный источник (12) в непрерывном режиме и происходит непрерывно регистрация спектра вторичного излучения флюоресценции спектрометром (8), а по команде «измерение» в памяти устройства выполнено сохранение последнего измеренного спектра флюоресценции, выключается узкополосный источник (12), на короткое время включается источник белого света (13) и регистрируется спектрометром (8) спектр отражения в белом свете, после чего все измеренные спектры передаются в блок управления и входных данных (15) для вычисления концентрации флюоресцирующего вещества.
Алгоритм, на основе которого проводится вычисление относительной концентрации флюорофоров в предлагаемом устройстве, основан на модифицированной модели Кубелки-Мунка, которая, в отличие от модели прототипа, работает и при малых расстояниях между осветительными и приемными волокнами и потому наиболее пригодна для задач лазерной флюоресцентной спектроскопии (Рогаткин Д.А. Об одной особенности в определении оптических свойств мутных биологических тканей и сред в расчетных задачах медицинской неинвазивной спектрофотометрии / Д.А. Рогаткин // Медицинская техника - 2007. - N 2. - С. 10-16). Применяя данную модель к мутной среде с равномерным распределением флюоресцирующих веществ (Rogatkin D., Guseva L, Lapaeva L. «Nonlinear Behavior of the Autofluorescence Intensity on the Surface of Light-Scattering Biotissues and its Theoretical Proof», Journal of Fluorescence, 2015, 25 (4), p. 917-24) расчет потока флюоресценции с поверхности исследуемого объекта J(0) выполняется по формуле:
0
ƒ
е
e
ƒ
e
ƒ
∞λ
-1
Здесь Φ - возбуждающий монохроматический поток, A(λ) [мм] обозначает часть возбуждающего потока, поглощенного флюорофором на элементарной единице длины dx среды, ϕ(λλ) - квантовый выход флюоресценции, λ, λ - длины волн возбуждения и флюоресценции, соответственно, r - коэффициент отражения ткани на длине волны λ,
,
1
2
-1
-1
где β(λ) [мм] и β(λ) [мм] - коэффициенты затухания и обратного рассеяния исследуемой ткани для модифицированной модели Кубелки-Мунка.
∞λ
1
2
ƒ
ƒ
При этом величины r, β(λ) и β(λ) сложным образом зависят от концентрации C флюорофора, выраженной в относительных единицах (0<C<1).
ƒ
ƒ
Ввиду того, что из уравнения (7) найти зависимость концентрации флюорофоров от регистрируемых параметров среды невозможно, так как зависимость функции J(0) от C достаточно сложная, в предлагаемом устройстве изначально производится расчет функции относительной концентрации Y(C), которая с 98% точностью линейна в пределах оптических параметров биотканей. Данная функция имеет вид:
ƒ
ƒ
Здесь Р - интегральные показатели потоков флюоресценции для исследуемой (C≠0) и реперной (С=0) областей, учитывающие влияние рассеивающих свойств ткани на зарегистрированную интенсивность флюоресценции. Данные показатели рассчитываются по формулам:
ƒ
J''(0) - нормированный на реперную точку поток флюоресценции, обозначающий поток на длине волны λ, нормированный на обратно рассеянный поток, измеренный на данной длине волны, с интактной (реперной) области .
ƒ
Такая нормировка позволяет сохранить линейность функции Y(C) и учесть влияние параметров зондирующего излучения, влияющего на показания флюоресценции. Последнее слагаемое в формуле 8(b) - поправка на нулевую концентрацию:
где
Таким образом, считая коэффициент отражения (Френеля) R постоянным, имея данные спектра отражения и флюоресценции с области исследования и реперной точки, по формулам 8-10 вычисляется значение Y для каждого измерения, при этом динамика функций относительной концентрации полностью совпадает с динамикой концентрации флюорофоров в ткани.
В отличие от алгоритмов, описанных в прототипе, предложенный метод не имеет ограничений на диапазон измеряемых величин, кроме того, ввиду отсутствия необходимости в нахождении каких-либо абсолютных показателей, разработанный алгоритм не использует априорные зависимости, чем упрощает вычисления и повышает их точность. Следует также отметить, что в предложенном способе расчета относительной концентрации флюорофоров учитывается влияние не только оптических показателей среды, но и параметров зондирующего излучения, что отсутствует в алгоритме прототипа.
Исходя из вышеописанного, для определения относительной концентрации флюорофора в интересующей области по формулам 8-10 необходимо помимо детектирования фонового спектра, спектров отражения и флюоресценции с исследуемой области, зарегистрировать спектр отражения с некой реперной точки, в которой концентрация флюорофоров близка к нулевой.