СРЕДСТВО ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОЙ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ
AGENT FOR TREATING ACUTE RADIATION SICKNESS

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения острой лучевой болезни.
17
18
1
16
Легкоизотопная вода (ЛВ) - вода, частично очищенная от дейтерия и тяжелых изотопов кислорода, относительно недавно упоминается в качестве биологически активного вещества [1]. Очистка воды от изотопов дейтерия, а также O и O достигается методом ректификации или воду синтезируют сжиганием очищенных изотопов протия Н и О. При этом концентрация дейтерия снижается со 145-150 ppm в обычной водопроводной воде до 30-35 ppm.
При пониженном содержании дейтерия в питьевой воде отмечают стимулирующее действие на жизненные процессы. При длительном наблюдении за растениями и животными, потреблявшими воду, в которой содержалось дейтерия на 25% ниже естественного содержания, оказалось, что свиньи, крысы и мыши дали потомство, гораздо многочисленнее и крупнее обычного, вдвое увеличилась яйценоскость кур, ускорялось созревание и урожайность пшеницы [2].
По данным [3, 4], вода с содержанием дейтерия на уровне 130-135 ppm увеличивает как всхожесть, так и скорость развития проростков семян бобовых, подсолнечника и пшеницы.
Показано, что совокупная семенная продукция при культивировании растения Arabidopsis Thaliana и Brassica в воде с пониженным содержанием дейтерия существенно больше в сравнении с тяжелоизотопной водой. В эксперименте тестировалась вода с различным соотношением легких и тяжелых изотопов [5].
В работе [6] было определено оптимальное соотношение D/H - 75-125 ppm, при котором выживаемость инфузорий максимальна.
В экспериментах, выполненных на аутбредных (сток CD-I) и инбредных мышах-самцах гибридах (CBA·C57B1)F1, установлено, что под влиянием приема «легкой» воды происходит временное, на протяжении 7-14 дней, ускорение роста массы тела животных, на 7-е - 8-е сутки эксперимента отмечено увеличение числа лейкоцитов в периферической крови и клеточности костного мозга необлученных животных [7].
Имеются сообщения о радиопротекторном (введение до облучения) действии ЛВ перед облучением в летальных [8] и нелетальных [9] дозах ионизирующего излучения.
Поскольку предсказать время казуистического облучения человека маловероятно, практическое значение имеет средство, оказывающее действие при введении после облучения.
Целью настоящего изобретения является исследование и доказательство возможности лечебного (введение после облучения) использования ЛВ, полученной ректификационным методом, при лучевом поражении организма, вызывающем острую лучевую болезнь.
Технический результат заключается в повышении выживаемости облученных животных, сохранении их массы тела, ускорении восстановления нарушенного облучением кроветворения.
Для достижения поставленной цели изучено влияние ЛВ на выживаемость, гемопоэз и восстановление массы тела облученных мышей и крыс. В ходе исследования установлено, что ЛВ при использовании после облучения способна существенно увеличивать выживаемость, ускорять восстановление гемопоэза и массы тела облученных животных.
В эксперименте использовали ЛВ, полученную ректификационным методом из московской водопроводной воды [10]. Содержание дейтерия в ЛВ составило 35-90 ppm, судя по результатам лазерной спектрометрии [11].
1
16
1
17
1
18
1
17
1
18
16
17
18
2
2
2
2
2
2
2
2
Установка для получения легкой воды [10] включает ректификационную колонну, которая содержит контактное устройство для увеличения поверхности при взаимодействии пар - жидкость, при этом содержание НО в легкой воде составляет не менее 997,13 г/кг от общего количества НO, а суммарное содержание H, О, H, O, HDО, HDO, D, О, DО, DO в легкой воде составляет не более 2,87 г/кг от общего количества НО
Использованный нами метод получения воды позволяет получить воду, очищенную от дейтерия, до концентрации 0 ррm, хотя в проводимых исследованиях мы использовали воду с ррm 35 и 90. Также полученная нами вода максимально очищена от солей и других примесей и поэтому наиболее адекватным контролем в этом случае является дистиллированная вода, тоже очищенная от солей.
1
16
1
16
2
2
2
Легкоизотопная вода в настоящем изобретении представляет собой высокочистую воду с большим содержанием легких молекул Н О, при этом содержание легких молекул Н О в полученной легкой воде составляет не менее 99,734% от общего количества НO.
1
16
17
18
18
2
2
<mrow><mo>−</mo><mn>994</mn><mstyle scriptlevel="+1"><mfrac bevelled="true"><mn>0</mn><mrow><mn>00</mn></mrow></mfrac></mstyle></mrow>
<mrow><mo>−</mo><mn>114</mn><mstyle scriptlevel="+1"><mfrac bevelled="true"><mn>0</mn><mrow><mn>00</mn></mrow></mfrac></mstyle></mrow>
<mrow><mo>−</mo><mn>500</mn><mstyle scriptlevel="+1"><mfrac bevelled="true"><mn>0</mn><mrow><mn>00</mn></mrow></mfrac></mstyle></mrow>
Также легкоизотопная вода в настоящем изобретении отличается тем, что содержание легких молекул Н О в полученной легкой воде составляет не менее 997,08 г/кг от общего количества НО; концентрация D составляет не более 138 ppm; концентрация O составляет не более 372 ppm; концентрация О составляет не более 1960 ppm; значение δD находится в диапазоне от
до
, значение δО находится в диапазоне от
до -22.
Лечебная эффективность ЛВ была изучена в опытах на 80 аутбредных мышах CD-I, самцах и самках, с исходной массой тела 31-34 г и 40 крысах-самцах породы Вистар с исходной средней массой тела 280-360 г. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляли по полу и массе тела.
60
Животных облучали тотально γ-квантами Со на установке Рокус-М (мощность дозы 0,21-1 Гр/мин) в дозах 5 Гр и 6,5 Гр. В результате облучения у животных развивалась костномозговая форма острой лучевой болезни.
Подопытным животным сразу после облучения в качестве питьевой воды давали в свободном доступе ЛВ с ppm 35 и 90, которую они получали до конца эксперимента. Контрольные нелеченые облученные животные получали дистиллированную воду (ДВ) с ppm 144. Необлученные животные, биоконтроль (БК), получали также ДВ.
Влияние ЛВ на статус облученных животных оценивали по их выживаемости в течение 30 суток после облучения, а также по динамике массы тела. Состояние гемопоэза определяли на 8 сутки после облучения мышей дозой 5 Гр по числу ядросодержащих клеток в костном мозге бедренной кости, числу эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке, выявляемых по Буэну, и числу лейкоцитов в периферической крови.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованем программного комплекса Microsoft Office Excel 2007.
2
При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали среднее арифметическое значение показателей и их стандартные ошибки. О статистической значимости показателей у животных сравниваемых групп судили по критерию Стьюдента. Для оценки суммарного эффекта по выживаемости использовали критерий χ.
Программа экспериментов была одобрена Комиссий по биоэтике ГНЦ РФИМБПРАН.
Острая лучевая болезнь является полиорганным заболеванием. Ведущим симптомом при костномозговой форме заболевания является снижение числа клеток в костном мозге и числа лейкоцитов в периферической крови. Появление фокусов кроветворения (эндогенных колоний) в селезенке характерно для начала восстановительных процессов. Течение острой лучевой болезни зависит от дозы облучения: чем она выше, тем тяжелее течение болезни, тем меньше выживаемость, тем меньше клеток в костном мозге и в периферической крови, тем меньше число фокусов кроветворения в селезенке, тем больше снижение массы тела. Применение различных лечебных средств снижает тяжесть течения острой лучевой болезни и повышает вероятность выживания организма.
В наших исследованиях на мышах было установлено, что нелеченые животные контрольной группы в большинстве погибли, выживаемость составила 10% и 16,6%. Лечебное применение ЛВ с ppm 35 и 90 повышало выживаемость облученных мышей до 40-55,5% (Табл. 1).
При наблюдении за клиническим течением острой лучевой болезни у крыс определяли динамику массы тела животных. Результаты обследования представлены на таблице 2.
На таблице 2 видно, что снижение массы тела леченых животных в разгар острой лучевой болезни не происходило, в то время как на 3 - 10 сутки после облучения отмечено снижение массы тела в группе контрольных облученных животных.
60
Помимо наблюдения за клиническим течением острой лучевой болезни подопытных мышей обследовали на предмет состояния кроветворения на 8 сутки после облучения в сублетальной дозе γ-квантов Со 5 Гр (Табл.3).
На таблице 3 видно, что число ядросодержащих клеток в костном мозге, число эндогенных колониеобразующих единиц в селезенке и число лейкоцитов в периферической крови леченых животных (ЛВ с 35 ppm) существенно выше, чем у контрольных облученных животных. Увеличение как числа костномозговых клеток (t=3,6, р≤0,01), так и эндогенных колоний в селезенке (t=2,6, р≤0,05) было статистически достоверно по критерию Стьюдента.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что лечение острой лучевой болезни ЛВ повышает выживаемость животных и стимулирует восстановление гемопоэза, судя по показателям костномозгового кроветворения и числу эндогенных колоний в селезенке.
Пример 1
Лечебную противолучевую эффективность ЛВ (ррm 35) изучают в опыте на 56 аутбредных мышах-самцах CD-I с исходной массой тела 31-34 г (28 голов леченых и 28 контрольных), находящихся на обычном рационе питания. Рандомизация животных по группам осуществляется по массе.
60
Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами Со в дозе 6,5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучают группами по 10-18 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две равноценные группы, одна из которых получает ЛВ, а другая - ДВ на протяжении всего срока наблюдения, в течение 30 суток.
Развитие острой лучевой болезни сопровождается падением массы тела, снижением двигательной активности, отказом от корма, потерей опрятности. Все эти признаки, более существенно выражены в группе нелеченых контрольных животных.
2
Интегральной оценкой влияния ЛВ на течение острой лучевой болезни у мышей является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения. В группе леченых животных при наблюдении в течение 30 суток из 28 животных выжило 13, тогда как в группе контрольных нелеченых - только 4 из 28. Таким образом, лечебное действие ЛВ выражалось в повышении выживаемости леченых животных до 46,4% по сравнению с 14,3% выживаемостью животных контрольной группы. Разница между показателями статистически значима (χ=5,4, р≤0,02).
Пример 2
Лечебную противолучевую эффективность ЛВ (90 ppm) изучают в опыте на 36 аутбредных мышах-самцах CD-I с исходной массой тела 31-34 г.Облучают группами по 18 голов. Рандомизация животных по группам осуществляется по массе.
60
Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами Со в дозе 6,5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучают группами по 10-18 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две равноценные группы, одна из которых получает ЛВ, а другая - ДВ на протяжении всего срока наблюдения, в течение 30 суток.
Развитие острой лучевой болезни сопровождается падением массы тела, снижением двигательной активности, отказом от корма, потерей опрятности. Все эти признаки более существенно выражены в группе нелеченых контрольных животных.
Интегральной оценкой влияния ЛВ на течение острой лучевой болезни у мышей является определение их выживаемости в течение 30 суток после облучения.
2
В группе леченых животных при наблюдении в течение 30 суток после облучения из 18 животных выжило 10, тогда как в группе контрольных - только 3 из 18. Таким образом, лечебное действие ЛВ (90 ppm) выразилось в повышении выживаемости леченых животных до 55,5% по сравнению с 16,6% выживаемостью контрольной группы. Разница между показателями статистически достоверна (χ=5,9, р≤0,025).
Пример 3
Влияние ЛВ (ppm 35) на пострадиационное подавление кроветворения изучают в опыте на 24 аутбредных CD-I мышах-самках с исходной массой тела 31-34 г (8 облученных леченых, 8 облученных контрольных и 8 необлученных контрольных), находящихся на обычном виварном рационе.
60
Для моделирования острого радиационного воздействия используют облучение γ-квантами Со в дозе 5 Гр на установке Рокус-М (средняя мощность дозы 1 Гр/мин). Животных облучали группами по 8 голов в пластмассовых коробках. После облучения животных делят на две рандомизированные группы, одна из которых получает в качестве питьевой воды ЛВ (ad libitum) (ppm 35), а другая - ДВ.
6
6
6
На 8 сутки после облучения животных умерщвляют методом цервикальной дислокации и стандартными методами определяют число ядросодержащих клеток в бедренной кости и число эндогенных колоний в селезенке. Содержание ядросодержащих клеток в костном мозге в леченой группе составляет 20,7±3,04·10 /бeдpo, в контрольной облученной - 12,55±3,98·10 /бeдpo, а в необлученном биоконтроле - 47,l±4,8·10 /бeдpo. Разница между показателями леченой и контрольной облученными группами статистически значима по критерию Стьюдента (t=3,6, р≤0,01).
Уровень эндогенных колоний в селезенке леченых облученных животных составляет 4,5±2,9, что существенно выше, чем в контрольной нелеченой облученной группе 0,88±0,88. Разница статистически значима по критерию Стьюдента (t=2,6, р≤0,05).
Таким образом, ЛВ повышает выживаемость облученных животных, способствует сохранению их массы тела, ускоряет восстановление нарушенного облучением кроветворения.
Это дает основание считать ЛВ эффективным средством лечения костно-мозговой формы лучевой болезни.
Источники информации:
1. Синяк Ю.Е., Григорьев А.И., Гайдадымов З.Н., Медникова Е.И., Лебедева З.Н., Гуськова Е.И. Метод получения бездейтериевой воды и исследование ее влияния на физиологический статус японского перепела // Космическая биология и авиакосмическая медицина. Материалы XI конференции, Москва. 1998. Т. II. С.201;
2. Бердышев Г.Д., Варнавский И.Н., Прилипенко В.Д. Целебная реликтовая вода-открытие третьего тысячелетия // Вопросы химии и химической технологии. 2002. №5. С.168-174;
3. Бердышев Е.Д., Варнавский И.Н., Прилипенко В.Д. Аквабиотика - наука о роли воды в жизненных процессах. // ЗАТ "ЗТНВФ "Коло". 2003. С.22-28;
4. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах // М.: Наука. 1978. С.215;
5. Синяк Ю.Е., Левинских М.А., Гайдадымов В.В. и др. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на культивирование высших растений: Arabidopsis thaliana и Brassica // Матер. Рос. Конф. «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (26-29 сентября, 2000). М., 2000. Т. 2. С.90-92;
6. Цисанова Е.С., Сыроешкин А.В., Ульянцев А.С., Успенская Е.В., Плетенева Т.В., Климова Э.В. Изучение биологической активности и соотношения протий/дейтерий (D/H) в воде с помощью клеточного биосенсора S. ambiguum // Электронный научный Журнал "Исследовано в России". 2010. Т. 56. С.588-593;
7. Иванов А.А. и др. Нужен ли дейтерий в питьевой воде?! // Рос. научн. Конф. с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии». С-Пб. 2011. С.132;
8. Bild W, Stefanescu I, Haulica I, Lupusom C, Titescu G, Iliescu R, Nastasa V. Research concerning the radioprotective and immunostimulating effects of deuterium-depleted water // Rom. J. Physiol. - 1999. - V.36. №3-4. P.205-21;
18
9. Раков Д.В. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия и кислорода О на развитие лучевых повреждений в организме мелких лабораторных животных при низких дозах облучения // Автореферат диссертационной работы на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва. ГНЦ РФ ИМБП РАН. 2007;
10. Соловьев С.П. Способ и установка для производства легкой воды // Патент РФ №2295493, Бюллетень №8 от 20.03.2007;
11. Van Trigh R. Lazer spectrometry for Stable Isotope Analysis of Water // Biomedical and Paleoclimatological Applications. Groningen: University Library Groningen. 2002. P.50.
Таблица 1
Влияние потребления легкоизотопной воды на выживаемость к 30 суткам после облучения аутбредных CD-I мышей-самцов γ-квантами <sup>60</sup>Со в дозе 6,5 Гр
№ п/п
Группа
N
Выживаемость
χ ,p
Абс
%
1
ДВ
10
1
10
ЛВ, ppm=35
10
4
40
χ<sup>2</sup>=2,4, p<0,2
2
ДВ
18
3
16,6
ЛВ, ppm=35
18
9
50
χ<sup>2</sup>=4,5, p<0,05
ЛВ, ppm=90
18
10
55,5
χ<sup>2</sup>=5,9, p<0,025
Таблица 2
Динамика средней массы тела крыс, облученных γ-квантами <sup>60</sup>Со в дозе 6,5 Гр и леченых ЛВ, в % по отношению к исходному значению
Группа
Время после облучения (сут)
0
3
7
10
14
17
21
24
28
31
ЛВ
100%
107,40%
110,30%
117%
114,30%
118,70%
120,20%
120,90%
122%
122%
ДВ
100%
99,10%
95,60%
99,95%
109,60%
96,30%
108,10%
108,60%
108,90%
109,20%
БК
100%
102,30%
106,70%
111,10%
112,50%
115,80%
113,40%
116,90%
117,90%
118,20%
Таблица 3
Гематологический статус аутбредных CD-I мышей-самок на 8 сутки после облучения γ-квантами <sup>60</sup>Со в дозе 5 Гр и леченых легкоизотопной водой (M±µ)
Группа
N
Клеточность костного мозга, n·10<sup>6</sup>/бедро
Число колониеобразующих единиц на селезенку
Число лейкоцитов в периферической крови, n·10<sup>9</sup>/л
ЛВ
8
20,7±3,04<sup>∗∗</sup>
4,5±2,9<sup>∗</sup>
0,99±0,51
ДВ
12,55±3,98
0,875±0,88
0,94±0,24
БК
47,1±4,8
0
3,68±1,46
Примечание: ∗ - статистически значимое различие по критерию Стьюдента между группами ЛВ и ДВ, р≤0,05, ∗∗ - статистически значимое различие по критерию Стьюдента между группами ЛВ и ДВ, р≤0,01.