Морфолого-культуральные свойства коллекционных штаммов Lactobacillus acidophilus, перспективных для включения в состав пробиотических кисломолочных продуктов

УДК 637.1

Ст. преподаватель А.Н. Иркитова (Алтайский гос. ун-т) кафедра экологии, биохимии и биотехнологии, тел. 8(3852)36-30-77

Морфолого-культуральные свойства коллекционных штаммов Lactobacillus acidophilus, перспективных для включения в состав пробиотических кисломолочных продуктов

Представлены сравнительные данные о морфолого-культуральных свойствах коллекционных штаммов Lactobacillus acidophilus, приведена их характеристика, отобраны наиболее перспективные штаммы для включения в состав пробиотических продуктов.

This article presents data on the morphological properties of the culture collection strains Lactobacillus acidophilus, shows the characteristics of native and foreign strains of Lactobacillus acidophilus, selected the most promising strains for inclusion in probiotic products

Ключевые слова: ацидофильная палочка, морфология клеток, культуральные свойства, кислотность.

Официально начало истории ацидофильной палочки относится к 1900 году, когда Moro Е. описал микроб, выделенный им из фекалий грудного младенца, и дал ему название Bacillus acidophilus. В настоящее время эта культура известна под названием Lactobacillus acidophilus, и ее селектированные штаммы применяют для производства ацидофильных молочных продуктов, фармацевтических и ветеринарных препаратов, пищевых и кормовых добавок лечебно-профилактического назначения. Во всех этих случаях используются пробиотические свойства этой лактобациллы и ,в первую очередь, ее антагонистическая активность по отношению к патогенной, условно-патогенной и гнилостной микрофлоре [1].

Одним из самых важных критериев при изучении и идентификации L. acidophilus являются морфологические признаки. Причем характеристика штаммов L. acidophilus, приведенная в патентах и научной литературе не является комплексной, завершенной. Поэтому актуально описывать и вести мониторинг морфологокультуральных особенностей коллекционных штаммов, используемых в промышленности для обеспечения экологической безопасности продуктов питания.

Все штаммы ацидофильной палочки, использованные в работе, предварительно проверили на чистоту культур (т.е. отсутствие примеси посторонних микроорганизмов) путем их посева в плотные питательные среды для получения изолированных колоний и последующей отвивки клонов из типичных колоний. О чистоте культур судили по гомогенности колоний.

Объектом исследования в нашей работе были 11 штаммов L. acidophilus из отраслевой коллекции ГНУ СО РАСХН СибНИИ сыроделия (табл. 1).

(Q Иркитова А.Н., 2014

Таблица 1

Штаммы Lactobacillus acidophilus, использованные в работе

Индекс штамма Источник и дата поступления штамма в ГНУ СибНИИсыроделия

СКМ-492 (97)* Омский филиал ВНИМИ, 1991 г.

СКМ-495 (630)* Омский филиал ВНИМИ, 1991 г.

СКМ-497 (ВКМ В-842) ИБФМ (Москва), 1983 г.

СКМ-498 (ВКМ В-845) ИБФМ (Москва), 1983 г.

СКМ-499 (ВМ-2)* ВНИМИ, 1997 г.

С КМ-500

С КМ-501

С КМ-502

СКМ-503 (НВМ-3)* ВНИМИ, 1997 г.

СКМ-504 (Омский)* Омский филиал ВНИМИ, 1989 г.

СКМ-505 (Угличский)* НПО «Углич», 1989 г.

Примечание: СКМ - сибирская коллекция микроорганизмов; в скобках указан исходный индекс штамма, под которым он поступил в коллекцию ГНУ СибНИИ сыроделия; звездочкой отмечены промышленные штаммы.

Для выращивания и дальнейшего культивирования микроорганизмов были использованы следующие микробиологические среды: стерильное обезжиренное молоко (среда для поддержания рабочих культур ацидофильной палочки); обогащенный агар с гидролизованным молоком - АГМ для палочек (среда для учета численности клеточных популяций ацидофильной палочки); бульон из гидролизованного молока - БГМ (среда для поддержания рабочих культур ацидофильной палочки).

Культуры ацидофильных палочек поддерживали путем периодических (1 раз в 2 недели) перевивок в стерильное обезжиренное молоко: инокуляция петлей, инкубирование в течение 16-18 час до образования молочного сгустка и хранение в холодильнике при температуре 4-6 °С до использования.

Активную кислотность питательных сред и других проб определяли с помощью рН-метра «Аквилон». Титруемую кислотность проб определяли методом титрования по ГОСТ 3624-67.

Микроскопию и окрашивание по Грамму проводили согласно ГОСТ Р 534302009 и МР 2.3.2.2327-08. Подготовленный препарат просматривали под микроскопом Вю1аг при увеличении 1250х с использованием масляной иммерсии.

Все изученные штаммы обладают высокой кислотообразующей активностью и хорошо растут в молоке, образуя плотный сгусток после 4-8 ч инкубации при 3740 °С (при дозе посевного материала 1 %).

Анализ полученных результатов показал, что все штаммы L. acidophilus при глубинном посеве в среду «АГМ для палочек» формируют в зависимости от густоты посева мелкие или средней величины (диаметром не более 2 мм) беловатые колонии с неровным контуром в виде комочков ваты или клубочков переплетенных нитей (рис. 1), а при выращивании в жидкой среде БГМ дают равномерное помутнение без образования придонного или пристеночного осадка. Заметных различий между штаммами в характере роста в этих питательных средах не выявлено.

При внесении культуры петлей в пробирку, содержащую 10 см3 стерильного обезжиренного молока, отечественные штаммы образуют сгусток после 10-12 ч инкубирования при оптимальной (37 °С) температуре; молочные сгустки - гомогенные, вязкие («сметанообразные»), без отделения сыворотки, вкус сгустка - чистый кисломолочный с металлическим оттенком. Исключение представляет лишь штамм L. acidophilus СКМ-503, образующий невязкий («колющийся») сгусток.

Рис. 1. Внешний вид колоний штамма L. acidophilus СКМ-492 на среде «АГМ для палочек» в зависимости от густоты посева

Нами было проведено измерение титруемой кислотности молочных сгустков в момент их образования, а также после 3 и 7 сут инкубации; результаты анализа 7-суточных сгустков считаются предельной титруемой кислотностью данного штамма ацидофильной палочки и свидетельствуют не только о его кислотообразующей способности, но и о степени его кислотоустойчивости.

Анализ результатов измерения титруемой кислотности выявил, что наибольшую кислотообразующую способность проявляют штаммы СКМ-498 (380 °Т), СКМ-500 (300 °Т), а наименьшую - штамм СКМ-495 (табл. 2).

В целом полученные нами данные о кислотообразующей способности исследованных штаммов L. acidophilus согласуются с публикациями отечественных исследователей относительно селектированных ими промышленных штаммов ацидофильной палочки [2, 3, 4].

Изучение численности клеток отечественных штаммов ацидофильной палочки после 18 ч инкубации в стерильном обезжиренном молоке при 37 °С показало, что наиболее высокий уровень численности за данный период достигали штаммы СКМ-492 и СКМ-497 (табл. 3). Слабее всего рост штамм СКМ-495; у остальных 8 штаммов численность клеточных популяций находилась в пределах 3,7-9,3х107 КОЕ/см3.

Внешний вид молочных культур всех отечественных штаммов ацидофильной палочки, кроме одного (штамма СКМ-495), оказался однообразным: грамположи-тельные, не имеющие жгутиков, аспорогенные палочки с закругленными концами, располагающиеся поодиночке, парами или в виде коротких цепочек; длина палочек варьировала от 2 до 20 мкм, толщина составила 0,8 мкм (рис. 2).

Таблица 2

Кислотообразующая активность отечественных штаммов L. acidophilus при культивировании в стерильном обезжиренном молоке

Индекс штамма Титруемая кислотность, °Т

после 18 ч после 3 сут после 7 сут

CKM-492 190 270 270

СКМ-495 120 120 140

СКМ-497 160 260 310

СКМ-498 170 320 380

СКМ-499 230 240 310

СКМ-500 200 320 330

СКМ-501 166 270 300

СКМ-502 120 300 300

СКМ-503 230 230 260

СКМ-504 190 280 300

СКМ-505 110 280 290

Таблица 3

Численность клеток в 18-часовых молочных культурах отечественных

штаммов L. acidophilus

Индекс штамма Численность клеток, КОЕ /см3

СКМ-492 1,1-108

СКМ-495 8,6-106

СКМ-497 1,3-108

СКМ-498 9,3-107

СКМ-499 7,8-107

СКМ-500 3,1-107

СКМ-501 6,5-107

СКМ-502 6,6-107

СКМ-503 5,7-107

СКМ-504 8,2-107

СКМ-505 6,0-107

Рис 2. Внешний вид исследуемых штаммов L. acidophilus

Отличие внешнего вида штамма СКМ-495 от остальных отечественных штаммов L. acidophilus заключалось в том, что клетки этого штамма содержали метахро-матические зерна волютина. Это признак, характерный для двух других видов термофильных лактобацилл - L. delbrueckii ssp. bulgaricus и L. delbrueckii ssp. lactis.

Следует, однако, заметить, что в отечественной научной литературе описаны штаммы L. acidophilus, клетки которых содержат гранулы волютина.

Изучение избирательности роста штаммов ацидофильной палочки на определенных питательных средах показало, все исследуемые отечественные штаммы ацидофильной палочки не характеризуются избирательностью по отношению к субстрату и, помимо цельного и обезжиренного молока, хорошо растут и на других субстратах молочного происхождения (творожная и подсырная сыворотка, альбуминная паста, бульон на основе гидролизованного молока), а также в питательной среде на основе капустного отвара.

Таким образом, по внешнему виду, способности к образованию колоний, численности, кислотообразующей активности и отношению к субстрату все исследуемые отечественные штаммы ацидофильной палочки соответствуют общепринятому описанию неотипового штамма L. acidophilus АТСС 4356 и могут быть рекомендованы для включения в состав пробиотических кисломолочных продуктов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Степанов, К.М. Идентификация и основные биологические свойства молочнокислых бактерий [Текст] / К.М Степанов // Вестник КрасГАУ; 2009. - № 9. - С. 158-161.

2. Иркитова, А.Н. Эколого-биологическая оценка штаммов Lactobacillus acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов: - автореферат дис. на соискание уч. степ. к. б. н. / Иркитова А.Н. - 2012. - 22с.

3. Ханхалдаева, С. Г-Д. Разработка и оценка качества симбиотического концентрата: автореферат дис. на соискание уч. ст. к.т.н. - Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Уде, 2013. - 17 с.

4. Хурхесова, Т. Е. Разработка технологии бактериального концентрата для продуктов гетероферментативного брожения: автореферат дис. на соискание уч. ст. к.т.н. / Хурхесова Т.Е. - Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, Улан-Уде, 2013. - 16 с.

REFERENCES

1. Stepanov, К.М. Identification and basic biological properties of acidolactic bacteria // Vestnik Krasgu, 2009. - № 9. - P. 160-161.

2. Irkutova, A.N. Ecologo-biological evaluation of strains of Lactobacillus acidophilus, used in the production of probiotic products. - The dissertation for obtaining the academic step. К. B. N. - 2012. - 22 p.

3. Khankhalaev S. G.-D.. Development and evaluation of quality symbiotic concentrate. - The dissertation for obtaining the academic Ph.D. senior - the Eastern-Siberian state University of technology and management, Ulan-Ude, 2013. - 16 p.

4. Jurasova T. E., Development of technology of bacterial concentrate for products of fermentation. - The dissertation for obtaining the academic Ph.D. senior - the East-ern-Siberian state University of technology and management, Ulan-Ude, 2013. - 16 p.