Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

Новости клеточных технологий

В результате исследований оказалось возможным сделать следующие выводы:

1) перепрограммирование соматических клеток в плю-рипотентные является стохастическим процессом, при этом практически все соматические клетки имеют возможность стать !РБ-клетками при непрерывном делении на фоне экспрессии факторов Скл4, Бох2, К№4 и с-Мус;

2) хотя перепрограммированные клетки появляются не ранее чем на 8—10-е сут. экспрессии 0сЬ4, Бох2, КН4 и с-Мус [8], время экспозиции в доксициклине (запускающем экспрессию лентивирусного вектора с факторами 0сЬ4, Бох2, КН4 и с-Мус) и число клеточных делений, прошедших до появления популяции клонов !РБ-клеток, сильно варьирует;

3) данные исследования не подтверждают гипотезу «элитных компонентов» для перепрограммирования клеток [9]: большинство, если не все, клеток линии В-лим-фоцитов и моноцитов с устойчивой экспрессией всех четырех факторов перепрограммирования оказалось способны произвести !РБ-клетки;

4) соматические клетки перепрограммируются с реализацией различных латентностей, что не может быть объяснено только разницей в темпе пролиферации и временем экспозиции в доксициклине. Подтверждается участие неопределенных стохастических событий, происходящих во время процесса перепрограммирования клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hanna J., Markoulaki S., Schorderet P. et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature В lymphocytes to pluripotency. Cell 2008; 133: 250-64.

2. Wernig М., Lengner C., Hanna J. et al. A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nature Biotechnol. 2DD8; 26: 916-24.

3. Markoulaki S., Hanna J., Beard C. et al. Transgenic mice with defined combinations of drug-inducible reprogramming factors. Nature Biotechnol. 2009; 27: 169-71.

4. Silva J., Nichols J., Theunissen T. et al. Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell 2009; 138: 722—37.

5. Boiani М., Gentile L., Gambles V. et al. Variable reprogramming of the pluripotent stem cell marker 0ct4 in mouse clones: distinct

developmental potentials in different culture environments. Stem Cells 2005; 23: 1089-104.

6. Egli D., Rosains J., Birkhoff G., Eggan K. Developmental reprogramming after chromosome transfer into mitotic mouse zygotes. Nature 2007; 447: 679—85.

7. Egli D., Birkhoff G., Eggan K. Mediators of reprogramming: transcription factors and transitions through mitosis. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2008; 9: 505-16.

8. BrambrinkT., Foreman R., Welstead G. et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 151-9.

9. Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation. Nature 2009; 460: 49—52.

Порготовип A.B. Иванов

По материалам: Hanna J„ Saha K.: Pando B. et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature 2009; 462: 595-601

Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

Более двух десятилетий исследователи и клиницисты пытаются разработать метод лечения, который гарантировал бы эффективное восстановление кожных покровов пациентам, получившим тяжелые ожоговые и травматические повреждения либо страдающим трофическими язвами различной этиологии. На сегодняшний день наиболее эффективной является операция аутотрансплантации кожи. В перспективе, на смену ей может прийти аутотрансплантация выделенных из биоптатов неповрежденных участков кожи и размноженных в культурах in vitro клеток-предшественниц кератиноцитов на трехмерных матриксах [1]. Главным недостатком этого подхода остается то, что на экспансию кератиноцитов в культурах in vitro перед трансплантацией требуется около 3 недель [2]. В течение всего этого времени пациент подвергается риску инфицирования и обезвоживания открытой ожоговой раны. Недели перед проведением аутотрансплантации остаются тем критическим периодом, в котором необходимо обеспечить максимальную защиту поврежденных покровов. В качестве временного покрова возможно использование децеллюляризован-ного трупного кожного лоскута, однако доступность по-

добного материала ограниченна, а его применение нередко приводит к развитию реакций воспаления.

Чтобы избежать применения временных трансплантатов и операций аутотрансплантации, предпринимается множество попыток разработки «эквивалентов кожи» на основе инертных синтетических и тканеинженерных матриксов, обычно содержащих коллаген I типа и алло-генные клетки (дермальные фибробласты и реже — фибробласты и кератиноциты) [3]. Однако до настоящего времени ни один из этих продуктов не продемонстрировал высокой эффективности в лечении пациентов с обширными глубокими ожогами [4].

Использование эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека могло бы стать решением проблемы создания эквивалентов кожи, пригодных для трансплантации, позволив получать необходимые типы клеток (дермальные фибробласты и кератиноциты) в неограниченном количестве. Основным препятствием использования данного подхода остается недостаточная эффективность протоколов дифференцировки ЗСК в требующиеся типы клеток и потенциальная туморогенность ЗСК [5—7]. Единственная оставшаяся в предназначенной для

Новости клеточных технологий

клинического использования клеточной культуре недифференцированная эмбриональная стволовая клетка теоретически может привести к формированию у реципиента тератомы — опухоли, развивающейся из ЭСК при их трансплантации.

В 2003 г. были впервые получены фрагменты кожи на основе кератиноцитов, дифференцированных из ЭСК мыши [8]. С тех пор предпринималось множество попыток разработки протокола дифференцировки ЭСК человека в кератиноциты, однако полученные клетки по неясным причинам не были способны к активной пролиферации [9]. Основная задача этих исследований — создание функционального стратифицированного эпидермиса с базальным слоем, содержащим малодифференцированные клетки-предшественницы кератиноцитов, — до настоящего времени так и не была решена [9—111,

В журнале The Lancet были опубликованы результаты работы научной группы, возглавляемой профессором С. Baldeschi. Исследователям впервые удалось получить эквиваленты кожи, аналогичные по своей структуре нормальной коже человека. В своей работе ученые создали протокол дифференцировки, моделирующий длительный многоступенчатый процесс дифференцировки клеток внутренней клеточной массы бластоцисты

в базальные кератиноциты эмбриона. Ключевым звеном этого протокола оказалось время, в течение которого клетки культивировали в среде, содержащей индукторы дифференцировки. Интересно отметить, что до этого ученые многие годы не обращали внимания на временные параметры, сосредоточившись на разнообразных химических индукторах дифференцировки [9—12].

ЭСК человека линий Н9 и SA01 культивировали на фидерном слое инактивированных эмбриональных фиб-робластов мыши в течение 40 суток в питательной среде, содержащей 0,5 ммоль/л ВМР4 (bone morphogenetic protein 4) и 0,3 ммоль/л аскорбиновой кислоты. В течение первых 20 суток культивирования в клетках постепенно снижалась экспрессия эмбриональных маркеров 0ct4 и Nanog, а к 40 суткам прекращалась экспрессия маркера SSEA3, что было подтверждено количественным ПЦР -анализом, флуоресцентно-активированным клеточным сортингом (FACS) и методом иммуноцитохимии. Параллельно с утратой эмбриональных маркеров в ЭСК происходила последовательность молекулярных событий, аналогичная происходящей в клетках развивающихся эмбриональных покровов [13—15]. В течение первых 10 суток нарастала продукция кератинов 8 и 18, после чего она начинала снижаться, сменяясь продукцией кератинов 5, 14 и 18. К 40 суткам в клетках

Схематическая презентация протокола дифференцировки чЭСК в кератиноциты. К-чЭСК - кератиноциты, полученные из чЭСК

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, N» 1, 2010

Новости клеточных технологий

23

активно продуцировались кератины 5 и 14, а экспрессия кератина 18 прекращалась. В контрольных культурах нормальных базальных кератиноцитов человека наблюдался аналогичный паттерн экспрессии кератинов, более того, в базальных кератиноцитах и кератиноцитах, полученных из ЭСК (К-ЭСК), совпадала и внутриклеточная локализация данных маркеров. Единственное отличие двух типов клеток заключалось в том, что в К-ЭСК не было отмечено экспрессии антигенов ША-АВС и ША-ОП.

Эффективность дифференцировки в базальные кератиноциты была одинаковой для обеих использованных линий ЭСК и составляла около 95%. После селекции клетки были высеяны на фибриновый матрикс, заселенный дермальными фибробластами человека. После того, как монослой К-ЭСК на поверхности матрикса достигал конфлюэнтности, полученные «кожные» лоскуты трансплантировали мышам с иммунодефицитом (пи/ пи, п = 5). Через 10—12 недель после трансплантации образцы ткани фиксировали и оценивали иммуногисто-химическим методом на присутствие специфических маркеров дифференцировки кератиноцитов. Следует отметить, что ни у одного из животных не было выявлено развития опухолей.

Было показано, что К-ЭСК формируют нормальный стратифицированный эпителий. В базальном слое наблюдали экспрессию кератинов 5 и 14, интегринов —6 и р4, коллагена VII типа и ламинина 5. В слоях, лежащих над базальным, обнаруживался кератин 10, а ин-волюкрин и филаггрин — маркеры терминальной дифференцировки кератиноцитов, — продуцировались только

в верхних слоях эпидермиса. Структура и плотность образовавшихся покровов также повторяла структуру и плотность нормальной кожи человека. При этом в базальном слое происходила пролиферация клеток, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на маркер Ю-67. Таким образом, полученная искусственная кожа была способна к обновлению.

Авторы этой работы уверены, что полученные ими эквиваленты кожи в будущем могут успешно применяться в качестве временных покровов, защищающих открытые раны перед предстоящей аутотрансплантацией. Возможно, они также смогут стать полноценной заменой аутотрансплантатов. Самоподдерживающиеся линии ЭСК решат проблему доступности материала, а низкая экспрессия молекул Н1.А на мембране полученных К-ЭСК должна свести к минимуму вероятность развития иммунных реакций при использовании трансплантата.

Выполненных на сегодняшний день экспериментов недостаточно для внедрения полученного продукта в клиническую практику. Для подтверждения безопасности использования искусственной кожи на основе К-ЭСК необходимо проведение расширенных доклинических испытаний на большем количестве экспериментальных животных, доказательство геномной стабильности и всесторонняя характеристика К-ЭСК. Тем не менее, данная работа — первое доказательство возможности получения чистых культур базальных кератиноцитов из ЭСК человека. Более того, это исследование является первым принципиально новым шагом в разработке разнообразных тканеинженерных эквивалентов кожи человека, история которых насчитывает уже более 20 лет [16].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Augustin М., Ermut Т., Johnsen S. Effects of autologous keratinocyte transplantation on the quality of life of patients with severe chronic leg ulcers. Dermatol. Psychosomat. 2001; 2: 73—6.

2. Gallico G.G., O’Connor N.E., Compton C.C. et al. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. N. Engl. J. Med. 1984; 311: 448-51.

3. Metcalfe A.D., Ferguson M.W. Bioengineering skin using mechanisms of regeneration and repair. Biomaterials 2DD7; 28: 51 DO—13.

4. Alsbjorn B. In search of an ideal skin substitute. Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. 1984; 18: 127—33.

5. Bongso A., Fong C-Y., Gauthaman K. Taking stem cells to the clinic: major challenges. J. Cell. Biochem. 2DD8; 105: 1352-60.

6. Knoepfler P.S. Deconstructing stem cell tumorigenicity: a roadmap to safe regenerative medicine. Stem Cells 2DD9; 27: 1D5D—6.

7. Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines. Stem Cells 2DD1; 19: 193—204.

8. Coraux C., Flilmi C., Rouleau M. et al. Reconstituted skin from murine embryonic stem cells. Curr. Biol. 2003; 13: 849—53.

9. luchi S., Dabelsteen S., Easley K. et al. Immortalized keratinocyte lines derived from human embryonic stem cells. PNAS 2006; 103: 1792—97.

10. Green H., Easley K., luchi S. Marker succession during the development of keratinocytes from cultured human embryonic stem cells. PNAS 2003; 100: 15625-30.

11. Aberdam D. Epidermal stem cell fate: what can we learn from embryonic stem cells? Cell Tissue Res. 2008; 331: 103—37.

12. Metallo C.M., Ji L., de Pablo J.J., Palecek S.P. Retinoic acid and bone morphogenetic protein signaling synergize to efficiently direct epithelial differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 2008; 26: 372-80.

13. Byrne C., Tainsky M., Fuchs E. Programming gene expression in developing epidermis. Development 1994; 120: 2369—83.

14. Fuchs E. Epidermal differentiation and keratin gene expression. J. Cell. Sci. Suppl. 1993; 17: 197-208.

15. Turksen K., Troy T.C. Epidermal cell lineage. Biochem. Cell. Biol. 1998; 76: 889-98.

16. Bell E., Sher S., Hull B. et al. The reconstitution of living skin. J. Invest. Dermatol. 1983; 81: 2s—10s.

Подготовила А,С, Григорян

По материалам: Guenou Н„ Nissan Х„ Larcher F. et al. Human embryonic stem-cell derivatives for full reconstruction of the

pluristratified epidermis: a preclinical study. The Lancet 2009; 374: 1745-53