Микробный препарат для утилизации углеводородных загрязнений
MICROBIAL PREPARATION FOR HYDROCARBON CONTAMINATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой микробный препарат для утилизации углеводородных загрязнений, содержащий психроактивные микроорганизмы: штамм Arthrobacter rhombi ARC 8 ВКПМ Ac-1987, штамм Psychrobacter cibarius ARC 13 ВКПМ В-12351, штамм Salinibacterium amurskyense ARC 14 ВКПМ Ас-1993. Данный препарат позволяет производить эффективную очистку акваторий водоемов и береговой линии от нефти и нефтепродуктов в условиях низких температур и высокой солености воды.
Уровень техники
В настоящее время для ликвидации загрязнений нефтепродуктами успешно применяют биологические методы. Используемые биопрепараты включают различные нефтеокисляющие микроорганизмы - бактерии и реже грибы.
8
Известен способ отчистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, заключающийся во внесении бактериальной культуры, представляющей собой консорциум клеток микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 в виде культуральной жидкости с общим титром не менее 10 КОЕ/мл в загрязненную нефтью и нефтепродуктами воду (патент РФ №2241032, приоритет 03.12.2002, опубл. 27.11.2004). Недостатком данного изобретения является то, что консорциум микроорганизмов применяется в виде культуральной жидкости, что не позволяет долговременно хранить консорциум. Также для поддержания жизнедеятельности аэробных микроорганизмов-нефтедеструкторов необходимо проводить аэрацию в водоеме, загрязненном нефтью или нефтепродуктами.
Известен препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений и способ его получения (патент РФ №2516412, приоритет 20.12.2011, опубл. 20.05.2014). Препарат содержит микроорганизмы - деструкторы нефти, сорбент, криопротектор - глицерин, микроудобрения - азотнокислый натрий 0,5% и фосфорнокислый калий 0,5%. В качестве деструкторов нефти препарат содержит ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов: Bacillus subtilis ВКМ В-81, Pseudomonas spp. ВКМ В-892, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Rhodococcus sp. ВКМ Ас-950, Mycobacterium flavescens ВКМ Ас-1415 в количестве 75-85% от общего числа клеток, а также почвенные бактерии Agrobacteium radiobacter ВКМ В-1219 в количестве 15-25% от общего числа клеток. Недостатком указанного препарата является его многокомпонентный состав и сложный процесс его приготовления.
Ближайшим аналогом изобретения является биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от углеводородного загрязнения, способ его получения и применения (патент РФ №2535978, приоритет 15.03.2013, опубл. 20.12.2014). Препарат представляет собой консорциум микроорганизмов, состоящий из следующих штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, взятых в равных соотношениях. Биопрепарат применяется в жидкой форме или в форме иммобилизованной клеточной биомассы. Недостатком данного препарата является то, что он эффективно работает при температурах не ниже 22°C и солености среды не выше 7% NaCl.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение микробного препарата на основе психроактивных микроорганизмов для утилизации углеводородных загрязнений в водной среде при температуре от+4 до +20°C и солености до 30 г/л.
Поставленная задача решается тем, что предложен микробный препарат для очистки водной среды, включающий ассоциацию психроактивных нефтеокисляющих микроорганизмов: штамм Arthrobacter rhombi ARC 8 ВКПМ Ac-1987, штамм Psychrobacter cibarius ARC 13 ВКПМ В-12351, штамм Salinibacterium amurskyense ARC 14 ВКПМ Ас-1993 в соотношении 1:1:1 с допустимой величиной отклонения от указанного значения не более 10%, способный утилизировать углеводородные загрязнения при температуре от +4 до +20°C и солености до 30 г/л.
Преимуществом предлагаемого биопрепарата является то, что он способен утилизировать углеводородные загрязнения в условиях, бедных по питательным субстратам, при низких температурах и высокой солености среды. Эффективность работы биопрепарата в таких условиях позволяет его использовать для утилизации углеводородных загрязнений в условиях северных морей.
Чистые культуры микроорганизмов выделены из нефтезагрязненных участков северных морей и депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1).
Штамм Arthrobacter rhombi ARC 8 ВКПМ Ac-1987. Колонии лимонно-желтые, округлые, блестящие, гладкие, выпуклые, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции. Размеры колонии до 1,5 мм. Клетки округлые, вытянутые в продольном направлении, размер 0,8-1,2×1,0-2,5 мкм. Окраска по Граму положительная. Штамм растет при температуре от +4 до +20°C, в аэробных условиях. Оптимум роста от +4 до +10°C. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
Штамм Psychrobacter cibarius ARC 13 ВКПМ В-12351. Колонии бледно-розовые, округлые, блестящие, однородной структуры, мягкой консистенции, с ровным краем. Размеры колонии до 1,2 мм. Клетки округлые, размером 0,9-1,3×1,5-2,0 мкм, неподвижные. Окраска по Граму отрицательная. Штамм растет при температуре от +4 до +20°C, в аэробных условиях. Оптимум роста от +4 до +10°C. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
Штамм Salinibacterium amurskyense ARC 14 ВКПМ Ас-1993. Колонии желтые, округлые, блестящие, гладкие, выпуклые, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции. Размеры колонии до 2,5 мм. Неподвижные короткие палочки. Окраска по Граму положительная. Штамм растет при температуре от +4 до +20°C, в аэробных условиях. Оптимум роста от +4 до +10°C. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
2
4
2
4
4
4
2
4
Штаммы были выделены на плотной питательной среде modPCA следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; рН 7,0.
Культивирование микроорганизмов по отдельности ведется на среде выделения modPCA.
Предлагаемый микробный препарат является естественной природной ассоциацией, выделенный из загрязненной нефтепродуктами среды. Состав консорциума стабилен во времени, соотношение штаммов может варьироваться в зависимости от условий культивирования микробного сообщества.
Степень утилизации углеводородных загрязнений в водной среде предлагаемого микробного препарата показана в модельном эксперименте.
2
2
Для утилизации углеводородных загрязнений в водной среде используют готовый препарат в сухом, лиофильно высушенном виде. Для обработки водной поверхности, загрязненной нефтепродуктами в концентрации от 5 до 15 г/м, наиболее предпочтительный расход препарата 3±1 г/м.
Пример 1. Исследование нефтеокисляющей активности биопрепарата.
2
4
2
4
4
4
2
4
Биомассу микроорганизмов, выращенных на плотной питательной среде modPCA, смывали физраствором и оценивали оптическую плотность полученной суспензии на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм. Далее доводили оптическую плотность до одинаковых значений, после чего вносили по 1 мл суспензии каждого штамма в питательную среду №1 следующего состава (г/л): КНРО - 1,5; КНРО - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; рН 7,0. В жидкой питательной среде в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9°АР1, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему. После проведения культивирования при температуре +4°C, 130 об/мин в течение 7 суток проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012, хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на приборе DSA 100 KRűS, оснащенном микрокапиллярной колонкой DB-lms, газ-носитель - гелий, расход газа - 39 мл/мин, детектор - ПИД, температура детектора - 320°C. Измерения проводили в условиях температурного градиента в термостате от 60 до 320°C. Результаты анализа были обработаны при помощи программного обеспечения OpenLAB CDS (Agilent).
Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 50% за 7 суток культивирования при температуре +4°C и солености среды 30 г/л.
Пример 2. Способ производства препарата на основе штаммов Arthrobacter rhombi ARC 8 ВКПМ Ас-1987, Psychrobacter cibarius ARC 13 ВКПМ B-12351, Salinibacterium amurskyense ARC 14 ВКПМ Ас-1993.
2
4
2
4
4
4
2
4
9
Штаммы, полученные по Примеру 1, взятые в объемном соотношении 1:1:1, вносят в питательную среду следующего состава (г/л): КНРО - 1,5; КНРО - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; рН 7,0. Далее культивируют при температуре +10°C на орбитальном шейкере в течение 3 суток до получения суммарного конечного титра 10 КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную жидкую биомассу замораживают и обезвоживают методом лиофилизации. Полученную сухую биомассу микроорганизмов смешивают с питательным премиксом (сухое обезжиренное молоко) в соотношении 1:10.
Таким образом, получен микробный препарат, способный утилизировать углеводородные загрязнения в условиях, бедных по питательным субстратам, при низких температурах и высокой солености среды, что позволяет его использовать для утилизации углеводородных загрязнений в условиях северных морей.