КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА
CULTURE MEDIUM

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к культуральной среде для эмбриона, гаметы или стволовой клетки.
Предшествующий уровень техники
Бесплодием поражено более 80 миллионов человек во всем мире. По проведенной оценке, 10% всех пар сталкиваются с первичным или вторичным бесплодием. Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) представляют собой проводимое по желанию лечение, которое может дать шанс зачать ребенка супружеской паре, неспособной сделать это иным способом. В этом процессе из яичника женщины отбирают яйцеклетки (ооциты), а потом оплодотворяют их спермой в лабораторных условиях. Образующийся в результате эмбрион затем вводят в матку для потенциальной имплантации.
Несмотря на достижения в области ВРТ, процент успешности остается низким, на уровне ~30% живорожденных детей на имплантацию. На успешный результат ВРТ влияет много факторов, особенно то, что при выращивании эмбрионов in vitro невозможно в точности воспроизвести физиологические условия in vivo. Например, активные формы кислорода (АФК), образующиеся в процессе обработки, манипуляций и культивирования гамет в окружающей среде in vitro, могут привести к возникновению окислительного стресса, который способен оказать негативное воздействие на качество эмбриона и привести к утрате им жизнеспособности. Основной вклад в АФК in vitro вносит содержание кислорода в атмосфере, в которой культивируют эмбрионы. Отбор и культивирование эмбрионов в присутствии кислорода воздуха (~20%) создавало условия с повышенным содержанием кислорода, которые вызывали повышенное образование экзогенных АФК, приводивших впоследствии к окислительному стрессу. Было показано, что влияние окислительного стресса на эмбрионы, отобранные и культивируемые при содержании кислорода 20%, отрицательно сказывается на экспрессии их генов, изменяет получающийся в результате протеом и нарушает обмен веществ. Даже кратковременное воздействие кислорода воздуха может оказать неблагоприятное воздействие на развитие эмбриона, приводя к замедленному редукционному делению. Однако несмотря на все возрастающее число свидетельств того, что высокая концентрация кислорода пагубна для развития и жизнеспособности эмбриона, значительно количество циклов ЭКО по всему миру все еще осуществляют в атмосферном воздухе.
Хотя культивирование эмбрионов в условиях 5%-ного содержания кислорода может частично смягчить вредное воздействие окислительного стресса, 5%-ная концентрация кислорода все еще приводит к окислительному стрессу. Кроме того, все гаметы подвергаются действию атмосферного кислорода в процессе их получения и обработки. Несмотря на очевидный факт, что высокая концентрация кислорода оказывает пагубное воздействие на развитие и жизнеспособность эмбриона человека, сообщалось о том, что лишь 25% циклов ЭКО по всему миру осуществляют исключительно при 5%-ном содержании кислорода, при этом 34% клиник сообщают об использовании 5% кислорода на определенных стадиях культивирования эмбриона, а в остальных клиниках используют только 20% кислорода (Christianson, et al., 2014 J. Assist Reprod. Genet. 31: 1029-1036).
Кроме того, влияние на эмбрионы окислительного стресса, вызванного высоким содержанием активных форм кислорода (АФК), может усугубляться вследствие того, что в культурах in vitro принципиально отсутствуют физиологические механизмы, необходимые для надлежащего регулирования содержания АФК. Безусловно, гаметы и эмбрионы образуют эндогенные АФК in vivo, и в низкой концентрации последние необходимы для правильного регулирования функционирования и развития гамет. Однако, в отличие от условий in vitro, избыток АФК in vivo нейтрализуется тонкой антиоксидантной системой защиты, которая обеспечивает восстановление и защиту от окислительного повреждения. Таким образом, в физиологических условиях между системными АФК и антиоксидантной способностью поддерживается тонкое равновесие/гомеостаз. В условиях in vitro это равновесие нарушается и, как в случае культивирования эмбрионов при содержании кислорода 20%, накопление экзогенных АФК и нехватка защитных механизмов неизбежно приводит к окислительному стрессу.
В условиях in vivo АФК нейтрализуется естественной антиоксидантной системой, состоящей из ферментов и не-ферментов. Ферментные антиоксиданты, включая каталазу, глутатионпероксидазу/редуктазу и супероксиддисмутазу (SOD), находятся в цитоплазме клетки, железистых клетках эндометрия и митохондриях, и оказывают защитное действие за счет захвата ROS. Неферментные антиоксиданты, такие как витамины (A, B, C и E), пируват, глутатинон (GSH) и гипотаурин, были обнаружены в яичниках, семенной плазме, эпителии эндометрия и фолликулярной и трубной жидкости, и предотвращают образование АФК путем обрыва цепей окислительных реакций. Поскольку в культуре in vitro подобные естественные антиоксиданты отсутствуют, для контроля содержания АФК и предотвращения окислительного поражения гамет и эмбрионов в культуральную среду добавляли различные антиоксиданты.
Окислительный стресс в культурах стволовых клеток также является задокументированной проблемой.
Несмотря на то, что сообщалось о влиянии индивидуальных антиоксидантов на развитие эмбрионов, сравнительно мало исследований посвящено влиянию антиоксидантов, находящихся в среде в виде группы, на развитие эмбрионов. Имеются противоречивые сообщения на тему положительного эффекта антиоксидантов в культуральных средах (Legge and Sellens, Hum Reprod 1991;6: 867-871; Nasr-Esfahani and Johnson, Hum Reprod 1992;7: 1281-1290; Noda, et al., Mol Reprod Dev 1991;28: 356-360; Payne, et al., Reprod Fertil Develop 1992;4: 167-174).
Поиск культуральных сред, ускоряющих развитие эмбрионов, а также пролиферацию и дифференциацию стволовых клеток, или поддерживающих или повышающих жизнеспособность гамет, представляет собой серьезную задачу.
Краткое описание изобретения
Согласно первому аспекту, в настоящем изобретении предоставлена культуральная среда для эмбриона, гаметы или стволовой клетки, содержащая:
а) ацетилкарнитин в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль, и
b) липоевую кислоту или ее производное в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлена культуральная среда для эмбриона, гаметы или стволовой клетки, содержащая:
c) ацетилкарнитин в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль,
d) липоевую кислоту или ее производное в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль, и
e) ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлен способ обработки и/или манипуляции и/или культивирования эмбриона и/или гаметы, или стволовой клетки, при этом данный способ включает в себя обработку и/или манипуляции и/или культивирование эмбриона и/или гаметы, или стволовой клетки в культуральной среде согласно настоящему изобретению.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлен способ снижения или предупреждения окислительного стресса и/или снижения или предупреждения образования свободных радикалов (например, образования активных форм кислорода (ROS)) и/или повышения уровня противоокислительной способности у эмбриона и/или гаметы или стволовой клетки, культивируемой in vitro, и/или для улучшения развития эмбриона, культивируемого in vitro, или для усиления пролиферации и дифференциации стволовой клетки, культивируемой in vitro, или для укрепления состояния и/или жизнеспособность гаметы или стволовой клетки в среде согласно настоящему изобретению.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлен способ оплодотворения in vitro, включающий в себя культивирование гамет, оплодотворения ооцитов спермой, и/или культивирование эмбриона в среде согласно настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления, указанный способ оплодотворения in vitro предпочтительно не включает в себя имплантацию эмбриона в организм человека или животного.
В настоящем изобретении также предоставлено использование комбинации ацетилкарнитина и липоевой кислоты или ее производного в культуральной среде для эмбрионов, и/или культуральной среде для гамет, и/или культуральной среде для стволовых клеток.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено использование комбинации ацетилкарнитина, липоевой кислоты или ее производного и ацетилцистеина в культуральной среде для эмбрионов, и/или культуральной среде для гамет, и/или культуральной среде для стволовых клеток.
В настоящем изобретении также предоставлено использование культуральной среды для эмбрионов, и/или культуральной среды для гамет, или культуральной среды для стволовых клеток согласно настоящему изобретения для снижения или предупреждения окислительного стресса и/или снижения или предупреждения образования свободных радикалов и/или повышения уровня противоокислительной способности у эмбриона или стволовой клетки, культивируемой in vitro, и/или для улучшения развития эмбриона, культивируемого in vitro, или для усиления пролиферации и дифференциации стволовой клетки, культивируемой in vitro, или для улучшения состояния и/или жизнеспособности гаметы.
В еще одном следующем аспекте настоящего изобретения предоставлено использование культуральной среды для эмбриона и/или культуральной среды для гаметы согласно настоящему изобретению для повышения успешности оплодотворения in vitro. В одном из вариантов осуществления, использование культуральной среды для эмбриона и/или культуральной среды для гаметы согласно настоящему изобретению для повышения успешности оплодотворения in vitro не включает в себя имплантацию эмбриона в организм человека или животного.
В следующем аспекте настоящего изобретения предоставлена культуральная среда согласно настоящему изобретению для использования при выращивании эмбриона, гаметы или стволовой клетки.
Краткое описание чертежей
Далее варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны в качестве примера со ссылкой на прилагаемые рисунки, в которых:
На Фигуре 1а показано развитие группы эмбрионов в атмосфере с 20% содержанием кислорода с добавлением ацетилкарнитина в разных дозах,
На Фигуре 1b показано развитие группы эмбрионов в атмосфере с 20% содержанием кислорода с добавлением ацетилцистеина в разных дозах,
На Фигуре 1с показано развитие группы эмбрионов в атмосфере с 20% содержанием кислорода с добавлением липоевой кислоты в разных дозах,
2
На Фигуре 2 показано распределение линий клеток эмбрионов, культивированных в условиях содержания 20% O. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Светлые и темные части столбцов представляют собой средние значения для TE и ICM клеток соответственно. Контроль (n=35), 10 мкмоль карнитина - 10 мкмоль цистеина (n=42), 10 мкмоль карнитина - 5 мкмоль липоевой кислоты (n=53), 10 мкмоль Цистеина - 5 мкмоль липоевой кислоты (n=48), Тройная смесь (10 мкмоль карнитина -10 мкмоль цистеина - 5 мкмоль липоевой кислоты) (n=44). 3 биологических повтора. **P<0.01, ****P< 0.0001;
2
На Фигуре 3 показано распределение линий клеток эмбрионов, культивированных индивидуально в условиях содержания 5 % O. Смесь содержит 10 мкмоль карнитина, 10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Светлые и темные части столбцов представляют собой средние значения для TE и ICM клеток соответственно. 3 биологических повтора. Контроль (n=154), смесь (n=168). ***P< 0.005, *P<0.05;
2
На Фигуре 4 показано распределение линий клеток эмбрионов, культивированных индивидуально в условиях содержания 20 % O. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Светлые и темные части столбцов представляют собой средние значения для TE и ICM клеток соответственно. 6 биологических повторов. Контроль (n=116), смесь (n=145). ****P< 0.0001, ***P<0.005;
На Фигуре 5 показаны выраженные в часах сроки главных этапов развития после инъекции ХГЧ. tPNB = время деления пронуклеуса, t2 = время 2-клеточного дробления, t3 = время 3-клеточного дробления, t4 = время 4-клеточного дробления, t5 = время 5-клеточного дробления, t6 = время 6-клеточного дробления, t8 = время 8-клеточного дробления, tCA = время кавитации (начинается формирование бластоцеля), tB = время формирования бластоцисты, tE = время, за которое происходит полное расширение бластоцисты, tH = время хетчинга бластоцисты. Сплошными столбцами обозначены контрольные опыты, заштрихованными серыми столбцами показаны группы, обработанные смесью, в трех биологических повторах **, P<0.01, ***, P<0.001, ****, P<0.0005 Данные представлены в виде среднего ± SEM.
2
На Фигуре 6 показано влияние продолжительности воздействия тройной смеси на распределение линий клеток эмбрионов культивируемых групп в условиях содержания 20 % O. Смесь содержит 10 мкмоль карнитина, 10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, добавленных в среду в первые 2 дня (G1) или в последние 3 дня (G2), или в обе среды (G1 & G2). Данные представлены в виде среднего ± SEM. Светлые и темные части столбцов представляют собой средние значения для TE и ICM клеток соответственно. 3 биологических повтора. Контроль (n=92), G1 (n=84), G2 (n=97), G1 & G2 (n=80). * P<0.05, ** P<0.01;
На Фигуре 7 показано влияние BSO на флюоресценцию MCB в 3х биологических повторах (n=6-12). **P=0.004, *P=0.011;
На Фигуре 8 показано флуоресцентное мечение эмбрионов 10 мкммоль MCB. Смесь содержит 10 мкмоль карнитина,10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты. Данные представлены в виде среднего ± SEM. 6 биологических повторов (n=60). Значения флюоресценции представлены в относительных единицах. **P<0.01;
На Фигуре 9 показано влияние смеси антиоксидантов на количество клеток бластоцист эмбрионов для ЭКО, культивированных индивидуально при содержании кислорода 20%. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Светлые и темные части столбцов представляют собой средние значения для TE и ICM клеток соответственно. Распределение линий клеток эмбрионов, культивированных индивидуально в присутствии 20% кислорода. Антиоксиданты (A3) содержались в рабочих средах и средах-носителях и/или культуральных средах для гамет. Контрольные среды (Контр) представляли собой рабочие среды для гамет и/или культуральные среды для гамет, не содержащие антиоксидантов: 4 биологических повтора. Контр/Контр (n= 34), Контр/A3 (n=34), A3/Контр (n=38), A3/A3 (n=48) . *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001;
На фигуре 10 показано влияние комбинации антиоксидантов на полученную в результате ЭКО бластоцисту, культивированную индивидуально в присутствии 20% кислорода - данные представлены в виде среднего ± SEM. Антиоксиданты (A3) содержались в рабочих/средах и средах-носителях и/или культуральных средах для гамет. Контрольные среды (Контр) представляли собой рабочие среды для гамет и/или культуральные среды для гамет, не содержащие антиоксидантов: 3 биологических повтора, Контр/Контр (n= 34), Контр/A3 (n=34), A3/Контр (n=38), A3/A3 (n=48). **P<0.01.
На фигуре 11 показана процентная доля использованных далее бластоцист человека от общего количества оплодотворенных ооцитов. В контрольной группе для дальнейшего клинического использования выбрали 12 из 44 оплодотворенных ооцитов, в группе, культивированной в средах с добавкой 10 мкмоль карнитина,10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, выбрали 26 из 49 для дальнейшего клинического использования. Бластоцисты, не удовлетворяющие требованиям качестве, не выбирали и отбраковывали. Различие между двумя данными группами было значительным, при этом р-значение в двухвыборочном t-тесте при использовании коммерчески доступного программного обеспечения (GraphPad Prism) составило 0,0112.
На фигуре 12 показана процентная доля использованных далее бластоцист человека от общего количества оплодотворенных ооцитов. В контрольной группе для дальнейшего клинического использования выбрали 12 из 28 оплодотворенных ооцитов, в группе, культивированной в средах с добавкой 10 мкмоль карнитина,10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, выбрали 26 из 36 для дальнейшего клинического использования. Бластоцисты, не удовлетворяющие требованиям качестве, не выбирали и отбраковывали. Различие между двумя данными группами было значительным, при этом р-значение в двухвыборочном t-тесте при использовании коммерчески доступного программного обеспечения (GraphPad Prism) составило 0,0173.
На фигуре 13 показана процентная доля бластоцист человека, достигающих показателя бластоцист хорошего качества (GQB), который эквивалентен классу 3AB или более высокому по шкале Гарднера, от общего количества бластоцист. В контрольной группе 8 из 30 бластоцист был присвоен класс GQB, в группе, культивированной в средах с добавкой 10 мкмоль карнитина,10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, 18 из 36 бластоцист был присвоен класс GQB. На большое различие между двумя данными группами указывает р-значение в двухвыборочном t-тесте при использовании коммерчески доступного программного обеспечения (GraphPad Prism), составившее 0,0545.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что определенные комбинации ацетилкарнитина в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль, и липоевой кислоты или ее производного в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль, и особенно в виде комбинации с ацетилцистеином в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль, значительно улучшают развитие эмбриона, культивируемого in vitro, или пролиферацию и дифференциацию стволовой клетки, культивируемой in vitro, или состояние и жизнеспособность гамет и/или оплодотворение ооцита спермой.
Настоящее изобретение относится к культуральной среде для гамет, культуральной среде для эмбрионов, или культуральной среде для стволовых клеток, содержащей:
а) ацетилкарнитин в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль, и
b) липоевую кислоту или ее производное в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда для гаметы, культуральная среда для эмбриона, или культуральная среда для стволовой клетки согласно настоящему изобретению содержит также ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 до примерно 50 мкмоль.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 до примерно 20 мкмоль.
В следующем варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 до примерно 15 мкмоль.
В предпочтительном варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации примерно 10 мкмоль.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит липоевую кислоту или ее производное в концентрации от примерно 2,5 мкмоль до примерно 20 мкмоль, например, от 5 мкмоль до примерно 20 мкмоль.
В следующем варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит липоевую кислоту или ее производное в концентрации от примерно 2,5 мкмоль до примерно 10 мкмоль, например, от 5 мкмоль до примерно 10 мкмоль.
В предпочтительном варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит липоевую кислоту или ее производное в концентрации примерно 5 мкмоль.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 мкмоль до примерно 20 мкмоль.
В следующем варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации от примерно 5 мкмоль до примерно 15 мкмоль.
В предпочтительном варианте осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению содержит ацетилцистеин в концентрации примерно 10 мкмоль.
Подходящим образом, среда согласно настоящему изобретению может также содержать одно или более дополнительных соединений, например, неорганическую соль, источник энергии, аминокислоту, источник белка, цитокин, хелатирующий агент, антибиотик, гиалуронан, фактор роста, гормон, витамин и/или гранулоциатрный/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF).
В одном из вариантов осуществления культуральная среда может содержать неорганическую соль. В одном из вариантов осуществления неорганическая соль может представлять собой соль, диссоциирующую в водном растворе на составляющие ее неорганические ионы. Подходящим образом, неорганическая соль может представлять собой соль, состоящую из одного или более следующих неорганических ионов: Na(+), K(+), Cl(-), Ca(2+), Mg(2+), SO(4)(2-), or PO(4)(2-).
В одном из вариантов осуществления культуральная среда может содержать источник энергии. В зависимости от стадии развития эмбриона, источник энергии может представлять собой пируват, лактат или глюкозу. Требования к источнику энергии изменяются от предпочтения пирувата-лактата, пока до стадии 8 клеток эмбрионы находятся под материнским генетическим контролем, до метаболизма, основанного на глюкозе, после активации эмбрионального генома, поддерживающего их развитие от стадии 8 клеток до бластоцисты.
Подходящим образом, одно или более дополнительных соединений может представлять собой или включать в себя углеводы, лактат и пируват в качестве источника энергии.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может представлять собой гиалуроновую кислоту. В одном из вариантов осуществления культуральная среда может содержать аминокислоту. Данная аминокислота может представлять собой незаменимую аминокислоту. Подходящим образом, незаменимые аминокислоту включают в себя цистеин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, валин, аргинин, глутамин, фенилаланин, треонин и/или триптофан. В альтернативном варианте осуществления аминокислота может представлять собой не незаменимую аминокислоту, такую как пролин, серин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глицин и/или глутаминовую кислоту. В среды, обеспечивающие развитие зигот до стадии 8 клеток, обычно можно добавить не незаменимые аминокислоты, такие как пролин, серин, аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глицин и/или глутаминовую кислоту. В среды, обеспечивающие развитие 8-клеточных эмбрионов до стадии бластоцист, обычно добавляют незаменимые аминокислоты, такие как цистеин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, валин, аргинин, глутамин, фенилаланин, треонин и/или триптофан.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда может содержать источник белка. Источник белка может представлять собой альбумин или синтетическую сыворотку (например, в концентрации от 5 до 20% масса/об. или об./об. соответственно). Подходящие источники добавки белка включают в себя сыворотку крови человека, сыворотку пуповинной крови человека (HCS), сывороточный альбумин человека (HSA), эмбриональную телячью сыворотку (FCS) или бычий сывороточный альбумин (BSA).
В одном из вариантов осуществления культуральная среда может содержать фактор роста.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений могут представлять собой любое из соединений, присутствующее в средах, подходящих для культивирования эмбриона, гаметы или стволовой клетки.
Подходящим образом, одно или более дополнительных соединений включают в себя источник белка, такой как сывороточный альбумин человека.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может включать в себя воду.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может включать в себя буферный раствор. Подходящие буферные растворы включают в себя, например, буферный раствор HEPES или буферный раствор MOPS.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может включать в себя воду, неорганические соли и, по меньшей мере, один источник энергии.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может включать в себя воду, неорганические соли, по меньшей мере, один источник энергии и одну или более аминокислот.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может представлять собой или включать в себя по меньшей мере один источник энергии (например, углевод, такой как лактат, пируват), источник белка (например, сывороточный альбумин человека) и воду или буферный раствор.
В одном из вариантов осуществления одно или более дополнительных соединений может представлять собой или включать в себя по меньшей мере один источник энергии (например, углевод, такой как лактат, пируват), аминокислоту, гиалуронат и воду, или буферный раствор.
Одно или более дополнительных соединений может находиться в виде среды, подходящей для культивирования гаметы, эмбриона или стволовой клетки, при этой данную среду можно назвать базовой средой.
Используемый в настоящем описании термин «культуральная среда» не ограничен средой для культивирования (например, в условиях, подходящих для роста), но включает в себя среду, используемую для обращения или сбора, или манипуляций с гаметами, эмбрионами и/или стволовыми клетками.
Подходящим образом, одно или более дополнительных соединений могут образовывать буферную среду (например, гидрокарбонатную буферную среду).
Одно или более дополнительных соединений могут находиться в виде среды, разработанной для поддержания эмбриона (например, эмбриона млекопитающего) до 4-клеточной стадии, при этом данную среду можно называть базовой средой.
Одно или более дополнительных соединений могут находиться в виде среды, разработанной для поддержания эмбриона (например, эмбриона млекопитающего) до 8-клеточной стадии, при этом данную среду можно называть базовой средой.
Одно или более дополнительных соединений могут находиться в виде среды, разработанной для поддержания эмбриона (например, эмбриона млекопитающего) до стадии бластоцисты, при этом данную среду можно называть базовой средой.
(Базовая) среда может представлять собой любую среду, подходящую для культивирования эмбриона, гаметы или стволовой клетки.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой специальную среду для переноса эмбриона.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой одну или более сред из группы, включающей в себя рабочую среду для гамет (включая среду для сбора гамет), среду для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI), среду оплодотворения, одноступенчатую культуральную среду для эмбрионов, среду для переноса эмбрионов, среду для дозревания ооцитов, среду для подготовки спермы и оплодотворения, или любую другую подходящую среду, используемую для гамет или эмбрионов.
В одном из вариантов осуществления, культуральная среда для эмбрионов или культуральная среда для гамет согласно настоящему изобретению может представлять собой одну или более сред, выбранных из группы, включающей в себя рабочую среду для гамет (включая среду для сбора гамет), среду для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI), среду для оплодотворения, одноступенчатую культуральную среду для эмбрионов, среду для переноса эмбрионов, среду для дозревания ооцитов, среду для подготовки спермы и оплодотворения, или любую другую подходящую среду, используемую для гамет или эмбрионов.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой любую коммерчески доступную простую культуральную среду, такую как человеческая трубная жидкость (HTF), среда Уиттингема T6 и сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS) (от Irvine Scientific).
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой базовую среду, такую как среда IVF™ от Vitrolife. IVF™ можно считать средами оплодотворения.
В одном из вариантов осуществления среды IVF считаются средами оплодотворения.
TM
Альтернативным образом, или дополнительно, среда может представлять собой одну или более сред из числа G-1™, G-2™, HSA-solution™, G-MOPS™ Plus, G-MOPS™, EmbryoGlue, ICSI™ or G-TL™ или их комбинации. Данные продукты доступны от фирмы Vitrolife AB, Швеция. Их можно считать базовыми средами.
В одном из вариантов осуществления подходящая рабочая среда (например, рабочая среда для гамет) может представлять собой G-MOPS™.
В одном из вариантов осуществления подходящая одноступенчатая культуральная среда может представлять собой G-TL™.
TM
В одном из вариантов осуществления среда для переноса эмбрионов может представлять собой EmbryoGlue. В некоторых вариантах осуществления среда для переноса эмбрионов может называться средой для переноса, способствующей трансплантации.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой среду, такую как среда для дозревания ооцитов или среда для подготовки спермы и оплодотворения, или их комбинация.
Среда для дозревания ооцитов была разработана, чтобы обеспечить улучшенное развитие и выживание культивируемых ооцитов. Полный состав подходящей среды для дозревания ооцитов предоставлен в приведенной далее таблице:
Концентрации в данной таблице приведены в ммоль, если не указано иначе; среда водная.
Полный состав подходящих сред для подготовки спермы и оплодотворения предоставлен в приведенной далее таблице:
Концентрации в данной таблице приведены в ммоль, если не указано иначе; среда водная.
Среда для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ICSI), например, ICSI™, разработана для облегчения манипуляций со сперматозоидами, облегчения иммобилизации сперматозоидов и инъекции в ооцит в процессе оплодотворения. Полный состав подходящих сред для ICSI предоставлен в приведенной далее таблице:
Среда G-1™ разработана для обеспечения развития эмбрионов на стадии дробления до примерно 8-клеточной стадии. Подобная среда содержит углеводы, аминокислоты и хелатирующие агенты. Полный состав подходящей среды G-1™ предоставлен в приведенной далее таблице:
Концентрации в данной таблице приведены в ммоль, если не указано иначе.
Альтернативным образом, (базовая) среда может представлять собой доступную в продаже культуральную среду IVF, которая способна поддерживать жизнедеятельность эмбрионов в период после 3 дня развития (8-клеточная стадия). Данные культуральные среды были разработаны для перевода эмбрионов на стадию бластоцисты перед имплантацией. Один из примеров включает в себя α-модифицированную питательную среду (αMEM), описанную Desai et al (Human Reprod. 12: 328-335 (1997)). Второй пример включает в себя среду HECM-6 с добавкой пантотената (McKiernan SH & Bavister BD, Human Reprod. 15: 157-164 (2000). Другие примеры включают в себя G-2™ от компании Vitrolife. Среда G-2™ разработана для обеспечения развития эмбриона от примерно 8-клеточной стадии (3 день) до стадии бластоцисты. Эта среда содержит углеводы, аминокислоты и витамины для обеспечения более поздней стадии развития эмбриона.
Полный состав подходящей среды G-2™ предоставлен в приведенной далее таблице:
Концентрации в данной таблице приведены в ммоль, если не указано иначе.
В одном из вариантов осуществления эмбрионы 8-клеточной стадии переносят из эмбриональной культуральной среды, оптимизированной для обеспечения ранней стадии роста (т.е. до 8-клеточной стадии), содержащей добавки согласно настоящему изобретению, в эмбриональную культуральную среду, оптимизированную для обеспечения более поздней стадии роста (т.е. до стадии бластоцисты), в которую можно ввести дополнительные добавки согласно настоящему изобретению.
Концентрация каждого из соединений в культуральной среде может изменяться в зависимости от стадии развития эмбриона, для которой оптимизирована данная среда. Обычные концентрации неорганических солей в культуральных средах могут составлять от примерно 100 ммоль до примерно 150 ммоль или от примерно 110 ммоль до примерно 140 ммоль.
Обычные концентрации источника энергии в средах могут составлять от примерно 5 ммоль до примерно 40 ммоль, например, от примерно 5 ммоль до примерно 30 ммоль, или от примерно 5 ммоль до примерно 15 ммоль.
Обычные концентрации общего количества аминокислот в культуральных средах могут составлять от примерно 0,1 ммоль до примерно 15 ммоль, или от примерно 0,5 ммоль до примерно 12 ммоль, или от примерно 0,5 ммоль до примерно 6 ммоль.
Витамины, факторы роста, гормоны и другие вспомогательные ингредиенты культуральной среды обычно добавляют в довольно низкой концентрации, например, 1 ммоль или меньше, 0,5 ммоль или меньше, или даже 0, 1 ммоль или меньше.
Предпочтительно эмбрион, гамету или стволовую клетку культивируют под слоем парафинового масла. Это позволяет избежать испарения среды и, таким образом, поддерживать постоянную осмолярность. Помимо этого, добавление масла способно минимизировать флуктуации рН и температуры.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда по настоящему изобретению может содержать антибиотик. Некоторые примеры подходящих антибиотиков включают в себя пенициллин и стрептомицин.
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предоставлен способ обращения и/или манипуляций и/или культивирования эмбриона и гаметы, при этом данный способ включает в себя обращение и/или манипуляции и/или культивирование эмбриона и гаметы в культуральной среде согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает в себя использование комбинации ацетилкарнитина (например, в концентрации 5-50 мкмоль) и липоевой кислоты или ее производного (например, в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль) и, необязательно, ацетилцистеина (например, в концентрации примерно 5 до примерно 50 мкмоль) в процессе как манипуляций с гаметами (например, в рабочей среде для гамет (включая среду для сбора гамет), в среде для подготовки сперматозоидов, в среде для созревания ооцитов или любой другой среде, используемой для гамет), так и манипуляций с эмбрионами (например, в среде для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI), среде для оплодотворения, одноступенчатой культуральной среде для эмбрионов, среде для переноса эмбрионов, или любой другой подходящей среде, используемой для эмбрионов).
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению комбинации ацетилкарнитина (например, в концентрации 5-50 мкмоль) и липоевой кислоты или ее производного (например, в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль) и, необязательно, ацетилцистеина (например, в концентрации примерно 5 до примерно 50 мкмоль) в процессе как манипуляций с гаметами (например, в рабочей среде для гамет (включая среду для сбора гамет), так и манипуляций с эмбрионами, например, в процессе ICSI, или оплодотворения, или переноса эмбрионов (например, в среде для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ICSI), или в среде для оплодотворения, или в среде для переноса эмбрионов).
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению комбинации ацетилкарнитина (например, в концентрации 5-50 мкмоль) и липоевой кислоты или ее производного (например, в концентрации от примерно 2,5 до примерно 40 мкмоль) и, необязательно, ацетилцистеина (например, в концентрации примерно 5 до примерно 50 мкмоль) в эмбриональной культуральной среде.
В некоторых вариантах осуществления, соединения для применения в настоящем изобретении добавляют в процессе манипуляций с гаметами, и/или в процессе манипуляций с эмбрионами, и/или в процессе культивирования эмбриона. Иными словами, соединения для применения в настоящем изобретении можно добавлять в течение нескольких стадий в ходе процесса IVF/ICSI.
В некоторых вариантах осуществления, соединения для применения в настоящем изобретении добавляют в рабочую среду для гамет, и/или рабочую среду для эмбрионов, и/или культуральную среду для эмбрионов.
Используемый в настоящем изобретении термин «обработка» может включать в себя любое взятие или перемещение, например, гаметы, эмбриона или стволовой клетки. Например, он может включать в себя перенос гамет в процессе сбора, или после сбора, или перенос эмбрионов для имплантации.
Используемый в настоящем изобретении термин «манипуляция» может включать в себя любую манипуляцию с гаметой, и/или эмбрионом, и/или стволовой клеткой. Например, он может включать в себя ICSI или оплодотворение (например, при введении сперматозоидов для оплодотворения яйцеклетки).
Используемый в настоящем изобретении термин «культивирование» может означать выдерживание в условиях, подходящих для роста или созревания.
рН культуральной среды предпочтительно составляет (поддерживается) от 7,2 до 7,4 (во время культивирования).
Неожиданно было найдено, что культуральная среда согласно настоящему изобретению снижает или предупреждает окислительный стресс и/или снижает или предотвращает образование свободных радикалов (например, образование активных форм кислорода (АФК)) и/или повышает уровень антиоксидантной способности гаметы, эмбриона или стволовой клетки, культивируемой in vitro.
2−
2
2
Окислительный стресс является отражением дисбаланса между системным появлением активных форм кислорода и способности эмбриона или стволовой клетки с легкостью обезвредить реакционноспособные интермедиаты или восстановиться после полученного поражения. Нарушения нормального редокс-состояния клеток способно оказать токсическое действие вследствие образования перекисей и свободных радикалов, поражающих все компоненты клетки, включая белки, липиды и ДНК. Окислительный стресс, развивающийся вследствие окислительного метаболизма, приводит к повреждению оснований, а также к разрывам цепи ДНК. Повреждение оснований является, в основном, косвенным, и вызывается генерированными активными формами кислорода (АФК), например, O (супероксидными радикалом), OH (гидроксильным радикалом) и HO (перекисью водорода). Кроме того, некоторые активные формы кислорода играют роль клеточных мессенджеров в редокс-сигналинге. Таким образом, окислительный стресс способен нарушить нормальные механизмы клеточной передачи сигнала.
Используемый в настоящем описании термин «антиоксидантная способность» означает способность эмбриона или стволовой клетки переносить окислительный стресс. Антиоксидантную способность эмбриона можно определить косвенным способом, измеряя скорость роста эмбриона и/или измеряя концентрацию внутриклеточного глутатиона (GSH) (как подробно описано в разделе материалы и методы далее).
В одном из вариантов осуществления, в культуральной среде согласно настоящему изобретению концентрацию GSH у эмбрионов, культивируемых in vitro, поддерживают практически на том же уровне, что и у эмбрионов, развивающихся in vivo. Другими словами, определенная комбинация ацетилкарнитина, липоевой кислоты и (необязательно) ацетилцистеина, которой обучают в настоящем изобретении, в культуральной среде согласно настоящему изобретению, повышает концентрацию GSH у эмбрионов, культивируемых in vitro, по сравнению с эмбрионами, культивируемыми in vitro, в культуральной среде, не содержащей данной комбинации соединений.
Не желая привязываться к какой-либо определенной теории отметим, что GSH представляет собой пептид, содержащий сульфгидрильную (тиоловую группу), играющий ключевую роль в защите клеток от окислительного поражения. Его роль в развитии эмбрионов была показано на примере пролиферации и развития клеток в процессе эмбрионального развития. Синтез GSH зависит от наличия цистеина и, благодаря торможению по методу обратной связи, внутриклеточная концентрация цистеина определяет верхний предел концентрации клеточного GSH. Следовательно, повышение концентрации GSH способно защитить клетку от окислительного стресса благодаря более высокой антиоксидантной способности, таким образом, способствуя повышению качестве эмбрионов.
Скорость роста можно измерить, определяя количество клеток трофэктодермы, количество внутренней клеточной массы, или общее количество клеток, например, на 2 день культивирования в культуральной среде согласно настоящему изобретению, или на стадии бластоцисты, например, подходящим образом, при определении через 5 дней после культивирования в культуральной среде согласно настоящему изобретению, определяя период времени до достижения стадии расширенной бластоцисты, и/или определяя период времени до достижения стадии хетчинга бластоцисты.
Кроме того, или альтернативным образом, неожиданно было найдено, что культуральная среде согласно настоящему изобретению улучшает развитие эмбриона, культивируемого in vitro.
Используемый в настоящем изобретении термин «улучшает развитие» применительно к эмбриону может включать в себя одно или более из следующего:
a) увеличение количества клеток трофэктодермы у эмбриона на стадии бластоцисты, например, при определении на 5 или 6 день культивирования в культуральной среде согласно настоящему изобретению),
b) увеличение внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты, например, при определении на 5 или 6 день культивирования в культуральной среде согласно настоящему изобретению,
c) увеличение общего количества клеток эмбриона на стадии бластоцисты, например, при определении на 5 или 6 день культивирования в культуральной среде согласно настоящему изобретению,
d) уменьшение периода времени до достижения стадии расширенной бластоцисты,
e) уменьшение периода времени до достижения хетчинга бластоцисты,
f) увеличение массы плода после переноса эмбриона,
g) увеличение копчико-теменного размера плода после переноса эмбриона,
h) увеличение массы плаценты после переноса эмбриона,
i) повышение хорошего качества бластоцист (GQB) (т.е. фракции бластоцист, достигающей категории 3АВ или более высокой по классификации бластоцист по Гарднеру (смотри Gardner et al 1999) из общего количества бластоцист по сравнению с эмбрионами, культивируемыми в похожих средах в отсутствие антиоксидантов, и/или
a) увеличение частоты дальнейшего использования бластоцист (т.е. фракции бластоцист, которые либо используют свежими для переноса, либо подвергают криоконсервированию для более позднего переноса пациенту, например, в процентах от общего количества оплодотворенных ооцитов или в процентах от общего количества бластоцист.
Используемый в настоящем описании термин «внутренняя клеточная масса (ВКМ)» означает массу клеток внутри эмбриона, из которых впоследствии разовьются определенные структуры плода. Внутренняя клеточная масса известна также как эмбриобласт или плюрибласт.
Используемый в настоящем описании термин «трофэктодерм (ТЭ)» означает клетки, образующие внешний слой бластоцисты, например, которые обеспечивает поступление питательных веществ к эмбриону и развивается в большую часть плаценты.
Используемый в настоящем описании термин «расширенная бластоциста» означает стадию развития, на которой полость бластоцеля больше эмбриона. Обычно это сопровождается утончением оболочки бластоцисты (блестящей оболочки).
Используемый в настоящем описании термин «хетчинг бластоцисты» означает момент, в который эмбрион освобождается из покрывающей его блестящей оболочки. В результате ряда циклов сжатия-расширения эмбрион разрывает данную оболочку. Этому содействуют ферменты, растворяющие блестящую оболочку на не содержащем эмбриобласт полюсе бластоцисты. Ритмическое расширение и сжатие приводит к выхождению эмбриона за пределы полости и освобождению его из жесткой гликопротеиновой оболочки (блестящей оболочки).
Термин «улучшает» (например, применительно к развитию и/или пролиферации и/или дифференциации) означает улучшение по сравнению с контролем (например, рост в аналогичной культуральной среде, но в отсутствие комбинации ацетилкарнитина и липоевой кислоты или ее производного, или комбинации ацетилкарнитина и липоевой кислоты или ее производного и ацетилцистеина, определенной в настоящем изобретении).
В предпочтительном варианте осуществления эмбрион представляет собой эмбрион млекопитающего, например, эмбрион человека.
В одном из вариантов осуществления эмбрион представляет собой эмбрион человека.
Предимплантационный период развития эмбриона различается для разных видов млекопитающих. Однако для эмбрионов человека и мыши наблюдается наибольшее сходство в продолжительности развития (от примерно 4 до 5 дней), а также проявляется сходство в имплантации. Бластоцисты обоих видов достигают одинакового размера, и схема расхода питательных веществ имеют очень большое сходство для эмбрионов человека и мыши (смотри, например, Gott AL, Hardy K, Winston RM, Leese HJ. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod. 1990;5(1):104-8; Leese HJ, Barton AM. Pyruvate and glucose uptake by mouse ova and preimplantation embryos. J Reprod Fertil. 1984;72(1):9-13; and Gardner DK, Wale PL. Analysis of metabolism to select viable human embryos for transfer. Fertility and Sterility. 2013;99(4):1062-72). Сходство в развитии человека и мыши таково, что оно позволяет оценивать развитие человека на основании экспериментов, проведенных на мышах (смотри Csaba Pribensky et al. Reproductive Biomedicine Online (2010) 20, 371-379). Следовательно, считается, что мышь представляет собой наиболее подходящую модель предимплантационного эмбриона человека.
Используемый в настоящем описании термин «гамета» может относиться к ооциту и/или к сперматозоиду.
Используемый в настоящем описании термин «эмбрион» может иметь широкое определение, включающее в себя пре-эмбриональную фазу. Используемый в настоящем описании термин «эмбрион» может включать в себя все стадии развития от оплодотворения ооцита, включающие в себя компактизацию, стадии образования морулы, бластоцисты, хетчинг и имплантацию.
В некоторых случаях термин «эмбрион» используется для описания оплодотворенного ооцита после имплантации в матку до истечения 8 недель после оплодотворения, после чего у человека он считается плодом. Согласно этому определению, до момента имплантации оплодотворенный ооцит часто называют пре-эмбрионом. Однако, как отмечалось выше, использованный в настоящем описании термин «эмбрион» может включать в себя фазу пре-эмбрионального развития.
Эмбрион имеет приблизительно сферическую форму и состоит из одной или более клеток (бластомеров), окруженных неклеточным матриксом, известной под названием блестящая оболочка. До момента хетчинга эмбриона блестящая оболочка выполняет ряд функций и представляет собой хороший ориентир для оценки эмбриона. Блестящая оболочка является сферической и прозрачной и должна хорошо отличаться от омертвевших клеток.
Оплодотворение представляет собой момент времени, в который ооцит распознает и принимает сперматозоид. Сперматозоид запускает процесс активации яйцеклетки после того, как мейотический цикл ооцита остановился на стадии метафазы второго мейотического деления. В результате происходит образование и экструзия второго направительного тельца. В настоящем описании этот момент времени называется разрушением второго направительного тельца (смотри ссылку ii.). Через несколько часов после слияния сперматозоида и яйцеклетки начинается синтез ДНК. Образуются женский и мужской пронуклеусы (ПН). Этот момент времени называется моментом образования пронуклеусов (ПН) (смотри ссылку iii.). ПН движется к центру яйца, и мембраны разрушаются и ПН исчезает. В настоящем описании этот момент времени называется моментом исчезновения (или растворения) пронуклеуса (смотри ссылку i.). Это объединение двух геномов называется сингамией. После этого начинается деление клеток.
В процессе эмбрионального развития количество бластомеров увеличивается в геометрической прогрессии (1-2-4-8-16- и тд.). У человеческих эмбрионов синхронное деление клеток обычно продолжается до 8-клеточной стадии. После этого деление клеток становится асинхронным и, наконец, отдельные клетки обретают свой собственный клеточный цикл. Человеческие эмбрионы, полученные в процессе лечения бесплодия, обычно переносят реципиенту до стадии 8 бластомеров. В некоторых случаях эмбрионы культивируют также до стадии бластоцист перед переносом. Это делают предпочтительно в тех случаях, когда получается много эмбрионов хорошего качестве или требуется продолжительная инкубация до получения результатов предимплантационного генетической диагностики (ПГД). Однако по мере совершенствования методики инкубации наблюдается тенденция к увеличению продолжительности инкубации.
Соответственно, далее термин эмбрион используется для обозначения каждой из стадий оплодотворенного ооцита, зиготы, 2-клеточной, 4-клеточной, 8-клеточной, 16-клеточной стадии, компактизации, стадии образования морулы, бластоцисты, расширенной бластоцисты, и хетчинга бластоцисты, а также промежуточных стадий (например, 3-клеточной или 5-клеточной).
Эмбрион образуется при оплодотворении ооцита путем слияния или внедрения мужской половой клетки (сперматозоида). Данный термин традиционно используется также после наступления хетчинга (т.е. разрыва блестящей оболочки) и последующей имплантации. У человека оплодотворенный ооцит традиционно называется зиготой или эмбрионом в течение первых 8 недель. Потом (т.е. по прошествии восьми недель и после того, как сформировались все главные органы) он называется плодом. Однако, в целом, различие между зиготой, эмбрионом и плодом не определено точно. В настоящем описании термины эмбрион и зигота используются взаимозаменяемо.
В одном из вариантов осуществления эмбрион может культивироваться индивидуально.
В еще одном варианте осуществления эмбрион культивируют в культуральной среде согласно настоящему изобретению до стадии бластоцисты, стадии расширенной бластоцисты или стадии хетчинга бластоцисты.
Кроме того, или альтернативным образом, неожиданно было найдено, что культуральная среда согласно настоящему изобретению улучшает пролиферацию и дифференциацию стволовой клетки, культивируемой in vitro.
Используемый в настоящем описании термин «дифференциация» (например, применительно к развитию стволовой клетки) означает процесс, посредством которого происходит изменение клетки от одного клеточного типа в другой. Данный термин может включать в себя переход менее специализированного типа клетки в более специализированный тип клетки, например, в процессе клеточного роста.
Используемый в настоящем описании термин «пролиферация» (например, применительно к развитию стволовой клетки) означает размножение стволовых клеток, например, приводящее к увеличению популяции стволовых клеток.
Используемый в настоящем описании термин «стволовая клетка» означает недифференцированную биологическую клетку, которая способна дифференцироваться в специализированные клетки и способна к делению (путем митоза), образуя новые стволовые клетки. Термин «стволовая клетка» включает в себя как эмбриональные стволовые клетки, которые можно выделить из внутренней клеточной массы бластоцисты, и взрослые стволовые клетки, которые находятся в различных тканях. Кроме того, или альтернативным образом, термин «стволовая клетка» означает индуцированную плюрипотентную стволовую клетку (ИПСК). ИПСК представляют собой тип плюрипотентных стволовых клеток, которые можно получить из взрослых клеток.
В одном из вариантов осуществления термин стволовая клетка означает эмбриональную стволовую клетку.
Примечательно, что эмбриональные стволовые клетки получают из внутренней клеточной массы эмбриона. Авторами настоящего изобретения показано, что культуральная среда согласно настоящему изобретению защищает и/или улучшает развитие внутренней клеточной массы. Таким образом, культуральная среда согласно настоящему изобретению защищает эмбриональные стволовые клетки, полученные из внутренней клеточной массы.
В одном из вариантов осуществления стволовая клетка может представлять собой стволовую клетку человека.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда может представлять собой среду, специфическую для культуры стволовых клеток. В качестве базовой среды можно использовать любую известную среду для культуры стволовых клеток.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда для стволовых клеток может представлять собой среду для культивирования плюрипотентной стволовой клетки.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда для стволовых клеток может представлять собой среду для культивирования эмбриональных стволовых клеток человека и/или ИПСК.
В одном из вариантов осуществления (базовая) среда для стволовых клеток может представлять собой коммерчески доступную среду, известную как mTeSR™1, например, без-фидерную поддерживающую среду определенного состава для эмбриональных стволовых клеток человека и/или ИПСК (от компании StemCell™ Technologies, Великобритания).
Эмбрион или стволовую клетку можно культивировать при содержании кислорода в интервале от 5-20% об./об.
В одном из вариантов осуществления эмбрион, гамету или стволовую клетку культивируют в условиях содержания кислорода воздуха. Использованные в настоящем изобретении условия содержания кислорода воздуха могут включать в себя примерно 18-22% об./об. или примерно 19-21% об./об. В одном из вариантов осуществления условия содержания кислорода воздуха составляют примерно 20% об./об.
В следующем варианте осуществления эмбрион, гамету или стволовую клетку культивируют в условиях пониженного содержания кислорода. Условия пониженного содержания кислорода, использованные в настоящем изобретении, могут включать в себя содержание кислорода от примерно 3% (об./об.) до примерно 7% (об./об.) или от примерно 4% (об./об.) до примерно 6% (об./об.) В одном из вариантов осуществления условия пониженного содержания кислорода составляют примерно 5% (об./об.)
Настоящее изобретение относится к использованию липоевой кислоты или ее производное. Термин липоевая кислота может означать α-липоевую кислоту. Это соединение может быть в любой форме рацемата, например, (±)-1,2-дитиолан-3-пентановой кислоты, (R)-5-(1,2-дитиолан-3-ил)пентановой кислоты или (S)-1,2-дитиолан-3-пентановой кислоты. Липоевую кислоты или ее производное можно добавить в виде смеси энантиомерных форм, или в виде индивидуального энантиомера. В последнем случае было найдено, что R-энантиомер обладает большей биологической активностью. Одним из производных липоевой кислоты для применения в настоящем изобретении является липоат. Липоат представляет собой соль или эфир липоевой кислоты. Еще одно производное липоевой кислоты включает в себя метилзамещенную липоевую кислоту. Используемый в настоящем изобретении термин «производное» применительно к липоевой кислоте означает биологически активные амфифильные дисульфидные/тиоктовые молекулы, обладающие физиологическими свойствами, которые фактически эквивалентны свойствам липоевой кислоты.
Использованный в настоящем описании термин «ацетилцистеин» может представлять собой N-ацетил-L-цистеин (NAC) (например, немодифицированный NAC), или его производное, такое как N-ацетилцистеинамид (NACA).
В предпочтительном варианте осуществления использованный здесь термин «ацетилцистеин» означает N-ацетил-L-цистеин (NAC) (например, немодифицированный NAC).
Термин ацетилкарнитин может относиться к ацетил-L-карнитину.
В одном из вариантов осуществления эмбрион или стволовую клетку можно культивировать в среде согласно настоящему изобретению при температуре от примерно 35°C до примерно 39°C.
В предпочтительном варианте осуществления эмбрион или стволовую клетку можно культивировать в среде согласно настоящему изобретению при температуре от примерно 36,5°C до примерно 37,5°C.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления эмбрион или стволовую клетку можно культивировать в среде согласно настоящему изобретению при температуре примерно 37°C.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению не содержит кофермента Q, или убихинона.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению не содержит кофермента Q, или убихинона в концентрации от 0,0001% до 0,005% от массы конечной композиции.
В одном из вариантов осуществления культуральная среда согласно настоящему изобретению не содержит полисорбатного поверхностно-активного вещества. Полисорбатное поверхностно-активное вещество может представлять собой, например, Tween™ или Span™.
Что касается гаметы, упоминаемой в настоящем описании, то она включает в себя как индивидуальную гамету, так и множество гамет. Другими словами, гамета означает «гамету или гаметы».
Что касается эмбриона, упоминаемого в настоящем описании, то он включает в себя как индивидуальный эмбрион, так и множество эмбрионов. Другими словами, эмбрион означает «эмбрион или эмбрионы».
Что касается стволовой клетки, упоминаемой в настоящем описании, то она включает в себя как индивидуальную стволовую клетку, так и множество стволовых клеток. Другими словами, стволовая клетка означает «стволовую клетку или стволовые клетки».
Если не определено иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют то же значение, что обычно подразумевается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Общий словарь для специалиста в данной области, содержащий многие термины, использованные в настоящем описании, может быть представлен Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991).
Настоящее изобретение не ограничено теми материалами и методами, которые в качестве примера раскрыты в настоящем описании, и для осуществления на практике или тестирования вариантов осуществления настоящего изобретения можно использовать любые материалы и методы, сходные или эквивалентные описанным здесь материалам и методам.
В случае, когда приведен диапазон значений, понятно, что здесь также конкретно раскрыта каждая промежуточная величина, до десятой доли нижнего предела, если в контексте ясно не указано иначе, от верхнего до нижнего значения данного диапазона. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением и любым другим указанным или промежуточным значением в данном заявленном диапазоне входит в настоящее описание. Верхние и нижние значения этих меньших диапазонов можно независимо включать или исключать из диапазонов, и каждый диапазон, в который входит один из, ни один из, или оба значения, также включены в настоящее описание. В случае, когда заявленный диапазон включает в себя один или оба верхнее и нижнее значение, диапазоны, исключающие либо один, либо оба таких значения, также входят в настоящее описание.
Следует отметить, что при использовании в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения признаков в единственном числе, подразумевается, что оно также включает в себя множественное число, если в контексте ясно не указано иначе. Так, например, упоминание «эмбриона» включает в себя множество таких возможных эмбрионов, и так далее.
Публикации, обсуждаемые здесь, предоставлены исключительно в целях их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто из предоставленного в настоящем изобретении не следует считать допущением, что подобные публикации составляют предшествующий уровень техники в отношении прилагаемой формулы изобретения.
Все патентные и непатентные ссылки, цитированные в этой заявке, или в настоящей заявке, также включены ссылкой во всей ее полноте.
Теперь настоящее изобретение будет описано, только в качестве примера возможного воплощения, со ссылкой на следующие фигура и примеры.
Примеры
Материалы и методы
Коллекция эмбрионов
Неоплодотворенным самкам мышей-гибридов линии F1 (C57BL/6 x CBA) в возрасте 3-4 недель делали внутрибрюшинную инъекцию 5 МЕ гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл. Спустя 48 часов вводили 5 МЕ человеческого гонадотропина в виде хорулона, и спаривали самок мышей с самцами мышей линии F1 в возрасте >12 недель. Успешное спаривание подтверждалось наличием слизистой пробки во влагалище на следующее утро. Пронуклеарные ооциты отбирали через 22 часа после инъекции ХГЧ, в предварительно подогретой рабочей среде (G-MOPS) с добавкой 5 мг/мл сывороточного альбумина человека. Ооциты отделили от кумулюсных клеток при помощи среды GMOPS, содержавшей 300 МЕ/мл гиалуронидазы. Все эмбрионы дважды промывали средой G-MOPS и однократно – средой G-1™ перед распределением для культивирования. Животных расселяли в условиях 12-часового светового периода при неограниченном наличии пищи и воды. Все опыты на мышах были одобрены Комитетом по этичному обращению с животными.
Культивирование эмбрионов
2
2
Эмбрионы культивировали в группах по 10, в капле среды объемом 20 мкл под слоем парафинового масла при содержании в воздухе 6% CO(кислород воздуха ~20%), или при 6% CO и 5% кислорода при 37°C в инкубаторе с газовой смесью в условиях высокой влажности (Sanyo MCOK-5M[RC], Япония). Эмбрионы культивировали в среде G-1™ (G-1™ с добавкой HSA-solution™, Vitrolife) в течение 48 часов, а затем еще в течение 48 часов в среде G-2™ (G-2™ с добавкой HSA-solution™, Vitrolife). Бластоцисты, выбранные для переноса в матку на 4 день, культивировали в среде G2 в течение 24 часов перед переносом. Все культивирование проводили в чашках Петри размером 35 мм (Falcon, BD Biosciences).
Перенос эмбрионов
Самок мышей линии в возрасте 8-12 недель спаривали с вазэктоминизированными самцами для установления ложной беременности. Успешное спаривание подтверждалось наличием слизистой пробки во влагалище на следующее утро. На 4 день (через 96 часов после осеменения) хирургическим способом бластоцисты переносили в матку ложнобеременных самок мышей (синхронизировано с состоянием репродуктивных органов самок-реципиентов). Самок мышей-реципиентов анестезировали газообразным изофлураном. Пять эмбрионов переносили при помощи пипетки через разрез дорсальной стенки в полость каждого рога матки, при этом каждой самке-реципиенту вводили эмбрионы из контрольной группы и опытной группы. Чтобы избежать систематической ошибки, связанной с предпочтительной имплантацией, альтернативные группы переносили как в правый, так и в левый рог реципиента. После переноса эмбрионов рану на коже герметизировали при помощи стерильных хирургических зажимов. Беременных самок умерщвляли через 10 дней и регистрировали развитие плода или участки резорбции. Проводили измерения копчико-теменного размера плода, массы плода и плаценты, и морфологические показатели развития ушей, глаз и конечностей плода, по рекомендации Wahlsten и Wainwright (1977) (J. of Embryology and Experimental Morphology 42: 79-92), ссылка на которых включена в настоящее описание ссылкой.
Определение количества эмбриональных клеток.
Дифференциальную окраску эмбрионов проводили методами, общеизвестными в данной области, для определения отнесения клеток к внутренней клеточной массе (ВКМ) и трофэктодерме (ТЭ) на 5 день (например, в бластоцисте). Вкратце, после удаления оболочки при помощи проназы, эмбрионы подвергали реакции, при которой вводится метка йодида пропидия в ядро ТЭ, при этом ВКМ остается нетронутой и немеченной. После обработки бисбензимидом все ядра были окрашены. Готовили препараты целых эмбрионов в глицерине и делали их снимки при помощи инвертированного флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse TS100) с цифровой камерой (Nikon digital sight DS-Fi1) и производили подсчет ядер при помощи программного обеспечения обработки изображений ImageJ.
Эмбриональная культура для обработки MCB и BSO
2
2
2
Эмбрионы культивировали в группах по 10, в 20 мкл каплях среды под слоем парафинового масла (Ovoil, Vitrolife) при содержании 6% CO, 20% O74% Nпри 37°C в инкубаторе с газовой смесью в условиях высокой влажности (Sanyo MCOK-5M[RC], Japan). Половину эмбрионов распределяли в контрольную группу, а оставшуюся половину – в опытную группу. Эмбрионы контрольной группы культивировали в среде G-1™ (G-1™ с HSA-solution™, Vitrolife) в течение 4 часов. Эмбрионы опытной группы аналогичным образом культивировали в среде G-1™ с добавкой оптимальной дозой тройного антиоксиданта (как определено в примере 2).
Оптимизация дозы BSO
2
2
2
2
2
2
Сразу после отбора эмбрионы, предназначенные для контроля пронуклеусов, инкубировали в среде G-1™ с добавкой BSO в дозах 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 мкмоль в течение 4 часов в условиях содержания 6% CO, 20% O, 74% Nпри 37°C. Эмбрионы тщательно промывали средами G-1™ с HSA-solution™ и помещали индивидуально в 2 мкл каплю GMOPS с HSA-solution™ (G-MOPS™ Plus, Vitrolife AB, Швеция), нанесенную на чашку со стеклянным дном (Fluorodish, Coherent Scientific, Австралия) и покрывали слоем парафинового масла (Ovoil, Vitrolife) для визуализации флуоресценции. Оптимальную дозу определяли путем регистрации флуоресценции при длине волны возбуждения/испускания 360 ± 40 нм/ 460 ± 40 нм при помощи флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse TS100). Получали результаты, вычитая значения слепых опытов (эмбрионы, не подвергавшиеся действию BSO) и базальных уровней культуральных сред из зарегистрированных значений флуоресценции. Все использованные среды и масло предварительно выдерживали в течение ночи в условиях содержания 6% CO, 20% O, 74% Nпри 37°C.
Оптимизация дозы МСВ
Оптимизация дозы MCB при помощи флуоресцентного образца проводили аналогично оптимизации дозы BSO, как описано ранее, на эмбрионах, инкубированных в среде G-1™ с добавкой MCB в дозе 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 мкмоль в течение 15 минут.
Проверка специфичности MCB к глутатиону (GSH)
Для проверки специфичности MCB к GSH использовали оптимальные дозы, составлявшие 200 мкмоль BSO и 10µ мкмоль MCB. Проверку проводили так же, как и оптимизации модельных доз. Сразу после отбора эмбрионы с пронуклеусами инкубировали в среде G-1™ с добавкой 200 мкмоль BSO в течение 4 часов. После тщательного промывания средами G-1™ с HSA-solution™, эмбрионы дополнительно культивировали в 10 мкмоль MCB в течение 15 минут. После конечного тщательного промывания средой G-1™ с HSA-solution™, эмбрионы помещали индивидуально в 2 мкл капли GMOPS с HSA-solution™ под слой парафинового масла и получали снимки флуоресцентных изображений.
Определение концентрации глутатиона
Через 4 часа после отбора и инкубирования ооцитов, эмбрионы из группы контроля и опытной группы обрабатывали 10 мкмоль MCB в течение 15 минут в тех же условиях культивирования. После того, как все эмбрионы промывали и помещали в индивидуальные 2 мкл капли среды G-1™, детектировали флуоресценцию, как описано выше. Чтобы оценить период действия MCB, снимки делали каждый 10 минут.
Статистический анализ
Данные относительно количества клеток для всех обработок по сравнению с контрольными экспериментами подвергали однофакторному дисперсионному анализу (ANOVA) с последующей поправкой Бонферрони. Данные относительно долей сравнивали с использованием таблицы сопряженности 3x2. В случае разовых доз, средние значения сопоставляли с контрольными экспериментами с использованием t-критерия Стъюдента. Все группы тестировали на нормальности перед анализом с использованием критерия Бартлетта. Различия считались биологически значимыми при р-значении, равном 0,05. Все анализы проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism version 5.04 for Windows (от GraphPad Software).
2
Пример 1: развитие группы эмбрионов при 20% содержании O с одним из соединений
Эмбрионы, культивированные в контрольных группах, выращивали в среде G-™1 и G-2™ с добавкой HSA 5 мг/мл (HSA, Vitrolife). Эмбрионы в опытных группах аналогичным образом культивировали в среде G-1™ и G-2™ с добавкой ацетилкарнитина, ацетилцистеина или α-липоевой кислоты от фирмы Sigma Aldrich, США, в дозах 1, 10 и 100 мкмоль и с добавкой HSA, как в контрольной группе. Оптимальные дозы карнитина (Фигура 1a и таблица 1a, представляющие два независимых эксперимента), цистеина (Фигура 1b и таблица 1b, представляющие два независимых эксперимента) и липоевой кислоты (Фигура 1с и таблица 1с) определяли путем культивирования эмбрионов и анализа количеств полученных конечных клеточных поколений. «Суммарное среднее» означает среднее общее количеств клеток в эмбрионе (включая внутреннюю клеточную массу и трофэктодерму) на 5 день. Доза, которая привела к значительно большему количеству клеток, считали оптимальной дозой. Было найдено, что оптимальная доза для ацетилкарнитина составила 10 мкмоль, которая вызвала значительный рост количества клеток трофэектодермы, что привело к увеличению количества клеток в бластоцисте. Аналогичным образом, оптимальная доза ацетилцистеина составила 10 мкмоль, при которой значительно возросло количество внутренних клеток бластоцисты. Было найдено, что 5 мкмоль представляют оптимальную дозу для липоевой кислоты, при которой наблюдается значительно большее количество клеток трофэктодермы и внутренних клеток, что приводило к увеличению количества клеток в бластоцисте. Ни одна обработка не оказала отрицательного влияния на образование бластоцист по сравнению с контрольными экспериментами (данные не показаны).
Таблица 1a:
Обработка
Количество эмбрионов
Общее среднее
Контроль
11
90,09
1 мкмоль
13
95,85
10 мкмоль
11
107,83
30 мкмоль
14
86,93
1000 мкмоль
17
67,41
Таблица 1b:
Обработка
Количество эмбрионов
Общее среднее
Контроль
12
93,75
1 мкмоль
12
81,92
10 мкмоль
7
109,29
30 мкмоль
8
104,38
1000 мкмоль
12
95,17
Таблица 1c
Обработка
Количество эмбрионов
Общее среднее
Контроль
66
80,2
5 мкмоль
62
90,2
10 мкмоль
62
91,3
20 мкмоль
63
94
80 мкмоль
65
34,0
Кроме того, из представленных данных видно, что повышение концентрации только лишь одного соединения не дает преимуществ, связанных с комбинациями согласно настоящему изобретению.
Пример 2: Влияние комбинации антиоксидантов на количество клеток в бластоцисте
Эмбрионы, культивированные в контрольных группах, выращивали в среде G-1™ и G-2™ с добавкой HSA-solution™ в концентрации 5 мг/мл. Эмбрион в опытных группах аналогичным образом культивировали в среде G-1™ и G-2™ с добавкой 10 мкмоль ацетилкарнитина - 10 мкмоль ацетилцистеина, 10 мкмоль ацетилкарнитина - 5 мкмоль липоевой кислоты, 10 мкмоль ацетилцистеина - 5 мкмоль липоевой кислоты, тройной смеси из 10 мкмоль ацетилкарнитина -10 мкмоль ацетилцистеина - 5 мкмоль липоевой кислоты и с добавкой HSA. Через 5 дней инкубирования количество клеток бластоцист было значительно выше для эмбрионов, обработанных тройной смесью антиоксидантов по сравнению с обработкой двойной смесью антиоксидантов. Несмотря на то, что в группе, обработанной 10 мкмоль ацетилкарнитина - 5 мкмоль липоевой кислоты, также наблюдалось значительно более высокое общее количество клеток по сравнению с контрольной группой, обработка тройной смесью кроме этого эффекта также вызывала значительное увеличение количества клеток ТЭ, что в результате дало большее общее количество клеток (Фигура 2).
2
Пример 3: Развитие группы эмбрионов при 5% содержании O в присутствии комбинации соединений
2
2
2
2
Эмбрионы культивировали в группах по 10 в 20 мкл капли среды под слоем парафинового масла (Ovoil, Vitrolife) в условиях содержания 6% CO, 5% O, 89% Nпри 37°C в инкубаторе с газовой смесью в условиях высокой влажности (Sanyo MCOK-5M[RC], Japan). Половину эмбрионов распределяли в контрольную группу, а оставшуюся половину – в опытную группу. Эмбрионы контрольной группы культивировали в описанной выше среде с добавкой оптимальной дозы антиоксидантов, как определено ранее. При культивировании в присутствии 5% О,уэмбрионов, культивированных индивидуально с добавкой тройной смеси, наблюдалось значительное увеличение ВКМ и клеток трофэктодермы, что приводило к возрастанию общего количества клеток бластоцисты (Фигура 3).
2
Пример 4: Индивидуальное культивирование эмбриона при 20% O в присутствии комбинации соединений
2
2
Эмбрионы культивировали индивидуально в 20 мкл капли среды под слоем парафинового масла при содержании 6% CO в воздухе (атмоферного О ~20%)при 37°C в инкубаторе с газовой смесью в условиях высокой влажности (Sanyo MCOK-5M[RC], Japan). Половину эмбрионов распределяли в контрольную группу, а оставшуюся половину – в опытную группу. У эмбрионов, культивированных индивидуально в присутствии тройной смеси, наблюдалось значительное увеличение ВКМ и клеток трофэктодермы, что приводило к возрастанию общего количества клеток бластоцисты (Фигура 4). Из данных результатов видно, что при индивидуальном культивировании также наблюдается улучшенное развитие эмбриона. Несмотря на то, что в случае индивидуального культивирования эмбрионов общее количестве клеток было меньше, влияние комбинации антиоксидантов было больше для эмбрионов, культивированных индивидуально, по сравнению с культивированием в группах, при этом наблюдалось увеличение ВКМ, ТЭ и общего количества клеток (сравни Фигуру 4 и Фигуру 2).
Пример 5: Деление и продолжительность периодов развития индивидуальных эмбрионов, культивированных в присутствии тройной смеси
Данные по кинетике развития эмбрионов получали при помощи PrimoVison (Vitrolife) с использованием инкубатора-термостата с двумя камерами для газа, снабженного светлопольной оптикой (MCOK-5M[RC], Sanyo, Осака, Япония) и системой цейтраферной съемки EmbryoScope™ (Unisense FertiliTech). Эмбрионы культивировали индивидуально в контрольных группах и в опытных группах при оптимальной дозе антиоксидантов, и в течение всего периода культивирования с интервалом в 15 минут проводили цейтраферную съемку. Сроки морфокинетических событий регистрировали в часах после введения ХГЧ. Сроки деления клетки и развития эмбрионов, культивированных индивидуально в присутствии 20% O2 в средах с добавкой антиоксидантной смеси, состоящей из 10 мкмоль карнитина, 10 мкмоль цистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, или в контрольных средах в отсутствие антиоксидантов (Фигура 5). Анализ кинетики развития показал, что рост эмбрионов, культивированных в группе с добавлением тройной смеси, (99,8 ± 0,5 ч по сравнению с 102,8 ± 0,7 ч; P< 0,05), а также хетчинг бластоцист (102,6 ± 0,8 ч по сравнению с 104,9 ± 1,1 h; P<0,01), происходили значительно быстрее, чем в случае эмбрионов, культивированных к контрольных группах (Фигура 5), указывая на то, что положительный эффект действия антиоксидантов наблюдается и на более поздних стадиях развития, например при образовании бластоцист.
Пример 6: Влияние продолжительности действия соединений
Влияние продолжительности действия антиоксидантов
В случае эмбрионов, выращенных в среде с добавление смеси на протяжении всего периода культивирования, составлявшего до 5 дней (G1 & G2), наблюдался значительный рост внутренней клеточной массы бластоцист, приводящий к значительному увеличению общего количества клеток, по сравнению с контролем. Кроме того, наблюдалось значительное увеличение общего количества клеток бластоцит для эмбрионов, выращенных в средах, добавленных лишь к среде G-1™ (Фигура 6), что свидетельствует о положительном влиянии до стадии компактизации.
Пример 7: Корреляции снижения уровня GSH вследствие BSO специфичности
Было найдено, что оптимальные дозы для флуоресцентного зонда составляют 200 мкмоль бутионинсульфоксимина (BSO) и 10 мкмоль/мл монохлорбимана (MCB). BSO представляет собой ингибитор глутатионсинтетазы. MCB связывается с восстановленным глутатионом (GSH) и является маркером флуоресценции GSH, используемым для определения GSH внутри клеток.
У эмбрионов, подвергнутых предварительной обработке 200 мкмоль BSO, а затем обработанных 10 мкмоль/мл или 40 мкмоль/мл MCB, наблюдалась значительно сниженная флуоресценция по сравнению с группами, обработанными только MCB (Фигура 7). Полученные результаты указывают на высокоспецифичное связывание BSO с глутатионсинтетазов, понижающее эндогенную концентрацию GSH, что приводит к снижению интенсивности флуоресценции. На Фигуре 7 показано значительное ослабление флуоресценции у эмбрионов, обработанных комбинацией 200 мкмоль BSO и либо 10 мкмоль, либо 40 мкмоль MCB, по сравнению с эмбрионами, обработанными только MCB. Обработка 10 мкмоль MCB привела к большему ослаблению флуоресценции (P=0,004) по сравнению с 40 мкмоль (P=0,011), поэтому в последующих экспериментах использовали именно эту концентрацию (40 мкмоль). Интересно отметить, что при 80 мкмоль MCB не наблюдалось существенных различий в флуоресценции между группами, обработанными BSO, и группами, не обработанными BSO, что указывает на то, что при более высоких концентрациях MCB флуоресценция ослабевает из-за того, что из-за высокого уровня флуоресценции MCB нельзя определить секвестирование BSO.
Пример 8: Влияние антиоксидантов на концентрацию GSH в эмбрионах
Эмбрионы культивировали в соответствии с разделом материалы и методы – смотри «культуральная среда для эмбрионов для обработки MCB и BSO», а концентрацию глутатиона (GSH) определяли во время «Определения концентрации глутатиона» в приведенном выше разделе материалов и методом. У эмбрионов в контрольных группах, которые культивировали в отсутствие соединений (например, антиоксидантов), концентрация GSH была значительно ниже (P<0,01), чем у эмбрионов, промытых in vivo (Фигура 8). Однако, когда эмбрионы культивировали в присутствии тройной смеси антиоксидантов, концентрация GSH была аналогична концентрации в эмбрионах, развивавшихся in vivo, что свидетельствует о том, что антиоксиданты поддерживают концентрацию GSH в эмбрионах, культивируемых in vitro.
2
Пример 9: Влияние соединений на развитие плода и беременность (20% O)
После переноса бластоцист реципиентам с ложной беременностью, у эмбрионов, культивированных в присутствии антиоксидантов, наблюдались значительно большие значения копчико-теменных размеров (11,6 ± 0,1 мм по сравнению с 11,3 ± 0,1 мм; P<0.01), большая масса плода (209,8 ± 11,8 мг по сравнению с 183,9 ± 5,9 мг; P<0.05) и плаценты (103,5 ± 3,1 мг по сравнению с 93,6 ± 2,7 мг; P<0,01) по сравнению с контрольными опытами (Таблица 2). Существенного различия в скорости имплантации для контрольной группы культивированных эмбрионов и эмбрионов, в присутствии тройной смеси антиоксидантов, не было. Аналогично, между двумя данными группами не наблюдалось существенного различия в морфологических показателях развития конечностей, глаз и ушей, и определяющих пол параметров.
Пример 10: Влияние соединение на развитие плода и беременность эмбрионами, культивированными при 5% содержании кислорода и сравнение с вымытыми на 4 день эмбрионами in vivo
После переноса бластоцист реципиентам с ложной беременностью, эмбрионы, вымытые in vivo, дали плоды со значительно большей массой (P<0,0001) по сравнению с эмбрионами контрольной группы и группы, получавшей тройную смесь антиоксидантов (Таблица 3). Помимо этого, плоды in vivo вымытой группы имели значительно больший копчико-теменной размер (P<0,01) по сравнению с контрольной группой, однако отсутствовало различие с группой, обработанной тройной смесью. Кроме того, между тремя данными группами отсутствовали значительные различия в скорости имплантации, морфологических показателях развития конечностей, глаз, ушей, и определяющих пол параметров.
Пример 11: Влияние комбинации антиоксидантов в процессе ЭКО значительно улучшает развитие эмбриона
Окислительный стресс происходит на всех стадиях развития ВРТ, причем гаметы особенно подвержены окислительному повреждению. Авторами изобретения показано, что введение комбинации антиоксидантов, включающей в себя липоаты и карнитин (и необязательно цистеин), в культуральные среды оказывает в высшей степени благотворное влияние на развитие эмбриона.
В настоящем экспериментальном исследовании авторами изобретения показано, что присутствие антиоксидантов во время ЭКО также оказывало положительное влияние. Поэтому авторы изучили влияние данной группы антиоксидантов во время сбора ооцитов и спермы, и ЭКО.
Материалы и методы: Коллекция гамет от мышей линии F1 mice и IVF проводили при содержании кислорода 20% в присутствии или отсутствие 10 мкмоль ацетил-L-карнитина /10 мкмоль N-ацетил-L-цистеина /5 мкмоль α-липоевой кислоты. Полученные эмбрионы индивидуально культивировали в средах G-1™ и G-2™ в присутствии или в отсутствие антиоксидантов, тем самым разделив на четыре группы. Развитие эмбрионов анализировали при помощи цейтраферной микроскопии с последующим дифференциальным окрашиванием ядер для отнесения клетки к бластоцисте.
Общее количество клеток и количество внутренней клеточной массы (ВКМ) в контрольной группе составляло 32,9 ± 2,1 и 7,7 ± 2,1 соответственно. Добавление антиоксидантов только в среду для ЭКО приводило к значительному возрастанию общего количества клеток (48,7 ± 2,8; P<0.01). Присутствие антиоксидантов только в культуральной среде для эмбрионов приводило к значительному возрастанию общего количества клеток (50,4 ± 3,2; P<0,001). Однако присутствие антиоксидантов как в среде для ЭКО, так и эмбриональных культуральных средах привело к значительному увеличению как общего количества клеток бластоцисты, так и ВКМ (59,8 ± 3,4, 15,3 ± 1,1; P<0,01). Последующий цейтраферный анализ эмбрионов, полученных методом ЭКО, показал, что обработка антиоксидантами во время ЭКО и культур, была связана с более быстрым развитием до фазы деления на 5 клеток (51,8 ± 0,6 ч по сравнению с 54,1 ± 0,7 ч), которая продолжалась до фазы расширения бластоцисты.
В заключение, присутствие антиоксидантов во время ЭКО и в эмбриональной культуральной среде оказывает значительный положительный эффект на скорость развития эмбриона и последующее количество клеток и их распределение. Эти открытия свидетельствуют о том, что добавление антиоксидантов в среду для ЭКО, а также в эмбриональную культуру, будет дополнительно способствовать поддержанию жизнеспособности эмбрионов человека в процессе ВРТ, вероятно, за счет уменьшение окислительного стресса.
В отдельном исследовании, пронуклеарные эмбрионы собирали в присутствии или в отсутствие антиоксидантов в рабочей среде для гамет, а именно, G-MOPS™, и культивировали в контрольных средах в отсутствие антиоксидантов. Среда для оплодотворения, используемые для ЭКО, представляла собой G-IVF™, эмбриональная культуральная среда, использованная для культивирования эмбрионов от стадии одной клетки до бластоцисты, представляла собой среду G-1™, а затем G-2™ (G-1™ использовали в 1 день в течение 48 часов, а G-2™ использовали на 3 день в течение 48 ч). Анализ развития эмбрионов проводили методом дифференциального окрашивания клеток.
Результаты: Добавление антиоксидантов исключительно в рабочие среды для гамет для проведения ЭКО приводило к получению эмбрионов со значительно увеличенным количеством клеток бластоцист по сравнению с контрольной группой (48,9 ± 3,3 по сравнению с 33,6 ± 2,1; P<0,001) (смотри фигуру 9). Аналогичным образом, присутствие антиоксидантов только в эмбриональных культуральных средах приводило к значительному увеличению количества клеток бластоцист по сравнению с контрольной группой (59,3 ± 3,1 по сравнению с 33,6 ± 2,1; P<0,001)) (смотри фигуру 9). Присутствие антиоксидантов как в культуральной среде для сбора гамет, так и в эмбриональной культуральной среде также приводило к дальнейшему значительному увеличению количества клеток в бластоцисте по сравнению с контрольной группой (61,0 ± 3,9 по сравнению с 33,6 ± 2,1; P<0,001) (смотри фигуру 9). В результате последующего цейтраферного анализа эмбрионов, полученных методом ЭКО, было обнаружено, что обработка антиоксидантами как во время сбора, так и культивирования была связана с более быстрым развитием до фазы деления на 5 клеток (51,8 ± 0,6 ч по сравнению с 54,1 ± 0,7 ч), которая продолжалась до фазы расширения бластоцисты (смотри фигуру 10).
В независимом исследовании обработка пронуклеарных ооцитов антиоксидантами в течение 20 минут во время сбора эмбрионов приводила к значительному увеличению количества внутриклеточной массы по сравнению с контрольной группой (19,3 ± 1,2 по сравнению с 16,2 ± 1,1; P<0,05).
Вывод: Введение антиоксидантов во время подготовки гамет и ЭКО, а также на протяжении периода культивирования оказывает благоприятное воздействие на количество клеток эмбриона и скорость развития. Данные открытия указывают на то, что добавка антиоксидантов в среды для подготовки/рабочие среды для гамет и среды для ЭКО, а также в эмбриональную культуру внесет дополнительный вклад в развитие и жизнеспособность эмбрионов человека в процессе ВРТ за счет уменьшения окислительного стресса.
Пример 12: Влияние комбинации антиоксидантов на значительно улучшение развития эмбриона человека in vitro
В настоящей экспериментальной работе авторами изобретения показано, что присутствие антиоксидантов оказало благотворное влияние на развитие эмбриона in vitro. Авторы исследовали влияние группы антиоксидатов, а именно, 10 мкмоль ацетилкарнитина, 10 мкмоль ацетилцистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты в процесс развития эмбриона in vitro.
Материалы и методы
Для экспериментальной группы антиоксиданты (10 мкмоль ацетилкарнитина/10 мкмоль ацетилцистеина/5 мкмоль α-липоевой кислоты) добавляли в среду Vitrolife G-IVF, используемую для извлечения и оплодотворения ооцитов человека, и в среды G1 и G2 с добавкой белка (от компании Vitrolife), использованные для культивирования эмбриона человека, при этом на третий день производили замену сред с G-1 на G-2.
Эмбрионы культивировали в присутствии 5% кислорода.
Оценку развития эмбрионов проводили методом цейтраферной микроскопии, а качество эмбрионов определяли на 5 день при помощи класификации по Гарднеру (смотри Gardner et al 1999 In vitro culture of human blastocyst In Jansen R and Mortimer D (eds) Towards reproductive certainty: fertility and genetics beyond 1999. Parthenon Publishing Carnforth, UK, pp. 378-388)). Конечные параметры представляли собой процент дальнейшего использования и качество эмбриона на стадии бластоцисты.
Результаты: Добавление антиосидантов в эмбриональные культуральные среды приводило к бластоцистам более высокого качества (т.е. фракции бластоцист, которая достигала категории 3AB или выше по классификации Гарднера (смотри Gardner et al 1999) по сравнению с эмбрионами, культивированными в сопоставимых средах в отсутствие антиоксидантов (смотри фигуру 13). На фигуре 13 показана процентная доля бластоцист, достигающих категории бластоцист хорошего качества (GQB) по классификации Гарднера от общего количества бластоцист. В контрольной группе 8 из 30 бластоцист присвоили категорию GQB, а в группе, культивируемой в среде с добавкой 10 мкмоль ацетилкарнитина, 10 мкмоль ацетилцистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты, 18 из 36 присвоили категорию GQB. Значительное различие между двумя данными группами показано величиной p-значения, составляющего 0,0545, при использовании двухвыборочного t-теста с коммерчески доступным программным обеспечением (GraphPad Prism).
Кроме того, антиоксиданты значительно повышают процент дальнейшего использования бластоцист (т.е. долю бластоцист, которую либо используют в свежем виде для переноса, или подвергают криоконсервации для более позднего переноса пациенту - (смотри фигуру 11 и фигуру 12)). На фигуре 11 показана процентная доля использования бластоцист от общего количества оплодотворенных ооцитов. Из контрольной группы для дальнейшего клинического применения были выбраны 12 из 44 оплодотворенных ооцитов, из группы, культивированной в средах с добавкой 10 мкмоль ацетилкарнитина, 10 мкмоль ацетилцистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты для дальнейшего клинического терапевтического применения были выбраны 26 из 49. Бластоцисты, не удовлетворяющие требованиям качества, не выбирали и утилизировали. Различие между двумя данными группами было значительным, и p-значение составляло 0,0112 при использовании двухвыборочного t-теста с коммерчески доступным программным обеспечением (GraphPad Prism).
На фигуре 12 показана процентная доля использования бластоцист от общего количества бластоцист. Из контрольной группы для дальнейшего клинического применения были выбраны 12 из 28 бластоцист, из группы, культивированной в средах с добавкой 10 мкмоль ацетилкарнитина, 10 мкмоль ацетилцистеина и 5 мкмоль липоевой кислоты для дальнейшего клинического терапевтического применения были выбраны 26 из 36. Бластоцисты, не удовлетворяющие требованиям качества, не выбирали и утилизировали. Различие между двумя данными группами было значительным, и p-значение составляло 0,073 при использовании двухвыборочного t-теста с коммерчески доступным программным обеспечением (GraphPad Prism).
Вывод: Введение антиоксидантов во время извлечения, оплодотворения ооцитов, и культивирования эмбрионов in vitro оказывает благоприятное влияние на качество бластоцист. В частности, использование антиоксидантов приводило к большему количеству бластоцист более высокого качества, которые можно использовать для терапевтического лечения.
Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в него ссылкой. Специалисту в данной области будут очевидны различные модификации и изменения описанных способов и системы настоящего изобретения, не выходящие за рамки изобретения. Несмотря на то, что настоящее изобретения описано в связи с определенными предпочтительными вариантами осуществления, нужно понимать, что заявленное изобретение не должно ограничиваться подобными конкретными вариантами осуществления. На самом деле, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в данной области, входят в объем следующей формулы изобретения.