СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ЗУБА, ЗУБНОЙ РЯД И СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ТКАНИ
METHOD OF TOOTH FORMATION, DENTITION AND METHOD OF TISSUE FORMATION

Область изобретения
Изобретение относится к способу формирования зуба, зубного ряда и к способу формирования ткани, в частности к способу формирования зуба, зубного ряда и к способу формирования ткани с использованием клеток.
Предшествующий уровень техники
Зуб представляет собой орган, который может быть утрачен в результате зубного кариеса, заболеваний периодонта и тому подобного и который имеет твердые ткани, такие как эмаль в самом наружном слое и дентин во внутреннем слое, и, кроме того, имеет одонтобласт, образующий дентин в более глубоком слое зуба, и зубную пульпу в сердцевине. Как правило, потеря зуба в настоящее время, в основном, компенсируется во многих случаях искусственными зубами и имплантатами, поскольку полагают, что она представляет минимальную угрозу жизни. Тем не менее существует возрастающий интерес к разработке технологии регенерации зубов ввиду значительного влияния, которое наличие или отсутствие зубов оказывает на внешний вид человека и на вкус пищи и ввиду перспективы поддержания здоровья и высокого качества жизни.
Зубы представляют собой функциональные единицы, которые образуются в результате индукции в течение процесса развития на эмбриональной стадии и составлены множеством клеточных типов, полагают, что они представляют собой такие же органы, как и внутренние органы. Таким образом, зубы не формируются системой стволовых клеток, в которой клеточные типы формируются из стволовых клеток, таких как кроветворные стволовые клетки и мезенхимные стволовые клетки, во взрослом организме, и зубы не могут быть регенерированы исключительно путем имплантации стволовых клеток (терапии путем имплантации стволовых клеток), которая в настоящее время находится в стадии разработки регенеративной медициной. Кроме того, хотя рассматривают регенерацию зубов путем идентификации гена, который специфично экспрессируется в процессе развития зуба, и искусственной индукции зубного зачатка, регенерация зуба не может быть полностью индуцирована просто путем идентификации гена.
Таким образом, недавно проведены исследования, сфокусированные на регенерации зуба путем трансплантации восстановленного зубного зачатка, полученного путем восстановления зубного зачатка с использованием изолированных клеток зубного зачатка.
Например, в непатентном документе 1 раскрыто, что ткань, подобную ткани зуба, регенерируют путем трансплантации клеток, таких как эпителиальные клетки, изолированные из зубного зачатка, и мезенхимальные клетки зубных фолликул, с биоабсорбируемым носителем в брюшную полость крысы.
В непатентном документе 2 описано, что совместное культивирование с помощью коллагенового геля эффективно в качестве системы, в которой может быть реализовано эпителиально-мезенхимное взаимодействие клетками пересеваемой культуры.
В качестве способа регенерации зубного зачатка описано, например в патентном документе 1, что клетки зубного зачатка культивируют в присутствии физиологически активных веществ, таких как факторы роста фибробластов и тому подобное. В патентном документе 2 предложено культивирование по меньшей мере одного типа клеток, выбранного из клеток зубного зачатка и клеток, которые могут быть дифференцированы в эти клетки зубного зачатка, параллельно с носителем, содержащим фибрин, и описано, что "зуб", имеющий специфическую форму, образуют путем использования носителя, содержащего фибрин, имеющего желаемую форму для зубного зачатка.
В патентных документах 3 и 4 раскрыт способ образования зубов, при котором смесь клеток зубного зачатка, содержащую мезенхимные клетки, образующие дентин, выделенные из зубной пульпы, и эпителиальные клетки, которые вносят вклад в формирование эмали, из верхней челюсти 6-месячной свиньи засевают в каркас, который представляет собой затвердевший биоразрушаемый полимер, содержащий сополимер полигликолевой кислоты/полиуксусной кислоты; и трансплантируют его в организм животного. В данных документах описано, что "зуб", имеющий специфическую форму, образуется в результате использования каркаса, имеющего желаемую форму для зубного зачатка.
Кроме того, в патентном документе 5 раскрыт способ регенерации зуба для лечения пациента с разрежением или повреждением кости. В соответствии с этим способом кость образуют путем засевания мезенхимных клеток в сетчатом носителе из полигликолевой кислоты, после чего этот носитель наслаивают эпителиальными клетками и коллагеном или завертывают его в пласт эпителиальных клеток. Кроме того, в патентном документе 5 носитель используют для конструирования формы кости.
Непатентный документ 1: J. Dent. Res., 2002, Vol.81 (10), pp.695-700.
Непатентный документ 2: "Regenerative medicine using teeth and cells derived from tooth germ and the possibility of the same," Regenerative Medicine, Journal of the Japanese Society for Regenerative Medicine, 2005, Vol.4(1), pp.79-83.
Патентный документ 1: японская выложенная патентная заявка №2004-331557.
Патентный документ 2: японская выложенная патентная заявка №2004-357567.
Патентный документ 3: публикация патентной заявки США №2002/0119180.
Патентный документ 4: публикация патентной заявки США №2004/0219489.
Патентный документ 5: международная публикация (WO) №2005/014070.
Описание изобретения
Цели изобретения
Тем не менее для функционирования в качестве ткани важно, чтобы множественные типы клеток, составляющих ткань, были расположены в правильном относительном положении (расположение клеток) и обладали направленностью в качестве ткани. Ткань, например зуб, представляет собой "внутренний орган" или "орган", формируемый путем взаимодействия между эпителиальными клетками, происходящими из зубного зачатка, и мезенхимными клетками, происходящими из клеток краниального нервного валика во время процессов дифференцировки-развития. Можно формировать нормальные зубы путем трансплантации самого зубного зачатка; тем не менее, зубы, обладающие специфичным расположением клеток и направленностью функциональной единицы, представляющей собой зуб, не могут быть регенерированы исключительно путем изоляции и культивирования клеток зубного зачатка, состоящего из множества типов клеток.
Хотя при вышеупомянутых методиках зубной зачаток реконструируют с использованием клеток, клеточных факторов и тому подобного, специфичное расположение клеток и направленность, достаточные для осуществления функций зуба, не регенерируют.
Кроме того, сложно реконструировать ткань, обладающую специфичным расположением клеток, просто путем изоляции и культивирования множества клеток, составляющих ткань.
Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка способа формирования зуба, имеющего специфичное расположение клеток, зубного ряда, полученного данным способом, и способ формирования ткани периодонта.
Кроме того, другой целью настоящего изобретения является разработка способа формирования ткани, имеющей тканеспецифичное расположение клеток.
Средства для достижения цели
Способ формирования зуба по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.
Способ формирования ткани периодонта по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя до того, как будет сформирован зуб и ткань периодонта, примыкающая к зубу, и изоляцию ткани периодонта, полученной путем культивирования.
Зубной ряд по настоящему изобретению получают путем расположения первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, где по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй тип клеток, выбранный из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.
При обоих вышеупомянутых способах формирования зуба или зубного ряда предпочтительно, чтобы вышеупомянутые как первая клеточная масса, так и вторая клеточная масса происходили из зубного зачатка.
Кроме того, вышеупомянутые как первая клеточная масса, так и вторая клеточная масса могут представлять собой массу отдельных клеток.
Кроме того, способ формирования ткани по настоящему изобретению представляет собой способ формирования ткани, образованной в результате взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, где этот способ включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, и второй клеточной массы, по существу содержащей только второй из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом, и культивирование первой и второй клеточной массы внутри поддерживающего носителя.
При вышеупомянутом способе формирования ткани предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из вышеупомянутых типов мезенхимных клеток и эпителиальных клеток представлял собой клетки, происходящие из целевой ткани.
Кроме того, вышеупомянутая ткань характеризуется тем, что она выбрана из группы, состоящей из зуба, волоса, почки, легкого и печени.
В настоящем изобретении, поскольку клеточные массы, по существу содержащие только мезенхимные клетки или эпителиальные клетки, располагают и культивируют внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом, каждая из клеточных масс растет внутри поддерживающего носителя, не смешиваясь с клетками, составляющими другую клеточную массу, тогда как состояние контакта между этими массами сохраняется. Это обеспечивает возможность эффективного воспроизведения отличного взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, необходимого при образовании ткани.
В результате может быть получена ткань, имеющая специфичное расположение клеток для целевой ткани. Кроме того, зуб или зубной ряд, имеющий специфичное расположение клеток, при котором эмаль находится снаружи и дентин внутри, может быть получен, когда по меньшей мере один из типов мезенхимных клеток и эпителиальных клеток происходит из зубного зачатка.
Эффект(ы) изобретения
В соответствии с настоящим изобретением может быть предложен способ формирования зуба, имеющего специфичное расположение клеток, зубного ряда, полученного при помощи этого способа, и способ формирования ткани периодонта.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением может быть предложен способ формирования ткани, имеющей расположение клеток, специфичное для этой ткани.
Краткое пояснение чертежей
[Фиг.1] Фиг.1 представляет собой схематическую диаграмму, демонстрирующую образование зубного зачатка.
[Фиг.2] (A)-(D) представляют собой схематические изображения, по существу демонстрирующие способ реконструкции зубного зачатка с использованием мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, в соответствии с Примерами по настоящему изобретению.
[Фиг.3] Фиг.3 демонстрирует фазово-контрастные изображения и окрашенные изображения нормальных тканей зубного зачатка и изображения окрашивания в зависимости от времени для зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу нормального зубного зачатка в соответствии со сравнительным Примером 1 по настоящему изобретению.
[Фиг.4] Фиг.4 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания в зависимости от времени зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 1 по настоящему изобретению.
[Фиг.5] Фиг.5 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальной ткани, выделенной из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка мыши GFP, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 1 по настоящему изобретению.
[Фиг.6] Фиг.6 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка мыши GFP, и мезенхимных тканей, выделенных из зубного зачатка, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 2 по настоящему изобретению.
[Фиг.7] Фиг.7 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображение окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 3 по настоящему изобретению.
[Фиг.8] Фиг.8 демонстрирует фазово-контрастные изображения эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных тканей, выделенных из зубного зачатка, и цветные изображения на 14-е сутки после трансплантации в индивидуальную субренальную капсулу каждой из вышеуказанных тканей в соответствии со сравнительным Примером 2 по настоящему изобретению.
[Фиг.9] Фиг.9 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка низкой плотности, восстановленного с использованием эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания на 20-е сутки после трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка низкой плотности, в соответствии со сравнительным Примером 3 по настоящему изобретению.
[Фиг.10] Фиг.10 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного путем восстановления эпителиальных тканей, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, при высокой плотности и без компартментализации, и изображения окрашивания на 20-е сутки после трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка низкой плотности в соответствии со сравнительным Примером 4 по настоящему изобретению.
[Фиг.11] Фиг.11 демонстрирует изображения окрашивания альвеолярного отростка и корневой оболочки, которые представляют собой ткани периодонта, образованные вокруг зуба, сформированного из восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примерами 1-3 по настоящему изобретению.
[Фиг.12] Фиг.12 демонстрирует изображения окрашивания обнаруженной мРНК периостина, специфичного для корневой оболочки, которая представляет собой ткань периодонта, образованную вокруг зуба, сформированного из восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 2 по настоящему изобретению (17-е сутки после трансплантации) и сравнительным Примером 1 (14-е сутки после трансплантации).
[Фиг.13] Фиг.13 демонстрирует фазово-контрастные изображения и изображения окрашивания зуба, сформированного при помощи органной культуры путем продления процесса культивирования после получения восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примерами 4 и 5 по настоящему изобретению и сравнительным Примером 5.
[Фиг.14] Фиг.14 демонстрирует фазово-контрастные изображения зубного зачатка, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из зубного зачатка, и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, и изображения окрашивания на 14-е сутки зуба, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного зубного зачатка в соответствии с Примером 6 по настоящему изобретению.
[Фиг.15] (А) представляет собой изображение окрашивания для нетрансплантированной мыши на 14-е сутки после удаления зуба по настоящему изобретению и (В) представляет собой увеличенное изображение области, ограниченной рамкой в (А), в соответствии со сравнительным Примером 6.
[Фиг.16] Фиг.16 демонстрирует изображения окрашивания на 14-е сутки после трансплантации индивидуально выделенного зубного зачатка в ротовую полость в соответствии с Примером 6 по настоящему изобретению.
[Фиг.17] Фиг.17 демонстрирует изображения окрашивания на 14-е сутки после трансплантации индивидуально выделенного зуба в ротовую полость в соответствии с Примером 7 по настоящему изобретению.
[Фиг.18] Фиг.18 демонстрирует фазово-контрастные изображения волосяного фолликула, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и изображения окрашивания на 14-е сутки волоса, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула, в соответствии с Примером 8 по настоящему изобретению.
[Фиг.19] Фиг.19 демонстрирует стереоскопические микроскопические изображения на 14-е сутки волосяного фолликула, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула из эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, в соответствии с Примером 8 по настоящему изобретению.
[Фиг.20] Фиг.20 демонстрирует фазово-контрастные изображения волосяного фолликула, восстановленного при помощи эпителиальных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, и мезенхимных клеток, выделенных из ткани волосяного фолликула, в соответствии со сравнительным Примером 7 по настоящему изобретению, и изображения окрашивания на 14-е сутки волосяного фолликула, сформированного путем трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула.
Наилучший способ реализации изобретения
Способ формирования зуба по настоящему изобретению включает расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, в которой по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, выделен из зубного зачатка, и второй клеточной массы, по существу содержащей другой тип клеток, выбранный из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя и в контакте друг с другом (процесс расположения), а также культивирование вышеупомянутой первой и второй клеточной массы внутри вышеупомянутого поддерживающего носителя (процесс культивирования).
При настоящем способе формирования зуба, поскольку мезенхимные клетки и эпителиальные клетки выращивают в виде клеточных масс в поддерживающем носителе и в контакте друг с другом, причем по меньшей мере один из типов клеток, выбранных из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, происходит из зубного зачатка, взаимодействие между клетками может быть эффективно осуществлено благодаря состоянию тесного контакта между ними, и может быть сформирован зуб, имеющий расположение клеток, специфичное для зубов, при котором дентин находится внутри, а эмаль снаружи.
В настоящем изобретении термин "зуб" относится к ткани, имеющей слой дентина внутри и прилегающий слой эмали снаружи, и предпочтительно к ткани, имеющей эти слоистые структуры, а также направленность, имеющую коронку и корень. Специалисты в данной области техники легко могут идентифицировать дентин и эмаль морфологически путем окрашивания ткани и тому подобного. Кроме того, эмаль может быть идентифицирована по наличию энамелобласта, и наличие энамелобласта может быть подтверждено присутствием амелогенина. С другой стороны, дентин может быть идентифицирован по наличию одонтобласта, и наличие одонтобласта может быть подтверждено по наличию сиалопротеина дентина. Наличие амелогенина и сиалопротеина дентина легко может быть подтверждено при помощи способа, хорошо известного в данной области техники, например гибридизации in situ, окрашивания антителами и тому подобного.
Кроме того, направленность зуба может быть идентифицирована по расположению коронки и корня. Коронка и корень могут быть подтверждены на основании визуально наблюдаемой формы и окрашивания ткани.
Дополнительно в настоящем изобретении термин "ткань периодонта" относится к альвеолярному отростку и корневой оболочке, которые образованы, в основном, в наружном слое зуба. Альвеолярный отросток и корневая оболочка легко могут быть идентифицированы морфологически специалистами в данной области техники путем окрашивания ткани или тому подобного.
Кроме того, в настоящем изобретении термин "мезенхимные клетки" относится к клеткам, имеющим происхождение из мезенхимной ткани, а "эпителиальные клетки" относится к клеткам, имеющим происхождение из эпителиальной ткани.
В настоящем изобретении термины "зубной зачаток" и "зубная почка" представляют собой выражения, используемые по отношению конкретно к зубному зачатку и зубной почке, которые являются отличимыми от другой ткани на основе описанной позже стадии развития. В этом случае "зубной зачаток" относится к зародышу зуба ранней стадии, который предназначен для того, чтобы стать зубом в будущем, и к ткани от стадии почки до стадии колокола при типичных стадиях развития зуба, и, в частности, к ткани, в которой не идентифицируется аккумуляция дентина и эмали, которые являются признаками зуба как твердой ткани. "Зубная почка" относится к ткани в отношении перехода между стадиями "зубного зачатка", используемыми в настоящем изобретении, и к ткани между стадиями, на которых начинается аккумуляция дентина и эмали, которые являются признаками твердой ткани зуба, и стадией, предваряющей прорастание зуба из десны с проявлением типичных функций зуба.
Зубной зачаток, как показано на Фиг.1, развивается в процессе онтогенеза через каждую из стадий: стадию почки, стадию мешочка, раннюю стадию колокола и позднюю стадию колокола. На стадии почки эпителиальные клетки впячиваются с оборачиванием вокруг мезенхимных клеток (см. (А) и (В) Фиг.1), и часть эпителиальных клеток становится наружной эмалью, а часть мезенхимных клеток начинает образовывать дентин внутри (см. (С) и (D) Фиг.1) по мере продвижения к ранней стадии колокола и поздней стадии колокола. Таким образом, зубной зачаток образуется в результате взаимодействия между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками.
Мезенхимные клетки и эпителиальные клетки в настоящем изобретении могут представлять собой клетки на стадиях от вышеупомянутой стадии почки до поздней стадии колокола, на которых образуется или может образоваться зубной зачаток (далее просто называемый "зубной зачаток"), и с точки зрения уровня незрелости и однородности на стадиях дифференциации клеток предпочтительно, чтобы они находились на стадиях от стадии почки до стадии мешочка.
Кроме того, термин "клеточная масса" относится к состоянию, в котором клетки плотно упакованы, и может относиться к состоянию ткани или к состоянию отдельных клеток. Дополнительно термин "по существу содержащий" означает, что что-либо иное, кроме целевых клеток, исключено в наибольшей возможной степени. Поскольку каждая клеточная масса может представлять собой саму ткань или ее часть, либо массу отдельных клеток, любая из клеточных масс может представлять собой клеточную массу, состоящую из отдельных клеток, либо обе клеточные массы могут представлять собой клеточные массы, состоящие из отдельных клеток; тем не менее, в целях эффективного достижения реконструкции ткани по настоящему изобретению предпочтительно, чтобы обе клеточные массы состояли из отдельных клеток.
1
8
3
8
Любая из первой клеточной массы или второй клеточной массы может представлять собой эпителиальные клетки или мезенхимные клетки, и число клеток, составляющих клеточную массу, может варьировать в зависимости от вида животного, а также от типа, жесткости и размера поддерживающего носителя, но, как правило, оно может составлять от 10 до 10 клеток на клеточную массу, и предпочтительно составляет от 10 до 10 клеток на клеточную массу.
В процессе расположения первую клеточную массу и вторую клеточную массу располагают внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом.
В процессе расположения при способе формирования по настоящему изобретению, поскольку вышеупомянутые первую и вторую клеточные массы располагают внутри поддерживающего носителя, который может поддерживать состояние контакта клеток, клетки, составляющие каждую клеточную массу, не смешиваются с клетками, составляющими другую клеточную массу. Таким образом, в процессе расположения каждая клеточная масса располагается без смешивания с другой, и между клеточными массами образуется пограничная поверхность. Такой способ расположения в настоящем описании подходящим образом обозначают как "компартментализацию".
В этом случае первую клеточную массу и вторую клеточную массу готовят в независимых процессах подготовки (первом процессе подготовки и втором процессе подготовки) таким образом, что каждая из клеточных масс по существу может состоять из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток.
По меньшей мере один из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, использованных при настоящем способе формирования, может происходить из зубного зачатка с целью воспроизведения расположения клеток in vivo с образованием зуба, имеющего специфическую структуру и направленность; тем не менее, в целях обеспечения формирования зуба наиболее предпочтительно оба типа мезенхимных клеток и эпителиальных клеток происходят из зубного зачатка.
Примеры мезенхимных клеток, имеющих иное происхождение, чем из зубного зачатка, включают клетки, выделенные из других мезенхимных тканей in vivo; предпочтительно клетки костного мозга, не включающие клетки крови, или мезенхимные стволовые клетки; более предпочтительно мезенхимные клетки в ротовой полости и клетки костного мозга внутри челюстной кости и мезенхимные клетки, происходящие из клеток краниального нервного валика; а также мезенхимные клетки-предшественники, которые могут генерировать вышеупомянутые мезенхимные клетки, их стволовые клетки и тому подобное.
Кроме того, примеры эпителиальных клеток, выделенных из тканей, иных, чем зубной зачаток, включают клетки, выделенные из других эпителиальных тканей in vivo; предпочтительно эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки или десны в ротовой полости; и более предпочтительно незрелые эпителиальные клетки-предшественники, которые могут продуцировать дифференцированные эпителиальные клетки, например кератинизированные или паракератинизированные эпителиальные клетки кожи и слизистой оболочки; например некератинизированные эпителиальные клетки и их стволовые клетки и тому подобное.
Зубной зачаток и другие ткани могут быть собраны из челюстной кости различных животных, таких как млекопитающие-приматы, такие как люди и обезьяны; копытные животные, такие как свиньи, коровы и лошади; небольшие млекопитающие-грызуны, такие как мыши, крысы и кролики. При сборе зубного зачатка и ткани условия, обычно используемые при сборе ткани, могут быть применены без модификации, и зубной зачаток и ткань могут быть выделены в стерильных условиях и сохранены в подходящем консервирующем растворе. Кроме того, примеры человеческого зубного зачатка включают фетальный зубной зачаток, а также третий моляр или так называемый зуб мудрости, но предпочтительно использовать зубной зачаток зуба мудрости с точки зрения использования аутогенной ткани.
Получение мезенхимных клеток и эпителиальных клеток из такого зубного зачатка начинают путем разделения зубного зачатка, который был изолирован от окружающей ткани, на мезенхимную ткань зубного зачатка и эпителиальную ткань зубного зачатка в соответствии с их формами. Ткани зубного зачатка могут быть легко разделены путем разрезания или разрывания с использованием анатомических ножниц, пинцетов или тому подобного, поскольку можно структурно идентифицировать ткани зубного зачатка под микроскопом. Кроме того, отделение мезенхимной ткани зубного зачатка и эпителиальной ткани зубного зачатка от зубного зачатка легко может быть осуществлено путем разрезания или разрывания с использованием инъекционных игл, вольфрамовых игл, пинцетов или тому подобного, в соответствии с их формами.
Предпочтительно можно использовать ферменты, чтобы легко отделить клетки зубного зачатка от окружающей ткани и/или для отделения эпителиальной ткани и мезенхимной ткани от ткани зубного зачатка. Примеры ферментов, используемых в таких применениях, включают диспазу, коллагеназу, трипсин и тому подобное.
Мезенхимные клетки и эпителиальные клетки могут быть получены в состоянии отдельных клеток соответственно из мезенхимной ткани и эпителиальной ткани. В процессе получения можно использовать ферменты, чтобы сделать клетки легко диспергируемыми в виде отдельных клеток. Примеры таких ферментов включают диспазу, коллагеназу, трипсин и тому подобное. В этом случае для отделения эпителиальных клеток от эпителиальной ткани предпочтительно осуществлять обработку трипсином и обработку ДНКазой после обработки коллагеназой. С другой стороны, для отделения мезенхимных клеток от мезенхимной ткани предпочтительно одновременно осуществлять обработку коллагеназой и обработку трипсином и в конечном итоге осуществлять обработку ДНКазой. В этом случае осуществляют обработку ДНКазой в целях предотвращения уменьшения количества выделенных клеток в результате агрегации клеток, вызванной ДНК, высвобождаемой в раствор после лизиса клеточной мембраны, после того, как некоторые из клеток повреждаются в результате ферментативных обработок.
Дополнительно мезенхимные клетки и эпителиальные клетки могут представлять собой клетки, которые подвергнуты предварительному культивированию перед процессом расположения с целью получения достаточно большого количества каждого типа клеток. В культуре мезенхимных клеток и эпителиальных клеток могут применяться обычные условия, такие как температура, используемые в культуре животных клеток, без модификации.
В качестве среды, используемой в культуре, можно использовать среду, обычно используемую для культур животных клеток, такую как среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM). Может быть добавлена сыворотка для стимуляции клеточной пролиферации, или в качестве альтернативы сыворотке могут быть добавлены клеточные факторы роста, такие как фактор роста фибробластов (FGF), эпителиальный фактор роста (EGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF) и тому подобное, или хорошо известные компоненты сыворотки, такие как трансферин. Дополнительно, когда добавляют сыворотку крови, концентрацию сыворотки можно соответствующим образом менять в зависимости от культуральных условий, но обычно она может составлять 10%. Для клеточной культуры могут быть применены условия культивирования, обычно используемые в культурах, такие как культура в инкубаторе при 5% концентрации С02 при 37°С. Кроме того, если пригодно, могут быть добавлены антибиотики, такие как стрептомицин.
В качестве поддерживающего носителя, используемого в настоящем изобретении, может быть использован поддерживающий носитель, в котором можно культивировать клетки, и предпочтительной является смесь с вышеупомянутой культуральной средой. Примеры таких поддерживающих носителей включают коллаген, фибрин, ламинин, смесь внеклеточного матрикса, полигликолевую кислоту (ПГК), полимер молочной кислоты (ПМК), сополимер молочной кислоты/гликолевой кислоты (МКГК), Cellmatrix (торговое название), Mebiol Gel (торговое название) и Matrigel (торговое название). Эти поддерживающие носители могут иметь жесткость, которая по существу может поддерживать приблизительную локализацию, при которой клетки располагают внутри носителя, и их примеры включают носители гелеобразного типа, волокнистого типа и твердого типа. В этом случае уровень жесткости, который может поддерживать локализацию клеток, может представлять собой уровень жесткости, обычно применяемый в трехмерной культуре; другими словами, уровень жесткости, который не ингибирует гипертрофию клеток вследствие пролиферации при поддержании расположения клеток, и этот уровень жесткости легко определяют. Например, в случае коллагена использование при конечной концентрации 2,4 мг/мл обеспечивает подходящий уровень жесткости.
Дополнительно в этом случае поддерживающий носитель может иметь толщину, достаточную для первой и второй клеточной масс для роста внутри носителя, и ее установка пригодно основана на размере целевых тканей.
Кроме того, поддерживающий носитель может представлять собой носитель, который может поддерживать состояние контакта между клетками. Здесь "состояние контакта" предпочтительно представляет собой состояние высокой плотности для обеспечения межклеточного взаимодействия внутри каждой клеточной массы или между клеточными массами.
7
9
8
9
8
8
Состояние высокой плотности относится к плотности, подобной плотности в момент времени, когда формируется ткань, такой как в случае клеточных масс от 5×10 до 1×10/мл в момент расположения клеток, предпочтительно от 1×10 до 1×10/мл, для обеспечения взаимодействия между клетками без потери клеточной активности, и наиболее предпочтительно от 2×10 до 8×10/мл. Для приготовления клеточной массы при такой плотности клеток предпочтительно агрегировать клетки путем центрифугирования и иметь их осадок, поскольку это удобно для обеспечения высокой плотности без потери клеточной активности. Центрифугирование можно проводить при частоте вращения, эквивалентной центробежной силе от 300 до 1200 × g, которая не будет препятствовать выживанию клеток, и предпочтительно от 500 до 1000 × g, в течение от 3 до 10 минут. Центрифугирование при центробежной силе ниже, чем 300 × g, может привести к недостаточному осаждению клеток, и плотность клеток может оказаться низкой, тогда как центрифугирование при центробежной силе выше 1200 × g может привести к повреждению клеток и, таким образом, ни один из этих случаев не является предпочтительным.
При получении высокой плотности клеток путем центрифугирования это центрифугирование, как правило, проводят после приготовления суспензии отдельных клеток в контейнерах, таких как пробирки, используемые для центрифугирования клеток, и надосадочную жидкость удаляют в наибольшей возможной степени, оставляя клетки в виде осадка. Предпочтительно, чтобы контейнеры, такие как пробирки, были покрыты силиконом с точки зрения полного удаления надосадочной жидкости.
Когда осадки получают путем центрифугирования, эти осадки можно непосредственно располагать внутри поддерживающего носителя. Здесь компоненты, иные чем целевые клетки (например, культуральный раствор, буферный раствор, поддерживающий носитель и тому подобное), предпочтительно имеют объем, равный или меньший, чем объем клеток, и наиболее предпочтительно компоненты, иные чем целевые клетки, исключены. В такой клеточной массе высокой плотности клетки находятся в тесном контакте друг с другом, и может быть достигнуто эффективное взаимодействие между клетками.
При использовании в состоянии ткани предпочтительно удалить компоненты, иные чем целевые клетки, такие как соединительные ткани, путем осуществления ферментативной обработки или тому подобного. Когда имеется множество компонентов, иных чем целевые клетки, например, когда объем других компонентов равен объему клеток или превосходит его, достаточное взаимодействие между клетками может не быть достигнуто, и это не является предпочтительным.
Кроме того, более предпочтительно, когда первая клеточная масса и вторая клеточная масса находятся в очень тесном контакте, и особенно предпочтительно располагать вторую клеточную массу таким образом, чтобы прижимать ее к первой клеточной массе. Кроме того, окружение первой клеточной массы и второй клеточной массы культуральным раствором или твердым веществом, которое не ингибирует проникновения кислорода, также эффективно при осуществлении более тесного контакта между клеточными массами, и также предпочтительно добавлять и располагать клеточную суспензию с высокой плотностью в растворе, обладающем отличной вязкостью, для затвердевания самого раствора, поскольку таким образом легко может поддерживаться клеточный контакт. Здесь предпочтительно располагать узел эмали эпителиальной ткани зубного зачатка в контакте с первой клеточной массой, когда первая клеточная масса представляет собой массу отдельных клеток из мезенхимных клеток зубного зачатка и вторая клеточная масса представляет собой эпителиальную ткань зубного зачатка, но изобретение не ограничено этим.
Когда поддерживающий носитель находится в гелеобразном состоянии, твердом состоянии или тому подобном, процесс затвердевания, в ходе которого затвердевает поддерживающий носитель, может быть организован таким образом, чтобы он следовал после процесса расположения. Клетки, расположенные внутри поддерживающего носителя, могут быть фиксированы внутри поддерживающего носителя в результате процесса затвердевания. Для затвердевания поддерживающего носителя могут быть применены условия, как правило, используемые для затвердевания поддерживающих носителей, без модификации. Например, когда для поддерживающего носителя используют затвердевающие соединения, такие как коллаген, они могут затвердевать в обычно применяемых условиях, например, путем выдерживания в покое в течение от нескольких минут до нескольких десятков минут при температуре культуры. Таким образом, связывание между клетками внутри поддерживающего носителя может быть фиксированным и прочным.
В процессе культивирования способа формирования по настоящему изобретению первую клеточную массу и вторую клеточную массу культивируют внутри поддерживающего носителя. В этом процессе культивирования взаимодействие между клетками эффективно осуществляется первой клеточной массой и второй клеточной массой, которые находятся в тесном контакте, для восстановления ткани, а именно зуба.
Процесс культивирования может быть осуществлен таким образом, что состояние контакта между первой клеточной массой и второй клеточной массой поддерживают при помощи поддерживающего носителя, и этот процесс может представлять собой культивирование в поддерживающем носителе, который просто содержит первую и вторую клеточные массы, или культивирование в присутствии других клеток животных.
Период культивирования варьирует в зависимости от числа клеток, расположенных в поддерживающем носителе, состояния клеточной массы и, кроме того, от условий, в которых осуществляют процесс культивирования; тем не менее, он типично занимает от 1 до 300 суток, предпочтительно от 1 до 120 суток, с образованием зуба, имеющего эмаль снаружи и дентин внутри, и предпочтительно от 1 до 60 суток с точки зрения получения быстрых результатов. Кроме того, он типично занимает от 1 до 300 суток, и предпочтительно от 1 до 60 суток, с образованием зуба, имеющего ткань периодонта.
Когда культивирование проводят только в поддерживающем носителе, культивирование может быть осуществлено в обычных условиях, используемых для культуры животных клеток. Здесь условия культивирования, обычно используемые для животных клеток, могут быть применены без модификации, и вышеупомянутые условия могут быть применены без модификации. Кроме того, к культуре может быть добавлена сыворотка, полученная от млекопитающих, и различные клеточные факторы, которые, как известно, эффективны при пролиферации и дифференцировке этих клеток. Примеры этих клеточных факторов включают FGF и BMP.
Кроме того, предпочтительно использовать органную культуру с точки зрения газообмена и снабжения питательными веществами тканей и клеточных масс. Как правило, в органной культуре культивирование осуществляют путем флотации пористой мембраны на культуральной среде, пригодной для пролиферации животных клеток, и помещения клеточных масс, заключенных в поддерживающий носитель, на мембрану. Используемая здесь пористая мембрана предпочтительно представляет собой мембрану, имеющую множество пор от 0,3 до 5 мкм в диаметре, и конкретные примеры включают Cell Culture Insert (торговое название) и Isopore Filter (торговое название).
Осуществление культивирования в присутствии других клеток животных является предпочтительным, поскольку зуб, имеющий специфичное расположение клеток, может быть сформирован на ранней стадии в ответ на действия различных цитокинов и тому подобного из клеток животных. Такое культивирование в присутствии других клеток животных можно проводить ex vivo с использованием изолированных клеток и культивируемых клеток.
Кроме того, особенно предпочтительно проводить культивирование in vivo путем трансплантации поддерживающего носителя, имеющего первую и вторую клеточные массы, в живом организме, поскольку зуб и/или ткань периодонта может образоваться на ранней стадии. В этом случае первую и вторую клеточные массы трансплантируют с поддерживающим носителем в живой организм.
Животные, которые могут быть использованы для данного применения, предпочтительно включают млекопитающих, например людей, свиней, мышей и тому подобных, и более предпочтительно животных, происходящих из того же вида, от которого взята ткань зубного зачатка. Когда трансплантируют ткань человеческого зубного зачатка, предпочтительно использовать человека или млекопитающих, отличающихся от людей, которые имеют изменения, в результате которых обладают иммунодефицитом. В отношении мест живого организма, подходящих для такого роста in vivo, для трансплантации в целях генерирования органов или тканей клеток животных, настолько нормальных, насколько это возможно, предпочтительными являются субренальная капсула, мезентерий и подкожная трансплантация.
Период роста в соответствии с трансплантацией варьирует в зависимости от размера эксплантата в момент трансплантации и размера зуба, который нужно сформировать, но типично составляет от 3 до 400 суток. Например, период для трансплантации субренальной капсулы предпочтительно составляет от 7 до 60 суток с точки зрения регенерации зуба и размера зуба, который нужно сформировать в месте трансплантации, хотя он варьирует в зависимости от размера эксплантата, подлежащего трансплантации, и размера зуба, подлежащего регенерации.
Культивирование ex vivo (предварительное культивирование) может быть осуществлено перед трансплантацией в живой организм. Предварительное культивирование является предпочтительным, поскольку связи между клетками и связь между первой и второй клеточными массами могут быть усилены для получения более сильного взаимодействия между клетками. В результате общий период роста может быть сокращен.
Период предварительного культивирования может быть коротким или длинным. Желательно иметь более длительный период, например 3 суток или более, и предпочтительно 7 суток или более, поскольку зубная почка может быть сформирована из зубного зачатка, и таким образом может быть укорочен период до образования зуба после трансплантации. Период предварительного культивирования, например органной культуры для трансплантации под субренальную капсулу, предпочтительно составляет от 1 до 7 суток для эффективной регенерации зуба.
Зуб, сформированный в соответствии со способом формирования по настоящему изобретению, имеет специфическое для зуба расположение клеток (структуру), имеющее дентин внутри и эмаль снаружи, и предпочтительно имеет направленность, то есть имеет верхушку (коронку) и корень зуба. В результате обладания по меньшей мере этим специфическим расположением клеток и предпочтительно обладания направленностью дополнительно к расположению клеток могут проявляться функции зуба. Таким образом, такой зуб может быть широко использован в качестве зубного заместителя. В частности, при использовании мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, выделенных из аутогенного зубного зачатка, можно избежать проблем, вызванных отторжением. Как правило, также можно избежать проблем, вызванных отторжением, когда клетки выделены из зубного зачатка другого человека, обладающего совместимым трансплантационным антигеном.
Кроме того, в настоящем изобретении можно формировать ткань периодонта дополнительно к самому зубу, такую как альвеолярный отросток и корневая оболочка, которая поддерживает и стабилизирует зубы на челюстной кости, путем удлинения периода культивирования. В результате после трансплантации может быть получен пригодный для практического применения зуб.
То есть способ формирования ткани периодонта по настоящему изобретению характеризуется тем, что он включает вышеупомянутый процесс культивирования в качестве стадии для культивирования вышеупомянутой первой и второй клеточных масс внутри поддерживающего носителя до возможности получения зуба и ткани периодонта, примыкающей к зубу (процесс культивирования), и дополнительно включает стадию изоляции ткани периодонта, полученной путем вышеупомянутого культивирования.
При данном способе может быть образована ткань периодонта, примыкающая к зубу, путем удлинения периода культивирования до получения ткани периодонта, и ткань периодонта может быть получена в изолированном виде путем отделения ее от зуба. Изоляцию ткани периодонта можно осуществить в соответствии с любым из способов, при котором ткань периодонта, сформированная во время процесса культивирования, может быть отделена от зуба, например, отделением при помощи пинцета или тому подобного, путем частичного переваривания ферментами или тому подобного.
Дополнительно, что-либо описанное в вышеупомянутом способе формирования зуба, может быть применено к настоящему способу формирования ткани периодонта, поскольку период культивирования неограничен.
Зуб и ткань периодонта, полученные вышеупомянутым способом формирования зуба и способом формирования ткани периодонта по настоящему изобретению, могут быть использованы в качестве эффективного средства исследования формирования ткани, связанной с зубами, в будущем, поскольку дополнительно к применению в качестве эксплантата они могут быть применены для исследований процессов развития зубов.
Кроме того, когда полученный зуб или ткань периодонта используют в качестве эксплантата, процесс культивирования в соответствии со способом формирования предпочтительно осуществляют в органной культуре, в которой отсутствует контакт с другими клетками животных, и вся процедура может быть осуществлена in vitro.
Зубной ряд по настоящему изобретению представляет собой ряд зубов, имеющих специфическое для зуба расположение клеток, получаемый при помощи вышеупомянутого способа формирования зуба.
Поскольку такой зубной ряд составляет множество зубов, имеющих специфическое для зуба расположение клеток, каждый индивидуальный зуб может быть выделен из ряда зубов и использован в качестве эксплантата отдельного зуба, как описано ниже. Таким образом, при способе формирования зуба по настоящему изобретению, когда одновременно формируют множество зубов, зубы могут быть получены в виде зубного ряда, состоящего из множества зубов. В результате могут быть эффективно сформированы зубы для эксплантатов.
Зубной ряд может быть легко получен путем применения вышеупомянутого способа формирования зуба без модификации. В частности, при первом и втором вышеупомянутом процессе получения клеток каждую из первой и второй клеточных масс готовят отдельно, а затем располагают внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом в ходе процесса расположения, и, таким образом, множество зубов может быть легко образовано из группы клеток, которые в норме образуют только один зуб.
При способе формирования зубного ряда предпочтительно, чтобы и первая, и вторая клеточная масса были составлены отдельными клетками для облегчения повторной индукции зубных зачатков с формированием множества зубов. Кроме того, процесс культивирования может представлять собой либо органную культуру, либо культуру субренальной капсулы, как упомянуто выше, и, когда полученный зуб используют в качестве эксплантата, предпочтительно проводить органную культуру, в которой отсутствует контакт с другими клетками животных, и вся процедура может быть проведена in vitro.
Кроме того, в настоящее изобретение включен способ трансплантации зуба. Этот способ трансплантации включает: процесс получения вышеупомянутого зубного ряда; процесс, в котором каждый зуб отделяют от зубного ряда; и процесс, в котором отдельный зуб выравнивают таким образом, что он имеет такую же направленность, как другие зубы, в месте трансплантации, и осуществляют трансплантацию.
Таким образом, одновременно может быть получено множество зубов, имеющих специфическое расположение клеток и направленность, и может быть эффективно осуществлена трансплантация зуба.
Зуб по настоящему изобретению можно применять для терапий или процедур при утрате зуба, вызванной различными симптомами, сопровождаемыми утратой или повреждением зубов: например, зубным кариесом, краевым периодонтитом (альвеолярной пиореей) и заболеваниями периодонта, поломкой зуба или травматическим вывихом зуба, вызванными несчастными случаями, и тому подобного.
Другими словами, способ лечения по настоящему изобретению включает трансплантацию зуба и/или ткани периодонта, полученных при помощи способа формирования по настоящему изобретению, в место утраты и/или повреждения зуба. Таким образом, можно лечить и/или уменьшать интенсивность вышеупомянутых симптомов в области утраты и/или повреждения зуба.
Еще один способ лечения по настоящему изобретению включает осуществление только процесса культивирования по настоящему изобретению или осуществление процесса расположения и процесса культивирования в месте утраты и/или повреждения зуба. В этом случае сама окружающая ткань в месте утраты и/или повреждения зуба может быть использована в качестве поддерживающего носителя дополнительно к поддерживающим носителям, упомянутым выше. Таким образом, место утраты и/или повреждения зуба скорее можно обработать цитокинами и тому подобным из окружающих тканей в живом организме.
В настоящем изобретении, поскольку ткань может быть эффективно восстановлена путем взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, также может быть предложен способ формирования ткани, которую конструируют путем взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками.
Другими словами, способ формирования ткани по настоящему изобретению представляет собой способ формирования ткани, конструируемой путем взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, и включает: расположение первой клеточной массы, по существу содержащей только один из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, и второй клеточной массы, по существу содержащей другой из типов мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, внутри поддерживающего носителя в контакте друг с другом; и культивирование вышеупомянутых первой и второй клеточных масс внутри вышеупомянутого поддерживающего носителя.
Кроме того, если не указано иное, моменты, описанные в вышеупомянутом способе формирования зуба, могут быть подобным образом применены к настоящему способу формирования ткани.
В качестве тканей, формируемых при помощи настоящего способа формирования ткани по настоящему изобретению, уместны ткани, сконструированные путем взаимодействия между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, и примеры этих тканей дополнительно к упомянутому выше зубу включают волосы, почку, легкое, печень или тому подобное, и могут включать целую ткань или ее часть.
В этом случае предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из типов мезенхимных клеток и эпителиальных клеток был выделен из целевой ткани. Таким образом, ткань может быть легко образована в результате использования клеток, которые уже направлены на целевую ткань. Кроме того, в целях более надежного формирования целевой ткани наиболее предпочтительно, чтобы оба типа мезенхимных клеток и эпителиальных клеток были выделены из целевой ткани.
Примеры тканей, используемых для получения клеточной массы, соответственно состоящей из мезенхимных клеток или эпителиальных клеток, включают: в случае зуба, зубного зачатка и клеток зубной пульпы клетки корневой оболочки и эпителиальные/мезенхимные клетки в ротовой полости; в случае волоса зародышевый волосяной фолликул в процессе развития и ткань волосяного фолликула взрослого; в случае почки зародышевая почка в процессе развития и почечная ткань взрослого; в случае легкого зародышевое легкое в процессе развития и легочная ткань взрослого; и в случае печени зародышевая печень в процессе развития и печеночная ткань взрослого.
В целях получения каждой клеточной массы из этих тканей первая и вторая клеточная масса может быть получена, как описано выше, путем выделения мезенхимных клеток и эпителиальных клеток из ткани, расположения их внутри поддерживающего носителя и культивирования и/или трансплантации, как описано выше.
Таким образом, как с вышеупомянутым зубом, может быть получена ткань, имеющая расположение клеток, специфичное для целевой ткани.
Нижеследующее представляет собой объяснения Примеров по настоящему изобретению, но настоящее изобретение не ограничено этими примерами. Если не указано иное, используемый в Примерах "%" основан на массе.
Примеры
[Примеры 1-3 и Примеры для сравнения 1-4]
(1) Получение эпителиальных клеток зубного зачатка и мезенхимных клеток зубного зачатка
Зубной зачаток реконструировали с образованием зуба. Мышей использовали в качестве модели для этого эксперимента.
2+
2+
Ткань зубного зачатка нижнечелюстного резца извлекали из эмбриона мыши C57BL/6N, имеющего эмбриональный возраст 14,5 суток (приобретенной в CLEA Japan, Inc.), или C57BL/6-TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131 (мышь GFP: RIKEN Bioresource Center), представляющей собой мышь, трансгенную по зеленому флуоресцентному белку (EGFP, Enhanced Green Fluorescent Protein), при помощи общепринятого способа под микроскопом. Ткань зубного зачатка нижнечелюстного резца промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ (-)), не содержащим ни Са, ни Мg, обрабатывали раствором фермента, в котором к ФСБ (-) была добавлена диспаза II (Roche, Mannheim, Germany) при конечной концентрации 1,2 U/мл, при комнатной температуре в течение 12,5 минут, и затем трижды промывали средой DMEM (Sigma, St. Louis, МО), в которую была добавлена 10% фетальная сыворотка теленка (ФСТ) (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Кроме того, добавляли раствор ДНКазы I (Takara, Shiga, Japan) до получения конечной концентрации 70 U/мл, и ткань зубного зачатка диспергировали, а эпителиальные ткани зубного зачатка и мезенхимные ткани зубного зачатка отделяли хирургическим путем с использованием инъекционной иглы 25G (Terumo, Tokyo, Japan).
Для эпителиальных клеток зубного зачатка полученную выше эпителиальную ткань зубного зачатка трижды промывали ФСБ (-) и дважды обрабатывали раствором фермента, в котором в ФСБ (-) была растворена коллагеназа I (Worthington, Lakewood, NJ) при конечной концентрации 100 U/мл, при 37°С в течение 20 минут. Клетки, осажденные и выделенные путем центрифугирования, дополнительно обрабатывали 0,25% трипсином (Sigma) - ФСБ (-) при 37°С в течение 5 минут. После промывания клеток трижды DMEM с добавлением 10% ФСТ к клеткам добавляли раствор ДНКазы I при конечной концентрации 70 U/мл, и отдельные эпителиальные клетки зубного зачатка получали путем пипетирования.
С другой стороны, для мезенхимных клеток зубного зачатка мезенхимную ткань зубного зачатка трижды промывали ФСБ (-) и обрабатывали ФСБ (-), содержащим 0,25% трипсин (Sigma) и 50 U/мл коллагеназы I (Worthington). Добавляли 70 U/мл ДНКазы I (Takara), и отдельные мезенхимные клетки зубного зачатка получали путем пипетирования.
(2) Получение восстановленного зубного зачатка
Затем зубной зачаток реконструировали с использованием эпителиальных клеток зубного зачатка и мезенхимных клеток зубного зачатка, полученных, как описано выше.
Эпителиальные клетки зубного зачатка или мезенхимные клетки зубного зачатка, суспендированные с DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (JRH Biosciences), добавляли в микропробирку объемом 1,5 мл, покрытую силиконовой смазкой (Eppendorf, Hamburg, Germany), и клетки выделяли в виде осадков путем центрифугирования (580 × g). Надосадочную жидкость культурального раствора после центрифугирования удаляли в наибольшей возможной степени, центрифугирование вновь повторяли, и культуральный раствор, оставшийся вокруг клеточных осадков, полностью удаляли с использованием наконечника GELoader Tip 0,5-20 мкл (Eppendorf), в то же время наблюдая под стереомикроскопом, с получением клеток, используемых для генерирования восстановленного зубного зачатка.
30 мкл Cellmatrix тип I-A (Nitta Gelatin, Osaka, Japan), приготовленного с вышеупомянутым культуральным раствором в концентрации 2,4 мг/мл, капали на чашку Петри, покрытую силиконовой смазкой, для получения капли (капли геля) коллагенового раствора. В этот раствор с использованием наконечника для пипетки (Quality Scientific Plastics) объемом от 0,1 до 10 мкл добавляли от 0,2 до 0,3 мкл осадков после центрифугирования вышеупомянутых эпителиальных клеток зубного зачатка или мезенхимных клеток зубного зачатка с образованием клеточных агрегатов в виде клеточных масс.
Это объяснение дано со ссылкой на Фиг.2.
Клеточный агрегат 12, который сначала помещали внутрь капли геля 10 с использованием наконечника для пипетки 16, образует сферическую форму внутри капли геля 10 (см. Фиг.2 (В)). Когда затем вводят еще один клеточный агрегат 14, сферический клеточный агрегат 12 разрушается и во многих случаях заключает внутри клеточный агрегат 14 (см. Фиг.2 (С)). Затем путем затвердевания капли геля 10 связи между клетками усиливаются.
В настоящем Примере в виде клеточных масс готовили и использовали соответственно клеточный агрегат, содержащий отдельные эпителиальные клетки или мезенхимные клетки, а также частичную ткань, содержащую эпителиальные клетки, и частичную ткань, содержащую мезенхимные клетки зубного зачатка.
В настоящем Примере после объединения восстановленных зубных зачатков, полученных из клеточного агрегата, и ткани (Примеры 1 и 2) после переноса частичной ткани, содержащей эпителиальные клетки или мезенхимные клетки, в каплю геля пограничную поверхность зубного зачатка каждой ткани помещали в тесный контакт с клеточным агрегатом, полученным из эпителиальных клеток или мезенхимных клеток зубного зачатка, с использованием вольфрамовой иглы с образованием восстановленного зубного зачатка.
Кроме того, для восстановленного зубного зачатка (Пример 3) с использованием эпителиальных клеток зубного зачатка и мезенхимных клеток зубного зачатка, которые были получены в виде отдельных клеток, клеточный агрегат получали путем использования эпителиальных клеток зубного зачатка подобно вышеописанному таким образом, чтобы они контактировали с клеточным агрегатом мезенхимных клеток зубного зачатка, полученным ранее, и восстановленный зубной зачаток получали таким образом, что оба типа клеток находились в тесном контакте друг с другом.
2
Восстановленный зубной зачаток, приготовленный внутри капли геля, оставляли в покое в СО инкубаторе на 10 минут для затвердевания Cellmatrix типа I-A (Nitta Gelatin), и клеточный агрегат вместе с окружающим гелем в качестве поддерживающего носителя переносили на мембрану вкладыша для клеточной культуры в сосуде для культивирования, который размещали так, чтобы вкладыш для клеточной культуры (мембрана из полиэтилентерефталата (PET) с размером пор 0,4 микрона; BD, Franklin Lakes, NJ) находился в контакте с DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (JRH), и орган культивировали в течение 18-24 часов. После культивирования органа образование зуба анализировали путем стимуляции эктопического образования зуба после трансплантации эксплантата вместе с окружающим гелем под субренальную капсулу 8-недельной мыши C57BL/6 или путем продолжения органной культуры на вкладыше для клеточной культуры.
В качестве сравнительных Примеров каждый из нижеследующих получали и анализировали так же, как описано выше: эксплантат, трансплантированный тканью целого зубного зачатка под субренальную капсулу (сравнительный Пример 1); эксплантат, соответственно трансплантированный каждой из эпителиальной ткани и мезенхимной ткани, индивидуально выделенных из зубного зачатка (Сравнительный Пример 2); эксплантат с использованием агрегата низкой плотности, содержащего количество культурального раствора, эквивалентное объему клеток (Сравнительный Пример 3); и эксплантат, образованный из клеточного агрегата внутри поддерживающего носителя путем смешивания эпителиальных клеток и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка без компартментализации между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками (сравнительный Пример 4). Кроме того, в сравнительном Примере 4 после мягкого смешивания эпителиальных клеток и мезенхимных клеток в отношении 1:1 получали клеточный агрегат, используемый для генерирования восстановленного зубного зачатка, таким же путем, как в Примерах 1-3.
(3) Гистологический анализ
В случае трансплантации субренальной капсулы восстановленный зубной зачаток вместе с окружающей тканью почки извлекали на 7-е сутки или 14-е сутки после трансплантации, декальцинировали 4,5% этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (рН 7,2) в течение 24 часов после фиксации 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 6 часов и заливали в парафин общепринятым способом для получения 10 мкм среза восстановленного зубного зачатка. Для гистологического анализа проводили окрашивание гематоксилином-эозином в соответствии с общепринятым способом.
Когда для восстановленного зубного зачатка использовали зубной зачаток, полученный от мыши GFP, зубной зачаток обеззоливали 4,5% ЭДТА (рН 7,2) в течение 24 часов после фиксации в 50% (масс/об) сахарозе и 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 18 часов, заливали в соединение OCT (Miles Inc., Naperville, IL) и готовили 10 мкм срезы при помощи криостата (Leica, Wetzlar, Germany), которые наблюдали под флуоресцентным микроскопом (производства Zeiss).
Результаты культуры ткани целого зубного зачатка изображены на Фиг.3, а результаты культуры в соответствии со способом формирования по настоящему изобретению изображены на Фиг.4-7.
В сравнительном Примере 1 целый извлеченный зубной зачаток трансплантировали под субренальную капсулу. Как изображено на Фиг.3, поскольку взаимодействие между мезенхимными клетками и эпителиальными клетками, составляющими зубной зачаток, не нарушено, образовывались эмаль, имеющая происхождение из эпителиальных клеток, дентин и зубная пульпа, имеющие происхождение из мезенхимных клеток, и образовался зуб, имеющий верхушку и корень, расположенные в определенных положениях, дополнительно к эмали и дентину.
С другой стороны, как изображено на Фиг.4-6, когда форму отдельных клеток, полученных из зубного зачатка, использовали в соответствии с настоящим изобретением, другими словами, когда восстановление осуществляли путем объединения мезенхимных клеток зубного зачатка с эпителиальной тканью зубного зачатка (Пример 1, см. Фиг.4 и 5) и путем объединения мезенхимной ткани зубного зачатка с эпителиальными клетками зубного зачатка (Пример 2, см. Фиг.6), зуб, имеющий специфическое расположение клеток с дентином внутри и эмалью снаружи, генерировали путем трансплантации субренальной капсулы в 11-14-суточный период. На основании полученного таким образом зуба продемонстрировано, что можно восстановить тот же тип зуба, как в норме генерируют путем культивирования целого зубного зачатка (Фиг.3).
Кроме того, как изображено на Фиг.4, при настоящем восстановлении и трансплантации субренальной капсулы наружную эмаль, энамелобласт, амелобласт, дентин и одонтобласт было легко идентифицировать на 11-е сутки после трансплантации. Корневой участок также был таким же, как корень в результате нормального генерирования зуба, и альвеолярный отросток идентифицировали в наружном периметре корневого участка. Кроме того, при наблюдении во времени дентин и одонтобласт легко идентифицировали на 3-е сутки после трансплантации, и в расположении тканей начинала образовываться специфичная для зуба структура. Дополнительно на 7-е сутки была очевидна аккумуляция дентина, одонтобласта и энамелобласта, и после этого генерирование зуба прогрессировало (данные не представлены).
Кроме того, сразу после расположения внутри капли геля под микроскопом наблюдали, что клетки, составляющие клеточный агрегат, присутствовали по отдельности, а после одних суток краткосрочного культивирования клетки были прочно связаны и изменились в единую связанную ткань, как в случае нормального извлеченного зубного зачатка. Это указывает на то, что краткосрочное культивирование перед трансплантацией эффективно при образовании зуба.
Кроме того, когда использовали мезенхимные клетки, выделенные из мыши GFP, эти клетки были локализованы среди клеток зубной пульпы и одонтобластов, происходящих из мезенхимных клеток с внутренней стороны (Фиг.5). С другой стороны, когда использовали эпителиальные клетки, выделенные из мыши GFP, эти клетки были локализованы среди энамелобластов с наружной стороны, и флуоресцентные изображения соответствовали изображениям используемых клеточных типов (Фиг.6). Таким образом, очевидно, что осуществлялось такое же клеточное взаимодействие, как при нормальном генерировании, и что восстановление ткани осуществляли без нарушения направленности клеток в процессе генерирования.
Дополнительно, когда органную культуру продолжали без применения трансплантации субренальной капсулы, восстановленный зубной зачаток, который культивировали с течением времени от начала культуры, постепенно увеличивался, дентин и одонтобласт легче идентифицировали на 16-е сутки после трансплантации, и в расположении ткани идентифицировали образование специфичной для зуба структуры (данные не представлены). Этот тип конструирования при помощи органной культуры идентифицировали не только при использовании в качестве ткани одного или другого типа эпителиальных клеток и мезенхимных клеток, но при использовании обоих типов.
Кроме того, когда использовали эпителиальные клетки зубного зачатка и мезенхимные клетки зубного зачатка (Пример 3), как изображено на Фиг.7, было подтверждено присутствие дентина и эмали, как и в том случае, когда в качестве ткани использовали только один из типов эпителиальных клеток зубного зачатка или мезенхимных клеток зубного зачатка. Когда использовали эпителиальные клетки зубного зачатка и мезенхимные клетки зубного зачатка, наблюдали, что из отдельного восстановленного зубного зачатка были часто генерированы множественные зубы, обладающие направленностью и структурой, что свидетельствует о возможности генерирования множественных зубов в результате отделения зубной почки после ее образования. В частности, когда мезенхимные клетки зубного зачатка сначала располагали внутри капли геля, а затем эпителиальные клетки зубного зачатка располагали таким образом, чтобы они были прижаты к мезенхимным клеткам зубного зачатка, специфическая структура, где эмаль и дентин расположены соответственно снаружи и внутри, была сконструирована более точно, и форма зуба образовалась легче, и было показано, что это может быть благоприятным при образовании зуба (данные не представлены).
Кроме того, когда зубной зачаток, восстановленный путем расположения эпителиальных клеток и мезенхимных клеток согласно настоящему изобретению, был культивирован в органной культуре, часто наблюдали образование множественных зубных зачатков и/или зубных почек. Это свидетельствует о возможности генерирования множества зубов из отдельного восстановленного зубного зачатка путем хирургического разделения этих множественных зубных зачатков и/или зубных почек.
С другой стороны, в случае сравнительного Примера 2, когда культивирование проводили только с эпителиальной тканью или только с мезенхимной тканью, как представлено на Фиг.8, зуб, имеющий специфическую упомянутую выше структуру, не может быть сконструирован. Таким образом, это свидетельствует о том, что ткань, обладающая специфической структурой, восстанавливается в результате осуществления межклеточного взаимодействия способом по настоящему изобретению.
Кроме того, в случае сравнительного Примера 3, когда использовали клеточный агрегат низкой плотности, как изображено на Фиг.9, отдельные клетки уже были диспергированы в капле коллагенового геля во время культивирования, и специфическая для зуба структура не была восстановлена даже путем трансплантации клеток под субренальной капсулой. Это свидетельствует о том, что предпочтительно использовать клетки с максимально возможной плотностью для восстановления зуба в результате межклеточного взаимодействия.
Кроме того, в случае сравнительного Примера 4, где использовали клеточный агрегат с высокой плотностью путем предварительного смешивания эпителиальных клеток зубного зачатка и мезенхимных клеток зубного зачатка в отношении 1:1 без компартментализации, как изображено на Фиг.10, твердую ткань, такую как эмаль и дентин, не идентифицировали. Это свидетельствует о том, что важно формировать клеточный агрегат, в котором осуществляется компартментализация массы эпителиальных клеток зубного зачатка и массы мезенхимных клеток зубного зачатка, после того как соответствующие массы получают по отдельности.
(4) Подтверждение ткани периодонта
Далее подтверждали, имеет ли зуб, образованный в соответствии со способом по настоящему изобретению, ткань периодонта. Описанную ниже гибридизацию in situ использовали для подтверждения присутствия ткани периодонта дополнительно к вышеупомянутому наблюдению с использованием изображений окрашивания гематоксилином-эозином (ГЭ).
Восстановленный зубной зачаток, трансплантированный под субренальную капсулу, вырезали на 14-е сутки после трансплантации, заливали в парафин общепринятым способом и готовили срезы толщиной 10 мкм. Парафин удаляли путем проведения срезов через серию разведений ксилол/этанол. Срезы обрабатывали 10 мкг/мл протеазы К (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) в ФСБ (-) в течение 3 минут и фиксировали 4% параформальдегидом (Nacalai Tesque) в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 15 минут. Срезы обрабатывали 0,1% (об./об.) Triton X-100 (Sigma) в ФСБ (-) в течение 3 минут и промывали ФСБ (-) в течение 3 минут. Затем их обрабатывали 0,2 н. HCl (Wako) в течение 10 минут и промывали каждым из ФСБ (-) и ДЭПК-воды (воды, обработанной диэтилпирокарбонатом) соответственно в течение 5 минут каждый. После обработки 1,5% (об./об.) триэтаноламином (Nacalai Tesque), 0,33 н. HCl (Wako) и 0,25% (об./об.) уксусным ангидридом (Nacalai Tesque) в ДЭПК-воде в течение 10 минут срезы дважды промывали 2 х SSC в течение 10 минут. Зонд Periostin (Genbank №NM#015784) использовали путем мечения дигоксигенином DIG фрагментов кДНК, полученных в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием смыслового праймера (-7; ggctgaagatggttcctctc, SEQ NO: 1) и антисмыслового праймера (573; gtacattgaaggaataacca, SEQ NO: 2). Гибридизацию in situ проводили в соответствии с общепринятым способом, окрашивание осуществляли с использованием меченных дигоксигенином антител (anti-DIG-Ap) к фрагменту Fab (Roche) и концентрированного раствора нитросинего тетразолия NBТ)/бромхлориндолилфосфата (BCIP) (Roche), и анализ осуществляли с использованием установки для визуализации Axio Imager А. 1 (Zeiss) и AxioCam Mrc5 (Zeiss).
Когда ткань периодонта в вышеупомянутых Примерах подробно проверяли на присутствие или отсутствие ткани периодонта, альвеолярный отросток, подобный тому, который обнаружен при трансплантации нормального зубного зачатка в сравнительном Примере 1 (см. Фиг.3), образовывался вокруг зуба на 14-е сутки после трансплантации в каждом из Примеров 1-3, как изображено на Фиг.4-7.
Кроме того, как изображено на Фиг.11, несмотря на объединение отдельных клеток и ткани, альвеолярный отросток и корневая оболочка, подобные тем, которые обнаружены при трансплантации нормального зубного зачатка в сравнительном Примере 1, образовывались вокруг полученного зуба в каждом из Примеров 1-3. Кроме того, когда наблюдали зуб в соответствии с Примером 2, как изображено на Фиг.12, экспрессию мРНК периостина, представляющего собой ген, специфичный для корневой оболочки, идентифицировали в области, в которой путем окрашивания ГЭ было идентифицировано образование корневой оболочки (то же было идентифицировано в Примерах 1 и 3).
Вышеизложенное свидетельствует о том, что зубной зачаток, полученный, как в Примерах 1-3, может образовывать ткани периодонта, такие как альвеолярный отросток и корневая оболочка.
[Примеры 4 и 5, Сравнительный Пример 5]
После завершения вышеописанного процесса расположения культуру органна, обычно используемую в процессах культивирования, непрерывно проводили в течение 14 суток для анализа генерирования зуба. Комбинацию эпителиальной ткани и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, использовали в Примере 4, а комбинацию эпителиальных клеток и мезенхимных клеток, выделенных из зубного зачатка, использовали в Примере 5. Дополнительно органную культуру с использованием нормального зубного зачатка использовали в сравнительном Примере 5. Результаты изображены на Фиг.13.
Как изображено на Фиг.13, в обоих Примерах 4 и 5 размер зубного зачатка увеличивался по мере продления периода культивирования, и наблюдали генерирование зуба, обладающего специфической структурой, примерно такой же, как была получена путем осуществления трансплантации субренальной капсулы.
Кроме того, в обоих Примерах 4 и 5 зубы, полученные из органной культуры, образовывали ряд, составленный из множества зубов (например, шесть зубов при использовании мезенхимных клеток и эпителиальных клеток; Фиг.13, самый нижний ряд).
[Примеры 6 и 7, Сравнительный Пример 6]
Как представлено в Примере 5, зуб, полученный из восстановленного зубного зачатка, повторно индуцировали на образование множества зубов несмотря на факт, что мезенхимные клетки и эпителиальные клетки были получены из отдельного восстановленного зубного зачатка. Анализ проводили для того, чтобы посмотреть, может ли каждый зуб, повторно индуцированный одновременно при помощи восстановленного зубного зачатка, вырасти в отдельный зуб.
(1) Анализ разделения множественных зубных зачатков, образованных из восстановленных зубных зачатков, и потенциал генерирования зуба
1) Индивидуальное разделение и органная культура множественно генерируемых зубных зачатков
Восстановленный зубной зачаток, полученный подобно Примеру 3, представлял собой орган, культивируемый в течение от 2 до 5 суток, и множественные зубные зачатки получали из отдельного восстановленного зубного зачатка. Затем на 2-5-е сутки органной культуры отдельные зубные зачатки хирургическим путем отделяли от восстановленного зубного зачатка, который генерировал множественные зубные зачатки, с использованием инъекционной иглы и пинцета под стереомикроскопом.
2
Капли геля получали путем капания 30 мкл Cellmatrix тип l-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) на чашку Петри, покрытую силиконовой смазкой, таким же путем, как в Примере 1. Каждый из вышеупомянутых индивидуально отделенных зубных зачатков помещали внутрь капли геля и оставляли в покое в СО инкубаторе на 10 минут для затвердевания Cellmatrix тип l-A (Nitta Gelatin). Каждый из индивидуально отделенных зубных зачатков вместе с окружающим гелем, который представлял собой поддерживающий носитель, переносили на мембрану вкладыша для клеточной культуры в сосуде для культивирования, в котором вкладыш для клеточной культуры (мембрана из полиэтилентерефталата (PET) с размером пор 0,4 микрона; BD, Franklin Lakes, NJ) помещали таким образом, чтобы он находился в контакте с DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (JRH), и орган культивировали в течение 18-24 часов.
2) Гистологический анализ
После культивирования каждый из индивидуально отделенных зубных зачатков вместе с окружающим гелем трансплантировали под субренальную капсулу 8-недельной мыши C57BL/6, и индивидуально отделенные зубные зачатки вырезали на 14-е сутки после трансплантации вместе с окружающей тканью почки. После фиксации ткани 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 6 часов ткань заливали в парафин общепринятым способом для получения срезов толщиной 10 мкм. Для гистологического анализа проводили окрашивание гематоксилином-эозином общепринятым способом.
3) Результаты
Результаты гистологического анализа отделенных зубных зачатков, которые трансплантировали под субренальную капсулу для генерирования в течение 14 суток, изображены на Фиг.14. Как представлено на Фиг.14, каждый из трансплантированных отделенных зубных зачатков развивался в отдельный зуб, характеризующийся эмалью, дентином, зубной пульпой, коронкой и корнем. Кроме того, в полученных зубах наблюдали наличие эмали и дентина в участке коронки (см. "а" в среднем и нижнем рядах Фиг.14) и отверстие корня в корневом участке (см. "b" в среднем ряду Фиг.14).
Эти наблюдения указывают на то, что: в участке коронки присутствуют энамелобласт и одонтобласт, как в нормально генерируемом зубе; зуб имеет такую же конфигурацию, как конфигурация нормально генерируемого зуба; и каждый зуб, генерируемый одновременно как один из ряда зубов, является таким же, как нормально генерируемый зуб, с точки зрения расположения клеток и направленности.
(2) Генерирование зуба путем трансплантации восстановленного зубного зачатка в ротовую полость
1) Генерирование индивидуально отделенных зубных зачатков и индивидуально отделенных зубов
Индивидуально отделенные зубные зачатки получали из восстановленного зубного зачатка, из которого были генерированы множественные зубные зачатки, на 2-5-е сутки органной культуры, как описано выше. Кроме того, множественные зубы, генерируемые из восстановленного зубного зачатка, который трансплантировали под субренальную капсулу и вырезали через 14 суток после трансплантации, индивидуально отделяли хирургическим путем с использованием инъекционной иглы и пинцета под стереомикроскопом.
2
В случае индивидуально отделенного зубного зачатка каплю геля получали путем капания 30 мкл Cellmatrix тип I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan), который готовили в концентрации 2,4 мг/мл в вышеупомянутом культуральном растворе, на чашку Петри, покрытую силиконовой смазкой, как описано выше. Вышеупомянутый индивидуально отделенный зубной зачаток помещали внутрь этой капли геля и оставляли в покое в СО инкубаторе на 10 минут для затвердевания Cellmatrix тип l-A (Nitta Gelatin). Затем индивидуально отделенный зубной зачаток вместе с окружающим гелем в качестве поддерживающего носителя переносили на мембрану вкладыша для клеточной культуры в сосуде для культивирования, в котором вкладыш для клеточной культуры (мембрана из полиэтилентерефталата (PET) с размером пор 0,4 микрона; BD, Franklin Lakes, NJ) помещали таким образом, чтобы он находился в контакте с DMEM (Sigma) с добавлением 10% ФСТ (JRH), и орган культивировали в течение 18-24 часов.
После культивирования окружающий гель удаляли хирургическим путем при помощи инъекционной иглы и пинцета, и индивидуально отделенный зубной зачаток трансплантировали в лунку после удаления нижнечелюстного резца 8-недельной мыши C57BL/6; и его обозначили как Пример 6. Кроме того, зуб, индивидуально отделенный от восстановленного зубного зачатка, который был трансплантирован под субренальную капсулу, трансплантировали в лунку после удаления нижнечелюстного резца 8-недельной мыши C57BL/6 без погружения в гель после отделения; и его обозначили как Пример 7.
2) Способы удаления резца и трансплантации в ротовую полость
За 3 дня до трансплантации в ротовую полость 8-недельной мыши C57BL/6, которую анестезировали путем ингаляции диэтиловым эфиром, внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия, в количестве 200 мкл на каждые 20 г массы тела. Нижнюю челюсть около места прорезывания нижнечелюстного резца мыши, болевая чувствительность которой была понижена, расслаивали при помощи скальпеля и обнажали кончик резца, погруженного в челюстную кость. Резец удаляли из нижней челюсти с использованием пинцета, кровь промокали гигроскопической ватой, и кровотечение останавливали. С целью поглощения корма нижнечелюстной резец удаляли только с одной стороны и ежесуточно давали тонко измельченный корм для разведения.
8-Недельную мышь C57BL/6, зуб которой был удален вышеупомянутым способом, анестезировали путем ингаляции диэтиловым эфиром, внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор, содержащий 5 мг/мл пентобарбитала натрия, в количестве 200 мкл на каждые 20 г массы тела. Мышь, болевая чувствительность которой была понижена, фиксировали на секционном столе таким образом, что сторона челюсти, из которой удаляли зуб, была обращена вверх, и нижнюю челюсть обнажали путем разрезания кожи и мышечного слоя со стороны головы в корневом участке лунки, оставшейся после удаления зуба. Отверстие диаметром 1 мм в случае индивидуально отделенного зубного зачатка и отверстие диаметром 2 мм в случае индивидуально отделенного зуба создавали при помощи скальпеля на нижней челюсти, захватывая область корневого участка лунки, оставшейся после удаления зуба, затем индивидуально отделенный зубной зачаток или индивидуально отделенный зуб трансплантировали в области корневого участка лунки, оставшейся после удаления зуба, через отверстие, созданное при помощи скальпеля. Ориентацию индивидуально отделенного зубного зачатка или индивидуально отделенного зуба, который нужно было трансплантировать, выравнивали с ориентацией нормально генерируемого зуба, а также с направленностью эмали и корневой оболочки, наблюдаемой в нижнечелюстных резцах взрослой мыши. Разрезанный мышечный слой и кожу зашивали общепринятым способом. 8-Недельную мышь C57BL/6, которая претерпевала трансплантацию в ротовую полость, ежесуточно кормили измельченным кормом для разведения.
Дополнительно сравнительный Пример 6 был обозначен как пример, в котором трансплантацию не осуществляли на мыши, которая не подвергалась трансплантации.
3) Гистологический анализ
Нижние челюсти, в которые трансплантировали индивидуально отделенный зубной зачаток и индивидуально отделенный зуб, вырезали на 14-е сутки после трансплантации в ротовую полость. Кость подвергали обеззоливанию с использованием 22,5% муравьиной кислоты в течение 72 часов после фиксации 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 16 часов; затем заливали в парафин общепринятым способом для получения срезов толщиной 10 мкм. На каждые две челюсти использовали по 50 мл обеззоливающего раствора, и все количество заменяли на 48-й час обеззоливания. Для гистологического анализа проводили окрашивание гематоксилином-эозином в соответствии с общепринятым способом.
Когда зубной зачаток, полученный от мыши C57BL/6 TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131, использовали для индивидуально отделенного зубного зачатка и индивидуально отделенного зуба, его подвергали обеззоливанию с использованием 22,5% муравьиной кислоты в течение 72 часов после фиксации 4% фосфатно-солевым буферным раствором в течение 16 часов, заливали в соединение OCT (Miles Inc., Naperville, IL) в соответствии с общепринятым способом, и срезы толщиной 10 мкм готовили при помощи криостата (Leica, Wetzlar, Germany) для исследования под флуоресцентным микроскопом (Zeiss).
4) Результаты
Гистологические картины на 14-е сутки после удаления зуба мыши в сравнительном Примере 6, в котором трансплантацию не проводили на мыши после удаления резца, изображены на Фиг.15, и гистологические картины индивидуально отделенного зубного зачатка (Пример 6) и индивидуально отделенного зуба (Пример 7) на 14-е сутки после трансплантации в лунку, оставшуюся после удаления резца, представлены соответственно на Фиг.16 и 17.
Как изображено на Фиг.15, у нетрансплантированной мыши в сравнительном Примере 6, были идентифицированы только инфильтрированные клетки и сформированная кость, а зуб, имеющий твердую ткань, не был идентифицирован в области, соответствующей месту трансплантации в лунке, оставшейся после удаления резца.
С другой стороны, как изображено на Фиг.16, в вышеупомянутом месте, в котором был трансплантирован индивидуально отделенный зубной зачаток в Примере 6, был генерирован зуб, имеющий эмаль снаружи и дентин внутри. Этот генерируемый зуб имел верхушку и корень зуба, направленность зуба и такую же структуру, как у нормально генерируемого зуба.
Кроме того, у мыши Примера 7, у которой зуб, отделенный после образования в результате трансплантации субренальной капсулы, трансплантировали в лунку, оставшуюся после удаления зуба, как изображено на Фиг.17, в вышеупомянутом месте был генерирован зуб, имеющий эмаль снаружи и дентин внутри. Этот генерируемый зуб имел верхушку и корень зуба, кровеносные сосуды внутри зубной пульпы, а также корневую оболочку и альвеолярный отросток вокруг зуба, и такую же структуру, как у нормально генерируемого зуба.
[Пример 8 и Сравнительный Пример 7]
(1) Восстановление волосяного фолликула
В целях демонстрации, что технология, разработанная в настоящем изобретении, так же полезна при образовании других органов, как и способствует генерированию зубного зачатка, осуществляли восстановление волосяного фолликула. В качестве моделей для этого эксперимента использовали мышей.
1) Способ разделения клеток
2+
2+
Ткань волосяного фолликула нижнечелюстного волоска вырезали у эмбриона мыши C57BL/6N, имеющего эмбриональный возраст 14,5 суток (приобретенной в CLEA Japan, Inc.), или мыши C57BL/6-TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131 (RIKEN Bioresource Center), представляющей собой мышь, трансгенную по зеленому флуоресцентному белку (EGFP), общепринятым способом под микроскопом. Ткань волосяного фолликула нижнечелюстного волоска промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ (-)), не содержащим ни Са, ни Mg, обрабатывали раствором фермента, в котором к ФСБ (-) была добавлена диспаза II (Roche, Mannheim, Germany) при конечной концентрации 1,2 U/мл, при комнатной температуре в течение 60 минут, и затем трижды промывали DMEM (Sigma, St. Louis, МО) с добавлением 10% ФСТ (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Кроме того, добавляли раствор ДНКазы I (Takara, Shiga, Japan) до получения конечной концентрации 70 U/мл для диспергирования ткани волосяного фолликула, и эпителиальные ткани волосяного фолликула и мезенхимные ткани волосяного фолликула отделяли хирургическим путем с использованием инъекционной иглы 25G (Terumo, Tokyo, Japan).
Для эпителиальных клеток волосяного фолликула полученную выше эпителиальную ткань волосяного фолликула трижды промывали ФСБ (-) и дважды промывали раствором фермента, в котором в ФСБ (-) была растворена коллагеназа I (Worthington, Lakewood, NJ) при конечной концентрации 100 U/мл, при 37°С в течение 20 минут. Клетки, осажденные и выделенные путем центрифугирования, дополнительно обрабатывали 0,25% Трипсином (Sigma) - ФСБ (-) при 37°С в течение 5 минут. После промывания клеток трижды DMEM с добавлением 10% ФСТ к клеткам добавляли раствор ДНКазы I при конечной концентрации 70 U/мл, и отдельные эпителиальные клетки волосяного фолликула получали путем пипетирования.
С другой стороны, для мезенхимных клеток волосяного фолликула мезенхимную ткань волосяного фолликула трижды промывали ФСБ (-) и обрабатывали ФСБ (-), содержащим 0,25% Трипсин (Sigma) и 50 U/мл коллагеназы I (Worthington). Добавляли 70 U/мл ДНКазы I (Takara), и отдельные мезенхимные клетки волосяного фолликула получали путем пипетирования.
2) Способ генерирования восстановленного волосяного фолликула
Затем клетки, используемые при генерировании восстановленного волосяного фолликула, готовили тем же путем, как в Примере 1, за исключением того, что использовали полученные выше эпителиальные клетки волосяного фолликула и мезенхимные клетки волосяного фолликула; от 0,2 до 0,3 мкл каждого из типов клеток наносили в каплю коллагенового геля для получения соответствующих клеточных агрегатов; и восстановленный волосяной фолликул генерировали путем расположения обоих клеточных агрегатов в тесном контакте друг с другом.
3) Трансплантация субренальной капсулы
Для восстановленного волосяного фолликула, генерируемого в геле, как в Примере 1, клеточные агрегаты вместе с окружающим гелем в качестве поддерживающего носителя наносили на мембрану вкладыша для клеточной культуры в сосуде для культивирования, и орган культивировали в течение 18-48 часов. После культивирования органа его трансплантировали под субренальную капсулу 8-недельной мыши C57BL/6 для стимуляции эктопического роста волоса и анализировали рост волоса.
С другой стороны, в сравнительном Примере 7 агрегат отдельных клеток готовили путем смешивания двух типов клеток ex vivo таким же образом, как в сравнительном Примере 4, за исключением того, что использовали эпителиальные клетки волосяного фолликула и мезенхимные клетки волосяного фолликула, и его трансплантировали под субренальную капсулу, как в Примере 8.
4) Гистологический анализ
В случае трансплантации субренальной капсулы восстановленный волосяной фолликул вырезали вместе с окружающей почечной тканью на 14-е сутки после трансплантации. В органной культуре клеточный агрегат извлекали на 14-е сутки культивирования. Затем ткань или клеточный агрегат фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буферном растворе в течение 6 часов и заливали в парафин общепринятым способом для получения срезов толщиной 10 мкм. Для гистологического анализа проводили окрашивание гематоксилином-эозином в соответствии с общепринятым способом.
5) Результаты
Результаты трансплантации в субренальную капсулу волосяного фолликула мыши такого же типа в соответствии с Примером 8 изображены на Фиг.18. Как представлено на Фиг.18, фолликул, внутреннее эпителиальное влагалище корня волоса и наружное эпителиальное влагалище корня волоса, происходящие из эпителиальных клеток, и клетки волосяного сосочка, происходящие из мезенхимных клеток, идентифицировали на продольном срезе волосяного фолликула (срез А), поскольку межклеточное взаимодействие между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками, которые составляют исходный волосяной фолликул, не было нарушено, когда трансплантировали восстановленный волосяной фолликул. Кроме того, на срезе А, хотя волос растворялся в момент окрашивания ткани, идентифицировали волос, который был растворен неполностью. На поперечном срезе (срез В) было идентифицировано такое расположение клеток внутреннего эпителиального влагалища корня волоса и наружного эпителиального влагалища корня волоса, что эпителиальные клетки могут окружать поры. Поскольку волос растворялся в момент окрашивания ткани, идентифицировали остаток после растворения волоса.
Кроме того, как представлено на Фиг.19, на эксплантате, который был вырезан на 14-е сутки после трансплантации в субренальную капсулу восстановленного волосяного фолликула, был идентифицирован волос, выросший из волосяного фолликула.
С другой стороны, в случае сравнительного Примера 7, когда эпителиальные клетки и мезенхимные клетки смешивали предварительно и восстанавливали в поддерживающем носителе, ткань волосяного фолликула не была идентифицирована, как изображено на Фиг.20.
Таким образом, в соответствии с Примером 8 волос может быть генерирован из ткани волосяного фолликула подобно случаям, в которых зуб был генерирован при использовании зубного зачатка в Примерах 1-7.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением продемонстрировано, что клеточная дифференцировка может быть эффективно индуцирована и может быть сформирована ткань, имеющая тканеспецифичное расположение клеток и направленность, путем раздельного получения эпителиальной ткани/клеток и мезенхимной ткани/клеток таким образом, что может быть эффективно осуществлено взаимодействие между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками, и путем компартментализации ткани/клеток и их культивирования в контакте друг с другом с высокой плотностью, и не только для зубов и волоса.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением можно искусственно формировать ткань, конструируемую в результате межклеточного взаимодействия, поскольку ткань может быть реконструирована из различных отдельных клеток без нарушения межклеточного взаимодействия.
Объяснение букв и чисел
10 - упаковка геля (поддерживающего носителя);
12 - клеточный агрегат (первая клеточная масса);
14 - клеточный агрегат (вторая клеточная масса);
16 - наконечник пипетки.