СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПОУГ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДАННЫХ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF POAG USING GENETIC DATA

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы на основе генетических данных.
Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) - это хроническая патология глаз, характеризующаяся периодическим или постоянным повышением внутриглазного давления (ВГД) и сопровождающаяся прогрессирующей оптической нейропатией, которая проявляется атрофией зрительного нерва (с экскавацией) и характерными изменениями поля зрения [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство / Под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.]. По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований за последние пять лет удельный вес глаукомы среди причин инвалидности по зрению значительно возрос с 20 до 28%, распространенность увеличилась с 0,12 до 0,62 и более на 10 тысяч населения субъекта федерации в зависимости от его особенностей и возрастной группы жителей [Либман E.С. Эпидемиологическая характеристика глаукомы / Либман E.С. // Глаукома. - 2009. - №1 (Прил.). - С. 2 - 3]. При этом только половина заболевших знают о своем диагнозе и лишь четверть из них получает адекватное лечение [Quigley, H. Glaucoma / Quigley H. // The Lancet. - 2011. - Vol.377, no. 9774. - P. 1367-1377]. В начальной стадии ПОУГ протекает практически бессимптомно, данное заболевание часто выявляется на стадиях, когда изменения зрительного нерва уже необратимы [Нестеров А.П. Глаукома. / Нестеров А. П. // М.: Мед. информ. агент., 2008. - 360 с.]. ПОУГ является мультифакториальным заболеванием, в этиопатогенезе которого важная роль принадлежит факторам роста [Banerjee, D. Comprehensive analysis of myocilin variants in east Indian POAG patients / Banerjee D., Bhattacharjee А., Ponda А., Ray K. // Molecular Vision. - 2012. Vol.18. - P. 1548-1557]. Сосудистая теория патогенеза ПОУГ развитие глаукомной оптической нейропатии (ГОН) рассматривает как результат нарушения кровоснабжения головки зрительного нерва (ГЗН) вследствие действия различных факторов риска [Flammer, J. The impact of ocular blood flow in glaucoma / Flammer J., Orgul S., Costa V. et аl. // Prog. Ret. Eye Res. - 2002. - 21. №4 - P. 359-393]. Одним из ключевых механизмов, обеспечивающих кровообращение в питающих ДЗН сосудах, является ауторегуляция кровотока. При изменениях перфузионного давления ауторегуляция контролирует расширение или сужение артериол, регулируя, таким образом, кровоток в них. Существенную роль при этом играют эндотелиальные клетки. Они являются продуцентами вазоактивных веществ, среди которых наибольшее значение имеют оксид азота (NO), эндотелин 1 (ЭТ-1) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-А) [Resch, H. Endothelial dysfunction in glaucoma. / Resch H., Garhofer G., Fuchsjager-Mayrl G. // Acta Opthalmologica. - 2009. - vol. 87. - P. 4-12].
VEGF-A представляет собой гепаринсвязывающий гликопротеин молекулярной массой 45 кДа - это специфический митоген эндотелиальных клеток, являющийся стимулятором физиологического и патологического ангиогенеза, роста и пролиферации эндотелиоцитов, подавляет апоптоз циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток [Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors / Ferrara N., Gerber H.P., Le Couter J. // Nat. Med. - 2003. - Vol.9(6). - P. 669-76].
Ген VEGF-А находится на коротком плече 6 хромосомы в локусе 6p21.3, состоит из восьми экзонов, разделенных семью интронами, имеющих альтернативный сплайсинг, и контролирует синтез целой группы белков. Экспрессия гена VEGF-А модулируется различными факторами, в частности цитокинами, липополисахаридами, гормонами и гипоксией. Экспрессия VEGF-А весьма вариативна, описано не менее 25 различных полиморфизмов, которые ее определяют [Heist, R. VEGF polymorphisms and survival in early-stage non-small cell lung cancer. / Heist R., Zhai R., Liu G. // Journal of clinicаl oncology. - 2008. - Vol.26. - P. 856-62].
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2014 гг. Анализ документов производился по направлению: Способ прогнозирования риска развития ПОУГ с использованием генетических данных.
http://fips.ru
Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности .
Известен способ прогнозирования риска развития и прогрессирования глаукомы по патенту РФ №2354287 (опубликован 10.05.2009), в котором определяют корнеальный гистерезис и центральную толщину роговицы и затем по формуле рассчитывают биомеханический коэффициент роговицы: К=КГ/ЦТР·50, где К - биомеханический коэффициент роговицы, КГ - корнеальный гистерезис, ЦТР - центральная толщина роговицы, и при значении менее 0,82 прогнозируют риск развития и прогрессирования глаукомы. Способ обеспечивает адекватное прогнозирование риска развития и прогрессирования глаукомы с учетом эластических свойств роговицы и ее центральной толщины и проведение соответствующего лечения.
К недостаткам данного способа относится то, что он не учитывает роль генетических полиморфизмов и, кроме того, предусматривает необходимость наличия дорогостоящего офтальмологического оборудования: анализатор биомеханических свойств глаза и пахиметр.
За прототип выбран метод прогнозирования риска развития ПОУГ у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, на основании полиморфных вариантов генов факторов некроза опухолей и их рецепторов и других возможных факторов риска, изложенный в диссертации Тикуновой Е.В. «Роль генетических полиморфизмов факторов некроза опухолей и их рецепторов в развитии первичной открытоугольной глаукомы». В ходе данного исследования методом дискриминантного анализа (далее ЛДФ) проведено изучение больных ПОУГ и контрольной группы по десяти предикторам: возраст, наличие сердечно-сосудистых заболеваний, уровень систолического артериального давления, уровень диастолического артериального давления, наличие ПОУГ среди родственников, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз, состояние пигментной каймы зрачкового края радужной оболочки, степень пигментации угла передней камеры, генетический вариант по локусу+1663A/G TNFR2. Материалом для исследования служила венозная кровь, выделение геномной ДНК проводилось методом фенольнохлороформной экстракции. Типирование локуса+1663A/G TNFR2 проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (далее ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time.
Определение риска развития глаукомы по значениям, полученным при решении уравнений ЛДФ общей формулы. Уравнение ЛДФ имеет следующий вид [Реброва О.Ю., 2006]:
1
1
2
2
3
3
n
n
y=aх+ах+ах+…+ах+C,
i
i
где C - константа, х - информативные признаки, а - коэффициенты признаков.
Указанный способ, взятый за прототип, подтверждает, что выявленные предикторы имеют важное клиническое значение в формировании ПОУГ в совокупности с генетическими данными о вовлеченности полиморфизма+1663A/G TNFR2. Недостатком указанного способа является то, что в нем отсутствуют данные о влиянии на развитие первичной открытоугольной глаукомы генетического полиморфизма VEGF-A с.-958C>T.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы с использованием генетических данных у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья.
Технический результат использования изобретения - возможность прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, с учетом генетического полиморфизма VEGF-A с.-958C>T, в сочетании с такими предикторами развития данного заболевания как возраст, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степени пигментации угла передней камеры.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития первичной открытоугольной глаукомы у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, с использованием генетических данных включающий определение следующих предикторов: возраст пациента, уровень систолического и диастолического артериального давления, отягощенный семейный анамнез, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степени пигментации угла передней камеры; выделение ДНК из периферической венозной крови, в который внесены следующие новые признаки
- проводят анализ полиморфизма гена VEGF-A с.-958C>T (rs 833061);
p
k
- определяют значения дискриминантных показателей D и D по формулам:
p
1
2
3
4
5
6
7
8
D=-110,685+1,175·x+0,383·x+0,892·x+5,434·x+2,742·x - 14,578·x- 0,391·x+8,193·x,
k
1
2
3
4
5
6
7
8
D=-94,672+1,089·x+0,308·x+0,953·x+3,483·x+0,243·x -11,515·x- 2,607·x+7,026·x,
1
2
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
7
7
7
8
8
8
где x - возраст (лет), x - систолическое артериальное давление (мм рт. ст.), x - диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.), x - отягощенный семейный анамнез (нет - x=0; есть - x=1), x- наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (нет - x=0; есть - x=1), x- микрососудистые изменения в конъюнктиве (нет - x=0; есть - x=1), x- степень пигментации угла передней камеры (нет - x=0; I степень - x=1; II степень - x=2; III степень - x=3; IV степень - x=4), x - генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T (TT или CT- x=1; CC- x=2);
p
k
- прогнозируют риск развития первичной открытоугольной глаукомы в случае, если DбольшеD.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники неизвестна возможность прогноза риска развития первичной открытоугольной глаукомы в зависимости от генетических вариантов по локусу VEGF-A с.-958C>T в сочетании с другими предикторами развития данного заболевания.
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе 4 мл крови смешивают с лизирующим буфером, в котором содержится 320 г сахарозы, 1% тритон Х - 100, 5 мл MgCl, 10 мл трис - HCl (pH 7,6), центрифугируют 20 минут при температуре 4°С на 4000 об/мин. Далее добавляют 4 мл ЭДТА - Soline, 400 мкл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют в течение 16 часов при 40°С.
На втором этапе из уже очищенного лизата производят экстракцию ДНК равными долями фенола, фенол-хлороформа, хлороформа и центрифугированием в течение 10 минут при 4000 об/мин. После центрифугирования водный слой удаляют и добавляют два объема охлажденного этанола 96%. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде, хранят при температуре -20°С и в дальнейшем используют для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Анализ генетического полиморфизма VEGF-A с.-958C>T осуществляют методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, USA) с использованием олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР фирмы «Синтол» (фиг. 1). Генотипирование осуществляют с использованием программного обеспечения «CFX Manager™».
Изобретение охарактеризовано на фигурах 1-3.
На фиг. 1 представлена дискриминация аллелей по локусу VEGF-A с. -958C>T (rs 833061), где - CС VEGF-A, - ТТ VEGF-A, - СТ VEGF-A, - отрицательный контроль.
p
k
На фиг. 2 представлена таблица 1 со значениями константы и дискриминантных коэффициентов для расчета дискриминантных показателей DиD.
На фиг. 3 в таблице 2 представлены статистические параметры признаков, включенных в уравнение ЛДФ.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития первичной открытоугольной глаукомы на основе генетических данных подтверждает анализ результатов наблюдений 252 человек (450 глаз) с ПОУГ и 191 человек (382 глаза) контрольной группы. Формирование выборок больных и контроля осуществлялись на базе офтальмологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа и медицинского центра микрохирургии глаза ООО «Ковчег».
Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. В группу больных включались пациенты с ранее установленным или впервые выявленным диагнозом ПОУГ, подтвержденным клиническими, инструментальными и лабораторными методами обследования. Диагноз глаукома устанавливался по основным диагностическим критериям: повышенное ВГД, наличие глаукоматозной экскавации ДЗН, характерные изменения ППЗ [Егоров E.А. Глаукома. Национальное руководство / Под ред. E.А. Егорова. - М.: ГЭОТАР-Медиа. - 2013. - 824 с.].
Группа контроля была сформирована из индивидуумов, не имеющих острых и хронических заболеваний глаз, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также они не имели тяжелых соматических патологий, в том числе приводящих к поражениям глаз. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0».
Прогнозирование риска развития ПОУГ осуществлялось с использованием дискриминантного анализа по уравнению ЛДФ следующего вида [Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - [3-е изд.]. - Москва: Медиа Сфера, 2006 с. - 305 с.]:
1
1
2
2
3
3
n
n
D=K+b·х+b·х+b·х+…+b·х,
i
i
где D - дискриминантный показатель, K - константа, х- предиктор или независимая переменная, b- дискриминантный коэффициент.
На первом этапе данного исследования методом дискриминантного анализа проведено изучение исследуемых групп - больных ПОУГ и группы контроля по различным признакам, характеризующим медико-биологический, офтальмологический статус пациентов и их генетические характеристики по исследуемому локусу VEGF-A с.-958C>T. Получены две дискриминантные функции
p
1
2
3
4
5
6
7
8
D=-110,685+1,175·x+0,383·x+0,892·x+5,434·x+2,742·x- 14,578·x- 0,391·x+8,193·x,
k
1
2
3
4
5
6
7
8
D=-94,672+1,089·x+0,308·x+0,953·x+3,483·x+0,243·x -11,515·x- 2,607·x+7,026·x,
1
2
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
7
7
7
8
8
8
где x - возраст (лет), x- систолическое артериальное давление (мм рт. ст.), x- диастолическое артериальное давление (мм рт. ст.), x- отягощенный семейный анамнез (нет- x=0; есть- x=1), x- наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (нет- x=0; есть- x=1), x- микрососудистые изменения в конъюнктиве (нет- x=0; есть- x=1), x- степень пигментации угла передней камеры (нет- x=0; I степень- x=1; II степень- x=2; III степень- x=3; IV степень- x=4), x - генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T (TT+CT- x=1; CC- x=2) (фиг. 2).
Полученные значения критериев Уилкса, F-критериев, вероятности Р и показателей толерантности представлены на фиг. 3 (р≤0,05, Т<0,10) [Дерябин В.E. Многомерные биометрические методы для антропологов / В.E. Дерябин. - М.: ВИНИТИ, 2001. - С. 105-265].
Таким образом, исследуемые нами группы по набору из 8 изученных признаков демонстрируют неслучайную межгрупповую вариацию.
Точность распознания индивидуумов, относящихся к группе больных ПОУГ, составляет 91,70%, а группы контроля - 91,06%. В среднем процент правильных дискриминаций в исследуемых группах составляет 91,43%.
Следовательно, с помощью полученных коэффициентов дискриминантной функции, на основе значений конкретных показателей у индивидуумов можно прогнозировать риск развития первичной открытоугольной глаукомы.
Примеры осуществления изобретения
1. У индивидуума А. определены следующие показатели: возраст - 71 год, уровень систолического артериального давления - 130 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 80 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - есть (1), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве - есть (1), III степень пигментации угла передней камеры (3), генетический вариант по локусу VEGF - CC (2).
После подстановки значений признаков в уравнения ЛДФ и вычисления их значений получены следующие результаты:
p
D=-110,685+1,175·71+0,383·130+0,892·80+5,434·1+2,742·1- 14,578·1- 0,391·3+8,193·2=-110,685+83,425+49,79+71,36+5,434+2,742 - 14,578-1,173+16,386=102,7,
k
D=-94,672+1,089·71+0,308·130+0,953·80+3,483·1+0,243·1 -11,515·1-2,607·3+7,026·2=-94,672+77,319+40,04+76,24+3,483+0,243-11,515 - 7,821+14,052=97,369.
p
k
Так как значение D больше значения D, индивидуум А был включен в группу риска. Дальнейшее наблюдение и детальное клинико-инструментальное обследование этого индивидуума выявило у него ПОУГ.
2. У индивидуума Б. определены следующие показатели: возраст - 85 лет, уровень систолического артериального давления - 150 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 100 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - нет (0), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве - есть (1), IV степень пигментации угла передней камеры (4), генетический вариант по локусу VEGF - ТТ (1).
p
D=-110,685+1,175·85+0,383·150+0,892·100+5,434·0+2,742·1 - 14,578·1- 0,391·4+8,193·1=-110,685+99,875+57,45+89,2+0+2,742 - 14,578-1,564+8,193=130,6,
k
D=-94,672+1,089·85+0,308·150+0,953·100+3,483·0+0,243·1 -11,515·1-2,607·4+7,026·1=-94,672+92,56+46,2+95,3+0+0,243-11,515 - 10,43+7,026=124,7.
p
k,
Значение D больше значения Dследовательно, данного индивидуума можно включить в группу риска развития ПОУГ, что подтвердилось при комплексном офтальмологическом обследовании данного пациента.
3. Для индивидуума В. были определены следующие показатели: возраст - 66 лет, уровень систолического артериального давления - 140 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 90 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - нет (0), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - нет (0), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - нет (0), II степень пигментации угла передней камеры - (2), генетический вариант по локусу VEGF - CT (1).
Подставляя значения признаков в уравнения ЛДФ, при расчетах мы выявили максимальное значение D для группы контроля, что дает возможность отнести пациента В. в контрольную группу:
p
D=-110,685+1,175·66+0,383·140+0,892·90+5,434·0+2,742·0- 14,578·0- 0,391·2+8,193·1=-110,685+77,55+53,62+80,28-0,782+8,193=108,1,
k
D=-94,672+1,089·66+0,308·140+0,953·90+3,483·0+0,243·0 - 11,515·0 -2,607·2+7,026·1=-94,672+71,87+85,77+76,24 - 5,214+7,026=141,0.
k
p
Значение D больше значения D, следовательно, данного индивидуума можно было не включать в группу риска развития ПОУГ, что подтвердилось при комплексном офтальмологическом обследовании данного пациента.
4. Для индивидуума Г. были определены следующие показатели: возраст - 50 лет, уровень систолического артериального давления - 120 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 80 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - есть (1), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - нет (0), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - нет (0), I степень пигментации угла передней камеры - (1), генетический вариант по локусу VEGF - СС (2).
p
D=-110,685+1,175·50+0,383·120+0,892·80+5,434·1+2,742·0- 14,578·0- 0,391·1+8,193·=-110,685+58,75+45,96+71,36+5,434+0 - 0-0,391+16,386=86,81,
k
D=-94,672+1,089·50+0,308·120+0,953·80+3,483·1+0,243·0 -11,515·0-2,607·1+7,026·2=-94,672+54,45+36,96+76,24+3,483+0-0 - 2,607+14,052=87,91.
k
p
Значение D больше значения D, следовательно, данного индивидуума несмотря на наличие глаукомы у близких родственников, можно было не включать в группу риска развития ПОУГ, что подтвердилось при комплексном офтальмологическом обследовании данного пациента.
5. Для индивидуума Д. были определены следующие показатели: возраст - 57 лет, уровень систолического артериального давления - 130 мм рт. ст., уровень диастолического артериального давления - 90 мм рт. ст., отягощенный семейный анамнез - есть (0), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз - нет (0), микрососудистые нарушения в переднем отрезке глаз - нет (0), 0 степень пигментации угла передней камеры - (0), генетический вариант по локусу VEGF - СС (2).
p
D=-110,685+1,175·57+0,383·130+0,892·90+5,434·0+2,742·0- 14,578·0- 0,391·0+8,193·2=-110,685+66,97+49,79+80,28+0+0 - 0 - 0+16,386=102,74,
k
D=-94,672+1,089·57+0,308·130+0,953·90+3,483·0+0,243·0 -11,515·0-2,607·0+7,026·2=-94,672+62,07+40,04+85,77+0+0 - 0 - 0+14,052=107,26.
k
p
Так как значение D больше значения D, индивидуум Д не был включен в группу риска.
Предложенный способ прогнозирования развития ПОУГ позволит формировать группы риска по данному заболеванию, что будет способствовать более эффективному осуществлению лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению развития ПОУГ и ее ранней диагностики.