Регенерация головного ганглия в отсеченных хвостовых фрагментах планарий

Литература: 1. Богоявленский Ю.К. Сравнительно-гистологическое

исследование соматической мускулатуры некоторых нематод подотряда Filariata. Матер. научн. конф. Всесоюзн. об-ва гельминтологов. М., 1965. - С. 17.

Morphological characteristics of Dirofilaria immitis and D. repens.

Kravchenko V.M., Itin G.S. Kuban State Agrarian University.

Summary. D. immitis and D. repens were recovered in 7 species of carnivores (domestic dog, domestic cat, common fox, jackal, badger, raccoon dog, wild cat). Particularly D. immitis was found in dog, cat, raccoon dog, wild cat as while D. repens - in dog, badger and jackal. Both Dirofilaria species were recovered in dog and jackal. Mature Dirofilaria in different animal species had differences in linear size. Morphological variations were not found.

РЕГЕНЕРАЦИЯ ГОЛОВНОГО ГАНГЛИЯ В ОТСЕЧЕННЫХ ХВОСТОВЫХ ФРАГМЕНТАХ ПЛАНАРИЙ

Крещенко Н.Д.

ФБУ Институт биофизики клетки РАН

Введение. Плоские черви занимают стратегически важное положение в эволюции, они являются одними из самых простых организмов с билатеральной симметрией, у которых появляется третий зародышевый листок - мезодерма, и происходит концентрация нервных элементов и формирование централизованной нервной системы. Планарии, являясь высшим звеном экологической цепи (хищниками), осуществляют в природе стратегию и тактику поиска пищи, проявляя разнообразие поведенческих реакций. Нервная система у разных представителей плоских червей играет важную роль в реализации жизненно важных функций организма, включая питание, движение, репродукцию, миграцию, прикрепление к органам хозяина. В нервной системе планарий обнаружены нейроны, синтезирующие основные медиаторы - серотонин (5-HT), ацетилхолин, дофамин, гистамин, ГАМК, а также нейропептиды: соматостатин, морфоген гидры, вещество P, ЯТамид, FMRF, GYIRF, NPF, EGRF (3). Кроме всего прочего, планарии характеризуются способностью полностью регенерировать нервную систему благодаря наличию в их теле стволовых клеток - необластов (2). Сведения о дифференцировке нервных элементов в ходе эмбрионального развития или регенерации у плоских червей немногочисленны и представляют несомненный интерес. В настоящей работе изучали регенерацию головного нервного ганглия в отсеченных хвостовых фрагментах планарий.

200

Материалы и методы. Планарий Girardia tigrina (Turbellaria, Dugasiidae), бесполой лабораторной расы содержали в аквариумах при 20±1°С, кормили личинками хирономид раз в неделю. Перед опытом животных держали голодными. Регенерацию вызывали отсечением хвостового фрагмента тела, около 1/4 длины тела интактных животных. Исследование проводили параллельно на двух группах особей, ткани которых окрашивали антителами к (1) серотонину, или (2) к нейропептиду FMRFамиду. Для приготовления тотальных препаратов особей фиксировали на 1, 2, 3, 5 и 7-е сутки регенерации 4%-ным параформальдегидом в 0.1 М PBS 4 ч при комнатной температуре. Переносили в раствор (1:1000) первичных антител на 48 ч (4°С), промывали в PBS и помещали во вторичные антитела (FITC-меченные иммуноглобулины, 1:30) на 48 ч (4С). После промывки в течение 24 ч образцы окрашивали TRITC-меченым фаллоидином (1:100, 12 ч), для визуализации мускулатуры тела. Препараты размещали на стекле под каплей 90 % глицерина, накрывали покровным стеклом и анализировали с помощью флуоресцентного и конфокального лазерного сканирующего микроскопов.

Результаты. Интенсивная иммуноокраска к FMRFамиду присутствовала у планарий G. tigrina в старых тканях отсеченного фрагмента - в клетках и волокнах центральной нервной системы (цнс): в паре брюшных нервных стволов и многочисленных поперечных комиссурах, соединяющих оба нервных ствола на регулярном расстоянии и образующих в хвостовом конце тела кольцевое утолщение. В периферической нервной системе, представленной двумя нервными сетями (субмышечной и субэпителиальной), FMRF-иммунопозитивная(ип) окраска была выявлена в многочисленных нервных волокнах, а также в телах нейронов (12-14цш, иногда до 17цш), в большинстве своем мультиполярных, с 6-8 отростками, простирающимися в разных направлениях. Тонкие FMRF-ип волокна пронизывали ткани планарий и в дорзо-вентральном направлении. На 1-е сутки после отсечения в хвостовом фрагменте раневая поверхность покрывалась тонким слоем эпителия, под которым из поделившихся стволовых клеток начинала формироваться головная регенерационная бластема. На протяжении эксперимента размер бластемы существенно увеличивался. К 2-ым суткам после операции иммуноокраска к FMRF усиливалась в отсеченных концах нервных стволов и периферических волокнах, которые утолщались. По переднему краю фрагмента наблюдали образование тонкой нервной дуги, формируемой нервными волокнами периферического плексуса,

происходящими из старых тканей фрагмента. Эти волокна смыкались в апикальной части бластемы и, по нашему мнению, служили своеобразной разметкой ее переднего края. На 1-2-е сутки регенерации были заметны FMRF-ип волокна, прорастающие из остатков старых нервных стволов в бластему. К 3-м суткам регенерации FMRF-ип волокон становилось больше, и они смыкались, образуя остов нового головного ганглия. Между обрезанными концами нервных стволов на границе бластемы и старой ткани к 3-м суткам была заметна формирующаяся комиссура, которая утолщалась, и соединяла

201

отсеченные концы нервных стволов в поперечном направлении. На 5-е сутки регенерирующий головной ганглий, приобретал форму дуги (или подковы), как у интактных планарий, утолщался, волокон в нем становится заметно больше, к этому времени иммуноокраска к FMRFамиду из пунктирной становилась сплошной. Тела новых FMRF-ип нейронов становились хорошо заметными. Таким образом, к 5-м суткам регенерации остов нового головного ганглия был сформирован.

Иммуноокраска к серотонину (5-HT) присутствовала в тканях отсеченного фрагмента: в клетках и волокнах, составляющих центральную и периферическую нервную системы - в брюшных нервных стволах и комиссурах, в тонких волокнах нервного плексуса. Размеры тел 5-НТ-ип уни-, би- и мультиполярных нейронов составляли от 14 до 28цш. У хвостовых фрагментов на вторые сутки в регенерационной бластеме появлялись слабо окрашенные мелкие 5-НТ-ип клетки. К 3-м суткам число 5-НТ-ип клеток увеличивалось, их нервные отростки простирались по направлению старых нервных стволов и соединялись с ними, образуя паттерн церебрального ганглия. К 5-м суткам число 5-НТ-ип клеток в регенерирующем головном ганглии визуально приближалось к их числу у интактных планарий, однако размеры тел нейронов оставались меньшими, и окраска их была более слабо выраженной, чем в старых тканях фрагмента. Большинство 5-НТ-ип нейронов располагались по внутренней дуге формирующегося головного ганглия, образованной волокнами 5-НТ-ип FMRF-ип нейронов. С 5 по 7-е сутки наблюдения продолжалось добавление нервных волокон в церебральную комиссуру, а также усиление иммуноокраски к серотонину в телах нейронов, отражающее, вероятно увеличивающуюся его продукцию в ходе созревания нейронов. На 4-6-е сутки после отсечения у регенерирующих хвостовых фрагментов появлялись фоторецепторы - пара просто устроенных глаз. На 7-е сутки регенерации новый ганглий по структуре соответствовал таковому у интактных животных, уступая лишь размером.

Обсуждение. Топографически серотонин и нейропептиды семейства FMRF-подобных пептидов выявлены в нервной системе ряда паразитических и свободноживущих плоских червей (1, 5, 6). Наши наблюдения показали, что у планарий: 1) серотонинергические элементы, как и пептидергические, присутствуют в центральных и в периферических отделах нервной системы и следуют одному и тому же паттерну; 2) серотонинергические нейроны крупнее пептидергических, и расположены в цнс по бокам от нервных стволов и дуги головного ганглия; 4) волокна FMRF-ергических нейронов, многочисленнее, толще по сравнению с серотонинергическими, особенно в периферических отделах нервной системы; 5) иммуноокраска тканей к FMRFамиду более интенсивная, по сравнению с окраской к серотонину.

Полученные нами сведения о динамике дифференцировки 5-НТ-ергических и FMRF-ергических нервных клеток согласуются в целом с восстановительными событиями, происходящими в отделившихся хвостовых зооидах Dugesia tigrina в ходе бесполого размножения (4). Использование

202

тотальных препаратов, а не замороженных срезов, позволило нам обнаружить больше пространственно-временных деталей регенерационного процесса. Установлено, что в ходе регенерации нервной системы у планарий происходит постепенное ее усложнение, как в плане появления большего числа клеток и волокон, так и увеличение размеров самих тел нейронов, а также усиления иммуноокраски, соответствующее увеличению экспрессии специфических нейрональных веществ (серотонина, нейропептидов). Серотонинергические элементы нервной системы дифференцируются независимо от пептидергических элементов в ходе регенерации, а также на ранних этапах эмбрионального развития у плоских червей (6).

Выражаю благодарность Яшину В.А. за техническую поддержку при работе на сканирующем микроскопе. Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-00243а и 12-04-01086-а.

Литература: 1. Теренина Н.Б. и др.,// Росс. паразитол. ж. - 2011. - № 2. -C. 93-98. 2. Ermakov A.M. и др.,//Мо1.Бю1.Кер. - 2011. - DOI 10.1007/s11033-011-1070-1. 3. Reuter M., Kreshchenko N.//Can.J.Zool. - 2004. - V. 82. - P. 334356. 4. Reuter M. et al.,//Invert.Rep.Dev. - 1996. - V.3. - N. 3. - P. 199-211. 5. Tolstenkov O.O. et al. //Acta Parasitol. - 2010. - V. 55. - P. 123-132. 6. Tolstenkov O.O. et al.//Parasitol.Res. - 2011. DOI 10.1007/s00436-011-2526-x.

Cephalic ganglion regeneration in dissected tail fragments of planarian.

Kreshchenko N.D. Institute of Cell Biophysics of RAS.

Summary. The investigation of the nervous system in flatworms was carried out using immunocytochemical technique and confocal laser scanning microscopy. The dynamics of differentiation of peptidergic (FMRF) and serotoninergic (5-HT) nervous elements in dissected tail fragments of Girardia tigrina was described. The gradual development of the nervous system complexity was revealed during regeneration. The formation of the new cephalic ganglion has been completed to the day 7 of regeneration. The independent formation of the 5-HT and FMRF-immunopositive nervous elements was suggested.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТГЕЛЬМИНТИКОВ ПРИ МИКСТИНВАЗИИ У СОБАК

Крючкова Е.Н.

Ивановская государственная сельскохозяйственная академия

Введение. Для профилактики и лечения отдельных гельминтозов собак отечественными и зарубежными учеными предложен широкий спектр препаратов из разных химических групп [1-4, 6,10,11]. Однако у плотоядных

203