Фенотипическая и генетическая характеристика желатиназной активности у клинически значимых

ment of the postoperative period. A Letter of the MH RF of May 6. - 2014. - № 15-4/10/2-3190.

5. Shifman E.M., Kulikov A.V, Krugova L.V, Var-tanov VYa., Marshalov D.V. Safety of uterotonics: what should an anesthesiologist know about them? // Anesthesiology and Reanimatology. - 2017. - Vol. 62(3). -P. 220-224.

6. Gallos I.D., Williams H.M., Price M.J., Merriel A., Gee H., Lissauer D., Moorthy V., Tobias A., Deeks J.J., Widmer M., Tungalp O., Gulmezoglu A.M., Hofmeyr G.J., Coomarasamy A. Uterotonic agents for preventing post-partum haemorrhage: anetworkmeta-analysis // Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2018. - Issue 4. Art. No.:CD011689. D0I:10.1002/14651858.CD011689.pub2.

7. Gizzo S., Patrelli T.S., DiGangi S., Carrozzini M., Saccardi C., Zambon A., Bertocco A., Fagherazzi S., D'Antona D., Nardelli G.B. Which Uterotonic Is Better-to Prevent the Postpartum Hemorrhage? Latest News in Terms of Clinical Efficacy, Side Effects, and Contraindications // Reprod Sci. - 2013. - № 20 (9). - P. 1011-1019.

8. Jonsson M., Hanson U., Lidell C. ST depression at ceaesarean section and the relation to oxytocin dose. A randomised controlled trial // Br. J. Obstet. Gynaecol. -2010. - № 117. - № 76-83.

9. Kovacheva VP., Soens M.A., Tsen L.C. A randomized, double-blinded trial of a «rule of threes» algoritm

versus continuous infusion of oxytocin during elective ce-sarean delivery // Anesth. - 2015. - № 123. - № 92-100.

10. Martinez-Quintana E., Rodriguez-Gonzilez F. Pregnancy and coronary artery dissection // Clin. Invest. Arterioscler. - 2015. - № 27 (4). - P. 215-219.

11. Pinder A.J., Dresner M., Calow C., Shorten G.D., O Riordan J., Johnson R. Haemodynamic changes caused by oxytocin during caesarean section under spinal anaesthesia // Int. J. Obstet. Anaesth. - 2002. - № 11. -P. 156-9.

12. Snegovskikh D., Clebone A., Norwitz E. Anesthetic management of patients with placenta accreta and resuscitations trategies for associated massive hemorrhage // Curr Opin Anaesthesiol. - 2011. - № 24. - P. 274-281.

13. Thomas J.S., Koh S.H., Copper G.M. Haemody-namic effects of oxytocin given as i.v. bolus or infusion on women undergoing Caesarean section // Br. J. Anaesth. -2007. - № 98. - P. 116-119.

14. Vallera C., Choi L.O., Cha C.M., Hong R.W. Uterotonic Medications Oxytocin, Methylergonovine, Carboprost, Misoprostol //Anesthesiology Clin. - 2017. -№ 35. - P. 207-219.

15. Vercauteren M., Palit S., Soetens F., Jacquemun Y., Alahuhta S. Anaesthesiological considerations on toco-lytic and uterotonic therapy in obstetrics // Actaanaesth. Scand. - 2009. - № 53. - P. 701-709.

Координаты для связи с авторами: Дегтярев Евгений Николаевич - врач отделения анестезиологии и реанимации акушерского стационара Амурского областного перинатального центра, аспирант кафедры акушерства и гинекологии ФПДО АмГМА, тел. +7-924-675-10-15, e-mail: dormicumtrade@gmail.com; Шифман Ефим Муневич - д-р мед. наук, президент Ассоциации акушерских анестезиологов-реаниматологов, профессор кафедры анестезиологии и реаниматологии ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, заслуженный врач Республики Карелия, эксперт по анестезиологии и реаниматологии Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения, член Президиума ФАР, член редколлегии журнала «Анестезиология и реаниматология»; Жуковец Ирина Валентиновна - д-р мед. наук, зав. кафедрой акушерства и гинекологии ФПДО АмГМА; Ходус Сергей Васильевич - канд. мед. наук, зав. кафедрой анестезиологии, реанимации, интенсивной терапии и скорой медицинской помощи АмГМА.

УДК 579.61

Т.С. Коменкова1, Е.А. Зайцева1, Н.В. Стрельникова2,3

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЖЕЛАТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ

ENTEROCOCCUS FAECALIS, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИИ

'Тихоокеанский государственный медицинский университет, 690002, пр-т Острякова, 2, тел. 8-(423)-245-17-06, e-mail: vgmu.nauka@ mail.ru, г. Владивосток; 2Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-76-13-96, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru; 3Краевая клиническая больница № 1 им. проф. С.И. Сергеева, 680009, ул. Краснодарская, 9, тел. 8-(4212)-39-04-05, e-mail: kkb1@dvmc.khv.ru, г. Хабаровск

Резюме

В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus. Известно, что тяжесть системных заболеваний обуславливает наличие гена gelE, кодирующий синтез желатиназы. Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны.

В работе проанализированы фенотипические особенности и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинических изолятов Enterococcus faecalis, выделенных в дальневосточном регионе России. Отмечена фенотипическая и генетическая вариабельность желатиназной активности среди клинически значимых E. faecalis. Ген gelE, детектировался у 74,5±6,1 % E. faecalis, выделенных в Приморском и Хабаровском краях. Однако in vitro разжижение желатины наблюдалось только у 30,2±7,1 % изучаемых энтерококков. Выявлено большое количество E. faecalis с «молчащим» геном gelE, что требует дальнейшего изучения. Ключевые слова: Enterococcus faecalis, gelE, желатиназная активность.

T.S. Komenkova1, E.A. Zaitseva1, N.V. Strelnikova2

PHENOTYPIC AND GENETIC CHARACTERISTICS OF GELATINASE ACTIVITY IN CLINICALLY RELEVANT ENTEROCOCCUS FAECALIS IN THE FAR EAST OF RUSSIA

'Pacific state medical university, Vladivostok;

2Far Eastern state medical university;

Regional clinical hospital № ' of KhabarovskRegion Health Ministry, Khabarovsk

Summary

The etiological role of the genus Enterococcus has increased in the last decade. It is known that the severity of systemic diseases is associated with gelatinase activity encoded by gelE gene. It has been revealed that gelatinase-producing E. faecalis are more virulent.

In the present study the phenotypic features and genetic diversity of gelatinase activity of E. faecalis clinical isolates in the Far East of Russia were analyzed. It has been described that clinically relevant E. faecalis have phenotypic and genetic variability of gelatinase activity. Presence of gelE gene was detected in 74,5±6,1 % of E. faecalis. However, in vitro liquefaction of gelatin was observed only in 30,2±7,1 % of studied enterococci.

A large number of E. faecalis with a «silent» gelE gene has been identified. It requires further study.

Key words: Enterococcus faecalis, gelE, gelatinase activity.

В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus [10, 13]. Колонизиру-ясь на слизистых оболочках полости рта, кишечника, коже, периуретральной области, обладая особой троп-ностью к почечной ткани, они могут вызывать эндокардит, инфекции кожи и мягких тканей, мочеполовой системы, остеомиелит, катетер-ассоциированные инфекции и др. [5, 6, 11, 12, 13].

В настоящее время идентифицированы разнообразные факторы вирулентности энтерококков, наиболее важными из которых являются гемолизин (Cyl), жела-тиназа (GelE), энтерококковый поверхностный белок (Esp), субстанция агрегации (As), адгезин коллагена (Ace), сериновая протеаза (SprE) и т. д. [1, 5, 7, 8, 13].

Материалы

В работе исследованы Е. faecalis (n=51), изолированные из клинического материала - мочи (n=40), цервикального канала (n=2), уретры (n=1), секрета простаты (n=2), мокроты (n=2), бронхоальвеолярного лаважа (n=1), хирургической раны (n=3) - пациентов в Приморском и Хабаровском краях. В качестве рефе-ренс-штамма использовали E. faecalis NCTC 12697.

Биологические свойства энтерококков изучали классическим бактериологическим методом. Жела-тиназную активность определяли с использованием коммерческого набора Микро-ЖЕЛАТИНАЗА-НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия), ферментацию молока - на среде Эйкмана.

Бактериальную ДНК энтерококков выделяли кипячением (Т. Маниатис, 1984). Детекцию гена gelE у E. faecalis проводили с помощью полиме-разной цепной реакции (ПЦР), применяя систему праймеров - 5'ACCCCGTATCATTGGTTT3' и 5'ACGCATTGCTTTTCCATC3' (размер продукта 419 п.н.) (Soares R.O., et al., 2014), синтезированную компанией «Евроген» (Россия). Реакционная смесь

Желатиназа (цинк-зависимая металлопротеиназа), опосредуемая геном gelE, ответственна за гидролиз гемоглобина, желатина, коллагена и других белков [1]. Известно, что экспрессия гена gelE обусловливает тяжесть системных заболеваний, способствует образованию биопленок и очищает поверхность клеток от мутантных белков [1, 5, 11, 13]. Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны [5]. В тоже время роль гена gelE E.faecalis до конца не выяснена.

Цель исследования - оценить фенотипическое и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинически значимых E. faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России.

и методы

(20 мкл) включала 10х Taq buffer (2 мкл), 25 mM MgCl2 (1,6 мкл), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (0,8 мкл), специфические праймеры (по 0,4 мкл), Tag DNA - полимеразу (0,8 мкл) (Евроген, Россия), бактериальный лизат (1 мкл).

ПЦР проводили на амплификаторе TProfessional 96 (Biometra, Германия) по протоколу: 1 цикл - 94 °С, 5 мин.; далее 30 циклов в режимах 94 °С - 45 с; 56°С - 1 мин.; 72 °С - 1 мин.; финальное удлинение 72 °С - 3 мин.

Продукты амплификации анализировали в 1 % ага-розном геле, содержащим 1 мкг/мл бромистого этидия, в ультрафиолетовом свете с помощью Bio Doc Analyze (Biometra, Германия).

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 10. Средние значения в группах сравнивали при помощи од-нофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и t-критерия Стьюдента. Корелляционый анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты

В исследованиях проведенными нами ранее были изучены фенотипические проявления биологических свойств фекальных энтерококков, выделенных из клинического материала, оценены особенности про-теолитической активности Е. faecalis [3]. Установлено, что более половины исследуемых энтерококков (53,5±7,6 %) показали in vitro протеолитическую активность. При этом ферментировали и молоко и желатину 30,2±7,1 % исследуемых культур, только молоко - 23,3±6,4 % Е. faecalis. Энтерококков, обладающих только желатиназной активностью, в исследуемой коллекции не было.

В связи с выявленной фенотипической неоднородностью протеолитической активности Е. faecalis мы обратились к молекулярно-генетическим методам исследования. С помощью ПЦР был проведен анализ энтерококков на наличие гена gelE, кодирующего синтез желатиназы.

Ген gelE, детектировался у 74,5±6,1 % E. faecalis, выделенных в Приморском и Хабаровском краях (таблица). Однако in vitro разжижение желатины наблюдалось только у трети изучаемых культур (рисунок). Такое не соответствие фенотипического проявления желатиназной активности с наличием гена gelE у энтерококков также отмечалось в других независимых исследованиях [2, 4, 7, 8, 9, 11]. Например, в работах Saffari F. (2017) и Strzelecki Y. (2011) ген gelE выявлялся у 72 % и 91 % энтерококков, тогда как желати-назная активность обнаружена только у 34 % и 53 % культур соответственно [7, 11]. В исследовании Sem-edo T. (2003) при оценке энтерококков, выделенных из клинического материала и пищевых продуктов, ген gelE был «молчащим» у большинства исследованных штаммов, однако желатиназная активность регистрировалась преимущественно у клинических изолятов [8]. Многие ученые связывают такие особенности с отсутствием экспрессии гена и/или мутацией в gelE или в регуляторных генахfsrA, fsrB, fsrD, fsrC, активирующих синтез желатиназы [7, 11].

Методом корреляционного анализа была выявлена достоверная положительная связь между наличием гена gelE и желатиназной активностью у исследован-

Выводы

1. Более половины (52,8±8,3 %) E. faecalis, выделенных из клинического материала на Дальнем Востоке России, обладают протеолитической активностью, при этом in vitro разжижение желатины встречалось у 30,2±7,1 % исследованных энтерококков.

и обсуждение

ных энтерококков, выделенных в дальневосточном регионе России (rp=0,40; p=0,01). В тоже время в литературе есть сведения об отсутствии прямой зависимости между этими признаками [1]. Тем не менее, установленная в данной работе связь показывает необходимость определять желатиназную активность in vitro для оценки клинической значимости штаммов энтерококков, и согласуется с исследованиями Мироненко Л.Г. и соавт. (2013) [4]. Полученные нами результаты открывают перспективу дальнейших исследований в этом направлении.

Рис. Наличие гена gelE и желатиназной активности у Е. faecalis

Примечание. М - маркер молекулярного веса (GeneRuler 1kb DNA Ladder, Thermo Scientific, США); 1-21 - клинические штаммы Е. faecalis, 5 — Е. faecium, к - отрицательный контроль.

Таблица

Наличие протеолитической активности и гена gelE

у культур энтерококков, выделенных в Приморском и Хабаровском краях

Место выделения культуры Кол-во исследованных культур Ферментация Кол-во исследованных культур Наличие гена gelE

желатины молока

абс.

Приморский край 36 9

Хабаровский край 7 4 4 7 6

13 23 38

Всего 43 51

2. Отмечена фенотипическая и генетическая вариабельность желатиназной активности среди клинически значимых Е. /авааНз, выделенных в Дальневосточном регионе России.

3. Выявлено большое количество (30,2±7,1 %) Е. /авааИз с «молчащим» геном gвlE.

Лите

1. Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков: монография // Екатеринбург: УрО РАН, 2012. - 227 с.

2. Валышева И.В., Потехина Л.П., Пошви-на Д.В., Щепитова Н.Е., Сычева М.В. Характеристика желатиназной активности энтерококков на фенотипическом и генетическом уровне // Материалы 2-й научно-практической школы-семинара. Тольяттинский государственный университет. - То-

гтура

льятти: Издательство: SIMJET (Ульяновск), 2012. -С. 197-202.

3. Зайцева Е.А., Крукович Е.В., Мельникова Е.А., Лучанинова В.Н., Коменкова Т.С., Вайсеро Н.С. Роль факторов патогенности ЕЫвгоаоаат /авааИз в развитии пиелонефрита у детей // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2017. - № 2. - С. 58-61.

4. Мироненко Л.Г, Перетятько Е.Г. Изучение же-латиназной активности на генетическом и фенотипи-

ческом уровне у Enterococcus, выделенных из разных экотопов // Вюник проблем бюлогл i медицини. -2013. - Т. 1, № 4. - С. 239-242.

5. Gilmore M.S., Clewell D.B., Yasuyoshi I., Shan-kar N. Enterococci from commensals to leading causes of drug resistant infection // Massachusetts eye and ear infirmary Boston. - 2014. - 668 р.

6. Kafil H.S., Mobarez A.M. Assessment of biofilm formation by enterococci isolates from urinary tract infections with different virulence profiles // Journal of King Saud University - Science. - 2015. - 6 р.

7. Saffari F., Dalfardi M.S., Mansouri S., Ahmadra-jabi R. Survey for Correlation between Biofilm Formation and Virulence Determinants in a Collection of Pathogenic and Fecal Enterococcus faecalis Isolates // Infect Che-mother. - 2017. - Vol. 49, № 3. - Р. 176-183.

8. Semedo T., Santos M.A., Lopes M.F., Figueire-do M.J., Barreto C.M.T., Tenreiro R. Virulence factors in food, clinical and reference Enterococci: A common trait in the genus? // Syst Appl Microbiol. - 2003. - Vol. 26, № 1. - Р. 13-22.

9. Simonova P.M., Laukova A. Virulence factors genes possessing Enterococcus faecalis strains from

rabbits and their sensitivity to enterocins // Worid Rabbit Science. - 2017. - № 25. - P. 63-71.

10. Soares R.O., Fedi A.C., Reiter K.C., Caierao J., d'Azevedo P.A. Correlation between biofilm formation and gelE, esp, and agg genes in Enterococcus spp. clinical isolates // Virulence. - 2014. - Vol. 5, № 5. -P. 634-637.

11. Strzelecki Y., Hryniewicz W., Sadowy E. Gela-tinase-Associated Phenotypes and Genotypes Among Clinical Isolates of Enterococcus faecalis in Poland // Polish Journal of Microbiology. - 2011. - Vol. 60, № 4. -P. 287-292.

12. Toru M., Beyene G., Kassa T., Gizachew Z., Howe R., Yeshitila B. Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus species isolated from clinical samples of pediatric patients in Jimma University pecial-ized Hospital, south west Ethiopia // BMC Res Notes. -2018. - Vol. 11, № 281. - 6 p.

13. Upadhyaya G.P.M., Ravikumar K.L., Umapa-thy B.L. Review of virulence factors of enterococcus: An emerging nosocomial pathogen // Indian J Med Microbi-ol. - 2009. - Vol. 27. - P. 301-305.

Literature

1. Bukharin O.V, Valyshev A.V Biology and ecology of enterococci: monograph. - Yekaterinburg: UrB RAS, 2012. - 227 p.

2. Valysheva I.V, Potekhina L.P., Poshvina D.V, Shchepitova N.E., Sychova M.V. Characteristics of gelatinase activity of enterococci at the phenotypic and genetic level // Proceedings of the 2-nd cientific and Practical School-Seminar. Togliatti State University. - Togliatti: PH «SIMJET» (Ulyanovsk), 2012. - P. 197-202.

3. Zaytseva E.A, Krukovich E.V, Melnikova E.A., Luchaninova V.N., Komenkova T.S., Vaysero N.S. The role of pathogenicity factors of Enterococcus faecalis in the development of pyelonephritis in children // Pacific Medical Journal. - 2017. - № 2. - P. 58-61.

4. Mironenko L.G, Peretyatko E.G. The study of gelatinase activity at the genetic and phenotypic level in En-terococcus isolated from different ecotopes // Journal of Medical and Biological Problems. - 2013. - Vol. 1, № 4. -P. 239-242.

5. Gilmore M.S., Clewell D.B., Yasuyoshi I., Shan-kar N. Enterococci from commensals to leading causes of drug resistant infection // Massachusetts eye and ear infirmary Boston. - 2014. - 668 p.

6. Kafil H.S., Mobarez A.M. Assessment of biofilm formation by enterococci isolates from urinary tract infections with different virulence profiles // Journal of King Saud University - Science. - 2015. - 6 p.

7. Saffari F., Dalfardi M.S., Mansouri S., Ahmadra-jabi R. Survey for Correlation between Biofilm Formation and Virulence Determinants in a Collection of Pathogenic

and Fecal Enterococcus faecalis Isolates // Infect Che-mother. - 2017. - Vol. 49, № 3. - P. 176-183.

8. Semedo T., Santos M.A., Lopes M.F., Figueire-do M.J., Barreto C.M.T., Tenreiro R. Virulence factors in food, clinical and reference Enterococci: A common trait in the genus? // Syst Appl Microbiol. - 2003. - Vol. 26, № 1. - P. 13-22.

9. Simonova P.M., Laukova A. Virulence factors genes possessing Enterococcus faecalis strains from rabbits and their sensitivity to enterocins // Worid Rabbit Science. - 2017. - № 25. - P. 63-71.

10. Soares R.O., Fedi A.C., Reiter K.C., Caierao J., d'Azevedo P.A. Correlation between biofilm formation and gelE, esp, and agg genes in Enterococcus spp. clinical isolates // Virulence. - 2014. - Vol. 5, № 5. - P. 634-637.

11. Strzelecki Y., Hryniewicz W., Sadowy E. Gela-tinase-Associated Phenotypes and Genotypes Among Clinical Isolates of Enterococcus faecalis in Poland // Polish Journal of Microbiology. - 2011. - Vol. 60, № 4. -P. 287-292.

12. Toru M., Beyene G., Kassa T., Gizachew Z., Howe R., Yeshitila B. Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus species isolated from clinical samples of pediatric patients in Jimma University pecial-ized Hospital, south west Ethiopia // BMC Res Notes. -2018. - Vol. 11, № 281. - 6 p.

13. Upadhyaya G.P.M., Ravikumar K.L., Umapa-thy B.L. Review of virulence factors of enterococcus: An emerging nosocomial pathogen // Indian J Med Microbi-ol. - 2009. - Vol. 27. - P. 301-305.

Координаты для связи с авторами: Коменкова Татьяна Сергеевна - аспирант ФГБОУ ВО «Тихоокеанского государственного медицинского университета» Минздрава России, тел. +7-914-661-98-01, е-mail: atstl@mail.ru; Зайцева Елена Александровна - д-р мед. наук, доцент, ведущий научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Тихоокеанского государственного медицинского университета» Минздрава России, тел. +7-902-524-57-20, е-mail: elza200707@mail.ru; Стрельникова Наталья Викторовна - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет», зав. бактериологической лабораторией КГБУЗ «ККБ № 1», врач высшей квалификационной категории по специальности «Бактериология», тел.+7-924-925-89-85, e-mail: jpdom@mail.ru.