НУТРИТИВНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ФУНКЦИИ МОЗГА ПРИ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ
NUTRITIONAL COMPOSITION FOR IMPROVING CEREBRAL FUNCTION IN PHENYLKETONURIA

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Фенилкетонурия (ФКУ) является самой распространенной врожденной аминоацидопатией, вызванной дефицитом фенилаланингидроксилазы, в результате чего происходит накопление фенилаланина (Phe) и превращение в фенилпируват, также известный, как фенилкетон. Это накопление также происходит в мозге.
Генетические мутации, характерные для Фенилкетонурии (ФКУ) нарушают нормальное функционирование фермента фенилаланингидроксилазы (PAH), который в норме превращает фенилаланин (Phe) в тирозин (Tyr). Мутация вызывает накопление Phe в крови и мозге до токсических уровней. Дополнительно, поскольку Tyr является предшественником для нейротрансмиттеров допамина и норадреналина, то снижение синтеза Tyr препятствует биосинтезу этих катехоламинов. Одновременно Phe конкурирует с Tyr и триптофаном (Trp, предшественник серотонина) в транспортерах аминокислот через гематоэнцефалический барьер (BBB) и, как следствие, высокие концентрации Phe в крови также приводят к пониженному поступлению в мозг Tyr и Trp, дополнительно влияя на их доступность для нейротрансмиттеров и биосинтез белка в нейронах.
Аналогично, мутации в коферменте тетрагидробиоптерине (дефицит тетрагидробиоптерина) нарушает нормальное превращение Phe в Tyr, что в результате приводит к накоплению Phe или гиперфенилаланинемии. Доступность допамина и серотонина очень важна, поскольку эти нейротрансмиттеры участвуют в различных функциях, в частности в префронтальной коре, которая является основным участком высших когнитивных функций. Хотя у пациентов с ФКУ на диете концентрации Phe в плазме контролируются на рекомендованном уровне, предполагается нарушенный метаболизм обоих, и допамина и серотонина, поскольку измерения цереброспинальной жидкости показали пониженные уровни метаболитов этих нейротрансмиттеров. Одновременно, исследования, включающие рано и непрерывно леченных детей с ФКУ, показали недостаток исполнительного функционирования, включая стратегическое мышление, скорость мышления, решение проблем, невербальный интеллект, кратковременную память и гибкость внимания.
В заключение, ФКУ нарушает развитие мозга и вызывает прогрессирование задержки умственного развития и когнитивного расстройства. К счастью, некоторые когнитивные расстройства наряду с определенными структурными нарушениями, наблюдаемыми у пациентов с ФКУ, считаются обратимыми. Например, было установлен, что время реакции, параметр скорости мышления, который снижен у пациентов с ФКУ, обратим, когда пациенты, не придерживающиеся диеты для ФКУ, возвращались к диете свободной от белка, обогащенной аминокислотами. Дополнительно, нарушения белого вещества мозга и, в частности нарушение образования миелинового слоя, ассоциированы с уровнем Phe в крови. Аналогично, эффект возобновления диеты на когнитивные функции наблюдается при магнитно-резонансном исследовании, которое показывает частичное восстановление нарушений миелина. В Lili Liang et al., опубликованной в NeuroReport 201 1, 22:617-622 указывается, что нарушения мозга, связанные с ФКУ, сопровождаются аномальными дендритными шипиками и синапсом у BTBR-Pah мышиной модели.
Безотносительно к ФКУ в EP2162019 описывается композиция, содержащая липидную смесь необязательно в комбинации с цитидином или уридином, для улучшения функции мозга при болезни Альцгеймера. Синаптическая дисфункция при болезни Альцгеймера тесно связанна с бета-амилоидной токсичностью и отложением бета-амилоидных бляшек, как причиной синаптической дисфункции и нейродегенерации. Следовательно, болезнь Альцгеймера рассматривается, как потеря существующих (функционирующих) синапсов.
Приведенные выше наблюдения указывают на потенциальную возможность улучшенного применения диеты, нацеленной на сохранение неврональной и когнитивной функции, связанных с ФКУ, что является объектом настоящего изобретения. Применяемое в настоящее время лечение диетами с низким Phe предотвращает задержку в умственном развитии, но когнитивные результаты остаются неоптимальными. Следовательно, продолжает существовать потребность в улучшении нутритивного лечения ФКУ и неврологических повреждений, связанных с ФКУ, по сравнению с имеющим место в настоящее время в данной области, и для улучшения нутритинвого лечения ФКУ за счет улучшения функций мозга.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что у пациентов с ФКУ когнитивные нарушения, связанные с пониженной функциональностью клеток мозга, могут быть улучшены при использовании нутритивной терапаии, нацеленной на снижение уровней фенилаланина в мозге в комбинации со стимуляцией синтеза нейротрансмиттеров и/или высвобождения и стимуляцией защитных и/или поддерживающих процессов в клетках мозга. В противоположность нейродегенеративным расстройствам повышение фенилаланина при ФКУ и гиперфенилаланинемии является наследственным заболеванием, которое развивается от рождения, в результате приводя к пониженному синтезу белка в мозге, таким образом, ухудшая формирование синапса в нейронной сети мозга. Механизм, лежащий в основе неврологических проблем при болезни Альцгеймера и деменции, следовательно, очень отличается от механизма, лежащего в основе ФКУ и гиперфенилаланинемии.
В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к нутритивной композиции, содержащей белковую, жировую и углеводную фракции, причем белковая фракция по существу свободна от фенилаланина и содержит свободные аминокислоты и/или, возможно, гликомакропептиды (GMP), жировая фракция содержит по меньшей мере одно, выбираемое из группы, состоящей из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров, при этом композиция может содержать углеводную фракцию, содержащую 5-70 эн.% усвояемых углеводов и, возможно, 1-5 эн.% неусвояемых углеводов от общего энергосодержания композиции, при этом композиция дополнительно содержит одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров. Также настоящее изобретение относится к применению композиции в диетотерапии или лечебном питании у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или у пациентов с фенилкетонурией и/или для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией.
В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к нутритивной композиции для применения в диетотерапии или лечебном питании при гиперфенилаланинемии или для применения в диетотерапии или лечебном питании у пациентов с фенилкетонурией, или для улучшения функции мозга или когнитивной функции у пациентов с ФКУ, в частности, к нутритивной композиции для применения в диетотерапии при гиперфенилаланинемии, или для применения при лечении пациентов с фенилкетонурией, или для улучшения функции мозга или когнитивной функции у пациентов с ФКУ, содержащей (a) белковую фракцию, (b) одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров; и (c) по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров. Предпочтительно композиция дополнительно содержит холин, предпочтительно 200-600 мг холина на суточную дозу. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере докозагексаеновую кислоту (ДГК), уридинмонофосфат (UMP) и также предпочтительно холин. Белковая фракция предпочтительно содержит свободные аминокислоты или гликомакропептиды молочного белка (GMP) или их комбинации, и предпочтительно по существу свободна от фенилаланина. Предпочтительно композиция дополнительно содержит углеводную фракцию содержащую 5-70 эн.% усвояемых углеводов и, возможно, 1-5 эн.% неусвояемых углеводов от общего энергосодержания композиции. Иначе говоря, настоящее изобретение также относится к применению указанной выше композиции при получении продукта для лечебного питания или обеспечения диетотерапии у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или у пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или с гиперфенилаланинемией. В другом предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей (a) одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров; и (b) по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров, предпочтительно по меньшей мере UMP и ДГК, для применения в пищевой добавке при диетотерапии У пациентов с ФКУ в сочетании с нутритивной композицией, содержащей белковую фракцию по существу свободной от фенилаланина, причем общее суточное потребление как с добавкой, так и с нутритивной композицией составляет 40-80 г белка, 25-45 г углеводов и от 0,3 до 4г указанных выше омега-3 длиноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно от 0,3 до 4 г докозагексаеновой кислоты (ДГК).
Также настоящее изобретение относится к способам лечебного питания или обеспечения диетотерапии пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанный способ включает введение указанным пациентам композиций, приведенных в описании настоящей патентной заявки.
ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ВЫПОЛНЕНИЯ
[Вариант выполнения настоящего изобретения 1]
Применение препарата при получении нутритивной композиции i) для диетотерапии или лечебного питания у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) для диетотерапии или лечебного питания у пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, предпочтительно нутритивной композиции для диетотерапии или лечебного питания у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией и/или для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанная нутритивная композиция содержит:
a. белковую фракцию,
b. одно или более из уридина и цитидина или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров; и
c. по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 2].
Применение по варианту выполнения настоящего изобретения 1, в котором белковая фракция содержит менее чем 0,1 вес.% фенилаланина от общего содержания белка.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 3].
Применение по варианту выполнения настоящего изобретения 1 или 2, в котором белковая фракция содержит по меньшей мере 50% свободных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 90% свободных аминокислот, при этом белковая фракция необязательно содержит гликомакропептид в интактной или гидролизованной форме.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 4].
Применение по варианту выполнения настоящего изобретения 1 или 2, в котором белковая фракция содержит по меньшей мере 50 вес.% гликомакропептида (GMP) от общего содержания белка.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 5].
Применение по любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, в котором композиция дополнительно содержит холин, предпочтительно 200-600 мг холина на суточную дозу.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 6].
Применение по любому из предшествующих вариантов выполнения настоящего изобретения, в котором композиция представляет жидкую композицию, дополнительно содержащую комбинацию пектина и по меньшей мере одного неусвояемого углевода, выбираемого из группы, состоящей из ксантановой камеди и/или гуаровой камеди.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 7].
Применение по варианту выполнения настоящего изобретения 6, в котором вязкость композиции составляет от 5 до 1500 мПа*с при температуре 20 градусов Цельсия при скорости сдвига 100/с.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 8].
Нутритивная композиция, содержащая белковую фракцию, жировую фракцию и углеводную фракцию, причем белковая фракция по существу свободна от фенилаланина и содержит свободные аминокислоты и, возможно, гликомакропептиды, жировая фракция содержит по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров, при этом композиция может содержать углеводную фракцию, содержащую 5-70 эн.% усвояемых углеводов и, возможно, 1-5 эн.% неусвояемых углеводов от общего энергосодержания композиции, при этом композиция дополнительно содержит одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 9].
Нутритивная композиция по варианту выполнения настоящего изобретения 8, содержащая 30-65 эн.% белка и от 1 до 15 эн.% жира, и от 1 до 60 эн.% усвояемых углеводов, при этом композиция представляет жидкость с общей калорийной плотностью от 50 до 300 ккал/100 мл.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 10].
Применение нутритивной композиции по варианту выполнения настоящего изобретения 8 или 9 для диетотерапии при ФКУ или гиперфенилаланинемии.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 11].
Применение композиции по варианту выполнения настоящего изобретения 8 или 9 при получении продукта для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 12].
Применению композиции, содержащей (a) уридин и цитидин или их соли, фосфаты, ацильные производные, или сложные эфиры; и (b) докозагексаеновую кислоту (22:6; ДГК), при получении добавки для диетотерапии ФКУ или гиперфенилаланинемии, причем указанную добавку вводят в сочетании с нутритивной композицией, содержащей источник белка по существу свободный от фенилаланина, причем общее суточное потребление как с добавкой, так и с нутритивной композицией составляет 40-80 г белка, 25-45 г углеводов, и от 0,3 до 4 г докозагексаеновой кислоты (ДГК).
[Вариант выполнения настоящего изобретения 13].
Нутритивная композиция для применения в i) диетотерапии или лечении пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) диетотерапии или лечении пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, в частности для применения в диетотерапии или лечении пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией и/или для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанная нутритивная композиция содержит:
a. белковую фракцию,
b. одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров; и
c. по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров, причем белковая фракция по существу свободна от фенилаланина и содержит свободные аминокислоты и, возможно, гликомакропептиды, при этом композиция может содержать углеводную фракцию, содержащую 5-70 эн.% усвояемых углеводов.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 14].
Композиция, содержащая (a) уридин и цитидин или их соли, фосфаты, ацильные производные, или сложные эфиры; и (b) докозагексаеновую кислоту (22:6; ДГК), для применения в пищевой добавке в диетотерапии при ФКУ или гиперфенилаланинемии, причем указанную добавку вводят в сочетании с нутритивной композицией, содержащей источник белка по существу свободный от фенилаланина, причем общее суточное потребление как с добавкой, так и с нутритивной композицией составляет 40-80 г белка, 25-45 г углеводов, и от 0,3 до 4 г докозагексаеновой кислоты (ДГК).
[Вариант выполнения настоящего изобретения 15].
Способ лечения или обеспечения диетотерапии у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанный способ включает введение указанным пациентам композиции, содержащей:
a. белковую фракцию,
b. одно или более из уридина и цитидина, или их соли, фосфата, ацильного производного или сложных эфиров; и
c. по меньшей мере одно из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5; ДПК), или их сложных эфиров, причем белковая фракция по существу свободна от фенилаланина и содержит свободные аминокислоты и, возможно, гликомакропептиды, при этом композиция может содержать углеводную фракцию, содержащую 5-70 эн.% усвояемых углеводов.
[Вариант выполнения настоящего изобретения 16].
Способ лечения или обеспечения i) диетотерапии или лечения пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) диетотерапии или лечения пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, предпочтительно способ лечения или обеспечения диетотерапии у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанный способ включает введение указанным пациентам композиции, содержащей (a) уридин и цитидин или их соли, фосфаты, ацильные производные, или сложные эфиры; и (b) докозагексаеновую кислоту (22:6; ДГК), причем указанную добавку вводят в сочетании с нутритивной композицией, содержащей источник белка по существу свободной от фенилаланина, причем общее суточное потребление как с добавкой, так и с нутритивной композицией составляет 40-80 г белка, 25-45 г углеводов, и от 0,3 до 4 г докозагексаеновой кислоты (ДГК).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Белок
Белок в продукте по изобретению, как для применения в качестве добавки, так и для сбалансированной нутритивной композиции, должен иметь низкое содержание фенилаланина. Поскольку ФКУ представляет хроническое заболевание, важно чтобы продукт имел высокую вкусовую привлекательность. Белковая фракция главным образом содержит свободные аминокислоты, и/или источник не аллергенного белка, такой как GMP. Согласно настоящему изобретению, свободные аминокислоты представляют аминокислоты не связанные друг с другом, что также относится к солям аминокислот или ди- и трипептидам, таким как цистеин- или гли-гли-дипептиды. Абсолютно свободный от фенилаланина продукт может быть получен при использовании свободных аминокислот, и композиция аминокислот легко может быть адаптирована к нутритивным потребностям в зависимости от возраста пациентов. Такие белковые композиции, отвечающие нуждам пациентов с ФКУ, доступны в предшествующем уровне техники.
Недостатком подавляющего большинства композиций свободных аминокислот является плохая вкусовая привлекательность, в частности из-за органолептически плохих аминокислот Met, Cys, Lys и Tip. Замена части свободных аминокислот гликомакропептидами интактного белка (GMP), который представляет белок, происходящий из казеина, и имеет низкое содержание фенилаланина, может значительно улучшить вкус, без значительного повышения содержания фенилаланина в составе. Следовательно, в предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к смеси GMP, обогащенной свободными аминокислотами. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере 50 вес.% GMP от общего содержания белка. Еще более предпочтительно композиция по изобретению содержит от 50 до 95 вес.% GMP, еще более предпочтительно от 70 до 90 вес.% GMP, обогащена до 100% свободными аминокислотами. GMP представляет пептид, образующийся в сыворотке из казеина. Когда молоко обрабатывают химозином в процессе получения сыра, молочный белок (k-казеин) гидролизуется на два пептида. GMP белок может быть доступен, например, от Davisco.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «по существу без Phe» или «по существу свободна от фенилаланина» включает в объем понятия белковый материал по изобретению, предпочтительно содержащий менее чем 1,0 вес.% фенилаланина, более предпочтительно менее чем 0,5 вес.% Phe, более предпочтительно менее чем 0,2 вес.% Phe, еще более предпочтительно менее чем 0,1 вес.% Phe от общего содержания белкового материала в композиции. В одном варианте выполнения настоящего изобретения Phe не присутствует в качестве свободной аминокислоты.
Предпочтительная композиция свободных аминокислот по изобретению имеет относительно высокое содержание разветвленных аминокислот (BCAA) лейцина, изолейцина и валина. Эти аминокислоты могут потенциально заблокировать транспорт фенилаланина через кишечный барьер и также через гематоэнцефалитический барьер, способствуя, таким образом, снижению уровня фенилаланина в мозге. Предпочтительно белковая фракция содержит по меньшей мере 15 вес.% BCAA, более предпочтительно от 15 до 35 вес.%, еще более предпочтительно от 18 до 26 вес.% от общего содержания белка.
В одном варианте выполнения настоящего изобретения композицию используют в качестве сбалансированного нутритивного продукта, замещающего по меньшей мере все другие источники белка в диете пациента с ФКУ; предпочтительно в продукте присутствуют все незаменимые аминокислоты. Незаменимые аминокислоты представляют аминокислоты, которые не могут быть синтезированы de novo человеком, и следовательно должны поступать из диеты. Незаменимые аминокислоты представляют три BCAA, приведенных выше, и гистидин, метионин, лизин, треонин и триптофан (фенилаланин также является BCAA, но, как указано выше, его количество должно быть максимально низким). Следовательно, в предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение содержит BCAA лейцин, изолейцин и валин, гистидин, метионин, лизин, треонин и триптофан. Предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% белковой фракции составляет лейцин, изолейцин, валин, гистидин, метионин, лизин, треонин и триптофан, более предпочтительно по меньшей мере 55%, 60%, 65%, 70% от веса белковой фракции составляют эти незаменимые аминокислоты, как сумма этих аминокислот, как в свободной форме, так и как часть источника неаллергенного белка, такого как GMP. Предпочтительно от 50 до 100 вес.%, более предпочтительно от 70 до 100% белковой фракции составляет лейцин, изолейцин, валин, гистидин, метионин, лизин, треонин и триптофан.
ДГК/ЭПК/ДПК
Композиция содержит по меньшей мере одну омега-3 полиненасыщенную жирную кислоту (ДЦПНЖК; с длиной цепи 18 и более атомов углерода), выбираемую из группы, состоящей из докозагексаеновой кислоты (22:6; ДГК), эйкозапентаеновой кислоты (20:5; ЭПК) и докозапентаеновой кислоты (22:5 co-3; ДПК), предпочтительно по меньшей мере одну из ДГК и ЭПК. Предпочтительно композиция по изобретению содержит по меньшей мере ДГК, более предпочтительно ДГК и ЭПК. ЭПК превращается в DPA (омега-3), увеличивая последующее превращение DPA в ДГК в мозге. Следовательно, предпочтительно композиция по изобретению содержит значительное количество ЭПК, таким образом, дополнительно стимулируя in vivo образование ДГК.
ДГК, ЭПК и/или DPA предпочтительно обеспечены, как триглицериды, диглицериды, моноглицериды, свободные жирные кислоты или их соли, или их сложные эфиры, фосфолипиды, лизофосфолипиды, простые эфиры глицерина, липопротеины, церамиды, гликолипиды или их комбинации. Предпочтительно композиция по изобретению содержит по меньшей мере ДГК в форме триглицерида.
В пересчете на суточную дозу способ по изобретению предпочтительно включает введение от 400 до 5000 мг ДГК+ЭПК+DPA (предпочтительно ДГК+ЭПК) в сутки, более предпочтительно от 500 до 3000 мг (предпочтительно ДГК+ЭПК) в сутки, наиболее предпочтительно от 1000 до 2500 мг (предпочтительно ДГК+ЭПК) в сутки. ДГК предпочтительно вводят в количество от 300 до 4000 мг в сутки , более предпочтительно от 500 до 2500 мг в сутки.
Композиция по изобретению предпочтительно содержит 1-40 вес.% ДГК от общих жирных кислот, предпочтительно 3-36 вес.% ДГК от общих жирных кислот, более предпочтительно 10-30 вес.% ДГК от общих жирных кислот. Композиция по изобретению предпочтительно содержит 0,5-20 вес.% ЭПК от общих жирных кислот, предпочтительно 2-10 вес.% ЭПК от общих жирных кислот, более предпочтительно 5-10 вес.% ЭПК от общих жирных кислот. Указанные выше количества позволяют учитывать оптимизацию нескольких аспектов, включая вкус (например, слишком высокие уровни LCP снижают вкус, в результате приводя к снижению приверженности пациента лечению).
Композиция по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере один жир, выбираемый из рыбьего жира, масла водорослей и липидов яиц. Предпочтительно композиция по изобретению содержит рыбий жир, содержащий ДГК и ЭПК.
Весовое соотношение ДГК к ЭПК предпочтительно составляет более 1, более предпочтительно от 2:1 до 10:1, более предпочтительно от 3:1 до 8:1. Указанные выше соотношения и количества позволяют учитывать оптимизацию некоторых аспектов, включая вкус (например, слишком высокие уровни LCP снижают вкус, в результате приводя к снижению приверженности пациента лечению), баланс между ДГК и ее предшественниками гарантирует оптимальную эффективность с сохранением при этом низкого объема составов.Возможными источниками ДГК являются: жир тунца, (другой) рыбий жир, сложные алкильные эфиры богатые ДГК, масло водорослей, яичный желток или фосфолипиды, обогащенные n-3 ДЦПНЖК, например, фосфатидилсерин -ДГК.
Композиция по изобретению предпочтительно содержит очень низкие количества арахидоновой кислоты (АК). Предпочтительно весовое соотношение ДГК/АК в композиции по изобретению составляет по меньшей мере 5, предпочтительно по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15, предпочтительно вплоть до, например, 30 или даже вплоть до 60. Предпочтительно способ по изобретению включает введение композиции, содержащей менее чем 5 вес.% арахидоновой кислоты от общих жирных кислот, более предпочтительно менее 2,5 вес.%, например, вплоть до 0,5 вес.%.
Уридин UMP
Композиция по изобретению содержит одно или более из уридина, цитидин и/или их эквивалентов, включая соли, фосфаты, ацильные производные и/или сложные эфиры. Композиция предпочтительно содержит по меньшей мере одно из уридина или его эквивалента, выбираемых из группы, состоящей из уридина (например, рибозилурацил), дезоксиуридин (дезоксирибозилурацил), уридинфосфаты (UMP, dUMP, UDP, UTP), нуклеотидное основание урацила и ацилированные производные уридина. В одном варианте выполнения настоящего изобретения также может быть применен цитидин, CMP, цитихолин (CDP- холин). Предпочтительно вводимая композиция по изобретению содержит источник уридина, выбираемый из группы, состоящей из уридина, дезоксиуридина, уридин фосфата, урацила и ацилированного уридина. Предпочтительно композиция по изобретению содержит уридинфосфат, выбираемый из группы, состоящей из уридинмонофосфата (UMP), уридиндифосфата (UDP) и уридинтрифосфата (UTP); и/или цитидинфосфата (CMP, CDP, CTP, предпочтительно CMP). В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один из указанных уридинфосфатов. Наиболее предпочтительно композиция по изобретению содержит UMP, поскольку UMP наиболее эффективно поглощается организмом. Предпочтительно по меньшей мере 50 вес.% уридина в композиции по изобретению обеспечено UMP, более предпочтительно по меньшей мере 75 вес.%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 вес.%. Вводимые дозы приводятся, как UMP. Количество источников урацила может быть рассчитано по молярному эквиваленту к количеству UMP (молярная масса 324 Дальтон).
Предпочтительно способ по изобретению включает введение уридина (общее количество уридина, дезоксиуридина, уридинфосфатов, нуклеотидного основания урацила и ацилированных производных уридина) в количестве 0,08-3 г в сутки, предпочтительно 0,1-2 г в сутки, более предпочтительно 0,2-1 г в сутки. Предпочтительно способ по изобретению включает введение композиции, содержащей уридин, в количестве 0,08-3 г UMP на 100 мл жидкого продукта, предпочтительно 0,1-2 г UMP на 100 мл жидкого продукта, более предпочтительно 0,2-1 г на 100 мл жидкого продукта. Предпочтительно в сутки вводят 1-37,5 мг UMP на килограмм массы тела, более предпочтительно 5-35, еще более предпочтительно 5-30 мг UMP/кг массы тела. Указанные выше количества также учитывают любые количества цитидина, цитидинфосфатов и цитихолина, введенного в композиции или в способе. Предпочтительно композиция по изобретению содержит уридинфосфат, предпочтительно уридинмонофосфат (UMP). UMP очень эффективно поглощается организмом. Следовательно, включение UMP в композицию по изобретению обеспечивает высокую действенность или эффективность при самой низко дозировке и/или введении низкого объема субъекту.
Холин
В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к композиции, содержащей холин, соль холина и/или сложный эфир холина. Далее в абзаце используемый в описании настоящей патентной заявки термин «холин» следует рассматривать, как включающий в объем понятия все эти эквиваленты. Соль холина предпочтительно выбирают из хлорида холина, битартрата холина или стеарата холина. Сложный эфир холина предпочтительно выбирают из фосфатидилхолина и лизо-фосфатидилхолина. Предпочтительно способ по изобретению включает введение более чем 50 мг холина в сутки, предпочтительно от 80 до 2000 мг холина в сутки, более предпочтительно от 120 до 1000 мг холина в сутки, наиболее предпочтительно от 200 до 600 мг холина в сутки. Композиция по изобретению предпочтительно содержит от 50 мг до 3000 грамм холина на 100 мл жидкой композиции, предпочтительно от 200 мг до 1000 мг холина на 100 мл. Указанные выше количества приведены по холину, количество эквивалентов или источников холина могут быть рассчитаны, учитывая молярный эквивалент холина от общей молярной массы 104 г холина/моль.
Фосфолипиды
Предпочтительно композиция по изобретению содержит фосфолипиды, предпочтительно 0,1-50 вес.% фосфолипидов от общего веса липидов, более предпочтительно 0,5-20 вес.%, более предпочтительно от 1 до 10% вес.%, наиболее предпочтительно от 1 до 5 вес.% от общего веса липидов. Общее количество липидов предпочтительно составляет от 10 до 30 вес.% по сухому веществу и/или от 2 до 10 г липидов на 100 мл жидкой композиции. Композиция предпочтительно содержит от 0,01 до 1 грамм лецитина на 100 мл, более предпочтительно от 0,05 до 0,5 грамм лецитина на 100 мл. Было установлено, что композиция с такими количествами очень эффективна. В одном варианте выполнения настоящего изобретения фосфолипиды включают по меньшей мере два фосфолипида, выбираемых из группы, состоящей из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола и фосфатидилсерина, предпочтительно по меньшей мере PC и PE.
Витамины
Композиция по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере один из витаминов комплекса B. Витамин B выбирают из группы, состоящей из витамина Bl (тиамин), витамина B2 (рибофлавин), витамина B3 (ниацин или ниацинамид), витамина B5 (пантотеновая кислота), витамина B6 (пиридоксин, пиридоксаль или пиридоксамин, или пиридоксин гидрохлорид), витамина B7 (биотин), витамина B9 (фолиевая кислота или фолат)а и витамин B12 (различные кобаламины). Функциональные эквиваленты также входят в объем этого термина.
Предпочтительно по меньшей мере один витамин B выбирают из группы, состоящей из витамина B6, витамина B12 и витамина B9. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере два выбираемых из группы, состоящей из витамина B6, витамина B12 и витамина B9. В частности хорошие результаты были достигнуты при использовании комбинации, содержащей витамин B6, витамин B12 и витамин B9. Функциональные эквиваленты также входят в объем этого термина.
Витамин B вводят в эффективной дозировке, которая дозазависима от типа используемого витамина B. Как показывает опыт, подходящая минимальная или максимальная дозировка может быть выбрана, исходя из известных рекомендаций по питанию, например, как рекомендовано Институтом медицины (IOM) Национальной Академии Наук США (Institute of Medicine (IOM) of the U.S. National Academy of Sciences) или Научным Комитетом по питанию и пищевым продуктам (Scientific Committee on Food)(Научный Комитет EU), информация описана здесь и, возможно, ограничена рутинным тестированием. Минимальная доза может основываться на ожидаемой средней потребности (EAR), хотя более низкая доза тоже может быть эффективна. Максимальная доза предпочтительно не превышает максимально переносимое потребление (UL), как рекомендовано IOM.
В случае, когда в нутритивной композиции или лекарственном средстве присутствует витамин B6, он предпочтительно присутствует в количестве, обеспечивающем суточную дозу в пределах от 0,1 до 100 мг, в частности в пределах от 0,5 до 25 мг, предпочтительно в пределах от 0,5 до 5 мг. Композиция по изобретению предпочтительно содержит от 0,1 до 100 мг витамина B6 на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 0,5 до 5 мг витамина B6 на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 0,5 до 5 мг витамина B6 на 100 г (жидкого) продукта.
В случае, когда в нутритивной композиции или лекарственном средстве присутствует витамин B12, он предпочтительно присутствует в количестве, обеспечивающем суточную дозу в пределах от 0,5 до 15 мкг, в частности в пределах от 1 до 10 мкг, предпочтительно в пределах от 1,5 до 5 мкг. Композиция по изобретению предпочтительно содержит 0,5-15 мкг витамина B12 на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 1 до 10 мкг витамина B12 на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 1,5 до 5 мкг витамина B12 на 100 г (жидкого) продукта. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «витамин B12» включает в объем понятия все эквиваленты кобаламина, известные из предшествующего уровня техники.
Используемые в описании настоящей патентной заявки термины «фолиевая кислота», «фолат» и «B9» взаимозаменяемы. В случае, когда в нутритивной композиции или лекарственном средстве присутствует витамин B9, он присутствует предпочтительно в количестве, обеспечивающем суточную дозу в пределах от 50 до 1000 мкг, в частности в пределах от 150 до 750 мкг, предпочтительно в пределах от 200 до 500 мкг. Композиция по изобретению предпочтительно содержит от 50 до 1000 мкг фолиевой кислоты на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 150 до 750 мкг фолиевой кислоты на 100 г (жидкого) продукта, более предпочтительно от 200 до 500 мкг фолиевой кислоты на 100 г (жидкого) продукта. Фолат включает фолиевую кислоту, фолиновую кислоту, метилированную, метенилированную и формилированную форму фолатов, их соли или сложные эфиры, наряду с их производными с одной или более глутаминовой кислотой и все, как восстановленные, так и окисленные формы.
Витамины C, E
Витамин C или его функциональный эквивалент может присутствовать в количестве, обеспечивающем суточную дозу в пределах от 20 до 2000 мг, в частности в пределах от 30 до 500 мг, предпочтительно в пределах от 75 до l50 мг. В одном варианте выполнения настоящего изобретения витамин C или его функциональный эквивалент присутствует в количестве в пределах от 20 до 2000 мг, в частности в пределах от 30 до 500 мг, предпочтительно в пределах от 75 до l50 мг на 100 мл композиции.
Токоферол и/или его эквивалент (то есть соединение, обладающее активностью витамина E) может присутствовать в количестве, обеспечивающем суточную дозу в пределах от 10 до 300 мг, в частности в пределах от 30 до 200 мг, предпочтительно в пределах от 35 до 100 мг для предотвращения окислительного повреждения пищевых ПНЖК. В одном варианте выполнения настоящего изобретения токоферол и/или его эквивалент присутствует в количестве в пределах от 10 до 300 мг, в частности в пределах от 30 до 200 мг, предпочтительно в пределах от 35 до 100 мг на 100 мл композиции. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «токоферол и/или его эквивалент» «альфа- TE» включает в объем понятия токоферолы, токотриенолы, их фармацевтически и/или нутритивно приемлемые производные и любую их комбинацию. Приведенные выше числовые значения соответствуют количеству альфа-токоферола признанному в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Селен
Композиция по изобретению предпочтительно содержит селен в виду его антиоксидантной активности. Предпочтительно способ по изобретению обеспечивает введение композиции, содержащей от 0,01 до 5 мг селена на 100 мл жидкого продукта, предпочтительно от 0,02 до 0,1 мг селена на 100 мл жидкого продукта. Количество вводимого селена в сутки предпочтительно составляет более чем 0,01 мг, более предпочтительно от 0,01 до 0,5 мг.
В предпочтительном варианте выполнения настоящее изобретение относится к композиции, дополнительно содержащей на суточную дозу или предпочтительно на 100 мл композиции:
200-600 мг холина,
50-1000 мг фосфолипидов,
0,5-3 мг витамина B6,
50-500 мкг фолиевой кислоты и
1-30 мкг витамина B12.
Более предпочтительно композиция содержит на суточную дозу или предпочтительно на 100 мл композиции:
100-500 мг, предпочтительно 200-400 мг ЭПК,
1000-1500 мг, предпочтительно 1100-1300 мг ДГК,
50-600 мг, предпочтительно 60-200 мг фосфолипидов,
200-600 мг, предпочтительно 300-500 мг холина,
400-800 мг, предпочтительно 500-700 мг UMP (уридинмонофосфат),
20-60 мг, предпочтительно 30-50 мг витамина E (альфа-TE),
60-100 мг, предпочтительно 70-90 мг витамина C,
40-80 мкг, предпочтительно 50-70 мкг селена,
1-5 мкг, предпочтительно 2-4 мкг витамина B 12,
0,5-3 мг, предпочтительно 0,5-2 мг витамина B6, и
200-600 мкг, предпочтительно 300-500 мкг фолиевой кислоты.
В одном аспекте настоящего изобретения композиции, либо как указанное выше сбалансированное питание, либо как указанная выше пищевая добавка предназначены для применения в диетотерапии у пациентов с гиперфенилаланинемией, для применения в лечении пациентов с фенилкетонурией или для улучшения функции мозга или когнитивной функции у этих пациентов, в частности, У пациентов с ФКУ.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «улучшение функции мозга или когнитивной функции» включает профилактику или минимизацию риска нарушений функции мозга и когнитивной функции, замедление задержки умственного развития и снижение риска эпилептических припадков и тремора и улучшение нарушения внимания (то есть, проблемы концентрации).
В частности настоящее изобретение относится к сохранению и улучшению когнитивной функции, снижению нарушений когнитивной функции, которые ассоциируются с накоплением phe, в частности у людей, определенных, как пациенты с ФКУ.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или обеспечения i) диетотерапии или лечения пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) диетотерапии или лечения пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или у пациентов с гиперфенилаланинемией, предпочтительно к способу лечения или обеспечения диетотерапии пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией, указанный способ включает введение указанным пациентам указанных выше композиций.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к указанным выше композициям (в качестве сбалансированного питания или пищевой добавке) для применения в i) диетотерапии или лечении пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) диетотерапии или лечении пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или у пациентов с гиперфенилаланинемией, предпочтительно композиции для применения в лечение или диетотерапии пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или пациентов с гиперфенилаланинемией и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанных выше композиций при получении продукта (в качестве сбалансированного питания или пищевой добавки) для i) диетотерапии или лечения пациентов с гиперфенилаланинемией и/или ii) диетотерапии или лечения пациентов с фенилкетонурией; и/или iii) сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или у пациентов с гиперфенилаланинемиией, предпочтительно продукта для лечения или диетотерапии пациентов с гиперфенилаланинемией и/или пациентов с фенилкетонурией, в частности для сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции у пациентов с фенилкетонурией или у пациентов с гиперфенилаланинемией и/или сохранения и улучшения когнитивной функции, снижения нарушений когнитивной функции, ассоциируемых с фенилкетонурией или гиперфенилаланинемией.
ПРИМЕРЫ
В приведенных ниже Примерах пациенты с ФКУ потребляли пищевые аминокислотные добавки свободные от Phe для компенсации уменьшения натуральных источников белка, которым необходима профилактика избыточного потребления Phe. Эти пищевые добавки обогащены витаминами, минеральными веществами, микроэлементами, и/или длиноцепочечными полиненасыщенными жирными кислотами для баланса изменений, индуцированных ограничениями диетой с низким содержанием белка, которой придерживаются пациенты. В случае, когда, например, взрослому пациенту требуется потребить 60 г белкового эквивалента (PE) в сутки, он может быть разделен на 3 равные порции по 20г PE, которые потребляют в течение дня.
Пример 1
4 порции в сутки; 3 стандартные пищевые добавки + 1 порция пищевой добавки по изобретению.
Ежедневные нутритивные потребности обеспечивали 3 порциями стандартной пищевой добавки, содержащей аминокислоты и микронутриенты + 1 порция, содержащая суточные количества нутриентов по настоящей патентной заявке.
Композиция этой дополнительной пищевой добавки по существу адаптирована, чтобы гарантированно подходить для пациентов с ФКУ. Дополнительно, уровни витаминов, минеральных веществ, микроэлементов и длиноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот адаптированы, таким образом, что суточное потребление этих нутриентов не превышало допустимый верхний предел.
Таблица 1Примера 1
Общее количество (суточное потребление)
Стандартная пищевая добавка (на порцию)
Состав по изобретению (на порцию)
Энергия (ккал)
447
118,6
90,8
Белок/Белковый эквивалент (г)
60
20
-
Углеводы (г)
43
8,8
16,5
Жир (г)- Из которых ДГК (22:6n-3; мг)
3,891,2
0,380,16
2,760,71
Микронутриенты*
Кальций (мг)
1068
356
-
Фосфор (мг)
828
276
-
Витамин E (mg α-TE)
40
3,2
30,4
Витамин C (мг)
80
17,8
26,6
Фолиевая кислота (µг)
400
120
40
Ниацин/Витамин B3 (мг)
21,3
7,1
-
Витамин B6 (мг)
1,74
0,58
-
Витамин B12 (µг)
5,4
1,80
-
Холин (мг)
459
153
-
НуклеотидыУридин-5'- монофосфат (мг)
625
-
625
Аминокислоты (г)**только незаменимые aa
34,07
11,36
-
* Все другие витамины, минеральные вещества и микроэлементы добавлены на уровнях, достаточных для покрытия суточных потребностей.** Другие аминокислоты присутствуют для обеспечения общих 20 г PE на порцию.
Пример 2
3 порции в сутки; 2 Стандартных пищевых добавки + 1 порция нового состава.
Ежедневные нутритивные потребности обеспечивали 2 порциями стандартной пищевой добавки, содержащей аминокислоты и микронутриенты, + 1 порция, содержащая требуемые суточные количества нутриентов, приведенных в описании настоящей патентной заявки, наряду с такими же количествами аминокислот, витаминов, минеральных веществ и микроэлементов, как в других 2 пищевых добавках.
Эта дополнительная пищевая добавка по существу адаптирована, чтобы гарантированно подходить для пациентов с ФКУ. Дополнительно, уровни витаминов, минеральных веществ, микроэлементов и длиноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот адаптированы, таким образом, что суточное потребление этих нутриентов не превышало допустимый верхний предел.
Таблица 2Примера 2
Общее количество (суточное потребление)
Стандартная пищевая добавка (на порцию)
Состав по изобретению (на порцию)
Энергия (ккал)
410,7
118,6
173,5
Белок/Белковый эквивалент (г)
60
20
20
Углеводы (г)
34,1
8,8
16,5
Жир (г)- Из которых ДГК (22:6n-3; мг)
3,811,2
0,380,16
3,050,88
Микронутриенты*
Кальций (мг)
1068
356
356
Фосфор (мг)
828
276
276
Витамин E (мг α-TE)
40
3,2
33,6
Витамин C (мг)
80
17,8
44,4
Фолиевая кислота (µг)
400
120
160
Ниацин/Витамин B3 (мг)
21,3
7,1
7,1
Витамин B6 (мг)
1,74
0,58
0,58
Витамин B12 (µг)
5,4
1,80
1,8
Холин (мг)
459
153
153
НуклеотидыУридин-5'- монофосфат (мг)
625
-
625
Аминокислоты (г)**только незаменимые aa
34,07
11,36
11,36
* Все другие витамины, минеральные вещества и микроэлементы добавлены на уровнях, достаточных для покрытия суточных потребностей.
Пример 3
3 порции в сутки; 3 порции нового состава.
Ежедневные нутритивные потребности обеспечивали 3 порциями пищевой добавки, содержащей аминокислоты и микронутриенты, которая также содержит требуемые суточные количества, приведенные в описании настоящей патентной заявки. Каждая порция обеспечивает 1/3 суточных потребностей витаминов, минеральных веществ, микроэлементов и длиноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, наряду с 1/3 суточного количества нутриентов, приведенных в описании настоящей патентной заявки. Состав по существу адаптирован для пациентов с ФКУ.
Таблица 3Примера 3
Общее количество (суточное потребление)
Состав по изобретению (на порцию)
Энергия (ккал)
472,3
157,4
Белок/Белковый эквивалент (г)
60
20
Углеводы (г)
49,5
16,5
Жир (г)- Из которых ДГК (22:6n-3; мг)
3,811,2
1,270,4
Микронутриенты*
Кальций (мг)
1068
356
Фосфор (мг)
828
276
Витамин E (мг α-TE)
40
13,33
Витамин C (мг)
80
26,67
Фолиевая кислота (µг)
400
133,33
Ниацин/Витамин B3 (мг)
21,30
7,1
Витамин B6 (мг)
1,74
0,58
Витамин B12 (µг)
5,4
1,8
Холин (мг)
459
153
НуклеотидыУридин-5'- монофосфат (мг)
625
208,33
Аминокислоты (г)только незаменимые aa
34,1
11,4
* Все другие витамины, минеральные вещества и микроэлементы добавлены на уровнях, достаточных для покрытия суточных потребностей.
Пример 4
положительный эффект нутритивной композиции по изобретению на поведенческую и когнитивную функцию и синаптическую пластичность в мозге.
Материал и Способы
Животные & Рационы, используемые в эксперименте (FC)
FC представляет активную пищевую добавку, которую добавили до трех различных уровней Phe в базовый корм животных. Полученная пищевая добавка представляет специфическую комбинацию нутриентов, включающую уридин-5'-монофосфат, холин и n-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), докозагексаеновую кислоту (ДГК) и эйкозапентаеновую кислоту.
В этом эксперименте использовали C57B1/6 Pahenu2 мышиную модель. Гомозиготных самцов и самок мышей (ФКУ) и однопометных животных дикого типа (WT) получили собственным разведением. Самцов и самок мышей содержали в отдельных комнатах при одинаковых условиях: 12:12 цикл свет/темнота, температура и влажность. 60 индивидуумов с ФКУ и 10 WT мышей разделили на семь экспериментальных групп, получавших различные рационы. Базовый состав для всех рационов был AIN93G (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede). WT индивидуумы получали нормальный корм с содержанием Phe 8,8 г/кг. Шесть групп мышей с ФКУ – результат добавления FC и трех различных содержаний Phe случайным образом.
В результате были получены следующие группы: Первые две группы, получавшие один и тот же нормальный корм AIN93G, указанный выше для WT индивидуумов (содержание Phe 8,8 г/кг). Одна из этих групп получала рацион без FC, другая группа получала рацион, но с FC: указанный, как Phe8,8 и Phe8,8+FC, соответственно. Последняя группа получала рацион с низким содержанием Phe. Этот рацион содержал 4,4 г/кг Phe с или без FC: указанный, как Phe4,4 и Phe4,4+FC, соответственно. Наконец, создали группу со средним содержанием Phe, причем уровни Phe установили между группами с высоким и низким содержанием Phe. Рацион со средним содержанием Phe имел уровень 6,4 г/кг: указанный, как Phe6,4 и Phe6,4+FC, соответственно. Уровни аминокислот в пищевом продукте приведены в Таблице 1. Все рационы отвечали минимальным нутритивныем потребностям для лабораторных животных. Животные имели свободный доступ к воде и всем этим рационам в течение 12 недель.
В начале эксперимента (28 день после дня рождения (PND) 28), животных отлучили от материнского молока и взяли образцы крови из хвостовой вены проведением пункции. На PND 31, животных подвергли тесту открытое поле и затем распределили их по различным рационам на 12 недель. Всех животных ежедневно взвешивали в период 16:00-18:00 на первой неделе эксперимента (PND 31-PND 38) и далее с этого момента ежедневно. Потребление корма измеряли ежедневно. В течение этих 12 недель провели забор образцов крови на 59 и 87 PND. На PND 115 всех животных снова подвергли тесту открытое поле и затем подвергли эвтаназии через пункцию сердца для сбора крови с последующей перфузией. Все действия, касающиеся животных, в этом исследовании были разрешены этическим комитетом Университета Гронингена в Нидерландах (University of Groningen, The Netherlands).
Таблица 1Уровни аминокислот в различных нутритивных композициях экспериментальных групп Phe 8,8, Phe 6,4 и Phe 4,4
мг/кг
Phe8,8 WT
Phe8,8 - FC
Phe8,8 + FC
Phe6,4 - FC
Phe6,4 + FC
Phe4,4 - FC
Phe4,4 + FC
Минимальные требования
Аланин
4106
4350
4833
4294
4126
4114
4044
нет данных
Аргинин
5177
5060
4875
4902
4584
4839
4679
3000
Аспарагиновая кислота
12261
12003
11989
11564
10903
11046
11320
нет данных
Цистеин
нет данных
Глутаминовая кислота
нет данных
Глицин
2786
3298
3112
3119
2933
2806
2874
нет данных
Гистидин
3478
3336
3066
3026
2699
3053
3033
2000
Изолейцин
7293
7023
7201
7294
7149
7139
7133
4000
Лейцин
14170
14057
13952
13974
13926
14130
14161
7000
Лизин
10707
10690
9727
10509
8946
9818
9925
4000
Метионин
4403
4196
4226
4211
3845
4155
4061
5000
Фенилаланин
7623
7567
7392
5420
5218
3388
3377
7600
Пролин
нет данных
Серин
8465
8079
8350
8595
8231
8470
8601
нет данных
Треонин
6005
5698
5553
5895
5523
5457
5719
4000
Триптофан
1526
1567
1525
1554
1508
1558
1553
1000
Тирозин
8659
8467
8601
8515
8373
8633
8393
нет данных
Валин
8555
8421
8422
8612
8274
8398
8193
5000
Генотипирование
Для установления генотипа животных провели анализ количественной ПЦР (кПЦР) ДНК, выделенной из тканей хвоста. Процедуру выделения ДНК инициировали инкубированием тканей хвоста в 0,5 мл лизирующего буфера мышиных хвостов (100 мM Трис-HCl, pH 8,5; 5 мM ЭДТА, pH 8,0; 200 мM NaCl; 0,2 вес./об.% SDS и протеиназы K (100 мкг/мл, соотношение 100:1) в течение ночи при температуре 55°C при 600 об/мин. На следующий день образцы перемешали на вортексе и центрифугировали в течение 10 минут при 13,000 об/мин. Затем 450 мкл супернатанта переместили в новую пробирку, содержащую 0,5 мл изопропанола. После аккуратного перемешивания этих растворов пробирку центрифугировали в течение 10 минут при 6000 об/мин. Супернатант удалили и осажденную центрифугированием ДНК сушили на воздухе по меньшей мере 30 минут. Для получения ДНК для кПЦР осажденную центрифугированием ДНК ресуспендировали в 200 мкл TE- буфере (10 мM Трис-HCl; 1 мM ЭДТА), перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 10 минут при 55°C.
Затем образцы центрифугировали в течение 10 минут при 15,000 относительной центробежной силе (оцс), в 50 раз разбавили минерализованной водой, перемешали на вортексе и снова центрифугировали в течение 10 минут при 15,000 оцс.
96-луночный планшет (Biorad, HSP-9601) заполнили 2 мкл образцов вместе с 5 мкл мастер-микс. Этот мастер-микс содержал:
TE-буфер
ПЦР-смесь (Bioline SensiMixTM Probe Kit (500 реакций)) WT/PAH-enu2 прямое типирование
CCG TCC TGT TGC TGG CTT AC
WT/PAH-enu2 обратное типирование CAG GTG TGT ACA TGG GCT TAG ATC WT проба CCG AGT CZZ LCA LTG CA
PAH-enu2 проба CCG AGT CZL LCA CTG CA
Праймеры по базе данных Genbank и реплицировались согласно инструкциям Eurogentec. WT пробу пометили FAM флуорофором и ФКУ пробу пометили Yakima желтым флуорофором (Epoch Biosciences). Пластину обработали в системе детекции последовательностей ABI Prism 7500. При следующих параметрах цикла: 95°C в течение 10 минут, 95°C в течение 0,15 минут и 60°C в течение 1 минуты. Этот цикл повторили 39 раз.
Поведение анализа
На 31 и 115 PND всех животных подвергли тесту открытое поле. В этой поведенческой парадигме животные исследуют круглое открытое поле (r=40 см) с белой поверхностью и серыми сторонами. За несколько минут перед началом каждого эксперимента арену очищали 30% этанолом. В начале эксперимента животных помещали в центр арены, где они могли свободно исследовать арену в течение 10 минут. Каждый эксперимент записывали и внимательно изучали при использовании Etho Vision system (Noldus, the Netherlands). При использовании этой системы были получены следующие параметры поведения: время, частота и время ожидания до первого входа в центральную зону, среднюю зону и пограничную зону, расстояние перемещения, скорость и число транзитных зон.
Результаты в виде графика приведены на Фигуре 1. На Фигуре 1A показано определение различных зон; было использовано открытое поле 80 см. Программа анализа различала три зоны: центральную, среднюю и пограничную. На Фигуре 1B показано время покидания центральной зоны для групп с различной терапией и контрольных групп.
Иммуногистохимическое исследование
Для проведения иммуногистохимического исследования собрали мозги животных при использовании перфузии параформальдегидом (PFA). Сразу же после пункции сердца животных препарировали, таким образом, чтобы было видно сердце. Иглу, соединенную с насосной системой, погружали в левый желудочек. Затем разрезали правое предсердие и пропускали промывочный раствор (0,9% NaCl; 5 мл гепарина/л) при скорости 9,25 об/мин эквивалентной 15 мл/минуту. Когда печень стала бледной промывочный раствор заменили на фиксирующий раствор (4% PFA в 0,1M фосфатной буфере (PB); pH 7,4). После перфузии мозги собрали и подвергали постфиксации в течение 24 часов в фиксирующем растворе. Через 24 часа мозги отправили на хранение в 0,1M фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) при температуре 4°C. Мозги партиями помещали в раствор сахарозы (30% сахарозы 0,01M PB). Этот раствор использовали в качестве криопротектора. Мозги заморозили при использовании жидкого азота, сразу же после этого их погрузили на дно контейнера (через около 16 часов после выжержки мозгов в растворе сахарозы) и хранили при температуре -80°C. Мозги партиями нарезали в криостате Leica CM3050. Срезы препарата имели толщину 20 мкм, температура камеры и объекта поддерживалась от -16°C до -14°C. Срезы хранили в 0,01M PBS с 0,1% азидом натрия (NaN3) при температуре 4°C.
2
2
2
2
2
Иммунохимическое окрашивание провели PSD-95, как следующее: свободноплавающие срезы (5 срезов гиппокампов, 5 префронтальных и 5 срезов полосатого тела) 3 раза промыли 0,01M Трис-забуференным физиологическим раствором, pH 7,4 (TBS) перед инкубированием с 0,3% HO в TBS. Срезы снова промыли 4 раза TBS и инкубировали с 1:1000 мышиных моноклональных антител к PSD-95, Millipore, MABN68, 1% NGS и 0,5% Triton-X в TBS в течение 2 часов на водяной бане при температуре 37°C. После инкубирования при температуре 37°C срезы оставили при комнатной температуре на шейкере в течение 24 часов и затем хранили в течение 48 часов при температуре 4°C. Срезы промыли 6 раз TBS перед инкубированием раствором вторичных антител (1:500 биотин-SP-коньюгированный козий антимышиный, Jackson, код: 115- 0,65-166 Lot# 110630, 1% NGS и 0,5% Triton-X в TBS) в течение 2 часов при комнатной температуре. Срезы промыли 4 раза TBS, хранили в течение ночи при температуре 4°C и снова промыли 2 раза перед инкубированием с 1:400 AB комплексом, Vectastain PK-6100 стандартным в TBS в течение 2 часов. После инкубирования срезы промыли 6 раз TBS и поместили в раствор 3,3'- диаминобензидина (DAB; 7 мг/15 мл). Проявление цвета инициировали введением 100 мкл, 0,1% HO в HO до DAB раствора. Реакцию остановили 3-кратной промывкой TBS. Срезы хранили в течение ночи при температуре 4°C перед заливкой раствором желатина (1% желатина; 0,05% алуина (Aluin) в H2O). Обработанные срезы пропустили через серию из 7 ванн (2,3-100%) спирта, 4-70% спирта 30% ксилола, 5-30% спирта, 70% ксилола, 6,7,8-100% ксилола) перед покрытием раствором для защиты препаратов от высыхания DPX. Срезы сушили на воздухе по меньшей мере 7 дней перед проведением анализа.
Для количественного анализа использовали систему анализа изображений Quantimet 550 (Leica, Cambridge, UK). Создали макро для измерения при 10-кратном увеличении скорректированной оптической плотности выделенной вручную области. Измеряли следующие области: краевой слой (Stratum Oriens), пирамидальные клетки CA1, лучистый слой (Stratum radiatum), две субобласти молекулярного слоя (Мол. слой (IV) Мол. слой (V) на дорсальной поверхности зубчатой извилины и Мол. слой (IX) и Мол. слой (X) на вентральной поверхности зубчатой извилины), внутренний край и внешний край зубчатой извилины, хилус, блестящий слой (Stratum lucidum) и зернистоклеточный CA3. Оптическую плотность этих областей скорректировали по оптической плотности мозолистого тела.
Статистический анализ
Массу тела и потребление пищи измеряли еженедельно. Для обоих массивов данных использовали повторные измерения ANOVA с апостериорным тестом Бонферрони.
Несколько параметров в открытом поле имели ненормальное распределение. Следовательно, для определения статистически значимой разницы для расстояния перемещения, скорости и времени, потраченного в различных зонах, использовали тест Краскела-Уоллиса. Данные получили из перемещений между зонами, данные времени ожидания перед выходом из центральной зоны имели нормальное распределение. Следовательно, для определения статистически значимой разницы между WT и ФКУ на 31 PND и 115 PND использовали t-тесты. Для определения статистически значимой разницы между всеми группами в последнем параметре использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA.
При этом иммуногистохимические данные по PSD-95 не имели нормального распределения.
Следовательно, если требовалось определить статистически значимую разницы между группами, использовали тест Краскела-Уоллиса. Для определения, какие из групп статистически значимо отличаются друг от друга, использовали тест множественного сравнения Данна.
Неясный фенотип C57BI/6 мыши с ФКУ в открытом поле
Для определения статистически значимой разницы спонтанного поведения между WT и ФКУ с разными рационами использовали парадигму открытого поля. Для установления фенотипа мышей с ФКУ сравнивали следующие параметры индивидуумов WT и ФКУ на 31 PND и индивидуумов WT и ФКУ с высоким уровнем Phe без FC на 115 PND: время, частота и время ожидания до первого входа в центральную зону, среднюю зону и пограничную зону, расстояние перемещения, скорость и число транзитных зон. Самцов и самок мышей группировали вместе до установления для какого-либо параметра, имеющего статистически значимого различия по половому признаку. Не было обнаружено статистически значимые различия для скорости, расстояния перемещения и времени, потраченного в различных зонах на 31 PND. Статистически значимые различия были обнаружены в зоне транзита, в которой индивидуумы с ФКУ показали меньшие транзитные зоны от центральной до средней зоны и от средней до пограничной зоны (от центральной до средней зоны: T-тест (t=2,759 df=68) p=0,007, от средней до пограничной зоны: T-тест (t=2,140 df=68) p= 0,036).
Было обнаружено статистически значимое различие между индивидуумами WT и ФКУ группы с высоким уровнем Phe без FC по задержке времени перед выходом из центральной зоны (T-тест (t=2,709 df=12) p=0,019).
Диетотерапия восстанавливает снижение PSD-95 гиппокампальных синапсов в проксимальной части у индивидуумов с ФКУ на диете с высоким содержанием Phe.
Для исследования влияния FC на формирование синапса и пластичность деполяризующего синапса в качестве пост-синаптического маркера использовали PSD- 95. Для 12 субстратов гиппокампов рассчитали скорректированную оптическую плотность. Эти 12 областей были приблизительно поделены на синапсы проксимальной и дистальной частей. Область синапсов проксимальной части включала: CA3, внутренний и внешний край зубчатой извилины и CA3. Область синапсов дистальной части включала: краевой слой (Stratum Oriens), лучистый слой (Stratum radiatum), молекулярный слой подразделили на Мол. слой (IV), Мол. слой (V), Мол. слой (IX) и Мол. слой (X), хилус и блестящий слой (Stratum lucidum). Непараметрическое тестирование выявило статистически значимые различия между рационами в скорректированной оптической плотности во внутреннем и внешнем крае зубчатой извилины (внутренний край; p=0,041, внешний край p=0,024). Тест множественного сравнения Данна показал статистически значимые различия между WT: Phe8,8 и ФКУ на том же самом рационе (p<0,05). Этот результат позволяет объяснить положительный эффект диетотерапии на поведение группы с Phe8,8.
Заключение:
Наблюдаемый фенотип мышей с ФКУ в группе с высоким содержанием Phe восстановился до уровня WT при использовании нутритивной поддержки композицией по изобретению в группе с тем же содержанием Phe (Фиг.1). FC увеличивает экспрессию PSD-95 в гиппокампальных синапсах проксимальной части в группе с высоким содержанием Phe, указывая на улучшение неврональной функции синапсов у мышей с ФКУ. Эти находки позволяют предположить, что FC оказывает благоприятное влияние на синапс проксимальной части зубчатой извилины, область, которая получает возбуждающий входящий сигнал от энторинальной области коры головного мозга. Гиппокамп, а также энториальная область коры головного мозга вовлечены в обучение и запоминание. Положительное влияние FC на эту область указывает на положительной влияние на обучение и память у модели с ФКУ.