Оксид азота вносит положительный вклад в протекторное действие кратковременной адаптации к гипоксии на развитие стрессорных повреждений у крыс линии Крушинского-Молодкиной

ФИЗИОЛОГИЯ

УДК 612.821.6

ОКСИД АЗОТА ВНОСИТ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ВКЛАД В ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ КРАТКОВРЕМЕННОЙ АДАПТАЦИИ К ГИПОКСИИ НА РАЗВИТИЕ СТРЕССОРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ У КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСКОГО-МОЛОДКИНОЙ

В.С. Кузенков, В.П. Реутов1, А.Л. Крушинский, В.Б. Кошелев2, Е.Г. Сорокина3, Л.М. Байдер4, З.В. Куроптева4, Л.Х. Комиссарова4

Неселективный ингибитор МО-синтаза Ь-ККЛ (2,5 мг/100 г) уменьшал протекторный эффект кратковременной адаптации к гипоксии (1ч, 5000 м над ур. моря) на развитие индуцированных акустическим стрессом нарушений у крыс Крушинского—Молодкиной, генетически предрасположенных к аудиогенным судорогам. Методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) установлено увеличение продукции N0 в крови и селезенки крыс, адаптированных к кратковременной гипоксии. Результаты исследования позволяют заключить, что N0 вносит положительный вклад в защитный эффект при кратковременной адаптации к гипоксии.

Ключевые слова: адаптация к гипоксии, оксид азота, ЭПР метод.

Проведенные нами исследования показали, что кратковременная адаптация к умеренной гипоксии, соответствующей высоте 5000 м над ур. моря, оказывает значительный протекторный эффект на развитие стрессорных нарушений у крыс линии Крушинского—Молодкиной (КМ). Время гипоксической экспозиции составляло от 30 мин до 2 ч [1, 2, 3].

Созданная путем многолетней селекции генетическая модель судорожного припадка и сердечнососудистых нарушений является удобным объектом для исследований различных факторов, препятствующих или способствующих развитию стрессор-ных нарушений [4]. Эксперименты, проведенные на крысах этой линии, показали, что в результате длительного применения прерывистых звуковых раздражителей возникает резкое возбуждение мозга, которое сопровождается двигательными и вегетативными нарушениями, острыми нарушениями кровообращения и гибелью части животных от кровоизлияний в мозг [4].

Судорожный припадок является мощной функциональной нагрузкой на организм [5]. При эпилептическом статусе происходит значительное падение напряжения кислорода в нервной ткани [6, 7]. В мозге крыс линии КМ, подвергнутых акустическому стрессу, наблюдаются патологические изме-

нения нервных клеток и нейроглии, характерные для кислородной недостаточности [8]. Известно, что гипоксия мозга является одним из критических факторов при развитии внутричерепных кровоизлияний [2, 5].

Вероятно, протекторный эффект кратковременной адаптации к гипоксии на животных в условиях акустического стресса в значительной степени обусловлен улучшением утилизации кислорода тканями мозга в результате лучшей его доставки с кровью, что может обеспечиваться срочными реакциями адаптации [9]. Эти реакции реализуются прежде всего через увеличение скорости кровотока [10] и увеличение количества функционирующих капилляров [11].

Ранее нами было показано, что воздействие относительно низких доз (0,5 мг/100 г) МО-генери-рующего соединения — нитрита натрия (NN02) уменьшает развитие стрессорных нарушений у крыс линии КМ [12, 13]. Сходное протекторное действие оказывал предшественник оксида азота (N0) Ь-аргинин в дозе 20 мг/100 г [14]. Оксид азота, являясь активным вазодилататором [15—17], способен увеличивать скорость кровотока в мозге [18, 19] и, возможно, участвует в механизмах перехода резервных капилляров мозга в активные формы. Таким образом, это соединение может отвечать за реали-

1 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, г. Москва.

2 Кафедра нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.

3 Научный центр здоровья детей РАМН, г. Москва.

4 Институт биохимической физики РАН, г. Москва.

зацию ряда срочных реакции адаптации к гипоксии. Способность NO ингибировать агрегацию тромбоцитов [16, 20] также может препятствовать ишемии мозга и развитию кровоизлиянии в условиях акустического стресса. В то же время в литературе имеются данные о том, что умеренная гипоксия способствует усилению синтеза оксида азота [13, 21]. Возникает предположение, что оксид азота вносит положительную составляющую в реализацию защитного эффекта кратковременной адаптации к гипоксии на крыс линии КМ.

Материалы и методы

1. Исследовалось влияние неселективного ингибитора NO-синтазы L-NNA ^№-нитро-Ь-арги-нин, "Sigma") на устойчивость животных, кратковременно адаптированных к умереннои экзогеннои гипоксии в условиях акустического стресса. В экспериментах использовали 64 крысы линии КМ (самцы в возрасте 4,5 мес массоИ 200 ± 30 г). Животные были разделены на четыре группы по 16 животных в каждоИ серии. Первая группа служила контролем и находилась в условиях нормального атмосферного давления. Вторая группа помещалась на 1 ч в барокамеру, где создавали разряжение воздуха, соответствующее высоте 5000 м над уровнем моря. Третья группа, так же как и вторая, в течение первого часа находилась в барокамере, однако непосредственно перед "подъемом на высоту" животным внутрибрюшинно вводили L-NNA в дозе 2,5 мг/100 г. Четвертой группе животных за 1 ч до эксперимента вводили L-NNA в дозе 2,5 мг/100 г внутрибрюшинно без последующего "гипоксиче-ского" воздействия. ПервоИ и второИ группам животным за 1 ч до эксперимента вводили физио-логическиИ раствор в эквивалентном количестве. Акустическое воздеИствие проводили по ранее раз-работанноИ схеме [4]. После полутораминутного деИ-ствия сильного электрического звонка (110—115 дБ) подавали серию сильных и слабых (80 дБ) акустических сигналов длительностью 10 с с десятисе-кундными интервалами между ними. Через 15 мин такого воздеИствия делали трехминутныИ перерыв и затем снова включали сильныИ звук в течение 1 мин. Во время акустического воздеИствия у контрольных и опытных крыс определяли параметры, характеризующие возбудимость централь-ноИ нервноИ системы: величину латентного периода, интенсивность и характер судорожного припадка. Также оценивали выраженность нарушениИ движениИ и смертность животных во время акус-тическоИ экспозиции. Выделялись нарушения движениИ трех степенеИ: а) легкие нарушения движениИ (незначительные нарушения мышечного тонуса, не ограничивающие передвижение животного); б) средние нарушения движениИ (парез конечно-стеИ, чаще задних, затрудняющиИ передвижение);

в) тяжелые нарушения движений (животное практически теряет способность к передвижению). Сразу после окончания экспериментов животных де-капитировали, мозг фиксировали в 10%-м растворе формалина. Площадь субдуральных и видимых суб-арахноидальных кровоизлияний определяли на би-нокуляр-микрометре.

2. Исследовалась концентрация оксида азота (N0) в крови и селезенке крыс линии КМ, адаптированных к кратковременной экзогенной гипоксии по сравнению с контрольными животными. В эксперименте использовались 24 крысы линии КМ (самцы в возрасте 5 мес, массой 280—300 г). Адаптация к гипоксии проводилась в барокамере, где с помощью вакуумного насоса поддерживали разрежение воздуха, соответствующее высоте 5000 м над уровнем моря в течение одного часа. Концентрация N0 определялась методом ЭПР. Спектр ЭПР образцов крови и селезенки регистрировали на спектрометре Б8Я-300 фирмы "Брукер" (ФРГ), оснащенным мини-ЭВМ, при температуре жидкого азота.

Достоверность различий средних в разных экспериментальных группах животных оценивали с помощью 1>критерия Стьюдента. Достоверность процентных соотношений оценивалась с помощью критерия Фишера.

Результаты и обсуждение

Кратковременная адаптация к гипоксии значительно повысила устойчивость крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции (рис. 1). В опытной группе снижена смертность по сравнению с контролем (0% и 18,8% соответственно, р < 0,05) и доля животных с тяжелыми нарушениями движений (0% и 68,7% соответственно, р < 0,001). Среди адаптированных к гипоксии животных значи-

Рис. 1. Влияние кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии и блокатора N0-синтазы (L-NNA) на устойчивость крыс линии КМ к акустическому стрессу. 1 — контроль; 2 — барокамера (5000 м); 3 — барокамера + L-NNA; 4 — L-NNA 2,5 мг/100 г. *р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001

Рис. 2. Влияние кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии и блокатора N0-синтазы (Ь^КА) на развитие внутричерепных кровоизлияний у крыс линии КМ в условиях звукового стресса. 1 — контроль; 2 — барокамера (5000 м); 3 — барокамера + L-NNA; 4 — L-NNA 2,5 мг/100 г. **р < 0,01, ***р < 0,001

тельно больше доля крыс с легкими нарушениями движений по сравнению с контрольными (81,2% и 12,5% соответственно, р < 0,001). Параметры, характеризующие возбудимость центральной нервной системы, также различались у обеих групп животных. Латентный период наступления судорожного припадка в опытной группе был значительно увеличен по сравнению с контролем (4,5 ± 0,4 с и 2,5 ± 0,2 с соответственно, р < 0,001). В опытной группе уменьшена доля животных с максимальной интенсивностью судорожного припадка по сравнению с контролем (81,2% и 100% соответственно, р < 0,05). Кратковременная гипоксическая адаптация значительно уменьшала площади субду-ральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний по сравнению с контролем: 7,5 ± 2,6 мм2 и 28,4 ± 4,8 мм2 соответственно, р < 0,01 (рис.2). Предварительное введение ингибитора N0-синтазы значительно ослабляло эффект гипоксической стимуляции (рис. 1).

Так, в группе животных, получавших L-NNA на фоне адаптации к гипоксии по сравнению с животными, получавшими на фоне адаптации к гипоксии физиологический раствор в эквивалентном количестве, была увеличена смертность (18,8% и 0% соответственно, р < 0,05) и доля животных с тяжелыми нарушениями движений (81,2% и 0% соответственно, р < 0,001). У животных, получавших L-NNA на фоне адаптации к гипоксии, была значительно увеличена площадь субдуральных и видимых суб-арахноидальных кровоизлияний: 39,9 ± 7,2 мм2 и 7,5 ± 2,6 мм2 соответственно, р < 0,01 (рис. 2). Параметры, характеризующие возбудимость централь-

ной нервной системы, достоверно не различались у обеих групп животных.

Наиболее тяжело акустическую экспозицию переносили животные, получавшие блокатор N0-^^ тазы без гипоксического воздействия (рис. 1). В этой группе значительно увеличена смертность по сравнению с контролем (81,2% и 18,8% соответственно, р < 0,001), увеличена доля животных с тяжелыми нарушениями движений (100% и 68,7% соответственно, р < 0,01). В группе животных, получавших L-NNA без гипоксического воздействия, значительно увеличена средняя площадь субдураль-ных и видимых субарахноидальных кровоизлияний по сравнению с контролем: 129,1 ± 12,7 мм2 и 28,4 ± 4,8 мм2 соответственно, р < 0,001 (рис. 2). Параметры, характеризующие возбудимость центральной нервной системы, в обеих группах животных достоверно не различались.

Проведенные исследования показали достоверное увеличение концентрации оксида азота (по интенсивности ЭПР-сигнала №-N0 комплексов) в крови и селезенке у животных, адаптированных к кратковременной гипоксии по сравнению с контролем (рис. 3).

Рис. 3. Влияние кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии на интенсивность ЭПР сигнала гемоглобин-N0 комплексов у крыс линии КМ в крови и селезенке. 1 — контроль; 2 — барокамера (5000 м). *р < 0,05

Таким образом, значительное снижение протекторного эффекта адаптации к кратковременной экзогенной гипоксии на фоне блокатора N0-синтазы у крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции может свидетельствовать о существенной роли оксида азота в реализации защитных механизмов гипоксической адаптации антистрессовой защиты. По-видимому, защитный эффект кратковременной адаптации к гипоксии частично реализуется через умеренную активацию синтеза оксида азота.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ryasina T.V, Koshelev V.B., Krushinsky A.L., Lozh-nikova S.M., Sotskaya M.N., Lyndrovskaya J.Y. The role of short-term hypobaric hypoxia in prevention of disorders

of the cerebral circulation in rats during acoustic stress // Brain Research. 1988. Vol. 473. P. 153-156.

2. Крушинский А.Л., Рясина Т.В., Кошелев В.Б., Сот-ская М.Н., Ларский Э.Г. Протекторное деИствие разных видов и режимов адаптации к гипоксии на развитие стрессорных повреждениИ у крыс линии КМ // Физиол. журн. СССР. 1989. Т. 75. № 11. С. 1576—1584.

3. Крушинский А.Л., Кошелев В.Б., Рясина Т.В., Яс-кин В.А., Кузенков В.С. Кратковременная гипоксическая стимуляция повышает устоИчивость крыс линии КМ в условиях акустического стресса // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. 2001. № 3. С. 46—48.

4. Крушинский Л.В. Формирование поведения животных в норме и патологии. М., 1960.

5. Кошелев В.Б. Структурная перестроИка кровеносного русла при экспериментальноИ артериальноИ гипер-тензии и адаптации к гипоксии: Автореф. дис. ... докт. М., 1990.

6. Назаренко А.И. Значение гипоксии и адаптации к неИ в течении экспериментальных судорожных припадков // Физиол. журн. УССР. 1966. Т. 52. № 5. С. 622—625.

7. Elger C.E, Wieser. Phatophisiologie der Epileрsie // Schweiz. med Wochenschr. 1984. Vol. 114. N 38. P. 1278—1288.

8. Ничков С.В., Кривицкая Т.Н. АкустическиИ стресс и церебровисцеральные нарушения. М.: Медицина, 1969. 231 с.

9. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М., 1981. 230 с.

10. Иванов К.П., Левкович Ю.И., Калинина М.К. Скорость кровотока в капиллярах мозга при гипоксии // Докл. АН СССР. 1977. Т. 235. № 6. С. 1449—1452.

11. Francois-Dainville E., Bucweitz E., Weiss H.R. Effect of hypoxia on percent of arteriolar and сарШагу beds рerfused in the rat brain // J. Appl. Physiology. 1986. Vol. 60. N 1. P. 280—288.

12. Крушинский А.Л., Кузенков В.С., Кошелев В.Б. Влияние нитрита натрия (NO-генерирующего соединения) на развитие стрессорных повреждениИ у крыс линии Крушинского—МолодкиноИ // Роль неИромедиаторов и

регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности. Минск, 1999. C. 162—164.

13. Реутов В.П., Кузенков В.С., Крушинский А.Л., Кошелев В.Б., Рясина Т.В., Левшина И.П., Шуйкин Н.Н., Косицын Н.С., Айрапетянц М.Г. Развитие стрессорных повреждениИ у крыс линии Крушинского—МолодкиноИ, генетически предрасположенных к судорожным припадкам, при деИствии NO-генерирующего соединения и бло-катора NO-синтазы // Изв. НАН Беларуси. Сер. мед.-биол. наук. 2002. № 1. С. 5—10.

14. Крушинский А.Л, Кузенков В.С., Реутов В.П., Кошелев В.Б., Алексеенко А.А., Сорокина Е.Г., Косицин Н.С. Влияние L-аргинина на развитие стрессорных повреждениИ у крыс линии Крушинского—МолодкиноИ // Новости медико-биологических наук. 2004. № 1. С. 61—64.

15. Palmer R.M.J., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endo-thelium-derived relaxing factor // Nature. 1987. Vol. 327. P. 524—527.

16. Марков Х.М. Окись азота и окись углерода — новый класс сигнальных молекул // Усп. физиол. наук. 1996. Т. 27. № 4. C. 30—43.

17. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестн. РАМН. 2000. № 4. C. 3—5.

18. Zhang F., Iadecola C. Nitroprusside improves blood flow and reduces brain damage after local ischemia // NeuroReport. 1993. Vol. 4. N 5. P. 559—562.

19. Каменский А.А., Савельева К.В. Оксид азота и поведение. М., 2002.

20. Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. Comparative pharmacology of endothelium-derived relaxing factor, nitric oxide and prostacyclin in platelets // Br. J. Pharmacol. 1987. Vol. 92. P. 181—187.

21. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Архипенко Ю.В. Оксид азота в сердечно-сосудистоИ системе: роль в адап-тационноИ защите // Вестн. РАМН. 2000. № 4. С. 17—21.

Поступила в редакцию 14.12.07

NITRIC OXIDE PLAYS A ROLE IN THE PROTECTIVE EFFECTS OF SHORT-TERM ADAPTATION TO HIPOXIA ON THE STRESS-INDUCED DISORDERS IN RATS OF KRUSHINSKY-MOLODKINA STRAIN

V.S. Kuzenkov, V.P. Reutov, A.L. Krushinsky, V.B. Koshelev, E.G. Sorokina, L.M. Baider, Z.V. Kuropteva, L.Kh. Komissarova

The NO-synthase inhibitor LNNA (2,5 mg/100 g) abolished the protective effects of short-term adaptation to hypoxia (1 hour, 5000 m above sea level) on the development of stress-induced disorders on the model of acoustic stress in the Krushinsky—Molodkina rats genetically predisposed to audiogenic seizures. Using electronic spine resonance method (ESR) we also demonstrated an increase in NO production during short-term hypoxia in the blood and spleen. The results suggest that NO plays a positive role in protective effects of short-term adaptation to hypoxia.

Key words: adaptation to hypoxia, nitric oxide, ESR method.

Сведения об авторах

Кузенков Виктор Сергеевич — канд. биол. наук, ст. лаб. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. (495) 304-81-17; e-mail: kouzenkov@mail.ru

Реутов Валентин Палладиевич — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. Института высшеИ нервноИ деятельности и неИрофизиологии РАН. Тел. (495) 390-85-96; e-mail: valeninreutov@mail.ru

Крушинский Алексей Леонидович — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры высшеИ нервноИ деятельности биологического факультета МГУ. Тел. (499) 238-32-81; e-mail: krushinsky@pochta.ru

Кошелев Владимир Борисович — докт. биол. наук, проф. кафедры нормальноИ и патологиче-скоИ физиологии факультета фундаментальноИ медицины МГУ. Тел. (495) 932-89-32; e-mail: koshe-lev@fbm.msu.ru

Сорокина Елена Геннадиевна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. Научного центра здоровья де-теИ РАМН. Тел. (495) 390-85-96; e-mail: sorokina@nczd.ru

Байдер Лариса Михайловна — канд. хим. наук, ст. науч. сотр. Института биохимическоИ физики РАН. Тел. 613-60-33; e-mail: lmbaider@mail.ru

Куроптева Зоя Веньяминовна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. Института биохимическоИ физики РАН. Тел. (499) 193-28-26; e-mail: zvk@sky.chph.ru

Комиссарова Любовь.Хачиковна — канд. хим. наук, ст. науч. сотр. Института биохимическоИ физики РАН. Тел. (495); e-mail: komissarova@mail.ru