СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА
METHOD OF PREPARING INFLUENZA VACCINE

Изобретение относится к вирусологии, иммунологии, биотехнологии и медицине и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики против вирусов гриппа.
Вирус гриппа является возбудителем заболевания, которым каждый год болеют десятки миллионов людей на Земле. Этот вирус относится к группе ортомиксовирусов и состоит из поверхностных белков (гемагглютинина и нейроминидазы), вирусной липидной мембраны (состоящей из фосфолипидов), внутренних белков (мембранный белок, белок нуклеокапсида и белков полимераз) и РНК.
Главным способом борьбы с заболеванием гриппом является иммунопрофилактика при помощи различных вакцин. Вакцины для профилактики гриппа бывают живые (аттенуированные) и инактивированные (цельновирионные, субъединичные, расщепленные, виросомальные).
Известен способ получения живой гриппозной вакцины путем накопления вируса в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, стабилизацией и лиофилизацией целевого продукта, раскрытый в авторском свидетельстве СССР №1743270, 1964. Аналогичный, по существу, способ раскрыт в патенте США №4338296, A61K 39/145, C12N 7/00, 1982. Однако данные способы не обеспечивают высокой иммуногенности целевого продукта, о чем, в частности, сообщается в Руководстве по вакцинному и сывороточному делу (М.: Медицина, 1978, с.232-236).
Известен способ производства инактивированных гриппозных вакцин с использованием адъюванта «МФ-59» (Banzhoff A, Influenza ORV, 2008, v.2, р.243-254). Недостатком указанного способа является повышенная реактогенность полученной вакцины по сравнению с аналогичной вакциной без адъюванта «МФ-59».
1
2
Наиболее близким аналогом является способ получения вакцины "Гриппол" по патенту РФ №2164148, A61K 39/145, A61K 39/385, 2000. Названный способ предполагает заражение куриных эмбрионов вирусами гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (далее - ВАЖ), концентрирование ВАЖ на эритроцитах, очистку вирионов в градиенте плотности сахарозы, расщепление вирионов детергентом ТТАБ, удаление внутренних структур вирионов методом ультрацентрифугирования, удаление детергента диализом, стерилизующая фильтрация полуфабрикатов, добавление полиоксидония, сведение и розлив вакцины. Указанный способ принят в качестве наиболее близкого аналога.
Целью заявляемого изобретения является оптимизация технологии производства, а также создание новых методов очистки и стабилизации гриппозных антигенов, удешевление способа получения вакцины против вируса гриппа, повышение качества препарата.
Поставленная цель достигается тем, что куриные эмбрионы заражают вирусом гриппа, инкубируют, отбирают вируссодержащую жидкость, с использованием формализированных эритроцитов реакторным способом очищают вирусы гриппа, концентрируют элюат на мембранах и проводят окончательную очистку вируса методом гель-фильтрации на колонке с носителем HW-65C (фирма ТОСО, Германия). Очищенные вирионы разрушают детергентом β-октилглюкозидом, который удаляют хроматографией на колонке с Сефадексом G-50, и центрифугируют. Стабилизированный таким образом препарат разводят фосфатным буфером до концентрации по белку не более 200 мкг/мл и проводят стерилизующую фильтрацию. Три полуфабриката вакцины, полученные предложенным способом с использованием серотипов A(H1N1), A(H3N2) и В, объединяют в одной емкости так, чтобы содержание гемагглютинина каждого серотипа составляло около 30 мкг/мл, и разливают по ампулам, получая тривалентный препарат.
Следует отметить, что реакторная технология очистки с помощью эритроцитов позволяет повысить технологичность способа получения вакцины против гриппа. Использование хроматографического носителя HW-65С улучшает качество гриппозной вакцины и позволяет снизить себестоимость ее производства. Дополнение технологического процесса центрифугированием позволяет увеличить стабильность препарата при хранении.
Пример 1
4
50
Для заражения использовали 10-11-дневные куриные эмбрионы, которым взвесь посевного вируса серотипа A(H1N1) вводили в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубировали при 35°С в течение 48 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 15 часов. Для заражения использовали 12000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 10 ЭИД/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 12000 куриных эмбрионов получили около 100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 15 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного до 2-4°С физиологического раствора. Через 15 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 35°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 9,5 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 99,4 мкг/мл.
Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 440 мкг/мл.
Полученные вирионы разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Образовавшуюся смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л.
От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадексе G-50».
Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1400 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.
Пример 2
4
50
Для заражения куриных эмбрионов используют посевной вирус гриппа серотипа В, который готовят с учетом рекомендаций ВОЗ. Для заражения используют 10-11-дневные куриные эмбрионы, которым вводят взвесь вируса в объеме 0,2 мл в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 39°С в течение 72 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 19 часов. Для заражения использовали 14000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 10 ЭИД/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 14000 куриных эмбрионов получили около 120 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 19 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного физиологического раствора. Через 19 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 39°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 10,0 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 96,4 мкг/мл.
Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 435 мкг/мл.
Полученный препарат очищенных вирионов разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Полученную смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л.
От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадексе G-50». Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1500 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.
Пример 3
4
50
Для заражения использовали 10-12-дневные куриные эмбрионы, которым взвесь посевного вируса серотипа A(H3N2) вводили в хориоаллантоисную полость. Эмбрионы инкубировали при 37°С в течение 50 часов, с последующим выдерживанием при температуре 2-4°С в течение 17 часов. Для заражения использовали 12000 куриных эмбрионов, которым вводили по 0,2 мл взвеси возбудителя с инфекционным титром около 10 ЭИД/мл. После инкубации и охлаждения куриных эмбрионов отбирали вируссодержащую аллантоисную жидкость в асептических условиях. Из 12000 куриных эмбрионов получили около 100 л вируссодержащей аллантоисной жидкости, из которой вирус сорбировали в реакторе на формалинизированных эритроцитах при 2-4°С в течение 17 часов. После оседания эритроцитов надосадочную жидкость декантировали, а к осадку добавили около 100 л охлажденного до 2-4°С физиологического раствора. Через 17 часов надосадочную жидкость повторно декантировали, а к осадку эритроцитов добавили около 10 л физиологического раствора с температурой 37°С и осуществляли перемешивание в течение 5 часов при той же температуре. Для отделения эритроцитов от элюата осуществляли центрифугирование взвеси при охлаждении. В результате обработки было получено около 10 л элюата с титром вируса 1/8192. При этом концентрация гемагглютинина составила 99,4 мкг/мл.
Полученный элюат концентрировали до объема 1000 мл, концентрат очищали гель-фильтрацией с использованием носителя HW-65C. Объем собранного препарата составил 1500 мл при концентрации гемагглютинина по ОРИД - 440 мкг/мл.
Полученные вирионы разрушали β-октилглюкозидом. Для этого к 1500 мл препарата добавили 12,0 г детергента, растворенного в 100 мл стерильной воды, и 1500 мл фосфатного буфера, pH 7,2. Образовавшуюся смесь инкубировали 30 минут при 37°С, после чего лизат концентрировали до объема 1 л. От детергента освобождались гель-фильтрацией на носителе «Сефадекс G-50». Очищенный расщепленный препарат собрали в объеме 1400 мл в пике свободного объема колонки и центрифугировали при 80000 g в течение 90 мин для стабилизации препарата. Препарат был разведен так, чтобы концентрация белка была ниже 200 мкг/мл, и подвергнут стерилизующей фильтрации.
Пример 4
Для определения антигенной активности вакцин против гриппа, полученных заявляемым способом и способом, используемым в производстве (патент РФ №2164148), шести беспородным белым мышам массой 18-20 г двукратно внутрибрюшинно с интервалом 14 суток вводили по 0,5 мл вакцины. Через 12-14 суток после повторной иммунизации полученные сыворотки мышей исследовали с гомологичными антигенами вакцины в РТГА по МУ 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Препарат должен вызывать нарастание антител в титрах не ниже 1:40 к каждому из трех входящих в ее состав штаммов вирусов гриппа типа А и В. В качестве контроля брали смесь сывороток от 2-3 неиммунных мышей.
Таблица
Активность вакцин против гриппа, полученных заявляемым способом и способом, используемым в производстве
Наименование вакцины
Тип вируса /Титр антител:
A(H1N1)
A(H3N2)
В
Вакцина, полученная по предлагаемому способом
1:320
1:320
1:160
Вакцина «Гриппол» по патенту №2124148
1:80
1:80
1:40
Контроль
<1:10
<1:10
<1:10
Как видно из результатов, приведенных в таблице, вакцина, произведенная по предлагаемому способу, обладает более высокой антигенной активностью, чем вакцина, произведенная по технологии производства коммерческой вакцины «Гриппол».
Пример 5
Для изучения профилактической эффективности предлагаемой вакцины в многоцентровом, контролируемом, проспективном, рандомизированном исследовании приняли участие 5611 добровольцев (мужчины и женщины) в возрасте от 18 лет и старше, рандомизированных в две группы в соотношении 1,2:0,8. Указанные группы были сформированы в городах Санкт-Петербург, Томск и Пермь. Основная группа добровольцев 3107 человек (группа вакцинированных) была привита предлагаемой вакциной 45 мкг/доза, группе наблюдения численностью 2504 человека препарат не вводили.
В случае заболевания и лабораторного подтверждения диагноза «Грипп» у добровольцев была сопоставлена заболеваемость, оценены клиническое течение и тяжесть заболевания, возникновение осложнений.
В основной и контрольной группах добровольцев на всем протяжении исследования проводили оценку заболеваемости и тяжести клинического течения гриппа, а также осуществляли дифференциальную диагностику гриппа с другими вирусными и бактериальными инфекциями. Грипп диагностировали на основании клинических данных, а именно выявления основных симптомов: высокая температура, достигающая 39-40°С, длительностью около 3-4 дней; озноб; насморк; першение и боль в горле; сухой, лающий кашель, который сохранялся в течение 2 недель; общая выраженная слабость, недомогание, разбитость; боль и «ломота» в мышцах и суставах; одышка; боль при движении глаз; конъюнктивит.
Кроме того, для подтверждения клинического диагноза «Грипп» среди вакцинированных и невакцинированных участников исследования проведены лабораторно-серологические исследования парных сывороток в первые дни заболевания и через 14-21 день, а также оценены клиническое течение и тяжесть заболевания.
Согласно санитарным правилам (Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов. Санитарные правила СП 3.3.2.561-96, М., 1998) профилактическую эффективность вакцины оценивали по двум показателям: индексу эффективности и коэффициенту эффективности.
Проведенный анализ заболеваемости гриппом и ОРВИ в эпидемический сезон 2007-2008 гг. у привитых добровольцев и наблюдательной группы (невакцинированные) в г.Санкт-Петербург, Томске и Пермь позволил рассчитать профилактическую эффективность предлагаемой вакцины. Коэффициент эффективности вакцины в отношении лабораторно-подтвержденного гриппа составил 86,5%, а индекс эффективности - 7,4.
Из литературы известно, что в процессе эпидемиологических исследований вакцины, взятой за прототип (коммерческая вакцина «Гриппол») (Вакцины и лекарственные препараты, www.medep.ru), коэффициент профилактической эффективности составил - 59,3%, а индекс эффективности - 2,0.
По нашему мнению, более высокие значения профилактической эффективности предлагаемой вакцины по сравнению с коммерческой вакциной связаны с тем, что предлагаемая вакцина дополнительно содержит внутренние антигены возбудителя в нативном состоянии. Полученные результаты дают основания считать, что предлагаемая комбинация поверхностных и внутренних антигенов вируса гриппа обеспечивает получение высокоэффективного клеточного и гуморального иммунитета у привитых добровольцев и у лабораторных животных.
В результате проведенных клинических исследований было доказано, что предлагаемый способ производства вакцины обеспечивает получение безопасного и высокоиммуногенного препарата, обладающего высокой профилактической эффективностью и ареактогенностью.