КОНЪЮГАТЫ АФФИННАЯ МОЛЕКУЛА-ОЛИГОНУКЛЕОТИД И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ выбора T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(а) приведение множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со множеством T-клеток;
(b) прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к
(i) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в резервуаре из множества резервуаров и
(ii) полинуклеотиду TCR из отдельной T-клетки из множества T-клеток в резервуаре и
(c) секвенирование олигонуклеотидной части или ее комплементарной последовательности и полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая информацию о последовательности.
2. Способ определения аффинности связывания T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(a) приведение множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со множеством T-клеток;
(b) секвенирование олигонуклеотидной части или ее комплементарной последовательности, таким образом получая информацию о последовательности; и
(c) определение аффинности связывания TCR с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид на основании информации о последовательности.
3. Способ выбора T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(a) приведение множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со множеством T-клеток, при этом молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержат выявляемую часть;
(b) получение обогащенной популяции T-клеток из множества T-клеток из (a) на основании выявления выявляемой части;
(c) выделение отдельной T-клетки, связанной с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, из обогащенной популяции в первый резервуар из множества резервуаров,
(d) прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к
(i) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в первом резервуаре и
(ii) полинуклеотиду TCR из отдельной T-клетки в первом резервуаре и
(e) секвенирование олигонуклеотидной части или ее комплементарной последовательности и полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая информацию о последовательности.
4. Способ выбора T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(a) приведение множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со множеством T-клеток, при этом молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержат выявляемую часть;
(b) получение обогащенной популяции T-клеток из множества T-клеток из (a) на основании выявления выявляемой части;
(c) выделение отдельной T-клетки, связанной с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, из обогащенной популяции в первый резервуар из множества резервуаров,
(d) секвенирование олигонуклеотидной части или ее комплементарной последовательности и полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая информацию о последовательности; и
(e) определение аффинности связывания TCR, кодируемого полинуклеотидом TCR, с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид на основании информации о последовательности.
5. Способ по п. 3 или 4, при этом обогащенная популяция T-клеток содержит соотношение T-клеток, связанных с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, к общему количеству T-клеток, которое является большим, чем соотношение T-клеток, связанных с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, к общему количеству T-клеток во множестве T-клеток после контакта.
6. Способ выбора T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(a) приведение первого множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт с первым множеством T-клеток при первом соотношении молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид и клеток,
(b) приведение второго множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со вторым множеством T-клеток при втором соотношении молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид и клеток, которое является более низким, чем первое соотношение молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид и клеток,
(c) прикрепление первого меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к
(i) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в первом резервуаре из множества резервуаров и
(ii) первому полинуклеотиду TCR из отдельной T-клетки из первой популяции T-клеток в первом резервуаре,
(d) прикрепление второго меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к
(i) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид во втором резервуаре из множества резервуаров и
(ii) второму полинуклеотиду TCR из отдельной T-клетки из второй популяции T-клеток во втором резервуаре;
(e) секвенирование олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в первом резервуаре или ее комплементарной последовательности и первого полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая первый набор информации о последовательности,
(f) секвенирование олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид во втором резервуаре или ее комплементарной последовательности и второго полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая второй набор информации о последовательности,
(g) определение первого сигнала от связывания TCR, кодируемого первым полинуклеотидом TCR, с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид на основании первого набора информации о последовательности, и определение второго сигнала от связывания TCR, кодируемого вторым полинуклеотидом TCR, с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид на основании второго набора информации о последовательности,
при этом первый полинуклеотид TCR и второй полинуклеотид TCR кодируют один и тот же TCR.
7. Способ по п. 1 или 3, дополнительно включающий определение аффинности связывания TCR, кодируемого полинуклеотидом TCR, с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид на основании информации о последовательности.
8. Способ по п. 6, дополнительно включающий определение аффинности связывания одного и того же TCR, кодируемого первым полинуклеотидом TCR и вторым полинуклеотидом TCR, на основании первого сигнала от связывания и второго сигнала от связывания.
9. Способ по п. 6, при этом молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид из первого и второго множества содержат один и тот же пептид.
10. Способ по п. 6 или 9, при этом MHC в составе молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид из первого и второго множества относятся к одному и тому же подтипу.
11. Способ выбора T-клеточного рецептора (TCR), включающий
(a) приведение множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид в контакт со множеством T-клеток,
(b) прикрепление
(i) первого меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в первом резервуаре из множества резервуаров,
(ii) первому полинуклеотиду TCR из первой отдельной T-клетки из популяции T-клеток в первом резервуаре,
(iii) второго меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид во втором резервуаре из множества резервуаров и
(iv) полинуклеотида TCR из второй отдельной T-клетки из популяции T-клеток во втором резервуаре;
(c) секвенирование
(i) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид в первом резервуаре или ее комплементарной последовательности и первого полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая первый набор информации о последовательности, содержащий риды последовательности штрих-кода резервуара полинуклеотида TCR и риды последовательности штрих-кода резервуара олигонуклеотида, и
(ii) олигонуклеотидной части молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид во втором резервуаре или ее комплементарной последовательности и второго полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности, таким образом получая второй набор информации о последовательности, содержащий риды последовательности штрих-кода резервуара полинуклеотида TCR и риды последовательности штрих-кода резервуара олигонуклеотида;
(d) сравнение аффинности связывания TCR, кодируемого первым полинуклеотидом TCR, и аффинности связывания TCR, кодируемого вторым полинуклеотидом TCR, при этом аффинность связывания TCR, кодируемого первым полинуклеотидом TCR, определяют на основании первого набора информации о последовательности, и при этом определение аффинности связывания TCR, кодируемого вторым полинуклеотидом TCR, осуществляют на основании второго набора информации о последовательности; и
(e) выбор TCR, кодируемого первым полинуклеотидом TCR, на основании сравнения, при этом выбранный TCR, кодируемый первым полинуклеотидом TCR, характеризуется более сильной аффинностью связывания, чем TCR, кодируемый вторым полинуклеотидом TCR.
12. Способ по п. 11, при этом первая отдельная T-клетка происходит из пациента с заболеванием или состоянием.
13. Способ по п. 12, при этом вторая отдельная T-клетка происходит из пациента без заболевания или состояния.
14. Способ по любому из пп. 1, 6-13, при этом молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержат выявляемую часть.
15. Способ по п. 14, при этом получение обогащенной популяции T-клеток основывается на выявлении выявляемой части.
16. Способ по п. 14 или 15, при этом выявляемая часть содержит флуорофор.
17. Способ по любому из пп. 1-16, при этом последовательность штрих-кода резервуара в меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности в первом резервуаре отличается от последовательности штрих-кода резервуара в меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его ампликоне во втором резервуаре из множества резервуаров.
18. Способ по любому из пп. 1-17, при этом информация о последовательности содержит риды последовательности штрих-кода резервуара полинуклеотида TCR и риды последовательности штрих-кода резервуара олигонуклеотида.
19. Способ по любому из пп. 1, 6-18, при этом способ дополнительно включает после контакта получение обогащенной популяции T-клеток, содержащей более высокий процент T-клеток, связанных с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, чем процент T-клеток, связанных с молекулой конъюгата pMHC-олигонуклеотид, во множестве T-клеток после контакта.
20. Способ по любому из пп. 1-19, при этом способ дополнительно включает определение количества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид, связанных с отдельной клеткой.
21. Способ по любому из пп. 1-20, при этом олигонуклеотидная часть конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержит последовательность молекулярного штрих-кода тетрамера (TMB), которая является уникальной для отдельной молекулы конъюгата pMHC-олигонуклеотид из множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид.
22. Способ по п. 21, при этом информация о последовательности содержит риды последовательности молекулярного штрих-кода тетрамера.
23. Способ по п. 21 или 22, при этом количество молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид, связанных с одной T-клеткой, определяют из информации о последовательности.
24. Способ по любому из пп. 21-23, при этом количество молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид, связанных с отдельной T-клеткой, определяют из ридов последовательности молекулярного штрих-кода тетрамера.
25. Способ по любому из пп. 21-24, при этом каждая молекула конъюгата pMHC-олигонуклеотид из множества молекул конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержит уникальную последовательность TMB.
26. Способ по любому из пп. 1-25, при этом pMHC часть конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержит мультимер pMHC, необязательно, тетрамер pMHC.
27. Способ по любому из пп. 1-26, при этом MHC присутствует в растворимой форме.
28. Способ по любому из пп. 1-27, при этом пептид в составе pMHC части конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержит синтетический пептид.
29. Способ по любому из пп. 1-28, при этом pMHC часть связывается с T-клеточным рецептором (TCR) отдельной T-клетки.
30. Способ по любому из пп. 1-29, при этом олигонуклеотидная часть содержит идентификационную последовательность тетрамера (TID).
31. Способ по п. 30, при этом TID выступает в качестве штрих-кода для пептида или pMHC части конъюгата pMHC-олигонуклеотид.
32. Способ по любому из пп. 1-31, при этом меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид происходит из матричного меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида в резервуаре.
33. Способ по любому из пп. 1-32, при этом способ дополнительно включает определение характеристики отдельной T-клетки в резервуаре на основании информации о последовательности.
34. Способ по п. 33, при этом информация о последовательности содержит идентификационную последовательность тетрамера (TID) или ее комплементарную последовательность и/или содержит количество копий молекул, имеющих последовательность TID.
35. Способ по любому из пп. 1-34, при этом способ дополнительно включает отмывку множества T-клеток после контакта.
36. Способ по любому из пп. 1, 6-35, при этом способ дополнительно включает выделение отдельной T-клетки в резервуаре.
37. Способ по п. 36, при этом отдельная T-клетка связывается с конъюгатом pMHC-олигонуклеотид до выделения.
38. Способ по любому из пп. 1-37, при этом способ дополнительно включает лизис отдельной T-клетки.
39. Способ по п. 38, при этом лизис осуществляют после выделения отдельной T-клетки в резервуаре.
40. Способ по любому из пп. 1-39, при этом множество T-клеток представляет собой множество несортированных T-клеток.
41. Способ по любому из пп. 1-40, при этом последовательность штрих-кода резервуара в меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности в первом резервуаре из множества резервуаров отличается от последовательности штрих-кода резервуара в меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности во втором резервуаре из множества резервуаров.
42. Способ по любому из пп. 1-41, при этом последовательность штрих-кода резервуара в каждом меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности в отдельном резервуаре из множества резервуаров содержит одинаковую последовательность штрих-кода резервуара.
43. Способ по любому из пп. 1-42, при этом последовательность штрих-кода резервуара в каждом меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности в любом отдельном резервуаре из множества резервуаров является уникальной для последовательности штрих-кода резервуара в каждом меченом штрих-кодом резервуара полинуклеотиде или его комплементарной последовательности в любом другом отдельном резервуаре из множества резервуаров.
44. Способ по любому из пп. 1-43, при этом прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида к олигонуклеотидной части и прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида к полинуклеотиду TCR из отдельной T-клетки осуществляют одновременно.
45. Способ по любому из пп. 1-44, при этом способ дополнительно включает амплификацию олигонуклеотида или его комплементарной последовательности.
46. Способ по любому из пп. 1-45, при этом способ дополнительно включает амплификацию клеточного полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности.
47. Способ по п. 46, при этом амплификацию олигонуклеотида или его комплементарной последовательности и амплификацию полинуклеотида TCR или его комплементарной последовательности осуществляют одновременно.
48. Способ по любому из пп. 44-47, при этом последовательность штрих-кода резервуара в клеточном полинуклеотиде и последовательность штрих-кода резервуара в олигонуклеотиде является одинаковой.
49. Способ по любому из пп. 1-48, при этом способ дополнительно включает объединение олигонуклеотидов, их амплифицированных продуктов или их комплементарных последовательностей из двух или более резервуаров из множества резервуаров.
50. Способ по п. 49, при этом способ дополнительно включает объединение олигонуклеотидов, их амплифицированных продуктов или их комплементарных последовательностей и полинуклеотидов TCR или их комплементарных последовательностей из двух или более резервуаров из множества резервуаров.
51. Способ по п. 49 или 50, при этом объединение осуществляют до секвенирования.
52. Способ по любому из пп. 1-51, при этом конъюгат pMHC-олигонуклеотид содержит множество отличающихся конъюгатов pMHC-олигонуклеотид.
53. Способ по п. 52, при этом каждый конъюгат pMHC-олигонуклеотид из множества конъюгатов pMHC-олигонуклеотид содержит уникальную идентификационную последовательность тетрамера (TID).
54. Способ по любому из пп. 1-53, при этом олигонуклеотид содержит последовательность для слияния, и прикрепление включает прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида к последовательности для слияния.
55. Способ по любому из пп. 1-54, при этом олигонуклеотид содержит последовательность для связывания праймера.
56. Способ по любому из пп. 1-55, при этом олигонуклеотид содержит константную последовательность.
57. Способ по любому из пп. 1-56, при этом способ дополнительно включает анализ последовательностей штрих-кода резервуара в ридах последовательности олигонуклеотида.
58. Способ по любому из пп. 1-57, при этом способ дополнительно включает анализ идентификационных последовательностей тетрамера (TID) в ридах последовательности олигонуклеотида.
59. Способ по любому из пп. 1-58, при этом способ дополнительно включает анализ последовательностей молекулярного штрих-кода тетрамера (TMB) в ридах последовательности олигонуклеотида.
60. Способ по п. 59, при этом анализ включает определение частоты одной или нескольких последовательностей штрих-кода резервуара, одной или нескольких последовательностей TID, одной или нескольких последовательностей молекулярного штрих-кода тетрамера (TMB) или их комбинации.
61. Способ по п. 59 или 60, при этом анализ включает сравнение.
62. Способ по любому из пп. 57-61, при этом способ дополнительно включает сравнение идентификационных последовательностей тетрамера (TID) в ридах последовательности олигонуклеотида с последовательностями молекулярного штрих-кода тетрамера (TMB) в ридах последовательности олигонуклеотида.
63. Способ по любому из пп. 44-62, при этом способ дополнительно включает секвенирование полинуклеотида TCR, его комплементарных последовательностей, его амплифицированных продуктов или их комбинации, таким образом получая риды последовательности полинуклеотида TCR.
64. Способ по п. 63, при этом способ дополнительно включает сравнение ридов последовательности олигонуклеотида с ридами последовательности полинуклеотида TCR.
65. Способ по п. 63 или 64, при этом способ дополнительно включает сравнение последовательностей штрих-кода резервуара в ридах последовательности олигонуклеотида с последовательностями штрих-кода резервуара в ридах последовательности полинуклеотида TCR.
66. Способ по любому из пп. 63-65, при этом способ дополнительно включает сравнение ридов последовательности полинуклеотида TCR.
67. Способ по любому из пп. 63-66, при этом способ дополнительно включает анализ последовательностей штрих-кода резервуара в ридах последовательности полинуклеотида TCR.
68. Способ по любому из пп. 63-67, при этом способ дополнительно включает анализ последовательностей молекулярного штрих-кода в ридах последовательности полинуклеотида TCR.
69. Способ по любому из пп. 63-68, при этом способ дополнительно включает определение характеристики клетки на основании анализа или сравнения.
70. Способ по любому из пп. 57-69, при этом способ дополнительно включает выбор TCR на основании ридов последовательности олигонуклеотида.
71. Способ по любому из пп. 63-70, при этом способ включает выбор TCR на основании ридов последовательности полинуклеотида TCR.
72. Способ по любому из пп. 1-71, при этом меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид, прикрепленный к олигонуклеотиду, и меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид, прикрепленный к полинуклеотиду TCR, происходят из одного и того же матричного меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида в резервуаре.
73. Способ по любому из пп. 1-72, при этом меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид, прикрепленный к олигонуклеотиду, представляет собой продукт амплификации матричного меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида.
74. Способ по п. 72 или 73, при этом меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид, прикрепленный к полинуклеотиду TCR, представляет собой продукт амплификации матричного меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида.
75. Способ по любому из пп. 1-74, при этом резервуар содержит твердую подложку.
76. Способ по любому из пп. 1-74, при этом резервуар не содержит твердую подложку.
77. Способ по любому из пп. 1-76, при этом каждый резервуар из множества резервуаров содержит отдельную клетку.
78. Способ по любому из пп. 1-77, при этом резервуар представляет собой лунку, эмульсию или каплю.
79. Способ по любому из пп. 1-78, при этом матричный меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид не связан с твердой подложкой.
80. Способ по любому из пп. 1-78, при этом матричный меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид связан с твердой подложкой.
81. Способ по любому из пп. 1-80, при этом способ дополнительно включает прикрепление последовательности молекулярного штрих-кода в меченом молекулярным штрих-кодом полинуклеотиде из множества меченых молекулярным штрих-кодом полинуклеотидов к полинуклеотиду TCR, при этом последовательность молекулярного штрих-кода выступает в качестве штрих-кода для отдельной молекулы полинуклеотида TCR и ее амплифицированных продуктов.
82. Способ по любому из пп. 1-81, при этом прикрепление включает лигирование меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности с олигонуклеотидом.
83. Способ по любому из пп. 1-82, при этом прикрепление включает прикрепление меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности к олигонуклеотиду с помощью фермента.
84. Способ по любому из пп. 1-83, при этом прикрепление включает гибридизацию меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида или его комплементарной последовательности с олигонуклеотидом.
85. Способ по п. 84, при этом прикрепление дополнительно включает достройку олигонуклеотида.
86. Способ по любому из пп. 1-85, при этом прикрепление включает амплификацию матричного меченого штрих-кодом резервуара полинуклеотида.
87. Способ по любому из пп. 1-86, при этом олигонуклеотид является двухцепочечным.
88. Способ по любому из пп. 1-86, при этом олигонуклеотид является одноцепочечным.
89. Способ по любому из пп. 1-88, при этом олигонуклеотид представляет собой ДНК.
90. Способ по любому из пп. 1-88, при этом олигонуклеотид представляет собой РНК.
91. Способ по любому из пп. 1-90, при этом клеточный полинуклеотид содержит последовательность вариабельного участка.
92. Способ по любому из пп. 1-91, при этом способ дополнительно включает спаривание последовательностей нативных цепей TCR, содержащих последовательность вариабельного участка.
93. Способ по любому из пп. 1-92, при этом полинуклеотид TCR представляет собой ДНК.
94. Способ по любому из пп. 1-93, при этом полинуклеотид TCR представляет собой РНК.
95. Способ по п. 94, при этом РНК представляет собой мРНК.
96. Композиция, содержащая множество резервуаров, при этом резервуар из множества резервуаров содержит
(a) отдельную T-клетку из образца, содержащего множество T-клеток, и
(b) меченый штрих-кодом резервуара полинуклеотид, содержащий последовательность штрих-кода резервуара,
при этом резервуар дополнительно содержит конъюгат pMHC-олигонуклеотид, который связывается с TCR отдельной T-клетки.
97. Композиция, содержащая множество резервуаров, при этом резервуар из множества резервуаров содержит
(a) отдельную лизированную T-клетку из образца, содержащего множество T-клеток, и (b) конъюгат pMHC-олигонуклеотид, содержащий pMHC часть, которая связывается с TCR отдельной лизированной T-клетки;
при этом олигонуклеотидная часть конъюгата pMHC-олигонуклеотид содержит последовательность штрих-кода резервуара, и при этом полинуклеотид TCR из отдельной лизированной T-клетки содержит одинаковую последовательность штрих-кода резервуара.