НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ЛИСТВЕННЫХ ПОРОД - ГРИБА POLYPORUS SQUAMOSUS МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES KIT FOR DNA DETECTION OF POLYPORUS SQUAMOSUS FUNGUS - HARDWOOD DISEASE AGENT BY POLYMERASE CHAIN REACTION

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярно-генетической диагностике фитопатогенов леса и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней лиственных пород - гриба Polyporus squamosus методом полимеразной цепной реакции. Изобретение может быть использовано фитокарантинными службами для экспресс-диагностики фитопатогена в ПЦР-лабораториях и в научно-исследовательских целях.
Уровень техники
Polyporus squamosus (чешуйчатый трутовик) - гриб, вызывающий белую раневую ядровую гниль многих лиственных пород (ильмовых, клена, липы, дуба, тополя, березы и других). Плодовые тела гриба однолетние, в виде шляпок с немного загнутыми краями и чаще всего боковой ножкой. Поверхность шляпки немного вдавленная, желтоватая, с крупными коричневыми чешуйками. Кожа мясистая, коричневая, с черным основанием. Ткань плодового тела в свежем состоянии белая, мягкая, при высыхании желтеет и крошится. Гименофор трубчатый, с очень большими, в виде ячеек, угловатыми, часто расщепленными порами.
Заражение ствола происходит через раны в коре, морозобоины и другие повреждения. Гниль, вызываемая чешуйчатым трутовиком, ядровая, но распространяется и на заболонь. Развивается чаще всего в нижней части ствола, иногда заходит в корни. В конечной стадии гниль становится белой, часто с темными линиями, и в ней появляются многочисленные трещинки, идущие в разных направлениях, в трещинах образуются скопления белого мицелия.
Чешуйчатый трутовик является типичным раневым паразитом и особенно часто встречается в поврежденных старых древостоях, лесопарках и других насаждениях с высокой рекреационной нагрузкой.
Для эффективной борьбы с грибами фитопатогенами леса наибольшее значение имеет точность определения конкретного патогена до вида. В последнее время в практику исследований входит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). С этой целью на базе ПЦР нами разработаны методы молекулярно-генетической идентификации грибов фитопатогенов. Применение данного подхода в комплексе с классическими методами систематики позволяет значительно повысить скорость определения и добиться практически 100% точности определения.
ITS-регион - наиболее секвенируемый регион у грибов. Он широко используется в молекулярной систематике грибов на уровне видов и может служить маркером даже для внутривидового определения (например, у географически разобщенных внутривидовых типов или штаммов).
Так как эти регионы непосредственно не связаны с кодированием РНК, они активно изменятся в процессе эволюции, что и создает предпосылки для использования их в качестве маркеров эволюционных событий.
При этом у гриба Polyporus squamosus эта область изучена слабо, в литературе и патентных базах мы не обнаружили праймеров, подобранных на эту область.
Осуществление изобретения
Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.
1. С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома, уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов). В данном случае на основе анализа баз релевантных последовательностей мы не обнаружили, поэтому на автоматическом секвенаторе было впервые проведено секвенирование ITS-области этого гриба. Последовательность сиквенса представлена на фиг 1.
2. На основании секвенированного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (2 праймера). Для этого секвенированная последовательность выравнивается с гомологичными последовательностями (близкородственных грибов) и подбираются праймеры, уникальные для искомой последовательности.
3. Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.
4. С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).
Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК фитопатогенного гриба гриба Polyporus squamosus, который вызывает белую раневую ядровую гниль многих лиственных пород (ильмовых, клена, липы, дуба, тополя, березы и других). Однако аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этого гриба не известны.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанного гриба в биологическом материале (защищенный грунт, семена, растения, кора).
Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур - гриба Polyporus squamosus, включающего в себя праймеры:
5'-TGT ATT GTG ATG TAA CGC АТС G-3'
5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'
Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ.
2
1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку гриба Polyporus squamosus - область ITS, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MGCl), внутренний контрольный образец (ВК).
Праймеры представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.
2) Раствор фермента Taq-полимеразы.
3) Положительный контрольный образец - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 453 п.н. генома гриба Polyporus squamosus. Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках, с тем, как должно получаться при "положительной реакции". Соответственно, добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.
4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.
Данный набор применяется следующим образом.
1) Биологический материал (защищенный грунт, семена, растения, кора) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую в свою очередь используют для ПЦР.
2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.
3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.
4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К- (отрицательный контрольный образец), К+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.
5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец.
6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец.
7) Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно следующей программе: 1 цикл 95°C 5 минут, 35 циклов 94°C 45 секунд, 55°C 45 секунд, 72°C 45 секунд, 1 цикл 72°C 10 минут. Хранение 4°C. Могут быть использованы амплификаторы любых производителей.
8) Анализ продуктов реакции проводится с помощью гель электрофореза продуктов реакции в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Визуализируется полоса длиной 453 п.о. с помощью трансиллюминатора.
Положительный результат ПЦР во многом зависит от качества ДНК, выделенной из исследуемого материала. Для решения задачи выделения ДНК из грибов фитопатогенов леса с целью последующей молекулярно-генетической идентификации лучше всего использовать свежесобранные образцы либо высушенный гербарный материал.
Следует понимать, что специалист в данной области техники может без дополнительных экспериментов, с учетом настоящего описания, применить настоящее изобретение на практике в полном объеме. Следовательно, приведенное в данном контексте описание изобретения представлено для иллюстрации, не уменьшающей объем притязаний.