Редактирование генома на клеточной модели генетической формы болезни Паркинсона

РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА НА КЛЕТОЧНОй МОДЕЛИ генетической формы БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА

А.С. Ветчинова 1, Е.В. Коновалова 1, П.Ю. Волчков 2, НЮ. Абрамычева 1, С.Н. Иллариошкин 1

1 Научный центр неврологии, Москва, Россия

2 Московский физико-технический институт, Долгопрудный, Россия

Genome editing on cell model of the genetic form of Parkinson's disease

A.S. Vetchinova 1, E.V. Konovalova 1, P.Yu. Volchkov2, N.Yu. Abramycheva 1, S.N. Illarioshkin 1

1 Research Center of Neurology, Moscow, Russia

2 Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, Russia

В современной нейробиологии все большую роль играют новые высокотехнологичные подходы к моделированию нейродегенеративных заболеваний человека. Среди них — направленное геномное редактирование с помощью искусственных нуклеазных систем (CRiSPR/Cas9 и др.), позволяющее осуществлять коррекцию генетических дефектов на уровне клеток. Особенно перспективным представляется применение технологии геномного редактирования специализированных нейронов и индуцированных плюрипотент-ных стволовых клеток, получаемых от больных с наследственными формами нейродегенеративных заболеваний в результате клеточного репрограммирования.

Нами с помощью системы CRiSPR/Cas9 проведено редактирование генома индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из фибробластов пациента с аутосомно-рецессивной формой болезни Паркинсона — носителя компаунд-гетерозиготных мутаций в гене РАЙК2.

В результате геномного редактирования удалось восстановить нормальную нуклеотидную последовательность в обеих аллелях гена РАЙК2, исправив экзонную Ше1202-203AG) и интронную (^1+^/А) мутации. Возможность коррекции генома и последующего получения из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток нормальных дофаминергических нейронов имеет большое значение как для изучения молекулярных основ нейродегенера-тивной патологии, так и для успешного развития методов клеточной терапии при болезни Паркинсона.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, ген РАЙК2, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, редактирование генома, CRiSPR/Cas9.

New technological approaches for modeling of neurodegenerative disorders play growing role in modern neurobiology. One of such technologies is targeted genome editing with the use of artificial nuclease systems (CRiSPR/ Cas9, etc.), that allow to correct genetic defects on the cellular level. Especially promising is the use of genome editing technology on specialized neurons and induced pluripotent stem cells obtained by cell reprogramming from patients with hereditary forms of neurodegenerative diseases.

Using CRiSPR/Cas9 system we performed editing of genome of induced pluripotent stem cells obtained from fibroblasts of a patient with autosomal recessive form of Parkinson's disease carrying compound heterozygous mutations in the PARK2 gene.

Genome editing allowed to restore normal nucleotide sequence in both alleles of the PARK2 gene, correcting exonic (del202-203AG) and intronic (iVS1+1G/A) mutations. Possibility of genome editing and further obtaining of normal dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells is important both for studies of molecular mechanisms of neurodegenerative disorders and for successful development of cell therapy methods for Parkinson's disease.

Keywords: Parkinson's disease, PARK2 gene, induced pluripotent stem cells, genome editing, CRiSPR/Cas9.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, обусловленным гибелью дофаминергических нейронов среднего мозга и падением уровня нейротрансмит-тера дофамина в стриатуме, что приводит к мышечной ригидности, гипокинезии, тремору, посту-ральной неустойчивости и другим неврологическим проявлениям [1]. В механизмах развития БП важная роль принадлежит «генетике». На сегодняшний день известны 20 самостоятельных локусов БП, что свидетельствует о ее выраженной гетерогенности и потенциально большом числе молекулярных путей, ведущих к патологии нигростриатной системы [2, 3]. Один из наиболее часто вовлекаемых генов — PARK2 — расположен на хромосоме 6q25.2-27 и связан с развитием аутосомно-рецессивной БП с ранним проявлением симптомов [4].

Благодаря последним открытиям в области молекулярной и клеточной биологии в настоящее время активно развиваются высокотехнологичные подходы для исследования «моделей заболевания в пробирке» [5]. Индуцированные плюрипотентные стволовые

e-mail: snillario@gmail.com

клетки (ИПСК), полученные из зрелых соматических клеток, представляют собой уникальную платформу для моделирования нейродегенеративных заболеваний, изучения их тонких патофизиологических основ и оценки действия лекарственных препаратов [6—9]. Такие модели на основе ИПКС позволяют преодолевать трудности в изучении нейродегенеративной патологии, связанные с ограниченным доступом к человеческим нервным клеткам [10].

Нами была создана клеточная модель генетической БП в результате репрограммирования фибро-бластов кожи пациента с мутациями в гене РАИК2 [8]. Полученные ИПСК были успешно дифференцированы в дофаминергические нейроны [11, 12]. Показано, что уровень проапоптотического белка Вак в клетках с мутацией РАИК2 практически в два раза ниже по сравнению со здоровыми клетками, тогда как экспрессия антиапоптотических факторов Вс1-Х1_, Вс!^ и Вс1-2 была достоверно увеличена в мутантных клетках по сравнению со здоровыми до-фаминергическими нейронами [13]. Эти данные позволили предположить, что мутации в гене РАИК2 сопровождаются сложной разбалансировкой систем

программируемой клеточной гибели, в рамках которой ведущая роль принадлежит неапоптозным молекулярным механизмам. Установлена также функциональная несостоятельность дофаминового транспортера в мутантных дофаминергических нейронах, несмотря на повышенную экспрессию данного белка в культуре [14]. Таким образом, созданная клеточная модель позволила раскрыть ряд важных молекулярных механизмов РА1Ж2-формы БП.

Полученные в результате репрограммирования РА1Ж2-дофаминергические нейроны были трансплантированы в стриатум крыс с токсической экспериментальной моделью паркинсонизма, индуцированного введением 6-гидроксидофамина в черную субстанцию [11]. Отмеченный при этом у животных терапевтический эффект сопровождался отчетливой дофаминергической реиннервацией стриатума, подтвержденной иммуноцитохимическими методами [11, 15]. Полученные результаты продемонстрировали, что нейроны с мутациями в гене PARK2 сохраняют определенную функциональную активность in vivo на протяжении длительного времени после нейротрансплантации, однако к 120 сут. наблюдения эта активность начинает постепенно снижаться [15]. Очевидно, что общий репаративный потенциал мутантных нейронов ограничен, поэтому для успешной реализации данного терапевтического подхода в клинике требуется коррекция нарушенной нуклео-тидной последовательности гена.

Такая коррекция может быть осуществлена с помощью новейших технологий направленного геномного редактирования, основанных на использовании искусственных программируемых нуклеазных систем [16, 17]. Для прицельной генетической модификации сайтов-мишеней применяют искусственные нуклеазные системы на основе белков с «цинк-пальцевыми» доменами (ZNF) [18], аналогов транскрипционных активаторов (TALEN) [19] и бактериальных CRiSP-локусов, ассоциированных с ферментом Cas9 и использующих короткие РНК при распознавании мишени (CRiSPR/Cas9) [20]. Система CRiSPR/Cas9 за последние годы благодаря своей простоте и эффективности уже нашла применение в самых различных областях фундаментальной и прикладной биологии, биотехнологии и медицины. С помощью системы CRiSPR/Cas9 можно осуществлять все виды модификаций генома: вносить точковые мутации, встраивать в определенные места новые гены либо, наоборот, удалять крупные участки ну-клеотидных последовательностей, исправлять или заменять отдельные генетические элементы и фрагменты генов [17, 21-23].

В нашей работе мы впервые предприняли попытку коррекции мутаций в гене PARK2 в уже упомянутой выше культуре ИПСК, полученной из фибробластов пациента с аутосомно-рецессивной формой БП. Развитие данного подхода позволит значительно расширить возможности персонифицированной медицины и неврологии и улучшить результаты проводимого лечения у конкретного пациента.

Материал и методы

В работе были использованы культуры клеток здорового донора и пациента с аутосомно-рецес-сивной ювенильной формой БП, являющегося носителем компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2 (del202-203AG и iVS1+1G/A). Из биоптатов кожи обоих исследуемых лиц нами ранее получены фибробласты, которые были репрограммированы при помощи оригинальных лентивирусных векторов с факторами плюрипотентности (LeG0-h0CT4, LeG0-hS0X2-iRES-GFP, LeG0-hc-Myc, LeG0-hKLF4) с целью получения клонов ИПСК [8]. В результате репрограммирования были получены клеточная линия Tr5, несущая мутации в гене PARK2, и клеточная линия от здорового пациента без мутаций.

Анализ нуклеотидных последовательностей в «областях интереса» в гене PARK2, а также последовательностей спейсоров РНК-гидов проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, США). Ниже представлена структура праймеров, задействованных в работе:

• PARK2_1F: 5'-GTGAGGAGAAACTACGCGTTAGAA-3';

• PA RK2_1R: 5'-GTCATTGACAGTTGGCACCG-3';

• Park 2.2 forw_long: 5'-GGAAATCTCGTGGGTAACTAACTCTG-3';

• Park2.2rev_long:5'-ATTCACTAAGCCTAGCTCGTGTG-3'.

Для выбора двухцепочечных спейсоров при работе с системой CRiSPR/Cas9 применяли следующие биоинформатические ресурсы и программы: www.gemome-engineering.org,www.dna20.com/ ecommerse/cas9/input и www.e-crisp.org.

В нашей работе мы использовали плазмиды pgRNA и pCaG_Cas9_GFP (Addgene iDs #44251, #44719, США).

Подобранные с помощью биоинформационных программ гиды клонировали в вектор рgRNA рестрикцией по сайтам Nde i и Xba i. Сайты рестрикции вносились в ПЦР-продукты благодаря дизайну соответствующих праймеров: F0RW Nde i (5'-AATGGACTA TCATATGCTTACCGTAACTTG-3') и REV Xba i (5'-AACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTCTAGAA-3').

Для ПЦР-амплификации спейсоров РНК-гидов применяли различные пары праймеров, нуклеотид-ные последовательности которых приведены в табл.

Таблица. Праймеры, использованные для амлификации спейсоров РНК-гидов

Последовательность спейсоров

Праймер прямой

Праймер обратный

РНК-гид для

коррекции мутации в интроне

РНК-гид для

коррекции мутации в экзоне

№ 2: AGTGACCATGATAGATACGTGG AGTGACCATGATAGATACGGTTTTAGAGC

№ 14: TAGGTACGTGGGTACCTGCCAGG TAGGTACGTGGGTACCTGCCGTTTTAGAGCT

№ 6: GTGTCAGAATCGACCTCCACTGG GTGTCAGAATCGACCTCCACGTTTTAGAGC

№ 15: CAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGG CAGCATCTTCCAGCTCAAGGGTTTTAGAG

№ 16: GGAGGTGGTTGCTAAGCGACAGG GGAGGTGGTTGCTAAGCGACGTTTTAGAGC

CGTATCTATCATGGTCACTCCGGTG GGCAGGTACCCACGTACCTACCGGTG

GTGGAGGTCGATTCTGACACCCGGTG CCTTGAGCTGGAAGATGCTGCCGGTG GTCGCTTAGCAACCACCTCCCCGGTG

Первоначально с внешним праймером FORW Nde i и внутренними праймерами REV амплифицировали продукт длиной 104 п.о., а с помощью внутренних праймеров FORW и внешнего праймера REV Xba i — продукт длиной 129 п.о. ПЦР-продукты наносили на 2% агарозный гель и после разделения фрагменты элюировали из геля с применением набора isolate ii PCR and gel kit (Bioline, Великобритания). В следующем раунде амплификации с праймерами FORW Nde i и REV Xba i в качестве матрицы брали элюирован-ные фрагменты. Полученный ПЦР-продукт для каждого гида секвенировали, а затем лигировали с помощью набора NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (BioLabs, Великобритания) в плазмиду рд^А, предварительно рестрицированную по сайтам Nde i и Xba i. Клетки E. coli трансформировали 10 мкл ли-газной смеси согласно стандартному протоколу. Для дальнейшего анализа выросшие колонии (по десять для каждого двухцепочечного спейсора) проверяли на наличие и размер вставок при помощи ПЦР без выделения плазмидной ДНК с праймеров, указанных в табл. Продукты ПЦР-амплификации анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Из проанализированных таким образом клонов (n = 50) 32 колонии содержали вставку необходимой длины (200 п.н.).

Отобранные клоны для гидов № 2, 6, 14, 15 и 16 (табл.) нарастили и выделили из них плазмиды в препаративных количествах.

Для доставки в ИПСК генетических конструкций (плазмиды, одноцепочечные донорные молекулы ДНК) применяли метод липофильной трансфекции с Turbofect (Fermentas, США). В качестве донорных молекул были использованы нижеследующие олиго-нуклеотиды длиной 120 п.о. (Евроген, Россия):

• WT-iNTRON: CCGCTGCGCG CATGGGCCTG TTCCTGGCCC GCAGCCGCCA CCTACCCAGTGA CCATGATAGGTA CGTGGGTACCTG CCAGGTACAG CCTCTCTGCG CCGCCCCAC GCCCCGGTA TGGCGC;

• WT-Exon: CCCAGTGGAG GTCGATTCTG ACACCAGCAT CTTCCAGCTC AAGGAGGTGG TTGCTAAGCG ACAGGGGGTT CCGGCTGACC AGTTGCGTGT GATTTTCGCA GGGAAGGAGC TGAGGAATGA.

Через 48 ч. в ИПСК здорового пациента, транс-фицированных плазмидой pCAG_Cas9_GFP, подсчитывали эффективность трансфекции по количеству GFP-позитивных клеток методом проточной цито-метрии на приборе BD FACSCalibur (BD Biosciences, США), а также по проценту клеток, экспрессирующих белок GFP, с применением конфокального микроскопа (Zeiss Axio imager, Германия).

Через 72 ч. после проведенной трансфекции для коррекции мутаций клетки снимали диспазой (Gibco, США), промывали раствором PBS, после чего выделяли геномную ДНК набором Wizard genomic DNA purification kit (Promega, США). Участки гена PARK2, которые служили мишенями для редактирования генома, амплифицировали с применением высокоточной полимеразы Pfu DNA polymerase (Fermentas, США) и соответствующих пар праймеров.

Результаты и обсуждение

Для оценки эффективности доставки генетических конструкций ИПСК, полученные от здорового пациента, трансфицировали плазмидой pCAG_ Cas9_GFP. Эффективность трансфекции оценивали посредством конфокальной микроскопии по экс-

прессии зеленого флюоресцентного белка — GFP (рис. 1), кодируемого генетической конструкцией в одной рамке считывания с геном нуклеазы Саэ9 через линкерную последовательность Т2А, а также с помощью метода проточной цитометрии. Эффективность трансфекции составила 10%.

Рис. 1. Трансфекция ИПСК здорового донора плазмидой pCas9_GFP

ИПСК линии Тг5, полученные из фибробластов пациента с болезнью Паркинсона, ассоциированного с мутациями в гене РАИК2, трансфицировали плаз-мидами рСаэ9, различными вариантами плазмиды рдтА и одноцепочечными олигонуклеотидами для коррекции мутации в экзоне, интроне, в экзоне и ин-троне одновременно.

После выделения ДНК из клеток были проведены ПЦР-амплификации участков-мишеней (экзон 2, интрон 1) и их прямое секвенирование. Секвенирова-ние второго экзона гена (рис. 2) РАИК2 показало, что введение AG в положении 202-203 с восстановлением нормального генотипа было достигнуто при использовании гидов № 6, 15 и одноцепочечного зонда, выступающего в качестве донорного фрагмента «дикого» типа для гомологичного участка экзона.

В то же время коррекция мутации с помощью гидов № 8 и 16 оказалась не эффективной.

Редактирование однонуклеотидной замены в 1-м интроне гена РАИК2 с помощью системы CRISPR/Cas9 осуществляли при использовании гидов № 2, 14 и одноцепочечного зонда, выступающего в качестве донорного фрагмента «дикого» типа для гомологичного участка интрона, а также в эксперименте по одновременной коррекции мутаций в интроне и экзоне с применением гидов № 2 и 16, соответственно.

Сопоставление соотношения пиков, соответствующих аденину и гуанину в положении однонуклео-тидной замены в 1-м интроне гена РАИК2, в клеточных линиях Тг5 до и после трансфекции показывает, что замена G>A с нормализацией нуклеотидной последовательности частично произошла (четкое увеличение пика G на рис. 3Б и 3В относительно

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

117

рис. 3А); при этом эффективность геномного редактирования в случае применения РНК-гида № 14 (рис. 3В) была заметно более высокой по сравнению с гидом № 2 (рис. 3Б). Нарастание пика G, соответствующего нормальному сиквенсу, объясняется увеличением числа матриц, несущих нативную нукле-отидную последовательность, относительно матриц, несущих мутацию.

Одновременная коррекция мутации в экзоне и интроне гена РАИК2 с помощью системы С1^Р1Р/ Cas9 оказалась не эффективной. Вероятно, это связано с низкой эффективностью одновременной

А

-.гатит сст----. зсБ.-.с.-.ЕБакттссс&ст s-.cc--.gt т&с<;т бте.^тттт с<5с.-.азс.-. мвАбсГСАвс.-.

--.ес1бс115ст--л(х:б---с---еоебе11ссеос1б---ссдст1осз1 гтз тг1тс5с.--3«с- ззл-зстз- зз

Рис. 2. Коррекция мутации в экзоне 2 гена РАЙК2 с помощью системы СР1БРР/Саз9: А — клеточная линия Тг5, исходная нуклеотидная последовательность с делецией del202-203AG (обведенная область);

Б — клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы СР1БРР/Саз9 и РНК-гидов № 8 и 16 (сохраняется мутантная последовательность с делецией del202-203AG); В — клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы СР1БРР/Саз9 и РНК-гидов № 6 и 15 (восстановление нормальной нуклеотидной последовательности);

Г — электрофореграмма сиквенса экзона 2 клеточной линии, полученной из фибробластов здорового донора (нормальная нуклеотидная последовательность).

Фигурной скобкой на А и Б показана область

со сдвигом рамки и наложением пиков,

на В — та же область с восстановлением рамки

доставки в нужных соотношениях молекул нуклеаз Саз9, РНК-гидов и донорных одноцепочечных фрагментов в ядро клетки при формировании комплексов ДНК-турбофект. Для повышения эффективности доставки генетических конструкций в ИПСК могут использоваться различные подходы — липо-фильная трансфекция, нуклеофекция, современные методы сортировки клеток и т.д. В дальнейшей работе мы планируем применять GFP-сортинг для получения обогащенной клеточной популяции, в которой система CРiSPР/Cas9 работает наиболее эффективно.

А

ССвСС ССТАСССАвТВАССАТвАТАвАТАСвТОСЗОТАССТвССАвбТА

ССбСС ССТАСССА6Т0АССА7вАТАвАТАС6Твв<ЗГАССТвССАв6ТА

CCGCC-CCTA.CCCA.GTGACCA7GATAG.AT АССТСвОТАССТвССАвСТА

ССВССАССТАСССАбТОАССАТОАТАбвТАСЭТввЗГАССТЭССАббТА

Рис. 3. Коррекция мутации в 1-м интроне гена РАЙК2

с помощью системы СР1БРР/Саз9: А — клеточная линия Тг5, исходная нуклеотидная последовательность с точковой мутацией ^Б1+^/А; Б — клеточная линия Тг5 после редактирования

с помощью системы СР1БРР/Саз9 и РНК-гида № 2 (по сравнению с рис. ЗА — нарастание пика G относительно пика А (стрелка)); В — клеточная линия Тг5 после редактирования с помощью системы СР1БРР/Саз9 и РНК-гида № 14 (значительное нарастание пика G относительно пика А (стрелка));

Г — электрофореграмма сиквенса интрона 1 клеточной линии, полученной из фибробластов здорового донора (нормальная нуклеотидная последовательность).

Таким образом, нами проведено успешное редактирование генома ИПСК, полученных из фибробла-стов пациента — носителя компаунд-гетерозиготных мутаций в гене PARK2. С помощью системы CRISPR/ Саэ9 удалось восстановить нормальную нуклеотид-ную последовательность в обеих аллелях данного гена, обусловливающего развитие аутосомно-рецес-сивной формы БП с ранним проявлением симптомов. На следующем этапе исследований будет осуществлена дифференцировка «нормализованных» ИПСК в дофаминергические нейроны, с детальным сопоставлением морфофункциональных свойств культур

нейронов, имеющих мутантный и нормальный генотипы. Такие сопоставления позволят уточнить тонкие молекулярные механизмы PARK2-формы первичного паркинсонизма. Возможность направленной коррекции генотипа и получения дофаминергических нейронов, не несущих мутации, имеет большое значение для успешного развития нейротрансплантации при БП и других нейродегенеративных заболеваниях.

Благодарности

Работа поддержана грантом РНФ № 14-15-01047.

ЛИТЕРАТУРА

1. Thomas B., Beal M.F. Parkinson's disease. Hum. Mol. Genet. 2007; 16: R183-94.

2. Bonifati V. Genetics of Parkinson's disease — state of the art. Parkinsonism Relat. Disord. 2014; 20 Suppl 1: S23-8.

3. Lin M.K., Farrer M.J. Genetics and genomics of Parkinson's disease. Genome Med. 2014; 6: 48.

4. Kitada T., Asakawa S., Hattori N. et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 1998; 392: 605-8.

5. Vogel G. Stem cells. Diseases in a dish take off. Science 2010; 330: 1172-3.

6. Takahashi K., Okita K., Nakagawa M. et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2007; 2: 3081-9.

7. Богомазова А.Н., Васина Е.М., Киселев С.Л. и др. Генетическое репрограммирование клеток: новая технология для фундаментальных исследований и практического использования. Генетика 2015; 4: 466-78.

8. Некрасов Е.Д., Лебедева О.С., Честков И.В. и др. Получение и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из фибробластов кожи пациентов с нейродегене-ративными заболеваниями. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; YI(4): 82-8.

9. Hunsberger J.G., Efthymiou A.G., Malik N. et al. Induced pluripotent stem cell models to enable in vitro models for screening in the CNS. Stem Cells Devel. 2015; 24: 1852-64.

10. Hargus G., Ehrlich M., Hallmann A.L. et al. Human stem cell models of neurodegeneration: a novel approach to study mechanisms of disease development. Acta Neuropathol. 2014; 127: 151-73.

11. Лебедева О.С., Лагарькова М.А., Киселев С.Л. и др. Мор-фофункциональные свойства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из фибробластов кожи человека и дифференцированных в дофаминергические нейроны. Нейрохимия 2013; 3: 233-41.

12. Коновалова Е.В., Новосадова Е.В., Гривенников И.А. и др. Фенотипические различия культур нейронов, получаемых путем ре-программирования фибробластов пациентов с мутациями в генах

паркинсонизма LRRK2 и PARK2. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2015; 6: 749-53.

13. Коновалова Е.В., Лопачева О.М., Гривенников И.А. и др. Экспрессия про- и антиапоптопических факторов в ИПСК здорового донора и пациента с болезнью Паркинсона, являющегося носителем мутаций в гене PARK2. Acta Naturae 2015; 4: 83-6.

14. Коновалова Е.В., Ивашкин Е.Г., Лопачёв А.В. и др. Функциональные свойства дофаминергических нейронов, полученных из фибробластов пациента с PAR^-формой болезни Паркинсона. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова 2015; 12: 103-7.

15. Ставровская А.В., Воронков Д.Н., Ямщикова Н.Г. и др. Мор-фохимическая оценка результатов нейротрансплантации при экспериментальном паркинсонизме. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2015; 2: 28-32.

16. Медведев С.П., Шевченко А.И., Сухих Г.Т. и др. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН; 2014.

17. Gaj T., Gersbach C., Barbas C. ZNF, TALEN and CRISPR/CAS-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 2013; 31: 397-405.

18. Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 2010; 9: 636-46.

19. Schmid-Burgk J.L., Schmidt T., Kaiser V. et al. A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes. Nat. Biotechnol. 2013; 31: 76-81.

20. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2012; 339: 823-6.

21. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П. и др. Системы редактирования генома TALEN и CRISPR/Cas-инструменты открытий. Acta Naturae 2014; 23: 20-42.

22. Васильева Е.А., Мелино Д., Барлев Н.А. Применение системы направленного геномного редактирования CRISPR/Cas к плюри-потентным стволовым клеткам. Цитология 2015; 1: 19-30.

23. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339 (6121): 819-23.

Поступила: 19.02.2016