ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ЛАККАЗЫ ГРИБА STECCHERINUM OCHRACEUM LE (BIN) 1833 D И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

1. Термостабильная лакказа I обладает следующими свойствами:
субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту), катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;
молекулярная масса: 57500±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75);
611
-1
-1
коэффициент экстинкции при 611 нм (ε):7300 М см;
pH оптимум: - 2,06 (в Britton and Robinson буфере [Xu et al., Appl Environ Microbiol 2000, V.66, P.2052-2056] при 25°С, субстрат - АБТС);
- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - сирингальдазин);
- 4,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметоксифенол);
- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметилфенол);
диапазон pH-стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне pH от 2 до 6 и температуре 25°С;
температурный оптимум: 70°С;
термостабильность: в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0, субстрат - АБТС,
после 8 ч инкубации при 60°С остается 20% активности;
после 2 ч инкубации при 70°С остается 35% активности;
после 30 мин инкубации при 80°С остается 15% активности;
кинетические константы: в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0
m
max
cat
-1
K=114,9 мкМ, V=25,6 ед/мг, k=24,6 с, субстрат - АБТС;
m
max
cat
-1
K=2 мкМ, V=12,2 ед/мг, k=11,7 с, субстрат - сирингальдазин;
m
max
cat
-1
K=63,3 мкМ, V=17,2 ед/мг, k=16,4 с, субстрат - 2,6-диметоксифенол;
m
max
cat
-1
K=400 мкМ, V=16,9 ед/мг, k=16,2 с, субстрат - 2,6-диметилфенол;
m
max
cat
-1
K=78,7 мкМ, V=16,9 ед/мг, k=16,2 с, субстрат - пирогаллол;
m
max
cat
-1
K=90,9 мкМ, V=44,8 ед/мг, k=42,9 с, субстрат - конифериловый спирт;
m
max
cat
-1
K=1333,3 мкМ, V=27,3 ед/мг, k=26,1 с, субстрат - гваякол;
m
max
cat
-1
K=500 мкМ, V=23,5 ед/мг, k=22,5 с, субстрат - катехол.
2. Термостабильная лакказа II, выделенная из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D и имеющая следующие свойства:
субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту), катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт.
молекулярная масса: 59500±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75).
611
-1
-1
коэффициент экстинкции при 611 нм (ε): 7800 М см
pH оптимум:
- 1,25 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - АБТС);
- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - сирингальдазин);
- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметоксифенол);
- 5,20 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметилфенол);
диапазон pH-стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне pH от 2 до 6 и температуре 25°С;
температурный оптимум 75°С;
термостабильность в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0, субстрат - АБТС:
после 8 ч инкубации при 60°С остается 40% активности;
после 2 ч инкубации при 70°С остается 41% активности;
после 30 мин инкубации при 80°С остается 35% активности;
кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0:
m
max
cat
-1
K=900 мкМ, V=359 ед/мг, k=356 с, субстрат - АБТС;
m
max
cat
-1
K=1,7 мкМ, V=23 ед/мг, k=22,8 с, субстрат - сирингальдазин;
m
max
cat
-1
K=26,3 мкМ, V=194,4 ед/мг, k=192,8 с, субстрат - 2,6-диметоксифенол;
m
max
cat
-1
K=667 мкМ, V=31,2 ед/мг, k=30,9 с, субстрат - 2,6-диметилфенол;
m
max
cat
-1
K=47,6 мкМ, V=7,2 ед/мг, k=7,1 с, субстрат - пирогаллол;
m
max
cat
-1
K=17,9 мкМ, V=89 ед/мг, k=88,3 с, субстрат - конифериловый спирт;
m
max
cat
-1
K=90,9 мкМ, V=13,3 ед/мг, k=13,2 с, субстрат - гваякол;
m
max
cat
-1
K=1667 мкМ, V=52,3 ед/мг, k=51,9 с, субстрат - катехол.
3. Термостабильная лакказа III, выделенная из штамма базидиального гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D и имеющая следующие свойства:
субстратная специфичность: окисляет ряд субстратов, в частности, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту), катехол, 2,4-диметилфенол, 2,6-диметилфенол, 2,6-диметоксифенол, пирогаллол, гваякол, сирингальдазин, конифериловый спирт;
молекулярная масса: 63000±500 дальтон (при определении методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии ДСН и методом гель-фильтрации на колонке Superdex 75);
611
-1
-1
коэффициент экстинкции при 611 нм (ε):7200 М см;
pH оптимум:
- <1,2 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - АБТС);
- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - сирингальдазин);
- 4,50 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметоксифенол);
- 5,00 (в Britton and Robinson буфере при 25°С, субстрат - 2,6-диметилфенол);
диапазон pH-стабильности: лакказа стабильна в течение одной недели при хранении в Britton and Robinson буфере в диапазоне pH от 2 до 6 и температуре 25°С;
температурный оптимум: 80°С;
термостабильность в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0, субстрат - АБТС:
после 8 ч инкубации при 60°С остается 36% активности;
после 2 ч инкубации при 70°С остается 35% активности;
после 30 мин инкубации при 80°С остается 65% активности;
кинетические константы в натрий-ацетатном буфере, pH 5,0:
m
max
cat
-1
K=60,6 мкМ, V=12,7 ед/мг, k=13,4 с, субстрат - АБТС;
m
max
cat
-1
K=7,1 мкМ, V=3,2 ед/мг, k=3,3 с, субстрат - сирингальдазин;
m
max
cat
-1
K=40 мкМ, V=33 ед/мг, k=34,7 с, субстрат - 2,6-диметоксифенол;
m
max
cat
-1
K=625 мкМ, V=3,3 ед/мг, k=3,4 с, субстрат - 2,6-диметилфенол;
m
max
cat
-1
K=400 мкМ, V=40,8 ед/мг, k=42,8 с, субстрат - пирогаллол;
m
max
cat
-1
K=10,5 мкМ, V=7,7 ед/мг, k=8,1 с, субстрат - конифериловый спирт;
m
max
cat
-1
K=1250 мкМ, V=2,1 ед/мг, k=2,2 с, субстрат - гваякол;
m
max
cat
-1
K=250 мкМ, V=1,7 ед/мг, k=1,8 с, субстрат - катехол.
4. Способ получения термостабильных лакказ гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D, характеризующийся тем, что штамм гриба Steccherinum ochraceum LE (BIN) 1833 D выращивают на глюкозо-пептонной среде, культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрацией и последующим центрифугированием, супернатант наносят на колонку с DE52 целлюлозой в качестве носителя, уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буфером (буфер А), элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, фракции с лакказной активностью объединяют, концентрируют и обессоливают и наносят на колонку с ионообменным носителем Q-Sepharose, предварительно уравновешенную буфером А, элюцию проводят линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в буфере А, затем полученные две активные фракции с лакказной активностью концентрируют и обессоливают,
полученную первую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных активных фракций с лакказной активностью получают лакказу I,
полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Q-Sepharose вторую фракцию с лакказной активностью концентрируют и наносят на колонку с ионообменным носителем Resource Q, элюцию проводят ломанным градиентом 1 М NaCl в буфере А, полученные две активные фракции концентрируют и обессоливают,
первую фракцию с лакказной активностью полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75, элюцию проводят 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу II,
вторую фракцию с лакказной активностью, полученную после хроматографии на колонке с ионообменным носителем Resource Q, наносят на колонку для гель-фильтрации Superdex 75 и элюируют 0,1 М NaCl в буфере А, после концентрирования объединенных фракций с лакказной активностью получают лакказу III.