Использование конфокальной сканирующей микроскопии для определения объема и плотности пыльцевых зерен сибирских растений

УДК 551.52:528.4

В.В. Головко, К.П. Куценогий ИХКГ СО РАН, Новосибирск В.Л. Истомин

ИГиЛ СО РАН, Новосибирск

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОНФОКАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЪЕМА И ПЛОТНОСТИ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН СИБИРСКИХ РАСТЕНИЙ

Произведена оценка изменения объема пыльцевых зерен в процессе высыхатия. Определен объем и плотность пыльцы растений, доминирующих экосистемах Западной Сибири.

V.V. Golovko, K.P. Koutsenogii

Institute of Chemical Kinetics and Combusion SB RAS, Novosibirsk V.L. Istomin

Institute of Hydrodynamics, SB RAS, Novosibirsk

CONFOCAL SCANNING MICROSCOPY USED TO DETERMINE THE VOLUME AND DENSITY OF THE POLLEN GRAINS OF SIBERIAN PLANTS

The change in the volume of pollen grains upon drying was estimated . The volume and density of the pollen grains of the dominating ecosystems of West Siberia were determined.

Решение ряда задач аэробиологии (построение моделей переноса пыльцы в атмосфере, оценка количества переносимого пыльцой вещества и др.) тесно связано с определением величины объема и плотности пыльцевых зерен.

Размеры пыльцевых зерен растений отчетливо различаются (от 2-5 до 250 микрометров), причем преобладающая в атмосфере пыльца анемофильных видов средних размеров (20-50 микрон). Зерна пыльцы бывают сфероидальной, сплющено-сфероидальной, эллипсоидальной, ромбоидальной, тетраэдральной, гексагональной либо иной формы. У ряда хвойных растений пыльцевые зерна имеют сложную форму из-за наличия у них воздушных мешков [1].

Имеющиеся в литературе данные преимущественно описывают линейные размеры пыльцевых зерен, обработанных ацетолизным или каким-либо иным методом - фактически только оболочки пыльцевого зерна, лишенной содержимого. При обработке проб пыльцы различными методами возможны изменения линейных размеров пыльцевых зерен, иногда довольно значительные [2]. Отмечено наличие в пробах пыльцы большого количества деформированных зерен, различия размеров пыльцы разных популяций одного вида [1]. Поступая в атмосферу, пыльцевые зерна высыхают, что приводит к

изменению их объема, плотности и массы. При этом даже исходно сферические пыльцевые зерна либо сморщиваются (рис. 1), либо (существенно реже), потеря воды заставляет содержимое оболочки сжиматься, оставляя большие воздушные пространства внутри зерен. Количественные описания формы пыльцевых зерен, находящихся в атмосфере во взвешенном состоянии, необходимые для оценки их аэродинамических характеристик скудны либо отсутствуют.

Рис. 1. Сухое пыльцевое зерно двукисточника тростникового.

В связи с этим в данной работе представлены результаты экспериментальных исследований изменения формы пыльцевых зерен в процессе высыхания методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, а также определения величины объема и плотности пыльцы березы бородавчатой, клена ясенелистного, двукисточника тростникового, тимофеевки луговой, сосны обыкновенной, лиственницы сибирской - растений, доминирующих в экосистемах Западной Сибири.

Определение геометрических характеристик пыльцевых зерен методом конфокальной сканирующей микроскопии проводилось в ИЦиГ СО РАН с помощью лазерного сканирующего микроскопа (ЛСМ) LSM 510 META.

Одной из главных особенностей конструкции данного ЛСМ является конфокальная апертура, расположенная в одной плоскости с сопряженным промежуточным изображением предметной плоскости микроскопа. В ходе конфокальной сканирующей лазерной микроскопии исследуемые образцы поточечно облучаются сфокусированным лучом лазера и флуоресценция облученных частей объекта измеряется точка за точкой. Свет от объекта фокусируется в плоскости сопряженного изображения на точечном отверстии объектива. Освещенная точка объекта и наблюдаемая точка изображения расположены конфокально. Детектор (ФЭУ) может измерять только свет, прошедший через апертуру. Свет, идущий от плоскостей ниже и выше фокальной, не сфокусирован в момент прохождения апертуры, так что большая часть его не может пройти через это отверстие и потому не вносит вклад в формирование изображения. Для получения информации об образце в целом

лазерным лучом проводится сканирование через всю поверхность образца. Координированием перемещением точного фокуса микроскопа с построением изображения получают трехмерные серии данных. Путем их компьютерной обработки определяют различные размерные характеристики объекта.

В ходе работы была использована способность пыльцевых зерен автофлюоресцировать при облучении многими различными длинами волн. Условия сканирования (оптимальной длины волны возбуждающего излучения, шаг сканирования, масштаб сканирования) для каждого типа пыльцевых зерен подбирались индивидуально. Исследование формы гидратированных пыльцевых зерен производилось на образцах, помещенных в глицерин-желатиновую среду, воздушносухих пыльцевых частиц - на образцах, при определенной влажности воздуха помещенных в иммерсионное масло 1ттегео1 518 К

Для оценки изменения величины объема пыльцевых зерен в процессе высыхания были исследованы полностью гидрартированные и воздушносухие пыльцевые зерна березы бородавчатой и клена ясенелистного. Результаты измерений приводятся в табл. 1. Результаты даются по 30 измерениям.

Таблица 1. Среднегеометрические значения объемов влажных и сухих

пыльцевых зерен древесных растений

№ № Название таксона Объем сухого пыльцевого (Ус) зерна, і г\ 3 3 х10 мкм (влажность 60%) Объем гидратированного (Уг) зе^на пыльцы, х 10 мкм (влажность 100%) Vc/Vг, %

1 Береза бородавчатая 2,5 5,3 47,2

2 Клен ясенелистный 7,6 12,6 60,3

Из табл. 1 видно, что в процессе высыхания пыльца растений теряет 40 -50% исходного объема. Значительные изменения объема неизбежно вызывают изменение плотности и массы пыльцевых зерен. Данные характеристики пыльцевых частиц, как правило, определяются экспериментально.

Для определения массы пыльцевых зерен использовалась экспериментальная установка для распыления порошкообразных материалов, разработанная в лаборатории ИГиЛ СО РАН. Схема данной установки и принцип ее работы приводился нами ранее [3]. Найденные среднегеометрические значения массы индивидуальных пыльцевых зерен приводятся в табл. 2.

В настоящее время определены массы пыльцевых зерен около 120 видов растений, преимущественно древесных, произрастающих в Европе и Северной Америке. Пыльца растений других регионов изучена значительно хуже. В ходе данного исследования были установлены массы пыльцевых зерен ряда растений, произрастающих в Сибири.

Исследованные пыльцевые зерна растений по особенностям своего строения можно разделить на две группы. Если воздушносухая пыльца березы бородавчатой, клена ясенелистного, двукисточника тростникового, тимофеевки

луговой, лиственницы сибирской представлена частицами неправильной формы, не содержащими полостей, то пыльцевые зерна сосны обыкновенной снабжены парой воздушных мешков (рис. 2). Фотография трех проекций пыльцевого зерна сделана с помощью ЛСМ, на которых они хорошо видны.

Таблица 2. Объем, масса и вычисленная по ним плотность пыльцевых зерен растений, доминирующих в экосистемах Западной Сибири

№ № Название таксона Объем, л г\ 3 3 х10 ,мкм Масса пыльцевого зерна, нг Плотность пыльцевого зерна, г/см3

1 Береза бородавчатая (пыльцевое зерно) 2,5 2,8 1,1

2 Клен ясенелистный (пыльцевое зерно) 7,6 8,3 1,1

3 Двукисточник тростниковый (пыльцевое зерно) 11,1 9,2 0,8

4 Тимофеевка луговая (пыльцевое зерно) 11,8 15,7 1,3

5 Лиственница сибирская (пыльцевое зерно) 141,4 159,0 1,1

6 Сосна обыкновенная (тело пыльцевого зерна) 17,5 14,5 0,8

7 Сосна обыкновенная (пыльцевое зерно с воздушным мешками) 38,0 0,4

При освещении возбуждающим излучением объекта, некоторые части которого не флуоресцируют, на оптических срезах 7-серии появятся незакрашенные участки, а в его трехмерной модели -незаполненные, занимающие определенную долю объема объекта. Имеющееся программное обеспечение позволяет

вычислить размерные характеристики как объекта в целом, так и его полых участков. Таким образом, в отличие от использовавшегося ранее метода определения геометрических характеристик частиц путем фотограмметрической обработки их изображений, лазерная сканирующая

конфокальная микроскопия позволяет

установить не только размеры пыльцевых зерен в целом, но и величины объемов отдельных внутренних частей пыльцевого зерна.

Рис. 2. Сухое пыльцевое зерно сосны обыкновенной с воздушными мешками

В табл. 2 приводятся данные измерения величины объемов как пыльцевых зерен исследованных видов растений в целом, так и значения величины объемов воздушных мешков и тел пыльцевых зерен сосны обыкновенной.

Вычисленные по данным экспериментальных исследований значения плотности пыльцевых зерен близки к значениям плотности спор грибов и других компонент аэропланктона [4].

Из табл. 2 видно, что плотность пыльцевых зерен растений, не содержащих

-5

воздушных полостей составляет в среднем 1,0 г/см . Плотность тела пыльцевого зерна сосны близка к данному значению. Вместе с тем, плотность пыльцевого зерна сосны в целом более чем в два раза ниже. Такое снижение плотности пыльцевого зерна воздушными мешками является приспособлением к переносу пыльцы ветром. Именно благодаря низкой удельной плотности пыльцевые зерна сосны способны переноситься за тысячи километров [6].

Выводы.

1. Оценено изменение объема пыльцевых зерен в процессе высыхания. Показано, что в ходе данного процесса их объем уменьшается практически вдвое.

2. Установлены величины объема массы и плотности пыльцевых зерен растений, доминирующих в экосистемах Западной Сибири.

3. Показана возможность определения данных характеристик не только пыльцевого зерна в целом, но и его отдельных частей.

4. Предложенная методика пригодна для определения величины объема и плотности и к другим частицам аэропланктона.

В работе использовалось оборудование центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (проект № 3695).

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Куприянова Л. А., Алешина Л. А. Пыльца и споры двудольных растений флоры европейской части СССР. Л.: Наука, 1978, Т. 1, 174 с.

5. Федорова Р. В. Некоторые особенности морфологии пыльцы культурных злаков // АН СССР, Труды института географии, Материалы по геоморфологии и палеогеографии СССР, работы по спорово-пыльцевому анализу, 1959, Вып. 77, с. 166-189.

6. Головко В.В., Куценогий К.П., Истомин В.Л. Определение скорости седиментации одиночных пыльцевых зерен и агломератов растений - доминант лесных экосистем Западной Сибири /Труды VI Международной выставки и Научного конгресса ГЕО-СИБИРЬ-2010 (19-29 апреля 2010, Новосибирск), том 4, часть 2. Дистанционные методы зондирования земли и фотограмметрия, мониторинг окружающей среды, геоэкология (издательство СГГА, Новосибирск, ред. А.П. Гук, И.Г. Журкин, Б.Г. Михайленко, Ю.В. Дементьев, А.В. Комиссаров) с. 59-62

7. Грегори Ф. Микробиология атмосферы. / Пер. с англ. Муромцева Г.С. -М.: Мир, 1964. - 372 с

8. Кабайлене М. В. // О дальности и количестве переноса пыльцы и особенностях периодизации пыльцевых диаграмм. // Проблемы периодизации плейстоцена (Материалы симпозиума «Периодизация и геохронология плейстоцена», Ленинград, ноябрь, 1970 г.), Ленинград, 1971, с. 105-114.

© В.В. Головко, К.П. Куценогий, В.Л. Истомин, 2011