Роль остатков Tyr62 и Tyr165 в стабильности бактериальной формиатдегидрогеназы

УДК 577.15.02

РОЛЬ ОСТАТКОВ TYR62 И TYR165 В СТАБИЛЬНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

А. Е. Серов, А. М. Рожкова, В. И. Тишков*

NAD+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ; КФ 1.2.1.2) из метилотрофных бактерий значительно превосходят по термостабильности аналогичные ферменты из других источников -дрожжей, грибов и высших растений. В аминокислотных последовательностях бактериальных ФДГ в 62-м и 165-м положениях находятся остатки Tyr, тогда как в остальных ФДГ в данных участках первичной структуры расположены остатки Phe и Trp. Это может являться одной из причин более низкой стабильности ФДГ из эукариот. Для изучения роли Tyr62 и Tyr165 в стабильности бактериальных формиатдегидрогеназ были получены мутанты ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (РзеФДГ), содержащие аминокислотные замены Tyr62Phe и Tyr 165Phe. Показано, что остаток Tyr165 существенно стабилизирует структуру РзеФДГ за счет образования водородной связи с основной цепью остатка Gly328, принадлежащего другой субъединице молекулы белка. Замена Tyr62 на Phe не влияет на термостабильность PseФДГ.

В метаболизме метилотрофов МАБ+-зависимые формиатдегидрогеназы (ФДГ; КФ 1.2.1.2) играют ключевую роль, катализируя финальный шаг катаболизма С1-соединений и обеспечивая метилотрофные организмы энергией и восстановительными эквивалентами [1]. ФДГ состоят из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 36-48 кДа, имеют два активных центра (по одному на субъединицу) и не содержат каких-либо простетических групп и ионов металлов [1].

Диапазон источников, из которых были выделены ФДГ, достаточно широк - это бактерии, дрожжи, грибы и высшие растения. На сегодняшний день известны полные последовательности генов ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 [2], Mycobacterium vaccae N10 [3], Moraxella C-1 (EMBL Accession 008375), дрожжей Saccharomyces cerevisiae (EMBL Accession Z75296), Pichia angusta (прежнее название Hansenula polymorpha) [4], Candida methylica [5], Candida boidinii [6-7], низших грибов Aspergillus nidulans [8], Neuraspora crassa [9], из митохондрий картофеля [10] и из ячменя [11].

Для бактериальных формиатдегидрогеназ характерна гораздо более высокая стабильность по сравнению с ФДГ из других источников [12]. Самым стабильным среди бактериальных ФДГ является фермент из мети-лотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseФДГ). В присутствии стабилизаторов (ЭДТА) PseФДГ может храниться при 4° более года без потери активности, в то время как ФДГ из метилотрофных дрожжей Candida methylica при тех же условиях теряет 50% активности за 2 недели [6].

Бактериальные ферменты отличаются от ФДГ из эукариот тем, что они имеют более длинную N-концевую часть. По-видимому, это отличие является одной из основных причин высокой стабильности бактериальных ФДГ.

Кроме того, существует ряд других особенностей первичной структуры ФДГ из бактерий, которые могут объяснять повышенную устойчивость этих ферментов к тепловой денатурации. Так, в 62-м и 165-м положениях аминокислотных последовательностей бактериальных ФДГ расположены остатки тирозина. В небактериальных ферментах эти остатки заменены на более гидрофобные триптофан и фенилаланин (рис. 1).

Целью данной работы было выяснение роли остатков Tyr62 и Tyr 165 в термостабильности ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101. Ген этого фермента был ранее клонирован в нашей лаборатории [2], были также созданы векторные конструкции, обеспечивающие его эффективную экспрессию в клетках E. coli [13]. В нашем распоряжении имеются данные о трехмерной структуре апо- и холо-форм ФДГ из Pseudomonas sp. 101 [14]. В данной работе были получены мутанты PseФДГ Tyr62Phe и Tyr 165Phe и изучена их термостабильность.

Методы исследования

В работе использовали ДНК-полимеразу (10 ед./мкл), ДНК-лигазу (400 ед./мкл) и полинуклеотидкиназу (16 ед./мкл) фага Т4 (New England Biolabs, США). Все реактивы, использованные для генно-инженерных манипуляций, были марки «Molecular Biology Grade» (Sigma).

*Адресат для переписки.

а1 а5

<-> <->

PseFDH 60 RKYLESNG 67 •••• • • • • 163 RNYLPSHEWARKG 175

MycFDH 60 REYLESNG 67 •••• • • • • 163 RNYLPSHEWARKG 175

MorFDH 60 RKYLESQG 67 •••• • • • • 163 RNYIPSHDWARNG 175

StuFDH 60 REWLESKG 67 •••• • • • • 163 RNFLPGHHQVING 175

BarFDH 58 RDWLESKG 65 •••• • • • • 161 RNFLPGYQQVVKG 173

SceFDH 33 RNFIEEQG 40 • • • • ••••137 RNYNGGHQQAING 149

CmeFDH 30 ANWLKDQG 37 • • • • ••••135 RNFVPAHEQIINH 147

HanFDH 30 RDWLEKQG 37 • • • • ••••135 RNFVPAHEQIISG 147

NeuFDH 31 RKWLEDQG 38 • • • • ••••136 RNFVPAHEQIQEG 148

AspFDH 26 RKWIEEQG 33 •••• ••••131 RNFVPAHDQIRNG 143

Рис. 1. Аминокислотные последовательности формиатдегидрогеназ из различных источников в районах спиралей a 1 и a5: PseFDH - Pseudomonas sp. 101, MycFDH - Mycobcaterium vaccae N10, MorFDH -Moraxella C-1, StuFDH - картофель, BarFDH - ячмень, SceFDH - Saccharomyces cerevisiae, CmeFDH -Candida methylica, HanFDH - Pichia angusta (Hansenula polymorpha), NeuFDH - Neuraspora crassa, AspFDH — Aspergillus nidulans. Жирным шрифтом выделены остатки в 62-м и 165-м положениях. Структурные элементы относятся к ФДГ из Pseudomonas sp. 101

Направленный мутагенез осуществляли по модифицированному методу Кункеля [15-16], как описано ранее [12]. При изучении термостабильности для каждого мутанта получали ферментные препараты, используя плаз-миды, выделенные из двух независимых клонов. Мутанты ФДГ и рекомбинантный фермент дикого типа, экспресси-рованные в клетках E. coli TG1, выделяли и очищали по стандартной методике, разработанной для ФДГ из метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 [17]. Чистота полученных препаратов фермента, согласно данным аналитического электрофореза в 12%-м полиакриламид-ном геле в присутствии додецильсульфата натрия, составляла не менее 90-95%.

Активность формиатдегидрогеназы определяли спект-рофотометрически по накоплению NADH при длине волны 340 нм (вз40 = 6220 М-1см-1) на спектрофотометре «Beckman D4-8B» (США) при 37° в 0,1 М калий-фосфатном буфере, 0,02 M ЭДТА (рН 7,0). Концентрация NAD+ и формиата натрия в кювете составляла 2 мМ и 0,3 М соответственно.

Термостабильность мутантов ФДГ и рекомбинантного фермента дикого типа измеряли при 60° в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Для каждого мутанта и ФДГ дикого типа готовили серию из пластиковых пробирок объемом 1,5 мл по 100 мкл раствора фермента (0,3 мг/мл) в каждой пробирке. Пробирки помещали в предварительно прогретый до 60° водяной термостат (точность термо-статирования ±0,1°). В моменты отбора проб пробирки с ферментными препаратами переносились из водяного термостата в лед на время более 30 мин. Константу скорости термоинактивации кин определяли из зависимости остаточной активности А от времени в координатах 1пА -t, мин с помощью метода линейной регрессии в про-

грамме «Sigma plot 4.0». Каждое значение константы кин для всех изученных форм РБеФДТ является средней величиной, полученной из двух независимых экспериментов для каждого их двух выделений конкретного фермента (всего 4 измерения). Анализ трехмерной структуры натив-ной ФДГ из Pseudomonas sp. 101 проводили на компьютере Pentium II с помощью программы «RasMol 2.6b».

Результаты экспериментов

Остатки Tyr62 и Tyr 165 расположены в аа-спиральных участках молекулы белка. Tyr62 входит в состав спирали a1. Анализ структуры PseФДГ показывает, что гидроксиль-ная группа Tyr62 не образует водородных связей с другими аминокислотными остатками. В целом боковая группа Tyr62 находится в гидрофобном окружении. В большинстве эукариотических ФДГ в этом положении аминокислотной последовательности расположен остаток Trp. Представлялось интересным изучить, как замена Tyr62 на более гидрофобную аминокислоту повлияет на термостабильность PseФДГ. Однако замена Tyr62 на Trp может привести к возникновению стерических затруднений в молекуле PseФДГ. Вклад от удаления гидроксильной группы из данного участка белковой глобулы лучше всего оценить при замене Tyr62 на его структурный аналог - Phe.

Остаток Tyr165 входит в состав спирали a5. Боковая группа Tyr 165 находится в окружении аминокислотных остатков, принадлежащих другой субъединице фермента (рис. 2, A). Это остатки Ser160, Met157, Leu166 и Gly328 (рис. 2, Б). Можно предположить, что остаток Tyr165 играет важную роль в стабильности межсубъединичного контакта. В большинстве ФДГ из эукариот в данном положении находится остаток Phe, который может участвовать лишь в гидрофобных взаимодействиях с остатками

8 ВМУ Химия, № 6

Leu и Met. Анализ трехмерной структуры PseФДГ дает основания предполагать, что гидроксильная группа Tyr 165 участвует в образовании водородной связи с карбонильным кислородом основной цепи остатка Gly328. Расстояние между атомами O0H(Tyr165) и O"C0"NH"(Gly328) составляет 2,8 А, а угол между атомами С (Tyr165), O0H(Tyr165) и o_C0_NH(Gly328) равен 115°. Следовательно, в бактериальных ФДГ межсубъединичный контакт стабилизирован дополнительной водородной связью. Для выяснения вклада данной водородной связи в стабильность ФДГ из бактерий необходимо удалить из области контакта гидроксильную группу, не затронув при этом гидрофобные взаимодействия. Такого эффекта можно достичь при замене остатка Tyr на Phe.

Были получены мутанты, содержащие аминокислотные замены Tyr62Phe и Tyr 165Phe. Инактивацию мутантов PseФДГ и фермента дикого типа изучали при температуре 60°. Зависимости остаточной ферментативной активности от времени инактивации в полулогарифмических координатах представлены на рис. 3. Линейный вид графиков, а также независимость наблюдаемых констант скорости инактивации от начальной концентрации фермента

1,GG <° G,5G

А,

т с

§ G,2G и

и т к

2 G,1G я а н

<з

S G,G5 т с

о

G,G2

Время, мин

Рис. 3. Зависимости остаточной активности от времени для ре-комбинантной РйеФДГ дикого типа и мутантов Туг62РЬе и Туг165РЬе при 60°. Шкала ординат представлена в логарифмическом масштабе. Концентрация ферментов 0,3 мг/мл, 0,1 М фосфатный буфер

Рис 2. А. Апо-форма формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101 [14]. Б. Структура апо-формы РйеФДГ в районе остатка Tyr165. Темный цвет имеют остатки, принадлежащие одной субъединице РвеФДГ, светлый цвет - остатки, принадлежащие другой субъединице. Стрелкой обозначена водородная связь между гидроксильной группой остатка Tyr165 и карбонильным кислородом основной цепи остатка Gly328

свидетельствуют о протекании термоденатурации РБеФДТ и ее мутантов в соответствии с кинетикой реакции первого порядка.

Как следует из рис. 3, константы скорости термоинактивации для рекомбинантной РБеФДГ дикого типа и мутанта Tyr62Phe практически идентичны, т.е. данная аминокислотная замена не приводит к изменению термостабильности фермента. При замене Tyr 165 на Phe происходит сильное снижение термостабильности РБеФДГ (константа скорости инактивации при 60° выросла в результате мутации в 18 раз, что соответствует дестабилизации фермента на 1,9 ккал/моль).

Обсуждение результатов

Замена Tyr62 на Phe не привела к существенным изменениям термостабильности РБеФДГ. Следовательно, наличие в 62-м положении бактериальных ФДГ остатка Tyr не является одной из причин их более высокой по сравнению с ферментами из эукариот термостабильности. Ранее в нашей лаборатории было показано, что эффективным подходом для повышения термостабильности бактериальной ФДГ является гидрофобизация a - спиралей (замены Ser Ala в a-спиральных участках белка) [12]. Остаток Ala является структурным аналогом остатка Ser, и эффект, который наблюдается при мутации Ser Ala, определяется исключительно удалением гидроксильной группы. Среди 20 основных природных аминокислот есть еще только одна подобная пара - Tyr и Phe. Можно предположить, что замены Tyr Phe в общем случае также будут приводить к увеличению общей гидрофобности a -спиралей и как следствие этого стабилизации белка. При замене Tyr165Phe происходит разрушение существенной для стабильности межсубъединичного контакта

водородной связи. Поэтому данная мутация не позволяет оценить вклад, который может вносить замена Tyr Phe в стабилизацию a -спирали. Боковая цепь остатка Tyr62 в PseФДГ не образует водородных связей, но его замена на Phe также не приводит к увеличению термостабильности фермента. Это может быть связано с тем, что спираль a 1 в молекуле фермента и так уже достаточно стабильна за счет электростатической связи между Lys61 и Asp43. Эксперименты по направленному мутагенезу ФДГ в положении 61 [3] показали, что разрушение этой связи приводит к увеличению скорости термоинактивации фермента в 4-6 раз.

Полученные данные свидетельствуют о существенном влиянии остатка Tyr 165 на стабильность бактериальных ФДГ. Замена данного остатка на Phe в ФДГ из эукарио-тических источников сопровождается потерей водородной связи, что, по-видимому, является одной из причин более низкой стабильности этих ферментов. Отметим высокую энергию этой связи, составляющую 1,9 ккал/моль.

Разрушение водородной связи не всегда приводит к дестабилизации структуры белка. В литературе встречаются примеры, когда замена водородной связи гидрофобными контактами вызывает увеличение стабильности. Так, в лизоциме цыпленка остаток His15 находится вблизи от поверхности белка и образует водородную связь с гидроксильной группой Thr89 [18]. Однако замена His15 на Leu оказалась стабилизирующей благодаря вращению вокруг b-g-связи Leu15, в результате чего его боковая цепь помещается внутрь гидрофобного ядра. Стабилизация при заменах водородной связи гидрофобными

контактами наблюдалась для лизоцима фага Т4 (мутация Ser117Phe) [19] и термолизин-подобной нейтральной про-теазы из Bacillus stearothermophilus (мутация Thr63Phe) [20]. Ранее на примере РБеФДТ нами было также показано, что замена Ser131Ala, сопровождавшаяся потерей водородной связи между боковыми группами Serl 31 и Asp128, приводит к увеличению термостабильности фермента [12].

Приведенные примеры подтверждают исключительную важность водородной связи между Tyr 165 и Gly328 для межсубъединичного контакта в PseФДГ. В данном случае замена Tyr 165 на более гидрофобную аминокислоту не только не стабилизировала структуру белка, но и приводит к ее резкой дестабилизации. Однако необходимо подчеркнуть тот факт, что потеря водородной связи при переходе от ФДГ из бактерий к ферментам из дрожжей, грибов и высших растений частично компенсируется увеличением гидрофобности межсубъединичного контакта. На это указывает проведенный нами анализ аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников. В эукариотических ФДГ Gly328 заменен на остаток Ala, а расположенный в области контакта Ser160 - на остатки Val, Leu или Ile.

Межсубъединичный контакт в молекуле PseФДГ очень прочный. Он не разрушается полностью даже в 8 М мочевине. В этих условиях не происходит диссоциации фермента на субъединицы. Мутант PseФДГ Tyr 165Phe с ослабленным межсубъединичным контактом может быть использован для получения отдельных субъединиц и для изучения их стабильности и каталитических свойств.

Данная работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 99-04-49156).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Popov V.O., Lamzin VS. II Biochem. J. 1994. 301. P. 625.

2. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D.,

Egorov A.M. II Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. 18. P. 201.

3. Galkin A.G., Kulakova L.B., Tishkov V.I., Esaki N., Soda K. II

Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. 44. P. 479.

4. Hollenberg C.P., Janowic, Z. II European Patent Application EP 0

299 108 A1, Bulletin 89I03. 1989.

5. Allen S.J., Holbrook J.J. II Gene. 1995. 162. P. 99.

6. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. II Eur. J. Biochem.

2000. 267. P. 1280.

7. Sakai Y., Murdanoto A.P., Konishi T., Iwamatsu A., Kato N. II J.

Bacteriol. 1997. 179. Р. 4480.

8. Saleeba J.A., Cobbett C.S., Hynes M.J. II Mol. Gen. Genet. 1992.

235. P. 349.

9. Chow C.M., RajBhandary U.L. II J. Bacteriol. 1993. 175. P. 3703.

10. Colas des Francs-Small C., Ambard-Bretteville F., Small I.D., Remy R. II Plant Physiol. 1993 102. P. 171.

11. Suzuki K., Itai R., Nakanishi H., Suzuki K., Nishizawa N.K., Yoshimura E, Mori S. II Plant Physiol. 1998. 116. P. 725.

12. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. II FEBS Letters. 1999. 445. P. 183.

13. Tishkov V.I., Galkin A.G., Fedorchuk V.V., Savitsky P.A., Rojkova A.M., Gieren H, Kula M.-R. II Biotechnol. Bioeng. 1999. 64. P. 1 87.

14. Lamzin V.S., Dauter Z., Popov V.O., Harutyunyan E.H., Wilson K.S. II J. Mol. Biol. 1994. 236. P. 759.

15. Kunkel T.A., Roberts J.D., Zakour R.A. II Methods Enzymol. 1987. 154. P. 367.

16. Kunkel T.A. II Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. 82. P. 488.

17. Тишков В.И., Галкин А.Г., Гладышев В.Н., Kap3aHoe В.В., Егоpов А.М. II Биотехнология. 1992. 5. C. 52.

18. Shih P., Kirsch J.F. IIProtein Sci. 1995. 4. P. 2063.

19. Anderson D.F., Hurley J.H., Nickolson H., Baase W.A., Matthews B.W. II Protein Sci. 1993. 2. P. 1285.

20. Burg B.van den, Dijkstra B.W., Vriend G., van der Vinne B., Venema G., Eijsink G.H. II Eur. J. Biochem. 1994. 220. P. 981.

Поступила в редакцию 20.06.2000

9 ВМУ, Химия, № б