ВАКЦИНА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ LAWSONIA INTRACELLULARIS, MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE, ЦИРКОВИРУСА СВИНЕЙ
VACCINE FOR PROTECTION AGAINST LAWSONIAINTRACELLULARIS, MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE AND PORCINE CIRCOVIRUS

Настоящее изобретение относится к вакцине для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковирусом свиней. Защита в указанном смысле означает, что вакцина по меньшей мере обеспечивает снижение отрицательного влияния, вызываемого Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковирусом свиней, указанное негативное влияние представляет собой например, повреждение тканей и/или клинические признаки, такие как снижение прироста массы, диарея, кашель, чихание и т.д. Настоящее изобретение также относится к набору, включающему первую емкость, содержащую неживые антигены Lawsonia intracellularis, одну или более других емкостей, содержащих антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней и инструкции по смешиванию антигенов Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae, и цирковируса свиней для создания одной комбинированной вакцины, предназначенной для системной вакцинации.
Пролиферативная энтеропатия (PE или PPE, также называемая энтеритом или илеитом) у многих животных, в особенности у свиней, представляет собой клинический признак или патологический синдром с гиперплазией незрелых эпителиальных клеток крипт слизистой оболочки, главным образом, в терминальном отделе подвздошной кишки. Другие участки кишечника, которые могут быть поражены, включают тонкую кишку, слепую кишку и толстую кишку. Поражаются, главным образом, поросята-отъемыши и молодые взрослые свиньи с типичным клиническим проявлением быстрой потери веса и дегидратации. Природное клиническое заболевание свиней встречается повсеместно. Заболевание неизменно ассоциировано с присутствием внутриклеточной бактерии изогнутой формы, в настоящее время известной как Lawsonia intracellularis.
Микоплазменная пневмония свиней, вызываемая бактериальным патогеном Mycoplasma hyopneumoniae, представляет собой широко распространенное хроническое респираторное заболевание свиней. Молодые поросята особенно восприимчивы к этому несмертельному заболеванию. Энзоотическая пневмония является хроническим заболеванием, которое приводит к уменьшению усвоения корма и угнетению роста. Заболевание является высоко контагиозным, и передача заболевания обычно происходит путем непосредственного контакта с выделениями из инфицированного респираторного тракта, например, в форме инфицированных капель при кашле/чихании. Наиболее проблематичным последствием данного заболевания является то, что оно вызывает предрасположение для всех видов вторичных инфекций респираторной системы. Установлено, что, например, в США инфицировано 99% свиноферм.
Считают, что цирковирус свиней связан с мультисистемным синдромом истощения после отъема (PMWS), наблюдаемым у молодых поросят. Впервые данное заболевание обнаружили в Канаде в 1991 г. Клинические признаки и патология опубликованы в 1997 г., и они включают прогрессирующее истощение, затрудненное дыхание, тахипноэ, и иногда, иктеричность и желтуху. Цирковирус свиней представляет собой маленький (17 нм) икосаэдрический безоболочечный вирус, содержащий кольцевой одноцепочечный ДНК-геном. Другой большой проблемой для фермеров является PDNS (синдром дерматита и нефропатии поросят), который появляется приблизительно в то же время, что и PMWS, и которой также связан с цирковирусом свиней. Характерной особенностью PDNS являются красные/коричневый круговые повреждения кожи с кровоизлияниями, обычно на ушах, боках, ногах и бедрах.
В отношении PE показано, что пероральная вакцинация против Lawsonia intracellularis является экономически эффективной мерой контролирования илеита и обеспечения наилучшего использования генетического потенциала роста свиньи (Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3.0, July 2006; доступно в Boehringer Ingelheim). Кроме того, пероральная вакцинация скорее, чем парентеральная уменьшает передачу переносимых с кровью инфекций, таких как PRRS, через многоразовые иглы и обеспечивает уменьшение побочных реакций от инъекций и числа игл, оставляемых в теле животного. Пероральная вакцинация снижает стресс у животного и у человека, время, затраты на оплату труда и усилия, по сравнению с индивидуальной вакцинацией (McOrist: "Ileitis - One Pathogen, Several Diseases" at the IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, June 28th, 2004).
В целом, само собой разумеется, что преимущество подхода с использованием ослабленной живой вакцины состоит в том, что эффективность иммунитета обычно является сравнительно хорошей, поскольку иммунная система хозяина подвергается воздействию всех антигенных свойств микроорганизма более "естественным" образом. Считают, в частности, что для внутриклеточных бактериальных агентов, таких как Lawsonia intracellularis, подход с использованием живой ослабленной вакцины обеспечивает наилучшую доступную защиту вакцинированных животных благодаря полному и адекватному Т-клеточному иммунному ответу. Указанный иммунный ответ отличается с вариациями от слабого иммунитета, ассоциированного с типами субъединичной или убитой вакцины против внутриклеточных бактерий. Данное утверждение также является верным, в частности, для облигатных внутриклеточных бактерий, таких как Lawsonia intracellularis или Chlamydia sp, которые вызывают патогенные инфекции слизистой оболочки. Исследования показывают, что полные живые ослабленные формы обсуждаемых внутриклеточных бактерий наилучшим образом доставляются к мишени - слизистой оболочке, что они необходимы в виде целых живых бактериальных форм для получения полностью защищающего иммунного ответа мишени - слизистой оболочки, и также что они иммунологически лучше вакцин, приготовленных с использованием отдельных бактериальных компонентов. Стало общепринятой практикой, что вакцину против Lawsonia intracellularis следует вводить перорально (см. Technical Manual 3.0, как указано выше в данном документе). Указанный путь введения обусловлен тем фактом, что основой устойчивости организма к илеиту является местный иммунитет кишечника, который представляет собой продукт клеточно-опосредованного иммунитета и местной обороны посредством антител, в особенности IgA. Согласно современным данным сывороточные антитела (IgG) не обеспечивают защиту, просто потому что они не достигают просвета кишечника. В исследованиях было показано, что пероральная вакцинация вызывает клеточный иммунитет, а также местную продукцию IgA в кишечнике (Murtaugh, in Agrar- und Veterinar-Akademie, Nutztierpraxis Aktuell, Ausgabe 9, Juni 2004; and Hyland et al. in Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338). Напротив, внутримышечное введение не приводит к формированию защиты. Кроме того, наряду с общепринятым представлением, что удачная вакцина против внутриклеточных бактерий должна индуцировать клеточный иммунитет, а также продукцию местных антител, специалисту в данной области техники известно, что только очень небольшой процент перорально поступивших антигенов действительно абсорбируется энтероцитами, и что внедрение Lawsonia intracellularis внутрь клетки является активным процессом, инициируемым бактерией. Таким образом, инактивированная вакцина обеспечивала бы кишечник неполным иммуногенным антигеном (Haesebrouck et al. in Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268). Поэтому полагают, что только ослабленные живые вакцины индуцируют достаточную клеточно-опосредованную защиту клеток кишечника (см. Technical Manual 3.0, как отмечено выше в данном документе). В настоящее время на рынке представлена только одна вакцина для защиты от Lawsonia intracellularis, а именно Enterisol Ileitis, предлагаемая Boehringer Ingelheim. Указанная вакцина представляет собой действительно живую вакцину для перорального введения.
До настоящего времени в известном уровне техники предлагали комбинированные вакцины Lawsonia intracellularis. Однако немногие из указанных комбинаций действительно проверяли на эффективность. Причиной этого является общепринятое мнение, что комбинация антигенов с антигенами Lawsonia intracellularis может приводить к успешной защите только в случае, если антигены Lawsonia представлены в виде живых (ослабленных) клеток. В связи с этим, авторы изобретения ссылаются на международную патентную заявку WO 2005/011731, которая также предлагает все виды комбинированных вакцин на основе Lawsonia intracellularis. Однако, принимая во внимание структуру описания и формулы патентной заявки, патентовладелец (Boehringer Ingelheim), по-видимому, уверен, что комбинированные вакцины только предположительно имеют обоснованный шанс на успех, если антигены Lawsonia представлены в них в виде живых клеток. Данное утверждение справедливо и для патентной заявки WO 2006/099561, также принадлежащей Boehringer Ingelheim. Действительно, исходя из общедоступных сведений, вышеуказанное мнение является очевидным соображением. Однако комбинация живых антигенов не дает непосредственно высокой вероятности взаимного влияния между антигенами и сложности производства такой живой комбинированной вакцины.
Задачей настоящего изобретения является предоставление вакцины для борьбы с Lawsonia intracellularis, и в то же время для борьбы с одним или более другими патогенами свиней. Для указанной задачи разработали вакцину, которая включает в комбинации неживые антигены Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней, и фармацевтически приемлемый носитель. Неожиданно, вопреки устойчивому общепринятому представлению как бороться с Lawsonia intracellularis, и что комбинированная вакцина должна включать живые антигены Lawsonia intracelluaris, обнаружили, что при использовании неживых антигенов Lawsonia intracellularis в комбинации с антигенами Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней, может быть предоставлена вакцина, которая защищает от Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней.
В общем, вакцина может быть получена путем применения известных в данной области техники способов, которые по существу включают смешивание антигенов с носителем. Обычно антиген (антигены) соединяют со средой для перемещения антигенов, часто называемой просто носителем или "фармацевтически приемлемым носителем". Такой носитель может представлять собой любой растворитель, дисперсионную среду, покрытие, противобактериальный и противогрибковый реагент, изотонический реагент и реагент, задерживающий абсорбцию, и т.п., которые физиологически совместимы и приемлемы для животного-мишени, например, будучи простерилизованы. Некоторые примеры таких несущих сред представляют собой воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, бактериальную культуральную жидкость, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Они могут обеспечивать жидкую, полужидкую и твердую дозированную лекарственную форму, в зависимости от предполагаемого способа введения. Широко известно, что наличие несущей среды не является существенным для эффективности вакцины, но может значительно облегчить дозировку и введение антигена. По существу, производство вакцины может происходить в промышленной среде, но антигены также могут быть смешаны с другими компонентами вакцины in situ (т.е. у ветеринаров, на ферме и т.д.), например, (непосредственно) перед фактическим введением животному. В вакцине антигены должны быть представлены в иммунологически эффективном количестве, т.е. в количестве, способном стимулировать иммунную систему мишени-животного по меньшей мере для снижения отрицательных эффектов после вакцинации при контрольном заражении микроорганизмами дикого типа. По желанию добавляют другие вещества, такие как адъюванты, стабилизаторы, модификаторы вязкости или другие компоненты в зависимости от предполагаемого использования или требуемых свойств вакцины. В воплощении вакцина находится в форме, предназначенной для системного введения. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что можно индуцировать защиту от Lawsonia intracellularis, которая сравнима или даже превосходит защиту, получаемую с помощью живой вакцины EnterisolIleitis (вводимой согласно соответствующим инструкциям), если комбинированную вакцину по настоящему изобретению вводить системно, т.е. способом, при котором она достигает системы кровообращения организма (включая сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), воздействуя, таким образом, на организм в целом, а не на определенный участок, например, на желудочно-кишечный тракт. Системное введение может быть осуществлено, например, путем введения антигенов в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (внутрикожно), под кожу (подкожно), под слизистую (субмукозно), в вены (внутривенно) и т.д. Для системной вакцинации подходят многие формы, в особенности жидкие препараты (с растворенными, эмульгированными или суспендированными антигенами), а также твердые препараты, такие как импланты, или промежуточная форма, такая как твердый носитель для антигена, суспендированного в жидкости. Системная вакцинация, в особенности парентеральная вакцинация (т.е. не через пищеварительный тракт), и подходящие (физические) формы вакцин для системной вакцинации известны уже более 200 лет. Преимуществом указанного воплощения является возможность использования пути введения, аналогичного существующему стандарту для введения антигенов Mycoplasma hyopneumoniae или цирковируса свиней, а именно парентеральный путь введения, в особенности с помощью внутримышечной или внутрикожной инъекции (в последнем случае часто с помощью безыгольной инъекции).
В воплощении неживые антигены Lawsonia intracellularis получают из композиции, содержащей углевод, указанный углевод также обнаружен в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток. Неожиданно для авторов изобретения, хорошая защита от PE могла быть обеспечена при использовании фракции, содержащей углевод клеток Lawsonia intracellularis (т.е. композиция, содержащая углеводы, которые представлены в живых клетках Lawsonia intracellularis) в комбинированной вакцине. Отмечают, что для получения вакцины может быть использована непосредственно содержащая углевод композиция, полученная из клеток Lawsonia intracellularis, а также композиция, полученная из нее, например, разведение или концентрат исходной композиции или экстракт, один или более очищенных компонентов и т.д. Отмечают, что субъединицы клеток Lawsonia intracellularis описаны в качестве антигенов в вакцине для защиты от указанной бактерии. Однако они представляют собой, главным образом, рекомбинантные белки, и до настоящего времени не доказано, что они способны обеспечивать или обеспечивают хорошую защиту. Также отмечается, что композиция, содержащая углевод, где углевод также обнаруживают в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток, известна из Kroll et al. (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, June 2005, 693-699). Однако указанную композицию используют для диагностики. Указанную композицию не тестировали в качестве защитного антигена по причинам, которые изложены выше.
В воплощении содержащая углевод композиция представляет собой материал, полученный в результате уничтожения бактерий Lawsonia intracellularis. Обнаружили, что очень удобным способом получения углевода для применения по настоящему изобретению является убийство клеток Lawsonia intracellularis и применение полученного в результате материала в качестве источника углевода. Теоретически также возможно экстрагирование углевода из живых клеток (аналогично получению "теней" живых клеток путем удаления клеточной стенки), но оно требует более сложных и, следовательно, более дорогих технологий. Материал может быть использован в целом виде, например, в виде суспензии целых клеток, или в виде лизата клеток Lawsonia intracellularis, или углевод может быть очищен или даже выделен из материала. Указанный способ может быть осуществлен путем использования относительно простых технологий, известных в данной области техники.
В предпочтительном воплощении композиция, содержащая углевод, включает целые клетки убитых бактерий Lawsonia intracellularis. Доказано, что указанная композиция представляет собой наиболее удобный способ предоставления углевода в качестве антигена в вакцине. Кроме того, эффективность вакцины еще более увеличивается, возможно, в связи с тем, что представление антигена иммунной системе животного-мишени наилучшим образом имитирует природное окружение углевода.
В воплощении вакцина включает адъювант типа "масло в воде", содержащий капли масла субмикронного размера. В целом, адъювант представляет собой неспецифический иммуностимулирующий агент. В принципе, любое вещество, которое способно поддерживать или усиливать определенный процесс в каскаде иммунологических событий, приводящих в конечном итоге к усилению иммунологического ответа (т.е. интегральный системный ответ на антиген, в особенности ответ, опосредованный лимфоцитами и обычно включающий распознавание антигенов специфическими антителами или предварительно сенсибилизированными лимфоцитами), может быть обозначено как адъювант. Показано, что использование адъюванта типа "масло в воде", содержащего капли масла субмикронного размера, обеспечивает очень хорошую защиту от Lawsonia intracellularis. Действительно, включение масла в водные адъюванты по существу обычно применительно к неживым антигенам. Однако, в целом, известно, что наилучшие иммуностимулирующие свойства получают, если капли масла имеют большой диаметр. В частности, капли масла диаметром менее 1 микрометра применяют, если полагают, что важным вопросом является безопасность. В таком случае можно было бы использовать небольшие капли, поскольку известно, что они вызывают меньше повреждений тканей, клинических симптомов и т.д. Однако, в случае получения защиты от заболевания, ассоциированного с кишечником, с помощью системной вакцинации (как в случае настоящего изобретения), можно было бы выбрать большие капли, поскольку предполагалось бы, что иммунный ответ значительно усилится. Напротив, авторы изобретения обнаружили, что применение небольших капель масла в композиции обеспечивало очень хорошие результаты в отношении защиты от Lawsonia intracellularis.
В еще одном предпочтительном воплощении адъювант включает капли биодеградируемого масла и капли минерального масла, капли биодеградируемого масла, имеют средний размер, который отличается от среднего размера капель минерального масла. Показано, что применение смеси биодеградируемого масла и минерального масла дает очень хорошие результаты в отношении эффективности и безопасности. В дополнение к этому, стабильность композиции очень высока, что является важным экономическим преимуществом. Доказано, что стабильность является очень хорошей, в особенности, если средний размер (взвешенный по объему) капель биодеградируемого масла или минерального масла составляет менее 500 нм (предпочтительно около 400 нм).
Настоящее изобретение также относится к набору, включающему первую емкость, содержащую в себе неживые антигены Lawsonia intracellularis, одну или более других емкостей, содержащих в себе антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней, и инструкции по смешиванию антигенов Lawsonia intracellularis, Mycoplasma hyopneumoniae, и цирковируса свиней для получения одной комбинированной вакцины, предназначенной для системной вакцинации. В указанном воплощении предоставляют отдельную емкость для антигенов Lawsonia intracellularis в наборе, содержащем также другие антигены (которые либо объединены в одной емкости, как известно из уровня техники, либо представлены в отдельных емкостях, которые образуют часть емкостей набора). Преимуществом данного воплощения является то, что можно предотвратить взаимодействие антигенов Lawsonia с другими антигенами до введения вакцины. Кроме того, поскольку антигены находятся в отдельной емкости, будет происходить меньше производственных потерь. В воплощении антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней содержатся в одной емкости, включенные в состав адъюванта типа "масло в воде". В указанном воплощении антигены Lawsonia могут быть смешаны с другими антигенами непосредственно перед применением.
Далее изобретение будет объяснено на основании следующих примеров.
Пример 1 описывает способ получения в основном безбелковой композиции, содержащей углевод и вакцину, которую создают при использовании указанной композиции. Пример 2 описывает эксперимент, в котором вакцину по настоящему изобретению сравнивают с вакциной, представленной в настоящее время на рынке, и с экспериментальной вакциной, включающей субъединицы белков Lawsonia intracellularis. Пример 3 описывает эксперимент, в котором две различные вакцины, содержащие неживые антигены Lawsonia intracellularis сравнивают с вакциной, представленной в настоящее время на рынке.
ПРИМЕР 1
В настоящем примере описан способ получения композиции в основном свободного от белка углевода, ассоциированного с наружной мембраной клеток Lawsonia intracellularis и вакцины, которая может быть получена с применением данной композиции. В целом, углевод представляет собой органическое соединение, которое включает углерод, водород и кислород, обычно в отношении 1:2:1. Примерами углеводов являются сахара (сахариды), крахмалы, целлюлозы и смолы. Обычно они служат главными источниками энергии в питании животных. Lawsonia intracellularis представляет собой грам-отрицательную бактерию, которая, таким образом, имеет наружную мембрану, которая построена не только из фосфолипида и белка, но также включает углеводы, в частности полисахарид (обычно полисахариды, такие как липополисахарид, липоолигосахарид, или даже полисахариды в нелипидной форме).
ФРАКЦИЯ УГЛЕВОДА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ
8
Брали двадцать миллилитров забуференной воды (0,04 M PBS, забуференный фосфатом физиологический раствор) содержащие клетки Lawsonia intracellularis в концентрации 3,7E8 (=3,7×10) клеток/мл. Клетки лизировали путем выдерживания их при 100°C в течение 10 минут. Добавляли протеазу K (10 мг/мл) в 0,04 M PBS в конечной концентрации 1,7 мг/мл. Данную смесь инкубировали при 60°C в течение 60 минут, чтобы разрушить все белки и сохранить углеводы интактными. Затем смесь инкубировали при 100°C в течение 10 минут, чтобы инактивировать протеазу K. Полученный в результате материал, который представлял собой композицию, содержащую углевод, в частности содержащую углеводы, которые представлены в живых бактериях Lawsonia intracellularis в ассоциации с их внешней мембраной (см. нижеприведенный параграф), хранили при 2-8°C до дальнейшего использования. Композицию получали в адъюванте Дилувак форте. Данный адъювант (см. также европейскую патентную заявку EP 0382271) включает 7,5 процентов по весу капель витамина Е ацетата со средним объемным взвешенным размером приблизительно 400 нм, суспендированного в воде и стабилизированного 0,5 процентами по весу Твин 80 (полиоксиэтиленсорбитан моноолеат). Каждый миллилитр вакцины содержал материал, который был экстрагирован из 1,2E8 клеток Lawsonia intracellularis.
ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ УГЛЕВОДНЫХ АНТИГЕНОВ LAWSONIA
2
4
2
4
4
Две партии моноклональных антител (MoAb's), полученных против целой клетки Lawsonia intracellularis, преципитировали сатурированной NaSO при комнатной температуре в соответствии со стандартными способами. Преципитат осаждали центрифугированием (10000g в течение 10 минут). Осадок промывали 20% NaSO и ресуспендировали в 0,04 M PBS. Активированные тилозилом бусины Dynal (DynaBeads, DK) предварительно промывали 0,1 M NaPO (pH 7,4), согласно инструкции производителя. Из каждой партии MoAb брали 140 мкг и добавляли к 2E8 предварительно промытых бусин и инкубировали в течение ночи при 37°C. Бусины осаждали центрифугированием и несвязанные MoAb удаляли аспирацией супернатанта. Спектрофотометрические измерения показали, что от 20 до 35% добавленных MoAb связывались с бусинами.
4
Две партии клеток Lawsonia intracellularis объемом по 1 мл (3,7E 8/мл) в 0,04 M PBS обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты. Полученные клеточные лизаты добавляли к тилозил-активированным бусинам - моноклональным комплексам и инкубировали в течение ночи при 4°C. Тилозил-активированные бусины - моноклональные комплексы промывали три раза 0,1 M NaPO (pH 7,4). Связанные соединения элюировали путем промывки бусин в 0,5 мл 8 M мочевины в 0,04 M PBS (E1); 0,5 мл 10 мМ глицина pH 2,5 (E2); и 0,5 мл 50 мМ HCI (E3), последовательным образом. После элюирования E2 и E3 нейтрализовали 100 мкл и 200 мкл 1 M Tris/HCI (pH 8,0).
Образцы брали на каждой стадии и помещали на гели ДСН-ПААГ. Гели окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (CBB) и серебром или блотировали. Блоты проявляли с помощью аналогичных MoAb, которые упоминались выше. Проверка гелей и блотов показала, что полоски, выявленные с помощью MoAb, с кажущейся молекулярной массой 21 и 24 кДа, которые невидимы на гелях CBB, были видимы на гелях, окрашенных серебром. Кроме того, установили, что фракция клеток, которая связывалась с MoAb, была устойчива к протеазе K. Таким образом, исходя из результатов можно заключить, что указанная фракция включает углеводы (т.к. белок лизируется, и обработанные ультразвуком фракции ДНК не проявляются в виде четкой полосы при окраске серебром), и что углеводы находятся в ассоциации (т.е. формируют часть или связаны) с внешней клеточной мембраной Lawsonia intracellularis (т.е. MoAb, индуцированные против указанной фракции, также распознавали целые клетки Lawsonia intracellularis). Учитывая, что Lawsonia intracellularis является грам-отрицательной бактерией, полагают, что углеводная композиция включает полисахарид(ы).
ПРИМЕР 2
Данный эксперимент проводили, чтобы тестировать удобный способ получения углеводного антигена в вакцине, а именно с помощью убитой целой клетки (известной также в качестве бактерина). В качестве контролей применяли коммерчески доступную вакцину Enterisolileitis и экспериментальную субъединичную вакцину, содержащую белковые субъединицы. Наряду с этим использовали невакцинированных животных в качестве контроля.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ПРИМЕРА 2
8
Инактивированную цельноклеточную вакцину получали следующим образом. Собирали живые клетки Lawsonia intracellularis, полученные из кишечника свиней с диагнозом PPE. Клетки инактивировали 0,01% BPL (бета-пропиолактон). Полученный в результате материал, который по существу является неживой композицией, содержащей углевод, по настоящему изобретению (в частности, поскольку он включает углеводы, которые представлены в живых бактериях Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной), получали в адъюванте Дилувак форте (см. Пример 1) в концентрации приблизительно 2,8×10 клеток на мл вакцины.
Субъединичная вакцина содержала рекомбинанты P1/2 и P4, которые известны из европейской патентной заявки EP 1219711 (белки 19/21 и 37 кДа, соответственно), и рекомбинантные белки, экспрессированные генами 5074, 4320 и 5464, как описано в международном патенте WO 2005/070958. Белки получали в адъюванте Дивалис форте. Вакцина содержала приблизительно 50 мкг каждого белка на миллилитр.
Использовали сорок свиней породы SPF в возрасте 6 недель. Свиней распределили по 4 группам, по десять свиней в каждой. Группу 1 вакцинировали однократно перорально (в T=O) 2 мл живой вакцины "Enterisolileitis" (Boehringer Ingelheim) согласно инструкциям производителя. Группы 2 и 3 вакцинировали дважды, внутримышечно (в T=O и T=4w) 2 мл инактивированной вакцины из целых клеток Lawsonia и рекомбинантной субъединичной комбинированной вакцины, как описано выше, соответственно. Группу 4 оставляли в качестве невакцинированного контроля. В T=6w всех свиней контрольно заражали пероральным путем с помощью гомогенизированной слизистой оболочки, инфицированной Lawsonia intracellularis. Затем проводили ежедневное наблюдение всех свиней на появление клинических признаков свиной пролиферативной энтеропатии (PPE). Периодически до и после контрольного заражения у свиней брали образцы сыворотки крови (для серологии) и фекалий (для ПЦР). В T=9w ко всем свиньям применяли эвтаназию и вскрывали их. Брали гистологические образцы подвздошной кишки и проводили микроскопическое исследование.
Инокулят для контрольного заражения готовили из инфицированной слизистой оболочки: 500 грамм инфицированной слизистой (соскобленной из инфицированных кишечников) смешивали с 500 мл физиологического раствора. Смесь гомогенизировали в смесителе омнимиксер в течение одной минуты на максимальной скорости, на льду. Всех свиней контрольно заражали пероральным путем 20 мл инокулята для контрольного заражения в T=6w.
В моменты времени T=0, 4, 6, 7, 8 и 9w брали образец фекалий (в количестве грамма) и образец сыворотки крови каждой свиньи и хранили в замороженном виде до тестирования. Образцы фекалий тестировали с помощью анализа количественного ПЦР (Q-PCR) и данные выражали в виде логарифма обнаруженного количества в пикограммах (пг). Образцы сыворотки крови тестировали с помощью обычно применяемого теста IFT (реакция иммунофлуоресценции для обнаружения антител против целых клеток Lawsonia intracellularis в сыворотке крови). Для гистологической оценки брали подходящий образец подвздошной кишки, фиксировали в 4% забуференном формалине, заливали обычным путем и готовили микроскопические препараты. Указанные препараты окрашивали гемотоксилином-эозином (краситель HE) и иммуногистохимическим красителем с применением моноклональных антител против Lawsonia intracellularis (краситель IHC). Препараты изучали под микроскопом. Гистологические оценки представлены, как указано ниже.
Краситель HE
Патологии не обнаружено
оценка = 0
Сомнительное повреждение
оценка = 1/2
Легкие повреждения
оценка = 1
Умеренные повреждения
оценка = 2
Тяжелые повреждения
оценка = 3
Краситель IHC
нет явных бактерий L. intracelluaris
оценка = 0
сомнительное присутствие бактерий
оценка = 1/2
присутствие единичных/небольшого числа бактерий в препарате
оценка = 1
присутствие умеренного числа бактерий в препарате
оценка = 2
присутствие большого числа бактерий в препарате Тяжелые повреждения
оценка = 3
Все данные записывали для каждой свиньи в отдельности. Оценку в группе рассчитывали как среднее значение положительных животных для различных параметров после контрольного заражения. Непараметрический U-критерий Манна-Уитни использовали для оценки статистической значимости (двухсторонний тест, уровень значимости устанавливали 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕРА 2
Серология
Перед первой вакцинацией все свиньи были серонегативными при IFT-тестировании титров антител. После вакцинации цельноклеточным бактерином (группа 2) у свиней обнаружили высокие титры антител IFT, тогда как контроли и свиньи, вакцинированные субъединичной вакциной, оставались отрицательными до контрольного заражения (таблица 1). Две из вакцинированных Enterisol свиней (группа 1) имели средние титры IFT, тогда как все остальные свиньи в данной группе оставались серонегативными. После контрольного заражения у всех свиней обнаружили высокие титры антител IFT. Результаты в виде средних значений описаны в таблице 1 (с использованным разведением нижний предел обнаружения составлял 1,0).
Таблица 1Средние значения титров антител IFT (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации и контрольного заражения
Группа
Т=0 недель
Т=4 недель
Т=6 недель
Т=9 недель
1
<1,0
1,1
1,7
>11,4
2
<1,0
3,7
>11,8
>12,0
3
<1,0
<1,0
<1,0
>11,6
4
<1,0
<1,0
<1,0
>12,0
ПЦР в режиме реального времени образцов фекалий
До контрольного заражения все образцы фекалий были отрицательными. После контрольного заражения положительные реакции обнаружили во всех группах. Группа 1 (p=0,02), группа 2 (p=0,01) и группа 3 (p=0,03) имели значительно более низкий уровень снижения массы, по сравнению с контролем. Обзор результатов после контрольного заражения представлен в таблице 2.
Таблица 2Результаты в виде средних значений анализа ПЦР образцов фекалий (log пг) после вакцинации и контрольного заражения
Группа
Т=6 недель
Т=7 недель
Т=8 недель
Итог после контрольного заражения
1
0
1,3
3,6
6,3
2
0
0,8
2,8
5,5
3
0
0,5
3,8
5,9
4
0
0,8
4,9
10,0
Гистологические оценки
Группа 2 имела самую низкую гистологическую оценку HE (p=0,05), оценку IHC (p=0,08) и общую гистологическую оценку (p=0,08). Другие группы имели более высокие оценки и не отличались существенно от контрольной группы. См. таблицу 3.
Таблица 3Среднее значение гистологической оценки подвздошной кишки
Группа
Оценка НЕ
Оценка IHC
Общая оценка
1
1,8
1,5
3,3
2
1,3
1,5
2,7
3
1,8
1,6
3,4
4
2,4
2,3
4,7
ЗАКЛЮЧЕНИЯ ПРИМЕРА 2
Из результатов можно заключить, что неживая цельноклеточная вакцина Lawsonia intracellularis, которая по существу включает углевод, который обнаружен также в ассоциации с наружной мембраной живых клеток Lawsonia intracellularis, индуцировала по меньшей мере частичную защиту. Все исследованные параметры и гистологические оценки были в значительной степени или практически в значительной степени лучше, по сравнению с контролями.
ПРИМЕР 3
Данный эксперимент проводили для тестирования вакцины, содержащей в основном безбелковую композицию, содержащую углевод в качестве антигена. Вторая вакцина, которую тестировали, включала кроме убитых целых клеток Lawsonia intracellularis, антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней (вакцина "комби"). В качестве контроля применяли коммерчески доступную вакцину Enterisol ileitis. Наряду с этим, в качестве второго контроля использовали невакцинированных животных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ПРИМЕРА 3
Вакцину на основе, главным образом, свободной от белков композиции, содержащей углевод, получали, как описано в Примере 1.
8
Экспериментальная комбивакцина содержала антиген инактивированных целых клеток Lawsonia intracellularis (способ получения инактивированных бактерий см. в Примере 2) в концентрации 1,7×10 клеток/мл. Помимо этого, вакцина содержала инактивированный антиген PCV-2 (20 мкг/мл белка, кодированного ORF 2, PCV-2; белок, который экспрессируется в бакуловирусной системе экспрессии, которая общеизвестна в данной области техники, например, как описано в международном патенте WO 2007/028823) и инактивированный антиген Mycoplasma hyopneumoniae (аналогичный антиген в аналогичной дозе, как известно из коммерчески доступной вакцины Porcilis Mhyo, полученной от Intervet, Boxmeer, The Netherlands). Антигены получали в двойной эмульсии адъюванта "X". Данный адъювант представляет собой смесь 5 объемных частей адъюванта "A" и 1 объемной части адъюванта "B". Адъювант "A" состоит из капель минерального масла со средним размером (объемно взвешенным) приблизительно 1 мкм, стабилизированных Твин 80 в воде. Адъювант "A" включает 25% масс минерального масла и 1% масс Твин. Остаток представляет собой воду. Адъювант "B" состоит из капель биодеградируемого витамина Е ацетата со средним размером (измеренным в объеме) приблизительно 400 нм, стабилизированных также Твин 80. Адъювант "B" включает 15 % масс витамина Е ацетата и 6 % масс Твин 80, остаток представляет собой воду.
Использовали шестьдесят четыре поросенка породы SPF в возрасте 3-х дней. Свиней распределили по четырем группам из 14 поросят и одну группу из 8 поросят (Группа 4). Группу 1 вакцинировали внутримышечно в возрасте 3 дней 2 мл комбивакцины, с последующей повторной вакцинацией в возрасте 25 дней. Группу 2 вакцинировали внутримышечно один раз 2 мл комбивакцины в возрасте 25 дней. Группу 3 вакцинировали перорально 2 мл Enterisol ileitis (Boehringer Ingelheim) в возрасте 25 дней согласно рекомендациям. Группу 4 вакцинировали внутримышечно в возрасте 3 и 25 дней 2 мл небелковой углеводной вакцины. Группу 5 оставляли невакцинированной, в качестве группы для контрольного заражения. В возрасте 46 дней всех свиней контрольно заражали пероральным путем с помощью гомогенизированной инфицированной слизистой оболочки. Затем проводили ежедневное наблюдение всех свиней на появление клинических признаков свиной пролиферативной энтеропатии (PPE). Периодически до и после контрольного заражения у свиней брали образцы сыворотки крови для серологии и анализа ПЦР соответственно. В возрасте 68 дней ко всем свиньям применяли эвтаназию и вскрывали их. Проводили гистологическое исследование подвздошной кишки.
Другие вопросы по дизайну эксперимента были аналогичны вопросам, описанным в Примере 2, если не указано иначе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕРА 3
Серология
1- Lawsonia. Перед первой вакцинацией все свиньи были серонегативными при тестировании IFT титров антител. После вакцинации комбивакциной (группы 1 и 2) и небелковой углеводной вакциной (группа 4) у большинства свиней обнаружили титры антител IFT, тогда как контроли и свиньи, вакцинированные Enterisol, оставались серонегативными до контрольного заражения. После контрольного заражения у всех свиней (за исключением двух в группе Enterisol) обнаружили титры антител IFT. Обзор полученных средних значений представлен в таблице 4 (ввиду более высокого разведения по сравнению с Примером 2, предел обнаружения составлял 4,0).
Таблица 4Средние значения IFT титров антител Lawsonia (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации и контрольного заражения
Группа
Т=3 недель
Т=25 дней
Т=46 дней
Т=67 дней
1
<4,0
<4,0
7,9
10,3
2
<4,0
<4,0
4,8
9,8
3
<4,0
<4,0
4,0
8,5
4
<4,0
<4,0
6,9
10,6
5
<4,0
<4,0
<4,0
9,0
2 - Mycoplasma hyopneumoniae
В отношении Mhyo, в начале эксперимента, а также в день ревакцинации (в возрасте 25 дней) все свиньи были серонегативными по Mhyo. После ревакцинации в группе 1 обнаружили высокие титры антител Mhyo, сравнимые с титрами, получаемыми с помощью коммерчески доступной вакцины типа "прайм-буст" Porcilis Mhyo. Результаты представлены в таблице 5 ниже. По-видимому, в указанных условиях (внутримышечное введение), только в случае проведения вторичной вакцинации титры антител в возрасте 46 дней превышают предел обнаружения (6,0 для применяемого способа). Известно, однако, что однократно проводимая вакцинация антигенами Mhyo может обеспечивать достаточную защиту, в особенности при внутрикожном введении (см., например, международную патентную заявку WO 2007/103042).
Таблица 5Среднее значение IFT титров антител против Mhyo (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации
Группа
Т=3 дня
Т=25 дней
Т=46 дней
1
ниже уровня обнаружения
ниже уровня обнаружения
8,3
2
ниже уровня обнаружения
ниже уровня обнаружения
ниже уровня обнаружения
5
ниже уровня обнаружения
ниже уровня обнаружения
ниже уровня обнаружения
3 - Цирковирус свиней
В отношении PCV, в возрасте 3-х дней поросята имели высокие титры материнских антител против PCV. В день ревакцинации (в возрасте 25 дней) вакцинированные животные (группа 1) имели титр, сходный с титром антител группы 2 и с титром антител контрольной группы. Титр антител против PCV в возрасте 25 дней был несколько ниже, по сравнению с титром, определяемым в возрасте 3 дней. После вакцинации в возрасте 25 дней титры группы 1 (2 вакцинации в дни 3 и 25) и группы 2 (одна вакцинация в день 25) оставались на высоком уровне, тогда как поросята контрольной группы демонстрировали обычное снижение материнских антител. Полученные PCV-титры сравнимы с титрами, получаемыми с отдельной вакциной, содержащей аналогичный антиген (например, Intervet's Circumvent PCV, вакцина, которая обеспечивает очень хорошую защиту от PCV). Обзор средних значений представлен в таблице, приведенной ниже.
Таблица 6Среднее значение IFT титров антител к PCV (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации
Группа
Т=3 дня
Т=25 дней
Т=46 дней
1
11,5
9,6
10,1
2
12,1
9,5
10,8
5
10,9
9,1
7,0
ПЦР в режиме реального времени образцов фекалий
Через три недели после контрольного заражения у свиней групп 1, 2 и 4 содержалось меньшее количество Lawsonia (ДНК) в фекалиях, по сравнению с группами 3 и 5. Статистически значимыми были только различия между группами 1 и 3 (Enterisol) и между группами 4 и 3 (p<0,05, U-критерий Манна-Уитни). Результаты в виде средних значений представлены в таблице 7.
Таблица 7Средние значения результатов анализа ПЦР образцов фекалий (log, пг) после вакцинации и контрольного заражения
Группа
Среднее значение
1
1,0
2
1,2
3
2,0
4
0,6
5
1,8
Гистологические оценки
Гистологические оценки групп 1 и 4 были значительно ниже, по сравнению с оценками групп 3 и 5 (p<0,05, двухсторонний U-критерий Манна-Уитни (см. таблицу 8). Число свиней с подтвержденным диагнозом PPE составляло 2/13 в группе 1, 6/12 в группе 2, 12/14 в группе 3, 2/7 в группе 4 и 12/14 в контрольной группе 5. Группы 1 и 4 имели значительно более низкую частоту возникновения PPE, по сравнению с группами 3 и 5 (p<0,05, двухсторонний точный критерий Фишера).
Таблица 8Среднее значение гистологической оценки подвздошной кишки
Группа
Оценка HE
Оценка IHC
Общая оценка
1
0,4
0,6
1,0
2
0,7
0,7
1,4
3
1,6
1,4
3,0
4
0,4
0,4
0,8
5
1,9
1,5
3,4
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРИМЕРА 3
Из результатов можно заключить, что антиген углевода наружной клеточной мембраны обеспечивает относительно хорошую защиту против илеита. Установлено также, что использование цельноклеточного бактерина Lawsonia является хорошим способом предоставления углеводного антигена в вакцине для борьбы с илеитом. Кроме того, принимая во внимание тот факт, что комбинированная вакцина обеспечивала титры антител против Mhyo и PCV в концентрации сопоставимой с концентрациями, получаемыми с доступными отдельными вакцинами, которые подходят для борьбы с указанными микроорганизмами, показано, что комбинированная вакцина, содержащая неживые антигены Lawsonia intracellularis в комбинации с антигенами Mhyo и PCV, применима для борьбы с Lawsonia intracellularis, а также с Mycoplasma hyopneumoniae и цирковирусом свиней.