Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А
INACTIVATED SORPTIVE FOOT-AND-MOUTH DISEASE TYPE A VACCINE

Широкое распространение вируса ящура, равно как и сложности, возникающие при диагностике заболевания и подборе вакцинных штаммов во время противоэпизоотических мероприятий, обусловлены высокой мутационной изменчивостью генома и, как следствие, антигенным разнообразием вируса ящура [1, 2].
Профилактическая эффективность вакцин, определяемая по эпидемиологическим показателям, устанавливается в группах привитых животных при угрозе возникновения и распространения болезни. Вакцины должны обеспечивать создание массовой невосприимчивости и препятствовать распространению эпизоотических штаммов вируса ящура.
Так, для успешного проведения профилактической групповой иммунизации необходима информация о результатах сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вакцинных штаммов и эпизоотических изолятов вируса ящура, циркулирующих в зоне профилактической вакцинации. При возникновении вспышек заболевания именно путем сравнительного анализа нуклеотидного и аминокислотного определения антигенного соответствия эпизоотического изолята производственному штамму можно наиболее оперативно подобрать необходимый штамм для производства вакцин, применяемых в угрожаемой зоне [3].
Возбудитель ящура обладает высокой антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях в зависимости от видового состава восприимчивого поголовья, иммунного статуса животных и множества других факторов. Мутационная изменчивость изолятов вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), локализованных на поверхности капсидных белков.
Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью способствуют ослаблению специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном, и, кроме того, вызывают затруднения штаммоспецифической диагностики.
В 2015 году на территории Армении была отмечена вспышка ящура. Выделенный изолят значительно отличался от производственных штаммов вируса ящура. В связи с этим для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя возникла необходимость разработать вакцину на основе эпизоотического штамма вируса ящура серотипа А.
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А22 №550, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении [4].
22
Штамм А №550 вируса ящура выделен в 1964 году в Азербайджане и в настоящее время используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
В качестве чувствительной биологической системы используют новорожденных крольчат, а поддерживающей средой служит фосфатно-буферный раствор (ФБР). Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей применяют хлороформ в количестве 2% от объема и последующее центрифугирование. Инактивацию вируса проводят с использованием формальдегида. В качестве адъюванта выступает гидроокись алюминия (ГОА) в смеси с сапонином.
22
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А Ирак 24/64, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении.
22
Штамм А Ирак 24/64 вируса ящура был передан в виде афтозного материала из института Рази (Иран) в 1967 году. В Российской Федерации используется в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ. С целью очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в количестве 2% от общего объема и последующее центрифугирование. Для инактивации вируса применяют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), а в качестве адъювантов - гидроокись алюминия с сапонином.
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2045/Киргизия/2007, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта и поддерживающей среды в эффективном соотношении.
Исходный вирус был выделен в 2007 году в Республике Киргизия. Вакцинный штамм получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей проводят с помощью хлороформа в количестве 2% от общего объема с последующим центрифугированием. Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин, а из адъювантов - гидроокись алюминия с сапонином [5].
Известна вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2187/Кути/2013 [6].
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2187/Кути/2013 [7], был выделен в сентябре 2013 года от больных свиней в селе Кути Приаргунского района Забайкальского края (экспертиза №2187). Производственный штамм получен из данного изолята путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в количестве 2% от общего объема и последующее центрифугирование. Инактивацию вируса проводят с применением аминоэтилэтиленимина. В качестве адъюванта используют смесь гидроокись алюминия и сапонина.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма А №2187/Кути/2013. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2187/Кути/2013 представляет собой суспензию преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура и используется в качестве производственного штамма при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.
среды
Исходный вирус для получения штамма А №2187/Кути/2013 выделен в июле 2013 году в селе Нижний Куркужин Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики. Штамм получен путем многократных последовательных пассажей в чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам из свиной почки (СП), а также к перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30). Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно суспензионную перевиваемую клеточную линию ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки крови с добавлением ферментативных гидролизатов мышц сухого (ФГМС), гидролизатов белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков (рН 7,4-7,6).
Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей применяют полигексаметиленгуанидин (ПГМГ). С целью инактивации вируса используют аминоэтилэтиленамин (АЭЭИ), который добавляют в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05%. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [8]. В качестве адъювантов используют ГОА с сапонином.
Данная вакцина характеризуется следующим качественным и количественным составом:
3
антигенный материал - не менее 3,0 мкг/см,
3
ГОА - 11000,0-15000,0 мкг/см,
3
сапонин - 500,0-1500,0 мкг/см,
3
поддерживающая среда - до 1000000,0 мкг/см.
Существенный недостаток известных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, заключается в их недостаточной иммуногенной активности. Они не обеспечивают надежной защиты восприимчивых животных от эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка вакцины противоящурной инактивированной сорбированной, позволяющей обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин инактивированных сорбированных против ящура типа А. Указанный технический результат достигнут созданием вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А, характеризующейся совокупностью признаков, которые приведены ниже.
3
Предлагаемая вакцина в 1 см препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 [9], полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17, в количестве не менее 3,0 мкг и целевые добавки: ГОА предпочтительно в количестве 11000,0-15000,0 мкг, сапонин предпочтительно в количестве 500,0-1500,0 мкг.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в декабре 2015 года от больных свиней в Республике Армения (экспертиза №2269). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы использовали предпочтительно суспензионную перевиваемую клеточную линию ВНК-21/2-17, а в качестве поддерживающей среды - раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,4-7,6.
Для инактивации вируса применяли АЭЭИ, который добавляли в вируссодержащую суспензию до концентрации 0,025-0,05% от общего объема. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализовали внесением в суспензию тиосульфата натрия [8]. Полученный антиген очищали от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносили в суспензию до концентрации 0,005-0,007% от общего объема [10].
Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 представлял собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75 S иммуногенные компоненты вируса ящура. Качественное и количественное содержание вирусного сырья в полученном материале определяли методом турбидиметрии [11].
3
Для приготовления сорбированной вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см не менее 0,5 мкг 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.
3
3
3
Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов вируса ящура в предлагаемой вакцине, составляющую не менее 3 мкг в 1 смготового препарата, получают путем добавления в авирулентный и очищенный антигенный материал расчетного количества адъюванта-сорбента ГОА. Оптимальным является содержание ГОА в 1 см готового препарата в диапазоне от 11000,0 мкг до 15000,0 мкг. К полученному концентрату дополнительно вносят 10%-ный водный раствор сапонина, достигая его содержание в диапазоне от 500,0 мкг до 1500,0 мкг в 1 см готового препарата.
Разработанная сорбированная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана.
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А.
2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в эффективном количестве.
3. Целевые добавки.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типа А;
2. Активное вещество;
3. Целевые добавки.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества готовый препарат содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.
1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток животного происхождения и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А.
3
4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см готового препарата.
5. В качестве целевой добавки вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА.
3
6. ГОА предпочтительно в количестве 11000,0-15000,0 мкг в 1 см готового препарата.
7. В качестве целевой добавки вакцина содержит сапонин.
3
8. Сапонин предпочтительно в количестве 500,0-1500,0 в 1 см готового препарата.
3
9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S и 75 S иммуногенные компоненты вируса ящура типа А, ГОА, сапонин в соотношении, мкг/см, готового препарата:
3
антигенный материал - не менее 3,0 мкг/см,
3
ГОА - 11000,0-15000,0 мкг/см,
3
сапонин - 500,0-1500,0 мкг/см.
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против вируса ящура серотипа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Достижение технического результата от использования изобретения достигается тем, что в состав предлагаемой вакцины введен в качестве активного вещества антигенный материал из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура серотипа А, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение противоящурной вакцины сорбированной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А депонирован 01 февраля 2015 года в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») под регистрационным номером (ссылкой): штамм ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 (производственный), (контрольный КРС), (контрольный свиной).
По сравнению с известными штаммами А №2269/ВНИИЗЖ/2015 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.
Экспериментально подтверждена возможность использования вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов с целью диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
1
Сущность изобретения пояснена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
1
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена VP штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А;
1
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А.
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:40.
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и выведена первичная структура белка VP1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм вируса ящура типа А №2269/ВНИИЗЖ/2015 значительно отличается от производственных штаммов типа А.
22
22
Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 со штаммами вируса ящура серологического типа А составило: А№550 - 16,12%, А/Ирак/64 - 15,78%, А/Иран/96 - 15,78%, А/Армения/98 - 15,34%, А/Турция/06 - 18,47%, А/Иран/05 - 18,62%.
Филогенетический анализ показал, что штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 принадлежит к генетической линии G-VII топотипа Азия.
22
Антигенное родство штамма ВЯ А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с имеющимися производственными штаммами ВЯ типа А исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 антигенно отличается от производственных штаммов А №550, А/Ирак/64, А/Иран/97, А/Турция/06 (А/Иран/05), А №2187/Кути/13, А №2171/Кабардино-Балкарский/13.
1
22
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r) составило для А №550 - 0,01, А/Ирак/64 - 0,01, А/Иран/97 - 0,05, А/Турция/06 - 0,02, А №2187/Кути/13 - 0,01, А №2171/Кабардино-Балкарский/13 - 0,06. При значении r1 ≥ 0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r1 < 0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса [12, 13].
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 репродуцируется в первично-трипсинизированной монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, и в течение 17-24 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,75 до 7,25 1g ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1-10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 24 часа. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 3 пассажей (срок наблюдения).
Гено- и хемотаксономическая характеристика
6
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP VP, VP и VP. Липопротеиновая оболочка отсутствует.
1
66
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VPa) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам.
Наиболее стабилен при pH 7,2-7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам. Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного антигена морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.
Для снижения эпизоотической опасности ящура типа А и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.
Получена высокоиммуногенная инактивированная сорбированная вакцина против ящура типа А из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена также примерами его осуществления и использования, которые не ограничивают объем правовой охраны изобретения.
Пример 1. Получение и исследование биологических свойств штамма А№2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в декабре 2015 года от подозреваемых в заболевании ящуром свиней из села Аразап, Армавирский марз, Республика Армения (экспертиза №2269/2015). Пробы афтозного материала поступили в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 25 декабря 2015 года.
При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [14].
Биологические и вирусологические методы включали:
2
3
50
Выделение вируса проводили в культуре первично-трипсинизированных клеток СП, перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2 с последующей адаптацией в течение 3 пассажей. Применяемые клеточные линии выращивали с использованием требуемых питательных сред в стационарных условиях в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 см, отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформа. После контакта с вирусом при температуре 37°С в течение 0,5 ч во флаконы вносили по 5 см поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД вируса, характеризующегося округлением клеток, дегенерацией и отделением клеток от стекла, повышение оптической плотности суспензии. После развития ЦПД флаконы подвергали процессу замораживания-оттаивания, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 об/мин (1200 g) в течение 0,25 ч. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, применяя коммерческие типоспецифические сыворотки, хранящихся в музее ФГБУ «ВНИИЗЖ». Возбудитель ящура считали адаптированным к культурам клеток, если в течение 20-24 часов клеточный монослой деструктировал под влиянием вируса на 90-100%.
Вирус, адаптированный к клеткам линий ПСГК-3030, IB-RS-2 и ВНК-21/2-17, использовали с целью получения антигена для РСК. Результаты адаптации вируса к указанным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А к использованным линиям клеток.
Пример 2. Сравнительный анализ биологических свойств штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 с производственными штамма вируса ящура типа А.
При изучении свойств штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 выявлены значительные преимущества в сравнении с используемыми производственными штаммами.
В таблицах 3 и 4 приведены результаты культивирования штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013 вируса ящура типа А, из которых следует:
1) штаммы А №2187/Кути/2013 и А №2269/ВНИИЗЖ/2015 имеют разное время репродукции, 10,30±0,35 и 15,35±0,58 часов, соответственно;
2) процент выхода иммуногенных компонентов при культивировании штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура выше, чем у штамма А №2187/Кути/2013.
Пример 3. Получение инактивированного антигена.
50
Инактивированную сорбированную вакцину против ящура типа А производят из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, выращенного в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без внесения сыворотки крови с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при pH 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,200 ТЦД/клетка.
3
Культивирование вируса проводят при температуре 36-37°С. Через 6-7 часов инкубирования определяют количество живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то экспозицию продлевают еще 2-3 часа. При доле мертвых клеток, равной 90-95%, культивирование прекращают, и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов. Количество 146S и 75S компонентов для сорбированной вакцины в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см.
Пример 4. Исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75S) компоненты вируса ящура штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013.
По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой, корректируя pH 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,050%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при температуре 36-37°С и pH 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. Остаток АЭЭИ нейтрализуют добавлением тиосульфата натрия.
В теплую суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией.
В таблице 5 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные (146S и 75 S) компоненты вируса ящура штаммов А №2269/ВНИИЗЖ/2015 и А №2187/Кути/2013. Из таблицы 5 следует, что иммуногенные компоненты штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства штамму А №2187/Кути/2013. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 концентрация 146S и 75S компонентов, полученных при репродукции вируса, не снижается.
Пример 5. Изготовление сорбированной вакцины против вируса ящура из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
Полученный антиген контролируют на содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса, авирулентность и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в 1 см для сорбированной вакцины достигают путем концентрирования антигена ГОА.
3
3
В охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке вносят 3% ГОА, перемешивают содержимое в течение 30 минут. После седиментации ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна находиться в пределах 1,750±0,300 (p<0,001 мкг/см, n=10), а содержание 146S и 75S компонентов вируса ящура в готовом препарате - не менее 3,0 мкг/см. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10% раствор сапонина до конечной концентрации 0,075%, что соответствует 750,0 мкг сапонина в 1 см готовой вакцины. Вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль ее стерильности в соответствии с ГОСТ 28085-89.
Пример 6. Оценка авирулентности и безвредности сорбированной противоящурной вакцины из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
3
3
Внешний вид и оптимальный компонентный состав вакцины. Авирулентность и безвредность вакцины оценивают на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 см, а затем подкожно в дозе 10,0 см. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или на морских свинках.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании. Оптимальный компонентный состав полученной сорбированной вакцины против ящура типа А отражен в таблице 6.
Пример 7. Оценка гуморального иммунитета у КРС при использовании сорбированной противоящурной вакцины из штамма
А №2187/Кути/2013 против гетерологичного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015.
3
2
2
2
2
Изучен гуморальный иммунитет у КРС, привитого сорбированной вакциной из штамма А №2187/Кути/2013, против гетерологичного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, оценивали уровень иммунного ответа против вакцинного штамма А №2187/Кути/2013 и против штамма А №2269/ВНИИЗЖ/ 2015. Испытание проводили с использованием 10 голов КРС. Сорбированную вакцину вводили подкожно в дозе 2,0 см. Результаты исследований представлены в таблице 7, из которой видно, что сорбированная вакцина у КРС стимулировала выработку вируснейтрализующих антител (ВНА) против штамма А №2187/Кути/2013 в количестве от 5,05±0,12 log, а против гетерологичного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 титр ВНА был более, чем в 2 раза меньше и составлял от 2,25±0,27 log. Разница в титрах ВНА является существенной и статистически достоверной (p<0,001 log, n=10). Из этого следует, что вакцина, изготовленная из производственного штамма А №2187/Кути/2013 не вызывает формирования гуморального иммунитета для защиты животных от заражения гетерологичным штаммом А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вирусом ящура. По данным OIE (МЭБ) титр вируснейтрализующих антител против возбудителя ящура должен составлять не менее 5,00 log [15].
3
Пример 8. Сравнительный анализ формирования гуморального иммунитета у КРС при использовании сорбированной противоящурной вакцины из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015, изготовленной так, как описано в примерах 3, 4 и 5 и содержащей следующие компоненты, мкг в 1 см готового препарата:
авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура типа А
3,0
ГОА
1740,0
сапонин
750,0.
22
Изучен гуморальный иммунитет у КРС, привитого сорбированной вакциной из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 вируса ящура, против вакцинных штаммов вируса ящура типа А. Уровень гуморального иммунитета оценивали против вакцинных штаммов А №2171/Кабардино-Балкарский/2013, А №2187/ Кути/2013, А Ирак 24/64, А №2029 Турция/2006 и против гомологичного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015. Результаты анализа отражены в таблице 8.
Титры антител на 21 сутки после вакцинации против гомологичного штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 были в 1,30-3,46 раз выше, чем против производственных штаммов.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 в соответствии с предлагаемым изобретением обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья, Центральной Азии, Среднего и Ближнего Востока.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина сорбированная инактивированная против ящура типа А»:
1. Domingo, Е. Evolution of FMD virus / E. Domingo, C. Escarmis, E. Baranovski // Virus Res. - 2003. - Vol. 91. - P. 47-63.
2. Узюмов, В.Л. Ультраструктура и физико-химические свойства вируса ящура / В.Л. Узюмов: Фрунзе: Кыргызстан, 1970. - 246 с.
3. Дудников А.И., Борисов В.В., Дудников С.А. Противояшурный иммунитет и практические достижения в области противоящурной защиты // Пробл. зооiженерii та вет. Медицини: зб. наук. прац. - Харькiв, 2007. - Вип. 15(40). - Ч. 2, - т. 1. - С. 116-120.
22
4. Временная инструкция по изготовлению и контролю противоящурной концентрированной гидроокись алюминиевой формолвакцины из лапинизированного вируса А. Утверждена ГУВ СССР 25.03.1971 г.
5. Патент РФ №2451745, С12 №7/00, 27.05.2010 г.
6. Патент РФ №2563345, А61К 39/135, 20.09.2015 г.
7. Патент РФ №2553219, С12 №7/00, 10.06.2015 г.
8. Заявка на изобретение №2016127971/10 от 12.07.2016 г.
9. Патент РФ №594771, А61К 39/12, 07.07.93 г.
10. Патент РФ №2054039, C12N 7/02, А61К 39/135, 10.02.1996 г.
11. Авт. свид. СССР №784335, C12Q 1/02, 20.03.2000 г.
12. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 7th Ed. -, Paris, 2012-Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
13. Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bergman [et al.] // Rev. Sci. Tech. OIE. - 2005. - Vol. 24(3). - P. 981-983.
14. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура / Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. [и др.]. Владимир, 2002,31 с.
15. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. -, Paris, 2016 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
Примечание: *ВСБ - вирусспецифический белок
Примечание: *ВСБ - вирусспецифический белок
Примечание: *ВСБ - вирусспецифический белок
Примечание: А №2269 - штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 культурального вируса ящура,
А Турция - штамм А №2029/Турция/2006 культурального вируса ящура,
А КБР - штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 культурального вируса ящура,
А Кути - штамм А №2187/Кути/2013 культурального вируса ящура,
22
22
А Ирак - штамм А Ирак 24/64 культурального вируса ящура
Примечание: А №2269 - штамм А №2269/ВНИИЗЖ/2015 культурального вируса ящура,
А Турция - штамм А №2029/Турция/2006 культурального вируса ящура,
А КБР - штамм А №2171/Кабардино-Балкарский/2013 культурального вируса ящура,
А Кути - штамм А №2187/Кути/2013 культурального вируса ящура,
22
22
АИрак - штамм А Ирак 24/64 культурального вируса ящура.