Рекомбинантная вакцина против вируса ветряной оспы (VZV)
RECOMBINANT VACCINE AGAINST VARICELLA ZOSTER VIRUS (VZV)

Область техники
Настоящее изобретение относится к препарату вакцины и, в частности, к разработке препарата вакцины, который может стимулировать иммунную систему человека к продуцированию нейтрализующих антител против рекомбинантного слитого белка гликопротеина Е (gE) вируса ветряной оспы (VZV).
Предшествующий уровень техники
VZV, являющийся представителем подсемейства Alphaherpesvirinae семейства Herpesviridae, представляет собой двухцепочечный ДНК-вирус диаметром от 150 нм до 200 нм. Морфологически VZV имеет шаровидную структуру, состоящую из ядра нуклеиновой кислоты, белкового капсида и оболочки. Геном VZV представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК размером примерно 125 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), которая включает уникальную длинную последовательность (UL) размером примерно 100 т.п.н. и уникальные короткие последовательности (US) размером примерно 5,4 т.п.н., которые отделены друг от друга концевыми и внутренними повторами размером 6,8 т.п.н., имея всего 72 открытых рамки считывания (ORF). Помимо белковых молекул, ассоциированных с репликацией, транскрипцией, упаковкой, высвобождением и другими видами биологической активности VZV, и белков, взаимодействующих с клетками-хозяевами, геном VZV кодирует 8 гликопротеинов: гликопротеин В (gB), гликопротеин С (gC), gE, гликопротеин Н (gH), гликопротеин I (gI), гликопротеин К (gK), гликопротеин L (gL) и гликопротеин М (gM), которые играют чрезвычайно важную роль в созревании и упаковке VZV. GE включает 623 аминокислоты (АА) и кодируется геном ORF68, который состоит из 1872 оснований и расположен в области короткой последовательности генома VZV. gE имеет гидрофильный внеклеточный домен из 544 АА (включая сигнальный пептид) на N-конце и имеет гидрофобный трансмембранный домен из 17 АА и внутриклеточный домен из 62 АА на С-конце. Как мембранный белок типа I, gE является важным гликопротеином для образования инфекционных частиц VZV, а также гликопротеином с наиболее сильной антигенностью и наиболее высоким содержанием в вирусной оболочке и инфицированной клеточной мембране. Более того, gE также широко присутствует на поверхности частиц VZV и клеточной мембране клеток-хозяев, а также в цитоплазме клеток-хозяев и может индуцировать клеточный иммунитет и гуморальный иммунитет.
gE VZV включает две области, кодирующие эпитопы e1 и c1. Эти эпитопы стабильны среди штаммов VZV из разных регионов, обладают высокой консервативностью и являются подходящими антигенными субъединицами вакцины-кандидата. gE присутствует на поверхности частиц VZV и инфицированных клеток и в цитоплазме инфицированных клеток, причем существует в различных гликопептидных формах на разных стадиях зрелости VZV. Молекула gE включает транспортный сигнал и может участвовать в сборке вирусных белков и образовании оболочки в аппарате Гольджи. В сыворотке пациентов с ветряной оспой и опоясывающим герпесом на стадии выздоровления антитела против VZV в основном нацелены на три гликопротеина: gB, gH и gE, особенно нацелены на gE. Специфический гуморальный и клеточный иммунитет, вырабатываемый организмом при индукции gE, может защитить организм от вирусной атаки. gE включает фосфорилированные О-цепочечные и N-цепочечные комплексные гликаны с высоким содержанием маннозы, которые могут взаимодействовать с gI для связывания с Fc-сегментом человеческого IgG. gE и gI ковалентно связываются для выполнения функции Fc-рецептора на поверхности инфицированных клеток.
VZV проникает в местные лимфатические узлы через эпителий слизистой оболочки дыхательных путей и реплицируется во время первичной инфекции, затем лимфоциты, инфицированные VZV, попадают в кровоток через лимфатическую циркуляцию, и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) инфицируются, а вирус распространяется в кожу через кровоток, что клинически проявляется ветряной оспой. После излечения от ветряной оспы вирус остается латентным в черепно-мозговых ганглиях, ганглиях спинных корешков, вегетативных нейронах или кишечных нейронах. Когда сопротивляемость организма снижается, латентный вирус реактивируется, реплицируется и мигрирует к коже по периферическим нервам, что клинически проявляется как опоясывающий герпес.
VZV очень заразен. Пациенты с ветряной оспой или опоясывающим герпесом являются единственным источником инфекции. VZV в основном передается воздушно-капельным путем и при прямом контакте. Пациенты с ветряной оспой выделяют вирус через слюну или глазную жидкость за 2 дня до появления сыпи. В волдырях пациентов с ветряной оспой или опоясывающим герпесом содержатся частицы инфекционного вируса. Восприимчивые люди будут инфицированы при вдыхании капель, выделяемых пациентами с ветряной оспой или опоясывающим герпесом во время дыхания, а также будут инфицированы при прямом контакте с волдырями из кожных поражений, при этом чем больше поражений кожи, тем сильнее инфекционность. Ветряная оспа может возникать у инфицированных восприимчивых людей, но инфекция не вызывает непосредственно опоясывающий герпес.
Сероэпидемиологические исследования показывают, что от 95% до 97% женщин детородного возраста имеют положительные сывороточные антитела против VZV, поэтому вероятность заражения ребенка инфекцией VZV в течение 6 месяцев после рождения очень мала. Взрослые с отрицательными антителами против VZV в сыворотке, младенцы, рожденные беременными женщинами с отрицательными антителами против VZV в сыворотке, люди с ослабленным иммунитетом, плоды беременных женщин, перенесших ветряную оспу на 4-5-м месяцах беременности, и новорожденные, рожденные матерями, у которых была ветряная оспа до и после родов, все имеют предрасположенность к тяжелой первичной инфекции VZV. Пожилые люди с ослабленным иммунитетом, дети, чьи матери переболели ветряной оспой во время беременности, а также дети, перенесшие ветряную оспу через год после рождения, имеют повышенный риск развития опоясывающего герпеса.
Более 95% молодых людей в Северной Америке и Европе имеют положительные сывороточные антитела против VZV, поэтому они подвержены риску развития опоясывающего герпеса. Согласно статистическим данным, основанным на численности населения, опоясывающим герпесом заболевают от 3 до 5 на 1000 человек в год, в том числе: от 3 до 10 на 1000 человек в год в Азиатско-Тихоокеанском регионе, 10,4 на 1000 человек в год в Южной Корее, 10,9 на 1000 человек в год в Японии, от 3,4 до 5,8 на 1000 человек в год на материковой части Китая и от 4,89 до 5,67 на 1000 человек в год на Тайване в Китае. В настоящее время отсутствуют данные о заболеваемости опоясывающим герпесом в Африке.
Примерно от 13% до 47% пациентов с опоясывающим герпесом имеют осложнения или последствия, которые в основном затрагивают нервную систему и глаза. Осложнения со стороны нервной системы включают постгерпетическую невралгию (PHN), синдром Рамсея-Ханта, паралич Белла, менингит, миелит и транзиторную ишемическую атаку (TIA) или инсульт. Глазные осложнения в основном включают офтальмологический опоясывающий герпес (HZO).
PHN представляет собой наиболее частое последствие опоясывающего герпеса, для которого существует международно признанное определение, согласно которому боль продолжается более 90 суток после появления сыпи. Примерно у 30% до 50% PHN продолжается более 1 года, а в некоторых случаях может продолжаться до 10 лет. Примерно от 5% до 30% пациентов с опоясывающим герпесом имеют PHN, от 10% до 20% по сообщениям в большинстве литературных источников и от 8,6% до 13,8% на материковой части Китая. Заболеваемость PHN увеличивается с возрастом пациентов, заболеваемость PHN составляет около 8% среди пациентов не моложе 50 лет, а среди пациентов не моложе 80 лет заболеваемость PHN достигает 33%. Относительно очевидные факторы восприимчивости к PHN включают пожилой возраст, тяжелые продромальные симптомы, сильную сыпь, сильную боль и слабый иммунитет. Люди с поражением тройничного нерва, сопровождаемым системной красной волчанкой (SLE), диабетом или психоневрологическими расстройствами, также восприимчивы к PHN.
HZO возникает при вовлечении офтальмологического отдела тройничного нерва после реактивации и репликации латентного VZV. Согласно статистическим данным, основанным на численности населения, заболеваемость HZO составляет 30,9 на 100000, достигая 104,6 на 100000 среди людей в возрасте не моложе 65 лет. Согласно статистическим данным, основанным на базовом количестве пациентов с опоясывающим герпесом, заболеваемость HZO составляет от 10% до 20% и также увеличивается с возрастом. Клинические проявления HZO включают блефарит, кератит, конъюнктивит, склерит, увеит или острый прогрессирующий некроз сетчатки. Около 2,5% пациентов с HZO в США страдают от поражения глаз, причем 6% из них становятся слепыми. Около половины пациентов с HZO страдают поражениями кожи, причем у около 21% из них в конечном итоге развивается PHN.
Пожилые пациенты или пациенты с ослабленным иммунитетом также могут подвергнуться повторной атаке опоясывающего герпеса, распространению кожных поражений, сопутствующих бактериальным инфекциям, или бородавчатой гиперплазии, что также может привести к резистентности к вирусу. В тяжелых случаях могут быть вовлечены несколько органов, таких как легкие, желудочно-кишечный тракт и мозг, а гепатит, панкреатит, пневмония, миокардит, эзофагит или язвенная болезнь могут возникнуть до появления сыпи при опоясывающем герпесе, что легко приводит к неправильной диагностике.
Люди, которым был привит аттенуированный штамм VZV (штамм ОКА) или которые естественным образом были инфицированы вирусом VZV, могут получить защитный иммунитет. Живая аттенуированная вакцина штамма ОКА была одобрена FDA США, Национальным управлением медицинских продуктов Китая, Европейским Союзом и другими ведомствами по вакцинации детей для предупреждения инфицирования детей VZV дикого типа. Живая аттенуированная вакцина штамма ОКА с высокой дозировкой была одобрена FDA США и Европейским союзом для вакцинации пожилых людей старше 50 лет для предупреждения у них заболеваний, вызываемых VZV, таких как межреберная невралгия, или снижения риска развития таких заболеваний. В настоящее время более 60 стран и регионов, включая Европейский Союз и США, рекомендовали Зоставакс людям с нормальной иммунной функцией не моложе 50 лет для предупреждения опоясывающего герпеса и PHN. Вакцину Зоставакс вводят путем инъекции однократной дозы (0,65 мл, включающие 19400 бляшкообразующих единиц (БОЕ) вируса) подкожно в дельтовидную область плеча. Иногда могут возникать побочные реакции, такие как головные боли и местные реакции на инъекции. Крупномасштабными многоцентровыми клиническими испытаниями подтверждено, что после вакцинации заболеваемость опоясывающим герпесом снижается на 69,8% у людей с нормальной иммунной функцией в возрасте от 50 до 59 лет, а заболеваемость опоясывающим герпесом, заболеваемость PHN и тяжесть заболевания снижается на 51,3%, 66,5% и 61,1%, соответственно, у людей не моложе 60 лет. Профилактическая эффективность Зоставакса постепенно снижается с возрастом субъектов вакцинации. Людям с тяжелой иммуносупрессией и беременным женщинам вакцинация запрещена. Поэтому крайне необходимо получить более безопасные и более эффективные вакцины по сравнению с существующими вакцинами. Компания GSK разрабатывает субъединичную вакцину против опоясывающего герпеса, изготавливаемую из рекомбинантного VZV gE и адъюванта AS01B. При введении этой субъединичной вакцины людям с нормальной иммунной функцией не моложе 50 лет, заболеваемость опоясывающим герпесом и заболеваемость PHN снижаются на 97,2% и 91,2%, соответственно; а при введении этой субъединичной вакцины людям в возрасте не моложе 70 лет, заболеваемость опоясывающим герпесом и заболеваемость PHN снижаются на 89,8% и 88,8%, соответственно. Субъединичная вакцина показывает лучший эффект, чем живая аттенуированная вакцина Зоставакс, и может иметь многообещающие перспективы применения. Разбавитель AS01B, используемый в рекомбинантной вакцине VZV gE, включает масляные адъюванты, такие как QS21, 3-О-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) и фосфатидилхолин (PC). Следовательно, хотя эффект рекомбинантной вакцины VZV gE значительно лучше, чем эффект живой аттенуированной вакцины VZV Зоставакс, рекомбинантная вакцина VZV gE будет вызывать образование узелков в месте инъекции, для исчезновения которых требуется короткое или долгое время.
++
В CN 102517302 A раскрыт способ рекомбинантной экспрессии VZV усеченного gE и его применение. В этом способе VZV усеченный gE (где трансмембранный домен и внутриклеточный домен удалены и His-метка добавлена) ген вводят в клетки-хозяева для экспрессии с получением рекомбинантного VZV усеченного gE. Данный способ экспрессии способствует повышению уровня экспрессии целевого белка, упрощению последующей очистки, а также позволяет легко реализовать крупномасштабное производство белка. Рекомбинантный белок может быть использован в качестве иммобилизованного антигена для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) VZV-специфических иммуноглобулинов в образцах плазмы, что может повысить точность клинической диагностики инфекции VZV. Более того, рекомбинантный белок также может быть использован в других областях, где требуются VZV-специфические иммуноглобулины для высокопроизводительного обнаружения. Продукт данного способа представляет собой экспрессируемый прокариотами негликозилированный белок, который в основном используют для обнаружения предыдущих инфекций VZV, и не подходит для приготовления иммунных композиций или вакцин для человека, которые требуют комплексного гликозилирования для образования сывороточных нейтрализующих антител к VZV. В Li Fumin et at. раскрыта амплификация гена VZV gE с помощью ПЦР, клонирование этого гена в эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3.1 и идентификация этого гена путем двойного ферментативного переваривания и секвенирования. Результаты показывают, что амплифицированный целевой ген включает полноразмерный ген gE длиной около 1,9 т.п.н., и рекомбинантный экспрессионный вектор, несущий ген gE, успешно сконструирован (Practical Journal of Clinical Medicine, 2006 (02)). В Yi Xingxu et al. раскрыт способ конструирования эукариотической экспрессионной плазмиды pCDNA3.1-gE с геном внеклеточного домена VZV gE. После секвенирования плазмиду трансфицируют в клетки COS-7 путем липофекции и клеточные линии, стабильно экспрессирующие VZV gE, подвергают скринингу с помощью G418. мРНК VZV gE выявляют с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а иммунореактивность gE определяют с помощью вестерн-блоттинга и непрямой иммунофлуоресценции (IIF). Продукт экспрессии очищают с помощью колонки Ni-NTA и наносят на планшет ELISA для определения уровня антител VZV-IgG в 127 образцах сыворотки здоровых детей в возрасте от 0 до 10 лет. Результаты показывают, что линия клеток COS-7, способная стабильно экспрессировать ген внеклеточного домена VZV gE, успешно подвергается скринингу; мРНК gE обнаруживается с помощью ОТ-ПЦР; по данным вестерн-блоттинга и IIF экспрессированный gE является иммунореактивным; и имеется экспрессия gE как в линии клеток COS-7, так и в ее культуральном супернатанте с уровнем экспрессии около 0,632 мкг/мл и чистотой около 90%. В тесте ELISA 127 образцов сыворотки от детей в возрасте от 0 до 10 лет тестированы на VZV-IgG антитела с общим положительным показателем 81,89%, специфичностью и чувствительностью, соответственно, 93,75% и 88,24% (Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2015 (03)). Эти исследования VZV gE в основном сосредоточены на реализации экспрессии белка в эукариотических клетках. Продукт экспрессии имеет очень низкую чистоту, которая может удовлетворить только фактические потребности обнаружения, и вовсе не удовлетворяет требованиям к качеству вакцин для человека. Нет никаких исследований по последующей очистке продукта экспрессии, а также нет никаких сообщений об использовании продукта экспрессии в вакцинах для человека.
++
++
В Li Chunming et al. раскрыт способ конструирования рекомбинантной эукариотической экспрессионной плазмиды pCI-neo-gE537-His, который включает: инфицирование диплоидных клеток человека (линия 2BS) с помощью VZV-Oka; извлечение геномной ДНК (гДНК); используя гДНК в качестве матрицы, амплификацию целевого фрагмента gE537 с помощью ПЦР; и клонирование целевого фрагмента в вектор pCI-neo с получением рекомбинантной эукариотической экспрессионной плазмиды pCI-neo-gE537-His. После массивной амплификации плазмиду извлекают и трансфицируют в клетки 293FT для временной экспрессии, и продукт экспрессии очищают на никелевой колонке с получением целевого белка gE537-His. Этот очищенный продукт может специфически связываться с мышиным моноклональным антителом (mAb) против gE при относительной молекулярной массе около 90 кДа и может реагировать с mAb против gE mAb-10 и mAb-12 (Chinese Journal of Biologicals, 2016 (11)). В Yi Xingxu раскрыт способ клонирования и экспрессии фрагмента гена внеклеточного домена VZV gE. В частности, этот метод заключается в следующем: жидкость кожных пузырьков, клинически собранную у пациентов с опоясывающим герпесом, инокулируют в монослойные эмбриональные фибробласты человека для выделения вируса; и выделенные штаммы вирусов подвергают характеристическому цитопатическому эффекту (CPE), IIF и анализу секвенирования ДНК. Проверенные клинически выделенные штаммы VZV культивируют in vitro и фрагмент гена внеклеточного домена gE VZV амплифицируют с помощью ПЦР для конструирования прокариотической экспрессионной плазмиды gE-pET-32a (+) и эукариотической экспрессионной плазмиды gE-pCDNA3.1/myc-His (-). После секвенирования прокариотическую плазмиду трансформируют в компетентную Escherichia coli (Е. coli) BL21 (DE3) и используют для индукции изопропил-p-D-тиогалактопиранозид (IPTG) с получением экспрессируемого прокариотами слитого белка VZV gE. Специфичность рекомбинантного белка определяют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и вестерн-блоттингом и экспрессированный белок подвергают очистке и рефолдингу на колонке с использованием колонки Ni-NTA. Эукариотическую плазмиду трансфицируют в клетки COS-7 путем липофекции, клеточную линию, стабильно экспрессирующую VZV gE, подвергают скринингу с помощью G418, и продукт экспрессии очищают на колонке Ni-NTA. мРНК гена gE VZV обнаруживают с помощью ОТ-ПЦР и иммунореактивность слитого белка gE анализируют с помощью вестерн-блоттинга и IIF. Очищенный gE, экспрессируемый прокариотами, и gE, экспрессируемый эукариотами, используют для раздельной иммунизации новозеландских кроликов с получением кроличьих поликлональных антител (pAbs) против VZV gE (Аньхойский медицинский университет, кандидатская и докторская диссертации). Приведенные выше результаты показывают, что экспрессия VZV gE в клетках животных достигается, но полученные продукты экспрессии имеют низкую чистоту.
+
Рецепторы Fc экспрессируются на поверхности многих клеток врожденного иммунитета, поэтому Fc-фрагменты также широко используют при изучении нацеливания на дендритные клетки (DC). В соответствии с различными подтипами антител, с которыми Fc-рецепторы связываются, Fc-рецепторы подразделяют на FcaR (IgA), Fca/yR (IgA и IgM), FcsR (IgE) и FcγR (IgG). Кроме того, Fc-рецепторы также можно разделить на высоко аффинные рецепторы и низкоаффинные рецепторы в соответствии с их аффинностью. Высокоаффинные рецепторы связываются с mAb, а низкоаффинные рецепторы связывают pAbs. В исследовании нацеливания на DC нацеливание на FcγR применялось раньше всего. Многие опубликованные исследования показали, что нацеливание на FcγR может значительно повысить эффективность презентации антигена in vitro и способствовать связыванию антигена с МНС II. Антиген, нацеленный на FcγR, в итоге презентируется CD4Т-клеткам для активации ТН1-сигнального пути (Dai X, Jayapal М, Тау НК, Reghunathan R, et al., Differential signal transduction, membrane trafficking, and immune effector functions mediated by FcγRI versus FcγRIIa. Blood. 2009; 114: 318-27).
Слитый белок, сконструированный путем слитой экспрессии VZV gE (или антигена, имеющего происхождение из других патогенных микроорганизмов) и Fc-фрагмента mAb против рецептора DC, интернализуется DC. Во время процесса эндоцитоза Fc-рекомбинантный белок или Fc-сопряженный белок разрушается внутриклеточными протеиназами и образованные антигенные пептиды могут быть загружены на молекулы МНС-1 и/или МНС-П. Важнейшим преимуществом этого Fc-опосредованного способа является то, что антигены могут доставляться непосредственно к антигенпрезентирующим клеткам (АРС), что повышает эффективность презентации антигена. Более того, этим способом можно избирательно активировать специфические сигнальные пути посредством нацеливания на специфические рецепторы на поверхности клеток DC (Caminschi I, Shortman К. Boosting antibody responses by targeting antigens to dendritic cells. Trends in immunology. 2012; 33: 71-7).
В настоящем изобретении ген, кодирующий внеклеточный домен VZV gE пептидной цепи, связывают с геном, кодирующим СН2-СН3 область иммуноглобулина человека, полученный целевой ген встраивают в эукариотический экспрессионный вектор и полученный эукариотический экспрессионный вектор трансфицируют в клетки яичника китайского хомячка (СНО), в которых слитый белок VZV gE-Fc успешно экспрессируется. Этот рекомбинантный белок очищают с помощью аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии и хроматографии на молекулярных ситах и возможные вирусные контаминанты удаляют путем инактивации вируса, с получением таким образом высокоочищенного слитого белка. Fc-фрагмент слитого белка может связываться с Fc-рецептором на поверхности DC в иммунной системе организма человека, тем самым повышая эффективность презентации антигена DC, и после иммунизации могут быть получены сывороточные нейтрализующие антитела в высоком титре.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к способу предупреждения и/или снижения степени тяжести опоясывающего герпеса и/или PHN, включающему введение индивидууму иммуногенной композиции, которая включает живой аттенуированный VZV (штамм ОКА) или полностью инактивированный VZV и антиген VZV или его рекомбинантное иммуногенное производное gE.
Настоящее изобретение также относится к способу предупреждения или ослабления реактивации VZV и/или PHN, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму иммуногенной композиции или вакцины, которая включает слитый белок gE или его иммуногенные производное или фрагмент и адъювант.
Принимая во внимание вышеупомянутые проблемы предшествующего уровня техники, одна из задач настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить ген слитого белка VZV gE-Fc для получения продукта экспрессии гена VZV gE высокой степени чистоты у млекопитающих.
Для решения указанной выше задачи настоящего изобретения в настоящем изобретении приняты следующие технические решения.
В настоящем изобретении предложен препарат рекомбинантной вакцины VZV, включающий слитый белок, образованный аминокислотной последовательностью внеклеточного домена рекомбинантного гликопротеина gE гена живого аттенуированного штамма VZV (штамм ОКА) и Fc-фрагментом иммуноглобулина человека, где слитый белок имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.
Препарат вакцины по настоящему изобретению может дополнительно включать адъювант вакцины. Адъювант вакцины может представлять собой адъювант гидроксид алюминия, адъювант фосфат алюминия или смесь адъювантов гидроксида алюминия и фосфата алюминия.
Каждая единица дозировки препарата вакцины по настоящему изобретению может включать от 5 мкг до 200 мкг слитого белка.
Предпочтительно, каждая единица дозировки препарата вакцины по настоящему изобретению может включать от 10 мкг до 100 мкг слитого белка.
Более предпочтительно, каждая единица дозировки препарата вакцины по настоящему изобретению может включать от 20 мкг до 60 мкг слитого белка.
Препарат вакцины по настоящему изобретению может дополнительно включать другие вещества, которые могут усиливать иммуногенность, и эти другие вещества, которые могут усиливать иммуногенность, включают, без ограничения: фосфатидилхолин (PC), лецитин, 3-О-деацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL), длинноцепочечную жирную кислоту (сложный эфир), минеральное масло, растительное масло, метилцеллюлозу натрия (MC-Na), карбоксиметилцеллюлозу натрия (CMC-Na) и холестерин-содержащие липосомы.
Препарат вакцины по настоящему изобретению может представлять собой лиофилизированный препарат. Лиофилизированный препарат может быть растворен в суспензии адъюванта гидроксида алюминия перед применением, а затем полученную смесь можно тщательно перемешать и ввести внутримышечно или подкожно.
В настоящем изобретении дополнительно предложен рекомбинантный ген, способный экспрессировать слитый белок по настоящему изобретению, и этот рекомбинантный ген имеет последовательность ДНК, показанную в SEQ ID NO: 2.
Экспрессионный вектор для слитого белка (далее обозначенного как gE-Fc или VZV gE) по настоящему изобретению получают путем вставки гена слитого gE-Fc в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих.
Слитый белок по настоящему изобретению представляет собой экзогенный антиген или его производное, которые могут эффективно стимулировать иммунную систему организма человека к выработке иммунного ответа, и этот иммунный ответ относится к индуцированному ответу иммунной системы организма с продуцированием сывороточных нейтрализующих антител в высоком титре. Такой ответ может снизить заболеваемость опоясывающим герпесом у человека или может облегчить боль, такую как межреберная невралгия или симптомы, вызываемые опоясывающим герпесом. Обычную методику в данной области техники, такую как определение уровня сывороточных нейтрализующих антител или определение уровня антител на VZV gE (гликозилированный белок) посредством ELISA, используют для оценки повышения иммунного ответа, или известные клинические критерии используют для оценки улучшения клинических симптомов или степени проявления признаков заболевания.
В качестве предпочтительного воплощения вышеупомянутый продукт экспрессии может быть смешан с адъювантом на основе алюминия или другим лекарственным средством, повышающим иммуногенность, с получением препарата, который можно использовать у пожилых людей старше 50 лет для предупреждения инфекционных заболеваний, вызываемых опоясывающим герпесом, таких как межреберная невралгия, а также может быть использован у младенцев для предупреждения инфекций, вызываемых VZV.
Подобно защитным антигенам различных вирусов, защитные антигены VZV также являются гликопротеинами, особенно gE, который является основным гликозилированным белком VZV. Разнообразные формы гликозилирования обеспечивают основные нейтрализующие антигены для VZV. Существующими исследованиями подтверждено, что сывороточные антитела против gE могут нейтрализовать VZV.
Другие подходящие антигены также включают различные гликопротеины, такие как gB, gH, gC, gI и IE63 (например, см. Huang et al., J. Virol. 1992, 66: 2664; Sharp et al., J. Inf. Dis. 1992, 165: 852; Debrus, J Virol. 1995 May, 69 (5): 3240-5; и упомянутые там ссылки), IE62 (например, см. Arvin et al., J. Immunol. 1991 146: 257; Sabella J Virol. 1993 Dec, 67 (12): 7673-6; и упомянутые там ссылки), ORF4 или ORF 10 (Arvin et al., Viral Immunol. 2002 15: 507.), но распространенность этих гликопротеинов на мембране VZV ниже gE, поэтому эти гликопротеины не являются для организма основным источником выработки нейтрализующих антител к VZV.
В настоящем изобретении реализуется высокоэффективная экспрессия гена VZV gE в системе экспрессии млекопитающих. Без изменения аминокислотной последовательности, ген внеклеточной области VZV gE синтезируют на основе оптимизации кодонов в соответствии с предпочтительным кодоном клеток СНО, конструируют ген слитого gE-Fc и на этой основе конструируют эукариотический экспрессионный вектор и трансфицируют его в клетки СНО K1. Аффинную хроматографию с белком A (HPLC) используют для обнаружения экспрессии белка, а ELISA используют для определения активности связывания VZV gE с человеческим aHTH-VZV-специфическим иммуноглобулином. Подтверждено, что секреция и экспрессия гена VZV gE в клетках СНО успешно достигается. Проводили тест нейтрализации сыворотки, в котором кроликов и мышей BALB/C иммунизируют высокоочищенным VZV gE и полученную иммунную сыворотку используют для нейтрализации штамма ОКА, и результаты этого теста подтверждают, что экспрессированный белок VZV gE-Fc имеет выраженную иммуногенность, причем высокий титр сывороточных нейтрализующих антител может быть достигнут после 2 иммунизаций.
Антиген VZV gE следует использовать в дозировке, которая может стимулировать организм к выработке защитного иммунного ответа без выраженных побочных эффектов. Дозировка антигена зависит от используемого адъюванта и формы его существования. В целом, можно ожидать, что каждая дозировка может включать от 2 мкг до 1000 мкг VZV gE. Когда VZV gE используют у людей, адъювант на основе алюминия может быть использован для адсорбции, чтобы уменьшить число инъекций, и когда адъювант на основе алюминия используют для адсорбции, предполагают использование от примерно 5 до 200 мкг VZV gE для выработки нейтрализующих антител в высоком титре. Предпочтительная дозировка может включать от примерно 10 мкг до 100 мкг VZV gE, и соответствующая дозировка иммунизации может включать примерно 10 мкг, 25 мкг, 50 мкг, 100 мкг или примерно 200 мкг VZV gE. Оптимальная дозировка для взрослых может включать 50 или 100 мкг VZV gE, а оптимальная дозировка для младенцев может включать 10 или 20 мкг VZV gE.
Путь введения препарата вакцины по настоящему изобретению может включать, например, местное введение, интраназальное введение, введение через слизистые оболочки, внутрикожное введение, внутрибрюшинное введение, подкожную инъекцию и внутримышечную инъекцию.
Препарат вакцины по настоящему изобретению может быть возможно объединен с адъювантами и/или (другими) подходящими носителями.
В случае использования режима бустерной иммунизации или в случае использования режима многократной иммунизации могут быть предприняты 2, 3, 4 или более иммунизаций. Режимы, подходящие для активации и бустера, могут включать иммунизацию с интервалом в 1, 2, 3 или 6 месяцев.
Последовательность внеклеточного домена VZV gE оболочки является частью последовательности, перечисленной в Приложении 1 настоящего изобретения. Полная последовательность VZV gE была впервые опубликована в Virus Research (Virus Research, Haumont et al. Vol. 40, 1996 p: 199-204).
Если в контексте явно не указано иное, VZV gE или gE, упомянутые здесь и далее, включают усеченный VZV gE или другие фрагменты или производные VZV gE-Fc.
gE или его производные или фрагменты являются жидкими или лиофилизированными. Кроме того, gE или его производные (gE-Fc), фрагменты или полимеры могут присутствовать в суспензии с адъювантом на основе алюминия или могут присутствовать в растворе или суспензии с другими компонентами иммунного усилителя (например, в растворе или суспензии с QS21, холестерином, минеральным маслом, растительным маслом, рыбьим жиром, длинноцепочечной жирной кислотой, сложным эфиром длинноцепочечной жирной кислоты, адъювантом 3D-MPL и др.).
gE или его производные могут быть инкапсулированы в микроносители из полимолочной кислоты (PLA) или в микроносители, образованные из сополимера дигликолида/лактида. После того как образованные микроносители введены внутримышечно или подкожно, инкапсулированное рекомбинантное белковое лекарственное средство медленно высвобождается в течение определенного периода времени, чтобы стимулировать иммунную систему организма к выработке антител.
По сравнению с предшествующим уровнем техники настоящее изобретение обладает следующими преимуществами.
1. В настоящем изобретении используют клетки млекопитающих (СНО) для эффективной экспрессии секретируемого слитого белка gE-Fc, а полученный целевой продукт представляет собой гликозилированный белок, который находится главным образом в форме димера и вторично в форме мономера. Каждая молекула димера включает 4 молекулы gE. Слитый белок, полученный в соответствии с настоящим изобретением, имеет большую молекулярную массу и сильную иммуногенность.
2. gE-Fc по настоящему изобретению представляет собой слитый белок внеклеточного домена VZV gE и Fc-фрагмента иммуноглобулина человека (область СН2-СН3). Имеющаяся в продаже колонка для аффинной хроматографии с белком А может быть использована для достижения высокоэффективного предварительного выделения и очистки целевого белка, что сводит к минимуму выбросы загрязняющих веществ в окружающую среду, является экологически чистым и благоприятствует дальнейшей очистке этого целевого белка путем ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии по размеру молекул и т.д. на последующих этапах.
3. Рекомбинантный слитый белок gE-Fc, экспрессируемый клетками СНО, по настоящему изобретению представляет собой гликозилированный белок, который сохраняет пространственную структуру природного белка gE, проявляет выраженную иммуногенность и является перспективным и подходящим для крупномасштабной популяризации.
4. Fc в слитом белке gE-Fc, предложенном в настоящем изобретении, может связываться с Fc-рецепторами на поверхности АРС, существующих в иммунной системе человека, чтобы активно презентировать gE антигены. Результаты экспериментов на иммуногенность у животных показывают, что, когда белок gE-Fc, продуцируемый рекомбинантными клетками СНО, по настоящему изобретению используют в качестве антигена для иммунизации кроликов и мышей без масляных адъювантов и иммуностимуляторов, сывороточные нейтрализующие антитела в высоком титре по-прежнему могут вырабатываться.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показан результат электрофореза в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления плазмид VZV gE-Fc,
где дорожка 1: ДНК-маркер DL10000 (10000 п. н., 7000 п. н., 4000 п. н., 2000 п. н., 1000 и.о., 500 п. н. и 250 п. н.),
дорожки 2 и 3: продукты ферментативного расщепления плазмиды pUC57-gE-Fc,
и
дорожки 4-5: продукты ферментативного расщепления плазмиды pXC-K383L.
На Фиг. 2 показаны положительные клоны, полученные с помощью ПЦР-скрининга колоний рекомбинантных плазмид VZV gE-Fc,
где дорожка 1: ДНК-маркер DL10000 (10000 п. н., 7000 п. н., 4000 п. н., 2000 п. н., 1000 п. о., 500 п. н. и 250 п. н.),
дорожки 2-7: 6 клонов gE-Fc-1-6, полученных с помощью ПЦР-скрининга колоний.
На Фиг. 3 показан результат электрофореза в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления с линеаризацией плазмидного экспрессионного вектора,
где дорожка 1: ДНК-маркер DL10000 (10000 п. н., 7000 п. н., 4000 п. н., 2000 п. н., 1000 п. о., 500 п. н. и 250 п. н.),
дорожка 2: плазмида pXC4-VZV gE-Fc, и
дорожка 3: линеаризованная плазмида VZV gE-Fc-straight.
На Фиг. 4 показана хроматограмма HPLC-SEC рекомбинантного белка VZV gE, очищенного с помощью аффинной хроматографии.
На Фиг. 5 показана хроматограмма HPLC-SEC рекомбинантного белка VZV gE.
На Фиг. 6 показан титр (средний геометрический титр (GMT)) сывороточных антител, продуцируемых у мышей, иммунизированных вакциной VZV gE, включающей адъювант на основе алюминия, в различных дозировках.
На Фиг. 7 показаны результаты определения титра сывороточных нейтрализующих антител, продуцируемых у мышей BALB/C, иммунизированных рекомбинантной вакциной VZV gE, включающей адъювант на основе алюминия для адсорбции.
На Фиг. 8 показан GMT нейтрализующих антител, продуцируемых у мышей BALB/C, иммунизированных вакциной VZV gE, включающей адъювант на основе алюминия, в различных дозировках.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, однако эти примеры не предназначены ограничивать настоящее изобретение.
Пример 1. Конструирование плазмидного экспрессионного вектора
1. Источник последовательности гена
+
VZV gE по настоящему изобретению представлял собой внеклеточный домен (ECD, 31-546 аминокислотных остатков) gE, содержащий всего 516 аминокислот. Fc-фрагмент представлял собой Fc человеческого IgG1, содержащий всего 232 аминокислоты (Приложение: аминокислотная последовательность 1). Ген VZV gE и ген Fc человеческого IgG1 связывали в тандеме (Приложение: последовательность ДНК 2). Компании Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd было поручено синтезировать последовательность гена слитого белка gE-Fc VZV и встроить последовательность гена в вектор pUC57-1.8K, при этом синтезированный ген включал сайт переваривания ферментом, последовательность Козака, сигнальный пептид, целевой ген (2244 п. н.) и стоп-кодон, общей длиной 2355 п. н. Оптимизацию кодонов проводили при синтезе рекомбинантного гена для облегчения экспрессии в клетках СНО Cricetulus griseus. 2. Конструирование экспрессионных плазмид, несущих ген VZV gE-Fc gene Фиксированный в глицерине штамм с рекомбинантным геном, предоставленный Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd, инокулировали в среду LB (Amp) и культивировали при 37°С и 180 об/мин в течение 15 ч, и набор для очистки плазмиды TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0 использовали для выделения плазмиды pUC57-gE-Fc; плазмиду pUC57-gE-Fc расщепляли ферментами HindIII и EcoR с получением целевого генного фрагмента gE-Fc-H/E (размером примерно 2300 п. н.); и плазмиду для экспрессии в млекопитающих pXC-K383L расщепляли с получением фрагмента вектора рХС-Н/Е (размером примерно 7000 п. н.). Результат электрофореза в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления показан на Фиг. 1.
Набор для экстракции из агарозного геля TaKaRa MiniBest использовали для извлечения целевого фрагмента (показан стрелкой на Фиг. 1). Используя технологию лигирования липких концов, выделенные продукты расщепления gE-Fc-H/E и рХС-Н/Е подвергали лигированию при 16°С в течение 6 часов с использованием набора для лигирования TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (TaKaRa), а затем продукт лигирования трансформировали в компетентные клетки DH5a и подвергали инвертированному культивированию при 37°С в течение 15 ч; два клона gE-Fc-1 и gE-Fc-2 подвергали скринингу с помощью ПЦР-скрининга колоний (Фиг. 2); используя pXC-F и pXC-R в качестве праймеров и плазмиду gE-Fc-1 в качестве матрицы, целевой ген амплифицировали с помощью ПЦР с размером примерно 2400 п. н.; продукт амплификации секвенировали с помощью Beijing Huada Gene, и в результате добавления двух дополнительных реакций была определена вся последовательность; результат секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения BioEdit7.0.9.0, и было обнаружено, что последовательность gE-Fc-1 кишечной палочки была точно такой же, как и разработанная последовательность.
Праймеры для секвенирования:
+
Клон gE-Fc-1 инокулировали в 300 мл среды LB (Amp) и культивировали при 37°С и 180 об/мин в течение 16 часов; плазмиду pXC-VZV gE-Fc выделяли с использованием набора для экстракции большого количества/большой плазмиды (Beijing Biomed Gene Technology Co., Ltd.); плазмиду линеаризовали эндонуклеазой Pvul (TaKaRa), очищали экстракцией фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом, осаждали этанолом и повторно растворяли в 1 мл стерильного буфера ТЕ (TaKaRa). Результат гель-электрофореза плазмиды pXC-VZV gE-Fc и линеаризованной плазмиды VZV gE-Fc-straight показан на Фиг. 3.
7
2
2
Пример 2. Установление и скрининг стабильных клонированных штаммов В стерильном ламинарном боксе напряжение перфорации в Gene Pulse Generator Xcell (Bio-Rad) устанавливали следующим образом: 300 В, одиночный импульс 900 мкФ и бесконечное сопротивление; брали одноразовую кювету для электропорации (Bio-Rad) с зазором 4 мм, добавляли 40 мкг линеаризованной плазмидной ДНК (100 мкл) и 0,7 мл суспензии клеток СНО K1 (1,5×10 клеток/мл) и линеаризованную плазмиду VZV gE-Fc-straight трансфицировали непосредственно в клетки СНО K1 путем электротрансфекции; клетки в кювете для электропорации переносили в треугольную колбу для культивирования, добавляли 30 мл среды CD СНО (GIBCO) и культивировали в шейкере при температуре от 36°С до 37°С, 5% СО и 135 об/мин в течение 24 ч; затем клетки собирали низко скоростным центрифугированием и вместе с тем инокулировали в 50 мкМ MSX-содержащую среду CD СНО (без глутамина); полученную суспензию клеток переносили в 96-луночный планшет с плоским дном для культивирования методом предельного разведения, и планшет для культивирования инкубировали в инкубаторе с температурой 37°С и 10% СО; клетки наблюдали под инвертированным микроскопом и лунки моноклональных клеток помечали; затем моноклональные линии с высокой экспрессией подвергали скринингу с помощью ELISA (антитела козы к IgG человека + продукт экспрессии VZV gE-Fc +антитела   к IgG человека-HRP (пероксидаза хрена)) и HPLC с белком А; отобранные линии непрерывно субкультивировали и тестировали и, в итоге, получили 3 линии клонов клеток с высокой экспрессией целевого гена, с номерами клонов 5 В3, 8D8 и 12СЗ; и уровень экспрессии рекомбинантного белка в супернатанте культуры определяли согласно указанному тесту с подпиткой и HPLC, и линия клона 5 В3 была отобрана для эксперимента в увеличенном масштабе.
Пример 3. Экспрессия и очистка целевого продукта
2
2
4
6
6
Полученную линию клонов 5 В3 инокулировали в треугольную колбу объемом 2 л с 500 мл среды CD СНО, крышку колбы, способной пропускать воздух, закрывали, а затем линию клонов культивировали во вращающемся шейкере при температуре от 36°С до 37°С, 5% СО и 135 об/мин в течение 4 суток; клетки 5 В3 переносили в полностью автоматический биореактор объемом 5 л с 2,0 л среды CD Opti-CHO и культивирование проводили при следующих параметрах: скорость вращения: 60 об/мин, температура: 36,5°С, рН: от 7,0 до 7,4, и растворенный кислород (DO): от 40% до 60%; образец собирали каждый день для определения жизнеспособности клеток, плотности клеток и содержания глюкозы; через 4 суток после культивирования (когда плотность жизнеспособных клеток увеличилась с 5хЮ до 7хЮ клеток/мл) добавляли от 200 мл до 300 мл питательной добавки CD Efficient Feed С, а затем CD Efficient Feed С добавляли через день; содержание глюкозы в культуре определяли каждый день, причем, если содержание глюкозы было ниже 11,1 ммоль/л, 40% раствор глюкозы добавляли в полностью автоматический биореактор через перистальтический насос до тех пор, пока содержание глюкозы не достигало 22 ммоль/л; через 12-14 суток после культивирования (когда доля жизнеспособных клеток снизилась до 60-70%) культивирование прекращали; и культуру центрифугировали при 12000 об/мин (или с использованием фильтра глубиной 3 М) для удаления клеток и клеточного дебриса и сбора супернатанта клеточной культуры. Супернатант культуры фильтровали через фильтрующую мембрану 0,45 мкм и фильтрат пропускали через колонку для гель-хроматографии с белком A (Mabselect™ Sure, MabSelect™ Sure LX, MabCapture™ A, AT Besterose А и др.), предварительно уравновешенную 40 мМ PBS (рН 7,4, 150 мМ NaCl); колонку промывали 2-4 объемами колонки 40 мМ PBS до достижения значения А280 исходного уровня, а затем 100 мМ буфера глицин-соляная кислота (или буфера лимонная кислота-цитрат натрия, буфера уксусная кислота-ацетат натрия, рН: от 3,0 до 4,0) альтернативно использовали для элюирования конъюгированного вещества; и собранный элюат помещали в условия комнатной температуры (от 18°С до 25°С) на 30 мин (низкий рН для инактивации вирусов), затем рН доводили до 7,4-8,0 с помощью 0,2М NaHPO и полученную смесь фильтровали через фильтрующую мембрану 0,45 мкм для дополнительного удаления нерастворимых частиц. Раствор белка, полученный после очистки с помощью аффинной хроматографии с белком А, анализировали с помощью Shimadzu LC-20AT HPLC (BioCore SEC-500, 7,8 мм × 30 см, Suzhou Nanowin Science and Technology Co., Ltd). Основной пик (димер) составлял примерно от 65% до 78%, мономер составлял примерно от 20% до 30%, и все еще оставались полимерные продукты перед основным пиком, обычно составляющие менее 10%. Хроматограмма представлена на Фиг. 4.
Затем полученный белковый раствор с целевым продуктом загружали на диэтиламиноэтил(ВЕАЕ)-сефарозу Sepharose 4 Fast Flow (или Q Sepharose 4 Fast Flow, NanoGel 50Q, Besterose DEAE, Besterose Q, POROS Q, POROS XQ и др.), уравновешенную 20 мМ буфером РВ (рН: от 7,4 до 8,0); после завершения загрузки хроматографическую колонку промывали 20 мМ буфером РВ до достижения значения А280 исходного уровня; затем растворы NaCl с различными концентрациями использовали для градиентной элюции и собирали целевой белок VZV gE; колонку для анионообменной хроматографии промывали 1 объемом колонки 1,0 М раствора NaCl для регенерации и, наконец, уравновешивали 20 мМ буфером РВ (рН: от 7,4 до 8,0) для последующего использования.
Собранный VZV gE очищали с помощью Sephacryl S400 HR или другой подходящей хроматографической колонки с молекулярным ситом и целевой продукт собирали, стерилизовали фильтрацией и хранили при температуре от 2°С до 8°С.
2
4
Очищенный VZV gE тестировали на чистоту с помощью Shimadzu LC-20AT HPLC в следующих условиях: подвижная фаза: 40 мМ PBS (включающий 0,5 М NaSO, рН 7,5), скорость потока: 0,750 мл/мин, и аналитическая колонка: BioCore SEC500 (7,8×300 мм, Nanowin Science and Technology Co., Ltd; или TSK 5000 SW×1, Toyo Soda), и результаты тестов при А280 показали, что VZV gE имел чистоту более 98% (как показано на Фиг. 5) и относительную молекулярную массу около 400 кДа.
Пример 4. Инактивация формальдегидом для целевого продукта
Рекомбинантный VZV gE, полученный в Примере 3, разбавляли от 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл с использованием 20 мМ PBS (рН: от 7,2 до 8,0, 135 мМ NaCl); затем добавляли 38% раствор формальдегида до конечной концентрации 0,1% (об./об.) от общего объема полученной смеси и эту смесь выдерживали при 37°С в течение периода времени 72 часа, во время которого смесь встряхивали дважды в сутки для тщательного перемешивания; а затем смесь помещали в условия температуры от 2°С до 8°С.
Пример 5. Инактивация р-пропиолактоном для целевого продукта
Раствор рекомбинантного VZV gE, полученный в Примере 3, охлаждали до температуры от 2°С до 8°С и взвешивали, затем добавляли р-пропиолактон до конечной концентрации от 0,1% до 0,01% от массы раствора и полученную смесь помещали в условия температуры от 2°С до 8°С на 72 ч, причем в течение этого периода смесь встряхивали дважды в сутки для тщательного перемешивания. Через 72 часа раствор VZV gE нагревали до 37°С и выдерживали при этой температуре в течение 4 часов, для того чтобы р-пропиолактон полностью превратился в молочную кислоту, а затем раствор помещали в условия температуры от 2°С до 8°С.
Пример 6. Удаление формальдегида или Р-пропиолактона из целевого продукта
280
Белковый раствор с рекомбинантный VZV gE, полученный в Примере 5 или 6, соответствующим образом разбавляли 20 мМ РВ (рН: 7,2-8,0) или 20 мМ раствором Tris-HCl (рН: 7,2-8,0) до достижения концентрации NaCl в растворе ниже 50 мМ; затем раствор, содержащий VZV gE, пропускали через хроматографическую колонку с DEAE-сефарозой 4FF, уравновешенную 20 мМ РВ (или 20 мМ Tris-HCl, рН: от 7,2 до 8,0); затем колонку промывали 20 мМ раствором РВ (или 20 мМ раствором Tris-HCl, рН: от 7,2 до 8,0) до полного достижения значения А исходного уровня, а затем дополнительно промывали 4 объемами колонки раствора; элюент с 0,4 М NaCl (раствор с 20 мМ РВ или 20 мМ Tris-HCl, рН: 7,5) использовали для элюирования VZV gE, конъюгированного на геле; и раствор с целевым продуктом собирали и фильтровали через стерилизационную фильтрующую мембрану 0,2 мкм с получением фильтрата, который представлял собой исходный раствор вакцины.
Пример 7. Приготовление вакцины с адъювантом на основе алюминия
Исходный раствор вакцины, полученный в Примере 6, разбавляли 20 мМ Tris-HCl (рН: от 7,2 до 7,5, включающим 135-150 мМ NaCl) до концентрации от 10 мкг/мл до 800 мкг/мл, полученный раствор тщательно перемешивали с равным объемом суспензии адъюванта гидроксида алюминия (содержание алюминия: от 0,2 мг/мл до 1,5 мг/мл) при комнатной температуре и полученную смесь помещали в условия температуры от 2°С до 8°С.
Раствор вакцины с адъювантом на основе алюминия извлекали из условий температуры от 2°С до 8°С и разливали во флаконы объемом 2 мл (или предварительно заполненные стеклянные шприцы) в асептических условиях по 0,5 мл (или 1,0 мл) на флакон и затем эти флаконы герметично закрывали и хранили при температуре от 2°С до 8°С в темноте.
В приведенной ниже таблице в качестве примера взято приготовление 1000 мл вакцины с различным содержанием VZV gE (в первом столбце слева показано содержание антигена в 1 мл приготовленной вакцины, а в первом столбце справа показано содержание антигена в 0,5 мл вакцины для обычного внутримышечного введения). Исходный раствор вакцины с концентрацией VZV gE 800 мкг/мл использовали для приготовления вакцин с адъювантом на основе алюминия, и способ приготовления был следующим:
Пример 8. Лиофилизация рекомбинантного слитого белка VZV gE
Исходный раствор вакцины, полученный в Примере 6, разбавляли до концентрации от 40 мкг/мл до 800 мкг/мл с использованием 20 мМ Tris-HCl (рН: от 7,2 до 7,5, включающего 135 мМ NaCl), затем 10% сахарозы (или 10% трегалозы, 10% маннита и 10% лактозы) добавляли до конечной концентрации 3%, и концентрацию VZV gE в дозируемом растворе доводили до 20 мкг/мл (или 50 мкг/мл, 80 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл и 400 мкг/мл); полученную смесь тщательно перемешивали и затем распределяли в 2 мл трубчатые флаконы по 1,0 мл на флакон, и эти флаконы частично закрывали пробками из бутилкаучука и затем помещали в резервуар для лиофилизации; при температуре предварительного замораживания от -40°С до -45°С раствор вакцины замораживали в течение 4 часов, а затем проводили вакуумную откачку для лиофилизации, при этом для контроля температуры была принята программа автоматического повышения температуры: повышение на 6 часов от -40°С до -25°С, повышение на 4 часа от -25°С до -5°С, выдерживание при температуре от 0°С до 5°С в течение 1 часа, выдерживание при 25°С в течение 1 часа и выдерживание при 35°С в течение периода от 6 ч до 8 ч; а затем пробки из бутилкаучука плотно прижимали под вакуумом (или вводили азот высокой степени чистоты или аргон для прессования).
Флаконы с пробками вынимали из резервуара для лиофилизации и направляли в автоматическую укупорочную машину для закручивания алюминиевых крышек. Затем флаконы хранили в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С.
Перед использованием 1,0 мл воды для инъекций или суспензии адъюванта гидроксида алюминия набирали одноразовым стерильным шприцем и вводили во флакон с лиофилизированным VZV gE и полученную смесь осторожно перемешивали в течение примерно 5 мин с получением вакцины без видимых частиц. Вакцину следует использовать сразу после растворения или самое позднее в течение 30 минут после растворения. Эта вакцина должна быть использована для подкожных или внутримышечных инъекций и запрещена к использованию для внутривенных инъекций.
Пример 9. Эксперимент по иммунизации на животных
Вакцину, которая включала 100 мкг/мл VZV gE и адъювант на основе алюминия для адсорбции, извлекали из условий холодного хранения при 2-8°С и разбавляли 20 мМ Tris-HCl с получением растворов с концентрацией 8 мкг/мл и 2 мкг/мл VZV gE, а затем добавляли равный объем адъюванта на основе алюминия с получением вакцин, содержащих адъювант на основе алюминия с 4 мкг/мл и 1 мкг/мл VZV gE (или 2 мкг/мл и 0,5 мкг/0,5 мл VZV gE) для эксперимента на животных.
Самок мышей BALB/C возрастом от 4 до 6 недель случайным образом делили на 5 групп, по 8 в каждой группе. Каждой мыши контрольной группы внутрибрюшинно вводили 0,5 мл адъюванта на основе алюминия. Мышам в 4 экспериментальных группах внутрибрюшинно вводили 0,5 мл вакцины, содержащей адъювант на основе алюминия, в дозировках VZV gE 50 мкг, 10 мкг, 2 мкг и 0,5 мкг. Для каждой группы дозирования использовали 8 мышей. После первичной иммунизации иммунизацию проводили один раз в две недели, всего 4 иммунизации. Кровь собирали из хвостовой вены через 7 суток после второй и третьей иммунизаций, сыворотку отделяли и подвергали криоконсервации при -70°С. Кровь собирали из сердца через 7 суток после четвертой иммунизации, сыворотку отделяли и подвергали криоконсервации при -70°С.
Определение титра антител с помощью ELISA: рекомбинантный белок VZV gE-His разбавляли до концентрации 1 мкг/мл карбонатным буфером, наносили на 96-луночный микропланшет (Costar) в концентрации 100 мкл/лунку, помещали в условия температуры 37°С на 1 ч, а затем помещали на ночь в условия температуры от 2°С до 8°С; жидкость из 96-луночного планшета удаляли, а затем планшет промывали 3 раза 20 мМ PBS; по 200 мкл блокирующего раствора (2% бычий сывороточный альбумин (BSA) и компонент V) добавляли в каждую лунку и блокирование проводили при комнатной температуре в течение 60 мин; раствор из лунок удаляли и планшет промывали 3 раза 20 мМ раствором PBS-T; мышиную сыворотку, предварительно разведенную в соотношении 1:50 (или 1:500 или 1:1000), добавляли в лунки в первой колонке 96-луночного микропланшета, а затем проводили 2-кратное серийное разведение, где только мышиную сыворотку (1:100) при внутрибрюшинной иммунизации адъювантом на основе алюминия использовали в качестве отрицательного контроля; реакцию проводили при 37°С в течение 60 мин, затем раствор из лунок удаляли и планшет промывали 3 раза 20 мМ раствором PBS-T; брали конъюгат антитела козы к IgG мыши-HRP и разбавляли его разбавителем для конъюгата с ферментом в соотношении 1:100 (разбавитель включал 1 мг/мл человеческого IgG), подвергнутого предварительной реакции в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем добавляли к 96-луночному микропланшету по 100 мкл/лунку; реакцию проводили при 37°С в течение 30 мин, блокирующий раствор из лунок удаляли, а затем планшет промывали 3 раза 20 мМ раствором PBS-T; 100 мкл хромогенного раствора ТМВ добавляли в каждую лунку, а через 10 минут добавляли 50 мкл стоп-раствора для остановки реакции; затем использовали ридер для микропланшетов TECAN Infinit 200 для определения значений оптической плотности при А450; и значение, в 3 раза превышающее значение А450 смешанной сыворотки в отрицательном контроле, было принято в качестве порогового значения (если значение А450 в отрицательном контроле было ниже 0,100, оно принималось за 0,100) для определения титра иммунизированной сыворотки. Среднее геометрическое и стандартное отклонение титров антител против VZV gE в сыворотке мышей в каждой экспериментальной группе показаны в Таблице 2 ниже. После второй иммунизации все мыши были положительными по сывороточным антителам, за исключением того, что 1 мышь в группе с наименьшей дозировкой (0,5 мкг) не была положительной по сывороточным антителам. Статистический анализ титров антител, определенных для экспериментальных мышей в каждой группе, показал, что после третьей иммунизации титр сывороточных антител экспериментальных мышей в каждой группе дозирования был значительно выше, чем после второй иммунизации; после четвертой иммунизации титр сывороточных антител частично увеличился, что было незначительным; и после второй, третьей и четвертой иммунизаций не было значительной разницы в титрах сывороточных антител среди мышей в трех группах с высокими дозировками. Титры сывороточных антител мышей BALB/C, иммунизированных вакцинами VZV gE с адъювантом на основе алюминия, в различных дозировках, показаны на Фиг. 6.
50
Определение титра нейтрализующих антител в сыворотке: VZV представляет собой вирус, который может вызывать поражения диплоидных клеток легких эмбриона человека. Таким образом, тест нейтрализации уменьшения вирусных бляшек можно использовать для проверки способности антител с различными разведениями сыворотки нейтрализовать вирус, а также рассчитать титр сыворотки, при котором количество бляшек снижается на 50%. Тест нейтрализации вируса с использованием сывороточных антител является наиболее прямым тестом для определения наличия антител, которые могут нейтрализовать VZV в иммунизированной сыворотке. Этот тест имеет недостатки, такие как громоздкие операции, низкая чувствительность, высокая стоимость рабочей силы, большие затраты времени и невозможность использования оборудования для автоматической интерпретации, а для расчета ED требуется профессиональное программное обеспечение для обработки данных. Из-за вышеуказанных проблем мало кто использует этот тест для определения сывороточных нейтрализующих антител. Из-за большого расхода сыворотки в этом тесте определение нейтрализующих антител проводили только в сыворотке мышей, собранной после последней иммунизации.
2
Этот тест представлял собой тест нейтрализации сыворотки VZV, проводимый на 96-луночном микропланшете с плоским дном, и клетки MRC-5, чувствительные к VZV (приобретенные в АТСС), использовали в качестве клеточного матрикса. Сыворотку, замороженную в холодильнике при -70°С, извлекали и размораживали при комнатной температуре, разбавляли в соотношении 1:10 10% FBS-содержащей средой 199 (GIBCO) на стерильном чистом столе, а затем серийно разводили в 4 раза в 96-луночном планшете, всего 7 разведений и две лунки для каждого разведения. Кроличью анти-VZV gE сыворотку принимали в качестве положительной контрольной сыворотки, а смешанную сыворотку мышей, иммунизированных адъювантом на основе алюминия (разведенным в соотношении 1:10), принимали в качестве отрицательной контрольной сыворотки. На каждом 96-луночном планшете были установлены 6 контрольных лунок с раствором вируса и 6 контрольных лунок с клетками. Разбавленную сыворотку для тестирования смешивали с определенным количеством вируса ОКА (приобретенного в АТСС в США), а затем этот 96-луночный микропланшет покрывали. Микропланшет встряхивали на шейкере в течение 30 сек, затем помещали в инкубатор с 10% СО и при 37°С (10%) и реакцию проводили в течение 30 мин.
2
2
Колбу для культивирования с одним слоем конфлюэнтных клеток MRC-5 (АТСС, поколения от 25 до 38) вынимали из инкубатора с СО, среду из колбы для культивирования Т75 (Corning) удаляли в стоуровневом ламинарном боксе и 5 мл 0,25% раствора трипсина (GIBCO) добавляли для переваривания единственного слоя клеток MRC-5; полученную смесь подвергали реакции в течение 3 минут при комнатной температуре, затем раствор трипсина удаляли и добавляли 10 мл среды для культивирования клеток; внутреннюю поверхность колбы для культивирования клеток осторожно промывали для диспергирования клеток MRC-5 и добавляли определенный объем среды для культивирования клеток с получением суспензии клеток. Этот 96-луночный микропланшет с исследуемой сывороткой извлекали из инкубатора, добавляли суспензию клеток с помощью многоканальной пипетки и планшет покрывали; микропланшет встряхивали на шейкере в течение 30 сек, а затем инкубировали в инкубаторе с СО при 37°С (10%) в течение 3-4 суток; и 48 часов спустя проводили наблюдение за цитопатическим эффектом в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа каждый день, количество бляшек в каждой лунке точно подсчитывали и регистрировали. Через 96 часов 12-канальную пипетку использовали для переноса жидкости из каждой лунки в резервуар для отработанной жидкости с 0,1% гипохлоритом натрия, добавляли 0,1% кристаллического фиолетового для окрашивания в течение 1 часа и после обесцвечивания микропланшет помещали на впитывающую бумагу обратной стороной и сушили при комнатной температуре.
Количество бляшек в каждом образце сыворотки при каждом разведении вводили в таблицу EXCEL 2016. При среднем количестве бляшек в лунках с вирусным раствором (в среднем по 6 лунок, от 25 до 30 на лунку), равном 100%, рассчитывали уменьшение количества бляшек в сыворотке при каждом разведении и преобразовывали в проценты, а затем на основе этих данных рассчитывали значение ED50 с использованием программного обеспечения Prism 5.0. Значение ED50 представляет собой титр сыворотки, при котором количество бляшек уменьшается на 50%. Кривая определения титра ED50 сывороточных нейтрализующих антител для каждой мыши в четырех группах дозировок показана на Фиг. 7, a GMT сывороточных нейтрализующих антител и распределение титров нейтрализующих антител в каждой группе дозировки показаны в Таблице 3. Сравнение GMT нейтрализующих антител сыворотки против VZV среди групп дозировок показано на Фиг. 8, из которой видно, что титр нейтрализующих антител в группе с самой низкой дозировкой был значительно ниже, чем в трех других группах, и титры сывороточных нейтрализующих антител в трех других группах все достигли высокого уровня.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Beijing Luzhu Biotechnology Co., Ltd.
<120> РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА ВЕТРЯНОЙ ОСПЫ (VZV)
<130> GWPCTP202104409
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  748
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Слитый белок
<400>  1
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp
1               5                   10                  15
Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser
20                  25                  30
Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn
35                  40                  45
Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn
50                  55                  60
Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser
65                  70                  75                  80
Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu
85                  90                  95
Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp
100                 105                 110
Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe
115                 120                 125
Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val
130                 135                 140
Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu
165                 170                 175
Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys
180                 185                 190
His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu
195                 200                 205
Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly
210                 215                 220
Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu
225                 230                 235                 240
Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu
245                 250                 255
Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn
260                 265                 270
Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr
275                 280                 285
Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro
290                 295                 300
Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val
305                 310                 315                 320
Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys
325                 330                 335
Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro
340                 345                 350
Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr
355                 360                 365
His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr
370                 375                 380
Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln
385                 390                 395                 400
Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser
405                 410                 415
His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr
420                 425                 430
Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe
435                 440                 445
Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val
450                 455                 460
Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro
465                 470                 475                 480
Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr
485                 490                 495
Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Tyr Ala Ala Trp Thr
500                 505                 510
Gly Gly Leu Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
515                 520                 525
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
530                 535                 540
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
545                 550                 555                 560
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
565                 570                 575
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
580                 585                 590
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
595                 600                 605
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
610                 615                 620
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
625                 630                 635                 640
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
645                 650                 655
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
660                 665                 670
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
675                 680                 685
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
690                 695                 700
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
705                 710                 715                 720
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
725                 730                 735
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
740                 745
<210>  2
<211>  2244
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ДНК, экспрессирующая слитый белок
<400>  2
agcgtgctgc ggtacgacga tttccacatc gacgaggata agctggacac caatagcgtg       60
tatgagcctt actatcactc cgaccacgcc gagtccagct gggtgaacag gggcgagtct      120
tcccggaagg cttacgacca caactctccc tatatctggc ctagaaatga ctacgatggc      180
tttctggaga acgcccatga gcaccatggc gtgtataatc agggccgggg catcgactct      240
ggcgagagac tgatgcagcc tacacagatg tccgctcagg aggatctggg cgacgataca      300
ggcatccacg tgatcccaac cctgaatggc gacgacaggc ataagatcgt gaacgtggat      360
cagaggcagt acggcgacgt gttcaagggc gatctgaatc ccaagcctca gggccagcgc      420
ctgatcgagg tgtccgtgga ggagaaccat ccattcaccc tgcgcgcccc tatccagcgc      480
atctacggcg tgaggtatac cgagacatgg tcctttctgc ctagcctgac ctgcacaggc      540
gacgctgctc cagctatcca gcacatctgc ctgaagcata ccacatgttt tcaggacgtg      600
gtggtggacg tggattgtgc cgagaataca aaggaggatc agctggctga gatcagctac      660
agattccagg gcaagaagga ggccgatcag ccatggatcg tggtgaacac ctctacactg      720
tttgacgagc tggagctgga cccccctgag atcgagcctg gcgtgctgaa ggtgctgcgc      780
accgagaagc agtacctggg cgtgtatatc tggaacatga ggggcagcga cggcacctcc      840
acatacgcta ccttcctggt gacatggaag ggcgatgaga agacccggaa tccaacacca      900
gctgtgaccc ctcagccaag aggcgctgag tttcacatgt ggaactatca cagccacgtg      960
ttctccgtgg gcgacacctt ttccctggcc atgcacctgc agtacaagat ccatgaggct     1020
ccattcgacc tgctgctgga gtggctgtat gtgcccatcg atcctacatg ccagcccatg     1080
cgcctgtaca gcacctgtct gtatcaccca aatgcccccc agtgcctgtc ccatatgaac     1140
agcggctgta cctttacatc cccacacctg gcccagaggg tggctagcac agtgtaccag     1200
aactgcgagc atgccgacaa ttacaccgct tattgtctgg gcatctctca catggagcct     1260
tccttcggcc tgatcctgca tgacggcggc accacactga agtttgtgga tacccctgag     1320
agcctgtctg gcctgtacgt gttcgtggtg tacttcaacg gccacgtgga ggccgtggct     1380
tacacagtgg tgtctaccgt ggatcatttc gtgaacgcca tcgaggagag gggatttcca     1440
ccaacagctg gacagcctcc agctaccaca aagcccaagg agatcacacc tgtgaaccca     1500
ggcacctccc ctctgctgag atatgccgct tggaccggcg gcctggctga gcccaaatct     1560
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca     1620
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc     1680
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg     1740
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg     1800
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac     1860
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc     1920
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcctc catctcggga tgagctgacc     1980
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg     2040
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgccccc cgtgctggac     2100
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag     2160
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag     2220
agcctctccc tgtctccggg taaa                                            2244
<210>  3
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Праймер для секвенирования pXC-F
<400>  3
taacagactg ttcctttcca tg                                                22
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Праймер для секвенирования pXC-R
<400>  4
gtaaaacctc tacaaatgtg gt                                                22
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Праймер для секвенирования 1-F
<400>  5
agcacatctg cctgaagc                                                     18
<210>  6
<211>  19
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Праймер для секвенирования 1-F1
<400>  6
gcttattgtc tgggcatct                                                    19
<---