СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЛОРИНОВ И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR PRODUCING CHLORINES AND PHARMACEUTICAL APPLICATIONS THEREOF

Настоящее изобретение относится к способам получения, свойствам, фармацевтическим композициям и применению в терапии сульфонированных хлоринов и бактериохлоринов, предназначенных для фотодинамической терапии (ФДТ) гиперпролиферативных тканей, таких как опухоли, гиперпролиферативные кровеносные сосуды и другие расстройства или аномалии, которые реагируют на ФДТ. В частности, настоящее изобретение относится к новому способу, позволяющему химический синтез стабильных хлоринов и бактериохлоринов в широком масштабе, который характеризуется отсутствием растворителя и отсутствием основания. В другом воплощении предложены фармацевтические композиции и способы их применения в терапии при системном введении. В следующем воплощении также предложены фармацевтические композиции и способы их применения в терапии при местном введении. Также предложены способы обнаружения гипепролиферативных тканей, таких как опухоли, с применением фотодинамических способов или МРТ (магниторезонансная томография).
I. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
I.А. Уровень техники
Различные тетрапиррольные макроциклы, такие как пурпурины, хлорины, бактериохлорины, фталоцианины и бензохлорины, показали способность как преимущественно собираться в гиперпролиферативных тканях при инъекции в организм, так и поглощать свет с образованием активированного состояния в ответ на свет. Поэтому эти макроциклы проявляют цитотоксический эффект на клетки или другие ткани, в которых они локализованы, при облучении при соответствующей длине волны. Кроме того, эти соединения также вызывают эмиссию энергии из ткани, что можно применять для обнаружения их локализации.
2
-
2
q
2
При ФДТ пациенту вводят фотосенсибилизатор (обычно от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг массы тела), который проявляет некоторую селективность для фотоповреждения опухолевой ткани, а затем через некоторое время область опухоли облучают видимым или ближним инфракрасным светом (примерно от 50 до 200 Дж/см). Фотосенсибилизатор поглощает свет и флуоресцирует или взаимодействует с субстратными молекулами в тканях посредством реакций переноса электрона или атома водорода (процессы типа I), либо переносит свою энергию на молекулярный кислород основного состояния, генерируя синглетный кислород O ('Δ), который атакует ткани (процессы типа II). Основным участником, вносящим вклад в процесс типа I, является супероксид (О ), образованный в результате переноса электрона от электронно-возбужденного сенсибилизатора. Существуют данные в подтверждение преобладания процесса фотоокисления типа II над процессами типа I в клетках [1, 2], но имеются также доводы в пользу амплифицированного ФДТ ответа, когда также генерируется супероксид [3]. В случае обнаружения флуоресценцию определяют под действием света при желаемой длине волны, и для этого требуются более низкие энергии, чем для лечения. Эффективное лечение обычно требует образования высоких выходов синглетного кислорода в ткани, что может обладать синергическим эффектом с сопутствующим образованием супероксида или других активных форм кислорода.
Свойства оптимальных сенсибилизаторов для лечения ФДТ включают: (i) простой, эффективный и экономичный синтез; (ii) стабильность, чистоту и длительный срок хранения; (iii) растворимость в биосовместимых растворителях или носителях; (iv) высокий коэффициент поглощения в "фототерапевтическом окне" (600-900 нм); (v) сенсибилизацию синглетного молекулярного кислорода и/или генерирование супероксида с высоким квантовым выходом; (vi) сниженную темновую токсичность или ее отсутствие; (vii) селективную аккумуляцию и пролонгированное удерживание в опухолевых тканях; (viii) низкую кожную фотосенсибилизацию при системном введении; (ix) контролируемое фотообесцвечивание; (х) легкий метаболизм или выделение после лечения. Сенсибилизатор является только предшественником цитотоксических соединений, а именно синглетного кислорода и других активных форм кислорода, таких как супероксидный ион. Непосредственным предшественником синглетного кислорода, и часто супероксида, является триплетное состояние сенсибилизатора. Таким образом, высокий квантовый выход синглетного кислорода требует по меньшей мере трех свойств триплетного состояния сенсибилизатора: (i) почти единичного квантового выхода, (ii) электронной энергии по меньшей мере на 20 кДж/моль выше, чем у синглетного кислорода (94 кДж/моль), (iii) а также длительного времени жизни (сотни микросекунд). Аккумуляция и удерживание в опухолевых тканях могут быть усилены добавлением специфичных векторов, но релевантным собственным свойством сенсибилизатора для этих целей является гидрофильность/липофильность сенсибилизатора, и способность к приспособлению таких свойств к достижению желаемых мишеней является наиболее благоприятным свойством.
Нижняя граница фототерапевтического окна определяется присутствием гемсодержащих белков, которые, в основном, отвечают за поглощение света в видимой области в тканях. Проницаемость тканей для света быстро падает ниже 550 нм. Однако существует значительное возрастание проницаемости от 550 до 630 нм, и проницаемость снова удваивается до 700 нм. За этим следует 10% увеличение тканевой проницаемости, по мере того как длина волны перемещается в направлении к 800 нм. Верхняя граница фототерапевтического окна определяется поглощением инфракрасного излучения водой и энергетическими потребностями для эффективного переноса энергии на кислород. Действительно, регулируемый диффузией перенос триплетной энергии от сенсибилизатора на молекулярный кислород требует, чтобы триплетная энергия сенсибилизатора составляла по меньшей мере 115 кДж/моль. Кроме того, расщепление энергии синглета-триплета в тетрапиррольных макроциклах составляет примерно 40 кДж/моль [4], что требует того, чтобы сенсибилизатор обладал синглетной энергией более чем 150 кДж/моль. С учетом того, что стоксов сдвиг таких сенсибилизаторов обычно мал, они должны поглощать свет непосредственно ниже 800 нм. Вывод заключается в том, что идеальный сенсибилизатор должен сильно поглощать свет при длинах волн примерно 750 нм. Сильное поглощение бактериохлоринов при этой длине волны делает их идеальными кандидатами для ФДТ сенсибилизаторов. Для применений, где проницаемость для света не является критической, хлорины также являются подходящими кандидатами для ФДТ.
Фотофрин, производное гематопорфирина [5], является наиболее широко применяемым фотосенсибилизатором и одобрен для лечения ряда солидных опухолей [6]. Производное гематопорфирина (HpD) получают путем смешивания гематопорфирина с ледяной уксусной кислотой и серной кислотой с последующим гидролизом и осаждением в кислых условиях. Этот способ был частично описан Lipson et al. [7]. HpD, полученный таким образом, состоит из сложной смеси порфиринов. Когда HpD выделяют в его двух основных фракциях с помощью гель-фильтрации Sephadex LH-20, часть с более высокой молекулярной массой, названная Фотофрином, является более эффективным агентом ФДТ [8]. Рекомендуемая доза Фотофрина для человека составляет 1-2 мг/кг массы тела. Основными компонентами Фотофрина являются димеры и более высокие олигомеры, связанные эфирными, сложноэфирными и, возможно, углерод-углеродными связями [9].
Фотофрин обладает некоторыми желаемыми характеристиками, включая хорошую эффективность, растворимость в воде, разумный выход синглетного кислорода и легкость получения. Однако Фотофрин также обладает некоторыми неблагоприятными свойствами: (i) он представляет собой сложную смесь димеров и более высоких олигомеров порфиринов, связанных эфирными, сложноэфирными и/или углерод-углеродными связями; (ii) он проявляет кожную фототоксичность у пациентов в течение четырех-шести недель после введения; (iii) вследствие его относительно слабого поглощения в красной области спектра (630 нм) отсутствие проницаемости света в ткань ограничивает современные клинические применения Фотофрина в ФДТ разрушением раковой ткани, локализованной менее чем на 4 мм от источника света, применяемого в терапии. Следовательно, существует необходимость в более эффективных, химически чистых, менее фототоксичных, лучше локализующих сенсибилизаторах, которые поглощают свет более интенсивно и поглощают в инфракрасной области.
В данной области техники показано, что химическое восстановление тетрапиррольных колец, соответствующее преобразованию порфирина в хлорин, приводит к смещению длины волны самой длинной полосы поглощения далее в красную область спектра, сопровождаемому увеличением его коэффициента поглощения. Такие свойства были применены во втором поколении фотосенсибилизаторов ФДТ, и появился 5,10,15,20-тетракис(3-гидроксифенил)хлорин (m-THPC), имеющийся в продаже под названием Фоскан, как один из наиболее эффективных из этих фотосенсибилизаторов второго поколения [10]. Дальнейшее восстановление противоположного пиррольного кольца, соответствующее преобразованию хлорина в бактериохлорин, приводит к смещению полосы поглощения в инфракрасную область и дальнейшему увеличению его коэффициента поглощения. Однако до недавнего времени было широко распространено мнение, что бактериохлорины являются очень нестабильными соединениями [10], и усилия по исследованию ФДТ сенсибилизаторов были сосредоточены на хлоринах [11]. Впоследствии показано, что стабильные бактериохлорины действительно можно синтезировать [12]. Это было не полностью принято в научной литературе, где было заявлено, что синтез стабильных бактериохлоринов при таком подходе ограничен получением бактериохлоринов с инертными функциональными группами [13]. Однако бактериохлорины с дополнительными функциональными группами получены (см. РСТ/ЕР 2005/012212, WO/2006/053707).
Очевидный интерес к бактериохлоринам как сенсибилизаторам ФДТ и сообщения о том, что некоторые встречающиеся в природе бактериохлорины являются эффективными фотосенсибилизаторами как in vitro, так и in vivo [14, 15], мотивировали многие попытки синтезировать бактериохлорины. Синтетические бактериохлорины получены из соответствующих порфиринов посредством дигидроксилирования соседних атомов тетраоксидом осмия [16], внутримолекулярной циклизации [17], реакций Дильса-Альдера, применяя порфирины в качестве диенофила [18], или реакций Дильса-Альдера с винилпорфиринами, где порфирин является диеном [19], посредством 1,3-биполярных циклоприсоединений [20], а также путем самоконденсации производных дигидродипирринацеталя [21]. Кроме того, существует классический способ, разработанный несколько десятилетий назад Whitlock, получения бактериохлоринов путем восстановления 7,8-17,18-пиррольных положений порфирина диимидом [22]. Именно этот способ применен Bonnet для синтеза Фоскана и 5,10,15,20-тетракис(3-гидрофенил)бактериохлорина [23]. В то же время проводили очень интенсивные исследования по синтезу производных бактериохлорина, которые привели к ряду патентов, основанных на вышеописанных способах (см., например, US 2007/7166719; US 2003/6624187; US 2003/6569846; US 2002/6376483; US 1999/5864035; US 1998/5831088; WO 90/12573; WO 94/00118; WO 95/32206; WO 96/13504; WO 97/32885; US 2006/194960).
Некоторые из вновь синтезированных бактериохлоринов обладали пренебрежимо малой темновой токсичностью и высокой опухолевой селективностью, частично растворимы в воде и имеют заметные полосы поглощения в диапазоне от 700 нм до 800 нм. Однако некоторые недостатки остаются, а именно: (i) сложный и дорогостоящий синтез, включающий трудоемкие очистки; (ii) ограниченная растворимость в воде, что в случае системного применения приводит в результате к растворению в органических растворителях с дополнительной химической нагрузкой на организм, либо к связыванию с носителем, что повышает стоимость обработки; (iii) химическая нестабильность, особенно в присутствии света; (iv) низкие или неизвестные квантовые выходы синглетного кислорода. Интересным представителем этого третьего поколения фотосенсибилизаторов является палладий-бактериофеофорбид, в настоящее время известный как Tookad, который одобрен для клинических испытаний фазы III. Tookad образуется из бактериохлорофилла и, как большинство встречающихся в природе бактериохлоринов, очень чувствителен к кислороду, что приводит в результате к быстрому окислению до состояния хлорина, который имеет максимум поглощения при 660 нм или ниже. Кроме того, если лазер применяют для возбуждения бактериохлорина in vivo, окисление может привести в результате к образованию нового хромофора, поглощающего вне окна лазера, что снижает фотосенсибилизирующую эффективность. Фотохимическое разложение соединений этого семейства измеряли с освещением 778 нм (13 мВт) в ТХ-100/PBS (ТХ-100 - тритон Х-100, PBS - фосфатный солевой буфер) и выявили, что 90% соединения было необратимо потеряно за 5 мин (4 Дж) при сопутствующем нарастании полосы хлорина при 660 нм [3].
ФДТ также широко исследована для лечения кожных заболеваний, а именно актинических кератозов, чешуйчатоклеточной карциномы, болезни Боуэна (внутриэпителиальной чешуйчатоклеточной карциномы), базальноклеточной карциномы, но мало информации доступно по злокачественной меланоме [24]. Высокая пигментация тканей меланомы ограничивает эффективность ФДТ при применении видимого света, поскольку меланин ослабляет проницаемость света в тканях для длин волн ниже 700 нм. Имеются также сообщения о местном применении ФДТ при не опухолевом состоянии, таком как псориаз. В более ранних исследованиях применяли производное гематопорфирина [25] и мезо-тетрафенилпорфинсульфоната тетранатриевую соль [26] в жидких препаратах, содержащих усилители чрескожной проницаемости. Однако, как правило, когда HpD или другие порфирины применяют местным путем в препарате (в виде жидкости, геля, крема, эмульсии и т.д.), содержащем носитель, предназначенный для усиления их диффузии через ткань, порфирины склонны к удерживанию, поскольку происходит разбавление усилителя проницаемости нормальными тканевыми жидкостями. При таких обстоятельствах порфирины больше не могут диффундировать через ткань (или даже остаются в растворе). Следовательно, местное применение порфиринов часто связано с утратой специфичности к злокачественным тканям, и в нормальной ткани около места применения может развиваться постоянная фотосенсибилизация в результате локализованной концентрации порфирина.
Чтобы преодолеть эти проблемы, предположили, что вероятнее, чем применение порфиринов местным путем, было бы предпочтительно применять агент, который сам не является фотосенсибилизатором, но который индуцирует синтез эндогенных порфиринов in vivo, а именно протопорфирина-IX (PplX) [27]. Известно, что 5-амино-4-оксопентановая кислота, иначе известная как 5-аминолевулиновая кислота (или ALA), является биологическим предшественником протопорфирина IX. Избыток ALA приводит к биологической аккумуляции PplX, который является действительным фотосенсибилизирующим агентом. Таким образом, путем нанесения ALA местным путем на опухоли кожи, а затем после нескольких часов воздействия на опухоли света может быть получен полезный фототерапевтический эффект (см., например, WO 91/01727). Поскольку покрывающие кожу базиломы и чешуйчатоклеточные карциномы легче проницаемы для ALA, чем здоровая кожа, и, поскольку синтез PplX более эффективен в опухолях кожи, обнаружено, что местное применение ALA приводит к селективно усиленному продуцированию PplX в опухолях. Это стало основой для ряда дерматологических препаратов ALA или некоторых из ее производных, которые одобрены и находятся в клиническом применении, наиболее примечательные Левулан и Метвикс.
Однако, хотя применение ALA представляет значительный прогресс в данной области техники, фотодинамическая терапия с ALA не полностью удовлетворительна. Пациенты повторно сообщают, что испытывают боль при ALA-ФДТ [28]. ALA является пролекарством, и эффективность продуцирования лекарства варьирует в зависимости от биосинтеза у субъекта. Только очень ограниченное количество PplX может биологически синтезироваться клетками. Она имеет склонность к нестабильности в фармацевтических препаратах. Она неспособна проникать во все опухоли и другие ткани с достаточной эффективностью для обеспечения лечения широкого спектра опухолей или других состояний. Ее предпочтительная длина волны фотоактивирующего света составляет примерно 635 нм, тогда как показано, что только от 1 до 10 процентов падающего красного света (600-700 нм) может пройти через пласт ткани человека толщиной 1 см. Следовательно, существует необходимость в усовершенствованных фотодинамических терапевтических агентах для местных применений.
I.В. Краткое изложение сущности изобретения
В соответствии с первым аспектом в настоящем изобретении предложен способ получения производного хлорина или бактериохлорина, имеющего формулу:
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
1
2
3
4
5
6
7
8
2
4
6
8
1
3
5
7
X, X, X, X, X, X, X, X каждый независимо выбран из атомов галогена (F, Cl, Br) и водорода, при условии, что либо все из X, X, X и X, либо все из X, X, X и X представляют собой атомы галогена, либо все Х представляют собой атомы галогена;
1
2
3
4
5
6
7
8
2
2
n
n
n
n
R, R, R, R, R, R, R, R независимо выбраны из Н, -ОН и -SOR, где R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода;
Y представляет собой либо атом фтора, либо атом водорода;
включающий приведенную ниже стадию:
(i) твердофазное восстановление соответствующего замещенного порфирина до производного хлорина или производного бактериохлорина с применением гидразидов в отсутствие растворителей и, возможно, в отсутствие оснований; где соответствующий замещенный порфирин имеет формулу:
Следовательно, соединение формулы (I) может представлять собой производное хлорина, имеющее формулу:
Иначе соединение формулы (I) может представлять собой производное бактериохлорина, имеющее формулу
2
4
6
8
Предпочтительно X, X, X, X каждый независимо выбран из галогена (F, Cl, Br).
5
6
7
8
Предпочтительно R, R, R, R представляют собой Н.
Предпочтительно Y представляет собой Н.
1
2
3
4
2
2
n
n
n
n
Предпочтительно R, R, R, R представляют собой -SOR, где R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода.
2
4
6
8
В следующем аспекте X, X, X, X каждый независимо выбран из галогена (F, Cl, Br);
5
6
7
8
R, R, R, R представляют собой Н;
Y представляет собой Н; и
1
2
3
4
2
2
n
n
n
n
R, R, R, R представляют собой -SOR, где R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения производного хлорина или бактериохлорина, имеющего формулу:
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
2
1
n
n
n
n
2
2
X выбран из атома галогена (F, Cl, Br), X выбран из атома водорода или галогена (F, Cl, Br); и R' представляет собой -SOR, где R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода, включающий приведенную ниже стадию:
(i) твердофазное восстановление соответствующего замещенного порфирина до производного хлорина или производного бактериохлорина с применением гидразидов в отсутствие растворителей и, возможно, в отсутствие оснований; где соответствующий замещенный порфирин имеет формулу:
Следовательно, соединение формулы (III) может представлять собой производное хлорина, имеющее формулу:
Иначе соединение формулы (III) может представлять собой производное бактериохлорина, имеющее формулу:
2
В следующем аспекте R' представляет собой -SOR, где R представляет собой -Cl для соответствующего замещенного порфирина формулы (IV); и способ включает дополнительную стадию:
n
n
n
n
2
(ii) связывание производного хлорина или бактериохлорина с амином H-NHR или H-NR ; аминокислотой или спиртом H-OR, где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода;
2
2
n
n
n
n
с получением производного хлорина или бактериохлорина, где R' представляет собой -SOR, где R представляет собой -аминокислоту, -OR, -NHR или -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая:
(а) производное хлорина или бактериохлорина, имеющее формулу;
или его производное фармацевтически приемлемой композиции,
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
2
1
2
X выбран из атома галогена (F, Cl, Br), X выбран из атома водорода или галогена (F, Cl, Br); и R' представляет собой -SOR;
n
n
n
n
2
каждый R независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода,
где производное хлорина или бактериохлорина эффективно при лечении фотодинамической терапией для облегчения симптомов гиперпролиферативного заболевания; и
(б) вещество, способствующее проникновению через поверхность.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложено применение производного хлорина или бактериохлорина или его производного фармацевтически приемлемой композиции для обнаружении гиперпролиферативной ткани; где производное хлорина или бактериохлорина имеет формулу:
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
2
1
2
X выбран из атома галогена (F, Cl, Br), X выбран из атома водорода или галогена (F, Cl, Br); и R' представляет собой -SOR;
n
n
n
n
2
R каждый независимо выбран из -CI, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода,
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложен способ обнаружения присутствия гиперпролиферативной ткани у субъекта, включающий:
(i) введение субъекту достаточного для диагностики количества производного хлорина или бактериохлорина, имеющего формулу:
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
2
1
2
X выбран из атома галогена (F, Cl, Br), X выбран из атома водорода или галогена (F, Cl, Br); и R' представляет собой -SOR;
n
n
n
n
2
R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода,
или его производное фармацевтически приемлемой композиции, которое преимущественно связывается с мишенью,
(ii) предоставление достаточного времени для связывания производного хлорина или бактериохлорина с мишенью и для выведения любого производного хлорина или бактериохлорина, которое не связывается преимущественно с тканью-мишенью, из ткани, не являющейся мишенью, и
(iii) визуализация соединения внутри пациента.
Стадию визуализации можно осуществлять путем создания МРТ изображения по меньшей мере части тела пациента.
Иначе стадию визуализации можно осуществлять путем воздействия на соединение света достаточной энергии, чтобы вызвать флуоресценцию этого соединения.
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтически приемлемая композиция для применения при лечении рака кожи или кожного заболевания, выбранного из актинических кератозов, чешуйчатоклеточной карциномы, болезни Боуэна, базальноклеточной карциномы, псориаза, обыкновенных и розовых угрей;
где композиция содержит:
(i) производное хлорина или бактериохлорина формулы:
где:
представляет собой углерод-углеродную простую связь или углерод-углеродную двойную связь;
2
1
2
X выбран из атома галогена (F, Cl, Br), X выбран из атома водорода или галогена (F, Cl, Br); и R' представляет собой -SOR;
n
n
n
n
2
R каждый независимо выбран из -Cl, -ОН, -аминокислоты, -OR, -NHR и -NR , где R представляет собой алкил из 1-12 атомов углерода;
и
(ii) фармацевтически приемлемый носитель для внутрикожной или чрескожной доставки такого соединения,
где носитель включает вещество, способствующее проникновению через поверхность, которое временно пермеабилизирует кожу и облегчает проникновение соединения через различные слои кожи;
где
а) композицию вводят субъекту;
б) предоставляют достаточное время, чтобы производное хлорина или бактериохлорина локализовалось преимущественно вблизи мишени дерматологического лечения: и
в) мишень облучают для получения желаемого ответа рака кожи или кожного заболевания.
Способ получения производных
Предпочтительно гидразин представляет собой пара-толуолсульфонилгидразид, 4-хлорбензолсульфоновый гидразид, 4,4'-оксибис(бензолсульфонил)гидразид, бензолсульфонилгидразид, 4-метоксибензолсульфонилгидразид или бензойный гидразид.
Твердофазные реакции требуют применения температуры, которая находится выше точки плавления одного из реагентов, так что другой реагент или реагенты частично растворены или диспергированы в расплавленном реагенте. Для твердофазных реакций между гидразидами и производными порфиринов твердофазную реакцию предпочтительно проводят выше точки плавления гидразида.
Предпочтительно стадию восстановления осуществляют при температуре по меньшей мере 70°С. Предпочтительно стадию восстановления осуществляют при температуре по меньшей мере 100°С. В следующем аспекте стадию восстановления осуществляют при температуре от 70 до 200°С. Предпочтительно стадию восстановления осуществляют в течение по меньшей мере 5 минут.
Предпочтительно стадию восстановления осуществляют в вакууме или в инертной атмосфере.
Фармацевтические композиции
Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере 0,01 масс.% производного хлорина или бактериохлорина или его фармацевтически приемлемой соли на основе общей массы композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит от 0,01 масс.% до 30 масс.% производного хлорина или бактериохлорина или его фармацевтически приемлемой соли на основе общей массы композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит от 0,01% до 10% масс/масс производного хлорина или бактериохлорина или его фармацевтически приемлемой соли на основе общей массы композиции. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит от 0,01 масс.% до 1 масс.% производного хлорина или бактериохлорина или его фармацевтически приемлемой соли на основе общей массы композиции.
Когда вещество, способствующее проникновению через поверхность, присутствует в фармацевтической композиции, предпочтительно композиция содержит от 0,05 до 10 масс.% вещества, способствующего проникновению через поверхность, на основе общей массы композиции. Предпочтительно композиция содержит от 0,1 до 10 масс.% вещества, способствующего проникновению через поверхность. Предпочтительно такое вещество, способствующее проникновению через поверхность, может быть выбрано из диметилсульфоксида и других диалкилсульфоксидов, N-метилформамида, диметилформамида, диметилацетамида, гликолей, различных производных пирролидона и различных 1-замещенных азациклоалкан-2-онов.
Подходящие гликоли могут быть выбраны из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля 425, триметиленгликоля и пропиленгликоля монолаурата.
Подходящие производные пирролидона могут быть выбраны из N-додецилпирролидин-3,5-диона, N-додецилпирролидин-2-тиона, N-додецил-2-пирролидона, N-(2-гидроксиэтил)-2-пирролидона, N-циклогексил-2-пирролидона, 1-бутил-3-додецил-2-пирролидона, 1,5-диметил-2-пирролидона, 1-этил-2-пирролидона, 1-гексил-4-метилоксикарбонил-2-пирролидона, 1-гексил-2-пирролидона, 1-(2-гидроксиэтил)пирролидинона, 3-гидрокси-N-метил-2-пирролидинона, 1-лаурил-4-метилоксикарбонил-2-пирролидона и N-метил-2-пирролидона.
Подходящие 1-замещенные азациклоалкан-2-оны, включающие 1-додецилазациклогептан-2-он, далее называемый в данной заявке Azone, раскрыты в патентах США №№4562075, 4405616, 4326893 и 3989816.
Обнаружение гиперпролиферативной ткани
Когда производные хлорина или бактериохлорина или их фармацевтически приемлемые соли применяют при обнаружении гиперпролиферативной ткани, предпочтительно гиперпролиферативная ткань может быть выбрана из сосудистой эндотелиальной ткани, ткани новообразованных сосудов, ткани новообразованных сосудов, присутствующей в глазу, аномальной сосудистой стенки опухоли, солидной опухоли, опухоли головы, опухоли шеи, опухоли глаза, опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли печени, опухоли молочной железы, опухоли простаты, опухоли легкого, несолидной опухоли, злокачественных клеток одной из гемопоэтической ткани и лимфоидной ткани, повреждений в сосудистой системе, пораженного заболеванием костного мозга и пораженных заболеванием клеток, в которых заболевание представляет собой одно из аутоиммунного и воспалительного заболевания.
Лечение гиперпролиферативных заболеваний
В следующем аспекте в настоящем изобретении предложено применение производного хлорина или бактериохлорина, как описано в данной заявке, или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении лекарственного средства для применения при лечении гиперпролиферативных расстройств.
Когда производное хлорина или бактериохлорина или его фармацевтически приемлемые соли применяют при лечении гиперпролиферативных расстройств, предпочтительно гиперпролиферативное расстройство выбрано из раков или карцином, миелом, псориаза, макулярной дегенерации. Подходящими примерами являются рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак матки, рак пищевода, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак гортани, саркомы, рак печени, рак мочевого пузыря, рак верхней челюсти, рак желчного протока, рак головы и шеи, рак языка, опухоль головного мозга, рак кожи, злокачественный зоб, рак простаты, рак прямой и ободочной кишки, рак околоушной слюнной железы, болезнь Ходжкина, множественная миелома, рак почки, лейкоз и злокачественная лимфоцитома.
Такое лечение предпочтительно включает облучение производного хлорина или бактериохлорина или его производного фармацевтически приемлемой композиции светом длины волны, соответствующей полосам поглощения производного хлорина или бактериохлорина. Предпочтительно свет имеет длину волны от 600 до 800 нм. Предпочтительно, когда применяют хлорины, свет имеет длину волны от 630 до 690 нм. Предпочтительно, когда применяют бактериохлорины, свет имеет длину волны от 720 до 780 нм.
2
2
2
2
Предпочтительно доза облучения составляет от 1 до 250 Дж/см. В некоторых аспектах предпочтительно доза облучения составляет 50 Дж/см, менее чем 20 Дж/см, менее чем 10 Дж/см.
Предпочтительно дозировка производных хлорина или бактериохлорина или их фармацевтически приемлемых солей составляет от 0,01 мг до 200 мг на килограмм массы тела в сутки. Предпочтительно дозировка составляет от 0,01 мг до 100 мг на килограмм массы тела в сутки.
Настоящее изобретение было осуществлено в свете вышеописанного предшествующего уровня техники. Синтез, описанный в WO 2006/053707 (РСТ/ЕР 2005/012212), включал только три почти количественные стадии: (i) функционализацию галогенированных тетракисфенилпорфиринов посредством хлорсульфонирования фенильного кольца; (ii) синтез амфифильных соединений посредством взаимодействия хлорсульфоновой группы с нуклеофилами, водой, а именно аминами или спиртами; iii) восстановление тетрапиррольного макроцикла гидразидными производными в присутствии неорганических или органических не нуклеофильных оснований. Однако, как проиллюстрировано на фиг.2 патента WO 2006/053707, синтез галогенированных сульфонированных бактериохлоринов этим способом связан с загрязнением аналогичным хлорином, и очистка требует трудоемкого отделения. Целью настоящего изобретения является разработка экономичного, благоприятного для окружающей среды, широкомасштабного синтеза чистых стабильных и функционализированных тетракисфенилхлоринов и тетракисфенилбактериохлоринов, несущих электроноакцепторные группы в ортоположениях фенильных колец. Целью настоящего изобретения также является разработка химических и терапевтических свойств указанных хлоринов и бактериохлоринов, способов терапии и фармацевтических композиций с этими молекулами и доказательство их эффективности при ФДТ.
Галогенированные сульфонированные бактериохлорины обладают отличительными признаками, которые делают их предпочтительными фотосенсибилизаторами при ФДТ:
1) Присутствие атомов галогена в ортоположениях фенильных групп выполняет три функции. Во-первых, оно производит контролируемый "эффект тяжелого атома", увеличивающий выход сенсибилизатора в триплетном состоянии, не подвергая риску время жизни триплета и его способности эффективно переносить энергию электронов на молекулярный кислород [29]. Во-вторых, оно стабилизирует восстановленное состояние тетрапиррольных макроциклов за счет как электронных, так и стерических эффектов. В-третьих, оно ускоряет константу скорости переноса энергии на молекулярный кислород посредством взаимодействий с переносом заряда, что приводит к высоким выходам синглетного кислорода, супероксида и других активных форм кислорода.
2) Присутствие группы сульфоновой кислоты в метаположениях фенильных групп выполняет две функции. Во-первых, оно обеспечивает инструмент для управления гидрофильностью/липофильностью сенсибилизаторов, поскольку сенсибилизаторы с сильной гидрофобностью оказываются менее фототоксичными, вероятно, за счет низкой растворимости и низкой способности к перемещению из плазматической мембраны в другие внутриклеточные компартменты, тогда как высокогидрофильные красители могут преимущественно локализоваться в строме опухоли и обладают сниженной эффективностью ФДТ [30]. Во-вторых, сульфоновая группа, особенно с объемными или длинными заместителями, присоединенными к ней, обеспечивает дополнительную стерическую защиту против окисления бактериохлоринового ядра красителей.
Одновременное присутствие атомов галогена в ортоположениях и группы сульфоновой кислоты в метаположениях фенильных групп выполняет дополнительную функцию. Молекулярное моделирование и экспериментальные данные показывают, что, когда имеется ограниченное вращение простой связи в мезоположении 5,10,15,20-тетрафенилпорфиринов с несимметрическими фенильными кольцами, геометрические изомеры (известные как атропоизомеры) являются результатом различного положения орто- и/или метазаместителей относительно плоскости порфирина [31]. Атропоизомеры обладают значительно различающимися полярностями и коэффициентами поглощения полосы поглощения самой длинной длины волны, которые могут различаться почти на один порядок величины. В частности, а4 изомер с четырьмя сульфамоильными заместителями на одной и той же стороне плоскости порфирина имеет самый высокий коэффициент поглощения и является наиболее амфифильным из атропоизомеров.
Широко распространенное применение сульфонированных хлоринов и бактериохлоринов в ФДТ требует экономичного и благоприятного для окружающей среды синтеза, который можно осуществлять в промышленном масштабе. Главной целью настоящего изобретения является разработка нового способа получения таких соединений, основанного только на порфирине-предшественнике и гидразиде, где последний добавляют в твердой фазе, нагревают выше температуры плавления в герметичном реакторе в отсутствие кислорода и основания, и через некоторое время получают желаемый продукт.
Целью настоящего изобретения также является разработка способов ФДТ с применением местного введения указанного сульфонированного хлорина или бактериохлорина с подходящим носителем. Носители для местного введения фотосенсибилизаторов могут принимать различные формы, включая жидкие растворы, гели, кремы, эмульсии, мази и т.д. Как правило, препарат таких носителей включает по меньшей мере одно вещество, способствующее проникновению через поверхность. В противоположность общепринятым знаниям в данной области техники, что лекарственные средства с молекулярными массами, превышающими 500 Да, плохо проникают через кожу [32], авторы изобретения разработали препараты для эффективной внутрикожной доставки указанных сульфонированных хлоринов и бактериохлоринов к местам кожных заболеваний, где эти молекулы достигают молекулярных масс, несколько превышающих 1 кДа.
Данное изобретение относится к соединениям для лечения и обнаружения гиперпролиферативных тканей, таких как опухоли, с применением фотодинамических способов. Соединения по настоящему изобретению также полезны для лечения дерматологических заболеваний, таких как псориаз, обыкновенные и розовые угри; гинекологических расстройств, таких как дисфункциональные маточные кровотечения; урологических расстройств, таких как вирус кондиломы; сердечно-сосудистых расстройств, таких как рестеноз и атеросклеротические бляшки; фотодинамического разрушения бактерий или вирусов; удаления волос и косметики; ингибирования иммунных ответов после трансплантации органов или тканей.
Наконец, еще одной целью изобретения является разработка способов диагностики гиперпролиферативных тканей с применением галогенированных сульфонированных хлоринов или бактериохлоринов. При условии, что эти соединения преимущественно аккумулируются в таких тканях, дополнительным свойством, необходимым для диагностических целей, является совершенно определенное обнаружение очень малых количеств таких соединений. Эти соединения имеют очень отчетливые полосы поглощения в красной и инфракрасной области, где ткани наиболее прозрачны. Избирательное возбуждение этих соединений приводит к отчетливой флуоресценции при длинах волны, где биологические молекулы не излучают. Обнаружение флуоресценции можно осуществлять с помощью очень чувствительного оборудования, и субнаномолярные количества галогенированных сульфонированных хлоринов или бактериохлоринов можно измерить в биологических средах. Источник облучения для фотодиагностики и фототерапии не ограничен, но лазерный луч предпочтителен, поскольку можно применять интенсивные световые лучи в желаемом диапазоне длин волны. Необходимо, чтобы световые лучи обладали достаточной энергией, чтобы вызвать испускание флуоресценции соединениями для диагностики, и чтобы проявлять эффект уничтожения клеток при терапии. Кроме того, когда применяют фторированные сульфонированные хлорины или бактериохлорины, фтор-МРТ (магнитно-резонансная томография) может обнаружить аккумуляцию этих соединений в малых участках тела и следить за метаболитами, образующимися при их выведении из организма.
II. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
II.А. Определения
Как используют в данной заявке, "гиперпролиферативные заболевания" означают те заболевания, которые объединены тем, что лежат в основе патологически избыточной клеточной пролиферации, вызванной нерегулируемым или аномальным клеточным ростом, и включают неконтролируемый ангиогенез. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают, но не ограничены ими, раки или карциномы, миеломы, псориаз, макулярную дегенерацию.
"Гиперпролиферативная ткань", как используют в данной заявке, означает ткань, которая растет без контроля, и включает опухоли и неукротимый рост кровеносных сосудов, как, например, рост кровеносных сосудов, обнаруживаемый при возрастной макулярной дегенерации.
Как используют в данной заявке, "опухоль" означает новообразование и включает как доброкачественные, так и злокачественные опухоли. Этот термин, в частности, включает злокачественные опухоли, которые могут быть либо солидными, либо не солидными (такими, как лейкоз). Примерами опухолей являются: рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак матки, рак пищевода, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак гортани, саркомы, рак печени, рак мочевого пузыря, рак верхней челюсти, рак желчного протока, рак головы и шеи, рак языка, опухоль головного мозга, рак кожи, злокачественный зоб, рак простаты, рак прямой и ободочной кишки, рак околоушной слюнной железы, болезнь Ходжкина, множественная миелома, рак почки, лейкоз и злокачественная лимфоцитома.
Как используют в данной заявке, "инфицирующий агент" означает инвазивные микроорганизмы или паразиты. Как используют в данной заявке, "микроорганизм" означает вирусы, бактерии, риккетсии, микоплазму, простейших, грибы и подобные микроорганизмы, а "паразит" означает инфекционных, как правило, микроскопических или очень маленьких многоклеточных беспозвоночных, либо их яйца или ювенильные формы, которые чувствительны к индуцированному антителами клиренсу, либо к литическому или фагоцитарному разрушению.
Как используют в данной заявке, "фармацевтический агент" или "лекарственное средство" относится к химическому соединению или композиции, способной индуцировать желаемый терапевтический или профилактический эффект при правильном введении субъекту. Он включает, но не ограничен ими, фотосенсибилизаторы, которые поглощают свет и используют его, либо чтобы действовать в качестве лекарства, либо чтобы активировать другие химические соединения, которые впоследствии действуют в качестве лекарств.
Как используют в данной заявке, "производное фармацевтически приемлемой композиции" относится к композициям, где фотосенсибилизаторы связаны с биологически активными группами, то есть с любой группой, которая избирательно стимулирует связывание, аккумуляцию или выведение в конкретной биологической окружающей среде. Примеры, известные в данной области техники, включают заместители, образованные из сахаров, производных аминокислот, олигонуклеотидов или лигандов, специфичных к рецепторам (стероидных гормонов, факторов роста, нейротрансмиттеров или антител). Оно также включает соли фотосенсибилизаторов.
Как используют в данной заявке, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, вспомогательные вещества для включения в препараты в виде таблеток, пилюль, капсул, кремов, растворов, суспензий или эмульсий. В данной области техники хорошо известно, как готовить эти фармацевтические композиции.
Как используют в данной заявке, "вещество, способствующее проникновению через поверхность" относится к химическому соединению или композиции, способной повышать или ускорять транспортировку лекарственного средства через барьер, такой как кожа и другие ткани, и включает диметилсульфоксид и другие диалкилсульфоксиды, М-метилформамид, диметилформамид, диметилацетамид, гликоли, различные производные пирролидона, Azone или любой другой из агентов, способствующих проникновению через кожу, описанных в литературе, или их смеси.
Как используют в данной заявке, "облучение" означает воздействие на субъекта всеми частотами электромагнитного спектра. Предпочтительно длина волны облучения выбрана так, что соответствует длине (длинам) волны, где лекарственное средство поглощает свет.
Как используют в данной заявке, "Luzitin" относится к любому сульфонированному тетракисфенилхлорину или тетракисфенилбактериохлорину, несущим электроноакцепторные группы в ортоположениях фенильных групп, и приведенные ниже сокращения относятся к конкретным химическим соединениям, которые являются не ограничивающими примерами данного ассортимента молекул:
- Luzitin-Cl-c представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-хлор-5-сульфонилфенил)хлорин,
- Luzitin-FMet-c представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-фтор-5-N-метилсульфамоилфенил)хлорин,
- Luzitin-F представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-фтор-5-сульфонилфенил)бактериохлорин,
- Luzitin-Cl представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-хлор-5-сульфонилфенил)бактериохлорин,
2
- Luzitin-Cl представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-сульфонилфенил)бактериохлорин,
- Luzitin-FMet представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-фтор-5-N-метилсульфамоилфенил)бактериохлорин,
2
- Luzitin-FMet представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2,6-дифтор-3-N-метилсульфамоилфенил)бактериохлорин,
2
- Luzitin-ClEt представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-N-этилсульфамоилфенил)бактериохлорин,
2
- Luzitin-ClHep представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-N-гептилсульфамоилфенил)бактериохлорин,
2
- Luzitin-FMet представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2-фтор-5-N,N-диметилсульфамоилфенил)бактериохлорин.
Также используемыми в данной заявке являются сокращения:
2
- ClPhB, который представляет собой 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлорфенил)бактериохлорин;
- БМПО, который представляет собой 5-трет-бутоксикарбонил-5-метил-1-пирролин-N-оксид;
- ДМПО, который представляет собой 5-диметил-1-пирролин-N-оксид;
- ДМСО, который представляет собой диметилсульфоксид.
II.В. Соединения-предшественники
5,10,15,20-тетракис(галогенированный фенил)порфирины и 5,10,15,20-тетракис(2-цианофенил)порфирины, 5,10,15,20-тетракис(2-трифторметилфенил)порфирины, 5,10,15,20-тетракис(2-нитрофенил)порфирины и 5,10,15,20-тетракис(2-карбоксиметилфенил)порфирины были синтезированы нитробензольным способом [33], смешивая пиррол с желаемыми галогенированными фенилальдегидами в смеси уксусная кислота/нитробензол при 120°С. После охлаждения чистый порфирин кристаллизуется непосредственно из реакционной среды. Все данные характеристики (ЯМР (ядерно-магнитный резонанс), FAB (Fast Atom Bombardment - бомбардировка быстрыми атомами) и микроанализ) хорошо согласуются с ранее описанными порфиринами.
2
4
Хлорсульфонирование указанных порфиринов осуществляли в соответствии с ранее описанным способом [34, 35]. Нужный порфирин (200 мг) и хлорсульфоновую кислоту (10 мл, 150 ммоль) перемешивали при температурах от 50 до 250°С в течение 1-3 ч. После этого периода к раствору добавляли дихлорметан (200 мл). Проводили непрерывную экстракцию водой при перемешивании до нейтрализации. Затем дихлорметановый раствор промывали гидрокарбонатом натрия и высушивали над безводным NaSO. В результате очистки колоночной хроматографией на силикагеле, применяя дихлорметан в качестве элюента, и последующего выпаривания растворителя получили желаемые хлорсульфонированные порфирины в виде пурпурных кристаллов.
Гидролиз вышеописанных хлорсульфонированных порфиринов проводили путем суспендирования 100 мг желаемого соединения в дистиллированной воде (120 мл) и кипячения с обратным холодильником в течение 12 ч. Полученные в результате растворы концентрировали роторным выпариванием, и полученное твердое вещество высушивали при 120°С. Сульфокислотные производные порфиринов были получены с количественными выходами. Их характеристика с помощью ЯМР, FAB и микроанализа хорошо согласуется с литературными данными [34, 35].
II.С. Приборы
Спектры поглощения записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-2100 или с помощью биоспектрофотометра Carry 50 (Varian, Mulgrave, США). Спектры флуоресценции измеряли с помощью спектрофотометра Spex Fluorolog 3 с коррекцией на систему зависимости от длины волны (фотоэлектронный умножитель RCA C31034) или спектрофлуориметра PerkinElmer LS 50. Спектры мгновенного поглощения измеряли на спектрометре кинетики импульсного фотолиза с лазером с наносекундными импульсами Applied Photophysics LKS 60, применяя третью гармонику лазера Spectra-Physics Quanta Ray GCR 130-01 Nd/YAG для возбуждения, фотоэлектронный умножитель Hamamatsu 1P28 и осциллоскоп Hewlett-Packard Infinium (1 ГС/с (GS/s, гигасэмплов/с)). Измерения импульсного фотолиза проводили в присутствии воздуха и в растворах, насыщенных аргоном. При фотоакустической калориметрии применяли тот же лазер Nd/YAG, фотоакустическую фронтальную ячейку местного изготовления с преобразователем 2,25 МГц Panametrics (модель 5676) и регистратором нестационарных процессов Tektronix DSA 601 [36]. Фосфоресценцию синглетного кислорода при комнатной температуре измеряли при 1270 нм с помощью фотоэлектронного умножителя Hamamatsu R5509-42, охлажденного до 193 К в камере с жидким азотом (Products for Research, модель PC176TSCE005), с последующим лазерным возбуждением аэрированных растворов при 355 нм, применяя адаптированный спектрометр Applied Photophysics [37]. Мониторинг испускания синглетного кислорода при 1270 нм также проводили с помощью германиевого детектора, охлажденного жидким азотом (North Coast), соединенного с цифровым осциллоскопом Tectronix (TDS 520 В), с последующим возбуждением образца 5-наносекундными лазерными импульсами третьей гармоники (355 нм), генерируемыми лазером с электрооптическим затвором Nd:YAG (Continuum Surelite II).
1
19
13
1
13
Элементные анализы проводили на элементном анализаторе Fisons Instruments EA 1108 CHNS-0. Точки плавления измеряли на капиллярном аппарате для измерения точек плавления Electrothermal. Спектры Н-ЯМР, F-ЯМР и С-ЯМР записывали на 300 МГц Brucker-Amx. Оценки H осуществляли, применяя эксперименты 2D COSY (Correlation spectroscopy, корреляционная спектроскопия) и NOESY (Nuclear Overhauser effect spectroscopy, спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера), тогда как оценки С осуществляли, применяя эксперименты 2D HSQC (Heteronuclear single quantum coherence, гетероядерная одноквантовая корреляция) и НМВС (Heteronuclear Multiple Bond Coherence, гетероядерная многополосная корреляция). Данные MALDI-TOFMS (Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time-of-flight mass spectrometry, времяпролетная масс-спектрометрия матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией) регистрировали, применяя прибор Applied Biosystems Voyager DE-STR (Framingham, MA, США), который оборудован азотным лазером (h=337 нм).
Спектры электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) форм по меньшей мере с одним неспаренным электроном снимали, применяя спектрометр Bruker ESP 300 (IBM Instruments Inc.). Типичные установки прибора представляли собой: микроволновая мощность 10 мВт, амплитуда модуляции 0,8 Тл, ширина полосы качания частоты 60,0 Тл. Спектры ЭПР записывали при излучении in situ диодным лазером Hamamatsu. Для регистрации спектров применяли приведенные ниже установки: высокая мощность (4 мВт), низкая амплитуда модуляции (0,2 Тл) и узкий диапазон сканирования (60 Тл), и для каждого спектра регистрировали 20 сканирований.
2
Эксперименты по облучению in vitro проводили, применяя либо галогеновую лампу, либо лазерный источник. В первом случае галогеновую лампу 500 Вт помещали на 50 см от облучаемой чашки, чтобы гарантировать однородное облучение. Охлажденный водяной фильтр (d=35 мм) и отсекающий фильтр 600 нм помещали между лампой и образцами. Плотность потока частиц, достигающего образцов, составляла 3 мВт/см. Спектр излучения галогеновой лампы записывали, применяя спектрорадиометр IL2000 (Spectrocube), фиг.1. Во втором случае применяли три диодных лазера с внешним резонатором Lynx TEC 500, управляемые PilotPC 500 Laser Controllers (Sacher Lasertechnik, Марбург, Германия). Лазерные энергии были стабильными при 40 мВт для лазера 748 нм, 10 мВт для лазера 649 и 10 мВт для лазера 633. Лазерные энергии регулярно измеряли с помощью Coherent LaserCheck. В некоторых экспериментах in vitro лазерное излучение фокусировали на оптическом волокне посредством коллиматора в микростанке и подавали на клетки. Эта система уменьшала лазерное излучение 748 нм до 30 мВт.
Для облучения бактериохлоринов в экспериментах по фотообесцвечиванию применяли диодный лазер 748 нм Lynx. Для исследований на животных авторы изобретения применяли изготовленный на заказ диодный лазер Hamamatsu, тип LA0873, S/N M070301, который подавал 140 мВт при 748 нм. Этот диодный лазер регулировался контроллером ThorLabs 500 mA ACC/APC Laser Diode Controller и встроенной электроникой. Лазерные энергии этого и других лазеров высокой энергии, применяемых в данной работе, регулярно проверяли измерителем мощности лазерного излучения Ophir, модель AN/2E.
Зависимый от времени клеточный захват фотосенсибилизаторов и жизнеспособность клеток подтверждали флуоресцентной микроскопией, применяя прибор Nikon ECLIPSE TS-100F.
+
Флуоресценцию образцов кожи анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus Fluorescence Microscopy, модель ВХ51М, применяя U-MSWG2 зеркальный блок флуоресценции (фильтр возбуждения 480-550, фильтр испускания 590, дихроматический фильтр 570 нм). Конфокальную микроскопию проводили с помощью инвертированного микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Mycrosystems CMS GmbH, Мангейм, Германия) (DMI6000) с 63' апохроматическим объективом (числовая апертура 1,2) водной иммерсии. Перед переключением на конфокальный режим суспензию GUV (giant unilamellar vesicle, гигантская моноламеллярная везикула) непосредственно наблюдали, применяя натриевую лампу в качестве источника света и фильтр для выбора флуоресценции Rhod-DOPE для оценки выхода образования GUV. Источник возбуждения при конфокальной флуоресцентной микроскопии представлял собой либо 514 нм линию с лазера Ar, либо 745 нм линию лазера Ti:Sa. Испускание регистрировали в диапазоне от 550 до 800 нм, применяя преимущества оптико-акустического настраиваемого волокна и светоделительной призмы системы Leica TCS SPC5. Рассеянный свет минимизирован в соответствии с "разумным смещением", которое остается всегда ниже 0,5% (обычно от -0,1% и 0,1%), и пренебрежимо малыми фотонными импульсами снаружи липидных структур. Конфокальные срезы толщиной ниже 0,5 мм были получены, применяя предметный столик с гальванометрическим приводом. 3D проекции были получены, применяя программное обеспечение Leica Application Suite - Advanced Fluorescence.
II.D. Методы
II.D.1 Коэффициенты распределения
Коэффициенты распределения (КР) н-октанол:вода измеряли, применяя незначительную модификацию способа встряхиваемой колбы, описанного некоторыми из авторов изобретения в литературе [35]. Модификация касалась возбуждения полосы поглощения примерно 500 нм и регистрации флуоресценции в красной/ИК-области.
II.D.2. Фотохимия и фотофизика
Эксперименты по фотообесцвечиванию проводили в растворах PBS, PBS:метанол (50:50) и в метаноле. Растворы облучали в кювете с оптическим путем 1 см диодным лазером Lynx. Исходное поглощение растворов составляло примерно 0,8. Механизм фотообесцвечивания оценивали при облучении сенсибилизатора, применяя диодный лазер Hamamatsu при 80 мВт. Сенсибилизатор облучали в PBS в присутствии аскорбиновой кислоты или азида.
F
2
Квантовые выходы флуоресценции (Ф) определяли в этаноле, принимая за стандарт квантовый выход флуоресценции ClPhB в толуоле [4]. Поглощения, как стандартного раствора, так и раствора образца, сравнивали примерно при 0,2 при длине волны возбуждения 515,5 нм, и растворы разводили с коэффициентом разведения 10 перед регистрацией флуоресценции. Квантовый выход флуоресценции получали на основании отношения полос флуоресценции образца против стандарта, умноженного на квантовый выход флуоресценции стандарта, 0,012 в соответствии с [12], после коррекции на различие показателей преломления этанола и толуола.
T
Спектры триплет-триплетного поглощения и время жизни триплетов фотосенсибилизаторов (T) измеряли с помощью описанного выше оборудования спектров мгновенного поглощения при возбуждении при 355 нм, где растворы имели значения поглощения при 0,25 и 0,30.
Фотоакустическую калориметрию с временным разрешением (РАС) проводили с описанными выше установками, применяя способ, описанный некоторыми из авторов изобретения [4]. Все измерения проводили в этаноле, применяя марганец 5,10,15,20-тетрафенилпорфирин в качестве фотоакустического стандарта.
Δ
Квантовые выходы синглетного кислорода в этаноле были получены, применяя способ, описанный некоторыми из авторов изобретения [37], применяя феналенон в качестве стандарта. Литературное значение квантового выхода синглетного кислорода, полученное с феналеноном в этаноле, равно Ф=0,95 [38].
II.D.3. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)
226
-1
-1
Активные формы кислорода, продуцируемые в результате облучения фотосенсибилизаторов в PBS, а именно супероксидный ион и гидроксильный радикал, образуют аддукты с различными спиновыми ловушками. Такие аддукты можно идентифицировать с помощью ЭПР. Буфер PBS, применяемый в этих измерениях, был предварительно обработан хелатирующей смолой, Chelex 100, чтобы удалить какие-либо загрязняющие ионы металлов, которые могут катализировать распад пероксидов. Применяли две спиновые ловушки: БМПО и ДМПО. ДМПО сначала очищали активированным углем/бензолом, а затем определяли исходную концентрацию 1,0 М, используя ε=7200 М см. Измерения ЭПР проводили при комнатной температуре, применяя спектрометр Bruker, описанный выше, при облучении in situ диодным лазером Hamamatsu.
II.D.4. Тесты на проникновение через кожу
Лучшей животной моделью для тестирования проникновения через кожу является карликовая свинья с точки зрения сходств между характеристиками кожи карликовой свиньи и человека [39]. Различные препараты в виде кремов, мазей, гелей и жидких растворов применяли для усиления проникновения фотосенсибилизатора через образцы кожи карликовых свиней. Препараты включали фотосенсибилизаторы в количествах, варьирующих от 0,1 до 10% вещества, способствующие проникновению, такие как Azone и ДМСО, и различные эксципиенты. В тестах ex vivo применяли кожу, вырезанную со спины карликовых свиней. Тесты in vivo проводили на спине карликовых свиней. В каждом тесте препараты наносили на площадь кожи примерно 1 см в течение желаемого периода времени под герметической повязкой. Как только время проходило, препарат удаляли шпателем и смывали медицинской ватой, смоченной в этаноле, до тех пор, пока следы сенсибилизатора не были видны на медицинской вате. В тестах in vivo образцы кожи брали операционным путем, а затем животных умерщвляли.
Первой стадией способа фиксации ткани для образцов кожи было погружение в параформальдегид (4% в водном растворе) по меньшей мере на 24 ч. Затем образцы переносили в 25% раствор сахарозы по меньшей мере на 48 ч. После этой обработки образцы кожи становились более плотными, чем раствор сахарозы. Аликвоту отбирали дерматомом, замораживали в сухом льду, а затем закрепляли в держателе с Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Нидерланды) и резали на срезы с контролируемой толщиной, выбранной между 25 и 100 мм, в криостате. Кожные срезы собирали на предметных стеклах и хранили в замороженном виде до тех пор, пока их не анализировали флуоресцентной микроскопией и конфокальной микроскопией. Кроме того, чаще, чем с применением параформальдегида в качестве фиксирующего средства, образцы кожи непосредственно замораживали в сухом льду.
II.D.5. Эксперименты in vitro
Лекарственные средства, описанные в данной заявке, оценивали в исследованиях in vitro. В одной серии исследований in vitro применяли облучение галогеновой лампой, оборудованной несколькими фильтрами. В другой серии применяли облучение диодным лазером для доставки света в каждую клеточную культуру.
II.D.5.i) Эксперименты in vitro с облучением галогеновой лампой
2
Клеточные линии, применяемые в облучении галогеновой лампой, представляли собой клетки MCF7 (карцинома молочной железы человека), SKMEL 188 (меланома человека) и S91/13 (меланома мыши). Их применяли в экспериментах как на цитотоксичность, так и на фотоцитотоксичность. Клетки MCF7 выращивали с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FBS), 25 ед./мл пенициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. Клетки меланомы человека SKMEL-188 выращивали в среде F10 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки меланомы сублинии 13 Cloudman S91 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 5% фетальной сыворотки теленка (FCS) (Gibco BRL). Все клеточные линии культивировали в виде монослоя в чашках Петри диаметром 60 мм и инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO.
2
4
Цитотоксичность. Метаболическую эффективность и жизнеспособность клеток определяли на основании захвата и восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) до нерастворимого красителя формазана клеточными микросомальными ферментами. Клеточные линии выращивали в среде RPMI с 10% фетальной сывороткой теленка, пенициллином и стрептомицином. Клетки поддерживали при 5% СО, 95% воздухе и 100% влажности. Для определения цитотоксичности эти клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 1×10 клеток на лунку в полной среде. После 24 ч клетки инкубировали с фотосенсибилизаторами при различных концентрациях (от 0,25 вплоть до 50 мкМ) в течение 18 часов при 37°С. Затем клетки дважды промывали PBS и инкубировали в ростовой среде при 37°С в течение 24 ч. Затем среду заменяли 100 мкл свежей среды и 20 мкл МТТ, и клетки инкубировали с МТТ в течение 3 ч при конечной концентрации 0,5 мг/мл. Затем культуральную среду заменяли раствором ДМСО - метанол (1:1) для растворения синих кристаллов формазана. 96-луночный культуральный планшет встряхивали в течение 0,5 мин при комнатной температуре и сразу считывали оптическую плотность при 560 нм, применяя считывающее устройство для иммуноферментного анализа (ИФА) (GENios Plus; Tecan Trading AG, Switzerland). Выживаемость клеток выражали в изменениях поглощения соли формазана, и уровень выживаемости был приведен в виде процентного отношения жизнеспособных обработанных клеток против числа жизнеспособных необработанных клеток. Число клеток определяли на основании линейной регрессии калибровочной кривой.
4
Зависимый от времени клеточный захват. Клетки SKMEL 188, S91 и MCF7 высевали на 96-луночные планшеты при концентрации 1×10 клеток на лунку и подвергали воздействию 20 мкМ концентраций фотосенсибилизаторов, представляющих собой хлорины и бактериохлорины, в PBS в течение различных интервалов времени от 10 мин вплоть до 180 мин для проверки зависимой от времени аккумуляции лекарственного средства. В конце интервала инкубации клетки промывали три раза PBS и ресуспендировали в 100 мкл 0,25% Тритон X-100 в PBS. Удерживание фотосенсибилизаторов, связанных с клеткой, определяли путем измерения флуоресценции аккумулированных фотосенсибилизаторов, применяя считывающее устройство для ИФА. Кроме того, захват фотосенсибилизатора и жизнеспособность клеток подтверждали с помощью флуоресцентной микроскопии. В этих экспериментах клетки SKMEL 188, S91 и MCF7 инкубировали в течение 2 часов с 20 мкМ фотосенсибилизатора с последующим промыванием клеток три раза PBS, ресуспендированием в PBS и исследованием с помощью флуоресцентной микроскопии.
2
2
Фотосенсибилизация клеток. Клетки SKMEL 188, S91 и MCF7 готовили, как описано выше. На основании анализов цитотоксичности 5 мкМ концентрация фотосенсибилизатора была выбрана для анализов фотосенсибилизации. Клетки инкубировали в течение 12 ч при 37°С, а затем облучали при плотности потока частиц 0,53 мВт/см и при дозах облучения в интервале от 0,1 до 0,64 Дж/см. Авторы изобретения напоминают, что фотосенсибилизатор использует только примерно 1/5 доступной плотности потока частиц фильтруемой галогеновой лампы. Тест МТТ проводили через 24 ч после облучения. Значения были получены из трех независимых экспериментов и выражены в процентах выживаемости клеток по сравнению с контрольными клетками, которые подвергали тем же манипуляциям таким же способом, но без инкубации с фотосенсибилизатором и без облучения.
II.D.5.ii) Эксперименты in vitro с лазерным облучением
2
2
Клеточные линии, применяемые при лазерном облучении, представляли собой НТ-29 (карцинома ободочной кишки человека), РС-3 (карцинома простаты человека), SW2 (мелкоклеточный рак легкого человека), А-549 (немелкоклеточный рак легкого человека), S91/I3 (меланома мыши) и СТ26 (карцинома ободочной кишки мыши). Их применяли для обоих экспериментов, цитотоксичности и фотоцитотоксичности. Клетки PC-3, SW2 и S91/I3 культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Штайнхайм, Германия), а клетки НТ-29, А-549 и СТ26 культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Cambrex Bioscience, Вервье, Бельгия). В обе клеточные культуральные среды добавляли 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Cambrex Bioscience, Вервье, Бельгия) и 100 МЕ/мл пенициллина - 100 мкг/мл стрептомицина (Cambrex Bioscience, Вервье, Бельгия). В среду DMEM, применяемую для клеток СТ26, также добавляли HEPES (ГЭПЭС, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) 10 мМ. Клеточные линии поддерживали во флаконах объемом 75 см (Orange Scientific, Braine-I'Alleud, Бельгия) при 37°С в увлажненной атмосфере при 5% CO. Для исследований in vitro клетки при 85-90% конфлюентности отделяли раствором Трипсин-Версен-ЭДТА (Cambrex Bioscience, Venders, Бельгия), считали и высевали в 96-луночные планшеты с плоским дном при желаемых плотностях.
Анализ выживаемости клеток. В конце экспериментов выживаемость клеток оценивали с помощью анализа восстановления резаурина [40], кратко, исходный раствор резаурина (Sigma-Aldrich, Штайнхайм, Германия) (0,1 мг/мл в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с рН 7,4) разводили до 10% в культуральной среде без PBS или антибиотиков, и 200 мкл добавляли к клеткам в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение 3-4 ч при 37°С. Значения поглощения каждой лунки измеряли при 540 нм и 630 нм, применяя считывающее устройство для микропланшетов Multiskan Ex (Thermo - Electron Corporation, Вартаа, Финляндия).
50
Цитотоксичность. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с плоским дном (Orange Scientific, Braine-I'Alleud, Бельгия) в 100 мкл культуральной среды и давали возможность прикрепиться в течение ночи. Фотосенсибилизатор добавляли к клеткам (разведенный в 100 мкл культуральной среды) при конечных концентрациях от 0,01 до 1 мМ. Каждую концентрацию тестировали в четырех повторах. Инкубационные периоды в темноте при 37°С составляли двукратное время удвоения для тестируемой клеточной линии. После инкубации оценивали выживаемость клеток. В параллельных контрольных экспериментах клетки инкубировали без лекарственного средства. Цитотоксичность определяли количественно путем выражения клеточной гибели относительно необработанных клеток (% от контрольных клеток). Результаты наносили на график в виде кривых доза-ответ (% клеточной гибели в зависимости от концентрации лекарственного средства), которые давали возможность определения концентрации, которая ингибирует 50% клеточного роста (IC).
2
Фотосенсибилизация клеток. Клетки высевали в черные 96-луночные планшеты DB Falcon с прозрачным плоским дном (DB Biosciences - Labware, NJ, США) в 100 мкл культуральной среды и давали возможность прикрепиться в течение ночи. Лекарственное средство добавляли к клеткам (разведенное в 100 мкл культуральной среды) с целью получения желаемой концентрации. Клетки инкубировали с лекарственным средством в темноте при 37°С в течение данного периода времени. Этот период инкубации обычно называют интервалом лекарство-свет. После инкубации клетки промывали один раз 200 мкл PBS для удаления непоглощенного лекарственного средства и добавляли 100 мкл свежей культуральной среды. Клетки облучали (каждую лунку индивидуально) светом 748 нм диодного лазера Lynx, описанного выше, при мощности 100,7 мВт/см. Время облучения было выбрано с целью получения желаемой дозы облучения. Тестировали два параллельных контрольных условия: клетки инкубировали в темноте с самой высокой дозой лекарственного средства и не облучали, и клетки облучали самой высокой дозой облучения без лекарственного средства. После облучения добавляли 100 мкл свежей культуральной среды. Выживаемость клеток оценивали примерно через 24 ч после облучения.
II.D.6. Эксперименты in vivo
В настоящем исследовании применяли мышей из двух источников. В исследованиях темновой токсичности, перераспределения и фармакокинетики применяли мышей линии DBA/2 массой 20-30 г из питомника при факультете биохимии, биофизики и биотехнологии Ягеллонского университета, Краков. Мышей содержали на стандартном лабораторном рационе при свободном доступе к питьевой воде. Применение таких животных в экспериментальных целях было одобрено Комитетом по этике экспериментов на животных Ягеллонского университета (заключение №384/99). Таких мышей также применяли в ФДТ.
Другие мыши представляли собой мышей линии Balb/C массой 20-25 г из питомника Charles River Laboratories (Барселона). Мышей содержали на стандартном лабораторном рационе при свободном доступе к питьевой воде. Применение таких животных в экспериментальных целях было одобрено Комитетом Центра неврологии и клеточной биологии (Коимбра).
2
Четыре карликовые свиньи были получены из IMIDRA (Institute Madrileno de Investigation у Desarrollo Rural, Agrario у Alimentario) - Аранхуэс (Мадрид). Все они представляли собой самок в возрасте 6-8 месяцев, белых с коричневыми пятнами, средняя масса 56,8 кг (66,2, 57,1, 43,5, 60,6 кг). Они были получены в Estacao Zootecnica Nacional, Vale de Santarem, где их размещали в индивидуальных боксах 1,5 м, кормили стандартным рационом для свиней и давали свободный доступ к воде в течение периода акклиматизации три недели. Исследование проводили в соответствии с этическим руководством Португалии по лицензии, выданной Direccao de Servicos de Saiide e Proteccao Animal, ref. 0420/000/000/2007. Доступ к пище прекращали за 24 ч до обработки. Спины животных брили за 24 ч перед нанесением препаратов. Местное введение фотосенсибилизаторов осуществляли под анестезией. Премедикация, применяемая за 30 мин предварительно, представляла собой: азаперон (Stresnil - Veterinaria ESTEVE - Испания), внутримышечная инъекция 2 мг/кг + атропина сульфат, 50 мг подкожно. Индукцию осуществляли кетамином (Clorketam - Vetoquinol, Франция), 20 мг/кг, внутримышечная инъекция. Анестезию поддерживали эндотрахеальной интубацией, применяя спонтанную вентиляцию 2-3 л/мин кислорода + 3% изофлуран (Isoflo - Veterinaria ESTEVE, Испания). Образцы собирали от 3 карликовых свиней под анестезией, описанной выше. Аликвоты кожи размером 20×20×10 (длина, ширина, глубина) получали с помощью хирургического надреза. После сбора образцов кожи животных умерщвляли передозировкой тиопентала натрия (25 мг/кг) + 20 мл 7,5% хлорида калия. Четвертую карликовую свинью наблюдали до 3 недель при кормлении стандартным рационом для свиней и свободном доступе к воде. После 3 недель местное введение фотосенсибилизаторов осуществляли снова под анестезией. Животное приводили в бессознательное состояние электрошоком и умерщвляли вскрытием яремной вены.
II.Е. Свойства соединений
II.Е.1. Физические свойства
Как упомянуто в описании предшествующего уровня техники, важнейшими физическими и химическими свойствами лекарственных средств, релевантных для ФДТ, являются сильное поглощение в диапазоне 600-800 нм, высокая эффективность генерации синглетного кислорода, химическая стабильность, контролируемое фотообесцвечивание и коэффициенты распределения октанол:вода от -2 до 5. Эти свойства соответствуют желаемому поглощению света в фототерапевтическом окне, эффективной фотогенерации цитотоксических форм, сниженному побочному эффекту, такому как пролонгированная фоточувствительность кожи, и облегчают системный или чрескожный пути введения.
max
max
F
Поглощающую способность соединений измеряли при нескольких концентрациях от 1 до 20 мкМ, и во всех случаях наблюдали, что она соответствует закону Бера-Ламберта. Кроме того, длина волны максимума поглощения (λ) в инфракрасной области не варьирует в исследованном диапазоне концентраций. Это является показателем малой агрегации между молекулами, которые существуют, главным образом, в виде мономеров при этих концентрациях в исследованных растворителях. В таблице 1 представлены типичные молярные коэффициенты поглощения в красной и инфракрасной областях (ε) и максимумы длины волны. В той же таблице также представлены репрезентативные квантовые выходы поглощения (Ф) Luzitin-ов. Снижение квантовых выходов флуоресценции этих молекул уменьшается в присутствии заместителей, представляющих собой атомы хлора, характерный признак эффекта тяжелого атома, ожидаемого для таких молекул.
2
T
Спектры триплет-триплетного поглощения Luzitin-ов, измеренные в данной работе, хорошо согласовались с данными, описанными в литературе для хлоринов и бактериохлоринов. Все распады триплетов были явно моноэкспоненциальными. В деаэрированных растворах, полученных путем продувания N в течение по меньшей мере 30 мин, время жизни триплетов (T) находится в миллисекундном диапазоне, демонстрируя неэффективную фотохимию в отсутствие кислорода. Репрезентативные значения приведены в таблице 1. В этаноле, насыщенном воздухом, время жизни триплетов падало до 200-300 наносекунд, что значительно короче, чем время жизни для соответствующих порфиринов. Такие значения согласуются с ограниченным диффузией переносом энергии с триплетного состояния сенсибилизатора на молекулярный кислород посредством взаимодействия с переносом заряда.
Δ
Δ
Все испускания синглетного кислорода, измеренные в аэрированных растворах этанола, очень хорошо описываются моноэкспоненциальными распадами с типичным временем жизни синглетного кислорода (T). Значения Ф таблицы 1 были получены с помощью способов, описанных выше, и являются репрезентативными для этих фотосенсибилизаторов.
Таблица 1
Квантовые выходы флуоресценции, время жизни триплетов, квантовые выходы синглетного кислорода и время жизни синглетного кислорода репрезентативных фотосенсибилизаторов в растворах этанола, насыщенных воздухом
λ<sub>max </sub>(нм)
ε<sub>max </sub>(М<sup>-1</sup> см<sup>-1</sup>)
Ф<sub>F</sub>
T<sub>T </sub>(воздух) (нс)
Ф<sub>Δ</sub>
T<sub>Δ</sub> (мкс)
Фотофрин
630
3200
400<sup>a)</sup>
<sup>b)</sup>
10,6<sup>a)</sup>
Luzitin-Cl-c<sup>c)</sup>
650
7000
0,039
-
0,69
-
Luzitin-Cl
746,5
23000<sup>d)</sup>
0,0403
240
0,43
13,6
Luzitin-Cl<sub>2</sub>
745,0
27000<sup>d)</sup>
0,0062
226
0,85
15,4
Luzitin-FMet
742,5
62000<sup>d)</sup>
0,0589
-
0,71
14,1
Luzitin-F<sub>2</sub>Met
742,5
78000<sup>d)</sup>
-
-
-
-
Luzitin-Cl<sub>2</sub>Et
745,5
96000
0,0081
265
0,66
13,7
Luzitin-Cl<sub>2</sub>Hep
746
75000
0,0082
295
0,63
14,3
Luzitin-FMet<sub>2</sub>
742,5
78000<sup>d)</sup>
0,0585
-
-
-
Фоскан
650
29600<sup>e)</sup>
0,089<sup>f)</sup>
0,43<sup>f)</sup>
<sup>а)</sup> [41]. <sup>b)</sup> Мономерные звенья HpD имеют Ф<sub>Δ</sub>=0,64 в метаноле, но в воде он, в основном, присутствует в форме димеров с Ф<sub>Δ</sub>=0,11 [42]. <sup>с)</sup> В водном растворе. <sup>d)</sup> Скорректировано на содержание хлорина. <sup>d)</sup> [43]. <sup>е)</sup> В метаноле, но падает до половины этого значения при 65% воды в метаноле [44]. <sup>f)</sup> В метаноле [45].
Типично сумма флуоресценции и квантовых выходов синглетного кислорода Luzitin-ов составляет 0,6-0,8, и от 20 до 40% поглощенного света используется для других процессов. Эти процессы были исследованы фотоакустической калориметрией с временным разрешением (РАС) и электронным парамагнитным резонансом (ЭПР). РАС измеряет количество энергии, высвобожденной неизлучающими процессами (внутренней конверсией, кросс-релаксацией, химическими реакциями) при распаде электронно-возбужденных состояний. ЭПР измеряет количество форм с неспаренными электронами (свободных радикалов), присутствующих в образце, и его применяли здесь при прямом лазерном облучении для измерения фотоинициированной генерации супероксидного иона, гидроксильного радикала и других активных форм кислорода (АФК). Высвобождение энергии, измеренное с помощью РАС, соответствует образованию триплетных состояний бактериохлорина с почти единичными квантовыми выходами и триплетными энергиями 105-125 кДж/моль, что согласуется с литературными данными по галогенированным бактериохлоринам [12]. Спектры ЭПР, снятые во время облучения Luzitin-ов в PBS и в присутствии ДМПО и БМПО, выявили присутствие супероксидного иона и гидроксильного радикала. Взятые вместе данные ЭПР и РАС однозначно показывают, что облучение этих фотосенсибилизаторов при 748 нм приводит к образованию супероксидного иона и, следовательно, гидроксильного радикала, которое вносит вклад в фототоксичность Luzitin-ов. Таким образом, фототоксичность сенсибилизаторов выше, чем предполагали на основании их квантовых выходов синглетного кислорода, которые уже в 5 раз выше, чем у Фотофрина.
1/2
Химическую стабильность соединений исследовали, подвергая их воздействию света, воздуха и изменений рН. Наиболее значительное разложение происходит для аэрированных растворов, облученных светом соответствующей длины волны. В таких условиях фотообесцвечивание соединений следует скорости первого порядка и пропорционально энергии падающего лазерного света. Как правило, также наблюдали, что скорость фотообесцвечивания возрастает с количеством воды, присутствующей в растворе. Bonnett сообщил о фотоконверсии Фоскана (m-THPC) и аналогичного бактериохлорина (m-THPB) в РВ8:метаноле (50:50) [46]. Scherz сообщил о фотоконверсии Tookad в ацетоне и Тритон-Х:РВ8 [3]. В целях сравнения фотостабильности Luzitin-ов с фотостабильностью Фоскана и Tookad авторы изобретения представили в таблице 2 время полужизни (t) репрезентативных лекарственных средств, описанных в данной заявке, вместе со временем полужизни Фоскана и Tookad, нормализованным для мощности лазера 100 мВт.
Таблица 2
Время полужизни бактериохлоринов при лазерном облучении 100 мВт при 748 нм и их коэффициенты распределения н-октанол:вода (K<sub>OW</sub>)
Лекарственное средство
Растворитель
t<sub>1/2</sub> (с)
log K<sub>OW</sub>
Tookad<sup>a)</sup>
Сурфактант:PBS
1,56
Luzitin-F
PBS
58
-
Luzitin-Cl
PBS
174
-1,70
Luzitin-Cl<sub>2</sub>
PBS
358
-1,75
Luzitin-FMet
PBS:метанол
647
2,3
метанол
3,553
Luzitin-FMet<sub>2</sub>
PBS:метанол
6,480
2,7
Luzitin-Cl<sub>2</sub>Et
PBS:метанол
4,013
1,8
Luzitin-FMet<sub>2</sub>
метанол
4,352
>4
Фоскан<sup>b)</sup>
PBS:метанол
8,582
Luzitin-Cl<sub>2</sub>Hep
метанол
164,105
>4
<sup>a)</sup> [3]. <sup>b)</sup> [46].
Авторы изобретения отличают фотообесцвечивание полученных ими бактериохлоринов от фотоконверсии m-THPB или Tookad. Это различие основано на том факте, что после пролонгированного лазерного облучения большая часть бактериохлоринов, полученных авторами изобретения, преобразуется в продукты, которые не обладают обнаружимым поглощением видимого света, что может быть, соответственно, описано как фотообесцвечивание. С другой стороны, лазерное облучение m-ТНРВ или Tookad продуцирует большие количества соответствующих хлоринов, которые не поглощают такое же лазерное излучение, и это более пригодно описывать как фотоконверсию в другой краситель. Фотообесцвечивание бактериохлоринов авторов изобретения является предпочтительным, поскольку оно приводит к меньшей кожной фоточувствительности, в противоположность фотоконверсии в другой краситель.
II.E.1. Биологические свойства
dark50
dark50
50
50
50
50
dark50
dark50
50
50
90
2
2
2
2
Фотофрин обеспечивает важные ориентировочные показатели для темновой токсичности и эффективности ФДТ in vitro. Токсичность Фотофрина в темноте в отношении клеточной линии немелкоклеточного рака легкого Н1299 оценивали для нескольких концентраций Фотофрина, и выживаемость клеток снижалась до 50% для IC=8 мкг/мл [47]. Подобное исследование по темновой токсичности Фотофрина в отношении Colo-26, клеточной линии карциномы ободочной кишки мыши, дало IC=20 мкг/мл (30 мкМ, учитывая мономер) [48]. Клеточная линия аденокарциномы человека (НТ29) является одной из наиболее широко исследованных клеточных линий при ФДТ. Исследования зависимости от концентрации Фотофрина на клетках НТ29 дали летальную дозу 50% уничтожения при 5 Дж/см фильтруемого галогенового света IC=7,5 мкг/мл. Для 90% уничтожения концентрация повышается до IC=40 мкг/мл [49]. Для той же клеточной линии Фоскан является значительно более фототоксичными при IC=0,8 мкг/мл, когда применяют лазер на красителе при 650 нм для подачи 10 Дж/см; однако, для данной дозы облучения IC составляет более 10 мкг/мл и попадает в пределы его темновой токсичности, IC=13 мкг/мл [50]. В противоположность Фотофрину молекулярная композиция Фоскана известна и более удобна для выражения его значений IC в молярных единицах. В этих единицах темновая цитотоксичность Фоскана составляет IC=19 мкМ, а токсичность для дозы облучения 10 Дж/см составляет IC=1,2 мкМ. Наконец, интересно сослаться на то, что Tookad вызывает 50% гибели в клетках НТ29 для дозы 48 мкМ при облучении 25 Дж/см (патент US 2003/6569846). Хотя значения IC и IC зависят от режимов введения, времени инкубации, плотностей светового потока и других деталей экспериментов, значения, приведенные выше, являются показателями хорошей практики в данной области техники.
2
В таблице 3 сравнена темновая токсичность Фотофрина и Фоскана с токсичностью Luzitin-ов. Применяя способы, описанные выше и дополнительно подробно описанные в приведенных ниже примерах, дозы облучения, необходимые для уничтожения 50% и 90% нескольких клеточных линий при фильтруемом галогеновом свете в присутствии галогенированного и сульфонированного хлорина, представлены в таблице 4, и соответствующие значения галогенированного и сульфонированного бактериохлорина представлены в таблице 5. В таблице 6 представлена фототоксичность в виде концентрации различных Luzitin-ов, необходимой для уничтожения 90% клеток при дозе лазерного облучения 6 Дж/см.
Таблица 3
Темновая токсичность фотосенсибилизаторов в раковых клеточных линиях человека и мыши
Клеточная линия
Время инкубации (ч)
Фотофрин IC<sub>50 </sub>(мкг/мл)
Фоскан IC<sub>50 </sub>(мкМ)
Luzitin-Cl<sup>a)</sup> IC<sub>50 </sub>(мкМ)
Н1299
8.0
-
НТ-29
48
-
19
500
SW2
48
-
-
400
РС-3
72
-
-
600
S91I3
40
-
-
500
<sup>а)</sup> Клетки инкубировали в течение двукратных периодов удвоения популяции в полной культуральной среде, в темноте, в присутствии варьирующих концентраций фотосенсибилизатора.
Таблица 4
Дозы облучения в Дж/см<sup>2</sup>, необходимые для уничтожения 50% и 90% клеток в указанных клеточных линиях, для [Luzitin-Cl-c]=20 мкМ (≈20 мкг/мл) при фильтруемом облучении галогеновой лампой
Клеточная линия
S91
SKMEL 188
MCF7
LD<sub>50</sub>
0,13
0,26
0,3
LD<sub>90</sub>
0,26
0,46
0,7
Таблица 5
Дозы облучения в Дж/см<sup>2</sup>, необходимые для уничтожения 50% и 90% клеток в указанных клеточных линиях, для [Luzitin-Cl]=20 мкМ (≈20 мкг/мл) при фильтруемом облучении галогеновой лампой
Клеточная линия
S91
SKMEL 188
MCF7
LD<sub>50</sub>
0,15
0,1
0,08
LD<sub>90</sub>
0,3
0,32
0,25
Таблица 6
Концентрация сенсибилизатора в мкМ, необходимая для уничтожения 90% клеток клеточных линий карциномы простаты человека (РС-3), аденокарциномы человека (НТ-29), немелкоклеточного рака легкого человека (А-549), меланомы мыши (S91I3) и карциномы ободочной кишки мыши (СТ26) при 6 Дж/см<sup>2</sup> облучения диодным лазером при 28,5 мВт
Фотосенсибилизатор
PC-3
НТ-29
A-549
S9113
СТ26
Luzitin-CL
20
50
-
40
-
Luzitin-Cl<sub>2</sub>Et
5
10
10
-
5
Luzitin-FMet
0,5
0,5
0,5
-
1,0
Luzitin-F<sub>2</sub>Met
0,5
-
0,5
-
1,0
2
В таблицах 4-6 показана низкая темновая токсичность Luzitin-ов и их очень высокая фототоксичность. В таблице 6 показано, что концентрации Luzitin, необходимые для уничтожения 90% клеток различных клеточных линий, вплоть до в 100 раз меньше, чем необходимые для Фотофрина, и вплоть до в 20 раз меньше, чем необходимые для Фоскана. При дозе лазерного облучения 6 Дж/см (60 секунд облучения в условиях экспериментов авторов изобретения) было возможно уничтожить 100% клеток любых из исследованных клеточных линий при концентрациях Luzitin пренебрежимо малой цитотоксичности в темноте.
II.F. Способы применения соединений и композиций
Luzitin можно вводить в местном, пероральном, внутривенном, подкожном, внутрибрюшинном, ректальном, подъязычном, назальном, глазном, ушном или ингаляционном препарате в зависимости от клинической ситуации. Фармацевтический препарат приспосабливают к выбранному пути введения. Препараты включают, кроме Luzitin-ов (индивидуально или в комбинации друг с другом), фармацевтически приемлемый носитель. Luzitin можно преобразовать в виде соответствующих солей, сложных эфиров, энольного эфира или сложных эфиров, ацеталей, кеталей, ортоэфиров, полуацеталей, полукеталей, кислот, оснований, сольватов, гидратов или пролекарств перед включением в препарат.
2
2
2
После местного или системного введения, либо обоих введений обработанную область подвергают воздействию света соответствующей длины волны, предпочтительно от 630 до 690 нм для хлоринов или от 720 до 780 нм для бактериохлоринов, и наиболее предпочтительно с применением лазера. Способы облучения различных областей тела хорошо известны в данной области техники. Интервал лекарство-свет может находиться в диапазоне от нескольких минут до нескольких суток в зависимости от пути введения. Доза облучения зависит от пути введения, источника света и терапевтической мишени. Для непрерывного лазерного облучения доза облучения должна составлять от 10 до 250 Дж/см при мощности лазера от 20 до 200 мВт/см. Возможно также применять импульсное лазерное излучение с дозами на импульс от 0,001 до 10 мДж/см. Дозу облучения можно применять в течение одного или нескольких сеансов. Для диагностических целей доза облучения может быть снижена. Когда при облучении применяют широкополосные источники излучения, дозы облучения повышают для поддержания энергии источника света в спектральных областях, где Luzitin поглощает, на уровне, предписанном для лазерного излучения.
Luzitin-ы можно вводить сразу или можно делить на число меньших доз для введения через интервалы времени. Luzitin-ы можно вводить в сочетании с другими лекарственными средствами для получения синергических эффектов. Дозы облучения, применяемого после интервала лекарство-свет, попадают в диапазоны, приведенные выше для однократной дозы. Лечение можно повторять несколько раз через различные интервалы времени. Понятно, что точная дозировка и продолжительность лечения зависит от заболевания, подлежащего лечению, и может быть определена эмпирическим путем с применением протоколов, известных в данной области техники.
II.F.1. Системное введение (пероральное, инъекционное, аэрозольное, ректальное)
OW
Общим ограничением, связанным с пероральным введением, является предполагаемое расщепление лекарственного средства в кислых условиях, имеющихся в желудке. Как показано в приведенном ниже примере, Luzitin-ы относительно стабильны при рН 1 в течение 3 часов. Спектральные изменения, наблюдаемые при низком рН, являются следствием протонирования пиррольного кольца, но являются обратимыми при нейтрализации кислотности. Другая трудность, часто встречающаяся при пероральном введении, состоит в биодоступности. Возможно получить Luzitin-ы, которые близки к соответствию правилу пяти Липински [51] для кишечного всасывания. Luzitin-ы могут иметь log K менее 5, 4 донора водородной связи, 12 акцепторов водородной связи и молекулярную массу 1 кДа. Только этот последний параметр значительно превышает пределы вышеупомянутого правила.
Учитывая физико-химические свойства Luzitin-ов, можно рассматривать как твердые и полутвердые, так и жидкие лекарственные формы. В этом аспекте следует рассматривать уровень техники в отношении фармацевтических адъювантов для различных фармацевтических лекарственных форм и путей введения.
Предпочтительный интервал лекарство-свет при системном введении может находиться в диапазоне от нескольких минут до 3 суток в зависимости от режима введения. Фармацевтические композиции должны обеспечивать дозировку от 0,01 мг до 100 мг Luzitin (или комбинации Luzitin-ов) на килограмм массы тела в сутки. Предпочтительная суточная доза Luzitin-ов составляет от 0,1 до 10 мг на килограмм массы тела.
II.F.2. Местное введение
Местное введение может быть достигнуто соответствующими препаратами, содержащими одно вещество или различные вещества, способствующие проникновению через поверхность, и другие эксципиенты в форме жидкости, геля, гидрогеля, крема, мазей, спреев или любого другого приемлемого дерматологического препарата. Как упомянуто в предшествующем уровне техники, проникновение через кожу, достигнутое для Фотофрина или других фотосенсибилизаторов большой молекулярной массы, недостаточно для эффективной ФДТ кожных расстройств. Luzitin-ы также не соответствуют большинству критериев для хорошей чрескожной доставки [32]. Однако наша способность к модулированию амфифильности и способности к водородному связыванию этих соединений и до некоторой степени их молекулярной массы упрощает задачу нахождения препаратов, которые способствуют их пассивной диффузии в дерму. Показано, что препарат в виде геля, представленный в Примере 21, обеспечивает быструю и эффективную местную доставку в дерму.
Предпочтительный интервал лекарство-свет при местном введении составляет от 15 мин до 3 ч. Препарат должен содержать от 0,01 до 10% Luzitin. В предпочтительном воплощении процент сенсибилизатора в препарате составляет от 0,1 до 1%.
Местное введение также предусматривает применение на глазу. Препараты, предназначенные для глазного применения, можно готовить в виде 0,01%-0% изотонических растворов, рН 5-7, с соответствующими солями.
Теперь данное изобретение будет описано более подробно в приведенных ниже, не ограничивающих Примерах со ссылкой на графические материалы, в которых:
Фиг.1. Спектральная плотность излучения 500 Вт галогеновой лампы с фильтром с отсечением 600 нм и инфракрасный спектр поглощения хлорина (точечная линия) и бактериохлорина (пунктирная линия).
Фиг.2. Спектр поглощения Luzitin-FMet-c, полученного в результате восстановления соответствующего порфирина путем синтеза, характеризующегося полным отсутствием органического растворителя и оснований.
2
Фиг.3. Спектр поглощения Luzitin-ClEt, полученного в результате восстановления соответствующего порфирина путем синтеза, характеризующегося полным отсутствием органического растворителя и оснований.
3
4
2
max
-1
-1
Фиг.4. Спектр поглощения фракции большей полярности (βα+α) атропоизомеров Luzitin-ClEt, иллюстрирующий повышенную поглощающую способность в инфракрасной области, оцениваемую как достигающая ε=150000 М см при 748 нм.
2
Фиг.5. Спектр поглощения Luzitin-Cl в нейтральном водном растворе (сплошная линия), после 2 часов при рН 1 (пунктирная линия) и после нейтрализации (пунктирная линия). Спектры были скорректированы на эффект разведения, полученный в результате добавления по каплям HCl и NaOH в водный раствор.
Фиг.6. Спектры поглощения Luzitin-FMet в PBS:метаноле (3:2) до (слева) и после (справа) 65 мин облучения диодным лазером 748 нм Lynx при 28,8 мВт (110 Дж), иллюстрирующие контролируемое фотообесцвечивание.
2
Фиг.7. Интенсивность фосфоресценции синглетного кислорода, полученная при 1270 нм после возбуждения при 355 нм Luzitin-ClHep или феналенона в этаноле, насыщенном воздухом. Наклон кривой зависимости фосфоресценции от интенсивности лазера применяли для определения квантового выхода синглетного кислорода сенсибилизатора.
Фиг.8. Спектры ЭПР, полученные в присутствии 80 мкМ Luzitin-Cl при облучении. Слева: с 40 мМ БМПО в PBS спектр соответствует спектру спинового аддукта БМПО с гидроксильным радикалом. Справа: с 40 мМ ДМПО в ДМСО спектр соответствует спектру спинового аддукта ДМПО с супероксидным ионом.
Фиг.9. Доля выживших клеток S91 (процент) для различных доз облучения в присутствии [Luzitin-Cl-c]=20 мкМ. Непоглощенный фотосенсибилизатор не удаляли перед облучением. Вкладка: Цитотоксичность в темноте Luzitin-Cl-c в отношении клеток клеточной линии S91 при различных концентрациях сенсибилизатора.
2
Фиг.10. Доля выживаемости клеток MCF7 (процент) для различных доз облучения в присутствии [Luzitin-Cl]=5 мкМ после 12 ч периода инкубации. Непоглощенный фотосенсибилизатор удаляли перед облучением. Вкладка: цитотоксичность в темноте Luzitin-Cl в отношении клеток клеточной линии MCF при различных концентрациях сенсибилизатора. Эффективная сила света составляет 0,53 мВт/см.
2
2
Фиг.11. Фототоксический эффект Luzitin-Cl в клеточной линии рака простаты РС-3 после интервала лекарство-свет 24 часа. Клетки в культуральной среде облучали лазерным излучением 748 нм в течение 30 или 60 секунд, что соответствует дозам облучения 3 и 6 Дж/см, соответственно.
2
2
Фиг.12. Процент выживаемости клеток относительно контроля для различных концентраций Luzitin-ClEt в клеточных линиях карциномы ободочной кишки мыши после интервала лекарство-свет 18 часов. Непоглощенный фотосенсибилизатор удаляли перед облучением. Клетки в культуральной среде облучали лазерным излучением 748 нм в течение 60 секунд, что соответствует дозе облучения 6 Дж/см.
2
Фиг.13. Процент выживаемости клеток относительно контроля для различных концентраций Luzitin-FMet в клеточных линиях аденокарциномы человека после периода инкубации 18 часов. Непоглощенный фотосенсибилизатор удаляли перед облучением. Клетки в культуральной среде облучали лазерным излучением 748 нм в течение 60 секунд, что соответствует дозе облучения 6 Дж/см.
2
2
Фиг.14. Процент выживаемости клеток относительно контроля для различных концентраций Luzitin-FMet в линиях немелкоклеточного рака легкого человека после периода инкубации 18 часов. Непоглощенный фотосенсибилизатор удаляли перед облучением. Клетки в культуральной среде облучали лазерным излучением 748 нм в течение 60 секунд, что соответствует дозе облучения 6 Дж/см.
2
Фиг.15. Флуоресценция Luzitin-ClEt при концентрациях в сыворотке человека 3,26 нМ (сплошная линия) и 0,26 нМ (пунктирная линия), применяемая для определения предела ее обнаружения. Также показан ее базовый уровень (пунктирно-точечная линия) и кривая Гаусса (точечная линия), применяемые для имитации самой низкой концентрации для более точного определения флуоресценции низкой интенсивности.
Фиг.16. Флуоресценция Luzitin-Cl-c, деленная на массу печени, крови и головного мозга, соответственно, в порядке интенсивности, после внутрибрюшинного введения 10 мг/кг мышам линии DBA/2.
Фиг.17. Фармакокинетика и биораспределение Luzitin-Cl после внутрибрюшинного введения 10 мг/кг мышам линии DBA/2. Интенсивность флуоресценции в различных тканях (крови, опухоли, сердце, легких, селезенке, печени, почках, кишечнике, мышце, коже) нормализовали по их соответствующим массам.
2
Фиг.18. Флуоресценция Luzitin-ClEt, деленная на массу опухоли и крови, соответственно, в порядке интенсивности, после внутрибрюшинного введения 10 мг/кг мышам линии DBA/2.
2
Фиг.19. Объем опухолей у мышей линии Balb/C с имплантированными опухолями СТ26, обработанных Luzitin-FMet. Толстой линией представлены средние размеры опухолей у четырех контрольных животных, которым вводили Luzitin-FMet, но не облучали. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения. Тонкими линиями представлены индивидуальные животные, обработанные Luzitin-FMet и 132 Дж/см лазерного излучения при 748 нм.
2
Фиг.20. Размер имплантированных опухолей S91 у мышей линии DBA/2, обработанных Luzitin-ClEt. Применяли две дозы лазерного облучения 748 нм.
Фиг.21. Конфокальная флуоресценция Luzitin-FMet через 3 ч после местного нанесения на спину карликовой свиньи. Многофотонное возбуждение при 744 нм; полная элиминация фона; плоскостные изображения флуоресценции, собранные из 6 изображений; 800 В @ детектор; точечная диафрагма=379 мкм. Фотосенсибилизатор диффундировал через 50 микрон рогового слоя и эпидермиса.
Фиг.22. Спектры поглощения Luzitin-FMet через 3 ч после местного нанесения на спину карликовой свиньи, полученные с помощью конфокальной спектроскопии. Различные линии соответствуют измерениям в различных частях образца.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА БАКТЕРИОХЛОРИНОВ С ЭЛЕКТРОНОАКЦЕПТОРНЫМИ ЗАМЕСТИТЕЛЯМИ
Данный пример иллюстрирует широкий спектр бактериохлоринов, которые могут быть синтезированы способом, отличающимся отсутствием растворителя и основания, следовательно, где только порфирин и гидразид (оба в твердом состоянии) применяют в качестве исходных веществ.
-5
-3
-3
2
3
При одном получении авторы изобретения смешивали 60 мг (6,8×10моль) 5,10,15,20-тетракис(2-трифторметилфенил)порсририна с 500 мг (2,7×10моль) пара-толуолсульфонилгидразида, оба в виде очень тонкоизмельченных порошков. Их добавляли в реактор, который был вакуумирован, герметично закрывали в атмосфере N и нагревали до температуры выше 100°С в течение нескольких минут. После охлаждения (комнатная температура) твердое вещество удаляли и добавляли несколькими порциями 250 мг пара-толуолсульфонилгидразида (1,4×10 моль) до полного исчезновения полосы Сорэ порфирина. Бактериохлорин экстрагировали малым количеством органического растворителя. Избыток гидразида удаляли кратковременным фильтрованием на силикагеле (высота колонки 8 см; внутренний диаметр колонки 2,5 см), применяя дихлорметан/н-гексан в качестве элюента. После выпаривания растворителя и перекристаллизации из диэтилового эфира/пентана было получено 90% CFPhB с менее чем 5% загрязнением хлорином. ЯМР выделенного продукта представляет собой:
1
-1
3
ЯМР H (400,13 МГц, CDCl) δ, млн: 7,47-7,45 (m, 4H): 7,26-7,20 (m, 8H); 7,15-7,12 (m, 4H); 2,42 (s, 4H); 2,37 (s, 4H); -1,27 (s, 2H).
ПРИМЕР 2. СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ ХЛОРИНОВ
-5
-5
2
При одном получении 5,10,15,20-тетракис(2-фторфенил-5-N-метилсульфамоилфенил)хлорина, Luzitin-FMet-c, авторы изобретения смешивали 50 мг (4,72×10 моль) 5,10,15,20-тетракис(2-фторфенил-5-N-метилсульфамоилфенил)порфирина с 18 мг (9,44×10 моль) пара-толуолсульфонилгидразида. Реактор вакуумировали, герметично закрывали в атмосфере N и нагревали при температуре выше 100°С в течение нескольких минут. После охлаждения (комнатная температура) твердое вещество извлекали небольшим количеством органического растворителя, и избыток гидразида удаляли кратковременным фильтрованием на силикагеле, применяя этилацетат/гексан в качестве элюента. Была получена смесь хлорина, загрязненного примерно 10% бактериохлорина. Эту смесь хлорина и бактериохлорина растворяли в дихлорметане и окисляли до соответствующего хлорина нагреванием при 50°С в присутствии воздуха.
После перекристаллизации из диэтилового эфира/пентана было получено 90% Luzitin-FMet-c менее чем с 1% загрязнения бактериохлорином. На фиг.2 показан спектр поглощения конечного продукта.
ПРИМЕР 3. СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ БАКТЕРИОХЛОРИНОВ
В данном примере описан четкий, простой, экономичный способ синтеза, благоприятный для окружающей среды, включающий однореакторный синтез без растворителя галогенированных амфифильных бактериохлоринов.
Соответствующий порфирин (твердый) и пара-толуолсульфонилгидразид (твердый) измельчают до очень тонкоизмельченных порошков и тщательно смешивают. Затем их вводят в реактор и вакуумируют до высокого вакуума. Затем реактор герметично закрывают и держат под вакуумом или многократно промывают инертным газом. Наконец, реактор нагревают (70-200°С) в течение 1-340 мин в герметично закрытом виде. Как только реакция завершена, и реактор доведен до комнатной температуры, получают соответствующий бактериохлорин при выходе 90%. После кратковременного фильтрования на колонке силикагеля получают бактериохлорин с загрязнением менее 5% соответствующего хлорина.
2
2
-5
-3
При одном получении 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-N-этилсульфамоилфенил)бактериохлорина, Luzitin-ClEt, данным способом авторы изобретения смешивали 50 мг (3,8×10 моль) 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-сульфоэтилфенил)порфирина с 188 мг (10 моль) пара-толуолсульфонилгидразида, вакуумировали реактор насосом Edwards, герметично закрывали, а затем нагревали реактор до температуры более 70°С в течение нескольких минут. После охлаждения (комнатная температура) твердое вещество извлекали небольшим количеством диэтилового эфира, и избыток гидразида удаляли кратковременным фильтрованием на силикагеле (высота колонки 4 см; внутренний диаметр колонки 2,5 см), применяя этилацетат/диэтиловый эфир в качестве элюента. После выпаривания растворителя полученное в результате твердое вещество перекристаллизуют из диэтилового эфира/пентана с получением Luzitin-ClEt при выходе 90%. Спектр поглощения на фиг.3 выявляет присутствие менее чем 5% соответствующего хлорина. Молярный коэффициент поглощения этого и других бактериохлоринов представлен в таблице 1, скорректированный на количество хлорина, иногда присутствующего в образцах. Сравнение между спектрами фиг.3 ниже и спектрами фиг.2 в патенте РСТ/ЕР 2005/012212, также от Университета Коимбра, выявляет, что примесь хлорина уменьшена по меньшей мере в 10 раз в результате этого нового способа синтеза, который также является более экономичным, менее трудоемким и благоприятным для окружающей среды. ЯМР и МС (масс-спектрометрия) выделенного продукта приведены ниже:
1
-1
+
3
2
3
ЯМР Н: (300 МГц, CDCl) δ, млн: 8,42 (d, J=8,55 Гц, 4Н, р-Н); 7,88 (d, J=8,55 Гц, 4Н, m-H); 7,84-7,82 (m, 4Н, β-Н); 5,01 (m, 4Н, N-H); 3,91 (s, 8H, β-Н); 3,22 (m, 8H, CH); 1,24 (t, 12H, J=6,73 Гц, СН); -1,29 (s, 2Н, NH). МС: (MALDI-TOF), m/z (отношение массы к заряду): 1322,0 [M].
ПРИМЕР 4. АТРОПОИЗОМЕРЫ В ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ БАКТЕРИОХЛОРИНАХ
Данный пример показывает, что стабильные атропоизомеры существуют в галогенированных и сульфонированных бактериохлоринах, и что их можно легко разделить. Он также показывает, что атропоизомеры с более высокой полярностью имеют более высокий коэффициент экстинкции в инфракрасной области.
2
2
2
3
4
-1
-1
Применяя способ, описанный в примере 3, но применяя колонку большего размера (высота колонки 8 см; внутренний диаметр колонки 2,5 см) с этилацетатом/н-гексаном (1:1) в качестве первого элюента и этилацетатом/н-гексаном (3:1) в качестве последнего элюента, авторы изобретения наблюдали разделение 5,10,15,20-тетракис(2,6-дихлор-3-N-этилсульфамоилфенил)бактериохлорина, Luzitin-ClEt, на две фракции. Каждая фракция показала два пятна на ТСХ (тонкослойная хроматография), которые были идентифицированы как смесь атропоизомеров меньшей полярности αβαβ+αβ или атропоизомеров большей полярности βα+α. На фиг.4 показан спектр поглощения смеси атропоизомеров с более высокой полярностью. Эта фракция проявляет 50% усиление ε при полосе 750 нм, которое достигает 150000 M см.
ПРИМЕР 5. рН СТАБИЛЬНОСТЬ ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ И СУЛЬФОНИРОВАННЫХ БАКТЕРИОХЛОРИНОВ
Данный пример демонстрирует стабильность галогенированных и сульфонированных бактериохлоринов при рН 1 и 37°С, то есть при кислотности, имеющейся в желудке.
2
2
2
Luzitin-Cl растворяли в нейтральном водном растворе и уравновешивали до 37°С для получения спектра поглощения, представленного на фиг.5. HCl в водном растворе добавляли по каплям, чтобы снизить рН до 1, и через 2 часа регистрировали спектр поглощения Luzitin-Cl при рН 1. Затем добавляли водный раствор NaOH для нейтрализации раствора и регистрировали новый спектр поглощения через 3 часа. На фиг.5 показаны спектры поглощения, скорректированные на разведение, полученное за счет добавления HCl и NaOH в водный раствор. Спектральные изменения, наблюдаемые при низком рН, являются следствием протонирования пиррольного кольца, но являются обратимыми, когда кислотность нейтрализуется. В этих условиях почти половина Luzitin-Cl возвращается в исходное состояние, а другая половина преобразуется в соответствующий хлорин.
ПРИМЕР 6. СВЕТОВАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ И СУЛЬФОНИРОВАННЫХ БАКТЕРИОХЛОРИНОВ
Данный пример демонстрирует повышенную стабильность галогенированных и сульфонированных бактериохлоринов в отношении облучения инфракрасным светом, которая решает проблемы лабильности, обнаруживаемой в других бактериохлоринах либо синтетического происхождения, таких как 5,10,15,20-тетракис(3-гидроксифенил)бактериохлорин, либо выделенных из натуральных продуктов, таких как Tookad.
Luzitin-FMet растворяли в PBS:метаноле (2:3), переносили в 1 см кварцевую кювету и регистрировали его спектр поглощения, фиг.6. Затем кварцевую ячейку помещали в луч 748 нм диодного лазера Lynx, предварительно не сфокусированного, чтобы он имел диаметр луча, совпадающий с окном кварцевой кюветы. Мощность лазера, измеренная в этих условиях, составляла 28,8 мВт. Каждые 5 минут облучение прерывали и регистрировали новый спектр поглощения. Эту процедуру выполняли в течение 65 минут. Фотообесцвечивание следует кинетике реакции первого порядка во временном окне эксперимента. На фиг.6 также показан спектр поглощения после облучения. Если пик бактериохлорина при 743 нм снижается с поглощения 1,128 до 0,337, поглощение хлорина только возрастает с 0,114 до 0,151. С учетом молярных коэффициентов поглощения соединений при этих длинах волны понятно, что, если 70% бактериохлорина разрушается во время облучения, только небольшой процент хлорина образуется. Остальные продукты не имеют спектров с хорошим разрешением в видимой/ИК-области, и доминирующий процесс фотодеструкции может быть описан как фотообесцвечивание.
Время полужизни фотообесцвечивания измеряли для различных интенсивностей лазерного излучения, и было показано, что оно пропорционально мощности лазера. Время полужизни других бактериохлоринов, нормализованное на лазерное излучение 100 мВт при 748 нм, представлено в таблице 1 вместе с литературными данными для фотодеструкции Фоскана и Tookad, нормализованными на такую же интенсивность излучения. Также наблюдали, что время полужизни для Luzitin-Cl повышено в 30 раз, когда раствор фотосенсибилизатора в PBS насыщен аргоном, который снижает концентрацию кислорода в растворе. Это указывает на участие АФК в фотообесцвечивании.
ПРИМЕР 7. ЭФФЕКТИВНАЯ ФОТОГЕНЕРАЦИЯ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА
В данном примере описана эффективная генерация синглетного кислорода в присутствии Luzitin-ов, света соответствующей длины волны и молекулярного кислорода, растворенного в растворе.
2
2
2
Δ
Δ
2
Насыщенный воздухом раствор Luzitin-ClHep в этаноле с поглощением примерно 0,2 при 355 нм подвергали возбуждению в 1 см кварцевой кювете импульсным лазером Nd:YAG, и за испусканием синглетного кислорода следили при 1270 нм, применяя оборудование и способы, описанные выше. Интенсивность фосфоресценции синглетного кислорода исследовали в зависимости от интенсивности лазерного излучения. Подобное исследование было проведено с феналеноном в этаноле при концентрации, соответствующей поглощению Luzitin-ClHep при 355 нм. На фиг.7 показана зависимость от лазерной энергии интенсивности фосфоресценции синглетного кислорода, измеренной при 1270 нм после возбуждения Luzitin-ClHep или феналенона при 355 нм в насыщенном воздухом этаноле. Применяли различные лазерные энергии, и на основании наклонов кривых энергетической зависимости испускания синглетного кислорода и значения Ф=0,95 для феналенона в этом этаноле авторы изобретения получили Ф=0,78 для Luzitin-ClHep. Значения для других бактериохлоринов представлены в таблице 1.
Фотостабильность этих бактериохлоринов, связанная с их примерно 70% квантовой эффективностью продуцирования синглетного кислорода, подразумевает, что данная молекула бактериохлорина при непрерывном облучении будет локально продуцировать очень большое количество электронно-возбужденных молекул кислорода, прежде чем подвергнется фотообесцвечиванию. Некоторые 30% энергии, поглощенной сенсибилизатором, теряются на другие процессы, некоторые из них идентифицированы в следующем примере.
ПРИМЕР 8. ФОТОГЕНЕРАЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОЛА (АФК)
В данном примере описана генерация активных форм кислорода, а именно супероксидного иона и гидроксильного радикала с применением Luzitin-Cl в качестве сенсибилизатора.
С целью оценки генерации супероксидного иона и гидроксильного радикала Luzitin-Cl спектры ЭПР в присутствии 30-80 мкМ Luzitin-Cl и 40 мМ БМПО измеряли в описанных ниже условиях:
a) Насыщенный воздухом водный раствор в темноте.
b) Насыщенный азотом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 8 минут.
c) Насыщенный воздухом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 4 минут.
d) Насыщенный воздухом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 8 минут.
e) Насыщенный воздухом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 16 минут.
f) Насыщенный воздухом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 16 минут в присутствии супероксиддисмутазы (50 мкг/мл).
g) Насыщенный воздухом водный раствор, облученный диодным лазером Hamamatsu в течение 16 минут в присутствии каталазы (30 мкг/мл).
В экспериментальных условиях (а) и (b) аддукт АФК-БМПО не был обнаружен. Однако экспериментальные условия (с), (d) и (е) приводят к обнаружению аддукта БМПО, который представляет собой аддукт, образованный между БМПО и гидроксильным радикалом, фиг.8. Присутствие света необходимо для образования такого аддукта. Экспериментальные условия (f) не дают сигнала, что означает, что супероксиддисмутаза, известный поглотитель супероксидного иона, ингибирует образование аддукта БМПО-гидроксильный радикал. Кроме того, экспериментальные условия (g) также не дают сигнала, и это доказывает, что каталаза, которая расщепляет пероксид водорода на воду и молекулярный кислород, также ингибирует образование аддукта БМПО-гидроксильный радикал. Эти результаты указывают на то, что гидроксильные радикалы не образуются непосредственно из фотосенсибилизатора и молекулярного кислорода, а вероятнее, в качестве вторичного продукта. Ингибирование, наблюдаемое посредством супероксиддисмутазы, является убедительным доказательством образования супероксидного иона. Ингибирование, наблюдаемое посредством каталазы, позволяет предположить, что пероксид водорода также является предшественником гидроксильного радикала.
Подобные эксперименты были проведены с ДМПО в ДМСО. Авторы изобретения обнаружили аддукт ДМПО-супероксид в присутствии воздуха и света, фиг.8. Однако в отсутствие воздуха или света или в присутствии супероксиддисмутазы этот аддукт не обнаруживают.
Взятые вместе эти данные указывают на то, что образование супероксидного иона следует за образованием пероксида водорода, а затем гидроксильного радикала, где все они являются очень хорошо документированными активными формами кислорода, способными причинить вред клетке. Эти АФК дополняют 70% эффективности образования синглетного кислорода этими бактериохлоринами и показывают, что остальные 30% энергии, поглощенной сенсибилизатором, не теряются, а, вероятнее, используются при образовании других цитотоксических форм в дополнение к синглетному кислороду.
ПРИМЕР 9. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-Cl-c В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЕЛАНОМЫ МЫШИ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ СТАНДАРТНОЙ ЛАМПОЙ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток меланомы мыши при облучении фильтруемым галогеновым светом при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
90
50
Цитотоксичность в темноте и фотосенсибилизирующую активность Luzitin-Cl-c в клеточных линиях S91 (меланомы мыши) измеряли с помощью описанных выше материалов и способов, за исключением того, что после инкубации клетки не промывали для удаления непоглощенного фотосенсибилизатора перед облучением. На вкладке к фиг.9 показана цитотоксичность в темноте различных концентраций Luzitin-Cl-c для времени инкубации 120 минут. На фиг.9 показана доля выживания клеток S91 для различных доз облучения, когда клетки облучают в присутствии [Luzitin-Cl-c]=20 мкМ. Дозы облучения, необходимые для уничтожения 90% (LD) или 50% (LD) клеток в культуре, представлены в таблице 3.
ПРИМЕР 10. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-Cl В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ОБЛУЧЕНИИ СТАНДАРТНОЙ ЛАМПОЙ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток карциномы молочной железы человека при облучении фильтруемым галогеновым светом при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
2
90
50
Цитотоксичность в темноте и фотосенсибилизирующую активность Luzitin-Cl в клеточных линиях MCF7 (карциномы молочной железы человека) измеряли с помощью описанных выше материалов и способов. На вкладке к фиг.10 показана цитотоксичность в темноте различных концентраций Luzitin-Cl и времени инкубации 12 часов. На фиг.10 показана доля выживания клеток MCF7 для [Luzitin-Cl]=5 мкМ и различных доз облучения. Ясно, что 5 мкМ концентрация Luzitin-Cl давала 100% уничтожения клеток при воздействии фильтруемого галогенового света при дозе облучения 0,6 Дж/см. Дозы облучения, необходимые для уничтожения 90% (LD) или 50% (LD) клеток в культуре, представлены на фиг.4.
2
ПРИМЕР 11. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-Cl В ОТНОШЕНИИ КАРЦИНОМЫ ПРОСТАТЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЛАЗЕРНОМ ОБЛУЧЕНИИ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток карциномы простаты человека при лазерном облучении при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
2
2
Цитотоксичность в темноте Luzitin-Cl в клеточных линиях РС-3 (карциномы простаты человека) измеряли с помощью описанных выше материалов и способов. Согласно этим экспериментам, концентрация 0,05 мМ является самой высокой концентрацией Luzitin-Cl, которая относительно не вызывает эффекта на жизнеспособность этих клеточных линий при тестировании в темноте. Эта концентрация составляет стандартную концентрацию в дальнейших исследованиях фототоксичности.
2
2
2
2
Фотосенсибилизирующую активность Luzitin-Cl в клеточных линиях PC-3 измеряли с помощью описанных выше материалов и способов. Доля выживания для доз облучения 3 и 6 Дж/см и времени инкубации 24 часа изображена на фиг.11 для различных концентраций этого фотосенсибилизатора. Согласно фиг.11, [Luzitin-Cl]=20 мкМ дает 100% уничтожения клеток при воздействии дозы лазерного облучения 6 Дж/см.
2
ПРИМЕР 12. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-ClEt В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ КАРЦИНОМЫ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ МЫШИ ПРИ ЛАЗЕРНОМ ОБЛУЧЕНИИ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток карциномы ободочной кишки мыши при лазерном облучении при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
2
50
2
Цитотоксичность в темноте Luzitin-ClEt в клеточных линиях СТ26 (карциномы ободочной кишки мыши) невозможно было измерить в отношении IC, поскольку это соединение осаждается в культуральной среде раньше достижения данного уровня цитотоксичности. Концентрация 50 мкМ является самой высокой концентрацией Luzitin-ClEt, которая относительно не вызывает эффекта на жизнеспособность этих клеточных линий при тестировании в темноте.
2
2
90
2
2
90
2
2
2
2
Фотосенсибилизирующую активность Luzitin-ClEt в клеточных линиях СТ26 измеряли с помощью описанных выше материалов и способов. Доля выживания при дозе облучения 6 Дж/см и времени инкубации 18 часов изображена на фиг.12 для различных концентраций этого фотосенсибилизатора. На этом чертеже показано, что Luzitin-ClEt при концентрации 5 мкМ дает 90% уничтожения клеток при воздействии дозой лазерного облучения 6 Дж/см, LD=5 мкМ. Согласно фиг.12, [Luzitin-ClEt]=10 мкМ дает 100% уничтожения клеток при воздействии лазерного излучения дозой 6 Дж/см. В таблице 6 представлены концентрации Luzitin-ClEt, необходимые для достижения LD в различных других клеточных линиях при облучении диодным лазером 6 Дж/смпри 28,5 мВт.
ПРИМЕР 13. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-FMet В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЛАЗЕРНОМ ОБЛУЧЕНИИ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток карциномы ободочной кишки человека при лазерном облучении при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
50
Цитотоксичность в темноте Luzitin-FMet в клеточных линиях НТ-29 (аденокарциномы ободочной кишки человека) невозможно было измерить в отношении IC, поскольку это соединение осаждается в культуральной среде раньше достижения данного уровня цитотоксичности. Концентрация 50 мкМ является самой высокой концентрацией Luzitin-FMet, которая относительно не вызывает эффекта на жизнеспособность этих клеточных линий при тестировании в темноте.
2
2
2
2
90
90
Фотосенсибилизирующую активность Luzitin-FMet в клеточных линиях НТ-29 измеряли с помощью описанных выше материалов и способов. Доля выживания при дозе облучения 6 Дж/см и времени инкубации 18 часов изображена на фиг.13 для различных концентраций этого фотосенсибилизатора. На этом чертеже показано, что Luzitin-FMet при концентрации 0,5 мкМ дает 90% уничтожения клеток при воздействии лазерного излучения дозой 6 Дж/см, LD=1 мкМ. Согласно фиг.13, [Luzitin-FMet]=1 мкМ дает 100% уничтожения клеток при воздействии лазерного излучения дозой 6 Дж/см. В таблице 6 представлены концентрации Luzitin-FMet, необходимые для достижения LD в различных других клеточных линиях при облучении диодным лазером 6 Дж/см при 28,5 мВт.
2
ПРИМЕР 14. ФОТОТОКСИЧНОСТЬ IN VITRO Luzitin-FMet В ОТНОШЕНИИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЛАЗЕРНОМ ОБЛУЧЕНИИ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы очень токсичны для клеток немелкоклеточного рака легкого человека при лазерном облучении при концентрациях, где их темновая токсичность пренебрежимо мала.
2
50
2
Цитотоксичность в темноте Luzitin-FMet в клеточных линиях А-549 (немелкоклеточного рака легкого человека) невозможно было измерить в отношении IC, поскольку это соединение осаждается в культуральной среде раньше достижения данного уровня цитотоксичности. Концентрация 50 мкМ является самой высокой концентрацией Luzitin-FMet, которая относительно не вызывает эффекта на жизнеспособность этих клеточных линий при тестировании в темноте.
2
2
2
2
2
90
2
90
Доля выживания при дозе облучения 6 Дж/см и времени инкубации 18 часов изображена на фиг.14 для различных концентраций этого фотосенсибилизатора. На этой фигуре показано, что Luzitin-FMet при концентрации 0,5 мкМ дает 90% уничтожения клеток при воздействии лазерного излучения дозой 6 Дж/см, LD=0,5 мкМ. Согласно фиг.14, [Luzitin-FMet]=0,5 мкМ дает 100% уничтожения клеток при воздействии лазерного излучения дозой 6 Дж/см. В таблице 6 представлены концентрации Luzitin-F2Met, необходимые для достижения LD в различных других клеточных линиях при облучении диодным лазером 6 Дж/см при 28,5 мВт.
ПРИМЕР 15. ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Данный пример показывает крайнюю чувствительность и избирательность обнаружения Luzitin-ов в биологических образцах.
2
Растворы различных концентраций готовили путем разведения в сыворотке человека 1% исходного раствора Luzitin-ClEt в этаноле. Концентрации находились в диапазоне от 0,2 нМ до 10 нМ. Образцы подвергали возбуждению при 514 нм в спектрофлуориметре, описанном выше, применяя щели 4:5:3: для возбуждения и испускания. Испускание регистрировали в инфракрасной области, как проиллюстрировано на фиг.15.
Предел обнаружения определяли, применяя уравнение:
ylx
где S представляет собой стандартное отклонение калибровочной кривой, и b представляет собой ее наклон. Был получен предел обнаружения 0,17 нМ (или 0,2 нг/г).
ПРИМЕР 16. ТОКСИЧНОСТЬ IN VIVO В ТЕМНОТЕ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы нетоксичны для мышей при значительно более высоких концентрациях, чем концентрации, одобренные для ФДТ с имеющимися в продаже фотосенсибилизаторами.
Мышей делили на следующие подопытные группы:
(a) 10 животных получали 2 мг/кг Luzitin-Cl;
(b) 10 животных получали 5 мг/кг Luzitin-Cl;
(c) 10 животных получали 10 мг/кг Luzitin-Cl;
(d) 10 животных получали 15 мг/кг Luzitin-Cl;
(e) 10 животных получали 20 мг/кг Luzitin-Cl;
(f) 10 животных не получали обработку и являются контрольной группой.
Растворы Luzitin-Cl (0,5 мл) инъецировали подкожно, и в течение 30 суток животных тщательно наблюдали. Первые 6 суток после инъекции животные из группы (е) проявляли чувствительность к свету, и некоторые из группы (d) также проявляли легкую чувствительность. Такая чувствительность выражалась у них в убегании от источника света, прямо направленного на них. Животных регулярно взвешивали, но значимых изменений массы не наблюдали ни для одного из них. После 30 суток животных анестезировали, применяя Морбитал (Biowet, Польша), проводили эксцизию их органов и образцов ткани и осуществляли исследования морфологии крови, а также гистологические исследования отобранных органов. Не наблюдали никаких изменений в крови или в органах.
Дозы, применяемые в этих анализах темновой токсичности, были в 10 раз выше, чем дозы, рекомендованные для применения Фотофрина и в 100 раз выше, чем дозы, применяемые с Фосканом. Кроме того, порог измеримой темновой токсичности у мышей не был достигнут. Это свидетельствует о том, что при ФДТ можно применять более высокие дозы Luzitin-ов, чем Фотофрина или Фоскана.
ПРИМЕР 17. БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРИНА ПОСЛЕ IP ВВЕДЕНИЯ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы могут пересекать гематоэнцефалический барьер через два часа после внутрибрюшинного введения.
Luzitin-Cl-c вводили в дозе 10 мг/кг мышам линии DBA/2 посредством внутрибрюшинной инъекции. Распределение хлорина в тканях анализировали через 2 ч после введения. После 30 суток животных анестезировали, применяя Морбитал (Biowet, Польша), и проводили эксцизию некоторых их органов, включая головной мозг, взвешивали, а затем хранили при -30°С до дальнейшего анализа. Содержание пигментов в образцах ткани анализировали спектрофотометрическим способом. С целью экстракции пигментов образцы ткани гомогенизировали 1 мин в 7 мл охлажденного во льду 90% водного ацетона, применяя гомогенизатор тканей MPW-120 (Medical Instruments, Польша) при скорости 10000 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин при 4°С, надосадочную жидкость собирали, и осадок повторно экстрагировали 90% водного ацетона, чтобы обеспечить полное выделение пигмента. Экстракты объединяли и анализировали на содержание пигмента. Образцы подвергали возбуждению при 413 нм, и спектры флуоресценции записывали в диапазоне от 600 до 800 нм. На фиг.16 проиллюстрирована интенсивность флуоресценции от головного мозга, крови и печени, нормализованная на их соответствующие массы.
Гематоэнцефалическое распределение сенсибилизатора составляло 4:1 через два часа после внутрибрюшинного введения мышам линии DBA/2. Принципиально, что подходящие Luzitin-ы могут пересекать гематоэнцефалический барьер в значительных количествах, чтобы стать активным фотосенсибилизатором в головном мозге. В следующем примере показано, что данный класс сенсибилизаторов склонен аккумулироваться в опухолях, дополнительно увеличивая количество фотосенсибилизатора, которое будет доступно для лечения опухолей головного мозга.
ПРИМЕР 18. ФАРМАКОКИНЕТИКА БАКТЕРИОХЛОРИНА ПОСЛЕ ВНУТРИБРЮШИННОГО ВВЕДЕНИЯ
Данный пример показывает, что после внутрибрюшинного введения Luzitin-ы сначала аккумулируются в опухолях, а затем выводятся с более медленными скоростями.
2
6
Моделью опухоли были клетки меланомы мыши S91 Cloudman, культивируемые в виде монослоя в среде RPMI, содержащей 5% фетальную сыворотку теленка, и с добавлением антибиотиков. Клетки выращивали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO. Клетки меланомы (~1×10) растворяли в 0,1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и имплантировали подкожно в правый бок животного. Опухоли вырастали до видимых за десять суток после имплантации. Животных обрабатывали через три недели после инъекции.
Luzitin-Cl вводили в дозе 10 мг/кг мышам линии DBA/2 посредством внутрибрюшинной инъекции, тканевое распределение бактериохлорина анализировали через следующие интервалы: 2 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч после внутрибрюшинного введения. Животных анестезировали кетамином и ксилазином, проводили эксцизию их органов и образцов ткани, взвешивали, а затем хранили при -30°С до дальнейшего анализа. Содержание пигментов в образцах ткани анализировали спектрофотометрическим способом. С целью экстракции пигментов образцы ткани гомогенизировали 1 мин в 7 мл охлажденного во льду раствора этанол/ДМСО (75:25), применяя гомогенизатор тканей MPW-120 (Medical Instruments, Польша) при скорости 10000 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин при 4°С, надосадочную жидкость собирали, и осадок повторно экстрагировали раствором этанол:ДМСО, чтобы обеспечить полное выделение пигмента. Экстракты объединяли и анализировали на содержание пигмента. Образцы подвергали возбуждению при 517 нм, и спектры флуоресценции записывали в диапазоне от 600 до 850 нм. На фиг.17 проиллюстрирована интенсивность флуоресценции от опухоли и некоторых органов, нормализованная на их соответствующие массы.
Значимая аккумуляция этого фотосенсибилизатора в опухоли происходит через одни сутки после внутрибрюшинного введения, когда она достигает концентрации, в 3 раза более высокой, чем в мышце. Кроме того, аккумуляция в коже пренебрежимо мала, что объясняет отсутствие фоточувствительности мышей в исследованиях темновой токсичности. Наконец, фотосенсибилизатор выводился из большинства органов за 24 ч. Данная фармакокинетика является очень благоприятной для выбора временного окна для лечения ФДТ, где побочные эффекты снижены, а эффективность лечения максимальна.
2
Подобные исследования были проведены с другими Luzitin-ами, и Luzitin-ClEt показал очень сильную избирательность опухоли против мышцы, фиг.18.
ПРИМЕР 19. ФДТ КАРЦИНОМЫ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ МЫШИ У МЫШЕЙ ЛИНИИ Balb/C С ПРИМЕНЕНИЕМ Luzitin-FMet
Данный пример показывает, что Luzitin-ы при воздействии света соответствующей длины волны производят регрессию/некроз опухоли.
2
6
2
2
2
Моделью опухоли были клетки карциномы ободочной кишки мыши линии СТ26, культивируемые в виде монослоя в среде RPMI, содержащей 5% фетальную сыворотку теленка, и с добавлением антибиотиков. Клетки выращивали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО. Клетки карциномы (~1×10) растворяли в 0,1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и имплантировали подкожно в правый бок мышей линии Balb/C. Опухоли вырастали до достижения 5 мм в диаметре примерно за одну неделю после имплантации. Спонтанный некроз не наблюдали. Обработку начинали, когда опухоль достигала 5 мм в диаметре у каждого животного. На сутки, когда опухоли достигали размера обработки, мышам инъецировали внутрибрюшинно дозу 10 мг/кг Luzitin-FMet в ПЭГ400 (полиэтиленгликоль-400). Через 24 ч после инъекции четырех мышей анестезировали кетамином и ксилазином и обрабатывали диодным лазером Hamamatsu 748 нм, описанным выше, при плотности потока частиц 100 мВт/см в течение 22 минут (суммарная доза облучения 132 Дж/см). Четырех других мышей не обрабатывали, и они служили в качестве контроля. Мышей проверяли ежесуточно, опухоли измеряли, применяя два ортогональных измерения L и W (перпендикулярно L), и объемы вычисляли, применяя формулу V=L×W/2, и записывали.
На фиг.19 показан относительный объем опухоли, измеренный на различные сутки после лазерного облучения. Размер опухолей у обработанных животных меньше, чем средний размер у контрольных животных, и в одном случае опухоль полностью исчезла.
2
ПРИМЕР 20. ФДТ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ У МЫШЕЙ ЛИНИИ DBA/2 С ПРИМЕНЕНИЕМ Luzitin-ClEt
Данный пример показывает, что Luzitin-ы при воздействии света соответствующей длины волны производят регрессию/некроз опухоли.
2
2
6
Моделью опухоли были клетки меланомы S91 Cloudman, культивируемые в виде монослоя в среде RPMI, содержащей 5% фетальную сыворотку теленка, и с добавлением антибиотиков. Клетки выращивали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO. Клетки меланомы (~1×10) растворяли в 0,1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) и имплантировали подкожно в правый бок мышей линии DBA/2. Опухоли вырастали до достижения 5 мм в диаметре примерно за одну неделю после имплантации. Спонтанный некроз не наблюдали. Обработку начинали, когда опухоль достигала 5 мм в диаметре у каждого животного. На сутки, когда опухоли достигали размера обработки, мышам инъецировали внутрибрюшинно дозу 10 мг/кг Luzitin-ClEt в ПЭГ400. Через 24 ч после инъекции мышей анестезировали кетамином и ксилазином и закрепляли в пластмассовых держателях, затем обрабатывали различными дозами облучения диодного лазера Hamamatsu 748 нм, описанного выше. В пределах минут облучения область опухоли представляла видимые сигналы некроза, которые распространялись на всю облученную область в пределах нескольких часов. Мышей проверяли ежесуточно, и размеры опухолей измеряли и записывали. На фиг.20 показан размер опухоли, измеренный на различные сутки после лазерного облучения. Ясно, что один сеанс однократной обработки производил долгосрочную регрессию опухоли.
ПРИМЕР 21. ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ МЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
Данный пример показывает, что Luzitin-ы могут быстро диффундировать через кожу при нанесении с подходящим чрескожным препаратом. Четырех карликовых свиней применяли для тестирования диффузии в кожу фотосенсибилизатора Luzitin-FMet и для оценки возможных побочных эффектов препаратов для местного введения.
Фотосенсибилизатор сначала растворяли в абсолютном этаноле (5 мг в 0,556 мл), затем добавляли 1,737 мл пропиленгликоля с последующим добавлением 0,22 мл Azone и 0,3 мл воды. Смесь тщательно смешивали на вортексе и обрабатывали ультразвуком для облегчения солюбилизации, а затем добавляли к основе геля, состоящей из воды (76,65%), 96% этанола (15%), глицерина (6%), триэтаноламина (1,35%), карбопола 940 (1%). Смесь тщательно смешивали до достижения хорошей гомогенизации. В данном препарате конечная концентрация фотосенсибилизатора составляет 0,1%, а концентрация Azone составляет 4%.
Содержание животных описано выше. При успокоении под анестезией препараты наносили вручную, применяя хирургические перчатки, в предопределенные области. Каждое нанесение покрывало примерно круговую область 3 см в диаметре, толщиной несколько миллиметров геля. Нанесение покрывали герметичным пластырем. У некоторых животных ту же процедуру повторяли через 3 часа в другой области спины. У одного из животных препараты удаляли через 6 ч после нанесения, спину животного очищали и сохраняли его живым в течение 10 суток для последующей оценки. Образцы кожи собирали, как описано выше. Каждый образец был примерно четырехугольным со сторонами 2 см и толщиной 1 см. Ни одно из животных, и, в частности, животное, которое оставалось живым, не проявляло признаков побочных эффектов, вызванных препаратом, с какими-либо из сенсибилизаторов или без них.
После фиксирующей обработки каждый образец резали на срезы для оценки с помощью флуоресцентной микроскопии и конфокальной микроскопии. Репрезентативный пример изображений, снятых с образцов, представлен на фиг.21. Изображения выявляют, что в пределах 3 ч после нанесения геля Luzitin-FMet диффундировал через весь эпидермис. Флуоресценция Luzitin-FMet была дополнительно подтверждена его спектром поглощения на фиг.22. Таким образом, возможно готовить препарат в виде композиции для местного введения Luzitin-ов, которые диффундируют через роговой слой и эпидермис в пределах нескольких часов, что очень удобно для ФДТ кожных заболеваний.
(1) К. Berg, in H. Honigsmann, G. Jori, A.R. Young (Eds.). The Fundamental Bases of Phototherapy. OEMF spa, Milano, 1996, p.181-207.
(2) R.V. Bensasson, EJ. Land, T.G. Truscott: Excited States and Free Radicals in Biology and Medicine, Oxford Univ. Press, Oxford, 1993.
(3) Y. Vakrat-Haglili, L. Weiner, V. Brumfeld, A. Brandis, Y. Salomon, B. Mcllroy, B.C. Wilson, A. Pawlak, M. Rozanowska, T. Sarna, A. Scherz, J. Am. Chem. Soc. 127(2005) 6487.
(4) M. Pineiro, A.L. Carvalho, M.M. Pereira, A.M. d. A.R. Gonsalves, L.G. Arnaut, S.J. Formosinho, Chem. Eur. J. 4 (1998) 2299.
(5) T.J. Dougherty, D.G. Boyle, K.R. Weishaupt Photodynamic Therapy -Clinical and Drug Advances, Porphyrin Photosensitization, Plenum Press, New York, 1983.
(6) TJ. Dougherty, C.J. Gomer, B.W. Henderson, G. Jori, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan, Q. Peng, J. Natl. Cancer Inst. 90 (1998) 889.
(7) R.L Lipson, E.J. Baldes, A.M. Olsen, J. Natl. Cancer Inst. 26 (1961) 1.
(8) T.J. Dougherty, D.G. Boyle, K.R. Weishaupt. B. Henderson, W. Potter, D.A. Bellnier, K.E. Wityk, Adv. Exp.Biol. Med. 160 (1983) 3.
(9) R.K. Pandey, M.M. Siegel, R. Tsao, J.M. McReynolds, T.J. Dougherty, Biomed. And Environ. Mass Spectrometry 19 (1990) 405.
(10) R. Bonnett, G. Martinez, Tetrahedron 57 (2001) 9513.
(11) E.D. Sternberg, D. Dolphin, C. Brucker, Tetrahedron 54 (1998) 4151.
(12) M. Pineiro, A.M. d. A. Rocha Gonsalves, M.M. Pereira, S.J. Formosinho, L.G. Arnaut. J. Phys. Chem. A 106 (2002) 3787.
(13) Y. Chen, G. Li, R.K. Pandey, Current Org. Chem. 8 (2004) 1105.
(14) E.M. Beems, T.M.A.R. Dubbelman, J. Lugtenburg, J.A.B. Best, M.F.M.A. Smeets, J.P.J. Boehgeim, Photochem. Photobiol. 46 (1987) 639.
(15) S. Schastak, B. Jean, R. Handzel, G. Kostenich, R. Hermann, U. Sack, A. Orenstein, Y. Wang, P. Wiedermann, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 78 (2005) 203.
(16) C.K. Chang, C. Sotiriou, W. Wu, J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1986) 1213.
(17) A.R. Morgan, D. Skalkos. G.M. Garbo, R.W. Keck, S.H. Selamn, J. Med. Chem. 34 (1991) 2126.
(18) P. Yong-Hin, T.P. Wijesekera. D. Dolphin, Tetrahedron Lett. 32 (1991) 2875.
(19) G. Zheng, A. Kozyrev. T.J. Dougherty, K.M. Smith. R.K. Pandey, Chemistry Lett. (1996) 119.
(20) A.C. Tome. P.S.S. Lacerda, M.G.P.M.S. Neves, J.A. S. Cavaleiro, Chem Commun (1997) 1199.
(21) H.-J. Kirn, J.S. Lindsey. J. Org. Chem. 70 (2005) 5475.
(22) H.W. Whitlock Jr., R. Hanauer, MY. Oester, B.K. Bower, J. Am. Chem. Soc. 91 (1969) 7485.
(23) R. Bonnett, R.D. White, U.-.I. Winfield, M.C. Berenbaum, Biochem. J. 261 (1989) 277.
(24) F.S. De Rosa. M.V.L.B. Bentley, Pharm. Res. 17 (2000) 1447.
(25) J.L. McCullough, G.D. Weinstein, L.L. Lemus. W. Rampone. J.J. Jenkins, J. Invest. Dermatol. 81 (1983) 528.
(26) O. Santoro, G. Bandieramonte, E. Melloni, R. Marchesini, F. Zunino, P. Lepera, G. De Palo, Cancer Res. 50 (1990) 4501.
(27) J.C. Kennedy, R.H. Pettier, D.C. Pross, J. Photochem. Photobiol. В 6 (1990) 143.
(28) S.R. Wiegell, I.-M. Stender, R. Na, H.C. Wulf, Arch. Dermatol. 139 (2003).
(29) E.G. Azenha, A.C. Serra, M. Pineiro. M.M. Pereira, J. Seixas de Melo, L.G. Amaut, SJ. Formosinho, A.M.d.A.R. Gonsalves, Chem. Phys 280 (2002) 177.
(30) R.W. Boyle, D. Dolphin, Photochem. Photobiol. 64 (1996) 469.
(31) A.S.M. Ressurreicao, M. Pineiro, L.G. Arnaut, A.M.d.A.R. Gonsalves, J. Porphyrins Phthalocyanines 11 (2007) 50.
(32) B.M. Magnusson, W.J. Pugh. M.S. Roberts, Pharm. Res. 21 (2004) 1047.
(33) A.M. d. A.R. Gonsalves, J.M.T.B. Varejao, M.M. Pereira, J. Heterocycl. Chem. 28 (1991) 635.
(34) A.M. d. A.R. Gonsalves, R.A.W. Johnstone, M.M. Pereira, A.M.P. deSantAna, A.C. Serra, A.J.F.N. Sobral, P.A. Stocks, HETEROCYCLES 43 (1996) 829.
(35) C.J.P. Monteiro, M.M. Pereira, S.M.A. Pinto, A.V.C. Simoes, G.F.F. Sa, L.G. Arnaut, S.J. Formosinho, S. Simoes. M.F. Wyatt, Tetrahedron 64 (2008) 5132.
(36) С.Serpa, P.J.S. Gomes, L.G. Arnaut, S.J. Formosinho, J. Pina, J. Seixas de Melo, Chem. Eur. J. 12 (2006).
(37) J.M. Dabrowski, M.M. Pereira, L.G. Arnaut, C.J.P. Monteiro, A.F. Peixoto, A. Karocki, K. Urbanska, G. Stochel, Photochem. Photobiol. 83 (2007) 897.
(38) R. Schmidt, С.Tanielian, R. Dunsbach, C. Wolff, J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 79 (1994) 11.
(39) M.H. Qvist, U. Hoeck, B. Kreilgaard, F. Madsen, S. Frokjaer, Eur. J. Pharm. Sc. 11 (2000) 59.
(40) J. O'Brien, I. Wilson, T. Orton, F. Pognan. Eur. J. Biochem. 267 (2000) 5421.
(41) M. Niedre, M.S. Patterson, B.C. Wilson. Photochem. Photobiol. 75 (2002) 382-91.
(42) С.Tanielian, С.Schweitzer, R. Mechin, С.Wolff, Free Radio. Biol. Med. 30 (2001) 208-12.
(43) С. Hadjur, N. Lange, J. Rebstein, P. Monnier, H. van der Bergh, G. Wagnieres, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 45 (1998) 170-78.
(44) R. Bonnett, B.D. Djelal, A. Nguyen, J. Porphyrins Phthalocyanines 5 (2001) 652.
(45) R, Bonnett, P. Charlesworth, B.D. Djelal, D.J. McGarvey, T.G. Truscott, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2 (1999) 325.
(46) R. Bonnett, B.D. Djelal, P.A. Hamilton, G. Martinez, F. Wierrani, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 53 (1999) 136-43.
(47) E. Crescenzi. A. Chiaviello, G. Canti, E. Reddi, B.M. Veneziani, G. Palumbo, Mol. Cancer Ther. 5 (2006) 776-85.
(48) D.G. Hilmey, M. Abe, M.I. Nelen, C.E. Stilts, G.A. Baker, S.N. Baker, F.V. Bright. S.R. Davies. S.O. Gollnick, A.R. Oseroff, S.L. Gibson, R. Hilf, M.R. Detty, J. Med. Chem. 45 (2002) 449-61.
(49) A. Hajri. S. Wack, C. Meyer, M.K. Smith, C. Leberquier, M. Kedinger, M. Aprahamian, Photochem. Photobiol. 75 (2002) 140.
(50) H. Rezzoug, L. Bezdetnaya, O. A'amar, J.L. Merlin, F. Guillemin, Lasers Med. Sci. 13 (1998) 119.
(51) C.A. Lipinski, F. Lombardo, B.W. Dominy. P.J. Feeney. Adv. Drug Del. Rev. 46 (2001) 3.