СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ МЕТОДОМ КАТОДНОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
METHOD FOR LIPOIC ACID MEASUREMENT IN BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVES BY CATHODE VOLTAMMETRY

Изобретение относится к области количественного определения липоевой кислоты с выраженными антиоксидантными свойствами в биологически активных добавках к пище. Метод определения - катодная вольтамперометрия.
Липоевая кислота (α-липоевая кислота, 3-(4-карбоксибутил)-1,2-дитиолан, тиоктовая кислота или липоиковая кислота) является коферментом, участвующим в каталитических реакциях переноса атомов водорода и ацильных групп, играет одну из основных ролей в метаболизме человека и животных, является мощным антиоксидантом.
Антиоксидантные свойства липоевой кислоты обусловлены наличием двух тиоловых групп в молекуле (фиг.1), а также способностью связывать молекулы радикалов и свободное тканевое железо, предотвращая его участие в перекисном окислении липидов. Известно, что липоевая кислота не только обладает самостоятельным антиоксидантным потенциалом, но и обеспечивает мощную поддержку работы других антиоксидантных звеньев в организме. В этом отношении ее протективное действие тесно связано с гомеостазом в системе глутатиона и убихинона.
Известно, что существует комплекс антиоксидантов, с которыми может взаимодействовать липоевая кислота и поддерживать как липидный, так и водный антиоксидантный статус, что важно для терапии или профилактики различных заболеваний, при которых отмечается дисбаланс окислительно-восстановительного клеточного статуса, таких как сахарный диабет, нарушения функции печени и др.
На основе липоевой кислоты создан целый ряд синтетических антиоксидантов для защиты клеток от окислительного стресса в виде биологически активных добавок к пище (БАД).
Эффективным и быстрым методом определения липоевой кислоты в фармацевтических препаратах считается капиллярный электрофорез со спектрофотометрическим способом детектирования (Sitton A., Schmid M.G., Gubitz G., Hassan Y. Aboul-Enein. Determination of lipoic acid in dietary supplement preparations by capillary electrophoresis // J. of Biochem. And Biophysic. Methods. - 2004. - V.61, №2. - P.119-124). В данном методе липоевую кислоту определяют в УФ-области при 208 нм. Время анализа не превышало 9 минут. Данный метод используют для определения липоевой кислоты в области от 0.8 до 2.5 мг/мл. Метод разработан для определения липоевой кислоты в биологически активных добавках диетического питания. Недостатком метода можно считать низкую чувствительность определения липоевой кислоты в БАД.
Для обеспечения контроля качества БАД, содержащих липоевую кислоту, необходимо разработать методику количественного определения ее в БАД. В настоящее время из методик количественного определения липоевой кислоты в разных объектах широко используются электрохимические методы.
2
4
-5
-4
Наиболее близким к теме изобретения является вольтамперометрическое определение липоевой кислоты в модельных растворах на стеклоуглеродном электроде (Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников, В.И. Погорельцев // Электрохимическое определение липоевой кислоты. Журнал аналитической химии. 2004. Т.59. №3. С.324-326). При вольтамперометрическом определении α-липоевой кислоты авторы использовали стационарный стеклоуглеродный электрод на фоне 0.05 моль/л HSO, при этом четко выраженный сигнал наблюдался при потенциале 0.72 В. Диапазон определяемых вольтамперометрически содержаний липоевой кислоты составил от 1.15·1 до 1.73·10 моль/л на стеклоуглеродном электроде.
Использование условий в способе-прототипе не обеспечивает чувствительности определения липоевой кислоты в реальных объектах БАД, что связано с внесением погрешности в суммарный сигнал определения липоевой кислоты через влияние сопутствующих компонентов БАД.
-6
-3
Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности способа определения липоевой кислоты в таблетированной форме БАД методом катодной вольтамперометрии. Поставленная задача достигается тем, что липоевую кислоту переводят из таблетированной формы в раствор и проводят вольтамперометрическое определение, используя катодную вольтамперометрию. Для разработки методики определения липоевой кислоты использован аналитический сигнал восстановления липоевой кислоты при потенциале -0.373 В в боратном буферном растворе pН 9.18 на ртутно-пленочном электроде (РПЭ). Циклическая вольтамперограмма липоевой кислоты на РПЭ представлена на фиг.2. Зависимость прироста предельного тока восстановления липоевой кислоты от увеличения ее концентрации в модельном растворе линейна. Эта область находится между концентрациями от 4.5·10 моль/л до 1.1·10 моль/л (фиг.3). Скорость развертки потенциала составила 0.06 В/с.
-6
Предел обнаружения липоевой кислоты 9.3·10 моль/л достаточен для применения ее в оценке количественного содержания в БАД.
Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического диапазона измерений концентрации липоевой кислоты при доверительной вероятности Р=0,95 представлены в табл.1.
Пример 1. Определение липоевой кислота в таблетках БАД «Липоевая кислота».
Одну таблетку растирают в ступке до получения порошка. Порошок взвешивают и переносят в колбу 50 мл, добавляют 10-15 мл боратного буферного раствора pH 9.18 и нагревают на водяной бане при температуре 45-50°C в течение 10 минут. После этого раствор фильтруют через бумажный фильтр, который промывают буфером два раза по 5 мл. Затем в кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10.0 мл раствора фонового электролита боратного буферного раствора pH 9.18, помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора (ТА-2, г.Томск). Опускают в раствор электроды: индикаторный - ртутно-пленочный электрод, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Регистрацию фоновой линии проводят в постоянно токовом режиме съемки при линейной скорости развертки потенциала 60 мВ/с после удаления кислорода из электрохимичекой ячейки инертным азотом в течение 15 минут, в интервале потенциалов от 0 до -0.8 В. Отсутствие пиков на вольтамперограмме и воспроизводимые кривые свидетельствовали о чистоте фона. После получения удовлетворительных кривых фона вносят аликвоту фильтрата липоевой кислоты объемом 0,1 мл. Перемешивают раствор 10 с газом азотом, успокаивают 20 с и снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Катодный пик регистрируют при потенциале -0.373 В. Концентрацию липоевой кислоты оценивали по высоте катодного пика методом добавок аттестованных смесей липоевой кислоты по общепринятой методике.
Предложенный способ количественного определения липоевой кислоты отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой экспрессностью и чувствительностью.
Предложенный способ может быть использован для количественного определения липоевой кислоты в БАД и лекарственных формах.
Таблица 1
Диапазон измерений, моль/л
Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости), r, %
Критический диапазон (относительное значение допускаемого расхождения между наибольшим и наименьшим из трех результатов измерений, полученных в одной лаборатории в условиях повторяемости), СR<sub>0,95 </sub>(3),%
Предел Воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатамиизмерений, полученными в разных лабораториях), R, %
от 4.5·10<sup>-6</sup> до 1.1·10<sup>-3</sup> включ.
16
19
25