10
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТА КОЭНЗИМА Q В СУБСТАНЦИИ МЕТОДОМ ЦИКЛИЧЕСКОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ
10
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF COENZYME Q ANTIOXIDANT IN SUBSTANCE THROUGH CYCLIC VOLTAMMETRY

10
Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ, в частности коэнзима Q - вещества с выраженными антиоксидантными свойствами.
10
10
Существует ряд способов определения коэнзима Q как в лекарственных формах, так и в биологических объектах. Но большинство из них содержат сочетания различных методов. Примером определения коэнзима Q с электрохимическим детектированием является работа (Y.Yamamoto, S.Yamashita. Plasma ratio of ubiquinol and ubiquinone as a marker of oxidative stress. 1997, V.18, №81, P.79-84).
Исследовано соотношение между убихинолом и убихиноном в качестве маркера интенсивности окислительного стресса в организме человека и предложена методика одновременного определения убихинола-10 и убихинона-10 в плазме крови человека. Плазму, содержащую гепарин, смешивали с 5 объемами метанола и 10 объемами гексана, энергично встряхивали и центрифугировали. Центрифугат (гексановую фазу) немедленно инжектировали в режиме online в систему обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с колонкой для восстановления и электрохимическим детектором для предотвращения окисления убихинола до убихинона.
Данный способ очень трудоемок, обладает плохой воспроизводимостью, имеет большую ошибку определения.
10
Для идентификации коэнзима Q в лекарственных формах используются методы жидкостной хроматографии и спектроскопии [И.С.Иванов. Связь структуры и токсичности в ряду производных изоборнилфенола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Матер. конф. / Под ред. В.В.Жданова. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007, 106 с.). Эти методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители для высокоэффективной жидкостной хроматографии имеют высокую стоимость, а спектрофотометрия в некоторых случаях не обладает необходимой селективностью и чувствительностью.
10
10
Наиболее близким к предлагаемому решению прототипом является высокочувствительная методика определения коэнзима Q в этанол-гексановых экстрактах сыворотки крови человека, основанная на ВЭЖХ с 8 кулонометрическими детекторами, настроенными на различные фиксированные значения потенциалов (P.H.Gamache, I.N.Acworth. Simultaneous analysis of fat soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin K and coenzyme Q in plasma // Northeast Regional Chromatography Discussion Group. 1998, Book of Abstr. - P.6). Нижняя граница определяемых содержаний <20 пг, а диапазон линейной зависимости составляет 3 порядка.
Недостатком способа является высокая себестоимость и уникальность оборудования, что затрудняет его использование в рутинных анализах, мешающее влияние ряда компонентов сыворотки крови.
Перспективно использование вольтамперометрии для количественного определения биологически активных веществ - простого, чувствительного и экспрессного метода.
10
Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности, а также уменьшение себестоимости способа определения коэнзима Q в субстанции биологически активных добавок методом циклической вольтамперометрии.
Съемка вольтамперных кривых проводится при скорости развертки потенциала W 0.04 В/с в диапазоне потенциалов (Е) от -0.5 до +0.5 В. Фоновым электролитом служит 0.025 М фосфатный буфер pH 6.86. Для устранения мешающего влияния кислород из раствора удаляется продувкой фонового раствора азотом, подаваемым в ячейку под давлением.
Регистрация вольтамперных кривых проводится в постоянно-токовом режиме развертки потенциала. В качестве индикаторного электрода используется стеклоуглеродный электрод (СУЭ), электродом сравнения и вспомогательным служили хлорид-серебряные электроды. В качестве оборудования для проведения анализа использовали вольтамперометрический анализатор «ТА-2» (производство «ООО Томьаналит», г.Томск).
10
а
В результате проведенных исследований были получены пики окисления-восстановления коэнзима Q при потенциалах Е +0.23 В,
к
Е-0.06 В (фиг.).
10
-5
-5
-5
Фиг. Циклическая вольтамперограмма коэнзима Q в фосфатном буфере pH 6.86 на СУЭ при скорости развертки 40 мВ/с: 0.1×10 моль/л (2), 0.2×10 моль/л (3), 0.3×10 моль/л (4), (1) - фоновая линия
10
Аналитическим сигналом служит анодный ток окисления коэнзима Q.
10
10
-5
-6
Градуировочная зависимость тока окисления коэнзима Q от его концентрации в фоновом растворе носит линейный характер в диапазоне концентраций 10-10 моль/л. Данный диапазон концентраций достаточен для определения коэнзима Q в биологически активных добавках.
10
Новым в способе является использование в качестве аналитического сигнала тока окисления коэнзима Q на стеклоуглеродном электроде при потенциале Е +0.23 В относительно хлорид-серебряного электрода сравнения в фосфатном буферном растворе с pH 6.86.
10
Пример 1. Определение коэнзима Q в субстанции методом циклической вольтамперометрии.
10
10
10
В кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10,0 мл раствора фонового электролита 0.025 моль/л фосфатного буфера pH 6.86 в водном растворе и помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора. Опускают в раствор электроды: индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Перемешивают 10 с, успокаивают 20 с, затем фиксируют циклическую вольтамперограмму фонового раствора в диапазоне потенциалов от -0.5 до +0.5 В при скорости развертки потенциала 0.04 В/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем в стаканчик с фоновым раствором вносят аликвоту 1% раствора коэнзима Q в воде объемом 0.5 мл. Перемешивают раствор 10 с, успокаивают 20 с и вновь снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Анодный пик регистрируют при потенциале +0.23 В. Концентрацию коэнзима Q по высоте анодного пика определяют методом градуировочного графика, построенного по стандартным растворам коэнзима Q с точно известными концентрациями.
10
Предложенный способ количественного определения коэнзима Q отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой селективностью, экспрессностью и чувствительностью.
10
Предложенный способ может быть использован для количественного определения коэнзима Q в порошке, его лекарственных формах, биологически активных добавках.
-7
-7
-5
10
Метрологические характеристики данного способа: предел обнаружения составляет 1·10 моль/л. Относительная ошибка определения: 5%, область определяемых содержаний коэнзима Q от 1·10 моль/л до 1·10моль/л.