ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1) pdm09 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ
VACCINE INFLUENZA VIRUS STRAIN A/17/Bolivia/2013/6585 (H1N1)pdm09 FOR PREPARING LIVE INFLUENZA INTRANASAL VACCINE FOR ADULTS AND CHILDREN

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09.
В апреле 2009 года Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила о появлении в циркуляции среди людей нового вируса гриппа A(H1N1)pdm. Новый вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm имеет генетическое родство по определенным генам с вирусами, вызывающими грипп свиней, птиц и человека, и никогда ранее не циркулировал среди людей. Вирус с легкостью передавался от человека к человеку и был более контагиозен, чем сезонные штаммы. ВОЗ рекомендовал использовать этот вирус как прототип для подготовки пандемической противогриппозной вакцины [World Health Organization. Characteristics of the emergent influenza A(H1N1) viruses and recommendations for vaccine development, http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/vaccinerecommendations/en/index.html].
Однако гемагглютинин вируса гриппа А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm, выделенного в 2009 году, не стабилен. Штаммы, циркулирующие в последнее время, более стабильны, что связано с мутацией Glu-47-Lys в ножке гемагглютинина (НА2). Эта единичная аминокислотная замена влияет также на инфекционность современных А/Калифорния/07/2009-подобных вирусов [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stability and infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838].
В связи с вышесказанным, в качестве А/Калифорния/07/2009-подобного вируса был выбран штамм А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, НА и NA которого антигенно и генетически сходны с другими пандемически-подобными вирусами, циркулирующими в настоящее время, а его гемагглютинин (НА2) содержит стабилизирующую мутацию Glu-47-Lys, отсутствующую у А/Калифорния/07/2009 эталонного вируса [Cotter CR, Jin Н, Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol. 2014. Vol. 10 (1). P.e1003831; Yang H, Chang JC, Guo Z et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P. 4828-4838].
В результате появления в циркуляции нового высокостабильного эпидемического штамма вируса гриппа, А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, известный вакцинный штамм А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) - прототип [Ларионова Н.В., Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г. Штамм вируса гриппа А/17/Калифорния/2009/38 (H1N1) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и детей Патент РФ №2413765 от 16.09.09. опубл. БИ 2011, №7] - утратил свою актуальность.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно-актуального А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm-подобного вакцинного штамма живой гриппозной вакцины для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, обладающего стабильностью гемагглютинина и высокой репродуктивной активностью.
Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа. Вопросы вирусологии. 1977. №4. С. 387-395].
Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л.,1968. С. 66-83].
Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно-актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации. На основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был создан вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 - прототип.
Получение вакцинного штамма. Вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору аттенуации при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие требованиям, предъявляемым к реассортантному вакцинному штамму.
Антигенная характеристика вакцинного штамма
Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 показало, что:
- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА с гомологичной сывороткой антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 и родительского штамма А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с крысиной антисывороткой, полученной к вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, полностью совпадали (табл. 1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА вирусов А/Калифорния/07/2009 (H1N1)pdm и А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09 с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1);
- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA) проверен методом микс-ПЦР, а также полногеномным секвенированием и идентичен вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09.
Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011. №4. С. 29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.
Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), принадлежат пандемическому родительскому вирусу А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, РА, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 представлены в табл. 2.
Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).
Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл. 3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09. Таким образом, полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 показало генетическую стабильность аттенуирующих мутаций.
В гемагтлютинине вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 присутствует стабилизирующая аминокислота - лизин - в позиции 47 субъединицы НА2, которая по данным Yang et al. [Yang H., Chang J.C., Guo Z. et al. Structural stability of influenza A(H1N1)pdm09 virus hemagglutinins. J. Virol. 2014. Vol. 88 (9). P.4828-4838.] и Cotter et al. [Cotter C.R., Jin H., Chen Z. A single amino acid in the stalk region of the H1N1pdm influenza virus HA protein affects viral fusion, stabilityand infectivity. PLoS Pathol 2014. Vol. 10 (1). Pe1003831] приводит к повышению стабильности и инфекционности Калифорния-подобных вирусов (Glu-47-Lys).
10
50
10
50
Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 проводили путем его параллельного титрования в развивающихся куриных эмбрионах при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила менее 1,7 log ЭИД/МЛ, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации составила 8,0 log ЭИД/МЛ, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.
Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Полногеномное секвенирование показало, что нуклеотидная последовательность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 до и после его пятикратного пассирования, осталась неизменной, в том числе в генах полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл. 3).
Фенотипические характеристики пассажного варианта также не претерпели никаких изменений (табл. 4).
Все вышесказанное подтверждает высокую генетическую стабильность вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09.
50
Безвредность для морских свинок. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 проводили на морских свинках обоего пола в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». - М.: 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html]. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.
Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении (табл. 5).
Данные физиологического исследования показали, что подкожное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.
Заключение
В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Боливия/559/2013 (H1N1)pdm09, структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.
Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.
Полученный штамм А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 депонирован 01.04.2015 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2809 и имеет характеристики, представленные в образце паспорта штамма.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
10
50
Инфекционная активность штамма А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.7 log ЭИД/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:32.
Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Боливия/2013/6585 (H1N1)pdm09 может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.