ВЕКТОР AAV И АНАЛИЗ НА НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ AAV (АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА)

1. Последовательность рекомбинантного вектора AAV, где последовательность вектора содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии, и (c) является фланкированным одним или несколькими фланкирующими элементами.
2. Рекомбинантный вектор AAV, где вектор содержит репортерный трансген, где репортерный трансген содержит (a) одноцепочечный или самокомплементарный геном, (b) является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии, и (c) является фланкированным одним или несколькими фланкирующими элементами, где рекомбинантный вектор AAV содержит инфекционную частицу рекомбинантного AAV.
3. Способ анализа или детекции, или измерения антител, которые связываются с AAV, включающий:
(a) получение инфекционных частиц рекомбинантного AAV, которые заключают в капсид рекомбинантный вектор, где (i) вектор содержит репортерный трансген, (ii) репортерный трансген содержит одноцепочечный или самокомплементарный геном, и (iii) репортерный трансген является функционально связанным с одним или несколькими регуляторными элементами экспрессии и фланкированным одним или несколькими фланкирующими элементами;
(b) получение биологического образца от индивидуума для анализа или детекции антител, которые связываются с AAV;
(c) получение клеток, которые можно инфицировать указанными инфекционными частицами рекомбинантного AAV;
(d) приведение в контакт или инкубирования инфекционных частиц рекомбинантного AAV (a) с биологическим образцом (b), получая таким образом, получаемую смесь (M);
(e) приведение клеток в контакт (c) с получаемой смесью (M) в условиях, в которых инфекционные частицы рекомбинантного AAV (a) могут инфицировать и экспрессировать репортерный трансген в указанных клетках;
(f) измерение экспрессии репортерного трансгена и
(g) сравнение указанной экспрессии репортерного трансгена (f) с репортерным трансгеном контроля, где указанный контроль отрицательный (-) контроль, (i) не содержащий антитела, которые связываются с AAV, или (ii) содержащий предопределенное количество антител, которые связываются с AAV, таким образом, анализируя или детектируя, или измеряя антитела, которые связываются с AAV.
4. Способ по п.3, где клетки включают клетки млекопитающих.
5. Способ по п.3, где клетки содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вспомогательные функции для репликации и/или геномной интеграции AAV.
6. Способ по п.3, где клетки можно инфицировать частицами AAV, содержащими последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.
7. Способ по п.3, где клетки можно инфицировать серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибридом или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.
8. Способ по п.3, где клетки включают клетки млекопитающих.
9. Способ по п.3, где клетки включают клетки HEK-293, CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI, клетки COS, BSC1, BSC40, BMT10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HER, HEK, HEL или HeLa.
10. Способ по п.3, где клетки экспрессируют ген E4 AAV.
11. Способ по п.3, где клетки включают клетки 2V6.11.
12. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген кодирует белок, который обеспечивает ферментативный, колориметрический, флуоресцентный, люминесцентный, хемилюминесцентный или электрохимический сигнал.
13. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген содержит ген люциферазы.
14. Способ по п.13, где ген люциферазы включает ген люциферазы Renilla или люциферазы светляка.
15. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген содержит ген β-галактозидазы, ген β-глюкоронидазы или ген хлорамфениколтрансферазы.
16. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген кодирует зеленый флуоресцентный белок (GFP), красный флуоресцентный белок (RFP) или щелочную фосфатазу.
17. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где рекомбинантный вектор содержит вектор AAV.
18. Вектор AAV или способ по п.17, где вектор AAV включает вектор AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10, или гибрид или химеру любого из указанных выше векторов AAV.
19. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где регуляторные элементы экспрессии включают функциональную в клетках млекопитающих промоторную и/или энхансерную последовательность нуклеиновой кислоты.
20. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где регуляторные элементы экспрессии включают предранний промотор/энхансер цитомегаловируса (CMV), промотор/энхансер вируса саркомы Рауса (RSV), промотор SV40, промотор дигидрофолатредуктазы (DHFR), промотор β-актина курицы (CBA), промотор фосфоглицеринкиназы (PGK) или промотор фактора элонгации-1 альфа (EF1-альфа).
21. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген представляет собой одноцепочечный геном.
22. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где репортерный трансген представляет собой самокомплементарный геном.
23. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где фланкирующий элемент(ы) содержат одну или более последовательностей инвертированного концевого повтора (ITR) AAV.
24. Способ по п.23, где репортерный трансген располагается между одним или более 5'- и/или 3'-ITR AAV.
25. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где самокомплементарнвй репортерный трансгенный геном содержит двухцепочечную структуру последовательности инвертированного повтора.
26. Вектор AAV по п.1 или способ по п.3, где фланкирующий элемент(ы) содержит мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который не процессируется белком Rep AAV.
27. Вектор AAV по п.1 или способ по п.3, где фланкирующий элемент(ы) содержит мутантный ITR AAV или вариант ITR AAV, который обеспечивает или облегчает формирование самокомплементарного репортерного трансгенного генома в двухцепочечную структуру последовательности инвертированного повтора в инфекционных частицах рекомбинантного AAV.
28. Вектор AAV или способ по п.27 или 28, где мутантный, модифицированный ITR AAV или вариант ITR AAV содержит удаленную последовательность D и/или мутантную, модифицированную последовательность сайта концевого разрешения (TRS) или ее вариант.
29. Вектор AAV или способ по п.28, где мутантная, модифицированная последовательность сайта концевого разрешения (TRS) или ее вариант содержит: CGGTTG.
30. Вектор AAV или способ по п.27 или 28, где мутантный ITR AAV или его вариант располагается между самокомплементарными последовательностями репортерного трансгена.
31. Вектор AAV или способ по п.27 или 28, где мутантный ITR AAV или его вариант содержит ITR AAV2, содержащий нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам 122-144 удаленной геномной последовательности AAV2.
32. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где рекомбинантный вектор содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) AAV; промотор, функциональный в клетках млекопитающих; репортерный трансген; сигнал полиаденилирования и необязательно второй ITR AAV.
33. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где рекомбинантный вектор содержит участок рестрикции для обеспечения возможности вставки репортерного трансгена ниже промотора, функционального в клетках млекопитающих, и посттранскрипционного регуляторного элемента ниже участка рестрикции, где промотор, участок рестрикции и посттранскрипционный регуляторный элемент располагаются ниже 5'-ITR AAV и выше необязательного 3'-ITR AAV.
34. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует приматов.
35. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV, который инфицирует людей или макак-резус.
36. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат последовательность VP1, VP2 или VP3, идентичную на 90% или более последовательности VP1, VP2 или VP3 серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.
37. Вектор AAV по п.1 или 2 или способ по п.3, где инфекционные частицы рекомбинантного AAV содержат серотип AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибрида или химеры любого из указанных выше серотипов AAV.
38. Способ по п.3, где биологический образец включает образец от примата.
39. Способ по п.3, где биологический образец содержит сыворотку.
40. Способ по п.3, где биологический образец содержит плазму.
41. Способ по п.3, где биологический образец содержит сыворотку человека или плазму человека.
42. Способ по п.3, где индивидуум представляет собой млекопитающее.
43. Способ по п.3, где индивидуум представляет собой человека.
44. Способ по п.3, где индивидуум страдает нарушением, обусловленным недостаточностью экспрессии или активности белка.
45. Способ по п.3, где индивидуум страдает нарушением, обусловленным экспрессией или активностью аномального, аберрантного или нежелательного белка.
46. Способ по п.3, где индивидуум страдает генетическим нарушением.
47. Способ по п.3, где индивидуум является кандидатом для генной заместительной терапии или терапии на основе биологических активных добавок.
48. Способ по п.3, где индивидуум является кандидатом для терапии на основе нокдауна или нокаута гена.
49. Способ по п.3, где индивидуум страдает заболеванием легких (например, кистозным фиброзом), нарушением свертываемости крови (например, гемофилией A или гемофилией B с ингибиторами или без них), талассемией, нарушением со стороны крови (например, анемией), болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, болезнью Хантингтона, боковым амиотрофическим склерозом (ALS), эпилепсией, лизосомными болезнями накопления, нарушениями накопления меди или железа (например, болезнью Вильсона или болезнью Менкеса) недостаточностью кислой лизосомной липазы, неврологическим или нейродегенеративным нарушением, злокачественной опухолью, диабетом 1 типа или 2 типа, болезнью Гоше, болезнью Гурлера, аденозиндезаминазной недостаточностью, дефектом метаболизма (например, болезнями накопления гликогена), дегенеративным заболеванием сетчатки (таким как недостаточность RPE65, хороидеремия и другие заболевания глаза), заболеванием паренхиматозных органов (например, головного мозга, печени, почки, сердца) или инфекционным вирусным (например, гепатитом B и C, ВИЧ и т.д.), бактериальным или грибковым заболеванием.
50. Способ по п.3, дополнительно включающий подсчет количества антител, которые связываются с AAV, в биологическом образце на основании экспрессии репортерного трансгена (f) в сравнении с (-) контролем.
51. Способ по п.3, дополнительно включающий введение или включение количества антител, которые связываются с AAV в биологическом образце, в отчет, связанный с указанным индивидуумом.
52. Способ по п.3, дополнительно включающий введение или включение количества антител, которые связываются с AAV в биологическом образце, в базу данных, таким образом проводя введение записи в базу данных, где запись в базе данных связанна с указанным индивидуумом.
53. Способ по п.3, где анализируемые или детектируемые антитела связываются с капсидным белком AAV.
54. Способ по п.3, где анализируемые или детектируемые антитела связываются серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибридом, или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.
55. Способ по п.3, где предопределенное количество антител связывается с серотипом AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74 или Rh10 AAV, или гибридом, или химерой любого из указанных выше серотипов AAV.
56. Способ по п.3, где биологический образец разбавляют перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).
57. Способ по п.3, где анализируют совокупность разбавлений биологического образца.
58. Способ по п.3, где анализируют совокупность различных степеней разбавления биологического образца.
59. Способ по п.3, где биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:1 до 1:500 перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).
60. Способ по п.3, где биологический образец разбавляют в диапазоне от 1:500 до 1:5000 перед приведением в контакт или инкубированием с инфекционными частицами рекомбинантного AAV (a).
61. Способ по п.3, где анализируют по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 различных степени разбавления биологического образца.
62. Способ по п.3, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 6-48 часов.
63. Способ по п.3, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 12-36 часов.
64. Способ по п.3, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода 20-30 часов.
65. Способ по п.3, где клетки приводят в контакт с получаемой смесью (d) в течение периода приблизительно 24 часов.
66. Способ по п.3, где клетки лизируют перед измерением экспрессии репортерного трансгена.
67. Способ по п.3, где биологический образец инактивировали нагреванием.
68. Способ по п.3, где биологический образец инактивировали нагреванием приблизительно при 50-70°C в течение периода приблизительно от 15 минут до одного часа.
69. Способ по п.3, где биологический образец инактивировали нагреванием приблизительно при 56°C в течение периода приблизительно 30 минут.
in vitro
70. Способ по п.3, где способ проводят .