Изучение взаимодействия тромболитического препарата Лонголитина с некоторыми ионами и лекарственными средствами in vitro

изучение вЭАимодЕИст! препарата лонголитинА с ИЕ1 и лекарственными средствами in

УДК 615.225:615.015:616.001.6 Поступила 17.08.2016 г.

Т.С. Шаркова, к.б.н., старший научный сотрудник кафедры микробиологии; И.Б. Павлова, младший научный сотрудник лаборатории защитных систем крови им Л.В. Подорольская, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории защитных систем им. проф. Б.А. Кудряшова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, 119991, Ленинские

Агрессивная природа протеаз-тромболитиков требует особо строгого подбора препаратов, применяемых одн и способных повлиять на тромболитический процесс.

Цель исследования — изучение взаимодействия фибринолитического и тромболитического препарата Лонголитина с не рыми ионами (Mg++, Ca++, Zn++) и лекарственными средствами — ацетилсалициловой кислотой, Гепарином и Пиявитом — антикоа-гулянтным препаратом из медицинской пиявки.

Материалы и методы. Использовали функциональный метод определения фибринолитической активности (ФА) по зонам лизиса на стандартных и прогретых при 86°С фибриновых пластинах для изучения ФА Лонголитина. 0,2% раствор препарата в 0,9% растворе NaCl смешивали с равным объемом исследуемого вещества: а) Mg++ в концентрациях от 0,0125 до 1,25%, Ca++ — от 0,024 до 2,4%, Zn++ — от 0,0001 до 0,01%; б) ацетилсалициловая кислота в концентрациях 0,01; 0,1; 1%; в) Гепарин в дозах 10, 50, 100 ед./мл; г) Пиявит в дозах 1,56, 7,8 и 15,6 мг/мл — и определяли зоны лизиса через 5 ч инкубации пластинок при 37°С. Для выявления антикоагулянтного действия Пиявита записывали тромбоэластограмму на тромбоэластографе Hellige (Hellige, Германия) при добавлении к нормальной плазме либо Пиявита, либо физиологического раствора.

Результаты. Изучаемые ионы не влияли на ФА Лонголитина во всех используемых концентрациях. Ацетилсалициловая кислота увеличивала ФА, особенно в малых (0,006 мг/мл) дозах, однако статистически не значимо. Гепарин статистически значимо стимулировал ФА Лонголитина, в 2 раза увеличивая его активность в дозе 10 мг/мл. Возможный механизм этого — комплексообра-зование Гепарина и Лонголитина с более мощным фибринолизом в результате. Пиявит дозозависимо тормозил ФА Лонголитина: от 50% при минимальной дозе до 100% — при максимальной, подавляя в равной степени как активность активатора, так и плазмино-подобную активность. При этом Пиявит полностью и дозозависимо проявлял антикоагулянтное действие, что демонстрировалось на тромбоэластограмме.

Заключение. ФА Лонголитина не изменяется под влиянием ионов Mg++, Ca++, Zn++, умеренно увеличивается под действием некоторых доз ацетилсалициловой кислоты и Гепарина и сильно снижается при взаимодействии с Пиявитом — препаратом из медицинской пиявки. Тромболизис, осуществляемый Лонголитином, нужно с большой осторожностью сочетать с антикоагулянтным действием Пиявита, а лучше применять другой антикоагулянт.

Ключевые слова: Лонголитин; Пиявит; тромболитические препараты; Гепарин; ацетилсалициловая кислота; тромбоэласто-грамма.

Как цитировать: Sharkova T.S., Pavlova I.B., Podorolskaya L.V. In vitro study of interaction of thrombolytic drug longolytin with some ions and medicines. Sovremennye tehnologii v medicine 2016; 8(4): 309-312.

English

In vitro Study of Interaction of Thrombolytic Drug Longolytin with Some Ions and Medicines

T.S. Sharkova, PhD, Senior Researcher, Department of Microbiology;

I.B. Pavlova, Junior Researcher, Laboratory of Protective Blood Systems named after Professor B.A. Kudriashov; L.V. Podorolskaya, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Protective Blood Systems named after Professor B.A. Kudriashov

Lomonosov Moscow State University, 1/12 Leninskie Gory, Moscow, 119991, Russian Federation

Для контактов: Шаркова Тамара Сергеевна, e-mail: sharkova06@mail.ru

Aggressive nature of thrombolytic proteinases requires particularly accurate selection of medicines used simultaneously and able to affect the thrombolytic process.

The aim of the investigation was to study the interaction of thrombolytic drug Longolytin with some ions (Mg++, Ca++, Zn++) and medicines (acetylsalicylic acid, Heparin and Piyavit, an anticoagulant drug from the medicinal leech).

Materials and Methods. There was used the functional method of evaluating fibrinolytic activity (FA) according to lysed zones on standard fibrin plates and those heated at 86°C for evaluation of Longolytin FA. 0.2% solution of Longolytin in 0.9% NaCl solution was mixed with an equal volume of substance under study: a) Mg++ in concentrations from 0.0125 to 1.25%, Ca++ in concentrations from 0.024 to 2.4%, Zn++ — from 0.0001 to 0.01%; b) acetylsalicylic acid in concentrations 0.01, 0.1, 1%; c) Heparin in doses of 10, 50, 100 units/ml; d) Piyavit — 1.56, 7.8 and 15.6 mg/ml). Lysed zones were detected after incubation of plates for 5 hours at 37°C. To test anticoagulant activity of Piyavit thromboelastography was performed with the use of Hellige thrombelastograph (Hellige, Germany) while adding Piyavit or saline solution to normal plasma.

Results. The studied ions did not affect Longolytin FA in any concentration used. Acetylsalicylic acid increased FA, particularly in low (0.006 mg/ml) doses, though statistically insignificantly. Heparin statistically significantly promoted Longolytin FA increasing the activator activity 2 times in the dose of 10 mg/ml. The likely mechanism of this was complex-formation of Heparin and Longolytin resulting in more powerful fibrinolysis. Piyavit inhibited Longolytin FA dose-dependently, from 50% at the minimum dose to 100% inhibition at maximum, equally depressing both the activator action and plasmin-like activity. At the same time, Piyavit manifested its anticoagulant activity fully and dose-dependently, which was demonstrated on the thromboelastogram.

Conclusion. Longolytin FA does not change under the influence of ions Mg++, Ca++, Zn++, moderately increases when affected by certain doses of acetylsalicylic acid and Heparin and strongly decreases while interacting with Piyavit, a drug from the medicinal leech. Thrombolysis carried out by Longolytin is to be very cautiously combined with anticoagulant action of Piyavit, moreover, another anticoagulant should better be used.

Key words: Longolytin; Piyavit; thrombolytic drugs; Heparin; acetylsalicylic acid; thromboelastogram.

Востребованность тромболитических препаратов в медицине обусловливает их интенсивное изучение. Совершенствуются уже проверенные тромболитиче-ские средства, идет поиск новых. Однако многие аспекты применения тромболитических препаратов требуют дальнейших исследований.

Тромболитические препараты часто используются в комплексе с другими лекарственными средствами, биологически активными веществами, пищевыми добавками, микроэлементами и т.д., взаимодействие с которыми не всегда очевидно, хотя, несомненно, важно и может существенно повлиять на конечный тром-болитический эффект

Комплекс грибных протеаз Лонголитин хорошо проявляет себя в качестве тромболитика и при внутривенном, и при наружном применении, а также при пероральном введении, надолго и без ретромбозов вызывая умеренный подъем фоновой фибринолити-ческой активности (ФА).

Цель исследования — изучение взаимодействия Лонголитина с наиболее часто употребляющимися ионами (Мд++, Са++, Zn++) и лекарственными средствами — ацетилсалициловой кислотой, Гепарином, а также относительно недавно появившимся антико-агулянтным препаратом из медицинской пиявки — Пиявитом.

Материалы и методы. ФА Лонголитина (0,2% раствор в 0,9% растворе №С1, полученный в лаборатории биологически активных веществ биологического факультета МГУ, Россия) изучали функциональным методом на стандартной фибриновой пленке при добавлении к нему в равных объемах

ионов Мд++ в концентрациях 0,0125 (физиологическая концентрация в крови) и 0,125; 1,25%; Са++ в концентрациях 0,024% (физиологическая) и 0,24; 2,4%; Zn++ в концентрациях 0,0001% (физиологическая) и 0,001; 0,01%. Также в равных объемах к Лонголитину добавляли ацетилсалициловую кислоту (стандартный аптечный препарат) в концентрациях 0,1% (из расчета стандартной дозы приема), 0,01; 1%; Гепарин (Gedeon Richter, Венгрия) — 10, 50, 100 ед./мл; Пиявит — препарат из медицинской пиявки Hirudo medicinalis (НВФ «Гируд И.Н.», Россия) в дозах 1,56; 7,8 и 15,6 мг/мл. Смеси инкубировали 10 мин и наносили на фибрино-вую пластинку. Через 5 ч инкубации при 37оС определяли зоны лизиса как произведение двух взаимно перпендикулярных диаметров. Часть фибриновых пластинок прогревали при 86оС, чтобы инактиви-ровать сопутствующий фибриногену плазминоген, на них определяли плазминоподобную активность. Активность активатора плазминогена измеряли как разность зон на стандартной и прогретой фибри-новой пленке. Кроме того, для выявления антикоа-гулянтного действия Пиявита записывали тромбо-эластограмму на тромбоэластографе Heilige (Hellige, Германия) при добавлении к нормальной плазме Пиявита либо физиологического раствора по схеме: 0,24 мл плазмы крови + 0,06 мл Пиявита (либо физиологического раствора) + 0,06 мл Ca++.

Результаты и обсуждение. Изучаемые ионы Mg++, Ca++, Zn++ не влияли на ФА Лонголитина ни в какой из используемых концентраций.

В отличие от них все применяемые препараты изменяли ее (табл. 1). Ацетилсалициловая кисло-

/////////////////////^^^^

310 СТМ J 2016 — ТОМ 8, №4 Т.е. Шаркова, И.Б. Павлова, Л.В. Подорольская

Таблица 1

Зоны лизиса фибрина при нанесении Лонголитина вместе с ионами либо лекарственными препаратами

Зоны лизиса, мм2

Условия эксперимента Дозы Суммарная фибринолитическая активность Плазминоподобная фибринолитическая активность Активность активатора плазминогена

Физиологический раствор — норма (п=3) _ 352±53 210±43 142±39

Мд++, % (п=3) 0,0125 325±48 225±31 100±35

0,1250 382±61 216±45 162±38

1,25 314±24 224±41 90±29

Са++, % (п=3) 0,0240 318±34 220±41 98±21

0,24 401±52 282±42 113±32

2,40 383±56 226±42 157±38

Zn++, % (п=3) 0,0001 322±51 216±42 106±30

0,0010 321±49 220±38 101±25

0,01 295±44 201±44 94±31

Ацетилсалициловая кислота, % 0,10 454±42; p=0,15 201±38 254±39; p=0,1

(п=6) 0,01 428±54; p=0,15 198±34 230±37; p=0,107

1,00 384±51 225±34 159±32

Гепарин, ед./мл (п=6) 10 532±54; p=0,045 245±38 287±34; p=0,044

50 498±49; p=0,05 214±38 207±34; p=0,35

100 408±41; p=0,15 201±38 207±34; p=0,35

Пиявит, мг/мл (п=6) 15,6 0 0 0

7,8 28±6, р<0,001 10±4; р<0,001 18±5; р<0,001

1,56 128±22; р=0,075 61 ±14; р=0,032 67±15; р=0,15

Примечание: р — статистическая значимость различий значений между опытом и нормой.

Таблица 2

Параметры тромбоэластограммы при добавлении к плазме крови Пиявита и физиологического раствора

Показатель Параметры тромбоэластограммы

R, мм К, мм MA, мм

Дозы Пиявита, мг/мл: 15,6 7,8 1,56 2,8 5,9 1,2 2.1 4,9 1,8 1.2 2,6 2,8

Физиологический раствор 0,8 1,9 3,2

Примечание. МА — максимальная амплитуда (0,024 мл плазмы крови + 0,06 мл Пиявита либо физиологического раствора + 0,06 Са++).

та и Гепарин увеличивали ФА почти во всех изучаемых дозах, при этом в основном за счет стимуляции активации плазминогена. Если в отношении ацетилсалициловой кислоты данные статистически недостоверны, то Гепарин в дозах 10 и 50 ед./мл статистически значимо увеличивал на 55% как сум-

марную ФА Лонголитина, так и активность активатора плазминогена, в том числе, вероятно, благодаря ранее обнаруженному процессу комплексообразова-ния Гепарина и Лонголитина [1].

Влияние Пиявита было прямо противоположным. ФА Лонголитина ингибировалась дозозависи-мо от частичного (50%) торможения при минимальной дозе (1,56 мг/мл) до 100% — при максимальной (15,6 мг/мл). В основе ингибирования фибринолиза Пиявитом лежит взаимодействие Лонголитина (комплекса сериновых протеиназ) с огромным количеством серинов, содержащихся в слюне медицинской пиявки, а значит, и в Пиявите [2]. При этом в равной мере подавлялась как плазминоподобная активность, так и активность активатора плазминогена. Однако во всех концентрациях Пиявит сохранял свои антикоагулянтные свойства, что было установлено при тромбоэластографической регистрации свертывания крови с добавлением его различных концентраций (табл. 2). Все параметры тромбоэластограммы дозозависимо сдвигались в направлении гипокоагу-ляции при всех дозах Пиявита.

Таким образом, перорально применяемый Пиявит обладает хорошим антикоагулянтным действием и

препятствует образованию новых тромбов, но одновременно он тормозит тромболитическое действие Лонголитина.

Заключение. Ионы Mg++, Ca++, Zn++ не влияют на фибринолитическую активность Лонголитина. Препараты ацетилсалициловой кислоты, Гепарина умеренно активируют ее, поэтому их использование вместе с Лонголитином вполне допустимо. Препарат Пиявит, дозозависимо снижающий фибринолитическую, а значит, и тромболитическую активность Лонголитина, следует использовать с осторожностью как фактор, препятствующий тромболизису.

Финансирование исследования и конфликт ин-

тересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Литература

1. Шаркова Т.С., Серебрякова Т.Н., Ляпина Л.А., Обер-ган Т.Ю., Подорольская Л.В. Влияние комплекса грибных протеиназ — лонголитина — на тромбоцитарный и плазменный гемостаз в опытах in vivo и in vitro. Успехи медицинской микологии 2013; 10: 371-373.

2. Baskova I.P., Zavalova L.L. Proteinase inhibitors from the medicinal leech hirudo medicinalis. Биохимия 2001, 66(7): 869-883.

312 СТМ J 2016 - том 8, №4

irnft

Т.С. Шаркова, И.Б. Павлова, Л.В. Подорольская