ОРТОГОНАЛЬНЫЙ СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА (rhPTH) (1-34)

1. Способ синтеза rhPTH (1-34), включающий:
i) конструирование кДНК, кодирующей химерный нуклеотид ORF, как указано в SEQ. ID NO.:1, путем амплификации кДНК с помощью RT-PCR с использованием ген-специфических праймеров, выбранных из SEQ. ID NO.:3, SEQ. ID NO.:4, SEQ. ID NO.:5, SEQ. ID NO.:6, SEQ. ID NO.:7 и SEQ. ID NO.:8, кодирующих rhPTH (1-34) химерный гибридный белок, как указано в SEQ. ID NO. 2,
ii) экспрессирование гибридного химерного белка в присутствии лактозы в качестве индуктора в пределах около 10-30% общего белка,
iii) очистка rhPTH (1-34), полученного с помощью ортогонального способа, в котором очистку осуществляют с помощью катионообменной хроматографии до чистоты >98%, необязательно с последующей хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC) или RP-HPLC до чистоты >99%.
2. Способ по п.1, в котором вектор экспрессии, содержащий нуклеотид ORF как указано в SEQ. ID NO.:1, выбирают из группы, состоящей из pLMab, pRA, pET19b, в котором вектор представляет собой рЕТ 19b.
BAD
3. Способ по п.1, в котором синтез гибридного нуклеотида ORF, как указано в SEQ. ID NO.:1, находится под контролем индуцибельного промотора, выбранного из группы, состоящей из ara, trp, T7, lac, Pho и trc, предпочтительно T7 промотора.
4. Способ по п.1, в котором гибридный химерный партнер, по существу, состоит из 41 аминокислоты пептида β-галактозидазы (LacZ) Escherichia coli.
5. Способ по п.1, в котором гибридный химерный белок, как указано в SEQ. ID. No.:2, состоит из аффинного конца (affinity handle) выбранной из группы, состоящей из полигистидин-tag, GST tag, связывающего лактозу белка и стафилококкового белка, в котором аффинный конец является полигистидин-tag.
6. Способ по п.1, в котором RP-HPLC колонку выбирают из группы, состоящей из С4, С8 и С18, в котором колонка представляет собой С4.
7. Способ по п.1, в котором rhPTH(1-34) имеет массу около 4117 Дальтон.
8. Ортогональный способ очистки rhPTH (1-34), по существу, состоящий из сочетания катионообменной хроматографии, дающей чистоту >98%, с HIC, дающей чистоту >99%, в котором усовершенствование включает избегание продуцирования (generation) окисленных примесей и дезаминированных пептидов применением водного окружения для элюирования и получение N и С концевого интактного rhPTH (1-34).
9. Способ по п.8, в котором катионообменную хроматографию проводят на колонке, выбранной из группы, состоящей из SP-XL, SP-FF, Source-30S и Source-15S, в котором колонка представляет собой SP-XL.
10. Способ по п.8, в котором rhPTH(1-34) связывается с катионообменной колонкой, и колонку промывают, используя промывной буфер, имеющий рН в пределах от 3,5 до 5,5 и проводимость в пределах от 1 mS/см до 3 mS/см.
11. Способ по п.8, в котором rhPTH (1-34) элюирует из катионообменной хроматографической колонки при значении рН в пределах от 4,0 до 5,5 и проводимости в пределах от 15 mS/см до 35 mS/см.
12. Способ по п.8, в котором на стадии HIC используют колонку, состоящую из сшитых агарозных бусин с лигандами, выбранными из группы, состоящей из этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, третичного бутила, пентила, изопентила, гексила, фенила, изопропанола, изобутанола, С4-С6 эфира, в котором колонка представляет собой сефарозу, а лиганд представляет собой фенил.
13. Способ по п.8, в котором HIC-колонку промывают раствором промывного буфера, содержащим 20 мМ ацетатного буфера и от 1000 до 2000 мМ сульфата аммония с рН 5,5.
14. Способ по п.8, в котором HIC-колонку промывают буфером для элюирования, содержащим от 10 до 50 мМ ацетатного буфера с рН 5,5 в градиенте или изократическим способом или их комбинацией.