Взаимодействие антимикробного пептида буфорина-2 с мембранами: роль пролиновой петли

ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 51.76

Т. В. Науменкова, М. Ю. Антонов, К В. Шайтан

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА БУФОРИНА-2 С МЕМБРАНАМИ: РОЛЬ ПРОЛИНОВОЙ ПЕТЛИ

Обсуждается проблема развития у микроорганизмов резистентности к современным антибиотикам и возможность её преодоления с помощью антимикробных пептидов - группы веществ, разрушающих мембраны микробных клеток. Описаны структурные свойства типичных литических антимикробных пептидов, а также антимикробного пептида буфорина-2 - фрагмента гистона H2B, который проникает в микробные клетки, не разрушая мембран, и взаимодействует с внутриклеточной мишенью, вызывая гибель клеток. Методом классической молекулярной динамики исследованы процессы взаимодействия буфорина-2 и его PllA-замещённого аналога с биомембранами. Подробно описан процесс создания модельных мембран про- и эукариотической клеток: этапы сборки бислоёв, релаксации и подбора параметров протокола молекулярной динамики, позволяющего получать бислои с характеристиками, близкими к экспериментальным. Проведен анализ различных характеристик вторичной структуры (стабильность, форма, амфифильность спирали) природного буфорина-2 и его аналога вблизи поверхности мембран в свободном и связанном состоянии. Изучен процесс первичного влияния на прокариотическую мембрану группы пептидов: обсуждается влияние таких параметров, как общий заряд пептидов, форма и стабильность спирали, гибкость молекул на взаимодействие с мембранами. Показана роль пролиновой петли в проявлении литических свойств.

Ключевые слова: молекулярная динамика, молекулярное моделирование, антимикробные пептиды, мембранная активность, лизис, буфорин-2, гистон H2B, пролиновая петля, биомембраны.

T. V. Naumenkova, M. Yu. Antonov, K. V. Shaytan

The Interaction of Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Membranes:

the Role of Proline Loop

The problem of the development of microorganisms resistant to modern antibiotics and the possibility to overcome it with the help of antimicrobial peptides (a group of substances that disrupt the microbial cell membranes) are discussed. Structural

НАУМЕНКОВА Татьяна Витальевна - стажер-исследователь биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

E-mail: tnaumenkova@gmail.com

NAUMENKOVA Tatsina Vitalievna - Intern Researcher of the Faculty of Biology of Moscow State University named after M. V. Lomonosov.

E-mail: tnaumenkova@gmail.com

АНТОНОВ Михаил Юрьевич - в. н. с. научно-исследовательской кафедры вычислительных технологий ИМИ СВФУ имени М.К. Аммосова.

E-mail: mikhail@s-vfu.ru

ANTONOV Mikhail Yurievich - Leading Scientific Researcher of the Scientific Research Department of Computer Technologies, the Institute of Mathematics and Informatics, the North-Eastern Federal University named after M.K. Ammosov.

E-mail: mikhail@s-vfu.ru

ШАЙТАН Константин Вольдемарович - профессор биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

E-mail: shaytan49@yandex.ru

SHAITAN Konstantin Voldemarovich - Professor of the Faculty of Biology, Moscow State University named after M. V. Lomonosov.

E-mail: shaytan49@yandex.ru

properties of the typical lytic antimicrobial peptides and antimicrobial peptide buforin 2 - fragment of histone H2B, which penetrates the microbial cells without destroying the membrane and interacts with the intracellular target, causing cell death, are described. Classical molecular dynamics method was used to investigate the processes of interaction of buforin 2 and its P11A-substituted analogue with biological membranes. The process of creating model membranes of prokaryotic and eukaryotic cells is described in detail: assemblage of the bilayers, relaxation and adjustment of molecular dynamics protocol parameters that allow obtaining bilayers with characteristics similar to the experimental ones. The analysis of various characteristics of the secondary structure (helix stability, shape and amphipathicity) of natural buforin 2 and its analogue close to membrane surface in the free and bound state is performed. The process of initial effect of the group of peptides on prokaryotic membranes is studied: the influence of such parameters as net charge of the peptides, helices form and stability, molecules flexibility on interactions with membranes are discussed. The role of proline loop in the manifestation of the lytic properties is shown.

Key words: molecular dynamics, molecular modeling, antimicrobial peptides, membrane activity, lysis, buforin 2, histone H2B, proline loop, biomembranes.

Введение

Антимикробные пептиды (АМП) были выделены в самостоятельную группу биологически активных веществ в конце 1970-х - начале 1980-х годов [1]. На сегодняшний день группа насчитывает, по разным оценкам, от 2500 [2-4] до 6000 [5-7] пептидов размером 10-80 аминокислотных остатков, преимущественно спиральной структуры, обладающих широким спектром противомикробных свойств. Группа представляет особый интерес в связи с наличием у большинства АМП мембранной активности: биологической мишенью большинства пептидов являются мембраны микробных клеток, что затрудняет выработку резистентности [1].

Несмотря на высокий терапевтический потенциал, широкого распространения в фармакологической практике АМП до сих пор не получили: на сегодняшний день лишь несколько десятков веществ из группы находятся на разных стадиях клинических испытаний [8]. Основными сложностями при разработке лекарственных средств на основе АМП являются неясный механизм действия и низкая селективность пептидов. Решению обеих проблем может значительно способствовать изучение роли отдельных аминокислотных остатков и специфических элементов структуры АМП, а также попытки создания аналогов АМП с заданными структурно-функциональными свойствами.

Среди известных на сегодняшний день антимикробных пептидов особый интерес представляет буфорин-2 [9]. Пептид был обнаружен в 1996 г. в составе желудочного секрета дальневосточной жабы Bufo gargarizans и представляет собой фрагмент гистона H2B длиной 21 аминокислотный остаток [10]. Буфорин-2 обладает всеми характерными чертами катионных альфа-спиральных антимикробных пептидов: короткая амфифильная молекула имеет альфа-спиральную структуру и общий заряд +7. Указанные свойства делают буфорин-2 потенциально мощным антимикробным пептидом: показано, что буфорин-2 in vitro и in vivo демонстрирует более

высокую эффективность, чем другие изученные антимикробные пептиды, проявляет синергизм с другими противомикробными молекулами (азитромицин, имипенем, миноциклин и др.) и при этом не обладает литическим действием на клетки [11-19]. Последнее обстоятельство вызывает особый интерес, поскольку большинство катионных альфа-спиральных АМП являются литическими пептидами, которые действуют на клетки либо через образование трансмембранных пор, либо через нарушение целостности мембран.

В отличие от них для буфорина-2 показана способность проникать в клетки, не нарушая целостности мембран, и накапливаться вблизи нуклеоида, что впоследствии ведет к клеточной гибели. По-видимому, проникая в клетки, буфорин-2, обладающий высоким сродством с ДНК, связывается с нуклеиновыми кислотами и блокирует их функционирование, что приводит к гибели клетки [20-22].

Несмотря на широкий спектр антимикробного действия и повышенный интерес исследователей, механизм проникновения буфорина-2 в клетки до сих пор неизвестен. Представляется возможным, что важную роль во взаимодействии с мембранами играет остаток пролина, расположенный в молекуле буфорина-2 в 13-м положении [23-25].

В настоящей работе методом молекулярной динамики изучено функциональное значение пролиновой петли буфорина-2 при взаимодействии пептида с мембранами. Проведено исследование взаимодействия буфорина-2 и его Р11А-замещенного аналога с модельными мембранами про- и эукариотической клетки. Обсуждается роль пролиновой петли в процессе взаимодействия с поверхностью бислоя. Показаны различия в процессе взаимодействия с прокариотической мембраной для группы пептидов.

Методы

Для выполнения исследования были созданы модельные мембраны клеток про- и эукариот. В качестве модельной мембраны эукариотической клетки

Рис. 1. Исследованные системы: 1 а - одиночный пептид на поверхности мембраны эукариотической клетки; 1 б - одиночный пептид на поверхности мембраны прокариотической клетки; 1 в - одиночный пептид на поверхности мембраны прокариотической клетки, вертикальная ориентация. Стержнями синего цвета показаны боковые радикалы положительно заряженных аминокислотных остатков пептида, Ван-дер-Ваальсовыми сферами серого цвета -атомы фосфора незаряженных молекул липидов, Ван-дер-Ваальсовыми сферами красного цвета - атомы фосфора

отрицательно заряженных молекул липидов

О £ и

1а 16 1в

использовался бислой из молекул 1,2-димиристоил-•п-глицеро-3-фосфатидилхолина (ДМФХ); в качестве модельной мембраны клеток прокариот -бислой из молекул 1,2-димиристоил-5и-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина (ДМФЭ) и 1,2-димиристоил-•п-глицеро-З-фосфатидилглицерола (ДМФГ) в соотношении 3:1. Структуры липидов были получены из базы данных липидов LMSD [26]. Бислои были созданы с помощью программы ВПауег. Каждый бислой являлся симметричным и включал 80 молекул липидов. Использовались 5 конформаций молекул каждого типа. Молекулы липидов помещались в узлы гексагональной решетки и поворачивались на случайный угол вокруг своей оси. Площадь поверхности на одну молекулу липида составляла 60 А2. Монослои погружались друг в друга на глубину 2,7 А. Полученные структуры были гидратированы из расчета не менее 70 молекул воды на 1 молекулу липида; использовалась модель воды Т1Р4Р [27]. Заряд модельной мембраны прокариот был нейтрализован добавлением 16 ионов №+.

Буфорин-2 и его структурный аналог были собраны в молекулярном редакторе НурегСИеш [28] в а-спиральной конформации, концы молекул были ионизированы. В случае горизонтальной ориентации пептиды располагались на поверхности мембраны таким образом, что положительно заряженные аминокислотные остатки были направлены

преимущественно в водное окружение от поверхности мембраны. Расстояние между центрами масс пептида и мембраны составляло около 3 нм; расстояние между центрами масс пептида и поверхности мембраны -около 1,5 нм (за поверхность мембраны принималась совокупность атомов фосфора липидов верхнего монослоя). В случае вертикальной ориентации буфорин-2 или его структурный аналог размещались на поверхности мембраны так, что ось спирали пептидов была перпендикулярна плоскости поверхности мембраны. вконец пептидов был направлен к мембране. Расстояние между центрами масс пептида и мембраны составляло около 4 нм; расстояние между центрами масс пептида и поверхности мембраны -около 2,5 нм.

В группе пептидов четыре молекулы пептида размещались в вершинах квадрата с длиной около 10 А. Длинная ось молекулы каждого пептида была перпендикулярна плоскости квадрата. Молекулы были ориентированы антипараллельно. Положительно заряженные аминокислотные остатки были направлены преимущественно внутрь квадрата, гидрофобные остатки - наружу, в водное окружение. Полученная таким образом группа пептидов размещалась на поверхности модельной прокариотической мембраны в вертикальной ориентации.

Исследованные системы представлены на рис. 1, 2.

Протокол молекулярной динамики. Вычислительные

Рис. 2. Исследованные системы: 2 а - группа пептидов на поверхности мембраны прокариотической клетки в начальный момент времени; 2 б - группа из 4 молекул буфорина-2 на 10-й нс моделирования; 2 в - группа

из 4 молекул аналога на 10-й нс моделирования

й II

2а 26 2в

эксперименты проводились в программном пакете ОгошасБ 4.5 [29]; использовалось силовое поле ОРЬ8-ЛЛ [30]. Системы подверглись минимизации энергии в течение 10000 шагов с использованием алгоритма наискорейшего спуска, а затем ступенчатой релаксации: 100 пс «нагревания» до 300 К, 100 пс моделирования с фиксированными связями, 800 пс моделирования без наложения ограничений. В ходе релаксации значения основных параметров систем выходили на плато. После релаксации осуществлялся набор рабочего участка траекторий длиной 20 нс.

Вычисления проводились в №Т-ансамбле. Использовался термостат стохастической динамики, температура термостатирования составляла 300 К, постоянная термостатирования - 0,2 пс. Использовался баростат Берендсена, с постоянной баростатирования 1 пс. Давление баростата вдоль нормали мембраны составляло 1 бар, перпендикулярно нормали мембраны - -50 бар. Радиусы обрезания для Кулоновских взаимодействий и взаимодействий Ван-дер-Ваальса

были равны 20 А. Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле. Начальные скорости атомов определялись с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла. Шаг интегрирования составлял 1 фс, шаг записи в траекторный файл - 10 пс.

Обработка и анализ траекторий осуществлялись с помощью встроенных модулей ОгошасБ 4.5 [29], программы анализа вторичной структуры DSSP [31] и пакета 8сПаЪ 5.2.2 [32-33]. Для визуализации использовался пакет VMD [34].

Результаты и обсуждение

Моделирование мембран

В таблице 1 приведены основные структурные характеристики бислоев после 20 нс моделирования. Усреднение проводилось для последних 2 нс траекторий.

Из таблицы 1 видно, что использованный протокол молекулярной динамики позволяет моделировать мембранные системы, структурные характеристики

Таблица 1

Основные структурные характеристики моделируемых бислоев

Параметр Бислой ДМФХ Бислой 3ДМФЭ:1ДМФГ

Э МД МД

Толщина бислоя, А 33,8 37,1±0,2 37,5±0,2

Площадь поверхности на липид, А2 65,4 55,2±0,2 53,1±0,1

Параметр порядка 0,184 0,218 0,251

Примечание: усреднение проводилось для последних 2 нс траекторий. Для сравнения приведены данные, полученные в экспериментах (Э) [35]

Рис. 3. Расстояние между центрами масс пептида и мембраны: Рис. 4. Флуктуации среднеквадратичного отклонения За- мембрана эукариотической клетки; 3 б - мембрана положения Са-атомов пептида от их начального положения: прокариотической клетки; 3 в - мембрана прокариотической 4 а - мембрана эукариотической клетки; 4 б - мембрана клетки, вертикальная ориентация прокариотической клетки; 4 в - мембрана прокариотической

клетки, вертикальная ориентация

3а

4а

36

46

3в

4в

которых близки к наблюдаемым в экспериментах. Полученные мембраны и разработанный протокол молекулярной динамики использовались для дальнейших вычислений.

Взаимодействие одиночных пептидов с мембранами.

Общая характеристика взаимодействия. При взаимодействии с эукариотической мембраной оба пептида отдалялись от поверхности бислоя (рис. 3); максимальное расстояние между пептидом и мембраной составило 4,7 нм для буфорина-2 (на 17-й

нс траектории) и 6,4 нм для аналога (на 20-й нс). В случае прокариотической мембраны буфорин-2 также отдалялся от поверхности, тогда как аналог, напротив, сближался с мембраной и даже погружался в толщу липидных голов (рис. 5). Погружение было полным и равномерным в случае горизонтальной ориентации аналога; при вертикальной ориентации аналог связывался с мембраной М-концом.

При моделировании с эукариотической мембраной водородные связи между пептидами и

Рис. 5. Положение Са-атомов пептида относительно положения центра масс атомов фосфора верхнего монослоя (у=0) в начале и в конце моделирования: 5 а - мембрана эукариотической клетки; 5 б - мембрана прокариотической клетки; 5 в - мембрана прокариотической клетки, вертикальная ориентация. Слева -

буфорин-2, справа - аналог

поверхностью мембраны либо не образовывались, либо образовывались, но по мере удаления пептида от мембраны разрывались (рис. 6). На последних нс вычислительного эксперимента количество связей между пептидом и эукариотической мембраной составило 0 как для буфорина-2, так и для аналога. В случае аналога на поверхности прокариотической мембраны как в горизонтальной, так и в вертикальной

ориентации количество связей между пептидом и мембраной увеличивалось на протяжении всего эксперимента. Максимальное число водородных связей составило 13 на 20-й нс моделирования в обеих системах. Буфорин-2 либо не связывался с прокариотической мембраной, либо образовывал единичные связи, которые по мере отдаления пептида от мембраны разрывались.

Рис. 6. Общее количество водородных связей в системах: 6 а - мембрана эукариотической клетки; 6 б - мембрана прокариотической клетки; 6 в - мембрана прокариотической клетки, вертикальная ориентация.

Слева - буфорин-2, справа - аналог

6а

66

6в

Согласно существующим представлениям, связывание антимикробных пептидов с мембранами обусловлено главным образом электростатическими взаимодействиями. В проведенных экспериментах оценивалась энергия электростатических взаимодействий отдельных аминокислотных остатков буфорина-2 и аналога с мембраной и водой в последние 2 нс моделирования (рис. 7).

В случае пептидов на поверхности эукариотичес-кой мембраны энергия взаимодействия пептидов с

мембранами была близка к нулю. Для заряженных остатков Thr01, Arg02, Arg05, Arg14, His16, Arg17, Arg20 и Lys21 наблюдались высокие значения энергии взаимодействия с молекулами воды.

Для буфорина-2 на поверхности прокариотической мембраны наблюдается аналогичная картина: пептид не взаимодействует с липидами, а заряженные остатки взаимодействуют с молекулами воды. В случае аналога на поверхности прокариотической мембраны в горизонтальной ориентации значения энергии

Рис. 7. Энергия электростатических взаимодействий отдельных остатков пептидов с мембраной в последние 2 нс моделирования: 7 а - мембрана эукариотической клетки; 7 б - мембрана прокариотической клетки; 7 в - мембрана прокариотической клетки, вертикальная ориентация. Слева - буфорин-2, справа - аналог

взаимодействия с молекулами воды (рис. 7 б, справа) для остатков ТЬг01, А^02, А^14, ЫЫ6, А^20 и Ыз21 были ниже, чем аналогичные значения в других системах. За счет этих остатков аналог электростатически взаимодействовал с поверхностью мембраны прокариот. При вертикальной ориентации аналога в начальный момент времени №конец пептида располагался ближе к поверхности мембраны, чем С-конец. В ходе эксперимента №концевой сегмент

погружался в область липидных голов, тогда как С-концевая часть молекулы оставалась в водном окружении.

Электростатическое связывание с мембраной осуществлялось за счет остатков ТЬг01 и А^02. Энергия электростатических взаимодействий этих двух остатков с молекулами воды была заметно ниже, чем в других системах. Заряженные остатки, расположенные в С-концевой части молекулы аналога, имели высокие

8а

86

8в

Рис. 8. Вторичная структура пептидов на поверхности мембраны последние 2 нс моделирования: 9 а - мембрана эукариотической клетки; 9 б - мембрана прокариотической клетки; 9 в - мембрана прокариотической клетки,

вертикальная ориентация. Слева - буфорин-2, справа - аналог

значения энергии электростатических взаимодействий с растворителем, характерные для остатков, не связанных с липидами мембраны.

Как видно из графиков общего количества водородных связей в системах (рис. 6), в случае буфорина-2 процесс разрушения внутримолекулярных водородных связей пептида согласован с процессом образования связей между пептидом и водой. В случае молекулы аналога разрушение внутримолекулярных водородных связей пептида сопровождается образованием водородных связей между пептидом и мембраной, наиболее ярко этот процесс выражен для аналога на поверхности прокариотической мембраны в горизонтальной ориентации.

Структура пептидов. Характер флуктуаций среднеквадратичного отклонения положения Ca-атомов от их начального положения (рис. 4) свидетельствует о том, что пептиды претерпевают наиболее выраженные изменения структуры в первые нс вычислительного эксперимента. Эти изменения происходят из-за замещения внутримолекулярных водородных связей пептидов на связи между пептидом и молекулами воды. Связывание пептида с

поверхностью мембраны стабилизирует его структуру (рис. 4 б), однако в случае вертикальной ориентации пептида вконец, взаимодействующий с поверхностью мембраны, деформируется больше, чем С-конец (рис. 4 в).

Как видно на графике вторичной структуры пептидов в последние 2 нс моделирования (рис. 8), элементы начальной альфа-спиральной структуры сохраняются лишь у тех пептидов или их сегментов, которые не взаимодействуют с мембраной. Наиболее стабильной во всех случаях оказывается С-концевая область молекул с 14-го по 20-й аминокислотные остатки. В случае связывания с мембраной спираль почти полностью разрушается, хотя, как было отмечено выше, связывание с мембраной значительно ограничивает флуктуации структуры пептидов.

Структура мембран. Основные структурные характеристики мембран при отсутствии и в присутствии пептидов приведены в таблице 2. При наличии в системе пептида характеристики мембран изменялись незначительно. Изменения касались преимущественно тех случаев, когда пептид взаимодействовал с мембраной, и тех молекул

Таблица 2

Основные структурные характеристики бислоёв в отсутствие и в присутствии пептидов

Система Толщина бислоя, Â Площадь поверхности на липид, Â2 Параметр порядка

ДМФХ 37,1±0,2 55,2±0,2 0,218

ДМФХ, буфорин-2 38,6±0,2 52,3±0,1 0,256

ДМФХ, аналог 39,4±0,2 51,4±0,2 0,291

3ДМФЭ: 1ДМФГ 37,5±0,2 53,1±0,1 0,251

3ДМФЭ:1ДМФГ, буфорин-2 38,7±0,2 50,1±0,2 0,326

3ДМФЭ:1ДМФГ, аналог 38,1±0,2 51,4±0,3 0,280

3ДМФЭ:1ДМФГ, буфорин-2 в вертикальной ориентации 36,1±0,2 54,1±0,2 0,255

3ДМФЭ:1ДМФГ, аналог в вертикальной ориентации 36,9±0,5 53,0±0,4 0,256

липидов, с которыми он связывался. Присутствие в среде пептидов нарушало однородность мембран: в той области поверхности, над которой располагался пептид, наблюдалось локальное увеличение толщины мембраны, в то время как остальные области обладали меньшей толщиной по сравнению со средней (данные не приведены). Присутствие в системе пептидов не оказывало влияния на распределение парциальной плотности различных компонентов системы и глубину проникновения молекул воды в толщу мембраны. Локальное уменьшение парциальной плотности воды в некоторых областях ячейки объясняется эффектом вытеснения.

Параметр порядка атомов С ацильных цепей липидов, характеризующий меру упорядоченности гидрофобного ядра мембраны, увеличивался при наличии в системе пептидов (рис. 9). Мера упорядоченности липидных хвостов росла, когда между пептидом и мембраной либо не наблюдалось взаимодействия, либо это взаимодействие было завершено стабильным связыванием пептида с мембраной.

В случае пептидов на поверхности прокариотической мембраны в вертикальной ориентации стабилизирующий эффект присутствия пептидов был скомпенсирован дестабилизирующим влиянием, которое оказывал на липиды протекающий процесс связывания.

Взаимодействие группы пептидов с мембранами

По достижении критической концентрации в растворе литические пептиды образуют кластеры. Дальнейшее взаимодействие с мембраной осуществляется кластером пептидов. В проведенных нами экспериментах группа молекул буфорина-2 не образовывала кластер на поверхности прокариоти-ческой мембраны, а по прошествии 10 нс вычислений наблюдалось лишь незначительное изменение кривизны поверхности мембраны (рис. 2 б). В случае молекул аналога группа пептидов связывалась с отрицательно заряженными молекулами фосфатидилглицерола мембраны за счёт положительно заряженных остатков, боковые цепи которых были обращены в водное окружение и направлены к поверхности мембраны. По прошествии 10 нс

Рис. 9. Параметр порядка атомов С углеводородных цепей липидов: гидратированная мембрана; мембрана с буфорином-2 на поверхности; мембрана с аналогом на поверхности. 10 а - эукариотическая мембрана;

10 б - прокариотическая мембрана

эксперимента отдельные молекулы липидов были частично вырваны из бислоя, мембрана была близка к разрушению (рис. 2 в).

Выводы

В проведенных нами экспериментах буфорин-2 не взаимодействовал с мембранами, однако замена пролина в 13-м положении нативного пептида на аланин привела к появлению у аналога мембраноактивных свойств в отношении модельной мембраны прокариотической клетки. Начальным этапом взаимодействия одиночной молекулы аналога с мембраной было электростатическое притяжение пептида к поверхности, после чего пептид связывался с отрицательно заряженными головками молекул фосфатидилглицерола и погружался в область липидных голов бислоя. Отсутствие взаимодействия с модельной мембраной эукариотической клетки, вероятно, обусловлено отсутствием заряда на поверхности мембраны и её относительно высокой гидрофобностью, которая обеспечивается большим количеством метильных групп фосфатидилхолина.

В случае взаимодействия группы пептидов с модельной прокариотической мембраной буфорин-2 не нарушал структуру бислоя, тогда как отдельные молекулы аналога связывались с отрицательно заряженными липидами мембраны и вырывали их из мембранной толщи. Образования трансмембранных структур в проведенных нами экспериментах не наблюдалось.

Выпрямление молекулы и стабилизация спиральной структуры, вызываемые заменой пролина в составе буфорина-2 на аланин, превращают пептид в литический. В проведенном нами исследовании аналог демонстрировал свойства мембраноактивного пептида, разрушающего мембраны посредством «коврового механизма»: пептиды связываются с поверхностью клетки и дестабилизируют отрицательно заряженные липиды в составе мембраны; по достижении критической концентрации молекул пептида мембрана разрушается, распадаясь на отдельные липидные группы. Можно также предполагать у аналога способность к образованию трансмембранных пор, которые нарушают избирательную проницаемость мембран, что также приводит к лизису клеток. Однако жёсткость, которую приобретает молекула аналога с аминокислотной заменой, может отрицательно сказываться на способности пептидов проникать в толщу мембраны. Представляется вероятным, что аналог буфорина-2 взаимодействует с клетками как через образование трансмембранных пор, так и посредством коврового механизма с преобладанием последнего.

Роль пролина в молекуле нативного буфорина-2 состоит в обеспечении высокой гибкости молекулы. Представляется возможным, что буфорин-2 способен

образовывать в мембранах трансмембранные поры, которые из-за высокого заряда пептида и его гибкости являются крайне нестабильными. Образование пор и их разрушение происходит настолько быстро, что целостность клеточной мембраны сохраняется, однако при разрушении пор часть молекул буфорина-2 оказывается внутри клетки, где взаимодействует с нуклеоидом. Наличие остатка пролина в структуре пептида также важно для поддержания конформации, в которой буфорин-2 эффективно взаимодействует с нуклеиновыми кислотами. Процессы проникновения буфорина-2 через мембраны и взаимодействия с внутриклеточными мишенями требуют дальнейших исследований, детализации и уточнения.

Вычислительные расчеты выполнены с использованием ресурсов суперкомпьютерного комплекса МГУ имени М. В. Ломоносова [36].

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований (№ 12-04-31934\13), гранта Научно-образовательного фонда поддержки молодых ученых Республики Саха (Якутия) (№ 2014-01-0008) и Российского научного фонда (№ 14-24-00172).

Л и т е р а т у р а

1. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. - Nature, 2002. - Vol. 415, No. 6870, P. 389-95.

2. Wang Z., Wang G. APD: the Antimicrobial Peptide Database., - Nucleic Acids Res., 2004. - Vol. 32. - P. D590-2.

3. Wang G., Li X., Wang Z. APD2: the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design., Nucleic Acids Res., 2009. - Vol. 37. - P. D933-7.

4. Piotto S. P., Sessa L., Concilio S., Iannelli P. YADAMP: yet another database of antimicrobial peptides. - Int. J. Antimicrob. Agents, - 2012. - Vol. 39, No. 4. P. 346-51.

5. Thomas S., Karnik S., Barai R. S., Jayaraman V. K., Idicula-Thomas S. CAMP: a useful resource for research on antimicrobial peptides. - Nucleic Acids Res. - 2010. - Vol. 38,

- P. D774-80.

6. Zhao X., Wu H., Lu H., Li G., Huang Q. LAMP: A Database Linking Antimicrobial Peptides. - PLoS One. - 2013. -Vol. 8, No. 6. - P. e66557.

7. Waghu F. H., Gopi L., Barai R. S., Ramteke P., Nizami B., Idicula-Thomas S. CAMP: Collection of sequences and structures of antimicrobial peptides. - Nucleic Acids Res. 2014. - Vol. 42, - P. D1154-8.

8. Fox J. L. Antimicrobial peptides stage a comeback.

- Nat. Biotechnol., 2013. - Vol. 31, No. 5, - P. 379-82.

9. Park C. B., Kim M. S., Kim S. C. A novel antimicrobial peptide from Bufo bufo gargarizans. - Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol. 218, No. 1. - P. 408-413.

10. Yi G. S., Park C. B., Kim S. C., Cheong C. Solution structure of an antimicrobial peptide buforin II. - FEBS Lett. 1996.

- Vol. 398, No. 1. - P. 87-90.

11. Giacometti A., Cirioni O., Del Prete M. S., Paggi A. M., D'Errico M. M., Scalise G. Combination studies between polycationic peptides and clinically used antibiotics against Grampositive and Gram-negative bacteria. - Peptides, 2000. - Vol. 21, No. 8. - P. 1155-1160.

12. Giacometti A., Cirioni O., Barchiesi F., Del Prete M. S., Fortuna M., Caselli F., Scalise G. In vitro susceptibility tests for cationic peptides: comparison of broth microdilution methods for bacteria that grow aerobically. -Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44, No. 6. - P. 1694-1696.

13. Giacometti A., Cirioni O., Del Prete M. S., Barchiesi F., Fortuna M., Drenaggi D., Scalise G. In Vitro Activities of Membrane-Active Peptides Alone and in Combination with Clinically Used Antimicrobial Agents against Stenotrophomonas maltophilia. - Antimicrob Agents Chemother, 2000. - Vol. 44, No. 6. - P. 1716-9,

14. Giacometti A., Cirioni O., Del Prete M. S., Barchiesi F., Scalise G. Short-term exposure to membrane-active antibiotics inhibits Cryptosporidium parvum infection in cell culture. -Antimicrob Agents Chemother, 2000. - Vol. 44, No. 12. P. 3473-5.

15. Giacometti A. Comparative activities of polycationic peptides and clinically used antimicrobial agents against multidrug-resistant nosocomial isolates of Acinetobacter baumannii.

16. Giacometti A., Cirioni O., Ghiselli R., Goffi L., Mocchegiani F., Riva A., Scalise G., Saba V. Polycationic peptides as prophylactic agents against methicillin-susceptible or methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis vascular graft infection. - Antimicrob. Agents Chemother., 2000. - Vol. 44, No. 12. - P. 3306-3309.

17. Giacometti A., Cirioni O., Ghiselli R., Goffi L., Mocchegiani F., Riva A., Scalise G., Saba V. Efficacy of polycationic peptides in preventing vascular graft infection due to Staphylococcus epidermidis. - J. Antimicrob. Chemother., 2000. -Vol. 46, No. 5. -P. 751-756.

18. Ghiselli R., Giacometti A., Cirioni O., Mocchegiani F., Viticchi C., Scalise G., Saba V. Cationic peptides combined with betalactams reduce mortality from peritonitis in experimental rat model. - J. Surg. Res., 2002. - Vol. 108, No. 1. -P. 107-111.

19. Giacometti A., Cirioni O., Ghiselli R., Mocchegiani F., Del Prete M. S., Viticchi C., Kamysz W., Lempicka E., Saba V., Scalise G. Potential therapeutic role of cationic peptides in three experimental models of septic shock. - Antimicrob. Agents Chemother., 2002. - Vol. 46, No. 7. P. 2132-2136.

20. Park C. B., Kim H. S., Kim S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998. -Vol. 244, No. 1. - P . 253-257.

21. Liang J. F., Kim S. C. Not only the nature of peptide but also the characteristics of cell membrane determine the antimicrobial mechanism of a peptide. - J. Pept. Res. Off. J. Am. Pept. Soc., 1999. - Vol. 53, No. 5. P. 518-522.

22. Takeshima K., Chikushi A., Lee K.-K., Yonehara S., Matsuzaki K. Translocation of analogues of the antimicrobial peptides magainin buforin across human cell membranes. - J. Biol.

Chem., 2003. - Vol. 278, No. 2. P. 1310-1315.

23. Park C. B., Yi K. S., Matsuzaki K., Kim M. S., Kim S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: the proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. - Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000. - Vol. 97, No. 15. - P. 8245-8250.

24. Kobayashi S., Takeshima K., Park C. B., Kim S. C., K. Matsuzaki. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: proline as a translocation promoting factor. - Biochemistry, 2000. - Vol. 39, No. 29. P. 8648-8654.

25. Kobayashi S., Chikushi A., Tougu S., Imura Y., Nishida M., Yano Y., Matsuzaki K. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. - Biochemistry, 2004. - Vol. 43, No. 49. P. 15610-15616.

26. Fahy E., Subramaniam S., Murphy R. C., Nishijima M., Raetz C. R. H., Shimizu T., Spener F., van Meer G., Wakelam M. J. O., Dennis E. A. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. - J. Lipid Res., 2009. Vol. 50 Suppl. - P. S9-14.

27. Jorgensen W. L., Chandrasekhar J., Madura J. D., Impey R. W., Klein M. L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. - J. Chem. Phys., 1983. - Vol. 79, No. 2. - P. 926.

28. Froimowitz M. HyperChem: a software package for computational chemistry and molecular modeling. -Biotechniques, 1993. - Vol. 14, No. 6. - P. 1010-1013.

29. Hess B., Kutzner C., van der Spoel D., Lindahl E. GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation. - J. Chem. Theory Comput., 2008. - Vol. 4, No. 3. - P. 435-447.

30. Kaminski G. A., Friesner R. A., Tirado-Rives J., Jorgensen W. L. Evaluation and Reparametrization of the OPLS-AA Force Field for Proteins via Comparison with Accurate Quantum Chemical Calculations on Peptides. - J. Phys. Chem. B, 2001. - Vol. 105, No. 28. - P . 6474-6487.

31. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. - Biopolymers, 1983. - Vol. 22, No. 12. P. 2577-2637.

32. Campbell S. L., Chancelier J. Modeling and Simulation in Scilab / Scicos. - Model. Simul. ScilabScicos with ScicosLab 44, 2006. - P. 1-308.

33. Scilab Enterprises (2012). Scilab: Free and Open Source software for numerical computation (OS, Version 5.XX) [Software]. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.scilab.org.

34. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: visual molecular dynamics. - J. Mol. Graph., 1996. - vol. 14, no. 1. -P. 33-8, 27-8.

35. Petrache H. I., Dodd S. W., Brown M. F. Area per lipid and acyl length distributions in fluid phosphatidylcholines determined by (2)H NMR spectroscopy. - Biophys. J., 2000. -Vol. 79, No. 6. - P. 3172-92.

36. Sadovnichy V., Tikhonravov A., Voevodin V., Opanasenko V. Lomonosov': Supercomputing at Moscow State University. Contemporary High Performance Computing: From Petascale toward Exascale, 2013. - P. 283-307.