КОМПЛЕКСНАЯ СИСТЕМА ДИАГНОСТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ И ПРОТОЗООНОЗОВ
INTEGRATED HELMINTHIASIS AND PROTOZOONOSIS DIAGNOSTICS SYSTEM

Изобретение относится к области медицинской лабораторной диагностики протозоонозов и гельминтозов человека в основе которого лежит оптимальная комбинация методов лабораторной диагностики гельминтозов и протозоонозов в пробах фекалий, в том числе и из консервантов.
Цель изобретения разработать комплексную систему (КС) для диагностики гельминтозов и протозоонозов, позволяющая использовать оптимальный набор методов копрологической диагностики и решать следующие задачи: 1) проводить исследования на разные виды паразитов из одной пробы фекалий; 2) использовать оптимальную комбинацию диагностических приемов за счет дублирования и взаимодополнения используемых методик; 3) выявлять микст-инвазию и оценивать интенсивность инвазии. При создании КС для диагностики гельминтозов и протозоонозов использован оптимальный арсенала методов копрологической диагностики и для решения следующих диагностических задач: выявлять разные виды паразитов из одной пробы; оптимизировать комбинацию диагностических приемов за счет дублирования и взаимодополнения используемых методик, в зависимости от клинических данных; выявлять микст-инвазии и степени интенсивности инвазии.
Гельминтозы и протозойные болезни составляют существенную часть инфекционной патологии человека. В последнее время под воздействием различных факторов происходит изменение клинической картины паразитарных заболеваний, проявляющееся в не специфичности проявлений, бессимптомном течении, формировании у паразитов клеточных структур, способных изменять иммунный ответ хозяина на присутствие в организме паразита. Особенностью большинства паразитарных болезней является субклиническое, медленное развитие болезни, хроническое течение, нередко с длительной компенсацией, не сопровождающееся развитием острых симптомов [4,7,8,12,14,15]. Вследствие полиморфизма и неспецифичной клинических симптомов, субклиническом течении при диагностике многих гельминтозов большое значение имеют данные эпидемиологического анамнеза и лабораторные паразитологические исследования [8,3,13]. Качество лабораторной диагностики, уровень выявляемости паразитов напрямую зависят от оптимальных методов диагностики, правильного забора материала, его хранения и транспортировки [1,2,5,9]. Разнообразие возбудителей определяет достаточно широкий спектр методов паразитологической диагностики, среди которых ведущее значение принадлежит прямым методам обнаружения гельминтов, их фрагментов, яиц и личинок, вегетативных и цистных форм патогенных простейших. Несмотря на введение в действие новых МУК 4.2.3145-13 проблема оптимизации лабораторной диагностики гельминтозов и протозоонозов остается весьма актуальной. Вместе с тем необходимо отметить, что несмотря на обнадеживающие результаты использования других комплексных "Диагностических систем" таких как КТ-МФЭО-МЦН (Консервант Турдыева, метод формалин эфирного обогащения-модификация Циля- Нильсена) представленных в некоторых исследованиях [13], они не нашли практического применения в арсенале современной лаборатории и практически не используются.
Заявленная к изобретению комплексная система (КС) для диагностики гельминтогзов и протозоонозов, позволяет использовать оптимальный арсенал методов копрологической диагностики и решать следующие задачи:
- проводить исследования на разные виды паразитов из одной пробы фекалий
- использовать оптимальную комбинацию диагностических приемов за счет дублирования и взаимодополнения используемых методик
- выявлять микст-инвазии и степени интенсивности инвазии. Что существенно отличает ее от таких прототипов как «Диагностическая система» КТ-МФЭО-МЦН.
В основе патентуемой КС лежит оптимальная комбинация методов лабораторной диагностики гельминтозов и протозоонозов, а именно забор кала из консерванта Турдыева, метод влажного мазка из консерванта, модифицированный метод Като и Миура (из консерванта), комбинированный гельминтоовоскопический метод, метод флотации с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка. К основным группам методов используемых для прямых микроскопических исследований на гельминтов и протозойные инвазии относят методы седиментации, флотации, значимость также сохраняет метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура (для диагностики гельминтозов). В основе методов седиментации, которые широко применяются для паразитологического обследования [8,9] лежит разность удельного веса используемых химических реактивов и яиц гельминтов- удельный вес яиц высокий и они концентрируются в осадке [8,9]. К основным методам седиментации относят- методы формалин-эфирной или уксусной седиментации. Использование седиментационных методов ограничивается необходимостью использования эфира и уксусной кислоты, что не всегда представляется возможным в условиях клинико-диагностической лаборатории. Также, к недостаткам данной группы методов следует отнести трудоемкость выполнения методик, необходимость большого набора реагентов. Этих ограничений не отмечается в современной модификации этой группы методов - одноразовых системах "PARASEP", минисистем "Real" применение которых ограничено высокой стоимостью концентраторов. Методы флотации, основываются на всплытии яиц гельминтов. В них применяются насыщенные или высокой плотности растворы различных солей или других жидкостей, удельный вес которых выше, чем удельный вес яиц паразитов. В поверхностной пленке обнаруживаются яйца большинства гельминтов, что исключает необходимость исследования осадка. Методы флотации преимущественно используются для диагностики яиц трематод и цестод. Методы малоэффективны для выявления яиц нематод. Из арсенала флотационных методов паразитологической диагностики в новой редакции МУК сохранили свою значимость методы Калантрян, использующий растворы нитрата натрия или азотнокислого натрия с плотностью 1,38-1,40 и Фюллюборна использующий насыщенный раствора хлорида натрия с плотностью 1,18-1,20. На эффективность работы этой группы методов кроме строго обязательного соблюдения условия оптимальной плотности раствора влияет значительное количество других факторов- скорость кристаллизации (один из главных недостатков всех однокомпонентных солевых флотационных растворов), большое количество детрита, затрудняющего поиск. Этих недостатков, во многом, лишены флотационные растворы, состоящие из нескольких ингредиентов, каждый из которых выполняет определенную функцию- замедляет время кристаллизации капли на предметном стекле, удешевляет стоимость проводимого анализа, увеличивает удельную плотность смеси [5,6,10].
В основе КС лежит использование консерванта Турдыева, метод влажного мазка из консерванта, модифицированного метод Като (из консерванта), комбинированного гельминтоовоскопического метода, метод флотации с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка.
В заявленном способе изобретении на первом этапе обследования кал собирается в консервант Турдыева и смешивается в соотношении: 1:3 (часть кала и 3 части консерванта). Условия для образцов фекалий: используются фракции фекалий из последней порции (прилежащие к тонкой кишке), собранные из 6-7 мест; перед исследованием на 2-3 дня исключаются медикаменты в связи с возможностью повреждения морфологии цист.
2
Используется следующая пропись Консерванта Турдыева: 80,0 мл 0,2% раствора азотистокислого натрия (0,16 г NaNO + 80,0 мл воды дистиллированной) + 2,0 мл глицерина + 10,0 мл концентрированного формалина (аптечного) + 8,0 мл концентрированного раствора Люголя.
На втором этапе обследования приготавливают две флотационные системы:
2
1) Флотационная система (трехкомпонентная), в состав которой входят насыщенные водные растворы хлорида цинка (ZnCl, ρ - 1,82), хлорида натрия (NaCl, ρ - 1,19) и глицерин в соотношении 2:1:1.
2) Флотационная система для выявления яиц трематод - насыщенный водный раствор хлористого цинка (ρ - 1, 82).
Пример, методики исследования кала КОМПЛЕКСНОЙ СИСТЕМОЙ.
1) Метод влажного мазка из консерванта- из пробы с консервантом, не взбалтывая содержимое флакона деревянной палочкой отобрать патологические примеси или немного фекалий (с булавочную головку), поместить в каплю с физиологическим раствором и в каплю с раствором Люголя, растереть до получения равномерной негустой эмульсии. Микроскопировать (проба N 1).
2) Модифицированный метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура. Не взбалтывая содержимое флакона, пипеткой нанести придонный осадок в количестве 0,5 мл на предметное стекло. Растереть индивидуальной палочкой (стеклянной, деревянной). Фекалии накрыть целлофановой полоской, обработанной в растворе Като. Целлофан сверху притереть резиновой пробкой или специальным валиком, ширина которого соответствует или немного больше ширины предметного стекла, до получения тонкого, равномерного, прозрачного слоя. Препарат выдержать при комнатной температуре в течение 1 часа. Микроскопировать (проба N 2)
3) Комбинированный гельминтоовоскопический метод. Не взбалтывая содержимое флакона, придонный осадок в количестве 0,5 мл. внести в 40-60 мл воды и тщательно размешать. После 5 минутного отстаивания над осадочную жидкость удалить. На дне оставить около 8-10 мл смеси, перелить в центрифужную пробирку, центрифугировать 5 мин. при 3000 об. /мин., после чего к осадку добавить флотационный раствор - трехкомпонентная флотационную систему. Тщательно перемешать. Осадок центрифугировать 5 мин. при 3000 об. /мин. Поверхностную пленку раствора снять при помощи стандартной металлической петли, перенести на предметное стекло (строго 8 капель). Микроскопировать (проба N 3)
4) Метод флотации с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка. Проводиться по показаниям - эпидемиологические, клинические данные и/или положительные результаты иммуноферментного анализа на антитела к антигенам описторхиса. Реализация метода: в химический стаканчик объемом 30-60 мл налить небольшое количество флотационного раствора и внести 0,5 мл придонного осадка из консерванта. Тщательно размешать палочкой. Удалить сразу же после размешивания всплывшие крупные частицы. Добавить флотационный раствор до образования выпуклого мениска. Через 30-40 мин. поверхностную пленку раствора снять при помощи стандартной металлической петли, перенести на предметное стекло (8-10 капель). Микроскопировать (проба N 3).
Особенности микроскопии. Микроскопировать при увеличении: объектив × 8 или × 10, окуляр × 7 или × 10; для уточнения морфологического строения яиц гельминтов, для дифференциальной диагностики амеб и жгутиковых, включая лямблии - объектив × 40. Микроскопия имеет ограничение во времени и должна быть проведена в течении 1-2 часов. Микроскопируют последовательно- пробы N 4, проба N 3 с (для устранения кристаллизации раствора), затем исследование на простейшие (проба N 1) и проба N 2. Оптимальным является микроскопия параллельно стекол N 4 и N 3 силами 2 врачей клинической лабораторной диагностики или 1 врача клинической лабораторной диагностики и 1 фельдшера-лаборанта. При отрицательном результате комплексного паразит логического обследования с учетом феномена прерывистого цист выделения на лямблии и другие простейшие исследование повторяют с интервалом в 3-5 дней (исследование N 1 повторяют 3-5 раз).
Комбинированный гельминтоовоскопический метод (КГМ) диагностики гельминтозов и протозойных инвазий, объединяющий методы флотации и седиментации [5,10]. В данном методе используется оригинальная флотационная система, в состав которой вошли насыщенные водные растворы хлорида цинка (ZnCb, ρ-1,82), хлорида натрия (NaCl, ρ-1,12) и глицерин(х.ч.) соотношении 1:1:1.
Показано на большом количестве обследованных (>500 обследованных в год, таб. N 1), что по выявляемости яиц нематод КГМ имеет преимущества перед формалин (уксусно)-эфирной седиментацией и методом PARASEP (выявляет значительно большее количество яиц, что ценно при инвазиях низкой интенсивности), методом толстого мазка под целлофаном по Като и Миура (выявляет большее количество яиц, что важно при инвазиях средней и низкой степени интенсивности, дифференцированные критерии оценки интенсивност инвазии см. ниже). По выявляемости яиц трематод сопоставимыми и оптимальными являются методы PARASEP и формалин-эфирной (уксусно-эфирной) седиментации (выявляют высокую, среднюю и низкую интенсивность инвазий). По выявляемости яиц трематод КГМ имеет преимущества перед методом толстого мазка под целлофаном (выявляет инвазии высокой степени интенсивности) и практически, диагностическая чувствительность данного метода для диагностики трематодозов очень низкая. По выявляемости яиц цестод при высокой и средней интенсивности инвазии КГМ сопоставим с методами формалин-(уксусно-эфирной) седиментация и PARASEP- при этом, как в методах седиментации, так и при использовании КГМ выявляются деформированные и нечетко идентифицируемые яйца, что следует отнести к недостаткам данной группы методов. Показано, что оптимальным для диагностики цестодозов среди изучаемой группы методов является метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура (выявляет недеформированные яйца и имеет диагностическую ценность при инвазиях низкой степени интенсивности). При диагностике протозоонозов (цисты лямблий, изоспоры) КГМ имеет преимущество по сравнению с методами PARASEPT, формалин (уксусно-эфирной) седиментации, нативного мазка с физиологическим раствором и раствором Люголя (выявляет большее количество цист, что ценно при низкой степени инвазии). Методы-нативный мазок с физиологическим раствором и раствором Люголя, формалин (уксусно) -эфирной седиментации, PARASEPT для диагностики протозоонозов являются сопоставимыми-выявляют инвазии преимущественно средней и высокой интенсивности. Недостаточная диагностическая ценность данных методов для диагностики низкой степени инвазий при протозоонозах определяется более выраженной загрязненностью поля просмотра детритом, по сравнению с КГМ, что затрудняет поиск паразитов.
Таким образом, КГМ оптимально может использоваться для диагностики нематодозов и протозоонозов. Несмотря на существенные недостатки (недостаточно эффективная диагностика трематодозов и цестодозов), ее использование позволило решить следующие задачи:
- Создать оптимальный флотационный раствор для выявления яиц нематод и цистных форм простейших.
- Увеличить время кристаллизации для более длительного просмотра образцов
- Резко уменьшить количество детрита для оптимального просмотра образцов
- Уменьшить себестоимость анализа по сравнению с сопоставимыми по диагностической ценности методами (PARASEPT).
Для нивелирования недостатков моно компонентных методов, и в частности КГМ, была разработана КС для диагностики гельминтозов и протозоонозов.
Составляющими КС являются забор кала в консервант Турдыева (см. выше), метод влажного мазка из консерванта, модифицированный метод Като и Миура (из консерванта), комбинированный гельминтоовоскопический метод. Для оптимизации диагностики трематодозов по показаниям используется методика флотации с насыщенным водным раствором хлористого цинка, который за счет более высокого удельного веса способствует выявлению яиц трематод при низких степенях инвазии. В КС обследование дублируется: на протозоонозы КГМ и нативный мазок с физиологическим раствором и раствором Люголя, на нематодозы и цестодозы -метод толстого мазка по целлофану по Като и Миура и КГМ, на трематодозы -КГМ с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка. КС для диагностики гельминтозов и протозоонозов была апробирована на большом количестве больных (>600 в год).
КС позволяет использовать оптимальный арсенал методов копрологической диагностики и решать следующие задачи:
- проводить исследования на разные виды паразитов из одной пробы фекалий
- использовать оптимальную комбинацию диагностических приемов за счет дублирования и взаимодополнения используемых методик
- выявлять микст и оценивать интенсивность инвазии.
Примеры, применимости изобретения КС в диагностике гельминтозов
Разработанная КС в диагностике гельминтозов была апробирована в сопоставлении с монометодами- толстый мазкок под целлофаном по Като и Миура, "PARASEP", формалин-эфирная седиментация. Для оценки интенсивности инвазии были введены дифференцированные критерии - для нативных препаратов (метод толстого мазка под целлофаном по Като и Миура) и методов седиментации, флотации и КС. В методе толстого мазка под целлофаном по Като и Миура интенсивность инвазии оценивалась как- низкая (не более 1-2 яиц гельминтов в препарате), средняя (0-1 яйцо в поле зрения), высокая (более 2 яиц в поле зрения). В методах седиментации, флотации и КС интенсивность инвазии оценивалась как - низкая (0-1 яйцо в поле зрения), средняя (1-2 яйца в поле зрения), высокая (3 и > яиц в поле зрения).
Сравнение комплексного обследования на гельминтов по критерию выявляемости паразитов на основании собственного опыта и данных литературы представлены в таб. N2. При диагностике нематодозов (преимущественно аскаридоз) диагностическая ценность КС при инвазиях высокой степени интенсивности была сопоставима с методом толстого мазка под целлофаном по Като и Миура, формалин-эфирной седиментации, "PARASEP"; при инвазиях средней степени с методом формалин-эфирной седиментации, "PARASEP"; низкой степени - только с "PARASEP". Диагностическая ценность методов (толстый мазок под целлофаном по Като и Миура, формалин-эфирной седиментации) при низкой степени инвазии была менее значимой. Диагностическая ценность КС в диагностике цестодозов (преимущественно геминолепидоз) при инвазиях высокой и средней степени интенсивности была сопоставима с методами толстого мазка под целлофаном по Като и Миура, "PARASEP", формалин-эфирной седиментации. При инвазиях низкой степени интенсивности диагностическая значимость КС была сопоставима только с методом толстого мазка под целлофаном по Като и Миура. При диагностике трематодозов была использована модификация КС с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка. Диагностическая ценность КС при инвазиях высокой и средней интенсивности была сопоставима с методами "PARASEP" и формалин-эфирной седиментации; при инвазиях низкой интенсивности с методом "PARASEP".
Таким образом, использование КС с оптимальной комбинацией приемов позволило преодолеть недостатки монометодов диагностики гельминтозов, в частности трематодозов (введение модификации с насыщенным водным раствором хлористого цинка) и цестодозов (использование в наборе методов модифицированного метода толстого мазка под целлофаном по Като и Миура). Также оптимизация паразитологической диагностики в КС определяется и возможностью дублирования методов при проведении исследований из единой пробы фекалий.
Примеры, реализации возможностей использования КС в диагностике протозойных инвазий.
К основным методам диагностики при исследовании кала на простейшие кишечника являются методы формалин (уксусно) эфирной седиментации и их модификации с применением концентраторов "PARASEP" и минисистем Real. К специальным методам диагностики протозойных инвазий относиться метод влажного мазка с физиологическим раствором и раствором Люголя или метиленовым синим [9], при этом он может проводиться как с использованием, так и без предварительного использования консерванта. КС для диагностики протозоонозов была апробирована в сопоставлении с методами -"PARASEP", формалин-эфирной седиментации, нативный мазок без использования консерванта, влажный мазок из консерванта (таб. N3). Для более полной оценки сопоставимости и диагностической эффективности методов эмпирическим путем (оценка результатов ИФА, данные клинического обследования) были выработаны критерии оценки степени инвазии. В методах концентрирования цист ("PARASEP", метод формалин-эфирной седиментации, КС) были введены параметры - низкая - 1-2 цисты в 3-5 полях зрения, средняя - 2-3 цисты в 3-5 полях зрения, высокая -более 4-5 цист в 3-5 полях зрения. Для методов использующих нативный мазок были введены параметры: низкая - 0-1 цисты в 3-5 полях зрения, средняя-1-2 цисты в 3-5 полях зрения, высокая - более 2-3 цист в 3-5 полях зрения.
Сравнение методов диагностики кишечных простейших по критерию выявляемости на основании собственных исследований с учетом интенсивности инвазии представлены в таб. N 2. При диагностике протозойных инвазий диагностическая ценность КС при инвазиях высокой степени интенсивности была сопоставима с "PARASEP", формалин-эфирной седиментацией, влажный мазок из консерванта. Нативный мазок без использования консерванта демонстрировал минимальную диагностическую ценность. При инвазиях средней степени интенсивности диагностическая ценность КС была сопоставима с методами "PARASEP", формалин-эфирной седиментации. Методы нативный мазок и влажный мзок из консерванта демонстрировали минимальную диагностическую ценность. При инвазиях низкой степени интенсивности КС имела наиболее высокую диагностическую ценность. Методы "PARASEP", формалин-эфирной седиментации имели минимальную диагностическую ценность, что определялось более выраженной загрязненностью полей просмотра детритом, что затрудняло поиск паразитов при низкой степени инвазии.
Таким образом, КС использующая комбинацию методов- консервант Турдыева, метод влажного мазка из консерванта, модифицированный метод Като и Миура (из консерванта), КГМ, метод флотации с использованием насыщенного водного раствора хлористого цинка позволяет оптимизировать паразитологическую диагностику и решить ряд задач:
- Диагносцировать нематодозы,цестодозы, трематодозы и протозоонозы, а также микст-инвазии в одной диагностической системе.
- Флотационная система позволяет оптимизировать время просмотра образца, удельную плотность флотационного раствора, значительно уменьшить количество детрита в пробе, уменьшить себестоимость анализа.
- Комплексная диагностическая система позволяет диагностировать инвазии низкой, средней и высокой эффективности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агафонова Е.В., Тюрин Ю.А., Долбин Д.А.. Куликов С.Н. К оптимизации диагностики лямблиоза. // Казанский медицинский журнал. - 2007. - №5. - С. 495 -496.
2. Агафонова Е.В., Долбин Д,А„ Куликов С.Н., Тюрин Ю.А. Современные аспекты диагностики лямблиоза у человека // Русский медицинский журнал. - 2008.- Т. 16. - №17.- с. 1120-1123.
3. Акбаев М.Ш., Водянов А.А. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М., «Колос», 2002.-С. 66 - 77.
4. Баранова И.П., Лесина О.Н. Гельминтозы и другие паразитарные заболевания .- Пенза, ГОУ ДПО.2008. - 80 с.
5. Долбин Д.А., Агафонова Е.В., Смирнова Л.Р., Хазиева С.М. Пути улучшения качества лабораторной диагностики гельминтозов. // Казанский медицинский журнал. -  2007. - №4. - С. 398-412
6. Долбин Д.А., Лутфуллин М.X., Латыпов Д.Г. Сравнительная эффективность различных гельминтоовоскопических методов для диагностики неоаскаридоза телят.// Тр. ВИГИС.- Т. 41. - М. - 2005. - С.2005. - С. 154 - 160.
7. Одинцева В. Е. Современные особенности глистно-паразитарных инвазий у детей: -Автореф.дис…канд. мед .наук. - СПб.-2010. - С. 16.
8. Паразитарные болезни человека (протозоонозы и гельминтозы): Руководство для врачей// Под. редакцией В.П. Сергиева, Ю.В. Лобзина., С.С. Козлова.- СПб. ООО "Издательство Фолиант", 2008. - 595 с.:ил.
9. «Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоонозов». Методические указания, 2013, 2-е изд., испр. и доп., М.: ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии"Роспотребнадзора. - 118 с.
10. Долбин Д.А., Фассахов Р.С, Тюрин Ю.А и др. Патент на изобретение «Способ диагностики аскаридоза у человека» Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 сентября 2009 г.. (N 2368324).
11. Долбин Д.А., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С. И др. Патент на изобретение «Способ диагностики лямблиозной инвазии» Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2009 г.. (N 2371719)
12. Поляков В. Е., Лысенко А. Я. //Гельминтозы у детей и подростков. - М., «Медицина», 2003. - С.6 - 11.
13. Торопова Н.П., Сафронова Н.А. Синявская О.А. и др. Дерматозы и паразитарные болезни у детей и подростков: аспекты патогенеза, клиники, диагностики, лечения и профилактики: Екатеринбург., Издательство Урал. Ун-та.- 2005.- 60 с.
14. Токмалаев А.К., Кожевникова Г.М. Клиническая паразитология: протозоозы и гельминтозы.-М.:000"Медицинское информационное агентство",2010.-С.432.
15. Халафли Х.Н. Влияние кишечных паразитозов на состояние здоровья детей-Фундаментальные исследования.-2013.- N 9-1.-С.156-162.