МИНИАТЮРНАЯ МАГНИТНАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
MINIATURE MAGNETIC FLOW CYTOMETRY

Данное изобретение относится к магнитному обнаружению клеток в потоке.
В области измерения клеток и обнаружения клеток, наряду с оптическими способами измерения, такими как измерения рассеиваемого света или флуоресценции, известны также магнитные способы обнаружения, в которых подлежащий обнаружению сорт клеток маркируют с помощью магнитных меток.
В частности, для магнитного измерения известны способы, в которых магнитно маркированные клетки отсортировывают с помощью магнитофореза из комплексной клеточной суспензии, например пробы крови. Для этого эту комплексную суспензию необходимо сначала подготавливать соответствующим образом, с целью обеспечения возможности отделения из нее подлежащих обнаружению клеток. Магнитная маркировка осуществляется, в частности, тем, что в комплексную клеточную пробу вводят специфичную для клеток метку. Магнитофорез применяется до настоящего времени для сортировки магнитно маркированных клеток или в целом магнитных частиц.
Однако в области магнитно-резистивной сенсорики для обнаружения клеток можно также динамически считать магнитно маркированные клетки в комплексной суспензии в потоке. Для этого важно, чтобы клетки по отдельности друг за другом протекали через датчик и чтобы магнитно маркированные клетки проходили достаточно близко к магниторезистивному датчику вдоль него.
Поэтому в магнитном проточном цитометре маркированные клетки транспортируются в канале поверхностно над магнитным датчиком. Близость магнитно маркированных клеток к датчику имеет решающее значение, поскольку магнитное поле рассеяния магнитных меток, на основании которого в конечном итоге маркированная клетка обнаруживается датчиком, уменьшается пропорционально третьей степени расстояния.
Для обеспечения прохождения маркированной клетки в непосредственной близости от датчика можно в принципе выполнять возможно меньший диаметр канала, через который протекает проба клеток. То есть в экстремальном случае диаметр канала как раз настолько велик, что могут проходить отдельные клетки. При этом, естественно, возникает проблема, что за счет присутствия загрязнений, соответственно, посторонних частиц очень быстро происходит закупоривание канала.
Если же канал выполнить больше, то повышается вероятность того, что некоторые маркированные клетки проходят мимо датчика вне его дальности действия и тем самым не обнаруживаются. Этому можно противодействовать тем, что магнитно маркированные клетки концентрируются. Было установлено, что возможно более длинный путь концентрации через микроканал для текучей среды длиной до 1 см положительно сказывается на том, что в конце участка концентрации (или, по-другому, участка концентрирования) почти 100% магнитно маркированных клеток концентрируются из комплексной суспензии у дна канала так, что становится возможным измерение с помощью магнитного датчика. Однако расположение такого длинного участка концентрации на полупроводниковой подложке, на которой образован магниторезистивный конструктивный элемент, приводит к большому соотношению ширины и толщины подложки, что наряду с высокой стоимостью всей поверхности, в частности, для кремниевого кристалла, приводит также к проблемам обработки в процессе изготовления. Чем выше скорость потока и чем больше концентрация клеток в пробе, тем длиннее необходимо выбирать путь концентрации, с целью обеспечения достаточной концентрации магнитно маркированных клеток в момент перехода над датчиком.
Задачей данного изобретения является создание устройства для магнитного обнаружения клеток, которое при одинаковой точности концентрации и измерения обеспечивает возможность уменьшения полупроводниковой подложки, в частности кремниевого чипа, и тем самым также упрощения расположения измерительной схемы на платине.
Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, заключается в миниатюризации устройства для магнитной проточной цитометрии за счет использования участка концентрирования, выполненного в форме меандра.
Задача изобретения решена с помощью устройства согласно пункту 1 формулы изобретения. Соответствующий способ изготовления указан в пункте 11 формулы изобретения. Способ магнитного обнаружения клеток указан в пункте 14 формулы изобретения. Предпочтительные варианты выполнения изобретения являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения.
Устройство для магнитной проточной цитометрии содержит магниторезистивный датчик, с помощью которого обеспечивается возможность обнаружения магнитно маркированных клеток. Кроме того, устройство содержит проточную камеру, в частности микроканал для текучей среды, который предназначен для прохождения потока клеточной суспензии. В частности, микроканал для текучей среды имеет для этого вход, через который клеточную пробу можно инъецировать в устройство обнаружения. Кроме того, внутренняя поверхность микроканала для текучей среды может быть согласована, например, относительно свойств своей поверхности, с клеточной пробой, в частности, с ее вязкостью. Кроме того, устройство содержит участок концентрации, при этом участок концентрации выполнен в форме меандра. При этом участок концентрации целесообразно проходит вдоль микроканала для текучей среды. При направлении магнитно маркированной клеточной пробы непосредственно после инъекции по магнитному датчику не могут быть естественно измерены все маркированные клетки, поскольку в момент времени инъекции клеточной пробы в устройство магнитно маркированные клетки в клеточной пробе еще расположены хаотично и случайным образом во всем объеме пробы. Поэтому участок концентрации проходит, в частности, во внешнем магнитном поле, которое создается, например, с помощью постоянного магнита. В этом магнитном поле на магнитно маркированные клетки в клеточной суспензии действует магнитная сила, за счет которой они перемещаются, например, в направлении дна микроканала для текучей среды. Тем самым магнитно маркированные клетки могут концентрироваться у дна канала, а затем могут направляться достаточно близко над магниторезистивным датчиком. Лишь за счет этого обеспечивается надежное по существу 100%-ное обнаружение каждой отдельной магнитно маркированной клетки. Чем длиннее участок концентрации, тем надежнее концентрация всех магнитно маркированных клеток до момента прохода над датчиком на дне канала.
Преимуществом имеющего форму меандра участка концентрации является уменьшенная занимаемая площадь и возможная за счет этого миниатюризация всего измерительного устройства и возможная интеграция всего измерительного устройства на полупроводниковом чипе.
Таким образом, устройство имеет решающее преимущество за счет уменьшения занимаемой площади для магнитофорезного участка концентрации и уменьшения стоимости полупроводниковой подложки, в частности, дорогого кремниевого кристалла. Также за счет небольшого соотношения ширины и толщины кристалла обеспечивается простота обработки. Кристаллом обозначается, например, не заключенный в корпус полупроводниковый чип, интегрированный электронный конструктивный элемент, полупроводниковая или сенсорная подложка.
Кроме того, наряду с полупроводниковым чипом, уменьшается также весь микрообъем текучей среды, что приводит к большому уменьшению стоимости и упрощению изготовления датчика. Более длинный участок концентрации можно предпочтительно использовать для повышения скорости потока клеточной пробы и тем самым для увеличения пропускной способности и/или для уменьшения необходимого для пробы времени измерения.
Проточная камера, т.е. в частности микроканал для текучей среды, имеет, например, диаметр примерно 1000 мкм, что во много раз превышает диаметр клеток. В принципе может быть реализован диаметр канала между 30 мкм и 30000 мкм.
В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения участок концентрации устройства для магнитной проточной цитометрии имеет магнитные направляющие полосы. Они расположены, в частности, так, что они направляют клетки на середину дна канала. Это имеет то преимущество, что сконцентрированные у дна канала магнитно маркированные клетки ориентированы так, например, вдоль центральной магнитной направляющей линии на дне канала, что при прохождении над датчиком обеспечивается обнаружение отдельных клеток. Кроме того, магнитные направляющие линии выполняют задачу ориентирования магнитно маркированных клеток так, что их поле рассеяния вызывает в датчике возможно больший сигнал.
Особенно предпочтительно магнитные направляющие полосы выполнены ферромагнитными. Магнитная маркировка клеток осуществляется, в частности, с помощью суперпарамагнитных меток.
Магнитные направляющие полосы участка концентрации служат, в частности, для направления клеток ближе к середине канала. Особенно в зонах изгиба имеющего форму меандра участка концентрации это поддерживается тем, что магнитные направляющие полосы расположены так, что они направлены к середине канала. Направление к середине канала осуществляется потому, что на конце участка концентрации или ориентации расположен посредине канала магниторезистивный датчик или, например, решетка датчиков. Перекрытие всей ширины канала отдельными датчиками приводило бы к слишком сложной измерительной электронике. Магниторезистивные конструктивные элементы могут быть расположены под микроканалом для текучей среды, в стенке микроканала для текучей среды или же внутри канала.
Устройство имеет, в частности, подложку, например полупроводниковую подложку, на которой расположены магниторезистивный датчик, а также микроканал для текучей среды и участок концентрации. При этом магниторезистивный датчик интегрирован, в частности, в виде интегральной схемы на полупроводниковой подложке. Микроканал для текучей среды проходит в свою очередь вдоль участка концентрации на подложке. Например, магнитные направляющие полосы участка концентрации могут быть также интегрированы в полупроводниковом чипе. Интегрированное выполнение устройства на полупроводниковом чипе имеет преимущество компактной конструкции и небольшой величины.
В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения микроканал для текучей среды расположен вдоль участка концентрации так, что протекающая через микроканал для текучей среды магнитно маркированная клеточная проба ориентирована по магнитным направляющим полосам. Эта система имеет то преимущество, что клетки, наряду с концентрацией на дне канала, претерпевают ориентацию полей рассеяния, которая обеспечивает возможность высокочувствительного обнаружения отдельных клеток на датчике.
В частности, устройство имеет для этого магнит, который расположен вместе с устройством так, что протекающая через микроканал для текучей среды магнитно маркированная клеточная проба концентрируется с помощью магнитного поля магнита у дна канала. Для этого магнитно маркированные клетки снабжаются, в частности, суперпарамагнитными метками. То есть к клеткам присоединяются, в частности, суперпарамагнитные частицы. За счет магнитного поля магнита, в частности постоянного магнита, на магнитно маркированные клетки действует внутри клеточной суспензии сила, которая направляет их в направлении дна канала.
В другом предпочтительном варианте выполнения изобретения микроканал для текучей среды и магниторезистивный датчик расположены так, что протекающая через микроканал для текучей среды магнитно маркированная клеточная проба направляется над датчиком. Таким образом, датчик расположен, в частности, внутри или ниже микроканала для текучей среды, так что протекающая через микроканал для текучей среды клеточная суспензия в любом случае направляется близко над датчиком. Целесообразно датчик расположен на дне канала или на стенке канала в направлении, в котором магнитное поле магнита концентрации направляет магнитно маркированные клетки. В соответствии с этим датчик обращен, в частности, точно к стороне микроканала для текучей среды, на которой концентрируются магнитно маркированные клетки.
В одном предпочтительном варианте выполнения изобретения длина участка концентрации составляет по меньшей мере 12500 мкм, в частности по меньшей мере 15000 мкм. Например, может быть достаточным участок концентрации длиной 1 мм. Требуемая минимальная длина участка концентрации может также составлять 20000 мкм или до 1 см. Факторы влияния на требуемую длину участка концентрации и ориентации еще будут указаны ниже.
Было установлено, что эта большая длина участка концентрации имеет то преимущество, что также высококонцентрированные клеточные пробы в конце участка концентрации могут быть концентрированы на дне канала и ориентированы с помощью магнитных направляющих линий участка концентрации так, что в момент прохождения над магниторезистивным датчиком обеспечивается надежное распознавание отдельных клеток.
Для такого длинного участка концентрации подложка имеет свой наибольший размер, в частности максимально 18000 мкм, по меньшей мере максимально 20000 мкм. Например, подложка имеет свой наибольший размер лишь максимально 10 мм. При этом в большинстве случаев полупроводниковые кристаллы имеют прямоугольно вырезанные участки тонкого диска и в соответствии с этим максимальный размер подложки соответствует ее диагонали. Благодаря имеющему форму меандра участку концентрации он нуждается лишь в небольшой занимаемой площади на подложке. Это особенно предпочтительно, поскольку использование полупроводниковых подложек, в частности кремниевых кристаллов, связано с высокой стоимостью. В соответствии с этим за счет меандровой формы участка концентрации обеспечивается, что при небольшой площади полупроводникового чипа может быть реализован достаточно большой участок концентрации, с помощью которого также высококонцентрированные клеточные пробы могут быть концентрированы и ориентированы так, что могут быть обнаружены по отдельности магнитно маркированные клетки в этих клеточных пробах с помощью магниторезистивного датчика. Одновременно меандровая форма участка концентрации уменьшает соотношение ширины и толщины подложки, что означает, что подложка становится более компактной и тем самым более простой для обработки.
Магниторезистивный датчик устройства является, в частности, датчиком GMR (GMR=Giant Magneto Resistance, т.е. огромное магнитное сопротивление), например, магниторезистивный датчик устройства является датчиком TMR (TMR=Tunnel Magneto Resistance, т.е. туннельное магнитное сопротивление), или магниторезистивный датчик является датчиком AMR (AMR=анизотропное магнитное сопротивление).
В альтернативных вариантах выполнения можно использовать также оптические датчики, такие как флуоресцентные датчики или датчики света рассеяния, или же в комбинации с магнитными датчиками.
В способе изготовления указанного выше устройства сначала изготавливают магниторезистивный датчик на подложке, наносят магнитные направляющие полосы на подложку и выполняют микроканал для текучей среды на подложке. В одном предпочтительном варианте выполнения способа изготовления датчик интегрируют на полупроводниковой подложке. Для этого используют известные способы микросистемной технологии.
В одном предпочтительном варианте выполнения способа изготовления магнитные направляющие полосы участка концентрации осаждают непосредственно на подложку, например, с помощью термического испарения или распыления. Магнитные направляющие полосы изготавливают, в частности, из ферромагнитного материала, например из никеля. Для этого можно использовать также ферромагнитные сплавы.
В одном способе измерения для магнитного обнаружения клеток инъецируют магнитно маркированную клеточную пробу в указанное выше устройство с имеющим форму меандра участком концентрации, внутри устройства направляют в микроканал для текучей среды, с помощью магнита концентрируют у дна канала так, что магнитно маркированные клетки проходят над магниторезистивным датчиком и там обнаруживаются.
Концентрация с помощью внешнего поля, т.е. поля постоянного магнита, и магнитофорезная ориентация с помощью ферромагнитных полос осуществляется предпочтительно на месте во время процесса измерения. Поэтому требуется достаточно длинный участок концентрации для магнитно маркированных клеток, с целью обеспечения желаемого коэффициента обнаружения маркированных клеток, равного по существу 100%. Факторами влияния на требуемую длину участка концентрации и ориентации с ферромагнитными полосами являются:
1) скорость, с которой клеточная проба прокачивается через микроканал для текучей среды,
2) сила прикладываемого магнитного поля концентрации,
3) концентрация суперпарамагнитно маркированных клеток в суспензии, а также
4) магнитные свойства используемых меток,
5) состав и реологические свойства клеточной суспензии, т.е., например, свойства ее текучести, и
6) сорт маркированных клеток и количество их изотопов на поверхности клеток и тем самым количество парамагнитных меток на каждую клетку, которое определяет силу подлежащего обнаружению поля рассеяния.
Клеточную суспензию прокачивают через микроканал для текучей среды, в частности, с помощью перепада давления. Перепад давления можно создавать, например, посредством управления вручную шприцем или системой шприцев. За счет этого обеспечивается образование ламинарного потока клеточной пробы. Поскольку клетки и окружающая клетки комплексная среда имеют приблизительно одинаковую плотность, то также в зонах кривизны имеющего форму меандра канала для текучей среды возникает лишь небольшая центробежная сила, и маркированные клетки могут оставаться на своих траекториях движения.
Тем самым устройство и способ измерения являются особенно предпочтительными для небольших объемов высококонцентрированных проб (1000 клеток в одном микролитре), например, клеток CD4+. В крови здорового взрослого человека Т-клетки CD4+ составляют примерно 25-60% лимфоцитов. В соответствии с этим проба крови имеет концентрацию примерно 300-1600 клеток на микролитр. Увеличение или уменьшение количества Т-клеток CD4+ может происходить при многих заболеваниях. Степень увеличения или уменьшения хотя и не может служить в качестве доказательства болезни, однако может быть индикатором или дополнительно подтверждать имеющийся диагноз. Примерами, при которых возникает увеличение количества клеток CD4+, являются ревматические заболевания или же различные лейкемии. Уменьшение количества клеток CD4+ может быть указателем иммунной слабости, такой как, например, ВИЧ-заболевание (СПИД).
Таким образом, при магнитной проточной цитометрии решающее значение имеет то, что магнитно маркированные клетки транспортируются очень близко мимо магниторезистивного датчика. Поскольку клеточная проба протекает через проточную камеру, например микроканал для текучей среды, то клетки необходимо транспортировать в этой проточной камере вблизи ее внутренней поверхности, где установлен магниторезистивный датчик. В частности, стенка канала находится в прямом контакте с магнитным датчиком. В альтернативных вариантах выполнения магниторезистивный датчик заделан в стенку канала. В качестве магнитной маркировки служат предпочтительно суперпарамагнитные метки. В качестве магниторезистивных датчиков можно использовать датчики GMR, TMR или AMR. Близость магнитно маркированной клетки к датчику имеет решающее значение потому, что магнитное поле рассеяния магнитной маркировки уменьшается в ближней зоне поля пропорционально третьей степени расстояния. Дополнительно к концентрации магнитно маркированных клеток на поверхности датчика ориентация магнитно маркированных клеток оказывает положительное влияние на возможность обнаружения. При этом магнитно маркированные клетки предпочтительно ориентируются в направлении потока так, что магнитное поле магнитной маркировки вызывает в датчике возможно более отчетливый сигнал. При магнитной проточной цитометрии требуется возможно более точная дифференсация между фальшиво позитивными и позитивными сигналами. Для этого для позитивных сигналов должна обеспечиваться возможность установки возможно более высокого порогового значения для сигнала, с целью отличия его от шумовых сигналов.
В противоположность методу направления магнитно маркированных клеток по отдельности над датчиком за счет их стеснения в микроканале для текучей среды за счет его диаметра так, что лишь отдельные клетки могут проходить через него, способ, согласно изобретению, имеет то преимущество, что обеспечивает по существу 100%-ное обнаружение отдельных клеток непосредственно из неподготовленной комплексной суспензии. Таким образом, преодолевается большой недостаток так называемого механического разделения клеток и закупоривания систем для пропускания текучей среды. В таком измерительном устройстве магнитно маркированные клетки различного диаметра также нельзя точно определять по отдельности. Клетки имеют, например, диаметр в диапазоне примерно 3-30 мкм. Они предпочтительно направляются через намного более широкий микроканал для текучей среды, который имеет в 10-1000 раз больший диаметр. При этом датчик или решетка из отдельных датчиков расположена поперек направления потока и имеет, например, ширину 30 мкм в соответствии с диаметром клетки.
Краткое описание чертежей
Ниже приводится в качестве примера описание вариантов выполнения данного изобретения со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых изображено:
фиг. 1 - имеющий форму меандра участок концентрации,
фиг. 2 - магнитные направляющие линии в первом изгибе участка концентрации;
фиг. 3 - альтернативное расположение магнитных линий в первом изгибе участка концентрации;
фиг. 4 - сравнение по величине между прямым и имеющим форму меандра участком концентрации;
фиг. 5 - разрез измерительного устройства.
На фиг. 1 показан имеющий форму меандра участок 10 концентрации, согласно одному примеру выполнения изобретения. Участок 10 концентрации имеет три прямых участка, которые соединены друг с другом через два изгиба К1, К2. Участок 10 концентрации предназначен, с одной стороны, для ориентации, а также для концентрации магнитно маркированных клеток 90 у дна канала. То есть в показанном на фиг. 1 виде сверху микроканал 50 для текучей среды выполнен вдоль участка 10 концентрации так, что на клеточную пробу, которая направляется через этот микроканал 50 для текучей среды, действуют магнитные силы постоянного магнита для концентрации у дна канала, а также магнитное действие магнитных направляющих линий 15. Показанные на фиг. 1 магнитные направляющие линии 15 проходят вдоль участка 10 концентрации непосредственно на подложке 12, которая является, в частности, поверхностью полупроводникового чипа. Вдоль первого прямого частичного участка магнитные направляющие линии 15 проходят под острым углом к средней линии участка 10 концентрации и направляют тем самым магнитно маркированные клетки 90 в середину канала. Вдоль первого изгиба К1 магнитные направляющие линии 15 проходят от края участка 10 концентрации, т.е. от края микроканала 50 для текучей среды, к середине участка 10 концентрации. В этом примере показана центральная магнитная направляющая линия, которая всегда расположена вдоль середины канала. Кроме того, на фиг. 1 на виде сверху на участок 10 концентрации показан вход 11 для клеточной пробы в микроканал для текучей среды.
На фиг. 2 показана часть участка 10 концентрации с первым изгибом К1 участка концентрации. На фиг. 2 показан альтернативный вариант выполнения магнитных направляющих линий 15. Они вместо схождения в виде веера на средней линии могут быть также имеющими форму полукруга линиями с различными радиусами, каждая из которых проходит по траектории с неизменным расстоянием до стенок микроканала 50 для текучей среды. В этом примере магнитно маркированные клетки 90 в клеточной пробе направляются по этим траекториям через изгиб К1. Стрелками обозначено направление потока клеточной пробы через изгиб К1 участка 10 концентрации.
На фиг. 3 показан больший отрезок участка 10 концентрации, который имеет первый изгиб К1, а также части первого и второго прямых частичных участков. Магнитные направляющие линии 15 проходят в этом варианте выполнения снова веерообразно. Они ведут от стенки канала к средней линии канала 50 как в изгибе К1, так и на прямых частичных участках. На прямых частичных участках они проходят, в частности, под острым углом к средней линии канала 50. В соответствии с этим проходящая через микроканал 50 для текучей среды клеточная проба направляется к середине канала 50.
На фиг. 4 снова показан на виде сверху участок 10а концентрации в сравнении с линейным участком 10b концентрации. Для этого показана длина каналов в микронах. Участок 10 концентрации имеет ту же общую длину, что и линейный участок 10b концентрации, однако для него необходим вдвое меньший полупроводниковый чип 12а в качестве подложки 12, на которой расположен участок 10а концентрации в виде магнитных направляющих линий 15.
На фиг. 5 показан разрез одного варианта выполнения измерительного устройства, в котором участок 10 концентрации выполнен не непосредственно на полупроводниковом чипе 12, а на упаковочном материале 16. В разрезе показаны магнитные направляющие линии 15, по которым направляются магнитно маркированные клетки 90. В частности, сверху или снизу измерительного устройства расположен постоянный магнит, с помощью магнитного поля которого клетки 90 концентрируются у дна канала 50. Кроме того, на фиг. 5 показана опора 13, на которой выполнены способом осаждения контакты 17. На опору 13 установлен полупроводниковый чип 12, который с помощью приваренных проволочных выводов 18 контактирует с подложкой опоры 13. На полупроводниковом чипе 12 находится, в частности, магниторезистивный датчик 20 и небольшой другой отрезок участка 600 концентрации с магнитными направляющими линиями 15, который может компенсировать смещение 601 относительно участка 10 концентрации на упаковочном материале 16. Например, с помощью способа литья под давлением вместе с упаковочным материалом 16 формируется проточная камера 50. Стрелками снова обозначено направление потока клеточной пробы, соответственно обозначен вход 11 в микроканал 50 для текучей среды.