Способ выявления в биологическом материале ДНК вируса гепатита В при низкой вирусной нагрузке на основе двухэтапной ПЦР с детекцией в режиме реального времени

Способ выявления ДНК вируса гепатита В в биологическом материале на основе двухэтапной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени, отличающийся тем, что на первом этапе применяется амплификация ДНК вируса с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных областям наибольшего сходства геномов различных изолятов ВГВ в регионах S-гена и Х-гена, а именно прямой праймер  и обратный праймер  продукт, которой затем используют для второго этапа амплификации, осуществляемого в одной пробирке со следующими парами вложенных праймеров и соответствующими флуоресцентно мечеными зондами: пара 1 прямой праймер  обратный праймер  зонд  пара 2 прямой праймер  обратный праймер  зонд  а также следующими вариантами обратного праймера в паре 2: обратный праймер с  обратный праймер d  обратный праймер е  причем результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, установленной в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале, позволяющего определить наличие или отсутствие для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов, при этом результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, а отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct или Ср), сомнительным во всех других случаях, причем
- образец считается положительным по содержанию ДНК ВГВ, если на каналах FAM и ROX получено значение порогового цикла Ct;
- образец считается отрицательным по содержанию ДНК ВГВ, если на каналах FAM и ROX отсутствует значение Ct;
- получение порогового цикла Ct только по одному флуорофору FAM или ROX может свидетельствовать о наличии ДНК ВГВ в образце в нагрузке менее 10 МЕ/мл, при этом рекомендуется повторное ПЦР-исследование соответствующего образца с экстракцией ДНК ВГВ из увеличенного объема плазмы 200-1000 мкл.