Способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида
METHOD FOR FLUORESCENCE HISTOLOGICAL DETECTION OF AMYLOID

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и предназначено для исследования вне- и внутриклеточной локализации амилоида в тканях, а также жидких средах.
Известен флуоресцентный способ выявления растворенных в воде фибрилл амилоида с помощью бензантрона (3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он) (Gorbenko G., Trusova V., Kirilova Ε., Kirilov G., Kalnina I., Vasilev Α., Kaloyanova S., Deligeorgiev T. New fluorescent probes for detection and characterization of amyloid fibrils // Chemical Physics Letters. - 2010. - Vol. 495. - P. 275-279).
Недостатками данного способа являются то, что этот препарат не апробирован на гистологических срезах, не производится в промышленных масштабах для лабораторного использования и не лицензирован. Как антраценовое производное 3-морфолино-7Н-бензо[de]антрацен-7-он возможно является канцерогеном, что исключает возможность его использования как лекарственного средства.
Известен способ гистохимического определения амилоида с помощью красителя Конго красный [по Н.Н. Benhold (1923), в кн.: Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 646 с]. Недостатком данного способа является низкая информативность, заключающаяся в отсутствии возможности получения количественного результата.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является диагностический способ флуоресцентного выявления амилоида в гистологических срезах органов людей, умерших от амилоидоза, с помощью окрашивания срезов тиофлавином Т, либо S (Bums J., Pennock C.A., Steward P.J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine Τ // Journal of pathology and bacteriology. - 1967. - Vol.94. - P. 337; Bancroft J.D., Stevens A. Theory and practice of histological techniques Ed. 2 / Churchill Livingstone. - Edinburgh & London, 1982 UK.), который заключается в том, что парафиновые срезы органов, зафиксированные в 10% формалине, предварительно окрашивают железным гематоксилином, после чего докрашивают 1% раствором тиофлавина Τ или S.
х
Докрашенные срезы подкисляют в растворе лимонной кислоты, высушивают, заделывают в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопируют на флуоресцентном микроскопе. При окрашивании тиофлавином Τ амилоид выглядит как зелено-коричневые флуоресцирующие объекты (рисунки 1а, 1б). Например, на рис. 1а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочке (Кл), канальцах (Кн) и цитоплазме эпителия канальцев (Э) (объектив 40), а на рис. 1б - свечение амилоидных депозитов в клубочке, после окрашивания тиофлавином Т.
На препаратах почки амилоидные депозиты в просвете канальцев и растворенные в цитоплазме эпителия канальцев выглядят как ярко-зеленые практически однородные объекты. В стенках сосудов и между капиллярными петлями почечных клубочков амилоид светится менее интенсивно коричневатым оттенком. Участки тканей, не содержащие амилоид, выглядят темно-зелеными, практически черными. Клеточные ядра дифференцируются как округлые несветящиеся объекты.
При замерах интенсивности свечения с помощью фотоумножителя максимум флуоресценции тиофлавина приходился на 534 нм. Интенсивность свечения интактных и пораженных амилоидом тканей приведена в таблице 1. Высокий размах вариационного ряда свидетельствует о том, что интенсивность флуоресценции амилоида, меченого тиофлавином, значительно различается в разных участках ткани почки, что может свидетельствовать о наличии концентрационной зависимости.
Этот же способ используется для выявления амилоида в биологических средах (плазма крови, спинно-мозговая жидкость) больных людей, а также изучения амилоида in vitro, как выделенного из тканей больных людей или животных, так и искусственно приготовленных из белков-амилоидогенов (Козлов В.А., Сапожников С.П., Шептухина А.И., Голенков А.В. Сравнительный анализ различных моделей амилоидоза // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2015. - №1. - С. 5-11; Сулацкая А.И., Волова Е.А., Комиссарчик Я.Ю., Снигиревская Е.С., Маскевич Α.Α., Дробченко Е.А., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. Исследование кинетики образования амилоидных фибрилл на основе инсулина // Цитология. - 2013. - Ν 11. - С.809-814).
Недостатком данного способа является дороговизна тиофлавинов (стоимость 25 г составляет 3318,16 руб., http://www.zymophore.ru/), они не производятся в Российской Федерации и закупаются за рубежом.
Задачей изобретения является расширение ассортимента препаратов со свойствами окрашивания гистологических срезов для оценки интенсивности амилоидогенеза, которые могут заменить дорогостоящий тиофлавин.
Технический результат - повышение экономичности за счет пониженной стоимости препаратов, информативности за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности.
17
2.6
Технический результат достигается тем, что способ флуоресцентного гистологического выявления амилоида, включающий фиксирование срезов ткани органов в 10%-ном формалине, окрашивание флуоресцентным красителем, промывку водой, обезвоживание, заделку в прозрачные нефлуоресцирующие среды и микроскопирование на флуоресцентном микроскопе согласно изобретению, в качестве флуоресцентного красителя используют производные 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2.1.0]дец-8-енов формулы
2
2
2
где Y=2-NO, 3-NO, 4-NO, 3-COOH, 4-COOH, а окрашивание осуществляют 1,5% спиртовым раствором красителя, смешанным с 1% водным раствором гидроксида натрия в соотношении 1:1.
Сущность способа флуоресцентного гистологического выявления амилоида заключается в следующем.
1.7
2.6
На основе представлений о супрамолекулярном неферментативном взаимодействии амилоида с известными флуоресцентными зондами тиофлавином Т (Сулацкая А.И. Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя: автореф. дис. … докт.биол. наук / А.И. Сулацкая; Институт цитологии РАН. - Санкт-Петербург, 2013. - 22 с. ) и конго-красным (Klunk W.E., Pettegrew J.W., Abraham D.J. Quantitative evaluation of Congo red binding to amyloid like proteins with a pleated sheet conformation // J. Histochem. and Cytochem. - 1989. - Vol.37. - N 1273. 1281) осуществлен синтез производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло[5.2..0]дец-8-енов формулы (1a-д), перспективных как флуоресцентные зонды, селективных к амилоиду.
1
Синтез исследуемых веществ (1a-д) осуществляли взаимодействием легкодоступных N-арил-2,5-дигидропиррол-2,5-дионов с фуран-2-карбальдегидом при эквимольном соотношении реагентов при комнатной температуре. В качестве растворителя использовали абсолютный 1,4-диоксан. Чистоту синтезированных продуктов контролировали по данным тонкослойной хроматографии, а структуру подтверждали методами ИК, ЯМР Н-спектроскопии.
Соединения (1a-д) представляют собой кристаллические вещества светло-желтого или оранжевого цвета, константы и данные элементного анализа которых приведены в таблице №2.
Флуоресцентные свойства апробированных веществ (1a-д), имеющих, подобно тиофлавину Т, строение молекулярного ротора, в сухом кристаллическом виде проявлялись при возбуждении ультрафиолетом в видимом диапазоне 421-435,5 нм. Ни спиртовой, ни водно-спиртовой растворы этих веществ в диапазоне концентраций от 0,75% до 1,5% регистрируемой с помощью ФЭУ-39 флуоресценции не обнаруживали.
Примеры выполнения способа.
Пример 1
1.7
2.6
Эксперименты проведены на 5 мкм парафиновых срезах почек человека с ранее клинически установленным и гистологически подтвержденным диагнозом амилоидоза. Обезличенные препараты были предоставлены «Республиканским бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Чебоксары. Депарафинированные срезы были предварительно окрашены гематоксилином, а затем в течение 3 мин дополнительно обработаны водно-спиртовыми растворами любого из производных 4-N-арил-3,5-диоксо-1-формил-10-окса-4-азатрицикло-[5.2.1.0]дец-8-енов формулы (1а-д). Водно-спиртовые растворы были получены следующим путем. Вначале соединения формулы (1а-д) растворяли в 96% спирте с получением спиртового раствора 1,5% концентрации, а затем к полученному раствору добавляли 1% водный раствор гидроксида натрия в соотношении 1:1 по объему. Конечная концентрация препаратов (1а-д) в полученном водно-спиртовом растворе составляла 0,75%, а среда такого раствора щелочная (рН>7). После окрашивания срезы были промыты водой, обезвожены и заделаны в полистирол.
возбужд.
6
Микроскопию срезов осуществляли на микроскопе «Люмам-4». Флуориметрию осуществляли с помощью микролюминиметра ФМЭЛ-1А, запирающий светофильтр ЖС18, λ=410 нм, светофильтры ФС, БС, СЗС. Электрические параметры на всех замерах определялись следующими параметрами: входное напряжение 900 В, сопротивление усилителя 10 Ом. В насадке был установлен зонд 0,5. Для измерения использовали ФЭУ-39, показания снимали с цифрового вольтметра, данные представлены в милливольтах (мВ). Микрофотографии получены с помощью цифровой камеры Levenhuk С800 NG 8М, USB 2.0.
На окрашенных препаратах максимум флуоресценции наблюдался при 534 нм.
х
После обработки парафиновых срезов амилоидной почки подщелоченными водно-спиртовыми растворами всех исследуемых веществ структуры (1a-д) наблюдалось интенсивное зеленое свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах (рисунки 2а-2д, объектив 40). Например, на рис. 2а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцевых структурах, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2г изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1г); на рис. 2д изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в канальцах, после окрашивания препаратом (1д).
1
Меньшее по интенсивности свечение обнаруживалось в клубочках с хорошо выявляемым париетальным листком капсулы и темно-зелеными депозитами амилоида, расположенными между петель клубочка, эпителия канальцев и эндотелии артериол. Например, на рис. 2а изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1а); на рис. 2б изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1б); на рис. 2в изображено свечение амилоидных депозитов, расположенных в клубочках, после окрашивания препаратом (1в).
Обнаруживаемое свечение равномерно располагалось в цитоплазме клеток. Клеточные ядра выглядели как темные нефлуоресцирующие овальные объекты. Интенсивность флуоресценции депозитов в канальцах различается на порядок, что может быть обусловлено количественными различиями содержания амилоида на разных участках срезов (таблица 3).
Как следует из данных, представленных в таблице, интенсивность флуоресценции исследуемых препаратов (1а-д) значительно не различается, что объясняется близостью их химического строения.
При применении соединений (1а-д), по сравнению с окраской тиофлавином Т, увеличивается информативность окраски за счет увеличенной контрастности рельефа поверхности. Кроме того, при окрашивании тиофлавином необходима инкубация срезов в 1% растворе лимонной кислоты, что необходимо для возбуждения флуоресценции тиофлавина. Тогда как в заявленном способе окрашивания необходимости в такой обработке нет. Поскольку рН растворов красителей, приготавливаемых по заявленному способу, имеет щелочную реакцию, то он более физиологичен, поскольку нативные (живые) ткани имеют рН≥7,37 (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник / Под. ред. акад. АМН СССР С.С. Дебова. - 2-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1990. - 528 с, С. 452-455. ISBN 5-225-01515-8). Данное обстоятельство должно способствовать большей сохранности гистологических срезов, чем при их обработке кислотами.
Заявленный способ позволяет селективно локализовать амилоид как свободно расположенный в межклеточном пространстве, так и внутриклеточно, а также в жидких средах и может быть использован в судебно-медицинской экспертизе, клинической диагностике амилоидоза, экспериментальной биологии и медицине.