СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ TIGIT АГЕНТЫ
METHODS FOR TREATING CANCER, INCLUDING TIGIT-BINDING AGENTS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[001] Настоящее изобретение в целом относится к способам лечения рака с применением агентов, которые связывают TIGIT человека, в частности, к антителам, которые специфично связывают внеклеточный домен TIGIT.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[002] В основе иммунотерапии лежит манипулирование над иммунной системой и/или ее модуляция, включая как врожденные иммунные ответы, так и приобретенные иммунные ответы. Основной целью иммунотерапии является лечение заболеваний путем контролирования иммунного ответа на "чужеродный агент", например, патоген или опухолевую клетку. Тем не менее, в некоторых случаях, иммунотерапию применяют для лечения аутоиммунных заболеваний, которые могут возникнуть в результате аномального иммунного ответа на белки, молекулы и/или ткани, обычно присутствующие в организме. Иммунотерапия может включать агенты и способы индукции или усиления специфичных иммунных ответов или ингибирования или ослабления специфичных иммунных ответов.
[003] Иммунная система представляет собой очень сложную систему, состоящую из множества типов клеток, включая, но не ограничиваясь указанными, Т-клетки, В-клетки, естественные клетки-киллеры, антигенпрезентирующие клетки, дендритные клетки, моноциты и макрофаги. Данные клетки имеют сложную и чувствительную систему контроля взаимодействий и ответов. Указанные клетки используют как активирующие, так и ингибирующие механизмы, а также петли обратной связи, чтобы держать ответы под контролем и не допускать негативных последствий неконтролируемого иммунного ответа (например, аутоиммунных заболеваний).
[004] Принцип иммунологического надзора за раковыми заболеваниями основан на теории, что иммунная система может распознавать опухолевые клетки, повышать иммунный ответ и подавлять развитие и/или прогрессирование опухоли. Однако, очевидно, что у многих раковых/опухолевых клеток развились механизмы ускользания от иммунной системы, которые создают возможности для неингибируемого роста данных клеток. Направленная против рака/опухоли иммунотерапия сосредоточена на разработке новых и ранее не существовавших агентов, которые могут активировать и/или стимулировать иммунную систему, чтобы добиться более эффективного воздействия на опухолевые клетки, приводящего к повышенному уничтожению опухолевых клеток и/или ингибированию роста опухоли.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[005] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы лечения рака (т.е., ингибирования роста опухоли) с помощью агентов, которые связывают Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM (TIGIT), включая, но не ограничиваясь ими, антитела, которые специфично связывают внеклеточный домен TIGIT. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT. В некоторых вариантах реализации способ включает применение связывающего TIGIT агента для индукции, активации, стимуляции, повышения, усиления или продления иммунного ответа на рак и/или опухоль. В некоторых вариантах реализации способ включает применение связывающего TIGIT агента для ингибирования роста опухоли. В некоторых вариантах реализации способ включает применение связывающего TIGIT агента для лечения рака. В некоторых вариантах реализации способ включает применение связывающего TIGIT агента в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом.
[006] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак (КРР), такой как колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью (КРР MSI) или микросателлитно-стабильный колоректальный рак (КРР MSS), трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит гипервариабельный участок 1 (CDR1) тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[007] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой микросателлитной нестабильностью (MSI). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ TD NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой MSI выбрана из группы, состоящей из КРР MSI, рака желудка MSI, рака эндометрия MSI, рака яичников MSI, рака печени и желчевыводящих путей MSI, рака мочевыводящих путей MSI, рака головного мозга MSI или рака кожи MSI.
[008] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак (КРР), такой как колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью или микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-1. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-L1.
[009] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой микросателлитной нестабильностью, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-1. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-L1. В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой MSI выбрана из группы, состоящей из КРР MSI, рака желудка MSI, рака эндометрия MSI, рака яичников MSI, рака печени и желчевыводящих путей MSI, рака мочевыводящих путей MSI, рака головного мозга MSI или рака кожи MSI.
[010] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В данной заявке опухоль устойчива или рефрактерна к лечению агентом, если происходит прогрессирование роста опухоли во время или после лечения указанным агентом. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению агентом, который вводят как отдельный агент. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению агентом, который вводят как терапию первой линии или терапию второй линии. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-1 (например, в виде отдельного агента). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-L1 (например, в виде отдельного агента). В некоторых вариантах реализации опухоль, устойчивая или рефрактерная к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, выбрана из группы, состоящей из меланомы, немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или с нарушением репарации ошибок спаривания оснований ДНК (dMMR)) и печеночно-клеточной карциномы.
[011] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению агентом, который вводят как терапию первой линии или терапию второй линии. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 в виде отдельного агента, но чувствительна к лечению данным агентом в комбинации со связывающим TIGIT агентом. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента, но чувствительна к лечению данным агентом в комбинации со связывающим TIGIT агентом. В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-1 (например, в виде отдельного агента). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-L1 (например, в виде отдельного агента). В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-1. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-L1. В некоторых вариантах реализации опухоль, устойчивая или рефрактерная к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[012] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом происходило прогрессирование заболевания во время или после лечения. В некоторых вариантах реализации происходил рецидив роста опухоли после лечения антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В данной заявке под рецидивом роста опухоли понимают возвращение рака после лечения и спустя некоторый период времени, во время которого рак не обнаруживался. Рак может вернуться в том же месте, где его впервые обнаружили, или может обнаружиться где-либо в другом месте организма. В некоторых вариантах реализации рецидив представляет собой местный рецидив, регионарный рецидив или отдаленный рецидив. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[013] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанного субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанного субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ TD NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом происходило прогрессирование заболевания во время или после лечения. В некоторых вариантах реализации происходил рецидив роста опухоли после лечения антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации рецидив представляет собой местный рецидив, регионарный рецидив или отдаленный рецидив. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия делает опухоль снова восприимчивой ("ресенсибилизирует") к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-1. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия включает антитело против PD-L1. В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[014] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль экспрессирует рецептор полиовируса (PVR) и/или подобный рецептору полиовируса белок 2 (PVRL2). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[015] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[016] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль содержит инфильтрирующие опухоль лимфоциты (ИОЛ). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль содержит инфильтрирующие опухоль лимфоциты; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[017] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит инфильтрирующие опухоль лимфоциты. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит инфильтрирующие опухоль лимфоциты; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[018] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль содержит регуляторные Т-клетки (Treg). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль содержит Treg; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[019] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит Treg. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит Treg; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[020] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, опухоль выбрана из группы, состоящей из: опухоли легкого, опухоли печени, опухоли молочной железы, почечно-клеточной карциномы/опухоли почки, опухоли предстательной железы, опухоли желудочно-кишечного тракта/желудка, меланомы, опухоли шейки матки, опухоли мочевого пузыря, глиобластомы, опухоли головы и шеи, опухоли поджелудочной железы, опухоли яичника, колоректальной опухоли, опухоли эндометрия, опухоли заднего прохода и опухоли пищевода.
[021] В некоторых вариантах реализации опухоль легкого включает НМКРЛ, такой как плоскоклеточный НМКРЛ или аденокарцинома НМКРЛ.
[022] В некоторых вариантах реализации опухоль молочной железы включает трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ).
[023] В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI. В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой микросателлитной нестабильностью представляет собой колоректальный рак MSI (КРР MSI), рак желудка MSI, рак эндометрия MSI, рак яичников MSI, рак печени и желчевыводящих путей MSI, рак мочевыводящих путей MSI, рак головного мозга MSI или рак кожи MSI. В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой MSI представляет собой КРР MSI.
[024] В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой микросателлитно-стабильную (MSS) опухоль. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой микросателлитно-стабильный колоректальный рак (КРР MSS).
[025] В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[026] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, указанный агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, которое содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), и CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), и/или CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[027] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, указанный агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или вариабельную область легкой цепи, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или вариабельную область легкой цепи, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11.
[028] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело, антитело человека, рекомбинантное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий участок, антитело IgG, антитело IgG1, антитело IgG2 или антитело IgG4. В некоторых вариантах реализации антитело моновалентное. В некоторых вариантах реализации антитело бивалентное. В некоторых вариантах реализации антитело моноспецифическое. В некоторых вариантах реализации антитело биспецифическое.
[029] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 15.
[030] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT мыши. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT крысы. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT кролика. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT мартышки. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT собаки. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT свиньи. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT яванского макака. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, не связывает TIGIT макака-резуса.
[031] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело, которое специфично связывает TIGIT человека, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи из антитела ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером РТА-122346. В некоторых вариантах реализации антитело содержит полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122346. В некоторых вариантах реализации антитело содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122347. В некоторых вариантах реализации антитело содержит легкую цепь, кодируемую плазмидой депонированной в АТСС под номером РТА-122347. В некоторых вариантах реализации антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122346, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122347. В некоторых вариантах реализации антитело включает полипептид, кодируемый плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122346, и полипептид, кодируемый плазмидой, депонированной в АТСС под номером РТА-122347.
[032] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент моновалентный. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент бивалентный. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент моноспецифический. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент биспецифический. В некоторых вариантах реализации указанный биспецифический агент представляет собой гетеродимерный агент или гетеродимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации гетеродимерный агент включает антитело, которое специфично связывает TIGIT. В некоторых вариантах реализации указанный биспецифический агент представляет собой гомодимерный агент или гомодимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации гомодимерный агент включает антитело, которое специфично связывает TIGIT.
[033] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое конкурирует за специфическое связывание с TIGIT человека с антителом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает такой же эпитоп на TIGIT человека, как и антитело, описанное в данной заявке. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп TIGIT человека, который перекрывается с эпитопом TIGIT, который связывает антитело, описанное в данной заявке. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62 и I109 с последовательностью SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, содержащий по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: N58, Е60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, Т117, Т119, G120 и R121, из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации эпитоп представляет собой конформационный эпитоп. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает эпитоп, который не содержит аминокислоту V100 из SEQ TD NO: 1.
[034] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, агент, который специфично связывает TIGIT, представляет собой антитело, при этом указанное антитело является частью биспецифического агента. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое связывает вторую мишень. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое специфично связывает TIGIT, и второе плечо, при этом указанное первое плечо содержит антитело против TIGIT. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое содержит антигенсвязывающий участок из антитела. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое специфично связывает PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, ОХ-40 или GITR. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое специфично связывает антиген опухоли. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое содержит стимулирующий иммунный ответ агент. В некоторых вариантах реализации стимулирующий иммунный ответ агент выбран из группы, состоящей из: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 15 (IL-15), В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), лиганда 4-1ВВ, GITRL, OX-40L, антитела против CD3, антитела против CTLA4, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против GITR, антитела против ОХ-40, антитела против LAG-3 и антитела против TIM-3.
[035] В некоторых вариантах реализации указанный биспецифический агент представляет собой гетеродимерный агент или гетеродимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации указанный биспецифический агент представляет собой гомодимерный агент или гомодимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое связывает TIGIT человека, и второе плечо, которое связывает вторую мишень. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое специфично связывает TIGIT человека, и второе плечо, при этом указанное первое плечо содержит антитело против TIGIT. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое связывает TIGIT человека, и второе плечо, которое содержит антигенсвязывающий участок из антитела, которое специфично связывает вторую мишень. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое связывает TIGIT человека, и второе плечо, которое специфично связывает антиген опухоли. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое связывает TIGIT человека, и второе плечо, которое специфично связывает PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, ОХ-40, 4-1ВВ или GITR. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит первое плечо, которое связывает TIGIT, и второе плечо, которое содержит иммунотерапевтический агент. В некоторых вариантах реализации иммунотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 3 (IL-3), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 15 (IL-15), В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), лиганда 4-1BB, GITRL, OX-40L, антитела против CD3, антитела против CTLA-4, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против 4-1ВВ, антитела против GITR, антитела против ОХ-40, антитела против LAG-3 и антитела против TIM-3.
[036] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, агент специфично связывает TIGIT и ингибирует связывание TIGIT с PVR. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует или блокирует взаимодействие между TIGIT и PVR. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует связывание TIGIT с PVRL2. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует или блокирует взаимодействие между TIGIT и PVRL2. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует связывание TIGIT с PVRL3. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует или блокирует взаимодействие между TIGIT и PVRL3. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует передачу сигналов TIGIT. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и представляет собой антагонист опосредованной TIGIT передачи сигналов. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует активацию TIGIT. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и ингибирует фосфорилирование TIGIT. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и уменьшает экспрессию TIGIT на поверхности клетки.
[037] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, агент специфично связывает TIGIT и индуцирует, активирует, вызывает, активирует, стимулирует и/или продлевает иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ направлен (например, убивает) на опухоль или опухолевую клетку. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает опосредованный клетками иммунитет. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает активность Т-клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает цитолитическую активность Т-клеток (CTL). В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает активность клеток-естественных киллеров (NK). В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает продукцию IL-2 и/или количество продуцирующих IL-2 клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает продукцию IFN-гамма и/или количество продуцирующих IFN-гамма клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает иммунный ответ Th1-типа. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает продукцию IL-4 и/или количество продуцирующих IL-4 клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает IL-10 и/или количество продуцирующих IL-10 клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает продукцию IL-6 и/или количество продуцирующих IL-6 клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает продукцию IL-5 и/или количество продуцирующих IL-5 клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает иммунный ответ Th2-типа. В некоторых вариантах реализации указанный агент уменьшает количество клеток Treg. В некоторых вариантах реализации указанный агент снижает активность Treg. В некоторых вариантах реализации указанный агент ингибирует и/или снижает супрессорную активность Treg. В некоторых вариантах реализации указанный агент уменьшает количество супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). В некоторых вариантах реализации указанный агент ингибирует и/или снижает супрессорную активность MDSC.
[038] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, агент специфично связывает TIGIT и ингибирует рост опухоли. В некоторых вариантах реализации указанный агент уменьшает рост опухоли. В некоторых вариантах реализации указанный агент уменьшает рост опухоли до недетектируемого размера. В некоторых вариантах реализации указанный агент индуцирует длительный противоопухолевый иммунитет.
[039] В другом аспекте настоящего изобретения предложены композиции, содержащие связывающий TIGIT агент, для применения в способах, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены фармацевтические композиции, содержащие связывающий TIGIT агент, для применения в способах, описанных в данной заявке, и фармацевтически приемлемый носитель.
[040] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент является выделенным. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент является по существу чистым.
[041] В соответствии с настоящим изобретением также предложены полинуклеотиды, включающие полинуклеотид, который кодирует связывающий TIGIT агент. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид является выделенным. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложены векторы, которые включают полинуклеотиды, а также клетки, которые содержат указанные векторы и/или указанные полинуклеотиды. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением также предложены клетки, содержащие или продуцирующие связывающий TIGIT агент. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой моноклональную линию клеток.
[042] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против PD-1, антитело против PD-L1, антитело против CTLA4, антитело против LAG-3 или антитело против TIM-3. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Notch, сигнального пути Wnt или сигнального пути RSPO/LGR. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой иммунотерапевтический агент. В данной заявке формулировку "иммунотерапевтический агент" используют в наиболее широком смысле, и она относится к веществу, которое непосредственно или опосредованно воздействует на иммунную систему или модулирует ее. В некоторых вариантах реализации иммунотерапевтический агент представляет собой агент, который непосредственно или опосредованно стимулирует иммунную систему, вызывая активацию или повышая активность любого компонента иммунной системы. Так как связывающие TIGIT агенты считают иммунотерапевтическими агентами, данный дополнительный иммунотерапевтический агент можно считать "вторым" иммунотерапевтическим агентом. В некоторых вариантах реализации указанный второй иммунотерапевтический агент выбран из группы, состоящей из: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), лиганда 4-1ВВ, GITRL, лиганда ОХ-40, антитела против CD3, антитела против CTLA-4, антитела против CD28, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против 4-1ВВ, антитела против GITR, антитела против ОХ-40, антитела против LAG-3 и антитела против TIM-3. В некоторых вариантах реализации указанный второй иммунотерапевтический агент представляет собой слитый белок, включающий: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), лиганд 4-1ВВ, GITRL, лиганд ОХ-40 или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации указанный второй иммунотерапевтический агент представляет собой слитый белок, содержащий по меньшей мере одну копию внеклеточного домена GITRL, лиганда ОХ40 или лиганда 4-1ВВ.
[043] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации у субъекта по меньшей мере частично удалили опухоль или рак.
[044] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, опухоль или рак экспрессирует PD-L1. В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает этап определения уровня экспрессии PD-L1 в опухоли или раке. В некоторых вариантах реализации определение уровня экспрессии PD-L1 осуществляют до лечения или контакта со связывающим TIGIT агентом. В некоторых вариантах реализации, если опухоль или рак характеризуются повышенным уровнем экспрессии PD-L1, то субъекту вводят связывающий TIGIT агент.
[045] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом опухоль представляет собой рак головы и шеи, рак пищевода/рак желудка и пищевода, рак желудка, колоректальный рак, рак заднего прохода, печеночно-клеточный рак/рак печени, рак шейки матки, рак легких (например, НМКРЛ), меланому, карциному из клеток Меркеля, почечно-клеточную карциному/рак почки, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак эндометрия и трижды негативный рак молочной железы, известную солидную опухоль с высокой MSI (включая КРР MSI) или колоректальный рак MSS; при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-1 или антителом против PD-L1; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[046] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 или антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 7,5 мг/кг или приблизительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, вводят приблизительно раз в неделю, приблизительно раз в две недели, приблизительно раз в три недели, или приблизительно раз в четыре недели. В некоторых вариантах реализации у субъекта есть гистологически подтвержденная распространенная рецидивировавшая или рефрактерная солидная опухоль.
[047] Если аспекты или варианты реализации настоящего изобретения описаны в формате группы Маркуша или другой группы альтернатив, то в объем настоящего изобретения входит не только вся группа, перечисленная как целое, но также каждый представитель указанной группы отдельно и все возможные подгруппы элементов основной группы, а также основная группа, в которой отсутствует один или более представителей группы. В настоящем изобретении также предусмотрено явное исключение одного или более из каких-либо представителей группы в предложенном изобретении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
3
[048] Фигура 1. Ингибирование роста опухоли антителом против TIGIT - ОМР-313М32 - в гуманизированной модели на мышах. Гуманизированным мышам вводили путем подкожной инъекции полученные из пациента с меланомой опухолевые клетки (ОМР-М9, 75000 клеток/мышь). Опухолям позволяли расти в течение 19 дней до достижения ими среднего объема, приблизительно равного 50 мм. Несущих опухоль мышей произвольно распределяли по группам (n=8 мышей на группу). Несущие опухоль мыши получали лечение либо контрольным антителом, либо антителом против TIGIT - ОМР-313М32. Мышам вводили дозу 1 мг/кг или 5 мг/кг каждые 5 дней. Отслеживали рост опухоли и измеряли объемы опухоли с помощью электронного кронциркуля в указанные моменты времени.
[049] Фигура 2. Схематическая диаграмма, на которой показано повышение дозы и применение максимальной переносимой дозы в расширенной популяции в исходной фазе клинического испытания с применением антитела против TIGIT - 313М32.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[050] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы применения новых агентов, при этом указанные агенты включают, но не ограничены перечисленными: полипептиды, антитела, гетеродимерные молекулы и гомодимерные молекулы, которые специфично связывают TIGIT человека. Предложены способы применения новых агентов для ингибирования роста опухоли и/или для лечения рака. Дополнительно предложены способы применения новых агентов, такие как способы активации иммунного ответа, способы стимуляции иммунного ответа, способы содействия иммунному ответу, способы повышения иммунного ответа, способы активации естественных клеток-киллеров (NK) и/или Т-клеток, способы повышения активности NK-клеток и/или Т-клеток, способы стимуляции активности NK-клеток и/или Т-клеток, способы снижения и/или ингибирования супрессорных Т-клеток (т.е., регуляторных Т-клеток) и/или способы снижения и/или ингибирования супрессорных клеток миелоидного происхождения.
I. Определения
[051] Для того чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, ниже представлены определения множества терминов и формулировок.
[052] Термины "агонист" и "агонистический" в данной заявке относятся к агенту или описывают агент, который способен, непосредственно или опосредованно, в значительной степени вызывать, активировать, стимулировать, повышать или усиливать биологическую активность мишени и/или пути. Термин "агонист", используемый в данной заявке, включает любой агент, который частично или полностью индуцирует, активирует, вызывает, повышает или усиливает активность белка.
[053] Термины "антагонист" и "антагонистический" в данной заявке относятся к агенту или описывают агент, который способен, непосредственно или опосредованно, частично или полностью блокировать, ингибировать, снижать или нейтрализовать биологическую активность мишени и/или пути. Термин "антагонист", используемый в данной заявке, включает любой агент, который частично или полностью блокирует, ингибирует, снижает или нейтрализует активность белка.
[054] Термины "модуляция" и "модулировать" в данной заявке относятся к изменению или преобразованию биологической активности. Модуляция включает, но не ограничена, стимуляцией активности или ингибированием активности. Модуляция может представлять собой повышение или снижение активности, изменение в свойствах связывания или любое другое изменение в биологических, функциональных или иммунологических свойствах, связанных с активностью белка, пути, системы или других интересующих биологических мишеней.
[055] Термин "антитело" в данной заявке относится к молекуле иммуноглобулина, которая распознает и специфично связывает мишень посредством по меньшей мере одного антигенсвязывающего участка. Мишень может представлять собой белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинацию любых из перечисленных молекул. В данной заявке в объем данного термина входят интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (такие как фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv), о дно цепочечные антитела Fv (scFv), мультиспецифические антитела, биспецифические антитела, моноспецифические антитела, моновалентные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антигенсвязывающий участок антитела, и любая другая модифицированная молекула иммуноглобулина, содержащая антигенсвязывающий участок, при условии, что антитела проявляют желательную биологическую активность. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, - или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), на основании идентичности их тяжелой цепи константные домены обозначают альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют различные и хорошо известные субъединичные структуры и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированными с другими молекулами, включая, но не ограничиваясь токсинами и радиоактивными изотопами.
[056] Термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела и в целом относится к вариабельным областям интактного антитела с антигенными детерминантами. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничены перечисленными: фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мульти специфические антитела, образованные из фрагментов антител. "Фрагмент антитела" в данной заявке содержит антиген связывающий участок или сайт связывания эпитопа.
[057] Термин "вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации. Как правило, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи состоит из четырех каркасных областей, соединенных тремя определяющими комплементарность участками (CDR), также известными как "гипервариабельные участки". Участки CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости каркасными областями и, вместе с участками CDR из другой цепи, принимают участие в образовании антигенсвязывающего участка(ов) антитела. Существует по меньшей мере две методики определения участков CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (т.е., Kabat и др., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5oe издание, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд), и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al Lazikani и др., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). Кроме того, в данной области иногда используют комбинации данных двух подходов, чтобы определить участки CDR.
[058] Термин "моноклональное антитело" в данной заявке относится к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании одной антигенной детерминанты или эпитопа. В отличие от моноклональных, поликлональные антитела обычно включают смесь различных антител, которые распознают различные антигенные детерминанты. В объем термина "моноклональное антитело" входят как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) антитела, слитые белки, содержащие фрагмент антитела, и любая другая модифицированная молекула иммуноглобулина, содержащая антигенсвязывающий участок. Кроме того, "моноклональное антитело" относится к таким антителам, полученным с помощью любого количества методик, включая, но не ограничиваясь перечисленными: получение гибридомы, селекцию фагов, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.
[059] Термин "гуманизированное антитело" в данной заявке относится к антителам, которые представляют собой специфичные цепи иммуноглобулинов, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат очень маленькие не относящиеся к человеку последовательности. Обычно, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых аминокислотные остатки участков CDR заменены на аминокислотные остатки из CDR не относящихся к человеку видов (например, мыши, крысы, кролика или хомяка), которые обладают желательной специфичностью, аффинностью и/или способностью к связыванию. В некоторых случаях аминокислотные остатки вариабельной области каркаса иммуноглобулина человека можно заменить на соответствующие аминокислотные остатки в антителе из не относящегося к человеку вида. Гуманизированное антитело можно дополнительно модифицировать путем замены дополнительных аминокислотных остатков в вариабельной области каркаса и/или внутри замененных не относящихся к человеку аминокислотных остатков, чтобы дополнительно улучшить и оптимизировать специфичность, аффинность и/или способность к связыванию у антитела. Гуманизированное антитело может содержать вариабельные домены, содержащие все или по существу все CDR, которые соответствуют не относящемуся к человеку иммуноглобулину, тогда как все или по существу все вариабельные области каркаса представляют собой последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации вариабельные домены включают каркасные области с последовательностью иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации вариабельные домены включают каркасные области с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может включать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, обычно из иммуноглобулина человека.
[060] Термин "антитело человека" в данной заявке относится к антителу, продуцированному человеком, или к антителу с последовательностью аминокислот, соответствующей таковой у антитела, продуцированного человеком, полученной с применением любой из методик, известных в данной области.
[061] Термин "химерное антитело" в данной заявке относится к антителу, в котором последовательность аминокислот молекулы иммуноглобулина получена из двух или более видов. Как правило, вариабельные области легкой и тяжелой цепей соответствуют вариабельным областям антитела, полученного из одного вида млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика и т.д.), с желательной специфичностью, аффинностью и/или способностью к связыванию, тогда как константные области гомологичны последовательности в антителе, полученном из другого вида.
[062] Термины "эпитоп" и "антигенная детерминанта" в данной заявке используют взаимозаменяемо, и они относятся к той части антигена или мишени, которая способна узнаваться и специфично связываться конкретным антителом. Если антиген или мишень представляет собой полипептид, то эпитопы могут быть образованы как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, сближенными благодаря третичной укладке белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот (также называемые линейными эпитопами), обычно сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные третичной укладкой (также называемые конформационными эпитопами), обычно утрачиваются при денатурации белка. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3 и чаще по меньшей мере 5, 6, 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.
D
D
[063] Термины "селективно связывает" или "специфично связывает" означает, что агент взаимодействует более часто, более быстро, с большей продолжительностью, с большей аффинностью или с некоторой комбинацией перечисленных выше свойств, с эпитопом, белком или целевой молекулой, чем с альтернативными веществами, включая родственные и неродственные белки. В некоторых вариантах реализации "специфично связывает" означает, например, что агент связывает белок или мишень с K, равной приблизительно 0,1 мМ или менее, но чаще менее чем приблизительно 1 мкМ. В некоторых вариантах реализации "специфично связывает" означает, что агент связывает белок или мишень с K, равной по меньшей мере приблизительно 0,1 мкМ или менее, по меньшей мере приблизительно 0,01 мкМ или менее или по меньшей мере приблизительно 1 нМ или менее. Ввиду идентичности последовательностей между гомологичными белками у различных видов, специфическое связывание может включать агент, который распознает белок или мишень в более чем одном виде (например, TIGIT мыши и TIGIT человека). Аналогичным образом, ввиду гомологии в некоторых участках полипептидных последовательностей различных белков, специфическое связывание может включать агент, который распознает более чем один белок или мишень. Должно быть очевидно, что в некоторых вариантах реализации агент, который специфично связывает первую мишень, может специфично связывать или не связывать вторую мишень. По этой причине термин "специфическое связывание" не обязательно требует (хотя может включать) исключительного связывания, т.е. связывания с одной мишенью. Таким образом, агент в некоторых вариантах реализации может специфично связывать более чем одну мишень. В некоторых вариантах реализации один и тот же антигенсвязывающий участок на агенте может связывать несколько мишеней. Например, антитело в некоторых случаях может содержать два идентичных антигенсвязывающих участка, каждый из которых специфично связывает один и тот же эпитоп на двух или более белках. В некоторых альтернативных вариантах реализации антитело может быть биспецифический и может содержать по меньшей мере два антигенсвязывающих участка с различными специфичностями. Как правило, но необязательно, упоминание связывания означает специфическое связывание.
[064] В данной заявке термины "выбор" и "выбранный" по отношению к пациенту используют для обозначения того, что конкретного пациента специально выбрали из большей группы пациентов на основании (вследствие) того, что конкретный пациент отвечает заранее определенным критериям, например, у указанного пациента есть опухоль с повышенным уровнем экспрессии PVR и/или PVRL2. Аналогично "избирательное лечение пациента с опухолью" относится к предоставлению лечения страдающему раком пациенту, которого специально выбрали из большей группы пациентов на основании (вследствие) того, что конкретный пациент отвечает заранее определенным критериям, например, у пациента есть опухоль с повышенным уровнем экспрессии PVR и/или PVRL2. Аналогично "избирательное введение" относится к введению лекарственного средства страдающему раком пациенту, которого специально выбрали из большей группы пациентов на основании (вследствие) того, что конкретный пациент отвечает заранее определенным критериям, например, у указанного пациента есть опухоль с повышенным уровнем экспрессии PVR и/или PVRL2. Выбор, избирательное лечение и избирательное введение означает, что пациенту доставляют персонализированное лечение рака на основании биологии рака у данного пациента вместо предоставления стандартной схемы лечения, основанной лишь на том, что у пациента есть рак, такой как КРР или НМКРЛ.
[065] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в данной заявке используют взаимозаменяемо, и они относятся к полимерам любой длины, состоящим из аминокислот. Указанный полимер может быть линейным или разветвленным, может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться не относящимися к аминокислотам молекулами. В объем данных терминов также входит полимер из аминокислот, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгирование с метящим компонентом. Также в объем данного определения входят, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты), а также другие модификации, известные в данной области. Должно быть очевидно, что так как полипептиды согласно настоящему изобретению можно получить на основе антител или других представителей суперсемейства иммуноглобулинов, в некоторых вариантах реализации "полипептид" может встречаться в виде отдельных цепей или в виде двух или более ассоциированных цепей.
[066] Термины "полинуклеотид", "нуклеиновая кислота" и "молекула нуклеиновой кислоты" в данной заявке используют взаимозаменяемо, и они относятся к полимерам любой длины, состоящим из нуклеотидов, и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания и/или их аналоги, или любой субстрат, который ДНК- или РНК-полимераза может включить в полимер.
[067] Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые одинаковы или содержат определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков, когда их сравнивают и выравнивают (вводя разрывы при необходимости) для максимального соответствия, при этом любые консервативные замены аминокислот не учитывают в проценте идентичности последовательностей. Процент идентичности можно измерить, применяя программное обеспечение или алгоритмы для сравнения последовательностей или путем визуального наблюдения. Различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно применять для получения выравнивания последовательностей аминокислот или нуклеотидов, хорошо известны в данной области. Они включают, но не ограничены перечисленными: BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Wisconsin Package и их варианты. В некоторых вариантах реализации, если говорят, что две нуклеиновые кислоты или два полипептида согласно настоящему изобретению являются по существу идентичными, то это означает, что они содержат по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% и в некоторых вариантах реализации по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков, когда их сравнивают и выравнивают для максимального соответствия, что измеряют с применением алгоритма сравнения последовательностей или путем визуального наблюдения. В некоторых вариантах реализации идентичность присутствует на протяжении участка последовательностей, длина которого составляет по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 40-60 нуклеотидов или аминокислотных остатков, по меньшей мере приблизительно 60-80 нуклеотидов или аминокислотных остатков, или любое целое значение между указанными значениями. В некоторых вариантах реализации идентичность наблюдается на более протяженном участке, чем 60-80 нуклеотидов или аминокислотных остатков, таком как по меньшей мере приблизительно 80-100 нуклеотидов или аминокислотных остатков, и в некоторых вариантах реализации указанные последовательности по существу идентичны на всем протяжении сравниваемых последовательностей, например, кодирующей области последовательности нуклеотидов.
[068] "Консервативная замена аминокислоты" представляет собой такую замену, при которой один аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток, содержащий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, содержащих сходные боковые цепи, в целом были охарактеризованы в данной области, и они содержат основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замену фенилаланина на тирозин считают консервативной заменой. Как правило, консервативные замены в последовательностях полипептидов и/или антител согласно настоящему изобретению не нарушают связывание указанного полипептида или антитела, содержащего указанную последовательность аминокислот, с целевым сайтом связывания. Способы идентификации консервативных замен нуклеотидов и аминокислот, которые не предотвращают связывание, хорошо известны в данной области.
[069] Термин "вектор" в данной заявке означает конструкцию, которая способна доставлять и, обычно, экспрессировать один или более интересующих генов или последовательностей в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, но не ограничены перечисленными: вирусные векторы, векторы экспрессии на основе голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами, и векторы экспрессии на основе ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомы.
[070] Полипептид, растворимый белок, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются "выделенными", представляют собой полипептид, растворимый белок, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которые находятся в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, растворимые белки, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают такие полипептиды, растворимые белки, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции, которые были очищены до такой степени, что они более не находятся в форме, в которой они встречаются в природе. В некоторых вариантах реализации полипептид, растворимый белок, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые являются изолированными, являются по существу чистыми.
[071] Термин "по существу чистый" в данном описании относится к материалу, который по меньшей мере на 50% чистый (т.е., свободный от примесей), по меньшей мере на 90% чистый, по меньшей мере на 95% чистый, по меньшей мере на 98% чистый или по меньшей мере на 99% чистый.
[072] Термин "иммунный ответ" в данной заявке включает ответы как врожденной иммунной системы, так и адаптивной иммунной системы. Он включает как опосредованные клетками, так и гуморальные иммунные ответы. Он включает как Т-клеточные, так и В-клеточные ответы, а также ответы других клеток иммунной системы, таких как естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, макрофаги и т.д., но не ограничен ими.
[073] Термины "рак" и "раковый" в данном описании относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничены перечисленными: карциному, бластому, саркому и гематологические типы рака, такие как лимфома и лейкоз.
[074] Термины "опухоль" и "новообразование" в данном описании относятся к любой массе ткани, которая возникла в результате избыточного роста или пролиферации клеток, либо к доброкачественной (нераковой), либо к злокачественной (раковой), включая предраковые патологические изменения.
[075] Термин "метастазирование" в данном описании относится к процессу, с помощью которого рак распространяется или переносится из места возникновения в другие части организма с развитием аналогичного ракового повреждения в новой локализации. Как правило, "метастатическая" или "метастазирующая" клетка представляет собой такую клетку, которая утрачивает адгезионные контакты с соседними клетками и мигрирует с помощью кровотока или лимфы из первичного очага заболевания во вторичные сайты по всему организму.
[076] Термины "раковая клетка" и "опухолевая клетка" относятся к общей популяции клеток, полученных из рака, или опухоли, или предракового патологического изменения, и включают как неонкогенные клетки, которые составляют основную массу популяции раковых клеток, так и онкогенные стволовые клетки (раковые стволовые клетки). В данной заявке термины "раковая клетка" или "опухолевая клетка" будут дополнены термином "неонкогенная", если они будут относиться только к таким клеткам, у которых нет способности возобновляться и дифференцироваться, чтобы отличить такие опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.
[077] Термин "субъект" относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь перечисленными: людей, отличных от человека приматов, псовых, кошачьих, кроликов, грызунов и тому подобных, - которое должно будет получить конкретное лечение. Обычно термины "субъект" и "пациент" в данной заявке используют взаимозаменяемо по отношению к субъекту - человеку.
[078] Термин "фармацевтически приемлемый" относится к веществу, которое одобрено или может быть одобрено регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечислено в фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных, включая людей.
[079] Термины "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или адъювант" или "приемлемый фармацевтический носитель" относятся к вспомогательному веществу, носителю или адъюванту, которые можно вводить субъекту вместе с по меньшей мере одним агентом согласно настоящему описанию, и которые не нейтрализуют его фармакологическую активность и нетоксичны при введении в дозах, достаточных для оказания терапевтического действия. В общем, специалисты в данной области и Управление США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) считают, что фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, носитель или адъювант должны быть неактивными ингредиентами любого состава.
[080] Термины "эффективное количество", или "терапевтически эффективное количество", или "терапевтическое действие" относятся к количеству агента, антитела, полипептида, полинуклеотида, малой органической молекулы или другого лекарственного средства, которое эффективно для "лечения" заболевания или расстройства у субъекта, такого как млекопитающее. В случае рака или опухоли терапевтически эффективное количество агента (например, полипептида или антитела) оказывает терапевтическое действие и поэтому может усиливать или стимулировать иммунный ответ, усиливать или стимулировать противоопухолевый ответ, повысить цитолитическую активность иммунных клеток, повысить уничтожение опухолевых клеток, повысить уничтожение опухолевых клеток иммунными клетками, уменьшить количество опухолевых клеток; снизить онкогенность, частоту онкогенеза или онкогенный потенциал; уменьшить количество или встречаемость раковых стволовых клеток; уменьшить размер опухоли; уменьшить популяцию раковых клеток; ингибировать или остановить инфильтрацию раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкую ткань и кость; ингибировать или остановить метастазирование опухолевых или раковых клеток; ингибировать или остановить рост опухолевых или раковых клеток; облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком; снизить заболеваемость и смертность; улучшить качество жизни; или оказать комбинацию таких действий.
[081] Термины "подвергать лечению", или "лечение", или "лечить", или "облегчение", или "облегчать" относятся как к (1) терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование диагностированного патологического состояния или расстройства, так и к (2) профилактическим или предупредительным мерам, которые предотвращают или замедляют развитие патологического состояния или расстройства, против которого они направлены. Таким образом, нуждающиеся в лечении субъекты включают субъектов, которые уже страдают расстройством; субъектов, склонных к данному расстройству; и субъектов, у которых указанное расстройство нужно предотвратить. В случае рака или опухоли субъекта успешно "лечат" в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, если у пациента наблюдают один или более из следующих эффектов: повышенный иммунный ответ, повышенный противоопухолевый ответ, повышенную цитолитическую активность иммунных клеток, повышенное уничтожение опухолевых клеток, повышенное уничтожение опухолевых клеток иммунными клетками, уменьшение количества или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие инфильтрации раковых клеток в периферические органы, включая распространение раковых клеток в мягкую ткань и кость; ингибирование или отсутствие метастазирования опухолевых или раковых клеток; ингибирование или отсутствие роста рака; освобождение от одного или более симптомов, связанных с конкретным раком; пониженную заболеваемость и смертность; улучшение качества жизни; снижение онкогенности; уменьшение количества или встречаемости раковых стволовых клеток; или некоторую комбинацию указанных эффектов.
[082] В настоящем описании и формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если в контексте явно не указано иное.
[083] Очевидно, что всякий раз, когда варианты реализации описаны в данной заявке с формулировкой "включающий (содержащий)", также предложены в остальном аналогичные варианты реализации, описанные с использованием терминов "состоящий из" и/или "состоящий по существу из". Также очевидно, что всякий раз, когда варианты реализации описаны в данной заявке с формулировкой "состоящий по существу из", также предложены в остальном аналогичные варианты реализации, описанные с использованием термина "состоящий из".
[084] В данном описании употребление терминов "около" или "приблизительно" по отношению к значению или параметру включает (и описывает) варианты реализации, которые направлены на данное значение или параметр. Например, описание, в котором ссылаются на "приблизительно X", включает описание "X".
[085] В данном описании считают, что термин "и/или", используемый в такой формулировке как "А и/или В", включает как А, так и В; А или В; А (отдельно); и В (отдельно). Аналогичным образом считают, что в объем термина "и/или", используемого в такой формулировке как "А, В и/или С", входит каждый из следующих вариантов реализации: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).
II. Способы применения и фармацевтические композиции
[086] Связывающие TIGIT агенты согласно настоящему изобретению пригодны для различных применений, включая, но не ограничиваясь способами терапевтического лечения, например, лечения рака. В некоторых вариантах реализации способы терапевтического лечения включают иммунотерапию рака. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент пригоден для активации, стимуляции, повышения и/или усиления иммунного ответа, ингибирования роста опухоли, уменьшения объема опухоли, повышения апоптоза опухолевых клеток и/или снижения онкогенности опухоли.
[087] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы ингибирования роста опухоли с применением связывающего TIGIT агента. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли включает введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации у субъекта есть опухоль или у субъекта была опухоль, которую по меньшей мере частично удалили.
[088] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью (КРР MSI), микросателлитно-стабильный колоректальный рак (КРР MSS), трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью (КРР MSI), микросателлитно-стабильный колоректальный рак (КРР MSS), трижды негативный рак молочной железы (ТНРМЖ), карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой рак пищевода, который прогрессировал на по меньшей мере одной предшествующей системной терапии или линии лечения неоперабельного и/или метастатического заболевания. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой трижды негативный рак молочной железы, который был гистологически подтвержден как неизлечимая, распространенная, негативная по рецептору эстрогенов, негативная по рецептору прогестерона и негативная по рецептору эпидермального фактора роста 2 человека аденокарцинома молочной железы.
[089] В некоторых вариантах реализации гистологическое подтверждение осуществляет квалифицированный специалист, такой как обученный клинический врач, применяя любой способ, известный в данной области, такой как иммуногистохимия.
[090] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой MSI может включать КРР MSI, рак желудка MSI, рак эндометрия MSI, рак яичников MSI, рак печени и желчевыводящих путей MSI, рак мочевыводящих путей MSI, рак головного мозга MSI или рак кожи MSI.
[091] Как правило, опухоли можно классифицировать по их микросателлитной стабильности (MSI). Например, солидные опухоли можно классифицировать как опухоли с высокой MSI, с низкой MSI или MSI-стабильные. Опухоли с высокой MSI могут включать, без ограничения, рак толстого кишечника, рак желудка, рак эндометрия, рак яичников, рак печени и желчевыводящих путей, рак мочевыводящих путей, рак головного мозга и рак кожи. MSI можно определить, применяя любой способ, известный в данной области, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) или иммуногистохимия (ИГХ). В некоторых вариантах реализации MSI определяют в образце, полученном из страдающего раком пациента. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой образец биоптата (например, пункционного биоптата). В некоторых вариантах реализации MSI определяют с помощью способа на основе полимеразной цепной реакции (ППР), такого как, но не ограничиваясь перечисленными: ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественная ОТ-ПЦР (кПЦР), анализ TaqMan™ или анализ с использованием чипа низкой плотности TaqMan™ (TLDA). В некоторых вариантах реализации MSI определяют, применяя микрочип. В некоторых вариантах реализации MSI определяют путем секвенирования ДНК, такого как секвенирование нового поколения. В некоторых вариантах реализации MSI определяют в иммуногистохимическом (ИГХ) анализе. В некоторых вариантах реализации MSI опухоли сравнивают с предварительно определенным MSI. В некоторых вариантах реализации опухоль классифицируют как опухоль с высокой MSI, если MSI в опухоли выше, чем заранее определенная MSI. В некоторых вариантах реализации заранее определенная MSI представляет собой MSI в эталонном образце опухоли, эталонном образце нормальной ткани, ряде эталонных образцов опухоли или ряде эталонных образцов нормальной ткани.
[092] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью, микросателлитно-стабильный колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, карциному из клеток Меркеля, рак эндометрия или рак пищевода, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой рак пищевода, который прогрессировал на по меньшей мере одной предшествующей системной терапии или линии лечения неоперабельного и/или метастатического заболевания. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой трижды негативный рак молочной железы, который был гистологически подтвержден как неизлечимая, распространенная, негативная по рецептору эстрогенов, негативная по рецептору прогестерона и негативная по рецептору эпидермального фактора роста 2 человека аденокарцинома молочной железы.
[093] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации солидная опухоль с высокой микросателлитной нестабильностью может включать КРР MSI, рак желудка MSI, рак эндометрия MSI, рак яичников MSI, рак печени и желчевыводящих путей MSI, рак мочевыводящих путей MSI, рак головного мозга MSI или рак кожи MSI.
[094] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-L1, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антителом против PD-L1.
[095] В некоторых вариантах реализации опухоль, которая устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, выбрана из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы.
[096] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 в виде отдельного агента или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации указанный антагонист PD-1 представляет собой антитело против PD-1. В некоторых вариантах реализации антитело против PD-1 представляет собой пембролизумаб (Китруда). В некоторых вариантах реализации антитело против PD-1 представляет собой ниволумаб (Опдиво). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (лечения рак) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль устойчива или рефрактерна к лечению антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антагонист PD-L1 представляет собой антитело против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб (Тецентрик). В некоторых вариантах реализации антитело против PD-L1 представляет собой авелумаб (MSB0010718C).
[097] В некоторых вариантах реализации опухоль, устойчивая или рефрактерная к лечению антагонистом PD-1 в виде отдельного агента или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента, может включать меланому, НМКРЛ, почечно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному головы и шеи, уротелиальную карциному, колоректальный рак (например, метастатический КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточную карциному.
[098] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-L1, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом происходило прогрессирование заболевания во время или после лечения. Субъектов, у которых происходило прогрессирование заболевания во время или после специфического лечения, в данной заявке могут называть "прогрессорами". В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 в качестве терапии первой линии. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 в качестве терапии второй или третьей линии. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 в качестве терапии первой линии. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 в качестве терапии второй или третьей линии. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение атезолизумабом (Тецентрик). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение авелумабом (MSB0010718C). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 в составе комбинированной терапии. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 и вторым ингибитором контрольных точек. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 и антителом против CTLA-4. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение ниволумабом (Опдиво) и ипилимумабом (Ервой). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1 и химиотерапевтическим агентом. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 и вторым ингибитором контрольных точек. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 и антителом против CTLA-4. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 и ипилимумабом (Ервой). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1 и химиотерапевтическим агентом.
[099] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1, при этом указанного субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-1; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации рост опухоли прогрессировал во время лечения антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации рост опухоли возобновлялся после лечения антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации опухоль была чувствительна к комбинированной терапии антителом против TIGIT и антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации опухоль была чувствительна к комбинированной терапии антителом против TIGIT и антителом против PD-1, при этом ответ опухоли был лучше, чем ответ, полученный при введении антитела против TIGIT отдельно. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1, при этом указанный субъект ранее получал лечение антагонистом PD-L1 в виде отдельного агента; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение атезолизумабом (Тецентрик). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение авелумабом (MSB0010718C). В некоторых вариантах реализации рост опухоли прогрессировал во время лечения антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации рост опухоли возобновлялся после лечения антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации опухоль была чувствительна к комбинированной терапии антителом против TIGIT и антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации опухоль была чувствительна к комбинированной терапии антителом против TIGIT и антителом против PD-L1, при этом ответ опухоли был лучше, чем ответ, полученный при введении антитела против TIGIT отдельно.
[0100] В некоторых вариантах реализации опухоль у субъекта, который ранее получал лечение антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, может представлять собой такую опухоль, как меланома, НМКРЛ, почечно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, уротелиальная карцинома, колоректальный рак (например, метастатический КРР MSI или dMMR) или печеночно-клеточная карцинома.
[0101] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации из субъекта получают образец опухоли и определяют уровень экспрессии PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR используют для выбора субъекта для лечения. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVRL2 используют для выбора субъекта для лечения.
[0102] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0103] В некоторых вариантах реализации опухоль/рак, экспрессирующий PVR и/или PVRL2, включает НМКРЛ, почечно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному головы и шеи, уротелиальную карциному, колоректальный рак (например, метастатический КРР MSI или dMMR) или печеночно-клеточную карциному.
[0104] В некоторых вариантах реализации опухоль/рак, экспрессирующий PVR и/или PVRL2, включает КРР, рак желудка, рак эндометрия, рак яичников, рак печени и желчевыводящих путей, рак мочевыводящих путей, рак головного мозга или рак кожи.
[0105] В некоторых вариантах реализации опухоль/рак, экспрессирующий PVR и/или PVRL2, включает КРР MSI, рак желудка MSI, рак эндометрия MSI, рак яичников MSI, рак печени и желчевыводящих путей MSI, рак мочевыводящих путей MSI, рак головного мозга MSI или рак кожи MSI.
[0106] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль экспрессирует PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с атезолизумабом (Тецентрик).
[0107] В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR и/или PVRL2 в образце опухоли определяют как высокий уровень. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR в образце сравнивают с предварительно определенным уровнем экспрессии PVR. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVRL2 в образце сравнивают с предварительно определенным уровнем экспрессии PVRL2. В некоторых вариантах реализации предварительно определенный уровень экспрессии PVR представляет собой уровень экспрессии PVR в эталонном образце опухоли, эталонном образце нормальной ткани, ряде эталонных образцов опухоли или ряде эталонных образцов нормальной ткани. В некоторых вариантах реализации предварительно определенный уровень экспрессии PVRL2 представляет собой уровень экспрессии PVRL2 в эталонном образце опухоли, эталонном образце нормальной ткани, ряде эталонных образцов опухоли или ряде эталонных образцов нормальной ткани. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR или PVRL2 определяют, применяя иммуногистохимический (ИГХ) анализ. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR и/или PVRL2 определяют, применяя анализ, который включает оценку Н-показателя. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR определяют, применяя антитело, которое специфично связывает PVR. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVRL2 определяют, применяя антитело, которое специфично связывает PVRL2. В некоторых вариантах реализации PVR детектируют на опухолевых клетках. В некоторых вариантах реализации PVRL2 детектируют на опухолевых клетках. В некоторых вариантах реализации PVR детектируют на инфильтрирующих опухоль иммунных клетках и/или в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах реализации PVRL2 детектируют на инфильтрирующих опухоль иммунных клетках и/или в микроокружении опухоли.
[0108] В некоторых вариантах реализации определяют уровень экспрессии PVR и/или PVRL2, применяя способы на основе ПЦР, такие как, но не ограниченные перечисленными: ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественная ОТ-ПЦР (кПЦР), анализ TaqMan™ или анализ с использованием чипа низкой плотности TaqMan™ (TLDA). В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии биомаркера определяют, применяя микрочип.
[0109] В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии PVR и/или PVRL2 определяют, применяя способы на основе белков. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии биомаркера измеряют или определяют с помощью анализа мультианалитного профиля, радиоиммуноанализа (RIA), анализа вестерн-блот, иммунофлуоресцентного анализа, ферментативного иммуноанализа, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммунопреципитационного анализа, хемилюминесцентного анализа, иммуногистохимического (ИГХ) анализа, дот-блот анализа или слот-блот анализа. В некоторых вариантах реализации определяют уровень экспрессии PVR и/или PVRL2, применяя анализ ИГХ. В некоторых вариантах реализации в анализе применяют антитело (например, такое как антитело против PVR или против PVRL2). В некоторых вариантах реализации, в которых в анализе применяют антитело, указанное антитело метят детектируемой меткой. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из группы, состоящей из иммунофлуоресцентной метки, хемилюминесцентной метки, фосфоресцентной метки, ферментативной метки, радиоактивной метки, метки авидин/биотин, частиц коллоидного золота, окрашенных частиц и магнитных частиц.
[0110] В некоторых вариантах реализации определение уровня экспрессии PVR и/или PVRL2 осуществляют до лечения связывающим TIGIT агентом. В некоторых вариантах реализации, если в опухоли или раке повышен уровень экспрессии PVR и/или PVRL2, то субъекту вводят связывающий TIGIT агент. В некоторых вариантах реализации указанный способ включает (i) получение образца опухоли из субъекта; (ii) измерение уровня экспрессии PVR и/или PVRL2 в образце; и (iii) введение эффективного количества связывающего TIGIT агента субъекту, если в опухоли или раке наблюдается повышенный или высокий уровень экспрессии PVR и/или PVRL2.
[0111] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1 на основании того, что в опухоли повышен уровень экспрессии PVR и/или PVRL2. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1, при этом в указанной опухоли повышен уровень экспрессии PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-L1 на основании того, что в опухоли повышен уровень экспрессии PVR и/или PVRL2; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с атезолизумабом (Тецентрик).
[0112] В некоторых вариантах реализации образец представляет собой образец биоптата. В некоторых вариантах реализации образец содержит опухолевые клетки, инфильтрирующие опухоль иммунные клетки, стромальные клетки и любую комбинацию перечисленных клеток. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой фиксированный в формалине и заключенный в парафин (FFPE) образец. В некоторых вариантах реализации образец представляет собой архивную, свежую или замороженную ткань.
[0113] У некоторых пациентов присутствуют опухоли с активным иммунным микроокружением. Данные опухоли называют "воспаленными" или "горячими" опухолями, и для них характерно наличие, например, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ), продуцирующих IFN-гамма CD8+ Т-клеток и экспрессии PD-L1. В некоторых исследованиях воспаленные или горячие опухоли ассоциировали с клиническим ответом на иммунотерапевтические средства.
[0114] Таким образом, в некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль содержит ИОЛ. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль содержит ИОЛ; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль содержит высокий уровень ИОЛ по сравнению с заранее определенным уровнем. В некоторых вариантах реализации уровень ИОЛ представляет собой абсолютное количество ИОЛ. В некоторых вариантах реализации уровень ИОЛ представляет собой процент от общего количества клеток.
[0115] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит ИОЛ. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит ИОЛ; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль содержит высокий уровень ИОЛ по сравнению с заранее определенным уровнем. В некоторых вариантах реализации уровень ИОЛ представляет собой абсолютное количество ИОЛ. В некоторых вариантах реализации уровень ИОЛ представляет собой процент от общего количества клеток. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с атезолизумабом (Тецентрик).
[0116] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента, при этом указанная опухоль содержит высокий уровень регуляторных Т-клеток (Treg). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, при этом указанная опухоль содержит высокий уровень клеток Treg; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 7), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 8).
[0117] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества связывающего TIGIT агента в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит высокий уровень клеток Treg. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли (например, лечения рака) у субъекта включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, в комбинации с антагонистом PD-1 или антагонистом PD-L1, при этом указанная опухоль содержит высокий уровень клеток Treg; и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с пембролизумабом (Китруда). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с ниволумабом (Опдиво). В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против TIGIT вводят в комбинации с атезолизумабом (Тецентрик).
[0118] В некоторых вариантах реализации присутствие иммунных клеток (например, ИОЛ, Treg, Teff) в опухоли или в микроокружении опухоли анализируют путем оценки экспрессии специфичных белков на поверхности или внутри клеток. Широко применяемые способы анализа экспрессии белка включают, но не ограничены, способами на основе иммуногистохимии (ИГХ), на основе антител и на основе масс-спектрометрии. В некоторых вариантах реализации экспрессию белка на поверхности или внутри иммунной клетки определяют с помощью анализа, известного специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленными: анализ мультианалитного профиля, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ, анализ вестерн-блот, иммунофлуоресцентный анализ, ферментативный иммуноанализ, иммунопреципитационный анализ, хемилюминесцентный анализ, иммуногистохимический (ИГХ) анализ, дот-блот анализ или слот-блот анализ. Антитела, как правило, моноклональные антитела, можно применять для детектирования экспрессии продукта гена (например, белка). В некоторых вариантах реализации антитела можно детектировать путем мечения напрямую самого антитела. В других вариантах реализации немеченое первичное антитело применяют в сочетании с меченым вторичным антителом.
[0119] В некоторых вариантах реализации экспрессию специфичного белка определяют, применяя агент, который специфично связывает указанный белок. Можно использовать любую молекулу, которая проявляет специфичное связывание с белком, чтобы оценить экспрессию данного белка в образце. Специфично связывающие агенты включают, но не ограничены перечисленными: антитела, миметики антител и полинуклеотиды (например, аптамеры). Специалист поймет, что необходимая степень специфичности определяется конкретным анализом, который применяют для детектирования белка.
[0120] CD45 (общий лейкоцитарный антиген, LCA; включая все белки из семейства CD45) используют в качестве маркера иммунных клеток, включая лимфоциты, NK-клетки, макрофаги, моноциты и т.д. Т-клетки можно разделить на различные субпопуляции, включая, но не ограничиваясь CD4+ Т-клетками или CD8+ Т-клетками. В некоторых вариантах реализации CD45 используют в качестве маркера ИОЛ в образце опухоли. В некоторых вариантах реализации ИОЛ детектируют и/или оценивают, применяя антитело против CD45. В некоторых вариантах реализации используют коктейль моноклональных антител против CD45, каждое из которых распознает различный изотип и/или различные эпитопы CD45. В некоторых вариантах реализации ИОЛ детектируют и/или оценивают, применяя антитело против CD4. В некоторых вариантах реализации ИОЛ детектируют и/или оценивают, применяя антитело против CD8.
[0121] Специалистам в данной области известно, что FOXP3 представляет собой маркер регуляторных Т-клеток (Treg), и его можно использовать для детектирования и/или идентификации клеток Treg в образце опухоли. Исследования показали, что клетки Treg состоят из множества субпопуляций с различными функциями, и одну субпопуляцию идентифицировали как FOXP3+ и TIGIT+. В некоторых вариантах реализации клетки Treg детектируют и/или оценивают по экспрессии FOXP3. В некоторых вариантах реализации экспрессию FOXP3 детектируют и/или оценивают, применяя антитело против FOXP3. В некоторых вариантах реализации используют коктейль моноклональных антител против FOXP3, каждое из которых распознает различный изотип и/или различные эпитопы. В некоторых вариантах реализации клетки Treg детектируют и/или оценивают по экспрессии FOXP3 и TIGIT. В некоторых вариантах реализации экспрессию TIGIT детектируют и/или оценивают, применяя антитело против TIGIT.
125
131
35
3
[0122] В некоторых вариантах реализации, в которых применяют антитело, указанное антитело метят детектируемой меткой. Примеры детектируемых веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, фосфоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, хемилюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, авидин/биотин, частицы коллоидного золота, окрашенные частицы и магнитные частицы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов с простетическими группами включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного материала включают I, I, S или Н.
[0123] В некоторых вариантах реализации экспрессию CD45, CD4, CD8, FOXP3 и/или TIGIT определяют, применяя анализ ИГХ. Например, делают срезы FFPE образца опухоли и приклеивают их к предметным стеклам с покрытием. Ткани депарафинизируют и регидратируют путем последовательной инкубации в ксилоле, 100% этаноле, 95% этаноле, 70% этаноле и дистиллированной воде для демаскирования антигена. Стекла помещают в раствор для демаскирования и помещают в Decloaker для демаскирования антигена. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы стекла инкубируют в перекиси водорода и промывают в ФБР. Для блокирования неспецифического фонового окрашивания стекла инкубируют в блокирующем растворе. Стекла инкубируют с антителом против PD-L1. Специфическое связывание детектируют, применяя набор, содержащий диаминобензидин (DAB). Осуществляют контрастное окрашивание срезов гематоксилином. В некоторых вариантах реализации срезы FFPE приклеивают к предметным стеклам с покрытием и окрашивают, применяя автоматизированную систему, например, на устройстве BenchMark ULTRA Ventana, применяя реагенты Ventana.
[0124] В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело мыши, которое связывает биомаркер человека (например, CD45, CD4, CD8, FOXP3, TIGIT). В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело кролика, которое связывает биомаркер человека (например, CD45, CD4, CD8, FOXP3, TIGIT). В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело козы, которое связывает биомаркер человека (например, CD45, CD4, CD8, FOXP3, TIGIT).
[0125] Стекла ИГХ можно проанализировать, применяя автоматизированное устройство, или оценить вручную с помощью микроскопа. Измеряют интенсивность окрашивания каждой клетки (0 - нет экспрессии, 1 - слабая экспрессия, 2 - умеренная экспрессия, 3 - сильная экспрессия), подсчитывают клетки с каждым уровнем окрашивания и рассчитывают процент для каждого типа. Результаты объединяют с получением взвешенного Н-показателя для каждого среза ткани: Н-показатель = [3 × (% 3 + клеток)] + [2 × (% 2 + клеток)] + [1 × (% 1 + клеток)]. При использовании данных параметров, наибольшее доступное значение Н-показателя = 300. В некоторых вариантах реализации Н-показатель, равный 1 или менее, считают негативным. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение специфичности. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение эффективности. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение, определенное путем скрининга позитивных и негативных опухолевых тканей. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение, равное приблизительно 25. В некоторых вариантах реализации в анализе ИГХ используют пороговое значение, равное приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, или приблизительно 110, или приблизительно 120.
[0126] Другие подходящие способы анализа уровня экспрессии биомаркера включают способы, основанные на протеомике. Протеомика включает, среди прочего, исследование общего изменения экспрессии белка в образце. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает следующие этапы: (1) разделение отдельных белков в образце с помощью двухмерного (2D) электрофореза (2D ЭФ в ПААГ), (2) идентификацию отдельных белков, полученных из геля (например, с помощью масс-спектрометрии или N-концевого секвенирования) и (3) анализ результатов с помощью биоинформатики. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает применение тканевого микрочипа (ТМА). Тканевые чипы можно сконструировать в соответствии с различными методиками, известными специалисту в данной области. В некоторых вариантах реализации применяют ручное устройство для изготовления тканевых чипов, чтобы удалить «сердцевину» из парафинового блока, полученного из образца ткани. Сердцевину затем вставляют в отдельный парафиновый блок в определенное положение на координатной сетке. Сердцевины из вплоть до приблизительно 400 образцов можно вставить в один принимающий блок. Полученный в результате этого тканевый чип можно обработать с получением тонких срезов для анализа. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает микрочип с антителами. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает применение масс-спектрометрии, включая, но не ограничиваясь перечисленными способами: усиленную поверхностью лазерную десорбцию/ионизацию (SELDI), матрично-активированную лазерную десорбцию/ионизацию (MALDI), электрораспыление и поверхностный плазмонный резонанс. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает методику на основе гранул, включая, но не ограничиваясь применением антител на гранулах в формате чипа. В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает белковый микрочип с обращенной фазой (RPPM). В некоторых вариантах реализации протеомный способ включает мультиплексный анализ профиля белков, включая, но не ограничиваясь способом анализа полного протеома (GPS).
[0127] Другие подходящие способы анализа уровня экспрессии биомаркера включают, но не ограничены перечисленными: способы, основанные на анализах экспрессии полинуклеотидов, секвенировании полинуклеотидов и/или анализах экспрессии белка. Например, определение уровней экспрессии биомаркера можно осуществить путем обнаружения экспрессии мРНК с интересующих генов и/или путем обнаружения экспрессии полипептида, кодируемого указанными генами.
[0128] Широко применяемые способы анализа полинуклеотидов включают анализ Саузерн-блот, анализ Нозерн-блот и гибридизацию in situ, анализы с защитой от РНКаз и способы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественная ПЦР (кПЦР), известная как ПЦР в реальном времени, анализ TaqMan™, анализ с использованием чипа низкой плотности TaqMan™ (TLDA), заякоренная ПЦР, конкурентная ПЦР, быстрая амплификация концов кДНК (RACE) и микрочиповые анализы. ОТ-ПЦР представляет собой количественный способ, который можно применять для сравнения уровней мРНК в различных образцах для исследования профилей экспрессии генов. Вариантом ОТ-ПЦР является количественная ПЦР в реальном времени, в которой измеряют накопление продукта ПЦР с помощью флуорогенного зонда с двойной меткой (например, зонда TaqMan™). Существует множество других методик на основе ПЦР, известных специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленными: дифференциальный дисплей, полиморфизм длины амплифицированных фрагментов, методику BeadArray™, определение профиля экспрессии с высоким покрытием (HiCEP) и цифровую ПЦР. Примеры способов анализа экспрессии генов, основанных на секвенировании, включают серийный анализ экспрессии генов (SAGE), анализ методом массивно-параллельного опознавательного секвенирования (MPSS) и секвенирования нового поколения, включая секвенирование мРНК.
[0129] В некоторых вариантах реализации экспрессию биомаркера определяют, применяя анализ методом количественной ПЦР. Например, общую РНК экстрагируют из свежезамороженного (FF) образца ткани или общую РНК экстрагируют из макроскопически препарированного фиксированного в формалине и заключенного в парафин (FFPE) образца ткани. Количество и качество полученной общей РНК оценивают с помощью стандартной спектрофотометрии и/или любого другого подходящего способа (например, с помощью биоанализатора Agilent). После экстрагирования РНК, образец РНК обратно транскрибируют, применяя стандартные способы и/или доступный для приобретения набор для синтеза кДНК (например, набор Transcriptor First Strand cDNA Synthesis). Полученную к ДНК предварительно амплифицируют, применяя, например, набор для предварительной амплификации ABI. Экспрессию биомаркера(-ов) (например, CD45, CD4, CD8, Foxp3, TIGIT, других генов иммунного ответа) оценивают, например, на системе Roche Lightcycler 480 (Roche Diagnostics), применяя общую реакционную смесь ABI TaqMan Gene Expression Mastermix. Реакции количественной ПЦР проводят в трех повторах. В каждом анализе запускают набор образцов без обратной транскрипции (негативный контроль ОТ), а также запускают контрольные образцы без матрицы. Универсальный эталонный образец РНК человека добавляют в каждый планшет, чтобы он служил в качестве положительного контроля. Подходящие эталонные гены идентифицируют из стандартной панели эталонных генов. Выбирают кандидатные эталонные гены с отличными функциями в клетке, чтобы минимизировать риск совместной регуляции. Наиболее подходящие эталонные гены оценивают и выбирают, применяя специальное программное обеспечение и алгоритмы (например, программное обеспечение Genex; алгоритмы GeNorm и Normfinder). Уровень экспрессии каждого биомаркера нормируют, применяя выбранные оптимальные эталонные гены. В некоторых вариантах реализации данные нормированные (или стандартизированные) значения экспрессии для каждого биомаркера используют для расчета порога решения для образца. В некоторых вариантах реализации данные нормированные (или стандартизированные) значения экспрессии для каждого биомаркера используют для расчета уровня экспрессии.
[0130] В некоторых вариантах реализации экспрессию биомаркера определяют, применяя анализ на основе ПЦР, включающий специфичные для биомаркера человека (например, CD45, CD4, CD8, Foxp3, TIGIT) праймеры и/или зонды. В данной заявке термин "зонд" относится к любой молекуле, которая специально предназначена для селективного связывания целевой биомолекулы. Зонды может синтезировать специалист в данной области, применяя известные методики, или их можно получить из биологических препаратов. Зонды могут включать, но не ограничены перечисленными: РНК, ДНК, белки, пептиды, аптамеры, антитела и органические молекулы. В объем термина "праймер" или "зонд" входят олигонуклеотиды с последовательностью согласно конкретному SEQ ID NO или олигонуклеотиды с последовательностью, комплементарной конкретному SEQ ID NO. В некоторых вариантах реализации зонд модифицируют. В некоторых вариантах реализации зонд модифицируют гасителем. В некоторых вариантах реализации зонд метят. Метки могут включать, но не ограничены перечисленными: колориметрические, флуоресцентные, хемилюминесцентные или биолюминесцентные метки.
[0131] В качестве альтернативы, уровни экспрессии биомаркера можно определить путем амплификации комплементарной ДНК (кДНК) или комплементарной РНК (кРНК), полученной из мРНК, и ее анализа с применением микрочипа. Методика микрочипов позволяет проводить одновременный анализ экспрессии тысяч генов. Множество различных конфигураций чипов и способы их получения известны специалистам в данной области. Кроме того, микрочипы доступны для приобретения (например, Affymetrix GeneChips) или могут быть изготовлены на заказ. Микрочипы, которые на сегодняшний день широко применяются, включают кДНК-чипы и олигонуклеотидные чипы. Обычно, интересующие полинуклеотиды (например, зонды или наборы зондов) наносят или упорядочивают на субстрате микрочипа. В некоторых вариантах реализации зонды к по меньшей мере 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 20000 или 25000 или более генам иммобилизуют на субстрате чипа. Субстрат может представлять собой пористую или непористую подложку, такую как поверхность из стекла, пластика или геля. Зонды могут включать ДНК, РНК, сополимерные последовательности ДНК и РНК, аналоги ДНК и/или РНК, или комбинации перечисленных молекул. В некоторых вариантах реализации микрочип включает подложку с упорядоченным массивом сайтов связывания для каждого отдельного гена. Микрочипы могут представлять собой адресуемые чипы или позиционно адресуемые чипы, например, каждый зонд чипа расположен в известном, заранее определенном положении на твердой подложке, так что каждый зонд можно идентифицировать по его положению на чипе.
[0132] Каждый зонд на микрочипе может быть длиной 10-50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации зонды на микрочипе могут состоять из последовательностей нуклеотидов длиной менее чем приблизительно 1000 нуклеотидов, менее чем приблизительно 750 нуклеотидов, менее чем приблизительно 500 нуклеотидов, менее чем приблизительно 250 нуклеотидов, менее чем приблизительно 100 нуклеотидов или менее чем приблизительно 50 нуклеотидов. Как правило, чип содержит зонды положительного контроля и зонды отрицательного контроля.
[0133] В некоторых вариантах реализации экспрессию биомаркера определяют, применяя микрочип. Например, общую РНК выделяют из свежезамороженного (FF) образца ткани или общую РНК выделяют из макроскопически препарированного фиксированного в формалине и заключенного в парафин (FFPE) образца ткани. Количество и качество общей РНК оценивают с помощью стандартной спектрофотометрии и/или любой другой подходящей методики (например, биоанализатора Agilent). После выделения РНК образец РНК амплифицируют, применяя стандартные способы и/или доступную для приобретения систему для амплификации (например, NuGEN Ovation RNA Amplification System V2). Амплифицированную кДНК разделяют на фрагменты, метят и гибридизуют с микрочипом (например, применяя Encore Biotin Module NuGEN и чип GeneChip Affymetrix), следуя стандартным процедурам. Чип промывают, окрашивают и сканируют в соответствии с инструкциями к микрочипу. Данные, полученные с микрочипа, предварительно обрабатывают, измеренные интенсивности уровня зонда корректируют с поправкой на фон, нормируют и суммируют как измерения экспрессии, применяя алгоритм Robust Multichip Algorithm (RMA). Результаты уровня зонда суммируют с получением уровня экспрессии каждого биомаркера (например, CD45, CD4, CD8, Foxp3, TIGIT). Комбинацию порога параметра качества и методики уплотнения данных (например, анализа главных компонентов) применяют к набору данных, чтобы установить качество профиля и определить потенциально выпадающие образцы. Данные нормированные (или стандартизированные) значения экспрессии каждого биомаркера используют для расчета порога решения для данного образца.
[0134] В некоторых вариантах реализации любого из способов, описанных в данной заявке, опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака: легкого, печени, молочной железы, почечно-клеточной карциномы/почки, предстательной железы, желудочно-кишечного тракта/желудка, меланомы, шейки матки, мочевого пузыря, глиобластомы, головы и шеи, поджелудочной железы, яичников, колоректального рака, эндометрия и пищевода. В некоторых вариантах реализации колоректальный рак представляет собой колоректальный рак с высокой микросателлитной нестабильностью. В некоторых вариантах реализации колоректальный рак представляет собой микросателлитно-стабильный колоректальный рак. В некоторых вариантах реализации опухоль пищевода представляет собой гистологически подтвержденный неоперабельный, распространенный или рецидивирующий рак пищевода или рак гастроэзофагеального соединения. В некоторых вариантах реализации опухоль пищевода представляет собой опухоль, которая прогрессировала на по меньшей мере одной предшествующей системной терапии или линии лечения неоперабельного или метастатического заболевания. В некоторых вариантах реализации колоректальная опухоль представляет собой гистологически подтвержденную неизлечимую распространенную аденокарциному толстой кишки или прямой кишки. В некоторых вариантах реализации колоректальная опухоль представляет собой опухоль, которую лечили по меньшей мере одной предшествующей линией стандартной химиотерапии колоректального рака или метастатического колоректального рака, и она была рефрактерна или прогрессировала на данных методах лечения. В некоторых вариантах реализации колоректальная опухоль представляет собой опухоль, которую лечили по меньшей мере двумя предшествующими линиями стандартной химиотерапии колоректального рака или метастатического колоректального рака, и она была рефрактерна или прогрессировала на данных методах лечения. В некоторых вариантах реализации опухоль печени или печеночно-клеточная опухоль представляет собой гистологически подтвержденную распространенную печеночно-клеточную карциному, не подходящую для хирургических и/или местно-регионарных методов лечения. В некоторых вариантах реализации опухоль печени или печеночно-клеточная опухоль прогрессирует или прогрессировала после хирургических и/или местно-регионарных методов лечения. В некоторых вариантах реализации опухоль шейки матки представляет собой гистологически подтвержденный рецидивирующий или метастатический рак шейки матки. В некоторых вариантах реализации опухоль шейки матки представляет собой опухоль, которая прогрессировала на по меньшей мере одной предшествующей линии химиотерапии рака шейки матки. В некоторых вариантах реализации опухоль молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации гистологически подтвердили, что опухоль молочной железы представляет собой неизлечимую, распространенную, негативную по рецептору эстрогенов, негативную по рецептору прогестерона и негативную по рецептору эпидермального фактора роста 2 человека аденокарциному молочной железы. В некоторых вариантах реализации опухоль головы и шеи представляет собой гистологически подтвержденную рецидивирующую или метастатическую плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN), которая не поддается стандартным лечебным или паллиативным методам лечения. В некоторых вариантах реализации опухоль головы и шеи включает, но не ограничена плоско клеточной карциномой полости рта, полости носа, околоносовых пазух, носоглотки, ротоглотки, гортаноглотки или гортани. В некоторых вариантах реализации опухоль головы и шеи включает первичный или рецидивирующий рак, от которого нет доступных лечебных или доказанных паллиативных способов терапии.
[0135] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложено применение связывающего TIGIT агента для производства или получения лекарственного средства для ингибирования роста опухоли или опухолевой клетки. В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложено применение связывающего TIGIT агента для производства или получения лекарственного средства для лечения рака. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT человека и ингибирует или уменьшает развитие рака. В некоторых вариантах реализации опухоль/рак содержит раковые стволовые клетки. В некоторых вариантах реализации встречаемость раковых стволовых клеток в опухоли/раке уменьшается. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации у субъекта по меньшей мере частично удалили опухоль.
[0136] В комбинированной терапии двумя или более терапевтическими агентами часто применяют агенты, которые работают через различные механизмы действия, хотя это необязательно. Комбинированная терапия с применением агентов с различными механизмами действия может приводить к аддитивному или синергическому действию. Комбинированная терапия может позволить применение более низкой дозы каждого агента, чем доза, используемая в монотерапии, тем самым снижая токсические побочные действия и/или повышая терапевтический(-е) индекс(ы) агента(-ов). Комбинированная терапия может снизить вероятность того, что разовьются устойчивые раковые клетки. В некоторых вариантах реализации комбинированная терапия включает терапевтический агент, который воздействует на иммунный ответ (например, усиливает или активирует иммунный ответ), и терапевтический агент, который воздействует на опухоль/раковые клетки (например, ингибирует или уничтожает их).
[0137] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, комбинация связывающего TIGIT агента и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента приводит к аддитивным или синергичным результатам. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия приводит к увеличению терапевтического индекса связывающего TIGIT агента. В некоторых вариантах реализации указанная комбинированная терапия приводит к увеличению терапевтического индекса дополнительного(-ых) терапевтического(-их) агента(-ов). В некоторых вариантах реализации комбинированная терапия приводит к уменьшению токсичности и/или побочных действий связывающего TIGIT агента. В некоторых вариантах реализации комбинированная терапия приводит к уменьшению токсичности и/или побочных действий дополнительного(-ых) терапевтического(-их) агента(-ов).
[0138] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, дополнительно к введению связывающего TIGIT агента, указанный способ или лечение дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. Дополнительный терапевтический агент можно вводить до, одновременно и/или после введения указанного агента. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент включает 1, 2, 3 или более дополнительных терапевтических агентов.
oe
[0139] Терапевтические агенты, которые можно вводить в комбинации со связывающими TIGIT агентами, включают химиотерапевтические агенты. Таким образом, в некоторых вариантах реализации способ или лечение включает введение связывающего TIGIT агента в комбинации с химиотерапевтическим агентом или в комбинации с коктейлем химиотерапевтических агентов. Лечение связывающим TIGIT агентом может происходить до, одновременно и/или после введения химиотерапии. Комбинированное введение может включать совместное введение, либо в одном фармацевтическом составе, либо с применением отдельных составов, или последовательное введение в любом порядке, но, как правило, в течение такого периода времени, что все активные агенты могут проявлять свои биологические активности одновременно. Способы получения и схемы приема таких химиотерапевтических агентов могут быть такими, как описано в инструкциях производителя, или их может определить опытным путем квалифицированный практикующий врач. Способы получения и схемы приема таких химиотерапевтических агентов также описаны в The Chemotherapy Source Book, 4 издание, 2008, M.С. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Филадельфия, Пенсильвания.
[0140] Полезные классы терапевтических агентов включают, например, антитубулиновые агенты, ауристатины, вещества, связывающиеся с малой бороздкой ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие агенты (например, комплексы платины, такие как цисплатин, моно(платина), бис(платина), трехъядерные комплексы платины и карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, сенсибилизаторы химиотерапии, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, антиметаболиты пурина, пуромицины, радиосенсибилизаторы, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка или тому подобные агенты. В некоторых вариантах реализации второй терапевтический агент представляет собой алкилирующий агент, антиметаболит, антимитотическое средство, ингибитор топоизомеразы или ингибитор ангиогенеза.
[0141] Химиотерапевтические агенты, полезные в настоящем изобретении, включают, но не ограничены перечисленными: алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (цитоксан); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфаорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, циклофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, арабинозид цитозина, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренергические средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средства для восполнения дефицита фолиевой кислоты, такие как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK; разоксан; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); таксоиды, например, паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотер); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; СРТ11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин (кселода); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных выше соединений. Химиотерапевтические агенты также включают антигормональные агенты, которые действуют как регуляторы или ингибиторы воздействия гормона на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных выше соединений. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой цисплатин. В некоторых вариантах реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой карбоплатин.
[0142] В некоторых вариантах реализации химиотерапевтический агент представляет собой ингибитор топоизомеразы. Ингибиторы топоизомеразы представляют собой химиотерапевтические агенты, которые препятствуют действию фермента топоизомеразы (например, топоизомеразы I или II). Ингибиторы топоизомеразы включают, но не ограничены перечисленными: доксорубицин HCl, цитрат даунорубицина, митоксантрон HCl, актиномицин D, этопозид, топотекан HCl, тенипозид (VM-26) и иринотекан, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты, или производные любого из перечисленных соединений. В некоторых вариантах реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой иринотекан.
[0143] В некоторых вариантах реализации химиотерапевтический агент представляет собой антиметаболит. Антиметаболит представляет собой химическое соединение, структура которого аналогична структуре метаболита, необходимого для нормальных биохимических реакций, но тем не менее достаточно отличается, чтобы препятствовать одной или более нормальным функциям клеток, таким как деление клетки. Антиметаболиты включают, но не ограничены перечисленными: гемцитабин, фторурацил, капецитабин, метотрексат натрия, ралитрексед, пеметрексед, тегафур, цитозин-арабинозид, тиогуанин, 5-азацитидин, 6-меркаптопурин, азатиоприн, 6-тиогуанин, пентостатин, фосфат флударабина и кладрибин, а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных соединений. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой гемцитабин.
[0144] В некоторых вариантах реализации химиотерапевтический агент представляет собой антимитотический агент, включая, но не ограничиваясь агентами, которые связывают тубулин. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой таксан. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой паклитаксел или доцетаксел, или фармацевтически приемлемую соль, кислоту или производное паклитаксела или доцетаксела. В некоторых вариантах реализации агент представляет собой паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), связанный с альбумином паклитаксел (абраксан), связанный с докозагексаеновой кислотой паклитаксел (ДГК-паклитаксел) или связанный с полиглутаматом паклитаксел (ПГ-паклитаксел). В некоторых альтернативных вариантах реализации антимитотический агент включает алкалоид барвинка, такой как винкристин, винбластин, винорелбин или виндезин, или фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные перечисленных соединений. В некоторых вариантах реализации антимитотический агент представляет собой ингибитор кинезина Eg5 или ингибитор митотической киназы, такой как Aurora А или Plk1. В некоторых вариантах реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой паклитаксел. В некоторых вариантах реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой связанный с альбумином паклитаксел (абраксан).
[0145] В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент включает агент, такой как малая молекула. Например, лечение может включать комбинированное введение агента согласно настоящему изобретению и малой молекулы, которая действует как ингибитор ассоциированных с опухолью антигенов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: EGFR, HER2 (ErbB2) и/или VEGF. В некоторых вариантах реализации агент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором протеинкиназ, выбранным из группы, состоящей из: гефитиниба (иресса), эрлотиниба (тарцева), сунитиниба (сутент), лапатаниба, вандетаниба (зактима), АЕЕ788, CI-1033, цедираниба (рецентин), сорафениба (нексавар) и пазопаниба (GW786034B). В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент включает ингибитор mTOR.
[0146] В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой агент, который ингибирует сигнальный путь раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Notch. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Wnt. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути BMP. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Hippo. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути RSPO/LGR. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути mTOR/AKR.
[0147] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, дополнительный терапевтический агент включает биологическую молекулу, такую как антитело. Например, лечение может включать комбинированное введение связывающего TIGIT агента и антитела против ассоциированного с опухолью антигена, включая, но не ограничиваясь антителом, которое связывает EGFR, HER2/ErbB2 и/или VEGF. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, специфичное к маркеру раковой стволовой клетки. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое связывает компонент сигнального пути Notch. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое связывает компонент сигнального пути Wnt. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое ингибирует сигнальный путь раковых стволовых клеток. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Notch. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути Wnt. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой ингибитор сигнального пути BMP. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое ингибирует сигнальный путь β-катенина. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое является ингибитором ангиогенеза (например, антитело против VEGF или против рецептора VEGF). В некоторых вариантах реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой бевацизумаб (авастин), рамуцирумаб, трастузумаб (герцептин), пертузумаб (омнитарг), панитумумаб (вектибикс), нимотузумаб, залутумумаб или цетуксимаб (эрбитукс).
[0148] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, дополнительно к введению связывающего TIGIT агента, указанный способ или лечение дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного иммунотерапевтического агента. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой агент, стимулирующий иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации иммунотерапевтический агент (например, стимулирующий иммунный ответ агент) включает, но не ограничен колониестимулирующим фактором (например, гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF), гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (G-CSF), фактором стволовых клеток (SCF)), интерлейкином (например, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), антителом, которое блокирует иммуносупрессивные функции (например, антителом против CTLA4, антителом против CD28, антителом против CD3, антителом против PD-1, антителом против PD-L1), антителом, которое усиливает функции иммунных клеток (например, антителом против GITR или антителом против ОХ-40), Toll-подобным рецептором (например, TLR4, TLR7, TLR9), растворимым лигандом (например, GITRL или OX-40L) или представителем семейства В7 (например, CD80, CD86). Дополнительный иммунотерапевтический агент (например, стимулирующий иммунный ответ агент) можно вводить до, одновременно и/или после введения связывающего TIGIT агента. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие связывающий TIGIT агент и дополнительный иммунотерапевтический агент (например, стимулирующий(-е) иммунный ответ агент(ы)). В некоторых вариантах реализации иммунотерапевтический агент включает 1, 2, 3 или более иммунотерапевтических агентов. В некоторых вариантах реализации стимулирующий иммунный ответ агент включает 1, 2, 3 или более стимулирующих иммунный ответ агентов.
[0149] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, которое является ингибитором контрольных точек иммунного ответа. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольных точек иммунного ответа представляет собой антитело против PD-1, антитело против PD-L1, антитело против CTLA4, антитело против CD28, антитело против LAG3, антитело против TIM3, антитело против GITR или антитело против ОХ-40. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольных точек иммунного ответа представляет собой антитело против 4-1ВВ. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против PD-1, выбранное из группы, состоящей из: ниволумаба (опдиво), пембролизумаба (китруда) или пидилизумаба. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против PD-1, выбранное из группы, состоящей из: MEDI0680, REGN2810, BGB-A317 и PDR001. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против PD-L1, выбранное из группы, состоящей из: BMS935559 (MDX-1105), атезолизумаба (тецентрик), дурвалумаба (MEDI4736) или авелумаба (MSB0010718C). В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против CTLA-4, выбранное из группы, состоящей из: ипилимумаба (ервой) или тремелимумаба. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против LAG-3, выбранное из группы, состоящей из: BMS-986016 и LAG525. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против ОХ-40, выбранное из группы, состоящей из: MEDI6469, MEDI0562 и MOXR0916. В некоторых вариантах реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело против 4-1ВВ, выбранное из группы, состоящей из PF-05082566.
[0150] Кроме того, лечение связывающим TIGIT агентом может включать комбинированное лечение другими биологическими молекулами, такими как один или более цитокинов (например, лимфокины, интерлейкины, интерфероны, факторы некроза опухоли и/или факторы роста), или может быть осуществлено путем хирургического удаления опухолей, удаления раковых клеток или любой другой терапии, которую сочтет необходимой лечащий врач.
[0151] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент можно вводить в комбинации с биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: адреномедуллина (AM), ангиопоэтина (Ang), BMP, BDNF, EGF, эритропоэтина (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, стимулирующего миграцию фактора, миостатина (GDF-8), NGF, нейротрофинов, PDGF, тромбопоэтина, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, IFN-гамма, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 и IL-18. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент можно вводить в комбинации с биологической молекулой, выбранной из группы, состоящей из: макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF) и фактора стволовых клеток (SCF),
[0152] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, лечение связывающим TIGIT агентом может сопровождаться хирургическим удалением опухоли, удалением раковых клеток или любой другой хирургической терапией, которую сочтет необходимой лечащий врач.
[0153] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, лечение включает введение связывающего TIGIT агента в комбинации с лучевой терапией. Лечение связывающим TIGIT агентом может происходить до, одновременно и/или после проведения лучевой терапии. Схемы проведения такой лучевой терапии может определить квалифицированный врач.
[0154] Комбинированное введение может включать совместное введение, либо в одном фармацевтическом составе, либо применяя отдельные составы, либо последовательное введение в любом порядке, но, как правило, в течение такого периода времени, что все активные агенты могут проявлять свои биологические активности одновременно.
[0155] Должно быть очевидно, что комбинацию связывающего TIGIT агента и по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента можно вводить в любом порядке или одновременно. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент будут вводить пациентам, которых ранее подвергли лечению вторым/отличным терапевтическим агентом. В некоторых других вариантах реализации связывающий TIGIT агент и второй дополнительный терапевтический агент будут вводить по существу одновременно или параллельно. Например, субъекту можно дать связывающий TIGIT агент при прохождении им курса лечения дополнительным терапевтическим агентом (например, химиотерапии). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент будут вводить в течение 1 года с момента лечения вторым терапевтическим агентом. В некоторых альтернативных вариантах реализации связывающий TIGIT агент будут вводить в течение 10, 8, 6, 4 или 2 месяцев с момента какого-либо лечения вторым терапевтическим агентом. В некоторых других вариантах реализации связывающий TIGIT агент будут вводить в течение 4, 3, 2 или 1 недели с момента какого-либо лечения вторым терапевтическим агентом. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент будут вводить в течение 5, 4, 3, 2 или 1 дня с момента какого-либо лечения вторым терапевтическим агентом. Также должно быть очевидно, что два (или более) агента или вида лечения можно вводить субъекту в течение порядка часов или минут (т.е., по существу одновременно).
[0156] Для лечения заболевания подходящая дозировка связывающего TIGIT агента зависит от типа заболевания, от которого лечат, тяжести и течения заболевания, восприимчивости заболевания к лечению, от того, вводят ли агент для терапевтических или превентивных целей, от предшествующей терапии, от истории болезни пациента и так далее, все на усмотрение лечащего врача. Связывающий TIGIT агент можно вводить однократно или серией введений длительностью от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не будет достигнуто излечение или снижение выраженности болезненного состояния (например, уменьшение размера опухоли). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят серией введений до момента прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах реализации оптимальные схемы приема рассчитывают по измерениям накопления лекарственного средства в организме пациента, и они будут изменяться в зависимости от относительной эффективности конкретного агента. Осуществляющий введение врач может определить оптимальные дозировки, методики введения доз и частоту повторений.
[0157] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, дозировка связывающего TIGIT агента составляет от 0,01 мкг до 100 мг/кг массы тела, от 0,1 мкг до 100 мг/кг массы тела, от 1 мкг до 100 мг/кг массы тела, от 1 мг до 100 мг/кг массы тела, 1 мг до 80 мг/кг массы тела, от 10 мг до 100 мг/кг массы тела, от 10 мг до 75 мг/кг массы тела или от 10 мг до 50 мг/кг массы тела. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 7,5 кг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 12 мг/кг, приблизительно 12,5 мг/кг приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 17,5 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг или приблизительно 25 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 20 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 0,3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 1 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 1,5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 2 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 2,5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 3 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 7,5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 12,5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 15 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 17,5 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозировка связывающего TIGIT агента составляет приблизительно 20 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозу можно вводить один раз или более ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят один раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели или раз в четыре недели.
[0158] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент можно вводить в первоначальной более высокой "ударной" дозе, а затем одной или более меньшими дозами. В некоторых вариантах реализации частота введения также может изменяться. В некоторых вариантах реализации схема применения может включать введение первоначальной дозы, а затем дополнительных доз (или "поддерживающих" доз) раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели или раз в месяц. Например, схема применения может включать введение первоначальной ударной дозы, а затем еженедельное введение поддерживающих доз, например, в размере половины от начальной дозы. Или схема применения может включать введение первоначальной ударной дозы, а затем поддерживающих доз, например, в размере половины от первоначальной дозы раз в две недели. Или схема применения может включать введение трех первоначальных доз в течение 3 недель, а затем введение поддерживающих доз, например, в том же размере раз в две недели.
[0159] Специалистам в данной области известно, что введение любого терапевтического агента может приводить к побочным действиям и/или токсичности. В некоторых случаях побочные действия и/или токсичность настолько тяжелы, что исключают введение конкретного агента в терапевтически эффективной дозе. В некоторых случаях лекарственную терапию необходимо прекратить, и можно попробовать применить другие агенты. Тем не менее, многие агенты одного терапевтического класса часто проявляют аналогичные побочные действия и/или токсичность, подразумевая, что данный пациент либо должен прекратить терапию, либо, если это возможно, должен терпеть неприятные побочные действия, связанные с терапевтическим агентом.
[0160] В некоторых вариантах реализации схема применения может быть ограничена определенным количеством введений или "циклов". В некоторых вариантах реализации указанный агент вводят на протяжении 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более циклов. Например, агент вводят раз в 2 недели на протяжении 6 циклов, агент вводят раз в 3 недели на протяжении 6 циклов, агент вводят раз в 2 недели на протяжении 4 циклов, агент вводят раз в 3 недели на протяжении 4 циклов и т.д. Схемы применения могут выбрать и впоследствии модифицировать специалисты в данной области.
[0161] В вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят приблизительно раз в неделю, приблизительно раз в две недели, приблизительно раз в три недели, приблизительно раз в четыре недели, приблизительно раз в пять недель, приблизительно раз в шесть недель, приблизительно раз в восемь недель, приблизительно раз в двенадцать недель, приблизительно раз в месяц, приблизительно раз в два месяца, приблизительно раз в три месяца или дольше. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 1,5 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 2,5 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 7,5 кг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 12 мг/кг, приблизительно 12,5 мг/кг приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 17,5 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг или приблизительно 25 мг/кг приблизительно раз в две недели.
[0162] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, раз в две недели.
[0163] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 1 мг/кг, раз в две недели.
[0164] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 3 мг/кг, раз в две недели.
[0165] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 10 мг/кг, раз в две недели.
[0166] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят субъекту в дозе, равной приблизительно 15 мг/кг, раз в две недели.
[0167] В некоторых вариантах реализации субъект получал предшествующее лечение антагонистом PD-1 и/или антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах реализации у субъекта есть гистологически подтвержденная распространенная рецидивировавшая или рефрактерная солидная опухоль.
[0168] В некоторых вариантах реализации субъект страдает раком головы и шеи, раком пищевода/раком желудка и пищевода, раком желудка, колоректальный раком, раком заднего прохода, печеночно-клеточный раком/раком печени, раком шейки матки, раком легких, меланомой, карциномой из клеток Меркеля, почечно-клеточной карциномой/раком почки, раком мочевого пузыря, раком яичников, раком поджелудочной железы, раком эндометрия, раком заднего прохода, трижды негативным раком молочной железы, солидной опухолью с известной высокой MSI (включая КРР MSI) или колоректальным раком MSS.
[0169] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы введения субъекту связывающего TIGIT агента, включающие применение стратегии прерывистого введения дозы для введения одного или более агентов, которые могут уменьшить побочные действия и/или токсичность, связанную с введением агента, химиотерапевтического агента и т.д. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования роста опухоли и/или лечения рака у человека включает введение указанному субъекту терапевтически эффективной дозы связывающего TIGIT агента в комбинации с терапевтически эффективной дозой химиотерапевтического агента, при этом один или оба из указанных агентов вводят в соответствии со стратегией прерывистого введения дозы. В некоторых вариантах реализации стратегия прерывистого введения дозы включает введение субъекту первоначальной дозы связывающего TIGIT агента и введение последующих доз связывающего TIGIT агента приблизительно раз в 2 недели. В некоторых вариантах реализации стратегия прерывистого введения дозы включает введение субъекту первоначальной дозы связывающего TIGIT агента и введение последующих доз связывающего TIGIT агента приблизительно раз в 3 недели. В некоторых вариантах реализации стратегия прерывистого введения дозы включает введение субъекту первоначальной дозы связывающего TIGIT агента и введение последующих доз связывающего TIGIT агента приблизительно раз в 4 недели. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент вводят, используя стратегию прерывистого введения дозы, и второй агент вводят еженедельно.
[0170] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы применения композиций, содержащих связывающие TIGIT агенты. В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы, описанные в данной заявке, в которых применяют фармацевтические композиции, содержащие связывающие TIGIT агенты и фармацевтически приемлемую среду. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции находят применение в иммунотерапии. В некоторых вариантах реализации композиции находят применение в ингибировании роста опухоли. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции находят применение в ингибировании роста опухоли у субъекта (например, пациента-человека). В некоторых вариантах реализации композиции находят применение в лечении рака. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции находят применение в лечении рака у субъекта (например, пациента-человека).
[0171] Составы получают для хранения и применения путем комбинирования очищенного связывающего TIGIT агента с фармацевтически приемлемой средой (например, носителем или вспомогательным веществом). Специалисты в данной области, как правило, считают, что фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества и/или стабилизаторы являются неактивными ингредиентами состава или фармацевтической композиции.
ое
[0172] Подходящие фармацевтически приемлемые среды включают, но не ограничены перечисленными: нетоксичные буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол; низкомолекулярные полипептиды (например, состоящие из менее чем приблизительно 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; углеводы, такие как моносахариды, дисахариды, глюкоза, манноза или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами, такие как комплексы Zn-белок; и неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN или полиэтиленгликоль (ПЭГ). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 издание, 2012 г., Pharmaceutical Press, Лондон).
[0173] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить любым количеством способов либо для местного, либо для системного лечения. В некоторых вариантах реализации введение является (i) топическим с помощью эпидермальных или трансдермальных пластырей, мазей, лосьонов, кремов, гелей, капель, суппозиториев, спреев, жидкостей и порошков; (ii) легочным, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая введение посредством небулайзера, внутритрахеальным и внутриназальным; (iii) пероральным или (iv) парентеральным, включая внутривенный, интраартериальный, внутриопухолевый, подкожный, интраперитонеальный, внутримышечный (например, инъекция или инфузия) или интракраниальный (например, интратекальный или интравентрикулярный) пути введения.
[0174] Указанный терапевтический состав может находиться в виде единичной лекарственной формы. Такие составы включают таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии в водных или безводных средах, или суппозитории. В твердых композициях, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем. Обычные ингредиенты для таблетирования включают кукурузный крахмал, лактозу, сахарозу, сорбит, тальк, стеариновую кислоту, стеарат магния, дикальцийфосфат или камеди, и разбавители (например, воду). Данные ингредиенты можно применять для получения твердой неформованной композиции, содержащей гомогенную смесь соединения согласно настоящему изобретению или нетоксичной фармацевтически приемлемой соли указанного соединения. Твердую неформованную композицию затем разделяют на лекарственные формы, содержащие отдельные единицы доз, описанного выше типа. Таблетки, пилюли и т.д. с составом или композицией можно покрыть или другим образом смешать с получением лекарственной формы, обладающей преимуществом пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутреннюю композицию, покрытую снаружи некоторым компонентом. Более того, два указанных компонента могут быть разделены кишечнорастворимым слоем, который служит для устойчивости к распаду и позволяет внутреннему компоненту пройти интактным через желудок или задерживает его высвобождение. Для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий можно использовать различные материалы, такие материалы включают множество полимерных кислот и смеси полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.
ое
[0175] Связывающие TIGIT агенты также можно заключить в микрокапсулы. Такие микрокапсулы получают, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, микросферах альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях, описанных в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 издание, 2012, Pharmaceutical Press, Лондон.
[0176] В некоторых вариантах реализации фармацевтические составы содержат связывающий TIGIT агент в комплексе с липосомами. Способы получения липосом известны специалистам в данной области. Например, некоторые липосомы можно получить путем обращенно-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-фосфатидилэтаноламин (ПЭГ-ФЭ). Липосомы можно экструдировать через фильтры с определенным размером пор для получения липосом желательного диаметра.
[0177] В некоторых вариантах реализации получают композиции с замедленным высвобождением, содержащие связывающий TIGIT агент. Подходящие примеры композиций с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие указанный агент, при этом матрицы находятся в виде формованных изделий (например, пленок или микрокапсул). Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели, такие как поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт, полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы состоят из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), ацетат-изобутират сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
III. Связывающие TIGIT агенты
[0178] Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM (TIGIT) представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа, который содержит вариабельный домен иммуноглобулина (IgV). TIGIT относится к семейству рецепторов полиовируса (PVR) и связывается с рецептором полиовируса (PVR; CD155) с высокой аффинностью и с PVRL-2 (CD112) и PVRL-3 (CD113) с более низкой аффинностью. TIGIT экспрессируется на Т-клетках, включая регуляторные Т-клетки (Treg) и Т-клетки памяти, а также на NK-клетках и, его экспрессия повышается после активации необученных CD4+ Т-клеток. Полноразмерная последовательность аминокислот (АК) TIGIT человека (UniProtKB № Q495A1) известна в данной области и предложена в данной заявке в виде SEQ ID NO: 1. В данной заявке упоминание положений аминокислот относится к нумерации полноразмерных последовательностей аминокислот, содержащих сигнальную последовательность.
[0179] В соответствии с настоящим изобретением предложены способы, в которых применяют агенты, которые специфично связывают TIGIT. Данные агенты в данной заявке называют "связывающими TIGIT агентами". В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой полипептид. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT мыши. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT мыши и TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT мыши. Лишь некоторые из примеров связывающих TIGIT агентов были описаны, например, в международной заявке на патент № PCT/US 2016/034549; публикациях международных заявок № WO 2016/106302 и WO 2016/028656 и заявке на патент США №2013/0251720.
[0180] В некоторых вариантах реализации указанный агент связывает TIGIT и препятствует взаимодействию TIGIT со вторым белком. В некоторых вариантах реализации агент связывает TIGIT и препятствует взаимодействию TIGIT с PVR. В некоторых вариантах реализации агент связывает TIGIT и препятствует взаимодействию TIGIT с PVRL2. В некоторых вариантах реализации агент связывает TIGIT и препятствует взаимодействию TIGIT с PVRL3. В некоторых вариантах реализации агент специфично связывает TIGIT и указанный агент нарушает связывание TIGIT с PVR, и/или нарушает активацию посредством PVR передачи сигналов TIGIT.
[0181] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT мыши, или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT человека, или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT мыши и TIGIT человека, или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает Ig-подобный домен TIGIT. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое специфично связывает домен IgV TIGIT. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывается внутри участка из аминокислот 22-141 TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывается внутри участка из аминокислот 22-141 в последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации указанный агент связывается внутри участка из аминокислот 22-124 TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации указанный агент связывается внутри участка из аминокислот 22-124 в последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывается внутри SEQ ID NO: 3, или ее фрагмента. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывается внутри участка из аминокислот 50-124 TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывается внутри участка из аминокислот 50-124 в последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывается внутри SEQ ID NO: 3, или ее фрагмента.
[0182] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты из SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62 и I109 из последовательности SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий аминокислоты Q62, Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, содержащий по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: N58, Е60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, Т117, T119, G120 и R121, - из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации эпитоп представляет собой конформационный эпитоп. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, которое связывает эпитоп, который не содержит аминокислоту V100 из последовательности SEQ ID NO: 1.
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
[0183] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент (например, антитело) связывает TIGIT с константой диссоциации (K), равной приблизительно 1 мкМ или менее, приблизительно 100 нМ или менее, приблизительно 40 нМ или менее, приблизительно 20 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее, приблизительно 0,1 нМ или менее, 50 пМ или менее, 10 пМ или менее, или 1 пМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 20 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 10 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 0,5 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 50 пМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 25 пМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 10 пМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT с K, равной приблизительно 1 пМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT человека, так и TIGIT мыши с K, равной приблизительно 10 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT человека, так и TIGIT мыши с K, равной приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT человека, так и TIGIT мыши с K, равной приблизительно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации константа диссоциации связывающего агента (например, антитела) от TIGIT представляет собой константу диссоциации, которую определили, применяя слитый белок TIGIT, содержащий по меньшей мере часть внеклеточного домена белка TIGIT, иммобилизованный на чипе Biacore. В некоторых вариантах реализации константа диссоциации связывающего агента (например, антитела) от TIGIT представляет собой константу диссоциации, которую определили, применяя связывающий агент, захваченный антителом против IgG человека на чипе Biacore, и растворимый белок TIGIT.
D
D
D
D
D
D
D
[0184] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывает TIGIT, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывает вторую мишень. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой биспецифический агент, который содержит первый антигенсвязывающий участок, который специфично связывает TIGIT, и второй антигенсвязывающий участок, который специфично связывает вторую мишень. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT, так и вторую мишень с K, равной приблизительно 100 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT, так и вторую мишень с K, равной приблизительно 50 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT, так и вторую мишень с K, равной приблизительно 20 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT, так и вторую мишень с K, равной приблизительно 10 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает как TIGIT, так и вторую мишень с K, равной приблизительно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации аффинность одного из антигенсвязывающих участков может быть слабее, чем аффинность другого антигенсвязывающего участка. Например, K одного антигенсвязывающего участка может составлять приблизительно 1 нМ и K второго антигенсвязывающего участка может составлять приблизительно 10 нМ. В некоторых вариантах реализации различие в аффинности между двумя антигенсвязывающими участками может быть приблизительно в 2 раза или более, приблизительно в 3 раза или более, приблизительно в 5 раз или более, приблизительно в 8 раз или более, приблизительно в 10 раз или более, приблизительно в 15 раз или более, приблизительно в 20 раз или более, приблизительно в 30 раз или более, приблизительно в 50 раз или более, или приблизительно в 100 раз или более. Модуляция аффинностей двух антигенсвязывающих участков может влиять на биологическую активность биспецифического антитела. Например, снижение аффинности антигенсвязывающего участка к TIGIT или второй мишени может оказать желательный эффект, например, сниженную токсичность связывающего агента и/или повышенный терапевтический индекс.
50
50
50
[0185] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент (например, антитело) связывает TIGIT с полумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС), равной приблизительно 1 мкМ или менее, приблизительно 100 нМ или менее, приблизительно 40 нМ или менее, приблизительно 20 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее, или приблизительно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывается с TIGIT человека с полумаксимальной эффективной концентрацией (ЕС), равной приблизительно 1 мкМ или менее, приблизительно 100 нМ или менее, приблизительно 40 нМ или менее, приблизительно 20 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее, или приблизительно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент связывает TIGIT мыши и/или TIGIT человека с ЕС, равной приблизительно 40 нМ или менее, приблизительно 20 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 1 нМ или менее или приблизительно 0,1 нМ или менее.
[0186] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой химерное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело человека. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело IgG2. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело IgG4. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий участок. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой биспецифическое антитело или мультиспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моновалентное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой моноспецифическое антитело. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой бивалентное антитело. В некоторых вариантах реализации антитело конъюгировано с цитотоксической молекулой. В некоторых вариантах реализации антитело является выделенным. В некоторых вариантах реализации антитело является по существу чистым.
[0187] В некоторых вариантах реализации связывающие TIGIT агенты представляют собой поликлональные антитела. Поликлональные антитела можно получить с помощью любого известного способа. В некоторых вариантах реализации поликлональные антитела получают путем иммунизации животного (например, кролика, крысы, мыши, козы, осла) интересующим антигеном (например, очищенным фрагментом пептида, полноразмерным рекомбинантным белком или слитым белком) с помощью многократных подкожных или интраперитонеальных инъекций. Антиген необязательно можно конъюгировать с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или сывороточный альбумин. Антиген (с белком-носителем или без него) разбавляют стерильным солевым раствором и, как правило, комбинируют с адъювантом (например, полным или неполным адъювантом Фрейнда) с получением стабильной эмульсии. Через достаточный период времени поликлональные антитела получают из иммунизированного животного, обычно, из крови или асцитической жидкости. Поликлональные антитела можно очистить из сыворотки или асцитической жидкости, в соответствии со стандартными в данной области способами, включая, но не ограничиваясь перечисленными: аффинная хроматография, ионообменная хроматография, электрофорез в геле и диализ.
[0188] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой моноклональное антитело. Моноклональные антитела можно получить, применяя гибридомные способы, известные специалисту в данной области. В некоторых вариантах реализации, применяя гибридомный способ, мышь, крысу, кролика, хомяка или другое подходящее животное-хозяина иммунизируют, как описано выше, чтобы вызвать продукцию антител, которые специфично связывают иммунизирующий антиген. В некоторых вариантах реализации лимфоциты можно иммунизировать in vitro. В некоторых вариантах реализации иммунизирующий антиген может представлять собой белок человека или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации иммунизирующий антиген может представлять собой белок мыши или его фрагмент.
[0189] После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей линией клеток миеломы, применяя, например, полиэтиленгликоль. Клетки гибридомы подвергают селекции, применяя специализированные среды, как известно в данной области, и неслитые лимфоциты и клетки миеломы не выживают в процессе селекции. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, специфично направленные против выбранного антигена, можно обнаружить с помощью различных способов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: иммунопреципитацию, иммуноблоттинг и анализ связывания in vitro (например, проточную цитометрию, сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS), ELISA и радиоиммуноанализ). Полученные гибридомы можно размножить либо в культуре in vitro, применяя стандартные способы, либо in vivo в виде асцитических опухолей в животном. Моноклональные антитела можно очистить из культуральной среды или асцитической жидкости, согласно стандартным в данной области способам, включая, но не ограничиваясь перечисленными: аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, электрофорез в геле и диализ.
[0190] В некоторых вариантах реализации моноклональные антитела можно получить, применяя технологии рекомбинантных ДНК, известные специалисту в данной области. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-клеток или клеток гибридомы, например, с помощью ОТ-ПЦР, применяя олигонуклеотидные праймеры, которые специфично амплифицируют гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, и определяют их последовательность, применяя стандартные методики. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые продуцируют моноклональные антитела при трансфекции ими клеток-хозяев, таких как Е. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые, в противном случае, не продуцируют белки иммуноглобулина.
[0191] В некоторых других вариантах реализации рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты можно выделить из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих вариабельные домены или CDR желательных видов.
[0192] Полинуклеотид(ы), кодирующие моноклональное антитело, можно модифицировать, например, применяя технологию рекомбинантной ДНК, с получением альтернативных антител. В некоторых вариантах реализации константные домены легкой цепи и тяжелой цепи, например, моноклонального антитела мыши можно заменить на константные области, например, антитела человека с получением химерного антитела, или на не относящийся к иммуноглобулинам полипептид с получением слитого антитела. В некоторых вариантах реализации указанные константные области укорачивают или удаляют с получением желательного фрагмента моноклонального антитела. Сайт-направленный мутагенез или мутагенез высокой плотности вариабельной(-ых) области(-ей) можно применять, чтобы оптимизировать специфичность, аффинность и т.д. моноклонального антитела.
[0193] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой гуманизированное антитело. Обычно, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека, в которых аминокислотные остатки участков CDR заменяют на аминокислотные остатки из участков CDR не относящегося к человеку вида (например, мыши, крысы, кролика, хомяка и т.д.), которые обладают желательной специфичностью, аффинностью и/или способностью к связыванию, применяя способы, известные специалисту в данной области. В некоторых вариантах реализации некоторые из аминокислотных остатков вариабельной области каркаса иммуноглобулина человека заменяют на соответствующие аминокислотные остатки антитела из не относящегося к человеку вида. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело можно дополнительно модифицировать путем замены дополнительных остатков в вариабельной области каркаса и/или среди заменяющих не относящихся к человеку остатков, чтобы дополнительно улучшить и оптимизировать специфичность, аффинность и/или способность у связыванию у антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать области вариабельного домена, содержащие все или по существу все участки CDR, которые соответствуют не относящемуся к человеку иммуноглобулину, тогда как все или по существу все каркасные области будут представлять собой последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации каркасные области получены из консенсусной последовательности иммуноглобулина человек. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, обычно из иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации такие гуманизированные антитела применяют в терапии, так как у них может быть меньшая иммуногенность и ответы НАМА (антитела человека против мыши) при введении человеку.
[0194] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело человека. Антитела человека можно получить напрямую, применяя различные способы, известные в данной области. В некоторых вариантах реализации антитела человека можно получить из иммортализованных В-лимфоцитов человека, иммунизированных in vitro, или из лимфоцитов, выделенных из иммунизированных индивидов. В любом случае, можно получить и выделить клетки, которые продуцируют антитело, направленное против целевого антигена. В некоторых вариантах реализации антитело человека можно выбрать из фаговой библиотеки, если указанная фаговая библиотека экспрессирует антитела человека. В качестве альтернативы, методику фагового дисплея можно применять для получения антител человека и фрагментов антител in vitro из репертуаров генов вариабельных доменов иммуноглобулина из неиммунизированных доноров. Методики получения и применения фаговых библиотек антител хорошо известны в данной области. После идентификации антител можно применять стратегии созревания аффинности, известные в данной области, включая, но не ограничиваясь перетасовкой цепей и сайт-направленным мутагенезом, с получением высоко аффинных антител человека.
[0195] В некоторых вариантах реализации антитела человека можно получить в трансгенных мышах, которые содержат локусы иммуноглобулина человека. После иммунизации данные мыши способны продуцировать полный репертуар антител человека при отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов.
[0196] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой биспецифическое антитело. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят биспецифические антитела, которые специфично распознают TIGIT и по меньшей мере одну дополнительную мишень. Биспецифические антитела способны специфично распознавать и связывать по меньшей мере два различных антигена или эпитопа. Различные эпитопы могут находиться либо внутри одной молекулы (например, два эпитопа на TIGIT), либо на различных молекулах (например, один эпитоп на TIGIT и один эпитоп на отличном белке). В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает повышенной эффективностью по сравнению с отдельным антителом или с комбинацией более чем одного антитела. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает пониженной токсичностью по сравнению с отдельным антителом или с комбинацией более чем одного антитела. Специалистам в данной области известно, что любой терапевтический агент может обладать уникальной фармакокинетикой (ФК) (например, временем полужизни в кровотоке). В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает способностью синхронизировать ФК двух активных связывающих агентов, при этом указанные два отдельных связывающих агента обладают различными ФК профилями. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает способностью сосредотачивать действия двух агентов на общей области (например, опухоли и/или микроокружении опухоли). В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает способностью сосредотачивать действия двух агентов на общей мишени (например, опухоли или опухолевой клетке). В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает способностью нацеливать действия двух агентов на более чем один биологический путь или функцию. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело обладает способностью нацеливаться на две различные клетки и сближать их (например, иммунную клетку и опухолевую клетку).
[0197] В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой антитело человека. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG2. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG4. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело характеризуется сниженной токсичностью и/или побочными эффектами. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело характеризуется сниженной токсичностью и/или побочными эффектами по сравнению со смесью двух отдельных антител или данными антителами в качестве отдельных агентов. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет повышенный терапевтический индекс. В некоторых вариантах реализации биспецифическое антитело имеет повышенный терапевтический индекс по сравнению со смесью двух отдельных антител или данными антителами в качестве отдельных агентов.
[0198] В некоторых вариантах реализации указанные антитела могут специфично распознавать и связывать TIGIT, а также второй целевой антиген, такой как эффекторная молекула на иммунной клетке (например, CD2, CD3, CD28, CTLA4, PD-1, PD-L1, CD80, или CD86) или Fc-рецептор (например, CD64, CD32 или CD16). В некоторых вариантах реализации антитела можно применять для нацеливания цитотоксических агентов на клетки, которые экспрессируют конкретный целевой антиген. Данные антитела содержать антиген-связывающее плечо и плечо, которое связывает цитотоксический агент или радионуклид-хелатор, такой как EOTUBE, DPTA, DOTA или ТЕТА.
[0199] Способы получения биспецифических антител известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах реализации биспецифические антитела содержат константные области тяжелой цепи с модификациями в аминокислотах, которые находятся на границе между двумя тяжелыми цепями. В некоторых вариантах реализации биспецифические антитела можно получить, применяя стратегию "выступы-во-впадины". В некоторых случаях, терминологию "выступы" и "впадины" заменяют на термины "возвышения" и "полости". В некоторых вариантах реализации биспецифические антитела могут содержать измененные шарнирные области, неспособные образовывать дисульфидные связи между тяжелыми цепями. В некоторых вариантах реализации модификации могут включать изменения в аминокислотах, которые приводят к измененным электростатическим взаимодействиям. В некоторых вариантах реализации указанные модификации могут включать изменения в аминокислотах, которые приводят к измененным гидрофобным/гидрофильным взаимодействиям.
[0200] Биспецифические антитела могут представлять собой интактные антитела или фрагменты антител, содержащие антигенсвязывающие участки. Также предложены антитела с более чем двумя валентностями. Например, можно получить триспецифические антитела. Таким образом, в некоторых вариантах реализации антитела против TIGIT являются мультиспецифическими.
[0201] В некоторых вариантах реализации антитела (или другие полипептиды), описанные в данной заявке, могут быть моноспецифическими. В некоторых вариантах реализации каждый из одного или более антиген связывающих участков, которые содержит антитело, способен связывать (или связывает) гомологичный эпитоп на TIGIT.
[0202] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой фрагмент антитела. У фрагментов антител могут быть функции или возможности, отличные от таковых у интактных антител; например, у фрагментов антител может быть повышенная способность к проникновению в опухоль. Известны различные методики получения фрагментов антител, включая, но не ограничиваясь, протеолитическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител включают фрагмент F(ab')2, полученный путем расщепления молекулы антитела пепсином. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител включают фрагмент Fab, полученный путем восстановления дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2. В других вариантах реализации фрагменты антител включают фрагмент Fab, полученный путем обработки молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител получают с помощью рекомбинантных способов. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител включают фрагменты Fv или одноцепочечный Fv (scFv). Фрагменты Fab, Fv и scFv антител можно экспрессировать в Е. coli или других клетках-хозяевах с последующей секрецией из них, позволяя получение больших количеств данных фрагментов. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител выделяют из фаговых библиотек антител, описанных в данной заявке. Например, способы можно применять для конструирования библиотек экспрессии Fab, чтобы позволить быструю и эффективную идентификацию моноклональных фрагментов Fab с требуемой специфичностью к TIGIT или его производным, фрагментам, аналогам или гомологам. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител представляют собой линейные фрагменты антител. В некоторых вариантах реализации фрагменты антител являются моноспецифическими или биспецифическими. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой scFv. Можно применять различные способы для получения одноцепочечных антител, специфичных к TIGIT.
[0203] В некоторых вариантах реализации, особенно в случае фрагментов антител, антитело модифицируют, чтобы изменить (например, увеличить или уменьшить) время его полужизни в сыворотке. Этого можно добиться, например, путем внедрения эпитопа связывания рецептора реутилизации в фрагмент антитела путем мутирования подходящего участка в фрагменте антитела или путем включения указанного эпитопа в пептидную метку, которую затем соединяют с любым концом или серединой фрагмента антитела (например, путем синтеза ДНК или пептида).
[0204] Гетероконъюгированные антитела также входят в объем настоящего изобретения. Гетероконъюгированные антитела состоят из двух соединенных ковалентной связью антител. Предположили, что такие антитела, например, нацеливают иммунные клетки на нежелательные клетки. Также предполагается, что гетероконъюгированные антитела можно получить in vitro, применяя известные способы химии синтеза белков, включая способы с применением перекрестно сшивающих агентов. Например, иммунотоксины можно сконструировать, применяя реакцию дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих для данной цели реагентов включают иминотиолят и метил-4-меркаптобутиримидат.
[0205] Для целей настоящего изобретения должно быть понятно, что модифицированные антитела могут содержать любой тип вариабельной области, которая обеспечивает ассоциацию антитела с мишенью (т.е., TIGIT). В этом отношении, вариабельная область может включать или быть получена из любого типа млекопитающего, у которого можно вызвать гуморальный ответ и получить иммуноглобулины против желательного антигена. По этой причине, вариабельная область модифицированных антител, например, может быть получена из человека, мыши, крысы, кролика, не относящегося к человеку примата (например, яванских макаков, макаков, и т.д.), или кролика. В некоторых вариантах реализации как вариабельные, так и константные области модифицированных иммуноглобулинов принадлежат человеку. В других вариантах реализации вариабельные области совместимых антител (обычно полученных из не относящегося к человеку источника) можно сконструировать или специально адаптировать для улучшения свойств связывания или снижения иммуногенности указанной молекулы. В этом отношении, вариабельные области, полезные в настоящем изобретении, можно гуманизировать или другим способом изменить путем включения импортируемых последовательностей аминокислот.
[0206] В некоторых вариантах реализации вариабельные домены как в тяжелой, так и в легкой цепях изменяют путем по меньшей мере частичной замены одного или более CDR и, при необходимости, путем частичной замены каркасной области и модификации и/или изменения последовательности. Хотя участки CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные области, предусмотрено, что указанные CDR можно получить из антитела отличного класса и, часто, из антитела из отличного вида. Не обязательно нужно заменять все CDR на все CDR из донорной вариабельной области, чтобы перенести способность связывать антиген с одного вариабельного домена на другой. Предпочтительнее, может потребоваться перенести только те остатки, которые необходимы для сохранения активности антигенсвязывающего участка.
[0207] Несмотря на изменения в вариабельной области, для специалиста в данной области очевидно, что модифицированные антитела согласно настоящему изобретению будут включать антитела (например, полноразмерные антитела или их иммунореактивные фрагменты), в которых по меньшей мере часть одного или более доменов константной области была удалена или другим способом изменена, чтобы придать желательные биохимические свойства, такие как повышенная локализация в опухоли или повышенное время полужизни в сыворотке по сравнению с антителом с приблизительно такой же иммуногенностью, содержащим нативную или неизмененную константную область. В некоторых вариантах реализации константная область модифицированных антител будет включать константную область из человека. Модификации константной области, подходящие для настоящего изобретения, включают вставки, делеции или замены одной или более аминокислот в одном или более доменах. Модифицированные антитела, описанные в данной заявке, могут содержать изменения или модификации в одном или более из трех константных доменов тяжелой цепи (CH1, СН2 или СН3) и/или в константном домене легкой цепи (CL). В некоторых вариантах реализации один или более доменов частично или полностью удаляют из константных областей модифицированных антител. В некоторых вариантах реализации модифицированные антитела будут включать конструкции с удаленным доменом или варианты, в которых домен СН2 целиком удален (конструкции ΔСН2). В некоторых вариантах реализации исключенный домен константной области заменяют на короткий состоящий из аминокислот спейсер (например, из 10 аминокислотных остатков), который обеспечивает некоторую молекулярную гибкость, которая обычно возникает в результате отсутствия константной области.
[0208] В некоторых вариантах реализации указанные модифицированные антитела сконструированы таким образом, чтобы соединять домен СН3 непосредственно с шарнирной областью антитела. В других вариантах реализации пептидный спейсер вставлен между шарнирной областью и модифицированными доменами СН2 и/или СН3. Например, можно экспрессировать конструкции, в которых домен СН2 был удален, а оставшийся домен СН3 (модифицированный или немодифицированный) соединяют с шарнирной областью с помощью спейсера длиной 5-20 аминокислот. Такой спейсер можно добавить, чтобы удостовериться в том, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными или что шарнирная область остается гибкой. Тем не менее, следует отметить, что состоящие из аминокислот спейсеры в некоторых случаях могут оказаться иммуногенными и вызвать нежелательный иммунный ответ против указанной конструкции. Соответственно, в некоторых вариантах реализации любой спейсер, добавленный к конструкции, будет относительно неиммуногенным, чтобы сохранить желательные биологические свойства модифицированных антител.
[0209] В некоторых вариантах реализации модифицированные антитела могут содержать лишь частично удаленный константный домен или замену нескольких или даже одной аминокислоты. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях домена СН2 может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание Fc. В некоторых вариантах реализации мутации одной аминокислоты в выбранных областях домена СН2 может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание Fc и повысить локализацию в раковых клетках и/или проникновение в опухоль. Аналогично, может быть желательным просто удаление части одного или более доменов константной области, которые контролируют определенную эффекторную функцию (например, связывание комплемента C1q), которую нужно модулировать. Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные свойства антитела (время полужизни в сыворотке), при этом оставляя интактными другие желательные функции, связанные с обсуждаемым доменом константной области. Более того, выше упоминалось, что константные области описанных антител можно модифицировать путем мутации или замены одной или более аминокислот, которые улучшают профиль полученной в результате этого конструкции. В этом отношении может оказаться возможным нарушить активность, которую проявляет консервативный сайт связывания (например, активность связывания Fc), при этом по существу сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. В некоторых вариантах реализации модифицированные антитела содержат вставку одной или более аминокислот в константной области, чтобы улучшить желательные свойства, такие как снижение или повышение эффекторной функции, или создать больше участков связывания цитотоксинов или углеводов.
[0210] В данной области известно, что константная область опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание компонента С1 комплемента с Fc-областью антител IgG или IgM (связанных с антигеном) активирует систему комплемента. Активация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Кроме того, Fc-область антитела может связываться с клеткой, экспрессирующей Fc-рецептор (FcR). Существует множество Fc-рецепторов, которые специфичны к различным классам антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эпсилон-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток запускает множество важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителом частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней клетками-киллерами (называемый антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичностью или АЗКЦ), высвобождение медиаторов воспаления, перенос через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов.
[0211] В некоторых вариантах реализации модифицированные антитела проявляют измененные эффекторные функции, которые, в свою очередь, влияют на биологический профиль введенного антитела. Например, в некоторых вариантах реализации делеция или инактивация (путем введения точечных мутаций или другими способами) домена константной области может уменьшить связывание с Fc-рецептором циркулирующего в кровотоке модифицированного антитела. В некоторых вариантах реализации делеция или инактивация (путем введения точечных мутаций или другими способами) домена константной области может уменьшить связывание с Fc-рецептором циркулирующего в кровотоке модифицированного антитела, тем самым повышая локализацию в раковых клетках и/или проникновение в опухоль. В других вариантах реализации модификации константной области увеличивают время полужизни антитела в сыворотке. В других вариантах реализации модификации константной области уменьшают время полужизни антитела в сыворотке. В некоторых вариантах реализации константную область модифицируют, чтобы устранить дисульфидные связи или олигосахаридные молекулы. Модификации константной области в соответствии с настоящим изобретением можно легко осуществить, применяя хорошо известные биохимические или молекулярные технологии инженерии.
[0212] В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который представляет собой антитело, не обладает одной или более эффекторными функциями. Например, в некоторых вариантах реализации антитело не обладает активностью АЗКЦ и/или не обладает активностью комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ). В некоторых вариантах реализации антитело н не связывает Fc-рецептор и/или факторы комплемента. В некоторых вариантах реализации антитело не обладает эффекторной(-ыми) функцией(-ями).
[0213] В объем настоящего изобретения дополнительно входят варианты и эквиваленты, которые по существу гомологичны указанным рекомбинантным, моноклональным, химерным, гуманизированным и человеческим антителам или фрагментам указанных антител, описанным в данной заявке. Данные варианты могут включать, например, консервативные замены, т.е. замену одной или более аминокислот на сходные аминокислоты.
[0214] В некоторых вариантах реализации антитела, описанные в данной заявке, являются выделенными. В некоторых вариантах реализации антитела, описанные в данной заявке, являются по существу чистыми.
[0215] Можно проанализировать специфическое связывание связывающих TIGIT агентов (например, антител) согласно настоящему изобретению с помощью любого способа, известного в данной области. Иммуноанализы, которые можно применять, включают, но не ограничены конкурентными и неконкурентными системами анализа с применением таких методик, как анализ Biacore, анализ методом FACS, иммунофлуоресценция, иммуноцитохимия, анализ методом вестерн-блот, радиоиммуноанализ, ELISA, "сэндвич"-иммуноанализ, анализ иммунопреципитации, реакция преципитации, реакция диффузной преципитации в геле, анализ иммунодиффузии, анализ агглютинации, анализ связывания комплемента, иммунорадиометрический анализ, флуоресцентный иммуноанализ и иммуноанализ с белком А. Такие анализы обычны и хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel и др., редакторы, 1994 - наст. вр., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Нью-Йорк, Нью-Йорк).
[0216] В лишь одном из примеров скрининг специфического связывания антитела с TIGIT человека можно осуществить, применяя ELISA. Анализ ELISA включает получение антигена (например, TIGIT или его фрагмента), покрытие лунок 96-луночного микротитрационного планшета антигеном, добавление в лунку тестируемых антител, конъюгированных с детектируемым соединением, таким как субстрат фермента (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), инкубацию в течение некоторого периода времени и обнаружение присутствия антитела, связанного с антигеном. В некоторых вариантах реализации тестируемые антитела не конъюгируют с детектируемым соединением, а вместо этого в лунку добавляют вторичное антитело, которое распознает указанное антитело (например, антитело против Fc) и конъюгировано с детектируемым соединением. В некоторых вариантах реализации вместо покрытия лунки антигеном лунку можно покрыть тестируемыми антителами, добавить в лунки антиген (например, TIGIT), а затем вторичное антитело, конъюгированное с детектируемым соединением. Специалист в данной области хорошо осведомлен о параметрах, которые можно модифицировать, чтобы усилить детектируемый сигнал, а также о других вариантах ELISA, известных в данной области.
[0217] В другом лишь одном из примеров специфическое связывание антитела с TIGIT можно определить, применяя FACS. Скрининговый анализ FACS может включать получение конструкции кДНК, которая экспрессирует антиген в виде полноразмерного белка (TIGIT) или слитого белка (например, TIGIT-CD4TM), трансфекцию указанной конструкцией клеток, экспрессирующих антиген на своей поверхности, смешивание тестируемых антител с трансфицированными клетками и инкубацию в течение некоторого периода времени. Клетки, связанные тестируемыми антителами, можно обнаружить, применяя вторичное антитело, конъюгированное с детектируемым соединением (например, конъюгированное с РЕ антитело против Fc), и проточный цитометр. Специалист в данной области хорошо осведомлен о параметрах, которые можно модифицировать, чтобы оптимизировать детектируемый сигнал, а также о других вариантах FACS, которые могут улучшить скрининг (например, скрининг для выявления блокирующих антител).
3
125
[0218] Аффинность связывания антитела или другого связывающего агента с антигеном (например, TIGIT) и скорость диссоциации взаимодействия антитело-антиген можно определить с помощью анализа конкурентного связывания. Один пример анализа конкурентного связывания представляет собой радиоиммуноанализ, включающий инкубацию меченого антигена (например, Н- или I-TIGIT), или его фрагмента или варианта, с интересующим агентом в присутствии возрастающих количеств немеченого антигена с последующим детектированием антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность антитела к антигену и скорости диссоциации связывания можно определить по результатам с помощью анализа графика Скэтчарда. В некоторых вариантах реализации кинетический анализ Biacore используют, чтобы определить скорости ассоциации и диссоциации связывания антител или агентов, которые связывают антиген (например, TIGIT). В некоторых вариантах реализации кинетический анализ Biacore включает анализ связывания и диссоциации антител от чипов с иммобилизованным на поверхностях чипов антигеном (например, TIGIT). В некоторых вариантах реализации кинетический анализ Biacore включает анализ связывания и диссоциации антигена (например, TIGIT) от чипов с иммобилизованным на поверхностях чипов антителом (например, антителом против TIGIT).
[0219] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом связывающий TIGIT агент содержит один, два, три, четыре, пять и/или шесть CDR из антитела ОМР-313М32 (см. таблицу 1). Антитело против TIGIT ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит один или более CDR из ОМР-313М32; два или более CDR из ОМР-313М32; три или более CDR из ОМР-313М32; четыре или более CDR из ОМР-313М32; пять или более CDR из ОМР-313М32; или все шесть CDR из ОМР-313М32.
[0220] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом связывающий TIGIT агент содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), и CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент дополнительно содержит CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ TD NO: 9). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит: (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), и CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6); и (b) CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0221] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом связывающий TIGIT агент содержит: (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот; (b) CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот, (с) CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот; (d) CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот; (е) CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот; и (f) CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9) или ее вариант, содержащий 1, 2, 3 или 4 замены аминокислот. В некоторых вариантах реализации замены аминокислот представляют собой консервативные замены. В некоторых вариантах реализации замены получают в процессе гуманизирования. В некоторых вариантах реализации замены получают в процессе гуманизирования последовательностей зародышевого типа. В некоторых вариантах реализации замены получают в процессе оптимизации связывания.
[0222] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или вариабельную область легкой цепи, последовательность которой по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 97% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область легкой цепи, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 97% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или вариабельную область легкой цепи, последовательность которой по меньшей мере приблизительно на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую по существу из SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, состоящую по существу из SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 11.
[0223] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую по существу из SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, состоящую по существу из SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из SEQ ID NO: 11.
[0224] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом связывающий TIGIT агент содержит: тяжелую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и/или легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит: тяжелую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и/или легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 13, и/или легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, состоящую по существу из SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, состоящую по существу из SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 15.
[0225] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент (например, антитело), который специфично связывает TIGIT человека, при этом указанный связывающий TIGIT агент содержит: тяжелую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 17, и/или легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит: тяжелую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 17, и/или легкую цепь, последовательность которой по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 17, и/или легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, состоящую по существу из SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, состоящую по существу из SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 15.
[0226] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи из антитела ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельные области из антитела ОМР-313М32, при этом вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи из антитела ОМР-313М32 была подвергнута созреванию аффинности. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь и легкую цепь антитела ОМР-313М32 (с лидерной последовательностью или без нее). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела ОМР-313М32 как часть тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела ОМР-313М32 как часть тяжелой цепи IgG1 человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела ОМР-313М32 как часть тяжелой цепи IgG2 человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела ОМР-313М32 как часть тяжелой цепи IgG4 человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела ОМР-313М32 как часть тяжелой цепи IgG4 человека, называют антителом ОМР-313М33.
[0227] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент содержит, состоит по существу или состоит из антитела ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит, состоит по существу или состоит из варианта антитела ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит, состоит по существу или состоит из антитела ОМР-313М33.
[0228] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Манассас, Виргиния, США, в соответствии с условиями Будапештского договора 11 августа 2015 г., которой был присвоен идентификационный номер РТА-122346. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС, 10801 University Boulevard, Манассас, Виргиния, USA, в соответствии с условиями Будапештского договора 11 августа 2015 г., которой был присвоен идентификационный номер РТА-122347. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122346, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122347. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122346. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит легкую цепь, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122347. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент содержит тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122346, и легкую цепь, кодируемую плазмидой, депонированной в АТСС под идентификационным номером РТА-122347.
[0229] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающие TIGIT агенты представляют собой гомодимерные агенты/молекулы и гетеродимерные агенты/молекулы. В некоторых вариантах реализации гомодимерные агенты представляют собой полипептиды. В некоторых вариантах реализации гетеродимерные молекулы представляют собой полипептиды. Как правило гомодимерная молекула содержит два идентичных полипептида. Как правило гетеродимерная молекула содержит по меньшей мере два различных полипептида. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула способна связывать по меньшей мере две мишени, например, биспецифический агент. Мишени могут представлять собой, например, два различных белка на одной клетке или два различных белка на двух отдельных клетках. Термин "плечо" можно применять в данной заявке для описания структуры гомодимерного агента, гетеродимерного агента и/или биспецифического агента. В некоторых вариантах реализации каждое плечо содержит по меньшей мере один полипептид. Как правило, у каждого плеча гетеродимерной молекулы есть отличная функция, например, связывание двух различных мишеней. В некоторых вариантах реализации одно плечо может содержать антигенсвязывающий участок из антитела. В некоторых вариантах реализации одно плечо может содержать связывающую часть рецептора. В некоторых вариантах реализации одно плечо может содержать лиганд. В некоторых вариантах реализации одно плечо может содержать связывающую область лиганда. В некоторых вариантах реализации гомодимерный агент содержит два идентичных плеча. В некоторых вариантах реализации гетеродимерный агент содержит два различных плеча. В некоторых вариантах реализации биспецифический агент содержит два различных плеча.
[0230] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент, который представляет собой гомодимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации гомодимерная молекула содержит два идентичных полипептида. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент, который представляет собой гетеродимерную молекулу. В некоторых вариантах реализации гетеродимерная молекула содержит по меньшей мере два различных полипептида. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент, который представляет собой гетеродимерный агент. В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен связывающий TIGIT агент, который представляет собой биспецифический агент. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой биспецифическое антитело.
[0231] В некоторых из вариантов реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложены полипептиды, включая, но не ограничиваясь антителами, которые специфично связывают TIGIT. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT мыши. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT мыши и TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT мыши. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT крысы. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT кролика. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT мартышки. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT собаки. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT свиньи. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT яванского макака. В некоторых вариантах реализации полипептид связывает TIGIT человека и не связывает TIGIT макака-резуса.
[0232] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, полипептид содержит один, два, три, четыре, пять и/или шесть CDR из антитела ОМР-313М32 (см. таблицу 1 в данной заявке). В некоторых вариантах реализации полипептид содержит участки CDR с вплоть до четырьмя (т.е., 0, 1, 2, 3 или 4) заменами аминокислот на каждый CDR. В некоторых вариантах реализации участок(-ки) CDR тяжелой цепи содержится(-атся) внутри вариабельной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах реализации участок(-ки) CDR легкой цепи содержится(-атся) внутри вариабельной области легкой цепи.
[0233] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, в соответствии с настоящим изобретением предложен полипептид, который специфично связывает TIGIT человека, при этом указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 97% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 97% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 64 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 10, и/или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 10, и/или аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11.
[0234] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, полипептид содержит одну или более из аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. Согласно настоящему описанию, полипептид может быть одноцепочечным или находиться в форме двух или более асоциированных цепей. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 12, и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 16, и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 17, и аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 15.
[0235] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 12, и аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 16, и аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 17, и аминокислотную последовательность, состоящую из SEQ ID NO: 15.
[0236] Многие белки, включая антитела, содержат сигнальную последовательность, которая направляет транспорт указанных белков в различные локализации. Как правило, сигнальные последовательности (также называются сигнальными пептидами или лидерными последовательностями) расположены на N-конце образующихся полипептидов. Они направляют полипептид в эндоплазматический ретикулум, и белки сортируются по их местам назначения, например, во внутреннее пространство органеллы, на внутреннюю мембрану, на наружную мембрану клетки или на внешнюю сторону клетки путем секреции. Большинство сигнальных последовательностей отщепляются от белка сигнальной пептидазой после того, как белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум. Отщепление сигнальной последовательности от полипептида обычно происходит в определенном сайте в последовательности аминокислот и зависит от аминокислотных остатков в сигнальной последовательности. Хотя обычно присутствует один сайт специфического расщепления, сигнальная пептидаза может узнавать и/или использовать более чем один сайт расщепления, что приведет к образованию негомогенного N-конца полипептида. Например, использование различных сайтов расщепления внутри сигнальной последовательности может привести к тому, что полипептид экспрессируется с различными N-концевыми аминокислотами. Соответственно, в некоторых вариантах реализации полипептиды, описанные в данной заявке, могут включать смесь полипептидов с различными N-концами. В некоторых вариантах реализации N-концы отличаются по длине на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. В некоторых вариантах реализации полипептид по существу гомогенный, т.е., полипептиды содержат одинаковые N-концы. В некоторых вариантах реализации сигнальная последовательность полипептида содержит одну или более (например, одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять и т.д.) замен и/или делеций аминокислот по сравнению с "нативной" или "исходной" сигнальной последовательностью. В некоторых вариантах реализации сигнальная последовательность полипептида содержит замены и/или делеций аминокислот, которые позволяют одному сайту расщепления доминировать, что позволяет получить по существу гомогенные полипептиды с одинаковыми N-концами. В некоторых вариантах реализации сигнальная последовательность полипептида влияет на уровень экспрессии указанного полипептида, например, повышает экспрессию или снижает экспрессию.
[0237] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент конкурирует за специфическое связывание с TIGIT человека со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за специфическое связывание с TIGIT со связывающим TIGIT агентом, содержащим: (a) CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), и CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6) и (b) CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0238] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент конкурирует за специфическое связывание с TIGIT человека со связывающим TIGIT агентом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, и вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за специфическое связывание с TIGIT человека со связывающим TIGIT агентом, содержащим тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за специфическое связывание с TIGIT человека со связывающим TIGIT агентом, содержащим тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 17, и легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 15.
[0239] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент конкурирует с антителом ОМР-313М32 за специфическое связывание с TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует с эталонным антителом за специфическое связывание с TIGIT человека, при этом указанное эталонное антитело представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует с эталонным антителом за специфическое связывание с TIGIT человека, при этом указанное эталонное антитело представляет собой антитело 313М33.
[0240] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент связывает тот же эпитоп, или по существу тот же эпитоп, на TIGIT, что и связывающий TIGIT агент, описанный в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент связывает тот же эпитоп, или по существу тот же эпитоп, на TIGIT человека, что и антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент связывает тот же эпитоп, или по существу тот же эпитоп, на TIGIT человека, что и антитело 313М33.
[0241] В другом варианте реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент связывает эпитоп TIGIT, который перекрывается с эпитопом TIGIT, который связывает связывающий TIGIT агент, описанный в данной заявке. В другом варианте реализации антитело или другой связывающий агент связывает эпитоп TIGIT, который перекрывается с эпитопом TIGIT человека, который связывает антитело ОМР-313М32. В другом варианте реализации антитело или другой связывающий агент связывает эпитоп TIGIT, который перекрывается с эпитопом TIGIT человека, который связывает антитело 313М33.
[0242] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты из SEQ ID NO: 27, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты из SEQ ID NO: 28, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты из SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62 и I109 из последовательности SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62, Q64 и I109 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62, Q64 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим аминокислоты Q62, Q64, I109 и Т119 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке. В некоторых вариантах реализации антитело или другой связывающий агент конкурирует за связывание с эпитопом, содержащим по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: N58, Е60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, Т117, Т119, G120 и R121 из SEQ ID NO: 1, со связывающим TIGIT агентом, описанным в данной заявке.
[0243] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) связывает TIGIT и модулирует активность TIGIT. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антагонист TIGIT и снижает активность TIGIT. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует активность TIGIT по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует активность TIGIT, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует активность TIGIT, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует активность TIGIT, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0244] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент связывает TIGIT и ингибирует или уменьшает передачу сигналов TIGIT. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент (например, антитело) ингибирует передачу сигналов TIGIT по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует передачу сигналов TIGIT мыши. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует передачу сигналов TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует передачу сигналов TIGIT, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует передачу сигналов TIGIT, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0245] TIGIT фосфорилируется по цитоплазматическому хвосту после взаимодействия с контррецептором PVR. Фосфорилирование TIGIT является началом каскада, который включает последующие события, влияющие на другие известные сигнальные пути. Следовательно, оценка фосфорилирования TIGIT может дать информацию об активности TIGIT и передаче сигналов TIGIT.
[0246] Анализы фосфорилирования известны специалистам в данной области, и их широко применяют для отслеживания активации белка и/или активации пути. Данные анализы можно применять для отслеживания влияния различных лечения на активацию целевого белка и/или целевого пути. Например, можно использовать анализ фосфорилирования in vitro для оценки влияния антагониста TIGIT на вызванную PVR активацию TIGIT.
[0247] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) ингибирует связывание TIGIT с рецептором. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует связывание TIGIT с PVR. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует связывание TIGIT с PVR-L2, PVR-L3 и/или PVR-L4. В некоторых вариантах реализации ингибирование связывания связывающего TIGIT агента с PVR составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 95%. В некоторых вариантах реализации ингибирование связывания связывающего TIGIT агента с PVR-L2, PVR-L3 и/или PVR-L4 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует связывание TIGIT с PVR, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует связывание TIGIT с PVR, представляет собой антитело ОМР-313М33. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует связывание TIGIT с PVR-L2, PVR-L3 и/или PVR-L4, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует связывание TIGIT с PVR-L2, PVR-L3 и/или PVR-L4, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0248] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) блокирует связывание TIGIT с рецептором. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент блокирует связывание TIGIT с PVR. В некоторых вариантах реализации блокирование связывания связывающего TIGIT агента с PVR составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент блокирует связывание TIGIT с PVRL2, PVRL3 и/или PVRL4. В некоторых вариантах реализации блокирование связывания связывающего TIGIT агента с PVRL2, PVRL3 и/или PVRL4 составляет по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 90% или по меньшей мере приблизительно 95%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который блокирует связывание TIGIT с PVR, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который блокирует связывание TIGIT с PVR, представляет собой антитело ОМР-313М33. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который блокирует связывание TIGIT с PVRL2, PVRL3 и/или PVRL4, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который блокирует связывание TIGIT с PVRL2, PVRL3 и/или PVRL4, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0249] Анализы связывания известны специалистам в данной области и описаны в данной заявке. Анализ связывания можно применять, чтобы отслеживать влияние тестируемого агента на взаимодействие между целевым белком и связывающим партнером указанного белка (например, рецептором или лигандом). Например, можно применять анализ связывания in vitro для оценки того, блокирует ли антагонист TIGIT взаимодействие TIGIT с PVR.
[0250] В некоторых вариантах реализации связывающие TIGIT агенты, описанные в данной заявке, оказывают одно или более из следующих действий: ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, ингибируют рост опухоли, снижают онкогенность опухоли, снижают онкогенность опухоли путем уменьшения встречаемости раковых стволовых клеток в опухоли, запускают гибель опухолевых клеток, усиливают или стимулируют иммунный ответ, усиливают или стимулируют противоопухолевый ответ, повышают цитолитическую активность иммунных клеток, повышают уничтожение опухолевых клеток, повышают уничтожение опухолевых клеток иммунными клетками, стимулируют клетки в опухоли к дифференцировке, дифференцируют онкогенные клетки в неонкогенное состояние, вызывают экспрессию маркеров дифференцировки в опухолевых клетках, предотвращают метастазирование опухолевых клеток, снижают выживаемость опухолевых клеток, повышают ингибирование роста, зависимое от клеточных контактов, повышают апоптоз опухолевых клеток, снижают эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ) или снижают выживаемость опухолевых клеток. В некоторых вариантах реализации указанные агенты оказывают одно или более из следующих действий: ингибируют вирусную инфекцию, ингибируют хроническую вирусную инфекцию, уменьшают вирусную нагрузку, запускают гибель инфицированных вирусом клеток или уменьшают количество или процент инфицированных вирусом клеток.
[0251] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающие TIGIT агенты ингибируют рост опухоли. В некоторых вариантах реализации связывающие TIGIT агенты ингибируют рост опухоли in vivo (например, в модели на мышах и/или у человека, страдающего раком). В некоторых вариантах реализации рост опухоли ингибируется по меньшей мере приблизительно в два раза, приблизительно в три раза, приблизительно в пять раз, приблизительно в десять раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 100 раз или приблизительно в 1000 раз по сравнению с нелеченой опухолью.
[0252] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, указанные агенты (например, полипептиды и/или антитела) связывают TIGIT и модулируют иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент активирует и/или повышает иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает опосредованный клетками иммунитет. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает врожденный опосредованный клетками иммунитет. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает приобретенный опосредованный клетками иммунитет. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает активность Т-клеток. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает цитолитическую активность Т-клеток (CTL). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает активность NK-клеток. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает активность клетки-киллера, активируемой лимфокином (LAK). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает активность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует или снижает активность клеток Treg. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует или снижает активность клеток MDSC. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает уничтожение опухолевых клеток. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает, стимулирует или усиливает ингибирование роста опухоли.
[0253] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент представляет собой антагонист TIGIT человека. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT и активирует и/или повышает иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT и активирует и/или повышает активность NK-клеток. В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает активность по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT и активирует и/или повышает активность Т-клеток (например, цитолитическую активность Т-клеток). В некоторых вариантах реализации указанный агент повышает активность по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT и индуцирует и/или усиливает иммунный ответ Th1-типа. Как правило, иммунный ответ Th1-типа включает продукцию интерферона-гамма (IFN-γ), IL-2 и фактора некроза опухоли-бета (TNF-β). Для сравнения, иммунный ответ Th2-типа, как правило, включает продукцию IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антагонист TIGIT и индуцирует и/или повышает продукцию цитокинов или лимфокинов. В некоторых вариантах реализации индукция и/или повышение продукции цитокинов или лимфокинов может быть опосредованным эффектом.
[0254] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент повышает активацию NK-клеток. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает активацию Т-клеток. В некоторых вариантах реализации активация NK-клеток и/или Т-клеток связывающим TIGIT агентом приводит к повышению уровня активации NK-клеток и/или Т-клеток на по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 95%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активацию NK-клеток, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активацию NK-клеток, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0255] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) является антагонистом активности регуляторных Т-клеток (Treg). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует или снижает активность клеток Treg. В некоторых вариантах реализации ингибирование активности клеток Treg связывающим TIGIT агентом приводит к ингибированию супрессорной активности клеток Treg по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует Treg активность, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует Treg активность, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0256] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) является антагонистом супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует активность клеток MDSC. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент ингибирует активность клеток MDSC по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует активность клеток MDSC, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который ингибирует активность клеток MDSC, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0257] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) повышает активность клеток-естественных киллеров (NK). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает активность NK-клеток по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность NK-клеток, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность NK-клеток, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0258] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) повышает активность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ИОЛ). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает активность ИОЛ по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность клеток ИОЛ, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность клеток ИОЛ, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0259] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент (например, антитело) повышает или усиливает активность активируемой лимфокином клетки-киллера (АЛК). В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент повышает активность АЛК по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 90% или приблизительно на 100%. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность клеток АЛК, представляет собой антитело ОМР-313М32. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент, который повышает активность клеток АЛК, представляет собой антитело ОМР-313М33.
[0260] Анализы in vivo и in vitro для определения того, модулирует ли связывающий TIGIT агент (или кандидатный связывающий агент) иммунный ответ, известны в данной области или в настоящее время разрабатываются. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют активацию Т-клеток. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют пролиферацию Т-клеток. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют активность NK. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют активность CTL. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют активность Treg. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют активность клеток MDSC. В некоторых вариантах реализации можно применять функциональный анализ, в котором детектируют продукцию цитокинов или лимфокинов или клетки, продуцирующие цитокины или лимфокины. В некоторых вариантах реализации анализ ELISpot используют для измерения встречаемости антиген-специфических Т-клеток. В некоторых вариантах реализации анализ ELISpot используют для измерения высвобождения/продукции цитокинов и/или используют для измерения количества продуцирующих цитокины клеток. В некоторых вариантах реализации анализ цитокинов используют, чтобы определить ответ Th1-типа. В некоторых вариантах реализации анализ цитокинов используют, чтобы определить ответ Th2-типа. В некоторых вариантах реализации анализ цитокинов используют, чтобы определить ответ Th17-типа. В некоторых вариантах реализации анализ FACS используют для измерения маркеров активации на иммунных клетках, включая, но не ограничиваясь перечисленными: Т-клетки, В-клетки, NK-клетки, макрофаги и/или миелоидные клетки.
[0261] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, время полужизни связывающих TIGIT агентов в кровотоке у мышей, крыс, яванских макаков или людей составляет по меньшей мере приблизительно 2 часа, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов, по меньшей мере приблизительно 24 часа, по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 1 неделю, или по меньшей мере приблизительно 2 недели. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело IgG (например, IgG1, IgG2 или IgG4), время полужизни которого в кровотоке мышей, яванских макаков или людей составляет по меньшей мере приблизительно 2 часа, по меньшей мере приблизительно 5 часов, по меньшей мере приблизительно 10 часов, по меньшей мере приблизительно 24 часа, по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 1 неделю, или по меньшей мере приблизительно 2 недели. Способы увеличения (или уменьшения) времени полужизни агентов, таких как полипептиды и антитела, известные в данной области. Например, известные способы увеличения времени полужизни в кровотоке антител IgG включают внедрение мутаций в Fc-область, которые повышают рН-зависимое связывание антитела с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) при рН 6,0. Известные способы увеличения времени полужизни в кровотоке фрагментов антител, в которых нет Fc-области, включают такие методики как пегилирование.
[0262] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающие TIGIT агенты представляют собой полипептиды. В некоторых вариантах реализации полипептиды представляют собой рекомбинантные полипептиды, природные полипептиды или синтетические полипептиды, включающие антитело, или его фрагмент, который связывают TIGIT. В данной области известно, что некоторые последовательности аминокислот согласно настоящему изобретению можно изменять, не оказывая значительного влияния на структуру или функцию белка. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно включает варианты указанных полипептидов, которые проявляют существенную активность или которые содержат участки антитела, или его фрагмента, которое связывает TIGIT. В некоторых вариантах реализации варианты последовательности аминокислот связывающих TIGIT полипептидов включают делеции, вставки, инверсии, повторы и/или другие типы замен.
ое
[0263] Указанные полипептиды, их аналоги и варианты можно дополнительно модифицировать, чтобы они содержали дополнительные химические молекулы, обычно не являющиеся частью указанного полипептида. Производные молекулы могут улучшить или другим образом модулировать растворимость, биологическое время полужизни и/или абсорбцию полипептида. Указанные молекулы также могут уменьшить или устранить нежелательные побочные действия полипептидов и вариантов. Обзор химических молекул можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 издание, 2012, Pharmaceutical Press, Лондон.
[0264] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающие TIGIT агенты применяют в любой из множества конъюгированных (т.е. иммуноконъюгат или радиоконъюгат) или неконъюгированных форм. В некоторых вариантах реализации агенты можно применять в неконъюгированной форме, чтобы использовать природные механизмы защиты субъекта, включая комплементзависимую цито токсичность (КЗЦ) и антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (АЗКЦ), для уничтожения злокачественных или раковых клеток.
90
125
131
123
111
131
105
153
67
67
166
177
186
188
212
[0265] В некоторых вариантах реализации способов, описанных в данной заявке, связывающий TIGIT агент конъюгирован с цитотоксическим агентом. В некоторых вариантах реализации связывающий TIGIT агент представляет собой антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом в виде КАТЛС (конъюгата антитела с лекарственным средством). В некоторых вариантах реализации цитотоксический агент представляет собой химиотерапевтический агент, включая, но не ограничиваясь перечисленными: метотрексат, адриамицин/доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин, пирролобензодиазепины (PBD) или другие интеркалирующие агенты. В некоторых вариантах реализации цитотоксический агент представляет собой ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или его фрагменты, включая, но не ограничиваясь перечисленными: А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина, А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. В некоторых вариантах реализации цитотоксический агент представляет собой радиоактивный изотоп для получения радиоконъюгата или радиоконъюгированного антитела. Для получения радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды включая, но не ограничиваясь перечисленными: Y, I, I, I, In, In, Rh, Sm, Cu, Ga, Ho, Lu, Re, Re и Bi. Также можно применять конъюгаты антитела и одного или более низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзиноид, трихотены и СС1065, и производных данных токсинов, которые обладают активностью токсина. Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно получать, применяя различные бифункциональные соединяющие белки агенты, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(пара-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(пара-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
IV. Полинуклеотиды
[0266] В соответствии с настоящим изобретением предложены полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют связывающий TIGIT агент. В объем термина "полинуклеотиды, которые кодируют полипептид", входит полинуклеотид, который содержит только кодирующие полипептид последовательности, а также полинуклеотид, который содержит дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть в виде РНК или в виде ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, и если она одноцепочечная, то может представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую) цепь.
[0267] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит полинуклеотид (например, последовательность нуклеотидов), кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17.
[0268] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит полинуклеотид, последовательность нуклеотидов которого по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, по меньшей мере приблизительно на 90% идентична, по меньшей мере приблизительно на 95% идентична и, в некоторых вариантах реализации, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентична полинуклеотиду, кодирующему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. Также предложен полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах реализации гибридизацию осуществляют при условиях высокой жесткости. Условия высокой жесткости известны специалистам в данной области и могут включать, но не ограничены перечисленными условиями: (1) использование низкой ионной силы и высокой температуры для промывки, например, 15 мМ хлорид натрия/1,5 мМ цитрат натрия (1 × SSC) с 0,1% додецилсульфатом натрия при 50°С; (2) использование в процессе гибридизации денатурирующего агента, такого как формамид, например, 50% (в объемном отношении) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 в 5 × SSC (0,75 М NaCl, 75 мМ цитрат натрия) при 42°С; или (3) использование 50% формамида, 5 × SSC, 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5 × раствора Денхардта, разрушенной ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% сульфата декстрана при 42°С, с промывками в 0,2 × SSC, содержащем 50% формамид, при 55°C с последующей промывкой в условиях высокой жесткости в 0,1 × SSC, содержащем ЭДТА, при 55°С.
[0269] В некоторых вариантах реализации нуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит полинуклеотид, последовательность нуклеотидов которого по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, по меньшей мере приблизительно на 90% идентична, по меньшей мере приблизительно на 95% идентична и, в некоторых вариантах реализации, по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности нуклеотидов, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. Также предложен полинуклеотид, который содержит полинуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах реализации способы гибридизации осуществляют при условиях высокой жесткости, описанных выше.
[0270] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую зрелый полипептид, слитую в одной рамке считывания с полинуклеотидом, который способствует, например, экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина (например, с лидерной последовательностью, которая действует как секреторная последовательность для контроля транспортировки полипептида из клетки). Полипептид, содержащий лидерную последовательность, представляет собой пре-белок, и его лидерная последовательность может быть отщеплена в клетке-хозяине с получением зрелой формы полипептида. Указанные полинуклеотиды также могут кодировать про-белок, который представляет собой зрелый белок плюс дополнительные аминокислотные остатки на 5'-конце. Зрелый белок, содержащий про-последовательность, представляет собой про-белок и является неактивной формой белка. После отщепления про-последовательности остается активный зрелый белок.
[0271] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую зрелый полипептид, слитую в одной рамке считывания с маркерной последовательностью, которая позволяет осуществить, например, очистку кодируемого полипептида. Например, маркерная последовательность может представлять собой гексагистидиновую метку, предоставляемую вектором pQE-9, обеспечивающую проведение очистки зрелого полипептида, слитого с указанным маркером, в случае бактериального хозяина, или маркерная последовательность может представлять собой гемагглютининовую (НА) метку, полученную из белка гемагглютинина гриппа, если используют млекопитающего хозяина (например, клетки COS-7). В некоторых вариантах реализации маркерная последовательность представляет собой метку FLAG - пептид с последовательностью DYKDDDDK (SEQ ID NO: 29), который можно использовать в сочетании с другими аффинными метками.
[0272] В настоящем изобретении дополнительно предложены варианты полинуклеотидов, описанные в данной заявке, при этом указанный вариант кодирует, например, фрагменты, аналоги и/или производные.
[0273] В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением предложен полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, последовательность нуклеотидов которого по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, по меньшей мере приблизительно на 90% идентична, по меньшей мере приблизительно на 95% идентична и в некоторых вариантах реализации по меньшей мере приблизительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентична полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий связывающий TIGIT агент.
[0274] В данном описании предполагается, что формулировка полинуклеотид, последовательность нуклеотидов которого по меньшей мере, например, на 95% "идентична" эталонной последовательности нуклеотидов, означает, что последовательность нуклеотидов указанного полинуклеотида идентична эталонной последовательности за исключением того, что указанная полинуклеотидная последовательность может содержать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной последовательности нуклеотидов. Другими словами, для получения полинуклеотида, последовательность нуклеотидов которого по меньшей мере на 95% идентична эталонной последовательности нуклеотидов, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности можно удалить или заменить на другой нуклеотид, или некоторое количество нуклеотидов до 5% всех нуклеотидов в эталонной последовательности можно вставить в эталонную последовательность. Данные мутации эталонной последовательности могут встречаться в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной последовательности нуклеотидов или в любом положении между этими концевыми положениями, либо отдельно разбросанными среди нуклеотидов эталонной последовательности, либо расположенными в виде одной или более примыкающих друг к другу групп в эталонной последовательности.
[0275] Варианты полинуклеотидов могут содержать изменения в кодирующих областях, некодирующих областях или в обоих типах областей. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида содержит изменения, которые приводят к молчащим заменам, вставкам или делециям, но не меняют свойства или активности кодируемого полипептида. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида содержит молчащие замены, которые не приводят к изменению последовательности аминокислот полипептида (вследствие вырожденности генетического кода). Варианты полинуклеотидов можно получить для различных целей, например, чтобы оптимизировать экспрессию кодонов для конкретного хозяина (т.е., заменить ко доны в мРНК человека на предпочитаемые бактериальным хозяином, таким как Е. coli). В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида содержит по меньшей мере одну молчащую мутацию в некодирующей или кодирующей области указанной последовательности.
[0276] В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида получают, чтобы модулировать или изменить экспрессию (или уровни экспрессии) кодируемого полипептида. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида получают, чтобы повысить экспрессию кодируемого полипептида. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида получают, чтобы понизить экспрессию кодируемого полипептида. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида приводит к повышенной экспрессии кодируемого полипептида по сравнению с исходной полинуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах реализации вариант полинуклеотида приводит к пониженной экспрессии кодируемого полипептида по сравнению с исходной полинуклеотидной последовательностью.
[0277] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один вариант полинуклеотида получают (без изменения аминокислотной последовательности кодируемого полипептида) для увеличения выхода гетеродимерной молекулы. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один вариант полинуклеотида получают (без изменения аминокислотной последовательности кодируемого полипептида) для увеличения выхода биспецифического антитела.
[0278] В некоторых вариантах реализации указанные полинуклеотиды являются выделенными. В некоторых вариантах реализации указанные полинуклеотиды являются по существу чистыми.
[0279] Также предложены векторы и клетки, содержащие полинуклеотиды, описанные в данной заявке. В некоторых вариантах реализации вектор экспрессии содержит молекулу полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, содержащий молекулу полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин содержит молекулу полинуклеотида.
V. Наборы, содержащие агенты, описанные в данной заявке.
[0280] В соответствии с настоящим изобретением предложены наборы, которые содержат связывающие TIGIT агенты, описанные в данной заявке, и которые можно применять для осуществления способов, описанных в данной заявке. В некоторых вариантах реализации набор содержит по меньшей мере один очищенный связывающий TIGIT агент в одном или более контейнерах. В некоторых вариантах реализации наборы содержат все компоненты, необходимые и/или достаточные для проведения анализа детектирования, включая все контроли, инструкции по проведению анализов и любое программное обеспечение, необходимое для анализа и представления результатов. Для специалиста в данной области будет очевидно, что описанные связывающие TIGIT агенты согласно настоящему изобретению можно легко включить в состав одного из установленных форматов набора, которые хорошо известны в данной области.
[0281] Дополнительно предложены наборы, которые содержат связывающий TIGIT агент, а также по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент. В некоторых вариантах реализации указанный второй (или более) терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. В некоторых вариантах реализации второй (или более) терапевтический агент представляет собой антитело.
VI. Дополнительные типичные варианты реализации.
[0282] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта, предложенные в настоящей заявке, включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль с высокой MSI выбрана из группы, состоящей из КРР, рака желудка, рака эндометрия, рака печени и желчевыводящих путей, рака мочевыводящих путей, рака головного мозга и рака кожи. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0283] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, выбранную из группы, состоящей из КРР MSI, рака желудка MSI, рака эндометрия MSI, рака печени и желчевыводящих путей MSI, рака мочевыводящих путей MSI, рака головного мозга MSI и рака кожи MSI, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 3 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0284] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, выбранную из группы, состоящей из КРР MSI, рака желудка MSI, рака эндометрия MSI, рака печени и желчевыводящих путей MSI, рака мочевыводящих путей MSI, рака головного мозга MSI и рака кожи MSI, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 10 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0285] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой солидную опухоль с высокой MSI, выбранную из группы, состоящей из КРР MSI, рака желудка MSI, рака эндометрия MSI, рака печени и желчевыводящих путей MSI, рака мочевыводящих путей MSI, рака головного мозга MSI и рака кожи MSI, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 15 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0286] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой опухоль, рефракторную к лечению антителом против PD1, выбранную из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSCSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0287] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой опухоль, рефракторную к лечению антителом против PD-L1, выбранную из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0288] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой опухоль, устойчивую к лечению антителом против PD1, выбранную из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD1. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0289] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, при этом опухоль представляет собой опухоль, устойчивую к лечению антителом против PD-L1, выбранную из группы, состоящей из меланомы, НМКРЛ, почечно-клеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, уротелиальной карциномы, колоректального рака (например, метастатического КРР MSI или dMMR) и печеночно-клеточной карциномы, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации субъект ранее получал лечение антителом против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0290] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2, при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации опухоль выбрана из группы, состоящей из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака шейки матки, ТНРМЖ, рака заднего прохода, печеночно-клеточного рака, солидной опухоли с высокой MSI (например, КРР MSI), НМКРЛ и колоректального рака. В некоторых вариантах реализации антитело, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг или приблизительно 15 мг/кг.
[0291] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2, при этом указанная опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака шейки матки, ТНРМЖ, рака заднего прохода, печеночно-клеточного рака, солидной опухоли с высокой MSI (например, КРР MSI), НМКРЛ и колоректального рака, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 3 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0292] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2, при этом указанная опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака шейки матки, ТНРМЖ, рака заднего прохода, печеночно-клеточного рака, солидной опухоли с высокой MSI (например, КРР MSI), НМКРЛ и колоректального рака, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 10 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0293] В некоторых вариантах реализации способы ингибирования роста опухоли у субъекта включают избирательное введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела, которое специфично связывает внеклеточный домен TIGIT, на основании того, что указанная опухоль/рак экспрессирует PVR и/или PVRL2, при этом указанная опухоль/рак выбран из группы, состоящей из рака головы и шеи, рака пищевода, рака желудка, рака шейки матки, ТНРМЖ, рака заднего прохода, печеночно-клеточного рака, солидной опухоли с высокой MSI (например, КРР MSI), НМКРЛ и колоректального рака, при этом антитело вводят раз в две недели в дозе, равной приблизительно 15 мг/кг, и при этом антитело, которое связывает TIGIT человека, содержит CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность TSDYAWN (SEQ ID NO: 4), CDR2 тяжелой цепи, содержащий YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO: 5), CDR3 тяжелой цепи, содержащий ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO: 6), CDR1 легкой цепи, содержащий KASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 7), CDR2 легкой цепи, содержащий SASYRYT (SEQ ID NO: 8), и CDR3 легкой цепи, содержащий QQHYSTP (SEQ ID NO: 9).
[0294] Варианты реализации согласно настоящему описанию можно дополнительно охарактеризовать путем ссылки на следующие лишь некоторые из примеров, в которых подробно описано получение некоторых антител согласно настоящему описанию и способы применения антител согласно настоящему описанию. Для специалистов в данной области должно быть очевидно, что можно осуществить множество модификаций, как материалов, так и способов, не отклоняясь от объема настоящего описания.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Ингибирование роста опухоли in vivo в гуманизированных мышах с помощью антитела против TIGIT.
3
[0295] Использовали гуманизированную модель на мышах, чтобы исследовать эффективность лечения антителом против hTIGIT опухоли человека. Гуманизированных мышей получали от Jackson Laboratories. Данных мышей получали путем введения с помощью инъекции гематопоэтических стволовых клеток (CD34+ клеток) человека облученным мышам NSG. Через 15 недель подтверждали присутствие зрелых лимфоцитов человека с помощью проточной цитометрии. Каждой мыши вводили путем подкожной инъекции полученные из пациента опухолевые клетки меланомы (ОМР-М9; 75000 клеток/мышь). Опухолям позволяли расти 19 дней до тех пор, пока они не достигли среднего объема, равного приблизительно 50 мм. Несущих опухоль мышей произвольно распределяли по группам (n = 8 мышей на группу). Несущие опухоль мыши получали лечение либо контрольным антителом, либо антителом против hTIGIT - ОМР-313М32. Мышам вводили дозу 1 мг/кг или 5 мг/кг каждые 5 дней. Рост опухоли отслеживали и объемы опухоли измеряли с помощью электронного кронциркуля в указанные моменты времени.
[0296] На фигуре 1 показано, что рост опухоли ингибировался в мышах, которые получали лечение антителом ОМР-313М32, по сравнению с контролем. Данные результаты показывают, что нацеливание на TIGIT эффективно усиливало противоопухолевый иммунный ответ лимфоцитов человека и способствовало ингибированию роста опухоли человека in vivo. Кроме того, данные результаты демонстрируют, что модели на гуманизированных мышах, несущих полученные из пациента ксенотрансплантаты, можно применять для исследования антитела против hTIGIT - ОМР-313М32 (которое связывает только TIGIT человека) параллельно с доклиническими исследованиями, которые проводят с антителами против TIGIT - 313R12 и 313R19 - и моделями мышиных опухолей.
Пример 2
Фаза I клинических испытаний.
[0297] Разработали открытое исследование ОМР-313М32 фазы 1 с повышением дозы и применением максимальной переносимой дозы в расширенной популяции у пациентов с некоторыми местнораспространенными или метастатическими опухолями. У пациентов были опухоли, которые прогрессировали после стандартной терапии, или были опухоли, терапия которых оказалась непереносимой или считалась нецелесообразной. Перед включением в исследование пациентов подвергали скринингу, чтобы определить пригодность к участию в исследовании. Цели данного исследования включали оценку безопасности и переносимости ОМР-313М32 у пациентов; оценку максимальной переносимой дозы (МПД) ОМР-313М32; характеристику ограничивающей дозу токсичности (ОДТ) ОМР-313М32; определение рекомендуемой для фазы 2 дозы ОМР-313М32; характеристику фармакокинетики ОМР-313М32; характеристику иммуногенного потенциала ОМР-313М32; предварительную оценку противоопухолевой активности ОМР-313М32; и предварительную оценку маркеров фармакодинамики (ФД).
[0298] На фигуре 2 показано, что осуществляли повышение дозы, чтобы определить максимальну переносимую дозу (МПД) или максимальную введенную дозу (МВД) в начальной фазе исследования. Уровни дозы 0,3, 1,0, 3, 10 и 15 мг/кг ОМР-313М32 вводили путем в/в инфузии раз в 2 недели. Не допускалось повышение или снижение дозы внутри дозовой группы. Трое пациентов получали лечение на каждом уровне дозы, если не наблюдалась ОДТ. Если 1 из 3 пациентов испытывал ОДТ, то расширяли популяцию, принимающую данный уровень дозы, до 6 пациентов. Если 2 или более пациентов испытывали ОДТ, то данный уровень дозы не вводили дополнительным пациентам, а 3 дополнительных пациента добавляли к предыдущей дозовой группе, если только на данном уровне дозы еще не получали лечение 6 пациентов. Оценивали ОДТ у пациентов в течение 28 дней (с дня 1 по день 29).
[0299] В фазе исследования с применением максимальной переносимой дозы в расширенной популяции, в исследование включаются пациенты при уровне дозы ОМР-313М32, равном МПД или МВД. Фазу с применением максимальной переносимой дозы в расширенной популяции разрабатывали таким образом, чтобы она лучше характеризовала безопасность и переносимость и чтобы предварительно оценить противоопухолевую активность ОМР-313М32 у пациентов с определенными типами или подтипами опухоли. Типы опухоли, которые рассматривали для оценки в фазе(-ах) применения максимальной переносимой дозы в расширенной популяции, включают, но не ограничены перечисленными: рак головы и шеи, рак пищевода/рак желудка и пищевода, рак желудка, колоректальный рак, печеночно-клеточный рак/рак печени, рак шейки матки, рак легких, меланому, карциному из клеток Меркеля, почечно-клеточную карциному/рак почки, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак эндометрия и трижды негативный рак молочной железы. В данной заявке, "рак легких" включает немелкоклеточный рак легких (НМКРЛ) и мелкоклеточный рак легких. НМКРЛ может включать плоско клеточный НМКРЛ и аденокарциному НМКРЛ. Колоректальные раки (КРР) могут включать КРР с высокой микросателлитной нестабильностью и микросателлитно-стабильный КРР. У пациентов в фазе применения максимальной переносимой дозы в расширенной популяции могут быть опухоли, которые устойчивы или рефрактерны к лечению антагонистом PD-1 (например, антителом против PD-1) или антагонистом PD-L1 (например, антителом против PD-L1). Пациенты в фазе применения максимальной переносимой дозы в расширенной популяции могут представлять собой субъектов, которые ранее получали лечение антагонистом PD-1 (например, антителом против PD-1) или антагонистом PD-L1 (например, антителом против PD-L1), при этом рост опухоли прогрессировал во время или после лечения (их могут называть прогрессорами на антагонистах PD-1/PD-L1).
[0300] Всех пациентов, включенных в группы с повышением доз и применением максимальной переносимой дозы в расширенной популяции, подвергали биопсии до лечения и по меньшей мере одной биопсии опухоли после начала лечения, если только не было медицинского противопоказания. Биопсию проводили в момент включения в исследование и приблизительно через 2-3 недели после первого введения ОМР-313М32. Дополнительные биоптаты могли собирать по усмотрению исследователя. Способы биопсии могут включать толстоигольную, штанцевую, щипцовую или эксцизионную/инцизионную биопсию. Экспрессию TIGIT, PVR, PVRL2, FOXP3 и других иммунных маркеров будут оценивать в образцах опухоли FFPE. Уровни экспрессии дополнительных белков и генов (например, профили экспрессии иммунных генов) можно оценить и коррелировать с клинической пользой.
Пример 3
Экспрессия белка TIGIT, которую оценивали с помощью ИГХ
[0301] Для того чтобы исследовать экспрессию белка TIGIT, разработали и оптимизировали иммуногистохимический (ИГХ) анализ TIGIT, применяя патентованное моноклональное антитело мыши против hTIGIT. Делали срезы FFPE толщиной четыре микрона и приклеивали их к положительно заряженным предметным стеклам с капиллярным зазором. Из тканей удаляли парафин с помощью четырех 5-минутных промывок в свежем ксилоле, а затем в серии снижающихся концентраций спирта вплоть до дистиллированной воды. Проводили вызванное паром демаскирование эпитопов (SHIER) с помощью раствора SHIER 2 (буфер на основе цитрата, рН 6,0-6,2) в течение 20 минут в верхней камере паровой установки Black and Decker. Стекла предварительно обрабатывали ферментом протеиназой K (разведение 1:40) в течение 10 минут и инкубировали в блокирующем растворе в течение 15 минут, чтобы уменьшить неспецифическое фоновое окрашивание. Стекла инкубировали с антителом против hTIGIT в течение ночи при концентрации 1 мкг/мл. Для блокирования активности эндогенной пероксидазы стекла трижды инкубировали в перекиси водорода в течение 2,5 минут и промывали в ФБР. Специфическое связывание детектировали, применяя набор для детектирования Polink-2 Plus, разработанный для мышиных антител, и применяя DAB и гематоксилин. На положительное окрашивание указывало присутствие коричневого продукта хромогенной реакции пероксидазы хрена и субстрата DAB. Контрастное окрашивание гематоксилином приводило к синему окрашиванию ядер, чтобы оценить морфологию клеток и ткани.
[0302] Панель образцов, охватывающую 17 различных типов рака, оценивали в анализе ИГХ (таблица 2) окрашивания TIGIT в опухолевых клетках, в ассоциированных с опухолью иммунных клетках и в неопухолевых/стромальных иммунных клетках.
[0303] Для опухолевых клеток оценивали реакционную способность на плазматической мембране, используя проценты, наблюдаемые при различных интенсивностях. Балльная оценка интенсивности включала: 0 = нулевая, 1+ = низкая или слабая, 2+ = умеренная и 3+ = высокая или сильная. Процент, зарегистрированный при каждом уровне интенсивности, регистрировали как от 0 до 100% с шагом 10 выше 10% и с шагом 1 ниже 10%. Результаты балльной оценки экспрессии TIGIT в опухолевых клетках оценивали, применяя стандартный подход Н-показателя и подход процентного показателя. Н-показатель рассчитывали, используя процент клеток с интенсивностью экспрессии на трехточечной полуколичественной шкале (0, 1+, 2+ или 3+). Таким образом, баллы находились в диапазоне от 0 до 300. Н-показатель = [(% с 1+)×1]+[(% с 2+)×2]+[(% с 3+)×3. Процентный показатель рассчитывали путем суммирования процента интенсивностей ≥ 1+, ≥ 2+ и ≥ 3+. Таким образом, баллы находились в диапазоне от 0 до 100. Процентный показатель ≥ 1+=(% с 1+)+(% с 2+)+(% с 3+); процентный показатель ≥ 2+=(% с 2+)+(% с 3+); процентный показатель ≥ 3+ = (% с 3+).
[0304] В каждом образце также анализировали реакционную способность TIGIT в иммунных клетках на (1) областях стромы/неопухолевых клеток и (2) областях внутри опухоли или тесно связанных с опухолью. Реакционную способность иммунных клеток оценивали, применяя шкалу распространенности от 0 до 3, где 0 = нет окрашивания иммунных клеток; 1 = окрашивание нескольких иммунных клеток; 2 = окрашивание умеренного количества иммунных клеток; и 3 = окрашивание большого количества иммунных клеток.
[0305] Результаты анализа ИГХ экспрессии TIGIT на ассоциированных с опухолью иммунных клетках кратко представлены в таблице 3.
[0306] В целом, для трижды негативного рака молочной железы, Т-клеточной лимфомы, рака головы и шеи и рака шейки матки обнаружили наиболее сильное окрашивание как в строме, так и в ассоциированных с опухолью иммунных клетках. В соответствии с результатами ИГХ, анализы 33 типов опухоли в The Cancer Genome Atlas (TGCA) с помощью секвенирования транс криптомов (RNA-seq) выявили хорошую корреляцию уровней экспрессии TIGIT и маркеров Т-клеток. Общее распространение окрашивания TIGIT на плазматической мембране опухолевых клеток было редким и с низкой интенсивностью. Данные результаты явно свидетельствуют о том, что TIGIT экспрессируется преимущественно на иммунных клетках в опухолях и в микроокружении опухоли.
Пример 4
Фармакодинамические (ФД) биомаркеры.
[0307] Использовали многоплатформенный подход, чтобы исследовать фармакодинамические (ФД) биомаркеры направленной против TIGIT терапии в опухолях и в соответствующих образцах цельной крови из несущих опухоли мышей, которые получали лечение суррогатным антителом против TIGIT 313R12. Опухолевые ткани и соответствующие образцы цельной крови анализировали с помощью микрочипа, иммунохимии (ИГХ) и проточной цитометрии для определения распространенности и функции иммунных клеток.
[0308] Антитело 313R12 вводили иммунокомпетентным мышам, несущим опухоли CT26.WT толстой кишки, 4Т1 молочной железы или B16F10 меланомы. Считают, что у данных опухолей различные уровни иммуногенности: опухоли CT26.WT высоко иммуногенные и богатые цитотоксическими Т-клетками; опухоли 4Т1 высоко иммуногенные и иммуносупрессивные; и опухоли B16F10 слабо иммуногенные и иммунологически молчащие. Мыши получали лечение раз в неделю в каждой из моделей.
[0309] Для того чтобы определить потенциальные ФД биомаркеры экспрессии гена, которые коррелируют с эффективностью, РНК выделяли из опухолевой ткани и собирали образцы периферической крови по окончании исследования для каждой из 3 моделей. Микрочиповые анализы проводили, используя образцы из 3 животных из следующих групп: (1) мыши, несущие опухоль 4Т1, которые получали лечение 0,1 мг/кг и 12,5 мг/кг 313R12, (2) мыши, несущие опухоль B16F10, которые получали лечение 0,1 мг/кг и 12,5 мг/кг 313R12, (3) мыши, несущие опухоль CT26.WT, которые получали лечение 0,1, 0,5, 2,5 и 12,5 мг/кг 313R12, и (4) контрольные мыши. Определяли профили общих уровней экспрессии генов с помощью микрочипа в леченых и контрольных тканях. Исследовали связанные с иммунными клетками изменения генов, с акцентом на Т-клеточные, NK-клеточные и В-клеточные маркеры. Изменения в популяциях иммунных клеток и секреции цитокинов отслеживали с помощью проточной цитометрии, Luminex, и ИГХ.
[0310] В образцах опухоли, направленная против TIGIT терапия вызывала повышенную экспрессию генов, ассоциированных с Т-клетками, CD8 Т-клетками, цитотоксическими клетками, Th1-клетками, NK-клетками, Teff-клетками и маркерами активации Т-клеток. Данные изменения экспрессии генов подтверждали с помощью количественной ПЦР в реальном времени (т.е., CD3e, CD8a, Ncr1, Ifn-гамма, Gzma и CD266). Сходные результаты наблюдали для изменений в экспрессии генов в образцах крови. Данные результаты позволяют предположить, что ФД биомаркеры можно использовать в клинике для исследования активности антитела против TIGIT OMP-313M32 на мишени.
[0311] Должно быть очевидно, что примеры и варианты реализации, описанные в данной заявке, приведены исключительно с целью иллюстрирования и что специалисту в данной области будут предложены различные их модификации или изменения, которые должны входить в сущность и содержание настоящей заявки.
[0312] Все публикации, патенты, заявки на патент, сайты в сети Интернет и номера доступа/последовательности из баз данных, включая как полинуклеотидные, так и полипептидные последовательности, упоминаемые в данной заявке, настоящим полностью включены в данную заявку посредством ссылки во всех отношениях до такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент, сайт в сети Интернет или идентификационный номер/последовательность из базы данных были конкретно и отдельно упомянуты как включенные посредством ссылки.
[0313] Последовательности, описанные в данной заявке, приведены далее:
Последовательность аминокислот TIGIT человека (SEQ ID NO: 1)
Последовательность аминокислот TIGIT человека без предсказанной сигнальной последовательности (SEQ IN NO: 2)
Последовательность аминокислот внеклеточного домена TIGIT человека (SEQ ID NO: 3)
CDR1 тяжелой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 4)
CDR2 тяжелой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 5)
CDR3 тяжелой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 6)
CDR1 легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 7)
CDR2 легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 8)
CDR3 легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 9)
Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 10)
Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 11)
Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32 с подчеркнутой предсказанной сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 12)
Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 13)
Последовательность аминокислот легкой цепи ОМР-313М32/313М33 с подчеркнутой предсказанной сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 14)
Последовательность аминокислот легкой цепи ОМР-313М32/313М33 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 15)
Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG4) 313M33 с подчеркнутой предсказанной сигнальной последовательностью (SEQ ID NO: 16)
Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG4) 313M33 без сигнальной последовательности (SEQ ID NO: 17)
Последовательность нуклеотидов вариабельной области тяжелой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 18)
Последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 19)
Последовательность нуклеотидов тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32 (SEQ ID NO: 20)
Последовательность нуклеотидов легкой цепи ОМР-313М32/313М33 (SEQ ID NO: 21)
Последовательность нуклеотидов тяжелой цепи (IgG4) 313M33 (SEQ ID NO: 22)
Константная область тяжелой цепи IgG1 человека (SEQ ID NO: 23)
Константная область тяжелой цепи IgG2 человека (SEQ ID NO: 24)
Константная область тяжелой цепи IgG3 человека (SEQ ID NO: 25)
Константная область тяжелой цепи IgG4 человека (SEQ ID NO: 26)
TIGIT человека, аминокислоты 55-70 (SEQ ID NO: 27)
TIGIT человека, аминокислоты 105-122 (SEQ ID NO: 28)
Метка FLAG (SEQ ID NO: 29)
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ONCOMED PHARMACEUTICALS, INC. DUPONT, JAKOB
PARMAR, HEMA
<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ TIGIT АГЕНТЫ
<130>  2293.164PC02/PAC/E-H/M-S
<150>  US 62/479,609
<151>  2017-03-31
<150>  US 62/427,903
<151>  2016-11-30
<160>  29
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  244
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот TIGIT человека
<400>  1
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1               5                   10                  15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20                  25                  30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35                  40                  45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50                  55                  60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85                  90                  95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100                 105                 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115                 120                 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130                 135                 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145                 150                 155                 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165                 170                 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180                 185                 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195                 200                 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210                 215                 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 2
<211> 223
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот TIGIT человека без предсказанной
сигнальной последовательности
<400>  2
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr
115                 120                 125
Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg
130                 135                 140
Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro
165                 170                 175
Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu
180                 185                 190
Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu
195                 200                 205
Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
210                 215                 220
<210>  3
<211>  120
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот внеклеточного домена TIGIT человека
<400>  3
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115                 120
<210>  4
<211>  7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  4
Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
1               5
<210>  5
<211>  16
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  5
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
<210>  6
<211>  11
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  6
Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  7
<211>  11
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR1 легкой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  7
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  8
<211>  7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR2 легкой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  8
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1               5
<210>  9
<211>  7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDR3 легкой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  9
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro
1               5
<210>  10
<211>  118
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи
OMP-313M32/313M33
<400>  10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  11
<211>  99
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи
OMP-313M32/313M33
<400>  11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly
<210>  12
<211>  467
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32 с
предсказанной сигнальной последовательностью
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(19)
<223> предсказанная сигнальная последовательность
<400>  12
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35                  40                  45
Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50                  55                  60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
85                  90                  95
Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>  13
<211>  448
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32 без
сигнальной последовательности
<400>  13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  14
<211>  234
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот легкой цепи OMP-313M32/313M33 с
предсказанной сигнальной последовательностью
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(20)
<223> предсказанная сигнальная последовательность
<400>  14
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35                  40                  45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100                 105                 110
Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  15
<211>  214
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот легкой цепи OMP-313M32/313M33 без
сигнальной последовательности
<400>  15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  16
<211>  464
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG4) 313M33 с предсказанной
сигнальной последовательностью
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(19)
<223> предсказанная сигнальная последовательность
<400>  16
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile
35                  40                  45
Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
50                  55                  60
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn
85                  90                  95
Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275                 280                 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355                 360                 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420                 425                 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450                 455                 460
<210>  17
<211>  445
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность аминокислот тяжелой цепи (IgG4) 313M33 без сигнальной
последовательности
<400>  17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20                  25                  30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355                 360                 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385                 390                 395                 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405                 410                 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420                 425                 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440                 445
<210>  18
<211>  354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеотидов вариабельной области тяжелой цепи
OMP-313M32/313M33
<400>  18
caggtccagc tgcaggagtc tggcccagga ctggtgaagc cttctgagac cctgtccctc       60
acctgcgctg tctctggtta ctccatcacc tccgattatg cctggaactg gattcggcag      120
cccccaggga aggggctgga gtggattggg tacataagct actctggtag cactagctac      180
aacccatctc tccggtcacg ggtcacaata tcacgggaca catccaagaa ccagttcttc      240
ctgaagctgt cctctgtgac cgccgctgac accgccgtgt attactgtgc aaggagacag      300
gtcgggctgg ggtttgctta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtcag ctca            354
<210>  19
<211>  297
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеотидов вариабельной области легкой цепи
OMP-313M32/313M33
<400>  19
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc       60
atcacttgca aggcttctca ggatgtgtct actgctgttg cctggtatca gcagaaacca      120
gggaaagccc ctaagctcct gatctactct gcatcctatc ggtacactgg ggtcccatca      180
aggttctccg gatctggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct      240
gaagatattg caacatatta ctgtcagcaa cattattcta ctccttggac attcggc         297
<210>  20
<211>  1404
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеотидов тяжелой цепи (IgG1) OMP-313M32
<400>  20
atggactgga cctggaggat actctttctc gtggctgcag ccacaggagc ccactcccag       60
gtccagctgc aggagtctgg cccaggactg gtgaagcctt ctgagaccct gtccctcacc      120
tgcgctgtct ctggttactc catcacctcc gattatgcct ggaactggat tcggcagccc      180
ccagggaagg ggctggagtg gattgggtac ataagctact ctggtagcac tagctacaac      240
ccatctctcc ggtcacgggt cacaatatca cgggacacat ccaagaacca gttcttcctg      300
aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgacacc gccgtgtatt actgtgcaag gagacaggtc      360
gggctggggt ttgcttactg gggccaagga accctggtca ccgtcagctc agccagcaca      420
aagggcccct ccgtgttccc tctggcccct tcctccaagt ccacctccgg cggcaccgcc      480
gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct      540
ggcgccctga cctctggcgt gcacaccttc ccagccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac      600
tccctgtcct ccgtggtgac cgtgccttcc tcctccctgg gcacccagac ctacatctgc      660
aacgtgaacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gggtggagcc taagtcctgc      720
gacaagaccc acacctgccc tccctgccct gcccctgagc tgctgggcgg accttccgtg      780
ttcctgttcc ctcctaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacccc tgaggtgacc      840
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggat cctgaggtga agttcaattg gtacgtggac      900
ggcgtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccaagggagg agcagtacaa ctccacctac      960
cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag     1020
tgcaaggtct ccaacaaggc cctgcccgct cccatcgaga aaaccatctc caaggccaag     1080
ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgccaccca gccgggagga gatgaccaag     1140
aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggag     1200
tgggagtcta acggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcctgt gctggactcc     1260
gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtcccggtg gcagcagggc     1320
aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc     1380
ctgtctctgt ctcctggcaa gtga                                            1404
<210>  21
<211>  705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеотидов легкой цепи OMP-313M32/313M33
<400>  21
atggtgctcc agacccaggt cttcatttcc ctgctgctct ggatcagcgg agcctacggg       60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc      120
atcacttgca aggcttctca ggatgtgtct actgctgttg cctggtatca gcagaaacca      180
gggaaagccc ctaagctcct gatctactct gcatcctatc ggtacactgg ggtcccatca      240
aggttctccg gatctggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct      300
gaagatattg caacatatta ctgtcagcaa cattattcta ctccttggac attcggccaa      360
gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccctcca      420
tctgatgagc agctcaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat      480
cccagagagg ccaaagtcca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg caactcccag      540
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcaa caccctgaca      600
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctatgcct gcgaagtcac ccatcagggc      660
ctgtcttccc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctaa                      705
<210>  22
<211>  1395
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеотидов тяжелой цепи (IgG4) 313M33
<400>  22
atggactgga cctggaggat actctttctc gtggctgcag ccacaggagc ccactcccag       60
gtccagctgc aggagtctgg cccaggactg gtgaagcctt ctgagaccct gtccctcacc      120
tgcgctgtct ctggttactc catcacctcc gattatgcct ggaactggat tcggcagccc      180
ccagggaagg ggctggagtg gattgggtac ataagctact ctggtagcac tagctacaac      240
ccatctctcc ggtcacgggt cacaatatca cgggacacat ccaagaacca gttcttcctg      300
aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgacacc gccgtgtatt actgtgcaag gagacaggtc      360
gggctggggt ttgcttactg gggccaagga accctggtca ccgtcagctc agccagcaca      420
aagggcccat ccgtcttccc cctggcaccc tgctcccgga gcacctccga gagcacagcc      480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg ttaccgtgtc ttggaactcc      540
ggcgcactga ccagcggcgt gcacaccttc cctgctgtcc tccaatcctc tggactctac      600
tccctctcct ccgtggtgac agtgccctcc agcagcctgg gcactaagac ctacacctgc      660
aacgtcgatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatgga      720
cccccatgcc caccttgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc      780
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac ttgcgtggtg      840
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtatgtgga tggcgtggag      900
gttcataatg ccaagacaaa gcctcgggag gagcagttca acagcaccta ccgggtggtc      960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaagactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc     1020
tccaacaaag ggctcccatc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc     1080
cgggagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaagagg agatgaccaa gaaccaagtg     1140
tccctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc     1200
aatgggcagc ctgagaacaa ctacaagacc actcctcccg tgctggactc cgacggctcc     1260
ttcttcctct actcccggct caccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg caatgtcttc     1320
tcctgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg     1380
tctctgggca aatga                                                      1395
<210>  23
<211>  330
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgG1 человека
<400>  23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  24
<211>  326
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgG2 человека
<400>  24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130                 135                 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195                 200                 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210>  25
<211>  377
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgG3 человека
<400>  25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100                 105                 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115                 120                 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130                 135                 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145                 150                 155                 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165                 170                 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180                 185                 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195                 200                 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210                 215                 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225                 230                 235                 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245                 250                 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260                 265                 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275                 280                 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290                 295                 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305                 310                 315                 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325                 330                 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340                 345                 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355                 360                 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370                 375
<210>  26
<211>  327
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи IgG4 человека
<400>  26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>  27
<211>  16
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TIGIT человека, аминокислоты 55 - 70
<400>  27
Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn
1               5                   10                  15
<210>  28
<211>  18
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> TIGIT человека, аминокислоты 105 - 122
<400>  28
Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly
1               5                   10                  15
Arg Ile
<210>  29
<211>  8
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Метка FLAG
<400>  29
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<---