ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ЭКСПРЕССИОННЫЕ ВЕКТОРЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ КЛАСТЕРОВ ГЕНА ГЛОБИНА

1. Способ рекомбинантного продуцирования представляющего интерес полипептида, где указанный способ включает стадии
(a) получения клетки-хозяина, содержащей экспрессионный кластер, включающий, функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена
γ-глобина или его гомолога; и
A
(iii) кодирующую область, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид;
(b) культивирования клетки-хозяина в условиях, при которых клетка-хозяин экспрессирует представляющий интерес полипептид; и
(c) выделения представляющего интерес полипептида.
2. Способ по п. 1, где кодирующая область экспрессионного кластера также включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид для секреторной экспрессии, и где в стадии (b), представляющий интерес полипептид секретируется клеткой-хозяином.
3. Способ по п. 1 или 2, также включающий, после проведения стадии (c), стадию
(d) приготовления представляющего интерес полипептида в виде фармацевтической композиции.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 SEQ ID NO: 1.
5. Способ по п. 4, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает элемент M1-кор-M2 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 742-995 SEQ ID NO: 1.
6. Способ по п. 5, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает по меньшей мере часть сайта гиперчувствительности 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 741-1109 SEQ ID NO: 1.
7. Способ по любому из пп. 4-6, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера также включает сайт гиперчувствительности 3 (HS3) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 310-735 SEQ ID NO: 1, и/или сайт гиперчувствительности 4 (HS4) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 13-294 SEQ ID NO: 1.
8. Способ по любому из пп. 1-3, где регуляторная область локуса экспрессионного кластера включает сайт гиперчувствительности 40 (HS40) или его часть в кластере человеческого гена α-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 24-278 SEQ ID NO: 5.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где промоторная область экспрессионного кластера содержит сайт инициации транскрипции и, необязательно, по меньшей мере часть 5'-нетранслируемой области человеческого гена
γ-глобина.
A
10. Способ по любому из пп. 1-9, где промоторная область экспрессионного кластера содержит нуклеотиды (-384)-(+36) сайта инициации транскрипции, человеческого гена
γ-глобина и/или последовательности нуклеиновой кислоты в положениях 1123-1542 SEQ ID NO: 1.
A
11. Способ по любому из пп. 1-10, где экспрессионный кластер также включает область терминации транскрипции.
12. Способ по п. 11, где область терминации транскрипции включает сигнал полиаденилирования, предпочтительно, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1725-1730 SEQ ID NO: 1 и сайт терминации транскрипции.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где экспрессионный кластер также включает энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена
γ-глобина, функционально присоединенную к другим элементам экспрессионного кластера.
A
14. Способ по п. 13, где энхансерная область экспрессионного кластера содержит последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 2136-2881 SEQ ID NO: 1.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где представляющим интерес полипептидом является гликопротеин или его часть.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из антител или их производных или частей, включающих тяжелую цепь или легкую цепь антитела; гонадотропинов, таких как FSH (фолликуло-стимулирующий гормон), CG (хорионический гонадотропин), LH (лютеинизирующий гормон) и TSH (тиреотропный гормон); эритропоэтина; и факторов свертывания крови, таких как фактор VII, VIII, IX или фактор фон Виллебранда.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где экспрессионный кластер стабильно трансфецирован в клетку-хозяина.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где клетка-хозяин была трансфецирована вектором, содержащим экспрессионный кластер и селективный маркерный ген, а предпочтительно, амплифицируемый селективный маркерный ген, и где условия культивирования в стадии (b) включают присутствие соответствующего селективного агента в клеточной культуральной среде.
19. Способ по п. 18, где селективный маркерный ген кодирует дигидрофолат-редуктазу (DHFR), предпочтительно, антифолат-резистентный вариант DHFR, а соответствующим селективным агентом является антифолат, предпочтительно, метотрексат.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где клеткой-хозяином является эукариотическая клетка, предпочтительно, клетка млекопитающего, а более предпочтительно, человеческая клетка или происходящая от нее клетка.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где клеткой-хозяином является клетка крови, предпочтительно, лейкоцит, предшественник клетки крови или клетка лейкоза или происходящая от них клетка.
22. Экспрессионный кластер, содержащий функционально присоединенные друг к другу:
(i) регуляторную область локуса, содержащую по меньшей мере функциональную часть регуляторной области локуса кластера человеческого гена β-глобина или кластера человеческого гена α-глобина;
(ii) промоторную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть промотора человеческого гена
γ-глобина;
A
(iii) необязательно, кодирующую область;
(iv) область терминации транскрипции; и
(v) энхансерную область, содержащую по меньшей мере функциональную часть 3'-энхансера человеческого гена
γ-глобина;
A
где экспрессионный кластер не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерный человеческий
γ-глобин.
A
23. Экспрессионный кластер по п. 22, где регуляторная область локуса включает коровый элемент сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 906-939 SEQ ID NO: 1.
24. Экспрессионный кластер по п. 23, где регуляторная область локуса включает элемент M1-кор-M2 сайта гиперчувствительности к ДНКазе I 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 742-995 SEQ ID NO: 1.
25. Экспрессионный кластер по п. 24, где регуляторная область локуса включает по меньшей мере часть сайта гиперчувствительности 2 (HS2) кластера человеческого гена β-глобина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 741-1109 SEQ ID NO: 1.
26. Экспрессионный кластер по любому из пп. 23-25, где регуляторная область локуса также включает сайт гиперчувствительности 3 (HS3) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 310-735 SEQ ID NO: 1, и/или сайт гиперчувствительности 4 (HS4) или его часть в кластере человеческого гена β-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 13-294 SEQ ID NO: 1.
27. Экспрессионный кластер по п. 22, где регуляторная область локуса включает сайт гиперчувствительности 40 (HS40) или его часть в кластере человеческого гена α-глобина, предпочтительно, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 24-278 SEQ ID NO: 5.
28. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-27, где промоторная область содержит сайт инициации транскрипции и, необязательно, по меньшей мере часть 5'-нетранслируемой области человеческого гена
γ-глобина.
A
29. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-28, где промоторная область содержит нуклеотиды (-384)-(+36) сайта инициации транскрипции, человеческого гена
γ-глобина и/или последовательности нуклеиновой кислоты в положениях 1123-1542 SEQ ID NO: 1.
A
30. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-29, где область терминации транскрипции включает сигнал полиаденилирования, предпочтительно, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 1725-1730 SEQ ID NO: 1 и сайт терминации транскрипции.
31. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-30, где энхансерная область включает последовательность нуклеиновой кислоты в положениях 2136-2881 SEQ ID NO: 1.
32. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-31, также включающий сайт клонирования, который содержит по меньшей мере одну последовательность распознавания рестриктирующего фермента.
33. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-32, где кодирующая область включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес полипептид.
34. Экспрессионный кластер по п. 33, где представляющим интерес полипептидом является гликопротеин или его часть.
35. Экспрессионный кластер по любому из пп. 33-34, где представляющим интерес полипептидом является антитело, тяжелая цепь или легкая цепь антитела или его часть.
36. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-35, где кодирующая область включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид для секреторной экспрессии.
37. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-36, содержащий в направлении транскрипции функционально присоединенные друг к другу
(i) регуляторную область локуса,
(ii) промоторную область,
(iii) кодирующую область и/или сайт клонирования,
(iv) область терминации транскрипции,
(v) энхансерную область.
38. Экспрессионный кластер по любому из пп. 22-37, который адаптирован для экспрессии в эукариотических клетках, предпочтительно, в клетках млекопитающх, а более предпочтительно, в человеческих клетках.
39. Вектор, содержащий экспрессионный кластер по любому из пп. 22-38.
40. Вектор по п. 39, также содержащий один или более селективных маркерных генов.
41. Вектор по п. 39 или 40, адаптированный для стабильной трансфекции эукариотической клетки.
42. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный кластер по любому из п.п. 22-38 или вектор по любому из пп. 39-41.
43. Клетка-хозяин по п. 42, представляющая собой эукариотическую клетку, предпочтительно, клетку млекопитающего, а более предпочтительно, человеческую клетку или происходящую от них клетку.
44. Клетка-хозяин по п. 42 или 43, представляющая собой клетку крови, предпочтительно, лейкоцит, предшественник клетки крови или клетку лейкоза или происходящую от них клетку.
45. Применение экспрессионного кластера по любому из пп. 22-38 или клетки-хозяина по любому из пп. 42-44 в способе по любому из пп. 1-21.
46. Способ по любому из пп. 1-21, где экспрессионным кластером является экспрессионный кластер по любому из пп. 22-38 и/или клеткой-хозяином является клетка-хозяин по любому из пп. 42-44.