Определение последовательности аминокислот в высвобождаемых фрагментах гидролизата молочного белка

УДК 637.12.04 / 07:66.094.941 Л.А. Остроумов, А.И. Линник,

О.В. Кригер, Л.К. Асякина

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ВЫСВОБОЖДАЕМЫХ ФРАГМЕНТАХ

ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОГО БЕЛКА*

Проведен детальный анализ пептидных профилей гидролизата молочных белков, полученных с использованием различных протеолитических ферментов, и определена аминокислотная последовательность полученных фрагментов, выявлены в составе казеиновых гидролизатов пептиды, обладающие биологической активностью.

Ключевые слова: гидролизат казеина, биологическая активность, ангиотензин-конвертирующий фермент, последовательность, термолизин, гидролиз, фермент, биологически активный пептид, функциональный продукт питания.

L.A. Ostroumov, A.I. Linnik,

O.V. Kriger, L.K. Asyakina

AMINO AdD SEQUENCE DETERMINATION IN THE MILK PROTEIN HYDROLYSATE

RELEASING FRAGMENTS

The detailed analysis of the milk protein hydrolysate peptide profiles that are received with the use of different proteolytic enzymes is conducted; the amino acid sequence of the received fragments is determined; the peptides, which have biological activity, are found in the casein hydrolysate composition.

Key words: casein hydrolysate, biological activity, angiotensin converting enzyme, sequence, thermoly-

sin, hydrolysis, enzyme, biologically active peptide, functional food.

Одним из перспективных направлений в области биотехнологии является использование белковых гидролизатов в качестве основного компонента продуктов специального назначения. Это продукты, предназначенные для систематического употребления в составе пищевых рационов, сохраняющие и укрепляющие здоровье за счет наличия в их составе веществ, обладающих способностью оказывать благоприятный эффект на физиологические функции и процессы обмена веществ в организме [1, 2].

Гидролиз пищевых белков и включение полученных гидролизатов в состав продуктов питания улучшают пищевую ценность последних, задерживают их порчу, придают им желательные функциональные характеристики (содержание аллергенов, токсинов и ингибиторов) [3, 4]. Особым при создании продуктов специализированного назначения является вопрос определения последовательности аминокислот в высвобождаемых фрагментах гидролизата молочного белка, который определяет особые свойства полученного продукта.

Целью данной работы является определение последовательности аминокислот в высвобождаемых фрагментах гидролизата молочного белка при оптимальных параметрах биотехнологической обработки.

Для достижения поставленной цели проведен детальный анализ пептидных профилей гидролизата молочных белков, полученных с использованием различных протеолитических ферментов, определена аминокислотная последовательность полученных фрагментов методом MALDI-TOF с помощью хромато-масс-спектрометра REFLEX IV. Анализ спектров молекулярных весов изученных образцов свидетельствует об

* Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по направлению 1.2.1, гос. контракт №16.740.11.0058.

очень многокомпонентном составе. Подавляющее большинство пептидов имеет молекулярную массу менее 1000 Да. Результаты полученных исследований представлены на рисунках 1-3 и в таблицах 1-3.

Время, мин

Рис. 1. Масс-спектры продуктов гидролиза молочного белка трипсином

Таблица 1

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза молочного белка трипсином

Номер Молекулярная масса, Да Порядок расположения в полипептидной цепи Аминокислотная последовательность

1 3803 1-25 RELEELNVPGEIVESLSSSEESITR

2 615 26-28 INK

3 98 29 К

4 390 30-32 IEK

5 1463 33-48 FQSEEQQTEDELQDK

6 4451 49-97 IHP- FAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPL TPVVVPPFLQPEVMGVSK

7 180 98-99 VK

8 664 100-105 EAMAPK

9 233 106-107 HK

10 690 108-113 EMPFPK

11 2107 184-202 DMPILYQEPVLGPVR

12 589 170-176 VLPVPQK

13 687 177-183 AVPYPQR

14 5172 114-169 YPVEPFTESQSLTLTDVENLHLP LPLLQSWMHQPHQPLPPWVMFP PQSVLSLSQSK

15 585 203-209 GPFPIIV

Примечание. А - аланин; N - аспарагин; D - аспарагиновая кислота; Q - глутамин; Е - глутаминовая кислота; G - глицин; Н - гистидин; I - изолейцин; L - лейцин; K - лизин; P - пролин; S - серин; T - треонин; W - трипотофан; Y - тирозин; V - валин.

На рисунке 2 представлена хроматограмма химотрипсинового гидролизата казеина с расшифровкой пептидных фракций и пиков.

Время, мин

Рис. 2.. Масс-спектры продуктов гидролиза молочного белка химотрипсином

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза молочного белка химотрипсином, представлена в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза молочного белка химотрипсином

Номер Молекулярная масса, Да Порядок расположения в полипептидной цепи Аминокислотная последовательность

1 3803 1-25 RELEELNVPGEIVESLSSSE ESITR

2 1802 26-32

3 2329 33-51 QSEEQQQTEDELQDKIHPF

4 3754 52-86 AQTQSLVYPFPGPIPNSLPQ NIPPLTQTPWVPPF

5 3668 87-118 LQPEVMGVSKVKEAMAPKHK EMPFPKYPVEPF

6 2734 119-142 TESQSLTLTDVENLHLPLPL LQSW

7 5286 143-189 MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL SLSQSKVLPVPQKAVPYPQR DMPIQAF

8 1717 190-209 QEPVLGPVRGPFPIIV

Примечание см. табл. 1.

На рисунке 3 представлена хроматограмма термолизинового гидролизата казеина с расшифровкой пептидных фракций и пиков.

Время, мин

Рис. 3. Масс-спектры продуктов гидролиза молочного белка термолизином

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза молочного белка термолизина, представлена в таблице 3.

Анализ данных, представленных на рисунках 1-3 и в таблицах 1-3, свидетельствует о том, что все исследованные фракции гидролизата содержат в своем составе какие-либо пептиды разной молекулярной массы.

Таблица 3

Характеристика пептидов, образовавшихся в результате гидролиза молочного белка термолизином

Номер Молекулярная масса, Да Порядок расположения в полипептидной цепи Аминокислотная последовательность

1 1197 55-64 LSKDIGSEST

2 763 100-104 KEDVPS

3 915 205-210 ENSEKTT

4 972 81-88 SSSEEIVP

5 914 22-28 KHQGLPQ

6 773 185-190 GTQYTD

7 705 118-122

8 683 177-183 AVPYPQR

9 616 195-199 SDIPN

10 642 125-129 EIVPN

11 385 173-176 AYP

12 585 145-148 QQKE

13 443 161-163 YPE

14 439 92-94 EQK

15 416 17-19 PKH

16 368 48-50 GKE

Примечание см. табл. 1.

Идентификацию полученных последовательностей пептидов проводили посредством поиска в базах данных NCBI (www.ncbi.nlm.gov) и SwissProt (www.expasy.ch). Результаты сравнительных исследований представлены в таблице 4.

В результате идентифицирования в исследуемых гидролизатах пептидов было выявлено, что в каждом из исследуемых образцов при ферментации трипсином или химотрипсином, или термолизином образуется хотя бы один пептид, обладающий биологической активностью.

Исследования показали, что в казеиновых гидролизатах присутствуют более 10 олигопептидов.

Основным результатом данной части исследования явилось нахождение в составе казеиновых гидролизатах пептидов, обладающих биологической активностью.

Таблица4

Пептиды, идентифицированные в исследуемых гидролизатах

Фраг- мент Используемый фермент Последовательность аминокислот в пептидах Название Функция

1-25 Трипсин, химотр-ипсин Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro- Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu- Ser(P)Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Se^Ne- Thr-Arg Фосфо- пептид Стимулирование усвоения минеральных веществ

177-183 Термолизин Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg р-Казоки- нин Ингибитор ангио-тензинконверти-рующего фермента

В трипсиновом и химотрипсиновом гидролизате казеина идентифицирован фосфопептид с последовательностью аминокислот Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)Ser(P)-

Ser(P)-Glu-Glu-Ser-lle-Thr-Arg, который обладает функцией усвоения и стимулирования минеральных веществ в организме человека [5]. К основной функции фосфопептидов относят связывание минеральных элементов и поддержание их в растворенном состоянии для облегчения всасывания кальция и фосфора в кишечнике человека.

Из термолизинового гидролизата казеина выделен пептид р-казокинин (аминокислотная последовательность Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg), который является ингибитором ангиотензин-конвертирующего фермента. Механизм действия основан на ингибировании ангиотензин-конвертирующего фермента (АКФ) - неспецифической дипептидилкарбоксипептидазы, играющей ключевую роль в регуляции давления в системе кровообращения путем модуляции ренин-ангиотензиновой системы (РАС). Поэтому подавление активности АКФ имеет антигипертензивный эффект, что в дальнейшем важно учитывать при разработке технологии функциональных продуктов питания.

Полученные исследования могут быть использованы при разработке технологии получения функциональных продуктов питания на основе биологически активных ферментативных гидролизатов.

Литература

1. Бакулина О.Н., Бзюк О.В. Функциональные ингридиенты для воплощения концепции здорового питания // Пищевые ингридиенты. Сырье и добавки. - 2005. - №2. - С. 30-31.

2. Алексеева, Н.Ю., Павлова Ю.В., Шишкин Н.И. Современные достижения в области химии белков молока // Обзорная информ. Сер. Молочная пром-сть. - М.: АгроНИИТЭИММП, 1988. - 32 с.

3. Арбатская Н.И., Анохина Л.Н. Молочно-белковые концентраты - казециты для детского и диетического питания. - М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1985. - 27 с.

4. Грачева, И.М., Иванова Л.А., Кантере В.М. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и биоэнергия. - М.: Колос, 1992. - 382 с.

5. Phosphopepeptides interacting with colloidal calcium phosphate isolated by trypic hydrolysis of bovine casein micelles / V. Gagnaire [et al.] // J. Dairy Res. - 1996. - № 63. - Р. 405-422.

♦

УДК 637.35 О.Б. Соснина, П.Е. Влощинский

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИФФУЗИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ПЛЕНОК ДЛЯ УПАКОВКИ САЛАТОВ ИЗ КАПУСТЫ

В статье приведены результаты исследований диффузионных характеристик пленок, применяемых для упаковки салатов из капусты в газовой среде.

Установлена проницаемость пленок двух типов по отношению к кислороду, азоту и углекислому газу в зависимости от давления, температуры и толщины самих пленок.

Ключевые слова: салат, пленка упаковочная, газовая среда, диффузия, давление, температура.

O.B. Sosnina, P.E. Vloshchinsky DIFFUSION CHARACTERISTIC RESEARCH OF THE FILMS FOR CABBAGE SALAD PACKING

The research results of the film diffusion characteristics, which are used for cabbage salad packing in the gas environment, are given in the article. Permeability of the films of two types in relation to oxygen, nitrogen and carbon dioxide depending on pressure, temperature and the film thickness is determined.

Key words: salad, film wrapper, gas environment, diffusion, pressure, temperature.

Среди овощных культур капуста занимает одно из ведущих мест по посевным площадям, урожайности и употреблению в пищу, что обусловлено ее способностью сохраняться в свежем виде в течение длительного промежутка времени, пригодностью для переработки в охлажденном и замороженном виде, квашения и консервирования [2, 5].