СРЕДА ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СЕМЕНИ БЫКА И СПОСОБ ЕЁ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
MEDIUM OF CRYOPRESERVATION OF BULL SEMEN AND METHOD OF ITS PREPARATION

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к искусственному осеменению крупного рогатого скота.
Известны среда для замораживания семени быка, включающая в себя лактозу, глицерин, пенициллин, стрептомицин, полимиксин, ЭДТА-кальций, ЭДТА-цинк, ЭДТА-меди, воду и желток куриных яиц (патент RU 2355358, A61D 19/02, опубл. 20.05.2009);
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая фруктозу, цитрат натрия, TRIS, липопротеины низкой плотности из свежего желтка, глицерин, пенициллин и дистиллированную воду (патент CN 101220345, C12N 5/6, опубл. 16.07.2008);
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, глицерин, антиоксиданты - сорбит или тиосульфат натрия и желток (патент UA 10894, A61D 19/02, опубл. 29.12.1999);
среда для разбавления и замораживания семени быков, содержащая лактозу, желток куриных яиц, глицерин, цитрат натрия, дистиллированную воду и тканевый экстракт, полученный из половых органов коров (патент UA 31304, A61D 19/02, 10.04.2008).
Известен способ подготовки семени животных производителей к ее использованию, включающий смешивание лактозы, лимонной кислоты, трис-(оксиметил)-аминометана, глицерина, бромида-N, воды и желтка куриных яиц, смешивание со спермой и замораживание полученной смеси (патент RU №2393816, A61D 19/02, опубл. 10.07.2010).
Известен способ обработки семени быка, когда в лактозо-глицерино-желточную среду вводят сукцинат хитозана и полученной синтетической средой разбавляют цельную сперму быка (патент RU №2223718, A61D 19/02, опубл. 20.02.2004).
Однако все вышеописанные среды содержат вещество животного происхождения (желток куриного яйца), который при высокой криозащитной эффективности обладает рядом существенных недостатков: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении, способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки, опасность патогенной передачи вирусов.
Известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды и фосфотидилхолина из фосфолипидов сои (патент WO 2003/022046 A1, A01N 1/02, опубл. 20.03.2003);
известен способ криоконсервации животных клеток и тканей, включающий смешивание клеток и тканей фруктозы, лимонной кислоты, трис-(гидроксиметил)-аминоэтана, глицерина, очищенной воды, гиалуроновой кислоты и фосфолипидов сои с животными клетками, в том числе семенем быка сои (патент US 2003/0077566 A1, A01N 1/02, опубл. 24.04.2003).
Однако все известные способы не обеспечивают длительного хранения среды для криоконсервации, т.к. разработанные способы не включают стерилизацию среды для криоконсервации, также среда для криоконсервации содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду для криоконсервации совершенно непрозрачной, что крайне затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени.
Известны способы приготовления среды для разбавления семени производителей: способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде с последующей стерилизацией раствора разбавителя, при этом стерилизацию раствора разбавителя осуществляют в герметично закрытых емкостях электромагнитным полем определенной частоты, удельной энергоемкости при температуре нагрева 70-75°C (патент RU 1769422, 6 A61D 19/02, опубл. 27.06.1995);
способ, включающий смешивание углеводных, криогенно-протекторных и липидно-белковых компонентов в водной среде, при этом смесь компонентов герметизируют в емкостях, которые помещают в водную среду с температурой 18-20°C и воздействуют на смесь электромагнитным полем СВЧ-диапазона, затем данные емкости выдерживают в течение 16-20 часов, а потом осуществляют их нагрев до 58-60°C в течение 20-25 мин (патент RU 2073499, A61D 19/02, опубл. 20.02.1997).
Основными недостатками этих решений являются необходимость наличия сложной дорогостоящей техники, и, следовательно, высокая стоимость затрат на их выполнение, а также непостоянство состава среды и недостаточная для полного уничтожения патогенных микроорганизмов, вызывающих хламидийную и микоплазменную инфекции, степень стерилизации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является синтетическая среда для замораживания семени быка, которая включает в себя трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,65-2,85%, фруктоза - 0,70-0,80%, лимонная кислота - 1,3-1,5%, глицерин - 5-7%, сухой соевый лецитин Центролекс Ф - 8-12%, вода дистиллированная - остальное (патент RU 2323701, A61D 19/02, опубл. 10.05.2008).
Данная среда, взятая в качестве прототипа, готовится следующим способом. В чистую химическую колбу вносят по рецепту трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту и заливают прокипяченной дистиллированной водой с температурой 80-90°C. Тщательно растворяют все компоненты. Затем раствор охлаждают до 40°C и вносят туда глицерин и сухой соевый лецитин. Соевый лецитин в предложенном варианте криозащитной среды гидратируется спонтанно и образует крупные липосомы со средним диаметром более 1000 нм.
Среда обладает высокой криозащитной эффективностью, не содержит компонентов животного происхождения, что обеспечивает ее санитарно-эпидемиологическую безопасность, но обладает двумя существенными недостатками. Данная среда не предназначена для длительного хранения и предполагает использование в течение 6 ч после приготовления; среда содержит лецитин в виде грубой суспензии, что делает среду совершенно непрозрачной. Это свойство среды затрудняет визуальный анализ качества замороженно-оттаяного семени и делает невозможным использование более прогрессивного инструментального анализа качества семени, требующего оптически прозрачной среды.
Целью изобретения является повышение биологической безопасности синтетической среды для криоконсервации семени быка и повышение ее технологических свойств (прозрачность, увеличение срока хранения).
Технический результат изобретения достигается тем, что предложена среда для криоконсервации семени быка, включающая трис-(гидроксиметил)-аминометан, фруктозу, лимонную кислоту, сахарозу, глицерин, сухой соевый лецитин (фосфолипиды сои), в качестве источника которого могут выступать коммерческий растительный лецитин разных марок (Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит высокомолекулярное нетоксическое поверхностно-активное вещество, в качестве которого используют метилцеллюлозу, или плуроник (F68, или F127, или F168), или каррагинан, или альгинат натрия, или гиалуроновую кислоту, или бычий сывороточный альбумин при следующих соотношениях компонентов, мас.%:
трис-(гидроксиметил)-аминометан
1,9
фруктоза
0,9
лимонная кислота
0,7
сахароза
2
глицерин
4,5-6,5
фосфолипиды сои
0,04-2,00
поверхностно-активное вещество
0,01-1
вода бидистиллированная
остальное
Предложен способ приготовления среды для криоконсервации семени быка, включающий приготовление безлипидной основы среды для криоконсервации семени быка путем разведения в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C трис-(гидроксиметил)-аминометана, лимонной кислоты, фруктозы, добавления глицерина и охлаждения до комнатной температуры, доведения pH раствора до 6,8, отличающийся тем, что отдельно готовят липосомальный концентрат посредством добавления в 10%-ный раствор сахарозы 0,2-20,0 мас.% фосфолипидов сои, поверхностно-активное вещество, выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа, затем обрабатывают суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут и смешивают безлипидную основу среды для криоконсервации семени быка и липосомальный концентрат в соотношении 4:1, стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа или стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 мкм.
Общеизвестно, что для замораживания семени быка в основном используют среды, содержащие яичный желток. Яичный желток снижает чувствительность сперматозоидов к холодовому шоку и замораживаию. Носитель криозащитных свойств яичного желтка - легкая липопротеиновая фракция желтка. Основная часть легких липопротеинов ЯЖ организованна в небольшие конгломераты со средней молекулярной массой около 5×106 (Cook, Martin, 1969). Легкая липопротеиновая фракция желтка состоит из фосфолипидов (яичного лецитина) и белковой компоненты. Полагают, что криопротекторными свойствами обладает яичный лецитин. У очищенных белков легкой липопротеиновой фракции не обнаружено криопротекторных свойств. Тем не менее очищенные яичные фосфолипиды обладают более слабыми криозащитными свойствами по сравнению с полной фракцией легких липопротеинов. Яичный желток обладает высокой эффективностью в защите сперматозоидов от холодового шока как при охлаждении, так и при замораживании. Достаточно сказать, что удаление яичного желтка из стандартной среды для замораживания семени быка приводит к падению выживаемости сперматозоидов в цикле замораживания-оттаивания примерно в 6 раз, в то время как удаление из той же среды традиционного криопротектора - глицерина - только в 2 раза. Но, при высокой криозащитной эффективности желток обладает целым рядом нежелательных свойств: непостоянство состава, сложность стерилизации, быстрая потеря криозащитных свойств при хранении (несколько часов), способность вызывать иммунную сенсибилизацию при введении в половые пути самки. Кроме того, в последнее время в связи с массовым импортом племенных быков в Россию участились случаи абортов, вызванных хламидийной и микоплазменной инфекциями. В настоящее время нет четкой методики выявления возбудителей данных инфекций, а применяемая реакция цепной полимеризации не всегда дает возможности видового определения возбудителя. Таким образом, желток куриного яйца при наличии в нем антител к микоплазме часто является причиной выбраковки доброкачественной криоконсервированной семени быков-производителей.
Наиболее перспективным заменителем желтка является фосфолипиды растительного происхождения (соевый лецитин). Известно, что криозащитная эффективность фосфолипидов существенно зависит от формы организации фосфолипидных частиц в криопротектирующем растворе. Мы предлагаем вводить растительные фосфолипиды в виде липосом малого размера (30-350 нм). Лецитин в виде липосом малого размера образует более стабильную суспензию, не склонен к образованию осадка, легче взаимодействует с мембраной сперматозоида. Кроме того, фосфолипиды в виде липосом малого размера позволяет получить оптически прозрачную суспензию, что важно для визуальной и инструментальной оценки качества семени, разбавленного криосредой. Помимо фосфолипидов в среду вводится высокомолекулярное повехностно-активное веществово. Таким веществом может быть сухой очищенный альбумин либо высокомолекулярные поверхностно-активные вещества небелковой природы, а именно метилцеллюлоза, альгинат натрия, гиалуроновая кислота, каррагинан, плуроник и некоторые другие. Перечисленные вещества не только стабилизируют липосомы, но и меняют взаимодействие липосом с клеточной мембраной сперматозоида, повышая криозащитный эффект липосом.
Приготовление среды для криоконсервации семени быка заключалось в следующем.
Готовят безлипидную основу криозащитной среды для семени быка. Для этого в горячей бидистилированной воде с температурой 80-90°C разводят трис-(гидроксиметил)-аминометан, лимонной кислоту, фруктозу, глицерина. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят pH раствора до 6,8.
Дополнительно готовят липосомальный концентрат следующего состава: сахароза 9-10 г, фосфолипиды сои (коммерческий соевый лецитин марок Липоид C75, Липоид C100, Липоид C40, Азолектин, Леци-Про-90, Лецигран) 0,2-10 г. Для получения суспензии фосфолипидов навеску сухого лецитина в растворе сахарозы и выдерживают при комнатной температуре, периодически помешивая 4-24 часа. После гидратации лецитина в течение указанного времени получают первичную грубодисперсную суспензию фосфолипидов, содержащую мультиламмелярные липосомы со средним диаметром 1000-2000 нм (размер зависит от длительности гидратации, интенсивности помешивания и температуры раствора). Первичную грубодисперсную суспензию обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе в течение 5-30 минут. В результате обработки ультразвуком крупные липосомы в суспензии дробятся и переходят в форму преимущественно моноламмелярных липосом со средним диаметром 30-350 нм. Затем к суспензии липосом добавляют стабилизатор, в качестве которого может выступать: метилцеллюлоза в концентрации 0,05-0,25%, или плуроник (F68, или F127, или F168) в концентрации 0.05-0.25%, или каррагинан в концентрации 0,05-0,25%, или альгинат натрия в концентрации 0,05-0,5%), или гиалуроновая кислота в концентрации 0,1-0,5%), или бычий сывороточный альбумин в концентрации 1-5%).
Приготовленную безлипидную основу (первого либо второго вариантов) смешивают с липосомальным концентратом в соотношении 4:1.
Полученную криозащитную среду для семени быка можно использовать без дополнительной обработки либо подвергнуть стерилизации.
Метод стерилизации зависит от разновидности добавляемого стабилизатора и от среднего размера частиц, который находится в зависимости от конкретной марки коммерческих лецитинов и от режима ультразвуковой обработки.
Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией или автоклавированием. Криозащитную среду стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,22 нм. Метод пригоден для суспензии липосом со средним размером частиц примерно до 150-170 нм. При более высоком среднем размере частиц в суспензии фильтры быстро забиваются и дальнейшая фильтрация становится невозможной.
Криозащитную среду стерилизуют автоклавированием при температуре 115°C и давлении 1,4 атмосферы в течение 1 часа. Более высокотемпературное автоклавирование недопустимо, т.к. будет вызывать карамелизацию сахаров. Автоклавирование недопустимо, если в качестве стабилизатора липосом используют бычий сывороточный альбумин.
Готовую среду хранят при температуре +4°C в темном месте, т.к. свет и высокие температуры могут вызвать перекисное окисление в липосомах. Без стерилизации среда сохраняет стабильность и криозащитные свойства не менее 5 дней. Стерилизация может увеличивать срок хранения готовой криозащитной среды для семени быка до 2-3 месяцев.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Определение размера частиц в суспензии соевых фосфолипидов марки Lecy-Pro-90 в растворе сахарозы.
2
В эксперименте использовали пищевой лецитин марки Lecy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» Lecy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Известно, что «сухие» соевые лецитины, которые содержат не менее 95% полярных липидов, способны при помещении в водную среду спонтанно образовывать суспензию, состоящую из мультиламеллярных липосом. Для получения суспензии навеску сухого лецитина Lecy-Pro-90 из расчета 6% помещали в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, при постоянном помешивании 4 часа. Затем часть суспензии помещали в холодильник (+4°C) на 20-24 часа. В течение этого времени происходит практически полная гидратация лецитина и образуется суспензия, содержащая мультламеллярные липосомы. Данную суспензию далее называем суспензий, полученной спонтанной гидратацией. Вторую часть подвергали обработке ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т. Суспензию обрабатывали ультразвуком 22 Гц, 60 Вт/см в течение 5 минут при помощи погружного зонда с диаметром торца 2 мм. Для предотвращения окисления лецитина во время ультразвуковой обработки суспензию охлаждали до +10°C на ледяной бане. Затем полученную суспензию хранили в холодильнике (+4°C) до измерений. Данный раствор далее назван суспензией, полученной ультразвуковым дроблением.
Измерение размеров частиц проводили через сутки после приготовления.
Размеры липосом или липидных мицелл в полученной суспензии определяли методом измерения динамического светорассеяния на анализаторе размеров субмикронных частиц «N5 Submicron Particle Size Analyser «BeckmanCoulter». Размеры липидных частиц в суспензии определяли через 1 сутки после приготовления. Также визуально оценивали внешний вид суспензии.
Результаты измерений представлены в таблице 1.
Таблица 1
Характеристика суспензий лецтина LeCy-Pro-90, полученных спонтанной гидратацией лецитина и ультразвуковым дроблением суспензионных частиц.
Способ приготовления суспензии
Средний размер частиц, нм.
Визуальная характеристика суспензии
Суспензия, полученная спонтанной гидратацией
1788,3±55,4
Непрозрачная смесь молочной консистенции, желтоватого цвета, слабый ореховый запах
Суспензия, полученная ультразвуковым дроблением
74,6±12,9
Полупрозрачная опалесцирующая жидкость, слабый ореховый запах. В тонком слое (около 0,5 см) на просвет можно различить напечатанный текст.
Помимо исследования характеристик суспензии были сделаны визуальные исследования сперматозоидов в 5% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной спонтанной гидратацией и в 1% суспензии лецитина LeCy-Pro-90, полученной ультразвуковым дроблением. Как видно на фиг.1, суспензия, обработанная ультразвуком, не препятствует визуальному исследованию сперматозоидов (фиг. 1б), в то время как в суспензии, полученной спонтанной гидратацией, сперматозоиды трудно различимы (фиг.1а).
Пример 2. Определение оптимальной концентрации лецитина LeCy-Pro-90 в суспензии, обработанной ультразвуком для обеспечения криозащитного воздействия на сперматозоиды быка при криоконсервации.
2
2
2
В эксперименте использовали пищевые лецитины марок LeCy-Pro-90, приобретенные в компании «Протеин плюс». Суспензии лецитина готовили на основе 10% раствора сахарозы. Первичную (грубодисперсную) суспензию «сухого лецитина» LeCy-Pro-90 получали спонтанной гидратацией сухого лецитина. Для получения суспензии навеску сухого лецитина в раствор сахарозы и выдерживали при комнатной температуре, периодически помешивая 4 часа. Затем обрабатывали суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см в течение 5 минут). Семя быков голштинской породы разбавляли 1/4 или более (в зависимости от концентрации спермиев в эякуляте) лактозо-глицериновой средой (10% лактозы, 0,2% HEPES, 5% глицерина с добавлением либо 20% яичного желтка (контроль), либо 20% липосомального концентрата с разной концентрацией липосом так, чтобы конечная концентрация липидов в среде составляла от 0,03 до 3%. Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl, 0,5 мМ MgCl, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.
Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.
Результаты исследований, представленые на фиг.2, свидетельствуют, что оптимальные концентрации соевого лецитина в виде суспензии липосом со средним диаметром 80-100 нм лежат в довольно широких пределах, от 0,1 до 1% лецитина в криозащитной среде. Подвижность сперматозоидов через 10 минут после оттаивания в экспериментальных группах с указанными концентрациями не имела достоверных отличий от контрольной группы с добавлением яичного желтка.
Пример 3. Сравнение криозащитной эффективности трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с яичным желтком и трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды с добавлением растительных фосфолипидов в виде липосом малого размера.
2
В данном примере проводили сравнение криозащитного воздействия на спермин быка яичного желтка и липосомального концентрата, изготовленного из фосфолипидов сои на фоне трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среды. В качестве контроля выступало семя быка, криоконсервированное в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с добавлением 20% яичного желтка. В эксперименте к трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде вместо желтка добавляли 20% липосомального концентрата следующего состава: сахароза 10 г, фосфолипиды сои (азолектин) 1,8 г, альгинат натрия 0,5 г, бидистиллированной воды 88 мл. Липосомы дробили ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см в течение 5 минут).
2
2
Замораживание осуществляли в открытых гранулах на пластинах твердой двуокиси углерода (сухом льду) по стандартной методике (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008,160 с). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl, 0,5 мМ MgCl, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Hepes, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.
Криозащитную эффективность соевых фосфолипидов определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Сравнение показателей замороженно-оттаянного семени быка, криоконсервированного в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде и в безжелточной трис-цитрат-глицериновой среде с фосфолипидами сои в форме липосом со средним диаметром 80-100 нм.
Криопротектирующая среда
Подвижных спермиев сразу после оттаивания, %.
Средняя скорость движения спермиев сразу после оттаивания
Подвижных спермиев через 5 часов культивирования при 38°C, %.
Визуально
Спермо-анализатор
Трис-цитрат-фруктозо-глицерожелточная среда
39,0±2,0
39,5±2,8
73,1±3,5
21,1±5,5
Трис-цитрат-фруктозо-глициновая среда с фосфолипидами сои
38,5±1,1
36,5±1,2
69,0±2,2
19,5±2,3
Как можно видеть из таблицы двигательные характеристики семени, криоконсервированного в трис-цитрат-фруктозо-глицериновой среде с яичным желтком (контроль) и с липосомальным концентратом, содержащим сахарозу, растительные фосфолипиды в виде липосом со средним диаметром 80-100 нм и альгинат натрия, не имеют достоверных различий. Так подвижность после размораживания в контроле и экспериментальной группе составила соответственно 39,5±2,8% и 36,5±1,2% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после оттаивания 21,1±5,5% в контроле и 19,5±2,3 в экспериментальной группе. Данные свидетельствуют об эффективности предлагаемой криозащитной среды.
Пример 4. Исследование влияния хранения криозащитной среды перед использованием на ее криозащитную эффективность.
2
2
2
В эксперименте использовали семя быков Голштинской и черно-пестрой пород. Липосомальный концентрат готовили на основе 10% раствора сахарозы, в качестве источника растительных фосфолипидов использовали экстракт соевых бобов «Азолектин»(«Сигма»). Суспензию лецитина обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (22 Гц, 60 Вт/см в течение 5 минут). После озвучивания в липосомальный концентрат в качестве стабилизатора добавляли 0,1% плуроника Р68. Использовали безлипосомальную основу следующего состава (в весовых процентах): трис-(гидроксиметил)-аминометан - 2,4; фруктоза - 0,9; лимонная кислота - 1,3; глицерин - 6, бидистиллированная вода. Безлипосомальную основу и липосомальный концентрат смешивали в соотношении 4:1. Среду стерилизовали автоклавированием при 115°C в течение 1 часа и запечатывали до использования. Среду хранили в холодильнике (+4°). Криоконсервацию семени быков проводили по стандартному методу замораживания в гранулах. Для замораживания использовали среду после 1 суток (контроль) и 10 суток хранения (В.Н. Виноградов и др. Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быков производителей // М., 2008, 160 с.). Оттаивание гранул проводили в растворе оттаивателя (130 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ CaCl, 0,5 мМ MgCl, 14 мМ фруктозы, 10 мМ Нереs, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) на водяной бане при температуре 39-40°C.
Криозащитную эффективность среды определяли по выживаемости сперматозоидов в процессе криоконсервации. О жизнеспособности судили по подвижности замороженно-оттаяной спермы через 5 минут после оттаивания и через 5 часов выдерживания замороженно-оттаяной спермы при 38°C. Подвижность определяли на спермоанализаторе "Биола" SFA-500.
Таблица 3.
Влияние хранения среды перед использованием (хранение при +4°C) Показатели замороженно-оттаяной спермы в трис-цитрат-фруктозоглицериновой среде с липосомами, альгинатом и антиоксидантами.
Подвижность до замораживания, %.
Показатели спермы после оттаивания
Подвижность после размораживания
Подвижность после культивирования при 38°C, 5 часов, %.
Количество подвижных сперматозоидов, %.
Средняя скорость
Криоконсервация семени в среде через 1 сутки послеприготовления*
80±1
39±5
62±7
15±5
Криоконсервация семени в среде через 10 суток послеприготовления*.
79±1
36±6
66±7
17±6
Результаты исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что среда сохраняет криозащитную эффективность в течение 10 суток хранения. Так, двигательные характеристики семени составили: после криоконсервации в свежеприготовленной среде подвижность сразу после размораживания - 80±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания -15±5% подвижных сперматозоидов; после криоконсервации в среде, сохранявшейся при +4 в течение 10 суток подвижность сразу после размораживания - 79±1% подвижных сперматозоидов, подвижность через 5 часов после размораживания - 17±6% подвижных сперматозоидов Таким образом, десятидневное хранение среды с соевым лецитинов в виде липосом малого размера не влияло на ее криозащитные характеристики.
Предлагаемая среда имеет повышенную биологическую безопасность, т.к. не содержит в своем составе яичного желтка или других сложных компонентов животного происхождения, которые могут быть носителями опасных патогенов.
В отличие от прототипа, среда с растительными лецитином в виде липосом, размером до 350 нм обладает оптической прозрачностью. Новая среда для криоконсервации семени быка не препятствует визуальному и инструментальному контролю качества семени.
За счет более эффективного взаимодействия липосом малого размера с клеточной мембраной сперматозоида оптимальные концентрации фосфолипида в криозащитной среде снижаются с 4-8% до 0,1-1%.
За счет высокой стабильности размеров липосом и стерилизации срок возможного использования готовой криосреды возрастает от 5 часов до 2-3-х месяцев, что позволяет оптимизировать затраты труда технологов на племпредприятиях.
Изобретение применимо в предприятиях, деятельность которых заключается в получении и криоконсервации семени быков-производителей.