СПОСОБ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА БЕЛКА ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ERCC1 В СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR IMMUNOFLUORESCENCE ASSAY OF EXCISION REPAIR PROTEIN ERCC1 IN HUMAN SOLID TUMOURS

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики активности эксцизионной репарации повреждений ДНК, и касается определения экспрессии ключевого белка эксцизионной репарации ERCC1 (excision repair cross-complementing protein 1) в солидных опухолях человека.
th
Система эксцизионной репарации повреждений ДНК играет ведущую роль в реализации противоопухолевого действия наиболее эффективных противоопухолевых средств, таких как препараты платины, часто используемые в лечении опухолей. В основе механизма их действия лежит реакция с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и образование ковалентных сшивок в ДНК, большое количество которых способно привести к остановке репликации ДНК и гибели клеток. Однако опухолевые клетки обладают системой устранения подобного рода нарушений путем эксцизионной репарации поврежденных нуклеотидов и гиперактивность этой системы является доказанной причиной резистентности к препаратам платины [Reed Ε. Cisplatin, carboplatin, oxaliplatin and analogs. / Chabner B.A., Longo D.L. // Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice, 5 ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2010; Bowden N.A. Nucleotide excision repair: why is it not used to predict response to platinum-based chemotherapy? Cancer letters 2014, Vol. 346, №2, p. 163-171].
Одним из ключевых белков эксцизионной репарации является белок ERCC1, который обладает функцией 5′-эндонуклеазы и входит в состав репаросомы [Reed Ε. ERCC1 and clinical resistance to platinum-based therapy. Clinical cancer research 2005, Vol. 11, №17, p. 6100-6102].
Существует связь между уровнем мРНК ERCC1 в опухоли и продолжительностью жизни пациентов при лечении цисплатином [Metzger R., Leichman C.G., Danenberg K.D. et al. ERCC1 mRNA Levels Complement Thymidylate Synthase mRNA Levels in Predicting Response and Survival for Gastric Cancer Patients Receiving Combination Cisplatin and Fluorouracil Chemotherapy. Journal of Clinical Oncology 1998, Vol. 16, №1, p. 309-316]. Выявлены корреляции между уровнем белка ERCC1 и резистентностью к препаратам платины [Reynolds С., Obasaju С., Schell M.J. et al. Randomized phase III trial of gemcitabine-based chemotherapy with in situ RRM1 and ERCC1 protein levels for response prediction in non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology, 2009, Vol. 27, №34, p. 5808-5815].
Известен способ иммуногистохимического анализа белка ERCC1 [De Dosso S., Zanellato Ε., Nucifora Μ., et al. ERCC1 predicts outcome in patients with gastric cancer treated with adjuvant cisplatin-based chemotherapy. Cancer chemotherapy and pharmacology 2013, Vol. 72, №1, p. 159-165].
Способ иммуногистохимического анализа эксцизионной репарации белка ERCC1 заключается в следующем.
Из парафинового блока, включающего образец исследуемой опухоли, фиксированной в 4%-ном растворе формальдегида и обезвоженной в результате последовательных проводок через панель этилового спирта с повышающейся до 96% концентрацией, готовят на микротоме срез ткани. Затем ткань депарафинизируют и проводят гидратацию через панель этилового спирта с понижающейся до 50% концентрацией. После инкубации с Tween 20 для увеличения проницаемости клеточной мембраны образцы ткани инкубируют с первичными антителами к ERCC1, далее инкубируют с вторичными антителами. Количество окрашенных клеток и интенсивность их окрашивания оценивают визуально под микроскопом.
Недостатки способа:
1) не позволяет выявить достоверных корреляций между уровнем экспрессии белка ERCC1 и резистентностью опухолей к препаратам платины;
2) не позволяет количественно оценить уровень белка ERCC1 в исследуемой опухоли.
Задачей изобретения является создание способа иммунофлуоресцентного анализа белка эксцизионной репарации ERCC1 в солидных опухолях человека, позволяющего количественно оценить в опухолевой ткани экспрессию белка ERCC1.
Технический результат изобретения заключается в том, что заявляемый способ позволяет количественно оценить экспрессию белка ERCC1, что исключает субъективный компонент в оценке результата.
Задача решается тем, что предложен способ иммунофлуоресцентного анализа белка эксцизионной репарации ERCC1 в солидных опухолях человека, включающий приготовление одноклеточной суспензии из опухолевой ткани, которую фиксируют в 4%-ном растворе формальдегида, инкубацию с Tween 20, отмывку фосфатным буфером pH 7,4, инкубацию с первичными антителами, инкубацию с вторичными антителами и двойную отмывку фосфатным буфером pН 7,4; проведение анализа данных на проточном цитофлуориметре; применение монослойной культуры рака молочной железы человека линии MCF-7 в качестве культуры сравнения, расчет уровня экспрессии белка с помощью статистического теста Колмогорова-Смирнова и расчет интенсивности экспрессии с помощью геометрического среднего флуоресценции опухолевых клеток.
Способ осуществляется следующим образом.
Для получения одноклеточной суспензии культуры сравнения - суспензии клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 - из культурального матраца сливают питательную среду, дважды промывают монослой раствором фосфатного буфера pH 7,4, добавляют раствор Версена до покрытия клеток тонким слоем жидкости и помещают в термостат на 30 мин при t+37°C. Раствор Версена осторожно сливают, клетки снимают со дна матраца рабером, переносят в пробирку с раствором фосфатного буфера pH 7,4 и пипетируют до получения одноклеточной суспензии. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывают в камере Горяева и добавляют раствор формальдегида до 4%-ной конечной концентрации.
3
Для получения суспензии клеток из биопсийного материала опухолевую ткань разрезают ножницами на мелкие кусочки объемом менее 1 мм в чашке Петри и добавляют в полученную кашицу раствор Версена. Затем инкубируют в течение 30 мин в термостате при t+37°C. После инкубации содержимое чашки Петри гомогенизируют в цилиндрическом стеклянном гомогенизаторе и переносят в пробирку, объемом 50 мл, доводя фосфатным буфером pH 7,4 объем жидкости в ней до 40 мл. Далее проводят фильтрацию суспензии с помощью фильтров на 100 и на 40 мкм. Очищенную от крупных фрагментов ткани суспензию центрифугируют 10 мин при 3 тыс. об/сек. Надосадочную жидкость удаляют пипеткой, а осадок ресуспендируют в 3-7 мл раствора фосфатного буфера pH 7,4. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывают в камере Горяева и добавляют раствор формальдегида до 4%-ной конечной концентрации.
Окрашивание одноклеточных суспензий моноклональными антителами, специфичными к белку ERCC1
Для анализа белка ERCC1 используют мышиные моноклональные антитела фирмы Abeam (ab2356), клон 8F1. В исследовании используют следующие концентрации антител: 0,25, 0,5 и 1,0 мкг/мл. В качестве изотипического контроля используют мышиные моноклональные антитела IgG2a (аb18415, Abcam), в эквивалентных специфическим антителам концентрациях. В качестве вторичных антител используют козьи поликлональные антимышиные антитела (ab98729, Abcam), меченные флуоресцентным красителем DyLight 650 в разведении 1: 500.
Суспензию исследуемых клеток центрифугируют в течение 10 мин при 3 тыс. об/мин, отбирают надосадочную жидкость и инкубируют в 1 мл 1%-ного раствора Tween 20 в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее в пробирку добавляют 10 мл фосфатного буферного раствора pH=7,4 и центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают и доводят суспензию до необходимого объема фостафтным буферным раствором pH=7,4. В пластиковые пробирки для проточного цитофлуориметра к 100 мкл суспензии исследуемых клеток добавляют соответствующие разведения специфических и изотипических антител и инкубируют при t+4°C в течение 18 час. После окончания инкубации в пробирку добавляют 2 мл фосфатного буферного раствора pH 7,4 и центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают и доводят суспензию до объема 100 мкл. Затем добавляют вторичные антитела и инкубируют при t+4°C в течение 1,5 час. После окончания инкубации для отмывки свободных антител в каждую пробирку добавляют по 2 мл фосфатного буферного раствора pH 7,4 и центрифугируют при 3 тыс.об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирают и процедуру отмывки проводят повторно. Осадок ресуспендируют в 200 мкл фосфатного буферного раствора pH 7,4.
Измерение флуоресценции проводят на проточном цитофлуориметре при λex=633 нм, λем=650 нм. Число анализируемых событий - 5 тыс. Анализ гистограмм проводят по количеству специфически окрашенных клеток, которое оценивают статистическим методом Колмогорова-Смирнова, включенным в программу FlowJo (TreeStar).
При наложении FSC файла измеренной пробы с изотипическим контролем на файл пробы со специфическими антителами в подразделе программы «Сравнение популяций» (Population Comparison) вычисляется значение, которое принимают за процент окрашенных клеток - Kolmogorov-Smirnov Chi Squared Value. Все файлы записываются на проточном цитофлуориметре с помощью программы FACSDiva. Процент окрашенных клеток соответствует уровню экспрессии белка ERCC1.
При делении геометрического среднего пробы со специфическими антителами на изотопический контроль (раздел статистики программы FlowJo) получают параметр, характеризующий интенсивность экспрессии белка ERCC1.
Изобретение иллюстрируется фиг. 1 (А и Б) и фиг. 2 (А-Г). По оси абсцисс - концентрация антител (мкг/мл); по оси ординат - уровень экспрессии белка ERCC1 (фиг. 1А) и интенсивность экспрессии белка ERCC1 (фиг. 1Б). На фиг. 1 (А и Б) и фиг. 2 (А-Г): кривые 1 () - пример высокого уровня и интенсивности экспрессии белка ERCC1, кривые 2 (♦) - пример низкого уровня и интенсивности экспрессии белка ERCC1.
На фиг. 1 (А и Б) представлены кривые зависимости уровня и интенсивности экспрессии белка ERCC1 от концентрации моноклональных специфических антител для культуры сравнения - клеток рака молочной железы человека линии MCF-7. Показано, что плато окрашивания клеток рака молочной железы человека линии MCF-7 достигается на концентрациях специфических антител к ERCC1 0,5 и 1,0 мкг/мл и значениях уровня экспрессии 72 и 75% (фиг. 1А). При этом интенсивность экспрессии при тех же концентрациях специфических антител к белку ERCC1 составляет 3,7 и 4,2 усл. ед. (фиг. 1Б). Такие показатели уровня и интенсивности экспрессии белка ERCC1 являются высокими, что позволяет четко контролировать изменение активности специфических антител.
На фиг. 2 (А-Г) представлен результат окрашивания клеток, полученных из солидных опухолей человека.
На фиг. 2 (А и Б) приведены уровень и интенсивность экспрессии белка ERCC1 в ткани немелкоклеточного рака легкого. Показано увеличение уровня экспрессии белка ERCC1 при увеличении концентрации специфических антител от 0,25 до 1,0 мкг/мл с 36 до 65% (фиг. 2А), при этом интенсивность экспрессии изменяется с 2,0 до 3,5 усл. ед. соответственно. Эти показатели экспрессии белка ERCC1 являются высокими.
На фиг. 2 (В и Г) приведены уровень и интенсивность экспрессии белка ERCC1 в ткани рака молочной железы. При увеличении концентрации специфических антител от 0,25 до 1,0 мкг/мл не происходит изменения уровня и интенсивности экспрессии белка ERCC1, при этом уровень составляет 12-16% (фиг. 2В), а интенсивность - 1,1-1,3 усл. ед. (фиг. 2Г). Эти показатели экспрессии белка ERCC1 являются низкими.