Искусственный ген N1new, кодирующий нуклеокапсидный белок коронавируса SARS-CoV-2, и рекомбинантная плазмида pET-28a-N1new, обеспечивающая экспрессию искусственного гена
ARTIFICIAL GENE N1NEW, ENCODING NUCLEOCAPSID PROTEIN OF CORONAVIRUS SARS-CoV-2, AND RECOMBINANT PLASMID PET-28A-N1NEW, PROVIDING EXPRESSION OF THE ARTIFICIAL GENE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложен ген, позволяющий продуцировать рекомбинантный искусственный белок, обладающий иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2, плазмида, его содержащая, а также сам искусственный белок, полученный с помощью клеточной линии E. coli, модифицированной предлагаемой плазмидой. Полученный рекомбинантный белок обладает иммуногенными свойствами в отношении SARS-CoV-2 и может быть использован в качестве активной субстанции для получения вакцины против SARS-CoV-2.
Описание предшествующего уровня техники
6
В настоящее время известно несколько способов получения иммуногенного белка для производства вакцины против коронавируса SARS-CoV-2. Так, патент RU 2733831 описывает ген для создания вакцины против коронавируса на основе штамма вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_SC2, модифицированного с помощью уникальной плазмиды pStem-rVSV-Stbl_RBD_SC2, имеющей молекулярную массу 8,85×10 дальтон, размер 14309 п.н. Данная плазмида кодирует получение искусственного белка-иммуногена RBD гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, с определенной аминокислотной последовательностью. Белок S представляет собой спайковый (Spike, S) белок, который находится на поверхности вируса, в виде шипов на поверхности вируса. С их помощью коронавирус проникает в клетку, таким образом, S белок играет ключевую роль в распознавании рецептора в процессе слияния с мембраной клетки.
Техническим результатом изобретения по патенту RU 2373831 является улучшение фолдинга белка и повышение инфекционного титра рекомбинантного вируса, стабильности целевого трансгена, и иммуногенных/антигенных свойств заявляемого рекомбинантного вируса.
Помимо данного изобретения, известны другие клеточные линии и плазмиды для получения белков, содержащихся в структуре коронавируса SARS-CoV-2, и которые могут быть использованы в качестве активной субстанции для получения вакцины.
Так, согласно заявке CN111607003A, известна система экспрессии белка нуклеокапсида (N) белка и спайкового белка (S1) коронавируса SARS-CoV-2, при этом использована прокариотическая система экспрессии E. coli. Данная комбинация белков SARS-CoV-2N/S1(RBD) может быть использована для создания антигена вакцины против коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. В качестве плазмиды использована плазмида pET30a-SARS-CoV-2-N-S1, содержащая ген для экспрессии двух указанных белков.
Согласно описанной выше заявке CN111607003A, в результате использования данной системы, получается конструкция из 2 белков, которая может быть более аллергенной, не стабильной, а также - иметь значительные побочные действия при применении в качестве вакцины.
Также, из заявки CN112280794 известно получение N белка с помощью pet28a вектора и штамма E. coli BL21(DE3). Данный способ включает многоступенчатую трансформацию штамма E. coli указанным вектором, что в конечном итоге позволяет получить рекомбинантный N белок SARS-CoV-2, который может быть в дальнейшем использован для получения вакцины.
Однако, все указанные способы получения рекомбинантных белков коронавируса SARS-CoV-2 могут иметь свои недостатки, например, при получении белка образуется достаточное количество нецелевых белковых продуктов, что затрудняет очистку и выделение целевого белка и может вызывать аллергические реакции и нестабильность полученного белка. Кроме того, получаемые белки могут иметь неоптимальные показатели иммуногенности и сложности в выделении, очистке и хранении.
Настоящее изобретение предлагает искусственный ген, который может быть использован для получения нуклеокапсидного белка (белка N) вируса SARS-CoV-2, плазмиду, его содержащую, с помощью которой возможно трансформирование клеток E. coli для экспрессии белка N вируса SARS-CoV-2, сам рекомбинантный белок N, способный к формированию четвертичной структуры в виде гомотетрамеров, содержащей 4 рекомбинантных белка в одной единице. Использование искусственного гена для получения белка N, согласно изобретению, приводит к снижению риска неправильного фолдинга белка, снижению вероятности интерферирующих иммунных реакций на полигистидиновый мотив и снижению риска аллергенности при использовании полученного белка N в качестве антигена.
Описание изобретения
Настоящее изобретение предлагает искусственный ген, который может быть использован для получения нуклеокапсидного белка (белка N) вируса SARS-CoV-2, плазмиду, его содержащую, с помощью которой возможно трансформирование клеток E. coli для экспрессии белка N вируса SARS-CoV-2, а также сам белок N, в т.ч. способный к формированию четвертичной структуры в виде гомотетрамеров, содержащей 4 белка в одной единице.
Согласно настоящему изобретению, предложен искусственный ген, используемый для получения белка N коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген, представленный в SEQ ID NO:1 длиной 1260 п.н.
Указанный ген может быть включен в состав любой из плазмид семейства pET, использующих промотор бактериофага T7 с соответствующей T7 полимеразой, таких как: pET-9a, pET-24a(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-30a(+), pET-33b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-42a(+), pET-47b(+), pET-48b(+), pET-49b(+), pET-50b(+) и другие. Указанные плазмиды используются для трансформации штаммов клеток E.coli для экспрессии N белка - иммуногена к коронавирусу SARS-CoV-2.
Также, согласно изобретению, предложена рекомбинантная плазмида pET-28a(+)-N1new, используемая для получения рекомбинантной линии E. сoli, продуцирующей рекомбинатный белок N коронавируса SARS-CoV-2, имеющая молекулярную массу 4014050,88 дальтон, размер 6496 п.н., согласно карте плазмиды, представленной на Фиг. 2, содержащая:
f1 ori (f1 bacteriophage origin of replication) - участок инициации репликации ДНК бактериофага f1 (координаты 12-467);
KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов E. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 560-1375);
ori (ori, origin of replication) - участок инициации репликации (координаты 1497-2085);
bom (basis of mobility) - участок для конъюгации (координаты 2271-2413);
ROP ген, регулирующий копийность плазмиды (координаты 2515-2706);
lacI - транскрипционный репрессор lacI связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в E. coli (координаты 3515-4597). Это ингибирование можно снять, добавив лактозу или изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG).
lacI promoter - промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lacI (координаты 4598-4695);
T7 promoter - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 4984-5002);
RBS (ribosome binding site) - эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 5042-5064);
T7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 6424-6471);
NcoI/XhoI фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO:1, используемый для получения нуклеокапсидного белка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 5069-6339). Нуклеотидная последовательность плазмиды pET-28a(+)-N1new включает последовательность SEQ ID NO:3.
Кроме того, согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о., полученный с помощью предложенной плазмиды, в качестве иммуногена в отношении коронавируса SARS-CoV-2.
При этом, указанный рекомбинантный белок способен формировать четвертичную структуру гомотетрамера, включающую 4 белка с SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о.
Описание фигур
На Фиг. 1 представлена карта плазмиды pET-28a(+)-N1new.
На Фиг. 2 представлены возможные структуры гомотетрамера белка N(с тетрамерной структурой): с параллельным и анти-параллельным расположением полипептидных цепей.
На Фиг. 3 представлены гистологические картины легких животных из контрольных и исследуемых групп.
Подробное описание изобретения
Предложен искусственный ген с последовательностью SEQ ID NO:1, который можно использовать для продукции белка N коронавируса SARS-CoV-2, для получения профилактической вакцины против SARS-CoV-2. Данный искусственный ген кодирует рекомбинантный белок-иммуноген, представленный в SEQ ID NO:2 длиной 420 аминокислотных остатков (а.к.о.), который содержит последовательность белка N, белка нуклеокапсида коронавируса SARS-CoV-2. Указанный белок N может использоваться в качестве антигена для получения вакцины или иммуногенной композиции против SARS-CoV-2.
Данные свойства сохраняются у искусственных генов нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 с гомологией 70% и выше.
Данный искусственный ген может быть помещен в рекомбинантную плазмиду pET-28a(+), которая в дальнейшем используется для трансформации клеток линии E. coli с целью получения рекомбинантного белка, обладающего иммуногенными свойствами в отношении коронавируса SARS-CoV-2. Данная плазмида имеет молекулярную массу 4014050,88 дальтон, размер 6496 п.н. Карта плазмиды представлена на Фиг. 1. Указанная плазмида содержит:
- f1 ori (f1 bacteriophage origin of replication) - участок инициации репликации ДНК бактериофага f1 (координаты 12-467);
- KanR - ген устойчивости к канамицину, обеспечивающий устойчивость трансформантов E. coli к селективному антибиотику канамицину (координаты 560-1375);
- ori (ori, origin of replication) - участок инициации репликации (координаты 1497-2085);
- bom (basis of mobility) - участок для конъюгации (координаты 2271-2413);
- ROP ген, регулирующий копийность плазмиды (координаты 2515-2706);
- lacI - транскрипционный репрессор lacI связывается с оператором lac, чтобы ингибировать транскрипцию в E. coli (координаты 3515-4597).
- lacI promoter - промотор для связывания РНК полимеразы, транскрибирующей ген lacI (координаты 4598-4695);
- T7 promoter - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 4984-5002);
- RBS (ribosome binding site) - эффективный сайт связывания рибосомы из гена 10 бактериофага Т7 (координаты 5042-5064);
- T7 terminator - терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7 (координаты 6424-6471);
- NcoI/XhoI фрагмент, содержащий искусственный ген SEQ ID NO:1, используемый для получения нуклеокапсидного белка коронавируса SARS-CoV-2, кодирующий искусственный белок-иммуноген (координаты 5069-6339).
- Уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами со следующими координатами: EcoRV - 3796, NcoI - 5069, XbaI - 5030, XhoI - 6334.
Нуклеотидная последовательность плазмиды pET-28a(+)-N1new включает последовательность SEQ ID NO:3.
Указанная плазмида согласно изобретению позволяет получить трансформированные клеточные линии E. coli, экспрессирующие белок N с последовательностью аминокислот SEQ ID NO:2. Данный белок имеет существенное отличие от рекомбинантных белков, известных ранее. Получаемый в результате рекомбинантный белок N согласно изобретению не имеет His-Tag метки в начале, внутри или конце последовательности, что приводит снижению риска неправильного фолдинга белка, снижению вероятности интерферирующих иммунных реакций на полигистидиновый мотив и снижению аллергенности при использовании его в качестве антигена.
Таким образом, рекомбинантный белок согласно изобретению, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 420 а.к.о. и может быть получен с помощью плазмиды, содержащей искусственный ген, описанный выше. Полученный белок отличается стабильностью, высокой иммуногенностью, и может быть использован в качестве антигена в составе вакцины для профилактики SARS-CoV-2.
Дополнительно, экспериментальные данные динамического рассеяния света показали, что белок N, получаемый согласно изобретению, и не имеющий His-Tag метки, с последовательностью SEQ ID NO:2, имеет способность к самоорганизации в олигомерные структуры, т.е. структуры, включающие одинаковые цепи белка, с доминирующей структурой гомотетрамера. Как показано на Фиг. 2, полипептидные цепочки могут быть расположены параллельно или антипараллельно. Данная структура образует отдельную белковую единицу и также может быть использована в качестве антигена для получения вакцины. Более того, такая гомотетрамерная структура может являться более активной в отношении иммуногенных свойств, чем отдельный белок N с одной полипептидной цепочкой.
Описанный белок как в виде отдельного белка, так и в виде гомотетрамерной структуры может быть использован для получения вакцины в отношении SARS-CoV-2, в виде композиции, содержащей растворитель, а также адъювант, иные вспомогательные вещества, например, стабилизаторы или консерванты, буферные растворы, или в виде лиофилизата, например, с применением лиопротектора или без него.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые не носят ограничительный характер.
Примеры
Пример 1
Получение плазмиды, содержащей ген белка
Плазмиду, содержащую ген белка N (Genbank YP_009724397.2), использовали для получения модифицированной оптимизированной по кодонам нуклеотидной последовательности с использованием Codon Adaptation Index (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/). Кодоны выбраны таким образом, чтобы по возможности использовались наиболее часто встречающиеся у E. coli кодоны, а также содержание нуклеотидов гуанин и цитозин был в диапазоне 50-55%. Последовательность на 5' и 3' концах фланкировалась последовательностями для распознавания эндонуклеазами NcoI (CCATGG) и XhoI (CTCGAG), соответственно. Синтез гена и клонирование по указанным сайтам рестрикции в плазмиду без вставки pET-28a(+) были заказаны на коммерческой основе. Полученную плазмиду секвенировали с помощью праймеров T7_promotor (TAATACGACTCACTATAGGG), fwd_122 (GCCTTATGGTGCAAATAAGG) и fwd_300 (AAACATTGGCCGCAGATTGC) для подтверждения нуклеотидной последовательности и проверки на однонуклеотидные мутации.
Нуклеотидная последовательность соответствовала последовательностиSEQ ID NO:3.
Пример 2
Получение клеточной линии E. coli, модифицированной плазмидой
Клеточную линию E. coli трансформировали по следующему протоколу. Пробирку с компетентными клетками извлекали из морозильной камеры хранения на -80°C. Давали оттаять льду в течение 10 мин. Далее вносили 1 мкл, содержащий 1 пкг-100 нг плазмиды. Аккуратно перемешивали пробирку 4-5 раз. Полученную смесь помещали на лёд на 30 мин. Далее смесь подвергали тепловому шоку при 42°C на 30-60 c. Полученную обработанную смесь помещали на лёд на 5 мин. Вносили 950 мкл среды SOC при комнатной температуре. Инкубировали при 30°C-37°C в течение 1 - 2 ч при перемешивании 250 оборотов в минуту. Высевали 10-50 мкл на чашку с твердой селективной средой, содержащей антибиотик канамицин. Инкубировали при 30°C - 37°C в течение ночи. Выросшие колонии содержат клетки E. coli, трансформированные плазмидой, несущей искусственный ген белка N.
Таким образом получали клеточную линию E. coli с включением искусственного гена согласно изобретению.
Пример 3
Получение рекомбинантного белка N SARS-CoV-2
2
4
2
4
2
4
Биомассу E. coli, содержащую экспрессированный белок N, ресуспендировали в буфере для лизиса (Трис-HCl 50 мM, pH 9) и гомогенизировали с помощью лабораторного гомогенизатора, например, GEA Panda 1000. Все буферы, кроме буферов для хроматографии на третьей стадии очистки, содержали ингибиторы протеаз ЭДТА и ФМСФ. Затем нерастворимую фракцию биомолекул осаждали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин. Растворимую фракцию переносили в чистую посуду, и к ней добавляли 20% (по массе на объем) сульфата аммония для осаждения белка N. Осажденную фракцию собирали центрифугированием при 20000 x g, 4°C, 30 мин, с последующим растворением в буфере Трис-HCl 50 мM, pH 9. После фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм раствор использовали для хроматографической очистки. Первую стадию очистки на анион-обменной хроматографии проводили в режиме проскока (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Вторую стадию очистки на катион-обменной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом NaCl от 0 M до 1 M (буфер Трис-HCl 50 мM, pH 9). Третью стадию очистки на гидрофобной хроматографии проводили в режиме захвата с элюцией градиентом сульфата аммония от 1 M до 0 M (буфер NaHPO 50 мM, pH 7,5). Идентификацию пиков белка на хроматограммах производили с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в редуцирующих и денатурирующих условиях путем обнаружения соответствующей по молекулярной массе полосе. Полученный после третьей стадии раствор белка диализировали относительно фосфатного буфера (NaCl 0,137 M, NaHPO 0,010 M, KHPO 0,0018 М, KCl 0,0027 М, pH 7,4).
Анализ аминокислотной последовательности полученного белка
Подтверждение аминокислотной последовательности белка осуществлялось с помощью масс-спектрометрии MALDI-MS пептидов после протеолитического расщепления ферментом трипсином. Спектры были зарегистрированы с использованием матрицы DHB в рефлекторном режиме регистрации положительных ионов. Последовательность SEQ ID NO:2 представляет собой итоговое покрытие последовательности с учетом трипсинолиза. Итоговое покрытие аминокислотной последовательности для образца белка N составило 97,8%.
Пример 4
Исследование иммуногенных свойств белка SARS-CoV-2
Исследование иммуногенных свойств полученного белка проводили на лабораторных животных. Исследование проводили на сирийских хомяках обоего пола в равных соотношениях. Возраст хомяков 8-10 недель к моменту иммунизации, 10-12 недель к моменту заражения вирусом SARS-CoV-2. Условия содержания: в условиях вивария с соблюдением основных зоогигиенических требований: температурный режим 18-22°С, 12-часовой световой день, воды давали вдоволь, кормление производили ежедневно, 2 раза в сутки.
4
Лабораторные животные, иммунизированные изучаемыми образцами вакцин и подвергнутые заражению возбудителем новой коронавирусной инфекции COVID-19 вирусом SARS-CoV-2 в дозе 4×10 TCID50 (интраназально, 13 мкл вируссодержащего раствора в каждую ноздрю).
50
Интраназальное введение выполняли с помощью механического дозатора. Активность вируса SARS-CoV-2, полученного из клинического изолята, оценивали с помощью определения 50 % тканевой цитопатической дозы (ТЦД50 (TCID)) на культуре клеток Vero B в микропланшете.
Животных разделили на группы по 15 самцов и самок, группам вводили:
Контрольная группа 1 и 2 - растворитель (физиологический раствор), 1 мл.
Группа 3 и 4 - 0,5 мл антигена в 1 мл. растворителя.
Далее, хомяков из всех групп инфицировали:
Группа 1 и 3 - вводили коронавирусную инфекцией COVID-19 в виде вируса SARS-CoV-2 в дозе 4×104 TCID50 (интраназально, 13 мкл вируссодержащего раствора в каждую ноздрю).
Группа 2 и 4 - в качестве контрольного образца интраназально вводили аналогичный объем супернатанта культуральной жидкости (13 мкл в каждый носовой ход).
За 1 сут до введения вируса SARS-CoV-2 у лабораторных животных проводили прижизненный отбор крови для получения сыворотки в объёме 50-100 мкл. Кровь отбирали из ретроорбитального синуса в пробирки с активатором свертывания, которые далее центрифугировали. При выведении животных из эксперимента перед завершением эвтаназии проводили отбор венозной крови в пробирки с активатором свертывания и далее действовали также, как описано выше.
Исследование проводили в течение 14 суток, с ежедневным осмотром. Введение антигена и инфицирование проводили с разрывом в 7 дней, с последующим наблюдением в течение 7 дней. Далее, отбирали кровь, проводили эвтаназию животных и гистологию внутренних органов после вскрытия.
Анализировали по истечении 7 суток после инфицирования: температуру тела, массу тела, определяли количество вируса SARS-CoV-2 в легких и носовых ходах золотистого сирийского хомяка методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» (далее - ПЦР-РВ). После эвтаназии и вскрытия определяли массовый коэффициент легких и проводили исследование патоморфологической картины, развившейся в тканях легких, трахеи, печени, селезенки, кишечника, сердца и головного мозга иммунизированных животных, подвергнутых заражению вирусом SARS-CoV-2.
Полученные результаты
У групп 1 и 3 не наблюдали признаков инфицирования. При этом у группы 3 у 4 животных из 15 наблюдали кратковременное повышение температуры (до 39°) в течение суток. Далее, температура становилась нормальной и более не повышалась.
У групп 2 и 4 наблюдали повышение температуры, вялость, отсутствие аппетита. При этом у животных группы 2 температура присутствовала в течение 7-8 дней, наблюдали статистически значимое снижение веса. У двух животных выявлен летальный исход.
После эвтаназии животных рассчитывали массовый коэффициент легких. Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Массовый коэффициент легких.
Группа животных
Срок наблюдения
3 сут
7 сут
14 сут
Группа №1
3,43[3,32;4,12]*
4,89[4,36;5,08]
3,94[3,84;4,22]
Группа №2
6,8 [5,87;7,25]
7,3 [6,34;7,51]
7,5 [6,97;7,81]
Группа №3
4,00[3,51;4,27]
5,00[4,84;5,25]
4,62[4,17;5,24]
Группа №4
4,03[3,58;4,25]
6,99 [5,38;7,05]
4,87[4,33;5,70]
* - в скобках указаны значения Me[Q1; Q3].
В ходе анализа полученных данных было установлено, что у хомяков в группах 2 и 4 динамика инфекционного процесса протекала аналогично и по показателю легочного коэффициента характеризовалась статистически значимым увеличением на 7 сут. по сравнении с таковыми на 3 сут и 14 сут. При этом также была прослежена характерная динамика нарастания выраженности поражения легких от 3 сут к 7 сут., и в группе 4 - полный регресс заболевания к 14 сут.
На фоне введения антигена у хомяков в группах 3 и 4 определяли статистически значимо меньшие значения массового коэффициента легких на 7 сут относительно группы 2.
Гистологические изменения, свидетельствующие об уменьшении тяжести поражения лёгких, характеризовались слабо выраженным полнокровием, небольшим количеством дислектазов, отсутствием проявлений цитопатического действия вируса. Просвет альвеол и бронхиол был незначительно заполнен слизистым содержимым. Отмечали слабо выраженные проявления интерстициального отёка, слабо выраженную очаговую инфильтрацию межальвеолярных перегородок клетками лейкоцитарного диферона. Признаки васкулита практически отсутствовали. Через 14 сут после заражения наблюдали остаточные проявления альвеолита и бронхиолита в виде незначительного утолщения стенок альвеол и бронхиол, местами покрытых тонким слоем слизи.
Результаты гистологии клеток легких животных приведены на Фиг. 3.
Пример 5
Определение титра антител
Титр антител, вырабатываемых после введения белка согласно изобретению, определяли по следующей методике.
Использовали следующие реактивы:
1. Посадочные антигены, 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку, термостатирование.
2. Блокировка, 0,5 % молоко в отмывочном буфере (20 мM Tрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), термостатирование.
3. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Tрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.
4. Нанесение сывороток, подбирается титр для каждой отдельной сыворотки, 100 мкл/лунку, термостатирование.
5. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Nрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.
6. Нанесение вторичных антител, разведение 1:64000, 100 мкл/лунку, термостатирование.
7. Отмывка: Слить содержимое планшета, планшет промыть отмывочным буфером (20 мM Nрис, 150 мМ NaCl, 0,05 % полисорбат 20), с последующей просушкой.
8. Добавление раствора хромогена, в защищенном от света месте.
9. Добавление стоп-раствора.
10. Съем результатов, длина волны 450 нм, референс 620 нм.
Дополнительное описание реактивов и приборов:
- Антитела кроличьи к антителам мыши (H+L), Goat Anti-Mouse IgG(H+L) (пероксидаза хрена конъюгированная);
- Белок N, полученный согласно настоящему изобретению, концентрация3,5 мг/мл;
- Позитивная и негативные сыворотки (K+, позитивная сыворотка, сыворотка мышиная после вакцинации белком; K-, негативная сыворотка, интактная мышиная сыворотка № 4);
- Спектрофотометр микропланшентый MultiscanSky, Thermo Fisher.
Критерии приемлемости были подобраны в соответствии с рекомендацией Европейского медицинского агентства (Guideline on bioanalytical method validation). Результаты принимаются, если выполнены критерии пригодности и критерии приемлемости.
Согласно IUPAC, предел обнаружения рассчитывают по стандартному отклонению холостой пробы. Для этого измеряют величину аналитического сигнала для достаточного количества холостых проб и рассчитывают стандартное отклонение их значений.
Как правило, используется формула (Kaiser H. Zur definition der nachweisgrenze, der garantie grenze und der dabei benutzten begriffe, Дёрффель К. Статистика в аналитической химии): LOD = Ср. +k*SD, где k = 3, Ср - среднее значение, LOD - предел обнаружения.
Предел обнаружения (LOD) рассчитывают по оптической плотности блокирующего буфера по формуле: LOD = ср+10*SD,
Где Ср - среднее значение оптической плотности блокирующего буфера,SD - среднеквадратичное отклонение оптической плотности блокирующего буфера.
Принимается, что в образце присутствуют специфичные антитела, если средняя оптическая плотность образца больше, чем Сut-off, при этом Сut-off = LOD + 20% (20% соответствуют критерию пригодности иммуноферментной системы для оптической плотности на уровне поглощения блокирующего буфера (бланка)): Cut-off = 1,2* LOD = 1,2*(Ср+10*SD).
Титром сыворотки считается крайнее разведение, при котором оптическая плотность превышает сигнал дискриминационного уровня (cut-off), используется усредненная оптическая плотность.
Ниже представлены данные по титрам антител, полученные для испытуемых образцов крови, взятых от группы мышей.
Мышам вводили белок, полученный согласно настоящему изобретению, в количестве 50 мг/мл, и спустя 7 дней отбирали кровь с получением сыворотки.
Далее, по рекомендациям, описанным выше, получали значение оптической плотности с пересчетом в титр антител, при этом использовали различное разведение. Результаты представлены в таблице ниже.
Таблица 2. Расчет оптической плотности испытуемых образцов.
Сыворотки
Оптическая плотность
Стоковый раствор 1
Стоковый раствор 2
Ср
SD
RSD (CV, %)
1
2
1
2
мышь 1,разв. 1000
0,822
0,773
0,815
0,813
0,806
0,022
2,8
мышь 1,разв. 2000
0,631
0,595
0,629
0,622
0,619
0,017
2,7
мышь 1,разв. 4000
0,444
0,430
0,449
0,453
0,444
0,010
2,3
мышь 1,разв. 8000
0,305
0,291
0,304
0,317
0,304
0,011
3,5
мышь 1,разв. 16000
0,215
0,199
0,209
0,217
0,210
0,008
4,0
мышь 1,разв. 32000
0,145
0,143
0,149
0,148
0,146
0,003
1,9
мышь 1,разв. 64000
0,107
0,103
0,109
0,109
0,107
0,003
2,7
мышь 1,разв. 128000
0,086
0,081
0,084
0,086
0,084
0,003
3,1
мышь 2,разв. 1000
0,654
0,699
0,632
0,630
0,654
0,032
5,0
мышь 2,разв. 2000
0,460
0,501
0,450
0,464
0,469
0,022
4,8
мышь 2,разв. 4000
0,339
0,344
0,324
0,317
0,331
0,013
3,8
мышь 2,разв. 8000
0,230
0,239
0,212
0,230
0,228
0,011
4,9
мышь 2,разв. 16000
0,157
0,161
0,146
0,151
0,154
0,007
4,3
мышь 2,разв. 32000
0,118
0,116
0,108
0,115
0,114
0,004
3,9
мышь 2,разв. 64000
0,089
0,094
0,084
0,088
0,089
0,004
4,5
мышь 2,разв. 128000
0,076
0,076
0,076
0,073
0,075
0,001
1,8
Таблица 3. Расчет оптической плотности блокирующего раствора.
1
2
3
4
5
6
7
8
Ср.
SD
RSD
Ср. +10*SD
Cut-off
0,054
0,058
0,054
0,058
0,056
0,061
0,054
0,053
0,056
0,003
4,841
0,082
0,099
Все значения системы и полученных значений оптической плотности позитивной и негативной сыворотки соответствовали критериям приемлемости и пригодности.
Соответственно, титр для образца «мышь 1» составлял 1:64000, для образца «мышь 2» составлял 1:32000.
Далее, таким же образом были получены для других образцов.
Титр для образца «мышь 3» составлял 1:64000, для образца «мышь 4» составлял 1:64000, титр для образца «мышь 5» составлял 1:32000, для образца «мышь 6» составлял 1:32000.
Расчёт титра специфичных антител
Из 6 проанализированных сывороток у 3 сывороток титр составил 1:32000,у трех - 1:64000.
Среднее геометрическое для данных образцов рассчитывали, как:
Среднегеометрический титр для образцов сывороток после вакцинации равен 1:45255.
Пример 6
Анализ стабильности белка SARS-CoV-2
Стабильность полученного рекомбинантного N белка проверяли в виде раствора в PBS (фосфатно-солевом буферном растворе), при различных температурах: +4°С, -20°С, +25°С. Далее, по истечении 1, 2, 5, 6, 7 или 14 сут, в зависимости от температуры, исследовали изменения образца методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле, а также размеры частиц методом динамического рассеяния света.
Данные по размерам частиц при хранении представлены ниже.
Таблица 4. Снижение активности белка при хранении в различных условиях.
Рекомбинантный N белок, концентрация = 0.600 мг/мл
День
T°
d, нм
PDI, %
Инт., %
Мас., %
0
-
13±5
31,2
93,3
100,0
1
+4
13±5
31,9
100,0
100,0
2
+4
12±2
19,0
87,8
99,9
5
+4
14±2
11,0
66,8
99,9
6
+4
14±3
21,9
91,7
100,0
7
+4
13±3
21,1
93,9
100,0
14
+4
13±3
23,8
87,8
100,0
День
T°
d, нм
PDI, %
Инт., %
Мас., %
0
-
13±5
31,2
93,3
100,0
1
-20
12±2
17,3
86,1
100,0
2
-20
12±2
18,6
91,0
100,0
5
-20
12±4
26,7
77,2
99,9
6
-20
12±2
17,8
86,1
99,9
7
-20
13±2
16,3
94,0
100,0
14
-20
13±4
28,9
100,0
100,0
День
T°
d, нм
PDI, %
Инт., %
Мас., %
0
-
13±5
31,2
93,3
100,0
1
+25
14±3
20,7
45,6
99,7
7
+25
12±2
17,4
55,1
99,5
По данным электрофоретограмм, изменений в составе белка не выявлено.
Полученный белок N является стабильным при рассмотренных температурах.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ФГУП СПбНИИВС ФМБА России
<120> Искусственный ген N1new, кодирующий нуклеокапсидный белок
коронавируса SARS-CoV-2, и рекомбинантная плазмида pET-28a-N1new,
обеспечивающая экспрессию искусственного гена
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 3
<210> SEQ ID NO 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> искусственная нуклеотидная последовательность
<400> SEQUENCE 1:
atgggcagcgataatggcccgcagaatcagcgtaatgcaccgcgtattacctttggcggc  60
ccgagtgatagtaccggtagtaatcagaatggtgaacgcagtggtgcacgtagcaaacag  120
cgccgcccgcagggcctgcctaataataccgccagttggtttaccgccctgacccagcat  180
ggcaaagaagatctgaaatttccgcgcggtcagggcgtgccgattaataccaatagcagt  240
ccggatgatcagattggctattatcgccgcgccacccgccgcattcgcggtggtgacggt  300
aaaatgaaagatctgagcccgcgttggtatttttattatctgggcaccggcccggaagcc  360
ggtctgccttatggtgcaaataaggatggtattatttgggtggcaaccgaaggtgcactg  420
aataccccgaaagatcatattggtacccgtaatccggcaaataatgcagcaattgttctg  480
cagctgccgcagggtaccaccctgccgaaaggcttttatgccgaaggcagtcgcggcggc  540
agtcaggctagtagccgtagcagtagccgtagtcgcaatagcagtcgcaatagtaccccg  600
ggcagcagccgtggcaccagtcctgctcgtatggcaggtaatggtggtgacgccgccctg  660
gcactgctgctgctggatcgcctgaatcagctggaaagcaaaatgagtggtaaaggccag  720
cagcagcagggccagaccgtgaccaaaaaatctgcagcagaagcaagcaaaaaaccgcgc  780
cagaaacgtaccgcaaccaaagcatataatgtgacccaggcctttggtcgtcgtggtccg  840
gaacagacccagggcaattttggcgatcaggaactgattcgccagggcaccgattataaa  900
cattggccgcagattgcccagtttgccccgagcgcaagcgcatttttcggcatgagtcgc  960
attggcatggaagttaccccgagcggtacctggctgacctataccggtgcaattaagctg  1020
gatgataaagatccgaattttaaagatcaggttattctgctgaacaaacatattgatgcc  1080
tataaaaccttcccgccgaccgaaccgaaaaaagataaaaagaaaaaggcagatgagacc  1140
caggcactgccgcagcgtcagaaaaaacagcagaccgtgacactgctgccggcagccgat  1200
ctggatgattttagtaaacagctgcagcagagtatgagtagcgcagatagtacccaggca  1260
<210> SEQ ID NO 2
<211> 420
<212> искусственная последовательность
<213> искусственная аминокислотная последовательность
<400> SEQUENCE 2:
MGSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQN  30
GERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQH 60
GKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRR 90
ATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEA 120
GLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTR 150
NPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGG 180
SQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPAR 210
MAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQ 240
QQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYN 270
VTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYK 300
HWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGT 330
WLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDA 360
YKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQ 3900
QTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA 420
<160> SEQ ID NO: 3
<210> 3
<211> 6496
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<400> искусственная нуклеотидная последовательность
tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcg 60
cagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttc 120
ctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagg 180
gttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttc 240
acgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgtt 300
ctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattc 360
ttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgattta 420
acaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttt 480
tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgta 540
tccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttat 600
tcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaa 660
actcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactc 720
gtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgaga 780
aatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttcc 840
agacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaac 900
cgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggac 960
aattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatat 1020
tttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcag 1080
tggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggca 1140
taaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctac 1200
ctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattg 1260
tcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatcca 1320
tgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacac 1380
cccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaa 1440
cgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttga 1500
gatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcg 1560
gtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagc 1620
agagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaag 1680
aactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgcc 1740
agtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcg 1800
cagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctac 1860
accgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggaga 1920
aaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagctt 1980
ccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgag 2040
cgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg 2100
gcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtta 2160
tcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc 2220
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg 2280
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagta 2340
caatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactg 2400
ggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtct 2460
gctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagag 2520
gttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtc 2580
gtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccag 2640
aagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgttt 2700
ggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaa 2760
acgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacg 2820
ttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcaggg 2880
tcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcc 2940
tgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagacttta 3000
cgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagca 3060
gcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaacc 3120
ccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgc 3180
catgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaa 3240
ggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgc 3300
gctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctac 3360
gagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgccca 3420
ccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgccta 3480
atgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaa 3540
cctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtat 3600
tgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttca 3660
ccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa 3720
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgt 3780
atcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattg 3840
cgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattca 3900
gcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgcta 3960
tcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccg 4020
agacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagat 4080
gctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtct 4140
ggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatgg 4200
catcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagat 4260
tgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgc 4320
tggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgca 4380
gggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg 4440
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttt 4500
tcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccgg 4560
catactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactct 4620
cttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccggga 4680
tctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgagg 4740
ccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtccc 4800
ccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtgg 4860
cgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtg 4920
gcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatctcgatcccgcga 4980
aattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataa 5040
ttttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcgataatggcccgcagaatcag 5100
cgtaatgcaccgcgtattacctttggcggcccgagtgatagtaccggtagtaatcagaat 5160
ggtgaacgcagtggtgcacgtagcaaacagcgccgcccgcagggcctgcctaataatacc 5220
gccagttggtttaccgccctgacccagcatggcaaagaagatctgaaatttccgcgcggt 5280
cagggcgtgccgattaataccaatagcagtccggatgatcagattggctattatcgccgc 5340
gccacccgccgcattcgcggtggtgacggtaaaatgaaagatctgagcccgcgttggtat 5400
ttttattatctgggcaccggcccggaagccggtctgccttatggtgcaaataaggatggt 5460
attatttgggtggcaaccgaaggtgcactgaataccccgaaagatcatattggtacccgt 5520
aatccggcaaataatgcagcaattgttctgcagctgccgcagggtaccaccctgccgaaa 5580
ggcttttatgccgaaggcagtcgcggcggcagtcaggctagtagccgtagcagtagccgt 5640
agtcgcaatagcagtcgcaatagtaccccgggcagcagccgtggcaccagtcctgctcgt 5700
atggcaggtaatggtggtgacgccgccctggcactgctgctgctggatcgcctgaatcag 5760
ctggaaagcaaaatgagtggtaaaggccagcagcagcagggccagaccgtgaccaaaaaa 5820
tctgcagcagaagcaagcaaaaaaccgcgccagaaacgtaccgcaaccaaagcatataat 5880
gtgacccaggcctttggtcgtcgtggtccggaacagacccagggcaattttggcgatcag 5940
gaactgattcgccagggcaccgattataaacattggccgcagattgcccagtttgccccg 6000
agcgcaagcgcatttttcggcatgagtcgcattggcatggaagttaccccgagcggtacc 6060
tggctgacctataccggtgcaattaagctggatgataaagatccgaattttaaagatcag 6120
gttattctgctgaacaaacatattgatgcctataaaaccttcccgccgaccgaaccgaaa 6180
aaagataaaaagaaaaaggcagatgagacccaggcactgccgcagcgtcagaaaaaacag 6240
cagaccgtgacactgctgccggcagccgatctggatgattttagtaaacagctgcagcag 6300
agtatgagtagcgcagatagtacccaggcataactcgagcaccaccaccaccaccactga 6360
gatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaa 6420
taactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaagga 6480
ggaactatatccggat                                             6496
<---