Методические подходы к оценке ДНКазной и протеолитической активности поликлональных иммуноглобулинов

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ДНКАЗНОЙ И ИРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

ЖЕЛЕЗНЯК Н.В., ДМИТРАЧЕНКО Т.Н.. КУНДЕР Е.В..

ГЕНЕРАЛОВА А.Г.

УО «Витебский государственный народовмедицинскийуниверситет»

Резюме. Разработаны планшетные микромодификации методов определения ДНКазной и протеолитической (амидазной) абзимной активности. Метод определения ДНКазной абзимной активности основан на предупреждении образования сгустка ДНК риванолом. для выявления протеолитической активности использован субстрат БАПНА.

Модификации сохранили высокую чувствительность и воспроизводимость (коэффициенты вариации внутри одного определения и между определениями не превышают 5-10%). Способы пригодны для массового определения абзимной активности в клинических условиях.

Ключевые слова: абзимы, ДНКазная активность. протеолитическая активность. иммуноглобулины, антитела

Abstract. Micro-modifications of methods for DNAse and proteolytic abzyme activity determination in polystyrene plates were elaborated. DNAse activity was determined with rivanol clot formation prevention test; proteolytic activity was assessed by means of BAPNA hydrolysis.

Modifications maintained high initial sensitivity and reproducibility (intraassay and inter-assay variations didn’t exceed 5-10%). The devised methods were implicated for mass screening of abzyme activity in clinical situations.

Key words: abzymes, DNAse activity. proteolytic activity.

immunoglobulins. antibodies

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 210023. г. Витебск. пр. Фрунзе. 27. УО «Витебский государственный

медицинский университет» - Железняк Н.В.

Впервые существование природных каталитических антител

активности. протеолитической и амидазной. гиалуронидазной. амилазной. протеинкиназной и липидкиназной. уреазной. разнообразной окислительновосстановительной активности. включая супероксиддисмутазную.

пероксидазную. каталазную и некоторые другие [10].

Сейчас область. находящаяся на стыке химии. биотехнологии и иммунологии - абзимология - представляет собой весьма динамично развивающуюся научную отрасль. Получены первые моноклональные и генно-инженерные абзимы. пригодные для промышленного и медицинского применения [1. 6. 10].

В настоящее время абзимное направление представляет очевидный интерес и для проведения клинических исследований. Значительное количество работ по этой проблеме публикуется в ведущих российских и зарубежных журналах. Каталитические АТ уже определяются как «новый молекулярный инструмент» [5. 9] для изучения ревматологических и кардиологических заболеваний. болезней эндокринной системы.

аутоиммунных заболеваний ЦНС. сепсиса. ВИЧ-инфекции. другой инфекционной патологии.

Оценка диагностической значимости абзимных АТ требует адаптации или разработки точных методов определения каталитической активности. пригодных для оценки абзимной функции. С одной стороны. такие методы должны быть высокочувствительными. поскольку каталитическая активность

АТ в целом ниже соответствующей активности ферментов. С другой стороны. эти методы должны быть адаптированы для применения в клинических условиях с возможностью массового автоматизированного учета реакций.

Среди вышеуказанных видов абзимного действия наибольший интерес представляют нуклеазная и протеолитическая активность АТ. Высокая нуклеазная абзимная активность указывает на прогрессирование аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки. ревматоидного артрита. аутоиммунный тиреодита и др.. [5. 9]). Повышенная

протеолитическая активность АТ является индикатором благоприятного прогноза при генерализованной бактериальной инфекции (сепсисе. [11]).

В абзимологии для оценки протеолитической и нуклеазной активности применяются сложные методы. основанные на электрофоретическом разделении или ВЭЖХ-анализе продуктов гидролиза нуклеиновых кислот и белков под действием АТ.

Эти способы являются весьма чувствительными. но для своей постановки требуют соответствующего оборудования и специальных субстратов. В частности. основным методом оценки ДНКазной активности абзимов является электрофоретический способ. предложенный в Новосибирском институте молекулярной биологии и химической медицины СОРАН [6].

Однако в данном методе необходимо использовать особый субстрат -суперспирализованную форму плазмидной ДНК (в частности плазмиды В1иеБСпр1 или риС 19). Приготовление такого субстрата требует отдельной многоэтапной методики очистки.

С учетом всего вышеизложенного целью нашего исследования стала разработка собственных модификаций методов определения ДНКазной и протеолитической активности. адаптированных к оценке абзимного действия АТ и ИГ.

Методы

В работе были использованы ДНК тимуса теленка. бензоил-DL-аргинин-р-нитроанилид (БАПНА) (производства фирмы Sigma. США). агароза. конъюгированная с белком А золотистого стафилококка (институт им.Пастера, г.С.-Петербург. Россия). панкреатическая ДНКаза производства Олайнского завода химреактивов. Латвия. панкреатический трипсин (Чехия). Остальные реактивы - отечественного производства и перефасовки квалификации «хч» и «чда».

Материалом для оценки абзимной активности послужили IgG подклассов 1. 2 и 4. Препараты иммуноглобулинов получали из сывороток практически здоровых лиц (доноров). больных хроническими вирусными гепатитами ВиС. герпетической вирусной инфекцией.

Для выделения поликлональных IgG из сывороток крови использовался комбинированный риванол-аффинно-хроматографический метод с применением протеина А золотистого стафилококка [8]

С целью количественного определения протеолитической абзимной активности нами была разработана микромодификация способа. предложенного Эрлангером с соавт. [3]. Субстратом данной реакции является бeнзoил-DL-apгинин-p-нитpoaнилид (БАПНА). Объем реакционной смеси в исходном варианте метода составляет 3-5 мл.

Для определения нуклеазной абзимной активности нами был модифицирован способ определения ДНКазной активности. предложенный К.С. Азаренком с соавт.. 1992 г. [7]

Данный метод основан на количественном определении сгусткообразования ДНК риванолом обратно пропорционально степени деполимеризации нуклеиновой кислоты. Все разработанные модификации были адаптированы для учета реакций на отечественном фотометре-мультискане Ф300 (производства РУП «Витязь». Республика Беларусь).

Результаты и обсуждение

Модификация метода определения протеолитической (БАПНА-амидазной) активности для оценки абзимного действия иммуногло булинов.

Базовый вариант методики был видоизменен нами следующим образом: к 0.2 мл препарата IgG (концентрация - 0.5 мг/мл) прибавляли 0.05 мл раствора БАПНА (2.5 мг/мл. растворяется в минимальном объеме диметилсульфоксида) на трис-HCl буфере pH 7.4. В контроле использовали буфер. Инкубировали в течение 20 ч при температуре 37°С. Реакция ставилась в планшетах для иммуноферментного анализа (ИФА). Опытные и контрольные пробы дублировали. Учет проводили на фотометре Ф300 (методика №20. двухволновое измерение на 405 и 570 нм). В дальнейших экспериментах в реакционный буфер добавляли хлорид магния. кальция. цинка и сульфат меди в концентрации 0.001М. Полученные величины активности выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

Оценка аналитических параметров метода

Для оценки чувствительности способа был использован коммерческий препарат фермента трипсина. Оказалось. что при 20-часовой инкубации выявляется менее 100 нг/мл трипсина. что свидетельствует о достаточно высокой чувствительности метода. Коэффициенты вариации внутри одного определения и между анализами при выполнении протеолитической реакции с ферментом трипсином не превышали 5-10%. что также подтверждает и высокую воспроизводимость метода.

Адаптация метода определения ДНКазной активности для оценки абзимной активности иммуноглобулинов.

ПриготовлениерабочегораствораДНК.

Готовили исходный 0.1% раствор ДНК (1 мг/мл). тщательно перемешивая необходимую навеску ДНК до полного растворения в дистиллированной воде. Рабочий раствор готовили из основного раствора

непосредственно перед постановкой реакции. Его концентрация обычно составляет 0.25-0.35 мг ДНК/мл. Перед постановкой методики проверяли состояние рабочего раствора ДНК. Для этого к 0.2 мл рабочего раствора ДНК добавляли 0.1 мл физиологического раствора и 0.1 мл 0.02М трис-HCl буфера. pH 7.4-7.5 с 0.01 М хлоридом магния. Затем к пробе добавляли 0.02 мл 0.75% раствора риванола и встряхивали до образования сгустка ДНК. Он должен быть плотным и компактным. Его отмывали. экстрагируя при 100°С 1М раствором HCl в течение 1-2 минут.

После экстракции хромогена 0.2 мл пробы вносили в стандартный планшет для ИФА и фотометр провали на фотометре-мультискане Ф300 (максимум поглощения светофильтра - 405 нм). Для работы использовали сгусток ДНК при оптической плотности 0.8-0.95 при фотометрии. В случае необходимости (при образовании рыхлого мелкого сгустка с низкой оптической плотностью) концентрацию раствора ДНК увеличивали и процедуру проверки повторяли.

Определение ДНКазной абзимной активности в препаратах иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови больных и здоровыхлиц

Реакцию ставили в дублях. В исходном варианте метода к 0.1 мл раствора ДНК (500-600 мкг/мл) добавляли 0.2 мл препарата IgG (0.5 мг/мл) и

0.1 мл трис-HCl буфера pH 7.4 с 0.01М MgCl2. Контроль - буферный раствор. Предварительные эксперименты показали. что в присутствии только катионов магния обнаруживается лишь небольшое количество проб с абзимной активностью. Ранее было доказано. что абзимы с ДНКазной активностью. выделенные из одного источника. могут активироваться самыми различными катионами металлов [6]. Отсюда в последующих экспериментах в буферный раствор добавлялись хлорид магния. кальция. цинка и сульфат меди в концентрации 0.001М.

Постановка реакции осуществляется в центрифужных пробирках. После инкубации в течение 20 часов при 37°С на поверхность проб

наслаивали 20 мкл 0.75% раствора риванола и встряхивали до получения сгустка.

Результаты реакции сгусткообразования выражали в баллах: 0 баллов -отсутствие активности (крупный. компактный сгусток); 1 балл -

минимальная активность (мелкий. рыхлый сгусток); 2 - слабая активность (рыхлый сгусток. хлопья. нити); 3 - умеренная активность (хлопья. нити); 4 -высокая активность (распад сгустка; мелкие хлопья. нити); 5 - максимальная активность (полный распад сгустка с образованием гомогенной взвеси.

При количественном учете реакции по окончании инкубации проводили экстракцию хромогена риванола из сгустка.

Для этого пробу с начальным сгустком отбирали. ее отмывали однократно дистиллированной водой. центрифугируя при 1000 об/мин в течение 1 мин. надосадок сливали. К осадку сгустка ДНК добавляли 0.5 мл 1 н HCl. Для экстракции риванола пробы кипятили в течение 1-2 минут. Далее 0.2 мл пробы вносили в стандартный планшет для ИФА и фотометрировали на мультискане Ф300 (методика №1. максимум

поглощения светофильтра - 405 нм). Величину ДНКазной активности (ДА) определяли по убыли оптической плотности в опытных пробах в сравнении с контролем. Результат выражали в условных единицах.

Их устанавливали аналогично с другими методами оценки ферментативной активности деполимеризующего действия (как. например. для определения амилазы по Меньшикову с соавт [4]).

При этом из среднего значения оптической плотности контрольных проб вычитали среднее значение опытных проб и делили этот показатель на среднее значение контролей.

Формула для определения ДНКазной активности (ДА) выглядит как

ДА = [(Ек - Е0)/Ек] * 100%.

где ДА - ДНКазная активность. выраженная в условных единицах (УЕ). Ек - оптическая плотность контрольных проб. Ео - оптическая

плотность опытных проб. Отсюда единица ДНКазной активности была эквивалентна проценту уменьшения оптической плотности в сравнении с контролем.

Оценка аналитических параметровметода

Нами была проведена оценка воспроизводимости и чувствительности усовершенствованного метода с использованием коммерческого препарата фермента панкреатической ДНКазы.

Установлено. что разработанная модификация не ухудшила аналитических параметров метода в сравнении с традиционным учетом [2] на спектрофотометре. Коэффициенты вариации для опытных проб составили менее 10% как при учете на планшетном фотометре. так и при учете на спектрофотометре СФ-46; для контрольных проб 3.39% и 3.38%. соответственно.

При проверке чувствительности предлагаемого способа при 30 и 60 мин инкубации оказалось. что за 30 мин достоверно открывается до 10 нг ДНКазы (по панкреатическому энзиму). За 1 час - до 1-2 нг. Когда же инкубация была увеличена до суток. то чувствительность разработанного способа увеличилась более. чем на порядок.

Данные эксперименты подтвердили высокие аналитические характеристики нашего метода.

Предложенный способ оценки ДНКазной абзимной активности с использованием хромогена риванола обладает рядом преимуществ перед другими методами оценки нуклеазной абзимной активности. Способ не требует специальных субстратов и дорогостоящего оборудования. Используемый хромофор риванол дешев. легко доступен. безопасен. обладает высокой молярной экстинкцией. что увеличивает чувствительность способа. Введение полуколичественного учета реакции дает возможность массовой постановки и внедрения методики в клинические условия.

Таким образом. разработанные нами микромодификации методов определения ДНКазной и БАПНА-амидазной активности уменьшили более чем в 20 раз объем используемых реагентов. а также ускорили учет реакций с сохранением их высокой чувствительности и воспроизводимости.

Определение ДНКазной и БАПНА-амидазной абзимной активности у больных герпетической инфекцией и у больных вирусными гепатитами.

Предложенные методы были апробированы при изучении ДНКазной и протеолитической абзимной активности у больных герпетической инфекцией (инфекционным мононуклеозом. ветряной оспой. опоясывающим лишаем) и вирусными гепатитами ВиС.

Оказалось. что при определении ДНКазной активности препаратов в присутствии катионов (М£(П). Са(11). Zn(II), Си(11)) из 34 обследованных больных активность была обнаружена у 4 из 19 больных инфекционным мононуклеозом. 1 больного вирусным гепатитом. 4 из 6 больных ветряной оспой иу 1 больного опоясывающим лишаем.

БАПНА-амидазная активность была обнаружена у 9 из 19 больных инфекционным мононуклеозом. 3 больных из 8 вирусным гепатитом. 3 из 6 больных ветряной оспой.

В свою очередь. минимальная абзимная активность была обнаружена у 4 человек из 25 обследованных препаратов доноров.

Средние уровни ДНКазной активности в группе больных инфекционным мононуклеозом (Мср+ш) составили 12.88+2.99 Ед; в группе больных вирусным гепатитом 7.79+3.7; ветряной оспой и опоясывающим лишаем - 15.7+1.87 Ед. Достоверных отличий между группами выявить не удалось.

Средние уровни БАПНА-амидазной активности в группе больных инфекционным мононуклеозом (Мср+ш ЕОП) составили 0.026+0.002; в

группе больных вирусным гепатитом 0.03+0.003; ветряной оспой и опоясывающим лишаем - 0.034+0.004 ЕОП.

При этом были обнаружены достоверные различия в уровнях БАПНА-амидазной активности между группой больных ветряной оспой/опоясывающим лишаем и инфекционным мононуклеозом (р<0.05).

Полученные данные подтверждают возможность применения модифицированных методов определения ДНКазной и протеолитической активности для оценки абзимных АТ в клинических условиях. Способы пригодны для массовой постановки (одновременно можно учитывать до 3040 дублированных проб).

Заключение

1. Разработаны планшетные микромодификации способов определения ДНКазной и протеолитической абзимной активности. позволяющие уменьшить количество используемых реагентов не менее чем в 20 раз и автоматизировать учет реакции с применением отечественного фотометра Ф300.

2. Данные методики характеризуются высокой чувствительностью и воспроизводимостью (коэффициенты вариации внутри одного определения и между определениями не превышают 5-10%). Способы пригодны для массовой постановки в клинических условиях (одновременно можно учитывать реакцию 30-40 дублированных проб иммуноглобулинов. выделенных от разных больных).

Литература

1. Г енералов. П. И. Абзимная активность иммуноглобулинов / П. И. Генералов. - Витебск. 2000. - 105 с.

2. Генералова. А. Г. Оценка ДНКазной активности методом риванолового сгустка / А. Г. Генералова. П. И. Генералов // Клин. лаб. диагн. - 1997. - № 11. - С. 24. 33-34.

3. Горячковский, М. А. Справочное пособие по клинической биохимии / М. А. Горячковский. - Одесса: ОКФА, 1994. - С. 225-228.

4. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / под ред. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

5. Каталитические аутоантитела - новый молекулярный инструмент в кардиологии и офтальмологии / К. А. Мальцев [и др.] // Тер. арх. - 2006. - №

11. - С. 70-76.

6. Невинский, Г. А. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии / Г. А. Невинский, Т. Г. Канышкова, В. Н. Бунева // Биохимия. - 2000. - Т. 65, № 11. - С. 1245-1255.

7. Способ определения ДНКазной активности: пат. C1 BY, МПК С12 Q1/34, С12 N9/22 / К. С. Азаренок, И. И. Генералов, А. Г. Голубева [и др.]. -№ 243А; заявл. 06.04.1993; опубл. 14.03.1996 // Афщыйны бюлетэнь / Дзярж. пат. ведамства Рэсп. Беларусь. - 1996. - № 3.

8. Способ очистки иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови и устройство для аффинной хроматографии: пат. C1 BY, МПК 6G01N 33/48 / М. Р. Конорев, И. И. Генералов, И. В. Козловский [и др.]. - № 3205; заявл. 05.02.1996; опубл. 30.12.1999 // Афщыйны бюлетэнь / Дзярж.пат.ведамства Рэсп. Беларусь. - 1999. - № 4.

9. Каталитические аутоантитела как новый молекулярный инструмент в ревматоидной практике / А. Н. Хитров [и др.] // Тер. арх. - 2006. - № 6. - С. 59-66.

10. Catalytic Antibodies / ed. Keinan Eh. Weinheim. - Wiley-Vch Verlag, 2005. - 578 p.

11. High levels of catalytic antibodies correlate with favorable outcome in sepsis / S. Lacroix-Desmazes [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - N 102 (11). - P. 4109-4113.

Исследование выполнено при поддержке Белорусского Республиканского Фонда фундаментальных исследований. грант №Б08Р-010