Повышение воспроизводимости определения газохроматографических индексов удерживания с использованием капиллярных колонок

Е. С. Уколова, И. Г. Зенкевич

ПОВЫШЕНИЕ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ИНДЕКСОВ УДЕРЖИВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КАПИЛЛЯРНЫХ КОЛОНОК

Введение. Проблемы хроматографической идентификации неизвестных соединений относятся к числу наиболее сложных в современной аналитической органической химии. В общем случае следует иметь в виду не выбор из сравнительно небольшого числа заранее известных веществ, а в первую очередь такие задачи, когда априорные сведения о природе объектов минимальны и практически всю информацию приходится извлекать из совокупностей различных аналитических сигналов.

Величины удерживания, в частности индексы удерживания (ИУ, обозначение в формулах Ш) [1], являются наиболее воспроизводимой хроматографической характеристикой аналитов и на их основе проводят идентификацию органических соединений и определение физико-химических характеристик.

Концепция индексов удерживания широко применяется в хроматографии более 50 лет [2]. Повышение надежности хроматографической идентификации с использованием ИУ предполагает подробную характеристику факторов, влияющих на их воспроизводимость. Основными факторами, снижающими межлабораторную воспроизводимость ИУ, являются температурная зависимость [1, 3-5] и в значительно большей степени адсорбция определяемых веществ на поверхностях раздела фаз в насадочных и капиллярных колонках [6, 7]. В работах [8-11] приведены также зависимости индексов от дозируемых в хроматографическую колонку количеств аналитических образцов.

Эффекты первого типа определяют разброс ИУ, измеренных на близких по параметрам колонках при различных температурах, вторые — при использовании различных колонок или различающихся по инертности хроматографических систем [12]. Кроме того, на воспроизводимость ИУ влияет способ их расчёта и возможная нелинейность зависимостей ИУ реперных компонентов от времени их удерживания.

Однако существует ещё один фактор, влияющий на межлабораторную воспроизводимость ИУ [13, 14]. Как ни парадоксально, но его принимают во внимание исключительно редко. Это давно известная, но далеко не всегда учитываемая зависимость индексов от соотношения реперных и анализируемых компонентов. Вероятно, что одной из причин некоторого пренебрежения влиянием относительных количеств компонентов смесей на их ИУ оказалось отсутствие упоминания этого эффекта в первой работе Ковача [2].

В отличие от зависимостей ИУ от температуры [1, 3-5] и количества неподвижной фазы в хроматографической колонке [6, 7] влияние соотношения характеризуемых и реперных компонентов, если и рассматривали, то лишь на полуколичественном уровне [8, 9]. Впервые эту зависимость описали математическим уравнением в публикации [12], а дополненное и модифицированное уравнение было предложено в статье [13].

Для оценки соотношения характеризуемых и реперных компонентов целесообразно использовать не отношение их масс (чаще всего оно неизвестно), а отношение (у) непосредственно измеряемых площадей хроматографических пиков характеризуемых

© Е. С. Уколова, И. Г. Зенкевич, 2011

аналитов (Бх) к сумме площадей пиков соседних реперных компонентов (Бп + Бп+^ при условии Ьп,п < Ьк,х < ^^,п+г; г > 1) [12, 13, 15]:

Sx

Y

Sn + S

n+i

Для описания зависимости ИУ от соотношения количеств характеризуемых анали-тов и реперных компонентов в работе [13] было предложено уравнение

RIx = RIx,0 + k ln у (у > 0),

где значения RIXj0 и k (для распределительного варианта газохроматографического анализа k > 0), вычисляют методом наименьших квадратов. Коэффициент k характеризует «чувствительность» ИУ к изменениям соотношения площадей пиков определяемых и реперных компонентов.

Авторами предлагается метод выявления и устранения дополнительных погрешностей определения газохроматографических ИУ, обусловленных их зависимостью от соотношения характеризуемых и реперных компонентов. Поскольку значительная доля современных хроматографических определений выполняется с использованием капиллярных колонок, все обсуждаемые эффекты рассматриваются только для колонок данного типа.

Экспериментальная часть. 1. Приготовление смесей. Промежуточные растворы пяти органических соединений с ИУ в диапазоне от 1170 до 1840 готовили следующим образом: в хроматографических виалах объёмом 2 мл последовательно смешивали по 100 мкл выбранных компонентов (табл. 1). Приготовление смесей и их растворов проводили шприцами “Hamilton” ёмкостью 100 и 1000 мкл.

Таблица 1

Компоненты промежуточных растворов

№ раствора Компонент № раствора Компонент № раствора н-Алканы

1 1-Деканол Аценафтен Пропиофенон 2 Валерофенон Антрацен C6-Ci3, См 3 С18

№ образца Соотношение

2 1 1 8

3 8 1 1

4 8 8 1

5 1 8 1

Таблица 2 Модельный образец № 1 готовили, смешивая

Соотношения для образцов промежуточные растворы в соотношении объёмов

1:1:1. Остальные образцы готовили по аналогичной схеме, но в иных соотношениях (табл. 2).

Для анализа каждый образец разбавляли в 1000 раз бензолом.

2. Газохроматографический анализ проводили на приборе “Shimadzu QP 5000” с квадрупольным масс-анализатором, режим ионизации — электронный удар; колонка HP-5 MS длиной 25 м; внутренний диаметр колонки 0,2 мм; толщина плёнки фазы 0,33 мкм. Режим программирования температуры: 40-280 °С; скорость нагрева 10°/мин; время начала регистрации (отсечения растворителя) 6 мин; температура испарителя 260 °С; температура интерфейса 280 °С. Скорость потока газа-носителя (гелий) 1,2 мл/мин. Дозирование жидких образцов в режиме без сброса проводили микрошприцем “Hamilton” (10 мкл); объём проб 1,0 мкл. Хроматограммы регистрировали в режиме полного

ионного тока в диапазоне 39-700 m/z. Для измерения времени удерживания и площадей пиков использовали пакет программ GC-MS Solution. Для определения ИУ применяли смесь реперных н-алканов (Supelco), входящих в состав промежуточного раствора № 3. Статистическую обработку данных, вычисление линейных индексов удерживания и параметров уравнений линейной регрессии проводили с использованием простейших программ (QBasic), Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2003) и ORIGIN 8.0.

Результаты и их обсуждение. Единственным используемым в настоящее время способом регистрации времён удерживания в газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также в капиллярном электрофорезе является их измерение в точках максимумов хроматографических пиков. Так, в табл. 3 представлены значения времени удерживания компонентов модельных образцов, вычисленные «классическим» способом — по максимумам хроматографических пиков. Программное обеспечение GC-MS Solution позволяло определять время удерживания до одной тысячной доли минуты.

Таблица 3

Значения времени удерживания компонентов образцов 1—5, измеренные по максимумам хроматографических пиков

Компонент Время удерживания при соотношении промежуточных растворов в модельных образцах Среднее время удерживания, мин

1:1:1 1:1:8 8:1:1 8:8:1 1:8:1

Си 9,468* 9,507 9,492 9,475 9,472 9,483 ±0,016

Пропиофенон 10,691 10,705 10,707 10,740 10,772 10,723 ±0,033

Cia 11,069 11,118 11,071 11,071 11,073 11,080 ±0,021

1-Деканол 12,187 12,201 12,256 12,227 12,206 12,215 ±0,027

Cia 12,591 12,643 12,599 12,596 12,597 12,605 ±0,021

Валерофенон 13,610 13,627 13,629 13,660 13,688 13,643 ±0,031

Аценафтен 15,634 15,641 15,674 15,567 15,644 15,632 ±0,039

См 16,683 16,735 16,684 16,684 16,688 16,695 ±0,022

Cl8 19,071 19,125 19,073 19,073 19,176 19,104 ±0,046

Антрацен 19,543 19,542 19,541 19,548 19,557 19,546 ±0,007

Из приведённых данных следует, что диапазон стандартных отклонений времени удерживания составляет от 0,007 до 0,046 мин при среднем значении 0,026 мин (примерно 2 с). Причиной таких вариаций следует считать изменение соотношений характеризуемых и реперных компонентов. Конечно же, подобная погрешность является не столь существенной и ею вполне можно пренебречь, но даже от этого незначительного разброса можно избавиться, используя иной способ вычисления параметров удерживания, а именно вычисление времени удерживания по точкам на передних фронтах хроматографических пиков. Соответствующие данные приведены в табл. 4.

Время удерживания, измеряемое по передним фронтам хроматографических пиков, определяли на одном и том же уровне аналитического сигнала 400 000 усл. ед. (в символике ПО GC-MS Solution).

Отказ от стандартного способа регистрации времени удерживания уменьшает вариации его стандартных отклонений до 0,008-0,015 мин (среднее значение 0,006 мин), что примерно в пять раз меньше среднего стандартного отклонения, вычисленного по максимумам хроматографических пиков. В свою очередь, этот вариант регистрации даёт возможность повысить воспроизводимость значений ИУ.

Значения времени удерживания компонентов образцов 1—5, измеренные по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов

Компонент Время удерживания при соотношении промежуточных растворов в модельных образцах Среднее время удерживания, мин

1:1:1 1:1:8 8:1:1 8:8:1 1:8:1

Си 9,435 9,465 9,434 9,451 9,431 9,443 ±0,015

Пропиофенон 10,663 10,660 10,656 10,654 10,654 10,657 ±0,004

С12 11,044 11,038 11,035 11,036 11,037 11,038 ±0,004

1-Деканол 12,169 12,151 12,159 12,158 12,159 12,159 ±0,006

Си 12,561 12,568 12,570 12,569 12,555 12,565 ±0,006

Валерофенон 13,582 13,581 13,575 13,575 13,576 13,578 ±0,003

Аценафтен 15,608 15,602 15,595 15,595 15,599 15,600 ±0,005

См 16,657 16,653 16,647 16,647 16,649 16,651 ±0,004

С18 19,041 19,040 19,035 19,035 19,036 19,037 ±0,003

Антрацен - 19,517 19,509 19,500 19,503 19,507 ±0,008

Зависимость хроматографических ИУ от соотношения характеризуемых и реперных компонентов представляется одним из главных факторов, определяющих межла-бораторную воспроизводимость значений индексов. Этот эффект в случае насадочных колонок сопоставим с температурной зависимостью, тогда как для более эффективных капиллярных колонок он заметно меньше, что обусловливает их преимущества при определении и использовании данных аналитических параметров [14].

Линейные индексы удерживания (Шх) вычисляют по формуле

Шж = 100?? + 100—^,

^п+1 _ гп

где Ьх — время удерживания анализируемого соединения; Ьп и £п+1 — время удерживания н-алканов с п и п +1 атомами углеродов в молекуле.

В настоящей работе все аналиты характеризовали линейными ИУ прежде всего потому, что вариации Ш(у) проявляются вне зависимости от выбранной формулы расчёта индексов. Кроме того, линейные ИУ являются наиболее часто используемой формой индексов.

В табл. 5 представлены ИУ компонентов модельных образцов, вычисленные по максимумам хроматографических пиков.

Таблица 5

Воспроизводимость индексов удерживания, вычисленных по максимумам

хроматографических пиков

Компонент Воспроизводимость ИУ при соотношении промежуточных растворов в модельных образцах Средние значения индексов

1:1:1 1:1:8 8:1:1 8:8:1 1:8:1

Пропиофенон 1176,4 1174,4 1176,9 1179,3 1181,2 1177,6 ±2,6

1-Деканол 1273,5 1271,0 1277,6 1275,8 1274,3 1274,4 ±2,5

Валерофенон 1374,7 1372,1 1375,6 1378,1 1380,0 1376,1 ±3,1

Аценафтен 1523,1 1519,8 1525,8 1518,0 1523,4 1522,0 ±3,1

Антрацен 1839,5 1834,9 1939,2 1839,8 1830,6 1836,8 ±4,0

Значения параметра у и 1п у для всех компонентов модельных образцов указаны в табл. 6.

Таблица 6

Значения параметра у(1п у) для компонентов модельных образцов

Компонент уО п у) при соотношении промежуточных растворов

1:1:1 1:1:8 8:1:1 8:8:1 1:8:1

Пропиофенон 0,28

1-Деканол 0,26

Валерофенон 0,38

Аценафтен 0,30

Антрацен 0,06

Для всех соединений увеличение параметра у при постоянном объёме проб приводит к увеличению индексов. Поскольку при определении ИУ относительные количества реперных и характеризуемых компонентов в большинстве случаев не контролируют, то столь отчетливо выраженная зависимость Ш(у) может быть источником дополнительных межлабораторных погрешностей и снижать воспроизводимость полученных данных.

Но даже эту зависимость можно скомпенсировать, изменив способ регистрации аналитического сигнала. Идея была высказана Кейлемансом ещё в 1959 г. [10]. Для компенсации зависимости ИУ от дозы было предложено вычислять ИУ не по максимумам хроматографических пиков, а по их передним фронтам, однако в то время это предполагало графическое измерение так называемых расстояний удерживания, вследствие чего оказалось неудобным в практической работе и не получило распространения. Следует заметить, что Кейлеманс рассматривал данные эффекты исключительно для на-садочных колонок.

В результате компьютерного моделирования формы хроматографических пиков [13] было установлено, что, несмотря на существенное искажение формы пиков в области их максимумов, профили начальных участков остаются практически неизменными. Неизменность профилей аналитических сигналов на начальных участках хроматографических пиков вне зависимости от их искажений за счёт вариации количеств аналитов означает, что если вычисление ИУ «классическим» способом осложняется существованием зависимости Ш(у), то для получения более воспроизводимых значений ИУ их следует вычислять по передним фронтам хроматографических пиков в точках, соответствующих одинаковым интенсивностям сигналов как характеризуемых, так и реперных компонентов.

В табл. 7 приведены значения ИУ тех же соединений, что и в табл. 5, вычисленные не «классическим» способом, а по точкам на передних фронтах при одинаковой интенсивности аналитических сигналов.

Таким образом, если отказаться от «классического» способа регистрации времени удерживания, видно, что вариации стандартных отклонений индексов удерживания составляют от 0,2 до 0,6 (при среднем значении 0,4). Это примерно в восемь раз меньше, чем стандартные отклонения индексов, вычисленных по максимумам хроматографических пиков.

В работе [13] отмечено, что преимущества капиллярных колонок состоят не только в их большей эффективности по сравнению с насадочными, но и в существенно

меньшей зависимости измеряемых с их использованием ИУ от соотношения количеств характеризуемых и реперных компонентов. Следовательно, насадочные колонки более подходят для выявления и характеристики рассматриваемых эффектов, а капиллярные — для практической работы. Однако, исходя из приведённых данных (см. табл. 5 и 7) видно, что даже при использовании высокоэффективных капиллярных колонок гораздо более воспроизводимые значения индексов получаются при расчёте ИУ по начальным участкам хроматографических пиков. Воспроизводимость значений ИУ, вычисленных по передним фронтам хроматографических пиков в точках, соответствующих одинаковым интенсивностям сигналов, достигает долей единиц индекса.

Таблица 7

Воспроизводимость индексов удерживания, вычисленных по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов

Компонент Воспроизводимость ИУ при соотношении промежуточных растворов в модельных образцах Среднее значение индекса

1:1:1 1:1:8 8:1:1 8:8:1 1:8:1

Пропиофенон 1176,3 1176,0 1176,3 1175,9 1176,2 1176,1 ±0,2

1-Деканол 1274,2 1272,7 1273,2 1273,2 1273,9 1273,4 ±0,6

Валерофенон 1374,8 1374,4 1374,0 1374,0 1374,8 1374,4 ±0,4

Аценафтен 1523,2 1522,8 1522,6 1522,6 1523,1 1522,9 ±0,3

Антрацен - 1840,0 1839,7 1838,9 1839,1 1839,4 ±0,5

В современных вариантах программного обеспечения для регистрации и первичной обработки хроматографической информации («Мультихром», “UniChrom”, “GC-MS Solution”, «Хромотек») вариант расчёта параметров удерживания по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов специально не предусмотрен. Однако данную операцию вполне возможно выполнять вруч-

нук>.

Приведенные вариации ИУ и у позволяют сделать вывод о влиянии способов регистрации времени удерживания на зависимость индексов удерживания от соотношения количеств характеризуемых и реперных компонентов. Параметры соответствующего регрессионного уравнения (2), вычисленные методом наименьших квадратов по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов, приведены в табл. 8 (значения RIo, средние значения RI, взятые из табл. 5 и 7, значения коэффициентов k, коэффициенты корреляции г, значения генеральной дисперсии So).

Полученные значения RI и RI0 по передним фронтам хроматографических пиков практически во всех случаях совпадают в пределах суммы их стандартных отклонений, чего нельзя сказать о значениях RI и RIo, рассчитанных «классическим» способом — по максимумам пиков. Следует отметить, что уравнение (2), по которому рассчитывали значения RIo, никогда прежде не использовали при расчёте индексов по точкам на передних фронтах хроматографических пиков. Сравнение значений RI и RIo наглядно иллюстрирует отсутствие зависимости RI(y) в случае расчёта значений индексов по передним фронтам хроматографических пиков и её заметное влияние на значение ИУ в случае расчёта индексов по максимумам.

Следовательно, значения RIo « RI представляют собой параметр регрессионного уравнения (RIo) и экспериментальное значение ИУ (RI) при lnу = 0, т. е. при у = 1.

В случае у =1 сумма площадей хроматографических пиков двух соседних реперных компонентов равна площади пика характеризуемого компонента.

Таблица 8

Параметры регрессионного уравнения (2), вычисленные по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов и максимумам хроматографических пиков

RI Rio к г So

По максимуму хроматографического пика

Пропиофенон

1177,6 ±2,6 1178,2 ±0,1 1,3 ±0,1 0,997 0,2

1-Деканол

1274,4 ±2,5 1275,3 ± 0,6 1,1 ±0,3 0,950 1,2

Валерофенон

1376,1 ±3,1 1376,2 ±0,1 1,4 ±0,1 0,998 0,3

Аценафтен

1522,0 ±3,1 1525,0 ± 0,9 1,1 ±0,4 0,950 1,3

Антрацен

1836,8 ±4,0 1841,5 ±3,6 1,4 ±1,4 0,744 2,4

По началу хроматографического пика

Пропиофенон

1176,1 ±0,2 1176,5 ±0,1 0,1 ±0,0 0,952 0,07

1-Деканол

1273,4 ±0,6 1273,6 ±0,1 -0,2 ±0,1 0,942 0,3

Валерофенон

1374,4 ±0,4 1374,2 ±0,2 -0,2 ±0,1 0,817 0,3

Аценафтен

1522,9 ±0,3 1523,4 ± 0,2 0,1 ±0,1 0,962 ОД

Антрацен

1839,4 ±0,5 1838,7 ± 0,2 -0,4 ±0,1 0,977 0,2

Данные таблицы позволяют охарактеризовать «чувствительность» ИУ к параметру Y, определяемую коэффициентом k. Значения этого коэффициента в целом оказываются существенно большими в случаях измерения ИУ по максимумам хроматографических пиков, чем по их передним фронтам. Следовательно, расчёт индексов по начальным участкам пиков даёт возможность скомпенсировать влияние зависимости RI(y).

Важно отметить, что для выявления и компенсации погрешностей определения ИУ, вызванных адсорбцией или влиянием температуры, необходимым условием является повторение анализа. В случае расчёта значений индексов удерживания по передним фронтам хроматографических пиков на одном и том же уровне аналитических сигналов повторного анализа не требуется.

Литература

1. Гольберт К. А., Вигдергауз М. С. Введение в газовую хроматографию. М., 1990. 351 с.

2. KovatsE. Gas Chromatographische Charakterisierung Organicher Verbindungen // Helv. Chim. Acta. 1958. Vol. 41. P. 1915-1932.

3. Вигдергауз М. С., Семенченко Л. В., ЕзрецВ. Ф., Богословский Ю. Н. Качественный газохроматографический анализ. М., 1978. 244 с.

4. Kowalska T., Heberger K., Gorgenyl M. Temperature dependencе of Kovats indices in gas chromatography. Explanation of empirical constants by use of transition-state theory // Acta Chromato-graphica. 2003. Vol. 13. P. 60-68.

5. Zellner B. A., BicchiC., Dugo P. Linear retention indices in gas chromatographic analysis: a review // Flavor Fragr. J. 2003. Vol. 23. P. 297-314.

6. Березкин В. Г., Никитина Н. С., Фатеева В. М. Феномен адсорбции и идентификация хроматографических зон в распределительной хроматографии // Докл. АН СССР. 1973. Т. 22. № 6. С. 1179-1183.

7. Березкин В. Г., Айвазов Б. В., Лебединская Л. Ф. Влияние адсорбции на межлаборатор-ную воспроизводимость величин удерживания в газожидкостной хроматографии при использовании насадочных колонок // Журн. аналит. химии. 1983. Т. 38. № 8. С. 1475-1478.

8. Vernon F., Suratman J. B. The retention index system applied to alkylbenzenes and monosubstituted derivatives // Chromatographia. 1983. Vol. 17. P. 600-604.

9. Vernon F., Suratman J.B. Errors in the measurement of retention index on packed columns // Chromatographia. 1983. Vol. 17. P. 597-599.

10. Кейлеманс А. Хроматография газов / пер. с англ. М., 1959. 320 с.

11. БерезкинВ. Г., Королёв А. А. Зависимость индексов удерживания от величины анализируемой пробы // Журн. аналит. химии. 1993. Т. 48. № 8. С. 1355-1360.

12. Зенкевич И. Г., Макаров Е. Д., Макаров А. А., Климова И. О. Способ и критерии контроля инертности газохроматографических систем // Аналитика и контроль. 2006. Т. 10. № 2. С. 175-183.

13. Зенкевич И. Г., Цибульская И. А. Влияние относительных количеств компонентов смесей на точность измерения газохроматографических индексов удерживания // Журн. аналит. химии. 1989. Т. 44. Вып. 1. С. 90-96.

14. Зенкевич И. Г., Ивлева Е. С. Зависимость газохроматографических индексов удерживания от соотношения характеризуемых и реперных компонентов // Журн. аналит. химии. 2011.

15. Зенкевич И. Г., Ивлева Е. С. Зависимость хроматографических индексов удерживания от соотношения характеризуемых и реперных компонентов. Тестирование различных колонок // Сорбционные и хроматографические процессы. 2011.

Статья поступила в редакцию 4 февраля 2011 г.