СПОСОБ ПРОГНОЗА ИНТЕРФЕРОН-РИБАВИРИНИНДУЦИРОВАННОЙ НЕЙТРОПЕНИИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С, ПОЛУЧАЮЩИХ КОМБИНИРОВАННУЮ ПРОТИВОВИРУСНУЮ ТЕРАПИЮ
METHOD OF PREDICTING INTERFERON-RIVABIRIN-INDUCED NEUROPENIA IN PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C OBTAINING COMBINED ANTIVIRAL THERAPY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно инфекционным болезням, и предназначено для использования в качестве простого и доступного способа прогноза in vivo развития нейтропении у больных хроническим гепатитом С (ХГС), получающих комбинированную противовирусную терапию (КПТ).
ХГС относится к числу наиболее распространенных вирусных заболеваний печени и отличается выраженной склонностью к развитию цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. В настоящее время лишь применение комбинированной терапии препаратами рибавирина и интерферона альфа-2b (ИФНα) может обеспечить предупреждение этих неблагоприятных исходов ХГС. Согласно современным данным сочетание ИФНα с рибавирином позволяет добиться стойкого вирусологического ответа в 54-68% случаев (И.П. Баранова и др. / Противовирусная эффективность различных форм интерферона в терапии хронического гепатита С // Инфекционные болезни 2010; 8(2): 13-16).
Существует множество способов прогноза и динамического контроля за эффективностью противовирусной терапии у больных ХГС, отличающихся по своей трудоемкости и материальным затратам: В.А.Исаков. Современная терапия хронического вирусного гепатита С: Какая длительность комбинированной терапии оптимальна и почему? // Клиническая гастроэнтерология и гепатология. - 2009. - Т.2, №1. - С.9-12; К.-П.Майер. Гепатит и последствия гепатита: Практ. руководство: пер. с нем. - 2-е изд., перераб. и доп. - М: ГЕОТАР-МЕД, 2004. - С.267; М.Г.Авдеева с соавт. Вирусные гепатиты: стратегия и тактика терапии, организация медицинской помощи: пособие для врачей. - Краснодар: ООО «Качество», 2009. - 262 с.; Инвитро-диагностика. Лабораторная диагностика (под редакцией Е.А.Кондрашевой, А.Ю.Островского. - 3-е изд., переработанное и дополненное. - М.: Медиздат, 2009. - 832 с., и др.
R
К сожалению, все эти способы прогноза эффективности КПТ, выбранные нами в качестве аналогов, не учитывают вероятность развития такого серьезного нежелательного эффекта проводимого лечения, как развитие интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении. Между тем, клинические исследования показали, что у 95% пациентов, проходящих антивирусное лечение, количество нейтрофилов находится ниже нормы, у 20% из них развивается тяжелая нейтропения, требующая коррекции проводимой КПТ (Г.В.Мельник и др. / Опыт комбинированной интерферонотерапии хронического гепатита С // Инфекционные болезни, 2007; 5(2): 75-78): 1) при снижении абсолютного числа нейтрофилов менее 750 кл/мкл рассматривается вопрос о снижении дозы ИФН в 2 раза; 2) у больных с абсолютным числом нейтрофилов менее 500 кл/мкл лечение прерывается до восстановления числа нейтрофилов выше 1000 кл/мкл (Инструкция по медицинскому применению препарата Альтевир. ООО «ФАРМАПАРК», утверждено главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко №01-11/36-06 от 02.03.2006).
Между тем, очень важно сохранить высокую терапевтическую дозу препаратов в первые 24 недели лечения, поскольку уменьшение доз противовирусного лечения в первые 20 недель приводит к значительному снижению стойкого вирусологического ответа, что несомненно снижает эффективность КПТ у больных ХГС (А.В.Астахин и др. / Концентрация и противовирусная активность интерферона-α в сыворотке крови больных с патологией печени // Журн. микробиол. - 2004. - №1. - С.59-62).
Поэтому весьма актуальной проблемой представляется разработка способа прогноза развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С, с целью наиболее раннего назначения препаратов, направленных на ее предупреждение.
Что касается интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении при хроническом гепатите С, то способы точного прогноза этого побочного эффекта, развивающегося у ряда больных в ходе КПТ, не разработаны. Используемые клиницистами критерии могут дать лишь весьма приблизительную прогностическую оценку течения заболевания (Арямкина О.А. Прогнозирование течения и исходов хронических гепатитов. Автореф. … дисс. докт. мед. наук. - Ульяновск, 2006, а также исследование, проведенное Soza et al. (Neutropenia during combination therapy of interferon alpha and ribavirin for chronic hepatitis C // Hepatology. - 2002. - Vol.36. - P.1273-1279)). Авторами была предпринята попытка разработать способ прогноза бактериальных осложнений у больных ХГС с развившейся интерферон-рибавирининдуцированной нейтропенией на фоне проведения им КПТ. У 119 больных ХГС, получающих КПТ препаратами рибавирина и интерферона α-2b, была детально изучена динамика уровня нейтрофилов крови и частота развития бактериальных осложнений у наблюдаемых пациентов в ходе проведения им терапии. Существенным недостатком этого исследования является отсутствие четких рекомендаций в качестве прогноза в каждом конкретном случае развития, прежде всего, самой интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении и предупреждения тем самым появления бактериальных осложнений и других нежелательных эффектов КПТ, что, безусловно, весьма важно для достижения максимальной объективности оценки эффективности и целесообразности проводимой терапии больным ХГС.
Таким образом, проблема развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С представляется весьма актуальной.
К сожалению, механизм развития нейтропении, обусловленной КПТ, до настоящего момента окончательно не установлен. Как известно, существует два типа гибели клеток - некроз и апоптоз. Первый ассоциируется с нарушением целостности клеточной мембраны вследствие повреждения или формирования пор. Апоптоз характеризует более мягкий процесс и предполагает серию морфологических изменений, приводящих к клеточной гибели (А.О.Буеверов и др. / Апоптоз мононуклеаров периферической крови и оценка эффективности противовирусной терапии хронического гепатита С // Клиническая медицина - 2006. - №9. - С.12-15). Учение об апоптозе как о физиологически детерминированной клеточной смерти, закодированной в клеточном геноме и поддающейся регуляции, было создано более 30 лет назад (Kerr J.F.R. et al. Brit. J. Cancer, 1972. - V.26, p.239-257). В настоящее время общепризнано, что этот процесс занимает ключевые позиции в элиминации аутореактивных Т-лимфоцитов, уничтожении опухолевых и вирусинфицированных клеток, в том числе и при HCV-инфекции (A.Canbay at al. / Apoptosis: the nexus of liver injury and fibrosis // Hepatology. - 2004. - V.39. - P.273-278).
Из патентной литературы известен индуктор апоптоза, в качестве которого предложены органоспецифические гомеопатические препараты, стимулирующие миелоидный и лимфоидный ростки кроветворения. Данный препарат можно использовать как критерий точного подбора препаратов пациентам с различной патологией (см. патент России №2144824, опубл. 27.01.2000 г., кл. A61K 35/00).
При детальном анализе всех перечисленных аналогов не удалось выделить из них ближайшего, который можно было бы назвать прототипом к заявляемому техническому решению.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа прогноза развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию, с помощью использования феномена индукции апоптоза нейтрофилов in vivo.
Для решения поставленной задачи определение апоптоза нейтрофилов in vivo осуществлялось методом кожного «окна». Метод оценки функционального состояния нейтрофилов, моноцитов и макрофагов в кожном «окне» был впервые предложен Rebuck J.W., Crowley J.N., Ann. N.Y. Acad. Sci, 1955, v.59, p.757-805. Метод заключается в том, что на скарифицированном участке кожи на внутренней поверхности предплечья фиксируют предметное стекло на 24 часа. После снятия стекла его подвергают окраске по Романовскому-Гимза, под световым микроскопом подсчитывают клетки и описывают их морфологические особенности, которые отражают состояние миелоидного ростка кроветворения и способность организма реагировать на изменяющиеся условия гомеостаза.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в том, что предложенный способ технически прост и экономически дешев, обеспечивает быстрое получение результата и не требует для своего проведения специально оборудованной лаборатории, а разработанный нами индуктор апоптоза нейтрофилов, благодаря своим свойствам, позволяет прогнозировать развитие интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных ХГС при проведении им в дальнейшем КПТ.
Поставленный технический результат достигается тем, что способ прогноза интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных хроническим гепатитом С, получающих комбинированную противовирусную терапию (КПТ), включает использование феномена индукции апоптоза нейтрофилов in vivo, определяемого методом кожного «окна».
В соответствии с изобретением у пациентов перед назначением им КПТ в мазках-отпечатках проводят определение индуцированного апоптоза нейтрофилов. При этом в качестве индуктора апоптоза нейтрофилов используют раствор, состоящий из 0,2 г Ребетола и 1,7 млн ME Альтевира, разведенных в 1,0 л изотонического раствора.
При выявлении в кожном «окне» высоких значений индуцированного апоптоза нейтрофилов ≥40% прогнозируют высокий риск развития нейтропении у данной категории пациентов в случае проведения им в дальнейшем КПТ.
Способ прогноза интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении у больных ХГС осуществляется следующим образом. Перед назначением КПТ у пациентов с участка кожи на ладонной поверхности правого и левого предплечья, предварительно обработанных 96% этиловым спиртом, скарификатором снимают слой эпидермиса 0,5×0,5 см до сосочкового слоя дермы без повреждения сосудов. В место скарификации правого предплечья вносят 0,3 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Затем этот участок покрывается стерильным предметным стеклом, которое фиксируется к коже лейкопластырем. На другое предметное стекло наносят с помощью микропипетки 3-5 капель индуктора апоптоза нейтрофилов (ИАН) и после его высыхания фиксируют на скарифицированном участке левого предплечья. В качестве ИАН используется раствор, состоящий из 0,2 г Ребетола и 1,7 млн ME Альтевира, разведенных в 1,0 л изотонического раствора. Данный состав ИАН разработан на кафедре инфекционных болезней (зав. каф., проф. Ю.М.Амбалов) совместно с кафедрой биохимии (зав. каф., проф. Микашинович) РостГМУ (ректор проф. А.А.Сависько) с учетом фармакокинетических и терапевтических свойств входящих в него препаратов (биодоступность, объем распределения в крови, максимальная концентрация препарата в крови, период полувыведения препарата) и является оптимальным для индукции апоптоза в кожном «окне». Через 24 часа стекла снимают, высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза. Полученные мазки-отпечатки микроскопируют в иммерсионной системе 1×450, подсчитывают процентное содержание нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов от общего числа клеток (200 клеток) и проводят сравнительную морфологическую оценку с подсчетом процента нейтрофилов, находящихся в апоптозе, в каждом "кожном окне".
5
5
5
5
Заявляемый способ основан на фактическом материале, полученном нами при углубленном клинико-лабораторном обследовании 125 больных с РНК-положительным ХГС (Таблица). Все они нуждались в проведении КПТ и не имели к ней противопоказаний. Генотип 1β HCV регистрировался в 54,4% случаев, 3а - в 25,6%, 2а - в 16,8%. У 4 больных генотип HCV не был идентифицирован. Количество РНК HCV менее 3×10 МЕ/мл было отмечено у 24,0% наблюдавшихся лиц, от 3×10 МЕ/мл до 6×10 МЕ/мл - у 60,8% и более 6×10 МЕ/мл - у 15,2%.
Характеристика больных ХГС, у которых было выполнено определение спонтанного и индуцированного апоптоза нейтрофилов методом кожного «окна», перед назначением им КПТ
Пол
М
n (%)
33 (26,4)
Ж
n (%)
92 (73,6)
Возраст
лет
35,2±7,6
Длительность заболевания
лет
11,7±5,6
Индекс массы тела (ИМТ)
кг/м<sup>2</sup>
24,7±4,2
ПЦР (РНК HCV)
положительно
Качественный состав мазков-отпечатков кожи у больных ХГС был представлен нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами. Относительное количество указанных клеток, выделяемых на стекло с кожи правого предплечья контрольного «окна», составило соответственно 63,8±2,6%, 33,1±2,9% и 3,1±0,4%. Количественный состав клеток в мазках-отпечатках с кожи левого предплечья, т.е. опытного «окна», был практически идентичным (р>0,05).
Процент нейтрофилов, подвергнутых спонтанному апоптозу на правом предплечье, составил в среднем 7,5±2,5%. На левом предплечье у 108 пациентов  (86,4%) уровень индуцированного апоптоза не имел достоверных отличий с контролем (р>0,05), в дальнейшем при проведении КПТ уровень нейтрофилов в крови у них оставался в пределах допустимой нормы. У 17 больных ХГС (13,6%) процент сегментоядерных нейтрофилов, вступивших в апоптоз под действием ИАН, составил 62,5±22,3%, что значительно превысило средний показатель спонтанного апоптоза у этих пациентов на правом предплечье (р<0,001). Именно у данной категории лиц в последующем на разных этапах проведения противовирусной терапии была отмечена выраженная нейтропения, требующая коррекции КПТ либо ее прекращения. Таким образом, индукция апоптоза нейтрофилов является одним из наиболее существенных механизмов действия сочетания препаратов ИФНα и рибавирина как в методике "кожного окна", так и в условиях целостного организма.
Заявленный способ технически прост и экономически незатратен, обеспечивает быстрое получение результата и не требует для своего проведения специально оборудованной лаборатории, а также позволяет прогнозировать и предупреждать развитие интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении, повышая тем самым эффективность проводимой КПТ.
Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Больной N., 38 лет (и.б. №624-10), обратился в Гепатологический центр г. Ростова-на-Дону 24.03.2010 г., где у него в крови были обнаружены IgG к структурным и неструктурным белкам HCV методом ИФА, а также РНК HCV 1β-генотип методом ПЦР. Учитывая полученные результаты исследований, был поставлен диагноз: Хронический гепатит С, стадия реактивации. В связи с наличием показаний больному было назначено проведение комбинированной противовирусной терапии: «Альтевир» в/м 3 млн ME 3 раза в неделю и «Ребетол» перорально 1000 мг в сутки в 2 приема утром и вечером. Перед началом КПТ у больного определили уровень апоптоза нейтрофилов, спонтанный и индуцированный, методом кожного «окна». Показатель спонтанного апоптоза нейтрофилов в контрольном кожном «окне» составил 7%; в кожном «окне», где был нанесен ИАН, - 60%. Позже, через 6 недель от начала КПТ, у больного начала развиваться нейтропения. Поскольку абсолютное число нейтрофилов снизилось до 750-700 кл/мкл, то доза Альтевира была уменьшена на 50%, однако нейтропения продолжала прогрессировать и достигла уровня 500 кл/мкл, что потребовало прекращения КПТ.
Больной Р., 40 лет (и.б. №1238-10), страдающий ХГС, 3а генотипом HCV, поступил в Гепатологический центр г. Ростова-на-Дону 16.08.2010 г. для проведения противовирусной терапии. До ее начала у пациента разработанным способом было выполнено определение спонтанного и индуцированного апоптоза нейтрофилов. Процент спонтанного апоптоза нейтрофилов в контрольном кожном «окне» составил 8%. В опытном кожном «окне» процент сегментоядерных нейтрофилов, вступивших в апоптоз, составил 9%. В течение 24 недель проведения КПТ у больного абсолютное числом нейтрофилов оставалось в пределах 1200-1000 кл/мкл, что не требовало коррекции проводимого лечения.
Больная С., 34 года (и.б. №1365-10), страдающая ХГС в течение 9 лет, поступила в Гепатологический центр г. Ростова-на-Дону 22.10.2010 г. У пациентки методом кожного «окна» было выполнено определение спонтанного и индуцированного апоптоза нейтрофилов. Процент спонтанного и индуцированного апоптоза нейтрофилов составил 5% и 55% соответственно. Учитывая результаты пробы, больной на протяжении всего периода КПТ дополнительно проводилось еженедельное профилактическое в/в введение гемолизата аутокрови, одним из эффектов которого, как известно, является его стимулирующее воздействие на клетки миелоидного ряда (А.В. Усаткин. Клинико-патогенетическая оценка лечебной эффективности гемолизата аутокрови у больных рожей: Автореф. дисс. … канд. мед. наук. - Ростов н/Д, 2002. - 20 с.). В течение 24 недель проведения КПТ абсолютное число нейтрофилов у больной оставалось в пределах 1150-1000 кл/мкл.
В соответствии с заявленным способом это означает, что определение уровня индуцированного апоптоза методом кожном «окна» у больных ХГС позволяет в дальнейшем прогнозировать у них вероятность развития интерферон-рибавирининдуцированной нейтропении.