Способ фракционирования ниосом
METHOD FOR FRACTIONATION OF NIOSOMES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения фракций ниосом, и может быть использовано для исследования везикул и в терапевтических целях.
Уровень техники
Известен способ получения наночастиц низкомолекулярного хитозана, включающий приготовление раствора, предварительно очищенного низкомолекулярного хитозана в фильтрованной 1-2 мас. % водной уксусной кислоте, прибавление растворов гидроксидов щелочных металлов или аммония в течение 2 ч, диспергирование системы с помощью механической мешалки со скоростью 200-300 об/мин при температуре 20°С до рН 6,9-7,0, по окончании процесса дисперсию центрифугируют со скоростью 10000 об/мин и полученный твердый остаток редиспергируют в бидистилляте при механическом перемешивании со скоростью 200-300 об/мин при температуре 20°С (см. патент RU 2428432).
Рассмотренный способ характеризуется следующими недостатками: высокую продолжительность процесса диспергирования, сложность аппаратурного оформления и многостадийность процесса формирования наночастиц хитозана.
Известен способ получения экзосом из крови, включающий разделение крови на бесклеточную и клеточную фракции с помощью центрифугирования с последующим получением экзосом путем ультрацентрифугирования, при этом кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию, затем клетки крови последовательно, в две стадии, обрабатывают сначала буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, затем равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS, далее плазму и полученные супернатанты объединяют, удаляют клеточный дебрис и примеси неэкзосомального происхождения путем центрифугирования при 15000-20000 g в течение 10-20 минут и фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, а суммарный пул экзосом осаждают ультрацентрифугированием при 100000-160000 g в течение 60-120 минут. В способе, обработку буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, осуществляют в течение 5 минут с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта. В способе, обработку 0,15-0,35% раствором трипсина в PBS, осуществляют в течение 5 минут с последующим добавлением ингибитора фермента, перемешиванием, осаждением клеток крови центрифугированием в течение 20 минут при 300 g и сбором супернатанта (см. пат. RU №2556825).
Недостатком данного способа является длительность и сложность получения экзосом из крови в широкой лабораторно-диагностической практике.
Известен способ выделения высокодисперсных фрагментов пурпурных мембран, содержащих бактериородопсин из галофильных бактерий методом дезинтеграции, путем многократных процедур центрифугирования, промывки осадка и ресуспендирования в бидистилляте или солевых растворах, при этом с целью удешевления и ускорения процесса, а также получения гомогенных и мелких фрагментов пурпурных мембран размером от 50 до 400 нм, дезинтеграцию водной суспензии биомассы микроорганизмов проводят методом циклической экструзии под давлением от 10 до 150 МПа от 1 до 5 циклов, а последующую процедуру центрифугирования и отмывки в бидистиллированной воде осуществляют при 25000 g, 100000 g в течение 30 минут каждая до тех пор, пока отношение оптических плотностей суспензии фрагментов пурпурных мембран при длинах волн 280 и 560 нм не становится равным от 1,9 до 2,1. В способе, процедуру центрифугирования и отмывки в бидистиллированной воде осуществляют в два этапа, сначала при 25000 g в течение 30 минут, а затем при 100000 g в течение 30 минут попеременно (см. пат. RU №94033539).
Недостатками данного способа является большая продолжительность процесса ультразвукового диспергирования; малая производительность процесса; отсутствие возможности регулирования среднего размера фрагментов от величины ультразвукового воздействия.
Наиболее близким изобретением к описываемому способу по технической сущности является способ разделения липосом по плотности методом градиентного центрифугирования глицерина. После центрифугирования липосомы, выбранные из нескольких положений в таком градиенте, мигрируют как узкие полосы в положениях, близких к их исходным положениям, что указывает на то, что распределение липосом в первый градиент является результатом фракционирования на основе плотности. Молекулярно-ситовая хроматография, измерения мутности и захваченного объема показывают, что плотность липосом качественно связана с их размером, причем более крупные липосомы более плотные, чем более мелкие. Размеры, полученные с помощью электронной микроскопии указывают на то, что фракционирование эффективно для липосом диаметром от 200 до 600 А с максимальной эффективностью в диапазоне 200-300 А, где найдено большинство липосом (Goormaghtigh, Ε. Density-Based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation / E. Goormaghtigh, G. A. Carborough // Analytical biochemistry. - 1986. - №159. - P. 122-131).
Рассмотренный способ имеет ряд недостатков, основными из которых является: трудоемкость, длительность процесса, малая производительность процесса.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения являлась разработка такого способа фракционирования ниосом, который прост в исполнении, позволяет получить ниосомы достаточно однородного размера в больших количествах и в высоких концентрациях.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к сокращению длительности процесса, повышению его производительности, снижению трудоемкости получения фракций ниосом.
Технический результат достигается с помощью способа фракционирования ниосом, в котором производят центрифугирование, при этом 10 мл суспензии ниосом разбавляют 35 мл охлажденного 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) в пробирке типа Falcon, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 3 минут при 4°С, затем суперанатант переносят в чистую пробирку типа Falcon, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 1 часа при 4°С, осадок ниосом ресуспендируют в 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) до объема в 10 мл, хранят при температуре (2-8)°С.
Сущность способа фракционирования ниосом, включающий центрифугирование, при этом 10 мл суспензии ниосом разбавляют 35 мл охлажденного 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) в пробирке типа Falcon, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 3 минут при 4°С, затем суперанатант переносят в чистую пробирку типа Falcon, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 1 часа при 4°С, осадок ниосом ресуспендируют в 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) до объема в 10 мл, хранят при температуре (2-8)°С.
Краткое описание чертежей и их материалов
На фиг. 1, дан способ фракционирования ниосом, микрофотография частиц готовой ниосомальной дисперсии, полученная на приборе EVO LS 10 Carl Zeiss.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа фракционирования ниосом.
Пример №1.
Очистку ниосомальной дисперсии от крупных частиц (>1 мкм) и остатков компонентов ниосом проводят следующим образом: 6 мл суспензии ниосом разбавляют 30 мл охлажденного 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) в пробирке типа Falcon, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты при 2°С, затем суперанатант переносят в чистую пробирку типа Falcon, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1/4 часа при 2°С, осадок ниосом ресуспендируют в 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) до объема в 6 мл, хранят при температуре (2-8)°С.
Размер частиц составляет 500±130 нм. Наличие частиц размером более 500 нм, вероятно, можно объяснить образованием непрочных ассоциатов ниосом в растворе. Образование непрочных ассоциатов в растворах, содержащих ниосомы, было подтверждено в ходе исследования образцов после предварительной фильтрации дисперсий через фильтр с размером пор 220 нм методом зондовой и электронной микроскопии.
Пример №2.
Выполняется аналогично примеру 1, но 8 мл суспензии ниосом разбавляют 33 мл охлажденного 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) в пробирке типа Falcon, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 2 минут при 3°С, затем суперанатант переносят в чистую пробирку типа Falcon, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 0,5 часа при 3°С, осадок ниосом ресуспендируют в 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) до объема в 8 мл, хранят при температуре (2-8)°С.
Размер частиц составляет 350±95 нм. Также, как и в примере 1 наблюдалось образование непрочных ассоциатов в растворах, содержащих ниосомы.
Пример №3.
Выполняется аналогично примеру 1, но 10 мл суспензии ниосом разбавляют 35 мл охлажденного 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) в пробирке типа Falcon, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 3 минут при 4°С, затем суперанатант переносят в чистую пробирку типа Falcon, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 1 часа при 4°С, осадок ниосом ресуспендируют в 0,01 Μ фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) до объема в 10 мл, хранят при температуре (2-8)°С.
Размер частиц составляет 200±50 нм (фиг. 1).
Таким образом, оптимальным является пример 3. Рассмотренный способ позволяет получить ниосомы достаточно однородного размера в больших количествах и в высоких концентрациях, а также является простым в исполнении.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества: сокращение длительности процесса, повышение его производительности, снижению трудоемкости получения фракций ниосом.