ПОЛИМОРФНЫЕ И АМОРФНЫЕ ФОРМЫ (R)-2-ГИДРОКСИ-2-МЕТИЛ-4-(2,4,5-ТРИМЕТИЛ-3,6-ДИОКСОЦИКЛОГЕКСА-1,4-ДИЕНИЛ)БУТАНАМИДА
POLYMORPHOUS AND AMORPHOUS FORMS OF (R)-2-HYDROXY-2-METHYL-4-(2,4,5-TRIMETHYL-3,6-DIOXOCYCLOHEXA-1,4-DIENYL)BUTANAMIDE

Для настоящего изобретения испрашивается приоритет и преимущество по Предварительной патентной заявке США № 62/092,743, поданной 16 декабря 2014 г. и озаглавленной «Полиморфные и аморфные формы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида», и по Предварительной патентной заявке США № 62/133,276, поданной 13 марта 2015 г. и озаглавленной «Полиморфные и аморфные формы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида», содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте для любых целей.
Область техники, к которой относится изобретение
В настоящей заявке раскрыты композиции и способы, которые могут использоваться для лечения или подавления заболеваний, задержек в развитии и симптомов, связанных с нарушениями от окислительного стресса. Примеры таких нарушений включают митохондриальные заболевания, нарушения энергетического метаболизма, нейродегенеративные заболевания и болезни старения. В заявке также приведены способы получения таких композиций.
Предпосылки создания изобретения
Окислительный стресс вызывается нарушениями нормального окислительно-восстановительного состояния в клетках. Дисбаланс между рутинной выработкой и детоксификацией активных форм кислорода типа пероксидов и свободных радикалов может привести к окислительному повреждению клеточных структур и механизмов. Самым важным источником активных форм кислорода в нормальных условиях у аэробных организмов является, по всей видимости, утечка активированного кислорода из митохондрий при нормальном окислительном дыхании. Предполагается, что нарушения, связанные с этим процессом, способствуют митохондриальным заболеваниям, нейродегенеративным заболеваниям и болезням старения.
+
+
+
+
2
2
Митохондрии - это органеллы в эукариотических клетках, которые популярно называют “электростанцией” клетки. Одной из главных функций митохондрий является окислительное фосфорилирование. Молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) функционируют в качестве энергетической “валюты” или носителя энергии в клетке, а эукариотические клетки получают большую часть АТФ из биохимических процессов, протекающих в митохондриях. Эти биохимические процессы включают цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот или цикл Кребса), в котором из окисленного никотинамидадениндинуклеотида (NAD) образуется восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NADH + Н), и окислительное фосфорилирование, при котором NADH + H окисляется обратно в NAD. В цикле лимонной кислоты также происходит восстановление флавинадениндинуклеотида, или FAD, в FADH, причем FADH тоже участвует в окислительном фосфорилировании.
+
Электроны, высвобождаемые при окислении NADH + H, переносятся через ряд белковых комплексов (комплекс I, комплекс II, комплекс III и комплекс IV), известных как дыхательная цепь митохондрий. Эти комплексы встроены во внутреннюю мембрану митохондрий. Комплекс IV, в конце цепи, переносит электроны на кислород, который восстанавливается до воды. Энергия, выделяемая при прохождении этих электронов по комплексам, используется для создания протонного градиента через внутреннюю мембрану митохондрий, при этом образуется электрохимический потенциал на внутренней мембране. Другой белковый комплекс, комплекс V (который не связан непосредственно с комплексами I, II, III и IV), использует энергию, накопленную в виде электрохимического градиента, для превращения АДФ в АТФ.
Когда клетки в организме временно лишаются кислорода, используется анаэробное дыхание до тех пор, пока снова не появится кислород или клетка не умрет. При анаэробном дыхании пируват, образующийся при гликолизе, превращается в лактат. Считается, что накопление молочной кислоты ответственно за усталость мышц во время интенсивной активности, когда кислород не поступает в мышечные клетки. Когда же кислород снова появляется, лактат превращается обратно в пируват и используется при окислительном фосфорилировании.
Кислородное отравление или токсичность возникает при высоких концентрациях кислорода, которые могут нанести ущерб организму и увеличить образование свободных радикалов и других структур типа оксида азота, пероксинитрита и триоксидана. В норме организм обладает многими системами защиты от такого повреждения, но при высоких концентрациях свободного кислорода эти системы в конечном итоге со временем перегружаются, и скорость повреждения клеточных мембран превышает способность систем, контролирующих или восстанавливающих их. При этом происходит повреждение клеток и их гибель.
Качественные и/или количественные нарушения в переносе кислорода в ткани приводят к нехватке энергии при функционировании эритроцитов и способствуют различным заболеваниям типа гемоглобинопатии. Гемоглобинопатия - это тип генетического дефекта, который приводит к аномальной структуре одной из цепей глобина в молекуле гемоглобина. Распространенные гемоглобинопатии включают талассемию и серповидноклеточную анемию. Талассемия - наследственное аутосомно-рецессивное заболевание крови. При талассемии генетический дефект приводит к снижению скорости синтеза одной из цепей глобина, входящего в состав гемоглобина. В то время, как талассемия является количественной проблемой, при которой синтезируется слишком мало глобина, серповидно-клеточная анемия представляет собой качественную проблему синтеза неправильно функционирующего глобина. Серповидноклеточная анемия - это заболевание крови, характеризующееся тем, что эритроциты принимают аномальную, жесткую и серповидную форму. Серповидность уменьшает гибкость клеток и приводит к ограничению их движения через кровеносные сосуды, лишая кислорода ткани, лежащие дальше по течению.
Митохондриальные дисфункции способствуют различным заболеваниям. Некоторые митохондриальные заболевания обусловлены мутациями или делециями в митохондриальном геноме. Если некая пороговая доля митохондрий в клетке дефектна, а некая пороговая доля таких клеток в ткани содержит дефектные митохондрии, то могут возникнуть симптомы дисфункции тканей или органов. Может поражаться практически любая ткань, и имеет место большое разнообразие симптомов, в зависимости от степени вовлеченности различных тканей. Вот некоторые примеры митохондриальных заболеваний: атаксия Фридрейха (FRDA), наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON), митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактацидоз и инсульт (MELAS), миоклоническая эпилепсия со рваными красными мышечными волокнами (MERRF), синдром Лея, и расстройства дыхательной цепи. Большинство митохондриальных заболеваний затрагивают детей, у которых проявляются признаки и симптомы ускоренного старения, включающие нейродегенеративные заболевания, инсульты, слепоту, нарушения слуха, ухудшение зрения, диабет и сердечную недостаточность.
Атаксия Фридрейха - это аутосомно-рецессивное нейродегенеративное и кардиодегенеративное заболевание, вызванное снижением уровня белка фратаксина. Болезнь вызывает прогрессирующую потерю произвольной двигательной координации (атаксию) и сердечные осложнения. Симптомы обычно возникают в детском возрасте, причем заболевание постепенно ухудшается по мере взросления пациента; больные в конечном счете становятся прикованы к инвалидному креслу вследствие нарушения двигательной способности.
Наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) - это заболевание, которое характеризуется слепотой, возникающей в среднем в возрасте от 27 до 34 лет. Могут возникать и другие симптомы, такие как сердечные аномалии и неврологические осложнения.
Митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактацидоз и инсульт (MELAS) могут проявляться у младенцев, детей или молодых людей. Приступы, которые сопровождаются рвотой и судорогами, являются одним из самых серьезных симптомов; постулируется, что за гибель клеток и неврологические поражения ответственно нарушение метаболизма митохондрий в некоторых участках мозга, а не нарушение кровообращения, как это происходит при ишемическом инсульте.
Миоклоническая эпилепсия с разорванными красными мышечными волокнами (MERRF) входит в группу редких мышечных заболеваний, которые называют митохондриальными энцефаломиопатиями. Митохондриальные энцефаломиопатии - это заболевания, при которых возникает дефект в генетическом материале в той части клеточной структуры, которая выделяет энергию (митохондрии). Это может вызвать дисфункцию мозга и мышц (энцефаломиопатии). Всегда отмечается митохондриальный дефект, а также “рваные красные волокна” (аномалия ткани при осмотре под микроскопом). Наиболее характерным симптомом при синдроме MERRF являются миоклонические судороги, которые обычно бывают внезапными, кратковременными, с подергиваниями и спазмами, которые могут поражать конечности или все тело, а также может возникать расстройство артикуляции (дизартрия), атрофия зрительного нерва, невысокий рост, потеря слуха, деменция и непроизвольное подергивание глаз (нистагм).
Синдром Лея - редкое наследственное неврометаболическое заболевание, которое характеризуется дегенерацией центральной нервной системы, причем симптомы обычно возникают в возрасте от 3 месяцев до 2 лет и быстро прогрессируют. У большинства детей первыми признаками могут быть плохая сосательная способность, недержание головы и потеря двигательных навыков. Эти симптомы могут сопровождаться потерей аппетита, рвотой, раздражительностью, непрерывным плачем и судорогами. По мере прогрессирования заболевания симптомы также могут включать и общую слабость, отсутствие мышечного тонуса, эпизоды лактацидоза, что может привести к нарушению функции органов дыхания и почек. Также могут возникать проблемы с сердцем.
10
10
Недостаточность кофермента Q является расстройством дыхательной цепи с такими синдромами, как миопатия с непереносимостью физической нагрузки и периодическим появлением миоглобина в моче, которая проявляется атаксией, судорогами или умственной отсталостью и приводит к почечной недостаточности (Di Mauro et al. (2005) Neuromusc. Disord.,15:311-315), “Childhood-onset cerebellar ataxia and cerebellar atrophy” (Masumeci et al. (2001) Neurology 56:849-855; и Lamperti et al. (2003) 60:1206:1208); и инфантильная энцефаломиопатия, связанная с нефрозом. Биохимические измерения в гомогенатах мышц у пациентов с недостаточностью CoQ показали сильное снижение активности комплексов дыхательной цепи I и II + III при умеренном снижении комплекса IV (СОХ) (Gempel et al. (2007) Brain, 130(8):2037-2044).
Недостаточность комплекса I или недостаточность NADH-дегидрогеназы/NADH-CoQ-редуктазы является расстройством дыхательной цепи с симптомами, которые классифицируются по трем главным формам: (1) смертельное инфантильное мультисистемное расстройство, характеризующееся задержкой развития, мышечной слабостью, сердечными заболеваниями, врожденным лактацидозом и дыхательной недостаточностью; (2) миопатия, возникающая в детстве или во взрослой жизни и проявляющаяся в виде непереносимости физической нагрузки или слабости; и (3) митохондриальная энцефаломиопатия (включая MELAS), которая может возникнуть в детстве или во взрослой жизни и состоит из различных сочетаний симптомов и признаков, включая офтальмоплегию, судороги, деменцию, атаксию, потерю слуха, пигментную ретинопатию, сенсорную нейропатию и непроизвольные движения.
Недостаточность комплекса II или недостаточность сукцинатдегидрогеназы является расстройством дыхательной цепи с симптомами, включающими энцефаломиопатию и различные проявления, в том числе нарушение физического развития, отставание в развитии, гипотонию, летаргию, дыхательную недостаточность, атаксию, миоклонус и лактацидоз.
Недостаточность комплекса III или недостаточность убихинон-цитохром c-оксидоредуктазы является расстройством дыхательной цепи с симптомами, которые подразделяются на четыре главные формы: (1) смертельная инфантильная энцефаломиопатия, врожденный лактацидоз, гипотония, дистрофическая поза тела, судороги и кома; (2) энцефаломиопатии позднего возникновения (от детства до взрослой жизни): различные сочетания слабости, маленького роста, атаксии, деменции, потери слуха, сенсорной нейропатии, пигментной ретинопатии и пирамидальных признаков; (3) миопатия с непереносимостью физической нагрузки, развивающаяся в постоянную слабость; и (4) инфантильная гистиоцитоидная кардиомиопатия.
Недостаточность комплекса IV или недостаточность цитохром c-оксидазы является расстройством дыхательной цепи с симптомами, которые подразделяются на две главные формы: (1) энцефаломиопатия, при которой пациенты обычно нормальны в течение первых 6-12 месяцев жизни, но затем проявляют регрессию в развитии, атаксию, лактацидоз, атрофию зрительного нерва, офтальмоплегию, нистагм, дистонию, пирамидальные признаки, нарушения дыхания и частые судороги; и (2) миопатия с двумя основными вариантами: а) смертельная инфантильная миопатия - может возникнуть вскоре после рождения и сопровождаться гипотонией, слабостью, лактацидозом, рваными красными волокнами, дыхательной недостаточностью и почечными проблемами; и (b) доброкачественная инфантильная миопатия - может возникнуть вскоре после рождения и сопровождаться гипотонией, слабостью, лактацидозом, рваными красными волокнами, нарушением дыхания, но (если ребенок выживет) с последующим спонтанным улучшением.
Недостаточность комплекса V или недостаточность АТФ-синтазы является расстройством дыхательной цепи, включающим такие симптомы, как медленная прогрессирующая миопатия.
Синдром CPEO или хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия - это расстройство дыхательной цепи, включающее такие симптомы, как зрительная миопатия, пигментный ретинит или дисфункция центральной нервной системы.
Синдром Кернса-Сейра (KSS) представляет собой митохондриальное заболевание, характеризующееся триадой признаков, включая: (1) типичное начало у лиц моложе 20 лет; (2) хроническую, прогрессирующую, внешнюю офтальмоплегию; и (3) пигментную дегенерацию сетчатки. Кроме того, KSS может включать и нарушения сердечной проводимости, мозжечковую атаксию и повышение уровня белка в цереброспинальной жидкости (CSF) (напр., >100 мг/дл). Другие признаки, связанные с KSS, могут включать миопатию, дистонию, эндокринные аномалии (напр., диабет, замедление роста или маленький рост и гипопаратиреоз), двустороннюю сенсоневральную глухоту, деменцию, катаракту и ацидоз проксимальных почечных канальцев.
Наследуемые по материнской линии диабет и глухота (MIDD) представляют собой митохондриальное расстройство, которое характеризуется передающимся по материнской линии диабетом и сенсоневральной глухотой. В большинстве случаев MIDD вызывают точечные мутации в митохондриальном гене MT-TL1, кодирующем митохондриальную тРНК для лейцина, а в редких случаях в генах MT-TE и MT-TK, кодирующих митохондриальные тРНК для глутаминовой кислоты и лизина, соответственно.
Наряду с врожденными нарушениями, связанными с наследственно дефектными митохондриями, приобретенная митохондриальная дисфункция также способствует заболеваниям, особенно нейродегенеративным расстройствам, связанным со старением, типа болезней Паркинсона, Альцгеймера и Хантингтона. Частота соматических мутаций в митохондриальной ДНК возрастает экспоненциально с возрастом; у пожилых людей повсеместно встречается снижение активности дыхательной цепи. Митохондриальная дисфункция также причастна к эксцитотоксическим повреждениям нейронов типа связанных с цереброваскулярными инсультами, судорогами и ишемией.
ox
red
ox
ox
Некоторые из вышеприведенных заболеваний могут быть вызваны дефектами комплекса I дыхательной цепи. Перенос электронов из комплекса I на остальную часть дыхательной цепи опосредуется соединением кофермент Q (который также известен как убихинон). Окисленный кофермент Q (CoQ или убихинон) восстанавливается комплексом I до восстановленного кофермента Q (CoQ или убихинол). Восстановленный кофермент Q затем передает свои электроны на комплекс III дыхательной цепи, где он повторно окисляется до CoQ (убихинона). Затем CoQ может участвовать в дальнейших итерациях переноса электронов.
10
10
10
10
Существует очень мало способов лечения для пациентов, страдающих такими митохондриальными заболеваниями. Недавно для лечения атаксии Фридрейха было предложено соединение идебенон. Хотя клинические эффекты идебенона были сравнительно скромными, однако осложнения митохондриальных заболеваний могут быть настолько серьезными, что даже не очень полезная терапия предпочтительнее течения болезни без терапии. Было предложено и другое соединение, MitoQ, для лечения митохондриальных заболеваний (см. патент США № 7,179,928); клинические результаты по MitoQ пока не сообщались. Введение кофермента Q (CoQ) и витаминных добавок давало лишь кратковременные положительные эффекты в отдельных случаях KSS. Добавление CoQ также применялось для лечения дефицита CoQ с неоднозначными результатами.
Предполагается, что окислительный стресс играет важную роль в таких нейродегенеративных заболеваниях, как мотонейронная болезнь, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Мачадо-Джозефа, спиноцеребеллярная атаксия, рассеянный склероз (MS), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Считается, что окислительный стресс связан и с некоторыми сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также играет роль в ишемическом каскаде при реперфузионном повреждении кислородом после гипоксии. Этот каскад включает в себя как инсульты, так и инфаркты.
Теория накопления повреждений, также известная как свободно-радикальная теория старения, постулирует случайные эффекты свободных радикалов, образующихся при аэробном метаболизме, которые вызывают повреждения ДНК, липидов и белков и накапливаются с течением времени. Концепция свободных радикалов, играющих роль в процессе старения, была впервые выдвинута Himan D. (1956) “Aging - A theory based on free-radical and radiation chemistry,” J. Gerontol. 11, 298-300.
Согласно свободно-радикальной теории старения, процесс старения начинается с метаболизма кислорода (Valko et al. (2004) “Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence,” Mol. Cell. Biochem., 266, 37-56). Даже в идеальных условиях некоторые электроны “просачиваются” из цепи переноса электронов. Эти вытекающие электроны взаимодействуют с кислородом с образованием супероксидных радикалов, так что при физиологических условиях около 1-3% молекул кислорода в митохондриях превращаются в супероксид. Первичным сайтом повреждения радикалами кислорода из супероксидных радикалов является митохондриальная ДНК (мтДНК) (Cadenas et al. (2000) Mitochondrial free radical generation, oxidative stress and aging. Free Radic. Res, 28, 601-609). Клетка исправляет большую часть повреждений, нанесенных ядерной ДНК (nDNA), но исправление мтДНК, по-видимому, менее эффективно. Поэтому со временем накапливаются обширные повреждения мтДНК, которые отключают митохондрии, вызывая гибель клеток и старение организма.
Вот некоторые из заболеваний, связанных с возрастом: рак, сахарный диабет, гипертония, атеросклероз, ишемические/реперфузионные повреждения, ревматоидный артрит, нейродегенеративные расстройства, такие как слабоумие, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Заболевания, возникающие в результате процесса старения как физиологического спада, включают снижение мышечной силы, сердечной и легочной функции, зрения и слуха, а также появление морщин на коже и поседение волос.
Способность регулировать биологическую выработку энергии имеет применение и за пределами описанных выше заболеваний. Различные другие нарушения могут приводить к субоптимальным уровням энергетических биомаркеров (которые также иногда называют индикаторами энергетической функции), таких как уровень АТФ. Лечение этих расстройств также необходимо, чтобы модулировать один или несколько энергетических биомаркеров для улучшения здоровья пациента. В других применениях может потребоваться модулировать определенные энергетические биомаркеры от их нормальных значений у лиц, которые не страдают болезнями. Например, если какое-то лицо занимается чрезвычайно напряженным делом, то может потребоваться повысить уровень АТФ у этого лица.
Некоторые полиморфные или аморфные формы лекарственных средств могут иметь выгодные характеристики в сравнении с другими формами; например, повышенную стабильность, повышенную растворимость, лучшие технологические свойства, отсутствие ассоциированных токсичных растворителей и большую чистоту.
В примере 16 заявки PCT/US2008/082374, опубликованной в виде публикации WO 2009/061744 от 14 мая 2009 г., описан синтез рацемического 2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида; в этом примере конкретно не описан синтез какой-либо определенной полиморфной или аморфной формы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида или какого-либо определенного стереоизомера.
краткое описание сути изобретения
В одном аспекте изобретения представлены полиморфные формы ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфные формы входят в группу, состоящую из формы I, формы II, формы III, формы IV, формы V и формы VI, как описано в настоящем документе.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма ангидрата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой I, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгеновскую дифрактограмму (порошковую рентгенограмму), как показано на фиг. 10. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 12,06, 17,03 и 17,26, причем эти значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 12,06, 17,03 и 17,26, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 12,06, 15,33, 17,03 и 17,26, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 12,06, 15,33, 17,03 и 17,26, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 12,06, 15,33, 17,03, 17,26 и 18,72, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 12,06, 15,33, 17,03, 17,26 и 18,72, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 18,72, 20,04 и 23,92, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 18,72, 20,04, 20,64, 20,91, 21,14, 22,58, 23,13, 23,92, 24,19, 24,53, 27,21 и 27,56, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 5,48, 7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 17,71, 17,94, 18,40, 18,72, 19,51, 20,04, 20,64, 20,91, 21,14, 21,55, 21,91, 22,25, 22,58, 23,13, 23,41, 23,92, 24,19, 24,53, 25,64, 26,13, 26,34, 27,21, 27,56, 28,01, 29,04 и 29,46, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм II-VI, где формы II-VI описаны в табл. A или табл. 3-7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой V, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгенограмму, как показано в a) или b) на фиг. 30. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,61, 11,49 и 15,45, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,61, 11,49 и 15,45, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,61, 11,49, 15,45 и 23,96, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,61, 11,49, 14,80, 15,45, 23,96, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,61, 11,49, 12,93, 15,45 и 26,05, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,61, 11,49, 12,93, 14,80, 15,45, 16,53, 23,96, 24,54 и 26,05, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,61, 11,49, 12,93, 14,80, 15,45, 16,10, 16,34, 16,53, 20,18, 22,52, 22,86, 23,96, 24,54 и 26,05, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 6,91, 7,72, 9,61, 11,49, 11,86, 12,93, 13,19, 13,87, 14,80, 15,45, 16,10, 16,34, 16,53, 17,14, 17,85, 19,12, 19,85, 20,18, 21,00, 22,06, 22,52, 22,86, 23,09, 23,96, 24,54, 25,26, 26,05 и 26,90, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощениях, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм I-IV и VI, где формы I-IV и VI описаны в табл. A или табл. 2 и 4-7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма гидрата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой III, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгенограмму, как показано в a) или b) на фиг. 20. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 14,02, 15,23 и 21,10, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 14,02, 15,23 и 21,10, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,16, 14,02, 15,23 и 21,10, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,16, 13,74, 14,02, 15,23 и 21,10, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,16, 14,02, 15,23, 21,10 и 22,69, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10, 22,69 и 23,90, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 17,35, 21,10, 22,69, 23,15, 23,90 и 26,10, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,16, 11,53, 11,81, 12,68, 12,93, 13,74, 14,02, 15,23, 16,53, 17,35, 17,98, 18,54, 19,09, 20,23, 21,10, 21,93, 22,69, 23,15, 23,50, 23,90, 24,65, 25,09, 25,46, 25,79, 26,10, 27,79, 28,22, 28,93 и 29,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм I, II, IV, V и VI, где формы I, II, IV, V и VI описаны в табл. A или табл. 2-3 и 5-7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма гидрата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой II, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгенограмму, как показано в a) или b) на фиг. 15. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,63, 11,33 и 19,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,63, 11,33 и 19,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,63, 11,33, 10,85 и 19,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 9,63, 11,33, 10,85, 19,33 и 17,3, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 9,63, 10,85, 11,33, 13,47 и 19,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 5,76, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 13,47, 14,75, 17,37, 17,71 и 19,33, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 5,76, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 13,47, 14,75, 16,42, 16,89, 17,37, 17,71, 19,33, 22,89 и 24,59, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 5,76, 6,72, 7,57, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 12,38, 13,13, 13,47, 14,75, 15,28, 16,42, 16,89, 17,37, 17,71, 18,17, 18,66, 19,33, 20,01, 20,29, 20,67, 20,90, 21,36, 21,54, 21,80, 22,55, 22,89, 23,27, 23,54, 23,87, 24,35, 24,59, 24,87, 25,29, 25,55, 25,89, 26,44, 27,49, 28,01, 28,39 и 29,17, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм I и III-VI, где формы I и III-VI описаны в табл. A или табл. 2-4 и 6-7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой IV, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгенограмму, как показано в a), b) или c) на фиг. 25. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,31, 12,97 и 13,20, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 4,31, 12,97 и 13,20, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 4,31, 8,76, 12,97 и 13,20, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 4,31, 8,76, 12,97, 13,20, 16,66, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,31, 8,76, 12,97, 13,20 и 16,66, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,31, 7,94, 8,76, 12,97, 13,20, 16,66, 17,33 и 20,57, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,31, 7,94, 8,76, 12,97, 13,20, 15,08, 16,66, 17,33, 19,09, 20,57 и 21,58, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,31, 5,77, 6,28, 7,53, 7,94, 8,76, 9,39, 9,87, 10,54, 11,07, 11,68, 12,02, 12,28, 12,97, 13,20, 13,52, 14,40, 15,08, 15,90, 16,66, 16,96, 17,33, 17,59, 18,77, 19,09, 19,74, 20,27, 20,57, 21,09, 21,58, 22,81, 23,23, 24,01, 24,65 и 25,60, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм I-III и V-VI, где формы I-III и V-VI описаны в табл. A или табл. 2-5 и 7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлена полиморфная форма сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем полиморфная форма представлена формой VI, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях полиморфная форма имеет по существу такую порошковую рентгенограмму, как показано в a) на фиг. 33. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 6,27, 9,91 и 12,94, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 6,27, 9,91 и 12,94, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 6,27, 9,91, 12,94 и 15,71, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики по меньшей мере при следующих значениях угла: 6,27, 9,91, 12,94, 15,71 и 19,13, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 6,27, 9,41, 9,91, 12,94 и 13,29, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 6,27, 8,85, 9,41, 9,91, 12,94, 13,29, 16,67 и 19,13, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,39, 6,27, 8,85, 9,41, 9,91, 11,32, 12,94, 13,29, 14,03, 16,67, 19,13, 20,76 и 22,06, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях порошковая рентгенограмма данного полиморфа содержит характеристические пики при следующих значениях угла: 4,39, 6,27, 7,00, 8,62, 8,85, 9,41, 9,91, 11,32, 11,50, 12,25, 12,56, 12,94, 13,29, 14,03, 14,82, 15,10, 15,44, 15,71, 16,01, 16,67, 16,91, 17,33, 17,59, 18,33, 18,75, 19,13, 20,25, 20,76, 21,68, 22,06, 22,27, 22,61, 22,94, 24,01, 24,33, 24,65, 25,48, 26,05, 28,63 и 29,18, причем значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, значения угла могут варьироваться на ± 0,02. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф является выделенным. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем композиция практически не содержит форм I-V, где формы I-V описаны в табл. A или табл. 2-6, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный полиморф присутствует в композиции, причем по меньшей мере примерно 95% композиции составляет сам полиморф, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлены композиции, содержащие аморфный (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид. В некоторых воплощениях аморфная форма является выделенной. В некоторых воплощениях композиции практически не содержат форм I-VI, при этом формы I-VI описаны в табл. A или табл. 2-7, соответственно. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, по меньшей мере примерно 95% композиции составляет аморфный (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид, исключая любые растворители, носители или эксципиенты.
В другом аспекте изобретения представлены фармацевтические композиции, содержащие полиморфные или аморфные формы ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5)-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, либо композиции, содержащие такие формы, как описано в настоящем документе, включая любые из вышеприведенных или нижеприведенных воплощений, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой I. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой II. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой III. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой IV. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой V. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой VI. В некоторых воплощениях данная форма представлена аморфной формой. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция имеет чистоту по HPLC более чем примерно 95% в отношении ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, исключая любые растворители, носители или эксципиенты. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция имеет чистоту по HPLC более чем примерно 99% в отношении ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, исключая любые растворители, носители или эксципиенты. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция имеет чистоту по HPLC более чем примерно 99,9% в отношении ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, исключая любые растворители, носители или эксципиенты. Чистота по HPLC в % пропорциональна площади пика при HPLC данного соединения относительно площади всех пиков в данном спектре HPLC. Чистота в % рассчитывается путем деления площади HPLC-пика соединения на площадь всех пиков в спектре HPLC и умножения этого отношения на 100.
В другом аспекте изобретения представлены фармацевтические композиции, содержащие активное средство и фармацевтически приемлемый носитель, причем активное средство состоит или в основном состоит из полиморфной или аморфной формы ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, как описано в настоящем документе. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой I. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой II. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой III. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой IV. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой V. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой VI. В некоторых воплощениях данная форма представлена аморфной формой.
10
red
ox
tot
2
2
2
2
+
+
В другом аспекте изобретения представлен способ лечения или подавления расстройств окислительного стресса, модулирования одного или нескольких энергетических биомаркеров, нормализации одного или нескольких энергетических биомаркеров или повышения одного или нескольких энергетических биомаркеров, который включает введение нуждающемуся в этом лицу терапевтически эффективного количества или эффективного количества полиморфной или аморфной формы ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида либо композиции, содержащей такую форму, как описано в настоящем документе, включая любые из вышеприведенных или нижеприведенных воплощений. В способе может применяться любая индивидуальная полиморфная или аморфная форма по изобретению, как описано в настоящем документе, либо их комбинация. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой I. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой II. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой III. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой IV. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой V. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой VI. В некоторых воплощениях данная форма представлена аморфной формой. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, ангидрат, гидрат или сольват (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида вводится в виде фармацевтической композиции, содержащей полиморфную или аморфную форму и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, фармацевтическая композиция содержит активное средство, состоящее в основном из полиморфной или аморфной формы ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, способ представляет собой способ лечения или подавления расстройства окислительного стресса. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, способ является способом лечения расстройства окислительного стресса. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, способ является способом подавления расстройства окислительного стресса. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса входит в группу, состоящую из: митохондриальных заболеваний; наследственных митохондриальных заболеваний; болезни Альперса; синдрома Барта; дефектов бета-окисления; недостаточности карнитина-ацилкарнитина; недостаточности карнитина; синдрома дефицита креатина; недостаточности кофермента Q; недостаточности комплекса I; недостаточности комплекса II; недостаточности комплекса III; недостаточности комплекса IV; недостаточности комплекса V; недостаточности COX; хронической прогрессирующей внешней офтальмоплегии (CPEO); недостаточности CPT I; недостаточности СРТ II; атаксии Фридрейха (FA); глютаровой ацидурии II типа; синдрома Кернса-Сейра (KSS); лактацидоза; недостаточности ацил-CoA-дегидрогеназы длинноцепочечных жирных кислот (LCAD); LCHAD; синдрома Лея; синдрома типа Лея; наследственной оптической нейропатии Лебера (LHON); летальной инфантильной кардиомиопатии (LIC); болезни Люфта; множественной недостаточности ацил-CoA-дегидрогеназы (MAD); недостаточности ацил-CoA-дегидрогеназы среднецепочечных жирных кислот (MCAD); митохондриальной миопатии, энцефалопатии, лактацидоза и инсульта (MELAS); миоклонической эпилепсии со рваными красными мышечными волокнами (MERRF); синдрома митохондриальной рецессивной атаксии (MIRAS); митохондриальной цитопатии с истощением митохондриальной ДНК; митохондриальной энцефалопатии; митохондриальной миопатии; синдрома митохондриальной нейрогастроинтестинальной энцефалопатии (MNGIE); нейропатии, атаксии и пигментного ретинита (NARP); синдрома Пирсона; недостаточности пируваткарбоксилазы; недостаточности пируватдегидрогеназы; мутации POLG; нарушений дыхательной цепи; недостаточности ацил-CoA-дегидрогеназы короткоцепочечных жирных кислот (SCAD); SCHAD; недостаточности ацил-CoA-дегидрогеназы очень длинноцепочечных жирных кислот (VLCAD); миопатии; кардиомиопатии; энцефаломиопатии; нейродегенеративных заболеваний; болезни Паркинсона; болезни Альцгеймера; бокового амиотрофического склероза (ALS); мотонейронной болезни; неврологических заболеваний; эпилепсии; возрастных заболеваний; дегенерации желтого пятна; диабета; метаболических синдромов; рака; рака головного мозга; генетических заболеваний; болезни Хантингтона; аффективных расстройств; шизофрении; биполярных расстройств; первазивного расстройства развития (PDD); аутистического расстройства; синдрома Аспергера; детского дезинтегративного расстройства (CDD); синдрома Ретта; PDD без дополнительных уточнений (PDD-NOS); расстройства мозгового кровообращения; инсульта; нарушений зрения; оптической нейропатии; ювенильной оптической атрофии с доминантным наследованием; токсической оптической нейропатии; глаукомы; макулярной дистрофии Старгардта; диабетической ретинопатии; диабетической макулопатии; ретинопатии недоношенных; повреждения сетчатки при ишемической реперфузии; кислородного отравления; гемоглобинопатии; талассемии; серповидноклеточной анемии; судорог; ишемии; ацидоза почечных канальцев; синдрома дефицита внимания/гиперактивности (ADHD); нейродегенеративных заболеваний, ведущих к нарушениям слуха или равновесия; доминантной оптической атрофии (DOA); наследуемого по материнской линии диабета и глухоты (MIDD); хронической усталости; контрастовой нефропатии; контрастовой ретинопатии; абеталипопротеинемии; пигментного ретинита; болезни Вольфрама; синдрома Туретта; дефицита кобаламина c; метилмалоновой ацидурии; глиобластомы; синдрома Дауна; острого тубулярного некроза; мышечной дистрофии; лейкодистрофии; прогрессирующего супрануклеарного пареза; спинальной мышечной атрофии; нарушения слуха; нарушения слуха от воздействия шума; травматического повреждения мозга; ювенильной болезни Хантингтона; рассеянного склероза; NGLY1; мультисистемной атрофии; адренолейкодистрофии; и адреномиелонейропатии. В некоторых воплощениях расстройство окислительного стресса представлено мультисистемной атрофией. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено раком. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено биполярным расстройством. В некоторых воплощениях расстройство окислительного стресса представлено шизофренией. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено возрастным заболеванием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено болезнью Хантингтона. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено болезнью Альцгеймера. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено боковым амиотрофическим склерозом (ALS). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено эпилепсией. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено болезнью Паркинсона. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено судорогами. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено инсультом. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено митохондриальным заболеванием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено наследственным митохондриальным заболеванием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено атаксией Фридрейха (FA). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено синдромом Кернса-Сейра (KSS). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено синдромом Лея или синдромом типа Лея. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено наследственной оптической нейропатией Лебера (LHON). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено митохондриальной миопатией, энцефалопатией, лактацидозом и инсультом (MELAS). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено миоклонической эпилепсией со рваными красными мышечными волокнами (MERRF). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено дегенерацией желтого пятна. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено раком головного мозга. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено аутистическим расстройством. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено синдромом Ретта. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено наследуемым по материнской линии диабетом и глухотой (MIDD). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено хронической усталостью. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено контрастовой нефропатией. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено контрастовой ретинопатией. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, расстройство окислительного стресса представлено дефицитом кобаламина c. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, данный способ является способом модулирования одного или нескольких энергетических биомаркеров, нормализации одного или нескольких энергетических биомаркеров или повышения одного или нескольких энергетических биомаркеров, причем один или несколько энергетических биомаркеров входят в группу, состоящую из: уровня молочной кислоты (лактата) в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости либо в жидкости желудочков мозга; уровня пировиноградной кислоты (пирувата) в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости либо в жидкости желудочков мозга; соотношения лактат/пируват в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости либо в жидкости желудочков мозга; уровня общего, восстановленного или окисленного глутатиона либо соотношения восстановленный/окисленный глутатион в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровня общего, восстановленного или окисленного цистеина либо соотношения восстановленный/окисленный цистеин в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровня фосфокреатина; уровня NADH (NADH + H); уровня NADPH (NADPH + H); уровня NAD; уровня NADP; уровня АТФ; уровня восстановленного кофермента Q (CoQ); уровня окисленного кофермента Q (CoQ); общего уровня кофермента Q (CoQ); уровня окисленного цитохрома c; уровня восстановленного цитохрома c; соотношения окисленный цитохром c/восстановленный цитохром c; уровня ацетоацетата, уровня β-гидроксибутирата, соотношения ацетоацетат/β-гидроксибутират; уровня 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозина (8-OHdG); уровня активных форм кислорода; уровня потребления кислорода (VO); уровня выделения двуокиси углерода (VCO); дыхательного коэффициента (VCO/VO); переносимости физической нагрузки; и анаэробного порога. Энергетические биомаркеры можно измерять в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости, жидкости желудочков мозга, артериальной крови, венозной крови или в любой другой жидкой среде организма, газах организма или других биологических образцах, пригодных для таких измерений. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни модулируются до величины в пределах примерно 2 стандартных отклонений от значения у здорового лица. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни модулируются до величины в пределах примерно 1 стандартного отклонения от значения у здорового лица. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни у лиц изменяются по меньшей мере на примерно 10% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 20% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 30% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 40% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 50% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 75% выше или ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, уровни изменяются по меньшей мере на примерно 100% выше или по меньшей мере на примерно 90% ниже уровня у данного лица перед модулированием. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, лица, у которых выполняется способ лечения или подавления расстройств окислительного стресса, модулирования одного или нескольких энергетических биомаркеров, нормализации одного или нескольких энергетических биомаркеров или повышения одного или нескольких энергетических биомаркеров, входят в группу, состоящую из лиц, занимающихся напряженной или продолжительной физической активностью; лиц с хроническими энергетическими проблемами; лиц с хроническими дыхательными проблемами; беременных женщин; беременных женщин при родах; новорожденных; недоношенных новорожденных; лиц, подверженных экстремальным условиям; лиц, подверженных воздействию жары; лиц, подверженных воздействию холода; лиц, подверженных воздействию пониженного содержания кислорода; лиц, подверженных воздействию повышенного содержания двуокиси углерода; лиц, подверженных воздействию повышенного уровня загрязнения воздуха; авиапассажиров; стюардесс и бортпроводников; лиц на большой высоте; лиц, проживающих в городах с низким качеством воздуха; лиц, работающих в закрытых помещениях с плохим качеством воздуха; лиц с легочными заболеваниями; лиц с пониженной емкостью легких; больных туберкулезом; больных раком легких; больных эмфиземой; больных кистозным фиброзом; лиц, выздоравливающих после операции; лиц, выздоравливающих от болезни; пожилых лиц; пожилых лиц с пониженным уровнем энергии; лиц, страдающих хронической усталостью; лиц, страдающих синдромом хронической усталости; лиц с острыми травмами; лиц в состоянии шока; лиц, требующих хронической подачи кислорода; лиц, требующих визуализации органов при помощи контрастирующего раствора; или других лиц с острыми, хроническими или текущими потребностями в энергии, которым может пойти на пользу повышение энергетических биомаркеров.
В другом аспекте изобретения представлено применение полиморфных или аморфных форм ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, как описано в настоящем документе, включая любые из вышеприведенных или нижеприведенных воплощений, для лечения или подавления расстройств окислительного стресса. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой I. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой II. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой III. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой IV. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой V. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой VI. В некоторых воплощениях данная форма представлена аморфной формой.
В другом аспекте изобретения представлено применение полиморфных или аморфных форм ангидрата, гидрата или сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, как описано в настоящем документе, включая любые из вышеприведенных или нижеприведенных воплощений, при изготовлении лекарственных средств для применения при лечении или подавлении расстройств окислительного стресса. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой I. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой II. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой III. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой IV. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой V. В некоторых воплощениях данная форма представлена полиморфной формой VI. В некоторых воплощениях данная форма представлена аморфной формой.
Для всех композиций, описанных здесь, и всех способов с использованием описанных здесь композиций они могут либо содержать перечисленные компоненты или стадии, либо могут “в основном состоять из” перечисленных компонентов или стадий. Когда композиция описывается как “ в основном состоящая из” перечисленных компонентов, то она содержит перечисленные компоненты и может содержать другие компоненты, которые не влияют существенно на подлежащее лечению заболевание, но не содержит каких-либо других компонентов, которые существенно влияют на подлежащее лечению заболевание, кроме тех компонентов, которые перечислены в явном виде; или же, если композиция содержит дополнительные компоненты помимо перечисленных, которые существенно влияют на подлежащее лечению заболевание, то композиция содержит эти дополнительные компоненты в недостаточной концентрации или количестве для того, чтобы они существенно повлияли на подлежащее лечению заболевание. Когда способ описывается как “ в основном состоящий из” перечисленных стадий, то он содержит перечисленные стадии и может содержать другие стадии, которые существенно не влияют на подлежащее лечению заболевание, но способ не содержит никаких других этапов, которые существенно влияют на заболевание, кроме тех, которые перечислены в явном виде. В качестве неограничительного конкретного примера, когда композиция описывается как “состоящая в основном из” какого-то компонента, она может дополнительно содержать любое количество фармацевтически приемлемых носителей, растворителей или разбавителей и других таких компонентов, которые существенно не влияют на подлежащее лечению заболевание.
В другом аспекте изобретения представлен способ получения полиморфной формы I ангидрата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем способ включает стадии: (a) контактирование (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида с жидкостью, содержащей IPA; и (b) удаление жидкости. В некоторых воплощениях стадия (a) включает растворение (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в жидкости. В некоторых воплощениях стадия (a) включает суспендирование (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в жидкости. В некоторых воплощениях суспендирование на стадии (a) может проводиться в течение по меньшей мере 24 часов. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, жидкость представляет собой 100% IPA. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, жидкость представляет собой смесь 98% IPA/2% воды (об/об). В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, способ дополнительно включает стадию (a)(i): добавление гептана в жидкость. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) включает фильтрование (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, смесь на стадии (a) или стадии (a)(i) может быть засеяна кристаллами формы I. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, чистота (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида на стадии (a) составляет по меньшей мере примерно 95%. В различных воплощениях, включая любые из вышеперечисленных воплощений, чистота (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида на стадии (a) составляет по меньшей мере примерно 96%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 98%, по меньшей мере примерно 99%, по меньшей мере примерно 99,5%, по меньшей мере примерно 99,9%. В другом аспекте изобретения представлен ангидрат (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, полученный вышеописанным способом.
В другом аспекте изобретения представлен способ получения полиморфной формы II ангидрата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем способ включает стадии: (a) растворение (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в EtOAc; (b) быстрое охлаждение смеси из стадии (a); и (c) выделение (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. В некоторых воплощениях исходной формой (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида служит форма I. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (a) проводится при примерно 60°C. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) включает быстрое охлаждение смеси на ледяной бане. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, смесь на стадии (b) может быть засеяна кристаллами формы II. В другом аспекте изобретения представлен ангидрат (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, полученный вышеописанным способом.
В другом аспекте изобретения представлен способ получения полиморфной формы III сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем способ включает стадии: (a) смешивание (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и 0,5% MC/2% Tween 80 в воде с получением взвеси; (b) суспендирование смеси из стадии (a); и (c) удаление 0,5% MC/2% Tween 80 в воде. При этом “MC” означает метилцеллюлозу, а “Tween 80” означает коммерчески доступный полисорбатный неионный детергент. В некоторых воплощениях исходной формой (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида служит форма I. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) проводится в течение по меньшей мере примерно 24 ч. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) проводится при комнатной температуре. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, смесь на стадии (b) может быть засеяна кристаллами формы III. В другом аспекте изобретения представлен сольват (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, полученный вышеописанным способом.
В другом аспекте изобретения представлен способ получения полиморфной формы III сольвата (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, причем способ включает стадии: (a) смешивание (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и 0,5% MC в воде с получением взвеси; (b) суспендирование смеси из стадии (a); и (c) удаление 0,5% MC в воде. В некоторых воплощениях исходной формой (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида служит форма I, II, IV, V или VI. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) проводится при комнатной температуре. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, стадия (b) может проводиться в течение по меньшей мере примерно 7 дней. В некоторых воплощениях, включая любые из вышеприведенных воплощений, смесь на стадии (b) может быть засеяна кристаллами формы III. В другом аспекте изобретения представлен сольват (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, полученный вышеописанным способом.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлен пакет XRPD-рентгенограмм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида из краткосрочных экспериментов на суспензиях: a) спектр C, из суспензии в 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80; b) спектр B, из суспензии в тетрагидрофуране (THF); и c) исходный материал, спектр A.
На фиг. 2 представлено наложение XRPD-рентгенограмм образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) исходный материал, спектр A; и b) спектр D после кристаллизации выпариванием из 2-метилтетрагидрофурана (2-MeTHF).
На фиг. 3 представлено наложение XRPD-рентгенограмм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в экспериментах по кристаллизации: a) исходный материал со спектром A; b) со спектром D после кристаллизации выпариванием из 2-MeTHF (пример 4); c) при кристаллизации выпариванием в 2-MeTHF (пример 5, быстрое охлаждение); и d) при кристаллизации выпариванием в 2-MeTHF (пример 5, медленное охлаждение).
На фиг. 4 представлен пакет XRPD-рентгенограмм всех форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) исходный материал, спектр A; b) спектр B; c) спектр C; d) спектр D; e) спектр E при кристаллизации с быстрым охлаждением в этилацетате (EtOAc); и f) спектр F при кристаллизации с быстрым охлаждением в 2-MeTHF.
На фиг. 5 представлены XRPD-рентгенограммы образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) спектр E при кристаллизации с быстрым охлаждением в EtOAc (пример 5); и b) при масштабной кристаллизации с быстрым охлаждением в EtOAc (пример 6).
На фиг. 6 представлены XRPD-рентгенограммы образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) спектр B из суспензии в THF (пример 3); и b) из масштабной суспензии в THF (пример 6).
На фиг. 7 представлены XRPD-рентгенограммы образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) спектр C из суспензии в 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 (пример 3); и b) из масштабной суспензии в 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 (пример 6).
На фиг. 8 представлены XRPD-рентгенограммы образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) сравнительная суспензия в 0,5% метилцеллюлозе в воде через 24 часа; b) исходный материал, спектр A; c) спектр C; и d) сравнительная суспензия в 0,5% метилцеллюлозе в воде через 7 дней.
На фиг. 9 представлены XRPD-рентгенограммы образцов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида: a) сравнительная суспензия в IPA через 24 часа; b) сравнительная суспензия в IPA через 7 дней; c) исходный материал, спектр A; d) сравнительная суспензия в изопропаноле (IPA) с 2% воды через 24 часа; e) сравнительная суспензия в IPA с 2% воды через 7 дней.
На фиг. 10 представлена XRPD-рентгенограмма исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
На фиг. 11 представлен снимок при оптической микроскопии исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
На фиг. 12 представлена DSC-термограмма исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
На фиг. 13 представлена TGA-термограмма исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
На фиг. 14 представлен график сорбции-десорбции влаги у исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
На фиг. 15 представлены XRPD-рентгенограммы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E, выделенного при экспериментах с быстрым охлаждением в одинарном растворителе: a) в масштабе 50 мг; и b) в масштабе 300 мг.
На фиг. 16 представлен снимок при оптической микроскопии (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E.
На фиг. 17 представлена DSC-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E.
На фиг. 18 представлена TGA-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E.
На фиг. 19 представлен график сорбции-десорбции влаги у (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E.
На фиг. 20 представлены XRPD-рентгенограммы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C из суспензии в 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80: a) в масштабе 50 мг; и b) в масштабе 300 мг.
На фиг. 21 представлен снимок при оптической микроскопии (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C.
На фиг. 22 представлена DSC-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C.
На фиг. 23 представлена TGA-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C.
На фиг. 24 представлен график сорбции-десорбции влаги у (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C.
На фиг. 25 представлены XRPD-рентгенограммы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B из суспензии в THF: a) в масштабе 50 мг; и b) в масштабе 300 мг.
На фиг. 26 представлен снимок при оптической микроскопии (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B.
На фиг. 27 представлена DSC-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B.
На фиг. 28 представлена TGA-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B.
На фиг. 29 представлен график сорбции-десорбции влаги у (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B.
На фиг. 30 представлен пакет XRPD-рентгенограмм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром D при кристаллизации выпариванием в 2-MeTHF: a) из примера 4; b) пример 5 (быстрое охлаждение); c) пример 5 (медленное охлаждение); и d) исходный материал со спектром A.
На фиг. 31 представлена DSC-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром D.
На фиг. 32 представлена TGA-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром D.
На фиг. 33 представлен пакет XRPD-рентгенограмм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F при кристаллизации в одинарном растворителе 2-MeTHF: a) из примера 6; b) после анализа сорбции влаги (исходя из профиля F из примера 6); и c) спектр E.
На фиг. 34 представлен снимок при оптической микроскопии (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F.
На фиг. 35 представлена DSC-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F.
На фиг. 36 представлена TGA-термограмма (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F.
На фиг. 37 представлен график сорбции-десорбции влаги у (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F.
На фиг. 38 представлены взаимные отношения полиморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
На фиг. 39 представлен пакет XRPD-рентгенограмм полиморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида по Эдисону.
1
На фиг. 40 представлен спектр H-ЯМР исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром A.
1
На фиг. 41 представлен спектр H-ЯМР (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром B.
1
На фиг. 42 представлен спектр H-ЯМР (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром C.
1
На фиг. 43 представлен спектр H-ЯМР (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром D.
1
На фиг. 44 представлен спектр H-ЯМР (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром E.
1
На фиг. 45 представлен спектр H-ЯМР (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида со спектром F.
подробное описание изобретения
Изобретение охватывает полиморфные и аморфные формы ангидратов, гидратов и сольватов (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, применимые при лечении или подавлении заболеваний, задержек развития и таких симптомов, связанных с окислительным стрессом, как митохондриальные заболевания, нарушения энергетического обмена, нейродегенеративные заболевания и болезни старения, а также способы применения таких композиций для лечения или подавления расстройств окислительного стресса или для модулирования, нормализации или усиления одного или нескольких (напр., одного, двух, трех и более) энергетических биомаркеров. Изобретение также охватывает способы получения таких полиморфных и аморфных форм.
Используемые здесь сокращения имеют общепринятые значения в химической и биологической области, если не указано иначе.
Выражение “примерно” для значения или параметра здесь включает (и означает) отклонения, которые относятся к этому значению или параметру как таковому. Например, выражение “примерно X” включает и значение “X”.
Формы единственного числа в настоящем изобретении подразумевают один или несколько, если из контекста четко не следует иное.
Под “субъектом”, “индивидом” или “пациентом” имеется в виду индивидуальный организм, предпочтительно из позвоночных, более предпочтительно из млекопитающих, наиболее предпочтительно человек.
(R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид может существовать в виде ангидратов, гидратов и сольватов. Если не указано иначе или не ясно из контекста, термин “(R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид” в настоящем изобретении включает ангидратные, гидратные и сольватные формы соединения.
Термин “по существу такой, как показано в/на” при упоминании, к примеру, спектра XRPD, DSC-термограммы или графика TGA, включает спектры, термограммы или графики, которые необязательно идентичны приведенным в настоящем документе, но попадают в пределы погрешности эксперимента или колебаний при рассмотрении средним специалистом в данной области техники. Например, в спектре XRPD относительная интенсивность пиков в дифракционном спектре может колебаться, напр., из-за условий получения образца. Кроме того, на форму и расположение пиков могут повлиять изменения температуры (при получении данных XRPD). Приведенные здесь спектры XRPD получали при комнатной температуре (~25°C). В некоторых воплощениях спектры XRPD получают при температуре от примерно 15°C до примерно 30°C. В некоторых воплощениях спектры XRPD получают при температуре от примерно 20°C до примерно 30°C. В некоторых воплощениях спектры XRPD получают при температуре от примерно 23°C до примерно 27°C. В некоторых воплощениях спектры XRPD получают при температуре от примерно 24°C до примерно 26°C. В некоторых воплощениях спектры XRPD получают примерно при примерно 25°C.
Аналогичным образом, при описании полиморфов по характеристическим пикам (напр., угловым положениям пиков) следует иметь в виду, что расположение пиков может колебаться в зависимости от условий получения образца, температуры и т.п. Приведенные здесь характеристические пики XRPD получали при комнатной температуре (~25°C). В некоторых воплощениях данные по XRPD получают при температуре от примерно 15°C до примерно 30°C. В некоторых воплощениях данные по XRPD получают при температуре от примерно 20°C до примерно 30°C. В некоторых воплощениях данные по XRPD получают при температуре от примерно 23°C до примерно 27°C. В некоторых воплощениях данные по XRPD получают при температуре от примерно 24°C до примерно 26°C. В некоторых воплощениях данные по XRPD получают примерно при примерно 25°C.
Полиморфные или аморфные формы, которые “выделены”, в настоящем изобретении означают такие формы, в которых данная конкретная форма составляет по меньшей мере 90% (т.е. менее 10% материала составляют другие формы или другие соединения, в том числе, без ограничения, (S)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид).
Полиморфная композиция, которая “по существу не содержит” определенного компонента, означает, что композиция содержит менее чем примерно 5% данного конкретного компонента. В качестве неограничительного примера полиморфная композиция, которая по существу не содержит полиморфной формы II, означает, что композиция содержит менее чем примерно 5% формы II. В некоторых воплощениях “по существу не содержит” означает, что композиция содержит менее чем примерно 4%, менее чем примерно 3%, менее чем примерно 2% или менее чем примерно 1% данного компонента или что данный компонент не обнаруживается в пределах обнаружения.
“Значения угла” или “угловое положение” означают угол 2θ.
“Лечение” заболеваний с помощью приведенных здесь соединений, композиций и способов определяется как введение одного или нескольких приведенных здесь соединений или композиций, с дополнительными терапевтическими средствами или без них, для уменьшения или устранения самого заболевания либо одного или нескольких его симптомов, или же для замедления прогрессирования заболевания либо одного или нескольких его симптомов, или же уменьшения тяжести заболевания либо одного или нескольких его симптомов. “Подавление” заболеваний с помощью приведенных здесь соединений, композиций и способов определяется как введение одного или нескольких приведенных здесь соединений или композиций, с дополнительными терапевтическими средствами или без них, для подавления клинических проявлений заболевания или для подавления появления неблагоприятных симптомов заболевания. Различие между лечением и подавлением состоит в том, что лечение происходит после того, как у субъекта появляются неблагоприятные симптомы заболевания, тогда как подавление происходит до того, как у субъекта появятся неблагоприятные симптомы расстройства. Подавление может быть частичным, практически полным или полным. Поскольку некоторые заболевания являются наследственными, то для выявления пациентов с риском заболевания может применяться генетический скрининг. После этого бессимптомным пациентам с риском возникновения клинических симптомов заболевания могут вводиться соединения, композиции и применяться способы по изобретению, чтобы подавить появление неблагоприятных симптомов.
“Терапевтическое применение” приведенных здесь соединений и композиций определяется как использование одного или нескольких приведенных здесь соединений или композиций для лечения или подавления заболеваний, как определено выше. “Эффективное количество” соединения или композиции означает такое количество соединения или композиции, которое достаточно для модулирования, нормализации или усиления одного или нескольких энергетических биомаркеров (при этом модулирование, нормализация и усиление определены ниже). “Терапевтически эффективное количество” соединения или композиции означает такое количество соединения или композиции, которое при введении субъекту является достаточным для уменьшения или устранения самого заболевания либо одного или нескольких его симптомов, или же для замедления прогрессирования заболевания либо одного или нескольких его симптомов, или же уменьшения тяжести заболевания либо одного или нескольких его симптомов, или же для подавления проявления неблагоприятных симптомов заболевания. Терапевтически эффективное количество может вводиться за один или несколько приемов. “Эффективное количество” соединения или композиции охватывает как терапевтически эффективное количество, так и количество, эффективное для модулирования, нормализации или усиления одного или нескольких энергетических биомаркеров у субъекта.
“Модулировать” или “модулирование” энергетического биомаркера означает изменение уровня энергетического биомаркера до требуемого значения или изменение уровня энергетического биомаркера в нужном направлении (напр., увеличение или уменьшение). Модулирование может включать, без ограничения, нормализацию и усиление, как определено ниже.
“Нормализировать” или “нормализация” энергетического биомаркера определяется как изменение уровня энергетического биомаркера от патологического значения до нормального значения, причем нормальное значение энергетического биомаркера может представлять собой 1) уровень энергетического биомаркера у здорового человека или лица либо 2) такой уровень энергетического биомаркера, который снимает один или несколько нежелательных симптомов у человека или лица. Иными словами, нормализация энергетического биомаркера, который подавлен при заболевании, означает повышение уровня энергетического биомаркера до нормального (здорового) значения или до такого значения, которое облегчает нежелательный симптом; нормализация энергетического биомаркера, который повышен при заболевании, означает снижение уровня биомаркера энергии до нормального (здорового) значения или до такого значения, которое облегчает нежелательный симптом.
“Усиление” или “повышение” энергетических биомаркеров означает намеренное изменение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров в сторону от нормального значения либо значения до повышения для достижения полезного или требуемого эффекта. Например, в ситуации, когда у субъекта появляется значительная потребность в энергии, то может потребоваться повысить уровень АТФ у этого субъекта до уровня выше нормального уровня АТФ у этого субъекта. Усиление также может иметь положительный эффект у субъектов, страдающих такими заболеваниями, к примеру, как митохондриальные заболевания, поскольку нормализация энергетического биомаркера может не дать оптимальных для них результатов; в таких случаях усиление одного или нескольких энергетических биомаркеров может быть полезным, например для таких субъектов могут быть благоприятными более высокие, чем в норме, уровни АТФ, или более низкие, чем в норме, уровни молочной кислоты (лактата).
10
Под модулированием, нормализацией или усилением энергетического биомаркера кофермента Q понимается модулирование, нормализация или повышение того варианта или вариантов кофермента Q, которые преобладают у данного вида. Например, вариантом кофермента Q, который преобладает у людей, является кофермент Q. Если у какого-то вида или лица имеется более одного варианта коэнзима Q в значительных количествах (т.е. в таких количествах, модулирование, нормализация или повышение которых может оказывать благотворное влияние на данный вид или лицо), то модулирование, нормализация или усиление кофермента Q может означать модулирование, нормализацию или повышение любых или всех вариантов кофермента Q у данного вида или лица.
Под “расстройствами дыхательной цепи” понимаются расстройства, которые приводят к снижению утилизации кислорода митохондриями, клетками, тканями или организмом вследствие дефекта или расстройства белка или иного компонента, содержащегося в митохондриальной дыхательной цепи. Под “белком или другим компонентом, содержащимся в митохондриальной дыхательной цепи”, подразумеваются компоненты (включая, без ограничения, белки, тетрапирролы и цитохромы), составляющие митохондриальный комплекс I, II, III, IV и/или V. “Белки дыхательной цепи” означают белковые компоненты этих комплексов, а “расстройства белков дыхательной цепи” - расстройства, которые приводят к снижению утилизации кислорода митохондриями, клетками, тканями или организмом вследствие дефекта или расстройства белков, содержащихся в митохондриальной дыхательной цепи.
Термины “болезнь Паркинсона” (также называется “паркинсонизм” и “паркинсонический синдром”) (“PD”) служит для обозначения не только болезни Паркинсона, но также вызванного лекарственными средствами паркинсонизма и послеэнцефалитного паркинсонизма. Болезнь Паркинсона также известна как дрожательный паралич. Она характеризуется тремором, мышечной ригидностью и потерей постуральных рефлексов. Болезнь обычно прогрессирует медленно, проходит от 10 до 20 лет, прежде чем симптомы вызывают инвалидность. Для создания моделей болезни Паркинсона применяется обработка животных метамфетамином или MPTP из-за схожести их эффектов с болезнью Паркинсона. Эти модели на животных применялись для оценки эффективности различных средств лечения болезни Паркинсона.
Термин “атаксия Фридрейха” охватывает и другие разновидности атаксии, а также иногда именуется наследственной атаксией, семейной атаксией или сухоткой спинного мозга Фридрейха.
Термин “атаксия” означает неспецифическое клиническое проявление, которое подразумевает дисфункцию тех частей нервной системы, которые координируют движение, таких как мозжечок. У людей с атаксией есть проблемы с координацией, так как поражаются те части нервной системы, которые контролируют движение и равновесие. Атаксия может поражать пальцы, кисти, руки, ноги, тело, речь и движения глаз. Слово атаксия часто применяется для описания симптома дискоординации, который может быть связан с инфекциями, травмами, другими заболеваниями или дегенеративными изменениями в центральной нервной системе. Атаксия также применяется для обозначения группы специфических дегенеративных заболеваний нервной системы, которые называют наследственными и спорадическими формами атаксии. Атаксия зачастую также связана с нарушениями слуха.
Имеется три типа атаксии: мозжечковая атаксия, включающая вестибулярно-мозжечковую дисфункцию, спинально-мозжечковую дисфункцию и церебрально-мозжечковую дисфункцию; сенсорная атаксия; и вестибулярная атаксия. Примеры заболеваний, которые можно классифицировать как спинально-мозжечковую атаксию или мультисистемную атрофию, - это наследственная оливо-понто-церебеллярная атрофия, наследственная кортико-мозжечковая атрофия, атаксия Фридрейха, болезнь Мачадо-Джозефа, синдром Рамзая Ханта, наследственная дентаторубрально-паллидолюисная атрофия, наследственная спастическая параплегия, синдром Шая-Драгера, кортико-мозжечковая атрофия, стриато-нигральная дегенерация, синдром Маринеско-Шёгрена, алкогольная кортико-мозжечковая атрофия, паранеопластическия мозжечковая атрофия, связанная со злокачественными опухолями, токсическая мозжечковая атрофия, вызванная токсическими веществами, дефицитом витамина E из-за мутации переносящего токоферол белка (aTTP) или нарушением всасывания липидов типа абеталипопротеинемии, мозжечковая атрофия, связанная с эндокринными нарушениями и т.п.
Примерами симптомов атаксии являются моторная атаксия, атаксия туловища, атаксия конечностей и т.п., вегетативные нарушения типа ортостатической гипотензии, дизурии, гипогидроза, апноэ во сне, ортостатического обморока и т.п., тугоподвижность нижних конечностей, глазной нистагм, расстройство окуломоторного нерва, дисфункция пирамидального тракта, экстрапирамидные симптомы (дисфункция постуральной регуляции, мышечная ригидность, акинезия, тремор), дисфагия, языковая атрофия, симптом заднего канатика, мышечная атрофия, мышечная слабость, глубокая гиперрефлексия, сенсорные нарушения, сколиоз, кифосколиоз, деформации стопы, анартрия, деменция, маниакальное состояние, снижение мотивации к выздоровлению и т.п.
Полиморфные и аморфные формы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
Настоящим изобретением предусмотрены различные кристаллические и аморфные формы (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида:
а также способы получения таких форм и способы применения таких форм.
Ниже в табл. 1 представлена сводка по некоторым полиморфным формам (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида по изобретению.
Таблица 1. Сводные характеристики полиморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>XRPD [профиль] (условия)</b>
<b>Обозначение формы</b>
<b>DSC [°C]</b>
<b>TGA [потеря воды в%]</b>
<b></b><sup><b>1</b></sup><b>H-ЯМР [остаточный растворитель]</b>
<b>KF [вода </b><b>в %]</b>
<b>Оптическая микроскопия</b>
Кристаллы [спектр A] (исходный материал)
форма I (ангидрат)
152,9
0,0
соответствует структуре [0,28% IPA]
0,1
двойное лучепреломление
Кристаллы [спектр B] (взвесь в THF)
форма IV (сольват с THF)
70,5, 89,1, 149,7
4,7
соответствует структуре [6,9% THF]
0,3
двойное лучепреломление
Кристаллы [спектр C] (взвесь в 0,5% MC /2% Tween 80)
форма III (гидрат)
72,0, 150,7
2,5, 2,3
соответствует структуре
4,3
двойное лучепреломление
Кристаллы [спектр D] (крист. выпар. в 2-MeTHF)
форма V (сольват с 2-MeTHF)
67,2, 92,2, 150,6
2,7, 5,3
соответствует структуре [6,1% 2-MeTHF]
-
двойное лучепреломление
Кристаллы [спектр E] (крист. с быстрым охлажд. в EtOAc)
форма II (ангидрат)
133,9, 151,3
0,4
соответствует структуре [0,4% EtOAc]
0,1
двойное лучепреломление
Кристаллы [спектр F] (масшт. крист. с быстрым охлажд. в EtOAc)
форма VI (сольват с 2-MeTHF)
93,2, 135,2, 151,0
1,1, 0,2
соответствует структуре [3,9% 2-MeTHF]
0,1
двойное лучепреломление
На фиг. 38 представлена схема, проясняющая взаимные отношения между различными полиморфными формами (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. На фиг. 39 представлен пакет XRPD-рентгенограмм полиморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
В табл. A представлены различные варианты угловых положений некоторых характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для полиморфных форм по изобретению. В некоторых вариантах значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых вариантах значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых вариантах значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых вариантах значения угла могут варьироваться на ± 0,02.
Таблица A. Значения угла некоторых характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для форм I-VI
<b>Форма</b>
<b>Значения угла некоторых характеристических пиков (угол 2θ) </b><b>(все ± 0,2)</b>
I
вариант 1:  12,06, 17,03, 17,26
вариант 2:  12,06, 15,33, 17,03, 17,26, 18,72
вариант 3:  7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 18,72, 20,04, 23,92
вариант 4:  7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 18,72, 20,04, 20,64, 20,91, 21,14, 22,58, 23,13, 23,92, 24,19, 24,53, 27,21, 27,56
вариант 5:  5,48, 7,67, 10,75, 12,06, 15,33, 16,41, 17,03, 17,26, 17,71, 17,94, 18,40, 18,72, 19,51, 20,04, 20,64, 20,91, 21,14, 21,55, 21,91, 22,25, 22,58, 23,13, 23,41, 23,92, 24,19, 24,53, 25,64, 26,13, 26,34, 27,21, 27,56, 28,01, 29,04, 29,46
вариант 6:  12,06, 15,33, 17,03, 17,26
вариант 7:  12,06, 15,33, 17,03, 17,26, 18,72, 23,92
вариант 8:  12,06, 15,33, 17,03, 17,26, 18,72, 23,92, 16,41
вариант 9:  12,06, 15,33, 17,03, 17,26, 18,72, 23,92, 16,41, 10,75
вариант10: 12,06, 15,33, 17,03, 17,26, 18,72, 23,92, 16,41, 10,75, 20,64
V
вариант 1:  9,61, 11,49, 15,45вариант 2:  9,61, 11,49, 12,93, 15,45, 23,96, 26,05вариант 3:  9,61, 11,49, 12,93, 14,80, 15,45, 16,53, 23,96, 24,54, 26,05вариант 4:  9,61, 11,49, 12,93, 14,80, 15,45, 16,10, 16,34, 16,53, 20,18, 22,52, 22,86, 23,96, 24,54, 26,05вариант 5:  6,91, 7,72, 9,61, 11,49, 11,86, 12,93, 13,19, 13,87, 14,80, 15,45, 16,10, 16,34, 16,53, 17,14, 17,85, 19,12, 19,85, 20,18, 21,00, 22,06, 22,52, 22,86, 23,09, 23,96, 24,54, 25,26, 26,05, 26,90вариант 6:  9,61, 11,49, 12,93, 15,45вариант 7:  9,61, 11,49, 12,93, 15,45, 23,96вариант 8:  9,61, 11,49, 12,93, 15,45, 14,80вариант 9:  9,61, 11,49, 12,93, 15,45, 7,72вариант10: 9,61, 11,49, 12,93, 15,45, 7,72, 16,53
III
вариант 1:  14,02, 15,23, 21,10
вариант 2:  9,16, 14,02, 15,23, 21,10, 22,69
вариант 3:  9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10, 22,69, 23,90
вариант 4:  9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 17,35, 21,10, 22,69, 23,15, 23,90, 26,10
вариант 5:  9,16, 11,53, 11,81, 12,68, 12,93, 13,74, 14,02, 15,23, 16,53, 17,35, 17,98, 18,54, 19,09, 20,23, 21,10, 21,93, 22,69, 23,15, 23,50, 23,90, 24,65, 25,09, 25,46, 25,79, 26,10, 27,79, 28,22, 28,93, 29,33
вариант 6:  9,16, 14,02, 15,23, 21,10
вариант 7:  9,16, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10
вариант 8:  9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10
вариант 9:  9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10, 23,90
вариант10: 9,16, 11,81, 13,74, 14,02, 15,23, 21,10, 22,69, 23,90
II
вариант 1:  9,63, 11,33, 19,33
вариант 2:  9,63, 10,85, 11,33, 13,47, 19,33
вариант 3:  5,76, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 13,47, 14,75, 17,37, 17,71, 19,33
вариант 4:  5,76, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 13,47, 14,75, 16,42, 16,89, 17,37, 17,71, 19,33, 22,89, 24,59
вариант 5:  5,76, 6,72, 7,57, 8,04, 9,63, 10,85, 11,33, 11,97, 12,38, 13,13, 13,47, 14,75, 15,28, 16,42, 16,89, 17,37, 17,71, 18,17, 18,66, 19,33, 20,01, 20,29, 20,67, 20,90, 21,36, 21,54, 21,80, 22,55, 22,89, 23,27, 23,54, 23,87, 24,35, 24,59, 24,87, 25,29, 25,55, 25,89, 26,44, 27,49, 28,01, 28,39, 29,17
вариант 6:  9,63, 11,33, 10,85
вариант 7:  9,63, 11,33, 10,85, 19,33
вариант 8:  9,63, 11,33, 10,85, 19,33, 17,37
вариант 9:  9,63, 11,33, 10,85, 19,33, 17,37, 13,47
вариант10: 9,63, 11,33, 10,85, 19,33, 17,37, 13,47, 11,97
IV
вариант 1:  4,31, 12,97, 13,20
вариант 2:  4,31, 8,76, 12,97, 13,20, 16,66
вариант 3:  4,31, 7,94, 8,76, 12,97, 13,20, 16,66, 17,33, 20,57
вариант 4:  4,31, 7,94, 8,76, 12,97, 13,20, 15,08, 16,66, 17,33, 19,09, 20,57, 21,58
вариант 5:  4,31, 5,77, 6,28, 7,53, 7,94, 8,76, 9,39, 9,87, 10,54, 11,07, 11,68, 12,02, 12,28, 12,97, 13,20, 13,52, 14,40, 15,08, 15,90, 16,66, 16,96, 17,33, 17,59, 18,77, 19,09, 19,74, 20,27, 20,57, 21,09, 21,58, 22,81, 23,23, 24,01, 24,65, 25,60
вариант 6:  12,97, 13,20, 8,76
вариант 7:  12,97, 13,20, 8,76, 16,66
вариант 8:  12,97, 13,20, 8,76, 16,66, 4,31
вариант 9:  12,97, 13,20, 8,76, 16,66, 4,31, 17,33
вариант10: 12,97, 13,20, 8,76, 16,66, 4,31, 17,33, 20,57
VI
вариант 1:  6,27, 9,91, 12,94вариант 2:  6,27, 9,41, 9,91, 12,94, 13,29вариант 3:  6,27, 8,85, 9,41, 9,91, 12,94, 13,29, 16,67, 19,13вариант 4:  4,39, 6,27, 8,85, 9,41, 9,91, 11,32, 12,94, 13,29, 14,03, 16,67, 19,13, 20,76, 22,06вариант 5:  4,39, 6,27, 7,00, 8,62, 8,85, 9,41, 9,91, 11,32, 11,50, 12,25, 12,56, 12,94, 13,29, 14,03, 14,82, 15,10, 15,44, 15,71, 16,01, 16,67, 16,91, 17,33, 17,59, 18,33, 18,75, 19,13, 20,25, 20,76, 21,68, 22,06, 22,27, 22,61, 22,94, 24,01, 24,33, 24,65, 25,48, 26,05, 28,63, 29,18вариант 6:  6,27, 9,91, 12,94, 15,71вариант 7:  6,27, 9,91, 12,94, 15,71, 19,13вариант 8:  6,27, 9,91, 12,94, 15,71, 16,91, 19,13вариант 9:  6,27, 9,41, 9,91, 12,94, 15,71, 16,91, 19,13вариант10: 6,27, 8,85, 9,41, 9,91, 12,94, 15,71, 16,91, 19,13
В табл. 2-7 представлены дополнительные варианты угловых положений характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для полиморфных форм по изобретению. В некоторых воплощениях полиморфная форма характеризуется угловыми положениями пиков, приведенными в табл. A. В некоторых воплощениях полиморфная форма характеризуется 3 и более (напр., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше 10) угловыми положениями характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии, как показано ниже в табл. 2-7. В некоторых воплощениях значения угла могут варьироваться на ± 0,2. В некоторых воплощениях значения угла могут варьироваться на ± 0,1. В некоторых воплощениях значения угла могут варьироваться на ± 0,05. В некоторых воплощениях значения угла могут варьироваться на ± 0,02.
В качестве неограничительного примера полиморфная форма I может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 2.
Таблица 2. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра A (форма I, ангидрат)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
5,48
16,1
21,55
4,1
7,67
11,5
21,91
4,1
10,75
8,2
22,25
4,0
12,06
7,3
22,58
3,9
15,33
5,8
23,13
3,8
16,41
5,4
23,41
3,8
17,03
5,2
23,92
3,7
17,26
5,1
24,19
3,7
17,71
5,0
24,53
3,6
17,94
4,9
25,64
3,5
18,40
4,8
26,13
3,4
18,72
4,7
26,34
3,4
19,51
4,5
27,21
3,3
20,04
4,4
27,56
3,2
20,64
4,3
28,01
3,2
20,91
4,2
29,04
3,1
21,14
4,2
29,46
3,0
В некоторых примерах полиморфная форма I характеризуется по меньшей мере 3 и более угловыми положениями. В некоторых примерах эти значения угла включают 12,06, 17,03 и 17,26 ± 0,2. В некоторых примерах полиморфная форма I характеризуется по меньшей мере 4 и более угловыми положениями. В некоторых примерах эти по меньшей мере 4 значения угла включают 12,1, 17,0, 17,3 и 15,33 ± 0,2. В некоторых примерах эти по меньшей мере 4 значения угла включают 12,1, 17,0, 17,3, 15,33 и 18,72 ± 0,2.
Полиморфная форма V может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 3.
Таблица 3. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра D (форма V, cольват с 2-MeTHF)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
6,91
12,8
17,85
5,0
7,72
11,4
19,12
4,6
9,61
9,2
19,85
4,5
11,49
7,7
20,18
4,4
11,86
7,5
21,00
4,2
12,93
6,8
22,06
4,0
13,19
6,7
22,52
3,9
13,87
6,4
22,86
3,9
14,80
6,0
23,09
3,8
15,45
5,7
23,96
3,7
16,10
5,5
24,54
3,6
16,34
5,4
25,26
3,5
16,53
5,4
26,05
3,4
17,14
5,2
26,90
3,3
Полиморфная форма III может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 4.
Таблица 4. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра C (форма III, гидрат)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
9,16
9,6
21,93
4,0
11,53
7,7
22,69
3,9
11,81
7,5
23,15
3,8
12,68
7,0
23,50
3,8
12,93
6,8
23,90
3,7
13,74
6,4
24,65
3,6
14,02
6,3
25,09
3,5
15,23
5,8
25,46
3,5
16,53
5,4
25,79
3,5
17,35
5,1
26,10
3,4
17,98
4,9
27,79
3,2
18,54
4,8
28,22
3,2
19,09
4,6
28,93
3,1
20,23
4,4
29,33
3,0
21,10
4,2
Полиморфная форма II может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 5.
Таблица 5. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра E (форма II, ангидрат)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
5,76
15,3
20,67
4,3
6,72
13,2
20,90
4,2
7,57
11,7
21,36
4,2
8,04
11,0
21,54
4,1
9,63
9,2
21,80
4,1
10,85
8,1
22,55
3,9
11,33
7,8
22,89
3,9
11,97
7,4
23,27
3,8
12,38
7,1
23,54
3,8
13,13
6,7
23,87
3,7
13,47
6,6
24,35
3,7
14,75
6,0
24,59
3,6
15,28
5,8
24,87
3,6
16,42
5,4
25,29
3,5
16,89
5,2
25,55
3,5
17,37
5,1
25,89
3,4
17,71
5,0
26,44
3,4
18,17
4,9
27,49
3,2
18,66
4,8
28,01
3,2
19,33
4,6
28,39
3,1
20,01
4,4
29,17
3,1
20,29
4,4
Полиморфная форма IV может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 6.
Таблица 6. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра B (форма IV, сольват с THF)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
4,31
20,5
15,90
5,6
5,77
15,3
16,66
5,3
6,28
14,1
16,96
5,2
7,53
11,7
17,33
5,1
7,94
11,1
17,59
5,0
8,76
10,1
18,77
4,7
9,39
9,4
19,09
4,6
9,87
9,0
19,74
4,5
10,54
8,4
20,27
4,4
11,07
8,0
20,57
4,3
11,68
7,6
21,09
4,2
12,02
7,4
21,58
4,1
12,28
7,2
22,81
3,9
12,97
6,8
23,23
3,8
13,20
6,7
24,01
3,7
13,52
6,5
24,65
3,6
14,40
6,1
25,60
3,5
15,08
5,9
Полиморфная форма VI может характеризоваться 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более угловыми положениями, как показано в табл. 7.
Таблица 7. Значения угла характеристических пиков при порошковой рентгенодифрактометрии для спектра F (форма VI, сольват с 2-MeTHF)
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
<b>Угол 2θ</b>
<b>Интервал d, A</b>
4,39
20,1
16,91
5,2
6,27
14,1
17,33
5,1
7,00
12,6
17,59
5,0
8,62
10,3
18,33
4,8
8,85
10,0
18,75
4,7
9,41
9,4
19,13
4,6
9,91
8,9
20,25
4,4
11,32
7,8
20,76
4,3
11,50
7,7
21,68
4,1
12,25
7,2
22,06
4,0
12,56
7,0
22,27
4,0
12,94
6,8
22,61
3,9
13,29
6,7
22,94
3,9
14,03
6,3
24,01
3,7
14,82
6,0
24,33
3,7
15,10
5,9
24,65
3,6
15,44
5,7
25,48
3,5
15,71
5,6
26,05
3,4
16,01
5,5
28,63
3,1
16,67
5,3
29,18
3,1
Некоторые полиморфные или аморфные формы лекарственных средств могут иметь выгодные характеристики в сравнении с другими формами, что может повлиятьна желательность лекарственного средства с фармацевтической и/или производственной точки зрения, например: повышенную стабильность, повышенную растворимость, лучшие технологические свойства, отсутствие ассоциированных нежелательных растворителей (напр., сольватов с токсичными растворителями), повышенную чистоту, лучший размер и/или распределение частиц, лучшую насыпную плотность и легкость изготовления.
Формы I, II, III и аморфная форма являются ангидратами или гидратами и преимущественно не являются сольватами с нежелательными растворителями (напр., с THF и 2-MeTHF).
Было показано, что формы I-IV и VI обладают хорошей растворимостью в воде (каждая >1,3 мг/мл), причем форма I имеет самую высокую водорастворимость, равную 1,74 мг/мл (пример 10). Кроме того, было показано, что форма I растворима в различных полярных и неполярных растворителях (пример 2), что означает возможность введения с использованием различных растворителей. В некоторых воплощениях препарат предпочтительно имеет физиологическое значение log D, близкое к нулю; при этом растворимость в полярных и неполярных растворителях указывает на более благоприятное физиологическое значение log D. Также было показано, что форма I обладает повышенной растворимостью в простом детергенте (0,5% MC/2% Tween 80) (пример 2); такая растворимость в простых детергентах может быть выгодной, поскольку эти условия могут имитировать условия в кишечнике при пероральном введении препарата. В условиях с простым детергентом образуется форма III (гидрат), поэтому форма III может быть той формой препарата, которая будет вырабатываться в кишечнике.
Формы I, II и III преимущественно проявляли устойчивость к повышенной влажности (пример 8). Форму I также подвергали испытанию на измельчение, и она показала устойчивость к измельчению (пример 9). Как видно из примеров, проведенные эксперименты показали, что форма I является очень устойчивой.
Формы, которые не являются гигроскопичными, легче поддаются обработке с точки зрения производства. Как видно из примера 11, формы I, II, IV и VI не являются гигроскопичными.
Определенные формы и размеры частиц могут быть предпочтительными: частицы, которые ближе к сферическим, могут быть предпочтительными, а пластины и иглы менее предпочтительны. Как видно из примера 11, формы I, II и III имеют более благоприятные формы, тогда как форма VI была пластинчатой, а форма IV - игольчатой формы. В отношении размера частиц предпочтительными могут быть мелкие, более однородные по размеру. Более мелкие частицы могут обладать большей биологической доступностью, они легче растворяются и легче поддаются обработке из-за уменьшения времени сушки. Кроме того, более мелкие частицы могут не требовать стадии микронизации, которая может потребоваться для более крупных частиц. Как видно из фигур, формы I-III имеют более благоприятные размеры частиц, чем IV и VI.
Более высокие температуры плавления могут указывать на формы с лучшими характеристиками при обработке (напр., они легче поддаются сушке и обработке) и на большую термическую стабильность. Форма I имела самую высокую точку плавления из форм I-VI. Кроме того, в некоторых воплощениях предпочтительным может быть один пик, так как множественные пики могут указывать на преобразование в другие формы. Форма I имела единственный пик DSC, у всех остальных было два или три.
Различные формы (полиморфные и аморфные) (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида также могут применяться в качестве промежуточных продуктов при получении требуемой формы. В качестве неограничительного примера, если предпочтительный способ синтеза для получения (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида не дает предпочтительной формы, эта непредпочтительная форма может использоваться в качестве промежуточного продукта для получения требуемой формы.
Заболевания, подходящие для лечения или подавления с помощью композиций и способов по изобретению
Считается, что различные расстройства/заболевания вызываются или усугубляются окислительным стрессом, нарушающим нормальный поток электронов в клетках, как-то митохондриальные расстройства, нарушения энергетического метаболизма, нейродегенеративные заболевания и болезни старения, которые можно лечить или подавлять с помощью полиморфных и аморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и способов по изобретению.
10
10
Неограничительные примеры расстройств окислительного стресса включают, к примеру, митохондриальные заболевания (включая наследственные митохондриальные заболевания), как-то болезнь Альперса, синдром Барта, дефекты бета-окисления, недостаточность карнитина-ацилкарнитина, недостаточность карнитина, синдром дефицита креатина, недостаточность кофермента Q, недостаточность комплекса I, недостаточность комплекса II, недостаточность комплекса III, недостаточность комплекса IV, недостаточность комплекса V, недостаточность COX, хроническая прогрессирующая внешняя офтальмоплегия (CPEO), недостаточность CPT I, недостаточность СРТ II, атаксия Фридрейха (FA), глютаровая ацидурия II типа, синдром Кернса-Сейра (KSS), лактацидоз, недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы длинноцепочечных жирных кислот (LCAD), LCHAD, синдром Лея, синдром типа Лея, наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON, также именуется как болезнь Лебера, оптическая атрофия Лебера (LOA) или оптическая нейропатия Лебера (LON)), летальная инфантильная кардиомиопатия (LIC), болезнь Люфта, множественная недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы (MAD), недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы среднецепочечных жирных кислот (MCAD), митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактацидоз и инсульт (MELAS), миоклоническая эпилепсия со рваными красными мышечными волокнами (MERRF), синдром митохондриальной рецессивной атаксии (MIRAS), митохондриальная цитопатия, истощение митохондриальной ДНК, митохондриальная энцефалопатия, митохондриальная миопатия, синдром митохондриальной нейрогастроинтестинальной энцефалопатии (MNGIE), нейропатия, атаксия и пигментный ретинит (NARP), синдром Пирсона, недостаточность пируваткарбоксилазы, недостаточность пируватдегидрогеназы, мутации POLG, нарушения дыхательной цепи, недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы короткоцепочечных жирных кислот (SCAD), SCHAD, недостаточность ацил-CoA-дегидрогеназы очень длинноцепочечных жирных кислот (VLCAD); миопатии типа кардиомиопатии и энцефаломиопатии; нейродегенеративные заболевания, как-то болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS, также известный как болезнь Лу Герига); мотонейронные болезни; неврологические заболевания типа эпилепсии; возрастные заболевания, в особенности такие, для лечения которых предложен CoQ, как-то дегенерация желтого пятна, диабет (напр., сахарный диабет 2 типа), метаболический синдром и рак (напр., рак головного мозга); генетические заболевания типа болезни Хантингтона (которая также является и неврологическим заболеванием); аффективные расстройства типа шизофрении и биполярных расстройств; первазивные расстройства развития (PDD) типа аутистического расстройства, синдрома Аспергера, детского дезинтегративного расстройства (CDD), синдрома Ретта и PDD без дополнительных уточнений (PDD-NOS); расстройства мозгового кровообращения, такого как инсульт; нарушения зрения, такие как возникающие при нейродегенеративных заболеваниях глаз, как-то оптическая нейропатия, наследственная оптическая нейропатия Лебера, ювенильная оптическая атрофия с доминантным наследованием, оптическая нейропатия, вызванная токсическими веществами, глаукома, возрастная дегенерация желтого пятна (“сухая”, не экссудативная дегенерация желтого пятна, и “мокрая”, экссудативная дегенерация желтого пятна), макулярная дистрофия Старгардта, диабетическая ретинопатия, диабетическая макулопатия, ретинопатия недоношенных и повреждения сетчатки при ишемической реперфузии; заболевания, вызванные нарушением энергетики, включая заболевания, вызванные лишением, отравлением или токсичностью кислорода и качественным или количественным нарушением транспорта кислорода типа гемоглобинопатии, к примеру, талассемия или серповидноклеточная анемия; другие заболевания, при которых отмечается митохондриальная дисфункция, как-то эксцитотоксические повреждения нейронов, такие как связанные с судорогами, инсультом и ишемией; и другие расстройства, включая ацидоз почечных канальцев; синдром дефицита внимания/гиперактивности (ADHD); нейродегенеративные заболевания, ведущие к нарушениям слуха или равновесия; доминантная оптическая атрофия (DOA); наследуемый по материнской линии диабет и глухота (MIDD); хроническая усталость; контрастовая нефропатия; контрастовая ретинопатия; абеталипопротеинемия; пигментный ретинит; болезнь Вольфрама; синдром Туретта; дефицит кобаламина c; метилмалоновая ацидурия; глиобластома; синдром Дауна; острый тубулярный некроз; мышечная дистрофия; лейкодистрофия; прогрессирующий супрануклеарный парез; спинальная мышечная атрофия; нарушения слуха (напр., нарушения слуха от воздействия шума); травматическое повреждение мозга; ювенильная болезнь Хантингтона; рассеянный склероз; NGLY1; мультисистемная атрофия; адренолейкодистрофия; и адреномиелонейропатия. Следует иметь в виду, что некоторые специфические заболевания или расстройства могут подпадать под более чем одну категорию; к примеру, болезнь Хантингтона - это генетическое заболевание, а также и неврологическое заболевание. Кроме того, некоторые заболевания от окислительного стресса также можно рассматривать как митохондриальные заболевания.
При некоторых заболеваниях, подходящих для лечения с помощью композиций и способов по изобретению, первичной причиной заболевания является дефект дыхательной цепи или иной дефект, препятствующий нормальной утилизации энергии в митохондриях, клетках или тканях. Неограничительные примеры заболеваний, подпадающих под эту категорию, включают наследственные митохондриальные заболевания, такие как миоклоническая эпилепсия со рваными красными мышечными волокнами (MERRF), митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактацидоз и инсульт (MELAS), наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON, также именуется как болезнь Лебера, оптическая атрофия Лебера (LOA) или оптическая нейропатия Лебера (LON)), болезнь Лея или синдром Лея, синдром Кернса-Сейра (KSS) и атаксия Фридрейха (FA). При некоторых заболеваниях, подходящих для лечения с помощью композиций и способов по изобретению, первичной причиной заболевания не является дефект дыхательной цепи или иной дефект, препятствующий нормальной утилизации энергии в митохондриях, клетках или тканях; неограничительные примеры заболеваний, подпадающих под эту категорию, включают инсульт, рак и диабет. Однако эти последние заболевания особенно усугубляются при нарушениях энергетики и они особенно подходят для лечения с помощью композиций по изобретению с тем, чтобы ослабить заболевание. Подходящие примеры таких заболеваний включают ишемический инсульт и геморрагический инсульт, когда первичной причиной заболевания является нарушение кровоснабжения головного мозга. Хотя при ишемических эпизодах, вызванных тромбозом или эмболией, либо геморрагических эпизодах, вызванных разрывом кровеносных сосудов, первичной причиной не является дефект дыхательной цепи или иной дефект, препятствующий нормальной утилизации энергии, но окислительный стресс играет роль в ишемическом каскаде из-за реперфузионного повреждения кислородом после гипоксии (этот каскад возникает и при инфаркте, и при инсульте). Соответственно, лечение с помощью соединений и способов по изобретению должно ослабить эти эффекты при заболеваниях. Модулирование одного или нескольких энергетических биомаркеров, нормализация одного или нескольких энергетических биомаркеров или усиление одного или нескольких энергетических биомаркеров также может оказаться благотворным при таких заболеваниях, как в качестве терапевтического мероприятия, так и профилактического мероприятия. Например, при подготовке пациентов к не срочному устранению аневризмы, усиление энергетических биомаркеров до и во время предоперационного периода может улучшить прогноз у пациента, если вдруг аневризма прорвется еще до операции.
Термин “расстройство окислительного стресса” или “болезнь окислительного стресса” охватывает как заболевания, вызванные окислительным стрессом, так и заболевания, усугубляемые окислительным стрессом. Термины “расстройство окислительного стресса” или “болезнь окислительного стресса” охватывают и заболевания, первичной причиной которых является дефект дыхательной цепи или иной дефект, препятствующий нормальной утилизации энергии в митохондриях, клетках или тканях, и заболевания, первичной причиной которых не является дефект дыхательной цепи или иной дефект, препятствующий нормальной утилизации энергии в митохондриях, клетках или тканях. Первую группу заболеваний можно назвать “первичными расстройствами окислительного стресса”, а последнюю - “вторичными расстройствами окислительного стресса”. Следует отметить, что различие между “заболеваниями, вызванными окислительным стрессом” и “заболеваниями, усугубляемыми окислительным стрессом” не является абсолютным; заболевание может представлять собой как заболевание, вызванное окислительным стрессом, так и заболевание, усугубляемое окислительным стрессом. Граница между “первичными расстройствами окислительного стресса” и “вторичными расстройствами окислительного стресса” является более четкой, при условии, что существует только одна первичная причина заболевания и эта главная причина известна.
Принимая во внимание некоторую зыбкость границы между заболеваниями, вызванными окислительным стрессом, и заболеваниями, усугубляемыми окислительным стрессом, митохондриальные заболевания и заболевания с нарушениями энергетического метаболизма, как правило, относятся к категории заболеваний, вызванных окислительным стрессом, тогда как нейродегенеративные заболевания и болезни старения, как правило, относятся к категории заболеваний, усугубляемых окислительным стрессом. Митохондриальные заболевания и заболевания с нарушениями энергетического метаболизма, как правило, являются первичными расстройствами окислительного стресса, тогда как нейродегенеративные заболевания и болезни старения могут быть и первичными, и вторичными расстройствами окислительного стресса.
Клиническая оценка окислительного стресса и эффективности терапии
+
+
red
ox
tot
2
2
2
2
10
10
Для оценки метаболического состояния пациентов с заболеваниями окислительного стресса применяются несколько легко измеримых клинических маркеров. Эти маркеры также могут применяться в качестве показателей эффективности данной терапии по мере того, как уровень маркера смещается от патологического значения до здоровой величины. Эти клинические маркеры включают, без ограничения, такие энергетические биомаркеры, как уровень молочной кислоты (лактата) в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровень пировиноградной кислоты (пирувата) в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; соотношение лактат/пируват в цельной крови, плазме, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровень общего, восстановленного или окисленного глутатиона либо соотношение восстановленный/окисленный глутатион в цельной крови, плазме, лимфоцитах, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровень общего, восстановленного или окисленного цистеина либо соотношение восстановленный/окисленный цистеин в цельной крови, плазме, лимфоцитах, спинномозговой жидкости или в жидкости желудочков мозга; уровень фосфокреатина; уровень NADH (NADH + H) или NADPH (NADPH + H); уровень NAD или NADP; уровень АТФ; анаэробный порог; уровень восстановленного кофермента Q (CoQ); уровень окисленного кофермента Q (CoQ); общий уровень кофермента Q (CoQ); уровень окисленного цитохрома c; уровень восстановленного цитохрома c; соотношение окисленный цитохром c/восстановленный цитохром c; уровень ацетоацетата, уровень β-гидроксибутирата, соотношение ацетоацетат/β-гидроксибутират; уровень 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозина (8-OHdG); уровень активных форм кислорода; уровень потребления кислорода (VO); уровень выделения двуокиси углерода (VCO); и дыхательный коэффициент (VCO/VO). Некоторые из этих клинических маркеров регулярно измеряются в физиологических лабораториях по физической подготовке и обеспечивают удобные оценки метаболического состояния субъекта. В одном воплощении изобретения уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров у пациента, страдающего от расстройства окислительного стресса типа атаксии Фридрейха, наследственной оптической нейропатии Лебера, MELAS, KSS или недостаточности CoQ, улучшается с точностью до двух стандартных отклонений от среднего уровня у здоровых лиц. В другом воплощении изобретения уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров у пациента, страдающего от расстройства окислительного стресса типа атаксии Фридрейха, наследственной оптической нейропатии Лебера, MELAS, KSS или недостаточности CoQ, улучшается с точностью до одного стандартного отклонения от среднего уровня у здоровых лиц. В качестве показателя эффективности данной терапии также может применяться непереносимость физической нагрузки, причем улучшение переносимости физической нагрузки (т.е. снижение непереносимости физической нагрузки) указывает на эффективность данной терапии.
10
Некоторые метаболические биомаркеры уже применялись для оценки эффективности CoQ, и эти метаболические биомаркеры можно регистрировать в качестве энергетических биомаркеров для применения в способах настоящего изобретения. Лактат, продукт анаэробного метаболизма глюкозы, удаляется путем восстановления до пирувата в аэробных условиях или при окислительном метаболизме, который зависит от функциональной митохондриальной дыхательной цепи. Дисфункция дыхательной цепи может привести к недостаточному удалению лактата и пирувата из кровообращения, а при митохондриальных цитопатиях наблюдается повышенное соотношение лактат/пируват (см. Scriver CR. The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th ed., New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1995; и Munnich et al., J. Inherit. Metab. Dis. 15(4): 448-55 (1992)). Поэтому соотношение лактат/пируват в крови (Chariot et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 118(7):695-7 (1994)) широко применяется в качестве неинвазивного теста для выявления митохондриальных цитопатий (опять же см. Scriver CR. The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th ed., New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1995; и Munnich et al., J. Inherit. Metab. Dis. 15(4): 448-55 (1992)) и токсических митохондриальных миопатий (Chariot et al., Arthritis Rheum, 37(4): 583-6 (1994)). Можно исследовать изменения окислительно-восстановительного статуса митохондрий печени путем измерения соотношения артериальных кетоновых тел (ацетоацетат/3-оксибутират: AKBR) (Ueda et al., J. Cardiol., 29(2): 95-102 (1997)). В качестве биомаркера для оценки степени исправления вызванных ROS повреждений ДНК как в клинических, так и в рабочих условиях часто применялось содержание 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозина (8-OHdG) в моче (Erhola et al., FEBS Lett. 409(2):287-91 (1997); Honda et al., Leuk. Res. 24(6): 461-8 (2000); Pilger et al., Free Radic. Res. 35(3):273-80 (2001); Kim et al., Environ Health Perspect. 112(6): 666-71 (2004)).
1
31
При диагностике митохондриальных цитопатий оказалась полезной магнитно-резонансная спектроскопия (MRS), демонстрируя повышение лактата в цереброспинальной жидкости (CSF) и в белом веществе коры мозга методом протонной MRS (H-MRS) (Kaufmann et al., Neurology 62(8): 1297-302 (2004)). Фосфорная MRS (P-MRS) применялась для демонстрации низких уровней фосфокреатина (PCr) в коре (Matthews et al., Ann. Neurol., 29(4): 435-8 (1991)) и замедленной кинетики восстановления PCr в скелетных мышцах после физической нагрузки (Matthews et al., Ann. Neurol., 29(4): 435-8 (1991); Barbiroli et al., J. Neurol. 242(7): 472-7 (1995); Fabrizi et al., J. Neurol. Sci. 137(1): 20-7 (1996)). Низкий уровень PCr в скелетных мышцах у пациентов с митохондриальной цитопатией также подтвердился при прямых биохимических измерениях.
2 max
2 max
c
2
В качестве средства оценки и скрининга при митохондриальных миопатиях особенно полезно тестирование на физические нагрузки. Одним из характерных признаков митохондриальных миопатий является снижение максимального потребления кислорода во всем организме (VO) (Taivassalo et al., Brain 126 (Pt 2): 413-23 (2003)). Учитывая, что VO определяется по сердечному выбросу (Q) и периферической экстракции кислорода (артериовенозной разнице по общему содержанию кислорода), некоторые митохондриальные цитопатии затрагивают сердечную функцию, когда может изменяться доставка кислорода; однако при большинстве митохондриальных миопатий проявляется характерный дефицит по периферической экстракции кислорода (A-V разности O) и повышенная доставка кислорода (гиперкинетическая циркуляция) (Taivassalo et al., Brain 126 (Pt 2): 413-23 (2003)). Это может быть установлено по отсутствию вызванной физической нагрузкой деоксигенации венозной крови при прямом измерении AV-разности (Taivassalo et al., Ann. Neurol., 51(1): 38-44 (2002)) и неинвазивным методом при ближней инфракрасной спектроскопии (Lynch et al., Muscle Nerve 25(5): 664-73 (2002); van Beekvelt et al., Ann. Neurol. 46(4): 667-70 (1999)).
Некоторые из этих энергетических биомаркеров обсуждаются более подробно далее. Следует подчеркнуть, что, хотя некоторые энергетические биомаркеры обсуждаются и перечислены здесь, изобретение не ограничивается модулированием, нормализацией или усилением только этих перечисленных энергетических биомаркеров.
+
+
Уровни молочной кислоты (лактата): дисфункция митохондрий обычно приводит к аномальным уровням молочной кислоты, так повышаются уровни пирувата и пируват превращается в лактат для поддержания способности к гликолизу. Дисфункция митохондрий также может приводить к аномальным уровням NADH + H, NADPH + H, NAD или NADP, так как восстановленные никотинамидадениндинуклеотиды не эффективно перерабатываются дыхательной цепью. Уровни лактата можно измерить, взяв образцы подходящих жидкостей организма, таких как цельная кровь, плазма или цереброспинальная жидкость. При помощи магнитного резонанса можно измерить уровни лактата практически в любом желательном объеме организма, таком как головной мозг.
Измерение церебрального лактацидоза методом магнитного резонанса у больных MELAS описано в Kaufmann et al., Neurology 62(8): 1297 (2004). Представлены значения уровней молочной кислоты в боковых желудочках головного мозга при двух мутациях, вызывающих MELAS - A3243G и A8344G. Уровни лактата в цельной крови, плазме и цереброспинальной жидкости можно измерять при помощи коммерчески доступного оборудования, такого как анализаторы глюкозы и лактата YSI 2300 STAT Plus (YSI Life Sciences, Ohio).
+
+
Уровни NAD, NADP, NADH и NADPH: измерение NAD, NADP, NADH (NADH + H) или NADPH (NADPH + H) может проводиться различными флуоресцентными, энзиматическими или электрохимическими методами, напр., электрохимическим методом, описанным в US 2005/0067303.
h
Уровни GSH, GSSG, Cys и CySS: вкратце, уровни GSH, GSSG, Cys и CySS в плазме используются для расчета значений E in vivo. Образцы отбирают по методике Jones et al. (2009) Free Radical Biology & Medicine 47(10) pp 1329-1338), для алкилирования свободных тиолов используют бромбиман, а для разделения, выявления и количественного определения молекул применяется HPLC и электрохимические методы либо MSMS. Как описано более подробно в заявке PCT/US2013/058568, разработан метод для различных экспериментальных параметров при анализе наиболее распространенных монотиолов и дисульфидов (цистина, цистеина, восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG)), присутствующих в плазме человека, а в качестве внутреннего стандарта (IS) используется батофенантролиндисульфоновая кислота. Полное разделение всех целевых аналитов и IS осуществляется при 35°C на колонке C18 RP (250 мм × 4,6 мм, 3 микрона) с использованием смеси 0,2% TFA:ацетонитрил в качестве подвижной фазы, подаваемой со скоростью 0,6 мл/мин, используя электрохимический детектор в режиме постоянного тока при потенциале на детекторе 1475 мВ.
2
2
2
2
2
2
2
2
2 max
2 max
2
2
2
2
2
2
Потребление кислорода (VO или vO), выброс двуокиси углерода (VCO или vCO) и дыхательный коэффициент (VCO/VO): VO обычно измеряется в состоянии покоя (VO в покое) или же при максимальной интенсивности нагрузки (VO). Оптимально следует измерять оба значения. Однако для пациентов с тяжелой инвалидностью измерение VO может быть нецелесообразным. Измерение обеих форм VO легко осуществляется с помощью стандартного оборудования от различных поставщиков, напр., Korr Medical Technologies, Inc. (Salt Lake City, Utah). Также легко измеряется VCO и соотношение VCO к VO в таких же условиях (VCO/VO в покое либо при максимальной интенсивности нагрузки), давая дыхательный коэффициент (RQ).
ox
red
ox
red
Окисленный цитохром c, восстановленный цитохром c и отношение окисленного цитохрома c к восстановленному цитохрому c: такие параметры цитохрома c, как уровни окисленного цитохрома c (cyt c), уровни восстановленного цитохрома c (cyt c) и соотношение окисленный цитохром c/восстановленный цитохром c (cyt c)/(cyt c) можно измерять in vivo методом близкой инфракрасной спектроскопии, напр., см. Rolfe P., “In vivo near-infrared spectroscopy,” Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:715-54 (2000); и Strangman et al., “Non-invasive neuroimaging using near-infrared light” Biol. Psychiatry 52: 679-93 (2002).
Переносимость физической нагрузки/непереносимость физической нагрузки: непереносимость физической нагрузки определяется как “снижение способности к выполнению такой деятельности, которая включает динамические движения больших скелетных мышц вследствие симптомов одышки или усталости” (Piña et al., Circulation 107: 1210 (2003)). Непереносимость физической нагрузки часто сопровождается миоглобинурией из-за разрушения мышечной ткани и последующего выведения мышечного миоглобина с мочой. Можно использовать различные меры непереносимости физической нагрузки, такие как время, проведенное при хождении или беге на бегущей дорожке до истощения, время, проведенное на велотренажере (стационарном велосипеде) до истощения, и т.п. Применение соединений, композиций или способов по изобретению может приводить к улучшению переносимости физической нагрузки на примерно 10% или больше (например, увеличение времени до истощения на примерно 10% или больше, напр., от 10 минут до 11 минут), улучшению переносимости физической нагрузки на примерно 20% или больше, на примерно 30% или больше, на примерно 40% или больше, на примерно 50% или больше, на примерно 75% или больше или же на примерно 100% или больше. Хотя переносимость физической нагрузки, строго говоря, не является энергетическим биомаркером, в целях изобретения модулирование, нормализация или усиление энергетических биомаркеров включает модулирование, нормализацию или повышение переносимости физической нагрузки.
red
ox
tot
Аналогичным образом, в данной области техники известны тесты на нормальные и аномальные значения уровня пировиноградной кислоты (пирувата), соотношения лактат/пируват, уровня АТФ, анаэробного порога, уровня восстановленного кофермента Q (CoQ), уровня окисленного кофермента Q (CoQ), общего уровня кофермента Q (CoQ), уровня окисленного цитохрома c, уровня восстановленного цитохрома c, соотношения окисленный цитохром c/восстановленный цитохром c, общего уровня, восстановленного и окисленного GSH и цистеина и их соотношений, уровня ацетоацетата, уровня β-гидроксибутирата, соотношения ацетоацетат/β-гидроксибутират, уровня 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозина (8-OHdG) и уровня активных форм кислорода, которые можно использовать для оценки эффективности соединений, композиций и способов по изобретению. (В целях изобретения модулирование, нормализация или усиление энергетических биомаркеров включает и модулирование, нормализацию или усиление анаэробного порога).
Далее приведена табл. 8, иллюстрирующая влияние различных дисфункций на биохимические и энергетические биомаркеры. Также указаны физические эффекты (такие как симптомы заболевания или другие эффекты дисфункции), обычно связанные с данной дисфункцией. Следует отметить, что любые из энергетических биомаркеров, приведенных в таблице, наряду с энергетическими биомаркерами, перечисленными в других местах, также могут подвергаться модулированию, усилению или нормализации при помощи соединений, композиций и способов по изобретению. RQ = дыхательный коэффициент; BMR = базальная скорость обмена; HR (CO) = частота сердечных сокращений (сердечный выброс); T = температура тела (предпочтительно измеряется как внутренняя температура); AT = анаэробный порог; pH = pH крови (венозной и/или артериальной).
Таблица 8
<b>Место дисфункции</b>
<b>Биохимическое событие</b>
<b>Энергетический биомаркер</b>
<b>Физический эффект</b>
Дыхательная цепь
↑ NADH
Δ лактат, Δ соотношение лактат:пируват; Δ соотношение ацетоацетат:β-гидроксибутират
метаболическая дискразия и усталость
Дыхательная цепь
↓ H<sup>+</sup>-градиент
Δ ATP
органозависимая дисфункция
Дыхательная цепь
↓ поток электронов
Δ VO<sub>2</sub>, RQ, BMR, ΔT, AT, pH
метаболическая дискразия иусталость
Митохондрии и цитозоль
↓ ATP, ↓ VO<sub>2</sub>
Δ работа, Δ HR (CO)
непереносимость физ. нагрузки
Митохондрии и цитозоль
↓ ATP
Δ PCr
непереносимость физ. нагрузки
Дыхательная цепь
↓ cyt c<sub>ox</sub>/<sub>red</sub>
Δ λ ~700-900 нм (близкая ИК-спектроскопия)
непереносимость физ. нагрузки
Промежуточный метаболизм
↓ катаболизм
Δ <sup>14</sup>C-меченые субстраты
метаболическая дискразия иусталость
Дыхательная цепь
↓ поток электронов
Δ смешанное венозное VO<sub>2</sub>
метаболическая дискразия иусталость
Митохондрии и цитозоль
↑ окислительный стресс
Δ токоферол и токотриенолы, CoQ<sub>10</sub>, докозагексановая кислота
неопределенный
Митохондрии и цитозоль
↑ окислительный стресс
Δ глутатион восст.
неопределенный
Митохондрии и цитозоль
окисление нуклеиновых кислот
Δ 8-гидрокси-2′-дезоксигуанозин
неопределенный
Митохондрии и цитозоль
окисление липидов
Δ изопростаны, эйкозаноиды
неопределенный
Клеточные мембраны
окисление липидов
Δ этан (дыхание)
неопределенный
Клеточные мембраны
окисление липидов
Δ малоновый диальдегид
неопределенный
Лечение лиц, страдающих расстройствами окислительного стресса, в соответствии со способами по изобретению может приводить к уменьшению или облегчению симптомов у данных лиц, напр., прекращению дальнейшего прогрессирования расстройства.
Частичное или полное подавление расстройств окислительного стресса может привести к уменьшению тяжести одного или нескольких симптомов, которые субъект мог бы испытывать в противном случае. Например, частичное подавление MELAS может привести к уменьшению числа перенесенных эпизодов инсульта или приступов судорог.
Любые из описанных здесь энергетических биомаркеров или их комбинаций дают легко измеряемые показатели, по которым можно оценить эффективность лечения или профилактической терапии. Кроме того, специалистам известны и другие энергетические биомаркеры, которые можно отслеживать для оценки эффективности лечения или профилактической терапии.
Применение соединений или композиций для модулирования энергетических биомаркеров
Наряду с мониторингом энергетических биомаркеров для оценки состояния лечения или подавления заболеваний от окислительного стресса, соединения или композиции по изобретению могут применяться для модулирования одного или нескольких энергетических биомаркеров у субъектов или пациентов. Модулирование энергетических биомаркеров может осуществляться для нормализации энергетических биомаркеров у субъектов или для усиления энергетических биомаркеров у субъектов.
Нормализация одного или нескольких энергетических биомаркеров определяется как восстановление уровня одного или нескольких таких энергетических биомаркеров до нормального или почти нормального уровня у субъекта, у которого уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров проявляет патологическое отличие от нормального уровня (т.е. уровня у здоровых лиц), или же изменение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров для облегчения патологических симптомов у субъекта. В зависимости от природы энергетического биомаркера такие уровни при измерении могут проявлять значения выше или ниже нормального значения. Например, патологический уровень лактата обычно выше, чем уровень лактата у нормального (то есть здорового) лица, и может потребоваться снижение этого уровня. Патологический уровень АТФ обычно ниже, чем уровень АТФ у нормального (то есть здорового) лица, и может потребоваться повышение уровня АТФ. Соответственно, нормализация энергетических биомаркеров может означать восстановление уровня энергетических биомаркеров в пределах по меньшей мере примерно двух стандартных отклонений от нормы у субъекта, более предпочтительно в пределах по меньшей мере примерно одного стандартного отклонения от нормы у субъекта, по меньшей мере примерно половины стандартного отклонения от нормы или же по меньшей мере примерно четверти стандартного отклонения от нормы.
Повышение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров определяется как изменение существующего уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до такого уровня, который обеспечивает полезные или требуемые эффекты для этого лица. Например, человек, подвергающийся напряженному усилию или продолжительной сильной физической активности, такой как альпинизм, может получить пользу от повышения уровня АТФ или снижения уровня лактата. Как описано выше, нормализация энергетических биомаркеров может не достигать оптимального состояния у лиц с заболеваниями от окислительного стресса, но такие лица тоже могут получить пользу от усиления энергетических биомаркеров. Примеры лиц, которым могло бы пойти на пользу повышение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров, включают, без ограничения, лиц, занимающихся напряженной или продолжительной физической активностью, лиц с хроническими энергетическими проблемами или лиц с хроническими респираторными проблемами. К таким лицам относятся, без ограничения, беременные женщины, особенно беременные женщины при родах; новорожденные, особенно недоношенные новорожденные; лица, подверженные экстремальным условиям типа жары (температура, часто превышающая примерно 85-86°F или примерно 30°C в течение примерно 4 часов в день или больше), холода (температура, часто оказывающаяся ниже примерно 32°F или примерно 0°C в течение 4 часов в день или больше) или пониженного содержания кислорода, повышенного содержания двуокиси углерода или повышенного уровня загрязнения воздуха (авиапассажиры, стюардессы и бортпроводники, лица на большой высоте, лица, проживающие в городах с низким качеством воздуха, лица, работающие в закрытых помещениях с плохим качеством воздуха); лица с легочными заболеваниями или с пониженной емкостью легких, такие как больные туберкулезом, больные раком легких, больные эмфиземой и больные кистозным фиброзом; лица, выздоравливающие после операции или болезни; пожилые лица, включая пожилых лиц с пониженным уровнем энергии; лица, страдающие хронической усталостью, включая лиц, страдающих синдромом хронической усталости; лица с острыми травмами; лица в состоянии шока; лица, требующие острой подачи кислорода; лица, требующие хронической подачи кислорода; или другие лица с острыми, хроническими или текущими потребностями в энергии, которым может пойти на пользу повышение энергетических биомаркеров.
Соответственно, когда каким-то лицам приносит пользу повышение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров, то усиление одного или нескольких энергетических биомаркеров может означать повышение уровня соответствующего энергетического биомаркера или энергетических биомаркеров по меньшей мере на четверть стандартного отклонения выше нормы, на половину стандартного отклонения выше нормы, на одно стандартное отклонение выше нормы или на два стандартных отклонения выше нормы. С другой стороны, уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров может повышаться по меньшей мере примерно на 10% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения, по меньшей мере примерно на 20% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения, по меньшей мере примерно на 30% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения, по меньшей мере примерно на 40% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения, по меньшей мере примерно на 50% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения, по меньшей мере примерно на 75% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения или по меньшей мере примерно на 100% выше уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до повышения.
Когда же требуется снижение уровня одного или нескольких энергетических биомаркеров для улучшения одного или нескольких энергетических биомаркеров, то уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица может снижаться по меньшей мере примерно на четверть стандартного отклонения от нормы, примерно на половину стандартного отклонения от нормы, примерно на одно стандартное отклонение от нормы или примерно на два стандартных отклонения от нормы. С другой стороны, уровень одного или нескольких энергетических биомаркеров может снижаться по меньшей мере примерно на 10% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения, по меньшей мере примерно на 20% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения, по меньшей мере примерно на 30% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения, по меньшей мере примерно на 40% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения, по меньшей мере примерно на 50% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения, по меньшей мере примерно на 75% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения или по меньшей мере примерно на 90% ниже уровня соответствующего одного или нескольких энергетических биомаркеров у лица до снижения.
Применение соединений или композиций в исследовательских целях, экспериментальных системах и методах анализа
Соединения или композиции по изобретению также могут применяться в исследовательских целях. Они могут применяться в экспериментах in vitro, in vivo или ex vivo для модулирования одного или нескольких энергетических биомаркеров в экспериментальной системе. Такие экспериментальные системы могут представлять собой образцы клеток, образцы тканей, клеточные компоненты или смеси клеточных компонентов, части органов, целые органы или организмы. В экспериментальных системах или в исследовательских целях может применяться любое одно или несколько соединений или композиций. Такие исследовательские области применения могут включать, без ограничения, применение в качестве аналитических реагентов, выяснение биохимических путей или оценку эффектов других агентов на метаболическое состояние экспериментальной системы в присутствии или в отсутствие одного или нескольких соединений или композиций по изобретению.
Кроме того, соединения или композиции по изобретению могут применяться в биохимических тестах или анализах. Такие тесты могут включать инкубацию одного или нескольких соединений или композиций по изобретению с образцами ткани или клеток у лица для оценки потенциального ответа лица (или ответа определенного подмножества лиц) на введение данного одного или нескольких соединений или композиций или для определения того, какое соединение или композиция по изобретению дает оптимальный эффект у определенного лица или подмножества лиц. Один из таких тестов или анализов включает: 1) получение образца клеток или образца ткани у лица, у которого можно проанализировать модуляцию одного или нескольких энергетических биомаркеров; 2) введение одного или нескольких соединений или композиций по изобретению в образец клеток или образец ткани; и 3) определение степени модуляции одного или нескольких энергетических биомаркеров после введения одного или нескольких соединений или композиций по сравнению со статусом энергетических биомаркеров до введения одного или нескольких соединений или композиций. Другой такой тест или анализ включает: 1) получение образца клеток или образца ткани у лица, у которого можно проанализировать модуляцию одного или нескольких энергетических биомаркеров; 2) введение по меньшей мере двух соединений или композиций по изобретению в образец клеток или образец ткани; 3) определение степени модуляции одного или нескольких энергетических биомаркеров после введения этих по меньшей мере двух соединений или композиций по сравнению со статусом энергетических биомаркеров до введения этих по меньшей мере двух соединений или композиций; и 4) отбор соединения или композиции для применения при лечении, подавлении или модулировании, исходя из степени модуляции, определенной на стадии 3.
В некоторых воплощениях предусмотрены способы применения полиморфных форм I-VI для лечения или защиты от повреждений, вызванных воздействием радиации, и способы применения таких соединений для лечения или защиты от повреждений, вызванных радиоактивным облучением. В некоторых воплощениях способы лечения или защиты от повреждений, вызванных радиационным воздействием, включают введение в клетки или ткани либо нуждающимся в этом лицам терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества полиморфной формы I-VI или приведенной здесь композиции. В одном воплощении полиморфные формы I-VI применяются терапевтически во время или после либо во время и после радиационного воздействия. В другом воплощении полиморфные формы I-VI применяются профилактически перед радиационным воздействием. В другом воплощении полиморфные формы I-VI вводятся одновременно с радиационным воздействием. В другом воплощении одно или несколько соединений вводятся после радиационного воздействия.
В некоторых воплощениях предусмотрены способы применения полиморфных форм I-VI для лечения от повреждений, вызванных воздействием радиации, и способы применения таких соединений для лечения или защиты от повреждений, вызванных радиоактивным облучением. В некоторых воплощениях способы лечения от повреждений, вызванных радиационным воздействием, включают введение в клетки или ткани либо нуждающимся в этом лицам терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества полиморфной формы I-VI или приведенной здесь композиции. В одном воплощении полиморфные формы I-VI применяются терапевтически во время или после либо во время и после радиационного воздействия. В другом воплощении полиморфные формы I-VI применяются профилактически перед радиационным воздействием. В другом воплощении полиморфные формы I-VI вводятся одновременно с радиационным воздействием. В другом воплощении одно или несколько соединений вводятся после радиационного воздействия.
Фармацевтические составы
Соединения или композиции, описанные здесь, можно получать в виде фармацевтических композиций путем их составления вместе с такими добавками, как фармацевтически приемлемые эксципиенты, фармацевтически приемлемые носители и фармацевтически приемлемые растворители. Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители и растворители включают технологические добавки и модификаторы и усилители доставки лекарственных средств, такие, к примеру, как фосфат кальция, стеарат магния, тальк, моносахариды, дисахариды, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, декстроза, гидроксипропил-β-циклодекстрин, поливинилпирролидон, низкоплавкие воски, ионообменные смолы и т.п., а также любые комбинации из двух или нескольких из них. Другие подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты описаны в “Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Pub. Co., New Jersey (1991); и “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 20th edition (2003), 21st edition (2005); которые включены в настоящий документ посредством отсылки.
Фармацевтическая композиция может составлять стандартную дозовую форму, при этом стандартная доза есть доза, достаточная для терапевтического или подавляющего эффекта, или количество, эффективное для модулирования, нормализации или усиления энергетического биомаркера. Стандартная доза может быть достаточной в виде разовой дозы для оказания терапевтического или подавляющего эффекта или же соответствовать количеству, эффективному для модулирования, нормализации или усиления энергетического биомаркера. С другой стороны, стандартная доза может быть такой, которая вводится периодически в ходе лечения или подавления заболевания или для модулирования, нормализации или усиления энергетического биомаркера.
Фармацевтические композиции, содержащие соединения или композиции по изобретению, могут быть в любом виде, подходящем для предполагаемого способа введения, включая, к примеру, растворы, суспензии или эмульсии. При приготовлении растворов, суспензий и эмульсий обычно используются жидкие носители. Жидкие носители, предназначенные для применения в практике настоящего изобретения, включают, к примеру, воду, солевые растворы, фармацевтически приемлемые органические растворители, фармацевтически приемлемые масла или жиры и т.п., а также смеси из двух или нескольких из них. Жидкие носители могут содержать и другие подходящие фармацевтически приемлемые добавки, такие как солюбилизаторы, эмульгаторы, питательные вещества, буферы, консерванты, суспендирующие вещества, загустители, регуляторы вязкости, стабилизаторы и пр. Подходящие органические растворители включают, к примеру, одноатомные спирты, такие как этанол, и многоатомные спирты, такие как гликоли. Подходящие масла включают, к примеру, соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло, сафлоровое масло, хлопковое масло и др. При парентеральном введении носителем также может быть масляный эфир, такой как этилолеат, изопропилмиристат и т.п. Композиции по настоящему изобретению также могут быть в виде микрочастиц, микрокапсул, липосомных инкапсулятов и т.п., а также любых комбинаций из двух или нескольких из них.
Можно использовать системы доставки с постепенным высвобождением или с контролируемым высвобождением, такие как системы с контролируемым диффузией матриксом или эрозионные системы, как описано, к примеру, в Lee, “Diffusion-Controlled Matrix Systems”, pp. 155-198, и Ron и Лангер, “Erodible Systems”, pp. 199-224, в “Treatise on Controlled Drug Delivery”, A. Kydonieus, Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992. Матрикс может представлять собой, к примеру, биоразлагаемый материал, который может спонтанно разлагаться in situ и in vivo, к примеру, путем гидролиза или ферментативного расщепления, например протеазами. Система доставки может представлять собой, к примеру, природный или синтетический полимер или сополимер, например в виде гидрогеля. Типичные полимеры с расщепляемыми связями включают полиэфиры, полиортоэфиры, полиангидриды, полисахариды, поли(фосфоэфиры), полиамиды, полиуретаны, поли(имидокарбонаты) и поли(фосфазены).
Соединения или композиции по изобретению могут вводиться энтерально, перорально, парентерально, под язык, путем ингаляции (напр., в виде аэрозоля или спрея), ректально или топически в стандартных дозовых формах, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и растворители, по необходимости. Например, подходящие способы введения включают пероральное, подкожное, трансдермальное, трансмукозальное, ионтофоретическое, внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное (напр., через слизистую оболочку носа), субдуральное, ректальное, желудочно-кишечное введение и т.д., а также непосредственно в определенный или пораженный орган или ткань. Для доставки в центральную нервную систему можно использовать спинальное и эпидуральное введение или введение в желудочки мозга. Топическое введение также может включать и трансдермальное введение типа трансдермальных пластырей или устройств для ионтофореза. Термин “парентеральное” в настоящем изобретении включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудные методы инъекции или вливания. Соединения или композиции смешивают с фармацевтически приемлемыми носителями, адъювантами и растворителями, подходящими для требуемого способа введения. Предпочтительным способом введения является пероральное введение, а предпочтительными формами являются формы, подходящие для перорального введения. Описанные здесь соединения могут вводиться в твердом виде, в жидком виде, в виде аэрозоля или в виде таблеток, пилюль, порошковых смесей, капсул, гранул, инъекций, кремов, растворов, свечей, клизм, спринцеваний, эмульсий, дисперсий, пищевых премиксов и в виде других подходящих форм. Соединения или композиции также можно вводить в липосомальных формах. Соединения также можно вводить в виде пролекарств, при этом пролекарство подвергается трансформации у проходящего лечение лица в форму, которая является терапевтически эффективной. В данной области известны и другие способы введения.
В некоторых воплощениях изобретения, особенно в тех воплощениях, где применяются формы для инъекций или иного парентерального введения, включая приведенные здесь способы, а также включая воплощения, используемые для перорального, желудочного, желудочно-кишечного или кишечного введения, формы и препараты, используемые в способах по изобретению, являются стерильными. Стерильные лекарственные формы составляют или изготавливают по фармацевтическим стандартам стерилизации (United States Pharmacopeia Главы 797, 1072 и 1211; California Business & Professions Code 4127.7; 16 California Code of Regulations 1751, 21 Code of Federal Regulations 211), которые известны специалистам в данной области.
Препараты для инъекций, например, стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, могут быть составлены в соответствии с известными методами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильные препараты для инъекций также могут представлять собой стерильные растворы или суспензии для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, к примеру, в виде раствора в пропиленгликоле. В число приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителей или суспендирующих сред обычно используют стерильные, нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любые легкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при приготовлении препаратов для инъекций находят применение такие жирные кислоты, как олеиновая кислота.
Твердые дозовые формы для перорального введения могут включать капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозовых формах активное соединение может находиться в смеси по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозовые формы могут содержать и другие вещества, отличные от инертных разбавителей, например смазывающие вещества, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль дозовые формы могут содержать и буферные вещества. Кроме того, таблетки и пилюли могут иметь энтеросолюбильное покрытие.
Жидкие дозовые формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие такие инертные разбавители, широко используемые в данной области, как вода. Такие композиции также могут содержать адъюванты, такие как смачивающие вещества, эмульгирующие и суспендирующие вещества, циклодекстрины и подсластители, ароматизаторы и отдушки.
Соединения или композиции по настоящему изобретению также можно вводить и в виде липосом. Как известно, липосомы обычно получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образуются из моно- или многослойных гидратированных жидких кристаллов, диспергированных в водной среде. Можно использовать любые нетоксичные, физиологически приемлемые и метаболизируемые липиды, способные к образованию липосом. Данные композиции в виде липосом могут содержать, наряду с соединением по настоящему изобретению, стабилизаторы, консерванты, эксципиенты и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как природные, так и синтетические. Способы получения липосом известны в данной области. Например, см. Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y., стр. 33 и далее (1976).
Изобретением также предусмотрены изделия и наборы, содержащие материалы, пригодные для лечения или подавления расстройств окислительного стресса. Изобретением также предусмотрены наборы, содержащие одно или несколько из соединений или композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых воплощениях наборы по изобретению содержат подходящие контейнеры.
В других аспектах наборы могут применяться для любых из описанных здесь способов, в том числе, к примеру, для лечения лиц с митохондриальными расстройствами или для подавления у них митохондриальных расстройств.
Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалами-носителями для получения разовой дозовой формы, будет варьироваться в зависимости от организма, которому вводится активный ингредиент, и конкретного способа введения. Однако следует иметь в виду, что конкретный уровень дозы для каждого конкретного пациента будет зависеть от различных факторов, включая активность используемого конкретного соединения, возраст, массу тела, площадь тела, индекс массы тела (BMI), общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, способ введения, скорость выведения, комбинации лекарств и тип, прогрессирование и тяжесть конкретного заболевания, подлежащего терапии. Выбранные стандартные фармацевтические дозы обычно изготавливают и вводят так, чтобы получить определенную конечную концентрацию препарата в крови, тканях, органах или других целевых частях тела. Терапевтически эффективное количество или эффективное количество для данной ситуации легко определяется с использованием рутинных экспериментов и входит в рамки квалификации и суждения обычного врача.
Примеры дозировки, которые можно использовать, составляют терапевтически эффективное количество или эффективное количество в дозовом диапазоне от 0,1 мг/кг до 300 мг/кг массы тела или от 1,0 мг/кг до 100 мг/кг массы тела или от 1,0 мг/кг до 50 мг/кг массы тела или от 1,0 мг/кг до 30 мг/кг массы тела или от 1,0 мг/кг до 10 мг/кг массы тела или от 10 мг/кг до 100 мг/кг массы тела или от 50 мг/кг до 150 мг/кг массы тела или от 100 мг/кг до 200 мг/кг массы тела или от 150 мг/кг до 250 мг/кг массы тела или от 200 мг/кг до 300 мг/кг массы тела или же от 250 мг/кг до 300 мг/кг массы тела. Соединения или композиции по настоящему изобретению можно вводить в виде одной суточной дозы или же вводить общую суточную дозу в дробных дозах по два, три или четыре раза в день.
Хотя соединения или композиции по изобретению можно вводить в виде единственного активного фармацевтического средства, однако их также можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими средствами, применяемыми при лечении или подавлении заболеваний. Типичные средства, пригодные для использования в комбинации с соединениями или композициями по изобретению для лечения или подавления митохондриальных заболеваний, включают, без ограничения, кофермент Q, витамин E, идебенон, MitoQ, витамины, NAC и антиоксидантные соединения.
При использовании дополнительных активных средств в комбинации с соединениями или композициями по настоящему изобретению дополнительные активные средства обычно применяются в терапевтических количествах, которые приведены в Physicians’ Desk Reference (PDR) 53rd Edition (1999), или же в таких терапевтически полезных количествах, которые известны среднему специалисту в данной области.
Соединения или композиции по изобретению и другие терапевтически активные средства можно вводить в рекомендуемых максимальных клинических дозах либо в меньших дозах. Уровни дозировки активных соединений в композициях по изобретению можно варьировать с тем, чтобы получить требуемый терапевтический ответ в зависимости от способа введения, тяжести заболевания и реакции пациента. При введении в комбинации с другими терапевтическими средствами эти терапевтические средства можно составить в виде отдельных композиций, которые вводятся в одно и то же время или в разное время, или же можно вводить терапевтические препараты в виде единой композиции.
Далее изобретение будет дополнительно описано на нижеследующих неограничивающих примерах.
Получение композиций по изобретению
Композиции настоящего изобретения могут быть получены из легкодоступных исходных материалов с использованием следующих общим методов и процедур. Следует иметь в виду, что в тех случаях, когда указаны типичные или предпочтительные условия процесса (то есть температура реакции, время, мольные соотношения реагентов, растворители, давление и т.д.), могут применяться и другие условия процесса, если не указано иначе. Оптимальные условия реакции могут варьироваться в зависимости от конкретных реагентов или растворителей, но такие условия могут быть определены специалистами в данной области при помощи рутинных процедур оптимизации.
Параметры реакций синтеза
Растворители, используемые при синтезе соединений и композиций по изобретению, включают, к примеру, метанол (“MeOH”), ацетон, воду, ацетонитрил, 1,4-диоксан, диметилформамид (“DMF”), бензол, толуол, ксилол, тетрагидрофуран (“THF”), хлороформ, метиленхлорид (или дихлорметан (“DCM”)), диэтиловый эфир, пиридин, 2-метил-тетрагидрофуран (“2-MeTHF”), диметилацетамид (“DMA”), этилацетат (“EtOAc”), этанол (“EtOH”), изопропиловый спирт (“IPA”), изопропилацетат (“IPAc”), метилцеллюлозу (“MC”), ацетонитрил (“MeCN”), метанол(MeOH), метил-трет-бутиловый эфир (“MTBE”), физраствор с фосфатным буфером (“PBS”), тетрагидрофуран (“THF”) и др., а также их смеси.
Термин “q.s.” означает добавление количества, достаточного для достижения указанной функции, напр., для доведения раствора до нужного объема (то есть 100%).
Приведенные здесь соединения и композиции синтезируют по соответствующей комбинации общеизвестных методов синтеза. Методы, применяемые для синтеза приведенных здесь соединений и композиций, являются вполне очевидными и доступными для специалистов в соответствующей области в свете изложенных здесь принципов. Нижеприведенное обсуждение служит для иллюстрации некоторых из самых разных способов, доступных для применения при синтезе приведенных здесь соединений и композиций. Однако это обсуждение не должно определять объем реакций или последовательностей реакций, применяемых при получении приведенных здесь соединений и композиций.
Специалистам в данной области будут очевидны и другие способы получения соединений и композиций по изобретению с учетом изложенных здесь принципов.
Примеры
Пример 1. Синтез (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (форма I)
Пример 1A. Выделение свободного основания (1S,2S)-(+)-псевдоэфедрина
В суспензию (1S,2S)-(+)-псевдоэфедрина гидрохлорида (300 г, Spectrum) в 2-MeTHF (1,5 л, 5 об.) добавляли 20% водный раствор NaOH (750 мл, 2,5 об.) и перемешивали смесь в течение 30 мин (часть твердых веществ осталась нерастворенной), а затем переносили в делительную воронку. Нижний водный слой сливали вместе с веществами, которые оставались на интерфазе, и снова экстрагировали 2-MeTHF (750 мл, 2,5 об.), при этом нерастворенные вещества полностью растворялись, образуя два прозрачных слоя. Объединенные органические слои упаривали досуха на роторном испарителе, а полученные твердые вещества сушили в вакуумной печи при 50°C в течение ночи, получая 240,3 г свободного основания в виде белого твердого вещества (выход 97,7%).
Пример 1B. Осаждение (1S,2S)-псевдоэфедрина из 2-MeTHF/гептана
Растворяли (1S,2S)-псевдоэфедрин (Sigma-Aldrich, sku # 212464, 8,2 г) при 50°C в 2-MeTHF (41 мл, 5 об.). Полученный раствор разбавляли гептаном (82 мл, 10 об.), а полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Отфильтровывали кристаллизовавшийся (1S,2S)-псевдоэфедрин и сушили в течение ночи при 40°C под вакуумом, получая 6,4 г (78%) белого кристаллического вещества. Фильтрат сбрасывали в общие отходы.
Относительно низкий (78%) выход при кристаллизации потребовал дополнительного эксперимента по кристаллизации с более высоким соотношением гептан/2-MeTHF. Кристаллический (1S,2S)-псевдоэфедрин, полученный в эксперименте выше, растворяли при 50°C в 2-MeTHF (32 мл, 5 об.). Полученный раствор разбавляли гептаном (32 мл, 5 об.), а полученную суспензию отгоняли с гептаном (3×50 мл) на роторном испарителе до тех пор, пока молярное соотношение 2-MeTHF/гептан не стало ниже 6% по данным ЯМР. Полученную суспензию отфильтровывали, а продукт сушили в течение ночи при 40°C под вакуумом, получая 6,3 г (98%) белого кристаллического вещества.
Пример 1C. Хиральное разделение тролокса с помощью (1S,2S)-(+)-псевдоэфедрина
Вносили рацемическую 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокислоту (Trolox) (316,6 г, 1,27 моль) и свободное основание (1S,2S)-(+)-псевдоэфедрина, описанное в примере 1A (240,0 г, 1,46 моль), в реактор на 4 л с рубашкой, снабженный навесной мешалкой, датчиком температуры и продувкой азотом. Затем вносили этилацетат (EtOAc, 1585 мл, 5 об.) и нагревали суспензию до 50°C, получая прозрачный раствор. Иногда наблюдалось преждевременное (еще до полного растворения рац. тролокса) осаждение соли (R)-тролокс-псевдоэфедрина при 40°C. Если происходило преждевременное осаждение, то реакционную смесь нагревали (обычно до температуры кипения) до полного растворения. Реакционную смесь охлаждали в течение ночи до комнатной температуры, при этом наблюдалось массивное выпадение осадка. Смесь охлаждали до 10°C в течение 30 мин и выдерживали при этой температуре в течение 1 часа. Образовавшееся твердое вещество собирали фильтрованием, а влажный осадок на фильтре промывали EtOAc (1,9 л, 6 об.) и сушили в вакуумной печи при 25-30°C до постоянного веса, получая 188,1 г (71,3% в пересчете на (R)-тролокс) белого твердого вещества. По данным хиральной HPLC, энантиомерная чистота составила почти 100%.
Пример 1D. Выделение (R)-тролокса из его соли с (1S,2S)-(+)-псевдоэфедрином
Полученную ПЭ-соль (R)-тролокса (187,3 г, 0,45 моль) вносили в круглодонную колбу на 2 л, а затем добавляли 2-MeTHF (570 мл, 3 об.), получая взвесь. Порциями добавляли соляную кислоту (2,5 М, 325 мл, 0,81 моль, 1,75 экв.), поддерживая температуру ниже 25°C. ПЭ-соль тролокса растворялась, а (R)-тролокс экстрагировался в органическую фазу. Небольшой черный клочок наблюдался в интерфазе и переходил в водную фазу. Водную фазу дополнительно экстрагировали 2-MeTHF (2×200 мл). Затем объединенный органический слой промывали 15% NaCl (200 мл), а затем водой (200 мл). Органический слой сушили над безводным сульфатом натрия (150 г), фильтровали и упаривали досуха, получая белое твердое вещество, которое высушивали в вакуумном шкафу при 30°C до постоянной массы в 128,3 г, что превышает стехиометрическое количество.
Пример 1E. Получение (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида
2
В 3-горлую круглодонную колбу на 2 л, снабженную навесной мешалкой, подачей азота и датчиком температуры, вносили N,N′-карбонилдиимидазол (CDI) (Sigma-Aldrich) (188 г, 1,16 моль). Добавляли 2-MeTHF (290 мл), получая перемешиваемую взвесь, а затем медленно добавляли (R)-тролокс (126,0 г, 504 ммоль) в 2-MeTHF (500 мл) при температуре ниже 30°C. Наблюдалась небольшая экзотермическая реакция, сопровождающаяся выделением CO. Выделение газа начиналось после добавления примерно одной трети (R)-тролокса. Полное растворение исходных материалов наблюдалось примерно через 15 мин.
Содержимое этой колбы медленно вносили в предварительно охлажденный до 5°C 28-30% водный аммиак (380 мл), поддерживая температуру ниже 30°C. Полученную двухфазную суспензию перемешивали при комнатной температуре и проверяли по HPLC. Было обнаружено, что реакция завершалась через 36 ч, а дальнейшая обработка проводилась через 48 ч.
3
Реакционную смесь подкисляли до рН 1-2 серной кислотой (1:4 об./об.) (850 мл), поддерживая температуру ≤ 28°C, причем реакция была сильно экзотермичной. Водный слой (pH = 1) удаляли, а органический слой промывали NaCl (15% водный раствор, 250 мл), NaHCO (1М, 250 мл), NaCl (15% водный раствор, 250 мл) и водой (250 мл). Большую часть органического слоя использовали для дальнейших стадий.
Пример 1F. Получение (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
В 3-горлую круглодонную колбу на 2 л, снабженную навесной мешалкой и датчиком температуры, вносили раствор (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида (708 мл), содержащий ~0,39 моль промежуточного амида и воду (126 мл).
3
2
3
2
Исходный раствор FeCl×6HO (480 г, 1,78 моль) в воде (336 мл) разделяли на 4 равные части (по 204 г) и четверть этого раствора хлорида железа (III) вносили в реакционную колбу. Наблюдалась слабая (~3°C) экзотерма, окраска органического слоя стала почти черной, затем посветлела до темно-коричневой. Двухфазную реакционную смесь энергично перемешивали 40 мин при комнатной температуре. После удаления слегка окрашенной водной фазы добавляли еще одну порцию раствора хлорида железа (III) и перемешивали еще 40 мин. Операцию повторяли еще раз и хранили органическую фазу в течение ночи при комнатной температуре. На следующее утро проводили четвертую обработку FeCl×6HO. Наблюдалась почти полная (99,44%) конверсия (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида в (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид.
3
3
3
Экстракцию железа сначала проводили 1М раствором тринатрийцитрата (2 × 350 мл); значение AUC (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида повысилось до 0,84%. Органическая фаза оставалась очень кислой (pH = 1). Порцию органической фазы в 1 мл обрабатывали 1М NaHCO, что приводило к массивному выпадению осадка красного Fe(OH). Исходя из этого, проводили еще одну промывку тринатрийцитратом (175 мл) (0,74% (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида). Проверка новой порции в 1 мл с 1М NaHCO не давала осадка в водном слое, а окраска водного слоя была желтой, а не красной, что указывает на полное или почти полное удаление железа.
Органический слой нагревали до 40°C, чтобы предотвратить преждевременное осаждение (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида, и промывали 1М раствором бикарбоната натрия (175 мл). Разделение фаз происходило не сразу, но завершилось через 15 мин, давая два прозрачных желтых слоя. Органический слой (0,30% (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида) еще раз промывали водой (350 мл), получая 0,22% (R)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксамида. После выпаривания органического слоя получили 96 г (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
Объединенные бикарбонатные/водные слои еще экстрагировали 2-MeTHF (2 × 250 мл). После выпаривания этих экстрактов по отдельности получили 4,0 и 0,9 г (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
Объединенные твердые вещества (100,9 г - неочищенный (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид, выход 84% исходя из соли (R)-тролокс-псевдоэфедрина) растворяли в изопропаноле (600 мл) при 70°C и вносили полученный желтый раствор в 3-горлую круглодонную колбу на 2 л, снабженную навесной мешалкой и датчиком температуры.
Добавляли гептан (600 мл), осадка не наблюдалось. Реакционную смесь снова нагревали до 55°C и медленно охлаждали до комнатной температуры. Добавляли затравочные кристаллы требуемого полиморфа (0,2 г) и перемешивали реакционную смесь в течение ночи при комнатной температуре. Ночью наблюдалось массивное выпадение осадка. Реакционную смесь охлаждали до 7°C и перемешивали еще 8 часов. Продукт фильтровали, промывали смесью изопропанол-гептан 1:1 (2 × 75 мл) и сушили в течение выходных при 40°C. Получили 69,4 г (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (выход 58%, исходя из соли (R)-тролокс-псевдоэфедрина). Данные XRPD для продукта соответствовали требуемой форме I.
Пример 2. Измерение растворимости для спектра A
Получали (R)-тролокс из рацемического тролокса путем двойного разделения с помощью метилбензиламина таким же способом, как описано в примере 29 патента США № 4,026,907. Этот (R)-тролокс использовали для синтеза исходного (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. Именно этот исходный материал, обозначаемый как спектр A, использовали для измерения растворимости.
Суспендировали избыточное количество твердого вещества в 17 системах растворителей с различными свойствами как минимум на 3 дня. Суспензии центрифугировалии использовали прозрачные растворы для гравиметрического метода. Соединение проявляло повышенную растворимость в МеОН, EtOH при комнатной температуре и в IPA, ацетоне, MeOH, EtOH и 2-MeTHF при 50°C. Умеренная растворимость наблюдалась в EtOAc, THF, IPA, ацетоне, 2-MeTHF, MeCN, 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80, IPAc и 4% DMA в PBS при комнатной температуре и при 50°C. Ограниченная растворимость наблюдалась в гептане, толуоле, MTBE, воде и 0,5% метилцеллюлозе в воде при комнатной и повышенной температуре. В табл. 9 представлены полученные при измерении данные по растворимости. Ожидается ошибка ± 10%.
Таблица 9. Растворимость (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в различных системах растворителей (исходный материал со спектром A)
<b>Растворитель</b>
<b>мг/мл при 25°C</b>
<b>мг/мл при 50°C</b>
Гептан
6
6
Толуол
3
<18
MTBE
10
16
EtOAc
22
38
THF
28.
33
IPA
20
53
Ацетон
39
90
EtOH
40
>121
MeOH
>101
>112
2-MeTHF
35
59
MeCN
20
38
Вода
3
3
<sup>1</sup>Вода
2
6
0,5% MC/2% Tween 80*
26
30
IPAc
13
16
0,5% MC в воде*
7
4
4% DMA в PBS*
10
13
* Часть концентрации относится к компонентам растворителя
Как видно из табл. 9, спектр A растворим в различных полярных и неполярных растворителях и, кроме того, обладает повышенной растворимостью в простом детергенте (0,5% MC/2% Tween 80).
Пример 3. Краткосрочные эксперименты на суспензиях
Краткосрочные эксперименты на суспензиях исходного материала со спектром A проводили как минимум в течение 3 дней в 17 различных системах растворителей с различными свойствами при двух разных температурах (25 и 50°C). Для нагревания и перемешивания суспензий, которые находились во флаконах для HPLC на 2 мл, использовали 48-гнездный реакционный блок Chemglass. По прошествии заданного времени флаконы центрифугировали и использовали влажные твердые вещества для дифракции рентгеновских лучей. В табл. 10 приведены результаты экспериментов на суспензиях. Эти результаты показывают, что твердое вещество со спектром A было относительно стабильным при суспендировании в большинстве этих растворителей на короткий период времени. Однако при суспендировании вещества со спектром A в THF и 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 появились два новых рентгеновских профиля, обозначенных как спектры B и C, соответственно (фиг. 1).
Таблица 10. Сводка по 3-дневным суспензиям (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (исходный материал со спектром A)
<b>     25°C</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Исходная форма</b>
<b>Полученная форма, влажная</b>
<b>Полученная форма, сухая</b>
<b>Полученная форма, влажная</b>
Гептан
A
A
A
Толуол
A
A
A
MTBE
A
A
A
EtOAc
A
A
A
THF
A
B
B
-
IPA
A
A
A
Ацетон
A
A
A
EtOH
A
A
-
MeOH
A
-
-
2-MeTHF
A
A
A
MeCN
A
A
A
Вода
A
A
A
<sup>1</sup>Вода
A
A
A
0,5% MC/2% Tween 80
A
C
C
A
IPAc
A
A
A
0,5% MC в воде
A
A
A
4% DMA в PBS
A
A
A
Пример 4. Эксперименты по кристаллизации выпариванием
Эксперименты по кристаллизации выпариванием (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида проводили на образцах, полученных при гравиметрическом определении растворимости (пример 2). При XRPD-анализе большинства образцов получали спектр A. Однако при XRPD-анализе веществ, выделенных из 2-MeTHF при 25°C, получали уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр D, показанный на фиг. 2. При XRPD-анализе образцов из IPAc, 0,5% MC в воде и 4% DMA в PBS в основном получали аморфный профиль, за исключением IPAc при 50°C, который давал кристаллический профиль, совпадающий со спектром А. Все результаты приведены в табл. 11.
Таблица 11. Сводка из экспериментов по кристаллизации выпариванием (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (исходный материал со спектром A)
<b>     25°C</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Исходная форма</b>
<b>Полученная форма, влажная</b>
<b>Полученная форма, сухая</b>
<b>Полученная форма, влажная</b>
Гептан
A
-
-
Толуол
A
A
A
MTBE
A
масло
аморфная
EtOAc
A
A
A
THF
A
аморфная
A
IPA
A
аморфная
аморфная
Ацетон
A
A
A
EtOH
A
A
A
MeOH
A
A
A
2-MeTHF
A
D
н/п
A
MeCN
A
A
A
Вода
A
A
A
<sup>1</sup>Вода
A
A
A
0,5% MC/2% Tween 80
A
масло
масло
IPAc
A
аморфная
A
0,5% MC в воде
A
аморфная
-
4% DMA в PBS
A
аморфная
аморфная
Н/п: высушивание не проводилось, так как образец высыхал в течение ночи
Пример 5. Эксперименты по кристаллизации
Эксперименты по кристаллизации в одинарных растворителях с быстрым и медленным охлаждением проводили в толуоле, EtOAc, IPA, ацетоне, EtOH, 2-MeTHF и IPA с 2% воды (табл. 12). Для нагревания и перемешивания, которое проводилось во флаконах на 4 мл, использовали 48-гнездный реакционный блок Chemglass. В каждый флакон, снабженный магнитной мешалкой, вносили 50-80 мг исходного материала (спектр А). Добавляли первичный растворитель и нагревали с перемешиванием до растворения. После полного растворения образцы медленно охлаждали путем излучательного охлаждения или быстро охлаждали на ледяной бане, после чего уравновешивали в течение ночи с перемешиванием. При кристаллизации в бинарных растворителях антирастворитель (гептан) добавляли двумя способами (табл. 13). В первом антирастворитель добавляли по каплям в раствор образца до тех пор, пока не появлялся небольшой осадок. Во втором использовали обратное добавление раствора образца в нагретый антирастворитель в соотношении 2:1 и оставляли остывать. Образцы, которые давали твердые осадки после уравновешивания в течение ночи, выделяли фильтрованием, а образцы, которые не давали осадка, выпаривали под слабой струей азота. Все образцы сушили в течение ночи в вакуумной печи при обычных условиях и анализировали методом XRPD для проверки на перемену формы. Все подробности и результаты экспериментов приведены в табл. 12-13.
XRPD-анализ всех выделенных твердых веществ в основном давал кристаллические спектры, совпадающие со спектром A исходного материала. Однако при кристаллизации в одинарном растворителе, проводившейся в 2-MeTHF с быстрым и медленным охлаждением, осадки при охлаждении не появлялись, поэтому их охлаждали и упаривали досуха в атмосфере азота. Было обнаружено, что эти испаренные вещества дают спектры XRPD, совпадающие с ранее наблюдавшимся профилем D (фиг. 3). При кристаллизации с быстрым охлаждением, проводившейся в EtOAc, получали кристаллические вещества с уникальным профилем XRPD, который сравнивали со всеми известными формами и обозначили как спектр E (фиг. 4). При кристаллизации в бинарных растворителях с быстрым и медленным охлаждением, проводившейся в EtOH/гептане и ацетон/гептане, получали спектры XRPD, совпадающие со спектром A.
Таблица 12. Сводка из экспериментов по кристаллизации в одинарных растворителях (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (исходный материал со спектром A)
<b>Исходный материал (спектр A)    мг</b>
<b>Первичный растворитель</b>
<b>Темп. (°C)</b>
<b>Скорость охлажд.</b>
<b>Выделение</b>
<b>XRPD [профиль]</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Объем (мл)</b>
49,7
толуол
2,75
60
быстро
н/п
-
52,3
EtOAc
1
60
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр E]
55,9
IPA
1
60
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
50,9
ацетон
0,5
60
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
82,0
EtOH
0,5
60
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
51,1
2-MeTHF
1
60
быстро
выпар.
кристалл. [спектр D]
48,9
IPA с 2% воды
0,5
60
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
50,2
толуол
2,75
60
медленно
н/п
кристалл. [спектр A]
49,2
EtOAc
1
60
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
54,9
IPA
1
60
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
51,9
ацетон
0,5
60
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
82,7
EtOH
0,5
60
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
54,6
2-MeTHF
1
60
медленно
выпар.
кристалл. [спектр D]
54,0
IPA с 2% воды
0,5
60
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
Таблица 13. Сводка из экспериментов по кристаллизации в бинарных растворителях (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида (исходный материал со спектром A)
<b>Исходный материал (спектр </b><b>A)    мг</b>
<b>Первичный растворитель</b>
<b>Темп. (°C)</b>
<b>Антираствори-тель</b>
<b>Скорость добавл. антираст-ворителя</b>
<b>Выделение</b>
<b>XRPD [профиль]</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Объем (мл)</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Объем (мл)</b>
84,5
EtOH
0,5
60
гептан
2,5
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
53,7
ацетон
0,5
60
гептан
1,5
медленно
фильтр.
кристалл. [спектр A]
82,2
EtOH
0,5
60
гептан
1,0
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
56,1
ацетон
0,5
60
гептан
1,0
быстро
фильтр.
кристалл. [спектр A]
Пример 6. Эксперименты по масштабированию
Эксперименты по масштабированию проводились в масштабе 300 мг методом кристаллизации в одинарных растворителях с быстрым охлаждением в 2-MeTHF, EtOAc и на суспензиях в THF и 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 в попытке выделить ранее отмеченные спектры D, E, B и C, соответственно, для дальнейшей их характеристики. Подробности и результаты экспериментов приведены в табл. 14-15.
Эксперименты по кристаллизации в одинарных растворителях с быстрым охлаждением проводились в 2-MeTHF и EtOAc (табл. 14). Для нагревания и перемешивания, которое проводилось во флаконах на 4 мл, использовали 48-гнездный реакционный блок Chemglass. В каждый флакон, снабженный магнитной мешалкой, вносили примерно 300 мг исходного материала. Добавляли 6 мл первичного растворителя и нагревали при 60°C с перемешиванием до растворения. После полного растворения образцы переносили в ледяную баню (быстрое охлаждение) и вносили затравку на кончике шпателя, заполненном профилем D или E, после чего уравновешивали в течение ночи при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы, которые давали твердые осадки после уравновешивания в течение ночи, выделяли фильтрованием, а образцы, которые не давали осадка, выпаривали под слабой струей азота. Все образцы сушили в течение ночи под вакуумом при обычных условиях и проводили анализ методом XRPD для проверки на перемену формы.
Эксперименты на суспензиях проводили в THF и 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 (табл. 15). Для нагревания и перемешивания, которое проводилось во флаконах на 4 мл, использовали 48-гнездный реакционный блок Chemglass. В каждый флакон, снабженный магнитной мешалкой, вносили примерно 300 мг исходного материала. Добавляли растворитель для суспензии до 2 мл при обычных условиях и оставляли для уравновешивания на 30 мин, после чего добавляли спектр B или C на кончике шпателя.
При XRPD-анализе твердых веществ, выделенных при кристаллизации в одинарном растворителе, проводившейся в 2-MeTHF с быстрым охлаждением, получали уникальный спектр XRPD, обозначенный как спектр F (фиг. 4). При кристаллизации с быстрым охлаждением, проводившейся в EtOAc, получали кристаллические вещества, совпадающие со спектром E по XRPD (фиг. 5). В экспериментах на суспензиях, проводившихся в THF и 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80, после 24-часового уравновешивания получали спектры B и C, соответственно (фиг. 6-7).
Таблица 14. Сводка из экспериментов по масштабированию при кристаллизации в одинарных растворителях (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>Исходный материал (спектр A)    мг</b>
<b>Первичный растворитель</b>
<b>Темп. (°C)</b>
<b>Скорость охлажд.</b>
<b>Затравка [мг] при охлажд.</b>
<b>Выделение</b>
<b>XRPD [профиль]</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Объем (мл)</b>
312,0
2-MeTHF
6,0
60
быстро
[~10]
выпар.
кристалл. [спектр F]
300,7
EtOAc
6,0
60
быстро
[~10]
фильтр.
кристалл. [спектр E]
Таблица 15. Сводка из экспериментов по масштабированию на суспензиях (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>Исходный материал (спектр A)    мг</b>
<b>Первичный растворитель</b>
<b>Темп. взвеси (°C)</b>
<b>Образование суспензии</b>
<b>Затравка [мг] в суспензии</b>
<b>XRPD [профиль] 24 часа</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Объем (мл)</b>
305,7
THF
6,0
комн.
да
[~10]
кристалл. [спектр B]
308,3
0,5% MC/ 2% Tween 80 в воде
6,0
комн.
да
[~10]
кристалл. [спектр C]
Пример 7. Cравнительные суспензии
Проводили сравнительные эксперименты на суспензиях с профилями A, B, C, D, E и F в IPA, IPA с 2% воды и 0,5% метилцеллюлозе в воде при обычных условиях, как указано в табл. 16. В стеклянный флакон с магнитной мешалкой вносили примерно 100 мг исходного материала со спектром A. Во флакон добавляли растворитель и проводили суспендирование со спектром A в течение 15 мин, после чего в каждый флакон добавляли примерно 10-20 мг каждого сравнительного спектра (B, C, D, E и F). Образцы оставляли уравновешиваться с перемешиванием, а через 24 часа или после уравновешивания XRPD-анализ показал, что вещества, выделенные из суспензии в 0,5% метилцеллюлозе в воде, представляют собой смесь спектров A и C (фиг. 8). Все остальные вещества, выделенные из IPA и IPA с 2% воды, соответствовали исходному материалу со спектром A (фиг. 9). Однако после 7 дней уравновешивания наблюдалась полная конверсия в спектр C из суспензии в 0,5% метилцеллюлозе в воде (фиг. 8), тогда как вещества, выделенные из сравнительных суспензий в IPA и IPA с 2% воды, соответствовали спектру A (фиг. 9).
Таблица 16. Сводка из сравнительных экспериментов на суспензиях (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в 2 млрастворителя
<b>Растворитель</b>
<b>Спектр (мг)</b>
<b>XRPD</b>
<b>Спектр A</b>
<b>Спектр B</b>
<b>Спектр C</b>
<b>Спектр D</b>
<b>Спектр E</b>
<b>Спектр F</b>
<b>24 ч</b>
<b>7 дней</b>
IPA
101,9*
~10
~10
~10
~10
~10
A
A
IPA:вода (98:2)
107,3*
~10
~10
~10
~10
~10
A
A
0,5% MC/вода
103,9*
~10
~10
~10
~10
~10
A/C
C
* Использовался для насыщения растворителя и получения негустой суспензии спектра A
Пример 8. Исследования при повышенной влажности
Проводили 7-дневные эксперименты при повышенной влажности на всех профилях A, B, C, D, E и F в обычных условиях при относительной влажности >95% (табл. 17). Взвешивали примерно 30 мг каждого спектра в стеклянном флаконе на 4 мл. Незакрытый флакон вставляли в сцинтилляционный флакон на 20 мл, наполовину заполненный водой и закрытый крышкой. После 24 часов уравновешивания проводили визуальный осмотр, чтобы проверить изменения внешнего вида, однако никаких изменений не наблюдалось. После 7 дней уравновешивания при повышенной влажности образцы не проявляли никаких физических изменений и их подвергали XRPD-анализу для проверки на формы. Спектры A, C и E не проявляли перемены формы после 7 дней уравновешивания; однако спектр B преобразовался в смесь спектров A/B. Спектр D преобразовался в смесь спектров D/B, а спектр F преобразовался в спектр E при отн. влажности > 95%. Все подробности и результаты экспериментов приведены в табл. 17.
Таблица 17. Сводка из 7-дневных экспериментов при повышенной влажности (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>[мг]</b>
<b>Условия хранения</b>
<b>Исходный профиль</b>
<b>Визуальные наблюдения</b>
<b>XRPD [профиль]</b>
<b>1 день</b>
<b>7 дней</b>
<b>7 дней</b>
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
A
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [спектр A]
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
B
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [смесь спектров A/B]
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
C
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [спектр C]
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
D
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [смесь спектров D/B]
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
E
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [спектр E]
~ 30
> 95% RH при комн. темп.
F
желтое вещество
желтое вещество
кристалл. [спектр E]
Пример 9. Эксперименты по измельчению
Проводили эксперименты по измельчению исходного материала путем сухого измельчения и измельчения в каплях растворителя - IPA и воды - с помощью ступки и пестика (табл. 18). После легкого измельчения спектра A не отмечалось изменения кристаллической формы при XRPD-анализе.
Таблица 18. Сводка из экспериментов по измельчению (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>Вес образца (мг)</b>
<b>Растворитель</b>
<b>Измельчение</b>
<b>Условия</b>
<b>XRPD</b>
30-50
-
да
комн. темп.
спектр A
30-50
IPA (2 капли)
да
комн. темп.
спектр A
30-50
H<sub>2</sub>O (2 капли)
да
комн. темп.
спектр A
Пример 10. Водорастворимость
Изучали водорастворимость спектров A, B, C, E и F на установке Agilent HPLC. В стеклянные флаконы на 2 мл с магнитной мешалкой вносили примерно по 10-20 мг каждой формы и добавляли 2 мл воды. Образцы оставляли перемешиваться в течение ночи при обычных условиях. После 24 часов уравновешивания образцы центрифугировали и декантировали во флаконы для HPLC. Строили калибровочную кривую на основе спектра А в МеОН при 0,05, 0,1, 0,5 и 1,0 мг/мл. После введения проб для стандартной кривой запускали образцы прямо как они есть. Все подробности и результаты экспериментов приведены в табл. 19.
Таблица 19. Сводка из экспериментов по водорастворимости (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида
<b>(мг)</b>
<b>Вода (мл)</b>
<b>Профиль</b>
<b>Обозначение формы</b>
<b>% AUC</b>
<b>Растворимость (мг/мл)</b>
15,0
2
F
сольват с 2-MeTHF, форма VI
6813
1,36
12,1
2
E
ангидрат, форма II
6602
1,32
12,3
2
B
сольват с THF, форма IV
6514
1,30
13,5
2
C
гидрат, форма III
6646
1,32
21,5
2
A
ангидрат, форма I
8729
1,74
Пример 11. Характеристика форм
1
Изучение характеристик полиморфных форм (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в твердом виде осуществляли методами XRPD, DSC, TGA, H-ЯМР, Карла Фишера, оптической микроскопии и сорбции влаги. Результаты приведены в табл. 1.
Спектр A (ангидрат, форма I)
Используя исходный материал, отмеченный в примере 2, XRPD-анализ исходного материала желтого цвета давал кристаллический профиль, обозначенный как спектр A (фиг. 10). Кристалличность, наблюдавшаяся при XRPD, подтверждалась проявлением двойного лучепреломления, наблюдавшегося при оптической микроскопии. Морфология кристаллов оказалась неправильной формы с некоторой агрегацией, как видно из фиг. 11.
Термический анализ методом DSC показал единственное эндотермическое событие с пиком при 152,9°C, а затем разложение после 200°C (фиг. 12).
Анализ методом TGA показал отсутствие потери массы при 45-160°C, однако наблюдалась потеря массы вследствие разложения при 160-300°C (фиг. 13). Минимальное содержание влаги проверяли методом Карла Фишера, который показал, что материал содержит примерно 0,12% масс. воды.
1
Дальнейший анализ методом H-ЯМР показал, что исходный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и содержит 0,28% масс. остаточного IPA. См. фиг. 40.
Анализ сорбции влаги у исходного материала проводили путем уравновешивания образца при 25°C и относительной влажности 50% RH, имитируя обычные лабораторные условия. Затем влажность уменьшали до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, снижали с 95 до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, а затем уменьшали с 95 до 50% RH. Каждая точка представляет собой оценку каждого асимптотического значения влажности или веса. Исходный материал оказался негигроскопичным, адсорбируя лишь 0,1% воды при 90% RH. При десорбции не наблюдалось гистерезиса (фиг. 14). XRPD-анализ образца после анализа сорбции влаги показал, что он соответствует исходному материалу со спектром A.
Спектр E (ангидрат, форма II)
Спектр E (ангидрат, форма II) наблюдался при кристаллизации в одинарных растворителях (примеры 5 и 6) с быстрым охлаждением в масштабе 50 мг и опять же в масштабе 300 мг. XRPD-анализ твердого вещества давал уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр E (фиг. 15). Кристалличность, наблюдавшаяся при XRPD, подтверждалась проявлением двойного лучепреломления, наблюдавшегося при оптической микроскопии. Морфология кристаллов оказалась неправильной формы с некоторой агрегацией, как видно из фиг. 16.
Термический анализ препарата в 50 мг методом DSC показал два эндотермических события с пиками при 133,9°C и 151,3°C, а затем разложение после 200°C (фиг. 17).
Анализ препарата в 50 мг методом TGA показал потерю массы в 0,4% при 120-140°C, что объясняется потерей EtOAc, а затем разложение (фиг. 18). Минимальное содержание влаги проверяли методом Карла Фишера, который показал, что материал содержит примерно 0,1% масс. воды.
1
Дальнейший анализ спектра E (из препарата в 300 мг) методом H-ЯМР показал, что данный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и содержит 0,4% масс. остаточного EtOAc. См. фиг. 44.
Анализ сорбции влаги у спектра E (из препарата в 300 мг) проводили путем уравновешивания образца при 25°C и относительной влажности 50% RH, имитируя обычные лабораторные условия. Затем влажность уменьшали до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, снижали с 95 до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, а затем уменьшали с 95 до 50% RH. Каждая точка представляет собой оценку каждого асимптотического значения влажности или веса. Спектр E оказался негигроскопичным, адсорбируя лишь 0,2% воды при 95% RH. При десорбции не наблюдалось гистерезиса (фиг. 19). XRPD-анализ образца после анализа сорбции влаги показал, что он соответствует спектру E.
Спектр C (гидрат, форма III)
Спектр C (гидрат, форма III) наблюдался при краткосрочном суспендировании в 0,5% метилцеллюлозе/2% Tween 80 в масштабе 50 мг и опять же в масштабе 300 мг (примеры 3 и 6, соответственно). XRPD-анализ твердого вещества давал уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр C (фиг. 20). Кристалличность, наблюдавшаяся при XRPD, подтверждалась проявлением двойного лучепреломления, наблюдавшегося при оптической микроскопии. Морфология кристаллов оказалась неправильной формы с некоторой агрегацией, как видно из фиг. 21.
Термический анализ препарата в 50 мг методом DSC показал два эндотермических события с пиками при 72°C и 150,7°C, а затем разложение после 200°C (фиг. 22).
Анализ препарата в 50 мг методом TGA показал потерю массы в 2,5% при 20-60°C, затем потерю массы в 2,3% при 60-125°C, что объясняется потерей воды, а затем разложение (фиг. 23). Содержание влаги проверяли методом Карла Фишера, который показал, что материал содержит примерно 4,3% масс. воды, что немного меньше, чем у моногидрата.
1
Дальнейший анализ спектра C (препарата в 300 мг) методом H-ЯМР показал, что данный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида. См. фиг. 42.
Анализ сорбции влаги у спектра C (препарата в 300 мг) проводили путем доведения до равновесия образца при 25°C и относительной влажности 50% RH, имитируя обычные лабораторные условия. Затем влажность уменьшали до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, снижали с 95 до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, а затем уменьшали с 95 до 50% RH. Каждая точка представляет собой оценку каждого асимптотического значения влажности или веса. Спектр C оказался слегка гигроскопичным, адсорбируя 2% воды при 95% RH. При этом общее содержание воды возрастало до 6%, что соответствует содержанию воды у моногидрата. Однако после уменьшения относительной влажности вещество теряло свою воду. Поэтому это может быть канальный гидрат. При десорбции не наблюдалось гистерезиса (фиг. 24). XRPD-анализ образца после анализа сорбции влаги показал, что он соответствует спектру C.
Спектр B (сольват с THF, форма IV)
Спектр B (сольват с THF, форма IV) наблюдался при краткосрочном суспендировании в THF в масштабе 50 мг и опять же в масштабе 300 мг (примеры 3 и 6, соответственно). XRPD-анализ твердого вещества давал уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр B (фиг. 25). Кристалличность, наблюдавшаяся при XRPD, подтверждалась проявлением двойного лучепреломления, наблюдавшегося при оптической микроскопии. Морфология кристаллов оказалась неправильной формы с некоторой агрегацией, как видно из фиг. 26.
Термический анализ препарата в 50 мг методом DSC показал три эндотермических события с пиками при 70,5, 89,1°C и 149,7°C, а затем разложение после 200°C (фиг. 27).
Анализ препарата в 300 мг методом TGA показал потерю массы в 4,7% при 25-115°C, что объясняется потерей THF, а затем разложение (фиг. 28). Содержание влаги проверяли методом Карла Фишера, который показал, что материал содержит примерно 0,3% масс. воды.
1
Дальнейший анализ спектра B (препарата в 300 мг) методом H-ЯМР показал, что данный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и содержит 6,9% масс. остаточного THF. См. фиг. 41.
Анализ сорбции влаги у спектра B (препарата в 300 мг) проводили путем доведения до равновесия образца при 25°C и относительной влажности 50% RH, имитируя обычные лабораторные условия. Затем влажность уменьшали до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, снижали с 95 до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, а затем уменьшали с 95 до 50% RH. Каждая точка представляет собой оценку каждого асимптотического значения влажности или веса. Спектр B оказался негигроскопичным, проявляя потерю массы, вероятно, из-за выделения остаточного THF (фиг. 29). Основная потеря массы в начале была связана с потерей растворителя. XRPD-анализ образца после анализа сорбции влаги показал, что он соответствует спектру A.
Спектр D (сольват с 2-MeTHF, форма V)
Спектр D (сольват с 2-MeTHF, форма V) наблюдался при кристаллизации выпариванием в 2-MeTHF (примеры 4 и 5). XRPD-анализ твердого вещества давал уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр D (фиг. 30).
Термический анализ спектра D из примера 5 (медленное охлаждение) методом DSC показал 4 эндотермических события с пиками при 67-2, 92,2, 132,6 и 150,6°C, а затем разложение после 220°C (фиг. 31).
Анализ препарата из примера 5 с медленным охлаждением методом TGA показал потерю массы в 2,7% при 40-60°C, затем потерю массы в 5,3% при 60-115°C, что объясняется потерей 2-MeTHF, а затем разложение (фиг. 32).
1
Дальнейший анализ спектра D (препарата из примера 5 с медленным охлаждением) методом H-ЯМР показал, что данный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и содержит 6,1% масс. остаточного 2-MeTHF. См. фиг. 43.
Спектр F (сольват с 2-MeTHF, форма VI)
Спектр F (сольват с 2-MeTHF, форма VI) наблюдался в экспериментах по масштабированию при кристаллизации в одинарном растворителе 2-MeTHF в масштабе 300 мг (пример 6). XRPD-анализ твердого вещества давал уникальный кристаллический профиль, обозначенный как спектр F (фиг. 33). Кристалличность, наблюдавшаяся при XRPD, подтверждалась проявлением двойного лучепреломления, наблюдавшегося при оптической микроскопии. Морфология кристаллов оказалась пластинчатой с некоторой агрегацией, как видно из фиг. 34.
Термический анализ спектра F (из примера 6) методом DSC показал три эндотермических события с пиками при 93,2, 135,2°C и 151,0°C, а затем разложение после 220°C (фиг. 35).
Анализ спектра F (из примера 6) методом TGA показал потерю массы в 1,1% при 30-110°C, затем потерю массы в 0,2% при 110-160°C, что объясняется потерей 2-MeTHF,а затем разложение (фиг. 36). Содержание влаги проверяли методом Карла Фишера, который показал, что материал содержит примерно 0,1% масс. воды.
1
Дальнейший анализ спектра F (из примера 6) методом H-ЯМР показал, что данный материал соответствует структуре (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и содержит 3,9% масс. остаточного 2-MeTHF. См. фиг. 45.
Анализ сорбции влаги у спектра F (из примера 6) проводили путем доведения до равновесия образца при 25°C и относительной влажности 50% RH, имитируя обычные лабораторные условия. Затем влажность уменьшали до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, снижали с 95 до 0% RH, повышали с 0 до 95% RH, а затем уменьшали с 95 до 50% RH. Каждая точка представляет собой оценку каждого асимптотического значения влажности или веса. Спектр F оказался негигроскопичным, проявляя потерю массы, вероятно, из-за выделения остаточного 2-MeTHF (фиг. 37). Основная потеря массы в начале была связана с потерей растворителя. XRPD-анализ образца после анализа сорбции влаги показал, что он соответствует спектру E (фиг. 15).
Пример 12. Скрининг соединений по изобретению на дермальных фибробластах человека от больных атаксией Фридрейха
Первоначальный скрининг проводился для идентификации соединений, эффективных для исправления редокс-расстройств. Исследуемые образцы тестировали на их способность спасать фибробласты FRDA, поврежденные добавлением L-бутионин-(S,R)-сульфоксимина (BSO), как описано в Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24): 3055 (2002); Jauslin et al., FASEB J. 17:1972-4 (2003); и Международной патентной заявке WO 2004/003565. Было показано, что дермальные фибробласты человека от больных атаксией Фридрейха гиперчувствительны к ингибированию синтеза глутатиона (GSH) de novo L-бутионин-(S,R)-сульфоксимином (BSO), специфическим ингибитором GSH-синтетазы (Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24): 3055 (2002)).
Среду MEM (среда, обогащенная аминокислотами и витаминами, кат. № 1-31F24-I) и среду 199 (M199, кат. № 1-21F22-I) со сбалансированными солями Эрла (EBS), без фенольного красного, приобретали у фирмы Bioconcept. Фетальную телячью сыворотку получали из PAA Laboratories. Основной фактор роста фибробластов и эпидермальный фактор роста приобретали у PeproTech. Смесь пенициллин-стрептомицин-глутамин, L-бутионин-(S,R)-сульфоксимин и инсулин из бычьей поджелудочной железы приобретали у фирмы Sigma. Кальцеин-AM приобретали у Anaspec. Культуральную среду для клеток получали путем сочетания 125 мл M199 с EBS, 50 мл фетальной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл EGF и 10 нг/мл bFGF; добавляли MEM с EBS до объема 500 мл. В ходе экспериментов этот раствор хранили при + 4°C. Клетки получали из репозитория клеток Coriell Cell Repositories (Camden, NJ, инвентарный номер GM04078) и выращивали в планшетах для тканевых культур на 10 см. Через каждые 3 дня их делили в соотношении 1:3.
Исследуемые образцы помещали в стеклянные флаконы на 1,5 мл. Соединения разбавляли ДМСО, этанолом или PBS, получая исходные растворы в 5 мМ. После растворения их хранили при -20°C.
Исследуемые образцы подвергали скринингу по следующему протоколу.
2
Культуры с фибробластами FRDA запускали из флаконов на 1 мл, содержащих примерно 500,000 клеток, хранившихся в жидком азоте. Клетки размножали на чашках для клеточных культур размером 10 см, отделяя через каждые 3 дня в соотношении 1:3 до тех пор, пока не получилось девять чашек. По достижении конфлюентности собирали фибробласты. Для 54 микропланшетов (96-луночных) ресуспендировали в общей сложности 14,3 млн. клеток (8-й пассаж) в 480 мл среды, что соответствует 3000 клеток на лунку в 100 мкл среды. Остальные клетки наносили на чашки размером 10 см (500 000 клеток на чашку) для размножения. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C в атмосфере с 5% СО при влажности 95%, чтобы обеспечить прикрепление клеток к стенкам планшета.
В лунки микропланшета вносили 10% ДМСО (242,5 мкл). Исследуемые соединения размораживали и растворяли 7,5 мкл исходного 5 мМ раствора в лунке, содержащей 242,5 мкл 10% ДМСО, получая рабочий раствор в 150 мкМ. Из рабочего раствора делали серийные разведения. Промежутки между отдельными стадиями разведения старались делать как можно короче (как правило, менее 30 секунд). Клетки подвергали обработке различными разведениями соединений как минимум через 4 часа после прикрепления к микропланшетам.
Планшеты держали в инкубаторе для клеточных культур в течение ночи. На следующий день в лунки добавляли раствор, содержащий BSO, таким же образом, как описано в Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24): 3055 (2002); Jauslin et al., FASEB J. 17: 1972-4 (2003); и Международной патентной заявке WO 2004/003565. Через 48 часов исследовали три планшета под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться, что клетки в отрицательном контроле (лунки E1-H1) были точно мертвы. Из всех планшетов отбрасывали среду, а оставшуюся жидкость удаляли, осторожно постукивая по перевернутому планшету на бумажном полотенце. Планшеты дважды промывали 100 мкл PBS, содержащего кальций и магний.
50
Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл PBS + Ca + Mg, содержащего 1,2 мкМ кальцеина-AM. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°C. После этого считывали флуоресценцию (длины волн возбуждения/излучения 485 нм и 525 нм, соответственно) на считывающем устройстве Gemini для флуоресценции. Данные переносили в Microsoft Excel (EXCEL - зарегистрированный товарный знак Microsoft Corporation для программы обработки электронных таблиц), а для расчета концентраций EC для каждого из соединений использовали ExcelFit.
Соединения тестировали три раза, т.е. эксперимент проводился три раза, причем число пассажей клеток при каждом повторении возрастало на единицу.
Растворители (DMSO, этанол, PBS) не оказывали вредного воздействия на жизнеспособность не обработанных BSO клеток и не оказывали положительного влияния на обработанные BSO фибробласты даже при самой высокой концентрации (1%). Ни одно из соединений не проявляло аутофлуоресценции. Жизнеспособность фибробластов, не обработанных BSO, принимали за 100%, а жизнеспособность обработанных BSO и соединениями клеток рассчитывали относительно этой величины.
50
В нижеследующей таблице приведено значение EC для (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
<b>Заболевание</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub>
Атаксия Фридрейха
+++
+++ означает меньше 100 нM
Пример 13. Скрининг (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида на фибробластах от пациентов с различными заболеваниями от окислительного стресса
Тестировали (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид таким же способом скрининга, как описано в примере 12, заменяя клетки FRDA на клетки пациентов с другими заболеваниями от окислительного стресса.
50
В нижеследующей таблице приведены значения EC для (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида при различных заболеваниях.
<b>Заболевание</b>
<b>Линия клеток</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub>
Синдром Лея
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер GMOI503A)
+++
Наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON)
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер GM03858)
+++
Болезнь Паркинсона
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер AG20439)
++
Болезнь Хантингтона
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер GM 04281)
+++
Синдром Ретта
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер GM-17567)
+++
Недостаточность CoQ<sub>10</sub>
от пациентов с мутацией CoQ2
+++
Боковой амиотрофический склероз (ALS)
Coriell Cell Repositories (Camden, NJ; инвентарный номер ND29523)
+++
+++ означает меньше 100 нM; ++ означает 100-500 нМ
Пример 14. Скрининг (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида на предмет защиты от вызванной цисплатином ототоксичности
2
Условно иммортализованные слуховые клетки HEI-OC1 из долгосрочных культур улитки уха трансгенных мышей Immortomouse™, как описано в Kalinec G. et al., Audiol. Nerootol. 2003, 8:177-189, поддерживали в модифицированной по Дюльбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM), содержащей 10% FBS, в пермиссивных условиях: 33°C, 10% CO. Клетки предварительно обрабатывали в течение ночи с помощью (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида и определяли апоптоз по активности каспазы 3/7 после 24-часовой инкубации с 50 мкМ цисплатина. Контролем служили клетки, инкубировавшиеся только в разбавителе.
25
В нижеследующей таблице приведено значение EC для (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида.
<b>Заболевание</b>
<b>EC</b><sub><b>25</b></sub>
Индуцированная цисплатином ототоксичность слуховых клеток
+++
+++ означает меньше 100 мкМ
Пример 15. Скрининг полиморфных и аморфных композиций по изобретению на фибробластах от пациентов
Полиморфные и аморфные композиции по изобретению тестировали такими же способами скрининга, как описано в примерах 12-14, заменяя сам (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамид его полиморфными или аморфными формами. Полиморфные и аморфные композиции по изобретению также тестировали такими же способами скрининга, как описано в примерах 12-14, при необходимости заменяя клетки FRDA или другие линии клеток на клетки, полученные от пациентов с описанными здесь заболеваниями от окислительного стресса (напр., MERRF, MELAS, KSS, болезнь Альцгеймера, первазивное расстройство развития типа аутизма и т.д.). Композиции тестировали на их способность защитить дермальные фибробласты человека от этих пациентов от окислительного стресса или на их способность защитить клетки от токсичности, вызванной цисплатином.
Пример 16. Введение композиций по изобретению
Композиции по изобретению представлены в капсулах, содержащих 300 мг (R)-2-гидрокси-2-метил-4-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диенил)бутанамида в фармацевтически приемлемом носителе. Капсулы принимаются внутрь, один раз в день.
Раскрытия всех публикаций, патентов, патентных заявок и опубликованных патентных заявок, упомянутых здесь посредством цитирования, настоящим включены в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.
Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно при помощи иллюстраций и примеров для ясности понимания, специалистам в данной области техники должно быть ясно, что возможны некоторые небольшие изменения и модификации. Поэтому описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.