Фармакологические подходы к профилактике реперфузионных поражений головного мозга в эксперименте

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2017-19-12-252-256

УДК 615:612.825

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПРОФИЛАКТИКЕ РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Курганов Н.А., Гераськина М.М., Низин П.Ю., Блинова Е.В., Кильмяшкина М.Ф.

ФГБОУ ВО Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва, г. Саранск,

Российская Федерация

Аннотация. В работе проведено изучение профилактической активности магниевого производного этансульфоновой кислоты. Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самцах, из которых были сформированы три группы. Репер-фузионное поражение головного мозга воспроизводили путем интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии. Оценку неврологических изменений проводили по таблицам McGrow в модификации Ганнушкиной, Combs и D'Alecy и Garcia, поведенческих реакций - в системе «открытое поле». Морфологическую картину головного мозга изучали методом световой микроскопии. Было показано, что окклюзия средней мозговой артерии с последующей реперфузией вызывает у животных стойкие неврологические нарушения, которые сопровождаются вялостью, неспособностью отдергивать конечность при удержании, левосторонним полуптозом, а также поведенческими изменениями, отеком головного мозга. Превентивная терапия исследуемым соединением и препаратом сравнения мексидолом приводило к улучшению клинической картины остроты поражения головного мозга после реперфузии средней мозговой артерии, что проявлялось со стороны: двигательных и чувствительных сфер, мнестических функций. Уровни тревожности и познавательной активности не выходили за рамки легкого поражения. Также, характерно снижение летальности, относительно контрольной группы, уменьшался пе-рецеллюлярный и переваскулярный отек ткани головного мозга.

Ключевые слова: острое нарушение мозгового кровообращения, магниевое производное этансульфоновой кислоты, неврологический статус, белые крысы.

Введение. Инсульт уже в течение многих лет продолжает оставаться одной из главных проблем медицинской науки. За последние 50 лет отмечается высокая смертность и заболеваемость с последующей первичной инвалидизацией пациентов, что позволяет говорить о эпидемии этого заболевания [1]. Стоит лишь отметить, что в России лиц, имеющих инвалидность, после перенесенного инсульта насчитывается около 1 млн. человек [2]. Большую значимость в структуре ОНМК занимают именно ишемические поражения головного мозга, что в общей доле составляет 80-85% [3].

Каждый год по мировой статистике около 15 млн. человек переносят инсульт, 5 млн из них умирают. Остальные 5 млн.- необратимо утрачивают свою функциональную самостоятельность в повседневной жизни за счет необратимых изменений в нервной системе [4]. У 80% контингента отмечается частичная потеря трудоспособности, а у 10% - полная. Утрата профессиональных навыков тяжело переживается всеми больными. Для государства это имеет не только социальные, но и значительные экономические последствия.

Важным звеном в патогенезе церебральной ишемии является глутамат-кальциевый каскад, который

приводит к эйксатотоксической гибели нейронов. Пусковым моментом для данного механизма является значительное повышение ионов кальция внутри клетки. Поступление ионов кальция в клетку осуществляется главным образом через глутаматные инотропные каналы, деятельность которых регулируется рецепторами, чувствительными к возбуждающим нейротранс-миттерам - глутамату и аспартату. Механизм их действия заключается в том, что через 10-30 минут от начала острой фокальной ишемии происходит выброс данных медиаторов из ишемизированных нейронов в межклеточное пространство в избыточном количестве, что приводит к активации рецепторов. В зависимости от чувствительности к различным нейротрансмитте-рам выделяют 4 разновидности данных рецепторов: NMDA, AMРА, К и L-AP4. Возбуждение NMDA-под-типа глутаматных рецепторов провоцирует "шоковое" открытие кальциевых каналов с массивным поступлением ионов кальция в клетку. Кроме того, аспартат и глутамат оказывают цитопатическое действие путем взаимодействия с постсинаптическими рецепторами на нейронах, что приводит к дендросоматическим поражениям клеток.

—--—

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

Давно известно, что риск развития острого нарушения мозгового кровообращения коррелирует с множеством факторов: сопутствующие хронические заболевания, пороки клапанного аппарата сердца (пролапс митрального клапана), нарушения сердечного ритма (мерцательная аритмия), антифосфолипидный синдром, фибромускулярная дисплазия, мутация P1173L в гене метионин-синтазы, Мутация 169Ш> А (Лейденская) в гене фактора свертывания крови V и др. [3]. Сегодня сосудистым катастрофам головного мозга подвержены не только лица старшего возраста, но и молодые люди, которые в повседневной жизни не отмечали у себя симптомов этих заболеваний [5].

Вышесказанное позволяет выделить ОНМК в группу социально значимых заболеваний. Следовательно, остро встает вопрос о своевременной профилактики, диагностики и рационального лечения данной патологии. Что в свою очередь требуется создания новых перспективных лекарственных средств, обладающих максимальной эффективностью и минимальными побочными эффектами.

Материалы и методы исследования. Целью нашего исследования явилось изучение превентивной активности нового магнийсодержащего производного этансульфоновой кислоты (ЛБК-527) на экспериментальной модели интралюминальной окклюзии мозговых сосудов крысы.

Экспериментальные исследования проводились на белых нелинейных крысах самцах массой 260-300 грамм, полученных из питомника «Столбовая» ФГБНУ НЦБМТ ФМБА России. Лабораторные животные находились в специализированных боксирован-ных помещениях экспериментально-биологической клиники Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств Университета на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской Конвенции по защите животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводились под общим обезболиванием с использованием уретана (800 мг/кг внутрибрюшинно). Протокол исследования прошел этическую экспертизу на заседании Локального этического комитета ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Интралюминальную окклюзию средней мозговой артерии (СМА) крыс проводили после фиксации животных на операционном столе на левом боку. Затем сбривали шерсть с передней поверхности шеи, кожу обрабатывают антисепетиком и выполняли срединный разрез от нижнего края нижней челюсти до верхнего края рукоятки грудины кожи и подкожно-жировой клетчатки, тупым способом раздвигали фасции и мышцы шеи. Между грудинно-ключично-сосцевидной и подъязычно-грудинной мышцами справа находили

сосудисто-нервный пучок. Отпрепаровывали правую общую сонную артерию, правую наружную сонную артерию и правую внутреннюю сонную артерию до места ее вхождения в полость черепа через каротид-ный канал. После лигирования проксимального конца выделенного участка общей сонной артерии и наружной сонной артерии накладывают клипсу на ее ди-стальный конец, подводя под сосуд лигатуру и через разрез вводили силиконизированную нейлоновую нить диаметром 0,13 мм. Суживали просвет дисталь-ного участка общей сонной артерии лигатурой, не затягивая ее полностью, снимают клипсу и под контролем зрения продвигают нейлоновую нить через внутреннюю сонную артерию в полость черепа приблизительно на 15-20 мм от места бифуркации сонной артерии, что соответствует отхождению средней мозговой артерии. Через 80 минут нейлоновую нить извлекали, лигатуру затягивали и рану послойно ушивали, воспроизводя таким образом реперфузионное поражение головного мозга экспериментальных животных.

Исследуемое соединение ЛБК-527 и препарат сравнения мексидол вводили в бедренную вену за 5 минут до окклюзии СМА в дозах, составляющих 5% от показателя LD50, определенного для мышей при внутри-брюшинном введении с учетом правил межвидового переноса дозы. В группе контроля использовали плацебо - физиологический раствор, который вводили животным внутривенно в эквивалентном объеме.

Оценка неврологического дефицита осуществляли на основании таблиц McGrow в модификации Ганнуш-киной, Combs и D'Alecy и Garcia через 1, 3, 6, 12, 24 часов, после реперфузии. Поведенческие реакции изучали в тесте «Открытое поле» (АО «НПО «Открытая наука», Санкт-Петербург) с системой видеорегистрации и программного анализа результатов.

Гистологтическое изучение морфологических изменений головного мозга проводили через 48 часов. После декапитации животных извлекали головной мозг и помещали на сутки его в 10%-ый раствор формалина. После промывания исследуемого материала под проточной водой в течении часа приступали к его обезвоживанию. С этой целью использовали следующие растворы этилового спирта с различной концентрацией (50%-ый раствор - длительность экспозиции 15 минут, 70%-ый раствор - 20 минут, 96%-ый раствор - 20 минут, 100%-ый раствор - 30 минут). После обезвоживания исследуемый материал пропитывали смесью эпоксидных смол с окисью пропилена, взятых в отношении 1:1. На следующем этапе осуществляли заливку парафином. Далее с помощью микротома производили срезы толщиной 10 мкм. После удаления парафина путем помещения материала в раствор ксилола осуществляли окрашивание гистологических препара-

тов гематоксилин — эозином после окрашивания препаратов гематоксилин — эозином. Техника окрашивания включала в себя следующие этапы:

1. после пятиминутного окрашивания гематоксилином, препарат промывали в воде в течение 2 минут;

2. в течение нескольких секунд выдерживали в спирте, подкисленном соляной кислотой (1% раствор соляной кислоты в 70% спирте), затем в течении минуты в подщелоченной воде;

3. после минутного промывания под проточной водой, в течение 2 минут окрашивали 1% эозином, в конце ополаскивали дистиллированной водой.

Готовые срезы выдерживали в спирте на протяжении 2 минут, затем в ксилоле также в течении 2 минут. После нанесения на срез одной капли канадского бальзама его накрывали покровным стеклом. Полученные таким образом гистологические препараты головного мозга изучали при помощи светового микроскопа СМ-125.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики. Достоверность данных оценивали с помощью непараметрического критерия «х-квадрат» и t-критерия Сть-юдента при 5% уровне значимости. В работе использован стандартный пакет программ по статистике

Результаты исследования и их обсуждение. Окклюзия правой средней мозговой артерии у животных контрольной группы приводила к появлению признаков неврологического дефицита, проявляющихся вялостью, неспособностью одергивать конечность при удержании, левостороннему полуптозу. В клетке животные совершали манежные движения, походка была нарушена за счет левостороннего гемипареза. По таблице McGrow в модификации Ганнушкиной, средний балл группы составил 5 единиц, что соответствует тяжелой степени неврологического дефицита (рис. 1 А).

Неврологический дефицит по шкале McGrow и Ганнушкиной

.Контроль

. Мексидол 22 мг/кг

ЛБК-527 28 мг/кг

Неврологический дефицит по шкале Combs и D'Alecy

.Контроль

. Мексидол 22 мг/кг

ЛБК-527 28 мг/кг

Рис. 1. А. Степень неврологического дефицита при интралюминарной окклюзии СМА при профилактическом введении ЛБК-527 по шкале McGrow и Ганнушкиной через 24 часа после реперфузии СМА, Б - по шкале Combs и D'Alecy через 24 часа после реперфузии СМА

При оценке неврологического статуса на основании таблицы Combs и D'Alecy у части крыс отмечается неспособность удержать себя на экране-сетке, стержне и верёвке. Средний балл - 4,3 (рис. 1Б).

По таблице Garcia отмечается, что животные не достигают краев клетки и едва двигаются в ней. Лапы вытягиваются не симметрично (на левой стороне минимально). При прикосновении к крысе, реакция замедлена и не одинакова с разных сторон (слева минимальная). Средний балл - 9,6.

При изучении поведенческих реакций по методике "открытое поле" до операции животные равномерно исследовали всю площадь, наблюдалось адекватное количество дефекаций, вертикальных стоек, исследований отверстий, груминга. Через 24 часа после окклюзии, животные проявляли среднюю активность только

в момент помещения их в "открытое поле". Через 1 минуту после этого животные, в большинстве своем, засыпали.

Профилактическое введение препарата сравнения мексидола в дозе, составляющей 5% от показателя DL5o при соответствующем пути введения, сопровождалось сглаживанием остроты поражения головного мозга и клинической симптоматики экспериментального реперфузионного поражения органа: нарушения двигательной и чувствительной сфер, мнестических функций, уровень тревожности и познавательной активности не выходили за рамки средне-тяжелого или легкого поражения, о чем говорят значения комплексных оценочных шкал (рис. 1,А, Б). Летальность в группе животных, получавших мексидол, также была невысока.

Фармакологическая профилактика реперфузион-ного поражения головного мозга крыс внутривенным введением соединения ЛБК-527 характеризовалась выраженным протекторным действием. Косвенным свидетельством тому явилось сохранение двигательных и чувствительных функций в динамике, а также в исходе наблюдения за животными (рис. 1 А, Б). Хорошим прогностическим признаком явилось отсутствие летальных исходов в описываемой группе животных. При оценке поведенческих реакций грызунов в тесте «Открытое поле» отмечены несущественные изменения со стороны познавательной сферы. Уровень тревожности, оцениваемый по интенсивности груминга, его це-фало-каудальному градиенту, а также частоте дефекаций, практически сохранялся на исходных значениях.

В контрольной группе крыс изучение гистологических препаратов головного мозга показало наличие пе-риваскулярного и перицеллюлярного отека с выраженной гиперемией сосудов и явлениями стаза в капиллярах на фоне нейрональной деструкции. Также было отмечено нарушение четкого послойного строения коры головного мозга по сравнению с гистологическими препаратами ложнооперированных животных. Кроме того, в данной группе животных наблюдалось более интенсивное окрашивание перинуклеона нейронов, что является косвенным признаком нарушения процессов жизнедеятельности клеток.

Для группы животных, получавших мексидол и ЛБК-527, также характерным оказалось наличие пери-васкулярного и перицеллюлярного отека с явлениями стаза в сосудах микроциркуляторного русла. Однако по сравнению с контрольной группой данные явления выражены в меньшей степени. К тому же при изучении морфологических изменений головного мозга в данной группе животных было отмечено наличие участков нервной ткани без признаков дегенерации. Кроме того, во всех гистологических препаратах отмечалось

уменьшение выраженности морфологических изменений по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, результаты проведенного исследования демонстрируют высокую профилактическую це-ребропротекторную активность соединения амино-этансульфоната магния. Дискуссионным вопросом при этом остается механизм реализации фармакологического действия вещества. По современным представлениям ведущим патогенетическим механизмом гибели клеток головного мозга в результате ишемического и реперфузионного поражения является глутамат-опо-средованная эксайтотоксичность, реализующаяся через гипервозбуждение потенциал-зависимых некаи-натных глутаматных NMDA-рецепторов. В этой связи есть основания полагать, что биологической мишенью при реализации эффекта ЛБК-527 может быть либо ионный канал, либо глутаматный сайт указанного типа рецепторов.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

[1] Инсульт: диагностика, лечение, профилактика: Руководство для врачей / Под ред. З.А. Суслиной, М.А. Пи-радова. М.: МЕДпресс-информ; 2009

[2] Маркин, С.П. Реабилитация больных с острым нарушением мозгового кровообращения / С.П. Маркин // Consilium Medicum: Неврология. - 2010. - № 1.

[3] Овсянникова А.Н., Машин В.В., Белова Л.А., Саенко Ю.В. Генетические факторы риска развития острой ишемии мозга у пациентов молодого и среднего возраста // Ульяновский медико-биологический журнал. 2015. №2. С.56-62

[4] Addams L.R., del Zoppo G., Alberts M.J. et al . Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke // Stroke. 2007; 38: 1655—711.

[5] Широков Е.А. Идеология современной системы профилактики инсульта // Клиническая медицина. 2014. №3. С.5-10

PHARMACOLOGICAL APPROACHES TO REPERFUSION-INDUCED BRAIN INJURY

PREVENTION IN EXPERIMENT

Kurganov N.A., Geraskina M.M., Nizin P. Yu., Blinova E. V., Kilmyashkina M.F.

Ogarev Mordovia State University, Saransk, Russian Federation

Annotation. A study was made of the prophylactic activity of the magnesium derivative of ethanesulfonic acid. The experiments were performed on white non-linear male rats, from which three groups were formed. Reperfusion injury of the brain was reproduced by intraluminal occlusion of the middle cerebral artery. Evaluation of neurologic changes was carried out according to the tables of McGrow in the modification of Gannushkina, Combs and D'Alecy and Garcia, behavioral reactions in the "open field" system. The morphological structure of the brain was studied by light microscopy. It has been shown that the occlusion of the middle cerebral artery with subsequent reperfusion causes persistent neurologic disorders in animals, which are accompanied by lethargy, inability to withdraw the retention limb, left-sided semoptosis, as well as behavioral changes, edema of the brain.

Preventive therapy with the test compound and mexidol comparative medicine led to an improvement in the clinical picture of the severity of brain damage after reperfusion of the middle cerebral artery, which was manifested by: motor and sensitive spheres, mnestic functions. The levels of anxiety and cognitive activity did not go beyond an easy defeat. Also, a decrease in mortality is characteristic of the control group, and the perecular and perovascular cerebral edema.

Key words: acute disturbance of cerebral circulation, magnesium derivative of ethanesulfonic acid, neurological status, white rats.

REFERENCES

[1] Stroke: diagnosis, treatment, prevention: A guide for doctors / Ed. BEHIND. Suslina, M.A. Piradov. M . : MEDpress-inform; 2009

[2] Markin, S.P. Rehabilitation of patients with acute impairment of cerebral circulation / S.P. Markin // Consilium Medicum: Neurology. - 2010. - №1.

[3] Ovsyannikova AN, Mashin V.V., Belova L.A., Saenko Yu.V. Genetic risk factors for the development of acute cerebral ischemia in patients of young and middle age // Ulyanovsk Medico-Biological Journal. 2015. №2. pp.56-62

[4] Addams L.R., del Zoppo G., Alberts M.J. et al . Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke // Stroke. 2007; 38: 1655—711.

[5] Shirokov E.A. Ideology of the modern system of stroke pre-ventation // Clinical Medicine. 2014. №3. pp.5-10