СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ИДИОПАТИЧЕСКОМУ СКОЛИОЗУ
METHOD FOR DIAGNOSIS OF GENETIC PREDISPOSITION TO IDIOPATHIC SCOLIOSIS

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в детской ортопедии для лабораторной и клинической диагностики идиопатического сколиоза, относящегося к типу подросткового идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью, оцениваемой как один-два случая из ста больных идиопатическим сколиозом.
Данный рассматриваемый далее тип подросткового идиопатического сколиоза, в отличие от непрогрессирующего и вялопрогрессирующего типов, является наиболее тяжелым, сложным для лечения и характеризуется своим быстрым развитием в период интенсивного роста в подростковом возрасте (10-15 лет).
Заболевание проявляется в виде сложной трехплоскостной деформацией позвоночника, при которой позвоночник не только искривлен во фронтальной плоскости, но и повернут вокруг вертикальной оси, сочетая в себе два варианта патологической ротации позвонков. При одном из вариантов, типичном, во фронтальной плоскости чаще наблюдается боковое правостороннее искривление, в сагиттальной плоскости лордозирование, в горизонтальной плоскости тела позвонков смещены в сторону выпуклости. Возможно прогрессирующее течение. При атипичном патологическом сколиозе во фронтальной плоскости чаще наблюдается боковое левостороннее искривление, в сагиттальной плоскости кифозирование, в горизонтальной плоскости тела позвонков смещены в сторону вогнутости. Чаще происходит доброкачественное течение. Причина такого сложного механогенеза усматривается в том, что процессы продольного роста и развития позвоночного столба с мышечно-связочным аппаратом и расположенного в канале позвоночного столба спинного мозга не синхронизированы, в результате чего происходит торсия более длинной части позвоночного комплекса вокруг более короткой.
Быстро прогрессирующая форма этого заболевания, позднее клиническое проявление, отсутствие скелетных дисплазий на ранних диагностических сроках, до начала прогрессирующего течения, приводят к необходимости хирургического вмешательства. Однако после хирургической коррекции позвоночника быстрое и неуклонное прогрессирование болезни данного типа продолжается, поскольку остаются неустраненными причины патологии.
Среди многочисленных этиологических факторов идиопатического сколиоза присутствует генетическая составляющая. О наследственной природе данной патологии свидетельствуют наличие семейных форм и высокая конкордантность среди монозиготных близнецов, выявленная в результате исследований. В разных популяциях мира проведено множество генетических исследований связи различных классов генов и идиопатического сколиоза.
Из патентных источников известен способ определения наличия у человека сколиоза, в том числе идиопатического сколиоза, риска развития сколиоза или риска развития кривой сколиоза, включающий: обнаружение в генетическом материале указанного субъекта наличия или отсутствия одного или нескольких полиморфизмов высокого риска, которые расположены в гене CNTNAP2 (контактин-ассоциированный белок-подобный 2), расположенном в хромосомном положении 7q35-q36 (145444762-147749019) (см. WO 2008/033813 А1, изобретение «Генетические маркеры хромосомы 3, ассоциированные со сколиозом, и их применение», опубл. 20.03.2008).
В отношении гена, рассматриваемого в известном способе определения наличия у человека сколиоза, в настоящее время не найдено объяснение, какое отношение данный ген имеет к нарушению функций, приводящих в организме к развитию идиопатического сколиоза. Как следствие, совпадение с заболеванием носит статистический характер.
Известен способ прогнозирования риска развития идиопатического сколиоза у детей, включающий выделение геномной ДНК из периферической венозной крови пациентов и выявление полиморфизма С-509Т гена, трансформирующего фактора роста β1, с последующим прогнозированием в случае выявления генотипа -509ТТ повышенного риска развития идиопатического сколиоза, а в случае выявления генотипов -509СТ и -509СС - отсутствия риска развития идиопатического сколиоза у детей (см. RU 2456925 С1, опубл. 10.01.2017).
Ген, рассматриваемый в данном известном способе прогнозирования риска развития идиопатического сколиоза у детей, ассоциируемый с фактором роста, не является кандидатным исключительно по сколиозу. Он имеет отношение к проблемам, связанным также с иммунной, сосудистой, гормональной системами, что не позволяет опираться на данные по работе продукта гена с прицелом на определение высокого риска возникновения сколиотической деформации.
Известно также, что идиопатический сколиоз, в том числе и легкой формы, является проявлением одной из мутаций в гене CHD7, локализованном в области 8q12, известном как АТФ зависимый ремодельер (фермент) хроматина) (см. Gao X., Gordon D., Zhang D. et al. CHD7 gene polymorphisms are associated with susceptibility to idiopathic scoliosis // Am. J. Hum. Genet.-2007 / - Vol. 80.-P.957-965; https://genokarta.ru/gene/CHD7). Основное свойство гена - это участие в образовании продукта, который влияет на симметрию при закладке внутренних органов. Американскими учеными в связи с синдромом множественных врожденных пороков развития (CHARGE - колобома, аномалии сердечно-сосудистой системы, задержка умственного и физического развития, тяжелый сколиоз, аномалии органа слуха и гениталий) была протестирована большая группа пациентов, включая детей со сколиозом и членов их семей. Одну из мутаций в гене, которых описано около 600, проверили на ассоциацию со сколиозом от I-ой до IV-ой степени выраженности деформации. Во втором интроне гена CHD7 в сайте связывания соответствующего транскрипционного фактора идентифицирована полиморфная нуклеотидная замена, достоверно снижающая уровень экспрессии гена. Частота этой замены у больных с семейными формами идиопатического сколиоза значительно превышает контрольный уровень (см. Jongmans М.С.J., Admiraal R.J., van der Donk K.P. et al. CHARGE syndrome: the phenotypic spectrum of mutations in the CHD7 gene // J. Med. Genet. - 2006. - Vol. 43. - P. 306-314).
Как следует из представленного уровня техники, известные технические решения не имеют прицельной связи с развитием рассматриваемого прогрессирующего в подростковом возрасте идиопатического сколиоза, сочетающего в себе типичную и атипичную патологические ротации позвонков, приводящего к инвалидизации из-за быстрого прогрессирования в подростковом возрасте.
Технический результат изобретения заключается в выявлении молекулярно-генетических маркеров наиболее сложного, быстро прогрессирующего типа подросткового идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью, с целью диагностики на ранних сроках.
Для достижения технического результата исходили из того, что сколиоз - это общее заболевание организма, самым ярким проявлением которого является сколиотическая деформация позвоночного столба. Сколиоз является одним из клинических проявлений около 400 моногенных синдромов, для многих из которых идентифицированы гены и определены первичные биохимические дефекты. Среди множества этих наследственных синдромов на базе ведущих клинических проявлений можно выделить скелетные дисплазии, нервно-мышечные заболевания и заболевания центральной нервной системы. Основной причиной развития сколиоза при наследственных скелетных дисплазиях является нарушение баланса между ростом и дифференцировкой костной ткани. Основными причинами развития сколиоза при нервно-мышечных заболеваниях являются мышечная слабость, нарушения нейромышечного синапса и дефекты развития периферической нервной системы. Участие центральной нервной системы в гепезе сколиоза подтверждается тем, что развитием сколиоза часто сопровождаются формы неспецифической умственной отсталости и наследственные синдромы с задержкой не только физического, но психического развития.
Учитывая доказанное участие в патогенезе сколиоза нейрогенного фактора и структур нервной системы, кандидатным для рассматриваемого типа идиопатического сколиоза геном был принят локализованный в длинном плече хромосомы 8 ген SNTG1, кодирующий синтрофин G1 - белок дистрофин-ассоциированного комплекса, ассоциированный с нарушениями, связанными с нейромышечными заболеваниями (миодистрофиями). При генетическом анализе семей, в которых наблюдал ось большое число больных, найдено сцепление заболевания с тремя локусами - 19р13.3, 17р11.2 и 8 q11-q12. У некоторых пациентов с семейными формами сколиоза идентифицированы небольшие структурные перестройки, затрагивающие ген SNTG1 (см. Chan Т.-K. А genetic locus for adolescent idiopathic scoliosis linked to chromosome 19p13.3 // Am. J. Hum. Genet. 2002. Vol. 71. P. 401-406; Salehi L.В., Mangino M., De Serio S. et al. Assignment of a locus for autosomal dominant idiopathic scoliosis (IS) to human chromosome 17p11 // Hum. Genet. 2002. Vol. 111. P. 401-405; Bashiardes S., Veile R., Allen M. et al. SNTG1, the gene encoding gamma-1-syntrophin: a candidate gene for idiopathic scoliosis // Hum. Genet. - 2004. Vol. 115. P. 81-89).
Выбор двух указанных генов позволяет выявить такие нарушения функционирования организма, которые приводят к асимметрии (ген CHD7) и отсутствию возможности компенсировать подобные асиметричные нарушения (ген SNTG1) основными группами тканей и органов, включая нервную и мышечную ткань.
Технический результат достигается таким образом, за счет того, что из периферической венозной крови при помощи известного метода молекулярной генетики, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР), выделяют геномную ДНК, после чего проводят совместное выявление патогенных аллелей двух генов - гена CHD7, для которого ассоциация с идиопатическим сколиозом является доказанной, и гена SNTG1, имеющего патогенетическое отношение к рассматриваемому типу идиопатического сколиоза, изучаемого давно в связи с его ассоциацией с миодистрофией.
Сочетанное проявление молекулярно-патогенетических маркеров идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью в генах CHD7 и SNTG1, а также доказанная связь патогенеза идиопатического сколиоза данного типа с нарушениями в указанных генах позволяют достоверно определять наследственную предрасположенность на доклиническом этапе методом лабораторной диагностики. Это дает возможность своевременного проведения эффективных профилактических и лечебных мероприятий на ранних стадиях, не доводя до фазы хирургической коррекции заболевания.
Способ осуществляют следующим образом.
Выделение геномной ДНК проводят с использованием известного метода молекулярной генетики, например, метода ПЦР, с выделением ядер лейкоцитов из периферической крови и дальнейшей депротеинизацией раствора ДНК фенол-хлороформом. Осаждение ДНК проводят натриевой солью в этаноле. Осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в 100-150 мкл ТЕ-буфсра или деионизованной воды.
Типы изученных полиморфизмов генов SNTG1 и CHD7, последовательности олигопраймеров и размеры амплифицированных фрагментов приведены в Таблице 1.
Для проведения ПЦР приготавливают реакционную смесь, в состав которой входят: 7.5 мкл амплификационной смеси, 14 мкл воды, 2 мкл праймеров и 2.5 мкл раствора ДНК.
4
2
4
2
Смесь для амплификации объемом 25 мкл включает 15 нМ каждого праймера, 0.67 мМ трис-HCI, рН 8.8 при 25°С; 16.6 мМ (NH)SO; 6.7 мМ MgCI; 6.7 мкм ЭДТА; 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 1.0 мМ каждого и Tag-полимеразу, 1 ед/мкл («Сибэнзим», г. Новосибирск).
Для амплификации используют программируемый термоциклер фирмы "Perkin Elmer", Cetus (США). После предварительной денатурации ДНК (10 минут при 98°С) проводят 25 циклов амплификации в режиме: денатурация 96°С в течение 30 сек, гибридизация ДНК с праймерами (отжиг праймеров) 60°С в течение 45 сек и синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК (элонгация) при 72°С в течение 50 сек.
2
Расщепление ДНК проводят по прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем эндонуклеаз ("Сибэнзим", г. Новосибирск). Условия реакции эндонуклеаз Ags I (ген SNTG1) и TaqI (ген CHD7): 33 мМ трисацстата (рН=7,9 при 25 с), 10 мМ MgCl, 66 mM KCI и 1 м М DTT и 1 мкг ДНК.
Продукты амплификации и рестрикции (Таблица 2) разделяют в 10%-ном геле, приготовленном на десятикратном трис-боратном буфере в аппарате для вертикального электрофореза, с длиной стекла 15 см.
Гель окрашивают в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл), просматривают и фотографируют на аппарате Praktika (ФРГ) в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue (LKB. Великобритания).
Генотипы SNTG1 С/С, А>С, K26Q, rs35384568 и CHD7 G/G, A>G, rs1231738122 являются гомозиготными по патологическому признаку. Это значит, что выявление таких генотипов у обследуемого пациента является показателем риска развития у него быстро прогрессирующего идиопатического сколиоза рассматриваемого типа.
Ошибки оценки частот аллелей исследованных генов вычисляют по известной формуле:  где р - частота аллеля, N - количество встреченного аллеля (см. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991. 271 с.).
Определение соответствия частот генотипов в популяциях равновесию Харди-Вайнберга и определение достоверности различий популяционных частот проводят методом χ2 по формуле: χ2=(N1N3-1/4N22)2N/(n12n22), где N1, N2 и N3 - численности генотипов SS, Ss и ss; N - общий объем выборки; n1 и n2 - число аллелей исследуемых генов в выборке (см. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991.271 с.).
Определение достоверности различий частот аллелей производят с помощью точного двустороннего критерия Фишера по известной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений с контрольной группой, а также с помощью критерия хиквардрат (χ2) по известной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений и поправки Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой (Гланц С. Медикобиологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.). В случае достоверных отличий между сравниваемыми признаками в исследуемых группах также используют коэффициент соотношения шансов (odds ratio - OR).
Значение OR применительно к полученным данным показывает, во сколько раз выше вероятность иметь заболевание при наличии определенного генотипа. При патологическом генотипе OR составляет 2,3. В случае выявления патологической аллели OR составляет 1,7.
Таким образом, согласно коэффициенту соотношения шансов, риск развития прогрессирующего идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью при наличии аллеля С (полиморфизма А>С, K26Q, rs35384568 гена SNTG1) и аллеля G (полиморфизма A>G, rs1231738122 гена CHD7) увеличивается более, чем в 2 раза (OR=2,3) при обнаружении в гомозиготном состоянии.
Пример реализации способа.
Группа обследованных составила 1100 человек, из них группа с тяжелым сколиозом состояла из 130 чел, группа контроля - дети с компрессионным переломом (КП) 150 чел, остальные - легкий и не прогрессирующий сколиоз 1-2 степени.
Сочетание гомозиготных позиций по двум исследуемым генам CHD7 и SNTG1 позволило выявить три случая идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью.
Встречаемость генов была проверена на популяциях малых народностей России.
Частый, связанный с геном, ассоциированным, в том числе и с легким сколиозом, ген (CHD7), встречается с частотой, сравнимой с общепопуляционными признаками. Второй ген (SNTG1) не встречается, что является доказательством его патогенности, а также доказательством сочетанного проявления патогенетических маркеров рассматриваемого типа сколиоза в выбранных генах.
Таким образом, два гена CHD7 и SNTG1 отлично сгруппированы в направлении патогенеза идиопатического сколиоза с редкой встречаемостью. Выявление патогенных аллелей двух данных генов, согласно изобретению, дает возможность достоверно выявлять пациентов, предрасположенных к развитию такого типа сколиоза, до его клинического проявления, что позволяет не упускать таких пациентов в условиях отсутствия возможности проведения скринингового ортопедического обследования с использованием современных инструментальных методов диагностики, таких как компьютерная оптическая томография, использование рентгенограммы позвоночника, клинического ортопедического осмотра и др.