СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРЕМНЕЗЕМАЛЬДЕГИДОВ
SILICA ALDEHYDE SYNTHESIS METHOD

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к средствам анализа биологических и небиологических материалов и способам их получения, и может быть использовано в качестве твердофазной матрицы для иммобилизации ферментов и хромогенных реагентов, в том числе для создания твердофазных тестовых средств для определения различных веществ.
Кремнеземы с активными группами являются ценными твердофазными матрицами для ковалентной иммобилизации ферментов и хромогенных реагентов. Свойства ферментов, как уникальных специфических катализаторов, ускорителей многих химических реакций, индикаторов в генной инженерии улучшаются при их химической иммобилизации на твердофазные матрицы по таким параметрам, как устойчивость и многократность действия.
Развитие нанотехнологии требует получение носителей для иммобилизации лекарств и клеточных органелл, для синтеза в мембранных реакторах с иммобилизованными ядрами заданных клеток, присоединения различных ферментов (например, глюкоамилазы, трипсина к клеткам дрожжей для осуществления гидролиза декстринов и белков), для биологических способов получения различных препаратов. Однако если ковалентная иммобилизация широко разработана на органических (природных и синтетических) полимерах, то на кремнеземных носителях она ограничена из-за отсутствия ряда кремнеземов с четко определенными по количеству активными группировками, в частности альдегидными группами.
Ковалентная иммобилизация на матрице с альдегидными группами основана на образовании ковалентной азометиновой связи матрицы с аминами, гидразинами, аминобелками и аминоферментами:
2
CH=N
М-СНО+HN-R→M--R, где М - твердофазная матрица
Разработан также путь к образованию подобных связей - химическая иммобилизация с образованием азометиновой связи с помощью усиливающего реагента - глутарового альдегида между аминосоединениями или аминобелками и твердофазной матрицей - аминокремнеземом:
2
2
3
2
2
3
=N
M-NH+O=СН-(СН)-СН=O+HN-R→M-N=СН-(СН)-СН-R
Как видно, это - более сложный многостадийный метод ковалентной иммобилизации аминосоединений и аминобелковых субстратов на кремнеземных матрицах.
При разработке способа ковалентного присоединения ферментов и других аминосоединений к кремнеземным носителям необходима информация по размеру зерен, количеству реакционноспособных групп, содержащихся в единице веса носителя, максимальному количеству молекул, которое может быть связано с носителем, его влиянию на устойчивость иммобилизованных соединений.
Перед авторами стояла задача - разработать универсальный способ получения кремнеземальдегидов с широким рядом заданных характеристик: статической обменной емкостью (СОЕ) по альдегидной группе, размером зерен и пор.
Известны целлюлозные и стеклянные матрицы с альдегидной группой для иммобилизации аминобелков [Лурье А.А. Хроматографические материалы (справочник). М.: Химия, 1978. С.237]. Среди них нет кремнеземов с альдегидной группой.
Наиболее близким по техническому решению к предлагаемому изобретению является использование силикагелей с диольными группами после их активации периодатом натрия [Химия привитых поверхностных соединений. / Под ред. Г.В.Лисичкина. М.: Физматлит, 2003. 590 стр.]. Недостатком такого способа является то, что не указаны условия получения, не выделен и не охарактеризован конкретный продукт этой активации, что ограничивает возможности его использования как исходного заданного продукта для получения индикаторных порошков и трубок, а также специальных носителей для иммобилизации биологических субстратов.
Изобретение направлено на разработку универсального и простого способа получения кремнеземальдегидов с широким рядом характеристик для активных твердофазных матриц в биотехнологии, для индикаторных тестовых средств анализа технологических и природных объектов.
Технический результат изобретения - способ получения кремнеземальдегидов, конкретно макропористых силикагельальдегидов, таких как сферосилальдегидов, порасилальдегидов или диасорбальдегидов, и аэросилогельальдегидов или силохромальдегидов с заданным размером зерен, пор и других характеристик.
Технический результат достигается тем, что предложен способ получения кремнеземальдегидов, конкретно макропористых силикагельальдегидов, таких как сферосилальдегидов, порасилальдегидов или диасорбальдегидов, и аэросилогельальдегидов или силохромальдегидов, характеризующихся размерами зерен 40÷800 мкм, размерами пор 60÷1500 Å и статической обменной емкостью 20÷245 мкмоль/г, заключающийся в окислении кремнеземдиолов, конкретно макропористых силикагельдиолов, таких как сферосилдиолов, порасилдиолов или диасорбдиолов, и аэросилогельдиолов или силохромдиолов в водной среде при рН 3÷6, при этом в качестве окислителя используют соединение иода (VII), выбранное из группы:
дигидроортопериодат, мезоиодат, или метаиодат щелочного металла или аммония при соотношении окислителя и кремнеземдиола от 1:50 до 1:1.
При меньшем количестве окислителя количество альдегидных групп ничтожно мало, при большем - остается неизрасходованный реагент.
Кремнеземальдегиды имеют белый цвет и проявляют характерное для альдегидов химическое свойство - взаимодействуют подобно мономерным альдегидам с арил- и гетерилгидразинами с образованием соответственно окрашенных арил- и гетерилгидразонов, проявляющих заданные химические и аналитические свойства
Например, кремнеземальдегиды взаимодействуют с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонилкремнеземов (ДНФГ-К), окрашенных в оранжевый цвет, со спектрами диффузного отражения, интенсивность которых зависит от количества ДНФГ, вступившего в реакцию с исходным кремнеземальдегидом (фиг.1), СОЕ которого определена по остатку не вступившего в реакцию ДНФГ. СОЕ по альдегидным группам в исходном кремнеземальдегиде также определена по интенсивности цвета образующегося ДНФГ-К (фиг.2). Таким же образом получен и гетерилгидразонилкремнезем (фиг.3). Получены образцы кремнеземальдегидов с размером зерен 40-800 мкм, пор 60÷1500 Å и СОЕ 20÷243 мкмоль/г. В табл.1 показана зависимость СОЕ кремнеземальдегидов, мкмоль/г, определенная по титрованию тиосульфатом, и цвета комплекса 8-гидрокси-3,5-дихлор-2-хинолилгидразонилкремнеземов с железом (КЖ) от соотношения окислителя и диасорбдиола по ТУ 2641-003-49299217-01. В табл.2 показана зависимость СОЕ кремнеземальдегидов, мкмоль/г, определенная по реакции с ДНФГ, и цвета 2,4-динитрофенилгидразонилкремнеземов, полученных из кремнеземальдегидов разных марок путем окисления кремнеземдиолов метапериодатом калия.
Изобретение проиллюстрировано фиг.1-3, выполненными с использованием спектральных характеристик, полученных за 3 секунды с помощью миниспектрофотометра Eye-One Pro (X-Rite Inc. USA) с диаметром входного окна 4 мм.
Фиг.1. Спектры диффузного отражения в виде функции F (Кубелки-Мунка) 2,4-динитрофенилгидразонилкремнеземов (ДНФГ-К) для образцов с различным количеством альдегидным групп, вступивших в реакцию с ДНФГ.
Фиг.2. Градуировочная кривая зависимости СОЕ кремнеземальдегидов от функции F их продукта - ДНФГ-К.
3+
Фиг.3. Спектры диффузного отражения 8-гидрокси-3,5-дихлор-2-хинолилгидразонилкремнезема 1 сухого (1) и влажного (2) и его комплекса с Feсухого (3) и влажного (4).
Ниже приведены примеры осуществления способа, которые иллюстрируют, но не ограничивают его.
Пример 1. Получение диасорб-60-альдегида Н (II).
Диасорб-60-диолН (ТУ 2641-003-49299217-01) с размером зерен 40-63 мкм и размером пор 60 Å в количестве 10 г смешивали с 5 г метапериодата натрия в 200 мл ацетатного буферного раствора при рН 4,5 и при периодическом осторожном перемешивании оставляли в темном месте на 10 ч. Реакция протекала по схеме:
Диасорб-60-альдегид Н
Диасорб-60-альдегид Н II
1
0
1
0
Продукт II отделяли от раствора, промывали дистиллированной водой, ацетоном и изопропанолом, сушили. Получили порошок белого со слегка желтоватым оттенком цвета, размер зерен 40-63 мкм, размер пор 60÷120 Å. Определяли СОЕ продукта по альдегидным группам. Для этого около 0,5000 г образца в колбе обрабатывали 10 мл 0,05 М раствора тетраборнокислого натрия х.ч. по ГОСТ 4199-86, 10 мл 0,1 М раствора иода, оставляли на 4 ч в темном месте, затем прибавляли 15 мл 0,1 н соляной кислоты ч.д.а. ГОСТ 3118-87, 2 капли 0,5%-го водного раствора крахмала по ГОСТ 10163-83 и титровали 0,02 н раствором тиосульфата натрия. СОЕ вычисляли по формуле Х=(V-V)·00029·100/С %, где V и V - количество мл раствора тиосульфата, пошедшее на титрование кремнеземальдегида и контрольной пробы, С - навеска порошка. СОЕ равно 243 мкмоль/г. Диасорб-60-альдегид Н проявлял характерное для альдегида химическое свойство - взаимодействовал с 2-гидразино-3,5-дихлор-8-гидроксихинолином (III) подобно мономерному ацетальдегиду (IV). Так, например, с ацетальдегидом образовывался 8-гидрокси-3,5-дихлор-2-хинолилгидразон ацетальдегида (V) (m/z 270, мол.м 270,12) по схеме:
А при действии этого же гидразина III на кремнеземальдегид II образуется полидентатный 8-гидрокси-3,5-дихлор-2-хинолилгидразон диасорб-60-альдегида (I):
Гидразон I полностью сходен с мономерным аналогом V по цвету (кремовый), спектрам и образованию комплексов с железом. Различие в последующих цветных реакциях полидентатных гидразонов V и 1 заключаются в том, что гидразон V в растворе, также как и в адсорбированном на силикагеле виде, образует темно-зеленые комплексы с железом состава 2:1, а также голубые комплексы с никелем, ртутью и свинцом, осадки с кадмием, кобальтом и медью; а кремнеземный гидразон 1 оказался более селективен и дает только с железом темно-серо-зеленые комплексы состава 1: 1 (фиг.3) (по причине ковалентной иммобилизации на кремнеземной матрице другой состав комплексов образоваться не может), а с другими тяжелыми металлами цветных комплексов не образует.
Таким образом, кремнеземный гидразон 1 в форме индикаторного порошка отличаются интенсивной контрастностью (фиг.3) и уникальной селективностью при образовании комплексов с железом.
Пример 2. Получение диасорб-350-альдегида.
Смесь метапериода калия, порошка диасорб-350-диола (ТУ 2641-003-49299217-01), дигидрофосфата натрия и воды в мас. соотношении 5: 5:1:100 выдерживали в течение 5 ч. Затем продукт отделяли от раствора, промывали дистиллированной водой и сушили. Продукт - порошок белого цвета, частицы размером 40÷70 мкм, размер пор 350÷500 Å. Определяли СОЕ продукта по альдегидным группам. Для этого навеску образца обрабатывают титрованным раствором 0,001 М ДНФГ в 1:1 об. смеси воды и ацетонитроила и выдерживают реакционную смесь в течение 3 суток до постоянной оптической плотности раствора, измеряемой при 420 нм. СОЕ определяли по количеству связанного ДНФГ, пошедшего на образование ДНФГ-К. СОЕ порошка равно 230 мкмоль/г.
По коэффициенту отражения порошка ДНФГ-К возможно определение содержания ДНФГ в анализируемых растворах с помощью образца диасорб-350-альдегида (фиг.2).
Табл.1.
Окислитель(О)
Диасорбдиол (Д)
О:Д
СОЕ
Цвет*КЖ
Метапериодат калия
Сферосилдиол
1:50
20
К
Метапериодат натрия
Порасилдиол
1:40
26
К
Мезоиодат аммония
Силохромдиол 1
1:30
55
С-Се-3
Дигидроортопериодат натрия
Силохромдиол 2
1:20
102
Се-3
Метапериодат натрия
Силохромдиол 3
1:10
161
Т-Се-3
Метапериодат натрия
Диасорб-60-диол Н
1:2
243
Т-Се-3
*Ж - желтоватый, 3 - зеленый, К - кремовый, С - светло-, Се - серо-, Т- темно-.
Табл.2.
Марка и размер зерен кремнеземдиола (ТУ 2641-003-49299217-01); соотношение метапериодата калия и кремнезема.
СОЕ по ДНФГ мкмоль/г
Цвет* ДНФГ-К
F при ДНФГ-К 460 нм
Силлохромдиол С-80, 100-200 мкм; 1: 40
29
Б
1,31
Силлохромдиол С-80, 100-200 мкм; 1:20
65
Ж
8,68
Силлохромдиол С-80, 100-200 мкм; 1:10
103
C-O
23,64
Диасорбдиол-60, 40-63 мкм; 1:1
180
C-O
35,77
Диасорбдиол-350, 40-63 мкм; 1:1
230
O
53,35
*Б - белый, Ж - желтоватый, С - светло-, О - оранжевый.
Диасорб-60-альдегид Н (СОЕ 243 мкмоль) был испытан в качестве носителя для иммобилизации фермента трипсина. При выдержке 100 мг трипсина в 10 мл воды и 2 мл 10% суспензии диасорб-60-альдегиде Н при рН 6 и температуре 5°С в течение 3 ч, с последующей промывкой осадка 1%-ным раствором хлорида натрия, количество связанного трипсина 120 мг/г, относительная активность 40% (по 4-нитроанилиду N-бензоиларгинина) [Fleming Ch., Gabert A., Roth P., Wand Н. Acta Bid. Med. Germ. 1973. B. 31. S. 365, 449].
Таким образом, предложен способ получения кремнеземальдегидов, конкретно макропористых силикагельальдегидов, таких как сферосилальдегидов, порасилальдегидов или диасорбальдегидов, и аэросилогельальдегидов или силохромальдегидов с заданным размером зерен, пор и статической обменной емкостью.
Способ получения дает возможность создавать матрицы с широким набором характеристик для применения их в аналитической химии и биотехнологии.