СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ И РАЗДЕЛЕНИЯ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И МИОФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ МЯСА НА ФРАКЦИИ МЕТОДОМ ОДНОМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
METHOD OF EXTRACTION AND SEPARATION OF SARCOPLASMIC AND MYOFIBRILLAR MEAT PROTEINS TO FRACTIONS BY METHOD OF ONE-DIMENSIONAL ELECTROPHORESIS IN POLYACRYLAMIDE GEL

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле.
Метод зонального электрофореза в полиакриламидном геле широко используется при исследовании биологических макромолекул. Его высокая разрешающая способность позволяет не только разделять смеси, содержащие большое число разных видов макромолекул, но и характеризовать их по заряду, молекулярной массе и конфирмации (Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. / Э.Гааль, Г.Медьеши, Л.Верецкеи - М.: Мир, 1982. С.74) [1].
Наиболее близким к заявляемому является способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков свинины на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле предложенный Aro A. Juan М. (Aro A. Juan М. Влияние времени обработки органическими кислотами на протеолитические изменения в сухих и полусухих колбасах / Aro A. Juan М., Chaina S. Amelia, Segura P. Roger, Sekikava Mitsuo // Материалы 56-го Международного конгресса по вопросам науки и технологии мясной промышленности. Пер. ВНИИМП. (15-20 августа, 2010 г., Джеджу, Корея). - М.: Изд-во ВНИИИМ - 2010. С.610.) [2].
Согласно данному способу четыре грамма исследуемого образца свинины гомогенизировали в 40 мл 0,03 М калий-фосфатного буфера (pH 7,4) в течение 2 мин при 13500 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин и температуре 4°C. Полученный супернатант содержал саркоплазматические белки. Из оставшегося осадка путем гомогенизации в течение 2 мин в растворе, содержащем 2 М молярную мочевину и 1% 2-меркаптоэтанол, экстрагировали миофибриллярные белки. Гомогент центрифугировали в тех же условиях, полученный супернатант содержал миофибриллярные белки.
Образцы саркоплазматических белков разводили 1:1 с помощь буфера для электрофореза и нагревали при 100°C в течение 5 мин. Электрофорез проводили в 12,5% разделяющем и 6% концентрирующем геле, при напряжении 120-150 В, в течение 4-6 часов. В каждую электрофоретическую ячейку было закапано по 10 мкл исследуемых образцов. Окраску проводили с помощью кумасси бриллиантового голубого R-250, 30% метанола и 10% уксусной кислоты. Молекулярные массы белков определяли с помощью пропускания через гель белков с известной массой. Гель после электрофореза отмывали и фотографировали.
Полученные согласно данному способу электрофореграммы не дают четкой картины разделения белковых треков из за неэффективной экстракции белков и чрезмерной плотности геля. Также необходимо отметить длительность процесса фракционирования - 4-6 часов, селективность способа - возможность электрофракционирования только белков свинины.
Недостатками данного способа являются:
- недостаточно четкое разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков;
- длительность процесса электрофоретического фракционирования;
- возможность фракционирования только белков свинины.
Задачей изобретения является улучшение разделения белковых зон мясных экстрактов, уменьшение длительности процесса электрофракционирования и унификации исследований различных видов и качественных групп мяса.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле, заключающемся в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере, согласно изобретению проводят экстракцию саркоплазматических белков, используя буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), а для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6 в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), после этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов.
Разработанные условия экстракции с использованием 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 и 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 позволяют полностью экстрагировать саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины из исследуемого материала. Хорошая экстракция дает возможность получить более четкое и воспроизводимое разделение белковых зон мясных экстрактов, чем при использовании распространенных способов экстракции, например, с использованием неионных детергентов и хаотропов (мочевина, гуанидиния хлорид), а также позволяет отказаться от нагрева пробы перед анализом.
Проведенными исследованиями установлено, что при использовании 5% концентрирующего геля при напряжении 90 В и разделяющего 11% геля при напряжении 300 В улучшается подвижность белковых макромолекул, а также уменьшается время электрофоретического фракционирования. Это происходит за счет уменьшения плотности геля и усиления напряжения, приходящегося на гель. Таким образом, подобранные условия являются оптимальными для электрофоретического разделения белков мяса.
Пример. Два грамма измельченного на часовом стекле мяса гомогенизировали в 5 мл 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,1 М Трис, pH 7,8. Экстракт перемешивают в течение 1 ч при 4°C на шейкере, затем центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Полученный в результате центрифугирования супернатант содержит саркоплазматические белки. Осадок ресуспендировали в 5 мл 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6, перемешивали в течение 10 минут при 4°C, гомогенат фильтровали через три слоя марли, чтобы удалить остатки соединительнотканного белка. Неочищенный миофибриллярный белок очищали путем диализа против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). Каждый очищенный миофибриллярный белок центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C 10 минут. Окончательно миофибриллярные белки растворяли в 0,6 М KCl, 0,1 М Трис, pH 7,8. Миофибриллярные и саркоплазматические белки хранят при -18…-20°C.
Готовят блок-пластины полиакриламидного геля толщиной 1 мм, размером 125×125 мм, состоящие из 11% разделительного геля высотой 100 мм и 5% концентрирующего геля высотой 25 мм. В качестве состава для буфера нанесения используют - 1 М Трис-HCl, pH 6,8, 10%-ный раствор DS-Na, глицерин, вода, 2-мсркаптоэтанол и 0,5%-ный раствор бромфенолового синего. Буфер нанесения и экстракты белков наносят на гребенку с двадцатью ячейками и количестве 6 мкл каждого образца.
Электрофорез проводят в ТРИС-глициновом буфере pH 8,3. В качестве стандарта белков на гелевых пластинах с исследуемыми пробами используют коммерческий препарат белков с известными молекулярными массами.
Прибор для электрофореза с нанесенным белком и камерами, заполненными электродным буфером, устанавливают в холодильник и подключают к источнику питания в соответствии с инструкцией. Устанавливают напряжение 90 В на гель 125×125×1 мм. Когда белок войдет в разделяющий гель, напряжение увеличивают до 300 В на пластину и поддерживают его на таком уровне до окончания электрофореза. Контроль за движением белка осуществляют по движению бромфенолового синего, который идет впереди белкового фронта. При описанном режиме электрофореза время деления белка составляет 2 часа.
По окончании электрофоретического разделения белков полученную гелевую пластину окрашивают раствором Кумасси R-250 в течение 15 мин. Отмывку геля от красителя проводят в уксусно-спиртовой смесь, завершают отмывку в 10% уксусной кислоте.
Отмытый гель фотографируют. На фиг.1 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков говядины. На фиг.2 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков свинины. Полученные электрофореграммы свидетельствуют о высокой разделяющей способности заявляемого способа.
Таким образом, заявляемый способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки как свинины, так и говядины.