Микробиологические исследования начальный этап разработки лекарственного растительного средства для местного лечения гнойных ран

ВЕСТНИК ВГМУ, 2009, Том 8, №4

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - НАЧАЛЬНЫЙ ЭТАП РАЗРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА ДЛЯ МЕСТНОГО ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНЫХ РАН

ФРОЛОВА А.В.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»

Резюме. С целью разработки лекарственного средства растительного происхождения для местного лечения гнойных ран в качестве перспективных источников выбраны листья маклейи мелкоплодной и подорожника большого. In vitro проведен сравнительный анализ антимикробной активности лекарственных форм (присыпки и настоя) предлагаемого состава при различном соотношении его компонентов.

Показано, что выраженный антимикробный эффект в отношении возбудителей хирургической инфекции присущ присыпке из листьев маклейи мелкоплодной. Лекарственные формы из листьев подорожника большого не обладают антимикробной активностью.

Установлено, что соотношение компонентов «маклейя / подорожник» 2:1 является наиболее перспективным для применения в I фазе раневого процесса. Установлено, что проведение радиационного облучения с целью деконтаминации сырья оказывает влияние на выраженность фармакологической активности всех образцов.

Ключевые слова: гнойные раны, растительное средство, антимикробный эффект.

Abstract. With the purpose to develop vegetable drug for local treatment of purulent wounds Macleayae microcarpae and Plantago major leaves have been chosen as promising sources. In vitro the comparative analysis of antimicrobial activity of medicinal forms (powder and infusion) of the offered composition has been made, the proportion of its components being different.

It has been shown, that the marked antimicrobial effect on causative agents of surgical infections is inherent in Macleayae microcarpae leaves powder. Medicinal forms obtained using Plantago major leaves do not possess antimicrobial activity. It has been determined, that 2:1 proportion of «macleaya/plantago» components is the most promising for application at the first stage of wound process. It has also been determined, that conducting radioactive irradiation for decontamination of raw material influences the expressiveness of pharmacological activity of all samples.

Key words: purulent wounds, herbal remedy, antimicrobic effect

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210023, г.Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» - Фролова А.В.

Литературные данные и собственные исследования подтверждают, что возбудителям хирургической инфекции присуща множественная, интенсивно формирующаяся резистентность к синтетическим антимикробным препаратам [1-5]. Селекции полирезистентных микроорганизмов способствует нерациональное назначение антибиотиков без достаточного контроля за видовым составом возбудителей, в том числе госпитальными штаммами, их чувствительностью к антибактериальным препаратам [6-8].

По мнению ряда исследователей на современном этапе препаратам растительного происхождения, обладающим рядом преимуществ, не следует отводить последнее место в местной терапии воспалительных заболеваний. Как правило, они проявляют слабое общетоксическое действие, не имеют мутагенного и тератогенного эффекта, к ним высоко чувствительны микроорганизмы [9-14].

Это диктует необходимость разработки и последующего внедрения новых эффективных лекарственных средств растительного происхождения. Поскольку антибактериальная терапия требует значительных финансовых

затрат, то включение фитофармакологии в комплекс профилактических и лечебных мероприятий на различных стадиях заболеваний становится не только патогенетически оправданным и полезным, особенно при хронических процессах, но и экономически выгодным.

Известно, что лечебные свойства растений обусловлены их богатым химическим составом. Поэтому при производстве фитопрепаратов с целью обеспечения высокой эффективности лекарственного средства, как правило, проводится извлечение действующих веществ растений или синтез их аналогов. При этом происходят колоссальные сырьевые и производственные затраты, что зачастую ведет к снижению промышленного выпуска и исчезновению эффективных средств из аптечной сети.

Новые эффективные и при этом относительно дешевые лекарственные средства, можно создавать, не прибегая к дорогостоящим оборудованию и технологиям, а используя перспективные растительные источники.

В нашей стране задачами государственной программы «Фитопрепараты» на 2005-2010 гг. определены создание новых и совершенствование существующих фитопрепаратов, организация их промышленного выпуска.

Целью настоящей работы явилось провести сравнительное лабораторное изучение антимикробной активности растительного состава при различном соотношении его компонентов для выявления наиболее перспективного при использовании в I фазе раневого процесса.

Методы

Определение спектра антимикробной активности лекарственных растений проведено методом стекающей капли.

На чашку Петри с мясопептонным агаром (МПА) вносят взвесь 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) суточной культуры музейных штаммов S. aureus АТСС 25923, Bacillus cereus АТСС 6633, E. coli 026, P. aeruginosa АТСС 27853, P. vulgaris АТСС 4636.

После подсыхания чашек Петри с микробной взвесью в термостате при 37°С в течение 30 мин. на их поверхность наносят стерильной пипеткой 0,1 мл испытуемых образцов.

Контролем служат чашки Петри с высеянной тождественной культурой микроорганизмов, в которые соответственно вносят 0,1 мл физиологического раствора. Контрольные и опытные чашки помещают в термостат (t=37°G) под углом 75° и через сутки проводят учет антимикробной активности в отношении возбудителей (по ширине «дорожки» от стекающей капли).

Определение чувствительности микроорганизмов к лекарственным растениям проведено методом диффузии в агар [15]. На чашку Петри с мясопептонным агаром (МПА) вносят взвесь 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) суточной культуры исследуемого штамма микроорганизма.

Настой (присыпку) испытуемого образца, раствор сангвиритрина (позитивный контроль) и стерильный физиологический раствор (негативный контроль) в объеме 20 мкл вносят в лунки, и после суточной инкубации в термостате при t=37^ измеряют диаметры зон ингибирования роста микроорганизмов. При отсутствии зоны ингибирования роста считают, что антимикробная активность отсутствует.

В исследовании использованы 10 образцов - присыпки и настои из листьев маклейи мелкоплодной, из листьев подорожника большого и их композиции при разном соотношении компонентов.

Для приготовления настоя 3 г сырья помещают в стерильную плоскодонную колбу, заливают 100 мл стерильного физиологического раствора, закрывают пробкой и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин.

Затем охлаждают в течение 45 мин., процеживают и оставшуюся массу отжимают. Полученный настой доводят стерильным физиологическим раствором до первоначального объема.

Результаты и их обсуждение

В основу разработки растительного лекарственного средства изначально были положены требования, предъявляемые к современным препаратам для местного лечения гнойных ран, - быть малокомпонентными, экономически выгодными, обладать многонаправленным действием на основные патогенетические факторы раневого процесса и четко соответствовать его фазе. Введение в лекарственное средство антимикробного компонента обусловлено наличием патогенной микрофлоры в очаге в I фазе раневого процесса.

При этом учитывались и собственные исследования, продемонстрировавшие, что превалирующим возбудителем хирургической инфекции выступает грамположительная микрофлора, в частности, S. aureus [2]. Проведенное ранее изучение ряда растительных извлечений с предполагаемым или описанным в литературе антимикробным эффектом, показало, что достоверно максимальным в отношении грамположительной микрофлоры обладал настой из листьев маклейи мелкоплодной, а против грамотрицательных возбудителей он был менее эффективен [16].

На рисунках 1-2 приведены чашки Петри с микробной взвесью и дорожкой от стекающей капли настоя.

Рис. 1. Чашка Петри со взвесью S. Aureus.

Рис. 2. Чашка Петри со взвесью E.

Coli.

Слабо выраженным антимикробным эффектом в отношении как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры обладали отвар из корней окопника лекарственного, настои из соцветий календулы лекарственной и из травы зверобоя продырявленного.

Настой из листьев подорожника большого был неэффективен в отношении как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры. Более того, на чашке Петри с нанесенной культурой Е. соИ настой усиливал ее рост, что дает возможность предполагать о высокой степени контаминации сырья.

В таблице 1 приведены данные, характеризующие антимикробную активность каждого из исследованных растительных извлечений.

Таблица 1- Диаметры зон ингибирования роста возбудителей водными растительными извлечениями_________________________________________________

S. aureus B. subtilis E. coli P. aeruginosa P. vulgaris

настой маклейи мелкоплодной 22,5 ± 0,05 23,8 ± 0,02 14,5 ± 0,8 6,9 ± 0,16 2,9 ± 0,17

настой чистотела большого 16,5 ± 0,09 17 ± 0,28 9,5 ± 0,25 4,4 ± 0,15 1,4 ± 0,12

настой сфагнума 18,5 ± 0,02 19,1 ± 0,15 12,3 ± 0,8 6,5 ± 0,16 2,3 ± 0,17

отвар ольхи серой 12,4 ± 0,18 14,4 ± 0,25 18,9 ± 0,17 10,7 ± 0,2 5,6 ± 0,38

настой календулы лекарственной 3,8 ± 0,1 3,9 ± 0,4 0,2 ± 0,1 0 0

настой зверобоя продырявленного 7,7 ± 0,06 7,9 ± 0,07 1,2±0,12 0 0

настой подорож-ника большого 0 0 0 0 0

отвар окопника лекарственного 3,5 ± 0,02 4,2 ± 0,04 0 0 0

В последующем, исходя из полученных in vitro данных об антимикробном эффекте, из наиболее активных лекарственных растений были сформированы только 4 композиции.

Для сравнительного изучения их влияния на течение раневого процесса на модели гнойной раны были сформированы 6 групп кроликов, которым на раневую поверхность накладывали марлевую салфетку, пропитанную настоем (отваром) одного из составов: «сфагнум / листья подорожника большого» при соотношении компонентов 2:1, «листья маклейи мелкоплодной / корни

окопника лекарственного / листья подорожника большого» (1:1:1), «листья маклейи мелкоплодной / листья подорожника большого» (1:1), «листья маклейи мелкоплодной / соплодия ольхи серой / листья подорожника большого» (1:1:1).

Полученные экспериментальные данные позволили сделать вывод, что из рассмотренных композиций состав «маклейя мелкоплодная / подорожник большой» является оптимальным вариантом средства для местного лечения гнойных ран, поскольку сочетает в себе антимикробный, противовоспалительный и ранозаживляющий эффекты [17].

Под действием настоя из предлагаемого состава снижалась микробная обсемененность, очищение ран от микроорганизмов происходило быстрее на 36 дней по сравнению с контролем, а их заживление наступало без присоединения гнилостной инфекции. Ко 2-м суткам затихала острая воспалительная реакция, на 8-е сутки нормализовались гематологические показатели, на 3-4 дня раньше, чем в контроле купировался перифокальный отек, ослабевали гипертермия и гиперемия, уменьшалось количество раневого отделяемого.

О противовоспалительном эффекте судили по отсутствию затеков и затечных карманов, а также по нормализации микроциркуляции в раневом канале, что способствовало более раннему появлению и созреванию грануляционной ткани и активизации краевой эпителизации. Под действием состава отмечено сокращение сроков полного заживления раны на 6 дней или на 33,3% по сравнению с контролем.

Полученные результаты позволили предположить, что изменение соотношения компонентов в данном составе может отразиться на выраженности его эффектов, необходимых в той или иной фазе раневого процесса. К тому же вызывало интерес сравнительное изучение настоя и наиболее редко применяемой в хирургической практике на сегодняшний день твердой лекарственной формы - присыпки. Поэтому для совершенствования будущего средства был проведен сравнительный бактериологический анализ обеих лекарственных форм.

Методом диффузии в агар установлено, что присыпка маклейи мелкоплодной обладала более выраженной антимикробной активностью в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры в сравнении с настоем (р < 0,0001). При этом диаметр зоны ингибирования роста S. aureus составил 23,11 ± 0,31 мм, E. coli - 14,63 ± 0,49 мм, P. aeruginosa - 8,38 ± 0,49 мм, P. vulgaris - 4,0 ± 3,59 мм.

Присыпка из листьев подорожника большого так же, как и настой, не проявила антимикробной активности в отношении грамположительной микрофлоры и была неэффективна в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

На рисунках 3-4 приведены лунки чашки Петри, характеризующие в отношении S. aureus выраженную антимикробную активность у присыпки из листьев маклейи мелкоплодной и отсутствие ее у присыпки из листьев подорожника большого.

Рис. 3. Зона ингибирования роста Рис. 4. Отсутствие зоны ингибирования

S. aureus присыпкой из листьев роста S. aureus присыпкой из листьев

маклейи мелкоплодной. подорожника большого.

Настой состава при соотношении компонентов «маклейя мелкоплодная / подорожник большой» 1:1 проявлял слабый антимикробный эффект в отношении грамположительной микрофлоры, E. coli, P. aeruginosa и был неэффективен в отношении P. vulgaris. Диаметр зоны ингибирования роста S.

aureus составил 13,77 ± 0,60 мм, E. coli - 8,13 ± 0,34 мм, P. aeruginosa - 4,58 ± 3,51 мм.

Нестерильная присыпка при таком же соотношении компонентов обладала антимикробным эффектом, значительно менее выраженным в сравнении с присыпкой из листьев маклейи мелкоплодной, как в отношении грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры (p < 0,0001). Диаметр зоны ингибирования роста S. aureus составил 15,70 ± 0,46 мм, E. coli -9,47 ± 0,51 мм, P. aeruginosa - 5,73 ± 3,55 мм. Против P. vulgaris активность отсутствовала.

Это можно объяснить двумя причинами:

1) концентрация маклейи мелкоплодной в составе сбора уменьшается в 2

раза;

2) нестерильный подорожник большой оказывает подавляющее действие на антимикробную активность маклейи мелкоплодной.

При изменении соотношения компонентов и увеличении в 2 раза содержания маклейи мелкоплодной в составе диаметр зоны ингибирования роста S. aureus присыпкой составил 20,16 ± 0,37 мм, E. coli - 11,28 ± 0,81 мм, P. aeruginosa - 7,45 ± 0,50 мм, в отношении P. vulgaris - 2,50 ± 3,48 мм.

Настой состава «маклейя / подорожник» 2:1 также проявил более выраженный эффект, чем таковой при соотношении компонентов 1:1, однако он был достоверно слабее настоя маклейи мелкоплодной (р < 0,0001). Диаметр зоны задержки роста S. aureus составила 18,04 ± 0,19 мм, E. coli - 10,59 ± 0,50 мм, P. aeruginosa - 7,20 ± 0,40 мм, P. vulgaris - 2,0 ± 3,28 мм.

Поскольку была установлена неэффективностью нестерильного сырья подорожника большого, то изучение антимикробной активности присыпки и настоя из состава при соотношении компонентов «М / П» 1:2 не проводилось.

Использование лекарственного средства в хирургической практике предусматривает его стерильность. Проведенная радиационная стерилизация оказала влияние на выраженность антимикробной активности образцов. Сравнительные данные приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Диаметры зон ингибирования роста возбудителей образцами до и после стерилизации______________________________________________________

Образец S. aureus E. coli

до стерили- зации после стери- лизации достовер- ность различий до стерили- зации после стерилизации достовер- ность различий

присыпка маклейи мелкоплодной 23,11 ± 0,31 23,16 ± 0,50 р=1,00000 14,63 ± 0,49 14,69 ± 0,47 р=0,674388

настой маклейи мелкоплодной 22,38 ± 0,49 22,55 ± 0,78 р=0,99992 14,47 ± 0,57 14,59 ± 0,56 р=0,411520

присыпка подорожника большого 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

настой подорожника большого 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00

присыпка М:П 1:1 15,70 ± 0,46 17,73 ± 0,45 р<0,00001 9,47 ± 0,51 11,09 ± 0,69 р<0,00001

настой М:П 1:1 13,77 ± 0,60 14,75 ± 0,51 р<0,00001 8,13 ± 0,34 9,16 ± 0,51 р<0,00001

присыпка М:П 2:1 20,16 ± 0,37 22,07 ± 0,66 р<0,00001 11,28 ± 0,81 13,19 ± 0,97 р<0,00001

настой М:П 2:1 18,04 ± 0,19 20,02 ± 0,73 р<0,00001 10,59 ± 0,50 12,25 ± 0,72 р<0,00001

присыпка М:П 1:2 0,00 ± 0,00 7,79 ± 0,87 р<0,00001 0,00 ± 0,00 3,06 ± 3,53 р<0,00001

настой М:П 1:2 0,00 ± 0,00 3,38 ± 3,53 р<0,00001 0,00 ± 0,00 1,97 ± 3,20 р<0,00001

Таким образом, бактериологические исследования позволили сделать следующие выводы:

1) Лекарственные формы «присыпка» и «настой» из листьев маклейи мелкоплодной проявляют выраженный антимикробный эффект в отношении грамположительной и грамотрицательной микрофлоры, независимо от стерильности сырья.

2) Настой из листьев маклейи мелкоплодной более эффективен, чем настой состава при соотношении компонентов «маклейя мелкоплодная / подорожник большой» 1:1 (р < 0,001), но слабее по сравнению с присыпкой из листьев маклейи.

3) При приготовлении лекарственного средства растительного происхождения на основе подорожника большого обязательным условием выступает стерилизация сырья.

4) С целью достижения выраженной антимикробной активности лекарственного средства необходимо использовать соотношение компонентов «маклейя мелкоплодная / подорожник большой» 2:1.

Литература

1. Хирургические инфекции: руководство / под ред. И.А. Ерюхина, Б.Р. Гельфанда, С.А. Шляпникова. - СПб.: Питер, 2003. - 864 с.

2. Этиологическая структура возбудителей хирургической инфекции / А.В. Фролова, А.Н. Косинец, В.К. Окулич, С.Д. Федянин // Достижения фундамент., клин. медиц. и фармац.: матер. 62-й науч. сессии ун-та. - Витебск, 2007. - С. 50-53.

3. Абаев, Ю.К. Современные особенности хирургической инфекции / Ю.К. Абаев // Вестн. хирургии. - 2005. - Т. 164, № 3. - С. 107-111.

4. Сидоренко, С.В. Клиническое значение антибиотикорезистентности грамположительных микроорганизмов / С.В. Сидоренко // Клин. фармакол. и тер. - 2004. - Т. 13, №2. - С. 16-26.

5. Титов, Л.П. Эволюция микробов и ее медицинское значение / Л.П. Титов [и др.] // Здравоохранение. - 2002. - № 8. - С. 30-35.

6. Основные направления эволюции этиологической структуры и устойчивости к антимикробным препаратам возбудителей внутрибольничной раневой инфекции в хирургических и ожоговых стационарах Республики Беларусь / Е.И. Гудкова [и др.] // Инфекция и иммунитет: материалы Респ. науч.-практ. конф., посвящ. 75-летию БелНИИЭМ. - Минск, 1999. - С. 215-219.

7. Русаков, В.И. Некоторые общие проблемы хирургии / В.И. Русаков // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. - 2000. -Т. 159, № 4.- С. 99-101.

8. Страчунский, Л.С. Политика применения антибиотиков в хирургии / Л.С. Страчунский, Ж.К. Пешере, П.Э. Деллинджер // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. - 2003. - Т. 5, № 4. - С. 302-317.

9. Шулипенко, И.М. Современные взгляды на роль и значение фитотерапии в структуре научной медицины / И.М. Шулипенко // Врач. дело. -1990. - №3. - С. 147-150.

10. Организационно-экономические исследования по обоснованию создания и внедрения в медицинскую практику новых отечественных фитопрепаратов антимикробного действия / В.А. Егоров [и др.] // Человек и лекарство: тез. докл. Рос. нац. конгр., Москва, 2-6 апреля 2001 г. - М., 2001. - С. 562.

11. Пашинский, В.Г. Пути рационального исследования лекарственных растительных средств (фармакологические подходы) / В.Г. Пашинский, Т.Н. Поветьева, Л.В. Ратахина // Человек и лекарство: тез. докл. Рос. нац. конгр., Москва, 8-12 апреля 2005 г., М., 2005. - С. 99.

12. Поиск фитопрепаратов и создание на их основе лекарственных форм многофакторного воздействия на воспалительные процессы / В.И. Погорелов [и др.] // Человек и лекарство: тез. докл. Рос. нац. конгр., Москва, 2-6 апреля 2001 г., М., 2001. - С. 604.

13. Шретер, А.И. Результаты и перспективы научных исследований в области создания лекарственных средств из растительного сырья / А.И. Шретер [и др.] // Раст. ресурсы. - 1996. - Т. 22, Вып.3. - С. 435-438.

14. Батеха, Т.И. Терапевтический и фитоэнергетический эффект фитонцидов растений / Т.И. Батеха, А.А Жученко, А.М. Рабинович // Человек и лекарство: тез. докл. Рос. нац. конгр., Москва, 2-6 апреля 2001 г. - М., 2001. - С. 546.

15. Поляк, М.С. Клиническая значимость и методология определения антибиотиков в биосубстратах / М.С. Поляк. - Санкт-Петербург, 1998. - 21 с.

16. Фролова, А.В. Сравнительный анализ антимикробной активности лекарственных растений / А.В. Фролова, А.Н. Косинец, Г.Н. Бузук // Вестн. фармации. - 2006. - № 4. - С. 54-61.

17. Фролова, А.В. Экспериментальный подбор состава лекарственного средства растительного происхождения для местного лечения гнойных ран / А.В. Фролова, А.Н. Косинец, М.Л. Жолнерович, В.Н. Грушин // Ученые записки. - 2009. - Том 45. - Вып. 1. - Ч. 1. - С. 99-103.