СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ МАТЕРИАЛОВ К БИОДЕГРАДАЦИИ
METHOD FOR DETERMINING RESISTANCE OF MATERIALS TO BIODEGRADATION

Изобретение относится к технике исследования механических свойств материалов. Предлагаемый способ может быть применен для оценки степени устойчивости к деградации, индуцируемой микроорганизмами, как уже существующих, так и вновь разрабатываемых изделий и материалов, для которых данный параметр является одним из целевых (биодеградируемые материалы) либо нежелательных (биологически устойчивые материалы).
Известен способ оценки и прогнозирования процессов старения полимерных материалов по динамике суммарного газовыделения и токсичности летучих органических соединений, мигрирующих из полимера в процессе старения, детектируемых методом хромато-масс-спектрометрии, по которому деградацию тестируемых образцов оценивали хромато-масс-спектрометрически по изменению общего количества и состава летучих органических соединений, выделяемых образцами до и после проведения с ними ускоренных термовлажностных климатических испытаний (патент RU 2554623, публ. 27.06.2015 г.).
Недостатком этого метода является то, что степень деградации тестируемых образцов здесь определяется косвенно - а значит, с достаточно малой объективностью. Кроме того, этот способ весьма дорогостоящ в плане используемого оборудования и сложен в выполнении.
В патенте «Штамм гриба Aspergillus flavus link, как тест-культура для определения грибостойкости сталей, оксидных алюминиевых и магниевых сплавов» деградацию тестируемых образцов оценивали следующим образом. Сначала тестируемые образцы выдерживали при 30°С в течение 9 месяцев на поверхности газона тест-культуры, выращенной на агаризованной питательной среде, в чашках Петри, помещенных в эксикатор, поддерживающий общую 97% влажность тестируемых образцов. Затем образцы с помощью скальпеля и растворов различных химических реактивов очищали от остатков микроорганизмов, питательной среды и продуктов коррозии, промывали, просушивали и взвешивали (для определения потери массы). После чего, визуально определяли площадь пораженной коррозией поверхности тестируемых образцов наложением на поверхность этих образцов пластины из прозрачного материала с нанесенной на нее сеткой и глубину коррозионных поражений на этой поверхности с помощью оптического микроскопа (патент RU 1766073, публ. 19.06.1995 г.).
Недостатками этого метода является его длительность (9 месяцев); то, что степень деградации тестируемых образцов здесь определяется визуально, а следовательно, довольно субъективно; а также то, что здесь не определяется влияние на степень деградации тестируемых образцов отдельно влаги и биохимических факторов.
Известен способ определения гидролитической устойчивости материалов. В нем предлагается обрабатывать тестируемые образцы высокотемпературной газовой смесью, содержащей пары воды и добавки, катализирующие процесс гидролиза. После чего оценивать механические свойства этих образцов в виде разрывной нагрузки. И по изменению механических свойств этих образцов (в виде их разрывной нагрузки) до и после их обработки газовой смесью судить о гидролитической устойчивости испытываемого материала (прототип-патент RU 2043619, публ. 10.09.1995 г.).
Недостатком этого способа является то, что с его помощью осуществляется оценка изменения свойств тестируемых образцов только вследствие химического гидролиза образцов, в то время как биохимический гидролиз образцов, осуществляемый в присутствии микроорганизмов, не учитывается.
В связи с ростом производства и потребления человеческим обществом различной продукции утилизация отходов стала в настоящее время одной из основных экологических проблем человечества. Одним из лучших способов решения этой проблемы является создание и как можно более широкое использование материалов, способных достаточно быстро разлагаться под воздействием различных климатических, биологических и иных факторов. С другой стороны, в целом ряде случаев, наоборот, желательно применение материалов, проявляющих возможно большую устойчивость к воздействию на них различных живых организмов и иных потенциально разрушающих факторов. В связи с этим, все более актуальной в настоящее время становится и проблема разработки достаточно экспрессных, объективных, простых, доступных и дешевых способов оценки устойчивости материалов к деградации, индуцируемой различными факторами, из которых живые организмы являются одними из наиболее действенных. Причем среди последних микроорганизмы являются наиболее распространенными. А кроме того, взаимодействие упомянутых микроорганизмов с тестируемыми образцами, в большинстве случаев, может служить наиболее статистически достоверной, экспрессной, простой и дешевой моделью взаимодействия таковых образцов с другими живыми организмами.
Целью заявляемого изобретения стало создание способа, позволяющего определять гидролитическую устойчивость тестируемых материалов при воздействии не только химических, но и биохимических факторов, определяемых жизнедеятельностью тестовых микроорганизмов.
6
7
Цель эта достигается за счет того, что в предлагаемом способе, который включает в себя такие операции как подготовка образцов с тестируемыми материалами, подготовка стерильной жидкой питательной среды (СЖПС) и жидкой питательной среды с тестовыми микроорганизмами (МЖПС), инкубирование образцов в этих средах и измерение механических свойств тестируемых образцов до и после их инкубирования; инкубирование образцов проводят в течение 8-10 суток при температуре 29-31°С с ежесуточной заменой 40% инкубационной жидкой питательной среды на СЖПС, представляющей собой водный раствор с рН 6,8-7,4, содержащий 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCl; МЖПС перед началом инкубирования в ней тестируемых образцов дополнительно к СЖПС содержит штамм Escherichia coli АТСС 25922 в количестве от 5×10 до 5×10 жизнеспособных клеток на мл; а расчет изменения механических свойств тестируемых образцов в результате их деградации, индуцируемой различными факторами, производится по следующим формулам:
ОР
Б
Э
Э
К=100×(σ-σ)/σ,
МР
И
Э
Э
К=100×(σ-σ)/σ,
ХР
К
И
И
К=100×(σ-σ)/σ,
БР
Б
К
К
К=100×(σ-σ)/σ,
где
ОР
К - общий коэффициент разлагаемости, отражающий изменение прочности тестируемых образцов после инкубирования их в МЖПС с тестовыми микроорганизмами относительно исходной прочности эталонных образцов,
МР
К - коэффициент механоразлагаемости, обусловленной различными механическими воздействиями на тестируемые образцы, отражающий изменение исходной прочности тестируемых образцов относительно исходной прочности эталонных образцов,
ХР
К - коэффициент хеморазлагаемости, обусловленной взаимодействием тестируемых образцов с водой и другими химическими компонентами, содержащимися в СЖПС, отражающий изменение прочности контрольной части тестируемых образцов после инкубирования их в СЖПС относительно исходной прочности тех же образцов,
БР
К - коэффициент биоразлагаемости, обусловленной взаимодействием тестируемых образцов с тестовыми микроорганизмами, отражающий изменение прочности биоразлагаемой части тестируемых образцов после инкубирования их в МЖПС относительно прочности образцов того же материала после инкубирования их в СЖПС,
Э
σ - прочность образцов, содержащих эталонные изделия или материалы, не подвергавшихся инкубации (прочность эталонных образцов),
И
σ - прочность образцов, содержащих тестируемые изделия или материалы, не подвергавшихся инкубации (исходная прочность тестируемых образцов),
К
σ - прочность образцов, содержащих тестируемые изделия или материалы, после инкубации их в СЖПС (прочность контрольных образцов),
Б
σ - прочность образцов, содержащих тестируемые изделия или материалы, после инкубации их в МЖПС (прочность биоразлагаемых образцов);
БР
после чего при значениях К больше -10% тестируемые образцы считаются гидролитически устойчивыми в присутствии микроорганизмов,
БР
при значениях К меньше -30% тестируемые образцы считаются гидролитически не устойчивыми в присутствии микроорганизмов,
ХР
при значениях К больше -10% тестируемые образцы считаются гидролитически устойчивыми в отсутствие микроорганизмов,
ХР
при значениях К меньше -30% тестируемые образцы считаются гидролитически не устойчивыми в отсутствие микроорганизмов.
При этом выбор режима инкубирования образцов (продолжительность 8-10 суток при температуре 29-31°С), связан с тем, что при более длительном инкубировании эффективность деградации тестируемых образцов увеличивается незначительно по сравнению с затратами на ее определение; при более низкой температуре либо меньшем времени инкубирования не достигается степень деградации тестируемых образцов, достаточная для ее надежного и достоверного определения предлагаемым методом; а при более высокой температуре инкубации для поддержания активной жизнедеятельности тестовых микроорганизмов (необходимой для эффективной биодеградации ими тестируемых образцов) будет требоваться более частая замена части инкубационной питательной среды на СЖПС, что существенно увеличит трудоемкость заявляемого способа анализа и затраты на его проведение.
Ежесуточная замена 40% инкубационной жидкой питательной среды на СЖПС необходима для поддержания высокой метаболической активности тестовых микроорганизмов в течение всего периода инкубирования в их присутствии тестируемых образцов (что требуется, в свою очередь, для увеличения эффективности биодеградации тестируемых образцов и сокращения, вследствие этого, общего времени анализа устойчивости таковых образцов к воздействию микроорганизмов), а также для поддержания стерильности среды, в которой инкубируется контрольная часть тестируемых образцов.
Выбор состава СЖПС (водный раствор с рН 6,8-7,4, содержащий 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCl) связан с необходимостью обеспечения оптимальных условий для развития в этой среде тестовых микроорганизмов, что как и в предыдущем случае, нужно для увеличения эффективности биодеградации тестируемых образцов и сокращения, вследствие этого, общего времени анализа устойчивости таковых образцов к воздействию микроорганизмов.
Дополнительное введение в состав СЖПС штамма Escherichia coli АТСС 25922 дает возможность оценивать устойчивость тестируемых образцов к воздействию не только химических факторов (как это делалось в прототипе), но также биохимических факторов, определяемых жизнедеятельностью тестовых микроорганизмов.
Данный штамм был выбран в качестве тестового биообъекта потому, что E. coli является общепринятым санитарно-показательным микроорганизмом; способна к активной жизнедеятельности как в аэробных, так и в анаэробных условиях на самых разнообразных субстратах (включая полное отсутствие органических веществ), а кроме того, способна к активной сорбции на твердых поверхностях и обладает развитой ферментной системой - что, в совокупности, позволяет E. coli обитать в большинстве мест возможной эксплуатации либо утилизации широкого спектра тестируемых материалов, активно деградируя последние.
Так, в частности, Escherichia coli является официально рекомендуемым санитарно-показательным микроорганизмом при оценке качества воды, пищевой продукции, фармакологических и иных препаратов и т.п. (ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа. + ГОСТ 30726-2001. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli. + Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под. ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.). В то же время, использование штамма Escherichia coli АТСС 25922 для определения биогидролитической устойчивости материалов не выявлено.
6
7
При этом выбранное количество жизнеспособных тестовых микроорганизмов, которое должно присутствовать в МЖПС перед началом ее инкубации в присутствии тестируемых образцов (от 5×10 до 5×10 кл/мл), определяется тем, что при меньшем количестве таковых микроорганизмов снижается скорость и эффективность индуцируемой ими деградации тестируемых образцов; а при большем количестве тестовых микроорганизмов в инкубационной среде для поддержания активной жизнедеятельности таковых микроорганизмов (необходимой для эффективной деградации ими тестируемых образцов) будет требоваться более частая замена части инкубационной питательной среды на СЖПС, что существенно увеличит трудоемкость заявляемого способа анализа и затраты на его проведение.
Достижение цели заявляемого способа анализа обеспечивается тем, что в ходе него осуществляется точная, инструментальная, количественная оценка изменения механических свойств тестируемых образцов вследствие воздействия на них влаги, тестовых микроорганизмов, а также различных механических нагрузок.
Реализация предлагаемого способа оценки устойчивости материалов к биодеградации осуществляется следующим образом:
6
7
6
7
Этап 1. В две или несколько стерильных емкостей заливается необходимое количество жидкой питательной среды (ЖПС), представляющей собой водный раствор с рН 6,8-7,4, содержащий 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCl. Далее, все емкости с ЖПС закрываются и стерилизуются автоклавированием в течение 20 минут при 115°С. Затем в одну или несколько емкостей, содержащих 10 об. % от общего количества стерильной ЖПС (СЖПС), стерильно вносится 1 об. % закваски, содержащей жизнеспособные клетки Escherichia coli АТСС 25922, суспендированные в ЖПС. После чего все емкости с СЖПС в течение всего времени анализа тестируемых образцов хранятся в закрытом виде при 2-4°С. В то время как емкости с ЖПС, содержащей жизнеспособные клетки Escherichia coli АТСС 25922 (МЖПС), инкубируются (также в закрытом виде) при 36-38°С (температура, оптимальная для роста и развития тестового штамма микроорганизмов) в течение 12 ч. Далее, турбидо- либо нефелометрическим методом измеряется интенсивность упругого светорассеяния (Iod) инкубируемой МЖПС. По предварительно построенному калибровочному графику (представляющему собой зависимость Iod МЖПС от концентрации содержащихся в ней клеток Escherichia coli АТСС 25922) удостоверяется, что полученное значение Iod соответствует концентрации E.coli в МЖПС от 5×10 до 5×10 клеток на мл. При Iod, соответствующем концентрации E.coli в МЖПС меньше 5×10 кл/мл, МЖПС инкубируется при 36-38°С в течение еще 3 ч; после чего для нее проводится повторное определение Iod. При Iod, соответствующем концентрации E.coli в МЖПС больше 5×10 кл/мл, МЖПС разбавляется необходимым количеством СЖПС.
Этап 2. Исходный образец, содержащий материал, устойчивость которого к биодеградации требуется определить, делится на три части (исходную, контрольную и биоразлагаемую), каждая из которых, в свою очередь, дополнительно разделяется на 4-6 одинаковых частей. Затем все исходные части тестируемого образца сохраняются в герметично закрытой сухой емкости при 2-4°С до начала 3-го этапа анализа. А контрольные и биоразлагаемые части тестируемого образца помещаются в емкости (например, пробирки) с СЖПС (в случае контрольных частей) либо с МЖПС (в случае биоразлагаемых частей), предварительно приготовленной и инкубированной как описано ранее. Далее, все емкости с ЖПС, содержащие тестируемые образцы, инкубируются в течение 8-10 суток при 29-31°С с ежесуточной заменой в каждой из этих емкостей 40% инкубационной ЖПС на СЖПС (хранящейся, как уже говорилось, в течение всего времени анализа тестируемых образцов в закрытых емкостях при 2-4°С).
Этап 3. После окончания 2-го этапа анализа все образцы достаются из емкостей, промываются (чтобы избавиться от остатков инкубационной среды и тестовых микроорганизмов) и высушиваются. Затем для всех частей тестируемых образцов (включая исходные, не подвергавшиеся инкубации), а также (при необходимости) для эталонных образцов осуществляется регистрация таких механических свойств, как прочность на прокалывание, разрыв, сжатие, изгиб или кручение. Потом по предлагаемым формулам определяются 4-е коэффициента деградации тестируемых образцов, обусловленной разными причинами. После чего делается общий вывод о причинах и степени устойчивости тестируемых образцов к различным видам деградации.
Более детально настоящее изобретение описывается следующим конкретным примером.
7
Для анализа было взято 6 пленочных образцов толщиной 0,3 мм, синтезированных на основе поливинилхлорида (ПВХ) с добавлением крахмала, природного бентонита и ZnO. После этого была приготовлена инкубационная тестовая среда (ИТС). Для чего в колбу вместимостью 1 л было залито 800 мл стерильной жидкой питательной среды (СЖПС) и 100 мл микробной закваски. При этом в качестве СЖПС использовался стерилизуемый автоклавированием в течение 20 минут при 115°С водный раствор с рН 7,2, содержащий 5 г/л глюкозы, 18 г/л белкового гидролизата и 2 г/л NaCl. А в качестве микробной закваски - та же ЖПС, но уже не стерильная, а содержащая в 1 мл примерно 10 жизнеспособных клеток Escherichia coli АТСС 25922 (что удостоверялось оптическим способом по стандарту мутности). Затем колба с ИТС помещалась в термостат и инкубировалась в нем в течение следующих 12 часов при 37±0,1°С. Далее, каждый из предназначенных для анализа образцов был разрезан на 12 частей размером 20×20 мм, 4-е из которых составили исходную выборку, другие 4-е - контрольную, а последние 4-е - биоразлагаемую. После чего каждая из частей тестируемых образцов, входящая в состав контрольной либо биоразлагаемой выборки, была помещена в отдельную пробирку и залита 3 мл СЖПС (в случае контрольной выборки) либо ИТС, приготовленной описанным выше способом (в случае биоразлагаемой выборки). Затем все пробирки закрывались герметичными пробками (поскольку наличие кислорода не является принципиально необходимым для развития E.coli), ставились в термостат и инкубировались в нем в течение 9-и суток при 30±0,1°С. При этом через каждые сутки такой инкубации в каждой из пробирок, содержащих тестируемые образцы, производилась замена 40% ИТС на СЖПС.
После окончания инкубации все образцы доставались из пробирок, промывались и высушивались. После чего у всех частей исследуемых образцов (включая исходные, не подвергавшиеся инкубации), а также у исходных частей эталонного образца (в качестве которого в данном случае был выбран 100% ПВХ) с помощью текстуромера «ТА.ХТ+» производилось измерение прочности на прокалывание (σ, МПа). И на основании анализа изменения о у биоразлагаемой выборки тестируемых образцов относительно контрольной, а также относительно эталонных образцов, определялись 4-е коэффициента деградации тестируемых образцов (общий и три «частных» его составляющих, обусловленных исходной малой механической прочностью тестируемого образца, а также взаимодействием оного образца с влагой и с тестовыми микроорганизмами), и делался общий вывод о причинах и степени устойчивости исследуемых образцов к различным видам деградации. Результаты проведенных измерений и расчетов приведены в таблице 1.
Коэффициенты деградации, приведенные в данной таблице, рассчитывались по следующим формулам:
ОР
Б
Э
Э
К=100×(σ-σ)/σ - общий коэффициент разлагаемости (отражающий изменение прочности тестируемых образцов после инкубирования их в ЖПС с тестовыми микроорганизмами относительно исходной прочности эталонных образцов);
МР
И
Э
Э
К=100×(σ-σ)/σ - коэффициент механоразлагаемости (обусловленной различными механическими воздействиями на тестируемые образцы), отражающий изменение исходной прочности тестируемых образцов относительно исходной прочности эталонных образцов;
ХР
К
И
И
К=100×(σ-σ)/σ - коэффициент хеморазлагаемости (обусловленной взаимодействием тестируемых образцов с водой и другими химическими компонентами, содержащимися в стерильной ЖПС), отражающий изменение прочности тестируемых образцов после инкубирования их в стерильной ЖПС относительно исходной прочности тех же образцов;
БР
Б
К
К
К=100×(σ-σ)/σ - коэффициент биоразлагаемости (обусловленной взаимодействием тестируемых образцов с тестовыми микроорганизмами), отражающий изменение прочности тестируемых образцов после инкубирования их в ЖПС с тестовыми микроорганизмами относительно прочности образцов того же материала после инкубирования их в стерильной ЖПС.
Э
И
В качестве эталонного материала в данном случае был взят 100% ПВХ (соответственно σ=σ для 100% ПВХ).
И на основании приведенных данных были сделаны следующие выводы:
ОР
ОР
ОР
ОР
ОР
ОР
Исходя из величины К, для всех тестируемых ПВХ-материалов с добавками была характерна существенно большая степень общей разлагаемости, чем для чистого ПВХ. Причем наибольшую степень разлагаемости среди исследованных материалов имели образцы с 10% добавкой крахмала (К=-82% относительно К=-4% у чистого ПВХ), после которых в порядке уменьшения степени разлагаемости следовали образцы с 10 и 5% добавками бентонита (К=-64% и -58% соответственно), образцы с 1% добавкой ZnO (К=-59%) и образцы с 1% добавкой крахмала (К=-44%).
МР
Однако, в основном, высокая разлагаемость исследуемых образцов с добавками была обусловлена их значительно меньшей исходной устойчивостью к механическим воздействиям, по сравнению с чистым ПВХ (при этом, исходя из значений К, наименьшую исходную механическую прочность имели образцы с 10% крахмала и бентонита, после которых в порядке увеличения исходной механопрочности следовали образцы с добавками 5% бентонита, 1% ZnO и 1% крахмала).
ХР
При том, что устойчивость к воздействию влаги у всех исследованных образцов была весьма высокой (К от 0 до -7%). ПВХ образцы без добавок и с 1% ZnO уменьшали свою механическую прочность в результате взаимодействия с тестовыми микроорганизмами в течение времени анализа всего на 4 и 6% соответственно. ПВХ образцы с добавками 1 и 10% крахмала в результате взаимодействия с тестовыми микроорганизмами в течение времени анализа уменьшали свою механическую прочность на 10 и 20% соответственно. А ПВХ образцы с добавками 5 и 10% природного бентонита в результате взаимодействия с тестовыми микроорганизмами в течение времени анализа даже наоборот, увеличивали свою механическую прочность на 14 и 30% соответственно.
Таким образом, заявляемый способ может обеспечить быструю, объективную, и информативную оценку устойчивости тестируемых образцов к различным видам деградации (включая деградацию, индуцируемую действием на тестируемые образцы механических факторов, влаги, а также тестовых микроорганизмов) и может найти применение, в частности, при оценке свойств уже существующих, а также разработке новых изделий и материалов, для которых желательна повышенная либо пониженная устойчивость к воздействию механических нагрузок, влаги, а также жизнеспособных микроорганизмов.