СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ IN VITRO В ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОМ НАПРАВЛЕНИИ
METHOD OF STIMULATING LIVER STEM CELL DIFFERENTIATION IN VITRO IN TISSUE-SPECIFIC DIRECTION

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении.
Известно большое количество способов стимуляции in vitro клеток-предшественников различных классов [1-4].
Наиболее близким по техническому результату прототипом является способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток в печеночном направлении с помощью фактора роста гепатоцитов, получаемого генно-инженерным методом [5].
Недостатком данного способа является его недоступность для широкого использования, связанная с высокой стоимостью фактора роста гепатоцитов [6], а также недостаточная эффективность способа.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа и доступности его использования.
Поставленная задача решается тем, что клетки печени в условиях in vitro подвергают в течение 10 минут воздействию питательной среды, содержащей 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Новым в предлагаемом изобретении является применение для стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Многие заболевания печени зачастую не поддаются лечению существующими медикаментозными средствами. Данное обстоятельство указывает на актуальность разработки новых гепатопротекторов. При этом наиболее перспективным является создание препаратов, способных оказывать влияние на стволовые клетки (СК) [7, 8].
Для изучения закономерностей функционирования клеток-предшественников печени и исследования механизмов их регуляции с целью создания патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний печени используют различные экспериментальные способы культивирования клеточного материала in vitro. Для эффективного культивирования и стимуляции пролиферативно-дифференцировочных потенций СК необходимым условием является добавление в питательную среду факторов роста, которые значительно повышают эффективность клонирования клеток-предшественников [1-4]. При этом СК печени представляют собой гетерогенную популяцию элементов, которые способны давать начало не только тканеспецифичным, но и другим клеточным типам [8]. Данное обстоятельство с целью адекватной трактовки получаемых в экспериментах in vitro результатов требует использования специализированных ростовых факторов, позволяющих регистрировать образование лишь паренхиматозных СК печени. Кроме того, стимуляция развития СК в тканеспецифическом направлении является важным фактором, облегчающим изучение процессов их жизнедеятельности. На сегодняшний день в экспериментах in vitro наиболее часто для стимуляции дифференцировки СК печени в тканеспецифичном направлении используют дорогостоящий генно-инженерный фактор роста гепатоцитов [5], который, несмотря на свое название, является плейотропным фактором, действующим в отношении прогениторных клеток различных классов.
Вместе с тем известна возможность стимуляции стволовых клеток костного мозга с помощью иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (гиалуронидазы) [9] за счет образования под ее влиянием in situ низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты, повышающих интенсивность процессов клеточного деления [9, 10].
Однако способность гиалуронидазы оказывать прямое влияние на стволовые клетки печени, заключающееся в стимуляции их дифференцировки в тканеспецифичном направлении, не известна.
Факт применения иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции in vitro дифференцировки стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении, для специалиста не является очевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Взвесь клеток печени лабораторных животных (мышей) помещают на 10 минут в питательную среду, содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 26 шт. массой 18-20 г, которые получены из питомника экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Пример 1
У мыши линии CBA/CaLac массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали печень. Печень отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем ее помещали в гомогенизатор с питательной средой DMEM и гомогенизировали до получения однородной клеточной взвеси. После этого клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клеточный материал поместили на 10 минут в среду DMEM (“Serva”, ФРГ), содержащую 2 ЕД/мл иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск).
5
2
2
Для регистрации процессов дифференцировки СК использовали культуральные методы. Для этого клетки, обработанные веществом, дважды отмыли центрифугированием и помещали их в концентрации 10/мл в среду следующего состава: 90% среды DMEM (“Serva”, ФРГ), 10% ЭТС («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 5000 МЕ/л гепарина (“Biochemie“, Австрия), 5 мг/л свиного многокомпонентного инсулина (“Novo Nordisk“, Дания). По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещали в 24-луночные планшеты («Corning», США) в CO-инкубаторе при 37°C, 5% CO и 100% влажности воздуха и инкубировали 20 сут. После этого в 20-ти суточных культурах регистрировали рост паренхиматозных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) [4] и фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) [1]. Подсчет проводили под инвертированным микроскопом «Axio Observer A.1» (Carl Zeiss, Германия). Под КОЕ-Печ подразумевали круглое либо неправильной формы неприлипающее образование, содержащее более 30 клеток, под КОЕ-Ф - прилипшее образование из 30 и более фибробластоподобных клеток. Морфологический контроль проводили путем изучения под иммерсией препаратов, окрашенных азур II-эозином в течение 30-40 мин.
Для сравнения эффективности заявляемого способа со способом-прототипом дополнительно использовали культуру клеток печени (не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой) в среде того же состава, но с добавлением 20 нг/мг фактора роста гепатоцитов («Sigma», США).
В ходе эксперимента наблюдалась значительная стимуляция роста КОЕ-Печ при добавлении в культуру клеток, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, фактора роста гепатоцитов (табл.). При этом значение показателя составляло 255,6% от контроля. Полученные результаты свидетельствовали об активации процессов дифференцировки СК под влиянием данного фактора в тканеспецифичном направлении [5].
Изучение изменения роста КОЕ-Печ из клеток, обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, также выявило существенное возрастание их количества (таблица). Причем величина исследуемого параметра достоверно превышала таковую в случае стимуляции процессов дифференцировки СК по способу-прототипу.
Более того, при изучении культур ткани печени было обнаружено, что внесение в питательную среду фактора роста гепатоцитов в меньшей степени, чем преинкубация клеток в растворе иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы снижает рост стромальных колоний (КОЕ-Ф). Данный феномен в совокупности с вышеприведенными результатами (падение выхода КОЕ-Ф на фоне резкого увеличения образования КОЕ-Печ) подтверждает тот факт, что использование предлагаемого изобретения приводит к стимуляции дифференцировки мультипотентных стволовых клеток печени [11, 12] в паренхиматозном направлении.
Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать дифференцировку стволовых клеток печени в тканеспецифичном направлении в условиях in vitro.
Цитируемая литература
1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
2. Патент (RU) на изобретение №2308280 «Способ клонирования in vitro регионарных клеток-предшественников сердца», 2007 г. (опубл. 20.10.2007., Бюл. №.29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
3. Патент (RU) на изобретение №2308281 «Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы», 2007 г. (опубл. 20.10.2007. Бюл. №29). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
4. Патент (RU) на изобретение №2295971 «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита», 2007 г. (опубл. 27.03.2007 г., Бюл. №9). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др.
5. Liu WH, Tao KS, You N, Liu ZC, Zhang HT, Dou KF. Differences in the properties and mirna expression profiles between side populations from hepatic cancer cells and normal liver cells // PLoS One. 2011; 6 (8):e23311.
6. Каталог SIGMA-ALDRICH 2004/2005.
7. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы. // Наука в России. - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С.4-8.
8. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.
9. Патент (RU) на изобретение №2405822 «Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме» (опубл. 10.12.2010, Бюл. №34). Авторы: Артамонов А.В., Бекарев А.А., Верещагин Е.И. и др.
10. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы. // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.
11. Fausto N. Oval cells and liver carcinogenesis: an analysis of cell lineages in hepatic tumors using oncogene transfection techniques. Prog. Clin. Biol. Res.1990; 331:325-34.
12. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liver regeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143(6):1606-20.
Рост КОЕ-Печ и КОЕ-Ф в культуре клеток печени, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (1), в культуре клеток печени, не обработанных иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой, при добавлении фактора роста гепатоцитов (2) и в культуре клеток печени, подвергшихся воздействию иммобилизированной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы (3) (X±m)
Группы
КОЕ-Печ, на 100 тыс. нуклеаров
КОЕ-Ф, на 100 тыс. нуклеаров
1
7,63±0,38
3,47±0,15
2
19,5±0,94*
1,98±0,06*
3
23,27±1,1*
1,23±0,07*
#
#
* - отмечена достоверность различий с показателями в 1 группе при p<0,05.
# - отмечена достоверность различий с показателями между 2 и 3 группами при p<0,05.