СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА
METHOD FOR PRODUCING LOW-MOLECULAR CHITOSAN

Изобретение относится к области получения хитина и его производных, а именно к способам получения низкомолекулярного хитозана.
7
С целью получения гомологов с заданной степенью полимеризации используют различные способы физической или химической деструкции исходных высокомолекулярных гликанов. К первой группе способов относится деструкция под действием различных видов излучения высокой энергии. Изучена кинетика фрагментации хитозана под действием импульсов лазерного излучения; применены методы вискозиметрии и ВЭЖХ. Выход разрывов полимерных цепей возрастает с ростом ММ хитозана (фрагментация крупных молекул). Полидисперсность образующегося полимерного материала возрастает с увеличением длительности облучения. Насыщение растворов кислородом мало влияет на выход разрывов. Фрагментация хитозана определяется процессами фотопоглощения при минимальном влияния окисления (Патент РФ №2263681, МПК С08В 37/08, 2005).
Основной недостаток этих методов заключается в протекании побочных реакций окисления, декарбоксилирования, сопровождающихся дезаминированием, деструкцией пиранозных циклов структуры звеньев полимера. Деструкция гликозидных центров в кислой среде имеет также ряд недостатков, таких как сложность управления процессом, очистки образующихся низкомолекулярных полимергомологов.
3
Разработан способ получения водорастворимых гомологов хитозана, который включает обработку хитозана в кислых средах. В качестве кислой среды используют паровую дисперсию вода - кислота. Применяют пары водного раствора одноосновной кислоты, в качестве последней применяли HCl, НСООН, СНСООН (Гизатулина Г.А. Деполимеризация хитина и хитозана при кислотном гидролизе/ Г.А.Гизатулина, В.Ю.Новиков, И.Н.Коновалова // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Восьмой Международной конференции. // Казань, 12-17 июня 2006 г. - С.27).
Кислотная деполимеризация зависит от начальной степени деацетилирования хитина. Рост степени деацетилирования приводит к увеличению количества деацетилированных олигомеров, значительно более устойчивых в кислой среде, чем ацетилированные продукты; выход мономеров при этом снижается (ВЭЖХ продуктов гидролиза хитина и хитозана). Концентрация кислоты оказывает сильное действие на скорость гидролиза. Отмечено резкое падение ММ при рН 5 в сравнении с рН 7 (продолжительность гидролиза 30 мин) (Выделение и очистка высокоактивных фракций низкомолекулярного хитозана /П.А.Кузнецов и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых. // Щелково, 5-6 октября 2004 г. - С.124-128).
Достаточное распространение получил также способ ферментативного гидролиза хитозанов с использованием специфических хитинолитических ферментов, действие которых селективно направлено на деструкцию β-1,4 межзвеньевой связи. Этому способу свойственна сложность управления процесса, кроме того, образующиеся гомологи, предназначенные в качестве сырья фармако-химической технологии, требуют особых приемов для очистки от использованных биокатализаторов (Разделение хитоолигосахаридов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и тонкослойной хроматографии / Fang Zi a.o. // Period. Ocean Univ. - 2005. - V.35, N 1. - P.113-115; Xia Wen-Shui. Успехи в области исследования и получения хитоолигосахаридов / Xia Wen-Shui, Wei Xin-Lja // J. Appl. Chem. - 2004. - V. 21, N 4. - P.332-337; Tsaih Min Lamg. Влияние удаления мелких фрагментов с помощью ультрафильтрации при ультразвуковой обработке на кинетику хитозана/ Tsaih Min Lamg, Tseng Lan Zang, Chen Rong Huei // Polim. Degrad. and Stab. - 2004. - V.86, N 1. -P. 25-32; патент РФ №2073016, МПК С08В 37/08, 1997).
Известен способ получения низкомолекулярного хитозана, растворимого в щелочных условиях, по которому хитозан растворяют в водном растворе кислоты с последующим добавлением к полученному раствору хитозана раствора щелочи, рН 7,0-8,0, после чего выпавший в осадок хитозан удаляют из раствора, а низкомолекулярный хитозан остается в растворе или лиофильно высушивается (заявка РФ №2008113410, С08В 37/08, 2009).
Известен способ получения низкомолекулярного хитозана кислотным гидролизом хитозана с помощью азотистой кислоты (Allan G.G., Ryan C.A. // Carbohydr. Res. 1995. V.277. N2. - P.257-272).
Однако в этом случае трудно получить целевой продукт с молекулярной массой ниже 20 кДа и процесс сопровождается частичным дезаминированием полисахарида и соответственно приводит к изменению его свойств.
Известен способ получения низкомолекулярного хитозана путем обработки водной суспензии 3 мас.% свежеосажденного хитозана при рН 6,9-7,5 перекисью водорода (пероксидом водорода), 0,1 мас.%, при 85°С в течение 32 мин, после фильтрации и трехкратной промывки активизируют в реакторе с дисковой мешалкой (патент РФ №2144040, МПК С08В 37/08, А61К 31/722, 1998).
Известен способ получения хитозана с СД 80-85% и требуемой величиной ММ путем обработки водной суспензии хитозана с исходной ММ 300-600 кДа перекисью водорода и способ получения деструктурированного хитозана ММ 80 кДа, СД 68-72% из свежепереосажденного хитозана (патент РФ №2215749, МПК С08В 37/08, А61К 31/722, 2003). К 5,5 мас.% суспензии, загруженной в эмалированный или стеклянный реактор и разбавленной деминерализованной водой до концентрации 3 мас.%, нагретой до температуре не выше 80°С, добавляют перекись водорода в расчете 0,15 мас.% от общего веса суспензии и при интенсивном перемешивании выдерживают в течение 25 мин, затем фильтруют, промывая холодной деминерализованной водой, и отжимают.
Данные способы получения низкомолекулярного хитозана реализуются в гетерогенных условиях, т.е. в условиях присутствия взвешенных частиц в растворе.
Технический результат заключается в проведении процесса получения низкомолекулярного хитозана в гомогенных условиях, т.е. в условиях отсутствия взвешенных частиц в растворе, что обеспечивает меньшую степень полидесперсности и композиционной неоднородности конечного продукта.
Технический результат достигается тем, что способ получения низкомолекулярного хитозана включает приготовление раствора высокомолекулярного хитозана в 1% водной уксусной кислоте, прибавление к нему раствора перекиси водорода в количестве 0,5-1,5 мас.% к общей массе раствора в присутствии каталитических количеств оксида марганца (IV), выдерживание при температуре 18-50°С в течение 30 мин, добавление по окончании времени реакции водного раствора аммиака, доводя рН реакционной смеси до 6,9-7,0, после выпадения осадка в реакционную массу прибавляют ацетон и выдерживают в течение 2 часов, осадок отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и ацетоном, сушат.
2
2
Изучена деструкция высокомолекулярного хитозана HO с целью получения полимергомологов со степенью полимеризации от 6 до 1000 аминоглюкозных единиц и сохранением СД более 90%.
2
2
На фиг.1 представлена зависимость молекулярной массы хитозана от концентрации НО (концентрация полимера 2 мас.%, 50°С, время реакции 30 мин).
2
2
На фиг.2 представлена зависимость молекулярной массы хитозана от температуры (концентрация полимера 2 мас.%, время реакции 30 мин, концентрация HO 1,5 мас.%).
2
2
В таблице 1 приведена зависимость молекулярной массы и выхода низкомолекулярного хитозана от концентрации HO (70°С).
В таблице 2 приведена зависимость молекулярной массы хитозана от температуры (концентрация полимера 2 мас.%, время реакции 30 мин).
2
2
2
2
Важнейшим параметром, определяющим степень деструкции высокомолекулярного хитозана соответственно и молекулярную массу конечного продукта, является концентрация НОв реакционной среде. Исследования проводились при постоянной температуре 50°С. Из фиг.1 видно, что с увеличением концентрации пероксида водорода молекулярная масса снижается. Однако по мере повышения концентрации HO происходит увеличение степени дисперсности целевого продукта, о чем свидетельствует расширение величин молекулярных масс полимеров в серии параллельно выполненных при одинаковых условиях опытов.
Изучение влияния температуры на глубину протекания деструции исследовали в интервале 20-70°С. Установлено, что более перспективным параметром, позволяющим в большей степени регулировать молекулярную массу образующихся полимергомологов, является температура. Как видно из фиг. 2, с ростом температуры при постоянстве остальных параметров реакции, молекулярная масса снижается. Причем величина молекулярной массы полимеров, полученных в серии параллельных опытов, изменяется в пределах 5-10%, что соответствует ошибке эксперимента.
Использование каталитических количеств оксида марганца (IV) позволяет существенно ускорить процесс окислительной деструкции β-1-4 гликозидных связей макромолекул хитозана за счет того, что в его присутствии активно идет разложение перекиси водорода и, как следствие, атомарный кислород, выделяющийся в процессе, обеспечивает более глубокую деструкцию при более низких температурах. Установлено, что в присутствии каталических количеств оксида марганца (IV) удается при температуре 18°С получать низкомолекулярные гомологи хитозана заданной молекулярной массы при прочих равных условиях, не используя нагревание до более высоких температур.
2
2
Наиболее надежным и удобным методом остановки процесса деполимеризации хитозана является физическое удаление HO: фазовое разделение, экстракция. Фазовое состояние продуктов гидролиза может быть различным (суспензия или раствор). Этот метод реализуется при получении гомологов хитозана со степенью полимеризации более 30.
Отличительной особенностью предложенного способа деструкции хитозана является использование водного раствора аммиака, который при окислении его остатками пероксида водорода превращается в экологически безопасный молекулярный азот, а пероксид разлагается до воды и молекулярного кислорода.
Деструкция высокомолекулярного хитозана.
Пример 1
Синтез хитозана с молекулярной массой 30 кДа
В трехгорлую колбу на 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой, помещают 3 л 1,5 мас.% раствора хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты. Включают перемешивание и выдерживают в течение 10 минут при температуре окружающей среды (50°С). После этого с помощью капельной воронки прибавляют 46 мл 36,4% (0,5 мас.% к массе реакционной смеси) раствора перекиси водорода. Реакционную смесь выдерживают в течение 30 минут при неизменной температуре (18°С). По окончании в реакционную смесь приливают 120 мл водного раствора аммиака, сопровождающегося выпадением продукта в осадок. Для полного выделения продукта в реакционную смесь при перемешивании добавляют 300 мл ацетона и выдерживают в течение 2 часов. Осадок отфильтровывают через марлю на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, осадок промывают 500 мл дистиллированной воды, затем 200 мл ацетона. Осадок переносят в кристаллизатор тонким слоем и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С двое суток. Полученный продукт представляет собой спекшуюся твердую массу коричневого цвета.
Пример 2
Синтез хитозана с молекулярной массой 30 кДа
-5
В трехгорлую колбу на 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой помещают 3 л 1,5 мас.% раствора хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты. Включают перемешивание и выдерживают в течение 10 минут при температуре окружающей среды (18°С). После этого с помощью капельной воронки прибавляют 46 мл 36,4% (0,5 мас.% к массе реакционной смеси) раствора перекиси водорода. Затем прибавляют 0,0005 г (1,6·10 мас.% по отношению к общей массе раствора) оксида марганца (IV). Реакционную смесь выдерживают в течение 30 минут при неизменной температуре (18-20°С). По окончании в реакционную смесь приливают 120 мл водного раствора аммиака, сопровождающегося выпадением продукта в осадок. Для полного выделения продукта в реакционную смесь при перемешивании добавляют 300 мл ацетона и выдерживают в течение 2 часов. Осадок отфильтровывают через марлю на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, осадок промывают 500 мл дистиллированной воды, затем 200 мл ацетона. Осадок переносят в кристаллизатор тонким слоем и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С двое суток. Полученный продукт представляет собой спекшуюся твердую массу коричневого цвета.
Пример 3
Синтез хитозана с молекулярной массой 9 кДа
В трехгорлую колбу на 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой, помещают 3 л 1,5 мас.% раствора хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты. Включают перемешивание и выдерживают в течение 10 минут при температуре окружающей среды (50°С). После этого с помощью капельной воронки прибавляют 94 мл 36,4% (1,0 мас.% к массе реакционной смеси) раствора перекиси водорода. Реакционную смесь выдерживают в течение 30 минут при неизменной температуре (18°С). По окончании в реакционную смесь приливают 135 мл водного раствора аммиака, сопровождающегося выпадением продукта в осадок. Для полного выделения продукта в реакционную смесь при перемешивании добавляют 300 мл ацетона и выдерживают в течение 2 часов. Осадок отфильтровывают через марлю на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, осадок промывают 500 мл дистиллированной воды, затем 200 мл ацетона. Осадок переносят в кристаллизатор тонким слоем и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С двое суток. Полученный продукт представляет собой спекшуюся твердую массу коричневого цвета.
Пример 4
Синтез хитозана с молекулярной массой 9 кДа
-5
В трехгорлую колбу на 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой помещают 3 л 1,5 мас.% раствора хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты. Включают перемешивание и выдерживают в течение 10 минут при температуре окружающей среды (18°С). После этого с помощью капельной воронки прибавляют 94 мл 36,4% (1,0 мас.% к массе реакционной смеси) раствора перекиси водорода. Затем прибавляют 0,0005 г (1,6·10 мас.% по отношению к общей массе раствора) оксида марганца (IV). Реакционную смесь выдерживают в течение 30 минут при неизменной температуре (18°С). По окончании в реакционную смесь приливают 135 мл водного раствора аммиака, сопровождающегося выпадением продукта в осадок. Для полного выделения продукта в реакционную смесь при перемешивании добавляют 300 мл ацетона и выдерживают в течение 2 часов. Осадок отфильтровывают через марлю на воронке Бюхнера с использованием водоструйного насоса, осадок промывают 500 мл дистиллированной воды, затем 200 мл ацетона. Осадок переносят в кристаллизатор тонким слоем и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С двое суток. Полученный продукт представляет собой спекшуюся твердую массу коричневого цвета.
Пример 5
Синтез хитозана с молекулярной массой 3 кДа
В четырехгорлую колбу на 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником, капельной воронкой, термометром, помещают 3 л 1,5 мас.% раствора хитозана в 1% водном растворе уксусной кислоты. Включают перемешивание и нагревают смесь до температуры 50°С. После этого с помощью капельной воронки прибавляют 130 мл 36,4% (1,5 мас.% к массе реакционной смеси) раствора перекиси водорода. Реакционную смесь выдерживают в течение 30 минут при температуре 50°С. По окончании в реакционную смесь приливают 150 мл водного раствора аммиака, сопровождающегося выпадением продукта в осадок. Для полного выделения продукта в реакционную смесь при перемешивании добавляют 300 мл ацетона и выдерживают в течение 2 часов. Полученную реакционную массу оставляют на сутки для отстаивания, верхний жидкий слой декантируют. В полученную гелеобразную массу приливают 200 мл ацетона и после перемешивания дают отстояться в течение 5 часов. После выделения твердой массы жидкую фазу отделяют декантацией. Полученный продукт представляет собой густую гелеобразную массу белого цвета.
Таблица 1
Способ получения низкомолекулярного хитозана
№
СД хитозана, %
Конц. Н<sub>2</sub>O<sub>2</sub> в системе, %
Выход, %
ММ, кДа
1
90
5.7
72
1.0
2
90
5.1
73
1.0
3
90
4.7
78
1.0
4
90
4.2
78
1.0
5
90
4.1
75
1.2
6
90
2.0
80
1.4
7
90
1.5
81
1.6
8
90
1.3
84
1.7
9
90
1.1
82
1.8
10
90
1.0
79
2.0
11
90
0.9
84
1.8
12
90
0.8
85
2.0
13
90
0.7
81
1.9
14
90
0.6
86
2.3
15
90
0.5
85
2.5
16
90
0.4
77
3.0
17
90
0.3
83
3.6
18
90
0.25
85
5.0
19
90
0.2
87
6.0
20
90
0.15
87
18.0
21
90
0.1
85
20.0
22
90
0.05
83
27.0
Таблица 2
Способ получения низкомолекулярного хитозана
№
СД хитозана, %
Конц. Н<sub>2</sub>O<sub>2</sub> в системе, %
Выход, %
ММ, кДа
1
90
5.7
72
1.0
2
90
5.1
73
1.0
3
90
4.7
78
1.0
4
90
4.2
78
1.0
5
90
4.1
75
1.2
6
90
2.0
80
1.4
7
90
1.5
81
1.6
8
90
1.3
84
1.7
9
90
1.1
82
1.8
10
90
1.0
79
2.0
11
90
0.9
84
1.8
12
90
0.8
85
2.0
13
90
0.7
81
1.9
14
90
0.6
86
2.3
15
90
0.5
85
2.5
16
90
0.4
77
3.0
17
90
0.3
83
3.6
18
90
0.25
85
5.0
19
90
0.2
87
6.0
20
90
0.15
87
18.0
21
90
0.1
85
20.0
22
90
0.05
83
27.0