ИЗОЛИРОВАННАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СПОСОБНЫЙ СВЯЗЫВАТЬ ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ (VEGF), СЛИТЫЙ ПОЛИПЕПТИД, РЕПЛИЦИРУЕМЫЙ ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛИТОГО ПОЛИПЕПТИДА, ЛОВУШКА VEGF, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И НАБОР ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ VEGF-ОПОСРЕДОВАННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ СОСТОЯНИЯ
ISOLATED MOLECULE OF NUCLEIC ACID, WHICH CODES FUSED POLYPEPTIDE THAT IS ABLE TO BIND VESSEL ENDOTHELIOCYTES GROWTH FACTOR (VEGF), FUSED POLYPEPTIDE, COPIED EXPRESSIVE VECTOR, METHOD FOR PRODUCTION OF FUSED POLYPEPTIDE, TRAP OF VEGF, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, METHOD FOR TREATMENT AND SET FOR TREATMENT OF VEGF-MEDIATED DISEASE OR CONDITION

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к слитым полипептидам, способным связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF), представителей семейства VEGF и варианты сплайсинга с конкретными требуемыми характеристиками, а также к терапевтическим способам применения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
X
Y
В первом аспекте отличительным признаком изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, содержащий компоненты рецепторов (R1R2) и/или (R1R3), где R1 означает компонент рецептора фактора роста эндотелиальных клеток сосудов (VEGF) в виде Ig-домена 2 Flt-1 (Flt1D2), R2 означает компонент рецептора VEGF в виде Ig-домена 3 Flk-1 (Flk1D3) и R3 означает компонент рецептора VEGF в виде Ig-домена 3 Flt-4 (Flt1D3 или R3) и где Х≥1 и Y≥1.
X
Y
X
X
Y
В связанном втором аспекте отличительным признаком изобретения является мономерная ловушка VEGF или слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3), где X≥1, Y≥1 и R1, R2 и R3 имеют значения, определенные выше. Компоненты рецептора VEGF R1, R2 и R3 могут быть непосредственно связаны друг с другом или связаны посредством одной или нескольких спейсерных последовательностей. В одном конкретном варианте мономерная ловушка VEGF представляет собой (R1R2), где X=2. В более конкретном варианте мономерной ловушкой VEGF является SEQ ID NO: 24 или ее функционально эквивалентный аминокислотный вариант. Изобретение относится к мономерной ловушке VEGF, главным образом состоящей из компонентов рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3) и их функционально эквивалентных аминокислотных вариантов.
X
Y
X
Y
В третьем аспекте отличительным признаком изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3) и компонент, являющийся партнером в слиянии (FP), выбранный из группы, состоящей из мультимеризующего компонента (MC), сывороточного белка или молекулы, способной связывать сывороточный белок. В предпочтительном варианте FP является мультимеризующим компонентом (MC), способным взаимодействовать с мультимеризующим компонентом в другом слитом полипептиде с образованием мультимерной структуры, например димера или тримера. Наиболее предпочтительно MC выбран из группы, состоящей из (i) мультимеризующего компонента, содержащего расщепляемую область (C-область), (ii) укороченного мультимеризующего компонента, (iii) аминокислотной последовательности длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, имеющей по меньшей мере один остаток цистеина, (iv) лейциновой молнии, (v) мотива спиральной петли, (vi) coil-coil мотива и (vii) домена иммуноглобулина. Кроме того, предлагаются слитые полипептиды, по существу состоящие из (R1R2) и/или (R1R3) и FP. В предпочтительном варианте слитый полипептид по существу состоит из
X
(R1R2) и MC.
X
Y
X
X
X
X
В четвертом аспекте отличительным признаком изобретения является слитый полипептид, содержащий компоненты рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3) и FP, которые описаны выше. Компоненты рецептора могут быть расположены в разном порядке, например (R1R2)-FP; (R1R2)-FP-(R1R2); FP-(R2R1) и т.д. Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или связаны посредством спейсерной последовательности.
X
Y
В пятом аспекте отличительным признаком изобретения является ловушка VEGF, содержащая мультимер из двух или более слитых полипептидов, состоящих из компонентов рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3) и FP, где компонент FP является мультимеризующим компонентом (MC), содержащим C-область. C-область может быть природного происхождения или искусственной и может находится в любой точке в мультимеризующем компоненте и функционирует, обеспечивая расщепление исходного MC до укороченного MC. Ловушка VEGF, состоящая из двух или более слитых полипептидов, имеющих по меньшей мере один укороченный MC, называется «укороченной миниловушкой».
2
C-область может быть создана в MC посредством инсерции, делеции или мутации так, чтобы был создан ферментативно или химически расщепляемый сайт. C-область может быть создана в любом MC и в любом положении в MC; предпочтительно C-область создают в полноразмерном домене Fc или его фрагменте или домене CH3. C-область может быть сайтом, расщепляемым ферментом, таким как тромбин, фицин, пепсин, матрилизин или пролидаза, или расщепляемым химически, например, муравьиной кислотой или CuCl.
X
Y
В шестом связанном аспекте отличительным признаком изобретения является укороченная миниловушка VEGF, которая является мультимерным белком, содержащим два или более слитых полипептида, состоящих из (R1R2) и/или (R1R3) и мультимеризующего компонента, который укорочен расщеплением исходного MC, содержащего C-область (tMC).
X
Y
В седьмом аспекте отличительным признаком изобретения является слитый полипептид, состоящий из компонентов рецептора VEGF (R1R2) и/или (R1R3) и MC, где MC представляет собой аминокислотную последовательность длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина, где по меньшей мере один остаток цистеина способен образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в MC другого слитого полипептида (cMC). В предпочтительном варианте cMC представляет собой аминокислотную последовательность длиной 1-50 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина. В более предпочтительном варианте cMC является аминокислотной последовательностью длиной 1-15 аминокислот, содержащей по меньшей мере один остаток цистеина. В еще более предпочтительном варианте cMC представляет собой аминокислотную последовательность длиной 1-10 аминокислот, содержащую 1-2 остатка цистеина. Иллюстрация данного варианта изобретения показана в SEQ ID NO: 27, имеющей сигнальную последовательность (1-26), за которой следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231), и далее следует последовательность из девяти аминокислот, заканчивающаяся остатком цистеина. В другом варианте, показанном в SEQ ID NO:28, за сигнальной последовательностью (1-26) следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231), за которыми следует последовательность из шести аминокислот, заканчивающаяся остатком цистеина.
X
Y
В восьмом аспекте отличительным признаком изобретения является миниловушка VEGF, содержащая мультимер из двух или более слитых полипептидов, состоящих из (R1R2) и/или (R1R3) и cMC. В более конкретном варианте миниловушка является димером. Иллюстрацией данного варианта миниловушки согласно изобретению является димер слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 2, в котором каждый слитый полипептид (R1R2-cMC) имеет молекулярную массу 23,0 кДа и pI 9,22.
В другом варианте cMC имеет 4 аминокислоты в длину и включает два остатка цистеина, например XCXC (SEQ ID NO: 3). В одном иллюстративном примере данного варианта изобретения миниловушка состоит из компонентов рецептора VEGF согласно изобретению и cMC состоит из ACGC (SEQ ID NO: 4). Одним иллюстративным примером данного варианта миниловушки согласно изобретению является димер слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 5, в котором каждый мономер имеет молекулярную массу 23,2 кДа и pI 9,22. Другой иллюстративный пример данного варианта изобретения показан в SEQ ID NO: 26, имеющей сигнальную последовательность (1-26), за которой следуют компоненты R1 (27-129) и R2 (130-231) с последующей последовательностью из девяти аминокислот, заканчивающейся CPPC.
X
Во всех вариантах ловушки VEGF согласно изобретению (включая укороченную миниловушку VEGF, миниловушки VEGF и мономерные миниловушки VEGF) сигнальная последовательность (S) может быть включена в начале (или на N-конце) слитого полипептида согласно изобретению. Сигнальная последовательность может быть нативной для клетки, рекомбинантной или синтетической. Если сигнальная последовательность связана с N-концом первого рецепторного компонента, то слитый полипептид может быть обозначен, например, как S-(R1R2).
Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством спейсеров. В конкретных вариантах один или несколько рецепторных компонентов и/или компонентов, являющихся партнерами в слиянии, в слитом полипептиде непосредственно связаны друг с другом без спейсеров. В других вариантах один или несколько рецепторных компонентов и/или компонентов, являющихся партнерами в слиянии, связаны посредством спейсеров.
Изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включая экспрессирующие векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с последовательностью регуляции экспрессии. Изобретение, кроме того, относится к системам хозяин-вектор для получения слитого полипептида, которые содержат экспрессирующий вектор в подходящей клетке-хозяине; к системам хозяин-вектор, в которых подходящей клеткой-хозяином является бактериальная, дрожжевая клетка, клетка насекомых, клетка млекопитающих; клетка E. coli или клетка COS или CHO. Кроме того, предлагаются ловушки VEGF согласно изобретению, модифицированные ацетилированием или пэгилированием. Способы ацетилирования или пэгилирования белка хорошо известны в данной области.
В связанном девятом аспекте отличительным признаком изобретения является способ получения ловушки VEGF согласно изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, трансфицированной вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению, в условиях, подходящих для экспрессии белка клеткой-хозяином, и извлечение полученного таким образом слитого полипептида.
Ловушки VEGF согласно изобретению терапевтически применимы для лечения любого заболевания или состояния, которое улучшается, становится ослабленным или подавленным при удалении, ингибировании или уменьшении количества VEGF. Неполный список конкретных состояний, улучшаемых при ингибировании или уменьшении количества VEGF, включает например нежелательное просачивание плазмы или проницаемость сосудов, нежелательный рост кровеносных сосудов, например, такой как в опухоли, отек, связанный с воспалительными заболеваниями, такими как псориаз или артрит, включая ревматоидный артрит; астму; генерализованный отек, связанный с ожогами; асцит и плевральный выпот, связанный с опухолями, воспалением или травмой; хроническое воспаление дыхательных путей; астму; синдром капиллярной утечки; сепсис; болезнь почек, связанную с повышенным просачиванием белка; аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDAC) и глазные заболевания, такие как связанная с возрастом дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия. Миниловушка VEGF, в частности, применима для лечения заболеваний глаз и как вспомогательное средство при операциях на глазах, включая операцию по поводу глаукомы; и лечения внутриглазных опухолей, например, таких как увеальная меланома, ретинобластома, посредством доставки в стекловидное тело.
Соответственно в десятом аспекте отличительным признаком изобретения является терапевтический способ лечения связанного с VEGF заболевания или состояния, включающий введение ловушки VEGF согласно изобретению субъекту, страдающему от связанного с VEGF заболевания или состояния. Хотя любое млекопитающее можно лечить терапевтическими способами согласно изобретению, субъектом предпочтительно является больной человек, страдающий или подверженный риску развития состояния или заболевания, которое может быть улучшено, ослаблено, ингибировано или подвергнуто лечению ловушкой VEGF.
В одиннадцатом аспекте отличительным признаком изобретения являются способы диагностики и прогнозирования, а также наборы для выявления, количественного анализа и/или слежения за VEGF с использованием миниловушек согласно изобретению.
В двенадцатом аспекте отличительным признаком изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие ловушку VEGF согласно изобретению с фармацевтически приемлемым носителем. Такие фармацевтические композиции могут содержать ловушку из димерного слитого полипептида или нуклеиновые кислоты, кодирующие слитый полипептид. Миниловушки согласно изобретению находят конкретные применения при состояниях, при которых требуется ловушка VEGF с пониженным временем полужизни в сыворотке (например, более быстрый клиренс) и/или повышенным проникновением в ткани вследствие меньшего размера. Конкретные применения миниловушки VEGF включают, например, заболевания, при которых желательно локальное введение в конкретную ткань или клетку. Примерами такого состояния являются офтальмологические болезни глаза.
Другие объекты и преимущества станут очевидными при ознакомлении со следующим подробным описанием.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Перед тем как ознакомиться с описанием предлагаемых способов, следует понимать, что данное изобретение не ограничено описанными конкретными способами и экспериментальными условиями, как таковые способы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология применяется только с целью описания конкретных вариантов и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
В используемом в данном описании и прилагаемой формуле изобретения смысле формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст четко не диктует обратное. Таким образом, например, ссылка на «способ» включает один или несколько способов и/или стадий указанного в данном описании типа и/или тех, которые станут очевидными специалистам в данной области при чтении данного описания и т.д.
Если не оговорено особо, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой данное изобретение относится. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут быть использованы любые способы и вещества, сходные или эквивалентные веществам, указанным в данном описании, описаны предпочтительные способы и вещества. Все публикации, упоминаемые в данном описании, включены в него в виде ссылки, чтобы описать способы и/или вещества, в связи с которыми цитированы публикации.
Общее описание
Изобретение относится к ловушке VEGF, способной связывать и ингибировать активность VEGF, которая является мономером или мультимером одного или нескольких слитых полипептидов. Молекулы согласно изобретению связывают и ингибируют биологическую активность VEGF и/или физиологическую реакцию или ответ. Описание основанных на рецепторе VEGF антагонистических ловушек VEGF Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 7-8) и VEGFR1R2-FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10) смотри в PCT WO/0075319, содержание которой включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
X
Y
Миниловушка согласно изобретению меньше, чем полноразмерная ловушка, примерно 50-60 кДа по сравнению с 120 кДа исходной ловушки, и включает мономерные ловушки, состоящие главным образом из доменов рецепторов VEGF (R1R2), (R1R3) или их комбинаций, ловушки, образованные отщеплением части исходной мультимерной ловушки, имеющей компонент, являющийся партнером в слиянии, который представляет собой мультимеризующий компонент (MC), содержащий область расщепления (C-область); или связыванием остатка цистеина или аминокислотной последовательности, содержащей один или несколько остатков цистеина, с доменами рецепторного компонента или между доменами рецепторного компонента. В конкретных вариантах миниловушка согласно изобретению имеет молекулярную массу меньше 60 кДа, как измерено посредством SDS-ПААГ-анализа; более предпочтительно примерно 50 кДа; еще более предпочтительно примерно 20-30 кДа или примерно 25 кДа и способна связывать VEGF с аффинностью, сравнимой с полноразмерной исходной ловушкой, описанной в PCT/US00/14142.
Конструкции нуклеиновой кислоты и экспрессия
Настоящее изобретение относится к конструкции молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих отдельный слитый полипептид, способный связывать VEGF, или мультимерные ловушки VEGF. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут кодировать компоненты рецепторов дикого типа R1, R2 и/или R3 или их функционально эквивалентные варианты. Варианты аминокислотной последовательности рецепторных компонентов R1, R2 и/или R3 ловушек согласно изобретению также могут быть получены в результате создания мутаций в кодирующих молекулах нуклеиновых кислот. Такие варианты включают, например, делеции, или инсерции, или замены аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности R1, R2 и/или R3. Может быть осуществлена любая комбинация делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает способностью связывать и ингибировать VEGF.
Указанные молекулы нуклеиновых кислот встраивают в вектор, который способен экспрессировать слитый полипептид при введении в подходящую клетку-хозяина. Подходящие клетки-хозяева включают, но не ограничены указанным, клетки бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Можно применять любые способы, известные специалисту в данной области, для встраивания фрагментов ДНК в вектор, чтобы сконструировать экспрессирующие векторы, кодирующие слитый полипептид согласно изобретению, под контролем сигналов регуляции транскрипции/трансляции.
Экспрессия молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению может регулироваться второй последовательностью нуклеиновой кислоты так, чтобы молекулы экспрессировалась в хозяине, трансформированном молекулой рекомбинантной ДНК. Например, экспрессия может регулироваться любым промоторным/энхансерным элементом, известным в данной области. Промоторы, которые можно использовать для регуляции экспрессии химерных полипептидных молекул, включают без ограничения длинный концевой повтор (Squinto et al. (1991) Cell 65: 1-20); область раннего промотора SV40, промотор CMV, M-MuLV, промотор тимидинкиназы, регуляторные последовательности гена металлотионина; прокариотические экспрессирующие векторы, такие как промотор b-лактамазы или промотор tac (смотри также Scientific American (1980) 242: 74-94); промоторные элементы дрожжей или других грибов, такие как промотор Gal 4, ADH, PGK, промотор щелочной фосфатазы и области регуляции тканеспецифичной транскрипции, полученные из таких генов, как эластаза I.
Экспрессирующие векторы, способные реплицироваться в бактериальном или эукариотическом хозяине, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, используют для трансфекции хозяина и таким образом для управления экспрессией таких нуклеиновых кислот, чтобы получить слитый полипептид согласно изобретению, который образует ловушки, способные связываться с VEGF. Трансфицированные клетки могут временно или предпочтительно конститутивно и постоянно экспрессировать ловушки VEGF согласно изобретению.
Ловушки согласно изобретению могут быть очищены любым способом, который обеспечивает последующее образование стабильной биологически активной ловушки. Например, но не с целью ограничения, факторы могут быть извлечены из клеток либо в виде растворимых белков, либо в виде тел включения, из которых их можно экстрагировать количественно 8М гидрохлоридом гуанидиния и диализом (смотри, например, патент США No. 5663304). Чтобы дополнительно очистить факторы, можно использовать обычную ионообменную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, хроматографию с обращенной фазой или гель-фильтрацию.
Компоненты рецептора VEGF
Компоненты рецептора VEGF в миниловушках VEGF состоят из Ig-домена 2 Flt-1 (Flt1D2) (R1), Ig-домена 3 Flk-1 (Flk1D3) (R2) (вместе, R1R2), и/или R1 и Ig-домена 3 Flt-4 (Flt1D3) (R3) (вместе R1R3). Подразумевается, что термин «Ig-домен» Flt-1, Flt-4 или Flk-1 охватывает не только полный домен дикого типа, но также его варианты с инсерциями, делециями и/или заменами, которые по существу сохраняют функциональные свойства интактного домена. Специалисту в данной области без труда будет понятно, что могут быть получены многочисленные варианты указанных выше Ig-доменов, которые будут сохранять по существу такие же функциональные свойства, как и домен дикого типа.
1/2
Подразумевается, что термин «функциональные эквиваленты» при использовании со ссылкой на R1, R2 или R3, охватывает домен R1, R2 или R3 по меньшей мере с одним изменением, например делецией, присоединением и/или заменой, который сохраняет по существу такие же функциональные свойства, как и домен R1, R2 или R3 дикого типа, то есть по существу эквивалентное связывание с VEGF. Будет понятно, что могут быть сделаны различные аминокислотные замены в R1, R2 или R3, не отходя от сути изобретения в отношении способности указанных рецепторных компонентов связывать и инактивировать VEGF. Функциональные свойства ловушек согласно изобретению можно определить любым подходящим скрининговым анализом, известным в данной области для измерения требуемой характеристики. Примеры таких анализов описаны в экспериментальном разделе ниже, которые позволяют определять связывающие свойства ловушек для VEGF (Kd), а также время их полужизни в случае диссоциации комплекса ловушка-лиганд (T). Другие анализы, например изменение способности специфично связываться с VEGF, можно измерить в анализе связывания VEGF конкурентного типа. Модификации свойств белка, таких как термостабильность, гидрофобность, чувствительность к протеолитической деградации или тенденция к агрегации, могут быть измерены способами, известными специалистам в данной области.
Компоненты слитого полипептида могут быть непосредственно связаны друг с другом или могут быть связаны посредством спейсеров. В общем, термин «спейсер» (или линкер) означает одну или несколько молекул, например нуклеиновых кислот, или аминокислот, или непептидных остатков, таких как полиэтиленгликоль, которые могут быть встроены между одним или несколькими составляющими доменами. Например, спейсерные последовательности могут быть использованы для обеспечения требуемого представляющего интерес сайта между компонентами для облегчения обработки. Спейсер также может быть введен, чтобы усилить экспрессию слитого полипептида клеткой-хозяином, чтобы уменьшить стерические помехи, так чтобы компонент мог принимать свою оптимальную третичную структуру и/или соответствующим образом взаимодействовать со своей молекулой-мишенью. Спейсеры и способы идентификации требуемых спейсеров смотри, например, в работе George et al. (2003) Protein Engineering 15: 871-879, включенной в данное описание в виде ссылки. Последовательность спейсера может содержать одну или несколько аминокислот, связанных в природе с рецепторным компонентом, или может представлять собой добавленную последовательность, используемую для усиления экспрессии слитого полипептида, обеспечения специальных требуемых представляющих интерес сайтов, обеспечения возможности для образования составляющими доменами оптимальных третичных структур и/или для усиления взаимодействия компонента с его молекулой-мишенью. В одном варианте спейсер содержит одну или несколько пептидных последовательностей между одним или несколькими компонентами, которые содержат 1-100 аминокислот, предпочтительно 1-25.
В более конкретных вариантах R1 представляет собой аминокислоты 27-126 SEQ ID NO: 8 или 1-126 SEQ ID NO: 8 (включая сигнальную последовательность 1-26); или аминокислоты 27-129 SEQ ID NO: 10 или 1-129 SEQ ID NO: 10 (включая сигнальную последовательность в положении 1-26). В более конкретных вариантах R2 представляет собой аминокислоты 127-228 SEQ ID NO: 8, или аминокислоты 130-231 SEQ ID NO: 10. В более конкретных вариантах R3 представляет собой аминокислоты 127-225 SEQ ID NO: 13 (без сигнальной последовательности). В том случае, когда, например, R2 помещают на N-конце слитого полипептида, может быть желательно, чтобы сигнальная последовательность предшествовала рецепторному компоненту. Рецепторный компонент(ы), связанный с мультимеризующим компонентом, кроме того, может содержать спейсерный компонент, например последовательность GPG из аминокислот 229-231 SEQ ID NO: 7.
Компоненты, являющиеся партнерами в слиянии, и мультимеризующие компоненты
Партнером в слиянии является любой компонент, который усиливает функции слитого полипептида. Таким образом, например, партнер в слиянии может усиливать биологическую активность слитого полипептида, помогать его продуцированию и/или извлечению или усиливать фармакологическое свойство или фармакокинетический профиль слитого полипептида, например, посредством увеличения его времени полужизни в сыворотке, проницаемости в ткани, обеспечения отсутствия иммуногенности или обеспечения стабильности. В предпочтительных вариантах партнер в слиянии выбран из группы, состоящей из мультимеризующего компонента, сывороточного белка или молекулы, способной связывать сывороточный белок.
В том случае, когда партнер в слиянии является сывороточным белком или его фрагментом, он выбран из группы, состоящей из α-1-микроглобулина, AGP-1, орозомукоида, α-1-кислого гликопротеина, связывающего витамин D белка (DBP), гемопексина, сывороточного альбумина человека (hSA), трансферрина, ферритина, афамина, гаптоглобина, α-фетопротеина тироглобулина, α-2-HS-гликопротеина, β-2-гликопротеина, гиалуронан связывающего белка, синтаксина, C1R, цепи C1q, связывающего галектин 3-Mac2 белка, фибриногена, полимерного рецептора Ig (PIGR), α-2-макроглобулина, белка, транспортирующего мочевину, гаптоглобина, IGFBP, фагоцитарных рецепторов макрофагов, фибронектина, гиантина, Fc, α-1-антихимотрипсина, α-1-антитрипсина, антитромбина III, аполипопротеина A-1, аполипопротеина B, β-2-микоглобулина, церулоплазмина, компонента комплемента C3 или C4, ингибитора эстеразы CI, C-реактивного белка, цистатина C и белка C. В более конкретном варианте партнер в слиянии выбран из группы, состоящей из α-1-микроглобулина, AGP-1, орозомукоида, α-1-кислого гликопротеина, связывающего витамин D белка (DBP), гемопексина, сывороточного альбумина человека (hSA), афамина и гаптоглобина. Включение компонента, являющегося партнером в слиянии, может при желании продлевать время полужизни слитого полипептида согласно изобретению в сыворотке. Смотри, например, патенты США No. 6423512, 5876969, 6593295 и 6548653, специально включенные в данное описание в виде ссылки в полном объеме, в отношении примеров полипептида, слитого с сывороточным альбумином. hSA широко распределен в организме, особенно в кишечнике и компонентах крови, и играет важную роль в поддержании осмолярности и объема плазмы. Он медленно выводится из печени и у людей обычно имеет время полужизни in vivo 14-20 дней (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; pp. 255-275).
В том случае, когда партнером в слиянии является молекула, способная связывать сывороточный белок, молекула может быть синтетической малой молекулой, липидом или липосомой, нуклеиновой кислотой, включая синтетическую нуклеиновую кислоту, такую как аптомер, пептидом или олигосахаридом. Кроме того, молекула может быть таким белком, как, например, FcγR1, FcγR2, FcγR3, полимерный рецептор Ig (PIGR), ScFv и другие фрагменты антител, специфичные по отношению к сывороточному белку.
В том случае, когда партнером в слиянии является мультимеризующий компонент (MC), он представляет собой любую природную или синтетическую последовательность, способную взаимодействовать с другим MC с образованием структуры более высокого порядка, например димера, тримера и т.д. Подходящие MC могут включать лейциновую молнию, включая домены лейциновой молнии, полученные из c-jun или c-fos; последовательности, полученные из константных областей легких цепей каппа или лямбда; синтетические последовательности, такие как мотивы спираль-петля-спираль (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432: 45-49), coil-coil мотивы и т.д., или другие общепринятые мультимеризующие домены, известные в данной области. В некоторых вариантах слитый компонент содержит домен, полученный из иммуноглобулина, например из IgG, IgM или IgA человека. В конкретных вариантах полученный из иммуноглобулина домен может быть выбран из группы, состоящей из Fc-домена IgG, тяжелой цепи IgG и легкой цепи IgG. Fc-домен IgG может быть выбран из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также любого аллотипа в каждой группе изотипов. В одном примере ловушки VEGF согласно изобретению мультимеризующим компонентом является Fc-домен IgG4 (SEQ ID NO: 29).
Создание укороченных миниловушек VEGF
В одном варианте ловушки согласно изобретению укороченную миниловушку VEGF, содержащую два или более слитых полипептида согласно изобретению, создают, подвергая исходную ловушку, имеющую MC, содержащие C-область, воздействию условий, при которых отщепляются один или несколько MC, содержащих C-область. Полученная в результате укороченная миниловушка может быть продуктом полного и частичного расщепления исходной ловушки.
MC, содержащий C-область, может представлять собой любой MC, способный взаимодействовать с другим MC с образованием структуры более высокого порядка, например димера или тримера. C-область может быть создана в MC в любом требуемом положении. В свете инструкций, представленных в примерах ниже, специалист в данной области сможет выбрать требуемый сайт для создания C-области на основе требуемых свойств получаемых в результате укороченных ловушек, например молекулярной массы, мономерной или димерной структуры и т.д.
В конкретном варианте C-область представляет собой сайт расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 6), встроенный в домен FcΔC1 после N-концевой последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1). В данном варианте конструкция полноразмерной исходной ловушки VEGF экспрессируется в клетке в виде Fc-меченого белка, обеспечивая таким образом улавливание и очистку, например, с использованием колонки с белком A. После образования димера и ковалентного связывания по одному или обоими остатками цистеина последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1) димер подвергают воздействию тромбином в условиях, при которых отщепляются один или оба домена FcΔC1, так что образуются укороченные димерные миниловушки, имеющие молекулярную массу примерно 50-90 кДа и обладающие аффинностью по отношению к VEGF, сравнимой с аффинностью исходной ловушки. Специалист в данном области может регулировать условия расщепления, чтобы предпочтительно образовывать продукт частичного расщепления или продукт полного расщепления, при этом вариант условий расщепления выбирают на основе потребности в конкретном продукте, обладающем конкретными свойствами, такими как молекулярная масса.
D
В конкретном варианте C-область является сайтом расщепления тромбином (LVPRGS) (SEQ ID NO: 6), встроенным в домен FcΔC1 на N-конце по отношению к последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1). После образования димера и ковалентного связывания по одному или обоим остаткам цистеина последовательности CPPC (SEQ ID NO: 1) димер подвергают воздействию тромбина в условиях, при которых возникают один или оба домена FcΔC1 и образуются укороченные мономерные миниловушки. Мономерная укороченная миниловушка, образованная таким образом, содержит рецепторный компонент, небольшой фрагмент Fc и имеет размер примерно 25 кДа и проявляет пониженную аффинность по отношению к VEGF по сравнению с укороченной димерной ловушкой и полноразмерной исходной ловушкой. Показано, что подобная мономерная ловушка, полученная в виде рекомбинантного белка, имеет K примерно 1 нМ.
Создание миниловушек VEGF
X
Y
C
C
В одном варианте изобретение относится к миниловушкам VEGF, имеющим один или несколько доменов рецепторных компонентов (R1R2) и/или (R1R3), где X≥1, Y≥1 и R1, R2 и R3 имеют значения, определенные выше, и необязательно партнер в слиянии, который предпочтительно является доменом MC, который представляет собой аминокислотную последовательность длиной от 1 до примерно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один остаток цистеина, где по меньшей мере один остаток цистеина способен образовывать дисульфидную связь с остатком цистеина, присутствующим в MС другого слитого полипептида (cMC). cMC может находиться на N-конце или C-конце слитого полипептида или между двумя доменами рецепторных компонентов. В одном конкретном варианте цистеин добавляют к C-концу компонента рецептора VEGF, например R1R2, который позволяет слитому полипептиду образовывать ковалентные димеры посредством образования ковалентной дисульфидной связи между остатком цистеина на C-конце одного слитого полипептида и остатком цистеина на C-конце другого слитого полипептида. В данном иллюстративном примере миниловушка является димером слитого полипептида, показанного в SEQ ID NO: 2, где каждый слитый полипептид (R1R2-cMC или R1R2) имеет молекулярную массу примерно 23,0 кДа.
В другом варианте cMC является последовательностью 4 аминокислот (XXXX) (SEQ ID NO: 11), где X означает любую аминокислоту и последовательность содержит, по меньшей мере, один остаток цистеина. В конкретном варианте cMC добавляют к C-концу домена рецепторного компонента. В более конкретном варианте последовательность из 4 аминокислот представляет собой ACGC (SEQ ID NO: 4) и cMC образует две дисульфидные связи с остатками цистеина, присутствующими во втором слитом полипептиде. Как показано ниже (таблица 2), обе приведенные в качестве примера миниловушки проявляют аффинность по отношению к VEGF, сравнимую с аффинностью исходной ловушки.
Терапевтические применения
Миниловушки VEGF согласно изобретению терапевтически применимы для лечения любого заболевания или состояния, которое улучшается, ослабляется, подавляется или предотвращается при удалении, ингибировании или уменьшении количества VEGF. Неограничивающий список конкретных состояний, улучшаемых ингибированием или уменьшением количества VEGF, включает клинические состояния, которые характеризуются избыточной пролиферацией эндотелиальных клеток сосудов, проницаемостью сосудов, отеком или воспалением, такие как отек головного мозга, связанный с повреждением, инсультом или опухолью; отек, связанный с воспалительными заболеваниями, такими как псориаз или артрит, включая ревматоидный артрит; астму; генерализованный отек, связанный с ожогами; асцит и плевральный выпот, связанный с опухолями, воспалением или травмой; хроническое воспаление дыхательных путей; синдром капиллярной утечки; сепсис; болезнь почек, связанную с повышенным просачиванием белка; и глазные заболевания, такие как связанная с возрастом дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия.
Композиции согласно изобретению терапевтически применимы для лечения широкого множества заболеваний, связанных с повышенными уровнями VEGF. Например, воспаление с аномальным повышением Th2 и ремоделирование дыхательных путей характерны для патогенеза астмы (смотри, например, Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 1001-6). Повышенные уровни VEGF обнаружены в тканях и биологических образцах пациентов с астмой, которые прямо коррелируют с активностью заболевания (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107: 1106-1108) и обратно коррелируют с диаметром дыхательных путей и чувствительностью дыхательных путей. Кроме того, предполагалось, что VEGF вносит вклад в отек ткани при астме.
Другим заболеванием, связанным с повышенным уровнем VEGF, является аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC). Указанная злокачественная опухоль часто имеет очаг усиленной пролиферации эндотелиальных клеток и часто сверхэкспрессирует VEGF (Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543). PDAC является причиной более 20% смертельных исходов вследствие злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта, что делает данное заболевание четвертым из наиболее распространенных причин связанной со злокачественными опухолями смертности в США и других промышленно развитых стран. Экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли VEGF в развитии злокачественной опухоли поджелудочной железы, таким образом, ингибитор VEGF является многообещающим в качестве терапевтического средства для ослабления роста опухоли внутри поджелудочной железы и региональных и дистальных метастазов.
Меньшая по размеру негликозилированная миниловушка, экспрессированная в E. coli (пример 4), гликозилированная миниловушка, экспрессированная в клетках CHO (пример 5), или основанная на рецепторе мономерная ловушка (пример 6) имеет оптимизированные характеристики для локальной/интравитреальной доставки, т.е. более короткое время полужизни в сыворотке для более быстрого клиренса и минимизации нежелательного системного воздействия. Кроме того, вследствие своего меньшего размера миниловушка обладает способностью проникать через внутреннюю ограничивающую мембрану (ILM) в глаз и диффундировать через стекловидное тело к сетчатке/пигментному эпителиальному слою сетчатки (RPE), что поможет лечить болезнь сетчатки. Кроме того, миниловушку можно использовать для локального введения при лечении такой глазной болезни, как неоваскуляризация сосудистой оболочки глаза, диабетический макулярный отек, пролиферативная диабетическая ретинопатия, неоваскуляризация роговицы/отторжение трансплантата. Кроме того, миниловушку можно применять в любой ситуации, когда требуется временное (кратковременное) блокирование VEGF, например, чтобы избежать хронического воздействия блокады VEGF, например, при лечении псориаза.
Серьезной проблемой, приводящей к неблагоприятному исходу после операции по поводу глаукомы, является ранее воспаление и ангиогенез, а также слишком быстрое заживление раны. Соответственно ловушки VEGF согласно изобретению могут быть эффективно использованы в качестве адъюванта при оперировании глаукомы, чтобы предотвратить ранний гем- и лимфангиогенез и рекрутирование макрофагов к фильтрационной подушке после операции по поводу глаукомы и улучшить исход операции.
Комбинированная терапия
В многочисленных вариантах ловушка VEGF может быть введена в комбинации с одним или несколькими дополнительными соединениями или терапевтическими средствами, включая вторую молекулу ловушки VEGF, хемотерапевтическое средство, хирургию, катетерные устройства и облучение. Комбинированная терапия включает в себя введение одного фармацевтического дозированного препарата, который содержит ловушку VEGF, и одного или нескольких дополнительных средств; а также введение ловушки VEGF и одного или нескольких дополнительных средства в своих отдельных фармацевтических дозированных препаратах. Например, ловушка VEGF и цитотоксическое средство, хемотерапевтическое средство или ингибирующее рост средство могут быть введены пациенту вместе в одном дозированном препарате, таким как комбинированный препарат, или каждое средство может быть введено в виде отдельного дозированного препарата. В том случае, когда используют отдельные дозированные препараты, VEGF-специфичный слитый полипептид согласно изобретению и одно или несколько дополнительных средств могут быть введены одновременно или в отдельные периоды времени со сдвигом, например последовательно.
131
125
90
186
Термин «цитотоксическое средство» в используемом в данном описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, I, I, Y и Re), хемотерапевтические средства и токсины, такие как ферментативно активные токсины из бактерий, грибов, растений или животных или их фрагменты.
«Хемотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры хемотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (Cytoxan); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицин, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренальные средства, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например паклитаксел (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J.) и доцетаксел (Taxotere; Aventis Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин C; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств. Также в данное определение включены антигормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен (Fareston); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств.
«Ингибирующее рост средство» при использовании в данном описании относится к соединению или композиции, которая ингибирует рост клетки, особенно клетки злокачественной опухоли, либо in vitro, либо in vivo. Примеры ингибирующих рост средств включают средства, которые блокируют прохождение клеточного цикла (в другой фазе, отличной от S-фазы), такие как средства, которые индуцируют задержку в G1 и задержку в M-фазе. Классические блокаторы фазы M включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), Taxol и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Указанные средства, которые задерживают G1, также распространяются на задержку S-фазы, например ДНК-алкилирующие агенты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C.
Способы введения
Изобретение относится к способам лечения, включающим в себя введение субъекту эффективного количества ловушки VEGF согласно изобретению. В предпочтительном аспекте ловушка в значительной степени очищена (например, по существу не содержит веществ, которые ограничивают ее действие или дают нежелательные побочные эффекты). Субъектом предпочтительно является млекопитающее и наиболее предпочтительно человек.
Известны различные системы доставки, которые могут быть использованы для введения средства согласно изобретению, например инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, опосредованный рецепторами эндоцитоз (смотри, например, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты в виде части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения могут быть энтеральными или парентеральными и включают без ограничения интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, внутриглазной и пероральный способы. Соединения могут быть введены любым удобным способом, например посредством инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые выстилающие (например, слизистую оболочку ротовой полости, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Введение может быть срочным или хроническим (например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно и т.д.) или в комбинации с другими средствами. Также может быть применено легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя и препарат с агентом для аэрозоля.
В другом варианте активный агент может быть доставлен в везикулах, в частности липосомах, в системе контролируемого высвобождения или в насосе. В другом варианте, когда активным агентом согласно изобретению является нуклеиновая кислота, кодирующая белок, нуклеиновая кислота может быть введена in vivo, чтобы поддерживать экспрессию кодируемого ею белка, посредством конструирования ее в виде части соответствующего вектора для экспрессии нуклеиновой кислоты и введения его таким образом, чтобы он стал внутриклеточным, например, используя ретровирусный вектор (смотри, например, патент США No. 4980286), прямой инъекцией или используя бомбардировку микрочастицами, или покрывание липидами, или посредством рецепторов клеточной поверхности или трансфицирующих агентов, или путем введения его в связи с пептидом, подобным гомеобоксу, который, как известно, проникает в ядро (смотри, например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868) и т.д. Альтернативно нуклеиновая кислота может быть введена внутрь клетки и включена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии посредством гомологичной рекомбинации.
В конкретном варианте может быть желательным введение фармацевтических композиций согласно изобретению локально в необходимую для лечения область; указанное можно осуществить, например, без ограничения посредством локальной инфузии во время операции, местным применением, например, посредством инъекции, с помощью катетера или с помощью имплантата, при этом имплантат является пористым, непористым или гелеобразным материалом, включая мембраны, такие как силиконовые мембраны, волокна или промышленные заменители кожи.
Композиция, применимая при практическом осуществлении способов согласно изобретению, может быть жидкостью, содержащей агент согласно изобретению в растворе, в суспензии или и в том и в другом. Термин «раствор/суспензия» относится к жидкой композиции, в которой первая часть активного агента присутствует в растворе, а вторая часть активного агента присутствует в форме частиц в суспензии в жидком матриксе. Жидкая композиция также включает гель. Жидкая композиция может быть водной или в форме мази. Кроме того, композиция может принимать форму твердой частицы, которая может быть введена в глаз, например между глазом и веком или в конъюнктивальный мешок, где высвобождается ловушка VEGF. Высвобождение из такой частицы обычно происходит к роговой оболочке либо через слезную жидкость, либо непосредственно к самой роговице, с которой твердая частица обычно находится в прямом контакте. Твердые частицы, подходящие для имплантации в глаз, обычно главным образом состоят из биоразрушаемых или небиоразрушаемых полимеров. Водный раствор и/или суспензия могут быть в форме глазных капель. Требуемая доза активного агента может быть измерена введением известного количества капель в глаз. Например, в случае объема капли 25 мкл введение 1-6 капель будет доставлять 25-150 мкл композиции.
Водная суспензия или раствор/суспензия, применимые при практическом осуществлении способов согласно изобретению, могут содержать один или несколько полимеров в качестве суспендирующих агентов. Применимые полимеры включают водорастворимые полимеры, такие как полимеры целлюлозы, и водонерастворимые полимеры, такие как перекрестно сшитые карбоксилсодержащие полимеры. Водная суспензия или раствор/суспензия согласно настоящему изобретению предпочтительно являются вязкими или мукоадгезивными или еще более предпочтительно как вязкими, так и мукоадгезивными.
В другом варианте композиция, применимая при практическом осуществлении способов согласно изобретению, является желатинизируемой in situ водной композицией. Такая композиция содержит желатинизирующий агент в концентрации, эффективной для стимулирования гелеобразования при контакте с глазом или с слезной жидкостью. Подходящие желатинизирующие агенты включают, но не ограничены указанным, термоотверждающиеся полимеры. Термин «желатинизируемый in situ» в используемом в данном описании смысле включает не только жидкости с низкой вязкостью, которые образуют гели при контакте с глазом или слезной жидкостью, но также включает более вязкие жидкости, такие как полутекучие и тиксотропные гели, которые имеют в значительной степени повышенную вязкость или плотность геля при введении в глаз.
Способы диагностики и скрининга
Ловушки VEGF согласно изобретению можно использовать диагностически и/или в способах скрининга. Например, ловушка может быть использована для наблюдения за уровнями VEGF во время клинического исследования, чтобы оценить эффективность лечения. В другом варианте способы и композиции согласно настоящему изобретению используют для отбора индивидуумов для введения в клиническое исследование, чтобы идентифицировать людей, имеющих, например, слишком высокий или слишком низкий уровень VEGF. Ловушки можно использовать в способах, известных в данной области, связанных с локализацией и активностью VEGF, например, при визуализации, измерении его уровней в соответствующих физиологических образцах, в диагностических способах и т.д.
Ловушки согласно изобретению можно использовать в скрининговом анализе in vivo и in vitro, чтобы оценить количество присутствующего несвязанного VEGF, например, в скрининговом способе для идентификации тестируемых агентов, способных снижать экспрессию VEGF. Более широко ловушки согласно изобретению можно использовать в любом анализе или способе, в котором требуется количественное измерение и/или выделение VEGF.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим миниловушку VEGF согласно изобретению. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество одной или нескольких миниловушек и фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства или правительства штата или указанный в фармакопейном списке США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных и более конкретно на человеке. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла из нефти, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобные. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция при желании также может содержать небольшие количества увлажнителей, или эмульгаторов, или агентов для забуферивания pH. Указанные композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов длительного высвобождения и тому подобные. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences», E. W. Martin.
Миниловушка VEGF согласно изобретению может быть приготовлена в виде нейтральной или солевой формы. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, такие как соли, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные со свободными карбоксильными группами, такие как соли, полученные с гидроксидами натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д.
Кроме того, водные композиции, применимые для практического осуществления способов согласно изобретению, имеют совместимые с глазом pH и осмотическое давление. Один или несколько приемлемых для глаз агентов для корректировки pH и/или буферных агентов могут быть введены в композицию согласно изобретению, включая кислоты, такие как уксусная, борная, лимонная, молочная, фосфорная и соляная кислоты; основания, такие как гидроксид натрия, фосфат натрия, борат натрия, цитрат натрия, ацетат натрия и лактат натрия; и буферы, такие как цитрат/декстроза, бикарбонат натрия и хлорид аммония. Такие кислоты, основания и буферы вводят в количестве, требуемом для поддержания pH композиции в приемлемых для глаза пределах. Одна или несколько приемлемых для глаза солей могут быть включены в композицию в количестве, достаточном для доведения осмотического давления композиции до приемлемых для глаза пределов. К таким солям относятся соли, имеющие катионы натрия, калия или аммония и анионы хлорида, цитрата, аскорбата, бората, фосфата, бикарбоната, сульфата, тиосульфата или бисульфата.
Количество ловушки, которое будет эффективным в случае ее планируемого терапевтического применения, можно определить стандартными клиническими способами, основанными на данном описании. Кроме того, необязательно можно использовать анализы in vitro, помогающие идентифицировать оптимальные пределы доз. В общем, подходящие пределы доз для внутривенного введения обычно составляют примерно 50-5000 мг активного соединения на килограмм массы тела. Подходящие пределы доз для интраназального введения обычно составляют примерно от 0,01 пг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела. Эффективные дозы могут быть экстраполированы на основе кривых дозовой зависимости, полученных в тест-системах in vitro или в моделях на животных.
50
Для системного введения терапевтически эффективная доза может быть сначала определена в анализах in vitro. Например, доза может быть разработана в моделях на животных, чтобы достичь пределов циркулирующей концентрации, которые включают IC, определенную в культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения доз, приемлемых для человека. Исходные дозы также можно оценить на основе данных in vivo, например, в моделях на животных, используя способы, которые хорошо известны в данной области. Специалист в данной области без труда может оптимизировать введение человеку на основе данных, полученных на животных.
Дозовое количество и интервал можно корректировать индивидуально, чтобы обеспечить уровни соединений в плазме, которые являются достаточными для поддержания терапевтического эффекта. В случаях локального введения или избирательного поглощения эффективная локальная концентрация соединений может быть не связана с концентрацией в плазме. Специалист в данной области сможет оптимизировать терапевтически эффективные локальные дозы без чрезмерного экспериментирования.
Количество вводимого соединения, конечно, будет варьироваться в зависимости от субъекта, подвергаемого лечению, массы субъекта, тяжести болезни, способа введения и решения лечащего врача. Терапию можно повторять периодически, пока симптомы выявляются или даже когда они не регистрируются. Терапия может проводиться отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами.
Трансфекция клеток и генная терапия
Настоящее изобретение относится к применению нуклеиновых кислот, кодирующих слитый полипептид согласно изобретению, для трансфекции клеток in vitro и in vivo. Указанные нуклеиновые кислоты могут быть встроены в любой из ряда хорошо известных векторов для трансфекции клеток-мишеней и организмов. Нуклеиновые кислоты трансфицируют в клетки ex vivo и in vivo посредством взаимодействия вектора и клетки-мишени. Композиции вводят (например, посредством инъекции в мышцу) субъекту в количестве, достаточном, чтобы вызвать терапевтический ответ. Количество, адекватное для осуществления указанного, определяют как «терапевтически эффективную дозу или количество».
В другом аспекте изобретение относится к способу снижения уровней VEGF у человека или другого животного, включающему в себя трансфекцию клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый полипептид согласно изобретению, при этом нуклеиновая кислота содержит индуцируемый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей слитый полипептид или миниловушку. Способы генной терапии при лечении или профилактике болезни человека смотри, например, в Van Brunt (1998) Biotechnology 6: 1149-1154.
Наборы
Изобретение также относится к предметам производства, содержащим упаковочный материал и фармацевтическое средство, находящееся в упаковочном материале, при этом фармацевтическое средство содержит, по меньшей мере, одну ловушку VEGF, состоящую из двух или более слитых полипептидов согласно изобретению, и упаковочный материал содержит этикетку или вкладыш в упаковку, на котором указано, что VEGF-специфичный слитый полипептид можно применять для лечения опосредованного VEGF заболевания или состояния.
Трансгенные животные
Изобретение включает трансгенных животных, отличных от человека, экспрессирующих ловушку согласно изобретению. Трансгенное животное может быть получено введением нуклеиновой кислоты в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки, например микроинъекцией, ретровирусной инфекцией, и обеспечением возможности для развития яйцеклетки у псевдобеременной приемной самки. Любые регуляторные или другие последовательности, применяемые в экспрессирующих векторах, могут образовывать часть трансгенной последовательности. Тканеспецифичная регуляторная последовательность(ти) могут быть оперативно связаны с трансгеном, чтобы управлять экспрессией трансгена в конкретных клетках. Трансгенное животное, отличное от человека, экспрессирующее слитый полипептид или миниловушку согласно изобретению, применимо для множества применений, включая применение в качестве средств получения такого слитого полипептида. Кроме того, трансген может быть помещен под контроль индуцируемого промотора так, чтобы экспрессию слитого полипептида или миниловушки можно было регулировать, например, введением малой молекулы.
Конкретные варианты
2
В описанных ниже экспериментах создавали меньшие по размеру ловушки VEGF и исследовали их способность связывать VEGF. Такие миниловушки предпочтительно используются в конкретных применениях. Например, некоторые состояния или заболевания предпочтительно можно лечить с помощью локального введения ловушки VEGF в конкретный орган, ткань или клетку, а не системным введением. В одном иллюстративном примере миниловушек согласно изобретению создавали меньшую по размеру ловушку VEGF прямым расщеплением димеризованной ловушки VEGF, имеющей область расщепления (C-область), созданную в домене Fc (пример 2). Укороченная ловушка проявляла сравнимую аффинность по отношению к VEGF и время полужизни как и полноразмерная исходная ловушка. В примерах 3-5 описана конструкция слитого полипептида, имеющего компонент рецептора VEGF и мультимеризующий компонент, состоящий из одного или двух остатков цистеина. Измерения аффинности показали, что негликозилированный слитый полипептид, экспрессированный в Е. coli, или гликозилированный полипептид, экспрессированный в клетках CHO, имели сравнимую аффинность связывания для VEGF, как и полноразмерная исходная ловушка. Пример 6, кроме того, иллюстрирует мономерную ловушку VEGF, состоящую из (R1R2), которая способная связывать и ингибировать VEGF. В примере 7 описана конструкция миниловушки VEGF (SEQ ID NO: 26), имеющей высокую аффинность связывания VEGF по сравнению с полноразмерной ловушкой (SEQ ID NO: 10).
Другие отличительные признаки изобретения будут очевидными в ходе дальнейшего описания примерных вариантов, которые приведены для иллюстрации изобретения и не предназначены для его ограничения.
ПРИМЕРЫ
Следующий пример приведен с тем, чтобы представить специалистам в данной области полное раскрытие и описание того, как получать и применять способы и композиции согласно изобретению, и не предназначен для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают как свое изобретение. Были предприняты усилия для того, чтобы обеспечить точность в отношении используемых числовых значений (например, количеств, температуры и т.д.), но следует принимать во внимание некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не оговорено особо, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах по Цельсию и давление является атмосферным или близким к атмосферному.
Пример 1. Конструкция Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
Конструкция исходной ловушки VEGF Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 7-8), VEGFR1R2.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10) и Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 12-13) подробно описана в публикации PCT WO/0075319, специально включенной в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Также в WO/0075319 описаны способы конструирования и экспрессии конструкций нуклеиновой кислоты, кодирующих ловушки VEGF, способы регистрации и измерения связывания ловушки VEGF с VEGF, способы определения стехиометрии связывания VEGF с использованием анализа BIAcore и фармакокинетические анализы.
Пример 2. Расщепленная тромбином димерная миниловушка VEGF
2
Конструкцию VEGFR1R2.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10) модифицировали инсерцией сайта расщепления тромбином после CPPC (SEQ ID NO: 1) домена Fc. Очищенную ловушку VEGF (5 мкг) инкубировали с тромбином (Novagen) в 20 мМ трис-HCl, pH 8,4, 50 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl в течение 16 час при 37°C. Контроли включали белок для контроля расщепления (CCP) и белок исходной ловушки VEGF, инкубированный без тромбина. SDS-ПААГ-анализ (трис-глициновый 4-20% гель; 5 мкг белка на дорожку) подтвердил правильное расщепление (результаты не показаны).
Определение аффинности
165
165
165
. Kd связывания каждой ловушки VEGF с hVEGF165 определяли, как описано в WO/0075319, для исходной ловушки VEGF, нерасщепленной ловушки VEGF, содержащей сайт расщепления тромбином («нерасщепленная ловушка VEGF»), расщепленной миниловушки VEGF и рекомбинантной мономерной R1R2-myc myc his. Более конкретно способность ловушек блокировать VEGF-зависимое фосфорилирование рецептора определяли, используя первичные эндотелиальные клетки человека (HUVEC). VEGF инкубировали в присутствии различных концентраций тестируемых ловушек и смесь добавляли к HUVEC, чтобы стимулировать фосфорилирование тирозина VEGFR2. При субстехиометрических концентрациях ловушки VEGF несвязанный VEGF индуцировал фосфорилирование рецептора. Однако при молярном отношении 1:1 или больше ловушки VEGF к лиганду наблюдали полное блокирование передачи сигнала рецептором, установив, что одна молекула димерной ловушки способна блокировать одну молекулу VEGF человека. Таким образом, высокая аффинность связывания ловушки VEGF в отношении VEGF приводит к образованию комплекса, который предотвращает взаимодействие VEGF с рецепторами клеточной поверхности. Эквивалентные результаты получили в случае идентичных экспериментов по ингибированию фосфорилирования для исходной ловушки VEGF, нерасщепленной ловушки VEGF и расщепленной миниловушки VEGF. Результаты показаны в таблице 1.
Таблица 1
Ловушка
Кинетическая скорость диссоциации (1/с)
Т<sub>1/2</sub> (ч)
Исходная ловушка VEGF
5,51×10<sup>-5</sup>±0,94%
3,5
Нерасщепленная ловушка VEGF
4,93×10<sup>-5</sup>±0,70%
3,9
Расщепленная миниловушка VEGF
5,46×10<sup>-5</sup>±0,62%
3,53
Мономер R1R2-myc myc his
6,74×10<sup>-3</sup>±0,38%
0,028
Пример 3. Конструкция плазмид, кодирующих миниловушки VEGF
Миниловушки VEGF конструировали из предшественника исходной ловушки VEGF, VEGFR1R2.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10), в котором три аминокислоты глицин-аланин-пролин служили в качестве линкера между Flk1D3 и FcΔC1(a). Данную плазмиду pTE115 использовали для конструирования миниловушек VEGF, так как линкерная последовательность ДНК содержала последовательность узнавания эндонуклеазой рестрикции Srf I, что облегчало конструирование ловушки VEGF. Во всех других отношениях ловушка VEGF, кодируемая pTE115, идентична ловушке VEGF VEGFR1R2.FcΔC1(a) (SEQ ID NO: 9-10), подробно описанной в публикации PCT WO/0075319.
C
ACGC
C
ACGC
Конструировали две миниловушки VEGF с доменами для мультимеризации, состоящими либо из одного остатка цистеина (R1R2) (SEQ ID NO: 2), либо аминокислот ACGC (SEQ ID NO: 4) (R1R2) (SEQ ID NO: 5), добавляемых к C-концу рецепторных компонентов Flt1D2.Flk1D3. Обе полученные конструкции способны образовывать гомодимерные молекулы, стабилизированные одной (R1R2) или двумя (R1R2) межмолекулярными дисульфидными связями.
C
ACGC
Плазмиду pTE517 получали удалением фрагмента длиной 690 п.о., вызванного расщеплением ДНК pTE115 с помощью Srf I и Not I, и встраиванием фрагмента синтетической ДНК, образованного отжигом олигонуклеотидов R1R2NC (SEQ ID NO: 14) и R1R2CC (SEQ ID NO: 15). Полученная в результате плазмида кодирует R1R2, которая состоит из доменов Flt1D2.Flk1D3, за которыми следует остаток цистеина (SEQ ID NO: 23). Подобным образом получали плазмиду pTE518 удалением фрагмента длиной 690 п.о., вызванного расщеплением ДНК pTE115 с помощью Srf I и NotI, с последующим лигированием фрагмента синтетической ДНК, образованного отжигом олигонуклеотидов R1R2NACGC (SEQ ID NO: 16) и R1R2CACGC (SEQ ID NO: 17). Полученная в результате плазмида кодирует R1R2, которая состоит из доменов Flt1D2.Flk1D3, за которыми следуют аминокислоты ACGC (SEQ ID NO: 25).
C
ACGC
C
ACGC
Также конструировали плазмиды для управления экспрессией указанных миниловушек в E. coli. Использовали праймеры R1R2N-Nco1 (SEQ ID NO: 18) и R1R2CNot1 (SEQ ID NO: 19), чтобы амплифицировать фрагмент ДНК pTE115, который кодирует аминокислоты с G30 по K231 относительно исходной ловушки VEGF (SEQ ID NO: 10). Амплификация данной последовательности приводила к слиянию начального кодона метионина на 5'-конце и слиянию кодона цистеина с последующим стоп-кодоном на 3'-конце (SEQ ID NO: 2). Затем полученный фрагмент ДНК клонировали в сайтах Nco I и Not I экспрессирующей плазмиды E. coli pRG663, получая pRG1102, так чтобы экспрессия R1R2 была зависима от транскрипции с промотора Φ1.1 фага T7. Индукция генной экспрессии с pRG1102 приводит к накоплению R1R2cys в цитоплазме штамма-хозяина E. coli RFJ238. Подобным образом праймеры R1R2N-Nco1 (SEQ ID NO: 18) и R1R2ACGC-Not1 (SEQ ID NO: 20) использовали для амплификации фрагмента ДНК из pTE115, который кодирует аминокислоты с G30 по K231 (SEQ ID NO: 10), получая в результате слияние начального кодона метионина на 5'-конце и слияние кодонов ACGC (SEQ ID NO: 4) с последующим стоп-кодоном на 3'-конце (SEQ ID NO: 5). Затем полученный фрагмент клонировали в сайтах Nco I и Not I экспрессирующей плазмиды E. coli pRG663, получая pRG1103, так чтобы экспрессия R1R2 зависела от транскрипции с промотора Φ1.1. фага T7. Индукция генной экспрессии как с pRG1102, так и с pRG1103 приводила к накоплению R1R2 или R1R2 соответственно в цитоплазме штамма-хозяина E. coli RFJ238.
Пример 4. Очистка и характеристика миниловушек VEGF из E. coli
C
ACGC
2
C
C
И R1R2, и R1R2 экспрессировали в виде цитоплазматических белков в E. coli и очищали одним и тем же способом. Индукция промотора Φ1.1 фага T7 либо в pRG1102, либо в pRG1103 в E. coli K12 штамма RFJ238 приводила к накоплению белка в цитоплазме. После индукции клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 20 мМ EDTA и лизировали пропусканием через гомогенизатор для клеток Niro-Soavi. Тельца включения собирали из лизированных клеток центрифугированием, один раз промывали дистиллированной HO, затем растворяли в 8М гуанидиний-HCl, 50 мМ трис-HCl, pH 8,5, 100 мМ сульфите натрия, 10 мМ тетратионате натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение 16 часов. Осветленный надосадок фракционировали на колонке S300, уравновешенной 6М гуанидинием-HCl, 50 мМ трис-HCl, pH 7,5. Фракции, содержащие R1R2, объединяли и диализовали против 6М мочевины, 50 мМ трис-HCl, pH 7,5. Диализованный белок разбавляли до 2М мочевины, 50 мМ трис-HCl, pH 8,5, 2 мМ цистеин, затем медленно перемешивали в течение 7 дней при 4°C. Подвергнутый рефолдингу белок диализовали против 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, затем наносили на колонку с SP-сефарозой, уравновешенную 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, и элюировали градиентом NaCl от 0 до 1М в 50 мМ трис-HCl, pH 7,5. Фракции, содержащие R1R2, объединяли, концентрировали и наносили на колонку Superdex 200, уравновешенную 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl. Фракции, содержащие димер миниловушки, собирали и объединяли. С помощью SDS-ПААГ определили молекулярную массу очищенной миниловушки, составляющую примерно 46 кДа.
C
ACGC
Проводили анализ BIAcore (как описано в WO/0075319), чтобы определить аффинность ловушки по отношению к VEGF, и результаты показали, что миниловушки R1R2 и R1R2 имели аффинность к VEGF, сравнимую с аффинностью полноразмерной ловушки VEGF (таблица 2).
Таблица 2
Ловушка
Кинетическая скорость диссоциации (1/с)
Т<sub>1/2</sub> (ч)
Ловушка VEGF
4,23×10<sup>-5</sup>
4,53
R1R2<sub>C</sub>
3,39×10<sup>-5</sup>
5,68
R1R2<sub>ACGC</sub>
3,41×10<sup>-5</sup>
5,65
Пример 5. Экспрессия миниловушек VEGF в CHO K1
C
Экспрессия миниловушек VEGF, кодируемых pTE517 и pTE518, зависит от транскрипции с промотора CMV-MIE человека и приводит к секреции миниловушек в культуральную среду при экспрессии в клетках CHO. При экспрессии в виде секретируемых белков в CHO K1 обе миниловушки обнаруживали в кондиционированных средах, и определение их молекулярной массы в SDS-ПААГ свидетельствовало, как и ожидалось, что белки были гликозилированы. Анализ в SDS-ПААГ также показал, что миниловушки способны образовывать гомодимерные молекулы, стабилизированные межмолекулярной дисульфидной связью(ями) между C-концевыми цистеинами. В частности, миниловушка R1R2 эффективно образовывала ковалентные димеры при экспрессии в виде секретируемого белка в клетках CHO.
Пример 6. Конструирование и экспрессия одноцепочечной миниловушки VEGF
Также конструировали миниловушку VEGF, в которой не требуется домен для мультимеризации (SEQ ID NO: 24). Данную миниловушку конструировали непосредственным слиянием одного домена Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (аминокислоты 30-231 SEQ ID NO: 24) со вторым доменом Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (аминокислоты 234-435 SEQ ID NO: 24) с помощью линкера Gly-Pro между рецепторными доменами тандема (аминокислоты 232-233 SEQ ID NO: 24).
Чтобы сконструировать ген, кодирующий тандемные домены Flt1D2.Flk1D3, синтезировали фрагмент ДНК (Blue Heron Biotechnology), который кодировал один домен Flt1D2.Flk1D3, который минимизировал гомологию ДНК с ДНК, кодирующей домен Flt1D2.Flk1D3, обнаруженной в pTE115. Полученный синтезированный фрагмент ДНК клонировали в виде фрагмента Srf I-Not I в сайтах Srf I-Not I pTE115, чтобы получить pTE570, которая экспрессирует миниловушку VEGF R1R2-R1R2 с промотора CMV-MIE. Когда данную плазмиду трансфицируют в клетки CHO K1, миниловушка VEGF R1R2-R1R2 накапливается в культуральной среде.
Пример 7. Конструирование и экспрессия миниловушки VEGF
Миниловушку VEGF конструировали, как описано выше, непосредственным слиянием одного домена Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (аминокислоты 30-231 SEQ ID NO: 26) с C-концевой последовательностью из девяти аминокислот, заканчивающейся CPPC. Когда такую плазмиду трансфицируют в клетки CHO K1, миниловушка VEGF с SEQ ID NO: 26 секретируется в культуральную среду. Последующая очистка электрофорезом в невосстанавливающем SDS-ПААГ, а также простой анализ светорассеяния выявляли молекулу ловушки с молекулярной массой примерно 64 кДа. Указанная молекулярная масса свидетельствует, что был образован ковалентный димер между двумя слитыми полипептидами с SEQ ID NO: 26. Сходные эксперименты проводили с плазмидами, кодирующими слитые полипептиды с SEQ ID NO: 27 и 28, и подобным образом показали, что указанные молекулы образовывали гомодимерные ловушки. Определения аффинности для связывания VEGF-165 человека с ловушками EGF, состоящими из димеров с SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 26, показаны в таблице 3.
Таблица 3
Ловушка VEGF
ka (1/Ms)
kd (1/с)
KD (M)
SEQ ID NO: 10
2,73×10<sup>+7</sup>
1,79×10<sup>-5</sup>
6,55×10<sup>-13</sup>
SEQ ID NO: 26
2,00×10<sup>+7</sup>
6,56×10<sup>-6</sup>
3,28×10<sup>-13</sup>
SEQ ID NO: 26
2,61×10<sup>+7</sup>
5,77×10<sup>-6</sup>
2,21×10<sup>-13</sup>