МАСШТАБИРУЕМЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА (AAV) В СИСТЕМЕ БЕССЫВОРОТОЧНОЙ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, ПОДХОДЯЩЕГО ДЛЯ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

1. Композиция, содержащая смесь плазмиды/PEI, содержащую компоненты:
(a) одну или несколько плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(b) плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт; и
(c) раствор полиэтиленимина (PEI),
где указанные плазмиды находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, и где смесь указанных компонентов (a), (b) и (c), необязательно, инкубируют в течение периода времени от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов.
2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая клетки.
3. Композиция по п.2, где указанные клетки приводят в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI из указанных компонентов (a), (b) и (c).
4. Композиция по п.3, дополнительно содержащая свободный PEI.
5. Композиция по п.4, где указанные клетки приводят в контакт с указанным свободным PEI.
6. Композиция по п.3, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов.
7. Композиция по п.3, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 140 часов.
8. Композиция по п.3, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 96 часов.
9. Композиция по п.5, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) и указанным свободным PEI в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов.
10. Композиция по п.5, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 140 часов.
11. Композиция по п.5, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c) в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 96 часов.
12. Композиция по любому из пп.6-11, где указанные клетки продуцируют рекомбинантный вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
13. Композиция по любому из пп.1-12, где указанная композиция содержит контейнер, необязательно, включающий флакон, планшет, мешок или биореактор, указанный контейнер, необязательно, является стерильным и/или, необязательно, подходит для поддержания жизнеспособности или роста клеток.
14. Композиция по п.1, дополнительно содержащая плазмиду, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие белки капсида AAV.
15. Композиция по п.14, дополнительно содержащая клетки, приведенные в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI из указанных компонентов (a), (b) и (c), и указанная плазмида содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие белки капсида AAV.
16. Композиция по п.15, дополнительно содержащая свободный PEI, где указанные клетки приводят в контакт с указанным свободным PEI.
17. Композиция по п.16, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c), где указанная плазмида содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие белки капсида AAV, и указанным свободным PEI в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов.
18. Композиция по п.16, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c), где указанная плазмида содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие белки капсида AAV, и указанным свободным PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 140 часов.
19. Композиция по п.16, где указанные клетки приводят в контакт со смесью указанных компонентов (a), (b) и (c), где указанная плазмида содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие белки капсида AAV, и указанным свободным PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 96 часов.
20. Способ получения трансфицированных клеток, включающий:
(a) получение плазмиды;
(b) получение раствора, содержащего полиэтиленимин (PEI);
(c) смешивание плазмиды, полученной на стадии (a), с раствором PEI, полученным на стадии (b), для получения смеси плазмиды/PEI и, необязательно, инкубацию указанной смеси плазмиды/PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов;
(d) приведение клеток в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI, полученной на стадии (c), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(e) добавление свободного PEI к указанной культуре клеток с нуклеиновой кислотой/PEI, полученной на стадии (d), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI; и
(f) инкубацию указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (e), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов и, таким образом, получение трансфицированных клеток.
21. Способ по п.20, где указанная плазмида содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
22. Способ получения трансфицированных клеток, продуцирующих рекомбинантный вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, включающий:
(a) получение одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(b) получение плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт;
(c) получение раствора, содержащего полиэтиленимин (PEI);
(d) смешивание плазмид, полученных на стадиях (a) и (b), с раствором PEI, полученным на стадии (c), где указанные плазмиды находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, для получения смеси плазмиды/PEI и, необязательно, инкубацию указанной смеси плазмиды/PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов;
(e) приведение клеток в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI, полученной на стадии (d), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(f) добавление свободного PEI к указанной культуре клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (e), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI; и
(g) инкубацию указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (f), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов и, таким образом, получение трансфицированных клеток, продуцирующих рекомбинантный вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
23. Способ по п.20 или 22, дополнительно включающий стадию сбора указанных трансфицированных клеток, полученных на стадиях (f) или (g), и/или среды для культивирования указанных трансфицированных клеток, полученной на стадиях (f) или (g), для получения сбора клеток и/или среды для культивирования.
24. Способ по п.22, дополнительно включающий выделение и/или очистку рекомбинантного вектора AAV от указанного сбора клеток и/или среды для культивирования, полученного на стадии (g), и, таким образом, получение рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
25. Способ получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, включающий стадии:
(a) получения одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(b) получения плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт;
(c) получения раствора, содержащего полиэтиленимин (PEI);
(d) смешивания указанных плазмид, полученных на стадиях (a) и (b), с указанным раствором PEI, полученным на стадии (c), где указанные плазмиды находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, для получения смеси плазмиды/PEI и, необязательно, инкубацию смеси плазмиды/PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов;
(e) приведения клеток в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI, полученной на стадии (d), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(f) добавления свободного PEI к указанной культуре клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (e), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI;
(g) инкубации указанной культуры клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (e), или указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (f), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов для получения трансфицированных клеток;
(h) сбора указанных трансфицированных клеток, полученных на стадии (g), и/или среды для культивирования трансфицированных клеток, полученной на стадии (g), для получения сбора клеток и/или среды для культивирования; и
(i) выделения и/или очистки рекомбинантного вектора AAV от указанного сбора клеток и/или среды для культивирования, полученного на стадии (h), и, таким образом, получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
26. Способ получения трансфицированных клеток, продуцирующих рекомбинантный вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, включающий стадии:
(a) получения смеси компонентов (i), (ii) и (iii):
(i) одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(ii) плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт; и
(iii) раствора полиэтиленимина (PEI),
(b) смешивания указанных плазмид (i) и (ii) с указанным раствором PEI (iii) таким образом, что указанные плазмиды находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, для получения смеси плазмиды/PEI и, необязательно, инкубации указанной смеси плазмиды/PEI в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов;
(c) приведения клеток в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI, полученной на стадии (b), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(d) добавления свободного PEI к указанной культуре клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (c), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI;
(e) инкубации указанной культуры клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (c), или указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (d), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов для получения трансфицированных клеток, продуцирующих рекомбинантный вектор AAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
27. Способ по п.25 или 26, дополнительно включающий стадию сбора трансфицированных клеток, полученных на стадии (e), и/или среды для культивирования трансфицированных клеток, полученной на стадии (e), для получения сбора клеток и/или среды для культивирования; и/или выделения и/или очистки рекомбинантного вектора AAV от сбора клеток и/или среды для культивирования, полученного на стадии (e), и, таким образом, получение рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
28. Способ получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, включающий стадии:
(a) получения смеси компонентов (i), (ii) и (iii):
(i) одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(ii) плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт; и
(iii) раствор полиэтиленимина (PEI),
(b) смешивания указанных плазмид (i) и (ii) с указанным раствором PEI (iii) таким образом, что указанные плазмиды находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, для получения смеси плазмиды/PEI и, необязательно, инкубации указанной смеси плазмиды/PEI в течение периода времени от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов;
(c) приведения клеток в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI, полученной на стадии (b), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(d) добавления свободного PEI к указанной культуре клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (c), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI;
(e) инкубации указанной культуры клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (c), или указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (d), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов для получения трансфицированных клеток;
(f) сбора указанных трансфицированных клеток, полученных на стадии (e), и/или среды для культивирования трансфицированных клеток, полученной на стадии (e), для получения сбора клеток и/или среды для культивирования; и
(g) выделения и/или очистки рекомбинантного вектора AAV из сбора клеток и/или среды для культивирования, полученного на стадии (f), и, таким образом, получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
29. Способ получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, включающий стадии:
(a) получения смеси компонентов (i), (ii) и (iii):
(i) одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки;
(ii) плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт; и
(iii) раствор полиэтиленимина (PEI),
где указанные плазмиды (i) и (ii) находятся в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 1:0,01 до приблизительно 1:100 или в диапазоне молярного соотношения от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:0,01, и где смесь компонентов (i), (ii) и (iii), необязательно, инкубируют в течение периода времени от приблизительно 10 секунд до приблизительно 4 часов.
(b) приведения клеток в контакт со смесью, полученной на стадии (a), для получения культуры клеток с плазмидой/PEI;
(c) добавления свободного PEI к указанной культуре клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (b), для получения культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI;
(d) инкубации указанной культуры клеток с плазмидой/PEI, полученной на стадии (b), или указанной культуры клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, полученной на стадии (c), в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов для получения трансфицированных клеток;
(e) сбора указанных трансфицированных клеток, полученных на стадии (d), и/или среды для культивирования трансфицированных клеток, полученной на стадии (d), для получения сбора клеток и/или среды для культивирования; и
(f) выделения и/или очистки рекомбинантного вектора AAV от сбора клеток и/или среды для культивирования, полученного на стадии (e), и, таким образом, получения рекомбинантного вектора AAV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт.
30. Композиция или способ по любому из пп.3-29, где указанную культуру клеток с плазмидой/PEI, или указанную культуру клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI, или указанную культуру клеток с нуклеиновой кислотой/PEI инкубируют в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 140 часов.
31. Композиция или способ по любому из пп.3-30, где указанную культуру клеток с плазмидой/PEI или указанную культуру клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI инкубируют в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 4 часов до приблизительно 96 часов.
32. Композиция или способ по любому из пп.1-31, где указанная смесь плазмиды/PEI имеет массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 5:1 или массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 5:1 до приблизительно 0,1:1, или где указанная культура клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI имеет массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 5:1 или массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 5:1 до приблизительно 0,1:1.
33. Композиция или способ по любому из пп.1-32, где указанная смесь плазмиды/PEI имеет массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 5:1 или массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 5:1 до приблизительно 1:1; или где указанная культура клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI имеет массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 5:1 или массовое соотношение PEI:плазмида в диапазоне от приблизительно 5:1 до приблизительно 1:1.
34. Композиция или способ по любому из пп.1-33, где PEI из указанной смеси плазмиды/PEI и/или свободный PEI содержит гидролизованный линейный полиэтиленимин.
35. Композиция или способ по любому из пп.1-34, где PEI из указанной смеси плазмиды/PEI и/или указанный свободный PEI содержит гидролизованный линейный полиэтиленимин с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 4000 до приблизительно 160000 и/или в диапазоне от приблизительно 2500 до приблизительно 250000 в пересчете на свободное основание.
36. Композиция или способ по любому из пп.1-35, где PEI из указанной смеси плазмиды/PEI и/или указанный свободный PEI содержит гидролизованный линейный полиэтиленимин с молекулярной массой приблизительно 40000 и/или приблизительно 25000 в пересчете на свободное основание.
37. Композиция или способ по пп.1-36, где молярное соотношение азота (N) в общем PEI и фосфата (P) в плазмиде находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1 (N:P) в указанной культуре клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI.
38. Композиция или способ по пп.1-37, где молярное соотношение азота (N) в общем PEI и фосфата (P) в плазмиде составляет приблизительно 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1 (N:P) в указанной культуре клеток со свободным PEI/плазмидой/PEI.
39. Композиция или способ по любому из пп.1-38, где указанную смесь плазмиды/PEI инкубируют в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 30 секунд до приблизительно 4 часов.
40. Композиция или способ по любому из пп.1-39, где указанную смесь плазмиды/PEI инкубируют в течение периода времени в диапазоне от приблизительно 1 минуты до приблизительно 30 минут.
41. Композиция или способ по любому из пп.1-40, где количество свободного PEI находится в диапазоне от приблизительно 10% до приблизительно 90% общего PEI.
42. Композиция или способ по любому из пп.1-41, где количество свободного PEI находится в диапазоне от приблизительно 25% до приблизительно 75% общего PEI.
43. Композиция или способ по любому из пп.1-42, где количество свободного PEI составляет приблизительно 50% общего PEI.
44. Композиция или способ по любому из пп.4, 5 и 9-43, где указанный свободный PEI добавляют к указанным клеткам до, во время или после приведения указанной смеси плазмиды/PEI в контакт с указанными клетками.
45. Композиция или способ по любому из пп.2-44, где указанные клетки находятся в суспензионной культуре.
46. Композиция или способ по любому из пп.2-44, где указанные клетки выращивают или поддерживают в бессывороточной среде для культивирования.
5
8
47. Композиция или способ по любому из пп.2-46, где указанные клетки имеют плотность в диапазоне от приблизительно 1×10 клеток/мл до приблизительно 1×10 клеток/мл при контакте с указанной смесью плазмиды/PEI и/или с указанным свободным PEI.
48. Композиция или способ по любому из пп.2-47, где жизнеспособность указанных клеток при контакте с указанной смесью плазмиды/PEI или указанным свободным PEI составляет приблизительно 60% или более 60%, или где указанные клетки находятся в логарифмической фазе роста при контакте с указанной смесью плазмиды/PEI.
49. Композиция или способ по любому из пп.2-48, где жизнеспособность указанных клеток при контакте с указанной смесью плазмиды/PEI или указанным свободным PEI составляет приблизительно 90% или более 90%, или где указанные клетки находятся в логарифмической фазе роста при контакте с указанной смесью плазмиды/PEI или указанным свободным PEI.
50. Композиция или способ по любому из пп.1-49, где кодируемые упаковывающие белки AAV включают rep AAV и/или cap AAV.
51. Композиция или способ по п.50, где кодируемые упаковывающие белки AAV включают белки rep AAV и/или cap AAV любого серотипа AAV.
52. Композиция или способ по любому из пп.1-51, где кодируемые хелперные белки содержат белки E2 и/или E4 аденовируса, белки VARNA и/или не-AAV хелперные белки
53. Композиция или способ по любому из пп.2-52, где указанные клетки являются клетками млекопитающих.
54. Композиция или способ по любому из пп.2-52, где указанные клетки являются клетками HEK 293E или HEK 293F.
55. Композиция или способ по любому из пп.2-54, где общее количество плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, и одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки, находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 15 мкг на мл клеток.
56. Композиция или способ по любому из пп.1-55, где молярное соотношение плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, и одной или нескольких плазмид, содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки, находится в диапазоне от приблизительно 1:5 до приблизительно 1:1 или в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 5:1.
57. Композиция или способ по любому из пп.1-56, где указанные одна или несколько плазмид содержат первую плазмиду, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и вторую плазмиду, содержащую нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки.
58. Композиция или способ по п.57, где молярное соотношение плазмиды, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или транскрибирующуюся в представляющий интерес транскрипт, и первой плазмиды, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие упаковывающие белки AAV, и второй плазмиды, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие хелперные белки, находится в диапазоне приблизительно 1-5:1:1, или 1:1-5:1, или 1:1:1-5.
59. Композиция или способ по любому из пп.1-58, где рекомбинантный вектор AAV имеет любой из серотипов AAV 1-12, белок капсида VP1, VP2 и/или VP3 AAV, или модифицированный белок капсида VP1, VP2 и/или VP3 AAV или его вариант, или белок капсида VP1, VP2 и/или VP3 AAV дикого типа.
60. Композиция или способ по любому из пп.1-59, где вектор AAV имеет серотип AAV или псевдотип AAV, где указанный псевдотип AAV имеет серотип капсида AAV, отличающийся от серотипа ITR.
61. Композиция или способ по любому из пп.1-60, где вектор AAV дополнительно содержит интрон, элемент контроля экспрессии, один или несколько инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV) и/или филлерную полинуклеотидную последовательность.
62. Композиция или способ по п.61, где интрон находится в нуклеиновой кислоте, кодирующей белок или транскрибирующейся в представляющий интерес транскрипт, или фланкирует ее, или где элемент контроля экспрессии функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или транскрибирующейся в представляющий интерес транскрипт, или где ITR AAV фланкируют 5'- или 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или транскрибирующейся в представляющий интерес транскрипт, или где филлерная полинуклеотидная последовательность фланкирует 5'- или 3'-конец нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или транскрибирующейся в представляющий интерес транскрипт.
63. Композиция или способ по п.61, где элемент контроля экспрессии содержит конститутивный или регулируемый контрольный элемент, или тканеспецифический элемент контроля экспрессии, или промотор.
64. Композиция или способ по п.61, где элемент контроля экспрессии содержит элемент, обеспечивающий экспрессию в печени.
65. Композиция или способ по п.61, где ITR содержит один или несколько ITR любого из серотипов AAV2 или AAV6 или их комбинацию.
66. Композиция или способ по любому из пп.1-65, где вектор AAV содержит белок капсида VP1, VP2 и/или VP3, имеющий 75% или более идентичности последовательности по отношению к любому из белков капсид VP1, VP2 и/или VP3 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11 или AAV-2i8, или содержит модифицированный белок капсида VP1, VP2 и/или VP3 или его вариант, выбранный из любого из серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV10, AAV11 и AAV-2i8 AAV.
67. Композиция или способ по любому из пп.3-65, где клетки субкультивируют до достижения сниженной плотности клеток перед контактом с указанной смесью плазмиды/PEI.
6
6
68. Композиция или способ по любому из пп.3-65, где клетки субкультивируют до достижения плотности клеток в диапазоне от приблизительно 0,1×10 клеток/мл до приблизительно 5,0×10 клеток/мл перед контактом с указанной смесью плазмиды/PEI.
69. Композиция или способ по любому из пп.67-68, где клетки приводят в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI в пределах периода от 2 до 5 дней после субкультивирования.
70. Композиция или способ по любому из пп.67-68, где клетки приводят в контакт с указанной смесью плазмиды/PEI в пределах периода от 3 до 4 дней после субкультивирования.
71. Способ по п.20, где количество плазмиды, встраиваемой в указанные трансфицированные клетки, составляет по меньшей мере на 50% больше при использовании стадии добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI по сравнению с отсутствием добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI.
72. Способ по любому из пп.22-71, где количество полученного рекомбинантного вектора на основе AAV составляет по меньшей мере на 50% или более больше при использовании стадии добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI по сравнению с отсутствием добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI.
73. Способ по любому из пп.22-71, где количество полученного рекомбинантного вектора на основе AAV составляет в 1-5, 5-10 или 10-20 раз больше при использовании стадии добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI по сравнению с отсутствием добавления свободного PEI к культуре клеток с плазмидой/PEI.