СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ РЕСТЕНОЗА ПОСЛЕ СТЕНТИРОВАНИЯ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ СТЕНТАМИ БЕЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПОКРЫТИЯ
METHOD OF FORECASTING PROGRESS OF RESTENOSIS AFTER CORONARY ARTERIES STENTING WITH STENTS WITHOUT DRUG COATING

Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, в частности к эндоваскулярным методам лечения, и может быть использовано при определении риска развития рестеноза в стенте у пациентов после стентирования коронарных артерий стентами без лекарственного покрытия.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) - ведущая причина смертности и потери трудоспособности среди взрослого населения развитых стран. Восстановление коронарного кровотока является основным методом лечения ИБС, позволяющим эффективно улучшить качество жизни пациента и отдаленный прогноз заболевания. Эндоваскулярные методы лечения, такие как стентирование коронарных артерий, получили широкое распространение в лечении ИБС, однако рестенозирование в стенте является главным ограничением эффективности этого метода, и даже применение стентов с лекарственным покрытием не решило проблему окончательно (John А. Spertus, Ravi Nerella, Richard Kettlekamp et al. Risk of Restenosis and Health Status Outcomes for Patients Undergoing Percutaneous Coronary Intervention Versus Coronary Artery Bypass Graft Surgery. Circulation, Feb 2005; 111: 768-73). Учитывая широкое распространение стентирования коронарных артерий в лечении ИБС, несомненно, актуальным является поиск новых предикторов развития рестеноза в стенте. Существуют основания считать, что генетические факторы, такие как полиморфизм генов кодирующих некоторые ферменты и рецепторы, играют роль в увеличении риска развития рестеноза (Harry С Lowe, Stephen N Oesterle, Levon M Khachigian. Coronary In-Stent Restenosis: Current Status and Future Strategies. J Am Coll Cardiol, 2002; 39: 183-93).
В настоящее время во всем мире активно проводятся исследования влияния на развитие рестеноза в стенте полиморфизма генов, кодирующих различные ферменты и рецепторы. Рестенозирование в стенте - это многофакторный процесс, включающий комплекс эндотелиальных и воспалительных реакций, что обуславливает интерес исследователей, изучающих различные гены и их полиморфизмы, вероятно вовлеченные в развитие рестеноза после коронарного стентирования.
В своих исследованиях Kastrati А. с соавторами продемонстрировал ассоциацию аллеля PlA 2 полиморфизма РlА 1/PlA 2 гена GP IIIa с тромбозом в стенте (р=0,002) (Kastrati A., Koch W., Gawaz М. et al.: PlA polymorphism of glycoprotein IIIa and risk of adverse events after coronary stent placement. J Am Coll Cardiol, 2000; 36:84-89) и полиморфизма VNTR интрон 2 гена IL-lra с риском развития рестеноза после стентирования коронарных артерий, при этом носители 2 аллеля имели меньший риск развития рестеноза в стенте (Отношение Шансов (ОШ)=0,78; 95% Доверительный Интервал (ДИ): 0,63-0,97) (Kastrati A., Koch W., Berger Р.В. et al.: Protective role against restenosis from an interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism in patients treated with coronary stenting. J Am Coll Cardiol, 2000; 36:2168-73).
Wijpkema JS с соавторами изучал гены ренин-ангиотензиновой системы и показал достоверную ассоциацию полиморфизма A1166C гена рецептора к ангиотензину II тип-1 с развитием рестеноза в стенте (JS Wijpkema, PL van Haelst, PS Monraats, M Bruinenberg et al.: Restenosis after percutaneous coronary intervention is associated with the angiotensin-II type-1 receptor 1166A/C polymorphism but not with polymorphisms of angiotensin-converting enzyme, angiotensin-II receptor, angiotensinogen or heme oxygenase-1. Pharmacogenet Genomics, May 2006; 16(5):331-7).
Gomma A.H. с соавторами провел исследование 226 пациентов с ИБС и коронарным стентированием. В этом исследовании изучалась взаимосвязь полиморфизма Glu298Asp гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) с риском развития рестеноза после стентирования коронарных артерий (Gomma А.Н., Elrayess M.A., Knight C.J. et al.: The endothelial nitric oxide synthase (Glu298Asp and -786T>C) gene polymorphism are associated with coronary instent restenosis. Eur Heart J, 2002; 23:1955-62). Носители аллеля 298Asp (минорный аллель) полиморфизма Glu298Asp гена eNOS достоверно чаще встречались в группе пациентов с рестенозом по сравнению с гомозиготами по аллелю Glu298 (дикий аллель). Риск развития рестеноза был выше у носителей аллеля 298Asp полиморфизма Glu298Asp гена eNOS (ОШ=1,88; 95% ДИ:1,01-3,51; р=0,043).
Однако способа прогнозирования развития рестеноза после стентирования коронарных артерий с использованием этих и других полиморфизмов предложено не было. Это связано с тем, что для увеличения специфичности метода необходимо проведение более полного анализа генов, кодирующих антиоксидантные ферменты, в частности гена глутатинопероксидазы, которая является одним из основных ферментов утилизирующих активные формы кислорода (АФК), принимает участие в метаболизме пероксинитрита, а также разрушает органические перекиси в организме, в том числе липогидропероксиды (Ana Fortuno, Gorka San Jose, Maria U. Moreno et al. Oxidative stress and vascular remodelling. Exp Physiol 2005; 90.4:457-62).
Окислительный стресс в сосудистой стенке развивается сразу после ее повреждения и его признаки сохраняются как на стадии тромбообразования и воспаления, так и на стадии пролиферации и миграции гладко-мышечных клеток (ГМК) (Azevedo LC, Pedro MA, Souza LC. Oxidative stress as a signaling mechanism of the vascular response to injury: the redox hypothesis of restenosis. Cardiovasc Res, 2000; 47(3):436-5). АФК являются важным фактором в регуляции процессов роста, пролиферации, апоптоза и миграции сосудистых ГМК, модуляции функции эндотелия, включая эндотелий-зависимую дилятацию, модификации внеклеточного матрикса и воспалительного ответа на повреждение сосуда (Ana Fortuno, Gorka San Jose, Maria U. Moreno et al. Oxidative stress and vascular remodelling. Exp Physiol 2005; 90.4:457-62). АФК могут индуцировать дисфункцию эндотелия и активацию макрофагов и как следствие высвобождение цитокинов и факторов роста, которые стимулируют ремоделирование матрикса и пролиферацию ГМК. Накопление нового экстрацеллюлярного матрикса и ГМК приводит к формированию неоинтимы, отвечающей за уменьшение просвета сосуда после установки стента и являющейся ведущим механизмом формирования рестеноза после коронарного стентирования (Hoffmann R, Mintz GS: Coronary in-stent restenosis - predictors, treatment and prevention. Europ Heart J, 2000; 21:1739-49).
Техническим результатом предлагаемого решения является возможность осуществления с высокой степенью достоверности прогнозирования развития рестеноза после стентирования коронарных артерий с использованием стентов без лекарственного покрытия, что достигается за счет выявления в генотипах пациентов минорных аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и Prol98Leu гена глутатионпероксидазы-1 (GPx-1). В предлагаемом методе исследовалось влияние полиморфизма только после стентирования стентами без лекарственного покрытия. Это обусловлено тем, что использование обоих видов стентов широко распространено в медицинской практике, но в силу преобладания у каждого из них своих видов осложнений требуется дифференцированный подход к вопросу выбора стента.
Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что у пациентов определяют генотипы полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1. В том случае, если у пациента:
- присутствуют только дикие аллели полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1, то есть аллели Glu298 и Pro198, то риск развития рестеноза у него низкий;
- присутствует в генотипе один из минорных аллелей этих полиморфизмов, то есть либо аллель 298Asp полиморфизма Glu298Asp гена eNOS либо аллель 198Leu полиморфизма Pro198Leu гена GPx-1, то риск развития рестеноза у него средний;
- присутствуют оба минорных аллеля полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1, то риск развития рестеноза у него высокий.
Способ осуществляют следующим образом.
Для анализа берут цельную кровь пациента и замораживают ее при -20°C. Выделение ДНК из замороженной цельной крови проводят методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К по стандартной методике. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят с использованием индивидуальных пар праймеров для каждого полиморфизма (табл. 1). Определение генотипа проводят методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, который основан на создании в ходе ПНР естественного сайта рестрикции в одном из аллелей, с использованием фермента индивидуального для каждого полиморфизма (табл. 1). Продукты рестрикции анализируют электрофорезом в 2,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Размер фрагментов определяют с помощью стандарта массы 50 bp.-Ladder фирмы Fermentas.
Носители только диких аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Prol98Leu гена GPx-1, то есть сочетания аллелей Glu298/Pro198, встречаются чаще среди пациентов без рестеноза (51% против 18% среди пациентов с рестенозом). Пациенты, имеющие только один из минорных аллелей этих полиморфизмов, то есть сочетание аллелей 298Asp/Pro298 или Glu298/198Leu, с одинаковой частотой встречаются среди пациентов как с рестенозом, так и без рестеноза (16% против 21% и 21% против 27%, соответственно). Носители обоих минорных аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1, то есть сочетания аллелей 298Asp/198Leu, встречаются чаще среди пациентов с рестенозом (34% против 12%). Риск развития рестеноза у носителей только диких аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1 ниже по сравнению с носителями одного из минорных аллелей и обоих минорных аллелей этих полиморфизмов (ОШ=0,2; 95%ДИ:0,09-0,54). В тоже время риск развития рестеноза у носителей обоих минорных аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1 выше по сравнению с носителями только диких аллелей или одного из минорных аллелей этих полиморфизмов (ОШ=3,7; 95% ДИ:1,35-10,11) (табл. 2).
Предлагаемый метод реализован в следующих клинических наблюдениях.
Пример 1. Больной К., 59 лет, история болезни №4336/05, поступил в отдел проблем атеросклероза ФГУ РКНПК. В анамнезе транслюминальная коронарная ангиопластика со стентированием огибающей артерии стентом без лекарственного покрытия в 2005 году. При генетическом исследовании определены генотипы полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1: GluGlu и ProPro, соответственно. В соответствии с предлагаемым методом, наличие такого сочетания генотипов предполагает низкий риск развития рестеноза в стенте. При проведении контрольной коронарографии гемодинамически значимого сужения в месте ранее установленного стента не выявлено (степень сужения просвета сосуда - 24%).
Пример 2. Больной Л., 59 лет, история болезни №546/06, поступил в отдел проблем атеросклероза ФГУ РКНПК. В анамнезе транслюминальная коронарная ангиопластика со стентированием артерии тупого края стентом без лекарственного покрытия в 2005 году. При генетическом исследовании определены генотипы полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1: GluGlu и ProPro, соответственно. В соответствии с предлагаемым методом, наличие такого сочетания генотипов предполагает низкий риск развития рестеноза в стенте. При проведении контрольной коронарографии гемодинамически значимого сужения в месте ранее установленного стента не выявлено (степень сужения просвета сосуда - 31%).
Больной Г., 53 лет, история болезни №2541/05, поступил в отдел проблем атеросклероза ФГУ РКНПК. В анамнезе транслюминальная коронарная ангиопластика со стентированием передней нисходящей артерии стентом без лекарственного покрытия в мае 2005 года. При генетическом исследовании определены генотипы полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1: GluAsp и LeuLeu соответственно, то есть он является носителем обоих минорных аллелей изученных полиморфизмов. В соответствии с предлагаемым методом, наличие такого сочетания генотипов предполагает высокий риск развития рестеноза в стенте. При проведении контрольной коронарографии выявлен рестеноз в месте ранее установленного стента (степень сужения просвета сосуда - 91%).
Использование предлагаемого способа позволяет прогнозировать развития рестеноза после стентирования коронарных артерий с использованием стентов без лекарственного покрытия по наличию в генотипах пациентов минорных аллелей полиморфизмов Glu298Asp гена eNOS и Pro198Leu гена GPx-1. Это позволит определить тип стента (с лекарственным или без лекарственного покрытия) для каждого конкретного пациента, так как имплантация стента с лекарственным покрытием требует длительного (до 1,5 лет) назначения дополнительных антиагрегантов в связи с повышенным риском поздних тромбозов стентов, что ограничивает возможность последующих инвазивных вмешательств из-за увеличения риска кровотечений.
Способ апробирован в отделе проблем атеросклероза НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ «РКНПК Федерального агентства высоких медицинских технологий» у 101 больного. Он дал достоверно положительные результаты и найдет широкое применение в медицинской практике.