Значение биологических свойств клебсиелл в формировании нарушений микробиоценоза кишечника

ЗНАЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕБСИЕЛЛ В ФОРМИРОВАНИИ НАРУШЕНИЙ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА

ЛЕВАНОВА Л.А., ЗАХАРОВА Ю.В.

ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Кемерово, Россия

ORIGINAL ARTICLE

k

KLEBSIELLA FEATURES ARE ASSOCIATED WITH SEVERITY OF INTESTINAL DYSBIOSIS

LYUDMILA A. LEVANOVA, YULIYA V. ZAKHAROVA

Kemerovo State Medical University (22a, Voroshilova Street, Kemerovo, 650056), Kemerovo, Russian Federation

Резюме

Цель. Изучение факторов персистенции и чувствительности к антибиотикам клебсиелл, выделенных из кишечного содержимого детей при микроэкологических нарушениях различной степени.

Материалы и методы. В работе исследованы 120 штаммов клебсиелл, изолированных из кишечника. Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами. Были изучены антилизоцимная и анти-интерфероновая активность, чувствительность к антибиотикам.

Результаты. Установлено, что клебсиеллы высоко экспрессировали факторы вирулентности и обладали высокой устойчивостью к антибиотикам при III степени дисбактериоза.

Заключение. Полученные данные раскрывают патогенетическую основу развития эндогенных инфекций при микроэкологических нарушениях кишечной микрофлоры.

Область применения. Медицинская микробиология.

Ключевые слова: клебсиеллы, персистен-ция, антибиотики, микробиоценоз, дисбакте-риоз.

English  Abstract

Aim: To study antimicrobial resistance of Klebsiella strains isolated from feces of children with intestinal dysbiosis.

Materials and Methods: We isolated 120 strains of Klebsiella. Isolation and identification of microorganisms were performed by conventional techniques. We then compared antilysozyme and anti-interferon activity along with antimicrobial resistance in strains isolated from children with

intestinal dysbiosis of different severity.

Results: High expression of virulence factors and high antimicrobial resistance of Klebsiella strains were associated with the III degree of intestinal dysbiosis.

Conclusions: High virulence and antimicrobial resistance of Klebsiella strains are associated with severe intestinal dysbiosis.

Keywords: Klebsiella, persistence, antibiotics, microbiota, dysbiosis

Введение

Многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы в процессе эволюции приобретают свойства, направленные не столько на пора-

жение хозяина, сколько на взаимную адаптацию, позволяющую возбудителю длительно персисти-ровать в условиях организма-хозяина. Способность к персистенции связана с бактериальными

VOL. 1, № 1

FUNDAMENTAL

AND CLINICAL MEDICINE

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

субстанциями, выделяемыми преимущественно экзоклеточно. К таким бактериальным экзоком-понентам относится, в частности фактор инакти-вирующий лизоцим хозяина. К секретируемым началам, обеспечивающим персистирование микробной клетки, относится и антиинтерфероно-вый белок, обусловливающий способность бактерий инактивировать бактерицидный компонент лейкоцитарного интерферона человека. В результате возникают хронические инфекции и бактерионосительство [1, 2]. Для лечения инфекций довольно широко используют антибиотики, основное влияние которых, как известно, направлено на сдерживание роста микрофлоры и её уничтожение. Однако антибиотики своим воздействием нарушают «бактериально-грибковое» равновесие в организме, что приводит к размножению условно-патогенных микромицетов, способных вызывать оппортунистические инфекции. Назначение противогрибковых препаратов лишь на время оказывает положительный эффект, однако в дальнейшем, при длительном применении ан-тимикотиков, снижается иммунологическая реактивность макроорганизма, что способствует развитию бактериально-грибковых эндогенных инфекций [3, 4].

Цель исследования

- изучение факторов персистенции и чувствительности к антибиотикам клебсиелл, выделенных из кишечного содержимого детей при микроэкологических нарушениях различной степени.

Материалы и методы

Объектом исследования были 120 штаммов клебсиелл, изолированных от детей 1-го года жизни с дисбактериозами кишечника. Идентификацию бактерий осуществляли с использованием коммерческих тест-систем СИБ для энтеробактерий, набор № 2 (НПО «Микро-ген», Нижний-Новгород). Определение анти-лизоцимного признака и антиинтерфероно-вой активности микроорганизмов проводили с помощью метода отсроченного антагонизма в агаре по P.M. Muriana, T.R. Klaehammer [5], в модификации О.В. Бухарина [6]. Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом с использованием среды Мюллер-Хинтон агар (НИЦФ, Санкт-Петербург) и коммерческих стандартных дисков c аминопенициллинами (ампициллин), аминогликозидами (гентамицин, сизоми-цин), цефалоспоринами (цефазолин, цефотак-

сим, цефуроксим), левомицетином, полимик-сином.

Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1 лицензионное соглашение BXXR 006B092218 FAN 11). Видовой состав клебсиелл, структура микроорганизмов по антилизоцимной (АЛА) и «анти-интерфероновой» (АИА) активности, ан-тибиотикорезистентность представлены в виде относительных величин. Характер распределения переменных величин в рассматриваемой совокупности определяли с помощью построения гистограмм. В связи с тем, что характер распределения данных не соответствовал нормальному, для статистической обработки применяли непараметрические критерии оценки статистической значимости. Сравнение изучаемых частот проводили с помощью критерия . Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Показано, что частота колонизации клеб-сиеллами слизистой кишечника у обследованных детей достигает 60%. При этом на долю Klebsiella oxytoca приходится 57%, Klebsiella pneumoniae - до 43%.

Среди выделенных штаммов клебсиелл установлена широкая распространеннность антилизоцимной и «антиинтерфероновой» активности. Все штаммы клебсиелл обладали АЛА. При этом 61,0% штаммов обладали средним уровнем АЛА (5 - 7 мкг/мл), 26,0% штаммов - высоким (8 - 10 мкг/мл) и у 13,0% штаммов антилизоцимная активность была низкой - менее 5 мкг/мл.

Среди 57 культур K.oxytoca максимальная доля штаммов (89,5%) имела средние и высокие значения АЛА. Из них 57,9% составляли штаммы со средними значениями АЛА в диапазоне от 5 до 7 мкг/мл и только 31,6% имели высокие значения признака от 8 до 10 мкг/мл.

Из 43 штаммов K.pneumoniae средние и высокие значения АЛА определялись у 83,7%. Большинство штаммов (65,1%) K.pneumoniae проявляло признак в пределах 5 - 7 мкг/мл и у 18,6% штаммов АЛА находились в диапазоне от 8 до 10 мкг/мл. Распределение клеб-сиелл с низким уровнем признака выглядело

так: на долю К.охуЮса приходилось 10,5% и К.риеытотае - 16,3% штаммов.

Не менее важным признаком в характеристике биологических свойств клебсиелл является их способность инактивировать бактерицидный компонент интерферона. Проведенные исследования позволили обнаружить у 72% выделенных штаммов клебсиелл «антиинтерфероновую» активность, АИА отсутствовала только у 28% штаммов. Среди К.охуЮса АИА выявили у 71,9% штаммов, а среди К.риеытотае - у 72,1%. Более чем в половине случаев (68,1%) уровень АИА, обнаруженный у клебсиелл, оказался низким (менее 2 ед.), средние (2 - 3 ед.) и высокие (4 - 6 ед.) значения АИА установлены у 26,4 и 5,5% штаммов клебсиелл соответственно. При этом штаммы К.охуЮса со средними и высокими значениями составили 29,3%, К.риеытотае - 34,5%.

При распределении всех штаммов клебси-елл, обладающих высокими АЛА и АИА соответственно степени дисбактериоза, установлено, что при I степени в большинстве случаев выделяются клебсиеллы с низкими значениями АЛА (69,2%) и АИА (71,4%). При II степени дисбактериоза основная часть штаммов обладала средними значениями АЛА и АИА, составляющими, соответ-

ственно, 41% и 47,4%. При III степени дис-бактериоза увеличивается число штаммов клебсиелл с высокими значениями признаков, составивших для АЛА и АИА 53,8% и 50% соответственно. Различия в структуре факторов персистенции у клебсиелл при различной степени микроэкологических нарушений были статистически значимы ( % = 12,8, df=6, р=0,04).

Широкая распространенность факторов персистенции у клебсиелл свидетельствует об их высокой возможности к колонизации и, кроме того, определяет тяжесть и длительность дисбиотических нарушений.

Одним из факторов, характеризующих устойчивость возбудителя к неблагоприятным факторам, является его отношение к антимикробным препаратам. При изучении чувствительности условно-патогенных бактерий, выделенных у детей при дисбиоти-ческих нарушениях кишечной микрофлоры установлено, что при I и II степени дисбак-териоза доля чувствительных штаммов была практически идентична ( %2 =11,3, df=11, р=0,62). Однако при III степени удельный вес чувствительных штаммов статистически значимо снижался соответственно глубине дисбиотических нарушений ( %2 =21,7, df=11, р=0,04) (таблица 1).

Таблица 1. Структура чувствительности/ устойчивости к антибиотикам штаммов клебсиелл, выделенных из кишечника при разных степенях дисбактериоза %)_

Table 1. Antimicrobial resistance of Klebsiella strains isolated from feces of children with intestinal dysbiosis of different severity

СТЕПЕНЬ ДИСБИОЗА

АНТИБИОТИК I II III

S 66,7±8,6 60,0±8,9 36,7±8,8

Цефазолин I 33,3±8,6 36,6±8,8 20,0±7,3

R 0 3,4±3,3 43,3±9,0

S 40,0±8,9 40,0±8,9 6,7±4,5

Цефотаксим I 50,0±9,1 40,0±8,9 43,3±9,0

R 10,0±5,4 20,0±7,3 50,0±9,1

S 55,6±2,8 50,0±9,1 25,0±7,9

Цефуроксим I 26,6±8,0 25,0±7,9 0

R 17,8±6,9 25,0±7,9 75,0±7,9

S 0 0 0

Ампициллин I 0 0 0

R 100 100 100

S 56,6±9,0 53,3±9,1 30,0±8,3

Гентамицин I 30,0±8,3 26,6±8,0 20,0±7,3

R 13,4±6,2 20,1±7,3 50,0±9,0

S 80,0±7,3 80,0±7,3 46,7±9,1

Сизомицин I 10,0±5,4 0 16,6±6,7

R 10,0±5,4 20,0±7,3 36,7±8,7

S 53,3±9,1 50,0±9,1 16,6±6,7

Хлорамфеникол I 10,0±5,4 13,3±6,2 16,6±6,7

R 36,7±8,7 36,7±8,7 66,8±8,6

S 63,3±8,7 53,3±9,1 16,7±6,7

Полимиксин М I 26,6±8,0 33,3±8,6 16,7±6,7

R 10,1±5,4 13,4±6,2 66,7±8,6

Примечание: S - чувствительные; I - промежуточные; R - резистентные.

S is for sensitive; I is for intermediate; R is for resistant. -•-

VOL. 1, № 1

FUNDAMENTAL

AND CLINICAL MEDICINE

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Так, среди цефалоспоринов, использованных в работе, цефазолин подавлял рост 66,7% штаммов клебсиелл при I стадии дисбиоза и 60% - при II; чувсвительность к цефурокси-му при I степени составила 55,6%, а при II - не превышала 50%, тогда как цефотаксим и при I, и при II степени дисбактериоза угнетал рост только 40% выделенных штаммов клебсиелл. Из аминогликозидов сизомицин подавлял рост и размножение 80% штаммов клебсиелл при I и II стадии, а гентамицин -только 56,6% и 53,3% соответственно. Клеб-сиеллы, выделенные при I степени дисбио-тических нарушений, были чувствительны к полимиксину М в 63,3% случаев, а при II -в 53,3%. Хлорамфеникол ингибировал рост 53,3% штаммов при I степени и 50% - при II степени дисбактериоза. При анализе результатов антибиотикограмм у штаммов клебсиелл, выделенных при III степени дисбиотиче-ских нарушений, было отмечено увеличение доли устойчивых и снижение удельного веса чувствительных штаммов к цефалоспоринам, аминогликозидам, левомицетину, полимик-сину М. Так, чувствительными к цефазоли-ну при III степени дисбактериоза оказались только 36,7% штаммов клебсиелл, к цефу-роксиму - 25%. Цефотаксим же ингибировал рост и размножение 6,7% штаммов клебсиелл. Чуствительность к гентамицину и сизо-мицину при III степени дисбиоза была выявлена у 30% и 46,7% штаммов клебсиелл. По-лимиксин М и хлорамфеникол угнетали рост только 16,7% штаммов, тогда как количество резистентных штаммов, выделенных при III степени дисбактериоза, достигало 66,7%. К ампициллину, при всех степенях дисбакте-риоза, выделенные штаммы клебсиелл проявляли 100% устойчивость.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что чувствительность клебсиелл к антимикробным препаратам снижается соответственно усугублению степени дисбиоти-ческих нарушений. Дисбиотические нарушения, вызванные клебсиеллами с высокой ак-

тивностью факторов персистенции, как правило, плохо поддаются коррекции и требуют длительного лечения антимикробными препаратами. Однако частое применение таких препаратов приводит у грамотрицательных бактерий (клебсиелл) к появлению штаммов, устойчивых к антибиотикам. Кроме того, длительное применение антимикробных препаратов приводит к селекции клонов с более выраженными патогенными свойствами, что ведет к потере способности выполнять в полном объеме присущие нормальной микрофлоре физиологические функции. Это, в свою очередь, обусловливает нарушение процессов пищеварения и всасывания. Длительное персистиро-вание клебсиелл с антилизоцимной активностью приводит к снижению количества лизоци-ма, что способствует накоплению гистамина в органах и тканях и сенсибилизации организма. Доказательством этому является большая распространенность аллергических заболеваний среди детей. Антиинтерфероновая активность клебсиелл не только способствует персисти-рованию микробной клетки, но и придает способность бактериям инактивировать лейкоцитарный интерферон. В результате разрушения интерферона снижается неспецифическая резистентность организма и иммунный статус в целом, что проявляется повышенной инфекционной заболеваемостью у детей.

Заключение

Таким образом, степень и длительность дисбиотических нарушений определяется биологическими свойствами условно-патогенных бактерий, выступающих в роли этиологического фактора и способствующих развитию эндогенных инфекций на фоне сниженной иммунологической реактивности макроорганизма. Выявление факторов пер-систенции условно-патогенных бактерий является важным диагностическим признаком, позволяющим использовать более эффективные методы коррекции дисбиотических нарушений кишечного микробиоценоза.в

Литература / References:

1. Grishenko VA, Ivanov UB. The role of the microorganisms' persistence properties in pathogenesis of endogenous infections. Microbiology, epidemiology and immunobiology. 2009; (4): 66-71. Russian (Гриценко В. А., Иванов Ю. Б. Роль персистентных свойств микроорганизмов в патогенезе эндогенный инфекций // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2009. №4. С. 66-71).

2. Leung V, Leversque CM. A stress-inducible quorumsensing peptide mediates the formation of persister cells with noninherited

multidrug tolerance. J Bacteriol. 2012; (194): 2265-2274.

-•-•-

49

3. Aleshkin VA, Aleshkin AV, Afanasev SS, Karaylov AV, Voropaeva EA, Afanasev MS et al. Microbiocenosis of intestine. Voprosy dietologii. 2015; 5(4): 15-52. Russian (Алешкин В.А., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С. и др. Микробиоценоз кишечника // Вопросы диетологии. 2015. Т.5, № 4. С. 15-52).

4. Cho I, Blaser MJ. The human microbiome: at the interface of health and disease. Nat. Rev. Genet. 2012, 13 (4): 18933-18938.

5. Muriana PM, Klaenhammer TR Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity of Lactobacillus acidophilus 88. Appl. Environ Microbiol. 1987; (53): 553-560.

6. Bukharin OV, Valyshev AV, Elagina NN. Photometric determination of antilizotsimny activity of microorganisms. Microbiology, epidemiology and immunobiology. 1997; (4): 117-120. Russian (Бухарин О.В., Валышев А.В., Елагина Н.Н. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1997. №4. С.117-120).

Authors:

Prof. Lyudmila A. Levanova, MD, PhD, Head of the Department of Microbiology, Immunology and Virology, Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation

Dr. Yuliya V. Zakharova, MD, PhD, Associate Professor of Microbiology, Immunology and Virology, Kemerovo State Medical University, Kemerovo, Russian Federation

Acknowledgements: There was no funding for this project.

Корреспонденцию адресовать:

Леванова Людмила Александровна 22а, ул. Ворошилова, Кемерово, 650056, Тел. раб. +7 (3842) 73-28-71 E-mail: micro@kemsma.ru

Corresponding author:

Prof. Lyudmila A. Levanova,

Voroshilova Street 22a, Kemerovo, 650029, Russian

Federation

E-mail: micro@kemsma.ru