Эритроцитарно-тромбоцитарный механизм иммуномодулирующих эффектов эспа-липона и фосфоглива при острой гемической гипоксии

8. Марков Х.М. Простаноиды и атеросклероз // Патологическая физиология. - № 1. - 2004. -С. 2-8.

9. Марков Х.М. Сосудистые эффекты липопро-теинов и оксида азота: клеточные и молекулярные механизмы // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2006. -№ 3. - С. 2-7.

10. Покровский М.В., Кочкаров В.И., Покровская Т.Г. и др. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции // Российский журнал иммунологии. - 2006. - Т. 9. - С. 6061.

11. Покровский М.В., Скопин Д.Е., Артюшко-ва Е.Б. и др. Исследование кардиопротектив-ного действия каптоприла в эксперименте с регистрацией трансмуральной компрессии в очаге ишемии // Человек и лекарство. - М., 1997.- С. 102.

12. Репин А.Н. Оценка кардиопротективного действия эмоксипина при тромболитической реперфузии миокарда // Кардиология. - 1994. -Т. 3, № 34. - С. 4-7.

13. Bonetti P.O., Lerman L.O., Lennan A. // Arterio-scler. Tliromb. Vase. Biol. - 2003. - Vol. 23, N 2. - P. 168-175.

14. Boger R.H., Bode-Boger S.M., Brandes R.P. et al. Dietary L-arginine reduces the progression of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits— comparison with lovastatin // Circulation. -1997. - Vol. 96. - P. 1282-1290.

15. Esposito K., Nappo F., Giugliano G. et al. Effect of dietary antioxidants on endothelial dysfunction induced by high-fat meel // Am. J. Clin. Nutrition. - 2003. - Vol. 77, N 1. - P. 139-143.

16. Frisbee J.C., Stepp D.W. Impaired NO-dependent dilation of skeletal muscle arterioles in hypertensive diabetic obese Zucker rats // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2001. - Vol. 281. -P. H1304-H1311.

17. Heitzer T., Schlinzig T., Krohn K. et al. Endothelial dysfunction, oxidative stress, and risk of cardiovascular events in patients with coronary artery disease // Circulation. - 2001. - Vol. 104. -P.2673-2678.

18. Heilzer T., Schlinzig T., Krohn K. et al. Antioxidant vitamin C improves endothelial dysfunction in chronic smokers // Circulation. - 2001. -Vol. 104, N 22. - P. 2638-2646.

19. Herbst U., Toborek M., Kaiser S. et al. Hy-droxynonenal induces dysfunction and apoptosis in cultured endothelial cells // J. Cell. Physiol. -

1999. - Vol. 181. - P. 295-303.

20. Landmesser U., Hornig B., Drexler H. Pharmacological approaches to improve endothelial repair mechanisms // Circulation - 2004. -Vol. 109, N 21, suppl. 1. - P. 1129-1133.

21. Landmesser U., Spiekermann S., Dikalov S. et al. Vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in patients with chronic heart failure: Role of xanthine-oxidase and extracellular superoxide dismutase // Circulation. - 2002. -Vol. 106. - P. 3073-3078.

22. Laufs U., La F., Plutzky J., Liao J.K. Upregula-tion of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors // Circulation. - 1998. -Vol. 97. - P. 1129-1135.

23. Nigris F., Lerman L.O., Ignarro S.W. et al. Beneficial effect of antioxidants and L-arginine on oxidant-sensitive gene expression and endothelial NO synthase activity at sites of disturbed shear stress // PNAS. - 2003. - Vol. 100. - P. 14201425.

24. Somers M.J., Harrison D.J.Reactive oxygen species and the control of vasomotor tone // Curr. Hypertens. Rep. - 1999. - Vol. 1. - P. 102-108.

25. Suzuki T., Fukuo K., Suhara T. et al. Eicosapen-taenoic acid protects endothelial cells against anoikis through restoration of cFLIP // Hypertension. - 2003. - Vol. 42. - P. 342-348.

26. Taniyama Y., Griendling K.K. Complex multiplication of abelian varieties and applications to number theory/ Hypertension // Hypertension. -2003. - Vol. 42, N 6. - P. 1075-1081.

27. Touys R.M. Oxidative stress and vascular damage in hypertension // Curr. Hypertens. Rep. -

2000. - Vol. 2. - P. 98-105.

28. Vladimirova-Kitova L.G. Asymmetric dime-thylarginine--mechanisms and targets for therapeutic management // Folia Med. - Plovdiv, 2008. - Vol. 50, N 1. - P. 12-21.

УДК 612.273.2:616-097:615.37

ЭРИТРОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНЫЙ МЕХАНИЗМ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ

ЭФФЕКТОВ ЭСПА-ЛИПОНА И ФОСФОГЛИВА ПРИ ОСТРОЙ ГЕМИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

© Николаев С.Б., Лазаренко В.А., Быстрова Н.А.

Кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета, Курск

E-mail: main@kgmu.kursknet.ru

Острая гемическая гипоксия приводит к развитию вторичного иммунодефицита, усилению перекисно-го окисления липидов, снижению показателей энергетического и антиоксидантного статуса эритроцитов, индуцирует появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов. Иммуносупрессия при острой гемической гипоксии реализуется при участии тромбоцитов. Легкие эритроциты в присутствии сывороточных факторов усиливают индуцированные кровопотерей иммуносупрессирующие свойства тромбоцитов. Сочетанное использование фосфоглива и эспа-липона нормализует иммунометаболические нарушения, развивающиеся в условиях острой гемической гипоксии, реализуясь через эритроцитарно-тромбоцитарный механизм.

Ключевые слова: гемическая гипоксия, иммуномодулирующие эффекты, фосфоглив, эспа-липон, эритроцитарно-тромбоцитарный механизм.

COOPERATION OF ERYTHROCYTES AND THROMBOCYTES IN THE REALIZATION OF IMMUNOMODULATING EFFECTS OF ESPA-LIPON AND PHOSPHOGLIV IN THE CASE OF

ACUTE HEMIC HYPOXIA Nikolaev S.B., Bystrova N.A., Konoplya A.I.

Biochemistry Department of the Kursk State Medical University, Kursk An acute hemic hypoxia results in the development of a secondary immune deficiency, the increase of lipid peroxide oxidation, the decrease of energy indexes and antioxidant erythrocyte’s status, induces appearance of the immunosuppressive properties at the light fraction of erythrocytes. Immunosuppression due to acute hemic hypoxia is realized at participation of the thrombocytes. The light erythrocytes at the presence of the serumal factors strengthen immunosuppressive properties of thrombocytes, induced by hemorrhage. Combined introduction of Es-pa-lipon and Phosphogliv in this case normalizes immunometabolic disturbances being realized through the cooperation of erythrocytes and thrombocytes.

Keywords: hemic hypoxia, immunomodulating effects, Espa-lipon, Phosphogliv, cooperation of erythrocytes and thrombocytes.

Выраженные нарушения энергетического гомеостаза возникают при острой кровопоте-ре, приводящей к развитию гемической гипоксии, в основе которой лежит утрата организмом части объема циркулирующей крови. Нарушение энергообеспечения является прямым следствием возникающих при острой кровопотере гипоксии тканей, усиления анаэробного гликолиза, истощения резерва углеводов, гипогликемии. Индуцируемое гипогликемией ускорение липолиза в жировых депо приводит к развитию гиперлипидемии и разобщению окислительного фосфорилиро-вания в митохондриях [13]. Возможности коррекции иммунных нарушений при острой

субмаксимальной кровопотере, токсической анемии, гепатопатиях лизоцимом, комбинациями препаратов регуляторов углеводного обмена и мембранопротекторов изучены в работах ряда авторов [2, 8, 9]. Однако механизмы возникающих нарушений раскрыты еще не до конца. В связи с этим сохраняет свою актуальность проблема поиска эффективных фармакологических иммунокорректоров на основе изученных механизмов изменения иммунометаболических показателей при острой гемической гипоксии (ОГГ).

Коррекция нарушений биоэнергетических процессов может быть достигнута введением соединений, активирующих этапы метабо-

лизма основных энергоносителей. К числу таких соединений относится эспа-липон, действующим началом которого является альфа-липоевая кислота (а-ЛК). Под действием а-ЛК происходит усиление окислительного и неокислительного распада глюкозы, активация пентозофосфатного цикла, ускорение утилизации липидов. Эффективность иммуномодулирующего действия регуляторов энергетического обмена в значительной степени определяется состоянием билипидного каркаса клеточных мембран [13]. ОГГ вызывает значительное нарушение их структуры, вследствие усиления процессов перекисного окисления липидов. Поэтому есть основания ожидать, что применение стабилизаторов клеточных мембран повысит эффективность действия регуляторов энергетического обмена в условиях ОГГ.

Высокой антиоксидантной и мембраностабилизирующей активностью обладают по-линенасыщенные фосфолипиды. В клинической практике широкое распространение получил новый препарат с гепатопротекторной активностью - фосфоглив. Механизм действия фосфоглива складывается из двух составляющих. Первая - аналогична действию эссенциальных фосфолипидов (фосфатидил-холин восстанавливает поврежденные мембраны подобно мембранному клею). Вторая обусловлена натрием глицирризинатом, который обладает противовоспалительным, ан-тиоксидантным и иммуномодулирующим действием.

Принципиально важным для понимания механизма иммуносупрессирующего влияния различных стресс-индуцирующих агентов является выявление клеточных элементов микроокружения иммуноцитов в регуляции функции последних. В литературе имеются сведения о важной роли эритроцитов и тромбоцитов в сопряжении метаболических эффектов, вызываемых различными внешними агентами, и функцией иммуноцитов [7].

Данные теоретические предпосылки определили цель исследования: изучение им-мунометаболических эффектов сочетанного использования эспа-липона и фосфоглива в условиях ОГГ и установление роли форменных элементов крови в реализации их иммуномодулирующих эффектов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на крысах обоего пола массой 180-220 г. с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Острую гемическую гипоксию вызывали по Барнет кровопотерей 1,5% массы тела животного [18]. Препараты вводили крысам внутрибрюшинно в дозах: эспа-липон

- 50 мг/кг веса и фосфоглив - 200 мг сухого лиофилизированного порошка /кг веса за 1 ч до кровопотери и четырехкратно с интервалом в 24 ч после кровопотери.

Крыс иммунизировали однократным вну-трибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ) на первые сутки после моделирования ОГГ. О выраженности гуморального иммунного ответа (ГИО) судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) [6] в селезенке на пятые сутки после иммунизации. О выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на ЭБ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального подколенных лимфатических узлов (РМЛ) на пятые сутки после иммунизации [15]. Функционально-метаболическую активность

(ФМА) нейтрофилов крови оценивали по величинам фагоцитарного числа (ФЧ), фагоцитарного индекса (ФИ), показателей спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-теста (НСТ-сп. и НСТ-инд.) [11,16]. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах оценивали по содержанию в них ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА) [1], энергообеспечение - по содержанию в них АТФ и 2,3-бисфосфоглицерата (БФГ) [4], а их анти-оксидантный статус - по активности супе-роксиддисмутазы (СОД) и глутатионредукта-зы (ГР) [10].

Эритроциты крыс выделяли по Веиіег [17] и фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина [12] на две фракции: легкую (ё<1,079 г/см3) и тяжелую (ё>1,117 г/см3). Иммуномодулирующие свойства фракций эритроцитов крыс, подвергнутых острой гемической гипоксии (КПОГГ), определяли путем трехкратного (с интервалом в

Таблица 1

Влияние эспа-липона и фосфоглива на антиоксидантный и энергетический статус эритроцитов, ___________________развитие ГИО и ГЗТ, ФМА нейтрофилов у КПОГГ________________________

№ п/п Показатели Условия опыта

Контроль КПОГГ КПОГГ + фосфоглив КПОГГ + эспа-липон КПОГГ + фосфоглив + эспа-липон

1 2 3 4 5

1. СОД 52,1±3,2 33,2±2,4*1 34,6±2,6М 35,1±2,5*1 51,6±3,1 2-4

2. ГР 104,7±7,3 72,4±4,9*1 74,6±5,1*1 73,0±5,0*1 103,5±7,1*2-4

3. АГП 1,2±0,1 3,7±0,4*1 3,5±0,3*1 3,4±0,3М 1,4±0,15*2-4

4. МДА 43,6±3,0 65,1±4,5*1 63,9±4,5*1 62,5±4,3*1 41,8±2,9*2-4

5. БФГ 5,6±0,3 3,3±0,2*1 3,5±0,2*1 5,4±0,3*2-3 5,7±0,4*2-3

6. АТФ 1,8±0,2 0,6±0,1*1 0,7±0,1 1 1,6±0,2*2-3 1,9±0,2*2-3

7. АОК 25,7±2,1 9,6±0,8*1 14,2±1,3*12 12,0±1,0*1 24,1±2,0*2-4

8. РМЛ 5,3±0,4 2,7±0,2^ 3,6±0,3^ 3,2±0,3М 5,2±0,4*2-4

9. ФИ 43,4±3,8 20,9±1,7*1 29,6±2,3*1,2 24,5±1,9*1 42,8±3,6*2-4

10. ФЧ 1,7±0,2 0,8±0,1*1 1,25±0,1 *1,2 1,0±0,1*1 1,8±0,2*2-4

11. НСТ-сп. 12,1±0,8 8,0±0,6*1 8,4±0,6*1 8,7±0,7*1 11,6±0,8*2-4

12. НСТ-инд. 33,2±2,5 17,1±1,4*1 24,5±1,7*1,2 19,4±1,5*1 32,8±2,4*2-4

Примечание: 1. * - достоверность различий средних арифметических величин, р<0,05, цифры рядом со звездочкой обозначают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны; 2. СОД - ЕД/мл эритроцитов; АГП -АБ233/мл эритроцитов; ГР, МДА, БФГ, АТФ - мкмоль/мл эритроцитов; АОК - тыс. на орган; РМЛ - мг; ФИ - %; ФЧ -количество поглощенных частиц на один фагоцит.

24 ч) внутривенного введения (по 10 клеток на 1 кг массы) интактным аллогенным реципиентам. Иммунизацию животных ЭБ проводили в последний день введения аллогенных эритроцитов.

Плазму, дефицитную по тромбоцитам и обогащенную тромбоцитами, получали путем центрифугирования гепаринизированной крови (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) в течение 5 минут при 180§ [5]. После расслоения крови на плазму, лейкоцитарный слой и эритроциты, отбирали первый слой и центрифугировали в течение 10 минут при 600§.

Супернатант представлял собой плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОТ). Для получения тромбоцитов и плазмы, дефицитной по тромбоцитам (ПДТ), ПОТ центрифугировали в течение 15 минут в градиенте плотности человеческого альбумина при 1000§. После

выделения ПДТ и тромбоцитов, взвесь последних пропускали через колонку с сефаро-зой 2В, получая концентрированную и очищенную взвесь тромбоцитов. ПОТ и ПДТ использовали для обработки легких эритроцитов (107 клеток инкубировали в 1 мл плазмы в течение 1 часа при 37°С). Тромбоциты и легкие эритроциты инкубировали в плазме крови (108 тромбоцитов плюс 107 эритроцитов в 1 мл плазмы, 30 минут при 37°С). Иммуномодулирующая активность инкубата определялась путем трехкратного (с шестичасовым интервалом) внутривенного введения здоровым аллогенным реципиентам, которых иммунизировали ЭБ при последнем поступлении инкубата [5].

Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась с помощью однофакторного дисперси-

онного анализа - ЛКОУЛ, критерия Ньюме-на-Кейлса и Стьюдента с поправкой Бонфер-рони в программном комплексе "БИОСТАТИСТИКА для Windows".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У КПОГГ установлена супрессия формирования гуморальной и клеточной форм иммунного ответа, угнетение ФМА нейтрофи-лов, усиление ПОЛ и снижение показателей энергетического статуса эритроцитов (табл. 1).

Выявлено, что фосфоглив не влиял на величину показателей, характеризующих анти-оксидантный потенциал и энергетический статус эритроцитов КПОГГ. Эспа-липон не влиял на антиоксидантный потенциал и выраженность ПОЛ, но нормализовал энергетический статус эритроцитов, нарушенный ОГГ. У КПОГГ, получавших эспа-липон и фосфоглив одновременно, показатели метаболического состояния эритроцитов не отличались от контроля (табл. 1).

Сочетанное применение фосфоглива и эс-па-липона нормализовало ФМА нейтрофилов крови и развитие обеих форм иммунного ответа у животных с кровопотерей 1,5% от массы тела. Эспа-липон не влиял на иммунный статус КПОГГ, а фосфоглив обладал умеренной иммуностимулирующей активностью, полностью не нормализуя исследуемые показатели (табл. 1).

ОГГ индуцирует появление иммуносу-прессирующих свойств у легких эритроцитов и не влияет на иммуномодулирующую активность тяжелых клеток. Легкие эритроциты КПОГГ, получавших фосфоглив, при алло-генном переносе супрессируют развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ в такой же степени, как и клетки КПОГГ, не получавших препарат. На свойства тяжелых эритроцитов фосфоглив не оказывал влияния. Эспа-липон отменял иммуно-супрессирующие свойства легких эритроцитов КПОГГ и не влиял на свойства тяжелых клеток. При совместном введении фосфогли-ва и эспа-липона легкие эритроциты теряли иммуносупрессирующие свойства, а тяжелые приобретали способность стимулировать развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ при аллогенном переносе. Введение фосфоглива не влияло на

способность легких эритроцитов КПОГГ снижать ФМА мононуклеаров периферической крови здоровых крыс. Тяжелые эритроциты КПОГГ, получавших фосфоглив, увеличивают фагоцитарную и кислородзависи-мую бактерицидную активность нейтрофи-лов. Введение эспа-липона уменьшало угнетающее влияние легких эритроцитов на фагоцитарные показатели, а совместное введение фосфоглива и эспа-липона индуцировало появление у тяжелых эритроцитов КПОГГ способности повышать ФМА мононуклеаров и отменяло иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов (табл. 2).

Постоянной составной частью микроокружения иммуноцитов в крови являются эритроциты и тромбоциты. Эффективным индуктором активации тромбоцитов являются окисленные липопротеиды низкой плотности (ЛНП). Окислительно-модифицированные ЛНП в определенной степени обуславливают появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов и повышение функциональной активности тромбоцитов. В связи с этим обоснованным является предположение о взаимосвязи между этими феноменами при различных состояниях организма, характеризующих возникновение окислительного стресса и о важной роли окислительно-модифицированных ЛНП и, возможно, других продуктов ПОЛ в реализации этой взаимосвязи.

Принимая во внимание высказанное предложение, можно ожидать, что антиоксиданты и мембраностабилизаторы окажутся эффективными средствами отмены иммуно-супрессирующей активности тромбоцитов. Учитывая прямую зависимость между энергообеспечением клеток, интенсивностью ПОЛ есть основания считать, что ингибирование иммуносупрессирующей активности тромбоцитов может быть достигнуто введением препаратов нормализующих энергообеспечение клеток. Изучена иммуномодулирующая активность тромбоцитов и их инку-батов с эритроцитами и сывороткой, полученными от интактных животных и КПОГГ. Оказалось, что внутривенное введение крысам тромбоцитов интактных животных не влияло на развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. В противоположность этому инъекции тромбоцитов, выделенных из крови

КПОГГ, супрессировали развитие обеих форм иммунного ответа (табл. 3).

Эти данные свидетельствуют о том, что после кровопотери повышается функциональная активность тромбоцитов, одним из

проявлений которой является появление у них иммуносупрессирующих свойств.

Фосфоглив или эспа-липон не индуцировали появления иммуномодулирующих свойств у тромбоцитов здоровых крыс и сни-

Таблица 2

Влияние эритроцитов КПОГГ, получавших эспа-липон и фосфоглив, на ФМА нейтрофилов,

развитие ГИО и ГЗТ у интактных крыс

У словия опыта Показатели

АОК РМЛ ФИ ФЧ НСТ-сп. НСТ-инд.

1. К 25,7±2,1 5,3±0,4 43,4±3,8 1,7±0,2 12,1±0,8 33,2±2,5

Введение эритроцитов КПОГГ

2. ЛЭ 11,2±0,9*1 3,2±0,2М 23,1±1,7*1 0,9±0,1*1 8,1±0,6*1 18,2±1,5*1

3. ТЭ 24,5±2,1 5,1±0,4 42,1±3,7 1,65±0,15 11,8±0,8 33,6±2,5

Введение эритроцитов КПОГГ, получавших фосфоглив

4. ЛЭ 13,Ш,1*Х 3,4±0,25*х 26,4±1,9*1 0,9±0,1*1 8,2±0,6*1 19,0±1,6*1

5. ТЭ 23,8±2,0*9 5,4±0,4*9 57,5±4,4*1,3 2,4±0,2*1,3 15,4±0,9*1,3 43,6±3,2*1,3

Введение эритроцитов КПОГГ, получавших эспа-липон

6. ЛЭ 25,1±2,0*2,4 5,2±0,4*2,4 32,2±2,4*1,2 1,4±0,15*2,4 10,8±0,7*2,4 25,4±1,8*2,4

7. ТЭ 26,0±2,2*9 5,3±0,4*9 43,7±3,9*5 1,7±0,2*5,9 12,3±0,9*5,9 32,5±2,6*5,9

Введение эритроцитов КПОГГ, получавших эспа-липон и фосфоглив

8. ЛЭ 26,3±2,2*2,4 5,4±0,4*2,4 44,1±3,7*2’4’6 1,7±0,2*2,4 12,8±0,9*2,4 33,7±2,4*2’4’6

9. ТЭ 39,1±3,1*1,3 7,2±0,5*1,3 61,8±4,8*1,3,7 2,7±0,25*1,3 17,3±1,0*1,3 49,3±3,6*1,3

Примечание: К - контроль; ЛЭ - легкие эритроциты; ТЭ - тяжелые эритроциты

Таблица 3

Влияние тромбоцитов КПОГГ, получавших фосфоглив и эспа-липон, на развитие ГИО и ГЗТ

у здоровых животных

№ п\п Условия опыта АОК РМЛ

1. Контроль (без введения тромбоцитов) 25,7±2,1 5,3±0,4

2. Введение тромбоцитов интактных крыс 25,1±2,0 5,25±0,4

3. Введение тромбоцитов здоровых крыс, получавших фосфоглив 27,5±2,2 5,4±0,45

4. Введение тромбоцитов здоровых крыс, получавших эспа-липон 24,9±1,9 5,2±0,35

5. Введение тромбоцитов КПОГГ 11,8±1,0*1-4 2,9±0,2*1-4

6. Введение тромбоцитов КПОГГ, получавших фосфоглив 18,3±1,4*1-5 3,8±0,25*1-5

7. Введение тромбоцитов КПОГГ, получавших эспа-липон 17,5±1,3*1-5 3,6±0,2*1-5

Таблица 4

Влияние плазмы, дефицитной по тромбоцитам, обогащенной тромбоцитами, и тромбоцитов интактных крыс и КПОГГ на иммуномодулирующие свойства эритроцитов интактных крыс

№ п\п Условия опыта АОК РМЛ

1. Контроль (без введения тромбоцитов) 25,7±2,1 5,3±0,4

2. Введение нативных эритроцитов 25,1+2,1 5,2+0,35

3. Введение эритроцитов, инкубированных с ПИКДТ 26,0±2,2 5,5±0,4

4. Введение эритроцитов, инкубированных с ПИКОТ 24,8±2,0 5,1±0,3 5

5. Введение эритроцитов, инкубированных с ТИК 26,7±2,3 5,4±0,4

6. Введение эритроцитов, инкубированных с ПКПОГГДТ 24,8±2,0 5,2±0,4

7. Введение эритроцитов, инкубированных с ПКПОГГОТ 16,2+1,2*1'6 3,5+0,25*1'6

8. Введение эритроцитов, инкубированных с ТКПОГГ 8,3+0,7*1-7 2,4+0,2*1-7

Таблица 5

Влияние инкубата ТИК и ЭИК, раздельно обработанных сывороткой КПОГГ, на развитие

ГИО и ГЗТ у здоровых крыс

№ п\п Условия опыта АОК РМЛ

1. Контроль (без введения инкубатов) 25,7±2,1 5,3±0,4

2. Введение инкубата ТИК, обработанных СКПОГГ, с ЭИК 16,2+1,2*1 3,8+0,3**

3. Введение инкубата ЭИК, обработанных СКПОГГ, с ТИК 10,8+0,9*1’2 2,6+0,2*1,2

Примечание: СКПОГГ - сыворотка КПОГГ.

Таблица 6

Влияние супернатанта и осадочной фракции, выделенной из инкубата ТИК и ЭИК в СКПОГГ на

развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс

№ п\п Условия опыта АОК РМЛ

1. Контроль 25,7+2,1 5,3+0,4

2. Введение супернатанта 18,4+1,4** 4,0±0,3*1

3. Введение осадочной фракции 12,1+1,О*1’2 2,9+0,2*и

Таблица 7

Влияние эспа-липона и фосфоглива на активность клеточных компонентов системы реализации

иммуносупрессирующего эффекта ОГГ

№ п/п Условия опыта АОК РМЛ

1. Контроль 25,7±2,1 5,3±0,4

2. Введение инкубата ТИК, ЭИК и СКПОГГ 11,2±0,9*1 2,7± 0,2**

Введение инкубата ЭИК, СКПОГГ и ТИК к рыс, получавших:

3. Фосфоглив 24,3±1,9*2 5,0±0,35*2

4. Эспа-липон 12,8±1,0*и 2,8±0,2*и

Введение инкубата ТИК, СКПОГГ и ЭИК к рыс, получавших:

5. Фосфоглив 10,4±0,9*и 2,7±0,2*и

6. Эспа-липон 25,1±2,2*2’4’5 5,2±0,4*2’4’5

жали, но не отменяли полностью, иммуносу-прессирующую активность тромбоцитов КПОГГ (табл. 3).

ОГГ приводит к появлению иммуносу-прессирующих свойств у легких эритроцитов. Естественно возник вопрос о взаимосвязи тромбоцитов и эритроцитов в реализации иммуносупрессирующего эффекта кровопо-тери. Для его выяснения изучены иммуномодулирующие свойства эритроцитов интакт-ных крыс, инкубированных с плазмой, обогащенной тромбоцитами, дефицитной по тромбоцитам или осажденными из плазмы тромбоцитами интактных крыс и КПОГГ.

Установлено, что плазма интактных крыс, дефицитная по тромбоцитам (ПИКДТ), не индуцирует появление иммуномодулирующих свойств у эритроцитов интактных крыс. Неактивной была также плазма интакт-ных крыс, обогащенная тромбоцитами (ПИ-КОТ). Инкубат эритроцитов интактных крыс (ЭИК) с тромбоцитами интактных крыс (ТИК) при аллогенном переносе не влиял на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Плазма КПОГГ, бедная тромбоцитами (ПКПОГГДТ), как и плазма интактных крыс, не индуцировала появление иммуномодулирующих свойств у ЭИК. В отличие от этого плазма КПОГГ, обогащенная тромбоцитами (ПКПОГГОТ), вызывала появление иммуно-супрессирующей активности. Инкубат ЭИК с тромбоцитами КПОГГ (ТКПОГГ) при алло-генном переносе значительно супрессировал развитие иммунного ответа на ЭБ (табл. 4).

Сопоставление иммуносупрессирующей активности ТКПОГГ и инкубатов ТКПОГГ с

ЭИК показало, что вторая значительно выше первой. Показатели АОК и РМЛ реципиентов ТКПОГГ были соответственно в 2,2 и 1,8 раза ниже, чем в контроле. В то же время показатели АОК и РМЛ реципиентов инкубата ТКПОГГ с ЭИК были ниже контрольного уровня соответственно в 3,1 и 2,3 раза.

Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что тромбоциты участвуют в развитии иммуносупрессии при ОГГ, а также что это действие тромбоцитов усиливается легкими эритроцитами и соединениями, накапливающимися в сосудистом русле после кровопотери.

На основании полученных результатов можно считать, что в крови КПОГГ накапливаются соединения, являющиеся необходимым звеном взаимодействия тромбоцитов и эритроцитов, приводящего к появлению у них способности вызывать иммуносупресси-рующий эффект при аллогенном переносе. Неясным остается вопрос - влияют ли сывороточные соединения на отдельные клеточные элементы инкубата или мишенью для них являются эритроцитарно-тромбоцитар-ные агрегаты. Проведены эксперименты, в которых ТИК или ЭИК в начале инкубировали в среде, содержащей сыворотку КПОГГ, а затем, после отмывания сыворотки, инкубировали с другим необработанным сывороткой клеточным компонентом. Показано, что в случае предварительной обработки сывороткой ТИК, инкубат ТИК с ЭИК при аллоген-ном переносе вызывал слабо выраженный иммуносупрессирующий эффект. При обработке сывороткой ЭИК инкубат ТИК с ЭИК

значительно супрессировал развитие иммунного ответа на ЭБ у аллогенных животных (табл. 5). Выраженность этой супрессии была существенно выше, чем при введении ТИК или ЭИК, обработанных сывороткой КПОГГ.

Результаты этих экспериментов позволяют предположить, что наиболее эффективная активация тромбоцитов происходит при связывании их с мембраной эритроцитов, включившей соединения сыворотки КПОГГ. Таким образом, эритроциты выполняют адап-торную функцию в процессе активации тромбоцитов модифицированными сывороточными факторами. Разделение тромбоцитов и эритроцитов, содержащихся в инкубате, методом центрифугирования с последующим аллогенным переносом супернатанта, содержащего тромбоциты, и взвеси осадка эритроцитов показало, что супернатант вызывает слабовыраженный иммуносупрессирующий эффект, а осадок приводит к выраженному угнетению ГИО и ГЗТ, индуцированных у реципиентов ЭБ (табл. 6). Вероятно, агрегат, включающий эритроциты и фиксированные на них тромбоциты, генерирует более сильный иммуносупрессорный сигнал, чем диспергированные в плазме тромбоциты.

Выше было показано, что эспа-липон и фосфоглив уменьшают выраженность имму-носупрессирующих свойств тромбоцитов КПОГГ. Не исключено, что это действие этих препаратов обусловлено их влиянием на различные звенья иммуносупрессорного механизма, зависимого от эритроцитов, тромбоцитов и сывороточных соединений КПОГГ. Для выяснения этого вопроса изучили влияние эспа-липона и фосфоглива на иммуносу-прессорную активность инкубатов ТИК и ЭИК в сыворотке КПОГГ. Установлено, что фосфоглив не влиял на свойства легких эритроцитов интактных крыс, но отменял способность тромбоцитов реагировать появлением иммуносупрессирующей активности после инкубации с ЭИК и сывороткой КПОГГ. Эс-па-липон не влиял на тромбоциты, но отменял способность легких эритроцитов ин-тактных крыс приобретать иммуносупресси-рующие свойства после инкубации с ТИК и сывороткой крови КПОГГ (табл. 7).

Одной из составляющих иммунокорригирующего эффекта изученной комбинации является нивелирование энергетического

дисбаланса иммуноцитов в условиях гипоксии, а второй не менее важной - изменение свойств клеток микроокружения - эритроцитов и тромбоцитов.

Имеющиеся в литературе данные однозначно свидетельствуют о том, что эритроциты участвуют в регуляции физиологических функций при различных формах патологии и стресса, в том числе в сопряжении метаболических эффектов, вызываемых различными внешними агентами, и функцией иммуноци-тов.

Тромбоциты выделяют катионный белок, известный под названием тромбоцитарный катионный белок (ТКБ). Метаболическое и биологическое действия ТКБ определяется его мембранопротекторностью, способностью регулировать ПОЛ и функциональное состояние мембран клеток различных физиологических систем [14]. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют об участии ТКБ в клеточной кооперации "тромбоцит-эритроцит-макрофаг" [3]. Не исключено, что следствием тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий является выделение тромбоцитами биологически активных соединений и модификация мембраны эритроцитов. Оба эти эффекта могут существенно повлиять на функциональную активность иммуноцитов и привести к изменению иммунологической реактивности организма в целом [7].

Приведенные в настоящей работе данные позволяют предположить, что при кровопо-тере тромбоциты при участии сывороточных соединений, взаимодействуя с легкими эритроцитами, индуцируют появление у них им-муносупрессирующих свойств за счет образования тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов и модификации структур мембраны легких эритроцитов биологически активными соединениями, выделяющимися активированными тромбоцитами. Есть основания считать, что необходимым условием реализации предполагаемых событий является усиление процессов ПОЛ в тромбоцитах и эритроцитах, а также снижение энергообеспечения в эритроцитах.

Результаты проведенных экспериментов подтверждают эти предположения: фосфоглив и эспа-липон действуют на различных звеньях механизма развития иммуносупрессии, реализующегося при участии тромбоци-

тов, эритроцитов и сывороточных факторов. Сочетанное использование двух препаратов показало, что фосфоглив оказывает селективное влияние на протективную активность эс-па-липона в отношении функций иммуноци-тов, эритроцитов и тромбоцитов в условиях ОГГ. Эти свойства обусловлены стабилизацией клеточных мембран фосфогливом, а, следовательно, и более эффективной работой связанных с ними ферментов, являющихся точкой приложения а-ЛК: фосфоглив и эспа-липон при совместном применении нормализовали не только энергетический статус эритроцитов, но и показатели характеризующие их про- и антиоксидантный баланс; обладали выраженным иммуностимулирующим действием.

Комбинация эспа-липона и фосфоглива предотвращает появление иммуносупресси-рующих свойств у ЛЭ и индуцирует появление иммуностимулирующей активности у ТЭ. Фосфоглив, по-видимому, предотвращает активацию тромбоцитов сывороточными соединениями (возможно продуктами ПОЛ). Механизм действия эспа-липона, вероятно, обусловлен увеличением энергообеспечения эритроцитов, изменением эпитопных структур мембраны эритроцитов, следствием чего является снижение способности этих клеток взаимодействовать с субстанциями сыворотки и тромбоцитами.

Общность направленности и в значительной степени выраженность сдвигов, наблюдающихся при различных формах стресса и патологии, сочетается с неодинаковой эффективностью корригирующего действия различных фармакологических средств. Однако, полученные нами результаты согласуются с данными о выраженной иммуноме-таболической эффективности совместного применения энергизаторов и антиоксидантов при физических нагрузках, голодании, отравлении гепатотропными и гемолитическими ядами [9, 13]. При этом достоинствами указанной комбинации препаратов являются несколько точек приложения, что позволяет более эффективно корригировать нарушения возникающие при ОГГ. Таким образом, получается, что:

1. Острая гемическая гипоксия супресси-рует гуморальную и клеточную формы иммунитета, угнетает функционально-метаболи-

ческую активность нейтрофилов, усиливает перекисное окисление липидов и снижает показатели энергетического статуса эритроцитов.

2. Острая гемическая гипоксия индуцирует появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов и не влияет на иммуномодулирующую активность тяжелых клеток.

3. Иммуносупрессия при острой гемиче-ской гипоксии реализуется при участии тромбоцитов. Легкие эритроциты в присутствии сывороточных факторов усиливают индуцированные кровопотерей иммуносу-прессирующие свойства тромбоцитов.

4. Сочетанное использование фосфогли-

ва и эспа-липона нормализует иммуномета-болические нарушения, развивающиеся в условиях острой гемической гипоксии, реализуясь через эритроцитарно-

тромбоцитарный механизм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бенисевич В.И., Идельсон Л.И. Образование перекисей непредельных жирных кислот в оболочке эритроцитов при болезни Мар-киафавы-Микели // Вопр. мед. химии. - 1973.

- Т. 19, № 6. - С. 596-599.

2. Бровкина И.Л., Рыбников В.Н. Иммуномета-болические эффекты, вызываемые лизоцимом при острой кровопотере // Патол. физиол. и эксперим. терапия. - 2004. - № 2. - С. 14-16.

3. Бухарин О.В., Сулейманов К.Г. Свойства и функции тромбоцитарного катионного белка // Успехи совр. биологии. - 1988. - Т. 118, № 2.- С. 194-204.

4. Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю.,

Дервиз Г.В. Метод одновременного определения 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах // Лаб. дело. - 1980. - № 7. - С. 424-426.

5. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М., 1987. - 472 с.

6. Коган А.Х., Ершов В.И., Соколова Н.Я., Алекперова Г.Р. Влияние тромбоцитов на генерацию активных форм кислорода лейкоцитами // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1992. - Т. 113, № 6. - С. 582-583.

7. Конопля Н.А., Прокопенко Л.Г., Утешев Б.С. Коррекция иммуносупрессирующих свойств тромбоцитов и эритроцитов при остром токсическом поражении печени // Метаболическая иммуномодуляция / Под. ред. Л.Г. Прокопенко и А.И. Конопли. - Курск, 2000. -С.51-60.