Модулятор мозговой деятельности у возрастных млекопитающих
MODULATOR OF BRAIN ACTIVITY IN AGE-RELATED MAMMALS

Изобретение относится к классу модуляторов на основе пробиотиков и может быть использовано для улучшения мозговой деятельности у возрастных млекопитающих и профилактики развития возраст-ассоциированных когнитивных дисфункций. Микробиота играет важную роль в обеспечении здоровья человека и в развитии различных заболеваний, в том числе и возраст-ассоциированных.
Новая концепция, рассматривающая микрофлору кишечника как важный регулятор функционирования головного мозга, в том числе и поведения, представляет собой смену парадигмы в нейронауке и клинической гериатрии (Тренева Е.В., Булгакова С.В., Романчук П.И. Захарова Н.О., Сиротко И.И. Мозг и микробиота: нейроэндокринные и гериатрические аспекты. Бюллетень науки и практики, 2019, Т. 5, № 9, С. 27-52). Показано, что кишечная микрофлора модулирует синтез гормонов, иммунных факторов, нейромедиаторов и может воздействовать на развитие и функционирование мозга, в том числе влиять на выраженность симптомов ряда психических расстройств, таких как депрессия, постстрессовая патология, шизофрения, аутизм (Аверина О.В., Даниленко В.Н. Микробиота кишечника человека: роль в становлении и функционировании нервной системы // Микробиология. - 2017. - Т. 86. - № 1. - С. 5-24).
Установлена зависимость состояния клеток мозга от качественного и количественного состава микробиоты кишечника (Шалагинова И.Г. и др. Эпигенетический механизм влияния микробиоты кишечника на развитие постстрессорного нейровоспаления // Экологическая генетика. - 2019. - Т. 17. - № 4). Известно, что мыши, лишенные микробиоты (germ-free, GF-мыши), демонстрировали значимо большую активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (ГГН) оси в ответ на стрессор по сравнению с млекопитающими, в микробиоте которых отсутствуют патогенные организмы (specific pathogen free, SPF-мыши).
Известен ряд пищевых добавок на основе пре- и пробиотков, влияющих на мозговую деятельность млекопитающих, в том числе и при нейродегенеративных и психических расстройствах.
Например, известен пробиотический штамм Enterococcus faecium L-3, для лечения нейродегенеративных заболеваний, используемый как пищевая добавка в комплексной терапии рассеянного склероза (RU 2642246, А61К 35/74, 2018).
Известен способ сопроводительной терапии нейродегенеративных заболеваний индуцированных окислительным стрессом, в частности синдрома паркинсонизма, включающий использование в качестве биологически активной добавки к пище штамм Lactobacillus fermentum В-12075, обладающий антиоксидантными свойствами (RU 2705250, C12N 15/74, 2019).
Известно применение лактоферрина (пребиотик) в качестве биологически активной добавки к пище для повышения скорости обучения здорового ребенка (RU 2682257, А61К 38/40, A23L 29/28, 2017).
2
13
Известна комбинация синбиотиков для улучшения мозговой деятельности. Это питательная композиция, содержащая белок, жир, усваиваемый углевод и дополнительно содержащая: Bifidobacteriumbreve в количестве от 10 до 10 КОЕ на г сухой массы питательной композиции, по меньшей мере один неусваиваемый олигосахарид, выбранный из фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов, в количестве от 0,5 до 20 мас.% в расчете на сухую массу питательной композиции, по меньшей мере 4 мас.% глутамина (в форме свободных аминокислот, дипептидов, и/или трипептида) в расчете на сухую массу питательной композиции и LC-PUFA в виде или арахидоновой кислоты, и/или докозагексаеновой кислоты. Также заявлен набор компонентов, включающий первый контейнер, содержащий глутамин и неусваиваемый олигосахарид, и второй контейнер, содержащий Bifidobacteriumbreve. Изобретение позволяет улучшить мозговую деятельность и когнитивные функции у младенцев и детей младшего возраста, страдающих от аллергии, воспаления или атопического заболевания (RU 2630905, А61К 35/24, A23L 33/00, 2017).
Известно применение пробиотиков для использования при лечении одного или нескольких расстройств аутистического спектра (РАС) или эпилепсии у субъекта, нуждающегося в этом. Пробиотики могут включать бактерии Bacteroides (например, В. fragilis). В некоторых вариантах реализации изобретения субъект идентифицирован как нуждающийся в лечении РАС или эпилепсии на основе комбинации поведенческих симптомов и необязательных генетических маркеров. После лечения у субъекта улучшаются одно или несколько видов поведения, связанных с РАС (AU 2015339281, A01N 63/00, 2017).
Известна биологически активная добавка к пище - мультисинбиотический препарат ВедаБиотик, представляющий собой комплекс пробиотиков (лиофилизированная биомасса живых активных бифидобактерий, лактобактерий, термофильного стрептококка), пребиотиков (микрокристаллическая целлюлоза, лактулоза), и витамина С.
Состав препарата ВедаБиотик: Биомасса бифидобактерий (Bifidobacteriumbifidum; B-686, Bifidobacteriumbifidum AC 1257, Bifidobacteriumlongum AC-1243, Bifidobacteriumlongum AC 1665, Bifidobacteriumbreve AC1664, B.adolescentis AC1253), обезжиренное молоко, желатоза, аскорбиновая кислота Е300 - антиокислитель). Биомасса бифидобактерий (Lactobacillusacidophilus В-5863, Lactobacilluscasei В-5724, Lactobacillusplantarum В-3962, Lactobacillusrhamnosusj В-8238), обезжиренное молоко, желатоза, аскорбиновая кислота (Е300 - антиокислитель). Биомасса термофильного стрептококка (St.Termophilus В-3386) обезжиренное молоко, желатоза, аскорбиновая кислота (Е300 - антиокислитель), лактулоза, E460i, Е551.
(Свидетельство о госрегистрации RU.77.99.88.003. R.000658.03.20 от 06.03.2020).
В соответствии с Рекомендацией по применению «ВедаБиотик» подавляет рост и развитие патогенных микроорганизмов в кишечнике, а также восстанавливает микрофлору других органов и систем, балансирует и восстанавливает углеводный и жировой обмен, способствует снижению сахара и холестерина в крови, снижению избыточной массы тела, повышает неспецифическую резистентность организма.
С целью расширения арсенала средств, обладающих модулирующими мозговую деятельность свойствами, предлагается использовать препарат «ВедаБиотик», представляющий собой комплекс пробиотиков (лиофилизированная биомасса живых активных бифидобактерий, лактобактерий, термофильного стрептококка), пребиотиков (микрокристаллическая целлюлоза, лактулоза), и витамина С в качестве модулятора мозговой деятельности у возрастных млекопитающих.
Сущность изобретения заключается в том, что при оценке влияния препарата «ВедаБиотик» у возрастных млекопитающих на паттерны поведения и уровень ряда регуляторных цитокинов в головном мозге показан позитивный модулирующий мозговую деятельность эффект.
Предложенное изобретение, на наш взгляд, является новым.
Для подтверждения модулирующих мозговую деятельность свойств препарата «ВедаБиотик» у млекопитающих использовались возрастные мыши-гибриды (СВА × C57BI/6)F1, самцы (в возрасте 10 месяцев), поскольку у возрастных млекопитающих, как и у пожилых людей, хорошо известным фактом является повышенный риск нейродегенеративной патологии и снижение когнитивных функций, продемонстрированное в том числе и на использованной линии мышей (Тренева Е.В., Булгакова С.В., Романчук П.И., Захарова Н.О., Сиротко И.И. Мозг и микробиота: нейроэндокринные и гериатрические аспекты. Бюллетень науки и практики, 2019, Т. 5, № 9, С. 27-52; Маркова Е.В. Чернова Т.Г., Филлимонов П.Н., Короткова Н.А., Абрамов B.В, Козлов В.А. Иммуноморфологические особенности животных с разным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т. 138, № 10, С. 466-469). Учитывая наличие в популяции самцов-мышей (CBA×C57BI/6)F1 с активным и пассивным типами поведения, представители которых характеризуются определенными структурно-функциональными характеристиками нервной системы и различным изменением ее функциональной активности после приема нейромодулирующих веществ (Маркова Е.В. Иммунная система и высшая нервная деятельность. Механизмы нейроиммунных взаимодействий в реализации и регуляции поведенческих реакций / Saarbruken. 2012; Маркова Е.В., Княжева М.А., Рюмина Т.В., Козлов В.А. Особенности функционирования клеток иммунной системы у особей с агрессивно- и депрессивноподобным типами поведения /В мире научных открытий. 2014. № 8 (56). C. 131-147; Markova Е., Savkin I., Anikeeva О., Shushpanova Т. Immunomodulatory effect of original anticonvulsant meta-chloro-benzhydryl-urea in mice with experimental alcoholism // European Psychiatry, 2019, T. 56, № S1, C. S662 - S663) с целью формирования однородных экспериментальных групп животных, все мыши были предварительно протестированы в «открытом поле» и в исследование были включены только особи со средним уровнем поведения, которые в дальнейшем были подвергнуты внутрижелудочному введению препарата «ВедаБиотик», растворенного в питьевой воде (экспериментальная группа 1). Экспериментальную, группу 2 составили мыши, которые на фоне введения препарата «ВедаБиотик» были подвергнуты однократному введению циклофосфана. Три контрольные группы млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме экспериментальной, группы 2 вводили циклофосфан с целью подавления естественной микрофлоры кишечника, (контрольная группа 1), мыши, которым в аналогичном объеме и режиме экспериментальной группы 1 вводили растворитель препарата «ВедаБиотик» - питьевую воду (контрольная группа 2) и интактные возрастные мыши аналогичного 10-месячного возраста, не подвергшиеся никаким воздействиям (контрольная группа группа 3). Оценка эффективности способа осуществлялась путем сравнения у соответствующих экспериментальных и контрольных групп возрастных млекопитающих количественного состава кишечной микрофлоры, паттернов поведения и содержания ряда цитокинов в головном мозге, регулирующих когнитивные функции, в том числе и поведение.
Пример 1. Определение влияния препарата «ВедаБиотик» на микрофлору кишечника у возрастных млекопитающих.
Для оценки влияния препарата «ВедаБиотик» на микрофлору кишечника in vivo у возрастных млекопитающих использовались возрастные мыши-гибриды (СВА × C57BI/6)F1, самцы в возрасте 10 месяцев, которые были подвергнуты курсовому внутрижелудочному (через зонд) введению препарата «ВедаБиотик», растворенному в питьевой воде из расчета 2 мг/мышь (80 мг/кг), ежедневно, в течение 14 суток, которые составили первую экспериментальную группу.
Вторую экспериментальную группу млекопитающих составили мыши, которым на фоне приема препарата «ВедаБиотик» вводили циклофосфан (-N'-бис-(-Хлорэтил)-N'-O-триметиленового эфира диамида фосфорной кислоты; Бакстер Онкология, ГмбХ, Германия), внутрибрюшинно однократно, в 0,5 мл 0,9 % NaCl, в дозе 250 мг/кг, определенной в серии предварительных экспериментов. Первую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме второй экспериментальной группы вводили циклофосфан с целью подавления естественной микрофлоры кишечника. Вторую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме первой экспериментальной группы вводили растворитель препарата «ВедаБиотик» - питьевую воду.
Третью контрольную группу млекопитающих составили интактные, не подвергавшиеся никаким воздействиям, мыши (СВА × C57BI/6)F1 аналогичного 10-месячного возраста.
Бактериологическое исследование фекалий у всех вышеобозначенных групп млекопитающих проводили после курсового введения препарата «ВедаБиотик», методом посева в полужидкой среде, в соответствии с ГОСТ 56139-2014. Для этого фекалии мышей собирали в стерильную пробирку и производили посев в полужидкую среду ГМК-1. По окончании периода культивирования подсчитывали количество колоний бифидобактерий (КОЕ/1г). При исследовании влияния препарата «ВедаБиотик» на рост микрофлоры кишечника in vivo у возрастных млекопитающих были получены результаты, представленные в таблице 1.
Представленные в таблице 1 результаты свидетельствуют о повышении количества колоний бифидобактерий после курсового приема препарата «ВедаБиотик» у возрастных млекопитающих; а также восстановление препаратом «ВедаБиотик» нормальной микрофлоры кишечника возрастных млекопитающих, подавление которой было вызвано введением циклофосфана. до уровня, наблюдаемого у интактных животных аналогичного возраста.
Пример 2. Определение влияния препарата «ВедаБиотик» на параметры ориентировочно - исследовательского поведения у возрастных млекопитающих.
Для оценки влияния препарата «ВедаБиотик» на паттерны поведения возрастных млекопитающих использовались мыши-гибриды (СВА × C57BI/6)F1, самцы, в возрасте 10 месяцев, которые были подвергнуты курсовому внутрижелудочному введению препарата «ВедаБиотик», растворенному в питьевой воде из расчета 2 мг/мышь (80 мг/кг), ежедневно, в течение 14 суток, которые составили первую экспериментальную группу. Вторую экспериментальную группу млекопитающих составили мыши, которым на фоне приема препарата «ВедаБиотик» с целью подавления естественной микрофлоры кишечника вводили циклофосфан (-N'-бис-(-Хлорэтил)-N'-О-триметиленового эфира диамида фосфорной кислоты; Бакстер Онкология, ГмбХ, Германия)), внутрибрюшинно однократно, в 0,5 мл 0,9 % NaCl, в дозе 250 мг/кг, определенной в серии предварительных экспериментов. Первую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме второй экспериментальной группы вводили циклофосфан с целью подавления естественной микрофлоры кишечника. Вторую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме первой экспериментальной группы вводили растворитель препарата «ВедаБиотик» -питьевую воду. Третью контрольную группу млекопитающих составили интактные, не подвергавшиеся никаким воздействиям, возрастные мыши (СВА × C57BI/6)F1 аналогичного 10- месячного возраста.
Ориентировочно-исследовательское поведение всех групп млекопитающих оценивали в тесте «открытое поле». Для этого использовалась прямоугольная камера (100×100 см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см. Полом служил лист белого пластика, разделенный на 100 (10×10 см) равных квадратов. Освещение проводилось бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля. Животное помещали в угол камеры и поминутно регистрировали его моторную и исследовательскую активность в течение 5 минут. Для этого подсчитывали число пересеченных центральных и периферических квадратов поля, количество вертикальных стоек (свободных и с опорой на стенку камеры), суммарную горизонтальную и вертикальную двигательную активность каждого животного. Все эксперименты проводились в период времени с 10 до 14 часов. Препарат «ВедаБиотик» оказывает стимулирующее влияние на паттерны ориентировочно - исследовательского поведения возрастных 10-месячных экспериментальных животных. Параметры поведения двух экспериментальных и трех контрольных групп возрастных млекопитающих в тесте «открытое поле» представлены в таблице 2, где даны показатели поведения возрастных млекопитающих после курсового приема препарата «ВедаБиотик» (Ме(25 %;75 %)).
Примечание: в качестве возрастных млекопитающих использованы мыши (CBA × 57BI/6)F1 10-месячного возраста; n=17-20 в каждой группе; * - р<0,05, ** - р<0,01 по сравнению с контрольной группой 3; # - р<0,05, ## - р<0,01 по сравнению с группой 1.
Представленные в таблице 2 результаты поведенческого тестирования свидетельствуют о том, что препарат «ВедаБиотик» стимулирует поведенческую активность возрастных млекопитающих, значительно увеличивая показатели горизонтальной двигательной активности в периферических квадратах поля (моторный компонент поведения); выявленное при этом появление активности в центральных квадратах поля, равно как и свободных стоек, свидетельствует о стимуляции не только моторного, но и исследовательского компонентов ориентировочно-исследовательского поведения возрастных млекопитающих, при этом показатели их поведенческой активности более чем в 2 раза превышают таковые у интактных млекопитающих аналогичного возраста (контрольная группа 3) и сопоставимы с соответствующими показателями поведения у молодых самцов (CBA × 57BI/6)F1 3-4 - месячного возраста (Маркова Е.В., Чернова Т.Г., Филлимонов П.Н., Короткова Н.А., Абрамов В.В, Козлов В.А. Иммуноморфологические особенности животных с разным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т. 138, № 10, С. 466-469; Маркова Е.В. Иммунная система и высшая нервная деятельность. Механизмы нейроиммунных взаимодействий в реализации и регуляции поведенческих реакций/ Saarbruken. 2012). При этом препарат «ВедаБиотик» предотвращает вызываемое циклофосфаном подавление двигательной активности (контрольная группа 1), сохраняя ее практически на уровне, соответствующем таковому у млекопитающих аналогичного возраста (контрольные группы 2 и 3).
Продемонстрированные в примерах 1 и 2 однонаправленные изменения под действием циклофосфана, а именно, подавление естественной микрофлоры кишечника млекопитающих, подавление поведенческой активности млекопитающих, и их коррекция после курсового введения препарата «ВедаБиотик», основной составляющей частью которого является комплекс пробиотиков (лиофилизированная биомасса живых активных бифидобактерий, лактобактерий, термофильного стрептококка), подтверждают влияние кишечной микробиоты на когнитивные функции у млекопитающих и демонстрирует модулирующий мозговую деятельность эффект препарата «ВедаБиотик» (в настоящем примере стимулирующий поведенческую активность), которая, как известно, снижена у возрастных млекопитающих (Маркова Е.В., Чернова Т.Г., Филлимонов П.Н., Короткова Н.А., Абрамов В.В, Козлов В.А. Иммуноморфологические особенности животных с разным уровнем ориентировочно-исследовательского поведения. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 200, Т. 138, № 10, С. 466-469; Маркова Е.В. Иммунная система и высшая нервная деятельность. Механизмы нейроиммунных взаимодействий в реализации и регуляции поведенческих реакций / Saarbruken. 2012).
Пример 3. Определение влияния препарата «ВедаБиотик» на уровень регуляторных цитокинов в головном мозге возрастных млекопитающих. Для оценки влияния препарата «ВедаБиотик» на уровень регуляторных цитокинов в головном мозге возрастных млекопитающих использовались мыши-гибриды (СВА × C57BI/6)F1, самцы, в возрасте 10 месяцев, которые были подвергнуты курсовому внутрижелудочному введению препарата «ВедаБиотик», растворенному в питьевой воде из расчета 2 мг/мышь (80 мг/кг), ежедневно, в течение 14 суток, которые составили первую экспериментальную группу. Вторую экспериментальную группу млекопитающих составили мыши, которым на фоне приема препарата «ВедаБиотик» с целью подавления естественной микрофлоры кишечника вводили циклофосфан (-N'-бис-(-хлорэтил)-N'-O-триметиленового эфира диамида фосфорной кислоты; Бакстер Онкология, ГмбХ, Германия)), внутрибрюшинно однократно, в 0,5 мл 0,9 % NaCl, в дозе 250 мг/кг, определенной в серии предварительных экспериментов. Первую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме второй экспериментальной группы вводили циклофосфан. Вторую контрольную группу млекопитающих составили мыши, которым в аналогичном объеме и режиме первой экспериментальной группы вводили растворитель препарата «ВедаБиотик» - питьевую воду. Третью контрольную группу возрастных млекопитающих составили интактные, не подвергавшиеся никаким воздействиям, мыши (СВА × C57BI/6)F1 аналогичного 10-месячного возраста.
У всех экспериментальных и контрольных групп млекопитающих, регистрировали количественное содержание цитокинов в образцах структур головного мозга, значимых для реализации когнитивных функций и поведенческих реакций. Для исследования количественного содержания цитокинов в головном мозге, проводилось выделение его отдельных структур с последующим лизированием. Лизаты структур головного мозга получали путем гомогенизирования тканей в среде RPMI-1640 с добавлением 0,1 % Triton Х-100 (GERBU Biotechnik GmbH), с последующим центрифугированием в течение 3 минут при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования.
Определение количественного содержания цитокинов в исследуемых образцах проводили с использованием тест - систем фирмы «INVITROGEN» (Vienna, Austria), согласно прилагаемой инструкции фирмы производителя. Оптическую плотность исследуемых образцов измеряли при помощи спектрофотометра с вертикальным прохождением света Anthos 2020 («AnthosLabtec», Ausria) при длине волны 450 нм. Уровень неспецифического связывания с пластиком меченных антител и субстратной смеси оценивали, как фоновый. Количество цитокинов выражали в пг/мл.
В данном примере у возрастных млекопитающих после курсового введения препарата «ВедаБиотик» демонстрируется модулирующее действие препарата на уровень ряда про- и противовоспалительных цитокинов в отдельных структурах головного мозга, участвующих в реализации и регуляции когнитивных функций и поведенческих реакций: снижение содержания провоспалительного цитокина ИЛ - 1β во фронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе, наряду с повышением уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в указанных областях мозга у возрастных мышей, что наблюдалось также и на фоне введения циклофосфана. Указанная выше модуляция уровней регуляторных цитокинов в структурах головного мозга у возрастных млекопитающих после курсового введения препарата «ВедаБиотик» представлена в таблице 3.
Для пожилого возраста характерно состояние системного хронического низкоградуированного воспаления, связанного с составом микробиоты кишечника и когнитивной дисфункцией (Филиппова Ю.Ю, Холодилина М.Е, Бурмистрова А.Л. Цитокины и нейротрофический фактор мозга в контексте когнитивных нарушений у пожилых людей. Медицинский академический журнал, 2019, Т. 19, № 1S, С. 18-19; Тренева Е.В., Булгакова С.В., Романчук П.И., Захарова Н.О., Сиротко И.И. Мозг и микробиота: нейроэндокринные и гериатрические аспекты. Бюллетень науки и практики, 2019, Т. 5, № 9, С. 27-52). Повышенная продукция клетками указанных выше структур головного мозга млекопитающих провоспалительного цитокина ИЛ-1β, ключевого цитокина, инициирующего воспалительный процесс посредством ауто- и паракринных механизмов, ассоциирована с повышенным риском развития нейродегенеративной патологии, когнитивной дисфункцией и со снижением поведенческой активности, свойственной возрастным млекопитающим.
После курсового введения препарата «ВедаБиотик» у возрастных млекопитающих достигается снижение содержания провоспалительного цитокина ИЛ-1β и повышение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-10 в структурах головного мозга (во фронтальной коре, гипоталамусе и гиппокампе), обеспечивающих регуляцию когнитивных функций и поведенческих реакций, ассоциированное с повышением количества колоний бифидобактерий в кишечнике (пример 1), что может быть существенными звеньями в механизмах стимуляции паттернов ориентировочно-исследовательского поведения возрастных млекопитающих, продемонстрированной в вышеприведенном примере 2.
Таким образом, в результате курсового введения препарата «ВедаБиотик» у возрастных млекопитающих на фоне повышения количества колоний бифидобактерий в кишечнике достигается позитивный модулирующий мозговую деятельность эффект, проявляющийся в активации поведенческой активности в сочетании с модуляций уровней про- и противовоспалительных цитокинов в головном мозге (снижение уровня провоспалительного цитокина ИЛ - 1β и повышение уровня противовоспалительного цитокина ИЛ - 10 в различных регионах головного мозга), свидетельствующих о протективном эффекте препарата «ВедаБиотик» в отношении развития нейровоспаления у возрастных млекопитающих.
Оценивая в целом результаты, можно утверждать, что препарат «ВедаБиотик», как источник пробиотических микроорганизмов, у возрастных млекопитающих оказывает позитивный модулирующий мозговую деятельность эффект и может быть использован для улучшения качества жизни и профилактики развития возраст ассоциированных когнитивных дисфункций.