КОМБИНАЦИИ ИЗ ДЕЛЕЦИЙ ГЕНОВ ДЛЯ ЖИВЫХ ОСЛАБЛЕННЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ SHIGELLA
COMBINATIONS OF GENE DELETIONS FOR LIVE ATTENUATED VACCINE STRAINS OF SHIGELLA

Область техники
Настоящее изобретение относится, в целом, к вакцине против Shigella, штаммам, их использованию в вакцинах и способам лечения дизентерии.
Предшествующий уровень техники
Shigella spp. представляет этиологический фактор бактериальной дизентерии. Дистальный конец толстой кишки и прямой кишки, которые демонстрируют интенсивное и резкое растяжение, являются зонами желудочно-кишечного (GIT) углубления, наиболее поражаемыми при шигеллезе. Очень небольшое количество инокулята из 10-100 бактерий является достаточным для развития заболевания, которое затем легко передается, часто непосредственно, фекально-оральным путем или посредством мух, заражающих пищу и воду. Соответствующие антибиотики, которые эффективны против грамотрицательных бактерий, используются для борьбы с инфекцией Shigella; однако, как со многими бактериальными патогенами, развитие устойчивости к антибиотикам четко выделяет потребность в безопасной и эффективной вакцине.
Современные кандидаты в вакцины против Shigella включают субклеточные комплексы, очищенные от вирулентных культур (напр., вакцина Invaplex), которые охватывают обезвреженный липополисахарид (LPS), конъюгированный с белком-носителем, и живые ослабленные вакцинные штаммы. При применении цельноклеточных инактивированных организмов, которые принимают в больших и многократных дозах, наблюдаются плохие иммуногенность и защитная эффективность. Живые вакцины проявляют лучшее решение, поскольку они имитируют естественную инфекцию при нарушении исхода заболевания.
3
4
Патент США 5762941 иллюстрирует один подход для живой вакцины и включает удаление гена virG(icsA) из S. flexneri 2a, S. Sonnei и S. dysenteriae 1. Были получены вакцинные штаммы SC602, WRSS1 и WRSdl, при этом SC602 и WRSS1 были протестированы в 1 фазе клинических испытаний на добровольцах, и было обнаружено, что они являются безопасными при пероральном применении в дозах от 10 до 10 КОЕ. Однако у 15-25% добровольцев, принимаемых SC602 или WRSS1, развились симптомы легкой диареи и повысилась температура.
Патенты США 589380 и 5468639 иллюстрируют другой подход, согласно которому применяли два кандидатных гена, setAB(shET1) и senA(shET2), поскольку они, как было показано ранее, кодируют энтеротоксичную активность. Так как setAB(shET1) присутствует в основном на хромосоме штаммов S. flexneri 2a, ген senA(shET2) располагается на большой вирулентной плазмиде всех штаммов Shigella.
9
Статья в Journal of Infectious Disease (2004, 190: 1745-54) иллюстрирует еще другой подход для обеспечения живой вакцины против Shigella. Симптомы диареи и лихорадки, развивающиеся в связи с приемом мутанта guaBA от вакцинного кандидата CVD 1204 S. flexneri 2a, исчезали при введении CVD 1208, который содержит мутацию guaBA в сочетании с делециями в генах setAB и senA(shET2). Примечательно, senB(shET2-2) представляет предполагаемый энтеротоксичный ген, который разделяет >60% гомологии по уровню аминокислот с senA(shET2-1) и может быть функциональным аналогом senA(shET2). Хотя высоко ослабленный CVD 1208 принимается в очень больших дозах (10), это может вызвать повышение температуры у 10% субъектов.
Патент США 6759241 направлен относительно способа, включающего применение гена msbB2 при разработке живой вакцины. Ген msbB2 кодирует фермент ацилтрансферазу жирных кислот, который присоединяет остатки жирных кислот к части липида А бактериальной молекулы LPS. Часть липида А представляет эндотоксин, который ответственен за сильную воспалительную активность и пирогенные свойства бактериального LPS. В фенотипе Е. coli, мутация в гене msbB приводит к потере токсичности LPS, но, в отличие от Е. coli, Shigella содержит два гена msbB, первый (msbB1) на хромосоме и второй (msbB2) на вирулентной плазмиде. Делеция каждого гена msbB в фенотипе S. flexneri 2a приводит к снижению гистопатологии инфекции Shigella на модели перевязанной подвздошной кишки кролика и делеция обоих генов msbB снижает патологию, даже следующую.
Данные нашей лаборатории, которые были представлены конференции Gordon Conference в 2006, показывают, что удаление обоих генов msbB1 и msbB2 в фенотипе S. flexneri 2a влияет на рост и инвазивные свойства бактерий. Однако удаление гена msbB1 или гена msbB2 в отдельности не нарушает рост, инвазивность, иммуногенность или защиту, порожденные в экспериментальной модели инфекции Shigella по сравнению с диким штаммом Shigella. Кроме того, удаление каждого гена msbB приводило к снижению уровня провоспалительных цитокинов (напр., IL-1b и МСР-1) в смывах легких мышей, интраназально инфицированных бактериями.
Обзорная статья в Expert Review Vaccines (2006, 5:5) обсуждает некоторые живые ослабленные вакцины против Shigella с четко определенными мутациями в специфичных генах. В этих работах, иммунные реакции, протекающие вслед за применением каждого вакцинного штамма, сравнивали с данными, полученными от клинических испытаний заражения дикими штаммами Shigella. Данные от этих испытаний показали, что живые ослабленные вакцинные штаммы вызывали иммунные реакции, сравнимые с реакциями индивидуумов, зараженных дикими штаммами Shigella. Следовательно, можно предположить, что комбинация генных делеций устраняет реактогенность при развитии защитных иммунных реакций.
Статья, напечатанная в Vaccines (2007, 25: 2269-2278), описывает вакцинный кандидат S. Flexneri 2a, WRSf2G11, который имеет делеции в генах virG(icsA), set и sen. Этот штамм был сконструирован, используя лямбда-красную рекомбинантную систему, и демонстрировал, что вакцинные штаммы Shigella, основанные на virG, с удаленными энтеротоксичными генами, показывают низкие уровни реактогенности без препятствования развитию стойких иммунных реакций.
Сущность изобретения
Изобретение относится к вакцинным кандидатам Shigella из всех 4 основных серотипов, чьими первичными ослабляющими признаками являются делеция гена virG(icsA) и дополнительные делеции в двух или более генах setAB(shET1), senA(shET2), senB(shET2-2), stxAB и msbB2. Таким образом, штамм будет иметь три или более делеций в определенных генах и будет более безопасным, что приведет к отсутствию или более легким повышению температуры и диареи при тестировании на добровольцах.
Были сконструированы следующие вакцинные штаммы: WRSS3 (ΔsenA, ΔsenB, ΔvirG, ΔmsbB2), WRSf2G15 (ΔvirG, ΔsetAB, ΔsenA, ΔsenB, ΔmsbB2) и WRSd5 (ΔvirG, ΔstxAB, ΔsenA, ΔsenB, ΔmsbB2).
Штаммы изобретения были разработаны для защиты против дизентерии и диареии, вызванных Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae и Shigella boydii. В дополнении, штаммы изобретения могут применяться в сочетании с живыми ослабленными поливалентными вакцинами, которые содержат два или более серотипов Shigella (напр., Shigella flexneri и Shigella sonnei). Штаммы изобретения также могут использоваться в комбинации с живыми ослабленными вакцинами против энтеротоксигенного Е. coli (ETEC) для обеспечения защиты от дизентерии и диареи, вызванных этой бактерией. Очевидно, что поливалентные вакцины, использующие эти штаммы, могут защищать от широко распространенных серогрупп Shigella и ETEC.
Первичная иммунизация типа «prime-boost», при которой за начальной иммунизацией живыми вакцинами следует иммунизация субъединичной вакциной, будет обеспечивать защиту против дизентерии и диареи, вызванных Shigella.
Вакцинные штаммы Shigella изобретения могут использоваться как носители для антигенов других вызывающих диарею патогенов, таких как Campylobacter, векторы для доставки в слизистую оболочку для других антигенов прокариот, векторы для антигенов эукариот и как носители иммуномодуляторов, таких как цитокины.
4
6
Вакцинные штаммы Shigella изобретения могут применяться в дозах менее 10-10КОЕ. По мере того, как вакцины, основанные на virG(icsA), тестировались на людях и показали удовлетворительную безопасность, у 15-25% добровольцев проявились реактогенные симптомы, которые были нежелательны. Делеция гена virG(icsA) в комбинации с делениями генов, связанными с энтеротоксичной активностью, предполагаемыми энтеротоксинами, и/или генов, связанными с токсичностью LPS, будут создавать более безопасную вакцину против Shigella для перорального применения.
Вакцинные штаммы Shigella характеризуются тем, что имеют делецию/инактивацию гена virG(icsA) в комбинации с двумя или более генами setAB(shET1), senA(shET2), senB(shET2-2), stxAB и msbB2. Вакцина против Shigella представляет собой невирулентный штамм, состоящий из 4 серогрупп, а именно S. flexneri, S. sonnet, S. Dysenteriae и S. boydii.
10
Вакцинные штаммы Shigella характеризуются одним или более следующими свойствами: инвазивность в эпителиальные клетки, отсутствие бляшек на монослоях эпителиальных клеток, отсутствие развития кератоконъюнктивита в глазах морских свинок, индукция иммунных ответов, которые являются защитными от заражения у морских свинок, и эффективное выведение из организма обезьян после внутрижелудочного прививания в дозе 10 КОЕ.
Вакцинные штаммы Shigella могут быть составлены в виде иммуногенной композиции, в которой штаммы смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, и присутствовать в количестве, которое вызывает защитную иммунную реакцию после одного или более введений. Вакцинная композиция, содержащая несколько штаммов, может быть составлена в виде композиции для однократного применения, которая обеспечивает защитную иммунную реакцию. Точное количество может быть определено эмпирически и будет изменяться в зависимости от вида животного, массы, состояния и возраста.
Композиции и штаммы изобретения могут быть укомплектованы как набор для облегчения применения и обеспечения оптимальной защиты. Набор может содержать один или более контейнеров, каждый из которых содержит специфичный вакцинный штамм Shigella или смесь штаммов. Количество или тип штаммов может выбираться как часть режима или применения. Вакцинные штаммы Shigella изобретения могут быть упакованы вместе с письменными инструкциями и таким образом, чтобы обеспечить сохранение жизнеспособности штаммов.
4
6
При введении субъекту в однократной дозе или сериями доз, вакцинные штаммы Shigella изобретения вызывают мукозный (оральный или интраназальный) иммунный ответ. Одним из преимуществ вакцинного состава является то, что защитная реакция может достигаться пероральным применением однократной дозы, содержащей относительно мало колониеобразующих единиц (10-10 КОЕ), по сравнению с альтернативами из множества доз живой, неинвазивной вакцины или инактивированных цельноклеточных вакцинных штаммов.
Другие признаки и преимущества изобретения, а также структура и применение различных воплощений описываются более подробно ниже со ссылками на прилагаемые чертежи.
Краткое описание чертежей
Вышеприведенные признаки и преимущества изобретения будут наглядно пояснены из следующего, более специфичного описания предпочтительного воплощения изобретения, как иллюстрируется в сопровождающих чертежах, в которых одинаковые регистрационные номера обычно показывают идентичные, функционально сходные и/или структурно сходные элементы. Крайние левые цифры в соответствующем регистрационном номере показывают чертеж, в котором элементы впервые указаны.
Фиг.1 показывает конструкцию определенных вакцинных штаммов Shigella, a именно WRSS1, WRSS2 и WRSS3,
фиг.2 показывает характеристику вакцинных штаммов WRSS1, WRSS2 и WRSS3 посредством иммунологического анализа клеток HeLa (2,A), иммуноблотинга колоний (2,В) и анализа бляшкообразования (2,С),
фиг.3 показывает протокол иммунизации штаммами WRSS1, WRSS2 и WRSS3 морских свинок,
фиг.4 показывает титры антител в сыворотке крови (4,А) и титры антител в слизистой оболочке (4,В) у окулярно иммунизированных морских свинок,
фиг.5 показывает защитную эффективность WRSS1, WRSS2 и WRSS3 после заражения штаммом дикого типа,
фиг.6 показывает протокол внутрижелудочной иммунизации обезьян,
фиг.7 показывает результаты выделения вакцины для штаммов WRSS1, WRSS2 и WRSS3 по протоколу иммунизации обезьян,
фиг.8 показывает конструкцию вакцинных штаммов Shigella WRSf2G12 и WRSf2G15 посредством штамма 2457Т S. flexneri,
фиг.9 показывает характеристику вакцинных штаммов WRSf2G12 и WRSf2G15 посредством иммуноблотинга колоний (А) и инвазии клеток HeLa (В),
фиг.10 показывает протокол окулярной (ОС) иммунизации морских свинок,
фиг.11 показывает титр антител в сыворотке крови (А) и титр антител в слизистой оболочке (В) у окулярно иммунизированных морских свинок,
фиг.12 показывает защитную эффективность SC602, WRSf2G12 и WRSf2G15 после заражения диким штаммом 2457Т S. flexneri.
Подробное описание настоящего изобретения
Предпочтительное воплощение изобретения подробно обсуждается ниже; однако, хотя специфические примерные воплощения обсуждаются, необходимо понимать, что они представлены только в иллюстративных целях. Специалисту в данной области техники будет понятно, что могут применяться другие компоненты и конфигурации, не отделяясь от сущности и объема изобретения.
3
4
WRSS1, SC602 и WRSd1, которые представляют собой три кандидата в вакцины против Shigella, основанные на делециях гена virG(icsA), недавно протестировали в 1 фазе клинических испытаний на здоровых взрослых, показав, что все три вакцины являются безопасными при пероральном приеме в дозах в интервале от 10 до 10 КОЕ. Кроме того, добровольцы, вакцинированные SC602, были иммунизированы от тяжелой формы дизентерии после заражения гомологичным штаммом дикого типа S. flexneri 2a. Однако расширенная 1 фаза клинических испытаний выявила, что у недопустимого количества добровольцев, получивших SC602 или WRSS1, проявлялись симптомы легкой диареи и повышение температуры. Недавние клинические испытания, проводимые исследователями Центра разработки вакцин (CVD), показали, что большинство этих симптомов можно снять путем выведения энтеротоксинов ShET1 (set) и ShET2-1 (senA). Дополнительная цель for further attenuating живых вакцин против Shigella включает модификацию липида А, который является биоактивным центром LPS. Посредством делеции медленной формы гена ацетилтрансферазы (msbB) было показано, что при перестройках до канонической структуры липида А значительно снижается эндотоксичность молекулы.
Были сконструированы новые, второго поколения кандидаты в вакцины против S. sonnei (WRSS2 и WRSS3), основанные на virG(icsA), с дополнительными делециями в двух энтеротоксинах, содержащихся в плазмиде, и гене с модифицированным липидом А, которые должны снижать реактогенные симптомы, связанные с WRSS1. Как WRSS2 (содержащем делеции в virG(icsA), ShET2-1 (senA) и ShET2-2 (senB)), так и WRSS3 (содержащем делеции, такие как в WRSS2 с дополнительной делецией в гене msbB2, содержащемся в плазмиде) являются инвазивными в культивированных эпителиальных клетках, но негативными в реакциях бляшкообразования. Морские свинки, которые были окулярно иммунизированы WRSS1, WRSS2 или WRSS3 и затем заражены диким штаммом 53 G S. Sornnei, показали относительные уровни иммуногенности и защитной эффективности. Таким образом, делеция senA, senB и содержащихся в плазмиде генов msbB2 не изменяет защитные иммунные реакции, вызванные вакцинными штаммами содержащих единичную мутацию virG(icsA). Кроме того, внутрижелудочное введение трех вакцинных кандидатов макакам-резус показало, что все три штамма выводились в одинаковом количестве, из чего можно сделать вывод, что генетические модификации, которые изменяют уровень насыщения липида А и ацилов, не снижают жизнеспособность в модели кишечной колонизации.
Штамм S. Sonnei, Mosely, который стабилен по отношению к вирулентному фенотипу, был использован для конструирования вакцинных штаммов Shigella WRSS1, WRSS2 и WRSS3 (фиг.1). Вакцинный штамм первого поколения (WRSS1) был сконструирован с использованием суицидного вектора, который описан в Hartman AB et а1., 1998. WRSS2 и WRSS3 были сконструированы посредством серий делеционных мутаций, используя λ-красное рекомбинирование, как описано в Ranallo et al., 2007. Дополнительные модификации для завершения конструкции WRSS2 включают лишение устойчивости к тетрациклину, используя фузаровую кислоту. Для создания WRSS3, ген msbB2 был удален из WRSS2 и для подтверждения всех генных делеций выполняли анализ геномной ДНК с помощью ПЦР. Штаммы затем характеризовали путем анализа инвазии клеток HeLa, иммуноблотинга колоний и анализа бляшкообразования, как показано на фиг.2.
8
9
Четыре группы, содержащие обычно морских свинок, были окулярно привиты 4×10 КОЕ WRSS1, WRSS2, WRSS3 или физиологическим раствором, в качестве контроля (см. фиг.3). При этом дополнительные эксперименты также показали, что прививочная доза может составлять 5×10 без повреждающего эффекта (см. фиг.10). Иммунизации повторяли на 14 день и, через четыре недели после начальной иммунизации, каждую морскую свинку заражали окулярно (тест Sereny) диким штаммом 53 G S. sonnei. Кровь и выделения из слизистой собирали для оценки образования сывороточных антител (фиг.4,А) и образования антител слизистой оболочки (фиг.4,В) у морских свинок, иммунизированных WRSS1, WRSS2 и WRSS3. Сывороточный IgG-специфичный, serum IgA-специфичный и мукозный IgA-специфичный иммунные реакции против LPS S. sonnei и комплекса инвазин-LPS S. sonnei (Invaplex) измеряли с помощью анализа ELISA. IgG и IgA иммунный ответ определяли на день 0 (D0), день 14 (D14) и день 28 (D28), а также через две недели после заражения (CLG). Средний геометрический титр (GMT) каждой группы рассчитывали с 95% доверительными интервалами, что показано посредством значений погрешностей. Не обнаружено значимых различий между иммунными реакциями WRSS1, WRSS2 и WRSS3, определенными с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA.
8
Всех морских свинок заражали 1×10 КОЕ/глаз диким штаммом 53G S. sonnei через 26 дней после конечной иммунизации (см. фиг.5). Морским свинкам (десяти на группу) делали прививку в конъюнктивальный мешок и анализировали на предмет развития кератоконъюнктивита в течение 7 дней. Реакции оценивали следующим образом: 0 - нет воспаления или заболевания легкой степени; 1 - легкий кератоконъюнктивит; 2 - кератоконъюнктивит без нагноения и 3 - тяжелый гнойный кератоконъюнктивит. Все морские свинки, иммунизированные различными вакцинными штаммами (WRSS1, WRSS2 и WRSS3), были защищены от кератоконъюнктивита.
10
Три группы, состоящие из пяти обезьян, прививали внутрижелудочно 4×10 КОЕ WRSS1, WRSS2 и WRSS3, и затем ежедневно наблюдали за развитием клинических симптомов (см. фиг.6). Собирали пробы фекалий и осуществляли взятие крови, ректальное промывание и ректоскопию, как показано.
Выведение вакцины у обезьян определяли путем нанесения образцов фекалий на планшеты с гектоеновым энтеро-агаром (см. фиг.7). Колонии проверяли на агглютинацию с антисывороткой S. sonnei (группа D) и дополнительно идентифицировали посредством иммуноблотинга колоний с анти-IpaB антителами. Знак (+) представляет культуро-позитивные образцы фекалий и знак (-) представляет негативные культуры или отсутствие образцов (см. фиг.7). WRSS1, WRSS2 и WRSS3 были выделены из фекалий обезьян через 5-7 дней после иммунизации. Не наблюдалось значимого различия в выведении вакцины между тремя группами.
Таблица 1
Иммунные реакции сывороточных IgA и IgG у обезьян после вакцинации вакцинными штаммами S. sonnei
Вакцина
ID животного
Сывороточный IgA LPS Invaplex
Сывороточный IgG LPS Invaplex
B34Z
-
+
-
+
F942
-
+
-
+
WRSS1
JKA
-
+
-
+
JPT
-
+
-
+
TAB
-
+
-
+
2OH
+
+
+
+
694Z
-
+
-
+
WRSS2
89-129
-
-
-
+
C42Z
-
+
+
+
CJ2W
-
+
-
+
89-155
-
+
-
+
A14Z
-
-
-
-
WRSS3
BVF
-
+
-
+
J778
+
+
-
+
TAJ
-
-
-
+
Таблица 2
Общие иммунные реакции слизистой у обезьян после вакцинации вакцинными штаммами S. sonnei
Вакцина
ID животного
Фекальный IgALPS Invaplex
ASC LPSInvaplex
B34Z
-
+
-
+
F942
+
+
+
+
WRSS1
JKA
-
+
-
+
JPT
-
-
-
+
TAB
-
+
+
+
2OH
+
+
+
+
694Z
-
+
-
+
WRSS2
89-129
-
-
-
-
C42Z
+
+
-
+
CJ2W
-
+
+
-
89-155
-
+
-
-
A14Z
-
-
-
-
WRSS3
BVF
+
+
-
+
J778
-
+
+
+
TAJ
-
-
+
+
4
Штамм 2457T S. flexneri 2а использовался для конструирования ослабленных штаммов Shigella, показанных на фиг.8. Первое поколение вакцинного штамма SC602 (не показан) аналогично WRSf2G, но более активный, когда его давали добровольцам в дозе более 10 колониеобразующих единиц. Более ослабленные штаммы (WRSf2G10-15) были сконструированы посредством серий делеционных мутаций с использованием λ-красного рекомбинирования. Анализ геномной ДНК с помощью ПЦР использовали для подтверждения всех генных делеций. Штаммы затем характеризовали посредством анализа инвазии на клетках и иммуноблотинга колоний (см. фиг.9).
8
Четыре группы, состоящие из одиннадцати морских свинок, были окулярно привиты 5×10 КОЕ SC602, WRSf2G12, WRSf2G15 или физиологическим раствором в качестве контроля (см. фиг.10). Иммунизации повторяли на 14 день и, через четыре недели после начальной иммунизации, каждая морская свинка была заражена окулярно (тест Sereny) диким штаммом 2457Т S. flexneri. Кровь и выделения из слизистой собирали для оценки образования сывороточных антител (фиг.11,А) и образования антител слизистой оболочки (фиг.11,В) у морских свинок, иммунизированных SC602, WRSf2G12, WRSf2G15 или физиологическим раствором. Пик (день 28) IgG-специфичного, сывороточного IgA-специфичного и мукозного IgA-специфичного иммунных реакций против LPS S. flexneri и комплекса инвазин-LPS S. flexneri (Invaplex) измеряли с помощью анализа ELISA. Геометрический средний титр (GMT) каждой группы рассчитывали с 95% доверительными интервалами, как показано значениями погрешностей. Такие же значимые реакции анти-LPS и анти-Invaplex IgG и IgA определяли в сыворотке всех вакцинированных животных по сравнению с контрольными группами. Столь же значительные реакции анти-LPS мукозного IgA определяли у всех вакцинированных животных по сравнению с контрольными группами. WRSf2G15 развивал значительно более выраженные анти-Invaplex реакции по сравнению с обоими SC602 и WRSf2G12, как показано звездочками на фиг.11,В.
8
Каждая морская свинка была заражена 1×10 КОЕ/глаз диким штаммом 2457Т S. flexneri через 27 дней после конечной иммунизации (см. фиг.12). Морских свинок прививали в конъюнктивальный мешок и анализировали на предмет развития кератоконъюнктивита в течение 4 дней. Реакции оценивали следующим образом: 0 - нет воспаления или заболевания легкой степени; 1 - легкий кератоконъюнктивит; 2 - кератоконъюнктивит без нагноения и 3 - тяжелый гнойный кератоконъюнктивит. Все морские свинки, иммунизированные различными вакцинными штаммами (SC602, WRSf2G12 и WRSf2G15), были защищены от кератоконъюнктивита.
4
6
Проводили оценку бивалентной смеси из живых вакцин против Shigella двух различных серотипов. Два новых вакцинных кандидата WRSf2G12 и WRSf2G15 S. flexneri 2а были введены перорально группам из макак-резус либо сами по себе, либо в сочетании с вакцинным кандидатом WRSs3 S. sonnei. Предварительные данные выведения из организма показывают, что гены setAB, удаленные из WRSf2G12 и WRSf2G15, не влияют на колонизацию кишки, ген msbB2, удаленный из WRSf2G15, не влияет на колонизацию кишки и что бивалентная смесь вакцины S. sonnei с вакциной S. flexneri 2a, содержащая комбинацию делеций генов, не оказывает воздействия на колонизацию каждого штамма. Поскольку колонизация кишечника является ключом к генерации защитной иммунной реакции, эти результаты показали, что поливалентная смесь из вакцинных кандидатов различных серотипов, ослабленных посредством комбинации генных делеций, описанных в этой патентной заявке, может вводиться добровольцам и, как предполагается, является более безопасной и выявляет защитный иммунный ответ на каждый серотип. Возможность комбинирования этих штаммов в поливалентный состав, который может приниматься однократно и который будет приниматься в достаточно низких дозах (в пределе от 10 до 10 КОЕ), дополняет значение для этой патентной заявки.
Несмотря на то что различные воплощения настоящего изобретения были описаны выше, необходимо понимать, что они представлены только для пояснения, но не для ограничения. Следовательно, объем и область применения настоящего изобретения не должны быть ограничены любым из вышеприведенных примерных воплощений, но вместо этого должны быть определены только в соответствии со следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.