ПОЛИПЕПТИД

1. Полипептид варианта PS4, происходящий от родительского полипептида, обладающего амилазной активностью, где указанный полипептид варианта PS4 содержит аминокислотную замену в положении 307 на лизин (K) или аргинин (R), в соответствии с нумерацией положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO: 1.
2. Полипептид варианта PS4 по п.1, происходящий от родительского полипептида, обладающего экзоамилазной активностью, предпочтительно не-мальтогенной экзоамилазной активностью.
3. Полипептид варианта PS4 по п.1, где аминокислотной заменой в положении 307 является замена на лизин (307K), предпочтительно H307K, или замена на аргинин (307R), предпочтительно H307R.
4. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, который дополнительно включает аминокислотную замену в положении 70.
5. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где аминокислотной заменой в положении 70 является замена на аспарагиновую кислоту (70D), предпочтительно G70D.
6. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, в котором аминокислота в положении 272 последовательности полипептида варианта PS4 является гистидином (H).
7. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, в котором аминокислота в положении 303 последовательности полипептида варианта PS4 является глицином (G).
8. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 дополнительно включает одну или несколько мутаций, выбранных из группы, состоящей из положений: 33, 34, 121, 134, 141, 146, 157, 161, 178, 179, 223, 229, 309 или 334.
9. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где дополнительная(ые) мутация(и) полипептида варианта PS4 выбрана(ы) из группы, состоящей из: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P, предпочтительно N33Y, D34N, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P и S334P.
10. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 содержит следующие замены: 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307K, 309P, 334P, предпочтительно N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307K, A309P, S334P, по сравнению с последовательностью экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO: 1.
11. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 содержит последовательность SEQ ID NO: 21 (pSac-pMS382).
12. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 содержит следующие замены: 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 307R, 309P, 334P, предпочтительно N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, H307R, A309P, S334P по сравнению с последовательностью экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO: 1.
13. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 содержит последовательность SEQ ID NO: 23 (pSac-pMS382R).
14. Полипептид варианта PS4, происходящий от родительского полипептида, обладающего не-мальтогенной экзоамилазной активностью, где полипептид варианта PS4 содержит следующие замены 33Y, 34N, 70D, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P, предпочтительно N33Y, D34N, G70D, G121F, G134R, A141P, Y146G, I157L, S161A, L178F, A179T, G223E, S229P, A309P, S334P по сравнению с последовательностью экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO:1.
15. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 содержит последовательность SEQ ID NO: 25 (pSac-pMS382H).
16. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где родительский полипептид содержит не-мальтогенную экзоамилазу, предпочтительно, глюкан-1,4-альфа- мальтотетрагидролазу (EC 3.2.1.60).
17. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где родительский полипептид представляет собой полипептид из видов Pseudomonas, предпочтительно, Pseudomonas saccharophilia или Pseudomonas stutzeri, или происходит от этого полипептида.
18. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где родительским полипептидом является не-мальтогенная экзоамилаза из Pseudomonas saccharophilia, имеющая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:5.
19. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5.
20. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где родительским полипептидом является не-мальтогенная экзоамилаза из Pseudomonas stutzeri, имеющая последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 11.
21. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 11.
22. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, который содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 21 (pSac-pMS382), SEQ ID NO: 23 (pSac-pMS382R) и SEQ ID NO: 25 (pSac-pMS382H).
23. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где полипептид варианта PS4 обладает более высокой термостабильностью по сравнению с родительским полипептидом или полипептидом дикого типа при их тестировании в одних и тех же условиях.
l/2
24. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, время полужизни которого (t), предпочтительно при 60°С на 15% или более, предпочтительно на 50% или более, наиболее предпочтительно на 100% или более превышает время полужизни родительского полипептида или полипептида дикого типа.
25. Полипептид варианта PS4 по пп.1, 2 или 3, где пищевой продукт, обработанный полипептидом варианта PS4, имеет любое одно или более предпочтительно все следующие свойства, такие как (а) пониженная плотность; (b) повышенная упругость; (c) повышенная слипаемость; (d) пониженная раскрашиваемость; и (e) более высокая способность к сворачиваемости по сравнению с пищевым продуктом, обработанным родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
26. Полипептид варианта PS4 по п.25, где упругость, слипаемость или сворачиваемость пищевого продукта независимо друг от друга на 15%, или более предпочтительно на 50%, или наиболее предпочтительно на 100%, или превышают указанные параметры пищевого продукта, обработанного родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
27. Полипептид варианта PS4 по п.25, где каждый из упругости, слипаемости и сворачиваемости пищевого продукта, обработанного полипептидом варианта PS4, являются улучшенными по сравнению с указанными свойствами пищевого продукта, обработанного родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
28. Полипептид варианта PS4 по п.25, где плотность или раскрашиваемость указанного пищевого продукта независимо друг от друга на 15%, или более предпочтительно на 50%, или наиболее предпочтительно на 100%, или ниже, чем указанные параметры пищевого продукта, обработанного родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
29. Полипептид варианта PS4 по п.25, где каждый из плотности и раскрашиваемости указанного пищевого продукта, обработанного полипептидом варианта PS4, ниже по сравнению с указанными свойствами пищевого продукта, обработанного родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
30. Полипептид, содержащий фрагмент, состоящий по меньшей мере из 20 остатков полипептида варианта PS4 по любому из предыдущих пунктов, где полипептид обладает не-мальтогенной экзоамилазной активностью.
31. Полипептид, происходящий от полипептида варианта PS4 по любому из предыдущих пунктов, путем введения мутаций в одном или нескольких остатках полипептидной последовательности варианта PS4, где полипептид обладает более высокой термостабильностью, или более высокой экзоспецифичностью, или и тем и другим свойством, по сравнению со свойствами родительского полипептида, полипептида варианта PS4, или полипептида дикого типа, либо где пищевой продукт, обработанный полипептидом варианта PS4, имеет одно или несколько, предпочтительно все следующие свойства: (а) пониженная плотность; (b) повышенная упругость; (c) повышенная слипаемость; (d) пониженная раскрашиваемость; или (e) более высокая способность к сворачиваемости по сравнению с пищевым продуктом, обработанным родительским полипептидом или полипептидом дикого типа.
32. Применение полипептида варианта PS4 по любому из предыдущих пунктов в качестве пищевой или кормовой добавки.
33. Способ обработки крахмала, включающий контактирование крахмала с полипептидом по любому из пп.1-31 и получение из указанного крахмала одного или нескольких линейных продуктов под действием указанного полипептида.
34. Применение полипептида по любому из пп.1-31 для получения пищевого или кормового продукта.
35. Применение по п.34, где пищевой продукт содержит тесто или продукт из теста предпочтительно обработанный продукт из теста.
36. Применение по пп.34 и 35, где пищевой продукт является хлебобулочным изделием.
37. Способ получения пищевого или кормового продукта, включающий смешивание полипептида по любому из пп.1-31 с пищевым или кормовым ингредиентом.
38. Способ по п.37, где пищевой продукт содержит тесто или продукт из теста предпочтительно обработанный продукт из теста.
39. Способ по пп.37 и 38, где пищевой продукт является хлебобулочным изделием.
40. Способ изготовления хлебобулочного изделия, включающий: (a) приготовление крахмальной среды; (b) добавление в крахмальную среду полипептида по любому из пп.1-31, и (c) подачу тепла к крахмальной среде во время или после стадии (b) с получением хлебобулочного изделия.
41. Пищевой продукт, кормовой продукт, продукт из теста или хлебобулочное изделие, получаемые способом по п.37 или 40.
42. Улучшенная композиция для теста, где указанная улучшенная композиция содержит полипептид по любому из пп.1-31 и по меньшей мере один дополнительный ингредиент теста или добавку в тесто.
43. Композиция, содержащая муку и полипептид по любому из пп.1-31.
44. Применение полипептида варианта PS4 по любому из пп.1-31 в продукте из теста для замедления или снижения черствения, предпочтительно, нежелательной ретроградации продукта из теста.
45. Применение полипептида варианта PS4 по любому из п.п.1-31 в продукте из теста для улучшения любого одного или нескольких свойств, таких как плотность, упругость, слипаемость, раскрашиваемость или сворачиваемость продукта из теста.
46. Комбинация полипептида варианта PS4 по любому из предыдущих пунктов вместе с любым одним или несколькими из следующего:
(a) мальтогенная альфа-амилаза, также называемая глюкан- 1,4-α-мальтогидролазой (EC 3.2.1.133) из Bacillus stearothermophilus или ее вариант, гомолог или мутанты, обладающие мальтогенной альфа-амилазной активностью;
(b) пекарская ксиланаза (EC 3.2.1.8) из, например, Bacillus sp., Aspergillus sp., Thermomyces sp. или Trichoderma sp.;
(c) α-амилаза (EC 3.2.1.1) из Bacillus amyloliqufaciens или ее вариант, гомолог или мутанты, обладающие альфа-амилазной активностью; и
(d) липаза, такая как гликолипаза из Fusarium heterosporum.
47. Применение комбинации по п.46 в соответствии с любым из предыдущих пунктов.
48. Пищевой или кормовой продукт, полученный путем обработки комбинацией по п.46.
49. Нуклеиновая кислота, способная кодировать полипептид по любому из пп.1-31.
50. Нуклеиновая кислота по п.49, имеющая последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 12.
51. Нуклеиновая кислота, содержащая фрагмент, состоящий по меньшей мере из 60 остатков нуклеиновой кислоты по п.49 или 50, которая способна кодировать полипептид, обладающий не-мальтогенной экзоамилазной активностью.
52. Последовательность нуклеиновой кислоты, происходящая от родительской последовательности, способной кодировать не-мальтогенную экзоамилазу, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит замену в одном или нескольких остатках, в результате чего такая нуклеиновая кислота кодирует лизин (K) или аргинин (R) в положении 307, необязательно вместе с одной или несколькими дополнительными мутациями, в результате чего такая нуклеиновая кислота кодирует один или несколько остатков, выбранных из группы, состоящей из: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 309P, 334P в соответствии с нумерацией положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO: 1.
53. Последовательность нуклеиновой кислоты PS4 по любому из пп.49-52, которая происходит от родительской последовательности, кодирующей не-мальтогенную экзоамилазу, в результате замены одного или нескольких нуклеотидных остатков.
54. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп.49-52, выбранная из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 22 (pSac-pMS382), SEQ ID NO: 24 (pSac-pMS382R) и SEQ ID NO: 26 (pSac-pMS382H).
55. Плазмида, содержащая нуклеиновую кислоту PS4 по любому из пп.49-54.
56. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту PS4 по любому из пп.49-55, или способный экспрессировать полипептид по любому из пп.1-31.
57. Клетка-хозяин, содержащая плазмиду по п.55 или экспрессионный вектор по п.56, предпочтительно трансформированная указанной плазмидой или указанным экспрессионным вектором.
58. Клетка, способная экспрессировать полипептид по любому из пп.1-31.
59. Клетка-хозяин по п.57 или клетка по п.58, которая представляет собой бактериальную, грибковую или дрожжевую клетку.
60. Способ экспрессии полипептида варианта PS4, включающий получение клетки-хозяина или клетки по пп.57, 58 или 59, и экспрессию полипептида из клетки или клетки-хозяина, и необязательно очистку полипептида.
61. Способ изменения последовательности полипептида предпочтительно не-мальтогенной экзоамилазы путем введения аминокислотной замены в положение 70 на основный или положительно заряженный остаток, необязательно, вместе с одной или несколькими дополнительными мутациями, выбранными из группы, состоящей из: 33Y, 34N, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P (в соответствии с нумерацией положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO:1), в родительский полипептид, обладающий не-мальтогенной экзоамилазной активностью.
62. Способ по п.61, где основным или положительно заряженным остатком является лизин (K), аргинин (R) или гистидин (H).
63. Способ по п.61 или 62, где последовательность не-мальтогенной экзоамилазы изменяют путем изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей не-мальтогенную экзоамилазу.
64. Способ получения полипептида варианта PS4, включающий введение аминокислотной замены в родительский полипептид, обладающий не-мальтогенной экзоамилазной активностью, где аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из: 33Y, 34N, 70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P в соответствии с нумерацией положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO:1.
65. Способ по п.64, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую родительский полипептид, изменяют путем введения аминокислотной замены.
66. Способ изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей не-мальтогенную экзоамилазу, включающий введение в последовательность кодона, кодирующего аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из: 33Y, 34N, 70K/R/H, 121F, 134R, 141P, 146G, 157L, 161A, 178F, 179T, 223E, 229P, 272H, 303G, 309P, 334P, в соответствии с нумерацией положений последовательности экзоамилазы Pseudomonas saccharophilia, представленной в SEQ ID NO:1.
67. Способ повышения термостабильности или экзоспецифичности полипептида или того и другого, включающий стадии по любому из пп.60-66.
68. Способ по п.60, в котором полипептид выделяют или очищают, или и то и другое.
69. Полипептид, полученный способом по любому из пп.60-68.