Материал для обнаружения антигенов ротавирусной инфекции
MATERIAL FOR ROTAVIRUS INFECTION ANTIGENS DETECTION

Уровень техники
Из уровня техники известен источник (справочник Медицинские лабораторные технологии (в 2 томах) под редакцией А.И. Карпищенко, Санкт-Петербург «Интермедика», 2002, с. 389-390), который устанавливает: ротавирусы человека и животных относятся к роду Rotavirus семейства Reoviridae. Родовое название происходит от латинского слова Rota - колесо, так как на электронной микрофотографии форма наружного капсида напоминает обод колеса, а капсомеры внутреннего капсида - колесные спицы. Геном вириона представлен двухцепочечной РНК.
Механизм передачи - фекально-оральный, заражение детей происходит чаще всего контактно-бытовым путем через руки взрослых, постельное белье, иные предметы. В 1 г фекалий больного содержится до 10 млрд вирусных частиц. Пассивный противовирусный иммунитет за счет антител класса Ig G после 3-х месяцев жизни ослабевает, в дальнейшем он поддерживается только антителами класса Ig А, содержащимися в грудном молоке. Поэтому инфицирующая доза для детей раннего возраста может быть небольшой.
Постинфекционный иммунитет достаточно прочный и длительный, так как поддерживается естественной антигенной стимуляцией при периодическом поступлении ротавирусов в кишечник извне.
Практическая лабораторная диагностика базируется на раннем обнаружении в копрофильтратах антигенов ротавирусов, несколько позднее - сывороточных специфических антител класса Ig М. В обоих случаях чаще всего применяют иммуноферментный анализ с соответствующими тест-системами.
Сущность изобретения
Задачей изобретения является увеличение времени хранения исследуемого материала. Эта задача достигается применением высушенных мазков кала больного, положительных на антигены ротавирусов человека, хранившихся 2 месяца и более при комнатной температуре в сейфе, для обнаружения антигенов ротавирусной инфекции.
Для этого используют, например, иммунохроматографическую тест-систему «РотаСтик» производства компании Novamed Ltd., Израиль, каталожный №R-5178, согласно приложенной инструкции по применению. Исследуемый материал готовят из кала больного положительного на антигены ротавирусов:
1. Открывают пробирку с буферным раствором 0,5 мл;
2. Вносят в пробирку 0,05 г пробы в случае твердого кала или 50 мкл в случае жидких испражнений и плотно закрывают крышкой;
3. Суспендируют пробу энергичным встряхиванием пробирки;
4. Ждут пока крупные частицы не осядут на дно пробирки.
5. Из пробирки дозатором берут 50 мкл пробы, переносят на предметное стекло и делают мазок шириной 15 мм, длиной 20 мм. Так готовят 6 мазков.
Таким же образом по п.п. 1-5 готовят 4 мазка из кала, отрицательного на ротавирус, взятого у практически здорового человека. Мазки высушивают в горизонтальном положении при комнатной температуре в течение 35-40 минут. Затем их хранят в сейфе при комнатной температуре 2 месяца и более. В нашем случае дата изготовления мазков 04.12.2018 г.
Получение исследуемого материала из этих мазков для обнаружения антигенов ротавирусной инфекции увеличивает время его хранения, т.к. антигены в них сохраняются долго, 2 месяца и более.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Высушенные мазки после 2 месяцев хранения (в нашем случае 11.02.2019 г.) вытаскивают из сейфа. На каждый мазок дозатором наносят 0,1 мл стерильного физиологического раствора (0,9% раствор NaCl), осторожно перемешивают одноразовой стеклянной палочкой до полного растворения мазков. Исследуемый материал готов для качественного иммунологического анализа на антигены ротавирусов человека.
Для проведения анализа используют, например, тест систему РотаСтик производства компании Novamed Ltd., Израиль.
Принципы анализа
РотаСтик производства компании Novamed Ltd., Израиль представляет собой полоску нитроцеллюлозной мембраны с фиксированными на ней в области добавления пробы моноклональными мышинными антителами к ротавирусу человека, конъюгированными с окрашенными частичками латекса. В области тестового окошка также зафиксированы моноклональные антитела к ротавирусу человека. Поликлональные антимышинные антитела зафиксированы в контрольной зоне полоски. Ротавирус человека, содержащийся в пробе, реагирует со специфическими меченными моноклональными антителами, формируя комплекс антиген-антитело, который мигрирует по мембране, образуя красную цветную линию в тестовой зоне мембраны, что оценивается как положительный результат. Непрореагировавший конъюгат мигрирует далее к контрольной зоне, где захватывается поликлональными антимышинными антителами, формируя зеленую цветную линию в контрольной зоне мембраны. Контрольная линия появляется всегда. Наличие контрольной линии подтверждает корректность результатов теста (правильный объем пробы, необходимый темп миграции, требуемое качество реагентов).
Техника выполнения анализа
1. Вытаскивают из набора 10 тест-полосок.
2. В пластиковом штативе готовят 10 пробирок, содержащих по 0,5 буфера для разведения пробы.
3. В первые 6 пробирок вносят по 50 мкл суспензии кала с 6 мазков, положительных на антигены ротавирусов, а на последующие 4 пробирки также вносят по 50 мкл суспензии кала с 4-х мазков, отрицательных на антигены ротавирусов.
4. Вставляют полоски (10 штук) вертикально в пробирки с разведенными пробами (синими стрелками вниз).
5. Результаты анализов учитывают через 10 минут.
Маркировка тест-полосок слева направо:
1 - первая;
2 - вторая;
3 - третья;
4 - четвертая;
5 - пятая;
6 - шестая;
7 - седьмая;
8 - восьмая;
9 - девятая;
10 - десятая.
Интерпретация результатов. Рисунок 1.
Отрицательный результат: зеленая линия появляется в контрольной зоне (С) полоски;
Положительный результат: в дополнение к зеленой контрольной линии появляется красная линия в тестовой зоне (Т) полоски.
На рисунке 2 представлены результаты анализов 10 образцов исследуемого материала:
1 тест-полоска - положительный результат (зеленая и красная линии появились в контрольной (С) и тестовой (Т) зонах соответственно). 2, 3, 4, 5, 6 тест полоски - положительный результат.
7 тест-полоска - отрицательный результат (зеленая линия появилась только в контрольной (С) зоне).
8, 9, 10 - отрицательный результат.
Вывод:
Применение суспензии кала, полученную растворением в 0,1 мл физиологического раствора мазков кала, содержащих антигены ротавирусов человека, в качестве материала для обнаружения антигенов ротавирусов, дает достоверные и воспроизводимые результаты.