СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НА ПОВРЕЖДЕНИЯХ КОЖИ И ТКАНЕЙ
METHOD FOR FORMING CELLULOSE FILM APPLICABLE ON SKIN AND TISSUE DAMAGES

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу получения пленки на основе целлюлозы, которая применяется для покрытия и регенерирования повреждений кожи и тканей, а также к получаемой таким образом биотехнологической пленке.
Acetobacter xylinum
В частности, изобретение относится к способу получения, в котором вышеуказанная пленка на основе целлюлозы получается с помощью бактерии .
Acetobacter xylinum
В патенте ЕР-А-0114481 описывается получение салфеток, пропитанных жидкостью, применимых в качестве лекарственных препаратов для ран и ожогов, производимых из целлюлозной пленки, которую получают микробиологически с помощью культуры . Способ получения предусматривает культивирование микроорганизма в статических условиях (среда без перемешивания); при этом бактерия культивируется на поверхности питательной среды с образованием плотной пленки, которая обычно имеет толщину от 0,1 мм до приблизительно 15 мм; полученная таким образом пленка удаляется из питательной среды, обрабатывается гидроксидом натрия для удаления бактерий, нейтрализуется и промывается водой, что приводит к получению пропитанной водой пленки из микробиологически полученной целлюлозы.
Acetobacter xylinum
Acetobacter xylinum
В патенте WO 86/02095 также описывается получение пленок из целлюлозы, полученных при культивировании , используемых при трансплантации искусственной кожи;  засевается в культуральную среду, содержащую в качестве питательных веществ углеводы и источники азота, в специфических примерах среда состоит из экстракта Tea Sinensis с добавлением сахара; способ получения включает инкубирование микроорганизма при 28°С в течение примерно 36 часов, после чего пленку удаляют из культуральной среды и высушивают при комнатной температуре на подложке в разрыхленном состоянии. Этот патент лежит в основе лекарственного препарата, продаваемого под маркой BIOFILL, используемого для лечения различных поражений кожи.
Acetobacter xylinum
В патенте US 5846213 описывается получение лекарственных препаратов на основе целлюлозы, обладающих механическими свойствами и эластичностью, подобными механическим свойствам и эластичности кожи человека. Полученную культивированием  пленку на основе целлюлозы растворяют в системе растворителей, содержащей диметилацетамид и соль лития, получая раствор, из которого литьем и коагуляцией в гелевой ванне получают целлюлозную мембрану.
Объектом настоящего изобретения является бактериально-получаемая пленка на основе целлюлозы и способ ее получения, пленка эффективна для создания среды, благоприятной для лечения повреждений кожи, и может быть использована в качестве лекарственного препарата для лечения повреждений кожи.
Другим объектом настоящего изобретения является пленка на основе целлюлозы, обладающая подходящими механическими характеристиками, в частности, высокой эластичностью, близкими к механическим характеристикам кожи человека.
Таким образом, объектом изобретения является способ получения и кристаллическая пленка на основе целлюлозы, обладающая характеристиками, определенными в следующих пунктах.
Acetobacter xylinum
Leuconostoc
В частности, способ получения по изобретению отличается тем, что биосинтетическую пленку на основе целлюлозы получают культивированием в культуральной среде, содержащей источники азота и углерода, микроорганизмов, принадлежащих к виду  в присутствии, по крайней мере, одного микроорганизма, принадлежащего к роду .
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombae
Saccharomyces malidevorans
В предпочтительном воплощении получение сопровождается засеванием дрожжей в культуральную среду, предпочтительно, дрожжи выбираются из: ,  и/или  и смесь из двух или трех перечисленных дрожжей.
Acetobacter
Acetobacter xylinum
- это грамотрицательная, строго аэробная палочковидная бактерия. Она характеризуется способностью продуцировать многочисленные цепи поли-бета-1,4-глюкана, химически идентичного целлюлозе. Целлюлозные цепи в виде микрофибрилл синтезируются на поверхности бактерий на сайтах, расположенных вне клеточной мембраны. Изобретение охватывает использование любого штамма , способного продуцировать целлюлозные микрофибриллы, как в статической среде, так и при условиях перемешивания среды, включая специфические штаммы, описанные в EP 0228779.
Leuconostoc
Lactococcus
Leuconostoc
Leucocostoc oenos
Oenoscoccus oenos
Род  включает бактерии сферической формы, отличающиеся от рода  продуцированием газа. Все виды рода  обладают гетероферментативным метаболизмом; бактерии широко распространены в природе, особенно в образцах растительного происхождения. Для этих бактерий оптимальная для роста температура находится в диапазоне от 20°С до 30°С, они являются менее ацидофильными по сравнению с лактобактериями, предпочитая слабокислые или нейтральные субстраты, за исключением  (недавно заново классифицированную как ), адаптированной к низким значениям рН вина и известной как агент молочнокислого брожения вина.
Leuconostoc
Acetobacter xylinum
Основываясь на тестах, проведенных заявителем, установлено, что присутствие бактерий рода  в среде , значительно влияет на продукцию и рост биомассы.
Пленка, полученная способом по изобретению, построена главным образом из кристаллической целлюлозы, и характеризуется относительно низкой степенью полимеризации, находящейся в диапазоне от 250 до 400. Важной особенностью такой пленки, отличающей ее от классической кристаллической целлюлозы, является ее нерастворимость в концентрированной серной кислоте. Эта особенность позволяет сделать предположение о наличии связей между одиночными цепочками целлюлозы, что делает продукт нерастворимым в концентрированной серной кислоте и затрудняет гидролиз.
В способе получения по изобретению культивирование вышеупомянутых микроорганизмов проводят при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 36°С, и при значениях рН, находящихся в диапазоне от 1 до 6, предпочтительно, при температуре, находящейся в диапазоне от 26°С до 30°С, и при значениях рН, находящихся в диапазоне от 2 до 4.
Предпочтительная культуральная среда для симбиотического роста содержит тростниковый сахар, и/или жидкий экстракт тростникового сахара в качестве источников углерода и азота. Дополнительно культуральная среда может содержать сахар и уксусную кислоту.
Культивирование осуществляют главным образом в статических условиях.
Образующуюся пленку отделяют от культуральной среды известными из уровня техники способами и дегидратируют высушиванием.
Когда пленку смачивают физиологическим раствором, она приобретает прозрачность, эластичность и плотность, близкие к таковым для неповрежденной кожи человека; более того, пленка обладает селективной проницаемостью для газа и паров воды и, в тоже время, она непроницаема для воды и бактерий. Пленка обладает превосходной адгезивной способностью по отношению к поврежденному участку; образовавшаяся окклюзия (преграда) защищает рану, предотвращая загрязнения, уменьшая боль и создавая идеальную микросреду для грануляции и реэпителизации.
Такая пленка особенно рекомендуется для ожогов, язв и ран от I до глубокой II степени без повышенной экссудации; пленка превосходно приклеивается на поврежденный участок, является инертной, нетоксичной, неаллергенной и не содержит латекса.
Пример 1
В 500-литровый нержавеющий стальной сосуд вносят: 250 кг экстракта тростникового сахара, 20 кг тростникового сахара и уксус, в количестве, необходимом для достижения значения pH смеси 3,5. В культуральную среду при комнатной температуре засевают микроорганизмы Acetobacter xylinum и Leuconostoc, в частности, Leucocostoc oenos, в общем количестве 30 мл. Используется штамм Acetobacter xylinum, выбранный из группы, включающей АТСС 23769, АТСС 23770; и штамм Leucocostoc oenos, выбранный из группы, включающей АТСС 23277, АТСС 23278, АТСС 23279.
Во время этого процесса поддерживают значение pH 2,5 добавлением тростникового сахара и уксуса. После завершения биомассу промывают и с использованием промышленного пульверизатора доводят до жидкого состояния; полученную таким образом жидкость выливают на хлопковую подложку и помещают в нержавеющие стальные контейнеры, соединенные друг с другом и затем с вакуумной системой, которая, высушивая жидкую часть, определяет образование гладкой и однородной пленки на хлопковой подложке.
Хлопковую подложку с приклеенной пленкой затем помещают в печь и, после завершения процесса высушивания, пленку удаляют с подложки и пересылают на хранение. В зависимости от количества жидкой биомассы и размера используемых контейнеров, могут быть получены пленки различного размера и толщины: например, из 750 мл биомассы в жидком состоянии, помещенной в контейнер размером 23×30 см, получается пленка размером 21×27 см толщиной примерно 0,05 мм.
Пример 2
Процедуру, описанную в примере 1, осуществляют в вышеприведенных условиях, используя в качестве посевного материала в дополнении к вышеуказанным бактериям Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombae.
Пленку, полученную, как описано в примере 2, подвергали анализу для подтверждения структуры и определения содержания целлюлозы.
Проводили следующие анализы.
-1
Записывали ИК-Фурье спектр (прибор ASI React I 1000 с алмазной ячейкой, анализ непосредственно образца, разрешение 4 см).
Регистрировали следующие полосы ИК-поглощения:
-1
3340 см растяжение OH
-1
2984 см растяжение алифатических CH
-1
2
2
1460-1200 см деформационные колебания CH, вращательные колебания CH и CH, деформационные колебания OH в плоскости
-1
2
1100-1000 см растяжение CНO и СOС
-1
897 и 663 см колебания, типичные для целлюлозы.
Таким образом, ИК-Фурье спектр соответствует ИК-Фурье спектру целлюлозы.
Общий анализ на углеводы методом ВЭЖХ с использованием детектора-рефрактометра.
Использованные методы являются стандартными для определения содержания целлюлозы и гемицеллюлозы.
Содержание целлюлозы определяли методом, принятым на Stazione Spermentale carta Cartoni e Pasta per carta, (SSCCPC; Экспериментальная станция Бумаги, Картона и Бумажной массы), Милан, применяя полный гидролиз полисахаридов в концентрированной серной кислоте с последующим измерением общего количества восстанавливающих Сахаров (методом Somogyi-Nelson) и определением глюкозы ферментативным методом.
Содержание гемицеллюлозы определяли методом, принятым на SSCCPC, заключающимся в селективном гидролизе гемицеллюлозы в разбавленной серной кислоте с последующим измерением общего количества восстанавливающих сахаров (методом Somogyi-Nelson).
Полученные результаты (выраженные в весовых процентах по отношению к весу сухого анализируемого образца) свидетельствуют, что полученная пленка не растворима в принятых условиях, которые обычно ведут к гидролизу целлюлозы и гемицеллюлозы.
При анализе образца были получены следующие результаты:
1,7% смолистых веществ, экстрагируемых циклогексаном/этанолом,
75% остатка, нерастворимого после гидролиза концентрированной (72%) серной кислотой с последующим гидролизом разбавленной (3%) серной кислотой, или в условиях экспериментов, которые обычно позволяют гидролизовать и целлюлозу, и гемицеллюлозу до соответствующих моносахаридов,
4,6% восстанавливающих сахаров, определяемых в растворе после гидролиза,
1,8% глюкозы (как считается, из целлюлозы),
2,8% восстанавливающих сахаров (как считается, из гемицеллюлозы),
85% остатка, нерастворимого после гидролиза в 1М серной кислоте остатка, нерастворимого после гидролиза 72% и 3% серной кислотой (условия эксперимента, которые обычно позволяют селективно гидролизовать гемицеллюлозу до соответствующих моносахаридов),
2,5% восстанавливающих сахаров в остатке после гидролиза 1М серной кислотой (как считается, из гемицеллюлозы).
13
Для того чтобы лучше определить химическую структуру пленки, регистрировали спектр ядерного резонанса для твердого образца. С ЯМР спектр регистрировали с использованием метода DD CP-MAS (Dipolar Decoupling Cross-Polarization Magic Angle Spinning, биполярная декаплинг кросс-поляризация при вращении под магическим углом).
Этот метод, необходимый для уменьшения биполярных расщеплений, и, как следствие, для уменьшения ширины сигнала, заключается в декаплинге при высокой мощности и вращении образца вокруг оси, расположенной под углом в 54°7' (называемый «магическим углом») к фиксированной оси. Вращение под магическим углом позволяет исключить биполярные и гомоядерные взаимодействия, а также анизотропию химического сдвига. В частности, метод DD CP-MAS был использован для увеличения интенсивности сигналов редко встречающихся ядер и для того, чтобы исключить проблемы, связанные с чрезмерно продолжительными временами релаксации этих самых ядер.
13
В этом эксперименте использовали спин-поляризацию часто встречающихся атомов, таких как, например, протоны, которая является относительно сильной для того, чтобы увеличить спин-поляризацию редко встречающихся ядер, таких как, например, C.
Измерения проводили на приборе As×300 Bruker, оснащенным 4 мм датчиком, вращая образец со скоростью 8 кГц.
В ЯМР спектрах содержится набор сигналов, типичных для повторяющейся гликозидной субъединицы целлюлозы, спектр которой аналогичен спектру целлюлозы I, полученной из Acetobacter.
4
4
4
4
Более того, что касается общего количества кристаллического С и аморфного С, было установлено, что содержание кристаллического С составляет 75%, что является достаточно высоким показателем, позволяющим говорить о высоком индексе кристалличности; в дальнейшей серии тестов, процентное содержание кристаллического C находилось в диапазоне от 65% до 90%.
Среднюю степень полимеризации определяли вискозометрическим методом UNI 8282/94. Образец был полностью растворим в использованном растворителе (куприэтилендиамин) со средней степенью полимеризации 290.