Способ обнаружения свойств митохондрий глиобластомы человека индуцировать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных
METHOD FOR DETECTING PROPERTIES OF HUMAN GLIOBLASTOMA MITOCHONDRIA TO INDUCE EXTRACRANIAL DIFFUSE TUMOR GROWTH IN THE ORGANS OF EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения свойств митохондрий глиобластомы формировать экстракраниальные очаги диффузного опухолевого роста.
Глиобластома (ГБ), также известна как мультиформная глиобластома, является наиболее агрессивным типом астроцитомы. ГБ происходит как из глиальных, так и из глиомных стволовых клеток и прогноз пациентов с ГБ по-прежнему остается плохим (см. Ostrom Q.T. et al., 2019; см. Grespi F. et al., 2022 г.).
На основании четко определенных изменений экспрессии генов в масштабах всего генома, соматических мутаций и изменений числа копий, ГБ обычно делят на четыре подтипа: классический, пронейральный, мезенхимальный и нейронный (см. Louis D.N. et al., 2016). Классический подтип наиболее встречаемый (97% опухолей) и характеризуется измененной экспрессией рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Глиомы классифицируются ВОЗ на различные степени в зависимости от тяжести заболевания - IV степень является наиболее агрессивной со средней выживаемостью 15 месяцев с момента постановки диагноза (см. Katz A.M. et al., 2012). Несмотря на многочисленные исследования, направленные на изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе развития ГБ, ее клеточное происхождение остается до конца не изучено. Была выдвинута гипотеза, что ГБ возникает из нейроэктодермальных стволовых клеток: наделенные высоким пролиферативным потенциалом, последние проявляют сильные миграционные способности и могут подвергаться дифференцировке в клетки ГБ (см. Bachoo R.M. et al., 2002). Однако клетки ГБ гетерогенны: опухолевая масса содержит эндотелиальные клетки, стволовые клетки, астроциты, клетки-предшественники и иммунные клетки (см. Gimple R.C. et al., 2019; см. Prager B.C. et al., 2019).
Недавние результаты показали, что половые различия играют важную роль в результатах лечения ГБ, когда пациенты женского пола имеют преимущество в выживаемости по сравнению с пациентами мужского пола (см. Gittleman H. et al., 2019; Ostrom Q.T. et al., 2019; Yang W. et al., 2019). Вскоре после этого было показано, что опухолевые клетки ГБ у мужчин и женщин несут разные молекулярные сигнатуры, которые влияют на их онкогенное поведение (Gittleman H. et al., 2019; Johansen M.L. et al., 2020). Вероятно, надо обращать внимание на популяционно-специфичный и специфичный для пола характер опухоли, при котором учитывается гетерогенность ГБ и клеток, инициирующих опухоль головного мозга (BTICS). Более старые методы определения характеристик опухоли не учитывали половые различия, поскольку большинство доклинических моделей ГБ in vivo воспроизводились только на самцах или самках мышей, и не проводили параллельных исследований между самцами и самками (Vaubel R.A. et al., 2019). Показано, что иммунная система является одним из факторов, способствующих половым различиям в нервном микроокружении и онкогенезе (Bayik D. et al., 2020; Turaga S.M. et al., 2020). Как показано Bayik et al., иммунная система, как внешняя особенность микросреды, вызывала половой диморфизм, когда иммунная система мужчин способствовала росту опухоли, а иммунная система женщин оказывала противоопухолевое действие (Bayik D. et al., 2020). Было показано, что опухолевые клетки ГБ обладают внутренними молекулярными свойствами, которые различаются в зависимости от пола, и эти внутренние молекулярные различия влияют на опухолевое поведение и выживаемость (Kfoury N. et al., 2018). Garcia C. A. et al. (2021) были созданы и охарактеризованы доклинические модели ГБ, специфичные для пола, на основе первичных полученных BTIC - клеток-предшественников глиобластомы. Использование первичных женских клеточных линий ГБ для моделирования в опытах in vivo является своевременным, т.к. существующие исследования, в основном, используют мужские, мышиные или коммерческие клеточные линии для создания моделей ГБ in vivo при изучении половых различий.
ГБ остается одним из неизлечимых первичных злокачественных новообразований головного мозга из-за нескольких факторов. Например, отсутствие единого целевого онкогенного пути является одним из факторов, которые еще больше усложняют курс лечения и исследований глиобластомы (см. Iranmanesh Y. et al., 2021). ГБ редко метастазируют за пределы центральной нервной системы (ЦНС). Однако она может быть очень инвазивной в пределах паренхимы головного мозга, что серьезно ограничивает эффективность хирургического вмешательства и лучевой терапии. Инвазия клеток ГБ в мозг отражает динамическое взаимодействие между межклеточной адгезией, ремоделированием внеклеточного матрикса и подвижностью клеток. В частности, во время эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) раковые клетки усиливают миграционные и инвазивные возможности за счет реорганизации цитоскелета и образования мембранных выступов (см. Yilmaz M., Christofori G., 2008).
Как и в других солидных опухолях, сообщается о нарушении физиологии митохондрий, которое считается ключевым фактором прогрессирования ГБ. Как митохондриальная функция, так и дисфункция играют важную роль в онкогенезе ГБ, поскольку митохондрии модулируют поддержание стволовости, покоя и дифференцировки ГБ, тогда как митохондриальные нарушения необходимы для разрешения устойчивости глиальных стволовых клеток к лечению (см. Iranmanesh Y. et al., 2021). Наблюдались нарушения биоэнергетики клеток, изменения в регуляции мембранного потенциала митохондрий, нарушение апоптотических сигнальных путей, набухание митохондрий с частичным или полным разрушением митохондриальных крист (кристолиз) и нарушение процессов слияния и деления. Эти ультраструктурные изменения согласуются с изменениями биоэнергетики митохондрий, указывая на критическое нарушение окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в клетках ГБ (см. Arismendi-Morillo G., 2011). Эти пути контролируются как взаимодействием между эндоплазматическим ретикулумом (ER) и митохондриями в местах контакта, так и ремоделированием цитоскелета, что позволяет предположить, что эти два фактора способствуют развитию ГБ (см. Giacomello M., Pellegrini L., 2016).
Субклеточное распределение митохондрий коррелирует с миграционными и инвазионными возможностями клеток ГБ (см. Iranmanesh Y. et al., 2021). Было показано, что антагонисты PI3K запускают транспорт энергетически активных удлиненных митохондрий в кортикальный цитоскелет опухолевых клеток. По-видимому, перемещенные митохондрии ускоряют динамику ламеллиподий, вызывают более быстрый оборот фокальных адгезивных комплексов, увеличивают скорость и ширину миграции клеток, что в конечном итоге приводит к более высоким показателям инвазии клеток GB (см. Altieri D.C., 2019). Митохондрии поддерживают инвазивность ГБ не только за счет снабжения АТФ, но и за счет контроля экспрессии поверхностных гликанов в стволовых клетках глиомы. Действительно, хотя точный механизм не был полностью выяснен, Bassoy E.Y. et al. (2017) показали, что взаимодействия ER с митохондриями, а не митохондрии как таковые, определяют экспрессию поверхностных гликанов. Предполагают, что митохондрии отвечают за поддержание окислительно-антиоксидантной системы в клетке. Окислительное повреждение, которое вовлечено в онкогенез, обычно следует за дисфункцией митохондрий. Мутации в генах, кодирующих компоненты митохондриальных белковых комплексов, могут приводить к повышенной выработке супероксидного радикала, что приводит к устойчивым АФК-зависимым онкогенным путям и индукции митохондриальной ДНК. Эти изменения связаны с повышенным риском онкогенеза и метастазирования при глиобластоме (см. Raimondi V. et al., 2020).
Экстракраниальные метастазы глиобластомы встречаются редко, частота их возникновения составляет от 0,4% до 2,0%. Метастазы вне ЦНС в основном встречаются у взрослых, особенно у мужчин. Прогноз метастатической глиобластомы неблагоприятный, медиана общей выживаемости (ОВ) с момента постановки диагноза метастазирования составляет 6,0 ± 0,8 мес. (см. Pietschmann S. et al., 2015). Редкость внечерепных метастазов объясняется коротким периодом выживания больных, наличием гематоэнцефалического барьера и отсутствием классической лимфатической дренажной системы (см. Xu M. et al., 2016). Нарушение проницаемости ГЭБ у пациентов с метастазами и ГБ высокой степени злокачественности связан с нарушением, как эндотелиальных плотных контактов, так и взаимодействий астроцитов и эндотелиальных клеток. На нарушение ГЭБ также влияет перитуморальный отек, развитие и прогрессирование опухоли. В дополнение к вышеупомянутым факторам, другие механизмы выхода раковых клеток включают сосудистую инвазию, лимфатическое распространение, периневральное распространение черепных нервов и прямую инвазию (см. Liu J. et al., 2020).
Суммируя предполагаемые препятствия для метастазирования ГБ следует отметить: защиту ГЭБ, отсутствие лимфатических метастазов, приписываемое отсутствию лимфатических каналов в системе ЦНС, подавление экстракраниального роста клеток ГБ иммунной системой и предположение о неспособности клеток ГБ проникать/разрушать внеклеточный матрикс других тканей, кроме тканей головного мозга (см. Lah T.T. et al., 2020). Однако и эти факты в литературе оспариваются. Во-первых, экспериментальные данные доказывают, что ГЭБ неэффективно блокирует перенос клеток за пределы внутричерепного пространства, а кровеносные сосуды ГБ скомпрометированы вставками дифференцированных мезинхимальных стволовых клеток (перицитов), ассоциированных с раком фибробластов (КАФ) и даже самих раковых клеток, имитирующих эндотелиальные клетки. Во-вторых, в ЦНС мышей и человека была обнаружена функциональная выстилка лимфатических сосудов, состоящая из типичных эндотелиальных синусов твердой мозговой оболочки, ведущих к глубоким шейным лимфатическим узлам (см. Carvalho JADW et al., 2019). Эти данные подтверждают предыдущие сообщения о метастазах ГБ в лимфатические узлы при отсутствии какой-либо ранее существовавшей хирургической процедуры. Они появлялись примерно в половине случаев зарегистрированных метастазов ГБ, другие наиболее распространенные локализации - плевра/легкие (60%), затем следуют метастазы в кости (31%), печень (12%) и даже кожу (см. Thomas J. G. et al., 2018).
Piccirilli M. et al. (2008) сообщили, что распространенными местами метастазирования были легкие и плевра (60%), лимфатические узлы (51%) и кости (31%).
В последнее время, в связи с ростом заболеваемости глиомой и достижениями в методах обследования, количество сообщений о пациентах ГБ с экстракраниальными метастазами постепенно увеличивается. В исследовании Chen J. et al. (2022) были рассмотрены и проанализированы клинические характеристики 15 пациентов ГБ с метастазами в позвоночник. Клинические проявления у этих пациентов, в основном, включали сдавливание пораженных сегментов спинного мозга, что приводило к соответствующей дисфункции, которая часто проявлялась в виде нарушений движений нижних конечностей, боли и нарушения мочеиспускания. Поскольку такие метастазы обычно возникает одновременно или последовательно с прогрессированием ГБ, они часто протекают бессимптомно или симптомы появляются поздно. Действительно, поскольку большинство симптомов возникает на поздней стадии заболевания, прогрессирование ГБ, приводящее к моторным нарушениям и сенсорным нарушениям, может маскировать симптомы.
В недавнем метаанализе Cunha et al. (2019) в 11 из 114 случаев метастатического поражения глиобластомы были метастазы в один орган или место, и только 12 случаев метастазов ГБ в несколько очагов были описаны без внутричерепного повторения или с ним. Наиболее частая первичная локализация ГБ с экстракраниальными метастазами - височная доля, а его метастатические очаги включают легкие, плевру, лимфатические узлы, печень, кожу, волосистую часть головы, околоушную железу, селезенку, поджелудочную железу, брыжейку кишечника, брюшину, эпидуральное пространство и костей, а также часто распространяется на мозговые оболочки или спинной мозг через спинномозговую жидкость.
Liu J. et al. (2020) сообщили о здоровом в других отношениях 46-летнем мужчине с первичной ГБ, у которого развилась обширная внечерепная прогрессия и отдаленные метастазы. Магнитно-резонансная томография (МРТ) выявила контрастно-усиленное образование (60 × 60 × 54 мм) с частичной кистозной дегенерацией в его левой височной доле. Пациент прошел послеоперационный режим Stupp, включающий одновременную химиолучевую терапию с последующей адъювантной химиотерапией TMZ. Первичная опухоль исчезла на МРТ после лечения, однако вскоре появились множественные образования на коже головы в лобной и височной областях, подтвержденные как ГБ положительные. Однако через 6 месяцев, у него появилась боль в груди. Физикальное обследование выявило низкое дыхание в нижней части легких с обеих сторон. Рентгенограмма грудной клетки показала множественные легочные узелки разного размера. Биопсия узлов левого легкого привела к гистологическому диагнозу: низкодифференцированная злокачественная опухоль, которая считается метастазами ГБ (класс IV по ВОЗ). Мультиформную глиобластому с метастазами в кожу описали и Nakib C. E. et al. (2022).
Костная ткань продолжает оставаться исключительным местом для появления метастазов (см. Zhang W. et al. , 2021). Zapata Laguado M. et al. (2021) сообщили о 32 летней женщине с диагнозом ГБ IV степени по классификации ВОЗ, размер поражения составлял 53x54 мм, располагался в нижней лобной извилине с расширением до колена мозолистого тела. На шестом курсе противоопухолевого лечения у пациентки начались боли в бедре и нижних конечностях. Были сделаны МРТ бедер и КТ грудной клетки, брюшной полости и таза. Задокументирован литический метастаз в третьей реберной дуге, левой задней подвздошной области размером 47x31 мм с инфильтративным поражением костного мозга в средней трети диафиза бедренной кости с кортикальной передней инфильтрацией. Метастаз подтвержден гистологически. Аналогичные случаи описывают Krishnan, A. S. et al. (2022), Conte B. et al. (2022).
Место метастазирования ГБ влияет на прогноз выживаемости, и сообщается, что метастазы в легких имеют худший прогноз (см. Lun M. et al., 2011). Сообщается также, что наиболее часто регистрируемыми начальными метастазами являются легкие и плевра, за которыми следуют лимфатические узлы. В недавнем мета-анализе метастазирование в легкие и лимфатические узлы встречалось в 21,7% и 12,2% соответственно (см. da Cunha M. L. et al., 2019). В исследовании Briones-Claudett K.H. et al. (2020) 66-летний мужчина поступил с метастазами в легкие после хирургической резекции первичной мультиформной глиобластомы. Через 17 дней после операции в реанимационном отделении у больного развился лейкоцитоз с преобладанием нейтрофилов. Исследовательская бронхоскопия показала белое поражение, которое мешало визуализации бронха. Образец был взят для патологического исследования, которое продемонстрировало легочные метастазы из мультиформной глиобластомы. Экстракраниальное метастазирование ГБ в легкие описывают Chai M., Shi Q. (2022). Послеоперационное наблюдение пациента с ГБ выявило экстракраниальные метастазы во множество органов, включая череп, кожу головы, ребра, позвоночник, печень и легкие. Пациент умер от системной полиорганной недостаточности (см. Luan, X. Z. et al., 2021).
Таким образом, к настоящему времени описано достаточно много случаев экстракраниального метастазирования ГБ, однако механизмы этого явления остаются достаточно неизученными. Очевидна и роль митохондрий в прогрессировании ГБ, однако и их роль в экстракраниальном метастазировании не известна. И не известно такое свойство митохондрий глиобластомы как способность формировать в организме экстракраниальный дифузный опухолевый рост.
Линейные животные широко используются в экспериментальной практике, во многих областях биологии и медицины. Результаты исследований, выполненных на Линейных животных, являются сопоставимыми и могут быть повторены в любое отдаленное время и в любом другом научном центре.
Выбор животного определяется видовой принадлежностью клеточного материала. Для исследования туморогенности клеточных линий и биопрепаратов, полученных на их основе от грызунов, можно использовать здоровых сингенных животных. Для исследования всех остальных, рекомендуется использовать иммунодефицитных животных. Наиболее предпочтительными моделями являются стандартные сертифицированные животные с генетически обусловленным иммунодефицитом - бестимусные мыши (голые мыши, Nude). Эти животные являются носителями аутосомно- рецессивной мутации, которая в гомозиготном состоянии приводит к отсутствию внутриутробной закладки тимуса и волосяных луковиц, в результате чего они дефицитны по Т-лимфоцитам и лишены шерстного покрова. Используются как новорожденные, так и взрослые гомозиготные особи (Nu/Nu) (см. Lewis A.M.Jr., 2005; Rubio D. et al., 2005).
Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа получения экстракраниальных диффузных опухолевых очагов глиобластомы в организме мышей Balb/c Nude путем трансплантации митохондрий, изолированных из глиобластомы человека.
Поставленная цель достигается тем, что самцам мышей линии Balb/c Nude однократно внутрибрюшинно вводят митохондрии, изолированные из глиобластомы человека из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора и через 14-21 день проводят регистрацию морфологически подтвержденного диффузного опухолевого роста в органах экспериментальных животных.
Изобретение «Способ обнаружения свойств митохондрий глиобластомы человека индуцировать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о свойствах митохондрий, изолированных из глиобластомы человека, вызывать при парентеральном введении развитие экстракраниального диффузного опухолевого роста в организме животных.
Новизна изобретения заключается в использовании митохондрий, изолированных из глиобластомы человека, для воспроизведения в организме мышей линии Balb/c Nude вновь образованного экстракраниального диффузного опухолевого роста. Проведение экспериментальной митохондриальной трансплантации приводило к возникновению в организме животных экстракраниального диффузного опухолевого роста, доказанного при морфологическом исследовании.
Для лучшего понимания способа приводим фигуры.
Фиг. 1. Фрагменты селезенки мыши Balb/c Nude после введения изолированных митохондрий глиобластомы человека: а, б) - частичное сохранение общей архитектоники с участками кровонаполнения, ув.х 5; в - е) - расширение стромальных путей миграции атипичных клеток, принимающих форму рекрутированных фибробластов и лимфоцитоподобных клеток, ув.х40, х 100; ж, з) - обилие мегакариоцитов, ув.х100. Окр. гематоксилин-эозином.
Фиг. 2. Брыжейка и лимфатический узел мыши Balb/c Nude после введения изолированных митохондрий глиобластомы человека. Сохранение общей архитектоники лимфоузла с диффузными изменениями трабекулярных синусов, лабиринтов и мозговых синусов, ув. х50, окр. гематоксилин-эозин.
Фиг. 3. Брыжейка и лимфатические узлы мыши Balb/c Nude после внутрибрюшинного введения изолированных митохондрий глиобластомы человека: а-г) - локализация атипичных лимфоцитоподобных клеток в фиброзных перегородках и синусах лимфоузлов, ув.х40; д,е) - кровенаполнение сосудов, диффузный рост мультиформных клеток глиобластомы в стромальных участках, ув.х 100. Окр. гематоксилин-эозином.
Фиг. 4. Цитоплазматическая реакция в фиброзных перегородках селезенки мыши Balb/c Nude. Экспрессия GFAP: Ув. х30 (а), х50 (б), х200 (в). Цитоплазматическое окрашивание.
Фиг. 5. Иммуногистохимическая реакция в фиброзных перегородках селезенки мыши Balb/c Nude. Экспрессия ki-67 при цитоплазматическом окрашивании атипичных клеток.: Ув. х50 (а), х200 (б).
Фиг. 6. Селезенка мыши Balb/cNude после трансплантации митохондрий, изолированных из клеток глиобластомы человека. Экспрессия S100. Ув. х150.
Фиг. 7. Брыжейка и ткань лимфатического узла мыши Balb/cNude после трансплантации митохондрий, изолированных из клеток глиобластомы человека. Экспрессия S100. Ув. х30.
Фиг. 8. Брыжейка, ткань лимфатического узла, цитоплазматическая экспрессия GFAP в клетках, локализующихся в синусах и фиброзных перегородках лимфатических узлов. Ув. х30.
Фиг. 9. Брыжейка, ткань лимфатического узла мыши Balb/cNude после трансплантации митохондрий, изолированных из клеток глиобластомы человека. Цитоплазматическая экспрессия ki-67. Ув. х30.
Фиг. 10. Контрольный образец лимфатического узла для ki-67 с типичным ядерным окрашиванием герминативного центра фолликула, ув.х200.
Изобретение «Способ обнаружения свойств митохондрий глиобластомы человека индуцировать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной трансплантации митохондрий, изолированных из опухоли, изучения новых свойств митохондрий клеток глиобластомы человека вызывать при парентеральном введении в организме животных экстракраниальный диффузный опухолевый рос.
«Способ обнаружения свойств митохондрий глиобластомы человека индуцировать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных» выполняется следующим образом.
Во время операции краниотомия производят удаление у больного глиобластомы. Часть опухоли быстро помещают в холодную стерильную среду выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4).
Митохондрии выделяют с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А. (см. Егорова М.В., Афанасьев С.А., 2011 г.; см. Гуреев А.П., Кокина А.В. и др. 2015 г.). Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани добавляют по 10 мл стерильной среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизируют и центрифугируют первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2°С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2°С. Между центрифугированием проводят процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищают от лизосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте Перколла. Суспензию субклеточных структур наслаивают на градиент Перколла, центрифугируют 15 мин при 21000 g, после этого наблюдается разделение на 3 фазы, оставляют нижний слой митохондрий и ресуспендируют средой выделения. Следующую промывку митохондрий осуществляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2°С. Митохондриальные образцы разводят 0,9% раствором NaCl до концентрация белка 3 мг белка в 0,4 мл физиологического раствора.
Мышам линии Balb/c Nude внутрибрюшинно одноразово трансплантируют свежеизолированные митохондрии глиобластомы из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора.
Контролем служат мыши-самцы линии Balb/c Nude, которым одноразово внутрибрюшинно соответственно вводят 0,4 мл физиологического раствора.
Всех животных умерщвляют путем декапитации на гильотине через 2 недели после парентеральной трансплантации митохондрий, изолированных из глиобластомы.
Пример применения способа.
Характеристика больной. Больная Ч. 28.11.1958 г.р. поступила в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России 30.09.2022 г. с жалобами на периодические головные боли, общую слабость.
Из анамнеза. В начале августа 2022 г. остро возникла слабость левых конечностей и лица. Госпитализирована в ГБУЗ «НИИ-Краевая клиническая больница №1 им. Проф. С.В. Очаповского» Минздрава КК, где находилась с 31.08. 2022 г. по 06.09.2022 г. Выполнено МРТ головного мозга с контрастным усилением с выраженными артефактами 01.09.2022 г: объемное образование правой лобно-височно-подкорковой области 42х56х54 мм, смещение срединных структур 10 мм. Самостоятельно обратилась в «НМИЦ онкологии». Рекомендовано хирургическое лечение в отделении нейрохирургии. МРТ головного мозга 14.09. 2022 г: срединные структуры смещены влево на уровне СЧЯ до 5-6 мм. В подкорковых ядрах, островке, лобной, височных долях правого полушария выявлена зона распада. Компрессия 3-го и правого бокового желудочка мозга. Снижение с/а пространства, боковой щели правого полушария. После в/в усиления отмечается диффузное равномерное периферическое накопление контраста тканью опухоли в правом полушарии, размерами узла 45х60 мм. При DTI разрушение проводящих трактов на уровне опухоли, вовлечение в процесс правого кортико-спинального тракта, инфильтрация передних его отделов, большая часть тракта сдавлена. Боковые желудочки мозга ассиметричны, D<S, не расширены. IV желудочек не расшинен. Очаг глиоза в левой лобной доли. Гиперостаз левой лобной кости. Дополнительных образований в области мосто-мозжечковых углов не выявлено. Орбиты и хиазмальная область без особенностей, гипофиз в размерах не увеличен, ткань гипофиза имеет обычный сигнал. Хиазмальная цистерна не расширена. Умеренное расширение большой мозговой и нижней ретроцеребральной цистерн. Остальные субарахноидальные пространства и борозды полушарий головного мозга нерезко неравномерно расширены. Боковые щели мозга ассиметричны, D<S. Миндалины мозжечка расположены на уровне большого затылочного отверстия Краниовертебральный переход без особенностей.
Тяжесть пациента при поступлении: средней тяжести.
Диагноз: глиальная опухоль правых лобных и височных долей головного мозга T3N1M0 с распространением в сильвиев пакет, подкорковую область, стадия опухолевого процесса: III a. Клиническая группа 2.
Оперативное вмешательство: удаление новообразования больших полушарий головного мозга с применением микрохирургической техники.
Гистологическое исследование от 12.10.2022 г.: морфологическая картина характерна для глиобластомы, NOS, Grad4 (ВОЗ, 2016). Для уточнения иммунофенотипа опухолевых клеток и степени злокачествености рекомендуется ИГХ исследование.
Иммуногистохимическое исследование от 20.10.2022 г.: морфологическая картина и иммунофенотип опухолевых клеток (GFAP+, S100, ki-67 - 15%) характерная для глиобластомы, NOS, Grad4 (ВОЗ, 2016).
Получение опухолевого материала.
После удаления опухоли, часть материала сразу помещали в холодную стерильной среды выделения - 0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4.
Митохондрии изолировали с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева С.А., 2011 г., и Гуреева А.П., Кокиной А.В. и др., 2015). Для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую обработку тканей с измельчением ножницами и гомогенизацией в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани добавляют по 10 мл стерильной среды выделения (0,22 М маннитол, 0,3 М сахароза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гомогенизируют и центрифугируют первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2°С, второе и третье центрифугирование осуществляется при 20000 g, 20 мин, температура 0-2°С. Между центрифугированием проводят процедуру ресуспендирования осадка митохондрий в среде выделения. Митохондрии дополнительно очищают от лизосом, пероксисом, меланосом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте Перколла. Суспензию субклеточных структур наслаивают на градиент Перколла, центрифугируют 15 мин при 21000 g, после этого наблюдается разделение на 3 фазы, оставляют нижний слой митохондрий и ресуспендируют средой выделения. Следующую промывку митохондрий осуществляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2°С. Митохондриальные образцы разводят 0,9% раствором NaCl до концентрация белка 3 мг белка в 0,4 мл физиологического раствора.
Проведение трансплантации митохондрий глиобластомы животным-реципиентам.
Мышам линии Balb/c Nude (n=6) внутрибрюшинно однократно трансплантировали свежеизолированные митохондрии глиобластомы из расчета 3 мг белка на 1 животное в 0,4 мл физиологического раствора.
Контролем служили мыши-самцы линии Balb/c Nude (n=6), которым одноразово внутрибрюшинно соответственно вводили 0,4 мл физиологического раствора.
Всех животных умерщвляли путем декапитации на гильотине через 2 недели после парентеральной трансплантации митохондрий, изолированных из глиобластомы.
Морфологическое и иммуногистохимическое исследование некоторых внутренних органов мышей Balb/c Nude.
При общем морфологическом исследовании препарата селезенки мышей Balb/c Nude после введения изолированных митохондрий глиобластомы отмечено сохранение общей архитектоники со значительным кровонаполнением, отвечающим кроветворному статусу органа (фиг. 1 а, б). Красная пульпа селезенки была представлена расширенными венозными синусами и клеточными элементами, включая, главным образом, эритроциты и лимфоциты, а также лейкоциты, плазматические клетки, моноциты и макрофаги. Обращало внимание реактивное состояние ретикулярной ткани, переходящей в ретикулярную строму мальпигиевых телец (белая пульпа селезенки), размеры и структура которых значительно варьировали по всей поверхности органа с доминированием крупных с расширенными герминативными центрами и узкими периферическими слоями иммунокомпетентных клеток.
Вместе с тем, были выявлены особые изменения структуры селезенки, которые указывали на развитие патологического процесса. На множественных полях зрения отмечалось значительное расширение стромальных путей активной миграции атипичных клеток, принимающих форму рекрутированных фибробластов (фиг. 1 в, г), а также образование тяжей из клеток, напоминающих мультиформную глиобластому (фиг. 1 д, е).
Кроме того, отмечались скопления округлых атипичных лимфоцитоподобных клеток с выраженной гиперхромией ядер, а также множественные участки с гигантскими многоядерными клетками типа мегакариоцитов с характерными ядрами неправильной формы (фиг. 1 ж, з). Обилие мегакариоцитов по всей поверхности препарата, как известно, служит косвенным подтверждением воздействия фактора опухолевой природы, который оказывает существенное гемолитическое влияние.
При морфологическом исследовании брыжейки и лимфоузлов на малом увеличении микроскопа (об. х 5), их структура не была патологически изменена и никаких аномальных макроконгломераций выявлено не было (см. фиг. 2, 3 а, б). Однако при значительном приближении (об. х 10, х 40), были выявлены множественные участки с атипичными клетками, напоминающие мультиформную глиобластому, локализующиеся в фиброзных перегородках и синусах (фиг. 3 в, г). Необычная тропность митохондрий глиобластомы к структурным элементам лимфоидной ткани проявлялась формированием стромальных клеток глиального характера в стенках трабекулярных синусов, лабиринтах лимфатических узлов и мозговых синусов, а также в окружении кровеносных сосудов (фиг. 3 д, е). Помимо ретикулярной сети коллагеновых волокон и проводящей системы, возможность заселения имплантируемого опухолевого материала, состоящего из изолированных митохондрий, продемонстрирована на снимках перегородок брыжейки, которые, как хорошо известно, также включают помимо кровеносных сосудов и нейрональные структуры. В связи с этим, полученный эффект диффузного распространения митохондрий глиобластомы через фибробластический ретикулярный путь вполне соответствует существующим представлениям о двусторонней связи нервной и иммунной систем, которая может трансформироваться как вариант патологического взаимодействия и демонстрировать вклад важнейших органоидов клеток глиобластомы в инициацию опухолевого роста.
Исходя из полученных нами данных о клинической картине глиобластомы больной Ч. 28.11.1958 г.р и установленного иммунофенотипа опухолевых клеток (ИГХ от 20.10.2022 г.: GFAP+, S100, ki-67 - 15%, характерного для глиобластомы, NOS, Grad4 ), был проведен сравнительный иммуногистохимический анализ экспериментальных препаратов селезенки, брыжейки и лимфоузлов мышей Balb/c Nude, которым была осуществлена внутрибрюшинная трансплантация митохондрий, изолированных из глиобластомы пациентки Ч .
Об инициации диффузного роста клеток глиобластомы в стромальной части красной пульпы селезенки, не затрагивающего фолликулярные структуры белой пульпы, свидетельствовало определение экспрессии GFAP и ki-67.
На фигуре 4 (а, б, в) представлены препараты, подтверждающие экспрессию GFAP при различном увеличении объектива. Важным обстоятельством явилось то, что при увеличении х200 (фиг. 4 в) четко прослеживается цитоплазматическая (а не ядерная) реакция в фиброзных перегородках селезенки мыши Balb/c Nude, что подтверждает локализацию митохондрий именно в цитоплазме. Такая выраженная экспрессия GFAP свидетельствует о содержании маркера глиобластомы, который фиксировался и в препарате опухоли пациентки Ч. Следовательно, впервые можно было констатировать инициацию идентичного процесса канцерогенеза путем целенаправленного митохондриального заноса в экспериментальных условиях внутрибрюшинной трансплантации митохондрий из опухоли человека в организм животного
Подобная иммуногистохимическая реакция была зафиксирована в селезенке мыши Balb/c Nude в отношении ki-67. Наиболее значительная экспрессия маркера регистрировалась в фиброзных перегородках (фиг. 5 а), что характеризовало возможность опухолевого роста клеток глиобластомы, инициированного субклеточным носителем злокачественной митохондриальной ДНК. Мы полагаем, что подтверждением митохондриального канцерогенеза в стромальном матриксе красной пульпы селезенки служит именно обнаруженное на препаратах цитоплазматическое, а не ядерное окрашивание, поскольку речь идет о митохондриальном компоненте цитоплазмы, как носителе злокачественной генетической информации. На фигуре 5(б) при увеличении х200, нельзя ни отметить единообразие цитоплазматического окрашивания маркера ki-67 во всем опухолеобразующем пространстве фиброзных перегородок красной пульпы селезенки.
Дополнительное исследование иммунофенотипа клеток у мышей Balb/c Nude в селезенке, брыжейке и лимфоузлах по общепринятому маркеру S100 (фиг. 6, 7) не оставляло сомнений в индукции злокачественного роста после трансплантации митохондрий, изолированных из глиобластомы человека. Экспрессия маркера S100 отражала ведущую роль стромального и цитоплазматического звена в реализации митохондриального канцерогенеза.
Далее мы исследовали экспрессию маркеров GFAP, ki-67 в брыжейке и лимфатических узлах, как одних из часто встречаемых органов экстракраниального метастазирования глиобластомы и сопоставили с контролем.
На снимках брыжейки и лимфатического узла мыши Balb/cNude после трансплантации митохондрий глиобластомы человека четко определяется преимущественно центральная область расположения окрашенных гранул с соответствующим иммуногистохимическим профилем - GFAP и ki-67 (фиг. 8, 9).
Так же, как и в селезенке, экспрессия маркеров регистрировалась в фиброзных перегородках центральной зоны мякотных тяжей лимфатических узлов. Аналогичным образом на препаратах обнаруживалось цитоплазматическое, а не ядерное окрашивание, что также указывало на свойственную митохондриям дислокацию в цитоплазме клетке и проявлению канцерогенного влияния в виде переноса митохондриальной ДНК глиобластомы человека.
В качестве альтернативного примера цитоплазматического окрашивания иммуногистохимического маркера ki-67, приводим контрольный препарат метастатически пораженного лимфоузла, где со всей очевидностью проявляется злокачественное поражение герминативного центра фолликуллов лимфоузлов (фиг. 10), а не синусы и фиброзные перегородки с характерным ядерным окрашиванием.
В этом отношении, можно указать на несомненную важность ранее приведенных данных о наличии функциональной выстилки лимфатических сосудов, состоящей из типичных эндотелиальных синусов твердой мозговой оболочки, ведущих к глубоким шейным лимфатическим узлам (Carvalho JADW et al., 2019). Такое сродство структурных элементов тканей демонстрирует высокую вероятность межклеточного взаимодействия и подтверждает возможность метастазирования ГБ в другие лимфоидные органы. Безусловным фактором индукции митохондриями ГБ диффузного роста опухоли являются и кровеносные сосуды ГБ, которые, как уже отмечалось, скомпрометированы вставками дифференцированных мезинхимальных стволовых клеток (перицитов), ассоциированных с раком фибробластов (КАФ) и даже самих раковых клеток, имитирующих эндотелиальные клетки.
Высокая миграционная активность митохондрий ГБ и способность к транслокации с использованием механизмов рекрутизации фибробластических элементов соединительной ткани, по-видимому, представляет ранее неизвестный путь злокачественного метастазирования, опосредованного насыщением внутренних сред организма клеточными подсистемами, таких как архейоподобные генетически трансформированные и/или прокариоподобные митохондриальные подсистемы. Приобретенная самостоятельность онкогенных субклеточных носителей митохондриальной ДНК способствует ускоренному доступу и поражению органов, более выраженному, чем у целых злокачественных клеток.
Технико-экономическая эффективность «Способ обнаружения свойств митохондрий глиобластомы человека индуцировать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных» заключается в том, что применение парентеральной трансплантации митохондрий, изолированных из глиобластомы человека, у мышей-самцов линии Balb/c Nude вызывает в организме экстракраниальный диффузный опухолевый рост.
Обнаруженные свойства митохондрий глиобластомы образовывать экстракраниальный диффузный опухолевый рост в органах экспериментальных животных позволяют понять патогенез злокачественного роста глиобластомы человека, что важно для клиники, так как доказывает новый, ранее не известный, механизм диссеминации глиобластомы.
Способ экономичен, доступен для исполнения.
Список литературы
1. Гуреев А.П., Кокина А.В., Сыромятникова М.Ю., Попов В.Н. Оптимизация методов выделения митохондрий из разных тканей мыши. Вестник ВГУ, серия: химия, биология, фармация. 2015 г.
2. Егорова М.В., Афанасьев С.А. Выделение митохондрий из клеток и тканей животных и человека: Современные методические приемы. Сибирский медицинский журнал. 2011 г.
3. Luan X. Z., Wang H. R., Xiang W., Li S. J., He H., Chen L. G., Wang J. M., Zhou J. Extracranial multiorgan metastasis from primary glioblastoma: A case report. World journal of clinical cases. 2021;9(33):10300-10307. doi: 10.12998/wjcc.v9.i33.10300.
4. Chai M., Shi Q. Extracranial metastasis of glioblastoma with genomic analysis: a case report and review of the literature. Translational cancer research. 2022;11(8):2917-2925. doi: 10.21037/tcr-22-955.
5. Conte B., Rich B. J., Gultekin S. H., Azzam G., Del Pilar Guillermo Prieto Eibl M. A Case of Glioblastoma, Isocitrate Dehydrogenase Wild Type, With Widely Disseminated Osseous Metastasis. Cureus. 2022;14(9): e28803. doi: 10.7759/cureus.28803.
6. Briones-Claudett KH, Briones-Claudett MH, Villacrés Garcia F, Ortega Almeida C, Escudero-Requena A, Benítez Solís J, Briones Zamora KH, Briones Márquez DC, Grunauer M. Early Pulmonary Metastasis After a Surgical Resection of Glioblastoma Multiforme. A Case Report. Am J Case Rep. 2020;21:e922976. doi: 10.12659/AJCR.922976.
7. da Cunha M. L. V., Maldaun M. V. C. Metastasis from glioblastoma multiforme: a meta-analysis. Revista da Associacao Medica Brasileira. 2019;65(3):424-433. doi: 10.1590/1806-9282.65.3.424.
8. Lun M., Lok E., Gautam S., Wu E., Wong E. T. The natural history of extracranial metastasis from glioblastoma multiforme. Journal of neuro-oncology. 2011;105(2):261- 273. doi: 10.1007/s11060-011-0575-8.
9. Nakib C. E., Hajjar R., Zerdan M. B., Darwish H., Zeidan Y., Alame S., Kassouf H. K., Chamseddine N., Assi H. I. Glioblastoma multiforme metastasizing to the skin, a case report and literature review. Radiology case reports. 2021;17(1):171-175. doi: 10.1016/j.radcr.2021.10.029.
10. Krishnan A. S., Gupta S., Mandal S., Phulware R. H., Gupta M. Metachronous Osseous Metastases From Gliobliostoma Mutiforme: An Unusual Presentation. Cureus. 2022;14(2): e22587. doi: 10.7759/cureus.22587.
11. Zapata Laguado M., Baez J. M., Luna A., Mantilla C., Palencia M. Bone Metastasis From Glioblastoma Multiforme: A Case Report. Cureus. 2022;14(5):e25464. doi: 10.7759/cureus.25464.
12. Zhang W., Cai YY., Wang XL., et al. Bone metastases of glioblastoma: a case report and review of the literature. Front Oncol. 2021;11:705455. doi: 10.3389/fonc.2021.705455.
13. Liu J., Shen L., Tang G., Tang S., Kuang W., Li H., Tian Y., Zhou Q. Multiple extracranial metastases from glioblastoma multiforme: a case report and literature review. J Int Med Res. 2020;48(6):300060520930459. doi: 10.1177/0300060520930459.
14. Piccirilli M., Brunetto GM., Rocchi G., et al. Extra central nervous system metastases from cerebral glioblastoma multiforme in elderly patients. Clinico-pathological remarks on our series of seven cases and critical review of the literature. Tumori. 2008;94:40-51.
15. Thomas J. G., Parker Kerrigan B. S., Hossain A., Gumin J., Shinojima N., Nwajei F., et al. Ionizing radiation increases glioma tropism of mesenchymal stem cells. J. Neurosurgeon. 2018;128:287-295. doi: 10.3171/2016.9.JNS16278.
16. Carvalho JADW, de L. Barbosa K.S., Feher O., Maldown M.V.K., de Camargo V.P., Moraes F.Yu., Martha G.N. Systemic dissemination of glioblastoma: a review of the literature. Rev. Assoc. Honey. Bras. 2019;65:460-468. doi: 10.1590/ 1806-9282.65.3.460.
17. Lah T.T., Novak M., Breznik B. Brain malignancies: Glioblastoma and brain metastases. Semin Cancer Biol. 2020;60:262-273. doi: 10.1016/j.semcancer.2019.10.010.
18. Cunha MLVD, Maldaun MVC. Metastasis from glioblastoma multiforme: a meta-analysis. Rev Assoc Med Bras. 2019;65:424-433. doi: 10.1590/1806-9282.65.3.424.
19. Xu M., Wang Y., Xu J., et al. Extensive therapies for extraneural metastases from glioblastoma, as confirmed with the OncoScan assay. World Neurosurg. 2016;90:698.e7-698.e11. doi: 10.1016/j.wneu.2016.01.074.
20. Pietschmann S., Von Bueren AO., Kerber MJ., et al. An individual patient data meta-analysis on characteristics, treatments and outcomes of glioblastoma/gliosarcoma patients with metastases outside of the central nervous system. PLoS One. 2015;10:e0121592. doi: 10.1371/journal.pone.0121592.
21. Chen J., Shi Q., Li S., Zhao Wu., Huang H. Clinical characteristics of glioblastoma with metastatic dissemination in the spine. Ann Palliat Med. 2022; 11(2):506-512. doi: 10.21037/apm-21-3387.
22. Garcia C. A., Bhargav A. G., Brooks M., Suárez-Meade P., Mondal S. K., Zarco N., ReFaey K., Jentoft M., Middlebrooks E. H., Snuderl M., Carrano A., Guerrero-Cazares H., Schiapparelli P.,  Functional Characterization of Brain Tumor-Initiating Cells and Establishment of GBM Preclinical Models that Incorporate Heterogeneity, Therapy, and Sex Differences. Molecular cancer therapeutics. 2021;20(12):2585-2597. doi: 10.1158/1535-7163.
23. Bayik D., Zhou Y., Park C., Hong C., Vail D., Silver DJ., et al. Myeloid-Derived Suppressor Cell Subsets Drive Glioblastoma Growth in a Sex-Specific Manner. Cancer Discov. 2020;10:1210-25. doi:10.1158/2159-8290.
24. Turaga SM., Silver DJ., Bayik D., Paouri E., Peng S., Lauko A., et al. JAM-A functions as a female microglial tumor suppressor in glioblastoma. Neuro Oncol. 2020;22:1591-601. doi: 10.1093/neuonc/noaa148.
25. Vaubel RA., Tian S., Remonde D., Schroeder MA., Mladek AC., Kitange GJ., et al. Genomic and phenotypic characterization of a broad panel of patient derived xenografts reflects the diversity of glioblastoma. Clinical Cancer Research. 2019:clincanres.0909.2019.
26. Gimple RC., Bhargava S., Dixit D., Rich JN. Glioblastoma stem cells: lessons from the tumor hierarchy in a lethal cancer. Genes Dev. 2019;33:591-609. doi: 10.1101/gad.324301.119.
27. Prager BC., Xie Q., Bao S., Rich JN. Cancer Stem Cells: The Architects of the Tumor Ecosystem. Cell Stem Cell. 2019;24:41-53. doi: 10.1016/j.stem.2018.12.009.
28. Ostrom QT., Cioffi G., Gittleman H., Patil N., Waite K., Kruchko C., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2012-2016. Neuro Oncol. 2019;21:v1-v100. doi: 10.1093/neuonc/noz150.
29. Raimondi V., Ciccarese F., Ciminale V. Oncogenic pathways and the electron transport chain: a dangeROS liaison. Br J Cancer. 2020;122(2):168-81. doi: 10.1038/s41416-019-0651-y.
30. Kim W, Yoo H, Shin SH, Gwak HS, Lee SH. Extraneural Metastases of Glioblastoma without Simultaneous Central Nervous System Recurrence. Brain Tumor Res Treat. 2014;2(2):124-7. doi: 10.14791/btrt.2014.2.2.124.
31. Bassoy E.Y., Kasahara A., Chiusolo V., Jacquemin G., Boydell E., Zamorano S., Riccadonna C., Pellegatta S., Hulo N., Dutoit V., et al. ER-Mitochondria Contacts Control Surface Glycan Expression and Sensitivity to Killer Lymphocytes in Glioma Stem-like Cells. EMBO J. 2017;36:1493-1512. doi: 10.15252/embj.201695429.
32. Altieri D.C. Mitochondrial Dynamics and Metastasis. Cell. Mol. Life Sci. 2019;76:827-835. doi: 10.1007/s00018-018-2961-2.
33. Iranmanesh Y., Jiang B., Favour O.C., Dou Z., Wu J., Li J., Sun C. Mitochondria’s Role in the Maintenance of Cancer Stem Cells in Glioblastoma. Front. Oncol. 2021;11:101. doi: 10.3389/fonc.2021.582694.
34. Giacomello M., Pellegrini L. The Coming of Age of the Mitochondria-ER Contact: A Matter of Thickness. Cell Death Differ. 2016;23:1417-1427. doi: 10.1038/cdd.2016.52.
35. Arismendi-Morillo G. Electron Microscopy Morphology of the Mitochondrial Network in Gliomas and Their Vascular Microenvironment. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 2011;1807:602-608. doi: 10.1016/j.bbabio.2010.11.001.
36. Yilmaz M., Christofori G. EMT, the Cytoskeleton, and Cancer Cell Invasion. Cancer Metastasis Rev. 2009;28:15-33. doi: 10.1007/s10555-008-9169-0.
37. Grespi F., Vianello C., Cagnin S., Giacomello M., De Mario A. The Interplay of Microtubules with Mitochondria-ER Contact Sites (MERCs) in Glioblastoma. Biomolecules. 2022;12(4):567. doi: 10.3390/biom12040567.
38. Louis D.N., Perry A., Reifenberger G., von Deimling A., Figarella-Branger D., Cavenee W.K., Ohgaki H., Wiestler O.D., Kleihues P., Ellison D.W. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: A Summary. Acta Neuropathol. 2016;131:803-820. doi: 10.1007/s00401-016-1545-1.
39. Katz A.M., Amankulor N.M., Pitter K., Helmy K., Squatrito M., Holland E.C. Astrocyte-Specific Expression Patterns Associated with the PDGF-Induced Glioma Microenvironment. PLoS ONE. 2012;7:e32453. doi: 10.1371/journal.pone.0032453.
40. Bachoo R.M., Maher E.A., Ligon K.L., Sharpless N.E., Chan S.S., You M.J., Tang Y., DeFrances J., Stover E., Weissleder R., et al. Epidermal Growth Factor Receptor and Ink4a/Arf: Governing Terminal Differentiation and Transformation Stem Cell to Astrocyte Axis. Cancer Cell. 2002;1:269-277. doi: 10.1016/S1535-6108(02)00046-6.
41. Guan X., Hasan M.N., Maniar S., Jia W., Sun D. Reactive Astrocytes in Glioblastoma Multiforme. Mol. Neurobiol. 2018;55:6927-6938. doi: 10.1007/s12035-018-0880-8.
42. Bunse L., Pusch S., Bunse T., Sahm F., Sanghvi K., Friedrich M., Alansary D., Sonner J.K., Green E., Deumelandt K., et al. Suppression of Antitumor T Cell Immunity by the Oncometabolite (R)-2-Hydroxyglutarate. Nat. Med. 2018;24:1192-1203. doi: 10.1038/s41591-018-0095-6.
43. Yang W., Warrington NM., Taylor SJ., Whitmire P., Carrasco E., Singleton KW., et al. Sex differences in GBM revealed by analysis of patient imaging, transcriptome, and survival data. Sci Transl Med. 2019;11(473):eaao5253. doi: 10.1126/scitranslmed.aao5253.
44. Ostrom QT., Coleman W., Huang W., Rubin JB., Lathia JD., Berens ME., et al. Sex-specific gene and pathway modeling of inherited glioma risk. Neuro Oncol. 2019;21:71-82. doi: 10.1093/neuonc/noy135.
45. Gittleman H., Ostrom QT., Stetson LC., Waite K., Hodges TR., Wright CH., et al. Sex is an important prognostic factorfor glioblastoma but not for nonglioblastoma. Neurooncol Pract. 2019;6:451-62. doi: 10.1093/nop/npz019.
46. Johansen ML., Stetson LC., Vadmal V., Waite K., Berens ME., Connor JR., et al. Gliomas display distinct sex-based differential methylation patterns based on molecular subtype. Neuro-Oncology Advances. 2020;8;2(1):vdaa002. doi: 10.1093/noajnl/vdaa002.
47. Kfoury N., Sun T., Yu K., Rockwell N., Tinkum KL., Qi Z., et al. Cooperative p16 and p21 action protects femaleastrocytes from transformation. Acta Neuropathol Commun. 2018;6(1):12. doi: 10.1186/s40478-018-0513-5.
48. Lewis A.M.Jr. Regulatory implications of neoplastic cell substrate tumorigenicity / U. S. Food and Drug Administration. 2005:31p.
49. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65: 3035-3039.