СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ ВОЛОКОН
METHOD OF OBTAINING POLYMER-CONTAINING FIBRES

Настоящее изобретение относится к способу прядения полимерного волокна. Кроме того, оно относится к полимерному волокну, получаемому по упомянутому способу, и к вариантам его применения. Изобретение также относится к продуктам, включающим упомянутое полимерное волокно.
Уровень техники
Обычным способам получения полимерного волокна свойственны значительные недостатки в отношении как способов, так и продуктов. K способам обычно предъявляются требования, чрезмерно жесткие для включения биологического материала, такого как белки или клетки, в отношении условий, касающихся температуры, давления или использования химических реагентов и растворителей. Продукты обычно разрабатывают для демонстрации превосходства в одном свойстве, таком как прочность, упругость или масса. Однако объединение всех данных свойств оказалось затруднительным.
Натуральный шелк паука может принимать различные формы в зависимости от железы, в которой он образуется (Gosline et al., J. Exp. Biol. (202): 3295, 1999). Его свойства достойны внимания: его предел прочности при растяжении может превосходить соответствующую характеристику стали и быть равным пределу прочности при растяжении арамидных элементарных волокон, например, марки кевлар. Шелк паука также может быть очень податливым будучи растяжимым вплоть до приблизительно 300% его длины без разрыва. Помимо прочего, он является легким по массе.
Поскольку получение нативного шелка паука является непрактичным вследствие территориальной и каннибалистической природы пауков, научный и коммерческий интерес инициировал исследование искусственного изготовления шелка паука с целью возможного получения в промышленном масштабе. Однако отыскание коммерчески конкурентоспособного способа массового получения шелка паука оказалось затруднительным. Искусственное получение столкнулось с проблемами достижения как достаточного выхода белка, так и качественной сборки нитей. На решение проблемы источника белка направлено получение рекомбинантных белков шелка паука при использовании бактерий (Scheibel, Microb. Cell. Fact., (1): 14, 2004). Тем не менее, вытяжка волокна из водных растворов данных белков невозможна, поскольку такой раствор, сам по себе, не демонстрирует достаточную продольную вязкость.
Прядение волокон представляет собой способ, по которому деформирующие напряжения в направлении оси волокна конкурируют с поверхностным натяжением прядильного сиропа. Например, невозможно вытягивать стабильное текучее элементарное волокно из воды вследствие высокого поверхностного натяжения воды.
Это иллюстрирует неустойчивость Рэлея, которая вызывает разрушение струи воды, которая истекает из водопроводного крана, на капли. Данный эффект вызывается поверхностным натяжением воды.
Соотношение между вязкостными силами и силами поверхностного натяжения описывает число Онезорге Oh.
<mrow><mi>O</mi><mi>h</mi><mo>=</mo><mfrac><mi>η</mi><mrow><msqrt><mrow><mi>ρ</mi><mi>σ</mi><mi>R</mi></mrow></msqrt></mrow></mfrac></mrow>
Небольшое значение числа Oh (Oh<<1) означает то, что текучее элементарное волокно будет разрушаться на небольшие капли, что стимулирует поверхностное натяжение. Большое значение числа Oh означает то, что текучее элементарное волокно будет оставаться стабильным (Edmond, Schofield et al. 2006). В результате это означает то, что прядильный сироп должен демонстрировать большое значение числа Онезорге. Очевидно, значение числа Oh может быть увеличено в результате увеличения вязкости. У текучих сред, характеризующихся высоким коэффициентом Трутона, в процессах продольного течения будет доминировать продольная вязкость и поэтому большие значения числа Oh могут быть достигнуты для текучих сред, которые характеризуются довольно низкой сдвиговой вязкостью η, но высоким коэффициентом Трутона Tr.
Рекомбинантный белок шелка паука может быть получен при использовании бактерий, его сборка была подробно исследована (Scheibel, Microb. Cell. Fact., (1): 14, 2004; Huemmerich et al., Curr. Biol., (22): 2070-4, 2004; Rammensee et al., PNAS, (105):6590-6595, 2008). Искусственные прядильные сиропы, имеющие низкие концентрации белка (10-20 мг/мл eADF3 и eADF4), не обнаруживают соотношения Tr>>1. Поверхностное натяжение является все еще намного большим, чем эффекты вязкости, таким образом, также имеет место и Oh<<1, поэтому получение волокна из данных растворов, имеющих низкую концентрацию белка, было невозможным. Получение волокна обеспечивали только растворы рекомбинантного белка шелка паука, имеющие очень высокие концентрации белка (~200 мг/мл), (Exier et al., Angewandte Chemie-Intemational Edition, (19): 3559-3562, 2007). Однако увеличение концентрации белка приводит к увеличению сдвиговой вязкости раствора, а перерабатываемость текучей среды, характеризующейся очень высокой (>1 Па-сек) сдвиговой вязкостью, является довольно плохой.
Изобретатели настоящего изобретения, к своему удивлению, обнаружили то, что для прядения волокна по способу настоящего изобретения требуются только очень низкие концентрации полимера. Использованию очень низких концентраций полимера свойственно преимущество, заключающееся в отсутствии увеличения сдвиговой вязкости раствора, что, в свою очередь, улучшает перерабатываемость текучей среды.
К удивлению, получение волокна из очень низкоконцентрированных полимеров, например полипептидов шелка, таких как полипептиды шелка паука, в мягких условиях облегчалось включением улучшителей продольной вязкости. Хотя прядильные сиропы шелка паука по их природе и описывались как характеризующиеся очень высокими процентными уровнями содержания белка шелка паука, настоящий способ, к удивлению, требует использования только очень низких концентраций полипептидов шелка, начиная от концентраций, составляющих всего лишь 0,15 мг/мл.
Кроме того, настоящий способ, к удивлению, требует использования только очень низких концентраций вышеупомянутых улучшителей продольной вязкости. Низкие концентрации упомянутых улучшителей, с одной стороны, являются достаточными для увеличения продольной вязкости раствора, но, с другой стороны, по существу не увеличивают сдвиговую вязкость раствора, так что образование волокон улучшается.
Таким образом, использование очень низких концентраций полимеров и/или очень низких концентраций улучшителей продольной вязкости в способе настоящего изобретения облегчает прядение волокон из прядильного раствора. Кроме того, технические препятствия в способе невелики, поскольку проводят непосредственную вытяжку волокон из раствора полипептида шелка в условиях окружающей среды или условиях, близких к ним.
Краткое изложение изобретения
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу прядения волокна из прядильного раствора, включающему стадии:
(a) получения прядильного раствора, содержащего (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель; и
(b) вытяжки волокна из прядильного раствора или комбинирования экструдирования и вытяжки волокна из прядильного раствора, в результате чего получают волокно.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к прядильному раствору для реализации способа настоящего изобретения, содержащему (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к волокну, получаемому по способу первого аспекта, и к его применению.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предлагает продукты, включающие волокно второго аспекта.
Данное краткое изложение изобретения необязательно описывает все признаки изобретения.
Подробное описание изобретения
До приведения ниже подробного описания настоящего изобретения необходимо понять то, что данное изобретение не ограничивается конкретными методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьироваться. Также необходимо понимать то, что терминология в соответствии с использованием в настоящем документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, которое будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если только не будет определено другого, то все технические и научные термины в соответствии с использованием в настоящем документе имеют те же самые значения, что и обычно понимаемые специалистами в соответствующей области техники.
Предпочтительно термины в соответствии с использованием в настоящем документе определяются согласно описанию в публикации «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», Leuenberger, H.G.W., Nagel, B. and Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).
По ходу всего изложения текста данного описания изобретения цитируются несколько документов. Каждый из документов, процитированных в настоящем документе (в том числе все патенты, заявки на получение патента, научные публикации, технические описания от производителя, инструкции, представления последовательностей с номерами доступа GenBank и тому подобное), будь выше или ниже в настоящем документе, во всей своей полноте посредством ссылки включается в настоящий документ. Ничто в настоящем документе не должно восприниматься как допущение того, что изобретение не имеет права на испрашиваемую дату приоритета на основании приоритетной заявки.
В последующем изложении будут описываться элементы настоящего изобретения. Данные элементы перечисляются совместно с конкретными вариантами осуществления, однако необходимо понимать то, что для создания дополнительных вариантов осуществления они могут быть объединены любым образом и в любом количестве. Различным образом описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не должны восприниматься как ограничивающее настоящее изобретение только подробно описанными вариантами осуществления. Данное описание изобретения должно пониматься как обосновывающее и охватывающее варианты осуществления, которые объединяют подробно описанные варианты осуществления с любым количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, раскрытыми в описании настоящей заявки должны считаться любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке, если только контекст не будет указывать на другое.
По ходу всего изложения данного описания изобретения и формулы изобретения, которая следует далее, если только контекст не будет требовать другого, слово «включать» и вариации, такие как «включает» и «включающий», будут пониматься как подразумевающие включение указанных целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любых других целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.
В соответствии с использованием в данном описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа (например, один, некий и данный) включают соответствия во множественном числе, если только содержание ясно не будет диктовать другого.
Остатки в двух и более полипептидах считаются «соответствующими» друг другу, если остатки занимают аналогичное положение в полипептидных структурах. Как хорошо известно на современном уровне техники, аналогичные положения в двух и более полипептидах могут быть определены в результате выравнивания полипептидных последовательностей на основе подобия аминокислотной последовательности или структурного подобия. Средства для такого выравнивания специалистам в соответствующей области техники хорошо известны и могут быть, например, получены в Интернете, например, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) или Align (http://www.ebi.ac.uk//emboss/align/index.html) при использовании стандартных установок, предпочтительно для выравнивания EMBOSS: needle, Матрица: Blosum62, Штраф за открытие пробела: 10.0, Штраф за продолжение пробела 0.5.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу прядения волокна из прядильного раствора, включающему, по существу, состоящему из или состоящему из следующих стадий:
(а) получения прядильного раствора, содержащего (i) полимер, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединение, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворитель; и
(b) вытяжки волокна из прядильного раствора или комбинирования экструдирования и вытяжки волокна из прядильного раствора, в результате чего получают волокно.
В контексте настоящего изобретения термин «полимер» относится к молекуле, образованной из повторяющихся структурных звеньев, обычно соединенных ковалентными химическими связями.
В одном предпочтительном варианте осуществления полимер представляет собой биополимер, такой как полипептид или синтетический полимер.
Термин «биополимер» в соответствии с использованием в настоящем документе относится к молекуле, включающей мономерные звенья, которые ковалентно связаны с образованием более крупных структур. Биополимеры при классификации могут быть разделены на три основных класса на основании различающихся использующихся мономерных звеньев и структуры полученных биополимеров. Первый класс биополимеров представляет собой полинуклеотиды, которые являются полимерами, образованными из нуклеотидных мономеров, например полимерами, образованными из 10 и более нуклеотидных мономеров. Второй класс биополимеров представляет собой полипептиды, которые являются полимерами аминокислот. Третий класс биополимеров представляет собой полисахариды, которые зачастую являются линейными связанными полимерными углеводными структурами. Предпочитается, чтобы биополимер представлял бы собой полипептид.
Предпочтительно биополимер является биоразлагаемым, а более предпочтительно также и компостируемым. Биоразлагаемые биополимеры разлагаются с образованием COz и воды под действием микроорганизмов. Биоразлагаемые биополимеры, которые также являются и компостируемыми, могут быть введены в способ промышленного компостирования и будут разлагаться в течение месяцев.
Также предпочитается, чтобы биополимер был бы биосовместимым. Это означает то, что полимер является нетоксичным, немутагенным и вызывает нулевую или только минимальную воспалительную реакцию.
Таким образом, также и волокна, спряденные из биополимеров по способу настоящего изобретения, могут демонстрировать вышеупомянутые выгодные характеристики, а именно могут быть биоразлагаемыми, компостируемыми и/или биосовместимыми или могут быть в основном биоразлагаемыми, компостируемыми и/или биосовместимыми. В частности, поскольку количество улучшителей продольной вязкости в прядильном растворе способа настоящего изобретения предпочтительно является очень низким.
Как уже упоминалось выше, в полипептиде повторяющиеся структурные звенья представляют собой аминокислоты, соединенные ковалентными амидными связями (пептидными связями).
Если только не будет указано другого, термины «полипептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемым образом и обозначают любую пептидно-соединенную цепь аминокислот вне зависимости от длины или посттрансляционной модификации.
Предпочтительно полипептидом являются полипептид шелка, включающий, по меньшей мере, два идентичных повторяющихся звена, бычий сывороточный альбумин (БСА), зеин или казеин. Полипептид также может представлять собой коллаген, фибронектин или кератин.
Бычий сывороточный альбумин (БСА), также известный как «Fraction V», представляет собой сывороточный альбуминовый белок. Зеин представляет собой проламиновый белок, встречающийся в кукурузе. Казеин (от латинского caseus «сыр») представляет собой преобладающий фосфопротеин (αS1, αS2, β, κ), который отвечает почти за 80% белков в коровьих молоке и сыре.
В контексте настоящего изобретения термин «полипептид шелка» относится к полипептиду или белку шелка (необходимо отметить то, что, если только не будет указано другого, данные два термина в соответствии с использованием в настоящем документе являются взаимозаменяемыми), который экспрессируют в рекомбинантной экспрессирующей системе (например, микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих), то есть отделяют от его естественной среды в железе паука (рекомбинантный полипептид или белок шелка). Предпочтительно «полипептид шелка» выделяют или очищают. В частности, «очищенный полипептид шелка» или «выделенный полипептид шелка» является свободным или по существу свободным от клеточного материала или других загрязняющих белков из клеточного или тканевого источника, из которого белок выделяют или производят. Формулировка «по существу свободный от клеточного материала» включает препараты полипептида шелка, в которых полипептид шелка отделен от клеточных компонентов клеток, из которых его рекомбинантно получают. Таким образом, полипептид шелка, который является по существу свободным от клеточного материала, включает препараты полипептидов шелка, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5% или 1% (в расчете на сухую массу) загрязняющего белка. В случае экспрессии полипептида шелка в клеточной культуре он также будет свободным или по существу свободным от культуральной среды, то есть культуральная среда будет представлять собой менее чем приблизительно 20%, 10%, 5% или 1% от объема полипептидного препарата.
2
6
16
24
12
16
«Полипептид шелка» в соответствии с контекстом настоящего изобретения дополнительно относится к полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, которая включает или состоит из, по меньшей мере, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, а наиболее предпочтительно 100%, множественных копий одного идентичного повторяющегося звена (например, А, Q или С, где позиции 2, 6 или 16 представляют собой количество повторяющихся звеньев) или множественных копий двух и более различных повторяющихся звеньев (например, (AQ) или (AQ), C).
Термины «повторяющееся звено» и «звено повтора» в контексте настоящего изобретения могут быть использованы взаимозаменяемым образом,
В контексте настоящего изобретения термин «полипептид шелка» также относится к полипептиду шелка, который включает или состоит из по меньшей мере двух идентичных повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из идентичных копий аминокислотных последовательностей полипептидов шелка, встречающихся в природе, или вариаций аминокислотных последовательностей полипептидов шелка, встречающихся в природе, или комбинаций обоих вариантов.
В контексте настоящего изобретения «повторяющееся звено» относится к области, которая в аминокислотной последовательности соответствует области, которая включает или состоит из по меньшей мере одного пептидного мотива (например, АААААА (SEQ ID NO:13) или GPGQQ (SEQ ID NO:4)), который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка, встречающемся в природе, (например, MaSpI, ADF-3, ADF-4 или Flag) (то есть к идентичной аминокислотной последовательности), или к аминокислотной последовательности, по существу подобной ей (то есть к варианту аминокислотной последовательности). В данном отношении термин «по существу подобный» относится к степени аминокислотной идентичности, по меньшей мере, для 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%, предпочтительно по всей длине, соответствующей эталонной аминокислотной последовательности, встречающейся в природе. «Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «по существу подобной» соответствующей аминокислотной последовательности в полипептиде шелка, встречающемся в природе (то есть повторяющееся звено дикого типа), также является подобным и в отношении своих функциональных свойств, например, полипептид шелка, включающий «по существу подобное повторяющееся звено», все еще обладает способностью образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего «по существу подобное повторяющееся звено», все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.
«Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «идентичной» аминокислотной последовательности полипептида шелка, встречающегося в природе, например, может представлять собой часть полипептида шелка, соответствующую одному или нескольким пептидным мотивам MaSpI (SEQ ID NO:43), MaSpII (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2). «Повторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «по существу подобной» аминокислотной последовательности полипептида шелка, встречающегося в природе, например, может представлять собой часть полипептида шелка, соответствующую одному или нескольким пептидным мотивам MaSpI (SEQ ID NO:43), MaSpII (SEQ ID NO:44), ADF-3 (SEQ ID NO:1) и/или ADF-4 (SEQ ID NO:2), но включающее одно или несколько аминокислотных замещений в специфических аминокислотных положениях.
«Повторяющееся звено» не включает неповторяющихся гидрофильных аминокислотных доменов, в общем случае предположительно присутствующих на карбокси- и амино-концах полипептидов щелка, встречающихся в природе.
«Повторяющееся звено» в соответствии с настоящим изобретением дополнительно относится к аминокислотной последовательности, имеющей длину от 3 до 200 аминокислот или от 5 до 150 аминокислот, предпочтительно имеющую длину от 10 до 100 аминокислот или от 15 до 80 аминокислот, а более предпочтительно имеющую длину от 18 до 60 аминокислот или от 20 до 40 аминокислот. Например, повторяющееся звено, соответствующее настоящему изобретению, может иметь длину 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 аминокислот. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено, соответствующее изобретению, состоит из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 аминокислот.
Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, предпочтительно состоит из аминокислот в количестве от 6 до 1500, аминокислот в количестве от 50 до 1500 или аминокислот в количестве от 200 до 1300, а наиболее предпочтительно аминокислот в количестве от 250 до 1200 или аминокислот в количестве в от 500 до 1000.
2
16
24
8
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев. Например, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев. Наиболее предпочтительно полипептид шелка включает 4, 8, 12, 16, 24, 32 или 48 повторяющихся звеньев. Как упоминалось выше, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья. Таким образом, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать множественные копии одного идентичного повторяющегося звена (например, А или С, где позиции 2 или 6 представляют количество повторяющихся звеньев) или множественные копии двух и более различных повторяющихся звеньев (например, (AQ) или (QAQ)). Например. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 из 80 повторяющихся звеньев, которые могут быть включены в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.
Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из аминокислотной последовательности любого полипептида шелка, известного специалисту в соответствующей области техники. Предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида шелка насекомого, предпочтительно полипептида членистоногого или полипептида шелка паука. Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из аминокислотной последовательности полипептида шелка митилид.
Предпочитается, чтобы полипептид шелка паука включал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида большой ампуловидной железы (MaSp), такого как полипептид каркасной нити шелка паука, полипептида малой ампуловидной железы (MiSp), полипептида ловчей спиральной нити (flagelliform), полипептида шелка паука из древовидной железы (aggregate), полипептида шелка паука из дольковидной железы (aciniform) или полипептида шелка паука из грушевидной железы (pyriform). Наиболее предпочтительно полипептид шелк паука включает или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка паука каркасной нити или полипептида шелка паука ловчей спиральной нити. В общем случае предпочитается, чтобы аминокислотная последовательность полипептида каркасной нити или полипептида ловчей спиральной нити была бы выбрана из полипептида каркасной нити или полипептида ловчей спиральной нити пауков-кругопрядов Araneidae или Araneoid.
Предпочитается, чтобы полипептид шелка насекомого выключал бы или состоял бы из аминокислотной последовательности полипептида шелка Lepidoptera. Более предпочтительно полипептид шелка насекомого включает или состоит из аминокислотной последовательности полипептида шелка Bombycidae, наиболее предпочтительно Bombyx mori.
Предпочтительно вышеупомянутые полипептиды шелка получаются рекомбинантным образом, то есть представляют собой рекомбинантные полипептиды шелка. Например, полипептиды шелка, использующиеся в способе настоящего изобретения, являются рекомбинантными полипептидами шелка паука, такими как полипептиды шелка паука каркасной нити или полипептиды шелка паука ловчей спиральной нити, рекомбинантными полипептидами шелка насекомого или рекомбинантными полипептидами шелка митилид.
Повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из аминокислотной последовательности любой области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка, известном специалистам в соответствующей области техники. Предпочтительно повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка насекомого, более предпочтительно в полипептиде шелка членистоногого или полипептиде шелка паука. Повторяющееся звено полипептида шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует в полипептиде шелка митилид.
Предпочитается, чтобы повторяющееся звено шелка паука включало бы или состояло бы из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде большой ампуловидной железы (MaSp), таком как полипептид шелка паука каркасной нити, полипептиде малой ампуловидной железы (MiSp), полипептиде ловчей спиральной нити, полипептиде шелка паука из древовидной железы, полипептиде шелка паука из дольковидной железы или полипептиде шелка паука из грушевидной железы. Наиболее предпочтительно повторяющееся звено включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка паука каркасной нити или полипептиде шелка паука ловчей спиральной нити.
Предпочитается, чтобы повторяющееся звено шелка насекомого включало бы или состояло бы из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка Lepidoptera. Более предпочтительно повторяющееся звено шелка насекомого включает или состоит из аминокислотной последовательности области, которая включает или состоит из, по меньшей мере, одного пептидного мотива, который повторяющимся образом присутствует во встречающемся в природе полипептиде шелка насекомого Bombycidae, наиболее предпочтительно Bombyx mori.
Термин «консенсусная последовательность» в соответствии с использованием в контексте настоящего изобретения относится к аминокислотной последовательности, которая включает аминокислоты, которые часто присутствуют в определенном положении (например, «G») и где другие аминокислоты, которые не определяют дополнительно, заменяют символом-заполнителем «X».
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из, по меньшей мере, двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, консенсусную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из A, S, G, Y, Р, N и Q;
ii) GGX, где Х представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р и Q; и
x
iii) A, где х представляет собой целое число в диапазоне от 5 до 10.
Также предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы или состоял бы из, по меньшей мере, двух идентичных повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
х
Повторяющиеся (пептидные) мотивы GPGXX (SEQ ID NO:3) и GGX, то есть мотивы, обогащенные глицином, придают гибкость полипептиду шелка и, таким образом, нити, полученной из белка шелка, включающего упомянутые мотивы. Говоря подробно, повторяющийся мотив GPGXX (SEQ ID NO:3) образует спиральные структуры β-поворот, которые придают полипептиду шелка эластичность. Как шелк большой ампуловидной железы, так и шелк ловчей спиральной нити включают мотив GPGXX (SEQ ID NO:3). Повторяющийся мотив GGX связан со спиральной структурой, включающей три аминокислоты на один виток, и встречается в большинстве шелков паука. Мотив GGX может придавать шелку дополнительные эластические свойства. Повторяющийся полиаланиновый А (пептидный) мотив образует кристаллическую структуру β-лист, которая придает полипептиду шелка прочность, (WO 03/057727). (Пептидные) мотивы GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19) выбирали из ресилина (WO 08/155304). Ресилин представляет собой эластомерный белок, встречающийся у большинства членистоногих (arthropodd). Он располагается в специализированных областях кутикулы, придавая низкую жесткость и высокую прочность (Elvin et al. Nature (473): 999-1002, 2005).
Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое 14 из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7). GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40) и GPGGS (SEQ ID NO:11). В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7 или 8), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN и GGQ. В одном дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16) и АААААААААА (SEQ ID NO:17).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид шелка включает или состоит из повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGQG (SEQ ID NO:40), GPGGS (SEQ ID NO:11), GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, GGQ, ААААА (SEQ ID NO:12), АААААА (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16), АААААААААА (SEQ ID NO:17), GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Наиболее предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из:
(i) GPGAS (SEQ ID NO:5), АААААА (SEQ ID NO:13), GGY и GPGSG (SEQ ID NO:6) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(ii) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGY (SEQ ID NO:7) и GPGGP (SEQ ID NO:8) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(iii) GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4) и GPGQQ (SEQ ID NO:4) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(iv) GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9) и GGP в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(v) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15),GPGQG (SEQ ID NO:40) и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(vi) AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGG (SEQ ID NO:10), GGR, GGN и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(vii) GGA, GGA, GGA, GGS, GGA и GGS в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(viii) GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11) и GPGGY (SEQ ID NO:7) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке.
Необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в вышеупомянутые полипептиды шелка, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, каждое их которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, консенсусную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из A, S, G, Y, Р, N и Q;
и) GGX, где Х представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р и Q; и
x
iii) A, где х представляет собой целое число в диапазоне от 5 до 10.
Как упоминалось выше, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.
Также предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы или состоял бы из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из: GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Таким образом, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, предпочтительно включает, по существу состоит из или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, каждое из которых включает, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25), предпочтительно одну, аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из GPGAS (SEQ ID NO:5), GPGSG (SEQ ID NO:6), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGP (SEQ ID NO:8), GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQG (SEQ ID NO:40), GPGGG (SEQ ID NO:10), GPGGS (SEQ ID NO:11), GGY, GGP, GGA, GGR, GGS, GGT, GGN, GGQ, AAAAA (SEQ ID NO:12), AAAAAA (SEQ ID NO:13), AAAAAAA (SEQ ID NO:14), AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), AAAAAAAAA (SEQ ID NO:16), AAAAAAAAAA (SEQ ID NO:17), GGRPSDTYG (SEQ ID NO:18) и GGRPSSSYG (SEQ ID NO:19).
Наиболее предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из:
(i) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: GPGAS (SEQ ID NO:5), AAAAAA (SEQ ID NO:13), GGY и GPGSG (SEQ ID NO:6) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(ii) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: AAAAAAAA (SEQ ID NO:15), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGY (SEQ ID NO:7) и GPGGP (SEQ ID NO:8) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(iii) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4), GPGQQ (SEQ ID NO:4) и GPGQQ (SEQ ID NO:4) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(iv) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9), GGP, GPGGA (SEQ ID NO:9) и GGP в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(v) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: АААААААА (SEQ ID NO:15),GPGQG (SEQ ID NO:40) и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(vi) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: АААААААА (SEQ ID NO:15), GPGGG (SEQ ID NO:10), GGR, GGN и GGR в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке,
(vii) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: GGA, GGA, GGA, GGS, GGA и GGS в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке, и/или
(viii) повторяющихся звеньев, которые включают или состоят из: GPGGA (SEQ ID NO:9), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11), GPGGY (SEQ ID NO:7), GPGGS (SEQ ID NO:11) и GPGGY (SEQ ID NO:7) в качестве аминокислотной последовательности, предпочтительно в данном порядке.
Необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в вышеупомянутые полипептиды шелка, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из:
n
(i) (GPGXX) (SEQ ID NO:3) в качестве повторяющегося звена, где Х представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из A, S, G, Y, Р, N и Q, а n составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9;
n
(ii) (GGX) в качестве повторяющегося звена, где Х представляет собой любую аминокислоту, предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р, R, S, А, Т, N и Q, более предпочтительно в каждом случае независимо выбираемую из Y, Р и Q, а n составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; и/или
x
n
(iii) (A) в качестве повторяющегося звена, где x представляет собой целое число в диапазоне от 5 до 10, а n составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
Как упоминалось выше, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептиды шелка, использующиеся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья.
Предпочитается, чтобы повторяющиеся звенья были бы независимо выбраны из модуля A (SEQ ID NO:20), модуля С (SEQ ID NO:21), модуля Q (SEQ ID NO:22), модуля K (SEQ ID NO:23), модуля sp (SEQ ID NO:24), модуля S (SEQ ID NO:25), модуля R (SEQ ID NO:26), модуля X (SEQ ID NO:27) или модуля Y (SEQ ID NO:28) или их вариантов (то есть вариантов модуля А, вариантов модуля С, вариантов модуля Q, вариантов модуля К, вариантов модуля sp, вариантов модуля S, вариантов модуля R, вариантов модуля Х или вариантов модуля Y). Модули A (SEQ ID NO:20) и Q (SEQ ID NO:22) в своей основе имеют аминокислотную последовательность ADF-3 паука Araneus diadematus. Модуль С (SEQ ID NO:21) в своей основе имеет аминокислотную последовательность ADF-4 паука Araneus diadematus. Модули K (SEQ ID NO:23), sp (SEQ ID NO:24), X (SEQ ID NO:27) и Y (SEQ ID NO:28) в своей основе имеют аминокислотную последовательность белка FLAG ловчей спиральной нити паука Nephila clavipes (WO 2006/008163). Модули S (SEQ ID NO:25) и R (SEQ ID NO:26) в своей основе имеют ресилин (Arthropoda) (WO 2008/155304).
Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения повторяющиеся звенья полипептида шелка состоят из модуля А: GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ (SEQ ID NO:20), модуля С: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:21), модуля Q: GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ (SEQ ID NO:22), модуля K: GPGGAGGPYGPGGAGGPYGPGGAGGPY (SEQ ID NO:23), модуля sp: GGTTIIEDLDITIDGADGPITISEELTI (SEQ ID NO:24), модуля S: PGSSAAAAAAAASGPGQGQGQGQGQGGRPSDTYG (SEQ ID NO:25), модуля R: SAAAAAAAAGPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSSSYG (SEQ ID NO:26), модуля Х: GGAGGAGGAGGSGGAGGS (SEQ ID NO:27) или модуля Y: GPGGAGPGGYGPGGSGPGGYGPGGSGPGGY (SEQ ID NO:28) или их вариантов.
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает, по существу состоит из или состоит из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, более предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, которые независимо выбирают из модуля A (SEQ ID NO:20), модуля С (SEQ ID NO:21), модуля Q (SEQ ID NO:22), модуля K (SEQ ID NO:23), модуля sp (SEQ ID NO:24), модуля S (SEQ ID NO:25), модуля R (SEQ ID NO:26), модуля X (SEQ ID NO:27) или модуля Y (SEQ ID NO:28) или их вариантов (то есть вариантов модуля А, вариантов модуля С, вариантов модуля Q, вариантов модуля K, вариантов модуля sp, вариантов модуля S, вариантов модуля R, вариантов модуля Х или вариантов модуля Y). Необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья (модули).
Таким образом, предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы, по существу состоял бы из или состоял бы из: (i) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, и/или повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля A, (ii) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, и/или повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (hi) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, и/или повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, (iv) (a) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, (b) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, (с) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, (d) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, (v) (а) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (b) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (с) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (d) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (vi) (а) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, (b) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, (с) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, (d) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, или (vii) (a) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (b) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (с) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (d) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (е) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (f) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля С, (g) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С, (h) повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля А, повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля Q, и повторяющегося звена (звеньев), состоящего из вариантов модуля С.
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
12
12
8
8
Модули А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y или их варианты (то есть варианты модуля А, варианты модуля С, варианты модуля Q, варианты модуля K, варианты модуля sp, варианты модуля S, варианты модуля R, варианты модуля Х или варианты модуля Y) также могут быть объединены друг с другом в любой комбинации и при любом количестве каждого, то есть модуль (повторяющееся звено) А может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) Q (то есть комбинация AQ), модуль (повторяющееся звено) С может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) Q (то есть комбинация CQ), модуль (повторяющееся звено) Q может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) А и модулем (повторяющимся звеном) Q (то есть комбинация QAQ), модуль (повторяющееся звено) А может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) А и модулем (повторяющимся звеном) Q (то есть комбинация AAQ), и так далее при том условии, что полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из, по меньшей мере, двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Например, полипептид шелка использующийся в способе настоящего изобретения, может включать или состоять из: A, (АА), (AQ), (QA), Q, (QQ), (QAQ), (AQA), C, (CC), (CCC), (CQ), (QC), (QCQ), (CQC), (AA)Q, (QQ)A, (AAA)Q, (QQQ)A, (AQQ), (QQA), K, sp, S, R, X, Y, (Ksp), (spK), (XY), (YX), (XX), (YY), (XXX), (YYY), (AX), (XA), (CX), (XC), (QX), (XQ), (YQ), (QY), (SS), (SR), (RS) или (RR), где n составляет, по меньшей мере, 2, предпочтительно 4, 8, 9, 10, 12, 16, 20, 24 или 32. В случае полипептида шелка, состоящего из (AQ), необходимо отметить то, что в полипептиде шелка модуль (повторяющееся звено) А присутствует 12 раз, и модуль (повторяющееся звено) Q присутствует также 12 раз, и что, таким образом, полипептид шелка состоит из 24 модулей (повторяющихся звеньев). Компоновка модулей (повторяющихся звеньев) полипептида шелка, состоящего из (AQ), представляет собой следующее далее: AQAQAQAQAQAQAQAQAQAQAQAQ. Кроме того, в случае полипептида шелка, образованного из модулей (повторяющихся звеньев) полипептида шелка и состоящего из (QAQ), необходимо отметить то, что в полипептиде шелка модуль (повторяющееся звено) А присутствует 8 раз, а модуль (повторяющееся звено) Q присутствует 16 раз, и что, таким образом, полипептид шелка состоит из 24 модулей (повторяющихся звеньев). Компоновка модулей (повторяющихся звеньев) полипептида шелка, состоящего из (QAQ), представляет собой следующее далее: QAQQAQQAQQAQQAQQAQQAQQAQ.
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
Полипептид шелка, использующегося в способе настоящего изобретения, также может включать нижеследующее или состоять из него: (A*Q), (AQ*), (A*Q*), (Q*A), (QA*), (Q*A*), (QAQ*), (QA*Q), (Q*AQ), (QA*Q*), (Q*A*Q), (Q*AQ*), (Q*A*Q*), (AQA*), (AQ*A), (A*QA), (AQ*A*), (A*Q*A), (A*QA*), (A*Q*A*), где n составляет, no меньшей мере, 2, предпочтительно 4, 8, 9, 10, 12, 16, 20, 24 или 32, и где * указывает на вариант модуля, то есть вариант модуля А или Q.
Термины «объединенный друг с другом» или «сцепленный друг с другом» в контексте настоящего изобретения могут обозначать то, что модули (повторяющиеся звенья) объединены или сцеплены друг с другом непосредственно, или в контексте настоящего изобретения могут обозначать то, что модули (повторяющиеся звенья) объединены или сцеплены друг с другом через одну или несколько спейсерных аминокислот. В предпочтительных вариантах осуществления модули (повторяющиеся звенья), включенные в полипептид шелка, объединены или сцеплены друг с другом непосредственно. В других предпочтительных вариантах осуществления модули (повторяющиеся звенья), включенные в полипептид шелка, объединены или сцеплены друг с другом через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 25 или от 1 до 20, более предпочтительно через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 15 или от 1 до 10, а наиболее предпочтительно через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 5, то есть через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 спейсерных аминокислот. Упомянутые спейсерные аминокислоты могут быть любыми аминокислотами, встречающимися в природе в белках. Предпочтительно упомянутая спейсерная аминокислота не является пролином. Предпочтительно спейсерную аминокислоту (аминокислоты), имеющую заряженные группы, независимо выбирают из группы, состоящей из аспарагината, глутамината, гистидина и лизина. Упомянутые спейсерные аминокислоты должны быть аминокислотами, которые не оказывают негативного воздействия на способность полипептида шелка образовывать покрытие, предпочтительно образовывать однородное покрытие, на инертном или встречающемся в природе материале, таком как кевлар или шерсть. Кроме того, упомянутыми спейсерными аминокислотами должны быть аминокислоты, которые не приводят к возникновению стерических затруднений, например аминокислоты, имеющие небольшой размер, такие как лизин и цистеин.
В более предпочтительных вариантах осуществления полипептид шелка включает модули, которые объединены друг с другом непосредственно, и модули, которые объединены друг с другом через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 25 или от 1 до 20, более предпочтительно через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 15 или от 1 до 10, а наиболее предпочтительно через спейсерные аминокислоты в количестве от 1 до 5, то есть через 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 спейсерных аминокислот.
Вариант модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y отличается от эталонного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, от которого он произошел, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотными изменениями в аминокислотной последовательности (то есть замещениями, присоединениями, вставками, удалениями, отсечениями с N-конца и/или отсечениями с С-конца). Такой вариант модуля в альтернативном или дополнительном варианте может характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности эталонному модулю (дикого типа), от которого он произошел. Таким образом, вариант модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y характеризуется идентичностью последовательности соответствующему эталонному модулю (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, составляющей, по меньшей мере, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%. Предпочтительно идентичность последовательности наблюдается на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 27, 28, 30, 34, 35 и более аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего эталонного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y.
В особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 85% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 90% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 95% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 98% по всей длине или составляла бы, по меньшей мере, 99% по всей длине соответствующего эталонного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y. Кроме того, в особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 85% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 90% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 95% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 98% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот или составляла бы, по меньшей мере, 99% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 15, 18, 20, 24, 28 или 30 аминокислот, соответствующего эталонного модуля (дикого типа) А, С, Q, K, sp, S, R, X или Y.
Фрагмент (или делеционный вариант) модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
В дополнение к этому, вариант или фрагмент модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y в контексте настоящего изобретения считается вариантом или фрагментом модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, только если модификации в отношении аминокислотной последовательности, на которой базируются данный вариант или фрагмент, не оказывают негативного воздействия на способность полипептида шелка образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего вариант или фрагмент модуля А, С, Q, K, sp, S, R, Х или Y, все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.
C
K
C
K1
K2
KC
C
K
C
K1
K2
KC
C
K
C
K1
K2
KC
Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения повторяющиеся звенья независимо выбирают из модуля A (SEQ ID NO:29), модуля A (SEQ ID NO:30), модуля C (SEQ ID NO:31), модуля С (SEQ ID NO:32), модуля С (SEQ ID NO:33) или модуля С (SEQ ID NO:34). Модули А (SEQ ID NO: 29), A (SEQ ID NO:30), C (SEQ ID NO:31), С (SEQ ID NO:32), С (SEQ ID NO:33) и С (SEQ ID NO:34) представляют собой варианты модуля А, который в своей основе имеет аминокислотную последовательность ADF-3 паука Araneus diadematus, и модуля С, который в своей основе имеет аминокислотную последовательность ADF-4 паука Araneus diadematus, (WO 2007/025719). В модуле А (SEQ ID NO:29) аминокислота S (серии) в положении 21 замещена аминокислотой С (цистеин), в модуле A (SEQ ID NO:30) аминокислота S в положении 21 замещена аминокислотой K (лизин), в модуле С (SEQ ID NO:31) аминокислота S в положении 25 замещена аминокислотой С, в модуле С (SEQ ID NO:32) аминокислота S в положении 25 замещена аминокислотой K, в модуле С(SEQ ID NO:33) аминокислота Е (глутаминат) в положении 20 замещена аминокислотой K и в модуле С (SEQ ID NO:34) аминокислота Е в положении 20 замещена аминокислотой K, а аминокислота S в положении 25 замещена аминокислотой С (WO 2007/025719).
C
K
C
K1
K2:
KC
Предпочтительно повторяющиеся звенья в полипептиде шелка, использующемся в способе настоящего изобретения, состоят из модуля А: GPYGPGASAAAAAAGGYGPGCGQQ (SEQ ID NO:29), модуля A:GPYGPGASAAAAAAGGYGPGKGQQ (SEQ ID NO:30), модуля C: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPCGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:31), модуля С: GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPKGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:32), модуля С GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPSGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:33) или модуля С: GSSAAAAAAAASGPGGYGPKNQGPCGPGGYGPGGP (SEQ ID NO:34).
C
K
C
K1
K2
KC
Также предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы, по существу состоял бы из или состоял бы из 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, которые независимо выбирают из модуля A (SEQ ID NO:29), модуля A (SEQ ID NO:30), модуля C (SEQ ID NO:31), модуля С (SEQ ID NO:32), модуля С (SEQ ID NO:33) или модуля С (SEQ ID NO:34). Необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенных в полипептид шелка использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья (модули).
C
C
C
C
C
C
C
4
8
16
32
5
8
10
Например, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, может включать нижеследующее или состоять из него: модули С , С , С , С , A , А  или А .
K
C
K1
K2
KC
K
C
K
C
K1
K2
KC
K1
K2
KC
K
C
K1
K2
KC
K
C
C
C
K1
K2
K2
K1
K1
K2
K1
K2
K1
K2
K1
K2
KC
KC
K2
KC
KС
K2
K1
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
Модули A, С, C, С и С также могут быть объединены друг с другом, то есть модуль (повторяющееся звено) A может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) C (то есть комбинация АC), модуль (повторяющееся звено) С может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) С и с модулем (повторяющимся звеном) С (то есть комбинация CCC) и так далее при том условии, что полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из, по меньшей мере, двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Таким образом, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из: модулей (А), (С), (С), (С), (С), (АА), (CC), (CC), (CC), (CCC), (CCC), (CCC), (CCC) или (CCC), где n составляет, по меньшей мере, 2, предпочтительно 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 16 или 20. Термин «объединенный друг с другом» определяется выше.
C
K
C
K1
K2
KC
Кроме того, предпочитается, чтобы полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включал бы, по существу состоял бы из или состоял бы из: 2-80 повторяющихся звеньев, 3-80 повторяющихся звеньев или 4-60 повторяющихся звеньев, предпочтительно от 8 до 48 повторяющихся звеньев или от 10 до 40 повторяющихся звеньев, а наиболее предпочтительно от 16 до 32 повторяющихся звеньев, то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 повторяющихся звеньев, которые независимо выбирают из модуля A (SEQ ID NO:20) или его вариантов, модуля С (SEQ ID NO:21) или его вариантов, модуля Q (SEQ ID NO; 22) или его вариантов, модуля K (SEQ ID NO; 23) или его вариантов, модуля sp (SEQ ID NO:24) или его вариантов, модуля S (SEQ ID NO:25) или его вариантов, модуля R (SEQ ID NO:26) или его вариантов, модуля Х (SEQ ID NO:27) или его вариантов, модуля Y (SEQ ID NO:28) или его вариантов, модуля А (SEQ ID NO:29), модуля A (SEQ ID NO:30), модуля C (SEQ ID NO:31), модуля C (SEQ ID NO:32), модуля С (SEQ ID NO:33) или модуля С (SEQ ID NO:34). Опять-таки необходимо отметить то, что, по меньшей мере, два повторяющихся звена, включенные в полипептид, использующийся в способе настоящего изобретения, представляют собой идентичные повторяющиеся звенья (модули).
K
C
K1
K2
KC
K
K
C
C
K
K
K
K
K
K
C
C
C
C
C
C
C
C
C
С
C
C
C
K1
K1
K1
K1
KC
KC
KC
KC
KC
KC
KC
K
K1
K2
K
Kl
K2
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
Модули А, С, С, С и С также могут быть объединены с модулями А, С, Q, K, sp, S, R, X или Y, то есть модуль (повторяющееся звено) A может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) С (то есть комбинация АС), или модуль (повторяющееся звено) С может быть объединен с модулем (повторяющимся звеном) С (то есть комбинация СС) и так далее при том условии, что полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из, по меньшей мере, двух повторяющихся звеньев, которые являются идентичными. Таким образом, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, также может включать или состоять из модулей (AQA), (QA), (QAQ), (AQA), (AQA), (CC), (CCC), (CCC), (CCC), (CQ), (QC), (QCQ), (CQC), (CQC), (CQC), (CC), (CC), (CCC), (CCC), (CCC), (CCC), (CQ), (QC), (QCQ), (ACQ), (QCA) или (CCC), где n составляет, по меньшей мере. 2, предпочтительно 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 16 или 20. Термин «объединенный друг с другом» определяется выше.
16
16
8
8
8
8
8
8
4
8
4
4
8
4
24
24
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Например, полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, включает или состоит из модулей СС, СC, CCC, CC , С C, CC C, С СC , C(AQ) или (AQ)C.
Полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, дополнительно может включать, по меньшей мере, одно неповторяющееся (NR) звено, то есть 1, 2, 3, 4, 5, 6 и более звеньев NR, предпочтительно одно звено NR. В контексте настоящего изобретения термин «неповторяющееся (NR) звено» относится к области аминокислот, присутствующих в полипептиде шелка, встречающемся в природе, который не обнаруживает какого-либо очевидного характера повторения (неповторяющееся звено или звено NR). Предпочтительно аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствует неповторяющейся аминокислотной последовательности полипептидов каркасной нити, встречающихся в природе, предпочтительно ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), или аминокислотной последовательности, по существу подобной ей.
В особенности предпочитается, чтобы аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствовала бы неповторяющейся аминокислотной последовательности карбокси-конца полипептидов каркасной нити, встречающихся в природе, предпочтительно ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), или аминокислотной последовательности, по существу подобной ей. Более предпочтительно аминокислотная последовательность неповторяющегося звена соответствует неповторяющейся аминокислотной последовательности карбокси-конца ADF-3 (SEQ ID NO:1), которая включает аминокислоты от 513 до 636, или ADF-4 (SEQ ID NO:2), которая включает аминокислоты от 302 до 410, или аминокислотной последовательности, по существу подобной им.
В данном отношении термин «по существу подобный» относится к степени аминокислотной идентичности, по меньшей мере, для 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%, предпочтительно для 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 и более аминокислот, предпочтительно по всей длине, соответствующей эталонной неповторяющейся (карбокси-концевой) аминокислотной последовательности полипептидов каркасной нити, встречающихся в природе, предпочтительно ADF-3 (SEQ Ю NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2).
«Неповторяющееся звено», включающее аминокислотную последовательность, которая является «по существу подобной» соответствующей неповторяющейся (карбокси-концевой) аминокислотной последовательности в полипептиде каркасной нити, встречающемся в природе (то есть неповторяющемуся (карбокси-концевому) звену дикого типа), предпочтительно в пределах ADF-3 (SEQ ID NO:1) или ADF-4 (SEQ ID NO:2), также является подобным и в отношении своих функциональных свойств, например, полипептид шелка, включающий «по существу подобное неповторяющееся звено» все еще обладает способностью образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего «по существу подобное неповторяющееся звено», все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.
Наиболее предпочтительно неповторяющееся (NR) звено представляет собой NR3 (SEQ ID NO:41) или его варианты или NR4 (SEQ ID NO:42) или его варианты. Звено NR3 (SEQ ID NO:41) в своей основе имеет аминокислотную последовательность ADF-3 паука Araneus diadematus, а звено NR4 (SEQ ID NO:42) в своей основе имеет аминокислотную последовательность ADF-4 паука Araneus diadematus (WO 2006/008163).
Вариант звена NR3 или NR4 отличается от эталонного звена NR3 (SEQ ID NO:41) или NR4 (SEQ ID NO:42), от которого он произошел, вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8 9 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 18, 19, 20, 25 или 30 аминокислотными изменениями в аминокислотной последовательности (то есть замещениями, присоединениями, вставками, удалениями, отсечениями с N-конца и/или отсечениями с С-конца). Такой вариант звена NR3 или NR4 в альтернативном или дополнительном варианте может характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности эталонному звену NR3 или NR4, от которого он произошел. Таким образом, вариант звена NR3 или NR4 характеризуется идентичностью последовательности с соответствующим эталонным звеном NR3 или NR4, составляющей, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%. Предпочтительно идентичность последовательности наблюдается на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и более аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего эталонного звена NR3 или NR4.
В особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 85% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 90% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 95% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 98% по всей длине или составляла бы, по меньшей мере, 99% по всей длине, соответствующего эталонного звена NR3 или NR4. Кроме того, в особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 85% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 90% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 95% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 98% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот или составляла бы, по меньшей мере, 99% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 аминокислот, соответствующего эталонного звена NR3 или NR4.
Фрагмент (или делеционный вариант) звена NR3 или NR4 предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
В дополнение к этому, вариант или фрагмент звена NR3 или NR4 в контексте настоящего изобретения считается вариантом или фрагментом звена NR3 или NR4, только если модификации в отношении аминокислотной последовательности, на которой базируются данный вариант или фрагмент, не оказывают негативного воздействия на способность полипептида шелка образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, 20 см/сек, 50 см/сек, 75 см/сек, 1 м/сек, 2 м/сек, 3 м/сек, 4 м/сек, 5 м/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.
В альтернативном варианте, может быть проведено испытание в отношении того, будет ли вариант или фрагмент звена NR3 или NR4 все еще обеспечивать прохождение полимеризации и/или увеличивать растворимость полипептида шелка, в который он включен. Специалист в соответствующей области техники легко может оценить то, будет ли полипептид шелка, включающий вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, обладать вышеупомянутыми функциональными свойствами, подобными свойствам полипептида шелка, включающего соответствующее эталонное звено NR3 или NR4. Подходящие для использования анализы хорошо известны специалистам в соответствующей области техники. Например, полимеризация для полипептидов шелка, включающих вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, и полимеризация для полипептидов шелка, включающих соответствующее эталонное звено NR3 или NR4, легко могут быть визуализированы при использовании нативного гель-электрофореза. Растворимость полипептида шелка, включающего вариант или фрагмент звена NR3 или NR4, и растворимость полипептида шелка, включающего соответствующее эталонное звено NR3 или NR4, могут быть подвергнуты простому испытанию в результате насыщения упомянутыми полипептидами шелка водного раствора. Результаты, в заключение, могут быть сопоставлены друг с другом.
m
n
z
z
m
n
n
z
z
n
o
z
o
o
z
p
p
P
Предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, выбирают из группы, состоящей из ADF-3 (SEQ ID NO:1) или его вариантов, ADF-4 (SEQ ID NO:2) или его вариантов, MaSp I (SEQ ID NO:43) или его вариантов, MaSp II (SEQ ID NO:44) или его вариантов, (С), (C)NR, NR(C), (AQ), (AQ)NR, NR(AQ), (QAQ), NR(QAQ), (QAQ)NR, Y, X и K, где m представляет собой целое число в диапазоне от 8 до 48 (то есть 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48), n представляет собой целое число в диапазоне от 4 до 24 (то есть 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24), о представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 20 (то есть 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), р представляет собой целое число в диапазоне от 8 до 16 (то есть 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16), a z представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 3 (то есть 1, 2 или 3), предпочтительно 1, a NR обозначает неповторяющееся звено. Вышеупомянутые формулы определяются одним из следующего далее: в формуле
m
(i) (C) - объединено друг с другом количество «m» модулей С, а именно от 8 до 48 модулей С, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:21,
m
z
(ii) (C)NR - объединено друг с другом количество «m» модулей С, а именно от 8 до 48 модулей С, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:21, где упомянутые модули С дополнительно объединены с количеством «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно с неповторяющимися (NR) звеньями в количестве в диапазоне от 1 до 3, например с неповторяющимися (NR) звеньями NR3, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41, или NR4, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42,
z
m
(iii) NR(C) - присутствует (z=1) или объединено друг с другом (z=2 или 3) количество «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например неповторяющихся (NR) звеньев NR3, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41, или NR4, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42, где упомянутое неповторяющееся (NR) звено (звенья) дополнительно объединено с количеством «m» модулей С, а именно с модулями С, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:21, в количестве в диапазоне от 8 до 48,
n
(iv) (AQ) - объединено друг с другом количество «n» комбинаций модулей А и Q, а именно от 6 до 24 комбинаций модулей А и Q, где модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20, а модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22,
n
z
(v) (AQ)NR - объединено друг с другом количество «n» комбинаций модулей А и Q, а именно от 6 до 24 комбинаций модулей А и Q, где модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20, а модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22, и где упомянутые комбинации модулей А и Q дополнительно объединены с количеством «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно с неповторяющимися (NR) звеньями в количестве в диапазоне от 1 до 3, например с неповторяющимися (NR) звеньями NR3, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41, или NR4, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42,
z
n
(vi) NR(AQ) - присутствует (z=1) или объединено друг с другом (z=2 или 3) количество «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например, неповторяющихся (NR) звеньев NR3, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41, или NR4, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42, где упомянутое неповторяющееся (NR) звено (звенья) дополнительно объединено с количеством «n» комбинаций модулей А и Q, а именно с комбинациями модулей А и Q в количестве в диапазоне от 6 до 24, где модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20, а модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22,
o
(vii) (QAQ) - объединено друг с другом количество «о» комбинаций модулей Q, A и Q, а именно от 8 до 16 комбинаций модулей Q, А и Q, где модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22, а модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20,
o
z
(viii) (QAQ)NR - объединено друг с другом количество «о» комбинаций модулей Q, А и Q, а именно от 8 до 16 комбинаций модулей Q, А и Q, где модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22, а модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20, и где упомянутые комбинации модулей Q, А и Q дополнительно объединены с количеством «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно с неповторяющимися (NR) звеньями в количестве в диапазоне от 1 до 3, например с неповторяющимися (NR) звеньями NR3, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41, или NR4, представляемыми аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42,
z
(ix) NR(QAQ)o - присутствует (z=1) или объединено друг с другом (z=2 или 3) количество «z» неповторяющихся (NR) звеньев, а именно от 1 до 3 неповторяющихся (NR) звеньев, например неповторяющихся (NR) звеньев NR3, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:41 или NR4 представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:42, где упомянутое неповторяющееся (NR) звено (звенья) дополнительно объединено с количеством «о» комбинаций модулей Q, А и Q, а именно с комбинациями модулей Q, A и Q в количестве в диапазоне от 8 до 16, где модуль Q представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:22, а модуль А представляет аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO:20,
p
(х) Y - объединено друг с другом количество «р» модулей Y, а именно от 8 до 16 модулей Y, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:28,
p
(xi) X - объединено друг с другом количество «р» модулей X, а именно от 8 до 16 модулей X, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:27, и
p
(xii) K - объединено друг с другом количество «р» модулей K, а именно от 8 до 16 модулей K, представляемых аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID N0:23.
Более предпочтительно
m
z
z
m
m
z
z
m
m
z
z
m
(i) z в (C)NR или NR(C) составляет 1, a m представляет собой целое число в диапазоне от 8 до 48 (то есть 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48), z в (C)NR или NR(C) составляет 2, a m представляет собой целое число в диапазоне от 8 до 48 (то есть 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48) или z в (C)NR или NR(C) составляет 3, а m представляет собой целое число в диапазоне от 8 до 48 (то есть 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48),
n
z
z
n
n
z
z
n
n
z
z
n
(ii) z в (AQ)NR или NR(AQ) составляет 1, а n представляет собой целое число в диапазоне от 4 до 24 (то есть 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24), z в (AQ)NR или NR(AQ) составляет 2, a n представляет собой целое число в диапазоне от 4 до 24 (то есть 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24) или z в (AQ)NR или NR(AQ) составляет 3, а n представляет собой целое число в диапазоне от 4 до 24 (то есть 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24),
z
o
o
z
z
o
o
z
z
o
o
z
(iii) z в NR(QAQ) или (QAQ)NR составляет 1, а о представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 20 (то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20), z в NR(QAQ) или (QAQ)NR составляет 2, а о представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 20 (то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) или z в NR(QAQ) или (QAQ)NR составляет 3, а о представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 20 (то есть 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20),
где NR обозначает неповторяющееся звено, предпочтительно NR3 или NR4.
16
32
16
32
12
24
12
24
12
24
16
32
8
16
8
16
8
16
Наиболее предпочтительно полипептид шелка, использующийся в способе настоящего изобретения, представляет собой CNR3, CNR3, CNR4, CNR4, (AQ), (AQ), (AQ)NR3, (AQ)NR3, (AQ)NR4, (AQ)NR4, C, C, Y, Y, X, X, K или K.
Вариант ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II отличается от эталонного полипептида (дикого типа) ADF-3 (SEQ ID NO:1), ADF-4 (SEQ ID NO:2), MaSp I (SEQ ID NO:43) или MaSp II (SEQ ID NO:44), от которого он произошел, вплоть до 150 (вплоть до 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35,40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150) аминокислотными изменениями в аминокислотной последовательности (то есть замещениями, присоединениями, вставками, удалениями, отсечениями с N-конца и/или отсечениями с С-конца). Такой вариант в альтернативном или дополнительном варианте может характеризоваться определенной степенью идентичности последовательности с эталонным полипептидом (дикого типа), от которого он произошел. Таким образом, вариант ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II характеризуется идентичностью последовательности с соответствующим эталонным полипептидом (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II, составляющей, по меньшей мере, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 99,9%. Предпочтительно идентичность последовательности наблюдается на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 250, 300, 350, 400 и более аминокислот, предпочтительно по всей длине соответствующего эталонного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II.
В особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 85% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 90% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 95% по всей длине, составляла бы, по меньшей мере, 98% по всей длине или составляла бы, по меньшей мере, 99% по всей длине, соответствующего эталонного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II. Кроме того, в особенности предпочитается, чтобы идентичность последовательности составляла бы, по меньшей мере, 80% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 85% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 90% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 95% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, составляла бы, по меньшей мере, 98% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот или составляла бы, по меньшей мере, 99% на непрерывной протяженности, по меньшей мере, в 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 или 300 аминокислот, соответствующего эталонного полипептида (дикого типа) ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида ADF-3 (SEQ ID NO:1) предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 150, 170, 200, 220, 250, 270, 300, 320, 350, 370, 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 570, 600 или 610 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида ADF-4 (SEQ ID NO:2) предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 100, 120, 150, 170, 200, 220, 250, 270, 300, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 или 390 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида MaSp I (SEQ ID NO:43) предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 620, 640, 660, 670, 680 или 690 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
Фрагмент (или делеционный вариант) полипептида MaSp II (SEQ ID NO:44) предпочтительно включает удаление вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 520, 540, 560 или 570 аминокислот с N-конца и/или с С-конца. Удаление также может быть внутренним.
В дополнение к этому, вариант или фрагмент ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II в контексте настоящего изобретения считается вариантом или фрагментом ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II, только если модификации в отношении аминокислотной последовательности, на которой базируются данный вариант или фрагмент, не оказывают негативного воздействия на способность полипептида шелка образовывать волокно. Предпочтительно из полипептида шелка, включающего вариант или фрагмент ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II, все еще можно проводить вытяжку гладкого и однородного волокна при скорости, составляющей, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно 10 см/сек, а более предпочтительно 10 м/сек. Специалист в соответствующей области техники может провести визуальную оценку того, будет ли все еще иметь место получение волокна. Гладкий и однородный внешний вид упомянутого волокна можно контролировать при использовании электронной микроскопии.
Предпочтительно способ реализуют при температурах в диапазоне от 5°С до 60°С, более предпочтительно при температурах в диапазоне от 10°С до 50°С, а наиболее предпочтительно при температурах в диапазоне от 20°С до 40°С. Таким образом, способ может быть реализован при температуре 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60°С.
Предпочтительно способ реализуют при давлении в диапазоне от 10 кПа до 1000 кПа, более предпочтительно от 40 кПа до 500 кПа, а наиболее предпочтительно от 50 кПа до 150 кПа. Таким образом, способ может быть реализован при 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 950, 1000 кПа. В особенности предпочитается, чтобы способ был бы реализован в стандартных условиях по температуре и давлению, то есть при 20°С и 101,325 кПа.
В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения прядильный раствор, полученный на стадии (а), содержит более чем один полимер, предпочтительно 2, 3 или 4 полимера, например полипептида, такого как полипептиды шелка, казеин, зеин или БСА. Например, прядильный раствор, полученный на стадии (а), может содержать (i) полипептид шелка и казеин, (ii) полипептид шелка и зеин, (iii) полипептид шелка и БСА, (iv) полипептид шелка, зеин и казеин, (v) полипептид шелка, казеин и БСА, (vi) полипептид шелка, БСА, казеин и зеин, (vi) зеин и казеин, (viii) зеин и БСА, (ix) казеин и БСА или (х) зеин и казеин и БСА. Полипептиды могут быть мечеными, например, ферментными метками, биотином, радиоактивными или флуоресцентными метками, например флуоресцеином (ФИТЦ).
В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения прядильный раствор, полученный на стадии (а), содержит более чем один тип полипептида шелка. Предпочтительно прядильный раствор, полученный на стадии (а) способа настоящего изобретения, содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных типов полипептидов шелка, наиболее предпочтительно 2 различных типа полипептидов шелка. Например, прядильный раствор может содержать полипептиды шелка паука каркасной нити, которые отличаются друг от друга в отношении своей аминокислотной последовательности. Прядение, проводимое в способе настоящего изобретения, также может включать полипептиды шелка паука каркасной нити и шелка ловчей спиральной нити паука, которые отличаются друг от друга в отношении своего природного происхождения. Полипептид шелка паука каркасной нити возникает в большой ампуловидной железе, в то время как полипептид ловчей спиральной нити возникает в жгутиковидной (flagelliform) железе.
Концентрация полимера, например, полипептида шелка, БСА, зеина или казеина, предпочтительно находится в диапазоне от 0,15 мг/мл до 500 мг/мл, более предпочтительно в диапазоне от 0,15 мг/мл до 99,9 мг/мл, в диапазоне от 0,15 мг/мл до 90 мг/мл, в диапазоне от 0,15 мг/мл до 80 мг/мл, в диапазоне от 0,15 мг/мл до 70 мг/мл, в диапазоне от 0,15 мг/мл до 60 мг/мл или в диапазоне от 0,15 мг/мл до 50 мг/мл, наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,5 мг/мл до 50 мг/мл, в диапазоне от 0,5 мг/мл до 40 мг/мл, в диапазоне от 0,5 мг/мл до 30 мг/мл или в диапазоне от 1 мг/мл до 20 мг/мл. В особенности предпочитается, чтобы концентрация полимера, например полипептида шелка, БСА, зеина или казеина, находилась бы в диапазоне от 0,15 мг/мл до 20 мг/мл.
Таким образом, например, концентрация полимера, например полипептида шелка, казеина, зеина или БСА, составляет (по меньшей мере) 0,15 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 17 мг/мл, 18 мг/мл, 19 мг/мл, 20 мг/мл, 21 мг/мл, 22 мг/мл, 23 мг/мл, 24 мг/мл, 25 мг/мл, 26 мг/мл, 27 мг/мл, 28 мг/мл, 29 мг/мл, 30 мг/мл, 31 мг/мл, 32 мг/мл, 33 мг/мл, 34 мг/мл, 35 мг/мл, 36 мг/мл, 37 мг/мл, 38 мг/мл, 39 мг/мл, 40 мг/мл, 41 мг/мл, 42 мг/мл, 43 мг/мл, 44 мг/мл, 45 мг/мл, 46 мг/мл, 47 мг/мл, 48 мг/мл, 49 мг/мл, 50 мг/мл, 55 мг/мл, 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, 95 мг/мл, 100 мг/мл, 110 мг/мл, 120 мг/мл, 130 мг/мл, 140 мг/мл, 150 мг/мл, 160 мг/мл, 170 мг/мл, 180 мг/мл, 190 мг/мл, 195 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл, 300 мг/мл или 350 мг/мл.
Необходимо отметить то, что способ настоящего изобретения требует использования только очень низких концентраций полимеров, например полипептидов шелка, начиная от концентраций, составляющих всего лишь 0,15 мг/мл, и предпочтительно заканчивая концентрациями, не большими чем 90 мг/мл, более предпочтительно не большими чем 50 мг/мл, а наиболее предпочтительно не большими чем 20 мг/мл. Преимущество этого заключается в очень низкой сдвиговой вязкости прядильного раствора, использующегося в способе настоящего изобретения, что, в свою очередь, улучшает перерабатываемость упомянутого прядильного раствора.
На соединение, увеличивающее вязкость, по его структуре никаких ограничений не накладывают до тех пор, пока оно будет увеличивать продольную вязкость прядильного раствора.
Предпочтительно соединение, которое увеличивает продольную вязкость раствора, представляет собой линейный или разветвленный полимер, имеющий молекулярную массу, составляющую, по меньшей мере, 20 кДа, например 25 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 200 кДа, 300 кДа, 400 кДа, 500 кДа, 600 кДа, 700 кДа, 800 кДа, 900 кДа, 1 МДа, 1,5 МДа, 2 МДа, 2,5 МДа, 3 МДа, 3,5 МДа, 4 МДа, 4,5 МДа или 5 МДа. Предпочитается, чтобы линейный или разветвленный полимер имел бы молекулярную массу в диапазоне от 20 кДа до 5 МДа или от 50 кДа до 4 МДа, более предпочтительно от 100 кДа до 2 МДа или от 100 кДа до 1 МДа.
Более предпочтительно соединение, которое увеличивает продольную вязкость раствора, представляет собой линейный или разветвленный полимер, имеющий молекулярную массу, составляющую, по меньшей мере, 500 кДа, например 550 кДа, 600 кДа, 650 кДа, 700 кДа, 750 кДа, 800 кДа, 850 кДа, 900 кДа, 950 кДа, 1 МДа, 1,5 МДа, 2 МДа, 2,5 МДа, 3 МДа, 3,5 МДа, 4 МДа, 4,5 МДа или 5 МДа. Более предпочитается, чтобы линейный или разветвленный полимер имел бы молекулярную массу в диапазоне от 500 кДа до 5 МДа или от 900 кДа до 5 МДа, наиболее предпочтительно от 1 МДа до 4 МДа или от 1 МДа до 3 МДа.
Предпочитается, чтобы соединение, которое увеличивает продольную вязкость раствора, было бы выбрано из группы, состоящей из полиакриламида (ПАА), полиэтилена (ПЭ), полиэтиленгликоля (ПЭГ), полисахаридов, декстранов, поливиниловых спиртов, нуклеиновых кислот и их смесей. В одном предпочтительном варианте осуществления декстран представляет собой декстран-сульфат.
Предпочтительно соединение, которое увеличивает продольную вязкость раствора, представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий молекулярную массу, составляющую, по меньшей мере, 20 кДа, например 25 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 50 кДа, 60 кДа, 70 кДа, 80 кДа, 90 кДа, 100 кДа, 200 кДа, 300 кДа, 400 кДа, 500 кДа, 600 кДа, 700 кДа, 800 кДа, 900 кДа, 1 МДа, 1,5 МДа, 2 МДа, 2,5 МДа, 3 МДа, 3,5 МДа, 4 МДа, 4,5 МДа или 5 МДа. Предпочитается, чтобы полиэтиленгликоль (ПЭГ) имел бы молекулярную массу в диапазоне от 20 кДа до 5 МДа или от 50 кДа до 4 МДа, более предпочтительно от 100 кДа до 2 МДа или от 100 кДа до 1 МДа.
Более предпочтительно соединение, которое увеличивает продольную вязкость раствора, представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий молекулярную массу, составляющую, по меньшей мере, 500 кДа, например 550 кДа, 600 кДа, 650 кДа, 700 кДа, 750 кДа, 800 кДа, 850 кДа, 900 кДа, 950 кДа, 1 МДа, 1,5 МДа, 2 МДа, 2,5 МДа, 3 МДа, 3,5 МДа, 4 МДа, 4,5 МДа или 5 МДа. Более предпочитается, чтобы полиэтиленгликоль (ПЭГ) имел бы молекулярную массу в диапазоне от 500 кДа до 5 МДа или от 900 кДа до 5 МДа, наиболее предпочтительно от 1 МДа до 4 МДа или от 1 МДа до 3 МДа.
Концентрация соединения, которое увеличивает продольную вязкость раствора, предпочтительно находится в диапазоне от 0,1% (масс./об.) до 5% (масс./об.), более предпочтительно в диапазоне от 0,5% (масс./об.) до 4% (масс./об.), а наиболее предпочтительно в диапазоне от 1% (масс./об.) до 3% (масс./об.).
Таким образом, например, концентрация соединения, которое увеличивает продольную вязкость раствора, составляет 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 или 5% (масс./об.).
Как, к своему удивлению, установили изобретатели настоящего изобретения, уже данная низкая концентрация соединения, которое увеличивает продольную вязкость раствора, является достаточной для прядения волокон при использовании способа, предложенного в настоящем документе. Низкая концентрация упомянутого соединения, с одной стороны, увеличивает продольную вязкость раствора, но, с другой стороны, по существу не увеличивает сдвиговую вязкость раствора, так что образование волокон улучшается. Таким образом, прядильный раствор, использующийся в способе настоящего изобретения, в основном образован из полимера, такого как полипептид шелка, зеин или казеин, то есть является относительно чистым. Кроме того, вследствие умеренного использования соединений или веществ в дополнение к полимеру, такому как полипептид шелка, зеин или казеин, способ настоящего изобретения является экономичным по затратам и экологически безопасным.
Соотношение по величинам % (масс.) между полипептидом шелка и улучшителем продольной вязкости предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 5, от 0,2 до 5, от 0,3 до 5 или от 0,4 до 5, более предпочтительно от 0,4 до 2, наиболее предпочтительно от 0,8 до 1,5. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления, в которых полипептид шелка присутствует в растворе в количестве в диапазоне от 1 до 20 мг/мл, количество улучшителя продольной вязкости выбирают таким, чтобы соотношение по величинам % (масс.) между полипептидом шелка и улучшителем продольной вязкости предпочтительно находилось бы в диапазоне от 0,1 до 10, более предпочтительно от 0,2 до 5, более предпочтительно от 0,4 до 2, наиболее предпочтительно от 0,8 до 1,5.
16
Например, в результате добавления высокомолекулярного полиакриламида (5 МДа,1% (масс./об.)) число Онезорге C прядильного раствора может быть увеличено в достаточной степени для обеспечения улучшенного получения волокна на межфазной поверхности воздух/жидкость.
Растворитель может представлять собой любой раствор, в котором будут растворимыми полимер, например полипептид, такой как полипептид шелка паука, зеин, БСА или казеин, и полимер, улучшающий продольную вязкость. Предпочитается, чтобы растворитель был бы выбран из группы, состоящей из полярного растворителя, предпочтительно воды, водного буфера, спирта, предпочтительно изопропанола, гексафторизопропанола, глицерина, этанола (ЕЮН), пропанола, бутанола, октанола или ацетона; неполярного растворителя, предпочтительно гексана, додекана или масла, других органических растворителей, предпочтительно этилацетата; и их смесей. Таким образом, растворитель также может представлять собой смесь полярного растворителя, например воды, и неполярного растворителя, например гексана. В одном предпочтительном варианте осуществления значение рН растворителя находится в диапазоне от 4 до 10.
Необходимо отметить то, что вследствие комбинированного использования очень низких концентраций полимеров, таких как полипептиды шелка, зеин или казеин, и очень низких концентраций соединений, которые увеличивают продольную вязкость раствора у прядильного раствора, при использовании способа настоящего изобретения может быть облегчено получение волокна.
В дополнение к этому, вследствие комбинированного использования очень низких концентраций полимеров, таких как полипептиды шелка, зеин или казеин, и очень низких концентраций соединений, которые увеличивают продольную вязкость раствора у прядильного раствора, упомянутый раствор не имеет высоковязкой консистенции в противоположность другим прядильным растворам предшествующего уровня техники. Тем самым может быть улучшена перерабатываемость прядильного раствора.
Предпочтительно вытяжку волокна инициируют в результате введения межфазной поверхности воздух/жидкость или жидкость/жидкость у раствора в контакт с инструментом для вытяжки и отвода инструмента для вытяжки от упомянутой межфазной поверхности. Термин «воздух» в соответствии с использованием в настоящем документе предпочтительно обозначает смесь газов, встречающуюся в природе в земной атмосфере. В контексте межфазной поверхности жидкость/жидкость, где одна из жидкостей представляет собой прядильный раствор, предпочитается, чтобы другая жидкость была бы плохо смешиваемой с прядильным раствором. В соответствии с этим в случае растворителя прядильного раствора в виде полярного растворителя другая жидкость предпочтительно будет неполярной. В альтернативном варианте, в случае растворителя прядильного раствора в виде неполярного растворителя предпочтительно другая жидкость будет полярной. Межфазная поверхность жидкость/жидкость также может быть получена, по меньшей мере, временно, при введении в контакт друг с другом двух смешиваемых жидкостей, например, в трубе, где один жидкий поток охватывает поток второй жидкости. Как можно себе представить без желания связывать себя какой-либо теорией, первоначальное введение межфазной поверхности в контакт с инструментом для вытяжки, например наконечником пипетки, создает для полимеров в прядильном растворе точку присоединения. Отвод пипетки приводит к ориентации полимеров в растворителе при обращении их головы или хвоста к инструменту для вытяжки, в результате чего полимеры выравниваются бок о бок друг с другом и все больше друг с другом ассоциируются. При последующем отводе полимеры переходят из упорядоченного состояния, относящегося к типу раствора или жидкого кристалла, в полутвердое или твердое состояние. Термин «вытяжка» в данном контексте используется не только для обозначения инициирования данного процесса выравнивания, но также и для обозначения непрерывного отвода выровненных или частично выровненных полимерных молекул из прядильного раствора. Во время данного состояния предпочтительно непрерывной вытяжки инструмент для вытяжки больше уже не находится в контакте с прядильным раствором, но производит «вытяжку» дальнейших полимерных молекул из раствора в «отделенный раствор», то есть раствор, содержащий выровненные полимеры, больше уже не находящиеся в контакте с основной массой прядильного раствора. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «вытяжка» обозначает вытяжку как процесс получения волокна, который также может включать растяжение или твердение. Кроме того, вытяжка волокна из раствора не является процессом, ограниченным вытягиванием волокна из отделенного раствора при использовании инструмента для вытяжки, подобного, например, стеклянной игле, как это продемонстрировано в примере 1. Способ также может включать любую надлежащую автоматизированную систему, например трубу, через которую раствор отбирают при восполняющем течении, с соплом на конце, где прядильный раствор экструдируется и уводится инструментом для вытяжки, что тем самым проводит непрерывную вытяжку волокна из экструдированного прядильного раствора. Инструмент для вытяжки может представлять собой любой тип инструмента с наконечником, соответствующим вытяжке волокна и изготовленным из соответствующего материала, например, способным обеспечить получение точки присоединения к полимерам в прядильном растворе. Примеры включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: наконечники пипеток, иглы или тонкие стержни, изготовленные из пластика, металла или стекла. На скорость вытяжки волокна никаких ограничений не накладывают до тех пор, пока она будет достаточно высокой для вытяжки тонкого текучего элементарного волокна, которое будет существовать в течение достаточно продолжительного периода времени для обеспечения испарения растворителя и получения волокна, предпочтительно тонкого, легкого и длинного волокна. Однако в одном предпочтительном варианте осуществления вытяжку проводят в результате соприкосновения раствора с инструментом для вытяжки и произведения вытяжки волокна с поверхности. В ходе проведения операции, то есть при получении первоначального контакта с поверхностью и вытяжке волокна с поверхности, термин «вытяжка» также относится к отводу волокна из раствора, предпочтительно при постоянной скорости. Идеальная скорость зависит от вязкости прядильного раствора, то есть от типа и концентрации использующихся полимеров, и должна быть определена в эксперименте. Предпочтительно вытяжку проводят при скоростях, составляющих, по меньшей мере, 0,1 см/сек, предпочтительно находящихся в диапазоне от 0,1 см/сек до 15 м/сек, от 1 см/сек до 5 м/сек, от 3 см/сек до 1 м/сек, от 5 см/сек до 50 см/сек, от 5 см/сек до 15 см/сек, а более предпочтительно составляющих 10 см/сек. Например, вытяжку проводят при скоростях, составляющих, по меньшей мере, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 см/сек, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 м/сек.
В способе изобретения также предусматривается экструдирование прядильного раствора для получения волокна. Термин «экструдирование» в данном контексте обозначает приложение к прядильному раствору давления для продавливания его через отверстие, например сопло. В области полимерной технологии способы «экструдирования» зачастую используют для получения волокон из расплавленных термопластов, то есть совокупный экструдированный материал затвердевает после покидания им отверстия. В контексте настоящего изобретения экструдированный прядильный раствор полностью не затвердевает. Вместо этого растворенные полимеры, которые содержатся в экструдированном прядильном растворе, ассоциируются с образованием волокна, которое обычно является меньшим по диаметру, чем отверстие, через которое экструдируют прядильный раствор, при одновременном отделении от таким образом полученного волокна остаточного растворителя. В одном предпочтительном варианте осуществления первоначально полученное волокно присоединяют к устройству извлечения волокна, например цилиндру, шпуле или бобине, на которые волокно непрерывно наматывают. В зависимости от относительной скорости, например, цилиндра по отношению к скорости получения волокна во время экструдирования также может возникать и вытягивающее усилие, воздействующее на экструдированное волокно, то есть волокно в некоторых вариантах осуществления может считаться подвергаемым «вытяжке» из экструдированного раствора.
Для дополнительного улучшения прядомости прядильного раствора одновременно с продольной вязкостью может быть увеличена и сдвиговая вязкость искусственных прядильных сиропов до величины, не наносящей вред переработке текучей среды, например, в результате добавления улучшителей ньютоновской вязкости. Тем самым, прядомость обозначает пригодность прядильного раствора для вытяжки волокна.
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения прядильный раствор дополнительно содержит соединение, которое увеличивает ньютоновскую вязкость, предпочтительно моносахариды, например глюкозу, галактозу или фруктозу; дисахариды, например лактозу или сахарозу; полисахариды, например гликоген; или полиолы, например, инозит, сорбит, глицерин или полигликоли; или их смеси.
Предпочтительно прядильный раствор дополнительно содержит диспергированный в нем дисперсный материал. При получении волокна данный дисперсный материал относительно равномерным образом внедряется в волокно. На дисперсный материал по его композиции никаких ограничений не накладывают до тех пор, пока он будет подходящим для использования при включении в волокно. Предпочитается, чтобы дисперсный материал был бы выбран из группы, состоящей из гранул, металлов, проводящих электричество (в том числе золота, меди), кристаллитов, комплексов белок/белок, ферментов (например, зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) или β-галактозидаза) и клеток (например, остеобластные клетки человека или клетки-предшественники сухожилий человека или любые полипотентные клетки или стволовые клетки). Предпочтительно клетки выбирают из клеток, секретирующих ферменты или гормоны, например клеток островка Лангерганса. Предпочтительные кристаллиты представляют собой красители, которые являются нерастворимыми в воде, флуоресцентные красители (например, судановый красный) или азокрасители (например, нильский красный).
На концентрацию дисперсного материала в прядильном растворе никаких ограничений не накладывают. Предпочтительно дисперсный материал в прядильном растворе присутствует в количестве в диапазоне от 0,01% (масс./об.) до 10% (масс./об.), предпочтительно от 0,5% (масс./об.) до 1% (масс./об.). Таким образом, дисперсный материал в прядильном растворе может присутствовать в количестве 0,01, 0,05, 0,1, 02, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5. 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0% (масс./об.).
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения прядильный раствор дополнительно содержит соединение, которое увеличивает ньютоновскую вязкость, например полигликоли, или дисперсный материал, например гранулы. В еще одном предпочтительном варианте осуществления прядильный раствор дополнительно содержит как соединение, которое увеличивает ньютоновскую вязкость, например полигликоли, так и дисперсный материал, например, гранулы.
Волокно после получения может быть подвергнуто обработке в результате отверждения в отверждающем растворе или сшивания. Таким образом, предпочитается, чтобы способ настоящего изобретения после стадии (b) включал бы стадию (с) отверждения волокна в отверждающем растворе или сшивания волокна.
Сшивание может включать соединение других соединений с волокном или соединение идентичных или различных волокон друг с другом, в результате чего могут быть получены, например, многоволоконные структуры, такие как многослойные волокна, или структуры «ядро-оболочка».
Термин «сшивание» в соответствии с использованием в настоящем документе относится к способу химического соединения двух молекул ковалентной связью. Реагенты сшивания или реакции сочетания имеют концевые группы, реакционно-способные по отношению к специфическим функциональным группам (первичные амины, сульфгидрил и тому подобное) у полипептидов или других молекул. Предпочтительно реагент сшивания или реакции сочетания, использующийся в способе настоящего изобретения, представляет собой гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК) или глутаральдегид.
В еще одном варианте осуществления волокно сматывают при одновременной непрерывной вытяжке. Это делает возможным получение и хранение длинных волокон.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к прядильному раствору для реализации способа настоящего изобретения, содержащему, по существу состоящему из или состоящему из: (i) полимера, который может быть введен в водный раствор с концентрацией, составляющей, по меньшей мере, 0,15 мг/мл, (ii) соединения, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, и (iii) растворителя.
В данном контексте в особенности предпочитается, чтобы полимер представлял бы собой определенный выше полипептид шелка.
Кроме того, в особенности предпочитается, чтобы концентрация полимера, например полипептида шелка, составляла бы, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 60 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 50 мг/мл, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 20 мг/мл.
Также в особенности предпочитается, чтобы концентрация соединения, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, находилась бы в диапазоне от 0,1% (масс./об.) до 5% (масс./об.), более предпочтительно в диапазоне от 0,5% (масс./об.) до 4% (масс./об.), а наиболее предпочтительно в диапазоне от 1% (масс./об.) до 3% (масс./об.).
В частности, еще больше предпочитается, чтобы концентрация полимера, например полипептида шелка, составляла бы, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 60 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 50 мг/мл, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 0,15 мг/мл и не более, чем 20 мг/мл, и чтобы концентрация соединения, которое увеличивает продольную вязкость прядильного раствора, находилась бы в диапазоне от 0,1% (масс./об.) до 5% (масс./об.), более предпочтительно в диапазоне от 0,5% (масс./об.) до 4% (масс./об.), а наиболее предпочтительно в диапазоне от 1% (масс./об.) до 3% (масс./об.).
В прядильном растворе, соответствующем данному аспекту изобретения, также могут содержаться и все другие компоненты прядильного раствора, упомянутые выше в контексте описания способа изобретения. Подобным образом это относится ко всем предпочтительным и в особенности предпочтительным вариантам осуществления различных вышеупомянутых компонентов.
В третьем аспекте настоящее изобретение предлагает волокно, получаемое по способу первого аспекта.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предлагает продукты, включающие волокно второго аспекта, такие как
(i) нить или
(ii) тканый материал или нетканый материал.
В одном дополнительном аспекте настоящее изобретение предлагает использование волокна или нити, включающих одну или несколько клеток, для анализа одной или нескольких функций клеток и/или для сохранения упомянутых клеток. Предпочтительно анализ функции клеток проводят до, во время и/или после воздействия на одну или несколько клеток тестирующим соединением или раздражителем, предпочтительно механическим, термическим и/или электрическим раздражителем. Волокна, включающие клетки, также могли бы исполнять функцию и каркасного материала для тканевой инженерии и выращивания искусственных органов.
Настоящее изобретение улучшает прядомость полимерного раствора, делая возможным получение всего ассортимента новых материалов. Настоящее изобретение является в особенности хорошо подходящим для включения живого и неживого биологического материала, поскольку способ может быть реализован в надлежащих условиях по использующимся температуре, давлению, растворителю и химическим реагентам.
Поскольку данным образом в волокна могут быть включены в общем случае все белки, в такие волокна может быть включена в принципе любая ферментативная активность. Может быть, более важным является то, что в волокна также могут быть внедрены и клетки так, как это было продемонстрировано для включения в волокна коллоидальных частиц микронного размера. Поскольку условия благоприятствуют жизнеспособности клеток, возможными являются области применения в биоинженерии и выращивании тканей. Волокна, включающие клетки, могли бы исполнять функцию и каркасного материала для тканевой инженерии и выращивания искусственных органов. Кроме того, инкапсулирование живых клеток делает возможным воздействие на данные клетки различных условий окружающей среды, например, в результате протягивания их через ванну с реагентами. При наличии таких подходов могут быть доступными новые инструменты для биологии клеток. В этом духе изобретение может быть использовано для последовательного, а также высокопроизводительного манипулирования с клетками в непрерывной цепочке. Одна возможность заключается в проведении вытяжки волокна при внедрении клеток из прядильного раствора, содержащего биологически активное соединение, и скрининг клеток по мере их выхода из раствора. Тем самым позиция на цепочке образует для клеток индекс, формируя новые подходы в одноклеточных высокопроизводительных скрининговых анализах. В дополнение к этому, возможными являются области применения при заживлении ран. Например, волокна, включающие клетки, секретирующие факторы заживления ран, могли бы быть включены в бандажи или ксерогели или дополнить их, в частности, в контексте заживления мокрых ран. Можно себе представить также и варианты использования при получении кожных трансплантатов, реконструкции связок или хирургической сетки. Кроме того, волокна, полученные в соответствии с изобретением, могут быть использованы в широком спектре других коммерческих продуктов, например в случае каната, сетки, одежной ткани, строительного материала, палаточной ткани, рюкзаков и многого другого, где желательными характеристиками являются прочность, эластичность и малая масса.
Следующие далее фигуры и примеры представляют собой просто иллюстрации настоящего изобретения и никоим образом не должны восприниматься в качестве ограничения объема изобретения, указанного в прилагаемой формуле изобретения.
Краткое описание фигур
Фигура 1
демонстрирует волокна, подвергнутые вытяжке из прядильного раствора, содержащего 5 мг/мл ФИТЦ-С<sub>16</sub> и 0,5% (масс./об.) ПАА. Иглу из бесцветного стекла вытягивают из аликвоты прядильного раствора (А), что
в результате приводит к получению тонкого текучего элементарного волокна (В). (С) Волокна, подвергнутые вытяжке при скорости, составляющей, по меньшей мере, 10 см/сек, имеют гладкий и однородный внешний вид. (D) Волокна, подвергнутые вытяжке при скорости, меньшей, чем надлежащая пороговая скорость. Капли жидкости все еще образуют покрытие текучего элементарного волокна и сохраняются после осаждения волокна на чистое предметное стекло микроскопа.
Фигура 2
демонстрирует волокна, подвергнутые вытяжке из прядильного раствора, содержащего приблизительно 10<sup>7</sup>/мл полистирольных гранул (диаметром в 1 мкм), диспергированных в растворе при 5 мг/мл C<sub>16</sub> и 0,5% (масс./об.) ПАА. Гранулы включены в волокна и распределены достаточно равномерно.
Фигура 3
демонстрирует полученное по методу атомно-силовой микроскопии изображение волокна, подвергнутого вытяжке из прядильного раствора, содержащего полистирольные гранулы (диаметром в 1 мкм), диспергированные в растворе при 5 мг/мл C<sub>16</sub> и 0,5% (масс./об.) ПАА.
Фигура 4
Гранулы покрыты материалом волокна и плотно соединены с волокном. Демонстрирует волокно зеина, подвергнутое вытяжке из прядильного раствора, содержащего 300 мг/мл зеина и 0,5% (масс./об.) ПАА в 63,75%-ном этаноле. Волокно зеина демонстрировало гладкую поверхность.
Примеры
Следующие далее примеры предназначены только для целей иллюстрации и никоим образом не ограничивают описанное выше изобретение.
Пример 1: Принцип способа вытяжки
16
Фигура 1А демонстрирует аликвоту прядильного раствора, состоящего из C в качестве полимерного компонента, ПАА в качестве полимера, улучшающего продольную вязкость, и воду в качестве растворителя, на предметном стекле микроскопа в контакте с иглой из бесцветного стекла в качестве инструмента для вытяжки. Вытягивание иглы, которая находится в контакте с прядильным раствором, из раствора приводит к получению тонкого текучего элементарного волокна. Данное элементарное волокно при достаточно быстрой вытяжке существует в течение достаточно продолжительного периода времени для обеспечения испарения воды в качестве растворителя и получения тонкого и легкого волокна (фигура 1В). Волокна содержат белок, что может быть продемонстрировано по методам ИК-спектроскопии и флуоресцентной микроскопии при использовании меченого белка.
Пример 2: Волокна из белка шелка паука низкой концентрации
16
100 мкл прядильного раствора (10 мг/мл ФИТЦ-С, 1,0% (масс./об.) ПАА) размещали на предметном стекле микроскопа. Иглу из бесцветного стекла (длиной в 5 см и диаметром в 1 мм) вводили в контакт с прядильным раствором, а после этого отводили рукой от предметного стекла микроскопа при переменных скоростях. Данный способ в результате приводил к вытягиванию волокна из прядильного раствора, при этом качество волокна зависело от использующейся скорости. При скорости вытягивания, составляющей 10 см/сек и более, волокна имели гладкий и однородный внешний вид (фигура 1С). В случае проведения вытягивания при скоростях, меньших, чем пороговая, капли жидкости все еще образовывали покрытие текучего элементарного волокна и сохранялись после осаждения волокна на чистое предметное стекло микроскопа (фигура 1D). При скорости вытягивания, составляющей 10 см/сек и более, имело место получение хорошего волокна.
Пример 3: Волокна, вытягиваемые падающей стальной гранулой
16
100 мкл прядильного раствора (10 мг/мл C, 1,0% (масс./об.) ПАА) размещали поблизости от края предметного стекла микроскопа. Между краем и прядильным раствором размещали стальную гранулу диаметром в 1 мм в соприкосновении с прядильным раствором. При удерживании предметного стекла микроскопа рукой стекло слегка наклоняли, вызывая падение гранулы с края. Как это ни удивительно, но падающая гранула вытягивала волокно из прядильного раствора почти так же, как и игла из примера 1. Способ с падением шарика и получением волокна может быть сопоставлен с падением паука, производящего волокно, хотя, очевидно, резервуар с прядильным сиропом находится на различных концах волокна.
Пример 4: Внедрение гранул в волокна
16
7
В 100 мкл прядильного раствора (10 мг/мл C, 1,0% (масс./об.) ПАА) диспергировали приблизительно 10/мл продукта Dynabeads (гранул из полистирола или ПС) диаметром в 1 мкм. Иглу из бесцветного стекла (длиной в 5 см и диаметром в 1 мм) вводили в контакт с прядильным раствором, а после этого отводили рукой от предметного стекла микроскопа при скорости, составляющей приблизительно 10 см/сек. Данный способ в результате приводил к вытягиванию из прядильного раствора волокна, включающего гранулы из ПС. Гранулы внедрялись в волокно и распределялись достаточно равномерно (фигура 2). Атомно-силовая микроскопия продемонстрировала покрытие гранул материалом волокна и плотное их соединение с волокном (фигура 3).
Поскольку данный эксперимент может быть проведен в условиях, соответствующих живым клеткам по температуре, давлению и растворителю, он демонстрирует возможность включения клеток вместо использующихся гранул из ПС, которые имели диаметр, подобный диаметрам многих клеток, например фибробластов.
Пример 5: Волокна из зеина
Зеин представляет собой запасной белок из кукурузы и в качестве материала он использовался в течение десятилетий. Он доступен с разумной чистотой в больших количествах при низкой стоимости (Tsai 1979). 300 мг/мл зеина в 85%-ном этаноле перемешивали с 2% (масс./об.) ПАА, при этом конечная концентрация ПАА составляла 0,5% (масс./об.). 100 мкл данного прядильного раствора размещали на предметном стекле микроскопа. Иглу из бесцветного стекла (длиной в 5 см и диаметром в 1 мм) вводили в контакт с прядильным раствором, а после этого отводили рукой от предметного стекла микроскопа при скорости, составляющей приблизительно 10 см/сек. Данный способ в результате приводил к вытягиванию из прядильного раствора волокна зеина (фигура 4). Такие волокна зеина были нерастворимыми в воде и имели гладкую поверхность. Они, по-видимому, демонстрировали хорошую механическую устойчивость, но были довольно хрупкими и неподатливыми. Волокна зеина могли быть сделаны более податливыми в формальдегидной ванне.
Пример 6: Включение в волокна кристаллитов
16
В прядильный раствор (10 мг/мл C, 1,0% (масс./об.) ПАА) в суспензии в виде тонкодисперсного порошка добавляли красители (судановый красный (Sigma 20161-8) или нильский красный (Fluka 72485)). Оба красителя внедрялись в волокна. Оба красителя являются гидрофобными и прочно пристают к гидрофобным белкам шелка паука.
Пример 7: Включение в волокна ферментов
16
В волокна (10 мг/мл C, 1,0% (масс./об.) ПАА) включали флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP). После включения наблюдали яркую флуоресценцию. Это демонстрирует все еще неповрежденность укладки белка (GFP) в волокнах и поэтому и самого белка.
16
В волокна (10 мг/мл C, 1,0% (масс./об.) ПАА) включали β-галактозидазу. В результате ферментативной гидролизации происходит гидролиз о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ОНФГ) с образованием желтого о-нитрофенольного красителя. Устанавливают концентрацию о-нитрофенола для количественного определения активности β-галактозидазы в волокне. Включение ферментов может быть использовано для любых областей применения, в которых требуются ферменты, которые являются достаточно большими для улавливания в волокне при одновременной возможности диффундирования веществ внутрь и наружу.