Исследование кефирных грибков, как продуцентов полисахаридов

Успехи в химии и химической технологии. Том XXVII. 2013. №9

УДК 579.67; 579.262

А.А. Саранцева, Е.Д. Мурзина, Н.Б. Градова

Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева, Москва, Россия

ИССЛЕДОВАНИЕ КЕФИРНЫХ ГРИБКОВ, КАК ПРОДУЦЕНТОВ ПОЛИСАХАРИДОВ

Исследована возможность получения полисахаридов из нативных кефирных грибков; проведен скрининг культур микроорганизмов, кефирного грибка, способных синтезировать экзополисаха-риды (ЭПС).

Possibility of production of polysaccharide from native kefir grains was investigated. Screening of cultures from kefir grains on ability to produce exopolysaccharide (EPS) was carried out.

Кефирные грибки, ассоциативная культура бактерий и дрожжей являются объектом активных исследований, во-первых, как продуцент широко используемого кисломолочного продукта, обладающего высокой биологической ценностью, а также как модель структурированной эволюционно сложившейся, стабильно функционирующей ассоциативной культуры, которые являются продуцентами полисахарида кефирана, выполняющего структурирующую роль в кефирных грибках, обладающего иммуномодулирующим, противоопухолевым, противовоспалительным, ранозаживляющим и противомикробным действием и может быть использован в медицине, в косметической и пищевой промышленности. Однако, в литературе отсутствуют результаты системных исследований кефирных грибков, как продуцентов полисахаридов, достоверно не определены продуценты полисахарида среди компонентов микробного сообщества грибка.

Цель настоящей работы заключалась в проведении скрининга микробных компонентов кефирного грибка, способных к синтезу полисахаридов и исследовании влияния источника углерода на активность продуцирования полисахаридов.

Материалы и методы.

В качестве объектов исследования использовали:кефирные грибки, применяемые при производстве кефира на Ставропольском молочном заводе (КГ), при их длительном культивировании на нативном молоке (КГ lac+) и молоке, в котором лактоза была гидролизована (КГ lac-); культуры микроорганизмов компонентов кефирных грибков и их культуральных жидкостей. Для культивирования кефирных грибков использовали нативное молоко (Parmalat 0,5% жир. lac+) и молоко, в котором лактоза была гидролизована (Valio Zero Lactose, 1,5% жир. lac-). В качестве критериев оценки функциональной активности грибков использовали

показатели активности образования сгустка культуральной жидкостью грибка (за- 22 -

кваской), изменения рН и титруемой кислотности молока. Выделение культур микроорганизмов из кефирных грибков проводили путем высева гомогенизированного и суспендированного в растворе триптона кефирного грибка [1] на традиционно используемые твердые среды: дрожжевая среда; среда Сабуро и среда MRS. Для определения В-галактозидазной активности культур использовали хро-могенный субстрата X-Gal [2]. Для определения способности культур синтезировать экзополисахариды - среду с красителем рутениевым красным [3]. Для оценки количества синтезированного экзополисахарида выделенные культуры высевали на жидкие среды (MRS) с различными источниками углерода: глюкозы, лактозы, сахарозы, и в сочетании глюкоза-сахароза (в соотношениях 10:10, 20:20 г/л), время экспозиции 6 суток при комнатной температуре. Из культуральной жидкости полисахариды выделяли многократным переосаждением спиртом [4] и количественно определяли в фенол-серной реакции.

Результаты и обсуждение.

Известен способ получения полисахаридов из нативных кефирных грибков при их нагревании до полного растворения полисахаридов [4]. В наших экспериментах при нагревании в кипящей воде равных по объему кефирных грибков, культивироваемых длительное время (в течение трех лет) на нативном (lac+) и безлактозном (lac-) молоке, было показано, что из КГ1ас- выделялось больше ЭПС, чем из КГ1ас+, соответственно, 1460 мг/л и 932 мг/л. При нагревании натив-ных кефирных грибков при 60°С в течение 15 минут часть полисахаридов растворялась, грибки уменьшались в размере, но сохраняли свою функциональную активность. Полученные данные показывают возможность разработки технологии получения полисахаридов из нативных кефирных грибков при сохранении их функциональной активности.

Для выбора культур компонентов сообщества кефирных грибков, способных к синтезу экзополисахаридов, был проведен скрининг культур, выделенных из нативного кефирного грибка 1ac+ при высеве на твердую среду MRS. Из выделенных 60 изолятов из всех отдельно стоящих колоний было отобрано шесть, обладающих Р-галактозидазной активностью и слабой активностью синтеза полисахаридов. Из кефирных грибков, длительное время культивируемых на 1ac+ и lac-молоке, и их культуральных жидкостей был проведен высев на четыре традиционно используемые питательные среды. Из 68 изолятов, выделенных из отдельно стоящих колоний, характеризующихся незначительными морфологическими различиями, было отобрано 7 изолятов, наиболее активно продуцирующих экзополисахариды. Отобранные изоляты культивировали на жидкой среде MRS с лактозой.

Результаты исследований активности синтеза полисахаридов (рис.1) показали большую гетерогенность отобранных изолятов по изучаемому признаку, концентрация синтезируемых полисахаридов колебалась от 70 до 300мг/л.

1 2 3 4 5 6 7 номер изолята

Рис.1. Концентрации экзополисахаридов при культивировании изолятов из кефирных

грибков на среде с лактозой

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

глюк20 лак20

сах.10+гл.10 сах.20+гл.20 сах20

сах20 сах.20+гл.20 сах.10+гл.10 лак20 глюк20

Номер изолята

7

Рис.2. Концентрации экзополисахаридов (мг/л) при культивировании изолятов из кефирных грибков на средах с различными источниками углерода

По литературным данным известно, что на синтез полисахаридов в значительной степени влияет источник углерода, в связи с этим были проведены исследования по изучению влияния источника углерода на активность синтеза полисахаридов. Отобранные изоляты культивировали на среде MRS при замене лактозы на глюкозу и сахарозу, а также использовали смесь глюкозы и сахарозы в различных концентрациях: 10:10 и 20:20 г/л, тем самым увеличивая концентрацию источников углерода углерода в среде. Анализ данных показывает, что

--24 -

при повышении концентрации источника углерода в среде повышается концентрация синтезированного экзополисахарида (рис.2). Наибольшее количество эк-зополисахаридов было синтезировано изолятами 2, 3, 4 при культивировании на среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода. Сравнение результатов, представленных на рис. 1 и рис.2, показывает, что активность синтеза полисахаридов выделенных изолятов на разных источниках углерода различна. Так изоляты 5, 6 и 7, синтезирующие наибольшее количество экзополисахаридов на лактозе, до 250-300мг/л, синтезируют наименьшее количество на сахарозе и глюкозе. Активность изолятов 2 и 3, синтезирующих до 2500-3500мг/л полисахаридов на сахарозе, на лактозе значительно ниже, до 70-150 мг/л.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают два возможных направления в разработке технологии получения полисахаридов, синтезируемых кефирными грибками:

- технология, основанная на разработке способов повышения скорости прироста биомассы кефирных грибков, как сырьевого источника для выделения полисахаридов, при сохранении их функциональной активности;

- технологии, основанные на культивировании чистых культур молочнокислых бактерий. При этом культуры, обладающие Р-галактозидазной активностью могут быть использованы для получения полисахаридов на молочной сыворотке, а культуры, не обладающие Р-галактозидазной активностью, на сырьевых источниках, содержащих сахарозу.

Отобранные изоляты бактериальных культур, способные синтезировать полисахариды на разных углеводных источниках, дают возможность проведения сравнительных исследований состава и структуры полисахаридов, синтезируемых кефирными грибками и отдельными группами молочнокислых бактерий.

Библиографический список

1. G.L. Garrote, A. G. Abrham and G.L. de Antoni. Chemical and microbiological characterisation of kefir grains/Journal of Dairy Research. - 2001. № 68. P. 639-652.

2. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 c.

3. Ботина С.Г. Молекулярно-биологические подходы к отбору бактериальных культур при создании заквасок для биотехнологии: Автореф. дис. д.б.н. -М., 2011. - 46с.

4. J.A.Piermaria, M.L. de la Canal, A.G.Abraham. Gelling properties of kefiran, a food-grade polysaccharide obtained from kefir grain//Food Hydrocolloids. - 2008. Vol. 22. - P.1520-1527.