Биохимические реакции растений Tussilago farfara L. из природных местообитаний с разным уровнем техногенного загрязнения на избыток меди в среде

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 3. С. 246-256

Биология

УДК 574.24 + 574.21

Биохимические реакции растений Tussilago farfara L. из природных местообитаний с разным уровнем техногенного загрязнения на избыток меди в среде

Э. Р. Фазлиева, И. С. Киселева

Аннотация. Тяжелые металлы — экстремальный фактор, способный вызвать загрязнение окружающей среды и повреждение растительных организмов. Изучение влияния тяжелых металлов на растения важно для оценки состояния самого растения, так и для научной и практической работы по экологическому мониторингу. В данной работе было оценено содержание фотосинтетических пигментов у растения Tussilago farfara L., а также определена концентрация пролина и ферментативная активность (супероксиддисмутаза) в норме и при стрессе. Показано, что растения из биотопов с высоким уровнем техногенной нагрузки обладают лучшей способностью адаптироваться к стрессовым воздействиям, чем растения из фоновых биотопов. Определена возможность использования данного вида в качестве биомонитора техногенной нагрузки.

Ключевые слова : Tussilago farfara L., тяжелые металлы, медь, фотосинтетические пигменты, пролин, супероксиддисмутаза.

Введение

К экстремальным факторам, способным вызывать повреждения растительных организмов, следует отнести загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Изучение влияния тяжелых металлов важно как для оценки состояния самого растения, так и для научной и практической работы по экологическому мониторингу. Растительность не только весьма чувствительна к нарушениям окружающей среды, но и наглядно отражает ее нарушения в результате антропогенного воздействия путем изменения разных признаков. Для оценки состояния антропогенной среды многие авторы [1, 2, 3], предлагают использовать изменения параметров фотосинтетического аппарата растений, который характеризуется широкими возможностями адаптивных изменений. Фотосинтетический аппарат в

первую очередь и в наибольшей степени подвергается неблагоприятным воздействиям. От его состояния в большой степени зависят возможность выживания растений, их жизнедеятельность, и, в конечном итоге, продуктивность.

Кроме того, общеизвестно, что важную роль в защите от негативного действия тяжелых металлов и вызываемых при этом свободных радикалов, в том числе активных форм кислорода, а также в адаптации растений играют ферменты антиоксидантной защиты и низкомолекулярные антиоксиданты.

Способность растений в большей или меньшей степени адаптироваться к стрессовым факторам может служить также основой для их использования в качестве мониторов или индикаторов загрязнения окружающей среды.

1.1. Определение объекта. Объектом нашего исследования было

многолетнее травянистое растение (сем. Asteraceae): Tussilago farfara

L. [4], эврибионтный вид, имеющий исключительно широкий ареал и встречающийся повсеместно, в том числе, в градиенте загрязнения. Мать-и-мачеха является одним из эффективных лекарственных растений, ранних медоносных, используется в косметологии. В засилосованном виде используют как кормовое растение. В связи с этим интерес представляет накопление в этих растениях токсикантов в естественных условиях их произрастания, особенно в местообитаниях, подвергающихся техногенному воздействию, а также реакции растений на это воздействие.

В условиях Среднего Урала одним из широко распространенных токсичных тяжелых металлов является медь, источниками которой в среде являются как отвалы предприятий горно-добывающей промышленности, так и аэротехногенные выбросы заводов, перерабатывающих меднорудное сырье. В зоне действия этих предприятий в градиенте загрязнения сформировались экосистемы, компоненты которых проявляют различный уровень устойчивости к техногенному загрязнению.

В данной работе у растений мать-и-мачехи ( Tussilago farfara L.) из местообитаний, различающихся техногенной нагрузкой, было оценено содержание фотосинтетических пигментов, концентрация низкомолекулярного антиоксиданта пролина и активность фермента супероксиддисмутазы в норме и при стрессовом воздействии высокими концентрациями солей меди.

1.2. Цель и методика исследований. Цель исследования - выявление физиолого-биохимических реакций у растений Tussilago farfara L. из зон с разным уровнем техногенной нагрузки при действии ионов меди в качестве стрессора, а также оценка возможности использования данного вида в качестве индикаторного или вида-монитора загрязнения среды медью.

Растения мать-и-мачехи были взяты из пяти местообитаний в окрестностях г. Нижний Тагил Свердловской области, в разной степени подверженных техногенному воздействию. Это — с. Покровское, Корабельный мыс, поселок Рудник имени III Интернационала, Алапаевская ветка и Строгановский отвал. Дополнительный сбор растений осуществляли

на биологической станции УрФУ в Сысертском районе Свердловской области, которая была определена как зона относительного экологического благополучия.

Суммарная токсическая нагрузка (Si) на исследованных участках, оцененная по содержанию в почве тяжелых металлов, изменялась от 1.00 до 22.78 отн. ед. [5]. Для расчета Si в почве были определены концентрации Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии на спектрофотометре AAS 300 («Perkin Elmer»). Тем же методом измеряли концентрацию меди в кислотных вытяжках, полученных из растений, обитающих в природных биотопах.

Физиологическую устойчивость растений к присутствию в среде меди оценивали по содержанию фотосинтетических пигментов и по изменению содержания низкомолекулярного антиоксиданта пролина и ферментативной активности СОД. Для оценки адаптивных свойств растений были проведены опыты с использованием 10 мМ раствора сульфата меди, как аналога загрязняющего вещества, действующего в природных популяциях. Эта концентрация в более чем в 200 раз превышает физиологически необходимую норму меди — 0,01-20 мкМ [6].

Пробы листьев отбирали в период цветения растений из средней части побега. Эксперимент был проведен в 10 биологических повторностях (10 растений в каждом местообитании). Число аналитических повторностей при определении изученных параметров — 6. Для проведения эксперимента листовые высечки выдерживали в дистиллированной воде в течение двух часов. Затем часть их них подвергали воздействию ионов меди в течение двух часов (опытный вариант). Другую часть растительного материала оставляли на два часа в воде и использовали в качестве контроля. Температуру воды или раствора сульфата меди поддерживали на уровне 23° ± 1°С. В контрольных и опытных растениях определяли концентрацию пролина и активность супероксиддисмутазы (СОД).

Для определения содержания фотосинтетических пигментов растительный материал (50 мг) растирали в 2 мл 80 %-го ацетона, с добавлением кварцевого песка и карбоната кальция. Гомогенат центрифугировали в течение 10 минут при 8000 об/мин. Супернатант сливали в мерную колбу объемом 25 мл., осадок дважды промывали и центрифугировали. Экстракты объединяли и доводили до метки 80 %-м ацетоном. Содержание пигментов определяли в одном экстракте при длинах волн 440,5 нм (хлорофилл «а»), 649 нм (хлорофилл «Ь») и 665 нм (каротиноиды). Концентрация пигментов в вытяжке рассчитывалась по формулам Vernon (1960) для хлорофиллов и Wettstein (1957) для каротиноидов. Вычисляли отношения Са/Сь и (С„+Сь)/Скар [7].

Содержание свободного пролина в растениях определяли по методу Bates [8] в модификации Калинкиной с соавт. [9] с использованием кислого нингидринового реактива. Для этого навеску листьев (200 мг) помещали в пробирку, заливали 10 мл кипящей дистиллированной воды и помещали на

10 мин в кипящую водяную баню. В пробирки вносили 1 мл приготовленного экстракта, 1 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл нингидринового реактива и помещали в кипящую водяную баню на 1 ч, затем охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 520 нм. Концентрацию свободного пролина определяли по калибровочной кривой.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли методом, основанным на измерении ингибирования фотохимического восстановления нитросинего тетразолия [10].

Все спектрофотометрические измерения проводили на цифровом ИУ-УШ спектрофотометре РБ 303 ИУ («АРЕЬ», Япония). Статистический анализ результатов проведен с использованием стандартных методов описательной статистики с вычислением среднеарифметического (М), его ошибки (т) и стандартного отклонения (Б). Различия между растениями с разных по уровню токсической нагрузки участков оценивали с использованием дисперсионного анализа, с помощью непараметрического критерия и

— критерия Манна-Уитни. Сравнение выборок по признакам провели Б-методом множественных сравнений Шеффе. Анализ данных выполнен в 81а^8^са-6.0 («81а18ой», 1984-2001). Бары на графиках соответствуют ошибке среднего.

Основной результат

Местообитания, в которых собирали растительный материал, в соответствии с уровнем техногенной нагрузки были отнесены к фоновой, буферной и импактной зонам (таблица 1). В ходе предварительных исследований установили, что приоритетным загрязнителем на этих участках является медь [5]. Минимальное содержание меди было характерно для почвы биологической станции. На максимально загрязненном участке (Строгановский отвал) концентрация меди в 78-130 раз превышала фоновый уровень. С увеличением концентрации меди в среде наблюдали рост содержания данного элемента в листьях мать-и-мачехи. Однако различия в этом случае были не столь велики, как в почве: в импактной зоне — в 3,8-4 раза в сравнении с фоновой. Это свидетельствует о том, что растения мать-и-мачехи обладают рядом физиологических барьеров, препятствующих поступлению больших концентраций меди в листья растений. По литературным данным [11, с.58] средний нормальный уровень меди в растительных тканях — 3-10 мкг/г сухой массы, следовательно, в надземных органах растений из импактного местообитания содержание этого элемента избыточно в сравнении с физиологически необходимой нормой.

Метод Шеффе (Б-метод) показал, что различия по содержанию меди в листьях растений мать-и-мачехи из буферных и импактной зон в сравнении

Таблица 1

Содержание меди в почве исследуемых участков, мкг/г

Местообитание Зона Содержание меди в почвах, мкг/г Содержание меди в надземных органах мать-и-мачехи, мкг/г

Биологическая станция УрГУ им. А.М. Горького фоновая 7, 35 ± 0, 78 14, 83 ± 0, 37

с. Покровское фоновая 12, 26 ± 1, 8 15, 40 ± 0, 95

Корабельный мыс буферная 38, 62 ± 0, 59 12, 35 ± 1, 36***

Алапаевская ветка буферная 78, 64 ± 12,41 17, 01 ± 1, 23***

п. Рудник им. III Интернационала буферная 101, 57 ± 11,13 24, 0 ± 2, 66***

Строгановский отвал импактная 951, 49 ± 236, 0 59, 34 ± 25, 39***

с фоновыми биотопами статистически значимы (F = 21, 6; df = 5; 55; p < < 0, 001).

В связи с этим важно было понять, изменяется ли в листьях этих растений содержание фотосинтетических пигментов, а также их антиоксидантный статус.

При определении содержания фотосинтетических пигментов у Tussilago farfara L. были полученные следующие данные (рис. 1).

Меньшей концентрацией хлорофиллов «а» и «Ъ» обладали растения из наиболее загрязненных медью участков: п. Рудник им. III Интернационала, Алапаевская ветка, Строгановские отвалы. При этом соотношение хлорофиллов а и Ъ в листьях мало изменялось при умеренном загрязнении в сравнении с контролем и существенно отличалось у растений из зон с сильным загрязнением, за исключением растений из местообитания Строгановский отвал. Из этого следует, что синтез хлорофилла Ъ у этих растений нарушен сильнее, чем хлорофилла а. Зная, что все формы хлорофиллов в растениях, в том числе хлорофилл Ъ, формируются из хлорофилла а [12], мы можем сделать предположение о подавлении или нарушении синтеза хлорофилла Ъ в результате окислительного стресса, индуцируемого избытком меди в среде. Использование U — критерия Манна-Уитни подтвердило наличие значимых различий в содержание фотосинтетических пигментов в листьях мать-и-мачехи (p ^ 0, 05).

Каротиноиды в растительном организме помимо функции добавочных фотосинтетических пигментов играют антиоксидантную роль, препятствуя развитию окислительного стресса. Общеизвестно, что их содержание может расти по мере увеличения силы стрессового воздействия. Мы не наблюдали закономерного изменения содержания каротиноидов у растений в градиенте техногенной нагрузки. Однако относительная доля каротиноидов в общем количестве фотосинтетических пигментов была

Рис. 1. Фотосинтетические пигменты Tussilago /ат/ата Ь.: а — концентрация в листьях, мг/г сырой массы, б — соотношение содержания пигментов: хлорофилл «а»/хлорофилл «Ь», сумма хлорофиллов/каротиноиды. Бары на графиках соответствуют ошибке

среднего

наименьшей в листьях мать-и-мачехи из фоновой зоны биостанции УрФУ, где уровень меди в почве минимальный. В местообитаниях с более высоким содержанием меди этот показатель был выше, о чем свидетельствует снижение отношения хлорофиллы/каротиноиды (рис.1 б). Это позволяет предположить наличие некоторых адаптивных изменений в пигментном аппарате листа мать-и-мачехи в условиях загрязнения среды. Аналогичная тенденция отмечена и в работах Маракаева и др. [13], Андреевой и др. [14].

По сравнению с другими участками у растений из местообитания Корабельный мыс была обнаружена наибольшая концентрация хлорофиллов

а, Ь и каротиноидов. Это может быть связано с тем, что данная территория

— разнотравный луг, в почвах которого содержание азота существенно выше, чем на деградированных участках других местообитаний. Возможно в этом местообитании, наблюдается ослабление токсического действия меди за счет перевода металла в физиологически инертные формы путем связывания с органическими компонентами богатых гуминовыми веществами почв, как было показано в работе Гладкова [15].

Полученные данные свидетельствуют в целом о невысоком содержании фотосинтетических пигментов, что может быть следствием большой техногенной нагрузки исследуемых биотопов. Пигментный комплекс мать-и-мачехи чувствителен к воздействию тяжелых металлов, что говорит

о возможных индикаторных [14] или биомониторных.свойствах данного признака у вида.

Для оценки устойчивости к поллютантам растения из разных местообитаний в лабораторных условиях подвергали действию высоких концентраций основного загрязняющего агента — ионов меди, погружая листовые высечки в раствор 10 мМ CUSO4. При этом концентрация ионов меди в растворе составляла 4 мМ.

Было показано, что у Tussilago farfara L. из фоновых участков базовый уровень активности СОД был невысоким. У растений из буферных зон этот уровень был выше, а в сильно загрязненных местообитаниях снова был ниже (рис. 2). При стрессовом воздействии в листьях растений из буферных местообитаний и импактной зоны активность СОД возрастала по сравнению с контролем (H2O), в то время как у растений из фоновых участков активность фермента снижалась. Это свидетельствует о неодинаковой способности растений из популяций, приуроченных к местообитаниям с разным уровнем техногенной нагрузки, переживать стресс, вызванный избытком меди в среде. Вероятно, растения, длительное время обитающие в условиях повышенных концентраций меди в почве, обладают лучшими адаптивными свойствами за счет усиления активности ключевого фермента антиоксидантной защиты растений — СОД. Проведенный дисперсионный анализ подтвердил наличие значимых различий активности супероксиддисмутазы в листьях мать-и-мачехи в зависимости от интегрального антропогенного воздействия (p ^ 0, 05).

Пролин, будучи низкомолекулярным антиоксидантом, может также быть фактором формирования устойчивости растений при стрессе. Определение содержания пролина в тканях листьев растений мать-и-мачехи в контроле не выявило закономерного изменения этого параметра в градиенте техногенного загрязнения. При обработке раствором сульфата меди не наблюдали увеличения концентрации пролина в тканях (табл.2). Это означает, что данный антиоксидант не является фактором формирования устойчивости у мать-и-мачехи при стрессе, индуцированном ионами меди.

Таблица 2

Содержание пролина в листьях мать-и-мачехи из местообитаний с различной степенью антропогенной нагрузки

Местообитание Пролин, мг/г сыр.веса

контроль 10 мМ CuSO4

Биологическая станция 110, 26 ± 2, 99 85, 55 ± 1, 22

с. Покровское 81, 38 ± 1,18 74,19 ± 0, 57

Корабельный мыс 88, 58 ± 0, 82 88, 71 ± 1, 22

п. Рудник им. III Интернационала 72, 88 ± 0, 31 65,09 ± 1, 37

Алапаевская ветка 77, 67 ± 2, 06 74, 31 ± 0, 71

Строгановские отвалы 94, 31 ± 0, 34 74, 91 ± 0, 64

Рис. 2. Активность СОД (а) и ее изменение (в процентах от исходного уровня) (б) при действии сульфата меди (10 мМ) у растений мать-и-мачехи из разных местообитаний. Бары на графиках соответствуют

ошибке среднего

Сравнение содержания пролина у мать-и-мачехи методом Шеффе (Б-метод) показало, что этот показатель у растений максимально загрязненных участков значимо отличается от такового у растений из фоновых биотопов (^ = 858; # = 5; 55; р< 0, 001).

Таким образом, у растений Тиввйадо /ат/ата Ь. из загрязненных местообитаний в условиях стресса наблюдается проявление неспецифической устойчивости, обусловленное изменением активности СОД. У растений фоновых местообитаний данный биохимический механизм защиты при воздействии высокой дозы ионов меди был выражен слабее.

Выводы

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы:

1. Растения мать-и-мачехи из природных биотопов, различающихся по содержанию меди в почве, накапливали этот элемент в тканях листьев в неодинаковых количествах: в загрязненных местообитаниях в 4 раза больше, чем в фоновых.

2. Были выявлены существенные различия в содержании хлорофиллов «а» и «Ь» в листьях ТпввИадо /ат/ата Ь. из разных местообитаний в зависимости от уровня техногенной нагрузки: в зонах с избыточным содержанием меди в среде содержание хлорофиллов было меньше, чем

в фоновых зонах. В условиях загрязнения среды сильнее уменьшалось содержание хлорофилла b, чем хлорофилла а.

3. Относительная доля каротиноидов в общем количестве фотосинтетиче-ских пигментов была выше у растений мать-и-мачехи из буферных и импактной зон, что связано с защитной, антиоксидантной функцией каротиноидов.

4. У растений из загрязненных местообитаний имеются механизмы адаптации на биохимическом уровне, проявляющиеся в существенной индукции синтеза или активации СОД при действии поллютантов.

Результаты исследования позволяют заключить, что растения из биотопов с высоким уровнем техногенной нагрузки обладают лучшей способностью адаптироваться к стрессовым воздействиям, чем растения из фоновых биотопов. Растения, находящиеся в условиях сильного продолжительного стресса, в сравнении теми, которые не испытывают или в меньшей степени испытывают стресс, обладают большей неспецифической устойчивостью.

Наличие у вида Tussilago farfara L. количественных ответных реакций на загрязнение среды ионами меди и его широкое распространение, в том числе, в зонах сильного техногенного загрязнения, позволяет рассматривать этот вид как биомонитор.

Список литературы

1. Устойчивость растений к тяжелым металлам. /А.Ф. Титов [и др.].Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. 172 с.

2. Khudsar T, Mahmooduzzafar, Iqbal M. Cadmium-induced changes in leaf epidermis, photosynthetic rate and pigment concentrations in Cajianus cajan // Biol. Plant. 2001. V.44, №1. С.59-64.

3. Изменение фотосинтетического аппарата листьев бобов в зависимости от содержания тяжелых металлов в среде выращивания /В.А. Караваев [и др.] // Физиология растений. 2001. Т.48, №1. С.47-54.

4. Определитель сосудистых растений Среднего Урала / П.Л. Горчаковский [и др.]. М.: Наука, 1994. 525 с.

5. Жуйкова ТВ., Безель В.С., Мордвина Е.С. Фитоценозы техногенно нарушенных территорий и их роль в биогенных циклах химических элементов // Уч. записки НТГСПА. Нижний Тагил: НТГСПА, 2006. С.31-72.

6. Graham R.D. Absorption of copper by plant roots in: Copper in Soils and Plants. New York: Academic Press , 1981. 141 р.

7. Га,вриленко В.Ф. Большой практикум по фотосинтезу: учеб. пособие. М.: Изд. центр «Академия», 2003.

8. Bates L.S. Rapid Determination of Free Proline for Stress Studies // Plant Soil. 1973. V.39. P.205-207.

9. Калинкина Л.Г., Назаренко Л.В., Гордеева Е.Е. Модифицированный метод выделения свободных аминокислот для определения на аминокислотном анализаторе // Физиология растений. 1990. Т.37. С.617-621.

10. Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide Dismutase: Improved Assays and an Assay Applicable to Acrylamide Gels // Anal. Biochem. 1971. V.44. P.276-287.

11. Ботаника. Учебник для вузов в 4 т. /П. Зитте [и др.]. М.: Издат. центр «Академия», 2008. 496 с.

12. Медведев С.С. Физиология растений. СПб.: СПбГУ, 2004. 278 с.

13. Маракаев О.А., Смирнова Н.С., Загоскина Н.В. Техногенный стресс и его влияние на лиственные древесные растения (на примере парков г. Ярославля) // Экология. 2006. №6. С.410-414.

14. Оценка экологического состояния окружающей среды по спектрам отражения индикаторных видов растительности /А.В. Андреева [и др.] // Современные проблемы дистанционного зондирования Земли из космоса. 2006. Т.2, №3. С.265-270.

15. Гладков Е.А. Влияние комплексного взаимодействия тяжелых металлов на растения мегаполисов // Экология. 2007. №1. С.71-74.

Фазлиева Эльвира Рашидовна (elvira_nt@list.ru), аспирант, младший научный сотрудник, кафедра физиологии и биохимии растений, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Екатеринбург.

Киселева Ирина Сергеевна (Irina.Kiselyova@usu.ru), к.б.н., доцент, кафедра физиологии и биохимии растений, Уральский Федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Екатеринбург.

Biochemical reactions of Tussilago farfara L. from natural habitats with different level of technogenic pollution on surplus of copper in the environment

E. R. Fazlieva, I. S. Kiseleva

Abstract. Heavy metals — the extreme factor, that can cause environmental contamination and damages of plants. Studying the influence of heavy metals on plants is important for an estimation of a plant vitality, and for scientific and practical work on ecological monitoring. In the given work the amount of photosynthetic pigments in Tussilago farfara L has been estimated and also the concentration of proline and enzyme activity (Superoxide dismutase) in normal and stress conditions. It was shown that the plants from highly polluted biotops have a better ability to tolerate stress conditions then plants from non-polluted habitats. We aasume that this species is possible to use as the biomonitor of technogenic impact.

Keywords: Tussilago farfara L., heavy metals, copper, photosynthetic pigments, proline, superoxide dismutase.

Fazlieva Elvira (elvira_nt@list.ru), postgraduate student, junior research assistant, department of physiology and biochemistry of plants, Yeltsin Ural Federal University, Ekaterinburg.

Kiseleva Irina (Irina.Kiselyova@usu.ru), candidate of biological sciences, associate professor, department of physiology and biochemistry of plants, Yeltsin Ural Federal University, Ekaterinburg.

Поступила 17.09.2011