Способ получения холодоустойчивого посадочного материала батата
METHOD FOR OBTAINING COLD-RESISTANT PLANTING MATERIAL OF SWEET POTATOES

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, и может быть использовано для получения холодоустойчивого посадочного материала батата (Ipomoea batatas.L).
Территория Российской Федерации разделена на климатические зоны, большинство из которых расположены в зоне неустойчивых температур. Поэтому растения в этих зонах постоянно подвергаются действию гипотермического стресса (кратковременные заморозки или длительное действие пониженных температур). Температура - один из главных факторов, который влияет на развитие растений в процессе онтогенеза. Пониженные температуры (вплоть до 0°С) и заморозки (температуры ниже 0°С) могут замедлять прорастание семян, рост растений и оказывать существенное отрицательное влияние на количество и качество продукции. Многие сельскохозяйственные растения (кукуруза, сахарная свекла, рис, соя, картофель, томат, красный перец, дыня, огурец, фасоль, горох, банан и цитрусовые виды), терпят повреждения и/или существенное отставание в уровне развития при температурах ниже +5°С. А для растений стевии, например, при температуре ниже +12°С не происходит цветение и тем более формирование семян. Поэтому гибель растений от охлаждения или повреждения заморозками наносит существенный ущерб для агропромышленного комплекса.
В настоящее время известно достаточное количество технологий, предусматривающих предотвращение повреждений растений от охлаждения и заморозков (патенты RU №2195809, №2229215, №2269895, №2349088,; патент №014777, В1, 28.02.2011).
Известные способы основываются на применении химических веществ или регуляторов роста растений. Однако данные технологии являются довольно неудовлетворительными из-за их сложности или факта, что часто невозможно получить желаемые результаты. Возможностями, которые должны быть упомянуты в этом контексте, являются создание растений, обладающих устойчивостью к гипотермическому стрессу.
Одним из перспективных направлений, направленных на создание стрессоустойчивых растений, является клеточная биотехнология, в частности, селекция растений in vitro (клеточная или тканевая селекция in vitro).
Создание новых форм растений, обладающих устойчивостью к гипертермическому стрессу, остается актуальной проблемой и для растений батата (Ipomea batatas (L.) Lam.). Интерес к данной культуре связан прежде всего с тем, что клубни являются источником минералов, витаминов, антиоксидантов и, конечно, инулина, а также является хорошим источником бета-каротина, предшественника витамина А. Благодаря содержанию в клубнях различных компонентов, его диетологи считают более здоровым продуктом, чем картофель. Он менее калориен, обладает низким гликемическим индексом, а значит, не влияет на уровень сахара в организме. Поэтому его смело можно использовать в рационе питания диабетикам. В мире существует около 6000 сортов батата, которые возделывают в разных странах. Родиной батата являются Перу и Колумбия, а сегодня эту культуру выращивают в США, Израиле, Китае, Индии, Индонезии, Грузии, странах Средней Азии и в Украине. В Российской Федерации сладкий картофель возделывают только в южных районах с достаточно жарким климатом. И для расширения ареала возделывания батата в Российской Федерации необходимо создавать сорта с повышенной устойчивостью к низким положительным температурам.
Например, известен способ повышения термоустойчивости овощных культур, заключающийся в предпосевной обработке семян в течение 10-12 часов раствором фитопрепарата, в качестве которого используют раствор эпибрасинолида в концентрации 10 нМ/л (RU 2349088, МПК, A01N 65/00, 20.03.2009). Кроме того, способ предусматривает проведение повторной обработки да иным препаратом молодых растений в полевых условиях из расчета 2-3 мл/растение.
Недостатком данного способы является применение дорогостоящего препарата (14000 рублей за 1 кг), сложность его приобретения, а также сложность точного расчета его применения в полевых условиях на одно растение.
Известен другой способ повышения устойчивости растений к низким положительным температурам, предусматривающий проведение предпосевной обработки зерновок озимой пшеницы биологически активным препаратом на основе тритерпеновых кислот, полученных из хвои пихты, путем экстракции и последующей обработкой щелочным агентом (RU 2269895, МПК A01N 65/00, 20.02.2006). Недостатком данного способа является применение высоких норм расхода препарата (0,5-1 л/т семян), а также отсутствие информации о более широком спектре его применения в качестве антистрессора.
-11
При проведении патентного поиска были найдены и другие способы повышающие устойчивость растений к низким температурам. Так, например, известно Средство для повышения холодоустойчивости растений (патент RU №2195809), предусматривающий обработку семян огурца сорта Вязниковский 37 препаратом Тидиазурон в концентрации 10М в течение 8 часов или обработку растений в фазу трех настоящих листьев. Недостатком данного способа является то, что предлагаемый способ разработан только для одного сорта огурца и не гарантирует его эффективное применение для растений разных таксономических групп.
2
Известен также Способ повышения холодостойкости растений (патент RU №2229215). Способ повышения холодостойкости растений, включающий получасовое замачивание семян в растворе, отличающееся тем, что раствор готовят из расчета 2 г пролина и 30 г глюкозы на 1 л дистиллированной воды, а замоченные семена в течение трех суток выдерживают в холодильной камере при температуре 5…7°С, проращивают в течение недели в термостате в увлажненном названным выше раствором песке при температуре 25…27°С, а затем проростки опрыскивают с помощью распылителя раствором, приготовленным из расчета 10 г пролина, 20 г глюкозы и 10 г сахарозы на 1 л дистиллированной воды нормой 0,1 л раствора на 1 м листовой поверхности и подвергают ступенчатому охлаждению в холодильной камере в температурном режиме: первые сутки 12…15°С, вторые 5…7°С и последующие двое суток 0…2°С при искусственном освещении 7 тыс.лк с использованием названного выше раствора для поддержания постоянной (60% от ПВ) влажности субстрата (песка). Недостатком данного способа является то, что предлагаемый способ сложен в исполнении и требует проведения многоступенчатой обработки семян и сформировавшихся растений.
Анализ известных технических решений показал, что технической проблемой в данной области является необходимость создания универсальной технологии, позволяющей получать устойчивые растения разных таксономических групп к гипертермическому стрессу.
Технический результат предлагаемого изобретения - получение растений-регенерантов батата, обладающих устойчивостью к действию низких положительных температур.
Для решения указанной проблемы и получения заявленного технического результата в способе получения генетически стабильного посадочного материала батата, полученную из сегментов стебля и листовых пластинок микроклонов батата калусную ткань культивируют in vitro в условиях действия пониженных положительных температур от +4 до 6°С, на питательной среде по прописи Мурасига и Скуга, содержащей препарат Мивал в концентрации 150 мг/л и из живых, устойчивых к гипотермическому стрессу каллусных клеток получают растения - регенеранты.
В процессе культивирования каллусной ткани в условиях гипотермического стресса у клеток запускаются определенные биохимические реакции, позволяющие клеткам выживать в стрессовых условиях, усиливается синтез эндогенных гормонов, увеличивается количество углеводов и пролина. Устойчивость растений к действию гипотермического стресса вызвана изменениями не только на биохимическом уровне, но и на генетическом. Наблюдается полиморфизм ДНК, который проявляется в экспрессии генов.
Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.
Для получения холодоустойчивых растений батата можно использовать один клубнеплод, на котором имеется несколько спящих почек. Предварительно клубнеплод помещают в увлажненный земляной субстрат, заглубив его примерно на половину. Через 5-7 суток из спящих почек начинают формироваться ростки, которые продолжают свой рост в течение последующих 10 суток. В среднем на одном клубнеплоде формируется до 10 ростков. Каждый росток делят на сегменты (микрочеренки), состоящие из части побега и пазушной меристемы. Микрочеренки помещают в марлевые мешочки и в условиях ламинар-бокса проводят поверхностную их стерилизацию 0,1%-ным раствором сулемы в течение 6 минут с последующим выдерживанием в стерильной дистиллированной воде. Микрочеренки вынимают из марлевого мешочка, подрезают стерильным скальпелем базальную часть и переносят на питательную среду в биологические пробирки. Культивирование микрочеренков батата проводят на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС). В качестве индуктора роста пазушных почек служат гормоны - кинетин в концентрации 0,5 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л. Пробирки с эксплантами переносят в световую комнату, где поддерживается температура 23°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами, интенсивность освещения 3 тыс.лк. Через 7 суток отмечается начало формирования микропобегов, в базальной части которых формируется корневая система. К концу пассажа (30 суток) из пазушных меристем формируются микропобеги высотой 15-20 см. Данные микрорастения служат источником для дальнейших исследований по клеточной селекции. Для этого, у микрорастений отрезают листовые сегменты или выделяют участки междоузлий и самостоятельно культивируют их на среде содержащей минеральные соли по прописи МС, а также НУК в концентрации 1 мг/л в сочетании с БАП 0,5 мг/л. Культивирование в этих условиях приводит к формированию из стеблевых или листовых эксплантов каллусной ткани, которую размножают в течение следующего пассажа путем ее деления на более мелкие части. На следующем этапе хорошо пролиферирующую каллусную ткань переносят на питательную среду с препаратом Мивал 150 мг/л и помещают в условия холодильника от +4 до 6°С. В условиях гипотермического стресса каллусную ткань выращивают в течение 30 суток и отбирают устойчивые клетки к действию стрессового фактора. Отбор клеток осуществляют на основе визуальных наблюдений, по цвету. Мертвые клетки окрашены в бурый/коричневый цвет, а живые - остаются желтыми. На новую питательную среду переносят только ткань желтого цвета. Для получения растений-регенерантов из устойчивых клеточных культур применяют питательную среду МС, содержащую 3 мг/л БАП и 0,5 мг/л ИУК и культивируют в условиях световой комнаты, где поддерживается 16-ти часовой фотопериод, температура 22-25°С и освещение люминесцентными лампами с интенсивностью освещения 5 тыс.лк. В течение следующего пассажа из каллусной ткани формируются растения-регенеранты, которые характеризуются устойчивостью к действию пониженных положительных температур. Данный признак закрепляется на уровне ДНК и передается следующему поколению.
Появление устойчивых каллусных клеток происходит благодаря присутствию в составе питательной среды препарата Мивал в концентрации 150 мг/л. Мивал - это биоорганический регулятор роста и развития растений на основе кремния. Кремний в соединении силатрана выступает в роли активатора физиологических процессов в клетке, облегчает выброс шлаков и ускоряет процессы метаболизма, обеспечивает функциональную активацию клеточных органелл. В клетке кремний способствует образованию соединений, которые связывают свободную воду и превращают ее, в своего рода, гель, и тем самым повышают водоудерживающую способность клетки и растения в целом. Таким образом, кремний препятствует образованию кристаллов льда при заморозках или испарению воды при высоких температурах в засуху. Препарат Мивал обладает широким спектром биологического действия, а по специфическому механизму действия не имеет аналогов. Такое действие достигается за счет того, что препарат Мивал является комплексным препаратом в состав которого, кроме кремнийсодержащего соединения входит аналог фитогормонов из группы ауксинов - крезацин, один из первых отечественных адаптогенов и антиоксидантов, прошедших всесторонние лабораторные, полевые и производственные испытания и хорошо зарекомендовавший себя в сельскохозяйственной практике.
Предлагаемый способ получения растений батата, устойчивых к действию гипотермического стресса сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе:
- использование в небольших количествах легкодоступный материал (всего один клубнеплод) для проведения работ по клеточной селекции;
- проведение работ в лабораторных условиях не зависимо от сезона;
- ускоренно получать растения батата, обладающих устойчивостью к действию пониженных положительных температур, не требует привлечения дорогого оборудования.
Использование изобретения позволит увеличить выход генетически стабильного материала батата, устойчивого к действию гипотермического стресса, что дает возможность расширить площади возделывания этой ценно овощной культуры на территории Российской федерации.