КОМПЛЕКСНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
INTEGRATED METHOD FOR DETECTING CIRCULATING TUMOUR CELLS IN BLOOD OF PATIENTS SUFFERING FROM BREAST CANCER

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии при адъювантной терапии опухолей, а также при длительном наблюдении за пациентами после оперативного удаления опухолей, что позволяет существенно улучшить эффективность лечения и выживаемость онкологических больных.
В настоящее время существует острая потребность в разработке способа определения (выделения и дифференцировки) циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы в условиях их малого количества, который бы мог эффективно выявлять циркулирующие опухолевые клетки, чувствительные к адъювантной гормональной терапии, а также клинически значимо дифференцировать циркулирующие опухолевые клетки по их принадлежности к различным локализациям онкологических заболеваний.
Известно достаточно много методов выделения и исследования циркулирующих опухолевых клеток в крови онкологических больных.
В патентных заявках WO 2003076942, WO 2009043159, WO 2010005991, WO 2003019141, WO 2007141626, WO 2010070124, WO 200642005 содержится информация о различном комбинировании методов иммуноцитохимии, EPISPOT (EPithelial ImmunoSPOT) анализа и проведения полимеразной цепной реакции для количественного выделения циркулирующих опухолевых клеток, но без качественной дифференцировки последних. Кроме того, в описаниях к патентам РФ №2384297, №2107294, №2338751 и в описаниях к патентным заявкам WO 2010135603, RU 2009125575, WO 2011002649 приведенные выше методы используются для клинического прогнозирования течения болезни и определения наличия опухолей. Так, в частности, в описании изобретения по патентной заявке WO 2011002649 основное внимание уделяется автоматизации метода выделения опухолевых клеток, с дальнейшим определением их концентрации.
В описаниях изобретений по патентным заявкам WO 2011028905, WO 2010151109, WO 2007089911 и US 20070031876 описывают методики качественной дифференцировки выделенных опухолевых клеток по характерным эпитопам опухолевых клеток, таких как HER-2, IGF-IR, EGFR.
В описании изобретения по патентной заявке РФ №2009135780 представлена тест-система, использующая методику дифференцировки выделенных опухолевых клеток при помощи экспрессии генов и транскрипционного анализа последних с использованием панели белковых антигенов для дифференцировки полученных циркулирующих опухолевых клеток.
Известные аналоги имеют ряд существенных недостатков:
- отсутствие количественной оценки экспрессии анализируемых генов, что может являться важным клиническим показателем, используемым для оценки прогноза и эффективности терапии;
- ограниченность перечня изучаемых генов, в частности, при анализе циркулирующих опухолевых клеток важно получить информацию о чувствительности/резистентности циркулирующих опухолевых клеток к воздействию гормональной терапии;
- некоторые из описанных аналогов используют узкоспециализированное дорогостоящее оборудование, не получившее в настоящее время широкого распространения и недоступное для выполнения диагностических тестов в России.
Наиболее близким к предлагаемому техническом решению, выбранным в качестве прототипа, можно считать способ, описанный в описании изобретения по заявке WO 2003023060, в которой описываются технология и аппаратная база для выделения циркулирующих опухолевых клеток и их последующей дифференцировки по экспрессии панели генов EGF-R, СЕА, Stannio-calcin, CK20, MAGE-3, GA733.2, MUC1, Her-2/neu.
Недостатками данного метода являются: отсутствие количественной оценки экспрессии анализируемых генов, что может являться важным клиническим показателем, используемым для оценки прогноза и эффективности терапии, а также ограниченность перечня изучаемых генов, в частности генов, ответственных за наличие чувствительности/резистентности циркулирующих опухолевых клеток к воздействию гормональной терапии.
В основу настоящего изобретения положена техническая задача создания способа определения циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, в крови онкологических больных раком молочной железы посредством определения уровня экспрессии маркерных генов, позволяющего значительно увеличить вероятность обнаружения таких циркулирующих опухолевых клеток, повысить точность измерений и увеличить число анализируемых характеристик циркулирующих опухолевых клеток и, соответственно, повысить чувствительность методов анализа и эффективность диагностики при работе с больными раком молочной железы для оценки прогноза и эффективности терапии.
Решение поставленной технической задачи достигается тем, что предлагается способ определения циркулирующих раковых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, в крови больных раком молочной железы, включающий выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками, получение лизатов циркулирующих опухолевых клеток, извлечение мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток, получение кДНК, получение амплифицированной ДНК, количественное определение экспрессии маркерных генов, отличающийся тем, что в случае наличия одного из маркеров: GA733-2, MUC-1, HER2 делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток и при обнаружении маркеров ESR1, PGR делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии.
При этом в случае наличия одного из маркерных генов GA733-2, Muc-1, HER2 признается сам факт наличия циркулирующих опухолевых клеток и при обнаружении маркеров ESR1, PGR делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии, что может являться показанием к изменению либо коррекции проводимой противоопухолевой терапии.
Таким образом, совокупность известных признаков в виде выделения и обогащения циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками, получения лизатов циркулирующих опухолевых клеток, извлечения мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток, получения кДНК, получения амплифицированной ДНК и отличительных признаков в виде использования при оценке экспрессии количественного анализа ее уровня маркерных генов из ряда GA733-2, MUC-1, HER2, ESR1, PGR - позволяет получить новый неожиданный эффект, а именно значительно увеличить вероятность обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, повысить точность измерений и увеличить число анализируемых характеристик циркулирующих опухолевых клеток (Фиг.1) и, соответственно, повысить чувствительность методов анализа и эффективность диагностики, а также обеспечить врача дополнительной информацией об отличительных чертах выявляемых клеток, что крайне важно при определении тактики лечения больных раком молочной железы.
Перечень фигур чертежей
На Фиг.1 представлено сравнение определяемых характеристик в предлагаемом способе и определяемых характеристик в прототипе.
На Фиг.2 представлен пример количественной оценки изменения относительной экспрессии на примере гена ESR1 (относительно референтного гена АСТА1).
На Фиг.3 представлено соотношение компонент смеси для проведения полимеразной цепной реакции.
На Фиг.4 представлен протокол проведения полимеразной цепной реакции.
На Фиг.5 представлена электрофореграмма с результатами анализа экспрессии генов ACTA1, ESR 1, PGR в ЦОК, выделенных у больной раком молочной железы.
Осуществление заявляемого способа определения циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы происходит следующим образом.
Для выделения циркулирующих опухолевых клеток к образцу крови добавляют смесь конъюгированных с магнитными частицами антител к следующим опухолевым антигенам: GA733-2, Muc-1, Her-2, специфичных для циркулирующих опухолевых клеток при раке молочной железы. Затем образец крови с добавленными магнитными частицами с конъюгатом антител в пробирке инкубируются 15-30 минут. После этого магнитные частицы и связанные с ними через антитела клетки с помощью магнита собирают в одном месте пробирки, и производится их отмывка в образце крови от остальных форменных элементов крови и сыворотки.
После того как выделенные на магнитных частицах клетки отмыты, к ним добавляют лизирующий буфер, который приводит к высвобождению РНК из клеток и ее консервации. Остатки клеточных оболочек удаляются из раствора, так как остаются связанными с антителами и магнитными частицами. Полученный раствор, содержащий РНК, инкубируется с новыми магнитными частицами, связанными с олигонуклеотидами с поли-Т концами, что позволяет выделить из раствора поли-А мРНК, что в дальнейшем позволяет работать только с кодирующей РНК, а не со всем пулом РНК, включающим, в том числе, в больших количествах рибосомную РНК.
Затем на поли-А РНК, выделенной из циркулирующих опухолевых клеток, получают кДНК и далее получают амплифицированную ДНК при помощи полимеразной цепной реакции.
СтАСТА1-СтERS1
Для количественной оценки экспрессии используется метод полимеразной цепной реакции на кДНК, синтезированной на поли-А РНК, выделенной из циркулирующих опухолевых клеток. Затем путем сравнения экспрессии маркерных генов относительно экспрессии референтных генов (АСТА1, GAPDH, HPRT) определяют относительное нормализованное количество экспрессии целевых генов. Пример количественной оценки изменения относительной экспрессии на примере гена ESR1 (относительно референтного гена АСТА1) представлен на Фиг.2, где Ст - цикл количественной ПЦР, на котором отмечен экспоненциальный рост флуюоресцентного сигнала. Относительная экспрессия оценивается по формуле: 2. Изменение экспрессии оценивается по формуле: относительная экспрессия ESR1 после терапии / относительная экспрессия ESR1 до терапии. На основании данных произведенного качественного и количественного анализа специалист может произвести оценку развития заболевания. В частности, в данном примере можно отметить снижение экспрессии гена ESR1 в 4 раза после терапии, что в зависимости от результатов других клинических исследований может свидетельствовать как о снижении числа циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии, так и об изменении профиля экспрессии циркулирующих опухолевых клеток.
Использование в предлагаемом способе определения циркулирующих опухолевых клеток количественной оценки экспрессии панели генов GA733-2, MUC-1, HER2, ESR1, PGR позволяет получить информацию о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии и позволяет даже в условиях их малого количества получить количественную оценку числа или активности таких циркулирующих опухолевых клеток, важных для эффективности проведении диагностики, при подборе противоопухолевой терапии, оценке прогноза развития заболевания, а также для проведения дополнительных научных исследований природы циркулирующих опухолевых клеток. В клинической практике новые возможности позволяют увеличить точность и информативность и эффективность проводимой диагностики.
Методика определения типов выделенных циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии обеспечивает повышение точности и достоверности измерений, увеличение вероятности выявления циркулирующих опухолевых клеток определенного вида в крови.
Пример конкретного осуществления предлагаемого комплексного способа
1. Выделение циркулирующих опухолевых клеток
1.1. Подготовка
Для выделения циркулирующих опухолевых клеток подготавливают расчетное количество магнитных частиц, конъюгированных с антителами к маркерам циркулирующих опухолевых клеток - 100 мкл на один образец крови объемом 5 мл. Для этого тщательно перемешивают магнитные частицы при помощи пипетирования. Магнитные частицы помещают в 1,5 мл пробирку. Помещают пробирку в магнитный концентратор магнитных частиц MPC-S (Invintrogen). Через 1 мин извлекают супернатант пипеткой. Пробирку с осадком магнитных частиц извлекают из магнитного штатива и добавляют 1 мл фосфатного буфера PBS и перемешивают магнитные частицы пипетированием. Затем помещают пробирку с магнитными частицами в MPC-S. Через 1 мин полностью извлекают из пробирки супернатант. Всего производится три повтора очищения. Затем извлекают пробирку из магнитного концентратора и размешивают пипетированием осадок магнитных частиц в объеме PBS в размере начального объема.
1.2. Обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками
Для выделения циркулирующих опухолевых клеток отбирают 5 мл образца крови и помещают в 15 мл пробирку. Затем перемешивают магнитные частицы пипетированием и добавляют по 100 мкл раствора магнитных частиц в фосфатном буфере PBS в каждый образец крови. После чего помещают пробирки в прибор для вращения пробирок и медленно вращают (~5 оборотов в мин) в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Далее помещают пробирки в магнитный концентратор AdnaMag-L на 3 мин при комнатной температуре. Одновременно с этим лизирующий (связывающий) буфер доводят до комнатной температуры.
Затем полностью извлекают супернатант крови при помощи 10 мл пипетки, не касаясь магнитных частиц. После этого производят отмывку, для чего извлекают магнит из магнитного концентратора AdnaMag-L, добавляют 5 мл PBS, закрывают пробирки и аккуратно и медленно покачивают пробирки 5 раз, чтобы комплекс магнитная частица/клетка ресуспендировался. После этого помещают магнит в магнитный концентратор и инкубируют пробирки в течение 1 мин при комнатной температуре и затем извлекают супернатант. Отмывка производится трехкратно. После этого извлекают магнит из магнитного концентратора AdnaMag-L. Перемешивают комплекс магнитных частиц с клетками в 1 мл PBS и перемещают каждый образец в 1,5 мл пробирку.
2. Получение лизатов циркулирующих опухолевых клеток
Пробирки с магнитными частицами помещают в концентратор магнитных частиц MPC-S. Через 1 мин полностью извлекают супернатант для оптимизации последующего лизирования клеток. Затем извлекают магнит из концентратор магнитных частиц MPC-S. После чего добавляют по 200 мкл лизирующего (связывающего) буфера в каждую пробирку и перемешивают пипетированием не менее 5 раз. Магнит помещают в концентратор магнитных частиц MPC-S и инкубируют пробирки в течение 1 мин при комнатной температуре. Далее перемещают супернатант (лизат клеток) в новую 1,5 мл пробирку и немедленно проводят процедуру выделения РНК.
3. Выделение мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток
В пробирку, полученную в результате этапа 2, добавляют 20 мкл раствора, содержащего магнитные частицы, связанные с олигонуклеотидами с поли-Т концами. Пробирку помещают на 10 минут в перемешиватель с частотой вращения 5 об/мин. Потом помещают пробирку в магнитный концентратор на 1 минуту и забирают супернатант. Осадок магнитных частиц промывают трижды 1 мл PBS и ресуспендируют в 29,5 мкл воды.
4. Получение кДНК
В пробирку с суспензией магнитных частиц с мРНК добавляют 10 мкл реакционной смеси для обратной транскрипции и 0,5 мкл ингибитора РНКаз. Содержимое перемешивают и инкубируют 60 мин при 37 градусах, после чего выдерживают 5 мин при 95 градусах. Получившуюся кДНК можно хранить при -20 градусах 2 недели.
5. Получение амплифицированной ДНК
Полученную кДНК используют для количественного анализа экспрессии маркерных генов из ряда GA733-2, MUC-1, HER2, ESR1, PGR, PI3Kα, BRCA1, Twist 1, ALDH1. Количественную полимеразную цепную реакцию (ПНР) проводят согласно следующему протоколу. Реагенты для проведения ПНР (буфер, нуклеотиды и полимераза), олигонуклеотиды для амплификции маркерных генов, дистиллированную воду размораживают и перемешивают, после чего центрифугируют 2 секунды при 15000 оборотов/мин. Соотношение компонет для приготовление смеси в зависимости от количества образцов показано на Фиг.3.
Для каждого приготовления добавить 42,0 мкл смеси без кДНК в каждую 0,1 мл ПЦР-пробирку. Суспензию кДНК/магнитные частицы перемешивают пипетированием и добавляют по 8,0 мкл этой суспензии.
Количественную полимеразную цепную реакцию проводят по протоколу на Фиг.4.
Запускают с использованием ПЦР-машины полимеразную цепную реакцию со скоростью изменения температуры 2°C/с.
Звездочкой отмечен этап программы ПЦР-машины, на котором производится измерение флуоресцентного сигнала. Специфичность прохождения реакций подтверждена анализом полученных в ходе ПЦР ампликонов методом электрофореза в 2% агарозном геле.
На Фиг.5 продемонстрировано, что в образцах 1, 3 и 5 определена кДНК, соответствующая фрагментам РНК генов АСТА1, ESR1 и PGR, соответственно. В образцах 2, 4 и 6, являющихся отрицательными контролями прохождения ПЦР, соответствующих полос не обнаружено, что свидетельствует о специфичности разработанной реакции. Данные результаты подтверждают возможность осуществления изобретения, то есть возможность определения циркулирующих опухолевых клеток в крови больных раком молочной железы, экспрессирующих гены ESR1 и PGR и, соответственно, чувствительных к гормональной терапии.
6. Определение экспрессии маркерных генов.
При помощи стандартной обработки сигналов флуоресценции, встроенной в программное обеспечение ПЦР-машины, получают данные о наличии амплификата экспрессирующих генов. Затем путем сравнения экспрессии используемых маркерных генов GA733-2, MUC-1, HER2, ESR1, PGR относительно экспрессии референтных генов (АСТА1, GAPDH, HPRT) определяют относительное количество экспрессии целевых генов. По полученным в результате осуществления заявляемого способа качественным данным и количественным данным об изменении уровня экспрессии маркерных генов специалист делает вывод об эффективности проводимой терапии. На примере Фиг.2. можно отметить снижение экспрессии гена ESR1 в 4 раза после терапии.
Приведенные примеры подтверждают, что разработанный способ позволяет получать данные о наличии или отсутствии экспрессии двух генов ESR1 и PGR. При этом в клинических образцах может быть обнаружена экспрессия одного или другого гена или обоих одновременно. Наличие экспрессии данных генов свидетельствует о том, что выявляемые циркулирующие опухолевые клетки обладают чувствительностью к гормональной терапии антиэстрогенами (при обнаружении экспрессии ESR1), например тамоксифеном, или прогестинами (при обнаружении экспрессии PGR), например медроксипрогестероном.
Данная информация о циркулирующих опухолевых клетках при раке молочной железы может быть особенно полезной в случаях обнаружения опухоли, клетки которой изначально не экспрессируют данные гены, и в лечении стандартно не используются данные препараты, однако циркулирующие опухолевые клетки при таких опухолях могут иметь экспрессию гормональных рецепторов. При этом именно метастазирование, в основе которого лежат циркулирующие опухолевые клетки, в большей степени определяет прогноз течения заболевания. Лечащему врачу важно иметь инструменты наиболее эффективного воздействия не только и не столько на первичную опухоль, которая часто является операбельной, но именно на ЦОК, приводящие в конечном итоге к появлению метастазов. В стандартных протоколах диагностического обследования пациентов с раком молочной железы входит анализ биоптатов первичной опухоли, но пока практически отсутствуют инструменты для анализа ЦОК. Определение дополнительных характеристик циркулирующих опухолевых клеток, часто отличающихся от первичной опухоли, позволит врачам подбирать наиболее точную и эффективную терапию в каждом конкретном клиническом случае.
Изобретение может быть использовано в медицине, в частности в онкологии, для развития диагностических методов и методических рекомендаций их применений при адъювантной терапии опухолей, а также при длительном наблюдении за пациентами после оперативного удаления опухолей, что существенно улучшит эффективность лечения и выживаемость.
Источники
1. Описание изобретения по заявке WO 2003076942.
2. Описание изобретения по заявке WO 2009043159.
3. Описание изобретения по заявке WO 2010005991.
4. Описание изобретения по заявке WO 2003019141.
5. Описание изобретения по заявке WO 2007141626.
6. Описание изобретения по заявке WO 2010070124.
7. Описание изобретения по заявке WO 200642005.
8. Описание изобретения по патенту РФ №2384297.
9. Описание изобретения по патенту РФ №2107294.
10. Описание изобретения по заявке WO 2010135603.
11. Описание изобретения по заявке RU 2009125575.
12. Описание изобретения по патенту РФ №2338751.
13. Описание изобретения по заявке WO 2011002649.
14. Описание изобретения по заявке WO 2011028905.
15. Описание изобретения по заявке WO 2010151109.
16. Описание изобретения по заявке WO 2007089911.
17. Описание изобретения по заявке США US 20070031876.
18. Заявка на изобретение RU 2009135780.
19. Описание изобретения по заявке WO 2003023060.