Последовательная обработка компонентов золя водной вытяжки чаги органическими растворителями. I. исследование хлороформного экстракта

ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

УДК 615.322 : 542.61 : 547.412.123

М. А. Сысоева, М. А. Бурмасова, В. С. Гамаюрова

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА КОМПОНЕНТОВ ЗОЛЯ

ВОДНОЙ ВЫТЯЖКИ ЧАГИ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ.

I. ИССЛЕДОВАНИЕ ХЛОРОФОРМНОГО ЭКСТРАКТА

Ключевые слова: чага, водная вытяжка, экстракция хлороформом, электронная спектроскопия, хроматография, chaga, the water extract, extraction by chloroform, electronic spectroscopy, chromatography..

Исследуется состав веществ водной вытяжки чаги, отделяемых из нее хлороформом. Анализ хлороформного экстракта, проведенный бумажной, тонкослойной хроматографиями и электронной спектроскопией, показал в исследуемом объекте присутствие ассоциата, включающего липиды, простые фенолы, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды и белок. The article is devoted to the investigation of composition of substances that were extracted from chaga water extract by chloroform. The analysis of chloroform extract using paper, thin - layer chromatography and electronic spectroscopy allowed us to define the unit, which includes lipids, simple phenols, phenol carbon acids, polysaccharide and protein

В последнее время возрос интерес к природному лекарственному сырью, одним из источников которого является чага. Водные извлечения из чаги обладают лечебными свойствами и используются в медицине как средства для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, онкологических заболеваний различной этиологии.

Из литературных источников 50-х годов известно, что в состав водной вытяжки чаги входят (в % на сухой вес гриба): общий азот 0,10 - 0,18%, зольные элементы 2,30 -3,50%, полисахарид 2,08 - 4,80%, щавелевая кислота 0,88 - 1,58%, свободные ароматические кислоты 0,28 - 0,35%, свободные фенолы 0,08 - 0,12%, полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК), осаждаемый кислотой - 25% [1]. Водная вытяжка, изготавливаемая для таких препаратов как «Бефунгин» и «Экстракт березового гриба», содержит (в % от сухого веса): зольные элементы 25,00 - 29,00%, азот общий 0,48 - 0,55%, летучие кислоты 0,73 - 0,79%, щавелевую кислоту 3,98 - 4,50%, полисахарид 6,00 -8,00%, ароматические кислоты 0,54 -

0,78%, тритерпеновые кислоты - следы, стерины и тритерпены - 0,20%, фенолы 0,28 -

0,36%, ПФК 48,00 - 60,00%. Основным действующим компонентом водных извлечений чаги является ПФК [2]. Ранее для изучения состава водных извлечений и ПФК применялся химический гидролиз в жестких условиях: при избыточном давлении и высокой температуре [3]. Это может приводить к разрушению или изменению структуры некоторых веществ. Например, термолабильных фенольных соединений, а также ряда гликозидов. Поэтому перспективным является выделение и анализ биологически - активных веществ различных классов из сложно организованной коллоидной системы водного извлечения чаги последовательной экстракцией органическими растворителями.

Целью настоящей работы явилось исследование состава веществ экстрагируемых из водной вытяжки чаги хлороформом, после удаления из нее липидов петролейным и диэти-ловым эфирами.

Экспериментальная часть

Лекарственное сырье закупалось в аптечной сети. Использовался гриб чага измельченный, производства ЗАО «Здоровье», МО, Красногорский район, серия 020706.

Водную вытяжку чаги получали методом ремацерации [4]. Содержание экстрактивных веществ в вытяжке определяли согласно методике [5]. Обработка органическими растворителями осуществлялась по схеме [6]. Содержание фенольных веществ определяли по методике, описанной в [7]. Кислотный гидролиз хлороформного экстракта проводился 15% раствором НО! в течение 2 часов.

Качественный состав липидов определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «8огЬШ» в системах растворителей:

1) петролейный эфир : диэтиловый эфир : уксусная кислота (90:10:1) - Система I;

2) гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (80:20:1) - Система II;

3) хлороформ : ацетон : метанол : уксусная кислота : вода (6:8:2:2:1) - Система III.

В качестве проявителя использовали 20% раствор сульфата аммония с последующим нагреванием до 180°О. Для идентификации применяли 1% раствор лауриновой кислоты в гексане и 2% раствор лецитина в петролейном эфире [8]. Для количественного определения липидов использовали весовой метод [9].

Качественный состав фенолкарбоновых кислот определяли методом бумажной хроматографии в системах растворителей:

1) бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5);

2) бензол : пропионовая кислота : вода

В качестве проявителей применяли 2% спиртовой раствор РеО!з, реактив Паули [10,11].

Кислотный гидролиз полисахаридов проводили по методике [12].

Качественный состав углеводов и простых фенолов определяли методом бумажной хроматографии в системе растворителей бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:5).

В качестве проявителей использовали анилин-фталевый реактив и пары аммиака [10,12].

Количественное определение белка проводили по методу Флореса [13].

Электронные спектры снимали на спектрофотометре Ц№СО ЦУ/УК 2800.

Обсуждение результатов

Водная вытяжка чаги представляет собой коллоидную гидрофильную полидисперс-ную систему сложного состава. Дисперсная фаза этой системы представлена ПФК, а дисперсионная среда содержит соли органических и минеральных кислот, полисахариды и фенолы [14]. Для отделения биологически - активных соединений различных классов, находящихся в водной вытяжке чаги в свободном или слабосвязанном состоянии с его дисперсной фазой, проведена последовательная исчерпывающая экстракция водной вытяжки чаги органическими растворителями по схеме: петролейный эфир, диэтиловый эфир и хлороформ.

Водную вытяжку чаги сначала обрабатывали петролейным и диэтиловым эфирами для удаления из нее терпенов и липидов. Затем в качестве экстрагента использовали хлороформ. Хлороформный экстракт может содержать нейтральные и полярные липиды, обладающие биологической активностью.

Полученный хлороформный экстракт содержит 0,93% экстрактивных веществ от сухого остатка водной вытяжки чаги. Анализ хлороформного экстракта с помощью тонкослойной хроматографии на присутствие липидов показал, что в нем находятся не индивидуальные соединения, а, вероятнее всего, соединения в ассоциированном состоянии. Поэтому хлороформный экстракт после удаления растворителя был подвергнут кислотному гидролизу. В нейтрализованном и сконцентрированном гидролизате выпадал осадок, который отделяли от жидкой фракции и исследовали отдельно.

Поскольку в составе дисперсной фазы водного извлечения чаги ранее было показано присутствие как полярных, так и нейтральных липидов [15], поэтому был проведен

анализ жидкой фракции гидролизата методом тонкослойной хроматографии на присутствие липидов в двух системах растворителей (Системы I и II). Использование этих систем позволили обнаружить: моноглицериды, 1,2 (1,3) - диглицериды, стерины, высшие алифатические спирты, жирные кислоты, триглицериды, о-алкилдиглицериды, триалкиловые эфиры глицерина, эфиры стеринов. Кроме того, в первой системе определены воски. Применение второй системы растворителей позволило выявить: высшие алифатические альдегиды. Из полярных липидов был идентифицирован фосфолипид - лецитин (Система III). Количество этих соединений составило 27,0% веществ от сухого остатка хлороформного экстракта.

В природных объектах как растительного, так и животного мира широко распространены фенолкарбоновые кислоты. Они могут стимулировать или замедлять рост клеток, способствовать запасанию некоторого количества энергии, а также играть особенно важную роль в метаболизме природного объекта. Исследователи 50-х годов показали, что в водном извлечении чаги в основном присутствуют ванилиновая, сиреневая, п-оксибензойная и протокатеховая кислоты [16, 17]. Следовательно, в состав исследуемого ассоциата могут переходить как фенолокислоты, так и простые фенолы. Для их выделения проанализированы жидкая фракция гидролизата и осадок. Разделение фенолкарбоновых кислот и простых фенолов проводили с использованием бумажной хроматографии. В жидкой фракции гидролизата соединений этих классов не обнаружено. Осадок растворяли в диэтиловом эфире и хроматографировали. Качественный состав подтвержден обработкой соответствующими проявляющими реактивами. Полученные пятна элюировали этиловым спиртом и снимали электронные спектры соединений. Электронная спектроскопия позволила идентифицировать (относительно контрольных образцов), кроме обнаруженных ранее фенолкарбоновых кислот, салициловую кислоту (рис. 1). Из фенольных соединений идентифицирован резорцин (рис. 2). Экспериментально установленная сумма фенольных веществ составляет 2,6% веществ от сухого остатка хлороформного экстракта.

Рис. 1 - Электронные спектры образцов 1

К соединениям, обеспечивающим биологическую активность полифенолов чаги, полученных при экстракции с использованием ультразвука, относят его углеводный компонент [3]. Кроме того, показано, что в водных извлечениях чаги и в составе самого ПФК

содержатся полисахариды б,7% и 1б,0% соответственно [1B], со структурными единицами, представленными глюкозой, ксилозой, галактозой и сорбитом [3]. Для определения состава углеводов, включенных в ассоциаты, переходящие в состав хлороформного экстракта, осадок растворяли в воде и проводили кислотный гидролиз. Гидролизат анализировали посредством бумажной хроматографии. Подбор условий гидролиза позволил установить наличие уроновых кислот в полисахаридных комплексах исследуемого объекта. На основании стандартов сахаров мономерные структурные единицы полисахаридов, входящих в состав ассоциата, идентифицированы как глюкоза, ксилоза и уроновые кислоты.

В исследуемом ассоциате определено количественное содержание белка, которое составило 0,017 мг/мл.

Таким образом, нами обнаружено, что хлороформом из коллоидной системы водного извлечения чаги экстрагируется сложный ассоциат, в состав которого входят липиды, фенольные соединения - салициловая кислота, резорцин - полисахариды и белок.

Выводы

1. Последовательная обработка водного извлечения чаги органическими растворителями позволила получить хлороформный экстракт, содержащий 0,93% веществ от сухого остатка водной вытяжки чаги. Показано, что хлороформом из водной вытяжки чаги извлекается сложно организованный ассоциат.

2. Определено в составе ассоциата 27,0% липидов (от сухого остатка), представленных нейтральными липидами и фосфолипидом - лецитином; 0,017 мг/мл белка; 2,б% фенольных веществ (от сухого остатка), представленных салициловой кислотой и резорцином. Салициловая кислота в чаге обнаружена впервые.

3. Установлено, что полисахариды исследуемого ассоциата, состоят из глюкозы, ксилозы и уроновых кислот.

Литература

1. Шиврина, А.Н. О химическом составе чаги / А.Н. Шиврина, Е.В.Ловягина, Е. Г. Платонова // В сб.: Комплексное изучение физиологически - активных веществ низших растений. - М.: Наука, 19б1. - С.55-б2.

2. Шиврина, А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги / А.Н. Шиврина // В сб.: Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. - М.: Наука, 19бб. - С.49-55.

3. Рыжова, Г.Л. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги / Г.Л. Рыжова [и др.]// Химико - фармацевтический журнал. - 1997. - №10. - С.44-47.

4. Сысоева, М.А. Исследование золя водных извлечений чаги. II Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами / М.А. Сысоева [и др.]// Вестник Казан. технол. унта. - 2003. - №2. - С.172-179.

5. Государственная фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М.: Медицина, 19B7. - ЗЗбс.

6. Запрометов, М.Н. Основы биохимии фенольных соединений / М.Н. Запрометов. - М.: Высшая школа, 1974. - 214с.

7. Полюдек-Фабини, Р. Органический анализ / Р. Полюдек-Фабини, Т. Бейрих - Л.: Химия, 19B1. -б24.

B. Кейтс, М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / М. Кейтс. - М.: Мир, 1975. 322с.

9. Северин, С.Е. Практикум по биохимии / С.Е. Северин, Г.А. Соловьева. - М.: Мир, 19B9. - 509с.

10. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. - М.: Изд-во иностранной литературы, 19б2. - 851с.

11. Бандюкова, В.А. Фенолкислоты растений, их эфиры и гликозиды / В.А. Бандюкова// Химия природных соединений. - 1983. - №3. - С.2бЗ-27З.

12. Захарова, И.Я. Методы изучения микробных полисахаридов / И.Я. Захарова, Л.В. Косенко. -Киев: Наукова думка, 1982. - 192с.

13. Дункан, А. Применение спектроскопии в химии / А. Дункан [и др.] - М.: Издат. ин. лит., 1959. -260с.

14. Якимов, П.А. О причинах изменения устойчивости пигментного комплекса в водных экстрактах из чаги / П.А. Якимов, С.М. Андреева, Е.В. Алексеева // В сб.: Комплексное изучение физиологически - активных веществ низших растений. - М.: Наука, 1961. - С.50-54.

15. Юмаева, Л.Р. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги / Л.Р. Юмаева [и др.] // В материалах Общероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Пищевые технологии». - Казань, 2006. - С.118-119.

16. Ловягина, Е.В. Изучение кислотного состава чаги методом распределительной хроматографии на бумаге / Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина, Е.Г. Платонова // В сб.: Чага и ее лечебное применение при раке ІУ стадии. Л.: Медгиз, 1959. С.62-71.

17. Шиврина, А.Н. К вопросу о природе и происхождении водорастворимого комплекса, образованного трутовым грибом чага / А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова // РЖ Биохимия. -1959. - Т.24, - Вып.1. - С.67-72.

18. Пат. №2231786. 2004. (Российская Федерация) // Бюл. № 18.

© М. А. Сысоева - канд. хим. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; М. А. Бурмасова -соиск. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ.