СЛИТЫЙ БЕЛОК НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА ГАНОДЕРМЫ И СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, А ТАКЖЕ ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
FUSION PROTEIN BASED ON RECOMBINANT GANODERMA IMMUNOREGULATORY PROTEIN AND HUMAN SERUM ALBUMIN, METHOD FOR PREPARATION THEREOF, AS WELL AS USE THEREOF

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к конструированию, экспрессии, очистке и применению рекомбинантного слитого белка, а более конкретно к способу получения и применения слитого белка на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческого сывороточного альбумина, который используется для лечения заболеваний, таких как лейкопения и опухоли, вызванные химиотерапией.
Описание предшествующего уровня техники
Ganoderma tsugae
Иммунорегуляторный белок ганодермы (LZ-8) получают из мицелия . Структура рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы содержит: важный N-концевой домен для образования димера и С-концевой домен FNIII; где N-концевой домен rLZ-8 включает α-спираль и β-нить, α-спираль и β-нить N-конца мономера LZ-8 образуют важный гантелевидный димер, связывающий домен через пространство обмена с соответствующими доменами другого LZ-8. Сообщалось, что LZ-8 обладает биологической активностью по иммунорегулированию (ссылаясь на китайский патент CN201110222012.5) и уничтожению опухолевых клеток (ссылаясь на китайский патент ZL200810050206.X).
in vivo
Обычно основными причинами короткого периода полураспада белковых препаратов являются: 1) гидролиз является одним из способов метаболизма для большинства белков, и наличие белковых ферментов в тканях организма снижает активность белка; 2) почки являются наиболее важным органом в процессе расщепления и метаболизма низкомолекулярного белка; большинство белков, с относительной молекулярной массой менее 69000 Да, могут быть экскретированы путем клубочковой фильтрации; 3) печень играет важную роль в процессе метаболизма белковых лекарственных средств, где лекарственное средство доставляется в клетки печени путем диффузии и переноса носителями, а затем разрушается под действием микросомальных ферментов Р450, протеаз или лизосом в цитозоли; пептиды и белки с более крупными молекулами, абсорбируются клетками печени через эндоцитоз, опосредованный рецептором, прежде чем разрушаются клетками печени. Молекулярная масса димера составляет менее 26 кДа; скорость клиренса может быть высокой; и фармакокинетические параметры являются сложными, чтобы удовлетворить требования фармацевтических разработок. Таким образом, только за счет продолжительного времени действия LZ-8  путем слияния на уровне генов и других технических методов может быть заложен прочный фундамент для клинического применения. Для того чтобы продлить период полураспада белковых лекарственных препаратов в последние годы исследователи, в основном, проводили исследования с точки зрения аспектов, таких как слияние с альбумином, химическая модификация, микрокапсуляция, конструирование мутантов и гликозилирование. По мере развития исследований, появляются новые разновидности белковых лекарственных препаратов длительного действия.
Технология слияния генов соединяет различные гены, для экспрессии слитого белка со сложными функциями. С помощью технологии слияния генов молекулярные массы пептидных и белковых лекарственных средств увеличиваются или сродство между лекарственным средством и рецептором изменяется таким образом, чтобы продлить период полураспада лекарственных средств. Принцип построения слитого белка является следующим: удаление стоп-кодона кодирующего гена белка, а затем присоединение кодирующего гена другого белка со стоп-кодоном так, чтобы реализовать слияние кодирующих генов двух белков для одновременной экспрессии двух белков. Ген слитого белка обладает высокой стабильностью и может регулироваться и экспрессироваться, его продукт однороден, воздействия на активность белковых и пептидных лекарственных средств малы, и т.д., что обычно обеспечивает подходящий метод для изучения пролонгированного действия пептидных и белковых лекарственных средств.
Традиционно широко изученные слитые гены являются генами сывороточного альбумина человека, генами иммуноглобулина человека (IgG4, IgG1) и т.д. Сывороточный альбумин человека (HSA для краткости) представляет собой белок в плазме крови человека, его не-гликозилированный одноцепочечный полипептид содержит 585 аминокислот, а молекулярная масса составляет 66 кДа. Концентрация HSA в плазме составляет 42 г/л, что составляет приблизительно 60% от общего количества белков плазмы. Человеческий сывороточный альбумин в жидкостях организма, способен транспортировать жирные кислоты, желчные пигменты, аминокислоты, стероидные гормоны, ионы металлов, различные терапевтические молекулы и т.д.; в то время как поддерживается нормальное кровяное давление. Клинически, сывороточный альбумин человека применим для лечения шока и ожога, и может быть использован в качестве вспомогательного средства при потере крови, вызванной хирургическим вмешательством, несчастного случая или кровотечений; сывороточный альбумин человека также может быть использован в качестве компатибилизатора плазмы.
Человеческий иммуноглобулин (IgG) является наиболее распространенным белком в крови человека, период полураспада которого составляет 21 день. Сообщалось, что слияние Fc-фрагмента IgG и других белков может значительно увеличить биологическую активность и период полураспада других белков in vivo, где большинство исследователей выбирают Fc-фрагменты IgG1 и IgG4 в качестве объектов для слияния. Метод широко использовался в некоторых клинически важных клеточных факторах, и растворимых рецепторах, таких как sTNF-αR, LFA3, CTLA-4, IL-2 и IFN-α, со значительным успехом.
С учетом вышеизложенного уровня техники, настоящее изобретение использует технологию рекомбинации генов для слияния иммунорегуляторного белка ганодермы с альбумином сыворотки крови человека и Fc-фрагментом иммуноглобулина человека IgG, соответственно, с тем, чтобы сконструировать эукариотическую экспрессирующую систему. После экспрессии и очистки получают целевой белок, и проводят соответствующие исследования биологической активности и фармацевтические исследования для целевого белка. Результат показывает, что иммунорегуляторный белок ганодермы (LZ-8) значительно отличается от слитого белка HSA в фармацевтической и биологической активности, а также патологическим применением.
СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является предоставление слитого белка на основе рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодремы и сывороточного альбумина человека, и способа его получения, таким образом, чтобы изучить его применение в лечении заболеваний, таких как лейкопения, вызванная химиотерапией и противоопухолевыми препаратами.
Последовательность слитого белка: в соответствии с настоящим изобретением, слитый белок rLZ-8-HSA иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и HSA состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и HSA; его аминокислотная последовательность представляет собой:
SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:1), в которой аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
В соответствии с настоящим изобретением, слитый белок rLZ-8-Fc1 иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и Fc-фрагмента человеческого IgG1 состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и Fc-фрагмента IgG1; где его аминокислотная последовательность представляет собой:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO.2), аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
В соответствии с настоящим изобретением, слитый белок RLZ-8-Fc4 иммунорегуляторного белка ганодермы (LZ-8) и Fc-фрагмента человеческого IgG4 состоит из иммунорегуляторного белка ганодермы и Fc-фрагмента IgG4; где его аминокислотная последовательность представляет собой:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSYTQRFKDKAKLTAVTSANTAYMELSSLTNEDSAVYYCSIIYFDYADFIMDYWGQGTTVTVSTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQXSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLXGKEYKCKVSXKGLPSSIEKTISXAXGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSXWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO.3), аминокислотная последовательность связывающего пептида, соединяющего C-конец иммунорегуляторного белка ганодермы и человеческий сывороточный альбумин представляет собой GGGGSS.
Pichia pastoris
Pichia pastoris
Конструирование инженерных штаммов, а также экспрессия и очистка целевого белка являются такими, как указано далее: соответственно образование носителей нуклеотидных последовательностей слитого белка на основе LZ-8; использование технологии электротрансформации для получения клетки-хозяина с помощью как внеклеточной экспрессии слитого белка; где условия ферментации  оптимизированы и показатель экспрессии слитого белка улучшен; очистка целевого продукта с помощью таких методов, как аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием», молекулярное сито, метод аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC), анионообменная хроматография, где степень чистоты различных полученных слитых белков составляет выше 99%, что предоставляет неочищенные лекарственные препараты для последующих фармакологических экспериментов.
Фармакологические эксперименты являются такими, как указано далее: использование различных слитых белков, в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по активности, где путем применения метода ELISA результат теста показывает, что биологическая активность слитого белка rLZ-8-HSA выше, чем биологическая активность rLZ-8, который не является слитым, и существует значительная разница, которая является статистически значимой; однако биологические активности rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 ниже, чем показатель активности rLZ-8, который не является слитым, и существует значительная разница; используя различные слитые белки, в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по периоду полураспада in vivo, в которых в соответствии с методом ELISA, периоды полураспада различных слитых белков in vivo все значительно повышаются приблизительно до 3 раз относительно периода полураспада rLZ-8; в то же время, используя различные слитые белки в качестве контрастов rLZ-8 для экспериментов по лечению лейкопении, и подсчета белых клеток крови с помощью анализатора клеток цельной крови животных, в которых результат теста показывает, что существует значительное различие между различными слитыми белками и rLZ-8 в лечении лейкопении; причем при одинаковой дозировке, слитый белок rLZ-8-HSA имеет наиболее короткий цикл для стимуляции роста лейкоцитов; и при одинаковом цикле лечения, слитый белок rLZ-8-HSA способствует большему росту белых кровяных клеток. Поэтому HSA больше подходит в качестве партнера слияния для rLZ-8, который способен существенно расширить возможности применения LZ-8 в лечении лейкопении. Согласно экспериментам по ингибированию роста клеток меланомы слитого белка rLZ-8-HSA, показано, что при одинаковой дозировке (в дозировке LZ-8), слитый белок rLZ-8-HSA эффективно ингибирует рост клеток меланомы, что значительно отличается от лечебного эффекта rLZ-8, который не является слитым. В то же время, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления слитого белка rLZ-8-HSA для ингибирования роста опухолевых клеток печени, можно видеть, что при одинаковом цикле лечения, показатель эффективности лечения слитого белка rLZ-8-HSA значительно улучшен, что является неожиданным для изобретателя. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительный вариант слитого белка rLZ-8-HSA для лечения тромбоцитопении также предоставляется. Соответственно, по сравнению с модельной группой, лекарственный препарат rLZ-8-HSA значительно стимулирует пролиферацию тромбоцитов мыши в начале кормления, где разность является чрезвычайно важной. В середине срока кормления, его эффект возвращается к нормальному уровню. Достаточный эффект также наблюдается при лечении экспериментальных животных моделей с тромбоцитопенией, вызванной инъекцией антитромбоцитарной сыворотки.
in vivo
Pichia pastoris
Pichia pastoris
Pichia pastoris
in vivo
in vivo
in vitro
Благоприятные эффекты настоящего изобретения заключаются в следующем. В соответствии с настоящим изобретением, период полураспада  предложенного слитого белка значительно увеличивается по сравнению с rLZ-8. Слитый белок, сконструированный с помощью технологии слияния генов, будет иметь сниженную биологическую активность целевого белка после того, как получится слитый белок. Однако, в соответствии с настоящим изобретением, биологическая активность слитого белка rLZ-8-HSA, как было экспериментально доказано, является значительно лучше, чем биологическая активность rLZ-8, который не является слитым. К тому же, в соответствии с настоящим изобретением, ферментация слитого белка rLZ-8-HSA с использованием инженерного штамма  проста в технике исполнения, имеет высокий выход, единственный продукт экспрессии, и не требует усилий в очистке, что обеспечивает благоприятные условия для промышленного производства. Существуют проблемы, такие как продукт экспрессии легко разлагается в процессе ферментации из-за экспрессирующей системы . Таким образом, настоящее изобретение контролирует условия ферментации, для значительного уменьшения разложения целевых продуктов в процессе ферментативной экспрессии , и повышения выхода. С помощью экспериментов in vivo, настоящее изобретение доказывает, что по сравнению с rLZ-8, который не является слитым, период полураспада  значительно продлевается, в то время как самые низкие дозировки и время начала болезни в изучении лечения лейкопении также улучшены. Меланома и опухоль печени исследованы в качестве примеров противоопухолевого действия, и представлены эксперименты  и , соответственно. В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления меланомы и опухоли печени, терапевтические эффекты в двух экспериментальных методах являются значительно более высокими, чем от rLZ-8, который не является слитым, что является неожиданным для изобретателя. В соответствии с предпочтительным вариантом лечения тромбоцитопении, по сравнению с модельной группой, препарат rLZ-8-HSA значительно стимулирует пролиферацию тромбоцитов мыши в начале кормления, где разность является чрезвычайно важной. В середине срока кормления, его эффект возвращается к нормальному уровню, который является обычно лучшим эффектом слитого белка rLZ-8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 иллюстрирует индуцирование экспрессии различных слитых белков в 66 ч и 72 ч; где образец дорожки 1 представляет собой белковый маркер; образец дорожки 2 представляет собой стандартный HSA; образец дорожки 3 представляет собой rLZ-8; образец дорожки 4 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-HSA после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 5 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-HSA после индуцирования в течение 66 ч; образец дорожки 6 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc1 после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 7 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc1 после индуцирования в течение 66 ч; образец дорожки 8 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc4 после индуцирования в течение 72 ч; образец дорожки 9 представляет собой надосадочную жидкость rLZ-8-Fc4 после индуцирования в течение 66 ч.
Фиг. 2 представляет собой Вестерн-блоттинг идентифицирующую карту различных слитых белков;
где образец дорожки 1 представляет собой белковый маркер; образец дорожки 2 представляет собой rLZ-8; образец дорожки 3 представляет собой rLZ-8-HSA; образец дорожки 4 представляет собой rLZ-8-Fc1; образец дорожки 5 представляет собой rLZ-8-Fc4.
Фиг. 3 представляет собой хроматографическую карту слитого белка rLZ-8-HSA после очистки с помощью молекулярного сита.
in vivo
Фиг.4 иллюстрирует сравнения периодов полураспада  различных слитых белков и rLZ-8.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предпочтительный вариант осуществления 1: конструирование и экспрессия инженерных штаммов слитого белка rLZ-8
Конструирование: последовательности целевых фрагментов rLZ8-HSA, rLZ8-Fc1 и rLZ8-Fc4 соответственно синтезируют в соответствии с предпочтительным использованием дрожжевых кодонов, и хранят в плазмиде puc57; конструируют праймер, содержащий маскированные сайты рестрикционного фермента StuI и KpnI; праймер синтезируют следующим образом:
(1) LZ-8-HSA:
5' CATAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3'
5' CGGGGTACCGAATTCCTATTACA 3'
(2) LZ-8-Fc1:
5' GTTAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3'
5' TAGGGTACCTCATTTACCAGGGG 3'
(3) LZ-8-Fc4:
5' CCGAGGCCTTCTGATACTGCTT 3'
5' GATGGTACCTCACGGAGCATGAG 3'
Получение целевых фрагментов посредством ПЦР, где условия для ПЦР представляют собой: во-первых, 95°С в течение 30 сек; затем 95°С в течение 30 сек, 58°С в течение 30 сек и 72°С в течение 2 мин, при этом вышеуказанные процессы повторяют 30 раз; и, наконец, 72°С в течение 10 мин, и поддерживание при 16°С.
Идентификация с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, что фрагменты, соответственно, на 2184bp (LZ-8-HSA), 1064bp (LZ-8-Fc1) и 774bp (LZ-8-Fc4); обработка носителя pPICZa и целевых фрагментов согласно иллюстративному материалу набора для «бесшовного» клонирования и сборки GENEART (Seamless Cloning and Assembly Kit), где молярное соотношение носителя и фрагментов составляет 1:3, где носитель и фрагменты взаимодействуют 5× с буфером и 10× со смесью ферментов в течение 30 минут; превращение 10 мкл продукта присоединения в компетентную кишечную бактерию DH5 альфа; после культивирования при 37°С в течение 30 мин, нанесение продукта присоединения на планшет LB с устойчивостью к блеомицину; выбор одной бактериальной колонии для культивирования при 37°С и встряхивании в течение ночи; центрифугирование бактериальной жидкости при 12000g, и удаление надосадочной жидкости; извлечение рекомбинантной плазмиды с использованием набора для экстракции малых плазмид и анализ ее последовательности; использование двойного ферментативного переваривания и электрофореза, чтобы идентифицировать, верен ли преобразователь; и, наконец, использование праймеров 5'AOX и 3'AOX для проверки правильности последовательности.
Pichia pastoris
600
Линеаризация рекомбинантной плазмиды с помощью фермента SacI при 37°С в течение приблизительно 1 ч; добавление 33 раза  для инокулирования в YPD при 30°С, и культивирование с использованием шейкера при 300 об/мин. в течение ночи; увеличение до 500 мл; когда OD достигает приблизительно 1,3, получение компетентных дрожжей; выдерживание в ледяной бане в течение 30 минут и ресуспендирование с помощью стерилизованной воды, охлажденной в ледяной бане; центрифугирование при 1500g и температуре 4°С в течение 5 минут, и разделение по 80 мкл компетентных дрожжей на пробирку; добавление 10 мгк линеаризованной плазмиды; выдерживание в ледяной бане в течение 5 мин; перенос в электротрансформирующее устройство и проведение электротрансформации при 1,5 кВ, 50 мкФ, 25 мА; шейкер-культивирование при 30°С в течение 2 ч, нанесение на планшет YPDS с устойчивостью к блеомицину зеоцину, и культивирование при 30°С в течение 3-х дней.
Скрининг: в асептических условиях, отбор 20 моно-клонов каждого слитого белка на планшете YPDS с устойчивостью к блеомицину зеоцину и помещение в 10 мл жидкой культуральной основы YPD для культивирования при 30°C с использованием встряхиваемой колбы при 300 об/мин в течение 12 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин и удаление надосадочной жидкости; перемещение в культуральную основу BMGY для культивирования при 30°С с использованием встряхиваемой колбы при 300 об/мин в течение 18 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин и удаление надосадочной жидкости; перемещение в культуральную основу BMGY (с 1% метанола) и при добавление 1% метанола один раз в 24 ч; обеспечение индуцирования экспрессии в течение 72 ч; центрифугирование при 1500g в течение 5 мин, и сохранение надосадочной жидкости при -20°С; количественное и качественное описание экспрессии целевых белков посредством SDS-электрофореза и идентификация Вестерн-блоттингом, с тем, чтобы отобрать инженерные штаммы с экспрессией на высоком уровне.
Предпочтительный вариант осуществления 2: способы очистки слитых белков
Так как слитый белок имеет общую структуру LZ-8, способы очистки, такие как аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием», молекулярное сито, метод аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC), анионообменная хроматография исследованы в соответствии с характеристиками структуры, где конкретные методы такие как указано далее.
Способы очистки rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 заключаются в следующем.
Микрофильтрация: центрифугирование ферментационной жидкости при 10000 об/мин для получения надосадочной жидкости, затем очистка (микро-фильтрация) с помощью колонки с полыми волокнами с диаметром отверстий 100 Кд, с тем, чтобы удалить низкомолекулярные соли и сахара, для получения 8 л желтой прозрачной жидкости, содержащей пигмент, нуклеиновые кислоты и белки.
Аффинная колоночная хроматография с «гравитационным элюированием» rProtein Gravitrap: приготовление буферного раствора фазы A: 0,22 M фосфатный буферный раствор, рН 7,7, и 0,15 М хлорид натрия; приготовление буферного раствора фазы B: 0,1 М цитратный буферный раствор, рН 4,0, 0,22 мкм вакуумная фильтрация, дегазация ультразвуком; уравновешивание хроматографической колонки с помощью фосфатного буферного раствора фазы A, где его объем составляет 10 мл; соответственно отбор образца 10 мл предварительно обработанной rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 ферментативной жидкости и смешивание два раза; (обработка образца: 90 мл ферментативной жидкости и 10 мл 10× фосфатного буферного раствора, 0,22 мкм фильтрация и стерилизованное хранение), промывание хроматографической колонки с помощью фосфатного буферного раствора фазы A, элюирование без смешивания; промывание элюированного образца цитратным буферным раствором фазы B, где его объем составляет 10 мл; ожидание в течение 2 мин, и удаление 1 мл объема в хроматографической колонке; получение образцов с помощью 1,5 мл трубки для центрифугирования, и хранение для анализа; регенерация хроматографической колонки после использования в течение 5 раз, добавление 5 мл 6 М гуанидина гидрохлорида, ожидание в течение 2 мин и промывание хроматографической колонки с помощью фазы А.
2
4
2
4
Хроматография на молекулярных ситах: использование колонки с наполнителем Superdex 75 (GE, XK16/70, где ее внутренний диаметр 16 мм, высота ее составляет 70 см), где высота наполнения составляет 60 см; анализ с помощью 100 мкл 1%-ного ацетона, где эффективность колонки составляет приблизительно 10000 согласно результату; отбор пробы белка со скоростью потока 2 мг/мл и концентрацией 5 мл, затем элюирование с помощью буферного раствора NaHPO-NaHPO (50 мм) с рН 7,5 (показан на фиг.3.); отбор пробы в пике сбора, и проведение электрофореза и анализов ВЭЖХ.
Результаты: после тонкой очистки, чистота белка составляет выше 99% в соответствии с анализом ВЭЖХ, электрофорез SDS-PAGE имеет одну полосу.
Способ очистки rLZ-8-HSA включает стадии:
стадия (1): очистка rLZ-8-HSA с помощью метода аффинной хроматографии с иммобилизованными хелатами металлов (IMAC), где наполнитель IMAC Sepharose 6Fast Flow 1 приобретают у GE; наполнение колонки XK50/30 с высотой наполнения 15 см; замена жидкости для хранения чистой водой; прохождение 0,1 М раствора сульфата меди через хроматографическую колонку, где объем сульфата меди равен объему колонки и вымывание ионов меди, которые не адсорбируются очищенной водой, где объем очищенной воды равен четырем объемам колонки; затем уравновешивание хроматографической колонки с использованием буферного раствора А: 20 ммоль/л фосфат, 0,6 моль/л хлорид натрия и рН 7,3, где надосадочную жидкость, содержащую человеческий сывороточный альбумин, добавляют в фосфат и хлорид натрия для получения 20 ммоль/л фосфата, 0,6 моль/л хлорида натрия, и рН 7,3; затем отбор пробы с помощью хроматографической системы AKTA™ Purify со скоростью потока 50 мл/мин; после отбора пробы, промывка с использованием буферного раствора A, пока степень поглощения не достигнет основной точки; элюирование целевого белка с помощью буферного раствора B: 20 ммоль/л фосфат, 0,6 моль/л хлорид натрия, 0,3 М иминазол и рН 7,5; сбор пика элюирования буферного раствора B;
стадия (2): очистка с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC), где пик элюирования буферного раствора В собранный на стадии (1) очищают с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием; наполнение хроматографической колонки, имеющей диаметр 5 см с использованием фенильной гидрофобной среды для хроматографии Phenyl Sepharose™ 6Fast Flow (высокозамещенной) (от GE), где высота колонки составляет 15 см; где перед использованием, среда уравновешивается с помощью буферного раствора C: 50 ммоль/л фосфат, 0,5 М хлорид натрия, и рН 6,5, и объем буферного раствора C составляет 3 объема колонки; добавление деионизированной воды в буферный раствор B, содержащий целевой белок, который получают на стадии (1), разведение до концентрации 0,5 М NaCl, и доведение значения рН до 6,5 с помощью фосфорной кислоты; отбор проб с использованием хроматографической системы AKTA™ Purify со скоростью потока 50 мл/мин; после отбора проб элюирование с использованием буферного раствора C: 50 ммоль/л фосфат, 0,5 М раствор хлорида натрия и рН 6,5, где объем буферного раствора C составляет 2 объема колонки; сбор элюата пика и элюирование пика с помощью буферного раствора C; элюирование смешанной части с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием с использованием деионизированной водой, имеющей объем равный двум объемам колонки и слив жидкости элюата; добавление собранной жидкости из гидрофобной хроматографической колонки в тетраборат натрия и раствор хлорида кальция с конечной концентрацией 0,1 М, доведение рН до 9,0 и обработка в течение 0,5-24 ч, затем центрифугирование при 10000 об/мин в течение 20 мин, сбор надосадочной жидкости, и обессоливание с помощью ультрафильтрационной мембраны MILLIPORE 10K; и
стадия (3): доочистка образца с помощью анионообменной хроматографии, загрузка наполнителя Q Sepharose™ High Preformance в хроматографическую колонку с диаметром 2,6 см и высотой 15 см, где объем наполнения составляет 80 мл; промывка с помощью деионизированной воды, где ее объем составляет два объема колонки; затем уравновешивание с использованием буферного раствора E (50 мМpb, рН 7,0), имеющего объем, равный пяти объемам колонки; после отбора проб, промывка буферным раствором E, где его объем составляет два объема колонки; затем элюирование с помощью 0-0,5M NaCl с градиентом, составляющим 10 объемов колонки, и сбор основного пика.
Результаты: после тонкой очистки, чистота белка выше 99% в соответствии с анализом ВЭЖХ, электрофорез SDS-PAGE имеет одну полосу.
Предпочтительный вариант осуществления 3: сравнение различных слитых белков по промотированию пролиферации клеток селезенки мыши
6
6
6
2
2
450
Анализ воздействий слитых белков на пролиферацию клеток селезенки мыши с помощью метода WST-1, который иллюстрирует силу биологической активности, где в соответствии с настоящим изобретением, используются самки мышей BALB/C, вес которых контролируется на 20-22 г; умерщвление мышей путем смещения их шейных позвонков, изъятие селезенок в стерильных условиях, и помещение в планшет с 5×10/мл DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка; вскрытие селезенки с помощью пинцета, фильтрация суспензии ткани с помощью марли для удаления тканевых блоков, и получение клеточной суспензии из клеток селезенки; добавление 100 мкл суспензии ткани в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты для подсчета с помощью микроскопа; доведение концентрации клеток до 5×10/мл с использованием DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитых белков и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентных концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 5×10/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1Биологическая активность различных слитых белков по промотированию клеточной пролиферации (х±s n=9)
БелокКонцентрация
rLZ-8
rLZ-8-Fc1
rLZ-8-Fc4
rLZ-8-HSA
5,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,739±0,23
0,543±0,26
0,452±0,43
0,936±0,31<sup>*</sup>
10,0×10<sup>-9</sup> моль/л
1,197±0,31
0,937±0,29
0,840±0,27
1,680±0,38<sup>*</sup>
15,0×10<sup>-9</sup> моль/л
1,567±0,27
1,114±0,31
0,929±0,21
2,373±0,35<sup>*</sup>
Примечание: сравнение с rLZ-8, *<i>р</i><0,05
Что качается таблицы 1, с увеличением концентрации белка, воздействие слитых белков на пролиферацию клеток селезенки также увеличивается. При одной и той же концентрации белка, можно сделать вывод из сравнения воздействия на пролиферацию различных слитых белков и rLZ-8, что rLZ-8-HSA лучше, чем rLZ-8 в промотировании пролиферации клеток селезенки, и имеется существенное различие, которое является статистически значимым. Тем не менее, эффекты промотирования rLZ-8-Fc1 и rLZ-8-Fc4 на пролиферацию клеток селезенки мыши значительно уменьшаются. Согласно экспериментальным результатам, что активные точки не подвергаются воздействию при слиянии LZ-8 и HSA, в то время как после слияния LZ-8 и IgG-Fc1 или IgG-Fc4, активность белка уменьшается, что затрудняет активность LZ-8.
Предпочтительный вариант осуществления 4: анализ периодов полураспада различных слитых белков
Использование мышей BALB/C общим весом приблизительно 18-22 г в экспериментах, причем каждая группа состоит из 10 мышей; внутривенно вводят 100 г/кг (исходя из дозы LZ-8) слитого белка, соответственно отбирают пробы крови через 2, 4, 6, 8 и 10 ч после инъекции, рисуя кривую концентрации лекарственного лекарства в единицу времени (как показано на фиг. 4) с использованием полученных результатов, где показано результатами эксперимента, что период полураспада слитого белка значительно продлен (Р<0,0001) судя по rLZ-8, который не является слитым, концентрация его в крови значительно продлена, а период полураспада rLZ-8 у мышей увеличен.
Предпочтительный вариант осуществления 5: исследование слитого белка rLZ-8-HSA в лечении
Использование крыс Wistar в опытах, где используют 18 крыс весом приблизительно 100 г. Способ получения реагентов включает в себя этапы: растворения rLZ-8 в стерильном физиологическом растворе, и разбавления до получения групп дозировок 60 мкг/кг, 30 мкг/кг и 15 мкг/кг; растворения слитого белка rLZ-8-HSA в стерильном физиологическом растворе, и разбавления до получения групп дозировок 60 мкг/кг, 30 мкг/кг и 15 мкг/кг (исходя из дозы LZ-8); разбавления GenLeiScimax [инъекция рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ)], номер партии: 20130403, 75 мкг/ампула, до получения 13,5 мкг/мл и 0,1 мл на крысу с помощью стерильного физиологического раствора; разбавления инъекции Циклофосфамида (CP), номер партии 13020225, 200 мг/ампула, до получения 20 мг/мл и 0,1 мл на крысу с помощью стерильного физиологического раствора, или 20 мг/кг.
Эксперимент имеет группу с низкой дозировкой rLZ-8, группу со средней дозировкой rLZ-8, группу c высокой дозировкой rLZ-8, группу c низкой дозировкой rLZ-8-HSA, группу со средней дозировкой rLZ-8-HSA, группу c высокой дозировкой rLZ-8-HSA, и группу с позитивным контролем с использованием лекарственного средства (использование GenLeiScimax). Крысам каждой группы вводили с помощью инъекции циклофосфамид в хвостовую вену в течение трех дней, за исключением того, что стерильный физиологический раствор вводят здоровой контрольной группе, дозировка составляет 20 мг/мл и 0,1 мл на крысу. На третий день отбирают кровь из хвостовой вены, и подсчитывают лейкоциты с помощью цитоанализатора. После успешного моделирования на крыс каждой группы соответственно воздействуют с помощью rLZ-8, трех видов слитых белков, или положительного лекарственного средства (GenLeiScimax) с соответствующей дозировкой, и такую же дозировку стерильного физиологического раствора вводят крысам здоровой контрольной группы и СР-группы. Кровь отбирают из хвостовой вены на первый, третий и седьмой дни лечения, и лейкоциты подсчитывают с использованием цитоанализатора. Медицинская эффективность анализируется согласно количественному различию между лейкоцитами до и после воздействия.
Таблица 2Влияние rLZ-8 на модели крыс с лейкопенией (n=10)
группа
количество лейкоцитов до
на первый день лечения
на третий день лечения
на седьмой день лечения
здоровая контрольная группа
14,11×10<sup>9</sup>/л
14,36×10<sup>9</sup>/л
13,8×10<sup>9</sup>/л
12,13×10<sup>9</sup>/л
CP-контрольная группа
5,1×10<sup>9</sup>/л
5,3×10<sup>9</sup>/л
5,8×10<sup>9</sup>/л
9,27×10<sup>9</sup>/л
GenLeiScimax
4,55×10<sup>9</sup>/л
6,4×10<sup>9</sup>/л
11,83×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
11,17×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8(низкая дозировка)
3,71×10<sup>9</sup>/л
4,6×10<sup>9</sup>/л
9,3×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
11,2×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8(средняя дозировка)
3,12×10<sup>9</sup>/л
5,1×10<sup>9</sup>/л
9,7×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
12,78×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8(высокая дозировка)
4,09×10<sup>9</sup>/л
5,4×10<sup>9</sup>/л
9,6×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
14,5×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8-HSA(низкая дозировка)
3,11×10<sup>9</sup>/л
8,5×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
10,8×10<sup>9</sup>/л<sup>**</sup>
13,2×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8-HSA(средняя дозировка)
2,89×10<sup>9</sup>/л
9,2×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
11,98×10<sup>9</sup>/л<sup>**</sup>
13,4×10<sup>9</sup>/л
rLZ-8-HSA(высокая дозировка)
3,33×10<sup>9</sup>/л
8,4×10<sup>9</sup>/л<sup>*</sup>
14,4×10<sup>9</sup>/л<sup>**</sup>
15,5×10<sup>9</sup>/л
Примечание: сравнение с CP-контрольной группой, *<i>р</i><0,05, **<i>р</i><0,01
В таблице 2 проиллюстрировано, что на первый день воздействия количество лейкоцитов у крыс групп rLZ-8-HSA значительно возрастает по сравнению с крысами СР-группы, а на седьмой день воздействия, количество лейкоцитов в основном приближается к нормальному уровню. На первый день воздействия количество лейкоцитов у крыс групп rLZ-8-HSA значительно увеличивается по сравнению с крысами контрольной группы GenLeiScimax, а на седьмой день воздействия количество лейкоцитов в основном приближается к нормальному уровню. Следует подчеркнуть, что при сравнении с группами rLZ-8 при той же дозировке, группы rLZ-8-HSA имеют достаточный эффект пролиферации лейкоцитов с первого дня лечения, где количество лейкоцитов примерно в 2 раза больше, чем количество лейкоцитов групп rLZ-8; при одинаковом периоде воздействия, эффект пролиферации лейкоцитов группы с низкой дозировкой rLZ-8-HSA превосходит эффект пролиферации лейкоцитов группы с высокой дозировкой rLZ-8 и других групп rLZ-8.
Предпочтительный вариант осуществления 6: Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на меланому
in vivo
5
5
2
2
450
Эксперимент : анализ ингибирующего действия слитого белка rLZ-8-HSA на меланому с помощью метода WST-1, получение суспензии ткани меланомы; добавление 100 мкл тканевой суспензии в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты и подсчет с помощью микроскопа; доведение концентрации ткани до 2×10/мл с помощью DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитого белка rLZ-8-HSA и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентные концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 2×10/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на меланому (х±s, n=9)
БелокКонцентрация
rLZ-8
rLZ-8-HSA
5,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,427±0,44
0,411±0,31<sup>*</sup>
10,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,372±0,21
0,212±0,29<sup>*</sup>
15,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,302±0,24
0,118±0,11<sup>**</sup>
Примечание: сравнение с rLZ-8, *<i>р</i><0,05, **<i>р</i><0,05
in vivo
2
7
Эксперимент : во-первых, установление формы опухоли мыши, где клетки меланомы мыши B16-F10 культивируют с помощью DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубационном устройстве при 37°С в СО; медленная подкожная инъекция 200 мкл клеточной суспензии B16-F10 (содержащей от 1×10 клеток) с помощью 1 мл шприца в дорсальную и вентральную кожу мыши с тем, чтобы установить форму трансплантированной опухоли мыши.
in situ
Разделение на группы и способ лечения: 24 ч после инъекции опухолевых клеток, инъекция в хвостовую вену для групп rLZ-8 (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг), групп rLZ-8-HSA (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг, исходя из LZ-8), и группы дакарбазина (2,5 мг/кг) или группы физиологического раствора, где rLZ-8 и rLZ-8-HSA инъецируют один раз в день, дакарбазин непрерывно инъецируют в течение 5 дней, а затем инъецируют снова через 3 недели, где цикл лечения включает 28 дней; в процессе эксперимента, наблюдение за активными состояниями мыши, взвешивание один раз каждые семь дней, и отбор проб крови хвостовой вены мыши один раз в 2 недели; отделение тел опухолей по окончании эксперимента, взвешивание тел опухолей и регистрация; вычисление степени ингибирования лекарственных средств, использованных при лечении, на рост опухоли  в соответствии с формулой, что степень ингибирования опухоли=(средний вес опухоли в группе физиологического раствора - средний вес опухоли группы, получавшей лечение)/средний вес опухоли группы физиологического раствора.
P
Р
Ссылаясь на экспериментальные результаты: после взвешивания тел опухолей, вычисляется средний вес опухоли каждой группы; в соответствии с таблицей 4, показано, что через 28 дней, масса опухоли группы с высокой дозировкой rLZ-8-HSA меньше масс опухолей других групп; в пределах групп rLZ-8 или групп rLZ-8-HSA, чем больше концентрация лекарственного средства, тем меньше будет вес опухоли. Различие между группами rLZ-8-HSA и отрицательной контрольной группой является чрезвычайно важным. Разница между группой с низкой дозировкой, группой со средней дозировкой и группой с высокой дозировкой rLZ-8 является также значительной (n=10, <0,05). Разница между группой с низкой дозировкой, группой со средней дозировкой и группой с высокой дозировкой rLZ-8-HSA является также значительной (n=10, <0,05).
Таблица 4Влияние rLZ-8 на массу опухоли B16-F10 <i>in situ</i>
СпособкормленияГруппа
Непрерывное кормление в течение 28 дней
Количество животных
Масса опухоли (г)
степень ингибирования опухоли (%)
физиологический раствор
10
1,24±0,53
<sup>_____</sup>
дакарбазин
10
0,52±0,12<sup>**</sup>
62,57±0,27
низкая дозировка rLZ-8
10
0,53±0,21<sup>**##</sup>
56,72±0,41
средняя дозировка rLZ-8
10
0,43±0,17<sup>**##</sup>
64,91±0,77
высокая дозировка rLZ-8
10
0,25±0,04<sup>**</sup>
83,04±0,51<sup>##</sup>
низкая дозировка rLZ-8-HSA
10
0,35±0,11<sup>**##</sup>
71,77±0,31<sup>##</sup>
средняя дозировка rLZ-8-HSA
10
0,27±0,14<sup>**##</sup>
78,22±0,47<sup>##</sup>
высокая дозировка rLZ-8-HSA
10
0,13±0,05<sup>**</sup>
89,51±0,88<sup>##</sup>
Примечание: сравнение с контрольной группой, *<i>Р</i><0,05, **<i>Р</i> <0,01, причем эксперимент повторяют три раза, суммарные результаты имеют тенденцию быть одинаковыми, и таблица 4 является результатом только одного эксперимента; сравнение с группой дакарбазина, <sup>#</sup><i>P</i><0,05, <sup>##</sup><i>P</i><0,01, причем эксперимент повторяют три раза, суммарные результаты имеют тенденцию быть одинаковыми, и таблица 4 является результатом только одного эксперимента.
Предпочтительный вариант осуществления 7: ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA на асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши
in vitro
5
5
2
2
450
Эксперимент : анализ ингибирующего действия слитого белка rLZ-8-HSA на асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши с помощью метода WST-1, получение суспензии ткани мышиной асцитной опухоли Эрлиха S180; добавление 100 мкл тканевой суспензии в 900 мкл 2% ледяной уксусной кислоты и подсчет с помощью микроскопа; доведение концентрации ткани до 2×10/мл с использованием DMEM, содержащей 2% сыворотки теленка; соответственно получение слитого белка rLZ-8-HSA и rLZ-8 с тем же градиентом молярной концентрации, где имеются 3 градиентные концентрации, каждая концентрация занимает 9 лунок со 100 мкл на лунку; добавление суспензии ткани с концентрацией 2×10/мл со 100 мкл на лунку; встряхивание для равномерного смешивания, а затем помещение в инкубационное устройство при 37°C, 5% CO для инкубирования в течение 24 ч; после инкубации, добавление WST-1 с 20 мкл на лунку; помещение в инкубационное устройство при 37°С, 5% СО для инкубирования в течение 3 часов, а затем анализ OD (с помощью BIO-RAD); где результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5Ингибирующее действие слитого белка rLZ-8-HSA асцитную опухоль Эрлиха S180 мыши (х±s, n=9)
БелокКонцентрация
rLZ-8
rLZ-8-HSA
5,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,453±0,23
0,408±0,21<sup>*</sup>
10,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,366±0,31
0,233±0,18<sup>*</sup>
15,0×10<sup>-9</sup> моль/л
0,345±0,27
0,127±0,15<sup>**</sup>
Примечание: сравнение с группами rLZ-8, *<i>р</i><0,05, **<i>р</i><0,05
in vivo
Эксперимент : экспериментальный материал: мыши весом 18-22 г из Центра лабораторных животных Цзилиньского университета; штаммы клеток асцитной опухоли Эрлиха предоставлены лабораторией изобретателя; Цитоксан (CTX) от Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd, номер партии которого 06101921; экспериментальные группы асцитной опухоли S180 и солидной опухоли соответственно содержат здоровую контрольную группу, группу отрицательного контроля, группу положительного контроля, группу с низкой дозировкой rLZ-8 (0,25 мг/кг), группу со средней дозировкой rLZ-8 (0,5 мг/кг), группу с высокой дозировкой rLZ-8 (1 мг/кг), группу с низкой дозировкой rLZ-8-HSA (0,25 мг/кг), группу со средней дозировкой rLZ-8-HSA (0,5 мг/кг) и группу с высокой дозировкой rLZ-8-HSA (1мг/кг), где дозировку в группах rLZ-8-HSA судят исходя из дозировки LZ-8, причем каждая группа включает в себя 10 мышей.
7
-1
Экспериментальный метод: экспериментальный метод подкожного ингибирования опухоли S180: отбор хорошо растущих клеток S180, разбавление с помощью подходящего количества стерильного физиологического раствора для приготовления суспензии клеток опухоли, клетки которой определены как 10 л, подкожная инъекция в правую подмышку каждой мыши с дозировкой 20 мл (за исключением здоровой контрольной группы); лечение мышей через 24 часа; внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора для здоровой контрольной группы и группы отрицательного контроля с дозировкой 0,2 мл на мышь в день; внутрибрюшинная инъекция 20 мг/кг циклофосфамида для положительной контрольной группы с дозировкой 0,2 мл на мышь в день; проведение инъецирования в хвостовую вену для групп rLZ-8 с соответствующими дозировками, 0,2 мл на мышь в день и сроком 10 дней; перед инъекцией и 10 дней после инъекции, отбор образца крови из орбитального венозного сплетения мыши и подсчет белых клеток крови клинической лабораторией Первой больницы Цзилиньского университета; на следующий день после инъекции, умерщвление всех мышей путем смещения шейных позвонков, препарирование и изъятие опухолевых блоков, взвешивание и расчет степени ингибирования опухоли в соответствии со следующей формулой:
Степень ингибирования опухоли (%)=(средний вес опухоли в контрольных группах - средний вес опухоли в экспериментальных группах)/средний вес опухоли в контрольных группах × 100%.
Результат эксперимента: экспериментальные результаты подкожного ингибирования опухоли S180: ссылаясь на таблицу 6, три группы rLZ-8 все способны ингибировать рост S180, где их степень ингибирования опухоли составляет соответственно 16,8%, 25,7% и 45,5%. По сравнению с группой отрицательного контроля, массы опухолей групп rLZ-8 имеют существенную разницу (P<0,01). По сравнению с группой отрицательного контроля, массы опухолей групп rLZ-8-HSA имеют существенную разницу (P<0,01). В то же время, по сравнению с группами rLZ-8, массы опухолей групп rLZ-8-HSA также имеют существенное различие (P<0,01).
Таблица 6Ингибирующее действие rLZ-8 на трансплантированную опухоль S180 мыши (х±s, n=10)
Группа
Масса опухоли (г)
степень ингибирования опухоли (%)
отрицательный контроль
1,01±0,03
<sup>_____</sup>
CTX
0,36±0,02<sup>*</sup>
64,3
низкая дозировка rLZ-8
0,83±0,03<sup>*</sup>
17,8
средняя дозировка rLZ-8
0,74±0,02<sup>*</sup>
26,7
высокая дозировка rLZ-8
0,57±0,03<sup>*</sup>
43,5
низкая дозировка rLZ-8-HSA
0,73±0,03<sup>*#</sup>
27,7
средняя дозировка rLZ-8-HSA
0,44±0,05<sup>*#</sup>
56,4
высокая дозировка rLZ-8-HSA
0,21±0,08<sup>**##</sup>
29,3
Примечание: сравнение с группой отрицательного контроля, *Р<0,05, **Р<0,01; сравнение с группами rLZ-8, <sup>#</sup>P<0,05, <sup>##</sup>P<0,01.
Предпочтительный вариант осуществления 8: фармакодинамический эксперимент с слитым белком rLZ-8-HSA по лечению тромбоцитопении мышей, вызванной циклофосфамидом
Экспериментальное лекарственное средство: приготовление групп дозировок 19,25 мкг/кг и 9,625 мкг/кг рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы (rLZ-8) со стерильной водой для инъекций, и 0,2 мл на мышь, а также приготовление групп дозировок 19,25 мкг/кг и 9,625 мкг/кг (исходя из LZ-8) слитого белка rLZ-8-HSA рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодермы.
-1
Лекарственное средство положительного контроля: тромбопоэтин (THPO) от Shenyang 3SBio Inc., с дозировкой 770 мкг×кг/день и 0,2 мл на мышь.
Химиотерапевтическое лекарственное средство: циклофосфамид (Cy) от Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd, номер партии которого 12112121, 200 мг/флакон; приготовление до получения 100 мкг/кг, 0,2 мл на мышь с помощью стерильной воды для инъекций.
Разведение тромбоцитов: мочевина: 1,3 г; цитрат натрия: 0,5 г; формальдегид: 0,1 мл; добавление дистиллированной воды до 100 мл для смешивания, а затем фильтрация для дальнейшего использования.
9
Экспериментальный метод: разделение экспериментальных животных на 5 групп, причем каждая группа содержит 10 мышей с 5 самцами и 5 самками; за исключением здоровой контрольной группы (инъецировали физиологический раствор, имеющий одинаковый объем), внутрибрюшинное введение с помощью инъекции циклофосфамида мышам с дозировкой 100 мг/кг, 0,2 мл на мышь в день, в течение трех дней; когда количество тромбоцитов уменьшалось до уровня ниже 300×10/л, подкожное введение с помощью инъекции rLZ-8, слитого белка rLZ-8-HAS (19,25 мкг/кг, 9,625 мкг/кг, 0,2 мл на мышь в день), и положительного лекарственного средства (THPO 770 мкг/кг, 0,2 мл на мышь в день) в соответствии с указанными выше группами с соответствующими дозировками, и введение с помощью инъекции физиологического раствора, имеющего объем равный объему в здоровой контрольной группе и группе СР; соответственно отбор проб крови из хвостовой вены мыши на 3 день, 7 день и 14 день после лечения, подсчет тромбоцитов с помощью линзы с сильным увеличением, где его результаты приведены в таблице 7.
Экспериментальный результат: по сравнению с группой CP, число тромбоцитов мышей из групп, подвергнутых лечению, значительно увеличилось на третий день, и вернулось к нормальному уровню на седьмой день, причем существует значительная разница (р<0,05); число тромбоцитов мышей из групп rLZ-8-HSA значительно увеличилось и вернулось к нормальному уровню на третий день, причем существует значительная разница (р<0,05) по сравнению с группой СР, которая является статистически значимой.
Таблица 7Экспериментальные результаты rLZ-8 при лечении тромбоцитопении мышей (х±s, n=10) (единица измерения: ×10<sup>9</sup>/л)
группа
до
после
3 день
7 день
14 день
здоровая контрольная группа
838±0,11
946±0,18
870±0,23
760±0,31
965±0,70
CP-контрольная группа
850±0,34
239±0,12
256±0,93
301±0,30
323±0,67
THPO
851±0,34
284±0,19
390±0,38
420±0,32
689±0,65
rLZ-8 (9,625 мкг/кг)
839±0,40
201±0,41
483±0,45
585±0,78
898±0,61<sup>*</sup>
rLZ-8 (19,25 мкг/кг)
946±0,45
226±0,78
501±0,48
680±0,28
1021±0,31<sup>**</sup>
rLZ-8-HSA (9,625 мкг/кг)
843±0,65
261±0,52
624±0,43<sup>*</sup>
697±0,43<sup>*</sup>
929±0,61<sup>**</sup>
rLZ-8-HSA (19,25 мкг/кг)
852±0,82
246±0,36
760±0,38<sup>*</sup>
978±0,67<sup>*</sup>
1035±0,78<sup>**</sup>
Примечание: существует значительная разница по сравнению с группой СР, где *р<0,05, **р<0,01
Предпочтительный вариант осуществления 9: получение противоопухолевый композиции rLZ-8-HSA
1) В соответствии с приведенными выше фармакологическими экспериментами доказано, что противоопухолевое действие rLZ-8-HSA является чрезвычайно эффективным по поддержанию уровня белых кровяных телец в организме без побочных токсических эффектов. Поэтому, считается, что rLZ-8-HSA подходит для медицины и является безопасным.
2) В соответствии с настоящим изобретением, применение rLZ-8-HSA в качестве противоопухолевого лекарственного средства может быть в форме для перорального применения и в форме для парентерального применения. Их дозировка зависит от таких факторов, как симптомы, возраст и вес. Для формы для перорального применения для взрослого, 10-1000 мг за раз и несколько раз в день; для формы для парентерального введения, 10-100 мг за раз и несколько раз в день.
3) Настоящее изобретение включает в себя пероральные таблетки и капсулы с гранулами (включая твердые и мягкие капсулы), причем вышеуказанные формы содержат rLZ-8 и, по меньшей мере, один инертный разбавитель (например, лактоза, маннит, глюкоза, крахмал, поливинилпирролидон). Кроме инертного разбавителя, фармацевтически приемлемые добавки, такие как смазывающие вещества, дезинтегрирующие вещества и стабилизаторы также могут быть добавлены. При необходимости таблетки или гранулы могут быть покрыты с помощью кишечно- или желудочно-растворимого вещества в один или более слоев. Непарентеральные инъекции содержат rLZ-8-HSA и, по меньшей мере, один инертный разбавитель (такой как дистиллированная вода, физиологический раствор). Или rLZ-8-HSA может быть получен в виде лиофилизированных порошков, которые растворяют в инертном растворителе для инъекций перед использованием.
(1) Приготовление 1
Растворение 1000 мг в rLZ-8-HSA в 100 мл стерильного физиологического раствора, равномерное смешивание и разделение rLZ-8-HSA во флаконы для лекарственного средства с концентрацией 10 мг/мл/ампула, запечатывание и стерилизация для образования конечного продукта; причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к инъекционной жидкости Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(2) Приготовление 2
Приготовление капсул с использованием 100 г rLZ-8-HSA и 0,5 кг фармацевтического крахмала с использованием обычных технологий и устройств для получения капсул, где rLZ-8-HSA делят на гранулы по 10 мг/гранула, причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к капсулам Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(3) Приготовление 3
Приготовление таблеток с использованием 100 г rLZ-8-HSA, 560 г микрокристаллической целлюлозы, 380 г безводной лактозы и 200 г стеарата магния с использованием обычных технологий и устройств для получения таблеток, где rLZ-8-HSA делят на 10 мг/таблетка, причем другие мероприятия находятся в соответствии с требованиями к таблеткам Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.
(4) Приготовление 4
Приготовление жидкой лекарственной формы для перорального применения с соответствующим количеством rLZ-8-HSA с использованием обычных технологий и устройств для получения жидкой лекарственной формы для перорального применения в соответствии с требованиями к жидким лекарственным формам для перорального применения Фармакопеи Китайской Народной Республики, 2010.