АНТИТЕЛА И ИХ КОНЪЮГАТЫ

1. Конъюгат антитела, включающий (1) антитело против VEGF-A и (2) полимер, содержащий фосфорилхолин, где полимер ковалентно связан с антителом через цистеин вне вариабельной области антитела, причем указанный цистеин добавлен с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
2. Конъюгат антитела по п. 1, где антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, причем указанная тяжелая цепь включает Fc область.
3. Конъюгат антитела по п. 2, где цистеин находится в Fc области тяжелой цепи.
4. Конъюгат антитела по п. 3, где антитело против VEGF-A представляет собой иммуноглобулин G (IgG).
H
H
H
L
L
L
5. Конъюгат антитела по п. 3 или 4, где тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), и легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).
6. Конъюгат антитела по п. 4 или 5, где изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой человеческий IgG1.
7. Конъюгат антитела по п. 6, где константный домен тяжелой цепи антитела против VEGF-A имеет одну или более мутаций относительно константного домена человеческого IgG1 для модуляции эффекторной функции.
8. Конъюгат антитела по п. 7, где мутации находятся в одном или более из следующих аминокислотных положений (нумерация EU): Е233Х, L234X, L235X, G236X, G237X, А327Х, А330Х и Р331Х, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту.
9. Конъюгат антитела по п. 8, где мутации выбраны из группы, состоящей из (нумерация EU): Е233Р, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S.
10. Конъюгат антитела по п. 9, включающий следующие мутации: L234A, L235A и G237A (нумерация EU).
11. Конъюгат антитела по п. 10, где цистеин находится в тяжелой цепи антитела против VEGF-A и представляет собой Q347C (нумерация EU) или L443C (нумерация EU).
12. Конъюгат антитела по п. 11, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO. 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO. 2.
13. Конъюгат антитела по п. 11, где цистеин представляет собой L443C (нумерация EU).
14. Конъюгат антитела по любому из пп. 1-13, где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономеры 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфата (МРС), как указанные ниже:
15. Конъюгат антитела по п. 14, где полимер имеет три или более плеча или синтезирован с инициатором, включающим 3 или более сайтов инициации полимера.
16. Конъюгат антитела по п. 14, где полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера.
17. Конъюгат антитела по п. 16, где полимер имеет 2, 3, 6 или 9 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера.
18. Конъюгат антитела по п. 17, где полимер имеет 9 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 9 сайтов инициации полимера.
19. Конъюгат антитела по п. 18, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до приблизительно 1750000 Да, определяемую с помощью эксклюзионной хроматографии с многоугловым светорассеянием (здесь и далее "SEC-MALS").
20. Конъюгат антитела по п. 19, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 500000 до приблизительно 1000000 Да.
21. Конъюгат антитела по п. 20, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 750000 до приблизительно 850000 Да.
22. Конъюгат антитела по любому из пп. 1-21, который является очищенным.
23. Конъюгат антитела по п. 22, в котором полимер является полидисперсным.
24. Конъюгат антитела по п. 23, где полимер имеет индекс полидисперсности (ИП) меньше чем приблизительно 1,2.
25. Конъюгат антитела, включающий иммуноглобулин G (IgG) против VEGF-А, связанный с полимером, включающим мономеры МРС, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-А представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-А представляет собой SEQ ID NO: 2, и где антитело связано с полимером в положении С449 последовательности SEQ ID NO: 1.
26. Конъюгат антитела по п. 25, где
полимер имеет 9 плеч; и
полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до приблизительно 900000 Да.
27. Конъюгат антитела по п. 25, имеющий следующую структуру:
где каждая тяжелая цепь антитела против VEGF-A обозначена буквой Н, и каждая легкая цепь антитела против VEGF-А обозначена буквой L;
полимер связан с антителом против VEGF-A через сульфгидрильную группу С443 (нумерация EU), причем связь изображена на одной из тяжелых цепей;
PC представляет собой  где волнистая линия указывает точку присоединения к остальной части полимера, где X представляет собой a) OR, где R представляет собой Н, метил, этил, пропил, изопропил, b) Н или с) любой галогенид, включая Br; и
n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, n8 и n9 являются одинаковыми или различными, такими что сумма n1, n2, n3, n4, n5, n6, n6, n7, n8 и n9 равна 2500 плюс или минус 15%.
28. Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитела по любому из пп. 1-27 в жидком растворе.
29. Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат антитела по любому из пп. 1-27 и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Антитело против VEGF-A, включающее тяжелую цепь и легкую цепь, где:
H
H
H
L
L
L
тяжелая цепь включает CDR1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), и легкая цепь включает CDR1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14); и
изотип тяжелой цепи представляет собой IgG1, где константный домен IgG1 включает одну или более из следующих мутаций для модуляции эффекторной функции (нумерация EU): Е233Р, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S.
31. Антитело по п. 30, включающее следующие мутации (нумерация EU): L234A, L235A и G237A.
32. Антитело по п. 30, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.
33. Антитело по любому из пп. 30-32, представляющее собой IgG.
34. Способ лечения или профилактики офтальмологического заболевания, включающий введение конъюгата антитела по любому из пп. 1-27 или фармацевтической композиции по п. 28 или п. 29.
35. Способ лечения или профилактики по п. 34, где офтальмологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), возрастной макулярной дегенерации (ВМД), диабетического макулярного отека (ДМО), патологической миопии, болезни фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоза глаз, окклюзии центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзии ветвей центральной вены сетчатки (ОВЦВС), неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации сетчатки, ретинопатии недоношенных (РН), субконъюнктивального кровоизлияния и гипертонической ретинопатии.
36. Способ лечения или профилактики по п. 34, где заболевание представляет собой диабетическую ретинопатию.
37. Способ получения конъюгата антитела, включающего антитело против VEGF-A, конъюгированное с полимером, содержащим фосфорилхолин, включающий стадию конъюгирования антитела против VEGF-A с полимером, содержащим фосфорилхолин;
где антитело против VEGF-A включает остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантньгх ДНК, и где цистеин находится вне вариабельной области антитела;
где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает сульфгидрильную специфическую реакционноспособную группу, выбранную из группы, состоящей из малеимида, винилсульфона, ортопиридилдисульфида и иодацетамида; и
где сульфгидрильная специфическая реакционноспособная группа на полимере, содержащем фосфорилхолин, взаимодействует с остатком цистеина на антителе против VEGF-A с получением конъюгата антитела.
38. Способ по п. 37, где антитело против VEGF-A представляет собой иммуноглобулин G (IgG), а цистеин находится в Fc области антитела.
H
H
H
L
L
L
39. Способ по п. 37 или 38, где антитело против VEGF-A включает легкую цепь и тяжелую цепь, где тяжелая цепь антитела против VEGF-A включает CDR1: GYDFTHYGMN (SEQ ID NO: 9), CDR2: WINTYTGEPTYAADFKR (SEQ ID NO: 10) и CDR3: YPYYYGTSHWYFDV (SEQ ID NO: 11), и легкая цепь антитела против VEGF-A включает CDR1: SASQDISNYLN (SEQ ID NO: 12), CDR2: FTSSLHS (SEQ ID NO: 13) и CDR3: QQYSTVPWT (SEQ ID NO: 14).
40. Способ по п. 38 или 39, где изотип тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой IgG1.
41. Способ по п. 40, где константный домен антитела против VEGF-A имеет одну или более мутаций относительно константного домена IgG1 для модуляции эффекторной функции.
42. Способ по п. 41, где мутации находятся в одном или более из следующих аминокислотных положений (нумерация EU): Е233Х, L234X, L235X, G236X, G237X, G236X, D270X, K322Х, А327Х, Р329Х, А330Х, А330Х, Р331Х и Р331Х, где X представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту.
43. Способ по п. 42, где мутации выбраны из группы, состоящей из (нумерация EU) Е233Р, L234V, L234A, L235A, G237A, A327G, A330S и P331S.
44. Способ по п. 43, где мутации представляют собой (нумерация EU) L234A, L235A и G237A.
45. Способ по п. 44, где остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, выбран из группы, состоящей из Q347C (нумерация EU) и L443C (нумерация EU).
46. Способ по п. 45, где остаток цистеина, добавленный с помощью технологии рекомбинантных ДНК, представляет собой L443C (нумерация EU).
47. Способ по п. 45 или 46, где последовательность тяжелой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 1, и последовательность легкой цепи антитела против VEGF-A представляет собой SEQ ID NO: 2.
48. Способ по п. 37, где сульфгидрильная специфическая реакционноспособная группа представляет собой малеимид.
49. Способ по п. 48, где полимер, содержащий фосфорилхолин, включает мономеры 2-(метакрилоилоксиэтил)-2'-(триметиламмоний)этилфосфата (МРС), как указанные ниже:
50. Способ по п. 49, где полимер имеет три или более плеча или синтезирован с инициатором, включающим 3 сайта инициации полимера.
51. Способ по п. 49, где полимер имеет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 сайтов инициации полимера.
52. Способ по п. 51, где полимер имеет 2, 3, 6 или 9 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 2, 3, 6 или 9 сайтов инициации полимера.
53. Способ по п. 52, где полимер имеет 9 плеч или синтезирован с инициатором, включающим 9 сайтов инициации полимера.
54. Способ по п. 53, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 300000 до 1750000 Да.
55. Способ по п. 54, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до 1000000 Да.
56. Способ по п. 55, где полимер имеет молекулярную массу от приблизительно 600000 до 850000 Да.
57. Способ по п. 37, дополнительно включающий стадию взаимодействия антитела против VEGF-A с тиоловым восстановителем в условиях, при которых получают восстановленную сульфгидрильную группу цистеина с образованием восстановленного антитела против VEGF-A, в котором все цистеиновые остатки восстановлены.
4
3
58. Способ по п. 57, где тиоловый восстановитель выбран из группы, состоящей из трис[2-карбоксиэтил]фосфин гидрохлорида (ТСЕР), дитиотреитола (DTT), дитиоэритритола (DTE), боргидрида натрия (NaBH), цианоборгидрида натрия (NaCNBH), β-меркаптоэтанола (ВМЕ), гидрохлорида цистеина и цистеина.
59. Способ по п. 58, где тиоловый восстановитель представляет собой ТСЕР.
60. Способ по п. 59, где концентрация тиолового восстановителя составляет от 1-до 100-кратного молярного избытка относительно концентрации антитела против VEGF-A.
61. Способ по п. 60, где концентрация тиолового восстановителя составляет от 20-до 50-кратного молярного избытка относительно концентрации антитела против VEGF-A.
62. Способ по п. 60, дополнительно включающий стадии удаления тиолового восстановителя из восстановленного антитела против VEGF-A и обработки восстановленного антитела против VEGF-A окислителем.
4
63. Способ по п. 62, где окислитель представляет собой воздух, водный CuSO или дегидроаскорбиновую кислоту (ДАК).
64. Способ по п. 37, дополнительно включающий стадию очистки конъюгата антитела.
65. Способ по п. 64, где конъюгат антитела очищают с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии и их комбинаций.
66. Способ по п. 65, где очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 20% биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.
67. Способ по п. 66, где очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 50% биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.
68. Способ по п. 67, где очищенный конъюгат антитела сохраняет по меньшей мере 90% биологической активности относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.
69. Способ по п. 66, где очищенный конъюгат антитела имеет увеличенный период полувыведения относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.
70. Способ по п. 69, где очищенный конъюгат антитела имеет по меньшей мере 1,5-кратное увеличение периода полувыведения относительно неконъюгированного антитела против VEGF-A.
71. Способ по п. 37, дополнительно включающий стадию полимеризации свободнорадикально полимеризуемого мономера, содержащего фосфорилхолин, в полимеризационной среде с получением полимера, содержащего фосфорилхолин, причем среда включает
радикально полимеризуемый мономер, содержащий фосфорилхолин;
t
t
t
(q-1)
t
q
(q-1)+
(q-1)+
q+
катализатор на основе переходного металла M, где M представляет собой переходный металл, q представляет собой максимальную степень окисления металла, а q-1 представляет собой степень окисления металла, который может действовать как катализатор, где катализатор на основе переходного металла поставляют в виде соли формы MX', где X' представляет собой противоион или группу, или катализатор на основе переходного металла поставляют in situ путем обеспечения неактивной соли металла в ее высшей степени окисления MX' вместе с восстановителем, который способен восстанавливать переходный металл из окисленного неактивного состояния до восстановленного активного состояния;
лиганд; и
инициатор.
72. Способ по п. 71, где радикально полимеризуемый мономер, содержащий фосфорилхолин, представляет собой
1-6
где R1 представляет собой Н или C алкил;
каждый R2, R3, R4 представляет собой метил; и
каждый из X и Y равен 2.
t
73. Способ по п. 72, где M выбран из группы, состоящей из Cu, Fe, Ru, Cr, Mo, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au и Ag.
t
(q-1)
(q-1)+
74. Способ по п. 73, где металлический катализатор поставляют в виде соли формы MX'.
t
1-6
4
1/2
4
1/3
4
1/2
2
4
2
1-6
(q-1)+
1+
2+
2+
2+
2+
2+
3+
3+
2+
+
2+
+
+
+
75. Способ по п. 74, где M выбран из группы, состоящей из Cu, Fe, Ru, Cr, Мо, W, Mn, Rh, Re, Co, V, Zn, Au, и Ag, и X' выбран из группы, состоящей из галогена, C алкокси, (SO), (PO), (R7PO), (R7PO), трифлата, гексафторфосфата, метансульфоната, арилсульфоната, CN и R7CO, где R7 представляет собой Н или прямую или разветвленную C алкильную группу, которая может быть замещена 1-5 галогеном.
t
(q-1)+
1+
76. Способ по п. 75, где M представляет собой Cu, и X' представляет собой Br.
t
(q-1)+
77. Способ по п. 72, где M поставляют in situ.
t
q
2
q+
78. Способ по п. 77, где MX представляет собой CuBr.
79. Способ по п. 72, где восстановитель представляет собой неорганическое соединение.
80. Способ по п. 79, где неорганическое соединение выбрано из группы, состоящей из соединения серы с низкой степенью окисления, гидросульфита натрия, неорганической соли, включающей ион металла, металла, гидразингидрата и производных таких соединений.
81. Способ по п. 80, где восстановитель представляет собой металл.
0
82. Способ по п. 81, где восстановитель представляет собой Cu.
83. Способ по п. 72, где восстановитель представляет собой органическое соединение.
84. Способ по п. 83, где органическое соединение выбрано из группы, состоящей из алкилтиолов, меркаптоэтанола или карбонильных соединений, которые могут быть легко енолизованы, аскорбиновой кислоты, ацетилацетоната, камфорсульфоновой кислоты, гидроксиацетона, восстанавливающих сахаров, моносахаридов, глюкозы, альдегидов и производных таких органических соединений.
85. Способ по п. 72, где лиганд выбран из группы, состоящей из 2,2'-бипиридина, 4,4'-ди-5-нонил-2,2'-бипиридина, 4,4-динонил-2,2'-дипиридила, 4,4',4''-трис(5-нонил)-2,2':6',2''-терпиридина, N,N,N',N',N''-пентаметилдиэтилентриамина, 1,1,4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина, трис(2-диметиламиноэтил)амина, N,N-бис(2-пиридилметил)октадециламина, N,N,N',N'-тетра[(2-пиридил)метил]этилендиамина, трис[(2-пиридил)метил]амина, трис(2-аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-бутокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина, трис(2-бис(3-(2-этилгексокси)-3-оксопропил)аминоэтил)амина и трис(2-бис(3-додекокси-3-оксопропил)аминоэтил)амина.
86. Способ по п. 85, где лиганд представляет собой 2,2'-бипиридин.
87. Способ по п. 72, где инициатор имеет структуру:
где R1 представляет собой нуклеофильную реакционноспособную группу, R2 включает линкер, и R3 включает фрагмент инициатора полимерного синтеза, имеющий структуру
где R4 и R5 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкилена, алкокси, карбоксиалкила, галогеналкила, циклоалкила, циклического простого алкилового эфира, алкенила, алкенилена, алкинила, алкинилена, циклоалкилена, гетероциклоалкила, гетероциклоалкилена, арила, арилена, ариленокси, гетероарила, амино, амидо и любой их комбинации;
Z представляет собой галоген или CN; и s представляет собой целое число от 1 до 20.
88. Способ по п. 87, где Z представляет собой Br, а каждый из R4 и R5 представляет собой метил.
2
89. Способ по п. 88, где R1 выбран из группы, состоящей из NH-, ОН- и SH-.
90. Способ по п. 89, где R1 представляет собой NH2-.
91. Способ по п. 90, где R2 представляет собой алкил, замещенный алкил, алкилен, алкокси, карбоксиалкил, галогеналкил, циклоалкил, циклический простой алкиловый эфир, алкенил, алкенилен, алкинил, алкинилен, циклоалкилен, гетероциклоалкил, гетероциклоалкилен, арил, арилен, ариленокси, гетероарил, амино, амидо и любую их комбинацию.
92. Способ по п. 91, где R2 представляет собой
где X и Y являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 1 до 20.
93. Способ по п. 92, где каждый из X и Y равен 4.
94. Способ по п. 93, где R3 дополнительно включает
где R6, R7 и R8 являются одинаковыми или различными и выбраны из группы, состоящей из
и
где Z представляет собой NCS, F, Cl, Br или I.
95. Способ по п. 94, где Z представляет собой Br.
96. Способ по п. 94, где каждый из R6, R7 и R8 представляет собой
97. Способ по п. 96, где инициатор имеет структуру
где А и В являются одинаковыми или различными и представляют собой целые числа от 2 до 12, и Z представляет собой Вr.
98. Способ по п. 97, где каждый из А и В равен 4.
99. Способ по п. 98, дополнительно включающий стадию взаимодействия полимера с малеимидным реагентом с получением полимера, имеющего концевой малеимид.
100. Способ по п. 99, где малеимидный реагент представляет собой
101. Антитело, включающее
аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая включает SEQ ID NO: 1; и
аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 2.
102. Антитело по п. 101, которое представляет собой человеческий IgG1, и константный домен тяжелой цепи включает одну или более мутаций, которые снижают иммунно-опосредованную эффекторную функцию.
103. Конъюгат антитела по п. 101, где антитело дополнительно конъюгировано с полимером с образованием биоконъюгата, который имеет молекулярную массу от приблизительно 350000 до 1900000 дальтон.
104. Конъюгат антитела по п. 103, где индекс полидисперсности (ИП) равен или меньше 1,5.
105. Антитело, связывающееся с VEGF-A, включающее:
h
h
CDR1, который представляет собой CDR1 в SEQ ID NO: 1;
h
h
CDR2, который представляет собой CDR2 в SEQ ID NO: 1;
h
h
CDR3, который представляет собой CDR3 в SEQ ID NO: 1;
l
l
CDR1, который представляет собой CDR1 в SEQ ID NO: 2;
l
l
CDR2, который представляет собой CDR2 в SEQ ID NO: 2;
l
l
CDR3, который представляет собой CDR3 в SEQ ID NO: 2;
по меньшей мере одну из следующих мутаций (нумерация EU): L234A, L235A и G237A; и
по меньшей мере одну из следующих мутаций (нумерация EU): Q347C или L443C.
106. Антитело по п. 105, где антитело включает все три из следующих мутаций (нумерация EU) L234A, L235A и G237A, и где антитело включает L443C (нумерация EU).
107. Способ получения конъюгированного белка, включающий
восстановление одного или более цистеинов в белке с образованием декэппированного белка в растворе;
повторное окисление декэппированного белка для восстановления по меньшей мере одной дисульфидной связи в восстановленном белке, наряду с обеспечением того, что сконструированный остаток цистеина в белке остается в свободной тиоловой форме, чтобы таким образом образовать в растворе повторно окисленный декэппированный белок;
добавление по меньшей мере одного эксципиента к раствору, где эксципиент уменьшает осаждение белка, индуцированное полимером;
добавление полимера к раствору; и
конъюгирование полимера с повторно окисленным декэппированным белком в сконструированном остатке цистеина с образованием конъюгированного белка.
108. Способ по п. 107, где белок представляет собой антитело, гибридный белок слияния, содержащий антитело, или их связывающий фрагмент.
109. Способ по п. 108, где эксципиент представляет собой кислоту или основание.
110. Способ по п. 109, где эксципиент выбран из группы, состоящей из по меньшей мере одного из детергента, сахара и заряженной аминокислоты.
111. Способ по п. 107, где взаимодействие полимера с восстановленным белком осуществляют в водной среде при рН от 6,0 до 8,5.
112. Способ по п. 107, где количество восстановленного белка меньше, чем количество полимера.
113. Способ по п. 107, где полимер конъюгирует с белком при температуре от 2 до 37°С.
114. Способ по п. 107, дополнительно включающий способ взаимодействия раствора, содержащего конъюгированный белок, со средой для ионообменной или гидрофобной хроматографии или средой для аффинной хроматографии.
115. Способ по п. 114, где среда для ионообменной или гидрофобной хроматографии или среда для аффинной хроматографии отделяет конъюгированный белок от свободного полимера и повторно окисленного декэппированного белка.
116. Способ по п. 107, где полимер включает цвиттер-ион.
117. Способ по п. 107, где полимер включает фосфорилхолин.
118. Способ по п. 107, где полимер включает линкер PEG, соединяющий центр точки разветвления полимера с малеимидной функциональной группой.
119. Конъюгат антитела против VEGF, способный блокировать по меньшей мере 90% взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF-рецептором.
120. Конъюгат антитела против VEGF, блокирующий по меньшей мере 95% взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF-рецептором.
121. Антитело против VEGF, блокирующее по меньшей мере 90% взаимодействия между лигандом VEGF и VEGF-рецептором.