СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ, РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА И ГЕМОФИЛЕЗА СВИНЕЙ
METHOD FOR PREPARING HYPERIMMUNE SERUM AGAINST PORCINE CIRCOVIRUS, REPRODUCTIVE-RESPIRATORY SYNDROME AND HEMOPHILOSIS

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной эпизоотологии и иммунологии, и касается средств для специфической пассивной профилактики и лечения ассоциированных болезней вирусно-бактериальных этиологии.
В структуре инфекционных респираторных болезней поросят - отъемышей цирковирусная инфекция занимает высокий удельный вес.Получены положительные результаты при серологическом исследовании в ИФА среди разных половозрастных групп: доращивание - 50%, ремонтный молодняк - 81,0%, свиноматки - 62,7%, хряки - 30%, что в среднем составляет - 55,9% (Шкаева М.А., Верховский О.А. с сотр., 2005). Заболевание характеризуется тем, что на фоне развития иммунодефицитного состояния наслаиваются сопутствующие инфекции вирусной и бактериальной этиологии, в частности вирус репродуктивно-респираторного синдрома, возбудитель гемофилеза и др. (Шахов А.Г. и др., 2003, 2008, 2009; Федоров Ю.Н., 2006).
Ассоциированные формы цирковирусной инфекции наносят свиноводческим комплексам значительный экономический ущерб, складывающийся из высокой смертности заболевших, снижения привесов, больших затрат на лечение больных и проведение общих ветеринарно-санитарных и специфических профилактических мероприятий.
Особенностью инфекционного процесса является размножение цирковируса в активно делящихся клетках, в частности в макрофагах. Экспериментальная или естественная иммуноактивация может привести к повышенному содержанию макрофагов и, следовательно, увеличивает репликацию цирковируса (Krakowka S.A. et al., 2001; Segales J., 2002; Allan J.M. et al., 2000).
В естественных условиях клинические признаки цирковирусной инфекции свиней отмечаются у 5-12 недельных поросят в виде синдрома послеотъемного мультисистемного истощения с дальнейшим развитием респираторной патологии в результате наслоения сопутствующих вирусных и бактериальных возбудителей. В разных хозяйствах заболеваемость молодняка обычно составляет 5…20% (иногда 50…70%), летальность достигает 80…100%. Частота заболевания и тяжесть его течения находятся в прямой зависимости от концентрации поголовья животных в хозяйстве.
На современном этапе развития ветеринарной науки в области промышленного свиноводства эффективных средств и специфической профилактики и лечения свиней при ассоциированной форме течения цирковирусной инфекции не существует. Профилактические мероприятия сводятся к тщательной дезинфекции помещений, недопущению заноса инфицированных животных из неблагополучных хозяйств и другим карантинным действиям. Внедрение такой стратегии снижения заболеваемости поросят и санитарно-гигиенических мероприятий как ранний отъем поросят от свиноматок, откорм в группах, подобранных по возрасту, оказались малоуспешными в профилактике вирусных заболеваний послеотъемного периода поросят (Орлянкин Б.Г., Алипер Т., Непоклонов Е.А., 2002, 2003, 2007, 2009; Дрю Т., 2005).
С синдромом мультисистемного послеотъемного истощения поросят связывают несколько респираторных патогенов как вирусной, так и бактериальной природы. Наиболее часто в этой связи находят цирковирус второго типа, вирус репродуктивного и респираторного синдромов, возбудитель гемофилеза.
В настоящее время для специфической профилактики цирковирусной инфекции свиней в нашей стране применяется инактивированная тканевая вакцина и проходит широкое производственное испытание вакцина «Веррес - Цирко» производства ООО «Ветбиохим» г.Москва. Однако не разработаны поливалентные вакцины и гипериммунные сыворотки против ЦВИС и вторичных инфекций (Гречухин А.Н., 2008).
Предложен биопрепарат, содержащий поливалентную гипериммунную сыворотку свиней с антителами к возбудителям сальмонеллеза, колибактериоза, пастереллеза, рожи и трансмиссивного гастроэнтерита, а также трансфер-фактор, полученный из лейкоцитарной массы крови гипериммунизированных свиней после отделения сыворотки (Щербаков П.Н., Юров К.П., Караваев Ю.Д., Щербакова Т.Б., 2002).
Его недостатком является отсутствие специфических антител к наиболее часто встречающимся возбудителям респираторных инфекций и требует дополнительного введения соответствующих сывороток.
Известна гипериммунная антиадгезивная и антитоксическая сыворотка против эшерихиоза сельскохозяйственных животных, содержащая комплекс антител против соматических 09, 078, 0141, белковых адгезивных К88, К99, 987Р, 741 и полисахоридных капсульных К30, К80, К87 антигенов (Малахов Ю.А., Тугаринов О.А., Пирожков М.К., Солодков B.C., 1993).
Недостатком известного препарата является то, что он не обладает иммуноспецифической активностью при ассоциированных формах течения инфекционного процесса.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является гипериммунная сыворотка против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней получаемая от продуцентов волов (Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., Скородумов Д.И. 2004; Гринь С.А., 2008). Известную гипериммунную сыворотку получают 7…10 кратными внутримышечными инъекциями антигенов волов-продуцентов с интервалом 2…3 дня. Предложенный способ получения гипериммунной сыворотки является трудоемким и высокозатратным, так как основан на предварительном получении необходимого количества антигенов путем высева на питательные среды с последующим этапом их инактивации. Не предусмотрено использование иммуностимулирующего препарата для повышения уровня вырабатываемых антител после инъекции антигенов животным-продуцентам.
Эффективность известной сыворотки недостаточна, т.к. она содержит только антитела нейтрализующие возбудителей бактериальной природы, но не действует на возбудителей вирусных респираторных инфекций свиней. У поросят в группе доращивания, как правило, основным пусковым механизмом в развитии респираторной болезни являются агенты вирусной природы или сочетание нескольких вирусов таких как цирковирус и возбудитель репродуктивно-респираторного синдрома, которые сильно подавляют иммунную систему и на этом фоне размножаются вторичные бактериальные инфекции. Увеличение количества антигенов и числа инъекций нецелесообразно, так как оказывает дополнительную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не выгодна с экономической точки зрения.
Цель работы - разработать оптимальную технологию получения поливалентной сыворотки против цирковирусной инфекции, репродуктивно-респираторного синдрома и гемофилеза свиней, обеспечивающую эффективный пассивный иммунитет в предельно короткие сроки и сокращение лечения при возникновении болезни.
Задача изобретения - получить иммуноспецифическую поливалентную сыворотку для профилактики и лечения ассоциированных вирусно-бактериальных инфекций свиней.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении профилактического эффекта и сокращении сроков лечения ассоциированных вирусно-бактериальных заболеваний у поросят -отъемышей за счет содержания в сыворотке высоких титров защитных антител к цирковирусной инфекции не менее 1:25600 и к репродуктивно-респираторному синдрому не менее 1:12800 (в ИФА), к гемофилезу не менее 1:512 (в РА).
Сущность изобретения. Поливалентная гипериммунная сыворотка для профилактики и лечения ассоциированных респираторных болезней поросят содержит антитела к возбудителям цирковирусной инфекции в титре не менее 1:25600 (в ИФА), репродуктивно-респираторному синдрому в титре не менее 1:12800 (в ИФА), к возбудителю гемофилеза в титре не менее 1:512 (в РА).
3
Препарат представляет собой прозрачную, слегка опалесцирующую, соломенно-желтого цвета с красноватым оттенком жидкость. Выпускают расфасованным в стеклянные флаконы емкостью 100 см. Хранят препарат в сухом, темном месте при +4…+10°C. Срок годности - 12 месяцев со дня изготовления.
3
3
Сыворотку вводят подкожно поросятам с профилактической целью в дозах по 7…10 см на голову двукратно с интервалом 10 дней. С лечебной целью препарат вводят в двойной дозе по 15…20 мл см на голову в сочетании с антибиотиками.
В рекомендуемых дозах препарат не вызывает осложнений и не оказывает побочного действия.
Способ изготовления поливалентной гипериммунной сыворотки осуществляется следующим образом.
Пример 1. Сыворотку получают путем 6 кратной гипериммунизации свиней моновалентными инактивированными вакцинами против цирковирусной инфекции, репродуктивно-респираторного синдрома и гемофилеза внутримышечными инъекциями в возрастающих дозах с интервалом по 7 дней, с параллельным введением иммуностимулятора гамавита. Свиней-продуцентов, живой массой 150…160 кг, предварительно карантинируют, подвергают исследованию и необходимой обработке, против инфекционных болезней согласно действующей «Инструкции о порядке заготовки и санитарной обработки животных, используемых для производства биопрепаратов». Гипериммунизация свиней проводится по схеме, приведенной в таблице 1.
Таблица 1
Схема гипериммунизации свиней-продуцентов
Количество инъекций
III
IV
V
VI
Общая доза препарата (см<sup>3</sup>)
Веррес-Цирко (Ветбиохим)
40
50
80
115
Концентр. инакт. против РРСС (Ветбиохим)
40
50
75
105
Инакт. сорбиров. против гемофилеза (ВНИИЗЖ)
45
60
90
125
Гамавит(иммуностимулятор)
30
40
50
60
Активность сыворотки
ЦВИС в ИФА
1:6400
1:12800
1:25600
1:25600
РРСС в ИФА
1:3200
1:6400
1:12800
1:12800
Гемофилез в РА
1:128
1:256
1:512
1:512
Из данных таблицы 1 следует, что максимальная активность сыворотки получена после пяти кратной инъекции вакцин к цирковирусной инфекции на уровне 1:25600 и к репродуктивно-респираторному синдрому - 1:12800 (в ИФА), к возбудителю гемофилеза 1:512 (в РА). Дальнейшее увеличение числа инъекций вакцин не приводит к повышению уровня титров антител
Взятие крови необходимо проводить при наличии уровня антител к цирковирусной инфекции 1:25600, репродуктивно-респираторному синдрому в титрах не менее 1:12800 (в ИФА) и к гемофилезному полисерозиту в титре не менее 1:512 (в РА).
Забор крови осуществляется путем тотального обескровливания при убое животных через 3…4 недели после завершающей гипериммунизации в стерильные 20…30 литровые бутыли. Сыворотку из крови получают цитратным методом. Для предохранения крови от свертывания применяют антикоагулянт 10%-ный раствор лимонно-кислого натрия, который готовят физиологическом растворе, стерилизуют в автоклаве при температуре 120°C в течение 30 мин. В стерильные бутыли наливают раствор лимонно-кислого натрия из расчета 34 мл на 1 литр крови. В процессе и после окончания взятия крови раствор антикоагулянта и кровь смешивают, покачиванием бутыли плавными круговыми движениями.
Для отделения форменных элементов полученную цитратную кровь сепарируют на сепараторе марки Ж5-АС-2Ж с последующим дефибринированием плазмы в стерильном дефибринаторе с мешалкой. К плазме, при работе мешалки, через штуцер добавляют 30%-ный раствор хлористого кальция из расчета 1,3 мл на литр плазмы и свежеприготовленную сыворотку, содержащую фермент тромбин, из расчета 10 мл на 1 л. Процесс дефибринирования плазмы обычно длится 25…30 мин. По истечении этого времени берут пробу для проверки на полноту перевода фибриногена в фибрин, для чего в пробирку наливают 7…8 мл испытуемой сыворотки и 5…6 мл насыщенного раствора хлористого кальция, смесь тщательно встряхивают и оставляют в покое на 10…15 мин. Прозрачность смеси указывает на полноту перехода фибриногена в фибрин. Полученную сыворотку проверяют манганометрическим методом на содержание кальция, присутствие которого в сыворотке не должно превышать 35 мг%. Далее сыворотку крови консервируют 5%-ным раствором фенола до концентрации его в общем объеме сыворотки 0,5%. После этого сыворотку перекачивают в отстойник и выдерживают 2…2,5 месяца при 2…15°C. Отстаивание сыворотки можно заменить сепарированием. Затем сыворотку подвергают последовательно предварительной и стерилизующей фильтрации через пластины марок «Ф2» и «СФ», после чего снова проверяют на стерильность как указано в примере 2.
Пример 2. Приготовленные серии сыворотки проверяют на внешний вид, стерильность, безвредность и активность.
3
Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, плесени, неразбивающихся хлопьев, герметичности укупорки все флаконы с сывороткой встряхивают, просматривают в проходящем свете и переворачивают вниз пробками. Стерильность сыворотки проверяют путем высева на мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, Сабуро, регенерированную среду Китт-Тарацци. Посевы культивируют при температуре 37…38°C. Через двое суток из жидких сред делают пересевы на мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонно-печеночный агар под вазелиновым маслом. Первичные посевы выдерживают в течение 10, а вторичные - 8 суток. Стерильность подтверждается отсутствием роста на обычных и селективных питательных средах. Безвредность сыворотки определяют на 10 белых мышах массой 14…18 г и 10 морских свинках массой 350…400 г при подкожном введении соответственно 0,5 и 2,0 см препарата. Сыворотку считают безвредной, если все животные остаются клинически здоровыми в течение 10 суток.
3
Пример 3. Полученную по примеру 1 гипериммунную сыворотку применяют для профилактики респираторных болезней поросят. Опыт проведен на 80 поросятах в возрасте 28 суток перед переводом в группу доращивания, со средней живой массой тела по 7,1-7,5 кг. Поросята разделены на 4 группы по принципу аналогов. Животным 1,2 и 3 групп (опытные) по 20 голов подкожно вводили полученную по примеру 1 сыворотку соответственно 5, 7 и 10 см на голову. Поросята 4-ой группы 20 голов вводили сыворотку (прототип) в дозе 10 см. Сыворотку вводили трехкратно, с интервалом в 10 дней. Срок наблюдения 60 суток.
Таблица 2
Уровень заболеваемости респираторных болезней поросят - отъемышей
Показатели
Опытные группы
Прототип (контроль)
I
II
III
Количество животных, (гол.)
20
20
20
20
Доза сыворотки (см<sup>3</sup>)
5
7
10
10
Кратность введения
3 инъекции с интервалом 7 дней
Заболело респираторными болезнями (%)
25
10
10
20
Из табл.2 следует, что наиболее оптимальной дозой сыворотки является 7 см3 на голову, при которой получен высокий профилактический эффект, с повышением дозы препарата до 10 см3 эффективность осталась на прежнем уровне.
3
3
Пример 4. Полученную по примеру 1 сыворотку применяют для лечения ассоциированных респираторных заболеваний у поросят на доращивании 60…65 суточного возраста с живой массой тела 20…22 кг. У больных поросят наблюдается отставание в росте, истощение, кашель, одышка, повышение температуры до 41°C. В опыте использованы 60 поросят, которых разделили на четыре группы по принципу пар-аналогов. Поросятам первой, второй и третьей групп вводил полученную по примеру 1 сыворотку в дозах 10, 15, 20 см на голову. Поросятам четвертой группы вводили сыворотку (прототип) в дозе 20 см на голову. Поросятам всех групп вводили внутримышечно гентамицин в рекомендуемых дозах. Срок наблюдения 60 суток. Результаты опытов представлены в табл.3.
Таблица 3
Эффективность сыворотки при респираторных болезнях поросят
Показатели
Опытные группы
Прототип (контроль)
I
II
III
Доза сыворотки (см<sup>3</sup>)
10
15
20
20
Количество животных (гол.)
15
15
15
15
Выздоровело, гол.
12
14
14
12
Пало, гол.
3
1
1
3
Сохранность, %
80
93,3
93,3
80
3
Из приведенных данных табл.3 видно, что предлагаемая гипериммунная сыворотка в дозе 15 см на голову с повторным введением сыворотки через 48 ч., до 3-5 инъекций, обладает более выраженным терапевтическим эффектом по сравнению с гипериммунной сывороткой - прототипом. В особо тяжелых случаях клинического течения болезни суточную дозу сыворотки следует вводить дробно 2-3 раза через промежутки в 3-4 часа, что обеспечивает надежный терапевтический эффект.
Список литературы
1. Гречухин, А.Н. Особенности проявления цирковирусной инфекции свиней и ее специфическая профилактика/ А.Н. Гречухин // Свиноводство. - 2010. - №2. - С.48-50.
2. Гринь, С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов: дис…докт. биол. наук / С.А. Гринь. - Щелково, 2008. - С.305.
3. Дрю, Т. Синдром послеотъемного мультисистемного истощения: роль цирковируса свиней в его этиологии / Промышленное и племенное свиноводство, 2005. - №4. - С.51-52.
4. Малахов, Ю.А. Специфическая профилактика эшерихиоза животных / Ю.А.Малахов, О.А.Тугаринов., М.К.Пирожков // Ветеринария. - 1993. - №3. - С.5-7.
5. Орлянкин, Б.Г. Цирковирусная инфекция / Б.Г. Орлянкин, Т. Алипер, Е.А. Непоклонов // Ветеринария. - 2002. - №8. - С.24-25.
6. Орлянкин, Б.Г. Цирковирусная инфекция / Б.Г. Орлянкин, Т. Алипер, Е.А. Непоклонов // Животноводство России, - 2003. - №11. - С.48-51.
7. Орлянкин, Б.Г. Цирковирусная инфекция / Б.Г. Орлянкин // Проблемы инфекционной патологии свиней: материалы XVI междунар. Москов. Конгресса, 2007. - Москва. - 2007. - С.19-24.
8. Орлянкин, Б.Г. Инфекционные респираторные болезни свиней / Б.Г. Орлянкин // Животноводство России. - 2009. - №5. - С.35-36.
9. Справочник Vidal ветеринарный, «Лекарственные средства ветеринарного назначения», Москва, Астра Фарм Сервис, 2003-2004. - С.480.
10. Федоров, Ю.Н. Иммунный статус поросят в хозяйствах промышленного типа / Ю.Н. Федоров [и др.] // Ветеринария. - 2006.-№6. - С.18-21.
11. Щербаков, П.Н. Профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней поросят / Щербаков П.Н. [и др.] // Свиноводство. - 2002. - №5. - С.25-26.
12. Патент 2180239 Российская Федерация, А61К 39/395. Биологический препарат для профилактики и лечения желудочно-кишечных и респираторных болезней поросят / Щербаков П.Н., Юров К.П., Караваев Ю.Д., Щербакова Т.Б.; заявитель и патентообладатель Урал. Государств. Академия ветеринарной медицины.- №2000122079/13; заявл. 22.08.2000; опубл. 10.03.2002.
13. Патент 2357756 С2 Российская Федерация, А61К 39/40. Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза, стрептококкоза и пастереллеза свиней / Школьников Е.Э.; заявитель и патентообладатель Госуд. науч.-исследов. И технолог, институт биолог, пром.-ти, - №200713692/13; заявл. 26.06.2007; опубл. 10.06.2009.
14. Патент 2043772 С1 Российская Федерация, А61К 39/108, А61К 39/40. Способ получения сыворотки антиадгезивной и антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных / Малахов Ю.А., Тугаринов О.А., Пирожков М.К., Солодков B.C.; заявитель и патентообладатель Малахов Ю.А., Тугаринов О.А., Пирожков М.К., Солодков B.C. - №93009805/13; заявл. 25.02.1993; опубл. 20.09.1995.
15. Шахов, А.Г. Применение иммуномодуляторов при вакцинации животных против сальмонеллеза / А.Г. Шахов [и др.] // Ветеринария.- 2006. - №6. - С.21-26.
16. Шахов, А.Г. Этиология респираторных болезней поросят в промышленных свиноводческих хозяйствах и меры их профилактики / А.Г. Шахов [и др.] // Свиноводство. - 2008. - №5. - С.26-28.
17. Шахов, А.Г. Влияние состояния иммунного статуса на врзникновение и развитие респираторных болезней свиней / А.Г. Шахов, М.И. Рецкий, Ю.Н. Масьянов и др. // Доклады РАСХН. - 2009. - №4. - С.55-58.
18. Шкаева, М.А. ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа / Шкаева М.А. [и др.] // Ветеринария. - 2005. - №9. - С.20-23.
19. Школьников, Е.Э. Испытание сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней / Е.Э.Школьников, Г.Ф.Коломнина, Д.И.Скородумов // Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее: материалы междунар. науч.-практич. конференции, 2004. - Щелково. - 2004. - С.56-57.
20. Allan, G.M. Immunostimulation, PCV-2 and PMWS / G.M. Alan [et al.] // Vet. Rec, 2000. - V. 147. №6. - P.170-171.
21. Krakowka, S. Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2) / S. Krakowka, J.A. Ellis, F. McNeilly [et al.] // Vet. Pathol, 2001. - V. 38. - P. 31-42.
22. Segales, J. Postweaning multisystemic wasting sysndrome (PMWS) in pigs. A review / J. Segales, M. Domingo // Vet. Quaterty, 2002. - V. 24. - P.109-124.