Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
RECOMBINANT PROTEIN Mio-HSP, METHOD OF ITS PRODUCTION, INJECTION PREPARATION FOR MUSCLE MASS INCREASE IN FARM ANIMALS, BIRDS AND ANIMALS OF CANIDS, AS WELL AS METHOD OF USING PREPARATION

Область применения
Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и ветеринарии, а конкретно к рекомбинантному белку Миостатин-глюкагонсвязывающий домен (ГСД), способу его получения, иммуногенной композиции, содержащей в качестве антигена миостатин, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также метод использования указанного инъекционного препарата для увеличения мышечной массы животных.
Известный уровень
Миостатин (Мио) - белок, который подавляет рост и дифференцировку мышечной ткани. Исследования на животных показывают, что блокирование активности миостатина приводит к значительному увеличению мышечной массы организма.
Известен препарат, состоящий из пептидов, связывающих миостатин и ингибирующих его активность (WO 2004/058988 А2, МПК A61K 38/08, 2004). Связывающий агент включает, по крайней мере, один миостатинсвязывающий белок, присоединенный непосредственно или косвенно, по меньшей мере, к одному носителю, такому как полимер или Fc домен. Препараты такого рода не связаны с ингибированием миостатина посредством синтеза антимиостатиновых антител и требуют регулярного введения в организм животного для поддержания эффекта.
Фармацевтическая компания Виет Фармасьютикалс (Wyeth Pharmaceuticals) разработала препарат MYO-029 (Стомалумаб; Stamulumab), представляющий собой комбинацию рекомбинантных гуманизированных антител, которые связываются с миостатином и блокируют его эффекты. В начале 2005 года были проведены клинические исследования безопасности и переносимости препарата на 116 пациентах (Wagner et al., А phase I-II trial of MYO-029 in adult subjects with muscular dystrophy, Annals of Neurology, 2008 Vol 63, Is 5, p. 561-571).
Данные клинических испытаний были опубликованы в январе 2008 года, а уже в марте 2008 года, после окончания клинических испытаний, компания Виет Фармасьютикалс объявила о приостановке развития этого проекта, так как ни у кого из обследуемых пациентов не было обнаружено статистически значимого улучшения мышечной силы или роста мышечной ткани.
Сущность изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в создании рекомбинантного иммунологически активного миостатинсодержащего белка, легко поддающегося очистке и обладающего достаточной иммуногенностью в отношении миостатина как антигена, который может быть использован для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики), птицы, а также для повышения мышечной массы животных семейства псовых за счет индукции синтеза специфических аутоантител к миостатину, блокирования его действия и, как следствие, стимуляции роста мышечной ткани.
Другая задача изобретения заключается в реализации препарата на основе указанного белка и в создании способа использования этого препарата, решающего задачу повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы и повышения мышечной массы животных семейства псовых при условии несистематического применения препарата. Следует отметить, что аминокислотная последовательность миостатина идентична у всех сельскохозяйственных животных и животных семейства псовых. Вследствие этого разработанный препарат является универсальным средством для повышения мясной продуктивности сельскохозяйственных животных, птицы и повышения мышечной массы животных семейства псовых.
Решение первой поставленной задачи обеспечивается следующими объектами настоящего изобретения.
Рекомбинантный белок Мио-ГСД для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых с молекулярной массой 35,9 кДа, кодируемый последовательностью нуклеотидов гена Мио-ГСД SEQ ID NO 1.
Способ получения рекомбинантного белка Мио-ГСД на глюкане включает:
- выращивание клеток штамма Е. coli, экспрессирующих ген Мио-ГСД;
- связывание белка Мио-ГСД в составе клеточных экстрактов штамма Е. coli M15 с глюкансодержащим сорбентом за счет аффинного взаимодействия при процедуре инкубации;
- последующую отмывку от не связавшихся бактериальных белков и выделение целевого продукта.
Рекомбинантный белок Мио-ГСД включает в себя белковую последовательность глюкансвязывающего домена, определяющего способность данного белка связываться с глюкансодержащим сорбентом, что позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белкового продукта на глюкане. Иммобилизация на глюкане обеспечивается за счет присутствия в рекомбинантном белке глюкансвязывающего домена из альфа-глюкансвязывающего домена гена из Streptococcus mutans, который обладает высоким сродством к альфа-глюканам (пуллулан, гликоген, декстран, крахмал) и обеспечивает необратимое связывание с носителем в широком диапазоне значений pH 6,0-9,0 и концентраций соли 0-3 М NaCl.
Поскольку в клетках Е. coli отсутствуют белки, связывающиеся с альфа-глюканом, то синтезируемый в клетках Е. coli рекомбинантный белок Мио-ГСД является единственным белком клеток штамма-продуцента, прочно связывающимся с альфа-глюканом. Это обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата рекомбинантного белка, иммобилизованного на глюкансодержащем сорбенте.
Решение второй поставленной задачи обеспечивается следующими объектами настоящего изобретения.
Инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых содержит рекомбинантный белок Мио-ГСД, охарактеризованный выше, суспендированный в среде из глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе. Метод повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых включает: двукратное с интервалом в 14 суток проведение подкожных или внутримышечных инъекций препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, суспендированный в среде из глюкансодержащего сорбента в приемлемом для инъекционного использования жидком носителе, в дозе 5-200 мкг указанного белка на один килограмм массы тела животного или птицы.
Таким образом, создан бифункциональный рекомбинантный белок Мио-ГСД, обладающий способностью самопроизвольно связываться с глюкансодержащим сорбентом, формируя высокоиммуногенную композицию в форме полиантигена, индуцировать синтез специфических аутоантител к миостатину при введении животным и, как следствие, стимулировать рост мышечной ткани.
Получение рекомбинантного слитного белка Мио-ГСД
На первом этапе осуществляют получение гена миостатина с последующим его клонированием.
Ген миостатина получали химико-ферментативным методом. Был спланирован олигонуклеотидный дуплекс, кодирующий соответствующий ген, оптимизированный для экспрессии в E.coli. Затем осуществляли получение плазмиды рМио-ГСД, содержащей последовательности, кодирующие миостатин, Гли-Сер спейсер и глюкансвязывающий домен (ГСД).
Получение штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного антигена миостатина, соединенного с целлюлозосвязывающим доменом
Для получения штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного белка Мио-ГСД клетки Е. coli М15 трансформировали плазмидой рМио-ГСД. В культуру добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и выращивали в течение 3 часов при температуре 37°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli M15 [рМио-ГСД], обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка Мио-ГСД массе в 35,9 кДа. Уровень синтеза белков в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок Мио-ГСД синтезируется в клетках E. coli в нерастворимой форме в виде телец-включения.
Получение рекомбинантного белка Мио-ГСД, иммобилизированного на альфа-глюкане
Для получения рекомбинантного белка клеточную культуру штамма E. coli M15 [рМио-ГСД] выращивали в 1000 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°С до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 550 нм. В среду добавляли 15 мкл 0,1 М раствора ИПТГ и выращивали в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5500 g в течение 15 минут.
Осадок ресуспендировали в фосфатном буфере с лизоцимом. Дополнительно суспензию обрабатывали ультразвуком. После центрифугирования при 6000 g нерастворимый белок Мио-ГСД оставался в осадке. Осадок суспендировали в 8М мочевине, центрифугировали при 12000 g 30 минут и отбирали надосадочную жидкость. Для иммобилизации рекомбинантного белка Мио-ГСД на сорбенте супернатант разводили фосфатным буфером в четыре раза, добавляли 1/10 объема суспензии альфа-глюкана, инкубировали при 25°С в течение 2 часов. Центрифугировали при частоте оборотов, равной 8000 об/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере; отмывку альфа-глюкана повторяли 3 раза. Иммобилизованный на альфа-глюкане антиген Мио-ГСД представляет собой суспензию сорбента с адсорбированным на нем белком. Степень чистоты препарата составляла не менее 95%. Консервацию препарата проводили, добавляя бензиловый спирт до концентрации 0,1%.
Биологическое действие рекомбинантного белка Мио-ГСД
В предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат содержит рекомбинантный белок Мио-ГСД, суспендированный в растворе гликана (90% по массе), водно-масляной суспензии (10% по массе) или гидроокиси алюминия (равный объем); используется путем подкожных или внутримышечных инъекций препарата дважды с межинъекционным интервалом 14 суток в дозе 50-200 мкг рекомбинантного белка на один килограмм массы тела животного или птицы. Механизм действия препарата основан на временном блокировании активности эндогенного миостатина с помощью аутоантител.
Эффективность применения препарата для повышения мышечной массы тела у сельскохозяйственных животных иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела поросят.
В условиях промышленного свиноводческого комплекса поросятам в возрасте 100-110 суток с массой тела 50-52 кг был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок Мио-ГСД, суспендированный в среде из альфа-глюкана (90% по массе), водно-масляной суспензии (10% по массе) двукратно с интервалом 14 суток из расчета 50-200 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела поросят через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,2% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 12,6%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 13,4%.
В таблице 2 представлены титры аутоантител к миостатину после иммунизации препаратом, содержащем рекомбинантный белок Мио-ГСД (метод ИФА).
Из данных таблицы 2 следует, что оптимальной дозой препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, для индукции аутоантител у животных является доза, равная 50 мг/кг массы тела животного.
Пример 2. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела быков мясной породы.
В условиях откормочного комплекса бычкам калмыцкой породы в возрасте 10 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок Мио-ГСД, суспендированный в среде из альфа-гликана (90% по массе), водно-масляной суспензии (10% по массе) двукратно с интервалом 14 суток из расчета 50-200 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно или внутримышечно. Результаты представлены в таблице 3.
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение бычкам калмыцкой породы препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 9,0% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 9,8%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 9,9%.
Пример 3. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела ягнят.
Ягнятам романовской породы в возрасте 3,5-4 месяцев был введен препарат, содержащий рекомбинантный белок Мио-ГСД, суспендированный в среде из альфа-гликана (50% по массе), суспензии гидроокиси алюминия (50% по массе), двукратно с интервалом 14 суток из расчета 50-200 мкг рекомбинантного белка на 1 кг живой массы тела животных. Препарат вводили подкожно или внутримышечно. Результаты представлены в таблице 4.
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение ягнятам романовской породы препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,9% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 14,1%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 16,0%.
Пример 4. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела кроликов.
Препарат, содержащий рекомбинантный белок, был применен на кроликах породы советская шиншилла в возрасте 60 суток дважды с интервалом между инъекциями в 14 суток. Препарат применяли в дозе 50, 100, 200 мкг/кг рекомбинантного белка. Препарат вводили подкожно. Результаты представлены в таблице 5.
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение кроликам породы советская шиншилла препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела животных через 60 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 10,6% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 12,0%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 11,5%.
Пример 5. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела индеек.
Препарат, содержащий рекомбинантный белок, был применен на индейках (самцах) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) в возрасте 50 суток дважды с интервалом между инъекциями в 14 суток. Препарат применяли в дозе 50, 100, 200 мкг/кг рекомбинантного белка. Препарат вводили подкожно или внутримышечно. Результаты представлены в табл. 6
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение индейке (самцы) породы белая широкогрудая (тяжелый кросс) препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 12,1% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 12,6%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 12,0%.
Пример 6. Влияние препарата с рекомбинантным белком Мио-ГСД на увеличение массы тела собак.
Препарат был применен на кавказских овчарках (самцах) в возрасте 50-60 суток дважды с интервалом между инъекциями в 14 суток. Препарат применяли в дозе 50, 100, 200 мкг/кг рекомбинантного белка. Препарат вводили подкожно. Результаты представлены в таблице 7.
Как видно из представленных данных, двукратное (с интервалом 14 суток) введение самцам кавказской овчарки препарата, содержащего рекомбинантный белок Мио-ГСД, привело к увеличению массы тела животных через 90 суток после второй инъекции препарата при применении в дозе 50 мкг/кг рекомбинантного белка на 10,1% по отношению к этому показателю в контрольной группе; при применении препарата в дозе 100 мкг/кг рекомбинантного белка - на 6,7%; при применении препарата в дозе 200 мкг/кг рекомбинантного белка - на 13,1%.
Приведенные примеры осуществления изобретения не являются исчерпывающими. Возможны иные примеры осуществления, соответствующие объему патентных притязаний.