СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОПОРОДНОСТИ ЖИВОТНЫХ - ОБЪЕКТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО НАЗНАЧЕНИЯ
METHOD TO DETERMINE GENUINENESS OF STRAIN OF ANIMALS - OBJECTS OF AGRICULTURAL PURPOSE

Изобретение относится к генетике и разведению сельскохозяйственных животных, а именно к способам определения чистопородности животных, в частности крупного рогатого скота на основе диагностики и сравнительного анализа полиморфизма микросателлитов. Микросателлиты - некодирующие последовательности генома, характеризующиеся высоким уровнем полиморфизма и менделевским типом наследования (Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Research, 1989, Vol.17, P.6463-6471).
Известны тест-системы для мультилокусного анализа микросателлитов крупного рогатого скота (USA Part No. 4346135 StockMarks Horse, Cattle, and Dog Genotyping Kits, Applied Biosystems; Bovine Genotypes™ Panel 1, Instruction Manuals, Finnzymes Diagnostics, Finland, Version 1.0, 2009, p.1-24) и свиней (Tetranucleotide microsatellites contribute to a highly discriminating parentage test panel in pig // Animal Genetics, 2011, Guo L.Z., Hai G.J., Qi Z. Genetic diversity analysis of five cattle breeds native to China using microsatellites // Genetics. 2005. Vol.84. no.1. P.77-80), однако их использование ограничивается оценкой достоверности происхождения (родителей) животных или характеристикой генетической структуры популяций.
Известен способ определения чистопородности сельскохозяйственных животных на основании анализа племенных записей (Борисенко Е.Я. Разведение сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1967, 415 с.), однако данный способ в полной мере не гарантирует чистопородности индивидуумов вследствие ошибок, вызванных субъективными факторами, и/или фальсификации записей племенного учета.
Известен способ определения чистопородности животных посредством подтверждения достоверности их происхождения по группам крови (Лебедько Е.Я., Данилкив Э.И. Иммуногенетическая экспертиза достоверности происхождения крупного рогатого скота. Ростов-на-Дону: Феникс, 2007, 96 с.), однако его использование требует проведения исследований на достоверность происхождения всех предков до 4-го поколения включительно, что сопряжено с высокими материальными затратами и, в большинстве случаев, из-за отсутствия биологического материала ряда предков, невозможно.
Известен способ определения чистопородности крупного рогатого скота голштинской, джерсейской и бурой швицкой пород с использованием породоспецифических аллелей, частоты встречаемости которых близки к 1 у одной породы, и встречаются в гомозиготном состоянии менее чем у 30% животных в двух других породах, при этом число породоспецифичных маркеров отражает долю крови соответствующей породы у анализируемого животного (Wiggans G.R., Sonstegard T.S., VanRaden P.M., Matukumalli L.K., Schnabel R.D., Taylor J.F., Schenkel F.S., Van Tassel C.P. Selection of single-nucleotide polymorphisms and quality of genotypes used in genomic evaluation of dairy cattle in the United States and Canada // J. Dairy Science. 2009, 92 (7), p.3431-3436). Недостатком данного способа наряду с высокой стоимостью исследований является ограниченность его применения только на изученных популяциях крупного рогатого скота, а также необходимость определения породоспецифических SNP при распространении на другие виды и породы.
Известен способ определения чистопородности кур по морфотипологическим признакам (Моисеева И.Г. Принципы построения классификаций пород кур // Сельскохозяйственная биология. 1999. N6. С.23-32) и пчел по экстерьерным и морфологическим признакам, в частности кубитальному индексу (Губин В. К изучению кубитального индекса // Пчеловодство. 1970, №9, с.25-27). Однако данные способы являются очень трудоемкими, характеризуются зависимостью от субъективного фактора и, кроме того, не позволяют судить о генетической консолидированности пород.
Известен способ определения принадлежности особи к популяции на основании данных ДНК-анализа, взятый в качестве прототипа, включающий определение ДНК-профилей популяций по частотам встречаемости аллелей и генотипов одного или нескольких маркерных локусов в популяциях с известным происхождением и последующее отнесение индивидуума к популяции на основании показателя вероятности соответствия его генотипа конкретной популяции (US Patent No. 6770437. Method for assigning an individual to a population of origin based on multi-locus genotypes). Данный способ делает возможным определение популяционной принадлежности индивидуума, однако требует предварительное построение ДНК-профилей популяций. Кроме того, данный способ не затрагивает вопросов чистопородности.
Задача изобретения заключалась в разработке тест-систем и способа определения чистопородности животных - объектов сельскохозяйственного назначения, в частности крупного рогатого скота, на основе идентификации и анализа ДНК-профилей без необходимости проведения каких-либо предварительных исследований аллелофонда пород.
-10
Технический результат изобретения достигается тем, что осуществлен выбор локусов и предложены тест-системы для определения полиморфизма микросателлитов, предусматривающие выделение ДНК из биологического материала животных, проведение мультиплексной ПНР амплификации, анализ образующихся продуктов на ДНК-анализаторе, особенностью которых является мультиплексный анализ не менее 7 локусов со средним числом аллелей на локус не менее 6, вероятность совпадения генотипов животных - менее 1·10, а также предложен способ определения чистопородности на основании анализа полученных микросателлитных профилей, предусматривающий отнесение индивидуумов к чистопородным особям на основании расчета коэффициента подобия Q при значении Q≥0,75, отличающийся тем, что для определения чистопородности не требуется предварительного определения аллельных профилей пород и использования референтных популяций, а чистопородными признаются особи, имеющие значение коэффициента подобия Q≥0,75.
Нами был осуществлен выбор микросателлитных локусов и разработаны наборы реагентов для крупного рогатого скота «BOS-6» (локусы TGLA126, ILSTS005, ЕТН185, TGLA122, INRA023, ILSTS006) и «BOS-7» (локусы TGLA227, ЕТН225, ЕТН10, ВМ1818, ВМ2113, ВМ1824, SPS115) для включения в тест-систему.
Амплификацию фрагментов выбранных микросателлитных локусов осуществляют в двух мультиплексных реакциях (6 и 7 локусов на реакцию) с использованием флуоресцентно-меченных праймеров, после чего проводят разделение и детекцию образующихся фрагментов с использованием лазерного анализатора. Данные о генотипах животных по анализируемым локусам микросателлитов формируют в виде электронной таблицы, после чего для каждого индивидуума проводят расчет значений коэффициента подобия Q (Pritchard J.K. Inference of population structure usingmultilocus genotype data // Genetics. 2000. Vol.155. P.945-959) с использованием параметров «Admixture Model» и «Correlation Model» без введения предварительной информации о популяционной принадлежности особей с указанием числа популяций, равного потенциально возможному числу пород (k=2 и более). В качестве порогового значения чистопородности индивидуума используют значение коэффициента подобия Q≥0,75.
Пример. Контрольное использование предложенного способа для определения чистопородности животных - объектов сельскохозяйственного назначения проводили на 90 образцах крупного рогатого скота трех пород: черно-пестрая (n=30), симментальская (n=30) и бурая швицкая (n=30). Чистопородность животных была предварительно подтверждена результатами анализа их родословных.
1. ДНК выделяли из проб кожи (ухо) с использованием набора для выделения ДНК («ДНК-ЭЛЮТ», ООО «БИОСТРИМ»).
2. Мультиплексную амплификацию локусов микросателлитов крупного рогатого скота проводили в двух реакциях (7 и 8 локусов) в конечном объеме 15 мкл в соответствии с инструкциями разработчика.
3. Продукты реакции разделяли и анализировали с использованием ДНК-анализатора ABIPrism 3130×1.
4. Генотипы животных суммировали в виде матрицы в программе MSExcel.
-12
5. Анализ полученных матриц показал, что число локусов, фактически амплифицируемых в каждой из двух реакций, составило 5,99 и 6,99, среднее число аллелей на локус составило 6,57±0,32, вероятность совпадения генотипов животных составила в среднем 7,3·10.
6. Расчет значений коэффициента подобия Q у индивидуумов показал (фиг.1), что индивидуумы разных пород были отнесены к различным популяциям, при этом значение критерия Q у отдельных индивидуумов варьировало от 0,760 до 0,982 и в среднем составило 0,876. Таким образом, предложенный нами способ позволил осуществить распределение индивидуумов крупного рогатого скота трех пород к трем различным популяциям в соответствии с их породной принадлежностью без предварительного выбора породоспецифических аллелей, при этом значение критерия Q в 100% случаев было выше 0,75, что является подтверждением чистопородности животных.
Изобретение применимо в разведении животных, в частности крупного рогатого скота для контроля чистопородности с целью последующего использования полученной информации в селекции.