НАПРАВЛЕННАЯ НУКЛЕОТИДНАЯ ЗАМЕНА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ УЛУЧШЕННЫХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

1. Олигонуклеотид для направленного изменения дуплексной последовательности ДНК, где дуплексная последовательность ДНК содержит первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая является комплементарной первой последовательности ДНК, а олигонуклеотид содержит домен, который способен гибридизоваться с первой последовательностью ДНК, где домен содержит, по меньшей мере, один некомплементарный нуклеотид по отношению к первой последовательности ДНК, и где олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, один участок, который содержит, по меньшей мере, два модифицированных нуклеотида, обладающих большей аффинностью связывания по сравнению с природными нуклеотидами A, C, T или G, где
- по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид представляет собой LNA, которую располагают на расстоянии, по меньшей мере, одного нуклеотида, по меньшей мере, от одного некомплементарного нуклеотида, и где необязательно олигонуклеотид содержит не больше, чем приблизительно 50% LNA-модифицированных нуклеотидов; и
- по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид представляет собой C7-пропинпурин или C5-пропинпиримидин.
2. Олигонуклеотид по п.1, в котором, по меньшей мере, 2, предпочтительно, по меньшей мере, 3, более предпочтительно, по меньшей мере, 4, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 5, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 6 нуклеотидов представляют собой LNA.
3. Олигонуклеотид по п.1, в котором LNA независимо распределяют на расстоянии не больше, чем 10 нуклеотидов, предпочтительно не больше, чем 8 нуклеотидов, более предпочтительно не больше, чем 6 нуклеотидов, даже более предпочтительно не больше, чем 4, 3, или 2 нуклеотида с обеих сторон некомплементарного основания.
4. Олигонуклеотид по п.1, в котором 2, предпочтительно 3, более предпочтительно 4, даже более предпочтительно 5, наиболее предпочтительно 6 нуклеотидов представляют собой LNA.
5. Олигонуклеотид по п.1, в котором не больше, чем 40% модифицированных нуклеотидов олигонуклеотида представляют собой производные LNA, предпочтительно не больше, чем 30%, более предпочтительно не больше, чем 25%, даже более предпочтительно не больше, чем 20%, наиболее предпочтительно не больше, чем 10%.
6. Олигонуклеотид по п.1, в котором модифицированный нуклеотид независимо располагают с 5' стороны и/или с 3' стороны от некомплементарного основания.
7. Олигонуклеотид по п.6, в котором два LNA-модифицированных нуклеотида, расположенных на одной из 5' или 3' стороны некомплементарного основания, разделяют друг от друга, по меньшей мере, одним, предпочтительно, по меньшей мере, двумя парами оснований (нуклеотидов).
8. Олигонуклеотид по п.1, в котором пурин представляет собой аденозин или гуанозин, и/или пиримидин представляет собой цитозин, урацил или тимидин.
9. Олигонуклеотид по п.1, в котором независимо, по меньшей мере, 10% пиримидинов и/или пуринов заменяют их соответствующими пропинилированными производными, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 75%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 90%.
10. Олигонуклеотид по п.1, в котором модифицированный нуклеотид представляет собой пиримидин.
11. Олигонуклеотид по п.1, в котором модифицированный нуклеотид представляет собой пурин.
12. Олигонуклеотид по п.1, в котором, по меньшей мере, два модифицированных нуклеотида представляют собой пропинилированные нуклеотиды, независимо выбранные из пропинилированных пуринов и пропинилированных пиримидинов.
13. Олигонуклеотид по п.1, в котором олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, 2 участка, предпочтительно, по меньшей мере, 3 участка, которые независимо содержат, по меньшей мере, 2, более предпочтительно, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модифицированных нуклеотидов.
14. Олигонуклеотид по п.13, в котором участки располагают вблизи или на 3'-конце, 5'-конце и/или они включают или фланкируют положение некомплементарного основания.
15. Олигонуклеотид по п.1, в котором нуклеотид в положении некомплементарного основания является немодифицированным.
16. Олигонуклеотид по п.1, в котором, по меньшей мере, один из пропинмодифицированных нуклеотидов помещают в соседнее положение от некомплементарного основания, предпочтительно в пределах 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов от некомплементарного основания.
17. Олигонуклеотид по п.1, имеющий длину от 10 до 500 нуклеотидов.
18. Олигонуклеотид по п.1, в котором (модифицированный) участок представляет собой домен.
19. Олигонуклеотид по любому из предшествующих пунктов.
20. Способ направленного изменения дуплексной акцепторной последовательности ДНК, включающий смешение дуплексной акцепторной последовательности ДНК с донорным олигонуклеотидом, где дуплексная акцепторная последовательность ДНК содержит первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая является комплементарной первой последовательности ДНК, и где донорный олигонуклеотид содержит домен, который содержит, по меньшей мере, один некомплементарный нуклеотид по отношению к дуплексной акцепторной последовательности ДНК, которую нужно изменить, предпочтительно, по отношению к первой последовательности ДНК, и где олигонуклеотид содержит участок, который содержит, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид, обладающий большей аффинностью связывания по сравнению с природными A, C, T или G, и где модифицированный нуклеотид связывается сильнее с нуклеотидом в противоположном положении в первой последовательности ДНК по сравнению с природным нуклеотидом, комплементарным нуклеотиду в противоположном положении в первой последовательности ДНК, в присутствии белков, которые способны осуществлять направленную нуклеотидную замену, и где модифицированный олигонуклеотид определен по пп.1-19.
21. Способ по п.20, в котором изменение осуществляют в клетке, предпочтительно выбранной из группы, состоящей из клетки растения, клетки гриба, клетки грызуна, клетки примата, клетки человека или клетки дрожжей.
22. Способ по п.20, где белки получают из клеточного экстракта.
23. Способ по любому из пп.20-22, где клеточный экстракт выбирают из группы, состоящей из экстракта клеток растения, экстракта клеток гриба, экстракта клеток грызуна, экстракта клеток примата, экстракта клеток человека или экстракта клеток дрожжей.
24. Способ по п.20, в котором изменение представляет собой делецию, замещение или вставку, по меньшей мере, одного нуклеотида.
25. Способ по п.20, в котором клетка представляет собой эукариотическую клетку, клетку растения, клетку млекопитающего, не являющегося человеком, или клетку человека.
26. Способ по п.20, в котором ДНК-мишень получают из грибов, бактерий, растений, млекопитающих или человека.
27. Способ по п.20, в котором дуплексную ДНК получают из геномной ДНК, линейной ДНК, искусственных хромосом млекопитающих, искусственных хромосом бактерий, искусственных хромосом дрожжей, искусственных хромосом растений, ядерной хромосомной ДНК, хромосомной ДНК органелл, эписомальной ДНК.
28. Способ по п.20 для изменения клетки, исправления мутации восстановлением дикого типа, введения мутации, дезактивации фермента нарушением кодирующего участка, изменения биоактивности фермента изменением кодирующего участка, изменения белка нарушением кодирующего участка.
29. Применение олигонуклеотида, как он определен по пп.1-19, для изменения клетки, исправления мутации восстановлением дикого типа, введения мутации, дезактивации фермента нарушением кодирующего участка, изменения биоактивности фермента изменением кодирующего участка, изменения белка нарушением кодирующего участка, рапарации некомплементарного нуклеотида, направленного изменения генетического материала (растения), включая генную мутацию, направленную репарацию гена и генный нокаут.
30. Применение олигонуклеотида, как он определен по пп.1-19, для улучшенного направленного изменения дуплексной последовательности ДНК, дуплексная последовательность ДНК содержит первую последовательность ДНК и вторую последовательность ДНК, которая является комплементарной первой последовательности ДНК, олигонуклеотид содержит домен, который способен гибридизоваться с первой последовательностью ДНК, где домен содержит, по меньшей мере, один некомплементарный нуклеотид по отношению к первой последовательности ДНК, и где олигонуклеотид содержит, по меньшей мере, один участок, который содержит, по меньшей мере, два модифицированных нуклеотида, обладающих большей аффинностью связывания по сравнению с природными нуклеотидами A, C, T или G, где
- по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид представляет собой LNA, который располагают на расстоянии, по меньшей мере, одного нуклеотида, по меньшей мере, от одного некомплементарного нуклеотида, и где, необязательно, олигонуклеотид содержит не больше, чем приблизительно 50% LNA-модифицированных нуклеотидов; и
- по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид представляет собой C7-пропинпурин или C5-пропинпиримидин.
31. Применение олигонуклеотида, как он определен по пп.1-19, в способе для придания гербицидной устойчивости растениям.
32. Набор, содержащий олигонуклеотид, как он определен по пп.1-19.
33. Модифицированный генетический материал, полученный способом по пп.20-28.
34. Клетка, содержащая модифицированный генетический материал по п.32.
35. Способ увеличения эффективности направленной нуклеотидной замены дуплексной ДНК, включающий
(a) получение олигонуклеотида, содержащего домен, который способен гибридизоваться с первой последовательностью ДНК указанного дуплекса, где указанной домен содержит:
(i) по меньшей мере, один некомплементарный нуклеотид по отношению к первой последовательности ДНК; и
(ii) по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид, обладающий повышенной аффинностью связывания, и
(b) увеличение расстояния между указанным модифицированным нуклеотидом и указанным некомплементарным нуклеотидом до приблизительно 8 или меньше нуклеотидов; и
(c) выделение олигонуклеотида для применения в направленной нуклеотидной замене.
36. Олигонуклеотид для направленного изменения дуплексной ДНК, где указанной олигонуклеотид содержит домен, который способен гибридизоваться с первой последовательностью ДНК указанного дуплекса, и указанный домен содержит:
(a) по меньшей мере, первый некомплементарный нуклеотид по отношению к первой последовательности ДНК;
(b) по меньшей мере, один участок, содержащий, по меньшей мере, один модифицированный нуклеотид, обладающий повышенной аффинностью связывания, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой LNA, где указанный модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии не больше, чем 8 нуклеотидов от указанного некомплементарного нуклеотида.
37. Олигонуклеотид по п.36, в котором модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии не больше, чем 8 нуклеотидов от указанного некомплементарного нуклеотида.
38. Олигонуклеотид по п.36, в котором модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии не больше, чем 6 нуклеотидов от указанного некомплементарного нуклеотида.
39. Олигонуклеотид по п.36, в котором модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии не больше, чем 4 нуклеотида от указанного некомплементарного нуклеотида.
40. Олигонуклеотид по п.36, в котором модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии не больше, чем 2 нуклеотида от указанного некомплементарного нуклеотида.
41. Олигонуклеотид по п.36, в котором указанный домен содержит 2 LNA.
42. Олигонуклеотид для направленной нуклеотидной замены в дуплексной ДНК, где указанный олигонуклеотид содержит:
(a) модифицированный нуклеотид; и
(b) некомплементарный нуклеотид по отношению к цепи указанной дуплексной ДНК, где указанный модифицированный нуклеотид располагают на расстоянии приблизительно 1 нуклеотида от указанного некомплементарного нуклеотида.