АНАЛИЗАТОР ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Область техники
in vitro
Заявляемая полезная модель относится к области медицинской техники, а именно, к конструктивным реализациям анализаторов для медицинской диагностики , и может быть использована для быстрого выявления ДНК или РНК возбудителя в биологическом образце, в том числе РНК коронавируса SARS-CoV-2 (возбудителя COVID-19), методом изотермической амплификации нуклеиновых кислот с детекцией в реальном времени.
Уровень техники
Анализы на выявление возбудителя SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) достаточно трудоемки, длительны в реализации и требуют наличия специальных инструментов, в результате чего не могут удовлетворить текущий быстрый рост потребности в тестировании большого числа пациентов с подозрением на заболевание, бессимптомных пациентов и людей, имевших контакт с уже выявленными носителями заболевания. Таким образом, существует необходимость в создании быстрого, простого и чувствительного анализа.
Известен способ выявления нуклеиновых кислот, основанный на принципах изотермической амплификации (ИА). Все известные методики изотермической амплификации объединяет отсутствие необходимости термоциклирования реакции. Изотермические условия реакции реализуются за счет наличия в реакционной смеси фермента, имеющего сильную, так называемую, цепь-вытесняющую активность (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12): E63. doi: 10.1093/nar/28.12. e63).
Сущность данного способа заключается в удвоении участка ДНК с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры. При совмещении с обратной транскрипцией реакция изотермической амплификации может с высокой эффективностью наращивать участок РНК последовательности. Данный метод основан на автоматическом цикле синтеза ДНК цепи со смещением при использовании ДНК-полимераз с высокой активностью смещения и четырех (или в некоторых способах шести) специально созданных праймеров. ИА-анализ является быстрым, не требует применения дорогостоящего оборудования и реагентов, что может снизить стоимость обнаружения коронавируса.
Благодаря этому появляется возможность, во-первых, упростить конструкцию анализатора и, во-вторых, значительно уменьшить время анализа, доведя его до уровня «прикроватного» теста. Скорость получения результата с помощью метода ИА намного выше, чем у классического теста ПЦР.
Из публикации US20210071236A1 известно портативное молекулярно-диагностическое устройство, включающее корпус; модуль пробоподготовки, расположенный внутри корпуса, включающий нагреватель и узел пробоподготовки, определяющий входной объем образца, который принимает необработанный биологический образец, и проточный канал, сообщающийся жидкостью с входным объемом образца, нагреватель, сконфигурированный для нагрева необработанного биологического образца по мере его прохождения через проточный канал для извлечения РНК из целевого вируса в необработанном биологическом образце и получения раствора обратной транскрипции, содержащего комплементарную ДНК;
модуль амплификации, сконфигурированный для приема раствора обратной транскрипции из модуля подготовки образца, и для нагрева раствора обратной транскрипции для амплификации комплементарной ДНК в растворе обратной транскрипции для получения детектирующего раствора;
модуль реагента, включающий контейнер реагента, содержащий реагент обнаружения, разработанный для облегчения получения сигнала, указывающего на наличие целевого ампликона; и
модуль обнаружения, включающий поверхность обнаружения, сконфигурированную для захвата целевого ампликона из раствора обнаружения, модуль обнаружения в жидкой связи с модулем реагента таким образом, что сигнал вырабатывается в ответ на реагент, передаваемый в модуль обнаружения.
Из публикации AU2015373998A1 известно устройство для молекулярной диагностики, содержащее: корпус; модуль амплификации, сконфигурированный для приема входного образца, определяющий реакционный объем и включающий нагреватель при этом модуль амплификации может выполнять полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на входном образце; и модуль обнаружения, сконфигурированный для приема выходного сигнала от модуля усиления и реагента, составленного для получения сигнала, указывающего на присутствие целевого ампликона внутри входного образца, причем модуль усиления и модуль обнаружения интегрированы в корпус матрицы и где тестовое устройство молекулярной диагностики является портативным.
Недостатками раскрытых выше устройств является одноразовость узла пробоподготовки, в результате чего для реализации одного анализа требуется изготовить сложную внутреннюю структуру анализатора, которая должна быть утилизирована после проведения анализа. Такой подход является экономически и производственно нецелесообразным. Кроме того, недостатком является ограниченность реактивов и, как следствие, невозможность проведения анализа на другой возбудитель, поскольку реактивы помещают внутрь анализатора при его производстве.
В публикациях US 6767512 B1, US 7074367, US 7347977 B2, US 6340589, US 6528302, US 20070246858A1, US 20080084004, US 20030180192 и US 20060120927 рассмотрены системы CFX-96 для проведения ПЦР диагностики в реальном времени. Известные устройства выполнены в виде массивного прибора, содержащего планшет с 96 лунками для исследуемых проб, модуль терморегуляции и нагрева проб для проведения ПЦР, сложную подвижную оптомеханическую систему, детектирующую флуоресцентный сигнал от лунок планшета, заполненного реагентами, и сенсорный экран, обеспечивающий возможность управления работой прибора и вывода результатов исследования проб. Данная оптомеханическая система не только повышает стоимость и длительность процесса изготовления устройства, но также увеличивает массу устройства, его габариты, чувствительность к вибрациям и травмоопасность.
Устройства аналогичного назначения раскрыты также в публикациях:
https://www.labgene.ch/isothermal-fluorescence-pcr/655-labgene-8c-isothermal-fluorescence-pcr-system.html
http://www.optigene.co.uk/instruments/instrument-genie-iii/
Данные устройства предназначены для проведения ПЦР диагностики на открытом воздухе, при этом каждое устройство содержит один нагревательный блок на 8 лунок. Прибор (https://www.labgene.ch/isothermal-fluorescence-pcr/655-labgene-8c-isothermal-fluorescence-pcr-system.html), выбранный в качестве прототипа, работает на основе метода изотермической амплификации и имеет 2 оптических канала для возбуждения и детекции флуоресцентного сигнала. Важно заметить, что перечисленные выше устройства не осуществляют этап экстракции, а следовательно, данный ключевой этап изотермической амплификации необходимо проводить отдельно либо с применением особых реагентов, но которые не всегда имеется возможность применять для различных заболеваний.
Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемой полезной модели, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу, за счет создания компактного, простого и надежного в использовании индивидуального портативного устройства (далее анализатора) определения возбудителей инфекционных заболеваний у пациента, в частности РНК коронавируса SARS-CoV.
Краткое раскрытие сущности полезной модели
Технический результат, достигаемый при использовании полезной модели, заключается в упрощении конструкции устройства анализатора за счет модификации и упрощения оптической системы детекции и системы поддержания температуры пробы.
Заявляемый технический результат достигается тем, что анализатор для проведения изотермической амплификации, включающий корпус, в котором расположен блок управления анализатором и модуль амплификации и детекции, включающий нагревательный элемент, снабженный средством контроля температуры пробы, и блок оптической детекции, согласно техническому решению, снабжен модулем экстракции, расположенным в верхней панели корпуса, и предназначенным для выделения нуклеиновых кислот из пробы биологического материала термокоагуляционным методом, и содержит два модуля амплификации и детекции, расположенные в боковых откидных отсеках корпуса, при этом модуль экстракции включает по меньшей мере, один нагреватель экстракции со слотами для размещения пробирок и средство контроля температуры пробы, а нагревательный элемент модуля амплификации и детекции снабжен слотами для размещения реакционных пробирок с независимыми блоками оптической детекции, каждый из которых включает светодиодный осветитель, соосно расположенный с ним полосовой светофильтр с полосой пропускания 440-500 нм, и последовательно расположенные на оси, отличной от оси осветителя, собирающую линзу детектора, расположенную с обеспечением размещения ее фокуса в центре объема жидкости, предназначенной для размещения внутри каждой реакционной пробирки, установленной в соответствующий слот нагревателя амплификации, а также полосовой светофильтр с полосой пропускания 520-550 нм и одноканальный кремниевый фотодетектор. Независимые блоки оптической детекции обеспечивают последовательную детекцию флуоресцентного свечения из объемов реакционных пробирок, выполненных с возможностью установки в слотах нагревателя амплификации, с возбуждением в спектральной области 440–500 нм и эмиссией в спектральной области 520–550 нм. Слоты нагревательного элемента модуля амплификации и детекции предназначены для размещения 4 пробирок объемом не более 0,2 мл, а слоты нагревательного элемента модуля экстракции предназначены для размещения двух пробирок объемом не более 1,5 мл, при этом слоты нагревателя экстракции и нагревательного элемента модуля амплификации и детекции выполнены конусообразными и соответствуют форме размещаемых в них пробирок. Блок управления анализатором обеспечивает определение интенсивности флуоресцентного сигнала с использованием принципа цифрового синхронного детектирования с оцифровкой аналогового сигнала и определяет валидность анализа. Средство контроля температуры пробы модуля экстракции и средство контроля температуры пробы модуля амплификации и детекции выполнены в виде металлической панели с терморезисторами и термоэлектрическим преобразователем и обеспечивают контроль поддержания температуры пробы в соответствующем модуле с точностью до 0,5°С. Нагреватель экстракции обеспечивает нагрев размещаемой в слотах модуля экстракции пробирки до температуры до 95°С. Дисплей устройства может быть выполнен сенсорным.
К техническим преимуществам заявляемого устройства относятся также:
1) более простое устройство термостата и оптического детектора по сравнению с аналогами, отсутствие подвижных частей, что способствует упрощению и удешевлению производства анализатора, а также повышает его надежность;
2) возможность проведения всех стадий анализа в стандартных одноразовых пластиковых пробирках, что минимизирует перекрестное загрязнение проб и способствует снижению загрязнения окружающей среды, а также упрощает процедуру проведения анализа;
3) малый вес и компактные размеры анализатора, что позволяет использовать устройство как прикроватную тест-систему;
4) конструктивная возможность проводить полностью валидный молекулярно-диагностический тест с использованием разнообразных контролей;
5) повышение точности измерений в результате модификации оптического блока детекции.
Все элементы блока оптической детекции смонтированы в одну деталь с обеспечением их взаимной неподвижности. Отсутствие оптико-механических компонент в составе оптического блока упрощает сборку, способствует более стабильной работе устройства, ускоряет проведение анализа, повышает надёжность и удешевляет устройство. Кроме того, в блоке детекции геометрически разделены оптические пути осветителя и детектора. Данное решение позволяет исключить из оптической схемы детекции светоделители. Такого расположения оптических путей удалось достичь, в том числе и из-за особой формы нагревательных элементов, в которых конусообразные слоты расположены под углом к оси оптической системы. Угол наклона слота позволяет расположить реакционную пробирку так, чтобы оптические оси осветителя и детектора имели минимальный угол с нормалью к боковой поверхности пробирки. Такое расположение позволяет с одной стороны минимизировать преломление и потери света при прохождении через стенку пробирки, а с другой, за счет конусообразной формы пробирки, позволяет развести оптические оси осветителя и детектора так, чтобы не включать в оптическую схему светоделитель.
В нагревательных элементах анализатора не используется элементы Пельтье, что также упрощает и удешевляет конструкцию устройства.
При помощи заявляемого устройства проводят анализ методом изотермической амплификации и детектируют результаты амплификации в реальном времени, что позволяет выявлять наличие в пробе генетического материала тех или иных возбудителей инфекционных заболеваний (в частности, SARS-CoV-2).
Краткое описание чертежей
Заявляемая полезная модель характеризуется следующими чертежами и изображениями, где
на фиг.1 представлен общий вид анализатора с открытым модулем амплификации и детекции,
на фиг. 2 представлен модуль экстракции в разрезе,
на фиг. 3–4 представлено внутреннее устройство анализатора,
на фиг. 5–6 представлен вид модуля амплификации и детекции без корпуса,
на фиг. 7 представлен блок оптической детекции анализатора в разрезе,
на фиг. 8–9 представлены изображения сенсорного экрана.
Позициями на чертежах обозначены:
1 – Нагреватель экстракции
2 – Держатель реакционных пробирок
3 – Зона экстракции и заполнения реакционных пробирок
4 – Верхняя часть корпуса
5 – Цветной сенсорный экран
6 – Нижняя часть корпуса
7 – Модуль амплификации и детекции
8 – Слот модуля амплификации и детекции
9 – Реакционные пробирки
10 – Силиконовые накладки
11 – Пробирка экстракции
12 – Конусообразные слоты нагревателя экстракции
13 – Плата нагревателя экстракции
14 – Система прижима
15 – Плата управления цветным сенсорным экраном
16 – Плата контроллера амплификатора
17 – Плата контроллера нагревателей
18 – Терморезисторы нагревателя экстракции
19 – Упругие элементы системы прижима
20 – Ось модуля амплификации и детекции
21 – Плата детектора
22 – Плата осветителя
23 – Нагреватель модуля амплификации
24 – Линза детектора
25 – Светофильтр осветителя
26 – Терморезистор нагревателя модуля амплификации
27 – Светодиодные осветители
28 – Держатель осветителя
29 – Конусообразные слоты нагревателя модуля амплификации
30 – Светофильтры детектора
31 – Кремниевый фотодетектор
Осуществление полезной модели
Заявляемое устройство представляет собой компактный настольный прибор (анализатор), предназначенный для проведения молекулярно-генетического анализа, позволяющего установить факт присутствия в пробе генетического материала возбудителей инфекционных заболеваний. Для проведения такого анализа в анализаторе реализуется метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот с детекцией в реальном времени с помощью интеркалирующего флуоресцентного красителя.
Анализатор имеет возможность работать как от бытовой электросети, так и при питании от внешнего аккумулятора, что позволяет проводить диагностику, в том числе, и вне помещений. Малый вес и компактные размеры анализатора делают возможным его использование не только стационарно в специализированной лаборатории, но и как прикроватную тест-систему. Анализатор обеспечивает возможность проведения анализа двух проб одновременно совместно с положительным, отрицательным и внутренним контролями для обеспечения условия валидности результата. Для проведения реакции анализа с помощью заявляемого анализатора используют стандартные пластиковые лабораторные пробирки, что дает возможность использовать обычные расходные материалы клинико-диагностических лабораторий.
Устройство выполнено в едином корпусе. Корпус устройства может быть изготовлен, например, методом 3D-печати из пластика АБС с последующей обработкой и покраской внешней стороны, либо методом литья полиуретана в силиконовую форму, либо литьем под давлением с применением термопластавтомата. Использование полиуретана для корпуса обусловлено такими его свойствами как: нетоксичность, влагостойкость, химическая стойкость, теплостойкость, малый вес. Корпус анализатора (6) закрыт верхней панелью (4), на которой расположена зона экстракции и заполнения реакционных пробирок (3). На боковых поверхностях корпуса расположены крышки двух откидных боковых отсеков, в которых смонтированы модули амплификации и детекции (7), по одному с каждой стороны. В передней части корпуса расположена лицевая панель, на которой установлен цветной сенсорный экран (5), например, с диагональю 3,5 дюйма, с помощью которого оператор осуществляет управление анализатором, производит запуск процедур выделения генетического материала из пробы, запуск реакции ИА и получает результаты анализа. На нижней поверхности корпуса анализатора расположены силиконовые накладки (10), которые препятствуют скольжению анализатора по рабочей поверхности. Внутри корпуса анализатора расположены: плата нагревателя модуля экстракции (13), система прижима (14), плата управления цветным сенсорным экраном (15), плата контроллера амплификатора (16), плата контроллера нагревателей (17). Внутренний вид анализатора показан на фиг. 3–4.
В корпусе, со стороны верхней панели анализатора расположен модуль экстракции и заполнения реакционных пробирок (3), включающий панель с отверстиями, предназначенными для размещения пробирок для проведения экстракции (11), и реакционных пробирок (9). Панель может быть выполнена из полиоксиметилена, обеспечивающего теплоизоляцию нагревательной части зоны экстракции. Модуль экстракции включает также нагреватели экстракции (1) с конусообразными слотами (12) (предпочтительно, два) и держатели реакционных пробирок (2) для удобства проведения процедуры экстракции (выделения) и заполнения реакционных пробирок. Нагревательный элемент экстракции (1) с конусообразными слотами (12), изготовлен из алюминиевого сплава, например, Д16Т. Форма конусообразных слотов (12) повторяет форму пробирок экстракции (11), что обеспечивает высокую и равномерную теплопередачу от нагревателя к раствору в пробирке. Четыре терморезистора нагревателя экстракции (18) мощностью 30 Вт, осуществляют нагрев пробирок экстракции (11) с пробами в соответствующих растворах до температуры 95°С. Контроль температуры осуществляется с помощью терморезисторов нагревателя экстракции (18) и при помощи термоэлектрического преобразователя. Указанная температура поддерживается с точностью до 0,5°С. Управление нагревом зоны экстракции осуществляется с помощью платы нагревателя экстракции (13) и платы контроллера нагревателей (17) с помощью реализованного на них пропорционально-интегрально-дифференцирующего (ПИД) регулятора.
При заполнении реакционных пробирок (9) их располагают на верхней панели в специальных держателях (2), после чего помещают в модуль амплификации и детекции (7).
В боковых откидных панелях на осях (20) расположены два модуля амплификации и детекции (7). Каждый модуль (7) обеспечивает возможность размещения 4-х реакционных пробирок в специальных слотах на откидных панелях.
Таким образом, каждый модуль (7) имеет 4 слота амплификации и детекции (8). Каждый модуль амплификации и детекции (7) снабжен термостатом, который позволяет поддерживать температуру необходимую для протекания реакции изотермической амплификации. Термостат состоит из нагревателя модуля амплификации (23) и терморезисторов (26). Нагреватель (18) может быть изготовлен из алюминиевого сплава, например марки Д16Т, методом прецизионной ЧПУ фрезерной обработки. В нагревателе (18) выполнены конусообразные слоты нагревателя (29) для плотной посадки реакционных пробирок (9). Для обеспечения наилучшего теплового контакта данные конусообразные слоты (29) соответствуют форме реакционных пробирок. За счет этого обеспечивается высокая и равномерная теплопередача от нагревателя к раствору. К каждому нагревателю (23) присоединены по два терморезистора (26) мощностью 30 Вт. Терморезисторы (26) осуществляют одновременный синхронный нагрев 4-х слотов амплификации и детекции (7) до задаваемой пользователем температуры, например, 65°С. Терморезистор нагревателя модуля амплификации (26) обеспечивает поддержание температуры с точностью 0,5°С, так как перегрев реакционной смеси амплификации может привести к порче реакционной смеси, а недостаточная температура увеличивает время протекания реакции амплификации. Средство контроля температуры модуля амплификации представляет собой термоэлектрический преобразователь, расположенный в каждом модуле амплификации и детекции (7). Управление нагревом в модуле амплификации осуществляется с помощью платы контроллера амплификатора (16) и платы контроллера нагревателей (17) с помощью реализованного на них ПИД регулятора. В закрытом положении слота с модулем амплификации и детекции (7) реакционные пробирки (9) дополнительно прижимаются к нагревателю амплификации (23) с помощью упругого элемента (19) системы прижима (14).
В каждом слоте нагревателя амплификации расположен отдельный блок оптической системы детекции, включающий светодиодный осветитель (27), закрепленный в держателе (28), детектор и светофильтры.
Оптическая система разработана, исходя из спектров возбуждения и эмиссии наиболее распространенных интеркалирующих флуорофоров, входящих в состав современных наборов реагентов для проведения ИА анализа. На фиг. 5–7 представлен вид блока амплификации и детекции с разных ракурсов и в разрезе.
Принципиальное устройство оптической системы детекции анализатора описывается следующей последовательностью расположения элементов в анализаторе: светодиодный осветитель (27), закрепленный в держателе (28), полосовой светофильтр осветителя (25), слот амплификации и детекции (8) с реакционной пробиркой (9) со смесью пробы и реагентов изотермической амплификации, собирающая линза детектора (30), полосовой светофильтр детектора (30), одноканальный кремниевый фотодетектор (31). В качестве осветителя используется светодиод с центральной длиной волны 465±5 нм и спектральной шириной на полувысоте 20±5 нм. Используемая пара светофильтров не имеет спектральной области одновременного пропускания, а значит, на кремниевый фотодетектор (31) анализатора может поступать только флуоресцентное излучение интеркалирующего флуорофора, а возбуждающее излучение источника (светодиодного осветителя (27)) отсекается. Кроме того, оптические оси осветителя и детектора расположены под углом друг к другу, что также позволяет минимизировать прямое попадание излучение источника на детектор. Собирающая линза детектора (24) позволяет направить на кремниевый фотодетектор (31) большее количество излучения флуоресценции из объема пробы. Линза расположена так, что точка фокуса расположена в центре объема жидкости в реакционной пробирке. Кроме того, линза позволяет сформировать квазипараллельный световой пучок через полосовой фильтр, что необходимо для его корректной работы. Такие характеристики фильтров и положение оптических осей и элементов позволяют использовать весь динамический диапазон детектора для регистрации целевого сигнала, и, тем самым, детектировать слабые сигналы с большей точностью. В качестве фотодетектора (31) используют кремниевый фотодиод, подключенный к трансимпедансному усилителю тока. Описанная оптическая схема реализована для каждой из 8-ми реакционных пробирок. Детекция флуоресцентного свечения от реакционных пробирок происходит последовательно, что позволяет избежать перекрестной засветки и перекрестного детектирования. Блок оптической системы выполнен таким образом, что все оптические элементы и одноразовые реакционные пробирки с пробами расположены в одной детали. Такая геометрия не требует постоянной прецизионной юстировки положения оптических элементов и реакционных пробирок. Управление блоком оптической системы детекции обеспечивается с помощью электронного блока, состоящего из платы детектора (21), платы осветителя (22) и платы контроллера амплификатора (16). Данный электронный блок обрабатывает сигналы методом синхронного детектирования с параллельным аналогово-цифровым преобразованием. Описанный блок оптической системы детекции и электронный блок управления и детекции позволяют регистрировать процесс амплификации в реальном времени с высокими показателями сигнал/шум и сигнал/фон. Таким образом достигается высокая точность измерений.
На лицевой стороне заявляемого анализатора расположен цветной сенсорный экран (5), с помощью которого осуществляют управление анализатором и на который выводятся результаты анализа. Управление анализатором осуществляют с помощью платы управления (15). С помощью экрана пользователь может: запустить нагреватель экстракции (1); запустить модуль амплификации и детекции (7); посмотреть результаты проведенного анализа или предыдущих анализов в виде графиков временной зависимости интенсивности флуоресцентного сигнала, или виде автоматически обработанной инфографики. Также на цветной сенсорный экран (5) выводятся подсказки по действиям, необходимым для проведения всех этапов анализа.
Заявляемый анализатор работает следующим образом.
1) Анализатор включают с помощью кнопки включения и выключения, расположенной на задней стенке корпуса, при этом включается нагреватель экстракции (1), осуществляющий предварительный нагрев термостата экстракции до 95°С. Данная функция способствует ускорению процесса проведения экстракции. Прогрев происходит в течение нескольких минут, в зависимости от температуры в помещении. После прогрева анализатора, на цветном сенсорном экране (5) автоматически выводится соответствующее сообщение о готовности устройства.
2) Экстракция нуклеиновых кислот из биологической пробы проводится в модуле экстракции термокоагуляционным методом при температуре, рекомендованной производителем реагентов.
о
При экстракции происходит выделение генетического материала (нуклеиновых кислот) из клеток и/или вирусных частиц, находящихся в биологическом образце. Такое выделение необходимо для последующих химических реакций и детектирования количества продуктов. Анализатор позволяет проводить экстракцию с помощью термокоагуляционного метода. [J. Membrillo-Hernandez, A. Nunez-de la Mora, T. del RioAlbrechtsen, R. Camacho-Carranza and M. C. Gomez-Eichelmann, J. Basic Microbiol., 1995, 35, 41–46.\] [D. S. Holmes and M. Quigley, Anal. Biochem., 1981, 114, 193–197.]  [ E. M. Southern, J. Mol. Biol., 1975, 98, 503–517.]  [R. K. Saiki, D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich, Science, 1988, 239, 487–491]. При таком методе выделения происходит лизис клеточных и вирусных мембран в специальном буферном растворе при температуре до 95 С, в течение рекомендованного производителем времени. Преимуществом такого типа выделения является минимальное, по сравнению с другими методами анализа, время. При использовании заявляемого анализатора для экстракции нуклеиновых кислот используют, например, набор реактивов “IsoAmp SARS-CoV-2 Express” (производство компании ООО НПФ “Литех”, РУ № РЗН 2020/9904 от 27 марта 2020 г.), в частности, реактив «НК-экспресс» и «транспортный буфер» из данного набора (время экстракции составляет не более 12 минут). Заявляемый анализатор имеет возможность работать с любыми наборами реактивов, которые позволяют проводить экстракцию генетического материала с помощью термокоагуляционного метода.
Экстракцию проводят в стандартных одноразовых пластиковых пробирках экстракции (11) объемом 1,5 мл, конусообразной формы (например, одноразовые полипропиленовые пробирки вместимостью 1,5 мл с защелкивающейся крышкой; Eppendorf Safe-Lock Tubes, РУ ФСЗ 2009/04520 от 19.06.2009 (Кат. № 0030120086)). Значимой является форма нижней части пробирки, она должна являться конусом с углом раствора 8,7±0,2°, с радиусом скругления вершины 2,8±0,2 мм и диаметром основания 10,3±0,5 мм. Материал пробирки должен выдерживать нагрев до 100°С без изменения формы и пластичности.
Для проведения этапа экстракции предварительно подготавливают пробирки экстракции (11) объемом 1,5 мл с раствором для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала (например, используют раствор для выделения РНК вируса «НК-экспресс»). Затем в пробирку экстракции (11) вносят раствор, содержащий пробу, в необходимом объеме согласно инструкции к используемому набору реагентов. После чего пробирку экстракции (11) помещают в нагреватель экстракции (1), устанавливая ее в соответствующий слот нагревателя экстракции на верхней панели корпуса. С помощью сенсорного экрана (5) запускают процедуру экстракции. В данном примере реализации происходит необходимый для выделения нуклеиновых кислот прогрев пробы до температуры 95°С в течение не более 12 минут. По истечении указанного времени процесс экстракции окончен. Растворы готовы для дальнейшего проведения амплификации. Пробирки экстракции (16) извлекают из нагревателя экстракции (1).
При проведении экстракции плата нагревателя экстракции (13) подает ток на терморезисторы нагревателя экстракции (18), за счёт чего происходит нагревание. В нагреватель экстракции в качестве средства контроля температуры встроен термоэлектрический преобразователь, сигнал с которого передается на плату нагревателей (13). Поддержание температуры происходит за счёт модулирования тока на терморезисторе посредством ПИД-регулирования, сигнал с термоэлектрического преобразователя используется для обратной связи. Частота считывания сигнала термоэлектрического преобразователя до 100 Гц. Оба слота модуля экстракции прогреваются одновременно и равномерно, таким образом, обе пробирки экстракции находятся при одинаковой температуре. При использовании разных наборов реактивов для успешного проведения экстракции может понадобиться выдерживать смеси при разных температурах разное время. Анализатор позволяет пользователю изменять количество этапов работы нагревателя экстракции, длительность каждого этапа и температуру на каждом этапе.
3) Дальнейший анализ происходит в одноразовых реакционных пробирках (9). Для удобства работы с растворами реакционные пробирки (9) помещают в держатель (2) в зоне экстракции и заполнения (3). С помощью лабораторного семплера, согласно инструкции к набору реагентов, в реакционные пробирки (9) из пробирки экстракции (11) переносят раствор, прошедший процедуру выделения (экстракции). После чего заполненные реакционные пробирки (9) закрывают и помещают в слоты (8) зону амплификации и детекции (7) анализатора «Изаскрин-8».
В случае если необходима автоматическая интерпретация результатов анализа, пользователю следует помещать реакционные пробирки в слоты амплификации в следующей последовательности слева направо (вид со стороны соответствующего слота амплификации): слот  I – пробирка амплификационной смесью для отрицательного контроля; слот II – пробирка с амплификационной смесью, для проведения специфического анализа пробы; слот III – пробирка с амплификационной смесью, для проведения реакции внутреннего контроля пробы; слот IV – пробирка с амплификационной смесью, для проведения реакции положительного контроля пробы. Если необходимость автоматической интерпретации результатов отсутствует, или анализируются растворы других реакционных смесей, пользователь помещает реакционные пробирки в слоты в любой удобной ему последовательности, и самостоятельно производит интерпретацию результатов по графикам временной зависимости интенсивности флуоресценции, согласно инструкции к набору реагентов.
4) С помощью сенсорного экрана (5) запускают процедуру амплификации и детекции в реальном времени. При необходимости процессы экстракции и амплификации могут быть принудительно прерваны.
9
Изотермическая амплификация (ИА) – один из наиболее популярных методов амплификации нуклеиновых кислот в лабораторной диагностике вирусных заболеваний [Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12): E63. doi: 10.1093/nar/28.12. e63.]. В основе метода лежит выявление специфического фрагмента РНК вируса путем получения ДНК-копии (кДНК) с РНК-матрицы с помощью обратной транскрипции и её последующем накоплении (амплификации) в изотермическом режиме при постоянной температуре. Метод изотермической амплификации высокочувствителен за счёт использования шести олигонуклеотидных праймеров и ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Bacillius stearothermophilus. Конкретный набор праймеров определяет, какая генетическая последовательность будет амплифицирована, т. е. например, какой возбудитель инфекционного заболевания может быть выявлен. Амплификация является основным этапом проведения анализа по методике ИА. Критически важным условием для реализации метода ИА является стабильное поддержание температуры 65°С на всем протяжении реакции с минимальными отклонениями. В результате реакции изотермической амплификации образуются длинные участки цепей нуклеиновых кислот в объеме анализируемой смеси пробы и реагентов. Количество и общая длина данных продуктов амплификации, в общем случае, пропорциональна первоначальной концентрации в пробе нуклеотидных последовательностей, требуемых к выявлению. При отсутствии такового амплификация не происходит. При наличии искомого генетического материала в пробе происходит необычайно высокий выход продукта кДНК, за время реакции его количество увеличивается в ~10 раз. Таким образом, для установления факта наличия в пробе искомого генетического материала необходимо детектировать общее количество продуктов амплификации. Для детекции общего количества продуктов амплификации чаще всего используют интеркалирующий флуорофор.
0
В отличие от классической полимеразной цепной реакции, в которой наработка генетического материала происходит в ходе трехэтапного термоциклирования реакционной смеси, для реакции ИА достаточно поддержания одной заданной температуры образца 65С. Это позволяет избежать необходимой интеграции в устройство блока термоциклирования.
Для работы с заявляемым анализатором используют, например, набор химических реагентов для проведения анализа по методу изотермической амплификации “IsoAmp SARS-CoV-2 Express” (производство компании ООО НПФ “Литех”, РУ № РЗН 2020/9904 от 27 марта 2020 г.). Заявляемый анализатор имеет возможность работать с любыми наборами реактивов, которые позволяют проводить изотермическую амплификацию с детекцией результатов с помощью интеркалирующего флуоресцентного красителя с возбуждением в спектральной области 440–500 нм и эмиссией в спектральной области 520–550 нм.
Из специфики свойств реактивов и системы детекции следует, что реакцию ИА необходимо проводить в термостойких реакционных камерах с постоянной геометрией и высоким светопропусканием в спектральном диапазоне флуорофора. В качестве таких реакционных камер при работе с анализатором «Изаскрин-8» используют стандартные одноразовые пластиковые конусообразные лабораторные реакционные пробирки объемом 0.2 мл (9) (например, бесцветные одноразовые полипропиленовые микропробирки вместимостью 0,2 мл для амплификации. SSIbio, 0.2 mL SnapStrip II PCR Tubes, РУ ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 (Кат. № 3245–00)). Значимой является форма нижней части пробирки, она должна являться конусом с углом раствора 8,65±0,1°, с радиусом скругления вершины 1,5±0,1 мм и диаметром основания 5,8±0,25 мм. Материал пробирки должен выдерживать нагрев до 100°С без изменения формы, пластичности и характеристик светопропускания. Стенки пробирки должны обладать светопропусканием не ниже 91% в спектральном диапазоне 440–550 нм.
5) На первом этапе амплификации, длящемся не более 7 минут, происходит обратная транскрипция, и температура поддерживается на уровне 50°С. При этом происходит образование “базовой” гантелеобразной структуры молекулы ДНК, представляющей собой линейную одноцепочечную молекулы ДНК со шпильками на концах и содержащую целевой амплифицируемый участок. На первом этапе плата контроллера амплификатора (16) активирует плату нагревателей (17) и на терморезисторы (26) нагревателя амплификации (23) поступает ток, за счёт чего происходит нагревание. В нагреватель амплификации встроен термоэлектрический преобразователь, сигнал с которого заведен на плату нагревателей (17). Поддержание температуры происходит за счёт модулирования тока на терморезисторе посредством ПИД-регулирования, сигнал с термоэлектрического преобразователя используется для обратной связи. Частота считывания сигнала термоэлектрического преобразователя до 100 Гц. Оба модуля амплификации всегда нагреваются одновременно и равномерно, таким образом, все 8 реакционных пробирок находятся при одинаковой температуре. При использовании разных наборов реактивов для успешного проведения амплификации может понадобиться выдерживать реакционные смеси при разных температурах разное время. Анализатор позволяет пользователю изменять количество этапов работы нагревателя амплификации, длительность каждого этапа и температуру на каждом этапе. В данном примере реализации у процесса амплификации два этапа работы нагревателя. На первом этапе в нагревателе поддерживается температура 50°С в течение не более 5 минут, на втором этапе поддерживается температура 65°С в течение не более 17 минут.
6) После завершения первого этапа начинается второй этап амплификации, при котором поддерживается температура 65°С в течение не более 17 минут. Поддержание температуры происходит аналогичным первому этапу способом. Кроме того, на втором этапе, одновременно с поддержанием температуры, происходит оптическая детекция в реальном времени. В ходе оптической детекции фотодиод регистрирует изменение интенсивности флуоресцентного свечения из-за увеличения количества интеркалирующего красителя, связавшегося с нуклеиновыми кислотами. При этом детекция флуоресцентного сигнала от каждого слота амплификации происходит раздельно с шагом 30 с. Для детекции количества вновь синтезированных нуклеотидных последовательностей происходит возбуждение и считывание флуоресцентного интеркалирующего красителя в каждой реакционной пробирке по отдельности. При этом каждые 30 секунд плата осветителя (22) последовательно зажигает светодиодные осветители (27) для каждой реакционной пробирки. Свет от осветителя проходит через фильтр осветителя (25), где из спектра осветителя выделяется спектральная полоса возбуждения, например 440–500 нм. Далее отфильтрованное излучение освещает реакционную смесь в реакционной пробирке, возбуждая тем самым флуоресценцию. Смесь излучения осветителя и флуоресцентного излучения собирается линзой (24) и направляется через светофильтр детектора (30) на кремниевый фотодетектор (31). На светофильтре детектора из излучения выделяется спектральная полоса эмиссии, например 520–550 нм. Сигнал с фотодетектора (31) заведен в плату детектора (21), где он обрабатывается с помощью усилителя и цифрового преобразователя и сохраняется в памяти анализатора. Полученные таким образом значения интенсивности флуоресценции от времени далее представляются виде графика временной зависимости на экран анализатора (см. фиг 8). По истечению времени амплификации звучит звуковой сигнал и на цветном сенсорном экране (5) выводится соответствующее сообщение.
В данной разработке детекция результатов реакции ИА осуществляется в режиме реального времени одновременно с процессом амплификации по изменению уровня интенсивности флуоресцентного излучения из объема реакционной смеси. Для детекции общего количества продуктов амплификации могут быть использованы интеркалирующие флуорофоры, такие как, например, SYBR Green I, EvaGreen, Picogreen или иодид пропидия. Уровень эмиссии данных красителей возрастает на несколько порядков при встраивании молекулы флуорофора в двойную цепочку нуклеиновых кислот. Таким образом, по мере сборки новых цепочек ДНК в процессе амплификации, увеличивается интенсивность флуоресцентного свечения от объема реакционной смеси. Детектирование такого увеличения флуоресцентного сигнала позволяет установить факт присутствия в исходной пробе, того или иного возбудителя. Указанные красители является наиболее передовой разработкой в своей области, и демонстрирует наилучшую стабильность, яркость и устойчивость по сравнению с аналогами. Флуоресцентные красители добавляют непосредственно в реакционную смесь, и результаты амплификации можно визуализировать, не открывая реакционные пробирки, что снижает риск заражения или контаминации. Флуоресцентная молекула, связанная с ДНК, не влияет на активность других элементов в реакционной смеси, таких как ферменты [O.A.Petrusha, T.L.Chernichenko, I.A.Kofiadi, V.V.Zverev, E.B.Faizuloev effectiveness of the loop-mediated isotermal amplification with fluorescent detection in the diagnosis of parvovirus enteritis in carnivores]. При работе с заявляемым анализатором «Изаскрин-8» используют, например, интеркалирующий флуоресцентный краситель EvaGreen, входящий в состав набора реагентов “IsoAmp SARS-CoV-2 Express” (производство компании ООО НПФ “Литех”, РУ № РЗН 2020/9904 от 27 марта 2020 г.).
7) Во вкладке «Графики» меню сенсорного дисплея (см. фиг. 8) пользователь может наблюдать ход анализа в реальном времени. На данных графиках отображается зависимость интенсивность сигнала флуоресценции во времени. Сигнал флуоресценции откладывают по вертикальной оси в относительных единицах флуоресценции, время откладывают по горизонтальной оси с шагом 30 секунд. При этом сигналы от разных реакционных пробирок отображаются на экране различными цветами. Если значение интенсивности флуоресценции увеличивается со временем, это значит, что осуществляется реакция амплификации, что в свою очередь свидетельствует о наличие в исходной смеси искомой генетической матрицы. После окончания анализа, на цветной сенсорный экран (5) выводится сообщение об окончании амплификации и результат измерений. Выбрав соответствующую вкладку, пользователь может вывести на цветной сенсорный экран (5) графики изменения сигнала флуоресценции от отдельных реакционных пробирок или автоматически сформированную диаграмму результатов для всех реакционных пробирок см. фиг. 9. Графики изменения интенсивности флуоресценции во времени являются основным результатом анализа проведенного по методике ИА. В большинстве случаев пользователь интерпретирует графики самостоятельно, однако прибор позволяет провести автоматическую интерпретацию.
8) Во вкладке «Результат» пользователь может ознакомиться с автоматической интерпретацией анализа, которой можно воспользоваться в случае описанной выше правильной расстановки пробирок. По результатам автоматического анализа графиков, каждый слот получает обозначение результата «-» или «V». Результат «-» - обозначает, что в данном слоте не происходило значимое увеличение сигнала флуоресценции, следовательно, реакция специфической амплификации не протекала. Результат «V» - обозначает, что в данном слоте произошло значимое увеличение сигнала флуоресценции, следовательно, реакция амплификации имела место быть. Результат из слота II обеспечивает определение наличия генетического материала SARS-CoV-2 в биологическом образце индивида. Результат из слота III за счёт тестирования внутреннего контрольного образца (ВКО) позволяет контролировать качество выделенной РНК. Присутствие возможных ингибиторов, и возможную контаминацию реагентов, а результат из слота IV провести положительный контроль реакционной смеси. Сведённые вместе в диаграмму (см. фиг 9) эти результаты позволяют получить взаимно-однозначный результат анализа биологической пробы индивида и валидности анализа. Пользователь получает автоматическую интерпретацию результатов анализа в формате «Положительно»/ «Отрицательно»/ «Невалидно», которые обозначены «+»/ «-»/«?» соответственно. Пример алгоритма интерпретации результатов приведён в табл. 1. Во всех остальных случаях имеется возможность ручной интерпретации графиков изменения уровня флуоресцентного сигнала для каждого слота.
Таблица 1
Номер реакционной пробирки
Результат
Интерпретация
IV
V
Анализ валиден. ОТСУТСТВИЕ РНК SARS-CoV-2
III
V
II
-
I
-
IV
V
Анализ валиден. ПРИСУТСТВИЕ РНК SARS-CoV-2
III
V
II
V
I
-
IV
V
Анализ НЕ валиден. Ингибирование реакции. ТРЕБУЕТСЯ повтор анализа данного образца, начиная с этапа выделения РНК.
III
-
II
-
I
-
IV
-
Анализ НЕ валиден. Возможно нарушение методики анализа.
III
-
II
-
I
-
9) После завершения анализа реакционные пробирки (9) извлекают из анализатора и утилизируют соответствующим способом. Отходы биоматериала (инфицированные и потенциально инфицированные отходы) из клинико-диагностических лабораторий, работающих с микроорганизмами 1–4 групп патогенности, образцы материала после пробоподготовки (выделение РНК) и отходы после проведения амплификации относятся к классу Б (эпидемически опасные отходы). Отходы класса Б подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции)/обезвреживанию. Выбор метода обеззараживания/ обезвреживания определяется возможностями организации, осуществляющей медицинскую деятельность, и выполняется при разработке схемы обращения с медицинскими отходами.
Пример конкретного выполнения.
В качестве опытного образца изготовлен анализатор массой около 1.0±0,1 кг со следующими габаритными размерами корпуса: Д×Ш×В (мм): 180×106,5×114,5. Анализатор работает от сети переменного тока, напряжением 220 ± 20 В, частотой 50 Гц. Характеристики блока питания анализатора: вход - АС 100–240  В; выход: DC 20 В; 3,25А Максимальная потребляемая мощность составляет 65 Вт. Коммуникация пользователя с Анализатором происходит через интерфейс цветного сенсорного экрана (5) MOD-LCD2.8RTP фирмы Olimex с разрешением экрана 320×240 пикселей и диагональю 2,8 дюйма. Управление осуществляется по шине SPI. Блок питания использован Buro BUM-1245M90 ручной 90W 12V-24V 11-connectors 3,5A 1xUSB 1A от бытовой электросети с LСD индикатором. В качестве системы управления в анализаторе используется система на кристалле (СнК) модели ESP32-D0WD. Программное обеспечение данного устройства основано на операционной системе реального времени FreeRTOS. Нагреватели экстракции (1) и нагреватели амплификации (23) выполнены из алюминиевого сплава, например марки Д16Т. В качестве источников тепла использованы резисторы Bourns PWR221T-30-7R50J, 7,5 Ом, 30 Вт, соединенные последовательно (в сумме 15 Ом), на которых коммутируется 20 В. Контроль температуры осуществляется терморезисторами (18, 26) B57861S0303H040, 30 кОм, 1%. Управление контролем температуры производится при помощи платы контроллера нагревателя (17) на базе микроконтроллера STM32F051C8T6.
Блок оптической детекции опытного образца включает
- светодиодные осветители (27) с центральной длиной волны 465±5 нм спектральной шириной на полувысоте 20±5 нм WP710A10QBD/D Kingbright, 3.5В.
- одноканальный кремниевый фотодетектор (31) BPW21R (например, Vishay Intertechnology, США),
- собирающую линзу детектора (24) D6FL5,89 (например, Nanyang Optics, Китай) диаметром 6 мм и фокусным расстояние 5,89 мм. Такие линзы позволили компактно разместить рядом 4 независимые оптические системы возбуждения и детекции флуоресценции на каждую реакционную пробирку.
- светофильтры осветителя (25) с полосой пропускания 440–500 нм (например, Оптиспарк, Россия). Для эффективного подавления излучения светодиода в ближней ультрафиолетовой области многослойная интерференционная структура светофильтра может быть нанесена на цветное стекло ЖС-12. Данные светофильтры имеют размер светодиодного осветителя (27) имеют размер 4×4×1 мм.
- светофильтры детектора (30) с полосой пропускания 520–550 нм (например, Оптиспарк, Россия). Данные светофильтры имеют размер имеют размер 7×7×1 мм.
Для управления источником освещения использована плата осветителя (22) с микросхемой TLC59108 фирмы Texas Instruments. Микросхема представляет собой восьмиканальный драйвер светодиодов с контролем тока и возможностью диммирования с разрешением 8 бит. Управление микросхемой со стороны микроконтроллера осуществляется с использованием двухпроводной последовательной шины I2C. Токовый сигнал кремниевого фотодетектора (31) преобразуется в напряжение из диапазона 0-1 В при помощи трансимпедансного усилителя на основе сдвоенного прецизионного операционного усилителя LTC6078 фирмы Analog Device. Далее аналоговый сигнал приводится к диапазону 0.01–2,5 В, который является диапазоном входных значений аналого-цифрового преобразователя (АЦП) AD7923 фирмы Analog Device 4-Channel, 200 kSPS 12-Bit. Аналоговый сигнал в виде напряжения из диапазона входных значений C поступает на схему фильтрации, которая представляет собой фильтр нижних частот Чебышева второго порядка с частотой среза 1 кГц. В основе схемы фильтрации используется микросхема сдвоенного операционного усилителя с низким напряжением смещения нуля ADA4666-2 фирмы Analog Device.
Таким образом, с помощью заявляемого анализатора «Изаскрин-8» возможно проводить быстрое (<40 минут) обнаружение генетического материала того или иного возбудителя инфекционного заболевания в растворе пробы. Использование данного анализатора способствует снижению сроков постановки диагноза. Компактность анализатора и простота использования позволяет обеспечить доступность осуществления эпидемиологических скрининговых процедур на территории Российской Федерации.
Разработанное устройство является универсальным анализатором, с помощью которого можно проводить анализы на выявление возбудителей различных инфекционных заболеваний. Для этого на бортовом компьютере анализатора установлено оригинальное программное обеспечение, которое позволяет создавать и редактировать сценарии проведения анализа. Таким образом, температурные режимы и алгоритм работы модуля амплификации, а также периодичность и длительность работы модуля амплификации и детекции могут быть точно согласованы с параметрами конкретного используемого набора реактивов для проведения реакции ИА.