Анализ ассоциации аллелей генов Collal, VDR и CALCR с развитием остеопороза

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

М.В. Москаленко12, М.В. Асеев1, С.М. Котова3, B.C. Баранов1

1 НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург;2 Санкт-Петербургский государственный университет; 3 Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова

Ф Методом ПДРФ проанализированы частоты аллелей генов Collai, VDR и CALCR у 174 неродственных представителей Северо-Западного региона России и у 70 пациенток с тяжелым осте-опорозом (ТО). При анализе гена Collai выявлено достоверное повышение частоты функционально неполноценного (ФН) аллеля s в группе ТО (50,0±5,9%) (р<0,0001) по сравнению с таковой в популяции (17,5±4,9%). Частота ФН аллеля t гена VDR в группе ТО составила 51,4±5,9% и была достоверно (р<0,001) выше, чем в популяции 32,6±4,9%. При исследовании гена CALCR не было выявлено достоверных отличий (р>0,05) частоты ФН аллеля Т в группе ТО (84,4±4,9%) по сравнению с таковой в популяции (73,8±3,9%). Согласно полученным данным, анализ аллелей генов Collai и VDR позволяет осуществлять раннее выявление лиц с наследственной предрасположенностью к остеопорозу и, таким образом, делает возможным профилактику этого заболевания.

Ключевые слова: генетическая предрасположенность, полиморфизм, ассоциация, остеопороз, ген Collai, ген VDR, ген CALCR, коэффициент соотношения шансов (odds ratio — OR).

АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ COL1A1, VDR И CALCR С РАЗВИТИЕМ ОСТЕОПОРОЗА

ВВЕДЕНИЕ

Остеопороз — одно из частых мультифакториальных заболеваний, характеризующееся потерей костной массы, изменением микро- и макроархитектоники костей, нарушением процессов минерализации, резорбции и ремодели-рования костной ткани [32]. В структуре остеопороза ведущее место занимает тяжелый остеопороз (ТО), развивающийся не редко в сочетании со многими хроническими заболеваниями, такими как нервная анорексия, общее недоедание, эндометриоз, миома, почечная дисфункция, с заболеваниями, приводящими к частичной или полной неподвижности [9,11]. Важнейшим критерием в диагностике ТО является оценка минеральной плотности костной ткани (МПКТ). Последняя определяется как индивидуальными генетическими особенностями, так и различными экзогенными факторами, такими как прием системных гормональных препаратов, питание, физическая активность, курение, злоупотребление алкоголем и др. [9, 11, 45]. В пользу генетической природы заболевания свидетельствуют половые и расовые различия в частоте и проявлениях остеопороза, семейная предрасположенность к переломам, высокая конкордантность заболевания у монозиготных близнецов [6, 17, 37, 39].

Существенный вклад в изучение наследственных факторов остеопороза внесли работы по идентификации генов, вовлеченных в процесс остеогенеза. Среди многих генов, участвующих в регуляции метаболизма костной ткани, особенно важная роль принадлежит генам рецептора витамина D (VDR3), рецептора кальцитонина (CALCR) и гену а 1 цепи коллагена 1 типа (Collai). Ассоциации развития остеопороза с различными аллельными вариантами этих генов посвящены многочисленные исследования [4, 5,18,19,24,25,29, 33, 35,44].

Подобных молекулярно-генетических исследований остеопороза в России, насколько нам известно, не проводилось. Задача данной работы: сравнить частоты полиморфных аллелей и соответствующим им генотипов по генам Col 1 al, VDR и CALCR у больных остеопорозом и в популяции Северо-Западного региона России.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались образцы ДНК, выделенной из ядер лимфоцитов крови 70 пациентов с ТО, полученных из Санкт-Петербургской академии профилактической медицины, а также образцы ДНК 174 здоровых неродственных индивидуумов Северо-Западного региона России в качестве популяционного

контроля. Минеральную плотность костной ткани определяли с использованием обычной рентгенографии, позволяющей выявить степень деминерализации костной ткани при уровне более 30%. Согласно рекомендациям ВОЗ (1994) Т-критерий, т. е. стандартное отклонение (SD) от нормативных показателей пиковой костной массы здоровых людей, у таких пациентов составил менее чем -3,5 SD.

Типы изученного полиморфизма генов Collai, VDR и CALCR, последовательности олигопраймеров и размеры амплифицированных фрагментов приведены в табл. 1. Реакционная смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgC12,6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1 е.а. Taq-ДНК-полимеразы (ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск). Для амплификации использовали программируемый термоциклер фирмы «Perkin Elmer», Cetus (США). После предварительной денатурации ДНК (10 минут при 98°С) проводили 28 циклов амплификации в режиме для гена Collai: денатурация образовавшихся дву-нитевых структур при 96°С — 30 сек, гибридизация ДНК с праймерами (отжиг праймеров) и синтез последовательности, комплементарной матричной ДНК (элонгация) при 68°С — 20 сек; для гена VDR: денатурация при 94°С — 1 мин, отжиг праймеров при 58°С — 1мин и элонгация при 72°С — 1 мин и 30 сек, и заключительный этап синтеза при 72°С —10 мин; для гена CALCR: денатурация при 94°С — 1 мин, отжиг праймеров при 55°С — 1мин и элонгация при 72°С — 1 мин и 30 сек, и заключительный этап синтеза при 72°С —10 мин. Продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции: Apal — для гена Collai (полученные фрагменты — 235 п.о. и 20 п.о.), Taql—для гена VDR (полученные фрагменты — 248 п.о. и 112 п.о.) и AluI — для гена CALCR (полученные фрагменты — 120 п.о. и 108 п.о.). Расщепление ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы изготовителя (ООО «СибЭнзим», г. Новосибирск). Полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 6% полиакриламидном геле с последующей окраской этиди-умбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.

Для статистического анализа использован стандартный метод %2 (программа GraphPad InStat). В случае наличия

достоверных отличий между контролем и исследуемой группой применяли коэффициент соотношения шансов (odds ratio — OR) [28]. Значение OR рассчитывали по формуле: OR = a/b d/c, где а — число индивидуумов с наличием данного маркера у исследуемой группы; b — число индивидуумов с отсутствием данного маркера исследуемой группы; с — число индивидуумов с наличием данного маркера у контроля; d — число индивидуумов с отсутствием данного маркера у контроля. Соотношение шансов указано с 95% интервалом. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам: ORmjn= OR(l—1,96/V^2) и ORmax=OR(l+l,96/Vx2). В данной работе значение OR показывает, во сколько раз вероятность наличия данного генотипа у больных превышает вероятность его наличия в контрольной группе, то есть во сколько раз выше вероятность иметь заболевание при наличии определенного генотипа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты анализа частот генотипов и аллелей генов Collai, VDR и CALCR представлены в таблицах 2, 3 и 4 соответственно. Как следует из полученных данных, частота функционально неполноценного (ФН) аллеля s гена Collai в группе больных тяжелым остеопорозом (ТО) оказалось почти в три раза выше (50,0%±5,9) по сравнению с таковой в популяции ( 17,5%±4,9) (х2=5 l,96;df=l, р<0,0001 ) (табл. 2). Распределение соответствующих генотипов в популяции Северо-Западного региона России соответствовало распределению Харди-Вайнберга (%2=0,017; df=l, р>0,05). В то же время частоты генотипов SS, Ss и ss в группе ТО составили 32,9,34,3,4 и 32,9% соответственно и достоверно отличались от таковых в популяции Северо-Западного региона России (67,8, 29,3 и 2,9%; 50,07; df=2, р<0,0001) (табл. 2). При этом у пациентов с ТО частота ФН генотипа ss достигала 32,9% и более чем в 11 раз превысила популяционный уровень (2,9%) (табл. 2).

Сходные данные получены и в отношении распределения частот генотипов и аллелей гена VDR. Так, частота ФН аллеля t в группе ТО оказалась достоверно выше популяционной (32,6%±4,9) ("/2=13,06; df=l, р<0,001) и составила (51,4%±5,9) (табл. 3). Распределение генотипов ТТ, Tt и tt в популяции Северо-Западного региона

Таблица 1

Характеристика генов Collai, VDR и CALCR; структуры олигопраймеров, используемых для их изучения

Ген Локализация гена Изученный полиморфизм гена Размер амплифированного фрагмента Структура праймера

COL1Al 17q21.3—q22 в—>Т мутация в регулятор-ной области гена 255 п.о. 5'-TAACTTCTGGACTATTTGCGGACT-3' 5'-GTCCAGCCCTCATCCGGGCC-3'

VDR 12p12-q14 Т—>С мутация в 9 экзонс 360 п.о. 5'-GATGATCCAGAAGCTAGCCGACCT-3' 5'-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCT-3'

CALCR 7q21.3 Т—>С мутация в кодирующей З'-области гена в позиции 1377 228 п.о. 5'-CTCAGTGATCACGATACTGTG-3' 5'-ATTCAGTGGAACCAGCGTTGG-3'

Таблица 2

Распределение генотипов и частот аллелей гена Collai в популяции и у больных тяжелым остеопорозом

Группы и количество индивидуумов (п) Частоты аллелей, % Частоты генотипов, %

S s X2; df=I SS Ss ss Z2; df=2

Популяционная выборка (п=174) 82,5±2,2 17,5±4,9 51,96 р<0,0001 67,8 29,3 2,9 50,07 p<0,0001

Больные тяжелым остеопорозом (п=70) 50,0±5,9 50,0±5,9 32,9 34,3 32,9

Таблица 3

Распределение генотипов и частот аллелей гена УЭИ в популяции и у больных тяжелым остеопорозом

Группы и количество индивидуумов (п) Частоты аллелей, % Частоты генотипов, %

т t X2; df=l тт Tt tt X2; df=2

Популяционная выборка (п=138) 67,4±3,4 32,6±4,9 13,06 р<0,001 45,7 43,5 10,9 15,50 р<0,001

Больные тяжелым остеопорозом (п=70) 48,6±6,1 51,4±5,9 18,6 60,0 21,4

Табл. 4

Распределение генотипов и частот аллелей гена САЬСИ в популяции и у больных тяжелым остеопорозом

Группы и количество индивидуумов (п) Частоты аллелей % Частоты генотипов, %

Т С х2; df=l ТТ ТС СС X2; df=2

Популяционная выборка (п=84) 73,8±3,9 26,2±6,6 2,34 53,6 40,5 6,0 3,35

Больные тяжёлым остеопорозом (п=32) 84,4±4,9 15,6±11,5 р>0,05 68,8 31,3 0,0 р>0,05

России соответствовало распределению Харди-Вайнбер-га (х2=0,008; df=l, р>0,05). В то же время частоты генотипов ТТ, Tt и tt у больных ТО равнялись 18,6, 60,0 и 21,4% соответственно и достоверно отличались от таковых в популяции Северо-Западного региона России (45,7, 43,5 и 10,9%; х2=15,50; df=2, р<0,001) (табл. 3). Важно отметить трехкратное снижение частоты нормальных гомозигот ТТ на фоне удвоенной частоты ФН генотипа tt в группе ТО по сравнению с аналогичными показателями частот в популяционной (табл. 3).

Частота ФН аллеля Т гена CALCR в популяции (73,8%±3,9) и в группе с ТО (84,4%±4,9) достоверно не отличались (%2=2,34; df=l, р>0,05) (табл. 4). Частоты генотипов ТТ, ТС и ТТ в популяции соответствовали распределению Харди-Вайнберга (х2=0,095; df=l, р>0,05). Интересно отметить, что распределение этих генотипов у больных ТО слегка отличалось от популяционного (68,8, 31,3, 0,0 и 53,6, 40,5, 6,0% соответственно; х2=3,35; df=2, р>0,05), за счет увеличения в группе ТО частоты генотипа ТТ и отсутствия пациентов с генотипом СС (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты доказывают наличие достоверной ассоциации функционально неполноценных аллелей, по крайней мере, двух исследованных генов: гена рецептора витамина D (VDR) и гена коллагена (Collai) с развитием остеопороза. Важно отметить, что отсутствие четкой ассоциации с ТО аллельных вариантов гена CALCR не снижает интереса к изучению данного полиморфизма. Не исключено, что дальнейшие молекулярно-

генетические исследования этого гена позволят получить более объективную информацию о природе и механизме действия рецептора кальцитонина, как одного из важных регуляторов кальциевого метаболизма и его связи с патогенезом остеопороза.

Согласно полученным данным, частота ФН аллеля s гена Collai в популяции Северо-Западного региона России достоверно не отличается от таковой в популяциях многих европейских стран (Голландия, Дания, Англия, Чехия, Швеция, Греция, Бельгия и Франция) [3, 4, 7, 12, 25, 26, 29, 41, 42, 43]. Достоверные отличия отмечаются только для популяций Италии (х2=29,94; df=l, р<0,0001) и Испании (х2=3,96; df=l, р<0,05) [4, 7]. Вместе с тем обращает на себя внимание наличие определенной тенденции к снижению частоты ФН аллеля s в восточно-европейских популяциях (Россия и Чехия) [2,43]. Так, если для населения Западной Европы характерна частота s аллеля в пределах 18-21%, то в Центральной и Восточной Европе (у славян) она снижается до 13-17%. Максимальная частота s аллеля в Европе отмечена в популяциях Италии и Греции [7, 12]. Интересно, что в некоторых популяциях Азии (Япония и Южная Корея) этот аллель встречается еще реже или вообще отсутствует [20, 34]. Это доказывает наличие определенного градиента в распределении ФН аллеля гена Collai с Запада на Восток, а при анализе для популяций Испании, Швеции и Бельгии ассоциация не выявлена [3,4, 29]. Интересно, что аналогичный западно-восточный и северо-южный градиент отмечен и в распределении многих других генов, например гена муковисцидоза (CFTR), гена, определяющего чувствительность к вирусу ВИЧ (CCR5) [1].

Частота ФН аллеля t гена VDR в популяции Северо-Западного региона России (32,6%), как следует из наших данных, достоверно не отличается от таковой в популяции Дании и Англии [22, 27]. Достоверные отличия отмечены для популяций Франции 14,74; df=l, р<0,001), Словении (х2= 11,01; df=l, р<0,001), Испании (Х2=4,13; df=l, р<0,05), Греции (х2=5,10; df=l, р<0,05) и Англии (Саутгемптон) (%2= 11,87; df=l, р<0,001) [10, 14-16, 31]. Согласно многочисленным данным, в странах Европы частота аллеля t варьирует от 32 до 48%, а частота гомозигот по ФН t аллеля от 10 до 23%. Важно отметить, что для чернокожих американцев частота ФН аллеля t гена VDR составляет 14—17% [9, 12], в то время как в популяциях восточной Азии (Китая и Южной Кореи) она равна 4-8% [12]. Частота tt гомозигот у чернокожих равна 5%, а у жителей восточной Азии только 1-3%. Согласно нашим данным, частоты гомозигот tt и аллеля t в популяции Северо-Западного региона России близки к среднеевропейским показателям [1]. В то же время интересно отметить, что в большинстве популяций Европы не было выявлено ассоциации t аллеля гена VDR с низкой МПКТ и риском развития остеопороза.

Наши данные свидетельствуют не только о популяци-онных особенностях аллельных частот генов Collai и VDR, но и о популяционных различиях в ассоциации ФН аллелей этих генов с развитием остеопороза. Так, согласно результатам многочисленных исследований, проведенных в Европе, и собственным данным распределение аллелей изучаемых генов, особенно гена Collai, обнаруживает особенности, характерные для популяций Европы. Эти межпопуляционные различия свидетельствуют о сложности и многокомпонентное™ генной сети метаболизма костной ткани и позволяет предположить наличие многих других генов, кроме генов Col 1 а 1, VDR и CALCR, аллели которых ассоциированы с развитием остеопороза.

Для определения возможных путей влияния функционально неполноценных аллелей генов VDR и Col 1 а 1 на развитие остеопороза уместно рассмотреть, каковы мо-лекулярно-биохимические механизмы действия изучаемых генов в процессах остеогенеза. Коллаген типа 1 является мажорным белком костей. Его аминокислотная структура кодируется генами Collai и Со11а2. Механизм, при котором полиморфизм в регуляторной области гена Collai предрасполагает к развитию остеопороза, еще не достаточно изучен. Однако известно, что аллель s имеет почти в два раза большее сродство (аффинность) к транскрипционному фактору Spl по сравнению с S аллелем [21]. Увеличение степени аффинности приводит к двухкратному усилению транскрипции а, цепей проколлаге-на (белкового продукта гена Collai) с последующим изменением соотношения а, и а2 белковых цепей в молекуле коллагена и образованием гомотримера только из а( цепей [30]. Биохимические анализы образцов кости Ss гетерозигот указывают на уменьшение прочности и из-

менение состава костной ткани по сравнению с таковой у SS гомозигот. Возможно, что наличие патологического гомотримерного коллагена 1 типа приводит к изменению его четвертичной структуры с последующим нарушением минерализации костного матрикса [38].

В настоящее время признано, что витамин D и его активные метаболиты являются главными компонентами системы, регулирующей фосфорно-кальциевый обмен. Они участвуют в минерализации костной ткани, в поддержании гомеостаза кальция и через ядерный рецептор витамина D могут влиять на процессы ремоделирования костей. Как ядерный рецептор, белковый продукт гена VDR играет роль посредника в передаче биологического сигнала 1,25-дигидроксивитамина D3 (la,25(OH),D3-кальцитриол), влияя таким путем на экспрессию различных генов-мишеней [36]. Изучаемая нами мутация приводит к замене изолейцина на метионин в 9 экзоне (Т—>С) в белке ядерного рецептора витамина D, следствием чего является образование функционально неактивного рецептора, возможно, приводящего к нарушению гомеостаза кальция в организме [23]. Действительно, при анализе района 3'- конца гена VDR у двух индивидуумов, гомозиготных по генотипам tt и ТТ, было найдено еще несколько различий в нуклеотидной последовательности этого района [33]. В опыте по трансфекции клеток костной ткани фрагментами кДНК гена VDR, содержащими разные генотипы (TT, Tt, tt), были обнаружены функциональные различия в активности рецепторов витамина D [8].

Таким образом, изучаемые нами гены непосредственно вовлечены в процессы остеогенеза, хотя биомеханизмы их действия различны. Рецептор витамина D влияет на уровень гормональной регуляции остеогенеза, тогда как коллаген сам является важной составной частью костной ткани.

Распределение аллелей в изучаемых группах позволяет рассчитать коэффициент соотношения шансов, показывающий, во сколько раз выше вероятность развития остеопороза при наличии неблагоприятного генотипа. У пациентов, гомозиготных по ФН аллелю t гена VDR, вероятность развития остеопороза увеличивается более чем в 2,1 раза [95% CI: 1,4—3,3]. Если пациент является гомозиготным по ФН аллелю Т гена CALCR, эта вероятность возрастает в 2 раза [95%> CI: 0,9-4,1], а по ФН аллелю s гена Collai вероятность возрастает в 4,7 раза [95% CI: 3,1-7,2].

В заключение хотелось бы отметить, что несмотря на то, что изучению ассоциации аллелей генов Collai и VDR и остеопороза посвящено большое количество работ, имеющиеся данные не позволяют сделать окончательный вывод о роли этих генов в развитии остеопороза. Характер такого воздействия может варьировать и в зависимости от других неблагоприятных факторов. Несомненно, особый интерес для генетического тестирования наследственной предрасположенности к остеопорозу представляют пациенты, гомозиготные по функционально неполноценным

аллелям двух генов Collal и VDR3. Важно подчеркнуть, что определение гомозигот по функционально неполноценным аллелям s или t генов Collal и VDR перспективно в целях раннего досимптоматического выявления лиц группы высокого риска по развитию остеопороза.

Работа выполнена при под держке гранта CRDF «Мо-лекулярно-биологические основы здоровья человека и окружающей среды Северо-Запада России» (№ ST-012-0) и гранта для поддержки научно-исследовательской работы аспирантов высших учебных заведений Минобразования России 2003 г. (№ Г-07-47).

Литература

1. Баранов B.C., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину. — СПб.: Интермедика, 2000.

2. Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская Щ.Е., Котова С.М., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Анализ ассоциации аллелей гена Collal с развитием остеопороза // Генетика. — Т. 38, №11. — С.1443-1447.

3. AerssensJ., Dequeker J., Peeters J., Breemans S., Broos P., Booties S. Polymorphisms of the VDR. ER and COL1A1 genes and osteoporotic hip fractures in elderly postmenopausal women // Osteoporos Int. — 2000.— Vol. 11, — P. 583-91

4. Alvarez L., Oriola J., Jo J., Ferro Т., Pons F, Peris P., Guanabens N.. Duran M., Monegal A„ Martinez de Osaba M.J., Rivera-Fillat F., Ballesta A.M. Collagen type I alphal gene Spl polymorphism in premenopausal women with primary osteoporosis: improved detection of Spl binding site polymorphism in the collagcn type 1 gene // Clin Chem. — 1999. — Vol. 45 (6). — P. 904-6

5. Audi L., Carcia-Ramirez M., Carrascosa A. Genetic determinants of bone mass // Horm Res. — 1999. — Vol. 51 (3). — P. 105-23

6. Barthe N. Bassc-Cathalinat В Measurement of Bone mineral density in mather-daughter pairs for evaluating the family influence on bone mass acquisition: A GRIO survey // Osteoporos Int. — 1998. — Vol. 8 (4). — P. 379-84

7. Braga V., Mottes M„ Mirandola S., Lisi V,. Malerba G., Sartori L., Bianchi G., Gatti D., Rossini M., Bianchini D., Adami S. Association of CTR and COL1A1 alleles with BMD values in Peri- and Postmenopausal women // Calcif Tissue Int. — 2000. — Vol. 67. — P. 361-366

8. Brown M., Eisman J. The genetics of osteoporosis: Future diagnostic Possibilities // Clin Lab Med. — 2000. — Vol. 20 (3). — P. 527^17

9. Copper G.S. Umbach DM Are vitamin D receptor Polymorphisms associated with bone mineral density? A meta-analysis // J. Bone Miner Res. — 1996.— Vol. 11, — P. 1841-9

10. Dennison E.M., Arden N.K., Keen R.W., SyddallH„ Day IN. Spector T.D., Cooper C. Birthwcight. vitamin D receptor genotype and the programming of osteoporosis // Pacdiatr Pcrinat Epidemiol. — 2001. — Vol. 15(3). —P. 211-9

11. Eastell R., Reid D.M., Compston J., Cooper C., Fogelman /., Francis R.M., Hay S.M., Hosking D.J., Purdie D. W„ Ralston S.H., Reeve J., Russell R.G., Stevenson J.C. Secondary prevention of osteoporosis: when should a non-vertebral fracture be a trigger for action? // QJM. — 2001. — Vol. 94 (11). — P. 575-97

12. Efstathiadou Z, Tsatsoulis A., loannidis J.P., Association of collagcn Ialpha 1 Spl polymorphism with the risk of prevalent fractures: a meta-analysis // J. Bone Miner Res. — 2001. — Vol. 16 (9). — P. 1586-92.

13. Eisman J.A. Genetics of osteoporosis // Endocr Rev. — 1999. — Vol. 20(6). — P. 788-804.

14. FernandezE., FiblaJ., BetriuA., PiulatsJ.M., AlmirallJ., Montoliu J. Association between vitamin D receptor gene polymorphism and re-

lative hypoparathyroidism in patients with chronic renal failure // J. Am Soc Nephrol. — 1997. — Vol. 8 (10). — P. 1546-52.

15. Fountas L., Moutsatsou P., Kastanias /., Tamouridis N.. Tzanela M., Anapliotou M., Sekeris C.E. The contribution of vitamin D rcceptor gene polymorphisms in osteoporosis and familial osteoporosis // Osteoporos Int. — 1999. — Vol. 10 (5). — P. 392-8.

16. Garnero P., Arden N.K., Griffiths G., Delmas P.D.. Spector T.D. Genetic influence on bone turnover in postmenopausal twins // J Clin Endocrinol Metab. — 1996. — Vol. 81(1). — P. 140-6.

17. Grainge M.J., Coupland C.A., Cliffe S.J., Chilvers C.E., Hosking D.J. Association between a family history of fractures and bone mineral density in early postmenopausal women//Bone. — 1999. — Vol.24 (5).— P. 507-12.

18. Grant S.F., Reid D.M., Blake G., Herd R„ Fogelman I, Ralston S.H. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Spl binding site in the collagcn type I alpha 1 gene // Nat Genet. — 1996. — Vol. 14 (2). — P. 203-5.

19. Hampson G., Evans C„ PetittR.J., Evans W.D., WoodheadS.J., Peters J.R., Ralston S.H. Bone mineral density, collagcn type 1 alpha 1 genotypes and bone turnover in premenopausal women with diabetes mellitus//Diabetologia. — 1998.— Vol. 41 (11).— P. 1314-20.

20. Han K.O., Moon I.G., Hwang C.S., ChoiJ.T., Yoon H.K., Min H.K., Han IK. Lack of an intronic Spl binding-site polymorphism at the collagen type I alphal gene in healthy Korean women // Bone. — 1999. — Vol. 24 (2). — P. 135-7.

21. Hobson E., Dean V.. Grant S.F.A., Ralston S.H. Functional effects of a polymorphism of collagcn (I) alpha 1 gene (CollAl) in osteoporosis // J. Med Genet. — 1998. — Vol. 35. Suppl. — P. 32.

22. Houston L.A., Grant S.F., ReidD.M., Ralston S.H. Vitamin D receptor polymorphism, bone mineral density, and osteoporotic vertebral fracture: studies in a UK. population // Bone. — 1996. — Vol. 18 (3). — P. 249-52.

23. Hustmyer F.G., Deluca H.F., Peacock M. Apal.Bsml.EcoRV and Taql polymorphisms at human vitamin D rcceptor gene locus in Caucasians. Blacks and Asians // Hum Mol Genet. — 1993. — Vol. 2. — P. 487.

24. Hustmyer F.G., Liu G., Johnston C.C., Christian J., Peacock M. Polymorphism at an Spl binding site of COL1A1 and bone mineral density in premenopausal female twins and elderly fracture patients // Osteoporos Int. — 1999. — Vol. 9 (4). — P. 346-50.

25. Keen R.W., Woodford-Richens K.L., Grant S.F., Ralston S.H., Lanchbury J.S., Spector T.D. Association of polymorphism at the type I collagen (COL1A1) locus with reduced bone mineral density increased fracture risk and increased collagcn turnover // Arthritis Rheum. — 1999. — Vol. 42 (2). — P. 285-90.

26. Langdahl B.L., Ralston S.H., Grant S.F., Eriksen E.F. An Spl binding site polymorphism in the COLIA1 gene predicts osteoporotic fractures in both men and women // J. Bone Miner Res. — 1998. — Vol. 13 (9).— P. 1384-9.

27. Langdahl B.L., Gravholt C.H., Brixen K„ Eriksen E.F. Polymorphisms in the vitamin D receptor gene and bone mass, bone turnover and osteoporotic fractures // Eur J. Clin Invest. — 2000. — Vol. 30 (7). — P. 608-17.

28. Lau J., loannidis J.P., Schmid C.H. Quantitative synthesis in systematic reviews // Ann Intern Med. — 1997. — Vol. 127 (9). — P. 820-6.

29. Liden M., Wilen B., Ljunghall S., Melhus H. Polymorphism at the Sp 1 binding site in the collagcn type I alpha 1 gene docs not predict bone mineral density in postmenopausal women in Sweden // Calcif Tissue Int. — 1998. — Vol. 63 (4). — P. 293-5.

30. Mann V., Hobson E E., Li B„ Stewart T.L., Grant S.F., Robins S.P., Aspden R.M., Ralston S.H. A COL1A1 Spl binding site polymorphism predisposes to osteoporotic fracture by affecting bone density and quality // J. Clin Invest. — 2001. — Vol. 107 (7). — P. 899-907.

31. Marc J., Prezelj J., Komel R., Kocijancic A. Association of vitamin D rcceptor gene polymorphism with bone mineral density in Slovenian

postmenopausal women // Gynecol Endocrinol. — 2000. — Vol. 14 (1). — P. 60-4.

32. Melton L.J., Atkinson E.J., O. Fallon W.M., Wahner H. W„ Riggs B.L. Long-term fracture prédiction by bone mineral assessed at different skeletal sites// J. Bone Miner Res. — 1993, —Vol. 8.— P. 1227-33.

33. Morrison N.A., QiJ.C., Tokita A., Kelly P.J. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles // Nature. — 1994. — Vol. 367. — P. 284-287.

34. Nakajima T., Ota N.. Shirai Y, Hata A., Yoshida H„ Suzuki T., Hosoi T., Orimo H., Emi M. Ethnic difference in contribution of Sp 1 site variation of COLIA1 gene in genetic predisposition to osteoporosis // Calcif Tissue Int. — 1999. — Vol 65 (5). — P. 352-3.

35. Nakamura M, Zhang Z.Q., Shan L., Hisa T., Sasaki M., Tsukino R„ Yokoi T., Kaname A., Kakudo K. Allelic variants of human calcitonin receptor in the Japanese population // Hum Genet. —1997. — Vol. 99 (1). — P. 38-41.

36. Ozono K, Liao J., Kerner S.A., Scott R.A., Pike J.W. The vitamin D responsive element in the human osteocalcin gene. Association with a nuclear proto-oncogcnc enhcnccr // J. Biol. Chem. — 1990.— Vol. 265 (35).— P. 21881-8.

37. Ralston S.H. The genetics of osteoporosis // Bone. — 1999. — Vol.

25 (1). — P. 85-6.

38. Ralston S.H. Gcnctic control of susceptibility to osteoporosis // J. Clin Endocrinol Mctab. — 2002. — Vol. 87(6). — P. 2460-6.

39. Seeman E., Hopper J. L., Bach L.A., Cooper M.E., Parkinson E., McKay J., Jerums G. Rcduced bone mass in daughters of women with osteoporosis // N. Engl. J. Med. —- 1989. — Vol. 320 (9). — P. 554-8.

40. Uitterlinden A. G., Burger H., Huang Q., Yue F., McGuigan F.E., Grant S.F., Hofman A., van Leeuwen J.P., Pols H.A., Ralston S.H. Relation of alleles of the collagen type 1 alpha 1 gene to bone density and the risk of osteoporotic fractures in postmenopausal women // N. Engl. J. Med. — 1998.— Vol. 338 (15).— P. 1016-21.

41. de Vernejoul M., Haguenauer D., Cohen-Solal M.E., Beaudreuil J. Polymorphism of collagen I and vertebral osteoporosis: no association // J. Bone Miner Res. — 1997. — Vol. 12. Suppl. — S. 489.

42. Weichetova M., Stepan J.J., Michalska D., Haas T., Pols H.A. Uitterlinden A.G. Coll A1 polymorphism contributes to bone mineral density to assess prevalent wrist fractures // Bone. — 2000. — Vol.

26 (3). — P. 287-90.

43. Wood R.J., Fleet J.C. The genetics of osteoporosis: vitamin D receptor polymorphisms // Annu Rev Nutr. — 1998. — Vol. 18. — P. 233-58.

44. YeapS.S., Beaumont M., Bennett A., Keating N.A., White D.A. Genetic and environmental factors affecting bone mineral density in large families // Postgrad Med J. — 1998. — Vol. 74. — P. 872.

45. Zmitda J.M., Cauley J.A., Danielson M.E., Wolf R.L., Ferrell R E. Vitamin D receptor gene polymorphisms bone turnover and rates of bone loss in older African-American women // J Bone Miner Res. — 1997. — Vol. 12 (9). — P. 1446-52

The analysis of association between Collal, VDR and CALCR genes and development of osteoporosis

M. V. Moskalenko, M. V. Aseev, S.M. Kotova, KS. Baranov ' Ott Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences, St-Pctersburg, Russia

2 Department of Gcnctics and Breeding, St. Petersburg State University, St-Pctcrsburg, Russia

3 St. Petersburg State Medical Academy , St-Pctcrsburg,, Russia

<§¡3 THE SUMMARY: The allele rates of VDR, Collal and CALCR genes in 174 non-related individuals Northwest Russian population and in 70 patients with severe osteoporosis (SO) were investigated by PCR-RFLP method. The frequency of functionally abnormal allele t of VDR gene in a group of SO patients was 51,4±5,9%, and it was significantly higher (p<0,001) than this one in population (32,6±4,9%). Analysis of Collal gene proved significant preponderance (p<0,0001) of functionally abnormal allele s in SO patients (50,0±5,9%) compared to its average frequency in population (17,5±4,9%). No significant differences (p>0,05) between frequencies of functionally abnormal T allele of CALCR gene in SO (84,4±4,9%) patients and its average frequency in population were recorded (73,8±3,9%). Thus, according to our data clear-cut association between functionally abnormal alleles of VDR and Collal genes and osteoporosis manifestation is established. Prospects and prognostic values of VDR and Collal genes alleles s and t molecular testing for presymptomatic identification of women at high risk of osteoporosis in postmenopausal age are discussed.

KEY WORDS: genetic susceptibility, polymorphism, association, osteoporosis, Collal gene, VDR gene, CALCR gene, adds ratio.