МОДИФИКАЦИЯ ГЕНОМА ОРГАНЕЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАПРАВЛЯЕМОЙ ПОЛИНУКЛЕОТИДОМ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

1. Способ изменения генома органеллы, причем способ включает:
a. введение в органеллу конструкции рекомбинантной ДНК, содержащей следующее:
i. первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну направляющую РНК, причем по меньшей мере одна направляющая РНК направляет направляемый полинуклеотидом полипептид на расщепление по меньшей мере одной последовательности-мишени, имеющейся в геноме органеллы;
ii. второй полинуклеотид, кодирующий направляемый полинуклеотидом полипептид, причем направляемый полинуклеотидом полипептид при связывании с направляющей РНК расщепляет по меньшей мере одну последовательность-мишень;
iii. необязательно третий полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну гомологичную последовательность ДНК органеллы, причем по меньшей мере одна гомологичная ДНК органеллы имеет достаточный размер для гомологичной рекомбинации, причем встраивание по меньшей мере одной гомологичной последовательности ДНК органеллы в геном органеллы приводит к удалению по меньшей мере одной последовательности-мишени;
iv. необязательно четвертый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один селектируемый маркер или по меньшей мере один скринируемый маркер или оба; причем четвертый полинуклеотид функционально связан с промотором, который является функциональным в органелле; и
v. необязательно пятый полинуклеотид, кодирующий точку начала репликации, которая является функциональной в органелле; и
b. выращивание клетки, содержащей органеллу из (a), в условиях, в которых экспрессируется каждый из первого полинуклеотида из (i) и второго полинуклеотида из (ii).
2. Способ по п. 1, при этом способ дополнительно включает: (c) отбор клетки, имеющей органеллу, которая содержит измененный геном.
3. Способ по п. 2, при этом способ дополнительно включает: (d) отбор клетки, которая является гомоплазмической, на измененный геном органеллы.
4. Способ по п. 3, причем органеллой является пластида.
5. Способ по п. 3, причем органеллой является митохондрион.
6. Способ по любому из пп. 1-5, предусматривающий наличие третьего полинуклеотида из (iii), причем третий полинуклеотид из (iii) содержит шестой и седьмой полинуклеотид, причем шестой и седьмой полинуклеотиды соответствуют двум соседним областям гомологии в геноме органеллы, при этом шестой и седьмой полинуклеотиды разделены последовательностью, которая является гетерологичной для ДНК органеллы.
7. Способ по п. 6, причем последовательность, которая является гетерологичной для ДНК органеллы, содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, восьмого полинуклеотида и любой их комбинации, причем восьмой полинуклеотид кодирует РНК, которая является гетерологичной для органеллы.
8. Способ по любому из пп. 1-7, причем по меньшей мере одна направляющая РНК находится на полицистронной единице транскрипции.
9. Способ по п. 8, в котором по меньшей мере одну направляющую РНК процессируют из полицистронной РНК после транскрипции полицистронной единицы транскрипции за счет применения по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из: сайта расщепления РНК, сайта расщепления Csy4, сайта расщепления рибозима, сайта расщепления направляемого полинуклеотидом полипептида наличия последовательности тРНК и любой их комбинации.
10. Способ по п. 9, в котором полицистронная РНК содержит первую последовательность тРНК 5’ по меньшей мере к одной направляющей РНК и вторую последовательность тРНК 3’ по меньшей мере к одной направляющей РНК.
11. Способ по любому из пп. 7-10, предусматривающий наличие восьмого полинуклеотида, причем восьмой полинуклеотид кодирует по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: толерантного к гербициду белка, пестицидного белка, аксессорного белка, который связывается с пестицидным белком, дцРНК, миРНК, микроРНК, и любая их комбинация, причем дцРНК, миРНК и микроРНК подавляют по меньшей мере один ген-мишень, имеющийся у вредителя растения.
12. Способ по любому из пп. 7-11, предусматривающий наличие восьмого полинуклеотида, причем восьмой полинуклеотид функционально связан по меньшей мере с одним регуляторным элементом, который является активным в органелле.
13. Способ по любому из пп. 6-12, причем по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, пятого полинуклеотида и любых их комбинаций, находится за пределами области, ограниченной шестым и седьмым полинуклеотидом.
14. Способ по п. 13, предусматривающий наличие четвертого и пятого полинуклеотидов, причем как четвертый и пятый полинуклеотиды находятся за пределами области, ограниченной шестым и седьмым полинуклеотидами.
15. Способ по любому из пп. 1-14, предусматривающий наличие четвертого полинуклеотида, причем четвертый полинуклеотид содержит первую последовательность, кодирующую позитивный селектируемый маркер, и вторую последовательность, кодирующую негативный селектируемый маркер, причем каждая из первой и второй последовательности функционально связана с промотором, который является функциональным в органелле.
16. Способ по любому из пп. 1-15, предусматривающий наличие пятого полинуклеотида, причем пятый полинуклеотид кодирует точку начала репликации, которая является функциональной в пластиде, причем точка начала репликации, функциональная в пластиде, соответствует последовательности ДНК из межгенной области рРНК пластиды.
17. Способ по любому из пп. 1-15, предусматривающий наличие пятого полинуклеотида, причем пятый полинуклеотид кодирует точку начала репликации, которая является функциональной в митохондрии.
18. Способ по любому из пп. 1-17, причем указанный направляемый полинуклеотидом полипептид выбирают из группы, состоящей из: белка Cas9, белка MAD2, белка MAD7, нуклеазы CRISPR, домена нуклеазы белка Cas, белка Cpf1, Argonaute, их модифицированных версий и любых их комбинаций.
19. Способ по любому из пп. 1-18, причем конструкция рекомбинантной ДНК дополнительно содержит девятый и десятый полинуклеотид, которые имеют по меньшей мере 100 нуклеотидов со 100-процентной идентичностью последовательностей друг с другом, причем девятый и десятый полинуклеотиды расположены в виде прямых повторов в конструкции рекомбинантной ДНК.
20. Способ по п. 19, причем конструкция рекомбинантной ДНК - линейная, и кроме того при этом девятый и десятый полинуклеотиды присутствуют на 5’ и 3’-концах конструкции рекомбинантной ДНК.
21. Способ по любому из пп. 1-20, при этом способ дополнительно включает введение в органеллу полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один селектируемый маркер, выбранный из группы, состоящей из: позитивного селектируемого маркера, негативного селектируемого маркера и любых их комбинаций.
22. Способ по п. 21, причем способ дополнительно включает выращивание клетки в присутствии средства позитивной селекции и отбор клетки, которая является гомоплазмической, на измененный геном органеллы.
23. Способ по п. 22, причем способ дополнительно включает выращивание клетки в отсутствие средства позитивной селекции с последующим отбором клетки, в которой отсутствует невстроенная конструкция рекомбинантной ДНК.
24. Способ по п. 22, причем способ дополнительно включает выращивание клетки в отсутствие средства позитивной селекции с последующим выращиванием клетки в присутствии средства негативной селекции с последующим отбором клетки, в которой отсутствует невстроенная конструкция рекомбинантной ДНК.
25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором клеткой является клетка растения, в которой органеллой является пластида или митохондрион, и при этом способ дополнительно включает регенерацию растения из клетки растения, содержащей измененный геном органеллы.
26. Способ по любому из пп. 1-24 причем клеткой является дрожжевая клетка или клетка водорослей.
27. Способ по любому из пп. 6-26, причем изменение генома органеллы включает вставку экспрессионной кассеты.
28. Способ по п. 27, в котором экспрессионной кассетой является полицистронная экспрессионная кассета.
29. Способ по п. 28, в котором полицистронная экспрессионная кассета кодирует селектируемый маркер или скринируемый маркер или оба.
30. Клетка, полученная с помощью способа по любому из пп. 1-29, причем клетку выбирают из группы, состоящей из: дрожжевой клетки, клетки водорослей, клетки растения, клетки насекомого, клетки не являющегося человеком животного, выделенной и очищенной человеческой клетки и клетки культуры ткани млекопитающего.
31. Растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб, полученные с помощью способа по любому из пп. 1-29, причем растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб содержат органеллу с измененным геномом.
32. Конструкция рекомбинантной ДНК, содержащая следующее:
i. первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одну направляющую РНК, причем по меньшей мере одна направляющая РНК направляет направляемый полинуклеотидом полипептид на расщепление по меньшей мере одной последовательности-мишени, имеющейся в геноме органеллы;
ii. второй полинуклеотид, кодирующий направляемый полинуклеотидом полипептид, причем направляемый полинуклеотидом полипептид при связывании с направляющей РНК расщепляет по меньшей мере одну последовательность-мишень;
iii. третий полинуклеотид, содержащий шестой и седьмой полинуклеотид, причем шестой и седьмой полинуклеотиды соответствуют двум соседним областям гомологии в геноме органеллы, при этом шестой и седьмой полинуклеотиды разделены последовательностью, которая является гетерологичной для ДНК органеллы, причем последовательность, которая является гетерологичной для ДНК органеллы, содержит по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: первого полинуклеотида, второго полинуклеотида, четвертого полинуклеотида, восьмого полинуклеотида и любой их комбинации, причем восьмой полинуклеотид кодирует РНК, которая является гетерологичной для органеллы;
iv. необязательно четвертый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один селектируемый маркер или по меньшей мере один скринируемый маркер или оба; причем четвертый полинуклеотид функционально связан с промотором, который является функциональным в органелле; и
v. необязательно пятый полинуклеотид, кодирующий точку начала репликации, которая является функциональной в органелле.
33. Дрожжевая клетка, клетка водорослей, клетка растения, растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб, содержащие конструкцию рекомбинантной ДНК по п. 32.
34. Способ изменения генома органеллы, причем способ включает:
a. введение в клетку:
i. полинуклеотида, кодирующего последовательность РНК, содержащую нацеленную на органеллу РНК, функционально связанную с направляющей полинуклеиновой кислотой, причем направляющая полинуклеиновая кислота направляет направляемый полинуклеотидом полипептид на расщепление последовательности-мишени, имеющейся в геноме органеллы, причем полинуклеотид функционально связан по меньшей мере с одним регуляторным элементом; и либо
ii. второго полинуклеотида, кодирующего модифицированный направляемый полинуклеотидом полипептид, причем второй полинуклеотид функционально связан по меньшей мере с одним регуляторным элементом, и при этом модифицированный направляемый полинуклеотидом полипептид представляет собой направляемый полинуклеотидом полипептид, функционально связанный с нацеленным на органеллу пептидом; причем каждое из нацеленной на органеллу РНК из (i) и нацеленного на органеллу пептида из (ii) нацелено на одну и ту же органеллу; или
iii. третьего полинуклеотида, причем третий полинуклеотид функционально связан по меньшей мере с одним регуляторным элементом, причем третий полинуклеотид кодирует молекулу РНК, содержащую нацеленную на органеллу РНК, функционально связанную с последовательностью РНК, кодирующей направляемый полинуклеотидом полипептид; причем каждая из нацеленной на органеллу РНК из (i) и нацеленной на органеллу РНК из (iii) нацелена на одну и ту же органеллу; и
b. выращивание клетки в условиях, в которых экспрессируются и полинуклеотид из (i), и второй полинуклеотид из (ii), или третий полинуклеотид из (iii).
35. Способ по п. 34, дополнительно включающий введение полинуклеотида, содержащего по меньшей мере один донорский полинуклеотид в органеллу, причем по меньшей мере один донорский полинуклеотид содержит по меньшей мере одну гомологичную последовательность относительно генома органеллы, причем встраивание всего или части по меньшей мере одного донорского полинуклеотида в геном органеллы приводит к удалению сайта-мишени направляющей полинуклеиновой кислоты.
36. Способ по п. 35, в котором по меньшей мере один донорский полинуклеотид содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, гетерологичную геному органеллы, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты ограничена второй и третьей последовательностями нуклеиновой кислоты, причем вторая и третья последовательности нуклеиновой кислоты соответствуют двум соседним областям гомологии в геноме органеллы.
37. Способ по п. 36, в котором вторая или третья последовательность нуклеиновой кислоты или обе содержат по меньшей мере одну измененную последовательность, причем по меньшей мере одна измененная последовательность изменена в отношении по меньшей мере одного дополнительного сайта-мишени в геноме органеллы, причем по меньшей мере одна измененная последовательность не распознается по меньшей мере одной дополнительной направляющей полинуклеиновой кислотой, причем по меньшей мере одна дополнительная направляющая полинуклеиновая кислота направляет направляемый полинуклеотидом полипептид на расщепление по меньшей мере одного дополнительного сайта-мишени в геноме органеллы.
38. Способ по п. 37, в котором по меньшей мере один дополнительный сайт-мишень в геноме органеллы находится по меньшей мере в одной значимой кодирующей области.
39. Способ по п. 37 или 38, в котором полинуклеотид, введенный в органеллу, дополнительно содержит четвертую последовательность нуклеиновой кислоты, причем четвертая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере одну дополнительную направляющую РНК, функционально связанную с промотором, который является активным в органелле.
40. Клетка, полученная с помощью способа по любому из пп. 34-39, причем клетку выбирают из группы, состоящей из: дрожжевой клетки, клетки водорослей, клетки растения, клетки насекомого, клетки не являющегося человеком животного, выделенной и очищенной человеческой клетки и клетки культуры ткани млекопитающего.
41. Растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб, полученные с помощью способа по любому из пп. 34-39, причем растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб содержат органеллу с измененным геномом.
42. Способ изменения генома органеллы, причем способ включает:
(a) введение в органеллу клетки:
(i) по меньшей мере одной направляющей РНК, причем по меньшей мере одна направляющая РНК направляет направляемый полинуклеотидом полипептид на расщепление по меньшей мере одной последовательности-мишени, имеющейся в геноме органеллы;
(ii) направляемого полинуклеотидом полипептида, причем направляемый полинуклеотидом полипептид при связывании по меньшей мере с одной направляющей РНК расщепляет по меньшей мере одну последовательность-мишень; и
(iii) замещающей ДНК; и
(b) отбор клетки, содержащей органеллу, содержащую замещающую ДНК.
43. Способ по п. 42, в котором замещающая ДНК стадии (a) части (iii) содержит фрагменты ДНК органеллы или всю ДНК органеллы из сорта, линии, подвида и другого вида и отличается от генома органеллы стадии (a).
44. Способ по п. 42 или 43, в котором по меньшей мере одна последовательность-мишень отсутствует в замещающей ДНК.
45. Способ по любому из пп. 42-44, в котором после стадии (a) часть (ii) и перед стадией (a) часть (iii) отбирают клетку, в которой был устранен геном органеллы.
46. Клетка, полученная с помощью способа по любому из пп. 42-45, причем клетку выбирают из группы, состоящей из: дрожжевой клетки, клетки водорослей, клетки растения, клетки насекомого, клетки не являющегося человеком животного, выделенной и очищенной человеческой клетки и клетки культуры ткани млекопитающего.
47. Растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб, полученные с помощью способа по любому из пп. 42-45, причем растение, семя, корень, стебель, лист, цветок, плод или боб содержат органеллу с измененным геномом.