ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЕ КОНЪЮГАТЫ МОЛЕКУЛ С ПОВТОРЯЮЩИМСЯ МОТИВОМ
GLYCOSYLATED CONGUGATES OF MOLECULES WITH REPEATING MOTIF

Настоящее изобретение относится к гликозилированным конъюгатам молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC), которые получают рекомбинантно, и к гликозилированию in vivo, т.е. в типах клеток, экспрессирующих конъюгат молекул с повторяющимся мотивом (repeat-motif-molecule conjugate - ЕМОС), а также к способу получения таких конъюгатов и к их применению.
Предшествующий уровень техники
Разработаны разнообразные молекулы с повторяющимся мотивом, которые отличные от классических молекул связывания антигена, например, от иммуноглобулинов.
Примером молекул с повторяющимся мотивом являются сконструированные белки с повтором анкирина (designed ankyrin repeat protein - DARPin). Белки DARPin могут экспрессироваться в функциональной форме в цитоплазме штаммов Е.coli. Повторяющийся мотив в DARPin включает последовательность из 33 остатков аминокислот. Повторы включают мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. Обычно от 1 до более чем 30 повторяющихся мотивов содержится в молекулах с повторяющимся мотивом анкирина, наиболее части от 4 до 6.
Kohl и др. (Kohl А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100, cc.1700-1705) разработали модуль из повторов анкирина, основанный на выравнивании примерно 2000 природных повторяющихся последовательностей анкирина. Такая искусственная консенсусная последовательность повторов анкирина включает 27 фиксированных аминокислотных остатков и 6 вариабельных аминокислотных остатков, формирующих сайт связывания (часть сайта) (Forrer Р. и др., ChemBioChem 5, 2004, cc.183-189).
Для получения связывания молекул DARPin с определенной молекулой-мишенью, вариабельные аминокислотные остатки искусственной консенсусной последовательности повторов анкирина рандомизируют и выявляют специфическое связующее путем рибосомального дисплея (см., например, WO 02/020565; Hanes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).
В US 2009/0148905 описывают антигенсвязывающие конструкции. Конструкции антитела с коротким консенсусным повтором, производным от фактора комплемента Н, описывают в WO 2008/135237. Конъюгаты антитела с РНКазой описывают в WO 2007/122511. Вирус ньюкаслской болезни (атипичной чумы птиц), включающий рекомбинантную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота кодирует связывающий белок, обладающий терапевтическим действием при экспрессии инфицированных вирусом опухолевых клеток, описывают в US 2008/0206201. В US 2008/0248026 описывают способы PTEN/AKT и композиции, относящиеся к BMP. Рекомбинантную экспрессия белков в двухцепочечной форме с дисульфидной связью описывают в WO 2005/076902 и US 2008/0103098. В WO 2009/068649 описывают антигенсвязывающие конструкции.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении описывают конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом в гликозилированной форме, т.е. экспрессированные в клетках млекопитающих.
Соответственно, первым объектом, заявляемым в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом следующей формулы:
n
m
q
o
p
(молекула с повторяющимся мотивом - линкер) - (конъюгируемый партнер) - (линкер - молекула с повторяющимся мотивом),
в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин m, и p, и q, означают целые числа 0 или 1, a m и p независимо друг от друга означают целые числа 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, а q независимо от величин n, m, o и p означает целое число 0 или 1,
и в которой конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования,
и в которой по меньшей мере m=q=1 или p=q=1.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом анкирина или молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или ее варианты. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер является пептидным линкером, выбранным из последовательностей SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 25-33. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер является мультимеризируемым конъюгируемый партнером. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природной или сконструированной шарнирной области тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из домена лейцинового зиппера, из домена изолейцинового зиппера, из 4-спиральных пучков и из домена тетрамеризации p53 или из их комбинации.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат по настоящему изобретению отличается тем, что имеет формулу:
n
m
q
o
p
r
((молекула с повторяющимся мотивом - линкер) - (конъюгируемый партнер) - (линкер - молекула с повторяющимся мотивом)),
в которой
i) n=1, m=1, q=1, p=0, r=1, или
ii) n=1, m=1, q=1, p=0, r=2, или
iii) n=0, m=1, q=1, p=0, r=1, или
iv) n=0, m=1, q=1, p=0, r=2, или
v) m=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или
vi)m=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или
vii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=1, или
viii) m=0, o=0, q=1, p=1, r=2, или
ix) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=1, или
x) m=1, n=0, o=1, q=1, p=1, r=2, или
xi) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1, или
xii) m=1, n=1, o=1, q=1, p=1, r=1,
в которой конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, из природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природных или сконструированных шарнирных областей тяжелой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи,
и в которой молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что по меньшей мере один олигосахарид является смесью олигосахаридов, полученных в результате экспрессии конъюгата в клетках СНО или в клетках НЕК293.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат отличается тем, что m=0, q=1, p=1, и o=0 или o=1, и r=1 или 2, причем конъюгируемый партнер выбран из конъюгата N-конца последовательности SEQ ID NO: 50, или 51, или 52 и С-конца последовательности SEQ ID NO: 43, или 44, или N-конца последовательности SEQ ID NO: 53, или 54, или 55, и С-конца последовательности SEQ ID NO: 45, или 46, и
и в котором молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся повтором анкирина.
Другим объектом, представленным в настоящем изобретении, является гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом, отличающийся включением двух гликозилированных конъюгатов молекула с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом представляет два гликозилированных конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом по одному из ранее описанных вариантов осуществления настоящего изобретения.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированный конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом дополнительно включает
а) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 50, 51 и 52, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 53 или 54 или 55 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 45 или 46, или
б) если конъюгируемый партнер молекулы с повторяющимся мотивом выбран из последовательностей SEQ ID NO: 53, 54 и 55, два конъюгата N-концевой последовательности SEQ ID NO: 50 или 51 или 52 и C-концевой последовательности SEQ ID NO: 43 или 44.
Другой объект, описанный в настоящем изобретении, представляет нуклеиновую кислоту, включающую следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»). Другой объект, пописанный в настоящем изобретении, представляет способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом согласно описанному в настоящем изобретении, включающий:
- культивирование клеток млекопитающих, включающих нуклеиновую кислоту согласно описанному в настоящем изобретении, в условиях, допускающих экспрессию молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и получения в результате гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенного гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО и клеток НЕК293.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризируемый конъюгируемый партнер является сконструированной шарнирной областью тяжелой цепи с тремя остатками цистеина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает сконструированную шарнирную областью тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является антикалином. В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с N-концом конъюгируемого партнера.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении описаны гликозилированные конъюгаты молекул с повторяющимся мотивом (glycosylated repeat-motif-molecule conjugates - GEMOC) общей формулы:
n
m
q
o
p
(молекула с повторяющимся мотивом - линкер) - (конъюгируемый партнер) - (линкер - молекула с повторяющимся мотивом),
в которой n и o независимо друг от друга и независимо от каждой из величин тир означают целые числа 0 или 1, m и p независимо друг от друга означают другие целые числа, а именно 0, или 1, или 2, или 3, или 4, или 5, или 6, или 7, и q независимо означает 0 или 1,
в которой конъюгируемый партнер включает по меньшей мере один сайт гликозилирования и GEMOC экспрессируется в клетках млекопитающих.
Понятие «гликозилированный» или его грамматические эквиваленты означают, что соответствующая молекула с повторяющимся мотивом включает остаток сахарида, ковалентно связанный с аминокислотой каркаса молекулы аминокислоты молекулы с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере один мотив сайта N- или O-гликозилирования, или природный, или сконструированный мотив (см., SEQ ID NO: 56 и 58). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мотив сайта N-гликозилирования выбран из asp-X-thr, asp-X-ser или asp-X-cys, где Х может быть каким-либо остатком аминокислоты, но не пролином (pro, P). В другом варианте осуществления настоящего изобретения добавляют метку гликозилирования к молекуле с повторяющимся мотивом (см., например, SEQ ID NO: 60, 61, 62 и 63; см., также Meder D. и др., J. Cell Biol. 168, 2005, cc.303-313; Bulbarelli А. и др., J. Cell Sci., 115, 2002, cc.1689-1702). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат включает в качестве молекулы с повторяющимся мотивом молекулу последовательности SEQ ID NO: 62 или 63. С применением такой метки гликозилирования, включающей молекулы с повторяющимся мотивом, может быть достигнуто хорошее гликозилирование.
Понятие «клетка млекопитающего» означает клетку, выбранную из клеток СНО, клеток ВНК, клеток НЕК, клеток COS, клеток Per.C6 или клеток гибридом.
Понятие «аминокислота», применяемое в настоящем изобретении, означает группу карбокси-α-аминокислот, которые прямо или в форме предшественников могут кодироваться нуклеиновой кислотой. Отдельные аминокислоты кодируются нуклеиновыми кислотами, состоящими из трех нуклеотидов, так называемых кодонов или триплетов оснований. Каждая аминокислота кодируется по меньшей мере одним кодоном. Это явление называется «вырожденностью генетического кода». Понятие «аминокислоты», применяемое в настоящем изобретении, означает природные карбокси-α-аминокислоты, включающие аланин (трехбуквенный код: ala, обозначение одной буквой: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновую кислоту (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gln, Q), глутаминовую кислоту (glu, E), глицин (gly, G), гистидин (his, H), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, K), метионин (met, M), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Понятие «антитело» означает молекулу, состоящую из одного или нескольких полипептидов, по существу кодируемых генами антитела. Антитело обычно включает два так называемых полипептида легкой цепи (легкую цепь) и два так называемых полипептида тяжелой цепи (тяжелую цепь). Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи содержит вариабельный домен (вариабельную область) (обычно амино-концевую часть полипептидной цепи), включающий области связывания, способные взаимодействовать с антигеном. Каждый из полипептидов тяжелой и легкой цепи включает константную область (обычно с карбокси-конца). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание антитела i) с клетками, несущими рецептор Fc-гамма (Fc gamma receptor - FcγR), например, клетками фагоцитов, или ii) с клетками, несущими неонатальный рецептор Fc (Fc receptor - FcRn), также называемый рецептором Brambell. Она также опосредует связывание некоторых факторов, включая факторы классической системы комплемента, например, компонент (C1q). Вариабельный домен легкой или тяжелой цепи антитела в свою очередь включает разные сегменты, т.е. четыре каркасных участка (framework region - FR) и три гипервариабельные области (CDR).
Понятие «шарнирная область» означает фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины от остатка в положении 216, который в норме является остатком глутаминовой кислоты, до остатка в положении 226, который в норме является остатком цистеина, или до остатка в положении 230, который в норме является остатком пролина. Шарнирная область включает остатки цистеина, которые могут формировать дисульфидные связи с соответствующими остатками цистеина второй шарнирной области, например, второй тяжелой цепи антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения шарнирная область включает два остатка цистеина.
Понятия «второй константный домен тяжелой цепи», «домен CH2» и «CH2», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 231 по остаток 340. Домен CH2 включает остаток 297, который в норме является аминокислотой аспарагином, к которой сахарид ковалентно присоединен к аминокислотному каркасу.
Понятия «третий константный домен тяжелой цепи», «домен CH3» и «CH3», которые могут применяться взаимозаменяемо, означают фрагмент (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - фрагмент антитела человека) тяжелой цепи антитела полной длины с остатка 341 по остаток 447, т.е. С-конец домена CH2.
Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)» означает механизм лизиса клеток, на которые воздействуют неспецифические цитотоксические клетки, имеющие на своей поверхности Fc-рецептор (FcR), например, природных клеток-киллеров (natural killer cells - NK), нейтрофилов и макрофагов. Эти клетки распознают и лизируют клетки со связанным с поверхностью антителом, обладающим частью связывания Fc-рецептора, например, Fc-частью.
Понятие «комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity - CDC)» означает механизм лизиса клеток, вызываемый комплементом, который инициируется путем связывания C1q, например, с антителом, связанным с его антигеном.
D
D
D
D
D
-5
-3
-6
-7
-10
-8
Понятие «связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей, т.е. обеспечивающей комплементарность, молекулой и ее связываемым партнером, т.е. специфической молекулой-мишенью. Силу такого специфического взаимодействия выражают в качестве связывающего сродства, представленного в виде величины K. Понятие «неспецифическое связывание с молекулой-мишенью» означает неспецифическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулами-мишенями с величиной K 10 моль/л или больше (например, 10 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной K 10 моль/л или больше. Связывающее сродство определяют с помощью стандартного анализа связывания, например, метода поверхностного плазменного резонанса (BIAcore). Эта величина связывающего сродства не расценивается в качестве точного значения, это всего лишь контрольная точка. Понятие «специфическое связывание с молекулой-мишенью» означает специфическое взаимодействие между связывающей молекулой и ее молекулой-мишенью с величиной K 10 моль/л или меньше (например, 10 моль/л), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с величиной K 10 моль/л или меньше.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения повторы молекулы с повторяющимся мотивом составляют от 20 до 40 остатков аминокислот в длину. Повторы собраны в отдельные структурные единицы, которые вместе формируют молекулу с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом выбрана из молекулы с повторяющимся мотивом анкирина и молекулы с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRRP).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер включает иммуноглобулиновый мембранный якорный домен или GPI-якорный домен.
Понятие «молекула с повторяющимся мотивом» означает природный или искусственный полипептид, который может экспрессироваться в виде одной молекулы, т.е. не конъюгировать со второй молекулой или со второй собственной копией, в растворимой форме в цитоплазме или периплазме Е.coli. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом включает по меньшей мере две структурно идентичные единицы (два повтора). Не требуется, чтобы эти единицы были идентичными gj аминокислотной последовательности. Эти единицы могут быть независимо сворачивающимися доменами, но это не является обязательным условием. Молекула с повторяющимся мотивом может, но не обязана, включать другие отрезки последовательности помимо повторяющихся единиц. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекулой с повторяющимся мотивом анкирина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином.
Понятие «молекула с повторяющимся мотивом анкирина» означает искусственный полипептид, включающий от 1 до 30 консенсусных последовательностей, состоящих из 33 аминокислотных остатков. Каждый из повторов включает мотив β-витка, за которым следует пара антипараллельных α-спиралей и петля, приводящая к витку следующего повтора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина включает от 1 до 30 повторов, в другом варианте осуществления настоящего изобретения включает от 2 до 10 повторов, и в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения включает от 3 до 6 повторов.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом анкирина, производив от одной из следующих консенсусных последовательностей путем случайного мутагенеза и отбора по связыванию молекулы-мишени, например, путем рибосомального дисплея, дрожжевого дисплея и фагового дисплея:
DGNT(P,A)LHLA(A,V) ENG(H,N)LE(I,V)VKL L(L,I)EAGA(D,N)INA (SEQ ID NO: 01),
DSDGNTPLHL AAENGQLEVV KLLLEAGADV NAR (SEQ ID NO: 02),
(D,T)KNGLTPLH(L,I) AAQEGHLEVV KLLLENGA(D,N)(V,I) NAK (SEQ ID NO: 03),
DxxGxTPLHL AAxxGHLEIV EVLLK(H,N,Y)GADV NAx (SEQ ID NO: 04),
ADVNAKDKDG YTPLHLAARE GHLEIVEVLL KAG (SEQ ID NO: 05),
DxxGxTPLHLAaxxGpxpaVpxLLpxGADVNAx (SEQ ID NO: 06),
DxxGxTPLHLAxxxGxxxVVxLLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 07),
DxxGxTPLHLAxxxGxxxIVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 08),
D11G1TPLHLAA11GHLEIVEVLLK2GADVNA1 (SEQ ID NO: 09),
в указанных последовательностях «x» обозначает в полной мере вариабельное положение,
аминокислоты, приведенные в скобках, обозначают специфические варианты, возможные в этом положении,
«а» обозначает аминокислоту с неполярной боковой цепью,
«p» обозначает остаток аминокислоты с полярной боковой цепью,
«1» обозначает остаток аминокислоты, выбранный из группы, включающей (выраженные в однобуквенном коде) остатки аминокислот A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y, и
«2» обозначает аминокислотный остаток, выбранный из группы, включающей остатки аминокислот Н, N и Y.
Молекулы GEMOC, включающие молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, связывающиеся с какой-либо заранее определенной молекулой-мишенью, могут быть получены путем скрининга библиотек, включающих рандомизированные молекулы GEMOC или рандомизированные молекулы с повторяющимся мотивом анкирина, например, с помощью рибосомального дисплея (см., например, WO 02/120565; Hanes J., Plückthun A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, cc.4937-4942).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает N-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности DLGKKLLE AARAGQDDEVRILMANGADV (SEQ ID NO: 47).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает C-концевой кэпированный повтор аминокислотной последовательности VNAQDKFGKT AFDISIDNGNEDLAEILQ (SEQ ID NO: 48).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулой с повторяющимся мотивом является молекула с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином (leucine-rich-repeat-motif-molecule - LRR). Способы получения молекул с повторяющимся мотивом, обогащенным лейцином, описаны в WO 2006/083275.
В целом действие антител выбрано из нейтрализующего действия, нацеливающего действия в отношении токсической части молекулы, или эффекторной функции.
На фиг.1 показана конструкция домена антитела. Антитело полной длины включает две так называемые легкие цепи и две так называемые тяжелые цепи. Каждая из легких цепей в свою очередь включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи выбран из домена типа каппа и домена типа лямбда. Каждая из тяжелых цепей в свою очередь включает вариабельный домен тяжелой цепи, первый константный домен тяжелой цепи (CH1), шарнирную область, второй константный домен тяжелой цепи (CH2), третий константный домен тяжелой цепи (CH3) и необязательно четвертый константный домен тяжелой цепи (CH4). Кроме того, включает дисульфидные связи антитела полной длины между константным доменом легкой цепи и первым константным доменом тяжелой цепи, а также две дисульфидные связи между вторыми константными доменами тяжелой цепи двух тяжелых цепей.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в молекуле GEMOC является тяжелая цепь антитела полной длины или легкая цепь антитела полной длины, но каждая без вариабельного домена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером в GEMOC является тяжелая цепь антитела или легкая цепь антитела, каждая из которых с вариабельным доменом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула с повторяющимся мотивом конъюгирована с С-концом соответствующей цепи антитела непосредственно или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает две молекулы GEMOC предшествующего варианта осуществления настоящего изобретения.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является легкая или тяжелая цепь анти-Aβ антитела. Такое анти-Aβ антитело и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты, например, описаны в WO 2003/070760, или US 2005/0169925, или представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 50-55 или их варианта.
Конъюгаты согласно описанному в настоящем изобретении включают различные варианты, содержащие одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с той же молекулой-мишенью или с другими молекулами-мишенями. В конъюгатах, согласно описанному в настоящем изобретении, с одним концом молекулы без неповторяющегося мотива, т.е. конъюгируемого партнера, независимо от наличия связи с С-концом или с N-концом, ковалентно связана только одна, т.е. единственная молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана.
Первый вариант является конъюгатом, включающим две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, каждая из которых связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями, причем каждая пара молекул с повторяющимся мотивом соединена пептидным линкером. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения число молекул с повторяющимся мотивом выбрано из двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти. На фиг.2 показаны примеры конъюгатов, включающих две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, соединенных пептидными линкерами.
Вторым конъюгатом является конъюгат, включающий одну или несколько молекул с повторяющимся мотивом и одну или несколько молекул без повторяющихся мотивов. Каждая из молекул с повторяющимся мотивом связывается с одной и той же или с разными молекулами-мишенями. Молекула без повторяющегося мотива обеспечивает каркас молекулы, с которым одна или несколько молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связаны, необязательно и независимо друг от друга через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов выбрана из домена антитела CL, домена антитела CH1, шарнирной области антитела, домена антитела CH2, домена антитела CH3, домена антитела CH4, мотивов мембранного якоря, трансмембранных доменов, последовательностей метки гликозилирования, последовательностей метки для очистки или обнаружения, или комбинации одного или нескольких из указанных структур, или их природных или сконструированных вариантов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает два или несколько полипептидов, ковалентно связанных вместе одной или несколькими дисульфидными связями. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов является Fc-часть антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулой без повторяющихся мотивов является димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или димер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, или тетрамер, состоящий из двух мономеров, каждый из которых включает в направлении от N- к С-концу домен CH1, шарнирную область тяжелой цепи, домен CH2 и домен CH3, и два мономера, включающих константный домен легкой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения каждый из мономеров независимо друг от друга дополнительно включают вариабельный домен.
Понятие «пептидный линкер» означает линкеры природного и/или синтетического происхождения, включающие аминокислотные остатки, соединенные друг с другом пептидными связями. Они состоят из линейной аминокислотной цепи, в которой 20 природных аминокислот представлены мономерными строительными блоками. Длина цепи составляет от 1 до 50 аминокислотных остатков, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 3 до 28 аминокислотных остатков, в другом варианте осуществления настоящего изобретения от 4 до 20 аминокислотных остатков. Линкер может включать повторяющиеся аминокислотные последовательности или последовательности природных полипептидов. Функция линкера заключается в гарантировании того, что складчатость двух компонентов, соединенных через линкер, будет корректной и может быть представлена должным образом из-за стерической и ротационной свободы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкером является «синтетический пептидный линкер», который обозначен в качестве обогащенного остатками глицина, глутамина и/или серина. Эти остатки собраны, например, в малые повторяющиеся единицы, содержащие до пяти аминокислот, например, (G)GGGS, (Q)QQQG, или (S)SSSG (SEQ ID NO: 14, 15 и 16). Такие малые повторяющиеся единицы могут быть повторены от двух до пяти раз для формирования мультимерной единицы. Другие синтетические пептидные линкеры составлены из одной аминокислоты, повторенной 10-20 раз, например, серин в линкере GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 17). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер выбран из [GQ4]3GNN (SEQ ID NO: 18), LSLSPGK (SEQ ID NO: 19), LSPNRGEC (SEQ ID NO: 20), LSLSGG (SEQ ID NO: 21), LSLSPGG (SEQ ID NO: 22), G3[SG4]2SG (SEQ ID NO: 23) или G3[SG4]2SG2 (SEQ ID NO: 24).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер содержит от 4 до 20 аминокислотных остатков. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения между молекулами с повторяющимся мотивом имеется один и тот же линкер, в другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат содержит линкер с двумя или несколькими разными аминокислотными последовательностями. В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкер выбран из (G3S), (G3S)2, (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G4S), (G4S)2, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5 (SEQ ID NO: 14 и 25-33), предпочтительно из (G4S)3 и (G4S)4 (SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает одну молекулу с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно пептидный линкер между этими молекулами. Молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана или с С-концом, или с N-концом одной молекулы без повторяющихся мотивов или с одним из С-концов, или с одним из N-концов полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов.
На фиг.3-5 показаны примеры конъюгатов вариантов осуществления настоящего изобретения второго варианта. На фиг.3 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом разных отдельных доменов антител. На фиг.4 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом комбинаций двух, трех или четырех доменов антитела. На фиг.5 показаны конъюгаты одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом связанных дисульфидной связью доменов антител (CL-CH1 или шарнир-шарнир), необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат согласно описанному в настоящем изобретении включает две молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов, и необязательно до двух пептидных линкеров. Одна молекула с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна с N-концом молекулы без повторяющихся мотивов, или обе ковалентно связаны с С-концом или с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов, или одна из молекул с повторяющимся мотивом ковалентно связана с С-концом и одна ковалентно связана с N-концом полипептидов, формируя молекулу без повторяющихся мотивов. Указанные С-конец и N-конец являются концами одного полипептида или разных полипептидов. На фиг.6-8 показаны примеры конъюгатов по настоящему изобретению. На фиг.6 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей только один С-конец и один N-конец, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.7 и 8 две молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей дисульфидную связь между доменами антитела, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает четыре молекулы с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно от одного до четырех пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекул без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения две из молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов. На фиг.9-11 показаны примеры конъюгатов настоящего варианта осуществления изобретения. На фиг.9 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, включая два С-конца и два N-конца, причем молекула без повторяющихся мотивов может включать один или несколько доменов антител. На фиг.10 и 11 четыре молекулы с повторяющимся мотивом конъюгированы с молекулой без повторяющихся мотивов, содержащей связанные дисульфидной связью домены антител, необязательно эти конъюгаты могут включать дополнительно другие домены антител, за исключением вариабельных доменов.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает шесть молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до шести пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, ковалентно связанные, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения четыре молекулы из числа молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом, и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов, и две молекулы без повторяющихся мотивов не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов. На фиг.12 показан пример конъюгата по настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат включает восемь молекул с повторяющимся мотивом и одну молекулу без повторяющихся мотивов и необязательно до восьми пептидных линкеров. В этом варианте осуществления настоящего изобретения молекула без повторяющихся мотивов включает по меньшей мере два полипептида, связанных ковалентно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения через одну или несколько дисульфидных связей. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекулы с повторяющимся мотивом ковалентно связаны с соответствующим числом С-концов и N-концов молекулы без повторяющихся мотивов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения от двух до восьми молекул с повторяющимся мотивом конъюгированы друг с другом, формируя димерные молекулы с повторяющимся мотивом и димерная молекула с повторяющимся мотивом в свою очередь конъюгирована с молекулой без повторяющихся мотивов и оставшееся число молекул с повторяющимся мотивом не конъюгированы друг с другом, но каждая конъюгирована с одним концом молекулы без повторяющихся мотивов.
Молекула с повторяющимся мотивом может быть производной каркаса молекулы, выбранного из группы, включающей CTLA-4 (фирма Evibody), липокалин, молекулы - производные от белка А, например, Z-домен белка А (фирма Affibody, SpA), А-домен (фирма Avimer, Maxibody), белки теплового шока, например, GroE1 и GroES, трансферрин (трансантитело), пептидный аптамер, домен лектина С-типа (тетранектин), y-кристаллин человека и убиквитин (аффилины), домены PDZ, токсин скорпиона, домены типа kunitz ингибиторов протеазы человека, и фибронектин (аднектин), молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Src-гомологичных доменов (например, домены SH2 или SH3), молекулы с повторяющимся мотивом, производные от доменов PDZ, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от бета-лактамазы, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от ингибиторов протеазы высокого сродства, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от малых каркасов молекул дисульфид-связанных белков, например, токсины скорпиона, молекулы с повторяющимся мотивом, включающие повторяющие домены связывания, например, EGF-подобный домен, Kringle-домен, PAN домен, Gla домен, SRCR домен, Kunitz домен, домен ингибитора панкреатического трипсина быка, домен ингибитора сериновой протеазы типа Kazal, домен Trefoil (P-типа), домен фактора фон Виллебранда типа С, анафилатоксиноподобный домен, домен CUB, повтор тироглобулина типа I, домен LDL-рецептора класса А, домен Sushi, домен Link, домен тромбоспондина типа I, иммуноглобулино-подобные домены, домен лектина С-типа, домен МАМ, домен фактора фон Виллебранда типа А, домен соматомедина В, коровый домен с четырьмя дисульфидными связями WAP-типа, домен F518 типа С, домен Hemopexin, EGF-подобный домен типа ламинина, домен C2, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Avimers, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Telobody, молекулы с повторяющимся мотивом, производные от Evibody, молекул с повторяющимся мотивом, производные от Microbody (см., например, Jeong K.J., Silverman J., Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc.1493-1494; Panni S. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc.21666-21674; Schneider S. и др., Nat. Biotechnol. 17, 1999, cc.170-175; Legendre D. и др., Protein Sci. 11, 2002, cc.1506-1518; Stoop A.A. и др., Nat. Biotechnol. 21, 2003, cc.1063-1068; Vita С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1995, cc.6404-6408; WO 2006/055689; US 2006/0234299).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения GEMOC включает конъюгируемого партнера, выбранного из подструктуры антитела, минибоди, аднектина, антикалина, аффибоди, аффилина, кноттина, глибоди, лектино-подобного доменного белка С-типа, сконструированных белков с повтором анкирина (designed ankyrin repeat protein - DARPin), тетранектина, доменного белка kunitz, тиоредоксина, цитохрома b562, каркаса молекулы цинкового пальца, каркаса молекулы нуклеазы стафилококка, фибронектина или димера фибронектина, тенасцина, N-кадгерина, E-кадгерина, ICAM, титина, GCSF-рецептора, рецептора цитокина, ингибитора гликозидазы, антибиотического хромопротеина, молекулы адгезии к миелиновой мембране РО, CD8, CD4, CD2, класса I ГКГ, антигенного рецептора Т-клеток, CD1, C2 и I-set доменов VCAM-1, 1-set домена иммуноглобулина миозинсвязывающего белка С, 1-set домена иммуноглобулина миозинсвязывающего белка Н, 1-set домена иммуноглобулина телокина, NCAM, твитчина, нейроглианы, рецептора гормона роста, рецептора эритропоэтина, рецептора пролактина, рецептора интерферона-гамма, β-галактозидазы/глюкуронидазы, β-глюкуронидазы, трансглутаминазы, антигенного рецептора Т-клеток, супероксиддисмутазы, домена тканевого фактора, цитохрома F, зеленого флуоресцирующего белка, GroEL и тауматина.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является антикалин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антикалин является антикалином А-44. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгат включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, и/или SEQ ID NO: 65, и/или SEQ ID NO: 66. Установлено, что молекулы GEMOC, включающие антикалин, могут экспрессироваться на высоких уровнях по сравнению с молекулами GEMOC, включающими DARPin. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антикалин гибридизирован с Fc-частью антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения Fc-частью является Fc-часть IgG1 человека или IgG4 человека с мутациями или без мутаций. Примерами мутаций являются замены аминокислот L234A и L235A в IgG1 и S228P и L235E в IgG4.
Установлено, что благоприятно для выработки молекул GEMOC, включающих молекулы с повторяющимся мотивом, гибридизируют с N-концом Fc-части антитела, например, Fc-части IgG1 человека или Fc-части IgG4 человека с установленными выше аминокислотными заменами или без них, чтобы шарнирная область включала три межцепочечных дисульфидные связи. По сравнению с конъюгатами, содержащими два межцепочечных дисульфидных мостика в шарнирной области, конъюгаты с тремя межцепочечными дисульфидными связями в шарнирной области могут быть получены с пониженным содержанием побочных продуктов, особенно касающихся фрагментации.
Ранее описанные в настоящем изобретении молекулы GEMOC, включающие две или несколько молекул с повторяющимся мотивом, обеспечивают возможность биспецифического, трехспецифического или тетраспецифического связывания конструкциями молекул-мишеней. Понятие «биспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере две молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с двумя разными молекулами-мишенями. Понятие «трехспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере три молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с тремя разными молекулами-мишенями. Понятие «тетраспецифичные» означает, что GEMOC включает по меньшей мере четыре молекулы с повторяющимся мотивом, связывающиеся с четырьмя разными молекулами-мишенями.
В том случае, когда молекула GEMOC включает домены антитела, получение ошибочно спаренных побочных продуктов, а также фрагментов, обходят или по меньшей мере минимизируют для достижения приемлемого уровня продуктивности и для того, чтобы избежать необходимости в проведении сложных процедур очистки. Подход, заключающийся в том, чтобы обойти проблему ошибочно спаренных подобных продуктов, который называют «выступ-во-впадину», направлен на усиление спаривания двух разных конъюгатов, каждый из которых включает домен CH3 тяжелых цепей антитела путем внедрения мутаций в домены CH3 для модификации поверхности контакта. В одной цепи объемные аминокислоты замещены аминокислотами с короткими боковыми цепями для создания «впадины». Наряду с этим аминокислоты с большой боковой цепью интродуцируют в другой домен CH3 для создания «выступа». Путем совместной экспрессии этих двух модифицированных конъюгатов наблюдают высокие уровни образования гетеродимера («выступ-впадина») относительно формирования гомодимера («впадина-впадина» или «выступ-выступ») (см., например, Ridgway J.B., Protein Eng. 9, 1996, ее. 617-621; WO 96/027011). Другим подходом к четкому снижению формирования ошибочно спаренных побочных продуктов является применение метода, называемого «обмен домена» или «пересечение». Используют имеющееся специфическое взаимодействие между доменами антитела CL и CH1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер в молекулах GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении включает два полипептида, из которых один включает константный домен легкой цепи антитела (CL) и другой включает первый константный домен тяжелой цепи антитела (CH1). Примеры биспецифичных молекул GEMOC показаны на фиг.13.
Понятие «целевая молекула (молекула-мишень)» означает молекулу, которая комплементарна и предоставляет сайты взаимодействия для взаимодействия с молекулой с повторяющимся мотивом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения целевая молекула выбрана из молекул на поверхности клеток, растворимых молекул на поверхности клеток, цитокинов, гормонов, ферментов, иммуноглобулинов, токсинов, белков вирусных частиц, белков бляшек и предшественников белков бляшек или наночастиц.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении включают конъюгируемый партнер, обеспечивая каркас молекулы для присутствия молекулы (молекул) с повторяющимся мотивом. Такой конъюгируемый партнер может обеспечить дополнительную функциональность, например, функциональность связывания рецептора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конъюгируемый партнер выбран из доменов антител, в другом варианте осуществления настоящего изобретения включает домен CH2 антитела. Домен CH2 антитела обеспечивает функциональность связывания Fc-рецептора, которая требуется для ADCC или CDC. В другом варианте осуществления настоящего изобретения конъюгируемым партнером является молекула, которая может мультимеризироваться или ассоциироваться с другими GEMOC, включающими тот же конъюгируемый партнер или соответствующий комплементарно присоединенный партнер. Такой мультимеризируемый конъюгируемый партнер или пара конъюгируемого партнера и комплементарно ассоциированного партнера в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выбраны из лейциновых зипперов, пары, включающей регуляторную субъединицу сАМВ-зависимой протеинкиназы А (PKA) и заякоривающего домена якорных белков киназы (kinase anchoring proteins - AKA).
Применяемый конъюгируемый партнер в молекулах GEMOC должен происходить от человека, обладать высокой стабильностью в отношении складывания и разрушения, быть «инертным», т.е. не иметь функции цитокина или передачи сигнала, легким и экономичным в получении, допускающим дополнительную переработку (например, протеолитическое расщепление, химическую модификацию пептида, пост-трансляционную модификацию), соответствующего размера (без почечной фильтрации) или другую системную элиминацию и не иметь свойств иммуногенности.
Понятие «мультимеризирующий конъюгируемый партнер» означает молекулы, способные ковалентно или нековалентно ассоциировать два или несколько отдельных GEMOC. Мультимеризирующие конъюгируемые партнеры в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выбраны из домена лейцинового зиппера (Kostelny S.A. и др., J. Immunol. 148, 1992, ее. 1547-1553; de Kruif J. и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, cc.7630-7634), дрожжевого GCN4 лейцинового зиппера, домена изолейцинового зиппера, мотива спираль-виток-спираль (Pack Р. и др., Biotechnol. 11, 1993, cc.1271-1277), max-взаимодействующих белков и родственных молекул (US 5512473), доменов полиглутаминовой кислоты-полилизина (US 5582996), природной или сконструированной пары доменов CH2-CH3 тяжелой цепи, природной или сконструированной пары доменов CH1 тяжелой цепи - константного домена легкой цепи (Mueller К.М. и др., FEBS Lett. 422, 1998, cc.259-264), домена из 180 аминокислот с карбокси-конца связывающего белка ТАТА (Colemen R.A. и др., J. Biol. Chem. 270, 1995, cc.13842-13849), VCAM и VLA-4, интегринов и внеклеточных матриксных белков, интегринов и молекул на поверхности клетки (например, CD54 или CD 102), молекул клеточной адгезии активированных лейкоцитов (activated leukocyte cell adhesion molecule - ALCAM), глутатионтрансферазы, доменов SRCR, рецептора димерной пары (например, рецептора интерлейкина-8 (IL-8R), гетеродимеров интегрина (например, LFA-1 и GPIIIb/IIIa), или только области (областей) их димеризации, димерных лигандных полипептидов (например, фактора роста нервов (nerve growth factor - NGF), нейротрофина-3 (NT-3), интерлейкина-8 (IL-8), фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor - VEGF) и нейротрофического фактора мозга (brain-derived neurotrophic factor - BDNF) (см., например, Arakawa Т. и др., J. Biol. Chem. 269, 1994, ее. 27833-27839; Radziejewski С. и др., Biochem. 32, 1993, cc.13350-6), или только области (областей) их димеризации, обычно пары остатков цистеина, способных формировать дисульфидную связь, пары пептидов или полипептидов, каждый из которых включает по меньшей мере один остаток цистеина (например, из примерно одного, двух или от трех до примерно десяти остатков цистеина) таким образом, что дисульфидная связь (связи) могут формироваться между пептидами или полипептидами, в основном доменами двойной спирали (см., например, Lupas А. и др.. Science 252, 1991, cc.1162-1164), домена тетрамеризации p53, N-концевых остатков (20-80 аминокислот) олигомерного матриксного белка хряща (cartilage oligomeric matrix protein - COMP), альфа-спиральных последовательностей (см., например, Eisenberg D. и др., Protein 1, 1986, cc.16-22; Но S.P., DeGrado W.F., J. Am. Chem. Soc. 109, 1987, cc.6751-6758; Regan L., DeGrado W.F., Science 241, 1988, cc.976-978; Hill С.P. и др., Science 249, 1990, cc.543-546; Pluckthun A., Pack P., Immunotechnol. 3, 1997, cc.83-105). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, природной или сконструированной шарнирной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи, из природных или сконструированных последовательностей шарнирной области и доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи. В другом варианте осуществления настоящего изобретения мультимеризуемый конъюгируемый партнер выбран из природных или сконструированных пар доменов CH2 и CH3 тяжелой цепи, природных или сконструированных пар домена CH1 тяжелой цепи и константного домена легкой цепи.
Антитела могут протеолитически расщепляться ферментом папаином близко к N-концевой стороне такой шарнирной области, приводя к двум антигенсвязывающим фрагментам (Fab) и одному фрагменту константной области (Fc). Фрагмент Fab состоит из целой легкой цепи и N-концевого фрагмента тяжелой цепи, включающей домен VH и CH1. Fc-часть в свою очередь включает оставшиеся домены двух тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями в шарнирной области.
Fc-часть антитела взаимодействует с компонентами иммунной системы, например, каскадом комплемента (комплемент-зависимая цитотоксичность (complement dependent cytotoxicity- CDC)) или путем связывания с рецепторами Fc-гамма (антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC)) или цитотоксичными эффекторными клетками. Для изменения эффекторной функции Fc-части могут быть произведены замещения аминокислотных остатков (US 5648260; US 5624821). Fc-часть ответственна за опосредование эффекторных функций, например, индукции цитокина, ADCC, фагоцитоза, комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) и периода полураспада/скорости клиренса антитела и комплексов антиген-антитело. Fc-часть обычно начинается с положения 226 (Cys) или 230 (Pro) и продолжается до С-конца тяжелых цепей антитела.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении являются гликозилированными белками, включающими один или несколько углеводных остатков. Получение белков in vivo включает стадии посттрансляционной модификации, особенно гликозилирования. Остатки сахаров (глюкозиды) ферментативно присоединяют к аминокислотной последовательности белка по мотивам N- или O-гликозилирования. Антителами, например, являются гликозилированные белки с одной или несколькими углеводными частями молекулы в Fc-части и в вариабельных доменах. Углеводные части молекулы в Fc-части по меньшей мере частично ответственны за эффекторную функцию и только менее важны для связывания антигена или период полураспада антитела (Jefferis R., Biotechnol. Prog. 21, 2005, cc.11-16).
В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи антитела (иммуноглобулины) делятся на классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов дополнительно делятся на подклассы (изотипы), т.е. иммуноглобулины класса IgG делятся на подклассы IgGI, IgG2, IgG3 и IgG4, или иммуноглобулины класса IgA делятся на подклассы IgA1 и IgA2. В соответствии с классом иммуноглобулина, к которому принадлежит антитело, константные области тяжелой цепи иммуноглобулинов называются α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) и µ (IgM), соответственно. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена легкие цепи антител обозначают легкими цепями каппа (κ) или лямбда (λ).
Понятие «гликозилированные» означает, что олигосахариды присоединены по меньшей мере к одному аминокислотному остатку. Из-за участия множества ферментов в пост-трансляционном гликозилировании в клетках, т.е. in vivo, рекомбинантный полипептид получают, имея неоднородное гликозилирование, т.е. гетерогенное гликозилирование, из-за клеточной экспрессии полипептида. В связи с этим рекомбинантно получаемый полипептид включает не только один, определенный N- или O-связанный олигосахарид по определенному специфическому аминокислотному остатку, но имеется смесь полипептидов, каждый из которых содержит ту же аминокислотную последовательность, но включает разные олигосахариды по определенным аминокислотным положениям, т.е. вариант гликозилирования. Следовательно, гликозилированная молекула ЕМОС представляет группу конъюгатов, каждый из которых имеет одну и ту же аминокислотную последовательность, но с разными олигосахаридами, присоединенными к аминокислоте в определенном положении. Понятие «олигосахарид», применяемое в настоящем описании, означает полимерный сахарид, включающий две или несколько ковалентно связанных моносахаридных единиц. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахарид, присоединенный к сайту гликозилирования, представляет смесь олигосахаридов, полученных экспрессией конъюгата в клетках СНО или в клетках НЕК293, т.е. олигосахарид представляет смесь олигосахаридов, полученных путем посттрансляционной модификации клеток, экспрессирующих конъюгат, т.е. это признак, свойственный клеткам, экспрессирующим конъюгат. Гликозилирование и конфигурация гликозилирования, наблюдаемая в клетке, экспрессирующей полипептид, т.е. in vivo, полностью отличны от гликозилирования или конфигурации гликозилирования, наблюдаемых in vitro.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения молекул GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении путем экспрессии соответствующих кодирующих нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих.
В подробном изложении в настоящем изобретении описывают способ получения гликозилированного конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом в клетках млекопитающих, включающий:
- обеспечение клеток млекопитающих, включающих нуклеиновую кислоту, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- культивирование клеток в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы с повторяющимся мотивом,
- выделение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом из клеток или культуральной среды и посредством этого получение гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом,
- необязательно очистку выделенной гликозилированной молекулы с повторяющимся мотивом.
Молекулы GEMOC согласно описанному в настоящем изобретении могут быть получены в клетках млекопитающих, т.е. в виде гликозилированных in vivo конъюгатов молекулы с повторяющимся мотивом. В настоящем изобретении описан способ получения конъюгатов молекулы с повторяющимся мотивом в гликозилированной форме, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в виде гликозилированных in vivo форм. Такое гликозилирование in vivo, т.е. гликозилирование в той же клетке, которая также экспрессирует конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом, является специфической клеточной пост-трансляционной модификацией. Рекомбинантно вырабатываемые полипептиды могут быть гликозилированными in vitro, т.е. после выделения из образующих их клеток (см., например, Leung S. и др., J. Immunol. 154, 1995, cc.5919-5926; US 5443953 по антителам).
Способы очистки полипептидов и иммуноглобулинов хорошо разработаны и широко применяются, или по отдельности, или в комбинации. Такими способами, например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, являются аффинная хроматография, использующая белки микробного происхождения (например, аффинная хроматография с белком А или белком G), ионообменная хроматография (например, катион-обменная (карбоксиметильные смолы), анион-обменная (аминоэтильные смолы) и смешанного типа обменная хроматография), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), хроматография гидрофобного взаимодействия или ароматической адсорбции (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или m-аминофенилборной кислотой), метал-хелатирующая аффинная хроматография (например, с Ni(II)- и Cu(II)-аффинным материалом), эксклюзионная хроматография и методы препаративного электрофореза (например, гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, cc.93-102). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения содержимое хроматографической колонки является хроматографическим материалом, выбранным из аффинного хроматографического материала, или ионообменного хроматографического материала, или тиофильного адсорбционного хроматографического материала, или хроматографического материала гидрофобного взаимодействия, или ароматического адсорбционного хроматографического материала, или хелатирующего металлы материала аффинной хроматографии, или материала для эксклюзионной хроматографии.
Для получения секретируемого полипептида целевой структурный ген также может включать сегмент ДНК, который кодирует сигнальную последовательность/лидерный пептид. Сигнальная последовательность направляет вновь синтезированный полипептид к мембране и через мембрану эндоплазматической сети (ЭС), куда полипептид может поступать для секреции. Сигнальная последовательность расщепляется сигнальными пептидазами при прохождении белка через мембрану ЭР. В том, что касается функции сигнальной последовательности, важным является распознавание механизмом секреции клетки-хозяина. Соответственно применяемая сигнальная последовательность распознается белками клетки-хозяина и ферментами механизма секреции.
Элементы регуляции трансляции включают инициацию трансляции (AUG) и стоп-кодон (ТАА, TAG или TGA). Внутренняя сторона входа рибосомы (internal ribosome entry site - IRES) может быть включена в некоторые конструкции.
Таким образом, другим объектом согласно описанному в настоящем изобретении, является нуклеиновая кислота для экспрессии конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом в клетках млекопитающих, которая включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор из цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- последовательность, кодирующую конъюгат молекулы с повторяющимся мотивом,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 5'-нетранслируемая область гена зародышевой линии антитела является геном зародышевой линии антитела человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина является сигнальной последовательностью тяжелой цепи иммуноглобулина мыши или человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина включает интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]).
Сущность настоящего изобретения ниже может быть пояснена на примерах с двумя модельными молекулами с повторяющимся мотивом, связывающимися с HER2 (DARPin H10-2-G3, каркас молекулы N2C (2 повтора), Zahnd С.и др., J. Mol. Biol. 369, 2007, cc.1015-1028; DARPin 9-26, каркас мол N3C (3 повтора), Steiner D. и др., J. Mol. Biol. 382, 2008, cc.1211-1227). Четыре экспрессируемые конструкции для экспрессии таких молекул GEMOC в клетках НЕК.293 были проанализированы (в направлении от N-конца к С-концу):
1) лидерный пептид - молекула с повторяющимся мотивом - метка из шести остатков гистидина,
2) лидерный пептид- молекула с повторяющимся мотивом - фрагмент Fc иммуноглобулина,
3) лидерный пептид - фрагмент Fc иммуноглобулина - молекула с повторяющимся мотивом,
4) лидерный пептид - фрагмент Fc иммуноглобулина - молекула с повторяющимся мотивом.
Таким образом, другими объектами согласно описанному в настоящем изобретении являются молекулы GEMOC последовательностей SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, молекулы GEMOC, включающие SEQ ID NO: 11 и 11, SEQ ID NO: 13 и 13, SEQ ID NO: 11 и 13, SEQ ID NO: 34 и 34, SEQ ID NO: 35 и 35, SEQ ID NO: 34 и 35, SEQ ID NO: 36 и 37, SEQ ID NO: 39 и 39, а также соответствующие нуклеиновые кислоты, кодирующие их, и соответствующие нуклеиновые кислоты с этими кодирующими нуклеиновыми кислотами и комбинации последовательностей, и способы получения таких молекул GEMOC.
Приводимые ниже примеры, перечень последовательностей и фигуры предусмотрены для разъяснения настоящего изобретения, истинная область охвата которого приводится ниже в прилагаемой формуле настоящего изобретения. Очевидно, что могут быть произведены модификации в приводимых ниже процедурах, не отклоняясь от духа настоящего изобретения.
Описание перечня последовательностей
SEQ ID NO: 01. Аминокислотная консенсусная последовательность 1 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 02. Аминокислотная консенсусная последовательность 2 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 03. Аминокислотная консенсусная последовательность 3 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 04. Аминокислотная консенсусная последовательность 4 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 05. Аминокислотная консенсусная последовательность 5 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 06. Аминокислотная консенсусная последовательность 6 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 07. Аминокислотная консенсусная последовательность 7 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 08. Аминокислотная консенсусная последовательность 8 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 09. Аминокислотная консенсусная последовательность 9 молекулы с повторяющимся мотивом анкирина.
SEQ ID NO: 10. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 11. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1.
SEQ ID NO: 12. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 13. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1.
SEQ ID NO: 14-33. Последовательности пептидных линкеров.
SEQ ID NO: 34. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с двумя дисульфидными связями в шарнирной области.
SEQ ID NO: 35. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с двумя дисульфидными связями в шарнирной области.
SEQ ID NO: 36. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с CH3-выступ-доменом.
SEQ ID NO: 37. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 с CH3-впадина-доменом.
SEQ ID NO: 38. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26.
SEQ ID NO: 39. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgGI с двумя дисульфидными связями в шарнирной области с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26.
SEQ ID NO: 40. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 41. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца модельной молекулой с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 42. Димерная модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 43. Константная область IgG1 человека.
SEQ ID NO: 44. Константная область IgG4 человека.
SEQ ID NO: 45. Константная область домена каппа человека.
SEQ ID NO: 46. Константная область домена лямбда человека.
SEQ ID NO: 47. N-концевой кэпированный повтор.
SEQ ID NO: 48. C-концевой кэпированный повтор.
SEQ ID NO: 49. Последовательность промотора цитомегаловируса (CMV).
SEQ ID NO: 50. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 51. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 52. Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 53. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 54. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 55. Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-Aβ антитела.
SEQ ID NO: 56. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и интродуцированным сайтом гликозилирования в начале C-кэпированного повтора.
SEQ ID NO: 57. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 и конъюгированный с ней с С-конца домен мембранного якоря.
SEQ ID NO: 58. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и интродуцированным сайтом гликозилирования в начале C-кэпированного повтора.
SEQ ID NO: 59. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца Fc-частью IgG1 и конъюгированный с ней с С-конца домен мембранного якоря.
SEQ ID NO: 60. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования в области С-конца.
SEQ ID NO: 61. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования в области С-конца.
SEQ ID NO: 62. Модельная молекула с повторяющимся мотивом H10-2-G3 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования.
SEQ ID NO: 63. Модельная молекула с повторяющимся мотивом 9-26 с конъюгированной с С-конца аминокислотной последовательностью метки из шести остатков гистидина и меткой гликозилирования.
SEQ ID NO: 64. Модельный конъюгат, включающий антикалин А-44 с меткой из шести остатков гистидина.
SEQ ID NO: 65. Модельный антикалин А-44 с меткой Fc и тремя дисульфидными мостиками в шарнирной области.
SEQ ID NO: 66. Модельный антикалин А-44 с меткой Fc и двумя дисульфидными мостиками в шарнирной области.
Описание фигур
Фиг.1. Схематическое представление конструкции домена антитела и легенда с обозначениями для последующих фигур.
Фиг.2. Примеры конъюгатов, включающих две или несколько молекул с повторяющимся мотивом.
Фиг.3. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом разных отдельных доменов антител.
Фиг.4. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом комбинаций двух, трех или четырех доменов антител.
Фиг.5. Примеры конъюгатов одной молекулы с повторяющимся мотивом с N-концом и С-концом связанных дисульфидной связью доменов антитела.
Фиг.6. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих только один С-конец и один N-конец.
Фиг.7. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих домены антител, связанные дисульфидной связью (часть 1).
Фиг.8. Примеры конъюгатов двух молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих домены антител, связанные дисульфидной связью (часть 2).
Фиг.9. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих два С-конца и два N-конца.
Фиг.10. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих связанные дисульфидной связью домены антител (часть 1).
Фиг.11. Примеры конъюгатов четырех молекул с повторяющимся мотивом, конъюгированных с молекулой без повторяющихся мотивов, включающих связанные дисульфидной связью домены антител (часть 2).
Фиг.12. Пример конъюгата шести молекул с повторяющимся мотивом и одной молекулы без повторяющихся мотивов.
Фиг.13. Примеры молекул GEMOC с замененными доменами.
Фиг.14. Плазмидная карта плазмиды экспрессии 9800.
Фиг.15. Плазмидная карта плазмиды экспрессии 9801.
Фиг.16. Плазмидная карта конъюгата плазмиды экспрессии 9807 с полипептидом тяжелой цепи.
Фиг.17. Плазмидная карта вектора экспрессии легкой цепи антитела 5170.
Фиг.18. SDS-PAGE гели экспрессированных конъюгатов молекул с повторяющимся мотивом анкирина в супернатанте временно трансфецированных клеток HEK293 на 7 сутки; конструкция 1 = белок SEQ ID NO: 10, конструкция 2 = белок SEQ ID NO: 12, конструкция 3 = белок SEQ ID NO: 11, конструкция 4 = белок SEQ ID NO: 13.
Фиг.19. Анализ BIAcore связывания молекул GEMOC по настоящему изобретению с растворимым рецептором эпидермального фактора роста человека HER2.
Пример 1. Конструирование плазмид
Применяют стандартные методы работы с ДНК согласно описанию в кн.: Sambrook J. и др. «Molecular cloning: A laboratory manual», 1989, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Применяют реагенты для молекулярной биологии, следуя рекомендациям производителя. Необходимые генные сегменты получают генным синтезом. Синтезированные генные фрагменты клонируют в специфическом векторе экспрессии. Последовательность ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждают секвенированием ДНК.
Плазмиды экспрессии 9800 и 9803
Генный сегмент, кодирующий конъюгаты последовательностей SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12, клонируют в определенной плазмиде экспрессии по уникальным сайтам рестрикции BsmI и Bpu 10I. Плазмиду экспрессии конструируют для комбинирования последовательности, кодирующей конъюгат, с С-концевой меткой из шести остатков гистидина, например, для экспрессии в клетках HEK293 и последующей очистки. Рядом с кассетой экспрессии конъюгата плазмида включает:
- начало репликации из вектора pUC18, которое допускает репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции последовательности, кодирующей конъюгат, включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор из цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела человека,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальную последовательность 1, интрон, сигнальную последовательность 2 [L1-интрон-L2]) и уникальный сайт рестрикции BsmI с 3'-конца L2,
- последовательность, кодирующую конъюгат,
- линкер GSG, кодирующий уникальный сайт Bpu 10I с 3'-конца последовательности, кодирующей конъюгат, и в рамке с последовательностью, кодирующей конъюгат,
- метка из шести остатков гистидина с 3'-конца линкера GSG, в рамке с последовательностью, кодирующей конъюгат, и линкер GSG,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»), и
- уникальные сайты рестрикции NheI и EagI с 3'-конца экспрессированной последовательности.
Плазмидная карта плазмид экспрессии 9800 и 9803, соответственно, показана на фиг.14. Аминокислотные последовательности зрелых (без сигнальной последовательности) конъюгатов представлены в виде последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12.
Плазмиды экспрессии 9801 и 9804
Генный сегмент, кодирующий конъюгат последовательности SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, клонируют в специфической плазмиде экспрессии через уникальные сайты рестрикции HindIII и PmlI. Плазмиду экспрессии конструируют для конъюгации конъюгата к N-концу шарнирной области иммуноглобулина класса IgG1, таким образом замещая имеющиеся природные домены VH и CH1. Полученная плазмида экспрессии применима для экспрессии конъюгатов последовательностей SEQ ID NO: 11 и 13, соответственно, например, в клетках HEK293. Рядом с кассетой экспрессии для молекулы с повторяющимся повтором, конъюгированной с последовательностями IgG1-шарнира, -CH2 и -CH3 плазмида включает:
- начало репликации с вектора pUC18, позволяющее осуществлять репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом-шарнира-CH2-CH3 состоит из следующих элементов:
- предраннего энхансера и промотора от цитомегаловируса человека,
- последовательности интрона А от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемой области гена зародышевой линии антитела,
- сигнальной последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающей интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]) и уникальный сайт рестрикции BsmI с 3'-конца L2,
- последовательности, кодирующей конъюгат,
- последовательности, кодирующей шарнирную область, домены CH2- и CH3 в IgG1 человека, с уникальным сайтом рестрикции PmlI в шарнирной области, позволяющим клонировать последовательность, кодирующую конъюгат, и
- сигнальной последовательности полиаденилирования («поли А»).
Плазмидные карты плазмид экспрессии 9801 и 9804, соответственно, показаны на фиг.15. Аминокислотные последовательности зрелых (без сигнальной последовательности) конъюгатов показаны в виде последовательностей SEQ ID NO: 11 и 13.
Плазмиды экспрессии 9807 и 9808
Примером антитела, с которым молекулы с повторяющимся мотивом последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12 без метки из шести остатков гистидина могут быть конъюгированы, является антитело против амилоидного β-A4 пептида (анти-Aβ антитело). Такое антитело и соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты описаны, например, в WO 2003/070760 или US 2005/0169925. Генный сегмент, кодирующий конъюгат, клонируют в специальной плазмиде экспрессии через уникальные сайты рестрикции MroI и NheI. Плазмиду экспрессии разрабатывают для конъюгирования полипептида с С-концом тяжелой цепи иммуноглобулина человека подкласса IgG1 (геномно организованная кассета экспрессии; организация экзон-интрон). Получаемую плазмиду экспрессии можно применять для экспрессии конъюгатов, например, в клетках HEK293. Рядом с кассетой экспрессии тяжелой цепи конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом моноклонального антитела плазмида включает:
- начало репликации с вектора pUC18, позволяющее осуществлять репликацию этой плазмиды в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом тяжелой цепи включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]),
- вариабельный домен тяжелой цепи анти-Ab антитела, кодирующий сегмент, собранный с сайтом сплайсирования донора и уникальным сайтом рестрикции BamHI с 3'-конца,
- нуклеиновую кислоту, кодирующую константные домены γ1 человека CH1, шарнир, CH2 и CH3 разделенные интронами,
- линкер (G4S)3, гибридизированный в рамке с 3'-концом домена CH3,
- уникальные сайты рестрикции MroI и NheI с 3'-конца линкера для осуществления клонирования полипептида в рамке к С-концу линкера, и
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A»).
Плазмидные карты плазмид экспрессии 9807 и 9808 конъюгата молекулы с повторяющимся мотивом тяжелой, соответственно, показаны на фиг.15.
Плазмида экспрессии 5170
Для экспрессии легкой цепи антитела применяют плазмиду 5170. Плазмида 5170 является плазмидой экспрессии, например, временной экспрессии легкой цепи антитела (геномно организованная кассета экспрессии; организация экзон-интрон) в клетках НЕК293.
Рядом с кассетой экспрессии κ-легкой цепи антитела эта плазмида включает:
- ген устойчивости к неомицину в качестве селективного маркера,
- начало репликации от вектора pUC18, которое позволяет реплицировать эту плазмиду в Е.coli, и
- ген β-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину в Е.coli. Единица транскрипции гена κ-легкой цепи антитела включает следующие элементы:
- предранний энхансер и промотор от цитомегаловируса человека,
- 5'-нетранслируемую область гена зародышевой линии антитела,
- сигнальную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, включающую интрон сигнальной последовательности (сигнальная последовательность 1, интрон, сигнальная последовательность 2 [L1-интрон-L2]),
- вариабельный домен легкой цепи анти-Aβ антитела, кодирующий сегмент, собранный с сайтом сплайсирования донора и уникальным сайтом рестрикции BamHI с 3'-конца, усеченный интрон 2 κ-легкой цепи человека,
- константный домен гена κ-легкой цепи человека,
- сигнальную последовательность полиаденилирования («поли-A), и
- уникальные сайты рестрикции AscI и SgrAI с 3'-конца. Плазмидная карта вектора экспрессии 5170 κ-легкой цепи антитела показана на фиг.17.
Пример 2. Временная трансфекция и экспрессия
2
Рекомбинантные конъюгаты по настоящему изобретению, проиллюстрированные в примере 1, получают путем временной трансфекции клеток НЕК293 - Freestyle (линии 293 эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney cell line 293, фирма Invitrogen), растущих в суспензии. Трансфецированные клетки культивируют в среде F17 (фирма Gibco) или в среде Freestyle 293 (фирма Invitrogen), обогащенной 6 мМ глутамином, или ультра-глутамином (фирма Biowhittake/Lonza), или L-глутамином (фирма Sigma), с 8% CO при 37°С в качалочных колбах в количестве от 30 мл до 250 мл среды. Для трансфекции применяют фектин (фирма Invitrogen) в соотношении реагента (мкл) к ДНК (мкг) 4:3. В случае присоединения конъюгатов к С-концу тяжелой цепи антитела, легкие и тяжелые цепи экспрессируют с двух разных плазмид, используя мольное соотношение плазмиды, кодирующей легкую цепь, к плазмиде, кодирующей тяжелую цепь, в диапазоне от 1:2 до 2:1, соответственно. Супернатанты культур клеток, содержащие конъюгаты, собирают на 6-8 сутки после трансфекции. Общую информацию, касающуюся рекомбинантной экспрессии иммуноглобулинов человека, например, в клетках HEK293, приводят в публикации Meissner Р. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, cc.197-203.
Пример 3. Анализ экспрессии с применением метода SDS-PAGE
Буфер с литием додецилсульфатом для образцов в четырехкратной концентрации: 4 г глицерина, 0,682 г TRIS (tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-трис-гидроксиметиламнометан), 0,666 г TRIS-HC1 (tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-hydrochloride - трис-гидроксиметиламнометан гидрохлорид), 0,8 г лития додецилсульфата, 0,006 г EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 0,75 мл 1 мас.% раствора красителя Serva Blue G250 в воде, 0,75 мл 1 мас.% раствора красителя фенольного красного, добавляют воду до общего объема 10 мл.
Культуральную среду, содержащую секретированный конъюгат, центрифугируют для удаления клеток и клеточных фрагментов. Аликвоту осветленного супернатанта смешивают с 1/4 объема буфера с литием додецилсульфатом для образцов в четырехкратной концентрации и 1/10 объема 0,5 М 1,4-дитиотреитол (ДТТ). Затем образцы инкубируют в течение 10 мин при 75°С и белок выделяют методом SDS-PAGE. Гель-систему NuPAGE Pre-Cast (фирма Invitrogen) применяют по инструкции производителя. В частности применяют гели 10% NuPAGE No vex Bis-TRIS Pre-Cast (pH 6,4) и подвижный буфер NuPAGE MES. Полипептиды и конъюгаты полипептидов могут быть четко выявлены (см. фиг.18).
Пример 4. Очистка белка аффинной хроматографией и гель-фильтрующей хроматографией
Конъюгаты Fc и антитела
2
4
2
4
Экспрессированные и секретированные конъюгаты Fc и антитела очищают аффинной хроматографией, использую белок А в качестве материала со сродством MabSelectSure (фирма GE Healthcare). Вкратце, после центрифугирования (в режиме 10000 g в течение 10 мин) и фильтрации через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осветленные культуральные супернатанты, содержащие конъюгат, вносят в колонку MabSelectSure, уравновешенную буфером ФСБ (10 мМ NaHPO, 1 мМ KHPO, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные белки удаляют промыванием уравновешенным буфером. Конъюгат элюируют 0,1 М нитратным буфером, рН 3,3, и содержащий фракции продукт нейтрализуют 1 М TRIS рН 9,0. Затем раствор диализируют против буфера ФСБ при 4°С, концентрируют с помощью концентрирующего устройства Amicon Centricon и хранят в ледяной бане при 0°С. Агрегирование конъюгатов Fc и антитела исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Фракции, в которых выявляют высокомолекулярные агрегаты, подвергают препаративной эксклюзионной хроматографии. Вкратце, буфер конъюгата заменяют на гистидиновый буфер (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0) путем повторяемого концентрирования и разведения в устройстве Centricon (фирма Amicon). После концентрирования до 1-4 мл раствор, содержащий конъюгат, вносят в колонку Superdex200 High Load (фирма GE HealthCare), уравновешенную тем же гистидиновым буфером. Собирают фракции объемом 1 мл. Все фракции исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) (Superdex200, фирма GE HealthCare), и фракции с чистым мономерным конъюгатом объединяют. Целостность конъюгата исследуют методом SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента и окрашивают красителем кумасси бриллиантовым синим согласно описанному в предыдущем разделе.
Конъюгаты последовательностей SEQ ID NO: 10 и 12
3
4
Экспрессированные и секретированные конъюгаты, включающие метку из шести остатков гистидина (SEQ ID NO: 10 и 12), очищают аффинной хроматографией, используя хелатирующий никель аффинный материал Ni-Sepharose HP HighTrap (фирма GE Healthcare) по известным методикам. Вкратце, после центрифугирования (в режиме 10000 g в течение 10 мин) и фильтрации через фильтр с размером пор 0,45 мкм, осветленный культуральный супернатант, содержащий конъюгат, вносят в колонку Ni-Sepharose, уравновешенную фосфатным буфером (50 мМ NaPO, 300 мМ NaCl, рН 8,0). Несвязанные белки удаляют промывкой фосфатным уравновешивающим буфером, содержащим 20 мМ имидазол. Конъюгат элюируют с помощью проводящего градиента. Затем раствор, содержащий конъюгат, интенсивно диализируют против гистидинового буфера (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0) при 4°С, концентрируют с помощью концентрирующего устройства Amicon Centricon и хранят в ледяной бане при 0°С. Агрегирование конъюгатов Fc и антитела исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Фракции, в которых выявляют высокомолекулярные агрегаты, подвергают препаративной эксклюзионной хроматографии, проводимой известными методами. Вкратце, раствор с концентрированным конъюгатом вносят в колонку Superdex200 High Load (фирма GE HealthCare), уравновешенную тем же гистидиновым буфером согласно описанному выше. Отбирают фракции объемом 1 мл. Все фракции исследуют методом аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) (Superdex200, фирма GE HealthCare), и фракции с чистым мономерным конъюгатом объединяют. Целостность конъюгата исследуют методом SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента и окрашивают красителем кумасси бриллиантовым синим согласно описанному в предыдущем разделе.
Пример 5. Исследование связывания с помощью прибора BIAcore
2
4
2
4
Все измерения поверхностного плазменного резонанса проводят на приборе BIAcore 3000 (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) при 25°С. В качестве подвижного буфера и буфера для разведения используют ФСБ (1 мМ KHPO, 10 мМ NaHPO, 105 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl), рН 6,0, 0,005 об.% Tween 20. Растворимый белок А разводят в буфере 10 мМ натрия ацетата, рН 5,0, и иммобилизуют на чипе биосенсора СМ5, используя набор для стандартного присоединения амина (фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) для получения на поверхности плотности белка А примерно 1000 RU. HBS-P (10 мМ HEPES, рН 7,4, 118 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества P20; фирма GE Healthcare Biosciences AB, Швеция) применяют в качестве подвижного буфера при проведении иммобилизации. Исследуемые конъюгаты Fc и антитела разводят ФСБ, 0,005 об.% Tween 20, рН 6,0, до концентрации 450 нМ и вносят инъекцией на протяжении 3 мин при скорости тока 30 мкл/мин. Затем растворимый лиганд разводят в том же буфере до разных концентраций от 70 до 680 нМ и вносят инъекцией на протяжении 3 мин при скорости тока 30 мкл/мин. Затем сенсорный чип регенерируют в течение 1 мин с помощью ФСБ, рН 8,0, 0,005 об.% Tween 20. Анализ данных осуществляют с помощью программного обеспечения BIAevaluation (фирма BIAcore, Швеция) (см., фиг.19).
Пример 6. Исследование связывания методом ELISA
Связывание конъюгатов Fc и антитела определяют с помощью фермент-связанного иммуносорбентного анализа (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). В настоящем изобретении применяют метод сэндвича, основанный на стрептавидине/биотине. Для этого исследования используют планшеты для микротитрования с покрытием из стрептавидина.
Пример 7. Исследование связывания методом FACS
Клетки линии SK-BR-3 (АТСС# НТВ-30), стабильно экспрессирующие HER2, культивируют в среде McCoy 5a (PAN), обогащенной 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ) и 2 мМ L-глутамина. Для обнаружения HER2 на поверхности клеток конъюгатом по настоящему изобретению клетки промывают ФСБ, обогащенным 1% ФСТ в качестве блокирующего реагента. Конъюгат инкубируют в ФСБ/1% ФСТ с клетками при 4°С в течение 15 мин, промывают и инкубируют с соответствующим флуоресцентно меченым вторичным антителом, выявляющим конъюгат. Меченые клетки сортируют методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (fluorescence-activated cell sorting - FACS) для связывания конъюгата на клетках.