СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕКОНСТРУКЦИИ ДЕФЕКТОВ ТКАНЕЙ
METHOD FOR OBTAINING DECELLULARISED MATRIX OF AMNIOTIC MEMBRANE FOR FURTHER RECONSTRUCTION OF TISSUE DEFECTS

Изобретение относится к области медицины, в частности к биомедицине, а именно к регенеративной медицине и трансплантологии, тканевой инженерии для получения бесклеточного матрикса амниотической мембраны для последующей реконструкции дефектов тканей вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др., в качестве покрытия с сохранными структурными компонентами внеклеточного матрикса не вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации с целью заживления пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани и может быть использовано в научных и лечебных учреждениях.
Актуальность предлагаемого способа определяется необходимостью хирургической реконструкции поврежденных участков при полученной травме, вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др. Подобная реконструкция дефектов тканей имеет существенные ограничения, связанные с недостаточным количеством покрывного материла, пригодного для реконструкции. Для решения проблем трансплантации покрывного материала существуют подходы регенеративной медицины и тканевой инженерии.
Амниотическая мембрана используется, в качестве биологического покрывного материла, для лечения ожоговых ран и язв, преимущественно в трансплантологии и офтальмологии для лечения окулярного пемфигоида и синдрома Стивенса - Джонсона; Помимо ольфтамологии, амниотическая мембрана широко используется в лечении кожных заболеваний - хронических язв, некротизирующего фасциита, буллезного эпидермолиза и т.д. Известно, что клетки амниотической мембран обладают низкой иммуногенностью и не экспрессируют HLA-DR. Однако, M. Kubo и соавт. утверждают, что фибробласты амниотической мембраны могут экспрессировать антигены II класса при проведении иммуногистохимической реакции с антителом BL-IA/6. [Kubo М., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42(7): 1539-46].
2
Известен способ обработки амниотической мембраны, который заключается в ее криоконсервации с последующей оценкой биосовместимости посредством имплантации в иммуннонепривилегированную область (глазной лимб, капсула почки) и в неиммунопривилегированную область (роговица) [Kubo М., Sonoda Y., Muramatsu R., Usui M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001 Jun; 42(7): 1539-46]. С целью криоконсервации амниотическую мембрану аккуратно отделяют от хориона и нарезают на кусочки 5 см. Фрагменты амниотической мембраны промывают последовательно в 0.5 М, 1.0 М и 1.5 М DMSO и замораживают в 1.5 М DMSO при -80°С. При окрашивании препаратов криоконсервированной амниотической мембраны антителами к тяжелой и легкой цепям антигена МНС I класса выявляют положительную реакцию для эпителиальных клеток, мезенхимальных клеток и фибробластов. Таким образом, для амниотической мембраны характерна сильновыраженная экспрессия молекул МНС I класса, которая сохраняется после криоконсервации и в течение 6 месяцев во время хранения. Авторы оценили биосовместимости амниотической мембраны при лимбальной, интракорнеальной и гетеротипической имплантации (капсула почки). При имплантации криоконсервированного амниона в область глазного лимба крысам линии Левис наблюдали умеренную клеточную инфильтрацию, однако сам трансплантат был частично сохранен. Иммуногистохимический анализ через 1 неделю после операции показал, что имплантированный амнион был инфильтрирован главным образом CD4+-лимфоцитами. Таким образом, криоконсервированный трансплантат амниотической мембраны обладает относительной иммуногенностью при имплантации в иммунонепривилегированную область; ввиду того, что клетки практически всех трех слоев амниона экспрессируют HLA антигены класса Ia, которые являются антиген-презентирующими клетками Т-лимфоцитам глазного лимба. Однако, авторы показали, что при всех интракорнеальных ксенотрансплантациях амниотической мембраной отсутствовала иммунная реакция или Т-клеточная инфильтрация и ксенотрансплантаты сохраняли полную прозрачность при длительном наблюдении. При трансплантации амниона под почечную капсулу только несколько клеток хозяина инфильтрировали строму амниона, в отличие от криоконсервированных кожных ксенотрансплантатов, которые содержали большое количество HLA-DR - позитивных дендритных клеток кожи, в частности клеток Лангерганса. К недостаткам этого способа относится наличие после криоконсервации и размораживания живых клеток (фибробластов) в глубоких слоях амниона (компактный и спонгиозный слои), что при гетеротопической имплантации или трансплантации в иммунонепривилегированную область реципиента приводит к воспалительной инфильтрации. Амниотическая мембрана содержит существенно меньше фибробластов, экспрессирующих антиген II класса гистосовместимости и экспрессирует Fas лиганд (Fas L) - положительные мезенхимальные клетки в строме, который препятствует инфильтрации трансплантата лимфоцитами. Экспрессия антигена класса Ib (HLA-G и HLA-E) также характерна для клеток амниона; кроме этого, отмечается, что растворимая форма HLA-G (важный иммуносупрессивный фактор) секретируется эпителиальными клетками амиона и содержится в амниотической жидкости. Манифестация клетками амниона HLA-G может быть задействована в иммунологической толерантности: во-первых, HLA-G может играть роль толерогенного пептида, и соответственно, лимфоциты или дендритные клетки хозяина могут инактироваться связыванием HLA-G с ингибиторными рецепторами.
2
Известен способ получения лиофилизированных и криоконсервированных образцов амниотической мембраны [ МТ,  MJ,  R, Vieites B, Gude F, Silva MT, Couceiro J. Effects of lyophilization on human amniotic membrane. Acta Ophthalmol. 2009 Jun; 87(4): 396-403. doi: 10.1111/j.1755-3768.2008.01261.x.]. Экстраплацентарные зародышевые оболочки тщательно промывают от кровяных сгустков изотоническим раствором. Делают аккуратный неострый надрез и отделяют амниотическую мембрану от хориона, которую промывают несколько раз раствором антибиотиков - антимикотиков (10000 ЕД./мл, стрептомицин 50 мкг/мл и амфотерицин 2,5 мкг/мл). Затем амниотическую мембрану накладывают эпителиальной стороной вверх на нитроцеллюлозный фильтр и нарезают на куски 16 см. Часть образцов амниотической мембраны лиофилизируют и хранят в закрытом контейнере при комнатной температуре. Криоконсервированные образцы получают следующим образом: амнион помещают в среду содержащую эктрацеллюлярный криопротектор (DMEM и глицерин в соотношении 1:1) и хранят при -80°С. Криоконсервированные и лиофилизированные образцы хранят в течение одного месяца, при этом перед использованием криоконсервированные образцы размораживают при комнатной температуре, а лиофильно высушенные заливают изотоническим раствором для регидратации. Преимуществом данного способа является простота получения лиофильно высушенных образцов которые в дальнейшем могут использованы для получения гидрогелей амниотической мембраны. К недостаткам подобного способа можно отнести: 1)ухудшение структурной целостности криоконсервированных и лиофильно высушенных амнионов по сравнению с нативными образцами; так, например, гистологические препараты криоконсервированных амнионов характеризуются наличием плотно фиксированного на толстой базальной мембране слоя кубического эпителия с минимальной вакуолярной альтерацией, в то время как на препаратах лиофильно высушенного амниона вакуолярная альтерация (внутриклеточный отек) выражена в большей степени, при этом слой кубических эпителиальных клеток сохранен, однако наблюдается его стратификация наряду с бесклеточными участками, для стромы лиофильно высушенных препаратов амнион характерен эдематоз; 2) ухудшение биохимических свойств - в частности показано, что содержание тотального белка в экстрактах лиофильно высушенных препаратов амниона достоверно ниже, чем у нативных образцов, кроме того, содержание ростовых факторов bFGF и KGF у обработанных образцов амниона ниже по сравнению с нативными. Интересно, что уровень эпидермального фактора роста в лиофильно высушенных и криоконсервированных препаратах выше, чем у экстрактов нативного амниона; это объясняется тем, что этот фактор может выделяться в раствор при разрушении эпителиальных клеток; 3) препараты лиофильно высушенной амниотической мембраны содержат патологически измененные ядра клеток с вакуолярной альтерацией, потенциально способные индуцировать реакцию «трансплантат против хозяина».
Известен способ получения экстракта амниотической мембраны для лечения щелочных ожогов роговицы у кроликов [Мальцев Д.С., Рудько А.С., Куликов А.Н., Черныш В.Ф. Влияние экстракта амниотической мембраны на эпителизацию и неоваскуляризацию в моделях повреждения роговицы // ТМЖ. 2018. №2 (72)]. В соответствии с этим способом экстраплацентарные оболочки получают через 4 часа после кесарева сечения, аккуратно отделяют амнион от хориона в стерильных условиях и трижды промывают раствором Хэнкса. Амниотическую мембрану массой 5 г измельчают до фрагментов размером 2-3 мм. Измельченную массу смешивают с кварцевым песком (размер частиц 0,1 мм) и гомогенизируют ручным способом с использованием ступки и пестика. Далее эмульсию амниотической мембраны суспенидируют в физиологическом растворе (20 мл) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, не содержащую визуально различимых частиц, отделяют от осадка и фильтруют через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Затем аликвоты отфильтрованного экстракта разливают в одноразовые флаконы-капельницы в стерильных условиях и хранят до использования при -20°С. Моделирование щелочных ожогов роговицы и лимба (площадь 50%, сектор ожога 180°С) проводят на половозрелых кроликах весом 2,5-3 кг, при этом щелочные ожоги роговицы и лимба наносят путем нанесения на поверхность роговицы аппликаторов изготовленных из фильтровальной бумаги, пропитанных 1,0N раствором NaOH. При этом время аппликации для обоих глаз составляет 1 мин. Далее проводят инсталляцию в опытный глаз экстракта амниотической мембраны 4 раза в сутки в течение 30 суток, в контрольный - 0,4% раствора гентамицина. В ходе наблюдения регулярно оценивают площадь эпителизации и неоваскуляризации роговицы, при этом результаты регистрируют на 1, 3, 7, 21 и 30-е сутки после ожога при окрашивании глазной поверхности 1% флюоресцеином натрия. Преимуществом данного способа является увеличение зоны эпителизации обожженной стромы роговицы при использовании экстракта амниотической мембраны, при этом полную эпителизацию роговицы отмечают на 30-е сутки после создания щелочного ожога с сохранением эпителиопатии. Недостатком данного способа является непрактичность использования частиц кварцевого песка для гомогенизации амниотической мембраны, которые требуют тщательного удаления, и, кроме того, отмечается сохранение эпителиопатии на 30-е сутки после инсталляции в пораженный глаз экстракта амниотической мембраны.
2
Известен способ покрытия полнослойных ран в нижней трети носа с использованием бесклеточной амниотической мембраны [Xue SL, Liu К, Parolini О, Wang Y, Deng L, Huang YC. Human acellular amniotic membrane implantation for lower third nasal reconstruction: a promising therapy to promote wound healing. Burns Trauma. 2018; 6: 34].. Сначала при получении плацент от рожениц с информированным согласием выделяют амниотическую мембрану, которую несколько раз промывают стерильной водой. Далее проводят серологический скрининг для выявления ВИЧ 1, сифилиса, гепатита В и С. Свежую амниотическую мембрану погружают в раствор метанола и хлороформа, промывают стерильной дистиллированной водой и перфузируют додецилсульфатом натрия в дистиллированной воде в течение как минимум 5 часов. Далее погружают амнион в 0,25% трипсин на 6 часов и затем промывают физиологическим раствором. После амнион высушивают в сухом виде под вакуумом, нарезают на фрагменты 1 см, упаковывают в герметичный пассаж и стерилизуют гамма-излучением. Бесклеточный препарат амниотической мембраны хранят при комнатной температуре и изымают перед началом операции. При этом перед операцией пациент получает местную анестезию с помощью 0,1% лидокаина в положении супинации, затем поверхность раны разрезают скальпелем 15 с целью создания доступа к подкожным тканям, и с использованием влажной марли проводят гемостаз. При этом в опытной группе бесклеточный препарат амниотической мембраны сначала нарезают на кусочки (2*2 мм), накладывают на дно и стенку дефекта, после чего рану закрывают вазелиновой марлевой повязкой и сверху накладывают сухую повязку. В контрольной группе раневую поверхность закрывают без разрезания с использованием вазелиновой марлевой повязки и далее накладывают сухую марлю. Повязку меняют через день после операции и далее проводят замену каждые два дня до образования струпа. Преимуществом данного способа является снижение времени установления гемостаза при закрытии раневой поверхности с использованием децеллюляризированного лоскута амниотической мембраны. Дополнительно, бесклеточная амниотическая мембрана способствует исчезновению болевого синдрома после операции. Кроме того, при сравнении с контрольной группой, децеллюляризированная амниотическая мембрана ускоряет образование (4,75 суток) и сход струпа (6,70 суток) в постоперационном периоде. Закрытие глубокой раны с использованием децеллюляризированного препарата амниотической мембраны приводит к снижению возникновения кровотечений, инфицирования и образования рубцовой ткани. К недостаткам данного способа можно отнести использование высокотоксичных агентов (метанол и хлороформ), потенциально способных разрушить структуру амниотической мембраны, вызывающих ее расслоение и вакуолярную альтерацию клеток амниона. Кроме того погружение амниотической мембраны в раствор 0,25% трипсина приводит к ее разрушению, заметному даже на макроскопическом уровне, и к драматическому ухудшению механических свойств, что обусловливает разрыв мембраны при ее ушивании к раневой поверхности.
2
2
2
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ применения порошка и гидрогеля амниотической мембраны для лечения полнослойных кожных ран у свиней [S.S. Murphy., A. Nelson, R. Sunnon, A. Atala. Amnion Membrane Hydrogel and Amnion Membrane Powder Accelerate Wound Healing in a Full Thickness Porcine Skin Wound Model. STEM CELLS Translational Medicine. (2019)]. С целью получения порошка амниотической мембраны плаценту сначала отмывают физраствором от кровяных сгустков, затем амниотическую отделяют от хориона ножницами или пинцетом, далее амнион нарезают на участки 5*5 см, после чего 5 раз промывают 0,9% NaCl и затем один раз - стерильной очищенной бидистиллированной водой. Далее амнион помещают в конические пробирки и замораживают на -80°. Замороженную ткань затем переносят в стеклянные флаконы для лиофильной сушки и лиофилизируют, полученный при этом лиофилизат далее подвергают измельчению до тонкодисперсной пудры с помощью криомельницы. Далее полученную пудру разносят в стерильные флаконы из боросиликатного стекла и стерилизуют гамма-излучением в дозе 10-12 кГр, после стерилизации порошок амниотической мембраны хранят на -80°С. При этом гидрогель был получен следующим образом: 220 мг стерильного порошкообразного амниона и 22 мг пепсина добавляют в 15 мл пробирку, далее растворяют в 10 мл 0,01 н. соляной кислоты. Кислый гидролиз матрикса амниона проводят в течение двух суток при 37°С. Далее переваренный продукт центрифугируют при 4500 об./мин в течение 10 минут. После чего супернатант удаляют и переносят в новую 15 мл пробирку. Раствор нейтрализуют NaOH до рН=7. Далее используют набор для получения гидрогеля из тиол-модифицированного гиалуронана, желатина и гепарина, при этом смешивают Heprasil (натриевая соль гиалуроновой кислоты, содержащая тиол-функциональную группу с добавлением тиол модифицированного гепарина), Gelin-S (желатин с тиольной группой) и кросс-сшивающий агент Extralink (полиэтиленгликольдиакрилат) в соотношении 2:2:1, после чего смешивают гидрогель с раствором переваренной амниотической мембраны в соотношении 1:1. Формирование гидрогеля индуцируют при облучении источником УФ (длина волны 365 нм, мощность 18 Вт/см) на расстоянии 3 см от образца до источника. С целью моделирования полнослойных кожных ран используют шестерых йоркширских свиней, свободных от видоспецифических патогенов, которые проходят карантин в течение 2 недель. Далее животных наркотизиуруют кетамином, ксилазином и ацепромазином, при этом наркоз поддерживают ингаляцией изофлюрана. Далее животных бреют в области спины, фиксируют и размещают в дорсальной позиции. Расчерчивают 8 квадратов в дорсальной области площадью 4*4 см каждый с целью четкого обозначения границ раны. Кожу промывают мыльной водой и дезинфицируют β-йодином и 70% спиртом. В областях спины, груди и поясницы делают полнослойные разрезы кожи вплоть до поперечно-полосатой мускулатуры подкожной клетчатки, с удалением всех вышележащих слоев кожи. Далее распределяют животных на 6 экспериментальных групп: гидрогель амниотической мембраны, порошок, фотополимеризующийся гидрогель, GraftJacket (децеллюлялизированный лоскут кожи человека), AmnioGraft (криоконсервированный листок амниотической мембраны) и контроль (стандартное наложение на рану повязки). Наблюдение за животными проводят в течение 28 дней, при этом в ходе наблюдения два раза в неделю регистрируют площадь раны и реэпителизацию. Животных выводят из эксперимента введением летальной дозы пентобарбитала внутривенно, изымают кожу в местах наложения покрытий. Закрытие ран и эпителизацию измеряют на дни 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 и 28 путем обработки изображений в ImageJ, при которой площадь открытой раны и эпителизация выражаются цветом и текстурой залечивающейся раны. Уменьшение площади раневой поверхности (контракция) выражают как относительное значение начальной площади, ограниченной расчерченным квадратом (до создания раны) против площади квадрата в день наблюдения. К преимуществам данного способа относится эффективность применения гидрогеля и порошка из амниотической мембраны в закрытии полнослойных кожных ран у группы с имплантированным гидрогелем из амниотической мембраны характеризовалась самой маленькой площадью раневой поверхности и значительным улучшением регенерации по сравнению с группой с имплантированным фотополимеризуемым гидрогелем, заметным на 11 день (44,7% против 80,9%), 14 (25.3% против 49.5%) и 18 сутки (15.0% vs. 34.5%; р<.05), в то время как у группы с имплантированным подкожно порошком амниона площадь раны была наименьшей после гидрогеля, и значительно ниже по сравнению контроля с наложением повязки на 18 (22.5% против 32.4%) и 24 сутки (3.6% против 14.1%; р<.05). Недостатком данного способа относится неспособность гидрогеля из амниотической мембраны к самостоятельному желированию из-за низкого содержания коллагена I типа [, J., Ahearne, М. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Sci Rep 9, 14933 (2019)], что тем самым обусловливает необходимость использования вспомогательного гидрогеля из тиол-модифицированных гиалуроната натрия, гепарина и желатина с добавлением полиэтиленгликольдиакриалата (PEGDA) в качестве сшивающего агента; использование же вспомогательного гидрогеля для лечения полнослойных кожных ран не приводит к значимому уменьшению площади раневой поверхности по сравнению с обычной повязкой. Кроме того, продукты распада соединений содержащих акрильную группу токсичны, акриламид обладает канцерогенным действием, поэтому биоматериалы на основе акриламида (биочернила, гидрогели) не имеют перспектив для клинического применения.
Техническим результатом предлагаемого нами способа является получение бесклеточного матрикса амниотической мембраны для последующей реконструкции дефектов тканей вследствие термических, химических и радиационных ожогов, язв и др., в качестве покрытия с сохранными структурными компонентами внеклеточного матрикса не вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации с целью заживления пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани.
2
2
2
Указанный технический результат достигается тем, что донорскую плаценту переносят в ламинарно-потоковый шкаф биологической II класса биологической опасности, отделяют внутреннюю плодную амниотическую оболочку от хориона, при этом из одной плаценты выделяют примерно 300 см амниотической мембраны, после чего выделенные фрагменты амниона площадью 50 см тщательно отмывают от крови в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 250 ЕД./мл пенициллина и 250 мкг/мл стрептомицина троекратно в течение суток, через каждые 3 часа проводят замену раствора; затем выделенные фрагменты амниотической мембраны площадью 50 см подвергают детергентно-ферментативной децеллюляризации, используя при этом: (1) 0,5% дезоксихолат натрия + 0,5% TritonX100 - 24 ч, 400 об/мин; (2) 0,05% Трипсин-ЭДТА - 1 ч, 200 об/мин; (3) DMEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина - 24 ч, 400 об/мин; (4) 300 ЕД/мл ДНКазы I, 40 mM Tris-HCl, 10 тМ MgCl2, 10 тМ NaCl - 16 ч, 400 об/мин; (5) PBS, 1% пенициллина-стрептомицина - 48 ч, 400 об/мин, после чего матрикс анализируют на наличие/отсутствие ядер клеток или теней ядер, сохранность основных компонентов внеклеточного матрикса (коллаген, ламинин, фибронектин) и уровень остаточной геномной ДНК.
Режим предлагаемого способа основан на анализе результатов наблюдений за 10 лабораторными животными, которым имплантировали в брюшную область бесклеточных матрикс амниотической мембраны.
Описание предлагаемого способа
2
2
Для получения бесклеточных матриксов амниотической мембраны получали плаценту от роженицы с информированным согласием, прошедшей скрининг на ВИЧ, гепатит и сифилис. Далее плаценту переносили в ламинарно-потоковый шкаф биологической II класса биологической опасности, отделяли внутреннюю плодную амниотическую оболочку от хориона. Бесклеточный матрикс амниотической мембраны, полученный детергентно-ферментативным методом децеллюляризации, включающий такие этапы как (1) 0,5% дезоксихолат натрия + 0,5% TritonX100 - 24 ч, 400 об/мин; (2) 0,05% Трипсин-ЭДТА - 1 ч, 200 об/мин; (3) DMEM, 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина - 24 ч, 400 об/мин; (4) 300 ЕД/мл ДНКазы I, 40 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl, 10 тМ NaCl - 16 ч, 400 об/мин; (5) PBS, 1% пенициллина-стрептомицина - 48 ч, 400 об/мин, был проанализирован на наличие /отсутствие ядер клеток или теней ядер, сохранность основных компонентов внеклеточного матрикса (коллаген I типа, ламинин, фибронектин, окрашивание фиксированных срезов тканевого матрикса DAPI) и уровень остаточной геномной ДНК. Далее матрикс имплантировали в брюшную область крысы Wistar, при этом студенистый препарат децеллюляризированной амниотической мембраны 1*1 см имплантируют подкожно внутрибрюшинно, закрепив ниткой 7-0 к стенке брюшной полости. Наблюдение за лабораторными животными проводили в течение трех месяцев. У лабораторных животных не наблюдали вызывающего воспалительного фиброза и макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации в месте имплантации, отмечалось заживление пораженной поверхности за счет повышения репаративных и иммунных процессов, восстановления трофики, ремоделирования фиброзной, соединительной ткани. При гистологическом анализе участка брюшной стенки с закрепленным на ней амнионом обнаруживали фрагмент поперечно-полосатой мышечной ткани с окружающей жировой клетчаткой, наличием небольшого линейной формы участка слабовыраженного фиброза без воспалительной реакции, а также остатками шовного материла с перифокальной лимфоцитарной инфильтрацией. При этом сами экстраплацентарные оболочки на гистологическом препарате не определяются. Для эксперимента выбраны 10 самцов крыс линии Wistar весом 120 г, имеющее ветеринарное свидетельство и прошедшее карантин.