УСТРОЙСТВО И СПОСОБ НА ОСНОВЕ ФОТОННЫХ СТРУКТУР ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ САЙТОВ, НАХОДЯЩИХСЯ В ПРЕДЕЛАХ ПИКСЕЛЯ
DEVICE AND METHOD BASED ON PHOTON STRUCTURES FOR USE IN OBTAINING LUMINESCENT IMAGES OF SITES WITHIN PIXEL

Ссылка на связанную заявку
[0001] Датой приоритета для данной заявки является 22.04.2016 (дата подачи предварительной патентной заявки США №62/326,568, имеющей то же название). Содержание указанной патентной заявки полностью включено в данное описание посредством ссылки.
Область техники
[0002] Изобретение относится к получению люминесцентных изображений. Уровень техники
[0003] Некоторые современные средства секвенирования, разработанные лидерами данной отрасли для определения последовательности нуклеотидов, такой как последовательность ДНК или РНК, основаны на различных химических технологиях "секвенирования методом синтеза" ("sequencing by synthesis, SBS). Секвенирование может использовать средства получения люминесцентных изображений, например систему флуоресцентной микроскопии, чтобы идентифицировать нуклеотиды или локализованные кластеры идентичных нуклеотидов по длине волны испускания их соответствующих флуоресцентных маркеров. Хотя некоторые разрабатываемые химические методы SBS могут требовать использования всего лишь одного красителя, в коммерческих системах обычно используется несколько (до четырех) флуоресцентных красителей с целью обеспечить уникальную идентификацию нуклеотидов в полинуклеотиде, таких как нуклеотиды А, Г, Ц и Т в ДНК.
Раскрытие изобретения
[0004] Варианты изобретения соответствуют устройствам и конфигурациям на основе фотонных структур для использования при получении люминесцентных изображений сайтов, находящихся в пределах пикселя, а также способам использования таких устройств и конфигураций.
[0005] Согласно одному аспекту изобретения предлагается устройство для использования при получении люминесцентных изображений. Устройство может содержать массив пикселей, формирующих изображения, и фотонную структуру, наложенную на этот массив. Устройство может содержать также массив элементов, находящийся на фотонной структуре. Первый элемент из указанного массива элементов может быть расположен над первым пикселем из указанного массива пикселей; второй элемент из указанного массива элементов может быть также расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого элемента. Внутри первого элемента или над ним может находиться первый люминофор, а внутри второго элемента или над ним может находиться второй люминофор. Устройство может дополнительно содержать источник излучения, сконфигурированный для генерирования в первый период времени первых фотонов, имеющих первую характеристику, и для генерирования во второй период времени, который может отличаться от первого периода, вторых фотонов, имеющих вторую характеристику, которая может отличаться от первой характеристики. Первый пиксель может селективно принимать в первый период времени люминесценцию, испускаемую первым люминофором под воздействием первых фотонов, и селективно принимать во второй период времени люминесценцию, испускаемую вторым люминофором под воздействием вторых фотонов.
[0006] Как вариант, первые фотоны, имеющие первую характеристику, создают в первый период времени внутри фотонной структуры первый резонансный паттерн, селективно возбуждающий первый люминофор относительно второго люминофора, а вторые фотоны, имеющие вторую характеристику, создают во второй период времени внутри фотонной структуры второй резонансный паттерн, селективно возбуждающий второй люминофор относительно первого люминофора.
[0007] Дополнительно или альтернативно, указанные массив пикселей, фотонная структура и массив элементов интегрированы в единую монолитную структуру.
[0008] Дополнительно или альтернативно, фотонная структура может содержать фотонный кристалл, фотонную сверхрешетку, массив микрополостей или массив плазмонных наноантенн.
[0009] Массив элементов может содержать также множество углублений. Первый элемент может содержать первое углубление, внутри которого находится первый люминофор, а второй элемент может содержать второе углубление, внутри которого находится второй люминофор. Альтернативно, массив элементов может содержать множество столбиков. Первый элемент может содержать первый столбик, на котором находится первый люминофор, а второй элемент может содержать второй столбик, на котором находится второй люминофор.
[0010] Дополнительно или альтернативно, первая и вторая характеристики могут быть выбраны независимо из группы, состоящей из длин волн, поляризаций и углов. Например, первая характеристика может включать первую линейную поляризацию, а вторая характеристика - вторую линейную поляризацию, которая отличается от первой линейной поляризации. Как вариант, первая линейная поляризация, по существу, ортогональна второй линейной поляризации, или же первая линейная поляризация развернута относительно второй линейной поляризации на угол, составляющий 15°-75°. Дополнительно или альтернативно, первая характеристика может включать первую длину волны, а вторая характеристика -вторую длину волны, отличную от первой длины волны.
[0011] В дополнение, источник излучения может содержать оптический компонент. Как вариант, устройство дополнительно содержит контроллер, связанный с оптическим компонентом и сконфигурированный с возможностью управлять этим компонентом с целью придания первой характеристики первым фотонам и придания второй характеристики вторым фотонам. Как вариант, оптический компонент содержит двулучепреломляющий материал и сконфигурирован с возможностью поворота плоскости поляризации первых фотонов, при получении первого управляющего сигнала контроллера, до первой линейной поляризации и с возможностью поворота плоскости поляризации вторых фотонов, при получении второго управляющего сигнала контроллера, до второй линейной поляризации.
[0012] Как вариант, первые и вторые фотоны облучают фотонную структуру, по существу, под одинаковым углом. Дополнительно или альтернативно, первые и вторые фотоны облучают фотонную структуру примерно под прямым углом к основной поверхности фотонной структуры. Как альтернатива, первые и вторые фотоны облучают фотонную структуру в направлении, примерно параллельном основной поверхности фотонной структуры.
[0013] Как вариант, второй элемент смещен в поперечном направлении относительно первого элемента.
[0014] Дополнительно или альтернативно, третий элемент из указанного массива элементов расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого и от второго элементов. Устройство, как вариант, может содержать также третий люминофор, находящийся внутри третьего элемента или над ним, а источник излучения может быть сконфигурирован для генерирования в третий период времени, который может отличаться от первого и второго периодов времени, третьих фотонов, имеющих третью характеристику, которая может отличаться от первой и второй характеристик. Как вариант, первый пиксель способен селективно принимать в третий период времени люминесценцию, испускаемую третьим люминофором под воздействием третьих фотонов. Дополнительно или альтернативно, четвертый элемент из указанного массива элементов расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого, второго и третьего элементов. Как вариант, устройство дополнительно содержит четвертый люминофор, находящийся внутри четвертого элемента или над ним, а источник излучения сконфигурирован для генерирования в четвертый период времени, отличный от первого, второго и третьего периодов, четвертых фотонов, имеющих четвертую характеристику, отличную от первой, второй и третьей характеристик. Первый пиксель, как вариант, способен селективно принимать в четвертый период времени люминесценцию, испускаемую четвертым люминофором под воздействием четвертых фотонов. Как вариант, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор связан со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор связан с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор связан с четвертой нуклеиновой кислотой.
[0015] Дополнительно или альтернативно, третий элемент из указанного массива элементов расположен над вторым пикселем из указанного массива пикселей, а четвертый элемент из указанного массива элементов также расположен над вторым пикселем и пространственно отделен от третьего элемента. Устройство, как вариант, дополнительно содержит третий люминофор, находящийся внутри третьего элемента или над ним, а четвертый люминофор находится внутри четвертого элемента или над ним. Как вариант, второй пиксель способен селективно принимать люминесценцию, испускаемую третьим люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени. Как вариант, второй пиксель способен селективно принимать люминесценцию, испускаемую четвертым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени. Как вариант, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор связан со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор связан с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор связан с четвертой нуклеиновой кислотой.
[0016] Дополнительно или альтернативно, первый и второй элементы имеют, по существу, круглое поперечное сечение. Как вариант, фотонная структура может содержать гексагональную решетку, а пиксели, формирующие изображения, могут иметь прямоугольную форму.
[0017] Дополнительно или альтернативно, источник излучения сконфигурирован для сплошного равномерного облучения фотонной структуры первыми и вторыми фотонами. Дополнительно или альтернативно, источник излучения может содержать лазер. Как вариант первые и вторые фотоны имеют независимые длины волн в интервале 300-800 нм.
[0018] Как вариант, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, а второй люминофор связан со второй нуклеиновой кислотой. Дополнительно или альтернативно, устройство может содержать по меньшей мере один микрофлюидный элемент, находящийся в контакте с массивом элементов и сконфигурированный для подачи одного или более жидких аналитов к первому и второму элементам.
[0019] Дополнительно или альтернативно, первый люминофор связан с первым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию, а второй люминофор, как вариант, связан со вторым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию. Как вариант, первый полинуклеотид связан с первым элементом, а второй полинуклеотид связан со вторым элементом. Дополнительно или альтернативно, устройство дополнительно содержит первую полимеразу, добавляющую первую нуклеиновую кислоту к третьему полинуклеотиду, комплементарному первому полинуклеотиду и связанному с ним. Первая нуклеиновая кислота, как вариант, может быть связана с первым люминофором. Устройство, как вариант, дополнительно содержит вторую полимеразу, добавляющую вторую нуклеиновую кислоту к четвертому полинуклеотиду, комплементарному второму полинуклеотиду и связанному с ним. Вторая нуклеиновая кислота, как вариант, может быть связана со вторым люминофором. Как вариант, устройство может дополнительно содержать канал, по которому в или на первый и второй элементы поступает первая жидкость, содержащая первую и вторую нуклеиновые кислоты и первую и вторую полимеразы.
[0020] Согласно другому аспекту предлагается способ для использования при получении люминесцентных изображений. Способ может включать получение массива пикселей, формирующих изображения, и получение фотонной структуры, наложенной на указанный массив пикселей. Способ может дополнительно включать получение массива элементов, находящихся на фотонной структуре. Первый элемент из указанного массива элементов может быть расположен над первым пикселем из указанного массива пикселей, а второй элемент из указанного массива элементов может быть расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого элемента. Способ может дополнительно включать помещение первого люминофора внутрь первого элемента или над ним и помещение второго люминофора внутрь второго элемента или над ним. Способ может также включать генерирование в первый период времени, посредством источника излучения, первых фотонов, имеющих первую характеристику, и генерирование, посредством источника излучения во второй период времени, который может отличаться от первого периода, вторых фотонов, имеющих вторую характеристику, которая может отличаться от первой характеристики. Способ может дополнительно включать обеспечение в первый период времени селективного приема первым пикселем люминесценции, испускаемой первым люминофором под воздействием первых фотонов, и во второй период времени селективного приема первым пикселем люминесценции, испускаемой вторым люминофором под воздействием вторых фотонов.
[0021] Как вариант, первые фотоны, имеющие первую характеристику, генерируют в первый период времени внутри фотонной структуры первый резонансный паттерн, селективно возбуждающий первый люминофор относительно второго люминофора, а вторые фотоны, имеющие вторую характеристику, генерируют во второй период времени внутри фотонной структуры второй резонансный паттерн, селективно возбуждающий второй люминофор относительно первого люминофора.
[0022] Дополнительно или альтернативно, массив пикселей, формирующих изображения, фотонная структура и массив элементов интегрированы в единую монолитную структуру.
[0023] Дополнительно или альтернативно, фотонная структура может содержать фотонный кристалл, фотонную сверхрешетку, массив микрополостей или массив плазмонных наноантенн.
[0024] Массив элементов может также содержать множество углублений. Первый элемент может иметь первое углубление, внутри которого находится первый люминофор, а второй элемент - второе углубление, внутри которого находится второй люминофор. Альтернативно, массив элементов может содержать множество столбиков. Первый элемент может содержать первый столбик, на котором находится первый люминофор, а второй элемент - второй столбик, на котором находится второй люминофор.
[0025] Дополнительно или альтернативно, первая и вторая характеристики могут быть выбраны независимо из группы, состоящей из длин волн, поляризаций и углов. Например, первая характеристика может включать первую линейную поляризацию, а вторая характеристика - вторую линейную поляризацию, которая отличается от первой линейной поляризации. Как вариант, первая линейная поляризация может быть, по существу, ортогональной второй линейной поляризации или может быть развернута относительно второй линейной поляризации на угол, составляющий 15°-75°. Дополнительно или альтернативно, первая характеристика может включать первую длину волны, а вторая характеристика - вторую длину волны, отличную от первой длины волны.
[0026] Дополнительно или альтернативно, источник излучения может содержать оптический компонент, а способ, как вариант, дополнительно включает управление оптическим компонентом с целью придания первым фотонам первой характеристики, а вторым фотонам второй характеристики. Как вариант, оптический компонент содержит двулучепреломляющий материал, так что он способен поворачивать плоскость поляризации первых фотонов, при получении первого управляющего сигнала контроллера, до первой линейной поляризации и поворачивать плоскость поляризации вторых фотонов, при получении второго управляющего сигнала контроллера, до второй линейной поляризации.
[0027] Дополнительно или альтернативно, первые и вторые фотоны облучают фотонную структуру, по существу, под одинаковым углом. Как вариант, первые и вторые фотоны облучают фотонную структуру примерно под прямым углом к основной поверхности фотонной структуры или в направлении, примерно параллельном основной поверхности фотонной структуры.
[0028] Дополнительно или альтернативно, второй элемент смещен в поперечном направлении относительно первого элемента.
[0029] Дополнительно или альтернативно, третий элемент из указанного массива элементов находится на первом пикселе и пространственно отделен от первого и от второго элементов. Как вариант, способ дополнительно включает помещение третьего люминофора внутрь третьего элемента или над ним и генерирование в третий период времени, отличный от первого и второго периодов, третьих фотонов, имеющих третью характеристику, которая может отличаться от первой и второй характеристик. Способ, как вариант, может дополнительно включать селективный прием посредством первого пикселя в третий период времени люминесценции, испускаемой третьим люминофором под воздействием третьих фотонов. Как вариант, четвертый элемент из указанного массива элементов расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого, второго и третьего элементов. Как вариант, способ дополнительно включает помещение четвертого люминофора внутрь четвертого элемента или над ним и генерирование в четвертый период времени, который может отличаться от первого, второго и третьего периодов, четвертых фотонов, имеющих четвертую характеристику, отличную от первой, второй и третьей характеристик. Способ может также дополнительно включать селективный прием посредством первого пикселя люминесценции, испускаемой четвертым люминофором под воздействием четвертых фотонов в четвертый период времени. Как вариант, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой.
[0030] Дополнительно или альтернативно, третий элемент из указанного массива элементов может быть расположен над вторым пикселем из указанного массива пикселей, четвертый из указанного массива элементов также может быть расположен над вторым пикселем и пространственно отделен от третьего элемента. Способ дополнительно включает помещение третьего люминофора внутрь третьего элемента или над ним и помещение четвертого люминофора внутрь четвертого элемента или над ним. Как вариант, способ дополнительно включает селективный прием вторым пикселем люминесценции, испускаемой третьим люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени, а также селективный прием вторым пикселем люминесценции, испускаемой четвертым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени. Как вариант, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой.
[0031] Дополнительно или альтернативно, первый и второй элементы имеют, по существу, круглое поперечное сечение. Как вариант, фотонная структура может содержать гексагональную решетку, а пиксели, формирующие изображения, как вариант, имеют прямоугольную форму.
[0032] Дополнительно или альтернативно, способ может включать сплошное равномерное облучение фотонной структуры первыми и вторыми фотонами. Способ может также включать генерирование первых и вторых фотонов посредством лазера. Как вариант, первые и вторые фотоны имеют независимые длины волн в интервале 300-800 нм.
[0033] Дополнительно или альтернативно, первый люминофор связан с первой нуклеиновой кислотой, а второй люминофор связан со второй нуклеиновой кислотой. Как вариант, способ дополнительно включает использование по меньшей мере одного микрофлюидного элемента, который находится в контакте с массивом элементов, и подачу, посредством по меньшей мере одного микрофлюидного элемента, одного или более аналитов к первому и второму элементам.
[0034] Дополнительно или альтернативно, первый люминофор связан с первым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию, а второй люминофор - со вторым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию. Как вариант, первый полинуклеотид связан с первым элементом, а второй полинуклеотид связан со вторым элементом. Дополнительно или альтернативно, способ может включать добавление, посредством первой полимеразы, первой нуклеиновой кислоты, связанной с первым люминофором, к третьему полинуклеотиду, комплементарному первому полинуклеотиду и связанному с ним. Как вариант, способ дополнительно включает добавление, посредством второй полимеразы, второй нуклеиновой кислоты, связанной со вторым люминофором, к четвертому полинуклеотиду, комплементарному второму полинуклеотиду и связанному с ним. Как вариант, способ дополнительно включает подачу, посредством канала, первой жидкости, содержащей первую и вторую нуклеиновые кислоты и первую и вторую полимеразы в или на первый и второй элементы.
[0035] Согласно еще одному аспекту предлагается устройство для использования при получении люминесцентных изображений. Устройство может содержать массив пикселей, формирующих изображения, и фотонную структуру, наложенную на указанный массив пикселей. Устройство может дополнительно содержать массив элементов, находящийся на фотонной структуре. Первый из указанного массива элементов может быть расположен над первым пикселем из указанного массива пикселей, второй из указанного массива элементов также может быть расположен над первым пикселем и пространственно отделен от первого элемента. Фотонная структура может быть настроена для селективного облучения первого элемента светом, имеющим первую поляризацию, отличную от второй поляризации, и для селективного облучения второго элемента светом, имеющим вторую поляризацию.
[0036] Как вариант, устройство дополнительно содержит источник излучения, сконфигурированный для генерирования в первый период времени первых фотонов, имеющих первую поляризацию, и для генерирования во второй период времени вторых фотонов, имеющих вторую поляризацию.
[0037] Как вариант, устройство дополнительно содержит первый люминофор, находящийся внутри первого элемента или над ним, и второй люминофор, находящийся внутри второго элемента или над ним.
[0038] Дополнительно или альтернативно, устройство содержит первый целевой аналит, находящийся внутри первого элемента или над ним, и второй целевой аналит, находящийся внутри второго элемента или над ним, причем первый целевой аналит может отличаться от второго целевого аналита. Первый и второй целевые аналиты могут содержать нуклеиновые кислоты, имеющие различные нуклеиновые последовательности.
Краткое описание чертежей
[0039] На фиг. 1А схематично, в перспективном изображении, представлен пример устройства на основе фотонной структуры для использования при получении люминесцентных изображений сайтов в пределах пикселя.
[0040] На фиг. 1 В схематично, в перспективном изображении, представлен пример массива сайтов в составе комплекта устройств типа представленного на фиг. 1А, при этом каждый сайт соответствует отдельному пикселю.
[0041] На фиг. 1С пример устройства, представленного на фиг. 1А, схематично изображен в сечении.
[0042] Фиг. 2А схематично иллюстрирует, в перспективном изображении, пример возбуждения массива сайтов, проиллюстрированного на фиг. 1 В.
[0043] Фиг. 2 В схематично иллюстрирует смоделированный пример напряженности поля внутри комплекта устройств по фиг. 1А и 1С при их возбуждении способом, проиллюстрированным на фиг. 2А.
[0044] На фиг. 3А схематично, в перспективном изображении, представлен пример массива сайтов, в котором одному пикселю соответствует группа сайтов.
[0045] На фиг. 3 В схематично, в сечении, представлено устройство, в котором одному пикселю соответствует группа сайтов, как это показано на фиг. 3А.
[0046] Фиг. 4А схематично иллюстрирует, в перспективном изображении, пример возбуждения выбранных сайтов из массива сайтов, проиллюстрированного фиг. 3А, сканирующим сфокусированным пучком излучения.
[0047] Фиг. 4 В схематично иллюстрирует, в перспективном изображении, пример возбуждения выбранных сайтов из массива сайтов, проиллюстрированного фиг. 3А, посредством облучения несколькими лазерами.
[0048] Фиг. 5 схематично иллюстрируют пример фотонной структуры, пригодной для включения в предлагаемое устройство типа проиллюстрированного на фиг. 3А-3 В.
[0049] Фиг. 6A-6D схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри фотонной структуры, подобной проиллюстрированной на фиг. 5, создаваемых источником излучения, генерирующим фотоны, имеющие различные характеристики в различные периоды времени.
[0050] Фиг. 7А схематично иллюстрирует, на виде в плане, пример устройства типа проиллюстрированного на фиг. 3А-3 В, которое содержит первый и второй сайты (т.е. кластеры), соответствующие одному пикселю.
[0051] Фиг. 7 В схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств, подобных проиллюстрированным на фиг. 7А и 3А-3В и создаваемых источником излучения, генерирующим фотоны, которые имеют первую характеристику и селективно возбуждают первый сайт в первый период времени.
[0052] Фиг. 7С схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств, подобных проиллюстрированным на фиг. 7А и 3А-3В, создаваемых источником излучения, генерирующим фотоны, которые имеют вторую характеристику и селективно возбуждают второй сайт во второй период времени.
[0053] Фиг. 7D схематично иллюстрирует пример компонентов перекрестных помех, возникающих в результате селективного возбуждения первого и второго сайтов, проиллюстрированных соответственно на фиг.7В и 7С.
[0054] Фиг. 8А схематично иллюстрирует, на виде в плане, пример устройства на основе фотонной структуры типа показанного на фиг. 3А-3В и содержащего первый, второй и третий сайты (кластеры), соответствующие одному пикселю.
[0055] Фиг. 8 В схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств типа проиллюстрированного на фиг. 8А и 3А-3В для случая источника излучения, генерирующего в первый период времени фотоны, имеющие первую характеристику и селективно возбуждающие первый сайт.
[0056] Фиг. 8С схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройства типа проиллюстрированного на фиг. 8А и 3А-3В для случая источника излучения, генерирующего во второй период времени фотоны, имеющие вторую характеристику и селективно возбуждающие второй сайт.
[0057] Фиг. 8D схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств типа проиллюстрированного на фиг.8А и 3А-3В для случая источника излучения, генерирующего в третий период времени фотоны, имеющие третью характеристику и селективно возбуждающие третий сайт.
[0058] Фиг. 8Е схематично иллюстрирует пример компонентов перекрестных помех согласно некоторым вариантам в результате селективного возбуждения первого, второго и третьего сайтов, описанного выше и соответственно проиллюстрированного на фиг. 8B-8D.
[0059] На фиг. 9A-9D соответственно представлены схематичные примеры селективного возбуждения первого, второго, третьего и четвертого сайтов в составе комплекта устройств типа проиллюстрированных на фиг. 3А-3В и использующих источник излучения, генерирующий фотоны, имеющие различные характеристики в различные периоды времени.
[0060] На фиг. 10 приведена блок-схема примера способа для использования при получении люминесцентных изображений.
[0061] Фиг. 11 иллюстрирует пример последовательности операций, пригодной для использования при формировании предлагаемого устройства.
[0062] Фиг. 12 иллюстрирует другой пример последовательности операций, пригодной для использования при формировании предлагаемого устройства.
[0063] Фиг. 13 иллюстрирует пример предлагаемого устройства для использования при получении люминесцентных изображений.
Осуществление изобретения
[0064] Варианты изобретения относятся к устройствам на основе фотонных структур для использования при получении люминесцентных изображений сайтов, находящихся в пределах пикселя, и к способам использования таких устройств.
[0065] Сначала будут даны определения некоторых терминов, после чего будут описаны, в качестве примеров, варианты устройств и конфигураций на основе фотонных структур для использования при получении люминесцентных изображений, а также способы использования таких устройств.
[0066] Термин "фотонная структура" в контексте изобретения означает периодическую структуру, содержащую один или более оптически прозрачных материалов и селективно влияющую на распространение излучения, имеющего определенную характеристику, например в отношении длины волны, угла и поляризации. В частности, фотонная структура может селективно пропускать сквозь себя излучение с данной характеристикой, т.е. с определенным значением длины волны, угла и поляризации, и выводить излучение под тем же или иным углом. Кроме того, напряженность поля для такого излучения может иметь внутри фотонной структуры выбранный паттерн. В дополнение, структура может селективно запрещать распространение сквозь себя излучения, имеющего другую характеристику, т.е. другие длину волны, угол и/или поляризацию, или обеспечивать распространение излучения под другим углом за пределами структуры. Кроме того, такое излучение может иметь другой выбранный паттерн внутри фотонной структуры. Материал(ы) фотонной структуры может (могут) содержать элементы, распределенные в одном или более измерениях, т.е. в одном, в двух или в трех измерениях. Форма, размер и распределение элементов фотонной структуры, а также показатель преломления материала (материалов), могут быть подобраны так, чтобы задать определенные характеристики излучения (т.е. длину волны (длины волн), угол (углы) и/или поляризацию (поляризации)), которое может проходить, по существу, под тем же или иным углом через фотонный кристалл, и/или чтобы выбрать паттерн напряженности поля такого излучения внутри фотонной структуры. Примеры фотонных структур включают, не ограничиваясь ими, фотонные кристаллы, фотонные сверхрешетки, массивы микрополостей и массивы плазмонных наноантенн.
[0067] Термины "фотонный кристалл", "ФК", "фотонная решетка", "фотонная кристаллическая решетка" и "ФК решетка" означают фотонную структуру, содержащую один или более материалов, которые характеризуются изменениями показателя преломления с периодом порядка длины волны света. Например, фотонный кристалл может содержать материал, имеющий три измерения, т.е. длину, ширину и толщину. Материал может иметь две главные поверхности, каждая из которых лежит в плоскости, заданной длиной и шириной, и которые отделены одна от другой толщиной. Материалу может быть придан паттерн по двум или более измерениям, чтобы задать структуру фотонной запрещенной зоны, внутри которой излучение, имеющее определенные характеристики (т.е. длину волны (длины волн), угол (углы) и/или поляризацию), может проходить, по существу, под нормальным или иным углом через фотонный кристалл, и/или чтобы выбрать паттерн напряженности поля такого излучения внутри фотонного кристалла. Паттерн может содержать, например, множество элементов, таких как углубления или столбики, сформированных внутри материала с выходом из одной или обеих его главных поверхностей, так что материал отсутствует внутри или между элементами, т.е. внутри углублений или между столбиками. Пространство внутри или между элементами может быть заполнено одним или более дополнительными материалами, которые соответственно могут иметь различные показатели преломления, отличные от показателя преломления основного материала. Определенные характеристики излучения (т.е. длина волны (длины волн), угол (углы) и/или поляризация (поляризации)), которое проходит или не проходит, по существу, под нормальным или иным углом через фотонный кристалл, могут основываться на показателях преломления основного материала и любых дополнительных материалов, находящихся внутри элементов или между ними, а также на таких характеристиках элементов, как форма, размер и распределение элементов. При этом все элементы могут иметь одинаковые форму, размер и/или распределение.
[0068] Термины "фотонная сверхрешетка" и "ФК сверхрешетка" означают фотонную структуру, которая селективно влияет на распространение излучения, имеющего первую и вторую характеристики, т.е. первые и вторые длины волн, углы, или поляризации, в отличие от излучения, имеющего третьи характеристики, т.е. третьи длину волны, угол или поляризацию. Например, напряженность поля излучения, имеющего первые характеристики, может иметь первый паттерн, а напряженность поля излучения, имеющего вторые характеристики, может иметь второй паттерн, отличный от первого паттерна. Третья длина волны может занимать в электромагнитном спектре промежуточное положение между первой и второй длинами волн. Например, фотонная сверхрешетка может селективно пропускать сквозь себя излучения, имеющие первую и вторую характеристики, т.е. первые и вторые длины волн, углы или поляризации, с выходом излучения, по существу, под тем же или иным углом, причем паттерны напряженностей поля для излучений, имеющих первые и вторые характеристики, могут отличаться друг от друга. Альтернативно, фотонная сверхрешетка может селективно запрещать прохождение сквозь себя излучений, имеющих первые и вторые характеристики, т.е. первые и вторые длины волн, углы или поляризации, по существу, под нормальным или иным углом. Например, фотонная сверхрешетка может селективно пропускать сквозь себя излучение, имеющее третьи характеристики, (т.е. третью длину волны, угол или поляризацию), по существу, под нормальным или иным углом. Альтернативно, фотонная сверхрешетка может селективно запрещать распространение излучения через данную структуру, имеющего третьи характеристики (т.е. третью длину волны, угол или поляризацию), по существу, под нормальным или иным углом. Материал (материалы) может (могут) содержать элементы, которые распределены в одном или более измерениях, т.е. в одном, в двух или в трех измерениях. Форма, размеры и распределение элементов, а также показатель (показатели) преломления материала (материалов) можно подобрать так, чтобы задать определенные характеристики (т.е. длину волны (длины волн), угол (углы) или поляризацию (поляризации)) излучения, которое может проходить через фотонную сверхрешетку, по существу, под нормальным или иным углом, а также паттерны напряженности поля для таких характеристик, и чтобы выбрать определенные характеристики излучения, которое, по существу, не проходит сквозь фотонную сверхрешетку, по существу, под нормальным или иным углом.
[0069] В качестве примера, фотонная сверхрешетка может содержать материал, имеющий протяженность в трех измерениях, т.е. длину, ширину и толщину. Материал может иметь две главные поверхности, каждая из которых лежит в плоскости, заданной длиной и шириной, и которые отделены одна от другой толщиной.
Материалу может быть придан паттерн по двум или более измерениям, чтобы задать структуру фотонной запрещенной зоны, которая допускает распространение излучения, имеющего по меньшей мере первые и вторые характеристики (т.е. длины волн, углы или поляризации), с выходом из плоскости, заданной длиной и шириной, по существу, под нормальным или иным углом, и которая запрещает распространение по меньшей мере излучения, имеющего третьи характеристики (т.е. третьи длину волны, угол или поляризацию), с выходом из материала, по существу, под нормальным или иным углом. Паттерн может содержать, например, множество элементов, таких как углубления или столбики, сформированных внутри материала с выходом из одной или обеих главных поверхностей материала, так что материал отсутствует внутри или между элементами, т.е. внутри углублений или между столбиками. Пространство внутри или между элементами может быть заполнено одним или более дополнительными материалами, которые соответственно могут иметь различные показатели преломления, отличные от показателя преломления основного материала. Определенные характеристики излучения, которое проходит или не проходит, по существу, под нормальным или иным углом через фотонную сверхрешетку, могут основываться на показателях преломления основного материала и любых дополнительных материалов, находящихся внутри элементов или между ними, а также на таких характеристиках элементов, как форма, размер и распределение элементов. Некоторые элементы, как вариант, могут отличаться, по меньшей мере по одной характеристике, т.е. по форме, размеру или распределению, от других элементов. Другие подробности вариантов фотонной сверхрешетки, которые могут использоваться в предлагаемых устройствах и способах, можно найти в предварительной патентной заявке США №62/312,704 от 24.03.2016, озаглавленной "Photonic Superlattice-Based Devices and Compositions for Use in Luminescent Imaging, and Methods of Using the Same", содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[0070] "Массив микрополостей" представляет собой периодическую двумерную конфигурацию фотонных микрорезонаторов, поддерживающую несколько (т.е. по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) резонансов, которые можно возбуждать независимо один от другого путем изменения характеристики источника возбуждения, такой как длина волны, поляризация или угол, под которым распространяется излучение от источника возбуждения. Другие подробности в отношении массива микрополостей, который может использоваться в предлагаемых устройствах и способах, можно найти в статье Altug et al., "Polarization control and sensing with two-dimensional coupled photonic crystal microcavity array", Opt. Lett. 30: 1422-1428 (2011), содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[0071] "Массив плазмонных наноантенн" представляет собой периодическую двумерную конфигурацию плазмонных наноструктур, поддерживающую несколько (т.е. по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре) резонансов, которые можно возбуждать независимо один от другого путем изменения характеристики источника возбуждения, такой как длина волны, поляризация или угол, под которым распространяется излучение от источника излучения. Другие подробности в отношении плазмонных наноантенн, которые могут использоваться в предлагаемых устройствах и способах, можно найти в работе Regmi et al., "Nanoscale volume confinement and fluorescence enhancement with double nanohole aperture", Scientific Reports 5: 15852-1-5 (2015), содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[0072] Один или более материалов фотонной структуры могут представлять собой или включать "диэлектрический материал", т.е. текучую среду или твердый или полутвердый материал, которая (который) является оптически прозрачной (прозрачным) и электрическим изолятором. Примеры диэлектрических текучих сред включают газы, такие как воздух, азот и аргон, а также жидкости, такие как вода, а также водные и органические растворители. Примеры твердых диэлектрических материалов включают стекла (например неорганические, в частности силикатные, стекла или модифицированные, или специальные стекла) и полимеры (например акрилаты, полистирол, сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, TEFLON™, цикличные олефины, полиимиды, или найлон). Примеры полутвердых диэлектрических материалов включают гели, такие как гидрогели. Дополнительно или альтернативно, один или более материалов фотонной структуры могут представлять собой или содержать твердый полупроводниковый материал, который является оптически прозрачным.
[0073] Термин "гель" обозначает полутвердый или полужесткий материал, проницаемый для жидкостей и газов. В типичном варианте, гелевый материал может разбухать при поглощении жидкости и может сокращаться в размерах при удалении жидкости в результате сушки. Варианты гелей могут включать, не ограничиваясь ими, гели, имеющие коллоидную структуру (такие как агароза или гидрогель); смешанную полимерную структуру (такие как желатин) или поперечно сшитую полимерную структуру (такие как полиакриламид или насыщенная жирная кислота - см., например, заявку US 2011/0059865, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки), - или PAZAM (см., например, заявку US 2014/0079923, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки). Особенно полезный гелевый материал будет соответствовать форме углубления или другого вогнутого элемента, внутри которого он находится.
[0074] Термин "углубление" означает дискретный вогнутый элемент в материале, имеющий выходящее на поверхность отверстие, которое полностью окружено промежуточными участками. Углубление может характеризоваться такими параметрами, как размер (т.е. объем, диаметр и глубина) и форма поперечного сечения (т.е. круглая, эллиптическая треугольная, квадратная, многоугольная, звездообразная (с любым подходящим количеством вершин), нерегулярная), или представлять собой одно из концентричных углублений, разделенных диэлектрическим материалом. Углубления могут характеризоваться также распределением (т.е. пространственным расположением углублений внутри диэлектрического материала, включая регулярное (периодическое) расположение или нерегулярное расположение с апериодической локализацией). Поперечное сечение углубления может быть (хотя это и необязательно) однородным по его длине.
[0075] Термин "столбик" означает дискретный выпуклый элемент, выступающий из поверхности материала и полностью окруженный промежуточными участками поверхности. Столбик может характеризоваться такими параметрами, как размер (т.е. объем, диаметр и глубина) и форма поперечного сечения (т.е. круглая, эллиптическая, треугольная, квадратная, многоугольная, звездообразная (с любым подходящим количеством вершин), нерегулярная) или представлять собой один из концентричных столбиков, разделенных диэлектрическим материалом. Столбики могут характеризоваться также распределением (т.е. пространственным расположением столбиков, выступающих из поверхности диэлектрического материала, включая регулярное (периодическое) расположение или нерегулярное расположение с апериодической локализацией). Поперечное сечение столбика может быть (хотя это и необязательно) однородным по его длине.
[0076] Термин "поверхность" в контексте данного описания означает часть или слой материала, находящуюся (находящийся) в контакте с другим материалом.
[0077] Термин "промежуточный участок" означает участок внутри или на поверхности материала, который разделяет другие участки внутри или на поверхности материала. Например, промежуточный участок может отделять один элемент фотонной структуры от другого элемента этой структуры или один сайт из массива сайтов от других сайтов.
[0078] Термин "люминесцентный" означает "испускающий "холодное" излучение", а термин "люминофор" означает вещество, которое является люминесцентным. "Люминесцентное излучение" должно пониматься как отличающееся от теплового излучения, испускаемого материалом в результате его нагрева. В общем случае люминесценция возникает, когда источник энергии переводит электрон в атоме с его низшего (основного) энергетического состояния в возбужденное энергетическое состояние; затем электрон выделяет энергию в форме излучения, после чего он может вернуться в свое основное состояние. Особенно полезным является люминесцирующий объект, который испускает "холодное" излучение под действием энергии, обеспечиваемой возбуждающим излучением и который может именоваться, как "фотолюминесцентный объект". Примеры фотолюминесценции включают "флуоресценцию", соответствующую сравнительно быстрому испусканию излучения (менее чем через 1 мс после приема возбуждающего излучения), и "фосфоресценцию", соответствующую сравнительно медленному испусканию излучения (т.е. через 1 мс или более после приема возбуждающего излучения). Фотолюминесценция объекта может наблюдаться как излучение с длиной волны, отличной от длины волны излучения, облучающего объект. Другим полезным типом люминесцентного объекта является объект, испускающий "холодное" излучение при получении энергии посредством химической или биологической реакции. Такие объекты могут именоваться "хемилюминесцентными".
[0079] Согласно предлагаемому способу могут детектироваться сигналы многих типов, включая, например, оптический сигнал, соответствующий поглощению излучения, испусканию люминесценции, времени жизни люминесценции, поляризации люминесценции; рэлеевскому рассеянию и/или рассеянию Ми, и т.д. Примеры маркеров, которые могут детектироваться в предлагаемом способе, включают, не ограничиваясь ими, флуорофор, люминофор, хромофор, наночастицы (например золотые, серебряные, углеродные нанотрубки) и т.д.
[0080] Термин "элемент" означает в контексте данного описания изменение (вариацию) в структуре или композиции материала, например в его твердой основе. Как вариант, вариация в структуре или композиции материала является повторяющейся. Совокупность таких элементов может формировать определенную конфигурацию или решетку в или на материале. Примеры элементов включают, не ограничиваясь ими, углубления, столбики, перемычки, каналы, сайты, несущие аналиты, слои многослойного материала, участки в или на материале, имеющие химический состав, отличающийся от химического состава других участков в или на материале, и т.д. Элемент может характеризоваться такими параметрами, как размер (т.е. объем, диаметр и глубина) и форма поперечного сечения (т.е. круглая, эллиптическая, треугольная, квадратная, многоугольная, звездообразная (с любым подходящим количеством вершин), нерегулярная) или представлять собой одно из концентричных углублений, разделенных диэлектрическим материалом. Элемент может характеризоваться также распределением (т.е. пространственным расположением элементов, выступающих из поверхности диэлектрического материала, включая регулярное (периодическое) расположение или нерегулярное расположение с апериодической локализацией). Поперечное сечение элемента может (хотя это и необязательно) быть однородным по его длине..
[0081] Термин "сайт" означает локализацию в массиве конкретных видов молекул или клеток (или другого аналита). Сайт может содержать только одну молекулу (или клетку, или другой аналит) или популяцию из нескольких однородных молекул (или клеток, или аналитов). В некоторых вариантах сайты присутствуют на материале до прикрепления к ним конкретного аналита. В других вариантах сайт создается прикреплением молекулы или клетки (или другого аналита) к материалу. Сайты в составе массива в типичном случае дискретны. Дискретные сайты могут быть протяженными или отделенными друг от друга промежутками. Должно быть понятно, что сайт является разновидностью элемента. Элемент может функционировать как компонент решетки и/или массива.
[0082] Термин "массив" означает популяцию сайтов, которые можно отличать друг от друга по их относительной локализации.
[0083] Термин "шаг" в случае его применения в связи с элементами решетки (т.е. фотонной структуры) или массива характеризует расстояние между центрами смежных элементов решетки или массива. Паттерн элементов может характеризоваться в терминах среднего шага. Паттерн может быть упорядочен таким образом, чтобы коэффициент вариации относительно среднего шага был малым. Альтернативно, паттерн может быть случайным, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может быть, например, порядка длины волны света в одной или более областях спектра. Например, шаг может соответствовать длинам волн в видимом спектре (в интервале примерно 380-700 нм), в УФ спектре (в интервале от менее 380 нм до около 10 нм) и в ИК спектре (в интервале от более 700 нм до около 1 мм). В фотонной структуре элементы могут иметь различные шаги в различных направлениях. Например, в фотонной сверхрешетке элементы различных типов могут иметь различные шаги и паттерны. Так, шаг для элементов одного типа (например в первой решетке) может отличаться от шага для элементов другого типа (т.е. во второй решетке).
[0084] Термин "случайное" может использоваться применительно к пространственному распределению, т.е. к конфигурации локализаций на поверхности.
Например, один или более элементов (т.е. углублений или столбиков) фотонной структуры (в частности фотонной сверхрешетки) могут быть распределены случайным образом, так что смежные элементы (которые могут относиться к одному или к различным типам) расположены на различных расстояниях друг от друга. Альтернативно, расстояния между элементами одного или различных типов могут быть упорядочены, например, с формированием регулярного паттерна, такого как прямоугольная или гексагональная решетка.
[0085] Термин "нуклеотид" или "нуклеиновая кислота" означает молекулу, которая содержит сахар, по меньшей мере одну фосфатную группу и может содержать также нуклеиновое основание. Нуклеотид, не содержащий такого основания, может именоваться "абазическим". Нуклеотиды включают дезоксирибонуклеотиды, модифицированные дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные рибонуклеотиды, пептидные нуклеотиды, модифицированные пептидные нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды с углеводно-фосфатным скелетом и их смеси. Примерами нуклеотидов являются аденозинмонофосфат (АМФ), аденозиндифосфат (АДФ), аденозинтрифосфат (АТФ), тимидинмонофосфат (ТМФ), тимидиндифосфат (ТДФ), тимидинтрифосфат (ТТФ), цитидинмонофосфат (ЦМФ), цитидиндифосфат (ЦДФ), цитидинтрифосфат (ЦТФ), гуанозинмонофосфат (ГМФ), гуанозиндифосфат (ГДФ), гуанозинтрифосфат (ГТФ), уридинмонофосфат (УМФ), уридиндифосфат (УДФ), уридинтрифосфат (УТФ), дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксиаденозиндифосфат, дезоксиаденозинтрифосфат, дезокситимидинмонофосфат, дезокситимидиндифосфат, дезокситимидинтрифосфат, дезоксицитидиндифосфат, дезоксицитидинтрифосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезоксигуанозиндифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксиуридинмонофосфат, дезоксиуридиндифосфат, дезоксиуридинтрифосфат, обратимо блокированный аденозинтрифосфат, обратимо блокированный тимидинтрифосфат, обратимо блокированный цитидинтрифосфат и обратимо блокированный гуанозинтрифосфат.Сведения об обратимо блокированных нуклеотидтрифосфатах приведены в патентной заявке США №2013/0079232, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[0086] Термин "нуклеотид" или "нуклеиновая кислота" охватывает также любой аналог нуклеотида, который соответствует типу нуклеотида, содержащего модифицированные нуклеооснование, сахар и/или фосфат.Примерами модифицированных нуклеооснований, которые могут быть включены в полинуклеотид, имеющий регулярный скелет или аналогичную структуру, включают, инозин, ксатанин (xathanine), гипоксатанин (hypoxathanine), изоцитозин, изогуанин, 2-аденин, 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, 2-аминоаденин, 6-метиладенин, 6- метилгуанин, 2-пропилгуанин, 2-пропиладенин, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 2-тиоцитозин, 15-галоурацил, 15-галоцитозин, 5-пропинилурацил, 5-пропинилцитозин, 6-азоурацил, 6-азоцитозин, 6-азотимин, 5-урацил, 4-тиоурацил, 8-галоаденин или гуанин, 8-аминоаденин или гуанин, 8-тиоаденин или гуанин, 8-тиоалкиладенин или гуанин, 8-гидроксиаденин или гуанин, 5- галозамещенный урацил или цитозин, 7-метилгуанин, 7-метиладенин, 8-азагуанин, 8-азааденин, 7-деазагуанин, 7-деазааденин, 3-деазагуанин, 3-деазааденин и т.д. Как это известно специалистам, определенные аналоги нуклеотидов, например аденозин 5'-фосфосульфат, не могут быть встроены в полинуклеотид.
[0087] Термин "полинуклеотид" относится к молекуле, которая содержит последовательность нуклеотидов, химически связанных друг с другом. Примеры полинуклеотидов включают дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК) и их аналоги. Полинуклеотид может являться одноцепочечной последовательностью нуклеотидов, такой как РНК или одноцепочечная ДНК, двухцепочечной последовательностью нуклеотидов, такой как двухцепочечная ДНК, или содержать смесь одноцепочечных и двухцепочечных последовательностей нуклеотидов. Двухцепочечная ДНК (дцДНК) включает геномную ДНК, продукты полимеразной цепной реакции и амплификации. Одноцепочечная ДНК (оцДНК) может быть преобразована в дцДНК, и наоборот.Точная последовательность нуклеотидов в полинуклеотиде может быть известна или неизвестна. Примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена (например проба, праймер, экспрессируемая метка последовательности (expressed sequence tag (EST)) или метка сериального анализа экспрессии генов (serial analysis of gene expression (SAGE) tag), геномная ДНК, фрагмент геномной ДНК, экзон, интрон, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозим, сателлитная ДНК (сДНК), рекомбинантный полинуклеотид, синтетический полинуклеотид, разветвленный полинуклеотид, плазмида, вектор, изолированная ДНК с любой нуклеиновой последовательностью, изолированная РНК с любой нуклеиновой последовательностью, проба нуклеиновой кислоты, праймер или амплифицированная копия любого из приведенных примеров.
[0088] Выражение "химически связанные" означает соединение между первым и вторым компонентами. Согласно некоторым вариантам в условиях, в которых оно используется, такое соединение, как правило, является необратимым. В других вариантах такое соединение обратимо, но сохраняется по меньшей мере в течение периода времени, в котором оно используется при выполнении одной или более операций в способе анализа или подготовки к анализу (например аналитической операции определения секции полимера). Такое соединение может быть сформировано посредством химической связи, например ковалентной, водородной, ионной или диполь дипольной связи, лондоновских дисперсионных сил или любой приемлемой комбинации этих связей. Одним примером соединения, которое может эффективно использоваться для связывания первого компонента со вторым компонентом, являются ковалентные связи. Другие примеры включают олигонуклеотидные дуплексы, пептид-пептид взаимодействия и взаимодействия гаптен-антитело, например стрептавидин-биотин, стрептавидин-дестиобиотин и дигоксигенин-антидигоксигенин. В одном варианте соединение может быть сформировано путем гибридизации первого и второго полинуклеотидов, запрещающей отделение первого полинуклеотида от второго. Альтернативно, соединение может быть сформировано с использованием физических или биологических взаимодействий, например взаимодействия между первым и вторым протеинами, которое запрещает отделение первого протеина от второго. Термин "полимераза" означает в контексте описания фермент, имеющий активный сайт, который формирует полинуклеотиды путем полимеризации нуклеотидов в полинуклеотиды. Полимераза может связать матричную нить полинуклеотида-праймера и может последовательно добавлять нуклеотиды к растущему праймеру, чтобы сформировать полинуклеотид, имеющий последовательность, комплементарную матричной нити.
[0089] Термин "примерно" или "около" означает в данном описании "в пределах 10% от указанного значения".
[0090] Предлагаемые конфигурации и устройства содержат фотонные структуры, например обеспечивающие усиление сигнала от аналита (т.е. от ДНК кластеров) в форме люминесценции в одной или более спектральных полосах возбуждающего излучения и/или люминесценции, в том числе при нормальном падении возбуждающего излучения. Например, с целью уменьшения размеров ДНК-секвенаторов может использоваться интеграция фотонных и микрофлюидных чипов в монолитную структуру, расположенную поверх матричных приемников излучения на основе комплементарной структуры металл-оксид-полупроводник (КМОП). Производительность секвенирующих устройств на базе КМОП-структур может ограничиваться размерами пикселей, формирующих изображение. Например, пиксель с относительно крупными размерами может быть полезен для обеспечения достаточного уровня сигнала, получаемого от индивидуальных ДНК-молекул или кластеров идентичных молекул. Хотя пиксели могут быть уменьшены с целью повысить производительность, такое уменьшение может привести к уменьшению возможного количества углублений и к росту перекрестных помех между пикселями, что ухудшит отношение сигнал/шум при формировании изображений и секвенировании. Кроме того, такой подход может также повысить стоимость массива, формирующего изображения, например вследствие увеличения роста трудозатрат при изготовлении матричного приемника и его интегрировании в единую структуру с фотонными и/или микрофлюидными компонентами.
[0091] Альтернативный путь повышения производительности путем создания большего количества тестовых сайтов в одном устройстве может предусматривать использование группы люминесцентных сайтов (т.е. ДНК-кластеров, микроматричных реакционных камер и т.д.) в расчете на 1 пиксель. Например, в конкретных вариантах предлагаемых конфигураций, устройств и способов можно предусмотреть группу сайтов, каждый из которых может содержать соответствующий аналит, если использовать пиксель, формирующий изображение за счет селективного возбуждения различных сайтов в различные периоды времени посредством источника возбуждения, и получать соответствующее изображение в каждый такой период. Например, может быть предусмотрен массив пикселей, формирующих изображения, и группа сайтов может быть расположена на каждом таком пикселе. По сравнению с конфигурацией, в которой только один сайт находится на каждом конкретном пикселе, предлагаемая конфигурация с несколькими сайтами на одном пикселе может значительно увеличить количество сайтов, изображение которых можно получить с использованием такого массива пикселей. Однако, если бы все сайты, находящиеся на определенном пикселе, формирующем изображение, были возбуждены одновременно, пиксель принимал бы люминесценцию от каждого такого сайта одновременно, что ухудшило бы возможность отличать люминесценцию одного такого сайта от люминесценции другого аналогичного сайта, основываясь на электрическом сигнале, который генерирует пиксель, чувствительный к такой люминесценции.
[0092] Чтобы селективно возбуждать в заданный период времени только один из группы сайтов, находящихся на определенном пикселе, формирующем изображение, с целью получить электрический сигнал от этого пикселя, чувствительного к люминесценции именно этого сайта в указанный период, а затем возбудить второй из группы сайтов, находящихся над тем же пикселем во второй период времени с целью получить второй электрический сигнал от данного пикселя, чувствительного к люминесценции указанного второго сайта, и, благодаря этому, различить люминесцентные излучения, испущенные двумя сайтами, на основе электрических сигналов, полученных от указанного пикселя в два различных периода, можно использовать оптические методы, рассматриваемые далее. Предлагаемые конфигурации, устройства и способы обеспечивают возможность получения люминесцентных изображений большего количества сайтов, чем количество пикселей в массиве, формирующем изображения, т.е. превышающего количество пикселей в n раз, где n - целое число, превышающее 2, 3, 4 или 5.
[0093] Согласно изобретению различные сайты, находящиеся на пикселе, формирующем изображение, можно селективно возбуждать, селективно направляя на соответствующие сайты возбуждающие фотоны в различные периоды времени. Например, сфокусированный лазерный пучок может сканировать различные сайты в различные периоды времени с целью селективно возбуждать в эти периоды конкретные сайты. При этом пиксель будет генерировать в эти периоды электрические сигналы, обусловленные люминесценцией конкретного возбуждаемого сайта. В качестве другого примера, сайты могут облучаться в первый период времени любым подходящим количеством лазерных пучков, которые взаимодействуют друг с другом таким образом, чтобы сгенерировать первый паттерн оптической интенсивности, который селективно возбуждает один из сайтов в первый период времени. Во второй период времени сайты также могут облучаться любым подходящим количеством лазерных пучков, которые взаимодействуют друг с другом таким образом, чтобы сгенерировать второй паттерн оптической интенсивности, который селективно возбуждает другой сайт во второй период времени. Пиксель может генерировать в первый и второй периоды времени соответствующие электрические сигналы, обусловленные люминесценцией соответствующих сайтов. В качестве еще одного примера, сайты могут быть расположены над фотонной структурой, которая находится на пикселе, формирующем изображение, или внутри нее. Фотонная структура может быть сконфигурирована таким образом, чтобы селективно возбуждать один из сайтов, расположенных над пикселем, чувствительным к облучению фотонами, имеющими первую характеристику в первый период времени, и селективно возбуждать другой из сайтов, расположенных над пикселем, чувствительным к облучению фотонами, имеющими вторую характеристику, во второй период времени. Пиксель может генерировать в первый и второй периоды соответствующие электрические сигналы, обусловленные люминесценцией соответствующих сайтов.
[0094] Предлагаемые устройства, конфигурации и способы на основе фотонных структур совместимы с уже известными системами флуоресцентной и сканирующей микроскопии (в том числе с коммерчески доступными и применяемыми в платформах секвенирования, таких как выпускаемых фирмой Illumina, Inc. (США)), которые в некоторых ситуациях могут использовать различные флуоресцентные красители, возбуждаемые при нормальном падении излучения и формирующие изображения при нормальном падении в различных спектральных окнах. Такие красители могут быть связаны с нуклеотидами, чтобы облегчить секвенирование полинуклеотидов, например ДНК. Однако должно быть понятно, что предлагаемые устройства и конфигурации на основе фотонных структур, а также соответствующие способы могут эффективно использоваться при получении люминесцентных изображений любого типа или в любых других подходящих приложениях, а не только при секвенировании полинуклеотидов, например ДНК.
[0095] Формирование паттернов на диэлектрических подложках ранее было успешно использовано для управления размерами и однородностью полинуклеотидных кластеров и для увеличения плотности таких кластеров с целью повысить производительность секвенирования - см., например, патентную заявку США №2014/0243224 А1, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки. Однако уменьшение размеров кластера приводит к существенному снижению уровня флуоресцентного сигнала. Например, детектирование слабых флуоресцентных сигналов на различных длинах волн от крупных участков семплирования может становиться все более трудным по мере уменьшения количества маркированных нуклеотидов в ДНК-кластерах (вплоть до уровня отдельных молекул или до пределов разрешения систем, формирующих изображения). Поэтому значительное усиление сигнала флуоресценции может облегчить идентификацию нуклеотида и повысить производительность SBS-систем следующего поколения
2
5
[0096] Например, формирование периодических паттернов в материалах, таких как диэлектрики с высокими показателями преломления, вблизи биомолекул с флуоресцентными маркерами может усилить сигнал флуоресценции путем создания одно- или двумерных волноводов с варьированием показателя преломления с периодом порядка длины волны света. Такие волноводы, которые могут именоваться фотонными кристаллами (ФК), фотонными решетками, решетками фотонных кристаллов (ФК-решетками), способны поддерживать резонансные моды с высокой добротностью. Это может значительно усиливать флуоресцентные сигналы за счет резонансного усиления возбуждения флуорофора и/или принимаемой флуоресценции. Примеры усиления сигнала флуоресценции в единственном спектральном интервале за счет использования ФК-решетки приведены в следующих документах (содержание каждого из которых полностью включено в данное описание посредством ссылки): US 7768640; Estrada et al., "Small volume excitation and enhancement of dye fluorescence on a 2D photonic crystal surface", Opt. Express 18: 3693-3699 (2010); Zhen et al., "Enabling enhanced emission and low-threshold lasing of organic molecules using special Fano resonances of macroscopic photonic crystals", PNAS 110: 13711-13716 (2013); Kaji et al., "Fabrication of two-dimensional TaO photonic crystal slabs with ultra-low background emission toward highly sensitive fluorescence spectroscopy", Opt. Express 19: 1422-1428 (2011), и Pokhriyal et al., "Photonic crystal enhanced fluorescence using a quartz substrate to reduce limits of detection", Opt. Express 18: 24793-24808 (2010).
[0097] ФК-решетки могут использоваться также для усиления сигнала в случае флуоресценции в нескольких спектральных интервалах. Например, с использованием ФК было достигнуто усиление сигнала флуоресценции при двойном возбуждении благодаря резонансному усилению возбуждения на различных длинах волн, требующему регулировки угла падения излучения от источника возбуждения, чтобы добиться соответствия резонансам, поддерживаемым ФК. Дополнительные детали можно найти в патенте США №8344333, содержание которого полностью включено в данное описание посредством ссылки. Однако, поскольку схема усиления сигнала, описанного в данном патенте, функционирует в режиме транс-флуоресценции (trans-fluorescence mode) за счет регулировки углов облучения, такая схема неудобна для формирования изображений или для секвенирующих платформ, которые используют эпиосвещение в различных спектральных интервалах при фиксированном (т.е. нормальном или близким к нормальному) угле падения для всех интересующих длин волн.
1
2
1
2
[0098] На фиг. 1А представлено схематичное перспективное изображение примера устройства на основе фотонных структур для использования при получении люминесцентных изображений сайта в пределах пикселя. Устройство, проиллюстрированное на фиг. 1А, содержит пиксель, формирующий изображение, такой как датчик изображения на базе КМОП-структуры; фотонную структуру, такую как ФК слой, наложенный на данный пиксель, и нанояму, сформированную внутри третьего материала, наложенного на ФК слой. ФК слой может содержать первый материал (на фиг. 1А черный), имеющий показатель преломления n, и регулярные паттерны наноям, имеющих одинаковые форму и размеры, которые сформированы внутри первого материала и заполнены вторым материалом (на фиг. 1А белым), имеющим показатель преломления n, где n и n отличаются друг от друга. Внутри наноямы может находиться сайт, содержащий один или более люминофоров, т.е. один или более аналитов (один или более нуклеотидов), связанных с соответствующими люминофорами. В ближнем поле ФК слоя может (могут) находиться люминофор (люминофоры), возбуждение которого (которых) осуществляется имеющим подходящие характеристики оптическим излучением (т.е. фотонами), проиллюстрированным на фиг. 1А большой направленной вниз стрелкой. Формирующий изображение пиксель может быть соответствующим электронным образом связан с детекторным контуром (не проиллюстрирован), который может быть сконфигурирован для приема и анализа электрического сигнала, сформированногопикселем, формирующим изображение и чувствительным к люминесценции, сгенерированной люминофором (люминофорами). Хотя на фиг. 1А проиллюстрирован пиксель с размером каждой стороны 1,75 мкм, должно быть понятно, что могут использоваться пиксели, имеющие любые подходящие размеры.
[0099] Как вариант, может применяться комплект из любого подходящего количества таких устройств. В качестве примера, фиг. 1 В схематично, в перспективном изображении иллюстрирует пример массива сайтов, находящихся внутри комплекта устройств, подобных проиллюстрированному на фиг. 1А. При этом каждому из сайтов (обозначенных черными кружками) соответствует один из пикселей (обозначенных прямоугольниками). Другими словами, в примере комплекта, проиллюстрированного на фиг. 1 В, каждому пикселю соответствует один сайт. Дополнительно, каждое такое устройство может содержать любое количество материалов различных типов. Фиг. 1С схематично иллюстрирует, в сечении, пример устройства типа проиллюстрированного на фиг. 1А. В варианте устройства по фиг. 1А-1С ФК слой может быть нанесен на любой подходящий пиксель, формирующий изображение, например известный из уровня техники. ФК слой может содержать первый материал, такой как нитрид кремния (SiN), на котором сформирован паттерн с целью образовать фотонный кристалл. На ФК слой может быть нанесен второй материал, такой как оксид тантала (ТаО). В третьем материале, таком как SiN, может быть сформирована нанояма, и на нанояму может быть нанесен четвертый материал, такой как ТаО. Как показано на фиг. 1А-1С, на каждом пикселе, формирующем изображение, может находиться единственная нанояма. При таком выполнении каждый пиксель, формирующий изображение, может воспринимать люминесценцию от люминофора (люминофоров), находящегося (находящихся) внутри наноямы, расположенной над пикселем, и генерировать приемлемый электронный сигнал, соответствующий принятой люминесценции.
[00100] В качестве примера, фиг. 2А схематично иллюстрирует, в перспективном изображении, процесс возбуждения массива сайтов, показанного на фиг. 1 В. Массив сайтов может быть облучен, например, однородным (плоским) пучком излучения от единственного оптического источника, такого как лазер. Такое облучение может эффективно возбудить одну или более резонансных мод в ФК под такими сайтами (как это проиллюстрировано на фиг. 1А и 1С). Фиг. 2 В схематично иллюстрирует распределение электрического поля (внутри комплекта устройств типа проиллюстрированного на фиг. 1А и 1С), созданного в результате возбуждения типа проиллюстрированного на фиг. 2А. Элементы ФК могут быть настроены таким образом, чтобы обеспечить относительно высокую напряженность поля в зоне, расположенной прямо под наноямой 200, с обеспечением селективного возбуждения люминофора (люминофоров) на сайте, расположенном внутри этой наноямы.
2
2
2
[00101] Согласно изобретению количество сайтов может превышать количество пикселей в п раз, где n - целое число, большее 1. При этом различные сайты могут селективно возбуждаться в различные периоды времени. Например, на фиг. 3А представлено схематичное перспективное изображение примера предлагаемого массива сайтов, в котором одному пикселю соответствует группа сайтов. В неограничивающем примере по фиг.3А каждому пикселю (представленному в виде прямоугольника) соответствуют четыре сайта (представленных в виде кружков, имеющих различный вид). Однако должно быть понятно, что на один пиксель может приходиться любое подходящее количество сайтов, например 2 или более, 3 или более, 4 или более или 5 или более сайтов. Такие сайты можно сформировать, используя любые подходящие средства. В качестве примера, на фиг. 3 В схематично, в сечении, показано устройство, в котором одному пикселю соответствует группа сайтов, как это проиллюстрировано на фиг. 3А. В варианте устройства по фиг. 3А-3В на любой пиксель, формирующий изображение, может быть нанесена (как это известно из уровня техники) опционная фотонная структура. Опционный фотонный кристалл может содержать первый материал, такой как нитрид кремния (SiN), наложенный на пиксель, и второй материал, такой как диоксид кремния (SiO), наложенный на первый материал. Кроме того, фотонный кристалл содержит паттерн из третьего материала, такого как SiN, и из четвертого материала, такого как Si0. На слой ФК может быть нанесен пятый материал, такой как оксид тантала (ТаО). В шестом материале, таком как SiO, может быть сформировано несколько элементов, например несколько наноям, а на наноямы может быть, нанесен седьмой материал, такой как ТаО. Таким образом, как это показано на фиг.3А-3В, на каждом пикселе, формирующем изображение, можно сформировать группу элементов, в частности группу наноям. Каждый такой пиксель может принимать в различные периоды времени люминесценцию от люминофора (люминофоров), находящегося (находящихся) внутри каждого такого элемента или над ним (т.е. внутри каждой такой наноямы, расположенной над этим пикселем), и генерировать приемлемый электронный сигнал, соответствующий люминесценции, принятой в различные периоды времени. Как вариант, пиксель, формирующий изображение, опционная фотонная структура и элементы типа наноям могут быть интегрированы в единую монолитную структуру.
[00102] Должно быть понятно, что опционная фотонная структура, представленная на фиг. 3 В, не должна рассматриваться как ограничивающая изобретение. Например, эта структура может содержать фотонный кристалл или фотонную сверхрешетку, или массив микрополостей, или массив плазмонных наноантенн.
[00103] Для селективного возбуждения сайтов типа описанных со ссылками на фиг. 3А-3 В можно использовать любой подходящий метод. Например, фотонная структура может отсутствовать, и сайты над заданным пикселем можно селективно возбуждать, направляя на эти сайты фотоны. В частности, можно сканировать сфокусированным лазерным пучком различные сайты в различные периоды времени с целью селективно возбуждать в эти периоды различные сайты, и пиксель, чувствительный к люминесценции возбуждаемого конкретного сайта, будет генерировать в соответствующие периоды времени электрические сигналы. На фиг. 4А представлено схематичное перспективное изображение, иллюстрирующее вариант возбуждения, с использованием излучения сканирующего сфокусированного пучка, сайта, выбранного из массива сайтов, проиллюстрированного на фиг. 3А. Прецизионное управление пучками возбуждающего излучения может быть достигнуто использованием высокоточного направления пучка в свободном пространстве или путем манипулирования образцом, как это описано в статье Hahn et al., "Laser scanning lithography for surface micropatterning on hydrogels", Adv. Mater. 17: 2939-2942 (2005) или в статье Brakenhoff et al., "Confocal light scanning microscopy with high-aperture immersion lenses", J. Microsc. 117: 219-232 (1997). Содержание этих статей полностью включено в данное описание посредством ссылки.
[00104] В качестве другого примера, сайты могут быть облучены сначала любым подходящим количеством лазерных пучков, которые интерферируют друг с другом таким образом, чтобы сформировать первый паттерн интенсивности оптического излучения с целью селективно возбудить одну часть сайтов. Затем эти сайты могут быть облучены любым подходящим количеством лазерных пучков, которые интерферируют друг с другом таким образом, чтобы сформировать второй паттерн интенсивности оптического излучения с целью селективно возбудить другую часть сайтов. Пиксель, чувствительный к люминесценции соответствующих сайтов, может и в первый, и во второй периоды времени генерировать соответствующие электрические сигналы. На фиг. 4В представлено схематичное перспективное изображение, иллюстрирующее вариант возбуждения, с использованием излучения от группы лазеров, сайтов, выбранных из массива сайтов, проиллюстрированного на фиг. 3А. Селективное облучение сайтов может быть осуществлено посредством группы интерферирующих лазеров аналогично тому, как это описано в статье van Wolferen et al., "Laser interference lithography" в сборнике Lithography: Principles, Processes and Materials, pp.133-148, Theodore Hennessy, Ed., Nova Science Publishers, Inc. (2011), или в статье Не et al., "Polarization control in flexible interference lithography for nano-patterning of different photonic structures with optimized contrast", Optics Express 11518-11525 (May 4, 2015). Содержание этих статей полностью включено в данное описание посредством ссылки.
ФК
возбужд
[00105] В качестве еще одного примера, сайты могут быть сформированы на фотонной структуре, наложенной на пиксель, формирующий изображение, или внутри нее. Фотонная структура может быть сконфигурирована с возможностью в первый период времени селективно возбуждать один из находящихся над пикселем сайтов, чувствительный к облучению фотонами, имеющими первую характеристику, и селективно возбуждать во второй период времени другой находящийся над пикселем сайт, который чувствителен к облучению фотонами, имеющими вторую характеристику. Пиксель, чувствительный к люминесценции соответствующих сайтов, может генерировать в первый и второй периоды времени соответствующие электрические сигналы. Фиг. 5 схематично иллюстрирует пример фотонной структуры, которая может быть включена в предлагаемое устройство, такое как проиллюстрированное на фиг. 3А-3В. В варианте по фиг. 5 фотонная структура может содержать фотонный кристалл (ФК). Однако должно быть понятно, что эта структура может содержать фотонную сверхрешетку или массив микрополостей, или массив плазмонных наноантенн. Пример ФК, проиллюстрированный на фиг. 5, содержит заданную внутри материала гексагональную группу элементов, для которой расстояние ∧ между элементами имеет тот же порядок, что и длина волны λ. возбуждающего оптического излучения.
[00106] Фотонную структуру, т.е. ФК (конкретно, элементы ФК), можно подобрать таким образом, чтобы фотоны, имеющие различающиеся характеристики, могли селективно возбуждать различные резонансы внутри ФК. Конструктивные параметры фотонной структуры могут быть подобраны расчетным путем с целью подстроить резонансы к соответствующим желательным локализациям и/или к пикам возбуждения или испускания люминофоров. Для этой цели можно, например, использовать один или более из следующих методов: метод конечных разностей во временной области (Finite-Difference Time-Domain, FDTD), метод связанных волн (Rigorous Coupled-Wave Analysis, RCWA) и метод разложения плоской волны (Plane-Wave Expansion, PWE). Оптимизация конструктивных параметров может использовать мультипараметрические сканирования (multi-parameters sweeps) или алгоритмы самооптимизации, чтобы максимизировать люминесцентный (в общем случае флуоресцентный) сигнал в желательных физических областях и/или спектральных интервалах. Например, вычислительными методами можно определить показатели преломления материала (материалов) в составе фотонной структуры, пространственное положение участков, в которых желательно получить высокую напряженность поля, и длины волн, на которых желательно, чтобы фотонная структура селективно поддерживала резонансы. Кроме того, может быть использована любая подходящая комбинация методов FDTD, RCWA, PWE или любых других подходящих программ оптимизации с целью подобрать другие параметры структуры, такие как размеры, форма и распределение элементов внутри структуры, с целью исследовать диапазон параметров структуры и идентифицировать комбинации параметров, которые связывают спектральные и пространственные элементы структуры с желательным расположением люминофора и/или с длинами волны испускания или возбуждения.
2
5
2
[00107] Фиг. 6A-6D схематично иллюстрируют примеры моделирования напряженности поля внутри фотонного кристалла, такого как проиллюстрированный на фиг. 5, при облучении источником излучения, генерирующим в различные периоды времени фотоны, имеющие различные характеристики. Смоделированный фотонный кристалл содержит гексагональный набор воздушных отверстий в пленке из ТаO, расположенной поверх подложки из SiO. Более конкретно, фиг. 6А иллюстрирует смоделированные напряженности поля внутри фотонного кристалла по фиг. 5 для фотонов, имеющих в первый период времени первую поляризацию X (Х-пол.); фиг. 6 В иллюстрирует смоделированные напряженности поля внутри того же фотонного кристалла для фотонов, имеющих во второй период времени вторую поляризацию Y (Y-пол.); фиг. 6С иллюстрирует смоделированные напряженности поля внутри того же фотонного кристалла для фотонов, имеющих в третий период времени третью поляризацию RX (RX-пол.), а фиг. 6D иллюстрирует смоделированные напряженности поля внутри того же фотонного кристалла для фотонов, имеющих в четвертый период времени четвертую поляризацию RY (RY-пол.). Из фиг. 6A-6D следует, что, варьируя поляризацию фотонов, можно формировать различные паттерны напряженностей поля внутри фотонного кристалла. Должно быть понятно, что, варьируя другие характеристики фотонов, такие как длина волны или угол падения фотонов, также можно формировать различные паттерны напряженностей поля внутри фотонного кристалла. Аналогичным образом, т.е. правильно подбирая элементы фотонных структур и соответствующим образом варьируя характеристики фотонов, облучающих эти структуры в различные периоды времени, можно получить аналогичные различия в паттернах напряженностей поля для фотонных структур любых подходящих типов, таких как фотонные кристаллы, фотонные сверхрешетки, массивы микрополостей или массивы плазмонных наноантенн.
[00108] В некоторых вариантах предлагаемых устройств, конфигураций и способов могут использоваться сайты, содержащие люминофор, которые пространственно перекрываются с различными паттернами напряженности поля, формируемыми в различные периоды времени. Например, фиг. 7А схематично иллюстрирует, на виде в плане, пример устройства на основе предлагаемых фотонных структур типа проиллюстрированного на фиг. 3А-3В. Устройство содержит для каждого пикселя первый и второй сайты (т.е. кластеры). Устройство может содержать массив пикселей, формирующих изображение, фотонную структуру, наложенную на массив этих пикселей, и массив элементов, находящийся на фотонной структуре. Фотонная структура может, например, содержать фотонный кристалл, фотонную сверхрешетку, массив микрополостей или массив плазмонных наноантенн. Как вариант, массив пикселей, формирующих изображение, фотонная структура и массив элементов могут быть интегрированы в единую монолитную структуру. В одном неограничивающем примере фотонная структура может содержать гексагональную решетку, а пиксели, формирующие изображения, могут иметь прямоугольную форму.
[00109] Первый из массива элементов может находиться на первом пикселе из указанного массива пикселей. Второй из указанного массива элементов также может находиться на первом пикселе, будучи пространственно отделен от первого элемента. Так, в неограничивающем примере, проиллюстрированном на фиг. 7А, и первый элемент (обозначенный, как "Кластер 1"), и второй элемент (обозначенный, как "Кластер 2") находятся на одном и том же пикселе. Второй элемент может быть смещен в поперечном направлении относительно первого элемента, как это проиллюстрировано на фиг. 7А. В одном примере первый и второй элементы расположены соответственно в правом нижнем и в левом верхнем углах экранирующей свет металлической диафрагмы, позиционированной над пикселем. Первый люминофор может находиться внутри первого элемента или над ним, а второй люминофор - внутри второго элемента или над ним. Так, в некоторых вариантах массив элементов может содержать множество углублений; соответственно, первый элемент может содержать первое углубление, внутри которого находится первый люминофор, а второй элемент - второе углубление, внутри которого находится второй люминофор, подобно тому, как это проиллюстрировано на фиг. 3В. В других вариантах массив элементов может содержать множество столбиков; соответственно, первый элемент может содержать первый столбик, на котором находится первый люминофор, а второй элемент - второй столбик, на котором находится второй люминофор. Как вариант, и первый, и второй элементы (т.е. углубления или столбики) могут иметь, по существу, круглое поперечное сечение.
[00110] Устройство может содержать также источник излучения, сконфигурированный для генерирования в первый период времени первых фотонов, имеющих первую характеристику, и для генерирования во второй период времени, отличный от первого периода, вторых фотонов, имеющих вторую характеристику, отличную от первой характеристики. По контрасту с вариантами типа описанных выше со ссылкой на фиг. 4А-4В, источник излучения необязательно должен быть сконфигурирован так, чтобы селективно направлять излучение к различным сайтам в различные периоды времени. Вместо этого, в некоторых вариантах источник излучения может быть сконфигурирован для сплошного равномерного облучения фотонных структур первыми и вторыми фотонами в течение первого и второго периодов времени, а элементы фотонной структуры селективно могут направлять излучение на различные сайты. Дополнительно или альтернативно, источник излучения может содержать лазер. Как вариант, первые и вторые фотоны, испускаемые источником излучения, могут находиться в оптическом интервале спектра, т.е. первые и вторые фотоны имеют независимые длины волн в интервале 300-800 нм.
[00111] В некоторых вариантах фотонная структура может быть настроена для селективного облучения первого элемента светом, имеющим первую поляризацию, отличную от второй поляризации, и для селективного облучения второго элемента светом, имеющим вторую поляризацию, отличную от первой поляризации. Например, устройство может содержать первый люминофор, находящийся внутри первого элемента или над ним, и второй люминофор, находящийся внутри второго элемента или над ним. В качестве примера, устройство может содержать первый целевой аналит, находящийся внутри первого элемента или над ним, и второй целевой аналит, находящийся внутри второго элемента или над ним. При этом первый целевой аналит отличается от второго целевого аналита. Как вариант, первый и второй целевые аналиты могут содержать нуклеиновые кислоты, имеющие различные нуклеиновые последовательности.
[00112] В некоторых вариантах первый пиксель может селективно принимать люминесценцию, испускаемую первым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени, и селективно принимать люминесценцию, испускаемую вторым люминофором под воздействием вторых фотонов во второй период времени. Например, первые фотоны, имеющие первую характеристику, могут генерировать в первый период времени внутри фотонной структуры первый резонансный паттерн, который селективно возбуждает первый люминофор относительно второго люминофора. Фиг. 7В схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств типа рассмотренных в данном описании и проиллюстрированных фиг. 7А и 3А-3В применительно к источнику излучения, генерирующему фотоны, имеющие первую характеристику и селективно возбуждающие первый сайт в первый период времени. Можно видеть, что фотоны, имеющие первую характеристику, генерируют пространственный паттерн напряженностей поля, который является значительно более интенсивным на первом элементе, чем на втором элементе, и, следовательно, может селективно возбуждать в первый период времени первый люминофор относительно второго люминофора. При этом пиксель, формирующий изображение, может генерировать электрический сигнал в первый период времени, что, по существу, соответствует селективному возбуждению первого люминофора, находящегося внутри первого элемента или над ним. Дополнительно, вторые фотоны, имеющие вторую характеристику, могут генерировать во второй период времени внутри фотонной структуры второй резонансный паттерн, селективно возбуждающий второй люминофор относительно первого люминофора. Фиг. 7С схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств типа рассмотренных в данном описании и проиллюстрированных фиг. 7А и 3А-3В применительно к источнику излучения, генерирующему фотоны, имеющие вторую характеристику и селективно возбуждающие второй сайт во второй период времени. Можно видеть, что фотоны, имеющие вторую характеристику, генерируют пространственный паттерн напряженностей поля, который является значительно более интенсивным на втором элементе, чем на первом элементе, и, следовательно, может селективно возбуждать во второй период времени второй люминофор относительно первого люминофора. При этом пиксель, формирующий изображение, может генерировать электрический сигнал во второй период времени, что, по существу, соответствует селективному возбуждению второго люминофора, находящегося внутри второго элемента или над ним. Соответственно, два или более люминофоров, находящихся внутри зоны детектирования конкретного пикселя, можно отличить друг от друга, используя пространственные паттерны возбуждающего оптического излучения, подаваемого на люминофоры в различные периоды времени. Такая комбинация пространственного и временного разделения событий возбуждения позволяет пикселю различать два или более люминофоров внутри своей зоны детектирования.
[00113] Следует отметить, что, хотя в первый период времени первый люминофор можно селективно возбуждать относительно второго люминофора, как это проиллюстрировано на фиг. 7В, тем не менее, второй люминофор также может возбуждаться в первый период времени, но в меньшей степени, чем первый люминофор. Аналогично, хотя во второй период времени второй люминофор можно селективно возбуждать относительно первого люминофора, как это проиллюстрировано на фиг. 7С, тем не менее, первый люминофор может возбуждаться во второй период времени, но в меньшей степени, чем второй люминофор. Такое возбуждение второго люминофора в первый период времени и первого люминофора во второй период времени может именоваться "перекрестными помехами". Фиг. 7D схематично иллюстрирует пример компонентов перекрестных помех, возникающих в результате селективного возбуждения первого и второго сайтов (описанного выше), соответственно проиллюстрированного на фиг. 7В и 7С. Фотонная структура и/или соответствующие характеристики первых и вторых фотонов могут быть настроены с целью уменьшить перекрестные помехи до уровня, при котором излучения люминесценции первого и второго люминофоров могут быть отличены одно от другого.
[00114] В вариантах типа проиллюстрированных на фиг. 7В и 7С, первая и вторая характеристики первых и вторых фотонов могут быть выбраны независимо из группы, состоящей из длин волн, поляризаций и углов. Как пример, первая характеристика может включать первую линейную поляризацию, а вторая характеристика - вторую линейную поляризацию, которая отличается от первой линейной поляризации. Как вариант, первая линейная поляризация может быть, по существу, ортогональна второй линейной поляризации. В качестве примера, паттерн напряженностей поля, проиллюстрированный на фиг. 7В, который селективно возбуждает первый люминофор внутри первого элемента или над ним, сгенерирован с использованием фотонов, имеющих первую линейную поляризацию, такую как X-поляризация, а паттерн напряженностей поля, проиллюстрированный на фиг. 7С, который селективно возбуждает второй люминофор внутри второго элемента или над ним, сгенерирован с использованием фотонов, имеющих вторую линейную поляризацию, такую как Y-поляризация, которая, по существу, ортогональна первой линейной поляризации. Однако должно быть понятно, что фотоны в первый и второй периоды времени могут иметь любые подходящие поляризации. Например, чтобы сгенерировать другие паттерны напряженностей поля, как это было описано со ссылкой на фиг. 6A-6D, первая линейная поляризация может быть повернута относительно второй линейной поляризации на угол, составляющий 15°-75°. В качестве другого примера, оси поляризации могут быть повернуты на 30°, и могут использоваться соответствующие пучки (с поляризациями RX и RY). При этом должно быть понятно, что фотоны в первый и второй периоды времени могут иметь любые другие подходящие характеристики. Например, первая характеристика фотонов в первый период времени может включать первую длину волны, а вторая характеристика во второй период времени - вторую длину волны, отличную от первой длины волны.
[00115] Характеристиками первых и вторых фотонов, генерируемых в первый и второй периоды времени, можно управлять любым подходящим образом. Например, в некоторых вариантах источник излучения в составе устройства может содержать оптический компонент и контроллер, связанный с оптическим компонентом. Контроллер целесообразно сконфигурировать с возможностью управлять этим компонентом с целью придания первым фотонам первой характеристики и придания вторым фотонам второй характеристики. Например, в вариантах, где соответствующие характеристики фотонов включают поляризацию, оптический компонент может содержать двулучепреломляющий материал, сконфигурированный с возможностью поворота плоскости поляризации первых фотонов, при получении первого управляющего сигнала контроллера, до первой линейной поляризации и с возможностью поворота плоскости поляризации вторых фотонов, при получении второго управляющего сигнала контроллера, до второй линейной поляризации. В вариантах, в которых соответствующие характеристики фотонов включают длины волн, оптический компонент может содержать электронно-регулируемый фильтр, находящийся на траектории фотонов, который может регулироваться с целью управления длиной волны фотонов, падающих на фотонную структуру, в зависимости от управляющих сигналов контроллера. Альтернативно, данный компонент может представлять собой часть источника излучения, которая может регулироваться с целью управления длиной волны фотонов, генерируемых в заданный момент источником излучения в зависимости от управляющих сигналов контроллера. В вариантах, в которых соответствующие характеристики фотонов включают углы, оптический компонент может содержать оптический элемент, работающий на отражение или пропускание (т.е. зеркало и/или линзу), который может регулироваться с целью управления углом падения фотонов, падающих на фотонную структуру, в зависимости от управляющих сигналов контроллера. Должно быть понятно, что для селективного возбуждения заданного люминофора, наложенного на пиксель, относительно другого люминофора, наложенного на тот же пиксель, можно одновременно варьировать более одной характеристики фотонов. Например, можно регулировать любую подходящую комбинацию двух или более параметров из длин волн, углов и поляризаций фотонов.
[00116] В некоторых вариантах первые и вторые фотоны могут облучать фотонную структуру под любым подходящим углом. Например, первые и вторые фотоны могут облучать фотонную структуру, по существу, под одинаковым углом, в частности примерно под прямым углом к основной поверхности фотонной структуры или в направлении, примерно параллельном основной поверхности фотонной структуры.
[00117] Должно быть понятно, что в вариантах типа проиллюстрированных на фиг.7A-7D другие элементы массива элементов могут быть наложены на другие пиксели. Например, третий элемент из указанного массива элементов может быть расположен над вторым пикселем из массива пикселей, формирующих изображения, а четвертый элемент из того же массива элементов может быть также расположен над вторым пикселем и пространственно отделен от третьего элемента. Устройство может дополнительно содержать третий люминофор, находящийся внутри третьего элемента или над ним, и четвертый люминофор, находящийся внутри четвертого элемента или над ним. Второй пиксель может селективно принимать люминесценцию, испускаемую третьим люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени, например, если третий люминофор может возбуждаться первыми фотонами или вторыми фотонами. Второй пиксель может селективно принимать люминесценцию, испускаемую четвертым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени, например, если четвертый люминофор может возбуждаться первыми фотонами или вторыми фотонами.
[00118] Должно быть также понятно, что одному пикселю может соответствовать любое подходящее количество сайтов. Например, устройство типа показанного на фиг. 3А-3В и 7A-7D может, как вариант, дополнительно содержать третий элемент из указанного массива элементов, находящийся над первым пикселем и пространственно отделенный от первого и от второго элементов. Устройство может дополнительно содержать третий люминофор, находящийся внутри третьего элемента или над ним. Источник излучения может быть сконфигурирован для генерирования в третий период времени, отличный от первого и второго периодов, третьих фотонов, имеющих третью характеристику, отличную от первой и второй характеристик. Первый пиксель может селективно принимать в третий период времени люминесценцию, испускаемую третьим люминофором под воздействием третьих фотонов. Например, фиг. 8А схематично иллюстрирует, на виде в плане, пример устройства на основе фотонной структуры типа описанных выше и проиллюстрированного на фиг. 3А-3В.
Устройство содержит первый, второй и третий сайты (кластеры, изображенные в виде кружков), соответствующие одному пикселю. Подобно тому, как было описано выше со ссылкой на фиг. 6A-6D и 7А-7С, фотонная структура может облучаться в первый, второй и третий периоды фотонами, имеющим первую, вторую и третью характеристики, чтобы возбуждать в эти периоды соответственно первый, второй и третий люминофоры первого, второго и третьего сайтов.
[00119] Фиг. 8 В схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри комплекта устройств предлагаемого типа, проиллюстрированного фиг. 8А и 3А-3В для случая источника излучения, генерирующего в первый период времени фотоны, имеющие первую характеристику и селективно возбуждающие первый сайт. Фиг. 8С схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри такого же комплекта устройств для случая источника излучения, генерирующего во второй период времени фотоны, имеющие вторую характеристику и селективно возбуждающие второй сайт. Фиг. 8D схематично иллюстрирует пример смоделированных напряженностей поля внутри такого комплекта устройств в случае источника излучения, генерирующего в третий период времени фотоны, имеющие третью характеристику и селективно возбуждающие третий сайт. В качестве примера, первая характеристика может включать первую линейную поляризацию (т.е. Y-поляризацию), вторая характеристика может включать вторую линейную поляризацию (т.е. RY-поляризацию), а третья характеристика может включать третью линейную поляризацию (т.е. RX-поляризацию). Следует отметить, что одна или более из этих поляризаций могут быть (но необязательно должны быть) ортогональными одна другой. Например, RX- и RY-поляризации являются взаимно ортогональными и составляют с Y-поляризацией угол 15°-75°, например 45°. Таким образом, плоскость первой линейной поляризации может быть повернута относительно плоскости второй линейной поляризации на угол, составляющий 15°-75°, например, с целью генерировать различные паттерны напряженностей поля, как это было описано со ссылкой на фиг. 6A-6D. В качестве другого примера, плоскости поляризации могут быть совместно повернуты на 30°, так что могут использоваться результирующие поляризованные пучки (пучки с RX- и RY-поляризациями). Дополнительно следует отметить, что подобно тому, как было описано выше со ссылкой на фиг. 7D, селективное возбуждение первого сайта в первый период времени может также возбуждать, в меньшей степени, второй и/или третий сайты, селективное возбуждение второго сайта во второй период времени может также возбуждать первый и/или третий сайты и/или селективное возбуждение третьего сайта в третий период времени может также возбуждать первый и/или второй сайты. Фиг. 8Е схематично иллюстрирует пример компонентов перекрестных помех, возникающих согласно некоторым вариантам в результате селективного возбуждения первого, второго и третьего сайтов, описанного выше и соответственно проиллюстрированного фиг. 8B-8D. Фотонная структура и/или соответствующие характеристики первых и вторых фотонов могут быть настроены с целью уменьшения перекрестных помех до уровня, при котором люминесценцию первого и второго люминофоров можно достаточно легко отличить одну от другой.
[00120] Предлагаемые устройства могут дополнительно содержать даже большее количество сайтов, расположенных над каждым пикселем. Например, устройство, подобное описанному со ссылками на фиг. 3А-3 В и 8А-8Е, как вариант, может дополнительно содержать четвертый элемент из указанного массива элементов, находящийся на первом пикселе и пространственно отделенный от каждого из первого, второго и третьего элементов. Устройство может дополнительно содержать четвертый люминофор, находящийся внутри четвертого элемента или над ним. Источник излучения может быть сконфигурирован для генерирования в четвертый период времени, отличный от первого, второго и третьего периодов, четвертых фотонов, имеющих четвертую характеристику, отличную от первой, второй и третьей характеристик. Первый пиксель может селективно принимать люминесценцию, испускаемую четвертым люминофором под воздействием четвертых фотонов в четвертый период времени. На фиг. 9A-9D соответственно представлены схематичные примеры селективного возбуждения первого, второго, третьего и четвертого сайтов в составе комплекта устройств типа описанных выше, проиллюстрированных фиг. 3А-3В и использующих источник излучения, генерирующий фотоны, имеющие различные характеристики в различные периоды времени. Например, как это показано на фиг. 9А, в первый период времени фотонная структура может быть облучена фотонами, имеющими первую характеристику (т.е. первую поляризацию, такую как X-поляризация), чтобы селективно возбуждать первый сайт, находящийся на каждом пикселе. Далее, как показано на фиг. 9В, во второй период времени фотонная структура может быть облучена фотонами, имеющими вторую характеристику (т.е. вторую поляризацию, такую как XY-поляризация), чтобы селективно возбуждать второй сайт, находящийся на каждом пикселе. Далее, как это показано на фиг. 9С, в третий период времени фотонная структура может быть облучена фотонами, имеющими третью характеристику (т.е. третью поляризацию, такую как YX-поляризация), чтобы селективно возбуждать третий сайт, находящийся на каждом пикселе. Далее, как это показано на фиг. 9D, в четвертый период времени фотонная структура может быть облучена фотонами, имеющими четвертую характеристику (т.е. четвертую поляризацию, такую как Y-поляризация). Соответственно, пиксели могут генерировать в первый, второй, третий и четвертый периоды времени электрические сигналы, по которым первый, второй, третий и четвертый сайты, находящиеся на этих пикселях, могут быть отличены одни от других.
1
2
3
4
1
2
1
[00121] Предлагаемые устройства, конфигурации и способы могут эффективно использоваться с целью генерирования люминесцентных изображений при осуществлении секвенирования методом SBS для усиления сигнала флуоресценции в условиях освещения при нормальном падении. Например, устройство может дополнительно содержать по меньшей мере один микрофлюидный элемент, находящийся в контакте с массивом элементов и сконфигурированный для подачи одного или более жидких аналитов к первому и второму элементам. Дополнительно или альтернативно, предлагаемые конфигурации, устройства и способы могут повысить эффективность возбуждения любого подходящего количества люминофоров при использовании любого подходящего количества длин волн возбуждающего излучения, например повысить эффективность возбуждения при использовании четырех отдельных источников возбуждения, работающих на четырех резонансных длинах волн (λ λ, λ λ) в схеме 4-канального SBS, или могут повысить эффективность возбуждения на двух длинах волн (λ и λ) возбуждающего излучения в схеме 2-канального SBS, или могут повысить эффективность возбуждения на одной длине волны λ, в схеме 1-канального SBS. Примеры 4-канальной, 3-канальной, 2-канальной или 1-канальной схем SBS описаны, например, в патентной заявке США №2013/0079232 А1 (содержание которой включено в данное описание посредством ссылки), причем они могут быть модифицированы для использования совместно с предлагаемыми устройствами и способами. Например, возвращаясь к вариантам типа описанных со ссылками на фиг. 7A-7D, согласно которым на первом пикселе находятся первый и второй люминофоры, первый люминофор может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, а второй люминофор может быть, связан со второй нуклеиновой кислотой. В другом примере, соответствующем опционному варианту, описанному со ссылкой на фиг. 7A-7D, в котором первый и второй люминофоры находятся на первом пикселе, а третий и четвертый люминофоры - на втором пикселе, первый люминофор может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой. Еще в одном примере, соответствующем вариантам, описанным со ссылкой на фиг. 9A-9D, первый люминофор может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой. Например, в конфигурациях для использования при секвенировании ДНК с получением люминесцентных изображений первый люминофор может быть связан с нуклеотидом А, второй люминофор - с нуклеотидом Г, третий люминофор - с нуклеотидом С, а четвертый люминофор - с нуклеотидом Т. В качестве другого примера, в конфигурациях для использования при секвенировании РНК с получением люминесцентных изображений первый люминофор может быть связан с нуклеотидом А, второй люминофор - с нуклеотидом Г, третий люминофор - с нуклеотидом С, а четвертый люминофор - с нуклеотидом У.
[00122] В предлагаемых устройствах, например подобных описанным со ссылками на любую из фиг. 3А-3В, 7A-7D, 8А-8Е или 9A-9D, первый люминофор может быть связан с первым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию, а второй люминофор - со вторым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию. Например, первый полинуклеотид может быть связан с первым элементом, а второй полинуклеотид - со вторым элементом. Устройство может содержать также первую полимеразу, добавляющую к третьему полинуклеотиду, комплементарному первому полинуклеотиду и связанному с ним, первую нуклеиновую кислоту, связанную с первым люминофором. Устройство может дополнительно содержать вторую полимеразу, добавляющую к четвертому полинуклеотиду, комплементарному второму полинуклеотиду и связанному с ним, вторую нуклеиновую кислоту, связанную со вторым люминофором. В устройстве может дополнительно иметься канал, по которому первая жидкость, содержащая первую и вторую нуклеиновые кислоты и первую и вторую полимеразы, подается в или на первый и второй элементы. Например, первый и второй полинуклеотиды, которые подлежат секвенированию с использованием подходящей SBS-схемы, могут быть связаны с первым и вторым элементами, которые находятся на первом пикселе. Первый и второй люминофоры могут быть связаны соответственно с первой и второй нуклеиновыми кислотами, инкорпорированными соответственно в первый и второй полинуклеотиды, например, с использованием первой и второй полимераз. После выполнения шага SBS-метода по инкорпорированию первой и второй нуклеиновых кислот в первый и второй полинуклеотиды первый и второй люминофоры могут селективно участвовать в формировании люминесцентного изображения в различные периоды времени, как это было описано выше, с целью получения соответствующего электрического сигнала, чувствительного к присутствию первого люминофора на первом полинуклеотиде (т.е. к инкорпорации первой нуклеиновой кислоты в первый полинуклеотид), и чувствительного к присутствию второго люминофора на втором полинуклеотиде (т.е. к инкорпорации второй нуклеиновой кислоты во второй полинуклеотид).
[00123] Должно быть понятно, что для получения изображений люминофоров на нескольких сайтах с использованием заданного пикселя может быть применен любой подходящий для этого способ. На фиг. 10 приведена блок-схема примера способа, предлагаемого для использования при получении люминесцентных изображений. Способ 1000, проиллюстрированный на фиг. 10, может включать операцию (шаг) 1001 получения массива пикселей, формирующих изображения. Подобные массивы пикселей являются коммерчески доступными. Способ 1000 по фиг. 10 может также включать получение фотонной структуры, наложенной на указанный массив пикселей (операция 1002). Например, фотонный кристалл, фотонную сверхрешетку, массив микрополостей или массив плазмонных наноантенн можно наложить (нанести) на указанный массив пикселей, используя любую подходящую комбинацию методов получения материалов и формирования паттернов, известных из уровня техники.
[00124] Способ 1000 по фиг. 10 может также включать операцию 1003 получения массива элементов, находящихся на фотонной структуре. Например, используя любую подходящую комбинацию методов получения материалов и формирования паттернов, известных из уровня техники, на фотонной структуре можно сформировать массив углублений или столбиков. Данный массив элементов может быть пространственно согласован с фотонным кристаллом и с массивом пикселей таким образом, чтобы на каждом пикселе находилось целое число (n>2) элементов. Например, на первом пикселе из указанного массива пикселей могут находиться первый элемент из указанного массива элементов и второй элемент из того же массива, пространственно отделенный от первого элемента. В частности, второй элемент может быть смещен в поперечном направлении относительно первого элемента. В одном неограничивающем примере фотонная структура содержит гексагональную решетку, а пиксели, формирующие изображения, имеют прямоугольную форму. Как вариант, и первый, и второй элементы (т.е. и первый, и второй столбики или и первое, и второе углубления) могут иметь, по существу, круглое поперечное сечение. Как вариант, массив пикселей, формирующих изображения, фотонная структура и массив элементов могут быть интегрированы в единую монолитную структуру, т.е. может быть сформирована цельная структура с использованием последовательности операций, аналогичных КМОП-технологии.
[00125] Способ 1000 по фиг. 10 может также включать операцию 1004 помещения первого люминофора внутрь первого элемента или над ним и операцию 1005 помещения второго люминофора внутрь второго элемента или над ним. Например, массив элементов может включать множество углублений; при этом первый элемент может включать первое углубление, внутри которого находится первый люминофор, а второй элемент может включать второе углубление, внутри которого находится второй люминофор. В другом примере массив элементов может включать множество столбиков; при этом первый элемент может включать первый столбик, на котором находится первый люминофор, а второй элемент может включать второй столбик, на котором находится второй люминофор. Как вариант, первый и второй люминофоры могут быть связаны непосредственно или косвенно соответственно с первым и вторым элементами. В одном неограничивающем примере первый и второй люминофоры могут быть связаны соответственно с первой и второй нуклеиновыми кислотами и/или с первым и вторым полинуклеотидами, секвенируемыми аналогично тому, как это было описано выше.
[00126] Способ 1000 по фиг. 10 может также включать операцию 1006 генерирования посредством источника излучения в первый период времени первых фотонов, имеющих первую характеристику. Первые фотоны, имеющие первую характеристику, могут создавать внутри фотонной структуры в первый период времени первый резонансный паттерн, селективно возбуждающий первый люминофор относительно второго люминофора. Способ 1000 по фиг.10 включает также операцию 1007 генерирования посредством источника излучения во второй период времени вторых фотонов, имеющих вторую характеристику. Вторая характеристика может отличаться от первой характеристики, а второй период времени может отличаться от первого периода времени. В одном примере операции 1006 и 1007 могут включать сплошное равномерное облучение фотонной структуры соответственно первыми и вторыми фотонами и/или генерирование первых и вторых фотонов посредством лазера. Как вариант, первые и вторые фотоны могут соответствовать видимому диапазону спектра и иметь независимые длины волн в интервале 300-800 нм.
[00127] Вторые фотоны, имеющие вторую характеристику, могут генерировать внутри фотонной структуры во второй период времени второй резонансный паттерн, селективно возбуждающий второй люминофор относительно первого люминофора. Примеры источников излучения, характеристик фотонов и резонансных паттернов приведены в других частях данного описания. В частности, первая и вторая характеристики фотонов могут быть выбраны независимо из группы, состоящей из длин волн, поляризаций и углов. Как пример, характеристика первых фотонов может включать первую линейную поляризацию, а характеристика вторых фотонов - вторую линейную поляризацию, которая отличается от первой линейной поляризации. Как вариант, первая линейная поляризация, по существу, ортогональна второй линейной поляризации. Альтернативно, первая линейная поляризация может быть повернута относительно второй линейной поляризации на угол, составляющий 15°-75°. В другом примере характеристика первых фотонов может включать первую длину волны, а характеристика вторых фотонов - вторую длину волны, отличную от первой.
[00128] Как вариант, возможно облучение фотонной структуры первыми и вторыми фотонами, по существу, под одинаковым углом. Например, первые и вторые фотоны могут облучать фотонную структуру примерно под прямым углом к основной поверхности фотонной структуры. Альтернативно, можно облучать фотонную структуру первыми и вторыми фотонами в направлении, примерно параллельном основной поверхности фотонной структуры. В некоторых вариантах источник излучения может содержать оптический компонент, а способ 1000 может дополнительно включать управление оптическим компонентом с целью придания первым фотонам первой характеристики и придания вторым фотонам второй характеристики. Например, оптический компонент может содержать двулучепреломляющий материал, способный поворачивать, при получении первого управляющего сигнала контроллера, плоскость поляризации первых фотонов до первой линейной поляризации и, при получении второго управляющего сигнала контроллера, поворачивать плоскость поляризации вторых фотонов до второй линейной поляризации. Дополнительно или альтернативно, оптический компонент может управлять длиной волны или углом падения первых и вторых фотонов, реагируя на управляющие сигналы контроллера.
[00129] Способ 1000 по фиг. 10 может также включать операцию 1008 селективного приема, посредством первого пикселя, люминесценции, испускаемой первым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени, и операцию 1009 селективного приема, посредством первого пикселя, люминесценции, испускаемой вторым люминофором под воздействием вторых фотонов во второй период времени. При этом, как это было описано выше, первый пиксель может генерировать в первый и второй периоды времени соответствующие электрические сигналы, позволяющие различать первый и второй люминофоры.
[00130] Как это описано выше со ссылками на фиг. 3А-3В, 7A-7D, 8А-8Е или 9А-9D, над первым пикселем может быть расположено любое подходящее количество элементов, в частности три или четыре элемента. Как вариант, над первым пикселем может быть расположен третий элемент из указанного массива элементов, пространственно отделенный от первого и от второго элементов. Соответственно, способ 1000 может дополнительно включать следующие операции: помещение третьего люминофора внутрь третьего элемента или над ним; генерирование в третий период времени, отличный от первого и второго периодов, третьих фотонов, имеющих третью характеристику, отличную от первой и второй характеристик, и селективный прием, посредством первого пикселя, люминесценции, испускаемой третьим люминофором под воздействием третьих фотонов в третий период времени. Как еще один вариант, над первым пикселем может быть расположен также четвертый элемент из указанного массива элементов, пространственно отделенный от первого, второго и третьего элементов, а способ 1000 может дополнительно включать следующие операции: помещение четвертого люминофора внутрь четвертого элемента или над ним; генерирование в четвертый период времени, отличный от первого, второго и третьего периодов, четвертых фотонов, имеющих четвертую характеристику, отличную от первой, второй и третьей характеристик, и селективный прием, посредством первого пикселя, люминесценции, испускаемой четвертым люминофором под воздействием четвертых фотонов в четвертый период времени. В одном неограничивающем примере первый люминофор может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой.
[00131] Дополнительно или альтернативно, над вторым пикселем может быть расположено любое подходящее количество элементов, в частности два, три, четыре или более четырех элементов. Как вариант, над вторым пикселем из указанного массива пикселей могут быть расположены третий и четвертый элементы из указанного массива элементов, причем четвертый элемент пространственно отделен от третьего элемента. Соответственно, способ 1000 может дополнительно включать помещение третьего люминофора внутрь третьего элемента или над ним и помещение четвертого люминофора внутрь четвертого элемента или над ним. Способ 1000 может дополнительно включать также селективный прием вторым пикселем люминесценции, испускаемой третьим люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени, а также селективный прием вторым пикселем люминесценции, испускаемой четвертым люминофором под воздействием первых фотонов в первый период времени или под воздействием вторых фотонов во второй период времени. В одном неограничивающем примере первый люминофор может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, второй люминофор - со второй нуклеиновой кислотой, третий люминофор - с третьей нуклеиновой кислотой, а четвертый люминофор - с четвертой нуклеиновой кислотой.
[00132] Способ 1000 может быть адаптирован для получения люминесцентных изображений при осуществлении метода SBS. Например, способ 1000 может использовать по меньшей мере один микрофлюидный элемент, находящийся в контакте с массивом элементов, чтобы осуществлять подачу, посредством по меньшей мере одного микрофлюидного элемента, одного или более аналитов к первому и второму элементам. В другом примере первый люминофор может быть связан с первым нуклеотидом, а второй люминофор - со вторым нуклеотидом. Дополнительно или альтернативно, первый люминофор связан с первым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию, а второй люминофор - со вторым полинуклеотидом, подлежащим секвенированию. Первый полинуклеотид может быть связан с первым элементом, а второй полинуклеотид - со вторым элементом. Способ 1000 может дополнительно включать добавление, посредством первой полимеразы, первого нуклеотида, связанного с первым люминофором, к третьему полинуклеотиду, комплементарному первому полинуклеотиду и связанному с ним. Далее, способ 1000 может включать добавление, посредством второй полимеразы, второго нуклеотида, связанного со вторым люминофором, к четвертому полинуклеотиду, комплементарному второму полинуклеотиду и связанному с ним. Способ 1000 может дополнительно включать подачу, посредством канала, первой жидкости, содержащей первый и второй нуклеотиды и первую и вторую полимеразы в или на первый и второй элементы.
[00133] Как уже отмечалось, предлагаемые устройства и способы могут быть реализованы с использованием любой подходящей комбинации материалов и методов обработки и формирования паттернов. Фиг. 11 иллюстрирует пример последовательности операций (шагов), пригодной для использования при формировании предлагаемого устройства или конфигурации. В частности, устройство, которое было описано со ссылкой на фиг. 3А-3 В, может быть изготовлено с использованием двух литографических операций (шагов) получения нанооттисков, за которыми следуют шаги нанесения диэлектрика. Например, на шаге (а) (см. фиг. 11) первый, оптически прозрачный материал, такой как диэлектрик или полупроводник, например полимер (в частности смола), может быть нанесен на подложку, в частности на стеклянную подложку. На шаге (b) в первом материале методом литографии может быть сформирован паттерн, чтобы образовать группу элементов, таких как углубления или столбики. На шаге (с) поверх элементов, сформированных в первом материале, может быть нанесен слой постоянной толщины из третьего, оптически прозрачного, т.е. из диэлектрического или полупроводникового, материала, имеющего более высокий показатель преломления, чем первый материал. На шаге (d) на третий материал может быть нанесен четвертый, оптически прозрачный материал, такой как диэлектрик или полупроводник, например полимер (в частности смола). На шаге (е) в четвертом материале методом литографии может быть сформирован паттерн, чтобы образовать группу углублений или наноям. Как вариант, четвертый материал заполняет полости внутри фотонной структуры, как это проиллюстрировано фиг. 11(e). Второй материал (не изображен), который содержит один или более люминофоров, может находиться внутри углублений или наноям, т.е. он может быть расположен над фотонной структурой. Хотя фиг. 11 иллюстрирует получение единственного углубления для одного пикселя, должно быть понятно, что можно легко сформировать несколько углублений в расчете на один пиксель, изменяя распределение и размеры элементов, формируемых на шаге, соответствующем второму нанооттиску.
[00134] В качестве другого примера, устройство, которое было описано со ссылкой на фиг. 3А-3В, может быть изготовлено с использованием сочетания двух фотолитографических операций (шагов), двух шагов реактивного ионного травления (РИТ), нанесения диэлектрика и химико-механического полирования (ХМП). Фиг. 12 иллюстрирует пример соответствующей последовательности шагов, которая может использоваться для получения предлагаемого устройства. На шаге (а) (см. фиг. 12) первый, оптически прозрачный материал, такой как диэлектрик или полупроводник, например полимер (в частности смола), может быть нанесен на подложку, в частности на стеклянную подложку. На шаге (b) в первом материале методом фотолитографии с последующим РИТ может быть сформирован паттерн, чтобы образовать группу элементов, таких как углубления или столбики. На шаге (с) поверх элементов, сформированных в первом материале, может быть нанесен слой постоянной толщины из третьего, оптически прозрачного, т.е. из диэлектрического или полупроводникового, материала, имеющего более высокий показатель преломления, чем первый материал. На шаге (d) на третий материал может быть нанесен четвертый, оптически прозрачный материал, такой как диэлектрик или полупроводник, например полимер (в частности смола). На шаге (е) четвертый материал может быть планаризован, например посредством ХМП. На шаге (f) в четвертом материале методом фотолитографии с последующим РИТ может быть сформирован паттерн, чтобы образовать группу углублений или наноям. Как вариант, четвертый материал заполняет полости внутри фотонной структуры, как это проиллюстрировано фиг. 12(f). Второй материал (не изображен), который содержит один или более люминофоров, может находиться внутри углублений или наноям, т.е. он может быть расположен над фотонной структурой. Хотя фиг. 12 иллюстрирует получение единственного углубления для одного пикселя, должно быть понятно, что можно легко сформировать несколько углублений в расчете на один пиксель, изменяя распределение и размеры элементов, формируемых на шаге, соответствующем второй литографии и РИТ.
[00135] Должно быть понятно, что описанные устройства могут эффективно использоваться в самых различных приложениях, относящихся к получению люминесцентных изображений. Например, фиг. 13 иллюстрирует пример устройства для использования при получении люминесцентных изображений. На фиг. 13 представлено устройство, которое содержит фотонную структуру 1310, оптический компонент 1330, формирующий изображение пиксель 1350 и детекторный контур 1340. Фотонная структура 1310 содержит первый материал (обозначенный косой штриховкой), имеющий первый показатель преломления, и второй материал (обозначенный горизонтальной штриховкой), имеющий второй показатель преломления, отличный от первого показателя. Первый материал может иметь первую и вторую главные поверхности 1311, 1312 и первое и второе множества 1313, 1314 элементов, т.е. углублений, сформированных по меньшей мере в одной из первой и второй главных поверхностей. Элементы (углубления) в составе первого множества 1313, как вариант, могут отличаться по меньшей мере одной характеристикой (т.е. формой, размером или распределением) от элементов (углублений) в составе второго множества 1314. Например, в примере фотонной структуры 1310, проиллюстрированной на фиг. 13, элементы (углубления) первого множества 1313 могут отличаться размером (шириной) и распределением (т.е. взаимными расстояниями) от элементов второго множества 1314. В неограничивающем примере по фиг. 13 внутри первого и второго множеств 1313, 1314 элементов (углублений) или между ними может находиться второй материал, причем он может содержать первый и второй люминофоры 1321, 1322. Например, части первого и второго люминофоров 1321, 1322 могут находиться внутри элементов (углублений) первого множества 1313 или между ними, тогда как другие части первого и второго люминофоров 1321, 1322 могут находиться внутри элементов (углублений) второго множества 1314 или между ними. В других вариантах, подобных рассмотренному со ссылкой на фиг. 3А-3В, второй материал может быть расположен над первым и вторым множествами элементов. Как вариант, первый материал может содержать полимер или стекло, или другой подходящий материал, а второй материал может содержать жидкость или гель, или другой подходящий материал. Как вариант, фотонная структура 1310 дополнительно содержит третий материал, имеющий третий показатель преломления, отличный от первого и второго показателей. Третий материал наложен по меньшей мере на одно из первого и второго множеств элементов, а второй материал наложен на третий материал подобно тому, как это было описано со ссылкой на фиг. 3А-3В. Как вариант, первый люминофор 1321 может быть связан с первой нуклеиновой кислотой, а второй люминофор 1322 может быть связан со второй нуклеиновой кислотой, отличной от первой нуклеиновой кислоты.
1
2
[00136] Фотонная структура 1310 может селективно поддерживать в первый период времени первый резонансный паттерн, чувствительный к облучению фотонами, имеющими первую характеристику. Чувствительный к таким фотонам первый люминофор 1321 может испускать излучение с первой длиной волны λ. Фотонная структура 1310 может селективно поддерживать во второй период времени второй резонансный паттерн, чувствительный к облучению фотонами, имеющими вторую характеристику. Чувствительный к таким фотонам второй люминофор 1322 может испускать вторую длину волны λ. Первая и вторая длины волн могут отличаться одна от другой. Например, они могут быть разделены первой нераспротраняющейся длиной волны, которая неспособна селективно резонировать внутри фотонной структуры. Оптический компонент 1330 может быть расположен над первой или второй главной поверхностью 1311, 1312 первого материала, например над первой главной поверхностью 1311, на некотором расстоянии от нее. Оптический компонент 1330 может быть сконфигурирован для облучения фотонной структуры 1310 в первый период времени первыми фотонами, а во второй период времени вторыми фотонами. В примере устройства по фиг.13 фотонная структура 1310 облучается первыми и вторыми фотонами под примерно прямым углом к первой главной поверхности 1311 первого материала. Однако должно быть понятно, что можно использовать любой другой угол, как это было описано выше.
ь
2
[00137] Фотонная структура 1310 может быть расположена над пикселем 1350, формирующим изображение, который может содержать датчик изображения, способный формировать изображение на первой и второй длинах волн λ λ, принимаемых в первый и второй периоды времени соответственно. Пиксель 1350 может быть пространственно отделен от фотонной структуры 1310 или находиться в контакте с ней, т.е. в контакте с ее второй главной поверхностью 1312. Как вариант, пиксель 1350 может содержать датчик изображения на базе структуры КМОП, находящегося в контакте с фотонной структурой 1310. Детекторный контур 1340, предпочтительно связанный электронным образом с пикселем 1350, может быть сконфигурирован с возможностью принимать и анализировать электрические сигналы от пикселя 1350 в первый и второй периоды времени. В неограничивающем примере, в котором первый и второй люминофоры соответственно связаны с первой и второй нуклеиновыми кислотами, детекторный контур 1340 может быть сконфигурирован с возможностью идентифицировать, базируясь на электрических сигналах, принятых в первый и второй периоды времени, какая из первой и второй нуклеиновых кислот была добавлена к полинуклеотиду, который связан с фотонной структурой, как это описано в других частях данного описания. Может использоваться и другой пиксель, формирующий изображения, такой как пиксель ПЗС-камеры. Примеры детекторов приведены в следующих документах: Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008); международные заявки. WO 91/06678, WO 04/018497 и WO 07/123744; патенты США №№. 7057026, 7329492, 7211414, 7315019 и 7405281 и патентная заявка США №2008/0108082. Содержание этих документов включено в данное описание посредством ссылок.
[00138] Устройства описанного типа способны переносить излучение к фотонной структуре, чтобы эффективно возбуждать находящиеся в ней люминофоры. Например, устройство 1300 может дополнительно содержать широкополосный источник возбуждения, такой как светодиод, или узкополосный источник возбуждения, такой как лазер, сконфигурированный для генерирования излучения, которое переносится к фотонной структуре посредством оптического компонента 1330.
[00139] Следует отметить, что предлагаемые устройства типа устройства 1300 по фиг. 13, как вариант, могут содержать один или более микрофлюидных элементов типа описанных выше. Например, устройство 1300, как вариант, может дополнительно содержать по меньшей мере один микрофлюидный элемент, находящийся в контакте с фотонной структурой и сконфигурированный для подачи одного или более жидких аналитов в первую и вторую группы элементов, находящихся на пикселе, между этими элементами или поверх них. Данные аналиты, как вариант, могут содержать один или более реагентов для секвенирования нуклеиновых кислот, такие как нуклеотиды, нуклеиновые кислоты или полимеразы.
[00140] Таким образом, предлагаются устройства, конфигурации и способы, которые используют фотонные структуры и, благодаря этому, могут обеспечить усиление сигнала люминесценции (в единственном или в нескольких спектральных интервалах) от сайтов, количественно превосходящих пиксели, используемые при получении люминесцентных изображений, и которые совместимы с известными сканирующими системами для эпифлуоресцентной микроскопии типа применяемых в секвенирующих платформах, коммерчески доступных, например, от фирмы Illumina, Inc. В частности, некоторые варианты предлагаемых устройств, конфигураций и способов способны создавать при возбуждении "горячие точки", разделенные расстояниями порядка длины волны света. Пространственное распределение этих высокоинтенсивных резонансных элементов (например резонансов Фано или резонансов волноводных мод) может настраиваться, например, путем соответствующего подбора элементов и свойств фотонной структуры решетки (в частности симметрии) и/или длины волны, угла и/или состояния поляризации пучка возбуждения. Помещая люминофоры (т.е. биомолекулы, связанные с такими люминофорами) вблизи этих фотонных структур, можно усиливать сигнал люминесценции за счет резонансного усиления возбуждения люминофора и/или сбора люминесценции. Таким образом, фотонные структуры являются привлекательной платформой для обеспечения усиления сигнала люминесценции от группы сайтов, формирующих изображение и расположенных над единственным пикселем, в частности с использованием однородного облучения, при котором селективное возбуждение сайта может быть достигнуто путем управления характеристиками пучка возбуждения в различные периоды времени. При этом фотонные структуры могут настраиваться с целью уменьшения компонентов перекрестных помех, как это было описано со ссылками на фиг. 7D и 8Е. Альтернативно, фотонная структура может не использоваться; в этом случае пучок возбуждения можно направить на выбранные сайты, формирующие изображения, используя оптику, размещаемую в свободном пространстве, или многолучевую лазерную интерференцию. Другие альтернативные варианты
[00141] Специалисту будет понятно, что в различные иллюстративные варианты изобретения, описанные выше, могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за пределы изобретения. Например, хотя определенные конфигурации систем и способов были рассмотрены со ссылками на получение люминесцентных изображений, ассоциированных с секвенированием полинуклеотидов, таких как ДНК или РНК, должно быть понятно, что предлагаемые системы и способы могут быть эффективно адаптированы для использования при получении люминесцентных изображений, ассоциированных с любым подходящим объектом. Предусматривается, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие модификации, которые соответствуют изобретательскому замыслу и объему изобретения.