ПРИМЕНЕНИЕ ВИТАМИНОВ И ГЕНОВ И БЕЛКОВ МЕТАБОЛИЗМА ВИТАМИНОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1. Эукариотическая система экспрессии, содержащая
по меньшей мере один первый полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один белок метаболизма витаминов под контролем по меньшей мере одной первой регуляторной последовательности и
под контролем по меньшей мере одной второй регуляторной последовательности, по меньшей мере один сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции и/или по меньшей мере один второй полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере один целевой продукт.
2. Эукариотическая система экспрессии по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один белок метаболизма витаминов представляет собой белок транспорта витаминов.
3. Эукариотическая система экспрессии по п. 1, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один второй полинуклеотид встроен в указанный по меньшей мере один сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.
4. Эукариотическая система экспрессии по п. 2 или 3, отличающаяся тем, что указанный белок транспорта витаминов переносит растворимый витамин, такой как витамин В1, В5 и/или Н.
5. Эукариотическая система экспрессии по любому из пп. 2-4, отличающаяся тем, что указанный белок транспорта витаминов представляет собой THTR-1, THTR-2, ТРК, ТРС и/или SMVT (натрий-зависимый мультивитаминный транспортер).
6. Эукариотическая система экспрессии по любому из пп. 2-5, отличающаяся тем, что указанный белок транспорта витаминов представляет собой SMVT.
7. Эукариотическая система экспрессии по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная система экспрессии представляет собой по меньшей мере один вектор экспрессии.
8. Эукариотическая система экспрессии по п. 7, отличающаяся тем, что отдельный вектор содержит указанный по меньшей мере один первый и указанный по меньшей мере один второй полинуклеотид.
9. Эукариотическая система экспрессии по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанная первая и/или указанная вторая регуляторная последовательность представляют собой промоторы, энхансеры, области контроля локуса (LCR), участки прикрепления к ядерному матриксу (MAR), участки прикрепления к ядерному скаффолду (SAR), инсуляторные элементы и/или ДНК, ассоциированные с ядерным матриксом.
10. Набор, содержащий в одном контейнере указанную эукариотическую систему экспрессии по любому из предшествующих пунктов, а во втором контейнере - инструкции по применению указанной системы.
11. Набор по п. 10, дополнительно содержащий среду для культивирования клеток, предпочтительно содержащую лимитирующую и/или насыщающую концентрацию по меньшей мере одного витамина.
12. Набор по п. 11, отличающийся тем, что указанная среда для культивирования клеток содержит лимитирующую и/или насыщающую концентрацию витамина B1, В5 и/или Н.
13. Рекомбинантная эукариотическая клетка, содержащая систему экспрессии по любому из пп. 1-9; и/или
содержащая повышающую или понижающую мутацию белка метаболизма витаминов и содержащая второй полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, при этом указанный белок метаболизма витаминов является необязательно присущим указанной клетке.
14. Рекомбинантная эукариотическая клетка по п. 13, отличающаяся тем, что указанная клетка представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).
15. Рекомбинантная эукариотическая клетка по п. 13 или 14, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один первый полинуклеотид или последовательность, регулирующая экспрессию указанного по меньшей мере одного первого полинуклеотида, содержит повышающую или понижающую мутацию.
16. Рекомбинантная эукариотическая клетка по п. 13 или 14, отличающаяся тем, что указанный белок метаболизма витаминов нарушает метаболизм витаминов и/или связывает витамин внутри клетки.
17. Рекомбинантная эукариотическая клетка по п. 16, отличающаяся тем, что указанный белок метаболизма витаминов представляет собой пантотенатную киназу 1, 2 и/или 3 и/или тиаминпирофосфаткиназу, такую как ТРК1 (тиаминпирофосфаткиназа 1).
18. Рекомбинантная эукариотическая клетка по любому из пп. 13-17, содержащая указанную систему экспрессии, причем указанный белок метаболизма витаминов является селектируемым маркером для указанной рекомбинантной эукариотической клетки, и указанная рекомбинантная эукариотическая клетка продуцирует и, предпочтительно, секретирует указанный целевой продукт.
19. Среда для культивирования эукариотических клеток, содержащая указанные рекомбинантные эукариотические клетки по любому из пп. 13-18, экспрессирующие (i) белок транспорта витаминов в качестве селектируемого маркера и (ii) указанный целевой белок.
20. Среда для культивирования клеток по п. 19, отличающаяся тем, что указанная среда представляет собой среду с лимитирующей концентрацией В5 или среду с насыщающей концентрацией В5, но с лимитирующей концентрацией или нелимитирующей концентрацией Н; или среду с насыщаяющей концентрацией Н, но с лимитирующей или нелимитирующей концентрацией В5, предпочтительно среду с лимитирующей концентрацией В5 или среду с насыщающей концентрацией В5, но лимитирующей концентрацией Н.
21. Способ культивирования и, необязательно, отбора рекомбинантных эукариотических клеток, включающий:
обеспечение системы экспрессии по любому из пп. 1-9,
обеспечение эукариотических клеток, причем жизнеспособность, рост и/или деление указанных эукариотических клеток зависит от поглощения витаминов,
введение указанной системы экспрессии в указанные эукариотические клетки для получения указанных рекомбинантных эукариотических клеток, экспрессирующих указанный белок метаболизма витаминов и указанный целевой белок,
культивирование указанных эукариотических клеток в среде для культивирования клеток и
необязательно отбор посредством указанного белка метаболизма витаминов, который предпочтительным образом экспрессируется на поверхности указанных рекомбинантных эукариотических клеток, причем указанные рекомбинантные эукариотические клетки стабильно экспрессируют указанный целевой продукт.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что указанная среда представляет собой среду с лимитирующей концентрацией В5 или среду с насыщающей концентрацией В5, но с лимитирующей концентрацией Н.
23. Применение белка метаболизма витаминов в качестве селективного маркера для отбора рекомбинантной эукариотической клетки, стабильно экспрессирующей целевой продукт, при этом жизнеспособность, рост и/или деление указанной клетки зависит от поглощения витаминов.
24. Среда для культивирования, содержащая по меньшей мере один витамин
в концентрации менее, чем 10 нМ и/или
в концентрации 20 мкМ или более, при этом указанный по меньшей мере один витамин представляет собой незаменимый витамин.
25. Среда для культивирования по п. 24, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один витамин представляет собой витамин B1, В5 и/или Н.
26) Среда для культивирования по п. 24 или 25, отличающаяся тем, что указанная среда для культивирования содержит по меньшей мере одну рекомбинантную эукариотическую клетку, экспрессирующую, предпочтительно секретирующую целевой белок.
27. Среда для культивирования по п. 26, отличающаяся тем, что указанный целевой белок представляет собой терапевтический белок.
28) Среда для культивирования по п. 26 или 27 или способ обеспечения указанной среды для культивирования, отличающиеся тем, что рост и/или деление указанных клеток останавливают, и образование указанного целевого белка происходит на максимальном уровне остановки (MAL в [г/Л]), который превышает максимальный уровень (ML в [г/л]) белка, экспрессируемого указанными клетками, при выращивании на среде, предпочтительно на стандартной среде, в которой рост не останавливают, при этом значение MAL более, чем в 1,5 больше значения ML, более, чем в 2 раза больше значения ML или даже более, чем в 2,5 или 3 раза больше значения ML.
29. Способ получения целевого белка, включающий
(a) трансформацию эукариотических клеток системой экспрессии по любому из пп. 1-9 для получения рекомбинантных эукариотических клеток;
(b) культивирование указанных рекомбинантных эукариотических клеток в среде для культивирования, в которой жизнеспособность, рост и/или деление указанных рекомбинантных эукариотических клеток зависят от активности по меньшей мере одного белка метаболизма витаминов;
(c) отбор рекомбинантных эукариотических клеток, экспрессирующих указанный по меньшей мере один белок метаболизма витаминов, при этом указанный белок метаболизма витаминов является селектируемым маркером для получения отобранных рекомбинантных эукариотических клеток и
(d) очистку указанного целевого белка, полученного из указанных отобранных рекомбинантных эукариотических клеток или из их среды для культивирования, содержащей указанные отобранные рекомбинантные эукариотические клетки.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный белок метаболизма витаминов представляет собой белок транспорта витаминов, предпочтительно переносящий витамины В5, В1 и/или Н, и указанная среда для культивирования содержит лимитирующую концентрацию и/или насыщающую концентрацию по меньшей мере одного из указанных витаминов.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанный белок транспорта витаминов представляет собой SMVT, и указанная среда для культивирования представляет собой среду с лимитирующей концентрацией В5 или среду с насыщающей концентрацией В5, но среду с лимитирующей концентрацией Н.