Рекомбинантные белки Pseudomonas aeruginosa: влияние на цитокиновый профиль мышей

гена TLR9 (в 62, 18 и 13 раз соответственно), но уровень экспрессии гена дефенсина при этом менялся незначительно. Через 20 и более дней статистически значимых отличий в уровне экспрессии относительно групп сравнения нами не было выявлено. В дальнейшем планируется изучить влияние данных лигандов на уровень экспрессии других эндосомальных TLRs (TLR3, TLR7), а также увеличить спектр эффекторных молекул, продуцируемых в ответ на введение исследуемых лигандов.

Таким образом, разработанный подход, основанный на определении экспрессии генов распознающих рецепторов TLR9 и эффекторной молекулы BD-2 в лейкоцитах мышей, которым внутрибрюшинно за 24 часа вводятся иммунотропные препараты, содержащие лиганды TLRs как синтетические, так и природные, может быть использован для оценки действия этих препаратов на систему врожденного иммунитета, а именно, на активацию TLRs.

Л ИТЕРАТУРА

1. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Бахарева И.В. и др. Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности. Вестник РГМУ, 2009, 4: 34-37.

2. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Макаров О.В. и др. Роль экспрессии генов Toll-подобного рецептора 2, каспаз и их ингибиторов в ткани плаценты в норме и при преждевременных родах инфекционного генеза. Рос. иммунол. журн., 2010, 4 (13; 1): 48-53.

3. Ганковская О.А., Бахарева И.В., Ганковская Л.В. и др. Исследование экспрессии генов TLR9, NF-kB, ФНОа в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной инфекцией. Журн. микробиол., 2009, 2: 61-65.

4. Ганковская О.А., Зверев В.В. Взаимодействие вирусов и Toll-подобных рецепторов. Журн. микробиол., 2010, 2: 101-105.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.

6. Еричев В.П., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В. и др. Изменение некоторых иммунологических показателей слезной жидкости при избыточном рубцевании у пациентов с первичной от-крытоугольной глаукомой после антиглаукомных операций. Вестник офтальмол., 2010, 2: 19-22.

7. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при патологии. Журн. микробиол., 2005,4: 96-104.

8. Costello D.A., Lynch M.A. Toll-like receptor 3 activation modulates hippocampal network excitability, via glial production of interferon-p. Hippocampus, 2013, 4, doi: 10.1002.

9. Lappalainen J., Rintahaka J., Kovanen P.T. Intracellular RNA recognition pathway activates strong anti-viral response in human mast cells. Clin. Exp. Immunol., 2013, 172 (1): 121-128.

10. Mouchess M.L., Arpaia N., Souza G. Transmembrane mutations in Toll-like receptor 9 bypass the requirement for ectodomain proteolysis and induce fatal inflammation. Immunity, 2011, 35 (5): 721-732.

Поступила 18.06.13

Контактная информация: Свитич О. А., д.м.н.,

105064, Москва, М. Казенный переулок, 5А, р.т. (495)917-42-55

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

А.В.Солдатенкова, Л.А.Гейдерова, Н.К.Ахматова, Н.А.Михайлова

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA: ВЛИЯНИЕ НА ЦИТО-КИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ МЫШЕЙ

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва

Цель. Изучение цитокин-опосредованного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантными антигенными препаратами Pseudomonas aeruginosa. Материалы и методы. Изучен цитокин-опосредованный иммунный ответ у мышей, вакцинированных мембранными рекомбинантными белками OprF, OprL, гибридным рекомбинантным белком OprF-I, состоящим из последовательностей белков OprF и OprI, и рекомбинантной

атоксичной формой экзотоксина А с делецией 106 аминокислотных последовательностей (рекомбинантный анатоксин- aTox) P. aeruginosa. Результаты. Выявлено, что у мышей индуцировался широкий спектр исследуемых цитокинов. Наиболее высокий уровень наблюдали в отношении IL-1 и IL-6 при введении рекомбинантных белков OprL, OprF, OprF-I, aTox. OprF-I активно стимулировал продукцию IL-2, являющегося фактором роста и дифференцировки лимфоцитов натуральных киллеров и цитотоксических лимфоцитов; а также IL-5, IL-10, TNF-a и IFN-y Рекомбинантный белок OprF-I способствовал индукции IL-6, IL-17, TNF-a и IFNy, в то время как aTox — экспрессии IL-1, IL-2, IFN-y. Рекомбинантный белок OprL в наибольшей степени индуцировал синтез IL-17 и умеренно TNF-a и IL-10. Заключение. Полученные рекомбинантные белки P. aeruginosa при внутрибрюшинном введении мышам способствовали формированию иммунного ответа с индукцией направленности как по Th1, так и Th2 пути.

Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 80—87

Ключевые слова: рекомбинантные белки P. aeruginosa, рекомбинантный анатоксин, ци-токины, Th1/Th2

A.V.Soldatenkova, L.A.Geiderova, N.K.Akhmatova, N.A.Mikhailova

PSEUDOMONAS AERUGINOSA RECOMBINANT PROTEINS: EFFECT ON MICE CYTOKINE PROFILE

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

Aim. Study cytokine-mediated immune response in mice vaccinated with Pseudomonas aeruginosa recombinant antigen preparations. Materials and methods. Cytokine-mediated immune response was studied in mice vaccinated with membrane recombinant proteins OprF, OprL, a hybrid recombinant protein OprF-I consisting of sequences of OprF and OprI proteins and a recombinant atoxic form of exotoxin A with a deletion of106 amino acid sequences (recombinant anatoxin — aTox) of P. aeruginosa. Results. An induction of a wide specter of studied cytokines was detected in the mice. The highest level was observed for IL-1 and IL-6 after administration of recombinant proteins OprL, OprF, OprF-I, aTox. OprF-I actively stimulated production of IL-2 that is a factor of growth and differentiation of lymphocytes, natural killers and cytotoxic lymphocytes; as well as IL-5, IL-10, TNF-a and IFN-y. Recombinant protein OprF-I facilitated induction of IL-6, IL-17, TNF-a and IFN-y, whereas aTox — expression of IL-1, IL-2, IFN-y. Recombinant protein OprL induced IL-17 synthesis to the most extent and TNF-a and IL-10 — moderately. Conclusion. The P. aeruginosa recombinant proteins obtained during intraperitoneal administration to mice facilitated formation of immune response with the direction of induction in both Th1 and Th2 pathways.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 80—87

Key words: P. aeruginosa recombinant proteins, recombinant anatoxin, cytokines, Th1/Th2 ВВЕДЕНИЕ

Защита от синегнойной инфекции является одной из важнейших задач медицинской практики, так как возбудитель отличается высоким уровнем антимикробной резистентности, и решить проблему его эрадикации с помощью антибиотиков крайне сложно [23]. Поэтому создание эффективных вакцинных препаратов может существенно помочь решению данной проблемы. Однако разработать вакцину против P. aeruginosa оказалось сложной задачей, что зависело от различных факторов, как со стороны патогена, так и организма хозяина. Во-первых, колонизации и инфицированию способствует повсеместное распространение этого оппортунистического патогена (в том числе в водоемах и почве). Врожденные защитные механизмы, особенно респираторного тракта, как правило, предотвращают развитие инфекции у

6. ЖМЭИ 6 № 5187

81

здоровых лиц. Однако при иммунодефицитных состояниях, связанных с ослаблением местных и системных защитных механизмов, P. aeruginosa может «прорвать» му-козальные защитные барьеры и привести к поражению органов бронхолегочного аппарата, желудочно-кишечного тракта, мочевыводящих путей, центральной нервной системы, кожи и т.д. Предрасполагающими факторами для инфицирования являются бронхоэктазы, хронические бронхиты, муковисцидоз, а также затяжные инфекции.

Основной группой, подлежащей вакцинации против синегнойной инфекции, являются пациенты с кистозным фиброзом ^F), у которых заболевание сопровождается колонизацией респираторного тракта бактериальными патогенами с формированием антибиотикорезистентности и биопленки. Механизмы возникновения этих изменений остаются мало изученными. Однако ясно, что эта среда при CF влияет на врожденную защиту хозяина, приводя к электролитному дисбалансу, ухудшению барьерной функции слизистых, нарушению фагоцитоза, дисрегуляции иммуновоспа-лительного ответа и повышению бактериальной адгезии [7]. Поэтому именно вакцинация пациентов с муковисцидозом от синегнойной инфекции выступает самой эффективной стратегией, способствующей формированию специфического иммунного ответа до колонизации патогеном [21].

В настоящее время индукция иммунного ответа под воздействием P. aeruginosa, а также клеточные и молекулярные события, вызванные антигенными компонентами этого патогена, остаются мало охарактеризованными. Недостаточно известно о влиянии их на систему врожденного иммунитета, механизмы которого реализуются через клеточные и гуморальные факторы. Важнейшую роль в межклеточных взаимодействиях на уровне врожденного иммунитета, регуляции иммунной дифференци-ровки Т-лимфоцитов и определении направления развития иммунных процессов играют цитокины. Определение динамики продукции цитокинов в процессе вакцинации позволяет на клеточно-молекулярном уровне определить механизм действия препарата и наиболее рациональный спектр его использования.

Цель работы — изучение цитокин-опосредованного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантными антигенными препаратами P. aeruginosa.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали рекомбинантные белки P.aeruginosa: белки наружной мембраны OprL, OprF, слитый рекомбинантный белок OprF-I, состоящий из последовательностей белков OprI и OprF, и рекомбинантная нетоксичная форма экзотоксина А с делецией 106 аминоксилотных остатков (анатоксин, aTox) [1 — 3,10].

Мышей линии СВА массой 18 — 20 г получали из питомника «Андреевка» Московской области. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Штаммы-продуценты рекомбинантных белков на основе Escherichia coli M15 или E. coli BL21(DE3) культивировали в жидкой LB среде. содержащей 50 мкг/мл кана-мицина и 100 мкг/мл ампициллина в случае OprL, OprF, OprF-I и 50 мкг/мл канами-цина в случае aTox при температуре 37°С и скорости перемешивания 250 об/мин. По достижении оптической плотности среды значения 0,6 (при длине волны 600 нм) добавляли ИПТГ (изопропил^-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 3 ч. Биомассу собирали центрифугированием с ускорением 5000 g в течение 10 мин при температуре 4°C. Очистку реком-бинантного белка проводили при помощи Ni-агарозы с использованием буферных растворов на основе 8 М мочевины. Специфичность полученных белковых препаратов оценивали в иммуноблоттинге.

Мышам внутрибрюшинно вводили по 50 мкг рекомбинантных белковых препа-

ратов P. aeruginosa в 0,5 мл физиологического раствора. Для оценки уровня цитокинов у мышей забирали кровь через определенные интервалы времени (2, 4, 6, 24 ч) после однократного введения препарата.

Уровень цитокинов определяли в сыворотке крови мышей при помощи тест-системы FlowCytomixMouse Thl/Th2 10 plex с использованием шариков, сенсибилизированных моноклональными антителами к цитокинам (GM-CSF, IFN-y, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a), производства BenderMedSystems (Австрия) согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Culter, США).

Статистическую обработку данных проводили с использованием интегрированного пакета статистического анализа StatSoft 7.0 (Windows 2007) с применением параметрических (t-критерия Стьюдента) и непараметрических (критерия Вилкоксона) методов сравнения.

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

При внутрибрюшинном введении мышам рекомбинантных белков P. aeruginosa уровень всех исследуемых цитокинов был статистически значимо выше, чем в группе контроля (интактные мыши). Наиболее высокие показатели отмечали в отношении провоспалительных цитокинов IL-1ß и IL-6. IL-1ß существенно (p<0,05) повышался в течение первых 2 ч после введения анатоксина (aTox) и слитого рекомбинантного белка OprF-I (887,0±11,3 и 1051,0+52,8 пкг/мл соответственно). Затем уровень данного цитокина под воздействием aTox начинал снижаться (511,0+6,4 пкг/мл), и к концу суток снова определяли некоторое его повышение (733,0+13,8 пкг/мл). Картина продукции IL-1ß в сыворотках мышей под воздействием других рекомбинантных белков была несколько иной: OprL максимально повышал синтез IL-1ß через 4 и 24 ч (с 285,0+9,7 пкг/мл до 803,0+8,1 и 894,0+51,0 пкг/мл), а OprF индуцировал продукцию данного цитокина постепенно в течение суток (с 352,0+53,0 пкг/мл — 2 ч до 547,0+55,0 пкг/мл — 24 ч). В отношение OprF-I максимальный уровень IL-1ß отмечали через 2 — 4 ч (1051,0+52,8 и 1060,0+48,6 пкг/мл, соответственно), после чего начиналось постепенное снижение его содержания в сыворотке мышей. То есть, самым активным в индукции IL-1ß в ранний срок наблюдения (2 ч) оказался препарат OprF-I. В последний срок наблюдения наиболее активным был aTox (6 ч) и OprL (24 ч).

В случае с IL-6 высокий уровень определяли в сыворотках мышей при введении аTox и OprF-I (соответственно, 3161,0+76,5 и 6165,0+171,0 пкг/мл через 2 ч, и 310,0+16,0 и 2445,0+97,0 пкг/мл через 4 ч). При этом OprF-I по действию на продукцию IL-6 превосходил (p<0,01) другие исследуемые препараты. Минимальный уровень IL-6 у мышей наблюдали во всех группах к концу суток после аппликации препаратов.

IL-2 повышался через 4 ч после введения OprF-I (с 5,0+0,3 до 25,3+1,6 пкг/мл) и далее нарастал в течение суток (31,5+2,3 пкг/мл, 24 ч). При этом aTox и OprL заметно (p<0,05) индуцировали синтез IL-2 только к концу суток (до 22,2+1,3 и 23,7+1,4 пкг/ мл, соответственно). Таким образом, OprF-I обладал большим потенциалом к синтезу IL-2.

В ранние интервалы времени после введения препаратов (2 и 4 ч) более активным в отношение IL-5 был антиген OprL, который повышал его уровень с 0,3+0,1 до 18,2+1,2 и 24,3+1,7 пкг/мл. Однако через 6 ч после аппликации данного препарата концентрация IL-5 начинала снижаться до 10,6+1,4 пкг/мл, достигая минимальных значений к концу суток (3,9+0,4 пкг/мл). Максимальные концентрации IL-5 определяли через 6 и 24 ч после введения aTox и OprF-I (46,7+1,3 и 27,1+2 пкг/мл и 58,9+6,3 и 25,4+3,7 пкг/мл, соответственно).

Уровень IL-17 в сыворотках мышей начинал повышаться под воздействием всех рекомбинантных белков через 4 ч после введения. Активность OprL в отношение

индукции IL-17 была максимальной на все сроки наблюдения (17,3±1,2 пкг/мл — 4 ч, 21,3±2,2 пкг/мл — 6 ч, 27,6±2,5 пкг/мл — 24 ч). При этом aTox хоть и повышал уровень данного цитокина по сравнению с контрольной группой, но в меньшей мере, чем остальные антигены.

На уровень противовоспалительного IL-10 сильное воздействие оказывал OprF-I уже с первых часов после аппликации препарата (повышение с 0,4±0,05 до 234,7±6,1 пкг/мл через 2 ч) с постепенным снижением его уровня к концу суток (с 122,2±3,7 пкг/мл через 4 ч до 20,9±1 пкг/мл через 24 ч). OprL индуцировал синтез IL-10 через 4 ч после введения (26,2±1,3 пкг/мл). Существенное повышение IFN-y наблюдалось через 6 и 24 ч после введения всех исследуемых препаратов, однако наиболее активными оказались aTox, OprL и OprF-I, максимальный уровень которых составил соответственно 248,8±4,8 пкг/мл (24ч), 72,3±4,2 пкг/мл (6 ч) и 174,7±7,7 пкг/мл (24 ч).

Уровень TNF-a в сыворотках мышей, наоборот, был повышен в интервале 2 — 4 ч под влиянием всех препаратов. При этом максимальное увеличение концентрации TNF-a наблюдали через 2 ч, в особенности после введения OprF-I (247,6±4,4 пкг/мл против 6,3±0,5 пкг/мл в контроле).

Таким образом, все исследуемые рекомбинантные белки P. aeruginosa в той или иной степени индуцировали синтез про-, противовоспалительных и регулярных ци-токинов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Большинство усилий за последние 40 лет было сосредоточено на разработке вакцин против синегнойной инфекции. Многочисленные антигены P. aeruginosa и системы их доставки были испытаны в качестве кандидатов на вакцину [20]. Наиболее перспективными антигенами для вакцин, установленные на данный момент, являются белки наружной мембраны, жгутиковые, PcrV и антигены системы секреции типа III, не вызывает сомнения необходимость включения в вакцину анатоксина. Однако испытания эффективности вакцин-кандидатов на грызунах со здоровой иммунной системой не может имитировать комплексное иммунное окружение, как в группах риска. Недавно появились новые модели животных с CF, такие как свинья и хорек, однако они еще не получили широкого применения [10].

До сих пор остается неясным, какой тип мукозального ответа необходим для предотвращения колонизации дыхательных путей. Из классических представлений вытекало, что наличия опсонизирующих антител может быть достаточным. Однако уже 20 лет тому назад было установлено, что продукция антител против альгината коррелирует с меньшей хронизацией мукоидной синегнойной инфекции [18], а с другой стороны, у пациентов с CF наличие высокого уровня системных антител не предотвращало колонизацию P. aeruginosa [24]. Поэтому становится очевидным, что одних антител не достаточно для формирования защиты, в частности, от легочной инфекции, и необходима стимуляция как клеточного, так и гуморального звеньев иммунной системы с активацией нейтрофилов [11], комплемента [16], NKT [2,17] и Th17 клеток [19].

Приоритетным направлением является изучение патогенеза инфекционных заболеваний с позиций определения роли врожденного и адаптивного иммунитета, а также особенностей взаимодействия между ними, которые осуществляются с помощью «языка межклеточного общения» — цитокинов. В отличие от адгезивных взаимодействий, которые достаточно инертны во времени, взаимодействия с помощью цитокинов гораздо более быстрые, оперативные, динамичные. Цитокины регулируют взаимодействия между клетками врожденного и адаптивного иммунного ответа. Определение цитокинов позволяет идентифицировать направление дифференциров-ки Т-клеток в Th1/Tc1 или Th2/Tc2 тип, тем самым определяя поляризацию иммунного ответа по Th1- и ТЬ2 пути, а также класс иммуноглобулинов, на продукцию

которого переключаются В-клетки. Результаты наших исследований показали, что при введении антигенных препаратов P. aeruginosa мышам индуцировался широкий спектр исследуемых цитокинов. Наиболее высокий уровень наблюдали у IL-1 и IL-6 при введении антигена OprF-I, OprL, aTox, OprF. Индукция синтеза IL-6 происходила в основном в срок до 6 часов, а IL-1, начиная с 4 часов, в течение суток после аппликации антигенов.

IL-1P является мощным провоспалительным цитокином, и известно, что связывание IL-1P с его рецептором приводит к параллельной активации активатора протеина 1 и ядерного фактора NF-kB, активирующего В-клеточный путь, что способствует, в свою очередь, экспрессии фактора роста фибробластов 2 и усилению миграции клеток [13]. IL-6 выступает как мощный фактор дифференцировки В- и Т-клеток, макрофагов, мощный стимулятор выработки белков острой фазы клетками печени. Одна из основных функций IL-6 — стимуляция продукции антител in vivo и in vitro. Было установлено, что при использовании рекомбинантного человеческого IL-6 в качестве адъюванта в субъединичной вакцине против туберкулеза усиливается Th1 ответ, характеризующийся повышением продукции INF-y и усилением клеточной пролиферации [15].

Под воздействием антигенных препаратов P.aeruginosa статистически значимое повышение уровня отмечали в отношении других цитокинов по сравнению с контролем. OprF-I более активно стимулировал продукцию IL-2, являющегося фактором роста и дифференцировки лимфоцитов NK, CTL, а также IL-5, IL-10, TNF-a и IFN-y Гибридный рекомбинантный белок OprF-I способствовал индукции IL-6, IL-17, TNF-a, IFNy, в то время как aTox — экспрессии IL-1, IL-2, IFN-y.

IL-5 описан как дифференцировочный фактор В-лимфоцитов. Главный источник IL-5 — ^2-клетки. Не влияя на переключение изотипов, этот цитокин повышает число продуцентов IgM, а также действуя на посттранскрипционном уровне усиливает продукцию IgA. Тем самым IL-5 способствует защите слизистых оболочек, в которых IgA составляет основной изотип антител. Однако основное проявление биологического действия IL-5 — его влияние на эозинофилы: он служит фактором выживаемости, роста, дифференцировки и хемотаксиса этих клеток. Выделяемый тучными и ^2-клетками в очаге аллергической реакции, IL-5 представляет главный фактор, ответственный за развитие отложенной фазы аллергической реакции немедленного типа, центральным событием которой является миграция в очаг поражения эозинофилов и некоторых других форм лейкоцитов (Wang H. et al., 2012). Повышение IL-10 в ходе иммунизации может способствовать снижению проявлений реакций ГЗТ и активации гуморального иммунитета (Petrella C. et al., 2013). В то же время, в наших исследованиях при введении белковых препаратов происходило одновременно достоверное повышение IFN-y, что может способствовать активации клеточно-опосредованного ответа на фоне стимулированного IL-10 гуморального ответа.

Примечательно, что антиген OprL P. aeruginosa в наших экспериментах у мышей в наибольшей степени индуцировал синтез IL-17 и умеренно TNF-a и IL-10. Многообещающие подходы в настоящее время сфокусированы на формировании Thn-опосредованных механизмов, обеспечивающих антитело-независимый про-тективный иммунитет против бактериальных патогенов у мышей [6], включая P. aeruginosa [19]. С использованием реверсивных генетических подходов Th17-стимулирующие антигены P. aeruginosa, в том числе OprL, или менее изученные белки системы секреции третьего типа, такие как PopB, недавно были идентифицированы как новые антигены, стимулирующие сильный Th17 ответ [26].

Резюмируя вышеизложенное, можно сделать заключение, что полученные антигены P. aeruginosa при внутрибрюшинном введении мышам способствуют формированию иммунного ответа с индукцией направленности как по Th1, так и Th2 пути.

В настоящее время важной задачей при разработке вакцин против синегнойной инфекции является оценка их доклинической эффективности с поиском соответствующих экспериментальных моделей. Мукозальный иммунный ответ при кистозных фиброзах (муковисцидозах) остается малоизученным, поэтому внимание должно быть сфокусировано на стратегии мукозальной иммунизации [5, 25] с целью выявления новых механизмов формирования иммунитета слизистых.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гатыпова Е.В., Злыгостев С.А., Калошин А.А., Михайлова Н.А. Исследование иммунобиологических свойств рекомбинантного белка OprL наружной мембраны Pseudomonas aeruginosa. Вестник РАМН. 2009, 4: 25-28.

2. Егорова Н.Б., Ахматова Н.К., Чертов И.В. и др. Влияние разных методов введения антигенов условно патогенных бактерий на субпопуляционную структуру и функциональную активность иммунокомпетентных клеток селезенки, кишечника и регионарных лимфатических узлов. Молекулярная медицина. 2009, 5: 48-54.

3. Калошин А.А., Исаков М.А., Михайлова Н.А., Вертиев Ю.В. Получение рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. БЭБИМ. 2012, 134 (9): 330335.

4. Калошин А.А., Михайлова Н.А., Леонова Е.И. Получение гибридного белка OprF-OprI Pseudomonas aeruginosa. Журн. микробиол. 2012, 3: 35-43.

5. Chen K., Cerutti A. Vaccination strategies to promote mucosal antibody responses. Immunity. 2010, 33: 479-491.

6. Chen K., McAleer J.P., Lin Y et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 2011, 35: 997-1009.

7. Cohen T.S., Prince A. Cystic fibrosis: a mucosal immunodeficiency syndrome. Nat. Med. 2012, 18 (4): 509-519.

8. Donta S.T., Peduzzi P., Cross A.S. et al. Immunoprophylaxis against Klebsiella and Pseudomonas aeruginosa infections. The federal hyperimmune immunoglobulin trial study group. J. Infect. Dis. 1996, 174: 537-543.

9. Doring G., Meisner C., Stern M. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, 104: 11020-11025.

10. Fisher J.T., Zhang Y, Engelhardt J.F Comparative biology ofcystic fibrosis animal models. Methods Mol. Biol. 2011, 742: 311-334.

11. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining recombinant forms of outer membrane protein (OprF) of Pseudomonas aeruginosa and assessment of their immunogenic properties. Appl. Biochemistry and Microbiology. 2011, 47 (8): 780-788.

12. Koh A.Y, Priebe G.P., Ray C. et al. Inescapable need for neutrophils as mediators of cellular innate immunity to acute Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Infect. Immun. 2009, 77: 5300-5310.

13. Krause A., Whu WZ., Xu Y et al. Protective anti-Pseudomonas aeruginosa humoral and cellular mucosal immunity by AdC7-mediated expression of the P. aeruginosa protein OprF. Vaccine. 2011, 29: 2131-2139.

14. Krause K., Metz M., Makris M. et al. The role of interleukin-1 in allergy-related disorders. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2012, 12 (5): 477-484.

15. Leal I.S., Florido M., Andersen P., Appelberg R. Interleukin-6 regulates the phenotype of the immune response to a tuberculosis subunit vaccine. Immunol. 2001, 103: 375-381.

16. Mueller-Ortiz S.L., Drouin S.M., Wetsel R.A. The alternative activation pathway and complement component C3 are critical for a protective immune response against Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia. Infect. Immun. 2004, 72: 2899-2906.

17. Nieuwenhuis E.E., Matsumoto T., Exley A. et al. CD1d-dependent macrophage-mediated clearance of Pseudomonas aeruginosa from lung. Nat. Med. 2002, 8: 588-593.

18. Pier G.B., Boyer D., Preston M. et al. Human monoclonal antibodies to Pseudomonas aeruginosa alginate that protect against infection by both mucoid and nonmucoid strains. J. Immunol. 2004, 1736: 5671-5678.

19. Priebe G.P., Walsh R.L, Cederroth T.A. et al. IL-17 is a critical component of vaccine-induced protection against lung infection by lipopolysaccharide-heterologous strains of Pseudomonas aeruginosa. J. Immunol. 2008, 181: 4965-4975.

20. Sharma A., Krause A., Worgall, S. Recent developments for Pseudomonas vaccines. Hum. Vac. 2011, 7: 999-1011.

21. Shupp J.W, Pavlovich A.R., Jeng J.C. et al. Epidemiology ofbloodstream infections in burn-injured patients: a review of the national burn repository. J. Burn Care Res. 2010, 31: 521-528.

22. Sorichter S., Baumann U., Baumgart A. et al. Immune responses in the airways by nasal vaccination with systemic boosting against Pseudomonas aeruginosa in chronic lung disease. Vaccine. 2009, 27: 2755-2759.

23. Sun H.Y., Fujitani S., Quintiliani R. et al. Pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa: part II: antimicrobial resistance, pharmacodynamic concepts, and antibiotic therapy. Chest. 2011, 139: 1172-1185.

24. Tan H.L., Regamey N., Brown S. et al. The Th17 pathway in cystic fibrosis lung disease. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2011, 184: 252-258.

25. Worgall S. 40 years on: have we finally got a vaccine for Pseudomonas aeruginosa? Future Microbiology 2012, 7 (12): 1333-1335.

26. Wu W, Huang J., Duan B. et al. Th17-stimulating protein vaccines confer protection against Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2012, 186: 420-427.

Поступила 12.02.13

Контактная информация: Михайлова Наталья Александровна, д.м.н., проф.,

105064, Москва, М.Казенный пер., 5А, р.т. (495)917-56-30

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Е.В.Сорокина, Н.К.Ахматова, С.А.Сходова

ВЛИЯНИЕ ТЕРАПИИ ИММУНОВАК-ВП-4 НА ЭФФЕКТОРЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ КОЛЬЦЕВИДНОЙ ЦЕНТРОБЕЖНОЙ ЭРИТЕМОЙ ДАРЬЕ

НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва

Цель. Выявление особенностей функционирования звеньев врожденного и адаптивного иммунитета у больных кольцевидной центробежной эритемой Дарье (ЭКЦ). Материалы и методы. Обследованы 14 больных ЭКЦ в возрасте от 14 до 52 лет. Больные были ранжированы в зависимости от вида терапии. Первую группу составили 6 больных, которые получали Иммуновак-ВП-4 (далее — Иммуновак) на фоне базисной терапии; вторая группа (4 больных) получала кагоцел на фоне базисной терапии; третья группа (4 больных) получали только базисную терапию; группу здоровых лиц составили 15 чел. Всем больным определяли уровень цитокинов в сыворотке крови методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем фирмы «Biosource» (Австрия). Оценку экспрессии TLRs на мононуклеарных лимфоцитах периферической крови и кератиноцитах осуществляли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов; содержание субпопуляций лимфоцитов в крови проводили с использованием моноклональных антител методом проточной цитометрии на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США). Результаты. Иммунотерапия Иммуновак и кагоцелом способствовала повышению CD3+, CD4+, CD8+. Иммуновак способствовал значительному повышению исходно низких значений CD25+, CD95+ и нормализации CD72+; нормализации уровня IgM. Иммуновак повышал уровень сывороточного IL-2, вызывал повышение синтеза IFN-y в отличие от кагоцела и базисной терапии, при применении которых происходило его снижение. TGF- в повышался в ходе иммунотерапии Иммуновак и снижался при базисной терапии. В ходе базисной терапии наблюдали достоверное повышение исходно повышенного уровня цитокина IL-1p. Заключение. Терапия Иммуновак приводила к коррекции содержания популяций лимфоцитов, сывороточных цитокинов, способствуя нормализации процессов пролиферации иммунокомпетентных клеток, активации NK-клеток, макрофагов и, в то же время, подавлению реакций ГЗТ. Иммуновак способствовал усилению экспрессии TLR3, 9 в коже, что указывает на включение внутриклеточных рецепторных механизмов врожденного иммунитета.

Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 87—94

Ключевые слова: кольцевидная центробежная эритема, Toll-подобные рецепторы, Иммуновак-ВП-4, кагоцел