Влияние штамма Escherihia coli s5/98, входящего в состав пробиотика микроцикола, на антилизоцимную активность энтеробактерий

Влияние штамма Escherihia одП S5/98, входящего в состав пробиотика микроцикола, на антилизоцимную активность энтеробактерий

В. В. Герасименко, В. Н. Никулин, д.с.-х.н, А. Г. Гудков, Оренбургский ГАУ; О. Л. Карташова, д.б.н,

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; Б. В. Тараканов, д.б.н., ГНУВНИИФБиПс.-х. животных

Фундаментальные исследования современной биологической, медицинской и ветеринарной науки позволили разработать и внедрить в практику многие пробиотики, основу которых составляют живые микробные культуры. Исследования взаимодействия пробиотиков с живым макроорганизмом показали, что процессы взаимодействия намного сложнее, чем простое подавление роста и активности болезнетворных микроорганизмов. Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов. В то же время эти биопрепараты характеризуются выраженным клиническим эффектом при лечении острых кишечных инфекций. Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, регулировать и стимулировать пищеварение. Проведенные исследования показали, что при применении пробиотиков значительно увеличиваются прирост живой массы и продуктивность животных, а продукты сохраняются безопасными, в отличие от профилактики и лечения, основанных на использовании антибиотиков. Изучение механизмов влияния пробиотиков на микрофлору кишечника имеет исключительно важное значение. Установление зависимости состояния микрофлоры и ее свойств от действия используемого пробиотика — одна из задач, поставленных перед современной микробиологией.

Материалы и методы исследований. В нашем опыте в качестве пробиотика был выбран микро-цикол, изготовляемый на основе штамма Escherihia coli S5/98, продуцирующего микроцин типа В. Изначально нами были выделены 2 типа колоний Escherihia coli из препарата; первый тип обладал АЛА в среднем 4 (мкг/мл), второй — 2 . В качестве исследуемых микроорганизмов были выбраны следующие виды энтеробактерий: Escherihia coli 295 (у данного штамма не обнаружено патогенных свойств), 2 штамма клебсиелл — Klebsiella 15, Klebsiella 597, обладающие патогенными свойствами. Сокультивирование осуществлялось тремя сериями (в каждой серии — 20 пробирок): 1,0 мл взвеси исследуемого штамма + 0,1 мл взвеси штамма пробиотика 1 типа; 1,0 мл взвеси

исследуемого штамма + 0,1 мл взвеси штамма пробиотика 2 типа и контроль (1,0 мл взвеси исследуемого штамма). Мутность взвеси — 10 ед. оптического стандарта. Через сутки определялась ан-тилизоцимная активность чашечным методом. Для этого был приготовлен ряд чашек Петри с питательным агаром, содержащим лизоцим в концентрации от 0 до 6 мкг/мл. На поверхность приготовленных сред «пяточками» были высеяны исследуемые суточные агаровые культуры микроорганизмов. После суточной инкубации в термостате выросшие колонии были убиты парами хлороформа. Затем сверху на колонии наслоили 3 мл полужидкого (0,7%) агара, смешанного с 0,1 мл взвеси индикаторной культуры М^гососсш 1и1еиБ (1узоёе1Шси8) АТСС 15307. Через сутки инкубации в термостате был проведен учет результата опыта по наличию роста микрококка на поверхности и вокруг исследуемых колоний, инактивировавших известную концентрацию лизоцима, внесенного в питательную среду. На поверхности и вокруг неактивных культур рост микрококка отсутствует.

Результаты исследований и их обсуждение. Целью проведенного нами исследования было выяснить действие пробиотика на антилизоцимную активность (АЛА) энтеробактерий. Были получены следующие результаты, которые представлены в таблицах 1, 2 и 3.

1. Влияние Escherihia coli S5/98 на АЛА Klebsiella 15, мкг/мл

№ пробирки Опыт Контроль

колонии 1 типа колонии 2 типа Кл. 15

1 1 2 3

2 1 2 3

3 1 2 3

4 1 2 3

5 1 2 3

6 1 3 5

7 1 2 4

8 1 2 3

9 1 2 3

10 1 2 4

11 1 2 3

12 1 2 3

13 1 2 3

14 1 3 3

15 1 2 4

16 1 2 3

17 1 2 3

18 1 2 2

19 1 2 3

20 1 2 3

2. Влияние Escherihia coli S5/98 на АЛА Klebsiella 597, мкг/мл

№ пробирки Опыт Контроль

колонии 1 типа колонии 2 типа Кл. S97

1 1 2 З

2 i 2 З

3 i 2 З

4 i 2 З

5 i 2 З

6 2 З S

7 2 2 З

8 i 2 З

9 i З 4

10 1 З З

11 1 2 4

12 i 2 З

13 i 2 З

14 i З 4

15 i 2 4

16 i 2 З

17 2 З 4

18 i 2 2

19 2 З З

20 1 2 З

3. Влияние Escherihia coli S5/98 на АЛА Escherihia coli 295, мкг/мл

№ пробирки Опыт Контроль

колонии 1 типа колонии 2 типа E. coli 29S

1 б S З

2 б S З

3 б S З

4 S S З

5 б S З

6 S S З

7 S S 4

8 S б З

9 S S З

10 б S З

11 S б 2

12 4 б 2

13 S б 4

14 S S 4

15 S S З

16 S б З

17 б S З

18 б S 2

19 б S З

20 б S З

Исходное значение антилизоцимной активности у Klebsiella 15 составило 3,2 мкг/мл, после со-культивирования с пробиотиком АЛА — снизилось до 1,5 мкг/мл.

Оценка влияния пробиотиков на факторы пер-систенции бактерий представляет собой достаточно интересную и перспективную задачу. Ее решение дает возможность спрогнозировать, каким образом качественно и количественно изменится состав микрофлоры кишечника под действием того или иного пробиотического препарата.

Как видно из данных табл. 2, АЛА у штаммов клебсиеллы 597 изначально составила 3,2 мкг/мл, а после сокультивирования снизилась до 1,75 мкг/мл.

Антилизоцимный признак является одним из секретируемых факторов персистенции бактерий и определяется как способность бактерий специфически инактивировать лизоцим хозяина [2]. По своей химической природе антилизоцимный признак представляет собой термостабильный анионный белок с молекулярной массой 21 кД, инактивируемый трипсином [3]. Таким образом, обладая этим признаком, энтеробактерии обеспечивают себя дополнительным механизмом выживания, «расчищая» эконишу в условиях внутриклеточного паразитирования [1].

Исходное значение АЛА у штамма Е. соН 295 составило 3,1 мкг/мл, после сокультивирования повысилось до 5,2 мкг/мл.

Персистенция патогенов внутри клеток организма, представленных как микро- и макрофагами, так и непрофессиональными фагоцитами, обеспечивается комплексом разнообразных механизмов, и в частности, антилизоцимным фактором возбудителя. На роль такого фактора, способствующего выживанию паразита, обратили внимание О. В. Бухарин и Б.Я. Усвяцов [2]. Обнаружена и зависимость между степенью антилизоцимной активности стафилококков и интенсивностью их размножения внутри эпителиоци-тов, а также длительностью перстистирования: от резидентных бактерионосителей значительно чаще выделялись штаммы с высокой АЛА [4]. Поскольку существует зависимость между свойствами энтеробактерий инактивировать лизоцим и динамикой их персистенции в организме хозяина, то вполне логично выявить степень влияния пробиотика на течение кишечных заболеваний, например, дисбактериоза. Микро-циногенный штамм EcS 5/98 обладает средней вирулентной дозой при введении мышам в желудок более 1011 микробных клеток на животное [5], не оказывает токсичного, токсигенного и аллергенного действия на организм лабораторных животных, не раздражает неповрежденные слизистые оболочки и имеет низкий порог диссе-минации во внутренние органы и ткани. По совокупности полученных данных изученный штамм EcS 5/98 отнесен к четвертому классу опасности, т.е. является малоопасным для человека и животных.

Исследования свидетельствуют, что в отношении двух штаммов клебсиелл пробиотик оказывал ингибирующее действие: в среднем микроци-кол вызывал снижение АЛА на 50%. Причем штамм пробиотика с высокой АЛА оказывал более интенсивное воздействие. На штамм Escherihia соН пробиотик оказывал стимулирующее действие: после сокультивирования в сред-

нем АЛА увеличилась на 40%. Таким образом, можно говорить о разнонаправленном влиянии пробиотика на персистенцию энтеробактерий при дисбактериозе. Так как исследуемые штаммы клебсиелл являются представителями патогенной микрофлоры, а штамм Escherihia coli — резидентной, то полученные данные частично объясняют механизм действия микроцикола на микрофлору кишечника, когда в результате его воздействия факторы персистенции патогенных бактерий подавляются, а резидентной микрофлоры — стимулируются.

Литература

Бухарин, О. В. Персистенции патогенных бактерий. — М.: Изд-во «Медицина», 1999. — С.26—58.

Соколов, В. Ю., Бухарин О. В. Связь структуры и функции бактерий в явлении микробной персистенции // Успехи совр. биологии. - 1994. - Т. 114. - Вып. 2. - С. 183-195. Усвяцов, Б. Я. Лизоцимная и антилизоцимная активность патогенных кокков: автореф. дис. ... докт. мед. наук. — Л., 1986 - С.14-21.

Чернова, О. Л. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве: автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Челябинск, 1989. — С.13—21. Тараканов, Б. В., Николичева, Т. А., Комкова, Н. М., Полякова Л. Л. Исследование безвредности микроциногенного штамма Escherichia coli S 5/98 для лабораторных животных. // Труды ВНИИ физиологии, биохимии и питания с.-х. животных. — Боровск, 2002. — С.4—13.