Способ индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены у млекопитающих
METHOD FOR INDUCING IMMUNOLOGICAL TOLERANCE ON TRANSPLANTATION ANTIGENS IN MAMMALS

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены с помощью трансфецированных дендритных клеток у млекопитающих, в том числе человека, и может быть использовано для снижения трансплантационных реакций, включая отторжение трансплантата и реакцию трансплантат против хозяина.
Проблемы отторжения пересаженных органов и реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) остаются актуальными, несмотря на современные методы антигенного совмещения тканей донора и реципиента и эффективную медикаментозную терапию. Так, согласно литературным данным, 60 из 315 аллотрансплантатов почки подвергаются острой реакции отторжения [Understanding the Causes of Kidney Transplant Failure: The Dominant Role of Antibody-Mediated Rejection and Nonadherence J. Sellares et all, American Journal of Transplantation 2012; 12: 388-399], а в 1921 из 2813 случаев неродственной пересадки костного мозга возникает острая реакция трансплантат против хозяина [Graft-versus-host disease in recipients of male unrelated donor compared with parous female sibling donor transplants. Anita J. Kumar et. all Blood Advances 2018 2:1022-1031].
В основе отторжения трансплантатов и РТПХ лежит развитие иммунного ответа на трансплантационные антигены, представленные в пересаженных тканях и организме реципиента соответственно, главным образом на антигены основных и минорных молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Принципиальная возможность индукции иммунологической толерантности, т.е. активной неотвечаемости иммунной системы, на трансплантационные антигены была показана в середине XX века П.Б. Медоваром, за что исследователь получил Нобелевскую премию [R.E. Billingham, L. Brent, Р.В. Medawar, Actively acquired tolerance of foreign cells, Nature 172 (1953) 603-606].
На данный момент для индукции иммунологической толерантности широко используются дендритные клетки (ДК). Дендритные клетки управляют иммунным ответом путем представления эпитопов антигена и ряда костимулирующих или ингибирующих сигналов лимфоцитам. В результате полученного сигнала лимфоциты приобретают способность игнорировать или уничтожать объекты, несущие представленные эпитопы антигена. Современный уровень биотехнологии позволяет модулировать активность дендритных клеток с целью получения иммунологической толерантности в ответ на определенный, в т.ч. трансплантационный, антиген.
Так, известно, что дендритные клетки, демонстрирующие незрелый фенотип, способствуют снижению иммунного ответа на трансплантационный антиген и продлевают выживание трансплантата, т.е. проявляют толерогенную функцию [Fu F., Li Y., Qian S., Lu L., Chambers F., Starzl Т.Е., et al. Costimulatory molecule-deficient dendritic cell progenitors (MHC class II+, CD80dim, CD86-) prolong cardiac allograft survival in nonimmunosuppressed recipients. Transplantation. 1996; 62: 659-65. Lutz M.B., Suri R.M., Niimi M., Ogilvie A.L., Kukutsch N.A., Rossner S. et al.].
Для получения таких незрелых-толерогенных ДК используют инкубирование клеток в среде, обедненной факторами созревания [Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivo. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 1813-22.], а также культивирование клеток в среде с дексаметазоном, витамином D, рапамицином, циклоспорином, ретиноевой кислотой и др. Такие ДК обладают пониженной экспрессией молекул костимуляции (CD80 и CD86) и провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-2, IL-12, INF-γ, TNF-α), повышенной экспрессией ингибиторных молекул (PD-L1, ICOSL) и противовоспалительных цитокинов (IL-10 и TGF-β), а также повышенной способностью активировать регуляторные Т-клетки, что и обеспечивает их толерогенную функцию [Haibin Li, Bingyi Shi, Tolerogenic dendritic cells and their applications in transplantation, Cell Mol Immunol. 2015 Jan; 12(1): 24-30.]. Однако, при попадании в условия in vivo, полученные таким образом клетки могут изменять свою функцию с толерогенной на иммунногенную в связи с провоспалительным влиянием их нового окружения [Generation, Characteristics and Clinical Trials of Ex Vivo Generated Tolerogenic Dendritic Cells, Sang-Hyun Kim, Ho-Hyun Jung, and Chong-Kil Lee, Yonsei Med J 2018 Sep; 59(7):807-815].
Для стабилизации толерогенных свойств ДК при переносе в организм реципиента используется метод трансфекции дендритных клеток ДНК-конструкциями, кодирующими различные иммунорегуляторные протеины.
Например, ДК мыши, трансфецированные лентивирусной конструкцией, кодирующей IL-10, вызывают снижение иммунного ответа на аллоантигены и трансплантационные антигены в реакции смешанной культуры лимфоцитов и реакции трансплантат против хозяина, соответственно [Wan J, Huang F, Hao S, Ни W, Liu С, Zhang W, Deng X, Chen L, Ma L, Tao R. lnterleukin-10 Gene-Modified Dendritic Cell-Induced Type 1 Regulatory T Cells Induce Transplant-Tolerance and Impede Graft Versus Host Disease After Allogeneic Stem Cell Transplantation. Cell Physiol Biochem. 2017; 43(1):353-366].
Для придания иммунологической толерантности антигенспецифичности дендритные клетки нагружают антигеном, против которого необходимо создать толерантность. На данный момент для нагрузки толерогенных ДК трансплантационными антигенами используют добавление к культуре клеток материала донора, например, клеточного или тканевого лизата донора [Alloantigen-specific T-cell hyporesponsiveness induced by dnIKK2 gene-transfected recipient immature dendritic cells, Fan C.B. et. all, Cell Immunol. 2015 Oct; 297(2):100-7] или везикул из донорской ткани [Renal Allograft Survival in Nonhuman Primates Infused with Donor Antigen-Pulsed Autologous Regulatory Dendritic Cells, M.B. Ezzelarab et. all, Am J Transplant. 2017 Jun; 17(6): 1476-1489]. Однако, такой способ не обеспечивает долговременного присутствия трансплантационного антигена в дендритных клетках, в результате чего свойство антигенспецифичности, индуцируемой ими толерантности, может пропадать при переносе в организм реципиента, что может приводить к индукции неспецифической толерантности в том числе и на потенциально опасные инфекционные и злокачественные агенты [Optimizing the process of nucleofection for professional antigen presenting cells, Mullins et al. BMC Res Notes (2015) 8:472; Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer, Jacques Banchereau, Nature Reviews (2005), Vol. 5, 296-306]. Для решения данной проблемы также используется метод трансфекции антигена в дендритные клетки для его длительной экспрессии в организме реципиента и формирования именно антигенспецифической толерантности.
Ряд способов индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены с помощью дендритных клеток описаны в российских и зарубежных патентах.
В патенте [RU 2597976, А61К 48/00, 2011] толерогенные дендритные клетки для снижения реакции отторжения и РТПХ получают с помощью инкубирования их предшественников в присутствии (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4] триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевины. Нагрузка полученных толерогенных ДК антигеном в способе не предусмотрена.
В патентах [JP 2004298181, А61К 35/12, 2004; US 2005032210, А61К 35/12, 2005] для снижения реакции отторжения и РТПХ толерогенные дендритные клетки получают с помощью инкубирования их предшественников в присутствии иммунорегуляторных цитокинов IL-10 и TGF-β. Нагрузка ДК антигеном происходит также простым добавлением в среду трансплантационного антигена.
В патенте [US 2017340669, А61К 35/15, 2017] толерогенные дендритные клетки для снижения реакции отторжения и РТПХ получают с помощью инкубирования их предшественников в присутствии дексаметазона и витамина D2. Нагрузка ДК антигеном происходит также простым добавлением в среду трансплантационного антигена.
В патенте [WO 2013036300, А61К 39/00, 2013] толерогенные дендритные клетки для снижения реакции отторжения и РТПХ получают с помощью инкубирования их предшественников в присутствии рапамицина и TGF-β. Нагрузка ДК происходит добавлением к среде не самого трансплантационного антигена, а его рестриктированных по ГКГС 1го или 2го типа эпитопов.
Недостатком описанных способов является то, что индукцию толерогенности ДК и нагрузку их антигеном или эпитопами производят простым добавлением соответствующих факторов в среду к дендритным клеткам. После переноса таких ДК в организм реципиента, данные факторы будут отсутствовать, что приводит к нарушению индукции такими ДК антигенспецифической толерантности и, впоследствии, к нежелательным иммунным реакциям, таким как развитие иммунного ответа вместо его подавления (в случае отсутствия формирования толерантности), а также индукции толерантности на потенциально опасные инфекционные и опухолевые агенты (в случае отсутствия способности ДК индуцировать именно антигенспецифическую толерантность).
Данные недостатки частично устранены в способе снижения реакции отторжения, где для обеспечения толерогенности ДК предложена их генетическая модификация вирусным вектором, кодирующим IL-10, TGF-β или другие иммунорегуляторные цитокины. Для обеспечения антигенспецифичности индукции иммунологической толерантности предложено включение в тот же вирусный вектор последовательностей, кодирующих трансплантационный антиген, в частности ГКГС. Таким образом, предлагаемая в патенте трансфекция генетически модифицирует ДК и закрепляет в них экспрессию иммунорегуляторных цитокинов и антигенов, необходимых для индукции антигенспецифической толерантности в организме реципиента. Также в способе предложено сокультивирование полученных генетически модифицированных дендритных клеток и аутологичных лимфоцитов для получения регуляторных Т-клеток с последующим введением полученной культуры реципиенту для усиления толерогенного эффекта [US 2004132674, А61К 35/12, 2004].
Однако, способ предполагает обязательное включение в вирусный вектор патентуемую иммунорегуляторную последовательность из гена фасцина, а остальные описанные последовательности, кодирующие иммунорегуляторные протеины и антигены, используются лишь в качестве возможной модификации этого вирусного вектора. Таким образом, данный способ индукции иммунологической толерантности осложняется необходимостью кодирования иммунорегуляторной последовательности из гена фасцина, а может быть использован только для снижения реакции отторжения, но не РТПХ.
Наиболее близким к заявленному способу является способ индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены у млекопитающих, включающий трансфекцию незрелых дендритных клеток ДНК-конструкцией, кодирующей иммунорегуляторный цитокин IL-10. В данном способе реципиенту вводят незрелые дендритные клетки, генетически модифицированные методом вирусной трансфекции для экспрессии минимум двух иммунорегуляторных белков в т.ч. IL-10, и трансплантационных антигенов, имеющих минимум 1 эпитоп. [US 2008311140, А61К 39/00, C12N 5/10, 2008].
Недостатком способа является сохраняющаяся возможность неэффективной презентации антигена дендритными клетками, поскольку целый белок антигена, трансфецированный в ДК, нуждается в дальнейшем процессинге и расщеплении до презентируемых эпитопов и, таким образом, сохраняет вероятность того, что: во-первых, антиген может вообще не расщепиться до требуемых эпитопов и не будет выполнять поставленную перед ним задачу обеспечения антигенспецифичности иммунологической толерантности; во-вторых, антиген может расщепиться до неиммуногенных эпитопов и тогда не будет выполнять данную задачу с должной эффективностью. Тем самым трансфекция целого белка антигена в ДК не гарантирует эффективной индукции антигенспецифической толерантности.
Кроме того, использование вирусного вектора для трансфекции ДК, которые далее вводятся реципиенту, требует дополнительных мер биологической безопасности, а сама вирусная трансфекция является генномодифицирующей и нарушает собственный геном ДК, что потенциально опасно при введении таких клеток реципиенту.
Задача изобретения заключается в создании более эффективного способа индукции антигенспецифической иммунологической толерантности, за счет доставки в ДК именно эпитопов трансплантационного антигена, а не целого антигена.
Поставленная задача решается в предложенном способе индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены у млекопитающих, включающем трансфекцию незрелых дендритных клеток ДНК-конструкцией, кодирующей иммунорегуляторный цитокин IL-10, путем индукции толерантности на трансплантационные антигены с помощью котрансфекции незрелых дендритных клеток дополнительной ДНК-плазмидой, кодирующей специально подобранные иммуногенные различающиеся у донора и реципиента эпитопы белков главного комплекса гистосовместимости, при этом трансфекция является негенномодифицурующей, а полученные трансфецированные дендритные клетки сокультивируют с аутологичными лимфоцитами для индукции регуляторных Т-клеток, с последующим введением реципиенту полученных культур.
Изобретение, на наш взгляд, является новым.
Увеличение эффективности индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены в заявленном способе обеспечивается котрансфекцией дендритных клеток дополнительной ДНК-плазмидой, кодирующей специально подобранные иммуногенные различающиеся у донора и реципиента эпитопы белков главного комплекса гистосовместимости, а не сам антиген, как в известном способе, что гарантирует презентацию дендритными клетками эпитопов, необходимых для эффективной индукции антигенспецифической иммунологической толерантности. Также эффективность индукции иммунологической толерантности на трансплантационные антигены увеличивается за счет этапов сокультивирования трансфецированных ДК и аутологичных лимфоцитов для индукции регуляторных Т-клеток. Полученные после сокультивирования клеточные культуры содержат регуляторные Т-клетки и обладают способностью к индукции толерантности к антигенам.
Изобретение осуществляется следующим образом
2
-4
2
Дендритные клетки получают из костного мозга мышей или из мононуклеарных клеток периферической крови человека. Суспензия клеток костного мозга мышей или мононуклеарные клетки периферической крови человека дважды промываются средой RPMI-1640. Далее клетки высаживаются в культуральный флакон 75 см и инкубируются в атмосфере 5% CO при 37°С. Через 30 минут инкубирования неприлипшая фракция клеток сливается. Прилипшая фракция собирается скребком, отмывается в среде RPMI-1640 и высаживается во флакон в концентрации 1 млн. клеток на 1 мл среды для культивирования, содержащей среду RPMI-1640, с добавлением 10% FCS, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера, 5*10М 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл бензилпенициллина. Для дифференцировки клеток в незрелые дендритные клетки в среду добавляют 20 нг/мл rmGM-CSF и 20 нг/мл rmIL-4. Через 48 часов культивирования выполняется смена среды для культивирования с повторным добавлением 20 нг/мл rmGM-CSF и 20 нг/мл rmIL-4. Через 72 часа культивирования дифференцированные незрелые дендритные клетки снимаются с пластика скребком в собственной среде и центрифугируются для получения односуточной кондиционной среды и клеточного осадка. Односуточная кондиционная среда эвакуируется и сохраняется. Клеточный осадок, т.е. дифференцированные незрелые дендритные клетки, подвергаются трансфекции путем электропорации кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы белков ГКГС и кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы молекул ГКГС и кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими мышиный или человеческий IL-10. Электропорация осуществляется в холодной среде OptiMem, содержащей 20 млн/мл дендритных клеток на электропораторе (например, ВТХ 830 square-wave) при следующих параметрах: сила импульса 260 V, длительность импульса 5 ms, концентрация плазмидной ДНК 60 мкг/мл. Далее, трансфецированные дендритные клетки ссаживаются с аутологичными спленоцитами мышей или аутологичными мононуклеарными клетками человека в соотношении 1:10 - 1:100 и культивируются в среде, состоящей из среды для культивирования и односуточной кондиционной среды в соотношении 1:1 без добавления факторов созревания. Через 72 часа полученная культура отмывается и используется для индукции иммунологической толерантности для снижения реакции отторжения или РТПХ. Причем для профилактики РТПХ готовят культуру толерогенных клеток донора а для профилактики отторжения культуру толерогенных клеток реципиента.
Способность изобретения индуцировать иммунологическую толерантность показана экспериментально в различных моделях, например, в смешанной культуре лимфоцитов, реакции отторжения кожного лоскута и в реакции трансплантат против хозяина.
Пример 1.
Индукция иммунологической толерантности у мышей линии C57BI/6 на белки ГКГС мышей линии СВА.
Незрелые дендритные клетки получали, как описано выше, из костного мозга мышей линии C57BI/6. Дендритные клетки трансфецировали кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы молекул Н-2K (pGVHD), т.е. аллеля ГКГС мышей линии СВА или кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы молекул Н-2К и кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими мышиный IL-10 (pGVHD+pIL-10). Далее дендритные клетки сокультивировали с аутологичными спленоцитами как описано выше.
Для установления способности полученных толерогенных культур ограничивать активацию аутологичных спленоцитов в ответ на стимуляцию аллоантигенами была поставлена смешанная культура лимфоцитов. Полученные толерогенные культуры мышей C57BI/6 сокультивировались со спленоцитами мышей СВА, предварительно обработанных митомицином С. Через 72 часа совместного культивирования оценивался уровень пролиферации в культурах и высчитывался индекс подавления пролиферации (пролиферация толерогенной культуры/пролиферация толерогенной культуры при добавлении аллогенных спленоцитов мышей СВА, обработанных митомицином С). Таким образом, чем выше оказывался индекс подавления, тем меньше пролиферировала исследуемая культура в ответ на стимуляцию аллоантигенами. Результаты показали, что культуры, полученные с помощью толерогенных ДК, трансфецированных pGVHD и pGVHD+pIL-10 обладают статистически значимо большей способностью угнетать пролиферацию аутологичных спленоцитов в ответ на аллогенный стимул по сравнению с культурой, полученной с помощью ДК, трансфецированных контрольной плазмидой р5, кодирующей неиммунногенные эпитопы. На рис. 1 представлен индекс подавления пролиферации аутологичных спленоцитов в ответ на аллогенный стимул для полученных культур. Стрелками показаны статистически достоверные отличия р<0.05. Представленные данные говорят о выполнении толерогеннной функции культурами, полученными с помощью ДК, трансфецированными pGVHD и pGVHD+pIL-10 в условиях in vitro.
Для установления способности полученных культур снижать реакцию отторжения in vivo была использована модель отторжения кожного лоскута. До пересадки кожного лоскута мышам C57BI/6 подкожно в область будущей операции вводили 1 млн клеток из культур, полученных с помощью толерогенных дендритных клеток. Через 24 часа мышам линии C57BI/6 на спину трансплантировали кожный лоскут с хвоста мышей линии СВА. Через 72 часа после трансплантации осуществляли повторное введение клеток толерогенных культур в количестве 1 млн. Выживаемость кожного лоскута оценивалась по его некротическим изменениям. Медиана выживаемости кожного лоскута при введении мышам, культур, полученных с помощью толерогенных ДК, трансфецированных pGVHD и pGVHD+pIL-10 составила 15 и 17 суток соответственно, что статистически значимо больше по сравнению с группой введения мышам контрольных культур DCp5 (10 суток). На рис. 2, показаны кривые выживаемости кожных лоскутов от мышей СВА, трансплантированных мышам C57BI/6, которым были введены толерогенные культуры.
Для установления способности полученных толерогенных культур in vivo угнетать реакцию трансплантат против хозяина мышам линии CBF, т.е. первому поколению от скрещивания C57BI/6 и СВА, внутривенно вводили 100 млн. клеток из полученных толерогенных культур. Выраженность реакции РТПХ оценивали по весу селезенки. Результаты показали, что вес селезенок мышей, которым были введены культуры, полученные с помощью толерогенных ДК, трансфецированных pGVHD и pGVHD+pIL-10, оказался статистически значимо меньшим по сравнению с весом селезенок мышей, которым вводили контрольные культуры DCp5. На рис. 3 показан вес селезенки мышей CBF через 3 недели после введения им полученных толерогенных культур. Стрелками показаны статистически достоверные отличия р<0.05.
Полученные результаты говорят о том, что предлагаемый способ индукции иммунологической толерантности с помощью дендритных клеток, трансфецированных ДНК-конструкциями, кодирующими эпитопы белков главного комплекса гистосовместимости, действительно индуцирует толерантность на трансплантационные антигены и способен подавлять реакции отторжения и трансплантат против хозяина у мышей.
Пример 2.
Индукция иммунологической толерантности на аллоантигены ГКГС в смешанной культуре лимфоцитов человека.
Для установления способности ДК, трансфецированных эпитопами белков ГКГС, индуцировать иммунологическую толерантность в смешанной культуре лимфоцитов человека среди 10 условно-здоровых доноров были выбраны пары «стимулятор»-«ответчик», где МНК «ответчика» наиболее выражено пролиферировали на МНК «стимулятора» в условиях смешанной культуры лимфоцитов. Гены ГКГС выбранных «стимуляторов» и «ответчиков» были секвенированы. На основе данных секвенирования были разработаны и синтезированы кольцевые ДНК-плазмиды, кодирующие подобранные иммуногенные эпитопы белков ГКГС «стимуляторов», способные встраиваться в антигенсвязывающие желобки ГКГС I класса «ответчиков» (рСКЛ). Далее полученные плазмиды использовались в экспериментах с соответствующими парами «стимулятор»-«ответчик».
Незрелые дендритные клетки получали как описано выше из мононуклеарных клеток периферической крови человека. Дендритные клетки доноров-"ответчиков" трансфецировали кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы белков ГКГС доноров-"стимуляторов"(рСКЛ) или кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы ГКГС доноров-"стимуляторов" и кольцевыми ДНК-плазмидами, кодирующими человеческий IL-10 (рСКЛ+pIL-10). Далее дендритные клетки культивировали совместно с аутологичными МНК как описано выше. Полученные культуры использовали для дальнейшего анализа и постановки смешанной культуры лимфоцитов человека.
hi
Через 96 часов в культурах, полученных с помощью ДК, трансфецированных рСКЛ и рСКЛ+pIL-10 была обнаружена значимо большая экспрессия FoxP3 среди CD4+CD25 клеток по сравнению с исходной культурой мононуклеарных клеток (Рис. 4А). Также в кондиционных средах этих групп обнаружено значимо большее содержание IL-10 (Рис. 4Б). На рис. 4. показано содержание Т-регуляторных клеток (А) и продукция IL-10 (Б) в совместных культурах МНК и ДК, трансфицированных плазмидами, кодирующими антигены ГКГС и IL-10.
Полученные данные говорят о выполнении полученными дендритными клетками толерогенной функции через активацию регуляторных Т-клеток и секрецию IL-10.
Для оценки способности полученных толерогенных культур ограничивать активацию аутологичных МНК в ответ на стимуляцию аллоантигенами была поставлена смешанная культура лимфоцитов. Полученные с помощью трансфекции ДК рСКЛ или рСКЛ+pIL-10 культуры мононуклеарных клеток доноров-"ответчиков" культивировались совместно с МНК доноров-"стимуляторов", предварительно обработанных митомицином С. Через 96 часов совместного культивирования оценивался уровень пролиферации в культурах и высчитывался индекс подавления пролиферации (пролиферация толерогенной культуры доноров-«ответчиков»/пролиферация толерогенной культуры доноров-ответчиков» при добавлении аллогенных МНК доноров-"стимуляторов", обработанных митомицином С). Следовательно, чем выше оказывался индекс подавления, тем меньше пролиферировала исследуемая культура в ответ на стимуляцию аллоантигенами. Результаты показали, что культуры, полученные с помощью толерогенных ДК, трансфецированных рСКЛ или рСКЛ+pIL-10, обладают статистически значимо большей способностью угнетать пролиферацию аутологичных МНК в ответ на стимуляцию аллоантигенами по сравнению с исходной культурой мононуклеарных клеток (Рис. 5). На рис. 5 представлен индекс подавления пролиферации аутологичных МНК в ответ на аллогенный стимул для полученных культур. Стрелками показаны статически достоверные отличия р<0.05.
Таким образом, предлагаемый способ индукции иммунологической толерантности с помощью ДК, трансфецированных ДНК-плазмидами, кодирующими эпитопы ГКГС, действительно индуцирует иммунологическую толерантность и подавляет активацию аутологичных МНК в ответ на аллоантигенную стимуляцию в условиях смешанной культуры лимфоцитов человека in vitro.
Преимущества заявленного способа заключаются в увеличенной эффективности индукции именно антигенспецифической толерантности на трансплантационные антигены за счет котрансфекции в ДК дополнительной ДНК-плазмиды, кодирующей специально подобранные иммунногенные различающиеся у донора и реципиента эпитопы белков ГКГС, что гарантирует их презентацию дендритными клетками и индукцию толерантности именно на закодированные эпитопы трансплантационных антигенов. Вдобавок, эффективность индукции иммунологической толерантности повышается за счет этапов сокультивитрования трансфецированных ДК с аутологичными лимфоцитами для индукции регуляторных Т-клеток и последующего введения реципиенту полученных культур.
Предложенный способ является универсальным, поскольку может быть использован для снижения реакции отторжения органов и тканей в случае если иммунологическая толерантность индуцируется у реципиента на белки ГКГС трансплантата или для снижения РТПХ в случае если иммунологическая толерантность индуцируется у клеток трансплантата костного мозга донора на белки ГКГС реципиента.
Также, предложенный способ не требует дополнительных мер биологической безопасности, поскольку трансфекция ДК осуществляется методом электропорации с помощью невирусных кольцевых ДНК-плазмид, что, к тому же, не приводит к изменению собственного генома дендритных клеток.