Воздействия токсикантов и репродуктивные процессы in vitro

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

Попов В.Б., Голубенцева Ю.В., Сайтгалина М.А., Кириленко П.С., Арсеньева Е.А.

ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ И РЕПРОДУКТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ IN VITRO

ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Санкт Петербург

Значительные проблемы с мужской и женской фертильностью населения ставят перед биологией репродукции необходимость интенсивно развивать новые подходы для углублённого понимания процессов созревания гамет и последствий их реакции на воздействия неблагоприятных факторов среды, включая действие токсикантов. В последние годы существенно обновились методы культивирования мужских и женских гамет in vitro на различных стадиях гаметоге-неза, разработаны условия культивирования, позволяющие достигать высокой степени созревания половых клеток с учетом их взаимодействия с окружающими соматическими клетками. Стали развиваться способы коррекции отклонений, индуцированных воздействиями. Всё это позволило подойти к готовности культивируемых мужских и женских гамет к оплодотворению и последующему развитию зародышей. Настоящая работа рассматривает некоторые практические стороны созревания гамет in vitro в норме и при воздействиях токсикантами.

Ключевые слова: репродукция in vitro; фолликулогенез; сперматогенез; оплодотворение in vitro.

Для цитирования: Попов В.Б., Голубенцева Ю.В., Сайтгалина М.А., Кириленко П.С., Арсеньева Е.А. Воздействия токсикантов и репродуктивные процессы in vitro. Медицина экстремальных ситуаций. 2018; 20(3): 419-431.

Для корреспонденции: Попов Вадим Борисович, доктор биол. наук, ведущий научный сотрудник ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, 188663, Санкт Петербург. Е-mail: vpopovlr@mail.ru

Popov V.B., Golubentseva Yu.V., Sitgalina M.A., Kirilenko P.S., Arseneva E.A. EFFECTS OF TOXICANTS AND REPRODUCTIVE PROCESSES IN VITRO

Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology, Saint Petersburg, 188663, Russian Federation

Significant problems with the male andfemale fertility of the population pose to the biology ofreproduction the need to intensively develop new approaches for an in-depth understanding of the processes of gamete maturation and the consequences of their response to the impacts of adverse environmental factors, including the action of toxicants. In recent years, methods of cultivating male and female gametes in vitro at various stages of gametogenesis have been significantly updated, there have been developed cultivation conditions allowing reaching a high degree of maturation of germ cells, taking into account their interaction with surrounding somatic cells. There were begun to develop approaches to correct the deviations induced by effects. All this made it possible to achieve the readiness of cultivated male and female gametes for fertilization and the subsequent development of embryos. This paper considers some practical aspects of gamete maturation in vitro in normal conditions and under exposure to toxic effects. Keywords: reproduction in vitro; folliculogenesis; spermatogenesis; in vitro fertilization.

For citation: Popov V.B., Golubentseva Yu.V., Sitgalina M.A., Kirilenko P.S., Arseneva E.A. Effects of toxicants and reproductive processes in vitro. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations) 2018; 20(3): 419-431. (In Russ.).

For correspondence: Vadim B. Popov, MD, Ph.D., DSci., Leading Researcher, Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology of the Federal Medical And Biological Agency of Russia, St. Petersburg, 188663, Russian Federation. E-mail: vpopovlr@mail.ru

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received 01 June 2018 Accepted 10 September 2018

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Токсикологические аспекты процессов репродукции и развития отражают сложные многоплановые стороны реальной жизни, сталкивающейся с многочисленными угрозами и фактами нарушения гомеостаза (стресс, физические и химические воздействия, биотоксины, и т. п.), стремлением организмов перевести их в разряд обратимых; однако не всегда процессы регуляции восстанавливают приоритет нормы, и организм вынужден сосуществовать с патологическими - функциональными, морфологическими - отклонениями. Процесс репродукции последовательно проходит следующие основные этапы: мужской и женский гаметогенез, оплодотворение и, как итоговый этап, запускается эмбриональное развитие. Естественно, что воздействия способны значительно изменять качество развития половых клеток или, собственно эмбриона, блокируя, в исключительных случаях (например, высокая доза), текущий морфогенетический процесс (заселение гонад гоноцитами, фолликулогенез, сперматогенез, нейруляция и т. п.), в других случаях (умеренные, слабые дозы), продуцируя снижение пролиферативной активности клеток, торможение дифференцировки или дис-морфогенез зачатков, органов, плода в целом. Воздействие нередко приводит к тяжёлым последствиям, таким как гибель плода, тератогенез, инфертильность особи. Печально известна трагедия применения талидомида в 1957-1961 гг., когда, в результате приёма препарата в течение 1-го триместра беременности, более 10 000 детей были рождены с тяжёлыми дефектами развития, главным образом фокомели-ей и амелией, дефектами развития глаз, ушей, ЦНС [1-4]. Другой тяжелейший случай связан с отравлением 3000 людей в 1950-1960 гг. в Японии метилртутью, содержащейся в рыбе (болезнь Минамата). Аналогичный случай, унёсший жизни более 10 000 людей, произошёл в Ираке после употребления зерна, импортированного из Мексики, где метилртуть использовалась как фунгицид [5, 6]. Дети отравившихся матерей имели серьёзные дефекты развития, поведенческие нарушения. Болезнь Минамата продуцирует умственную отсталость, нарушение координации, дисартрию, деформацию конечностей, нарушение роста. Огромное количе-

420

ство токсикантов, обладающих повреждающим действием, потребляется людьми в виде пищевых загрязнений, лекарственных препаратов, алкоголя, табачного дыма и т. п. Всё это приводит к осложнениям репродуктивной функции, включая торможение роста плода, преждевременные роды, спонтанные аборты. Та же ртуть, по данным US Environmental Protection Agency, в концентрации выше 5,8 мг/л (уровень, эквивалентный референтной дозе 0,1 мг/кг/день) содержится в крови у 8% женщин детородного возраста США.

В современном мире значительную обеспокоенность вызывает высокая и имеющая тенденцию к росту частота бесплодных браков — 12—15%, при этом причины бесплодия могут возникнуть у обоих полов. Мужская стерильность или слабая плодовитость тесно связаны с нарушениями оплодотворяющей способности зрелых спермиев, либо с нарушениями функционирования сперматогенного эпителия, ведущими к массовой гибели клеток и, как следствие, олиго- или азооспермии [7-9]. Исследования последних десятилетий [10, 11] показывают резкое снижение количества сперматозоидов у молодых людей в возрасте 18—25 лет: менее 20 млн/мл, что на 15—20% ниже критериев нормы ВОЗ; при этом снижено и качество спермы [12]. Безусловно, возникновение проблем с фер-тильностью во многом зависит от географии проживания, экологических и генетических факторов. Так, среди медицинских причин женского бесплодия в странах Средиземноморского бассейна и в Юго-Восточной Азии признаётся туберкулёз половых органов, в некоторых регионах Африки ведущей причиной является непроходимость маточных труб, обусловленная инфекцией, в западных странах чаще встречается эндометриоз и нарушения овуляции.

Серьёзным достижением в лечении бесплодия явились результаты исследований в области репродукции in vitro. В настоящее время в медицинскую практику широко внедрены методы дополнительных репродуктивных технологий (assisted reproductive technology, ART), такие как оплодотворение in vitro (in vitro fertilization, IVF) или экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), ICSI (инъекция сперматозоидов в цитоплазму яйцеклетки для её оплодотворения),

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

кратковременное культивирование дробящихся яйцеклеток и их трансплантация реципиенту. ЭКО позволяет решать проблемы бесплодия даже, казалось, при безвыходных её формах: отсутствии или истощении яичников, непроходимости маточных труб и даже при отсутствии матки. Методами ART решаются многие проблемы, связанные как с женской, так и мужской инфертильностью. Так, ИКСИ используется для лечения мужского бесплодия, обусловленного отсутствием оплодотворения неясного генеза, тяжёлыми формами олигоастенотерато-зооспермии, обструктивной и необструктивной формами азооспермии, обусловленных дефектами созревания сперматогенных клеток [13].

В процессы репродукции активно вмешиваются экотоксиканты, нарушая, в частности эндокринное обеспечение фолликулогенеза, репродукции мужских гамет, процесса оплодотворения. Американским агентством защиты окружающей среды (USEPA, United States Environmental Protection agency) выделена даже определённая группа токсикантов, нарушающих эндокринное обеспечение фолликулогене-за (EDC, endocrine disrupting compounds). Они вмешиваются в синтез, секрецию, транспорт, связывание и элиминацию естественных гормонов, ответственных за поддержание гомео-стаза, репродукции, развития. Репротоксиканты способны вмешиваться во все этапы созревания гамет. В первую очередь воздействиям подвержены быстро пролиферирующие примордиаль-ные фолликулы, ооциты на стадии первого мей-отического деления, что приводит к значительной редукции пула постнатальных фолликулов. Поскольку зрелые яичники содержат фолликулы на всех стадиях созревания, а приморди-альные фолликулы присутствуют в яичниках женщин в течение примерно 45 лет - это делает их мишенью для острого и хронического действия репротоксикантов. Следует также иметь в виду, что клетки гранулёзы также подвержены повреждающему действию, что отражается на развитии фолликула и ооцита.

Нарушения созревания мужских и женских гамет приводят не только к бесплодным бракам, но и, наряду с пренатальными воздействиями, к высокому уровню потерь и дисморфогенезу плодов. Показано, что 2-5% детей при рожде-

нии имеют врождённые пороки развития (ВПР). В течение последующих лет ВПР дополнительно выявляются еще у 5—7% детей, а с учётом детей с умственной отсталостью и аномальными формами поведения, общее количество детей с ВПР составляет приблизительно 10—12% [1, 14]. Однако и эти цифры не соответствуют реальному уровню патологических исходов беременностей: сюда следует добавить высокий уровень пренатальных потерь и мертворожде-ний: около 10% оплодотворённых яйцеклеток человека не имплантируются в матку, а общее число пренатальных потерь достигает 50—70% [15, 16]. Половина зародышей и плодов погибают аномальными. С учётом пренатальных потерь, риск быть рождённым с ВПР, оценивается в 25—35%, однако профилактические и лечебные мероприятия способствуют его снижению на порядок [17]. Большинство исследователей отмечают мультифакторный характер причин, вызывающих значительные уровни ВПР, пре- и постнатальных потерь, выделяя при этом действие генетического компонента и факторов окружающей среды, а также их сочетанное действие [18, 19]. При этом действие химических факторов среды обусловливает 1—3% патологических исходов беременности [20, 21].

В настоящее время уже не вызывает сомнения необходимость исследований in vitro в области репродукции, поскольку высока отдача их в практическую медицину - развитие ART. Необходимы дальнейшие исследования проблем инфертильности, направленные на понимание механизмов повреждения, вмешивающихся в длительную цепь процессов созревания и дифференциации мужских и женских гамет. Методы исследования in vitro помогают моделировать процессы созревания, развития гамет, их слияния при оплодотворении, процессы развития ранних эмбрионов млекопитающих, и при этом оценивать тяжесть патологических преобразований, осуществляя поиск способов коррекции индуцированных нарушений, в первую очередь, связанных с инфертильностью.

Сперматогенез in vitro как модель оценки токсических воздействий

Сперматогенез — сложный динамический процесс, который включает в себя комплекс различных клеточных явлений: самообновле-

421

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ния, пролиферации, коммитации, дифференциации мужских половых клеток с образованием гаплоидной популяции сперматозоидов. Фундаментальные закономерности сперматогенеза активно изучаются на протяжении более 50 лет. Процесс начинается со сперматогенной стволовой клетки (ССК), способной к самообновлению и коммитации; это сперматогонии типа As (у мышей). ССК митотически делятся и дают начало новой генерации - сперматогониям типа Apr (спаренные), которые пролиферируют и образуют цепочки из 4, 8, 16 клеток- сперматого-ний типа Aal (групповые). Дальнейшие деления приводят к возникновению популяции клеток-сперматогоний типа В, которые уже дифференцированы и коммитированы, и их митотическое деление приводит к образованию качественно новых клеток — сперматоцитов I порядка, вступающих в профазу мейоза. Эти клетки ещё диплоидны по хромосомному набору и после двух мейотических делений дают начало четырём гаплоидным сперматидам, созревающим в зрелые сперматозоиды [22, 23].

Воссоздание in vitro полного процесса мужского гаметогенеза от сперматогоний до образования спермий пока невозможно. До 1960—70-х гг. эксперименты по сперматогенезу in vitro в основном проводили путём культивирования органов, а также культивированием отдельных семенных канальцев. Сперматогенез в таких культурах прогрессировал только до мейотической стадии сперматоцитов, но не до образования гаплоидной клетки. Попытки культивирования ССК не были успешны [24]. Только с развитием новых клеточных технологий и накоплением информации о механизмах сперматогенеза стало возможным продвижение исследований в области мужской репродукции: появились новые методы выделения ССК и их культивирования. Так, в 2003 г. М. Kanatsu-Shinohara с соавторами [25] получили долгосрочную культуру ССК, способных при трансплантации в семенники пролиферировать и восстанавливать нормальный сперматогенез после воздействия. Огромный вклад в изучение процессов и механизмов регуляции сперматогенеза внесли методы, основанные на использовании нокаутных моделей трансгенных животных. С их применением были найдены специфические гены/белки,

422

участвующие в регулировании функций ССК и всего сперматогенеза. Большинство мутаций, образующихся в процессе сперматогенеза, способствуют постепенному истощению пула ССК, что ведёт к снижению фертильности самцов. ССК и недифференцированные спермато-гонии экспрессируют транскрипционные факторы и белки PLZF, OCT-4, Nanog, Sox3, Ngn3, Gfr-a1. Нарушение функционирования локуса Zpf145 (кодирует транскрипционный репрессор PLZF) приводит с возрастом к потере спермато-гоний из-за увеличения апоптоза клеток с последующим нарушением структуры канальцев [26]. OCT-4-гомеобоксный фактор траскрип-ции, экспрессируется в раннем эмбриогенезе в ЭСК и ППК, постнатальных сперматогони-ях As, Apr, Aal и округлых сперматидах. Роль OCT-4 заключается в поддержании стволовости ССК, но не их пролиферации [27]. Мутации по сигнальному пути GDNF-GFRal также приводят к истощению пула ССК снижением пролиферации гоноцитов. GDNF-глиальный нейро-трофический фактор экспрессируется в клетках Сертоли, а его ко-рецептор GFRa1 расположен на поверхности недифференцированных спер-матогоний. Главная роль GFRal и GDNF — в регуляции самообновления ССК. Снижение экспрессии GFRal и GDNF приводит к нарушению сперматогенеза уже в первые дни после рождения (ДПР). В 2004 г. Kubota и соавт. показали, что GDNF регулирует процессы самообновления и дифференцировки ССК. Повышение уровня экспрессии этого гена приводит к накоплению ССК с возрастом, что проявляется канцерогенезом в гонадах таких животных [28]. Экспрессия транскрипционного фактора ERM в клетках Сертоли начинается на 15 ДПР и совпадает с моментом завершения их дифферен-цировки и является регулятором самообновления ССК. У мышей, несущих делеции в обоих аллелях гена ERM, выявляется истощение пула ССК и формируются канальцы только из клеток Сертоли. Критическую роль в транскрипционном регулировании сперматогенеза мыши играет гонадоспецифичный белок Taf4b, который регулирует экспрессию тирозинкиназы c-Ret, основного рецептора для GDNF, синтезируется в гоноцитах, а также в сперматогониях типа А у новорождённых. Самцы с дефицитом Taf4b

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

субфертильны; потери половых клеток у мышей выявляют в возрасте 3 мес [29].

Для дифференцированных сперматогоний характерна экспрессия таких специфических маркёров как рецептор тирозинкиназа с-KIT, STRA-8, SOHLH1, SOHLH2. За вступление сперматогоний типа А на путь дифференциров-ки отвечают белки семейства SOHLH (SOHLH1, SOHLH2). По наблюдениям H.Suzuki и соавт. [30], эти белки могут работать как гетеродиме-ры и как гомодимеры, и их экспрессия исчезает во время перехода от сперматогоний к типу В. Экспрессия с-KIT активируется в сперматого-ниях Aal, затем усиливается в Aj и далее экс-прессируется во всех дифференцированных сперматогониях (A2-4, In и B). Установлено, что экспрессия рецептора с-KIT активируется на ст. VI-VII канальцев и сохраняется до фазы прелептотенных сперматоцитов. Транскрипционный фактор STRA-8 - один из факторов, необходимых для инициации мейоза. Его роль состоит в продвижении прелептотенных сперматоцитов в следующую мейотическую фазу. В опытах было показано, что дефицит STRA8 у самцов приводит к отсутствию экспрессии маркёров мейотической когезии (REC8) и синапто-немальных комплексов SYCP3.

Мейотические клетки сперматогенного компартмента характеризуются маркёрами -CREM, SYCP3, REC8, STRA8, лактатдегидро-геназа С (LDHC), Boule. Ядерный фактор -цАМФ-зависимый элементарный модулятор (CREM) - участвует в регуляции экспрессии гена цАМФ и экспрессируется в ядрах круглых сперматид на I-III стадиях созревания, максимальная экспрессия найдена в V-VII типах канальцев и слабый, но специфический сигнал -на стадии пахитены сперматоцита [31, 32]. Самцы с недостаточной функцией белка были бесплодными, спермиогенез останавливался на стадии круглых сперматид. LDHC экспресси-руется в цитозоле пахитенных сперматоцитов, ранних и средних сперматидах, сперматозоидах с 14 ДПР Сперматозоиды нулевых мышей по LDHC имеют тенденцию к снижению подвижности, затруднению при оплодотворении и снижению фертильности [33].

Для круглых сперматид характерна экспрессия протаминов, богатых аргинином, которые

участвуют в упаковке ДНК сперматозоидов. Boule - белок семейства DAZ, экспрессируется в сперматоцитах 2-го порядка и круглых сперматидах. В сперматогониях и первичных сперматоцитах экспрессия Boule не выявлена. Acrosin - постмейотический маркёр, ассоциирован с акросомой и участвует в компактизации хромосом на поздних стадиях спермиогенеза. Протеиназы MMP2 и Acrosin участвуют в про-теолизе в zona pellucida яйцеклеток [34].

Ключевая роль в сперматогенезе отводится соматическим клеткам семенника. Так, клетки Сертоли у взрослых особей участвуют в обеспечении нормального течения сперматоген-ного процесса, выполняя трофическую, фагоцитарную, эндокринную функции, принимают участие в формировании гематотестикулярного барьера регуляции детерминации пола плода. Ген SRY, локализующийся в Y-хромосоме го-надальных и соматических клеток, инициирует дифференциацию клеток Сертоли, запускает развитие гонад по мужскому пути. Активность SRY зафиксирована уже на 10,5 ДПР, выработка его ограничена 2 днями. SRY может изменять структуру хроматина и регулировать транскрипцию через собственный домен HMG [35]. На данный момент нет прямых доказательств и информации о регуляции SRY. Помимо гена SRY известны два других гена, участвующих в модификации и ремоделировании хроматина: М33 (Cbx2) и ATRX, ассоциированных с аномальным развитием гонад. Это подтверждает теорию о том, что регулирование хроматина играет важную роль в процессе детерминации гонад. Воздействие токсикантов на плод может вызывать различные аномалии на уровне детерминации пола. Мутации, вызывающие нарушения в начале гонадогенеза, могут привести к сокращению популяции клеток Сертоли.

Большая часть данных о токсическом воздействии на мужскую репродуктивную систему основывается на применении острых и хронически-токсикологических экспериментов на животных. Установлены 4 основные мишени воздействия токсикантов на семенники: зародышевые половые клетки, клетки Сертоли, клетки Лейдига и сосудистые клетки [36]. Цитотокси-ческий агент бусульфан летально воздействует на дифференцирующиеся сперматогонии, при-

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

водя к временной стерильности самцов. Однократное введение дипина мышам линии SAMP1 [37] выявило постепенные количественные и морфологические изменения сперматогенного компартмента. Наиболее чувствительными к дипину оказались дифференцирующиеся спер-матогонии и прелептотенные мейоциты; пахи-тенные сперматоциты повреждались в меньшей степени. Некоторые эфиры фталатов вызывают видимые патологические изменения в клетках Сертоли уже через 3 ч после воздействия [38]. Динитробензол, воздействуя на клетки Сер-толи, вызывает специфические эффекты у половых клеток. При низких дозах эффекты наблюдаются на стадии пахитены сперматоцитов I порядка, при высоких - затрагивают популяцию круглых сперматид [39]. A. Revel и соавт. в 2001 г. на мышах Balb C показал, что бенз(а)-пирен (ВаР) приводит к значительному снижению численности сперматозоидов, активирует образование аддуктов ДНК BPDE в половых клетках, вызывает их апоптоз, некроз, различные повреждения ДНК [40].

В 2010 г. в развитии органного метода культивирования сперматогенеза был сделан значительный скачок. А. Gohbara с соавторами сообщили о введении новых подходов в органном методе культивирования гонад, приводящих к образованию гаплоидных спермиев, способных к дальнейшему оплодотворению женских гамет [41]. Культивирование опирается на применение классического газожидкостного межфазного метода, описанного ранее Steinberger и Trowell, использование новых культуральных коммерческих сред, ростовых факторов, сыворотки, 1,5% агарозного геля в качестве подложки, выбора оптимального температурного режима. В комплексе это способствовало созреванию сперматого-ний до круглых сперматид, прошедших пахитен-ный арест мейоцитов. Полученные данные были воспроизводимы и другими авторами [42, 43].

Нами были проведены пробные эксперименты по получению сперматогониальной культуры семенников по описанной выше методике. В работе использовались постнатальные самцы мышей линии Fj CBA х C57Bl/6, забор семенников осуществляли на 7,5-й день после рождения. Семенники иссекали, удаляли белочную оболочку и разрезали на несколько (2-8) фраг-

424

ментов размером 1-3 мм, переносили на подложку из 1,5% агарозного геля в культуральные чашки. Агарозный гель готовили стандартным методом: агарозу растворяли в тёплой дистиллированный воде, автоклавировали, и затем готовили в 10-см чашках Петри. После остывания гель нарезали на шестигранники 10 х 10 х 5 мм. Эти подложки помещали в культуральную среду на 24 ч. На каждый гель помещали по 1-3 фрагмента ткани семенника. Культивировали в среде a-MEM, содержащей 10% сыворотку плодов животных или 10 % нокаутный заменитель сыворотки. Смену среды проводили 1-2 раза в неделю. Культивировали в СО2-инкубаторе с содержанием 5% СО2 при температуре 34°С. На 7, 16 и 19-й день культивирования образцы забирали на гистологию, фиксировали в растворе Буэна (рис. 1, а, б).

На рис. 1, а представлен срез семенника мыши в момент эксплантации в культуру, в котором превалируют сперматогонии. Через 19 дней культивирования (рис. 1,б) видна образовавшаяся популяция сперматоцитов, часть которых находится в профазе мейоза. Полностью повторить полноценный гаметогенез, что желательно для оценки действия токсикантов, ещё невозможно в силу разных пока непреодолимых проблем данного метода. Так, в процессе культивирования кусочков гонад активный гаметогенез идёт на периферии эксплантата, в то время как в центре, из-за недостаточного газообмена и питания тканей, наблюдается некроз ткани.

В 2016 г. R.E. Chapin и соавт. показали, что для прогностической модели требуется более 60% канальцев с активным сперматогенезом, то есть содержащих пахитенные сперматоциты и сперматиды [44]. Однако такая модель при использовании органного метода культивирования семенников пока не создана.

Фолликулогенез in vitro - создание модели для экспресс-оценки токсикантов

Фолликулогенез - один из центральных процессов репродуктивной функции человека и животных. Основные фазы фолликулогене-за происходят в женских гонадах (яичниках), в которые ещё на стадиях эмбриогенеза мигрируют первичные половые клетки. Эти про-гениторные половые клетки, заселяя гонады, активно пролиферируют, после чего входят в

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

Рис. 1. Гистологические срезы семенников новорожденных мышат в различные сроки культивирования: а- срез семенника новорождённых мышат линий F СВА х С57В1/6 на 7-й день после рождения (увеличение *40); б - гистологический срез, семенника на 19-й день культивирования (увеличение *40).

премейотическую стадию репликации ДНК (12,5-й день развития мыши, 8-я неделя у человека), после чего дружно входят в профазу I мейоза, на которой остаются до овуляции. В течение этого времени происходит созревание фолликулов, начиная со стадии примордиаль-ного фолликула, сопровождающееся ростом численности соматических клеток (клетки гранулёзы и теки), окружающих ооцит. Фолликул постепенно проходит стадии первичного, вторичного, преантрального фолликула, после чего среди клеток гранулёзы начинает образовываться полость и в ней накапливаться жидкость. Фолликул резко увеличивается в размерах, а собственно ооцит в окружении небольшого количества клеток cumulus oophorus (яйценосный бугорок) остаётся как бы на ножке в антральной полости. Эта пре-овуляторная стадия характеризуется формированием Граафова пузырька. Далее ооцит вместе с клетками cumulus oophorus овули-рует в воронку яйцевода, завершает профазу I мейоза, совершает первое редукционное деление (выталкивает 1-е полярное тельце), становясь гаплоидной клеткой и в анафазе II второго редукционного деления, встречается со сперматозоидом, выталкивая 2-е полярное тельце. Оплодотворённая яйцеклетка переходит к процессу дробления и формирования зародыша-эмбриона-плода.

Безусловно, яичник является не только органом, продуцирующим ооциты, но и важнейшим эндокринным органом (железой), который в комплексе с другими органами (гипофиз, гип-поталамус) продуцирует стероидные гормоны и контролирует овариальный цикл. Более того, известна и описана гипоталамо-гипофиз-овари-альная ось, влияющая на все этапы онтогенеза млекопитающих - пренатальный, постнаталь-ный периоды, взрослое состояние, репродуктивный цикл в целом. После овуляции в теле яичника остаётся значительное количество соматических клеток фолликула, формирующих жёлтое тело (corpus luteum). Эта временная эндокринная структура, секретирующая прогестерон - гормон, поддерживающий течение беременности. Рост фолликулов от приморди-альных до вторичных являются гонадотропин-независимыми, но со стадии преантрального фолликула начинается рост зависимости от гонадотропинов. Среди различных ростовых факторов, продуцируемых ооцитом, следует выделить суперсемейство трансформирующего ростового фактора-ß (transforming growth factor-ß, TGF-ß), в которое входят фактор роста и дифференциации 9 (growth and differentiation factor 9, GDF9) и костный морфогенетиче-ский белок 15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15). Эти секретируемые в ооците факторы и являются важными регуляторами клеточных

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

функций - пролиферации, дифференциации, стероидогенеза, апоптоза, экспансии cumulus и других процессов, способствующих развитию фолликулярных функций. Факторы GDF9 и BMP15 обладают паракринными функциями, действуя прямо через физические контакты на клетки гранулёзы, регулируя их мультипликацию, дифференциацию, функции. Щелевые контакты (gap junctions) позволяют переносить между cumulus и ооцитом молекулы с малой молекулярной массой, тогда как перенос крупных молекул осуществляется с помощью опосредуемого рецепторами эндоцитоза [8].

У человека первичная стимуляция примор-диальных фолликулов и созревание их до стадии вторичных фолликулов занимает более 120 дней (у крыс более 30 дней), рост от вторичных до антральных фолликуов у человека длится 71 день (у крыс 28 дней). Далее, у избежавших атрезии, преобразование в Граафов фолликул и преовуляторное состояние занимает у человека 14 дней (у крыс 2-3 дня). Таким образом, фол-ликулогенез у человека составляет ~ 205 дней, у крыс около 60 дней. Экотоксиканты активно вмешиваются как в процессы фолликулогенеза, так и в связанные с ним эндокринные процессы, нарушая репродукцию гамет (мужских и женских), процесс оплодотворения, эмбриогенез. Американским агентством защиты окружающей среды (USEPA, United States Environmental Protection agency) выделена даже определённая группа токсикантов, нарушающих эндокринное обеспечение фолликулогенеза (EDC, endocrine disrupting compounds). Они вмешиваются в синтез, секрецию, транспорт, связывание и элиминацию естественных гормонов, ответственных за поддержание гомеостаза, репродукции, развития. Репродуктивные токсиканты способны вмешиваться во все этапы созревания гамет: пре- и постнатальные яичники содержат огромное количество половых клеток и фолликулов на различных этапах созревания. В первую очередь воздействиям подвержены быстро про-лиферирующие примордиальные фолликулы, ооциты на стадии первого мейотического деления. Воздействия в этот период приводят к значительной редукции пула постнатальных фолликулов. Примордиальные фолликулы, покоящиеся на стадии блока 1-го мейотического

426

деления, присутствуют в яичниках женщин примерно до 45 лет - и это делает их мишенью для острого и хронического действия репродуктивных токсикантов. На развитие фолликула влияет также состояние клеток гранулёзы и теки (theca interna), нередко реагирующих на воздействие.

Методы культивирования фолликулов

Имеется несколько способов культивирования отдельных фолликулов - в условиях двумерного (2D) и трёхмерного (3D) пространства. При первом фолликулы уплощаются, а клетки гранулёзы распространяются по плоскости, т.е. фолликул теряет свою естественную форму. В условиях 3D субстратами являются гелевые среды - коллаген, агароза, матригель, альги-наты - соли альгиновой кислоты, полимеризу-ющиеся при добавлении растворов с ионами Ca2+ или Mg2+. Для культивирования важным является концентрация альгинатного субстрата. Эксперименты показали, что лучшие условия для роста и созревания фолликулов создаются в «мягких» альгинатных субстратах. Так, при культивировании в 0,25% гидрогеле происходило более выраженное увеличение размеров ооцита и собственно фолликула, чем в 1,5% геле, а также отмечался более высокий уровень экспрессии таких генов как Bmp15, Gdf9, Tcl1 и Zp3, соответствующий нормальному оогенезу in vitro [45].

Хорошие результаты дают модификации структуры альгинаного геля, например, фи-бриново-альгинатный гель, при котором возрастает выработка фолликулами эстрадиола и прогестерона и увеличиваются размеры ооци-тов. Другим способом является использование альгинат-коллагенового субстрата, при котором фолликул помещён в центр капли, а вокруг -альгинатный гидрогель. При использовании альгинатного геля культивирование сначала проводится в среде, способствующей росту фолликулов, как правило, это среда a-MEM, в которую добавляют инсулин, селенит, транс-феррин, БСА или эмбриональную телячью сыворотку, ФСГ. Затем в среду для созревания необходимо внести хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), необходимый для стимуляции овуляции, факторы роста (эпидермальный фак-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

тор роста - для успешного течения мейотичес-ких процессов). Культивирование проводится в инкубаторе с соотношением газов 5 % СО2 в воздухе, но пониженная концентрация кислорода приводит к улучшению роста фолликулов мыши [45, 46].

Оплодотворение in vitro

Для проведения оплодотворения in vitro можно или подготовить ооциты при их культивировании и созревании до овуляторного статуса в составе фолликулов, или выделить (вымыть) комплекс ооцит-клетки кумулюса (КОКК) из яйцеводов самок мыши. Кульминацией роста и созревания фолликулов в яичнике является их овуляция с или без последующего оплодотворения, а также формирование жёлтого тела (ЖТ, corpora lutea). Оплодотворению ооцита предшествуют многочисленные морфогенетиче-ские процессы, нарушение которых, вследствие многофакторных причин, может привести к их аномальному мейотическому созреванию [47], аномалиям оплодотворения и, как следствие, к невозможности имплантации [48]. У человека инфертильность супружеских пар составляет примерно 10-12%. Среди основных её причин называются овуляторные дефекты и неспособность ооцитов к оплодотворению [49]. Процесс созревания ооцитов сложен и связан с циклическими изменениями в организме самок. У грызунов начало каждого астрального цикла запускает рост очередной популяции примордиальных фолликулов, которые, постепенно проходя через стадии созревания (от примордиальных до антральных фолликулов) под действием фолли-кулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирую-щего гормонов (ЛГ), достигают конечной стадии преовуляторных фолликулов. ЛГ запускает каскад событий, которые приводят к овуляции зрелого ооцита, способного к оплодотворению. Некоторые вещества (например, бисфенол А) вмешиваются в процесс овуляции, что выражается в уменьшении числа ЖТ, но детально этот процесс не изучен [50].

Эксплантации комплекса ооцит-клетки cumulus

Для получения избыточного числа ооцитов мышам однократно в/б вводят ГСЖК (гонадо-тропин сыворотки жеребой кобылы «Фолли-

Рис. 2. Вымытые из яйцеводов неоплодотворённые ооциты мыши, окружённые клетками cumulus oophorus.

маг») в дозе 10 МЕ, а через 48 ч проводится инъекция хорионического гонадотропного гормона человека («Прегнил») в дозе 5 МЕ. Через 20 ч после введения второго гормона осуществляется эвтаназия самок дислокацией шейных позвонков. После извлечения яйцеводов, используя манипуляционную среду («EmbryoAssist», ОКЮЮ), вымывают из яйцеводов овулиро-вавшие яйцеклетки, окружённые клетками кумулюса (рис. 2). При необходимости отделить ооциты от клеток кумулюса, полученную суспензию под контролем микроскопа обрабатывают 10% гиалуронидазой (3-5 мин). Морфологически нормальные ооциты и суспензии клеток кумулюса промывают поочередно в 3-х каплях чистой среды с промежутком в 3 мин. В ходе последующего культивирования КОКК происходит завершение созревания ооцита как финального шага долгого процесса дифференциации первичной половой клетки. В течение этого процесса фолликул высокочувствителен к действию повреждающих факторов среды, что может критически сказываться на созревании и дальнейшем развитии.

Показано, что в фолликулярной жидкости женщин и лабораторных животных концентрация хлорорганических веществ до трёх раз превышает их содержание в крови [51]. Более того, ооциты из фолликулов, содержавших эти соединения, обладали низкой скоростью дробления. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что клетки кумулюса в течение т vitro-

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Рис. 3. Различные стадии оплодотворения и развития яйцеклетки мыши. а - оплодотворение яйцеклетки in vitro; б - 2-клеточный зародыш; в - бластоциста.

созревания ооцитов являются посредниками токсических эффектов. Так, воздействие на КОКК Aroclor-1254, усиливает уровни апоп-тоза в клетках кумулюса, что коррелирует с агрегацией митохондрий в ооцитах как проявление токсичности - нарушение компартмента-лизации органелл [52]. Предполагается, что в отсутствии клеток cumulus ооциты становятся в 100 раз менее чувствительными к действию Aroclor-1254. Вместе с тем показано, что этот же препарат не влияет на процесс оплодотворения ооцитов мыши, свободных от клеток cumulus. Всё это свидетельствует о существенной роли соматического компартмента в опосредовании токсического действия, в частности ПХБФ.

При подготовке к оплодотворению после проведения гормональной индукции овуляции у самок мыши через 14-16 ч после инъекции ХГГ яйцеводы иссекают и помещают в 1 мл среды (М-16), после чего проводят перфорацию ампу-лярной части яйцевода и как бы «выдавливают» скопления комплексов ооцит-клетки cumulus в среду. Уже в таком виде можно проводить инсеминацию или, при необходимости, предварительно с помощью гиалоуронидазы (см. выше) отделить ооциты от клеток cumulus. Подготовка сперматозоидов сводится к их выделению из головки эпидидимиса мыши также в среду М-16, дополненной БСА (4 мг/мл), капацитацией их в течение 1 ч в инкубаторе при 370С и 5% СО2 в воздухе. Для инсеминации КОКК или свободные ооциты инкубируют в течение 6 ч в присутствие капацитированных сперматозоидов

(1 х 104 клеток), после чего ооциты отмывают от сперматозоидов и помещают в микрокапли (20 мкл) среды М-16 с 4 мг/мл БСА для дальнейшего культивирования. Доказательством успешного оплодотворения служит начало дробления ооцита и последующее формирование бластоцисты (рис. 3).

Молекулярно-генетические аспекты процессов репродукции

В процессе эмбрионального развития происходит постепенное изменение спектра транскрипционных факторов, действующих в различных клеточных популяциях. От действия этих факторов зависит в какой последовательности будут дифференцироваться эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и какие из них сохранят плюрипотентность на более длительный период. Транскрипционные факторы Oct4 и Nanog считаются ключевыми регуляторами плюрипотентности и экспрессируются в линиях ЭСК in vitro, что было показано для клеток человека и мыши (см. таблицу) [53]. Существует предположение, что совместно с фактором FoxD3 они формируют систему регуляции транскрипции, поддерживая и ограничивая экспрессию друг друга. Подавление экспрессии Oct4 приводит к ингибированию развития внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты in vivo и ЭСК in vitro и к раннему формированию трофэктодермы. Гиперэкспрессия этого фактора выражается в дифференцировке ЭСК в первичные энтодерму и мезодерму. Таким обра-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

Транскрипционные факторы, определяющие дифференцировку ЭСК

Фактор транскрипции Паттерн экспрессии Результат подавления экспрессии в эмбриональном развитии

Oct4 Экспрессируется в ооците, оплодотворённой яйцеклетке, ВКМ, эпибласте, ЭСК, клетках эмбриональной карциномы и ППК Гибель эмбрионов на стадии бластоцисты, дифференцировка эпибласта в трофэктодерму, аппоптоз ППК, потеря плюрипотентности

Nanog Экспрессируется в клетках морулы, ВКМ, эпибласте, ЭСК, клетках эмбриональной карциномы и линии ППК Гибель эмбрионов, недоразвитие эпибласта, блок ППК, потеря плюрипотентности, блокирование дифференцировки ЭСК в мезодермальном направлении

Sox2 Экспрессируется в ооците, ВКМ, эпибласте, ППК, мультипотентных клетках внезароды-шевой эктодермы, клетках-предшественниках нервной ткани, энтодерме Гибель эмбрионов в связи с неспособностью образовывать эпибласт, нарушение экспрессии генов Fgf4 и Fbx15

Stat3 Экспрессируется большинством типов недифференцированных и дифференцированных клеток Гибель эмбрионов на стадии бластоцисты

Sdx2 Экспрессируется в наружных клетках морулы, а также трофэктодермы Гибель на стадии имплантации, остановка дифференцировки в трофэктодерму

Gata6 Экспрессируется в клетках внезародышевой энтодермы Гибель эмбрионов в связи с дефектами висцеральной энтодермы

зом, для поддержания плюрипотентности, экспрессия Oct4 в клетках должна строго контролироваться и поддерживаться на определённом уровне [54]. Oct4 регулирует экспрессию ткане-специфичных генов, взаимодействуя с другими факторами, а именно с FGF-4 (fibroblast growth factor-4), специфичным для ЭСК, Sox2 (high mobility group box protein Sox 2).

До недавнего времени считалось, что фактор Nanog на определённом уровне постоянно экс-прессируется в клетках ВКМ и ЭСК, а его отсутствие приводит к утрате плюрипотентности и немедленной дифференцировке ЭСК в первичную энтодерму. Однако в настоящее время показано, что его экспрессия не конститутивна и изменяется в процессе эмбриогенеза, модулируя способность ЭСК к образованию специализированных типов клеток. Делеция Nanog в ЭСК не приводит к немедленной активации процессов дифференцировки, и клетки сохраняют плюрипотентность, но полностью утрачивают способность давать начало линии первичных половых клеток [55].

Oct4, Sox2, Nanog являются факторами, ответственными как за плюрипотентность, так и за выбор пути дифференцировки ЭСК. Они обладают уникальными паттернами экспрессии в

клетках ВКМ бластоцисты и в ЭСК при комми-тировании к дифференцировке. Картирование сайтов связывания Oct4, Nanog и Sox2 в ДНК ЭСК человека и мыши позволило выявить ряд генов взаимодействия, а также оценить степень влияния профилей экспрессии на процессы развития (см. таблицу) [53]. От их баланса в каждый момент эмбрионального развития зависит коммитирование и дифференцировка ЭСК. Эффекты этих белков неодинаковы в условиях in vivo и in vitro, что говорит о существовании механизмов, регулирующих запуск тех или иных сигнальных путей в клетках.

К таким механизмам относятся эпигенетические внутриклеточные механизмы. Один из них - реорганизация хроматина - неразрывно связан с активацией генетических программ. Хроматин в ЭСК в основном представлен транскрипционно-активным эухроматином, что подтверждается большим количеством ацети-лированнных гистонов и повышенной чувствительностью хроматина к нуклеазам. Коммити-рование клеток сопровождается понижением степени ацетилирования гистонов и увеличением процента неактивного гетерохроматина [56]. Структурные белки хроматина в ЭСК слабо связаны с ДНК (в отличие от дифференцирован-

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ных клеток), обеспечивая быструю реорганизацию хроматина в процессе дифференцировки. Замена гистона H1 его модификацией, имеющей более высокое сродство к ДНК, приводит к ингибированию дифференцировки ЭСК [57].

Ещё один важный эпигенетический фактор, влияющий на экспрессию генома - это уровень метилирования гистонов и ДНК. В нескольких экспериментальных работах были показаны динамические изменения метилирования ги-стонов и ДНК in vivo у эмбрионов мыши. Сразу после оплодотворения уровень метилирования в яйцеклетках мыши и человека падает, а затем восстанавливается в ВКМ бластоцисты, вновь постепенно снижаясь с развитием эмбриона [58, 59].

Наиболее распространённым является симметричное метилирование цитозина в 5' позиции в СрG динуклеотидах. Локус-специфичное метилирование гистонов и ДНК в клетках ВКМ сохраняется в получаемых из них культурах ЭСК. В случае присутствия в клетках ВКМ эпигенетических нарушений, эти нарушения сохраняются в ЭСК и их производных. Уровень метилирования может ограничивать, или наоборот, стимулировать дифференцировку ЭСК в определённые типы клеток [58].

Характеристика изменения профиля метилирования в клетках ВКМ при развитии бла-стоцисты и в ЭСК в процессе культивирования in vitro, а также различия профилей метилирования между разными клеточными линиями ЭСК являются фундаментальными вопросами биологии развития.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

7. Захидов С.Т. Сперматогенез: от начала до конца.

М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2009. 37. Кулибин А.Ю., Захидов С.Т, Маршак Т.Л. Ответ сперматогенной системы ускоренно стареющих мышей на действие химического мутагена дипина. Известия РАН. Серия биологическая. 2008; 3: 272-82. 45. Филатов М.А., Храмова Ю.В., Семёнова М.Л. Рост и созревание фолликулов яичника мыши в альги-натном гидрогеле in vitro: состояние проблемы. Acta Naturae. 2015; 2(25): 52-61.

REFERENCES

1. Brent R.L., Holmes L.B. Clinical and basic science lessons from the thalidomide tragedy. Teratology. 1988; 38: 241-51.

2. McBride W.G. Thalidomide embryopathy. Teratology. 1977; 16(1): 79-82.

3. Thalidomide. Australion Prescriber. 2003; 26(6): 146-52.

4. Thalidomide. Pharmion, Melbourne, 2000: 1-62.

5. Hong Young-Seoub, Yu-Mi Kim, Kyung-Eun Lee Meth-ylmercury Exposure and Health Effects. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 2012; 45(6): 353-63.

6. International Program on Chemical Safety. Environmental methylmercury: health criteria 101, Geneva: World Health Organization, 1990.

7. Zakhidov S.T. Spermatogenesis: from beginning to end [Spermatogenez: ot nachala do kontsa]. Moscow: MGU im. M.V. Lomonosova. 2009. (in Russian).

8. Hales B. F., Robaire B Paternal Exposure to Drug and Environmental Chemicals: Effects on Progeny Outcomes. International Journal of Andrology. 2001; 22(6): 927-36.

9. Sharpe Richard M. Environmental lifestyle effects on spermatogenesis. Philosophical Transaction of the Royal Society B. 2010; 365: 1697-712.

10. Andersson A., Jorgensen N., Main K. Adverse trends in male reproductive health. International Journal of Andrology. 2008; 31: 74-80.

11. Jorgensen N., Asklund C., Carlsen E. and Skakkebaek N.E. Coordinated European investigations of semen quality: results from studies of Scandinavian young men is a matter of concern. International Journal of Andrology. 2006; 29: 54-61.

12. WHO Laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction, 4th edn., Cambridge, UK: Cambridge University Press. 1999.

13. Mansour R.T., Kamal A., Fahmy I. Intracytoplasmic sperm injection in obstructive and non-obstructive azoospermia. Human Reproduction. 1997; 12: 1974-9.

14. Wilson J.G. Environmental and birth defects. Academic Press. N-Y, London. 1973.

15. Hook E.B. Contribution of chromosome abnormalities to human mortality. In: Mutation epidemiology review and recommendation. Amsterdam. 1984: 383-423.

16. Miller J.F., Williamson E., Glue J. Fetal Loss After Implantation: A Prospective Study Lancet. 1980; 316: 554-6.

17. Fara M., Jelinek R., Peterka M. Orofacial clefts. A theoretical bases for their prevention and treatment. Acta Uni-versitatis Carolinae. Medica. Monographia. 1988; 124: 1.

18. Bacchetta R., Compagnoni E., Giatei C. Environmental discovery and toxicity of bentazone on the amphibian Xenopus laevis embryo. Aqua aria. 1997; 3: 119-23.

19. Berry C.L. Congenital malformations. Paediatric pathology. 1981: 67-86.

20. Brent R.L. Etiology of human birth defects. Developmental Toxicology. 1987; 3: 362-4.

21. Palmer A.K. Use on mammalian models in teratology in prevention on physical and mental congenital defects. Part 1. ed. M. Marios, Alan Liss. Inc., New York. 1985.

22. Lacham-Kaplan Orly In vivo and in vitro differentiation of male germ cells. Reproduction. 2004; 128: 147-52.

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

23. Phillips B.T., Gassei K., Orwig K.E. et al. Spermatogonia! stem cell regulation and spermatogenesis. Philosophical Transaction of the Royal Society B. 2010; 365: 1663-78.

24. Brinster R.L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 2002; 296: 2174-6.

25. Kanatsu-Shinohara M. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biology of Reproduction. 2003; 69: 612-6.

26. Costoya J.A., Hobbs R.M., Barna M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 2004; 36: 653-9.

27. Ohbo K., Yoshida S., Ohmura M. Identification and characterization of stem cells in prepubertal spermatogenesis in mice. Developmental Biology. 2003; 258: 209-22.

28. Kubota H., Avarbock M., Brinster R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. PNAS USA. 2004; 101: 16489-94.

29. Lovasco L.A., Gustafson E.A., Seymour K.A. TAF4b is required for mouse spermatogonial stem cell development. Stem Cells. 2015; 33(4): 1267-76.

30. Suzuki H.H., Won Ahn., Chu T., Bowden W. et al. SOHLH1 and SOHLH2 coordinate spermatogonial differentiation. Developmental Biology. 2012; 361 (2): 301-12.

31. Behr R., Weinbauer G.F. Germ Cell-Specific cAMPH Response Element Modulator Expression in Rodent and Primate Testis. The Endocrine Society. 1999; 6: 2746-54.

32. Weinbauer G.F, Behr R., Bergmann M. Testicular cAMP responsive element modulator (CREM) protein is expressed in round spermatids but is absent or reduced in men with round spermatid maturation arrest. Molecular Human Reproduction. 1998; 4 (1): 9-15.

33. Wiegen E.D Regulation of the Synthesis of Lactate Dehydrogenase^ during Spermatogenesis in the Mouse. Cell. Biology. 1981; 88 (3): 492-8.

34. Ferrer M., Rodriguez H., Zara L. MMP2 and acrosin are major proteinases associated with the inner acrosomal membrane and may cooperatein sperm penetration of the zona pellucida during fertilization. Cell and Tissue Research. 2012; 349: 881-95.

35. Harley V.R., Layfield S., Mitchell C.L. Defective import in ß recognition and nuclear import of the factor SRY are associated with XY mutations. PNAS USA. 2003; 100: 7045-50.

36. Griswold D., McLean The Sertoli Cell. Physiology of Reproduction. 2006; 19: 949-75.

37. Kulibin A. Yu., Zakhidov S.T., Marshak T.L. Response of the spermatogenic system in forced aging mice on the chemical mutagen dipine. Izv. Akad. Nauk, Ser. Biol., 2008; 3: 272-82.

38. Creasy D.M., Foster J.R., Foster P.M.D. The morphological development of di-n-pentyl phthalate-induced tes-ticular atrophy in the rat. J. Pathol. 1983; 139: 309-21.

39. Blackburn D.M., Gray A.J., Lloyd S.C. A comparison of the effects of the three isomers of dinitrobenzene on the testis in the rat. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1988; 92: 54-64.

40. Revel A., Raanani H., Younglai E. Resveratrol natural aryl hydrocarbon receptor antagonist, protects sperm from DNA damage and apoptosis caused by benzo(a) pyrene. Reproductive Toxicology. 2001; 15(5): 479-86.

41. Gohbara A., Katagiri K., Sato T. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biology of Reproduction. 2010; 83: 261-7.

42. Sato T., Katagiri K, Gohbara A. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 2011; 471: 504-7.

43. Sato T., Katagiri K., Kubota U. In vitro sperm production from mouse spermatogonial stem cell lines using an organ culture method. Nature Protocol. 2013; 11: 2098-104.

44. Chapin R. E., Winton T., Nowland W. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research (Part B). 2016; 107: 225-42.

45. Filatov M.A., Khramova Yu.V., Semenova M.L. Growth and maturation of mouse ovarian follicles in an alginate hydrogel in vitro: state of the problem. Acta Naturae. 2015; 2

46. Gook D.A., Edgar D.H., Lewis K. Molecular Human Reproduction. 2014; 20(1): 31-41.

47. Machtinger R., Combelles C.M., Missmer S.A Bisphe-nol-A and human oocyte maturation in vitro. Human Reproduction. 2013; 28: 2735-45.

48. Ehrlich S., Williams P.L., Missmer S.A. Urinary bisphenol A concentrations and early health outcomes among women undergoing IVF. Human Reproduction. 2012; 27: 3583-92.

49. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Optimal evaluation of the infertile female. Fertility and Sterility. 2006; 86: 264-7.

50. Adewale. H.B., Jefferson. W.N., Newbold. R.R. Neonatal bisphenol-A exposure alters rat reproductive development and ovarian morphology without impairing activation of GTRH neurons. Biology of Reproduction. 2009; 81: 690-9.

51. Trapp M. Pollutants in human follicular fluid. Fertility and Sterility. 1984; 42: 146-8.

52. Greenfeld C., Xiongqing W., Dukelow W.R. Aroclor 1254 does not affect the IVF of cumulus-free mouse oocytes. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 1998; 60: 766-72.

53. Loh Y.H., Wu Q., Chew J.-L. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nature Genetics. 2005; 38: 431-40.

54. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K. Formation of plu-ripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor. Cell. 1998; 95: 379-91.

55. Chambers I., Silva J., Colby D. Nanog safeguards plu-ripotency and mediates germline development. Nature. 2007; 450: 1230-5.

56. Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 2007; 134: 635-6.

57. Meshorer E., Yellajoshula D., George E. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Developmental Cell. 2006; 10: 105-16.

58. Santos F., Dean W. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction. 2004; 127: 643-51.

59. Santos F., Hendrich B., Reik W., Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Developmental Biology. 2002; 41: 172-82.

Поступила 01 июня 2018 Принята в печать 19 сентября 2018