Применение комплекса 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитотоксическим воздействием
USE OF COMPLEX OF 9-PHENYL-2,3,4,5,6,7,8,9-OCTAHYDRO-1H-SELENOXANTHENE WITH β-CYCLODEXTRIN FOR CORRECTION OF SPERMATOGENESIS DISORDERS CAUSED BY CYTOTOXIC EFFECT

Изобретение относится к медицине, а именно к андрологии и может быть использовано в фармакологии для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.
Изобретение также относится к ветеринарии и может быть использовано для лечения млекопитающих с нарушенной фертильностью.
Часто применяемые противоопухолевые препараты (цитостатики), независимо от их механизма действия, обладают выраженным токсическим эффектом на активно делящиеся нормальные (не поврежденные опухолью) ткани организма. К числу последних принадлежит сперматогенный эпителий мужских половых желез [Гершанович М.Л. Осложнение при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М. Медицина, 1982, - С. 51-80], в котором, благодаря постоянным клеточным делениям (сперматогониев и сперматоцитов), происходит созревание мужских половых клеток - сперматогенез. Нарушение сперматогенеза, наблюдаемое на фоне цитостатического воздействия, по этиологии, патогенезу отличается от других видов патологических процессов, которые сопровождаются угнетением сперматогенеза (травмы, воспаление, эндокринные расстройства, генетические заболевания).
В настоящее время химиотерапевтический метод лечения злокачественных новообразований позволяет добиться в ряде случаев не только длительных полных ремиссий, но даже излечения [Противоопухолевая химиотерапия. / Под ред. Н.И. Переводчиковой. - М.: Медицина, 2005, - С. 27-51]. В связи с этим актуальной становиться проблема необратимого мужского бесплодия как возможного последствия цитостатической химиотерапии [Резниченко А.Г. Влияние химио- и радиотерапии на сперматогенез у онкологических больных. // Проблемы репродукции. – 2007, - № 4, - С.70-75].
В основе необратимых изменений лежит повреждающее действие на источник пролиферативного пула сперматогенеза - стволовые сперматогонии. Необратимые изменения в мужских половых железах могут существенно снизить качество жизни пациентов молодого возраста, поскольку состояние их репродуктивной функции, с учетом его биологического, социального, психологического значения, является важным жизненным фактором.
Одним из способов решения проблемы отцовства пациентов, перенесших цитостатическую терапию и находящихся в длительной полной ремиссии, является криоконсервация семенной жидкости до начала лечения [Auger J., Kuntsmann J., Czuglik F. et al. Coservation du sperme avant traitement anticancerenx. Une mesure efficce pour preserverles chances de conception future. // Contacept.-fertil.-sex. – 1993, - Vol.21, № 10, - P. 749-752]. Однако в силу ограниченной доступности этого способа для большинства пациентов криоконсервация не нашла широкого применения. Поиски способов борьбы с мужским бесплодием, вызванным цитостатическим воздействием, продолжаются. Возлагаются большие надежды на трансплантацию зародышевых клеток [Meachem S., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective. // Reprod. – 2001, - Vol.121, №6, - P.825-834], но необходимо доказать, что их введение не приведет к снижению лечебного эффекта цитостатика.
Известен способ снижения повреждающего действия цитостатических препаратов на мужские половые железы с помощью средств фармакотерапии: антиоксиданты (левзея софлоровидная) [Щемерова Ю.А. Влияние ингибиторов топоизомеразной активности вепезида и иринотекана на репродуктивную систему крыс-самцов: Автореф. дисс. кан-та биол. наук. - Томск, 2006, - 23 с.]; гормоны (тестостерон) [Delic J., Harwood J., Stanly J. Time dependence for the protective effect of androgen from procarbazine - induced damage to rat spermatogenesis. // Cancer. – 1987, - № 5, - P.1344-1347]; препарат фосфолицин, который ослабляет токсическое действие на семенники платиновых цитостатических препаратов за счет снижения их нефротоксичности [Yoshi S., Monabe F., Hiroshi T. et al. Huxon ragary pexo tarray dsasel. // Chemotherapy. – 1990, - Vol.38, № 7, - P.670-675]. Недостатками предложенных способов снижения повреждающего действия цитостатических препаратов на мужские половые железы являются низкая эффективность, ограниченность использования, возможность появления побочных эффектов и противопоказаний для пациентов, имеющих в анамнезе онкологическое заболевание. В инструкциях по медицинскому применению выше указанных лекарственных средств отсутствует информация о состоянии сперматогенеза в отдаленные сроки после введения препаратов (3 и 6 мес.), что наиболее актуально для пациентов, находящихся в длительной полной ремиссии после перенесенного лечения. Отсутствуют также данные о влиянии на стволовые сперматогенные клетки, сохранение которых препятствует развитию необратимого мужского бесплодия.
Известен также способ коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитотоксическим воздействием, с помощью препарата «Нейпоген» - рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) / Патент на изобретение РФ2406527, опубл. 20.12.2010 г. / Этот способ, заключающийся в использовании средств фармакотерапии, является наиболее близким к заявленному и выбран в качестве прототипа. Существенными недостатками этого способа коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитотоксическим воздействием, с помощью препарата Г-КСФ являются:
- наличие побочных эффектов (тошнота/рвота, боль в мышцах и костях, дизурия, алопеция, диарея, кожная сыпь, воспаление слизистых оболочек, лихорадка, утомляемость, головные боли, кашель, анорексия, лейкоцитоз и др.);
- сложный и дорогой метод его получения (негликозилированный протеин, состоящий из 175 аминокислот, вырабатываемый лабораторным штаммом бактерии Escherichia coli, в которую методами генной инженерии введен ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека);
- неудобный и трудоемкий способ приготовления, применения препарата, который требует особых условий хранения (выпускается в виде иньекционного раствора для внутривенного и подкожного введения; применение осуществляется под пристальным наблюдением врача; храниться при температуре 2-8°C).
Данные клинических наблюдений свидетельствуют о том, что нарушение сперматогенеза после использования ряда химиотерапевтических схем носит необратимый характер [Гершанович М.Л. Осложнение при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М. Медицина, 1982, - С. 51-80; Резниченко А.Г. Влияние химио- и радиотерапии на сперматогенез у онкологических больных. // Проблемы репродукции. – 2007, - № 4, - С. 70-75]. Необратимые изменения в извитом семенном канальце, приводящие к патозооспермии, могут быть связаны с истощением пролиферативного пула сперматогенеза, источником которого является популяция сперматогоний, а именно, стволовых (резервных) клеток [Липатова Н.А. Лабораторные критерии фертильности эякулята // Клиническая лабораторная диагностика. – 1998, - Т.5, - С. 11-15; Сухоруков В.С., Шамшад Д.С. Определение степени зрелости сперматогенного пласта крысы при его регенерации и в процессе созревания интактного семенника// Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1989, - Т.97, №9, - 89 с.]. Это клетки-родоначальники, делятся только при повреждении и являются основой пролиферативного пула сперматогенеза. Для образования стволовых сперматогоний необходимо наличие ниш, которые формируют клетки Сертоли (клетки микроокружения) [Биология стволовых клеток и клеточные технологии. / Под ред. М.А. Пальцева. - М.: Медицина, Шико, 2009, - Т.2, - 456 с.]. Последние утрачивают способность к делению в зрелых извитых семенных канальцах [Курносова Т.Р., Вербицкий М.Ш., Сухих Г.Т., Молнар Е.М. Современные представления о структурных основах репаративной регенерации семенника млекопитающих животных и человека. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 1994, - №4, - С. 396-399]. Регенерация семенных канальцев в целом возможна только одним путем - путем формирования семенных канальцев незрелого типа из регенерационной зоны, которая содержит клетки Сертоли и первичные половые детерминанты, дающие начало новым сперматогониям. Недостаточность регенераторного потенциала семенника приводит к атрофии ткани в целом и служит причиной бесплодия.
В результате проведенных нами экспериментальных исследований обнаружено неизвестное до сих пор свойство фармацевтической композиции 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином стимулировать процессы репаративной регенерации тестикулярной ткани при сокращении численности клеточной популяции быстро обновляющихся и резервных (стволовых) сперматогоний при нарушениях сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием.
Свойство фармацевтической композиции 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином усиливать процессы репаративной регенерации тестикулярной ткани при сокращении численности клеточной популяции быстро обновляющихся и резервных (стволовых) сперматогоний при нарушениях сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, является для специалиста фактом неочевидным и не вытекает из уровня техники в данной области, не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Выше указанное свойство фармацевтической композиции 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином может быть использовано в практическом здравоохранении и ветеринарии для повышения качества лечения. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств, предназначенных для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием за счет усиления процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани при сокращении численности клеточной популяции быстро обновляющихся и резервных (стволовых) сперматогоний. Технический результат заключается в реализации предлагаемых средств, обеспечивающих коррекцию нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием.
Для решения поставленной технической проблемы и достижения максимально возможного результата в настоящем изобретении предлагается применение 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена в качестве средства для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием, за счет усиления процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани.
Предлагается фармацевтическая композиция для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием, которая содержит в качестве активного компонента 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен в эффективном количестве.
Активный компонент фармацевтической композиции для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием, 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен может быть представлен в виде клатратного комплекса с β-циклодекстрином или может содержать дополнительно β-циклодекстрин в соотношениях от 1:1 - до 1:10.
Предлагается лекарственный препарат для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием, который содержит в качестве активного компонента указанную фармацевтическую композицию. Указанный лекарственный препарат может применяться в форме таблеток, с содержанием 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена от 2 до 10%, а остальное - один или более наполнитель(и). При этом таблетки могут быть сформированы посредством прессовки или формовки. Лекарственный препарат может применяться и в форме желатиновых капсул, при следующем соотношении компонентов:
- 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен от 2 до 10%;
- наполнитель(и) или носитель(и) - остальное.
Лекарственный препарат может быть выполнен в виде растворов, эмульсий, суспензий и др., с содержанием активного компонента от 0,025 до 1%; остальное - наполнитель(и) или носитель(и).
Предлагаемое изобретение можно использовать в качестве средства для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием. Предлагаемое средство обеспечивает усиление процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани при сокращении численности клеточной популяции быстро обновляющихся и резервных (стволовых) сперматогоний.
Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения, в которых:
«Комплекс» - клатратный комплекс β-циклодекстрина с 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантеном в соотношении 10:1, полученный стандартным способом /патент RU2451680, C07D 345/00, опубл. 27.05.2012г./.
Усиление процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани при сокращении численности клеточной популяции быстро обновляющихся и резервных (стволовых) сперматогоний у самцов крыс популяции Вистар под влиянием заявляемых средств для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием, продемонстрировано в двух сериях экспериментов. В настоящем изобретении, если не указано иное, концентрации представлены в мас.%.
ПРИМЕР. Клатратный комплекс 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином («Комплекс») как средство для коррекции сперматогенеза оценивалось в экспериментах на крысах популяции Вистар при цитотоксическом воздействии «Паклитакселом».
Эксперименты проведены на 50 крысах-самцах Вистар, возраст 3 месяца. Животные содержались в стандартных пластиковых клетках (не более 10 особей в каждой) с мелкой древесной стружкой, на стандартном рационе - гранулированный корм ПК 120-3 (согласно приказу №1179 МЗ СССР от 10.10.83).
До проведения эксперимента животные проходили карантин в виварии в течение 5 дней. Далее определялась масса тела животных и их распределение по группам. «Паклитаксел» вводился 30-ти крысам-самцам опытных групп однократно внутривенно в максимально допустимой дозе (МПД) - 5,0 мг/кг массы тела. Доза «Паклитаксела» выбрана с учетом опыта клинического применения и была рассчитана для животных методом графического пробит-анализа при наблюдении за ними в течение 30 суток.
Через 1 месяц после введения «Паклитаксела» в течение 10-ти дней внутрижелудочно вводился клатратный комплекс 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена с β-циклодекстрином в следующих дозах: 0,3 и 1,0 мг/кг массы тела. Другой группе животных подкожно в течение 5-ти дней вводился препарат сравнения «Нейпоген» в дозе 100 мкг/кг через 1 месяц после введения «Паклитаксела». Животные контрольной группы получали «Паклитаксел» и дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Через 2 и 3 месяца после введения «Паклитаксела» определяли массу тела крыс, затем их умерщвляли дислокацией шейных позвонков (по 5 животных на каждый срок эксперимента), выделяли семенник и эпидидимис. Далее определяли общее количество половых клеток, приходящихся на эпидидимис, процент их подвижных форм [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред. Хабриева Р.У. - М.: Медицина, 2005]. При подсчете общего количества сперматозоидов (ОКС), приходящихся на придаток, использовали гомогенизированную клеточную взвесь эпидидимиса. Семенники фиксировали для проведения гистологического анализа в жидкости Карнуа. Затем были приготовлены парафиновые срезы. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. На срезе семенника определяли: численность клеточной популяции сперматогоний, количество клеток Сертоли и Лейдига [Саноцкий И.В., Фоменко В.И. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. - М.:Наука, 1979, – 210 с.]. Эндокринную активность семенника вычисляли как соотношение количества клеток Лейдига к клеткам Сертоли. На основании подсчета клеток Сертоли вычисляли степень зрелости сперматогенного пласта [Сухоруков В.С., Шамшад Д.С. Определение степени зрелости сперматогенного пласта крысы при его регенерации и в процессе созревания интактного семенника// Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1989, - Т.97, №9, - 89 с.].
При выборе сроков исследований учитывали длительность сперматогенеза у крыс, которая составляет 3 месяца. Срок 2 месяца после введения препарата соответствует, по времени проявления, воздействию на активно обновляющиеся сперматогонии, 3 месяца - на стволовые (резервные сперматогонии, которые делятся при повреждении).
«Паклитаксел» вводился внутривенно, «Нейпоген» - подкожно, что соответствует способам их применения в клинике. «Комплекс» вводился внутрижелудочно, что соответствует предполагаемому клиническому применению - приему внутрь.
Доза и режим введения препарата «Нейпоген» основаны на данных, полученных в исследованиях по стимулирующему действию препарата на регенераторные процессы в семенниках [Боровская Т.Г, Дыгай А.М., Жданов В.В., Румпель О.А., Пахомова А.В., Перова А.В., Зюзьков Г.Н., Гольдберг В.Е. - Патент на изобретение РФ № 2406527. Способ коррекции нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием. - 2010].
Крысы были рандомизированы на группы с учетом их массы тела:
1. Интактные животные (n=10) - фон;
2. Контроль. Крысам (n=10) вводился «Паклитаксел» однократно внутривенно в максимально переносимой дозе (МПД) - 5,0 мг/кг массы тела и дистиллированная вода;
3. Клатратный комплекс β-циклодекстрина с 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантеном («Комплекс»). Крысам (n=10) вводился внутрижелудочно испытуемый препарат в дозе 0,3 мг/кг в течение 10-ти дней, начиная через 1 месяц после введения «Паклитаксела»;
4. Клатратный комплекс β-циклодекстрина с 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантеном («Комплекс»). Крысам (n=10) вводился внутрижелудочно испытуемый препарат в дозе 1,0 мг/кг в течение 10-ти дней, начиная через 1 месяц после введения «Паклитаксела»;
5. Препарат сравнения. Крысам (n=10) вводился подкожно «Нейпоген» (Г-КСФ) в дозе 100 мкг/кг массы тела 1 раз в день в течение 5-ти дней через 1 месяц после введения «Паклитаксела».
Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - М.: Медицина, 1978. - С.72-75].
Первая серия эксперимента
Оценка состояния репродуктивной системы крыс-самцов через 2 месяца после введения «Паклитаксела»
Результаты оценки массы тела крыс, общего количества половых клеток, приходящихся на эпидидимис, процента подвижных форм зрелых спермиев через 2 месяца после введения «Паклитаксела» и 1 месяц после лечения препаратом «Комплекс» представлены в таблице 1. Установлено, что масса тела животных в начале эксперимента и через 2 месяца после введения цитостатического препарата во всех сравниваемых группах не отличалась (Р>0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что в начале эксперимента была осуществлена качественная рандомизация животных по массе тела, а также о том, что в течение 2-х месяцев эксперимента, все оказываемые фармакологические воздействия не приводили к изменению массы тела животных.
У интактных животных общее количество половых клеток (приходящихся на эпидидимис) и процент их подвижных форм находились в пределах возрастной нормы (возраст крыс 5-6 месяцев) [Боровская Т.Г., Гольдберг В.Е., Щемерова Ю.А., Полуэктова М.Е., Тимина Е.А., Перова А.В. Влияние ингибиторов топоизомеразной активности на морфологические и функциональные показатели сперматогенеза крыс // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2005. -Прил.№1. - С. 28-30]. Через 2 месяца после введения крысам-самцам «Паклитаксела» отмечалось статистически значимое снижение общего количества клеток, приходящихся на эпидидимис, а также процента их подвижных форм.
Таблица 1 - Морфологические и функциональные показатели зрелых спермиев и семенников крыс через 2 месяца после введения цитостатика «Паклитаксел»
Показатели
Фон
Контроль
«Комплекс» 0,3 мг/кг
«Комплекс» 1,0 мг/кг
Г-КСФ
Масса тела животногов начале эксперимента (г)
352,6±19,8
352,4±2,58
353,6±18,78
353,4±5,55
354,4±23,06
Масса тела животногов конце эксперимента (г)
445,2±10,7
456,6±9,87
464,8±23,64
445,4±9,33
457,6±40,24
Количество подвижныхформ сперматозоидов (%)
84,8±1,69
63,7±1,36 <sup>#</sup>
75,8±4,82<sup>*</sup>
69,2±3,60 <sup>#</sup>
81,7±3,30 <sup>*</sup>
Общее количествосперматозоидов (ОКС) (абс.ед.)
55,0±1,82
43,80±2,22 <sup>#</sup>
51,6±2,87 <sup>*</sup>
52,4±2,42 <sup>*</sup>
76,8±6,16 <sup>#*</sup>
Примечание: здесь и далее
# - статистическая значимость различий по сравнению с фоном
* - статистическая значимость различий по сравнению с контролем («Паклитакселом»).
Снижение общего количества половых клеток и их подвижности, наблюдаемые в эти сроки исследования в группах крыс, получавших «Паклитаксел», свидетельствует (с учетом длительности сперматогенеза у крыс) о токсическом действии препарата на полустволовые сперматогонии. Данные литературы подтверждают тот факт, что сперматогонии являются мишенью действия «Паклитаксела» [Сухачева Т.В., Богуш Т.А., Коломиец О.Л. Повреждающее действие таксола на сперматогенез мыши. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 2001.- Т.132, №11. - С. 554-560].
ОКС в группах крыс, получавших препарат «Комплекс» в обеих исследуемых дозах (0,3 и 1,0 мг/кг), статистически значимо возрастало (на 18-19,6 % соответственно) по сравнению с контролем («Паклитаксел»), и достигало фоновых значений. Введение препарата сравнения (Г-КСФ) также приводило к возрастанию (на 75 %) этого показателя по сравнению с контролем, превышая фоновые значения.
Процент подвижных форм в группе крыс, которым после «Паклитаксела» вводили препарат «Комплекс» в дозе 0,3 мг/кг, возрастал по сравнению с контролем («Паклитаксел») и практически не отличался от фона. При введении препарата «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг значение этого показателя оказалось ниже фона. Введение препарата сравнения Г-КСФ приводило к достоверному возрастанию процента подвижных форм по сравнению с контролем до уровня фоновых значений.
Таким образом, через 2 месяца после введения «Паклитаксела» выявляется тестикулярная недостаточность, признаками которой являются олигоспермия и астеноспермия. Судя по срокам проявления, эти нарушения обусловлены токсическим действием на делящиеся сперматогонии (полустволовые клетки). Введение препарата «Комплекс» оказывало положительное влияние на состояние сперматогенеза крыс, подвергнувшихся воздействию «Паклитаксела», о чем свидетельствует увеличение продуктивности сперматогенеза (возрастание ОКС в обеих дозах, увеличение доли подвижных форм - в группе «Комплекс», доза 0,3 мг/кг).
Установлено (табл. 2), что через 2 месяца после введения «Паклитаксела» численность клеточной популяции сперматогоний оказалась сниженной (составила 69,7% от фоновых значений). При введении препарата «Комплекс» в дозе 0,3 мг/кг через 1 месяц после введения «Паклитаксела» количество сперматогоний так же было статистически значимо снижено, по сравнению с фоном и практически не отличалось от значений контроля. У крыс, получавших «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг, этот показатель оказался статистически значимо выше (на 17%) по сравнению с контролем, хотя и не достигал значений интактных животных. Сходные данные были получены при введении препарата сравнения.
Определение количества клеток Лейдига (тестостерон продуцирующих клеток) показало, что во всех экспериментальных группах оно оказалось сходным с таковым у интактных животных (табл. 2).
При подсчете количества клеток микроокружения (клеток Сертоли) выявилось их статистически значимое снижение в группах крыс, подвергнувшихся воздействию «Паклитаксела». У животных, получавших препарат «Комплекс» в обеих используемых дозах, этот показатель возрастал по сравнению с контролем. Статистически значимое возрастание количества клеток Сертоли по сравнению с контролем выявилось и при введении препарата сравнения. Этот показатель оказался выше фоновых значений.
При изучении эндокринной активности семенника, которая высчитывается по отношению количества клеток Лейдига к клеткам Сертоли, установлено, что она была сходной почти во всех исследуемых группах животных, за исключением крыс, получавших «Паклитаксел» и Г-КСФ. Животные этой группы характеризовались пониженной эндокринной активностью, как по сравнению с контролем, так и фоном. Последнее обусловлено, очевидно, тем, что на фоне введения Г-КСФ существенно возрастало количества клеток Сертоли.
Таблица 2 - Морфологические и функциональные показатели семенников крыс через 2 месяца после введения препарата «Паклитаксел»
Показатели
Фон
Контроль
«Комплекс» 0,3 мг/кг
«Комплекс» 1,0 мг/кг
Г-КСФ
Количество сперматогоний (абс.ед.)
18,03±0,32
12,57±0,46 <sup>#</sup>
13,49±0,51 <sup>#</sup>
14,70±0,36 <sup># *</sup>
16,41±0,10 <sup>#*</sup>
Количество клеток Лейдига (абс.ед.)
15,75±0,36
15,65±1,24
15,92±0,62
15,84±0,68
15,12±0,58
Количество клеток Сертоли (абс.ед.)
2,75±0,02
2,58±0,06 <sup>#</sup>
2,94±0,07 <sup>*</sup>
2,82±0,08 <sup>*</sup>
4,89±0,18 <sup>#*</sup>
Эндокринная активность (усл.ед.)
5,73±0,12
6,10±0,56
5,42±0,22
5,64±0,32
3,11±0,19 <sup>#*</sup>
Степень зрелости сперматогенного пласта
6,07±0,00
5,49±0,01 <sup>#</sup>
5,42±0,01 <sup># *</sup>
5,44±0,01 <sup># *</sup>
5,07±0,03 <sup>#*</sup>
При определении степени зрелости сперматогенного пласта, являющейся основным показателем, характеризующим выраженность процессов репарации ткани, оказалось, что при введении как одного цитостатического препарата, так и всех изучаемых соединений, ее значения достоверно снижались по сравнению с фоном. Это свидетельствует о том, что в семенниках всех животных, получавших цитостатический препарат, происходили процессы репаративной регенерации тестикулярной ткани за счет образования новых канальцев. Однако при введении препарата «Комплекс» (в обеих примененных дозах) и препарата сравнения через 1 месяц после введения «Паклитаксела», степень зрелости сперматогенного пласта оказалась ниже контрольных значений (на соответственно, 10,8; 10,4 и 23,0%). Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат «Комплекс», как и препарат сравнения, обладает способностью стимулировать процессы репаративной регенерации сперматогенной ткани. Безусловно, это должно привести к возрастанию продуктивности сперматогенеза через 3 месяца после введения цитостатического препарата. Судя по проценту от фона, степень зрелости сперматогенного пласта у крыс, получавших Г-КСФ, оказалась выше, по сравнению с таковой при использовании препарата «Комплекс». Так как, этот показатель вычисляется на основании количества клеток Сертоли, то отмеченный эффект Г-КСФ, является результатом значительного возрастания их числа по сравнению с фоном.
Таким образом, через 2 месяца после цитостатического воздействия «Паклитаксела» на тестикулярную ткань, в семенниках крыс всех групп запущены процессы регенерации ткани, однако в группах терапии исследуемыми препаратом и препаратом сравнения обновление тестикулярной ткани, судя по степени зрелости сперматогенного пласта, происходило более интенсивно. Эффективность препарата сравнения оказалась по данному показателю выше таковой у «Комплекса» (обе дозы), что, очевидно, обусловлено существенным возрастанием количества клеток Сертоли. На фоне введения «препарата «Комплекс» (в дозе 1,0 мг/кг) через 1 месяц после введения «Паклитаксела» отмечается повышение, как и при использовании Г-КСФ, количества сперматогоний, что является, по-видимому, следствием повышенной интенсивности репаративных процессов.
Вторая серия эксперимента
Оценка состояния репродуктивной системы крыс-самцов через 3 месяца после воздействия «Паклитакселом»
Результаты оценки массы тела крыс, количество общих половых клеток, приходящихся на эпидидимис, процента подвижных форм зрелых спермиев через 3 месяца после введения «Паклитаксела» и 2 месяца после лечения препаратом «Комплекс» представлены в таблице 3. Установлено, что масса тела животных в начале эксперимента и через 3 месяца после введения цитостатического препарата во всех сравниваемых группах не различалась (Р>0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что в начале эксперимента была осуществлена качественная рандомизация животных по массе тела, а также о том, что в течение 3-х месяца эксперимента все оказываемые фармакологические воздействия не приводили к существенному снижению массы тела животных.
У крыс, получивших «Паклитаксел», ОКС, приходящихся на эпидидимис, оставалось статистически значимо сниженным (57% от фоновых значений). Это свидетельствует о выраженной недостаточности сперматогенеза в срок, соответствующий проявлению воздействия на стволовые сперматогонии. Значения ОКС в группе крыс, получавших препарат «Комплекс» в обеих исследуемых дозах (0,3 и 1,0 мг/кг) через 1 месяц после введения «Паклитаксела», оказались выше, соответственно, на 96 и 69% по сравнению с контролем («Паклитаксел»). ОКС при введении препарата «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг статистически значимо не отличалось от фоновых значений. Введение препарата сравнения (Г-КСФ) также приводило к возрастанию этого показателя (на 72%), по сравнению с контролем, и не отличалось от фоновых показателей. Обращает внимание на себя тот факт, что в группе крыс, получавших «Комплекс» в дозе 0,3 мг/кг, ОКС статистически значимо превышало фоновые значения.
Процент подвижных форм в группе крыс, получавших препарат «Комплекс» в обеих исследуемых дозах (0,3 и 1,0 мг/кг) через 1 месяц после введения «Паклитаксела», оказался на уровне контрольных значений. Введение препарата сравнения (Г-КСФ) приводило к статистически значимому возрастанию процента подвижных форм по сравнению с контролем, достигая фоновые значения. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат «Комплекс» приводил к увеличению продуктивности сперматогенеза, эффективность которого, судя по ОКС, была выше, чем у препарата сравнения. По показателю подвижность сперматозоидов, однако, более эффективным оказался препарат сравнения - Г-КСФ.
Таблица 3 - Морфологические и функциональные показатели зрелых спермиев крыс через 3 месяца после введения цитостатика «Паклитаксел»
Показатели
Фон
Контроль
«Комплекс» 0,3 мг/кг
«Комплекс» 1,0 мг/кг
Г-КСФ
Масса животногов начале эксперимента (г)
352,2±14,87
352,6±4,06
352,8±14,12
352,6±13,94
352,2±21,36
Масса животногов конце эксперимента (г)
488,0±17,47
490,0±10,17
491,0±5,55
490,2±6,18
489,8±8,67
Количество подвижныхформ сперматозоидов (%)
84,0±1,41
59,7±1,78 <sup>#</sup>
66,3±3,73 <sup>#</sup>
64,3±2,20 <sup>#</sup>
78,0±2,55 <sup>*</sup>
Общее количествосперматозоидов (абс.ед.)
77,0±5,17
44,0±2,07 <sup>#</sup>
86,2±3,17 <sup>*#</sup>
74,3±2,75 <sup>*</sup>
75,6±2,11 <sup>*</sup>
Через 3 месяца после введения «Паклитаксела» сперматогенный эпителий животных выглядел изреженным по сравнению с таковым у интактных крыс. Между канальцами располагалось небольшое число клеток Лейдига.
Установлено (табл. 4), что через 3 месяца после введения «Паклитаксела» численность клеточной популяции сперматогоний оставалась сниженной и составляла 67 % от фоновых значений. Эти данные свидетельствуют о том, что количество сперматогоний с течением времени не возрастает. Источником пополнения этой клеточной популяции являются стволовые сперматогонии, делящиеся при повреждении. Учитывая длительность сперматогенеза, срок проявления их повреждений - 3 месяца. В связи с этим, полученный факт свидетельствует о сокращении под действием «Паклитаксела» количества стволовых сперматогоний.
Через 3 месяца после начала эксперимента в группах введения «Комплекса» сперматогенный эпителий выглядел менее изреженным, чем в контроле (группа введения одного цитостатического препарата). Между канальцами отчетливо выявлялись клетки Лейдига, в количестве близком к норме.
При введении препарата «Комплекс» в дозе 0,3 мг/кг количество сперматогоний было статистически значимо сниженным по сравнению с фоном и не отличалось от контрольных значений. У крыс, получавших «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг, этот показатель статистически значимо превышал контрольные значения (на 22%). Сходные данные были получены в группе препарата сравнения.
При подсчете тестостерон продуцирующих клеток (клетки Лейдига) установлено, что в этот срок наблюдения их число в контроле оказалось сниженным по сравнению с фоном (табл. 4), что может быть результатом токсического действия препарата на гонадотропные клетки гипофиза. У крыс, которым вводились препараты «Комплекс» (в обеих дозах) и Г-КСФ количество клеток Лейдига не отличалось от фоновых значений. Значение этого показателя у крыс, получавших препарат «Комплекс», превышало таковое в контроле.
При подсчете количества клеток микроокружения (клетки Сертоли) выявлялось их статистически значимое снижение в группе крыс, получавших «Паклитаксел». У животных, получавших «Комплекс» в обеих используемых дозах, а также препарат сравнения, этот показатель превышал значения контроля. При введении препарата «Комплекс» в обеих дозах число клеток Сертоли превышало фоновые значения.
При определении степени зрелости сперматогенного пласта было установлено, что при введении цитостатического препарата значения этого параметра статистически значимо снижались по сравнению с фоном. В группе крыс, получивших исследуемые препараты-корректоры, этот показатель был также ниже фоновых значений. Отмеченные факты свидетельствуют о том, что в семенниках животных экспериментальных групп происходили процессы репаративной регенерации тестикулярной ткани. Примечательно, что при введении препарата «Комплекс» (в обеих используемых дозах), а также препарата сравнения степень зрелости сперматогенного пласта оказалась ниже контрольных значений (соответственно на 13, 14 и 10%), что, возможно, указывают на то, что препарат «Комплекс», как и препарат сравнения, обладает способностью стимулировать процессы образования стволовых сперматогоний. Следует отметить, что наиболее низкие значения этого показателя выявлялись в группе крыс, получавших «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг.
Таблица 4 - Морфологические и функциональные показатели семенников крыс через 3 месяца после воздействия «Паклитаксела»
Показатели
Фон
Контроль
«Комплекс» 0,3 мг/кг
«Комплекс» 1,0 мг/кг
Г-КСФ
Количество сперматогоний (абс.ед.)
18,44±0,27
12,35±0,17 <sup>#</sup>
13,18±0,36 <sup>#</sup>
15,02±0,44 <sup># *</sup>
16,72±0,14 <sup># *</sup>
Количество клеток Лейдига (абс.ед.)
15,45±0,53
12,68±0,55 <sup>#</sup>
15,51±0,50<sup>*</sup>
14,47±0,72<sup>*</sup>
14,45±0,92
Количество клеток Сертоли (абс.ед.)
2,51±0,18
2,10±0,09 <sup>#</sup>
3,46±0,05<sup>*#</sup>
3,70±0,23<sup>*#</sup>
2,53±0,13 <sup>*</sup>
Эндокринная активность (усл.ед.)
7,16±0,78
7,06±0,34
4,65±0,08 <sup># *</sup>
4,16±0,38 <sup># *</sup>
6,23±0,41 <sup>*</sup>
Степень зрелости сперматогенного пласта
6,12±0,04
5,57±0,02 <sup>#</sup>
5,33±0,01<sup>*#</sup>
5,28±0,04<sup>*#</sup>
5,49±0,02<sup># *</sup>
Введение цитостатического препарата «Паклитаксел» моделирует в семенниках крыс тестикулярную недостаточность, обусловленную истощением популяции сперматогоний (срок 2 месяца - недостаточность быстро обновляющихся сперматогоний, срок 3 месяца - недостаточность стволовых сперматогоний). О тестикулярной недостаточности свидетельствует снижение продуктивности сперматогенеза (показатель - ОКС). Доказательством того, что это обусловлено истощением источников пролиферативного пула сперматогенеза является снижение численности сперматогоний через 2 и 3 месяца после цитостатического воздействия. Учитывая, что стволовые клетки восполняют численность сперматогоний при повреждении, полученные данные свидетельствуют о частичной гибели под действием «Паклитаксела» стволовых сперматогоний, что подтверждают данные литературы [Сухачева Т.В., Богуш Т.А., Коломиец О.Л. Повреждающее действие таксола на сперматогенез мыши. // Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 2001.- Т.132, №11. - С. 554-560].
Образование новых сперматогоний в извитом семенном канальце лимитируется количеством клеток микроокружения, которые в зрелых канальцах не размножаются. Репаративная регенерация сперматогенной ткани идет только путем образования новых извитых семенных канальцев из регенераторной зоны, содержащей клетки Сертоли и первичные половые детерминанты, которые, впоследствии становятся сперматогониями. Вновь образующиеся семенные канальца характеризуются повышенным содержанием клеток Сертоли, что не ограничивает размножение сперматогоний. Критерием эффективности репаративной регенерации ткани является, прежде всего, степень зрелости сперматогенного пласта.
Результаты исследований показали, что степень зрелости сперматогенного пласта на фоне введения одного «Паклитаксела» снижается по сравнению с фоновыми значениями, как через 2, так и через 3 месяца после введения цитостатического препарата. Таким образом, после цитостатического повреждения в тестикулярной ткани идут естественные процессы репаративной регенерации. На фоне введения препарата «Комплекс» (в обеих дозах) этот показатель также снижался, но в большей степени, что свидетельствует о более интенсивных процессах репаративной регенерации. Сходный по степени выраженности эффект наблюдался при введении препарата сравнения. Наименьшие значения этого показателя выявлялись через 2 месяца после введения «Паклитаксела» в группе препарата сравнения, и через 3 месяца после введения «Паклитаксела» в группе препарата «Комплекс» в дозе 1,0 мг/кг.
В сперматогенном пласте более низкой степени зрелости, клеток микроокружения больше. Это подтверждают полученные результаты: через 2 месяца их число было больше на фоне введения Г-КСФ, через 3 месяца - на фоне введения препарата «Комплекс» (в обеих дозах), где этот параметр оказался выше, чем у препарата сравнения Г-КСФ и выше фоновых значений. У крыс, получавших Г-КСФ, количество клеток Сертоли не превышало фоновые значения.
Возрастание клеток Сертоли не ограничивает размножение сперматогоний. Их количество на фоне введения препарата «Комплекс» в обеих дозах возрастало (срок 2 мес - по сравнению с контролем; срок -3 месяца - по сравнению с контролем и фоном). Препарат сравнения приводил к существенному возрастанию этого показателя по сравнению с фоном только через 2 месяца после введения «Паклитаксела».
Возрастание количества сперматогоний должно привести к увеличению продуктивности сперматогенеза (увеличению общего количества сперматозоидов). И действительно, этот показатель в экспериментальных группах возрастал по сравнению с контролем: на фоне введения препарата «Комплекс» (срок 2 и 3 месяца - дозы 0,3 и 1,0 мг/кг); на фоне введения Г-КСФ также отмечалось возрастание продуктивности сперматогенеза (срок 2 и 3 месяца). Через 2 месяца после начала опыта эффективность препарата сравнения по этому показателю оказалась выше. Наибольшее возрастание ОКС (выше уровня фона) выявлялось при введении препарата «Комплекс» в дозе 0,3 мг/кг через 3 месяца после начала опыта. Это может быть связано не только со стимуляцией процессов репаративной регенерации, но и нормализацией количества тестостерон синтезирующих клеток (в этой группе их число практически не отличалось от фоновых значений). Данные литературы свидетельствуют о крайней резистентности клеток Лейдига к фармакологическим воздействиям [Сухоруков В.С., Шамшад Д.С. Определение степени зрелости сперматогенного пласта крысы при его регенерации и в процессе созревания интактного семенника // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1989. - Т.97, №9. - 89 с.]. Между тем, их роль в гормональной регуляции сперматогенеза является неоспоримой.
На модели тестикулярной недостаточности, связанной с истощением пролиферативного пула сперматогенеза (полу- и стволовых сперматогоний), вызванного цитотоксическим воздействием «Паклитаксела» установлено, что препарат «Комплекс» (в обеих дозах) обладает способностью корректировать нарушения сперматогенеза, за счет усиления процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани. Наиболее выраженный терапевтический эффект на стволовые сперматогонии выявлялся у препарата в дозе 1,0 мг/кг. Эффективность препарата сравнения, как стимулятора образования стволовых сперматогоний, оказалась сопоставимой с таковой у препарата «Комплекс». Вместе с тем при воздействии препарата «Комплекс» выявилось большее, чем при введении Г-КСФ, количество клеток Сертоли. Этот факт свидетельствует о большем регенераторном потенциале семенников на фоне введения препарата «Комплекс», чем Г-КСФ.
Проведенные исследования выявили способность препарата «Комплекс» нормализовать уровень тестостерон синтезирующих клеток, что не выявлялось при введении препарата сравнения. Это также может быть одним из преимуществ тестируемого лекарственного средства. Препарат «Комплекс» (доза 0,3 мг/кг) стимулировал сперматогенез в большей степени, чем препарат сравнения, о чем свидетельствуют показатель продуктивности сперматогенеза через 3 месяца после начала эксперимента.
Таким образом, корректирующее действие «Комплекса» на мужские половые железы при цитотоксическом повреждении обусловлено стимуляцией механизмов репаративной регенерации ткани семенника в целом, приводящей к образованию новых семенных канальцев, содержащих необходимое количество сперматогоний для обеспечения нормального уровня сперматогенеза.
Предлагаемое изобретение позволяет провести эффективную коррекцию нарушений сперматогенеза, вызванных цитотоксическим воздействием, с помощью «Комплекса» за счет стимуляции репаративных процессов тестикулярной ткани в целом, приводящих к образованию новых источников пролиферативного пула сперматогенеза.
Предлагаемый препарат расширяет арсенал средств, предназначенных в андрологии для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитотоксическим воздействием, за счет усиления процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани.
Примеры твердых лекарственных форм включают, например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др.
Примеры жидких лекарственных форм для инъекций и парентерального введения включают растворы, эмульсии, суспензии и др. Композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного соединения с жидким или тонко измельченным твердым носителем.
Готовый лекарственный препарат согласно изобретению в форме таблеток содержат от 2 до 10% активного соединения и наполнитель(и) или носитель(и). В качестве таковых для таблеток применяются: а) разбавители: свекловичный сахар, лактоза, глюкоза, натрия хлорид, сорбит, маннит, гликоль, фосфат кальция двузамещенный; б) связующие вещества: магниевый силикат алюминия, крахмальная паста, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и поливинил пиррол и дон; в) разрыхлители: декстроза, агар, альгиновая кислота или ее соли, крахмал, твин.
ПРИМЕР 1.1
100 мг таблетки, содержащие по 2 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 2 мг
Лактоза - 53,0 мг
Альгиновая кислота - 20,0 мг
Лимонная кислота - 5,0 мг
Трагакант - 20,0 мг
ПРИМЕР 1.2
100 мг таблетки, содержащие по 5 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 5 мг
Лактоза - 50,0 мг
Альгиновая кислота - 20,0 мг.
Лимонная кислота - 5,0 мг
Трагакант - 20,0 мг.
ПРИМЕР 1.3
100 мг таблетки, содержащие по 10 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 10 мг
Лактоза - 45,0 мг
Альгиновая кислота - 20,0 мг
Лимонная кислота - 5,0 мг
Трагакант - 20,0 мг.
Таблетка может быть сформирована посредством прессовки или формовки активного ингредиента с одним или более дополнительными ингредиентами. Получение прессованных таблеток осуществляется на специальной установке. Активный ингредиент в свободной форме, такой, как порошок или гранулы, в количествах 20 г или 50 г или 100 г (количество вещества, необходимое для получения 10000 таблеток) перемешивается со связующим веществом - трагакантом (200 г), смешивается с разбавителем - лактозой (530 г или 500 г или 450 г), в смесь добавляется разрыхляющее вещество - альгиновая кислота (200 г) и отдушка - лимонная кислота (50 г).
Для желатиновых капсул обычно используются дополнительно красители и стабилизаторы. В качестве красителей применяются: тетразин, индиго; в качестве стабилизаторов могут быть представлены: натрия метабисульфит, натрия бензоат. Предлагаемые желатиновые капсулы содержат от 2 до 10% активного ингредиента.
ПРИМЕР 2.1
1 капсула 2 мг содержит:
Активное вещество:
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 2 мг в пересчете на безводное вещество
Вспомогательные вещества:
Бетадекс (β-циклодекстрин) до массы содержимого 190 мг
Капсулы твердые желатиновые:
Желатин
Титана диоксид (Е171).
ПРИМЕР 2.2
1 капсула 5 мг содержит:
Активное вещество:
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 5 мг в пересчете на безводное вещество
Вспомогательные вещества:
Бетадекс (β-циклодекстрин) до массы содержимого 190 мг
Капсулы твердые желатиновые:
Желатин
Титана диоксид (Е171).
ПРИМЕР 2.3
1 капсула 10 мг содержит:
Активное вещество:
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 10 мг в пересчете на безводное вещество
Вспомогательные вещества:
Бетадекс (β-циклодекстрин) до массы содержимого 190 мг
Капсулы твердые желатиновые:
Желатин
Титана диоксид (Е171).
Активный ингредиент в свободной форме, такой, как порошок или гранулы, в количествах 20 г или 50 г или 100 г (количество вещества, необходимое для получения 10000 капсул) перемешивается с веществом β-циклодекстрин (бетадекс) (1880 г или 1850 г или 1800 г).
Инъекционные формы композиции предпочтительно представляют собой изотонические и масляные растворы, суспензии и содержат от 0,025 до 0,1% активного ингредиента. Вышеуказанные формы могут стерилизоваться и содержать добавки, такие как консерванты: натрия метабисульфит, бензойная кислота, натрия бензоат, смесь метилпарабена и пропилпарабена; стабилизаторы: абрикосовая и аравийская камедь, декстрин, крахмальный клейстер, метилцеллюлоза, твин; соли, регулирующие осмотическое давление (хлорид натрия), или буферы. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически полезные вещества.
ПРИМЕР 3.1
2 мл ампулы, содержащие по 0,5 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 0,5 мг
Соевое масло гидрированное - 2 мл.
ПРИМЕР 3.2
2 мл ампулы, содержащие по 1,0 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 1,0 мг
Соевое масло гидрированное - 2 мл.
ПРИМЕР 3.3
2 мл ампулы, содержащие по 2,0 мг 9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена
9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантен - 2,0 мг
Соевое масло гидрированное - 2 мл.
Для приготовления инъекционных форм активное соединение (0,5 г или 1 г или 2 г; количества, необходимые для изготовления 1000 ампул) тонко измельчают и смешивают в смесителе с соевым маслом гидрированным (2000 мл). Полученный раствор фасуют в ампулы по 2 мл и стерилизуют паром в течение 30 мин.
Назначаемая для приема доза активного компонента (9-фенил-2,3,4,5,6,7,8,9-октагидро-1Н-селеноксантена формулы 1 или его смеси с β-циклодекстрином или клатратного комплекса с β-циклодекстрином) варьирует в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, масса тела пациента, симптомы и тяжесть заболевания, конкретно назначаемое соединение, способ приема, форма препарата, в виде которой назначается активное соединение. Обычно, общая назначаемая доза составляет от 1 до 20 мг в день. Общая доза может быть разделена на несколько доз, например, для приема от 1 до 4 раз в день. При оральном назначении интервал общих доз активного вещества составляет от 1 до 20 мг в день, предпочтительно, от 1 до 10 мг. При парентеральном приеме интервал назначаемых доз составляет от 0,5 до 5 мг в день, предпочтительно, от 0,5 до 2 мг. Эффективная терапевтическая доза препарата может быть выбрана лечащим врачом.