Способ экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы
METHOD FOR RAPID DIAGNOSIS OF MALIGNANT TUMORS OF THE EYELIDS AND CONJUNCTIVA

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии, а именно, к офтальмоонкологии, и предназначено для экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы.
Наиболее частой патологией среди злокачественных новообразований органа зрения являются опухоли придаточного аппарата глаза (около 75%), чаще поражается кожа век, реже - конъюнктива. В структуре злокачественных опухолей кожи век превалирует базальноклеточный рак (94,7%), реже развиваются плоскоклеточный и метатипический рак (4%), аденокарцинома мейбомиевой железы (0,7%) и меланома (0,6%) [Бровкина А.Ф., Панова И.Е., Саакян С.В. Офтальмоонкология: новое за последние два десятилетия. Вестник офтальмологии 2014]. Среди немеланомных злокачественных новообразований конъюнктивы наиболее часто диагностируются плоскоклеточный рак конъюнктивы (8,5%) и лимфомы (7,1%); меланома конъюнктивы диагностируется у 12,1% [Shields C.L., Demirci Н., Karatza Е., Shields J. A. Clinical survey of 1643 melanocyte and nonmelanocytic tumors of the conjunctiva. Ophthalmology. 2004; 111 (9): 1747-54; Бровкина А.Ф., Вальский B.B., Гусев Г.А. и др. Офтальмоонкология. Руководство для врачей. Москва: Медицина, 2002].
Клиническое течение злокачественных опухолей век и конъюнктивы характеризуется большим полиморфизмом, высокой степенью злокачественности и способностью к инвазивному росту, их дифференциальная диагностика представляет значительные сложности [Бровкина А.Ф. Офтальмоонкология. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2002; Мачехин, В. А. Атипичный случай опухоли верхнего века (трудности клинической и морфологической диагностики) / В. А. Мачехин // Офтальмохирургия. - 2011. - №3. - С. 68-71].
Неправильная постановка первоначального диагноза и, как следствие, неправильный выбор лечебной тактики у превалирующего числа пациентов, приводит к рецидиву злокачественной опухоли и может представлять угрозу для жизни пациента [Енгибарян М.А. К вопросу о рецидивных злокачественных опухолях глаза. Кубанский науч. мед. вестник. 2011;1(124):116-118]. По данным различных авторов, частота возникновения рецидивов злокачественных новообразований придаточного аппарата глаза варьирует от 2,2% до 40% [Бровкина А.Ф. Офтальмоонкология: Руководство для врачей. - М.: Медицина, 2002; Абунамус С.М. Рецидивирующее течение базально - клеточного рака кожи век: клинико - морфологические особенности, лечение // Диссертация на соискание степени канд. мед. наук. Челябинск, 2004].
Базовым методом лечения злокачественных опухолей век и конъюнктивы остается хирургическое максимально полное удаление опухоли при оптимальном сохранении видимых здоровых тканей [Бровкина А.Ф., Вальский В.В., Гусев Г.А. и др. Офтальмоонкология. Руководство для врачей. Под ред. А.Ф. Бровкиной. М., 2002; Казанцева Е.Е. Тактические подходы к хирургическому лечению базально-клеточного рака кожи век // Диссертация на соискание ученой степени канд. мед. наук. Челябинск, 2005].
В настоящее время дооперационная диагностика с целью определения объема хирургического вмешательства проводится в основном с помощью клинического осмотра и цитологического исследования. При необходимости могут применяться дополнительные неинвазивные способы диагностики: оптическая когерентная томография, ультразвуковые методы, конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, отражательная и флюоресцентная спектроскопия, компьютерная томография. Но все эти способы диагностики не дают информацию о морфологической принадлежности опухоли, на основе чего принимается решение об объеме хирургического вмешательства и дальнейшей тактике ведения пациента.
Известен способ того же назначения, при котором проводят срочное интраоперационное морфологическое исследование замороженных срезов опухолей [Срочная интраоперационная морфологическая диагностика в онкологии / Н.Н. Волченко, О.В. Борисова, А.Г. Ермолаева, В.Ю. Мельникова, А.Н. Петров, Е.Н. Славнова // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена 2020, Т. 9, №1, с. 5-13]. Недостатками способа является длительность проведения исследования, ограниченное количество используемых участков и более низкое качество гистологических препаратов, чем при плановом гистологическом исследовании после приготовления парафиновых блоков, что влияет на точность морфологического диагноза из-за формирования в замороженных срезах кристаллов льда, вследствие чего происходит деформация материала и искажается архитектоника ткани.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения, при котором проводят исследование оптических свойств тканей для получения спектральной информации о структуре тканей с помощью комбинационного рассеяния и аутофлуоресцентного анализа [Оптическая диагностика злокачественных и доброкачественных новообразований кожи / Ю.А. Христофорова, И.А. Братченко, Д.Н. Артемьев [и др.] // Информационные технологии и нанотехнологии (ИТНТ-2017): сборник трудов III международной конференции и молодежной школы, Самара, 25-27 апреля 2017 года/ Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королева. - Самара: Предприятие "Новая техника", 2017. - С.265-268]. Недостатками ближайшего аналога является необходимость наличия дорогостоящего оборудования, необходимость в усложнении математического анализа спектральных данных для повышения точности диагностики опухолей.
В настоящий момент остается актуальной потребность в разработке новых способов экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы, который бы позволил оптимизировать тактику хирургического лечения и определить объем хирургического вмешательства.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы с определением морфологической принадлежности опухоли на основе спектрометрических характеристик биогенных наночастиц металлов, сформированных в присутствии опухолевых клеток.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность выбора оптимального объема хирургического лечения опухолей век и конъюнктивы с определением дальнейшей тактики ведения пациента.
Технический результат достигается за счет спектрометрического определения оптической плотности реакционной смеси с биогенными наночастицами серебра, сформированными в присутствии опухолевых клеток
Известно, что опухолевые клетки отличаются от нормальных клеток не только морфологически, но и более высоким уровнем клеточного метаболизма и биосинтеза. Эти особенности опухолевых клеток проявляются в способности с высокой скоростью восстанавливать катионы, что может приводить к последующему формированию in situ биогенных наночастиц металлов. Предлагаемый способ позволяет на основании восстановительной активности клеток в отношении катионов серебра оценивать метаболическую активность новообразований век и конъюнктивы и подтвердить их метаболические различия. Уточнение характера новообразования позволит обеспечить дооперационную или интраоперационную экспресс-диагностику опухолей век и конъюнктивы.
Как известно, определяющим признаком опухолевого процесса является аномальная неконтролируемая пролиферация, для поддержания которой опухолевые клетки подвергаются онкоген-ориентированному метаболическому перепрограммированию [Куликов В. А., Беляева Л. Е. Метаболическое перепрограммирование раковых клеток // Вестник ВГМУ. 2013. №2]. Было отмечено, что особенностью опухолевых клеток, обладающих высоким уровнем метаболизма, является повышенная способность восстановления катионов благородных и тяжелых металлов до нейтральных атомов с последующей их агрегацией и формированием наноразмерных биогенных частиц [Gao S., Chen D., Li Q. et al., Near-infrared fluorescence imaging of cancer cells and tumors through specific biosynthesis of silver nanoclusters. Scientific Reports. 2014; 4, 4384.]. Показано, что качественные и количественные распределения сформированных биогенных наночастиц в ходе взаимодействия метаболитов клеток с растворимыми солями благородных и тяжелых металлов, отличаются в зависимости от свойств эукариотических клеток и их метаболической активности [Singh A., et al., Green synthesis of metallic nanoparticles as effective alternatives to treat antibiotics resistant bacterial infections: A review, Biotechnology Reports, Volume 25, 2020].
Известен нанобиотехнологический способ получения биогенных наночастиц при восстановлении катионов металлов в присутствии в реакционном растворе живых метаболически активных клеток [Патент на изобретение «Способ обнаружения микробной и вирусной контаминации растворов». RU 2641960 от 23.01.2018].
Заявляемый нанобиотехнологический способ позволяет проводить экспресс-диагностику злокачественных опухолей век и конъюнктивы по повышенному уровню восстановительной активности опухолевых клеток в отношении катионов серебра, оцененной по совокупности спектрометрических характеристик биогенных наночастиц серебра, сформированных в присутствии опухолей век и конъюнктивы.
3
2
3
3
2
3
400
Проведено исследование на 28 пациентах с новообразованием века (n=15) и конъюнктивы (n=13), выявленными клинически. Для исследования брали опухолевую ткань из новообразования века или конъюнктивы, удаленного хирургическим методом. В качестве контрольного образца брали такой же участок здоровой ткани из того же глаза. Образцы опухолевой (С) и здоровой (N) ткани с помощью конъюнктивальных ножниц в асептических условиях делили на примерно одинаковые части, получая таким образом материал для повторных измерений. Фрагменты тканей помещали в стерильные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Измеряли массу каждого из исследуемых фрагментов образцов тканей на аналитических весах CPA225D (Sartorius, Германия). В качестве источника катионов серебра в каждую из пробирок с образцами тканей добавляли по 500 мкл стерильного раствора аммиаката серебра Ag(NH)NO. Для оптимизации режима сравнения восстановительных способностей тканей С и N типа в предварительных экспериментах использовали Ag(NH)NO в концентрациях 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,125 мг/мл, 0,062 мг/мл, 0,031 мг/мл, 0,015 мг/мл. Реакцию восстановления катионов Ag+ в присутствии образцов тканей проводили при температуре 37°С в термостатируемом шейкере ST-3 (Elmi, Латвия) с перемешиванием 60 и 300 об/мин или при комнатной температуре 23°С без перемешивания. Длительность реакции восстановления в разных вариантах опытов варьировали от 3 до 20 минут. Спектрометрическое определение сформированных биогенных наночастиц проводили при длинах волн близких к специфическим для наночастиц серебра (λ). Из каждой пробирки по 100 мкл реакционной смеси с помощью автоматической пипетки переносили в отдельные лунки микропланшета. Спектрометрическое определение оптической плотности реакционных смесей (А) с биогенными наночастицами серебра проводили на многофункциональном фотометре для микропланшетов Synergy MX (Bio-Tek, США). Оптическую плотность образцов регистрировали при фиксированных длинах волн (λ) 395, 400, 405, 410, 415, 420 нм. Полученные результаты измерений сохраняли в виде таблицы Excel.
Определение уровня восстановительной активности злокачественных и доброкачественных опухолей век и конъюнктивы по их способности формировать in situ биогенные наночастицы серебра показало, что оптическая плотность реакционных смесей в пробах со злокачественными и доброкачественными опухолями век и конъюнктивы выше, чем в контрольных образцах аналогичных здоровых тканей в каждой паре проб. Разница в оптической плотности реакционных смесей с биогенными наночастицами была наиболее достоверна при концентрации аммиаката серебра 0,031 мг/мл.
Способ осуществляют следующим образом.
Участок удаленной опухоли и такой же участок интактной ткани века или конъюнктивы помещают в раствор аммиаката серебра с концентрацией 0,031 мг/мл. Проводят спектрометрическое определение соотношения оптической плотности реакционных смесей с опухолевой и здоровой тканью. При его величине более 4 диагностируют злокачественную опухоль.
Возможность реализации заявляемого нанобиотехнологического способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Пациент К., в возрасте 65 лет направлен с диагнозом новообразование нижнего века левого глаза. При осмотре установлено зрение правого глаза 0,6, зрение левого глаза 0,9. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы. При осмотре на нижнем веке в средней его трети определяется проминирующее, густо-пигментированное образование с бугристой поверхностью, с нечеткими и неровными контурами, образование распространяется на интермаргинальное пространство. Передний отрезок глаза без патологии. В кортикальных слоях и ядре хрусталика начальные помутнения. Деструкция стекловидного тела. Глазное дно без патологии. По данным ультразвукового исследования в толще века определяется гипоэхогенная "плюс-ткань" размерами 2,8×8,5 мм, с собственными сосудами (режим цветового доплеровского картирования). По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз новообразование нижнего века. Из опухоли века взята биопсия для исследования, из того же глаза взят такой же образец здоровой (контрольной) ткани из кожи век. Проведен спектрометрический анализ реакционных смесей со здоровыми и опухолевыми тканями на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (Bio-Tek, США). Различия генерируемых биогенных наночастиц серебра регистрировали по разнице оптических плотностей реакционных смесей с биогенными наночастицами, сформировавшимися в присутствии клеток опухолевых и здоровых тканей. Разница в оптической плотности парных реакционных смесей с биогенными наночастицами серебра была заметна с пятой минуты реакции восстановления. Анализ восстановительной активности образцов опухолевой и здоровой ткани показал, что уровень формирования in situ биогенных наночастиц серебра в реакционной смеси выше у опухолевой ткани, чем у здоровой. Величина соотношения оптической плотности реакционной смеси с опухолью века с показателем оптической плотности реакционной смеси со здоровой тканью при концентрации 0,031 мг/мл составила 5,22. Результаты спектрометрического исследования показали высокую степень восстановительной активности опухолевых клеток в отношении катионов серебра, что может говорить о злокачественном характере опухоли. Учитывая возможный скрытый инвазивный рост злокачественных опухолей, использовали широкую резекцию опухоли и планировали дальнейшее комбинированное лечение.
Позднее принадлежность опухоли была подтверждена результатами патогистологического исследования: эпителиоидно-клеточная меланома кожи нижнего века, поверхностно-распространяющаяся форма с пигментообразованием.
Пример 2. Пациентка А., в возрасте 52 лет направлена с диагнозом новообразование нижнего века правого глаза. При осмотре установлено зрение правого и левого глаза 1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы. При осмотре в наружной трети нижнего века определяется проминирующее, беспигментное образование с приподнятыми краями, размерами около 7×8 мм, поверхность образования бугристая, определяются мелкие сосуды на поверхности. Передний отрезок глаза без патологии.
Хрусталик прозрачный. Деструкция стекловидного тела. Глазное дно без патологии. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз новообразование нижнего века правого глаза. Из опухоли века взята биопсия для исследования, из того же глаза взят такой же образец здоровой ткани из кожи век для контроля. Проведен спектрометрический анализ здоровой и опухолевой ткани на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (Bio-Tek, США). Различия генерируемых биогенных наночастиц серебра регистрировали по разнице оптических плотностей реакционных смесей с биогенными наночастицами, сформировавшимися в присутствии клеток опухолевых и здоровых тканей. Разница в оптической плотности парных реакционных смесей с биогенными наночастицами была заметна с пятой минуты реакции восстановления катионов серебра. Анализ восстановительной активности образцов опухолевой и здоровой ткани показал, что уровень формирования in situ биогенных наночастиц серебра в реакционной смеси выше у опухолевой ткани, чем у здоровой. Величина соотношения показателя оптической плотности реакционной смеси с опухолью с показателем оптической плотности реакционной смеси со здоровой тканью при концентрации 0,31 мг/мл составлял 4,5. По результатам спектрометрического исследования, можно судить о высокой степени восстановления катионов опухолевыми клетками, что свидетельствует о злокачественном характере опухоли. Учитывая возможный скрытый инвазивный рост злокачественных опухолей, использовали широкую резекцию опухоли. Пациенту планируется провести комбинированное лечение злокачественной опухоли. Принадлежность опухоли подтверждена результатами патогистологического исследования: базально-клеточный рак кожи, нодулярный вариант с наличием очагов пигментации.
Пример 3. Пациент Л., в возрасте 34 лет направлен с диагнозом новообразование нижнего века левого глаза. При осмотре установлено зрение правого и левого глаза 1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы. При осмотре в средней трети нижнего века определяется проминирующее, пигментное образование светло-коричневого цвета с мелкобугристой поверхностью, ровными, нечеткими краями, с распространением на интермаргинальное пространство. Передний отрезок глаза без патологии. Хрусталик прозрачный. Стекловидное тело прозрачное. Глазное дно без патологии. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз новообразование нижнего века левого глаза. Из опухоли века взята биопсия для исследования, из того же глаза взят такой же образец здоровой ткани из кожи век для контроля. Проведен спектрометрический анализ здоровой и опухолевой ткани на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (Bio-Tek, США). Различия генерируемых биогенных наночастиц серебра регистрировали по разнице оптических плотностей реакционных смесей с биогенными наночастицами, сформировавшимися в присутствии клеток опухолевых и здоровых тканей. Разница в оптической плотности парных реакционных смесей с биогенными наночастицами была заметна с пятой минуты реакции восстановления катионов серебра. Анализ восстановительной активности образцов опухолевой и здоровой ткани показал, что уровень формирования in situ биогенных наночастиц серебра в реакционной смеси выше у опухолевой ткани, чем у здоровой. Величина соотношения показателя оптической плотности реакционной смеси с опухолью с показателем оптической плотности реакционной смеси со здоровой тканью при концентрации 0,31 мг\мл составила 2,33. Таким образом, соотношение оптической плотности реакционных смесей с опухолевой и здоровой тканью было менее 4, то есть восстановление катионов опухолевыми клетками больше, чем в контрольной ткани, что говорит о доброкачественном характере опухоли. Учитывая это, во время оперативного вмешательства использовали экономную резекцию и планировали дальнейшее наблюдение пациента. Позднее принадлежность опухоли была подтверждена результатами патогистологического исследования: субэпителиальный невус кожи с начальным инвазивным ростом в подлежащую мышцу, края резекции интактные.
Пример 4. Пациентка Ф., в возрасте 44 лет направлена с диагнозом новообразование конъюнктивы левого глаза. При осмотре установлено зрение правого и левого глаза 1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы. При осмотре на конъюнктиве по меридианам с 2 до 3.30 часов определяется проминирующее неравномерно пигментированное образование коричневого цвета, с нечеткими краями, неровной поверхностью, с точечным распылением пигмента по нижнему краю, образование распространяется через лимб на край роговицы на 0,5 мм, вокруг образования расширенные сосуды конъюнктивы. Передний отрезок глаза без патологии. Хрусталик прозрачный. Стекловидное тело прозрачное. Глазное дно без патологии. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз новообразование конъюнктивы левого глаза. Из опухоли конъюнктивы взята биопсия для исследования, из того же глаза взят такой же образец здоровой ткани из бульбарной конъюнктивы для контроля. Проведен спектрометрический анализ здоровой и опухолевой ткани на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (Bio-Tek, США). Различия генерируемых биогенных наночастиц серебра регистрировали по разнице оптических плотностей реакционных смесей с биогенными наночастицами, сформировавшимися в присутствии клеток опухолевых и здоровых тканей. Разница в оптической плотности парных реакционных смесей с биогенными наночастицами была заметна с пятой минуты реакции восстановления катионов серебра. Анализ восстановительной активности образцов опухолевой и здоровой ткани показал, что уровень формирования in situ биогенных наночастиц серебра в реакционной смеси выше у опухолевой ткани, чем у здоровой. Величина соотношения показателя оптической плотности реакционной смеси с опухолью с показателем оптической плотности реакционной смеси со здоровой тканью при концентрации 0,31 мг\мл составляла 1,9. Восстановление катионов опухолевыми клетками больше, чем у контрольных тканей. Относительно низкая степень восстановления катионов опухолевыми клетками по сравнению с контрольными образцами здоровой ткани может говорить о доброкачественном характере опухоли. Учитывая это, использовали экономную резекцию опухоли и планировали дальнейшее наблюдение пациента. Позднее принадлежность опухоли подтверждена результатами патогистологического исследования: сложный меланоцитарный невус, края резекции элементов невуса не содержат.
Пример 5. Пациентка Б., в возрасте 62 лет направлена с диагнозом новообразование конъюнктивы левого глаза. При осмотре установлено зрение правого и левого глаза 0,9. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы. При осмотре определяется узловое образование темно-коричневого цвета, исходящее из конъюнктивы и частично нижнего свода, размерами около 10*9*9 мм, неровной поверхностью и собственными сосудами. Роговица прозрачная, передняя камера средняя, равномерная, влага чистая. Хрусталик прозрачный. Стекловидное тело прозрачное. Глазное дно без патологии. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз новообразование конъюнктивы левого глаза. Из опухоли конъюнктивы взята биопсия для исследования, из того же глаза взят такой же образец здоровой ткани из бульбарной конъюнктивы для контроля. Проведен спектрометрический анализ здоровой и опухолевой ткани на многофункциональном фотометре для микропланшет Synergy MX (Bio-Tek, США). Различия генерируемых биогенных наночастиц серебра регистрировали по разнице оптических плотностей реакционных смесей с биогенными наночастицами, сформировавшимися в присутствии клеток опухолевых и здоровых тканей. Разница в оптической плотности парных реакционных смесей с биогенными наночастицами была заметна с пятой минуты реакции восстановления катионов серебра. Анализ восстановительной активности образцов опухолевой и здоровой ткани показал, что уровень формирования in situ биогенных наночастиц серебра в реакционной смеси выше у опухолевой ткани, чем у здоровой. Величина соотношения показателя оптической плотности реакционной смеси с опухолью с показателем оптической плотности реакционной смеси со здоровой тканью при концентрации 0,31 мг\мл составляла 6,55. По результатам спектрометрического исследования можно судить об очень высокой степени восстановления катионов опухолевыми клетками по сравнению с контрольными образцами здоровой ткани, что может говорить о злокачественном характере опухоли. Учитывая это, использовали широкую резекцию опухоли и планировали дальнейшее комбинированное лечение. Злокачественный характер опухоли подтвержден результатами патогистологического исследования: пигментированная эпителиоидно-клеточная меланома конъюнктивы с диффузным инфильтративным характером роста, Грейд 4, края резекции интактные.
Таким образом, предложенный нанобиотехнологический способ экспресс-диагностики злокачественных опухолей век и конъюнктивы позволяет скорректировать технику хирургического вмешательства и определить необходимость проведения комбинированного лечения пациента.