КАНТИЛЕВЕРНЫЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТАТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА

Полезная модель относится к области биофизики и касается кантилеверного сенсора для определения простат-специфического антигена (ПСА), который может быть использован, например, для раннего обнаружения рака предстательной железы человека (РПЖ).
Известен кантилеверный сенсор для определения ПСА, состоящий из плоской гибкой консоли, у которой одна из плоскостей покрыта бычьим сывороточным альбумином (БСА), а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит антитела, специфические к ПСА, химически связанные с предыдущим слоем (Jeong Hoon Lee, Kyo Seon Hwang, Jaebum Park, Ki Hyun Yoon, Dae Sung Yoon, Tae Song Kim // Immunoassay of prostate-specific antigen (PSA) using resonant frequency shift of piezoelectric nanomechanical microcantilever, Biosensors and Biolectronics, 20, 2005, 2157-2162).
Наиболее близким к заявляемому является известный кантилеверный сенсор для определения ПСА, состоящий из плоской гибкой консоли, содержащей, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния, и способной отражать световое излучение, у которой одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА (Guanghua Wu, Ram H.Datar, Karolyn M.Hansen, Richard J.Cote and Arun Majumbar // Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilever/ Nature biotechnology, V.19, 2001, 856-860) - прототип. В данном техническом решении кантилевер, представляет собой консоль, выполненную из кремния, одна из плоскостей которого покрыта слоем БСА, а другая покрыта слоем напиленного золота. При хранении такого кремниевого кантилевера на воздухе неизбежно происходит образование диоксидной пленки на поверхности кремния. Позолоченная плоскость консоли содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли и представляет собой слой дитиобис-(сульфосукцинимидилпропионата). Другой слой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА.
Недостатком известного технического решения является недостатбчная чувствительность сенсора для определения ПСА, зависящая от состава жидкой среды и составляющая для модельной системы, аналогичной сыворотки крови человека, 0,2 нанограмм/миллилитр (нг/мл), не позволяющая достоверно регистрировать низкие концентрации ПСА в жидкой среде и, тем самым, не позволяющая выявлять ранние стадии заболевания РПЖ.
Задача полезной модели заключается в создании кантилеверного сенсора для определения ПСА, обладающего более высокой чувствительностью, а также расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы в качестве сенсора для определения ПСА.
Указанный технический результат достигается тем, что в кантилеверном сенсоре для определения ПСА, состоящем из плоской гибкой консоли, содержащей, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния, и способной отражать световое излучение, у которой одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, слой, ковалентно связанный с поверхностью консоли, выполнен из 3-аминопропилсилатрана (АПС).
Предлагаемый кантилеверный сенсор для определения ПСА не описан в научно-технической литературе и является новым.
Предлагаемое техническое решение может быть использовано для анализа жидких сред, например, таких как природные биологические жидкости (сыворотка крови человека, моча и т.д.), и модельных водных растворов, содержащих ПСА.
В предложенной полезной модели геометрические размеры консоли могут быть различны в пределах размеров кантилеверов, используемых в атомно-силовой микроскопии, что обусловлено тем, что полезным сигналом на присутствие ПСА в исследуемой биологической среде является механическая деформации консоли - изгиб, о степени которого, можно судить, например, по отклонению луча света, отраженного от поверхности кантилевера. При этом форма кантилевера может быть различной. Следует отметить, что используемый кантилевер обязательно должен быть достаточно гибким, что обусловлено способом регистрации присутствия ПСА в исследуемой жидкой среде, и плоским, что повышает гибкость кантилевера.
В предлагаемом техническом решении, по крайней мере, поверхность одной из плоскостей кантилевера должна содержать диоксид кремния, что обусловлено тем, что именно с диоксидом кремния можно осуществить ковалентное связывание АПС. В предлагаемом техническом решении кантилевер может быть выполнен как из кремния, так и из других материалов, например, из металла, из пластика и т.д. При использовании для изготовления кантилевера других материалов кроме кремния, необходимо дополнительно осуществить напыление кремния или диоксида кремния на поверхность кантилевера. При выдерживании на воздухе кантилевера, содержащего на поверхности атомы кремния, самопроизвольно происходит их частичное или полное окисление с образованием на поверхности диоксида кремния.
В предложенной полезной модели поверхность консоли должна быть способна отражать световое излучение, направленное на консоль, что обусловлено особенностями регистрации изгиба кантилевера, свидетельствующего о присутствии ПСА в исследуемой биологической жидкости. В качестве отражательной поверхности кантилевера может быть использована, например, полированная поверхность кремния или напыленный слой другого материала с хорошими отражательными свойствами. В качестве такого материала, как правило, используют золото. При этом в качестве светового излучения можно использовать, например, луч лазера или фокусированный луч от любого источника света. Если консоль не будет способна отражать световое излучение, то предлагаемая полезная модель становится неработоспособной.
В предлагаемом техническом решении у консоли одна из плоскостей должна быть покрыта БСА, а другая должна содержать два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела (белка), специфически распознающего ПСА. Если у консоли обе плоскости будут содержать два слоя, один из которых ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, то полезная модель становится неработоспособной вследствие того, что при взаимодействии ПСА со специфическими антителами, закрепленными на кантилевере, не будет происходить изгиб кантилевера из-за уравновешивания сил, действующих на каждую из плоскостей кантилевера. Таким образом, в предложенной полезной модели одна из плоскостей содержит закрепленные специфические антитела к ПСА, а поверхность другой плоскости, обработанной БСА, не может специфически связываться с ПСА. Наличие в предлагаемом техническом решении на одной из поверхностей кантилевера двух слоев обусловлено тем, что без этого химически закрепить антитела на поверхности кантилевера невозможно.
В предложенной полезной модели слой, ковалентно связанный с поверхностью консоли, выполнен из АПС. Экспериментально было установлено, что это соединение способно ковалентно связываться с поверхностью консоли, содержащей диоксид кремния, с образованием монослоя, позволяющего химически связывать на модифицированной поверхности кантилевера молекулы специфических реагентов на ПСА, в качестве которых в предложенном техническом решении использованы молекулы антитела к ПСА. Также экспериментально было установлено, что с поверхностью кантилевера, не содержащей диоксид кремния, АПС ковалентно не связывается. Следует отметить, что в предлагаемом техническом решении молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, должны быть обязательно химически связаны с модифицированной поверхностью кантилевера. Это достигается обработкой модифицированной поверхности кантилевера раствором, содержащим антитела к ПСА, с последующей отмывкой не вступивших в реакцию антител. После этого на поверхности кантилевера остаются только антитела, химически связанные с поверхностью кантилевера. Если на поверхности кантилевера кроме связанных также будут присутствовать молекулы антител к ПСА, несвязанные с кантилевером, то результаты анализа с использованием таких кантилеверов будут недостоверными.
Предлагаемые кантилеверный сенсор на ПСА может быть получен, например, путем использования плоского гибкого кремниевого кантилевера, содержащего на одной из плоскостей напыленный слой золота, обеспечивающий хорошее отражение светового излучения. При хранении такого кантилевера на воздухе на его не модифицированной поверхности неизбежно образуется слой диоксида кремния. После этого вышеуказанный кантилевер обрабатывают водным раствором АПС. При этом продолжительность такой обработки может варьироваться в широких пределах и составлять, например, в течении 15-60 минут (мин), затем кантилевер промывают дистиллированной водой для удаления не вступившего в реакцию АПС. После такой обработки получают кантилевер, содержащий на одной из плоскостей ковалентно связанный с поверхностью кантилевера слой АПС. При этом позолоченная плоскость кантилевера остается не модифицированной. Модифицированную поверхность полученного кантилевера после этого обрабатывают в течение ночи при 4°С раствором моноклональных антител, специфических к ПСА, взятых в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 молярном (М) К-фосфатном водном буферном растворе с рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой. После этого полученный кантилевер обрабатывают 1%-ным раствором БСА в том же буферном растворе в течение 1 часа (ч), в результате чего на позолоченной поверхности кантилевера сорбируются молекулы БСА, затем кантилевер промывают дистиллированной водой. После таких обработок получают плоский гибкий кантилевер, способный отражать световое излучение, у которой одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит диоксид кремния и, кроме того, имеет два слоя, один из которых, выполненный из АПС, ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит химически связанные с предыдущим слоем молекулы антитела, специфически распознающего ПСА.
Анализ жидкой среды на присутствие в ней ПСА с помощью предлагаемого кантилевера можно проводить как с использованием одного предлагаемого нами кантилевера, так и с использованием дополнительного кантилевера сравнения, содержащего на одной из плоскостей диоксид кремния, а на другой плоскости напыленный слой золота и обработанного с двух сторон БСА. Кантилевер сравнения необходим для учета влияния побочных факторов среды. Следует отметить, что при использовании одного кантилевера, содержащего напыленный материал, обязательно нужно осуществлять термостатирование исследуемой жидкой среды, чтобы избежать побочного изгиба кантилевера, вызванного разными коэффициентами расширения используемых материалов. Далее кантилевер закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилевера. В ячейку вводят сначала жидкую среду, не содержащую ПСА, затем на позолоченную плоскость кантилевера направляют световое излучение. По отклонению светового излучения от отражательной поверхности кантилевера определяют положение кантилевера. Отклонение отраженного луча света регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. После того, как система придет в состояние равновесия, раннее используемую жидкую среду вытесняют анализируемой жидкой средой. Изменение отклонения кантилевера свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемой жидкой среде. Таким методом можно осуществлять качественное определение ПСА. Если произвести предварительную градуировку системы, то можно осуществлять количественное определение ПСА в жидкой среде. Чувствительность определения (предел обнаружения) ПСА с помощью предложенного и известного кантилеверных сенсоров определяют путем последовательного снижения концентрации ПСА в анализируемой жидкой среде. Чувствительность кантилеверного сенсора для определения ПСА может варьироваться в зависимости от состава жидкой среды.
Преимущества предложенного кантилеверного сенсора для определения ПСА иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Опыт проводят с использованием исходного кремниевого кантилевера, представляющего собой плоскую гибкую консоль прямоугольной формы, содержащую на одной плоскости напыленный слой золота, поверхность которого обладает хорошими отражательными способностями. На другой поверхности кантилевера содержится диоксид кремния. Кантилевер обрабатывают водным раствором АПС в течение 30 мин, затем кантилевер промывают дистиллированной водой для удаления не вступившего в реакцию АПС. После такой обработки получают кантилевер, содержащий на одной из плоскостей ковалентно связанный с поверхностью кантилевера слой АПС. При этом позолоченная плоскость кантилевера остается не модифицированной. После этого полученный кантилевер в течение ночи при 4°С обрабатывают раствором моноклональных антител к ПСА в концентрации 100 мкг/мл в 0,01 М калий-фосфатном водном буферном растворе с рН 7,2, содержащем 0,15 М NaCl, после чего кантилевер промывают дистиллированной водой и обрабатывают в течение 1 ч 1%-ным раствором БСА в том же буферном растворе. В результате на позолоченной поверхности кантилевера сорбируются молекулы БСА, затем кантилевер промывают дистиллированной водой. Получают кантилеверный сенсор на ПСА. Сенсор способен отражать световое излучение, и у него одна из плоскостей покрыта БСА, а другая содержит два слоя, один из которых выполнен из АПС и ковалентно связан с поверхностью консоли, а другой содержит молекулы антитела, специфически распознающего ПСА, химически связанные с предыдущим слоем.
Полученный кантилевер и кантилевер сравнения (содержащий на одной из плоскостей диоксид кремния, а на другой плоскости напыленный слой золота и обработанный с двух сторон БСА), необходимый для учета влияния побочных факторов среды, закрепляют одним концом в жидкостной ячейке системы для определения положения кантилеверов. В ячейку вводят сначала буферный раствор (0,01М калий-фосфатный водный буферный раствор с рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl), затем на позолоченные плоскости кантилеверов направляют луч лазера. По отклонению луча от отражательной поверхности кантилеверов определяют положение кантилеверов. Отклонение отраженного луча лазера регистрируют с помощью позиционно-чувствительного фотодетектора. После того как система придет в равновесие производят ввод в жидкостную ячейку того же буферного раствора, содержащего различные концентрации ПСА (от 0 до 100 нг/мл). Разность отклонений предложенного кантилеверного сенсора и кантилевера сравнения, составляющая от 15 нм до 200 нм, свидетельствует о присутствии ПСА в анализируемом растворе. Таким образом, данный кантилеверный сенсор позволяет проводить качественный анализ на ПСА, в модельной системы, аналогичной сыворотки крови человека, с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.
Пример 2 (контрольный, с использованием жидкой среды, не содержащей ПСА).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют жидкую модельную среду, не содержащую ПСА. Нулевая разность отклонений предложенного кантилеверного сенсора и кантилевера сравнения свидетельствует об отсутствии ПСА в анализируемой жидкой среде.
Пример 3
Опыт проводят аналогично примеру 1, но без кантилевера сравнения, и в качестве исходного кантилевера используют плоский гибкий кремниевый кантилевер с полированной поверхностью, способной отражать световое излучение, на каждой из плоскостей которого содержится диоксид кремния. При этом только одна плоскость кантилевера обработана раствором АПС, а в качестве жидкой среды используют сыворотку крови человека. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор направляют фокусированный луч света от люминесцентного светодиода. Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ сыворотки крови на присутствие ПСА с чувствительностью определения 0,5 нг/мл.
Пример 4
Опыт проводят аналогичный примеру один, но без кантилевера сравнения. Чувствительность определения ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, составляет 0,1 нг/мл.
Пример 5
Опыт проводят аналогично примеру 1, но без кантилевера сравнения, и в качестве исходного кантилевера используют плоскую гибкую консоль, выполненную из полимерного материала марки SU-8, на одну из плоскостей которого напылен слой кремния, а на другую плоскость напылен слой золота. В качестве модельной жидкой среды используют буферный раствор (0,01М калий-фосфатный водный буферный раствор с рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl), дополнительно содержащий другой белок - сывороточный альбумин человека в концентрации 1 мг/мл. В ходе эксперимента на кантилеверный сенсор и кантилевер сравнения направляют фокусированный луч света от ртутной лампы.
Данный сенсор позволяет проводить качественный анализ жидкой среды на присутсвие ПСА с чувствительностью определения 0,1 нг/мл.
Пример 6 (количественный анализ ПСА)
Опыт проводят с использованием кантилеверного сенсора на ПСА, описанного в примере 1, но без кантилевера сравнения. Для количественного определения ПСА проводят предварительную градуировку системы. Для этого проводят эксперименты с пятью различными стандартными пробами, приготовленными на основе сыворотки крови человека и содержащими различные известные концентрации ПСА. На основе полученных экспериментальных результатов строят градуировочную кривую зависимости разности отклонений кантилеверного сенсора на ПСА и сенсора сравнения от концентрации ПСА в сыворотке крови.
После этого аналогичным образом определяют разность отклонений кантилевера для исследуемых образцов сыворотки крови с различными концентрациями ПСА. Разность отклонений в 16-200 нм свидетельствует о том, что анализируемые образцы сыворотки крови действительно содержат ПСА в концентрации 0,5-100 нг/мл.
Также были проведены эксперименты, которые показали, что кантилеверный сенсор, состоящий из плоской гибкой консоли, не будет являться сенсором на ПСА, если он не будет содержать, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния или будет содержать, по крайней мере, на одной из плоскостей диоксид кремния, но не будет способен отражать световое излучение. Сенсор также будет неработоспособен, если обе его плоскости будут покрыты БСА или рецепторами на ПСА. Кроме того, сенсор будет неработоспособен, если у него одна из плоскостей будет покрыта БСА, а другая будет покрыта рецепторами на ПСА, химически незакрепленными на поверхности кантилевера. Сенсор также будет неработоспособен, если слой, ковалентно связанный с поверхность консоли, химически не будет связан с молекулами рецептора на ПСА. Сенсор также утрачивает работоспособность, если он не будет плоским или гибким.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный кантилеверный сенсор действительно позволяет проводить качественный и количественный анализ жидких сред на содержание ПСА и позволяет повысить чувствительность определения ПСА в модельной системе, аналогичной сыворотки крови человека, с 0,2 нг/мл (прототип) до 0,1 нг/мл. Кроме того, предложенный сенсор расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы в качестве сенсора на ПСА.