УСТРОЙСТВО ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

Полезная модель относится к области экспериментальной медицины, конкретно, к устройствам для обнаружения стволовых клеток.
Методы культивирования клеток in vitro в настоящее время применяются для изучения биологических и структурных особенностей клеток, участвующих в различных патологических процессах, поскольку любой из них первоначально реализуется на клеточном уровне, сопровождаясь изменениями ультраструктуры и метаболизма клеток. В дальнейшем это ведет к нарушению функций тех или иных органов, тканей или систем организма. Именно через клетки, их взаимосвязи и взаимовоздействия опосредуются инициация, развитие и исход патологического процесса. Метод культуры клеток играет существенную роль в понимании единства и взаимопроникновения структуры и функций, позволяя изучать клетки в их живом состоянии, реальном действии и взаимодействии с микроокружением [1, 4]. Благодаря этому клетка в настоящее время рассматривается в качестве элементарной живой системы с собственными закономерностями организации и функционирования [5, 6].
Наиболее близким к предлагаемой полезной модели является устройство для обнаружения стволовых клеток - чашка Петри, выполненная из стекла или пластика, состоящая из камеры заполненной питательной средой с полупроницаемым фильтром для размещения клеточного материала [1].
Однако, известное устройство обладает следующими недостатками:
1. Условия культивирования недостаточно близки к естественным условиям их жизнеобеспечения.
2. Длительные сроки культивирования.
3. Невозможно получить большую численность культивируемых клеток.
Новая техническая задача - повысить физиологичность условий культивирования клеток и уменьшить сроки их дифференцировки.
3
Для решения технической задачи в устройстве для обнаружения стволовых клеток, содержащем камеру, заполненную питательной средой с полупроницаемым фильтром для размещения клеточного материала, камера соединена с емкостью, содержащей питательную среду, через насос, обеспечивающий равномерное однонаправленное движение среды через фильтр со скоростью 2,1-2,4 мм/мин.
Полезная модель поясняется технологической схемой, изображенной на фигуре 1
Устройство на фигуре 1 представляет собой замкнутую систему с камерой 1, содержащей полупроницаемый фильтр 2. Камера 1 соединяется с емкостью 3, заполненной питательной средой, через роликовый насос 4, например, аппарат «Аспиратор - 01», который снабжен поддерживающим клапаном 5 и обеспечивает равномерное однонаправленное движение среды. Камера 1 снабжена боковым клапанным отверстием 6 для введения клеточного материала, полупроницаемый фильтр 2 служит местом для его размещения.
6
Устройство работает следующим образом. Систему устройства предварительно заполняют с помощью емкости 3 питательной средой, содержащей 80% среды McCoy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 4% раствор гентамицина (из расчета 0,02 мл на 10 мл среды). Для исследования работы устройства были выбраны мононуклеары крови, обладающие функциональной полипотентностью [3, 7, 9, 10]. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров-добровольцев выделяли с помощью градиента фиколлверографин. Полученные методом фракционирования клетки доводят питательной средой до конечной концентрации 3·10 нуклеаров/мл. Клеточный материал вводят в камеру 1 с помощью шприца через клапанное отверстие 6 в ее боковой части.
3
После включения роликового насоса 4 в сеть в замкнутой системе устройства создается однонаправленное движение поддерживающей среды. Насос работает в постоянном режиме со скоростью 2,1-2,4 мм/мин. Данная скорость выбрана на основании экспериментальных исследований и является оптимальной: скорость меньшей величины недостаточна для достижения поставленной цели, скорость большей величины ведет к механическому повреждению клеток. Клеточную культуру инкубируют при 37°С в водонасыщенной атмосфере при постоянном движении поддерживающей среды в течение 24, 48 и 72 часов. По окончании эксперимента фильтр извлекают из системы, клеточный материал фиксируют и исследуют с помощью цитохимических методов.
В процессе культивирования in vitro мононуклеаров периферической крови в условиях направленного движения питательной среды получены следующие результаты. Через 24 ч культура мононуклеаров на фильтре была представлена прочно адгезированными к субстрату клетками округлой формы, с базофильной цитоплазмой, крупным бобовидным или круглым ядром. Цитохимически в клетках отмечали высокую активность α-нафтилацетатэстеразы, которая блокировалась фторидом натрия, что соответствует характеристике клеток моноцитарно-макрофагальной линии. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась. Через 48 ч в описываемых клетках отмечали повышение активности α-нафтилацетатэстеразы по сравнению с исходными показателями и клетками, которые культивировали в стандартных условиях (р<0,01). При проведении реакции с фторидом натрия на фильтре были обнаружены единичные элементы, в которых активность неспецифической эстеразы не подавлялась, а также выявлялась умеренная активность щелочной фосфатазы. По большинству морфологических параметров (форма клетки, форма и объем ядра, ядерно-цитоплазматическое отношение около 1) указанные клетки относятся к молодым формам фибробластической популяции. Через 72 ч культуры клеток на фильтре состояли из макрофагов и лимфоцитов, среди которых обнаруживались единичные, крупных размеров клетки неправильной, преимущественно, веретенообразной формы. Они были разобщены друг от друга по поверхности фильтра прочими клеточными элементами. Цитохимически в указанных клетках отмечали более высокую активность α-нафтилацетатэстеразы по сравнению с показателями через 48 ч культивирования и клетками, которые выращивали в стандартных условиях (р<0,01). Активность неспецифической эстеразы не подавлялась фторидом натрия. В подобных клетках отмечали также усиление активности щелочной фосфатазы по сравнению с показателем через 48 ч от начала эксперимента (р<0,01). Морфологические и цитохимические параметры указанных клеток соответствовали активно синтезирующим фибробластам.
При культивировании мононуклеаров крови в стандартных (стационарных) условиях на протяжении всей серии экспериментов клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы. Цитохимически в клетках отмечали умеренную активность α-нафтилацетатэстеразы, которая постепенно повышалась в процессе культивирования (р<0,05), что связано с дифференцировкой моноцитов в макрофагальные клетки. Активность неспецифической эстеразы ингибировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.
Таким образом, в предложенном устройстве реализация, преимущественно, дифференцировочных возможностей клеток-предшественников in vitro в значительной степени опосредуется не только полупроницаемым фильтром - субстратом, к которому адгезируются клетки; высокой плотностью первоначальной культуры; бедным составом питательной среды. Существенным фактором является наличие равномерного направленного движения питательной среды, что обеспечивается насосом.
Прикрепление клеток к субстрату является необходимым условием для дальнейшего действия модулирующих факторов внеклеточной среды [2, 8]. Кроме того, обеспечивая динамическое напряжение и архитектуру цитоскелета, а также пространственно-временную ориентацию клеток, субстрат тем самым оказывает формообразующее влияние на морфофункциональные особенности культивируемых клеток. Взаимодействуя с поверхностными рецепторами клеток, элементы внеклеточного матрикса регулируют также кариотипическую структуру клеток, их подвижность, пролиферацию и дифференцировку. Возможно, адгезированные к фильтру клетки-предшественники, находясь на пути движения питательной среды, претерпевают серию модификационных трансформаций, в ходе которых проявляется активность разных ферментных систем. При постоянном модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости и наличие внеклеточного матрикса) клетки-предшественники быстрее дифференцируются в зрелые формы.
Таким образом, предлагаемое устройство позволяет культивировать клетки в более физиологичных условиях и обнаруживать стволовые клетки на ранних сроках, за счет возможности моделировать однонаправленное движение питательной среды со необходимой для этого процесса скоростью, что сокращает время их дифференцировки.
Список литературы
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Пер. с англ. М.А.Попова // Под ред. В.Ю.Полякова. - М.: Мир, 1983. - 264 с.
2. Епифанова О.И. Покоящиеся клетки. Свойства и функции организме / О.И.Епифанова, В.В.Терских., В.А.Полуновский. - М.: Наука, 1983. - 176 с.
3. Земсков В.М. Гетерогенность мононуклеарных фагоцитов / В.М.Земсков, Е.Н.Николаева, С.В.Родионов // Успехи совр. биологии. - 1993. - Т.113, вып.3. - С.336-350.
4. Новые методы культуры животных тканей / Пер. с англ. // Под ред. Ю.М.Оленева. - М., "Мир", 1976. - 255 с.
5. Петленко В.В. Закон сохранения структурной организации живых систем / В.В.Петленко, С.А.Симбирцев, О.К.Хмельницкий // Морфология. - 1993. - Т.105, вып.11-12. - С.131-141.
6. Свенсон К. Клетка / К.Свенсон, П.Уэбстер: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980. - 303 с.
7. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете / И.Я.Учитель. - М.: Медицина, 1978. - 200 с.
8. Хрущов Н.Г. Стволовые клетки крови / Н.Г.Хрущов, В.И.Старостин, Е.И.Домарацкая // Итоги науки и техники. Морфология человека и животных. - 1988. - №13. - С.4-173.
9. Mononuclear phagocytes: Functional aspects / Eds. R. van Furth. - New York: М. Nijholt, 1980. - 1938 р.
10. Ryu J.Н. Monocyte heterogeneity in angiotensinconverting enzyme induction mediated by autologous T-lymphocytes / J.Н.Ryu, М.S.Rohrbach // Clin. Exp. Immunol. - 1992. - Vol.88, №2. - P.288-294.