Способ изготовления гистологических препаратов
METHOD OF MANUFACTURING HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к гистологии, и к гистологической технике и может быть использовано в практике патоморфологических лабораторий лечебных учреждений и морфологических кафедр высших учебных заведений медицинского и биологического профиля.
Известен способ изготовления гистологических препаратов (Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Изд-во «Наука», М., 1952, 447 с., Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника - 3-е изд. - Омск - Орел, 2006. - 290 с.), который включает фиксацию биологического материала в растворе 10-12% кислого или нейтрального забуференного формалина, промывку в проточной воде в течение 24 часов с последующим его проведением через спирты восходящей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% и абсолютном спирте), пропитку в растворах ароматических углеводов, затем в смеси хлороформа и парафина при 37°С. Затем биологический материал парафинируют и на парафиновом микротоме изготавливают срезы толщиной 5-7 мкм, которые монтируют на предметные стекла. Затем срезы на стеклах депарафинируют в 2-х порциях ксилола, проводят через спирты нисходящей концентрации (100%, 96%, 70% этанол), промывают дистиллированной водой, окрашивают, просветляют в двух порциях ксилола и заключают в полистирол или биомаунт. Основным недостатком известного способа является длительность изготовления гистологического препарата, который может составлять от нескольких дней до нескольких недель, а также использование большого количества химических растворителей.
Известен способ изготовления гистологических препаратов с использованием неионизирующего излучения бытовой микроволновой печи (патент RU №2104513, МПК G01N 1/28, G01N 33/483, приоритет от 06.03.1995 г., опубликовано 10.02.1998, который позволяет сократить время изготовления гистологических препаратов до 1 часа 20 минут. Существенным недостатком известного способа является специфичность липидно-белковых комплексов к термическим изменениям, что, в свою очередь, ведет к экзотермическим реакциям на макромолекулярном уровне, денатурации и деструкции белков, и, как следствие, деформации самой ткани на клеточном уровне.
Известен способ изготовления гистологических препаратов, при котором обезвоживание производят путем четырехкратной выдержки гистологических образцов в ацетоне [Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969, с. 69]. Обезвоживание в ацетоне происходит быстро: при использовании на каждой стадии свежего ацетона достаточного выдержать образец в каждой порции растворителя по 20 мин. Однако использование свежего растворителя на каждой стадии дорого. Поэтому свежий ацетон используют только для четвертой стадии, сдвигая сосуды на одну позицию; четырежды использованный ацетон очищают перегонкой. При обезвоживании по такой схеме образцы выдерживают в каждой порции по 40 мин. Гистологические препараты, изготовляемые по данной методике, нуждаются в постоянном контроле и сопровождаются перемещением среза из жидкой среды в воздушную, что, как известно, приводит к нежелательной деформации тканей.
Известен способ изготовления гистологических препаратов, в соответствии с которым для заключения и длительного хранения окрашенных гистологических препаратов применяют 19-21%-ный раствор пенопласта в ксилоле, стабилизированный добавлением диметилфталата из расчета 1:100. После нанесения капли раствора на подготовленный срез и высыхания он оказывается заключенным в прозрачный и устойчивый при хранении материал в виде пленки (патент RU №2117273, приоритет от 28.09.1994 г., МПК G01N 1/28, опубликовано 10.08.1998). Одним из недостатков известного способа является то, что полученная пленка не является прочной по отношению к повреждающим агентам. Использование такой пленки приемлемо для хранения базы экспресс-диагностики, но не для частого использования в качестве учебного материала.
Известен способ изготовления гистологических препаратов, в соответствии с которым для заключения и длительного хранения окрашенных гистологических препаратов на предметное стекло с окрашенным срезом наносят каплю состава (патент RU №2499988, приоритет от 17.07.2012, МПК G01N 1/28, опубликовано 27.11.2013 г.) полученного растворением пенополиуретана (ППУ) и дибутилфталата в ксилоле так, чтобы она полностью покрыла срез. Затем накрывают покровным стеклом. После полного высыхания препарата, которое наступает через 16 минут, препарат готов к микрокопированию. Одним из недостатков известного способа является использование хрупких покровных стекол для монтировки срезов, которые, как правило, разрушаются вследствие длительного использования и неосторожного обращения при световой микроскопии, что особенно неудобно в работе морфологических кафедр высших учебных заведений медицинского и биологического профиля.
Задачей изобретения является создание ускоренного способа изготовления гистологических препаратов, которые можно было бы длительное время хранить в условиях лабораторий и многократно использовать для изучения.
Техническим результатом является проведение обезвоживания и фиксации биологического материала в среде органического растворителя в один этап и последующее заключение гистологического среза в пластины из ламинационных пленок.
Это достигается тем, что для обезвоживания и фиксации биологического материала используют ацетон в присутствии обезвоженного хлорида кальция, взятого в количестве 10-12% от массы биологического материала. В качестве пластин для закрепления гистологических срезов используют пластины из ламинационных пленок, а защитную среду создают путем закатки гистологических срезов между пластинами из ламинационных пленок с полимерным клеем, предназначенными для холодного ламинирования.
В соответствии с заявленным изобретением способ изготовления гистологических препаратов включает обезвоживание и фиксацию биологического материала в среде органического растворителя, а именно ацетона в присутствии обезвоженного хлорида кальция, взятого в количестве 10-12% от массы биологического материала, в течение 1-2 часов при комнатной температуре, последующее парафинирование и приготовление из него срезов, которые закрепляют на пластинах, затем размягчают в воде и депарафинируют в ксилоле, окрашивают известными реагентами. Отличительным является то, что гистологический срез сначала натягивают на полимерную пластину из пленки для холодного ламинирования, выполненную в виде пакета, состоящую их двух одинаковых пластин, спаянных по краю короткой стороны, внутренние поверхности которых покрыты полимерным клеем. Подготовленный гистологический срез накрывают второй пластиной и осуществляют проводку через ламинатор. Пленки для ламинирования представляют собой композитный материал, состоящий их трех слоев: полиэстровой основы (PET), полиэтилена (РЕ) и этилена винилацетата (EVA). Пленки для холодного ламинирования покрыты специальным клеем, который активируется при низких температурах от 37°С
Среднее время изготовления гистологических препаратов заявленным способом составляет от 1,5 до 8 часов. Осуществление обезвоживания и фиксации в среде ацетона в присутствии обезвоженного хлорида кальция в один этап позволяет не только ускорить данный процесс, но и значительно сэкономить расход органического растворителя, который может быть после регенерации использован повторно. Количество добавляемого в ацетон хлорида кальция было подобрано эмпирическим путем. В лабораторных условиях изготовлены гистологические препараты из различных типов тканей и органов (щитовидной железы, печени, сердца, легкого, мозга и др.).
Пример 1
Выполнено взятие биологического материала - кусочка миокарда - методом аутопсии массой 50 г. Кусочек биологического материала выдерживают в суспензии ацетона, взятого соответственно объему кассеты и 5 г обезвоженного хлорида кальция в течение одного часа, после чего извлекают из ацетона, производят заливку в парафин и нарезку парафинового блока на микротоме. Полученные срезы расправляют на теплой воде и монтируют на полимерной пластинке из пленки для ламинирования. Затем осуществляется последовательная проводка через следующие жидкости: ксилол (в течение одной минуты), холодная вода (в течение 2 минут), гематоксилин (в течение 4 минут), холодная вода (в течение 4 минут), эозин (в течение 2 минут), теплая вода (в течение 2 минут). Окрашенные срезы накрывают второй полимерной пластинкой и пропускают через ламинатор, после чего гистологический препарат можно исследовать с помощью микроскопа. При изготовлении гистологических препаратов использовались ламинатор PingDa PD230-1 и пленка для ламинирования Lamir 54×86 125 мкм А8.
Пример 2
Выполнено взятие биологического материала - паренхимы печени - методом аутопсии массой 30 г. Далее материал выдерживают в суспензии ацетона и 3,6 г хлорида кальция массой в течение одного часа, после чего производят заливку в парафин и нарезку парафинового блока на микротоме. Аналогично примеру 1 срезы расправляют на теплой воде и монтируют на полимерной пластине из пленки для ламинирования. После осуществляется последовательная проводка через следующие жидкости: ксилол (в течение одной минуты), холодная вода (в течение 2 минут), гематоксилин (в течение 4 минут), холодная вода (в течение 4 минут), эозин (в течение 2 минут), теплая вода (в течение 2 минут). Окрашенные срезы накрывают второй полимерной пластиной из пленки для ламинирования, пропускают через ламинатор, после чего препарат можно исследовать с помощью микроскопа. При изготовлении гистологических препаратов использовались ламинатор PingDa PD230-1 и пленка для ламинирования Lamir 54×86 125 мкм А8.
Пример 3
Выполнено взятие кусочка биологического материала - кости массой 35 г - и помещение его в ацетон с 4,2 г безводного хлорида кальция. Далее материал выдерживают в суспензии в течение одного часа, по истечении которого производят заливку в парафин и нарезку парафинового блока на микротоме. Полученные срезы расправляют на теплой воде и монтируют на полимерной пластинке из пленки для ламинирования. Затем осуществляется последовательная проводка через следующие жидкости: ксилол (в течение одной минуты), холодная вода (в течение 2 минут), гематоксилин (в течение 4 минут), холодная вода (в течение 4 минут), эозин (в течение 2 минут), теплая вода (в течение 2 минут). Окрашенные срезы накрывают второй полимерной пластинкой для ламинирования и пропускают через ламинатор, после чего исследуют с помощью микроскопа. При изготовлении гистологических препаратов использовались ламинатор PingDa PD230-1 и пленка для ламинирования Lamir 54×86 125 мкм А8.
Использование заявленного способа изготовления гистологических препаратов позволяет получить тонкие гибкие небьющиеся гистологические препараты высокого качества. Между полимерными листками можно вкладывать маркировочную табличку, что создает дополнительные удобства для хранения изготовленных препаратов и использования их в учебном процессе морфологических кафедр высших учебных заведений медицинского и биологического профиля. Заявленный способ существенно сокращает время изготовления гистологических препаратов и не требует сложного оборудования, поэтому может успешно применяться при экспресс-диагностике в практике патоморфологических лабораторий лечебных учреждений.