Способ получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого
METHOD FOR OBTAINING ANTIGEN SPECIFIC CYTOTOXIC CELLS WITH ANTI-TUMOR CYTOTOXIC ACTIVITY AGAINST CELLS OF NON-SMALL CELLS LUNG CANCER

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам получения клеток с цитотоксической активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого. Изобретение направлено на получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой активностью.
Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) представляет собой морфологически неоднородную группу, включающую в основном плоскоклеточный или эпидермоидный рак, аденокарциному, крупноклеточный рак и некоторые более редкие формы, такие как аденосквамозный, недифференцированный и бронхиолоальвеолярный рак. Они объединяются в одну группу «немелкоклеточный рак легкого» по органному принципу и близким отдаленным результатам. Немелкоклеточный рак легкого является наиболее частым злокачественным новообразованием и причиной смерти от рака у мужчин, а также одним из частых видов рака у женщин [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2014. ил. - 250 с. ISBN 978-5-85502-193-6]. При этом данное злокачественное заболевание имеет низкий уровень 5-летней выживаемости при стандартных схемах лечения 73% (для Iа стадии) и 25% (для IIIа стадии) [Besse В., Le Chevalier Т. Developments in the treatment of early NSCLC: when to use chemotherapy // Annals of Oncology. - 2012. - 23. - V 23 (10). - p. 52-59].
В основе неспособности организма элиминировать опухолевые клетки лежит как снижение функциональной активности антиген-презентирующих клеток [Pinzon-Charry А., Maxwell Т.,  J.A. Dendritic cell dysfunction in cancer: a mechanism for immunosuppression Review // Immunol Cell Biol. - 2005. - V. 83(5). - P. 451-61], так и иммуносупрессирующий эффект самой опухоли.
Одним из активных компонентов иммуносупрессии является IDO - Индоламин-2,3-диоксигеназа - фермент, который катаболизирует триптофан, что создает локальный дефицит этой незаменимой аминокислоты и подавляет пролиферацию и функцию эффекторных лимфоцитов. Клетки, экспрессирующие IDO (опухолевые клетки, регуляторные клетки, дендритные клетки), вовлечены в индукцию иммунологической толерантности при различных физиологических и патологических условиях. Соответственно активно развиваются подходы по подавлению продукции этого фермента, для снижения эффекта иммуносупрессии и повышения уровня цитотоксического иммунного ответа.
В работе Sioud М с соавторами [Sioud М,  S, Hetland ТЕ, Kaern J, Mobergslien A, Kvalheim G. Silencing of indoleamine 2,3-dioxygenase enhances dendritic cell immunogenicity and antitumour imrniinity in cancer patients // Int J Oncol. 2013, Jul; 43(1): 280-8. doi: 10.3892/ijo.2013.1922. Epub 2013, Apr 25] был предложен подход с использованием малых интерферирующих РНК для подавления синтеза IDO в дендритных клетках с одновременной трансфекцией мРНК кодирующих 2 опухолевых антигена. Полученные ген-модифицированные дендритные клетки вводились пациентам с раком яичника. Полученные результаты подтвердили эффективность подхода по ингибированию IDO с увеличением способности Т-лимфоцитов активировать аллогенные Т-клетки и стимулировать реакцию ГЗТ у пациентов.
Основным отличием от предлагаемого нами подхода является использование siRNA для ингибирования IDO в дендритных клетках. Однако метод электропорации позволяет осуществлять только транзиентную трансфекцию, что снизит продукцию фактора IDO на несколько суток, что представляется недостаточно эффективным для проведения иммунотерапии in vivo больных злокачественными заболеваниями.
Основной интерес исследователей и клинических врачей сосредоточен на поиске лекарственного препарата для терапии злокачественных новообразований, в том числе среди ингибиторов активности IDO, поскольку они могут способствовать преодолению иммунорезистентности опухолей. К настоящему времени ряд ингибиторов IDO хорошо изучены и проходят клинические испытания как противоопухолевые препараты. Наиболее широко в доклинических исследованиях изучены эффекты низкомолекулярного ингибитора IDO 1-метил-триптофана (1МТ). В ранних работах продемонстрировано, что применение 1МТ ограничивало рост опухолей, сверхэкспрессирующих IDO [С. Uyttenhove, L. Рilotte, I. Т  et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. // Nat. Med. - 2003. - Vol. 9, №10. - P. 1269-1274].
Известны способы модификации ингибиторов IDO (см. патент МХ2015011374). Авторы предлагают осуществлять введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение, и/или его фармацевтически приемлемую соль, его стереоизомер или таутомер. При этом описанные соединения могут быть использованы для лечения или профилактики вирусных инфекций, пролиферативных заболеваний (например, рака) и аутоиммунных заболеваний или любого заболевания или состояния, которые чувствительны к ферментативной активности ИДО. Варианты введения пациенту предлагаются перорально или парентерально.
Во всех используемых комбинациях и модификациях соединения они используются для непосредственного введения пациенту, что усложняет оценку биологических эффектов препаратов и увеличивает количество побочных эффектов при системном введении.
Известен способ стимуляции противоопухолевого иммунного ответа (см. патент WO 2015153857) включающий одновременное введение антител к ОХ-40, 1-метилтриптофана и антигена опухоли. В экспериментальной мышиной модели с клеточной линией ТС-1 авторами было показано снижение роста опухоли, увеличение выживаемости и изменение соотношения CD8/Треги в опухоли.
Недостатком такого способа также является использование препаратов, включая 1-МТ системно in vivo, что увеличивает вероятность побочных эффектов при иммунотерапии на человеке.
Известен способ снижения иммуносупрессии с использованием комбинации препаратов, подавляющих супрессорные молекулы (US 2015352206, US 2010055111) / Авторы предлагают использовать 2, 3, 4 или 5 препаратов одновременно: ингибитор IDO, ингибитор PD-L1, ингибитор CTLA-4, ингибитор CD25 или IL-7. Предполагаются самые различные способы введения комбинации препаратов пациентам.
Недостатком такого подхода является вариативность использования препаратов без четкой структуризации назначения, поскольку чрезмерное использование ингибиторов-супрессоров может приводить к индукции аутоиммунных процессов. Кроме того, использование препаратов при непосредственном системном введении пациентам in vivo увеличивает вероятность побочных эффектов при иммунотерапии.
Известен способ комбинации ингибиторов IDO и химиотерапии (СА2520172) с использованием в качестве ингибиторов IDO 1-метил-DL-триптофана или метил-TH-DL-триптофана и таких химиотерапевтических агентов, как: паклитаксел (Taxol), цисплатин, карбоплатин, циклофосфамид, адриамицин.
Недостатком такого подхода может являться одновременное использование химиотерапии и подавления звена собственной иммунной системы, что может приводить к усилению побочных эффектов препаратов, вводимых системно in vivo.
Современные исследования сосредоточены на поиске модификаций и комбинаций использования ингибиторов IDO в качестве лекарственных средств. Представлен ряд изобретений, посвященных использованию ингибиторов IDO в качестве терапевтических препаратов с системным введением, однако существенным минусом применения 1МТ как лекарственного препарата является его достаточно низкая биодоступность и невысокая специфичность, что снижает эффективность его применения in vivo. Однако это позволяет эффективно использовать этот препарат в условиях подготовки клеточных препаратов для иммунотерапии в условиях in vitro.
В настоящее время ведется активный поиск и разработка современных подходов получения функционально-активных ДК и использование их для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа. По данным журнала Science (Couzin-Frankel J., 2013) научным прорывом 2013 года признаны методы иммунотерапии рака, в том числе и методы клеточной иммунотерапии рака. Такой подход позволит мобилизовать защитные системы организма больного, используя естественные пути распознавания опухолевых антигенов и их последующую элиминацию.
Однако, несмотря на пристальное внимание к клеточной противоопухолевой иммунотерапии во всем мире, на сегодняшний день не удалось разработать эффективный клеточный препарат. По данным FDA только для лечения метатстатического гормон-резистентного рака простаты была одобрена разработанная вакцина на основе дендритных клеток (Sipuleucel-T) [http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/pprovedProducts/].
Для других нозологий, несмотря на многообещающие результаты in vitro, in vivo значимых результатов при использовании клеточных подходов до сих пор не получено и не одобрено. Основной причиной является наличие системной, и, особенно, местной иммунодепрессии, которая развивается по мере увеличения опухолевой нагрузки и препятствует развитию эффективного иммунного ответа даже при применении активной клеточной иммунотерапии [Nishikawa Н, Sakaguchi S. Regulatory Т cells in cancer immunotherapy // Curr Opin Immunol. 2014, Apr; 27:1-7. doi: 10.1016/j.coi.2013.12.005. Epub 2014, Jan 14; Nishikawa H, Sakaguchi S: Regulatory T cells in tumor immunity. Int J Cancer, 2010, 127:759-767].
Известен способ увеличения противоопухолевой активности дендритных клеток при использовании 1-МТ [Li Y, Xu J, Zou H, Wang С. 1-MT enhances potency of tumor cell lysate-pulsed dendritic cells against pancreatic adenocarcinoma by downregulating the percentage of Tregs // 2010 Jun; 30(3): 344-8. doi: 10.1007/s 11596-010-0354-3. Epub 2010 Jun 17]. Авторами показано достоверное снижение роста опухоли в мышиной экспериментальной модели опухоли с клеточной линией Pan02 при одновременном введении дендритных клеток, нагруженных лизатом и инъекцией 1-МТ.
Недостатком этой работы можно считать использование для введения непосредственно дендритных клеток, поскольку они могут менять фенотип на толерогенные в условиях иммуносупрессии под воздействием опухоли, а также отсутствие данных по прямому цитотоксическому эффекту на опухолевые клетки. Также в этой работе используется системное in vivo введение ингибитора IDO 1-МТ.
Известен способ, при котором антиген-презентирующие клетки используют как реагенты для увеличения или снижения иммунологической толерантности (US 2013323832, CT2N 5/0784, 2013). Способ заключается в следующем. Из периферической крови больного выделяют МНК, прилипающую фракцию культивируют в течение 5 суток с цитокинами GM-CSF и IL-4, затем происходит созревание дендритных клеток в присутствии ФНО-α и CD40L в течение 2 суток. Созревшие дендритные клетки нагружают антигеном (лизат, пептид, ДНК-конструкции, РНК). Далее осуществляют магнитную сепарацию с использованием маркера CD123. С использованием магнитной сепарации получают две фракции клеток: толерогенные и стимулирующие. Анализ на пролиферацию Т-лимфоциров осуществляют с использованием 1-метил-L-триптофан (1МТ), как ингибитора толерогенных свойств. Способ показал, что добавление 1МТ к толерогенным дендритным клеткам увеличивает пролиферацию Т-лимфоцитов, а добавление 1МТ к стимулирующим дендритным клеткам не оказывает влияния на пролиферацию Т-лимфоцитов.
Недостатком такого подхода является необходимость использования процедуры магнитной сепарации для получения фракции клеток без толерогенных свойств, что подразумевает контаминацию конечной фракцией магнитными частицами, которую предполагают вводить пациенту, что существенно ограничивает использование в клинике.
Таким образом, оптимальным вариантом нам представляется использование дендритных клеток, нагруженных опухолевым антигеном, в качестве активатора эффекторных клеток, с одновременным использованием в условиях in vitro препаратов, блокирующих экспрессию IDO, для ингибирования индукции Т-регуляторных клеток и развития толерогенных реакций, что будет способствовать увеличению противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа.
Индукция эффективных дендритных клеток in vitro из предшественников моноцитов периферической крови позволяет получать фенотипически и функционально полноценные дендритные клетки, которые способны к презентации антигена цитотоксическим клеткам. Однако одновременно с запуском эффекторного звена иммунного ответа и в том числе при индукции провоспалительного цитокина IFNg дендритными клетками запускается петля обратной связи для подавления чрезмерного развития провоспалительных реакций, и в дендритных клетках индуцируется запуск IDO [Hwu Р, Du MX. Lapointe R. Do M, Taylor MW, Young HA Indoleamine 2,3-dioxygenase production by human dendritic cells results in the inhibition of T cell proliferation // J Immunol. 2000 Apr 1; 164(7): 3596-9]. Экспрессия IDO приводит к индукции толерогенных процессов, включая подавление пролиферации Т-лимфоцитов, и снижению клеточных реакций. Вещество 1-метил-триптофана (1-МТ) является конкурентным ингибитором IDO и может отменять толерантность, обусловленную экспрессией IDO. Показано, что 1-МТ не оказывает значимого влияния на экспрессию поверхностных костимуляторных молекул и стимулирует Tx1 профиль эффекторных лимфоцитов [ S, Perrin-Cocon L, Coutant F,  P, Lotteau V. 1-Methyl-tryptophan can interfere with TLR signaling in dendritic cells independently of IDO activity // J Immunol. 2006, Aug 15; 177(4): 2061-71].
Известен способ генерации цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого, включающий получение дендритных клеток из моноцитов периферической крови больного немелкоклеточным раком легкого, культивирование дендритных клеток в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4), с последующей нагрузкой антигенами аутологичной опухоли и созреванием с помощью фактора некроза опухоли (ФНО-α) и интерлейкина -1β (ИЛ-1β) в течение 24 часов, после чего зрелые дендритные клетки культивируют совместно с неприлипающей фракцией аутологичных мононуклеарных клеток. В качестве антигена используют лизат. Совместное культивирование дендритных клеток и неприлипающей фракции аутологичных мононуклеарных клеток проводят в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18. Через 5 суток проводят тест на определение цитотоксичности по отношению к аутологичным опухолевым клеткам (RU 2577992, C12N 5/0783, 2016).
Описанный способ получения цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого требует использования большого объема дорогостоящих рекомбинантных цитокинов (рчИЛ-12 и рчИЛ-18).
Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения антиген-специфических цитотоксических клеток, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого, включающем получение дендритных клеток из моноцитов периферической крови больного немелкоклеточным раком легкого, культивирование дендритных клеток в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4), с последующей нагрузкой антигенами опухоли и созреванием с помощью фактора некроза опухоли (ФНО-α) и интерлейкина -1β (ИЛ-1β) в течение 24 часов, после чего зрелые дендритные клетки культивируют совместно с неприлипающей фракцией аутологичных мононуклеарных клеток, при этом совместное культивирование зрелых дендритных клеток и неприлипающей фракции аутологичных мононуклеарных клеток проводят в присутствии ингибиторов ИДО.
В качестве ингибитора ИДО используют, например, 1-метил-L-триптофан (1МТ).
В качестве антигенов опухоли могут использовать, например, ДНК-конструкции, лизат аутологичных опухолевых клеток.
Предложенное изобретение, на наш взгляд, является новым. Осуществление совместного культивирования зрелых дендритных клеток и неприлипающей фракции аутологичных мононуклеарных клеток в присутствии ингибитора ИДО 1-метил-L-триптофана (1МТ) позволяет достигать эффективного цитотоксического иммунного ответа с меньшими затратами.
Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является использование 1-МТ для подавления толерогенных реакций в культуре дендритных клеток и неприлипающей фракции МНК, что позволяет эффективно презентировать антигены цитотоксическим лимфоцитам, усиливает их пролиферацию, а также отсутствие использования для стимуляции рчИЛ-18 и рчИЛ-12 существенно удешевляет способ получения препарата.
Техническим результатом изобретения является генерация in vitro клонов Т-клеток с активностью цитотоксических Т-лимфоцитов и Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа против клеток немелкоклеточного рака легкого.
Изобретение осуществляется следующим образом.
-5
2
Выделенная из периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл), рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 72 часа (трое суток) культивирования к полученным незрелым ДК добавляется опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 24 часа (одни сутки) для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов (одни сутки) вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл и рчИЛТ-β в дозе 10 нг/мл.
Полученные зрелые, антиген-нагруженные, дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением 1-МТ в дозе 0,5 мМ.
Для определения индукции цитотоксической активности Т-лимфоцитов с помощью полученных ДК оценивали гибель опухолевых клеток в цитотоксическом тесте. Для этого к мононуклеарным клеткам больного, которые предварительно сокультивировали со зрелыми нагруженными лизатом ДК, добавляли аутологичные опухолевые клетки. Цитотоксичность оценивали по увеличению содержания высвободившегося из клеток фермента лактатдегидрогеназы в кондиционной среде в результате гибели опухолевых клеток. Показано повышение цитотоксического эффекта МНК, культивированных в присутствии зрелых нагруженных лизатом ДК и с добавлением 1МТ, по сравнению с контрольными группами, что служит свидетельством активации клеточных механизмов, реализующих цитотоксический эффект против опухолевых клеток (табл.1).
Примечание: Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала. МНК+ДК (без лизата) - МНК, культивированные с ДК, не нагруженные опухолевым лизатом МНК+ДК (с лизатом) - МНК, культивированные с ДК, нагруженные опухолевым лизатом МНК+ДК (без/или с лизатом)+1МТ - МНК, культивированные с ДК, не нагруженные/нагруженные опухолевым лизатом, с добавлением 1МТ.
Совместное культивирование ДК и МНК больных немелкоклеточным раком легкого при добавлении 1-метил-L-триптофана приводит к снижению толерогенных эффектов и индукции цитотоксических Т-лимфоцитов, что подтверждается увеличением цитотоксической активности совместной культуры мононуклеарных клеток и зрелых дендритных клеток, нагруженных лизатом, против аутологичных опухолевых клеток in vitro.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.
Предлагаемое изобретение снизить стоимость способа при достижении генерации цитотоксических клеток.