Семафорин Sema4D в регуляции Tfh-подобных клеток

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2016 БИОЛОГИЯ Вып. 4

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 612.018

Е. М. Куклина, И. В. Некрасова, Ю. В. Валиева

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

СЕМАФОРИИ SEMA4D В РЕГУЛЯЦИИ TFH-ИОДОБИЫХ КЛЕТОК

Изучена роль эндогенного семафорина Sema4D в контроле активности циркулирующих фолликулярных Т-хелперных клеток (CD4 CXCR5 Т-лимфоцитов). Показано участие Sema4D в экспрессии этими клетками функциональной молекулы PD-1, а также в Т-зависимой дифференцировке В-лимфоцитов в совместной Т-/В-клеточной культуре в ответ на поликлональную активацию Т-лимфоцитов. Представленные данные демонстрируют новый потенциальный механизм Sema4D-зависимой регуляции гуморального иммунного ответа, связанный с непосредственным участием семафорина в дифференцировке В-лимфоцитов, поддерживаемой фолликулярными Т-хелперами.

Ключевые слова: Sema4D; фолликулярные Т-хелперы; дифференцировка В-лимфоцитов.

Е. M. Kuklina, I. V. Nekrasova, Yu. V. Valieva

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation

SEMAPHORIN SEMA4D IN THE REGULATION OF TFH-LIKE CELLS

The role of endogenous semaphorin Sema4D in the control of circulating follicular T helper cells (CD4 CXCR5 T lymphocytes) has been studied. The involving of Sema4D in functional molecule PD-1 expression increasing, as well as in T-dependent В lymphocyte differentiation in T-/B-coculture in response to polyclonal T lymphocyte activation was shown. The data demonstrate a possible new mechanism of Sema4D-dependent regulation of the humoral immune response, implying the direct semaphorin participation in B-lymphocyte differentiation, supported by follicular helper T cells.

Key words: Sema4D; follicular helper T cells; В lymphocyte differentiation.

Введение

Фолликулярные хелперные Т-клетки (Т follicular helper cells, Tfh) - субпопуляция CD4+T-лимфоцитов, ответственная за формирование эффективного гуморального иммунного ответа, предполагающего клональную экспансию В-лимфоцитов, переключение классов иммуноглобулинов и «созревание» их аффинности к антигену [Oi, 2016]. Эти процессы протекают в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов и завершаются образованием плазмобластов - активно пролиферирующих и продуцирующих иммуноглобулины клеток, которые, покидая зародышевые центры, финально дифференцируются в плазматические клетки или В-клетки памяти. Маркеры Tfh тесно связаны с функциями этих клеток: хемокиновый рецептор CXCR5 нужен для хоминга Т-лимфоцитов в В-клеточные фолликулы, а

функциональная молекула PD-1 регулирует формирование зародышевых центров, выживание В-лимфоцитов и селекцию высокоаффинных плазматических клеток, а также продукцию интерлейкина 21 (IL-21) [Good-Jacobson et al., 2010; Oi, 2016]. Циркулирующие Tfh, так называемые Tfh-подобные клетки, имеют общие черты с фолликулярными Т-хелперами зародышевых центров [Feng et al., 2011; Morita et al., 2011], поэтому анализ Tfh-подобных клеток периферической крови рассматривается как эффективный альтернативный подход к изучению их аналогов в зародышевых центрах [Т follicular ...,2015].

Семафорин Sema4D - многофункциональная молекула, играющая важную роль в процессах ак-сонального наведения, а также в ангиогенезе и иммунорегуляции [Zhang et al., 2013]. В иммунной системе основным источником Sema4D являются Т-лимфоциты [Kumanogoh et al., 2002]. Они экс-

© Куклина Е. М., Некрасова И. В., Валиева Ю. В., 2016

391

дрессируют семафорин на мембране и частично «сбрасывают» его в ответ на активацию [Wang et al., 2001]. При этом растворимый Sema4D сохраняет функции мембранной молекулы [Wang et al., 2001]. Основной рецептор для Sema4D в иммунной системе, CD72, экспрессируется преимущественно В-лимфоцитами и играет важную роль в ответе этих клеток на антиген [Kumanogoh et al., 2000], поэтому особый интерес вызывает роль семафори-на в Т-/В-клеточных взаимодействиях. В первую очередь, это относится к Tfh-зависимой дифферен-цировке В-лимфоцитов. Цель настоящей работы -определить вклад эндогенного Sema4D в регуляцию активности Tfh-подобных клеток in vitro, в совместной Т-/В-клеточной культуре на фоне по-ликлональной активации Т-лимфоцитов. В частности, мы оценили экспрессию функционального маркера PD-1 Tfh-подобными клетками в культуре и эффективность Tfh-зависимой дифференцировки В-лимфоцитов на фоне блокады семафорина.

Материал и методы исследования

Мононуклеарные клетки выделяли из гепари-низированной венозной крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см3). Из полученной суспензии далее выделяли Т-лимфоциты (CD4+-клетки) и В-лимфоциты (С019+-клетки) -фракционированием на иммуномагнитных частицах, с помощью стандартных систем для выделения ("R&D Systems"). Оценку роли эндогенного Sema4D в контроле Т-зависимой В-клеточной активации проводили в совместной Т/В-клеточной культуре [Т follicular ..., 2015]: фракционированные С04+Т-клетки культивировали с аутологичными В-лимфоцитами в соотношении 1:1 (5x104 клеток/мл) в течение 5 сут. в среде RPMI1640 ("Gibco") с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки ("Serva"), 300 мкг/мл L-глутамина ("Serva"), 0.01М HEPES ("Sigma") и 100 мкг/мл гентамицина ("Pharmacia") при 37°С и 5%-ным С02 - без активатора и на фоне поликлональной активации Т-лимфоцитов иммобилизованными антителами к CD3/CD28 ("Invitrogen"). Уровень Tfh-подобных клеток оценивали по экспрессии С04+Т-лимфоцитами хемокинового рецептора CXCR5, а их активность - по экспрессии функционального маркера PD-1 и по формированию плазмобластов (CD19+CD20~ С038+-клеток) в культуре [Т follicular ..., 2015; Jourdan et al., 2011] - проточной цитометрией, с использованием соответствующих мо-

ноклональных антител: а нт и - С X С R 5 * Р Е ("R&D Systems"), aHTH-PD-l*FITC ("Biolegend"), анти-CD38*PE ("Biolegend"), aHTH-CD20*FITC ("Biolegend"), анти-CD 19*PerCP ("R&D Systems"), ан-TH-CD4*PerCP ("R&D Systems"). Участие эндогенного Sema4D в этом процессе оценивали ингиби-

торным анализом, за счет внесения в культуру ре-комбинантного плексина В2 ("R&D Systems", 5329-РВ, 5 мкг/мл), эффективно связывающего Sema4D и блокирующего 8ета40-зависимый сигнал, - за 1 ч. до активации. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюден-та.

Результаты и их обсуждение

Процессы Т-зависимой В-клеточной активации исследовали на модели in vitro, предполагающей совместное культивирование Т-лимфоцитов с аутологичными В-клетками в условиях поликлональной активации Т-лимфоцитов [Т follicular ..., 2015]. При этом активность Tfh-подобных клеток оценивали как косвенно, по экспрессии молекулы PD-1, участвующей в реализации функций этих клеток, так и напрямую, по дифференцировке В-лимфоцитов, индуцируемой фолликулярными Т-хелперами.

Культивирование С04+Т-лимфоцитов в присутствии В-клеток не приводило к статистически значимым изменениям содержания Tfh-подобных (CD4+CXCR5+-) клеток ни в спонтанном варианте, ни в случае активации, и блокада Sema4D не оказывала влияния на эти процессы (рис. 1). Анализ функциональной молекулы PD-1 выявил повышение ее экспрессии на мембране CD4+CXCR5+T-лимфоцитов в ответ на активацию, причем на фоне блокады семафорина повышение было недостоверным (рис. 1), указывая на участие Sema4D в реализации данного эффекта.

Одновременно с экспрессией PD-1 оценивали непосредственную хелперную активность Tfh-подобных клеток, а именно - способность индуцировать дифференцировку В-лимфоцитов в плаз-мобласты, которая сопровождается характерными фенотипическими изменениями - появлением и последовательным усилением экспрессии на мембране гликопротеина CD38, а также утратой В-клеточного маркера CD20 [Jourdan et al., 2011].

Совместное культивирование Т-/В-лимфоцитов сопровождалось значительным увеличением количества плазмобластов (CD 19 CD20CD38 -клеток) в ответ на поликлональную активацию Т-лимфоцитов (рис. 2), причем на фоне блокады Sema4D этот показатель статистически значимо снижался.

Полученные данные свидетельствуют об участии Sema4D в ключевом этапе Т-зависимой дифференцировки В-лимфоцитов, формировании плазмобластов, и о том, что одним из механизмов реализации эффекта семафорина является регуляция активности Tfh-подобных клеток, в частности, повышение экспрессии этими клетками функциональной молекулы PD-1, которая защищает В-лимфоциты от апоптоза, поддерживает селекцию

Семафорим Sema4D в регуляции Tfh-подобных клеток

393

высокоаффинных плазматических клеток, а также 2016].

продукцию IL-21 [Good-Jacobson et al., 2010; Oi,

аши-ОЖГВв ашиСВЗДЖ

Рис. 1. Характеристика Tfh-подобных С04+Т-лимфоцитов ex vivo и в совместной Т-/В-клеточной культуре на фоне поликлональной активации Т-лимфоцитов:

а) содержание СХСЯ5+-клеток в популяции СБ4+Т-лимфоцитов; б) экспрессия PD-1 СХСК5+СБ4+Т-лимфоцитами. Незаштрихованные столбцы - пробы без блокатора; заштрихованные столбцы - на фоне блокады Sema4D. * - р < 0.05

ó

о

г

ф

1

1

-—

I ü

Рис. 2. Уровень плазмобластов ex vivo и в Т-/В-клеточной культуре.

Незаштрихованные столбцы - пробы без блока-тора; заштрихованные столбцы - на фоне блокады Sema4D. * -р < 0.05

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-04-05694.

Библиографический список

Feng J. et al. High frequency of CD4+CXCR5+TFH cells in patients with immune-active chronic hepatitis В // PLoS One. 2011. Vol. 6, № 7. P. 1-9.

Good-Jacobson K.L. et al. PD-1 regulates germinal center В cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells // Nat. Immunol. 2010. Vol. 11, № 6. P. 535-542.

Jourdan M. et al. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human В cell to plasma cell differentiation // J. Immunol. 2011. Vol. 187, № 8. P. 3931-3941.

Kumanogoh A. et al. Identification of CD72 as a lymphocyte receptor for the class IV semaphorin CD100: a novel mechanism for regulating В cell signaling // Immunity. 2000. Vol. 13, № 5. P. 621-631.

Kumanogoh A. et al. Requirement for the lymphocyte semaphorin, CD 100, in the induction of antigen-specific T cells and the maturation of dendritic cells // J. Immunol. 2002. Vol. 169, № 3. P. 1175-1181.

Morita R. et al. Human blood CXCR5+CD4+T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion //Immunity. 2011. Vol. 34, № 1. P. 108-121.

Oi H. T follicular helper cells in space-time // Nature. 2016. Vol. 16. P. 612-625.

T follicular helper cells. Preface / eds. M. Espeli, Ml. Linterman // Methods in Molecular Biology. 2015. Vol. 1291. P. 209-226.

WangX. et al. Functional soluble CD100/Sema4D released from activated lymphocytes: possible role in normal and pathologic immune responses // Blood. 2001. Vol. 97, № 11. P. 3498-3504.

Zhang Y. et al. Sema 4D/CD100-plexin B is a multifunctional counter-receptor // Cell. Mol. Immunol. 2013. Vol. 10, №2. P. 97-98.

References

Espeli M., Linterman Ml. (eds.) T follicular helper cells. Preface. Methods in Molecular Biology. V. 1291. (2015): pp. 209-226.

Feng J., Lu L., Hua C., Qin L., Zhao P., Wang J., Wang Y., Li W., Shi X., Jiang Y. High frequency of CD4+CXCR5+TFH cells in patients with immune-active chronic hepatitis B. PLoS One. V. 6. N. 7 (2011): pp. 1-9.

Good-Jacobson KL, Szumilas CG, Chen L, Sharpe AH, Tomayko MM, Shlomchik MJ. PD-1 regulates germinal center B cell survival and the formation and affinity of long-lived plasma cells. Nat Immunol. V. 11. N. 6 (2010): pp. 535-542.

Jourdan M., Caraux A., Caron G., Robert N, Fiol G, Rème T, Bolloré K, Vendrell JP, Le Gallou S, Mourcin F, De Vos J, Kassambara A, Duperray C, Hose D, Fest T, Tarte K, Klein B. Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation. J. Immunol. V. 187. N. 8 (2011): pp. 3931-3941.

Kumanogoh A., Suzuki K., Ch'ng E., Watanabe C., Marukawa S., Takegahara N., Ishida I., Sato T., Habu S., Yoshida K., Shi W., Kikutani H. Re-

quirement for the lymphocyte semaphorin, CD 100, in the induction of antigen-specific T cells and the maturation of dendritic cells. J. Immunol. V. 169. N. 3 (2002): pp. 1175-1181.

Kumanogoh A., Watanabe C., Lee I., Wang X, Shi W, Araki H, Hirata H, Iwahori K, Uchida J, Yasui T, Matsumoto M, Yoshida K, Yakura H, Pan C, Parnes JR, Kikutani H. Identification of CD72 as a lymphocyte receptor for the class IV semaphorin CD100: a novel mechanism for regulating В cell signaling. Immunity. V. 13. N. 5 (2000): pp. 621-631.

Morita R., Schmitt N., Bentebibel S., Ranganathan R., Bourdery L., Zurawski G., Foucat E., Dullaers M., Oh S., Sabzghabaei N., Lavecchio E., Punaro M., Pascual V., Banchereau J., Ueno H. Human blood CXCR5+CD4+T cells are counterparts of T follicular cells and contain specific subsets that differentially support antibody secretion. Immunity. V. 34. N. 1 (2011): pp. 108-121.

Oi H. T follicular helper cells in space-time. Nature. V. 16 (2016): pp. 612-625.

Wang X., Kumanogoh A., Watanabe C., Shi W., Yoshida K., Kikutani H. Functional soluble CD100/Sema4D released from activated lymphocytes: possible role in normal and pathologic immune responses. Blood. V. 97. N. 11 (2001): pp. 3498-3504.

Zhang Y., Liu В., Ma Y., Jin B. Sema 4D/CD100-plexin В is a multifunctional counter-receptor Cell. Mol. Immunol. 2013. V. 10. N. 2 (2013): pp. 97-98.

Поступила в редакцию 15.11.2016

Об авторах

Куклина Елена Михайловна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунорегуляции

ФГБУН Институт экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН

614081, Пермь, ул. Голева, 13; ibis_07@mail.ru;

(342)2808431

Некрасова Ирина Валерьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории иммунорегуляции

ФГБУН Институт экологии и генетики

микроорганизмов УрО РАН

614081, Пермь, ул. Голева, 13; nirina5@mail.ru

About the authors

Kuklina Elena Michajlovna, doctor of biology,

leading researcher of laboratory

immunoregulation

Institute of Ecology and Genetics of

Microorganism UB RAS. 13, Golev str., Perm,

Russia, 614081; ibis_07@mail.ru; (342)2808431

Nekrasova Irina Valeryevna, candidate of

biology, researcher of laboratory

immunoregulation

Institute of Ecology and Genetics of

Microorganism UB RAS. 13, Golev str., Perm,

Russia, 614081; nirina5@mail.ru

Валиева Юлия Вакифовна, аспирант Valieva Yulia Vakifovna, post-gradual student

ФГБУН Институт экологии и генетики Institute of Ecology and Genetics of

микроорганизмов УрО PAH Microorganism UB RAS. 13, Golev str., Perm,

614081, Пермь, ул. Голева, 13 Russia, 614081