Влияние иммуносупрессивных лекарственных препара тов на апоптоз лимфоцитов больных системной красной волчанкой in vitro

ВЛИЯНИЕ ИММУНОСУПРЕССИВНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ IN VITRO

Н.Ф. Сорока, Л.И. Свирновский, A.JI. Рекун Белорусский государственный медицинский университет Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии

г. Минск, Республика Беларусь

Резюме

Цель. Оценить влияние иммуносупрессивных лекарственных средств на апоптоз лимфоцитов периферической крови больных системной красной волчанкой (СКВ) in vitro.

Материал и методы. Исследованы 102 больных СКВ и 40 здоровых лиц (доноров). Выделенные из периферической крови больных и доноров лимфоциты культивировали в течение 24 час в присутствии (индуцированный апоптоз) или отсутствии (спонтанный апоптоз) дексаметазона (1 и 5 мкМ), лейкладина (2 мкг/мл), флуда-рабина (5мкг/мл) и циклофосфана (10 мкг/мл). Для регистрации апоптоза использовали морфологический метод (флуоресцентную микроскопию). Определяли процент апоптотических клеток (абсолютный апоптотический индекс, ААИ) и вычисляли относительный апоптотический индекс (ОАИ) по формуле ОАИ = [(ААИ -ААИ )/ААИ ] Ч 100%.

индуи СПОНТ' ' СПОНТJ

Результаты. Установлено, что интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов больных СКВ (14,0±0,58%) достоверно выше, чем у здоровых лиц (6,0±0,43%, р<0,001). Дексаметазон, лейкладин, флударабин и циклофосфан вызывают увеличение количества апоптотических лимфоцитов больных СКВ in vitro. Значения ОАИ указывают на сниженную чувствительность лимфоцитов больных СКВ к индукции апоптоза лекарственными препаратами in vitro. С учетом данного индекса использованные цитостатики можно ранжировать по степени индукции апоптоза мононуклеарных клеток больных СКВ следующим образом: лейкладин (82,1 ±6,06%) > флударабин (50,5+5,49%) > циклофосфан (28,9±2,57%). Заключение. Определение ОАИ может использоваться для выбора оптимальных средств патогенетической терапии у конкретного пациента. Новый цитостатик лейкладин, оказывающий наибольшее индуцирующее влияние на апоптоз моно-нуклеаров in vitro, может быть рекомендован к проведению клинических испытаний в качестве средства для лечения больных СКВ.

Ключевые слова: апоптоз, иммуносупрессивные лекарственные средства, лимфоциты, мононуклеарные клетки, системная красная волчанка

Существующие на сегодняшний день стандарты лечения больных системной красной волчанкой (СКВ) разработаны эмпирическим путем. Основой патогенетической терапии являются глюкокортико-иды (ГК). Их дополняют «мягкие» иммунодепрессанты - аминохинолиновые производные (гидрок-сихлороквин / плаквенил, хлороквин / делагил),

Адрес: 220116, г. Минск, пр. Дзержинского, 83 Тел. +375293693393 E-mail: sorokal949@mail.ru

преимущественно используемые при наличии кожных проявлений СКВ, а также мышечно-скелетных и конституциональных симптомов. Из цитоста-тических препаратов наиболее распространено применение высоких доз внутривенного болюсного циклофосфамида (ЦФ) в лечении «больших» волчаночных висцеритов и перорального приема азатиоприна для поддерживающей терапии люпус-нефрита. При СКВ все шире используются препараты, чаще употребляемые для лечения других аутоиммунных заболеваний (метотрексат, циклоспо-

рин А, внутривенный иммуноглобулин), и новые иммунодепрессанты, разработанные для онкогема-тологической практики и трансплантации органов (кладрибин, флударабин, мофетила микофенолат, такролимус) [2, 16].

С тех пор как в 1980 г. Andrew Wyllie впервые опубликовал статью о глюкокортикоид-индуциро-ванном апоптозе в культуре лимфоцитов, изучение фармакологической регуляции процессов апоптоза, или программированной гибели клеток, приобретает все большую значимость [5].

Рядом исследователей установлено, что ГК индуцируют апоптоз лимфоцитов больных СКВ in vitro, причем эффект препаратов напрямую зависит от их дозы (концентрации), длительности воздействия и уменьшается в ряду: дексаметазон > преднизолон > гидрокортизон. Выявлены популяции и субпопуляции мононуклеарных клеток, чувствительные к индукции апоптоза (Т-лимфоциты, Т-хелперы CD4+) и относительно устойчивые к действию ГК (В-лимфоциты, Т-супрессоры CD8+) [15, 23].

Противоречивы сведения о влиянии аминохинолиновых соединений на апоптоз мононуклеарных клеток. Одними исследователями демонстрируется способность гидроксихлороквина индуцировать программированную гибель лимфоцитов больных СКВ in vitro. Выдвигается гипотеза о том, что при действии in vivo гидроксихлороквин приводит к элиминации клона аутореактивных мононуклеаров [21]. Другие авторы указывают на значительное снижение процента апоптотическнх лимфоцитов при их культивировании в присутствии терапевтических концентраций гидроксихлороквина. Предполагается, что вмешательство препарата в трансформацию антигенов антиген-презентирую-щими клетками приводит к уменьшению стимуляции аутореактивных лимфоцитов и подавлению активационно-индуцированного апоптоза периферических мононуклеарных клеток [18].

Немногочисленны сообщения, посвященные действию цитостатических иммунодепрессантов на программированную гибель лимфоцитов больных СКВ. Широко используемый ЦФ при введении в организм подвергается метаболической трансформации до функционально активных соединений, способных не только подавлять пролиферацию участвующих в иммунном ответе лимфоцитарных клонов, но и индуцировать апоптоз мононуклеарных клеток [6].

Хорошо известный метотрексат (МТ), вмешиваясь в метаболизм фолиевой кислоты и блокируя ключевые реакции синтеза ДНК, подавляет клеточный и гуморальный иммунный ответ, образование провос-палительных цитокинов, а также митоген-индуци-рованную пролиферацию лимфоцитов. Кроме того, препарат вызывает апоптоз активированных Т- и В-лимфоцитов, в особенности субпопуляции продуцирующих аутоантитела CD5+ В1-клеток [6, 8].

Влияние других цитостатиков на апоптоз мононуклеарных клеток при СКВ не отражено в доступной для изучения литературе, однако имеется информация о разработке данной проблемы в экспериментах на животных, а также при других заболеваниях аутоиммунной либо опухолевой природы у человека. Так, азатиоприн, являясь пролекарством подобно ЦФ и антиметаболитом подобно МТ, при пероральном приеме превращается в 6-меркаптопурин и 6-тиогуанин, нарушающие биосинтез гуанин-содержащих пуриновых нуклеотидов и ДНК, что ведет к подавлению пролиферации активированных Т-лимфоцитов и снижению В-зависимого гуморального иммунного ответа [10]. Обнаружена способность азатиоприна, точнее его активных метаболитов, индуцировать апоптоз иммунокомпетентных клеток у рыб [14], а также у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника [13].

Новые антиметаболиты, кладрибин и флударабин, являются аналогами аденин-содержащих пуриновых нуклеотидов. Будучи исходно неактивными, в клетке препараты трансформируются в фосфорилированные производные, подавляющие синтез и репарацию ДНК благодаря ингибированию ДНК-полимеразы и рибонуклеотидредуктазы. Кладрибин и флударабин первоначально нашли свое применение в лечении хронических лимфопролиферативных заболеваний, при которых удалось установить индуцирующее влияние новых цитостатиков на апоптоз мононуклеарных клеток [9, 20]. Имеются сообщения об успешном использовании кладрибина и флударабина в терапии волчаночного гломерулонефрита [11], системного склероза [19], ревматоидного артрита [22], рассеянного склероза и других заболеваний аутоиммунной природы [7].

В Республике Беларусь на базе Института био-органической химии Национальной академии наук разработана оригинальная химико-ферментативная технология получения субстанции, а на АО “Белмедпрепараты” налажен выпуск готовой лекарственной формы нового отечественного цитостатического препарата “Лейкладин”, который соответствует синтезированному за рубежом клад-рибину. Высокоэффективный способ производства лейкладина позволяет снизить стоимость препарата в 8—10 раз по сравнению с импортным аналогом. Получен первый опыт клинического применения лейкладина в лечении хронического лимфолейко-за, волосатоклеточного лейкоза, неходжкинских лимфом низкой степени злокачественности [3, 4], а также рассеянного склероза. Продемонстрирована высокая эффективность и хорошая переносимость препарата. Сочетание иммуносупрессорной активности с относительно низкой в сравнении с другими иммунодепрессантами токсичностью, селективное и пролонгированное действие на С04+-клетки

и щадящее на СЭ8+-клетки явились предпосылками к использованию лейкладина для изучения влияния на апоптоз лимфоцитов с целью возможного его дальнейшего испытания в клинике при системных заболеваниях соединительной ткани (СЗСТ).

Итак, анализ информации о влиянии средств патогенетической терапии СКВ на апоптоз имму-нокомпетентных клеток демонстрирует ряд относительно хорошо известных (действие ГК), противоречивых (роль аминохинолиновых соединений) и недостаточно изученных (эффект цитостатиков) аспектов, побуждая к продолжению исследований в данной области. Целью настоящей работы явилась оценка влияния иммуносупрессивных лекарственных средств на апоптоз лимфоцитов периферической крови больных СКВ in vitro.

Материал и методы

В исследовании принимали участие 102 больных СКВ, стационарное лечение и амбулаторное наблюдение которых проводилось на базе Республиканского центра ревматологии (9-я клиническая больница г. Минска). Для постановки диагноза СКВ использовали международные диагностические критерии Американской ревматологической ассоциации (АРА, 1982). Среди больных были 92 (90,2%) жен. и 10 (9,8%) муж. в возрасте от 15 до 65 лет (средний возраст 33,7+1,32 лет). Длительность болезни составляла от 1 мес до 26 лет (в среднем 6,2±0,60 лет).

Контрольная группа включала 40 здоровых лиц (доноров): 26 (65,0%) жен. и 14 (35,0%) муж. в возрасте от 17 до 58 лет (средний возраст 34,2+2,04 лет).

Лимфоциты выделяли из гепаринизированной периферической венозной крови больных и доноров с помощью градиентного центрифугирования, переносили в среду RPMI-1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин и антибиотики, и инкубировали в течение 24 час в атмосфере 5% углекислого газа в воздухе при 37 °С. Для изучения спонтанного апоптоза часть моно-нуклеаров культивировали без добавления лекарственных препаратов. Для исследования индуцированного апоптоза в культуральную среду вводили иммунодепрессанты: дексаметазон в концентрациях 1 мкМ (соответствует средним терапевтическим дозам ГК) и 5 мкМ (соответствует высоким дозам), а также цитостатики в концентрациях, соответствующих терапевтическим, — лейкладин (2 мкг/ мл), флударабин (5 мкг/мл) и ЦФ (10 мкг/мл).

В задачи исследования входило сопоставление влияния ГК и цитостатиков на апоптоз лимфоцитов. Выбор дексаметазона определялся тем, что для изучения свойств ГК in vitro традиционно используется данное соединение как “золотой стандарт” в связи с большей чувствительностью к нему рецепторного аппарата клеток. Принимая во внимание эффективность лейкладина и флударабина в отно-

шении пролиферирующих и покоящихся мононук-леарных клеток, новые нуклеозидные аналоги были включены в схему опыта для выяснения возможных перспектив их применения при СЗСТ. Особого внимания заслуживал отечественный препарат лейкладин, не уступающий по своим свойствам импортному кладрибину, зато выигрывающий по сравнению с ним в цене. Действие новых иммунодепрессантов на апоптоз лимфоцитов сравнивалось с влиянием широко используемого ЦФ, не всегда достаточно эффективного в клинической практике.

После окончания культивирования клетки окрашивали акридиновым оранжевым и изучали под флуоресцентным микроскопом. Анализировали лимфоциты с конденсированным и фрагментированным хроматином и определяли процент апоп-тотических клеток (абсолютный апоптотический индекс, ААИ). С целью более объективной оценки степени индукции апоптоза вычисляли относительный апоптотический индекс (ОАИ) по формуле

ОАИ = [(ААИнняуц - ААИ сп(жт) / ААИспо J х 100%,

где ААИП1шуи — абсолютный апоптотический индекс для индуцированного апоптоза, а ААИспо|п — аналогичный показатель для спонтанного апоптоза.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью пакета компьютерных программ Statistica for Windows 6.0. Для каждой серии данных вычисляли среднюю арифметическую (М), среднее квадратическое отклонение (а), стандартную ошибку средней арифметической (ш). Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Исследование спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови больных СКВ in vitro выявило существенно более высокую его интенсивность (14,0±0,58%) по сравнению с донорами (6,0+0,43%, р<0,001), что отражено на рис. 1.

По-видимому, ускоренный апоптоз мононукле-арных клеток больных in vitro отражает степень их активации in vivo. Активационный апоптоз имму-нокомпетентных клеток призван ограничить избыточный иммунный ответ на периферии, но в то же время может служить источником аутоантигенов (продуктов упорядоченного расщепления хроматина, деградации внутриклеточных структур). Однако необходимо учитывать, что общая популяция мононуклеарных клеток неоднородна, и возможно наличие малочисленного клона аутоагрессивных лимфоцитов, устойчивых к апоптозу и ответственных за аутоиммунный процесс (синтез аутоантител, осуществление цитотоксических эффекторных функций).

Введение в культуру лимфоцитов дексаметазона вызывало достоверный рост количества апоптоти-ческих клеток в контрольной группе от 6,0±0,43%

Рисунок 1

ИНТЕНСИВНОСТЬ СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В СРАВНЕНИИ С ГРУППОЙ КОНТРОЛЯ

£  Больные СКВ

* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

(при спонтанном апоптозе) до 9,4+0,71% (при концентрации дексаметазона 1 мкМ) и 11,9±0,57% (при концентрации дексаметазона 5 мкМ), р<0,001, а у больных СКВ - от 14,0±0,58% до 19,3+1,20% (1 мкМ) и 20,4±0,73% (5 мкМ), р<0,001. Воздействие лейкладина (2 мкг/мл), флударабина(5 мкг/мл) и ЦФ (10 мкг/мл) приводило к увеличению числа апопто-тическихмононуклеаровдо 13,6+0,69%, 12,3±0,78% и 9,4±0,47% (р<0,001) в культуре донорских лимфоцитов и до 23,7±0,80% (р<0,001), 16,811,20% (р<0,05) и 17,3±0,80% (р<0,01) в культуре клеток больных СКВ соответственно (см. рис. 1).

Таким образом, ГК и цитостатики способны индуцировать программированную гибель лимфоцитов in vitro. Данный феномен можно рассматривать в качестве одного из механизмов действия иммуносупрессивных средств, которые могут обеспечить элиминацию аутоиммунного клона моно-нуклеаров, ограничить периферический аутоиммунный ответ, уменьшить плацдарм для развития иммунопатологических реакций. В то же время индукция апоптоза иммунокомпетентных клеток потенциально может способствовать накоплению аутоантигенного материала. Стимуляция удаления последнего, вероятно, входит в функции изучаемых лекарственных препаратов in vivo.

Процентное содержание апоптотических лимфоцитов, или ААИ, не в полной мере отражает индуцирующее влияние ГК и цитостатиков. Для более наглядного представления степени индукции программированной гибели лимфоцитов был вычислен относительный апоптотический индекс (ОАИ), значения которого представлены на рис. 2.

По величинам ОАИ можно судить о меньшей чувствительности иммунокомпетентных клеток больных СКВ к действию ГК и цитостатиков in vitro.

Так, воздействие дексаметазона в концентрации 1 мкМ на культуру лимфоцитов вызывало рост числа апоптотических клеток на 128,1 ±23,11 % (ОАИ) у доноров и на 43,314,66% у больных СКВ, а в концентрации 5 мкМ — на 110,3±19,88% и 56,4±5,31% соответственно (р<0,001). При использовании лейкладина и флударабина ОАИ составил для лимфоцитов здоровых лиц 115,0±14,81 % и 80,5± 12,59%, а для мононуклеаров больных СКВ 82,1+6,06% и 50,5±5,49% соответственно (р<0,05).

Оценка ОАИ позволяет также соотнести применявшиеся в исследовании иммуносупрессивные препараты между собой. Влияние дексаметазона в концентрациях 1 мкМ и 5 мкМ на культуру донорских лимфоцитов было сопоставимо с воздействием лейкладина {128,1+23,11%, 110,3±19,88%, 115,0114,81% соответственно) и превышало индуцирующие способности флударабина и ЦФ (80,5112,59% и 39,315,42% соответственно). ГК являются классическими индукторами апоптоза и действуют через геномные и негеномные механизмы, включающие изменение транспорта ионов Са2+, К+, подавление №+/Н+-обмена, падение трансмембранного потенциала митохондрий (А'И ), развитие окислительного стресса, а также активацию Са2+-, Х^2+-зависимой эндонуклеазы [1].

Лимфоциты больных СКВ в большей степени были подвержены программированной гибели под воздействием лейкладина (82,116,06%), чем дексаметазона в концентрациях 1 мкМ (43,314,66%) и 5 мкМ (56,415,31%). Действие последнего соотносилось с влиянием флударабина (50,515,49%) и превышало индуцирующие возможности ЦФ (28,912,57%). Таким образом, все использованные цитостатики можно ранжировать по степени индукции апоптоза мононуклеарных клеток доноров и больных следующим образом: лейкладин > флударабин > ЦФ.

Рисунок 2

ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ АПОПТОТИЧЕСКИЙ ИНДЕКС ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СКВ В СРАВНЕНИИ С ГРУППОЙ КОНТРОЛЯ

Больные СКВ

140,0

5 120,0

it

1 100,0

>Х

о 40,0

* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

Как видно, недостаточные возможности в отношении индукции программированной гибели лимфоцитов in vitro выявлены у ЦФ. Однако его нативная молекула не обладает биологической активностью. Образование функционально активных метаболитов происходит преимущественно в печени за счет окисления в гладком эндоплазматическом ретикулуме. Ряд авторов признают возможность трансформации препарата и в клетках-мишенях. Продукты превращения вызывают алкилирование ДНК, что нарушает ее правильную редупликацию и останавливает деление клетки [6]. Кроме того, метаболиты ЦФ способны индуцировать апоп-тоз мононуклеарных клеток как минимум двумя путями: активацией апоптотического протеазоак-тивируюшего фактора-1 (АЛАФ-1) и генов, кодирующих субъединицы цитохрома С. Становится понятным, почему при действии вне целостного организма ЦФ относительно малоэффективен. Низкий индуцирующий эффект данного препарата в сравнении с другими цитостатиками и ГК был в определенной мере предопределен дизайном нашего исследования.

В то же время новый цитостатик отечественного производства лейкладин, идентичный используемому за рубежом кладрибину, по нашим данным, обладал наибольшими способностями к индукции апоптоза мононуклеарных клеток больных СКВ. Следует заметить, что данный препарат тоже является пролекарством. Однако фосфорилирование его молекулы происходит непосредственно в лимфоцитах с образованием после последовательных превращений 5’-трифосфата 2-хлор-2’-дезоксиаденозина. Накопление в клетках данного активного метаболита, являющегося аналогом пуриновых нуклеотидов, зависит от соотношения между ферментами, ответственными за его продукцию (дезоксицитидинки-наза) и расщепление (5’-нуклеотидаза). Поскольку в мононуклеарных клетках равновесие между указанными энзимами смещено в пользу первого, лимфоциты оказываются довольно чувствительными к лейкладину. Действующее начало препарата вызывает межнуклеосомную деградацию ДНК посредством активации эндонуклеаз, а также запускает программу апоптоза другими путями, пролегающими через митохондрии. При этом высвобождаются апоптоз индуцирующий фактор (АИФ), цитохром С, ионы Са2+, активируются ген р53, АПАФ-1, каспазы-9, -3, а на необратимость апоптоза указывает снижение трансмембранного потенциала митохондрий (А'Рт) [17, 20]. Особенность лейкладина заключается в том, что он проявляет прямой цитотоксический и индуцирующий апоптоз эффекты как в отношении делящихся, так и покоящихся мононуклеаров, что может быть полезным при лечении аутоиммунной патологии [12].

Сходными свойствами обладает и флударабин (2-фтораденинмоно-фосфат). Проникнув в клетку,

препарат трансформируется с помощью дезокси-цитидинкиназы в активный метаболит - араби-нофуранозил-2-фтораденинтрифосфат, который инкорпорируется в ДНК и подавляет активность ключевых ферментов ее синтеза (полимеразы, при-мазы и лигазы), что приводит к нарушению построения цепи ДНК и запуску программы апоптоза. Флударабин, подобно лейкладину, с одинаковой активностью действует на пролиферирующие и непролиферирующие мононуклеарные клетки [9]. Однако, по результатам нашего исследования, его способности к индукции ПГ лимфоцитов уступали таковым у лейкладина.

Анализ абсолютных и относительных показателей индуцированного апоптоза мононуклеарных клеток показал, что ОАИ обладает наибольшей информативностью. Он отражает степень индукции программированной гибели клеток, которая, как выяснилось, варьирует между терапевтическими агентами. Различия в индуцирующих возможностях препаратов с учетом их фармакокинетики позволяют рассматривать избранную схему исследования в качестве тест-системы для выбора наиболее оптимальных средств патогенетической терапии.

Клиническая практика часто сталкивается с неэффективностью комбинированного медикаментозного лечения СКВ, особенно люпус-нефрита. На основании полученных данных о влиянии на апоптоз мононуклеарных клеток новый цитостати-ческий иммунодепрессант лейкладин может быть предложен для лечения больных СКВ, устойчивых к традиционной терапии. Необходимы клинические испытания препарата на пациентах после разрешения Фармакологического комитета Республики Беларусь, отработка дозы, продолжительности применения, оценка побочных эффектов. Возможно, включение нового отечественного цитостатика в схему лечения внесет свой вклад в решение проблемы преодоления лекарственной резистентности при данной патологии.

Замючение

Таким образом, доказано индуцирующее влияние ГК и цитостатиков на апоптоз лимфоцитов периферической крови больных СКВ in vitro, а также вариабельность этого влияния в зависимости от применяемого лекарственного препарата. Полагаем, что оценка степени индукции апоптоза мононуклеарных клеток по величине ОАИ может стать новым способом объективизации выбора и индивидулизации патогенетической терапии СКВ. Кроме того, выявлены определенные преимущества нового цитостатика лейкладина перед другими иммунодепрессантами в отношении индукции программированной гибели лимфоцитов in vitro, позволяющие рекомендовать проведение клинических испытаний данного препарата в качестве средства для лечения больных СКВ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бойчук С.В., Мустафин И.Г., Фассахов P.C. Механизмы дексаметазон-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме. Пульмонология, 2003, 2, 10-

16.

2. Клюквина Н.Г., Шекшина С.В., Насонов E.JI. Современный взгляд на лечение системной красной волчанки. Русс. мед. журн., 2002,10, 6, 307-313.

3. Сальников К.В., Свирновский А.И., Цвирко Д. Г. и сотр. Достижения медицинской науки Беларуси, Мн., 2001, 6, 6-7.

4. Ходина Т.В., Сачивко Н.В. Отечественный препарат лейкладин в лечении злокачественной лимфомы. Мед. новости, 2003, 2, 67-69.

5. Afford S., Randhawa S. Apoptosis. J. Clin. Pathol. Mol. Pathol, 2000, 53, 55-63.

6. Allison A.C. Immunosuppressive drugs: the first 50 years and a glance forward. Immunopharmacol.,

2000, 47, 2, 63-83.

7. Beutler E., Sipe J., Romine J. et al. Treatment of multiple sclerosis and other autoimmune diseases with cladribine. Semin. Hematol., 1996, 33, 28, 45-52.

8. Bohm I. Increased peripheral blood B-cells expressing the CD5 molecules in association to autoantibodies in patients with lupus erythematosus and evidence to selectively down-modulate them. Biomed. Pharmacother., 2004, 58, 5, 338-343.

9. Bromidge T.J., Turner D.L., Howe D.J. et al. In vitro chemosensitivity of chronic lymphocytic leukaemia to purine analogues — correlation with clinical course. Leukemia, 1998, 12, 8, 1230-1235.

10. Cara C.J., Pena A.S., Sans M. et al. Reviewing the mechanism of action of thiopurine drugs: towards a new paradigm in clinical practice. Med. Sei. Monit., 2004, 10, 11, 247-254.

11. Davis J.C., Austin H., Boumpas D. etal. A pilot study of 2-chloro-2’-deoxyadenosine in the treatment of systemic lupus erythematosus-associated glomerulonephritis. Arthr. Rheum., 1998, 41, 2, 335-343.

12. Dighiero G. Potential immunological action of purine nucleoside analogues. Drugs, 1994, 47, 6, 57-62.

13. Dubinsky M.C. Azathioprine, 6-mercaptopurine in inflammatory bowel disease: pharmacology,

efficacy, and safety. Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2004, 2, 9, 731-743.

14. Godal R.M.Jr., Smith B.J., Kalnitsky J. et al. Analysis of apoptosis of lymphoid cells in fish exposed to immunotoxic compounds. Cytometry,

2000, 39,4,310-318.

15. Ho C.Y., Wong C.K., Li E.K. et al. Effects of dexamethasone on the expression of Fas molecules and apoptosis of lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Immunol. Invest.,

2001, 30, 3, 231-243.

16. Kuiper-Geertsma D.G., Derksen R.H. Newer drugs for the treatment of lupus nephritis. Drugs, 2003,63,2, 167-180.

17. Liliemark J., Juliusson G. 2-Chloro-2’-deoxyadenosine — clinical, biochemical and pharmacokinetic considerations. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1994,42, 1, 7-10.

18. Liu S.T., Wang C.R., Yin G.D. et al. Hydroxychloroquine sulphate inhibits in vitro apoptosis of circulating lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Asian Pac. J. Allergy Immunol., 2001, 19, 1, 29-35.

19. Majewski S., Skopinska M., Blaszczyk M. et al. Systemic administration of 2-chloro-2’-deoxyadenosine (2-CdA) in patients with systemic scleroderma. Arch. Immunol. Ther. Exp., 1994,42, 1,33-34.

20. MarzoL, Perez-Galan P., Giraldo P.etal. Cladribine induces apoptosis in human leukaemia cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Biochem. J., 2001, 359, 3, 537-546.

21. Meng X.W., Feller J.M., Ziegler J.B. et al. Induction of apoptosis in peripheral blood lymphocytes following treatment in vitro with hydroxychloroquine. Arthr. Rheum., 1997, 40, 5, 927-935.

22. Schirmer M., Mur E., Pfieffer K.P. et al. The safety profile of low-dose cladribine in refractory rheumatoid arthritis. A pilot trail. Scand. J. Rheumatol., 1997, 26, 5, 376-379.

23. Seki M., Ushiyama C., Seta N. et al. Apoptosis of lymphocytes induced by glucocorticoids and relationship to therapeutic efficacy in patients with systemic lupus erythematosus. Arthr. Rheum., 1998, 41, 5, 823-830.

Поступила 11.07.06

Abstract

N.F. Soroka, A.I. Svirnovsky, A.L. Rekun

Immunosuppressive drugs influence on lymphocyte apoptosis in patients with systemic lupus erythematosus in vitro

Objective. To evaluate influence of immunosuppressive drugs on apoptosis in peripheral blood lymphocytes from pts with systemic lupus erythematosus (SLE) in vitro.

Material and methods. 102 pts with SLE and 40 normal controls (healthy donors) were studied. Peripheral blood lymphocytes collected from donors and pts were cultured for 24 hours in presence (induced apoptosis) or absence (spontaneous apoptosis) of Dexamethasone (1 and 5 pM), Leucladine (2 pg/ml), Fludarabine (5 pg/ml) and Cyclophosphamide (10 pg/ml). Cells undergoing apoptosis were identified by morphologic method (fluorescence microscopy). Apoptotic lymphocytes percentage (absolute apoptotic index, AAI) was determined and relative apoptotic index (RAI) was calculated according to the formula: RAI = [(AAIinduced - AAlspontaneous) / AAIspontaneoiis] x 100%. Results. SLE lymphocytes spontaneous apoptosis was accelerated (14,0±0,58%) in comparison with control (6,0+0,43%, p<0,001). Dexamethasone, Leucladine, Fludarabine and Cyclophosphamide caused statistically significant increase of apoptotic lymphocytes percentage. RAI values showed the lower sensitivity of SLE mononuclear cells to the drugs in vitro. This index it allows to range cytostatic agents according to their influence on SLE lymphocytes apoptosis in vitro: Leucladine (82,1 ±6,06%) > Fludarabine (50,5±5,49%) > Cyclophosphamide (28,9±2,57%).

Conclusion. The RAI evaluation may be used to choose an optimal immunosuppressive drug for each pt. Leucladine provided the most prominent induction of mononuclear cells apoptosis in vitro so it can be tested in clinical trials as a drug for SLE treatment.

Key words: apoptosis, immunosuppressive drugs, lymphocytes, mononuclear cells, systemic lupus erythematosus