СПОСОБ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
METHOD FOR HIGHLY SENSITIVE COMPETITIVE IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ANALYSIS

Изобретение относится к аналитической биохимии и пищевой биотехнологии, представляя собой способ конкурентного иммунохроматографического анализа.
К иммунохроматографическому анализу относятся методики выявления различных соединений, в которых используется связывание данных соединений со специфическими антителами и формирование посредством реакций антиген-антитело на иммунохроматографической мембране (тест-полоске) комплекса иммунореагентов и детектируемой (обычно окрашенной) метки, выявляемого по появлению на тест-полоске окрашенной полосы [Quesada-Gonzalez D., Merkoci A. Nanoparticle-based lateral flow biosensors. BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, 2015, v. 73, pp. 47-63]. Востребованность иммунохроматографического анализа определяется простотой его проведения - контакта тест-полоски с жидкой пробой или экстрактом и, при необходимости, с дополнительными растворами достаточно для инициирования движения жидкости по мембране под действием капиллярных сил и инициирования всех взаимодействий, необходимых для формирования детектируемых иммунных комплексов, Тем самым проведение анализа не требует дополнительных устройств и трудоемких действий оператора. Результатом иммунохроматографического анализа является наличие или отсутствие окрашенной зоны связывания на определенном участке тест-полоски, обусловленное связыванием в этом участке иммунореагентов, в том числе их комплексов с меткой. Благодаря этому оценка результатов тестирования может быть осуществлена визуально, а весь анализ может быть проведен непосредственно в месте отбора проб без их транспортировки в лабораторию.
При необходимости определения низкомолекулярных соединений, к которым относятся пестициды, антибиотики, микотоксины, фикотоксины и другие токсичные контаминанты сельскохозяйственной продукции и вырабатываемых из нее продуктов питания и кормов используется односайтный конкурентный иммунохроматографический анализ, что обусловлено способностью малых по размерам молекул антигенов связываться лишь с одной молекулой антитела [Posthuma-Trumpie G.A., Korf J., van Amerongen A. Lateral flow (immuno) assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY, 2009, v. 393 (2), pp. 569-582]. В основе конкурентного иммунохроматографического анализа лежит сочетание двух иммунных взаимодействий антител, меченных окрашенной меткой. Вначале антитела контактируют с тестируемой пробой, в которой потенциально содержится антиген, и в ходе этого контакта антитела специфично связываются с антигеном. Затем проба, смешавшись с препаратом антител, под действием капиллярных сил движется по порам мембраны тест-полоски. В определенную зону этой мембраны заранее наносится антигенный препарат, связанный с белком. Обычно для этого используется сам антиген, в состав которого введена реакционноспособная группа (или не модифицированный антиген, если его молекула уже содержит такую группу), который ковалентно связывается с белком, обеспечивающим сорбционную иммобилизацию полученного комплекса в месте нанесения на мембрану. В результате этих двух взаимодействий на мембране тест-полоски в зоне нанесения антигена, связанного с белком, при концентрации антигена в пробе ниже пороговой образуется регистрируемый по окрашиванию комплекс (белок-носитель - производное антигена - антитела - маркерная частица). Если же концентрация антигена в пробе равна или выше пороговой, комплекс не образуется в количестве, достаточном для регистрации по окрашиванию, Таким образом, исходя из результата регистрации окрашивания, неизвестная концентрация антигена в пробе сопоставляется с пороговой концентрацией. Если концентрация антигена в пробе ниже пороговой - окрашивание наблюдается, если равно или выше - отсутствует. Важно, чтобы сравнение с пороговой концентрацией анализа позволяли делать практически значимые выводы о свойствах тестируемой пробы, например, о том, превышена ли в нем допустимая концентрация токсичного контаминанта - пестицида, антибиотика и др. Однако пороговая концентрация конкурентного иммунохроматографического анализа - определенная величина, которая зависит от структуры антигена и антител, констант связывания их взаимодействия. Если анализ позволяет определять меньшие концентрации антигена, чем требуется для практических выводов, он все равно может эффективно применяться после разбавления тестируемой пробы. Если же пороговая концентрация иммунохроматографического анализа выше, чем контролируемый уровень определяемого антигена, необходимо усовершенствование аналитического метода [Ngom B., Guo,Y., Wang X. Et. al. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY, 2010, v. 397 (3), pp. 1113-1135].
Как видим, повышение чувствительности иммунохроматографического анализа - весьма востребованная задача. Для ее решения предлагаются различные подходы.
Одно из направлений совершенствования иммунохроматографических тестов связано с заменой используемого маркера. Вместо наночастиц золота, с использованием которых производится большая часть иммунохроматографических систем, предлагается применять другие связывающиеся с антителами частицы, детектируемые в меньших концентрациях. Так, известны успешные разработки, в которых применяются флуоресцентные или магнитные частицы, регистрируемые в крайне низких количествах и при малом фоновом сигнале мембраны и компонентов тестируемых проб [Urusov A.E., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Towards lateral flow quantitative assays: Detection approaches. BIOSENSORS, 2019, v. 9 (3), artticle 89]. Однако реализация такого иммунохроматографического анализа требует дополнительных регистрирующих устройств, что повышает стоимость определения и приводит к утрате основного достоинства иммунохроматографии как бесприборного аналитического метода, реализуемого непосредственно в точке отбора пробы.
Известны также разработки, в которых в качестве альтернативной метки используются наночастицы другого химического состава и, соответственно, с другими спектрами поглощения [Goryacheva I.Yu., Lenain P., De Saeger S. Nanosized labels for rapid immunotests. TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY, 2013, v. 46, pp. 30-43]. Однако изменение поверхностных свойств наночастицы влияет на эффективность иммобилизации на ее поверхности антител и степени сохранения ими антиген-связывающих свойств. Тем самым преимущества более интенсивно окрашенной метки могут быть реализованы только после проведения комплекса дополнительных исследований по выбору условий иммобилизации на ее поверхности антител.
Кроме того, в качестве альтернативной метки в иммунохроматографическом анализе предлагается использовать нанозимы - наночастицы, катализирующие трансформацию субстрата в регистрируемый окрашенный продукт. При этом за счет трансформации большого числа молекул субстрата действительно обеспечивается амплификация оптического сигнала [Nguyen Q.H., Kim M.I. Nanomaterial-mediated paper-based biosensors for colorimetric pathogen detection. TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY, 2020, v. 132, article 116038]. Однако комплектация тест-системы усложняется. Вместо одной тест-полоски с предварительно нанесенными на нее и высушенными реагентами возникает сочетание тест-полоски и субстратного раствора, свойства которого со временем могут изменяться, что влияет на регистрируемую интенсивность окрашивания.
Отмечалось влияние на пороговую концентрацию конкурентного иммунохроматографического анализа состава комплексов наночастиц-меток с антителами [Zvereva, E.A., Byzova N.A., Sveshnikov P.G. et al. Cut-off on demand: adjustment of the threshold level of an immunochromatographic assay for chloramphenicol. ANALYTICAL METHODS, 2015, v. 7 (15), pp. 6378-6384]. Действительно, снижение соотношения антитело:метка в комплексе от многих десятков и сотен до единиц сдвигает пороговую концентрацию в область более низких величин, так как для блокировки антигенсвязывающих сайтов антител требуется меньшее количество молекул антигена, содержащихся в пробе. Однако при меньшем количестве антител в комплексе с наночастицей снижается и эффективность связывания с иммобилизованным конъюгатом производного антигена с белковым носителем на мембране, что проявляется как снижение интенсивности окрашивания и менее достоверная регистрация получаемых результатов.
2
n
В литературе имеются также предложения по изменению свойств конъюгата антигенного препарата с белком, влияющие на связывание антител [Anfossi L., Baggiani C., Giovannoli C., Giraudi G. Lateral flow immunoassays for aflatoxins B and G and for aflatoxin M1. Chapter 215 in Aflatoxins - Recent Advances and Future Prospects Intechopen, 2013. Pp. 315-339]. Так, предлагается изменение длины «мостикового» -(CH)- участка антигенной молекулой и белком-носителем, расположения точки модификации на молекуле антигена. В ряде случаев также изменения приводят к более чувствительному определению свободного антигена. Однако успешность такой модификации не гарантирована, а достигаемые выигрыши могут сильно варьировать. К тому же изменение методики конъюгирования модифицированного антигена с белком требует дополнительной оптимизации условий синтеза и может быть сопряжено со снижением выхода целевого продукта.
Таким образом, для решения задачи повышения чувствительности иммунохроматографического анализа может быть применены разные методы, однако такие изменения могут быть сопряжены с возрастанием сложности проведения анализа или требовать дополнительных исследований при выборе условий получения необходимых новых реагентов.
При этом для таких востребованных классов контролируемых низкомолекулярных соединений, как пестициды, антибиотики, небелковые токсины известно значительное разнообразие структурно близких молекул, с разной степенью эффективности распознаваемых антителами - коммерческие химические препараты того же класса с несколькими модифицированными или замененными атомами, продукты частичной деструкции антигенов. Характеристика антител, используемых для определения того или иного антигена, включает такой параметр, как кросс-реактивность, отражающий результаты сравнения по связыванию с антителами данного производного антигена и исходной молекулы. [Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Zvereva E.A. et al. Changing cross-reactivity for different immunoassays using the same antibodies: Theoretical description and experimental confirmation. APPLIED SCIENCES, 2021, v. 11 (14), article 6581].
С учетом доступности таких реагентов в настоящем патенте предлагается использовать вместо нанесенного на мембрану антигенного препарата связанное с белком производное структурного аналога антигена, способное связываться с антителами, но с худшей аффинностью, чем сам антиген. Благодаря этому даже небольших концентраций антигена в пробе становится достаточно, чтобы предотвратить образование на мембране окрашенных комплексов. Поскольку предложенная замена снижает интенсивность окрашивания в отсутствие антигена в пробе, затрудняя сравнение результатов анализа для разных концентрацией антигена, замена сопровождается использованием дополнительного реагента - комплекса окрашенных частиц с антитело-связывающим белком, который движется вдоль тест-полоски по ее порам после завершения взаимодействий антиген-антитело. В результате связывания этого дополнительного реагента обеспечивается высокая интенсивность окрашивания в отсутствие антигена в пробе и возможность достоверного сравнения результатов анализа для разных концентраций антигена.
Согласно описанной в литературе математической модели конкурентной иммунохроматографии [Sotnikov D.V., Zherdev A.V., Byzova N.A., et al. Mathematical modeling of the immunochromatographic test-systems in competitive format: Analytical and numerical approaches.. BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL. (2020), v. 164, article 107763] сигнал в аналитической зоне определяется концентрации окраженного комплекса, которая зависит от параметров системы следующим образом:
где
А - антиген в пробе;
Р - антиген-связывающие центры антител на частицах маркера (маркерный конъюгат);
R - модифицированный антиген (антиген-белок) в аналитической зоне для связывания конъюгата коллоидного маркера;
AP - комплекс антигена с антителом на частице коллоидного маркера;
PR - комплекс специфических антител на частицах коллоидного маркера и модифицированного антигена в аналитической зоне;
ka1 - кинетическая константа ассоциации реакции меченых антител с антигеном;
ka2 - кинетическая константа ассоциации реакции меченых антител с модифицированным антигеном в аналитической зоне;
t - время анализа от начала реакции антигена с коллоидным конъюгатом;
T - разность между t и временем реакции в аналитической зоне.
Как видно из уравнения, концентрация окрашенного комплекса в аналитической зоне находится в степенной зависимости от соотношения констант ассоциации первой и второй реакции антиген-антитело. Количественно чувствительность анализа связана со значением абсциссы точки перегиба градуировочной зависимости (IC50). Чем меньше концентрация конкурента, соответствующая IC50, тем выше чувствительность. Константы иммунного взаимодействия, определяющие скорости реакций (1) и (2), соответственно ka1 и ka2, влияют на концентрацию образовавшегося в аналитической зоне окрашенного комплекса PR принципиально противоположным образом: [PR] увеличивается при уменьшении ka1 и повышении ka2. Расчеты показывают, что повышение значения ka1 приводит к смещению IC50 в сторону более низких значений аналита, иллюстрируя известное требование использовать в анализе как можно более аффинные антитела. При этом изменение ka1 слабо влияет на величину максимальной концентрации [PR]max, достижимой при отсутствии аналита. В противоположность этому, уменьшение кинетической константы ассоциации маркерного конъюгата с рецептором в аналитической зоне (ka2) смещает IC50 в сторону более низких значений аналита, но при этом максимальная концентрация [PR] значительно уменьшается, то есть чувствительность повышается, но снижается интенсивность окраски. Из модели следует, что более эффективно использование высоких концентраций низкоаффинного рецептора в аналитической зоне, чем низких концентраций высокоаффинного рецептора.
Соответственно, предметом изобретения является способ конкурентного иммунохроматографического анализа, в котором в качестве антигенного препарата, связанного с белком, используется менее аффинный по отношению к антителам структурный аналог антигена для повышения чувствительности, а после взаимодействий комплекса антител и маркерной частицы по мембране тест-полоски движется конъюгат маркерной частицы с антитело-связывающим реагентом для повышения интенсивности окраски.
Предлагаемое сочетание замен в комплектации иммунохроматографической тест-системы обеспечивает возможность выявления более низких концентраций антигена при сохранении востребованных характеристик анализа - методическая простота проведения, регистрация окрашивания мембраны как результата тестирования, отсутствие необходимости в приборном обеспечении, сохранение высокой интенсивности окрашивания.
Технический результат патента состоит в повышении чувствительности анализа, то есть в обеспечении возможности достоверного выявления более низких концентраций антигена.
Реализуемость предлагаемой идеи демонстрируется приводимым ниже примером:
Пример 1
Иммунохроматографический анализ антибиотика суфахлорпиридазина
Анализ суфахлорпиридазина проводится с использованием специфичных к данному соединению антител, а для получения комплекса антигенного препарата с белковым носителем используется сульфадиметоксин (перекрестная реактивность с используемыми антителами, по данным иммуноферментного анализа, -17%).
Для изготовления иммунохроматографических тест-полосок использовались нитроцеллюлозная мембрана CNPC с размером пор 15 мкм (CNPC-SS15), мембрана под образец GFB-R4, стекловолоконная мембрана PT-R7 и адсорбционная мембрана AP045 (“Advanced Microdevices”, Индия).
Сферические наночастицы золота (средний диаметр 30 нм) получали восстановлением золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия по методу Френса, а иммобилизацию на них поликлональных кроличьих антител к суфахлорпиридазину и стрептококкового белка G проводили адсорбцией при рН 9.0, исходя из флоккуляционной кривой.
Аналитическую зону тест-полоски формировали нанесением конъюгата сульфадиметоксина с бычьим сывороточным альбумином (0.5 мг/мл), контрольную зону - антивидовых антител (иммуноглобулины антисыворотки овцы против IgG кролика (0.15 мг/мл). Для сравнения использовали также иммобилизацию конъюгата суфахлорпиридазина с бычьим сывороточным альбумином (0.5 мг/мл), На стекловолоконную мембрану наносили комплекс золотых наночастиц с антителами к суфахлорпиридазину.
После нанесения иммунореагентов нитроцеллюлозную мембрану сушили 24 часа при комнатной температуре и 5 часов при 37°C. Высушенный и склеенный мембранный комплекс нарезали на тест-полоски шириной 3.5 мм с помощью автоматического гильотинного нарезчика.
Проведение иммунохроматографического анализа (контрольные эксперименты с иммобилизованным конъюгатом сульфониламида с бычьим сывороточным альбумином): В лунку микропланшета вносили 100 мкл тестируемой пробы (растворы суфахлорпиридазина разной концентрации) и погружали тест-полоску в вертикальном положении. Через 10 мин контролировали результат анализа.
Проведение иммунохроматографического анализа (предлагаемый вариант с иммобилизованным конъюгатом сульфадиметоксина с бычьим сывороточным альбумином): В лунку микропланшета вносили 100 мкл тестируемой пробы (растворы суфахлорпиридазина разной концентрации) и погружали тест-полоску в вертикальном положении. Через 10 мин тест-полоску переносили в другую лунку, содержащую 100 мкл конъюгата золотых наночастиц и стрептококкового белка G. Повторяли 10-минутную инкубацию и контролировали результат анализа.
Результаты анализа для двух вариантов - контрольного и предлагаемого, приведенные на рис. 1, отражают сдвиг пороговой концентрации с 10 до 3,3 нг/мл суфахлорпиридазина в пробе, т.е. подтверждают заявленное улучшение чувствительности конкурентного иммунохроматографического анализа.