3D морфология эритороцитов как универсальный диагностический и прогностический критерий

Е.И. Сокол, Т.М. Бархоткина, Т.В. Бернадская, Р.С. Томашевский, Д.А. Долинин 3D МОРФОЛОГИЯ ЭРИТОРОЦИТОВ КАК УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ И ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ.

Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт», Харьков, Украина

В работе проведен анализ методов оценки влияния озона на клеточную мембрану и последующих эффектов. Предложен метод визуального и количественного контроля степени воздействия озона на мембрану. Разработана и приведена оптическая схема голографического интерференционного микроскопа.

Ключевые слова: озонотерапия, клеточная мембрана, микроскопия, интерференционная голография

The paper analyzed the level of methods for assessing the effect of ozone on the cell membrane and subsequent effects. A method for visual and quantitative monitoring of the degree of exposure to ozone on the membrane. Designed and shows the optical scheme of holographic interference microscope.

Keywords: ozone therapy, cell membrane, microscopy, holography interference

В настоящее время является доказанным, что все элементарные биологические процессы в организме человека начинаются на уровне мембраны клетки. Это касается и различных патологических состояний и действия многих лекарственных препаратов.

Основные саногенетические эффекты озона также связаны с воздействием на клеточную мембрану, что показано в работах Г.А. Бояринова, С.П. Перетягина, К.Н. Конторщиковой [1]. Однако методы и результаты, представленные в этих работах позволяют только косвенно установить факт воздействия озона на мембрану.

Мы предлагаем очень простой и очень информативный способ определения состояния плазматических мембран и степени их изменения под влиянием озона. Принцип предлагаемого нами способ заключается в использовании оптического прибора, основанного на методе голографической микроскопии в сочетании с компьютерной обработкой изображений.

Методы голографической микроскопии фазового контраста и голографический метод интерференционного контраста в сочетании с методами компьютерной обработки изображений позволяют решать задачу трехмерной визуализации фазовых микрообъектов, в частности эритроцитов. Проблема оказалась настолько актуальной, что в последние годы предложены различные варианты цифровых голографических микроскопов [2].

В частности, голографические микроскопы построены по схемам Линника и Маха-Цендера в линзовом или безлинзовом варианте, по схемам интерферометра Миро. Однако наряду с неоспоримыми достоинствами эти методы имеют ряд недостатков: необходимость точной настройки, высокая чувствительность к вибрациям, сложность реализации, высокая стоимость, значительные аберрации, большое количество оптических элементов высокой стоимости.

Мы разработали следующую принципиальную оптическую схему цифрового голографического интерференционного микроскопа.

Рис. 1. Оптическая схема голографического интерференционного микроскопа: 1 - Источник света (лазер); 2 - Светоделительный куб; 3 - Зеркало; 4 - Зеркало;

5 - Поляризатор; 6 - Коллиматор; 7 - Поляризатор; 8 - Поляризатор; 9 - Пластина с образцом; 10 - Объектив микроскопа; 11 - Голографическая пластина; 12 - Окуляр

микроскопа; 13 - Цифровая камера.

Исследуемый образец 9 освещается когерентным пучком лучей, который излучается полупроводниковым лазером 1 с длиной волны излучения 638 нм. С помощью светоделительного кубика 2 пучок света разделяется на две оптические ветви. Одна из оптических ветвей предназначена для опорного пучка лучей, вторая - для объектного. Для изменения направления хода луча в оптических ветвях используют зеркала 3 и 4. В оптической ветви опорного пучка лучей, необходимого для записи и восстановления по голограмме объектной волны, расположен коллиматор 6, который строит изображение источника света в бесконечности. В оптической ветви объектного пучка лучей расположен микроскоп, увеличение которого должно быть Гмик > 400х. Учитывая, что Гмик= воб Гок, выбираем один из возможных вариантов: увеличение объектива роб =40х и увеличение окуляра Гок=10х .

Пластина с образцом крови устанавливается на расстоянии -а от передней поверхности объектива микроскопа 10 ,

где -f - переднее фокусное расстояние объектива микроскопа

-z - расстояние от переднего главного фокуса объектива микроскопа до пластины с образцом.

Если принять —z = 5 мм, то - fo6 = 200 мм, следовательно - а= 205 мм.

Числовая апертура объектива А=0,7 , что обеспечивает большую разрешающую способность и светосилу объектива.

Объектив микроскопа 10 создает изображение на голографической пластине 11, с которой должен совпадать передний фокус окуляра. 12.

Так как выбранный окуляр 12 имеет увеличение Гок=10х, то учитывая , что

Гок = 250/f ок, следовательно f ок = 25 мм.

Расстояние от передней поверхности окуляра 12 до голографической пластины 11 соответствует переднему фокальному отрезку окуляра микроскопа.

Расстояние между объективом 10 и окуляром 12 L рассчитывается таким образом:

L = 8000 + 25 = S025mm

Таким образом, вся схема получается очень громоздкой. Что не позволяет поучить адекватный измерительный прибор. Поэтому мы предлагаем вариант получения требуемого увеличения не в одну ступень, - микроскопом, а в две ступени - микроскоп совместно с телескопической системой. Целесообразно применить телескопическую систему Галилея, которая может давать два вида увеличения: в прямом и обратном видах. К тому же, телескопическая система Галилея имеет меньший габаритный размер по сравнению с телескопической системой Кеплера.

Качество и контраст голограммы и интерферограммы регулируется за счет введения в оптические ветви поляризационных светофильтров 5,7 и 8. Используются голографические пластины ПФГ-03.

Интерферограммы исследуемого образца регистрируются с помощью цифровой видеокамеры и в дальнейшем обрабатываются на компьютере.

Рис. 2. Изображение эритроцитов под обычным оптическим микроскопом

Рис. 3. Изображение эритроцитов в голографическом интерференционном микроскопе

Нами проведены следования состояния эритроцитов при различных заболеваниях воспалительного и гипоксического генеза. Определено влияние различных доз озона на мембраны эритроцитов in vitro [3]. Также проведены исследования in vivo динамики состояния мембран эритроцитов в зависимости от метода системной озонотерапии (раствор или БАГТО) и дозы озона при ряде заболеваний. На основании полученных данных разработаны прогностические и диагностические критерии использования различных технологий озонтерапии в лечении ряда заболеваний.

Список литературы

1. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование ознотерапии постгеморрагического периода. Дисс ..д-ра мед наук. Нижний Новгород, 1991. С. 12-14.

2. Черная В.В., Боровицкий В.Н. Сравнительный анализ современных голографических и интерференционных микроскопов //Вимiрювальна та обчислювальна техника в технолопчних процесах. 2010. №2. С. 36-43.

3. Бархоткина Т.М., Кудь А.А., Титарь В.П., Тишко Т.В. Деформабельность эритроцитов периферической крови как ингтегральный показатель эффективности озонотерапии // Общая реаниматология. 2006. Т. II, №4/1. С. 294-297.