КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ, СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ НА ОСНОВЕ CRISPR/Cas И ТРАНСПОЗАЗЫ

1. Способ обнаружения последовательности целевой нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) приведение в контакт олигонуклеотида, содержащего последовательность целевой нуклеиновой кислоты, с комплексом транспозона, где комплекс транспозона включает транспозазу и последовательность транспозона, содержащую один или несколько промоторов РНК полимеразы Т7;
(б) вставку одного или нескольких промоторов РНК полимеразы Т7 в олигонуклеотид с использованием транспозазы;
(в) амплификацию последовательности целевой нуклеиновой кислоты путем генерирования РНК олигонуклеотидов, содержащих последовательность целевой нуклеиновой кислоты, посредством транскрипции со вставленных одного или нескольких промоторов РНК полимеразы Т7.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий обнаружение амплифицированной целевой нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что амплифицированную целевую нуклеиновую кислоту обнаруживают с помощью системы обнаружения на основе CRISPR Cas13.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что транспозаза представляет собой транспозазу Tn5, транспозазу Mu или транспозазу Tn7.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что транспозаза представляет собой транспозазу Tn5.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что последовательность транспозона содержит две последовательности распознавания транспозазы Mosaic End (ME) Tn5 из 19 пар оснований.
7. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что транспозаза представляет собой сконструированную транспозазу.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что сконструированная транспозаза оптимизирована для работы при температуре от 30 до 45°C.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что сконструированная транспозаза оптимизирована для работы при температуре от 35 до 40°C.
10. Способ по любому из пп. 7-9, отличающийся тем, что сконструированная транспозаза оптимизирована для высвобождения из олигонуклеотида с более высокой скоростью по сравнению с транспозазой дикого типа.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что встраивание одного или нескольких промоторов РНК полимеразы Т7 в олигонуклеотид является случайным.
12. Способ по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что олигонуклеотид является двухцепочечным.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что встраивание одного или нескольких промоторов РНК полимеразы Т7 в двухцепочечный олигонуклеотид происходит в области  двухцепочечного олигонуклеотида богатого GC.
Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter
Lachnospira.
14. Способ по п. 3, отличающийся тем, что система обнаружения на основе CRISPR Cas13 включает фермент Cas13, происходящий из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: и
Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020; Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM 10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847; Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (вторые локусы CRISPR); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; Listeriaceae bacterium FSL M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; Blautia sp. Marseille-P2398; Leptotrichia sp. oral taxon 879 str. F0557; Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; Thalassospira sp. TSL5-1; Pseudobutyrivibrio sp. OR37; Butyrivibrio sp. YAB3001; Blautia sp. Marseille-P2398; Leptotrichia sp. Marseille-P3007; Bacteroides ihuae; Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA; Listeria riparia
Insolitispirillum peregrinum.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что фермент Cas13 происходит из организма, выбранного из группы, состоящей из:  и
16. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что амплифицированную целевую нуклеиновую кислоту выявляют с использованием системы обнаружения на основе CRISPR Cas12.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что система обнаружения на основе Cas12 содержит фермент Cas12a или Cas12b.
Francisella tularensis, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella sp., Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens and Porphyromonas macacae, Succinivibrio dextrinosolvens, Prevotella disiens, Flavobacterium branchiophilum, Helcococcus kunzii, Eubacterium sp., Microgenomates (Roizmanbacteria) bacterium, Flavobacterium sp., Prevotella brevis, Moraxella caprae, Bacteroidetes oral, Porphyromonas cansulci, Synergistes jonesii, Prevotella bryantii, Anaerovibrio sp., Butyrivibrio fibrisolvens, Candidatus Methanomethylophilus, Butyrivibrio sp., Oribacterium sp., Pseudobutyrivibrio ruminis
Proteocatella sphenisci.
18. Способ по п. 16 или 17, отличающийся тем, что система обнаружения на основе Cas12 содержит фермент Cas12, который происходит из организма рода, выбранного из группы, состоящей из  и
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что способ не требует нагревания олигонуклеотида.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что амплификацию последовательности целевой нуклеиновой кислоты проводят при постоянной температуре.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 20-30, около 30-40, около 40-50 или около 50-100 нуклеотидов.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 100-200, около 100-500 или около 100-1000 нуклеотидов.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность целевой нуклеиновой кислоты имеет длину около 1000-2000, около 2000-3000, около 3000-4000 или около 4000-5000 нуклеотидов.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий обнаружение амплифицированной нуклеиновой кислоты методом, выбранным из группы, состоящей из гель-электрофореза, обнаружения интеркалирующего красителя, ПЦР, ПЦР в реальном времени, флуоресценции, резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), масс-спектрометрии, RPA в реальном времени, LAMP в реальном времени, NEAR в реальном времени, HDA в реальном времени, TMA в реальном времени, NASBA в реальном времени и CRISPR-SHERLOCK.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту обнаруживают с фемтомолярной чувствительностью.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевую нуклеиновую кислоту определяют с аттомолярной чувствительностью.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигонуклеотид, содержащий целевую нуклеиновую кислоту, выбран из группы, состоящей из геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК, плазмидной ДНК и синтетической двухцепочечной ДНК.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что олигонуклеотид, содержащий целевую нуклеиновую кислоту, представляет собой олигонуклеотид РНК, и где способ включает стадию обратной транскрипции перед приведением в контакт олигонуклеотида с комплексом транспозона.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором последовательность целевой нуклеиновой кислоты происходит из образца, и где образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, стул, мокроту, слизистую, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асцит, плевральный выпот, серому, слюну, спинномозговую жидкость, воду или образец стекловидного тела, или любой секрет тела, транссудат, экссудат или жидкость, полученная из сустава, или мазок с кожи или поверхности слизистой оболочки.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что образец представляет собой кровь, плазму или сыворотку, полученную от пациента-человека.
32. Способ по п. 29, отличающийся тем, что образец представляет собой образец растения.
33. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что образец представляет собой неочищенный образец.
34. Способ по любому из пп. 1-32, отличающийся тем, что образец представляет собой очищенный образец.
35. Система для обнаружения последовательности целевой нуклеиновой кислоты в образце, включающая:
а. комплекс транспозона, в котором комплекс транспозона включает транспозазу и последовательность транспозона, содержащую один или несколько промоторов РНК полимеразы Т7, где транспозаза вставляет один или несколько промоторов РНК полимеразы Т7 в олигонуклеотид, содержащий последовательность целевой нуклеиновой кислоты;
б. РНК полимераза Т7, где РНК полимераза Т7 транскрибирует целевую нуклеиновую кислоту со встроенного одного или нескольких промоторов Т7; и
в. систему обнаружения на основе CRISPR для обнаружения транскрибированной целевой нуклеиновой кислоты.
36. Система по п. 35, отличающаяся тем, что система обнаружения на основе CRISPR является системой обнаружения на основе CRISPR-Cas13.
37. Система по п. 35, отличающаяся тем, что транспозаза представляет собой транспозазу Tn5.
38. Система по п. 35, отличающаяся тем, что транспозаза представляет собой вариант транспозазы Tn5.
39. Система по любому из пп. 35-38, отличающаяся тем, что последовательность транспозона содержит две последовательности распознавания транспозазы ME Tn5 из 19 пар оснований.
40. Система по п. 35, отличающаяся тем, что система обнаружения на основе CRISPR Cas13 представляет собой систему CRISPR-SHERLOCK на основе Cas13.
41. Система по п. 35, отличающаяся тем, что система обнаружения на основе CRISPR является системой обнаружения на основе CRISPR Cas12.
42. Система по любому из пп. 35-41, дополнительно содержащая реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
43. Система по любому из пп. 35-42, дополнительно содержащая реагенты для обратной транскрипции.