СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СООТНОШЕНИЯ СИГНАЛ/ШУМ ПРИ АНАЛИЗЕ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ МЕТОДОМ КР-СПЕКТРОСКОПИИ
METHOD OF INCREASING SIGNAL-TO-NOISE RATIO WHEN ANALYZING AQUEOUS SOLUTIONS USING RAMAN SPECTROSCOPY

Изобретение относится к области аналитической химии и спектроскопии комбинационного рассеяния света, в частности к анализу качества лекарственных препаратов методом КР-спектроскопии.
Предложенный способ может использоваться для качественного и количественного анализа водных растворов органических веществ, например, для контроля качества лекарственных средств в испытательных лабораториях и на производстве, а также в любых других областях где используется метод КР-спектроскопии.
Заявленный способ основывается на эффекте поглощения воды при образовании кристаллогидратов солей, что приводит к увеличению локальной концентрации растворенного вещества. Анализируемый раствор предлагается наносить на таблетку из спрессованных безводных или высушенных солей определенного состава (например, сульфата натрия, сульфата лития и хлорида кальция) и по истечению времени поглощения воды (не менее 5 минут), за счет образования кристаллогидратов, проводят регистрацию спектрограмм по стандартной методике, например, калибровка с использованием методов на основе закона Бера, CLS, SMLR, PCR или PLS, без дополнительных изменений.
Показано, что соли, не образующие кристаллогидратов, не вызывают эффекта усиления сигнала комбинационного рассеяния света. При использовании предложенного способа для анализа лекарственных препаратов наблюдалось 16-кратное увеличение соотношения сигнал/шум по сравнению с анализом по стандартной методике, что эквивалентно сокращению времени анализа и количеству зарегистрированных спектров в 256 раз. Проведено исследование концентрационной зависимости отклика аналитического сигнала и показана линейность калибровочного кривой для 10 - кратной разницы в концентрации аналита. Вычисление метрологических параметров методики доказывает применимость предложенного способа для количественного анализа.
Из уровня техники известен патент US 16072393, дата приоритета 21.06.2016, «Analysis method and analysis device» Предложенный способ отличается от указанного аналога тем, что в данном патенте используется метод прямого определения концентрации методом КР-спектроскопии на основе полученной калибровочной модели, описывающей зависимость интенсивности аналитического сигнала от концентрации аналита, без использования каких-либо методов усиления сигнала. Этот подход имеет ограничение по нижнему приделу определяемых концентраций вследствие низкого соотношения сигнал/шум в диапазоне концентраций ниже 1-5%, что является источником высоких погрешностей измерений, для снижений которых может потребоваться использование спектрометров комбинационного рассеяния более высокого класса точности, либо значительное увеличение времени анализа. Предлагаемый нами способ позволяет без изменения параметров анализа существенно повысить соотношение сигнал/шум и как следствие уменьшить предел количественного определения веществ в водных растворах как минимум до 0,25%.
Известно изобретение US 16022121, дата приоритета 28.06.2018 «Reaction control in acetic acid processes», где описана методика определения компонентов реакционной смеси, находящихся в высокой концентрации 65,3%-70,5% при этом содержание воды находится на уровне 2-14%, что снижает ее влияние на результат анализа. Предлагаемый нами способ позволят анализировать более сложные смеси на основе водных растворов с пределом обнаружения действующего вещества как минимум до 0,07%, при этом вода, как растворитель, может занимать основную часть анализируемого раствора (соответственно до 99,93%).
Ближайшим аналогом заявленного изобретения является заявка CN 102353665 (А), дата приоритета 15.02.2012 «Surface enhanced raman spectroscopy detection method for sulfanilamide medicines». Заявленный способ отличается от указанного аналога рядом важных технологических деталей. В предложенном нами способе отсутствует необходимость в длительно и многостадийном синтезе наночастиц драгоценных металлов (например, серебра, золота, платины и др.), поскольку эффект усиления сигнала достигается не за счет плазмонного резонанса наночастицы с молекулой аналита, а в следствие поглощения воды за счет образования кристаллогидратов солей в результате чего происходит повышение локальной концентрации аналита на поверхности солевой таблетки. Это существенно снижает стоимость анализа, а также отсутствует необходимость в предварительном изготовлении наночастиц и систем на их основе срок хранения которых ограничен.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение чувствительности анализа водных растворов веществ, за счет повышения соотношения сигнал/шум; снижение предела количественного определения и предела обнаружения веществ, находящихся в водном растворе с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния света.
Предложенный способ позволяет сократить время на проведение анализа за счет снижения числа сканирований для получения приемлемого соотношения сигнал/шум, а также позволяет проводить анализ водных растворов нестабильных веществ, которые склонны к разрушению, химической модификации либо любому иному виду изменения физико-химических и/или химических свойств под действием лазерного излучения в условиях анализа.
Технический результат достигается за счет выполнения следующих этапов пробоподготовки:
1. Получение тонкого порошка безводных (или высушенных) солей состава МхАу,
где х и у=1-2;
М - катион щелочных или щелочноземельных металлов;
А - анион одно-, или двухосновных кислот;
2
2. Изготовление таблетки из данных солей (одной соли или смеси солей указанного состава) путем прессования под давлением не менее 50 кг/см;
3. Нанесение аликвоты анализируемого водного раствора на полученную таблетку;
4. Анализ поверхности таблетки методом спектроскопии комбинационного рассеяния света и обработка спектральных данных с помощью соответствующего программного обеспечения (например TQ Analist).
Для осуществления изобретения в качестве модельного препарата были использованы следующие препараты:
1. «Кетоджект» (организация-разработчик: ООО «АПИ-САН», г. Москва). Противовоспалительный, жаропонижающий и анальгезирующий лекарственный препарат для ветеринарного применения. В качестве действующего вещества содержит кетопрофен - 100 мг/мл и вспомогательные вещества: L-аргинин, бензиловый спирт, натрия гидроксид и воду для инъекций.
2. «Энрофлон» (организация-разработчик: группа компаний «ВИК»). Антибактериальный инъекционный препарат. Содержит в качестве действующего вещества энрофлоксацин в концентрации 10%, а также вспомогательные вещества: натрия гидроксид и воду для инъекций.
Для работы использовали ИК-Фурье спектрометр с Фурье-Раман модулем Thermo Scientific Nicolet iS50, США (далее КР-спектрометр).
Анализ препаратов методом ВЭЖХ проводили на хроматографе Agilent 1260 Infinity с DAD- детектором 1260 ТТС, Германия.
2
-1
-1
2
Для проведения анализа готовили порошки безводных солей - хлорида кальция (Honeywell, США), сульфат лития (Acros, Бельгия) и сульфата натрия (Acros, Бельгия), путем их растирания в агатовой ступке. Затем из полученных порошков изготавливали таблетки диаметром 3 мм путем прессования 20-100 мг порошка с помощью ручного пресса (IS50 RMNZ pellet sample press, Thermo Scientific, США) с усилием не менее 50 кг/см. На полученную таблетку сразу же наносили 0,5 мкл анализируемого раствора. После выдерживания в течение не менее 5 мин при комнатной температуре, для завершения процесса кристаллизации, таблетку помещали в КР-спектрометр и регистрировали спектры комбинационного рассеяния света при следующих настройках прибора: Разрешение 16 см, диапазон измерения 3500-700 см, детектор- InGaAs, светоделитель - СаF, длина волны лазера λ=1064 нм, мощность лазера 0,50 Вт, число сканирований - 100, время анализа - 2 мин.
-1
Пример №1. Для определения диапазона линейности отклика аналитического сигнала приготовили серию разведений препарата «Кетоджект» в воде до получения растворов с концентраций кетопрофена: 10, 7, 5, 3, 2, 1%. КР-спектры полученных растворов регистрировали в описанных условиях на таблетке из сульфата натрия. Для получения калибровочной кривой использовали зависимость высоты пика на частоте 1598 см (соответствует С=С валентным колебаниям ароматического цикла) от концентрации кетопрофена в растворе. Была показана линейности отклика аналитического сигнала в диапазоне концентрации кетопрофена от 1 до 10%. Коэффициент корреляции (R) в этом диапазоне составил 0,9970, что соответствует хорошему уровню аппроксимации и доказывает применимость предлагаемой методики для количественного анализа в данном диапазоне концентраций. КР-спектры полученных растворов регистрировали в описанных условиях на таблетке из сульфата натрия. Калибровочная кривая кетопрофена концентрированного на таблетке из сульфата натрия приведена на рис. 1.
Пример №2. Было проведено количественное определение энрофлоксацина в препарате «Энрофлон» с использованием предлагаемого способа. В качестве поглотителя воды использовали сульфат натрия, запрессованный в таблетку по описанной методике. Значение концентрации энрофлоксацина в препарате определенное методом ВЭЖХ (согласно ТУ BY 811000025.029-2007, извещения об изменениях №1-5) составило 106,4 мг/мл с неопределенностью 4,4 мг/мл. Эта величина была принята в качестве аттестационного значения для определения валидационных параметров предложенной методики. Для калибровки приготовили раствор энрофлоксацина (Fluka) в воде с концентрацией 101,97 мг/мл, рН довели с помощью 1М NaOH до 10,0, что аналогично кислотности среды в анализируемом препарате. Результаты измерений, полученные методом КР-спектроскопии в 1 и 2 день анализа представлены в Таблице 1. Для расчета метрологических параметров анализ проводили с варьированием фактора «время анализа и оператор». В первый день оператор №1 сделал 4 пробоподготовки по указанному способу (в качестве соли-осушителя использовался сульфат натрия) и дважды провел измерение концентрации для каждой пробоподготовки. На 2 день оператор №2 провел те же этапы пробоподготовки и анализа. Данные представлены в табл. 1.
Для оценки методики на грубые ошибки (промахи) сомнительных значений выборки из случайной величины, имеющей нормальное распределение был применен критерий Граббса. При этом расчетное значение критерия Uрасч определяли по формуле
Здесь хср - среднее значение выборки, хс - сомнительное значение (максимальное или минимальное в выборке), s - выборочное среднеквадратическое отклонение (СКО), определяемое по формуле
где xi -элементы выборки, n - объем выборки.
Поскольку Uрасч < Uтабл, полученные значения не содержат грубых ошибок и не одно из них не исключали из выборки. Расхождение между дисперсиями оценивали по критерию Кохрена. Данные представлены в таблице 2.
Стандартная неопределенность в условиях повторяемости и относительная стандартная неопределенность в условиях промежуточной прецизионности представлены в таблице 3.
Смещение представляет собой систематическую ошибку в противоположность случайной ошибке. Большее систематическое отклонение от истинного значения соответствует большему значению смещения. В таблице 4 представлены значения оцененного смещения результатов измерения концентрации по предложенной методике относительно арбитражного значения. Так значения относительной суммарной стандартной неопределенности и суммарной стандартной неопределенности находится на уровне 2,6-2,7%.
Предел повторяемости - значение, которое с доверительной вероятностью 95% не превышает абсолютной величиной разность между результатами двух измерений (или испытаний), получены в условиях повторяемости (сходимости). Прецизионностью является мера схожести независимых результатов измерений, полученных методом КР-спектроскопии. Предел промежуточной прецизионности предложенной методики менее 3%. Данные представлены в таблице 5.
Результаты представленной метрологической оценки способа определения количественного содержания кетопрофена в лекарственном препарате методом КР-спектроскопии доказывают применимость данного способа согласно нормам изложенным в ГОСТ 8.563-2009, ГОСТ Р 5725-2002.
-1
-1
3
Пример №3. Для доказательства эффективности предложенного способа для усиления сигнала по сравнению со стандартной процедурой анализа проведено измерение соотношения сигнал/шум, предела количественного определения и предела обнаружения путем проведения анализа препаратов «Энрофлон» и «Кетоджект» согласно предложенному способу с использованием сульфата натрия, сульфата лития, хлорида кальция и бромида калия. Для этого растворы препаратов наносили на таблетки из порошков данных солей и регистрировали КР-спектры в описанных условиях. В случае препарата «Кетоджект» была зарегистрированы высота пика на 1598 см (соответствует С=С валентным колебаниям ароматического цикла), для препарата Энрофлон регистрировали высоту пика на 1388 см (соответствует деформационным колебаниям СН-группы).
Для сравнения были зарегистрированы спектрограммы препаратов без нанесения на таблетки из соли - каждый препарат в количестве 500 мкл был помещен в лунку планшета и проведено измерение спектрограммы в тех же условиях, что и в случае анализа на поверхности таблетки из солей. Данные представлены в таблице 6. Спектры препаратов, нанесенных на соответствующие соли представлены на рисунках 2-8 (Кетоджект / кальция хлорид - рисунок 2, Кетоджект / натрия сульфат - рисунок 3, Энрофлон / натрия сульфат - рисунок 4, Энрофлон / кальция хлорид - рисунок 5, Энрофлон / сульфат лития - рисунок 6, Энрофлон / бромид калия - рисунок 7, Кетоджект / бромид калия- рисунок 8).
Из приведенных данных видно, при использовании предложенного способа наблюдалось увеличение соотношения сигнал/шум по сравнению со стандартной процедурой анализа. Хлорид кальция показал набольший эффект усиления сигнала (в 16,09 раз) по сравнению с сульфатами лития (в 2,35 раза) и натрия (в 1,72 раз), что имеет корреляцию с разницей в растворимости данных солей в воде (19,2 г/100 мл - сульфат натрия, 34,3 г/100 мл -сульфат лития и 74,5 г/100 мл - хлорид кальция) и как следствие в способности поглощать воду с образованием кристаллогидратов. Максимальное усиление соотношения сигнал/шум (в 16,09 раз) наблюдалось в случае анализа препарата «Энрофлон» на таблетке из хлорида кальция. При этом для препарата «Кетоджект» анализ в этих же условиях показал увеличение сигнала только в 3,13 раза. В качестве возможной причины этого экспериментального факта может быть присутствие в данном препарате бензилового спирта, который может препятствовать полному поглощению воды за счет образования гидрофобного слоя на поверхности хлорида кальция.
Расчеты показывают, что повышение соотношения сигнал/шум в 16 раз эквивалентно увеличению числа сканирований и времени на проведение анализа в 256 раз, что в указанных условиях соответствует регистрации около 25600 спектров (примерно 8.5 часов непрерывной работы КР-спектрометра) по стандартной методике, в то время как при использовании предложенного способа требуется регистрация только 100 спектров и при этом весь анализ занимает 2 минуты. Кроме этого, при длительном времени анализа образец неминуемо будет претерпевать физико-химические и химические изменения, вследствие разогрева под действием лазерного излучения, что приведет к получению некорректных результатов. Таким образом предложенный способ позволяет исследовать водные растворы веществ методом КР-спектроскопии в области низких концентраций которые недоступны для стандартной процедуры анализа.
Было показано, что только соли способные к образованию кристаллических кристаллогидратов (например, хлорид кальция, сульфаты лития и натрия) приводят к усилению сигнала комбинационного рассеяния света в описанных условиях анализа. Так, например, при изготовлении спрессованной таблетки из бромида калия и нанесении на нее препаратов «Энрофлон» и «Кетоджект» не наблюдалось усиления сигнала, более того было зарегистрировано снижение интенсивности характеристических линий в 7 и 6 раз соответственно по сравнению анализом растворов этих препаратов (см. табл. 6). Поскольку известно, что бромид калия не образует кристаллогидратов, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что для усиления сигнала решающее значение имеет не степень растворимости солей в воде, а способность к образованию кристаллогидратов, при этом использование солей не имеющих данного свойства приводит к уменьшению локальной концентрации растворенного вещества на поверхности таблетки и как следствие снижение интенсивности сигнала.
Заявленный способ позволяет повысить чувствительность качественного анализа, а также предела количественного определения и предела обнаружения веществ, находящихся в водном растворе с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния света. Использование заявленного способа позволяет сократить время анализа, а также предоставляет возможность исследовать растворы веществ нестабильных в условиях длительного воздействия лазерного излучения.