СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ И ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF GROWING THE PLANTS WITH USING METAL NANOPARTICLES AND SUBSTRATUM FOR ITS IMPLEMENTATION

Предлагаемая группа изобретений относится к области био- и нанотехнологий в растениеводстве и может быть использована для получения высококачественного посадочного материала сельскохозяйственных растений, для проведения биотехнологических исследований, для повышения качества продукции, для использования в аэропонных и гидропонных технологиях, а также для создания систем жизнеобеспечения космонавтов в условиях длительных космических полетов.
Применение наноматериалов в качестве средств защиты растений и микроудобрений способствует повышению устойчивости растений к неблагоприятным погодным условиям, снижению заболеваемости, повышению урожайности и качества сельскохозяйственной продукции. Известны такие нанотехнологические препараты, как NanoGro, GreenLift, AgБион и др., однако, продолжаются исследования в области разработки новых препаратов и способов использования нанотехнологий для повышения эффективности сельскохозяйственного производства. Последние достижения в этой области обобщены в, частности, в обзорах [Azamal, Husen Khwaja Salahuddin Siddiqi. "Phytosynthesis of nanoparticles: concept, controversy and application" // Nanoscale Res. Lett., 2014, V. 9, №1, p. 229; L.R. Khot et al. "Applications of nanomaterials in agricultural production and crop protection: A review" // Crop Protection, V. 35, May 2012, p. 64].
В заявке [WO 2013121244 A1, опубл. 22.08.2013] описаны наноудобрения в форме наночастиц (НЧ) металлов, покрытых веществами, представляющими собой питательные микродобавки или их предшественники. Согласно изобретению, в качестве питательной микродобавки, служащей покрытием для наночастиц, может быть использован, по крайней мере, один компонент из широкого круга веществ, включающего соединения углерода, фосфора, азота, бора и других элементов, необходимых для питания и развития растений, а также соли, хелаты и оксиды металлов, и другие соединения. В данном техническом решении наночастицы металлов, таких, как благородные металлы, железо, медь и др., использованы в качестве «средства доставки» микроудобрения в ткани и клетки растений, их самостоятельную роль в качестве питательного компонента оценить невозможно.
Описан способ предпосевной обработки семян [UA 33863, опубл. 10.07.2008] и способы выращивания зерновых и овощных культур [UA 92875, опубл. 10.12.2010 и UA 92876, опубл. 10.12.2010], включающие использование коллоидных растворов смесей наночастиц биогенных микроэлементов - цинка, марганца, железа, меди, молибдена, кобальта, в комбинации с химическими препаратами, известными своей биологической активностью. Так же, как и в предыдущем аналоге, в данных технических решениях самостоятельную роль наночастиц в качестве питательных компонентов оценить невозможно, а введение в состав композиций органических препаратов создает дополнительную экологическую нагрузку и может отрицательно влиять на качество продукции.
Известные нанопрепараты, как правило, предназначены для стимулирования роста растений при выращивании в условиях открытого или защищенного грунта. В то же время современное развитие биотехнологий неразрывно связано с выращиванием растений и культур тканей на искусственных питательных средах, имеющих сбалансированный состав питательных компонентов, необходимых для полноценного роста и развития растений. Широкое использование биотехнологий связано с созданием и поддержанием коллекций ценных форм, с необходимостью быстрого размножения клона растения и получения в большом количестве вегетативного потомства трудно размножаемых в обычных условиях форм растений, а также с современными требованиями к качеству посадочного материала, с необходимостью его оздоровления и тестирования. Большое значение имеет применение искусственных питательных сред при разработке автономных систем жизнеобеспечения, например, в условиях длительных космических полетов. Все это предполагает использование высокотехнологичных приемов, совершенствование техники культивирования растений с целью получения посадочного материала, свободного от вирусных, грибковых и бактериальных болезней, клещей и нематод. В этом отношении использование наноструктур в различных приемах оздоровления и культивирования посадочного материала, а возможно, и клонального размножения растений, является перспективным направлением. Это тем более существенно, что одним из факторов культивирования растений являются условия их выращивания. Помимо температуры и освещенности, большое значение имеет состав питательных сред, изменение которых за счет введения наноструктурных форм должно отразиться на показателях качества растений.
2
Известно применение наночастиц диоксида титана для повышения всхожести семян и улучшения качества всходов петрушки на искусственной питательной среде [Dehkourdi Е Н. Mosavi М. Biol Trace Elem Res. 2013, Nov., 155(2), p. 283]. Наночастицы диоксида титана (наноанатаза) добавляют в среду Мурасиге-Скуга (далее по тексту «среда МС») в концентрациях 10-40 мг/л, при этом наибольший эффект - увеличение процента всхожести и индекса прорастания семян, увеличение длины корня и ростка, прирост количества зеленой массы и других показателей, получен при использовании концентрации 30 мг/мл наночастиц TiO. Однако рассматривать наночастицы диоксида титана в качестве стимулятора роста растений в растениеводстве пока не представляется возможным, поскольку до сих пор имеются сомнения в их безопасности для живых организмов. Так, например, исследования на крысах показали, что вдыхание порошка диоксида титана повышает вероятность возникновения раковых заболеваний, являясь канцерогенным фактором и для человека [http://www.neboleem.net/dioksid-titana.php].
По совокупности признаков в качестве прототипа заявляемого способа выращивания растений с использованием наночастиц принято изобретение, описанное в [ЕР 2499107 А1, опубл. 19.09.2012], сущность которого состоит в применении мультислойных углеродных нанотрубок в эффективной концентрации 10-200 пг/мл для увеличения всхожести семян томата и увеличения зеленой массы растений. Показано, что введение углеродных нанотрубок в заявленном интервале концентраций в среду МС ускоряет прорастание семян томата и увеличивает процент всхожести. Растения томата, выращенные на питательной среде в присутствии углеродных нанотрубок, имеют больший объем биомассы, чем в контроле, при этом не отличаются от контроля по длине корня. Улучшение показателей авторы связывают с увеличением интенсивности процессов водопоглощения семян в присутствии углеродных нанотрубок. Однако известно, что углеродные нанотрубки, проникая в организм человека через кожу, нос и рот, могут разрушать клетки так же, как это делает асбест. Причем способность нанотрубок глубоко проникать в ткани, не давая возможности иммунной системе уничтожить их, оказывает канцерогенное действие [A.A. Shvedova, E.R Kisin, N. Yanamala, А.V. Tkach et all. "MDSC and TGFβ are required for facilitation of tumor growth in the lungs of mice exposed to carbon nanotubes" // Cancer Research, 2015, V. 75 (8), pp. 1-9]. Поэтому для внедрения углеродных трубок в практику растениеводства нужны специальные исследования по их распределению, накоплению, выведению из растений, что делает маловероятным их применение в сельском хозяйстве в ближайшем будущем.
Известно несколько питательных сред, таких, как среды Мурасиге-Скуга, Гамборга, Хеллера и др., которые содержат сбалансированный комплекс необходимых для развития растений обязательных компонентов, включающий органические вещества - витамины, углеводы, аминокислоты и/или белковые гидролизаты, хелатирующие агенты, а также неорганические соли, содержащие макроэлементы - азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо, и микроэлементы, такие, как бор, марганец, цинк, медь, молибден и др. В качестве прототипа питательной среды для осуществления заявляемого способа взята широко применяемая питательная среда Мурасиге-Скуга [Murashing Т., Skoog F. "А received medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture". Physiol. Plant. 1962. V. 15, pp. 473-497]. В Таблице 1 показан состав агаризованной питательной среды по прототипу.
Такие металлы, как железо, медь и цинк относятся к жизненно-необходимым (эссенциальным) элементам, т.к. они участвуют в регуляторных и окислительно-восстановительных процессах в растениях, входят в состав коферментов. В составе питательной среды МС они присутствуют в ионной форме в виде растворов солей.
Задачей изобретения является разработка способа выращивания растений на питательной среде, включающей наночастицы жизненно необходимых элементов, и обеспечивающего улучшение прорастания семян, а также улучшение морфометрических и/или физиологических показателей растений с целью получения оздоровленного высококачественного посадочного материала.
Поставленная задача решается предлагаемым способом выращивания растений с использованием наночастиц, включающим проращивание семян и последующее выращивание растений в асептических условиях на агаризованной питательной среде, содержащей наночастицы, отличающимся тем, что используют агаризованную питательную среду, которая в качестве наночастиц содержит наночастицы железа, или наночастицы цинка, или наночастицы меди, или комбинацию наночастиц железа, цинка и меди.
Также задачей изобретения является разработка питательной среды для осуществления предлагаемого способа.
Поставленная задача решается предлагаемой агаризованной питательной средой для осуществления заявляемого способа, которая содержит необходимые для развития растений компоненты, входящие, в частности, в состав питательной среды Мурасиге-Скуга, а именно: органические вещества, включая витамины, углеводы и аминокислоты и/или белковые гидролизаты, хелатирующий агент - этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее натриевую соль, неорганические соли, содержащие азот, фосфор, натрий, калий, кальций, магний, серу, хлор, йод, бор, марганец, молибден и кобальт, а также железо, цинк и медь, и отличается тем, что железо или цинк, или медь, или железо, цинк и медь в комбинации входят в состав питательной среды в форме наночастиц этих металлов.
При этом питательная среда может дополнительно содержать хитозан.
Технический результат заявляемой группы изобретений состоит в улучшении прорастания семян, а также в улучшении морфометрических и/или физиологических показателей выращенных из них растений.
Сущность изобретения состоит в том, что выращивание растений на известных питательных средах, модифицированных таким образом, что соли жизненно-необходимых металлов, в частности, железа сульфат, или цинка сульфат, или меди сульфат, или одновременно соли железа, цинка, меди заменены на наночастицы этих металлов в электронейтральном состоянии с сохранением всех остальных компонентов питательной среды, приводит к улучшению прорастания семян и к улучшению морфометрических и/или физиологических показателей выращенных из них растений по сравнению с растениями, выращенными на питательных средах, не содержащих наночастиц указанных металлов.
Изобретение основано на результатах проведенных авторами исследований по влиянию наночастиц металлов на структурно-функциональное состояние различных биосистем. [Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. «Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов» // Химическая физика. 2002, Т. 21, №4, С. 79-85; Публикации на интернет-сайте: http://nanobiology.narod.ru]. Было показано, что наночастицы металлов в электронейтральном состоянии характеризуются пролонгированным и полифункциональным действием, низкой токсичностью, которая в 7-50 раз ниже токсичности соответствующих металлов в ионной форме, способностью в биотических дозах, т.е. в дозах в 10-50 раз меньших максимально переносимых доз, активно распределяться по органам и тканям растений и стимулировать протекание жизненно важных процессов.
В качестве абсорбента продуктов жизнедеятельности растущих растений и микрофлоры, а также в качестве стимулирующего фактора роста растений в заявляемую питательную среду дополнительно может быть введен хитозан. Известно, что хитозан обладает высокой сорбционной активностью по отношению к микробным клеткам, проявляет ростостимулирующее действие, повышает адаптативные свойства растений, защищает растения от развития болезней, способствует повышению урожайности [Няникова Г.Г., Маметнабиев Т.Э., Калинкин И.П., Гепецкая М.В., Комиссарчик С.М., Елдинова Е.Ю. «Области применения хитозана» http://science.spb.ru/]. Нами использован хитозан марки «Тяньши» (Китай), широко применяемый в китайской медицине в качестве детоксикатора. При введении хитозана не наблюдается контаминации среды бактериальной флорой, плесенью или грибками. В отдельных случаях, как будет показано ниже, имеет место синергизм сочетанного действия хитозана и наночастиц металлов в составе питательной среды, приводящий к дополнительному улучшению прорастания семян и улучшению морфометрических и физиологических показателей культивированных в этих условиях растений.
Ниже приведен перечень фигур чертежей, поясняющих сущность изобретения, и их краткое описание.
На Фиг. 1А - 1В показаны изображения наночастиц железа, цинка и меди, полученные методами электронной микроскопии, и гистограммы распределения частиц металлов по размеру: 1А - наночастицы железа; 1Б - наночастицы меди; 1В - наночастицы цинка.
На Фиг. 2А - 2Г показано влияние наночастиц металлов и хитозана в составе питательной среды на прорастание семян томата Venice. 2А - в среде присутствуют наночастицы железа; 2Б - в среде присутствуют наночастицы цинка, 2В - в среде присутствуют наночастицы меди; 2Г - в среде присутствуют наночастицы железа, цинка и меди.
На Фиг. 3А - 3Г показано влияние наночастиц металлов и хитозана в составе питательной среды на длину корня растений перца LJ-king. 3А - в среде присутствуют наночастицы железа; 3Б - в среде присутствуют наночастицы цинка, 3В - в среде присутствуют наночастицы меди; 3Г - в среде присутствуют наночастицы железа, цинка и меди.
0
3
2
4
На Фиг. 4 показана фотография растений перца LJ-king, выращенных на питательных средах, содержащих наночастицы цинка и хитозан. Zn-b - контроль, Zn-b - концентрация НЧ цинка в среде 0,016 мг/л, Zn-b - концентрация наночастиц цинка в среде 0,08 мг/л, Zn-b - концентрация наночастиц цинка в среде 0,4 мг/л.
На Фиг. 5А - 5Г показано влияние наночастиц металлов и хитозана в составе питательной среды на длину корня растений томата HY-2. 5А - в среде присутствуют наночастицы железа; 5Б - в среде присутствуют наночастицы цинка, 5В - в среде присутствуют наночастицы меди; 5Г - в среде присутствуют наночастицы железа, цинка и меди.
На Фиг. 6А - 6Г показано виляние наночастиц металлов и хитозана в составе питательной среды на активность корня растений перца LJ-king, томата HY-2 и томата Venice. 6А - в среде присутствуют наночастицы железа; 6Б - в среде присутствуют наночастицы цинка, 6В - в среде присутствуют наночастицы меди; 6Г - в среде присутствуют наночастицы железа, цинка и меди.
На Фиг. 7А показано виляние наночастиц железа и хитозана в составе питательной среды на содержание хлорофилла в листьях растений перца LJ-king.
На Фиг. 7Б показано виляние наночастиц цинка и хитозана в составе питательной среды на содержание хлорофилла в листьях растений томата HY-2.
На Фиг. 7В показано виляние наночастиц меди и хитозана в составе питательной среды на содержание хлорофилла в листьях растений перца LJ-king.
Наночастицы железа, цинка и меди в электронейтральном состоянии получают конденсационным левитационно-струйным методом [Авт.св. СССР №814432 // Бюлл. изобретений, 1981, №11, С. 25.] на установке Миген-3 [Жигач А.Н. и др. «Установка для получения и исследования физико-химических свойств наночастиц металлов» // Приборы и техника эксперимента. 2000. №6. С. 122-129].
Определение формы и размеров наночастиц железа, цинка, меди проводят методом просвечивающей электронной микроскопии на приборе LEO 912 АВ OMEGA. Определение фазового состава наночастиц проводят рентгенофазовым анализом на рентгеновском дифрактометре АДП-1 (Россия). Для определения среднего диаметра наночастиц микрофотографии, полученные на электронном микроскопе, обрабатывают с помощью компьютерной программы Micran 25 путем измерения поперечника, как минимум, тысячи частиц. На основании полученных данных строят кривую распределения наночастиц металлов по размеру и рассчитывают средний диаметр частиц. Электронные микрофотографии и кривые распределения наночастиц металлов по размеру приведены на Фиг. 1А - 1В. Кривая распределения наночастиц железа по размеру лежит в области 5-80 нм. Средний диаметр частиц железа составляет 27,0±0,51 нм. Кривая распределения наночастиц цинка по размеру лежит в области 10-200 нм. Средний диаметр полученных частиц цинка составляет 54,0±2,8 нм. Кривая распределения наночастиц меди по размеру лежит в области 5-225 нм. Средний диаметр частиц меди составляет 79,0±1,24 нм.
3
4
Как видно из Фиг. 1А - 1В, наночастицы железа, цинка и меди представляют собой монокристаллические структуры круглой правильной формы, покрытые полупрозрачной оксидной пленкой. Результаты рентгенофазового анализа свидетельствуют, что в наночастицах железа кристаллическая металлическая фаза составляет 53,6%, фаза железа оксида FeO - 46,4%, толщина оксидной пленки 3,5 нм. Наночастицы меди и цинка состоят из кристаллической металлической фазы с толщиной оксидной пленки 1,0-0,5 нм.
В качестве основы для приготовления питательной среды по изобретению может быть использована пропись любой из известных питательных сред, содержащих сбалансированный состав всех жизненно важных для растений органических и неорганических макро- и микрокомпонентов. При этом, согласно изобретению, вместо солей железа или цинка, или меди, или комбинации этих солей, обычно входящих в состав питательных сред, в среду включают наночастицы железа, или цинка, или меди в электронейтральном состоянии, или комбинации наночастиц железа, цинка и меди, оставляя остальные компоненты, входящие в состав питательной среды, взятой за основу, без изменения.
Для демонстрации возможности осуществления изобретения с получением заявленного технического результата в качестве основы для приготовления вариантов среды по изобретению, нами использована пропись агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга (см. Табл. 1).
Диапазоны концентраций наночастиц железа, цинка и меди в примерах осуществления изобретения выбраны с учетом содержания металлов в ионной форме в питательной среде, взятой за основу. Так, в пересчете на металл, концентрация железа в среде МС составляет 5,6 мг/л, а в примерах питательные среды содержат наночастицы железа в концентрациях 10,0-0,06 мг/л; концентрация цинка в пересчете на металл в среде МС составляет 1,96 мг/л, а в примерах питательные среды содержат наночастицы цинка в концентрациях 3,0-0,016 мг/л; концентрация меди в пересчете на металл в среде МС составляет 0,0064 мг/л, а в примерах питательные среды содержат наночастицы меди в концентрациях 0,04-0,00016 мг/л.
Ниже описано приготовление питательной среды МС (контроль) и вариантов питательных сред в соответствии с изобретением.
1. Приготовление питательной среды Мурасиге-Скуга.
Питательную среду МС готовят в соответствии с прописью, приведенной в Табл. 1.
1.1. Приготовление маточного раствора макроэлементов.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
Готовят навески (мг): NHNO - 33000, KNO - 38000, CaCl×2HO - 8800, MgSO×7HO - 7400, KHPO - 3400. Приготовленные навески растворяют в 1 литре воды при перемешивании на магнитной мешалке «IKA RH basic 2» (Германия) в течение 5 минут.
1.2. Приготовление маточного раствора микроэлементов.
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
Готовят навески (мг): KJ - 166, HBO - 1240, MnSO×4HO - 4460, ZnSO×7HO - 1720, NaMoO×2HO - 50, CuSO×5HO - 5, CoCl×6HO - 5. Приготовленные навески растворяют в 1 литре воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 минут.
1.3. Приготовление маточного раствора хелатного железа
2
2
4
2
Готовят навески (мг): NаЭДТА×2HO - 37,3, FeSO×7HO - 27,8. Приготовленные навески растворяют в 1 литре воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 минут.
1.4. Приготовление маточного раствора витаминов и органических веществ.
6
1
Готовят навески (мг): Мезоинозит - 100000, Никотиновая кислота (РР) - 500, Пиридоксин-HCl (В) - 500, Тиамин-HCl (В) - 500, Глицин - 2000. Приготовленные навески растворяют в 1 литре воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 минут.
Готовят навески (мг): сахароза в виде порошка - 30000, агар-агар - 7000.
1.5. Приготовление среды МС.
Для приготовления 1 л среды в колбу объемом 1,5 л вносят 50 мл маточного раствора макроэлементов, 5 мл маточного раствора микроэлементов, 5 мл маточного раствора хелатного железа и 1 мл маточного раствора витаминов и органических веществ. Доводят объем водой до 800 мл, добавляют навеску сахарозы и навеску агара при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 минут, доводят объем до 1000 мл.
Приготовленную питательную среду стерилизуют при температуре 120°С, давлении 0,1 МРа в течение 20 мин в автоклаве «Hirayama, HVE-50» (Япония).
Приготовленную, как описано выше, стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга используют в качестве контроля.
2. Приготовление питательной среды с добавкой хитозана
Для приготовления питательной среды с добавкой хитозана в 1 л стерильной, охлажденной до 45°С питательной среды Мурасиге-Скуга, приготовленной, как описано выше, вносят 100 мг хитозана «Тяньши» при перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 минут.
3. Приготовление питательных сред с добавками наночастиц металлов
3.1. Приготовление раствора хелатирующего агента.
2
2
Готовят навески (мг): NаЭДТА×2НО - 37,3. Приготовленную навеску растворяют в 1 литре воды при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 минут.
3.2. Приготовление водной суспензии наночастиц железа.
Для приготовления водной суспензии наночастиц железа навеску 2000 мг порошка наночастиц железа вносят в 200 мл дистиллированной стерильной воды и проводят диспергирование порошка наночастиц железа в воде на диспергаторе «Scientz JY 92-IIN» (Китай) в течение 30 сек. при мощности 99% при охлаждении. Процесс диспергирования повторяют трижды. К 1,0 мл приготовленной суспензии добавляют 9,0 мл дистиллированной стерильной воды и проводят диспергирование аналогично тому, как описано выше. Для получения суспензий с меньшими концентрациями наночастиц железа готовят серию соответствующих разведений стерильной дистиллированной водой с последующим диспергированием.
3.3. Приготовление питательной среды, содержащей наночастицы железа.
10 мл суспензии НЧ железа или ее соответствующих разведений (см. п. 3.2) вносят в 1 л стерильной, охлажденной до 45°С питательной среды, приготовленной, как описано в п. 1, но вместо маточного раствора хелатного железа в среду вводят 5 мл раствора хелатирующего агента, приготовленного, как описано в п. 3.1. Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 минут.
3.4. Приготовление водной суспензии наночастиц цинка
Для приготовления водной суспензии наночастиц цинка навеску 600 мг порошка наночастиц цинка вносят в 200 мл дистиллированной стерильной воды и проводят диспергирование порошка наночастиц цинка в воде аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.). К 1,0 мл приготовленной суспензии добавляют 9,0 мл стерильной дистиллированной воды и проводят диспергирование при охлаждении аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.). Для получения суспензий с меньшими концентрациями наночастиц цинка готовят серию соответствующих разведений стерильной дистиллированной водой с последующим диспергированием, аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.).
3.5. Приготовление питательной среды, содержащей наночастицы цинка.
4
2
10 мл суспензии НЧ цинка вносят в 1 л стерильной, охлажденной до 45°С питательной среды, приготовленной, как описано в п. 1, но не содержащей цинка сульфата (ZnSO×7HO). Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 минут.
3.6. Приготовление водной суспензии наночастиц меди
Для приготовления водной суспензии наночастиц меди навеску 8 мг порошка наночастиц меди вносят в 200 мл дистиллированной стерильной воды и проводят диспергирование порошка наночастиц меди в воде аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.). К 1,0 мл приготовленной суспензии добавляют 9,0 мл стерильной дистиллированной воды и проводят диспергирование аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.). Для получения суспензий с меньшими концентрациями наночастиц меди готовят серию соответствующих разведений стерильной дистиллированной водой с последующим диспергированием, аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.).
3.7. Приготовление питательной среды, содержащей наночастицы меди.
4
2
Полученную суспензию НЧ меди вносят в 1 л стерильной, охлажденной до 45°С питательной среды, приготовленной, как описано в п. 1, но не содержащей меди сульфата (CuSO×5HO). Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 минут.
3.8. Приготовление водной суспензии комбинации наночастиц железа, цинка и меди
Для приготовления водной суспензий комбинации наночастиц металлов в разных соотношениях смешивают по 2 мл суспензий наночастиц каждого из металлов, полученных, как описано выше (см. п.п. 3.2, 3.4 и 3.6.), и содержащих наночастицы в требуемой концентрации, доводят объем стерильной дистиллированной водой до 10 мл и проводят диспергирование, аналогично тому, как описано для порошка наночастиц железа (см. 3.2.).
3.9. Приготовление питательной среды, содержащей комбинацию наночастиц железа, цинка и меди.
4
2
4
2
4
2
10 мл суспензии, содержащей НЧ металлов в требуемом соотношении, вносят в 1 л стерильной, охлажденной до 45°С питательной среды, приготовленной, как описано в п. 1, но не содержащей железа сульфата (FeSO×7HO), цинка сульфата (ZnSO×7HO) и меди сульфата (CuSO×5HO). В среду вводят 5 мл раствора хелатирующего агента, приготовленного, как описано в п. 3.1. и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 минут.
Полученные, как описано выше, питательные среды немедленно разливают по 50 мл в стерильные сосуды объемом 200 мл, закрывают полиэтиленовой пленкой или полиэтиленовыми крышками и оставляют в стерильном боксе до полного охлаждения. Приготовленные таким образом, сосуды с питательной средой используют для проращивания семян и выращивания растений.
Аналогично готовят образцы питательных сред, содержащих наночастицы металлов с добавкой хитозана "Тяньши", используя в качестве основы соответствующий аналог среды МС, приготовленный с добавкой хитозана, как описано в п. 2.
Изобретение осуществляют следующим образом:
Для культивирования растений в стерильные сосуды на поверхность агаризованной питательной среды, содержащей, в соответствии с изобретением, наночастицы железа или цинка или меди, или комбинации этих наночастиц в различных количественных соотношениях, помещают семена растений по 3 шт. в каждый сосуд. Сосуды с семенами устанавливают на стеллажах в климатической комнате при температуре 22-25°С, влажности 36% и освещенности 3500-3000 Lux 12/12 час в сутки. Отдельные серии экспериментов проводят на стандартной среде МС (контроль) и на средах, содержащих, кроме наночастиц металлов, дополнительно хитозан "Тяньши" в концентрации 100 мг/л.
Способность семян к прорастанию оценивают на 15-е сутки, а морфометрические и физиологические показатели полученных растений - на 40-е сутки после начала культивирования растений.
Результаты экспериментов, полученные из 7-10 повторностей, обрабатывают статистически с помощью компьютерных программ Microsoft Excel, Statistica 6.0. Достоверность (р) полученных результатов оценивают по U-критерию по Манну-Уитни [Mann Н.B., Whitney D.R. Ann. Math. Statist. 1947, V. 18, №1, pp. 50-60]. Различия между двумя выборками считают статистически значимыми при 0,001≤р≤0,1.
Ниже приведены примеры выращивания растений перца и томатов, на питательных средах, содержащих различные концентрации наночастиц железа, или цинка, или меди, или комбинации наночастиц этих металлов. Приведенные примеры лишь иллюстрируют возможность осуществления изобретения с получением заявленного технического результата, однако, не исчерпывают всех возможных вариантов его практической реализации.
Пример 1. Влияние наночастиц металлов и хитозана в составе питательной среды на прорастание семян томата
Прорастание семян характеризуют величиной показателя прорастания семян, определяемого как процентное соотношение количества проросших семян по отношению к общему количеству семян, взятых для проращивания. Величину показателя прорастания семян определяют на 15-е сутки после начала культивирования растений.
Полученные результаты представлены на Фиг. 2А - 2Г, где показано влияние на прорастание семян томата Venice замены солей металлов в составе питательной среды на наночастицы металлов, а также влияние на прорастание семян добавки хитозана. Как видно из диаграммы, представленной на Фиг. 2А, введение в питательную среду наночастиц железа в концентрациях 0,6-10,0 мг/л повышает показатель прорастания семян томата на 13% - 27% по сравнению с контролем (прорастание семян на среде МС). Добавление в питательную среду, содержащую наночастицы железа в концентрации 0,6 или 10 мг/л, хитозана (100 мг/л) дает дополнительный прирост показателя прорастания семян на 23% и 33% соответственно.
Как видно из диаграммы, представленной на Фиг. 2Б, введение в питательную среду наночастиц цинка в концентрациях 0,2-3,0 мг/л повышает показатель прорастания семян томата в 2,0-2,3 раза по сравнению с контролем. Добавление хитозана в питательную среду, содержащую 1,0 мг/л наночастиц цинка, увеличивает показатель прорастания семян дополнительно на 13%.
Как видно из диаграммы, представленной на Фиг. 2В, введение в питательную среду наночастиц меди в концентрациях 0,0008-0,04 мг/л улучшает показатель прорастания семян томата в 2,0-2,8 раза по сравнению с контролем. При добавлении хитозана в питательную среду, содержащую наночастицы меди в концентрациях 0,0008 и 0,04 мг/л., наблюдается дополнительный прирост показателя прорастания семян до 20%.
Как видно из диаграммы, представленной на Фиг. 2Г, введение в питательную среду комбинации наночастиц железа, цинка и меди вместо солей этих металлов, также дает улучшение прорастания семян томата, причем прирост этого показателя тем выше, чем выше концентрация наночастиц в питательной среде. Так, например, комбинация (10,0 мг/л наночастиц железа + 3,0 мг/л наночастиц цинка + 0,04 мг/л наночастиц меди) обеспечивает повышение показателя прорастания семян томата в 2,7 раза по сравнению с контролем. Введение хитозана в питательную среду, содержащую наночастицы в комбинации (3,0 мг/л наночастиц железа + 1,0 мг/л наночастиц цинка + 0,004 мг/л наночастиц меди) приводит к дополнительному приросту показателя прорастания на 13%.
Пример 2. Влияние наночастиц металлов в составе питательной среды на морфометрические показатели растений перца и томата.
На 40-е сутки с начала культивирования растений в описанных выше условиях на питательных средах, содержащих наночастицы металлов, определяют морфометрические показатели полученных растений - длину ростка, длину корня, количество зеленой массы растений. Результаты представляют в виде отношения величины показателя, полученного при выращивании растений на питательной среде, содержащей наночастицы металлов (опыт), к величине показателя, полученного при выращивании растений на питательной среде МС (контроль), в процентах.
На Фиг. 3А - 3Г показано влияние наночастиц металлов в составе питательной среды на длину корня перца LJ-king.
Как видно из диаграммы, приведенной на Фиг. 3А, при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо железа в ионной форме (концентрация 5,6 г/мл в пересчете на металл) наночастицы железа в концентрации 0,06, 0,3 и 3,0 мг/л, длина корня увеличивается на 54%, 118% и 102% соответственно по сравнению с контролем. При этом, положительный эффект наблюдается при концентрации наночастиц железа почти на два порядка более низких, чем концентрация ионов железа в составе питательной среды МС.
Как видно из диаграммы, приведенной на Фиг. 3Б, при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо ионов цинка (концентрация 1,96 г/мл в пересчете на металл) наночастицы цинка в концентрации 0,4, 0,008 и 0,0016 мг/л, длина корня увеличивается на 71%, 80% и 62% соответственно по сравнению с контролем. При этом, концентрации наночастиц цинка в 5-122 раз меньше, чем концентрация цинка в ионной форме в составе питательной среды МС.
Введение хитозана в питательную среду, содержащую наночастицы цинка в концентрации 0,4 мг/л, дает дополнительный прирост длины корня на 30%.
Как видно из диаграммы, приведенной на Фиг. 3В, при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо ионов меди (концентрация 0,0064 г/мл в пересчете на металл) наночастицы меди в концентрации 0,00016, 0,0008 и 0,004 мг/л, длина корня увеличивается на 34%, 57% и 54% соответственно по сравнению с контролем. При этом, положительный эффект наблюдается при концентрации наночастиц меди в 1,6 - в 40 раз более низких, чем концентрация ионов меди в составе питательной среды МС.
Как видно из диаграммы, приведенной на Фиг. 3Г, при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо ионов железа, цинка и меди комбинации наночастиц этих металлов в различных соотношениях, длина корня увеличивается на 7-58% по сравнению с контролем. Исключение составляет опыт, в котором использована комбинация наночастиц, содержащая минимальные из испытанных концентрации наночастиц железа (0,06 мг/л), цинка (0,016 мг/л) и меди (0,00016 мг/л). Однако, результаты, приведенные на Фиг. 3Г, показывают значительный синергетический эффект сочетанного действия малых концентраций наночастиц металлов и хитозана, приводящий к увеличению длины корня растений перца на 40% по сравнению с контролем. Аналогичный синергетический эффект получен и для варианта питательной среды, содержащей хитозан и комбинацию наночастиц: железо (0,3 мг/л) + цинк (0,08 мг/л) + медь (0,0008 мг/л).
В качестве иллюстрации на Фиг. 4 представлена фотография растений перца LJ-king, выращенных на средах, в которых соль цинка заменена на наночастицы цинка и дополнительно добавлен хитозан. Видно, что присутствие в среде наночастиц цинка в концентрациях 0,0016 мг/л - 0,4 мг/л и хитозана способствует более активному по сравнению с контролем развитию корневой системы перца: длина корня увеличивается в 1,6-1,8 раза, причем, введение хитозана в питательную среду, содержащую наночастицы цинка в концентрации 0,4 мг/л, дает дополнительный прирост длины корня на 30%.
На Фиг. 5А - 5Г показано влияние наночастиц металлов в составе питательной среды на длину корня томата HY-2. При выращивании томата на питательной среде, содержащей вместо железа в ионной форме наночастицы железа в концентрации 0,06, 0,3 и 3,0 мг/л, длина корня увеличивается, соответственно, на 58%, 31% и 3% (см. Фиг. 5А). При выращивании томата на питательной среде, содержащей вместо цинка в ионной форме наночастицы цинка в концентрации 0,016, 0,08 и 0,4 мг/л, длина корня увеличивается на 1%, 17% и 38%, соответственно. В присутствии хитозана этот показатель дополнительно увеличивается на 17%, 2% и 15% соответственно (см. Фиг. 5Б). Замена ионов меди в концентрации 0,0064 г/мл на наночастицы меди в концентрации 0,0008 мг/л приводит к увеличению длины корня томата почти на 24%. (см. Фиг. 5В). При выращивании томата на питательной среде, содержащей вместо металлов в ионной форме комбинации наночастиц металлов, (0,3 мг/л железа + 0,008 мг/л цинка + 0,0008 мг/л меди) и (3,0 мг/л железа + 0,4 мг/л цинка + 0,004 мг/л меди), длина корня томата увеличивается на 7% и 12% соответственно, по сравнению с контролем.
В отдельных опытах добавка хитозана способствовала дополнительному увеличению длины корня растений томата. Так, например, одновременное присутствие в питательной среде наночастиц железа (3,0 мг/л), наночастиц цинка (0,4 мг/л), наночастиц меди (0,004 мг/л) и хитозана (100 мг/л) дает прирост длины корня томата почти на 70% по сравнению с контролем.
Введение наночастиц металлов в состав питательной среды слабо отражается на длине ростка и зеленой массе перца и томата. Исключение составляют наночастицы цинка, введение которых в среду, например, в концентрации 0,08 мг/л, способствует увеличению длины ростка томата HY-2 в 1,2 раза, а добавка в среду хитозана приводит к дополнительному росту этого показателя на 17%. На среде, содержащей наночастицы цинка в концентрации 0,4 мг/л, в присутствии хитозана прирост зеленой массы растений перца LJ-king по сравнению с контролем составляет 42%, а на среде, содержащей наночастицы цинка в концентрации 0,08 мг/л, прирост зеленой массы растений томата Venice по сравнению с контролем составляет 80%. На среде, содержащей комбинацию наночастиц (3,0 мг/л железа + 0,4 мг/л цинка + 0,004 мг/л меди), также получен прирост зеленой массы растений томата Venice в 1,3 раза по сравнению с контролем.
Пример 3. Влияние наночастиц металлов в составе питательной среды на физиологические показатели растений перца и томата
На 40-е сутки с начала культивирования растений в описанных выше условиях на питательных средах, содержащих наночастицы металлов, определяют физиологические показатели полученных растений - активность корня и содержание хлорофилла в листьях. Результаты представлены в виде отношения величины показателя, полученного при выращивании растений на питательной среде, содержащей наночастицы металлов (опыт), к величине показателя, полученного при выращивании растений на питательной среде МС (контроль).
Активность корня определяют по восстановлению трифенилтетразолия хлорида как описано в [Adebusoye О. Onanuga, Ping'an Jiang, Sina Adl. "Effect of phytohormones, phosphorus and potassium on cotton varieties (Gossypium hirsutum) root growth and root activity grown in hydroponic nutrient solution" // Journal of Agricultural Science. 2012, Vol. 4, N 3, pp. 93-110].
На Фиг. 6A - 6Г показано влияние наночастиц металлов, введенных в питательную среду вместо соответствующих солей металлов, на активность корня растений перца LJ-king и томатов HY-2 и Venice. Из диаграммы на Фиг. 6А видно, что при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо железа в ионной форме наночастицы железа в концентрации 0,06 и 0,3 мг/л, активность корня перца LJ-king увеличивается на 59% и 58% соответственно; при выращивании томата HY-2 на питательной среде, содержащей наночастицы железа в концентрации 0,06, 0,3 и 3,0 мг/л, активность корня увеличивается на 37%, 34% и 48% соответственно по сравнению с контролем. При выращивании томата Venice на питательной среде, содержащей наночастицы железа в концентрации 0,6, 3,0 и 10,0 мг/л, активность корня увеличивается на 112%, 125% и 76% соответственно по сравнению с контролем.
Аналогичный эффект обнаружен и при замене ионов цинка в составе питательной среды на наночастицы цинка (см. Фиг 6Б). Так при выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо цинка в ионной форме наночастицы цинка в концентрации 0,016, 0,08 и 0,4 мг/л, активность корня перца LJ-king увеличивается на 31%, 56% и 38% соответственно, активность корня томата HY-2 увеличивается на 86%, 8% и 29% соответственно по сравнению с контролем. При выращивании томата Venice на питательной среде, содержащей наночастицы цинка в концентрации 0,2, 1,0 и 3,0 мг/л, активность корня увеличивается на 25%, 15% и 42% соответственно по сравнению с контролем.
Из диаграммы на Фиг. 6 В видно, что в протестированном нами диапазоне концентраций наночастиц меди также наблюдается увеличение активности корня растений перца и томатов. При выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо меди в ионной форме наночастицы меди в концентрации 0,00016, 0,0008 и 0,004 мг/л, активность корня перца LJ-king увеличивается на 18%, 61% и 21% соответственно, активность корня томата HY-2 увеличивается на 43%, 151% и 149% соответственно по сравнению с контролем. При выращивании томата Venice на питательной среде, содержащей наночастицы меди в концентрации 0,0008 0,004 и 0,4 мг/л, активность корня увеличивается по сравнению с контролем на 65%, 10% и 12% соответственно.
В большинстве опытов обнаружено положительное влияние на активность корня одновременной замены железа, цинка и меди в ионной форме в составе питательной среды на наночастицы этих металлов (см. Фиг 6Г). При выращивании перца на питательной среде, содержащей вместо металлов в ионной форме комбинации наночастиц (0,06 мг/л железа + 0,016 мг/л цинка + 0,00016 мг/л меди), или (0,3 мг/л железа + 0,08 мг/л цинка + 0,0008 мг/л меди), или (3,0 мг/л железа + 0,4 мг/л цинка + 0,004 мг/л меди), активность корня растений перца увеличивается на 98%, 51% и 91% соответственно. При выращивании томата HY-2 на питательной среде, содержащей вместо металлов в ионной форме комбинации наночастиц (0,06 мг/л железа + 0,016 мг/л цинка + 0,00016 мг/л меди) и (0,3 мг/л железа + 0,08 мг/л цинка + 0,0008 мг/л меди), активность корня растений увеличивается на 33%, и 46%, соответственно, по сравнению с контролем. При выращивании томата Venice на питательной среде, содержащей вместо металлов в ионной форме комбинации наночастиц (0,6 мг/л железа + 0,2 мг/л цинка + 0,0008 мг/л меди) и (3,0 мг/л железа + 1,0 мг/л цинка + 0,004 мг/л меди, активность корня увеличивается на 43% и 48% соответственно по сравнению с контролем.
Введение в состав питательной среды, содержащей наночастицы металлов, дополнительно хитозана в концентрации 100 мг/л в большинстве опытов дает дополнительный прирост активности корня растений.
Содержание хлорофилла в листьях определяют, как описано в ["Chlorophylls and Carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy UNIT F4.3" // Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001, F4.3.1-F4.3.8]. Полученные результаты представлены на Фиг. 7А - 7В.
На Фиг. 7А показано влияние наночастиц железа, введенных в питательную среду вместо сульфата железа, на содержание хлорофилла в листьях перца LJ-king. Из диаграммы видно, что введение в среду наночастиц железа в концентрации 0,3 мг/л и 3,0 мг/л способствует увеличению содержания хлорофилла в листьях на 5% и 27% соответственно, по сравнению с контролем. Добавление в среду хитозана дополнительно повышает содержание хлорофилла в листьях растений перца на 6%, 10% при концентрациях наночастиц железа 0,06 мг/л и 0,3 мг/л соответственно.
На Фиг. 7Б показано влияние наночастиц цинка, введенных в питательную среду вместо цинка сульфата, на содержание хлорофилла в листьях томата HY-2. Наночастицы цинка в концентрации 0,08 мг/л и 0,4 мг/л увеличивают содержание хлорофилла в листьях томата HY-2 на 56% и 108% соответственно. Дополнительное введение в среду хитозана увеличивает этот показатель на 48% и на 20% при концентрации наночастиц цинка 0,016 мг/л и 0,08 мг/л соответственно.
На Фиг. 7В показано влияние наночастиц меди, введенных в питательную среду вместо меди сульфата, на содержание хлорофилла в листьях перца LJ-king. Введение в питательную среду наночастиц меди увеличивает содержание хлорофилла в листьях перца LJ-king, при этом максимальный эффект наблюдали при минимальной протестированной нами концентрации наночастиц меди 0,00016 мг/л, при которой содержание хлорофилла на 59% превышало показатель в контроле. Введение в среду дополнительно хитозана во всех случаях сопровождалось дополнительным увеличением содержание хлорофилла в листьях растений перца. При концентрации 0,0008 мг/л наночастиц меди в питательной среде содержание хлорофилла в перце увеличивалось на 75%.
Важно отметить, что замена в составе питательной среды железа, цинка и меди в ионной форме на наночастицы этих металлов не приводит к какому-либо нарушению развития растений - растения остаются прямостоячими, имеют развитую листовую пластину, сохраняют чередование листьев и другие характерные признаки. При этом не происходит заражения растений бактериальной флорой, плесенью или грибком.
Таким образом, заявляемый способ, основанный на использовании питательной среды, в которой произведена частичная или полная замена солей железа, цинка или меди на наночастицы этих металлов, позволяет получить оздоровленные растения с компактным стеблем, с развитой и активной корневой системой, что позволяет использовать их в качестве высококачественного посадочного материала.
Предложенная питательная среда может быть использована для проведения биотехнологических исследований, для повышения качества продукции, для использования в аэропонных и гидропонных технологиях. Предложенный способ выращивания растений на питательной среде, содержащей наночастицы железа, меди и цинка, может быть использован для создания систем жизнеобеспечения космонавтов в условиях длительных космических полетов.