СПОСОБ ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОБЪЕДИНЕНИЯ В КОМПОЗИЦИЮ С НОСИТЕЛЯМИ
METHOD FOR SELECTION OF MICROORGANISMS TO COMBINE IN COMPOSITION WITH CARRIERS

Отсылка к родственной заявке
Данная заявка претендует на привилегии, предоставляемые в связи с подачей предварительной заявки на патент США № 62/681,469, поданной 6 июня 2018 г., содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к микроорганизмам, продуцирующим дипиколиновую кислоту и к способам идентификации/выявления микроорганизмов с повышенной жизнеспособностью, к способам объединения микроорганизмов с носителями и к композициям, включающим эти микроорганизмы сами по себе и/или объединенные с носителями.
Уровень техники
Биостимуляторы растений на основе микроорганизмов создают возможность рациональной агрономической практики, обеспечивающей защиту экосистем. Также дополнение микробиомов почвы и растений полезными микроорганизмами может способствовать росту и приспособленности растений, что повышает их продуктивность, плодородие почвы, ведет к сокращению использования химикатов и в итоге достигается рациональное, то есть ресурсосберегающее и экологически безопасное,Р ведение сельского хозяйства. В современных агротехнологиях микробиологические биостимуляторы применяются совместно и/или будучи объединены с носителями (сухими или влажными).
Раскрытие изобретения
Микробиологические инокулянты могут быть чувствительны к химическим свойствам используемых для них носителей. На микроорганизмы влияют также условия и продолжительность хранения до применения, которые ухудшают их жизнеспособность и в итоге ограничивают практическую эффективность. В настоящем документе описываются композиции и способы, в результате применения которых повышается выживаемость микроорганизмов и/или улучшается их объединение с носителями или посевным материалом. В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают отбор одного или нескольких микроорганизмов с повышенной жизнеспособностью или выживаемостью - самих по себе или в объединении с одним или более носителями или посевными материалами.
По некоторым воплощениям данного изобретения в настоящем документе обсуждаются микроорганизмы, продуцирующие дипиколиновую кислоту (DPA), и композиции, включающие такие микроорганизмы. В одном из примеров композиция по данному изобретению включает Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus drentensis, Bacillus subtilis, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus paracasei, Fontibacillus sp. (panacisegetis), Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus sp. (chitinolyticus), Paenibacillus sp. (P1XP2), Pseudomonas sp. и Streptomyces griseus (в некоторых примерах эта совокупность микроорганизмов называется консорциумом DFC). В одном из воплощений данного изобретения предлагаемая композиция включает клетки или виды микроорганизмов, включенные в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC, Манассас, шт. Виргиния, США) 16 мая 2019 г. под регистрационным номером PTA-125924. В других воплощениях данного изобретения предлагаемые микробиологические консорциумы или композиции включают (или состоят из, или в основном состоят из) 2 или более (например, 5 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более) микроорганизмов, содержащих ДНК, кодирующую рибосомную 16S-РНК, которая по меньшей мере на 95% (например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентична последовательностям SEQ ID NO: 3-25.
Также в настоящем документе описываются композиции, включающие упомянутые микроорганизмы или микробиологические консорциумы (например, консорциум DFC) и один или более носителей (например, сухие или жидкие носители) или один или более посевных материалов. В некоторых примерах носители по данному изобретению включают жидкое или сухое удобрение, субстанцию почвенного происхождения, субстанцию органического происхождения, инертный материал, агент, подавляющий пылевыделение, или смесь двух или более из указанного.
В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают отбор микроорганизмов для объединения с носителем или посевным материалом, в том числе: идентификацию/выявление микроорганизмов, которые содержат один или более генов, кодирующих фермент для синтеза дипиколиновой кислоты (дипиколинат-синтазу), микроорганизмов, у которых экспрессируются один или более из этих генов (и, соответственно, образуются кодируемые ими ферменты) и/или микроорганизмов, которые продуцируют дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве; отбор микроорганизмов для объединения с носителем. В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы также включают объединение отобранных микроорганизмов с носителем или посевным материалом. В некоторых примерах отобранные микроорганизмы включают один или более из указанных в таблице 25 или 26, в том числе все микроорганизмы, перечисленные в таблице 26 (но не ограничиваясь этим).
В некоторых примерах описываемые способы включают выявление в микроорганизме одного или более из генов дипиколинат-синтазы (например, ген DpaA, кодирующий субъединицу А дипиколинат-синтазы, и/или ген DpaB, кодирующий субъединицу В дипиколинат-синтазы) или одного или более белков, кодируемых генами DpaA и/или DpaB. Гены DpaA включают нуклеотидные последовательности, кодирующие белок (субъединицу А дипиколинат-синтазы), аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 1 (например, SEQ ID NO: 26-41). Гены DpaB включают нуклеотидные последовательности, кодирующие белок (субъединицу В дипиколинат-синтазы), аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 2 (например, SEQ ID NO: 42-56). Белки, кодируемые генами DpaA, включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 1 (например, SEQ ID NO: 26-41). Белки, кодируемые генами DpaB, включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 2 (например, SEQ ID NO: 42-56). В других примерах описываемые способы включают выявление в микроорганизме одного или более из генов Isf или кодируемых ими белков. Гены Isf включают нуклеотидные последовательности, кодирующие белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 3 (например, SEQ ID NO: 57-67). Белки, кодируемые генами Isf, включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 60%) идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных на фиг. 3 (например, SEQ ID NO: 57-67). В других примерах описываемые способы включают определение дипиколиновой кислоты в микроорганизме или в содержащей его среде, например путем флуоресцентного анализа.
В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают объединение одного или более из отобранных микроорганизмов с носителем путем контактирования этих микроорганизмов (включая описанные в настоящем документе микробиологические консорциумы, но не ограничиваясь ими) в жидкой или сухой форме с одним или более из жидких или сухих носителей. В некоторых примерах носители включают жидкие или сухие удобрения, субстанции почвенного происхождения, субстанции органического происхождения, инертные материалы, агенты, подавляющие пылевыделение, или смеси двух иди более из указанного. В других примерах описываемые способы включают обработку посевного материала одним или более из отобранных микроорганизмов (включая описанные в настоящем документе микробиологические консорциумы, но не ограничиваясь ими). В некоторых примерах описываемые способы включают также объединение одного или более из отобранных микроорганизмов и одного или более из микроорганизмов, не содержащих одного или более генов дипиколинат-синтазы, не обладающих экспрессией этих генов и, соответственно, не производящих кодируемый ими белок (дипиколинат-синтазу), и/или микроорганизмов, не продуцирующих дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве, с носителем или посевным материалом.
Указанные выше в настоящем документе и другие признаки данного изобретения поясняются приведенным ниже подробным описанием и иллюстрируются прилагаемыми фигурами.
Краткое описание фигур
Фигура 1 - выравнивание аминокислотных последовательностей субъединицы А дипиколинат-синтазы (белок DpaA) из указанных видов бактерий. Выравнивание 14 последовательностей DpaA из 13 штаммов (SEQ ID NO: 26-39) проводили с помощью программы Clustal Omega (clustal.org/omega) с параметрами по умолчанию. Консенсусную последовательность (“Consensus60”; SEQ ID NO: 40) составляли, исходя из минимальной степени идентичности последовательностей 60%. PRK08306 (SEQ ID NO: 41) - консенсусная последовательность надсемейства, к которому принадлежит белок DpaA, составленная по базе данных семейств консервативных доменов (CDD) Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi).
Фигура 2 - выравнивание аминокислотных последовательностей субъединицы В дипиколинат-синтазы (белок DpaB) из указанных видов бактерий. Выравнивание 13 последовательностей DpaB из 13 штаммов (SEQ ID NO: 42-54) проводили с помощью программы Clustal Omega (clustal.org/omega) с параметрами по умолчанию. Консенсусную последовательность (“Consensus60”; SEQ ID NO: 55) составляли, исходя из минимальной степени идентичности последовательностей 60%. PRK08305 (SEQ ID NO: 56) - консенсусная последовательность надсемейства, к которому принадлежит белок DpaB, составленная по базе данных семейств консервативных доменов (CDD) Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (ncbi.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi).
Фигура 3 - выравнивание 10 аминокислотных последовательностей белка Isf из указанных 5 видов бактерий (SEQ ID NO: 57-66) и консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 67).
Фигура 4 - диаграмма, в которой сведены данные о выживании бактерий, объединенных с указанными носителями.
Фигура 5 изображает результаты определения сухой массы побегов у растений огурца, обработанных перлитом, пропитанным микробиологическим консорциумом AMC1, либо просто перлитом, на 32-й день.
Фигура 6 изображает результаты определения сухой массы побегов у растений огурца, обработанных перлитом, пропитанным микробиологическим консорциумом DFC, либо просто перлитом; бентонитом, пропитанным микробиологическим консорциумом DFC, либо просто бентонитом, на 32-й день.
Фигура 7 изображает результаты определения сухой массы побегов у ничем не обработанных растений огурца; у растений, обработанных жидким препаратом консорциума микроорганизмов DFC; и у растений, обработанных перлитом, пропитанным DFC, на 32-й день.
Фигура 8 иллюстрирует выживание бактерий в составе консорциума DFC, объединенного с зернами кукурузы или семенами из бобов сои, обработанными инсектицидным/фунгицидным агентом.
Перечень последовательностей
Все нуклеотидные и аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе или в прилагаемом к нему Перечне последовательностей, представлены стандартными буквенными сокращениями названий нуклеотидов и аминокислот согласно Своду федеральных нормативных документов США (C.F.R.) раздел 37, §1.822. В нескольких случаях приводится последовательность только одной цепи полинуклеотида, однако комплементарная цепь подразумевается, будучи включена в настоящий документ путем ссылки на приведенную цепь. Последовательность SEQ ID NO: 1 представляет собой консенсусную нуклеотидную последовательность, кодирующую рибосомную 16S-РНК (16S рДНК) Streptomyces pratensis.
SEQ ID NO: 2 - консенсусная нуклеотидная последовательность 16S рДНК Streptomyces venezuelae.
SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus firmus.
SEQ ID NO: 4 - консенсусная нуклеотидная последовательность 16S рДНК Paenibacillus azoreducens.
SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus amyloliquefaciens.
SEQ ID NO: 6 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus flexus.
SEQ ID NO: 7 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus licheniformis.
SEQ ID NO: 8 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus megaterium.
SEQ ID NO: 9 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus pumilus.
SEQ ID NO: 10 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus koreensis.
SEQ ID NO: 11 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus drentensis.
SEQ ID NO: 12 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Bacillus subtilis.
SEQ ID NO: 13 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Clostridium bifermentans.
SEQ ID NO: 14 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Clostridium beijerinckii.
SEQ ID NO: 15 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Clostridium pasteurianum.
SEQ ID NO: 16 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Lactobacillus paracasei.
SEQ ID NO: 17 is a partial 16S rDNA nucleic acid sequence from Fontibacillus sp. (panacisegetis).
SEQ ID NO: 18 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Oceanobacillus oncorhynchi.
SEQ ID NO: 19 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Paenibacillus lautus.
SEQ ID NO: 20 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Paenibacillus chibensis.
SEQ ID NO: 21 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Paenibacillus cookii.
SEQ ID NO: 22 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Paenibacillus sp. (chitinolyticus).
SEQ ID NO: 23 - часть нуклеотидной последовательности 16S рДНК Paenibacillus sp. (P1XP2).
SEQ ID NO: 24 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Pseudomonas sp.
SEQ ID NO: 25 - нуклеотидная последовательность 16S рДНК Streptomyces griseus.
SEQ ID NO: 26-39 - аминокислотные последовательности субъединицы А дипиколинат-синтазы.
SEQ ID NO: 40-41 - консенсусные аминокислотные последовательности субъединицы А дипиколинат-синтазы.
SEQ ID NOs: 42-54 - аминокислотные последовательности субъединицы В дипиколинат-синтазы.
SEQ ID NO: 55-56 - консенсусные аминокислотные последовательности субъединицы В дипиколинат-синтазы.
SEQ ID NO: 57-66 - аминокислотные последовательности, кодируемые генами Isf.
SEQ ID NO: 67 - консенсусные аминокислотные последовательности, кодируемые генами Isf.
Осуществление изобретения
Микроорганизмы, не образующие спор, зачастую более чувствительны к разрушительным факторам, действующим в процессах обработки и
применения в полевых условиях, нежели микроорганизмы, которые образуют споры. Отбор с целью выявления микроорганизмов, образующих споры, среди многочисленных имеющихся в наличии микроорганизмов - весьма трудоемкий и длительный процесс. Он обычно включает практические тесты на выживаемость (например, проверка выживаемости микроорганизмов, объединенных с выбранными носителями), причем трудно гарантировать выживание микробных клеток и продолжительный срок хранения конечного продукта.
В настоящем документе описан новый подход и способ отбора микроорганизмов, отличающийся высокой надежностью длительного срока хранения препаратов биостимуляторов самих по себе и/или в объединении с сухими или влажными носителями или посевными материалами; тем самым значительно сокращается время на освоение нового продукта до его проверки в полевых испытаниях. В настоящем документе предлагаются спорообразующие бактерии с идентифицированными генами дипиколинат-синтазы или кодируемыми ими белками и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту, которые, будучи продолжительное время объединены с носителями, превосходят по жизнеспособности штаммы, у которых не выявлены гены дипиколинат-синтазы и которые не производят дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве. Также в настоящем документе описывается микробиологический консорциум, включающий штаммы микроорганизмов, продуцирующие дипиколиновую кислоту.
I. Термины
В настоящем документе технические термины используются согласно их традиционному употреблению (если только особо не оговорено иное). Определения распространенных молекулярно-биологических терминов можно найти в работах Krebs et al., Lewin’s Genes XI, изд. Jones and Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, изд. Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, изд. Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789); George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2-е издание, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6).
Ниже приводится объяснение некоторых терминов и методов, чтобы лучше представить данное изобретение и облегчить рядовым специалистам в данной области техники его практическое осуществление. Формы единственного числа артиклей “a,” “an” и “the” употребляются в значении «один» или «более одного» (если только из контекста не следует с очевидностью иное). Например, выражение “comprising a cell” включает значения «содержащий клетку (одну)» или «содержащий клетки (множество)» и считается равнозначным выражению «содержащий по меньшей мере одну клетку». В настоящем документе глагол «содержит» означает «включает». Так, формулировка «содержащий А или В» означает «включающий А, B или A и B», причем не исключается наличие дополнительных элементов. Все упоминаемые в настоящем документе публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники включаются в него во всей полноте путем отсылки. В случае, если возникнут разночтения, для их урегулирования послужит настоящее описание, включая объяснения терминов.
Ниже описываются материалы и методы, пригодные для практического осуществления или проверки способов по данному изобретению, хотя для этого можно применять также материалы и методы, сходные с описанными в настоящем документе или эквивалентные им. Описанные в настоящем документе материалы, методы и примеры служат лишь для иллюстрации изобретения и не имеют ограничительного характера.
Для облегчения рассмотрения различных воплощений данного изобретения предлагаются нижеследующие разъяснения специфических терминов.
Носитель - субстанция или индивидуальное вещество, которое можно использовать в качестве несущей среды для доставки (например, в составе композиции или в роли инокулянта) микроорганизмов - отдельных видов или микробиологических консорциумов, описанных в настоящем документе, где носитель иногда называется агроносителем. Носитель может быть жидким или твердым (сухим) Примеры носителей по данному изобретению включают жидкие или сухие удобрения, субстанции почвенного происхождения (например, уголь, глина, торф), субстанции органического происхождения (например, опилки, пшеничные/соевые/овсяные отруби, компост) и инертные материалы (например, перлит, вермикулит, бентонит, азомит (Azomite), каолин, силикаты, тальк). В некоторых примерах носителем можно считать посевной материал.
Контактирование - расположение элементов в непосредственной физической близости, будь то в жидкой и/или твердой форме. Например, контактирование может иметь место между одним или более микроорганизмами (например, в составе микробиологического консорциума) и носителем или посевным материалом. Контактирование также может осуществляться между одним или более микроорганизмами, композицией, в которой объединены микроорганизмы и носитель, или микроорганизмы и посевной материал, с одной стороны и почвой, растениями и/или частями растений (например, листьями, стеблем, проростками, корнями и/или семенами) - с другой.
Культивирование - намеренное выращивание одного или более организмов/одной или более клеток в присутствии усвояемых источников углерода, азота и минеральных солей. В одном из примеров такое выращивание происходит в плотной или полужидкой питательной среде или в жидкой среде, в которой растворены или суспендированы питательные вещества. В другом примере культивирование осуществляется на поверхности или глубинным способом. Культуральная среда может включать комплекс питательных веществ или иметь определенный химический состав.
Дипиколиновая кислота (пиридин-2,6-дикарбоновая кислота; DPA) - соединение, описываемое структурной формулой
У большинства микроорганизмов дипиколиновая кислота образуется путем превращения дигидродипиколината в дипиколинат под действием фермента дипиколинат-синтазы. Дипиколинат-синтаза представлена двумя субъединицами - А (DpaA, или spoVFA) и B (DpaB, или spoVFB). В настоящем документе приведены примеры аминокислотных последовательностей DpaA и DpaB (см. фиг. 1 и 2)
Некоторые бактерии (например, некоторые представители рода Clostridium) способны синтезировать дипиколиновую кислоту, хотя у них не выявляются гены DpaA и DpaB. Не вдаваясь в теоретические рассуждения, отметим, что эти бактерии, как полагают, используют для синтеза дипиколиновой кислоты белок, структурно родственный дипиколинат-синтазе, а именно электронпереносящий флавопротеин (etfA), представляющий собой оксидоредуктазу, простетической группой которой является флавинмононуклеотид (FMN). Считается, что этот белок катализирует конечный этап пути биосинтеза дипиколиновой кислоты - превращение дигидродипиколината в дипиколинат (Orsburn et al., Mol. Microbiol. 75:178-186, 2010). Кроме того, у некоторых бактерий для образования дипиколиновой кислоты служит флавопротеин, содержащий железо-серный кластер (Isf).
Гетерологичный - происходящий из другого генетического источника или другого вида организмов. Например, полинуклеотид, гетерологичный для данной клетки, происходит из организма или вида организмов, отличных от того, к которому принадлежит клетка, в которой он экспрессируется. Методы внедрения гетерологичных полинуклеотидов в бактериальные клетки включают, например, трансформацию, в том числе путем электропорации, трансфекцию с использованием липидов (липофекцию) или генной пушки.
Другой пример употребления термина «гетерологичный»: полинуклеотид, функционально связанный с гетерологичным промотором, то есть промотор берется из гена, организма или вида организмов, отличного от того, к которому принадлежит данный полинуклеотид. Еще пример употребления этого термина: полинуклеотид, кодирующий полипептид или его часть, функционально связан с гетерологичным полинуклеотидом, кодирующим второй полипептид или его часть, например для создания не существующего в природе слитого белка.
Изолированный - Изолированным называют биологический компонент (например, полинуклеотид, белок или организм) в основном отделенный или очищенный от других биологических компонентов (например, других клеток, обломков клеток, других белков или полинуклеотидов). Изолированные биологические компоненты включают те компоненты, которые выделены с помощью стандартных методов очистки. Этот термин также охватывает рекомбинантные полинуклеотиды, белки или микроорганизмы, а также полинуклеотиды или пептиды, полученные путем химического синтеза. Термин «изолированный» (или «обогащенный», или «очищенный», или «выделенный») не подразумевает абсолютной чистоты, так что включает микроорганизмы или вещества, очищенные по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или даже 100%.
Микроорганизм - организм микроскопических размеров. Микроорганизмы включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) бактерии, архебактерии, грибы и водоросли (например, микроводоросли). В некоторых примерах микроорганизмы являются одноклеточными (например, бактерии, цианобактерии, некоторые грибы или некоторые водоросли). В других примерах микроорганизмы включают многоклеточные организмы, например определенные грибы или водоросли (например, многоклеточные филаментные грибы или многоклеточные водоросли).
Микробиологическая композиция - композиция (которая может быть в твердой, жидкой или частично жидкой и частично твердой форме), включающая клетки микроорганизмов по меньшей мере одного типа (или вида) или популяции клеток микроорганизмов по меньшей мере одного типа. В некоторых примерах микробиологическая композиция содержит клетки микроорганизмов одного или более типов/видов (или одну или более популяций микроорганизмов) в жидкой среде (например, в среде для хранения, или в культуральной среде, или в ферментационной среде, или в жидком удобрении), например в виде суспензии в жидкости. В других примерах микробиологическая композиция включает клетки микроорганизмов одного или более типов/видов (или одну или более популяций микроорганизмов) на поверхности или в толще плотной, или желеобразной (в том числе в чашках Петри или культуральных планшетах, но не ограничиваясь этим), или кашицеобразной, или пастообразной среды. В других примерах микробиологическая композиция включает клетки микроорганизмов одного или более типов/видов (или одну или более популяций микроорганизмов), связанные с сухим материалом или с посевным материалом, например на поверхности или в толще такого материала.
Микробиологический консорциум - смесь, сообщество или комплекс клеток микроорганизмов двух или более видов, которые в некоторых случаях находятся в физическом контакте друг с другом. Микроорганизмы в консорциуме могут влиять друг на друга путем непосредственного контакта или биохимических взаимодействий, или того и другого вместе. Например, микроорганизмы в консорциуме могут обмениваться питательными веществами, метаболитами или газами. Таким образом, в некоторых примерах по меньшей мере некоторые микроорганизмы в консорциуме являются метаболически взаимозависимыми. Специфика и интенсивность таких взаимодействий, создающих обоюдную зависимость, могут изменяться со временем и в связи с изменениями условий культивирования.
Трансдуцированный и трансформированный - когда происходит перенос полинуклеотида вектором или вирусом в клетку, она становится трансдуцированной; когда этот внедренный полинуклеотид (вирусная или векторная ДНК) реплицируется за счет клеточных механизмов - будучи интегрированным в клеточный геном или в составе эписомы - клетка становится трансформированной. В настоящем документе термин «трансформация» охватывает все методы, которыми молекулы нуклеиновой кислоты (полинуклеотиды) могут быть внедрены в клетки, включая конъюгацию бактерий, трансфекцию вирусными векторами, трансформацию плазмидными векторами, внедрение чистой («голой») ДНК путем электропорации, липофекции и с помощью генной пушки.
Вектор - полинуклеотид (молекула нуклеиновой кислоты), которую можно внедрить в клетку-хозяин, в результате чего получается трансформированная или трансдуцированная клетка. Рекомбинантные ДНК-векторы - это векторы, включающие рекомбинантные полидезоксирибонуклеотиды. Вектор может содержать нуклеотидные последовательности, обеспечивающие его репликацию в клетке-хозяине, например сайт инициации репликации. Вектор может содержать также один или более маркерных генов, служащих для отбора нужных клеток; сайты рестрикции для клонирования, чтобы встраивать гетерологичные полинуклеотиды; промотор (например, для экспрессии функционально связанного полинуклеотида) и/или другие генетические элементы, известные в данной области техники. Векторы включают плазмидные векторы, в том числе плазмиды для экспрессии в клетках грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. Примеры векторов включают векторы, используемые применительно к клеткам Escherichia coli.
Жизнеспособность - способность клеток (например, клеток микроорганизмов) расти или размножаться в условиях, пригодных для роста и размножения. В некоторых примерах термины «выживание» и «выживаемость» относятся к жизнеспособности клеток (например, клеток микроорганизмов) после периода хранения в жидком или сухом состоянии самих по себе или в смеси с клетками других микроорганизмов, и/или в составе кломпозиции, объединенные с носителями или посевным материалом.
II. Способы выявления/идентификации микроорганизмов, жизнеспособных в композициях с носителями
В настоящем документе описываются способы выявления/идентификации микроорганизмов, сохраняющих жизнеспособность или выживающих, когда они объединены с жидким или твердым носителем. Микроорганизмы можно объединить с носителем или посевным материалом сами по себе (например, с носителем или посевным материалом объединен отдельный штамм или вид микроорганизмов) или в составе консорциума или смеси микроорганизмов (например, два или более штаммов или видов микроорганизмов), объединенных с носителем или посевным материалом. В других воплощениях данного изобретения указанные способы включают выявление/идентификацию микроорганизмов, сохраняющих жизнеспособность или выживающих в течение продолжительного времени в составе консорциума (самого по себе или в составе композиции с носителем или посевным материалом).
В некоторых примерах микроорганизмы, выявленные способами, описанными в настоящем документе, например микроорганизмы, в которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется детектируемое количество дипиколиновой кислоты, обладают более высокой жизнеспособностью (сами по себе или в составе композиции с носителем/посевным материалом), чем микроорганизмы, в которых нет одного или более генов дипиколинат-синтазы, не экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или не образуется в детектируемом количестве дипиколиновая кислота. В некоторых примерах микроорганизмы, вывяленные способами, описанными в настоящем документе, обладают жизнеспособностью, по меньшей мере на 10% (например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или более) превышающей жизнеспособность микроорганизмов, в которых нет одного или более генов дипиколинат-синтазы, не экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или не образуется в детектируемом количестве дипиколиновая кислота. Выражение «повышенная жизнеспособность» включает тот факт, что через определенный промежуток времени жизнеспособно больше клеток и/или что клетки жизнеспособны более продолжительное время.
В некоторых воплощениях данного изобретения способы, описанные в настоящем документе, включают выявление/идентификацию микроорганизмов, у которых геном содержит один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется детектируемое количество дипиколиновой кислоты, Такие микроорганизмы выявляются как сохраняющие жизнеспособность или выживающие сами по себе либо в составе композиции с жидким или твердым носителем (например, например, при сравнении с микроорганизмами, в которых нет одного или более генов дипиколинат-синтазы, не экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или не образуется в детектируемом количестве дипиколиновая кислота). Среди выявленных таким образом микроорганизмов можно провести отбор для дальнейшего использования, например для объединения с жидким либо твердым носителем или посевным материалом. В некоторых примерах микроорганизмы по данному изобретению сохраняют жизнеспособность или выживают (сами по себе или будучи объединены с носителем либо посевным материалом) в течение пор меньшей мере 1 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 7 суток, по меньшей мере 10 суток, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 8 месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет или дольше (например, по меньшей мере 1-28 суток, по меньшей мере 5-21 суток, по меньшей мере 2-6 недель, по меньшей мере 4-8 недель, по меньшей мере 2-6 месяцев, по меньшей мере 3-9 месяцев, по меньшей мере 4-10 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев - 1 год, по меньшей мере 1-2 года или дольше).
Способы определения жизнеспособности или выживания микроорганизмов включают оценку их клеточного роста в культуре. В некоторых примерах препарат, содержащий клетки микроорганизмов (в жидкой форме, или в сухом виде, или микроорганизмы, объединенные с носителем либо посевным материалом) вносят в жидкую среду, инкубируют в условиях, пригодных для клеточного роста, и через определенное время измеряют массу и/или численность микроорганизмов. В других примерах препарат, содержащий клетки микроорганизмов (в жидкой форме, или в сухом виде, или микроорганизмы, объединенные с носителем либо посевным материалом) наносят штрихами на чашку/планшет, содержащий плотную или полужидкую среду, инкубируют в условиях, пригодных для клеточного роста, и через определенное время измеряют массу и/или численность (например, массу, размер и численное количество колоний). В некоторых примерах микроорганизмы выявляют/идентифицируют с помощью, например, методов с использованием полимеразной цепной реакции (PCR). Некоторые способы определения жизнеспособности и идентификации микроорганизмов описаны в Примере 1.
3
9
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
В других воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают отбор одного или более микроорганизмов, в которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется детектируемое количество дипиколиновой кислоты, и при необходимости объединение одного или более из отобранных микроорганизмов с одним или более носителем либо посевным материалом. В других примерах способы по данному изобретению включают получение препарата, в котором объединены один или более из отобранных микроорганизмов и один или более носителей либо посевных материалов. Эти способы включают контактирование одного или более микроорганизмов с одним или более носителем либо посевным материалом, например в твердой (сухой) или жидкой форме. В некоторых примерах один или более носителей либо посевных материалов контактируют со смесью микроорганизмов. Такая смесь включает микроорганизмы, в которых экспрессируется дипиколинат-синтаза или образуется дипиколиновая кислота (например, это микроорганизмы, отобранные или полученные способами, описанными в настоящем документе, в том числе консорциум DFC, но этот пример не имеет ограничительного характера) и может включать также один или более микроорганизмов, в которых не экспрессируется дипиколинат-синтаза и не образуется дипиколиновая кислота. В некоторых примерах носитель контактирует с жидкой средой, содержащей каждый из микроорганизмов в концентрации около 10-10 клеток/мл или больше (например, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл, около 1 × 10 клеток/мл, около 5 × 10 клеток/мл или больше).
В некоторых воплощениях данного изобретения обеспечивается контактирование жидкости, включающей один или более из отобранных микроорганизмов (и при необходимости один или более дополнительных микроорганизмов) с одним или более сухими носителями или посевными материалами. В некоторых примерах жидкость, содержащая микроорганизмы, является свежей или замороженной культурой бактериальных клеток. В других примерах жидкость, содержащая микроорганизмы, является жидкостью, в которую добавлены лиофилизованные микроорганизмы. Жидкостью, содержащей один или более микроорганизмов, пропитывают сухой носитель или посевной материал. В некоторых примерах берут такое количество жидкости, содержащей один или более микроорганизмов, чтобы сухой носитель или посевной материал пропитались ею до насыщения, например чтобы обеспечить относительно равномерное распределение микроорганизмов в массе носителя или посевного материала. Впрочем, можно брать и ненасыщающее количество жидкости. В примерах (не имеющих ограничительного характера) количество жидкости с микроорганизмами составляет от около 36 мкл/г до 6 мл/г. В некоторых примерах носитель или посевной материал, в который впитались микроорганизмы, высушивают (например, при комнатной температуре или при температуре около 30-35°C) и хранят при температуре окружающей среды (например, в закрытой или герметичной емкости).
В других воплощениях данного изобретения жидкость, содержащая один или более из отобранных микроорганизмов (и при необходимости один или более дополнительных микроорганизмов) смешивают с одним или более жидкими носителями. В некоторых примерах жидкость, содержащая микроорганизмы, является свежей или замороженной культурой бактериальных клеток или смесью свежих или замороженных бактериальных культур. В других примерах жидкость, содержащая микроорганизмы, является жидкостью, в которую добавлены лиофилизованные микроорганизмы. Жидкость, содержащую микроорганизмы, смешивают с жидким носителем в любом выбранном количестве, например в относительном количестве, например берут 0,1%-90% (объем/объем), например 0,5-1%; 1-5%; 2-10%; 3-6%; 4-8%; 5-15%; 8-20%; 10-25%; 20-40%; 30-50%; 40-60%; 50-75% или 70-90% (объем/объем). В некоторых примерах микроорганизмы смешивают с жидким носителем в количестве около 0,1%, около 0,2%, около 0,5%, около 1%, около 2%, около 3%, около 4%, около 5%, около 6%, около 7%, около 8%, около 9%, около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80% или около 90% (объем/объем). В одном примере (не имеющем ограничительного характера) смесь микроорганизмов добавляют к жидкому носителю в количестве 0,5% (объем/объем) или в соотношении 1:180. В другом примере (не имеющем ограничительного характера) смесь микроорганизмов добавляют к концентрированному жидкому носителю (например, к жидкому носителю, сконцентрированному в 10 раз) в количестве 90% (объем/объем), чтобы жидкий носитель соответственно разбавился. Количество клеток микроорганизмов в смеси можно подобрать в зависимости от коэффициента разбавления так, чтобы в итоге получалась желаемая конечная концентрация микроорганизмов. Смесь микроорганизмов хранят при температуре окружающей среды (например, в закрытой или герметичной емкости).
В некоторых воплощениях данного изобретения для объединения с сухим носителем или посевным материалом используют сухой препарат микроорганизмов (например, лиофилизованные клетки). В некоторых примерах лиофилизованные микроорганизмы смешивают с сухим носителем или посевным материалом (например, в количестве от около 40 мг препарата микроорганизмов на 1 кг носителя или посевного материала до около 1 г препарата микроорганизмов на 1 кг носителя или посевного материала). В некоторых примерах этого воплощения лиофилизованные микроорганизмы добавляют к жидкости, которая затем контактирует с сухим носителем или посевным материалом. В других примерах лиофилизованные микроорганизмы добавляют к жидкости и затем обеспечивают контактирование с сухим носителем или посевным материалом.
A. Определение полинуклеотидов, кодирующих дипиколинат-синтазу
В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают выявление присутствия одного или более полинуклеотидов, кодирующих дипиколинат-синтазу (например, ДНК, комплементарную ДНК (кДНК) или матричную РНК (мРНК)) в микроорганизме или в популяции микроорганизмов. В некоторых примерах методы по данному изобретению включают определение в геноме микроорганизма одного или более генов дипиколинат-синтазы (например, DpaA и/или DpaB). В некоторых примерах микроорганизм несет оба указанных гена - и DpaA, и DpaB. Примеры генов дипиколинатсинтазы включают DpaA B. subtilis (регистрационный номер в базе данных GenBank NC_000964.3, 1744367-1745260, депонирован 3 июня 2018 г.; включается в настоящий документ путем отсылки) и DpaB B. subtilis (регистрационный номер в базе данных GenBank NC_000964.3, 1745236-1745865, депонирован 3 июня 2018 г.; включается в настоящий документ путем отсылки). В некоторых примерах ген DpaA кодирует белок, представленный на фиг. 1, или белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или больше) идентична аминокислотной последовательности белка, представленного на фиг. 1 (например, это одна из последовательностей SEQ ID NO: 26-39). В некоторых примерах ген DpaB кодирует белок, представленный на фиг. 2, или белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или больше) идентична аминокислотной последовательности белка, представленного на фиг. 2 (например, это одна из последовательностей SEQ ID NO: 42-54). В некоторых примерах белок, кодируемый геном DpaA или DpaB содержит один или более консервативных участков, которые на фиг. 1 и 2 входят в консенсусную последовательность, обозначенную на этих рисунках “Consensus60” (последовательности SEQ ID NO: 40 и 55, соответственно).
В других воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают выявление присутствия одного или более полинуклеотидов (например, ДНК. кДНК или мРНК), которые участвуют в ином метаболическом пути синтеза дипиколиновой кислоты. В некоторых примерах способы по данному изобретению включают выявление присутствия или экспрессии одного или более полинуклеотидов, кодирующих электронпереносящий флавопротеин (например, Etf) или флавопротеин с железо-серным кластером (Isf). Электронпереносящие флавопротеин, клоторые относятся к надсемейству альфа-гидролаз, представляют собой гетеродимеры, состоящие из альфа- и бета-субъединиц. Типичным примером нуклеотидных последовательностей, кодирующих бактериальный белок EtfA, явялются последовательности, зарегистрированные в базе данных GenBank под номерами CP000312.1 (2508382-2509389), NC_004578.1 (2407768-2408697), NC_009089.1 (977905-978927), NC_019382.1 (1357738-1356809, комплементарная последовательность), NC_003030.1 (2833696-2833268, комплементарная последовательность), NC_002971.4 (1062557-1061613, комплементарная последовательность) и NC_003063.2 (650447-651376); все эти последовательности, депонированные 3 июня 2018 г., включаются в настоящий документ путем отсылки). Типичные аминокислотные последовательности бактериального белка EtfA включают последовательности с номерами ABG86939, NP_792007.1, YP_001087282.1, YP_006967336.1, NP_349315.1, NP_820116.1 и NP_357016.2; все они депонированы в GenBank 2 июня 2018 г. и включаются в настоящий документ путем отсылки. Типичные нуклеотидные и аминокислотные последовательности белка Isf включают имеющиеся в базе данных GenBank под регистрационными номерами CP016318 (3060700-3061308) и ARE63607 соответственно (эти последовательности, депонированные 3 июня 2018 г., включаются в настоящий документ путем отсылки) и последовательности, представленные на фиг. 3 (например, SEQ ID NO: 57-66).
В некоторых примерах полинуклеотиды, кодирующие дипиколинат-синтазу (или EtfA. или Isf) можно выявить путем анализа нуклеотидных последовательностей микроорганизма (например, путем секвенирования всего генома и/или с помощью олигонуклеотидов, специфичных к генам дипиколинат-синтазы). В некоторых примерах анализ последовательностей осуществляется с использованием последовательностей, имеющихся в одной или более базах данных, в том числе в GenBank (ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/), ENSEMBL (ensembl.org/index.html), IMG (img.jgi.doe.gov), MicrobesOnline (microbesonline.org), SEED (theseed.org), или GOLD (gold.jgi-psf.gov). Типичные способы выявления генов дипиколинат-синтазы приведены в Примере 1 ниже. Для выявления генов флавопротеинов EtfA или Isf можно использовать сходные способы.
В некоторых примерах прежде, чем определять указанные последовательности, из микроорганизма или популяции микроорганизмов выделяют или амплифицируют нуклеиновые кислоты, или делают и то, и другое. В некоторых примерах амплификацию и определение экспрессии проводят одновременно или почти одновременно. В некоторых примерах экспрессию нуклеотидных последовательностей определяют с помощью полимеразной цепной реакции, например, обычной (PCR), с обратной транскрипцией (RT-PCR) и в реальном времени (q-PCR), или количественной. Выделять и амплифицировать нуклеиновые кислоты можно, например, используя имеющиеся в продаже специальные наборы. В одном из примеров нуклеиновые кислоты инкубируют с праймерами, обеспечивающими амплификацию нуклеотидных последовательностей генов DpaA и/или DpaB (или EtfA, или Isf) в условиях, достаточных для такой амплификации. Определяют образующиеся в результате продукты амплификации (ампликоны).
В другом примере нуклеиновые кислоты, выделенные из микроорганизма или популяции микроорганизмов, инкубируют с зондами, связывающимися с нуклеотидными последовательностями, кодирующими белки DpaA и/или DpaB (или EtfA, или Isf), например с геномной ДНК, кДНК или РНК (например, мРНК) в высоко строгих условиях. Определяют происходящую в результате гибридизацию. В других примерах изолированные полинуклеотиды, полученные из микроорганизма или популяции микроорганизмов, анализируют с помощью матрицы. В одном из примеров матрица включает олигонуклеотиды, комплементарные к последовательностям генов DpaA и/или DpaB (или EtfA, или Isf). В одном из примеров нуклеиновые кислоты, выделенные из микроорганизма или популяции микроорганизмов, инкубируют с матрицей, включающей олигонуклеотиды, комплементарные к последовательностям генов DpaA и/или DpaB (или EtfA, или Isf)., в течение времени, достаточного для гибридизации между изолированными полинуклеотидами и олигонуклеотидными зондами, в результате которой образуются комплексы полинуклеотид-олигонуклеотид. Затем эти комплексы анализируют, чтобы определить, присутствуют ли в образце искомые полинуклеотиды.
B. Определение белков с дипиколинат-синтазной активностью
В качестве альтернативы или в дополнение выявлению нуклеотидных последовательностей, кодирующих дипиколинат-синтазу, можно выявлять соответствующие белки, применяя методы с использованием иммунологических реакций, например вестерн-блоттинг, иммуногистохимический анализ, проточную цитометрию, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или масс-спектрометрические методы. В некоторых примерах белки DpaA включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или больше) идентична аминокислотной последовательности белка, представленного на фиг. 1 (например, это одна из последовательностей SEQ ID NO: 26-39). В некоторых примерах белки DpaB включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или больше) идентична аминокислотной последовательности белка, представленного на фиг. 2 (например, это одна из последовательностей SEQ ID NO: 42-54). В некоторых примерах белок, кодируемый геном DpaA или DpaB, содержит один или более консервативных участков, которые на фиг. 1 и 2 входят в консенсусную последовательность “Consensus60” (последовательности SEQ ID NO: 40 и 55, соответственно). В других примерах белки Isf включают белки, аминокислотная последовательность которых по меньшей мере на 20% (например, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или больше) идентична аминокислотной последовательности белка, представленного на фиг. 3 (например, это одна из последовательностей SEQ ID NO: 57-66).
В некоторых примерах прежде, чем определять белки, их подвергают очистке. В одном из примеров белки DpaA и/или DpaB (или Isf) определяют путем инкубации образца, полученного из данного микроорганизма или популяции микроорганизмов, с антителом, специфично связывающимся с тем или иным из этих белков (DpaA и/или DpaB, или Isf). Это антитело (называемое первым, или первичным) может быть выявлено. Например, оно само может быть непосредственно помечено, или же образец после инкубации с первым антителом инкубируют со вторым (или вторичным) антителом, которое несет детектируемую метку (например, флуоресцентную). Метку детектируют путем, например, микроскопии, твердофазного иммуноферментного анализа, проточной цитометрии или спектрофотометрии. В другом примере образец анализируют методом вестерн-блоттинга, определяя экспрессию белков DpaA и/или DpaB. Получить антитела против DpaA, DpaB или Isf вполне может рядовой специалист в данной области техники, используя, например, аминокислотные последовательности, представленные на фиг. 1-3.
125
131
35
3
Пригодные по данному изобретению метки для первичных или вторичных антител включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные, люминесцентные и радиоактивные вещества, магнитные агенты. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению простетических групп (комплексов) включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин-изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению люминесцентных веществ включают люминол. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению магнитных агентов включают гадолиний. Примеры (не имеющие ограничительного характера) пригодных по данному изобретению радиоактивных меток включают I, I, S или H.
C. Определение дипиколиновой кислоты.
В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают выявление микроорганизма или популяции микроорганизмов, продуцирующих дипиколиновую кислоту (например, детектируемое количество этого вещества), В некоторых примерах способы по данному изобретению включают выявление дипиколиновой кислоты в концентрации по меньшей мере 1 нМ (например, по меньшей мере 2 нМ, по меньшей мере 5 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 25 нМ, по меньшей мере 50 нМ, по меньшей мере 100 нМ, по меньшей мере 200 нМ, по меньшей мере 500 нМ или больше). В одном примере способы по данному изобретению включают определение дипиколиновой кислоты флуорометрическим методом с тербием (см., например, Rosen, Anal. Chem. 69:1082-1085, 1997; Pellegrino et al., Anal. Chem. 70:1755-1760, 1998; Ammann et al., Int. J. Microbiol. 2011:435281, 2011). Коротко говоря, этот метод основан на том, что дипиколиновая кислота образует с трехвалентным тербием комплекс, флуоресцирующий интенсивнее, чем сам тербий(III), что позволяет выявить и/или количественно определить дипиколиновую кислоту в анализируемом образце. Типичный пример такого анализа описан в Примере 1.
III. Микроорганизмы и включающие их композиции
с носителями/посевным материалом
В настоящем документе описываются микроорганизмы у которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы в составе генома, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется дипиколиновая кислота. В некоторых примерах микроорганизмы по данному изобретению модифицированы таким образом, что в них имеются один или более генов дипиколинат-синтазы в составе генома, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется дипиколиновая кислота. Также в настоящем документе описываются композиции, в которых эти микроорганизмы объединены с одним или более носителями либо посевным материалом.
A. Микроорганизмы
Микроорганизмы у которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется дипиколиновая кислота, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus sp. (виды, близко родственные B. kochii, B. pocheonensis, и Bacillus sp. (штамм R-27341)), Clostridium beijerinckii, Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus lautus, Virgibacillus halophilus, Paenibacillus azoreducens и Bacillus firmus. В некоторых примерах эти бактерии включают описанные в публикации PCT WO 2018/045004 (содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки). Дополнительные микроорганизмы включают перечисленные в таблицах 25 и 26. В некоторых примерах эти микроорганизмы также обладают способностью образовывать споры, однако такая способность не вполне совпадает с наличием идентифицируемых генов дипиколинат-синтазы или выявляемого образования дипиколиновой кислоты (см., например, таблицу 6).
В дополнительных воплощениях данного изобретения предлагаются композиции, включающие микроорганизмы, в которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется дипиколиновая кислота, в том числе те, которые в настоящем документе называются консорциумом сухой композиции (DFC). Входящие в DFC микроорганизмы включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus, Bacillus flexus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus koreensis, Bacillus drentensis, Bacillus subtilis, Clostridium bifermentans, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum, Lactobacillus paracasei, Fontibacillus sp. (panacisegetis), Oceanobacillus oncorhynchi, Paenibacillus lautus, Paenibacillus azoreducens, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus sp. (chitinolyticus), Paenibacillus sp. (P1XP2), Pseudomonas sp. и Streptomyces griseus. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемая композиция включает клетки тех видов микроорганизмов, которые депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC, Манассас, шт. Виргиния, США) 16 мая 2019 г. под регистрационным номером PTA-125924.
Идентификация микроорганизмов, в особенности на уровне вида или штамма, не всегда возможна, что должно быть известно специалистам в данной области техники. В некоторых примерах микроорганизмы в составе композиций, описанных в настоящем документе, анализировали путем секвенирования ДНК, кодирующей рибосомную РНК 16S, а также всего генома с последующим сравнением установленных последовательностей с последовательностями, имеющимися в общедоступных базах данных. Однако, поскольку информация в базах данных последовательностей биологических макромолекул ограничена (в частности, по некоторым видам или штаммам сведения скудны или отсутствуют и/или названия микроорганизмов иногда изменяются), может оказаться проблематичным однозначно идентифицировать тот или иной вид или штамм. В связи с этим в некоторых воплощениях данного изобретения виды микроорганизмов, включенные в композиции, описанные в настоящем документе, идентифицируются по степени идентичности их нуклеотидных последовательностей последовательностям ДНК, кодирующей рибосомную РНК 16S, которые приведены в настоящем документе (SEQ ID NO: 3-25). В некоторых примерах микробиологические консорциумы или композиции, описанные в настоящем документе, включают два или более (например, 5 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более или все) микроорганизмов, содержащих последовательности ДНК, кодирующей рибосомную РНК 16S, которые по меньшей мере на 95% (например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или больше) идентичны последовательностям SEQ ID No: 3-25.
Микроорганизмы, у которых имеются один или более генов дипиколинат-синтазы, экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или образуется в детектируемом количестве дипиколиновая кислота, включают также микроорганизмы у которых от природы не было одного или более генов дипиколинат-синтазы, не экспрессировались один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или не образовывалась детектируемого количества дипиколиновой кислоты, но они модифицированы так, что обладают теперь этими признаками. В некоторых примерах микроорганизмы, у которых от природы нет одного или более генов дипиколинат-синтазы, не экспрессируются один или более белков с дипиколинат-синтазной активностью и/или не образуется дипиколиновая кислота, модифицированы таким образом, что у них экспрессируются один или более гетерологичных генов дипиколинат-синтазы, например DpaA и/или DpaB либо один или более генов Isf.. Типичные примеры генов DpaA и DpaB и кодируемых ими белков, а также генов Isf и кодируемых ими белков описаны в разделе II настоящего документа и иллюстрируются фиг. 1-3, включая последовательности SEQ ID NO: 26-67.
Бактерии, которых можно модифицировать так, чтобы у них экспрессировались один или более гетерологичных генов дипиколинат-синтазы, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь), Azotobacter (например, Azotobacter vinelandii), Clostridium (например, Clostridium pasteurianum), Streptomyces (например, Streptomyces griseus, Streptomyces venezuelae, Streptomyces pratensis), Sporolactobacillus spp. (например, Sporolactobacillus dextrus), Sporosarcina spp. (например, Sporosarcina halophila), Desulfotomaculum spp. (например, Desulfotomaculum guttoideum), Nocardiopsis spp. (например, Nocardiopsis sinuspersici), Promicromonospora spp. (например, Promicromonospora enterophila, Promicromonospora soli), Brevibacillus spp. (например, Brevibacillus centrosporus), Rummeliibacillus spp. (например, Rummeliibacillus pycnus), Lysinibacillus spp., Terribacillus spp. (например, Terribacillus shanxiensis), Micromonospora spp. (например, Micromonospora fulva, Micromonospora palomenea), Saccharopolyspora spp. (например, Saccharopolyspora spinose, Saccharopolyspora indica) и Fontibacillus spp. (например, Fontibacillus panacisegetis). В некоторых примерах эти бактерии включают те микроорганизмы, которые описаны в публикации РСТ WO 2018/045004 (содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки).
В некоторых примерах гетерологичные гены DpaA и/или DpaB помещают под контроль промотора. В некоторых примерах промотор является конститутивным, а в других примерах промотор индуцибельный (например, индуцибельный промотор фага T7). В дополнительных примерах промотором является промотор, индуцируемый арабинозой (например, pBAD), промотор lac-оперона (непосредственно индуцируется изопропил-бета-галактопиранозидом (IPTG)/лактозой), промотор trc promoter (непосредственно индуцируется IPTG/лактозой), промотор, индуцируемый тетрациклином, или промотор pho (индуцируемый дефицитом фосфата). Гетерологичные гены DpaA и/или DpaB могут быть включены в состав вектора, например функционально связаны с промотором. Сходные методы можно использовать применительно к генам EtfA или Isf.
В бактериальных клетках может происходить экспрессия одновременно многих искомых генов, например двух или более генов дипиколинат-синтазы и\или генов Isf. Для обеспечения правильной согласованной экспрессии ряда ферментов одного метаболического пути каждая из кодирующих нуклеотидных последовательностей гетерологичного гена при необходимости помещается под контроль промотора одного определенного типа, например индуцибельного промотора фага Т7. Одним из примеров такой конструкции являются векторы Duet™ (производство Novozymes), которые сконструированы с совместимыми репликонами и генами лекарственной устойчивости для эффективного существования и репродукции в четырех плазмидах в одной клетке. Таким образом достигается ко-экспрессия до восьми различных белков. В других примерах используется вектор pET, например pET21 или pET28. Векторы pET и векторы на основе pET имеются в продаже, например производства Novagen (Сан-Диего, шт. Калифорния, США) или Clontech (Маунтин-Вью, шт Калифорния, США).
В одном из примеров используется вектор pET21a или pET28a. В некоторых примерах вектор pET включает маркер лекарственной устойчивости (например, к ампициллину или канамицину) и промотор фага Т7. В этом векторе имеется сайт множественного клонирования, так что с одного вектора может экспрессироваться более одного гена (например, 2, 3, 4 или больше). В некоторых примерах нужные гены экспрессируются как полицистронный продукт (например, дицистронный, трицистронный и т.п.), то есть образуется единая мРНК, с которой транслируются несколько полипептидов. В других примерах нужные гены экспрессируются как несколько моноцистронных продуктов, то есть для каждого образуется отдельная мРНК и по ней синтезируется соответствующий полипептид. Подходящие векторы можно подобрать в зависимости от того, какие гены должны экспрессироваться и какие клетки-хозяева подлежат трансформации.
В некоторых примерах в клетку микроорганизма-хозяина вводится плазмида, функционирующая и реплицирующаяся вне хромосом В других примерах после введения в клетку плазмиды происходит двойная гомологичная рекомбинация, и один или более введенных генов встраиваются в геном.
2
2
Возможна трансформация бактериальных клеток рекомбинантной ДНК. В случае бактерий после фазы экспоненциального роста собирают клетки, обрабатывают их известным в данной области техники методом с использованием хлорида кальция (CaCl), магния (MgCl) или рубидия (RbCl), так что получаются компетентные клетки, в которые может проникнуть ДНК. Для трансформации бактериальных клеток применяют также электропорацию, конъюгацию или трансдукцию.
B. Обработка носителей и посевного материала
В настоящем документе описываются способы объединения одного или более микроорганизмов с одним или более носителей и композиции, включающие один или более микроорганизмов и один или более носителей. Носитель может быть жидким либо твердым (сухим). Носители по данному изобретению включают жидкие или сухие удобрения (например, такие удобрения, как мочевина, поташ, фосфат аммония и/или нитрат аммония), субстанции почвенного происхождения (например, глину, торф, каменный уголь, минеральный грунт), субстанции органического происхождения (например, растительный или животный уголь, опилки, пшеничные/соевые/овсяные отруби, компост, кокосовое волокно) и/или инертные материалы (например, перлит, вермикулит, бентонит, азомит (Azomite), каолин, силикаты, пемзу, тальк). Типичные примеры носителей по данному изобретению включают азомит (Azomite), перлит, биоуголь, сухие удобрения (например, хлорид калия (MOP) или однозамещенный фосфат аммония (MAP)), жидкие удобрения (например, смесь нитрата аммония с мочевиной (UAN)), и агенты, подавляющие пылевыделение (например, производимые компанией ArrMaz; шт. Флорида, США). Дополнительные примеры носителей по данному изобретению включают монтмориллонит, аттапульгит, водный алюмосиликат (Agsorb Products Group, шт. Иллинойс, США), акадаму (Eastern Leaf Inc, шт. Калифорния, США), глиняный гранулят Seramis (Greens hydroponics, Великобритания), влагоудерживатель Aquasmart™ Pro (Aquasmart, шт. Техас, США), вулканическую пирофилитовую глину Pyro-Gro (Green Air products, шт. Орегон, США), дробленую лаву, керамзит.
В некоторых воплощениях данного изобретения композиции, объединяющие микроорганизмы с носителями, включают консорциум из 22 микроорганизмов (в настоящем документе обозначается АМС1), описанный в публикации WO 2018/045004 (содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки) и один или более из носителей, описанных в настоящем документе. В других воплощениях данного изобретения композиции, объединяющие микроорганизмы с носителями, включают консорциум из 23 микроорганизмов, описанный в настоящем документе (например, микроорганизмы, перечисленные в таблице 26 или депонированные в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером PTA-125924) и один или более носителей. Композиции, объединяющие микроорганизмы с носителями, также включают один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или более) микроорганизмов и один или более носителей, описанных в настоящем документе. В некоторых примерах такая композиция включает по меньшей мере один микроорганизм, в котором имеются или экспрессируются один или более генов дипиколинат-синтазы и/или генов Isf (или образуется дипиколиновая кислота) и носитель. В других примерах такая композиция включает носитель и по меньшей мере один микроорганизм, в котором имеются или экспрессируются гены (один или более) дипиколинат-синтазы или образуется дипиколиновая кислота, и по меньшей мере один микроорганизм, в котором нет генов дипиколинат-синтазы или не образуется дипиколиновая кислота. Способы объединения носителя с одним или более микроорганизмами включают контактирование одного или более носителей с одним или более микроорганизмами. В некоторых примерах один или более микроорганизмов находятся в жидкой форме (например, в жидкой среде), или в твердой форме, или в сухом виде.
Также в настоящем документе описываются способы обработки посевного материала одним или более микроорганизмами (например, объединение одного или более микроорганизмов с одним или более посевными материалами) и композиции, содержащие один или более микроорганизмов и один или более посевных материалов. В таких воплощениях данного изобретения посевной материал является как бы носителем для микроорганизмов. В некоторых воплощениях данного изобретения обработка посевного материала включает использование консорциума из 22 микроорганизмов, описанного в публикации WO 2018/045004 (содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки), и один или более посевных материалов. В других воплощениях данного изобретения обработка посевного материала включает использование консорциума из 23 микроорганизмов, описанного в настоящем документе (например, микроорганизмы, перечисленные в таблице 26 или депонированные в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером PTA-125924), и один или более посевных материалов. В других примерах объединяющая композиция включает по меньшей мере один микроорганизм, в котором имеются или экспрессируются один или более генов дипиколинат-синтазы и/или генов Isf или образуется дипиколиновая кислота, и посевной материал. В других примерах объединяющая композиция включает по меньшей мере один микроорганизм, в котором имеются или экспрессируются один или более генов дипиколинат-синтазы и/или генов Isf или образуется дипиколиновая кислота, по меньшей мере один микроорганизм, в котором отсутствуют или не экспрессируются гены дипиколинат-синтазы или не образуется дипиколиновая кислота, и посевной материал. Типичные примеры посевного материала, подлежащего обработке одним или более микроорганизмами, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) зерна кукурузы, семена подсолнечника, семена канадских сортов рапса с пониженным содержанием эруковой кислоты (канолы), зерна пшеницы, семена огурцов, семена томатов, зерна риса и семена хлопка.
В некоторых примерах посевной материал, обработанный микроорганизмами, получают путем нанесения клеток микроорганизмов непосредственно на семена, зерно и т.п. (например, путем контактирования посевного материала с одним или более микроорганизмами). В других примерах посевной материал, обработанный микроорганизмами, получают путем нанесения клеток микроорганизмов как дополнительного слоя на семена, зерно и т.п., предварительно обработанные инсектицидным и/или фунгицидным препаратом (например, путем контактирования посевного материала, обработанного инсектицидным и/или фунгицидным агентом, с одним или более микроорганизмами). В других примерах посевной материал, обработанный микроорганизмами, получают путем смешивания микроорганизмов с инсектицидным и/или фунгицидным агентом (например, с инсектицидной/фунгицидной кашицеобразной массой) и нанесения полученной смеси на посевной материал (например, путем контактирования посевного материала со смесью инсектицидного и/или фунгицидного агента и одного или более микроорганизмов). Типичными примерами инсектицидных и фунгицидных агентов, которые можно использовать в сочетании с микроорганизмами, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) металаксил, трифлоксистробин, ипконазол, клотианидин, тиаметоксам, флудиоксонил, мефеноксам, азоксистробин, тиабендазол, пираклостробин, имидаклоприд, флуксапироксад и/или седексан. В некоторых примерах один или более микроорганизмов, наносимых на посевной материал, находятся в жидкой форме (например, в жидкой среде) или в твердой, форме или в сухом виде. Способы получения обработанного семенного материала включают (но не ограничиваются указанным здесь) те, которые описаны в работе Seed Treatment: Oregon Pesticide Applicator Training Manual (Paulsrud et al., Urbana, Illinois, 2001) и в Примере 13.
IV. Способы применения
Микробиологические композиции, описанные в настоящем документе, - сами по себе или будучи объединенными с одним или более жидкими или сухими носителями - можно использовать для обработки почвы, растений или частей растений (например, корней, стеблей, листьев, семян/плодов или проростков). В других примерах микробиологические композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать в виде обработанного посевного материала.
В некоторых примерах обработка описанными в настоящем документе композициями и/или носителями или посевным материалом, обработанным этими композициями, улучшает рост растений, их устойчивость к стрессовым факторам и/или повышает урожайность сельскохозяйственных культур. В некоторых воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают контактирование почвы, растений (например, листьев, стеблей, корней, проростков или других частей растения) или посевного материала с микробиологическими композициями или композициями, объединяющими микроорганизмы и носители/посевной материал, описанными в настоящем документе. В других воплощениях данного изобретения предлагаемые способы включают внесение в почву посевного материала, обработанного композициями, описанными в настоящем документе. Способы по данному изобретению могут также включать выращивание обработанных растений, частей растений или посевного материала и/или выращивание растений, частей растений или посевного материала в обработанной почве.
В некоторых примерах рассчитывается количество композиции (композиций) по данному изобретению - чисто микробиологической или объединяющей один или более микроорганизмов с носителями или посевным материалом, - которое нужно применить (например, в расчете на единицу площади - акр или гектар); указанная композиция разводится водой (в некоторых примерах жидким удобрением) до объема, достаточного для опрыскивания или полива территории, подлежащей обработке (если композиция жидкая). Композицию по данному изобретению можно применять во время внесения в почву посевного материала из расчета 0,5-2 литра на 1 акр (например, 0,5 л/акр; 1 л/акр; 1,5 л/акр или 2 л/акр). Указанную композицию можно наносить на почву (например, вблизи корней растений) или на растения один или более раз в течение периода роста в одном и том же или в различных количествах. В других примерах композицию смешивают с разбавленными гербицидными, инсектицидными, пестицидными агентами или химическими веществами, влияющими на рост растений. Если композиция в твердой форме (например, сухой препарат), ее можно наносить непосредственно на почву, растения или части растений либо перед использованием суспендировать или растворять ее в воде (или другой жидкости).
В некоторых примерах обработка почвы, посевного материала, растений или частей растений композициями по данному изобретению усиливает рост растений (например, увеличиваются размеры растения, облиственность/масса листвы, количество, длина и толщина корней, усиливаются образование побегов, плодов, пыльцы и/или семян) по меньшей мере на около 5% (например, по меньшей мере на около 10%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около100%, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз или больше). В других примерах способы по данному изобретению приводят к увеличению урожайности сельскохозяйственных культур на около 10-75% (например, на около 20-60% или около 30-50%) по сравнению с необработанными культурами. Другие показатели продуктивности сельскохозяйственных культур включают качество плодов, урожайность, содержание крахмала или сухого вещества, содержание сахара или градус по шкале Брикса, срок хранения плодов или иного собираемого продукта, товарный урожай, желаемый размер и качество плодов или иного продукта, кущение злаков, устойчивость к вытаптыванию, эффективность опыления и завязывания плодов, обильность цветения, количество цветков, продолжительность жизни цветка, качество цветения, укоренение и корневая масса, устойчивость к полеганию, сопротивляемость абиотическим стрессовым факторам (засухе, жаре, холоду), восстановление после стресса, приспособляемость к бедным почвам, уровень фотосинтеза и позеленение, жизнестойкость. При определении эффективности продуктов по данному изобретению для контроля осуществляют параллельно те же агротехнические действия, но без добавления микроорганизмов.
Способы и композиции и/или объединенные композиции, описанные в настоящем документе, можно использовать применительно к любой сельскохозяйственной культуре (например, для непосредственной обработки культуры или для обработки почвы перед посадкой или после нее). Типичные примеры сельскохозяйственных культур, подлежащих применению указанных способов и композиций, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) люцерну, миндаль, бананы, ячмень, брокколи, капусту, коноплю, канадские сорта рапса с пониженным содержанием эруковой кислоты (канолу), морковь, цитрусовые и другие плодовые деревья, кукурузу, хлопок, огурцы, комнатные и садовые декоративные растения, чеснок, виноград, хмель, плодоовощные культуры, лук-порей, дыню, масличную пальму, лук-репку, арахис и бобовые, ананас, тополь, сосну, древесинные породы деревьев, картофель, малину, рис, кунжут, сорго, сою, тыкву, клубнику/землянику, сахарный тростник, подсолнечник, томаты, дернообразующие и кормовые травянистые растения, арбуз, пшеницу и эвкалипт.
Примеры
Ниже приводятся примеры с целью проиллюстрировать определенные характерные признаки и/или воплощения данного изобретения. Эти примеры не следует считать ограничивающими данное изобретение описанными здесь конкретными признаками или воплощениями.
Пример 1. Материалы и методы
Выделение и идентификация микроорганизмов.
Все взятые для исследования микроорганизмы происходили из коллекции микроорганизмов компании Agrinos (AMC); они описаны ранее в публикации WO 2018/045004, за исключением четырех дополнительных микроорганизмов, которые описываются в настоящем документе. Эти дополнительные микроорганизмы были выделены, как описывается ниже.
Бактерий Streptomyces pratensis и Streptomyces venezuelae выделяли из основной почвы местности с координатами N38° 38' 49.402'', W121° 40'' 5.775'' Вкратце проделывали следующее. Образец почвы суспендировали в стерильном солевом растворе, забуференном фосфатом, содержащим полисорбат (TWEEN 80). Затем делали серийные разведения и высевали на несколько различных полужидких сред. S. pratensis и S. venezuelae выделяли из чашек с агаровой средой для выделения маннит-позитивных азотобактерий (HIMEDIA #M372) после инкубации в течение до 3 суток при температуре 30°C. Полученные штаммы пересевали штрихом на полужидкую среду MP (см. ниже) до изогенного состояния.
Bacillus firmus выделяли из образца микробиологического препарата HYT A (Agrinos AS), который предварительно смешивали с удобрением (UAN32) в соотношении 1:180. Инкубировали в течение 3 недель при комнатной температуры. После этого отбирали аликвоты смеси, высевали на различные полужидкие среды и инкубировали в течение до 3 суток при температуре 30°C. Колонии B. firmus собирали с агаровой среды Пиковской (HIMEDIA #M520). Полученные штаммы пересевали штрихом на полужидкую среду MP (см. ниже) до изогенного состояния.
2
4
4
2
4
2
4
Paenibacillus azoreducens выделяли из образца микробиологического препарата HYT A (Agrinos AS). Получали колонии P. azoreducens на агаровой среде, содержащем 1-10 мМ сульфата аммония (состав среды: 0,585 г/л NaCl; 0,075г/л KCl; 0,147 г/л CaCl; 0,049 г/л MgSO; 1,32-0,132 г/л (NH)SO; 0,054 г/л KHPO в буферном растворе (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES); pH 7,5). Полученные штаммы пересевали штрихом на полужидкую среду MP (см. ниже) до изогенного состояния.
Таксономическая классификация новых описанных микроорганизмов
Для всех четырех новых штаммов делали полногеномное секвенирование биологически чистых изолятов, как описано ниже. Сборку генома de novo осуществляли по технологии, известной под названием Hierarchical Genome Assembly Process (HGAP) компании Pacific Biosciences (Менло-Парк, шт. Калифорния, США).
Для таксономической идентификации использовали главным образом последовательности рибосомной РНК 16S. Последовательности рибосомной РНК 16S сначала идентифицировали в рамках сборки генома de novo, используя программу RNAmmer (cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/). Затем классифицировали последовательности 16S путем попарного выравнивания с помощью пакета программ BLASTn (Национальный центр биотехнологической информации; NCBI) и инструмента базы данных RDP (Ribosimal Database Project) - наивного классификатора Байеса (Wang et al. Appl. Environ. Microbiol. 73:5261-5267, 2007), а также конструирования de novo филогенетического древа по базе данных Greengenes и картирования с использованием ранговых корреляций (DeSantis et al. Appl. Environ. Microbiol. 72:5069-502, 2006). Видовую принадлежность микроорганизма устанавливали по согласующимся результатам всех трех методов.
На основании сказанного выше была проведена следующая классификация микроорганизмов.
- Streptomyces pratensis. Провели таксономическую классификацию всего генома, используя последовательности рибосомной РНК 16S. Последовательности, кодирующие белки, идентифицировали с помощью программы Prodigal (Hyatt et al. BMC Bioinformatics, 11:119, 2010). В этой классификации использовали набор из 49 консервативных семейств кластеров ортологических групп (COG) (Tatsuov et al. Science 278:631-637, 1997) с целью нахождения совпадения соответственных наборов последовательностей для определенного генома. Затем последовательности из выбранного генома вставляли в референсные выравнивания, выявляли и присоединяли ближайших соседей и строили филогенетическое древо с помощью программы FastTree2 (метод максимального правдоподобия; Price et al. PLoS One 5:e9490, 2010). Этим достаточно точным методом классификации вид Streptomyces pratensis был выбран как наиболее подходящий на роль референсного. Референсный геном Streptomyces pratensis ATCC 33331 взяли в базе данных NCBI RefSeq и провели выравнивание с полученной последовательностью всего генома с помощью программы MUMmer (mummer.sourceforge.net/). Выравнивание продемонстрировало общее совпадение и подтвердило, что эти две последовательности близко родственны в масштабе генома. Консенсусная последовательность рибосомной РНК 16S представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.
- Streptomyces venezuelae. По результатам, полученным всеми указанными методами, анализировавшийся изолят идентифицирован как S. venezuelae. Консенсусная последовательность рибосомной РНК 16S представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 2.
- Bacillus firmus. По результатам, полученным всеми указанными методами, анализировавшийся изолят идентифицирован как B. firmus. Консенсусная последовательность рибосомной РНК 16S представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 3.
- Paenibacillus azoreducens. По результатам, полученным всеми указанными методами, анализировавшийся изолят идентифицирован как P. azoreducens. Консенсусная последовательность рибосомной РНК 16S представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 4.
Определение потенциальной метаболической активности микроорганизмов
Потенциальную метаболическую активность микроорганизмов оценивали путем лабораторных анализов, как описано в публикации WO 2018/045004, содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки. Чтобы установить, обладает ли данный микроорганизм способностью в ходе метаболизма восстанавливать серусодержащие соединения до сульфидов, использовали идентификационную систему API согласно рекомендациям производителя (bioMérieux, Inc., Дарем, шт. Северная Каролина, США). Результаты определения спектра основных метаболических активностей новых идентифицированных микроорганизмов представлены в таблице 1.
Таблица1.
Метаболические активности изолятов новых микроорганизмов
Микро-организм
Обмен азота
Солетолерантность
Солюбилизация неорг. солей
Целлюлозолитическая активность/хитинолитическая активность
Другие активности, полезные для растений
Обмен серы
Обмен железа/сидерофоры
Streptomyces venezuelae
N, D
≥2,5%
Хитин+целлюлоза
M + IAA
Биосинтез и транспорт сидерофоров
Streptomyces pratensis
N
≥2,5%
Хитин+целлюлоза
M + IAA
Биосинтез и транспорт сидерофоров
Bacillus firmus
N
<5%
Целлюлоза
M + IAA
Транспорт сидерофоров
Paenibacillus azoreducens
N
<2,5%
P, Ca
IAA
H<sub>2</sub>S
Транспорт сидерофоров
2
D - денитрификация; N - фиксация азота; P - фосфаты; Ca - соли кальция; IAA - образование индол-3-уксусной кислоты; M - превращение яблочной кислоты; HS - образование сероводорода.
Определение образования дипиколиновой кислоты у бактерий
Определение образования дипиколиновой кислоты различными штаммами бактерий проводили флуориметрическим методом с тербием (Rosen et al. Anal. Chem. 69:1082-1085, 1997); Pellegrino et al. (Anal. Chem. 70:1755-1760, 1998); Ammann et al. (Int. J. Microbiol. 2011:435281, 2011). Вкратце, проделывали следующее. Изогенные штаммы растили на агаровых средах (см. таблицу 2) в аэробных либо анаэробных условиях. Аэробные штаммы культивировали при температуре 30°C в течение до 3 суток, а анаэробные - при 35°C в течение до 3 суток в анаэростате BD GasPak EZ (Becton, Dickinson and Company; Франклин-Лейкс, шт. Нью-Джерси, США) с газогенерирующими пакетами Pack-Anaero (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.; Токио, Япония). Для анализа на дипиколиновую кислоту из колонии в чашке отбирали примерно 5 мкл бактерий и суспендировали в 10 мл буферного раствора ацетата натрия (0,2 М; рН 5). Полученную суспензию помещали в автоклав на 15 мин при температуре 121°C и приборном давлении 15 psig, затем остужали при комнатной температуре в течение 30 минут. Смешивали равные объемы автоклавированной суспензии и раствора гексагидрата хлорида тербия(III) концентрацией 30 мкМ (Sigma-Aldrich; Сент-Луис, шт. Миссури, США). Измеряли флуоресценцию (длина волны возбуждения 272 нм, длина волны испускания 545 нм) с помощью фотометра Cytation 5 Imaging Reader (BioTek, Уинуски, шт. Вермонт, США).
Культивирование бактерий, использовавшихся в данном исследовании,
в полужидких средах
Изогенные штаммы бактерий, хранившиеся при температуре -80°C в качестве маточных банков клеток, растили на агаровых средах (таблица 2) до тех пор, пока не появлялись заметные колонии. Вкратце проделывали следующее. Аэробные штаммы культивировали при температуре 30°C в течение до 3 суток, а анаэробные - при 35°C в течение до 3 суток в анаэростате BD GasPak EZ (Becton, Dickinson and Company; Франклин-Лейкс, шт. Нью-Джерси, США) с газогенерирующими пакетами Pack-Anaero (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc.; Токио, Япония).
Таблица 2.
Агаровые среды для культур микроорганизмов
Род микроорганизмов
Агаровая среда*
Bacillus spp.
MP, NA (amyloliquefaciens; flexus; licheniformis; subtilis), BHI (subtilis; licheniformis; flexus), RCM (firmus; sp.(pocheonensis)), YPD (megaterium; amyloliquefaciens), RhX (amyloliquefaciens)
Lactobacillus spp.
RCM, MP, MRS
Virgibacillus spp.
YPD, MP
Paenibacillus spp.
BHI, MP, NA (cookii, lautus), RCM (azoreducens), R2A (chibensis)
Clostridium spp.
RCM (pasteurianum; beijerinckii), AMAS (pasteurianum), NA (beijerinckii), MP (pasteurianum; beijerinckii), MP
Oceanobacillus spp.
BHI, RhX, NA, MP
Acetobacter spp.
RCM, YPD, MP
Pseudomonas spp.
MP, YPD, BHI (putida), RCM (sp. (fluorescens))
Streptomyces spp.
MP, BHI, NA (pratensis), YPD (griseus)
Azotobacter spp.
MP, AMAS, RhX
4
2
4
2
4
4
2
2
4
2
4
*NA - питательный агар (BD #213000); YPD - дрожжевой экстракт/пептон/декстроза (BD #242720); BHI - агар с сердечно-мозговым экстрактом (Teknova, шт. Калифорния, США); RhX - среда 111 Rhizobium X medium (ATCC); AMAS - агаровая среда для азотобактерий (HIMEDIA #M372); RCM - усиленная среда для клостридий (BD#218081); MRS - агаровая среда для лактобацилл MRS (BD# 288210); R2A - агаровая среда R2A (HIMEDIA #SMEB962); MP - агаровая среда с патокой (2% масса/объем патоки; 0,15 г/л MgSO; 0,1 г/л CaCl; 0,12 г/л FeSO; 1 г/л KSO; 5 г/л дрожжевой экстракт; 10 г/л пептон; 5 г/л NaCl; 0,1 г/л NaMoO; 0,01 г/л MnCl; 0,03 г/л KHPO; 0,03 г/л NaHPO; 15 г/л агар)
Культивирование отдельных штаммов бактерий, использовавшихся в данном исследовании, в жидких средах
Отобранные колонии выращенных на агаровой среде штаммов инокулировали в стерилизованную жидкую среду нужного состава (таблица 3) и инкубировали в течение до 3 суток. Аэробные штаммы культивировали при температуре 30°C при перемешивании (125-175 об/мин); анаэробные штаммы культивировали в атмосфере азота в герметичных сывороточных флаконах или в пробирках Хангейта при температуре 35°C без перемешивания. Когда требовалось, получали микробиологический консорциум, смешивая в равных объемах выращенные по отдельности штаммы. Типичные данные о количестве клеток в единице объема (в миллилитре) для различных штаммов приведены в таблице 4. Содержание микроорганизмов определяли в системе цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ddPCR), используя набор реагентов Supermix For Probes (Bio-Rad Laboratories; Геркулес, шт. Калифорния, США), как описано в публикации WO 2018/045004.
Таблица 3.
Жидкие среды для культивирования микроорганизмов
Род микроорганизмов
Жидкая среда*
Bacillus spp.
BHI (flexus; licheniformis; sp.(pocheonensis); subtilis), YPDS (megaterium; amyloliquefaciens), NB (firmus)
Lactobacillus spp.
RCM
Virgibacillus spp.
BHIS
Paenibacillus spp.
BHI (chibensis; cookii; lautus), NB (azoreducens)
Clostridium spp.
RCM
Oceanobacillus spp.
BHIS
Acetobacter spp.
YPD
Pseudomonas spp.
YPDS 0.5%
Streptomyces spp.
YEME
Azotobacter spp.
MP
4
2
4
2
4
4
2
2
4
2
4
2
*YPD - дрожжевой экстракт/пептон/декстроза (BD #242720); YPDS - дрожжевой экстракт/пептон/декстроза (BD #242720) , содержащая 0,5 г/л NaCl; BHI - среда с сердечно-мозговым экстрактом (Teknova; шт. Калифорния, США); RCM - усиленная среда для клостридий (BD#218081); BHIS - среда с сердечно-мозговым экстрактом (Teknova; шт. Калифорния, США) , содержащая 45 г/л NaCl;(BD#218081); MP - среда с патокой (2% масса/объем патоки; 0,15 г/л MgSO; 0,1 г/л CaCl; 0,12 г/л FeSO; 1 г/л KSO; 5 г/л дрожжевой экстракт; 10 г/л пептон; 5 г/л NaCl; 0,1 г/л NaMoO; 0,01 г/л MnCl ; 0,03 г/л KHPO; 0,03 г/л NaHPO). YEME - среда с дрожжевыми солодовым экстрактами (3 г/л дрожжевой экстракт; 5 г/л бактопептон; 3 г/л солодовый экстракт; 10 г/л глюкоза; 340 г/л сахароза; 5 мМ MgCl); NB - питательный бульон (BD #234000).
Таблица 4.
Типичное содержание бактериальных клеток в конечной жидкой композиции, полученной путем смешивания культивировавшихся по отдельности штаммов (количество клеток в 1 мл)
Микроорганизмы
Количество клеток в 1 мл конечной жидкой композиции (смеси отдельных штаммов)
Bacillus megaterium
2,53E+07
Lactobacillus paracasei/casei
7,66E+07
Clostridium beijerinckii
1,97E+07
Acetobacter pasteurianus
4,58E+07
Lactobacillus buchneri
1,77E+07
Bacillus subtilis
5,26E+07
Paenibacillus cookii
9,14E+07
Lactobacillus vini
9,06E+07
Bacillus licheniformis
5,00E+08
Paenibacillus lautus
5,16E+07
Oceanobacillus oncorhynchi
2,12E+07
Bacillus amyloliquefaciens
8,30E+07
Bacillus sp.
1,26E+08
Pseudomonas putida
1,02E+08
Pseudomonas sp.
1,96E+08
Streptomyces griseus
3,76E+07
Paenibacillus chibensis
9,34E+07
Bacillus flexus
5,88E+07
Clostridium pasteurianum
3,29E+07
Azotobacter vinelandii
6,02E+07
Virgibacillus halophilus
1,95E+07
Lactobacillus delbrueckii
3,36E+07
Получение совместно культивируемых микробиологических консорциумов путем ферментации
600
Как аэробные, так и анаэробные бактерии культивировали в среде, содержащей 2% патоки и жизненно необходимые вещества, например фосфаты, натрий, калий и хлориды в виде готового (имеющегося в продаже) солевого раствора, забуференного фосфатом (PBS), а также аминокислоты, азот и пептиды/белки в виде сухой сыворотки для пищевого применения (0,1% масса/объем) и полученный ферментативным путем соевый экстракт, не содержащий генетически модифицированных организмов (0,25% масса/объем; Ferti-Nitro Plus Plant N; Ferti-Organic, Браунсвилл, шт.Техас, США). Концентрация хлорида натрия оставляла 0-4% масса/объем. Описанные выше штаммы, которые перечислены в таблице 4 (в настоящем документе обозначаются AMC1) инокулировали в 2-литровые биореакторы DASGIP (Eppendorf North America Hauppauge, Нью-Йорк, США)) с рабочим объемом 1,5 л до конечной оптической плотности на длине волны 600 нм (OD) для каждого из взятых штаммов в диапазоне 6,67E-05 - 6,67E-04. Поддерживали pH 5,5-6,9 с помощью гидроксида аммония и фосфорной кислоты. Температуру контролировали, поддерживая ее в диапазоне 28°C-35°C. Анаэробная ферментация осуществлялась при непрерывном барботаже с газообразным азотом для обеспечения анаэробности среды; при аэробной ферментации источником кислорода для микроорганизмов служил используемый для барботажа воздух. Ферментация продолжалась обычно до 3 суток. В некоторых опытах партии микроорганизмов после ферментации, содержавшие разные микроорганизмы, объединяли, чтобы в итоге получить одну полную смесь бактериальных клеток 22 штаммов. Типичные данные по содержанию микроорганизмов каждого из штаммов (количество клеток в 1 мл) представлены в таблице 5. Содержание бактериальных клеток в ферментатах определяли в системе цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ddPCR), используя набор реагентов Supermix For Probes (Bio-Rad Laboratories; Геркулес, шт. Калифорния, США), как описано в публикации WO 2018/045004.
Таблица 5.
Типичные данные по содержанию микроорганизмов (количество бактериальных клеток в 1 мл) в конечной жидкой совокупной композиции
Микроорганизмы
Количество бактериальных клеток в 1 мл конечной жидкой совокупной композиции
Bacillus megaterium
1,40E+04
Lactobacillus paracasei/casei
9,60E+05
Clostridium beijerinckii
1,60E+07
Acetobacter pasteurianus
1,20E+07
Lactobacillus buchneri
1,00E+05
Bacillus subtilis
1,30E+06
Paenibacillus cookii
6,60E+03
Lactobacillus vini
8,20E+04
Bacillus licheniformis
9,30E+05
Paenibacillus lautus
2,00E+09
Oceanobacillus oncorhynchi
2,00E+09
Bacillus amyloliquefaciens
6,00E+05
Bacillus sp.
3,20E+05
Pseudomonas putida
2,30E+07
Pseudomonas sp.
1,20E+07
Streptomyces griseus
7,50E+06
Paenibacillus chibensis
5,80E+03
Bacillus flexus
6,00E+06
Clostridium pasteurianum
4,80E+06
Azotobacter vinelandii
1,30E+07
Virgibacillus halophilus
6,10E+06
Lactobacillus delbrueckii
2,00E+06
Получение лиофилизованного препарата микробиологического консорциума
В некоторых экспериментах микроорганизмы до опыта лиофилизовали вместе с агроносителем. Консорциум получали путем объединения взятых в равных объемах микроорганизмов, культивировавшихся по отдельности, либо путем совместного культивирования ферментатов (описанных выше). Лиофилизацию осуществляли в основном так, как описано в публикации WO 2018/045004. Вкратце, проделывали следующее. Для получения лиофилизованного препарата смешивали жидкий препарат микробиологического консорциума с раствором маннита/лиопротектора (OPS Diagnostics, Лебанон, шт. Нью-Джерси, США) согласно инструкциям производителя, отбирали аликвоты полученной суспензии и помещали их в флаконы для лиофилизации (OPS Diagnostics, Лебанон, шт. Нью-Джерси, США). Держали при температуре -80°C в течение 60 минут, после чего помещали в лиофилизационную сушилку FreeZone 6 Freeze Dry System (Labconco, Канзас-Сити, шт. Миссури, США), создавали вакуум и держали образцы до тех пор, пока вся вода не сублимируется.. Полученные лиофилизованные образцы хранили при температуре 4°C вплоть до использования. В некоторых опытах готовили лиопротектор, для чего добавляли в культуры микроорганизмов следующие вещества до указанной конечной концентрации: 0,75 г/л триптический соевый бульон (Becton, Dickinson and Company, США); 10 г/л сахароза (Sigma Aldrich, США) и 5 г/л обезжиренное молоко (Carnation, Nestlé S.A, CH).
Препараты, объединяющие микроорганизмы с агроносителями
Жидкими препаратами микробиологических консорциумов (полученных путем совместного культивирования либо объединения культур, выращенных по отдельности) или отдельными бактериальными штаммами, полученными, как описано выше, насыщали такие агроносители, как перлит, азомит (Azomite шт. Юта, США), пемза, однозамещенный фосфат аммония (MAP; Mosaic Co., шт. Миннесота, США), хлорид калия (MOP; Мосаик, шт. Монтана, США) и биоуголь (Cool Terra; Cool Planet Energy system, шт. Колорадо, США). В зависимости от способности носителя удерживать воду для его насыщения микроорганизмами берут различные объемы препарата микробиологического консорциума - от 35 мкл на 1 г носителя до 6 мл/г. Смесь микроорганизмов с агроносителем сушат в течение ночи при температуре 30°C-35°C , после чего хранят в герметичных емкостях для дальнейших исследований выживания микроорганизмов в процессе хранения и влияния полученных препаратов на растения.
32
В тех случаях, когда в препарат включают жидкие агрохимикаты, например водные растворы мочевины и нитрата аммония (UAN; TGI, шт. Калифорния, США) или агенты, подавляющие пылевыделение в удобрениях (DUSTROL; ArrMaz, шт. Флорида, США), жидкие препараты микробиологических консорциумов, полученные, как описано выше, перед хранением и исследованием выживания смешивают в различных соотношениях (см. в примерах ниже). Все работы проводили с соблюдением санитарного режима, чтобы свести к минимуму возможность микробной контаминации.
В некоторых случаях использование лиофилизованных препаратов бактериальных консорциумов было обусловлено задачей минимизировать влияние культуральных сред на химические свойства носителей. Подробности манипуляций при необходимости описываются в примерах.
Анализ геномов бактерий для выявления образования дипиколинат-синтазы
Выделение геномной ДНК микроорганизмов
Клетки бактерий различных видов культивировали в оптимизированных жидких бульонах в подходящих условиях и из этих культур брали материал для анализа. Для выделения геномной ДНК в небольших количествах использовали набор PowerSoil DNA isolation kit (MO BIO Laboratories, Inc.; Карлсбад, шт. Калифорния, США). Для выделения геномной ДНК бактерий в большем масштабе использовали наборы GenElute Bacterial Genomic DNA kit (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, шт. Миссури, США) или набор буферных растворов Qiagen Genomic DNA Buffer Set и колонки Genomic-tip 500/G (Qiagen; Хидден, Германия) согласно инструкциям производителей. . Полученную геномную ДНК осаждали равным объемом изопропанола, промывали 70%-ным этиловым спиртом, высушивали на воздухе и суспендировали в буферном растворе TE (трис(гидроксиметил)аминометан с этилендиаминтетрауксусной кислотой)
Полногеномное секвенирование(WGS)
Определяли нуклеотидную последовательность всего генома биологически чистых изолятов с помощью секвенатора PacBio RSII (Pacific Biosciences; Менло-Парк, шт. Калифорния, США) способом, рекомендованным производителем для получения библиотеки и секвенирования. Для бактериальных изолятов было получено в среднем 73 000 прочтений (ридов) длиной в среднем по 24 кб, после чего провели сборку генома de novo путем иерархического процесса (Hierarchical Genome Assembly Process - HGAP, Pacific Biosciences; Менло-Парк, шт. Калифорния, США).
Идентификация нуклеотидных последовательностей, кодирующих
дипиколинат-синтазу, у отобранных штаммов бактерий
Первоначальный биоинформатический анализ включал отобранных представителей рода Bacillus (Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus sp., и Bacillus flexus), а также Lactobacillus (Lactobacillus delbrueckii). Вначале провели анализ пангенома этих бактерий, используя предварительно полученные для каждой из них последовательности всего генома с помощью программы BPGA (версия 1.3) (iicb.res.in/bpga/index.html), чтобы оценить геномное разнообразие и определить основные (консервативные), дополнительные (необязательные) и уникальные (штамм-специфические) наборы генов. Затем провели поиск последовательностей для субъединицы А дипиколинат-синтазы (DpaA) в дополнительном наборе генов. После этого провели полный поиск среди штаммов, перечисленных в таблице 1, последовательностей для субъединиц А и В (DpaA и DpaB), используя Bash-скрипт (Free Software Foundation, 2007).
−6
Вкратце, проделывали следующее. Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, аннотировали в два этапа. Для определения координат генов-кандидатов использовали алгоритм Prodigal (PROkaryotic Dynamic programming Gene-finding ALgorithm (Hyatt et al., BMC Bioinformatics 11:119, 2010)), но это не позволяло описать продукт гена. Тогда гены-кандидаты сравнивали иерархически с более обширной базой данных, начиная с небольшой надежной базы данных, затем брали предметно-ориентированную базу данных среднего объема и, наконец, специально подобранные модели семейств белков. По умолчанию порог величины Е брали 10 для следующих баз данных.
1. Все аминокислотные последовательности бактериальных белков в базе данных UniProt, для которых имеется реальный белок или транскрипт и которые не являются фрагментом. Для поиска использовали программу BLAST+.
2. Все аминокислотные последовательности белков из полных бактериальных геномов в базе данных RefSeq для определенного рода микроорганизмов. Для поиска использовали программу BLAST+.
3. Ряд баз данных профильных скрытых моделей Маркова (HMM), включая Pfam (Punta et al., 2012) и TIGRFAMs (Haft et al., 2013). Для этого использовали HMMscan из пакета программ HMMER 3.1 (Eddy, 2011).
4. Если не находилось совпадений, аминокислотную последовательность помечали как «гипотетический белок»
Эти данные сводили в таблицу наряду с данными по способности микроорганизмов к образованию спор и выживанию в составе сухих композиций (см. таблицу 6), чтобы установить корреляции между дипиколинат-синтазой и жизнеспособностью . Затем проводили выравнивание генов DpaA и DpaB с помощью программы Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) и рассчитывали статистические показатели аминокислотного состава и частоты встречаемости аминокислот с помощью программы Seaview 4 (Gouy et al. Mol. Biol. Evol. 27:221-224, 2010). Затем использовали выравнивания аминокислотных последовательностей, кодируемых генами DpaA и DpaB, для составления консенсусных последовательностей и вероятностных матриц в программной среде R с помощью пакетов программ Biostrings и Seqinr (Pagès et al., 2016; Charif and Lobry, Structural Approaches to Sequence Evolution, pp. 207-232, 2007; R Core Team, 2016).
Таблица 6.
Сводка штаммов, способных к образованию спор и продуцированию дипиколиновой кислоты (DPA)
Штаммы бактерий
Спорообразование
Наличие генов дипиколинат-синтазы
Образование дипиколиновой кислоты
A. pasteurianus
N
NF
ND
A. vinelandii
Y
NF
ND
B. amyloliquefaciens
Y
Y
Y
B. flexus
Y
Y
Y
B. licheniformis
Y
Y
Y
B. megaterium
Y
Y
Y
B. subtilis
Y
Y
Y
Bacillus sp.
Y
Y
Y
C. beijerinckii
Y
NF
Y
C. pasteurianum
Y
NF
ND
L. buchneri
N
NF
ND
L. casei/paracasei
N
NF
ND
L. delbrueckii
N
NF
ND
L. vini
N
NF
ND
O. oncorhynchi
Y
Y
ND
P. chibensis
Y
Y
Y
P. cookii
Y
Y
Y
P. lautus
Y
Y
Y
P. putida
N
NF
ND
Pseudomonas sp.
N
NF
ND
S. griseus
Y
NF
ND
V. halophilus
Y
Y
ND
S. venezuelae
Y
NF
ND
S. pratensis
Y
NF
ND
P. azoreducens
Y
Y
Y
B. firmus
Y
Y
Y
Y - есть; N - нет; NF - не обнаружено; ND - не определяется
Исследование выживания бактерий в составе консорциума
Приготовление образцов жидких препаратов
-1
-5
В процессе хранения жидких препаратов микробиологических консорциумов, объединенных с агрохимикатами, в определенные моменты времени отбирали пробы (1мл) и делали серийные разведения в стерильной пептонной воде от 10 до 10.
Приготовление образцов сухих препаратов
-1
-5
Из хранящихся сухих препаратов микробиологических консорциумов, объединенных с агроносителями, в определенные моменты времени отбирали пробы массой 0,03-1 г, суспендировали каждую в 3 мл культурального бульона (например, пептонной воды или иной подходящей среды) и инкубировали в течение до 1 часа при комнатной температуре. В некоторых случаях для высвобождения бактериальных клеток из сухого носителя применяли мягкую обработку ультразвуком (35 кГц), используя ультразвуковой излучатель с водяной баней (ультразвуковую лабораторную ванну VWR). Затем делали серийные разведения образца в стерильной пептонной воде от 10 до 10 или ином культуральном бульоне. В других случаях сухой препарат добавляли прямо в жидкую культуральную среду.
Анализ выживаемости
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
Обработанным бактериальным штаммам давали возможность размножаться. Чтобы достичь максимального клеточного роста каждого штамма в консорциуме, использовали несколько различных агаровых сред, например chA (полусухой хитин 5 г/л; KHPO 0,7 г/л; KHPO 0,3 г/л; MgSO × 5HO 0,5 г/л; FeSO ×7HO 0,01 г/л; ZnSO 0,001 г/л; MnCl 0,001 г/л; agar 15 г/л); среды RCM, NA, MP, YPD, RhX, AMAS и/или BHIS. В некоторых случаях каждое из указанных выше разведений наносили на одну или более агаровую среду (каждый опыт повторяли) В других случаях полученный, как указано выше, сухой препарат суспендировали в одной или более жидких сред (каждый опыт делали шесть раз). Культуры в чашках инкубировали в статичных инкубаторах в течение 3 суток: один набор в аэробных условиях при температуре 30°C и другой набор в анаэробных условиях при температуре 35°C. Жидкие культуры в пробирках инкубировали в течение 7 суток либо в аэробных условиях с перемешиванием при температуре 30°C или же в анаэробных условиях без перемешивания при температуре 35°C. Бактерии, выжившие после обработки, размножались: в чашках образовывали колонии, а в жидких культурах увеличивалась плотность клеток. Из культур отбирали образцы и определяли клеточный рост количественно путем цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ddPCR).
Из собранных бактериальных клеток выделяли геномную ДНК, используя набор DNeasy PowerLyzer PowerSoil kit (Qiagen, Inc., Джермантаун, шт. Мэриленд, США) согласно рекомендациям производителя. Определяли ДНК количественно с помощью флуориметра Quantas Fluorometer и набора реагентов QuantiFluor dsDNA (Promega Corporation, Мадисон, шт. Висконсин, США USA); для идентификации и количественного определения использовали штамм-специфичные зонды и ddPCR (Dreo et al., Anal. Bioanal. Chem. 406:6513-6528, 2014; Yin, et al., Journal of Microbiological Methods 65:21-31, 2006). Вкратце, проделывали следующее. Для цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ddPCR) образцы ДНК, праймеры и зонды (сконструированные с использованием уникальных последовательностей из генов рибосомной РНК 16S и/или уникальных кодирующих нуклеотидных последовательностей, идентифицированных по сборке всего секвенированного генома, как описано ранее в публикации WO 2018/045004, содержание которой полностью включается в настоящий документ путем отсылки) объединяли с реагентами набора Bio-Rad’s ddPCR Supermix for Probes согласно рекомендациям производителя. Компартменты (капли) получали с помощью генератора микродисперсионных капель QX200™ или AutoDG™ Instrument по инструкциям производителя. Полимеразную цепную реакцию (PCR) осуществляли в амплификаторе Mastercycler nexus gradient (Eppendorf) при температурных условиях, рекомендованных производителем Bio-Rad’s ddPCR Supermix for Probes. Последующий автоматический анализ продуктов амплификации проводили с помощью ридера капель QX200. Анализ концентраций осуществлялся с помощью программного обеспечения QuantaSoft™.
В случае одиночных штаммов определение выживаемости после объединения с жидким или сухим агроносителем проводили путем посева на агаровую среду, наиболее подходящую для данного штамма (см. таблицу 2).
Пример 2. Идентификация нуклеотидных последовательностей, кодирующих дипиколинат-синтазу, у выбранных штаммов бактерий
Субъединица А дипиколинат-синтазы (DpaA)
Выравнивание аминокислотных последовательностей, кодируемых геном DpaA из различных штаммов бактерий, выявило, что они различаются: консервативными являются только 28,4% аминокислотных остатков. Эти результаты представлены в таблицах 7-9 и на фиг. 1. Наиболее отличалась от остальных последовательность DpaA у Oceanobacillus oncorhynchi. По расчетам степени идентичности (%), в которых количество совпадающих аминокислотных остатков было знаменателем, последовательность O. oncorhynchi на 58% идентична консенсусной последовательности при использовании матрицы BLOSUM62. Кроме того, замены аминокислотных остатков имеют место, по-видимому, в той области, которая консервативна у большинства проанализированных штаммов. Выравнивание аминокислотных последовательностей DpaA также показало, что у Virgibacillus halophilus имеются две копии гена DpA - вероятно, в результате его дупликации. Первая копия сильно отличалась (степень идентичности с консенсусной последовательностью 51% по расчетам методом, указанным выше), а вторая копия помимо значительного количества аминокислотных замен оказалась укороченной на 21 аминокислотный остаток. Также у V. halophilus в отличие от всех других вариантов DpaA, которые располагались вслед за нуклеотидной последовательностью DpaB (как часть одного оперона), между этими двумя генами находятся 539 других генов.
Таблица 7.
Количество копий гена DpaA
Штаммы, имеющие гены дипиколинат-синтазы
Количество копийгена DpaA
Bacillus megaterium
1
Bacillus subtilis
1
Paenibacillus cookii
1
Bacillus licheniformis
1
Paenibacillus lautus
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
Bacillus amyloliquefaciens
1
Bacillus sp.
1
Paenibacillus chibensis
1
Bacillus flexus
1
Bacillus firmus
1
Virgibacillus halophilus
2
Paenibacillus azoreducens
1
Таблица 8.
Различия в последовательности генов DpaA
Выбранные сайты
303
100,0%
Полное совпадение (без пропусков, без Х)
262
86,5%
Варьирующие
208
68,6%
Информативные
176
58,1%
Пропуски или X
41
13,5%
Идентичные
54
17,8%
Консервативные (не идентичные)
32
10,6%
Всего консервативных
86
28,4%
Таблица 9.
Аминокислотный состав последовательностей, кодируемых генами DpaA
Аминокислотный состав (все сайты)
Группа 1
30,50%
E
5,7
D
6
Q
3,4
N
3,1
H
2,3
R
4,3
K
5,6
Группа 2
29,90%
I
9,3
L
10,2
M
2,8
V
7,6
Группа 3
33,50%
A
9
P
3,7
S
5,8
G
8,3
T
6,7
Группа 4
4,90%
F
3,2
Y
1,6
Группа 5
1,30%
W
0,1
C
1,2
Субъединица В дипиколинат-синтазы (DpaB)
Выравнивание аминокислотных последовательностей, кодируемых геном DpaB, из различных штаммов бактерий выявило, что они более консервативны, чем последовательности субъединицы А: неизменных аминокислотных остатков в них оказалось 45,5%. Эти результаты представлены в таблицах 10-12 и на фиг.2. Не было обнаружено ни дупликаций, ни значительного укорочения последовательности. Как указывалось выше, у всех штаммов копии гена DpaB располагались в непосредственной близости от гена DpaA как часть одного оперона, за исключением V. halophilus у которого DpaB находится на расстоянии 539 генов в сторону 5`-конца кодирующей цепи ДНК от DpaA.
Таблица 10.
Количество копий гена DpaB
Штаммы, имеющие гены дипиколинат-синтазы
Количество копий гена DpaB
Bacillus megaterium
1
Bacillus subtilis
1
Paenibacillus cookii
1
Bacillus licheniformis
1
Paenibacillus lautus
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
Bacillus amyloliquefaciens
1
Bacillus sp,
1
Paenibacillus chibensis
1
Bacillus flexus
1
Bacillus firmus
1
Virgibacillus halophilus
1
Paenibacillus azoreducens
1
Таблица 11.
Различия в последовательности генов DpaB
Выбранные сайты
202
100,0%
Полное совпадение (без пропусков, без Х)
196
97,0%
Варьирующие
133
65,8%
Информативные
104
51,5%
Пропуски или Х
6
3,0%
Идентичные
63
31,2%
Консервативные (не идентичные)
29
14,4%
Всего консервативных
92
45,5%
Таблица 12.
Аминокислотный состав последовательностей, кодируемых генами DpaB
Аминокислотный состав (все сайты)
Группа 1
30,30%
E
4,8
D
4,7
Q
3,8
N
6,2
H
1,4
R
3,2
K
6,3
Группа 2
29,00%
I
6,5
L
9,8
M
4,3
V
8,4
Группа 3
34,30%
A
8,3
P
6,6
S
5,2
G
7
T
7,1
Группа 4
4,70%
F
3
Y
1,7
Группа 5
1,70%
W
0,6
C
1,1
Корреляция между образованием дипиколиновой кислоты
и наличием генов дипиколинат-синтазы
Определение дипиколиновой кислоты флуориметрическим методом с использованием тербия см. выше. Как видно из таблицы 6, в бактериях Clostridium beijerinckii образуется дипиколиновая кислота, но гены DpaA и DpaB в геноме не выявляются. Мы обнаружили, что C. beijerinckii содержит флавопротеин с железо-серным кластером (Isf), близко родственный электрон-переносящим флавопротеинам (EtfA), который, как установлено ранее, участвует в образовании дипиколиновой кислоты (Orsburn et al., Mol. Microbiol. 75:178-186, 2010). В геноме C. beijerinckii идентифицировано 6 копий гена флавопротеина с железо-серным кластером. Было проведено выравнивание этих нуклеотидных последовательностей с последовательностями isf четырех различающихся бактерий: Archaeoglobus fulgidus, Methanocaldococcus jannaschii, Methanosarcina thermophila и Peptoclostridium difficile (фиг. 3). У Clostridium pasteurianum отсутствовал белок Isf, а у C. pasteurianum не выявлялось образование дипиколиновой кислоты. В Примере 12 представлены дополнительные данные о роли Isf в образовании дипиколиновой кислоты.
Пример 3. Выживание отбранных одиночных штаммов на носителе
Определяли выживаемость бактериальных клеток в объединении с носителем - азомитом (Azomite), который пропитывали одиночными штаммами. Для этого выбрали четыре штамма на основании их способности продуцировать дипиколиновую кислоту (по данным лабораторного анализа) и/или результатов выявления генов дипиколинат-синтазы. Пропитанный бактериями материал держали в сухом виде в условиях хранения в течение 5 суток, после чего определяли выживаемость. Результаты этих опытов представлены в таблице 13. Все (100%) штаммов, в которых имелось детектируемое количество дипиколиновой кислоты (2 из 2) оставались жизнеспособными в течение 5 суток. Из числа штаммов, у которых не было выявлено образования дипиколиновой кислоты в детектируемом количестве, у 50% (1 из 2) сохранялась жизнеспособность в течение 5 суток.
Таблица 13.
Выживание одиночных штаммов бактерий, объединенных с сухим азомитом и образование в них дипиколиновой кислоты.
Микроорганизм
Образование дипиколиновой кислоты
Жизнеспособность в течение 5 суток
Streptomyces venezuelae
0
1
Streptomyces pratensis
0
0
Bacillus firmus
1
1
Paenibacillus azoreducens
1
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Во втором эксперименте взяли большее количество штаммов. Выживаемость бактериальных клеток в азомите определяли на протяжении 1 месяца после пропитывания носителя бактериями. А именно, носитель (Azomite) пропитывали одиночными изогенными штаммами, высушивали и отбирали образцы для анализа на 3-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-й день хранения. Результаты, представленные в таблице 14, показывают, что все (100%; 4 из 4 штаммов) бактерии, у которых были выявлены гены дипиколинать-синтазы и образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не было выявлено генов дипиколинат-синтазы и образования детектируемого количества дипиколиновой кислоты, 40% (2 из 5) оставались жизнеспособными в течение 1 месяца.
Таблица 14.
Выживание одиночных штаммов бактерий, объединенных с сухим азомитом, наличие у них генов дипиколинат-синтазы и образование дипиколиновой кислоты
Микро-организм
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколиновой кислоты
3-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
Bacillus subtilis
1
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus putida
0
0
1
0
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
1
1
1
1
1
Streptomyces griseus
0
0
1
1
1
1
1
Streptomyces venezuelae
0
0
1
0
0
0
0
Streptomyces pratensis
0
0
0
0
0
0
0
Bacillus firmus
1
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus azoreducens
1
1
1
1
1
1
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Затем взяли второй носитель - перлит. Выживаемость бактериальных клеток в перлите определяли на протяжении 1 месяца, как описано выше для азомита. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 15. Они показывают, что все (100%; 4 из 4 штаммов) бактерии, у которых были выявлены гены дипиколинать-синтазы и образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не было выявлено генов дипиколинат-синтазы и образования детектируемого количества дипиколиновой кислоты, 60% (3 из 5) оставались жизнеспособными в течение 1 месяца.
Таблица 15.
Выживание одиночных штаммов бактерий, объединенных с сухим перлитом, наличие у них генов дипиколинат-синтазы и образование дипиколиновой кислоты
Микро-организм
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколиновой кислоты
3-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
Bacillus subtilis
1
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus putida
0
0
1
1
1
1
0
Pseudomonas sp.
0
0
1
1
1
1
0
Streptomyces griseus
0
0
1
1
1
1
0
Streptomyces venezuelae
0
0
1
0
0
0
0
Streptomyces pratensis
0
0
0
0
0
0
0
Bacillus firmus
1
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus azoreducens
1
1
1
1
1
1
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Пример 4. Выживание микробиологического консорциума на носителе
В данном эксперименте культивировали по отдельности 22 штамма бактерий и затем смешивали их, чтобы получить консорциум, как описано выше. Сухой азомит в гранулированной форме пропитывали препаратом этого консорциума в количестве 0,23-0,4 мл (целостность гранул сохранялась), высушивали и держали в условиях хранения в течение 2 недель, после чего определяли, какие бактерии выжили, способом анализа выживаемости микроорганизмов в консорциуме, описанным в Примере 1. Провели два независимых опыта, результаты которых, представленные в таблице 16, показывают, что 83% и 92% штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 2 недель после объединения с носителем (азомитом). У одного штамма (O. oncorhynchi) в двух одинаковых опытах получились разные результаты. Как отмечалось выше, у этого штамма субъединица А дипиколинат-синтазы отличалась сильнее, чем у большинства из остальных исследованных штаммов: ее аминокислотная последовательность лишь на 58% идентична консенсусной последовательности при использовании матрицы BLOSUM62. В случае штаммов, у которых не было выявлено генов дипиколинат-синтазы и образования дипиколиновой кислоты в детектируемом количестве, жизнеспособность через две недели после объединения с носителем сохранялась у 60%-70%. Воспроизводимость в этих двух опытах была низкой, что, возможно, объясняется различным метаболическим состоянием взятого набора микроорганизмов на момент пропитывания ими носителя.
Таблица 16.
Выживание штаммов бактерий, объединенных с сухим азомитом
Род/видбактерий
Гены дипико-линат-синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Опыт 1
Опыт 2
Через 2 недели
Через 2 недели
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
1
0
Paenibacillus lautus
1
0
1
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
0
1
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту
Azotobacter vinelandii
0
0
1
1
Clostridium pasteurianum
0
0
1
1
Lactobacillus buchneri
0
0
1
1
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
1
0
Lactobacillus vini
0
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
1
0
Pseudomonas sp.
0
0
1
1
Streptomyces griseus
0
0
1
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Так же, как в эксперименте с азомитом, описанном выше, 22 бактериальных штамма культивировали по отдельности и затем смешивали в консорциум. Пропитывали перлит препаратом этого консорциума в количестве 2-6 мл, высушивали и держали в течение 2 недель в условиях хранения, после чего определяли выживание бактерий, способом анализа выживаемости микроорганизмов в составе консорциума, описанном в Примере 1. Провели два независимых опыта, их результаты представлены в таблице 17. По этим данным 58% и 100% штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 2 недель после объединения с носителем (перлитом). В случае штаммов, у которых не было выявлено генов дипиколинат-синтазы и образования дипиколиновой кислоты в детектируемом количестве, жизнеспособность через две недели после объединения с носителем сохранялась у 60% и 80% бактериальных клеток. По сравнению с экспериментом, в котором использовался азомит, в случае тех бактерий, у кого были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, воспроизводимость была лучше даже с другим носителем. И по жизнеспособности они превосходили тех, у кого не были выявлены гены дипиколинат- или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемом количестве.
Таблица 17.
Выживание штаммов бактерий в составе консорциума, объединенных с перлитом
Род/вид бактерий
Гены дипико-линат-синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Опыт 1
Опыт 2
Через 2 недели
Через 2 недели
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
0
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
0
1
Paenibacillus lautus
1
0
1
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
1
Clostridium beijerinckii
0
1
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
1
0
Бактерии, не имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуци-рующие дипико-линовую кислоту
Azotobacter vinelandii
0
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
1
Lactobacillus buchneri
0
0
1
1
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
1
1
Lactobacillus vini
0
0
1
0
Pseudomonas putida
0
0
1
1
Pseudomonas sp.
0
0
1
1
Streptomyces griseus
0
0
1
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Пример 4. Выживание микробиологических консорциумов, объединенных с агентами, подавляющими пылевыделение
В описанных ниже экспериментах исследовавшиеся бактериальные штаммы культивировали в полужидких агаровых средах, описанных выше (см. таблицу 2). Получали препараты, объединяющие бактерии с химическими агентами, подавляющими пылевыделение, для чего суспендировали 1 мкл соскоба петлей с поверхности агаровой среды в 200 мкл стерильной пептонной воды и затем смешивали эту суспензию с химическими агентами, подавляющими пылевыделение, в соотношении 5% (объем/объем). Смесь бактерий с агрохимикатом инокулировали в свежую среду (таблица 3) и определяли выживаемость каждого из штаммов консорциума, оценивая признаки клеточного роста.
Выживаемость бактерий, объединенных с MDC-200
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, MDC-200 (ArrMaz, шт. Флорида, США) ). Результаты представлены в таблице18. Эти данные показывают, что 92% (11 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, ни один (0%; 0 из 10 штаммов) не сохранил жизнеспособность по истечении 1 месяца.
Выживаемость бактерий, объединенных с DUSTROL 3275
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, DUSTROL 3275 (ArrMaz, шт. Флорида, США). Результаты представлены в таблице 18. Эти данные показывают, что 100% (12 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, ни один (0%; 0 из 10 штаммов) не сохранил жизнеспособность по истечении 1 месяца.
Выживаемость бактерий, объединенных с DUSTROL 3133
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, DUSTROL 3133 (ArrMaz, шт. Флорида, США). Результаты представлены в таблице 18. Эти данные показывают, что 100% (12 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, ни один (0%; 0 из 10 штаммов) не сохранил жизнеспособность по истечении 1 месяца.
Выживаемость бактерий, объединенных с DUSTROL 3139
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, DUSTROL 3139 (ArrMaz, шт. Флорида, США). Результаты представлены в таблице 18. Эти данные показывают, что 92% (11 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, ни один (0%; 0 из 10 штаммов не сохранил жизнеспособность по истечении 1 месяца.
Выживаемость бактерий, объединенных с DUSTROL 3001
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, DUSTROL 3001 (ArrMaz, шт. Флорида, США). Результаты представлены в таблице 18. Эти данные показывают, что 33% (4 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, ни один (0%; 0 из 10 штаммов) не сохранил жизнеспособность по истечении 1 месяца.
Выживаемость бактерий, объединенных с DUSTROL 3010
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток через 1 месяц после их объединения с агентом, подавляющим пылевыделение, DUSTROL 3010 (ArrMaz, шт. Флорида, США). Результаты представлены в таблице 18. Эти данные показывают, что 75% (9 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными в течение 1 месяца. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, жизнеспособность по истечении 1 месяца сохранилась у 20% (2 из 10 штаммов) из них.
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием. В шести правых столбцах (MDC-200, DUSTROL 3275, 3133, 3139, 3001 и 3010) представлена выживаемость для двух групп бактерий: А) содержат гены дипиколинат-синтазы, продуцируют дипиколиновую кислоту, В) не содержат генов дипиколинат-синтазы, не продуцируют дипиколиновую кислоту.
Пример 5. Выживание микробиологического консорциума,
объединенного с жидким удобрением UAN
Определяли жизнеспособность бактериальных клеток в различные моменты времени на протяжении 1 месяца после их объединения с жидким удобрением - водным раствором мочевины и нитрата аммония (UAN). Вкратце, делали следующее. Взятые для консорциума штаммы бактерий выращивали по отдельности в жидкой культуральной среде (как описано выше) в аэробных либо анаэробных условиях. Полученные культуры смешивали в равных количествах и эту смесь объединяли с удобрением UAN32 в соотношении 1:180 (микроорганизмы:UAN). Данные по выживаемости микроорганизмов, полученные через примерно 1 час после объединения смеси бактериальных культур с удобрением (день 0) и на 7-й, 14-й и 28-й день, представлены в таблице 19. В день 0 были были жизнеспособны 83% (10 из 12) штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, жизнеспособными в день 0 были жизнеспособны только 20% (2 из 10 штаммов). На 7-й день из числа штаммов бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными 67% (8 из 12 штаммов); после этого момента времени в данной группе штаммов жизнеспособность не изменялась. Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, жизнеспособными в день 7 были жизнеспособны только 10% (1 из 10 штаммов).
Таблица 19.
Выживаемость бактерий, объединенных с удобрением UAN, на протяжении месяца
Род/вид бактерий
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколиновой кислоты
UAN - День 0
UAN -  День 7
UAN - День 14
UAN -  День 30
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
0
0
0
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
1
1
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
1
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
0
0
0
0
Paenibacillus lautus
1
0
1
1
1
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
0
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
1
0
0
0
Acetobacter pasteurianus
0
0*
0*
0*
0*
1
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту
Azotobacter vinelandii
0
0
0
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
1
1
1
Lactobacillus buchneri
0
0
0
0
0
0
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
0
0
0
Lactobacillus casei
0
0
0
0
0
0
Lactobacillus vini
0
0
0
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
0
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
0
0
0
0
Streptomyces griseus
0
0
1
0
0
0
1 = 1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием. В четырех правых столбцах представлены результаты для тех моментов времени, когда способом, описанным выше, определяли жизнеспособность бактериальных клеток в препарате консорциума с указанным удобрением.
* В день 30 Acetobacter pasteurianus (этот штамм не продуцирует дипиколиновую кислоту) оказался жизнеспособным, откуда следует, что результаты, полученные для этого штамма в дни 0, 7 и 14, являются ложно-отрицательными.
Пример 6. Выживание микробиологического консорциума, объединенного с биоуглем
В этом эксперименте 22 бактериальных штамма, перечисленных в таблице 4, выращивали по отдельности, затем смешивали, чтобы получить консорциум, как описано выше. Биоуголь (Cool Terra; Cool Planet Energy system, шт. Колорадо, США)) в количестве 1 г пропитывали препаратом консорциума (~ 0,5 мл), высушивали и держали в течение 7 суток в условиях хранения, после чего определяли выживание бактерий описанным выше способом. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 20. Из числа бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, через 7 суток после пропитывания ими биоугля оставались жизнеспособными 66,7% (7 из 12 штаммов). Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, через 7 суток после пропитывания ими биоугля оставались жизнеспособными 30% (3 из 10 штаммов).
Таблица 20.
Выживание бактерий в составе консорциума, объединенного с биоуглем, через 7 суток
Род/вид бактерий
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Через 7 суток
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
0
Paenibacillus cookii
1
1
0
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
0
Paenibacillus lautus
1
0
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
0
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве
Azotobacter vinelandii
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
Lactobacillus buchneri
0
0
1
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
1
Lactobacillus vini
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
0
Streptomyces griseus
0
0
0
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Пример 7. Выживание микробиологического консорциума,
объединенного с сухим гранулированным удобрением
В этом эксперименте 22 бактериальных штамма, перечисленных в таблице 4, выращивали по отдельности, затем смешивали, чтобы получить консорциум, как описано выше. Препарат консорциума смешивали с сухим удобрением - хлоридом калия (MOP 0-0-60) в соотношении 35 мкл/г, как описано выше. Эту смесь держали при комнатной температуре, периодически отбирая образцы для определения выживаемости микроорганизмов, как описано ранее. Результаты представлены в таблице 21. Из числа бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, в течение до 7 суток после объединения с удобрением оставались жизнеспособными 66,7% (8 из 12 штаммов). Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, в течение до 7 суток после объединения с удобрением оставались жизнеспособными 30% (3 из 10 штаммов).
Таблица 21.
Выживание бактерий в составе консорциума, объединенного с хлоридом калия (МОР) через 7 суток
Род/вид бактерий
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Выживание на 7-й день
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
0
Bacillus subtilis
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
0
Paenibacillus cookii
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
1
Paenibacillus lautus
1
0
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
0
Acetobacter pasteurianus
0
0
1
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве
Azotobacter vinelandii
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
Lactobacillus buchneri
0
0
0
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
1
Lactobacillus vini
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
1
Streptomyces griseus
0
0
1
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Также 22 бактериальных штамма, перечисленных в таблице 4, выращивали по отдельности, затем смешивали, получая таким образом консорциум, и пропитывали полученным препаратом однозамещенный фосфат аммония (MAP 11-52-0) в соотношении 35 мкл/г, как описано выше. Это удобрение с бактериями держали при комнатной температуре, периодически отбирая образцы для определения выживаемости микроорганизмов, как описано ранее. Результаты представлены в таблице 22. На этот раз из числа бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, в течение до 7 суток после объединения с удобрением оставались жизнеспособными 58,3% (7 из 12 штаммов). Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, в течение до 7 суток после объединения с удобрением оставались жизнеспособными 40% (4 из 10 штаммов).
Таблица 22.
Выживание бактерий в составе консорциума, объединенного с однозамещенным фосфатом аммония (МАР) через 7 суток
Род/вид бактерий
Гены дипиколинат-синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Выживание на 7-й день
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
0
Bacillus licheniformis
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
0
Bacillus subtilis
1
1
0
Paenibacillus chibensis
1
1
0
Paenibacillus cookii
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
1
Paenibacillus lautus
1
0
1
Virgibacillus halophilus
1
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
1
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве
Azotobacter vinelandii
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
Lactobacillus buchneri
0
0
0
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
0
Lactobacillus vini
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
1
Pseudomonas sp.
0
0
1
Streptomyces griseus
0
0
0
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Пример 9. Выживание микроорганизмов в составе консорциума в связи с экспрессией дипиколинат- синтазы/продуцированием дипиколиновой кислоты
В этом эксперименте 22 бактериальных штамма, перечисленных в таблице 4, выращивали по отдельности и затем смешивали, чтобы получить консорциум, как описано выше. Препарат консорциума держали при комнатной температуре, периодически отбирая образцы для определения выживаемости микроорганизмов, как описано ранее. Результаты представлены в таблице 23.
Через 2 недели из числа бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными 83% (10 из 12 штаммов). Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, за то же время остались жизнеспособными 60% (6 из 10 штаммов) Через 7,5 недель из числа бактерий, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, оставались жизнеспособными 58% (7 из 12 штаммов). Среди штаммов, у которых не были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или не образовывалась дипиколиновая кислота в детектируемых количествах, за то же время остались жизнеспособными 50% (5 из 10 штаммов).
Таблица 23.
Выживание бактерий в составе в истощенной среде
Род/вид бактерий
Гены дипико-линат синтазы
Образование дипиколи-новой кислоты
Через 2 недели
Через 7,5 недель
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
1
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Bacillus flexus
1
1
1
0
Bacillus licheniformis
1
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
1
Bacillus sp.
1
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
0
Oceanobacillus oncorhynchi
1
0
0
0
Paenibacillus lautus
1
0
1
0
Virgibacillus halophilus
1
0
0
0
Clostridium beijerinckii
0
1
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
1
1
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуци-рующие дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве
Azotobacter vinelandii
0
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
0
1
1
Lactobacillus buchneri
0
0
1
1
Lactobacillus delbrueckii
0
0
1
0
Lactobacillus paracasei/casei
0
0
1
1
Lactobacillus vini
0
0
1
1
Pseudomonas putida
0
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
0
0
Streptomyces griseus
0
0
0
0
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Гены дипиколинат-
синтазы» указано наличие/отсутствие обоих генов - DpaA и DpaB. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Пример 10. Выводы по данным о выживании микроорганизмов
Во всех изученных случаях спорообразующие бактерии, у которых были выявлены гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась дипиколиновая кислота, превосходили штаммы, у которых не выявлялись гены дипиколинат-синтазы и не образовывалось детектируемых количеств дипиколиновой кислоты, по выживаемости во времени в составе как жидких, так и сухих объединенных препаратов с агроносителями (см. таблицу 24 и фиг. 4). Следовательно, при составлении консорциумов микроорганизмов, обладающих полезными для растений/почвы признаками, для объединения с агроносителями (влажными и/или сухими) или для обработки посевного материала имеет смысл отбирать спорообразующие и продуцирующие дипиколиновую кислоту микроорганизмы, что обеспечит сохранение у выживающих микроорганизмов таких нужных функциональных способностей, как (перечисленное здесь не имеет ограничительного характера) метаболизм азота и серы, солеустойчивость, солюбилизация неорганических солей, расщепление целлюлозы и хитина, продуцирование фитогормонов, метаболизм железа, дефосфорилирование органического материала. В некоторых случаях этот подход может гарантировать достаточную избыточность действия микроорганизмов в рационально составленном консорциуме, которая позволит удовлетворить потребности нужных сельско-хозяйственных культур, почв и агропрактики, а также соответствовать географической специфике и отвечать нормативным требованиям.
Таблица 24.
Выживание штаммов микроорганизмов в объединенных препаратах с агрохимикатами/носителями
Носитель (изученный период хранения)
Бактерии, имеющие гены дипиколинат-синтазы и/или продуцирующие дипиколиновую кислоту
Бактерии, не имеющие генов дипиколинат-синтазы и/или не продуцирующие дипиколиновую кислоту в детектируемом количестве
MDC-200 (1 месяц)
92%
0%
DUSTROL 3275 (1 месяц)
100%
0%
DUSTROL 3133(1 месяц)
100%
0%
DUSTROL 3139 (1 месяц)
92%
0%
DUSTROL 3001 (1 месяц)
33%
0%
DUSTROL 3010 (1 месяц)
75%
20%
UAN (1 месяц)
67%
0%
Перлит (2 недели)
75-100%
60-80%
Азомит (2 недели)
83,3%
60%
Биоуголь (1 неделя)
66,7%
30%
MOP (1 неделя)
66,7%
30%
MAP (1 неделя)
58,3%
40%
Старая/истощенная среда (7,5 недель)
58%
50%
МАР - однозамещенный фосфат аммония; МОР - хлорид калия; UAN - водный раствор мочевины и нитрата аммония.
Пример 11. Определение положительного влияния микроорганизмов на рост растений
Огуречные семена, предоставленные The Seed Kingdom (Лаббок, шт.Техас, США) предварительно проращивали в течение 4 суток при температуре 22-24°C методом «самокрутки» - в бумажных рулонах (Anchor Paper, Сент-Пол, шт.Миннесота, США), пропитанных разбавленным в воде жидким удобрением NPK (азот/фосфор/калий 25 частей на миллион (ppm)). Горшечную смесь (Sunshine Mix) предварительно обрабатывали модифицированным раствором Хогланда (Hoagland, Calif. Agric. Exp. Stn. Bull. 347:36-39, 1938) следующего состава: P - 30,97 ppm; K - 39,1 ppm; Ca - 40,0 ppm; Mg - 14,59 ppm; S - 20,143 ppm; Fe - 1,010 ppm; Cu - 0,019 ppm; Co - 0,012 ppm; B - 2,44 ppm; Mn - 0,494 ppm; Mo - 0,001 ppm and Zn - 0,056 ppm. Для этой обработки брали 1 л указанного раствора на 1 фунт горшечной смеси. Перед высаживанием предварительно полученных огуречных проростков (отбирали проростки примерно равной длины) в каждый горшок добавляли 1 мл 10%-ного (масса/объем) раствора мочевины. Для каждого опыта (включая контрольный) 17-18 растений располагали случайным образом в лотках и держали в определенных условиях, контролируя температуру (16-24°C) и освещенность (световой период 12 часов). Контрольные горшки содержали по 2 г необработанного перлита. В опытные горшки клали перлит, пропитанный препаратом (2 мл) из 22 микроорганизмов, перечисленных в таблице 4. Перед использованием в этом эксперименте пропитанный перлит хранили в сухом виде в течение 2 недель. Лотки орошали модифицированным раствором Хогланда 3 раза в неделю. Через 28-32 суток у каждого растения брали побеги, высушивали и взвешивали. Эти данные анализировали, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и апостериорный анализ (критерий Тьюки) для сравнения образцов. У растений, в горшках которых перлит был пропитан исходным микробиологическим консорциумом, сухая масса побегов была больше, хотя этот прирост не был статистически значимым (фиг. 5). Как описывалось в Примере 4 (таблица 17) в пропитанном консорциумом перлите из составляющих его микроорганизмов выживали в основном те, у которых выявлялись гены дипиколинат-синтазы и/или образовывалась в детектируемом количестве дипиколиновая кислота.
Пример 12. Микробиологический консорциум,
продуцирующий дипиколиновую кислоту
Чтобы выявить штаммы микроорганизмов, пригодные для составления консорциума, продуцирующего дополнительно дипиколиновую кислоту, провели скрининг имевшейся в наличии микробиологической коллекции. Из хранящихся в среде с глицерином штаммов взяли представителей родов, способных к спорообразованию, реактивировали их в подходящей среде и культивировали в течение 3 суток. Отобрали отдельные выросшие колонии и пересевали их три раза, чтобы гарантировать чистоту культуры. У отобранных штаммов определяли образование дипиколиновой кислоты флуориметрическим методом с тербием, как описано в Примере 1. У штаммов, продуцирующих дипиколиновую кислоту, секвенировали весь геном. Полногеномное секвенирование биологически чистых изолятов проводили с помощью секвенатора Illumina NovaSeq 6000 (Illumina, Inc.; Сан-Диего, шт. Калифорния, США), следуя при создании библиотеки и секвенировании рекомендациям производителя. Для чистых изолятов было сделано в среднем 5 133 928 прочтений со средней длиной 87 пар нуклеотидов. Провели сборку генома de novo с помощью программы SPAdes 3.12.0 (Nurk et al., J. Comput. Biol. 20:714-737, 2013). Собранные контиги аннотировали, используя программу PROKKA (Seemann, Bioinformatics 30(14):2068-2069, 2014). В аннотированных геномах определяли наличие последовательностей, кодирующих субъединицу А (DpaA) и В (DpaB) дипиколинат-синтазы и флавопротеин с железо-серным кластером (Isf; таблица 25). В большинстве случаев у штаммов, продуцирующих дипиколиновую кислоту, имелись оба гена дипиколинат-синтазы (DpaA и DpaB), но не было генов Isf. У всех тех штаммов, которые продуцировали дипиколиновую кислоту, но не содержали генов DpaA и DpaB, имелись одна или больше копий гена Isf . У трех штаммов имелись все три гена (DpaA, DpaB и Isf). Таким образом, выявление образования дипиколиновой кислоты флуориметрическим методом с тербием согласовалось с наличием генов DpaA, DpaB и/или Isf.
Таблица 25.
Полногеномная таксономическая классификация, образование дипиколиновой кислоты и количество копий генов DpaA, DpaB и Isf
Полногеномная идентификация
Образование дипиколиновой кислоты
Количество копий гена
DpaA
DpaB
Isf
Bacillus megaterium
1
1
1
0
Bacillus koreensis
1
1
1
0
Bacillus clausii
1
1
1
0
Clostridium beijerinckii
1
0
0
6
Bacillus subtilis
1
1
1
0
Clostridium sp. (carboxidivorans)
1
0
0
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
0
Clostridium sp. (scatologenes)
1
0
0
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
0
Paenibacillus lautus
1
1
1
0
Brevibacillus sp. (choshinensis)
1
1
1
0
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
0
Bacillus sp. (pocheonensis)
1
1
1
0
Lysinibacillus sp. (fusiformis)
1
1
1
0
Lysinibacillus sp. (chungkukjangi)
1
1
1
0
Bacillus pumilus
1
1
1
0
Rummeliibacillus sp. (pycnus)
1
1
1
0
Bacillus cereus
1
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
0
Bacillus flexus
1
1
1
0
Brevibacillus parabrevis
1
1
1
0
Bacillus aryabhattai
1
1
1
0
Paenibacillus sp. (amylolyticus)
1
1
1
0
Clostridium beijerinckii
1
0
0
11
Bacillus subtilis
1
1
1
0
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
1
1
0
Bacillus sp. (wudalianchiensis)
1
1
1
0
Paenibacillus larvae
1
1
1
0
Bacillus licheniformis
1
3
3
0
Paenibacillus sp. (agaridevorans)
1
1
1
0
Clostridium sp. (tyrobutyricum)
1
0
0
1
Paenibacillus sp. (alvei)
1
1
1
0
Bacillus sp. (selenatarsenatis)
1
1
1
0
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
1
1
0
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
1
1
0
Bacillus firmus
1
1
1
0
Bacillus subtilis
1
1
1
0
Lysinibacillus sp. (chungkukjangi)
1
1
1
0
Paenibacillus sp. (ehimensis)
1
1
1
0
Paenibacillus lactis
1
1
1
0
Bacillus farraginis
1
1
1
0
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
1
1
0
Brevibacillus massiliensis
1
1
1
0
Paenibacillus azoreducens
1
1
1
0
Bacillus litoralis
1
1
1
0
Bacillus endophyticus
1
1
1
0
Paenibacillus xylanexedens
1
1
1
0
Bacillus frigoritolerans
1
1
1
0
Bacillus velezensis
1
1
1
0
Clostridium aerotolerans
1
1
1
1
Sphingomonas koreensis
1
0
0
2
Clostridium beijerinckii
1
0
0
10
Clostridium aerotolerans
1
1
1
2
Brevibacillus sp. (brevis)
1
2
2
0
Bacillus sp. (cereus)
1
1
1
0
Bacillus badius
1
1
1
0
Bacillus aryabhattai
1
1
1
0
Bacillus anthracis
1
1
1
0
Bacillus flexus
1
1
1
0
Bacillus drentensis
1
1
1
0
Bacillus sp. (cuccumis)
1
1
1
0
Paenibacillus peoriae
1
1
1
0
Bacillus sp. (cereus)
1
1
1
0
Bacillus aryabhattai
1
1
1
0
Bacillus sp. (solani)
1
1
1
0
Terribacillus sp. (aidingensis)
1
1
1
0
Bacillus sp. (circulans)
1
1
1
0
Brevibacterium frigoritolerans
1
1
1
0
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
У тех штаммов, у которых было выявлено образование дипиколиновой кислоты, определяли различные метаболические активности (например, но не ограничиваясь перечисленным здесь, обмен азота, обмен серы, солеустойчивость, солюбилизация неорганических солей, расщепление целлюлозы, расщепление хитина, образование фитогормонов, обмен железа, дефосфорилирование органического материала) аналитическими методами, описанными в публикации WO 2018/045004 и в Примере 1. Для включения в микробиологический консорциум отобрали штаммы, обладающие наибольшим числом метаболических активностей, а также в консорциум включили 5 штаммов, которые не продуцировали дипиколиновую кислоту, но обладали нужными метаболическими активностями (см. Пример 1). Штаммы, оказавшиеся пригодными для включения в препарат консорциума (см. Таблицу 26), который в настоящем документе называется «сухой препарат консорциума» (DFC), взяли для объединения с носителем, например бентонитом, перлитом и/или мочевиной.
L
L
Все консорциумы, обсуждающиеся в данном Примере, проходили ферментацию следующим образом. Бактерии - как аэробные, так и анаэробные - культивировали на среде, содержащей 2-10% источника сахара. Аминокислоты, азот и пептиды микроорганизмы получали в одной или более из следующих форм: сывороточный порошок (степень чистоты - для пищевого применения; 0,1-0,5% масса/объем), дрожжевой экстракт (0,1-0,5% масса/объем), экстракт ферментированных соевых бобов, не содержащий генетически модифицированных организмов (0,1-0,5% масса/объем; Ferti-Nitro Plus Plant N; Ferti-Organic; Браунсвилл, шт. Техас, США), спирулина (0,1-0,5% масса/объем) и пептон (0,1-0,5% масса/объем) При необходимости в среду включали дополнительные витамины и микроэлементы в виде экстракта морских водорослей (0,1-0,5% масса/объем), препарат очищенных витаминов группы В (Sigma) и/или питательную жидкость Вольфа, содержащую микроэлементы. При необходимости также добавляли соли в виде солевого раствора, забуференного фосфатом (PBS), и/или раствора хлорида натрия (0-4% масса/объем). Штаммы из AMC1 (см. выше) инокулировали в 2-литровые биореакторы DASGIP (Eppendorf North America Hauppauge, Нью-Йорк, США) с рабочим объемом 1,5 л. В процессе ферментации рН поддерживали между 5,0 и 7,0. Условия аэрации контролировали, варьируя перемешивание, газовый состав (воздух и/или газообразный азот) и скорость газового потока таким образом, чтобы получить нужную скорость переноса кислорода (оценивали по коэффициенту массопереноса ka) в диапазоне ka (в час) от 0 до 110. Температуру поддерживали от 28°C до 35°C.
Таблица 26.
Консорциум DFC, полученный путем совместного культивирования и предназначенный для объединения с носителями или для обработки посевного материала
Таксономическая принадлежность компонентов
Образование дипиколиновой кислоты
Bacillus amyloliquefaciens
1
Bacillus firmus
1
Bacillus flexus
1
Bacillus licheniformis
1
Bacillus megaterium
1
Bacillus pumilus
1
Bacillus koreensis
1
Bacillus drentensis
1
Bacillus subtilis
1
Clostridium bifermentans
1
Clostridium beijerinckii
1
Clostridium pasteurianum
0
Lactobacillus paracasei
0
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
Oceanobacillus oncorhynchi
0
Paenibacillus lautus
1
Paenibacillus azoreducens
1
Paenibacillus chibensis
1
Paenibacillus cookii
1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
Pseudomonas sp.
0
Streptomyces griseus
0
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Для объединения с носителями ферментат DFC наносили на бентонит или перлит и высушивали в течение приблизительно 24 часов В некоторых случаях перед нанесением на носитель ферментат концентрировали путем центрифугирования. В полученных препаратах консорциума с носителем определяли жизнеспособность микроорганизмов. Кроме того, в случае некоторых препаратов консорциума с носителем испытывали, как они влияют на рост растений, чтобы проверить полезные для растений свойства.
Жизнеспособность консорциумов DFC и AMC1, объединенных с носителями.
В испытаниях в полевых условиях использовали жидкий DFC, жидкий AMC1, перлит, пропитанный DFC, перлит, пропитанный AMC1, бентонит, пропитанный DFC и бентонит, пропитанный AMC1; во всех этих препаратах DFC и AMC1 были ферментированными и носитель пропитывали препаратом консорциума в количествах: DFC 2 мл на 1 г носителя, AMC1 1 мл/г. Пропитанные микроорганизмами перлит и бентонит держали в сухом виде в течение 1-3 недель, после чего определяли жизнеспособность микроорганизмов, чтобы установить, сколько штаммов жизнеспособны на момент применения. Также определяли жизнеспособность жидких препаратов DFC и AMC1, хранившихся в течение 1 недели, чтобы установить количество штаммов, жизнеспособных на момент применения. В жидком препарате DFC через неделю хранения были жизнеспособны 16 штаммов из 23, а в жидком препарате AMC1 - 14 из 22 (таблица 27).
Таблица 27.
Жизнеспособность жидких препаратов консорциумов DFC и AMC1 после хранения (старения)
DFC (жидкий препарат)
AMC1 (жидкий препарат)
T0 - момент применения
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
Bacillus flexus
0
1
Bacillus licheniformis
1
1
Bacillus megaterium
1
1
Bacillus subtilis
0
0
Paenibacillus chibensis
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
0
1
Paenibacillus lautus
1
1
Clostridium beijerinckii
1
1
Clostridium pasteurianum
1
1
Lactobacillus paracasei
1
1
Pseudomonas sp.
0
0
Streptomyces griseus
1
0
Bacillus koreensis
0
Bacillus pumilus
1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
Bacillus firmus
0
Clostridium bifermentans
1
Paenibacillus azoreducens
1
Bacillus drentensis
0
Bacillus sp.
0
Virgibacillus halophilus
0
Acetobacter pasteurianus
1
Azotobacter vinelandii
0
Lactobacillus buchneri
1
Lactobacillus delbrueckii
0
Lactobacillus vini
1
Pseudomonas putida
0
Всего жизнеспособных штаммов
16
14
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
В перлите, пропитанном микроорганизмами, в случае DFC сохранили жизнеспособность 17 штаммов из 23, в случае AMC1 - 14 из 22 (таблица 28).
Таблица 28.
Жизнеспособность консорциумов DFC и AMC1 в перлите после хранения (старения)
DFC + перлит
AMC1 + перлит
T0 - момент применения
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
Bacillus flexus
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
Bacillus megaterium
1
1
Bacillus subtilis
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
0
0
Paenibacillus lautus
1
1
Clostridium beijerinckii
1
1
Clostridium pasteurianum
1
1
Lactobacillus paracasei
0
1
Pseudomonas sp.
0
0
Streptomyces griseus
0
0
Bacillus koreensis
1
Bacillus pumilus
1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
Bacillus firmus
1
Clostridium bifermentans
0
Paenibacillus azoreducens
1
Bacillus drentensis
0
Bacillus sp.
1
Virgibacillus halophilus
0
Acetobacter pasteurianus
1
Azotobacter vinelandii
0
Lactobacillus buchneri
1
Lactobacillus delbrueckii
0
Lactobacillus vini
0
Pseudomonas putida
0
Всего жизнеспособных штаммов
17
14
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
В бентоните, пропитанном DFC, через три недели жизнеспособность сохранили 17 штаммов из 23, в случае AMC1 - 14 из 22 (таблица 29). Эти данные показывают, что штаммы, обладающие способностью продуцировать дипиколиновую кислоту, более жизнеспособны при хранении как в жидком виде, так и в сухом в составе препарата с носителем, например с бентонитом или перлитом.
Таблица 29.
Жизнеспособность консорциумов DFC и AMC1 в бентоните после хранения (старения)
DFC + бентонит
AMC1 + бентонит
T0 - момент применения
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
Bacillus flexus
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
Bacillus megaterium
1
1
Bacillus subtilis
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
0
0
Paenibacillus lautus
1
1
Clostridium beijerinckii
1
1
Clostridium pasteurianum
1
1
Lactobacillus paracasei
1
1
Pseudomonas sp.
0
0
Streptomyces griseus
0
0
Bacillus koreensis
0
Bacillus pumilus
1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
Bacillus firmus
1
Clostridium bifermentans
0
Paenibacillus azoreducens
1
Bacillus drentensis
0
Bacillus sp.
1
Virgibacillus halophilus
0
Acetobacter pasteurianus
0
Azotobacter vinelandii
0
Lactobacillus buchneri
1
Lactobacillus delbrueckii
0
Lactobacillus vini
1
Pseudomonas putida
0
Всего жизнеспособных штаммов
17
14
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции.
После хранения (и, соответственно, старения) в течение 3 месяцев перлита, пропитанного DFC, из входящих в его состав микроорганизмов остались жизнеспособными 15 штаммов, а в перлите, пропитанном AMC1, сохранили жизнеспособность 11 штаммов, из которых только один не продуцировал дипиколиновую кислоту (таблицы 30 и 31).
Таблица 30.
Жизнеспособность микроорганизмов консорциума AMC1 в пропитанных им перлите и бентоните после хранения
Образование дипиколиновой кислоты
ПерлитЧерез 3 мес.
БентонитЧерез 3 мес.
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
Bacillus flexus
1
1
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
Bacillus sp.
1
0
0
Bacillus subtilis
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
1
1
Paenibacillus lautus
1
1
1
Virgibacillus halophilus
0
0
0
Clostridium beijerinckii
1
1
1
Acetobacter pasteurianus
0
0
0
Azotobacter vinelandii
0
0
0
Clostridium pasteurianum
0
1
1
Lactobacillus buchneri
0
0
1
Lactobacillus delbrueckii
0
0
0
Lactobacillus paracasei
0
0
1
Lactobacillus vini
0
0
0
Pseudomonas putida
0
0
0
Pseudomonas sp.
0
0
0
Streptomyces griseus
0
0
0
Всего жизнеспособных штаммов
11
13
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
После такого же срока хранения бентонита, пропитанного DFC, из входящих в его состав микроорганизмов остались жизнеспособными 19 штаммов, а в бентоните, пропитанном AMC1, сохранили жизнеспособность 13 штаммов, из которых только три не продуцировали дипиколиновую кислоту (таблицы 30 и 31).
Таблица 31
Жизнеспособность микроорганизмов консорциума DFC в пропитанных им перлите и бентоните после хранения
Образование дипиколиновой кислоты
ПерлитЧерез 3 мес.
БентонитЧерез 3 мес.
Bacillus amyloliquefaciens
1
1
1
Bacillus flexus
1
0
1
Bacillus licheniformis
1
1
1
Bacillus megaterium
1
1
1
Bacillus subtilis
1
1
1
Paenibacillus chibensis
1
1
1
Paenibacillus cookii
1
1
1
Oceanobacillus oncorhynchi
1
1
1
Paenibacillus lautus
1
1
1
Clostridium beijerinckii
1
1
1
Clostridium pasteurianum
0
1
1
Lactobacillus paracasei
0
0
1
Pseudomonas sp.
0
0
0
Streptomyces griseus
0
0
0
Bacillus koreensis
1
0
1
Bacillus pumilus
1
1
1
Paenibacillus sp. (chitinolyticus)
1
1
1
Paenibacillus sp. (P1XP2)
1
1
1
Fontibacillus sp. (panacisegetis)
1
1
1
Bacillus firmus
1
0
1
Clostridium bifermentans
1
0
0
Paenibacillus azoreducens
1
1
1
Bacillus drentensis
1
0
0
Всего жизнеспособных штаммов
15
19
1 - имеется, 0 - не определено или ниже предела детекции. В колонке «Образование дипиколиновой кислоты» представлены результаты флуориметрического определения с тербием.
Оценка положительного влияния консорциума DFC на растения
3
4
2
Огуречные семена, предоставленные The Seed Kingdom (Лаббок, шт.Техас, США)предварительно проращивали в течение 4 суток при температуре 22°C методом «самокрутки» - в бумажных рулонах (Anchor Paper, Сент-Пол, шт. Миннесота, США), пропитанных разбавленным в воде жидким удобрением NPK (азот/фосфор/калий 25 частей на миллион (ppm)). Когда семена были подготовлены к посадке, горшечную смесь (Sunshine Mix) предварительно обрабатывали трикальцийфосфатом (TCP - ортофосфатом кальция (Ca(PO)) в количестве 67,60 кг/га и модифицированным раствором Хогланда (Hoagland, Calif. Agric. Exp. Stn. Bull. 347:36-39, 1938) следующего состава (NK+): N - 56,03 ppm; P - 0 ppm; K - 39,1 ppm; Ca - 40,0 ppm; Mg - 14,59 ppm; S - 20,143 ppm; Fe - 1,010 ppm; Cu - 0,019 ppm; Co - 0,012 ppm; B - 2,44 ppm; Mn - 0,494 ppm; Mo - 0,001 ppm and Zn - 0,056 ppm. Для этой обработки брали 1 л указанного раствора на 1 фунт горшечной смеси. В контрольных горшках также содержалось 10 г не обработанного перлита или 20 г не обработанного бентонита на 1 фунт горшечной смеси. В опытных горшках содержалось столько же перлита или бентонита, сколько в контрольных, но носитель были пропитаны микробиологическим консорциумом DFC: перлит - 2 мл/г, бентонит - 1 мл/г. Пропитанные микроорганизмами перлит и бентонит перед применением держали в сухом виде в условиях хранения в течение 2 недель, после чего определяли жизнеспособность микроорганизмов, чтобы установить, сколько штаммов, входивших в состав DFC, были жизнеспособны на момент применения. Большинство штаммов (15-18 из 23) благополучно пережили объединение с носителем и хранение.
После предварительного проращивания семян отбирали проростки примерно одинаковой длины и высаживали по одному в горшок. Для каждого опыта (включая контрольный) 17-18 растений располагали случайным образом в лотках и держали в определенных условиях, контролируя температуру (16-24°C) и освещенность (световой период 12 часов). Через три дня после высаживания лотки первый раз орошали модифицированным раствором Хогланда следующего состава (PK+): N - 0 ppm; P - 14,49 ppm; K - 19,55 ppm; Ca - 20,0 ppm; Mg - 14,59 ppm; S - 20,143 ppm; Fe - 1,010 ppm; Cu - 0,019 ppm; Co - 0,012 ppm; B - 2,44 ppm; Mn - 0,494 ppm; Mo - 0,001 ppm и Zn - 0,056 ppm. Затем лотки орошали 3 раза в неделю раствором Хогланда NK+. Через 32 суток собирали побеги и для каждого растения определяли сухую массу. Эти данные анализировали, используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) и апостериорный анализ (критерий Тьюки) для сравнения образцов. Данный эксперимент проводили два раза независимо.
Первый раз эксперимент показал значительное увеличение (по сравнению с контролем) массы побегов как в случае перлита, пропитанного DFC, так и в случае бентонита, пропитанного DFC (фиг. 6). По результатам, полученным на второй раз, также имело место значительное увеличение массы побегов в случае жидкого препарата DFC и в случае перлита, пропитанного DFC. При этом перлит, пропитанный DFC, оказался эффективнее жидкого препарата DFC, однако разница не была статистически значимой (фиг. 7). Таким образом, объединение с носителем не влияет существенно на эффективность консорциума микроорганизмов при сравнении с жидким не хранившимся его препаратом.
Пример 13. Обработка посевного материала микроорганизмами
Для обработки микроорганизмами в качестве посевного материала взяли зерна кукурузы и семена из плодов сои; обработку проводили с помощью порционного протравливателя SGS (SGS North America, Брукингс, шт. Южная Дакота, США). В каждом варианте обработки брали по 1 кг посевного материала. В различных вариантах обработки микроорганизмы либо наносили непосредственно на никак не подготовленный посевной материал, либо наносили микробиологический препарат как дополнительную оболочку на посевной материал, предварительно обработанный контактным инсектицидом/фунгицидом (образующим защитную оболочку), либо смешивали микроорганизмы с инсектицидным/фунгицидным средством до нанесения на посевной материал. В случае зерен кукурузы для инсектицидной/фунгицидной обработки использовали комплекс «Acceleron mix», содержащий металаксил, трифлоксистробин, ипконазол и клотианидин, или «CruiserMaxx mix», содержащий тиаметоксам (Cruiser), флудиоксонил, мефеноксам, азоксистробин и тиабендазол. В случае семян из плодов сои инсектицидная/фунгицидная обработка включала либо «Acceleron mix», содержащий металаксил, пираклостробин, имидаклоприд и флкусапироксад, либо «CrusierMaxx mix», содержащий тиаметоксам (Crusier), мефеноксам, флудиоксонил и седексан.
После обработки посевного материала проверяли жизнеспособность микроорганизмов (как в Примере 1) за 48 часов и через 3 недели после этого. Подавляющее большинство штаммов (жизнеспособны были 19-20 из 23 штаммов) благополучно пережило начальный период объединения с указанными выше препаратами. Спустя 3 недели наблюдалось лишь небольшое снижение жизнеспособности (жизнеспособными были 17-18 из 23 штаммов; фиг.8). Это означало, что отобранные штаммы, продуцирующие дипиколиновую кислоту, эффективны в объединении не только для сухих удобрений, например с перлитом и бентонитом, но и для обработки посевного материала. Также определяли всхожесть посевного материала, чтобы проверить, как влияет описанная обработка на его способность прорастать. Проводили холодный тест на энергию прорастания по 100 зерен/семян, повторяя его два раза. Каждую порцию из 100 семян/зерен располагали равномерно на увлажненной крепированной бумаге из целлюлозного волокна и держали при температуре 10°C в течение ночи. Затем поверх семян выкладывали слоем 1 дюйм нестерильный песок, увлажненный на 70% его впитывающей способности и помещали опять в холод (10°C) без освещения на 7 суток. После этого семена держали 4 суток при температуре 25°C. Оценивали проростки, пробившиеся сквозь слой песка. Результаты выражали как долю проростков (%), которые сочли нормальными согласно стандартам Ассоциации аналитиков семян (Association of Official Seed Analysts (AOSA)).По установлениям организации Seed Lab шт. Айова (США) и компании SGS значения 82% или больше считались минимально приемлемыми для представления зерен кукурузы на продажу. При всех описанных обработках результат холодного теста на энергию прорастания получался по меньшей мере 83,8% или больше (таблица 32). Это указывает, что штаммы бактерий, продуцирующие дипиколиновую кислоту - помимо положительного эффекта от обработки ими посевного материала - не влияют отрицательно на его прорастание.
Таблица 32.
Средний показатель в холодном тесте на энергию прорастания зерен кукурузы и семян из плодов сои, обработанных консорциумом DFC
Кукуруза
Соя
Без обработки
DFC
Без обработки
DFC
Без обработки фунгицидом
90,30%
87,50%
87,50%
83,80%
Acceleron
89,30%
87,90%
86,00%
84,90%
CruiserMaxx
88,00%
86,00%
85,00%
88,65%
С учетом множества возможных воплощений данного изобретения согласно настоящему описанию следует отметить, что проиллюстрированные в нем воплощения являются лишь типичными примерами и не ограничивают объем изобретения, который определяется приведенной ниже формулой изобретения. Предметом нашего изобретения является все, что охватывается объемом и сущностью этой формулы изобретения.