Носитель для трансплантируемых клеток для замещения дефекта, полученного при черепно-мозговой травме
CARRIER FOR TRANSPLANTABLE CELLS FOR REPLACEMENT OF A DEFECT OBTAINED WITH A HEAD INJURY

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к нейрохирургии, регенераторной медицине, клеточной биотехнологии, и может быть использовано для расширения арсенала носителей для трансплантируемых клеток (скаффолдов) для лечения тяжелой черепно-мозговой травмы и разработки новых терапевтических подходов, базирующихся на принципах клеточной медицины.
Носители для трансплантируемых клеток так называемые скаффолды представляют собой трехмерные пористые или волокнистые матрицы, основная функция которых состоит в обеспечении механического каркаса для клеток. В идеале скаффолды должны обладать рядом свойств, позволяющих достигнуть формирования полноценной костной или иной биологической ткани. Такими свойствами являются: наличие адгезивной поверхности, способствующей пролиферации и дифференцировке клеток, биосовместимость и отсутствие иммунологического отторжения, нетоксичность, биодеградация, скорость которой соответствовала бы росту собственной ткани, оптимальный размер пор для пространственного распределения клеток, васкуляризации, а также диффузии питательных веществ и удаления продуктов жизнедеятельности. Выбор материала для получения скаффолдов - один из важнейших этапов пластики дефектов. Исходя из того факта, что скаффолды выполняют функции, аналогичные функциям внеклеточного матрикса, основополагающим фактором при выборе материала является его способность к частичной имитации внеклеточного матрикса. В целом можно выделить три основные группы материалов, применяемых при изготовлении скаффолдов: природные полимеры, синтетические полимеры и керамика.
В настоящее время достигнуты определенные успехи в разработке скаффолдов в таких областях медицины, как ортопедия и травматология, сердечно-сосудистая хирургия, челюстно-лицевая хирургия, стоматология.
За прототип предлагаемого устройства выбран известный носитель для трансплантируемых клеток для замещения дефекта, полученного при черепно-мозговой травме, выполненный в виде 3D биодеградируемого скаффолда, содержащего каркас, выполненный с применением хитозана, связанного гидрогелем из гиалуроновой каислоты с посаженными аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия (см. А.В. Балябин, И.В. Мухина «Трансплантация аутологичных нейральных стволовых клеток обонятельного эпителия в терапии последствий тяжелой черепно-мозговой травмы (обзор)» в ж. СТМ 2016 - том 8, №1).
Хитозан - производное линейного полисахарида, макромолекулы которого состоят из случайно связанных р-(1-4)^-глюкозаминовых звеньев и N-ацетил^-глюкозамина. Данный материал обычно получают из хитина, встречающегося в составе оболочек ракообразных, кутикулы насекомых и клеточной стенки грибов. Ряд преимуществ делают хитозан широко используемым в тканевой инженерии. В отличие от синтетических материалов этот природный полимер растворим при рН<5,5 и, соответственно, не требует жестких условий обработки. Наличие боковых катионных групп для присоединения к другим молекулам позволяет комбинировать хитозан с различными биоактивными веществами. Также этот полимер показывает хорошую биосовместимость, отсутствие иммунологического отторжения и, что очень важно, противомикробные свойства в отношении некоторых бактерий и грибов. Механизм, обусловливающий эту способность, до конца не выявлен. По некоторым предположениям, катионные группы хитозана могут связываться с анионными группами клеточной стенки бактерий, нарушая транспорт веществ и подавляя биосинтез, что приводит к гибели бактерий.
Клеточный подход в тканевой инженерии заключается в предварительной посадке стволовых клеток на скаффолды перед трансплантацией носителя в место дефекта. Показано, что такие костные имплантаты в целом обладают лучшей интеграцией с тканями хозяина, а за счет аутологичности клеток отсутствует иммунный ответ.
Однако в известном источнике основное внимание было уделено исследованиям, изучающим способности нейральных стволовых клеток способности дифференцироваться в нейральном и глиальном направлении в зависимости от условий культивирования в специализированных нишах головного мозга, что также является важной проблемой при лечении травматических поражений мозга с помощью клеточных технологий.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке конструкции носителя для трансплантируемых клеток для терапии черепно-мозговой травмы.
Технический результат достигается тем, что в известном носителе для трансплантируемых клеток для замещения дефекта, полученного при черепно-мозговой травме, выполненном в виде 3D биодеградируемого скаффолда, состоящего из каркаса, выполненного с применением хитозана, связанного гидрогелем из гиалуроновой кислоты с посаженными аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия, каркас имеет форму пчелиных сот с внешним диаметром соты 250 мкм, внутренним диаметром соты 150 мкм, высотой соты 250 мкм, в качестве гидрогеля используют высокомолекулярную гиалуроновую кислоту, при этом в качестве исходных материалов для создания 3-х мерных структур используют композицию, состоящую из высокомолекулярного хитозана (80 кДа, степень ацетилирования 0.15) и высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (каталожный номер 9067-32-7) с соотношением по массе 3 части высокомолекулярного хитозана и 1 часть высокомолекулярной гиалуроновой кислоты, посадку аутологичных нейральных стволовых клеток обонятельного эпителия в гидрогель осуществляют на стадии образования нейросфер.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как при проведении патентно-информационных исследований не выявлено источников научно-медицинской информации и патентной документации, которые порочат новизну предлагаемого изобретения, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого устройства.
На фиг. 1 представлена 3D модель биодеградируемого скаффолда, каркас которого выполнен в виде пчелиных сот с внешним диаметром соты 250 мкм, внутренним диаметром соты 150 мкм, высотой соты 250 мкм, в качестве гидрогеля используют высокомолекулярную гиалуроновую кислоту, при этом в качестве исходных материалов для создания 3-мерных структур использовалась композиция, состоящая из высокомолекулярного хитозана (80 кДа, степень ацетилирования 0.15) и высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (каталожный номер 9067-32-7), с соотношением по массе 3 части высокомолекулярного хитозана и 1 часть высокомолекулярной гиалуроновой кислоты.
На фиг. 2 представлена микрофотография носителя.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании носителя трансплантируемых клеток для лечения больных с черепно-мозговой травмой.
При этом: - формирование каркасообразующей молекулы из высокомолекулярного хитозана;
- создание гидрогеля из высокомолекулярной гиалуроновой кислоты;
- определение соотношения по массе высокомолекулярного хитозана (3 части) и высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (1 часть) при сшивании каркаса;
- посадка аутологичных нейральных стволовых клеток обонятельного эпителия вводят в гидрогель на стадии образования нейросфер. Указанные существенные признаки позволяют сформировать гидрогелевый скаффолд-носитель биологически активных клеток, при использовании которого решается комплекс задач, связанных как со структурой дефекта ЧМТ, так и с воспалительными процессами, протекающими в месте травмы. Поскольку механические характеристики носителя совпадают с механическими характеристиками окружающей ткани, в процессе эксперимента не происходило формирования фиброзной капсулы, вызванной механическими повреждениями внеклеточного матрикса головного мозга материалом скаффолда Состав компонентов, на основе которых формировался носитель, и их соотношение по массе обеспечивает механические свойства структуры и инициирует процесс деградации при взаимодействии с окружающими тканями и биологическими жидкостями.
Проведены экспериментальные исследования по эффективности действия состава гидрогеля,на основе высоко-, средне- и низкомолекулярной гиалуроновой кислоты через 7 дней после травмы. Исследования показали, что в отличие от гидрогеля со средне- и низкомолекулярной гиалуроновой кислотой, гидрогель из высокомолекулярной гиалуроновой кислоты оказывает оптимизирующее влияние на функциональное состояние мышей в посттравматическом периоде.
in vivo
Включение биоактивных веществ в структуру скаффолда для их постепенного высвобождения в процессе биорезорбции материала является также очень важной задачей тканевой инженерии. Биоактивные вещества должны не только индуцировать остеогенную дифференцировку, но и привлекать новые стволовые клетки носителя, а также стимулировать ангиогенез. Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни (особенно в физиологических средах), неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности. Включение биоактивных веществ в скаффолд решает несколько основных задач: локализованная доставка оптимальной концентрации ростовых факторов внутрь имплантата, сохранение биологической активности молекул, контролируемое высвобождение веществ в течение необходимого периода времени. Как и сам скаффолд, система доставки должны иметь регулируемую скорость биодеградации, отсутствие токсичности и влияния на структуру матриц. Протестированы гидрогели с посаженными биологически активными клетками - аутологичные нейральные стволовые клетки обонятельного эпителия и аутологичные нейральные стволовые клетки обонятельного эпителия на стадии образования нейросфер. Использование последних показало значительное улучшение результатов поведенческого тестирования, выраженного уменьшения объема поврежденной ткани мозга. Морфофункциональными параметрами оценки биосовместимости скаффолда  являлись визуализация целостности ткани мозга с помощью МРТ и тестирование когнитивного поведения мышей.
1
Томография головного мозга мышей была проведена на высокопольном магниторезонансном томографе Agilent Technologies DD2-400 9.4 Т (400 MHz) с объемной катушкой М2М (Н). Мониторинг физиологических параметров животных (температура, дыхание, ЭКГ) во время проведения томографии проводился на оборудовании фирмы SA Instruments с использованием программы PC-SAM. Во время томографии животные находились под изофлюрановым наркозом. Подогрев животных осуществлялся теплым воздухом с температурой 37°C.
2
2
Для получения диффузионно-взвешенных изображений головного мозга животных была использована импульсная последовательность SEMSDWI (spin echo multi slice, «многослойное спиновое эхо»). Для получения оптимальных по контрасту и разрешению изображений были выбраны следующие параметры: время повторения - 1000 мс, время появления эха было в диапазоне от 20 до 25 мс, количество срезов - 15, толщина одного среза составляла 1 мм, поле зрения - 20×20 мм, размер матрицы - 128×128. Параметры диффузии были выбраны такими, что амплитуда равнялась 23.50 Гс/см, длительность импульсов - 6 мс, время между импульсами - 12 мс, b-фактор был выбран 1500 с/мм. Общая длительность последовательности составляла 8 мин 32 сек.
2
Для получения Т2-взвешенных изображений была использована импульсная последовательность MEMS (multi echo multi slice, «многослойное эхо») с параметрами - время повторения 1300 мс, время появления эха 8 мс, количество эхо - 10, количество накоплений - 4, количество срезов 15, толщина одного среза составляла 1 мм, поле зрения - 20×20 мм, размер матрицы - 128×128. Общая длительность последовательности была 10 мин 39 сек.
Эффективность работы носителя оценивают с использованием магнитно-резонансного томографа. На MP-томограммах головного мозга мыши визуализируется очаг размозжения ткани, неправильной формы, с нечеткими контурами, в области сенсомоторной коры. На 7 сутки после имплантирования 3D биодеградируемого скаффолда с аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия отмечается нарушение структуры ткани в очаге с отторжением некротических масс, которое к 21 суткам уменьшается в объеме на 82,51% (р<0,05) относительно показателя 7 суток. Объем очага повреждения у животного с имплантированием скаффолда с аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия в период с 14-х по 21-е сутки уменьшается относительно показателей контрольного животного на 6,12% (р>0,05) и 65,84% (р<0,05) соответственно, что позволяет сделать вывод о биосовместимости скаффолда. Через 5 месяцев после нейротрансплантации биодеградируемого скаффолда на основе высокомолекулярного хитозана в комплексе с гидрогелем высокомолекулярной кислоты с посаженными аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия, по данным МРТ в области очага повреждения обнаружено образование однородной ткани, которая по интенсивности сравнима с интактной тканью, не имеет выраженной границы с интактной тканью, не накапливает жидкость и не имеет уплотнений. Имплантация через неделю после моделирования ЧМТ в очаг повреждения предлагаемого носителя оказывала положительное действие на способность животных к обучению условным рефлексам на 10 сутки и актуализации следов кратковременной и долговременной памяти в отдаленном периоде.
Структуру носителя формируют непосредственно в объеме фоточувствительной композиции методом двухфотонной фотополимеризации [P.S. Timashev, T.S. Demina, N.V. Minaev, K.N. Bardakova, A.V. Koroleva, O.A. Kufelt, B.N. Chickov, V.Ya. Panchenko, T.A. Akopova, V.N. Bagratashvili. Fabrication of microstructured materials based on chitosan and its derivatives using two-photon polymerization. High Energy Chemistry 07/2015; 49(4):337-340] на установке Micro-3-Dimensional Structuring System (Лазерный центр Ганновера) с использованием второй гармоники фемтосекундного лазера ТеМа-100 (Авеста-Проект). С помощью лазерного излучения по заданной трехмерной модели послойно формируют сшитые области гидрогеля, представляющие собой гексагональный массив взаимно соединенных полых цилиндров из высокомолекулярного хитозана высотой 250 мкм, внешним диаметром 250 мкм и внутренним диаметром 150 мкм. Получают сшитые структуры в виде пчелиных сот диаметром около 3 мм и высотой 250 мкм. Создание изготавливаемых структур проводят в дистиллированной воде до тех пор, пока не отмыт несшитый материал.
Предлагаемый носитель работает следующим образом.
Моделируют тяжелую черепно-мозговую травму методом свободного падения груза. Наркотизированное животное (изофлюран 1,5%) фиксируют в стереотаксической установке для мышей «Narishige» (Япония). Голову животного прижимают к стальной пластине для предотвращения перелома челюсти и достижения горизонтального расположения свода черепа к торцевому участку груза, а также снижения рассеивания энергии удара. Затем на коже головы, свободной от шерсти, и обработанной асептическим раствором, делают срединный продольный разрез (1 см), и производят трепанацию фрезой костей черепа (bregma 2 мм, 2 мм латеральнее от срединной линии). Твердую мозговую оболочку оставляют неповрежденной. Груз, представляющий собой стальной цилиндр весом 4 г, поднимают на высоту 80 см, затем сбрасывают, тем самым нанося удар по области трепанационного окна (диаметр ударной части соответствует трепанационному окну 3 мм). После нанесения травмы кожу животных плотно ушивают хирургической нитью (0,2 мм), шов обрабатывают антисептическим раствором. В течение эксперимента температуру животных поддерживают на уровне 36,5-37,5°C с помощью электрической грелки. После моделирования ЧМТ мышей оставляют для восстановления от наркоза, затем возвращают в жилые клетки. Животным обеспечивают послеоперационный уход и свободный доступ к воде и пище.
На 7 сутки после моделирования черепно-мозговой травмы животных вновь наркотизируют 1,5% раствором изофлюрана. В очаг повреждения имплантируют 3D биодеградируемый скаффолд (2×1 мм) с аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия. Лабораторным животным контрольной группы вводят забуференный физиологический раствор (PBS, 30 мкл).
При моделировании ЧМТ у животных, вследствие нарушения неврологических функций, двигательного и эмоционального поведения, нарушалась способность к обучению, что согласуется с данными литературы. Поведенческие тесты выявили существенные улучшения восстановления когнитивных и моторных функций ЦНС у животных на фоне проведенной нейротрансплантации. Имплантирование через неделю после моделирования ЧМТ в очаг повреждения предлагаемого носителя оказывало протекторное действие, восстанавливая синаптическую пластичность нейронов головного мозга (коры, гиппокампа), лежащих в основе процессов обучения и памяти. Наблюдалось оптимизирующее действие на способность животных к обучению УРПИ на 10 сутки и актуализации следов кратковременной и долговременной памяти в отдаленном периоде.
Выявленные морфологические и функциональные параметры жизнедеятельности мышей свидетельствовали о биосовместимости биодеградируемого материала 3D скаффолда на основе высокомолекулярного хитозана в комплексе с гидрогелем из высокомолекулярной гиалуроновой кислоты с посаженными аутологичными нейральными стволовыми клетками обонятельного эпителия на стадии образования нейросфер. Интересным фактом явилось и то, что была сделана попытка частичного восстановления ткани, утраченной в результате травмы, которая в обычном случае навсегда остается невосполненной, так как на месте зоны повреждения остается киста, окруженная глиальным рубцом и заполненная ликвором. Трансплантация трехмерной оформленной биодеградируемой структуры способствовала формированию ткани мозга на месте поврежденной области при травме.