ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ АКТИВАЦИИ ИЛИ СТИМУЛЯЦИИ Т-КЛЕТОК
THERAPEUTIC USE OF INHIBITORS OF T-CELL ACTIVATION OR STIMULATION

По данной заявке испрашивают приоритет европейской патентной заявки № 16151539.0, поданной от имени HUMANITAS MIRASOLE S.P.A. 15 января 2016 года, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме. Все документы, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
Уровень техники
Сердечная недостаточность (HF) является основной причиной госпитализации, распространенности заболеваний и смертности; часто она встречается в виде конечной стадии патологической гипертрофии сердца и фиброза, обусловленных гемодинамической перегрузкой (Zarrinkoub et al., 2013). Некоторые формы кардиомиопатии, называемые воспалительными кардиомиопатиями, обусловлены аутоиммунностью или иммунными ответами на инфекцию, что указывает на то, что нарушения функции сердца также могут быть результатом заболевания иммунной системы (Bulut et al., 2012). Что интересно, недавние исследования выявили, что в HF, индуцированную гемодинамической перегрузкой, также вовлечен значимый воспалительный компонент (Shioi et al., 1997)(Oka et al., 2012)(Hofmann и Frantz, 2013). Это воспаление характеризуется присутствием в миокарде клеток врожденной иммунной системы (макрофагов) и повышающей регуляцией провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, IL-6 и IL-1β, которые отрицательно влияют на исход заболевания (Shioi et al., 1997)(Ancey et al., 2002)(Souders et al., 2012). Даже несмотря на то, что его конгенное отсутствие можно компенсировать (Lai et al., 2012), введения IL-6 достаточно для запуска процесса, ведущего к патологической гипертрофии сердца (Melendez et al., 2010). Полагают, что врожденные клетки иммунной системы и цитокины содействуют воспалению в сердце, ухудшая исход заболевания. Несмотря на то, что идея воспаления в качестве основного компонента HF консолидирована (Mann, 2002), клинические исследования попыток бороться с HF посредством блокирования цитокинов не были успешными (Yndestad et al., 2006)(Hofmann and Frantz, 2013). Причина этой неудачи может состоять в чрезмерной функции индивидуальных цитокинов (Lai et al., 2012). Следовательно, чтобы идентифицировать более подходящие мишени иммунотерапии для HF, авторам изобретения нужно лучше охарактеризовать вовлеченность и иерархию различных растворимых иммунных медиаторов и клеток врожденной и адаптивной иммунной системы при заболевании.
Врожденная иммунная система действует через продуцирование цитокинов в качестве неспецифической, но эффективной и быстрой линии защиты от патогенов. Однако во время длительных ответов это становится объектом контроля со стороны T-лимфоцитов (T-клеток) адаптивной иммунной системы (Loke et al., 2007), которые, наряду с B-клетками, опосредуют антиген-специфические иммунные ответы. Следовательно, T-клетки, если вовлечены в патогенез HF, могут стать привлекательными и более специфическими иммунологическими мишенями для терапевтического вмешательства. Это допущение подтверждено причастностью T-клеток к индуцированному перегрузкой давлением фиброзу сердца (Yu et al., 2006).
Сущность изобретения
Авторы изобретения идентифицировали иммунные медиаторы, вовлеченные в индуцированную перегрузкой давлением HF, обнаружив, что T-клетки инфильтрируют патологически гипертрофированный миокард, наряду с их ролью в длительном воспалении. Фактически, воспаление является ключевым фактором, отличающим патологическую гипертрофию от физиологической, «доброкачественной» гипертрофии, которая возникает во время физической подготовки. Воспользовавшись преимуществом присутствия T-клеток, авторы изобретения использовали абатацепт - одобренный FDA слитый белок CTLA4-Ig (представленный на рынке под торговым названием ORENCIA), который блокирует костимуляцию T-клеток, избирательно ингибирует провоспалительную функцию T-клеток (Moreland et al., 2006) -чтобы значительно снижать нарушение функции сердца в модели HF на мышах. абатацепт системно ингибировал активацию T-клеток и снижал T-клеточную инфильтрацию сердца, что вело к снижению гибели кардиомиоцитов через механизм, зависящий от противовоспалительного цитокина интерлейкина 10 (IL-10). В совокупности, находки авторов настоящего изобретения указывают на то, что T-клетки вовлечены в развитие патологической гипертрофии сердца и что вмешательство в их активацию с применением, например, существующих клинически валидированных стратегий имеет потенциал, чтобы стать терапевтической опцией для сердечной недостаточности.
Подробное описание изобретения
Следовательно, целью изобретения является ингибитор костимуляции и/или активации и/или функции T-клеток для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов. Предпочтительно, указанный ингибитор представляет собой ингибитор по меньшей мере одной молекулы, способствующей костимуляции T-клеток. Более предпочтительно указанный ингибитор увеличивает уровни IL-10 в сердце. Уровни IL-10 относятся к уровням мРНК или белка. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный ингибитор содержит или состоит из по меньшей мере одной молекулы, выбранной из группы, состоящей из: CTLA4, PD-1, PD-L1 или PD-L2, BTLA, CD160, LAG-3, 2B4, B7-H3, B7-H4, B7S3, BTNL2, блокирующих антител против CD28, их функционального фрагмента, функциональной производной или функционального аналога. Предпочтительно, молекулу, способствующую костимуляции T-клеток, выбирают из группы, состоящей из: B7-1 и B7-2 (также известного как CD80 и CD86), CD40, CD40L (также известного как CD154), OX40, OX40L, CD30, CD30L, 4-1BB, 4-BBL, GITR, лиганда GITR, LIGHT, CD27, CD45RB, CD2, LFA-3, B7-H3, B7-H4, ICOS и лигандов ICOS. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ингибитор представляет собой по меньшей мере одну молекулу, выбранную из группы, состоящей из: блокирующего антитела или его функционального фрагмента или низкомолекулярного ингибитора или полинуклеотида. Предпочтительно, указанный ингибитор представляет собой молекулу, содержащую или состоящую из CTLA4 или его функционального фрагмента или функционального производного или функционального аналога. Более предпочтительно, ингибитор представляет собой молекулу CTLA4-Ig или ее функциональный фрагмент или функциональное производное или ее функциональный аналог. Предпочтительно указанная молекула CTLA4-Ig представляет собой слитый белок, содержащий первую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки, соответствующие внеклеточному домену CTLA4, и вторую аминокислотную последовательность, содержащую Fc-область иммуноглобулина IgG1. Более предпочтительно указанная молекула CTLA4-Ig содержит или по существу состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 или ее функционального фрагмента или функционального производного или ее функционального аналога. В более предпочтительном варианте осуществления указанный ингибитор представляет собой абатацепт. Другие цели изобретения представляют собой молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ингибитор, как определено выше, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов; экспрессирующий вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту или кодирующий ингибитор, как определено выше, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов; генетически сконструированную клетку-хозяина или наночастицу или микровезикулу, которая экспрессирует ингибитор, как определено выше, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов. Дополнительная цель изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор как определено выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше, или экспрессирующий вектор, как определено выше, или генетически сконструированную клетку-хозяина или наночастицу или микровезикулу, как определено выше, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов. Ингибитор, как определено выше, предпочтительно выбирают из:
a) полинуклеотида;
b) полипептида;
c) полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид;
d) вектора, содержащего или экспрессирующего указанный полинуклеотид по a) или c);
e) генетически сконструированной клетки-хозяина, способной экспрессировать в подходящих условиях, указанный полипептид или указанный полинуклеотид по a) или c);
f) низкомолекулярного соединения;
g) антитела или его синтетического или рекомбинантного производного.
Патологии сердца включают по меньшей мере одну патологию выбранную из группы, состоящей из: заболеваний сердечной недостаточности; сердечной недостаточности после миокардита; болезни коронарных артерий, которая может вести к сердечным приступам и слабости сердечной мышцы; первичной слабости сердечной мышцы, которая может быть следствием вирусных инфекций или токсинов, например, длительного воздействия алкоголя; заболевания клапанов сердца, вызывающего слабость сердечной мышцы, что может быть обусловлено слишком большой утечкой крови или ригидностью сердечной мышцы от блокированного клапана; и гипертензии (высокого кровяного давления). Более редкие причины указанных патологий включают гипертиреоидизм (высокий тиреоидный гормон), дефицит витаминов и избыток амфетамина («скорости»). Указанные связанные симптомы патологий сердца предпочтительно представляют собой фиброз сердца и/или одышку (диспноэ) и/или кардиологическую астму (сердечную астму) и/или депонирование крови (стаз) в общей (системной) циркуляции организма или в (портальной) печеночной циркуляции и/или опухание (отек) и/или синюшность или сумеречность (цианоз) и/или увеличении (гипертрофию) сердца. В некоторых вариантах осуществления сердечная недостаточность не является воспалительной кардиомиопатией, обусловленной аутоиммунностью. В некоторых вариантах осуществления сердечная недостаточность не является воспалительной кардиомиопатией, обусловленной иммунным ответом на инфекцию. Такая инфекция, например, может представлять собой вирусную инфекцию или, например, бактериальную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления сердечная недостаточность не является воспалительной кардиомиопатией, обусловленной аутоиммунностью или иммунным ответом на инфекцию (например: не обусловлена иммунным ответом на вирусную инфекцию).
В контексте настоящего изобретения «ингибитор активации T-клеток» обозначает средство, способное ингибировать или снижать активацию T-клеток. Для целей данного изобретения, «активацию» определяют как стимулирующий сигнал (также известный как «сигнал 1»), получаемый T-клетками через их T-клеточный рецептор (например, через антиген в комплексе с главной молекулой гистосовместимости или через антитела против CD3), который сам по себе не достаточен для того, чтобы вызывать T-клеточный ответ в наивных T-клетках. Для полностью функционального T-клеточного ответа необходим второй сигнал (также известный как «сигнал 2»), который не зависит от антигена и который костимулирует T-клеточный рецептор. Этот второй сигнал называют, для целей данного изобретения, «костимуляцией». Более подробно об определении костимуляции см. в A Sharpe 2009 Immunological Reviews 2009: 229(1): 5-11.
После активации и костимуляции, T-клетки проявляют фенотип активированной (или функциональной) T-клетки. Выражение «активированная (или функциональная) T-клетка» описывает T-клетки или B-клетки, которые могут проявлять некоторые из следующих фенотипов: активацию T-клеток можно измерять с помощью способов, не ограниченных следующим: экспрессия CD69, CD25, HLA-DR, CD62L и/или CDl 54 и/или продуцирование IL-2, мобилизация кальция, фосфорилирование ZAP-70, фосфорилирование LAT, фосфорилирование Lck, активация NF-κB, активация MEK, активация NFAT, активация Ap-I; T-клеточная пролиферация и цитотоксичность (определена как способность уничтожать клетки-мишени).
В контексте настоящего изобретения «ингибитор костимуляции T-клеток» обозначает средство, способное ингибировать или снижать костимуляцию T-клеток. В контексте настоящего изобретения «ингибитор функции T-клеток» обозначает средство, способное ингибировать или снижать активацию, костимуляцию, дифференцировку или функцию T-клеток. Термин «ингибировать», «уменьшать», «снижать» или «подавлять» относится к снижению конкретного параметра (например, по меньшей мере приблизительно 1,1-кратному, 1,25-кратному, 1,5-кратному, 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному, 5-кратному, 6-кратному, 8-кратному, 10-кратному, 12-кратному или даже 15-кратному или более снижению) и/или снижению или уменьшению конкретной активности по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100%. В конкретных вариантах осуществления ингибирование или снижение ведет к небольшой или по существу не поддающейся обнаружению активности (самое большее, незначительному количеству, например, меньше приблизительно 10% или приблизительно 5%). Неограничивающие примеры ингибитора в соответствии с изобретением представляют собой антитело или его фрагмент или другой лиганд или его фрагмент, который специфически связывает и/или ингибирует активность белка CD3, белка CD40, белков семейства B7 и/или белков семейства CD28; циклоспорин; FK504; стероиды; и/или вещества, направленные на молекулы MHC-I и/или MHC-II, иммуносупрессорные лекарственные средства, интерфероны, кортикостероиды, азатиоприн, циклофосфамид и т. д. Также включены ингибиторы, которые снижают или ингибируют активность CD3 (например, моноклональное антитело OKT<(R)>3), CD40, B7 и/или CD28 в T-клетках на транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и/или посттрансляционном уровне, терапия, которая направлена на факторы транскрипции активации T-клеток, например, ингибиторы киназы IKB (IKK), которые также ингибируют фактор транскрипции, энхансер легкой цепи ядерного фактора каппа в B-клетках (NF-κb), или циклоспорин, который ингибирует путь кальциневрина, важный для активации фактора транскрипции, ядерного фактора активированных T-клеток. Также включены базиликсимаб (против CD25), алефацепт (слитый LFA3-Ig; блокирует CD2), даклизумаб (против CD25), тисабри (против VLA4) и Ab против CLA4. Другие ингибиторы, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь этим, инфликсимаб (mAb против IgE; направлено на тучные клетки и базофилы) и люмиликсимаб (против CD23; направлено на тучные клетки и базофилы).
Белок-предшественник IL-10 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_000563.1 GI:10835141. CTLA4 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_005205.2 GI:21361212 и NP_001032720.1 GI:83700231. PD-1 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_005009.2 GI: 167857792. PD-L1 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001300958.1 GI: 930425329, NP_001254635.1 GI: 390979639, NP_054862.1 GI: 7661534. PD-L2 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_079515.2 GI: 190014605. BTLA можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_861445.3 GI: 145580621, NP_001078826.1 GI: 145580619. CD160 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_008984.1 GI: 5901910. LAG-3 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_002277.4 GI: 167614500. 2B4 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_057466.1 GI: 7706529, NP_001160136.1 GI: 262263438, NP_001160135.1 GI: 262263435. B7-H3 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001019907.1 GI: 67188443, NP_079516.1 GI: 13376852. B7-H4 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001240779.1 GI: 359718947, NP_001240778.1 GI: 359718944, NP_078902.2 GI: 99028881. B7S3 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI:NP_001272892.1 GI: 552953846, NP_001272894.1 GI: 552953752. BTNL2 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001291490.1 GI: 752292706.
B7-1 (также известный как CD80) можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_005182.1 GI: 4885123. B7-2 (также известный как CD86) можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001193854.1 GI: 332634954, NP_001193853.1 GI: 332634950, NP_795711.1 GI: 332634944, NP_787058.4 GI: 332634934, NP_008820.3 GI: 332634929. CD40 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001289682.1 GI: 720642787, NP_690593.1 GI: 23312371, NP_001241.1 GI: 4507581. CD40L (также известный как CD154) можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_000065.1 GI: 4557433. OX40 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_003318.1 GI: 4507579. OX40L можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001284491.1 GI: 662033902, NP_003317.1 GI: 4507603. CD30 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001268359.2 GI: 597709797, NP_001234.3 GI: 597709795. CD30L можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001239219.1 GI: 356582497, NP_001235.1 GI: 4507607. 4-1BB можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001552.2 GI: 5730095. 4-BBL можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_003802.1. GITR можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_683700.1 GI: 23238197, NP_683699.1 GI: 23238194, NP_004186.1 GI: 4759246. Лиганд GITR можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_005083.2 GI: 157419142). LIGHT можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_742011.2 GI: 291045244, NP_003798.2 GI: 25952144). CD27 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001233.1 GI: 4507587. CD45RB можно представить последовательностью с номером доступа NCBI: NG_007730. CD2 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001758.2 GI: 156071472. LFA-3 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001138294.1 GI: 221316575, NP_001770.1 GI: 4502677. B7-H3 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001019907.1 GI: 67188443, NP_079516.1 GI: 13376852. B7-H4 можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001240779.1 GI: 359718947, NP_001240778.1 GI: 359718944, NP_078902.2 GI: 99028881. ICOS (также известный как B7-H2) можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_036224.1 GI: 15029518. Лиганды ICOS можно представить последовательностью с номерами доступа NCBI: NP_001269981.1 GI: 545688894. Ингибиторы в соответствии с изобретением предпочтительно представляют собой моноклональные блокирующие антитела или их фрагменты, ScFv или растворимые слитые белки ингибиторных молекул. Антиген 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA4), который также известен как CD152, представляет собой белок, участвующий в регуляции иммунной системы. Встречаемый в природе CTLA4 описан в патентах США №№ 5434131, 5844095 и 5851795. Природные белки CTLA4 кодирует ген CTLA4. CTLA4 представляет собой белок клеточной поверхности, который имеет N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и C-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывается и/или взаимодействует с антигенами-мишенями, такими как CD80 и CD86, служит в качестве природного прерывателя T-клеточной стимуляции. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен молекулы CTLA4 начинается с метионина в положении +1 и заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124; в других вариантах осуществления внеклеточный домен начинается аланином в положении ~1 и заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +124.
Молекула CTLA4 представляет собой молекулу, содержащую внеклеточный домен антигена 4 цитотоксических T-лимфоцитов (CTLA4). В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CTLA4 содержит часть белка CTLA4, которая распознает и связывает по меньшей мере один антиген B7 (CD80/86), такой как антиген B7, экспрессируемый на B-клетках и APC. Внеклеточный домен также может содержать фрагменты или производные CTLA4, которые связывают антиген B7. Внеклеточный домен CTLA4 также может распознавать и связывать CD80 (B7-1) и/или CD86 (B7-2). Внеклеточный домен также может содержать фрагменты или производные CTLA4, которые связывают CD80 и/или CD86. Молекула CTLA4 может представлять собой слитый белок, где слитый белок определяют как одну или несколько аминокислотных последовательностей, соединенных вместе, используя способы, хорошо известные в данной области. Соединенные аминокислотные последовательности тем самым формируют один слитый белок. В некоторых вариантах осуществления молекула CTLA4 содержит по меньшей мере часть иммуноглобулина, такую как Fc-часть иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления молекула CTLA4 представляет собой выделенную и очищенную молекулу CTLA4. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор T-клеточной костимуляции содержит внеклеточный домен CTLA4 или его функциональный фрагмент или иммунологически активный вариант. Ингибитор T-клеточной костимуляции может связывать антиген B7, экспрессируемый на B-клетках или других антигенпредставляющих клетках (APC). В некоторых вариантах осуществления антиген B7 экспрессируют B-клетки и APC. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой абатацепт. Абатацепт представляет собой растворимый слитый белок, который состоит из внеклеточного домена CTLA-4 человека, связанного с модифицированной Fc (шарнир, домены CH2 и CH3) частью иммуноглобулина G1 человека (IgG1). Абатацепт получают с помощью рекомбинантной D A технологии в экспрессирующей системе клеток млекопитающего. Кажущаяся молекулярная масса абатацепта составляет 92 кДа. Абатацепт разработан в Bristol-Myers Squibb и раскрыт, например, в патенте США 5851795, патенте США 7455835 и публикации патента США 2001 1/31 1529. Абатацепт избирательно связывается с CD80 и CD86, тем самым блокируя взаимодействие с CD28 и препятствуя T-клеточной активации. Он ингибирует активацию наивных T-клеток и, таким образом, имеет потенциал к избирательному ингибированию T-клеточного ответа на конкретные антигены вместо обширной иммуносупрессии. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит носитель на масляной основе, такой как эмульсия «вода-в-масле» (например, IFA или Montamide ISA). Композицию можно вводить посредством внутривенной инфузии, например, приблизительно в 50-200 мл физиологического раствора или в дозе в диапазоне приблизительно от 5 мг/кг приблизительно до 50 мг/кг или в дозе в диапазоне приблизительно от 250 до 2000 мг или в дозе 500 мг, 750 мг или 1000 мг.
Дозы средств могут варьировать в зависимости от субъекта и способа введения, в публикации патентной заявки США № US 2003/0083246 и публикации патентной заявки США № US 2004/0022787 приведены доза и схемы введения для CTLA4Ig, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, для лечения ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Все включено в настоящее описание посредством ссылки. Эффективное количество молекулы CTLA4Ig может представлять собой количество приблизительно от 0,1 до 100 мг/кг массы субъекта. В другом варианте осуществления эффективное количество представляет собой количество приблизительно от 0,1 до 20 мг/кг массы субъекта. В конкретном варианте осуществления эффективное количество CTLA4Ig составляет приблизительно 2 мг/кг массы субъекта. В другом конкретном варианте осуществления эффективное количество CTLA4Ig составляет приблизительно 10 мг/кг массы субъекта. В другом конкретном варианте осуществления эффективное количество CTLA4Ig составляет 500 мг для субъекта массой меньше 60 кг, 750 мг для субъекта массой 60-100 кг и 1000 мг для субъекта массой больше 100 кг. Эффективное количество молекулы CTLA4Ig можно вводить субъекту ежедневно, еженедельно, ежемесячно и/или ежегодно, за один или несколько раз в час/сутки/неделю/месяц/год, в зависимости от необходимости. Например, в одном из вариантов осуществления эффективное количество молекулы CTLA4Ig изначально можно вводить один раз каждые две недели в течение месяца и затем после этого один раз каждый месяц. Введение молекул CTLA4Ig по изобретению может представлять собой внутривенную инфузию от 30 минут до одного или нескольких часов. Альтернативно, необходимую дозу можно доставлять одной или несколькими подкожными инъекциями. Обычно во время ранней фазы лечения используют путь введения через внутривенную инфузию в течение 30 минут. Дозу можно повторять через 2 и 4 недели после начальной дозы, затем каждые 4 недели после этого. Ее можно вводить отдельно или с лекарственными средствами, модифицирующими заболевание, которые отличны от антагонистов TNF. Подкожная инъекция представляет собой типичный способ введения, используемый во время фазы поддержания. Например, после одной внутривенной инфузии в качестве загрузочной дозы (в соответствии с приведенными выше категориями массы тела), 125 мг, вводимые посредством подкожной инъекции, можно давать за сутки, после чего следует 125 мг подкожно раз в неделю. Пациенты, которые не способны принимать инфузию, могут инициировать еженедельные инъекции подкожно без внутривенной загрузочной дозы. Пациенты, переходящие от внутривенной терапии к подкожному введению, могут вводить первую подкожную дозу вместо следующей внутривенной дозы по схеме.
Мономер абатацепта содержит полипептид CTLA4-Ig со следующей последовательностью:
MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID № 1)
Внеклеточный домен CTLA4 соответствуют а. о. 1-125 в SEQ ID № 1. Функциональные производные CTLA4 содержат его варианты. Молекулы CTLA4-Ig могут иметь мутантные последовательности или дикого типа, например, в отношении последовательностей внеклеточного домена CTLA4 и константной области иммуноглобулина. Молекула мономера CTLA4-Ig может содержать внеклеточный домен CTLA4 человека. В одном из вариантов осуществления внеклеточный домен может содержать нуклеотидную последовательность из нуклеотидов 89-463 из SEQ ID № 1, как раскрыто в EP1962886, которые кодируют SEQ ID № 1. В другом варианте осуществления внеклеточный домен может содержать мутантные последовательности CTLA4 человека. В другом варианте осуществления внеклеточный домен может содержать такие изменения нуклеотидов в нуклеотидах 89-463 из SEQ ID № 1, как раскрыто в EP1962886, что получают консервативные замены аминокислот. В другом варианте осуществления внеклеточный домен может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентична нуклеотидам 89-463 из SEQ ID № 1, как раскрыто в EP1962886. В одном из вариантов осуществления молекула мономера CTLA4-Ig содержит модифицированную шарнирную область IgG1 человека (нуклеотиды 464-508 из SEQ ID № 1, как раскрыто в EP1962886; аминокислоты 152-166 из SEQ ID № 2), в которой серины в аминокислотных остатках 156, 162 и 165 из SEQ ID № 1 сконструированы из цистеинов, присутствующих в последовательности дикого типа. Варианты CTLA4 необязательно содержат по меньшей мере одну модификацию аминокислоты в нативном белке CTLA4 или в SEQ ID № 1. В этом варианте осуществления одну или несколько модификаций выполняют в одном или нескольких из следующих положений (нумерация по SEQ ID № 1): 29, 30, 31, 33, 35, 49, 51, 53, 59, 61, 63, 64, 93, 95, 97, 98, 102, 103, 104, 105 или 106. В некоторых вариантах осуществления модификация представляет собой одну или несколько из следующих замен: A29E, A29F, A29H, A29K, A29N, A29Q, A29R, T30E, T30H, T30R, T30V, E31D, E31I, E31M, E31T, E31V, R33E, R33F, R331, R33L, R33M, R33Q, R33T, R33W, R33Y, T35D, T35E, T35F, T35M, T35V, T35Y, A49D, A49E, A49F, A49T, A49W, A49Y, T51D, T51E, T51H, T51L, T51N, T51Q, T51R, T51S, T51V, M53E, M53F, M53H, M53Q, M53W, M53Y, T59H, T59I, T59L, T59N, T59Q, T59V, T59Y, L61A, L61D, L61E, L61F, L61G, L61H, L61I, L61,K, L61M, L61N, L61P, L61Q, L61R, L61S, L61T, L61V, L61W, L61Y, D63E, S64K, S64R, S64Y, K93D, K93E, K93F, K93H, K93N, K93Q, K93R, K93S, K93T, K93V, K93W, K93Y, E95D, E95H, E95L, E95Q, E95Y, M97D, M97F, M971, M97N, M97V, Y98F, Y98W, Y102F, Y102W, Y103D, Y103E, Y103F, Y103H, Y103N, Y103Q, Y103W, L104F, L104H, L104M, L104V, L104Y, G105D, G105E, I106E и I106Y. В некоторых вариантах осуществления конкретное применение имеют варианты CTLA4, которые имеют одну или несколько замен, выбранных из A29H, T51N, M53Y, L61E и K93Q, с комбинациями конкретного применения, в том числе A29H/K93Q, A29H/M53Y, A29H/T5 IN, T51N/K93Q, T51N/M53Y, A29H/L61E/K93Q, A29H/M53Y/K93Q, A29H/M53Y/L61E, A29H/T51N/L61E, M53Y/L61E/K93Q, T51N/L61E/K93Q, T51N/M53Y/L61E, A29H/M53Y/L61E/K93Q, A29H/T51N/L61E/K93Q, A29H/T51N/M53Y/K93Q, A29H/T51N/M53Y/L61E, T51N/M53Y/L61E/K93Q и A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q.
n
Можно выполнять любые комбинации индивидуальных замен, любых и всех возможных комбинаций, и индивидуальное положение или замену можно независимо включать или исключать из списка возможностей. В целом, по сравнению с дикого типа CTLA4 или исходным CTLA4 (или Fc-область), в целом варианты по изобретению имеют 1, 2, 3, 4 или 5 замен аминокислот в области CTLA4, несмотря на то, что в некоторых случаях можно использовать больше замен, до тех пор, пока сохранена желаемая функция. Таким образом, домен Fc также аналогично может иметь замены. Варианты CTLA4 в целом сохраняют или усиливают связывание с одним или несколькими лигандами CTLA4, например, усиленное связывание с B7-1 и/или B7-2. Fc-часть состоит из Fc-области или некоторой части Fc-области антитела. В определенных вариантах осуществления полипептиды представляют собой белки, которые представляют собой слияния CTLA4 с Fc-областью антитела. Под «Fc» или «Fc-область», как используют в настоящем описании, понимают полипептид, содержащий константную область антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина и, в некоторых случаях, части шарнира. Таким образом, Fc относится к последним двум доменам константной области иммуноглобулина IgA, IgD и IgG и последним трем доменам константной области иммуноглобулина IgE и IgM и гибкому шарниру на N-конце этих доменов. Для IgA и IgM, Fc может содержать J-цепь. Под «Fc полипептидом», как используют в настоящем описании, понимают полипептид, который содержит Fc-область целиком или частично. Fc полипептиды включают антитела, слияния Fc, выделенные Fc и фрагменты Fc. Белки CTLA4 можно связывать с Fc-областями через линкер. Термин «линкер» используют для обозначения полипептидов, содержащих два или больше аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, и используемых для соединения одной или нескольких антиген-связывающих частей. Различные линкеры могут находить применение в некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем описании, для ковалентного соединения Fc-областей с партнером слияния. «Линкер» в настоящем описании также обозначают как «линкерная последовательность», «спейсер», «связывающая последовательность» или их грамматические эквиваленты. Можно использовать несколько стратегий для ковалентного связывания молекул вместе. Они включают, но не ограничиваясь этим, полипептидные связи между N- и C-концами белков или доменов белков, соединение через дисульфидные связи и соединение через химические сшивающие реактивы. В одном из аспектов этого варианта осуществления, линкер представляет собой пептидную связь, создаваемую рекомбинантными способами или с помощью синтеза пептидов. Линкерный пептид преимущественно может содержать следующие аминокислотные остатки: Gly, Ser, Ala или Thr. Линкерный пептид должен иметь длину, которая достаточна для того, чтобы соединять две молекулы таким образом, чтобы они принимали правильную конформацию друг относительно друга с тем, чтобы они сохраняли желаемую активность. В одном из вариантов осуществления линкер составляет приблизительно от 1 до 50 аминокислот в длину, предпочтительно приблизительно от 1 до 30 аминокислот в длину. В одном из вариантов осуществления можно использовать линкеры от 1 до 20 аминокислот в длину. Эффективные линкеры включают глицин-сериновые полимеры, в том числе например (GS), где n представляет собой целое число, равное по меньшей мере единице, глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры. Альтернативно, различные небелковые полимеры, включая в качестве неограничивающих примеров полиэтиленгликоль (PEG), полипропиленгликоль, полиоксиалкилены или сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, могут найти применение в качестве линкеров, то есть могут найти применение в качестве линкеров.
Белки CTLA4-Ig, раскрытые в настоящем описании, могут содержать вариант CTLA4, вариант Fc-области или как вариант CTLA4, так и вариант Fc-области. Вариант содержит одну или несколько аминокислотных модификаций относительно исходного белка CTLA4-Ig, в котором аминокислотная модификация(и) обеспечивает одно или несколько описанных свойств. Аминокислотная модификация может представлять собой замену, инсерцию и/или делецию аминокислоты в полипептидной последовательности. Под «заменой аминокислоты» или «заменой» в настоящем описании понимают замену аминокислоты в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности на другую аминокислоту. Под «инсерцией аминокислоты» или «инсерцией», как используют в настоящем описании, понимают добавление аминокислоты в конкретное положение в исходной полипептидной последовательности. Под «делецией аминокислоты» или «делецией», как используют в настоящем описании, понимают удаление аминокислоты в конкретном положении в исходной полипептидной последовательности. Fc-области антител содержат углевод в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи. Антитело каждого изотипа имеет отчетливое разнообразие N-связанных углеводных структур. Помимо углевода, прикрепленного к тяжелой цепи, вплоть до 30% IgG человека имеют гликозилированную Fab-область. IgG имеет один N-связанный биантеннарный углевод в Asn297 домена CH2. Для IgG из сыворотки или полученного ex vivo в гибридомах или сконструированных клетках, IgG гетерогенны в отношении углевода, связанного с Asn297. Для IgG человека, олигосахарид сердцевины обычно состоит из GlcNAc2Man3GlcNAc, с различным числом внешних остатков. Термины «CTLA4-Ig» или «молекула CTLA4-Ig» или «молекула CTLA4Ig» или «слитый белок CTLA4-Ig» или «белок CTLA4-Ig» используют взаимозаменяемо, и они относятся к белковой молекуле, которая содержит по меньшей мере полипептид, имеющий внеклеточный домен CTLA4 или его часть или производные, и константную область иммуноглобулина или ее часть или производные. Внеклеточный домен и константная область иммуноглобулина могут быть дикого типа или мутантными или модифицированными и относиться к млекопитающему, в том числе человеку или мыши. Полипептид дополнительно может содержать дополнительные белковые домены. Молекула CTLA4-Ig также может относиться к мультимерным формам полипептида, например, димерам, тетрамерам и гексамерам. Молекула CTLA4-Ig также способна связываться с CD80 и/или CD86. Термин «B7-1» также относится к CD80; термин «B7-2» также относится к CD86; и термин «B7» относится как к B7-1, так и к B7-2 (CD80 и CD86). Термин «B7-1-Ig» или «B7-lIg» относится к CD80-Ig; термин «B7-2-Ig» или «B7-2Ig» относится к CD86-Ig.
Медиаторы костимуляции и ингибиторы костимуляции относятся к молекулам, влияющим положительно или отрицательно на процесс костимуляции T-клеток, как описано в (Sharpe, 2009) и (Pilat et al., 2012). В одном из вариантов осуществления «CTLA4Ig» относится к молекуле белка, имеющей аминокислотную последовательность из остатков: (i) 26-383 из SEQ ID № 2, (ii) 26-382 из SEQ ID № 2; (iii) 27-383 из SEQ ID № 2, или (iv) 27-382 из SEQ ID № 2, или необязательно (v) 25-382 из SEQ ID № 2, или (vi) 25-383 из SEQ ID № 2. В мономерной форме эти белки можно обозначать в настоящем описании как «мономеры SEQ ID № 2» или мономеры «имеющие последовательность SEQ ID № 2». Эти мономеры SEQ ID № 2 могут образовывать димеры так, что комбинации димеров могут включать, например: (i) и (i); (i) и (ii); (i) и (iii); (i) и (iv); (i) и (v); (i) и (vi); (ii) и (ii); (ii) и (iii); (ii) и (iv); (ii) и (v); (ii) и (vi); (iii) и (iii); (iii) и (iv); (iii) и (v); (iii) и (vi); (iv) и (iv); (iv) и (v); (iv) и (vi); (v) и (v); (v) и (vi); и (vi) и (vi). Эти различные комбинации димеров также могут ассоциироваться друг с другом для того, чтобы формировать тетрамерные молекулы CTLA4Ig. Эти мономеры, димеры, тетрамеры и другие мультимеры можно обозначать в настоящем описании как «белки SEQ ID № 2» или белки «имеющие последовательность SEQ ID № 2». Последовательность SEQ ID № 2, например, раскрыта в WO/2007/076354 и WO/2002/002638 и состоит из: MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID № 2). Соответствующая нуклеотидная последовательность раскрыта в WO/2002/002638. Как используют в настоящем описании, «абатацепт» предпочтительно относится к белкам SEQ ID № 1. Как используют в настоящем описании, термин «сердечная недостаточность» также включает «застойную сердечную недостаточность (CHF)», «хроническую сердечную недостаточность», «острую сердечную недостаточность» и относится к любому состоянию, при котором сердце не способно качать кровь с адекватной скоростью или выполняет это только в присутствии повышенного давления наполнения левого желудочка. Когда сердце неспособно в достаточной мере качать кровь в остальной организм при нормальном давлении наполнения левого желудочка, кровь может возвращаться в легкие lungs, вызывая застой жидкости в легких. Типичные симптомы сердечной недостаточности включают одышку (диспноэ), утомление, слабость, затрудненное дыхание в положении лежа и отекание ног, лодыжек или живота (отек). Причины сердечной недостаточности связаны с различными нарушениями, включая болезнь коронарных артерий, системную гипертензию, кардиомиопатию или миокардит, врожденное заболевание сердца, аномальные клапаны сердца или заболевание клапанов сердца, тяжелое заболевание легких, диабет, гипертиреоидизм при тяжелой анемии, аритмию или дисритмию и инфаркт миокарда. Сердечная недостаточность может возникать в присутствии нормальной (>50%) или сниженной (<50%) фракции выброса левого желудочка. Хорошо известно, что эти два состояния представляют два различных состояния заболевания, а не однородное (Borlaug BA, Redfield MM. Circulation. 2011 May 10; 123(18):2006-13).
Сердечная недостаточность в соответствии с настоящим изобретением включает явную и/или запущенную сердечную недостаточность. При явной сердечной недостаточности, субъект проявляет симптомы сердечной недостаточности, как известно специалисту в данной области. HF можно классифицировать по различным степеням тяжести. В соответствии с классификацией NYHA (New York Heart Association), пациентов с сердечной недостаточностью классифицируют как относящихся к классам I, II, III и IV по NYHA. Пациент, имеющий сердечную недостаточность, уже подвергся структурным и функциональным изменениям в его перикарде, миокарде, коронарной циркуляции или клапанах сердца. Он не способен полностью восстановить свое здоровье и нуждается в терапевтическом лечении. Пациенты класса I по NYHA не имеют очевидных симптомов сердечнососудистого заболевания, но уже имеют объективные свидетельства функционального нарушения. Пациенты класса II по NYHA имеют небольшие ограничения физической активности. Пациенты класса III по NYHA демонстрируют заметные ограничения физической активности. Пациенты класса IV по NYHA не способны осуществлять любую физическую активность без дискомфорта. Они демонстрируют симптомы сердечной недостаточности в покое. Эту функциональную классификацию дополняет более новая классификация из American College of Cardiology and American Heart Association (см. J. Am. Coll. Cardiol. 2001; 38; 2101-2113, обновлено в 2005 году, см. J. Am. Coll. Cardiol. 2005; 46; e1-e82). Определены 4 стадии A, B, C и D. Стадии A и B не являются HF, но их рассматривают в качестве помощи для идентификации пациентов задолго до развития «истинной» HF. Пациенты на стадиях A и B лучше всего определяют как тех, кто имеет факторы риска развития HF. Например, пациенты с болезнью коронарных артерий, гипертензией или сахарным диабетом, которые еще не демонстрируют ослабленную функцию левого желудочка (LV), гипертрофию или геометрическое искажение камер, следует относить к стадии A, тогда как пациентов, которые не имеют симптомов, но демонстрируют гипертрофию LV и/или ослабленную функцию LV, следует относить к стадии B. Затем, стадия C обозначает пациентов с текущими или прошедшими симптомами HF, связанными с подлежащим структурным заболеванием сердца (масса пациентов с HF), и стадия D обозначает пациентов с истинной рефракторной HF. Термины «антитело» и «иммуноглобулин» можно использовать взаимозаменяемо и в настоящем описании используются в самом широком смысле и охватывают различные антитела и структуры миметиков антител, включая в качестве неограничивающих примеров моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, нанотела, производные антител, фрагменты антител, антикалины, дарпины, аффитела, аффилины, аффимеры, аффитины, альфатела, авимеры, финомеры, монотела и другие связывающие домены, при условии, что они проявляют желательную антигенсвязывающую активность. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело.
2
H
L
Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваясь этим, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'); диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Fv из V или V также называют «нанотелами».
Термин «миметики антител» относится к тем органическим соединениям или связывающим доменам, которые не являются производными антител, но могут специфически связывать антиген подобно антителам. Они включают антикалины, дарпины, аффитела, аффилины, аффимеры, аффитины, альфатела, авимеры, финомеры, монотела и другие. Термин «химерное» антитело относится к антителу, у которого часть тяжелой и/или легкой цепи получают из конкретного источника или биологического вида, тогда как остальную тяжелую и/или легкую цепь получают из другого источника или биологического вида.
Антитело по данному изобретению может относиться к иммуноглобулину любого типа, в том числе IgG, IgM5, IgA, IgD и/или IgE.
В контексте настоящего изобретения, термин «полинуклеотид» включает молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК, миРНК, короткой шпилечной РНК) и аналоги ДНК или РНК, создаваемые с применением нуклеотидных аналогов. Полинуклеотид может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Полинуклеотид можно синтезировать с применением аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозиновых или фосфотиоатных нуклеотидов). Термин полинуклеотид и полипептид также включает их производные и функциональные фрагменты. «Производное» может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, в виде молекулы ДНК, кодирующую полинуклеотид, как определено выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, как определено выше, или полинуклеотид комплементарной последовательности. В контексте настоящего изобретения термин «производные» также относится к более длинным или более коротким полинуклеотидам и/или полипептидам, имеющим, например, процентную долю идентичности по меньшей мере 41%, 50%, 60%, 65%, 70% или 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% или 100% с указанными последовательностями или с комплементарной им последовательностью или с соответствующей им последовательностью ДНК или РНК. Термин «производные» и термин «полинуклеотид» также включают модифицированные синтетические олигонуклеотиды. Термин «производное» также может включать нуклеотидные аналоги, т. е. встречаемый в природе рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид, замещенный не встречаемым в природе нуклеотидом. Термин «производные» также включает нуклеиновые кислоты или полипептиды, которые можно создавать посредством мутирования одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот в их последовательностях, эквивалентах или последовательностях-предшественниках. Термин «производные» также включает по меньшей мере один функциональный фрагмент полинуклеотида.
Белок, упомянутый в настоящем изобретении, также включает соответствующий белок, кодируемый соответствующими ему ортологичными или гомологичными генами, функциональными мутантами, функциональными производными, функциональными фрагментами или аналогами, изоформами.
Термин «аналог», как используют в настоящем описании в отношении белка, обозначает модифицированный пептид, в котором один или несколько аминокислотных остатков пептида заменены на другие аминокислотные остатки и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков удалены из пептида и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков удалены из пептида и/или в котором один или несколько аминокислотных остатков добавлены в пептид. Такое добавление или делеция аминокислотных остатков может иметь место на N-конце пептида и/или на C-конце пептида.
Термин «производное», как используют в настоящем описании по отношению к белку, обозначает химически модифицированный пептид или его аналог, в котором по меньшей мере один заместитель не присутствует в немодифицированном пептиде или его аналоге, т. е. пептид, который модифицирован ковалентно. Типичные модификации представляют собой амиды, углеводы, алкильные группы, ацильные группы, сложные эфиры и т. п. Как используют в настоящем описании, термин «производные» также относится к более длинным или более коротким полипептидам, имеющим, например, процентную долю идентичности по меньшей мере 41%, предпочтительно по меньшей мере 41,5%, 50%, 54,9%, 60%, 61,2%, 64,1%, 65%, 70% или 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, например, по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% с определенными выше белками или с аминокислотной последовательностью соответствующей области, кодируемой ортологичным или гомологичным геном. Термин «производное» также включает нуклеиновые кислоты или полипептиды, которые можно создавать посредством мутирования одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот в их последовательностях, эквивалентах или последовательностях- предшественниках. Термин «производное» также включает функциональные мутанты белка.
В настоящем изобретении «функциональные мутанты» белка представляют собой мутанты, которые можно создавать посредством мутирования одной или нескольких аминокислот в их последовательностях и которые сохраняют свою активность, например, способность ингибировать костимуляцию T-клеток. В действительности, белок, который определен в изобретении, если необходимо, можно модифицировать in vitro и/или in vivo, например, посредством гликозилирования, миристоилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилирования, и можно получать, например, синтетическими или рекомбинантными способами, известными в данной области.
В настоящем изобретении «функциональный» предусмотрен, например, в качестве «сохраняющего свою активность», например, способность ингибировать костимуляцию T-клеток.
Как используют в настоящем описании, «фрагменты» относятся к полипептидам, предпочтительно имеющим длину по меньшей мере 10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 15, по меньшей мере 17 аминокислот или по меньшей мере 20 аминокислот, даже более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот или по меньшей мере 37 или 40 аминокислот и более предпочтительно по меньшей мере 50 или 100 или 150 или 200 или 250 или 300 или 350 или 400 или 450 или 500 аминокислот.
В соответствии с настоящим изобретением, «эффективное количество» композиции представляет собой то, которого достаточно для достижения желаемого биологического эффекта, в этом случае улучшения или лечения патологии сердца.
Понятно, что эффективная доза зависит от возраста, пола, здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, если имеет место, частоты лечения и природы желаемого эффекта. Предоставленные диапазоны эффективных доз ингибитора или молекулы по изобретению (например, от 1 мг/кг до 100 мг/кг, в частности, при системном введении) не предназначены для ограничения изобретения и представляют предпочтительные диапазоны доз. Однако предпочтительную дозу можно адаптировать к индивидуальному субъекту, как может понять и определить специалист в данной области, без излишних экспериментов.
Введение полинуклеотидов по настоящему изобретению можно осуществлять известными способами, в которых нуклеиновую кислоту вводят в желаемую клетку-мишень in vitro или in vivo.
Один из аспектов настоящего изобретения включает конструкцию нуклеиновой кислоты, находящуюся внутри носителя доставки. Носитель доставки представляет собой объект, в соответствии с чем нуклеотидную последовательность можно транспортировать из по меньшей мере одной среды в другую. Носители доставки в целом можно использовать для экспрессии последовательностей, кодируемых конструкцией нуклеиновой кислоты, и/или для внутриклеточной доставки конструкции. В объем настоящего изобретения входит то, что носитель доставки может представлять собой носитель, выбранный из группы носителей на основе РНК, носителей/векторов на основе ДНК, носителей на липидной основе, носителей на вирусной основе и носителей на клеточной основе. Примеры таких носителей доставки включают: биоразрушаемые полимерные микросферы, составы на липидной основе, такие как липосомные носители, нанесение конструкции на частицы коллоидного золота, липополисахариды, полипептиды, полисахариды, пегилирование вирусных носителей.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения может содержать вирус в качестве носителя доставки, где вирус можно выбирать из: аденовирусов, ретровирусов, лентивирусов, аденоассоциированных вирусов, герпесвирусов, вирусов осповакцины, пенящих вирусов, цитомегаловирусов, вируса леса Семлики, поксвирусов, вектора РНК-вируса и вектора ДНК-вируса. Такие вирусные векторы хорошо известны в данной области.
Широко используемые способы переноса генов включают фосфат кальция, DEAE-декстран, трансфекцию, электропорацию и микроинъекцию и вирусные способы. Другой способ введения ДНК в клетки состоит в применении катионных липосом. Коммерчески доступные катионные липидные составы представляют собой, например, Tfx 50 (Promega) или Lipofectamin 2000 (Life Technologies).
Вышеуказанные фармацевтические композиции предпочтительно для системного, орального, локального, предпочтительно ректального или топического введения.
Композиции по настоящему изобретению могут быть в форме раствора, например, инъецируемого раствора, крема, мази, таблетки, суспензии или тому подобного. Композицию можно вводить любым подходящим путем, например, посредством инъекции, в частности, посредством внутриглазной инъекции, посредством орального, топического, назального, ректального применения и т. д. Носитель может представлять собой любой подходящий фармацевтический носитель. Предпочтительно используют носитель, который способен повышать эффект полинуклеотида для проникновения в клетки-мишени. Подходящими примерами таких носителей являются липосомы, в частности, катионные липосомы.
Экспрессирующий вектор по изобретению может представлять собой любой подходящий рекомбинантный экспрессирующий вектор, и его можно использовать для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Подходящие векторы включают те, которые разработаны для воспроизводства и размножения или для экспрессии или того и другого, например, плазмиды и вирусы. Рекомбинантные экспрессирующие векторы по изобретению можно получать с применением стандартных способов рекомбинантной ДНК. Можно получать конструкции экспрессирующих векторов, которые являются кольцевыми или линейными, содержащие функциональную систему репликации в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Системы репликации можно получать, например, из CoIEl, плазмиды 2μ, λ, SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота и т. п.
Желательно, рекомбинантный экспрессирующий вектор содержит регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации транскрипции и трансляции и терминирующие кодоны, которые специфичны для типа хозяина (например, бактерии, гриба, растения или животного), введению которому подлежит вектор, в зависимости от ситуации и учитывая то, основан вектор на ДНК или РНК. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может включать один или несколько маркерных генов, которые делают возможным отбор трансформированных или трансфицированных хозяев. Маркерные гены включают устойчивость к биоцидам, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т. д., комплементацию у ауксотрофного хозяина, чтобы обеспечивать прототрофность, и т. п. Подходящие маркерные гены для патентоспособных экспрессирующих векторов включают, например, гены устойчивости к неомицину/G418, гены устойчивости к гигромицин, гены устойчивости к гистидинол, гены устойчивости к тетрациклину и гены устойчивости к ампициллину. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может содержать нативный или нормативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ингибитор (в том числе его функциональные части и функциональные варианты), или с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна или которая образует гибрид с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ингибитор. Выбор промоторов, например, сильных, слабых, индуцибельных, тканеспецифичных и для конкретных стадий развития, входит в обычные навыки специалиста. Аналогичным образом, объединение нуклеотидной последовательности с промотор также входит в навыки специалиста. Промотор может представлять собой не вирусный промотор или вирусный промотор, например, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40, промотор RSV и промотор, встречающийся в длинном концевом повторе вируса стволовых клеток мышей. Патентоспособные рекомбинантные экспрессирующие векторы можно разрабатывать для временной экспрессии, для стабильной экспрессии или для того и другого. Также рекомбинантные экспрессирующие векторы можно создавать для конститутивной экспрессии или для индуцируемой экспрессии.
Фармацевтические композиции по данному изобретению включают те, которые подходят для орального, ректального, топического, ингаляционного (например, через аэрозоль), буккального (например, сублингвального), вагинального, парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного, внутрисуставного, внутриплеврального, интраперитонеального, интрацеребрального, внутриартериального или внутривенного), топического и трансдермального введения, несмотря на то, что наиболее подходящий путь в любом заданном случае будет зависеть, как хорошо известно в данной области, от таких факторов, как биологический вид, возраст, пол и общее состояние субъекта, свойства и тяжесть состояния, подлежащего лечению, и/или от свойств конкретной композиции (т. е. дозы, состава), которая подлежит введению. Фармацевтические композиции, подходящие для орального введения, могут быть представлены в дискретных единицах, таких как капсулы, крахмальные капсулы, пастилки или таблетки, каждое содержит предварительно определяемое количество ингибитора по данному изобретению; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсии «масло-в-воде» или «вода-в-масле». Оральную доставку можно осуществлять посредством образования комплекса ингибитора по настоящему изобретению с носителем, способным выдерживать разрушение пищеварительными ферментами в кишечнике животного. Примеры таких носителей включают пластмассовые капсулы или таблетки, как известно в данной области. Такие составы получают любым подходящим фармацевтическим способом, который включает стадию приведения в контакт композиции и подходящего носителя (который может содержать один или несколько вспомогательных ингредиентов, как указано выше). Фармацевтические композиции, подходящие для буккального (сублингвального) введения, включают пастилки, содержащие композицию по данному изобретению в ароматизированной основе, обычно сахарозе и камеди или трагаканте; и лепешки, содержащие композицию в инертной основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и камедь. Фармацевтические композиции по данному изобретению, подходящие для парентерального введения, могут содержать стерильные водные и не водные инъекционные растворы композиции по данному изобретению, эти препараты предпочтительно являются изотоничными крови предполагаемого реципиента. Эти препараты могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной крови предполагаемого реципиента. Водные и не водные стерильные суспензии, растворы и эмульсии могут содержать суспендирующие средства и загустители. Примеры не водных растворителей представляют собой пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и буферные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактатный раствор Рингера или жирные масла. Внутривенные носители включают восполнители текучих и питательных веществ, восполнители электролитов (такие как те, что на основе декстрозы Рингера) и т. п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, например, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы и т. п. Композиции могут быть представлены в контейнерах со стандартной дозой или несколькими дозами, например, в закупоренных ампулах и флаконах, и их можно хранить в лиофилизированном состоянии, требующем добавления только стерильного жидкого носителя, например, физиологического раствора или воды для инъекции незамедлительно перед применением. Растворы и суспензии для экстемпоральных инъекций можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. Например, можно предоставлять инъецируемую, стабильную, стерильную композицию по данному изобретению в стандартной дозированной форме в закупоренном контейнере. Композицию можно предоставлять в форме лиофилизата, который можно восстанавливать подходящим фармацевтически приемлемым носителем для того, чтобы формировать жидкую композицию, подходящую для инъекции субъекту. Стандартная дозированная форма может составлять приблизительно от 0,1 мкг приблизительно до 10 г композиции по данному изобретению. Обычно дозы пациентов для парентерального введения соединений, описанных в настоящем описании, находятся в диапазоне приблизительно от 1 мг/сутки приблизительно до 10000 мг/сутки, более обычно приблизительно от 10 мг/сутки приблизительно до 1000 мг/сутки и наиболее типично приблизительно от 50 мг/сутки приблизительно до 500 мг/сутки. Выражаясь в единицах массы организма пациента, типичная доза находится в диапазоне приблизительно от 0,01 приблизительно до 150 мг/кг/сутки, более обычно приблизительно от 0,1 приблизительно до 15 мг/кг/сутки и наиболее типично приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг/кг/сутки, например, 5 мг/кг/сутки или 3 мг/кг/сутки.
Когда композиция по существу нерастворима в воде, достаточное количество эмульгирующего средства, которое является физиологически приемлемым, можно включать в достаточном количестве для того, чтобы эмульсифицировать композицию в водном носителе. Одно такое эффективное эмульгирующее средство представляет собой фосфатидилхолин. Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, предпочтительно представлены в виде суппозиториев со стандартными дозами. Их можно получать посредством смешивания композиции с одним или несколькими стандартными твердыми носителями, например, таким как масло какао, и последующего придания формы получаемой смеси. Фармацевтическим композициям по данному изобретению, подходящим для топического нанесения на кожу, предпочтительно придают форму мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые можно использовать, включают, но не ограничиваясь этим, вазелин, ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, трансдермальные усилители и комбинации двух или больше из них. В некоторых вариантах осуществления, например, топическую доставку можно осуществлять посредством смешивания фармацевтической композиции по настоящему изобретению с липофильным реактивом (например, DMSO), который способен проходить в кожу. Фармацевтические композиции, подходящие для трансдермального введения, могут быть в форме дискретных пластырей, адаптированных для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом субъекта в течение длительного периода времени. Композиции, подходящие для трансдермального введения, также можно доставлять посредством ионтофореза (см., например, Pharmaceutical Research 3:318 (1986)), и обычно им придают форму необязательно буферного водного раствора композиции по данному изобретению. Кроме того, композиции по данному изобретению можно вводить перорально, интраназально, парентерально (например, внутривенно), посредством внутримышечной инъекции, посредством интраперитонеальной инъекции, трансдермально, экстракорпорально, топически или тому подобное. Точное количество требуемой нуклеиновой кислоты или вектора, как определено выше, варьирует от субъекта к субъекту, в зависимости от биологического вида, возраста, массы и общего состояния субъекта, конкретной используемой нуклеиновой кислоты или вектора, их способа введения и т. п. Таким образом, невозможно конкретно определить точное количество для каждой нуклеиновой кислоты или вектора. Однако, подходящее количество может определять специалист в данной области, используя только стандартные эксперименты, с учетом положений настоящего описания. В вышеуказанных композициях дополнительные материалы, а также способы обработки и т. п., могут быть изложены в части 5 в Remington's Pharmaceutical Sciences, 20-е изд., 2000, Marck Publishing Company, Easton, Pennsylvania, которое включено в настоящее описание посредством ссылки. Соединения по данному изобретению также можно вводить в формах с замедленным высвобождением или из систем доставки лекарственных средств с замедленным высвобождением. Описание репрезентативных материалов с замедленным высвобождением также можно найти во включенных материалах в Remington's Pharmaceutical Sciences. Кроме того, фармацевтические составы можно получать с применением процесса, который в целом известен в области фармацевтики. Фармацевтическая композиция для применения в соответствии с изобретением дополнительно может содержать эффективное количество по меньшей мере другого терапевтического средства. Указанное терапевтическое средство может представлять собой одно или несколько из: β-блокаторов, диуретиков, антагонистов альдостерона, ингибиторов ACE, блокаторов ангиотензиновых рецепторов, диуретиков, наперстянки, ингибиторов фосфодиэстераз, гидралазина и изосорбиддинитрата, или введения механической опоры. В настоящем изобретении, когда молекулу по изобретению вводят с другим терапевтическим средством, ее можно вводить одновременно или последовательно.
Активацию T-клеток можно измерять с помощью способов, не ограниченных следующим: обнаружение и/или количественное определение белка и/или мРНК поверхностных клеточных маркеров, таких как CD69, CD25, HLA-DR, CD62L, CD154, и/или продуцирования IL-2, мобилизации кальция, фосфорилирования ZAP-70, фосфорилирования LAT, фосфорилирования Lck; активации NF-κB, активации MEK, активации NFAT, активации Ap-I; T-клеточной пролиферации и цитотоксичности (последнее только в случае CD8+ T-клеток) (которую определяют как способность уничтожать клетки-мишени).
Можно обнаруживать изменение количества вышеуказанных молекул на уровне белка и/или мРНК, в соответствии с чем увеличение или уменьшение их количества позволяет идентифицировать увеличение или уменьшение, соответственно, активации T-клеток с течением времени.
В предпочтительном варианте осуществления вектор в соответствии с изобретением представляет собой экспрессирующий вектор, выбранный из группы, состоящей из: плазмид, вирусных частиц и фагов.
Предпочтительно, указанную клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из: бактериальных клеток, грибковых клеток, клеток насекомого, клеток* животного, клеток растения, предпочтительны клетки животного, более предпочтительны клетки человека. Как используют в настоящем описании, термин «генетически сконструированная клетка-хозяин» относится к клеткам-хозяевам, которые трансдуцированы, трансформированы или трансфицированы полинуклеотидом или вектором, описанным ранее. В качестве репрезентативных примеров подходящих клеток-хозяев, можно перечислить бактериальные клетки, такие как E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium, грибковые клетки, такие как дрожжи, клетки насекомого, такие как Sf9, клетки животного, такие как CHO или COS, клетки растения и т. д. Полагают, что выбор подходящего хозяина входит в навыки специалистов в данной области, исходя из положений в настоящем описании. Предпочтительно, указанная клетка-хозяин представляет собой клетку животного и наиболее предпочтительно клетку человека.
В предпочтительном варианте осуществления ингибитор, как определено выше, объединяют с по меньшей мере одним терапевтическим средством, предпочтительно по меньшей мере одним из: β-блокаторов, диуретиков, антагонистов альдостерона, ингибиторов ACE, блокаторов ангиотензиновых рецепторов, диуретиков, наперстянки, ингибиторов фосфодиэстераз, гидралазина и изосорбиддинитрата, механической опоры.
В изобретении субъектом (или пациентом) является млекопитающее, предпочтительно человек.
Далее изобретение проиллюстрировано неограничивающими примерами со ссылкой на следующие фиг.
Фиг. 1. Определение характеристик воспалительной сигнатуры при гипертрофированном левом желудочке мыши. Анализ экспрессии генов (qPCR в реальном времени TaqMan) медиаторов воспаления в левом желудочке мышей C57BL6/J. Относительная экспрессия мРНК у контрольных мышей с имитацией операции (белые столбцы) и мышей с операцией TAC (черные столбцы) через 1 и 4 недели после хирургического вмешательства, со внутренней нормализацией по экспрессии 18s рРНК. Tnfa, Il6, Tgfb1, Ccl2, Ccl4, Ccl5, Cxcl10, Cxcl11 и врожденный клеточный маркер Itgam (CD11b) значительно возрастали в группе TAC по сравнению с имитацией, через 1 неделю после TAC. Через четыре недели после операции, Il4 и T-клеточный маркер Cd3e значительно возрастали. Значения представляют собой среднее±SEM (n=7-9). Двухфакторный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Бонферрони: *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01; ***, p-значение <0,001.
Фиг. 2. Связь между воспалением и нарушением функции сердца. Показатель нарушения функции сердца (HDI), отложенный по оси y, вычисляли как (-1)×(% фракции укорочения) для всех моделей на мышах, которые анализировали в этом исследовании (которые нормализовали по соответствующим им контрольным группам), в зависимости от показателя воспаления по оси x, который вычисляли как уровень мРНК провоспалительного цитокина IL-6, деленный на уровень мРНК противовоспалительного цитокина IL-10. Каждая точка представляет данные от одной мыши. Более крупные точки показывают среднее для каждой группы, тогда как затененные эллипсы представляют одно стандартное отклонение от среднего. Значения HDI нормализовали для того, чтобы избегать фоновых штамм-специфических вариаций. Здоровый относится к контрольным животным с имитацией операции (которых лечили PBS). TAC модель HF относится к контрольным мышам с операцией TAC (которых лечили PBS). Нормализацию HDI для каждой мыши вычисляли по следующей формуле: [[HDI образца - средний HDI соответствующего контроля]/средний HDI соответствующего контроля]. В качестве соответствующих контролей для нормализации использовали следующие группы: для мышей с операцией TAC через 1 или 4 недели после операции: мыши с имитацией операции перед операцией (базовые показания); для здоровых мышей (с имитацией операции): с имитацией операции перед операцией (базовые показания); для Akt трансгенных: контроль WT; для бегающих мышей: конгенные малоподвижные мыши.
Фиг. 3. T-клеточный инфильтрат в отказывающем левом желудочке. (A) Репрезентативное иммуногистохимическое (IHC) окрашивание левых желудочков на T-клеточный маркер CD3e (коричневая окраска) у мышей с имитацией и TAC через 4 недели. Исходное увеличение 10×; масштабная шкала=200 мкм. (B) Сводка IHC анализа. Значения представляют собой среднее±SEM (n=6). Непарный критерий Стьюдента: **, p-значение <0,01. (C) Окрашивание по T-клеточному маркеру CD3e (коричневая окраска) у мышей с операцией TAC, 1 неделя после операции. Исходное увеличение 10×; масштабная шкала=200 мкм (D) Репрезентативный FACS анализ CD3e+ клеток, обогащенных на градиенте Lympholyte-M из суспензии клеток сердца от мышей через 1 неделю после TAC. (E) Медиастинальные (дренирующие сердце) лимфатические узлы, паховые лимфатические узлы и селезенки собирали через 2 суток после TAC или имитации операции, окрашивали и анализировали посредством проточной цитометрии. Средние интенсивности флуоресценции CD25 на CD3e+ клетках нанесены в виде среднего±SEM; имитация (белые столбцы), TAC (черные столбцы) (n=4). Непарный критерий Стьюдента *, p-значение <0,05. (F) Репрезентативное трехцветное окрашивание AZAN биоптатов сердца от здоровых доноров ткани желудочка (n=3), от пациентов с дилятационной кардиомиопатией из-за мутации в ламине A/C, перед размещением вспомогательного устройства для левого желудочка (HF LVAD 1M) (n=4), и от пациентов с тяжелой дилятационной кардиомиопатией из-за мутации в ламине A/C и мутации в титине, перед размещением вспомогательного устройства для левого желудочка (HF LVAD 2M) (n=2). Синие (более темные) области показывают отложение коллагена (исходное увеличение, 20×; масштабная шкала=100 мкм). (G) Статистический анализ отложения коллагена в идентичных областях, представляющий интерес. Значения представляют собой среднее±SEM. Точный критерий Фишера для присутствия или отсутствия фиброза: *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01. Количество коллагена также положительно связано со степенью HF (однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием для линейной тенденции: p<0,001). (H) Репрезентативное окрашивание по T-клеточному маркеру CD3e (коричневая окраска; т. е. коричневые/более темные пятна в правой части «тяжелая сердечная недостаточность») на тех же образцах, что и на (F). (I) Статистический анализ CD3e IHC. Значения представляют собой среднее±SEM. Однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Данна: *, p-значение <0,05. (J) Статистический анализ отложения коллагена, в идентичных областях, представляющих интерес, в биоптатах сердца из здоровых тканей желудочка (n=3) и от пациентов с HF из-за аортального стеноза (n=2), с трехцветным окрашиванием AZAN. Значения представляют собой среднее±SEM. Здоровые ткани желудочка (белый столбец), HF с аортальным стенозом (черные столбцы). Точный критерий Фишера для присутствия или отсутствия фиброза: ***, p-значение <0,001. (K) Статистический анализ для IHC анализа CD3e на тех же образцах, что и в (J). Здоровые ткани желудочка (белый столбец), HF из-за аортального стеноза (черные столбцы). Значения представляют собой среднее±SEM. Критерий Манна-Уитни; *, p-значение <0,05.
Фиг. 4. Абатацепт снижает прогрессирование нарушения функции сердца у мышей с перегрузкой давлением. Мыши проходили TAC или имитацию операции; через 2 суток после операции мышей лечили тремя интраперитонеальными инъекциями в неделю 200 мкг абатацепта или PBS, в течение 4 недель. (A) Фракция укорочения (%FS), (B) фракция изгнания (%EF), (C) внутренний размер левого желудочка в диастоле (LVIDd) и (D) внутренний размер левого желудочка в систоле (LVIDs) у мышей с TAC и имитацией операции на базовом уровне и в моменты времени 1, 3 и 4 недели после операции, с введением абатацепта и без него. Данные показывают среднее значение %FS, %EF, LVIDd и LVIDs для каждой экспериментальной группы во все моменты времени±SEM (n=7-9). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони: p-значения приведены на фиг. Абатацепт улучшает индуцированный перегрузкой давлением фиброз сердца у мышей. (E) Репрезентативные макроскопические изображения сердца мышей без лечения, с лечением PBS и с инъекциями абатацепта через 4 недели после имитации или TAC (масштабная шкала=2 мм). (F) Осуществляли трехцветное окрашивание AZAN срезов сердца мышей без лечения, с лечением PBS или с лечением абатацептом, с TAC или имитацией операции, через 4 недели после операции (n=2). Пять идентичных областей, представляющий интерес (ROI), применяли ко всем образцам. Интенсивность окрашивания коллагена определяли количественно с помощью программного обеспечения регистрации изображений; точки на графиках указывают % пикселей коллагена в каждой ROI. Красные столбцы показывают средний % коллагена в каждой экспериментальной группе. ROI с сигналом коллагена выше нуля считали фиброзными. Точные критерии Фишера для присутствия или отсутствия фиброза применяли к группам с имитацией операции против TAC для каждой категории лечения. Красная пунктирная линия отделяет фиброзные от не фиброзных ROI. *, p-значение <0,05. (G-H) Мыши проходили TAC, через 2 недели после операции мышей лечили тремя интраперитонеальными инъекциями в неделю 200 мкг абатацепта или PBS, в течение 2 недель. (G) Фракцию укорочения (%FS) и (H) фракцию изгнания (%EF) измеряли на базовом уровне и через 2 и 4 недели после операции. Данные показывают среднее значение %FS и %EF для каждой экспериментальной группы во все моменты времени±SEM (n=7). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони: ***, p-значение <0,001.
Фиг. 5. Введение абатацепта подавляет иммунный ответ у мышей с операцией TAC. (A) Медиастинальные (дренирующие сердце), паховые лимфатические узлы и селезенки собирали через 1 неделю после TAC или имитации операции, окрашивали и анализировали посредством проточной цитометрии. Процентная доля CD25+ среди CD3e+ клеток нанесена на график в виде среднего±SEM; имитация (белые столбцы), TAC и абатацепт (серые столбцы) и TAC и PBS (черные столбцы) (n=3-4). Однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки: *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01, ***, p-значение <0,001. (B) Статистический анализ иммуногистохимического окрашивания левых желудочков на T-клеточный маркер CD3e у TAC мышей через 4 недели после операции, которых лечили абатацептом или PBS, и репрезентативные изображения окрашивания (коричневая окраска; исходное увеличение 40×; масштабная шкала=50 мкм). Число CD3e+ клеток нанесено на график в виде среднего±SEM; TAC и абатацепт (белые столбцы); TAC и PBS (черные столбцы). Непарный критерий Стьюдента; *, p-значение <0,00 (n=2). (C) Статистический анализ иммуногистохимического окрашивания левых желудочков на макрофагальный маркер AIF-1 у TAC мышей через 1 неделю после операции, которых лечили абатацептом или PBS, и репрезентативные изображения окрашивания (коричневая окраска; исходное увеличение 20×; масштабная шкала=100 мкм). Плотность AIF-1 нанесена на график в виде среднего±SEM; TAC и абатацепт (белые столбцы); TAC и PBS (черные столбцы). Непарный критерий Стьюдента; **, p-значение <0,001 (n=2). (D) Анализ экспрессии генов (qPCR в реальном времени TaqMan) левого желудочка мышей C57BL6/J, через 1 неделю после TAC или имитации операции, при лечении абатацептом или PBS. Столбцы показывают относительную среднюю экспрессию Il6 и Il10 со внутренней нормализацией по экспрессии 18s рРНК. Значения представляют собой среднее±SEM (имитация n=5; TAC n=8). Однофакторный дисперсионный анализ, апостериорный критерий Данна: *, p-значение <0,05; n.s. - не значимо. (E-F) Суспензии отдельных клеток сердца мышей с операцией TAC через 1 неделю после операции окрашивали и анализировали посредством проточной цитометрии. Процентную долю F4-80+ Ly6C+ среди CD11b+ CD45+ живых клеток (E) и F4-80+ Ly6C- среди CD11b+ CD45+ живых клеток (F) наносят на график в виде среднего±SEM; TAC и абатацепт (черные круги); TAC и PBS (черные квадраты). Непарный критерий Стьюдента; *, p-значение < 0,05; **, p-значение < 0,01 (n=4, 3).
Фиг. 6. Абатацепт ослабляет HF через действие IL-10. (A) Иммуногистохимическое окрашивание левых желудочков на T-клеточный маркер CD3e у IL-10 K/O мышей с операцией TAC, которых лечили абатацептом или PBS, через 4 недели после операции. Значения показывают среднее±SEM (n=2). Непарный критерий Стьюдента; не значимо (ns). Репрезентативное окрашивание по T-клеточному маркеру CD3e (коричневая окраска; регистрация изображения на увеличении 40×; масштабная шкала=50 мкм). (B-E) Функциональность сердца не предохраняли у IL-10 K/O TAC мышей после лечения абатацептом. Мыши проходили TAC или имитацию операции; через 2 суток после операции мышей лечили тремя интраперитонеальными инъекциями в неделю 200 мкг абатацепта или PBS в течение 4 недель. (B) Фракция укорочения (%FS). (C) Фракция изгнания (%EF). (D) Внутренний размер левого желудочка в диастоле (LVIDd). (E) Внутренний размер левого желудочка в систоле (LVIDs). Данные показывают среднее±SEM (n=5-9). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; , p-значение <0,05 против TAC WT и абатацепта; , p-значение <0,01 против TAC WT и абатацепта; , p-значение <0,001 против TAC WT и абатацепта; +, p-значение <0,05 против имитации без лечения; , p-значение <0,01 против имитации без лечения; , p-значение <0,001 против имитации без лечения; , p-значение <0,01 против TAC WT и PBS. (F) Лечение абатацептом в присутствии, но не в отсутствие IL-10, снижает апоптоз кардиомиоцитов у мышей с операцией TAC. Анализ окрашиванием TUNEL на препаратах для оценки апоптоза кардиомиоцитов осуществляли на сердцах мышей с лечением через 4 недели после операции TAC, у мышей как дикого типа, так и IL10K/O. Столбцы показывают среднее±SEM для TUNEL-положительных клеток (n=2); белые столбцы, мыши с операцией TAC и лечением абатацептом; черные столбцы, мыши с операцией TAC и лечением PBS. Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; *, p-значение <0,05. (G-H) Перенос B-клеток дикого типа, но не T-клеток, IL-10KO мышам с операцией TAC восстанавливает терапевтические эффекты абатацепта. IL-10KO мыши получали T- или B-клетки дикого типа. Впоследствии, они проходили TAC или имитацию операции; через 2 суток после операции мышей лечили тремя интраперитонеальными инъекциями в неделю 200 мкг абатацепта или PBS, в течение 1 недели. (G) Фракцию укорочения (%FS) и (H) фракцию изгнания (%EF) измеряли на базовом уровне и через 1 неделю после операции. Данные показывают среднее значение %FS и %EF для каждой экспериментальной группы во все моменты времени±SEM (n=3-7). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони, *, статистика для IL10 KO TAC и абатацепта; +, B-клетки WT; #, статистика для WT TAC и абатацепта; , статистика для имитации без лечения.
Фиг. 7. Абатацепт уменьшает нарушение функции сердца посредством подавления иммунного ответа
(A, B) Показатель нарушения функции сердца (HDI) (ось y) в зависимости от показателя воспаления (ось x), который вычисляли как для фиг. 2. Каждая точка представляет данные от одной мыши. Крупные точки представляют средне для каждой группы, тогда как затененные эллипсы представляют одно стандартное отклонение от среднего. Следующие группы использовали в качестве соответствующих контролей для экспериментальных наборов: для мышей с операцией TAC и лечением абатацептом или PBS через 1 неделю (A) или 4 недели (B) после операции: мыши с имитацией операции и лечением абатацептом или PBS, перед операцией (базовые показания); для здоровых (с имитацией операции и лечением PBS): с имитацией операции и лечением PBS перед операцией (базовые показания). (C) Схематическое изображение механизма действия абатацепта при сердечной недостаточности, CM: кардиомиоцит, T: T-клетка, MФ: макрофаг; APC: антигенпредставляющая клетка. При патологической гипертрофии происходит активация T-клеток (через их TCR) и они получают костимуляцию через CD28 от CD80/CD86-экспрессирующих антигенпредставляющих клеток (макрофаги, B-клетки, дендритные клетки). Полная активация T-клеток, идентифицируемая по высоким уровням CD25, усиливает хронический характер воспалительной реакции в сердце. Также сюда вовлечено провоспалительное действие макрофагов сердца. Как результат, имеет место увеличенный апоптоз кардиомиоцитов, фиброз и сниженная функциональность сердца. Во время лечения абатацептом лекарственное средство блокирует CD80/CD86-опосредованную костимуляцию макрофагами и B-клетками, что ведет к ингибированию активации T-клеток, пролиферации и/или инфильтрации. Эффекты, оказываемые на макрофаги (которые могут быть как прямыми, так и опосредованными), ведут к более слабому созреванию и инфильтрации. Прямые эффекты, оказываемые на B-клетки, ведут к продуцированию противовоспалительного цитокина IL-10, который также в меньшей степени могут продуцировать T-клетки. Как следствие эффекта, оказываемого на T-клетки, B-клетки и макрофаги, происходит блокирование прогрессирования патологии сердца, даже если лекарственное средство вводят на поздней стадии. Защитный эффект зависит от присутствия IL-10.
Фиг. 8. Иммунные медиаторы отсутствуют в моделях физиологической гипертрофии (A) Анализ экспрессии генов медиаторов воспаления в левом желудочке у тренированных упражнениями мышей (бег) по сравнению с малоподвижными мышами (малоподвижны). Столбцы показывают относительную среднюю экспрессию мРНК со внутренней нормализацией по экспрессии 18s рРНК. Экспрессия Tnfa, Il6, Ccl4, Ccl5, Cxcl10, Cxcl11, Il4, Itgam (CD11b) или Cd3e не меняется значительно, тогда как Ccl2 значительно снижен в группе тренированных мышей. Значения представляют собой среднее±SEM (n=3). Непарный критерий Стьюдента: *, p-значение <0,05. (B) Анализ экспрессии генов медиаторов воспаления с помощью qPCR в реальном времени TaqMan в левом желудочке Akt трансгенных мышей в возрасте 8 недель (Akt-Tg, белый) (n=6) по сравнению с мышами дикого типа (WT, черный) (n=7). Столбцы показывают относительную среднюю экспрессию мРНК со внутренней нормализацией по экспрессии 18s рРНК. Относительная экспрессия Tnfa, Il6, Il1b, Tgfb1, Ccl2, Cxcl11 и врожденного клеточного маркера Itgam (CD11b) не возрастает, тогда как Ccl4, Ccl5, Cxcl10, Il4 и Cd3e возрастают значительно. Значения приведены в виде среднего±SEM. Критерий Манна-Уитни: *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01.
Фиг. 9. В сердце абатацепт ограничивает прогрессирование гипертрофии сердца. Отношения (A) массы сердца/массы тела (мг/г), (B) левого желудочка/массы тела (мг/г), (C) массы сердца/длины большеберцовой кости (мг/см) у мышей с операцией TAC и лечением абатацептом или PBS через 4 недели после операции. Значения приведены в виде среднего±SEM (n=5-7). Непарный критерий Стьюдента: *, p-значение <0,05. Относительная экспрессия гена по qPCR в реальном времени со внутренней нормализацией по 18S для генов, экспрессирующих (D) β-миозин (Mhy7), (E) натрийуретический пептид головного мозга (Nppb) и (F) предсердный натрийуретический фактор (Nppa) у одних и тех же мышей. Значения представляют собой среднее±SEM (n=5-8). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01.
Фиг. 10. Функциональность сердца не меняется у мышей без операции после лечения абатацептом или изотипом IgG человека. (A) Фракция укорочения (%FS) и (B) фракция изгнания (%EF) у мышей без операции, которых лечили абатацептом или контролем изотипа IgG человека, или мышей с имитацией операции без лечения (включены для сравнения). Значения представляют собой среднее±SEM (n=3-5). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; значимые различия не наблюдали. (C) Фракция укорочения (%FS), (D) фракция изгнания (%EF), (E) внутренний размер левого желудочка в систоле (LVIDs) и (F) внутренний размер левого желудочка в диастоле (LVIDd) у мышей с операцией TAC и лечением абатацептом, PBS или контролем изотипа IgG человека в течение 1 недели, начиная со 2 суток после операции. Значения представляют собой среднее±SEM (n=6-9). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; *, p-значение <0,05; **, p-значение <0,01; ***, p-значение <0,001. (G) Внутренний размер левого желудочка в систоле (LVIDs) и (h) внутренний размер левого желудочка в диастоле (LVIDd) у мышей с операцией TAC и лечением абатацептом или PBS в течение 2 недель, начиная через 2 недели после операции. Значения представляют собой среднее±SEM (n=7-9). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; *, p-значение <0,05.
Фиг. 11. Абатацепт ослабляет T-клеточные ответы in vitro и индуцирует продуцирование IL-10. (A) Общие спленоциты мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель, активированные с применением средства против CD3 и культивированные с 20 мкг/мл абатацепта или контроля изотипа IgG в течение 72 часов, анализировали с помощью FACS по экспрессии CD3e. Столбцы показывают среднее±SEM для 4 независимых экспериментов (n=4). Однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями и апостериорным критерием Тьюки; *, p-значение <0,05; ***, p-значение <0,001. (B) Затем общие спленоциты анализировали на продуцирование IL-10. Конкретные популяционные частоты анализировали среди IL-10-экспрессирующих спленоцитов (CD19+ B-клетки, CD11c+ дендритные клетки, CD11b+ моноциты и миелоидные клетки, F4/80+ макрофаги, CD3e+ T-клетки и CD3e+ Foxp3+ Treg клетки). Столбцы показывают среднее±SEM для 3 независимых экспериментов (n=3).
Фиг. 12. Присутствие регуляторных T-клеток у мышей с TAC и имитацией операции. Анализ экспрессии генов посредством qPCR в реальном времени TaqMan для регуляторного T-клеточного маркера Foxp3 в левом желудочке мышей C57BL6/J через 1, 4 и 8 недель после TAC или имитации операции. Столбцы показывают экспрессию мРНК со внутренней нормализацией по экспрессии 18s рРНК. Значения показывают среднее±SEM (n=7-9). Двухфакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони; *, p-значение <0,05.
Фиг. 13. Линейная регрессия экспрессии мРНК IL-6 и CD3e в левом желудочке мышей с TAC и имитацией операции. Круги и соответствующая линия регрессии: линейная регрессия между экспрессией Cd3e и Il6 в левом желудочке мышей C57BL6/J с операцией TAC через 4 недели после операции (n=9). Анализ линейной регрессии; p-значение=00002. Квадраты и соответствующая линия регрессии: линейная регрессия между экспрессией Cd3e и Il6 в левом желудочке мышей C57BL6/J с имитацией операции через 4 недели после операции (n=7). Анализ линейной регрессии; p-значение=0,0037.
Фиг. 14. Репрезентативные изображения и статистический анализ иммуногистохимического окрашивания AIF-1 (коричневая окраска; исходное увеличение 20×; масштабная шкала=100 мкм) в левом желудочке мышей с TAC через 4 недели после операции, которых лечили абатацептом или PBS. Плотность AIF-1 приведена в виде среднего±SEM; TAC и абатацепт (белые столбцы); TAC и PBS (черные столбцы). Непарный критерий Стьюдента. (n=2).
Фиг. 15. Стратегия сортировки для проточного цитометрического анализа суспензий отдельных клеток сердца у мышей с операцией TAC через 1 неделю после операции, соответствующих данным на фиг. 5e, 5f. Клетки сортировали на основании прямого и бокового рассеяния, дублеты исключали и отсортировывали отдельные живые клетки. CD45- и CD11b-экспрессирующие клетки отбирали и идентифицировали на основании экспрессии Ly6C и F4-80: Ly6C+ F4-80- моноциты, Ly6C+ F4-80+ незрелые макрофаги и Ly6C- F4-80+ зрелые макрофаги.
Фиг. 16. Общие спленоциты или обедненные по T-клеткам спленоциты мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель активировали с применением 2 мкг/мл средства против CD3 и 5 мкг/мл LPS. После 48 часов в культуре с 20 мкг/мл абатацепта или без него, продуцирование IL-10 анализировали посредством проточной цитометрии. Столбцы показывают среднее±SEM для 3 независимых экспериментов (n=3) для процентной доли продуцирующих IL-10 клеток среди общих спленоцитов. Однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями и апостериорным критерием Тьюки; *, p-значение <0,05.
Примеры
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Животные: все процедуры осуществляли в соответствии с национальным законодательством и законодательством Европейского союза, а также ведомственными нормами.
Поперечное сужение аорты (TAC): процедуры проводили в соответствии с (Condorelli et al., 2001). TAC осуществляли у самцов мышей C57BL/6J в возрасте 8-10 недель (Charles River, France) и у самцов мышей C57BL6/J IL-10-/- в возрасте 8-10 недель (Jackson Laboratories, US). Скрининг всех животных осуществляли перед операцией через эхокардиографию, чтобы устанавливать их базовый уровень. Мышей анестезировали посредством интраперитонеальной инъекции смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Грудную полость открывали посредством небольшого надреза на уровне первого межреберья. После выделения дуги аорты, проленовую нить 8-0 помещали вокруг аорты и промеж скрепляли иглой 27G. Иглу незамедлительно удаляли для получения аорты со стенозированным просветом. Затем грудную полость закрывали одним швом из нейлона 6-0 и все слои мышц и кожи закрывали непрерывными рассасывающимися и нейлоновыми швами 6-0, соответственно. Группу имитации, проходившую хирургическое вмешательство без перевязывания аорты, использовали в качестве контроля.
Эхокардиография: систему визуализации высокого разрешения in vivo Vevo 2100 (Visualsonics Fujifilm) с «широкоформатной» сканирующей головкой зонда MS550S использовали для эхокардиографического анализа. Мышей анестезировали с применением 1,0% изофлурана для визуализации в M-режиме. Градиенты давления (от 60 до 90 мм рт. ст.), показатель биомеханического напряжения, определяли посредством эхо-Допплера у всех животных, которые проходили TAC хирургическое вмешательство.
Лечение абатацептом: начиная с 2 суток или 2 недели от TAC/имитации операции, мышам внутрибрюшинно инъецировали или 100 мкл PBS или 200 мкг CTLA-4 Ig (абатацепт) в 100 мкл PBS, три раза в неделю в течение 4 недель.
Абатацепт представляет собой слитый CTLA-4-Ig человека, хотя из-за высокого (75%) сходства между CTLA-4 человека и мыши, он также работает у мышей. Абатацепт в целом оказывает эффект in vivo у мышей (в различных патологических контекстах) при применении доз в диапазоне, например, 100-400 мкг/мышь. Его можно вводить каждые 2 сутки. 200 мкг/мышь каждые 2 сутки (приблизительно при 8 мг/кг) схоже с дозой человека, используемой у пациентов с ревматоидным артритом (8-10 мг/кг). Следовательно, эта доза «релевантна при переводе», и ее используют в настоящем описании.
6
Адоптивный перенос T- и B-клеток дикого типа у IL10 KO мышей: B- и T-клетки дикого типа выделяли у самцов мышей C57BL6/J, соответственно, с применением Cell Isolation Kit и Pan T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) на AutoMACS. Чистоту оценивали посредством окрашивания с применением средства против CD3ε мыши (145-2C11, BioLegend) или против CD19 мыши (eBio1D3, eBioscience), и анализировали посредством проточной цитометрии. Самцам IL-10 KO мышей C57BL6/J, перед базовым эхокардиографическим скринингом, инъецировали внутривенно 2×10 T- или B-клеток WT. Мыши проходили TAC хирургическое вмешательство и получали инъекции абатацепта, начиная с 2 суток после хирургического вмешательства.
Биопсия у человека: образцы пациентов с тяжелой кардиомиопатией (HF LVAD) получали у пациентов, страдающих мутациями ламина A/C, вызывающими дилятационную кардиомиопатию и сердечную недостаточность (HF LVAD 1M). Их подмножество несло вторую мутацию в титине (HF LVAD 2M), ведущую к более тяжелой дилятационной кардиомиопатии. Все образцы получали после информированного согласия в соответствии с протоколами исследований, одобренными больничным этическим комитетом, как описано в другом месте (Roncarati et al., 2013). Образцы желудочков при аортальном стенозе также получали после информированного согласия в соответствии с протоколами исследований, одобренными больничным этическим комитетом.
Количественный RT-ПЦР анализ: левые желудочки быстро замораживали в жидком азоте после сбора и хранили при -80°C. Ткани гомогенизировали в 1 мл реактива для выделения РНК PureZol (Biorad) с применением пробирок GentleMACS и GentleMACS M (Miltenyi Biotec). После выделения водной фазы хлороформом, РНК экстрагировали с применением RNeasy Mini Kit (Qiagen). То же количество РНК подвергали обратной транскрипции с применением набора High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). Реакции qPCR в реальном времени осуществляли с применением зондов TaqMan и TaqMan Universal Master Mix на термоциклере REALTIME AB 7900HT (все из Applied Biosystems). Использовали следующие анализы экспрессии гена TaqMan: Rn18S (Mm03928990_g1) в качестве внутреннего контроля, Cd3e (Mm005996484_g1), Foxp3 (Mm00475162_g1), Itgam (Mm00434455_m1), Tnfα (Mm00443260_g1), Il-4 (Mm00445259_m1), Il-17 (Mm00439618_m1), Ifng (Mm01168134_m1), Tgfb1 (Mm01227699_m1), Il-10 (Mm00439614_m1), Il-6 (Mm00446190_m1), IL-1b (Mm00434228_m1), Ccl2 (Mm00441242_m1), Ccl4 (Mm00443111_m1), Ccl5 (Mm01302427_m1), Cxcl10 (Mm00445235_m1), Cxcl11 (Mm00444662_m1). Экспрессия генов, кодирующих натрийуретический пептид головного мозга (Nppb), предсердный натрийуретический фактор (Nppa) и тяжелую цепь β-миозина (Myh7), тестировали с применением праймеров (IDT) и Sybr Select Master Mix (Applied Biosystems) на приборе ViiA7 (Applied Biosystems). Последовательности перечислены в таблице 3.
Трансгенные Akt (Akt Tg) мыши: самцов Akt Tg мышей, которые конститутивно чрезмерно экспрессируют активный мутант E40K Akt (Akt-E40K), как описано ранее (Condorelli et al., 2002), использовали в возрасте 8 недель.
Тренированные упражнениями мыши: мыши BKS.Cg-m +/+ Lepdb/+db гетерозиготны по мутации рецептора лептина, но проявляют метаболический фенотип дикого типа при питании нормальной диетой. Авторы изобретения использовали самцов мышей в возрасте 8 недель, которых произвольно относили к одной из двух групп: малоподвижные и тренированные упражнениями 80 минут/сутки, 5 суток/неделя, в течение 8 недель, как описано ранее (Stolen et al., 2009). Из-за различий в генетическом фоне (BKS), все анализы этих мышей осуществляли, сравнивая их с соответствующими им контролями, с тем, чтобы избегать специфичных эффектов генетического фона.
Иммуногистохимический анализ: образцы сердец мышей фиксировали в 4% формалине при 4°C, погружали в парафин и делали срезы по 4 мкм. Осуществляли трехцветное окрашивание AZAN препаратов на коллаген (BioOptica). Изображения препаратов оцифровывали и анализировали пять полей для срезов мышей и десять полей для биоптатов человека, чтобы количественно определять фиброз, с применением программы анализа изображений (ImageJ). Фиброз сердца оценивали посредством измерения областей трехцветного окрашивания AZAN в виде процентной доли от общей площади миокарда. Для иммуногистохимического анализа срезы образцов на препаратах депарафинизировали и гидратировали через нисходящую шкалу спиртов. Извлечение антигенов осуществляли с применением DIVA (Biocare Medical) для образцов мышей и W-Cap (Biocare Medical) для образцов человека. Срезы охлаждали и затем промывали в PBS (Lonza), содержащем 0,05% Tween 20 (Sigma). Эндогенную пероксидазу блокировали посредством инкубации с пероксидазой I (Biocare Medical) в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) и неспецифические сайты блокировали с применением Rodent Block and Background Sniper (Biocare Medical) для образцов мышей и человека, соответственно, 20 мин при RT. Затем срезы инкубировали в течение 1 ч при RT со средством крысы против CD3 человека (Serotec), разведенным 1:1000, или AIF-1 (Wako), разведенным 1:250, или поликлональным средством кролика против CD3 человека (Dako), разведенным 1:50, промывали и инкубировали в течение 30 мин при RT с Rat-on-Mouse HRP Polymer (Biocare Medical) или с Mach1 HRP Polymer (Biocare Medical) или с Envision+System с HRP против кролика (Dako). Наконец, срезы инкубировали с DAB (Biocare Medical), контрастно окрашивали гематоксилином, дегидратировали через восходящую шкалу спиртов и ксилол и закрывали покровными стеклами, используя Eukitt (Fluka). Все образцы наблюдали и фотографировали под микроскопом Olympus BX53 с цифровой камерой.
Анализ TUNEL на образцах сердец мышей: срезы образцов на препаратах депарафинизировали и гидратировали через нисходящую шкалу спиртов и осуществляли анализ TUNEL (анализ Click-it plus TUNEL C10617, Life Technology).
Стимуляция спленоцитов in vitro с применением абатацепта: общие спленоциты выделяли из селезенки самцов мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель. T-клетки обедняли с применением магнитных бус на AutoMACS (Miltenyi Biotec). Общие спленоциты или обедненные по T-клеткам спленоциты стимулировали с применением 2 мкг/мл средства против CD3 и культивировали с 20 мкг/мл абатацепта или контроля изотипа IgG. После 72 часов культуры, брефелдин А (eBioscience) добавляли во время последних 4 часов культуры и подготавливали спленоциты для FACS анализа.
Проточная цитометрия: суспензии отдельных клеток из селезенок и лимфатических узлов получали пропусканием через 70 мкм клеточные фильтры в холодном PBS-/-. Сердца собирали и расщепляли с применением Liberase TM (Roche). Из клеточных суспензий селезенки и сердца эритроциты удаляли с применением лизирующего буфера (BD Biosciences). Клетки окрашивали с применением Live/Dead Aqua Fluorescent Reactive Dye (Life Techonologies), PerCP против CD3ε мыши (145-2C11, BioLegend), eFluor450 против CD19 мыши (eBio1D3, eBioscience), Pacific Blue против CD11b мыши (M1/70, Biolegend), CD11c APC (Bu15, eBioscience), F4/80 Alexa488 (CI:A3-1, Serotec) на фиг. 11a, F4/80 (BM8, eBioscience) на фиг. 6d, e и 15, IL-10 PE (JES5-16E3, eBioscience), FoxP3 Alexa488 (FJK-165, eBioscience), Ly6C (HK1,4, eBioscience) или Pacific Blue против CD86 (GL-1, Biolegend), FITC против CD80 (16-10A1, BD Pharmigen) или PE против CD25 (PC61.5, eBioscience). Где применимо, использовали набор для внутриклеточного окрашивания eBioscience. Образцы регистрировали на FACS Canto II (BD) и анализировали с применением FlowJo10.
Статистика: статистический анализ осуществляли в GraphPad Prism. Все наборы данных тестировали на нормальное распределение с применением критериев нормальности прежде, чем приступить к параметрическому или непараметрическому анализу. Критерий Граббса использовали для исключения сомнительных выбросов. Статистическую значимость тестировали с применением непарного критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки и двухфакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Бонферрони для наборов данных с нормальными распределениями. Статистическую значимость тестировали с применением критерия Манна-Уитни и однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Данна для наборов данных без нормального распределения. Точный критерий Фишера использовали в анализе отложения коллагена, тестируя присутствие или отсутствие красителя коллагена. Построение стандартного отклонения на фиг. 2 и фиг. 7A, B вычисляли с применением специального скрипта на R.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Пример 1. Анализ растворимых и клеточных иммунных медиаторов находится в соответствии с иммунным ответом типа M1, который переключается на ответ типа Th2 при прогрессировании до сердечной недостаточности
Авторы изобретения подвергали мышей поперечному сужению аорты (TAC), стандартной модели для патологической гипертрофии сердца, и оценивали присутствие растворимых и клеточных иммунных медиаторов в миокарде через qPCR через 1 и 4 недели после операции TAC (фиг. 1). Мониторинг функциональности сердца осуществляли посредством регулярной трансторакальной эхокардиографии (таблица 1). Через 1 неделю после TAC авторы изобретения обнаруживали значимую повышающую регуляцию Tnfa и Il6, как описано ранее (Souders et al., 2012) (Kuang et al., 2013). Происходило рекрутирование клеток иммунной системы и/или их задержка в местах приложения их действия через хемокины. Авторы изобретения обнаруживали значимую раннюю экспрессию Ccl2 и Cxcl11 (Xia et al., 2009), а также Ccl4, Ccl5 и Cxcl10 (фиг. 1), большинство из которых представляют собой маркеры воспалительной реакции, ориентированной по типу 1 (M1/Th1) (Mantovani et al., 2004). Itgam (CD11b), признак присутствия врожденных клеток иммунной системы, таких как макрофаги или моноциты, также подвержен повышающей регуляции через 1 неделю после TAC, что подсказывает, что врожденные клетки иммунной системы, ориентированные по типу 1, заранее проходили рекрутинг в стрессированный миокард.
Авторы изобретения наблюдали значимую повышающую регуляцию специфического маркера T-клеток Cd3e через 4 недели после операции, что подсказывает, что T-клетки размножались и проходили рекрутинг в стрессированный левый желудочек в этот более поздний момент времени. Сопутствующая повышающая регуляция Il4, признак ответов, ориентированных по типу 2 (M2/Th2), указывает на постепенный сдвиг от ответа M1 к M2/Th2 по мере продвижения миокарда в направлении HF. В действительности, сообщалось, что Th2-ориентированные T-клетки содействуют фиброзу в других патологических состояниях (Wynn, 2004). Транскрипты цитокинов, которые характеризуют ответы Th1 и Th17, например, Ifng и Il17, или противовоспалительного цитокина Il10 не изменялись значительно в любой момент времени.
Пример 2. Начало воспаления коррелирует с T-клеточной инфильтрацией
Получив данные об экспрессии Cd3e (указывающей на присутствие T-клеток) и экспрессии il6 (указывающей на воспаление), авторы изобретения задались вопросом о том, коррелирует ли начало воспаления с T-клеточной инфильтрацией и/или пролиферацией. Исходя из линейной регрессионной модели, авторы изобретения сначала исследовали корреляцию между Cd3e и il6 в образцах, полученных от мышей с операцией TAC, через 4 недели после операции. Результаты (фиг. 13, круги и соответствующая линия регрессии) показывают значимый положительный наклон, указывающий на то, что такая корреляция существует. Вероятная интерпретация может состоять в том, что воспаление направляет инфильтрацию и/или пролиферацию T-клеток в миокард. Повторный анализ для животных с имитацией операции (фиг. 13, квадраты и соответствующая линия регрессии) также давал значимый положительный наклон, однако при более низких средних значениях il6 и cd3e. Это подсказывает, что даже в отсутствие сужения аорты, ограниченное (но тем не менее присутствующее) воспаление, вызванное имитацией операции (которая включает хирургическое вмешательство, хоть и без постоянного сужения), может вести к ограниченной инфильтрации/пролиферации T-клеток, даже если это значительно ниже, чем при TAC (как показано на фиг. 1).
Пример 3. Профиль медиаторов иммунного ответа различен для патологической и физиологической гипертрофии сердца
Приведенное выше показывает, что патологическая гипертрофия сердца, которая ведет к фиброзу и HF, связана с воспалением. Также существуют другие непатологические формы гипертрофии сердца, которые не ведут к фиброзу или нарушению функции сердца. Наиболее физиологически релевантной моделью для этого является физическая подготовка. Мыши, которые участвовали в программе бега, демонстрируют «физиологическую» гипертрофию, при которой увеличению размера кардиомиоцитов сопутствует увеличенная функциональность клеток и отсутствие фиброза (Perrino et al., 2006) (Kemi et al., 2008). Таким образом, авторы изобретения задались вопросом о том, также присутствовали ли у тренированных упражнениями мышей иммунные медиаторы, которые они идентифицировали в TAC модели HF. Авторы изобретения не обнаруживали значимой повышающей регуляции транскриптов медиаторов иммунного ответа у этих мышей (фиг. 8A). Эта находка явно указывает на то, что, в отличие от патологической гипертрофии, физиологическая гипертрофия отличается полным отсутствием не только фиброза, но также врожденного и адаптивного иммунного ответа.
Чтобы лучше визуализировать эти различия, авторы изобретения строили показатель нарушения функции сердца (потери в проценте фракции укорочения, т. е. снижение объема, прокачиваемого желудочком) в зависимости от показателя воспаления (т. е. соотношение экспрессии транскрипта провоспалительного цитокина IL-6 и противовоспалительного цитокина IL-10) (фиг. 2). Получаемая точечная диаграмма, где каждая точка представляет одно животное, а эллипсы представляют одно стандартное отклонение для обеих переменных, иллюстрирует отчетливую связь между воспалением* и ослабленной функцией сердца. Хотя и тренированные упражнениями мыши (фиг. 2: тренированные (бегом) мыши) и мыши с операцией TAC (фиг. 2: TAC модель HF) отличаются гипертрофией сердца, патологически-гипертрофированные мыши с операцией TAC имели повышенные показатели воспаления (значения смещены в направлении вправо по сравнению со здоровыми контролями) и увеличенное нарушение функции сердца (значения смещены в направлении вверх по сравнению со здоровыми контролями). С другой стороны, тренированные мыши имели показатель воспаления, схожий с таковым у здоровых контролей, но усовершенствованную функцию сердца (сдвиг вниз по оси y). Более «искусственная» модель не патологической гипертрофии, вызванной специфической сердечной сверхэкспрессией конститутивно активного мутанта E40K серин-треониновой киназы Akt в сердце (Condorelli et al., 2002), демонстрировала не полный массив провоспалительных медиаторов, присутствующих в левом желудочке Akt трансгенных мышей в возрасте 8 недель (фиг. 8B). Таким образом, эти мыши занимали промежуточное состояние в нарушении функции сердца на точечной диаграмме воспаления, т. е. положение между двумя крайностями в виде гипертрофий, индуцированных TAC и бегом. Таким образом, результаты авторов изобретения подтверждают положительную связь между воспалением и патологической природой гипертрофии сердца.
Пример 4. T-клетки присутствуют в стрессированном миокарде мышей и человека
Вышеуказанные находки подтверждают мнение, что ингибирование воспаления может быть перспективной стратегией против HF. Этот подход пытались применять ранее, но идентифицированные мишени оказывались неадекватными этой цели (Yndestad et al., 2006)(Hofmann and Frantz, 2013). T-клетки необходимы для поддержания долгосрочного иммунного ответа (Loke et al., 2007) и, таким образом, могут представлять собой более хорошую терапевтическую мишень. Движимые находкой повышающей регуляции мРНК Cd3e, специфичного для T-клеток, у мышей с TAC через 4 недели после TAC, авторы изобретения дополнительно исследовали присутствие T-клеток при патологической гипертрофии. Исследуя левые желудочки мышей с помощью иммуногистохимии (IHC) с применением средства против CD3e (фиг. 3A), авторы изобретения обнаружили, что T-клетки были видны и значительно более многочисленны при TAC по сравнению с имитационными мышами через 4 недели (фиг. 3B), что подтверждает данные об мРНК. Во время течения патологии T-клетки, предположительно, реагируют антиген-специфическим образом, вовлекая несколько специфичных клонов, которые впоследствии растут в числе. Таким образом, авторы изобретения предположили, что T-клетки также должны поддаваться обнаружению на ранней стадии развития заболевания. Авторы исследования проводили IHC анализ мышей через 1 неделю после TAC, и в действительности авторы изобретения смогли обнаруживать T-клетки (фиг. 3C). Также авторы изобретения осуществляли очистку в градиенте с обогащением лимфоцитов для суспензий сердца, полученных из сердец мышей через 1 неделю после TAC, и наблюдали, что получаемые популяции клеток содержали CD3e-экспрессирующие клетки, когда исследовали с помощью проточной цитометрии (фиг. 3D). Следовательно, T-клетки присутствовали в гипертрофированном миокарде даже на ранней стадии патологии. В предыдущих исследованиях на TAC модели установлено, что нарушение функции сердца можно обнаруживать уже через 2 суток после TAC. Активация T-клеток часто начинается в лимфатических узлах, которые дренируют место воспаления. Таким образом, авторы изобретения посредством проточной цитометрии исследовали, происходила ли на 2 сутки после TAC активация T-клеток в дренирующих сердце (медиастинальных) лимфатических узлах. Также авторы изобретения исследовали не дренирующие (паховые) лимфатические узлы, а также селезенки те же животных. Авторы изобретения обнаруживали, что в сутки 2 значимую повышающую регуляцию активационного маркера CD25 можно наблюдать среди CD3+ T-клеток в дренирующих сердце лимфатических узлах, но не в более дистальных, не дренирующих лимфоидных компартментах (фиг. 3e). Таким образом, раннее присутствие T-клеток и идентификация присутствия T-клеток в больном миокарде создают возможность для попытки манипулировать их функцией для терапевтических целей.
Для того чтобы подтверждать клиническую значимость своей находки для ситуации с человеком, авторы изобретения исследовали относительное содержание T-клеток в сердечной ткани, полученной от пациентов с сердечной недостаточностью, страдающих первичной кардиомиопатией, которая имеет общие патологические признаки с мышиной экспериментальной моделью авторов изобретения. Авторы изобретения исследовали ткань от пациентов, несущих мутации ламина A/C, которые ведут к дилятационной кардиомиопатии и сердечной недостаточности. Их подмножество несет вторую мутацию в титине, которая ведет к более тяжелой дилятационной кардиомиопатии. Авторы изобретения выбирали этих пациентов, поскольку их кардиомиопатия обусловлена не иммунологической причиной, в отличие от воспалительных, аутоиммунных или вирусных кардиомиопатий. Таким образом, обнаружение T-клеток в левом желудочке этих пациентов будет указывать, что присутствие T-клеток коррелирует не только с кардиомиопатиями, запускаемыми чрезмерным иммунным ответом, но также с кардиомиопатиями, запускаемыми не иммунными причинами. Эти образцы сердца получали во время хирургического вмешательства для размещения вспомогательного устройства для левого желудочка (LVAD), что свидетельствует о запущенной стадии нарушения функции сердца у них. Анализ трехцветного окрашивания AZAN на коллаген (фиг. 3G) подтверждал присутствие фиброза в этих образцах (фиг. 3F). Анализ относительного содержания T-клеток посредством CD3e IHC (фиг. 3I) в тех же образцах обнаруживал присутствие инфильтрирующих T-клеток, как в сердцах мышей на 4 неделе после TAC, (фиг. 3B). В дополнение к вышеуказанным образцам от LVAD пациентов с HF, авторы изобретения также исследовали образцы от пациентов, страдающих аортальным стенозом. Аортальный стеноз ведет к сердечной недостаточности24 и представляет собой клиническое состояние, которое механистически ближе всего к TAC модели на мышах. Авторы изобретения обнаруживали, что левые желудочки от пациентов с этой формой кардиомиопатии, также демонстрировали аналогичным образом увеличенный фиброз (фиг. 3j) и присутствие T-клеток (фиг. 3k). В совокупности, эти результаты дают дополнительное подтверждение связи между присутствием T-клеток, фиброзом сердца и патологической гипертрофией.
Пример 5. Блокада костимуляции T-клеток снижает тяжесть и задерживает прогрессирование HF у мышей
Авторы изобретения предполагали, что специфическое ингибирование функции T-клеток будет оказывать положительный эффект на развитие HF. CTLA4 представляет собой одну из ингибиторных молекул, через которые встречаемые в природе регуляторные T-клетки подавляют активацию T-клеток при физиологических условиях (Wing and Sakaguchi, 2010). Она блокирует сигналы костимуляции CD80/CD86, которые T-клетки должны получать от антигенпредставляющих клеток (дендритных клеток, B-клеток или макрофагов) для того, чтобы становиться полностью активированными (Moreland et al., 2006). Слитый белок CTLA4-Ig (абатацепт, одобренное FDA лекарственное средство для лечения ревматоидного артрита, аутоиммунного заболевания) представляет собой стабильную растворимую форму CTLA4. Следовательно, авторы изобретения тестировали, вызывало ли введение абатацепта положительный эффект в TAC модели HF. Авторы изобретения лечили мышей с TAC или с имитацией операции с применением трех интраперитонеальных инъекций в неделю 200 мкг абатацепта, в течение 4 недель, начиная на 2 сутки после операции. В качестве контролей мыши с TAC и имитацией операции получали PBS, в одни и те же моменты времени. Мониторинг функции сердца осуществляли посредством трансторакальной эхокардиографии (см. таблицу 2). Сутки 2 после операции выбирали в качестве первого момент времени для лечения, поскольку значимое нарушение функции сердца (увеличение толщины левого желудочка) уже может быть обнаружено на 2 сутки после TAC с помощью клинически-релевантных диагностических способов (эхокардиография).
Мыши с операцией TAC и лечением PBS в 1 и 4 неделю после операции демонстрировали значимое снижение функции сердца, выражаемое в виде процента фракции укорочения (FS) или фракции изгнания (EF) по сравнению с имитационными контролями, тогда как мыши с лечением абатацептом не имели значимого различия в FS или EF для имитационных контролей (фиг. 4A-B). Различие в FS очевидно с первой недели после операции TAC вплоть до конца эксперимента (фиг. 4A); также значимость различия в EF возрастала со временем между группами с лечением PBS и абатацептом (фиг. 4B). Таким образом, посредством введения абатацепта, начиная со 2 суток после операции TAC, авторы изобретения были способно значительно снижать степень и задерживать прогрессирование ухудшения функции сердца. Положительный эффект абатацепта также очевиден с помощью анализа других гемодинамических параметров, в том числе внутреннего диаметра левого желудочка в конце диастолы (LVIDd) (фиг. 4C) и в конце систолы (LVIDs) (фиг. 4D). Другие измеренные параметры приведены в (таблице 2). На 3 неделе после операции еще можно различать временное, но значимое различие между животными с лечением абатацептом и имитационным контролем. В конце четвертой недели авторы изобретения оценивали морфометрические показатели гипертрофии сердца: соотношение массы сердца и массы тела (фиг. 9A), соотношение левого желудочка и массы тела (фиг. 9B), соотношение массы сердца и длины большеберцовой кости (фиг. 9C). мыши с операцией TAC и лечением абатацептом демонстрировали значительно более низкую гипертрофию, чем контроли с лечением PBS, что соответствует большинству этих параметров. Анализ «генов стресса» миокарда, признака гипертрофии и отказа сердца, в левых желудочках посредством qPCR также демонстрировал значимую повышающую регуляцию мРНК тяжелой цепи β-миозина (Mhy7) (фиг. 9D), натрийуретического пептида головного мозга (Nppb) (фиг. 9E) и предсердного натрийуретического фактора (Nppa) (фиг. 9F) для групп с лечением PBS, но не абатацептом. Таким образом, лечение абатацептом значительно снижает тяжесть и задерживает прогрессирование нарушения функции сердца, обусловленного перегрузкой желудочков давлением.
Также авторы изобретения исследовали срезы с трехцветным окрашиванием AZAN для того, чтобы оценивать уровни фиброза (Condorelli et al., 1999). Сравнение интенсивности коллагена в идентичных областях, образцы которых получали для всех групп лечения, выявило значимое увеличение уровней фиброза для всех групп после операции TAC, за исключением мышей, которых лечили абатацептом (фиг. 4F). Эти результаты подсказывают, что положительные эффекты абатацепта также отражены в защите от фиброза сердца, биологической реакции, инвариантно связанной с сердечной недостаточностью (Kong et al., 2014).
Что важно, абатацепт основан на CTLA-4 человека, слитом с иммуноглобулином человека, и, таким образом, подходит для применения у человека, но всесторонне показано, что он функционирует у мышей из-за высокого сходства CTLA-4 человека и мыши (Dhirapong et al., 2013). Поскольку введение Ig человека может быть иммуногенным у мышей(), авторы изобретения включали дополнительное множество мышей без операции, которые получали абатацепт или иммуноглобулин изотипического контроля (Ig), чтобы оценивать любую реактивность реципиентов на Ig человека, используемый в слитом белке. Ни инъекции самого абатацепта, ни инъекции контрольного IgG человека не вели к какому-либо значимому изменению в функции сердца (фиг. 10), что обозначает, что любая аллореактивность на иммуноглобулин имела ограниченные эффекты. Тем не менее, потенциал аллореактивности контрольного IgG, в отсутствие иммуносупрессорного CTLA-4 домена, возможно, может усугублять TAC-индуцированное воспаление. По этой причине, авторы изобретения выбирали применение введения PBS вместо введения IgG в качестве контроля для их экспериментов, чтобы избегать любого вредного эффекта, оказываемого на контроли, создавая видимость более сильного терапевтического эффекта в группе с лечением абатацептом. В действительности, когда авторы изобретения оценивали эффект абатацепта in vivo у мышей с операцией TAC, они обнаруживали, что его защитный эффект выглядел даже более значимым по сравнению с лечением изотипическим контролем вместо мышей с операцией TAC и лечением PBS (фиг. 10c, d, e, f). Это подтверждало валидность контролей, выбранных авторами изобретения.
Пример 6. Ингибирование T-клеточной костимуляции эффективно на запущенной стадии заболевания.
Затем авторы изобретения задались вопросом, сможет ли лечение абатацептом блокировать прогрессирование нарушения функции сердца при введении только в поздний момент времени, когда заболевание является более запущенным. По этой причине авторы изобретения повторяли лечение абатацептом in vivo, несмотря на начало первого лечения через 2 недели после TAC, а не 2 суток после TAC. Как можно видеть (фиг. 4g, h), лечение в поздний момент времени, тем не менее, способно значительно блокировать дополнительное снижение FS и EF у животных с лечением. Значимый защитный эффект также наблюдали в LVIDs (фиг. 10 g). Эти результаты демонстрируют, что даже позднее лечение лекарственным средством может оказывать существенные положительные эффекты на ограничение прогрессирования HF.
Пример 7. Абатацепт защищает от патологической гипертрофии посредством ингибирования активации T-клеток, а также посредством воздействия на макрофаги
Экстенсивные исследования показали, что CTLA4-Ig ингибирует функцию T-клеток, посредством блокирования костимуляторных рецепторов на антигенпредставляющих клетках, которые необходимы для полной активации провоспалительных T-клеток (Linsley et al., 1991)(Moreland et al., 2006). В действительности, молекула CTLA-4 представляет один из основных доступных механизмов, через которые можно осуществлять физиологическую понижающую регуляцию уже инициированных T-клеточных ответов (Bluestone, 1997)(Krummey and Ford, 2014). Следовательно, авторы изобретения пытались анализировать, как абатацепт влияет на активацию T-клеток при патологической гипертрофии сердца. Для этого авторы изобретения исследовали, через проточную цитометрию, экспрессию активационного маркера CD25 в T-клетках в ранний момент времени (1 неделя после TAC), который вероятно представляет собой релевантный временной интервал для событий активации. Абатацепт значительно снижал процентную долю CD25+ клеток среди T-клеток не только в дренирующих сердце (медиастинальных) лимфатических узлах, но также в паховых лимфатических узлах и селезенке (фиг. 5A). Это подсказывает, что абатацепт вызывал системное ослабление активации T-клеток. Экспрессию CD25 на T-клетках, инфильтрирующих сердце, нельзя надежно оценивать из-за низкого числа T-клеток, встречающихся в сердце через 1 неделю после TAC, что делает проточный цитометрический анализ субпопуляций технически сложным.
Сниженная активация T-клеток вероятно ведет к сниженной пролиферации и более низкому числу T-клеток в более поздние моменты времени. В действительности, через 4 недели после хирургического вмешательства, миокард мышей с лечением абатацептом демонстрировал значительно меньше инфильтрирующих T-клеток, чем у мышей с лечением PBS (фиг. 5B). Следует отметить, что контроль изотипа IgG для абатацепта не оказывал эффекта на T-клеточные ответы in vitro, в отличие от самого абатацепта (фиг. 11A). Авторы изобретения также задавали вопросом, ведет ли опосредованная абатацептом супрессия T-клеток к нисходящему ингибиторному эффекту, оказываемому на активацию макрофагов, которая, как показано в последнее время, вносит вклад в патологию сердца (Epelman et al., 2014). С помощью иммуногистохимии авторы изобретения оценивали экспрессию AIF-1 (Iba-1), маркера T-клеточной активации макрофагов (Utans et al., 1995) (Tian et al., 2006), в сердцах оперированных мышей. У мышей с операцией TAC лечение абатацептом вело к значимому снижению сигнала AIF-1 по сравнению с контролями с лечением PBS (фиг. 5C). Мыши с имитацией операции имели незначительные сигналы AIF-1+ клеток. Через 4 недели после операции различия в AIF-1+ макрофагах между двумя группами были минимальными (фиг. 14), наиболее вероятно потому, что общие уровни AIF-1+ макрофагов или в действительности всех CD11b+ врожденных клеток иммунной системы (фиг. 1) у мышей с операцией TAC снижены на этой поздней стадии патологии.
Затем авторы изобретения исследовали состояние созревания макрофагов38, встречающихся в левом желудочке мышей с TAC и лечением абатацептом или контролем через 1 неделю после операции посредством проточного цитометрического анализа. Авторы изобретения рассматривали процентную долю Ly6C+F4-80+ (незрелых макрофагов) или Ly6C-F4-80+ (зрелых макрофагов) среди CD11b+CD45+ живых отдельных клеток (стратегия сортировки представлена на фиг. 15). Авторы изобретения обнаруживали, что сердца животных с лечением абатацептом имели значительно более высокую процентную долю незрелых макрофагов (фиг. 5e) и значительно более низкую процентную долю зрелых макрофагов (фиг. 5f) по сравнению с контролями.
Эта находка подсказывает, что ингибирование T-клеток в соответствии с изобретением также может иметь нисходящие эффекты, оказываемые на патогенные макрофаги в миокарде, в том числе, например, на состояние активации и созревания макрофагов в миокарде.
Пример 8. Защитный эффект абатацепта зависит от IL-10
Эффект абатацепта, оказываемый на активацию T-клеток, возникает через удаление провоспалительных костимуляторных сигналов (Krummey and Ford, 2014) на антигенпредставляющих клетках, но дополнительно может зависеть от продуцирования противовоспалительных сигналов, активно ингибирующих патогенный ответ (Linsley et al., 1991)(Sage et al., 2014). Чтобы дополнительно исследовать это, авторы изобретения изучали присутствие иммунных медиаторов через qPCR в реальном времени у животных с операцией TAC, которых лечили. Через 1 неделю после операции, в момент времени, когда абатацепт уже приводит к кардиопротективным эффектам, имеет место значительная повышающая регуляция экспрессии мРНК для провоспалительного цитокина IL-6 у мышей с операцией TAC и лечением как PBS, так и абатацептом (фиг. 5d: il6). Это не удивительно, поскольку обе группы животных подвергались одной и той же TAC обработке, где IL-6 имеет центральную роль в ответе стрессированного миокарда (Melendez et al., 2010). Однако только в группе с лечением абатацептом авторы изобретения могли наблюдать значимую повышающую регуляцию мРНК для цитокина IL-10 (фиг. 5d: il10). Таким образом, абатацепт вызывает значимую повышающую регуляцию Il10 у мышей с операцией TAC (фиг. 5D; il10). IL-10 является одним из наиболее активных противовоспалительных цитокинов, используемых иммунной системой для выключения нежелательных или более не нужных ответов, и показано, что он опосредует кардиопротективные эффекты при HF (Verma et al., 2012), его эффект, оказываемый на функцию кардиомиоцитов, противоположен таковому у IL-6 (Melendez et al., 2010). Введение самого абатацепта не оказывает какие-либо прямые эффекты на неонатальные кардиомиоциты, поскольку in vitro он не влияет на их гипертрофированное состояние. Эти находки, в совокупности, подсказывали, что абатацепт может опосредовать противовоспалительные эффекты и последующие эффекты против гипертрофии через IL-10. Поскольку Il10 подвержен повышающей регуляции у мышей с TAC и лечением абатацептом, авторы изобретения оценивали, какое подмножество клеток иммунной системы может выполнять функцию источников IL-10. Авторы изобретения исследовали экспрессию внутриклеточного IL-10 посредством проточной цитометрии в спленоцитах, на которые воздействовали абатацептом in vitro. Авторы изобретения обнаруживали, что абатацепт индуцировал IL-10 главным образом на антигенпредставляющих клетках, подавляющее большинство которых представляли собой B-клетки, хотя также можно идентифицировать несколько T-клеток, продуцирующих IL-10 (фиг. 11B).
Авторы изобретения, таким образом, исследовали, необходим ли IL-10 для защитных эффектов абатацепта. С этой целью авторы изобретения анализировали эффект абатацепта, оказываемый на мышей с дефицитом IL-10 (IL-10KO), которых подвергали TAC. Как изложено выше, признаком функции абатацепта является супрессия T-клеточных ответов. Что интересно, у IL-10KO мышей абатацепт более не может ингибировать присутствие T-клеток в сердце мышей с операцией TAC (фиг. 6A), что показывает, что IL-10 необходим для ослабляющего T-клетки противовоспалительного эффекта лекарственного средства. Впоследствии авторы изобретения задались вопросом, необходим ли IL-10 для опосредованных абатацептом эффектов, оказываемых на гипертрофию сердца. Эхокардиографический анализ IL-10KO мышей с операцией TAC подтверждал, что IL-10 необходим для положительного эффекта абатацепта, оказываемого на сердце (фиг. 6B-E). Наконец, апоптоз кардиомиоцитов является признаком патологической гипертрофии (Condorelli et al., 1999). Хотя абатацепт значительно снижал степень апоптоза кардиомиоцитов у мышей дикого типа с операцией TAC, этого не происходило у IL-10KO мышей, которые рефрактерны к лечению (фиг. 6F).
Результаты авторов изобретения, в совокупности, подсказывают, что абатацепт может защищать от прогрессирования HF посредством устранения и активного обращения патогенного иммунного ответа и, следовательно, влиять на гипертрофию сердца таким образом, который зависит от цитокина IL-10. Вычисление и построение показателей нарушения функции сердца и воспаления (фиг. 7A, B) показывает, что абатацепт ведет к снижению воспаления (сдвиг влево по сравнению с мышами с лечением PBS) и, следовательно, к усовершенствованию функции сердца, которую оценивают как снижение нарушения функции сердца (сдвиг к более низким значениям на оси y). Также улучшение функции сердца происходило через 4 недели после TAC, что указывает на задержку прогрессирования синдрома (фиг. 7B).
Пример 9. Предоставления IL-10 B-клеток дикого типа достаточно, чтобы избегать утраты опосредованного абатацептом защитного эффекта
6
6
Затем авторы изобретения пытались подтверждать, может ли быть достаточно продуцирующих IL-10 клеток, идентифицированных выше (т. е. главным образом B-клеток и, в меньшей степени, T-клеток), чтобы избегать утраты защитного эффекта у IL-10KO животных. Чтобы достигать этого, авторы изобретения сначала переносили 2×10 B-клеток дикого типа (с достаточным IL-10) или 2×10 T-клеток дикого типа (с достаточным IL-10) IL-10KO реципиентам. Затем авторы изобретения переходили к осуществлению операции TAC, после чего следовало лечение абатацептом или контролем, начиная с суток 2 после операции. Переноса IL-10 B-клеток дикого типа достаточно, чтобы избегать утраты опосредованного абатацептом защитного эффекта у IL-10KO мышей с операцией TAC (фиг. 6g, h: сплошные квадраты). С другой стороны, перенос IL10 T-клеток дикого типа не позволяет сохранять защитный эффект (фиг. 6g, h: пустые квадраты). Из этого авторы изобретения заключили, что IL-10, продуцируемый B-клетками в ответ на абатацепт, должен участвовать в механизме опосредованного абатацептом кардиопротективного эффекта. Для того чтобы оценивать, зависит ли этот опосредованный B-клетками эффект от эффекта лекарственного средства, оказываемого на T-клетки, или может ли это быть прямым эффектом, оказываемым на B-клетки, авторы изобретения оценивали способность спленоцитов продуцировать IL-10 после введения абатацепт in vitro, в присутствии или в отсутствии T-клеток. Авторы изобретения обнаруживали, что на продуцирование IL-10 не влияло отсутствие T-клеток (фиг. 16), что подсказывает, что опосредованный B-клетками эффект может быть прямым.
Результаты авторов изобретения, в совокупности, подсказывают, что абатацепт может защищать от прогрессирования HF посредством ингибирования патогенного иммунного ответа, опосредованного T-клетками и макрофагами, при этом также непосредственно вызывая полезное продуцирование противовоспалительного цитокина IL-10 B-клетками.
ОБСУЖДЕНИЕ
Авторы изобретения в настоящем описании демонстрируют, как абатацепт, одобренное FDA лекарственное средство, которое ингибирует костимуляцию T-клеток, снижает тяжесть и задерживает прогрессирование индуцированной перегрузкой давлением гипертрофии сердца и фиброза. Этот результат возможен, поскольку авторы изобретения в настоящем описании обнаружили, что патогенез HF связан со врожденным и адаптивным иммунным ответом. Абатацепт снижает этот ответ и, таким образом, ингибирует прогрессирование патологии сердца, через механизм, зависящий от действия IL-10.
Полагают, что секреция провоспалительных цитокинов стрессированными кардиомиоцитами запускает воспаление сердца, связанное с HF (Shioi et al., 1997,)(Ancey et al., 2002)(Souders et al., 2012). Присутствие таких цитокинов использовали для того, чтобы различать физиологическую и патологическую гипертрофию (Serra et al., 2010). Что важно, подтвердив и расширив сведения о связи между воспалением и патологией сердца, авторы изобретения показали здесь, что посредством направленного воздействия на клетки адаптивной иммунной системы возможно препятствовать ремоделированию сердца посредством снижения воспалительной реакции. Это отличается от неуспешных попыток ограничивать патологию посредством направленного воздействия на цитокины, которые, как доказано, являются более труднодостижимыми целями (Yndestad et al., 2006)(Hofmann and Frantz, 2013).
Основным клиническим признаком патологической гипертрофии сердца является фиброз. Похоже, что в других контекстах образование фиброза требует комбинированного действия Th2-ориентированных T-клеток и врожденных клеток иммунной системы (Wynn, 2004)(Niedermeier et al., 2009). Авторы изобретения определили, как воспаление сердца изначально опосредовано M1-ориентированными врожденными клетками иммунной системы и впоследствии может переключаться на M2/Th2-поляризацию с течением времени. Это согласуется с двумя предыдущими исследованиями, где сообщалось о более тяжелой HF у мышей BALB/c по сравнению с C57BL/6, что свойственно более сильному Th2-смещению при первой нагрузке (Yu et al., 2006)(Peng et al., 2011). Авторы изобретения также демонстрировали присутствие T-клеток в биоптатах пациентов-людей с HF, как от пациентов с тяжелой дилятационной кардиомиопатией, возникшей в следствие не иммунологических причин, так и от пациентов, страдающих аортальным стенозом.
Одно из основных средств иммунной системы для регулирования действия T-клеток опосредовано иммуносупрессорным регуляторным T-клетками (Treg), которые подавляют вредоносные или нежелательные ответы (Wing and Sakaguchi, 2010). Что интересно, свидетельства связывают дефицит Treg с хронической HF (Tang et al., 2010). Авторы изобретения обнаружили присутствие Treg, через экспрессию их генетического маркера Foxp3, у мышей с TAC, но только через 8 недель после операции (фиг. 12). Это может являться показателем естественной попытки иммуносупрессии, которая возникает слишком поздно, чтобы блокировать патогенный иммунный ответ (Garetto et al., 2015). Предпринято две успешные экспериментальные попытки использовать введение сингенных Treg (адоптивная Treg клеточная терапия) в моделях HF (Kvakan et al., 2009)(Kanellakis et al., 2011). Однако адоптивная клеточная терапия, хоть и является очень перспективной, представляет собой сложную и дорогостоящую процедуру, которая все еще требует усовершенствования прежде, чем ее можно будет использовать в клинике. Альтернативное средство получить преимущество супрессорной функции Treg состоит в том, чтобы избирательно активировать их через суперактивирующие антитела против CD28. Это использовали два раза в моделях репарации сердца после инфаркта миокарда (MI) (Tang et al., 2012)(Weirather et al., 2014). Хотя MI-индуцированный стресс сердца и ассоциированный с ним иммунный ответ имеет несколько ключевых отличий по сравнению с индуцированной перегрузкой давлением HF, тем не менее, успех этих исследований является обнадеживающей вехой. Однако важное предостережение для этого подхода кроется в том факте, что пациенты-люди имеют значительно более высокое число провоспалительных T-клеток памяти, которые в прошлых клинических исследованиях были активированы с помощью суперактивирующих клонов против CD28, при почти летальных последствиях для пациентов (Suntharalingam et al., 2006). Хотя эту проблему в настоящее время решают с применением более точных реактивов (Weirather et al., 2014), это решение все еще не полностью применимо в клинике. Таким образом, в поиске более легко переносимого решения, авторы изобретения решили использовать слитый белок на основании CTLA-4, одной из эффекторных молекул клеток Treg. Treg осуществляет через связанный с поверхностью CTLA-4, а также растворимый IL-10 или TGFβ, ингибируя функцию как врожденных, так и адаптивных клеток иммунной системы (Wing and Sakaguchi, 2010). CTLA-4 специфически ингибирует функцию T-клеток посредством блокирования способности T-клеток становиться костимулированными. Слитый белок CTLA4-Ig абатацепт легко вводить и он уже в клиническом применении для супрессии аутоиммунных ответов (Moreland et al., 2006). Поскольку лекарственное средство функционально у мышей, для попыток терапии авторы изобретения решили использовать TAC модель HF на мышах. TAC модель считают моделью золотого стандарта для индуцированной перегрузкой HF, и в действительности ее использовали в очень большом числе исследований в широком диапазоне условий, связанных с HF.
Даже несмотря на то, что авторы изобретения наблюдали системную супрессию T-клеток, явную даже в не дренирующих лимфоидных органах мышей с операцией TAC и лечением абатацептом, установленные показатели клинической безопасности абатацепта снижают риск того, что это иммуносупрессорное лечение может вызывать оппортунистические инфекции в организме.
Авторы изобретения демонстрировали, что абатацепт снижал тяжесть патологии сердца и задерживал развитие симптомов патологии сердца, обусловленной перегрузкой. Важно, что авторы изобретения могли демонстрировать, что лекарственное средство может значительно ограничивать прогрессирование патологии, даже когда введение начинали на поздней стадии заболевания.
Известно, что лекарственное средство ингибирует функцию T-клеток посредством блокирования костимуляторных лигандов CD80 и CD86 на антигенпредставляющих клетках (Moreland et al., 2006). Соответственно, авторы изобретения обнаружили, что абатацепт ингибировал T-клеточные ответы in vivo (фиг. 5), в том числе в дренирующих сердце лимфатических узлах, где, по-видимому, начинается активация T-клеток (фиг. 3e). Авторы изобретения также наблюдали ингибирование активации и созревания макрофагов сердца (фиг. 5c, e, f). Воспаление у мышей с лечением абатацептом ослабляли, влияя на активацию макрофагов сердца (фиг. 5C), а также баланс уровней про- и противовоспалительных цитокинов, как это можно легко визуализировать на графиках нарушения функции сердца в зависимости от воспаления (фиг. 7A, B). Абатацепт также индуцировал активные противовоспалительные сигналы, такие как цитокин IL-10, которые авторы изобретения обнаруживали in vivo (фиг. 5D) и которые могут продуцировать как T-клетки, так и антигенпредставляющие клетки (фиг. 11B). IL-10 (фиг. 6b-d) необходим для проявления защитных эффектов, и IL-10 могут продуцировать B-клетки после лечения лекарственным средством in vitro (фиг. 11b). Похоже, что B-клеток с достаточным IL-10 достаточно, чтобы избегать утраты кардиопротективных эффектов у IL-10KO животных с операцией TAC, которых лечили абатацептом (фиг. 6a-h). Поскольку T-клетки и антигенпредставляющие клетки взаимодействуют для их взаимной полной активации (Linsley et al., 1991), не удивительно, что обе популяции могут участвовать в индуцировании противовоспалительных сигналов. Схематическое представление этого комбинированного удаления провоспалительной активации T-клеток и индуцирования противовоспалительных сигналов (в B-клетках) приведено на (фиг. 7C). Поскольку показано, что IL-10 является непосредственно кардиопротективным и противофиброзным (Verma et al., 2012)(Wynn, 2004), преимущество, которое дает лечение абатацептом, может быть обусловлено комбинированным эффектом удаления провоспалительных сигналов, а также прямыми защитными эффектами IL-10. Оба эти эффекта зависели от IL-10, поскольку у мышей с дефицитом цитокина лечение абатацептом более не подавляло размножение T-клеток и не защищало от утраты функциональности сердца или апоптоза кардиомиоцитов.
Несмотря на то, что показано, что абатацепт индуцирует регуляторные T-клетки (Ko et al., 2010), авторы изобретения не наблюдали какой-либо значимой индукции экспрессии мРНК Foxp3 в своей системе. Однако авторы изобретения наблюдали продуцирование IL-10 в Foxp3+ Treg клетках in vitro после введения абатацепта, так что этот параллельный механизм формально не может быть исключен. Поскольку макрофаги сердца, супрессию которых абатацептом авторы изобретения обнаружили, могут действовать в качестве CD80/CD86-экспрессирующих антигенпредставляющих клеток, авторы изобретения также не могут исключить, что лекарственное средство супрессирует макрофаги как через его эффект, оказываемый на T-клетки, так и действуя непосредственно на сами макрофаги.
Лечение в соответствии с изобретением направлено на костимуляцию T-клеток и, таким образом, их оптимальную активацию. Активация T-клеток также может быть релевантна для хронического характера подлежащего заболевания сердца, и непрерывное присутствие когнатных антигенов, распознаваемых T-клетками, может препятствовать разрешению. В качестве примера ингибитора костимуляции и/или активации и/или функции T-клеток, который уже используют в клинике, молекулы, полученные из CLTA4, такие как CTLA4-Ig, например, абатацепт, могут быть более релевантны для переноса, чем другие средства для направленного воздействия на T-клетки, которые в настоящее время исследуют для лечения индуцированной перегрузкой давлением HF. Кроме того, костимуляция требует взаимодействия между T-клетками и антигенпредставляющими клетками. Следовательно, направленное воздействие на костимуляцию требует направленного воздействия на несущие CD80/CD86 макрофаги и B-клетки, которое вносит вклад в терапевтический эффект, как он влияет на ассоциированные с T-клетками ответы B-клеток и макрофагов.
IL-10 является непосредственно кардиопротективным и противофиброзным. Результаты авторов изобретения показывали, что присутствие IL-10 необходимо для кардиопротективных эффектов абатацепта, и также для супрессии размножения T-клеток (фиг. 6a). Также IL-10 оказывает нисходящее действие относительно введения лекарственного средства. Таким образом, регуляция индуцирования IL-10 зависит от определения местоположения и относительного содержания мишеней лекарственного средства. Ингибитор T-клеточной костимуляции, такой как ингибитор T-клеток типа CTLA4-Ig абатацепт, даже когда B-клетки и макрофаги являются его прямыми мишенями, влияет только на ответы, ассоциированные с T-клетками. Абатацепт влияет на активацию T-клеток системно (как показано на фиг. 5a), но по экстраполяции данных об аутоиммунных патологиях, которые цитированы выше, предсказано, что он не влияет на независимый от T-клеток врожденный иммунный ответ, даже если его действие зависит от IL-10. Доказанный профиль безопасности абатацепта в клинике дает существенную поддержку интерпретации о том, что баланс эффективной иммуносупрессии и индукции функционального иммунодефицита может быть удовлетворительным у ингибирующей T-клетки молекулы на основе CTLA4, такой как CTLA4-Ig, например, абатацепт.
В совокупности, находки данного исследования демонстрируют, как одобренное FDA лекарственное средство, которое ингибирует провоспалительную функцию T-клеток, может давать значимые терапевтические эффекты в модели HF. Причина, лежащая в основе этого, состоит в том, что адаптивный иммунный ответ причинно связан с патогенезом индуцированной перегрузкой давлением гипертрофии сердца и фиброза. Поскольку T-клетки вносят значительный вклад в хронический характер иммунного ответа, направленное воздействие на них кажется эффективным для контроля прогрессирования патологии.
Индукция иммунного ответа в качестве реакции на перегрузку сердца давлением может быть нежелательным последствием ответа, исходно возникшего для борьбы с инфекциями патогенов. Может быть так, что организм неспособен различать между сигналами стресса, индуцированными инфекцией и перегрузкой давлением. Все же, к счастью, эта связь между иммунитетом и патологической гипертрофией сердца также создает определенную возможность: функциональная и валидированная терапия, в настоящее время используемая в клинике для лечения заболеваний, опосредованных иммунитетом, может стать важным инструментом в борьбе против сердечной недостаточности.
Таким образом, вкратце, авторы изобретения описывают в настоящем описании, что ингибитор костимуляции и/или активации и/или функции T-клеток эффективен при лечении или предотвращении патологий сердечной недостаточности, которые не индуцированы воспалительной кардиомиопатией, обусловленной аутоиммунностью или иммунным ответом на инфекцию (например, не вирусной инфекцией). Сердечная недостаточность, индуцированная перегрузкой давлением, является репрезентативным примером патологий сердечной недостаточности, которые таким образом лечат или предотвращают.
Конечно, следует понимать, что настоящее изобретение описано выше только в качестве примера и что модификации деталей можно выполнять в пределах объема приложенной формулы изобретения.
Таблицы
Таблица 1: гемодинамические параметры мышей с TAC и имитацией операции через 1, 3 и 4 недели после операции.
SHAM
TAC
Базовые (n=3)
1 неделя после имитации (n=3)
3 недели после имитации (n=3)
4 недели после имитации (n=3)
Базовые(n=7)
1 неделя после TAC (n=7)
3 недели после TAC (n=7)
4 недели после TAC (n=7)
Возраст (нед.)
8,7 ± 0,0
9,6 ± 0,1
11,7 ± 0,1
12,6 ± 0,0
8,6 ± 0,1
9,6 ± 0,1
11,6 ± 0,1
12,6 ± 0,0
Масса (г)
22,0 ± 1,0
22,4 ± 0,8
23,6 ± 0,9
23,9 ± 1,1
22,8 ± 1,6
22,3 ± 1,3
24,0 ± 1,5
24,6 ± 1,5
HR в M-режиме (уд./мин)
545,7÷71,1
507,7÷93,9
549,7 ± 66,0
598,0 ± 29,0
577,0 ± 66,4
530,1 ± 48,7
517,9 ± 87,1
606,0 ± 36,6
%FS
43,4 ± 3,1
43,3 ± 1,4
42,9 ± 3,0
40,3 ± 1,7
40,5 ± 2,4
37,7 ± 1,2 †
33,2 ± 1,5*
30,6 ± 2,2*
%EF
75,7 ± 3,5
75,6 ± 1,5
75,0 ± 3,5
72,1 ± 2,1
72,3 ± 3,6
69,0 ± 1,6 †
62,7 ± 2,1*
58,8 ± 3,5*
LVIDd (мм)
3,4 ± 0,1
3,4 ± 0,1
3,5 ± 0,1
3,4 ± 0,0
3,4 ± 0,1
3,4 ± 0,2
3,7 ± 0,1°+
3,7 ± 0,3†
LVIDs (мм)
1,9 ± 0,1
1,9 ± 0,1
2,0 ± 0,2
2,0 ± 0,1
2,0 ± 0,2
2,1 ± 0,1°
2,5 ± 0,1 *
2,6 ± 0,3°*
IVSd (мм)
0,7 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,7 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,7 ± 0,0
0,9 ± 0,1°*
0,9 ± 0,1°*
1,0 ± 0,1#*
IVSs (мм)
1,1 ± 0,1
1,2 ± 0,0
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,3 ± 0,1†
1,3 ± 0,1°+
1,4 ± 0,1°+
LVPWd (мм)
0,7 ± 0,1
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,9 ± 0,1
0,9 ± 0,1#*
0,9 ± 0,1†
LVPWs (мм)
1,2÷0,1
1,3÷0,0
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,3 ± 0,1
1,3 ± 0,1°+
1,3 ± 0,1†
° p<0,05 TAC в сравнении с имитацией в тот же момент времени
# p<0,01 TAC в сравнении с имитацией в тот же момент времени
p<0,001 TAC в сравнении с имитацией в тот же момент времени
† p<0,05 Базов. TAC в сравнении с TAC в каждый момент времени
+ p<0,01 Базов. TAC в сравнении с TAC в каждый момент времени
* p<0,001 Базов. TAC в сравнении с TAC в каждый момент времени
Непарный критерий Стьюдента
Таблица 2: гемодинамические параметры мышей с TAC и имитацией операции, которых лечили абатацептом или PBS, через 1, 3 и 4 недели после операции
Имитация
Абатацепт
PBS
Базовые (n=8)
1 неделя после имитации (n=7)
3 недели после имитации (n=8)
4 недели после имитации (n=8)
Базовые (n=8)
1 неделя после имитации (n=5)
3 недели после имитации (n=7)
4 недели после имитации (n=7)
Возраст (нед.)
9,0 ± 0,3
9,9 ± 0,0
12,0 ± 0,0
12,9 ± 0,0
9 ± 0,3
10,1 ± 0,0
12,0 ± 0,1
13,0 ± 0,0
Масса (г)
22,6 ± 1,4
22,1 ± 1,3
23,5 ± 1,5
23,7 ± 1,7
22,6 ± 1,4
21,7 ± 1,4
23,11 ± 2,1
24,0 ± 1,9
HR в M-режиме (уд./мин)
564,4 ± 75,8
514,0÷56,4
602,8 ± 68,6
614,4 ± 44,5
564,4÷75,8
579,0 ± 18,9
577,3 ± 69,9
575,2 ± 85,6
%FS
41,4 ± 3,8
43,0 ± 4,1
42,6 ± 1,5
40,7 ± 2,0
41,4 ± 3,8
43,3 ± 2,5
40,6 ± 2,5
41,4 ± 1,7
%EF
73,2 ± 4,8
75,2 ± 4,8
74,9 ± 1,6
72,8 ± 2,4
73,2 ± 4,8
75,8 ± 2,6
72,7 ± 3
73,8 ± 1,9
LVIDd (мм)
3,4 ± 0,1
3,3 ± 0,2
3,3 ± 0,2
3,2 ± 0,2
3,4 ± 0,1
3,1 ± 0,2
3,2 ± 0,1
3,1 ± 0,3
LVIDs (мм)
2 ± 0,2
1,9 ± 0,2
1,9 ± 0,1
1,9 ± 0,1
2,0 ± 0,2
1,8 ± 0,1
1,9 ± 0,1
1,8 ± 0,2
IVSd (мм)
0,8 ± 0,0
0,7 ± 0,1
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,0
IVSs (мм)
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,0
1,3 ± 0,0
1,2 ± 0,0
1,2 ± 0,1
1,3 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
LVPWd (мм)
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,9 ± 0,1
LVPWs (мм)
1,2 ± 0,0
1,3÷0,0
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,1
1,2 ± 0,0
1,2 ± 0,0
1,2 ± 0,0
1,2 ± 0,0
TAC
Абатацепт
PBS
Базовые (n=9)
1 неделя после TAC (n=8)
3 недели после TAC (n=7)
4 недели после TAC (n=7)
Базовые (n=10)
1 неделя после TAC (n=10)
3 недели после TAC (n=10)
4 недели после TAC (n=10)
Возраст (нед.)
8,9 ± 0,0
9,9 ± 0,0
11,9 ± 0,0
12,9 ± 0,0
9,0 ± 0,3
10,1 ± 0,0
12,1 ± 0,0
12,9 ± 0,0
Масса (г)
22,5 ± 1,6
22,1 ± 1,4
23,4 ± 1,3
24 ± 1,8
22,6 ± 1,4
21,6 ± 1,8
23,6 ± 1,6
24,2 ± 1,4
HR в M-режиме (уд./мин)
556,9÷86,1
546,6÷55,8
597,9 ± 94,6
561,4 ± 66,0
564,4÷75,8
544,7÷46,2
575,2 ± 85,6
558,3 ± 60,9
%FS
42,0 ± 1,5
41,3 ± 3,2#
37,3 ± 1,6#+
36,5 ± 3,7#
41,4 ± 3,8
34,9 ± 1,3
30,7 ± 3,0
27,5 ± 3,8
%EF
74,1 ± 1,8
73,4 ± 3,9#
68,3 ± 2,2#
67,2 ± 4,8#
73,2 ± 4,8
65,2 ± 1,8
58,9 ± 4,6
53,9 ± 6,2
LVIDd (мм)
3,4 ± 0,1
3,3 ± 0,2
3,5 ± 0,2†°
3,5 ± 0,1#
3,4 ± 0,1
3,5 ± 0,2+
3,8 ± 0,3
3,8 ± 0,2
LVIDs (мм)
1,9 ± 0,1
1,9 ± 0,2
2,2 ± 0,2
2,2 ± 0,2
2,0 ± 0,2
2,3 ± 0,1
2,6 ± 0,3
2,8 ± 0,3
IVSd (мм)
0,8 ± 0,1
0,9 ± 0,1
0,9 ± 0,1°
1,0 ± 0,0
0,8 ± 0,0
0,9 ± 0,1
0,9 ± 0,1+
1,0 ± 0,1
IVSs (мм)
1,2 ± 0,1
1,3 ± 0,0
1,3 ± 0,1
1,4 ± 0,0
1,2 ± 0,1
1,3 ± 0,1
1,4 ± 0,1°
1,3 ± 0,1
LVPWd (мм)
0,7 ± 0,1
0,9 ± 0,1+
1 ± 0,1
0,9 ± 0,0
0,8 ± 0,1
0,9 ± 0,1
1,0 ± 0,1
1,0 ± 0,1+
LVPWs (мм)
1,2÷0,1
1,4÷0,1
1,4 ± 0,1
1,4 ± 0,0
1,2÷0,0
1,4÷0,1
1,4 ± 0,0
1,4 ± 0,1
° p<0,05 TAC и абатацепт/PBS в сравнении с имитацией и абатацептом/PBS в тот же момент времени
+ p<0,01 TAC и абатацепт/PBS в сравнении с имитацией и абатацептом/PBS в тот же момент времени
p<0,001 TAC и абатацепт/PBS в сравнении с имитацией и абатацептом/PBS в тот же момент времени
† p<0,05 TAC и абатацепт в сравнении с TAC и PBS в тот же момент времени
* p<0,01 TAC и абатацепт в сравнении с TAC и PBS в тот же момент времени
# p<0,001 TAC и абатацепт в сравнении с TAC и PBS в тот же момент времени
Таблица 3: список используемых праймеров
Ген
Прямой праймер
Обратный праймер
β-миозин (Mhy7)
5'-CGCATCAAGGAGCTCACC-3' (SEQ ID № 3)
5'-CTGCAGCCGCAGTAGGTT-3'(SEQ ID № 4)
Натрийуретический пептид головного мозга (Nppb)
5'-GTCAGTCGTTTGGGCTGTAAC-3'(SEQ ID № 5)
5'-AGACCCAGGCAGAGTCAGAA-3'(SEQ ID № 6)
Предсердный натрийуретический пептид (Nppa)
5'-CACAGATCTGATGGATTTCAAGA-3'(SEQ ID № 7)
5'-CCTCATCTTCTACCGGCATC-3'(SEQ ID № 8)
Рибосомная РНК 18S (18S)
5'-AAATCAGTTATGGTTCCTTTGGTC-3'(SEQ ID № 9)
5'-GCTCTAGAATTACCACAGTTATCCAA-3'(SEQ ID № 10)
Настоящее раскрытие также включает следующие пункты:
1. Ингибитор костимуляции и/или активации и/или функции T-клеток для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов.
2. Ингибитор для применения в соответствии с п. 1, который представляет собой ингибитор по меньшей мере одной молекулы, способствующей костимуляции T-клеток.
3. Ингибитор для применения в соответствии с п. 1 или 2, где указанный ингибитор увеличивает уровни IL-10 в сердце.
4. Ингибитор для применения в соответствии с любым одним из предыдущих пп., содержащий или состоящий из по меньшей мере одной молекулы, выбранной из группы, состоящей из: CTLA4, PD-1, PD-L1 или PD-L2, BTLA, CD160, LAG-3, 2B4, B7-H3, B7-H4, B7S3, BTNL2, блокирующих антител против CD28, их функционального фрагмента, функционального производного или функциональных аналогов.
5. Ингибитор для применения в соответствии с п. 2, где молекулу, способствующую костимуляции T-клеток, выбирают из группы, состоящей из: B7-1 и B7-2 (также известны как CD80 и CD86), CD40, CD40L (также известен как CD154), OX40, OX40L, CD30, CD30L, 4-1BB, 4-BBL, GITR, лиганд GITR, LIGHT, CD27, CD45RB, CD2, LFA-3, B7-H3, B7-H4, ICOS и лигандов ICOS.
6. Ингибитор для применения в соответствии с любым одним из предыдущих пп., который представляет собой по меньшей мере одну молекулу, выбранную из группы, состоящей из: блокирующего антитела или его функционального фрагмента или низкомолекулярного ингибитора или полинуклеотида.
7. Ингибитор для применения в соответствии с любым одним из пп. 1-3, который представляет собой молекулу, содержащую или состоящую из CTLA4 или его функционального фрагмента или функционального производного или функционального аналога.
8. Ингибитор для применения в соответствии с п. 7, который представляет собой молекулу CTLA4-Ig или ее функциональный фрагмент или функциональное производное или ее функциональный аналог.
9. Ингибитор для применения в соответствии с п. 8, где молекула CTLA4-Ig представляет собой слитый белок, содержащий первую аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки, соответствующие внеклеточному домену CTLA4, и вторую аминокислотную последовательность, содержащую Fc-область иммуноглобулина IgG1.
10. Ингибитор для применения в соответствии с п. 8 или 9, где молекула CTLA4-Ig содержит или по существу состоит из аминокислотной последовательности из SEQ ID № 1 или ее функционального фрагмента или функционального производного или ее функционального аналога.
11. Ингибитор для применения в соответствии с любым одним из предыдущих пп., где указанный ингибитор представляет собой абатацепт.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ингибитор, как определено в любом одном из пп. 1-11, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов.
13. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, как определено в п. 12, или кодирующий ингибитор, как определено в любом одном из пп. 1-11, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов.
14. Генетически сконструированная клетка-хозяин или наночастица или микровезикула, которая экспрессирует ингибитор, как определено в любом одном из пп. 1-11, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор, как определено в любом одном из пп. 1-11, или молекулу нуклеиновой кислоты, как определено в п. 12, или экспрессирующий вектор, как определено в п. 13, или генетически сконструированную клетку-хозяина или наночастицу или микровезикулу, как определено в п. 14, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, для применения в лечении и/или предотвращении патологий сердца, предпочтительно заболеваний сердечной недостаточности, и/или связанных симптомов.
ЛИТЕРАТУРА
Ancey, C., P. Corbi, J. Froger, A. Delwail, J. Wijdenes, H. Gascan, D. Potreau, and J.C. Lecron. 2002. Secretion of IL-6, IL-11 and LIF by human cardiomyocytes in primary culture. Cytokine. 18:199-205.
Bluestone, J.A. 1997. Is CTLA-4 a master switch for peripheral T cell tolerance? J Immunol. 158:1989-1993.
Bulut, D., G. Creutzenberg, and A. Mugge. 2012. The number of regulatory T cells correlates with hemodynamic improvement in patients with inflammatory dilated cardiomyopathy after immunoadsorption therapy. Scand J Immunol. 77:54-61. doi:10.1111/sji.12000.
Condorelli, G., A. Drusco, G. Stassi, A. Bellacosa, R. Roncarati, G. Iaccarino, M.A. Russo, Y. Gu, N. Dalton, C. Chung, M.V. Latronico, C. Napoli, J. Sadoshima, C.M. Croce, and J.J. Ross. 2002. Akt induces enhanced myocardial contractility and cell size in vivo in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:12333-12338. doi:10.1073/pnas.172376399.
Condorelli, G., C. Morisco, G. Stassi, A. Notte, F. Farina, G. Sgaramella, A. de Rienzo, R.
Roncarati, B. Trimarco, and G. Lembo. 1999. Increased cardiomyocyte apoptosis and changes in proapoptotic and antiapoptotic genes bax and bcl-2 during left ventricular adaptations to chronic pressure overload in the rat. Circulation. 99:3071-3078.
Condorelli, G., R. Roncarati, J. Ross, A. Pisani, G. Stassi, M. Todaro, S. Trocha, A. Drusco, Y. Gu, M.A. Russo, G. Frati, S.P. Jones, D.J. Lefer, C. Napoli, and C.M. Croce. 2001. Heart-targeted overexpression of caspase3 in mice increases infarct size and depresses cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 98:9977-9982. doi:10.1073/pnas.161120198.
Dhirapong, A., G.X. Yang, S. Nadler, W. Zhang, K. Tsuneyama, P. Leung, S. Knechtle, A.A.
Ansari, R.L. Coppel, F.T. Liu, X.S. He, and M.E. Gershwin. 2013. Therapeutic effect of cytotoxic T lymphocyte antigen 4/immunoglobulin on a murine model of primary biliary cirrhosis. Hepatology. 57:708-715. doi:10.1002/hep.26067.
Epelman, S., K.J. Lavine, A.E. Beaudin, D.K. Sojka, J.A. Carrero, B. Calderon, T. Brija, E.L.
Gautier, S. Ivanov, A.T. Satpathy, J.D. Schilling, R. Schwendener, I. Sergin, B. Razani, E.C.
Forsberg, W.M. Yokoyama, E.R. Unanue, M. Colonna, G.J. Randolph, and D.L. Mann. 2014. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40:91-104.
doi:10.1016/j.immuni.2013.11.019.
Garetto, S., A.E. Trovato, A. Lleo, F. Sala, E. Martini, A.G. Betz, G.D. Norata, P. Invernizzi, and M. Kallikourdis. 2015. Peak inflammation in atherosclerosis, primary biliary cirrhosis and autoimmune arthritis is counter-intuitively associated with regulatory T cell enrichment. Immunobiology. 220:1025-9. doi:10.1016/j.imbio.2015.02.006.
Hofmann, U., and S. Frantz. 2013. How can we cure a heart ʺin flameʺ? A translational view on inflammation in heart failure. Basic Res Cardiol. 108:356. doi:10.1007/s00395-013-0356-y.
Kanellakis, P., T.N. Dinh, A. Agrotis, and A. Bobik. 2011. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells suppress cardiac fibrosis in the hypertensive heart. J Hypertens. 29:1820-1828
Kemi, O.J., M. Ceci, U. Wisloff, S. Grimaldi, P. Gallo, G.L. Smith, G. Condorelli, and O. Ellingsen. 2008. Activation or inactivation of cardiac Akt/mTOR signaling diverges physiological from pathological hypertrophy. J Cell Physiol. 214:316-321. doi:10.1002/jcp.21197.
Ko, H.J., M.L. Cho, S.Y. Lee, H.J. Oh, Y.J. Heo, Y.M. Moon, C.M. Kang, S.K. Kwok, J.H. Ju, S.H. Park, K.S. Park, and H.Y. Kim. 2010. CTLA4-Ig modifies dendritic cells from mice with collagen-induced arthritis to increase the CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population. J Autoimmun. 34:111-120. doi:10.1016/j.jaut.2009.07.006.
Kong, P., P. Christia, and N.G. Frangogiannis. 2014. The pathogenesis of cardiac fibrosis. Cell Mol Life Sci. 71:549-574. doi:10.1007/s00018-013-1349-6.
Krummey, S.M., and M.L. Ford. 2014. Braking bad: novel mechanisms of ctla-4 inhibition of T cell responses. Am J Transplant. 14:2685-2690. doi:10.1111/ajt.12938.
Kuang, S.Q., L. Geng, S.K. Prakash, J.M. Cao, S. Guo, C. Villamizar, C.S. Kwartler, A.M. Peters, A.R. Brasier, and D.M. Milewicz. 2013. Aortic remodeling after transverse aortic constriction in mice is attenuated with AT1 receptor blockade. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33:2172- 2179. doi:10.1161/ATVBAHA.113.301624.
Kvakan, H., M. Kleinewietfeld, F. Qadri, J.K. Park, R. Fischer, I. Schwarz, H.P. Rahn, R. Plehm, M. Wellner, S. Elitok, P. Gratze, R. Dechend, F.C. Luft, and D.N. Muller. 2009. Regulatory T cells ameliorate angiotensin II-induced cardiac damage. Circulation. 119:2904-2912. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.108.832782.
Lai, N.C., M.H. Gao, E. Tang, R. Tang, T. Guo, N.D. Dalton, A. Deng, and T. Tang. 2012. Pressure overload-induced cardiac remodeling and dysfunction in the absence of interleukin 6 in mice. Lab Invest. 92:1518-1526. doi:10.1038/labinvest.2012.97.
Linsley, P.S., W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle, and J.A. Ledbetter. 1991. CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7. J Exp Med. 174:561-569.
Loke, P., I. Gallagher, M.G. Nair, X. Zang, F. Brombacher, M. Mohrs, J.P. Allison, and J.E. Allen. 2007. Alternative activation is an innate response to injury that requires CD4+ T cells to be sustained during chronic infection. J Immunol. 179:3926-3936.
Mann, D.L. 2002. Inflammatory mediators and the failing heart: past, present, and the foreseeable future. Circ Res. 91:988-998.
Mantovani, A., A. Sica, S. Sozzani, P. Allavena, A. Vecchi, and M. Locati. 2004. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25:677- 686. doi:10.1016/j.it.2004.09.015.
Melendez, G.C., J.L. McLarty, S.P. Levick, Y. Du, J.S. Janicki, and G.L. Brower. 2010. Interleukin 6 mediates myocardial fibrosis, concentric hypertrophy, and diastolic dysfunction in rats. Hypertension. 56:225-231. doi:10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.148635.
Moreland, L., G. Bate, and P. Kirkpatrick. 2006. Abatacept. Nat Rev Drug Discov. 5:185-186. doi:10.1038/nrd1989.
Niedermeier, M., B. Reich, M. Rodriguez Gomez, A. Denzel, K. Schmidbauer, N. Gobel, Y. Talke, F. Schweda, and M. Mack. 2009. CD4+ T cells control the differentiation of Gr1+ monocytes into fibrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:17892-17897. doi:10.1073/pnas.0906070106.
Oka, T., S. Hikoso, O. Yamaguchi, M. Taneike, T. Takeda, T. Tamai, J. Oyabu, T. Murakawa, H. Nakayama, K. Nishida, S. Akira, A. Yamamoto, I. Komuro, and K. Otsu. 2012. Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure. Nature. 485:251- 255. doi:10.1038/nature10992.
Peng, H., X.P. Yang, O.A. Carretero, P. Nakagawa, M. D'Ambrosio, P. Leung, J. Xu, E.L. Peterson, G.E. Gonzalez, P. Harding, and N.E. Rhaleb. 2011. Angiotensin II-induced dilated cardiomyopathy in Balb/c but not C57BL/6J mice. Exp Physiol. 96:756-764. doi:10.1113/expphysiol.2011.057612.
Perrino, C., S.V. Naga Prasad, L. Mao, T. Noma, Z. Yan, H.S. Kim, O. Smithies, and H.A. Rockman. 2006. Intermittent pressure overload triggers hypertrophy-independent cardiac dysfunction and vascular rarefaction. J Clin Invest. 116:1547-1560. doi:10.1172/JCI25397.
Pilat, N, C Schwarz, and T Wekerle (2012), 'Modulating T-cell costimulation as new immunosuppressive concept in organ transplantation.', Curr Opin Organ Transplant, 17 (4), 368-75.
Roncarati, R., C. Viviani Anselmi, P. Krawitz, G. Lattanzi, Y. von Kodolitsch, A. Perrot, E. di Pasquale, L. Papa, P. Portararo, M. Columbaro, A. Forni, G. Faggian, G. Condorelli, and P.N.
Robinson. 2013. Doubly heterozygous LMNA and TTN mutations revealed by exome sequencing in a severe form of dilated cardiomyopathy. Eur J Hum Genet. 21:1105-1111. doi:10.1038/ejhg.2013.16.
Sage, P.T., A.M. Paterson, S.B. Lovitch, and A.H. Sharpe. 2014. The coinhibitory receptor CTLA-4 controls B cell responses by modulating T follicular helper, T follicular regulatory, and T regulatory cells. Immunity. 41:1026-1039. doi:10.1016/j.immuni.2014.12.005.
Serra, A.J., M.H. Santos, D.S. Bocalini, E.L. Antonio, R.F. Levy, A.A. Santos, M.L. Higuchi, J.A. Silva, F.C. Magalhaes, V.G. Barauna, J.E. Krieger, and P.J. Tucci. 2010. Exercise training inhibits inflammatory cytokines and more than prevents myocardial dysfunction in rats with sustained beta-adrenergic hyperactivity. J Physiol. 588:2431-2442. doi:10.1113/jphysiol.2010.187310.
Sharpe, AH (2009), 'Mechanisms of costimulation.', Immunol Rev, 229 (1), 5-11.
Shioi, T., A. Matsumori, Y. Kihara, M. Inoko, K. Ono, Y. Iwanaga, T. Yamada, A. Iwasaki, K. Matsushima, and S. Sasayama. 1997. Increased expression of interleukin-1 beta and monocyte chemotactic and activating factor/monocyte chemoattractant protein-1 in the hypertrophied and failing heart with pressure overload. Circ Res. 81:664-671.
Souders, C.A., T.K. Borg, I. Banerjee, and T.A. Baudino. 2012. Pressure overload induces early morphological changes in the heart. Am J Pathol. 181:1226-1235. doi:10.1016/j.ajpath.2012.06.015.
Stolen, T.O., M.A. Hoydal, O.J. Kemi, D. Catalucci, M. Ceci, E. Aasum, T. Larsen, N. Rolim, G. Condorelli, G.L. Smith, and U. Wisloff. 2009. Interval training normalizes cardiomyocyte function, diastolic Ca2+ control, and SR Ca2+ release synchronicity in a mouse model of diabetic cardiomyopathy. Circ Res. 105:527-536. doi:10.1161/CIRCRESAHA.109.199810.
Suntharalingam, G., M.R. Perry, S. Ward, S.J. Brett, A. Castello-Cortes, M.D. Brunner, and N.
Panoskaltsis. 2006. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355:1018-1028. doi:10.1056/NEJMoa063842.
Tang, T.T., Y.J. Ding, Y.H. Liao, X. Yu, H. Xiao, J.J. Xie, J. Yuan, Z.H. Zhou, M.Y. Liao, R. Yao, Y. Cheng, and X. Cheng. 2010. Defective circulating CD4CD25+Foxp3+CD127(low) regulatory T-cells in patients with chronic heart failure. Cell Physiol Biochem. 25:451-458. doi:10.1159/000303050.
Tang, T.T., J. Yuan, Z.F. Zhu, W.C. Zhang, H. Xiao, N. Xia, X.X. Yan, S.F. Nie, J. Liu, S.F. Zhou, J.J. Li, R. Yao, M.Y. Liao, X. Tu, Y.H. Liao, and X. Cheng. 2012. Regulatory T cells ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 107:232. doi:10.1007/s00395-011-0232-6.
Tian, Y., S.E. Kelemen, and M.V. Autieri. 2006. Inhibition of AIF-1 expression by constitutive siRNA expression reduces macrophage migration, proliferation, and signal transduction initiated by atherogenic stimuli. Am J Physiol Cell Physiol. 290:C1083-91. doi:10.1152/ajpcell.00381.2005.
Utans, U., R.J. Arceci, Y. Yamashita, and M.E. Russell. 1995. Cloning and characterization of allograft inflammatory factor-1: a novel macrophage factor identified in rat cardiac allografts with chronic rejection. J Clin Invest. 95:2954-2962. doi:10.1172/JCI118003.
Verma, S.K., P. Krishnamurthy, D. Barefield, N. Singh, R. Gupta, E. Lambers, M. Thal, A. Mackie, E. Hoxha, V. Ramirez, G. Qin, S. Sadayappan, A.K. Ghosh, and R. Kishore. 2012. Interleukin-10 treatment attenuates pressure overload-induced hypertrophic remodeling and improves heart function via signal transducers and activators of transcription 3-dependent inhibition of nuclear factor-kappaB. Circulation. 126:418-429. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.112185.
Weirather, J., U. Hofmann, N. Beyersdorf, G.C. Ramos, B. Vogel, A. Frey, G. Ertl, T. Kerkau, and S. Frantz. 2014. Foxp3+CD4+ T Cells Improve Healing after Myocardial Infarction by Modulating Monocyte/Macrophage Differentiation. Circ Res. 115:55-67. doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.303895.
Wing, K., and S. Sakaguchi. 2010. Regulatory T cells exert checks and balances on self tolerance and autoimmunity. Nat Immunol. 11:7-13
Wynn, T.A. 2004. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nat Rev Immunol. 4:583 594. doi:10.1038/nri1412.
Xia, Y., K. Lee, N. Li, D. Corbett, L. Mendoza, and N.G. Frangogiannis. 2009. Characterization of the inflammatory and fibrotic response in a mouse model of cardiac pressure overload. Histochem Cell Biol. 131:471-481. doi:10.1007/s00418-008-0541-5.
Yndestad, A., J.K. Damas, E. Oie, T. Ueland, L. Gullestad, and P. Aukrust. 2006. Systemic inflammation in heart failure--the whys and wherefores. Heart Fail Rev. 11:83-92. doi:10.1007/s10741-006-9196-2.
Yu, Q., K. Horak, and D.F. Larson. 2006. Role of T lymphocytes in hypertension-induced cardiac extracellular matrix remodeling. Hypertension. 48:98-104. doi:10.1161/01.HYP.0000227247.27111.b2.
Zarrinkoub, R., B. Wettermark, P. Wandell, M. Mejhert, R. Szulkin, G. Ljunggren, and T. Kahan. 2013. The epidemiology of heart failure, based on data for 2.1 million inhabitants in Sweden. Eur J Heart Fail. 15:995-1002. doi:10.1093/eurjhf/hft064.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Humanitas Mirasole S.p.A.
<120>  ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ АКТИВАЦИИ ИЛИ
СТИМУЛЯЦИИ T-КЛЕТОК
<130>  192353
<150>  EP16151539.0
<151>  2016-01-15
<160>  10
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  357
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CTLA4-Ig
<400>  1
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1               5                   10                  15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20                  25                  30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35                  40                  45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50                  55                  60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65                  70                  75                  80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85                  90                  95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100                 105                 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115                 120                 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130                 135                 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145                 150                 155                 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165                 170                 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180                 185                 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195                 200                 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210                 215                 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245                 250                 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260                 265                 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275                 280                 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290                 295                 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325                 330                 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340                 345                 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210>  2
<211>  383
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CTLA4-Ig
<400>  2
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1               5                   10                  15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20                  25                  30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35                  40                  45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50                  55                  60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65                  70                  75                  80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85                  90                  95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100                 105                 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115                 120                 125
Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145                 150                 155                 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165                 170                 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180                 185                 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195                 200                 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210                 215                 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225                 230                 235                 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245                 250                 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260                 265                 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275                 280                 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290                 295                 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305                 310                 315                 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325                 330                 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340                 345                 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355                 360                 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370                 375                 380
<210>  3
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  3
cgcatcaagg agctcacc                                                     18
<210>  4
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  4
ctgcagccgc agtaggtt                                                     18
<210>  5
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  5
gtcagtcgtt tgggctgtaa c                                                 21
<210>  6
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  6
agacccaggc agagtcagaa                                                   20
<210>  7
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  7
cacagatctg atggatttca aga                                               23
<210>  8
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  8
cctcatcttc taccggcatc                                                   20
<210>  9
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  9
aaatcagtta tggttccttt ggtc                                              24
<210>  10
<211>  26
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетический праймер
<400>  10
gctctagaat taccacagtt atccaa                                            26
<---