СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧУМНОГО МИКРОБА ПЕРЕД СУБЛИМАЦИОННЫМ ВЫСУШИВАНИЕМ
METHOD FOR STABILIZING BACTERIAL CELLS OF PLAGUE MICROBE BEFORE FREEZE-DRYING

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам стабилизации бактериальных клеток средами высушивания, обеспечивающих защиту микроорганизмов от воздействия факторов замораживания и обезвоживания при сублимационном высушивании и может быть использовано при получении сухих препаратов на основе живых микроорганизмов.
Известны способы стабилизации микробных клеток в суспензии клеток перед высушиванием, включающие: приготовление защитной среды в виде водного раствора защитных компонентов с необходимой концентрацией и корректировка величины рН среды до значений, соответствующих рН микробной суспензии; смешение суспензии клеток с защитной средой (обычно в соотношении 2:1 по объему) [Е.Е. Никитин, И.В. Звягин Замораживание и высушивание биологических препаратов - М, 1971. - С. 169-181; Б.И. Бланков, Д.Д. Клебанов Применение лиофилизации в микробиологии - М, 1961. - С. 161-172; К.Е. Долинов Основы технологии сухих биопрепаратов, 1964. - С. 159-168].
При этом, защитные среды, стабилизирующие микробные клетки перед высушиванием, различаются по содержанию и количеству компонентов, выбор которых, в значительной степени, зависит от индивидуальных особенностей микроорганизмов и решаемых задач.
К недостаткам этих способов следует отнести внесение в микробную суспензию вместе с защитными компонентами дополнительного количества воды, в результате чего содержание воды в суспензии увеличивается до 80%. Это приводит к возникновению таких воздействий на клетки, как дегидратация и осмотический шок, а при замораживании, внесенная вода, служит дополнительным источником образования кристаллов льда. Указанные факторы приводят к разрушению жизненноважных структур микроорганизмов и снижению их выживаемости при сублимационном высушивании [А.А. Белоус, В.А. Бондаренко Структурные изменения биологических мембран при охлаждении - Киев, 1982. - С. 221-224; Н.С. Пушкарь Теория и практика криогенного и сублимационного консервирования - Киев, 1984. - С. 109-114; А.М. Карпов, А.А. Улумиев. Сушка продуктов микробиологического синтеза, 1982. - С. 79; С.Г. Игнатов Исследование функциональных и структурных изменений мембранного аппарата после низкотемпературного замораживания // Биохимия, 1981. - Т. 46, №1. - С. 996-2003].
В качестве прототипа выбран способ стабилизации микробных клеток многокомпонентным водным раствором, содержащим, процент (по массе): лактозу - 30; тиомочевину - 3; аскорбиновую кислоту - 3; полиглюкин - 3; дистиллированную воду - 61 [В.В. Тетерин, А.В. Ежов [и др.] Способ получения биопрепарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Патент РФ №2510825, опубл. 10.04.2014 г.].
Способ заключается:
Приготовление среды высушивания.
3
Навеску полиглюкина предварительно замачивают в 100-200 см теплой дистиллированной воды и выдерживают при температуре 18-24°С. Полученный раствор фильтруют через марлевый фильтр. Навеску лактозы заливают 500 см дистиллированной воды и подогревают до температуры 80°С при постоянном помешивании до полного растворения. После этого полученный раствор разделяют на две части, в одной части растворяют аскорбиновую кислоту, а в другой тиомочевину, растворение тиомочевины проводят при температуре 70°С. Раствор аскорбиновой кислоты нейтрализуют 40% раствором едкого натрия до величины рН 7,3-7,5 ед. рН. Приготовленные растворы тиомочевины и аскорбиновой кислоты фильтруют через марлевый фильтр и смешивают с раствором полиглюкина. Корректировку величины рН до значений 7,2-7,6 ед. рН производят 10% раствором едкого натрия.
Стабилизация бактериальных клеток.
В бутыль с концентрированной суспензией чумного микроба добавляют среду высушивания в соотношении 2:1 (2 части концентрированной суспензии и 1 часть среды высушивания). Содержимое бутыли тщательно перемешивают встряхиванием.
У прототипа и заявленного способа общими является: компонентный состав защитной среды (лактоза, тиомочевина, аскорбиновая кислота, полиглюкин) и смешение бактериальных клеток перед высушиванием с защитной средой для их стабилизации.
К недостаткам прототипа следует отнести:
в результате использования жидкой формы защитной среды происходит увеличение объема внеклеточной воды, что в итоге, как было сказано, при низкотемпературном замораживании и высушивании приводит к низкой выживаемости микробов возбудителей чумы;
продолжительный процесс сублимации, связанный с необходимостью испарить большее количество воды.
Задачей изобретения является разработка такого способа стабилизации бактериальных клеток, который обеспечил бы возможность проводить сублимационное высушивание за более короткий промежуток времени и получать сухой препарат с высоким содержанием живых клеток.
3
Технический результат достигается благодаря тому, что в заявленном способе, включающем приготовление защитной среды и смешение концентрированной суспензии с защитными веществами, для создания требуемой их концентрации, обеспечивающей стабилизацию и защиту клеток на этапах замораживания и высушивания, предусмотрены следующие отличия, заключающиеся в использовании вместо жидкой защитной среды сухой быстрорастворимой среды, в количестве 130 г на 1 дм суспензии. При этом процесс получения сухой среды включает приготовление жидкой среды с рН 7,0 -7,2 ед. рН и ее сублимационное обезвоживание.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем:
Приготовление сухой бысторостворимой защитной среды.
Готовят водный раствор защитных компонентов по прописи:
300 г лактозы;
30 г тиомочевины;
30 г аскорбиновой ктслоты;
30 г полиглюкина;
3
610 см дистиллированной воды.
Порядок приготовления раствора аналогичен порядку приготовления среды высушивания прототипа. Устанавливают величину рН раствора от 7,0 до 7,2 ед. рН.
Полученный раствор помещают в плоскодонные кюветы слоем в 7 мм, которые размещают на полках сушильной камеры. Проводят высушивание по следующему режиму: температура конденсатора-вымораживателя минус 60°С, температура замораживания материала минус 40°С, продолжительность выдержки материала при температуре замораживания 4 часа, рабочее давлении в сублимационной камере не более 20 Па, скорость повышения температуры материала не более 3°С/ч, максимальная температура материала при досушивании 25°С, общая продолжительность высушивания 36 часов.
Получают сухую форму среды, содержащую, процент (по массе): лактозу - 76,9; тиомочевину - 7,7; аскорбиновую кислоту - 7,7; полиглюкин - 7,7.
В сухой среде определяют значение остаточной влажности по методике [А.П. Коузов, Л.Я. Скрябина. Методы определения физико-химических свойств порошкообразных пылей - Л., 1983. - С. 83-84], которое должно составлять от 2,5 до 3,5%. Определяют степень растворимости сухой защитной среды в соответствии с требованиями [Общая фармакопейная статья (ОФС) 12.1.0005.11 «Растворимость»], при значение показателя не более 5 секунд - сухая среда считается легко растворимой в водной среде.
Сухую форму защитной среды хранят в герметичной емкости, оснащенной системой ввода в полость инертного газа, при температуре от 20 до 25°С в течение одного года.
Стабилизация бактериальных клеток.
3
Сухую защитную среду из расчета 13 г на 100 см концентрированной суспензии, вносят в емкость с культурой, вручную встряхивают и перемешивают до полного растворения.
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутым техническим результатом показано в таблице 1.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1.
Были приготовлены, по ранее описанным технологиям, две защитные среды:
сухая защитная среда, содержащая, процент (по массе): лактозу - 76,9; тио-мочевину - 7,7; аскорбиновую кислоту - 7,7; полиглюкин - 7,7;
жидкая защитная среда, содержащая, процент (по массе): лактозу - 30; тио-мочевину - 3; аскорбиновую кислоту - 3; полиглюкин - 3; дистиллированную воду - 61.
3
Затем проводили стабилизацию концентрированной суспензии вакцинного штамма чумного микроба приготовленными средами. Использовали концентрированную суспензию с биологической концентрацией 94 млрд живых кл./см, величиной сухого остатка 6,3%, полученную по технологии описанной в прототипе. Были приготовлены 2 серии стабилизированных суспензий:
3
серия 1 - концентрированную суспензию стабилизировали сухой формой защитной среды из расчета 13 г сухой среды на 100 см суспензии;
3
3
серия 2 - концентрированную суспензию стабилизировали жидкой защитной средой из расчета 50 см среды на 100 см суспензии.
Смешение защитных сред с суспензиями проводили вручную в течение 5 минут. Результаты оценки свойств стабилизированных суспензий представлены в таблице 2.
Для получения сухих препаратов проводили сублимационное высушивание стабилизированных суспензий в установке МАСС-5-02. Для этого за 3 часа до загрузки полки сушильной камеры охлаждали до температуры минус 40°С, конденсатор до минус 60°С. Суспензии разливами в металлические кюветы слоем не более 7 мм, которые помещали на полки сушильной камеры. Суспензии замораживали до температуры минус 40°С и выдерживали при данной температуре в течение 4 часов. Затем создавали рабочее давление в сублиматоре от 20 до 10 Па, через 1 час после создания заданной величины разрежения включали подогрев полок и проводили постепенное повышение температуры до 25°С. Досушивание материала проводили при температуре 25°С. Общая продолжительность высушивания составляла 36 часов.
В результате были получены 2 серии сухих препаратов: серия 1 (с использованием заявленного способа) и серия 2 (с использованием способа прототипа).
В сухих препаратах определяли биологическую концентрацию (бактериологическим методом) и рассчитывали выживаемость бактерий при высушивании, результаты представлены в таблице 2.
Для такого рода сухих препаратов, основными показателями являются биологическая концентрация (не менее 100 млрд живых кл./г) и остаточная влажность (от 2 до 5%). По данным таблицы 2, препараты, полученные при 36-часовом сублимационном высушивании, являлись кондиционными.
Пример 2.
Были приготовлены, по ранее описанным технологиям, две защитные среды: сухая защитная среда, содержащая (процент по массе): лактозу - 76,9; тио-мочевину - 7,7; аскорбиновую кислоту - 7,7; полиглюкин - 7,7;
жидкая защитная среда, содержащая (процент по массе): лактозу - 30; тио-мочевину - 3; аскорбиновую кислоту - 3; полиглюкин - 3; дистиллированную воду - 61.
3
Затем проводили стабилизацию концентрированной суспензии вакцинного штамма чумного микроба указанными средами. Использовали концентрированную суспензию с биологической концентрацией 105 млрд живых кл./см, величиной сухого остатка 6,5%, полученную по технологии описанной в прототипе. Были приготовлены 2 серии стабилизированных суспензий:
3
серия 3 - концентрированную суспензию стабилизировали сухой формой защитной среды из расчета 13 г сухой среды на 100 см суспензии;
3
3
серия 4 - концентрированную суспензию стабилизировали жидкой защитной средой из расчета 50 см среды на 100 см суспензии.
Смешение защитных сред с суспензиями проводили вручную в течение 5 минут. Результаты оценки свойств стабилизированных суспензий представлены в таблице 2.
Получение сухих препаратов проводили по режиму, описанному в примере 1 с тем отличием, что общая продолжительность высушивания составляла 26 часов.
В результате были получены 2 серии сухих препаратов: серия 3 (с использованием заявленного способа) и серия 4 (с использованием способа прототипа).
В сухих препаратах определяли биологическую концентрацию (чашечным методом) и рассчитывали выживаемость бактерий при высушивании, результаты представлены в таблице 2.
Из анализа данных таблицы 2 следует, что при использовании сухой защитной среды повышается выживаемость бактерий при высушивании, возрастает биологическая концентрация и содержание клеток в препарате. При этом кондиционных значений остаточной влажности, от 2 до 5%, возможно достичь при 26-часовом высушивании.