Набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli и способ выявления возбудителя Acidovorax citrulli
SET OF PRIMERS FOR DETECTING AGENT ACIDOVORAX CITRULLI AND METHOD OF DETECTING AGENT ACIDOVORAX CITRULLI

Изобретение относится к молекулярной микробиологии, экологии, растениеводству, к сфере карантина растений, в частности к специфичным праймерам для выявления возбудителя Acidovorax citrulli (A. citrulli) в семенах и тканях растений семейства Cucurbitaceae, и может быть использовано в фитосанитарной диагностике данного возбудителя.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) выбраны олигонуклеотидные праймеры для выявления возбудителя Acidovorax avenae subsp. citrulli в тканях арбузов и дынь, с последовательностью олигонуклеотидов SEQ. ID NO: 1 и SEQ. ID NO: 2 [WO 2004/013291 А2, (SEMINIS VEGETABLE SEEDS, INC., US) 12.02.2004, Д1]. Из указанного источника также известен способ определения возбудителя Acidovorax avenae  citrulli с использованием олигонуклеотидных праймеров SEQ. ID NO: 1 и SEQ. ID NO: 2, включающий следующие стадии:
- получение ДНК из растительной ткани или чистой культуры микроорганизма;
-амплификацию полученной ДНК с праймерами, содержащими олигонуклеотидную последовательность SEQ. ID NO: 1 и SEQ. ID NO: 2;
- детектирование продукта амплификации как индикатора присутствия патогена в исследуемом образце.
Недостатком [Д1] является отсутствие селективности праймеров к 16S рибосомальной РНК при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), что не позволяет идентифицировать возбудителя до вида бактерии.
Техническим результатом, достигаемым при осуществлении настоящего изобретения, является высокая специфичность синтезированных праймеров к 16S рибосомальной РНК, комплементарных к участку гена leucine-rich repeat ribonuclease inhibitor, позволяющих амплифицировать фрагмент комплементарной ДНК возбудителя A. citrulli с планируемым размером продукта 140 п.о. для проведения диагностики методом ПЦР, высокая чувствительность способа выявления возбудителя A. citrulli, а также сокращение времени проведения диагностической работы с подкарантинным материалом растений.
Технический результат достигается тем, что предложен набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli в семенах и вегетативных частях растений семейства Cucurbitaceae, специфичных к 16S рибосомальной РНК:
Технический результат достигается также тем, что способ выявления возбудителя A. citrulli в семенах и вегетативных частях растений семейства Cucurbitaceae включает получение ДНК из растительной ткани, амплификацию полученной ДНК с праймерами, детектирование продукта амплификации методом электрофореза, причем для амплификации используют праймеры SEQ. IDNO: A, SEQ. ID NO: В по п. 1, а амплификацию проводят по следующему протоколу: начальная денатурация при температуре 96°C в течение 5 минут, далее проводят 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 96°C в течение 5 секунд, отжиг при температуре 63°C в течение 30 секунд и элонгацию при температуре 72°C в течение 30 секунд, при этом финальную элонгацию проводят при температуре 72°C в течение 5 минут.
Существенным отличием работы с данными праймерами является:
1) высокая специфичность праймеров к 16S рибосомальной РНК и чувствительность, что позволяют выявлять ДНК возбудителя A. citrulli в семенах и вегетативных частях растений при низкой концентрации возбудителя A. citrulli, а также идентифицировать бактериальную культуру;
2) высокая температура отжига праймеров (63°C), что снижает вероятность образования неспецифических продуктов реакции;
3) использование данных праймеров для ПЦР совместимо с этапом выделения ДНК различными коммерческими наборами, такими как «НК-М-Сорб», «ДНК-Экстран-3», «ДНК-Экстран-4» - ЗАО «Синтол» (Россия), «Проба ГС» - ООО «АгроДиагностика» (Россия), «DNeasyKit» (Qiagen, США).
Предложенное изобретение поясняется следующими приложениями.
Приложение 1. Фиг. 1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров для выявления патогена Acidovorax citrulli.
Приложение 2. Фиг. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации при проверке подлинности и отработке температуры отжига праймеров АС-1 F/R (1-6 - праймеры АС-1 F/R с положительным контролем; М - маркер длины продукта ПЦР) (пример 1).
Приложение 3. Фиг. 3. Выявление патогена A. citrulli в семенах и вегетативных частях растений с помощью праймеров АС-1 F/R (1-4 - зараженные возбудителем A. citrulli семена и вегетативные части растений; 5 - слабозараженный возбудителем A. citrulli образец растения; 6 - отрицательные контроль; М - маркер длины продукта ПЦР (пример 3).
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1. Проверка подлинности для синтезированной пары праймеров.
При проверке подлинности для данной пары праймеров предварительно в отдельной пробирке готовили смесь для ПЦР следующего состава: Master-Mix (5Х MasCFETagMIX - 2025 не окрашенный) (Диалат, Россия) по 5 мкл на образец, праймеры прямые и обратные - по 0,75 мкл каждого (10 пмоль/мкл) на образец. После чего к общему объему добавляли 94,5 мкл воды, свободной от ДНК, и 30 мкл целевой ДНК возбудителя. Смесь тщательно перемешивали и переносили в чистые промаркированные пробирки по 25 мкл в каждую. ПЦР-амплификацию проводили согласно следующему протоколу: начальная денатурация при температуре 96°C 5 минут, далее 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 96°C 5 секунд, отжиг при температуре 63°C 30 секунд, элонгацию при температуре 72°C 30 секунд. Финальную элонгацию проводили при температуре 72°C в течение 5 минут. Хранение продукта при температуре +4°C. Результаты учитывали при помощи электрофореза. На электрофореграмме (Фиг. 2) наличие светлой полосы на уровне ~140 п.о. свидетельствовало о прохождении ПЦР и, соответственно, о возможности диагностировать бактерию A. citrulli.
Пример 2. Проверка специфичности синтезированных праймеров.
2
При проверке специфичности помимо целевой ДНК использовали ДНК других бактериальных культур. Смесь для ПЦР для каждого образца содержала: 5 мкл Master-Mix, по 0,75 мкл прямого и обратного праймера, 13,5 мкл воды, свободной от ДНК, и по 5 мкл ДНК различных бактериальных культур. ПЦР-амплификацию проводили согласно следующему протоколу: начальная денатурация при температуре 96°C - 5 минут, далее 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 96°C - 5 секунд, отжиг при температуре 63°C - 30 секунд, элонгацию при температуре 72°C - 30 секунд. Финальную элонгацию проводили при температуре 72°C в течение 5 минут. Хранение продукта при температуре +4°C. Результаты учитывали при помощи электрофореза. На электрофореграмме видно, что неспецифичных продуктов реакции при постановке ПЦР с праймерами АС-1 F/R, подобранными для возбудителя A. citrulli, не наблюдалось. В результате реакции был получен продукт хорошего качества размером 140 п.о. Данная пара праймеров также обладала высокой чувствительностью, что в ходе наших исследований позволяло обнаружить возбудителя в концентрации до 10 КОЕ/мл.
Пример 3. Выявление патогена A. citrulli в семенах и вегетативных частях растений.
При выявлении возбудителя A. citrulli в семенах и вегетативных частях растений, необходимо было выделить ДНК из зараженного растительного материала. Для выделения ДНК возбудителя можно использовать любой доступный коммерческий набор из перечисленных выше. После выделения ДНК в чистой комнате была приготовлена смесь для ПЦР, которая содержала 5 мкл Master-Mix, по 0,75 мкл прямого и обратного праймера, 13,5 мкл воды, свободной от ДНК. Далее для ПЦР вносили по 5 мкл ДНК из зараженного растительного материала в каждую пробирку. Амплификацию проводили по следующему протоколу: начальная денатурация при температуре 96°C 5 минут, далее 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 96°C 5 секунд, отжиг при температуре 63°C 30 секунд, элонгацию при температуре 72°C 30 секунд. Финальную элонгацию проводили при температуре 72°C в течение 5 минут. Хранение продукта при температуре +4°C. Результаты учитывали при помощи электрофореза. Наличие на электрофореграмме светлой полосы на уровне ~140 п.о. свидетельствовало о прохождении ПЦР и наличии возбудителя A. citrulli в растительном образце, отсутствие полосы - отсутствие искомого возбудителя в растительном материале (Фиг. 3).
Таким образом, предложенная пара олигонуклеотидных праймеров обеспечивает высокую чувствительность и сокращает время при выявлении данного патогена.