Анализ искажений волнового фронта в схеме голографической сканирующей микроскопии

Радиофизика

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2014, № 4 (1), с. 92-97

УДК 531.76

АНАЛИЗ ИСКАЖЕНИЙ ВОЛНОВОГО ФРОНТА В СХЕМЕ ГОЛОГРАФИЧЕСКОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ МИКРОСКОПИИ

© 2014 г. В.В. Дуденкова, М.С. Муравьева, Ю.Н. Захаров

Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского zhrv@rf.unn.ru

Поступила в редакцию 03.03.2014

Рассматривается задача записи и реконструкции цифровых голограмм, записанных в сканирующем режиме конфокального лазерного микроскопа. Применение радиооптического метода для аналитического описания прохождения опорного и предметного лучей в системе позволило сделать вывод о необходимости специального программного обеспечения для восстановления и компенсации искажений таких голограмм.

Ключевые слова: голографическая сканирующая микроскопия, фазовые искажения, радиоооптика, клеточные культуры.

Введение

Оптическая микроскопия является самым используемым методом для исследований в области биологии и медицины и в многих других смежных направлениях. С внедрением современных цифровых технологий оптическая микроскопия активно развивается в последние годы и продвигает разрешающую способность за дифракционный предел Аббе. Множество исследуемых биологических образцов, включая живые клетки, полностью прозрачны при освещении видимым светом и проявляют себя как фазовые объекты. Применение методик фазового контраста дает видимое контрастирование таких образцов путем преобразования фазовой информации в распределение интенсивности и таким образом визуализирует структурные детали биологических систем. Однако такая информация носит лишь качественный характер. Для восстановления количественной фазовой информации от прозрачных объектов подходят голографические методы. Голографическая интерферометрия позволяет неинвазивно выявлять изменения состояния исследуемого объекта, а в зависимости от специфики задачи целесообразно применять методы аналоговой или цифровой голографии [1], осевой или внеосевой [2], использовать широкопольный либо сканирующий режим записи изображения [3-5]. В своей предыдущей статье [3] мы показали возможность расширения стандартных методик исследования микрообъектов с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss LSM 510 путем добавления дополнительного голографического канала запи-

си. Но в конфигурации со сканирующим режимом записи мы столкнулись с фазовыми искажениями, вносимыми сканирующим блоком самого микроскопа. Нами были предложены возможные пути решения этой проблемы. Проведя дополнительные теоретические расчеты формирования голографического изображения таким методом и серию практических экспериментов, мы сделали выводы о невозможности реконструкции сканированных голограмм стандартным методом двойного преобразования Фурье с фильтрацией в частотной плоскости и о необходимости разработки специальных программ для восстановления таких голограмм и компенсации искажений, вызываемых сканирующим модулем.

Постановка задачи

Мы называем голографической сканирующей микроскопией технику голографической записи, в которой регистрируется массив данных интерференции опорного и предметного лучей с двумерным растровым (поточечным) сканированием. С помощью лишь одного сканирования (в латеральной плоскости) голограмма позволяет записать трехмерную информацию об объекте. В частности, методом записи голограммы исследуемого объекта установкой, собранной на базе конфокального микроскопа, мы проводим исследования активности клеточных культур. Таким образом, данный способ формирования голограмм микрообъектов можно назвать голографической сканирующей микроскопией (ГСМ). Так как изначально конфокальный микроскоп не был предназначен для

талом: лем

записи голограмм, нами была проведена его модернизация, и без серьезных конструктивных изменений нам удалось приспособить его для снятия голограмм. Для этого были добавлены оптические элементы для введения опорного луча (рис. 1, 2).

Однако в процессе записи таких голограмм были обнаружены нерегулярные фазовые искажения, меняющиеся по мере сканирования. Для того чтобы проверить, не являются ли эти искажения следствием неоднородной структуры

биологического объекта, было решено использовать тест-объект, голограмма которого заведомо известна. В качестве тест-объектов были использованы плоское зеркало и выпуклая линза. Но при исследовании и этих объектов искажения остались. Это показано на рис. 3.

Так как в схеме микроскопа присутствует сканирующий блок, то он может вносить дополнительные искажения, а именно фазовый набег, из-за того, что в его конструкции используется зеркало, которое меняет угол наклона по

94

B.B. Дуденкоит, М.С. Мyp4иьeи4, Ю.Н. З4X4poи

мере сканирования. На рис. 4 представлена принципиальная схема голографического канала микроскопа, согласно которой был проведен расчет прохождения пучка через оптические элементы радиооптическим методом [6].

На начальном этапе луч выходит из лазера и проходит светоделительную пластинку, после чего одна его часть отклоняется и попадает на плоское зеркало, отражение от которого образует опорный луч. Вторая часть пучка проходит сканирующий блок. Затем пучок проходит объектив и фокусируется им на какой-либо точке объекта. После этого его путь повторяется в обратном направлении до светоделительной пластинки. В результате он отклоняется на регистрирующую среду (фотоэлектронный умножитель), где интерферирует с опорным лучом.

Теоретический анализ

Расчет распространения объектной волны

Рассмотрим одномерный случай, что не нарушает общности при параксиальном приближении, в котором расчеты ведутся с использованием импульсной характеристики для зоны дифракции Френеля [7]. Рассчитаем амплитуду объектного пучка на входе в сканирующий блок, считая амплитуду на выходе из лазера единичной:

S ( х, z) = 1  h( z1) =

I* exp(i ——x'2 )dx = i

il.z. J-" 1,7.

теляХ где Ъ(2Х) =

ц 1кгх к z1

характеристика свободного пространства.

Затем объектная волна проходит сканирующий блок (искажения, вносимые сканирующим блоком, выражаются в нерегулярном фазовом набеге фк1 и 8т(0и), обусловленном углом

наклона зеркала, который меняется в результате сканирования), таким образом:

2ж1 . . -xsin ekl

S(x, z) = ie'm e 1

Далее волна снова распространяется в свободном пространстве с импульсной характеристикой h(z2):

2я' . _ I \ 2

. -x sin Oki 1 Я X

S(x, z) = em'e * U  -— exp(- '—) =

^ íXZ2 * Z2

flsin2 Ob¡Z2

. -i- tx-O ki ix-Oki

= emie * e * = A'e * ,

. я sin2 OkiZ2

где A' = e^e' * .

Затем волна фокусируется объективом (умножение на функцию линзы Li):

ix—smukl . ,—.

S (x, z) = A ' e 1 e 1F; =

., . 2ж . ж 2ч

= A exp(ix—smökl - i-x ),

i xf,

где р - фокусное расстояние объектива,

. % 2

—-х

Ц = е ^ .

Затем волна распространяется в свободном пространстве с импульсной характеристикой й(^):

2% % 5(х, z) = А' ехр(х— 81п9н - /— х2)  ОД) =

к

2% .

= A'exp(ix— sin9k - i-x

. * x ' )dx = i

I ilz, J-" Xz;

(с точностью до постоянного фазового множи-

1

exp(— i— ) - импульсная

к

-^exp(- i— ) = plF, 1 F;

= A'2ж Iexp(i—— x2)S(— sin9k ——x2) =

I iXF; XF; 1

XF,

= B'exp(i—— x2)S(— sinß k —— x),

Щ 1

xf;

где B ' = A' 2ж

iXF,

i

В результате волна падает на объект и отражается от него:

S

XF1

X

XF1

результате преобразований получим} =

л/2

= —— GQr(cos(29kl - Psin2 9kl -- N sin 9klx + Tx2 + y) + sin(29kl - P sin2 9kl -

Затем опорный пучок фокусируется линзой L2 (умножение на функцию линзы L2):

• Я 2

-i-x

XF2

где Rkl = r exp(iy kl) = r(cos y + i sin у) - коэффициент отражения от среды. Индексами k, l задается позиция сканирования.

Таким образом, аналогично вычисляя обратный путь, получим выражение для объектной волны в плоскости фотоприемника:

S(x,z) = iGyTiQRke2щы exp(-iPsin2 9kl)x

x exp(-iN sin 9 ux + iTx2) =

= { распишем exp(...) = cos(...) + isin(...),

V2

4¡ =-(1 + i), Rk¡ = r (cos y + isiny) и в

R

где F2 - фокусное расстояние линзы.

Затем волна распространяется в свободном пространстве с импульсной характеристикой h(F2):

-i-^ x 2

R(x, z) = e XF2  h(F2) =

= iyfi 2я

'XF,

i K x 2 O

e XF2 8(—— x) =

XF

2

i -1 42

AeiBx 5(-2Bx),

где A = I 2я, B = П

[XF2

xf2

V2

- N sin 9^x + Tx2 + y)) + i—GQr(cos(29kl -

- P sin2 9 kl - N sin 9 klx + Tx2 + y) -

- sin(29kl - P sin2 9kl - N sin 9klx + Tx2 + y)), где P, N, T, G, Q - действительные величины, зависящие от X, Fx, F2, z 2, z 3.

Расчет распространения опорной волны Рассчитаем амплитуду опорного пучка. Изначально волна распространяется в свободном пространстве:

-I ехр

2 '^2

Таким образом, получим выражение для

опорной волны в плоскости фотоприемника:

1 -1 2 Я

л/2

где Л, В - действительные величины.

В результате получим выражение для голо граммной структуры:

H =| S + R |2 = (Re(S) + Re(R))2 + + (Im(S) + Im(R))2 = G2 Q2 r2 + A2 5 2(-2Bx) +

+ 2GQAr5(-2Bx) x cos(29kl - Psin29kd -- Nsin9kdx + Tx2 + y - Bx2).

Учтем, что ФЭУ регистрирует сигнал, пропорциональный интегралу интенсивности по площади диафрагмы:

^а

+ Я\2 Сх = ВО202г2 +

+ DA2 + 2DGQArcos(2qkl - Psin29kl + у),

1

a

где Б - постоянный коэффициент, который определяется размером диафрагмы и учитывает неоднородность опорного пучка по площади диафрагмы.

В итоге: 1) при отражении от объекта получим выражение для голограммы вида:

Н = БО 202 г2 + БЛ2 +

,

+ 2ВОеЛгсо8(2фы -^т29и + у);

2) в случае отражения от идеального зеркала выражение для голограммы будет выглядеть следующим образом (положим г = 1, у = 0 в выражении (14)):

Н = БО 202 + БЛ2 +

+ 2DGQAcos(2<pu - Psin29k).

Восстанавливая голограмму методом двойного преобразования Фурье с фильтрацией в частотной плоскости, получим выражения вида:

2DGQArcos(2(pkl - Psin29kl + у) для случая отражения от объекта, и

2DGQArcos(2(pld - P2sin29k) для случая отражения от идеального зеркала.

Отсюда видно, что точного восстановления амплитуды и фазы объектной волны не происходит, как это имеет место в широкопольной голографии [1], поэтому необходимо разрабатывать специальный алгоритм для восстановления цифровых голограмм.

Анализ полученных данных и выводы

После анализа полученных выражений был сделан вывод, что в данном случае фазовые искажения, вносимые регулярными наклонами сканирующих зеркал, не являются аддитивными. Поэтому необходима разработка специальных программ для восстановления цифровых голограмм, записанных в сканирующем режиме работы микроскопа. Более того, практика показывает наличие нерегулярных и нестационарных фазовых искажений, что не позволяет по одной-единственной голограмме произвести адекватное восстановление предметного волнового фронта.

Однако если мы запишем голограмму идеального зеркала, то в ее восстановленном изображении будет содержаться полная информация об искажениях, что дает возможность использовать дополнительную цифровую обработку, чтобы от них избавиться. Иными словами, при наличии нестационарных фазовых искажений фи, вносимых сканирующим блоком, необходимо при каждом сканировании объекта записывать волновой фронт волны, прошедшей по пути объектной волны (то есть тоже приобретаю-

щей тот же самый фазовый набег, при прохождении сканирующего блока), но отраженной не от объекта, а от идеального зеркала. В результате появляется возможность проводить сравнительный анализ изменений состояний объекта с течением времени (динамика изменения оптической толщины и формы объектов). Также возможно проведение исследований объемной структуры путем цифровой фокусировки на различные слои восстановленного изображения в пределах толщины оптического среза. Как уже было сказано во введении, объектами исследования являются живые клеточные культуры (хотя данный метод исследования подходит и не только для биообъектов), и внедрение данной методики позволит существенно улучшить понимание процессов функционирования различных живых систем. Важным положительным критерием данной методики является неинвазивность по отношению к изучаемому объекту, что, несомненно, очень важно для задач медицины и биологии (при работе с живыми объектами).

Результатом работы являются выражения, позволяющие построить алгоритм восстановления волнового фронта в голографической сканирующей микроскопии.

Список литературы

1. Рыбников А.И., Дуденкова В.В., Муравьева М.С., Захаров Ю.Н. Применение цифровых внеосе-вых голограмм для исследования изменений состояния живых нейронных культур // Оптический журн. № 7. 2013. С. 66-73.

2. Lobyntseva V.V., Zakharov Yu.N. Phase Visualization in the Study of Cellular Structures by Confocal Microscopy// Physics of Wave Phenomena. 2011. V. 19. № 1. P. 10-12.

3. Захаров Ю.Н., Лобынцева В.В., Муравьева М. С. Восстановление волнового фронта микроскопических изображений в условиях записи голограмм с нерегулярными фазовыми искажениями сканирующего сигнального луча // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2011. Вып. 5 (3). С. 135-138.

4. Rappaz B., Marquet P., Cuche E. et al. Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy // J. Opt. Exp. 2005. V. 13. № 23. P. 93619373.

5. Xiu-Ling Wu, Xin Zhou, Qiohg-Hua Wang and Ting-Chung Poon. Deviation influences on sectional image reconstruction in optical scanning holography using a random-phase pupil // J. Appl. Opt. 2013. V. 52. № 1/1. P. A360-A366.

6. Зверев В.А. Радиооптика. М: Сов. радио, 1975. 304 с.

7. Зверев В.А. Физические основы формирования изображений волновыми полями. Н. Новгород: ИПФ РАН, 1998. 252 с.

AHanu3 ucrnwemu eоnноeого fypoHma e cxeMe гоnогрa$ицескоu CKampyw^eu MUKpocKonuu

97

ANALYSIS OF DISTORTIONS OF THE WAVE FRONT IN THE SCHEME OF HOLOGRAPHIC SCANNING MICROSCOPY

V.V. Dudenkova, M.S. Muravyeva, Yu.N. Zakharov

The article considers recording and reconstruction of digital holograms obtained with the help of a laser scanning confocal microscope. An application of the radio optical method for an analytical description of propagation of reference and object beams through the system has led to the necessity to develop of a special software package for reconstruction and distortion compensation of such holograms.

Keywords: holographic scanning microscopy (HSM), phase distortions, radio optics, cell cultures.

References

1. Rybnikov A.I., Dudenkova V.V., Murav'eva M.S., Zaharov Yu.N. Primenenie cifrovyh vneosevyh gologramm dlya issledovaniya izmenenij sostoyaniya zhivyh nejronnyh kul'tur // Opticheskij zhurn. № 7. 2013. S. 66-73.

2. Lobyntseva V.V., Zakharov Yu.N. Phase Visualization in the Study of Cellular Structures by Confocal Microscopy// Physics of Wave Phenomena. 2011. V. 19. № 1. P. 10-12.

3. Zaharov Yu.N., Lobynceva V.V., Murav'eva M.S. Vosstanovlenie volnovogo fronta mikroskopicheskih izobrazhenij v usloviyah zapisi gologramm s nereg-ulyarnymi fazovymi iskazheniyami skaniruyushchego

signal'nogo lucha // Vestnik Nizhegorodskogo universi-teta im. N.I. Lobachevskogo. 2011. Vyp. 5 (3). S. 135138.

4. Rappaz B., Marquet P., Cuche E. et al. Measurement of the integral refractive index and dynamic cell morphometry of living cells with digital holographic microscopy // J. Opt. Exp. 2005. V. 13. № 23. P. 9361-9373.

5. Xiu-Ling Wu, Xin Zhou, Qiohg-Hua Wang and Ting-Chung Poon. Deviation influences on sectional image reconstruction in optical scanning holography using a random-phase pupil // J. Appl. Opt. 2013. V. 52. № 1/1. P. A360-A366.

6. Zverev V.A. Radiooptika. M: Sov. radio, 1975. 304 s.

7. Zverev V.A. Fizicheskie osnovy formirovaniya izobrazhenij volnovymi polyami. N. Novgorod: IPF

RAN, 1998. 252 s.