СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕРМАЛЬНОГО МАТРИКСА
METHOD FOR PRODUCING DERMAL MATRIX

Изобретение относится к медицине, а именно, к медицинским биотехнологиям и может быть использовано для получения имплантационного материала на биологической основе, обладающего регенеративным потенциалом для применения в общей и пластической хирургии, комбустиологии, онкологии, урологии, гинекологии, стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, а также в качестве бионосителя при создании ткане-инженерных конструкций и прототипов органов.
Дерма как основная составляющая кожи человека и животных, является уникальным исходным материалом, для получения ацеллюлярных дермальных матриксов. Сам процесс получения сопряжен с необходимостью удаления из кожи всех клеток и их фрагментов, способных индуцировать иммунный ответ в организме донора. Достижение необходимых свойств для материалов на биологической основе возможно не только за счет тщательного соблюдения технологии, но и за счет контроля целевых параметров достигаемых свойств на каждом из ее этапов.
Известен способ получения бесклеточного дермального матрикса из кожи человека [1], заключающийся в обработке дермы 30% раствором карбамида с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,5% в соотношении дерма/карбамид 1:3 в течение 24 часов при +4°С. Далее концентрацию карбамида понижают до 20%, при этом, время экспозиции материала при комнатной температуре и периодическом встряхивании составляет 1 час.
Известен способ, включающий обработку кожи животного, предварительно очищенной от волосяных луковиц и подкожно-жировой клетчатки, водно-щелочным раствором на основе гидроксида натрия, калия дигидрофосфата и водного или безводного тетраборнокислого натрия, при температуре от 1 до 10°С; водным раствором сульфата натрия и гидроксида натрия; водным раствором борной кислоты. При этом, каждый из этапов отличается по длительности, температурному режиму рабочих растворов, необходимостью периодического взбалтывания или перемешивания. Для оценки конечного результата авторы приводят данные электронно-микроскопического исследования, подтверждающие сохранность пространственной ориентации коллагеновых волокон матрикса [2].
Недостатками перечисленных способов являются применение агрессивных химических соединений, щелочей и кислот; полное отсутствие или недостаточное воздействие физического фактора в виде интенсивного встряхивания, что способствует механическому удалению фрагментов клеток; не приводятся методы оценки тех или иных свойств матрикса по завершении каждого из этапов децеллюляризации, что также позволяет оценить их достаточность; не предусмотрены способы дополнительной обработки в случае не достижения требуемых свойств.
Известен способ получения дермального матрикса из кожи человека и животных толщиной до 0,38 мм. На первом этапе проводят децеллюляризацию кожного лоскута путем замораживания-оттаивания. Затем кожу погружают в гипертонический раствор натрия хлорида (1М) и перемешивают. Этим достигается деэпителизация кожного лоскута. Второй этап представляет собой децеллюляризацию собственно дермы при помощи детергентов, которыми могут быть растворы додецилсульфата натрия (0,5%), диспаза, Triton Х-100. Стерилизацию осуществляют 0,1-10% раствором азида натрия. Готовый ацеллюлярный матрикс при помощи сканирующего микроскопа изучают с целью оценки структурной организации коллагеновых фибрилл, а также проводят биохимический тест на деградацию коллагеназой [3].
Недостатками способа являются: использование в качестве детергентов додецилсульфата натрия или Triton Х-100, обладающих специфической избирательной токсичностью, которая заключается в возможности поражения отдельных органов мишеней при однократном воздействии, акватоксичности по данным тестирования на острую и хроническую токсичность и стойкой способности к биоаккумуляции. Также, материалы, полученные, в частности, с использованием натрия додецилсульфата в тестах in vitro, продемонстрировали свои цитотоксичные свойства. Имеются данные о выраженной пенообразующей способности Triton Х-100, что требует тщательной, многократной и длительной по времени отмывки. Способ предполагает оценку готового материала только на предмет целостности коллагеновых волокон. В способе не оцениваются показатели, значимо влияющих на его биосовместимость, такие как остаточное содержание липидов, ДНК и клеточных белков.
Известен способ изготовления дермального матрикса из донорской кожи человека, состоящий из этапа разделения эпидермиса и дермы путем помещения предварительно троекратно замороженного и оттаившего лоскута в 1,8М раствор натрия хлорида. После чего его встряхивают на орбитальном перемешивателе на скорости 250 об./мин до полного отделения эпителия. На втором этапе децеллюляризацию продолжают с использованием 0,2% раствора додецилсульфата натрия также на орбитальном перемешивателе и с той же скоростью в течение 1 часа. Завершают децеллюляризацию матрикса многократными промывками физиологическим раствором. Контроль качества проводят только на заключительном этапе по техническим, бактериологическим и морфологическим параметрам. Готовый матрикс упаковывают и криоконсервируют [4].
Недостатками данного способа является источник исходного сырья -кожа человека, что требует проведения тщательных исследований с целью исключения потенциальных инфекций у доноров. Такой источник сырья ограничивает возможность получения больших по площади лоскутов. Известна специфическая избирательная токсичность додецилсульфата натрия с возможностью поражения отдельных органов мишеней при однократном воздействии и его акватоксичность в исследованиях острой и хронической токсичности, а также цитотоксичность материалов, полученных с его применением в тестах in vitro [5]. Готовый матрикс подвергают анализу только на технические, морфологические и бактериологические показатели. Данный способ взят нами за прототип.
Целью изобретения является получение безопасного ацеллюлярного дермального матрикса с заданными параметрами, контролируемыми на этапах его получения.
Эта цель достигается тем, что исходным сырьем является кожа свиней, из которой выкраивают необходимые по размеру лоскуты, отмывают их, подвергают трехкратному циклу замораживания и оттаивания, после чего на первом этапе с целью деэпителизации лоскуты погружают в емкость с гипертоническим раствором, содержащим 605 мг основания Трис, 4,0 г натрия хлорида и 202,5 мг ЭДТА на каждые 100 мл фосфатно-солевого раствора; устанавливают емкость на платформу шейкера в режиме 250 уд./мин.; через 4 часа матрикс из гипертонического раствора переносят в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена, индуцируя осмотический шок; повторяют первый этап еще раз; эффективность деэпителизации оценивают визуально по отсутствию эпителиальных фрагментов на поверхности дермы; на втором этапе для децеллюляризации применяют раздельную трехкомпонентную децеллюляризующую систему: сначала лоскуты погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия, приготовленным на деионизированной воде, емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин; длительность обработки дезоксихолатом натрия составляет 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов; промывание лоскутов осуществляют деионизированной водой; затем их погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия и добавляют 0,07 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М трис-HCl буфера с рН 7,6-7,8; емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд/мин на 9 часов; смену децеллюляризующего раствора проводят трижды через каждые 3 часа; после этого лоскуты 4-5 раз ополаскивают в деионизированной воде и фосфатно-солевом растворе (рН 7,4); в контрольных образцах лоскутов определяют содержание липидов, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения результатов исследования; если в контрольных образцах выявляют любое отличное от нуля содержание липидов, то при комнатной температуре основные образцы размораживают и домывают, используя 1% раствор дезоксихолата натрия и 0,03 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М Трис-HCl буфера рН 7,6-7,8; целевым показателем содержания липидов считают их полное отсутствие; после этого лоскуты погружают в раствор ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленный с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция (II) хлорида и инкубируют их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора; лоскуты ополаскивают путем погружения в емкость с трис-HCl буфером рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция хлорида; заменяют промывочный раствор на деионизированную воду и устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре на 12 часов; в контрольных образцах лоскутов определяют содержание ДНК флуоресцентным методом, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения этих результатов исследования; если в контрольных образцах количество ДНК превышает 200 нг/мг, то основные образцы при комнатной температуре размораживают и повторно инкубируют в идентичном растворе ДНК-азы до достижения содержания ДНК в образцах не превышающего 200 нг/мг; далее их дважды в течение 12 часов промывают деионизированной водой и трехкратно в течение 12 часов фосфатно-солевым раствором рН 7,2-7,4 на шейкере в режиме 250 уд./мин при комнатной температуре; контрольные образцы подвергают морфологическому исследованию путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным; препараты исследуют, применяя поляризационную микроскопию, и оценивают матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации; качественный состав дермального матрикса исследуют с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем; достигаемым целевым параметром является удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин); при достижении целевых параметров дермальный матрикс подлежит химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.
Техническим результатом предлагаемого способа является возможность использования в качестве исходного сырья шкуры животных, что снимает ограничения на площадь иссекаемых лоскутов; отсутствие потенциальных рисков трансмиссии опасных инфекций, которыми являются ВИЧ, гепатит, сифилис, а также губчатой энцефалопатии, в случае использования в качестве исходного сырья шкур крупного рогатого скота.
Способ обладает повторяемостью и приводит к ожидаемым результатам при производстве полупродукта или готового продукта требуемого качества, то есть является валидированным. Предполагает использование реагентов исключительно биологического происхождения, основные действующие вещества которых естественным образом образуются в организме в процессе пищеварения - липаза, ДНК-аза, дезоксихолат натрия (компонент желчи). Четкая идентификация качественного состава готового продукта с абсолютной точностью подтверждает отсутствие основного пула клеточных белков - инициаторов иммунных реакций и идентифицировать в составе матрикса преимущественно матрисомные белки, что характеризует его биосовместимость и регенеративный потенциал.
4
2
Исследование полученного ацеллюлярного дермального матрикса проведено в соответствие с ГОСТ Р ИСО 10993.5-2011 методом прямого контакта, т.е образцы были помещены непосредственно на монослой фибробластов - цА17 6 пассажа по достижении ими конфлуентности (на 6 сутки). Посевная доза клеток составила 1×10 кл/см. Процент жизнеспособных клеток после снятия их с поверхности культурального пластика составил 98%. Результаты исследования показали, что на протяжении всего эксперимента клетки в основном сохраняли присущие дермальным фибробластам человека форму, размеры, характер роста, расположение и размеры ядер, структуру цитоплазмы. Показатели пролиферативной активности клеток в присутствии образцов ацеллюлярного дермального матрикса и в контрольных культурах представлены в таблице 1 Приложения 1 Результаты исследования показали, что полученный матрикс не обладает цитотоксичными свойствами.
Способ получения дермального матрикса реализуется следующим образом. Исходным сырьем является кожа свиней, из которой выкраивают необходимые по размеру лоскуты, отмывают их, подвергают трехкратному циклу замораживания и оттаивания. После чего на первом этапе с целью деэпителизации лоскуты погружают в емкость с гипертоническим раствором, содержащим 605 мг основания Трис, 4,0 г натрия хлорида и 202,5 мг ЭДТА на каждые 100 мл фосфатно-солевого раствора; устанавливают емкость на платформу шейкера в режиме 250 уд. /мин.; через 4 часа матрикс из гипертонического раствора переносят в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена, индуцируя осмотический шок; повторяют первый этап еще раз. Эффективность деэпителизации оценивают визуально по отсутствию эпителиальных фрагментов на поверхности дермы.
На втором этапе для децеллюляризации применяют раздельную трехкомпонентную децеллюляризующую систему: сначала лоскуты погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия, приготовленным на деионизированной воде, емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин; длительность обработки дезоксихолатом натрия составляет 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов; промывание лоскутов осуществляют деионизированной водой; затем их погружают в емкость с раствором, содержащим 2% раствор дезоксихолата натрия и 0,07 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М трис-HCl буфера с рН 7,6-7,8; емкость устанавливают на шейкер в режиме 250 уд/мин на 9 часов; смену децеллюляризующего раствора проводят трижды через каждые 3 часа; после этого лоскуты 4-5 раз ополаскивают в деионизированной воде и фосфатно-солевом растворе (рН 7,4). В контрольных образцах лоскутов определяют содержание липидов, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения результатов исследования. Если в контрольных образцах выявляют любое отличное от нуля содержание липидов, то при комнатной температуре основные образцы размораживают и домывают, используя раствор, содержащий 1% раствор дезоксихолата натрия и 0,03 г панкреатической липазы на каждые 100 мл 0,1М Трис-HCl буфера рН 7,6-7,8. Целевым показателем содержания липидов считают их отсутствие.
После этого лоскуты погружают в раствор ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленный с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и кальция (II) хлорида 1,9 мМ и инкубируют их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора; лоскуты ополаскивают путем погружения в емкость с трис-HCl буфером рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция хлорида; заменяют промывочный раствор на деионизированную воду и устанавливают на шейкер в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре на 12 часов. В контрольных образцах лоскутов определяют содержание ДНК флуоресцентным методом, а основные образцы погружают в разведенный 1:9 фосфатный буфер Серенсена и хранят при -18°С до получения этих результатов исследования. Если в контрольных образцах количество ДНК превышает 200 нг/мг, то основные образцы при комнатной температуре размораживают и повторно инкубируют в идентичном растворе ДНК-азы до достижения содержания ДНК в образцах не превышающего 200 нг/мг.
Далее образцы промывают дважды деионизированной водой и трижды фосфатно-солевым раствором рН 7,2-7,4 на шейкере в режиме 250 уд./мин. при комнатной температуре, при этом смену промывочных растворов осуществляют каждые 12 часов. Контрольные образцы подвергают морфологическому исследованию путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным. Препараты исследуют, применяя поляризационную микроскопию и оценивая матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации. Качественный состав дермального матрикса исследуют с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем. Достигаемым целевым параметром является удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин). При достижении целевых параметров дермальный матрикс подлежит химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.
Исследование биосовместимости ацеллюлярного дермального матрикса проведено в соответствие с ГОСТ ISO 10993-1-2011 на половозрелых крысах стока Wistar обоего пола. Ацеллюлярный дермальный матрикс имплантировали в карман, сформированный ниже поверхностной фасции шеи. Срок имплантации составил от 28 до 90 суток. Данные макроскопической оценки ацеллюлярного дермального матрикса и зоны имплантации показали отсутствие признаков отека, гематом, рубцов и фиброзных структур в виде капсулы. Матрикс на всех сроках сохранял свою изначальную локализацию. Признаки резорбции были отмечены только по краям материала, но без его фрагментации.
По данным гистологического исследования матрикс не индуцировал воспалительную реакцию, содержал на периферии значительное число тучных клеток (к 28 суткам); на периферии и в центре - фибробласты (28-45 суток), а также единичные скопления лимфоцитов и макрофагов (28 суток). К 90 суткам часть коллагеновых фибрилл матрикса была фрагментирована, а межфибриллярное пространство заполнено оформленной соединительной тканью реципиента.
Полученные результаты свидетельствуют о биосовместимости полученного материала в условиях длительного контакта с окружающими тканями и позволяют рекомендовать его в качестве имплантационного материала для решения конкретных клинических задач.
Способ может применяться в условиях биотехнологических производств для получения имплантационного материала на биологической основе, как альтернатива искусственным материалам.
Источники информации
1. Патент РФ на изобретение №2240809 от 27.11.2004 «Способ получения бесклеточного дермального матрикса».
2. Патент РФ на изобретение №2353397 от 13.04.2007 «Биорассасывающаяся коллагеновая матрица, способ ее получения и применение».
3. «Method of Preparing Isolated Cell-FreeSkin, Cell-Free Dermal Matrix, Method of Producing the Sameand Composite Cultured Skin with The Use of the Cell-Free Dermal Matrix». Патент US 2007/0269791 A1.
4. Патент РФ на изобретение №2524619 С2 от 02.04.2013 г. «Способ изготовления дермального матрикса».
5. Rieder Е., Kasimir М.Т., Silberhumer G. et al. // Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2004. V. 127 (2). P. 399-405.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Способ получения дермального матрикса