ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ T-КЛЕТОК
OBTAINING ANTIGEN-SPECIFIC T-CELLS

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Front Immunol.
Экспансия антигенспецифических T-клеток осложняется редкой встречаемостью антигенспецифических наивных предшественников, которых может насчитываться лишь один на миллион. Для генерации больших количеств опухоль-специфических T-клеток для адаптивной терапии (в качестве примера) лимфоциты обычно стимулируют антигеном в течение многих недель, после чего нередко следует отбор T-клеток и субклонирование в трудоемком процессе. Помимо этого, различные способы, применяемые в настоящее время для экспансии лимфоцитов, такие как анти-CD3/анти-CD28 гранулы, ориентированы на то, что в них образуются T-клетки с несколько истощенным фенотипом. См., Sachamitr P. et al., Induced pluripotent stem cells: challenges and opportunities for cancer immunotherapy,  2014 Apr 17;5:176.
Имеется потребность в технологиях, при помощи которых можно быстро генерировать большие количества и/или высокие частоты антигенспецифических T-клеток, в том числе T-клеток, которые не характеризуются истощенным фенотипом, как для терапевтических, так и для диагностических целей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении в различных аспектах предложено магнитное обогащение и/или экспансия антигенспецифических T-клеток, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать антигенспецифические T-клетки и их T-клеточные рецепторы (TCR) в терапевтических и/или диагностических целях, а также обеспечить получение антигенспецифических сконструированных T-клеток для терапии. Инкубация парамагнитных нано-иАПК (nano-aAPC) в присутствии магнитного поля во время стадий обогащения и/или экспансии активирует T-клетки путем магнитной кластеризации парамагнитных частиц на поверхности T-клетки.
В различных аспектах в данном изобретении предложены способы экспансии популяций антигенспецифических T-клеток для адаптивной иммунотерапии, в том числе сконструированные T-клетки, которые экспрессируют гетерологичный T-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор (CAR). T-клетки, экспансированные в соответствии с вариантами реализации данного изобретения, характеризуются поликлональным фенотипом (Tcm, Tem), в противоположность T-клеткам, экспансированным неспецифически с применением анти-CD3/анти-CD28, которые приближены к истощенному фенотипу.
В некоторых вариантах реализации в данном изобретении предложены искусственные антигенпрезентирующие клетки, специально сконфигурированные для магнитного обогащения и экспансии антигенспецифических T-клеток, что включает разделение антигенпрезентирующих комплексов (сигнал 1) и лимфоцитарных костимулирующих сигналов (сигнал 2) (например, анти-CD28) на отдельных гранулах с обеспечением дополнительных уровней контроля и изменчивости способа.
В еще одних аспектах в данном изобретении предложены способы скрининга большого числа антигенов-кандидатов на специфичность реактивности в популяции T-клеток. В способе используется последовательное обогащение антигенспецифических T-клеток при помощи магнитной колонки и парамагнитных иАПК, и негативная фракция используется для последующих стадий обогащения. Несколько антигенов-кандидатов можно сгруппировать в каждой стадии обогащения в результате презентации при помощи коктейля иАПК, презентирующих различные пептидные антигены. Поскольку в каждой стадии обогащения может происходить скрининг множества антигенных пептидов- кандидатов, то способ позволяет тестировать по меньшей мере 75 антигенов без снижения частоты предшественников антигенспецифических T-клеток в исходном образце.
В иллюстративных вариантах реализации изобретения в данном изобретении предложены способы лечения пациентов, имеющих гематологический рак, такой как острый миелогенный лейкоз (AML) или миелодиспластический синдром. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент имеет рецидив после аллогенной трансплантации стволовых клеток. При помощи источника T-клеток от HLA-совместимого донора антигенспецифические T-клетки магнитно обогащали и активировали с применением магнитной колонки с парамагнитными нано-иАПК, презентирующими по меньшей мере 2 или 3 опухоль-ассоциированные пептидные антигены. Пептидные антигены пассивно нагружали на подготовленные нано-иАПК, при этом лиганды были химически конъюгированы с частицами через свободные цистеины, которые были введены в белки возле C-конца Fc-участков иммуноглобулиновых последовательностей. Например, иАПК могут содержать сигнал 1 и сигнал 2 на одних и тех же или разных популяциях наночастиц.
В некоторых вариантах реализации изобретения магнитная активация происходит по меньшей мере в течение 5 минут, например, от 5 минут до 5 часов или от 5 минут до 2 часов с последующей экспансией в культуре в течение по меньшей мере 5 дней и в некоторых вариантах реализации изобретения до 3 недель. Полученные в результате CD8+ T-клетки могут быть фенотипически охарактеризованы с подтверждением того, что они представляют собой фенотип центральной памяти или эффекторной памяти и являются полифункциональными. Экспансированные T-клетки можно вводить пациенту для получения противоопухолевого ответа.
Другие аспекты и варианты реализации данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1
На изображен сигнал 1 и 2 в контексте активации T-клеток (левая панель) и конструкция искусственных антигенпрезентирующих клеток на парамагнитных частицах (правая панель). Только когнатные T-клетки активируются иАПК.
Фиг. 2
На изображены различные костимулирующие сигналы (сигнал 2), которые могут быть презентированы на наночастицах в соответствии с вариантами реализации изобретения, и изображен контроль сигнала 2, достигаемый в результате размещения сигнала 2 на отдельных частицах.
Фиг. 3
На изображена кластеризация парамагнитных частиц с T-клеточным корецептором (CD3ε) на поверхности T-клеток в присутствии магнитного поля.
Фиг. 4
На  демонстрирует, что наличие магнитного поля усиливает пролиферацию T-клеток с парамагнитными иАПК, и что это усиление зависит от количества сигнала 2, присутствующего на отдельной наночастице.
Фиг. 5
На демонстрирует, что сигнал 1 и сигнал 2 может поддерживать экспансию Т-клеток даже при расположении на отдельных наночастицах (A, левая панель), и что образующиеся в результате CD8 T-клетки являются эквивалентными таковым, активированным иАПК, презентирующими оба сигнала (A, правая панель). На панели B изображены профили секреции цитокинов (число секретируемых цитокинов или эффекторных молекул) T-клеток, активируемых иАПК, презентирующими оба сигнала, по сравнению с таковыми, которые имеют сигналы, презентируемые на отдельных частицах.
Фиг. 6
На  изображена кластеризация парамагнитных гранул, содержащих отдельные сигнал 1 и сигнал 2 в присутствии магнитного поля, по сравнению с частицами на основе полистирола, которые не кластеризируются (A), и повышенная экспансия, наблюдаемая в случае системы магнитной экспансии (B).
Фиг. 7
На  демонстрирует, что оптимальная экспансия T-клеток наблюдается в случае, когда сигналы 1 и 2 кластеризуются достаточно близко. По мере увеличения размера частиц эффективность подхода на основе S1+S2 снижается (правая панель). В отличие от этого, наночастицы, содержащие оба сигнала, характеризуются противоположным эффектом (левая панель).
Фиг. 8
На  демонстрирует, что оба типа костимуляции можно варьировать для подбора профиля активации.
Фиг. 9
На  изображена схема гейтинга, используемая для очистки клеток перед секвенированием их клонотипического T-клеточного рецептора. Изначально наивные T-клетки отбирали и стимулировали нано-иАПК с использованием системы О+Э. На 7-й день клетки собирали и анализировали при помощи проточной цитометрии. На левой панели изображено общее число событий, наблюдаемых в культуре и гейтированных по отношению к популяции лимфоцитов. На средней панели изображено, что живые/мертвые клетки окрашивали и гейтировали исключительно по отношению к живым клеткам, и на правой панели изображено, что ГКГС_Ig-димер, нагруженный пептидом trp-2, использовали для окрашивания, и сортировали только позитивные клетки (примерно 18,3%). Эти клетки затем отправляли на секвенирование TCR, а результаты изображены на фигуре 10.
Фиг. 10
На изображено число продуктивных и непродуктивных клонов на основании анализа секвенирования TCR.
Фиг. 11
Science
На  изображено сравнение частот топ-клонов (идентифицируемых в виде частоты >0,1% и >100 прочтений в Carreno et al, 15;348(6236):803-8 (2015)) (Panel A), по сравнению с частотами продуктивных клонов после магнитного обогащения и экспансии (панель B).
Фиг. 12
На изображены частоты клонотипов T-клеток на основании процента общих прочтений.
Фиг. 13
На изображена трехмерная гистограмма частоты спаривания V и J для всех клонов.
Фиг. 14
На изображена трехмерная гистограмма частоты спаривания V и J для топ-10 клонов на основании всех прочтений.
Фиг. 15
На изображена генерация функционально активных человеческих неоантигенспецифических CD-8+ T-клеток от здорового донора. Три неоэпитопа из рака молочной железы MCF-7 тестировали одновременно при помощи способа магнитного обогащения и экспансии.
Фиг. 16
На демонстрирует, что пассивная нагрузка пептида на наночастицы, характеризующаяся сайт-направленной конъюгацией ГКГС, обеспечивает повышенную экспансию через 1 неделю.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении в различных аспектах предложено магнитное обогащение и/или магнитная экспансия антигенспецифических T-клеток, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать антигенспецифические T-клетки и их T-клеточные рецепторы (TCR) в терапевтических и/или диагностических целях, а также обеспечить получение антигенспецифических сконструированных T-клеток для терапии. Магнитное обогащение относится к использованию парамагнитных наночастиц, имеющих на своей поверхности антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид, таким образом, что антигенспецифические T-клетки можно отделить от популяции T-клеток при помощи магнитной колонки, в то время как другие клетки (в том числе некогнатные T-клетки) просеиваются. Экспансия обогащенных T-клеток может происходить в присутствии и в отсутствии магнитного поля. Магнитно обогащенная экспансия относится к экспансии и/или активации T-клеток при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих на своей поверхности антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид и один или несколько лимфоцитарных костимулирующих лигандов (которые могут находиться на одних и тех же или разных частицах), таким образом, что наличие магнитного поля индуцирует магнитную кластеризацию наночастиц и TCR, тем самым направляя активацию и последующую экспансию фракции антигенспецифических T-клеток. Магнитная кластеризация нанодиапазонных искусственных аантигенпрезентирующих клеток с экспансией T-клеток раскрыта в патенте США № 2016/0051698, который включен в данный документ посредством ссылки. В различных вариантах реализации изобретения способ обогащения и экспансии включает магнитную активацию, в которой парамагнитые нано-иАПК, несущие сигнал 1 и сигнал 2 (либо на одной и тоже либо на разных популяциях наночастиц), инкубируют в присутствии магнитного поля. Инкубация в присутствии магнитного поля обычно происходит в течение по меньшей мере 5 минут, или по меньшей мере 10 минут, или по меньшей мере 15 минут, или по меньшей мере 30 минут, или по меньшей мере одного часа, или по меньшей мере 2 часов. Например, инкубация в присутствии магнитного поля может происходить в течение от 5 минут до приблизительно 2 часов или от приблизительно 10 минут до приблизительно 1 часа.
В различных аспектах в данном изобретении предложены способы экспансии популяций антигенспецифических T-клеток для адаптивной иммунотерапии, в том числе сконструированные T-клетки, которые экспрессируют гетерологичный T-клеточный рецептор или химерный антигенный рецептор (CAR). Адаптивная иммунотерапия включает в себя активацию и экспансию иммунных клеток ex vivo, при этом полученные в результате клетки переносят пациенту для лечения заболевания, такого как рак. Индукция ответов со стороны антигенспецифических цитотоксических (CD8+) лимфоцитов (CTL), например, посредством адаптивного переноса, могла бы быть перспективной терапией, если бы достаточное количество и частоту активированных и антигенспецифических CTL можно было бы генерировать за сравнительно короткое время, в том числе из редких клеток-предшественников. Этот подход в некоторых вариантах реализации изобретения мог бы даже приводить к генерации долговременной памяти, которая предупреждает повторное развитие заболевания. Помимо противоопухолевой иммунотерапии и видов иммунотерапии, включающих CTL, данное изобретение находит применение в случае других иммунных клеток, в том числе CD4+ T-клеток и регуляторных T-клеток, и, таким образом, является широко применимым к иммунотерапии инфекционного заболевания и аутоиммунного заболевания, в числе прочих. Кроме того, T-клетки, экспансированные в соответствии с вариантами реализации данного изобретения, характеризуются поликлональным фенотипом (Tcm, Tem), в противоположность T-клеткам, экспансированным неспецифически с применением анти-CD3/анти-CD28, которые приближены к истощенному фенотипу.
В некоторых вариантах реализации изобретения T-клетки, имеющие фенотип центральной памяти (Tcm) или эффекторной памяти (Tem), получают в соответствии со следующим раскрытием, и затем химерный антигенный рецептор или гетерологичный TCR вводят в клетку с получением CAR-T-клетки для адаптивной терапии. Такие клетки можно активировать и экспансировать in vivo при помощи способов, описанных в данном документе.
В еще одних вариантах реализации изобретения наночастица содержит лиганды, которые взаимодействуют с CAR-T-рецептором, такие как CD19, в качестве сигнала 1. Наночастицы в соответствии с этими вариантами реализации способствуют магнитной активации и последующей экспансии CAR-T-клеток.
Например, в различных вариантах реализации CD8+ лимфоциты, экспансированные в соответствии с вариантами реализации данного изобретения, содержат следующие фенотипы: низкая экспрессия PD-1; фенотип центральной памяти (CD3+, CD44+, CD62L+); и фенотип эффекторной памяти (CD3+, CD44+, CD62L-). В некоторых вариантах реализации изобретения CD8+ лимфоциты, обогащенные и экспансированные в соответствии с вариантами реализации данного изобретения, продуцируют провоспалительные маркеры, такие как IFNγ, TNFα, IL-2, MIP-1β, GrzB и/или перфорин при стимуляции иАПК, нагруженными когнатным антигеном.
В некоторых аспектах в данном изобретении предложен способ быстрой генерации больших количеств антигенспецифических T-клеток, которые можно охарактеризовать фенотипически и/или генотипически с идентификацией продуктивных и эффективных антигенспецифических TCR. Например, в данном аспекте в данном изобретении предложен способ идентификации антигенспецифического T-клеточного рецептора (TCR). Способ включает магнитное обогащение и/или магнитное экспансирование гетерогенной популяции T-клеток при помощи парамагнитных частиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на поверхности, как описано более подробно в данном документе. Экспансированные T-клетки затем сортируют (например, при помощи проточной цитомерии) при помощи лиганда ГКГС-пептид, с получением популяции Т-клеток, которая является высокообогащенной на предмет антигенспецифических TCR. Затем репертуар TCR можно секвенировать и/или профилировать. Наряду с функциональной характеристикой экспансированных T-клеток, за короткое время можно идентифицировать TCR с определенными аффинностями. Такие TCR находят применение для гетерологичной экспрессии в целях генерации сконструированных T-клеток для адаптивной терапии.
Данное изобретение в данном аспекте способствует генерации достаточных количеств T-клеток для секвенирования всего за несколько дней. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения магнитно обогащенные клетки экспансируют в культуре в течение от приблизительно 2 дней до 9 недель, или в некоторых вариантах реализации изобретения - от 5 дней до приблизительно 2 недель (например, приблизительно 1 недели). Секвенирование ДНК можно проводить при помощи любого известного способа, в том числе пиросеквенирования, секвенирования нового поколения (NGS; секвенирования ДНК или РНК) или секвенирования путем синтеза. Секвенирование, как правило, включает альфа- и/или бета-цепи TCR, в том числе участки, определяющие комплементарность TCR, например, CDR3 бета-цепи рецептора, образованные V-, D- и J-генными участками.
В другом аспекте в данном изобретении предложен способ скрининга популяции T-клеток на реактивность по отношению к библиотеке антигенных пептидов-кандидатов. В различных вариантах реализации способ включает магнитное обогащение и магнитное экспансирование антигенспецифических T-клеток в популяции при помощи коктейля парамагнитных наночастиц, каждая из которых имеет антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на своей поверхности, который презентирует антигенный пептид-кандидат. Способ дополнительно включает фенотипическую оценку обогащенных и экспансированных T-клеток, например, на предмет их реактивности по отношению к пептидам-кандидатам.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательное магнитное обогащение выполняют с применением проточной фракции из исходной стадии магнитного обогащения, при этом в каждом последующем обогащении используется другой антигенный пептид, представляющий интерес, или другая совокупность антигенных пептидов. Например, в некоторых вариантах реализации выполняют по меньшей мере 6, или по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20 последовательных магнитных обогащений. Поскольку в каждой стадии последовательного обогащения можно проводить скрининг от 5 до приблизительно 20 антигенных пептидов-кандидатов, то способ позволяет тестировать от 30 до 400 антигенов. В различных вариантах реализации изобретения тестируют по меньшей мере 50 антигенов, или тестируют по меньшей мере 75 антигенов, или тестируют по меньшей мере 100 антигенов, или тестируют по меньшей мере 150 антигенов, или тестируют по меньшей мере 200 антигенов, или тестируют по меньшей мере 300 антигенов без снижения частоты предшественников антигенспецифических Т-клеток в исходном образце.
В других аспектах в данном изобретении предложены способы экспансии T-клеток, содержащих гетерологичный или сконструированный T-клеточный рецептор (TCR). Способ включает магнитное обогащение и магнитное экспансирование популяции T-клеток, которая содержит T-клетки, экспрессирующие гетерологичный или сконструированный T-клеточный рецептор (TCR). Обогащение и экспансию проводят при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид, распознаваемый гетерологичным или сконструированным T-клеточным рецептором (TCR) на поверхности частиц.В некоторых вариантах реализации изобретения, начиная с антигенспецифических частот, составляющих от приблизительно 10% до приблизительно 40% (например, по меньшей мере приблизительно 20%), в способе продуцируется высокая частота и количество анигенспецифических T-клеток в течение приблизительно 10-14 дней.
В других аспектах в данном изобретении предложен способ получения популяции антигенспецифических T-клеток при помощи магнитного обогащения и экспансии, при этом комплекс ГКГС-пептид получают при помощи пассивной нагрузки наночастиц, конъюгированных с ГКГС. Пассивная нагрузка наночастиц отличается от рефолдинга ГКГС в присутствии пептида, после чего следует конъюгация или присоединение антигенпрезентирующего комплекса к поверхности частиц. При получении серий частиц, которые являются некомитированными по отношению к определенным антигенным частицам, производственный процесс и затраты на процесс значительно нормализуются. Как раскрыто в патенте США № 6734013, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, активная нагрузка пептидного антигена на ГКГС-Ig при помощи щелочного срыва, быстрой нейтрализации и рефолдинга в присутствии пептида, приводила к образованию лигандов, которые были в 10-100 раз более активными при окрашивании T-клеток, чем соответствующий пассивно нагруженный ГКГС-Ig. Однако в вариантах реализации данного изобретения предложены надежное обогащение и экспансия антигенспецифических T-клеток с лучшими функциональными свойствами с применением даже пассивно загруженных лигандов на основе HLA-Ig. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения наночастицы, конъюгированные с ГКГС, пассивно нагружают в течение по меньшей мере 2 дней при помощи инкубации с избытком пептидного антигена.
В то время как магнитное обогащение и экспансия были описаны в случае с иАПК, которые содержат как сигнал 1 (комплекс ГКГС-пептид), так и сигнал 2 (например, анти-CD28), в различных аспектах данного изобретения иАПК в некоторых вариантах реализации изобретения содержат только сигнал 1. Вторую частицу, имеющую лимфоцитарный костимулирующий лиганд, конъюгированный со своей поверхностью, добавляют во время стадии обогащения или во время экспансии извлеченных T-клеток. Помещая «сигнал 2» (например, лимфоцитарный костимулирующий фактор) на отдельную частицу, можно контролировать время и тип стимула. Вторая частица также может быть парамагнитной, способствуя тому, что вторая частица магнитно кластеризуется с первыми наночастицами, презентирующими антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид. В этих вариантах реализации изобретения наночастицы предпочтительно поддерживают небольшими, такими как менее чем приблизительно 200 нм, менее чем приблизительно 100 нм или менее чем приблизительно 50 нм. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения вторая наночастица является парамагнитной и вторую наночастицу добавляют во время экспансии T-клеток, извлеченных во время стадии(стадий) обогащения.
В некоторых вариантах реализации изобретения вторая наночастица не является парамагнитной и ее добавляют во время магнитного обогащения антигенспецифических T-клеток. Поскольку наночастица с сигналом 2 не будет магнитно связываться с колонкой, то наночастицы с сигналом 2 не будут приводить к магнитному захвату неспецифических T-клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения подход на основе непарамагнитных частиц используется для последовательного обогащения, чтобы избежать потерю или нежелательное удерживание некогнатных T-клеток в каждой стадии обогащения. Вторая наночастица может содержать любой непарамагнитный материал, в том числе любой из известных полимерных материалов, в том числе полистироловые или латексные частицы или частицы, которые содержат PLGA, PLGA-PEG, PLA или PLA-PEG.
В еще одних аспектах в данном изобретении предложен способ генерации T-клетки, экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), при этом способ включает в себя магнитное обогащение и экспансирование популяции T-клеток при помощи парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид на своей поверхности, в целях получения тем самым популяции обогащенных и экспансированных атигенспецифических T-клеток; и трансформации популяции T-клеток при помощи химерного антигенного рецептора (CAR).
В различных вариантах реализации изобретения пациент представляет собой пациента, больного раком, и экспансированные CAR-T-клетки можно адаптивно переносить пациенту, необязательно с применением реактивации путем введения биосовместимых иАПК. В некоторых вариантах реализации изобретения способ включает поддержку/усиление при помощи фармацевтической композиции, содержащей искусственную антигенпрезентирующую клетку (иАПК), презентирующую антигенпрезентирующий комплекс ГКГС-пептид и лимфоцитарный костимулирующий лиганд, в целях тем самым экспансии и реактивации CAR-T-клеток in vivo. Подходящие иАПК для терапевтического применения описаны в международной заявке № 2016/105542, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.
В связанном варианте реализации изобретения в данном изобретении предложен способ экспансии T-клетки, экспрессирующей CAR, в целях усиления процесса продукции. Например, способ может включать получение популяции T-клеток, экспрессирующих CAR, как описано выше, и магнитное обогащение и/или экспансирование популяции T-клеток в присутствии парамагнитных наночастиц, имеющих антигенпрезентирующий комплекс на основе ГКГС на своей поверхности.
Иллюстративные CAR включают в себя слияния одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), происходящих из моноклональных антител, слитых с CD3-зета-трансмембранным доменом или эндодоменом или другим TCR-сигнальным доменом. CAR может целенаправленно воздействовать на злокачественные B-клетки в результате нацеливания на CD19, к примеру.
В различных аспектах в данном изобретении используются искусственные антигенпрезентирующие клетки (иАПК), которые захватывают и доставляют стимулирующие сигналы к иммунным эффекторным клеткам, таким как антигенспецифические T-лимфоциты, такие как CTL. Сигналы, присутствующие на иАПК, которые поддерживают активацию T-клеток, включают в себя сигнал 1, антигенный пептид, презентированный в контексте главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), класса I или класса II, и которые связывают антигенспецфические T-клеточные рецепторы (TCR); и сигнал 2, один или несколько костимулирующих лигандов, которые модулируют T-клеточный ответ. Как описано в данном документе, сигнал 1 и сигнал 2 можно доставлять на отдельных частицах, и выбор материала частицы для сигнала 2 (например, парамагнитный или непарамагнитный) может придавать способам дополнительные функциональные характеристики. Лиганды на основе сигнала 1 и сигнала 2 можно химически конъюгировать с наночастицами сайт-направленным образом, таким образом, что лиганды поддерживают функциональную ориентацию на частицах.
В некоторых вариантах реализации этой системы сигнал 1 обеспечивается мономерной, димерной или многомерной конструкцией на основе ГКГС. Димерную конструкцию создают в некоторых вариантах реализации изобретения в результате слияния с вариабельным участком или CH1- или CH2-участком последовательности иммуноглобулиновой тяжелой цепи. Комплекс ГКГС нагружают одним или несколькими антигенными пептидами. Сигнал 2 представляет собой либо B7.1 (природный лиганд для T-клеточного рецептора CD28), либо активирующее антитело против CD28. Лиганды на основе сигнала 1 и сигнала 2 могут включать в себя вариации в гликозильных группах или модификации свободных сульфгидрильных групп цистеина.
В некоторых аспектах в данном изобретении предложен способ получения популяции антигенспецифических T-клеток для адаптивного переноса. В этих аспектах T-клетки происходят от пациента или подходящего донора. иАПК могут презентировать антигены, которые являются распространенными для заболевания, представляющего интерес (например, опухолевого типа), или могут презентировать один или несколько антигенов, выбранных на персонализированной основе. Стадия экспансии может осуществляться в течение от приблизительно 3 дней до приблизительно 2 недель в некоторых вариантах реализации изобретения, или от приблизительно 5 дней до приблизительно 10 дней (например, приблизительно 1 недели). Процесс обогащения и экспансии затем можно повторять один или несколько раз в целях оптимальной экспансии (или дополнительной чистоты) антигенспецифических клеток. Для последующих циклов обогащения и экспансии к Т-клеткам можно добавлять дополнительные иАПК для поддержания экспансии более крупной популяции антигенспецифических Т-клеток в образце. В определенных вариантах реализации изобретения конечный цикл (например, цикл 2, 3, 4 или 5) экспансии происходит in vivo, в котором биосовместимые нано-АПК добавляют к популяции экспансированных T-клеток и затем вводят пациенту.
8
В определенных вариантах реализации изобретения способ предусматривает приблизительно 1000-10000-кратную экспансию (или больше) антигенспецифических T-клеток, при этом генерируется более чем приблизительно 10 антигенспецифических T-клеток в течение, например, менее чем приблизительно месяца, или менее чем приблизительно трех недель, или менее чем приблизительно двух недель, или в течение приблизительно одной недели. Полученные в результате клетки можно вводить пациенту для лечения заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения иАПК можно вводить пациенту совместно с полученным препаратом на основе антигенспецифических T-клеток.
При отборе T-клеточных антигенов на персонализированной основе, проводят скрининг библиотеки иАПК, каждая из которых презентирует антигенный пептид-кандидат, совместно с Т-клетками от субъекта или пациента, и определяют или количественно определяют ответ T-клеток на каждый пептид иАПК. В некоторых вариантах реализации изобретения T-клеточный ответ можно количественно определить молекулярным образом, например, при помощи количественного определения экспрессии цитокинов или экспрессии другого суррогатного маркера активации Т-клеток (например, при помощи иммуногистохимического анализа или амплификации экспрессируемых генов, например, при помощи ОТ-ПЦР). В некоторых вариантах реализации изобретения стадию количественного определения осуществляют в культуре между приблизительно 15 часами и 48 часами. В других вариантах реализации изобретения T-клеточный ответ определяют при помощи детекции внутриклеточной передачи сигнала (например, передачи сигнала с участием Ca2+ или другой передачи сигнала, которая происходит рано во время активации T-клеток), и, таким образом, его можно определить в пределах от приблизительно 15 минут до приблизительно 5 часов (например, в пределах от приблизительно 15 минут до приблизительно 2 часов) после культивирования с нано-иАПК. Пептиды, проявляющие самые устойчивые ответы, отбирают для иммунотерапии, в том числе в некоторых вариантах реализации изобретения для подхода на основе адаптивной иммунотерапии, описанного в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения и, в частности, для иммунотерапии рака, опухоль пациента генетически анализируют (например, при помощи секвенирования нового поколения), и опухолевые антигены прогнозируют исходя из уникальной сигнатуры опухолевых мутаций пациента (например, содержащей уникальные мутации в ДНК опухоли пациента, которые не встречаются в неопухолевых клетках). Эти предполагаемые антигены («неоантигены») синтезируют и подвергают скринингу по отношению к T-клеткам пациента при помощи платформы на основе иАПК, описанной в данном документе. После идентификации/подтверждения реактивных антигенов иАПК можно получать для протокола обогащения и экспансии, описанного в данном документе, или в некоторых вариантах реализации изобретения иАПК можно непосредственно вводить пациенту.
В некоторых аспектах T-клетки субъекта или пациента подвергают скринингу по отношению к массиву или библиотеке парамагнитных нано-иАПК (как описано в данном документе), в которых каждая парамагнитная нано-иАПК презентирует пептидный антиген. На каждый из них определяют или количественно определяют Т-клеточные ответы, получая полезную информацию относительно репертуара Т-клеток человека, и, тем самым, состояния субъекта или пациента. Например, количество и идентичность Т-клеточных противоопухолевых ответов по отношению к мутировавшим белкам, сверхэкспрессируемым белкам и/или другим опухоль-ассоциированным антигенам можно использовать в качестве биомаркера для классификации риска, и в некоторых вариантах реализации изобретения можно включать в компьютеризированный алгоритм классификатора для классификации профиля ответа по отношению к устойчивости к лекарственным препаратом или чувствительности к лекарственным препаратом, или классификации профиля ответа в качестве кандидата для иммунотерапии (например, терапии на основе ингибиторов контрольных точек или терапии на основе адаптивного переноса Т-клеток). Например, число и интенсивность таких T-клеточных ответов могут быть обратно пропорциональными высокому риску прогрессирования заболевания, и/или могут быть непосредственно связаны с вероятным ответом пациента на иммунотерапию, которая может включать в себя одно или несколько из терапии на основе ингибиторов контрольных, адаптивного переноса T-клеток или другой иммунотерапии рака.
В еще одних аспектах и вариантах реализации изобретения T-клетки пациента подвергают скринингу по отношению к массиву или библиотеке парамагнитных нано-АПК, каждая из которых презентирует пептидный антиген-кандидат. Например, массив или библиотека могут презентировать опухоль-ассоциированные антигены, или могут презентировать аутоантигены, или могут презентировать T-клеточные антигены, связанные с различными инфекционными заболеваниями. При инкубировании массива или библиотеки с T-клетками пациента, а также в присутствии магнитного поля для содействия кластеризации T-клеточных рецепторов, можно быстро определить наличие T-клеточных ответов и/или число или интенсивность этих T-клеточных ответов. Эта информация является полезной для диагностики, например, субклинической опухоли, аутоиммунного или иммунного заболевания или инфекционного заболевания, и может обеспечить исходное понимание биологии заболевания, в том числе потенциальных патогенных или терапевтических T-клеток, T-клеточных антигенов, и понимание Т-клеточных рецепторов, представляющих интерес, которые представляют собой мишени лекарственной терапиии или иммунотерапии.
В данном изобретении предложена иммунотерапия рака и других заболеваний, в которых детекция, обогащение и/или экспансия антигенспецифических иммунных клеток ex vivo является терапевтически или диагностической желательной. Данное изобретение в целом применимо для детекции, обогащения и/или экспансии антигенспецифических T-клеток, в том числе цитотокических T-лимфоцитов (CTL), хелперных T-клеток и регуляторных T-клеток, а также NKT-клеток или даже B-клеток, в случае которых соответствующий лиганд был презентирован на поверхности иАПК.
В некоторых вариантах реализации пациентом является пациент, больной раком. Обогащение и экспансия антигенспецифических CTL ex vivo для адаптивного переноса пациенту обеспечивает устойчивый противоопухолевый ответ. Виды рака, которые можно лечить или оценивать в соответствии со способами, включают в себя виды рака, которые исторически вызывают слабые иммунные ответы или имеют высокую частоту повторного развития. Иллюстративные виды рака включают в себя различные типы солидных опухолей, в том числе карциномы, саркомы и лимфомы. В различных вариантах реализации рак представляет собой меланому (в том числе метастатическую меланому), рак толстой кишки, рак двенадцатиперстной кишки, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника, протоковый рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак почек, рак эндометрия, рак яичка, рак желудка, дисплазию слизистой полости рта, полипоз, рак головы и шеи, инвазивный рак полости рта, немелкоклеточную карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого, мезотелиому, переходноклеточную и плоскоклеточную карциному мочевыводящих путей, рак головного мозга, нейробластому и глиому.
В некоторых вариантах реализации рак представляет собой гематологический рак, в том числе лейкоз, лимфому или миелому. Например, гематологический рак может представлять собой острый миелоидный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, острый лейкоз у детей, неходжкинские лимфомы, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, миелодиспластический синдром, злокачественную T-клеточную лимфому кожи, фунгоидный микоз, не относящийся к ФМ T-клеточную лимфому кожи, лимфоматоидный папулез и лимфоидную гиперплазию кожи с высоким содержанием T-клеток.
В различных вариантах реализации изобретения рак представляет собой рак I стадии, II стадии, III стадии или IV стадии. В некоторых вариантах реализации рак является метастатическим и/или рецидивирующим. В некоторых вариантах реализации рак является доклиническим, и детектируется в системе скрининга, описанной в данном документе (например, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы или другой рак, которая сложно детектировать на ранней стадии).
В некоторых вариантах реализации пациент имеет инфекционное заболевание. Инфекционное заболевание может представлять собой таковое, при котором обогащение и экспансия антигенспецифических иммунных клеток (таких как CD8+ или CD4+ T-клеток) ex vivo для адаптивного переноса пациенту могли бы усилить или обеспечить продуктивный/защитный иммунный ответ. Инфекционные заболевания, которые можно лечить, включают в себя таковые, вызванные бактериями, вирусами, прионами, грибами, паразитами, гельминтами и др. Такие заболевания включают в себя СПИД, гепатит B/C, инфекци, вызванную ЦМВ, и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (ПТЛР). Например, ЦМВ является самым распространенным вирусным патогеном, обнаруженным у пациентов после трансплантации органов, и является основной причиной заболеваемости и смертности у пациентов, перенесших трансплантацию костного мозга или стволовых клеток периферической крови. Это обусловлено ослабленным иммунологическим статусом этих пациентов, который способствует реактивации латентного вируса у серопозитивных пациентов или оппортунистической инфекции у серогенативных индивидуумов. Полезной альтернативной этим видам лечения является профилактический иммунотерапевтический режим, включающий в себя генерацию специфических по отношению к вирусу CTL, происходящих от пациента или подходящего донора до начала процедуры трансплантации. ПТЛР появляется у значительной доли пациентов после трансплантации и происходит в результате инфекции, вызываемой вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ). Считается, что инфекция, вызываемая ВЭБ, присутствует примерно у 90% взрослого населения в Соединенных Штатах Америки. Острая вирусная репликация и инфекция контролируется иммунной системой, однако, как в случае с ЦМВ, индивидуумы с ослабленным иммунитетом вследствие трансплантационной терапии утрачивают контроль над популяциями Т-клеток, что способствует реактивации вируса. Это представляет собой серьезное препятствие трансплантационным протоколам. ВЭБ может также участвовать в опухолевой активации в ряде гематологических и негематологических видов рака. В случае инфекционных заболеваний, включающих биопленки, или поддерживаемых матриксом для размножения бактерий в непланктонном состоянии, CD8+ T-клетки могут быть важны для выздоровления. Антигенспецифические ответы, в которых происходит рекрутинг активированных CD8+ T-клеток, которые инфильтрируют матрикс биопленки, могли бы оказаться эффективными для устранения инфекции, вызываемой микроорганизмами, устойчивыми к антибиотикам.
В некоторых вариантах реализации изобретения пациент имеет аутоиммунное заболевание, при котором обогащение и экспансия регуляторных T-клеток (например, CD4+, CD25+, Foxp3+) ex vivo для адаптивного переноса пациенту могли бы ослаблять вредный иммунный ответ. Аутоиммунные заболевания, которые можно лечить, включают в себя системную красную волчанку, ревматоидный артрит, сахарный диабет I типа, рассеянный склероз, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, миастению гравис, синдром Гудпасчера, базедову болезнь, вульгарную пузырчатку, болезнь Аддисона, герпетиформный дерматит, целиакию и тиреоидит Хашимото. В некоторых вариантах реализации у пациента предполагается наличие аутоиммунного заболевания или иммунного состояния (такого, как таковые, описанные в предыдущем предложении), и оценка T-клеточных ответов по отношению к библиотеке парамагнитных нано-иАПК, описанных в данном документе, полезна для идентификации или подтверждения иммунного состояния.
Таким образом, в различных вариантах реализации данное изобретение включает обогащение и экспансию антигенспецифических T-клеток, таких как цитотоксические T-лимфоциты (CTL), хелперные T-клетки или регуляторные T-клетки. В некоторых вариантах реализации данное изобретение включает обогащение и экспансию антигенспецифических CTL. Т-клетки-предшественники можно получить от пациента или от подходящего совместимого по системе HLA донора. Т-клетки-предшественники можно получить из ряда источников, в том числе мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), костного мозга, ткани лимфатических узлов, ткани селезенки и опухолей. В некоторых вариантах реализации изобретения образец представляет собой образец МКПК от пациента. В некоторых вариантах реализации образец МКПК используется для выделения популяции T-клеток, представляющих интерес, таких как CD8+, CD4+ или регуляторные T-клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения Т-клетки-предшественники получают из единицы крови, собранной от субъекта, при помощи любого количества методик, известных специалисту в данной области, таких как фиколл-разделение. Например, Т-клетки-предшественники из циркулирующей крови индивидуума можно получить при помощи афереза или лейкафереза. Продукт афереза обычно содержит лимфоциты, в том числе T-клетки и T-клетки-предшественники, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты и тромбоциты. Лейкаферез представляет собой лабораторную процедуру, при которой лейкоциты отделяют от образца крови.
Клетки, собранные при помощи афереза, можно промывать с удалением плазменной фракции и помещать в подходящий буфер или среды для последующих стадий обработки. Стадии промывания можно осуществлять при помощи способов, известных специалистам в данной области, таких как использование полуавтоматической «проточной» центрифуги (например, клеточного процессора Cobe 2991) в соответствии с инструкциями производителя. После промывания клетки можно ресуспендировать в ряде биосовместимых буферов, таких как, например, бескальциевый, безмагниевый PBS. Альтернативно нежелательные компоненты образца после афереза можно удалять и клетки непосредственно ресуспендировать в среде для культивирования.
При необходимости T-клетки-предшественники можно выделить из лимфоцитов периферической крови при помощи лизирования эритроцитов и истощения моноцитов, например, при помощи центрифугирования в градиенте PERCOLL™.
При необходимости субпопуляции T-клеток можно отделить от других клеток, которые могут присутствовать. Например, специфические популяции T-клеток, таких как CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и CD45RO+T-клетки, можно дополнительно выделять при помощи методик позитивной и негативной селекции. Другие методики обогащения включают в себя сортировку клеток и/или селекцию путем негативной магнитной иммунной адгезии или проточной цитометрии, например, с применением коктейля моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на клетках, которые были негативно селектированы.
5
6
7
В определенных вариантах реализации изобретения лейкоциты собирают при помощи лейкафереза и затем обогащают CD8+ T-клетками при помощи известных способов, таких как использование колонок магнитного обогащения, которые имеются в продаже. Затем CD8-обогащенные клетки дополнительно обогащают антигенспецифическими T-клетками при помощи магнитного обогащения с применением реагента для иАПК. В различных вариантах реализации изобретения по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 10 CD8-обогащенных клеток выделяют для обогащения антигенспецифическими T-клетками.
В различных вариантах реализации изобретения образец, содержащий иммунные клетки (например, CD8+ T-клетки), приводят в контакт с искусственной антигенпрезентирующей клеткой (иАПК), имеющей магнитные свойства. Парамагнитные материалы имеют незначительную положительную восприимчивость к магнитным полям. Эти материалы притягиваются к магнитному полю и материал не сохраняет магнитные свойства в случае если внешнее поле удаляют. Иллюстративные парамагнитные материалы включают, но не ограничиваясь этим, магний, молибден, литий, тантал и оксид железа. Парамагнитные гранулы, подходящие для магнитного обогащения, имеются в продаже (DYNABEADSTM, MACS MICROBEADSTM, Miltenyi Biotec). В некоторых вариантах реализации изобретения частица, представляющая собой иАПК, представляет собой гранулу на основе декстрана и железа (например, покрытую декстрановой оболочкой гранулу из оксида железа).
Антигенпрезентирующие комплексы содержат антигенсвязывающую щель, которая несет антиген для презентации T-клетке или Т-клетке-предшественнику. Антигенпрезентирующие комплексы могут представлять собой, например, молекулы ГКГС I класса или II класса и могут быть соединены или связаны с получением димерного или многомерного ГКГС. В некоторых вариантах реализации изобретения ГКГС являются мономерными, однако их близкая ассоциация на наночастице является достаточной для авидности и активации. В некоторых вариантах реализации изобретения ГКГС являются димерными. Конструкции на основе димерного ГКГС I класса можно сконструировать при помощи слияния последовательностей иммуноглобулиновой тяжелой цепи с последовательностями иммуноглобулиновой легкой цепи, которые затем ассоциируют путем одной или нескольких дисульфидных связей (и с ассоциированными легкими цепями). В некоторых вариантах реализации изобретения комплекс на основе сигнала 1 представляет собой неклассическую ГКГС-подобную молекулу, такую как член семейства CD1 (например, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d и CD1e). Многомерные ГКГС можно создавать при помощи прямого связывания посредством пептида или химических линкеров, или они могут быть многомерными в результате ассоциации со стрептавидином посредством фрагментов биотина. В некоторых вариантах реализации изобретения антигенпрезентирующие комплексы представляют собой молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса или ГКГС II класса, включающие слияния с иммуноглобулиновыми последовательностями, которые являются чрезвычайно стабильными и легкими для получения, на основании стабильности и эффективности секреции, обусловленной иммуноглобулиновым остовом.
Молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса, имеющие иммуноглобулиновые последовательности, описаны в патенте США 6268411, который включен в данный документе посредством ссылки во всей своей полноте. Эти молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса могут образовываться конформационно интактным образом на концах иммуноглобулиновых тяжелых цепей. Молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса, с которыми связываются антигенные пептиды, могут стабильно связываться с рецепторами антигенспецифических лимфоцитов (например, T-клеточными рецепторами). В различных вариантах реализации изобретения последовательность иммуноглобулиновой тяжелой цепи не является полноразмерной, однако содержит шарнирный участок Ig и один или несколько CH1-, CH2- и/или CH3-доменов. Последовательность Ig может содержать или может не содержать вариабельный участок, однако в случае, когда присутствуют последовательности вариабельного участка, вариабельный участок может быть полным или частичным. Комплекс может дополнительно содержать иммуноглобулиновые легкие цепи. Лиганды на основе ГКГС класса I (например, HLA-Ig), не имеющие последовательностей вариабельной цепи, могут быть использовать для сайт-направленной конъюгации с частицами, как описано в международной заявке № 2016/105542, которая включена в данный документе посредством ссылки во всей своей полноте.
Иллюстративные молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса содержат по меньшей мере два слитых белка. Первый слитый белок содержит первую α-цепь ГКГС I класса и первую иммуноглобулиновую тяжелую цепь (или ее участок, содержащий шарнирный участок), и второй слитый белок содержит вторую α-цепь ГКГС I класса и вторую иммуноглобулиновую тяжелую цепь (или ее участок, содержащий шарнирный участок). Первая и вторая иммуноглобулиновые тяжелые цепи ассоциируются с образованием молекулярного комплекса на основе ГКГС I класса, который содержит две пептидсвязывающие щели ГКГС I класса. Иммуноглобулиновая тяжелая цепь может представлять собой тяжелую цепь IgM, IgD, IgG1, IgG3, IgG2β, IgG2α, IgG4, IgE или IgA. В некоторых вариантах реализации изобретения используется тяжелая цепь IgG для образования молекулярных комплексов на основе ГКГС I класса. Если требуются многовалентные молекулярные комплексы на основе ГКГС I класса, то можно использовать тяжелые цепи IgM или IgA для получения пентавалентных или тетравалентных молекул соответственно.
Иллюстративные молекулы I класса включают в себя HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E и они могут быть использованы по отдельности или в любой комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения антигенпрезентирующий комплекс представляет собой лиганд на основе HLA-A2. Термин ГКГС, используемый в данном документе, в каждом случае можно заменить HLA.
Иллюстративные молекулярные комплексы на основе ГКГС II класса описаны в патенте США 6458354, патенте США 6015884, патенте США 6140113 и патенте США 6448071, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Молекулярные комплексы на основе ГКГС II класса содержат по меньшей четыре два слитых белка. Два первых слитых белка содержат (i) иммуноглобулиновую тяжелую цепь (или ее участок, содержащий шарнирный участок) и (ii) внеклеточный домен β-цепи ГКГС II класса. Два вторых слитых белка содержат (i) иммуноглобулиновую κ- или λ-легкую цепь (или ее участок) и (ii) внеклеточный домен α-цепи ГКГС II класса. Два первых и два вторых слитых белка ассоциируются с образованием молекулярного комплекса на основе ГКГС II класса. Внеклеточный домен β-цепи ГКГС II класса каждого первого слитого белка и внеклеточный домен α-цепи ГКГС II класса каждого второго слитого белка образуют пептидсвязывающую щель ГКГС II класса.
Иммуноглобулиновая тяжелая цепь может представлять собой тяжелую цепь IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2β, IgG2α, IgG4, IgE или IgA. В некоторых вариантах реализации изобретения тяжелую цепь IgG1 используют для образования двухвалентных молекулярных комплексов, содержащих две антигенсвязывающих щели. Необязательно можно включать вариабельный участок тяжелой цепи. Можно использовать тяжелые цепи IgM или IgA для получения пентавалентных или тетравалентных молекулярных комплексов соответственно.
Слитые белки молекулярного комплекса ГКГС II класса могут содержать пептидный линкер, вставленный между иммуноглобулиновой цепью и внеклеточным доменом полипептида ГКГС II класса. Длина линкерной последовательности может варьировать в зависимости от требуемой гибкости в целях регуляции степени связывания антигенов и перекрестного сшивания рецепторов.
Иммуноглобулиновые последовательности в некоторых вариантах реализации изобретения представляют собой последовательности гуманизированных моноклональных антител.
Сигнал 2, как правило, представляет собой молекулу, воздействующую на T-клетку, т.е., молекулу, которая оказывает биологический эффект на Т-клетку-предшественник или на антигенспецифическую T-клетку. Такие биологические эффекты включают, например, дифференциацию Т-клетки-предшественника в CTL, хелперную T-клетку (например, Th1, Th2) или регуляторную T-клетку; и/или пролиферацию T-клеток. Таким образом, молекулы, воздействующие на T-клетку, включают в себя костимулирующие молекулы Т-клеток, адгезивные молекулы, факторы роста T-клеток и молекулы-индукторы регуляторных Т-клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения иАПК содержит по меньшей мере один такой лиганд; необязательно иАПК содержит по меньшей мере два, три или четыре таких лиганда.
В определенных вариантах реализации изобретения сигнал 2 представляет собой костимулирующую молекулу Т-клеток. Костимулирующие молекулы T-клеток содействуют активации антигенспецифических T-клеток. Такие молекулы включают в себя, но не ограничиваясь этим, молекулы, которые специфические связываются с CD28 (в том числе антитела), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H3, 4-1BB, 4-1BBL, CD27, CD30, CD134 (OX-40L), B7h (B7RP-1), CD40, LIGHT, антитела, которые специфически связываются с HVEM, антитела, которые специфически связываются с CD40L, и антитела, которые специфически связываются с OX40. В некоторых вариантах реализации изобретения костимулирующая молекула (сигнал 2) представляет собой антитело (например, моноклональное антитело) или его участок, такой как F(ab')2, Fab, scFv или одноцепочечное антитело, или другой антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело или его участок, имеющий антигенсвязывающую активность, или представляет собой полностью человеческое антитело или его участок, имеющий антигенсвязывающую активность.
Комбинации костимулирующих лигандов, которые можно использовать (на одних и тех же или разных наночастицах) включают в себя анти-CD28/анти-CD27 и анти-CD28/анти-41BB. Соотношения этих костимулирующих лигандов может варьировать в целях воздействия на экспансию.
Иллюстративные лиганды на основе сигнала 1 и сигнала 2 описаны в международной заявке № 2014/209868, в которой описаны лиганды, имеющие свободный сульфгидрил (например, неспаренный цистеин), таким образом, что константный участок можно связать с подложками наночастицы, имеющими соответствующую химическую функциональную группу.
Адгезивные молекулы, пригодные для нано-иАПК, можно использовать для опосредования адгезии нано-иАПК с T-клеткой или T-клеткой-предшественником. Пригодные молекулы адгезии включают в себя, например, ICAM-1 и LFA-3.
В некоторых вариантах реализации изобретения сигнал 1 представлен комплексами HLA-пептид-A2, а сигнал 2 представлен B7.1-Ig или анти-CD28. Иллюстративное анти-CD28 моноклональное антитело представляет собой 9.3 мАТ (Tan et al., J. Exp. Med. 1993 177:165), которое может быть гуманизированным в определенных вариантах реализации и/или конъюгированным с гранулой в виде полностью интактного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В некоторых вариантах реализации используются факторы роста T-клеток, которые влияют на пролиферацию и/или дифференциацию T-клеток. Примеры факторов роста T-клеток включают в себя цитокины (например, интерлейкины, интерфероны) и суперантигены. При необходимости цитокины могут присутствовать в молекулярных комплексах, содержащих слитые белки или могут быть инкапсулированы при помощи иАПК. Особенно пригодные цитокины включают в себя IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, гамма-интерферон и CXCL10. Необязательно цитокины представлены исключительно средовыми компонентами во время стадий экспансии.
Наночастицы могут быть изготовлены из любого материала, и материалы можно подходящим образом выбрать в отношении необходимого магнитного свойства, и они могут представлять собой, например, металлы, такие как железо, никель, кобальт, или сплав редкоземельного металла. Парамагнитные материалы также включают в себя магний, молибден, литий, тантал и оксид железа. Парамагнитые гранулы, подходящие для обогащения материалов (в том числе клеток) имеются в продаже и включают в себя гранулы на основе декстрана и железа, такие как покрытые декстрановой оболочкой гранулы с оксидом железа. В аспектах данного изобретения, в которых не требуются магнитные свойства, наночастицы также могут быть изготовлены из неметаллических или органических (например, полимерных) материалов, таких как целлюлоза, керамика, стекло, нейлон, полистирол, резина, пластик или латекс. В иллюстративном материале для получения наночастиц присутствует сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) или PLA и его сополимеры, которые можно использовать в связи с этими вариантами реализации. Другие материалы, в том числе полимеры и сополимеры, которые можно использовать, включают таковые, описанные в патнте США № 2014/25889, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В некоторых вариантах реализации изобретения магнитные частицы являются биосовместимыми. Это является особенно важным в вариантах реализации изобретения, в которых иАПК будут вводить пациенту в ассоциации с обогащенными и экспансированными клетками. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения магнитные частицы являются биосовместимыми парамагнитными гранулами на основе декстрана и железа.
В различных вариантах реализации изобретения частица имеет размер (например, средний размер) в пределах от приблизительно 10 до приблизительно 500 нм, или в пределах от приблизительно 20 до приблизительно 200 нм. Особенно в вариантах реализации изобретения, в которых иАПК будут вводить пациентам, микроразмерные иАПК являются слишком крупными для перенесения лимфатической системой, и при введении подкожно остаются в месте инъекции. При введении внутривенно они оседают на капиллярных ложах. Фактически неэффективная миграция микроразмерных гранул исключило исследование того, куда иАПК должна мигрировать для оптимальной иммунотерапии. Миграция и биораспределение нано-иАПК, по-видимому, являются более эффективными, чем микроразмерных иАПК. Например, два потенциальных участка, в которых иАПК могла быть наиболее эффективной, представляют собой лимфатический узел, в котором располагаются наивные Т-клетки и T-клетки памяти, и сама опухоль. Наночастицы с диаметром от приблизительно 50 до приблизительно 200 нм могут захватываться лимфатической системой и транспортироваться к лимфатическим узлам, тем самым гейтируется доступ к более крупному пулу T-клеток. Как описано в патенте США № 2014/25889, который включен в данный документ посредством ссылки, подкожная инъекция нано-иАПК приводила к меньшему опухолевому росту, чем в случае контроля или внутривенно вводимых гранул.
Для магнитной кластеризации предпочтительно, что наночастицы имеют размер в диапазоне от 10 до 250 нм, или в некоторых вариантах реализации изобретения от 20 до 100 нм. Взаимодействия рецептор-лиганд на границе раздела клетки и наночастицы полностью непонятны. Однако связывание наночастиц и клеточная активация являются чувствительными к пространственной организации мембраны, которая является особенно важной во время активации T-клеток, и можно использовать магнитные поля для манипуляции связанных в кластеры наночастиц с усилением активации. Например, активация T-клеток индуцирует состояние постоянно усиленной наноразмерной кластеризации TCR и наночастицы являются чувствительными к этой кластеризации в отношении, не характерном для более крупных частиц.
Кроме того, взаимодействия наночастиц с кластерами TCR можно использовать для усиления стимуляции рецепторов. Активация T-клеток опосредована агрегацией сигнальных белков, при этом сотни «сигнальных кластеров» нанометровых размерностей изначально образуются на периферии контактного сайта Т-клетка-АПК и мигрируют внутрь. Как описано в данном документе, можно использовать внешние магнитные поля в целях обогащения антигенспецифических T-клеток (в том числе редких наивных клеток) и регуляции агрегации магнитной нано-иАПК, связанной с TCR, приводящей к агрегации кластеров TCR и усиленной активации наивных T-клеток. Магнитные поля могут вызывать соответственно сильные влияния на парамагнитные частицы, однако в ином отношении являются биологически инертными, делая их эффективным средством контроля поведения частиц. T-клетки, связанные с парамагнитными нано-иАПК, активируются в присутствии прилагаемого извне магнитного поля. Нано-иАПК сами по себе намагничиваются и притягиваются как к источнику поля, так и к ближайшим наночастицам в поле, индуцируя агрегацию гранул и тем самым TCR в целях повышения иАПК-опосредованной активации.
Нано-иАПК связывают больше TCR и индуцируют более высокую активацию ранее активированных Т-клеток по сравнению с наивными Т-клетками. Кроме того, использование внешнего магнитного поля индуцирует агрегацию нано-иАПК на наивных клетках, усиливая пролиферацию T-клеток как in vitro, так и после адаптивного переноса in vivo. Важно, что в модели адаптивной иммунотерапии меланомы T-клетки, активированные нано-иАПК в магнитном поле, опосредуют отторжение опухоли. Таким образом, использование применяемых магнитных полей способствует активации популяции наивных T-клеток, которые иначе слабовосприимчивы к стимуляции. Это является важной особенностью иммунотерапии, поскольку, как было показано, наивные T-клетки являются более эффективными, чем более дифференцированные подтипы, для иммунотерапии рака, при этом имеется более высокая пролиферативная активность и более высокая способность к генерации сильных длительных T-клеточных ответов. Таким образом, нано-иАПК можно использовать для усиленной магнитными полями активации T-клеток в целях повышения выхода и активности антигенспецифических T-клеток, экспансированных из наивных предшественников, совершенствуя клеточную терапию, например, для пациентов с инфекционными заболеваниями, раком или аутоиммунными заболеваниями, или в целях обеспечения профилактической защиты для пациентов с ослабленным иммунитетом.
Молекулы можно непосредственно связывать с наночастицами при помощи адсорбции или при помощи прямого химического связывания, в том числе ковалентного связывания. См. Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996. Сама молекула может быть непосредственно активирована рядом химических функциональных групп, в том числе, нуклеофильными группами, уходящими группами или электрофильными группами. Активирующие функциональные группы включают в себя алкил- и ацилгалиды, амины, сульфгидрилы, альдегиды, ненасыщенные связи, гидразиды, изоцианаты, изотиоцианаты, кетоны и другие группы, которые, как известно, активируют химическое связывание. Альтернативно молекула может быть связана с наночастицей посредством использования низкомолекулярного связывающего реагента. Неограничивающие примеры связывающих реагентов включают в себя карбодиимиды, малеимиды, сложные эфиры н-гидросукцинимида, бисхлорэтиламины, бифункциональные альдегиды, такие как глутаральдегид, ангидриды и т.п. В других вариантах реализации изобретения молекула может быть связана с наночастицей при помощи аффинности связывания, такой как связывание или спаривание при помощи биотина и стрептавидина, как известно в данной области. Например, стрептавидин может быть связан с наночастицей путем ковалентного или нековалентного присоединения, и биотинилированная молекула может быть синтезирована при помощи способов, которые хорошо известны в данной области.
В случае, если предполагается ковалентное связывание с наночастицей, то подложку можно покрыть полимером, который содержит один или несколько химических фрагментов или функциональных группы, которые доступны для ковалентного присоединения с подходящим реагентом, обычно при помощи линкера. Например, аминокислотные полимеры могут иметь группы, такие как ε-аминогруппа лизина, доступная для ковалентного связывания молекулы при помощи подходящих линкеров. Данное раскрытие также предусматривает размещение второй оболочки на наночастицу для получения этих функциональных групп.
Можно использовать активирующие химические структуры для обеспечения специфического стабильного присоединения молекул к поверхности наночастиц. Существует множество способов, которые используются для присоединения белков к функциональным группам. Например, обычный кросс-линкер глутаральдегид используется для присоединения аминогрупп к аминированной поверхности наночастицы в двустадийном процессе. Полученная в результате связь является гидролитически стабильной. Другие способы включают использование кросс-линкеров, содержащих сложные эфиры н-гидроксисукцинимида (NHS), которые реагируют с аминами на белках, кросс-линкеров, содержащих активные галогены, которые реагируют с амино-, сульфгидрил- или гистидинсодержащими белками, кросс-линкеры, содержащие эпоксиды, которые реагируют с аминами или сульфгидрильными группами, конъюгацию между малеимидными группами и сульфгидрильными группами и образование белковых альдегидных групп при помощи окисления периодатом боковых фрагментов сахаров с последующим восстановительным аминированием.
В некоторых вариантах реализации изобретения лиганды на основе сигнала 1 и/или сигнала 2 химически конъюгируют с частицами при помощи свободного цистеина, сконструированного в Fc-участке иммуноглобулиновых последовательностей.
Соотношение определенных лигандов при одновременном использовании на одних и тех же или разных частицах можно варьировать в целях повышения эффективности частицы при презентации антигенов или костимулирующих пептидов. Например, наночастицы могут быть связаны с HLA-A2-Ig и анти-CD28 (или другими лигандами на основе сигнала 2) при множестве соотношений, таких как приблизительно 30:1, приблизительно 25:1, приблизительно 20:1, приблизительно 15:1, приблизительно 10:1, приблизительно 5:1, приблизительно 3:1, приблизительно 2:1, приблизительно 1:1, приблизительно 0,5:1, приблизительно 0,3:1; приблизительно 0,2:1, приблизительно 0,1:1 или приблизительно 0,03:1. В некоторых вариантах реализации соотношение составляет от 2:1 до 1:2. Общее содержание белка, связанного с подложками может составлять, например, приблизительно 250 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл или приблизительно 50 мг/мл частиц. Поскольку эффекторные функции, такие как высвобождение цитокинов и рост, могут характеризоваться другими требованиями в случае сигнала 1 в зависимости от сигнала 2, чем активация и дифференциация T-клеток, то эти функции можно определить отдельно.
Конфигурация наночастиц может варьировать от неправильной формы до сферической и/или от неровной или искривленной поверхности до гладкой поверхности. Несферические иАПК описаны в международной заявке № 2013/086500, которая включена посредством ссылки во всей своей полноте.
В определенных вариантах реализации изобретения иАПК представляют собой парамагнитные частицы в диапазоне от 50 до 100 нм (например, примерно 85 нм) с PDI (распределением размеров) менее чем 0,2 или в некоторых вариантах реализации изобретения - менее чем 0,1. иАПК могут иметь поверхностный заряд от 0 до -10 мВ, например, от приблизительно -2 до -6 мВ. иАПК могут иметь от 10 до 120 лигандов на частицу, например, от приблизительно 25 до приблизительно 100 лигандов на частицу, при этом лиганды конъюгированы с частицей при помощи свободного цистеина, введенного в Fc-участке иммуноглобулиновых последовательностей. Частицы могут содержать димер HLA:анти-CD28 в соотношении приблизительно 1:1, который может присутствовать на одних и тех же или разных популяциях частиц. Наночастицы обеспечивают эффективную экспансию когнатных T-клеток, при этом не оказывают стимуляции на некогнатные TCR, даже в случае пассивной нагрузки пептидного антигена. Частицы являются стабильными в лиофилизированной форме в течение по меньшей мере двух или трех лет.
иАПК презентируют антиген T-клеткам и, таким образом, могут использоваться как для обогащения, так и для экспансии антигенспецифических T-клеток, в том числе из наивных T-клеток. Пептидные антигены будут выбраны на основании требуемой терапии, например, рака, типа рака, инфекционного заболевания и т.п. В некоторых вариантах реализации изобретения осуществляют способ лечения пациента, больного раком, и неоантигены, специфические для пациента, идентифицируют и синтезируют для нагрузки на иАПК. В некоторых вариантах реализации изобретения в процессе генетического анализа опухоли идентифицируют от трех до десяти неоантигенов (например, секвенирования нуклеиновой кислоты) с последующим прогностическим биоинформационным анализом. Как показано в данном документе, несколько антигенов можно использовать совместно (на отдельных иАПК) без потери функциональных свойств способа. В некоторых вариантах реализации изобретения антиген представляют собой природные, немутировавшие раковые антигены, многие из которых являются известными. Данный способ идентификации антигенов на персонализированной основе более подробно описан ниже.
Ряд антигенов можно связать с антигенпрезентирующими комплексами. Природа антигенов зависит от типа антигенпрезентирующего комплекса, который используется. Например, пептидные антигены можно связывать с пептидсвязывающими щелями ГКГС I класса и II класса. Неклассические ГКГС-подобные молекулы можно использовать для презентации непептидных антигенов, таких как фосфолипиды, сложные углеводы и т.п. (например, компоненты мембраны бактерий, такие как миколовая кислота и липоарабиноманнан). Любой пептид, способный к индукции иммунного ответ, может быть связан с антигенпрезентирующим комплексом. Антигенные пептиды включают в себя опухоль-ассоциированные антигены, аутоантигены, аллогены и антигены инфекционных агентов.
«Опухоль-ассоциированные антигены» включают в себя уникальные опухолевые антигены, экспрессируемые исключительно опухолью, из которой они происходят, общие опухолевые антигены, экспрессируемые во многих опухолях, но не в нормальных тканях взрослых (онкофетальные антигены), и тканеспецифические антигены, экспрессируемые нормальной тканью, из которой опухоль произошла. Опухоль-ассоциированные антигены могут представлять собой, например, эмбриональные антигены, антигены с нарушенными посттрансляционными модификациями, дифференцировочные антигены, продукты мутировавших онкогенов или супрессоров опухолевого роста, слитые белки или онковирусные белки.
Ряд опухоль-ассоцииированных антигенов известен в данной области и многих из них имеются в продаже. Онкофетальные и эмбриональные антигены включают в себя карциноэмбриональный антиген и альфа-фетопротеин (обычно высокоэкспрессируемый только в развивающихся эмбрионах, но часто высокоэкспрессируемый опухолями печени и толстой кишки соответственно), MAGE-1 и MAGE-3 (экспрессируемые при мелономе, раке молочной железы и глиоме), плацентарная щелочная фосфатаза, сиалил-Lewis X (экспрессируемые при аденокарциноме), CA-125 и CA-19 (экспрессируемые при желудочно-кишечных, печеночных и гинекологических опухолях), TAG-72 (экспрессируемый при опухолях толстой кишки), эпителиальный гликопротеин 2 (экспрессируемый при многих карциномах), панкреатический онкофетальный антиген 5T4 (экспрессируемый при карциноме желудка), рецептор альфа-фетопротеина (экспрессируемый при многих типах опухолей, в частности, опухолях молочной железы) и M2A (экспрессируемый при новообразовании зародышевых клеток).
Опухоль-ассоциированные дифференцировочные антигены включают в себя тирозиназу (экспрессируемую при меланоме) и определенные поверхности иммуноглобулины (экспрессируемые при лимфомах).
Продукты мутировавших онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста включают в себя Ras и p53, оба из которых экспрессируются во многих типах опухолей, Her-2/neu (экспрессируемый при раке молочной железы и гинекологических видах рака), EGF-R, эстрогеновый рецептор, прогестероновый рецептор, продукт гена ретинобластомы, myc (ассоциированный с раком легкого), ras, p53, немутантный, ассоциированный с опухолями молочной железы, MAGE-1 и MAGE-3 (ассоциированные с меланомой, раком легкого и другими видами рака). Слитые белки включают в себя BCR-ABL, который экспрессируется при хроническом миелоидном лейкозе. Онковирусные белки включают в себя ВПЧ 16, E6 и E7 типа, которые встречаются при карциноме шейки матки.
Тканеспецифические антигены включают в себя меланотрансферрин и MUC1 (экспрессируемые при раке поджелудочной железы и раке молочной железы); CD10 (ранее известный как антигенный маркер острого лимфобластного лейкоза, или CALLA) или поверхностный иммуноглобулин (экспрессируемый при лейкозах и лимфомах B-клеток); α-цепь рецептора IL-2, T-клеточный рецептор, CD45R, CD4+/CD8+ (экспрессируемый при лейкозах и лимфомах T-клеток); простатический специфический антиген и простатическая кислая фосфатаза (экспрессируемые при карциноме предстательной железы); GP 100, MelanA/Mart-1, тирозин, gp75/brown, BAGE и S-100 (экспрессируемые при меланоме); цитокератины (экспрессируемые при различных карциномах); и CD19, CD20 и CD37 (экспрессируемые при лимфоме).
Опухоль-ассоциированые антигены также включают измененные гликолипидные и гликопротеиновые антигены, такие как гликосфинголипиды, содержащие нейраминовую кислоту (например, GM2 и GD2, экспрессируемые при меланомах и некоторых опухолях головного мозга); антигены групп крови, в частотности, T- и сиалированные Tn-антигены, которые могут аберрантно экспрессироваться при карциномах; и муцины, такие как CA-125 и CA-19-9 (экспрессируемые при карциномах яичника) или недоглюкозированный MUC-1 (экспрессируемый при карциномах молочной железы и поджелудочной железы).
Например, в некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак мочевого пузыря, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, MAGE-A10 и MUC-1. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак головного мозга, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, сурвивина и ЦМВ. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак молочной железы, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из MUC-1, сурвивина, WT-1, HER-2 и CEA. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак шейки матки, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена ВПЧ. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак толстой кишки, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, сурвивина, WT-1, MUC-1 и CEA. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак пищевода, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена NY-ESO-1. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак головы и шеи, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена ВПЧ. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак почки или печени, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена NY-ESO-1. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак легкого, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, сурвивина, WT-1, MAGE-A10 и MUC-1. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет меланому, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких из NY-ESO-1, сурвивина, MAGE-A10, MART-1 и GP-100. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак яичника, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, WT-1 или мезотелина. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет рак предстательной железы, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из сурвивина, hTERT, PSA, PAP и PSMA. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет саркому, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена NY-ESO-1. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет лимфому, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена ВЭБ. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет множественную миелому, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи одного или нескольких антигенов из NY-ESO-1, WT-1 или SOX2. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет лимфому, и T-клетки обогащают и экспансируют при помощи антигена ВЭБ.
В некоторых вариантах реализации изобретения пациент, подлежащий лечению, имеет острый миелогенный лейкоз или миелодиспластический синдром, и T-клетки обогащают и экспансируют одним или несколькими антигенами из (в том числе 1, 2, 3, 4 или 5 из) сурвивина, WT-1, PRAME, RHAMM и PR3.
«Антигены инфекционных агентов» включают в себя компоненты простейших, бактерий, грибов (как одноклеточных, так и многоклеточных), вирусов, прионов, внутриклеточных паразитов, гельминтов и других инфекционных агентов, которые могут вызывать иммунный ответ.
Бактериальные антигены включают в себя антигены грамположительных кокков, грамположительных бацилл, грамотрицательных бактерий, анаэробных бактерий, таких как организмы семейств Actinomycetaceae, Bacillaceae, Bartonellaceae, Bordetellae, Captophagaceae, Corynebacteriaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Micrococcaceae, Mycobacteriaceae, Nocardiaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Spirochaetaceae, Vibrionaceae и организмы родов Acinetobacter, Brucella, Campylobacter, Erysipelothrix, Ewingella, Francisella, Gardnerella, Helicobacter, Levinea, Listeria, Streptobacillus и Tropheryma.
Антигены инфекционных агентов, относящихся к простейшим, включают в себя антигены малярийных плазмодиев, видов Leishmania, видов Trypanosoma и видов Schistosoma.
Антигены грибов включают в себя антигены Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Paracoccicioides, Sporothrix, организмов порядка Mucorales, организмов, вызывающих хромомикоз и мицетому, и организмов родов Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton и Malassezia.
Вирусные пептидные антигены включают в себя, но не ограничиваясь этим, таковые аденовируса, вируса простого герпеса, вируса папилломы, респиратного-синцитального вируса, поксвирусов, ВИЧ, вирусов гриппа и ЦМВ. Особенно пригодные вирусные пептидные антигены включают в себя белки ВИЧ, такие как белки gag (в том числе, но не ограничиваясь этим, мембранный якорный (MA) белок, коровый капсидный (CA) белок и нуклеокапсидный (NC) белок), полимеразу ВИЧ, матриксный (M) белок вируса гриппа и нуклеокапсидный белок (NP) вируса гриппа, поверхностный антиген вируса гепатита B (HBsAg), коровый белок вируса гепатита B (HBcAg), белок гепатита e (HBeAg), ДНК-полимеразу вируса гепатита B, антигены вируса гепатита C и т.п.
Антигены, в том числе антигенные пептиды, могут связываться с антигенсвязывающей щелью антигенпрезентирующего комплекса, как активно, так и пассивно, как описано в патенте США № 6268411, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Необязательно антигенный пептид может ковалентно связываться с пептидсвязывающей щелью.
При необходимости можно использовать пептидную связь для связывания антигенного пептида с пептидсвязывающей щелью. Например, кристаллографические анализы молекул ГКГС I класса указывают на то, что аминоконец β2M расположен очень близко, на расстоянии примерно 20,5 ангстрем от карбоксиконца антигенного пептида, расположенного в пептидсвязывающей щели ГКГС. Таким образом, при помощи сравнительно короткой линкерной последовательности, составляющей примерно 13 аминокислоту в длину, можно связать пептид с аминоконцом β2M. В случае, если последовательность является подходящей, то этот пептид будет связываться со связывающей бороздой ГКГС (см. патент США № 6268411).
Антигенспецифические Т-клетки, которые связываются с иАПК, можно отделить от клеток, которые не связываются, при помощи магнитного обогащения или другой методики сортировки или захвата клеток. Другие способы, которые можно использовать для этой цели, включают в себя проточную цитометрию и другие хроматографические средства (например, включающие иммобилизацию антигенпрезентирующего комплекса или другого лиганда, описанного в данном документе). В одном варианте реализации изобретения антигенспецифические T-клетки выделяют (или обогащают) при помощи инкубации с гранулами, например, парамагнтитными гранулами, конъюгированными с антигенпрезентирующим комплексом/анти-CD28 (например, DYNABEADS), в течение периода времени, достаточного для позитивной селекции требуемых антигенспецифичесих T-клеток.
В некоторых вариантах реализации изобретения популяцию T-клеток можно достаточно истощить от ранее активных T-клеток при помощи, например, антитела к CD44, покидающего популяцию, обогащенную наивными T-клетками. Связывание нано-иАПК с этой популяцией не достаточно активировало бы наивные T-клетки, однако способствовало бы их очистке.
В еще одних вариантах реализации изобретения лиганды, которые целенаправленно воздействуют на NK-клетки, NKT-клетки или B-клетки (или другие иммунные эффекторные клетки), можно включить в парамагнитную наночастицу и использовать для магнитного обогащения этих клеточных популяций, необязательно при помощи экспансии в культуре, описанной ниже. Дополнительные иммунные эффекторные клеточные лиганды описаны в патенте США № 2014/25889, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Не ограничиваясь теорией, удаление нежелательных клеток может снижать конкуренцию за цитокины и сигналы роста, приводить к удалению супрессорных клеток или может просто обеспечивать физическое пространство для экспансии клеток, представляющих интерес.
Обогащенные T-клетки затем экспансируют в культуре, необязательно вблизи магнита, в течение периода времени в целях получения магнитного поля, которое усиливает кластеризацию T-клеточных рецепторов связанных с иАПК клеток. Культуры можно стимулировать в течение различных периодов времени, например, от приблизительно 5 минут до приблизительно 72 часов (например, приблизительно 0,5, 2, 6, 12, 36, 48 или 72 часов, а также при непрерывной стимуляции) при помощи нано-иАПК. Можно определить эффект стимуляции в культурах высокообогащенных антигенспецифических T-клеток. Антигенспецифические T-клетки можно помещать обратно в культуру и анализировать на предмет клеточного роста, скорости пролиферации, различных эффекторных функций и т.п., как хорошо известно в данной области. Такие условия могут варьировать в зависимости от требуемого антигенспецифического T-клеточного ответа. В некоторых вариантах реализации изобретения T-клетки экспансируют в культуре от приблизительно 2 дней до приблизительно 3 недель, или в некоторых вариантах реализации изобретения - от приблизительно 5 дней до приблизительно 2 недель, или от приблизительно 5 дней до приблизительно 10 дней. В некоторых вариантах реализации изобретения T-клетки экспансируют в культуре в течение приблизительно 1 недели, после этого времени необязательно выполняют вторую стадию обогащения и экспансии. В некоторых вариантах реализации изобретения выполняют 2, 3, 4 или 5 циклов обогащения и экспансии.
6
7
8
9
После одного или нескольких циклов обогащения и экспансии (например, приблизительно 7 дней) антигенспецифический T-клеточный компонент образца будет составлять по меньшей мере приблизительно 1% от T-клеток, или в некоторых вариантах реализации изобретения - по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, или по меньшей мере приблизительно 20%, или по меньшей мере приблизительно 25% от T-клеток в культуре. Кроме того, эти T-клетки, как правило, характеризуются активированным состоянием. Из исходного образца, выделенного от пациента, антигенспецифические T-клетки в различных вариантах реализации изобретения экспансируют (в течение приблизительно 7 дней) от приблизительно 100 раз до приблизительно 10000 раз, например, по меньшей мере приблизительно в 100 раз или по меньшей мере приблизительно в 200 раз. Через 2 недели антигенспецифические T-клетки экспансируют в различных вариантах реализации изобретения по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере приблизительно в 2000 раз, по меньшей мере приблизительно в 3000 раз, по меньшей мере приблизительно в 4000 раз или по меньшей мере приблизительно в 5000 раз. В некоторых вариантах реализации изобретения через две недели антигенспецифические T-клетки экспансируют более чем в 5000 раз или более чем в 10000 раз. После одного или нескольких циклов обогащения и экспансии (одна или две недели) получают по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 10, или по меньшей мере приблизительно 10 антигенспецифических T-клеток.
Влияние нано-иАПК на экспансию, активацию и дифференцировку T-клеток-предшественников можно определить в любом количестве способов, известных специалистам в данной области. Быстрое определение функции можно достичь при помощи анализа пролиферации, при определении увеличения числа CTL, хелперных T-клеток или регуляторных T-клеток в культуре при помощи маркеров детекции, специфических по отношению к каждому типу T-клетки. Такие маркеры известны в данной области. CTL можно детектировать при помощи определения продукции цитокинов или цитолитической активности при помощи анализов высвобождения хрома.
Помимо генерации антигенспецифических T-клеток с соответствующими эффекторными функциями, другим параметром эффективности антигенспецифических T-клеток является экспрессия «хоуминг»-рецепторов, которые обеспечивают миграцию T-клеток к поврежденным участкам (Sallusto et al., Nature 401, 708-12, 1999; Lanzavecchia & Sallusto, Science 290, 92-97, 2000).
Например, эффективность эффекторных CTL была связана со следующими фенотипами «хоуминг»-рецепторов, CD62L+, CD45RO+ и CCR7-. Таким образом, индуцированная нано-иАПК и/или экспансированная популяция CTL может быть охарактеризована на предмет экспрессии этих «хоуминг»-рецепторов. Экспрессия «хоуминг»-рецепторов является сложной характеристикой, связанной с исходными условиями стимуляции. Предположительно, она контролируется как костимулирующими комплексами, так и цитокиновым окружением. Одним важным цитокином, который участвовал в этом, является IL-12 (Salio et al., 2001). Как обсуждается ниже, нано-иАПК предлагают возможности для варьирования индивидуально отделенных компонентов (например, эффекторных молекул T-клеток и антигенпрезентирующих комплексов) в целях оптимизации параметров биологического исхода. Необязательно цитокины, такие как IL-12, могут быть включены в исходные индукционные культуры в целях воздействия на профили «хоуминг»-рецепторов в популяции антиген-специфических T-клеток.
Необязательно клеточную популяцию, содержащую антигенспецифические T-клетки, можно продолжать инкубировать либо с одной и той же нано-иАПК, либо со второй нано-иАПК, в течение периода времени, достаточного для образования второй клеточной популяции, содержащей повышенное количество антигенспецифических T-клеток по отношению к количеству антигенспецифических T-клеток в первой клеточной популяции. Обычно такие инкубации проводят в течение 3-21 дней, предпочтительно 7-10 дней.
Подходящие условия инкубации (среда для культивирования, температура и т.д.) включают в себя таковые, используемые для культивирования T-клеток или T-клеток-предшественников, а также таковые, известные в данной области для индуцирования образования антигенспецифических T-клеток при помощи DC или искусственных антигенпрезентирующих клеток. См., например, Latouche & Sadelain, Nature Biotechnol.18, 405-09, April 2000; Levine et al., J. Immunol.159, 5921-30, 1997; Maus et al., Nature Biotechnol. 20, 143-48, February 2002. См. также конкретные примеры ниже.
В целях определения величины пролиферативного сигнала популяции антигенспецифических T-клеток можно метить CFSE и анализировать на предмет скорости и числа клеточных делений. T-клетки можно метить CFSE через один-два цикла стимуляции нано-иАПК, с которыми антиген связан. В этот момент времени антигенспецифические T-клетки должны представлять 2-10% от всей клеточной популяции. Антигенспецифические T-клетки можно детектировать при помощи антигенспецифического окрашивания таким образом, что частоту и число делений антигенспецифических T-клеток можно отслеживать по потере CFSE. В различные момент времени (например, через 12, 24, 36, 48 и 72 часа) после стимуляции клетки можно анализировать как на предмет окрашивания антигенпрезентирующего комплекса, так и на предмет CFSE. Стимуляцию нано-иАПК, с которыми антиген не был связан, можно использовать для определения исходных уровней пролиферации. Необязательно пролиферацию можно детектировать при помощи контроля включения 3H-тимидина, как известно в данной области.
Антигенспецифические T-клетки, полученные при помощи нано-иАПК, можно вводить пациентам при помощи подходящих способов, в том числе внутривенного введения, внутриартериального введения, подкожного введения, интрадермального введения, внутрилимфатического введения и интратуморального введения. Пациенты включают в себя как пациентов-людей, так и пациентов ветеринарного назначения.
Антигенспецифические регуляторные T-клетки можно использовать для достижения иммуносупрессорного эффекта, например, для лечения или предупреждения реакции «трансплантат против хозяина» у пациентов после трансплантации, или для лечения или предупреждения аутоимунных заболеваний, таких как таковые, перечисленные выше, или аллергический реакций. Применения регуляторных T-клеток раскрыты, например, в патентах США №№ 2003/0049696, 2002/0090724, 2002/0090357, 2002/0034500 и 2003/0064067, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
6
8
9
9
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
6
6
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
11
12
Антигенспецифические T-клетки, полученные в соответствии с этими способами, можно вводить пациентам в дозах, варьирующих от приблизительно 5-10×10 CTL/кг массы тела (~7 x10 CTL/лечение) до приблизительно 3,3×10CTL/кг массы тела (~6×10 CTL/лечение) (Walter et al., New England Journal of Medicine 333, 1038-44, 1995; Yee et al., J Exp Med 192, 1637-44, 2000). В других вариантах реализации изобретения пациенты могут получать приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10 или приблизительно 10клеток на дозу, вводимую внутривенно. В еще одних вариантах реализации изобретения пациенты могут получать внутриузловые инъекции, например, приблизительно из 8×10или приблизительно из 12×10 клеток в 200 мкл болюсе. Дозы нано-АПК, которые необязательно вводят с клетками, включают по меньшей мере приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10, приблизительно 10, приблизительно 5×10 или приблизительно 10 нано-иАПК на дозу.
В иллюстративном варианте реализации процесс обогащения и экспансию выполняют повторно на одном и том же образце, взятом от пациента. Популяцию T-клеток обогащают и активируют на 0-й день с последующим подходящим периодом времени (например, приблизительно 3-20 дней) культивирования. Затем нано-иАПК можно использовать для повторного обогащения и экспансировании по отношению к антигену, представляющему интерес, дополнительно повышая популяционную частоту и обеспечивая дополнительный стимул для дальнейшей экспансии T-клеток. Смесь нано-иАПК и обогащенных T-клеток затем можно повторно культивировать in vitro в течение подходящего периода времени или незамедлительно реинфузировать пациенту для дополнительной экспансии и терапевтического эффекта in vivo. Обогащение и экспансию можно повторять любое количество раз до достижения требуемой экспансии.
В некоторых вариантах реализации изобретения коктейль из нано-иАПК, каждая из которых направлена против различного антигена, можно использовать сразу для обогащения и экспансии антигенспецифических T-клеток против нескольких антигенов одновременно. В этом варианте реализации изобретения ряд различных серий нано-иАПК, каждая из которых несет различный пептид ГКГС, будут комбинировать и использовать для одновременного обогащения T-клеток против каждого из антигенов, представляющих интерес. Полученный в результате пул T-клеток будет обогащен и активирован против каждого из этих антигенов и ответы против нескольких антигенов могут быть получены таким образом одновременно. Эти антигены могут быть связаны с одним терапевтическим мероприятием; например, несколько антигенов присутствует на одной опухоли.
В некоторых вариантах реализации изобретения пациент получает иммунотерапию на основе одного или нескольких ингибиторов контрольных точек, перед получением антигенспецифических T-клеток при помощи адаптивного переноса, или перед непосредственным введением аАПК, несущих неоантигены, идентифицированные in vitro в процессе генетического анализа опухоли пациента. В различных вариантах реализации изобретения ингибитор(ингибиторы) контрольных точек направлен(направлены) на одно или несколько из CTLA-4 или PD-1/PD-L1, которые могут включать в себя антитела против таких мишеней, такие как моноклональные антитела или их участки, или их гуманизированные или полностью человеческие варианты. В некоторых вариантах реализации терапия на основе ингибиторов контрольных точек включает ипилимумаб или Кейтруду (пембролизумаб).
В некоторых вариантах реализации пациент получает от приблизительно 1 до 5 циклов адаптивной иммунотерапии (например, один, два, три, четыре или пять циклов). В некоторых вариантах реализации изобретения каждое назначение адаптивной иммунотерапии проводят одновременно с циклом или после цикла (например, через от приблизительно 1 дня до приблизительно 1 недели) терапии на основе ингибиторов контрольных точек. В некоторых вариантах реализации изобретения адаптивная терапия предусмотрена через приблизительно 1 день, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 4 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней или приблизительно 1 неделю после введения дозы ингибитора контрольных точек.
В еще одних вариантах реализации изобретения адаптивный перенос или непосредственная инфузия нано-иАПК пациенту включает, в случае, если лиганд находится на грануле, лиганд, который целенаправленно воздействует на одно или несколько из CTLA-4 или PD-1/PD-L1. В этих вариантах реализации изобретения в результате осуществления способа можно избежать определенных побочных эффектов введения растворимого препарата на основе ингибитора контрольных точек.
В некоторых аспектах в данном изобретении предложены способы персонализированной иммунотерапии рака. Способы сопровождаются использованием иАПК в целях идентификации антигенов, на которые пациент будет реагировать, с последующим введением нагруженной соответствующим пептидом иАПК или с последующим обогащением и экспансией антигенспецифических T-клеток ex vivo.
Полногеномное секвенирование значительно изменило наше понимание биологии рака. Секвенирование видов рака привело к получению важных данных касательно молекулярных процессов, связанных с развитием многих видов рака человека. Были идентифицированы драйверные мутации в основных генах, участвующих в путях, регулирующих три основных клеточных процесса: (1) предопределение клеток, (2) выживание клеток и (3) поддержание генома. Vogelstein et al., Science 339, 1546-58 (2013).
Полногеномное секвенирование также имеет перспективу полностью изменить наш подход к иммунотерапии рака. Данные секвенирования могут предоставить информацию как об общих, так и о персонализированных мишенях для иммунотерапии рака. В принципе мутантные белки являются чужеродными для иммунной системы и предположительными опухоль-специфическими антигенами. Действительно усилия в области секвенирования привели к определению сотен, если не тысяч, потенциальных релевантных иммунных мишеней. Ограниченные исследования показали, что T-клеточные рецепторы против этих неоэпитопов можно обнаружить у пациентов, больных раком, или индуцировать противоопухолевыми вакцинами. Однако частота таких ответов против определенного вида рака и степень, до которой такие ответы являются общими среди пациентов, недостаточно известны. Одна из основных причин нашего ограниченного понимания опухоль-специфических иммунных ответов заключается в том, что современные подходы для валидации потенциальных иммунологически релевантных мишеней являются трудоемкими и занимают много времени.
Таким образом, в некоторых аспектах в данном изобретении предложен подход на основе платформы с высокой пропускной способностью для детекции T-клеточных ответов против неоантигенов при раке. В этом подходе используется платформа на основе иАПК, описанных в данном документе, для детекции T-клеточных ответов против раковых антигенов даже при низкой частоте. Понимание частоты и межиндивидуального различия таких ответов имело бы важное значение для разработки противоопухолевых вакцин и пеорсонализированной иммунотерапии рака.
Несмотря на то, что центральная толерантность подавляет T-клеточные ответы против собственных белков, онкогенные мутации индуцируют неоэпитопы, против которых могут формироваться Т-клеточные ответы. Каталоги мутаций, полученных в результате полноэкзомного секвенирования дают исходную точку для идентификации таких неоэпитопов. При помощи алгоритмов прогноза связывания HLA (Srivastava, PLoS One 4, e6094 (2009), было предсказано, что каждый вид рака может характеризоваться 7-10 неоэпитопами. В аналогичном подходе оценивали сотни опухолевых неоэпитопов. Однако такие алгоритмы могут иметь низкую точность прогноза T-клеточных ответов, и ожидается, что лишь 10% прогнозируемых эпитопов, связывающихся с HLA, связываются в контексте HLA (Lundegaard C, Immunology 130, 309-18 (2010)). Таким образом, прогнозируемые эпитопы должны быть валидированы на наличие T-клеточных ответов против таких потенциальных неоэпитопов.
В определенных вариантах реализации изобретения используется система нано-аАПК для скрининга неоэпитопов, которые индуцируют T-клеточный ответ при множестве видов рака или при рака у конкретного пациента. Виды рака можно анализировать генетически, например, при помощи полноэкзомного секвенирования. Например, из панели из 24 аденокарцином на поздней стадии, в среднем идентифицировали приблизительно 50 мутаций на опухоль. Из примерно 20000 проанализированных генов в 1327 была по меньшей мере одна мутация и в 148 - две или более мутаций. Выявили 974 миссенс-мутации с небольшим дополнительным числом делеций и вставок.
Перечень пептидов-кандидатов можно генерировать из перекрывающихся девяти аминокислотных окон в мутировавших белках. Все девять аминокслотных окон, которые содержат мутировавную аминокислоту и 2 немутировавших «контроля» от каждого белка, будут подвергнуты селекции. Эти пептиды-кандидаты будут оцениваться численно на предмет связывания ГКГС при помощи алгоритмов консенсусного прогноза связывания ГКГС, в том числе Net ГКГС и способа стабилизированной матрицы (SMM). Алгоритмы связывания нано-иАПК и ГКГС были разработаны впервую очередь для аллеля HLA-A2. Предел чувствительности консенсусного прогноза можно подбирать до тех пор, пока не будет идентифицировано поддающееся обработке число пептидов, содержащих мутацию (~500), и немутировавших контрольных пептидов (~50).
Затем синтезируют библиотеку пептидов. иАПК, несущие ГКГС (например, A2), помещают в многолуночные планшеты и пассивно нагружают пептидом. CD8 T-клетки можно отделить от МКПК как A2-позитивных здоровых доноров, так и A2-позитивных пациентов, больных раком. Затем выделенные T-клетки инкубируют с нагруженными иАПК для стадии обогащения. После инкубации планшеты или культуральные флаконы помещают на магтиное поле и удаляют супернатант, содержащий нерелевантные T-клетки, не связанные с иАПК. Оставшиеся T-клетки, которые связаны с иАПК, будут культивировать и экспансировать в течение 7-21 дня. Антигенспецифическую экспансию определяют при помощи рестимуляции иАПК и внутриклеточного флуоресцентного окрашивания IFNγ.
В некоторых вариантах реализации изобретения T-клетки пациента подвергают скринингу по отношению к массиву или библиотеке нано-АПК, а результаты используют для диагностических или прогностических целей. Например, число и идентичность T-клеточных противоопухолевых ответов, сверхэкспрессирующие белки и/или другие опухоль-ассоцииированыне антигены можно использовать в качестве биомаркера в целях классификации риска. Например, число таких T-клеточных ответов может быть обратно пропорциональным риску прогрессирования заболевания или риску устойчивости или невосприимчивости к химиотерапии. В других вариантах реализации T-клетки пациента подвергают скринингу по отншению к массиву или библиотеке нано-АПК и наличие T-клеточных ответов или число или интенсивность этих T-клеточных ответов, определяет, что пациент имеет субклиническую опухоль и/или обеспечивает исходное понимание биологии опухоли.
В некоторых вариантах реализации Т-клетки пациента или субъекта подвергают скринингу в отношении массива или библиотеки парамагнтиных иАПК, каждая из которых презентирует другой кандадитный пептидный антиген. Этот скрининг может предоставить много информации касательно репертуара Т-клеток субъета или пациента, и результаты пригодны для диагностических и прогностических целей. Например, число и идентичность T-клеточных противоопухолевых ответов, сверхэкспрессирующие белки и/или другие опухоль-ассоцииированыне антигены можно использовать в качестве биомаркера в целях классификации риска, в целях контроля эффективности иммунотерапии или прогноза исхода иммунотерапевтического лечения. Кроме того, число или интенсивность таких T-клеточных ответов может быть обратно пропорциональным риску прогрессирования заболевания или может указывать на устойчивость или невосприимчивость к химиотерапии. В других вариантах реализации изобретения Т-клетки субъекта или пациента подвергают скринингу по отношении к массиву или библиотеке нано-иАПК, каждая из которых презентирует пептидный антиген-кандидат, и наличие T-клеточных ответов или число или интенсивность T-клеточных ответов обеспечивает информацию касательно состояния здоровья пациента, например, в результате идентификации аутоиммунного заболевания, или идентификации того, что у пациента имеется субклиническая опухоль. В этих вариантах реализации изобретения при помощи способа не только происходит идентификация состояния потенциального заболевания, но и обеспечивается исходное понимание биология заболевания.
В иллюстративном вариант реализации изобретения пациент имеет гематологический рак, такой как острый миелогенный лейкоз (AML) или миелодиспластический синдром, и в некоторых вариантах реализации изобретения пациент имеет рецидив после аллогенной транасплантации стволовых клеток. При помощи источника T-клеток от HLA-совместимого донора антигенспецифические T-клетки магнитно обогащали и активировали с применением магнитной колонки и парамагнитных нано-иАПК, презентирующих от 2 до 5 опухоль-ассоциированных пептидных антигена, выбранных из сурвивина, WT-1, PRAME, RHAMM и PR3. Антигены пассивно нагружают на полученные нано-иАПК, которые презентируют сигнал 1 и сигнал 2 на одних и тех же или разных популяциях частиц, посредством сайт-направленной конъюгации.
Магнитная активация может происходить в течение от 5 минут до 5 часов, или от 5 минут до 2 часов с последующей экспансией в культуре в течение по меньшей мере 5 дней и до 2 недель или в некоторых вариантах реализации изобретения до 3 недель. Полученные в результате CD8+ T-клетки можно фенотипически охарактеризовать для подтверждения: низкой экспрессии PD-1; фенотипа центральной памяти (CD3+, CD45RA-, CD62L+); и фенотипа эффекторной памяти (CD3+, CD45RA-, CD62L-). Экспансированные T-клетки можно вводить пациенту в количестве от 1 до приблизительно 4 введений для получения противоопухолевого ответа.
Другие аспекты и варианты реализации изобретения будут очевидны специалисту в данной области исходя из следующих иллюстративных примеров.
ПРИМЕРЫ
Искусственные антигенпрезентирующие клетки (иАПК) можно сконструировать на парамагнитных частицах, таких как наночастицы на основе оксида железа с декстрановой оболочкой, в целях активации антигенспецифических T-клеток. ФИГ.1. Наличие сигнала 1, совместно с сигналом 2, приводит к активации и экспансии T-клеток. При помощи парамагнитых частиц кластеризацию сигнала 1 и/или сигнала 2 можно индуцировать при помощи магнитного поля. ФИГ. 3 и ФИГ.6A.
При помощи контроля презентации костимулирующего сигнала (сигнал 2) на отдельных наночастицах можно контролировать и варьировать констимулирующий сигнал. ФИГ. 2. Наличие магнитного поля при использовании парамагнитных частиц усиливает пролиферацию T-клеток, и данный эффект зависит от количества сигнала 2, присутствующего на отдельных наночастицах без сигнала 1. ФИГ.4. Полученные в результате T-клетки, вне зависимости от того, присутствует ли сигнал 1 и 2 на одних и тех же или разных частицах, количественно представляют собой одно и тоже. ФИГ. 5.
Максимальную экспансию антигенспецифических T-клеток наблюдали в случае, когда как сигнал 1, так и сигнал 2 присутствовали на отдельных (парамагнитных или непарамагнитных) гранулах, при этом максимальную экспансию наблюдали в случае, когда обе частицы были парамагнитными. ФИГ. 6.
По мере увеличения размера частиц эффективность подхода на основе S1+S2 снижается. В отличие от этого, наночастицы, содержащие оба сигнала, характеризуются противоположным эффектом. Таким образом, при использовании отдельных наночастиц для сигнала 1 и сигнала 2 размер частиц предпочтительно выдерживают на уровне 200 нм или менее, например, 100 нм или 30 нм, что поддерживало высокие уровни экспансии. ФИГ. 7.
Типы костимуляции можно варьировать для подбора профиля активации в результате размещения каждого сигнала на отдельную гранулу. Например, гранулы с сигналом 2, содержащие 50/50 анти-CD28 и анти-CD27, а также гранулы с сигналом 2, содержащие 25/75 анти-CD28 и анти-41BB, поддерживали высокие уровни экспрессии. ФИГ. 8.
Магнитное обогащение и экспансия приводят к быстрой идентификации новых TCR с требуемой антигенной специфичностью. ФИГ. 9, ФИГ. 10. Обогащенные и экспансированные T-клетки можно сортировать на основании тетрамеров или димеров с генерацией популяции антигенспецифических клеток высокой чистоты для секвенирования TCR. Это является быстрым способом идентификации и генерации достаточного материала для достаточного секвенирования TCR в течение очень короткого времени.
Магнитное обогащение приводило к высоким частотам продуктивных клонотипов. ФИГ. 11, ФИГ. 12. Данные результаты хорошо согласуются с результатами Carreno et al. (ФИГ. 11A), в которых частоты были распределены более равномерно. Клоны можно оценивать на предмет частоты спаривания V и J (ФИГ. 13, ФИГ. 14).
Магнитное обогащение и экспансия способствуют скринингу популяций Т-клеток на предмет реактивности против антигенов-кандидатов, в том числе неоантигенов. Скрининг можно проводить серийным способом. ФИГ. 15. Например, функционально активные человеческие неоантигенспецифические CD-8+ T-клетки идентифицировали от здорового донора. Три неоэпитопа из рака молочной железы MCF-7 тестировали одновременно при помощи способа магнитного обогащения и экспансии. Таким образом, можно выявлять ответ поликлонональной популяции CD8 T-клеток против предполагаемых неоэпитопов из мутировавших антигенов. Поскольку эти популяции T-клеток обычно являются очень редкими, то часто их невозможно выявить при помощи стандартных методик, таких как тетрамерный анализ.
Последовательное обогащение делает этот процесс более эффективным. При помощи последовательного обогащения популяцию негативных клеток, полученную на стадии магнитного обогащения (которая содержит только несвязанные T-клетки, которые были негативными по отношению к требуемому антигену), затем инкубируют с новыми наночастицами, нагруженными другой совокупностью антигенных пептидов. Этот процесс можно повторять много раз (например, по меньшей мере 6 раз) с использованием наночастиц, нагруженных 10-15 различными пептидами, в каждом цикле. Это способствует зондированию одного образца в подходе О+Э как минимум на 90 различных антигенов.
7
На ФИГ. 16 изображено, что пассивная нагрузка пептида на наночастицы, характеризующаяся сайт-направленной конъюгацией ГКГС, обеспечивала повышенную экспансию через 1 неделю. CD8+ T-клетки выделяли из интактных селезенок мышей C57BL/6 и инкубировали с наночастицами (Kb:Ig-димер/aCD28), нагруженными пептидом Trp2 при концентрации 20 мкл частиц на 10 клеток в течение 1 часа при 4°C. Затем клетки, связанные с наночастицами, выделяли при помощи магнитной колонки и культивировали в 96-луночном планшете в течение 7 дней. На 7-й день клетки собирали, подсчитывали и окрашивали анти-CD8 антителом и Trp2/Kb-пентамером. В качестве контроля использовали Kb-пентамер с нерелевантными пептидами.
Разработка и конструкция наночастиц, в которых сигн. 1 и сигн. 2 ковалентно связаны сайт-направленным способом посредством введенного свободного цистеина на FC-конце молекулы, делает их очень стабильными с длительным сроком хранения. Это способствует получению больших ненагруженных серий, которые позже пассивно нагружают пептидами, представляющими интерес. Например, во время процесса нагрузки ненагруженные частицы инкубируют с избытком пептида при 4° C в течение как минимум 3 дней. После этого несвязанный избыток свободного пептида удаляют промыванием нагруженных наночастиц на магнитной колонке. Парамагнитные частицы будут задерживаться на колонке, а свободный пептид будет вымываться. После тщательного промывания (3-5 раз) магнит будут удалять, а частицы элюируют. Такой подход на основе пассивной нагрузки вносит в систему высокую антигенную гибкость, снижает затраты на производство и способствует применению группирующих подходов для генерации индивидуальных специфических по отношению к пациенту коктейлей с мультиантигенными частицами (5-10 антигенов), а также способствует высокопроизводительному скринингу в целях идентификации неоэпитопов (>50 эпитопов).
В настоящем исполнении используется соотношение примерно 1:1 для сигнала 1 и сигнала 2 (анти-CD28) и высокая плотность белка (80-200 лигандов) на частицу. Частицы находятся в диапазоне от 50 до 150 нм.