ШТАММ Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807-ПРОДУЦЕНТ ЭРЕМОМИЦИНА
STRAIN Amycolatopsis orientalis SUBSP EREMOMYCINI ALL-RUSSIAN COLLECTION OF INDUSTRIAL MICROORGANISMS Ac-807 EREMOMYCIN PRODUCENT

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма актиномицета, образующего антибактериальный антибиотик эремомицин.
Антибиотик эремомицин по химическому строению относится к полициклическим антибиотикам группы ванкомицина-ристомицина, которые являются антибиотиками резерва для лечения тяжелых инфекций.
Структура антибиотика эремомицина сульфат
Эремомицин эффективен при лечении заболеваний, вызываемых грамположительными возбудителями, включая метициллинрезистентные штаммы золотистого стафилококка (MRSA) и анаэроба Clostridium difficile - возбудителя псевдомембранного колита.
Известен штамм Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-S892 - продуцент антибиотика эремомицина /1/, принятый в качестве прототипа. Недостатком данного штамма является невысокий уровень биосинтетической активности - не более 1800 мг эремомицина на 1 л ферментационной жидкости.
60
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент эремомицина путем мутантного преобразования свойств известного штамма Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-S892 в результате последовательного трехступенчатого воздействия метилнитрозогуанидина, ультрафиолетовых и гамма-лучей Со на исходный штамм и отбора оригинального мутантного штамма с повышенной антибиотической активностью.
Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур под номером штамм ВКПМ-Ас-807.
Штамм Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас-807 обладает повышенной продуктивностью эремомицина (2300 мг в 1 л ферментационной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807
Температура 28°С; длительность выращивания и изучения таксономических признаков - (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенной на глюкозоаспарагиновом агаре или на среде №2 Гаузе. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица 1).
Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или извилистые, распадающиеся на элементы различной длины; поверхность спор гладкая.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С, желатину разжижает, молоко пептонизирует.Сахарозу инвертирует.Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на провокационной среде Треснера с лимонно-кислым железом.
Использование источников углерода. Хорошо утилизирует фруктозу, арабинозу, инозит; галактозу, манит, глюкозу; умеренно - лактозу, рамнозу, ксилозу; не утилизирует рафинозу.
Антагонистические свойства. Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini ВКПМ-Ас-807 при росте на агаровых средах умеренно угнетает рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subfilis. Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и не действует на грамотрицательные бактерии Escherichia coli, Comamonas terrigena, Providencia stuartii.
Хранение штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807
Хранится в виде культуры, лиофилизированной в сахарозожелатиновой среде, в апмулах при (5-7)°С.
Антибиотическая активность штамма Amucolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807
определяется в культуральной жидкости методом диффузии в агар (трехдозный вариант ГФХ, стр.949) с использованием в качестве тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633.
Штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807 поясняется следующим примером.
Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807, выращенной в течение (10-14) суток при 28°С на среде Линденбайна, засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) и выращивают при 28°С в течение (24-36) часов на качалке при (220-240) об/мин.
Состав посевной среды, %:
Глицерин
2,0
Соевая мука
0,5
Калий азотно-кислый
0,1
Натрий хлористый
0,3
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
7,0-7,2
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,6 атм при 120°С.
Выросшим мицелием в количестве (5-10)% засевают питательную среду (150 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава,%:
Глицерин
3,0
Соевая мука
0,5
Калий азотно-кислый
0,1
Натрий хлористый
0,3
Магний серно-кислый
0,01
Глицин
0,0025
Мел
0,2
Вода
Водопроводная
рН до стерилизации
6,8-7,0
Ферментацию проводят при 28°С в течение (120-144) часов на качалке при (220-240) об/мин. Эремомицин накапливается в культуральной жидкости продуцента. Антибиотическую активность определяют методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание эремомицина в культуральной жидкости штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807 к концу ферментации составляет 2300 мкг/мл.
С целью выделения эремомицина проводят его сорбцию из нативного раствора (отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме, элюируют раствором аммиака, элюат нейтрализуют, обеззоливают, пропускают через сорбент ПТФЭ, антибиотик с сорбента вытесняют водой, концентрируют в вакууме до содержания эремомицина (120-140) мг/мл и кристаллизуют в форме сульфата.
73
89
10
26
2
4
Эремомицина сульфат, полученный путем биосинтеза новым штаммом - продуцентом Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807, представляет собой белый кристаллический порошок, легко растворимый в воде и нерастворимый в органических растворителях. Показатели, характеризующие эремомицина сульфат (физико-химические свойства, антибактериальная активность и токсичность) полностью соответствует показателям, которые определены для эремомицина сульфата, защищенного патентом РФ №2110578 (брутто-формула: CHNC1O×HSO. Мол. масса 1656 а.е.м.
max
1 см
max
10,0
УФ-спектр: λ(0,01 н. HCl) нм (Е% ) 280 (42); λ(0,01 н. NaOH) нм (Е см) 300 (60);
max
2
-1
20
ИК-спектр (KBr), ν, см: 3350, 1650,1500, 1200-1000; [α]D=-100°(с 1,0, HO).
Выход целевого продукта - очищенного (97% чистоты) кристаллического препарата эремомицина сульфата от содержания в нативном растворе составляет (60,0-65,0)%.
Таким образом, создан новый мутантный штамм Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807, отличающийся от известного по характеру роста на диагностических агаровых средах, по степени усвоения источников углерода (инозит, галактоза) и по способности антибиотикообразования, которая на 78% превосходит активность штамма-прототипа Amycolatopsis orientalis ВКПМ-S892 (Таблица 2).
Антибиотическая активность нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807 составляет 2300 мкг/мл. Использование нового штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807 как продуцента для биосинтеза эремомицина позволяет увеличить выход целевого продукта. Выход эремомицина составляет 1,2 г с 1 литра нативного раствора.
Источники информации
Патент RU 2110578 С1 от 18.06.97
Таблица 1.
Культурально-морфологические признаки штамма Amycolatopsis orientalis ВКПМ-Ас-807
Агаровая среда
Рост воздушно го мицелия*
Цвет мицелия
Растворимый пигмент
Воздушного
Субстратного
№1 Гаузе
Нет
Белый (Д-1)
Бесцветный
Нет
Овсяная
+ -
Белый (Д-1)
Бесцветный
Нет
Чапека
Нет
Белый (Д-1)
Бесцветный
Желтоватый
Глюкозоаспарагиновая
+ -
От белого (Д-1) до желтоватого (Ж-1)
Желтый (Ж-6)
Желтоватый (Ж-6)
Линденбайна (глицерин-нитратная)
+ +
Белый (Д-1),
Бесцветный
Желтоватый (Ж-6)
Глюкозонитратная
Нет
Белый (Д-1)
Бесцветный
нет
№2 Гаузе
+ -
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом)
Меланоидные пигменты отсутствуют
*/++- умеренный; +- слабый.