Образование биопленок симбионтными представителями микробиоты кишечника как форма существования бактерий

УДК 616-022.7

Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2013. Вып. 1

О. В. Рыбальченко, В. М. Бондаренко ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК

СИМБИОНТНЫМИ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМИ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА КАК ФОРМА СУЩЕСТВОВАНИЯ БАКТЕРИЙ*

Микробиота или нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) — один из наиболее многочисленных микробиоценозов, представленных разнообразными анаэробными и аэробными грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами, наибольшее количество которых обнаруживается в толстой кишке человека. Для обозначения всего генетического материала, содержащегося в микробиоте человека, принят термин «микробиом». В последние годы появились и другие словосочетания, такие как «метагеном», включающий в себя гены человека и гены его триллионов микроорганизмов, «протеом» и «метаболом», отражающих совокупность белков и метаболитов микробиоты соответственно [1]. Число генов в микробиоме на три порядка выше, чем генов организма человека, что послужило основанием рассматривать совокупность всех микроорганизмов в качестве «суперорганизма» [2; 3]. Позитивная роль микробиоты состоит в обеспечении колонизационной резистентности ЖКТ, являющейся слагаемым антагонистической активности нормофлоры и защитных иммунных факторов, а также иммуномодулирующим, антимутагенном и антиканцерогенном действии, участии в метаболических процессах, регуляции роста эпителиоцитов, защите слизистой оболочки от повреждений и регуляции местной толерантности [4-6].

Известно, что симбионтные микроорганизмы, колонизирующие пристеночную зону слизистых оболочек ЖКТ, организованы в сообщества, получившие название биопленок. Под бактериальной биопленкой подразумевают микробное сообщество, в котором адсорбированные на поверхности и друг к другу клетки заключены в матрицу внеклеточных полимерных субстанций, продуцируемых микроорганизмами в соответствии с уровнем развития популяции и условиями транскрипции генов [7]. Формирование бактериальной биопленки способствует выживанию микроорганизмов в определенном биотопе организма хозяина и зависит от активности регуляторной системы бактерий, обозначенной как QS-система (Quorum Sensing — чувство кворума) [8].

Показано, что нормальная микрофлора ЖКТ распределена в пристеночном му-козном слое слизистой оболочки, представляющем собой относительно прочный гель, состоящий из муцина, продуцируемого бокаловидными клетками эпителия слизистых оболочек, близкого по химической природе полисахаридным капсулам, которыми окружают себя многие бактерии. Такая среда пригодна для существования микроорганизмов в тонких слоях муциновой слизи в виде равномерно распределенных клеток на достаточно близком расстоянии друг от друга, что обеспечивает контакт для

Рыбальченко Оксана Владимировна — д-р биол. наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет; e-mail: ovr@inbox.ru

Бондаренко Виктор Михайлович — д-р мед. наук, профессор, НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи; e-mail: ovr@inbox.ru

* Работа поддержана грантом СПбГУ № 0.37.123.2011. © О. В. Рыбальченко, В. М. Бондаренко, 2013

быстрого обмена продуктами метаболизма. Через стенку кишечника и вдоль нее ежесуточно проходит около 10 л жидкости, включая слюну, желудочный сок с пищевым химусом, желчные и печеночные секреты и прочее. В противоположном всасыванию направлении движется муцин, содержащий микробную биопленку. С одной стороны, в биопленке, по сравнению с планктонными бактериальными клетками, максимально активизируются биохимические процессы, и именно в мукозном слое, облегающем слизистую оболочку кишечника, происходит усвоение необходимых питательных веществ эпителиоцитами стенки кишечника и синтез микроорганизмами ряда ферментов, витаминов, антибиотикоподобных веществ и иммуномодуляторов. С другой стороны, формирование биопленки патогенными и условно патогенными бактериями имеет значение для сохранения и длительного существования инфекционного очага, поскольку микроорганизмы в биопленке более устойчивы к действию этиотропных препаратов, клеточных и гуморальных защитных факторов. В связи с указанным, в первом случае важна стимуляция, а во втором, наоборот, подавление образования бактериальных биопленок [9; 10].

Материалы и методы. Объектами исследований стали бактериоциногенные штаммы: Lactobacillus plantarum 8PA-3 и Lactobacillus fermentum 97. В качестве клеток-мишеней использованы бактерии Escherichia coli М-17, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus АТСС 25923, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Klebsiella pneumoniae АТСС 13883, Proteus mirabilis АТСС 29906, Citrobacter freundii АТСС 8090 и Staphylococcus epidermidis 193, несущий ген ica (intercellular adhesin), выявленный с помощью ПЦР. В исследованиях использовали также клинические изоляты энтеротоксигенных штаммов: Staphylococcus aureus, продуцирующие энтеротоксин типа A; Citrobacter freundii, Enterobacter cloaceae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, вырабатывающие термолабильный или термостабильный энтеротоксины, контролируемые генами elt или est, выявляемые в ПЦР [11; 12]. Антагонистическую активность лактобацилл определяли с помощью метода отсроченного антагонизма на специальных агаризованных средах на основе MRS [13; 14].

Электронно-микроскопические исследования. Особенности подготовки образцов для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) описаны нами ранее [11; 13]. Пробы отбирали из зон близкого контакта исследуемых микроорганизмов. Участки бактериального роста, вырезанные вместе с агаром, предварительно фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на буфере Хенкса (pH 7,2), при температуре 4°C, наливая фиксатор в основание агаровой пластинки, чтобы не повредить поверхностные структуры микробных сообществ и не нарушить их целостность. Через 24 ч на поверхность фиксированных образцов наносили несколько капель 0,5-процентного раствора агарозы, расплавленной на водяной бане и охлажденной до 30°С. Заключенные в агарозный гель пробы промывали дистиллированной водой и подвергали вторичной фиксации в 1-процентном водном растворе ОsО4 в течение суток при температуре 4°C, полностью помещая их в раствор фиксатора. Далее проводили трехкратную отмывку от фиксатора, помещая образцы в буфер на 2 ч. Для обезвоживания образцы целиком погружали в растворы спиртов возрастающей концентрации по стандартной методике и заключали в смолу Spurr. Для устранения ошибок из заливочных блоков делали заготовки в виде пирамидок на пирамитоме (Pyramitome 11800, LKB, Швеция), что обеспечивало возможность правильно ориентировать исследуемый объект и оценивать местоположение зон бактериального роста относительно друг друга при дальнейшем

изготовлении ультратонких срезов. Окраску ультратонких срезов, полученных из зон бактериального роста культур, проводили общепринятым методом. Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM 100C (JEOL, Япония).

Результаты и обсуждение. Формирование биопленок индигенной микрофлорой. Нами проведено электронно-микроскопическое исследование биопленок, образуемых при росте микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред. Электро-нограммы бактериальных биопленок однородных микробных сообществ различных представителей микробиоты представлены на рисунках, отражающих фрагменты колоний лактобацилл (рис. 1 и 2), бифидобактерий (рис. 3), эшерихий (рис. 4), стафилококков (рис. 5), хеликобактеров (рис. 6) и энтерококков (рис. 7) соответственно.

Рис. 1. Поверхность бактериальной биопленки Lactobacillus acidophilus. СЭМ. Ув. 2000.

Рис. 2. Ультратонкий срез фрагмента биопленки Lactobacillus acidophilus.

Клетки заключены в межклеточный матрикс и покрыты поверхностной пленкой. ТЭМ. Ув. 40 000.

Рис. 3. Ультратонкий срез фрагмента биопленки.

Клетки Bifidobacterium bifidum1 окружены по-лисахаридным матриксом. ТЭМ. Ув. 40 000.

Рис. 4. Ультратонкий срез фрагмента биопленки Escherichia coli M-17.

Мембранные везикулы на поверхности клеток. ТЭМ. Ув. 50000.

Рис. 5. Ультратонкий срез фрагмента биопленки Staphylococcus aureus.

Клетки покрыты поверхностной пленкой. ТЭМ. Ув. 40 000.

Рис. 6. Поверхность бактериальной биопленки Helicobacter pylori. СЭМ. Ув. 3500.

Рис. 7. Ультратонкий срез фрагмента биопленки ЕШетососсш faecalis.

Межклеточный матрикс. ТЭМ. Ув. 50 000.

При анализе полученных нами электронограмм выявлена сложная ультраструктурная организация микробных сообществ, включенных в матрикс и экранированных компонентами комплексных защитных структур биопленки [6]. Микробные биопленки со стороны воздуха оказались защищенными комплексом поверхностных структур, объединяющих все клетки в единую систему и обеспечивающих контакт с внешней средой. Структура, находящаяся с наружной стороны биопленки, представлена в виде поверхностной пленки-мантии, одновременно выполняющей защитную и объединяющую микробное сообщество функцию. Основным элементом поверхностной пленки-мантии стала трехслойная мембрана, ультратонкое строение которой соответствует универсальной цитоплазматической мембране, содержащей дополнительные структуры в виде аморфных полисахаридных слоев, образующихся с внутренней или с внешней, а в некоторых случаях и с обеих сторон одновременно. Полагают, что эти же структуры обеспечивают контакт с внешней средой как отдельных клеток, так и всего бактериального сообщества в целом.

Как указано выше, микробные сообщества представляют собой социальные системы, характеризующиеся определенной кооперацией и функциональной специализацией, регулируемой QS-системой. Глобальная регуляция обеспечивает как формирование биопленки, так и усиление бактериальной адгезии, начало синтеза фак-

торов, ассоциированных с антагонистической активностью для представителей индигенной и проявлением патогенности для условно патогенной микрофлоры [8-10].

Стимулировать образование биопленок на поверхности твердых субстратов могут, помимо адгезинов, мукоидные капсулы и поверхностные полисахариды бактериальных клеточных стенок. После колонизации бактерии начинают активно выделять экзополисахариды, которые, заполняя межклеточное пространство, обеспечивают формирование биопленки. Коммуникативные связи в этом случае регулируются посредством выделяющихся в окружающую среду специальных веществ — ауторегулято-ров с установленной химической структурой. Такими агентами у грамотрицательных бактерий выступают ацилированные лактоны гомосерина, а у грамположительных бактерий — пептиды и некоторые короткоцепочечные жирные кислоты. Указанные агенты выполняют функцию сигнальных молекул, регулирующих многие важные процессы жизнедеятельности микроорганизмов, в том числе экспрессию факторов антагонистической активности [3; 8; 15].

Биопленки могут быть сформированы бактериями одного или нескольких видов и состоять как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся или некуль-тивируемых форм. Структурная реорганизация бактериальных клеток происходит в ответ на изменение температуры, pH среды, осмолярность и т. д. и может сопровождаться изменением метаболизма и коммуникативных связей. Сложная архитектоника биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри пространственно организованных систем, создает условия, благоприятствующие установлению симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов и защите от воздействия внешней среды [8; 16].

В настоящее время общепринята модель биопленки, созданная на основе данных конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, согласно которой биопленки состоят из фрагментированных структур, образуемых микроколониями бактерий и эк-зополимерным матриксом, между которыми располагаются наполненные жидкостью каналы [17]. Характерная особенность бактерий в биопленках — наличие мембранных пузырьков или везикул (рис. 4), в которых могут содержаться периплазматические гидролитические ферменты, транспортируемые к поверхности [6; 11]. Расшифрованы механизмы образования биопленок, учитывающие подвижность или неподвижность бактерий. У подвижных грамотрицательных бактерий, включая Escherichia coli, на начальном этапе образования биопленки доминирующая роль принадлежит жгутикам, с помощью которых бактерии достигают поверхности [16]. Далее, после прикрепления к поверхности отдельных клеток и образования монослоя, наблюдается движение клеток по поверхности с формированием микроколоний и стимуляцией образования полисахаридного матрикса. Созревание биопленки сопровождается формированием ее трехмерной структуры [17]. У неподвижных бактерий, в том числе лактобацилл, энтерококков, стрептококков и стафилококков, в составе клеточной стенки имеются так называемые Вар-протеины (Biofilm associated proteins), определяющие формирование биопленки [18].

Основной структурный компонент биопленки большинства симбионтных бактерий — экзополимерный матрикс, синтезируемый клетками in situ [7; 17]. Экзополиса-хариды при этом составляют значительную часть матрикса и входят в состав капсулы и мукополисахардных слизистых слоев, способных высвобождаться во внешнюю сре-

ду. При созревании биопленки продуцируется значительное количество экзополиса-харидов, объединяющих соседние клетки и формирующих матрикс. Экзополисахари-ды составляют 85% массы биопленки, в то время как на долю бактерий приходится лишь 15%. У Staphylococcus epidermidis матрикс представлен в основном внеклеточными полисахаридами, в то время как матрикс S. aureus содержит Вар (Biofilm associated proteins) и экзополисахариды [15; 18].

Клетки как индигенных, так и транзиторных представителей микробиоты в бактериальной биопленке заключены в полимерный матрикс, свойства которого определяют взаимоотношения клеточного сообщества с внешней средой. Матрикс у различных видов бактерий неодинаков по физическим свойствам и химическому составу. В состав матрикса могут, помимо экзополисахаридов и белков, входить нуклеиновые кислоты, липополисахариды, лектины, уроновые кислоты, аминосахара и минералы, необходимые для формирования полноценной биопленки. Функции матрикса разнообразны. Помимо каркасной, обеспечивающей стабильность биопленки, основная функция матрикса — защита бактерий в биопленке от повреждающих факторов внешней среды, таких как УФ, радиация, изменения рН, осмотический шок, высыхание [8]. Микробная биопленка играет важную роль, закрепляя бактерии в определенных экологических нишах ЖКТ, где существует угроза смыва током жидкости и перистальтикой. В матриксе полимикробных биопленок обнаружены коагрегаты, сформировавшиеся путем слипания, опосредованного его компонентами, включая бактериальные белки, полисахариды и лектины. Коагрегация, характерная для грамположительных симбионтных бактерий, важна на первом этапе биопленкообразования, в то время как для внутрипленочных бактерий характерна их в 1000 раз большая устойчивость к действию антибиотиков и других стрессорных факторов [19]. Одной из причин устойчивости внутрипленочных бактерий к действию антибактериальных агентов может быть неспособность агентов проникать вглубь биопленки. Возможно и то, что часть клеток в биопленках испытывает нехватку питательных веществ и существует в некульти-вируемом состоянии, тогда как не растущие клетки слабо восприимчивы ко многим антимикробным препаратам. Достигаемая таким образом пространственная неоднородность биопленок представляет важную стратегию выживания, поскольку клетки с широким разнообразием метаболических состояний значительно легче переживают неблагоприятное для них воздействие продуктов обмена веществ и разнообразных защитных механизмов организма хозяина.

Морфофизиологические изменения в клетках бактерий-мишеней при антагонистическом воздействии лактобацилл. Антагонистическое воздействие лактобацилл проявляется в ингибировании роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Оно обусловлено в первую очередь продукцией неспецифических антимикробных метаболитов, таких как органические кислоты, включая молочную, уксусную, пропионовую, масляную, а также бактерициноподобные ингибирующие субстанции (BLIS — bacteriocin-like inhibitory substances), перекись водорода, лизоцим и др. [3; 5; 8]. Наиболее подробно изучены BLIS, относящиеся к классу лантибиотиков с молекулярной массой <5-10 кДа, содержащие в своей структуре пострепликативно модифицированные аминокислоты (лантонин, в-метиллантонин или ненасыщенные аминокислоты, представляющие собой термостабильные пептиды). Определена природа и физико-химические свойства лантибиотиков и расшифрован механизм их повреждающего действия на молекулярном уровне [20; 21].

Нами при использовании трансмиссивной электронной микроскопии выявлены особенности межклеточных взаимодействий при совместном культивировании штаммов бактериоцинпродуцирующих лактобацилл и чувствительных к их антагонистическому действию культур условно патогенных бактерий различных таксономических групп [12-14]. Было установлено, что ответная реакция различных микроорганизмов на ингибирующее действие лактобацилл проявлялась на двух уровнях: популяцион-ном и клеточном. На популяционном уровне изменялось соотношение различных морфологических типов клеток, увеличивалась доля инволюционных, лизированных и покоящихся бактерий. При этом интенсивность выявленных ультраструктурных изменений в клетках тест-культур коррелировала с величиной зоны подавления роста при исследовании этих микроорганизмов культуральными методами. На электронно-микроскопическом уровне показано, что антагонистическое воздействие лактобацилл приводило к морфо-функциональным изменениям в клетках-мишенях, проявляющихся в деструктивных изменениях, о которых свидетельствовала характерная разреженность цитоплазмы и разрушение клеточных органелл (рис. 8 и 9).

Рис. 8. Ультратонкий срез фрагмента биопленки Proteus mirabilis: разрушение клеточных стенок и цитоплазмы в клетках Proteus mirabilis при воздействии BLIS L. fermentum 97 ТЭМ. Ув. 30000.

Рис. 9. Ультратонкий срез фрагмента биопленки Staphylococcus aureus: изменение структуры клеточных стенок и клеточных перегородок деления при воздействии BLIS L. fermentum 97 ТЭМ. Ув. 30000.

Долгое время оставалось неизвестным, что происходит в клетках самих бактерий-антагонистов, например лактобацилл. Электронно-микроскопические исследования, направленные на выявление морфологических изменений в клетках L. р1аПагиш 8РА-3 и L. fermentum 97 при их совместном выращивании с представителями других видов микроорганизмов, показали значительные отличия в ультраструктурной организации клеток лактобацилл, выращенных в монокультуре и совместно с другими бактериями. Наряду с лизисом и переходом в покоящееся состояние части клеток в популяции лактобацилл обнаружено специфическое дифференцирование клеток антагонистов, проявляющееся в увеличении толщины клеточной стенки и образовании на ее поверхности дополнительных защитных слоев.

Ультраструктурные изменения в клетках лактобацилл при проявлении антагонистической активности свидетельствовали об одновременном существовании в популяции бактериоциногенных бактерий нескольких защитных механизмов: переходе

в покоящееся состояние части клеток и образовании на поверхности клеток дополнительных защитных слоев.

Выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфофизиологические изменения отражают сложный характер взаимоотношений микроорганизмов во внутривидовых и межвидовых сообществах. Полученные данные свидетельствуют об особом характере социального поведения микроорганизмов на популяционном и клеточном уровнях. Электронно-микроскопический анализ структуры микробных популяций может быть использован при подборе наиболее эффективных штаммов инди-генных бактерий при создании новых препаратов-пробиотиков.

Литература

1. Qin J., Li R., Raes J. et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing// Nature. 2010. Vol. 464(7285). P. 59-65.

2. Goodacre R. Metabolomics of a superorganism// J. Nutr. 2007. Vol. 137 (Suppl.1). P. 259S-266S.

3. Miller M. B., Bassler B. L. Quorum sensing in bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 2001. Vol. 55. P. 165-199.

4. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М.: ГЭОТАР-медиа, 2007. 308 c.

5. Парфенов А. И., Бондаренко В. М. Что нам дал вековой опыт познания симбионтной кишечной микрофлоры // Арх. патол. 2012. № 2. C. 21-25.

6. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Добрица В. П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. СПб.: Изд-во СПб. ИИЦ. ВМА, 2008. 102 с.

7. Donlan R. M., Costerton J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms// Clin. Microbiol. Rev. 2002. Vol. 15. P. 167-193.

8. Macfarlane S. Microbial biofilm communities in the gastrointestinal tract // J. Clin. Gastroenterol. 2008. Vol. 242(Suppl. 3). P. S142-S143.

9. Бондаренко В. М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации. М.: Изд-во «Триада», 2011. 88 с.

10. Popat R., Crusz S., Doggle S. The social behaviours of bacterial pathogens // Brit. Med. Bullet. 2008. Vol. 87. P. 63-75.

11. Рыбальченко О. В. Электронно-микроскопическое исследование межклеточных взаимодействий микроорганизмов при антагонистическом характере взаимоотношений // Микробиология. 2006. Т. 75, № (4). C. 550-555.

12. Rybalchenko O., Bondarenko V., Rozlomiy V., Orlova O. Ultrastructural organization of biofilms of opportunistic microorganisms — representatives of gut human microbiota // Genes and Nutrition. 2010. Vol. 5. P. S92.

13. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Вербицкая Н. Б. Проявление антагонистического действия бак-териоциногенных Lactobacillus acidophilus на Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis // Журн. микробиол. 2006. № 7. С. 8-11.

14. Рыбальченко О. В., Бондаренко В. М., Гуслева О. Р. и др. Дезорганизация биопленок клинических штаммов стафилококков метаболитами лактобацилл // Журн. микробиол. 2010. № 6. С. 66-70.

15. Маянский А. Н., Чеботарь И. В., Евтеева Н. И. и др. Межвидовое взаимодействие бактерий и образование смешанной (полимикробной) биопленки // Журн. микробиол. 2011. № 1. C. 93-101.

16. Pratt L. A., Kolter R. Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemo-taxis and type I pili // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 30. P. 285-294.

17. Branda S. S., Vik A., Friedman L., Kolter R. Biofilms: the matrix revised // Trends Microbiol. 2005. Vol. 13. P. 21-25.

18. Lasa I., Penades J. R. Bap: a family of surface proteins involved in biofilm formation // Res. Microbiol. 2006. Vol. 157. P. 99-107.

19. Olson M. E., Ceri H., Morck D. W. et al. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics // Can. J. Vet. Res. 2002. Vol. 66. P. 86-92.

20. Sablon E., Contreras B., Vandamme E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis // Adv. Biochem. Engineering/Biotechnol. 2000. Vol. 68. P. 21-60.

21. Sahl H. G., Bierbaum G. Lantibiotic: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1998. Vol. 52. P. 41-79.

Статья поступила в редакцию 5 декабря 2012 г.