ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КОМПЛЕКСА В РАЦИОНЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
APPLYING ENZYME COMPLEX IN DIET OF FARM ANIMALS

Технической областью настоящего изобретения является область кормов для животных.
Streptomyces fradiae
Известно, что штамм  может продуцировать по меньшей мере пять типов протеаз, обозначенных Ia, Ib, II, III, IV, и две пептидазы (патент GB 1133579).
Streptomyces fradiae
В своей патентной заявке WO 87/07905 заявители описали способ получения протеолитического комплекса, состоящего исключительно из протеаз типа II, III и IV с преобладанием протеазы типа II. Этот комплекс получают, исходя из штамма  типа WAKSMAN 3535, путем ферментации, экстракции комплекса фильтрацией, затем ультрафильтрацией через мембрану, имеющую порог отсечения, соответствующий молекулярному весу от 2000 до 12000, и, наконец, распылением. Полученный в результате комплекс в виде порошка содержит по меньшей мере 2000 единиц Ансона на 1 мг белков.
В этой заявке протеаза типа II была охарактеризована молекулярным весом около 18 кДа и изоэлектрической точкой около 9,0.
Этот комплекс, использующийся в рационе животных, позволяет животным эффективно усваивать корма, богатые грубыми белками, и таким образом стимулировать их рост. Кроме того, этот комплекс, использующийся у беременных свиноматок, позволяет получить увеличение веса новорожденных поросят при уменьшении потребления пищи и улучшении состояния здоровья.
Однако этот способ не позволяет эффективно удалить загрязняющие побочные продукты.
В патентной заявке WO 97/37681 вносятся улучшения, позволяющие использовать продукт, содержащий по меньшей мере 4000 единиц Ансона на 1 мг белков, для терапевтических приложений. Так, преобладающая протеиназа имеет удельную активность выше 100000 единиц Ансона на 1 мг белков при молекулярном весе от 30 до 36 кДа и изоэлектрической точке около 7,0.
Анализы, проведенные позднее, показали, что молекулярный вес протеазы составлял 18-20 кДа.
Описанные терапевтические применения состоят в основном в положительном влиянии на уменьшение избытка секреции слизи, характерной для некоторых заболеваний, в улучшении кишечного всасывания и кровообращения или же в борьбе с инфекционными болезнями. Кроме того, описанные выше смеси облегчают регенерацию атрофированных или разрушенных ворсинок слизистой оболочки кишечника.
Streptomyces fradiae
Ввиду высоких терапевтических свойств ферментативного комплекса, выделенного из культур , важно использовать ферментативный комплекс как можно более полно очищенный от биологических примесей, которые могли бы ухудшить его активность.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на улучшение описанного выше ферментативного комплекса, чтобы способствовать, в частности, хорошим условиям разведения и здоровью животных в рамках промышленного животноводства.
Streptomyces fradiae
Таким образом, объектом изобретения является использование ферментативного комплекса, содержащего смесь протеаз, полученную культивированием штамма , для добавки в рацион сельскохозяйственных животных, отличающееся тем, что одна из протеаз смеси имеет изоэлектрическую точку порядка 7,0, а другая имеет изоэлектрическую точку порядка 8,0.
Указанный комплекс в подавляющем большинстве случаев содержит оба этих типа протеаз, то есть доля этих двух протеаз превышает 80% активности указанной смеси.
Согласно одному отличительному признаку изобретения протеаза, изоэлектрическая точка которой составляет порядка 7,0, имеет удельную активность примерно 150000 единиц Ансона на 1 мг белков.
Согласно одному отличительному признаку изобретения протеаза, изоэлектрическая точка которой составляет порядка 8,0, имеет удельную активность примерно 38000 единиц Ансона на 1 мг белков.
Согласно другому отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс применяется в качестве пищевой добавки в виде порошка, жидкости или любой другой форме, подходящей для смешивания с кормовыми смесями, для улучшения общего состояния животных в промышленном животноводстве.
Согласно одному отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс в виде порошка размешивают с кормовой смесью всухую до однородности во вращающемся барабане.
Согласно другому отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс в жидкой форме распыляют в виде псевдоожиженного слоя на кормовую смесь, а затем гранулируют.
Согласно одному отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс применяется в рационе питания домашней птицы.
Согласно другому отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс применяется в рационе питания свиней.
Согласно другому отличительному признаку изобретения ферментативный комплекс применяется в рационе питания рыб.
Объектом изобретения является также кормовая смесь для сельскохозяйственных животных, содержащая ферментативный комплекс согласно изобретению и факультативно инертные вспомогательные вещества или наполнители пищевого назначения или другие добавки.
Streptomyces fradiae
Наконец, объектом изобретения является способ получения ферментативного комплекса по изобретению, отличающийся тем, что культивируют штамм , фильтруют ферментативное сусло, затем экстрагируют ферментативный комплекс путем ультрафильтрации и ионообменной хроматографии с последующим изоэлектрофокусированием и, наконец, полученный комплекс лиофилизируют.
Настоящее изобретение позволяет создать пищевую добавку, характеристики которой строго определены.
Изобретение позволят, прежде всего, точно адаптировать дозы, вводимые в кормовые композиции, чтобы получить желаемый терапевтический эффект.
Преимуществом изобретения является также улучшение состояние здоровья животных в промышленном животноводстве.
Кроме того, изобретение обеспечивает также улучшение общего состояния животных в промышленном животноводстве, что повышает рентабельность применения.
Изобретение позволяет также увеличить рост животных, приводя одновременно к снижению потребления кормов.
Другие характеристики, детали и преимущества изобретения станут более понятными после прочтения следующего дополнительного описания вариантов осуществления, приведенных в качестве примера в сочетании с фигурами, иллюстрирующими кишечные ворсинки.
Streptomyces fradiae
Escherichia coli
Известно, что ферментативная смесь, выпускаемая в продажу под наименованием Panstimase (PANcreatic STIMulating diastASE), представляет собой ферментативный комплекс, полученный ферментацией . Этот комплекс описан как содержащий главным образом три протеазы, причем некоторые из них действуют специфически на белки склеры (коллаген, эластин, кератин), а также на некоторые токсины белковой природы, выделяемые холерным вибрионом или некоторыми патогенными штаммами .
В области зоотехники важно располагать технически определенным и строго неизменным продуктом, свойства которого, таким образом, четко определены.
Streptomyces fradiae
Чтобы получить ферментативный комплекс, согласно изобретению, выращивают штамм  и фильтруют бродильное сусло. Затем осуществляют экстракцию и определяют характеристики ферментативного комплекса путем ультрафильтрации, ионообменной хроматографии и изоэлектрофокусирования. Наконец, проводят лиофилизацию полученного комплекса.
Streptomyces fradiae
Для культивирования штамма  используют, например, штамм типа WAKSMAN 3535, который можно генетически улучшить, чтобы получить, в частности, повышение протеолитической активности или подавление любой секреции антибиотиков.
Культивирование происходит в промышленном ферментере в подходящей культурной среде. Эта культурная среда может иметь в основе, например, соевую муку (15 г/л), глюкозу (30 г/л), дикалий фосфат (1 г/л), карбонат кальция (10 г/л).
Реакция протекает при pH в интервале от 7,0 до 7,5, температуре ферментации примерно 28°C с продувкой интенсивностью 0,3 объема стерильного воздуха на объем среды в минуту.
После завершения культивирования мицелий удаляют фильтрацией бродильного сусла в присутствии осветляющего средства.
Экстракция ферментативного комплекса требует применения нескольких технических методов, в том числе ультрафильтрации, ионообменной хроматографии и изоэлектрофокусирования.
Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию фильтрата проводят с помощью мембраны с порогом отсечения 50 кДа.
После 3 часов фильтрации протеолитическую активность собранного фильтрата (71% от исходного объема) выявляют посредством теста с желатиновой пленкой. Этот тест состоит в разрушении пленки желатина, окрашенной серебром и нанесенной на твердую подложку.
Ионообменная хроматография
Применяется катионообменная хроматография, реализуемая с колонками геля карбоксиметилцеллюлозы Cellufine C-500 (Amicon) подходящих размеров.
Хроматографический буфер является цитратным буфером концентрацией 10 мМ и pH 5,5, элюирование реализуется через градиент NaCl от 0 до 1,0 М. Скорость элюирования подбирают в зависимости от размера колонок, например она составляет 10-15 мл/мин для колонки диаметром 2,5 см и высотой 27 см.
Изоэлектрофокусирование
Аналитическое изоэлектрофокусирование реализуют с гелями, готовыми для применения, компания Pharmacia, для pH от 3 до 9 на системе Phast. Проявление осуществляют в Кумасси синем.
В случае препаративного изоэлектрофокусирования в твердой среде ферментный раствор подвергают диализу против дистиллированной воды (95 мл) и смешивают с 5 мл амфолитов 3-9 с 4,7 г геля Ultrodex и 0,5 г глицина. Гель осушают в течение 6 ч при 40°C. Миграция имеет место в течение ночи или эквивалентного периода времени при постоянной мощности 3 Вт. Проявление проводят в Кумасси синем.
Отбирают различные полоски геля, промывают 3 мл воды, фильтруют, затем промывают 3 мл буфера Tris-HCl.
Полученные в результате фракции анализируют затем на протеолитическую активность и содержание в них белков. Затем образцы подвергают диализу против буфера Tris-HCl (0,3 M pH, 8,0).
В случае препаративного изоэлектрофокусирования в жидкой среде ферментный раствор, подвергнутый диализу против дистиллированной воды, смешивают с амфолитами (3,5 мл). Миграция проводится при постоянной мощности 8 Вт в течение 4 ч.
Отобранные фракции анализируют, а затем подвергают диализу против буфера Tris-HCl (0,3 M, pH 8,0).
Указанные выше экспериментальные условия должны корректироваться в соответствии с количеством продуктов, которые желательно получить, и с применением в промышленных условиях.
Таким образом, получают смесь преобладающей протеазы с изоэлектрической точкой (pI) порядка 7,0 и в меньшей доле протеазу с pI порядка 8,0.
Преобладающая протеаза с pI около 7,0 получена в объеме 9 мл с концентрацией белков 0,49 мг/мл. При очистке могут потребоваться особые меры предосторожности из-за осаждения этой протеазы в ее изоэлектрической точке. Полученный раствор имеет титр примерно 75000 U. A./мл.
Очистка этой протеазы после гомогенизации дает 4 мг с удельной активностью 150000 U. A. на 1 мг белков.
Единица Ансона (U. A.) определена здесь как количество фермента, которое при инкубации в течение 10 минут при 25°C и pH 7,5 в присутствии денатурированного гемоглобина выделяет из этого субстрата эквивалент 1 микрограмма тирозина, как определено спектрофотометрическим методом по поглощению на длине волны 280 нм на фильтрате, не осаждаемом трихлоруксусной кислотой.
Протеазу с pI около 8,0 собирают одновременно с предыдущей, но в более значительном объеме, например 35 мл, она имеет концентрацию белка 1,48 мг/мл. Титр этого раствора составляет примерно 56000 U. A./мл.
Очистка этой протеазы после гомогенизации дает 50 мг с удельной активностью примерно 38000 U. A. на 1 мг белков.
Вышеописанный очищенный ферментативный комплекс содержал в основном протеазы и другие белки. Предпринятая очистка и использованный метод электрофореза обеспечивают дополнительную очистку и удаление наполнителей, не имеющих протеолитической активности.
Эти разные полученные протеазы можно охарактеризовать лучше, определив их активности на таких белках, как коллаген, кератин, эластин и гемоглобин.
К сожалению, эти определения являются сложными ввиду недостатка чувствительности и специфичности. Поэтому необходимо прибегать к нескольким испытаниям на активность, относящимся к методам обнаружения, в основном к методу Ансона.
Испытания на активность
Тест Ансона
Этот тест позволяет количественно определить протеолитическую активность без специфичности. Он состоит в количественном анализе гидролиза денатурированного гемоглобина путем спектрофотометрического определения тирозина, содержащегося в выделившихся олигопептидах.
Тест с азоказеином
Этот тест состоит в определении методом спектрофотометрии на 440 нм гидролиза казеина, на котором связан оранжевый краситель. Этот тест не является специфическим. После инкубации с ферментом оставшийся азоказеин осаждают трихлоруксусной кислотой. Результаты измерения оптической плотности отражают присутствие выделившихся пептидов, то есть ферментативную активность.
Испытание на эластолитическую активность
Тест с эластином Конго красный
Этот тест состоит в спектрофотометрическом определении на 495 нм окрашенных пептидов, выделившихся в результате гидролиза эластина, на котором был связан красный краситель.
Возможная проблема при этом количественном анализе возникает из-за нерастворимости субстрата, и, следовательно, чувствительность зависит от точности его отбора, перемешивания инкубационной среды и прилипания субстрата к стенкам инкубационной камеры.
Проведенные опыты показывают отсутствие линейности между активностью и количеством фермента. При этом наблюдается линейность между активностью и временем инкубации, но кривая, показывающая эту линейность, не проходит через начало координат.
Таким образом, можно измерить разницу поглощения между двумя временами инкубации (20 и 40 мин). При 10 мкл десятикратно разбавленного комплекса определена разница 0,049 мкDO/мин. Таким образом, ферментативный комплекс согласно изобретению имеет хорошую протеолитическую активность по отношению к эластину.
Тест с NBA ((N-Boc-L-аланинат-пара-нитрофениловый эфир)
et al
Этот тест состоит в определении спектрофотометрическим методом на 347,5 нм активности эстеразы, присутствующей в эластине, по определению выделившегося пара-нитрофенола (Visser L. . Biochim, Biophys Acta 268 (1972) 207.260).
Этот количественный анализ не является специфическим в отношении эластолитической активности, но он очень быстрый (кинетика 3 мин) и имеет хорошую чувствительность.
Действительно, при 50 мкм комплекса, разбавленного в 100 раз, измерена разница 0,235 мкDO/мин. Таким образом, ферментативный комплекс имеет активность, позволяющую выделение пара-нитрофенола.
Испытание на коллагенолитическую активность
Тест с Azocoll
Этот тест состоит в определении спектрофотометрическим методом на 520 нм пептидов, выделившихся при гидролизе Azocoll (растертый коллаген, на котором связан бордово-красный краситель) (Chavira, Analytical Biochemistry 136 (1984) 446-450).
Этот тест имеет те же недостатки, что и тест с эластином и Конго красным (нерастворимый субстрат), но он имеет высокую чувствительность: при 50 мкм комплекса, разбавленного в 50 раз, измерено DO 0,398 по истечении 10 мин инкубации. Таким образом, ферментативный комплекс согласно изобретению обладает протеолитической активностью в отношении Azocoll.
Таким образом, установлена протеолитическая активность ферментативного комплекса согласно изобретению. Очистка указанного комплекса не ухудшает его активность.
Полученный и охарактеризованный таким способом белковый комплекс находит применение в лечении животных, в частности, в качестве иммуностимулятора и в качестве агента регенерации пейеровых бляшек, в частности, у пациентов пожилого возраста.
Кроме того, ферментативный комплекс позволяет регенерировать кишечные ворсинки у животных в возрасте (крысы, куры и т. д.) и таким образом значительно улучшить кишечную абсорбцию соответствующих кормов.
Ферментативный комплекс согласно настоящему изобретению предназначен в основном для зоотехники, в частности, для улучшения питания домашнего скота (крупный рогатый скот, свиньи, овцы), домашней птицы, кроликов и рыб и любых других животных с однокамерным желудком.
Вводимый в дозах 0,025-1 г/кг в кормовые смеси, этот ферментативный комплекс улучшает метаболизм указанных животных и способствует обеспечению их лучшего состояния здоровья. Предпочтительно дозы комплекса, вводимого в кормовые композиции, составляют от 0,05 до 0,2 г/кг.
В случае разведения на птицефабриках поддержание состояния здоровья играет важную роль, так как это предотвращает распространение болезней, связанных с теснотой или содержанием в замкнутом пространстве. В результате значительно снижается заболеваемость разводимых животных и особенно смертность из-за бактериального заражения.
Кормовые смеси на основе этого ферментативного комплекса содержат один или несколько инертных вспомогательных веществ или наполнителей пищевого назначения, как, например, мука зерновых (пшеница, мягкая пшеница, кукуруза, рожь, рис, просо, сорго), соя, углеводы (лактоза, манноза), наполнители (казеин, отруби, целлюлоза, производные целлюлозы) и/или минеральные элементы (мел, глина, бентонит, кремнезем) и любые другие элементы, использующиеся в кормлении животных.
Эти композиции размешивают с комплексом всухую до гомогенности во вращающемся барабане, или же ферментативный комплекс, в форме жидкости, в частности водного раствора, распыляют в виде псевдоожиженного слоя на кормовую смесь, а затем гранулируют. Такие операции можно проводить при различных температурах в диапазоне от 15 до 60°C.
Применение более чистого и более активного ферментативного комплекса позволяет более точно дозировать биологическую активность пищевых смесей согласно изобретению и обеспечить удовлетворительную однородность полученных результатов.
Таким образом, кормовые смеси согласно изобретению имеют четко определенное и строго постоянное содержание ферментативного комплекса.
Далее приводится несколько неограничивающих примеров кормовых смесей, предназначенных для сельскохозяйственных животных и содержащих ферментативный комплекс согласно изобретению в смеси с инертными вспомогательными веществами или наполнителями пищевого назначения.
Кормовая смесь для домашней птицы
Готовят смесь для порции 10 кг, добавляя ферментативный комплекс.
Пшеничная мука
2,5 кг
Лактоза
4,5 кг
Отруби
3 кг
Ферментативный комплекс по изобретению
0,2 г/кг
Такую смесь вводят из расчета 0,5 кг на тонну корма для домашней птицы.
Кормовая смесь для домашней птицы
Готовят смесь для порции 20,1 кг, в которую добавляют ферментативный комплекс и которую вводят в корм для домашней птицы.
Пшеничная мука
1,5 кг
Овсяная мука
4,5 кг
Целлюлоза
14 кг
Колодная окись кремния
0,100 кг
Ферментативный комплекс по изобретению
0,1 г/кг
Кормовая смесь для свиней
Готовят смесь для порции 10 кг, в которую добавляют ферментативный комплекс и которую вводят в корм для свиней:
Пшеничная мука
4 кг
Отруби
2 кг
Казеин
3 кг
Картофельный крахмал
1 кг
Ферментативный комплекс по изобретению
0,2 г/кг
Кормовая смесь для скота
Таким же способом готовят следующую смесь:
Рисовый крахмал
0,5 кг
Картофельный крахмал
2,5 кг
Ферментативный комплекс по изобретению
0,2 г/кг
Составленный так премикс маленькими порциями добавляют к смеси 6 кг бараньих белков в порошке и 14 кг казеина. Гомогенизированный препарат предназначен для введения в корм скоту из расчета 0,5 кг на тонну корма.
Кормовая смесь для домашней птицы
Готовят смесь для порции 10 кг, в которую добавляют ферментативный комплекс:
Кукуруза
5,65 кг
Соевая мука
3,23 кг
Мука из хлопкового семени
0,3 кг
Мука из проростков пшеницы
0,4 кг
Известняк
0,13 кг
Фосфат кальция
0,16 кг
NaCl
0,03 кг
Аминокислотный комплекс
0,1 кг
Ферментативный комплекс по изобретению
0,2 г/кг
Ферментативный комплекс согласно изобретению можно также добавлять в коммерческие кормовые смеси для домашней птицы с целью дополнения этих продуктов.
Кормовая смесь для рыб
Готовят следующую смесь, которую вводят в рацион для рыб согласно обычной практике, %:
Рыбная мука
50,8
Животные жиры и масла
28
Соевая мука
9,9
Пшеничная мука
10
Витаминный комплекс (A, D, E, C)
1
Ферментативный комплекс по изобретению
0,3
Экспериментальная часть
Для определения действия комплекса по изобретению на кишечные ворсинки были проведены опыты на крысах относительно большого возраста (возраст более семи месяцев).
Крысы получали корм на основе исключительно растительных белков типа пшеничной, соевой, кукурузной муки. В этот корм добавляли ферментативный комплекс согласно изобретению, как описано выше, из расчета 0,1 или 0,2 г/кг.
Результаты показаны на чертежах 1-4. Эти чертежи представляют собой виды в фотонный микроскоп (увеличение x120) ворсинок двенадцатиперстной кишки и тощей кишки.
Фигура 1 показывает ворсинки двенадцатиперстной кишки крыс, не получавших в своем рационе ферментативного комплекса согласно изобретению.
Фигура 2 показывает ворсинки двенадцатиперстной кишки крыс, получавших корм, включающий ферментативный комплекс согласно изобретению.
Фигура 3 показывает ворсинки тощей кишки крыс, не получавших в своем рационе ферментативного комплекса согласно изобретению.
Фигура 4 показывает ворсинки тощей кишки крыс, получавших корм, включающий ферментативный комплекс согласно изобретению.
Таким образом, установлено, что добавление ферментативного комплекса в рацион питания возрастных животных (крысы, куры и т. д.) увеличивает размер и число ворсинок как в двенадцатиперстной кишке, так и в тощей кишке. Найдено, что это увеличение доходит до 70%.
Эти результаты можно перенести на кишечные микроворсинки. Близкие результаты получены также на курах, свиньях и рыбах.
Увеличение развитой поверхности позволяет более быстрое всасывание питательных веществ или медикаментов.
Это улучшение всасывания наблюдается у форели, получавшей корм, содержащий антибиотик. В тесте корм содержал окситетрациклин (4 г/кг); результаты снимали через 48 часов. В этом случае обнаружено увеличение концентрации антибиотика в тканях примерно на 100% в печени (5,75 вместо 2,5 мкг/г), на 400% в мышцах (1,75 вместо 0,32 мкг/г) и на 1000% в почках (5,75 вместо 0,5 мкг/г).
Близкие результаты были получены на курах и свиньях.
Это увеличение концентрации может также лежать в основе увеличения локального продуцирования физиологически активных соединений, таких как кишечные гормоны.