Модификационная изменчивость признаков мегагаметофита табака, индуцированная фитогормонами

МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПРИЗНАКОВ МЕГАГАМЕГОФИТА ТАБАКА, ИНДУЦИРОВАННАЯ ФИТОГОРМОНАМИ

Л.П. Лобанова, О.А. Бокова

Саратовский государственный университет, кафедра генетики E-mail: biofac@sgu.ru

В условиях in vitro исследовалось влияние экзогенных фитогормонов на процессы формирования женского гаметофита табака. Показана зависимость цитологических событий мегагаметофитогенеза от концентрации фитогормонов. Отмечена определенная специфика реакций развивающегося гаметофита на ауксины (ИУК, 2,4-Д) и кинетин.

Modification variability of tobacco megagametophit tags induced by phitohormones

L.P. Lobanova, O.A. Bokova

The influence of exogenic phitohormones on the formation processes of female tobacco hametophit was studied in vitro. A relation between cyto-logical megagametophitogenesis events and phitohormone concentrations was revealed. A certain specificity of developing gametophit reactions to auxins (IAC, 2,4-D) and kinetin is noted.

Структурная организация мегагаметофита или зародышевого мешка (ЗМ) во многом определяет процессы оплодотворения, формирования зародыша и эндосперма. В норме ЗМ большинства покрытосеменных растений характеризуется специфической морфофункциональной организацией. Аномальные изменения структуры ЗМ обусловлены изменением числа митотических делений при его формировании, нарушениями цитокинеза и дифференциации его клеток. Фенотипически это проявляется в изменении размеров и формы клеток, увеличении или уменьшении числа ядер, появлении ценоцитных и атипично дифференцированных ЗМ. При изучении вариабельности структуры ЗМ выделяют также группу «субнормальных» ЗМ, у которых сохраняется типичный план строения, но изменяется морфология клеток яйцевого аппарата [1]. В этом случае обра-

зуются либо яйцеклеткоподобные синергиды, либо синергидоподобные яйцеклетки, либо клетки синергид со смещенным расположением относительно друг друга. Субнормальные ЗМ представляют интерес в связи с возможными изменениями функции синергид и яйцеклетки.

Данных о влиянии фитогормонов на процесс развития женского гаметофита практически нет. И хотя в ряде работ по индукции гиногенеза in vitro зарегистрирована возможность развития ЗМ до зрелой стадии на средах с разными комбинациями фитогормонов [2—4], в них никогда не ставилась цель исследования мегагаметофитогенеза. Только в единичных работах отмечается, что присутствие в питательной среде цитокининов и ауксинов может вызвать изменение нормального хода развития ЗМ [5J.

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния экзогенных фитогормонов на процессы формирования ЗМ табака: клеточные деления, цитокинез, дифференцировку клеток. Такие исследования в перспективе могли бы способствовать пониманию роли фитогормонов в реализации генетической программы мегагаметофитогенеза, а также выявить условия для индукции специфических модификаций ЗМ.

Материал и методы

Объектом исследования послужила линия Nicotiana tabacum RF-3. Выбор данной линии был обусловлен высокой константностью в проявлении цитологических признаков женс-

© Л./7. Лобанова, О.А Бонова, 2005

кого гамегофита. В полевых условиях произрастания у RF-формы формируются в основном нормальные 7-клеточные биполярные ЗМ, состоящие из 3-клеточного яйцевого аппарата, двухъядерной центральной клетки и трех антипод. Аномальные и «субнормальные» ЗМ встречаются с небольшой частотой в среднем равной 1,6% [6].

Исследование влияния фитогормонов на развитие ЗМ проводилось с помощью метода культивирования завязей in vitro [5]. Это позволило создать строго контролируемые условия, в том числе и гормональные.

Для культивирования брали завязи, содержащие ЗМ на одноядерной стадии развития. В качестве основной питательной среды использовали среду Мурасиге и Скуга. Семь вариантов питательных сред отличались только по содержанию фитогормонов: безгормональная, с ИУК в концентрации 2 и 10 мг/л, с 2,4-Д и кинетином в тех же концентрациях.

В каждом варианте исследовалась выборка из 100 ЗМ из 5—7 завязей. Процент аномальных ЗМ рассчитывался от общего числа проанализированных ЗМ (п ~ 100), а субнормальных — от числа ЗМ с типичной структурой, то есть «я минус аномальные ЗМ».

Результаты и их обсуждение

Через 3-е суток культивирования на всех средах одноядерные ЗМ достигали стадии зрелых ЗМ. На безгормональной среде 97—98% ЗМ имели нормальное строение. В единичных ЗМ типичного строения наблюдалось изменение дифференциации клеток яйцевого аппарата: появление синергидоподобных яйцеклеток и яйцеклеткоподобных синергид. В целом отмеченный на безгормональной среде спектр отклонений не отличался от обнаруженных у ЗМ, развитие которых осуществлялось in vivo [6].

При введении в состав питательной среды ауксинов и кинетина зарегистрировано увеличение числа отклонений. Результаты анализа зрелых ЗМ в зависимости от гормонального состава, концентрации и продолжительности культивирования приведены в таблице. Видно, что во всех вариантах повышение концентрации фитогормонов увеличивает количество нарушений в развитии ЗМ.

Действие ауксинов (ИУК и 2,4-Д) проявилось прежде всего в подавлении митозов. Результатом явилось увеличение числа ЗМ с числом ядер менее 8. Появление 2- и 4-ядерных биполярных ЗМ свидетельствует об остановке их развития на ранних стадиях. Появление моно- или аполярных ЗМ сопряжено с отсутствием крупной центральной вакуоли. В этом случае ядра не разделяются по полюсам

на две группы, а беспорядочно разбросаны в полости ЗМ или сгруппированы на одном конце. В таких ЗМ возможны асинхронные митозы, которые приводят к появлению ЗМ с нечетным числом ядер. У большинства аномальных ЗМ в вариантах с добавлением ауксинов наблюдается полное подавление цитокинеза и образование ценоцитных структур. Возможно, что все эти нарушения связаны с изменением цитоскелета, который является основой внутриклеточной структуры и внутриклеточной подвижности. В последнее время все больше накапливается данных о влиянии фитогормонов, в том числе и ауксинов, на ориентацию и переориентацию микротрубочек [7].

Повышенные концентрации ауксинов отчасти подавляют специфическую дифферен-цировку клеток яйцевого аппарата. Косвенным указанием на это служит появление в вариантах с ауксинами ЗМ, в которых размеры яйцеклеток и синергид уменьшены, а синерги-ды нередко различаются по размеру. Наиболее отчетливо влияние ауксинов на характер диф-ференцировки клеток яйцевого аппарата проявляется в увеличении числа синергидоподобных яйцеклеток. Однако наряду с четкими синергидоподобными яйцеклетками встречаются яйцеклетки, в которых ядро занимает промежуточное положение между апикальным и базальным положениями. Зарегистрирована также зависимость числа нарушений в диффе-ренцировке клеток яйцевого аппарата от продолжительности культивирования: на 5-е сутки количество аномально дифференцированных клеток было выше, чем через 3-е суток. Последнее указывает на возможность вторичных изменений в дифференцировке яйцеклетки. Возможно, что перемещение ядра в клетке обусловлено отмеченной выше, способностью ауксинов вызывать переориентацию микротрубочек и микрофиламентов цитоскелета, от которых зависит процесс циклоза [7]. В литературе также имеются данные о стимуляции скорости этого процесса ауксинами [8].

Влияние кинетина на формирование структуры женского гаметофита менее выражено, чем ауксинов. Это проявляется в снижении количества как аномальных, так и субнормальных ЗМ. Кинетин также подавляет митозы и цитокинез, но среди аномальных ЗМ возрастает доля с образованием клеточных перегородок.

В вариантах с кинетином, по сравнению с контролем, число нарушений в дифференцировке клеток яйцевого аппарата повышено незначительно. Этот результат не совпадает с данными, полученными ранее для линии табака БГ-6, об увеличении яйцеклеткоподобных синергид под действием кинетина (Еналеева, Лобанова, неопубл.). И хотя

Бпопогня

Z3

нельзя исключить, что эти межлинейные различия обусловлены особенностями генотипов линий, необходимо провести дополнительные исследования, поскольку данный тип отклонений представляет интерес и как контрастный действию ауксинов, и как перспективная модификация структуры ЗМ для получения гаплоидов и полиэмбрионов.

Таким образом, в ходе данной работы установлена зависимость определенных цитологических событий мегагаметофитогенеза от

присутствия фитогормонов. Изменения морфологической структуры ЗМ были обусловлены нарушением одного или нескольких процессов: митотических делений, поляризации, цитокинеза, клеточной дифференциации. Отмечена также определенная специфика реакций развивающегося ЗМ на ауксин и кинетин. Не исключено, что, используя фитогормоны, их разные концентрации и сочетания, можно активно вмешиваться в эмбриональные процессы, изменяя их ход.

Частота структурных изменений в зрелых зародышевых мешках табака, развитие которых проходило под влиянием различных фитогормонов

Фито- гор- моны 1 Концентрация, мг/л Г " Срок культивирования, сут. Всего аномальных ЗМ, % Нарушение признаков 3Mf %

число ядер отсутствие цитокинеза (ценоцитные ЗМ) дифференцировка

меньше 8 больше 8 нескольких клеток 8-ядерного ЗМ яйцеклетки (си-нергидоподобные) синергид (яйцеклеткоподобные) линейное расположение синергид

Б/Г** з 3 1 0 1 2 2 2 1

5 2 1 0 0 1 1 3 0

ИУК 2 3 10 7 1 3 1 3 2 4

5 7 7 0 5 2 5 4 0

10 3 28 28 0 25 0 8 5 3

2,4-Д 2 5 3 3 0 3 0 4 1 1

10 3 26 25 1 21 0 3 0 1

5 10 10 0 5 0 8 2 5

Кине- 2 3 5 5 0 2 0 3 3 4

тин 10 3 4 3 0 1 1 2 2 6

5 10 8 1 5 0 1 2 4

* В одном ЗМ возможно нарушение нескольких признаков.

** Безгормональная питательная среда.

Библиографический список

1. Еналеева Н.Х. Изменчивость цитологической структуры мегагаметофита // Физиология растений. 2003. Т.50, №3. С. 398-403.

2. Zhou С., Yang H.-Y. Induction of haploid rice plantlets by ovary culture // Plant Sei. Lett. 1981. V. 20. P. 231-237.

3. Бугара A.M., Русина Л.В. Культура неоплодотворен-ных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений // Физиология и биохимия культ, раст. 1988. Т. 20, №5. С. 219-230.

4. Van Geyt /., Speckmann G. D’Halluin K., Jacobs M. In vitro induction of haploid plants from unpollinated ovules and ovaries of the sugarbeet (Beta vulgaris L.) // Theor. Eppl. Genet. 1987. V. 73. P. 920-925.

5. Lobanova L., Enaleeva N. The development of embryo sacs in in vitro ovaries of Nicotiana tabacum L. // Plant Science. 1998. V. 132. P. 191-202.

6. Колесова А.Ю., Белашов С.Ю., Еналеева Н.Х. Эмбриологическое и морфологическое исследование форм табака с ранним зацветанием // Бюл. Бот. сада Сарат. гос. ун-та. 2002. Вып. 1. С. 80—86.

7. Клячко Н. Л. Фитогормоны и цитоскелет // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 3. С. 475—480.

8. Baluska F, Volkmann D., Barlow P. W. Hormone-cytoskeleton interactions in plant cells // Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones / Eds. K.L. Libbenga, M. Hall, P.J.J. Hooykaas. Leiden, 1999. P. 363-386.

24

Научный отдел