Диагностические коъюгаты для неинструментального иммуноанализа

дшшгм

ШГАТМ

МБ. Раев,

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

В.П. Тимганова,

кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

М.С. Бочкова,

кандидат биологических наук, научный сотрудник, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

П.В. Храмцов

аспирант, инженер,

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Разработана оригинальная технология синтеза прочных ковалентных диагностических конъюгатов аффинных соединений с частицами углерода. Такие диагностикумы не только устойчивы при хранении, но и обладают рядом привлекательных качеств: чрезвычайно высокой оптической контрастностью, низкой способностью к фонообразова-нию и другими, что позволяет использовать их при конструировании широкого спектра аналитических тест-систем. Системы на основе диагностических конъюгатов с использованием углеродных частиц имеют преимущества по сравнению с существующими аналогами, а в ряде случаев аналогов таким системам просто не существует.

Существенное место в методическом обеспечении современной лабораторной диагностической практики занимают системы количественного и качественного твердофазного иммуноферментного и неферментного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр. Проведение инструментального иммуно-ферментного анализа требует не только специальной регистрирующей аппаратуры, но и значительных временных затрат, в то время как неферментные (полуколичественный и качественный) анализы не

нуждаются в инструментальном обеспечении и более оперативны в процедурном отношении. Наиболее интересной и перспективной, на наш взгляд, является разработка и совершенствование именно безинструментальных методов, поскольку их применение является технологически и экономически привлекательным.

Большинство неинструментальных систем основано на применении диагностических конъюгатов из оптически плотных частиц, таких как эритроциты, цветные ла-тексные частицы, коллоиды золота, неме-

таллические коллоиды (коллоиды селена, теллура) [7, 9, 10, 11]. Результат таких анализов оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания антигенов с антителами на непористом или пористом твердом носителе. Наряду с достоинствами (простота и наглядность) все эти диагно-стикумы не лишены недостатков.

Минусами эритроцитарного диагно-стикума являются невозможность его точной стандартизации, высокая степень субъективизма в оценке результатов, ограниченный срок хранения. Кроме того, неинструментальные тест-системы с использованием эритроцитарного диагно-стикума имеют недостаточную чувствительность и специфичность, что в конечном итоге способствует получению лож-ноотрицательных и ложноположитель-ных результатов.

Латексные тесты, диагностические конъюгаты которых основаны на применении цветных латексных частиц, также имеют ряд существенных недостатков, обусловленных нестабильностью как самого диагностикума, так и результатов анализа. Необходимость визуальной регистрации результатов через строго определенное время (от 3-5 до 10-15 мин для разных тестов) увеличивает субъективность оценки результатов. Невозможность объективного учета результата и сохранения его для последующего динамического сравнения ограничивает ценность и сужает область применения ла-тексных тестов, а отклонение от оптимальных условий хранения часто становится причиной их непригодности.

Недостатками диагностикума на основе частиц золота является относительно сложная процедура получения стабильного коллоида, низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью (цветностью в видимом диапазоне светового спектра). Кроме того, для эффективного связывания частиц золота с иммуно-реагентом необходимо учитывать изо-электрическую точку белка.

Использование коллоидных диагно-стикумов селена и теллура в неинструментальных тест-системах требует высоких концентраций маркеров из-за слабой

цветности материала, что сомнительно оправданно с технологических и экономических позиций.

Таким образом, основными недостатками всех вышеуказанных реагентов являются: низкая хромофорность, нестабильность частиц носителя и готовых конъюгатов в силу нековалентного характера связывания метки с аффинным соединением (нехимические адсорбционные связи, которые существенно слабее ковалентных и делают невозможным добавление детергентов, часто применяющихся для подавления неспецифического связывания в большинстве твердофазных анализов).

Используемые нами диагностикумы на основе углеродных частиц, полученные авторским методом, обладают рядом неоспоримых преимуществ, таких как высокая контрастность (черный цвет), чувствительность и простота в применении [3, 5, 8]. Углеродная частица в отличие от вышеуказанных маркеров (эритроциты, латексные частицы и др.) обладает постоянной формой, не подвергается деформации и устойчива в процессе хранения.

Углеродные конъюгаты получали по технологии двухстадийного синтеза (рис. 1), при котором пептизирующий и аффинный компоненты - различные соединения [3, 5]. Сухую углеродную матри-

Пептизация инертным Ьщгком 1

Озвучивание

' I

Активация

Це игр иф V г ир о е а ние 1

Хроматография

I

Концентрирование

Конъюгирование Це нтрифугир о е а ние

Хроматография

Рис. 1. Схема двухэтапного синтеза углеродного диагностикума

цу, полученную конденсацией из пламени горящего толуола, растирали до мелкодисперсного состояния. Пептизацию (гидро-филизацию) поверхности частиц осуществляли внесением их в раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР) при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, после чего активировали пептизированную поверхность раствором глутарового альдегида. Для удаления не связавшегося бычьего сывороточного альбумина и глутарового альдегида проводили хроматографию на колонке с БерИагове СЬ-6Б. После хроматографической очистки осуществляли концентрирование суспензии активированных углеродных частиц с помощью метода концентрирующей ультрафильтрации в ячейке производства «МПНроге» (США), используя мембрану с пределом исключения 30 кДа. Конъюгиро-вание проводили инкубацией активированных частиц с белком О при комнатной температуре и перемешивании.

Синтез завершали гель-фильтрацией на колонке с БерИагове СЬ-6Б для удаления избытка белка О и добавлением БСА, глицерина и азида натрия в качестве стабилизатора, протектора и консерванта соответственно.

В результате применения разработанной технологии каждая углеродная частица оказывается заключенной в прочный протеиновый «каркас», все структурирующие связи которого ковалентные.

Благодаря привлекательным аналитическим и физическим характеристикам стало возможным применение синтезированных углеродных диагностикумов в различных аранжировках твердофазного неинструментального иммуноанализа для определения широкого спектра объектов биологического происхождения.

Углеродный диагностикум, в котором в качестве аффинного соединения был использован белок О стрептококка, обладает способностью связываться с практически любыми иммуноглобулинами класса О человека и большинства животных, что делает возможным его широкое применение не только для контроля за иммунизацией животных, но и в диагностике

различных инфекционных заболеваний. На основе этого конъюгата была сконструирована модельная тест-система для определения антител против токсина Yersinia рseudotuberculosis на непористой твердой фазе в различных аранжировках. Подобная система весьма актуальна, так как вспышки псевдотуберкулеза периодически регистрируются по всему миру. Немаловажен и факт отсутствия простых и оперативных аналитических систем, обладающих достаточными уровнями чувствительности и специфичности и пригодных для диагностического тестирования на разных стадиях заболевания [1, 2, 4, 6].

В одной из предложенных аранжировок проводили определение антител к токсину Yersinia рseudotuberculosis на непористой твердой фазе. В качестве основы твердофазного реагента использовали плоское дно лунок планшета, предназначенного для серийных разведений, изготовленного из белого полистирола фирмы «Linbro» (США). Схема анализа представлена на рис. 2.

п—

X у~

коньюгат Антилигант лиганд

Рис. 2. Схема определения лиганда с использованием твердофазного реагента и углеродного диагностикума

Модельная система тестирования выглядела следующим образом. На дно лунок планшета сорбировали токсин псевдотуберкулеза, иммуноглобулины О человека в качестве положительного и БСА в качестве отрицательного контролей.

В часть лунок (1-5) вносили сыворотку с антителами к токсину псевдотуберкулеза с серийным разведением пробы, кратно двум, начиная с разведения 1/500. В лунку 7 вносили сыворотку № 2 здорового человека в разведении 1/50, в лунки 6, 8 - сыворотку № 1 и 3 здорового человека в разведении 1/200 раз, в лунку 9 -забуференный физиологический раствор с 0,05 % твином (ЗФРТ). Время инкуба-

ции составляло 30 минут, после чего лунки промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом G белок-углерод в течение 15 минут.

Результаты проведенного эксперимента, представленные на рис. 3, наглядно демонстрируют отсутствие ложноположи-тельных реакций (внешние и внутренние отрицательные контроли), что свидетельствует о высокой специфичности сконструированной системы. Чувствительность системы определения антител в стандартной псевдотуберкулезной сыворотке (реагент из набора, используемого для реакции пассивной гемагглютинации - РПГА) соответствует разведению 1/8000 при диагностически значимом значении чувствительности - 1/200.

В качестве динамичной, пригодной для экспрессного анализа аранжировки

применяли иммунофильтрационное определение антител к токсину Yersinia pseudotuberculosis на пористой твердой фазе. Определение антител осуществляли с помощью пластикового цилиндра с заглубленным отверстием в верхней части, заполненного крупнопористой хромато-графической бумагой в качестве впитывающего элемента, с помещаемыми сверху опорным диском из крупнопористого полипропилена и иммуносорбентом, в качестве которого использовали нитроцел-люлозную мембрану с диаметром пор 8 мкм (рис. 4).

Иммуносорбент готовили нанесением токсина Yersinia pseudotuberculosis дотами из капель по 10 мкл в ЗФР и иммуноглобулинов G человека в качестве внутреннего положительного контроля. Высушенные после нанесения антилигандов

Рис. 3. Определение антител к токсину Yersinia pseudotuberculosis на непористой твердой фазе Левая точка в нижнем ряду в каждой лунке - положительный контроль (К+), правая точка в нижнем ряду - внутренний отрицательный контроль (К-), верхний ряд - исследуемый образец. Схемы аналитических процедур:

Лунки 1-5: Токсин Yersinia рseudotuberculosis. + антитела к токсину Yersinia рseudotuberculosis. (с серийным разведением пробы, кратном двум) + G белок-С -полная аналитическая система;

Лунка 6: Токсин Yersinia рseudotuberculosis. + сыворотка № 1:200 + G белок-С -внешний отрицательный контроль;

Лунка 7: Токсин Yersinia рseudotuberculosis. + сыворотка № 2:50 + G белок-С -внешний отрицательный контроль;

Лунка 8: Токсин Yersinia рseudotuberculosis. + сыворотка № 3:200 + G белок-С -внешний отрицательный контроль;

Лунка 9: Токсин Yersinia рseudotuberculosis. + ЗФРТ + G белок-С - контроль конъюгата

Рис. 4. Приспособление (ячейка) для иммунофильтрационного анализа: 1 - ячейка в сборе, 2 - нижняя часть корпуса, 3 - крупнопористый впитывающий элемент, 4 - полипропиленовая подложка, 5 - твердофазный иммуносорбент, 6 - крышка ячейки с отверстием для внесения реагентов

мембраны блокировали, замачивая их в блокирующем реагенте, содержащем 1 % казеина, на 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ЗФРТ и вновь высушивали. В ходе анализа в углубление крышки вносили 300 мкл ЗФРТ для смачивания иммуносорбента, следом 300 мкл предварительно подготовленной пробы, представляющей собой смесь равных объемов исследуемого образца (стандартная сыворотка для РПГА в разведении 1/300) и углеродного диагностикума с белком G в двукратном от рабочего разведении. После впитывания последней вносили 1 мл ЗФРТ для промывки поверхности мембраны. Время анализа составило 1,5-2 минуты. Результаты представлены на рис. 5.

Предложенный метод может оправдать себя как неинструментальный способ экспресс-диагностики серьезного заболевания с достаточной чувствительностью и привлекательными процедурными характеристиками.

Таким образом, использование диагностических конъюгатов на основе углерода способно помочь в решении ряда проблем лабораторной и внеклинической диагностики, связанных с недостатками и/или отсутствием тест-систем. На основе углеродных диагностикумов возможно создание принципиально новых систем диагностического тестирования, которые могут значительно сократить и упростить процедуру анализа, не требуя сложного лабораторного оборудования и специально обученного персонала.

Рис. 5. Иммунофильтрационное определение антител к токсину Yersinia pseudotuberculosis

Библиографический список

1. Андрюков Б.Г. Родо- и видоспецифические белки Yersinia pseudotuberculosis, их использование для конструирования диагностических препаратов: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 1999. - 24 с.

2. Девятилова С.И., Захарова Г.А., Нестерова Т.Г. Эпидемиологическая ситуация по псевдотуберкулезу в Приморском крае // Здоровье. Медицинская экология. Наука. - 2010. -№ 1-2. - Т. 41-42. - С. 124-125.

3. Плаксин Д., Раев М., Громаковская Е. Метод стереоспецифического анализа и метод получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ № 2089212 от 10.09.1997.

4. Псевдотуберкулез / Г.П. Сомов, В.И. Покровский, Н.Н. Беседнова [и др.]. - М.: Медицина, 2001. - 256 с.

5. Раев М.Б. Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ № 2314827 от 20 января 2008.

6. Токсины Yersinia pseudotuberculosis / Н.Ф. Тимченко, Е.П. Недашковская, Л.С. Долматова [и др.] -Владивосток, 2004. - 220 с.

7. Characterization of antibody labeled colloidal gold particles and their applicability in a sol particle immunoassay (SPIA) / J.M. Martin, M. Paques, T.A. Van der Velden-de Groot, E.C. Beuvery // J. Immunoassay. - 1990. - Vol. 11. - № 1. - P. 31-47.

8. Rayev M., Shmagel K. Carbon-protein covalent conjugates in noninstrumental immunodiagnostic systems // Journal of Immunological Methods. - 2008. - Vol. 336. - № 1. - P. 9-15.

9. Reliable serodiagnosis of imported cystic echinococcosis with a commercial indirect hemagglutination assay / H.R. Van Doorn, H. HofWegen, R. Koelewijn [et al.] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2007. -Vol. 57(4). - P. 409-412.

10. Russel J.C., Yang H., Yost D.A. Method for determinig sample analyte amount-involves reacting sample with colloidal non-metal particles before optical measurement of analyte-particle complexes. Europ. Pat. 298368 A. - 11.01.89.

11. Tarcha P.J., Wong M., Donovan J.J. Indicator reagents, diagnostic assays and kits employing organic polymer latex particles. Eur. Pat. 89116594.6. - 28.05.1990.