КОНЪЮГИРОВАННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩИЕ СКОНСТРУИРОВАННЫЕ С ЦИСТЕИНОМ АНТИТЕЛА

1. Соединение-конъюгат, содержащее сконструированное с цистеином антитело или Fc-гибридный белок и по меньшей мере один гетерологичный фрагмент, где
(i) Fc-домен антитела или Fc-гибридного белка содержит по меньшей мере одну сконструированную аминокислоту цистеин, выбранную из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 или 439, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat; и
(ii) где по меньшей мере один гетерологичный фрагмент конъюгирован с одним из сконструированных остатков цистеина.
2. Соединение-конъюгат по п. 1, где сконструированная аминокислота цистеин выбрана из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 или 435, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций.
3. Соединение-конъюгат по п. 1, где сконструированная аминокислота цистеин выбрана из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 258 или 435, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций.
4. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-3, содержащее:
(a) цистеин (C), вставленный между серином (S) в положении 239 и валином (V) в положении 240;
(b) цистеин (C), являющийся результатом замены глутаминовой кислоты (E), расположенной в положении 258;
(c) цистеин (C), являющийся результатом замены гистидина (H), расположенного в положении 435;
(d) цистеин (C), являющийся результатом замены аргинина (R), расположенного в положении 435; или
(e) их комбинацию,
где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
5. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-4, где Fc-домен дополнительно содержит по меньшей мере один сконструированный остаток цистеина, выбранный из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 239, 248, 254, 273, 279, 282, 284, 286, 287, 289, 297, 298, 312, 324, 326, 330, 335, 337, 339, 350, 355, 356, 359, 360, 361, 375, 383, 384, 389, 398, 400, 413, 415, 418, 422, 440, 441, 442, 443 и 446.
6. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-5, содержащее по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере 4 тиольные группы.
7. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-5, содержащее по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более тиольных групп.
8. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-7, где по меньшей мере один гетерологичный фрагмент химически конъюгирован со сконструированным цистеином.
9. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-8, содержащее по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере 4 гетерологичных фрагмента.
10. Соединение-конъюгат по п. 9, где каждый из гетерологичных фрагментов конъюгирован со сконструированным цистеином.
11. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-8, содержащее по меньшей мере 6, 8, 10, 12, 14, 16 или более гетерологичных фрагментов.
12. Соединение-конъюгат по п. 11, где каждый из гетерологичных фрагментов конъюгирован со сконструированным цистеином.
13. Соединение-конъюгат по любому из пп. 9-12, где все гетерологичные фрагменты являются одинаковыми.
14. Соединение-конъюгат по любому из пп. 9-12, где по меньшей мере один гетерологичный фрагмент отличается от остальных.
15. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-14, где Fc-домен антитела или Fc-гибридного белка является Fc-доменом IgG.
16. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-15, где Fc-домен антитела или Fc-гибридного белка является Fc-доменом IgG человека.
17. Соединение-конъюгат по п. 16, где IgG человека представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
18. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-17, где Fc-гибридный белок содержит полипептид, который опосредует связывание с мишенью.
2
19. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-18, где Fc-гибридный белок содержит антигенсвязывающий домен, выбранный из группы, состоящей из: (a) scFv, (b) диатела, (c) Fd-области, (d) Fv-области, (e) TANDAB, (f) F(abʹ)-области, (g) FCAB™ и (h) F(ab)-области.
20. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-18, где Fc-гибридный белок содержит белковый каркас или миметик антитела.
21. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-17, где Fc-гибридный белок содержит полипептид, выбранный из группы, состоящей из: (a) лиганда, (b) фермента, (c) лиганд-связывающей части рецептора и (d) адгезивного белка.
22. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-21, где Fc-домен антитела или Fc-гибридного белка дополнительно содержит по меньшей мере один не встречающийся в природе аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 2341, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 2351, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 2401, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 2621, 262A, 262T, 262E, 2631, 263A, 263T, 263M, 264L, 2641, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 2651, 265L, 265H, 265T, 2661, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 2961, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 2981, 298T, 298F, 2991, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 3051, 313F, 316D, 325Q, 325L, 3251, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 3281, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 3301, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 3311, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y и 443W, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
23. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-22, где антитело представляет собой моноклональное антитело, биспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, химерное антитело, человеческое антитело или гуманизированное антитело.
24. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-23, где по меньшей мере один гетерологичный фрагмент представляет собой токсин, лекарственное средство, радионуклид, иммуномодулятор, цитокин, лимфокин, хемокин, фактор роста, фактор некроза опухоли, гормон, антагонист гормона, фермент, олигонуклеотид, ДНК, РНК, siRNA, RNAi, микроРНК, пептидо-нуклеиновую кислоту, фотоактивное терапевтическое средство, антиангиогенное средство, проапоптозное средство, не встречающуюся в природе аминокислоту, пептид, липид, углевод, каркасную молекулу, флуоресцентную метку, пептид для визуализации, биотин, средство, продлевающее период полувыведения из сыворотки, метку захвата, хелатирующее средство, твердую подложку или их комбинацию, и где конъюгирование осуществляют по одному из сконструированных остатков цистеина.
25. Соединение-конъюгат по п. 24, где лекарственное средство представляет собой азотистый иприт, производное этиленимина, алкилсульфонаты, нитрозомочевину, гемцитабин, триазен, аналог фолиевой кислоты, антрациклин, таксан, ингибитор COX-2, пиримидиновый аналог, пуриновый аналог, антибиотик, ингибитор фермента, эпиподофиллотоксин, координационный комплекс платины, алкалоид барвинка, замещенную мочевину, производное метилгидразина, средство, подавляющее выработку адренокортикоидов, антагонист гормона, эндостатин, таксол, камптотецин, SN-38, доксорубицин, аналог доксорубицина, антиметаболит, алкилирующее средство, антимитотическое средство, антиангиогенное средство, ингибитор тирозинкиназы, ингибитор mTOR, ингибитор белков теплового шока (HSP90), протеосомальный ингибитор, ингибитор HDAC, проапоптозное средство, метотрексат, CPT-11 или их комбинацию, и где конъюгирование осуществляют по одному из сконструированных остатков цистеина.
26. Соединение-конъюгат по п. 24, где лекарственное средство представляет собой ауристатин, тубулизин или пирролобензодиазепин (PBD).
27. Соединение-конъюгат по п. 26, где ауристатин представляет собой MMAE (монометилауристатин E) или MMAF (монометилауристатин F).
28. Соединение-конъюгат по п. 24, где лекарственное средство представляет собой майтанзиноид.
29. Соединение-конъюгат по п. 28, где майтанзиноид представляет собой N-2'-деацетил-N-2'-(3-меркапто-1-оксопропил)-майтанзин (DM1), N-2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин (DM3) или N-2'-деацетил-N-2'(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтанзин (DM4).
30. Соединение-конъюгат по п. 24, где токсин представляет собой абрин, бруцин, цикутоксин, дифтерийный токсин, ботулотоксин, шига-токсин, эндотоксин, тетанотоксин, коклюшный токсин, сибиреязвенный токсин, холерный токсин, фалкаринол, альфа-токсин, гелданамицин, гелонин, лотавстралин, рицин, стрихнин, тетродотоксин, сапонин, рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу I, стафилококковый энтеротоксин-A, противовирусный белок лаконоса, экзотоксин синегнойной палочки и эндотоксин синегнойной палочки или их комбинацию.
31. Соединение-конъюгат по п. 24, где хелатирующее средство представляет собой DTPA, EC, DMSA, EDTA, Cy-EDTA, EDTMP, DTPA, CyDTPA, Cy2DTPA, BOPTA, DTPA-MA, DTPA-BA, DTPMP, DOTA, TRITA, TETA, DOTMA, DOTA-MA, HP-DO3A, pNB-DOTA, DOTP, DOTMP, DOTEP, DOTPP, DOTBzP, DOTPME, HEDP, DTTP, триамидэтиол N3S, DADS, MAMA, DADT, диаминтетратиол N2S4, дитиолбисфосфин N2P2, 6-гидразиноникотиновую кислоту, пропиленаминоксим, тетраамин, циклам или их комбинацию.
51
57
18
153
159
68
166
115
113
112
111
131
125
123
121
140
177
54
99
103
32
142
149
186
188
105
97
153
47
75
85
35
99
201
113
117
3
133
169
175
90
65
32. Соединение-конъюгат по п. 24, где радионуклид представляет собой хром (Cr), кобальт (Co), фтор (F), гадолиний (Gd, Gd), германий (Ge), гольмий (Ho), индий (In, In, In, In), йод (I, I, I, I), лантан (La), лютеций (Lu), марганец (Mn), молибден (Mo), палладий (Pd), фосфор (P), празеодим (Pr), прометий (Pm), рений (Re, Re), родий (Rh), рутений (Ru), самарий (Sm), скандий (Sc), селен (Se), стронций (Sr), серу (S), технеций (Tc), таллий (Tl), олово (Sn, Sn), тритий (H), ксенон (Xe), иттербий (Yb, Yb), иттрий (Y), цинк (Zn) или их комбинацию.
33. Соединение-конъюгат по п. 32, где радионуклид присоединен к соединению-конъюгату с помощью хелатирующего средства.
34. Соединение-конъюгат по п. 24, где средство, продлевающее период полувыведения из сыворотки, включает альбумин, альбуминсвязывающий полипептид, PAS, β-субъединицу C-концевого пептида (CTP) хорионического гонадотропина человека, полиэтиленгликоль (PEG), гидроксиэтилкрахмал (HES), XTEN, альбуминсвязывающие малые молекулы или их комбинацию.
in vitro
in vivo
ex vivo
35. Соединение-конъюгат по п. 24, где пептид для визуализации обеспечивает визуализацию или определение расположения соединения-конъюгата , , или при любой их комбинации.
36. Соединение-конъюгат по п. 35, где пептид для визуализации представляет собой биотин-акцепторный пептид, акцепторный пептид с липоевой кислотой, флуоресцентный белок, цистеин-содержащий пептид для лигирования красителя, содержащего два атома мышьяка или для конъюгирования метастабильного технеция, пептид для конъюгирования клатратов из европия для анализов с определением расстояния на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) или любую их комбинацию.
37. Соединение-конъюгат по п. 36, где флуоресцентный белок представляет собой GFP, RFP, YFP, EGFP или EYFP.
38. Соединение-конъюгат по п. 36, где краситель, содержащий два атома мышьяка представляет собой 4ʹ,5ʹ-бис(1,3,2-дитиоарсолан-2-ил)флуоресцеин (FlAsH).
39. Соединение-конъюгат по п. 36, где биотин-акцепторный пептид способствует конъюгированию реактивов на основе авидина и стрептавидина.
40. Соединение-конъюгат по п. 36, где акцепторный пептид с липоевой кислотой способствует конъюгированию зондов с реакционноспособной тиольной группой со связанной липоевой кислотой или непосредственному лигированию флуоресцентных аналогов липоевой кислоты.
41. Соединение-конъюгат по п. 24, где метка захвата представляет собой биотин или His6-метку (SEQ ID NO: 1).
42. Соединение-конъюгат по п. 24, где флуоресцентная метка включает краситель флуоресцеинового типа, краситель родаминового типа, краситель данзилового типа, краситель лиссаминового типа, краситель цианинового типа, краситель фикоэритринового типа, краситель типа техасский красный и их комбинации.
43. Соединение-конъюгат по п. 24, где флуоресцентная метка представляет собой Alexa Fluor 488 C5-малеимид.
44. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-43, где гетерологичный фрагмент конъюгирован с одним из сконструированных остатков цистеина посредством линкера.
45. Соединение-конъюгат по п. 44, где линкер представляет собой расщепляемый линкер.
46. Соединение-конъюгат по п. 44, где линкер представляет собой нерасщепляемый линкер.
47. Соединение-конъюгат по п. 44, где линкер включает линкер непептидной природы.
48. Соединение-конъюгат по п. 47, где линкер состоит из линкера непептидной природы.
49. Соединение-конъюгат по п. 47 или 48, где линкер непептидной природы включает MC, val-cit, MC-val-cit, MC-val-cit-PABC, Mal-PEG2C2, Mal-PEG3C2, Mal-PEG6C2, MP, MPEG, SMCC, MBS, SMPT, LC-SPDP, BMPEO, SPP или SMPB.
50. Соединение-конъюгат по п. 44, где линкер включает пептидный линкер.
51. Соединение-конъюгат по п. 44, где линкер состоит из пептидного линкера.
52. Соединение-конъюгат по п. 50 или 51, где пептидный линкер содержит по меньшей мере две аминокислоты, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аминокислот.
53. Соединение-конъюгат по любому из пп. 50 или 51, где пептидный линкер содержит по меньшей мере 200, по меньшей мере 300, по меньшей мере 400, по меньшей мере 500, по меньшей мере 600, по меньшей мере 700, по меньшей мере 800, по меньшей мере 900 или по меньшей мере 1000 аминокислот.
54. Соединение-конъюгат по п. 50, где пептидный линкер содержит пептид формулы [(Gly)x-Sery]z, где x равен 1-4, y равен 0 или 1 и z равен 1-50 (SEQ ID NO: 2).
55. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-54, где сконструированное с цистеином антитело или Fc-гибридный белок специфично связывается по меньшей мере с одной мишенью.
56. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень является белком.
57. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень является отличной от белка.
58. Соединение-конъюгат по п. 55, где антитело или Fc-гибридный белок связывается с той же мишенью, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из абаговомаба, абатацепта, абциксимаба, адалимумаба, адекатумумаба, алемтузумаба, алтумомаба, афелимомаба, анатумомаба мафенатокса, анетумумаба, анрукизумаба, аполизумаба, арцитумомаба, аселизумаба, атлизумаба, аторолимумаба, бапинеузумаба, базиликсимаба, бавитуксимаба, бектумомаба, белимумаба, бертилимумаба, бесилезомаба, бевацизумаба, бициромаба браллобарбитала, биватузумаба мертанзина, кампата, канакинумаба, кантузумаба мертанзина, капромаба, катумаксомаба, цеделизумаба, цертолизумаба пэгола, цетуксимаба, кленоликсимаба, дацетузумаба, дакликсимаба, даклизумаба, деносумаба, детумомаба, дорлимомаба аритокса, дорликсизумаба, дунтумумаба, дуримулумаба, дурмулумаба, экромексимаба, экулизумаба, эдобакомаба, эдреколомаба, эфализумаба, эфунгумаба, элсилимомаба, энлимомаба пэгола, эпитумомаба цитуксетана, эфализумаба, эпитумомаба, эпратузумаба, эрлизумаба, эртумаксомаба, этанерцепта, этарацизумаба, эксбивирумаба, фанолезомаба, фаралимомаба, фелвизумаба, фонтолизумаба, галиксимаба, гантенерумаба, гавилимомаба, гемтузумаба озогамицина, голимумаба, гомиликсимаба, ибализумаба, ибритумомаба тиуксетана, иговомаба, имциромаба, инфликсимаба, инолимомаба, инотузумаба озогамицина, ипилимумаба, иратумумаба, келиксимаба, лабетузумаба, лемалезомаба, лебрилизумаба, лерделимумаба, лексатумумаба, лекситумумаба, либивирумаба, линтузумаба, лукатумумаба, лумиликсимаба, мапатумумаба, маслимомаба, матузумаба, меполизумаба, метелимумаба, милатузумаба, минретумомаба, митумомаба, моролимумаба, мотавизумаба, муромонаба, наколомаба тафенатокса, наптумомаба эстафенатокса, натализумаба, небакумаба, нерелимомаба, нимотузумаба, нофетумомаба мерпентана, окрелизумаба, одулимомаба, офатумумаба, омализумаба, ореговомаба, отеликсизумаба, пагибаксимаба, паливизумаба, панитумумаба, пасколизумаба, пемтумомаба, пертузумаба, пекселизумаба, пинтумомаба, приликсимаба, притумумаба, ранибизумаба, раксибакумаба, регавирумаба, реслизумаба, ритуксимаба, ровелизумаба, руплизумаба, сатумомаба, севирумаба, сибротузумаба, сиплизумаба, сонтузумаба, стамулумаба, сулезомаба, такатузумаба тетраксетана, тадоцизумаба, тализумаба, таплитумомаба паптокса, тефибазумаба, телимомаба аритокса, тенеликсимаба, теплизумаба, тицилимумаба, тоцилизумаба, торализумаба, тоситумомаба, трастузумаба, тремелимумаба, тукотузумаба целмолейкина, тувирумаба, уртоксазумаба, устекинумаба, вапаликсимаба, велтузумаба, вепалимомаба, визилизумаба, волоциксимаба, вотумумаба, залутумумаба, занолимумаба, зиралимумаба и золимомаба аритокса.
59. Соединение-конъюгат по п. 55, где антитело или Fc-гибридный белок содержит антигенсвязывающий участок из антитела, выбранного из группы, состоящей из абаговомаба, абатацепта, абциксимаба, адалимумаба, адекатумумаба, алемтузумаба, алтумомаба, афелимомаба, анатумомаба мафенатокса, анетумумаба, анрукизумаба, аполизумаба, арцитумомаба, аселизумаба, атлизумаба, аторолимумаба, бапинеузумаба, базиликсимаба, бавитуксимаба, бектумомаба, белимумаба, бертилимумаба, бесилезомаба, бевацизумаба, бициромаба браллобарбитала, биватузумаба мертанзина, кампата, канакинумаба, кантузумаба мертанзина, капромаба, катумаксомаба, цеделизумаба, цертолизумаба пэгола, цетуксимаба, кленоликсимаба, дацетузумаба, дакликсимаба, даклизумаба, деносумаба, детумомаба, дорлимомаба аритокса, дорликсизумаба, дунтумумаба, дуримулумаба, дурмулумаба, экромексимаба, экулизумаба, эдобакомаба, эдреколомаба, эфализумаба, эфунгумаба, элсилимомаба, энлимомаба пэгола, эпитумомаба цитуксетана, эфализумаба, эпитумомаба, эпратузумаба, эрлизумаба, эртумаксомаба, этанерцепта, этарацизумаба, эксбивирумаба, фанолезомаба, фаралимомаба, фелвизумаба, фонтолизумаба, галиксимаба, гантенерумаба, гавилимомаба, гемтузумаба озогамицина, голимумаба, гомиликсимаба, ибализумаба, ибритумомаба тиуксетана, иговомаба, имциромаба, инфликсимаба, инолимомаба, инотузумаба озогамицина, ипилимумаба, иратумумаба, келиксимаба, лабетузумаба, лемалезомаба, лебрилизумаба, лерделимумаба, лексатумумаба, лекситумумаба, либивирумаба, линтузумаба, лукатумумаба, лумиликсимаба, мапатумумаба, маслимомаба, матузумаба, меполизумаба, метелимумаба, милатузумаба, минретумомаба, митумомаба, моролимумаба, мотавизумаба, муромонаба, наколомаба тафенатокса, наптумомаба эстафенатокса, натализумаба, небакумаба, нерелимомаба, нимотузумаба, нофетумомаба мерпентана, окрелизумаба, одулимомаба, офатумумаба, омализумаба, ореговомаба, отеликсизумаба, пагибаксимаба, паливизумаба, панитумумаба, пасколизумаба, пемтумомаба, пертузумаба, пекселизумаба, пинтумомаба, приликсимаба, притумумаба, ранибизумаба, раксибакумаба, регавирумаба, реслизумаба, ритуксимаба, ровелизумаба, руплизумаба, сатумомаба, севирумаба, сибротузумаба, сиплизумаба, сонтузумаба, стамулумаба, сулезомаба, такатузумаба тетраксетана, тадоцизумаба, тализумаба, таплитумомаба паптокса, тефибазумаба, телимомаба аритокса, тенеликсимаба, теплизумаба, тицилимумаба, тоцилизумаба, торализумаба, тоситумомаба, трастузумаба, тремелимумаба, тукотузумаба целмолейкина, тувирумаба, уртоксазумаба, устекинумаба, вапаликсимаба, велтузумаба, вепалимомаба, визилизумаба, волоциксимаба, вотумумаба, залутумумаба, занолимумаба, зиралимумаба и золимомаба аритокса.
60. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой бактериальный антиген, а гетерологичный фрагмент представляет собой антибактериальное средство.
61. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой вирусный антиген, а гетерологичный фрагмент представляет собой противовирусное средство.
62. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой опухолевый антиген, а гетерологичный фрагмент представляет собой противоопухолевое средство.
63. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой грибковый антиген, а гетерологичный фрагмент представляет собой противогрибковое средство.
64. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой антиген паразитического организма, а гетерологичный фрагмент представляет собой противопаразитарное средство.
65. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой микоплазменный антиген, а гетерологичный фрагмент представляет собой противомикоплазменное средство.
66. Соединение-конъюгат по п. 55, где мишень представляет собой антиген дифференцировки или гистосовместимости, а гетерологичный фрагмент представляет собой цитотоксическое средство.
67. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-66, где сконструированное с цистеином антитело или Fc-гибридный белок содержит два или три сконструированных остатка цистеина, выбранных из:
(i) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положении 258 исходного антитела или его области и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями по Kabat 239 и 240 исходного антитела или его области;
(ii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положении 289 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(iii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положении 339 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(iv) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положении 435 исходного антитела или его области и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями по Kabat 239 и 240 исходного антитела или его области;
(v) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положении 442 исходного антитела или его области и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями по Kabat 239 и 240 исходного антитела или его области;
(vi) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 258 исходного антитела и второй замены на цистеин в положении 289 исходного антитела;
(vii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 258 исходного антитела и второй замены на цистеин в положении 339 исходного антитела;
(viii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 258 исходного антитела или его области и второй замены на цистеин в положении по Kabat 435 исходного антитела или его области;
(ix) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 258 исходного антитела или его области и второй замены на цистеин в положении по Kabat 442 исходного антитела или его области;
(x) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 435 исходного антитела и второй замены на цистеин в положении 289 исходного антитела;
(xi) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 435 исходного антитела и второй замены на цистеин в положении 339 исходного антитела;
(xii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом первой замены на цистеин в положении 435 исходного антитела или его области и второй замены на цистеин в положении по Kabat 442 исходного антитела или его области;
(xiii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 258 и 289 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(xiv) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 258 и 339 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(xv) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 258 и 435 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(xvi) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 258 и 442 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(xvii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 289 и 339 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
(xviii) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 339 и 435 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела; и
(xix) аминокислоты цистеина, являющейся результатом замены на цистеин в положениях 435 и 442 исходного антитела и являющейся результатом вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 исходного антитела;
где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
68. Нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированное с цистеином антитело или Fc-гибридный белок по п. 1.
69. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 68.
70. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 68 или вектор по п. 69.
71. Состав, содержащий соединение-конъюгат по любому из пп. 1-67 и разбавитель, носитель или наполнитель.
72. Фармацевтический состав, содержащий соединение-конъюгат по любому из пп. 1-67 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.
73. Изделие, содержащее фармацевтический состав по п. 71, контейнер и инструкцию по применению или этикетку.
74. Способ получения соединения-конъюгата по любому из пп. 1-67, включающий:
(i) осуществление мутагенеза по меньшей мере последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или Fc-гибридный белок, путем замены по меньшей мере кодона в положении 258 или 435 на кодон, кодирующий аминокислоту цистеин (C), или вставки кодона, кодирующего цистеин (C), между кодонами, кодирующими аминокислоты в положениях 239 и 240, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat;
(ii) экспрессию сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка;
(iii) выделение сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка и
(iv) осуществление реакции по меньшей мере одной сконструированной цистеиновой группы сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка с гетерологичным фрагментом.
75. Способ получения соединения-конъюгата по любому из пп. 1-67, включающий:
(i) функциональное связывание последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи или гетерологичный белок, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, представляющий собой Fc-участок, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, представляющий собой Fc-участок, содержит:
(a) по меньшей мере кодон, кодирующий цистеин в аминокислотном положении 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 или 439, или вставленный между кодонами, кодирующими аминокислоты в положениях 239 и 240, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat; или
(b) по меньшей мере кодон, кодирующий цистеин в аминокислотном положении 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 или 435, или вставленный между кодонами, кодирующими аминокислоты в положениях 239 и 240, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat; или
(c) по меньшей мере кодон, кодирующий цистеин в аминокислотном положении 258 или 435, или вставленный между кодонами, кодирующими аминокислоты в положениях 239 и 240, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat;
(ii) экспрессию сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка;
(iii) выделение сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка и
(iv) осуществление реакции по меньшей мере одной сконструированной цистеиновой группы сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка с гетерологичным фрагментом.
76. Способ по п. 74 или 75, где осуществление мутагенеза предусматривает сайт-направленный мутагенез.
77. Анализ для выявления связывания соединения-конъюгата по любому из пп. 1-67 с клеткой-мишенью, включающий:
(a) воздействие на клетки соединением-конъюгатом по любому из пп. 1-67 и
(b) определение степени связывания соединения-конъюгата с клетками-мишенями.
78. Способ выявления рака, аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний или нарушений у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту соединения-конъюгата по любому из пп. 1-67.
79. Способ лечения рака, аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний или нарушений у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту соединения-конъюгата по любому из пп. 1-67.
80. Способ по п. 78, дополнительно включающий применение дополнительной терапии, где дополнительная терапия выбрана из группы, состоящей из химиотерапии, биологической терапии, иммунотерапии, лучевой терапии, гормональной терапии и оперативного вмешательства.
81. Способ доставки гетерологичного фрагмента в клетку, включающий обработку клетки соединением-конъюгатом по любому из пп. 1-67.
82. Способ по п. 80, где соединение-конъюгат интернализуется клеткой.
83. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-67, где по меньшей мере 70% соединения-конъюгата остается интактным после 3 дней инкубирования в сыворотке.
84. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-67, где по меньшей мере 70% соединения-конъюгата остается интактным после 7 дней инкубирования в сыворотке.
85. Соединение-конъюгат по любому из пп. 1-67, п. 83 или 84, где конъюгат характеризуется снижением активности на менее, чем 50% в течение 7-дневного периода при инкубировании с сывороткой.
86. Соединение-конъюгат по п. 83, 84 или 85, где сыворотка выбрана из сыворотки грызуна, сыворотки собаки, сыворотки примата и сыворотки человека.
87. Соединение-конъюгат по п. 68 или 69, где инкубирование проводят при 4-37°C.
88. Соединение-конъюгат по любому из пп. 85-87, где активность определена в анализе с уничтожением клеток.
89. Способ получения соединения-конъюгата, включающий
осуществление реакции по меньшей мере одной сконструированной цистеиновой группы сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка с гетерологичным фрагментом, где Fc-домен антитела или Fc-гибридного белка содержит по меньшей мере одну сконструированную аминокислоту цистеин, выбранную из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 241, 243, 251, 253, 258, 264, 269, 271, 272, 274, 280, 281, 285, 288, 291, 293, 294, 296, 301, 307, 309, 311, 318, 329, 340, 341, 345, 357, 385, 386, 387, 401, 402, 411, 417, 433, 435 или 439, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
90. Способ по п. 84, где сконструированная аминокислота цистеин выбрана из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 241, 243, 251, 253, 258, 264, 271, 285, 288, 291, 296, 301, 307, 309, 311, 329, 385, 387, 433 или 435, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
91. Способ по п. 84, где сконструированная аминокислота цистеин выбрана из аминокислоты цистеина, являющейся результатом замен на цистеин в аминокислотных положениях 258 или 435, вставки аминокислоты цистеина между положениями 239 и 240 и их комбинаций, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
92. Способ по любому из пп. 84-86, где эффективность конъюгирования составляет по меньшей мере 50% от таковой, полученной при осуществлении реакции сконструированной цистеиновой группы сравнительного сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка с гетерологичным фрагментом с заменой на аминокислоту цистеин в аминокислотном положении 289, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.
93. Способ по любому из пп. 84-86, где эффективность конъюгирования составляет более 100% от таковой, полученной при осуществлении реакции сконструированной цистеиновой группы сравнительного сконструированного с цистеином антитела или Fc-гибридного белка с гетерологичным фрагментом с заменой на аминокислоту цистеин в аминокислотном положении 289, где нумерация аминокислотных положений приведена в соответствии с EU-индексом, как изложено у Kabat.