СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ
IMMUNOSTIMULANTS

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.
В последнее время много внимания уделяется изучению и разработке специфических средств, стимулирующих или подавляющих иммунные реакции организма. Стало очевидным, что положительное действие различных лекарственных препаратов связано с их способностью повышать общую сопротивляемость организма, его неспецифическую резистентность, либо стимулировать специфические иммунные реакции. Повышение общей сопротивляемости организма может наблюдаться под воздействием ряда активирующих средств (кофеин) и витаминов. Способностью увеличивать иммунную реактивность обладают производные нуклеиновых кислот (деринат), экстрактивные препараты вилочковой железы (тимолин, тактивин), лиофилизаты клеточной стенки бактерий (бронхо-мунал), рекомбинантные аналоги эндогенных человеческих интерлейкинов (ронколейкин, беталейкин) [6]. Однако для вышеперечисленных препаратов существует ряд противопоказаний: индивидуальная повышенная чувствительность, наличие сопутствующих патологий, развитие толерантности, возникновение аллергических реакций. Поэтому практически значимым является поиск лекарственных веществ природного происхождения. Многолетний опыт применения препаратов из растительного сырья показал их эффективность, а отсутствие токсического действия делает возможным использование данных препаратов у лиц с сочетанными патологиями [9].
Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, доктор Тайсс настойка эхинацеи) [8, 13]. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной. Доктор Тайсс - настойку листьев эхинацеи. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].
Целью изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств.
Поставленная цель достигается использованием в качестве иммуностимулирующего средства жидкого экстракта крапивы, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, в соотношении 1:1. Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160). Основными биологически активными веществами крапивы являются витамины К и С, полисахариды, каротиноиды, органические кислоты, дубильные вещества, минеральные соли. В современной медицинской практике листья крапивы используются в качестве кровоостанавливающего, ранозаживляющего, противовоспалительного и витаминного средства [7].
Новым в предполагаемом изобретении является то, что жидкий экстракт крапивы впервые предложен для использования в качестве иммуностимулирующего средства.
Использование жидкого экстракта крапивы, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола в качестве иммуностимулирующего средства в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у него новых свойств, а именно стимуляции гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа и неспецифической резистентности. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Жидкий экстракт крапивы можно использовать у больных с иммунной недостаточностью, при лечении хронических, вялотекущих и рецидивирующих заболеваний.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".
Новые свойства жидкого экстракта крапивы были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.
Для установления иммуностимулирующих свойств жидкого экстракта крапивы было изучено его влияние на гуморальный иммунный ответ, клеточный иммунный ответ, а также на неспецифическую резистентность организма. Жидкий экстракт крапивы получали методом реперколяции с помощью 40% этанола в соотношении 1:1. Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160). В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).
8
6
Эксперименты по изучению влияния экстракта крапивы (ЭК) на гуморальный иммунный ответ были проведены на 60 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 20 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 20 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 20 мышей получали деалкоголизированный ЭК, который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. При изучении гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) - 6×10/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ЭК, ЭП или дистиллированной воды. На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общепринятыми методами [4] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [12] и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА) [3].
7
8
Эксперименты по изучению влияния экстракта крапивы на клеточный иммунный ответ были проведены на 18 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 6 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 6 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 6 мышей получали деалкоголизированный экстракт крапивы (ЭК), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Для оценки влияния препаратов на клеточный иммунный ответ использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [10]. Через 24 часа после последнего введения экстрактов животных сенсибилизировали эритроцитами барана подкожно 1×10 в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена (1×10 в объеме 20 мкл) вводили на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей. В контралатеральную лапу в качестве контроля вводили физиологический раствор в равном объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Индекс воспаления (ИВ) определяли по разнице масс опытной и контрольной лап.
Эксперименты по изучению влияния экстракта крапивы на неспецифическую резистентность организма были проведены на 36 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 12 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 12 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 12 мышей получали деалкоголизированный экстракт крапивы (ЭК), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Оценку неспецифической резистентности проводили путем изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови в тесте поглощения частиц латекса на 4 и 7 сут после окончания введения [4].
Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства жидкого экстракта крапивы.
Пример 1
8
6
Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт крапивы, в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 6×10/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общее количество спленоцитов (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×10) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови. Курсовое введение настойки эхинацеи пурпурной приводило к достоверному увеличению относительного количества антителообразующих клеток на 4 и 7 сут после иммунизации и абсолютного числа антителопродуцентов на 4 сут эксперимента по сравнению с контролем (табл.1). Кроме того, отмечалось повышение титра иммуноглобулинов класса G на 4 сут. Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает, что курсовое 5-дневное введение экстракта крапивы приводило к увеличению общей клеточности лимфоидного органа на 7 сут исследования, относительного числа антителообразующих клеток и титра IgG относительно животных контрольной группы во все сроки эксперимента. По сравнению с мышами, получавшими настойку эхинацеи, было достоверно повышено относительное и абсолютное количество клеток-антителопродуцентов на 7 сут.
Таблица 1
Влияние экстракта крапивы (ЭК) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m)
Группа мышей
Показатели
Сроки исследования
4 сут
7 сут
Контроль (ЭБ)
ОКС, 10<sup>6</sup>/орган
159,20±16,50
149,8±7,71
АОК, %
7,36±0,10
7±0,21
АОК, 10<sup>6</sup>/орган
11,72±1,23
10,47±0,57
IgM, log<sub>2</sub>T
2±0,32
2,2±0,32
IgG, log<sub>2</sub>T
8,4±0,75
7,30±0,50
Опыт 1 (ЭП+ЭБ)
ОКС, 10<sup>6</sup>/орган
190,00±22,67
163,00±10,85
АОК, %
11,44±0,49*
5,64±0,19*
АОК, 10<sup>6</sup>/орган
21,89±3,20*
9,22±0,77
IgM, log<sub>2</sub>T
2±0,32
1,2±0,49
IgG, log<sub>2</sub>T
10,4±0,25*
10±0,32*
Опыт 2 (ЭК+ЭБ)
ОКС, 10<sup>6</sup>/орган
151,80±8,68
171,60±16,07*
АОК, %
9,12±0,44*#
8,48±0,32*#
АОК, 10<sup>6</sup>/орган
13,87±1,29#
14,30±1,70#
IgM, log<sub>2</sub>T
1,2±0,2
0,6±0,25
IgG, log<sub>2</sub>T
10,4±0,4*
9,6±0,4*
Примечания: здесь и в табл.2, 3
* - различия с соответствующими значениями контроля достоверны;
# - различия с соответствующими значениями группы «опыт 1» достоверны.
Пример 2
7
8
Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); животные 1-й опытной группы получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно; мыши 2-й опытной группы получали деалкоголизированный экстракт крапивы (ЭК), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Через 24 часа после последнего введения экстрактов животных сенсибилизировали эритроцитами барана подкожно 1×10 в объеме 100 мкл. Разрешающую дозу антигена (1×10 в объеме 20 мкл) вводили на 5 день после сенсибилизации под апоневротическую пластинку одной из задних конечностей. В контралатеральную лапу в качестве контроля вводили физиологический раствор в равном объеме. Учет интенсивности воспалительной реакции осуществляли через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена. Индекс воспаления (ИВ) определяли по разнице масс опытной и контрольной лап.
Таблица 2
Влияние экстракта крапивы и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на клеточный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m)
Группы мышей
Контроль
Опыт 1 (ЭП)
Опыт 2 (ЭК)
Индекс воспаления
18,05±1,04
18,53±1,96
27,33±1,45*#
Приведенные в таблице 2 результаты эксперимента свидетельствуют о существенном стимулирующем влиянии экстракта крапивы на процесс образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов.
Пример 3
Контрольным мышам вводили в Течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт крапивы (ЭК) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. На 4 и 7 сут после последнего введения оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент нейтрофилов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ).
Таблица 3
Влияние экстракта крапивы (ЭК) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей линии СВА/Са Lac (X±m)
Группа мышей
4 сут
7 сут
ФИ (%)
ФЧ
ФИ (%)
ФЧ
Контроль
22±1,22
2,06±0,23
17,25±1,80
3,79±0,62
Опыт 1 (ЭП)
32±3,91*
4,72±0,45*
23,8±2,13
4,52±0,23
Опыт 2 (ЭК)
41,8±3,81*#
7,46±0,74*#
26±3,45*
2,32±0,15
Приведенные в таблице 3 результаты этих опытов показывают, что экстракт крапивы существенно стимулирует поглотительную активность нейтрофилов периферической крови (по сравнению как с контрольной, так и 1 опытной группой) как за счет повышения доли нейтрофилов, способных поглощать латекс (ФИ), так и за счет увеличения количества поглощенных каждой клеткой частиц (ФЧ) на 4 сут эксперимента. К 7 сут фагоцитарная активность исследуемых клеток у животных 2-й опытной группы была также достоверно выше, чем у мышей контрольной группы.
Таким образом, жидкий экстракт крапивы проявляет иммуностимулирующие свойства, что выражается в усилении гуморального иммунного ответа (повышение количества антителообразующих клеток и титра специфических гемагглютининов), клеточного иммунного ответа (стимуляция процесса образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов) и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, превышающие по выраженности настойку эхинацеи пурпурной.
Источники информации
1. Амосова Б.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил. 2. - С.24-34.
2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.
3. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.211-218.
4. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер, В.В.Овод, В.К.Позур, Н.Е.Вихоть. - К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1989. - С.202-204.
5. Линов Б.М., Барнаулов О.Д., Крылов В.А. и др. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1986. - С.89-90.
6. Машковский М. Д. Лекарственные средства. Москва: Изд-во «Новая волна», 2006. - 1205 с.
7. Положий А.В., Гольдберг Е.Д., Гуреева И.И. Лекарственные растения Сибири. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1995. - 325 с.
8. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацеи (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.
9. Синяков А.Ф. Фитотерапия против рака. - М., 1997. - 198 с.
10. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.
11. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т.74. - №8. - С.7-12.
12. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - V.207, №5001. - P.1106-1107.
13. Percival S.S. Use of echinacea in medicine // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - №2. - Р.155-158.