Композиция для предотвращения агрегирования и повышения однородности культуры, увеличения продуктивности клеточных линий-продуцентов рекомбинантных белков
COMPOSITION FOR PREVENTING AGGREGATION AND HIGHER HOMOGENEITY OF CULTURE, INCREASING PRODUCTIVITY OF RECOMBINANT PROTEINS PRODUCING CELL LINES

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к композиции для предотвращения агрегирования и повышения однородности культуры, увеличения продуктивности, и может быть использовано при суспензионном культивировании клеток млекопитающих, а также для получения рекомбинантных антител IgG и IgA классов при экспрессии клеток млекопитающих.
Уровень техники
В настоящее время разработано и успешно применяется несколько бессывороточных сред для культивирования различных эукариотических клеток, и в частности СНО клеток. Однако необходимо отметить, что различные клеточные линии имеют специфический метаболизм и особенности использования питательных элементов. Известно, что при высокой плотности клеток продукция рекомбинантных антител может снижаться из-за агрегирования СНО клеток и вследствие этого ухудшения снабжения клеток кислородом и питательными веществами. Однако для целей Фарминдустрии требуется оптимизация уровня экспрессии иммуноглобулинов в СНО клетках. Некоторые авторы также сообщают об увеличении продукции терапевтических протеинов и улучшении роста клеток при добавлении к бессывороточной среде добавок, представляющих собой комбинации витаминов и гормонов, а также гормонов и неорганических солей (Morris А.Е., Schmid J. "Effects of insulin and LongR3 on serum-free Chinese Hamster Ovary cell cultures expressing two recombinant proteins", Biotechnol. Progr. 2000. Vol. 16. P. 693-697), что позволило выработать подход к замещению компонентов животного происхождения (Kim D.Y., Lee J.С., Chang Y.N., Duk J.О. "Effects of supplementation of various medium components on Chinese hamster ovary cell cultures producing recombinant antibody", Cytotechnology. 2005. Vol. 47. P. 37-49).
Согласно литературным данным фактор роста фибробластов оказывает влияние на рост клеток роговицы и стволовых клеток (deVere J.K., White R.W. "Fibroblast growth factor 2: its structure and property, paracrine function tumor angiogenesis, and prostate-related mitogenic and oncogenic functions", Urology, 2000. Vol. 55. P. 800-806). Многочисленные исследования подтверждают способность FGF-2 стимулировать пролиферацию эпителиальных клеток роговицы, стромальных фибробластов и эндотелиальных клеток in vitro, а также в культуре клеток и системах по выращиванию органов в культуре (Giguere L., Cheng J, Gospodarowicz D. "Factors involved in the control of proliferation of bovine corneal endothelial cells maintained in serum-free medium", J. Cell Physiol. 1982. Vol. 110. P. 72-80., Sun P., Shen L., Zhang C., Du L., Wu X. "Promoting the expansion and function of human corneal endothelial cells with an orbital adipose-derived stem cell-conditioned", Stem Cell Res. Ther. 2017. Vol. 8. N. 1. P. 287-296. Chmielowiec J., Borowiak M. "In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors". Rev. Diabet Stud. 2014. Vol. 11. N. 1. P. 19-34).
Известно из литературных данных, что добавление сульфата цинка может увеличивать продукцию антител IgG класса при добавлении к среде культивирования. В некоторых работах исследовалось влияние микродобавок к бессывороточным средам. Микроэлементы часто заменяют применение сыворотки в бессывороточных средах. Особенно важно наличие в составе сред таких элементов как Zn, Cu, Se, а также трикарбоновых кислот, необходимых для нормального роста клеток, в частности для поддержания функционирования ферментов (Arora М. Cell Culture Media: A Review. Mater Metods. 2018. Vol. 3. N175).
Известен состав питательной среды, включающий в том числе янтарную кислоту (RU 2558253 «Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих», 2014-02-10 или RU 2014104467 А, 2015-08-20). Однако данная среда содержит глутамин, а содержание янтарной кислоты не превышает 0,06 мМ, что не обеспечивает должных времени культивирования и продуктивности. Кроме того, в изобретении показано использование состава только для культивирования ВНК-21 (клетки почки сирийского хомячка).
Также известен состав для культивирования клеток млекопитающих, использующий в составе безбелковых сред хелат железа, хелат цинка и декстран сульфата (ЕР 1482031 А1 «Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof», 1996-08-30, 2004-12-01). Описанный способ принят за прототип изобретения. Общим признаком является использование в составе ионов железа и цинка. Недостатком является присутствие железа и цинка в составе хелатных соединений и декстрана сульфата в многокомпонентной среде, которые не предотвращают агрегирование клеток.
Таким образом известные композиции (составы) не обеспечивают возможность получения однородной суспензионной культуры. Использование компонентов не предотвращало образование клеточных агрегатов в среде культивирования, и как следствие не способствовало улучшению роста, плотности клеточных культур.
Краткое описание чертежей
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:
Фиг. 1 Влияние фактора роста фибробластов (FGF-2) на жизнеспособность и концентрацию клеток стабильной клеточной линии, продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела димерной формы IgA2m1-изотипа.
Фиг. 2 Влияние добавления в среду культивирования композиции фактора роста фибробластов и сульфата цинка на продуктивность стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантных моноклональных антител димерной формы IgA2m1-изотипа.
Фиг. 3 Сравнение влияния композиции декстрана сульфата и цитрата железа на рост и продуктивность стабильных клеточных линий IgG1- и IgA1-изотипов.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой, решаемой изобретением является повышение продуктивности при культивировании клеточных линий-продуцентов антител на основе СНО клеток в базовых средах.
Техническим результатом заявляемого изобретения является предотвращение агрегирования клеток культуры и получение однородных суспензионных культур клеток, что дает возможность использовать их для эффективной экспрессии стабильных клеточных линий продуцентов как IgG, так и IgA. Особенно это актуально для клеточных линий, продуцирующих димерные формы IgA, которые по причине особенностей своей структуры и гликозилированию склонны к образованию агрегатов клеток, что приводит к уменьшению плотности и жизнеспособности клеток, и как результат - к снижению продуктивности. Что позволяет заменить дорогостоящие питательные среды и добавки для культивирования клеточных линий продуцентов как IgG, так и IgA.
Изобретение включает разработанные многокомпонентные добавки к базовым бессывороточным средам IMDM (среда Искова IMDM - модификация среды Дульбекко) или DMEM, которые включают в себя: водный раствор фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), соли цинка, цитрат железа и декстран сульфат. Данное изобретение увеличивает однородность суспензионной культуры, повышает плотность культуры, увеличивает продолжительности времени культивирования и повышает уровень экспрессии рекомбинантных антител класса IgG и IgA.
Данное решение было найдено при использовании композиций к базовой среде. В качестве базовой среды использовали среду IMDM производства «Gibco», США; «БиолоТ», РФи«ПанЭко», РФ.
Заявляемая композиция для предотвращения агрегирования, повышения плотности и однородности культуры, повышению продуктивности включает водные растворы фактора роста фибробластов-2 с концентрацией 5.6-11.2 нг/мл и сульфата цинка с концентрацией до 8.3 μМ/мл, при этом дополнительно используют декстрана сульфат и цитрат железа, взятые в концентрации 0.15-0.33 мМ/мл и декстрана сульфат в концентрации до 50 мкг/мл.
Наилучший результат достигается при использовании композиции, содержащей фактор роста фибробластов (FGF-2), сульфат цинка, декстран сульфат и цитрат железа, при этом раствор FGF-2 содержится в концентрации 11.2-22.4 нг/мл, цитрат железа - 0.15-0.33 мМ/мл, сульфат цинка - до 8.3 μM/мл, декстран сульфата - до 50 мкг/мл.
Впервые было установлено, что использование предлагаемой многокомпонентной добавки к базовой среде позволяет повысить плотность, время культивирования и продуктивность клеточных линий-продуцентов рекомбинантных антител клеток при их суспензионном культивировании.
Известные питательные среды и ростовые добавки, предлагаемые для культивирования клеток СНО фирмами-производителями «Lonza», «Invitrogen», являются затратными с точки зрения финансов и времени доставки, так как изготавливаются за рубежом и импортируется в Российскую Федерацию. Например, среда CD OptiCHO («Invitrogen», США) предназначена для культивирования клеток СНО DG44. Однако для биотехнологического производства требуется большое количество среды и добавок, из-за чего возрастает стоимость препаратов на основе антител
Изобретение позволяет получить качественную и экономически выгодную питательную среду.
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения, которые более подробно описывают возможность осуществления заявляемого изобретения с достижением заявляемого технического результата.
Пример 1. Повышение концентрации, жизнеспособности клеток и продуктивности стабильной клеточной линии, продуцирующей рекомбинантные моноклональные антитела димерной формы IgA2m1-изотипа, при добавлении в среду культивирования фактора роста фибробластов (FGF-2).
В опыте используют суспензионную стабильную клеточную линию - продуцент рекомбинантных антител IgA2m1-изотипа, на основе клеточной линии СНО DG44 (dhfr-) (клетки яичников китайского хомячка). Клеточные культуры выращивают на бессывороточной базовой среде DMEM/F12 ("ПанЭко", РФ). Для определения влияния на продуктивность, плотность и жизнеспособность клеточных культур культивирования, эксперимент проводят в формате статических культур в 6-луночных планшетах в стандартных условиях выращивания при 37 С° и 8%CO2 и 96% влажности при непрерывном перемешивании со скоростью 130 об/мин.
Для сравнения эффекта влияния на рост клеточных культур-продуцентов антител IgA2m1-изотипа в качестве стимулятора роста, используют фактор роста фибробластов (FGF-2), полученный в лаборатории инженерии белка ИБХ РАН и добавку инсулина-трансферрин-селенита натрия (ITS) фирмы "Gibco". Стандартная добавка ITS обычно применяется для повышения плотности культуры и стимулирования роста, однако является недешевым реагентом, что повышает затраты на производство терапевтических иммуноглобулинов.
Для изучения влияния на рост СНО клеток, в среду для культивирования DMEM/F12 в разных концентрациях добавляют фактор роста фибробластов FGF-2: в конечной концентрации 5.6 нг/мл и 11.2 нг/мл.
В качестве контроля используют культуру клеток, культивируемую в среде с добавлением инсулина-трансферрина-селенита (ITS). Увеличение плотности клеточной культуры происходит на 5-й день культивирования, причем увеличение роста находится в зависимости от концентрации фактора роста фибробластов в культуре. На Фиг. 1А показано увеличение плотности культуры клеток при добавлении FGF-2 в базовую среду DMEM/F12. При добавлении в среду раствора фактора роста фибробластов в концентрации 5.6 нг/мл плотность культуры увеличивалась в 6 раз, а при концентрации FGF-2 11.2 нг/мл - в 6.7 раза, по сравнению с контрольным образцом.
Применение в качестве ростовой добавки фактора роста фибробластов показывает также его пролонгированное действие на поддержание плотности клеточной культуры и времени роста в течение 9 дней в базовой среде, в отличие от добавки ITS. При добавлении ITS к среде на 9-10-й день культивирования происходит существенное уменьшение плотности клеток и практическая гибель клеточной культуры. (Фиг. 1A)
На Фиг. 1B продемонстрирован эффект влияния фактора роста фибробластов на жизнеспособность клеток. Через 9 дней культивирования все образцы, которые культивируют на среде с использованием фактора роста фибробластов имеют высокую степень жизнеспособности - свыше 85%, наиболее высокая степень жизнеспособности порядка 94% остается только для образца, в который добавляют препарат FGF-2 в концентрации 11.2 нг/мл. (Фиг. 1B)
Измерение концентрации клеток и их жизнеспособности проводят с использованием красителя 0.4% раствора трипанового синего в камере Горяева.
Пример 2. Влияние композиции раствора фактора роста фибробластов и сульфата цинка на увеличение продуктивности стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантные моноклональные антитела димерной формы IgA2m1-изотипа.
В опыте используют суспензионную стабильную клеточную линию-продуцент рекомбинантных антител IgA2m1-изотипа, на основе клеточной линии СНО DG44 (dhfr-) (клетки яичников китайского хомячка). Клеточные культуры выращивают на бессывороточной базовой среде IMDM ("ПанЭко", РФ). Для определения влияния на продуктивность, плотность и жизнеспособность клеточных культур культивирования, эксперимент проводят в формате статических культур в 6-луночных планшетах в стандартных условиях выращивания при 37 С° и 8%CO2 и 96% влажности при непрерывном перемешивании со скоростью 130 об/мин.
Для определения влияния на продукцию антител IgA в бессывороточную базовую среду IMDM фирмы "ПанЭко" добавляют раствор сульфата цинка, а также комбинацию фактора роста фибробластов и сульфата цинка. Стерильный раствор сульфата цинка добавляли в концентрации 8.3 μМ/мл, а раствор FGF-2 - в концентрации 11.2 нг/мл. В качестве контрольного образца используют культуру клеток, выращенную в базовой среде IMDM без добавок.
Продуктивность определяют методом ИФА на 6-й и 10-й дни культивирования. На Фиг. 2 показано влияние композиции на увеличение продуктивности по сравнению с контрольным образцом. При использовании композиции фактора роста фибробластов и сульфата цинка на 10-й день роста увеличение концентрации антител по сравнению с контролем составило 30%.
При этом добавление только раствора сульфата цинка увеличивает продуктивность на 6-й день культивирования по сравнению с контрольным образцом и образцом, культивируемым на среде с композицией. Однако на 10-й день концентрация антител в среде становится меньше по сравнению с данными контрольного образца.
Использование фактора роста фибробластов способствует как увеличению плотности клеток, так и продолжительности времени их культивирования и, как следствие, увеличению продуктивности.
Пример 3. Влияние композиции декстрана сульфата с цитратом железа на пролиферативную активность и продуктивность стабильных клеточных линий двух изотипов иммуноглобулинов: мономера IgG1 и димерной формы IgA1.
Влияние композиции на гомогенность суспензионной культуры, демонстрируют на стабильных клеточных линиях, продуцирующих разные классы иммуноглобулинов: IgG1 и IgA1. Для определения влияния как на продуктивность, так и на время культивирования, опыт проводят в формате статических культур в 6-луночных планшетах в стандартных условиях выращивания, упомянутых выше. В качестве контроля для культивирования используют среду IMDM без добавок. В качестве образца для сравнения в базовую среду добавляют реагент" - "Anti-clumping reagent” фирмы "Gibco".
В качестве композиции для базовой среды используют натриевую соль декстрана сульфата в конечной концентрации 50 мкг/мл и цитрат железа в 2-х концентрациях: 0.33 мМ/мл или 0.15 мМ/мл. Влияние на образование агрегатов в клеточных культурах и продолжительность их культивирования оказывает композиции натриевой соли декстрана сульфата в конечной концентрации 50 мкг/мл и цитрата железа в 2-х конечных концентрациях: 0.33 мМ/мл и 0.15 мМ/мл. В контрольном образце клеточной культуры, растущем на базовой среде IMDM без добавок, и образце клеточной культуры, растущем на базовой среде IMDM с "Anti-clumping reagent", Ha 7-й день культивирования происходило формирование клеточных агрегатов, в то время как образцы, растущие на базовой среде с исследуемыми добавками имеют гомогенный формат. Однако следует отметить различия для клеточных линий- продуцентов антител IgG1 - и IgA1-изотипов.
На Фиг. 3, А и Б представлена диаграмма роста и жизнеспособности культур.
6
Для клеточной линии - продуцента антител IgG1-изотипа наибольшую плотность 3.9×10 кл/мл показывают образцы с добавкой натриевой соли декстрана сульфата в конечной концентрации 50 мкг/мл, что является высоким показателем для культивирования в среде (Фиг. 3, А).
Результаты, полученные при культивировании клеточной линии-продуцента антител IgA1-изотипа, демонстрируют, что плотность клеток как с добавлением композиций, так и без них имеют близкие значения. Однако образцы культур, в которые добавляют комбинации из натриевой соли декстрана сульфата в конечной концентрации 50 мкг/мл и цитрата железа в 2-х вариантах концентраций продолжают рост на 11-й день культивирования, в то время как жизнеспособность других образцов снижается ниже 40%. Таким образом, добавление натриевой соли декстрана сульфата и цитрата железа повышает однородность культуры и увеличивает время культивирования клеточной линии-продуцента антител IgA1-изотипа (Фиг. 3, Б)
На Фиг. 4, А и Б представлена диаграмма продуктивности для клеточных-линий продуцентов IgG1 и IgA1-изотипов.
Продуктивность клеточной линии - продуцента IgA1 при культивировании в среде с добавлением натриевой соли декстрана сульфата в конечной концентрации 50 мкг/мл и цитрата железа в концентрации 0.33 мМ превосходит значения для контрольного образца культуры, растущего в среде без добавок, и образца, культивируемого в среде с добавлением "Anti-clumping reagent", образцов с добавлением декстрана сульфата или с композицией декстрана сульфата с цитратом железа при концентрации 0.33 мМ/мл - на 62%, 33%), 90% и 123%, соответственно (Фиг. 4, Б).
Результаты продуктивности для клеточной линии-продуцента антител IgG1-изотипа демонстирируют, что продуктивность культуры при использовании композиции с добавлением натриевой соли декстрана сульфата при концентрации цитрата железа 0.33 мМ превосходит контрольный и другие образцы (Фиг. 4, А).