Способ определения иммунодефицитных состояний на основании определения внутриклеточных витаминов
METHOD FOR DETERMINING IMMUNODEFICIENCY STATES BASED ON DETERMINING INTRACELLULAR VITAMINS

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к исследованию биологических материалов.
Известно, что витамины являются биологическими катализаторами и их основная задача усиливать биологические процессы в организме человека, а их недостаток вызывает развитие различных заболеваний [12]. Витамины обладают модулирующей активностью на иммунную систему, но неизвестно какие именно витамины обладают такой активностью. У большинства людей выявляется полигиповитаминоз независимо от возраста, места проживания и профессиональной принадлежности [10, 11, 17]. Помимо этого витамины А, Е, С в организме человека защищают ткани и клетки в антиоксидантной системе, которая по исследованиям на севере находится на сниженном уровне [1, 2, 16].
Известны способы диагностики иммунодефицитных состояний:
- Способ диагностики иммунодефицитного состояния (RU 2179316 С2), сущностью изобретения является проведение оценки как процентного содержания Т-клеток в периферической крови относительно региональной нормы, так и иммунореактивности клеток в нагрузочном тесте розеткообразования in vitro с Т-активином и определение показателя относительного содержания Т-клеток (ПОТ) и показателя реактивности Т-клеток (ПРТ). Техническим результатом является диагностика иммунодефицитных состояний, определение компенсированных и декомпенсированных форм.
- Способ определения иммунодефицитных состояний (SU 1654748 А1) заключается в определении уровня экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на поверхности иммунокомпетентных клеток с помощью хемилюминесцетного метода.
- Способ диагностики вторичного иммунодефицита (RU 2137129 С1), исследуют кровь и определяют формулу расстройств иммунной системы путем выбора трех наиболее отличающихся от нормы показателей. Отбор осуществляют с помощью критерия диагностической значимости из Т-, В-лимфоцитов и Jg A, G, М. Диагностику осуществляют для конкретной патологии по таблице.
- Способ диагностики вторичных иммунодефицитных состояний человека, связанных с химическим контаминантом (RU 2452963 C1), отбирают пробы биологического материала из ротоглотки или из полости носа, осуществляют выделение ДНК. Проводят полимеразную цепную реакцию (далее ПЦР) с использованием одновременно трех праймеров: LMP гена Эпштсйна-Барр (ЭБВ), MIE гена цитомегаловируса (ЦМВ), pol гена вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6). В качестве внутреннего контрольного образца (ВКО) используют В-глобиповый ген человека. По полученным в процессе ПЦР-амплификации данным рассчитывают количественное содержание в исследуемой пробе конкретной вирусной ДНК по формуле. Для каждой вирусной ДНК определяют индекс, в пробе крови устанавливают количественное содержание химического контаминанта, техногенно значимого на территории проживания, определяют наличие или отсутствие превышения этого контаминанта над его референтным значением, находят сумму индексов ЭБВ, ЦМВ, ВГЧ-6 и при ее значении более 1.0 и при одновременном превышении концентрации химического контаминанта в крови диагностируют вторичное иммуполефицитное состояние.
Все описанные варианты диагностики относятся к сложным инструментальным методам определения иммунодефицитных состояний у человека, при этом, если их вводить в качестве лабораторного исследования, то стоимость таких способов диагностики остается на высоком уровне.
Технической задачей данного изобретения является определение наличия иммунодефицитного состояния на основании содержания внутриклеточных витаминов в основных клетках крови (нейтрофилах, лимфоцитах, сыворотки).
Технический результат достигается выделением основных клеток крови (нейтрофилов, лимфоцитов и сыворотки) с последующим определением в данных популяциях (лимфоциты, нейтрофилы, сыворотка крови) содержания внутриклеточных витаминов А, Е, В1, В2, В6 и сравнении их концентраций С. Снижение концентрации внутриклеточного витамина В1 в лимфоцитах и нейтрофилах, а также снижение внутриклеточного витамина Е в нейтрофилах ниже нормативного показателя говорит о наличие иммунодефицитного состояния.
Преимущества данного способа определения иммунодефицитных состояний заключаются в простоте проведения анализа, невысокой стоимости проведения исследования, высокая достоверность полученных результатов.
В исследуемую группу вошли жители г. Архангельска родившиеся и проживающие на территории Архангельской области входящие в 1 и 2 группу здоровья, на момент сдачи крови не имевших воспалительных и обострения хронических заболеваний в количестве 273 человека в возрасте 18-30 лет. Общий анализ крови проводили с определением содержания лейкоцитов, эритроцитов, подсчет лейкоцитарной формулы и определяли содержание гемоглобина на гематологическом анализаторе ВС 3000 производства Германии.
Кровь забирали в 2 вакутейнера: для получения сыворотки использовали вакутейнеры без реагента, для выделения лимфоцитов и нейтрофилов вакутейнеры с гепарином.
Сыворотку получали путем центрифугирования вакутейнеров без наполнителя в течение 10 минут при 3000 об/мин.
Выделение лимфоцитов и нейтрофилов проводили в двойном градиенте плотности, для выделения лимфоцитов плотность составляла 1,077 г/мл, нейтрофилов 1,091 г/мл и отмывали 3 раза средой 199 при 1000 об/мин. Подсчитывали абсолютное количество лимфоцитов и нейтрофилов, проверяли цитологически процент клеток в каждом анализе.
Для фенотипирования лимфоцитов использовали непрямую иммунофлюоресцентную реакцию с использованием мышиных моноклональных антител производства НПЦ "МедБиоСпектр" г. Москва. Определяли лимфоциты с рецепторами CD5+, CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD25+, CD71+, HLA-DR+, CD22+, CD95+. Подсчет клеток проводили с помощью флуоресцентного микроскопа МИКМЕД - 2 вариант 11 производства фирмы Люмэкс Россия.
Фагоцитарную реакцию проводили с использованием убитой культуры Staphylococcus aureys содержащей 1 млн. убитой культуры на 1 мл в физиологическом растворе. Определяли процент активных клеток способных поглощать клетки микроорганизма (% активных нейтрофилов) и среднее число клеток поглощенное 1 нейтрофилом. Делали мазок, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимза, подсчет клеток проводили на микроскопе МИКМЕД-5 производства Россия.
Содержание Витаминов А (ретинол) и Е (α-токоферол) определяли в сыворотке и клеточной суспензии лимфоцитов и нейтрофилов по методу предложенному Черняускене Р.Ч. с соавторами [15]. Витамин В1 (тиамин) определяли тихромным методом [14]. Концентрацию витамина В6 определяли по способу предложенному Курсона и Броуна [14]. Содержание витамина В2 (рибофлавин) определяли люмифлавиновым методом [3]. Об обеспеченности витамином С судили по концентрации в плазме крови аскорбиновой кислоты, определяемой микрометодом визуального титрования реактивом Тильманса (2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия) [13]. Определение витаминов Е, А, В1, В2, В6 и С проводили в лизированных лимфоцитах и нейтрофилах, концентрацию витаминов пересчитывали на 3,5×109×100 кл Коэффициент 100 взят для перевода полученной концентрации на содержание витаминов в сыворотке, для установления одинаковых уровней в сыворотке и внутри клеток. Определение флюоресценции проводили на спектрофлюориметре флюорат-02-панорамма производства фирмы Люмэкс Россия. Супероксиддисмутазу (СОД) определяли в сыворотке и клетках по методу Е.Е. Дубининой [6].
Определение витамина Д (25-гидроксивитамин Д) проводили методом ИФА производства фирмы DRG, германия, определение проводили на риддере Anthos 2020 производства Швеция.
Исследуемые образцы делили на группы по физиологической активности рецепторов лимфоцитов [5]. В первую группу вошли лица, имеющие физиологические значения иммунных показателей (85 человек), во вторую группу вошли люди с лабораторно выявленным иммунодефицитом (188 человек). В каждом случае проводили определение клеточного иммунитета и концентрацию витаминов в сыворотке, лимфоцитах и нейтрофилах выявляли взаимосвязи между клеточным иммунитетом и концентрацией сывороточных и внутриклеточных витаминов.
На момент сдачи крови общий анализ крови, в каждом конкретном случае, соответствуют нормативным показателям [9]. Содержание лейкоцитов находилось в пределах физиологической нормы 6,34±0,11×109 кл/л. Относительное содержание лимфоцитов в среднем составляет 29,27±0,16%, в абсолютная концентрация 2,34±0,13×109 кл/л. Содержание моноцитов в относительных единицах находилось в пределе 5,94±0,09%, абсолютное содержание моноцитов составило 0,42±0,06×109 кл/л. Содержание эозинофильных лейкоцитов в абсолютных и относительных единицах находились (соответственно 0,07±0,03×109 кл/л; 1,03±0,07%). Нейтрофильные лейкоциты в относительных единицах составило 59,86±0,12%, а абсолютных единицах 4,27±0,10×109 кл/л.
Содержание эритроцитов находится в пределе 4,38±0,15×1012 кл/л, гемоглобина 164,32±0,28 г/л, тромбоцитов 250,08±0,64×109 кл/л.
По литературным данным известно, что на территории Европейского севера выявляется дисбаланс иммунных реакций, при этом у жителей наблюдается снижение активных клеток относительно физиологической нормы и эти изменения связывают с неблагоприятным экологозависимым иммунодефицитом [5, 7, 18].
Содержание фенотипов лимфоцитов в периферической крови в зависимости от группы приведено в таблице 1. Проведенный анализ показывает, что в группе с референтными значениями иммунной системы показатели клеточного иммунитета находятся в нормальных значениях и ни один показатель не вышел за пределы физиологической нормы [8].
В группе с лабораторно выявленным иммунодефицитом концентрация Т-лимфоцитов была снижена на 26% активных Т-лимфоцитов (CD3+), а так же снижено содержание CD5+ на 37%.
Выявляется снижение содержания в периферической крови дифференцированных лимфоцитов, так содержание CD4+ было снижено на 45%, CD8+ на 47%, a CD16+ на 66%.
Изменение содержания активированных лимфоцитов характеризуется схожей динамикой и показывает стойкое снижение активных клеток в группе с лабораторно выявленным иммунодефицитом. Так концентрация Т-лимфоцитов с рецептором к интерлейкину 2 снижена на 60%, Т-лимфоцитов с рецептором к трансферрину (CD71+) снижено на 53%, а клеток с молекулой к главному комплексу гистосовместимости 2 типа (HLA Dr+) снижено на 49%.
Снижение содержания в периферической крови В-лимфоцитов (CD22+) и клеток с маркером CD95+ фиксируется на уровне: 67% (В-лимфоциты) и 45% (CD95+).
Распределение витаминов относительно групп в сыворотке, лимфоцитах, нейтрофилов и активности супероксиддисмутазы приведено в таблице 2. В результате было получено, что изменение содержания витамин (А, Е, В6) в сыворотке крови как у людей в группе с иммунодефицитом, так и с физиологической нормой иммунных показателей изменяется незначительно. Более выраженные изменения наблюдаются в содержании сывороточных витаминов В2 и В1. Так в группе людей с физиологической нормой концентрация этих витаминов находится на более высоком уровне, чем в группе с дефицитом иммунных реакций. Концентрация витамина В2 в сыворотке крови у людей с физиологической нормой составляет 9,92±1,12 мкг/100 мл, что в средних результатах ниже физиологической нормы (дефицит содержания выявляется у 37,6%). В группе с дефицитом клеточного иммунитета концентрация рибофлавина находится на уровне 7,56±0,11 мкг/100 мл, при этом дефицит выявляется в 100% случаях. Содержание витамина В1 в группе с нормой иммунных показателей составляет 0,412±0,09 мкг/100 мл, а в группе с иммунодефицитом - 0,36±0,08 мкг/100 мл. Содержание витаминов В2 и В1 находится на нижнем уровне уровне нижней физиологической нормы (физиологическая норма В2, 12-25 мкг/100 мл, а В1 - 0,5-1,2 мкг/100 мл) дает основание говорить о нормальном функционировании иммунной системы. Концентрация аскорбиновой кислоты в группе с нормальными значениями рецепторов лимфоцитов находилось на уровне 3,36±0,36 мг/л, что выше, чем в группе с дефицитом (2,07±0,33 мг/мл). Нормальные значения показателей выявляются в группе с нормальными показателями иммунитета у 24, 13%, а в группе с иммунодефицитом в 21,84% случаев.
Относительно концентрации витамина Д, то установлено повышение содержание в группе с физиологическим состоянием иммунитета. Но при этом в группе с физиологической нормой содержания витамина Д, нормальное функционирование иммунной системы выявлена у 74%, в то время как норма витамина Д в группе с иммунодефицитом составляет 21%. Таким образом сывороточная концентрация витамина Д не является маркером состояния иммунной системы человека.
Активность SOD в сыворотке крови по группам характеризовалась незначительным снижением активности фермента в группе с физиологическими значениями относительно физиологической нормы и составила 4,01±0,53 ед, но при этом находилась на повышенном уровне относительно группы с иммунодефицитом.
Изменение внутриклеточных витаминов в лимфоцитах по группам характеризовалось тенденцией к снижению концентрации витаминов А, Е, В2 и В6 в группе с физиологическими значениями клеточного иммунитета (таблица 2). Установлено, что концентрация тиамина находилась на повышенном уровне в группе с физиологической нормой относительно группы с дефицитом (0,31±0,17 мкг/3,5×109×100 кл), в группе с физиологической нормой (0,43±0,12 мкг/3,5×109×100 кл).
Активность SOD в лимфоцитах характеризуется повышенным уровнем активности данного фермента в группе с физиологической нормой, что составило 27,21±3,64 ед, а в группе с дефицитом снижение активности супероксиддисмутазы (20,95±4,13 ед)
Характерной особенностью фагоцитарной реакции было, что в группе с физиологической нормой рецепторной активности лимфоцитов, у всех обследованных фагоцитоз находился в референтных значениях (больше 50% активных клеток), в то время как в группе с дефицитом физиологическая норма определялась только у 13,6% (Таблица 2). Содержание внутриклеточных витаминов в нейтрофилах показало тенденции к снижению концентрации витаминов А, В2, В6 и С в группе с физиологической нормой активности рецепторов лимфоцитов. В группе с физиологической нормой выявляются повышение концентрации витаминов Е и В1 относительно группы с дефицитом. Концентрация витамина Е в группе с нормой составляет 0,189±0,05 мкг/3,5×109×100 кл в то время как в группе с дефицитом содержание α-токоферола находится на уровне 0,081±0,02 мкг/3,5×109×100 кл. Содержание тиамина в группе с физиологическими значениями рецепторов лимфоцитов составляет 0,21±0,05 мкг/3,5×109×100 кл, а в группе с дефицитом 0,15±0,03 мкг/3,5×109×100 кл.
В нейтрофилах активность SOD изменялась по тому же принципу, как и сыворотке и лимфоцитах и показывало повышенную активность в группе с физиологической нормой (30,16±4,66 ед), а группе с дефицитом 22,57±4,14 ед.
Таким образом, концентрация витамина В1 в лимфоцитах и нейтрофилах является маркером иммунодефицитного состояния, при этом если концентрация витамина в лимфоцитах 0,4 мкг/3,5×109×100 кл, нейтрофилов 0,2 мкг/3,5×109×100 кл показывает наличие иммунодефицитного состояния.
Концентрация внутриклеточного витамина Е в нейтрофилах ниже 0,13±0,05 мкг/3,5×109×100 кл, также выявляется иммунодефицитное состояние.
Список литературы
1. Абубакирова О.Ю. Десинхроз суточного ритма показателей гемостаза, перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при перемещениях человека в условиях Заполярья // Бюллетень СГМУ. - 2010, №1. с. 178.
2. Борисенков Н.Ф., Пермилова Е.В., Косова А.А. Влияние светового и электромагнитного излучения на суточный ритм общей антиоксидантной активности слюны человека на Севере // Успехи геронтологии. - 2008, №3. - с. 474.
2
3. Вржесинская О.А., Коденцова В.М., Рисник В.В., Спиричев В.Б. Сравнение флуоресцентных методов определения концентрации В в крови / Вопросы питания. - 1991. - №4. - С. 67.
4. Горбачёв В.В., Горбачёва В.Н. Витамины, микро- и макроэлементы. Справочник. Мн.: Книжный Дом; Интерпрессервис. - 2002. - с. 554.
5. Добродеева Л.К., Сенькова Л.В., Московская Н.Б. Экологически зависимые изменения иммунитета на Севере. Тр. Коми науч. центра УрО РАН, - 1997. - №152 - С. 97.
6. Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисмутазы эритроцитов и плазмы крови человека // Лаб. дело. - 1983. - N10. - С. 30-33.
7. Жилина Л.П., Типисова Е.В., Дюжикова Е.М., Московская Н.Б., Кашутин С.Л., Щеголева Л.С., Добродеева Л.К. Иммунологическая реактивность человека на Севере // Физиологические закономерности гормональных, метаболических, иммунологических изменений человека на европейском Севере. - Сыктывкар, 1997, - С. 117-139.
8. Козинец Г.И. Физиологические системы организма человека, основные показатели. - М., «Триада-Х». - 2000. - С. 336.
9. Комаров Ф.И., Коровкин Б.Ф. Биохимические показатели в клинике внутренних болезней: Справочник / М.: МЕДпресс-информ. - 2006. - С. 208.
10. Конь И.Я. Шилина Н.М. Витаминная недостаточность / Лечащий врач. - 2005, №7. С. 64.
11. Кудрин А.В., Скальный А.В., Жаворонков А.А., и др. Иммунофармакология микроэлементов, М.: Изд-во КМК. - 2000. - С. 481.
12. Кукес В.Г., Тутелян В.А. Витамины и микроэлементы в клинической фармакологии. М. «Палея». - 2001. - С. 489.
13. Методы оценки обеспеченности населения витаминами. Теоретические и клинические аспекты науки о питании / Под ред. М.Н. Волгарева. - М: НИИ питания РАМН, 1987. - 8. - 210 с
14. Петрунькина A.M. Практическая биохимия. - Гос. изд-во мед. литературы МЕДГИЗ Ленинградское отделение. - 1961. - С. 427.
15. Черняускене Р.Ч., Варшкявичене 3.3., Грибаускас П.С. Одновременное флюорометрическое определение концентрации витаминов Е и А в сыворотке крови/ Лабораторное дело. - 1984. - №.6 - С. 362.
16. Шадрина В.Д. Сезонная динамика активности ферментов антиоксидантов у женщин на Европейском Севере России // Экология человека. - 2007, №8. - с. 43.
17. Ших Е.В. Витаминно-минеральная недостаточность / Русский медицинский журнал. - 2004, №21. - С. 11.
18. Щеголева, Л.С. Результаты исследования иммунного статуса у человека в условиях Севера / Л.С. Щеголева, Л.К. Добродеева. Иммунология. - 2003. - Том 24 N 3 - с. 177.
19. Ярилин А.А.. Основы иммунологии. - М.: Медицина. - 1999. - С. 608.