ПРИМЕНЕНИЕ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО АГЕНТА ПРИ ЛЕЧЕНИИ ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
USE OF PLANT EXTRACT AS ACTIVE AGENT IN TREATMENT OF DERMATOLOGICAL DISEASES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к применению экстракта Salvia haenkei в качестве активного агента при лечении дерматологических заболеваний, которое способно внести значительный вклад в регенерацию ткани. Кроме того, настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей экстракт Salvia haenkei и подходящие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, для применения при лечении дерматологических заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Многие кожные заболевания приводят к гипертрофии рогового слоя эпидермиса, явлению, известному также как гиперкератинизация. Утолщенный поверхностный слой эпидермиса вызывает образование шелушащихся пятен на поверхности кожи. Эти пятна являются общим проявлением серии заболеваний под названием ихтиоз из-за их схожести с чешуей рыбы. Пятна могут являться симптомами болезни, связанной с нижележащими слоями кожи, но однажды появившись, сами пятна препятствуют местному лечению заболевания, их вызвавшего. Кроме того, при этом гипертрофированные слои кожи также могут содержать в себе инфекции.
Типичные примеры ихтиоза не вполне ясной этиологии включают в себя псориаз, розовый лишай Жибера, розацею и себорейный дерматит. Эти заболевания обычно лечат симптоматически кератолитическими средствами для удаления пятен и глюкокортикоидами для ослабления воспаления. Дерматомикоз является ихтиозом, вызванным грибковыми инфекциями. Гифы и споры затрагивают только нежизнеспособные участки тканей, а затем разрастаются в гиперкератинизированные ткани кожи, волос и ногтей. Примеры типичного дерматомикоза включают в себя tinea capitis, tinea pedis (дерматофития стоп), tinea faciei, tinea corporis and tinea unguium. Эти заболевания лечатся противогрибковыми препаратами и местно кератолитическими средствами для удаления ороговевшего и инфицированного слоя.
Кожные заболевания также могут быть вызваны гормональным дисбалансом. Этот дисбаланс может привести к повышению уровней тестостерона, как в пубертатном периоде. Тестостерон преобразовывается в дигидротестостерон (ДГТ) в тканях-мишенях, в том числе и в сальных железах. При распространенном дерматологическом заболевании акне, ДГТ связывается с рецепторами в пилосебацейный комплекс и стимулирует избыточную секрецию себума. Себум выступает в качестве питательного вещества для таких бактерий, как Propionibacterium acnes, которые поражают сальные железы и приводят к воспалительной реакции и патологическому «коронованию» кожи. Акне обычно лечится с помощью антибактериальных и антисептических препаратов, а также таких кератолитических агентов, как салициловая кислота или ретиноевая кислота, для удаления гиперкератинизированной ткани.
Термины «экзема» и «дерматит» используются взамен общепринятых для указания на сильно выраженное воспаление кожи, обычно сопровождаемое покраснением, отечностью, мокнутием, образованием чешуек и зудом. Экзема может принимать форму контактного дерматита или атопического дерматита у людей «атопичных» или аллергичных по природе. Если затронута кожа головы, то заболевание именуется себорейным дерматитом. Дерматит может быть вызван химическими веществами, растениями, одежными тканями, металлическими материалами и даже лекарственными препаратами.
Атопический дерматит является хронической или хронической рецидивирующей экземой, вызванной иммунологическими или неиммунологическими факторами. Первые включают в себя пищевые аллергены, летучие вещества или контакт, последние - внешние раздражители, инфекции, нейровегетативные расстройства, нарушения липидного обмена, потоотделение и стресс. Атопический дерматит характеризуется снижением эпидермальных церамидов, которое приводит к ослаблению барьерной функции кожи, повышению чувствительности и повышению трансэпидермальной потери воды, которое может возрастать при сопутствующем воспалительном состоянии эпидермиса. Это облегчает проникновение в кожу аллергенов и гаптенов, которые связываются с кератиноцитами и клетками Лангерганса, активируя их. Кожа, пораженная дерматитом, более подвержена инфекциям благодаря повышенным уровням таких воспалительных цитокинов, как ИЛ-4 или ИЛ-13.
Такие кожные заболевания, как вышеописанные, могут лечиться известными препаратами, однако, важно помнить о том, что иногда лекарственные препараты сами могут быть причиной кожных реакций и, что их применение, тем не менее, должно быть максимально возможно ограничено.
Задачей настоящего изобретения является, таким образом, обеспечение эффективного лечебного средства для лечения дерматологических заболеваний, которое при этом хорошо переносится организмом и может использоваться в течение длительных периодов времени, при минимальных побочных эффектах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Указанная цель достигается использованием экстракта Salvia haenkei в качестве активного агента при лечении дерматологических заболеваний, как сообщается в пункте 1.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт Salvia haenkei и соответствующие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, для применения при лечении дерматологических заболеваний.
Применительно к целям настоящего изобретения, вышеуказанными дерматологическими заболеваниями являются ихтиоз, избыточная секреция себума, бактериальная инфекция, дерматомикоз, акне, псориаз, себорейный дерматит, розацеа, перхоть, алопеция, аллергический дерматоз, уртикария, склеродермия, контактный дерматит, атопический дерматит, хронический актинический дерматит, фотодерматит.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт Salvia haenkei и не менее одного из активных дерматологических компонентов, выбранных из противовоспалительных агентов, препаратов кортизона, антибиотиков, антигистаминных агентов, агентов для лечения акне, агентов для лечения перхоти, агентов для лечения псориаза, противогрибковых агентов, антимикробных агентов, агентов для лечения себорейного дерматита, кератолитических агентов, увлажняющих агентов, агентов для борьбы со свободными радикалами, антиоксидантов, витаминов, а также их комбинаций.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Характеристики и преимущества настоящего изобретения становятся ясными из следующего подробного описания, демонстративные примеры предложены в иллюстративных целях и прилагаются к фигурам, где:
2
- на Фиг. 1 показано влияние Salvia haenkei 0,1 и 0,01 мкМ (SH01) на экспрессию окклюдина в кератиноцитах линии HaCaT до (Фиг. 1A) и после (Фиг. 1B) воздействия ультрафиолетовым излучением спектра В 30 кДж/м. Мечение окклюдина (Alexa Fluor 488 λ возбуждения = 490 нм λ испускания = 525 нм) и ядра (пропидий иодид λ макс возбуждения = 495 нм; λ макс испускания = 610 нм);
- на Фиг. 2A показаны клетки линии HaCaT, обработанные в течение 24 часов Salvia haenkei 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ (SH01). Мечение филаггрина (λ возбуждения = 490 нм; λ испускания = 525 нм) и фаллоидина (λ возбуждения = 556 нм; λ испускания = 570 нм). Сбор данных с помощью микроскопа LSM 800 со встроенным программным обеспечением ZEN 2.1 с объективом 60X;
- на Фиг. 2B показаны клетки линии HaCaT, обработанные в течение 24 часов Salvia haenkei 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ (SH01). Мечение филаггрина (Alexia Fluor 488, λ возбуждения = 490 нм; λ испускания = 525 нм) и актина (фаллоидин, λ возбуждения = 556 нм; λ испускания = 570 нм). Сбор данных с помощью микроскопа LSM 800 со встроенным программным обеспечением ZEN 2.1 с объективом 60X;
2
- на Фиг. 3 показано влияние Salvia haenkei 0,1 и 0,01 мкМ (SH01) на транслокацию и экспрессию β-катенина в кератиноцитах линии HaCaT до (Фиг. 3A) и после (Фиг. 3B) воздействия ультрафиолетовым излучением спектра В 30 кДж/м. Мечение β-катенина (Alexa Fluor 488, λ возбуждения = 490 нм; λ испускания = 525 нм) и ядра (пропидий иодид λ макс возбуждения. = 495 нм; λ испускания = 610 нм).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Salvia haenkei является кустарником, происходящим из Боливии и Перу, и хотя его обычно называют «креветочным шалфеем», благодаря расцветке и форме цветков, похожих на креветку, его научное название ведет начало с эры испанских исследований Северной и Южной Америки в конце восемнадцатого столетия. Морфологически, он характеризуется ланцетовидными листьями с зубчатыми краями, длина которых превышает 12 см. Листья имеют светло-зеленый цвет и морщинистую поверхность. Цветение очень продолжительное, цветки больше 20 см и описываются как «кисть», т.е. цветки находятся на уровне центральной оси на цветоножках одинаковой длины, расположенных на разной высоте вдоль стебля цветка.
Для приготовления экстракта, обычно используются надземные части растения, т.е. стебель, листья, цветки или их смесь. Эти части можно использовать свежими или после сушки при заданных условиях. В обоих случаях отдельные части или их смеси контактируют с подходящим экстрагентом, при использовании таких традиционных способов экстрагирования, как мацерация или перколяция, или таких более сложных техник, как, например, экстрагирование с использованием ультразвука, микроволн, давления или сверхкритических жидкостей.
После отделения использованного растения, экстракт можно применять без дополнительной очистки, или после замены экстрагента более подходящим для медицинского использования (таким, как глицерин или гликоль, если он не использовался в стадии экстрагирования). Предпочтительно, удалить экстрагент для получения сухого экстракта. Для удаления экстрагента предпочтительными методами являются выпаривание при пониженном давлении и низкой температуре, и распыление.
Экстракт также может подлежать дальнейшим этапам очистки для удаления возможных загрязняющих веществ (таких как липофильные пестициды), включений (таких как хлорофилл) или для повышения концентрации вторичных метаболитов.
К сухому экстракту можно добавлять приемлемые вспомогательные вещества, например, для того, чтобы сделать его более однородным, менее гигроскопичным или стандартизировать по содержанию вторичных метаболитов. В числе вспомогательных веществ, пригодных для использования, присутствует, например, кремний, мальтодекстрины, микрокристаллическая целлюлоза.
Среди растворителей, приемлемых для приготовления экстракта Salvia haenkei, предпочтительно выбирать со средней полярностью, так как они способны эффективно экстрагировать из растения вторичные метаболиты. Предпочтительно, чтобы такие экстрагенты имели диэлектрическую проницаемость от 8 до 60. Полученный таким образом экстракт Salvia haenkei содержит комплекс терпеноидных соединений, в частности дитерпеноиды и тритерпеноиды (Almanza, G. et al., (1997), клеродановые дитерпеноиды и урсановый тритерпеноид из Salvia haenkei (Определение структуры с помощью ЭВМ, Tetrahedron, 53 (43), pp. 14719-14728), а также галлиевую кислоту и ее производные, и хлорогеновую кислоту и ее производные. Некоторые из этих соединений являются специфическими для вида Salvia и дифференцируют его от других видов этого рода, внося весомый вклад в характерную активность его экстрактов.
Примерами используемых экстрагентов являются спирты, имеющие до 4 атомов углерода, в том числе диолы и триолы, альдегиды, кетоны, органические сложные эфиры, хлорированные соединения, а также их комбинации. При смешивании такие растворители могут также использоваться в смеси с водой.
Предпочтительные растворители включают в себя метанол, этанол, изопропанол, бутанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, ацетон, этилацетат, а также их комбинации, как таковые или в смеси с водой.
В предпочтительных вариантах реализации, указанный экстрагент должен представлять собой водно-спиртовой раствор, еще более предпочтительно 40-80% спиртовой раствор. Вышеуказанный спирт предпочтительно должен являться метанолом или этанолом.
Варианты реализации, в которых экстрагент является 60-80% раствором этанола, особенно предпочтительны.
Предпочтительно, чтобы приготовление вышеуказанного экстракта Salvia haenkei включало в себя следующие этапы:
1. сбор надземных частей Salvia haenkei,
2. экстрагирование при помощи растворителя,
3. отделение использованного растения от жидкого экстракта, и
4. удаление растворителя для получения сухого экстракта.
Надземные части для этапа 1 могут быть свежими или предварительно высушенными. Если надземные части являются свежими, только что собранными, следует учитывать, что в растении будет физиологически присутствовать большее количество воды.
Таким образом, изобретение относится к применению экстракта Salvia haenkei в качестве реэпителизирующего агента при лечении дерматологических заболеваний.
Вышеуказанными дерматологическими заболеваниями являются ихтиоз, избыточная секреция себума, бактериальная инфекция, дерматомикоз, акне, псориаз, себорейный дерматит, розацеа, перхоть, алопеция, аллергический дерматоз, уртикария, склеродермия, контактный дерматит, атопический дерматит, хронический актинический дерматит, фотодерматит.
Предпочтительно, вышеуказанным дерматологическим заболеванием является ихтиоз.
Предпочтительно, вышеуказанным дерматологическим заболеванием является атопический дерматит.
В представленных ниже примерах, оценивались такие маркеры защитной активности против внешних причин стресса, как филаггрин. Филаггрин является белком, участвующим в важных физиологических функциях, вносящих свой вклад в гомеостаз и в формирование кожного барьера, но не только. Передовые технологии молекулярной биологии и применение генетически модифицированных моделей животных внесли ясность в вопрос о множестве ролей, которые филаггрин играет в физиологии кожи, в их числе, поддержание нормальной микрофлоры и предупреждение повреждения, вызываемого воздействием ультрафиолетового излучения. В дополнение к связыванию кератиновых волокон путем склеивания их между собой, вызывая резистентность к коже, его осмотически активные пептидные производные участвуют в формировании натурального увлажняющего фактора (НУФ), который регулирует основной баланс для функциональности и здоровья кожи. Между тем, производный хромофора транс-УКК (трансформа уроканиновой кислоты), находящийся в роговом слое человеческого эпидермиса, который поглощает ультрафиолет, образуя филаггрин, естественный фильтр УФ, в присутствии ультрафиолетового излучения спектра В фосфоизомеризуется в цис-УКК, которая является сильным иммунодепрессантом (для сдерживания чрезмерных реакций на клетки, поврежденные излучением в нормальных условиях облучения), которая в конечном итоге также принимает активную роль в процессах патогенезиса рака кожи, индуцированного УФ излучением, регулятором уровня pH и антибактериальным средством. Данные, полученные при иммуноцитохимии, демонстрируют, что экстракт Salvia haenkei способен индуцировать рост экспрессии филаггрина на уровне кератиноцитов, ясно указывающий эффективность экстракта по поддержанию кожной функции.
Также оценивались изменчивость экспрессии окклюдина в кератиноцитах, интегральный мембранный белок, участвующий в образовании плотного запирающего контакта, опоясывающего края клетки. В то же самое время, оценивалось влияние Salvia haenkei на клетки, подвергнутые ультрафиолетовому излучению, которое приводит к повреждению межклеточных контактов и, таким образом, целостности эпидермального слоя. При помощи иммунофлюоресценции наблюдалось повышение экспрессии окклюдина как в базисных условиях, так и в условиях стресса. Таким образом, здесь присутствует дальнейшее подтверждение того, что экстракт Salvia haenkei активирует процесс дифференциации клеток, но в то же время, главным образом сохраняет целостность барьера.
Кератиноциты взаимодействуют друг с другом также через прилегающие соединения, по этой причине была проведена оценка экспрессии β-катенина, белка, который стабилизирует эти соединения, выстраивая мост между цитоскелетом и поверхностными Е-кадеринами. Кроме того, учитывая УФ излучение спектра В в качестве стрессогенного фактора для клеток, клетки параллельно были подвергнуты УФ излучению спектра В. Фактически, когда кератиноциты подвергаются УФ излучению спектра В, известно, что β-катенин высвобождается из мембраны и может войти в ядро, включаясь в путь WNT, индуцируя гиперпролиферацию, дифференциацию и клеточное выживание, но по этому вопросу, кажется, нет подробных данных в отношении экстракта, хотя, вероятно необходимо расширить протокол облучения. Данные, полученные при иммуноцитохимии, демонстрируют, что экстракт Salvia haenkei повышает экспрессию β-катенина на уровне цитоплазматической мембраны, что указывает на повышенную способность поддерживать целостность эпителиального барьера, а если эти данные сопоставить с теми, что получены по окклюдину, то без сомнений подтверждается, что экстракт Salvia haenkei обладает способностью сохранять эпителиальный барьер в большей целостности, таким образом, предоставляя дополнительное подтверждение защиты. Сохранение эпителиального барьера играет важнейшую роль при многих дерматологических заболеваниях. Эта барьерная функция преимущественно осуществляется роговым слоем, самым поверхностным слоем кожи, а также межклеточными соединениями и белками, входящими в цитоскелет, который придает структуре прочность. Роговой слой не является абсолютно инертной выстилкой, фактически, это полупроницаемая мембрана, которая выступает в качестве биосенсора как для защиты от потенциальных элементов окружающей среды, так и для поддержания физиологического и динамического водного баланса, так как он позволяет более молодым клеткам замещать старые, достигшие терминальной дифференциации. Барьерные свойства рогового слоя также распространяются на его способность защищать организм от повреждений, индуцируемых воздействием ультрафиолетового (УФ) излучения и окисляющими агентами. В норме эпидермальный барьер обеспечивает абсорбцию воды и других необходимых питательных веществ через кожу, вместе с тем блокируя проникновение веществ, опознанных как вредные, или инфекционных агентов, благодаря узкоспециализированной структуре.
Взятые в совокупности, все эти данные ясно и категорично подтверждают, что экстракт Salvia haenkei обладает способностью поддерживать и стимулировать целостность эпителиального барьера даже в условиях стресса, вызванного УФ лучами спектра В, конкретизируя свою роль в качестве реэпителизирующего агента при лечении дерматологических заболеваний.
Предпочтительно, вышеуказанный экстракт должен использоваться для местного пути введения, более предпочтительно для наружного местного введения, подкожного местного введения, местного нанесения на слизистые оболочки, местного нанесения на десны, внутрипузырного местного введения, интравагинального местного введения, ректального местного введения, или местного применения на конъюнктиву глаз.
Предпочтительно, вышеуказанный экстракт вводится в дозе 0,1-1500 мг в день.
В предпочтительных вариантах реализации, вышеуказанный экстракт используется путем наружного местного введения в дозе 1-1000 мг в день, эффективная дозировка определяется масштабом и степенью тяжести дерматологического заболевания, подлежащего лечению.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт Salvia haenkei и фармацевтически приемлемые носители, для применения при лечении дерматологических заболеваний.
Вышеуказанная фармацевтическая композиция может использоваться для местного пути введения.
Предпочтительно, вышеуказанная фармацевтическая композиция должна использоваться для наружного введения, подкожного введения, нанесения на слизистые оболочки, нанесения на десны, внутрипузырного введения, интравагинального введения, ректального введения, или местного применения на конъюнктиву глаз.
В предпочтительных вариантах реализации, вышеуказанная композиция должна использоваться для наружного введения.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция должна содержать в своем составе экстракт Salvia haenkei в концентрации 0,1-500 мг/мл композиции, более предпочтительно 1-100 мг/мл.
Вышеуказанная фармацевтическая композиция может быть в форме мази, лосьона, крема, эмульсии, пасты, геля, водного раствора, спрея, пластыря, сыворотки, влажного компресса, повязки, или их комбинации.
Вышеуказанные фармацевтически приемлемые носители могут являться реологическими добавками, буферными агентами, антимикробными агентами, антиоксидантами, антиизотермическими агентами, антистатическими агентами, абсорбирующими агентами, агентами, абсорбирующими УФ излучение, вяжущими агентами, хелатирующими агентами, кондиционирующими агентами для кожи, консервирующими агентами, покровными агентами, денатурирующими агентами, депигментирующими агентами, эмульгирующими агентами, пленкообразующими агентами, желирующими агентами, увлажняющими агентами, гидротропными агентами, связующими веществами, смягчающими агентами, разглаживающими агентами, затемняющими агентами, пластифицирующими агентами, скользящими агентами, агентами для защиты кожи, восстанавливающими агентами, хладагентами, агентами, восстанавливающими себум, растворителями, стабилизирующими агентами, эмульсифицирующими стабилизирующими агентами, тонирующими агентами, смачивающими агентами, агентами, увеличивающими объем или их комбинациями.
В некоторых вариантах реализации, фармацевтическая композиция для применения при лечении дерматологических заболеваний дополнительно содержит в себе не менее одного дерматологически активного вещества, выбранного из противовоспалительных агентов, кортизонов, антибиотиков, антигистаминов, агентов для лечения акне, агентов для лечения перхоти, агентов для лечения псориаза, противогрибковых агентов, антибактериальных агентов, антиизотермических агентов, кератолитических агентов, увлажняющих агентов, агентов для борьбы со свободными радикалами, антиоксидантов, витаминов, а также их комбинаций.
Примерами противогрибковых агентов являются эконазол и миконазол.
Примерами антибактериальных агентов являются хлорхинол, гексахлорофен, 2,4,4'-трихлоро-2'-гидроксибифенил эфир и усниновая кислота.
Примером агента для лечения перхоти является кетоконазол.
Примерами антиизотермических агентов являются некоторые жировые вещества и тиоссолон.
Примерами агентов для лечения акне являются ретиноевая кислота и ее производные.
Примером кератолитического агента является салициловая кислота.
Примером агента для лечения псориаза является антралин.
Все вышеописанные фармацевтические композиции могут быть приготовлены способами, известными в фармацевтической технологии.
Также следует понимать, что все аспекты, указанные как предпочтительные и преимущественные для экстракта Salvia haenkei, являются, аналогичным образом, предпочтительными и преимущественными также для фармацевтических композиций и их применений.
Также следует понимать, что все комбинации предпочтительных аспектов изобретения экстракта Salvia haenkei, а также фармацевтические композиции и их применения, как указано выше, являются, таким образом, раскрытыми.
Ниже приведены демонстрационные примеры настоящего изобретения, предоставленные с иллюстративной целью.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Приготовление экстрактов Salvia haenkei
10 кг надземных частей Salvia haenkei собрали с полевых культур, которые затем подвергли процессу сушки в сушильной камере с вентилятором при заданных условиях.
В результате этого было получено 1,95 кг высушенного растения, которое измельчили в дисковой мельнице для получения сухого, измельченного Salvia haenkei.
Его использовали в качестве сырья для последующих испытаний по экстрагированию растворителем, проведенных как описано ниже:
1. 100 г высушенного, измельченного Salvia haenkei уложили в статический перколятор и полностью покрыли 200 мл смеси воды и 30-70% этанола об/об. Оставили настаиваться на 2 часа, экстрагент (170 мл) слили из нижней части перколятора и отставили (экстракт 1);
2. Влажное растение, оставшееся в перколяторе, покрыли новой аликвотой 70% водно-этанольного раствора (170 мл), оставив выдерживаться на 2 часа. Растворитель слили (165 мл - экстракт 2);
3. Процесс экстрагирования, описанный в пункте 2, повторяли до тех пор, пока сухой остаток извлеченного экстракта не составил менее 5% от общего сухого остатка, экстрагируемого на тот момент. На этом этапе экстрагирование сочли завершенным, и использованное мокрое растительное сырье уничтожили; потребовалось 6 извлечений;
4. Экстракты, полученные на отдельных этапах экстрагирования (с экстракта 1 до экстракта 6) смешали, отфильтровали и выпарили в роторном испарителе под действием вакуума, при низкой температуре. Процедуру повторяли до тех пор, пока не получили концентрированный, вязкий раствор (35 мл);
5. Концентрированный экстракт перенесли в стальной лоток и поместили в сушильный шкаф в условиях вакуума, с нагревательным элементом, установленным на 30°C. Через 12 часов, растворитель полностью испарился (потеря массы экстракта менее 10%, т.е. сухой остаток более 90%). Было получено 14,3 г цельного, сухого экстракта. Соотношение растительное сырье : экстракт (коэффициент экстракции (КЭ)) составило 7:1 (экстракт 1A);
6. К полученному сухому экстракту добавили 10 г мальтодекстрина (ДЭ 10) для улучшения консистенции, смесь измельчили и просеяли, получив, таким образом, 23,7 г измельченного сухого экстракта.
Применяя одну и ту же методику, но с разными экстрагентами, были приготовлены различные нативные сухие экстракты.
В таблице сведены результаты различных испытаний по экстрагированию:
экстракт
экстрагент
КЭ
1A
этанол : вода 70:30
7:1
1B
этанол : вода 95:5
9.5:1
1C
ацетон
11:1
1D
метанол
8:1
1E
этилацетат
15:1
1F
вода
5:1
1G
метанол : вода 50:50
6:1
В следующих примерах, использовался водно-спиртовой экстракт Salvia haenkei из примера 1A, сокращенно именуемый "SH01".
Пример 2
Качественная оценка экспрессии окклюдина
При помощи иммуноцитохимии оценивали влияние Salvia haenkei на мембранный белок окклюдин, который является важным для формирования межклеточных соединений и, таким образом, формирования и поддержания монослоя эпидермального барьера. Оценивали влияние экстракта на клетки, подвергнутые и не подвергнутые воздействию ультрафиолетового излучения, известного своей способностью повреждать кожный барьер.
На фиг. 1A отображены подготовленные микроскопические препараты с клетками линии HaCaT, не подвергнутыми ультрафиолетовому излучению спектра В. Можно увидеть, что уже в базовых условиях клетки, обработанные SH01, обладают более высокой экспрессией окклюдина, благоприятствуя, таким образом, образованию межклеточных соединений важных для поддержания целостности эпидермиса. В клетках, подвергнутых ультрафиолетовому излучению, можно увидеть, как у клеток изменены края и что они больше не являются четко очерченными. В клетках, обработанных экстрактом SH01, с другой стороны, ясно видно, как край, разграниченный окклюдином, сохранился нетронутым, подтверждая воздействие экстракта на формирование и поддержание межклеточных соединений.
На фиг. 1B показаны подготовленные микроскопические препараты с клетками линии HaCaT, подвергнутыми ультрафиолетовому излучению спектра В, где на контрольном препарате присутствует более слабо выраженная и менее интенсивная экспрессия окклюдина, в то время как в условиях обработки окклюдином, она более интенсивная и края клеток хорошо очерчены.
Пример 3
Качественный анализ экспрессии филаггрина
При помощи иммуноцитохимии оценивали изменение в экспрессии филаггрина в клетках линии HaCaT, цитоплазматического белка, присутствующего в кератиноцитах рогового слоя, который является совершенно необходимым для поддержания барьерной функции кожи. Частичная или полная потеря экспрессии филаггрина, его функциональные и структурные изменения, являются факторами патогенеза, ответственными за различные эпидермальные дисфункции.
Экспрессия и локализация филаггрина и актина визуализировались при помощи конфокального микроскопа.
Как показано на фиг. 2A, меченный филаггрин экспрессируется на основном уровне. Эта экспрессия возрастает через 24 часа обработки SH01 зависимым от концентрации образом. Параллельно, наблюдая экспрессию F-актина на фиг. 2B, можно наблюдать, как клетки распределяют белок в организованном порядке, создавая структурную непрерывность.
Пример 4
Оценка воздействий на β-катенин
2
Путем иммуноцитохимии провели оценку транслокации β-катенина из мембраны, где он участвует в поддержании межклеточной адгезии для взаимодействия с E-кадгерином и основной для осуществления его функций, к нуклеарной-перинуклеарной зоне, на фоне воздействия ультрафиолетовым излучением (спектра В 30 кДж/м) активирующий важный путь WNT для обеспечения клеточной пролиферации и дифференциации, ведущей к развитию инвазивного клеточного фенотипа. На фиг. 3A и 3B можно наблюдать препараты, которые приготовлены с клетками, подвергнутыми и неподвергнутыми воздействию ультрафиолетовых лучей спектра В. Можно увидеть, что, после воздействия ультрафиолетовым излучением, β-катенин начинает двигаться от мембраны к перинуклеарной зоне. Похоже, что экстракт не уменьшил эту дислокацию, однако, кажется, что его экспрессия в условиях обработки SH01 возрастает и адгезия между клетками укрепляется.