СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГИДРОГЕЛЕВОГО СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ
METHOD FOR PREPARING BIOSPECIFIC HYDROGEL SORBENT FOR PROTEINASE RECOVERY

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ. Сорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью получения очищенных препаратов ферментов или с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.
Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем взаимодействия ингибитора трипсина из сои с активированным сшитым полисахаридом - сефарозой [Gilliam Е.В., Kitto G.B. Isolation of starfish trypsin by affinity chromatography, Comparative Biochemistry and Physiology, 1976, V.54, №1, p.21-26].
Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного ингибитора трипсина из сои. Емкость сорбента составляет 0,2 мг фермента на 1 мг химически связанного с полимером ингибитора.
Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-1,5 мас.% овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты, 3,5-10,0 мас.% гидрофильного мономера, состоящего из акриламида, метакриламида или N-винилпирролидона, 3,5-10 мас.% N-этилбромиддиметиламиноэтилметакрилата и 0,7-15,0 мас.% бифункционального сшивающего агента, при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации: персульфат аммония и N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин [Патент РФ №2420739 C1, G01N 33/53, Бюл. №16, 10.06.2010].
Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного овомукоида, которая составляет 1,19-1,48 мг фермента на 1 мг овомукоида при сорбции из растворов с рН 7,4 и 0,84-1,11 мг фермента на 1 мг овомукоида при сорбции из растворов с рН 8,0.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9 мас.% овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-12,0 мас.% акриламида и 0,5-1,1 мас.% N,N'-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985].
Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного овомукоида - самого дорогого компонента сорбента. Емкость сорбента составляет 0,8-1,0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида.
Задачей изобретения является повышение эффективности использования иммобилизованного овомукоида.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является повышение эффективности использования овомукоида - самого дорогого компонента сорбента.
Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0,1-0,9 мас.% овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7,0-12,0 мас.% акриламида и 0,5-1,1 мас.% N,N'-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений полимеризацию проводят в присутствии 0,01-0,12 мас.% меркаптоуксусной кислоты.
Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12,5% глюкозамина и 7,8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе, Биохимия, 1981, т. 46, №3, с.473-480].
Ацилирование овомукоида проводят растворением 100 мг овомукоида в 20 мл раствора бикарбоната аммония с рН 8,0, добавлением к полученному раствору при 0-5°С 0,01 мл хлорангидрида акриловой кислоты и перемешиванием смеси в течение 15 минут. Ацилированный овомукоид выделяют путем лиофильного высушивания.
Меркаптоуксусная кислота является передатчиком цепи при радикальной полимеризации и при гомополимеризации ненасыщенных мономеров обеспечивает снижение их молекулярной массы без изменения скорости полимеризации. В реакциях образования пористых гидрогелей с одновременной иммобилизацией биологически активных веществ это соединение не использовалось.
Нижеследующие примеры иллюстрируют предлагаемое техническое решение, но никоим образом не ограничивают его.
Пример 1.
В 89 мл дистиллированной воды при комнатной температуре и перемешивании растворяют 0,1 г овомукоида, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 8,0 г акриламида и 1,0 г N,N'-метиленбисакриламида. После полного растворения всех веществ в раствор добавляют 0,08 г персульфата аммония, 0,08 мл N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина и 0,04 г меркаптоуксусной кислоты. Раствор вакуумируют при 10-12 мм рт.ст. и выдерживают при комнатной температуре (18-21°С) в течение 5 часов. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают продавливанием через сито с диаметром пор 1 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН 8,0 до полного удаления непрореагировавших веществ. Полноту удаления контролируют спектрофотометрически.
Количество иммобилизованного в гидрогеле овомукоида определяют по разнице между исходной концентрацией овомукоида и его концентрацией в промывных водах.
Для изучения емкости сорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают водный раствор с рН 7,4 или 8,0 или плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 1 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с рН 1,5.
Состав исходного раствора и свойства сорбента приведены в таблице.
Примеры 2-9.
Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества исходных соединений.
Состав исходных растворов и свойства сорбентов приведены в таблице.
Примеры 10-14 (контрольные).
Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества исходных соединений, но без добавления меркаптоуксусной кислоты.
Состав исходных растворов и свойства сорбентов приведены в таблице.
Видно, что использование передатчика цепи - меркаптоуксусной кислоты, приводит к неожиданному эффекту - повышению емкости сорбента и эффективности использования самого дорогого компонента сорбента - овомукоида из белка утиных яиц. Эффективность использования овомукоида при извлечении ферментов из плазмы крови человека (рН 7,4) в заявленном способе составляет 1,72-1,75 мг фермента на 1 мг овомукоида, а в способе-прототипе 0,8-1,0 мг фермента на 1 мг овомукоида.
Предельные значения ацилированного овомукоида в исходной смеси определяются тем, что при его концентрации ниже 0,1 мас.% суммарная емкость сорбента невелика, а при концентрациях выше 0,9 мас.% повышение емкости сорбента в расчете на 1 мг иммобилизованного овомукоида незначительно. Предельные значения концентраций акриламида и N,N'-метиленбисакриламида определяются оптимальной механической устойчивостью сорбента к потоку жидкости. Предельные количества вводимой в реакцию меркаптоуксусной кислоты (0,01-0,12 мас.%) определяются следующем. При концентрации ниже 0,01 мас.% эффект повышения емкости сорбента практически отсутствует, а при концентрации выше 0,12 мас.% полимеризация не происходит и гидрогель не образуется.