Питательная среда для культивирования биомассы дрожжей и способ ее получения
NUTRIENT MEDIUM FOR THE CULTIVATION OF YEAST BIOMASS AND A METHOD FOR ITS PRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для использования попутного нефтяного газа в качестве источника получения питательной среды на основе метанола для производства кормового белкового продукта - биомассы дрожжей.
Непрерывно растущая численность населения земного шара ставит все более актуальной задачу обеспечения населения полноценным питанием, в частности, по содержанию белка. Корма, используемые в сельском хозяйстве, также должны иметь оптимальный состав питательных веществ и прежде всего белка. Недостаток белка только для целей кормопроизводства для сельского хозяйства Российской федерации оценивается 2 млн. тонн. Одним из источников белка может служить биомасса микроорганизмов (например, дрожжей), получаемых с помощью биотехнологических процессов, осуществляемых в промышленных условиях.
Возможным источником непищевого сырья для производства белка в виде биомассы микроорганизмов является природный газ, содержащий метан.
Источником природного газа, содержащего метан, является природный газ, добываемый на газовых месторождениях и транспортируемый потребителям либо по газотранспортным трубопроводам, либо в сжиженном виде. Другим источником природного газа, содержащего метан, является попутный газ нефтяных месторождений. Если первый источник природного газа широко используется в виде топлива и сырья для химической промышленности, то второй источник природного газа, получаемый в местах нефтедобычи, как правило, не используется, из-за отсутствия необходимой инфраструктуры для его транспортировки потребителям. Поэтому попутный газ сжигается в местах нефтедобычи, являясь источником загрязнения окружающей среды продуктами сгорания.
Заявленный способ направлен на использование попутного газа нефтяных месторождений для получения основного компонента питательной среды, используемой для культивирования микроорганизмов - дрожжей рода Hansenula polymorphs При этом ставится техническая задача создания максимально простого для эксплуатации, использующего минимальную инфраструктуру технологического процесса получения из попутного нефтяного газа питательной среды на основе метанола.
Известно, что получение кормового белка осуществляют с использованием управляемого культивирования микроорганизмов в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, калия, магния, железа, кальция, ростовых веществ (аминокислот и витаминов). При получении белка на питательной среде из природного газа, в качестве источника углерода используется метан (СН4), в качестве источника азота используется аммиак (NH3), соли аммония или нитраты, в качестве источника фосфора используется фосфорная кислота или фосфаты, в качестве источника калия используют калийные соли (например, фосфаты, сульфаты, хлориды), в качестве источника магния используются сульфаты магния, в качестве источника железа используются сульфаты железа, а в качестве источника кальция используется хлорид кальция.
В частности, известна питательная среда для культивирования микроорганизмов, содержащая газообразный метан. Данная питательная среда используется для получения белкового продукта - гаприна («газового протеина»), в состав которого входят витамины группы В, аминокислоты и микроэлементы (см. статью Глухих С. Метан угольных пластов и шахт - источник кормового белка. "Комбикорма", №5, 2015 г., с. 84-87). Для обеспечения основных технологических стадий процесса предусмотрены вспомогательные стадии: прием, приготовление растворов и подача в ферментеры аммиачной воды, ортофосфорной кислоты, солей и других химикатов в необходимых концентрациях; подготовка и подача кислорода воздуха. Основной непрерывный технологический процесс выращивания гаприна происходит в ферментерах. Перемешивание и аэрирование в них ведется с помощью циркуляционных насосов с эжекторами с напорной стороны насосов для ввода воздуха и организации рециркуляции газовой фазы. Природный газ и, при необходимости, дополнительный воздух вводятся через барбатеры. Состав газовой фазы (кислород, метан, уг лекислый газ) на выходе ферментера контролируют газоанализаторы.
Известны также другие способы (RU 2064016, 20.07.1996; RU 2699986, 11.09.2019) получения белка на питательной среде, полученной из природного газа, содержащего метан, в которых метан подают в смеси с воздухом в водный раствор минеральных солей, содержащих источники азота, фосфора, калия, магния, железа, кальция, и некоторых других микроэлементов, необходимых для роста микроорганизмов. Подача указанной газовой смеси в водный раствор солей служит для обогащения этого раствора источником углерода, которым является метан, и кислородом воздуха. Таким образом, получают жидкую питательную среду, содержащую все необходимые компоненты для роста микроорганизмов.
Указанные способы обладают целым рядом недостатков.
Во-первых, газ метан имеет очень низкую растворимость в водной среде. Из-за этого осуществляют многократное циркулирование газовой смеси метана с воздухом через жидкую питательную среду, чтобы обеспечить более полное использование метана микроорганизмами. Из-за этого сильно усложняется конструктивное исполнение ферментеров (биоректоров), в которых культивируются микроорганизмы. Более того, сильно усложняется управление процессом культивирования микроорганизмов, т.к. в процессе роста последних образуются газообразные продукты жизнедеятельности (метаболизма) микроорганизмов, которые постепенном накапливаются в циркулирующей смеси метана с воздухом и при определенной концентрации могут угнетать рост микробной культуры. По этой причине циркулирующую смесь метана с воздухом необходимо периодически обновлять. Для своевременного обновления газовоздушной смеси необходимо осуществлять постоянный мониторинг ее состава. Это приводит к усложнению как оборудования, так и системы управления процессом культивирования микроорганизмов. Более того, периодическое обновление газовоздушной смеси приводит к выбросу в атмосферу значительной части нерастворенного в питательной среде метана. Следствием этого является как низкая эффективность использования природного газа в качестве основы питательной среды как источника углерода для роста микроорганизмов, при этом происходит загрязнение окружающей среды неиспользованным метаном.
Во-вторых, существенным недостатком известных способов получения питательной среды из природного газа является то, что газ метан образует с воздухом взрывоопасную смесь. Чтобы избежать взрыва ферментеры (биореакторы) вынуждены изготавливать во взрывобезопасном исполнении и оснащать газоанализаторами содержания метана воздухе и специальными средствами автоматики, чтобы избежать образования взрывоопасной концентрации метана в воздухе. Причем состав газовой смеси надо подвергать непрерывному мониторингу и контролю не только внутри оборудования, но и в производственном помещении, где ведется производство микробного белка из природного газа. Это приводит к сильному усложнению и удорожанию оборудования, а также системы управления технологическим процессом.
Известен способ культивирования метанотрофных бактерий Pseudomonas methylotropha и Psendomonas rosea на питательной среде, содержащей метанол (GB 13708992 A, US 3989594 A). Недостатком этого способа является использование в качестве микроорганизмов-продуцентов белка бактерий, которые растут на питательной среде с рН 6,8 и температуре близкой к 37°С. Указанные значения рН и температуры являются благоприятными для роста посторонних микроорганизмов. По этой причине производство белка по упомянутому способу ведется в стерильных условиях и в питательной среде, приготовленной на деминерализованной воде. Указанные условия сильно усложняют и удорожают процесс производства белка из метанола, требуют наличие высококвалифицированного производственного персонала умеющего осуществлять промышленное производство белка в стерильных условиях. Этот недостаток метанолокисляющих бактерий особенно затрудняют применение известного способа при производстве белка из попутного газа в удаленных местах нефтедобычи с неразвитой инфраструктурой и при отсутствии высококвалифицированных биотехнологов.
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является питательная среда, содержащая метанол и используемая для культивирования метанотрофных бактерий Methylocystis или Methylosinus, и способ ее приготовления (SU 770174, 07.09.1981). Питательная среда содержит источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве источника углерода и энергии, при этом в питательную среду дополнительно вводят угольную кислоту в виде бикарбоната натрия в концентрации 0,1-0,25% или в виде углекислого газа до концентрации в газовой фазе 3-10%.
Данная питательная среда и способ ее приготовления предназначены для использования в горнодобывающей промышленности для снижения метаноносности угольных пластов, т.е. имеет ограниченную область применения, соответственно данное изобретение не предназначено для промышленного производства белкового продукта.
Технической проблемой, решаемой заявленной группой изобретений, является создание способа получения питательной среды, получаемой из попутного газа нефтяных месторождений (далее для краткости называемого попутным газом) и питательная среда, полученная этим способом. Заявляемый способ также может быть применим для получения питательной среды из трубопроводного природного газа.
Для решения указанной технической задачи заявленный способ характеризуется следующими операциями.
Предварительно проводят анализ попутного газа для конкретного месторождения с целью определения химического состава газа, используя при этом известные способы. С учетом полученных результатов анализа состава попутного газа производят очистку попутного газа от воды, неорганических соединений серы (в том числе, сероводорода и меркаптана), пентакарбонила железа и тяжелых углеводородов, с получением технологического газа. Очистку попутного газа от вышеуказанных загрязнений проводят известными методами в установке комплексной подготовки газа (УКПГ) (Российская газовая энциклопедия. М., 2004. С. 462-464. - ISBN 5-85270-327-3).
Технологический газ, полученный после очистки попутного газа в УКПГ, используют для получения жидких компонентов питательной среды, являющихся источниками углерода и азота, и при этом хорошо растворимых в воде в отличие от газа метана, содержащегося в попутном газе.
Компонент питательной среды, являющийся источником углерода, получают в виде метанола-сырца.
Метанол-сырец, используемый в заявленном способе и являющийся основой для питательной среды, представляет собой бесцветную или слегка желтоватую прозрачную жидкость, содержащую метанол, диметиловый эфир и воду. В качестве примесей используемый в заявленном способе метанол-сырец может содержать изобутиловый спирт и олефины.
Компонент питательной среды, являющийся источником азота, получают в виде аммиака с последующим растворением аммиака в воде. Метанол-сырец и аммиак получают технологически из попутного газа совместно. При этом используют один из известных способов, например, способ, описанном в патенте РФ №2174953. На первой стадии технологического процесса получают метанол-сырец в виде смеси метанола (СН3ОН), диметилового эфира (СН3ОСН3) и воды. При этом метанол-сырец, как компонент питательной среды, являющийся источником углерода, получают с содержанием метанола от 84,0% до 96,0%, диметилового эфира от 0,1% до 3,6%, воды от 3,0% до 15,0%.
На второй стадии технологического процесса получают аммиак как компонент питательной среды, являющийся источником азота. Для целей производства белкового продукта (биомассы дрожжей) аммиак растворяют в воде с получением водного раствора аммиака - гидроокиси аммония (NH4OH) с содержанием от 5% до 22%.
Проводят приготовление питательной среды для культивирования микроорганизмов, растворяя в воде в определенной концентрации углеродсодержащий компонент (метанол-сырец), азотсодержащий компонент (гидроокись аммиака), минеральные соли, являющиеся источниками калия, фосфора, магния, железа и кальция, а также компонент, являющийся источником ростовых свойств питательной среды, например, дрожжевой экстракт.
Питательную среду готовят с добавлением следующих минеральных солей. В качестве источника калия используют KH2PO4 и/или KCl, в качестве источника фосфора - KH2PO4 и/или Na2HPO4, в качестве источника магния - MgSO4*7H2O, в качестве источника железа - FeSO4*7H2O, в качестве источника кальция - CaCl2 и/или СаНСО3, в качестве источника ростовых свойств питательной среды - дрожжевой экстракт.
Питательную среду готовят следующего состава с содержанием в 1 л среды:
- метанола от 3,00 г до 30,00 г,
- диметилового эфира от 0,01 г до 0,90 г,
- водного раствора аммиака (NH4OH) от 0,50 г до 5,00 г,
-K2HPO4 от 1,50 г до 3,50 г,
- MgSO4*7H2O от 0,5 до 2,50 г,
- FeSO4*7H2O от 0,01 г до 0,02 г,
- CaCl2 от 0,05 до 0,20 г,
- дрожжевого экстракта от 5,00 г до 30,00 г.
Для культивирования на вышеуказанной питательной среде используют, преимущественно, метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha.
Для культивирования на заявленной питательной среде может быть использован любой штамм дрожжей, относящихся к роду Hansenula polymorpha. Факт, что дрожжи, о тносящиеся к роду Hansenula polymorpha, успешно культивируются как на чистом метаноле, так и на питательной среде, содержащей метанол, давно и широко известен из уровня техники. На это указывают следующие публикации:
Подгорский B.C. Физиология и метаболизм метанолусваивающих дрожжей. Киев: Наукова думка, 1982, с. 48-51;
Троцеико Ю.А., Торгонская М.Л. Метилотрофные дрожжи. Москва: «ТР-Принт», 2011, с. 9-10.
Особенностью указанного рода дрожжей, является то, что они активно растут на питательной среде с метанолом. Вследствие этого нет необходимости производить очистку (ректификацию) метанола-сырца для использования ею в качестве источника углерода при приготовлении питательной среды для роста микроорганизмов. Следовательно, можно исключить ректификацию метанола-сырца, как это делается в известных из уровня техники способах, ив которых в качестве источника углерода при культивировании других метанолокисляющих микроорганизмов-продуцентов белка используется чистый метанол.
Техническим результатом, получаемым при осуществлении заявленного способа, является возможность использования попутного газа в качестве источника сырья для производства питательной среды, на которой осуществляется культивирование метилотрофных дрожжей как источника кормового белка. При этом из попутного газа одновременно производятся основные компоненты питательной среды, используемой для культивирования метилотрофных дрожжей с целью получения белка, а именно попутный газ является также источником углерода и источником азота. Наличие диметилового эфира в составе питательной среды, а также введение в ее состав водного раствора аммиака и дрожжевого экстракта в качестве источника ростовых свойств увеличивает скорость роста дрожжей и объем конечного продукта - биомассы дрожжей. Для питательной среды техническим результатом является также упрощение технологии и сокращение времени на ее производство за счет использования метанола-сырца (исключение операции ректификации) и воды питьевого качества (не требуется специальная водоподготовка). При этом получение питательной среды полностью основано на переработке попутного нефтяного газа (или природного газа).
Существенной особенностью заявленного способа и получаемой питательной среды является:
- упрощение технологии получения питательной среды за счет исключения стадии очистки метанола-сырца от примесей (стадии ректификации),
- приготовления питательной среды не на воде питьевого качества вместо дистиллированной или деионизованной воды.
Получаемые из попутного газа источник углерода и источник азота представляют собой полностью растворимые в воде источники углерода (метанол и диметиловый эфир) и источник азота (гидроокись аммония). Они входят как необходимые компоненты в питательную среду, и их наличие позволяет уменьшить количество вносимых добавок в виде минеральных веществ. Попутный нефтяной газ и обычный природный газ отличаются по составу, хотя основа у них - метан. В попутном газе метана меньше, чем в природном, но больше примесей, что для заявленного способа является преимуществом. Тем не менее, от части примесей необходимо производить очистку попутного газа, а именно, от неорганических соединений серы (в том числе, сероводорода и меркаптана), а также от пентакарбонила железа, если он имеется.
К преимуществам заявленного способа относится также одновременное с синтезом метанола получение аммиака, водный раствор которого используется в питательной среде как азотсодержащий компонент, что, помимо упрощения способа, позволяет снизить затраты на покупку, транспортировку и хранение солей, являющихся источником азота. Таким образом, основные компоненты, необходимые для получения питательной среды и культивирования микроорганизмов, производятся в рамках единого технологического процесса на месте нефтедобычи.
Кроме того, предлагаемое использование попутного газа позволяет снизить объемы его сжигания, т.е. снизить вредное воздействие этого процесса сжигания на окружающую среду.
Дрожжи Hansenula polymorpha, культивируемые на предложенной питательной среде, утилизируют получаемый из попутного газа метанол-сырец с высоким выходом биомассы дрожжей, содержащих микробный белок.
В отношении питательной среды следует также отметить, что используемые жидкие компоненты питательной среды не образуют с воздухом взрывоопасные смеси, по этой причине для осуществления заявленного способа не требуется оборудование в специальном взрывозащищенном исполнении со сложной системой непрерывного мониторинга и контроля состава газовой смеси метан-воздух, напротив, для реализации заявляемого способа используется простое оборудование, традиционно используемое при получении продукции с использованием микроорганизмов (ферментеры для ведения процесса в нестерильных условиях и другое технологическое оборудование
Пример реализации указанного способа:
Для приготовления питательной среды был использован метанол-сырец, полученный из попутного газа нефтяного месторождения, имеющего следующий состав:
Из попутного газа вышеуказанного состава был получен метанол-сырец, содержащий:
Из этого же попутного газа был получен аммиак, который растворили в воде для получения гидроокиси аммония (NH4OH) до концентрации 22% вес.
Питательную среду готовили на водопроводной воде питьевого качества: с использованием метанола-сырца, гидроокиси аммония и минеральных солей следующего состава в расчете на 1 л:
Процесс получения микробного кормового белкового продукта по заявляемому способу вели в стандартном ферментере с теплообменной рубашкой и мешалкой, изготовленном из нержавеющей стали, и имеющем рабочий объем 30 л (объем, занимаемый питательной средой).
В указанную питательную среду вносили посевной материал микроорганизмов в виде посевной культуры штамма культуры дрожжей Hansenula polymorpha, полученной на вышеуказанной питательной среде в качалочных колбах на термостатируемой качалке при температуре 42+/-1°С. Объем вносимого посевного материала составлял 10% от рабочего объема ферментера. Процесс культивирования осуществляли в непрерывном режиме со скоростью разбавления 0,12+/-0,02 ч-1. Процесс культивирования вели при температуре 42+/-1°С, значении рН 4,0+/-0,1, концентрации растворенного кислорода 25+/-5%, числе оборотов мешалки 500-800 об/мин, объемной скорости подачи воздуха на аэрацию культуры 40-50+/-2 л/мин, давлении в сосуде ферментера 1,2-2,7+/-0,2 кг/см2. Длительность непрерывного процесса культивирования составила 458 часов. Средняя удельная продуктивность процесса по биомассе дрожжей в пересчете на абсолютно сухой вес составила 14,8 г/л/час.
Полученную биомассу дрожжей концентрировали с помощью центробежной сепарации до концентрации биомассы 15+/-2% по абсолютно сухому весу. Сконцентрированную биомассу гранулировали в грануляторе с добавлением картофельного крахмала с соотношением вносимого крахмала к сырой биомассе в диапазоне 20-30% (вес).
Гранулированную биомассу дрожжей высушивали в вакуумном сушильном шкафу до остаточной влажности 8-10%. Содержание микробного белка в сухом гранулированном продукте составило от 28 до 36%.