Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени при помощи диеты, насыщенной фруктозой
METHOD FOR MODELLING NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE BY DIET RICH IN FRUCTOSE

Изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, и может быть использовано в эксперименте для изучения эффективности различных схем терапии неалкогольной жировой болезни печени.
Известен способ моделирования, предложенный рядом авторов, при помощи использования генетически модифицированной линии животных имеющих мутации гена лептина ob/ob (лептин-дефицитные), или рецептора лептина db/db (резистентные к действию лептина) [Бивалькевич Н. В. Закономерности структурно-функциональной реорганизации печени при формировании диет-индуцированной неалкогольной жировой болезни печени у крыс; кандидатская диссертация, Владивосток, 2015 г]. Тем не менее, в генетически-индуцированных моделях формирования неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) у крыс линий оb/оb и db/db в связи с недостаточной активностью лептина наблюдаются ожирение, инсулинорезистентность и стеатоз печени, однако отмечается устойчивость к прогрессированию стеатонекроза и фиброза [Norepinephrine regulates hepatic innate immune system in leptindificient mice with nonalcogolic steatohepatitis / Z. Li [et al.] // Hepatology. 2004. Vol. 40, N 2. P. 434-441.]. Помимо этого очевидна и дороговизна с труднодоступностью животных с данными мутациями.
Использование метионин-холин-дефицитной диеты (МХД) позволяет смоделировать тяжелую степень стеатоза печени и некротические изменения с воспалительным ответом уже на второй неделе эксперимента, с дальнейшим прогрессированием до септального и препортального фиброза [Fan J.G., Qiao L. Commonly used animal models of non-alcoholic steatohepatitis // Hepatobiliary pancreat. dis. int. 2009. Vol. 8, N 3. P. 233–240]. При всем сходстве патологических изменений в печени животных с НАЖБП у людей отмечаются различия в течении заболевания. Так, при модели МХД диеты у крыс наблюдается потеря мышечной и жировой массы до 40% за 10 недель. В отличие от НАЖБП у людей, у животных на МХД диете не развивается инсулинорезистентность, и, таким образом, не отражается в полной мере патофизиология неалкогольной жировой болезни печени. Кроме того, развитие заболевания наблюдается не у всех животных, содержащихся на экспериментальном рационе. В зависимости от вида, пола и линии животных может наблюдаться значительная резистентность к развитию НАЖБП при помощи МХД диеты. Эти несоответствия ограничивают использование данной модели в исследованиях [Fan J.G., Qiao L. Commonly used animal models of non-alcoholic steatohepatitis // Hepatobiliary pancreat. dis. int. 2009. Vol. 8, N 3. P. 233–240]. Кроме того, в ходе информационного поиска не удалось найти и подробной схемы данной диеты для лабораторных животных.
Диета с высоким содержанием жиров также довольно широко используется для формирования стеатоза и неалкогольного стеатогепатита у животных. В литературе упоминается модель Либера и др., при которой формирование НАЖБП происходит путем интергастрального кормления животных эмульсией с высоким содержанием жиров, представляющей собой смесь 71% жиров, 11% углеводов и 18% белков. При данной экспериментальной модели на 21 сутки происходит формирование стеатоза и воспалительной инфильтрации печени на фоне окислительного стресса и инсулинорезистентности [Mechanisms of hepatic steatosis in mice fed a lipogenic methionine choline-deficient diet / M.E. Rinella [et al.] // J. lipid. res. 2008. Vol. 5, N 49. P. 1068–1076. doi: 10.1194/jlr.M800042-JLR200]. Однако данный метод достаточно трудоемок и требует специального оборудования и определенных навыков исследователя.
Техническим результатом является создание пищевого рациона для самостоятельного кормления мышей линии C57Bl/6, позволяющего моделировать у животных изменения печени, аналогичные тем, которые наблюдаются у людей с неалкогольной жировой болезнью печени. За основу диеты была взята фруктоза, которая по данным ряда источников способна индуцировать жировой гепатоз печени у мышей [TakahashiY., SoejimaY., FukusatoT.Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis // WorldJ. gastroenterol. 2012. Vol. 18, N 19.P. 2300–2308]. Однако в ходе работы было установлено, что мыши не употребляют фруктозу ни в чистом виде, ни в составе сухой смеси с зерновыми кормами.
Технический результат достигнут при помощи применения следующей схемы. Сухой зерновой корм  для грызунов, из расчета 4-5 грамм корма в сутки на одну мышь весом 30-40 грамм перемешивают с сухой фруктозой, из расчета 2-3 грамма фруктозы на одну мышь весом 30-40 грамм в сутки. Смесь заливают кипятком, вновь перемешивают и настаивают до остывания. Затем сливают жидкую часть. Непосредственно перед употреблением во влажную смесь добавляют  фруктозу, из расчета 2-3 грамма фруктозы на одну мышь в сутки, перемешивают и используют для кормления животных. Корм насыпают в кормушку, животные поедают его самостоятельно. При этом объем питьевого режима мышей включает 30-40% водный раствор фруктозы в объёме 3-4 мл в сутки на одну мышь массой 30-40 грамма в сутки.
Способ был апробирован на 46 мышах линии C57Bl/6  на базе Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины ВГМУ им. Н.Н.Бурденко.* Масса тела животных на момент включения в исследование  составляла 30–40 г. Исследования проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных (National Academypress, 1996). Материалом для исследований явились ткань печени и кровь мышей. Было сформировано 3 экспериментальные группы. Забор крови и морфологическое исследование печени мышей производили на 30 и 75 сутки моделирования заболевания для определения референсных значений изучаемых показателей и оценки их изменений в ходе применения экспериментальной диеты. Общепринятыми методами в крови определяли такие биохимические маркеры, как содержание глюкозы, концентрацию общего билирубина, активность ферментов аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, и щелочной фосфатазы (ЩФ), содержание общего холестерина. Спектрофотометрическое исследование для измерения уровня малонового диальдегида в гомогенате печени при помощи тиобарбитуровой кислоты. Для гистологического исследования ткани печени фиксировали в 10% забуференном формалине (рН – 7,2). Структуру долек и клеток печени исследовали после заливки в парафин, на срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Липиды выявляли окраской REDOIL “O” с докраской гематоксилином на криостатных срезах. Для определения степени активности стеатогепатита использовали шкалу NAS [Диагностика и лечение неалкогольной жировой болезни печени; под редакцией академика РАН профессора В. Т. Ивашкина; Москва 2015 г., стр.13-14].
Уже начиная с 30-х суток исследования у животных опытной группы была замечена тенденция к увеличению уровня общего билирубина в плазме крови, в этом сроке наблюдения не более, чем на 5% превышающем норму, преимущественно за счет свободной фракции. Уровень показателя  продолжал нарастать в ходе эксперимента. Такой рост, на наш взгляд, отражает прогрессирующую дисфункцию печени по мере развития стетогепатита. Подтверждением этого тезиса является повышение и показателей цитолиза, таких как АлАт, АсАт уже к 30 дню на  37% выше нормы. Изучение содержания в крови животных исследуемой группы на 30 сутки эксперимента ЩФ — основного биохимического маркера холестатического синдрома — выявило достоверное умеренное нарастание активности этого фермента, составившее  13% выше нормы. Выявлено увеличение содержания малонового диальдегида в гомогенате печени на 16% выше референсных значений.
Гистологическое исследование структуры печени крыс при формировании неалкогольной жировой болезни печени в течение 30 суток показало выраженные изменения по сравнению с гистоморфологией печени контрольных мышей. У животных опытной группы  были выявлены признаки гидропической и жировой дистрофии печени. Мы обнаружили нарушение балочной структуры печеночных долек. Часть гепатоцитов имела признаки гидропической дистрофии: гепатоциты увеличены в объёме, были выявлены участки просветления цитоплазмы – вакуоли, заполненные жидкостью. Ядра изменённых клеток окрашивались бледно.
Окраска на липиды RedOil позволила выявить жировые включения, которые присутствовали в большем количестве, чем в группе контроля, затрагивая  уже 23±8% гепатоцитов, и были представлены преимущественно мелкокапельными и единичными среднекапельными включениями. Распределение липидов в разных долях печени  было однородным, была выявлена тенденция к более густой жировой инфильтрации в перицентральных областях.
В группе, содержавшейся на экспериментальной диете 75 суток, содержание малонового диальдегида в гомогенате печени было повышено  в среднем на 27%. Отмечалась выраженная гиперхолестеринемия, показатель возрос на 69% в сравнении с нормой; гипергликемия – на 13% выше нормы, гиперферментемия – АсАт на 76% выше нормы, АлАт на 69% выше нормы, незначительная гипербилирубинемия на 10% выше нормы. Содержание общего белка оставалось в рамках референсных значений.
При формировании НАЖБП в течение 75 суток в печени животных обнаруживалось резко выраженные  признаки гидропической и жировой дистрофии: гепатоциты увеличены в объёме, отмечаются участки просветления цитоплазмы – вакуоли, заполненные жидкостью. Значительная часть гепатоцитов имела признаки альтерации: изменение формы клеток  с выраженной вакуолизацией цитоплазмы вплоть до баллонной дистрофии. Участки зернистой слабоэозинофильной цитоплазмы располагаются вокруг ядер и вдоль клеточных мембран. Во всех зонах долек выявлялись грубые нарушения гистологической архитектоники и балочной структуры печёночных долек, признаки гидропической и жировой дистрофии. Баллонная дистрофия затрагивала до 75% гепатоцитов.
Жировая дистрофия гепатоцитов была значительно выражена и имела вид мелкокапельной и среднекапельной вакуолизации. При помощи окраски на липиды с помощью красителя RedOil, была выявлена массивная жировая дистрофия печени. Наибольшая аккумуляция липидов отмечалась в гепатоцитах перицентральных зон. При мелкокапельной вакуолизации цитоплазма гепатоцитов была пенистой, пылевидные вакуоли располагались равномерно по цитоплазме, не смещая ядра. При среднекапельной вакуолизации в цитоплазме имелись округлые капельные включения, накапливающие краситель. Жировые включения в образцах печени мышей после 75 суток эксперимента затрагивали  около 82±15% гепатоцитов, и были представлены мелкокапельными, 48±8%, и среднекапельными, 34±7%, жировыми включениями. Распределение липидов в разных дольках было однородным, имелась тенденция к более густой жировой инфильтрации в перицентральных областях.
Таким образом, по шкале NAS  срезы печени от мышей из группы, находящейся на экспериментальной диете, получили среднюю величину в 6,7 балла, что соответствовало высокой активности неалкогольного стеатогепатита.
Таблица 1. Изменения исследуемых показателей при моделировании неалкогольной жировой болезни печени в эксперимента по предлагаемому способу.
Название показателя
Среднее значение показателяна 30 сутки
Среднее значение показателяна 75 сутки
Стеатоз
123%
182%
Балл по шкале NAS
3,9
6,7
Билирубин
105%
110%
АлАт
132%
169%
АсАт
137%
176%
ЩФ
113%
123%
Холестерин
100%
169%
Малоновыйдиальдегид в печени
116%
127%
Таблица 2. Сравнительная характеристика предлагаемого  и известных способов моделирования НЖББП.
Параметры
Применение мутантных линий ob/ob db/db
МХД диета
модель Либера
Предлагаемый способ
Стеатоз печени
есть
есть
есть
есть
Морфологические признаки гепатита
есть/нет
есть
есть
есть
Наличие некровоспалительных изменений в печени
нет
есть
есть
есть
Гипергликемия
есть
нет
есть
есть
Гиперферментемия
нет
есть
есть
есть
Развитие у животных ожирения
есть
нет
есть
есть
Длительность кормления
30 суток
25 суток
21 день
75 суток
Самостоятельное употребление пищи животными
есть
есть
нет
есть
Необходимость наличия у исследователя особых навыков
нет
нет
есть
нет
Необходимость применения сложного специализированного оборудования
нет
нет
есть
нет
Простота
нет
нет
нет
есть
Дешевизна
нет
есть
нет
есть
Таким образом, предложенный нами пищевой рацион для самостоятельного кормления мышей линии C57Bl/6, приводил к развитию у экспериментальных животных стеатогепатита, характеризующегося явлениями мембранодеструкции, признаками жировой, гидропической дистрофии, нарушением гистологической архитектоники морфофункциональных единиц печени. Такие гистологические изменения характерны и для людей, больных неалкогольной жировой болезнью печени.  Имеются изменения и в биохимических показателях крови, нарастающие в зависимости от продолжительности содержания на экспериментальной диете, а именно гиперферментемия, гипергликемия, гипербилирубинемия, увеличение показателя щелочной фосфатазы. Так же  увеличивалось содержание малонового диальдегида в гомогенате печени, которое свидетельствует об усилении пероксидного окисления липидов и является характерными признаком НАЖБП у людей. Существенным преимуществом разработанного нами способа является простота выполнения, дешевизна и доступность предлагаемого нами экспериментального рациона. Животные питаются самостоятельно, дополнительного введения экспериментатором веществ перорально или иными путями не требуется.
* За помощь, оказанную при проведении различных этапов исследования авторы выражают благодарность сотрудникам НИИ экспериментальной биологии и медицины ВГМУ имени Н.Н.Бурденко:
руководителю лаборатории постгеномных исследований, старшему научному сотруднику, к.б.н. Антаковой Любви Николаевне; старшему научному сотруднику, к.б.н. Герасимовой Ольге Андреевне; старшему лаборанту Сенчуковой Любви Николаевне;  лаборанту Корденко Антону Анатольевичу;  лаборанту Самолдиной Светлане Викторовне; лаборанту Мешковой Валентине Юрьевне; Чусовой Лидии Петровне и Износовой Марии Борисовне.