Способ выделения гемозоина Opisthorchis felineus
METHOD FOR ISOLATING HEMOZOIN OPISTHORCHIS FELINEUS

Способ выделения гемозоина Opisthorchis felineus
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и биохимии и может быть использовано в медицине, при создании наборов для определения наличия и интенсивности инвазии Opisthorchis felineus, создании и тестировании перспективных противоописторхозных лекарственных средств. Изобретение представляет собой способ, получения гемозоина Opisthorchis felineus – специфического продукта метаболизма паразита.
В настоящее время существует два вида описторхов патогенных для человека - O. felineus и O. viverrini. Печеночные сосальщики вида O. viverrini распространены преимущественно на территории юго-восточной Азии (Тайланд, Вьетнам, Лаос, Камбоджа). В Евразии (на территории России, Украины и Казахстана) распространен вид O. felineus [1]. Отдельные случаи заражения O. felineus регистрируются так же на территории стран Евросоюза [2].
Описторхи постоянно подвергаются взаимодействию с активными формами кислорода в организме хозяина, выделяемыми активированными иммунными клетками и образовавшимися в дыхательной цепи. В процессе жизнедеятельности описторхи поглощают гемоглобин хозяина, который расщепляется несколькими протеолитическими ферментами [3,4] с образованием пептидов, аминокислот и протез группы гем [5].
Гем является амфифильной молекулой с низким молекулярным весом, которая играет важную биологическую роль, участвуя в процессах от клеточного дыхания до детоксификации лекарств [5]. Показано, что находясь в «свободном» состоянии, гем способен стимулировать выработку кислородаобразование свободных радикалов [6,7], перекисное окисление липидов [8,9] и окисление белков и ДНК [10,11]. Из-за его амфифильной природы, «свободный» гем также влияет на стабильность и растворимость фосфолипидов клеточных мембран [12,13]. В ходе эволюции питающиеся кровью организмы приобрели эффективные механизмы адаптации для избежание вредных последствий "свободного" гема [14]. Особый механизм присутствует у питающихся кровью малярийных паразитов (Plasmodium sp.) [15], кровососущего триатомового клопа R hodnius prolixus, переносчика болезни Шагаса [16], у паразита класса трематоды S. mansoni есть включения гемозоина, кристаллов гема темно-коричневый цвета [23]. Было показано, что кристаллизация гема представляет собой главный механизм детоксикации гема как у R. prolixus, так и у S. Mansoni. Взрослые самки S. mansoni производят большое количество гемозоина в кишечнике [17].
Известен подход обнаружения гемозоина в качестве индикатора малярии в образце крови, где гемозоин обнаруживают с помощью магнитного разделения, растворения и спектроскопического анализа [18]. Основным недостатком данного подхода является выделение гемозоина с использованием его магнитных свойств, что не позволяет достигнуть должного уровня чистоты гемозоина (очистка от примесей белков, липидов, железа гемоглобина), что является важным моментом в научных исследованиях при создании диагностических наборов или для проведения культуральных работ при создании лекарственных средств.
Описаны также системы, устройства и способы для обнаружения малярии, а также для мониторинга и лечения малярийной инфекции [19].
Наиболее близким техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является способ диагностики малярийной инфекции с помощью поверхностной усиленной спектроскопии комбинационного рассеяния света (SERS) [20]. Способ включает получение образца от пациента, смешивание образца с суспензией магнитных наночастиц, где указанные магнитные наночастицы адсорбируют гемозоин, присутствующий в образце, на их поверхности, получение спектров SERS образца и корреляцию полученных спектров с наличием гемозоина в образце, где наличие гемозоина свидетельствует о малярийной инфекции. Описанное средство принято за прототип изобретения. Протопит относится к диагностическим средствам, но позволяет выделять гемозоин из биологических образцов благодаря его магнитным свойствам. К недостаткам данного способа следует отнести, что данная методика позволяет выделять гемозоин из проб биологического материала, изначально содержащего большое количество гемозоина, а также контаминация полученного гемозоина различными белками, липидами, образцами биологического материла пациента.
Использование очищенных специфических продуктов метаболизма, антигенов паразита, установление генных последовательностей является важным аспектом для установления видовой идентификации возбудителей различных заболеваний в научных исследования и проведения дифференциальной диагностики в практической медицине.
Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является повышение скорости и очистки гемозоина O. felineus от яиц описторха, липидов, белков, биллирудина, гемоглобина крови.
Технический результат достигается в следующем техническом решении:
1. Биологический материал (зрелые формы паразита) гомогенизировать с помощью ультразвукового гомогенизатора в 1N растворе PBS.
2. 3 мл биологического материала центрифиугировать 8 минут 700 об/мин в градиенте перколла для очистки от яиц O. felineus.
3. Полученный супернатант центрифугировать на 13000 об/мин в течение 15 минут на цетрифуге типа MiniSpin.
4. Ресуспендировать осадок в 1 мл 1N PBS, перенести в пробирку на 15 мл, добавить 3.75 мл 1:2 (v/v) CHCl3:MeOH и хорошо перемешать.
5. Добавить 1.25 мл CHCl3 и перемешать, добавить 1.25 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать.
6. Центрифугировать 1000 g 5минут при комнатной температуре.
7. Отобрать гемозоин на границе раздела фаз.
8. Гемозоин ресуспензировать в 500 мкл 1% протеиназы К.
9. Термостатировать в течение 12 часов при 37°С.
10. Тщательно перемешать на гомогенизаторе.
11. Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре.
12. Осадок растворить в 1,5 мл 1N PBS, содержащем 2% SDS
13. Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре.
14. Процедуры 12-13 повторить дважды.
15. Осадок растворить в 1,5 мл 0.1 M NaHCO3 (pH 9.1) содержащем 2.5% SDS
16. Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре.
17. Процедуры 15-16 повторить 3 раза.
18. Осадок растворить в 1,5 мл дистиллированной воды.
19. Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре
20. Процедуры 18-19 повторить 5 раз.
21. Отфильтровать полученный гемозоин через сито.
22. Полученный гемозоин развести в 200 мкл 1N PBS.
Разработанная методика позволяет  выделять специфический продукт метаболизма паразита Opisthorchis felineus, и очищать гемозоина от липидов, яиц паразита и белковых примесей.
Список использованных источников:
1. Ogorodova L.M., Fedorova O.S., Sripa B. et al. Opisthorchiasis: an overlooked danger // PLoS Negl. Trop. Dis.-2015. –V. 9. -N.4 :e0003563.
2. Pozio E., Armignacco O., Ferri F., Gomez Morales M.A. Opisthorchis felineus, an emerging infection in Italy and its implication for the European Union // Acta Trop. -2013. -V. 126. N.1.- P.54-62.
3. Greenberg R. M. ABC multidrug transporters in schistosomes and other parasitic flatworms //Parasitology international. – 2013. – Т. 62. – №. 6. – С. 647-653.
4. Maule A. G., Marks N. J. (ed.). Parasitic flatworms: molecular biology, biochemistry, immunology and physiology. – CABI, 2006.
5. Ponka P. Cell biology of heme //The American journal of the medical sciences. – 1999. – Т. 318. – №. 4. – С. 241-256.
6. Davies M. J. Detection of peroxyl and alkoyl radicals produced by reaction of hydroperoxides with heme-proteins by electron spin resonance spectroscopy //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. – 1988. – Т. 964. – №. 1. – С. 28-35.
7. Van Der Zee J., Barr D. P., Mason R. P. ESR spin trapping investigation of radical formation from the reaction between hematin and tert-butyl hydroperoxide //Free Radical Biology and Medicine. – 1996. – Т. 20. – №. 2. – С. 199-206.
8. Tappel A. L. Unsaturated lipid oxidation catalyzed by hematin compounds //J Biol Chem. – 1955. – Т. 217. – №. 2. – С. 721-733.
9. Gutteridge J. M., Smith A. Antioxidant protection by haemopexin of haem-stimulated lipid peroxidation //Biochemical Journal. – 1988. – Т. 256. – №. 3. – С. 861-865.
10. Aft R. L., Mueller G. C. Hemin-mediated oxidative degradation of proteins //Journal of Biological Chemistry. – 1984. – Т. 259. – №. 1. – С. 301-305.
11. Aft R. L., Mueller G. C. Hemin-mediated DNA strand scission //Journal of Biological Chemistry. – 1983. – Т. 258. – №. 19. – С. 12069-12072.
12. Chou A. C., Fitch C. D. Mechanism of hemolysis induced by ferriprotoporphyrin IX //The Journal of clinical investigation. – 1981. – Т. 68. – №. 3. – С. 672-677.
13. Schmitt T. H., Frezzatti W. A., Schreier S. Hemin-induced lipid membrane disorder and increased permeability: a molecular model for the mechanism of cell lysis //Archives of biochemistry and biophysics. – 1993. – Т. 307. – №. 1. – С. 96-103.
14. Slater A. F. et al. An iron-carboxylate bond links the heme units of malaria pigment //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1991. – Т. 88. – №. 2. – С. 325-329.
15. Oliveira M. F. et al. Haem detoxification by an insect //Nature. – 1999. – Т. 400. – №. 6744. – С. 517.
16. Oliveira M. F. et al. Haemozoin in Schistosoma mansoni //Molecular and biochemical parasitology. – 2000. – Т. 111. – №. 1. – С. 217-221.
17. Oliveira M. F. et al. Structural and morphological characterization of hemozoin produced by Schistosoma mansoni and Rhodnius prolixus //Febs letters. – 2005. – Т. 579. – №. 27. – С. 6010-6016.
18. Патент CN107003311, 01.08.2017г.  «Malaria detection».
19. Патент US20110196239, 15.07.2014г. «Systems, devices, and methods for detection of malaria».
20. Патент US20120257199, 06.06.2017г. «Method of diagnosing malaria infection in a patient by surface enhanced resonance raman spectroscopy».