Результаты получения неонатальных клеток селезенки новорожденной свиньи для ксенотрансплантации

связаны с приступами пароксизмальной тахикардии.

Приступы пароксизмальной тахикардии были подтверждены в 7 случаях (13%) при проведении стандартной ЭКГ. Частота приступов была различна: от однократного приступа до нескольких приступов в неделю. Приступы пароксизмальной тахикардии впервые возникали в различные возрастные периоды: от 4 месяцев до 11 лет.

При проведении суточного холтеровского монитори-рования ЭКГ постоянный WPW-синдром выявлен у 25 детей (46%), транзиторный — у 29 (54%). Эктопическая активность выявлена у 46 пациентов (85%), из них су-правентрикулярные эктопии — у 29 (54%), желудочковые эктопии — у 17 (31%). В большинстве случаев эктопии были единичные и лишь у 7 детей (13%) зарегистрированы короткие пробежки суправентрикулярной пароксизмальной тахикардии и у 1 — короткий эпизод желудочковой пароксизмальной тахикардии. При этом у детей с подтвержденными приступами пароксизмальной тахикардии в анамнезе при проведении СХМ-ЭКГ у 3 детей (из 7) не выявлено никакой эктопической активности, у одного ребенка — единичные желудочковые экстрасистолы и у 3 пациентов — редкие одиночные су-правентрикулярные и желудочковые экстрасистолы.

Кроме эктопической активности при суточном мо-ниторировании ЭКГ с высокой частотой регистрировались миграция водителя ритма — 42 (78%), эпизоды синоатриальной блокады 2 степени — 44 (81%), реже —

атриовентрикулярная блокада 1 степени — 3 (5,5%), 2 степени 1 типа — 1 (1,8%), АВ-диссоциация — 1 (1,8%), паузы ритма, превышающие допустимые нормы — 10 (18,5%), единичные эпизоды остановки синусового узла фпиз-аггез^ — 2 (3,7%).

Всем детям с WPW-синдромом назначалась вегето-тропная терапия с учетом полученных результатов обследования. Антиаритмическая терапия проводилась только 5 детям с частыми приступами пароксизмальной тахикардии (атенолол или амиодарон). В этой же группе был ребенок с синдромом удлиненного интервала ОТ. Все эти дети были направлены на консультацию к кардиохирургу для решения вопроса о проведении элек-трофизиологического исследования и решения вопроса о необходимости оперативного лечения.

Таким образом, частота развития пароксизмальной тахикардии при WPW-синдроме составила 27 %. Поэтому при имеющихся жалобах на ощущение учащенного сердцебиения, особенно при наличии WPW-синдрома, необходимо рекомендовать контролировать частоту сердечных сокращений, по возможности — проведение ЭКГ во время приступа, т.к. при проведении суточного холтеровского мониторирования ЭКГ не всегда регистрируется эктопическая активность. Манифестные формы WPW-синдрома нередко требуют проведения постоянной антиаритмической терапии, а также хирургической коррекции в условиях кардиохирургического центра.

ЛИТЕРАТУРА

1. Белозеров Ю.М. Детская кардиология. — М.: МЕДпресс-информ, 2004. — 600с.

2. Белоконь H.Ä., Кубергер М.Б. Болезни сердца и сосудов у детей: руководство для врачей. — В 2 т. Т.1. — М.: Медицина, 1987. — 448с.

3. Кардиология: национальное руководство / Под ред. Ю.Н. Беленкова, Р.Г. Оганова. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. — 1232с.

4. Макаров Л.М. ЭКГ в педиатрии. — 2-е издание. — М.: МЕДПРАКТИКА-М, 2006. — 544с.

5. Мутафьян O.A. Аритмии сердца у детей и подростков (клиника, диагностика и лечение). — СПб.: Невский диалект, 2003. — 224с.

6. Орлова Н.В., Парийская ТВ. Кардиология: Новейший справочник педиатра. — М.: Изд-во Эксмо; СПб.: Сова, 2003. — 624с.

7. Осколкова М.К., Куприянова О. О. Электрокардиография у детей. — М.: МЕДпресс-информ, 2001. — 352с.

8. Середа Ю.В. Электрокардиография в педиатрии: учебное пособии. — 3-е изд. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2005. — 101с.

9. Хофман Дж. Кардиология. / Под ред. К. Рудольфа, А. Рудольфа. — Пер. с англ. — М.: Практика, 2006. — 704с.

10. Шипова Л.Г., Бабаш Г.В. Нарушения ритма сердца у детей. — Нижний Новгород: Изд-во НГМА, 2002. — 136с.

Информация об авторах: 664079, г. Иркутск, м-н Юбилейный, 100, ИГИУВ, кафедра неотложной педиатрии,

e-mail: tv_tolstikova@mail.ru Толстикова Татьяна Вячеславовна — ассистент, к.м.н.; Марчук Татьяна Павловна — заведующий отделением; Князева Татьяна Сергеевна — заведующий отделением; Матюнова Алла Егоровна — врач кардиоревматолог.

© ЛЕПЕХОВА С.А., КАРГИН А.Г., ГОЛЬДБЕРГ O.A., ПРОКОПЬЕВ М.В., БАТУНОВА Е.В., КОВАЛЬ Е.В., ЗАРИЦКАЯ Л.В., ПОСТОВАЯ О.Н. — 2011 УДК 576.088

РЕЗУЛЬТАТЫ ПОЛУЧЕНИЯ НЕОНАТАЛЬНЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ НОВОРОЖДЕННОЙ СВИНЬИ ДЛЯ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ

Светлана Александровна Лепехова1, Александр Германович Каргин1, Олег Аронович Гольдберг1,

Максим Владимирович Прокопьев1, Елена Владимировна Батунова2, Елена Владимировна Коваль1,

Лариса Васильевна Зарицкая2, Ольга Николаевна Постовая2

Резюме. Представленная работа посвящена разработке технологии забора, выделения, культивирования неонатальных клеток селезенки свиньи для трансплантации. Разработанная технология позволила получать культуру клеток селезенки, состоящую преимущественно из клеточных групп, изолированных клеток было 45,0 (40-55) %, с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х 107 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3 (98,9-99,4) %. Культура продуцировала фактор роста гепатоцитов с максимальными значениями на 5-е сутки, когда концентрация в среде культивирования увеличивалась в 255 раз.

Ключевые слова: клетки селезенки, культура, пролиферация.

THE RESULTS OF OBTAINING OF NEONATAL SPLEEN CELLS OF NEONATAL PIG FOR XENOTRANSPLANTATION

S.A. Lepekhova1, A.G. Kargin1, O.A. Goldberg1, M.V. Prokopiev1, E.V. Batunova2,

E. V. Koval1, L. V. Zaritskaya2, O.N. Postovaya2 ('Center of Reconstructive Surgery, Siberian Branch, Russian Academy of Medical Sciences;

2Irkutsk State Institute for Postgraduate Medical Education)

Summary. The given work is devoted to the research of technology of taking, excretion and cultivating of neonatal spleen cells of pig for transplantation. The developed technology let us create a culture of spleen cells, which consists mostly of cell groups, there were 45,0 (40-55) % of isolated cells with containing 4,6 (4,1-4,8) x 107 cells in 1 ml of suspension and proportion of viable cells 99,3 (98,9-99,4) %. The culture produced factor of hepatocytes growth with maximal values on the 5th day, when concentration in culture medium increased in 255 times.

Key words: spleen cells, culture, proliferation.

Для коррекции функциональной недостаточности различных органов (печень, поджелудочная железа) находит применение ксенотрансплантация свиного материала [2,3,6,7]. Накоплен опыт по выделению, культивированию и криоконсервации клеток печени, костного мозга [2,6,7].

В реферированной литературе мы не встретили данных по технологии получения клеточного материала из селезенки новорожденных свиней, характеристики клеток для трансплантации.

Целью работы явилась разработка технологии выделения, культивирования неонатальных клеток селезенки свиньи с высокой степенью жизнеспособности и сохранением клеточного микроокружения.

селезенки (изобретение «Среда для криоконсервации клеток селезенки», патент РФ № 2194753 дата получения 08.01.2001.).

Консервированные клетки хранили при температуре —70 оС в течение 7 суток. Пробирки с клетками отогревали на водяной бане при температуре +41оС. Перед ксенотрансплантацией в асептических условиях оценивали жизнеспособность клеток вышеуказанным способом.

Данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). Определение значимости различий полученных данных (р) в сравниваемых выборках проведено по критериям Манна-Уитни (и), Вилкоксона ^) [8].

Материалы и методы

Результаты и обсуждение

Работа выполнена на базе клеточного бокса научного отдела экспериментальной хирургии с виварием Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Нц РВХ СО РАМН (вет. удостоверение 238 № 0015220 от 25 марта 2009 г, служба ветеринарии Иркутской области). Забор биоматериала проводили с соблюдением правил гуманного обращения с животными, которые регламентированы «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом Минздрава СССР №742 от 13.11.1984 г. «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и №48 от 23.01.1985 г. «О контроле за проведением работ с использованием экспериментальных животных».

Для получения клеток использовали селезенки новорожденных поросят. Забор биоматериала производили по методике G. Starke (1970) [1]. Клетки получали комбинированным методом дезагрегации, за основу был взят метод M. Berry (1969) [5].

Выделение клеток селезенки проводили в 9 этапов. Подсчет жизнеспособных клеток проводили с помощью теста на исключение красителя с использованием камеры Фукса-Розенталя.

Культивирование выделенных клеток проводили в матрацах Ру с использованием стандартных питательных сред и добавок, производимых фирмами «ПанЭко» и «Sigma», в течение 5 суток по методу Р. Фрешни

[1]. Полученные клетки консервировали с применением модифицированной среды для криоконсервации клеток

Таблица 1

Сравнительная эффективность способов выделения клеток селезенки новорожденной свиньи

№ Способ выделения клеток Удельный вес жизнеспособных клеток(%) Кол-во клеток, полученных из 1 г ткани селезенки, x 107

1.4 Механическая дезагрегация ткани селезенки 68,0 (68,0-70,0)* 0,20 (0,19-0,23)*

1.5 Трипсинизация ткани селезенки 74,0 (74,0-76,0)* 1,20 (1,18-1,22)*

1.6 Комбинированный способ дезагрегации

Примечание: * — значимые различия показателя (рц < 0,05) по сравнению с комбинированным методом дезагрегации.

Для оценки эффективности выбранного метода диссоциации ткани селезенки, отдельные компоненты которого были известны ранее, мы исследовали жизнеспособность клеток на всех этапах забора донорского материала, в сравнении с результатами реферированных методов.

Для получения клеток селезенки по методу В.В. Малайцева, ткань селезенки измельчали с применением механической дезагрегации. Полученная взвесь, по данным цитологического исследования (мазки-отпечатки), содержала конгломераты клеток (100 клеток и более), изолированные лимфоциты, и клеточный детрит. Оказалось, что полученную взвесь очень трудно стандартизировать по составу и фракционировать в силу больших размеров клеточных конгломератов. Оценка жизнеспособности полученной взвеси выявила высокий уровень гибели изолированных клеток при сохранности клеток во фрагментах (табл. 1).

Далее в своей работе мы воспользовались известным способом выделения клеток путем трипсинизации ткани селезенки. Полученная взвесь содержала изолированные селезеночные лимфоциты с низкой степенью жизнеспособности, а на выходе отмечали большие потери клеточного материала.

В дальнейшем в связи с перечисленными недостатками мы отказались от применения названных методов.

За основу нами была взята методика, разработанная для получения клеток печени посредством комбинированного метода дезагрегации с применением механического измельчения и ферментативной обработки коллагеназой. Такой способ дезагрегации позволяет стандартизировать полученную взвесь клеток по составу и подсчитать количество полученных клеток. Центрифугированием клеток в прерывистом фиколловом градиенте добивались очистки клеточной суспензии и удаления клеточного детрита, элементов периферической крови, крупных фрагментов, поврежденных клеток.

Методика были разработана для получения изолированных гепатоцитов, а нам нужно было разработать метод получения клеток селезенки. Мы добивались получения изолированных клеток и микрофрагментов (не более 10 клеток в ассоциации) ткани селезенки с сохранением микроокружения клеток.

Таблица 2

Влияние рН питательной среды на жизнеспособность клеток селезенки

№ Исходное значение рН среды рН среды после размещения клеточной взвеси Жизнеспособность, через 2 часа культивирования, %

2.5 6,8 6,6

2.6 7,0 6,9

2.7 7,2 6,95

2.8 7,4 7,2

2.9 7,6 7,4

2.10 7,8 7,6

2.11 8,0 7,0

2.12 8,2 6,7

Примечание: показатель жизнеспособности и объем внесенных клеток до инкубации был одинаковым во всех сериях наблюдений.

Выбранный способ дезагрегации позволил получить взвесь изолированных клеток и микрофрагментов по 2-4 клетки. Применение разработанной методики позволило существенно (рц = 0,04) повысить жизнеспособность клеток — 99,4 (98,9-100) % и количество материала, получаемое из 1 г ткани селезенки 6,15 (5,86-6,40) х 107 (табл. 1.) Масса одной селезенки новорожденного поросенка по нашим данным составил 1,05 (0,9-1,1) г.

При цитологическом исследовании клеток селезенки, полученных по модифицированной нами методике, сразу после выделения состав клеточной суспензии был представлен изолированными лимфоцитами, макрофагами, моноцитами и ретикулярными клетками. Клетки располагались изолированно, либо группами по 2-4. Ядра клеток были расположены преимущественно в центре гомогенной цитоплазмы. Ядра малых, средних и больших лимфоцитов содержали отростки, встречались клетки с мелкозернистым хроматином, цитоплазма имела четкую границу. Ретикулярные клетки были с овальными ядрами, широкой зернистой цитоплазмой, с редкими вакуолями (рис. 1).

Таким образом, предложенный способ позволил получать клетки с жизнеспособностью 99,4 %, увеличением количества клеток выделенных из 1 г ткани селезенки до 6,15 (5,86-6,40) х 107. Клеточный состав был представлен изолированными лимфоцитами, макрофагами, моноцитами и ретикулярными клетками. Выделенные клетки большей частью располагались группами по 2-4.

При работе с клетками печени нами было показано, что закисление среды находится во взаимосвязи с витальными характеристиками культивируемого материала. Мы предположили, что и для клеток селезенки важна величина pH среды культивирования. Для уточ-

Рис. 1. Клетки селезенки новорожденных поросят после выделения из органа. Окраска по Романовскому. Ув. х 160.

Рис. 2. Клетки селезенки новорожденной свиньи после культивирования в течение 5 суток. 1 — группы клеток, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Окраска по Романовскому. Ув. х400.

нения оптимального уровня pH среды культивирования выполнены стендовые эксперименты с вариацией исходного pH среды, в которых клетки селезенки свиньи с известной жизнеспособностью инкубировали в течение 2-х часов.

Нами было показано снижение рН в среднем на 0,2 при исходных значениях 7,4-7,8, а при дальнейшем повышении рН питательной среды закисление ее после размещения клеток было более выраженным с существенным снижением удельного веса жизнеспособных клеток (табл. 2).

Следовательно, исходный показатель рН среды для культивирования, с учетом закономерного закисления, должен составлять 7,6.

Культивирование клеток селезенки проводили с использованием оригинальной среды (рац. предложение «Среда для культивации клеток селезенки свиньи» №194 от 07.03.2001, НЦРВХ ВСНЦ СО РАМН).

Состав среды для культивирования клеток селезенки включал в себя среду RPMI 1640; трансферрин — 1 мкг/ мл; глутамин — 0,3 мкг/мл; дексаметазон Е-6 5 Е/мл — 0,1 мл на 10 мл среды; липиды бобов сои без холестерина — 17 мкг/мл; сыворотку эмбриональную телячью кат. № К055 — 1 мл на 10 мл среды; рН среды — 7,6.

К пятым суткам культивирования количество клеток увеличивалось на 50%. Длительность культивирования была выбрана на основании наших данных о приобретении клетками печени в культуре максимальной пролиферативной активности к 5-м суткам.

Для определения пролиферативной активности культивированных клеток селезенки рассчитывали митотический индекс (табл. 3).

При оценке количества регуляторного пептида HGF нами выявлена его низкая концентрация в среде после центрифугирования выделенных клеток селезенки —16,8 (11,2-43,8) нг/мл. К пятым суткам исследования выявлено статистически значимое увеличение количества регуляторного пептида HGF до 4300 (38924770) нг/мл (pW = 0,00001).

При исследовании цитологических препаратов культивированных клеток обнаруживали разрозненные клетки и ассоциации, состоящие из лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и ретикулярных клеток. Ядра всех клеток и цитоплазма имели четкие контуры. В ядрах накапливался преимущественно крупноглобулярный хроматин, хорошо просматриваемый на фоне просветленного ядра. Апоптозных тел и сегментоядерных лейкоцитов не было (рис. 2).

Если во взвеси выделенных из селезенки клеток их наибольшее количество было изолированным друг от друга — 95,0 (90-99) %, то после культивирования преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 45,0 (40-55) %; ру/ = 0,015.

Таким образом, нами получена культура клеток селезенки, состоящая преимущественно из лимфоцитов, с содержанием 4,6 (4,1-4,8) х 107 клеток в 1 мл взвеси и удельным весом жизнеспособных клеток 99,3 (98,999,4) %. Культура продуцировала фактор роста гепато-

цитов с максимальными значениями на 5-е сутки, когда концентрация в среде культивирования увеличивалась в 255 раз. После культивирования преобладали клеточные группы, а изолированных клеток было 45,0 (4055) %.

ЛИТЕРАТУРА

1. Культура животных клеток: Методы. / Под ред. Р. Фрешни. — Пер. с англ. — М.: Мир,1989. — 333с.

2. Лепехова С.А., Гладышев Ю.В., Гольдберг O.A., Рунович A.A. Влияние ксенотрансплантации фетальных тканей на ультраструктуру гепатоцитов при остром токсическом гепатите.// Бюлл. экспер. биол. и мед. — 1998. — Т.126. Прил. 1. Трансплантация фетальных тканей и клеток: Сб. науч. ст. / Под ред. В.И. Кулакова, Г.Т. Сухих. — С.169-170.

3. Лепехова С.А., Апарцин К.А., Прокопьев М.В., Гольдберг O.A. Трансплантация криоконсервированных клеток при острой печеночной недостаточности // Материалы Всерос. конференции «Новые направления в клинической медицине». — Ленинск-Кузнецкий, 2000. — С. 94-95.

4. Практическая вирусология / Под ред. Г. Старке. — Пер. с нем. — М.: Колос,1970. — 352с.

5. Berry M.N., FriendD.S. High-yeld preparation of isolated rat liver parenchimal cells: a biochemical and fine structural study // J. Cell Biol. — 1969. — Vol. 43. — P. 506-520.

6. Gupta S., Rajvanshi P., Sokhi R., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium //Hepatology. — 1999. — Vol.29. — №2. — P. 509-519.

7. Yazigi N.A., Carrick T.L., Bucuvalas J.C., et al. In vitro evaluation of donor liver preservation fluids on human hepatocyte function // Transplantation. — 1997. — Vol.64. №6. — P816-820.

8. Глани, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц // Пер. с англ. — М.: Практика. — 1998. — С. 459-460.

Информация об авторах: 664079, Иркутск, Юбилейный, 100, а/я 23, lepekhova_sa@mail.ru 407-666 Лепехова Светлана Александровна — д.б.н., заведующий отделом,

Каргин Александр Германович — м.н.с., Прокопьев Максим Владимирович — к.м.н., с.н.с., Гольдберг Олег Аронович — к.м.н., заведующий лабораторией,

Коваль Елена Владимировна — м.н.с.,

Зарицкая Лариса Васильевна — к.б.н., заведующий отделом,

Постовая Ольга Николаевна — м.н.с., Батунова Елена Владимировна — м.н.с.

© МАКСИКОВА Т.М., КАЛЯГИН А.Н., ПИВЕНЬ Д.В. — 2011

УДК 615

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА У ЛИЦ, ЗАНИМАЮЩИХСЯ В ГРУППАХ ЗДОРОВЬЯ

Татьяна Михайловна Максикова1-2, Алексей Николаевич Калягин1, Дмитрий Валентинович Пивень3

Резюме. На группе из 12 лиц в возрасте около 60 лет, посещающих занятия физической культурой в группе здоровья, оценена возможность применения дигидрокверцетина для коррекции основных показателей, лимитирующих здоровье человека. Дигидрокверцетин способствует снижению массы тела, нормализации артериального давления, оказывает выраженное положительное влияние на функциональное состояние центральной и вегетативной нервной системы, повышает физическую выносливость и толерантность к физическим нагрузкам. Важно, что на фоне приема дигидрокверцетина произошел значимый прирост интегральных показателей здоровья: общих резервов и физических. Учитывая установленную эффективность, наличие соответствующей разрешительной документации и отсутствие побочных эффектов по результатам исследования, рекомендовано врачам центров здоровья и центров профилактики использование дигидрокверцетина в комплексе назначений с целью формирования здорового образа жизни и устранения выявленных факторов риска и функциональных нарушений.

Ключевые слова: дигидрокверцитин, группы здоровья, показатели, лимитирующие здоровье.

EFFICIENCY OF APPLICATION OF DIHYDROQUERCETIN BY PERSONS ENGAGED IN THE GROUPS OF HEALTH

Tatyana M. Maxikova1-2, Alexey N. Kalyagin1, Dmitry V. Piven3 (Irkutsk State Medical University; 2Irkutsk Regional Dispanser “Zdorovie”;

3Irkutsk State Institute of Improvement of Doctors)

Summary. The group of 12 persons in the age of about 60 years, attending classes of physical culture in the group of health, estimation of an opportunity of application of dihydroquercetin for correction of the main indicators, and limiting human health. Dihydroquercetin helps to reduce body weight, normalization of blood pressure, has a marked positive influence on the functional state of the central and vegetative nervous system, increases physical endurance and tolerance to physical activity. It is important, that on a background of reception dihydroquercetin occurred significant growth of integral parameters of health: general reserves and physical. Taking into account the established efficiency, availability of appropriate permits and absence of side effects on the survey results, recommended by the doctors of the health centres and the centres for the prevention of the use of dihydroquercetin in the complex assignments with the purpose of formation of a healthy way of life and the rectification of identified risk factors and functional disorders.

Key words: dihydroquercetin, health groups, indicators, limiting health.

Концепция здорового образа жизни является одной годы. Особое внимание она привлекает с позиции про-из наиболее динамично развивающихся в последние цесса демографического старения населения. В этой си-