Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для парентерального применения на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в лиофилизированной лекарственной форме
PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF NEUROPROTECTIVE ACTION FOR PARENTERAL APPLICATION ON BASIS OF HEXAMETHYLENEDIAMINE BIS-(N-MONOSUCCINYL-L-GLUTAMIL-L-LYSINE) IN LYOPHILIZED DOSAGE FORM

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и фармации и касается фармацевтической композиции в форме лиофилизата для изготовления инъекционной или инфузионной лекарственных форм, содержащей в качестве действующего вещества гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) и функциональные добавки, в качестве которых используют лиопротекторы и криопротекторы в определенном количественном соотношении компонентов при использовании рекомендованных режимов сушки и замораживания, и обладающей нейропротекторной активностью.
Уровень техники
Острые нарушения мозгового кровообращения являются важнейшей медико-социальной проблемой, что обусловлено их высокой долей в структуре заболеваемости и смертности населения. Так, в России уровень заболеваемости и смертности от инсульта - один из самых высоких в мире: частота цереброваскулярных заболеваний достигает 450 человек на 100 тыс. населения, а показатели смертности - 280 человек на 100 тыс. Смертность от сосудистых заболеваний мозга в нашей стране занимает 2-е место, уступая лишь смертности от кардиоваскулярных заболеваний. Инвалидизация вследствие инсульта занимает ведущее место среди причин первичной инвалидности. Согласно мировой статистике более половины инсультов приходится на лиц старше 70 лет. В России инсульты все чаще встречаются у лиц молодого возраста, что выводит их в ранг заболеваний, имеющих медицинскую, социальную и экономическую значимость для общества [Спирин Н.Н., Корнеева Н.Н. Данные госпитального регистра инсульта в Костроме // Фундаментальные исследования. 2012; 4 (ч. 1): 123-128].
Применяющиеся в терапии инсульта препараты, такие как блокаторы кальциевых каналов (нимодипин), антиоксиданты (мексидол), препараты с нейротрофическим действием, получаемые из тканей животных (актовегин, церебролизин, кортексин), ноотропы с нейропротекторным компонентом действия (семакс), не достаточно эффективны, о чем свидетельствует неутешительная статистика инвалидизации и смертности.
Исходя из патогенетических механизмов инсульта и известных данных о процессах сохранения и восстановления жизнеспособности нервной ткани, особое внимание уделяется нейротрофинам как потенциальным средствам, обладающим нейропротекторными свойствами [Pollack S, Harper S // Drug News and Perspectives, 2002. 15 (5), 268-277; Aloe L. et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use // Journal of Translational Medicine, 2012; 10: 239-252].
Накоплено большое количество данных, свидетельствующих о патогенетическом значении эндогенного нейропротекторного белка -фактора роста нервов (NGF) и о перспективах разработки на его основе новых препаратов для фармакотерапии инсультов.
Известно, что NGF участвует в компенсаторных механизмах при ишемических повреждениях мозга. Так, в эксперименте было установлено, что в первые несколько часов после начала церебральной ишемии резко увеличивается как экспрессия мРНК NGF, так и самого белка, что рассматривается в качестве эндогенного механизма нейропротекции [Yang J, Liu HJ, Yang H, Fenq PY. Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia // Neurol. Sci. 2011; 32 (3): 433-441; Guegan С, Onteniente В, Makiura Y. et al. Reduction of cortical infarction and impairment of apoptosis in NGF-transgenic mice subjected to permanent focal ischemia. Brain Res. Mol. Brain Res. 1998; 55 (1); 133-140]. Увеличение содержания NGF, вызванное ишемическим инсультом, наблюдалась и в клинике. Так, была установлена достоверная обратная зависимость между размерами сформированного к 5-7-м суткам инфаркта мозга и уровнем NGF в 1-е сутки: низкому содержанию NGF соответствует наибольший объем инфаркта при сопоставимых локализации сосудистого поражения и размерах ишемизированной зоны в 1-е сутки [Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. 328 с]. Эти факты подтверждают участие NGF в компенсаторных механизмах, противодействующих гибели нейронов в условиях церебральной ишемии.
Эффективность NGF при внутримозговом и интраназальном введении зарегистрирована при использовании ряда экспериментальных моделей ишемии головного мозга, при этом активность установлена как в короткие (до нескольких часов) сроки начала введения, так и через 24 ч после формирования ишемии [Yang J, Liu HJ, Yang H, Fenq PY. Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia // Neurol. Sci. 2011; 32 (3): 433-441; Zhu W, Cheng S, Xu G, et al. Intranasal nerve growth factor enhances striatal neurogenesis in adult rats with focal cerebral ischemia // Drug. Deliv. 2011; 5: 338-343].
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что NGF оказывает влияние на все ключевые этапы повреждения нейронов при церебральной ишемии. На этапе индукции глутамат-кальциевого каскада NGF эффективно противодействует глутаматной токсичности, снижая внутриклеточное накопление ионов кальция [Jiang Н, Tian S, Zeng Y, Shi J. Nerve growth factor inhibits Gd(3+)-sensitive calcium influx and reduces chemical anoxic neuronal death // J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2008; 28 (4): 379-382]. NGF участвует в защите клеток от окислительного стресса, стимулируя экспрессию белков-антиоксидантов, таких как белок теплового шока HSP32 (гемоксигеназа 1), супероксиддисмутаза и глутатионпероксидаза [Hassanzadeh Р, Arbabi Е, Atyabi F, Dinarvand R. Nerve growth factor-carbon nanotube complex exerts prolonged protective effects in an in vitro model of ischemic stroke // Life Sci. 2016. pii: S0024-3205 (16) 30681-30686]. NGF проявляет выраженную анти-апоптотическую активность, снижая экспрессию про-апоптотических белков, таких как Вах и каспаза-3 и стимулируя экспрессию анти-апоптотических белков, таких как Bcl-2 [Park J.H., Kang SS, Kim JY, Tchah H. Nerve Growth Factor Attenuates Apoptosis and Inflammation in the Diabetic Cornea // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2016; 57 (15): 6767-6775; Yang J, Liu HJ, Yang H, Fenq PY. Therapeutic time window for the neuroprotective effects of NGF when administered after focal cerebral ischemia // Neurol. Sci. 2011; 32 (3): 433-441]. Таким образом, NGF действует также и на заключительном, апоптотическом, этапе, общем для разных механизмов повреждения нейронов. Кроме того, известно, что NGF участвует в стимуляции нейрогенеза, регулируя выживаемость, миграцию и дифференцировку нейрональных стволовых клеток [Oliveira SL, Pillat MM, Cheffer A, et al. Functions of neurotrophins and growth factors in neurogenesis and brain repair // Cytometry A. 2013; 83 (1): 76-89]. Была показана способность NGF стимулировать нейрогенез в условиях экспериментальной церебральной ишемии [Zhu W., Cheng S., Xu G., et al. Intranasal nerve growth factor enhances striatal neurogenesis in adult rats with focal cerebral ischemia // Drug. Deliv. 2011; 5: 338-343]. Эти данные свидетельствуют о наличии у NGF, помимо нейропротекторного, и регенеративного потенциала.
Однако, несмотря на высокий терапевтический потенциал, использование NGF в клинике ограничено из-за его низкой биодоступности при системном введении, а также наличия побочных эффектов, связанных с плейотропностью белка, таких как гиперальгезия и потеря веса [Jonhagen ME //Alzheimer. Dis. Assoc. Disord., 2000; 14 (1): 31-38].
В настоящее время для преодоления этих проблем разрабатывается ряд основанных на использовании нейротрофинов терапевтических подходов - генная терапия, введение NGF в форме назальных и глазных капель и др. Теоретически оптимальным подходом является создание низкомолекулярных миметиков нейротрофинов, реализующих при системном введении фармакотерапевтические эффекты целого белка и не обладающих их побочными эффектами.
Известно, что NGF реализует свои основные эффекты, взаимодействуя со специфическими тирозинкиназными TrkA рецепторами. Проведение сигнала при активации TrkA рецепторов осуществляется в основном фосфатидилинозитол-3-киназным (PI3K/Akt) и митоген-активируемым протеинкиназным (MAPK/Erk) сигнальными путями, с первым из которых связана регуляция выживаемости, но не дифференцировки и образования нейритов [Kaplan DR, Miller FD. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Current Opinion in Neurobiology. 2000; 10 (3): 381-391]. В то же время МАР-киназный путь вовлечен как в нейропротекцию, так и в дифференцировку, а также, как полагают, необходим для индукции гиперальгезии [Obata K, Noguchi K. МАРК activation in nociceptive neurons and pain hypersensitivity. Life Sciences. 2004; 74 (21): 2643-5263].
В настоящее время ряд зарубежных фармацевтических компаний и научных групп ведут разработку низкомолекулярных миметиков NGF [Longo FM, Xie Y, Massa SM // Curr. Med. Chem., 2005; 5 29-41; Pollack J, Harper SJ. Small molecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factor mimetics / Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2002; 1 (1): 59-80; Colangelo AM, Bianco MR, Vitagliano L, et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J Neurosci. 2008; 28 (11): 2698-2709; Scarpi D, Cirelli D, Matrone C, et al. Low molecular weight, non-peptidic agonists of TrkA receptor with NGF-mimetic activity. Cell Death Dis. 2012; 3 (7): 339-364; US 5958875, US 7723328, US 8686045, US 8916556; US 6017878; EP 0743955; US 20030211982; EP 1265605; US 8461110]. Так, в Университете МакГилла (Канада) на основе фармакофоров моноклональных мышиных антител к TrkA-рецепторам и пептидных миметиков NGF сконструировано и отобрано нитроарилсодержащее циклическое соединение D3, которое являлось селективным лигандом TrkA-рецепторов и обладало нейропротекторной и дифференцирующей активностью [Maliartchouk S, Feng Y, Ivanisevic L, et al. A designed peptidomimetic agonistic ligand of TrkA nerve growth factor receptors. Mol. Pharmacol. 2000; 57 (2): 385-391]. На старых крысах было показано, что D3 при внутримозговом введении оказывает нейропротекторное и антиамнестическое действие [Bruno MA, Clarke РВ, Seltzer A, et al. Long-lasting rescue of age-associated deficits in cognition and the CNS cholinergic phenotype by a partial agonist peptidomimetic ligand of TrkA. J. Neurosci. 2004; 24 (37): 8009-8018]. В лаборатории им. Риты Леви-Монтальчини (Рим, Италия) в 2008 году были созданы пептиды, содержащие последовательности 1-й и 4-й петли NGF с N-концевым фрагментом, NL1L4, и без него, LIL4 [Colangelo AM, Bianco MR, Vitagliano L. et al. A new nerve growth factor mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 2008; 28 (11): 2698-2709]. Эти пептиды вызывали фосфорилирование TrkA рецепторов и обладали NGF-подобной дифференцирующей активностью. Пептид L1L4 при центральном введении увеличивал сниженный болевой порог на модели периферической нейропатии у крыс. Данных об эффектах D3 и L1L4 при системном введении в литературе нет. В 2012 году на факультете химии Флорентийского университета было синтезировано соединение МТ2, представляющее собой бициклический гетероцикл [Scarpi D., Cirelli D., Matrone С. et al. Low molecular weight, non-peptidic agonists of TrkA receptor with NGF-mimetic activity. Cell Death Dis. 2012; 3 (7): 339-364]. MT2 взаимодействует с TrkA-рецепторами и активирует Akt- и МАР-киназный внутриклеточный каскад; обладает нейропротекторной и дифференцирующей активностью. На клеточной модели болезни Альцгеймера МТ2 противодействует амилоидогенезу и увеличивает жизнеспособность нейронов.
Отметим, что описанные на настоящий момент в литературе миметики NGF, преодолевая фармакокинетические недостатки, не определяют фармакологического решения, поскольку они, аналогично NGF, активируют не только Akt-, но и МАР-киназный сигнальный путь, вовлеченный в нежелательные эффекты полноразмерного белка, то есть неспособны к диссоциации терапевтических и побочных действий полноразмерного белка.
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» создан низкомолекулярный дипептидный миметик 4-й петли NGF - гексаметилендиамид бис-(моносукцинил-глутамил-лизина), получивший рабочий шифр ГК-2 [Патент РФ №2410392, 2009 г.; Патент CN №102365294 В, 2009]. Установлено, что ГК-2 вызывает фосфорилирование специфических для NGF тирозинкиназных TrkA рецепторов и избирательно включает Akt-киназный пострецепторный путь трансдукции сигнала, преимущественно вовлеченный в нейропротекцию и не активирует МАР-киназный путь, связанный с гиперальгезией [Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Константинопольский М.А., Поварнина П.Ю., Середенин С.Б. Оригинальный дипептидный миметик фактора роста нервов ГК-2 избирательно активирует пострецепторные пути TrkA, не вызывая побочных действий полноразмерного неротрофина // ДАН 2014; 456 (1): 88-91]. ГК-2 проявляет нейропротекторную активность в микро-наномолярных концентрациях в условиях окислительного стресса, глутаматной и МФТП-токсичности как в иммортализованных, так и первичных клеточных культурах [Гудашева Т.А., Антипова Т.А., Середенин С.Б. Новые низкомолекулярные миметики фактора роста нервов // ДАН. 2010; 4 (1): 549-552]. ГК-2 продемонстрировал выраженную нейропротекторную активность in vivo при системном введении на моделях как фокальной, так и глобальной церебральной ишемии у крыс (модели фототромбоза коры головного мозга, модели транзиторного перекрытия среднемозговой артерии, модели неполной глобальной хронической ишемии, индуцированной перманентной окклюзией сонных артерий, модели полной глобальной ишемии, индуцированной остановкой сердца) [Середенин С.Б., Гудашева Т.А. Создание фармакологически активной малой молекулы, обладающей свойствами фактора роста нервов // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2015; 6: 63-70]. Кроме того, ГК-2 был активен на моделях болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и сахарного диабета в широком диапазоне доз: 0,01-5 мг/кг при внутрибрюшинном введении и 5-10 мг/кг при пероральном введении [Gudasheva ТА, Povarnina PYu, Antipova ТА, Seredenin SB. A Novel Dimeric Dipeptide Mimetic of the Nerve Growth Factor Exhibits Pharmacological Effects upon Systemic Administration and Has No Side Effects Accompanying the Neurotrophin Treatment // Neuroscience & Medicine. 2014; 5: 101-108]. При этом ГК-2 был лишен основных побочных эффектов, характерных для NGF, а именно не вызывал гиперальгезии и потери веса при введении в наиболее активных дозах [Gudasheva ТА, Povarnina Р, Logvinov IO, Antipova ТА, Seredenin SB. Mimetics of brain-derived neurotrophic factor loops 1 and 4 are active in a model of ischemic stroke in rats // Drug Des Devel Ther. 2016; 10: 3545-3553].
С учетом пептидной природы лекарственного средства, для избегания эффектов пресистемного метаболизма и повышения биодоступности дипептида представляется рациональной создание фармацевтической композиции для парентерального применения.
При разработке композиций и способов получения пептидов для фармацевтического применения следует принимать во внимание несколько факторов. Первостепенное значение имеет стабильность пептида на всех стадиях его получения, транспортировки и на стадиях применения, которые могут включать изготовление композиции, замораживание, сушку, хранение, транспортировку, восстановление, циклы замораживания-оттаивания и хранение после восстановления конечным пользователем.
Другие возможные факторы включают простоту и экономичность изготовления, применения и распределения; состав конечного продукта для введения пациенту; и простоту применения конечным пользователем.
Жидкие лекарственные формы на водной и неводной основе могут обеспечить выполнение определенных задач, в том числе необходимую биодоступность, простоту и экономичность изготовления и удобство для конечного пользователя, но при их создании вещество пептидной природы подвергается большому количеству факторов влияющих на целость молекулы и вызывающих их агрегацию и деструкцию. Часто пептиды в растворе нестабильны при их хранении на протяжении длительных периодов времени [Manning МС, Chou DK, Murphy ВМ, et al. Stability of protein pharmaceuticals: an update. Pharm. Res. 1989; 6: 903-918]. Соответственно, были разработаны дополнительные стадии обработки, позволяющие увеличить срок хранения, включающие сушку, например лиофилизацию.
Лиофилизированные композиции могут также обеспечивать определенные преимущества. Потенциальные преимущества лиофилизации включают возможность создания стабильной лекарственной формы, удобной для хранения, транспортировки и применения, но при условии того, что будут учтены переменные величины, которые могут сказаться на сохранности фармацевтической субстанции (pH, ионная сила раствора, тип и количество вспомогательных веществ в композиции, тип криозащиты, температура, давление и время операций замораживания, сублимации и высушивания). Нестабильность пептида может быть обусловлена физической деградацией (например, денатурацией, агрегацией или преципитацией) или химической деградацией (например, дезаминированием, окислением или гидролизом), что делает композицию неприемлемой для парентерального введения. Оптимизация компонентов композиции и их концентраций основана исключительно на эмпирических исследованиях и/или разумных способах устранения причин нестабильности.
Иногда при длительном хранении фармацевтических композиций, содержащих пептиды, включая водные и лиофилизированные композиции, возможна утрата активных пептидов из-за агрегации и/или деградации. Соответственно, типичные способы повышения стабильности пептидов могут включать изменение концентрации элементов композиции или добавление эксципиентов для модификации композиции [US 5580856; US 6171586]. Тем не менее, среди множества возможных вариантов использования вспомогательных веществ при изготовления лиофилизированных форм прямого указания и понимания какие именно регидратационные стабилизаторы следует добавлять к конкретным пептидам нет. Соответственно, специалисту в данной области техники, при всем множестве знаний возможных вариантов использования стабилизаторов, придется выявлять наилучшие для его пептида условия самостоятельно. Известна стабильная лиофилизированная композиция антитела против Her-2, где стабилизатор представляет собой сахар, трегалозу или буфер [US 2003/0202972 A1]. Тем не менее, полезность этих стабилизаторов для антител нельзя экстраполировать на другие белки и пептиды. Известен стабильный раствор иммуноглобулиноподобного белка содержащего Fc-домен где стабилизатором может быть фосфат натрия, фосфат калия, цитрат натрия или калия, яблочная кислота, ацетат аммония, трис-буфер (буфер с трис(гидроксиметил) аминометаном), ацетат, диэтаноламин, гистидин, лизин или цистеин [US 2003/0180287]. Из этих химически различных стабилизаторов, которые могут быть выбраны специалистом в данной области техники, наиболее подходящим оказался лизин. Однако, данный конкретный стабилизатор подходит лишь для конкретного белка, в данном случае белка, содержащего Fc-домен, что само по себе нельзя экстраполировать на другой белок или пептид. Таким образом, применение добавок нельзя экстраполировать с одного конкретного белка на другой неродственный белок или пептид. Действительно, несмотря на то, что применение добавок способствует хранению, оно может также приводить к инактивации пептидов. Кроме того, в случае лиофилизации, условия, обусловленные стадией регидратации, могут приводить к инактивации пептида, например, посредством агрегации или денатурации [Hora MS, Rana RK, Smith FW. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm. Res. 1992; 9 (1): 33-36]. Действительно, агрегация пептидов нежелательна, поскольку она может приводить к иммуногенности [Cleland JL, Powell MF, Shire SJ. The development of stable protein formulations: a close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation. Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems. 1993; 10: 307-377].
Необходимо понимать, что вспомогательные вещества определяют физическое состояние лиофилизата: аморфное стеклообразное состояние, аморфное рыхлое состояние, кристаллическое состояние или комбинацию этих состояний. Так, например, для отдельных молекул показано, что потеря активности лиофилизированного протеина прямо связана со степенью кристалличности криозащищающей молекулы [RU 2136306, 10.09.1999]. Показано оседание лиофилизата при температурах выше температуры стеклоперехода в процессе замораживания фармацевтической композиции, и изменение скорости кинетики межфазовых переходов [RU 2136306, 10.09.1999]. Кроме того, необходимо учитывать явление «коллапса», часто возникающее в случае отсутствия индивидуального подбора технологических режимов. «Коллапс» определяется как процесс, при котором структуры, созданные в ходе сублимационной сушки, разрушаются при прохождении границы сублимационного раздела фаз. В случае увеличения температуры выше температуры коллапса наблюдается потеря пористой структуры материала, образующейся в результате сублимации кристаллов льда, что увеличивает время досушивания до заданной влажности и вызывает потерю качества сухого продукта (внешнего вида, растворимости и т.д.). Типичные значения температур коллапса для водных растворов углеводов составляют от минус 32°C до минус 50°C. Кроме того, возможно проявление различных нежелательных свойств в результате «коллапса» таблетки лиофилизата во время сублимационной сушки (например, путем забивания пути, по которому должна идти испаряющаяся влага, снижение скорости сублимации). В результате, конечный продукт может удерживать более высокое содержание влаги, чем продукт, высушенный без разрушения, а остаточная вода может быть распределена неравномерно [Блынская Е.В., Тишков С.В., Алексеев К.В. Технологические подходы к совершенствованию процесса лиофилизации белковых и пептидных лекарственных препаратов // Рос. Биотерапевт. Журн. 2017; 7 (1): 6-11. Chang В S, Patro SY. Freeze-drying process development for protein pharmaceuticals // Lyophilization of biopharmaceuticals. American Association of Pharmaceutical Scientists, Arlington, 2004: 113-38; Rey L. (ed.). Freeze-drying/lyophilization of pharmaceutical and biological products. CRC Press, 2016].
Основной сложностью сушки с использованием лиопротектора в аморфном состоянии является поддержание температуры материала на этапе сублимации не выше минус 30-минус 40°C для предотвращения коллапса. Однако, низкие температуры коллапса предъявляют специальные требования к используемому лиофильному оборудованию и удлиняют процесс сушки [RU 2111426, 20.05.1998], что может вызвать дестабилизацию пептидной структуры.
В результате использования различных составов и соотношений кристаллических и аморфных вспомогательных веществ можно добиться увеличения температуры разрушения материала и получения лиофилизата с жесткой макроскопической структурой. Известно, что при сочетании кристаллического маннита с аморфными лиопротекторами, температура, при которой может произойти «коллапс», возрастает в несколько раз, что дает возможность производить сушку лиофилизата быстрее и повышает надежность стабилизации пептидной субстанции. Известен способ получения очищенного антитромбина III (AT III) на примере которого можно проследить влияние кристаллизующего компонента на аморфный компонент фармацевтической субстанции. В частности, показано положительное влияние кристаллизованных вспомогательных веществ (маннит, натрия хлорид, глицин) на стабилизацию лиофилизата, на повышение температуры разрушения и снижения времени лиофильной сушки [RU 2540480, 23.11.2010]. Однако использование только кристаллических криопротекторов иногда может приводить к повреждению структуры молекулы фармацевтической субстанции во время замораживания и сублимационной сушки. Например, в исследованиях по влиянию кристаллических и аморфных вспомогательных веществ на активность лактатдегигрогеназы во время лиофилизации было выявлено, что при сублимации с кристаллическими веществами (маннитом и глицином) активность фермента падает в несколько раз, по сравнению с аморфными веществами при таких же режимах сушки, что указывает на повреждения пептидной структуры фермента кристаллическими веществами во время заморозки [Pyne А, Chatterjee К, Suryanarayanan R. Solute crystallization in mannitol-glycine systems-implications on protein stabilization in freeze-dried formulations // Journal of pharmaceutical sciences. 2003; 92 (11): 2272-2283].
Таким образом, анализ имеющих данных относительно создания фармацевтических композиций в лиофилизированной лекарственной форме позволяет сделать вывод о противоречивом характере влияния вспомогательных веществ и технологических режимов на стабилизацию протеинов, что делает разработку данной фармацевтической композиции на основе дипептида (гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)) сложной многоступенчатой задачей имеющей много ограничивающих факторов и требующей оригинального подхода.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения явилась разработка фармацевтической композиции на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) сохраняющей структурные особенности молекулы дипептида, обладающей стабильностью и высокой фармакологической эффективностью и пригодной для изготовления инъекционной или инфузионной лекарственных форм.
Данная цель достигается созданием фармацевтической композиции на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в форме лиофилизата, с использованием стабилизаторов и определенных диапазонов режимов сушки и замораживания, отличных от общепринятых подходов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение арсенала качественных доступных нейропротекторных лекарственных средств, пригодных для внутривенного введения. Также техническим результатом является увеличение длительности нахождения дипептида в системном кровотоке по сравнению с его субстанцией. Также, данное техническое решение обеспечивает создание стабильной лекарственной формы, оптимальной для хранения и применения.
Сущность изобретения заключается в разработке фармацевтической композиции содержащей терапевтически эффективное количество гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) и функциональные добавки, в качестве которых используют лиопротекторы и криопротекторы при следующем соотношении компонентов на один флакон, масс. %:
Гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина)
1-10%
Лиопротектор
19-90%
Криопротектор
9-80%
В качестве лиопротектора в композиции данного изобретения может применяться одно или более соединений, способных обеспечить защиту лиофилизата в течение всего периода сушки, особенно во время первичной сушки. Желательно применять лиопротектор в количестве, близком к верхнему пределу интервала веса лиопротектора. Предпочтительными лиопротекторами являются сахара, такие как сахароза, трегалоза, декстроза, лактоза, мальтоза.
В качестве криопротектора в композиции данного изобретения может применяться одно или несколько соединений, которые защищают продукт преимущественно на этапе замораживания процесса лиофилизации от переохлаждения или снижают их физическую нестабильность при сушке и последующем хранении. Предпочтительными криопротекторами являются полиолы такие как маннит, сорбит, глицерол, полимеры, такие как декстран, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоли от 1500 до 8000 г/моль, аминокислоты такие как глицин.
Предпочтительно фармацевтическую композицию получают в форме лиофилизата с помощью сублимационного высушивания. Один из таких способов включает следующие стандартные стадии с включенными в них модификациями:
I. Получение раствора, содержащего лекарственное средство:
I.1 Отмеривание воды, гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), лиопротектора и криопротектора.
I.2 Перемешивание;
I.3 Стерилизующая фильтрация (предпочтительно использовать фильтр с диаметром пор 0,2 мкм);
I.4 Разлив раствора во флаконы;
II Замораживание раствора гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), полученного на стадии 1.4, при температуре минус 45°C;
II.1 Предпочтительно термоциклирование («отжиг») раствора предпочтительно при температуре минус 25°C, что является отличительной чертой для нашего способа приготовления лиофилизата;
III.1 Первичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от минус 45 до минус 28°C при давлении от 10 до 100 миллибар (выбранный интервал температур также является модификацией данного метода применительно к этой фармацевтической композиции);
III.2 Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар;
III Укупорка флаконов с лиофилизатом, полученным на стадии III.2.
Фармацевтическая композиция, полученная на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина), предпочтительно содержит (на флакон) от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина). Масса полученного лиофилизата предпочтительно составляет от приблизительно 0,101 г до приблизительно 1,01 г. Композиции данного изобретения могут использоваться также для получения раствора для инъекций и инфузий.
Осуществление изобретения
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами его конкретного осуществления.
Пример 1. Способ получения лиофилизата для приготовления инъекций. 1 мг (1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 20 мг (19,85 масс. %) сахарозы и 80 мг (79,25 масс. %) полиэтиленгликоля 4000, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается выдерживанием колб при температуре ниже минус 45°C. Термоциклирование («отжиг») осуществляют при температуре минус 25°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 2. Фармацевтическую композицию получают по способу, описанному в примере 1 исходя из следующего количественного содержания: 5 мг (1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 5 мл воды и добавляют 100 мг (19,85 масс. %) сахарозы и 400 мг (79,25 масс. %) полиэтиленгликоля 4000, затем перемешивают до полного растворения. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 3. 1 мг (9,1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 10 мг (90,9 масс. %) маннита, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота.
Пример 4. 1 мг (10,0 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 9 мг (90,0 масс. %) полиэтиленгликоля 4000, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата - предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота.
Пример 5. 1 мг (1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 90 мг (89,1 масс. %) сахарозы и 10 мг (9,9 масс. %) маннита, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 6. 1 мг (1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 70 мг (69,3 масс. %) сахарозы и 30 мг (29,7 масс. %) маннита, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 7. 10 мг (10,0 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 63 мг (63,0 масс. %) сахарозы и 27 мг (27,0 масс. %) маннита, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 8. 1 мг (1 масс. %) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 70 мг (69,3 масс. %) сахарозы и 30 мг (29,7 масс. %) поливинилпирролидона 12000, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
Пример 9. 1 мг (1 масс. %)) гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) растворяют в 2 мл воды и добавляют 90 мг (89,1 масс. %) сахарозы и 10 мг (9,9 масс. %) глицина, затем перемешивают до полного растворения. Полученную таким способом смесь фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После фильтрации раствор перекачивают в колбы для лиофилизации и обеспечивают соответствующими сублимационными пробками. Содержимое замораживается в результате выдерживания колб при температуре ниже минус 45°C. Первичная сушка процесса лиофилизации происходит при температуре от минус 45 до минус 28°C и давлении от 10 до 100 миллибар. Вторичная сушка лиофилизата предпочтительно при температуре от 0 до 10°C и при давлении 0,0001 миллибар. После сушки камеру лиофилизатора продувают инертным газом. Флаконы затем закрывают в атмосфере азота. Полученный лиофилизат соответствует всем требованиям ГФ XIII.
По представленным примерам были проведены исследования по нескольким технологическим характеристикам полученного продукта и другим параметрам в соответствии с ГФ XIII (Табл. 1).
Полученные данные, в особенности тест на прозрачность, доказывают необходимость применения наряду с криопротектором лиопротектора в качестве аморфной составляющей, повышающей устойчивость субстанции, и улучшающей технологические свойства субстанции. Мутность раствора говорит о нежелательных процессах, происходящих во время лиофилизации, в составах, представленных в примерах 3 и 4, которые содержат только кристаллизующий криопротектор. Составы, приведенные в примерах 3 и 4, не соответствуют требованиям ГФ XIII и не приемлемы для осуществления изобретения.
Пример 10. Изучение фармакокинетических показателей фармацевтической композиции гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) - ФК ГК-2 в дозе 1 мг/кг, полученной по способу, описанному в примере 1, и фармацевтической субстанцией гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) - ФС ГК-2 в дозе 1 мг/кг.
Эксперименты проведены на аутбредных белых крысах-самцах, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАН в возрасте 10-недель, массой 180-220 г и половозрелых кроликов-самцов породы Шиншилла массой в среднем 3 кг. Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом режиме, на стандартной диете, включающей гранулированный корм и воду в свободном доступе. При работе соблюдали требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Количественное определение соединения ГК-2 в биоматериале осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС).
Изучение фармакокинетики субстанции ГК-2 в плазме крови после его однократного внутривенного (в/в) и внутрибрюшинного (в/б) введения проводили на крысах, которых за 18 ч до опыта лишали корма. Содержание действующего вещества определяли в плазме крови через 0,0; 5, 10, 20, 30 мин и 1,0, 1,5 и 2,0 ч после введения препарата. На каждую дискретную точку использовали по 5 крыс.
После в/б введения ФС ГК-2 животным вещество быстро попадает в системный кровоток и определяется в плазме крови на протяжении 2 ч (Табл. 2). Учитывая, что период полуэлиминации (t1/2el) составил 0,39 ч, соединение ГК-2 можно отнести к группе «короткоживущих» лекарственных веществ. Такие фармакокинетические параметры, как короткий t1/2el (в среднем 0,4 ч), небольшое среднее время удерживания вещества в организме (MRT - 0,54-0,64 ч) указывают на недолгое нахождение исследуемого вещества в системном кровотоке животных. Поэтому для поддержания эффективных концентраций в системном кровотоке требуется введение исследуемого вещества через короткие временные интервалы. После в/в введения ФС ГК-2 животным в дозе 150 мг/кг вещество так же, как после в/б введения определяется в плазме крови на протяжении 2 ч.
Примечание: данные представлены в виде средних арифметических значений ± стандартная ошибка средней (Mean ± SEM);
MRT (ч) - среднее время удерживания лекарственного вещества в организме;
1/2
t (ч) - период, за который выводится половина введенной дозы вещества.
1/2
При внутривенном введении инъекционной лекарственной формы ФК ГК-2 также отмечено быстрое обнаружение соединения в системном кровотоке - через 5 минут после введения, но при этом показана более длительная регистрации действующего вещества в плазме крови, определяемое на протяжении 4 часов. Так, период полувыведения ГК-2 из плазмы крови кроликов и среднее время удерживания лекарственного вещества в организме были в 2 раза больше, по сравнению с величиной, рассчитанной для крыс, и составило: t=0,88±0,05 ч, MRT=1,27±0,06 ч (Табл. 2).
Таким образом, применение лекарственной формы фармацевтической композиции ГК-2 обеспечивает поддержание эффективных концентраций гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в системном кровотоке на протяжении более длительного времени, чем при введении субстанции ГК-2.
Пример 11. Изучение нейропротекторной активности фармацевтической композиции, полученной по способу, описанному в примере 1, на модели обратимой окклюзии средней мозговой артерии в дозах 0,5 и 1 мг/кг при внутривенном субхроническом введении (7 инъекций), в сравнении с фармацевтической субстанцией гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 1 мг/кг и Мексидолом в дозе 100 мг/кг.
Эксперименты проведены на 76 крысах-самцах линии Вистар (полученных из питомника лабораторных животных «Пущино») массой 230-280 г. Животные получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе. При работе соблюдали требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Ишемический инсульт моделировали внутрисосудистым перекрытием среднемозговой артерии наркотизированных крыс нитью [Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats // Stroke.1989; 20 (1): 84-91]. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, что и оперированные, за исключением перерезания сосудов и введения нити.
Фармацевтическую композицию ГК-2 (ФК ГК-2) в дозах 0,5 и 1 мг/кг (в/в) или субстанцию ГК-2 (ФС ГК-2) в дозе 1 мг/кг (в/в), разведенные в воде для инъекций, или Мексидол (раствор для внутривенного введения) (100 мг/кг, в/в), вводили животным через 6 ч после операции, и затем раз в сутки в течение последующих 6 дней (всего 7 инъекций). Крысы из групп «инсульт» и «ложная операция» получали в том же режиме воду для инъекций. Неврологический дефицит оценивали в тесте стимулирования конечностей на 3 и 6 сутки после операции. Тест стимулирования конечностей заключается в оценке ответа задних и передних конечностей животного на тактильную и проприоцептивную стимуляцию [Jolkkonen J, Puurunen К,  S, et al. Behavioral effects of the alpha(2)-adrenoceptor antagonist, atipamezole, after focal cerebral ischemia in rats // Eur. J. Pharmacol. 2000; 400( 2-3): 211-219]. Тест включает из 7 испытаний для левой и правой стороны тела, оцениваемых в баллах: 2 балла присваивают, если крыса полностью выполнила испытание; 1 балл - испытание выполнено с задержкой в более чем 2 с и/или не полностью; 0 баллов - нет ответа на стимулирование конечности. Максимально возможное суммарное количество баллов равно 14 для каждой стороны тела.
Для оценки объема инфаркта мозга [Bederson JB, Pitts LH, Germano SM, et al. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats // Stroke. 1986; 17 (6): 1304-1308] на 7-е сутки после операции животных декапитировали, головной мозг извлекали, замораживали и разрезали на 5 фронтальных срезов толщиной 1,7 мм. Срезы мозга помещали в чашку Петри с 2% раствором ТТХ в фосфатно-солевом буфере и инкубировали в течение 15 мин при 37°C. Затем срезы переворачивали и инкубировали еще 15 мин при 37°C, после чего фиксировали в 10%-ном формалине в течение 30 мин. Затем срезы помещали на предметные стекла и сканировали с двух сторон с помощью планшетного сканера с разрешением 2400 dpi в режиме цветного изображения. С помощью свободно распространяемой программы «Image J» (National Institutes of Health, США) измеряли площадь инфаркта (неокрашенная область) и площадь всего среза.
Объем ишемического инфаркта определяли по формуле:
i
i
V=d×Σ A/2, где Σ A - сумма площадей области повреждения на срезах мозга с каждой из сторон, d - толщина среза.
Статистическая обработка. Межгрупповые различия оценивали с помощью U-теста Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде средних арифметических значений и стандартных ошибок среднего (Mean ± SEM).
У оперированных нелеченых животных (контроль, группа «Инсульт») в тесте стимулирования конечностей наблюдался выраженный неврологический дефицит, что проявлялось в статистически достоверном нарушении ответа на тактильную и проприоцептивную стимуляцию передней и задней левых конечностей (контралатеральных по отношению к повреждению) в сравнении с ложнооперированными животными на 3-й и 6-е сутки после операции.
Фармацевтическая композиция и субстанция гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) - ФК ГК-2 и ФС ГК-2 в дозах 1 мг/кг (в/в) статистически достоверно улучшали неврологический статус животных по данным теста стимулирования конечностей на 3-й и 6-е сутки после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (Табл. 3).
Так на фоне введения фармацевтической композиции гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 1 мг/кг на 3 и 6 сутки после операции крысам с инсультом отмечалось снижение неврологического дефицита на 40% и 39,5%, соответственно, в тесте стимулирования конечностей по сравнению с животными контрольной группы. Различий между эффективностью фармацевтической композиции и субстанции гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 1 мг/кг в тесте стимулирования конечностей не обнаружено (Табл. 3).
Статистически достоверного влияния фармацевтической композиции гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 0,5 мг/кг на снижение неврологической симптоматики в тесте стимулирования конечностей не обнаружено (Табл. 3).
3
Субстация ГК-2 и фармацевтическая композиция гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) значительно снижали объем инфаркта мозга. По результатам морфометрии срезов головного мозга у оперированных животных было выявлена выраженная зона инфаркта в правом полушарии, включающая кору и стриатум. Объем инфаркта в группе оперированных нелеченых животных составлял около 800 мм (Табл. 4).
* - p<0,05 по сравнению с группой «Инсульт» (U-тест Манна-Уитни).
Фармацевтическая композиция гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозах 0,5 и 1 мг/кг (в/в) и его субстанция в дозе 1 мг/кг (в/в) статистически значимо снижали объем повреждения на 60% в сравнении с группой без лечения (Табл. 4).
На фоне введения Мексидола в дозе 100 мг/кг в тесте стимулирования конечностей улучшения регистрируемых показателей по сравнению с контрольными животными не отмечалось (Табл. 3). При этом объем повреждения мозга в группе крыс с инсультом, получавших Мексидол, был меньше на 30%, чем у оперированных животных без терапии (Табл. 4).
* - P<0,05 по сравнению с группой «Инсульт»;
# - P<0,05 по сравнению с группой «Инсульт + ФК ГК-2 (1 мг/кг, в/в).
Таким образом, показана способность новой фармацевтической композиции ГК-2 снижать неврологический дефицит и уменьшать объем инфаркта мозга, вызванные экспериментальной окклюзией средней мозговой артерии с последующей реперфузией, сравнимой с активностью субстанции, что указывает на сохранение структуры и стабильности дипептида, и его эффективности в лиофилизированной лекарственной форме. Кроме того, показана более высокая эффективность фармацевтической композиции гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в дозе 1 мг/кг относительно инъекционной лекарственной формы Мексидола в дозе 100 мг/кг в условиях экспериментального ишемического инсульта.
Совокупность полученных данных свидетельствует о перспективности разработанной фармацевтической композиции нейропротекторного действия для парентерального применения на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в лиофилизированной лекарственной форме.