Медико-генетическое прогнозирование десценции тазового дна у женщин Уральского региона

УДК 618.14.15-007.44-036-08

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ДЕСЦЕНЦИИ ТАЗОВОГО ДНА У ЖЕНЩИН УРАЛЬСКОГО РЕГИОНА

А.Г. Ящук

Кафедра акушерства и гинекологии № 2 (зав. - доц. А.Г. Ящук) Башкирского государственного медицинского университета , г. Уфа

Проблема десценции тазового дна по-прежнему достаточно актуальна, что обусловлено большой ее частотой (28,06%) и высокими материальными затратами на хирургическое лечение заболевания [1, 4]. Генитальный пролапс приводит к стойкой социальной дезадаптации, снижению качества жизни, утрате трудоспособности и ин-валидизации женщин [8, 9]. Этиология тазовой десценции у женщин имеет многофакторную природу. Наиболее значимыми причинами развития заболевания являются несостоятельность связочного аппарата матки и тазового дна, к которой могут приводить родовой травматизм, эст-рогенная недостаточность, возрастные изменения мышечной и соединительной ткани, повышенное внутрибрюшное давление в результате тяжелого физического труда, хронических заболеваний легких, хронических запоров, врожденная недостаточность (дисплазия) соединительной ткани, генетически детерминированные заболевания соединительной ткани [2, 3, 10, 11]. Ряд авторов отмечает «омоложение», появление осложненных и рецидивных форм ге-нитального пролапса [11, 12]. В гинекологии доля операций у больных с десценци-ей тазового дна составляет 15-20% [5].

Целью исследования стала разработка медико-генетического способа прогнозирования десценции тазового дна у женщин Уральского региона. В научно-медицинской и патентной литературе мы не обнаружили объективного и высокоинформативного способа прогнозирования развития десценции тазового дна, позволяющего оценить риск возникновения патологии как у больных, так и у практически здоровых женщин.

Для получения критериев прогноза заболевания проводились молекулярно-гене-

тические исследования ДНК. Из лейкоцитов свежей или замороженной консервированной венозной крови методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции осуществлялось выделение ДНК [14]. Генотипирование SpI полиморфизма гена а1-цепи коллагена 1 типа (Col1A1), FokI полиморфизма гена рецептора витамина D (VDR), PvuII и XbaI локусов гена рецептора эстрогенов (ER-а), Alu и VNTR повторов гена коллагена 3 типа (Col1A1) проводилось при помощи полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) с использованием праймеров (табл.1).

Были обследованы 116 пациенток с различной степенью пролапса гениталий (ПГ), в том числе 28 женщин с наиболее тяжелой рецидивной формой пролапса и 140 практически здоровых женщин без клинических признаков патологии соединительной ткани. Средний возраст обследованных пациентов составил 52,25 ±12,03 года.

Статистическая обработка результатов производилась с использованием пакета программ Statistica v.5.5 [16] и Genepop v.1.2[15].

Коллагены 1 и 3-го типа являются ин-терстициальными белками, формирующими крупные фибриллы. Они широко распространены в организме и находятся в связках, сухожилиях, сосудах, коже, стро-ме внутренних органов. Коллаген тазовой фасции играет важную роль в патогенезе недержания мочи при опущении внутренних половых органов. Предполагается, что стрессовое недержание мочи в пе-рименопаузе связано, по крайней мере частично, с нарушением метаболизма соединительной ткани [10].

Коллаген 1-го типа является основным белком матрикса соединительной

Таблица 1

Праймеры, использованные для амплификации исследованных локусов

Название локуса Хромосомная локализация Последовательность праймеров

SpI Col1A1 17q21.3-q22 5'-GTCCAGCCCTCATCCTGGCC-3' 5'-TAACTTCTGGACTATTTGCGGA CTTTTTGG-5' 69

FokI VDR 12q13-14 5-' AGCTGGCCCTGGCACTGACTC TGCTCT-3' 5'-ATGGAAACACCTTGCTTCTTC TCCCTC-3' 69

ER1 17q23 5'-CTGCCACCCTATCTGTATCTT TTCCTATTCTCC-3' 5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCG TCGATTATCTGA-3' 60

Alu Col3A1 2q31-2q32.3 интрон 8 5'-GAGTCCTTTAGAAGGATATGCTC TG-3' 5'-ACCTGCAGCACCAGGAGGTCCTG GAGGGCC-3' 69

VNTR Col3A1 2q31-2q32.32q 5'-CGCGGATCCTACAGTGAGCCAAG ATTGCG-3' 5'-CGCGAATTCATTCTTACCAGGAG CACCCTA-3' 55

ткани. В первом интроне гена Col1A1 имеется сайт узнавания транскрипционного фактора SpI, в котором возможна замена основания G на T, что приводит к возникновению Col1A1*s аллеля. Функциональная активность последнего составляет не более 16% от нормального аллеля Col1A1*s [6]. Анализ полиморфизма SpI гена Col1A1 не выявил достоверных различий между контрольной группой и больными, хотя наблюдается увеличение частоты аллеля Col1A1*s в группе больных до 0,142 по сравнению с контролем, где частота данного аллеля менее 1%. Различия в распределении частот генотипов полиморфизма SpI гена Col1A1 не достигают статистически достоверных значений (р>0,05).

Проведен анализ Alu полиморфизма в 8 интроне гена коллагена 3-го типа и VNTR полиморфизма тридцатинуклеотидных повторов в гене Col3A1 в контрольной группе и у больных с ПГ. Обнаружены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов Alu лок уса гена Col3A1 между контрольной группой и больными с ПГ из Башкортостана (табл. 2). Аллель с инсерцией Alu повтора является протективным для развития ПГ [%2=9,02,

р=0,005; относительный риск (0R)=0,133; 95%CI (0,029-0,617], а также гетерозиготный генотип Alu +/- (%2=9,26, р=0,005; 0R=0,127; 95%CI 0,27-0,594). При этом

Таблица 2

Распределение частот генотипов УМЖ локуса гена Со13Л1 у больных с пролапсом гениталий и в контрольной группе

Частоты генотипов VNTR локуса гена Col3A1 Больные

VNTR*2*2 0,190 0,059

VNTR*2*3 0,353 0,306

VNTR*2*4 0,138 0,200

VNTR*2*5 0,052 0,071

VNTR*2*7 0,017 0,035

VNTR*3*3 0,060 0,035

VNTR*3*4 0,112 0,153

VNTR*3*5 0,043 0,047

VNTR*3*6 0 0,012

VNTR*3*7 0,009 0,012

VNTR*4*4 0,026 0,024

VNTR*4*5 0 0,047

Таблица 3

Распределение частот аллелей УМЖ локуса гена Со13Л1 у больных с пролапсом гениталий и в контрольной группе

Частота аллелей VNTR локуса гена Col3A1 Больные

VNTR* 2 0,47 0,365

VNTR*3 0,319 0,3

VNTR* 4 0,147 0,3

VNTR* 5 0,047 0,082

VNTR*6 0 0,006

VNTR*7 0,013 0,024

рисковым генотипом развития ПГ оказался аллель Alu -/- (%2=5,598, р=0,025; OR=3,89; 95%CI 1,18-12,84).

При изучении VNTR полиморфизма гена Col3A1 в контрольной группе обнаружено 6 аллельных вариантов, у больных -5 (табл. 3). Наиболее частыми аллелями в контрольной группе оказались аллели VNTR*2, VNTR*3 и VNTR*4 с частотой 0,37 и по 0,3 соответственно, тогда как у больных с ПГ - только два аллеля VNTR*2 (0,47) и VNTR*3 (0,32) являются частыми. Гетерозиготность по дан-

(0R=0,55; 95%CI 0,33-0,92). Выявлено 10 генотипов у больных и 12 генотипов у здоровых доноров (табл. 4). Обнаружены достоверные различия между больными и контролем по генотипу VNTR*2*2(x2=7,049; р=0,01), который является генотипом риска развития ПГ у пациентов из Башкортостана (0R=3,67; 95%CI 1,33-10,09).

На основании полученных результатов по двум локусам гена можно сделать предположение, что ген Col3A1 выступает кандидатным геном, участвующим в патогенезе ПГ.

Нами проведено исследование полиморфизма Fokl гена VDR. Рецептор витамина D относится к ядерным и подобно другим рецепторам регулирует активность многих генов путем связывания со специфическими последовательностями ДНК в их промоторных областях. Вариации в экспрессии и функции гена VDR обусловливают различия в активности тех генов-мишеней, на которые воздействует продукт этого гена. Согласно литературным данным, выявлена связь полиморфизмов гена VDR с многими многофакторными заболеваниями [13]. Витамин D принимает участие в поддержании кальциевого гомеостаза, участвует в качестве кофактора свертыва-

Таблица 4

Распределение частот генотипов Alu локуса гена Col3A1 у больных с пролапсом гениталий и в

контрольной группе

Со13А1 Аллели Генотипы

Alu + Alu - Alu +/+ Alu +/- Alu -/-

n P n P n P n P n P

Больные (n=116) 1 0,004 231 0,996 0 0 1 0,008 115 0,992

Контроль (n=140) 19 0,068 261 0,932 0 0 19 0,135 121 0,864

ному локусу у здоровых доноров составляла 84,4%, у больных - 72,4%. При сравнении контрольной группы и больных с выпадением половых органов обнаружены статистически достоверные различия по частоте аллеля VNTR*4 (%2=5,29, р=0,025), который оказался протективным для развития десценции тазового дна

ния крови, его функция реализуется также на уровне соединительной ткани.

Установлены достоверные различия в частоте аллеля УБИ*Г (%2=5,74; р=0,025) и генотипа УБК*Г*Г между больными и здоровыми индивидуумами (%2=9,83; р=0,005). ОИ для носителей аллеля УБИ*Г составил 3,725 (95%СЬ 1,22-11,37), а для

носителей генотипа VDR*F/*F - 21,6 (95%CL 1,25-250), для аллеля VDR*f -0R=0,27 (p=0,025, 95%CL 0,088-0,82), что позволяет рассматривать аллель VDR*F в качестве аллеля риска, а аллель VDR*f -протективного варианта аллеля гена VDR. Поскольку эстрогены стимулируют синтез коллагеновых и неколлагеновых белков, му-кополисахаридов основного вещества соединительной ткани, мы провели исследование PvuII и XbaI полиморфизмов гена рецептора эстрогенов (ER-a^. Достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов локусов PvuII и XbaI гена ER-a между общими выборками больных ПГ и здоровых доноров не обнаружено (р>0,05).

Исходя из полученных результатов об ассоциации Alu и VNTR полиморфизма гена ColAl, Fokl полиморфизма гена VDR с развитием ПГ, мы использовали лог-линейную регрессию для оценки вероятности развития ПГ в зависимости от генотипов по этим двум локусам. Поскольку два полиморфизм а гена Со13А1 являются сцепленными, мы включили только один полиморфизм в анализ - Alu инсерцию как более информативный маркер.

В результате анализа было получена логистическая регрессия следующего вида:

exp(-4,5304+(2,90313)x +(0,316757)y Z 1+ехр(-4,5304+(2,90313)х+ (0.316757)у' где х - генотип по локусу Со13А1; у - генотип по локусу VDR.

Для предложенной модели, рассчитанной методом максимального правдоподобия, х2 составил 12,24 (df=2; p=0,0022). Таким образом, предложенная модель является статистически достоверной.

На следующем этапе нами был проведен дискриминантный анализ [16]: лямбда Уилкса=0,916, F=7,211802, р<0,0010. Классификационный анализ был произведен нами исходя из имеющихся данных. Из 116 пациенток только в одном случае диагностика на базе этой модели оказалась некорректной, т. е. больная была квалифицирована как здоровая. Вероятность правильной постановки диагноза на основе данных генотипов по локусам генов VDR и Со13А1 составила 99,13%. В то же время только в 13,33% случаев индивиды были

диагностированы как здоровые, в 86,67% -как больные. Таким образом, использование только генетических данных позволяет установить диагноз довольно точно.

В качестве следующего шага мы проанализировали вероятность развития заболевания с учетом как генетических данных, так и информации о маркерах дис-плазии соединительной ткани (ДСТ). При комплексном обследовании в 62 случаях была диагностирована маловыраженная форма (ДСТ), в 38 - умеренная (от 10 до 16 баллов), в 7 - тяжелая (более 16 баллов). Среди различных проявлений ДСТ наиболее часто встречались варикозная болезнь, геморрой, грыжи различных локализаций, переломы, привычные вывихи суставов, остеохондроз, пролапс митрального клапана, спланхноптоз.

При оценке показателей гемостазио-граммы у всех пациенток отмечалась тром-боцитопения. Снижение уровня агрегации тромбоцитов со всеми индукторами имело место у 22 больных, значительное снижение активности фактора Виллебранда -у 18, гиперфибриногенемия - у 11. При КУДИ у каждой третьей пациентки выявлялось стрессовое недержание мочи. У всех больных наблюдалась повышенная экскреция оксипролина (в 2 и более раза).

Была получена регрессионная модель при х2 = -122,5; f=4; р <0,000001, которая хорошо описывает имеющиеся данные. Дискриминантный анализ показал высокую информативность клинических параметров для оценки риска опущения и выпадения гениталий (лямбда Уилкса=0,51, F=35,07, p<0,000001). Правильно диагностированных случаев было 87,74%, однако ни один индивид из контрольной группы не был классифицирован как больной, что позволяет почти со 100% надежностью исключать у них возможность развития десценции тазового дна.

Вычисление генетического риска возникновения тазовой десценции при наличии генотипов локуса Alu -/- и VNTR*2*2 гена коллагена 3-го типа, аллеля VDR* F и генотипа VDR *F*F гена рецептора витамина D производят на основании расчета показателя отношения шансов - Odds ratio (OR) [7], отражающего относитель-

ный риск развития указанной гинекологической патологии по формуле: OR = (а + 0,5) (d +0,5) / (b + 0,5) (с +0,5), где а - частота генотипа в выборке больных; b - частота генотипа в контрольной выборке; с=1-а - сумма частот остальных генотипов в выборке больных; d=1-b - сумма частот остальных генотипов в контрольной выборке; параметр 0,5 в представленной формуле используют, когда одно из чисел a,b,c,d равняется нулю или оказывается меньше трех. Высокий риск развития десценции тазового дна констатируют при OR>1. В нашем исследовании OR1=385 (CI=1,18-12,84) при наличии генотипа локуса Alu -/-, OR2 = 3,67 (CI = 1,33-10,0) при VNTR*2*2 Col 3 AI, OR3 =2,3 (1,3-4,2) при VDR* F и OR4 =21,6 (1,25-250) при VDR* F*F.

Генотипы локуса Alu -/- и VNTR*2*2 гена коллагена 3-го типа, аллель VDR* F и генотип VDR* F*F гена рецептора витамина D являются диагностическими генетическими маркерами десценции тазового дна у женщин Уральского региона, и определение их может применяться для выявления групп лиц с высоким риском развития заболевания как среди практически здоровых, так и на ранних этапах возникновения болезни.

ВЫВОДЫ

1. На основании результатов исследований получены убедительные доказательства роли генетических факторов в развитии десценции тазового дна.

2. Для прогнозирования возникновения десценции тазового дна у женщин (в частности Уральского региона) могут использоваться генетические маркеры: генотипы локуса Alu -/- и VNTR*2*2 гена коллагена 3-го типа, аллель VDR*F и генотип VDR*F*F гена рецептора витамина D.

3. Анализ молекулярно-генетических результатов в сочетании с сопутствующими клиническими проявлениями патологии соединительной ткани дает повод рассматривать выпадение половых органов в качестве системного заболевания соединительной ткани.

ЛИТЕРАТУРА

1. Буянова С.Н., Смольнова Т.Ю., Гришин В.Л., Сенчакова Т.Н. // Акуш. и гин. - 2001. - № 3. - С.39-43.

2. Буянова С.Н., Смольнова Т.Ю., Иоселиани М.Н. и др. // Вестн. ассоц. акуш. - гин. - 1998. - № 1. -

С. 77-79.

3. Кадурина Т.И. Наследственные коллагенопатии -СПб, 2000.

4. Краснопольский В.И., Попов А.А., Горский С.Л. и др. // Вестн. Росс. ассоц. акуш.-гин. - 2000. - № 3. -С.107-109.

5. Радзинский В.Е., Дурандин Ю.М., Гагаев Ч.Г. и др. Перинеология. - М., 2006

6. Стрижакова М.А. Современные подходы к диагностике и хирургическому лечению опущения женских половых органов: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. - М., 2002.

7. Bland J.M., Altman D.G.// Br. Med. J.-2000.-Vol. 320. - P. 1468.

8. Becherini L., Gennari L., Masi L., et al. // Hum. Mol. Genet. - 2000. - Vol. 9 (13). - P. 2043-2050.

9. Deval В., Rafii A., Poilpot S. et al. // Gynaec. Obstet. Fertil. - 2002. - Vol. 30. - P.673-676.

10. Falconer C, Blomgren B., Johansson O. et al. // Acta Obstet Gynecol Scand. - 1998. - Vol. 77. - P. 87-94.

11. Gill E.J., Hurt Ж.У. // Obstet Gynaec. Clin. North. Amer. - 1998. - Vol. 25.- P. 757-769.

12. Glavind К., Mouritsen A.L., Pedersen L.M., Bek K.M. // Ugeskr. Laeger. - 2000. - Vol. 162.-P. 3475-3476.

13. Lucotte G, Mercier G, Burckel A. // Clin Genet. -1999. -Vol. 3. - P. 221-224.

14. Mathew C.C. // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M.N.Y. -1984. - P. 31-34.

15. RoussetF. Inferences from spatial population genetics // Balding D., Bishop M., Cannings C. Handbook of Statistical Genetics. John Wiley & Sons. London, 2001. - P. 239-269.

16. StatSoft, Inc. STATISTICA for Windows (Computer program manual). Tulsa, OK: StatSoft, Inc., 1999.

Поступила 19.07.07.

MEDICAL AND GENETIC PREDICTION OF PROLAPSUS OF PELVIC ORGANS IN WOMEN OF URAL REGION

A.G. Yaschuk

Summary

116 women with varying degrees of genital prolapsus were under observation, including 28 with a relapse prolapsus of vagina dome. Association of polymorphisms of Alu and VNTR of genes Col3A1, FokI and gene polymorphism of VDR with the fallout of female genital organs was established. Gene polymorphism of VDR and Col3A1 can be genetic markers of prolapsus of women's genitalia and can be used to assess the likelihood of developing pelvic floor prolapsus.