КОМПОЗИЦИИ БЕНДАМУСТИНА И ЦИКЛОПОЛИСАХАРИДА
COMPOSITIONS OF BENDAMUSTINE AND CYCLOPOLYSACCHARIDE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим бендамустин, заряженный циклополисахарид и стабилизирующий агент.
Уровень техники
Бендамустин, 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил] бутановая кислота, используется при лечении лейкемии и определенных лимфом. Тем не менее, это соединение имеет ограниченную стабильность в плазме, вследствие чего требуются высокие или повторяющиеся дозы для достижения терапевтического эффекта. Таким образом, существует необходимость в создании лекарственных форм указанного средства, которые будут иметь повышенную стабильность.
Предпринимались попытки увеличить стабильность бендмустина путем образования комплексов бендамустина с полимерными материалами. Однако при использовании такого подхода был достигнут лишь незначительный успех. Так, Пенчева с соавторами (Pencheva et al. "HPLC study on the stability of bendamustine hydrochloride immobilized onto polyphosphoesters" J. Pharma. Biomed. Anal. 2008) пытались улучшить стабильность бендамустина путем образования его комплексов со сложными полифосфоэфирами. Однако на Рис.2 в указанной статье показано, что даже наиболее стабильный комплекс распадается до полной log точки (90%) в течение около 45 минут при рН 7.
Практически аналогичным образом Ивджин (Evjen "Development of Improved Bendamustin-Liposomes" Masters Thesis. University of Tromso, 2007) применяли двойное асимметричное центрифугирование для включения бендамустина в липосомы. Согласно данным, приведенным в Табл. 18 (стр.79), эти композиции обеспечивают лишь незначительное увеличение стабильности по сравнению со свободным бендамустином (20 минутный период полураспада по сравнению с 14 минутным периодом полураспада для свободного бендамустина при растворении в культуральной клеточной среде).
Соответственно, существует необходимость в разработке улучшенных композиций бендамустина, которые обладают повышенной стабильностью в водных растворах, в особенности в плазме.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей: (а) бендамустин, (b) заряженный полисахарид и (с) стабилизирующий агент;
преимущественно имеющий заряд, противоположный заряду циклополисахарида. Такая композиция неожиданно обеспечивает нужную стабильность в реактивной окружающей среде, такой как плазма, в сочетании с желаемой противоопухолевой активностью. Такая композиция пригодна для инъекционного или инфузионного введения пациентам, нуждающимся в лечении бендамустином.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей: (а) бендамустин, (b) заряженный полисахарид и (с) стабилизирующий агент;
преимущественно имеющий заряд, противоположный заряду циклополисахарида.
Предпочтительно, соотношение активного ингредиента к циклополисахариду по весу, составляет, приблизительно, от 1:12500 до, приблизительно, 1:25; более предпочтительно, приблизительно от 1:5000 до, приблизительно, 1:50; и еще более предпочтительно, приблизительно, от 1:2500 до, приблизительно, 1:75, и наиболее предпочтительно, приблизительно, от 1:1500 до, приблизительно, 1:100.
Стабилизирующий агент обычно находится в весовом соотношении к циклополисахариду, которое составляет, приблизительно, от 5:1 до, приблизительно, 1:1000; предпочтительно, приблизительно, от 2:1 до, приблизительно, 1:200.
Циклополисахариды
Циклополисахариды, которые могут использоваться для осуществления настоящего изобретения, включают циклодекстрины, цикломаннины, циклоалтрины, циклофруктины и им подобные соединения. Предпочтительно, циклополисахариды включают от 6 до 8 сахаридных единиц. Одними из предпочтительных полисахаридов, используемых при осуществлении изобретения, являются циклодекстрины.
Циклодекстрины являются циклическими олиго-1-4-альфа-D-глюкопиранозами, включающими, по меньшей мере, 6 сахаридных единиц. Наиболее широко известные циклодекстрины содержат шесть, семь или восемь сахаридных единиц. Циклодекстрины, содержащие шесть сахаридных единиц, известны как альфа-циклодекстрины; циклодекстрины, содержащие семь сахаридных единиц, известны как бета-циклодекстрины, и циклодекстрины, содержащие восемь сахаридных единиц, известны как гамма-циклодекстрины. Предпочтительными циклодекстринами являются бета-циклодекстрины.
Циклополисахариды, согласно изобретению, модифицируют с помощью одной или более групп, несущих заряд. Такие группы могут быть анионными, в этом случае стабилизирующий агент является катионным; такие группы могут быть и катионными, в этом случае стабилизирующий агент является анионным. Предпочтительные анионные группы включают карбоксильную, сульфонильную и сульфатную группы; предпочтительные катионные группы включают группы четвертичного аммония.
1
6
1
6
Используемый здесь термин "заряженный циклополисахарид" относится к циклополисахариду с одной или более гидроксильными группами, замещенными фрагментом, несущим заряд. Такая молекула сама по себе может представлять собой группу, несущую заряд (например, такую, как сульфонильная группа), или может включать органическую молекулу (например, молекулу C-С алкила или C-С алкилового эфира), замещенную одним или более фрагментом, несущим заряд. Предпочтительные замещенные циклополисахариды включают, без ограничений указанными, сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина, бета-циклодекстрин, замещенный 2-гидрокси-N,N,N-триметилпропанаммонием, карбоксиметилированный бета-циклодекстрин, O-фосфатированный бета-циклодекстрин, сукцинил-(2-гидрокси)пропил-бета-циклодекстрин, сульфопропилированный бета-циклодекстрин, гептакис(6-амино-6-деокси)бета-циклодекстрин, O-сульфатированный бета-циклодекстрин и 6-монодеокси-6-моно(3-гидрокси)пропиламино-b-циклодекстрин; при этом наиболее предпочтительным является сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина.
Катионные стабилизирующие агенты
В тех вариантах осуществления изобретения, когда циклополисахарид модифицируется анионными группами, стабилизирующий агент выбирают из катионных агентов или из группы поликатионных соединений. К катионным агентам, которые могут быть использованы, относятся первичные амины, вторичные амины, третичные амины или четвертичные аммониевые соединения, такие как N-алкил-N,N-диметиламины, N-алкил-N,N-диэтиламины, N-алкил-N,N-диэтаноламины, N-алкилморфолин, N-алкилпиперидин, N-алкилпирролидин, N-алкил-N,N,N-триметиламмоний, N,N-диалкил-N,N-диметиламмоний, N-алкил-N-бензил-N,N-диметиламмоний, N-алкил-пиридин, N-алкил-пиколин, алкиламидометилпиридин, карбалкоксипиридин, N-алкилхинолин, N-алкилизохинолин, N,N-алкилметилпирролидин и 1-алкил-2,3-диметилимидазол. Наиболее предпочтительные катионные адъюванты включают пространственно затрудненные третичные амины, такие как N-алкил-N-N-диизопропиламин, N-алкилморфолин, N-алкилпиперидин и N-алкилпирролидин, и четвертичные аммониевые соединения, такие как хлорид цетилпиридина, бензилдиметилдодециламмония хлорид, додецилпиридинхлорид, гексадецилтриметиламмония хлорид, бензилдиметилтетрадециламмония хлорид, октадецилдиметилбензиламмония хлорид и домифен бромид.
Поликатионные соединения, такие как олиго- и полиамины или эгилированные олиго- или полиамины, также могут использоваться в качестве стабилизирующих агентов. Предпочтительные поликатионные соединения включают олигоамины, такие как спермин, спермидин, путресцин и кадаверин; полиамины, такие как полиэтиленимин, полиспермин, полипутресцин и поликадаверин, и эгилированные олигоамины и полиамины из группы, перечисленной выше. Наиболее предпочтительным является соединение PI2080, полиэтиленимин 2000, конъюгированный с PEG 8000.
Одним предпочтительным классом катионных стабилизирующих агентов являются полипептиды, включающие, приблизительно, от 5 до, приблизительно, 50, или, предпочтительно, приблизительно, от 6 до, приблизительно, 20 аминокислот; при этом приблизительно 50% указанных аминокислот несут положительный заряд. Более предпочтительно, такие заряженные аминокислоты представлены аргинином. Наиболее предпочтительные соединения из указанного класса пептидов включают пептиды, богатые аргинином, которые содержат, по крайней мере, одну последовательность из четырех аргининов. Другим наиболее предпочтительным соединением из указанного класса пептидов является протамин, расщепленный термолизином (далее обозначаемый как низкомолекулярный протамин или "LMWP", от англ. Low Molecular Weight Protamine).
Гидрофобно модифицированные олиго- или полиамины также могут использоваться в настоящем изобретении. Предпочтительные стабилизирующие агенты из этой группы включают ацетилспермин, ацетилполиспермин, ацетилполиэтиленимин, бутурилспермин, бутурилполиспермин, бутурилполиэтиленимин, лауроилспермин, лауроилполиспермин, лауроилполиэтиленимин, стеароилспермин, стеароилполиспермин и стеароилполиэтиленамин.
Кроме того, катионные полисахариды и синтетические поликатионные полимеры также могут использоваться в настоящем изобретении. Примерами таких катионных полисахаридов являются хитозан, деацетилированный хитозан, кватернизированная целлюлоза, кватернизированная амилоза, кватернизированный амилопектин, кватернизированная частично гидролизированная целлюлоза, кватернизированная частично гидролизированная амилоза и кватернизированный частично гидролизованный амилопектин. Примерами указанных синтетических поликатионных полимеров являются Поликватерний 2 (кватернизированная поли[бис(2-хлорэтил]эфир-альт-1,3-бис[3- диметиламино)пропил]-мочевина); Поликватерний 11 (кватернизированный поли(1-винилпирролидон-со-диметиламмониоэтил метакрилат); Поликватерний 16 и 44 (сополимер винилпирролидона и кватернизированного винилимидазола), и Поликватерний 46 (сополимер винилкапролактама, винилпирролидона и кватернизированного винилимидазола).
Анионные стабилизирующие агенты
Согласно тем вариантам осуществления изобретения, в которых циклополисахарид модифицируется катионными группами, стабилизирующий агент выбран из группы анионных агентов или из группы полианионных полимеров.
Предпочтительно, такой анионный агент выбран из группы соединений, включающих карбокси-, сульфат-, сульфоно-, фосфат- или фосфоно-группы. Один класс анионных агентов, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению, включает анионные сурфактанты, такие как натрий 3-[(3-хлорамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат, натрий-N-лауроилкаркозинат, натрий додецилсульфат, натрий додецилбензилсульфонат и им подобные соединения.
Катионные полисахариды также могут использоваться в качестве стабилизирующих агентов. Примерами таких соединений являются хондроитинсульфат, дерматансульфат, каппа-каррагенан, йота-каррагенан, лямбда-каррагенан, мю-каррагенан, кси-каррагенан, пси-каррагенан, тау-каррагенан, фурцелларан, гепарансульфат, кератин, фукоидан, гиалуроновая кислота, альгининовая кислота, поли(сульфонилпропило)декстран, поли(сульфонилбутуло)декстран, поли(сульфонилбутуло)амилаза и поли(сульфонилпропило)амилаза.
Стабилизирующий агент также может представлять собой полианионный полимер, выбранный из группы, включающей полиакрилаты, полиметакрилаты и их сополимеры.
Эксципиенты (наполнители)
Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, такие как сахара, полиспирты, растворимые полимеры, соли и липиды.
Сахара и полиспирты, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничений указанными, лактозу, сахарозу, маннитол и сорбитол.
Примеры растворимых сополимеров, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, включают полиоксиэтилен, полоксамеры, поливинилпирролидон и декстран.
К полезным солям относятся, без ограничений указанными, хлорид натрия, хлорид магния и хлорид кальция.
Липиды, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, без ограничений указанными, включают жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот и глицерина, гликолипиды и фосфолипиды.
Получение композиции
Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть приготовлены путем растворения твердого бендамустина в водном растворе циклополисахарида или путем смешивания водного раствора циклополисахарида с водным базовым раствором бендамустина. Полученную таким образом смесь затем интенсивно перемешивают и, необязательно, подвергают воздействию ультразвуковых волн для получения гомогенного и уравновешенного водного раствора. В том случае, когда циклополисахарид представляет собой циклодекстрин, предпочтительно, водный раствор циклодекстрина, используемый для приготовления композиции, содержит, по крайней мере, 4% циклодекстрина; более предпочтительно, такой раствор содержит, по крайней мере, 10% циклодекстрина.
Стабилизирующий агент и наполнитель (если таковой присутствует), предпочтительно, вводят в композицию, добавляя их к предварительно приготовленному водному гомогенному и уравновешенному раствору бендамустина с циклополисахаридом. Такие агенты могут добавляться как в виде чистых веществ, так и в виде водных растворов; предпочтительно их перемешивают путем аккуратного встряхивания.
Предпочтительно, конечную композицию фильтруют перед использованием для инъекционного введения.
Композиция, при необходимости, может быть лиофилизирована для получения твердого материала, пригодного для растворения в инъекционной среде перед использованием. Предпочтительно, композиции, содержащие амины в качестве стабилизирующих агентов, подвергают лиофилизации перед добавлением такого стабилизирующего агента; при этом указанный агент вводят в композицию после ее восстановления непосредственно перед использованием.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, заявленную композицию приготавливают путем смешивания ингредиентов и инкубации.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленную композицию получают путем смешивания компонентов и последующей ультразвуковой обработкой смеси.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленную композицию получают путем смешивания компонентов, инкубации и последующей лиофилизации полученного продукта.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленную композицию получают путем смешивания компонентов, последующей ультразвуковой обработкой смеси и лиофилизации конечного продукта.
Композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обладают повышенной стабильностью в водном растворе и при введении в плазму, как in vivo, так и in vitro. Таким образом, такие композиции будут иметь более продолжительный период полувыведения из плазмы, чем свободный бендамустин; период полувыведения бендамустина таким образом может быть увеличен более чем на 50%, предпочтительно, более чем на 100%.
Кроме того, композиции, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, как неожиданно было показано, обладают улучшенной противоопухолевой активностью по сравнению с композициями, содержащими только бендамустин и циклополисахарид, равно как и с композициями, содержащими только бендамустин.
Примеры.
Пример 1. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и хондроитином
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 20% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и смешивают с 1 мл 25% раствора хондроитинсульфата.
Пример 2. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и поли(сульфонилбутуло)целлюлозой
6 мг Бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% вес/вес раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане. После этого раствор смешивают с 1 мл 2% раствора натриевой соли поли(сульфонилбутуло)целлюлозы. Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 3. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и гиалуроновой кислотой
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане. После этого раствор смешивают с 1 мл 0,1% раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты. Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 4. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и декстрана 6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 20% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и затем смешивают с 1 мл 50% раствора декстрана 40 (MW 40000), после чего обрабатывают ультразвуком еще 15 минут.
Пример 5. Получение композиции бендамустина с 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином и декстраном
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 20% (вес/вес) раствора 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина. Раствор инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и затем смешивают с 1 мл 50% раствора декстрана 40 (MW 40000), после чего обрабатывают ультразвуком еще 15 минут.
Пример 6. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и кватернизированной целлюлозой
2 мг кватернизированной целлюлозы (гидрохлоридная соль) растворяют в 1 мл воды. Через 4 часа предварительной инкубации на ультразвуковой бане (при комнатной температуре) данный раствор смешивают с раствором 6 мг бендамустин гидрохлорида в 1 мл 20% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор хорошо перемешивают и инкубируют в течение 15 минут на ультразвуковой бане.
Пример 7. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и поливинилпирролидоном
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и затем смешивают с 1 мл 20% раствора PVP (MW=10000) и обрабатывают ультразвуком еще 20 минут.
Пример 8. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и цетилпиридиния хлоридом
6 мг бендамустин гидрохлорида и 8,5 мг маннитола растворяют в 0,8 г 50% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина.
Раствор инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и затем смешивают с 0,2 мл 2,5% раствора цетилпиридиний хлорида.
Пример 9. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и PI2080
Получение PI2080
Полиэтиленимин (PEI, MW 2000) получают в фирме Aldrich. Поли(этиленгликоля) монометиловый эфир (PEG, MW 8500) получают в компании Polymer Sources Inc.
1
PI2080, конъюгат PEG и PEI, получают при помощи методики, описанной у Виноградова и соавт. в статье "Bioconjugate Chem". 1998, 9, 805-812. 4 г PEG вступают в реакцию с 1,1-карбонилдиимидазолом в 20 мл безводного ацетонитрила. Продукт этой реакции дважды диализуют относительно воды при помощи мембраны SpectraPor3, MWCO 3500 и лиофилизируют. Лиофилизированный материал растворяют в 32 мл метанола, смешивают с 2,9 г PEI и инкубируют в течение 24 ч при 25°С. Продукт диализуют дважды относительно воды при помощи мембраны SpectraPor3, MWCO 3500 и продукт PI2080 лиофилизируют.
Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстринаи и PI2080.
2,5 мг бендамустин гидрохлорида и 4,3 мг маннитола растворяют в 0,8 г 50% (вес/вес) раствора натриевого су льфобу типового эфира β-циклодекстрина. Раствор инкубируют при 20°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане и затем смешивают с 0,2 мл 5% раствора PI2080.
Пример 10. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и протамин сульфатом
2,5 мг бендамустин гидрохлорида и 4,3 мг маннитола растворяют в 0,800 г 50% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор взбалтывают при 20°С в течение 90 минут и затем инкубируют в течение 30 минут на ультразвуковой бане. Затем смесь переносят в суспензию 30 мг протаминсульфата в 0,163 г воды и интенсивно перемешивают в течение 15 минут.
Пример 11. Фармакокинетика бендамустина при введении крысам в составе композиции с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и цетилпиридиний хлоридом.
Тестируемые композиции:
Контроль: 6 мг/мл бендамустин гидрохлорида, 10,2 мг/мл маннитола в 0,9% NaCl; доза 20 мг/кг
Композиция, заявленная в настоящем изобретении: 5 мг/г бендамустин гидрохлорида, 40% (вес/вес) натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина, 0,5% цетилпиридиний хлорида, 8,5 мг/г маннитола в воде (полученная, как описано выше в Примере 8); доза 20 мг/кг.
Животные:
Крысы Spargue-Dawley (250-350 г) женского пола. Животных содержат по три особи в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-часовой цикл смены света и темноты, свет включают в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводили под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina и воде ad libitim (по желанию). Животных не кормят в течение ночи накануне введения композиции и перед введением проводят анестезию.
Дозирование и образцы:
Заявленную композицию бендамустина и контроль вводят внутривенно крысам в хвостовую вену. Через промежутки времени 5, 10, 15, 30, 45 мин и 1, 1,5, 2 и 3 ч после введения забирают образцы крови. Анестезия включает общий наркоз и осуществляется путем ингаляции изофлурана. Образцы крови забирают из яремной вены в пробирку с гепарином и держат на льду. Кровь немедленно центрифугируют, плазму сепарируют. Образцы плазмы немедленно экстрагируют.
Экстракция образцов и анализ:
Образцы плазмы объемом 0,100 мл переносят в пластиковые пробирки. Образцы экстрагируют 0,400 мл 100 мМ НСl в ацетонитриле с одновременным интенсивным встряхиванием в течение 30 секунд. Образцы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют. Образцы замораживают на сухом льду и хранят при температуре -80°С до HPLC анализа. Аликвоты объемом 20 мкл помещают на колонку для HPLC для последующего анализа.
Условия HPLC:
Колонка с обратной фазой С18 50×4,6 мм, Symmetry/Shield 3,5 микрометра
Температура колонки: 30°С
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Вводимый объем: 20 микролитров
Флуоресцентная регистрация при следующих показателях длины волны: возбуждение 327 нм, эмиссия 420 нм
Мобильная фаза: Буфер А: 5% ацетонитрила 0,1% ТРА; буфер Б: 90%
ацетонитрила, 0,1% TFA.
Время анализа: 10 минут.
Улучшенные фармакокинетические профили бендамустина в составе тестируемой композиции против контрольных образцов представлены в Таблице 1 ниже.
Таблица 1
Концентрация бендамустина в плазме крыс в зависимости от времени после введения
Время [ч]
Контроль [нг/мл]
Заявленная композиция [нг/мл]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0,08
12304 (2498)
16721 (1981)
0,25
7625 (536)
10713 (1458)
0,5
3046 (260)
4855 (874)
0,75
966 (192)
2165 (101)
1
414 (143)
1108 (104)
1,5
133 (80)
418 (57)
2
54 (34)
197 (25)
3
9 (6)
57 (24)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Представленные выше данные показывают, что стабильность бендамустина в плазме существенно увеличивается при использовании композиции, заявленной в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 12. Фармакокинетика бендамустина при введении крысам в составе композиции с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и PI2080
Тестируемые композиции:
Контроль: 2,5 мг/мл бендамустин гидрохлорида, 4,25 мг/мл маннитола в 0,9% NaCl; доза 10 мг/кг
Композиция, заявленная в настоящем изобретении: 2,5 мг/г бендамустин гидрохлорида, 40% (вес/вес) натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина, 1% PI2080, 4,3 мг/г маннитола в воде (полученная, как описано выше в Примере 9); доза 10 мг/кг.
Животные:
Крысы Spargue-Dawley (250-350 г) женского пола. Животных содержат по три особи в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-часовой цикл смены света и темноты, свет включали в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводят под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina и воде ad libitim (по желанию). Животных не кормят в течение ночи накануне введения композиции и перед введением проводят анестезию.
Дозирование и образцы:
Заявленную композицию бендамустина и контроль вводят внутривенно крысам в хвостовую вену. Через промежутки времени 5, 10, 15, 30, 45 мин и 1, 1,5, 2 и 3 ч после введения забирают образцы крови. Анестезия включает общий наркоз и осуществляется путем ингаляции изофлурана. Образцы крови забирают из яремной вены в пробирку с гепарином и держат на льду. Кровь немедленно центрифугируют, плазму сепарируют. Образцы плазмы немедленно экстрагируют.
Экстракция образцов и анализ:
Образцы плазмы объемом 0,100 мл переносят в пластиковые пробирки.
Образцы экстрагируют 0,400 мл 100 мМ НСl в ацетонитриле с одновременным интенсивным встряхиванием в течение 30 секунд. Образцы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют. Образцы замораживают на сухом льду и хранят при температуре -80°С до HPLC анализа. Аликвоты объемом 20 мкл помещают на колонку для HPLC для последующего анализа.
Условия HPLC:
Колонка с обратной фазой С18 50×4,6 мм, Symmetry/Shield 3,5
микрометра
Температура колонки: 30°С
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Вводимый объем: 20 микролитров
Флуоресцентная регистрация при следующих показателях длины волны:
возбуждение 327 нм, эмиссия 420 нм
Мобильная фаза: Буфер А: 5% ацетонитрила 0,1% TFA, буфер Б: 90%
ацетонитрила, 0,1% TFA.
Время анализа: 10 минут
Улучшенные фармакокинетические профили бендамустина в составе тестируемой композиции против контрольных образцов представлены в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
Концентрация бендамустина в плазме крыс в зависимости от времени после введения
Время [ч]
Контроль [нг/мл]
Заявленная композиция [нг/мл]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0,08
6045 (388)
6124 (508)
0,25
2428 (250)
2814 (392)
0,5
520 (105)
1234 (92)
0,75
145 (35)
549 (95)
1
48 (11)
314 (118)
1,5
8 (1)
188 (97)
2
2 (1)
118 (60)
3
0 (1)
48 (23)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Представленные выше данные показывают, что стабильность бендамустина в плазме существенно увеличивается при использовании композиции, заявленной в соответствии с настоящим изобретением.
Пример 13. Фармакокинетика бендамустина при введении крысам в составе композиции с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и протамин сульфатом
Тестируемые композиции:
Контроль: 2,5 мг/мл бендамустин гидрохлорида, 4,25 мг/мл маннитола в 0,9% NaCl; доза 10 мг/кг
Композиция, заявленная в настоящем изобретении: 2,5 мг/г бендамустин гидрохлорида, 40% (вес/вес) натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина, 3% протамин сульфата, 4,3 мг/г маннитола в воде (полученная, как описано выше в Примере 9); доза 10 мг/кг.
Животные:
Крысы Spargue-Dawley (250-350 г) женского пола. Животных содержат по три особи в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-часовой цикл смены света и темноты, свет включают в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводят под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina и воде ad libitim (по желанию). Животных не кормят в течение ночи накануне введения композиции и перед введением проводят анестезию. Дозирование и образцы:
Заявленную композицию бендамустина и контроль вводят внутривенно крысам в хвостовую вену. Через промежутки времени 5, 10, 15, 30, 45 мин и 1, 1,5, 2 и 3 ч после введения забирали образцы крови. Анестезия включает общий наркоз и осуществляется путем ингаляции изофлурана. Образцы крови забирают из яремной вены в пробирку с гепарином и держат на льду. Кровь немедленно центрифугируют, плазму сепарируют. Образцы плазмы немедленно экстрагируют. Экстракция образцов и анализ:
Образцы плазмы объемом 0,100 мл переносят в пластиковые пробирки.
Образцы экстрагируют 0,400 мл 100 мМ НСl в ацетонитриле с одновременным интенсивным встряхиванием в течение 30 секунд. Образцы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют. Образцы замораживают на сухом льду и хранят при температуре -80°С до HPLC анализа. Аликвоты объемом 20 мкл помещают на колонку для HPLC для последующего анализа.
Условия HPLC:
Колонка с обратной фазой С 18 50×4,6 мм, Symmetry/Shield, 3,5 мкм.
Температура колонки: 30°С
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Вводимый объем: 20 микролитров
Флуоресцентная регистрация при следующих показателях длины волны:
возбуждение 327 нм, эмиссия 420 нм
Мобильная фаза: Буфер А: 5% ацетонитрила 0,1% TFA; буфер Б: 90%
ацетонитрила, 0,1% TFA.
Время анализа: 10 минут.
Улучшенные фармакокинетические профили бендамустина в составе тестируемой композиции против контрольных образцов представлены в Таблице 3 ниже.
Таблица 3
Концентрация бендамустина в плазме крыс в зависимости от времени после введения
Время [ч]
Контроль [нг/мл]
Заявленная композиция [нг/мл]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0,08
6045 (388)
3853 (787)
0,25
2428 (250)
2416 (716)
0,5
520 (105)
1100 (313)
0,75
145 (35)
595 (154)
1
48 (11)
415 (140)
1,5
8 (1)
139 (20)
2
2 (1)
126 (36)
3
0 (0)
47 (18)
4
19 (9)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Представленные выше данные показывают, что стабильность циклополисахаридной композиции существенно выше по сравнению со стабильностью одного бендамустина.
Пример 14. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и Liviquat FC370.
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане, а затем смешивают с 1 мл 0,1% раствора Liviquat FC370.
Liviquat FC370 (Поликватерний-16) представляет собой сополимер винилпирролидона и кватернизированного винилимидазола (CAS No. 95144-24-4 (BASF). Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 15. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и Liviquat HOLD
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 20 минут на ультразвуковой бане, а затем смешивают с 1 мл 0,15% раствора Liviquat HOLD.
Liviquat HOLD (Поликватерний-46) представляет собой 1H-имидазолий, 1-этенил-3-метил-метил сульфат полимер с 1-этенилгексагидро-2Газепин-2-оном и 1-этенил-2-пирролидоном, CAS No. 174761-16-1 (BASF). Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 16. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и кватернизированным поли(винилпирролидон-со-2-диметиламиноэтил метакрилатом)
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане. После этого раствор смешивают с 1 мл 0,1% раствора кватернизированного поли(винилпирролидон-со-2-диметиламиноэтил метакрилата). Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 17. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и кватернизированным поли(винилпирролидон-со-2-диметиламиноэтил метакрилатом)
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане. После этого раствор смешивают с 1 мл 0,1% раствора кватернизированного поли(винилпирролидон-со-2-диметиламиноэтил метакрилата). Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 18. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и хитозаном
5 мг низкомолекулярного хитозана суспендируют в 5 мл 0,2М соляной кислоты и оставляют перемешиваться в течение ночи. Содержимое флакона фильтруют через 0,45 мкм стекловолоконный фильтр и лиофилизируют. 2 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина добавляют к лиофилизированному материалу. Смесь инкубируют при 20°С в течение 24 часов и фильтруют через 0,45 мкм стекловолоконный фильтр. 1 мл указанного раствора используют для растворения 6 мг бендамустин гидрохлорида. Раствор инкубируют при 10°С в течение 20 минут на ультразвуковой бане.
Пример 19. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и кватернизированной поли(бис(2-хлорэтил)эфир-альт-1,3-бис[3-диметиламино)пропил]-мочевиной.
6 мг бендамустин гидрохлорида растворяют в 1 мл 30% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина. Раствор предварительно инкубируют при 10°С в течение 15 минут на ультразвуковой бане. После этого раствор смешивают с 1 мл 0,05% раствора кватернизированной поли(бис(2-хлорэтил)эфир-альт-1,3-бис[3-диметиламино)пропил]-мочевины. Образец инкубируют на ультразвуковой бане в течение 30 минут при 10°С.
Пример 20.
а. Получение низкомолекулярного протамина (LMWP)
2 мг протамин сульфата растворяют в 70 мл 0,1 М аммониевого ацетатного буфера, рН=7, для получения раствора протамин сульфата. 20 мг термолизина растворяют в 10 мл 50 мМ Tris буфера, рН=7 для образования раствора термолизина. Раствор термолизина добавляют к раствору протамин сульфата, после чего добавляют 70 мкл 1М водного раствора хлорида кальция. Смесь инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре, 0,7 мл 0,7М раствора ЭДТА добавляют к смеси. Смесь лиофилизируют. Сухой материал повторно растворяют в 0, 2% водной уксусной кислоте, 100 мг на 1 мл, и фильтруют через 0, 22 мкм фильтр. 5 мл раствора помещают на колонку Vaydac 218ТР 152050 для RP-HPLC, 5×25 см. Образец элюируют с градиентом этанола в воде, содержащим 0, 2% уксусную кислоту. Фракцию, содержащую продукт, собирают и лиофилизируют.
b. Получение композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина ("SBECD") и низкомолекулярным протамином ("LMWP")
400 мг раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина смешивают с 0,6 мл воды и встряхивают до полного растворения. 16 мг бендамустин гидрохлорида и 27,3 мг маннитола добавляют к полученному раствору и взбалтывают в течение 90 минут. 20 мг LMWP растворяют в 936,8 мг воды и смешивают с раствором бендамустина. Продукт хранят при 4°С.
Оценивают содержание бендамустина в продукте при помощи аналитической RP-HPLC, как описано ниже. 10 мкл образцы разделяют на колонке Waters SymmetryShield RP-18 3,5 мкм (4,6×50 мм) при скорости потока 1,5 мл/минуту в ацетонитрил-водном градиенте, содержащем 0,1% TFA. Пик определяют путем регистрации поглощения УФ излучения при 260 нм. Область пика бендамустина используют для оценки степени стабильности лекарства, трехкратно. Площадь под пиковой кривой для бендамустина через 24 часа составляет 101,8% от исходной (стандартное отклонение 2%).
Пример 21. Получение лиофилизированной композиции бендамустина с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и низкомолекулярным протамином
Композицию, полученную в Примере 20, лиофилизируют. Получают твердый белый аморфный продукт, растворимый в воде. Перед использованием продукт восстанавливают 1,536 мл воды.
Пример 22. Цитотоксичность композиций бендамустина
Клетки линий Н460, RPMI8226 и MDA-MB-231 культивируют в подходящей среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики.
Через 24 ч к клеточным культурам добавляют бендамустин (ВМ); ВМ в присутствии натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина (SBECD) и ВМ в присутствии 0, 1% SBECD и 0,002-0,005% низкомолекулярного протамина (LMWP) в различных концентрациях и клетки выращивают в течение трех дней.
Цитотоксичность лекарственного средства оценивают при помощи методики WST-1.
Величины IC50 определяют для бендамустина, бендамустина с SBECD и бендамустина вместе с SBECD/LMWP. В Таблице 4 показано увеличение активности ВМ, которое происходит при комбинировании лекарственного средства с SBECD или SBECD/LMWP. Для оценки изменений цитотоксической активности ВМ рассчитывают соотношения IC50 ВМ к IC50 ВМ в SBECD или SBECD/LMWP. Для каждой клеточной линии указанные соотношения соответствуют средним величинам в 3-12 независимых исследованиях
Таблица 4
Увеличение активности ВМ (ВМ IС50/IС50 композиции, в скобках приведено стандартное отклонение)
Клеточная линия
Композиция
Н460
RPMI8226
MDA-MB-231
ВМ
1
1
1
BM+SBECD
1,2 (0,2)
1,6 (0,1)
1,6 (0,5)
BM+SBECD+LM WP
1,9 (0,3)
2,5 (0,4)
2,2 (0,1)
Композиция на основе SBECD позволяет увеличить активность ВМ, уменьшая его IC50. Добавление LMWP к SBECD композиции дополнительно уменьшает величину ВМ IC50. В двух клеточных линиях, Н460 и RPMI8226, эффект LMWP был статистически значимым, р=0,036 и 0,018, соответственно. В клеточной линии MDA-MB-231 эффекты обеих композиций существенно не отличаются. Для указанных трех клеточных линий величины IC50 для ВМ в среднем уменьшаются в 1,5 и в 2,2 раза при введении композиций с SBECD и SBECD/LMWP, соответственно.
Пример 23. Цитотоксичность композиций бендамустина предварительно инкубированных со средой
ВМ и SBECD/LMWP композиции (40 мг/мл ВМ в 20% SBECD, 1% LMWP) инкубируют в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 0, 1 или 4 ч и затем в различных концентрациях добавлют к клеткам линии RPMI8226. Во время обработки ВМ поддерживают постоянные концентрации SBECD и LMWP в культуральной среде на уровне 0,1 и 0,05%, соответственно.
Затем клетки выращивают в течение 72 ч. Цитотоксичность лекарственного средства оценивают при помощи методики WST-1. Результаты представлены в Таблицах 5 и 6 ниже.
Таблица 5. Рост RPMI8226 клеток, обработанных бендамустином, предварительно инкубированным в клеточной культуральной среде в течение 0, 1 и 4 ч.
Бендамустин, ед. изм.
ВМ 0 ч
ВМ 1 ч
ВМ 4 ч
Клеточный рост, %
1
100
100
100
15
83
100
100
31
70
100
100
62
46
106
104
125
11
20
105
250
-23
-45
75
500
-87
-85
8
1000
-98
-102
-99
Таблица 6
Рост RPMI8226 клеток, обработанных композицией SBECD/LMWP бендамустина, предварительно инкубированной в клеточной культуральной среде в течение 0, 1 и 4 ч.
Бендамустин ед. изм.
BM/SBECD/LMWP
BM/SBECD/LMWP
BM/SBECD/LMWP
0 ч
1 ч
4 ч
Клеточный рост,
%
1
100
100
100
15
71
71
114
31
35
37
51
62
21
39
29
125
-14
-25
8
250
-99
-98
-104
500
-99
-98
-101
1000
-96
-98
-108
Таблица 7
Величины IС50 для бендамустина и BM/SBECD/LMWP композиции, предварительно инкубированной в клеточной культуральной среде в течение 0, 1 или 4 ч, в отношении клеток линии RPMI8226.
Время предварительной инкубации
IС50 бендамустина, ед. изм.
ВМ
BM/SBECD /LMWP
0
62
32
1
106
38
4
390
53
IC50, TGI, и LC50 параметры рассчитывают для каждого периода времени предварительной инкубации.
IC50, µM/h
TGI, µM/h
LC50, µM/h
ВМ
85+/- 10
98+/-18
107+/-11
SBECD/LMWP
5.2+/- 0.2
6.0+/-0.1
3.5+/-0.9
где:
IC50 - концентрация лекарственного средства, которая приводит к ингибированию роста 50% клеток;
TGI - концентрация лекарственного средства, которая вызывает полное ингибирование роста клеток;
LC50 - концентрация лекарственного средства, которая приводит к гибели 50% клеток.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что композиции ВМ с SBECD и LMWP продолжительнее сохраняют свою активность, чем ВМ, используемый отдельно.
Пример 24. Цитотоксичность композиции бендамустина, содержащей SBECD and LMWP
RPMI8226, Н69, MDA-MB-231 и Н460 клетки культивируют в подходящей среде, содержащей 10% FBS и антибиотики. Через 24 ч после помещения на планшеты к клеточным культурам в разных концентрациях добавляют бендамустин и бендамустин в составе композиции SBECD/LMWP (40 мг/мл ВМ в 20% SBECD, 1% LMWP) и клетки выращивают в течение трех дней. Цитотоксичность лекарственного средства оценивают при помощи методики WST-1. Результаты представлены ниже в Таблице 8.
Таблица 8
Клеточная линия
ВМ
SBECD/LMWP
RPMI8226
117
61
Н69
254
119
Н460
601
228
MDA-MB-231
600
321
Представленные данные свидетельствуют о том, что заявленные композиции обладают повышенной цитотоксичностью.
Пример 25. Фармакокинетика бендамустина при его введении крысам в композиции с натриевым сульфобутиловым эфиром β-циклодекстрина и низкомолекулярным протамином (LMWP)
Для исследования были приготовлены следующие композиции:
Контроль: 5 мг/мл бендамустин гидрохлорида, 10.2 мг/мл маннитола в 0,9% NaCl; доза 10 мг/кг
Композиция 25А
- 5 мг/мл бендамустин гидрохлрида, 20% (вес/вес) раствора сульфобутилового эфира β-циклодекстрина, 10,2 мг/г маннитола в воде; доза 10 мг/кг.
Композиция 25В
- 5 мг/мл бендамустин гидрохлорида, 20% (вес/вес) раствора натриевого сульфобутилового эфира β-циклодекстрина, 1% LMWP, 10,2 мг/г маннитола в воде; доза 10 мг/кг.
Животные
Крысы Spargue-Dawley (250-350 г) женского пола. Животных содержат по три особи в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-часовой цикл смены света и темноты, свет включают в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводят под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina и воде ad libitim (по желанию). Животных не кормят в течение ночи накануне введения композиции и перед введением проводят анестезию. Дозирование и образцы:
Заявленную композицию бендамустина и контроль вводят внутривенно крысам в хвостовую вену. Через промежутки времени 5, 10, 15, 30, 45 мин и 1, 1,5, 2 и 3 ч после введения забирают образцы крови. Анестезия включает общий наркоз и осуществляется путем ингаляции изофлурана. Образцы крови забирают из яремной вены в пробирку с гепарином и держат на льду. Кровь немедленно центрифугируют, плазму сепарируют. Образцы плазмы немедленно экстрагируют.
Экстракция образцов и анализ:
Образцы плазмы объемом 0,100 мл переносят в пластиковые пробирки. Образцы экстрагируют 0,400 мл 100 мМ НСl в ацетонитриле с одновременным встряхиванием в течение 30 секунд. Образцы центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отделяют. Образцы замораживают на сухом льду и хранят при температуре -80°С до HPLC анализа. Аликвоты объемом 20 мкл помещают на колонку для HPLC для последующего анализа.
Условия HPLC:
Колонка с обратной фазой С18 50×4,6 мм, Symmetry/Shield 3,5 микрометра
Температура колонки: 30°С
Скорость потока: 1,5 мл/мин
Вводимый объем: 20 мкл
Флуоресцентная регистрация при следующих показателях длины волны: возбуждение 327 нм, эмиссия 420 нм
Мобильная фаза: Буфер А: 5% ацетонитрила 0,1% TFA; буфер Б: 90% ацетонитрила, 0,1% TFA.
Время анализа: 10 минут
Улучшенные фармакокинетические профили бендамустина в составе тестируемой композиции против контрольных образцов представлены в Таблице 9 ниже.
Таблица 9
Концентрация бендамустина в плазме крыс в зависимости от времени после введения
Время [ч]
Контроль [нг/мл]
Композиция 25А [нг/мл]
Композиция 25В [нг/мл]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0.08
6045 (388)
5233 (143)
3629 (1286)
0.25
2428 (250)
1702 (217)
1915 (708)
0.5
520 (105)
307 (73)
852 (251)
0.75
145 (35)
72 (25)
468 (80)
1
47(11)
36(17)
317(53)
1.5
8(1)
16(10)
160(32)
2
2(1)
5(4)
93(27)
3
0(0)
0(0)
47(20)
4
12(5)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Пример показывает, что присутствие LMWP в композиции бендамустина с SBECD существенно увеличивает период полу выведения ВМ из плазмы. Пример 26. Изучение эффективности композиций бендамустина на экспериментальной модели метастазирующей опухоли легких у мышей
Животные:
Крыс Charles Rivers линии С57 В1/6 женского пола, возраст от 5 до 6 недель, получают в институте Charles River Canada Inc. Животных содержат по пять особей в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-ти часовой цикл смены света и темноты, свет включают в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводят под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina (Pro Lab PMH 4018, Товарный знак Agway, Syracuse, New York) и воде ad libitim (no желанию). Все исследования осуществляют в соответствии с "Конвенцией о защите экспериментальных животных".
Опухолевая клеточная культура
Клетки легочной карциномы Льюиса 3LL культивируют в подходящей культуральной среде. Клетки собирают во время логарифмической фазы роста для получения препарата для последующей имплантации.
Имплантация опухоли
5
Клетки легочной карциномы Льюиса 3LL (2,0-5,0×10 клеток в 200 мкл PBS) имплантируют внутривенно в хвостовую вену для создания модели метастазирующей опухоли легких. Лечение:
Лечение начинают на следующий день после имплантации опухоли. Животные получают дозы следующих растворов:
Контроль: (0,9%, NaCl)
Композиции:
- простой бендамустин (ВМ), (50 мг/кг)
- бендамустин (50 мг/кг) в 20% SBECD, 1% LMWP
Оценка эффективности:
Формирование метастазов оценивают путем подсчета количества метастатических пятен на поверхности легких. Стандартное обследование всех органов на предмет метастазов проводят в конце исследования. Результаты оценки эффективности лечения представлены ниже в Таблице 10
Таблица 10
Лечение
Количество метастазов в легких (количество животных)
Ингибирование формирования метастазов против контроля (%)
Ингибирование формирования метастазов против простого бендамустина (%)
Контроль
65,5±7,8 (8)
0
-
ВМ (50 мг/кг)
56,1±9,5 (9)
14,4
0
ВМ (50 мг/кг)
20%SBECD,
37,0±8.1 (9)
43,5**
34,0*
1%LMWP
** Статистически значимо, р<0.01
* Статистически значимо, р<0.05
Результаты показывают статистически значимое увеличение эффективности композиций, содержащих SBECD и LMWP, по сравнению с композициями, содержащими только бендамустин.
Пример 27. Эффективность композиций бендамустина в отношении твердой опухоли карциномы груди человека (MDA-MB 231), имплантированной подкожно (п/к) голым мышам
Животные:
Мышей линии balb/c, возраст от 5 до 6 недель, получают в институте Charles River Canada Inc. Животных содержат по пять особей в клетке, оснащенной воздушным фильтром, в условиях контролируемого освещения (12-ти часовой цикл смены света и темноты, свет включают в 06:00 ч) и температуре 22°С±1°С. Все манипуляции с животными проводят под стерильным ламинарным колпаком. Животные имеют доступ к корму Purina (Pro Lab PMH 4018, Товарный знак Agway, Syracuse, New York) и воде ad libitim (по желанию). Все исследования осуществляют в соответствии с "Конвенцией о защите экспериментальных животных".
Опухолевая клеточная культура:
Клетки линии MDA-MB 231 карциномы груди человека культивируют в подходящей культуральной среде. Клетки собирают во время логарифмической фазы роста для получения препарата для последующей имплантации.
Имплантация опухоли:
6
Опухолевые клетки человека или миеломные клетки (2,5 - 5,0 х 10 клеток) имплантируют подкожно в 0,200 мл среды, содержащей 30% Матригеля, в две паховые области мышей balb/c nu/nu на глубину 1-2 см при помощи иглы калибром 20.
Лечение:
Через 2-3 недели после имплантации опухоли отбирают животных, у которых подкожно развились твердые опухоли, и разделяют их на несколько гомогенных групп (n=5 животных на группу или дозу) в зависимости от размера опухоли (0,5-0,8 см в диаметре). Лечение начинают на следующий день.
Животным вводят дозы следующих растворов:
Контроль: (0,9%, NaCl)
Композиции:
- простой бендамустин (35 мг/кг)
- бендамустин (35 мг/кг) в 40% SBECD, 1% протамин сульфат (ВМ в составе композиции)
Оценка эффективности:
Измерение подкожной твердой опухоли осуществляют на следующий день после первой инъекции и затем с 3-4-дневным интервалом. Два наибольших перпендикулярных диаметра каждой опухоли определяют калипером, а размер опухоли рассчитывают при помощи следующей формулы: TV=L×W/2 где TV: объем опухоли; L: длина; W: ширина. Массу тела животных также регистрируют. Результаты представлены в Таблице 11 ниже.
Таблица 11
Группы (количество животных)
Масса дела на 14 день (г)
Объем опухоли на 14 день (количество опухолей)
Ингибирование против контроля на 14 день
Особые отметки
Контроль (0,9%, NaCI) (5)
19,9±0,35 (4)
1,80±0,19 (8)
-
1 животное из 5 погибло на 11 день исследования по причине метастазирования. Всех животных умерщвляли на 14 день исследования согласно протоколу, когда достигался лимитирующий объем опухоли
ВМ (35 мг/кг) (5)
18,1±0,39 (5)
0,54±0,06 (10)
70,20%
ВМ (35 мг/кг), 40% SBECD, 1% PS (5)
18,6±0,30 (2)
0,32±0,09 (4)
82,00%
3 животных из 5 погибли на 4 день от начала лечения
В Таблице 12 показано влияние ВМ и его композиций на рост опухолей.
Таблица 12
Вес твердых опухолей, развившихся после подкожного введения голым мышам клеточной линии карциномы груди человека MDA-MB 231
Время [дни]
Контроль, лечение не проводилось [1]
ВМ(35 мг/кг) [г]
ВМ (35 мг/кг), 40% SBECD, 1% PS [г]
Среднее(5Е М)
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0
0,277 (0,031)
0,237 (0,008)
0,247 (0,012)
2
0,329 (0,034)
0,250 (0,028)
0,242 (0,039)
4
0,436 (0,052)
0,294 (0,027)
0,151 (0,045)
7
0,615 (0,065)
0,313 (0,030)
0,182 (0,046)
9
0,838(0,095)
0,349(0,038)
0,216(0,046)
11
1,164(0,149)
0,417(0,046)
0,232(0,065)
14
1,803(0,185)
0,537(0,055)
0,324(0,092)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Результаты свидетельствуют о неожиданной токсичности и хорошей эффективности композиции, содержащей SBECD и протамин сульфат.
Пример 28. Эффективность композиций бендамустина в отношении твердой опухоли, развившейся из клеточной линии карциномы груди человека MDA-MB 231, введенной подкожно голым мышам.
Эксперимент осуществляют, как описано в Примере 27, для лечения используют следующие композиции:
Контроль: (0,9%, NaCl)
Композиции:
- простой бендамустин, (30 мг/кг)
- бендамустин (30 мг/кг) в 40% SBECD (BM в составе композиции) Лечение проводят на 1, 2, 9 и 10 дни.
Результаты представлены в Таблице 13.
Таблица 13
Группы (количество животных)
Схема лечения
Вес опухоли на 19 день, рассчитанный на основании измерений размера опухоли (г) (количество опухолей)
Реальный вес опухоли на 19 день, измеренный после аутопсии (г) (количество опухолей)
G1. Контроль (0,9%, NaCl) (5)
День 1, 2,9,10
1,70±0,15 (10)
0,855±0,105 (10)
G2.BM (30 мг/кг) (5)
День 1, 2, 9, 10
0,684±0,10 (10)
0,275±0,052 (10)
G3.BM (30 мг/кг), 40% SBECD (5)
День 1, 2, 9, 10
1,05±0,18 (10)
0,413±0,067 (10)
В Таблице 14 показано влияние ВМ и его композиций на рост опухолей.
Таблица 14
Вес твердой опухоли после лечения карциномы груди человека MDA-MB 231, развившейся после подкожного введения клеток опухоли голым мышам
Время [дни]
Контроль, группа, не получавшая лечение [г]
ВМ (30 мг/кг) [г]
ВМ (30 мг/кг), 40% SBECD, [г]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0
0,252 (0,020)
0,203 (0,028)
0,200 (0,024)
2
0,288 (0,019)
0,238 (0,023)
0,245 (0,022)
5
0,384 (0,029)
0,267 (0,022)
0,300 (0,027)
7
0,536 (0,028)
0,313 (0,028)
0,392 (0,038)
9
0,693 (0,044)
0,388 (0,045)
0,522 (0,060)
12
1,034 (0,049)
0,497 (0,060)
0,641 (0,071)
14
1,174 (0,065)
0,550 (0,075)
0,756 (0,090)
16
1,456 (0,104)
0,594 (0,084)
0,853 (0,125)
19
1,704 (0,145)
0,684 (0,098)
1,051 (0,176)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Представленные выше данные свидетельствуют о том, что двухкомпонентная система, включающая бендамустин и заряженный циклодекстрин (без стабилизирующего агента с противоположным зарядом), менее эффективна для лечения опухоли, чем простой бендамустин.
Пример 29. Эффективность композиций бендамустина в отношении твердой опухоли, развившейся из клеточной линии карциномы груди человека MDA-MB 231, введенной подкожно голым мышам
Эксперимент осуществляют как описано в Примере 28, используя следующие композиции для лечения:
Контроль: (0.9%, NaCl)
Композиции:
- простой бендамустин, (30 мг/кг)
- бендамустин (30 мг/кг) в 20% SBECD, 1% LMWP (ВМ в составе композиции).
Лечение проводят на 1, 2, 9 и 10 дни.
Результаты представлены в Таблице 15.
Таблица 15
Группы (количество животных)
Режим лечения
Вес опухоли на 16 день (г) (количество опухолей)
Ингибирование % против контроля (на 16 день)
G1. Контроль 1 (0,9%, NaCl) (6)
Day 1,2,9,10
0,789±0,056(6)
-
G2.BM (30 мг/кг) (6)
Day 1,2,9,10
0,487±0,067(6)
38.3
G3. BM (30 мг/кг), 20%SBECD, 1% LMWP (6)
Day 1,2,9,10
0,364±0,028(6)
53.9
Примечание: Опухоли, имплантированные в левую паховую область, были существенно меньше, чем опухоли, имплантированные в правую паховую область, по причине меньшего количества инокулированных клеток. Объем указанных опухолей не включен в представленные данные.
Результаты свидетельствуют о том, что композиция бендамустина с 20% SBECD и 1% LMWP является более активной, по сравнению с лекарственным средством, вводимым вне композиции, указанный результат является неожиданным с учетом результатов, полученных выше в Примере 28.
Таблица 16
Вес твердых опухолей, развившихся после подкожного введения голым мышам клеточной линии карциномы груди человека MDA-MB 231
Время [дни]
Контроль, группа, не получавшая лечения [г]
BM (30 мг/кг) [г]
BM (30 мг/кг), 20% SBECD, 1% LMWP [г]
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
Среднее (SEM)
0
0,161 (0,007)
0,139 (0,013)
0,140 (0,018)
2
0,187 (0,011)
0,178 (0,027)
0,163 (0,016)
4
0,233 (0,024)
0,202 (0,039)
0,167 (0,016)
6
0,288 (0,036)
0,259 (0,049)
0,188 (0,010)
8
0,344 (0,027)
0,295 (0,054)
0,216 (0,014)
10
0,422 (0,031)
0,319 (0,044)
0,234 (0,013)
12
0,508 (0,041)
0,361 (0,050)
0,258 (0,012)
14
0,589 (0,057)
0,417 (0,054)
0,319 (0,022)
16
0,789 (0,056)
0,48 (0,067)
0,364 (0,028)
SEM - стандартное отклонение от среднего
Пример 30. Химическая стабильность бендамустина в композиции с сульфобутиловым эфиром бета-циклодекстрина (SBECD) и низкомолекулярным протамином (LMWP)
4% SBECD (вес/вес) в фосфатном буфере (SBECD/PB) получают путем растворения SBECD в 5 мМ фосфатного буфера и доведения величины рН до 7,2.
Получают и тестируют следующие композиции:
Контроль: 0,6 мг/мл бендамустин гидрохлорида (ВМ) в воде; получают путем растворения ВМ в 5 мМ фосфатного буфера (РВ), рН 7,2. Композиция 30-1: 0,6 мг/мл ВМ в 4% SBECD, полученная путем растворения ВМ в SBECD/PB
Композиция 30-2: 0.6 мг/мл ВМ в 4% SBECD и 0.2% LMWP, полученная путем растворения ВМ в SBECD/PB и добавления LMWP
Композиция 30-3: 0.6 мг/мл ВМ в 4% SBECD и 1% LMWP, полученная путем растворения ВМ в SBECD/PB и добавления LMWP
Композиция 30-4: 0.6 мг/мл ВМ в 4% SBECD и 0.2% LMWP, полученная путем растворения LMWP в SBECD/PB и добавления ВМ
Композиция 30-5: 0.6 мг/мл ВМ в 4% SBECD и 0.2% LMWP, полученная путем растворения LMWP в SBECD/PB и добавления ВМ.
Композиции инкубируют при 25°С и периодически анализируют при помощи HPLC, как описано ниже. 10 - мкл образцы разделяют при помощи HPLC на колонке Waters SymmetryShield RP-18, 3,5 мкм (4,6 х 50 мм) при скорости потока 1,5 мл/мин в ацетонитрил-водном градиенте, содержащем 0,1% TFA. Пик определяют путем регистрации поглощения Уф излучения при 260 нм. Область пика бендамустина используют для оценки скорости разрушения лекарственного средства в кинетической модели первого уровня. Результаты, выраженные через период полувыведения (Т1/2), представлены в Таблице 17 ниже.
Таблица 17
Композиция
Т1/2
Контроль: 0,6 мг/мл ВМ
44 мин
Композиция 30-1: 4% SBECD, 0,6 мг/мл ВМ
642 мин
Композиция 30-2: 4% SBECD, 0,6 мг/мл ВМ 0,2% LMWP,
707 мин
Композиция 30-3: 4% SBECD, 0,6 мг/мл ВМ 1% LMWP,
789 мин
Композиция 30-4: 4% SBECD, 0,2% LMWP, ВМ0,6 мг/мл
673 мин
Композиция 30-5: 4% SBECD, 1% LMWP, 0 ВМ6 мг/мл
729 мин
Результаты показывают, что LMWP увеличивает стабильность ВМ в растворе ВМ и SBECD. Результаты также показывают, что стабилизирующий эффект LMWT выше, если указанное соединение добавляют к предварительно полученной смеси ВМ и SBECD (композиция 30-3 против 30-5 и композиция 30-2 против 30-4, соответственно).
Пример 31. Химическая стабильность бендамустина в плазме
В гепаринизированную человеческую плазму, 20 мкл гепарина на 780 мкл плазмы, вводят следующие композиции бендамустина (ВМ):
Контроль: 0,6 мг/мл бендамустин гидрохлорида (ВМ) в воде; получают путем растворения бендамустина в воде.
Композиция 31-А: 0,6 мг/мл ВМ в 4% SBECD, полученная путем растворения ВМ в 4% (вес/вес) растворе SBECD в воде.
Композиция 31-В: 0,6 мг/мл ВМ в 8% SBECD, полученная путем растворения ВМ в 8% (вес/вес) растворе SBECD в воде.
Композиция 31-С: 0,6 мг/мл ВМ в 20% SBECD, полученная путем растворения ВМ в 20% (вес/вес) растворе SBECD в воде.
Композиция 31-D: 0,6 мг/мл ВМ в 40% SBECD, полученная путем растворения ВМ в 40% (вес/вес) растворе SBECD в воде.
Композиция 31-1: 0,6 мг/мл ВМ в 4% SBECD и 3% PI2080, полученная путем растворения ВМ в 4% (вес/вес) растворе SBECD в воде и добавления PI2080.
Композиция 31-2: 0,6 мг/мл ВМ в 8% SBECD и 3% PI2080, полученная путем растворения ВМ в 8% (вес/вес) растворе SBECD в воде, и добавления PI2080. Композиция 31-3: 0,6 мг/мл ВМ в 20% SBECD и 3% PI2080, полученная путем ВМ в 20% (вес/вес) растворе SBECD в воде и добавления PI2080 Композиция 31-4: 0.6 мг/мл ВМ в 40% SBECD и 3% PI2080, полученная путем растворения ВМ в 40% (вес/вес) растворе SBECD в воде и добавления PI2080.
Первоначальная концентрация бендамустина в плазме после его введения составляет 0,015 мг/мл. Образцы плазмы инкубируют при 37°С. Периодически из плазмы забирают образец объемом 50 мкл и переносят его в 200 мкл 100 мМ раствора НС1 в ацетонитриле, смешивают и центрифугируют.50 мкл супернатанта разводят 20 раз 95% ацетонитрилом, затем 20 мкл разведенных образцов сепарируют на колонке Waters SymmetryShield RP18, 3,5 мкм (4,6×50 мм), используя градиент ацетонитрила (0,1% TFA) в воде (0,1% TFA), скорость потока 1,5 мл/мин. Пик определяют путем регистрации флуоресценции с угасанием при 327 нм и эмиссией при 420 нм. Область пика бендамустина используют для оценки скорости разрушения лекарствненого средства в кинетической модели первого уровня. Результаты, выраженные через величину периода полувыведения (Т 1/2), представлены в Таблице 18 ниже.
Таблица 18
Композиции:
Т 1/2 в плазме
Контроль: 0,6 мг/мл ВМ
123 мин
Композиция 31-А: 0,6 мг/мл ВМ, 4% SBECD
134 мин
Композиция 31-В: 0,6 мг/мл ВМ, 8% SBECD
137 мин
Композиция 31-С: 0,6 мг/мл ВМ, 20% SBECD
174 мин
Композиция 31-D: 0,6 мг/мл ВМ, 40% SBECD
242 мин
Композиция 31-1: 0,6 мг/мл ВМ, 4% SBECD, 3% PI2080
182 мин
Композиция 31-2: 0,6 мг/мл ВМ, 8% SBECD, 3% PI2080
251 мин
Композиция 31-3: 0,6 мг/мл ВМ, 20% SBECD, 3% PI2080
297 мин
Композиция 31-4: 0,6 мг/мл ВМ, 40% SBECD, 3% PI2080
302 мин
Результаты свидетельствуют о том, что PI2080 увеличивает стабильность ВМ в плазме.
Все примеры приведены исключительно с иллюстративной целью и не ограничивают объем притязаний.