УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ НАНОЧАСТИЦ

Полезная модель относится к области исследования поверхностных свойств наночастиц путем определения их электрофоретической подвижности методом горизонтального гель-электрофореза и предназначена для многопараметрической оптимизации условий синтеза и стабилизации наночастиц. Предлагаемое устройство может быть использовано для контроля качества конъюгации биомаркеров наночастиц золота и опухолеспецифичных антител.
Под поверхностной модификацией наночастиц понимают проведение такой реакции, когда вещество-модификатор реагирует с поверхностью наночастицы металла и, таким образом, прививается к поверхности частицы, обеспечивая экранирование поверхности и возможность проведения дальнейших реакций с другими функциональными группами молекулы вещества-модификатора. В качестве веществ-модификаторов предпочтительно используют вещества, содержащие как меркапто-группы (SH), так и карбоксильные группы (СООН). Поверхностная модификация наночастиц необходима для повышения стабильности их суспензий, а также для прививки на поверхность наночастиц желаемых веществ - красителей, антибиотиков, антител.
Известно устройство для исследования электрофоретического разделения наночастиц, содержащее колонку, заполняемую гелем, концы которой погружены в емкости с буферными растворами, с размещенными в них электродами, подключенными к источнику питания. Наночастицы, подаваемые с одного из концов колонки, за счет электрофореза проходят, разделяясь, через колонку и оказываются в буферном растворе (CN 102553438, 2012 г.). Определяя время прохождения частиц через колонку заданной длины, определяют электрофоретическую подвижность наночастиц.
Недостатком данного устройства является отсутствие возможности одновременного исследования большого количества образцов за счет использования одномерного массива образцов.
Из известных устройств наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является устройство для исследования электрофоретической подвижности наночастиц в зависимости от их формы и размеров, представляющее собой горизонтальную электрофоретическую ячейку, в которую загружается гель, на поверхности которого формируют лунки в виде одномерного массива, т.е. в один ряд. Пропускание электрического тока через гель осуществляется с помощью двух электродов, расположенных на противоположных концах ячейки [Hanauer, M.; Pierrat, S.; Zins, I.; Lots, Α.; Sonnichsen, C. Separation of Nanoparticles by Gel Electrophoresis According to Size and Shape. Nano Lett. 2007, 7, 2881-2885.]
Недостатком известного устройства также является отсутствие возможности одновременного анализа большого количества образцов наночастиц с разными свойствами, что приводит к необходимости проведения большой серии исследований и, соответственно, сказывается как на продолжительности времени анализа, так и на достоверности интерпретации результатов проведенных исследований, что обусловлено колебаниями внешних воздействий в серии экспериментов.
Кроме того, варьирование в процессе исследования свойств наночастиц по форме и размерам при одних и тех же условиях поверхностной модификации приводит к невозможности оптимизации модификации наночастиц в ходе одного эксперимента.
Задачей описываемой полезной модели является создание устройства, обеспечивающего ускорение оптимизации условий модификации наночастиц за счет одновременного определения в процессе одного эксперимента значений электрофоретической подвижности большого числа наночастиц, соответствующих различным условиям поверхностной модификации наночастиц.
Поставленная задача достигается тем, что устройство для исследования электрофоретической подвижности наночастиц содержит электрофоретическую ячейку, выполненную в виде прямоугольной горизонтальной ванны, на противоположных периферийных концах которой расположены электроды, подключенные к источнику постоянного тока, а ее центральная часть заполнена гелем, на поверхности которого сформированы лунки в виде двумерной матрицы, одна из которых заполнена контрольным образцом раствора для определения величины эндоэлектроосмотического потока, а другие - маркированными пробами суспензии наночастиц, модифицированных в различных условиях, причем в лунках по строках и столбцам двумерной матрицы расположены пробы, в которых варьируют, по меньшей мере, два условия проведения модификации поверхности наночастиц, при этом над ванной установлен оптический блок регистрации карты траекторий перемещения наночастиц в процессе электрофореза, подключенный к блоку аналитической обработки изображений, а пространство между электродами и гелем заполнено буферным раствором.
Достигаемый технический результат заключается в повышении достоверности исследования за счет многопараметрической оптимизации условий модификации поверхностей наночастиц и исключения погрешности, обусловленной различиями в свойствах гелей, используемых для исследования, и колебаниями внешних параметров, таких как колебания напряжения, температуры окружающей среды и др., при одновременном сокращении времени исследования.
Сущность полезной модели поясняется чертежом, на котором приведена принципиальная схема предлагаемого устройства.
Устройство содержит электрофоретическую ячейку, выполненную в виде прямоугольной горизонтальной ванны 1, на противоположных периферийных концах которой расположены электроды 2, подключенные к источнику постоянного тока 3. Центральная часть ванны 1 заполнена гелем 4, на поверхности которого сформированы лунки 5 в виде двумерной матрицы, расстояние между которыми составляет не менее 5 мм. Пространство между электродами 2 и гелем 4 заполнено буферным раствором 6, т.е. сами электроды 2 погружены в буферный раствор 6, через который осуществляется их контакт с гелем 4, обеспечивая замыкание электрической цепи.
Над ванной 1 установлен оптический блок регистрации карты траекторий перемещения наночастиц 7 в процессе электрофореза, подключенный к блоку аналитической обработки изображений 8.
Одна из лунок 5, выбранная в произвольном порядке, заполнена контрольным образцом раствора для определения величины эндоэлектроосмотического потока, а другие заполнены маркированными пробами суспензии наночастиц, модифицированных в различных условиях.
Устройство работает следующим образом.
12
В ванне 1 готовится гель 4 с нанесением лунок 5. В лунки 5 загружаются пробы, представляющие собой раствор наночастиц в буферном растворе, а также контрольный образец для определения величины эндоэлектроосмотического потока, представляющий собой, например, раствор витамина B. После завершения загрузки пространство ванны около электродов 2 заполняется буферным раствором 6, а электроды 2 подключаются к источнику постоянного тока 3. Далее, под действием электрического поля начинается электрофорез наночастиц в геле 4. Загруженные в лунки образцы наночастиц, обладающие определенным поверхностным зарядом, под действием электрического поля начинают двигаться к противоположно заряженному электроду.
При помощи блока регистрации карты траекторий перемещения наночастиц 7 ведется съемка поверхности геля для фиксации окрашенного следа раствора наночастиц для дальнейшего определения пробега частиц в единицу времени с помощью блока обработки изображений 8. Определяя параллельно подвижность набора растворов наночастиц, приготовленных при разных условиях (pH, концентрация модифицирующего агента и др.) можно определить оптимальные условия для модификации их поверхности.
В качестве геля могут быть использованы агарозные и полиакриламидные гели, а также ряд других гелей (крахмальные, декстрановые и др.) при необходимости.
-6
-3
Устройство может быть использовано для исследования модификации наночастиц путем определения электрофоретической подвижности в зависимости от условий, выбранных из ряда: концентрация модификатора (например, от 10 моль/л до 10 моль/л), pH среды при проведении модификации (например, от 3,0 до 11,0), молекулярная масса модификатора (например, HS-ПЭГ-COOH с молекулярной массой от 900 Да до 5000 Да), константа диссоциации модификатора (например, меркаптоуксусная кислота, меркаптопропионовая кислота, меркаптоундекановая кислота, меркаптобензойная кислота). Также можно варьировать и другие условия проведения модификации. Так как в ходе проведения электрофореза определяется электрофоретическая подвижность наночастиц, которая при прочих равных условиях (режим проведения электрофореза, концентрация геля, концентрация рабочего буферного раствора) целиком определяется эффективностью проведения модификации, становится возможным исследование влияния любых условий проведения модификации. В течение одного эксперимента может быть проведено исследование влияния сразу нескольких условий проведения модификации. В разных строках массива лунок в ячейке располагают пробы, для которых варьировалось первое условие проведения модификации и фиксировалось второе условие проведения модификации, а в разных столбцах массива лунок в ячейке располагают пробы, для которых варьировалось второе условие проведения модификации и фиксировалось первое проведения модификации. При этом число строк определяет число степеней варьирования первого условия проведения модификации, а число столбцов определяет число степеней варьирования второго условия проведения модификации. Таким образом, в течение одного эксперимента одновременно исследуется влияние двух условий проведения модификации.
Следует отметить, что в течение одного эксперимента возможно исследовать влияние более двух условий проведения модификации наночастиц. При этом делят массив лунок в геле на группы из заранее заданного числа лунок, располагающиеся по строкам и столбцам двумерного массива лунок в ячейке. При этом в разных строках массива групп лунок в ячейке располагают пробы, для которых варьировалось первое условие проведения модификации и фиксировалось второе условие проведения модификации, а в разных столбцах массива групп лунок в ячейке располагают пробы, для которых варьировалось второе условие проведения модификации и фиксировалось первое проведения модификации. Для лунок в пределах каждой группы варьируют третье условие модификации. При этом число строк определяет число степеней варьирования первого условия проведения модификации, число столбцов определяет число степеней варьирования второго условия проведения модификации, а число лунок в группе определяет число степеней варьирования третьего условия проведения модификации.
Работа устройства иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его применение.
Пример 1
Наностержни золота были приготовлены по методике, описанной в [Sau, T.K.; Murphy, C.J. Seeded high yield synthesis of short Au nanorods in aqueous solution. Langmuir 2004, 20, 6414-6420].
Поверхностную модификацию наночастиц осуществляли бифункциональным полиэтиленгликолем с карбокси- и меркаптогруппами различной длины полимерной цепи (ММ 900 Да, 3000 Да, 5000 Да). Для этого удаляли избыток бромида цетилтриметиламмония трехкратным повторением цикла осаждения наночастиц при центрифугировании (ускорение 10000 g) и растворения в воде (вода I типа, полученная на установке Millipore). После этого добавляли равный объем раствора бифункционального полиэтиленгликоля с определенной концентрацией, тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 2 часа.
-6
-3
Концентрацию реагентов варьировали от 10 M до 10 М. По истечении 2 ч удаляли избыток реагента центрифугированием, растворяли в трис-боратном буферном растворе (5 М, pH=8,8), снова центрифугировали смесь и удаляли надосадочный раствор. Полученную пеллету модифицированных наночастиц загружали в лунки геля в ячейку для горизонтального гель-электрофореза.
Гель готовили следующим образом. В стеклянный стакан емкостью 250 мл помещали 8,0 мл 0,125 М трис-боратного буферного раствора, 242 мл дистиллированной воды, 2,0 г агарозы. Смесь нагревали при перемешивании на плитке и кипятили раствор, накрыв стакан часовым стеклом, до полного растворения агарозы (приблизительно 20 мин). Таким образом получали гель с концентрацией агарозы 0,8%. Заливали гель в ячейку и накрывали гребенкой с регулярно расположенными остроконечными зубьями для формирования лунок для образцов. Количество лунок соответствует количеству загружаемых образцов и в данном эксперименте равнялось 27.
В качестве электролита использовали 5 мМ трис-боратный буферный раствор. Электрофорез проводили при напряженности поля 5 В/см в течение 30 мин.
Эффективность поверхностной модификации оценивали по длине пробега наночастиц, а также по однородности их движения под действием электрического поля. При эффективной модификации наночастицы движутся в геле единой зоной, не изменяя границ и формы зоны, тогда как при неоднородной модификации наблюдается значительное различие в электрофоретической подвижности, приводящее к размыванию зоны движения наночастиц.
По результатам электрофореза различных образцов наночастиц было установлено, что максимальная подвижность и наибольшая эффективность поверхностной модификации наблюдается для образцов наночастиц, функционализированных карбокси-тиол-полиэтиленгликолем с молекулярной массой 3000 Да в концентрации 1,0 мМ.
Пример 2
Наностержни золота были приготовлены по методике, описанной в [Sau, T.K.; Murphy, C.J. Seeded high yield synthesis of short Au nanorods in aqueous solution. Langmuir 2004, 20, 6414-6420].
-6
-2
Поверхностную модификацию наночастиц осуществляли бифункциональным полиэтиленгликолем с карбокси- и меркаптогруппами различной длины полимерной цепи (ММ 3000 Да). Для этого удаляли избыток бромида цетилтриметиламмония трехкратным повторением цикла осаждения наночастиц при центрифугировании (ускорение 10000 g) и растворения в воде (вода I типа, полученная на установке Millipore). После этого добавляли равный объем раствора бифункционального полиэтиленгликоля с определенной концентрацией, растворенного в универсальной буферной смеси, тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 2 часа. Концентрацию реагентов варьировали от 10 M до 10 М. Для каждой концентрации реагента использовали буферные растворы с различным pH, варьирующимся в диапазоне от 4 до 11.
По истечении 2 ч удаляли избыток реагента центрифугированием, растворяли в трис-боратном буферном растворе (5 М, pH=8,8), снова центрифугировали смесь и удаляли надосадочный раствор. Полученную пеллету модифицированных наночастиц загружали в лунки геля в ячейку для горизонтального гель-электрофореза.
Гель готовили следующим образом. В стеклянный стакан емкостью 250 мл помещали 8,0 мл 0,125 М трис-боратного буферного раствора, 242 мл дистиллированной воды, 3,75 г агарозы. Смесь нагревали при перемешивании на плитке и кипятили раствор, накрыв стакан часовым стеклом, до полного растворения агарозы (приблизительно 20 мин). Таким образом получали гель с концентрацией агарозы 1,5%. Заливали гель в ячейку и накрывали гребенкой с регулярно расположенными остроконечными зубьями для формирования лунок для образцов. Количество лунок составило 96 шт.
В качестве электролита использовали 5 мМ трис-боратный буферный раствор. Электрофорез проводили при напряженности поля 10 В/см в течение 15 мин.
Эффективность поверхностной модификации оценивали по длине пробега наночастиц, а также по однородности их движения под действием электрического поля. При эффективной модификации наночастицы движутся в геле единой зоной, не изменяя границ и формы зоны, тогда как при неоднородной модификации наблюдается значительное различие в электрофоретической подвижности, приводящее к размыванию зоны движения наночастиц.
По результатам электрофореза различных образцов наночастиц было установлено, что максимальная подвижность и наибольшая эффективность поверхностной модификации наблюдается для образцов наночастиц, функционализированных карбокси-тиол-полиэтиленгликолем в концентрации 1,0 мМ при pH 8,5.
Таким образом, предлагаемое устройство может быть использовано для определения полноты и однородности протекания реакции модификации поверхности металлических наночастиц, экспрессного поиска оптимальных условий реакции поверхностной модификации путем сравнения электрокинетических свойств большого числа образцов.