Способ оценки биологической активности тетрадекапептида
METHOD FOR EVALUATING THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF A TETRADECAPEPTIDE

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа оценки биологической (ранозаживляющей) активности тетрадекапептида, состоящего из 14 аминокислотных остатков, общей формулы TEKKRRETVEREKE (ТДП). ТДП оказывает заживляющее действие и может применяться в составе лекарственных препаратов для лечения язв и ран.
Впервые предложен способ оценки биологической (ранозаживляющей) активности ТДП, основанный на регистрации активации фибробластов, ключевых участников заживления, по изменению степени фосфорилирования внутриклеточной киназы (ERK1/2).
Способ может быть внедрен в условиях отдела контроля качества лекарственных препаратов на фармакологическом производстве.
Тетрадекапептид оказывает заживляющее действие и может применяться в составе лекарственных препаратов для лечения язв и ран. При фармацевтическом производстве препарата необходим тщательный контроль биологической активности.
Известен способ тестирования ранозаживляющей активности препаратов на крысах [Аль Зубейди А.Ф., Малинкина О.Н., Зудина И.В., Ковалева Я.О., Ксенофонтова О.Ю., Островский Н.В. ОЦЕНКА РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ L- И D-ИЗОФОРМ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИХ СОЛЕЙ С ХИТОЗАНОМ НА МОДЕЛИ ОЖОГОВОЙ РАНЫ У КРЫС // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - №6.; URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25942].
Недостатками подобных методов является использование лабораторных животных, имеющих большие биологические разбросы, кроме того, современные тенденции призывают минимизировать негуманное использование лабораторных животных [Каркищенко Н.Н., Грачев С.В. (ред.) Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях М.: Профиль, 2010. - 358 с, Festing M.F.W. Redacing the use of laboratory animals by better experimental desing. // Baltic. J. Lab. Anim. Sci, 2002, 12, 1, p. 7-16].
Известно, что основным типом клеток в процессах заживления являются фибробласты, которые под действием естественного сигнала цитокина TGF-в1 (TGF-в1 - трансформирующий ростовой фактор, бета-1) направленно мигрируют в очаг воспаления или повреждения, активно пролиферируют и реорганизуют внеклеточный матрикс [Clark R.A.F., Wound repair: overview and general considerations, In: The molecular and cellular biology of wound repair, Clark, Ed. New York: Plenum Press; 1996: 3-50., Martin P. Wound healing - aiming for perfect skin regeneration. Science 1997; 276:75-81]. При этом фибробласты дифференцируются в миофибробласты, особый тип клеток, характеризующийся усиленным синтезом полимеров внеклеточного матрикса - коллагена и фибронектина, а также особым типом микрофиламент, содержащих α-SМА-актин (α-SMA- актин гладких мышц, альфа) [Hinz В., Celetta G., Tomasek J.J., Gabbiani G., Chaponnier С. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Mol Biol Cell 2001; 12: 2730-2741, Gabbiani G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive disease. J. Pathol. 2003; 200: 500-503.]. Таким образом, процессы активации и дифференцировки фибробластов могут служить индикатором интенсивности процессов заживления.
Естественный индуктор заживления TGF-в1 включает процесс дифференцировки фибробластов в миофибробласты, сопровождающийся транскрипцией генов, кодирующих синтез α-SMA и коллагена [Tomasek J.T., Gabbiani G., Hinz В., Chaponnier С., Brown R.A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3: 349-63]. Активный TGF-в связывается с димерами рецептора TGF-вRII, что приводит к фосфорилированию транскрипционных факторов SMAD2 и/или SMAD3 [Moustakas A., Souchelnytskyi S., Heldin С.Н. Smad regulation in TGF-beta signal transduction, J. Cell. Sci. 2001; 114: 4359-4369], a также может активировать МАРK (МАРK - митоген-активируемая протеинкиназа) сигнальный путь через Raf/MEK/ERK каскад.
Сигнальный путь Raf/MEK/ERK регулирует такие важные клеточные события, как пролиферация, дифференциация, апоптоз, миграция [Lovric J., Dammeier S., Kieser A., Mischak H. and Kolch W. Activated Raf Induces the Hyperphosporylation of Stathmin and the Reorganization of Microtubule Network. J. Biol. Chem., 1998; 273(35): 22848-55]. Известно, что интенсивность и длительность активации ERK сигналов влияет на реализацию ответов в фибробластах [Wellbrock С., Karasarides М. and Marais R. The Raf proteins take centre stage. Nature Review Molecular Cell Biology 2004; 5: 875-886]. Длительная активация ERK необходима для активации пролиферации [Weber J.D., Raben D.M., Phillips P.J. and Baldassare J.J. Sustained activation of extracellular-signal-regulated kinase 1 (ERK1) is required for the continued expression of cyclin D1 in G1 phase. Biochemistry 1997, 326, 61-68]. Важной функцией фибробластов, находящейся под контролем ERK, является клеточная миграция. ERK регулирует движение клеток путем фосфорилировая киназы легкой цепи миозина (myosin light chain kinase, MLCK), калпаина или FAK (FAK - киназа фокальных контактов) [Huang С., Jacobson К., Schaller M.D. MAP kinases and cell migration. Journal of Cell Science 2004, 117: 4619-4628].
В процессах клеточной дифференцировки фибробластов ERK является важным регуляторным звеном. Так, было показано, что киназы ERK, в особенности ERK2 опосредуют фосфорилирование Smad2 и усиливают транскрипцию гена коллагена [Wang J., Zohar R., McCulloch C.A. Multiple roles of alpha-smooth muscle actin in mechanotransduction. Exp Cell Res. 2006; 312(3): 205-14]. Использование ингибитора киназ ERK в моделях in vitro и in vivo показало снижение пролиферации, синтеза коллагена и α-SMA [Gao Y., Wang Y., Li Y., Xia X., Zhao S., Che Y., Sun Y., Lei L. TGF-в1 promotes bovine mammary fibroblast proliferation through the ERK 1/2 signalling pathway. Cell Biol Int. 2016; 40(7): 750-60].
Таким образом, активация киназы ERK может отражать заживляющую функцию фибробластов и служить индикатором для тестирования направленных на фибробластов воздействий.
Использование оценки активности внутриклеточных киназ и фосфатаз находит применение для тестирования биологической активности препаратов на целых клетках. Например, известен способ тестирования активности фосфатазы на целых клетках [US 5958719, METHOD FOR THE DETERMINATION OF THE ACTIVITY OF SPECIFIC PHOSPHOTYROSINE PHOSPHATASES AND SPECIFIC EFFECTORS THEREOF IN INTACT CELLS]. Однако данный метод тестирования отражает фосфатазную активность, а не киназную активность и не применим в для тестирования ТДК на фибробластах.
К настоящему времени не существует способов оценки ранозаживляющей активности ТДК на фибробластах, тем более экспресс-тестов по оценки активности внутриклеточных киназ.
Технической задачей настоящего изобретения является создание способа оценки биологической активности ТДП, отвечающего следующим условиям:
- способ должен быть пригодным для внедрения в условиях отдела контроля качества лекарственных препаратов на фармакологическом производстве,
- использовать современные клеточные технологии (без использования лабораторных животных),
- выполняться за короткое время (экспресс-тест).
Поставленная техническая задача достигается предложенным способом оценки биологической (ранозаживляющей) активности тетрадекапептида, состоящего из 14 аминокислотных остатков, общей формулы TEKKRRETVEREKE (ТДП), заключающимся в том, что тестируемый пептид общей формулы TEKKRRETVEREKE прибавляют в культуру клеток фибробластов 3T3/NIH in vitro с последующим инкубированием полученной смеси в течение 5 минут и определением степени фосфорилирования полученной киназы ERK1/2 методом флуоресцентной микроскопии или методом иммуноблоттинга.
В результате проведенных исследований по действию ТДК на фибробласты неожиданно оказалось, что ранозаживляющее действие можно оценить по фосфорилированию ERK1/2 через 5-15 минут после воздействия препарата.
Технический результат - впервые предложен способ оценки биологической (ранозаживляющей) активности тетрадекапептида, который показывает, что степень фосфорилирования ERK1/2 под действием ТДП, определенная методом иммуноблоттинга, увеличивается в 1,3-2,4 раза, а определенная методом флуоресцентной микроскопии - на 15-25%.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем. Описание рисунков.
а
Рис. 1 - Анализ концентрации фосфорилированной формы киназ ERK1 и ERK2 в течение времени после воздействия на клетки 3T3/NIH тетрадекапептидом (ТДП, 10 мкг/мл) или цитокином TGF-в1 (5 нг/мл). Денситограмма Вестерн-блота экстрактов контрольных и активированных образцов (); Количественный анализ нормированного на GAPDH содержания белков pERK1 (б) и pERK2 (в) в определенных временных точках (N=3, p<0,05);
а
Рис. 2 - () Микрофотографии эпифлюоресценции клеток 3T3/NIH, окрашенных флюоресцентными антителами к фосфорилированной форме киназ ERK1 и ERK2. Через 5 мин после воздействия на клетки тетрадекапептидом (ТДП) или цитокином TGF-в1 клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали. Контроль - клетки без активации. (b) Количественный анализ эпифлюоресценции pERK1/2 (n=3, p<0,05).
Контроль - инкубация в среде
ТДП - тестируемый препрарат тетрадекапептид
TGF-в1 - положительный контроль.
Пример 1.
Фибробласты линии 3T3/NIH поддерживали в культуре клеток in vitro в соответствии с рекомендацией фирмы производителя [https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CRL-1658.aspx?geo_country=ro#documentation].
2
Для анализа динамики экспрессии фосфорилированной и общей формы белков ERK1/2 в культуре фибробластов NIH/3T3 клетки были посажены в плотности 50,000/см в среде DMEM (DMEM - питательная среда Игла в модификации Дельбекко) с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% ФБС (фетальная бычья сыворотка) в 6-луночный плейт (LUX tissue culture), обработанный коллагеном. Через 18 часов после адгезии клеток среду убирали, клетки промывали теплым буфером PBS/BSA, и проводили старвинг 24 часа в среде DMEM с 2% ФБС. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с ТДП (10 мкг/мл, ООО Иммафарма, Россия) или TGF-в1 (5нг/мл, Sigma, Т7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. После инкубации в течение 5, 30 и 60 минут, культуральную среду удаляют, 3 раза промывают клетки на льду холодным раствором DPBS, убирают остатки буфера и лизируют клетки в 100 мкл буфера (Invitrogen, Cell Extraction Buffer, FNN0011, США) в присутствии ингибиторов протеаз (Sigma, P2714-1BTL) 30 мин при 4°C. Клеточные экстракты осаждали на центрифуге (Eppendorf 5424R, Германия, 14000 rpm, 10 мин, 4°C), отбирали супернатанты и измеряли в них концентрацию белка с использованием коммерческого набора (Pierce, Protein Assay Reagent, 23225). Полученную смесь клеточных белков (10-50 мкг) разделяли в 8% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (Amersham Hybond-P). Для детекции целевых белков мембрану последовательно в течение 18 ч инкубировали с первичными антителами к pErk1/2 (Т202/204) (CST, Cat 4370, США), в разведении 1:1000 и GAPDH (Abeam, ab8245, США) в разведении 1:2000, а затем со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:1000000 (Sigma, A0545-1ML, США). Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминесценции (Pierce, SuperSignal West Femto Maximum sensitivity, 34095, США). Анализ интенсивности белковых полос проводили с помощью программы ImageJ 1.48v. Для этого в полученных изображениях в формате tiff, разрешением 8-bit выделяли анализируемые белковые полосы, затем, используя макро Analase Gels, получали пики интенсивности для каждой белковой полосы и вычисляли площади пиков. Полученные значения для целевого белка приводили в отношении к значениям нормировочного белка GAPDH. Для каждого экспериментального варианта исследовали 2 идентичные лунки, всего проведено три независимых эксперимента.
Исследование кинетики фосфорилирования киназ ERK1 и ERK2 в Вестерн-блоте показало, что как при действии ТДП, как и при воздействии TGF-в1 , происходит фосфорилирование обеих киназ, причем для обоих активаторов это очень быстрые процессы. Максимальное значение фосфорилирования обеих киназ при активации фибробластов тетрадекапептидом или цитокином TGF-в1 наблюдалось в первые пять минут после внесения активаторов в культуру клеток. Содержание фосфорилированной формы ERK1 повысилось под влиянием тетрадекапептида в 2,1±0,3 раза, a TGF-в1 - в 2,2±0,1 раза. Содержание фосфорилированной формы ERK2 возрастало при действии тетрадекапептида и TGF-в1 в 1,6±0,3 и 1,8±0,4 раза, соответственно. В течение последующего 1 часа содержание фосфорилированных ERK-киназ снижалось до фоновых значений в неактивированных клетках (Рис. 1).
Пример 2.
Фибробласты линии 3T3/NIH поддерживали в культуре клеток in vitro в соответствии с рекомендацией фирмы производителя [https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CRL-1658.aspx?geo_country=ro#documentation].
2
2
Для визуализации фосфорилированной формы киназ ERK1/2 клетки NIH/3T3 были посажены на слайд-камеры со стеклянной поверхностью (SPL Life Sciences Co., Корея), обработанной коллагеном 1 типа (rat tail collagen, Sigma, C3867, США) (10 мкг/см), в плотности 50000 клеток/см в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% ФБС. Через 18 часов, после адгезии клеток среду убирали, клетки промывали теплым буфером PBS/BSA, и проводили старвинг 24 часа в среде DMEM с 2% ФБС. После старвинга, среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами ТДП (10 мкг/мл) или TGF-в1 (5нг/мл), в контрольные лунки активатор не добавляли. Клетки инкубировали в течение 5 минут. По завершению инкубации клетки промывали теплым PBS, фиксировали 4% параформальдегидом (37°C, 20 мин), промывали PBS двукратно 500 мкл, премеабилизировали ледяным 96% метанолом на льду 20 минут, после чего клетки промывали PBS двукратно 500 мкл и инкубировали 1 час в PBS, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Фиксированные и премеабилизированные клетки инкубировали 18 часов при +4°C с моноклональными антителами anti-phospho-p44/42 МАРК (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) ХР (CST, Cat. 4695 или 4370, США) в буфере для забивки (разведение антител 1:200). Затем клетки отмывали трижды по 5 минут на шейкере в 500 мкл PBS/BSA, после чего окрашивали вторичными антителами goat anti-rabbit IgG (H+L), конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 в разведении 1:300 (Life technologies, А11034, США). Инкубировали 1 час при комнатной температуре и двукратно промывали 500 мкл PBS/BSA. К полученным образцам добавляли протектор окрашивания Prolong Gold Anti-Fade Reagent (CST, Cat. 8961, США), содержащий краситель DAPI для окрашивания ядер, закрывали препарат покровным стеклом и проводили визуализацию клеток на конфокальном микроскопе Carl Zeiss AxioObserver Z.1. для исследования распределения общей формы киназ ERK1/2 либо на микроскопе Olypus IX71S8F-3 (Olympus, Япония) для получения эпифлюоресцентного изображения клеток.
В каждом клеточном препарате на стекле для микроскопии, подготовленном по описанной выше методике, проводили съемку 10-15 полей при увеличении 20х. Изображения сохранялись в формате tiff и использовали для анализа в программе ImageJ 1.48v. Для анализа фосфорилирования киназ ERK1/2 проводили измерение среднего значения флюоресценции. Для этого предварительно вычитали фоновое значение флюоресценции для каждого изображения с помощью макро ImageJ-macro «Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool» используя параметры настройки: radius=1; offset=l; iterations=l, затем автоматически вычисляли среднее значение интенсивности для всего изображения. В трех независимых экспериментах в каждом поле съемки просчитывали 35-50 клеток. В каждом эксперименте значение флюоресценции опытных образцов, активированных ТДП, нормировали на значение флюоресценции контрольных неактивированных образцов. Методом оценки среднего значения эпифлюоресценции мы проанализировали изображения контрольных и активированных клеток, окрашенных моноклональными антителами к фосфорилированным ERK1/2, при 5 минутах экспозиции с активаторами. При действии тетрадекапептида среднее значение флюоресценции повышалось в 1,2±0,05 раза, а при действии TGF-в1 в 1,5±0,1 раза (Рис. 2). Микроскопия позволяет суммарно оценивать фосфорилирование обеих киназ.
Предложенный способ показывает, что степень фосфорилирования ERK1/2 под действием ТДП, определенная методом иммуноблотинга, увеличивается в 1,3-2,4 раза, а определенная методом флуоресцентной микроскопии - на 15-25%. Предлагаемое изобретение можно использовать в промышленном масштабе в условиях отдела контроля качества лекарственных препаратов на фармакологическом производстве, так как все операции способа адаптированы к условиям фармакологического производства.