БИОРЕАКТОР ДЛЯ ТРАНСКРИПЦИИ РНК IN VITRO
IN VITRO RNA TRANSCRIPTION BIOREACTOR

Область изобретения
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro,
in vitro
in vitro
in vitro
Настоящее изобретение относится к биореактору для транскрипции РНК , к способу транскрипции РНК , к модулю для транскрипции ДНК в РНК и к автоматизированному устройству для производства РНК. Кроме того, применение биореактора для транскрипции РНК , как описано в настоящем описании, является частью настоящего изобретения. Настоящее изобретение относится к реактору для транскрипции РНК  предназначенному для работы автоматизированным образом в условиях, соответствующих принципам GMP. В частности, указанный реактор для транскрипции РНК  позволяет многократное применение ДНК-матрицы для различных реакций транскрипции РНК . Кроме того, изобретение относится к устройству для производства РНК, содержащему (a) модуль для синтеза ДНК-матрицы, (b) модуль для транскрипции ДНК в РНК, содержащий указанный реактор для транскрипции РНК  и необязательно (c) модуль для составления РНК.
Уровень техники, к которому относится изобретение
Терапевтические нуклеиновые кислоты, включающие молекулы РНК, являются развивающимся классом лекарственных средств. Терапевтические средства на основе РНК включают молекулы мРНК, кодирующие антигены для применения в качестве вакцин (Fotin-Mleczek et al. 2012. J. Gene Med. 14(6):428-439). Кроме того, предусматривается применение молекул РНК для заместительной терапии, например, предоставления недостающих белков, таких как факторы роста или ферменты, пациентам (Karikó et al., 2012. Mol. Ther. 20(5):948-953; Kormann et al., 2012. Nat. Biotechnol. 29(2):154-157). Более того, предусматривается терапевтическое применение некодирующих иммуностимулирующих молекул РНК (например, WO2009/095226A2) и других некодирующих РНК, таких как микроРНК и длинные некодирующие РНК (Esteller, 2011. Nat. Rev. Genet. 12(12):861-74) или РНК, пригодные для редактирования генома (например, гидовые РНК для CRISPR/Cas9). Таким образом, терапевтические средства на основе РНК для применения в иммунотерапии, генной терапии и вакцинации, считаются наиболее перспективными и быстро развивающимися терапевтическими областями в современной медицине.
В настоящее время разработанные процессы производства молекул РНК, одобренные регулирующими органами, предполагают множество отдельных стадий производства. В частности, соответствующие стадии производства проводят с использованием нескольких различных устройств. Кроме того, осуществляют различные отдельные контроли качества на уровне ДНК и уровне РНК, как подробно описано в WO2016/180430A1.
in vitro,
Ключевой стадией продуцирования РНК является получение подходящей ДНК-матрицы, которая в промышленном масштабе является основным фактором стоимости. В настоящее время ДНК-матрицы можно использовать только для единичной реакции транскрипции РНК  а затем они должны быть разрушены расщеплением ДНК-азой и в итоге удалены посредством очистки РНК для обеспечения эффективности и безопасности терапевтических средств на основе РНК.
Производство РНК требует большой степени ручного управления в контролируемой GMP лаборатории, осуществляемого хорошо обученным техническим персоналом. Следовательно, разработанные в настоящее время процессы производства являются времязатратными, дорогостоящими и требуют большого пространства в лаборатории и лабораторного оборудования.
Сущность изобретения
in vitro
in vitro
Как указано выше, существует проблема, ассоциированная с обычными устройствами и способами производства, состоящая в том, что транскрипция РНК  требует большой степени ручного управления хорошо обученным техническим персоналом. Таким образом, существует потребность в предоставлении усовершенствованного биореактора для транскрипции РНК  и автоматизированного устройства для продуцирования РНК для экономии времени, пространства, оборудования и персонала.
Преимуществом усовершенствованного биореактора может быть то, что он может позволить многократное применение ДНК-матриц в нескольких процессах продуцирования РНК, что снижает стоимость, поскольку необходимо использовать меньше исходного материала (т.п. ДНК-матрицы) и можно не использовать или по существу минимизировать использование ДНК-аз. Более того, усовершенствованный биореактор может позволить надежное продуцирование РНК с более высоким профилем чистоты (без остаточной ДНК-азы, без остаточных фрагментов ДНК в конечном РНК-продукте). Преимуществами автоматизированного устройства для продуцирования РНК является то, что весь процесс производства может более отлаженным и надежным (вследствие минимизации человеческих ошибок) и что продуцирование РНК может быть ускорено.
Кроме того, ускорение производства РНК было бы в высокой степени преимущественным и имело бы большую важность для общественного здравоохранения, особенно в контексте пандемических сценариев. Кроме того, в этом контексте было бы преимущественным продуцирование терапевтических средств на основе РНК в области вспышки, что, однако, потребовало бы портативного устройства для продуцирования РНК.
in vitro
in vitro
Описанные выше проблемы решаются объектом независимых пунктов формулы изобретения, где приведенные ниже варианты осуществления включены в зависимые пункты формулы изобретения. Следует отметить, что признаки изобретения, описанные ниже, применимы в равной степени к биореактору для транскрипции РНК , к способу транскрипции РНК , к модулю для транскрипции ДНК в РНК, к автоматизированному устройству для производства РНК, и к применениям, описанным в настоящем описании.
in vitro
В первом аспекте настоящее изобретение относится к биореактору для транскрипции РНК , включающему:
- реакционную емкость, и
- магнитный элемент, находящийся у реакционной емкости.
in vitro
in vitro
Реакционная емкость пригодна для вмещения по меньшей мере одного из магнитных частиц, ДНК-матриц, буфера для иммобилизации ДНК, магнитных частиц с ДНК и основной смеси для транскрипции РНК  (IVT). Таким образом, магнитные частицы с ДНК представляют собой ДНК-матрицы, иммобилизованные на свободно плавающие магнитные частицы. Магнитный элемент предназначен для улавливания или для обеспечения движения магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК, находящихся в реакционной емкости. Посредством такого движения может быть индуцировано смешение или перемешивание магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК. Таким образом, в зависимости от количества компонентов, находящихся в реакционной емкости, магнитный элемент может индуцировать смешение или перемешивание магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК, а также по меньшей мере одного из ДНК-матрицы, буфера для иммобилизации ДНК и основной смеси IVT. Например, с использованием ДНК-матриц и свободно плавающих магнитных частиц в качестве компонентов, содержащихся в реакционной емкости, смешение или перемешивание магнитных частиц, индуцируемое магнитным элементом, может обеспечивать смешанные магнитные частицы с ДНК, где магнитные частицы с ДНК представляют собой ДНК-матрицы, иммобилизованные на магнитные частицы. В случае, когда магнитные частицы с ДНК и основная смесь IVT смешиваются или перемешиваются вследствие движения магнитных частиц с ДНК, индуцированного магнитным элементом, полученная таким образом более однородная смесь магнитных частиц с ДНК и основной смеси IVT способствует транскрипции РНК  ДНК-матрицы в РНК.
Биореактор в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, может быть пригодным для применения в контролируемых условиях (GMP), пригодных для фармацевтических применений (например, продуцирование фармацевтической нуклеиновой кислоты). Биореактор может позволять непрерывное продуцирование или повторяющееся периодическое продуцирование жидкой композиции нуклеиновой кислоты, предпочтительно композиции рибонуклеиновой кислоты (РНК). В контексте изобретения термин "РНК" используют для указания на любой тип рибонуклеиновой кислоты. Таким образом, термин "РНК" может относиться к молекуле или типам молекул, выбранным из группы, состоящей из длинноцепочечной РНК, кодирующей РНК, некодирующей РНК, одноцепочечной РНК (оцРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), линейной РНК (lin-РНК), кольцевой РНК (circ-РНК), матричной РНК (мРНК), РНК-олигонуклеотидов, малой интерферирующей РНК (миРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), антисмысловой РНК (асРНК), гидовых РНК для CRISPR/Cas9, рибопереключателей, иммуностимулирующей РНК (исРНК), рибозимов, аптамеров, рибосомальной РНК (рРНК), транспортной РНК (тРНК), вирусной РНК (вРНК), ретровирусной РНК или репликонной РНК, малой ядерной РНК (мяРНК), малой ядрышковой РНК (мякРНК), микроРНК (мкРНК), кольцевой РНК (circ-РНК) и Piwi-взаимодействующей РНК (pi-РНК).
В одном варианте осуществления внутренняя поверхность реакционной смеси имеет элипсоидную или овальную внутреннюю геометрию.
Авторы изобретения обнаружили, что эллипсоидная форма или овальная внутренняя геометрия обеспечивает лучший результат перемешивания. Кроме того, такая форма позволяет лучшее стекание или слив жидкостей и может обеспечить лучшую очищаемость. Последняя может предупреждать образование капель, которые в ином не предпочтительном случае могут высыхать на внутренней поверхности биореактора. Это может особенно касаться, например, белковых остатков жидкости, находившейся в реакционной емкости, которые могут, например, застывать или затвердевать при температуре 37°C или выше.
В одном варианте осуществления внутренняя поверхность реакционной емкости имеет яйцеобразную внутреннюю геометрию. Такая форма яйца может обеспечить те же или лучшие преимущества, относительно тех, что описаны выше в контексте эллипсоидной формы. Форма яйца может также обеспечить оптимальное распределение давления, оптимальное поведение магнитных гранул в ходе смешения или перемешивания, удержание магнитных гранул у внутренней поверхности реакционной емкости, распределение в ходе процесса очистки. Форма яйца может быть получена, например, с помощью двух полусфероидов с одним и тем же внутренним радиусом, где один из сфероидов представляет собой полусферу с высотой, равной внутреннему радиусу, а другой сфероид имеет высоту, превышающую внутренний радиус. Альтернативно внутренняя поверхность реакционной емкости может иметь сфероидальную форму, в частности форму сферы, или внутренняя поверхность может иметь форму пилюли. Внутренняя поверхность реакционной емкости также может иметь форму, полученную путем комбинирования формы яйца и эллипса, или комбинирования формы яйца и цилиндрической формы. Посредством такого комбинирования одна часть внутренней поверхности реакционной емкости имеет, например, форму яйца, в то время как другая часть внутренней поверхности имеет, например, цилиндрическую форму.
В одном варианте осуществления внутренняя поверхность реакционной емкости может иметь внутреннюю геометрию сферической формы. Такая сферическая форма может обеспечить те же или лучшие преимущества относительно тех, что описаны выше в контексте реакционной емкости в форме яйца.
В одном варианте осуществления внутренняя поверхность реакционной смеси имеет форму без граней (например, кубоид с закругленными краями). Эта форма, аналогично, способствует оптимальному стеканию капель и, тем самым, препятствует застыванию белковых остатков жидкости, находившейся в реакционной емкости. Такая форма (без краев) позволяет эффективную процедуру очистки.
В одном варианте осуществления реакционная емкость может иметь внутреннюю поверхность без щелей или трещин. В этом контексте щель или трещина более 2 мкм, предпочтительно щель или трещина более 1 мкм, более предпочтительно щель или трещина более 0,8 мкм все еще считается "широкой" щелью или трещиной. Такая форма (без широких щелей) позволяет эффективную процедуру очистки, поскольку более крупные щели могут обеспечить нишу для микробной контаминации и биопленок или остатков.
in vitro
В одном варианте осуществления движение магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК организовано так, что предотвращается оседание частиц, находящихся в реакционной емкости. Дополнительно или альтернативно, движение магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК организовано для поддержания частиц, находящихся в реакционной емкости, свободно плавающими таким образом, чтобы предотвращалось оседание на дно реакционной емкости. Кроме того, процесс смешения или вращения улучшается посредством поддержания частиц в емкости свободно плавающими и/или предотвращением или снижением слияния гранул. Преимущественно, поддержание магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК свободно плавающими и/или предотвращение оседания магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК улучшает биохимические реакции в биореакторе, а именно, иммобилизацию ДНК и транскрипцию РНК .
В одном варианте осуществления магнитный элемент биореактора предоставляется посредством матрицы электромагнитов. Последняя может находиться на или вблизи наружной поверхности реакционной емкости. Индивидуальные электромагнитные матрицы могут по отдельности включаться или выключаться. Таким образом, смешение или вращение магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК, находящихся в реакционной емкости, может улучшаться или лучше контролироваться. Предпочтительно такая матрица электромагнитов не является подвижной, и сам по себе биореактор не является подвижным (без качания и т.д.) и смешение или вращение обеспечивается путем взаимодействия магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента.
Альтернативно, в другом варианте осуществления магнитный элемент может представлять собой постоянный магнит или электромагнит, который может двигаться в продольном направлении вдоль продольной оси реакционной емкости. Дополнительно или вместо такого продольного движения, постоянный магнит или электромагнит может двигаться в поперечном направлении, к и от реакционной емкости. Аналогично случаю матрицы электромагнитов, продольно и/или поперечно двигающийся постоянный или электромагнит может позволить лучший контроль смешения/вращения, и лучший результат перемешивания.
Альтернативно, в другом варианте осуществления магнитный элемент может быть предоставлен посредством электромагнита и предпочтительно посредством по меньшей мере одной катушки индуктивности. В этом случае магнитный элемент способен двигаться в продольном направлении вдоль продольной оси реакционной емкости. Кроме того, магнитный элемент способен вращаться вокруг вертикальной оси реакционной емкости.
В подходящем случае магнитный элемент может быть организован в форме по меньшей мере одной катушки Гельмгольца.
Положение магнитного элемента вблизи реакционной емкости относится к расстоянию между магнитным элементом и реакционной емкостью, которое все еще обеспечивает установление подходящего магнитного поля внутри реакционной емкости, когда магнитный элемент включен. Таким образом, сила и форма магнитного поля должны быть такими, чтобы могло индуцироваться вращение/смешение магнитных частиц и/или магнитные частицы могли улавливаться на внутренних поверхностях реакционной емкости.
В одном варианте осуществления магнитный элемент организован так, чтобы вращаться вокруг продольной оси реакционной емкости, где направление вращения магнитного элемента переключается в ходе перемешивания. Магнитный элемент может обеспечивать движение магнитных частиц в радиальном направлении реакционной емкости путем индукции магнитных частиц в радиальном направлении относительно продольной оси реакционной емкости. Магнитная сила может быть статической или динамически генерируемой путем вращения магнитного элемента вокруг реакционной емкости для возникновения вращения, таким образом перемешивая магнитные частицы. Направление вращения магнитного элемента может быть по часовой стрелке или против часовой стрелки относительно продольной оси реакционной емкости и/или оно может поочередно меняться. Таким образом, магнитные частицы могут оставаться свободно плавающими бесконтактным образом, таким образом, смешение компонентов может улучшаться. Как только вращение магнитного элемента прекращается, магнитные частицы (например, магнитные частицы с ДНК) улавливаются на внутренней поверхности реакционной емкости и более не вращаются. Таким образом, магнитный элемент организован так, чтобы (i) вращаться вокруг продольной оси реакционной емкости для обеспечения движения магнитных частиц, как пояснено выше, и организован так, чтобы (ii) улавливать магнитные частицы при остановке вращения.
В одном варианте осуществления магнитный элемент содержит магнитное кольцо, где магнитное кольцо сконструировано так, чтобы оно окружало реакционную емкость. Для облегчения сборки и вращения магнитного элемента вокруг реакционной емкости, магнитный элемент может иметь форму кольца. Иными словами, реакционная емкость может находиться в центре кольцеобразного магнитного элемента, так чтобы магнитный элемент окружал реакционную емкость.
В одном варианте осуществления магнитное кольцо содержит по меньшей мере первый стержень и второй стержень, исходящие из внутреннего периметра магнитного кольца в центр магнитного кольца, так чтобы свободные концы первого и второго стержней были обращены друг к другу. В одном варианте осуществления свободный конец первого стержня содержит магнит с N-полюсом, и свободный конец второго стержня содержит магнит с S-полюсом.
Дискообразный или кольцеобразный магнитный элемент может содержать магнит, находящийся вдоль окружности магнитного кольца. Магнит может находиться непосредственно у магнитного кольца или в контакте с магнитным кольцом, или он может отступать от магнитного кольца ближе к реакционной емкости, находящейся в центре магнитного кольца, для уменьшения зазора между магнитом и реакционной емкостью. Для удержания магнита на расстоянии от кольца можно использовать держатель магнита, соединенный с внутренней поверхностью и выступающий в центр кольца. Держатель магнита может быть сконструирован в качестве удерживающего стержня, так что один конец удерживающего стержня соединен с внутренней окружностью магнитного кольца, а другой конец удерживающего стержня держит магнит. Магнитное кольцо и удерживающие стержни могут быть изготовлены по отдельности и соединены друг с другом или они могут быть произведены в качестве одного элемента, например, посредством литья.
Для эффективной индукции движения магнитных частиц магнитное кольцо может содержать по меньшей мере два стержня, находящихся на расстоянии друг от друга вдоль окружности магнитного кольца, так чтобы свободные концы стержней были обращены друг к другу. Кроме того, к каждому свободному концу стержней может быть прикреплен постоянный магнит с N-полюсом и S-полюсом в чередующемся порядке. Таким образом, при вращении магнитного кольца, магнитные частицы могут индуцироваться вращательным образом по реакционной емкости, что обеспечивает улучшение смешения компонентов в реакционной емкости.
Для эффективного улавливания магнитных частиц вращение магнитного кольца может останавливаться после смешения компонентов в реакционной емкости.
В другом варианте осуществления магнитное кольцо содержит множество стержней, где множество стержней выступает из внутреннего периметра магнитного кольца в центр магнитного кольца и организовано в форме звезды с равными расстояниями друг от друга. Предпочтительно, на каждом свободном конце стержней находится магнит с N-полюсом и магнит с S-полюсом в чередующемся порядке.
В предпочтительном варианте осуществления магнитное кольцо может содержать четное количество стержней, так чтобы множество стержней и, таким образом, множество магнитов, прикрепленных к каждому свободному концу стержней, были организованы парами для обеспечения гетерогенного или периодического магнитного поля. Кроме того, стержни, находящиеся на равных расстояниях вдоль окружности магнитного кольца, обеспечивают симметричное магнитное поле, индуцирующее магнитные частицы внутри реакционной емкости.
В одном варианте осуществления магнитное кольцо и стержни организованы для образования многослойной стопки для экранирования периферических компонентов от магнитного поля. Магнитное кольцо и стержни могут быть изготовлены из множества наслоенных друг на друга электротехнических листов, которые являются намагничивающимися. Наслоенные друг на друга электротехнические листы могут содержать электросталь и могут быть использованы для электрической изоляции. Многослойная стопка может экранировать магнитное поле, генерируемое постоянными магнитами, прикрепленными к свободным концам стержней, и не позволяет воздействовать ни на какие другие устройства кроме реакционной емкости. Экранирование от магнитного поля является особенно преимущественным и позволяет интегрирование биореактора в устройство, содержащее другие устройства/компоненты, на которые может влиять магнитное поле.
В одном варианте осуществления магнитное кольцо содержит множество направляющих пластин, выступающих из внутреннего периметра магнитного кольца в центр магнитного кольца. Предпочтительно, каждая направляющая пластина содержит электрическую катушку, предназначенную для генерирования магнитного поля. Магнитное кольцо может содержать по меньшей мере один, предпочтительно множество электромагнитов, генерирующих магнитные поля посредством электромагнитных катушек. Направляющая пластина может иметь форму звезды вдоль окружности магнитного кольца и выступать в центр магнитного кольца, где может находиться реакционная емкость. Электромагнитные катушки позволяют быстрое изменение магнитного поля путем контроля величины электрического тока.
В одном варианте осуществления магнитное кольцо находится в корпусе, имеющем средства охлаждения. Средства охлаждения могут быть встроены в корпус магнитного кольца вдоль периметра магнитного кольца для отвода тепла, вызываемого высоким током, проходящим через электромагнитные катушки. Средства охлаждения могут представлять собой охлаждающий канал, в котором циркулирует охлаждающая среда, такая как вода. Средства охлаждения предпочтительно могут быть встроены в магнитные кольца, содержащие электромагнитную катушку. Средства охлаждения могут не быть встроены в магнитные кольца, содержащие постоянные магниты (и не содержащие электромагнитную катушку).
В одном варианте осуществления магнитный элемент дополнительно содержит первое приводное устройство, предназначенное для вращения магнитного кольца вокруг продольной оси реакционной емкости, и второе приводное устройство, предназначенное для передвижения магнитного кольца в вертикальном направлении вдоль продольной оси реакционной емкости. Магнитное кольцо может удерживаться рамкой, которая двигается в продольном направлении реакционной емкости. Таким образом, магнитное поле может предоставляться и меняться как в продольном направлении, так и в радиальном направлении, реакционной емкости, когда магнитное кольцо вращается и двигается вертикально, что может приводить к еще более однородному смешению компонентов в реакционной емкости.
Приводное устройство для вращения магнитного кольца и приводное устройство для движения магнитного кольца в вертикальном направлении могут предоставляться по отдельности. Первое приводное устройство для вращения магнитного кольца может находиться непосредственно у магнитного кольца и может находиться выше реакционной емкости, в то время как второе приводное устройство для вертикального движения магнитного кольца может быть соединено с магнитным кольцом через рамку, неподвижно удерживающую магнитное кольцо и позволяющую магнитному кольцу двигаться вертикально.
В одном варианте осуществления реакционная емкость является парамагнитной, так что магнитные частицы и магнитные частицы с ДНК могут удерживаться на внутренней стенке реакционной емкости путем взаимодействия парамагнитной емкости и магнитного элемента, находящегося у реакционной емкости. Таким образом, вся реакционная емкость может быть парамагнитной или внутренняя поверхность реакционной емкости может быть парамагнитной, например, вследствие присутствия парамагнитного материала или магнитопроводящего материала. Термин "намагничивающийся" означает в рамках настоящего изобретения, что реакционная емкость или ее внутренняя поверхность может быть временно намагничена, так что магнитные частицы могут привлекаться и удерживаться у стенки реакционной емкости. Однако, намагничивание реакционной емкости или ее внутренней поверхности может быть прекращено, так чтобы магнитные частицы и магнитные частицы с ДНК, удерживаемые на стенке реакционной емкости, могли освобождаться. Таким образом, важно, чтобы материал биореактора и/или внутренняя поверхность биореактора не были постоянно намагниченными при включении магнитного элемента (т.е. не были ферромагнитными).
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления реакционная емкость является парамагнитной. В других вариантах осуществления реакционная емкость организована так, чтобы позволить проникновение магнитного поля без намагничивания.
in vitro,
В одном варианте осуществления магнитный элемент организован так, чтобы он был периодически активным для смешения магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК. Периодическая активация магнитного элемента может приводить к лучшему смешению компонентов по сравнению с непрерывной активацией магнитного элемента. Такая периодическая активация магнитного элемента, ведущая к улучшенному смешению компонентов, должна быть настроена таким образом, чтобы поддерживать магнитные частицы или магнитные частицы с ДНК свободно плавающими, и чтобы обеспечивать смешение таким образом, чтобы биохимические реакции протекали оптимизированным образом (все компоненты, вовлеченные в биохимическую реакцию, например, в транскрипцию РНК  смешиваются и контактируют друг с другом, в результате чего происходит синтез РНК). Аналогично, является важным настраивание смешения, индуцируемого периодически активным магнитом и магнитными частицами с ДНК/магнитными частицами, таким образом, чтобы нежелательные сдвиговые усилия минимизировались, и чтобы снижалось тепловыделение (тепловыделение может индуцироваться преобразованием магнитной энергии в тепло, или индуцироваться теплотой трения).
in vitro
in vitro
В одном варианте осуществления магнитный элемент организован так, чтобы активироваться для улавливания магнитных частиц с ДНК между двумя или более последовательными транскрипциями РНК  на одних и тех же ДНК-матрицах (предоставляемых в форме магнитных частиц с ДНК). Такое улавливание может быть связано с намагничиванием реакционной емкости, которое приводит к удержанию магнитных частиц с ДНК на внутренней поверхности реакционной емкости, и/или может быть связано с намагничиванием намагничивающихся, но химически инертных гранул или сфер, в реакционной емкости. Преимущественно, такое улавливание позволяет повторное применение магнитных частиц с ДНК в двух или более реакциях транскрипции РНК  и тем самым снижает время продуцирования путем снижения масштаба предоставления матрицы и стоимость продукта РНК-продукта (ДНК-матрицу можно использовать несколько раз).
in vitro
В одном варианте осуществления магнитный элемент организован так, чтобы активироваться для удаления магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК. Такое удаление магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК может быть предназначено для очистки реакционной емкости. Удаление магнитных частиц с ДНК можно проводить после последней реакции транскрипции РНК  (например, путем временной остановки вращения магнитного кольца). Такое удаление магнитных частиц с ДНК имеет преимущество, состоящее в том, что ДНК можно удалять без ферментативного расщепления посредством, например, ДНК-азы, которая уменьшает контаминацию посредством ДНК и контаминацию ферментами в конечном РНК-продукте (нет продуктов расщепления ДНК, нет фермента ДНК-азы), и снижает стоимость РНК-продукта (не требуется контроль контаминации ДНК-азой в конечном продукте, не требуется фермента ДНК-азы).
В одном варианте осуществления отсутствуют механические средства, обеспечивающие движение магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК. Согласно этому варианту осуществления отсутствуют дополнительные механические мешалки или устройства для встряхивания, которые могут индуцировать смешение или перемешивание компонентов, находящихся в реакционной емкости, так что смешение индуцируется только магнитным элементом. Это является особенно преимущественным в контексте изобретения, поскольку механические средства, обеспечивающие движение, находящиеся внутри реакционной емкости, могут вызвать образование нежелательных преципитатов (например, преципитатов на механических перемешивающих средствах). Более того, отсутствие механических средств, обеспечивающих движение, также улучшает очистку биореактора (уменьшение поверхности, отсутствие краев внутри граней внутри реакционной емкости).
В альтернативном варианте осуществления механические средства, обеспечивающие движение, для магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК присутствуют в форме встряхивателя (например, орбитальный встряхиватель), где встряхиватель предпочтительно находится снаружи реакционной емкости.
В одном варианте осуществления смешение или перемешивание компонентов, находящихся в реакционной емкости, может быть осуществлено посредством комбинирования (i) взаимодействия магнитных частиц и магнитного элемента, (i) механического средства, обеспечивающего движение, и/или (iii) подачи технологического газа или технологической жидкости в реакционную емкость.
В одном варианте осуществления реакционная емкость содержит по меньшей мере один прерыватель потока, расположенный по меньшей мере частично вдоль внутренней поверхности реакционной емкости в продольном направлении реакционной емкости. Прерыватель потока может нарушать равномерное течение компонентов в реакционной емкости и тем самым улучшать смешение. Более того, прерыватель потока может препятствовать оседанию магнитных частиц, когда магнитное кольцо прекращает вращаться и/или меняет направление вращения. Таким образом, прерыватель потока может быть организован непрерывно без какой-либо бороздки, в частности, в горизонтальном направлении перпендикулярно продольному направлению реакционной емкости, в которой могут накапливаться магнитные частицы.
Прерыватель потока может выступать из внутренней поверхности реакционной емкости в радиальном направлении реакционной емкости и располагаться вдоль продольного направления реакционной емкости. Прерыватель потока может непрерывно располагаться от верхней части до нижней части реакционной емкости или содержать множество элементов, расположенных отдельно друг от друга вдоль продольного направления реакционной емкости. Таким образом, прерыватель потока может содержать множество выступов, которые предпочтительно находятся на расстоянии друг от друга.
В одном варианте осуществления реакционная емкость содержит два прерывателя потока на расстоянии друг от друга вдоль периметра реакционной емкости. Реакционная емкость может содержать по меньшей мере один, ровно два или более прерывателей потока. Прерыватели потока предпочтительно равномерно распределены вдоль внутренней поверхности реакционной емкости в радиальном направлении реакционной емкости для улучшения смешения и для предупреждения оседания магнитных частиц.
В одном варианте осуществления прерыватель потока имеет форму гребня и прерыватель потока в форме гребня предпочтительно может иметь T- или L-образное поперечное сечение. Прерыватель потока, выступающий из внутренней поверхности в направлении к центру реакционной емкости, может иметь форму дуги вдоль искривленной внутренней поверхности реакционной емкости и иметь множество радиусов изгиба вдоль эллипсоидной внутренней геометрии реакционной емкости. Радиальное поперечное сечение прерывателя потока относительно продольной оси реакционной емкости также может варьироваться. Например, радиальное поперечное сечение может иметь T-, L- или выгнутую форму. Длина выступа на радиальном поперечном сечении прерывателя потока также может варьироваться вдоль внутренней поверхности от верхней части к нижней части реакционной емкости. В одном варианте осуществления прерыватель потока является рифленым. Прерыватель потока в форме гребня также может иметь волнообразную форму вдоль внутренней поверхности реакционной емкости, которая может препятствовать оседанию магнитных частиц. Волнообразная поверхность рифленого прерывателя потока может располагаться перпендикулярно внутренней поверхности реакционной емкости.
В одном варианте осуществления между внутренней поверхностью и наружной поверхностью реакционной емкости находится температурный элемент для коррекции температуры реакционной емкости. Иными словами, реакционная емкость может содержать толстую стенку, изготовленную из твердого материала, позволяющего встраивание температурного элемента между внутренней поверхностью и наружной поверхностью. Таким образом, можно обеспечить быструю коррекцию температуры для нагревания и охлаждения реакционной емкости.
В одном варианте осуществления температурный элемент содержит теплообменный канал, по меньшей мере частично винтообразно окружающий реакционную емкость в радиальном направлении реакционной емкости. Теплообменный канал может быть встроен между внутренней поверхностью и наружной поверхностью и приспособлен для коррекции температуры в реакционной емкости. Для обеспечения эффективного и однородного нагревания и охлаждения теплообменный канал может полностью окружать реакционную емкость и внутри теплообменного канала может протекать теплообменная среда.
В одном варианте осуществления теплообменный канал содержит первый конец и второй конец, где первый конец находится в верхней части реакционной емкости, а второй конец находится в нижней части реакционной емкости. Винтообразно организованный теплообменный канал может иметь по меньшей мере два отверстия для поступления и/или выхода теплообменной среды, где эффективному распределению теплообменной среды может способствовать расположение одного отверстия в верхней части реакционной емкости, а другого отверстия в нижней части реакционной емкости, в результате чего может использоваться сила тяжести.
В одном варианте осуществления теплообменный канал и/или реакционную емкость изготавливают посредством аддитивного процесса производства. Таким образом, может быть без труда реализована сложная геометрия реакционной емкости, включая теплообменный канал, винтообразно окружающий реакционную емкость между внутренней поверхностью и наружной поверхностью реакционной емкости.
В одном варианте осуществления реакционная емкость дополнительно содержит температурный элемент, который включает нагревательную нить, по меньшей мере частично винтообразно окружающую реакционную емкость в радиальном направлении относительно продольной оси реакционной емкости. В качестве альтернативы теплообменному каналу, нагревательная нить может быть расположена на реакционной емкости для изменения температуры компонентов реакционной емкости. Нагревательная нить также может винтообразно окружать реакционную емкость для обеспечения однородного нагревания.
В одном варианте осуществления нагревательная нить по меньшей мере частично встроена в наружную поверхность реакционной емкости или по меньшей мере частично покрывает наружную поверхность реакционной емкости. Для минимизации потерь тепла и для обеспечения эффективного нагревания посредством нагревательной нити, нагревательная нить может быть закреплена на наружной поверхности реакционной емкости. Альтернативно или в дополнение к этому, наружная поверхность реакционной емкости может быть покрыта теплоизоляционным материалом, и нагревательная нить может по меньшей мере частично находиться в теплоизоляционном материале.
В одном варианте осуществления реакционная емкость имеет такой размер, что она может вместить по меньшей мере 20 мл жидкости, или по меньшей мере 50 мл жидкости, или по меньшей мере 100 мл жидкости, или по меньшей мере 500 мл жидкости. Предпочтительно, она может вместить от 20 мл до 100 мл или от 20 мл до 50 мл жидкости. Также она может быть организована для вмещения 50 мл-100 мл жидкости. Следует отметить, что при использовании в способе согласно второму аспекту, указанную реакционную емкость заполняют только на от приблизительно 60% до приблизительно 80% чтобы обеспечить достаточное встряхивание жидкости. В конкретном варианте осуществления реакционная емкость имеет такие размеры, что она может вмещать приблизительно 100 мл жидкости, где реакционную емкость заполняют посредством только от 60 мл до 80 мл жидкости, что соответствует заполнению реакционной емкости только на приблизительно 60%-80%. В другом конкретном варианте осуществления реакционная емкость может вмещать приблизительно от 20 мл до 50 мл жидкости, где в этом случае реакционная емкость будет заполнена приблизительно на 60%.
Согласно одному варианту осуществления основная смесь IVT может содержать рибонуклеозидтрифосфаты и ДНК-зависимую РНК-полимеразу. Согласно одному варианту осуществления, буфер для иммобилизации ДНК может содержать ДНК и содержащие соль буферы. ДНК-матрицы обеспечены посредством линейных двухцепочечных ДНК-матриц, которые предпочтительно представляют собой амплифицированные посредством ПЦР ДНК-матрицы. В одном варианте осуществления магнитные частицы могут быть обеспечены посредством магнитных гранул, предпочтительно магнитных гранул со стрептавидином или химически функционализированных магнитных гранул, наиболее предпочтительно парамагнитных стрептавидиновых или химически функционализированных магнитных гранул.
В одном варианте осуществления внутренняя поверхность реакционной емкости имеет величину шероховатости поверхности (величина Ra) Ra<=0,8, предпочтительно Ra<=0,6. Внутренняя поверхность может быть, например, подвергнута электрополировке или иным образом, например химически или механически, обработана, так чтобы достигались вышеупомянутые величины Ra. Такие величины Ra являются особенно преимущественными, поскольку такой материал может улучшать очищаемость реактора, поскольку он может препятствовать отложению и застыванию, например, белковых остатков или биопленок на внутренней поверхности реакционной емкости.
В одном варианте осуществления биореактор имеет впускное отверстие, которое позволяет подавать заполняющую среду в реакционную емкость. Таким образом, впускное отверстие находится ниже максимальной амплитуды жидкости или уровня жидкости. В контексте настоящего изобретения под максимальной амплитудой жидкости понимают амплитуду жидкости, содержащейся в реакционной емкости и приводимой в движение встряхивания или вращения, которую она максимально достигает на внутренней поверхности реакционной емкости. В случае вращательного движения центрифужные силы, действующие на жидкие молекулы, ведут к выталкиванию жидкости вверх по внутренней поверхности реакционной емкости. Граница между увлажненной и сухой областью на внутренней поверхности определяет линию, которая обеспечивает максимальную амплитуду жидкости. Иными словами, максимальная амплитуда жидкости может быть связана с линией или областью, которая увлажняется в ходе встряхивающего или вращательного движения жидкости, содержащейся в реакционной емкости. Заполняющая среда для подачи через впускное отверстие реакционной емкости, может быть предоставлена, например, посредством магнитных частиц, ДНК-матриц, буфера для иммобилизации и/или основной смеси IVT. Кроме того, заполняющая среда может представлять собой очищающую, моющую или технологическую жидкость и т.п. Нахождение впускного отверстия ниже максимальной амплитуды жидкости может препятствовать отложению и застыванию веществ (например, белков, ДНК или частей, или солей и т.д.) на внутренней поверхности реакционной емкости, как может быть, например, в случае белка при температурах приблизительно 37°C.
В одном варианте осуществления реакционная емкость содержит отверстие для среды на дне реакционной емкости для подачи и/или удаления среды в/из реакционной емкости, и отверстие соединено с клапанным механизмом. Иными словами, биореактор содержит комбинированное впускное и выпускное отверстие (впускное/выпускное отверстие), предпочтительно находящееся в самой нижней точке реакционной емкости. Клапанный механизм может позволять подачу заполняющей среды в реакционную емкость и слив среды из реакционной емкости. Преимущественно, клапанный механизм может быть предназначен для поддержания, например, магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК внутри реакционной емкости, когда клапанный механизм закрыт, или позволять прохождение, например, жидкости, содержащей РНК-продукт, когда клапанный механизм открыт.
В одном варианте осуществления клапанный механизм включает магнитную ловушку. Последняя находится у отверстия для среды и предназначена для улавливания магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК. Таким образом, магнитные частицы и магнитные частицы с ДНК могут быть уловлены при чистке реакционной емкости. Дополнительно или альтернативно, магнитные частицы и магнитные частицы с ДНК, которые нежелательно вышли из реакционной емкости, могут улавливаться и, таким образом, отделяться от, например, продуцированной РНК. Магнитная ловушка может находиться снаружи реакционной емкости и может по меньшей мере частично окружать трубку для среды. Эта трубка может быть подсоединена к и ниже граничить с отверстием для среды реакционной емкости. Отверстие для среды может находиться в самой нижней точке реакционной емкости. Таким образом, жидкости могут без труда вытекать из реакционной емкости под действием силы тяжести.
В одном варианте осуществления магнитная ловушка содержит намагничивающиеся или магнитные сферы или намагничивающиеся или магнитные кольца и/или полупроницаемые фильтры, которые позволяют удерживать магнитные частицы и/или магнитные частицы с ДНК. Магнитная ловушка может содержать электромагнит или постоянный магнит. Магнитная ловушка может быть контролируемой для предупреждения выхода магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК из реакционной емкости. Такой контроль можно преимущественно использовать при отделении продуцированной РНК от магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК.
В одном варианте осуществления биореактор включает многопозиционный клапан. Последний находится ниже магнитной ловушки и предназначен для направления очищающего газа или очищающей жидкости через отверстие. Эта конфигурация служит для удаления магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК или другого осадка из них, накопившегося у отверстия.
В одном варианте осуществления вышеупомянутый многопозиционный клапан предназначен для направления технологического газа или технологической жидкости в реакционную емкость. Технологический газ или технологическая жидкость, направленные в реакционную емкость, могут приводить смешению, перемешиванию или вращению магнитных частиц или магнитных частиц с ДНК.
В одном варианте осуществления биореактор содержит клапанный механизм, находящийся на выпускном отверстии, впускном отверстии и/или впускном/выпускном отверстии и предназначенный для поддержания, например, магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК внутри реакционной емкости, когда клапанный механизм закрыт, или для позволения прохождения, например, жидкостей, содержащих РНК-продукт, когда клапанный механизм открыт. Преимущественно, клапанный механизм может быть предназначен для обеспечения закрытия и открытия выпускного отверстия и/или впускного отверстия, или комбинированного впускного/выпускного отверстия. В подходящем случае, такой клапанный механизм может представлять собой шаровой клапан, клапан-бабочку, регулирующий клапан, диафрагменный клапан, запорный клапан, игольчатый клапан или шланговый клапан, или их комбинации.
В одном варианте осуществления биореактор имеет по меньшей мере первую ножку и вторую ножку, удерживающую биореактор вертикально (вдоль продольного направления реакционной емкости). Первая ножка содержит первый патрубок и вторая ножка содержит второй патрубок. Первый патрубок организован так, чтобы находиться в гидравлическом соединении с клапанным механизмом, и второй патрубок организован так, чтобы находиться в гидравлическом соединении с одним концом теплообменного канала температурного элемента. Первая ножка и вторая ножка могут находиться на нижней части реакционной емкости и могут быть приспособлены для вертикальной стабилизации реакционной емкости. Более того, первая и вторая ножка могут содержать патрубки в соответствующих ножках. Первый конец первого патрубка, находящийся в первой ножке, может быть соединен с клапанным механизмом для подачи и/или слива компонентов реакции, и второй конец первого патрубка может быть соединен с периферическим устройством, подающим и/или сливающим реакционную среду. Кроме того, первый конец второго патрубка, находящегося во второй ножке, может быть соединен со вторым концом теплообменного канала, винтообразно закрученного вокруг реакционной емкости, и второй конец второго патрубка может быть соединен с периферическим устройством, подающим и/или сливающим теплообменную среду. Таким образом, реакционная емкость может быть сконструирована компактно.
В одном варианте осуществления биореактор содержит выходное отверстие. Выходное отверстие соединено по меньшей мере с одним из вытяжной трубы и отводящего канала. Например, выходное отверстие может быть соединено по меньшей мере как с вытяжной трубой, так и с отводящим каналом, посредством многопозиционного клапана. Выходное отверстие может обеспечить прием и вентиляцию отработанного газа или отработанных газов, появляющихся в реакционной емкости. В случае отработанной жидкости или очищающей жидкости, выходное отверстие может служить для слива жидкости из реакционной емкости. Выходное отверстие, вытяжная труба и/или отводящий канал могут содержать по меньшей мере одно средство для измерения и/или изменения давления.
В одном варианте осуществления биореактор дополнительно содержит датчик Холла. Последний находится ниже магнитной ловушки и служит для детекции магнитных полей. Датчик Холла может следить или контролировать, чтобы продукты, например, жидкости, попадающие в капилляры ниже магнитной ловушки, были свободными от магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК. Таким образом, датчик Холла помогает контролировать правильное действие магнитной ловушки. В результате измерения магнитных полей, генерируемых, например, магнитными частицами или магнитными частицами с ДНК посредством сенсора Холла, может быть дан сигнал неисправности.
В контексте настоящего изобретения "ниже" и "выше" относятся к направлению движения жидкостей или газов в процессах, охватываемых настоящим изобретением. Например, когда датчик Холла находится ниже магнитной ловушки, это подразумевает, что магнитная ловушка и датчик Холла находятся у, например окружают, капилляров, в которых проходят жидкости или газы, и что жидкость или газ, проходящие в капиллярах, сначала проходят мимо магнитной ловушки, а затем проходят мимо датчика Холла.
В одном варианте осуществления реакционная емкость содержит титан. Титан обеспечивает более низкую реманентность, иными словами, остаточный магнетизм, который означает намагничивание, остающееся в ферромагнитном материале после удаления внешнего магнитного поля. Таким образом, реакционная емкость, изготовленная из титана, может обеспечить немедленное взаимодействие между магнитной силой, генерируемой магнитным кольцом, и магнитными частицами, содержащимися внутри реакционной емкости.
В подходящем случае реакционная емкость имеет материал, который является устойчивым, например, к процедурам очистки (химически резистентным), крайним температурам (например, 75° и 85°C для процедуры очистки), крайним значениям pH (очистка реактора основаниями и кислотами, например, NaOH), механическим силам (например, трение, вызываемое магнитными частицами) и/или коррозии. Более того, материалы реакционной емкости должны быть теплопроводными при рабочих температурах приблизительно 20°C (например, величины W/(mK) по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15).
В подходящем случае и в контексте изобретения особенно важно, чтобы внутренняя поверхность реакционной емкости имела материал поверхности, который не высвобождает нежелательные соединения, которые могут контаминировать конечный продукт.
Подходящими материалами реакционной емкости и/или внутренней поверхности реакционной емкости являются аустенитная нержавеющая сталь (например, 1.4404 (AISI 316L), 1.4435 (AISI 316L)), не содержащие железа сплавы Hastelloy или титан (Ti1), которые являются парамагнитными, химически резистентными, pH-резистентными, резистентными к воздействию температур и теплопроводными.
Кроме того, подходящими материалами реакционной емкости и/или внутренней поверхности реакционной емкости являются стекло (например, борсиликатное стекло), техническая керамика (например, FRIDURIT), полиарилэфиркетон (например, полиэфирэфиркетон (PEEK)), термопластические материалы (например, DuraForm Pa или DuraForm GF), все из которых являются не намагничивающимися, химически резистентными, pH-резистентными и резистентными к воздействию температур. Преимуществом стекла (например, борсиликатного стекла) может быть то, что реакционную емкость можно осматривать визуально.
В одном варианте осуществления биореактор дополнительно содержит (полупроницаемый) фильтрующий элемент у отверстия для среды или трубки для среды. Фильтр может помочь удержать магнитные частицы и магнитные частицы с ДНК в реакционной емкости. Фильтрующий элемент может иметь размер пор менее 1 мкм для эффективной фильтрации. Полупроницаемый фильтр может содержать фильтрующую мембрану с пороговым значением молекулярной массы (MWCO), пригодным для удержания магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК. Для предотвращения забивания отверстия засоренным фильтром, фильтр предпочтительно может представлять собой одноразовый фильтр.
В одном варианте осуществления температурный элемент предназначен для изменения температуры в реакционной емкости до температуры иммобилизации ДНК или транскрипции РНК от 20°C до 37°C. Кроме того, температурный элемент также может быть предназначен для изменения температуры в реакционной емкости до температуры очистки от 75°C до 85°C. Подходящую температуру (например, от 20°C до 37°C или от 75°C до 85°C) можно контролировать посредством по меньшей мере одного из средств для измерения и/или изменения температуры (например, датчик температуры), указанное по меньшей мере одно средство в подходящем случае может находиться на внутренней поверхности реакционной емкости, и/или вблизи реакционной емкости, и/или вблизи температурного элемента. Температурный элемент и средство для измерения и/или изменения температуры являются особенно важными, поскольку, например, магнитная энергия или трение могут генерировать нежелательное тепло, которое может препятствовать биохимическим реакциям (например, нежелательное повышение температуры реакционной смеси).
В одном варианте осуществления биореактор содержит проточную ячейку впуска и/или проточную ячейку выпуска и/или проточную ячейку выхода. Проточная ячейка впуска может находиться выше впускного отверстия, и проточная ячейка выпуска может находиться ниже выпускного отверстия, и проточная ячейка выхода может находиться ниже выходного отверстия. Проточная ячейка впуска, и/или проточная ячейка выпуска, и/или проточная ячейка выхода, может быть откалибрована и может быть предназначена для мониторинга скорости потоков жидкостей или газов в или из реакционной емкости. Последняя может осуществлять частичный контроль процессов, например, транскрипции РНК или очистки биореактора, в контексте настоящего изобретения.
in vitro
В одном варианте осуществления реакционная емкость организована так, что она дополнительно содержит по меньшей мере один из следующих элементов, представленных буфером, пригодным для транскрипции РНК , рибонуклеозидтрифосфатами, аналогом кэпа, модифицированными рибонуклеозидтрифосфатами, ингибитором рибонуклеаз, пирофосфатазой, MgCl2, антиоксидантом, полиамином и раствором для очистки и/или дезинфекции.
В одном варианте осуществления реакционная емкость может быть дополнительно организована для содержания по меньшей мере одного средства для измерения и/или коррекции pH, или концентрации содержащихся компонентов, а также концентрации магния, концентрации фосфатов, температуры, давления, скорости течения, концентрации РНК и/или концентрации рибонуклеотидтрифосфатов. Средство может быть предоставлено посредством соответствующих датчиков или соответствующего зонда. Такое средство или средства могут осуществлять мониторинг процессов, охватываемых настоящим изобретением. Средство для измерения может представлять собой измеряющее устройство или датчик, и средство для коррекции может представлять собой устройство для дозирования. Например, средство может представлять собой датчик для измерения pH компонентов, находящихся в реакционной емкости, или датчик для измерения концентрации магния или соли. Кроме того, иллюстративно, средство может представлять собой устройство для измерения температуры, давления или скорости потока. В последнем случае средство может представлять собой, например, проточную ячейку внутри или на выходе потока из реакционной емкости.
in vitro
В одном варианте осуществления биореактор предназначен для периодического, периодического многократного, непрерывного режима или полунепрерывного или непрерывного режима. Многократная периодическая транскрипция РНК  (IVT) является предпочтительной, поскольку она позволяет несколько реакций на одной ДНК-матрице с преимуществами, уже указанными в настоящем описании.
В одном варианте осуществления, где биореактор содержит механическое средство, обеспечивающее движение, биореактор может содержать средство вращения для вращения реакционной емкости. Такое вращение может помочь предотвратить оседание магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК на выпускном отверстии.
in vitro
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу транскрипции РНК . Включает следующие стадии:
- предоставления магнитных частиц с ДНК и основной смеси IVT в реакционную емкость биореактора, где биореактор сконструирован согласно по меньшей мере одному из описанных вариантов осуществления согласно первому аспекту (S3a),
in vitro
- смешения свободно плавающих магнитных частиц с ДНК и основной смеси IVT посредством взаимодействия магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента биореактора и/или посредством устройства для встряхивания. Для этого магнитный элемент может быть предназначен для индукции движения магнитных частиц с ДНК и компонентов основной смеси IVT с использованием подходящих электромагнитных полей. В результате смешения получают транскрибированную  РНК (S3b).
Кроме того, способ согласно второму аспекту может включать следующие стадии:
- предоставление магнитных частиц, ДНК-матриц, буфера для иммобилизации ДНК в реакционной емкости биореактора, где биореактор сконструирован согласно по меньшей мере одному из описанных выше вариантов осуществления первого аспекта (S1),
- смешение магнитных частиц, ДНК-матриц и буфера для иммобилизации ДНК. Смешение проводят посредством взаимодействия магнитных частиц и магнитного элемента и/или посредством устройства для встряхивания (S2). Поэтому магнитный элемент может быть предназначен для индукции движения магнитных частиц и магнитных частиц с ДНК посредством соответствующих электромагнитных полей. В результате смешения получают магнитные частицы с ДНК, которые представляют собой ДНК-матрицы, иммобилизованные на свободно плавающих магнитных частицах. Указанные ДНК-матрицы, иммобилизованные на свободно плавающих магнитных частицах, можно смешивать с основной смесью IVT с получением РНК (как описано выше; S3). Таким образом, перед стадией S3 проводят стадии S1 и S2.
Способ согласно второму аспекту, кроме того, может включать следующие стадии:
in vitro
- улавливание магнитных частиц с ДНК посредством магнитного элемента и накопление/сбор полученной транскрибированной  РНК, например, через выпускное отверстие (S4a),
- предоставление свежей основной смеси IVT в реакционной емкости биореактора согласно первому аспекту (S4b),
- высвобождение уловленных магнитных частиц с ДНК для получения свободно плавающих магнитных частиц с ДНК (S4c),
- смешение свободно плавающих магнитных частиц с ДНК и основной смеси IVT посредством взаимодействия магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента и/или посредством встряхивателя с получением РНК (S4d).
in vitro
Предпочтительно, после стадии S3 проводят стадии S4a-S4d. Указанные стадии способа (S4) являются особенно пригодными в вариантах осуществления, где проводят более одной реакции транскрипции РНК . Предпочтительно, указанные стадии способа проводят по меньшей мере 2 раза, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или вплоть до 30 раз.
В одном варианте осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, может включать стадию коррекции pH и/или концентрации соли.
in vitro
В одном варианте осуществления способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, включает стадию доведения реакционной емкости до температуры от 20°C до 37°C. Такая температура может быть пригодной для транскрипции РНК . Доведение температуры можно проводить до заполнения реакционной емкости.
Реакционную емкость можно доводить до температуры от 20° до 25°C, предпочтительно 22°C на дополнительной стадии способа для иммобилизации ДНК-матриц на магнитных частицах. Кроме того, на дополнительной стадии способа реакционную емкость можно доводить до температуры от 75° до 85°C для/в ходе процесса очистки реакционной емкости.
in vitro
В одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию очистки реакционной емкости очищающим газом и/или очищающей жидкостью. До или в ходе очистки, реакционную емкость можно нагревать, например, до вышеупомянутой температуры от 75° до 85°C. После получения транскрибированной  РНК, магнитные частицы с ДНК можно удалять посредством взаимодействия магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента. Эта стадия способа позволяет удаление ДНК-матрицы без, например, проведения расщепления ДНК-азой.
Для обеспечения смешения или улавливания/высвобождения магнитных частиц или магнитных частиц с ДНК, важно, чтобы магнитные частицы были парамагнитными во избежание необратимого прилипания к стенке емкости реактора в ходе, например, смешения, обеспечиваемого магнитным элементом. Примерами подходящих магнитных частиц являются магнитные гранулы Dynabead (ThermoFisher Scientific).
Кроме того, способ может включать различные стадии контроля качества, которые могут позволить оценку, например, идентичности РНК, целостности РНК, чистоты РНК и т.д. Указанный контроль качества может быть осуществлен в потоке или у потока.
in vitro
in vitro
Способ транскрипции РНК , описанный в настоящем описании, можно проводить на одной ДНК-матрице для получения композиции РНК, содержащей один тип РНК. В других вариантах осуществления способ транскрипции РНК  можно проводить по меньшей мере на двух различных ДНК-матрицах для получения композиции, содержащей по меньшей мере два типа РНК. Например, способы, описанные в WO2017/1090134A1, можно адаптировать соответствующим образом и выполнять в реакционной емкости биореактора согласно первому аспекту.
Кроме того, способ может включать стадию ферментативного кэппирования РНК, которое можно проводить в реакционной емкости биореактора согласно первому аспекту (например, с использованием иммобилизованных кэппирующих ферментов на магнитных частицах; иммобилизованные кэппирующие ферменты можно получать с использованием способов, описанных в WO2016/193226). Магнитный элемент может быть предназначен для индукции движения кэппирующих ферментов на магнитных частицах и РНК посредством соответствующих электромагнитных полей. В результате смешения получают кэппированную РНК.
Кроме того, способ может включать стадию ферментативного полиаденилирования РНК, которое можно проводить в реакционной емкости биореактора согласно первому аспекту (например, с использованием иммобилизованных полиA-полимераз на магнитных гранулах, иммобилизованные полиA-полимеразы можно получать с использованием способов, описанных в WO2016/174271). Магнитный элемент может быть предназначен для индукции движения полиA-полимераз на магнитных частицах и РНК посредством соответствующих электромагнитных полей. В результате смешения получают полиаденилированную РНК.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к применению биореактора, как описано выше, в способе, как описано выше.
in vitro,
in vitro
Кроме того, биореактор согласно первому аспекту можно использовать для реакций транскрипции РНК  где ДНК свободна или иммобилизована на немагнитных частицах (например, агарозные гранулы, сефарозные гранулы, немагнитные полистироловые гранулы и другие подходящие синтетические смолы) и смешение проводят посредством взаимодействия магнитных частиц, которые не содержат ДНК-матрицу, и магнитного элемента биореактора согласно первому аспекту. В таком варианте осуществления реакцию транскрипции РНК  можно проводить только один раз. Кроме того, биореактор можно использовать в любом ферментном способе, вовлекающем нуклеиновые кислоты (например, полимеразная цепная реакция (ПЦР), изотермическая амплификация ДНК, обратная транскрипция РНК в кДНК), где смешение проводят посредством взаимодействия магнитных частиц и магнитного элемента биореактора согласно первому аспекту.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к модулю для транскрипции ДНК-матрицы в РНК. Модуль содержит биореактор в соответствии по меньшей мере с одним из описанных выше вариантов осуществления согласно первому аспекту, и, кроме того, по меньшей мере один из элемента для получения основной смеси IVT, элемента для получения буфера для иммобилизации, устройства для очистки полученного РНК-продукта, устройства для кондиционирования РНК и/или устройства для стерильной фильтрации РНК.
В предпочтительных вариантах осуществления устройство для очистки полученного РНК-продукта содержит элемент ВЭЖХ, предпочтительно элемент для проведения ОФ-ВЭЖХ. Особенно предпочтительной в этом контексте является ОФ-ВЭЖХ с использованием способа, описанного в WO2008/077592, предпочтительно с использованием пористой неалкилированной обращенной фазы на основе полистиролдивинилбензола, где обращенная фаза образована гранулами или присутствует в качестве полимеризованного блока (например, монолитного). Альтернативно или дополнительно, устройство для очистки полученного РНК-продукта может содержать элемент для очистки с олиго-dT для аффинной очистки полученной РНК с использованием функционализированных матриц, или гранул, или колонок с олиго-dT (например, как описано в WO2014152031A1).
В предпочтительных вариантах осуществления устройство для кондиционирования РНК включает элемент для проточной фильтрации вдоль потока. Особенно предпочтительной в этом контексте является проточная фильтрация вдоль потока, как описано в WO2016/193206, где TFF используют для диафильтрации, и/или концентрирования, и/или очистки РНК.
В одном варианте осуществления модуль дополнительно содержит элемент для подачи среды. Последний предназначен для подачи компонентов основной смеси IVT в элемент для получения основной смеси IVT.
В одном варианте осуществления ДНК-матрица представляет собой модифицированную на концах или функционализированную на концах полученную посредством ПЦР ДНК-матрицу. Предпочтительно, ДНК-матрица представляет собой биотинилированную полученную посредством ПЦР ДНК-матрицу, немодифицированную или модифицированную на концах линеаризованную плазмидную ДНК или немодифицированную или модифицированную на концах линеаризованную ДНК в виде собачьей косточки.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к автоматизированному устройству для производства РНК, содержащему вышеупомянутый биореактор согласно первому аспекту или модуль согласно четвертому аспекту, где устройство дополнительно содержит по меньшей мере один из модуля для синтеза ДНК и модуля для составления РНК.
В одном варианте осуществления модуль для синтеза ДНК предназначен для получения достаточного количества ДНК, пригодной для применения в биореакторе согласно аспекту 1, или модуле для транскрипции ДНК-матрицы в РНК согласно аспекту 2. В предпочтительном варианте осуществления модуль для синтеза ДНК может содержать элемент-термоциклер для амплификации ДНК на основе ПЦР и элемент для очистки полученных продуктов ПЦР. В подходящем случае указанный модуль для синтеза ДНК может генерировать биотинилированные ДНК-матрицы, предпочтительно биотинилированные ДНК-матрицы на основе ПЦР.
В одном варианте осуществления модуль для составления РНК организован для формирования РНК, инкапсулированной в липидные наночастицы (LNP). Таким образом, модуль для составления РНК включает модуль для составления LNP, где указанный модуль для составления LNP может содержать, например, насосный элемент (например, шприцевой насос), элемент тангенциального потока и фильтрующий элемент (например, содержащий стерильный фильтр).
В одном варианте осуществления модуль для составления РНК предназначен для образования РНК в комплексе с поликатионным пептидом или белком (например, протамин или полимерный носитель, например, полимер полиэтиленгликоль/пептид, например, согласно WO2012/013326). Таким образом, модуль для составления РНК содержит по меньшей мере один из модуля для составления/комплексообразования с протамином и/или модулем составления/комплексообразования с полимером полиэтиленгликоль/пептид. В этом контексте для модуля для составления РНК в подходящем случае могут использоваться способы и средства согласно WO2016165825A1 и/или WO2018041921A1.
В одном варианте осуществления автоматизированное устройство находится в закрытом контейнере и предпочтительно в одном контейнере, где контейнер содержит элемент для создания ламинарного воздушного потока. Такая конфигурация в одном контейнере, в частности, помогает сэкономить пространство, помимо оборудования и персонала. Более того, указанное автоматизированное устройство может быть организовано так, чтобы быть портативным, например, с таким размером, который позволяет транспортировку в регионы вспышки пандемии.
in vitro
in vitro
В одном варианте осуществления автоматизированное устройство дополнительно содержит по меньшей мере один из модуля для иммобилизации ДНК, например, для иммобилизации плазмидной ДНК, например, как описано в PCT/EP2017/084264 или PCT/EP2018/086684, модуля для линеаризации ДНК, например, для линеаризации плазмиидной ДНК или ДНК в виде собачьей косточки, модуля для кэппирования РНК, например, для присоединения структуры кэпа 0 или кэпа 1 к транскрибированной  РНК, модуля для полиаденилирования РНК, например, для присоединения полиA-хвостовой части к транскрибированной  РНК, модуля для смешения РНК, например, для смешения по меньшей мере двух различных типов РНК, модуля для распылительной сушки РНК, например, для получения высушенной распылительной сушкой или высушенной сублимационной сушкой РНК, например, согласно WO2016/184575 или WO2016184576, модуля для лиофилизации РНК для получения лиофилизированной РНК, например, согласно WO2016/165831 или WO2011/069586, и/или модуля для хранения конечного продукта.
В одном варианте осуществления автоматизированное устройство дополнительно содержит по меньшей мере один из модуля для NGS (секвенирование последнего поколения), например, для анализа последовательности, модуля для масс-спектрометрии (MS), модуля для контроля качества (например, включающего элемент ВЭЖХ для аналитической ВЭЖХ), модуля для кПЦР или dd-ПЦР, модуля для капиллярного электрофореза, стойки для подачи среды или модуля для подачи среды, модуля документации и/или модуля для компьютерного управления всеми стадиями процесса и интерфейсами для систем контроля и документации высшего порядка.
В общем, предоставлены устройства и способы для экономичного, контролируемого, воспроизводимого, непрерывного (многократного периодического) и совместимого с GMP продуцирования РНК. Описанные способы и средства позволяют многократное применение ДНК-матриц в нескольких способах (массового) продуцирования РНК. Таким образом, устройства, как описано выше, позволяют, например, ускоренное производство РНК. Кроме того, автоматизированное и, вследствие соответствующего размера, портативное устройство для продуцирования РНК, как описано выше, является преимущественным в контексте продуцирования терапевтических средств на основе РНК в регионе вспышки пандемии.
in vitro
in vitro
Должно быть понятно, что биореактор для транскрипции РНК , способ транскрипции РНК , применение биореактора согласно способу, модуль для транскрипции ДНК в РНК, и автоматизированное устройство для производства РНК согласно независимым пунктам формулы изобретения имеют сходные и/или идентичные предпочтительные варианты осуществления, в частности, как определено в зависимых пунктах формулы изобретения. Кроме того, должно быть понятно, что предпочтительный вариант осуществления изобретения также может представлять собой любую комбинацию зависимых пунктов формулы изобретения с соответствующим независимым пунктом формулы изобретения.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут понятными и будут установлены с помощью вариантов осуществления, описанных в настоящем описании далее.
Краткое описание чертежей
Фигуры, показанные ниже, являются только иллюстративными и дополнительно описывают настоящее изобретение. Эти фигуры не следует истолковывать как ограничивающие настоящее изобретение.
На фиг.1 представлено схематичное изображение биореактора согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.2 представлено схематичное изображение реакционной емкости согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.3A, B представлено схематичное изображение реакционной емкости согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.4 представлено схематичное изображение магнитного элемента согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.5 представлено схематичное изображение магнитных колец согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.6 представлено схематичное изображение магнитного элемента согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.7A-C представлены схематичные изображения биореактора согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.8A-C представлены схематичные изображения биореактора согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.9A-H представлены схематичные изображения биореактора согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.10 представлено схематичное изображение биореактора согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.11 представлено схематичное изображение биореактора согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения.
На фиг.12A, B представлены схематичные изображения биореактора с подвижным магнитным элементом согласно одному варианту осуществления изобретения.
На фиг.13 представлено схематичное изображение биореактора с вращающимся магнитным элементом согласно одному варианту осуществления изобретения.
На фиг.14A, B представлены схематичные изображения биореактора с орбитальным устройством для встряхивания.
На фиг.15 представлены иллюстративные компоненты модуля для транскрипции ДНК в РНК.
На фиг.16 представлен пример способа транскрипции ДНК в РНК согласно одному варианту осуществления.
На фиг.17 представлено иллюстративное устройство для автоматизированного продуцирования РНК согласно одному варианту осуществления.
На фиг.18 представлена иллюстративная схема процесса для продуцирования РНК согласно одному варианту осуществления.
in vitro
На фиг.19 представлен результат многократной периодической транскрипции РНК  с использованием одной и той же иммобилизованной ДНК-матрицы на протяжении 3 реакций IVT. Эксперимент проводили, как описано в примере 1.
На фиг.20A, B представлена эффективность продуцированной РНК, экспрессированной в клетках HepG2 (эксперимент проводили, как описано в примере 1.
Определения
Для ясности и простоты прочтения приводятся следующие определения. Любой технический признак, упоминаемый для этих определений, может охватываться каждым вариантом осуществления изобретения. В контексте этих вариантов осуществления могут быть специально предоставлены дополнительные определения и пояснения.
ДНК Doggybone, ДНК в виде собачьей косточки:
TM
Термин "Doggybone" (db-ДНК), как используют в рамках изобретения, означает минимальный закрытый линейный ДНК-вектор, ферментативно разработанный Touchlight Genetics Ltd. Линейную ДНК быстро продуцируют в свободной от плазмиды форме и синтезируют посредством ферментативного процесса, который обеспечивает векторную кассету, содержащую только представляющую интерес кодируемую последовательность, промотор, например, полиA-хвостовую часть и теломерные концы.
Смешение:
В контексте изобретения "смешение", как правило, представляет собой процесс, который вовлекает манипулирование гетерогенной физической системой с целью сделать ее более гомогенной. Смешение проводят для обеспечения переноса массы между одним или несколькими потоками, компонентами или фазами. Смешение фундаментально представляет собой изменение с течением времени пространственно зависимых концентраций в направлении более однородного состояния.
В контексте настоящего изобретения используют магнитный элемент, который позволяет взаимодействие с магнитными частицами и/или магнитными частицами с ДНК для улучшенного смешения компонентов, содержащихся в реакционной емкости, как определено в настоящем описании, предпочтительно без применения какого-либо механического стресса (такого как напряжение сдвига) в отношении указанных компонентов. В частности, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно избегают общепринятых средств смешения, о которых известно, что они индуцируют механический стресс в отношении компонентов, подлежащих смешению. Например, смешение жидкостей предпочтительно проводят без встряхивания и/или качания реакционной емкости. Вместо этого, магнитный элемент организован для генерирования соответствующих магнитных полей, которые обеспечивают силы действующие на магнитные частицы и/или магнитные частицы с ДНК, так что последние начинают движение в реакционной емкости, тем самым вызывая смешение компонентов, содержащихся в реакционной емкости.
Индуцированное движение магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК может приводить к турбулентности компонентов, находящихся в реакционной емкости, которая не вызвана встряхиванием или вибрацией, которые обеспечивают улучшенное смешение компонентов в реакционной емкости для получения однородной композиции.
Транскрипция РНК
:
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
Термин "транскрипция РНК " относится к процессу, в котором РНК синтезируется в бесклеточной системе. РНК может быть получена посредством ДНК-зависимой транскрипции РНК  с соответствующей ДНК-матрицы, которая в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой линеаризованную плазмидную ДНК-матрицу или амплифицированную посредством ПЦР ДНК-матрицу. Промотор для контроля транскрипции РНК  может представлять собой любой промотор для ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Конкретными примерами ДНК-зависимых РНК-полимераз являются РНК-полимеразы T7, T3, SP6 или Syn5.
in vitro
ДНК-матрица (например, плазмидная ДНК, ДНК в виде собачьей косточки) может быть линеаризована посредством подходящего фермента рестрикции и иммобилизована на магнитных гранулах (например, как описано в PCT/EP2017/084264 или PCT/EP2018/086684) до проведения транскрипции РНК . Альтернативно ДНК-матрицы может быть предоставлена в качестве амплифицированной способом ПЦР ДНК, иммобилизованной на магнитных частицах (с использованием биотинилированных праймеров для амплификации ДНК-матрицы на основе ПЦР и последующей иммобилизации на магнитных гранулах со стрептавидином).
in vitro,
Реагенты, используемые в транскрипции РНК  как правило, включают: ДНК-матрицу (линеаризованная ДНК или линейный продукт ПЦР) с промоторной последовательностью, которая обладает высокой аффинностью связывания в отношении ее соответствующей РНК-полимеразы, такой как кодируемые бактериофагом РНК-полимеразы (T7, T3, SP6 или Syn5); рибонуклеотидтрифосфаты (NTP) для четырех оснований (аденин, цитозин, гуанин и урацил); необязательно аналог кэпа (например m7G(5’)ppp(5’)G (m7G) или аналог кэпа, происходящий из структуры, описанной в пп.1-5 формулы изобретения WO2017/053297, или любые структуры кэпов, происходящие из структуры, определенной в п.1 или п.21 формулы изобретения WO2018075827); необязательно, дополнительные модифицированные нуклеотиды, как определено в настоящем описании; ДНК-зависимую РНК-полимеразу, способную связываться с промоторной последовательностью в ДНК-матрице (например, РНК-полимераза T7, T3, SP6 или Syn5); необязательно, ингибитор рибонуклеазы (РНК-азы) для инактивации какой-либо потенциально контаминирующей РНК-азы; необязательно, пирофосфатазу для деградации пирофосфата (ингибитор синтеза РНК); MgCl2, который предоставляет ионы Mg2+ в качестве кофактора для полимеразы; буфер (TRIS или HEPES) для подержания подходящей величины pH, который также содержит антиоксиданты (например, DTT), и/или полиамины, такие как спермидин, в оптимальных концентрациях, например, буферную систему, содержащую цитрат и/или бетаин, как описано в WO2017/109161.
in vitro,
in vitro,
Смесь нуклеотидов, используемая для транскрипции РНК  кроме того, может содержать модифицированные нуклеотиды, как определено в настоящем описании. В этом контексте предпочтительные модифицированные нуклеотиды включают псевдоуридин (ψ), N1-метилпсевдоуридин (m1ψ), 5-метилцитозин и 5-метоксиуридин. Смесь нуклеотидов (т.е. фракция каждого нуклеотида в смеси), используемая для реакций транскрипции РНК  может быть оптимизирована для данной последовательности РНК, предпочтительно, как описано в WO2015188933.
in vitro
Основная смесь для транскрипции РНК , основная смесь IVT:
in vitro
in vitro,
Основная смесь для транскрипции РНК  (IVT) может содержать компоненты, необходимые для проведения реакции транскрипции РНК  как определено выше. Таким образом, основная смесь IVT может содержать по меньшей мере один из компонентов, выбранных из смеси нуклеотидов, аналога кэпа, ДНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитора РНК-азы, пирофосфатазы, MgCl2, буфера, антиоксиданта, бетаина, цитрата.
Полупроницаемый фильтр:
Фильтр, который позволяет определенным частицам проходить через поры фильтрующего материала, когда частицы являются меньшими, чем размер пор, тем самым предотвращая переход частиц крупнее, чем размер пор фильтрующего материала.
Если далее определено, что группа содержит по меньшей мере определенное количество вариантов осуществления, это также подразумевает, что она охватывает группу, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.
Как используют в описании и в формуле изобретения, формы единственного числа также включают соответствующие формы множественного числа, если контекст явно не указывает на иное.
Необходимо понимать, что "содержащий" не является ограничивающим. Для целей настоящего изобретения термин "состоящий из" считается предпочтительным вариантом осуществления термина "содержащий".
Подробное описание данных, лежащих в основе настоящего изобретения
in vitro,
in vitro
фиг.1 и 7
Изобретение относится к биореактору для транскрипции РНК  предназначенному для автоматизированной работы в условиях, соответствующих GMP. Схематическое изображение биореактора для транскрипции РНК  согласно одному варианту осуществления изобретения предоставлено, среди прочено, на .
Биореактор 1 содержит реакционную емкость 2 для вмещения магнитных частиц, ДНК-матрицы, буфера для иммобилизации ДНК, магнитных частиц с ДНК и основной смеси IVT. Внутренняя поверхность 21 реакционной емкости 2 имеет яйцеобразную внутреннюю геометрию. Альтернативно внутренняя поверхность 21 реакционной емкости 2 в соответствии с настоящим изобретением может быть эллипсоидной или овальной. В любом случае предпочтительно, чтобы внутренняя поверхность 21 реакционной емкости 2 имела форму без граней. Это может быть особенно важным для свойств смешения биореактора 1. Более того, указанная эллипсоидная, овальная или яйцеобразная форма, в частности, отсутствие граней, является преимущественной для очищаемости (важно для соблюдения GMP) и снижает риск образования нежелательных преципитатов в биореакторе. Более того, яйцеобразная форма имеет преимущество над, например, плоской округлой формой, состоящее в том, что жидкости (например, РНК-продукт) могут без труда вытекать из биореактора 1 через отверстие 6 для среды в трубу 66 для среды (также см. фиг.11).
in vitro
Кроме того, описанная выше внутренняя геометрия позволяет предотвратить прилипание и высыхание, например, белковых остатков на внутренней поверхности, поскольку обычно форма без граней и, более конкретно, эллипсоидная, овальная или яйцеобразная форма способствует хорошему стеканию жидкостей. Кроме того, эллипсоидная, овальная или яйцеобразная форма имеет преимущество над, например, "формой конуса", состоящее в том, что минимизируется риск того, что магнитные частицы с ДНК будут собираться на дне реактора, что может снижать выход транскрипции РНК  (например, эти ДНК-матрицы не будут доступны для РНК-полимераз), или засорят отверстие 6 для среды. Для дальнейшего предотвращения засорения отверстия 6 для среды через отверстие 6 для среды может подаваться жидкость с регулярными интервалами в биореактор 1 в ходе реакции транскрипции. Это промывание может дополнительно улучшить свойства смешения биореактора при биохимической реакции (например, реакция IVT, реакция иммобилизации ДНК).
in vitro
Биореактор 1 организован для обеспечения многократных реакций транскрипции РНК  на ДНК-матрицах, которые иммобилизованы на свободно плавающих магнитных частицах ("магнитные частицы с ДНК"). Например, ДНК-матрицы могут быть предоставлены в качестве амплифицированной способом ПЦР ДНК, которая иммобилизована на магнитных гранулах (с использованием биотинилированных праймеров для амплификации ДНК-матрицы на основе ПЦР и последующей иммобилизации на магнитных гранулах со стрептавидином), или линеаризованной плазмидной ДНК, которая иммобилизована на магнитных гранулах (например, как описано в PCT/EP2017/084264 или PCT/EP2018/086684).
in vitro
Биореактор 1 дополнительно содержит магнитный элемент 3, находящийся в реакционной емкости 2. Магнитный элемент 3 позволяет бесконтактное смешение реакционной смеси, содержащей магнитные частицы или магнитные частицы с ДНК, предполагая, что в процессе смешения не должны быть использованы средства смешения, что является преимущественным признаком в контексте достаточной очищаемости биореактора 1, например, при фармацевтическом продуцировании РНК. Более того, смешение в реакции РНК  может проводиться без вращения/качания биореактора 1. Это является особенно преимущественным, поскольку вращению или качанию могут в значительной степени препятствовать различные отверстия впуска и выпуска, которые должны быть установлены на биореакторе 1.
in vitro,
in vitro
Кроме того, магнитный элемент 3 можно использовать для улавливания магнитных частиц с ДНК перед началом другого цикла транскрипции РНК  тем самым позволяя многократную периодическую транскрипцию РНК  (IVT) на одной и той же ДНК-матрице, что значительно снижает общую стоимость продуцирования РНК. Кроме того, магнитный элемент 3 можно использовать для удаления магнитных частиц с ДНК для конечной очистки или дезинфекции биореактора 1. Таким образом, ДНК можно удалять без необходимости в ферментативной обработке ДНК-азой, что (i) снижает стоимость, поскольку такой фермент не требуется, (ii) снижает риск контаминации РНК-продукта дополнительным компонентом (который представляет собой ДНК-азу), и (iii) снижает риск контаминации конечного РНК-продукта фрагментами ДНК или частично расщепленными фрагментами ДНК.
На фиг.1 магнитный элемент 3 имеет в форму кольца (также см. фиг.4) и вмещает реакционную емкость 2 в центре 33 магнитного элемента 3, так что магнитный элемент 3 может вращаться вокруг реакционной емкости 2. Магнитный элемент 3 прикреплен к оси 36 вращающегося центра с помощью ручки 37, где ось 36 вращающегося центра может двигать магнитный элемент 3 в вертикальном направлении. Посредством вертикального движения магнитного элемента 3 может генерироваться магнитное поле вдоль продольного направления реакционной емкости 2. Таким образом, может быть достигнуто однородное смешение компонентов в реакционной емкости 2 путем индукции магнитных частиц как в радиальном направлении, так и в продольном направлении. Обеспечивающее вращение средство 38 для магнитного элемента 3 находится на ручке 37 непосредственно выше реакционной емкости 2 и приводное средство 39 для работы оси 36 центра вращения находятся непосредственно на оси 36 центра вращения.
На фиг.2 представлена реакционная емкость 2 в перспективном виде, на фиг.3A представлен вид снизу реакционной емкости 2 и на фиг.3B представлен вид сверху реакционной емкости 2. Реакционная емкость 2 может быть изготовлена из такого материала, как титан, который является химически резистентным, резистентным к крайним температурам, крайним значениям pH, механическим силам и/или коррозии.
Во всех вариантах осуществления биореактора 1 в соответствии с настоящим изобретением внутренняя поверхность 21 реакционной емкости 2 имеет форму без граней, предпочтительно, эллипсоидную, овальную или яйцеобразную. Кроме того, предпочтительно, чтобы внутренняя поверхность 21 реакционной емкости 2 была отполирована с величиной Ra<=0,8. Подходящий способ получения таких величин Ra известен специалисту в данной области. Например, внутренняя поверхность 21 может быть механически отполирована, отполирована посредством электрополировки или химически отполирована, и т.п.
Как показано на фиг.3B, реакционная емкость 2 содержит выходное отверстие 7 для отработанного газа или отработанной жидкости. Выходное отверстие 7 можно использовать, например, для вентиляции реакционной емкости 2 в ходе заполнения емкости. Для этого выходное отверстие 7 находится на самой верхней точке реакционной емкости 2. В верхней части реакционной емкости 2 находится первый конец 52 теплообменного канала 51 температурного элемента 5. Как показано на фиг.11, выходное отверстие 7 может быть соединено по меньшей мере с одним из вытяжной трубки 73 и отводящего канала 74. Например, выходное отверстие 7 может быть соединено по меньшей мере с обоими из вытяжной трубки 73 и отводящего канала 74 многопозиционным клапаном. Выходное отверстие 7 может позволить прием и вентиляцию отработанного газа или отработанных газов, появляющихся в реакционной емкости 2. В случае отработанной жидкости или очищающей жидкости, выходное отверстие 7 может служить для слива жидкости из реакционной емкости 2. Выходное отверстие, вытяжная трубка и/или отводящий канал могут содержать по меньшей мере одно средство для измерения и/или коррекции давления.
Кроме того, отверстие 6 для среды находится в самой нижней точке реакционной емкости 2 и может быть дополнительно соединено с клапанным механизмом 60, контролирующим подачу или слив компонентов (на фиг.3A). Реакционная емкость 2 содержит две ножки 25, 26, которые могут поддерживать реакционную емкость 2 вертикально. Кроме того, каждая ножка 25, 26 содержит патрубок 251, 261, проходящий через ножки 25, 26. Таким образом, первая ножка 25 содержит первый патрубок 251, организованный так, что он находится в гидравлическом соединении с клапанным механизмом 60 и вторая ножка 26 содержит второй патрубок 261, организованный так, что он находится в гидравлическом соединении со вторым концом 53 теплообменного канала 51 температурного элемента 5 (см. фиг.7B и 7C).
На фиг.4 представлен предпочтительный вариант осуществления магнитного элемента 3. Магнитный элемент 3 имеет форму звезды, содержащей магнитное кольцо 31 и множество стержней 32. Магнитное кольцо 31 и стержни 32 могут быть изготовлены из множества наслоенных друг на друга электротехнических листов, которые являются намагничивающимися, таким образом, формируя многослойную стопку для экранирования периферических компонентов от магнитного поля. Магнитное кольцо 31 сконструировано так, что оно окружает реакционную емкость 2. Иными словами, реакционная емкость 2 может находиться в центре 33 магнитного кольца 31.
Магнитное кольцо 31 содержит первый стержень 320 и второй стержень 322, выступающий из внутреннего периметра 34 магнитного кольца 31 в центр 33 магнитного кольца 31, так чтобы свободные концы 321, 323 первого и второго стержней 320, 322 были обращены друг к другу. Свободный конец 321 первого стержня 320 содержит магнит с N-полюсом и свободный конец 323 второго стержня 322 содержит магнит с S-полюсом. Однако, как показано на фиг.5, количество и длина стержней 32 может варьироваться. Стержни 32 находятся на внутреннем периметре 34 магнитного кольца 31 и выступают в направлении центра 33 магнитного кольца 31. Множество стержней 32 имеют форму звезды и находятся на равных расстояниях друг от друга, так что магнитное кольцо 31 сформировано симметрично. На каждом свободном конце стержней 32, находится магнит с N-полюсом и магнит с S-полюсом в чередующемся порядке.
Альтернативно, как показано на фиг.6, магнитный элемент 3 содержит магнитное кольцо 31, включающее множество направляющих пластин 350 и электрических катушек 351. Направляющие пластины 350 в форме звезды выступают из внутреннего периметра 34 магнитного кольца 31 в центр 33 магнитного кольца 31. Каждая направляющая пластина 350 содержит электрическую катушку 351 для генерирования магнитного поля. Магнитное кольцо 31 окружено корпусом, имеющим средства 352 охлаждения. Средства 352 охлаждения встроены в корпус магнитного кольца вдоль периметра магнитного кольца 31 для отведения тепла, генерируемого высоким током, проходящим через электромагнитные катушки. Средства 352 охлаждения может представлять собой охлаждающий канал, в которым предоставлена охлаждающая среда, такая как вода.
На фиг.7A-7C показан другой предпочтительный вариант осуществления биореактора 1. Реакционная емкость 2 может быть изготовлена из твердого материала и содержит внутреннюю поверхность 21 и наружную поверхность 23. Между внутренней поверхностью 21 и наружной поверхностью 23 встроен температурный элемент 5 для изменения температуры реакционной емкости 2. Температурный элемент 5 содержит теплообменный канал 51, винтообразно окружающий реакционную емкость 2 в радиальном направлении относительно продольной оси реакционной емкости 2. Для облегчения изготовления такой реакционной емкости 2 со сложной геометрией реакционная емкость 2 может быть изготовлена посредством аддитивного производства.
Теплообменный канал 51 содержит первый конец 52 и второй конец 53 в гидравлическом соединении со вторым патрубоком 261 во второй ножке 26. Первый конец 52 находится в верхней части реакционной емкости 2, однако находится на расстоянии от самого верха или выходного отверстия 7 для обеспечения надежной доступности выходного отверстия 7. Второй конец 53 теплообменного канала находится в нижней части реакционной емкости 2, однако на расстоянии от самого дна или отверстия 6 для среды, для обеспечения надежной доступности отверстия 6 для среды. Через первый конец 52 или второй конец 53 теплообменная среда, такая как вода, может подаваться в теплообменный канал 51 для нагревания или охлаждения компонентов внутри реакционной емкости 2.
На фиг.8A и 8B представлен альтернативный вариант осуществления температурного элемента 5. Температурный элемент 5 содержит нагревательную нить 54, по меньшей мере частично, предпочтительно полностью, винтообразно окружающую реакционную емкость 2 в радиальном направлении относительно продольной оси реакционной емкости 2. Нагревательная нить 54 по меньшей мере частично встроена в наружную поверхность 23 реакционной емкости 2 (на фиг.8A). Кроме того или альтернативно наружная поверхность 23 реакционной емкости 2 может быть покрыта теплоизолирующим материалом 55 и нагревательная нить 54 по меньшей мере частично утоплена в теплоизолирующий материал 55 (на фиг.8B).
Ссылаясь на фиг.7B и 7C, реакционная емкость 2 содержит по меньшей мере один, предпочтительно два прерывателя потока 24, расположенных по меньшей мере частично вдоль внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2 в продольном направлении реакционной емкости 2. Прерыватель потока 24 может нарушать равномерное течение компонентов в реакционной емкости 2 и, таким образом, может улучшать смешение. Более того, прерыватель потока 24 может препятствовать оседанию магнитных частиц, когда магнитный элемент 3 прекращает вращаться и/или меняет направление вращения. Два прерывателя потока 24 находятся на расстоянии друг от друга в радиальном направлении относительно продольной оси реакционной емкости 2.
Как показано на фиг.9A-9H, прерыватель потока 24 может иметь форму гребня и выступает из внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2 вдоль продольного направления реакционной емкости 2. В другом варианте осуществления прерыватель потока 24 имеет форму дуги и имеет T-образное поперечное сечение (на фиг.9A и 9B) или L-образное поперечное сечение (на фиг.9E и 9F). В другом варианте осуществления прерыватель потока 24 является рифленым или волнообразным (на фиг.9C и 9D). Альтернативно прерыватель потока 24 содержит множество выступов в форме полукруга на расстояния друг от друга на внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2 вдоль продольного направления (на фиг.9G и 9H).
Следует отметить, что элементы и признаки биореактора 1 по изобретению, упомянутые в контексте фиг.10-12, аналогично могут быть частью реактора, показанного на фиг.1-9, даже если это явно не указано в настоящем описании. Таким образом, биореактор 1, как проиллюстрировано на фиг.1-9, также может содержать по меньшей мере одно, выбранное из магнитной ловушки 61, датчика Холла 63, проточной ячейки 64, температурного датчика 91, дополнительного датчика 92 или конкретного уровня заполнения 27 или максимальной амплитуды жидкости 28.
in vitro
in vitro,
in vitro
На фиг.10 представлен другой вариант осуществления биореактора 1. Биореактор 1 на фиг.10 содержит матрицу 3электромагнитов, находящуюся на наружной поверхности реакционной емкости. Матрица 3 электромагнитов позволяет смешение реакционной смеси (посредством циркуляции магнитных частиц или магнитных частиц с ДНК в реакционной смеси), которое обеспечивается периодической активацией указанной матрицы 3 электромагнитов. Это позволяет бесконтактное смешение реакционной смеси, содержащей магнитные частицы или магнитные частицы с ДНК, предполагая, что в процессе смешения не должны быть использованы средства смешения, что является преимущественным признаком в контексте достаточной очищаемости биореактора 1, например, при фармацевтическом продуцировании РНК. Более того, смешение в реакции РНК  может проводиться без вращения/качания биореактора 1. Это является особенно преимущественным, поскольку вращению или качанию могут в значительной степени препятствовать различные отверстия впуска и выпуска, которые должны быть установлены на биореакторе 1. Кроме того, указанную матрицу 3 электромагнитов можно использовать для улавливания магнитных частиц с ДНК до начала другого цикла транскрипции РНК  тем самым позволяя многократную периодическую транскрипцию РНК  (IVT) на одной и той же ДНК-матрице, что значительно снижает общую стоимость продуцирования РНК. Кроме того, указанную матрицу 3 электромагнитов можно использовать для удаления магнитных частиц с ДНК для конечной очистки или дезинфекции биореактора 1. Таким образом, ДНК можно удалять без необходимости в ферментативной обработке ДНК-азой, что (i) снижает стоимость, поскольку такой фермент не требуется, (ii) снижает риск контаминации РНК-продукта дополнительным компонентом (который представляет собой ДНК-азу), и (iii) снижает риск контаминации конечного РНК-продукта фрагментами ДНК или частично расщепленными фрагментами ДНК.
Кроме того, на фиг.10 показан уровень 27 заполнения жидкости, находящейся в реакционной емкости 2. Кроме того, пунктирной линией показана максимальная амплитуда 28 жидкости. Таким образом, под максимальной амплитудой 28 жидкости понимают амплитуду, которой жидкость, находящаяся в реакционной емкости 2 и приведенная в движение встряхиванием или вращением, максимально достигает на внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2. Кроме того, биореактор 1 содержит впускное отверстие 8, находящееся в реакционной емкости, которое позволяет заполнение средой реакционной емкости 2. Как можно видеть на фиг.11, впускное отверстие 8 находится сбоку на реакционной емкости 2 и ниже уровня максимальной амплитуды 28 жидкости на внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2. Эта конфигурация может помочь предотвратить, например отложение и застывание белковых остатков на внутренней поверхности 21 реакционной емкости 2, что может произойти в случае, когда впускное отверстие находится выше максимальной амплитуды жидкости. В последнем случае остатки после заполнения реакционной емкости 2 могут откладываться, например, на и/или вокруг впускного отверстия. Более того, боковое положение впускного отверстия 8 близко к уровню 27 заполнения позволяет заполнение средой реакционной емкости без нежелательного возникновения всплесков, которые могут приводить к отложению и застыванию остатков на внутренней поверхности 21 реакционной емкости. Выше впускного отверстия 8 находится впускная трубка 83 для заполнения средой реакционной емкости 2 через впускное отверстие 8. Биореактор 1 дополнительно содержит отверстие 7 сброса для отработанного газа или отработанных жидкостей. Отверстие 7 сброса может использоваться, например, для вентилирования реакционной емкости 2 в ходе заполнения емкости. В связи с этим, отверстие 7 сброса находится в самой верхней точке реакционной емкости 2. Ниже отверстия 7 сброса находится отводящий канал 74, который позволяет отведение отработанного газа или отработанных жидкостей, которые выходят из емкости 2 через отверстие 7 сброса. Кроме того, выпускное отверстие 6 находится в самой нижней точке реакционной емкости 2, тем самым обеспечивая удобную подачу или слив жидкостей через выпускное отверстие 6 для дальнейшего направления этих жидкостей через выпускную трубку 66.
in vitro
На фиг.11 представлен другой предпочтительный вариант осуществления биореактора 1 в соответствии с настоящим изобретением. Помимо компонентов, уже показанных на фиг.1-10 - а именно, например, реакционной емкости 2 и магнитного элемента 3, отверстия 7 сброса, отводящего канала 74, выпускного отверстия 6, выпускной трубки 66, впускного отверстия 8, впускной трубки 83, а также уровня 27 заполнения, указывающего на линию контакта поверхности жидкости на внутренней поверхности реакционной емкости 2, и максимальной амплитуды 28 жидкости - вариант осуществления на фиг.11, кроме того, включает магнитную ловушку 61, находящуюся у выпускного отверстия 6, для минимизации риска контаминации РНК-продукта магнитными частицами с ДНК и/или магнитными частицами с ДНК. Это подразумевает, что магнитная ловушка 61 помогает удерживать магнитные частицы и/или магнитные частицы с ДНК в реакционной емкости 2 при сливе продуцированной РНК из реакционной емкости 2 через выпускное отверстие 6. Магнитная ловушка 61 может, например, по меньшей мере частично окружать выпускное отверстие 6 или выпускную трубку 66, примыкающую снизу к выпускному отверстию 6. Предпочтительно, магнитная ловушка 61 может представлять собой кольцевой магнит, например, электромагнит в форме кольца. Ниже выпускного отверстия 6 и магнитной ловушки 61 находится многопозиционный клапан 62. Многопозиционный клапан 62 соединяет выпускное отверстие 6 или выпускную трубку 66, соединенную снизу с выпускным отверстием 6, с тремя дополнительными линиями. Первая из трех линий служит для отведения содержащего РНК жидкого компонента после успешной реакции транскрипции РНК . Для мониторинга отсутствия магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК в этом компоненте присутствует датчик Холла 63 ниже многопозиционного клапана 62 на первой линии. Таким образом, датчик Холла 63 предназначен для детекции нежелательных магнитных полей в РНК-продукте. Вторая линия, соединенная с выпускным отверстием 6, служит в качестве отводящего канала 67 для, например, очищающих жидкостей. Для мониторинга на второй линии находится проточная ячейка 64. Третья линия, соединенная с многопозиционным клапаном 62, может отводить отработанный газ или очищающий газ, например, N2 или синтетический раствор, в направлении, указанном стрелкой 65. Отработанный газ или очищающий газ может циклически направляться многопозиционным клапаном 62 в направлении выпускного отверстия 6. Таким образом, может быть предотвращено оседание магнитных частиц и/или магнитных частиц с ДНК на выпускном отверстии, вызывающее засорение отверстия.
in vitro
Кроме того, биореактор 1 содержит температурные элементы, например элементы Пельтье 9, для обеспечения нагревания или охлаждения биореактора 1 до 37°C, что является оптимальной температурой для транскрипции РНК , и нагревания биореактора 1 до 80°C, которая является оптимальной температурой для очистки/дезинфекции биореактора 1. Кроме того, в реакционной емкости 2 находится температурный датчик 91 для мониторинга температуры реакционной емкости 2. Кроме того, температурные датчики могут находиться на внутренней поверхности 21 реакционной емкости и/или вблизи реакционной емкости (например, на впускном отверстии или выпускном отверстии). Например, дополнительный датчик 92 может находиться внутри реакционной емкости 2 для измерения, например, температуры, величины pH или концентрации соли.
,
in vitro
Также на фиг.11 биореактор 1 дополнительно содержит многопозиционный клапан 71 ниже отверстия 7 сброса и отводящего канала 74, примыкающего к отверстию 7 сброса. Посредством многопозиционного клапана 71, отверстие 7 сброса и отводящий канал 74 соединены с линией для отработанной жидкости посредством проточной ячейки 72 сброса, присутствующей на этой линии для мониторинга потока отработанных жидкостей. Кроме того, многопозиционный клапан 71 соединяет отверстие 7 сброса и канал 74 сброса с вытяжной трубкой 73 для отработанных газов, которые могут появиться, например, в ходе заполнения или очистки реакционной емкости 2. Необязательно, на отверстии сброса или отводящем канале 74 может присутствовать датчик 76 давления для измерения давления на отверстии 7 сброса и/или в отводящем канале 74. На впускной трубке 83 выше впускного отверстия 8 находится нагревательный элемент 81, примером которого является нагревательная нить. Выше участка трубки с нагревательным элементом 81 находится проточная ячейка нагревательного элемента для мониторинга подачи компонентов в реакционную емкость 2. Указанный нагревательный элемент 81 можно использовать для доведения среды, которой заполнен реактор, до желаемой оптимальной температуры (например, 37°C для транскрипции РНК ).
На фиг.12A и 12B, а также на фиг.13 представлены альтернативные конструкции магнитного элемента биореактора 1 в соответствии с настоящим изобретением. На фиг.12A и 12B представлен вариант осуществления биореактора 1, содержащего реакционную емкость 2 с выпускным отверстием 6, отверстием 7 сброса, и впускным отверстием 8, а также магнитный элемент 3. Следует отметить, что элементы, упомянутые в контексте биореактора, как указано на фиг.11, аналогично могут быть частью реактора, показанного на фиг.12A, 12B (например, температурный датчик 91, датчик Холла 63, проточные ячейки 64, яйцеобразная форма, и т.д.), даже если они явно ну упоминаются в настоящем описании. Магнитный элемент 3 выпускается в форме магнита, предпочтительно электромагнита, или постоянного магнита, который может двигаться в направлении к и от реакционной емкости 2 вдоль поперечной оси реакционной емкости 2, как указано стрелками 363, или контролируемых катушек Гельмгольца. Кроме того, магнитный элемент 3 может двигаться вверх и вниз вдоль продольной оси реакционной емкости 2, как указано стрелками 362. Для этого магнитный элемент 3 размещают на подвижной опоре 361, которая обеспечивает описанное выше движение магнитного элемента 3. Кроме того, как далее указано на фиг.12A и 12B, в этом варианте осуществления реакционная емкость 2 может вращаться вокруг ее вертикальной оси. Альтернативно реакционная емкость 2 может быть установлена на подвижную опору (не показана), которая позволяет описанное выше движение реакционной емкости 2 относительно магнитного элемента 3 (который может не быть установлен на подвижной опоре 361). Кроме того, как далее указано на фиг.12A и 12B, в этом варианте осуществления реакционная емкость 2 может вращаться вокруг ее вертикальной оси
На фиг.12A показан биореактор 1 в состоянии, в котором магнитный элемент 3 двигается в боковом направлении от реакционной емкости 2, в то время как на фиг.12B представлена конфигурация, где магнитный элемент 3 находится в наиболее близком положении сбоку к реакционной емкости 2.
На фиг.13 представлен вариант осуществления биореактора 1 с магнитным элементом 3, выполненным посредством по меньшей мере двух магнитных катушек, которые способны вращаться вокруг реакционной емкости, как указано стрелками 111, и находятся на горизонтальной планке 11 опоры 10. Горизонтальная планка 11 может двигаться вверх и вниз, как указано стрелками 110, так что, кроме того, может изменяться положение магнитных полей магнитных катушек 3 в реакционной емкости 2. Следует отметить, что элементы, упомянутые в контексте биореактора, как указано на фиг.1-11, аналогично могут быть частью реактора, показанного на фиг.13 (например, температурный датчик 91, датчик Холла 63, проточные ячейки 64, яйцеобразная форма, и т.д.), даже если это явно не указано в настоящем описании.
На фиг.14A и 14B представлены варианты осуществления биореактора 1, которые позволяют смешение или перемешивание компонентов, находящихся в реакционной емкости, посредством механического средства, обеспечивающего движения, а также либо дополнительного направления технологического газа или технологической жидкости в реакционную емкость, либо путем взаимодействия магнитных частиц и магнитного элемента.
2
Помимо компонентов, уже описанных в контексте фиг.11, на фиг.14A представлен биореактор 1 с реакционной емкостью 2, находящейся на орбитальном встряхивателе OS. Орбитальный встряхиватель OS позволяет 3-мерное движение реакционной емкости, предпочтительно с небольшими амплитудами, вследствие соединений для жидкостей, газа, датчиков беориактора, которые не должны быть повреждены движением реакционной емкости 2. Для индукции движения реакционной емкости 2 посредством орбитального встряхивателя OS, ее размещают над орбитальным встряхивателем OS. Реакционная емкость 2 сбоку по меньшей мере частично окружена и, таким образом, может удерживаться опорой 20. Опора 20 содержит элементы Пельтье 9 для нагревания и/или охлаждения реакционной емкости. Через выпускное отверстие 6 и выпускную трубку 66 на фиг.14A, технологический газ, предпочтительно N, или альтернативно технологическая жидкость могут быть направлены в реакционную емкость 2 для обеспечения дополнительного движения для смешения/перемешивания компонентов, удерживаемых в реакционной емкости 2. Выпускное отверстие 6 и выпускная труба 66 также служат для выпуска среды, например, продуцированной РНК, из реакционной емкости. Через впускную трубку 83 и впускное отверстие 8 реакционная емкость может заполняться средой. Кроме того, на фиг.14A представлено отверстие 7 сброса и отводящий канал, находящийся в самой верхней точке реакционной емкости.
На фиг.14B представлен вариант осуществления биореактора 1, который позволяет смешение или перемешивание компонентов, находящихся в емкости 2, путем взаимодействия катушки Гельмгольца и магнитных частиц, орбитального встряхивателя OS и направления технологического газа или технологической жидкости в реакционную емкость. В связи с этим, орбитальный встряхиватель OS соединен через горизонтальную опору S с реакционной емкостью 2, которая удерживается опорой S и которая находится в центре магнитного элемента 3. Магнитный элемент в данном случае реализован в форме катушки Гельмгольца. Часть опоры, которая удерживает реакционную емкость 2, содержит углубления, в которых находятся элементы Пельтье 9. Элементы Пельтье находятся вблизи или даже касаются реакционной емкости для эффективного нагревания и/или охлаждения емкости. В дополнение к вышеупомянутым компонентам, на фиг.14B представлено впускное отверстие 8 и впускная трубка 83, отверстие 7 сброса и отводящий канал 74, а также выпускное отверстие 6 и выпускная трубка 66, последние из которых сходны с теми, что описаны в контексте фиг.11 и фиг.14A.
На фиг.15 представлен вариант осуществления модуля для транскрипции ДНК в РНК. Он содержит элемент для получения основной смеси 12 IVT, также называемый устройством предварительного смешения. Как указано стрелками, подходящими к элементу для получения основной смеси 12 IVT, этот элемент 12 может быть заполнен буфером IVT (HEPES, Tris), смесью нуклеотидов (содержащей нуклеотиды и необязательно модифицированные нуклеотиды), ДНК-зависимой РНК-полимеразой, аналогом кэпа, ингибитором РНК-азы, пирофосфатазой, MgCl2, антиоксидантом (DTT), бетаином, цитратом.
Соответствующие компоненты могут быть предоставлены посредством стойки для подачи среды (не показана). Продуцированная основная смесь IVT направляется из элемента для получения основной смеси 12 IVT через линию 121 в биореактор 1 в соответствии с настоящим изобретением. Помимо основной смеси IVT, ДНК поступает в биореактор 1 посредством линии 122. Кроме того, биореактор 1 может быть заполнен буфером для промывания путем подачи через линию 123. Будет понятно, что заполнение биореактора 1 происходит через впускное отверстие 8 биореактора 1, как в качестве примера показано и обсуждается в контексте фиг.12-15. Кроме того, на фиг.5, исходный РНК-продукт направляется через линию 124 в устройство 13 для кондиционирования, например, работающее посредством проточной фильтрации вдоль потока. После кондиционирования РНК направляется в устройство 14 для очистки РНК (например, ОФ-ВЭЖХ, с использованием способа, описанного в WO2008/077592; PureMessenger). Устройство 14 для очистки РНК предпочтительно представляет собой устройство ОФ-ВЭЖХ для автоматизированной очистки и фракционирования исходной РНК. Устройство 14 для очистки РНК, дополнительно или альтернативно содержит устройство для очистки олиго-dT для автоматизированной очистки и фракционирования исходной РНК. Как указано посредством точечной стрелки, РНК затем может быть направлена в другие устройства, например, в другое устройство для кондиционирования РНК, например, посредством проточной фильтрации вдоль потока, и/или устройство для стерильной фильтрации РНК.
В качестве пригодной обстановки для проведения процесса в контексте настоящего изобретения может быть предоставлено технологическое помещение или площадь. Технологическое помещение или площадь могут быть отделены от систем контроля, необходимых для контроля и/или мониторинга процесса. В технологическом помещении может находиться экспериментальная установка. Передняя часть технологического помещения может открываться, например, посредством раздвижных дверей. Основание технологического помещения может состоять из модульной структуры, которая может быть разделена на три части. В качестве примера, три модуля могут состоять из модуля размером один метр, модуля размером два метра и задней части, имеющей общую длину 3,5 метра и высоту приблизительно 2 метра. Кроме того, может быть включена система выпуска отработанных газов, которая может требовать дополнительного пространства. Поступление среды может осуществляться в модуле размером один метр, и оно должно быть физически отделено от фактического технологического помещения, находящегося в модуле размером два метра, посредством разделяющей стенки. Разделяющая стенка может быть выполнена, например, в виде стеклянного разделителя, а также шторки из PVC, находящейся позади раздвижных дверей.
Внутреннее технологическое помещение может быть необязательно соединено с системой выпуска отработанных газов. Могут быть желательными дополнительные меры безопасности для жидкостей, которые перерабатываются. Это включает защиту от взрыва и/или дополнительные биологические и химические меры безопасности, которые могут быть находиться в технологическом помещении.
in vitro
in vitro
in vitro
Нафиг.16 представлена блок-схема для способа транскрипции РНК  согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения. Способ включают стадию S1, на которой магнитные частицы, ДНК-матрицы, буфер для иммобилизации ДНК и основная смесь IVT подаются в реакционную емкость биореактора согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения. На стадии S2 магнитные частицы, ДНК-матрицы и буфер для иммобилизации ДНК смешиваются посредством взаимодействия магнитных частиц и магнитного элемента биореактора для получения магнитных частиц с ДНК, которые представляют собой ДНК-матрицы, иммобилизованные на свободно плавающих магнитных частицах. На стадии S3 способа магнитные частицы с ДНК смешиваются с основной смесью для IVT посредством взаимодействия магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента с получением РНК. После стадии S3 способ может включать стадию S4, включающую улавливание магнитных частиц с ДНК посредством магнитного элемента и накопления/сбора полученной  транскрибированной РНК, например, посредством выпускного отверстия (S4a), предоставление свежей основной смеси IVT в реакционной емкости биореактора согласно первому аспекту (S4b), высвобождение уловленных магнитных частиц с ДНК для обеспечения свободно плавающих магнитных частиц с ДНК (S4c), смешение свободно плавающих магнитных частиц с ДНК с основной смесью для IVT посредством взаимодействия магнитных частиц с ДНК и магнитного элемента с получением РНК (S4d), и, наконец, удаление магнитных частиц с ДНК из РНК с получением свободной от ДНК транскрибированной  РНК. Следует отметить, что S4 можно проводить несколько раз.
В дополнение к вышеуказанным стадиям, стадию ST нагревания реакционной емкости биореактора можно проводить между стадиями S1 и S2 или/и между стадиями S2 и S3. После стадии S3 может дополнительно следовать стадия очистки или дезинфекции SC, где реакционную емкость очищают очищающей жидкостью и/или очищающим газом S3.
in vitro
in vitro
Фиг.17 и 18 относятся к вариантам осуществления автоматизированного устройства для производства РНК в соответствии с настоящим изобретением. На фиг.17 представлен пример с модулями автоматизированного устройства и элементами для каждого модуля. Устройство содержит модуль для синтеза ДНК ("генератор матрицы"), T, модуль для транскрипции ДНК в РНК, M, и модуль для составления РНК, и заполнения и заключительной обработки, F. Модуль для синтеза ДНК содержит устройство 40 для предварительно смешения, которое представляет собой элемент для получения основной смеси 41 для ПЦР, которая направляется в элемент для препаративной ПЦР 42. Затем полученная исходная ДНК-матрица направляется в элемент 43 для кондиционирования ДНК. Точечной линией, а также точечной рамкой указано, что кондиционированная ДНК-матрица может далее направляться в дополнительные элементы, такие как элемент для очистки (например, включающий ОФ-ВЭЖХ и/или олиго-dT). Затем очищенная ДНК может выходить, как указано пунктирной стрелкой, указывающей горизонтально, из модуля T. Однако очищенная ДНК также может поступать в модуль M, в частности, в элемент 1, биореактор, модуля N. В качестве дополнительного входа, в биореактор 1 поступает основная смесь IVT из элемента для получения основной смеси 12 для IVT. Исходная РНК, продуцированная посредством реакции транскрипции РНК  в биореакторе 1, направляется в элемент для кондиционирования исходной РНК (например, включающий TFF), 13, а затем в элемент в элемент 14 для очистки РНК (например, включающий ОФ-ВЭЖХ и/или олиго-dT). Как указано пунктирной линией и пунктирной рамкой, далее могут следовать дополнительные элементы, которые могут далее обрабатывать и/или очищать полученную РНК (например, модуль кэппирования РНК для присоединения структуры кэпа 0 или кэпа 1 к транскрибированной  РНК, модуль полиаденилирования РНК, модуль смешения РНК, модуль распылительной сушки РНК, модуль лиофилизации РНК). После описанных стадий РНК поступает в модуль F. В этом модуле может продуцироваться, например, инкапсулированная в LNP РНК посредством комбинирования различных элементов, содержащих по меньшей мере один из элемента для смешения, элемента для кондиционирования (например, посредством TFF), элемента для стерильной фильтрации и элемента для заполнения полученного лекарственного продукта.
in vitro
,
На фиг.18 представлен обзор стадий способа, включающих синтез ДНК, очистку ДНК и транскрипцию РНК , проводимых в контексте примера 1 описанного ниже.
Пример
Приведенный ниже пример является только иллюстративным и далее описывает настоящее изобретение. Этот пример не следует истолковывать как ограничивающий настоящее изобретение.
Пример: Модельная партия
in vitro
in vitro
in vitro
В качестве иллюстративного примера процессов и способов, описанных в контексте изобретения, в лаборатории был проведен иллюстративный процесс получения модельной партии вручную. Соответствующие стадии способа представлены на фиг.18. В ходе первой стадии, стадии получения ДНК-матрицы, проводили подстадии ПЦР (полимеразная цепная реакция), T1, и очистки ДНК (с использованием ОФ-ВЭЖХ), T2, а также очистки AXP (с использованием Agencourt AMPure XP). Таким образом, последняя подстадия T3 не проводится в конечном и автоматизированном процессе согласно вариантам осуществления настоящего изобретения и требуется только для обрабатываемой вручную модельной партии согласно примеру. На следующей стадии проводят транскрипцию РНК , где эта стадия включает следующие подстадии: первая подстадия иммобилизации ДНК, M1, где ДНК-матрицы иммобилизуют на свободно плавающих магнитных гранулах. Вторая подстадия M2 относится к реакции транскрипции РНК . В качестве следующей подстадии (не указана на фиг.20), проводят очистку AXP, где вновь эту стадия не будет проводиться в конечном и автоматизированном процессе, а проводится только для обрабатываемой вручную модельной партии. На подстадии M3, продуцированная исходная РНК очищается. Подстадия M4 относится к ультрафильтрации (UF)/диафильтрации (DF), например, с использованием TFF, и на подстадии M5 проводят стерильную фильтрацию. Этот пример не является ограничивающим, и чтобы подчеркнуть тот факт, что можно проводить дополнительные стадии способа, пунктирная рамка у ссылочной позиции M5 указывает на то, что могут дополнительные подстадии на стадии транскрипции РНК . На третьей стадии проводят составление продуцированной исходной РНК. Для этого на подстадии F1 проводили смешение в пределах линии. В качестве следующей стадии, не указанной на фиг.20, проводили диализ, где также эту подстадию не включают в конечный и автоматизированный процесс, и она требовалась только для обрабатываемой вручную модельной партии. Следующая подстадия F2 относится к UF/DF, за которой следует стадия криопротеции, также не указанная на фиг.20, поскольку эта стадия требуется только для обрабатываемой вручную модельной партии. Последние три подстадии также могут быть объединены в одну стадию UF/DF. На подстадии F3 проводят стерильную фильтрацию. Пунктирной рамкой у ссылочной позиции F4 показано, что в способ согласно изобретению могут быть включены дополнительные подстадии. Однако в случае примера дополнительные подстадии не проводили.
in vitro,
in vitro
Многократная периодическая транскрипция РНК  проводимая в соответствии с примером, включает стадии получения матрицы для ПЦР и очистки ДНК-матрицы, обе из которых проводят в генераторе матрицы. На следующей стадии продуцирования РНК на первой подстадии происходит иммобилизация матрицы, после которой следует стадия многократной периодической реакции транскрипции РНК . После последней из них следует подстадия многократной периодической ВЭЖХ и, наконец, подстадия однократной TFF.
in vitro,
in vitro
in vitro
Результаты многократной, т.е. повторяющейся реакции транскрипции РНК  приведены на фиг.19. Одну и ту же иммобилизованную ДНК-матрицу использовали в 3 реакциях транскрипции РНК . Результаты показывают стабильную производительность на протяжении трех циклов транскрипций РНК , как количественно, так и качественно.
in vitro,
На фиг.20A и B, представлен анализ эффективности РНК продуцированного лекарственного вещества, продуцированной (очищенной посредством ВЭЖХ) РНК, экспрессированной в клетках HepG2 (мРНК RAVG), демонстрируя, что многократная реакция транскрипции РНК  которую в подходящем случае можно проводить в биореакторе по изобретению, продуцирует РНК высокого качества надежным и воспроизводимым образом.
Следует отметить, что варианты осуществления изобретения описаны применительно к различным объектам. В частности, некоторые варианты осуществления описаны в отношении пунктов формулы изобретения на способ, в то время как другие варианты осуществления описаны в отношении пунктов формулы изобретения на устройство. Однако специалист в данной области установит из приведенного выше и ниже описания, что, если нет иных указаний, в дополнение к любой комбинации признаков, относящихся к одному объекту, также в качестве раскрытой в настоящей заявке можно рассматривать любую комбинацию признаков, касающихся объектов. Однако можно комбинировать все признаки, обеспечивающие синергические эффекты, которые являются более чем простым суммированием признаков.
Хотя изобретение проиллюстрировано и подробно описано на чертежах и в приведенном выше описании, такая иллюстрация и описания считаются иллюстративными и типовыми, но не ограничивающими. Изобретение не ограничивается описанными вариантами осуществления. Другие изменения описанных вариантов осуществления могут быть понятными и выполнены специалистами в данной области при применении заявленного изобретения на практике, при изучении чертежей, описания и зависимых пунктов формулы изобретения.
В формуле изобретения слово "содержащий" не исключает других элементов или стадий, и форма единственного числа не исключает множественного числа. Только тот факт, что определенные признаки указаны во взаимно различающихся зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что комбинацию этих признаков нельзя использовать для достижения преимущества. Никакие и ссылочных позиций в формуле изобретения не следует истолковывать как ограничивающие объем.
Перечень ссылочных позиций
1 - биореактор
10 - опора
11 - горизонтальная планка
110 - стрелка
111 - стрелка
2 - реакционная емкость
21 - внутренняя поверхность реакционной емкости
23 - наружная поверхность реакционной емкости
24 - прерыватель потока
25 - первая ножка реакционной емкости
251 - первый патрубок
26 - вторая ножка реакционной емкости
261 - второй патрубок
27 - уровень заполнения
28 - максимальная амплитуда жидкости
3 - магнитный элемент
31 - магнитное кольцо
32 - стержень
320 - первый стержень
321 - свободный конец первого стержня
322 - второй стержень
323 - свободный конец второго стержня
33 - центр магнитного элемента
34 -внутренний периметр магнитного кольца
350 - направляющая пластина
351 - электрическая катушка
352 - охлаждающее средство
36 - ось вращения
37 - ручка
38 - приводное средство вращения
39 - приводное средство
361 - подвижная опора
362 - стрелка
363 - стрелка
5 - температурный элемент
51 - теплообменный канал
52 - первый конец теплообменного канала
53 - второй конец теплообменного канала
54 - нагревательная нить
55 - теплоизолирующий материал
6 - отверстие для среды/ выпускное отверстие
60 - клапанный механизм
61 - магнитная ловушка
62 - многопозиционный клапан
63 - датчик Холла
64 - проточные ячейки
65 - стрелка
66 - трубка для среды/выпускная трубка
67 - отводящий канал
7 - выходное отверстие/отверстие сброса
71 - многопозиционный клапан
72 - проточная ячейка сброса
73 - выводная трубка
74 - отводящий канал
76 - датчик давления
8 - впускное отверстие
81 - нагревание
83 - впускная трубка
91- температурный датчик
92 - дополнительный датчик
12 - основная смесь IVT
121 - линия в биореактор
122 - линия
123 - линия
124 - линия
13 - устройство для кондиционирования
14 - очистка РНК
40 - устройство для предварительного смешения
41 - основная смесь для ПЦР
42 - препаративная ПЦР
43 - элемент для кондиционирования ДНК