ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА
YEAST STRAIN Saccharomyces cerevisiae USED FOR OBTAINING ALCOHOL

Изобретение относится к спиртовой промышленности и представляет собой новый штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae В - 3855, используемый для производства спирта.
В производстве спирта из мелассы дрожжи должны обладать высокой бродильной энергией с анаэробным типом дыхания, переносить большую концентрацию солей и сухих веществ, быть устойчивыми к продуктам обмена посторонних микроорганизмов.
В производстве спирта из мелассы применяются различные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и среди них наиболее распространенной является производственная раса Я, с хорошими технологическими свойствами [1, 2] - аналог. Однако, эта раса имеет сравнительно невысокую генеративную активность, обладает повышенной потребностью к стимуляторам роста, чувствительностью к вредным примесям мелассной среды. В морфологическом отношении штамм неоднороден по величине и форме, с наличием в популяции удлиненных клеток, имеющих замедленную скорость роста, более длительное время генерации по сравнению с овальными клетками.
Известно также, что традиционной средой для выращивания дрожжей S. cerevisiae, используемых в спиртовой промышленности является мелассная питательная среда. Создание современных прогрессивных технологий пищевого спирта диктует необходимость получения физиологически активных рас дрожжей, обеспечивающих эффективное сбраживание концентрированного мелассного сусла. Нами установлено, что минеральные и органические вещества геотермальной воды нефенольного класса можно рассматривать как новый источник питания дрожжей. Установлено также, что интенсификация синтеза этанола на 25% и значительное снижение весьма нежелательных примесных соединений с использованием штамма S. cerevisiae Y-503 обусловлены возможностью изменения метаболизма дрожжей на основе влияния биологически активных веществ геотермальной воды [3, 4]. В связи с этим, новый штамм получают на мелассной питательной среде, где в качестве минерального и органического питания используют геотермальную воду нефенольного класса с общей минерализацией 5.2-5.4 г/л, разбавленную водопроводной водой до минерализации 4.0-5.2 г/л. Наличие таких важных минеральных веществ, необходимых для жизнедеятельности живых организмов, как K, Na, Mg, Ca, Fe, Mn, а также борная, кремниевая кислоты, органические вещества, в частности, гумусовые, являющиеся стимуляторами мембранных перестроек в живой клетке, создают благоприятные условия в среде культивирования для выращивания дрожжевых организмов.
3
Задачей изобретения является создание стабильного штамма спиртовых дрожжей для эффективного сбраживания мелассной питательной среды с использованием геотермальной воды нефенольного класса с концентрацией углеводов 21.0 г / 100 см, способного сохранять спиртоустойчивость, высокие биохимические и технологические свойства в результате селекции при длительном пассажировании его на твердых и жидких средах. Технический результат направлен на повышение выхода спирта.
Предлагаемый штамм дрожжей имеет следующую характеристику. Морфолого-культуральные признаки. Клетки в суточной культуре на мелассной питательной среде с геотермальной водой (МПСГВ) имеют округло-овальную форму, размером 6-8×11-13 мкм; на МПСГВ + агар - овальная, яйцевидная, размером 6-7×11-12 мкм. Культура размножается вегетативным путем, образует сумки со спорами (среда Городковой, гипсовые блоки, голодный агар). Микроколонии на МПСГВ + агар - округлые, гладкие, слегка блестящие с ровным краем, размером 4-7 мм, палевого цвета. Макроколонии (20-ти суточная)- округлой формы, размером 2.9×2.7 см, поверхность радиально исчерченная с концентрическими кругами, слегка блестящая, светло-палевая, край волнистый, профиль слегка выпуклый с небольшими конусом, структура однородная, консистенция мажущаяся (рис.1,2).
3
Физиолого-биохимические признаки. Штамм S. cerevisiae В - 3855 полностью сбраживает: глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, простые декстрины; не сбраживает и не усваивает лактозу и инулин. Усваивает уксусную, молочную, не усваивает янтарную, яблочную, винную, лимонную кислоты [5]. Сбраживает высококонцентрированные рассиропки с содержанием углеводов 21.0 г / 100 см, синтезируя 12.4 об.% спирта. Оптимальная температура роста 20-30°С, однако может расти и при температуре 32-33°С. Оптимальными значениями рН среды являются 4.5-5.5.
Предлагаемый штамм S. cerevisiae В - 3855 хранится в ВКПМ ГНИИгенетика под коллекционным номером В - 3855 и в дрожжевой коллекции Прикаспийского института биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН г.Махачкала. Пример получения штамма.
Исходной культурой для получения штамма S. cerevisiae В - 3855 служил штамм S. cerevisiae Y-503 [4]. Для получения дрожжей с требуемыми свойствами была проведена адаптация штамма S.cerevisiae Y-503 к мелассной питательной среде с геотермальной среднеминерализованной, сульфатно-хлоридно-гидрокарбонатной натриевой водой из скважины №26 Махачкалинского месторождения. По мере воздействия состава питательной среды микроорганизмы адекватно изменились, что привело к возникновению новых форм. При этом немаловажное значение имела и частота пересевов на свежие среды.
3
На первом этапе исследований из отдельных многочисленных микроколоний (95), путем поиска полезных морфофизиологических свойств был проведен скрининг активных популяций исследуемых рас. В результате было выделено 6 монокультур путем рассева отобранных клонов на питательные среды с повышенной концентрацией сухих веществ. Наблюдения за динамикой брожения всех культур выявили идентичность выделения углекислого газа в течении первых 24 ч после инокуляции. Значительный рост бродильной активности проявился на 3-8-е сутки, который в большей мере отмечен у 3-х вариантов. На втором этапе адаптированную дрожжевую суспензию высевали на плотную мелассную питательную среду с геотермальной водой. Каждая выросшая колония отсевалась на скошенное агаризированное мелассное сусло. На всех этапах исследования осуществлялся контроль за функциональной морфологией дрожжевых клеток. Наблюдения велись за скоростью и характером почкования, ростом, размножением, формой и величиной клеток. Из них наибольшей бродильной способностью, лучшими морфофизиологическими свойствами обладала культура В - 3855. Концентрация этанола в бражке увеличилась и составила 12.4 об %. Сравнительное исследование динамики сбраживания мелассного сусла с концентрацией углеводов 21.0 г / 100 смселекционным штаммом В - 3855, исходным Y-503 и промышленным - Я, показали перспективность использования отобранного штамма.
Предлагаемый штамм хранится на скошенном МПСГВ+агар в холодильнике при температуре 0±6°С.
Пример использования штамма.
3
Выращивание дрожжей с использованием предлагаемого штамма S. cerevisiae В - 3855 осуществляют в течение 72 ч глубинным методом в периодическом режиме в анаэробных условиях в лабораторной установке при температуре 30°С±1, рН 5.0 на мелассной питательной среде с геотермальной водой (МПСГВ) и содержанием углеводов 21.0 г / 100 смследующего состава (г/л):
- меласса 488.74
- гидроортофосфат аммония 2.58
- геотермальная вода с минерализацией 4.0-4.2 г/л с определенным качественным и количественным составом необходимым для выращивания дрожжей остальное
3
К мелассе добавляют разбавленную водопроводной водой геотермальную воду до содержания в среде углеводов 21.0 г/100 см, гидроортофосфат аммония - 2.58 г/л, концентрированную серную кислоту, для достижения в среде рН 5.0, из расчета 0.4-0.6 мл на 100 г мелассы. Содержимое хорошо перемешивают. Стерильную питательную среду разливают по 1.5 л. в сосуды вместимостью 3 л., затем засевают вегетативной культурой указанного штамма в количестве 150 мл. из дрожжевой суспензии последней стадии адаптации на МПСГВ, 1 мл которой содержится 95.6 млн/мл клеток. В качестве пеногасителя используют структол 0.1 мл/1.5 л среды. По окончании 72-х часового эксперимента дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием (5000g, 15 мин) на лабораторной стационарной центрифуге ЦЛС-344.2. По завершению эксперимента в сброженном субстрате определены остаточный сахар, накопление спирта и содержание примесных соединений. Наибольшее количество спирта отмечено в образце S. cerevisiae В - 3855 при минимальном содержании остаточного сахара (табл.1).
Усвоение раффинозы данной культурой (предлагаемый штамм) происходит в большей степени, чем исходным S. cerevisiae Y-503 и производственной расой Я (на 1/3), что обусловлено активацией фермента α-галактозидазы, катализирующего сбраживание этого углевода. Видимо, органические компоненты геотермальной воды (гуминовые кислоты), влияя на коллоиднохимические свойства протоплазмы и эффективность использования клеткой из питательной среды биологически активных веществ, усиливают тем самым ферментативную активность живой клетки.
2
Установлено, что опытный вариант имеет более высокий уровень активности β-фруктофуранозидазы, который проявляется с первых минут брожения. Обнаружено, что уровень активности альдолазы у штамма S. cerevisiae В - 3855 превышает показатели исходного и контрольного на 6 и 25% соответственно. Ключевым веществом анаэробного расщепления глюкозы и метаболизма Сахаров является пировиноградная кислота, разложение которой на ацетальдегид и СО катализируется пируватдекарбоксилазой. Полученные данные позволяют говорить о более высокой активности фермента в опытной живой биомассе на 27 и 37% по сравнению с исходной культурой и контролем. Заключительный этап брожения катализирует алкогольдегидрогеназа, восстанавливающая ацетальдегид до этанола. Активность данного фермента в клетках опытного варианта S. cerevisiae В - 3855 намного превышает данный показатель у исходного и контрольного (табл.2).
3
Анализ хроматограмм летучих примесей выявил идентичный качественный состав, причем штамм S. cerevisiae В - 3855 отличался количеством синтезируемых побочных метаболитов - 30.18% меньше по сравнению с S. cerevisiae Y-503, что является результатом изменения регуляторных функций клетки (табл.3). Так, S. cerevisiae В - 3855 синтезирует ацетальдегида почти вдвое меньше, чем штамм S. cerevisiae Y-503. Ацетон (на 29.16% меньше в опыте) может служить необходимым продуктом для образования высших спиртов, что нежелательно для получения основного продукта - этанола. С использованием культуры S. cerevisiae В - 3855 спирты: пропанол-1, изобутанол, бутанол-1, изоамилол и гексанол обнаружены в значительно меньшем количестве по сравнению со штаммом Y-503 (8518.24:10947.20 мг/дм, опыт: исходный). В большей степени присутствие пропанола-1 и изоамилола в контроле на 30 и 14%, соответственно, ухудшает технологическую характеристику субстрата с приобретенным сивушным запахом. Увеличение концентрации кротональдегида, как сильного лакриматора, в контроле на 40% сообщает горечь, ухудшает пробу спирта на окисляемость. Содержание фенилалкоголя и бензальдегида - гликозида с запахом горького миндаля, превышает пороговые концентрации в субстратах, но с использованием культуры S. cerevisiae В - 3855 они меньше на 19.5% и 32.9% соответственно. Очевидно, положительные результаты исследований обусловлены биохимическими изменениями в клетке в результате проведенной адаптации и селекции к соответствующим условиям культивирования.
3
Таким образом, использование штамма дрожжей S.cerevisiae В - 3855, способного сбраживать мелассное сусло с концентрацией углеводов 21.0 г/100 см, позволит интенсифицировать технологический процесс получения спирта до 12.4 об.%, снизить на 30% образование побочных метаболитов.
Библиография
1. Маринченко В.А., Метюгиев Б.Д., Щвец В.Н. Технология спирта из мелассы // Издательское объединение «Вища школа», Киев. 1975. С.75-153.
2. Микелов А.Н., Соболев Э.М., Боярский В.М. Бродильная способность рас дрожжей // Известия вузов. Пищ. технол. 1995. №5, 6. С.14-16.
3. Патент РФ №2329302 Способ сбраживания мелассного сусла / Ш.А.Абрамов, Э.А.Халилова // Б.И. 2008. №20.
4. А.с СССР №1284998 Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503, используемый в производстве хлебобулочных изделий / Ш.А.Абрамов, С.Ц.Котенко, Б.И.Далгатова, А.Т.Маммаев // Б.И. 1986, №3.
5. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. М.: Из-во АНСССР.1954, 212 с.
Таблица №2
Культура
Ферменты(Е/мг)
β-фруктофура нозидаза
Альдолаза
Пируватдекар боксилаза
Алкогольдегид рогеназа
S.cerevisiae Y-503 (исходный)
29.3±1.96
0.33±0.03
15.2±1.19
0.55±0.05
S.cerevisiae В - 3855 (опыт)
33.4±1.59
0.38±0.02
18.1±1.30
0.74±0.06
S.cerevisiae Я (контроль)
27.4±1.78
0.26±0.02
12.3±1.15
0.45±0.03
Таблица 3
Продукт брожения
Единица измерения
Мелассная питательная среда с геотермальной водой
Штамм Saccharomyces cerevisiae В - 3855
Штамм Saccharomyces cerevisiae Y-503
1. Ацетальдегид
мг/дм<sup>3</sup>
2318.74
4637.48
2. Ацетон
=
55.95
78.98
3. Этилацетат
=
26.95
54.67
4. Пропанол-1
=
3700.84
5253.26
5. Изобутанол
=
1116.52
1299.47
6. Бутанол-1
=
100.42
122.44
7. Изоамилол
=
3593.68
4244.99
8. Гексанол
=
6.78
27.04
9. Кротональдегид
=
27.28
68.47
10. Фенилалкоголь
=
580.33
720.88
11. Бензальдегид
=
62.81
93.62
Сумма примесных соединений
=
11590.3
16601.3