СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ ВОЛОС КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ИССЛЕДОВАНИЮ НА МАКРО- И МИКРОЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ
METHOD OF PREPARING CATTLE FUR SAMPLES FOR ANALYSIS OF MACRO- AND MICROELEMENT COMPOSITION

Изобретение относится к химической технологии и может быть использовано при подготовке проб биоматериала для исследования на макро- и микроэлементный состав, для очистки проб терминальных волос крупного рогатого скота.
В медицинской литературе известно, что волос является более подходящей тканью, чем кровь или моча, для исследования баланса микроэлементов. Он является метаболически активным, простым и безболезненным при получении материалом. Волосы используются как предпочтительный тест-объект Агентством по Защите Окружающей Среды США (АЗОС) для определения полученной дозы тяжелых металлов, для биологического мониторинга экологических антропогенных загрязнений окружающей среды. Однако интерполирование вопросов пробоподготовки волоса к описываемому исследованию из медицинской практики в ветеринарную недопустимо ввиду того, что волос животного находится в постоянном контакте с фекалиями и подстилочным материалом, что искажает результат исследования и не дает возможности объективной оценки минерального обмена в организме животного. В ветеринарии до настоящего времени не существует унифицированной методики подготовки проб волос животных к исследованию на макро- и микроэлементный состав. В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, т.о. заявляемое решение соответствует критерию изобретения «новизна».
Известен механический способ очистки (груминг) волосяного покрова длинношерстных животных (кошки, собаки, грива и хвост лошади), включающий чистку волоса гребнем, щеткой и т.д. Для очистки сильно загрязненных животных проводят мытье волосяного покрова нейтральным шампунем с тщательной отмывкой водой и высушиванием [2].
Существуют щетки для волос с механизмом очистки [5]. Такое устройство содержит корпус с прикрепленным к нему корпусом ручки, зубцы, установленные на рабочей поверхности корпуса, чистящий узел с чистящим элементом, накрывающим рабочую поверхность корпуса таким образом, что зубцы проходят через чистящий элемент. В щетку дополнительно введен узел управления чистящим узлом, состоящий из оси, установленной в корпусе, и полом корпуса ручки таким образом, что она проходит по оси их симметрии и обеспечивается ее вращение в корпусе и ручке.
Недостатком указанных способов является их гигиеническая цель, призванная проводить видимую очистку волоса, а также сложность их реализации для очистки проб исследуемого биоматериала, представляющего собой фрагменты волос. Помимо этого данные способы не обеспечивают нужной для биохимического исследования степени очистки волос от экзогенных загрязнений.
Известен способ очистки неорганических волокон от твердых частиц, используемый в химической, металлургической и других отраслях промышленности. Очистку осуществляют циклически. Пульпу, состоящую из воды и волокна, подогревают до 40-60°С и вращают в течение 2-3 мин с угловой скоростью 30-80 об/мин. Данный способ обеспечивает очистку неорганического волокна до нужной в промышленности степени его чистоты, однако не позволит достигнуть нужной степени чистоты исследуемой пробы волос для исследования на макро- и микроэлементный состав [6].
2
Известен способ, применяемый при обработке шерсти в текстильной промышленности, заключающийся в очистке волокна в жидкой среде, сушке волокна мытой шерсти и дальнейшему воздействию низкотемпературной плазмой высокочастотного емкостного разряда в вакуумной камере в течение 180-300 с при рабочем давлении 13,0-30,0 Па, расходе плазмообразующего газа аргона 0,03-0,05 г/с, плотности ионного тока 0,2-0,7 А/м. Недостатком способа является невозможность его применения в лабораторной ветеринарной практике, трудоемкость и значительные энергозатраты [7].
При определении изменений в биологической системе макро- и микроэлементного гомеостаза у человека при различных заболеваниях по способу [4], предварительная очистка волоса не проводится. У животных данный способ применять нецелесообразно ввиду сильной загрязненности исследуемого материала, что вносит высокую погрешность в результаты исследований.
Известен способ очистки проб биоматериала от экзогенных загрязнений для последующего их анализа на содержание макро- и микроэлементов (МАГАТЭ). Способ предусматривает очистку волос в моющей среде последовательно моющими средствами: ацетон - вода - ацетон. При этом контроль степени очистки представляет собой сложную и длительную технологию определения элементного состава исходных (загрязненных) волос, промывных растворов и отмытых волос [8].
Недостатком такого способа является разрушение жировой и кератиновой структуры волоса при обработке его ацетоном, что приводит к потере эндогенных макро- и микроэлементов. Это существенно снижает достоверность проводимого далее анализа.
Известен способ подготовки волоса человека, когда накануне исследования волосы моют мылом и хорошо промывают водой. Недостатком данного способа является то, что на пробе волос могут остаться следовые количества мыла, которые содержат макро- и микроэлементы [3].
Наиболее близким техническим решением к заявляемому, является способ подготовки пробы терминальных волос крупного рогатого скота к анализу на содержание макро- и микроэлементов, включающий замачивание волос на 10-12 часов, а затем воздействие на нее моющей среды, в качестве которой используется вода, с контролем степени очистки волос от экзогенных загрязнений. Воздействие осуществляют механическим путем обеспечения высокоскоростного вихревого движения пробы в моющей среде в течение 1 часа, обеспеченного использованием миксера с двумя насадками кругового вращения до 1000 об/мин. Степень очистки контролируют путем оценки мутности промывного раствора [1].
Недостатками данного способа являются длительность пробоподготовки, механическое повреждение структуры волоса с потерей эндогенных микроэлементов, потери измельченного волоса, использование бытовых приборов, низкая технологичность способа в лабораторном производстве.
Задачей предлагаемого технического решения является полная очистка исследуемого материала от экзогенных загрязнений без потерь эндогенных макро- и микроэлементов при минимальных временных, энергетических и финансовых затратах.
Технический результат достигается тем, что, в отличие от известного способа, предлагается способ очистки, заключающийся в том, что пробы волос замачивают в воде с температурой от плюс 40 до плюс 60°С в течение 2-3 часов, промывают под проточной водой до исчезновения видимых загрязнений, далее очищают в ультразвуковой ванне, используя последовательно следующие моющие среды: бидистиллированная вода - 40%-ный этиловый спирт - бидистиллированная вода (по 60 минут в каждой среде). При этом степень очистки волоса контролируется путем оценки мутности промывающего агента и микроскопического исследования волоса.
В предлагаемом способе не требуется использование бытовых приборов, а предварительное замачивание сокращается до 2-3 часов (в зависимости от степени загрязнения исходной пробы). Использование ультразвуковой ванны по сравнению с применением бытового миксера предотвращает потери эндогенных микроэлементов вследствие повреждения структуры волоса вращающимися насадками. Ультразвуковая ванна позволяет готовить к исследованию одновременно несколько проб (в зависимости от объема ванны и способа помещения в нее пробы). Применение в качестве промывающего агента воды исключает вымывание из пробы эндогенных макро- и микроэлементов. Очищающее воздействие ультразвука заключается в образовании в моющей жидкости чередующихся высоких и низких волн давления, которые создают кавитацию, то есть образуют множество микроскопических пузырьков, при соприкосновении с волосом обеспечивающих возникновение множества микровзрывов, отрывающих экзогенные частицы, не повреждая при этом структуру самого волоса. 40%-ный этиловый спирт является хорошим растворителем, при этом не повреждает структуру волоса и не приводит к потерям эндогенных макро- и микроэлементов.
Степень очистки волоса после пробоподготовки контролируют посредством измерения оптической плотности конечного промывающего агента и световой микроскопии. При этом на 1 см волоса, подготовленного к исследованию по заявляемому способу, отмечалось 0,11 экзогенных частицы, а на 1 см волоса, подготовленного по известному способу, приходилось 2,3 экзогенных частицы.
Нами впервые показано, что достижение технического результата очистки загрязненных волос животных для исследования на макро- и микроэлементный состав возможно при последовательном использовании промывающих сред: бидистиллированная вода - 40%-ный этиловый спирт - бидистиллированная вода с обработкой в ультразвуковой ванне акустической волной с рабочей частотой колебания 35 кГц. Следовательно, изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Способ осуществляется следующим образом:
1. Проба длинных терминальных волос КРС массой не менее 2 г погружается в лабораторный стакан объемом 50 мл с водой, температурой от плюс 40 до плюс 60°С, на 2-3 часа;
2. По истечении указанного времени воду сливают, а лабораторный стаканчик помещают под проточную воду с большим напором, и проводят отмывание волос до исчезновения видимых загрязнений, разбивая их стеклянной палочкой;
3. Затем пробу заливают бидистиллированной водой, а стаканчик с ней помещают в ультразвуковую ванну (рабочая частота 35 кГц) на 60 минут;
4. По истечении указанного времени воду сливают, пробу заливают 40%-ным этиловым спиртом и снова помещают на 60 минут в ультразвуковую ванну;
5. Затем спирт сливают, пробу заливают бидистиллированной водой и снова подвергают очистке в ультразвуковой ванне в течение 1 часа;
6. Пробу высушивают в сушильном шкафу при 40°С и исследуют посредством МС-ИСП.
Для сравнительного анализа параллельно проведена подготовка проб по двум способам - заявляемому и прототипу. Всего было исследовано 840 проб волос. Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов пробоподготовки волоса крупного рогатого скота к исследованию представлена в таблице 1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика способов подготовки проб волос к исследованию на макро- и микроэлементный состав
Показатель
Известный способ
Заявляемый способ
Время предварительного замачивания
10-12 часов
2-3 часа
Промывающий агент
вода
вода, 40%-ный этанол
Использование приборов
Бытовой миксер, сушильный шкаф
Лабораторная ультразвуковая ванна, сушильный шкаф
Повреждение структуры волоса
Происходит посредством механического воздействия насадок миксера
Отсутствует
Возможность одновременной подготовки нескольких проб
Нет. Использование миксера допускает одномоментную подготовку только одной пробы
Да. Число одновременно подготавливаемых проб зависит от объема ультразвуковой ванны
Экстинкция промывающего агента на последней стадии отмывки волоса
0,002
0,002
Количество экзогенных частиц на 1 см готового к исследованию волоса
2,33
0,11
Представленные в таблице данные демонстрируют определенные различия в получаемом техническом результате пробоподготовки волоса к исследованию. Наиболее значимые различия состоят в установленном повреждающем механическом действии насадок миксера на структуру волоса (потери эндогенных микроэлементов), а также то, что при одинаковой конечной степени экстинкции промывающего агента на пробах волос, подготовленных известным способом, остаются значительные количества внешних загрязнений. Указанные различия, полученные экспериментальным путем, могут оказать существенное влияние на объективность получаемого результата.
Проведенный анализ 840 проб волос животных на содержание макро- и микроэлементов посредством МС-ИСП выявил определенные различия, представленные в таблицей. Анализ достоверности различий между макро- и микроэлементным составом проб, подготовленных разными способами, был проведен с использованием критерия Манна-Уитни (U).
Таблица 2
Содержание макро- и микроэлементов в пробах волос крупного рогатого скота, подготовленных различными способами
Содержание макро- и микроэлементов в пробе, мг/кг
Предлагаемый способ
Способ RU 2304763
U
Li7
0,0000+0,0000
0,0000±0,0000
45
Ве9
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
15
Na23
23,9853±0,2213
24,6578±0,2543
2**
Mg24
339,7576±25,2217
342,4572±21,2215
5*
Аl27
2,5248±0,1416
2,5275±0,1116
30
К39
32,322±6,1478
32,328±4,1278
8*
Са44
233,1565±28,1576
233,2621±24,6211
6*
V51
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
34
Сr52
0,7939±0,0041
0,7922±0,0021
32
Мn55
7,6948±0,0145
7,7020±0,0254
28
Fe57
14,0253±1,1200
14,0186±1,5210
12
Со59
0,0784±0,0014
0,0778±0,0016
11
Ni60
0,0001±0,0000
0,0001±0,0000
18
Cu63
5,5634±0,0014
5,5521±0,0018
8*
Zn66
99,5212±4,0015
98,5146±3,0085
5*
Ga71
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
32
As75
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
24
Se78
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
41
Rb85
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
14
Sr88
3,0182±0,1900
3,0214±0,2145
12
Ag107
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
11
Cd114
0,0383±0,0010
0,0388±0,0014
18
In115
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
14
Cs133
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
32
Ba137
1,7799±0,0580
1,7821±0,0482
11
Hg202
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
12
Tl205
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
23
Pb208
0,0000±0,0000
0,0000±0,0000
54
Bi209
0,0283±0,0014
0,0292±0,0162
12
Анализ таблицы 2 показывает, что содержание натрия, магния, кальция и калия в пробах волос, подготовленных по известному способу достоверно выше, нежели в пробах, подготовленных по заявляемому способу. При этом содержание меди и цинка в пробах, подготовленных известным способом, наоборот, достоверно ниже. Указанные различия указывают на факт потери эндогенного микроэлементного пула проб волос, вследствие механического их повреждения насадками миксера и усугубляемое искажение результата механическими примесями, оставшимися после пробоподготовки.
Таким образом, предлагаемый способ подготовки проб терминальных волос КРС для исследования на макро- и микроэлементный состав позволяет достичь необходимой степени чистоты пробы с минимальными временными, энергетическими и трудовыми затратами.
Источники информации
1. Патент RU №2304763 С2.
2. Домашний доктор для кошек и собак / под ред. Н.Ярошенко. - М.: изд. «Ридерз Дайджест», 2003. - С.138-140.
3. Кустаров В.Н. Изучение микроэлементного состава волос женщин в репродуктивном и пременопаузальном периодах / В.Н.Кустаров [и др.] // Российский вестник акушера-гинеколога. - Т.3, №4, 2003. - С.23-25.
4. Патент RU №2180121 C1.
5. Патент RU №2186514 C1.
6. Патент RU №2326196 С2.
7. Патент RU №2378422 С2.
8. Jackie Morton, Vikki A.Carolan, Philip H.T.Gardiner. Removal of exogenously bound elements from human hair by various washing procedures and determination by inductively coupled plasma mass spectrometry. / Anal. Chim. Acta. - 455 (2002). - P.23-34.