СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА
METHOD OF OBTAINING IMMUNOGLOBULIN MEDICINE

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, выделяемых экстракцией из осадка Б (III фракции по Кону) солями металлов.
Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения, включающий экстракцию спиртового осадка Б ((III фракции Кона) хлороформом в концентрации 10% в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия с последующим осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (RU, патент 2084229 C1, А61К 35/14, 20.07.1997).
Основным недостатком этого изобретения является то, что длительная обработка хлороформом приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, их полимеризации и снижению титра антител в продукте.
Наиболее близким по своей сути к заявляемому является способ получения иммуноглобулинового препарата, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией (RU, патент 2189833 С2, А61К 39/395, 35/16, 27.09.2002).
Основным недостатком прототипа является использование хлороформа для связывания липидов, что малоэффективно, и больших концентраций сульфата меди для осаждения липопротеидов, что приводит к снижению выхода выделяемых из осадка Б иммуноглобулинов.
В основу заявляемого изобретения положена задача исключения из технологического цикла токсичного реагента, повышения выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.
Задача решена тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.
В результате проведенных исследований нами впервые показано, что высокой степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей (балластных белков, липопротеидов, липидов) можно добиться, создав такие условия проведения реакции, когда с реагентом будут взаимодействовать только примеси, находящиеся в растворе. Это реализуется при сочетании следующих факторов: реагент - сульфат меди в концентрации 0,003-0,03%, рН проведения реакции 4,9-5,1 и температура смеси 0-5°С. При таком сочетании факторов сульфат меди реагирует только с примесными белками и липопротеидами, а рН и температура раствора способствуют выделению липидов. Кроме того, рН раствора создает условия попадания примесных белков в изоэлектрическую точку, что приводит к их коагуляции, которая усиливается взаимодействием этих белков с ионами меди.
Таким образом, указанное сочетание факторов обеспечивает высокую степень очистки иммуноглобулинового раствора от примесей, что позволило отказаться от использования токсичного реагента - хлороформа.
Применение сульфата меди в концентрации менее 0,003%, так же как изменение рН и температуры реакции, ведет к ухудшению степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей, а превышение концентрации более 0,03% приводит к снижению выхода иммуноглобулинов из осадка Б.
В результате проведенных исследований впервые показана возможность выделения 50-99% иммуноглобулинов из раствора осадка Б посредством осаждения примесных белков и липидов сульфатом меди без использования токсичного реагента - хлороформа.
Согласно изобретению исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей обеспечивается тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.
Заявляемый способ получения иммуноглобулинового препарата является новым и в литературе не описан.
Техническим результатом заявляемого изобретения является исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.
Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны результатами экспериментальных исследований. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Содержание балластных примесей определяли на биохимическом анализаторе Cobas Integra 400+ по методикам разработчика, а содержание общих липидов - с помощью «Bio-la-test» Lachema. Гравитационное осаждение примесей осуществляли в центрифугах MLW T24D. Ультафильтрацию - на установке с полыми волокнами или фильтрационной установке Millipore.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей при использовании заявляемого способа.
Пример 1
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,03 мг/мл (0,003%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,1. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Пример 2
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,3 мг/мл (0,03%). При этом рН суспензии снижался до 4,8-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Пример 3
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,115 мг/мл (0,0115%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Таблица
Характеристики
Значения характеристик для
прототипа
заявляемого способа при концентрации сульфата меди, %
осадок Б
препарат
осадок Б
0,003
0,0115
0,03
Общий белок, мг/мл
35,4
56,0
23,6
60,0
67,0
56,0
Общие Ig, мг/мл
16,9
54,9
11,9
58,5
65,0
54,0
Содержание IgG, IgA, IgM, %
39;35;26
60;23;17
59,28,13
59,25,16
64;24;12
62;24;14
Примесные белки, мг/мл
18,5
1,1
11,7
1,5
2,0
1,0
Доля примесей, %
52,0
1,8
49,6
1,9
1,7
3,0
Альбумин, мг/мл
17,5
1,0
10,8
1,4
1,8
1,0
Трансферрин, мг/мл
0,1
0,1
0,13
0,1
0,1
0,1
Церулоплазмин, мг/м
0,2
0,1
0,2
0,1
0,1
0,1
Холестерол, мг/мл
1,68
0,7
1,5
0,5
0,5
0,2
Триглицериды, мг/мл
1,3
0,3
1,6
0,3
0,3
0,1
Общие липиды, мг/мл
2,07
1,04
2,90
1,04
0,90
0,5
Выход иммуноглобулинов, %
-
15
-
97
64
54
Предлагаемый способ позволяет исключить из технологического цикла токсичный реагент, повысить выход выделяемых иммуноглобулинов и степень очистки препарата от примесей при одинаковой производительности с прототипом.