Особенности локального обмена цитокинов у больных наружным генитальным эндометриозом

© Коллектив авторов, 2008 УДК 618.14-002:576.8.097.3

ОСОБЕННОСТИ ЛОКАЛЬНОГО ОБМЕНА ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

Р.В. Павлов, Л.В. Стариченко, А.А. Акобджанян Ставропольская государственная медицинская академия

В патогенезе наружного генитального эндо-метриоза (НГЭ) в последнее время большое значение отводится нарушениям иммунной системы. Особый интерес при этом заболевании представляет изучение особенностей местного иммунитета [2, 5, 12].

Установлено, что активный эндометриоз сопровождается пролиферацией клеток, повышенным со-судообразованием как внутри очага эндометриоза, так и вокруг него. Формирование и функционирование эндометриального трансплантата во многом определяется степенью васкуляризации. Стимуляция процессов ангиогенеза в очагах эндометриоза осуществляется на локальном уровне и контролируется ангиогенными факторами роста и цитокинами, секре-тируемыми перитонеальными макрофагами, клетками эндометриоидных гетеротопий и клетками эндотелия [3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13].

Большое количество публикаций, посвященных этой проблеме, подчеркивает значимость изучения регуляции ангиогенеза при НГЭ. Однако в доступной литературе нами не было найдено работ, посвященных изучению локального обмена цитокинов, с учетом пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия очагов НГЭ.

Целью настоящей работы было изучение продук-

Показатели пролиферати очагов перитонеал

ции отдельных цитокинов тканью эндометриоидных гетеротопий и определение их уровня в перитонеальной жидкости в зависимости от пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия и степени распространения заболевания.

Материал и методы. Продукция цитокинов тканью эндометриоидных гетеротопий была изучена у 150 больных НГЭ. Возраст больных колебался от 20 до 35 лет, гормональное лечение НГЭ не проводилось, а на этапе операции ни одна из пациенток не была беременной и не имела внутриматочной спирали. В контрольную группу были включены 30 практически здоровых женщин, поступивших для проведения плановой хирургической стерилизации, после исключения тяжелой экстрагенитальной патологии и при условии исключения гинекологической патологии, по данным клинического обследования и лапароскопии.

Всем исследованным проводилось стандартное предоперационное обследование, включающее общеклинические методы, ультразвуковое исследование органов малого таза, определение уровня СА125 в периферической крови.

Лапароскопия проводилась по общепринятой методике с использованием оборудования фирмы «Karl Storz» (Германия). После визуальной ревизии брюшной полости и исключения другой патологии осуществлял-

Таблица 1

ной активности эпителия ного эндометриоза

Показатели Больные НГЭ II-III степени Р

Красные очаги

Высота клеток, мкм 14,4+1,2 9,5+1,2 <0,05

Площадь ядер, мкм2 15,8±1,2 11,5+1,2 <0,05

Плоидность клеток, с 2,6±0,2 2,3+0,1 >0,05

Количество ОЯОР в ядре 2,9±0,2 2,4+0,1 <0,05

Средняя площадь ОЯОР мкм2 1,3+0,1 1,2+0,1 >0,05

Суммарная площадь ОЯОР, мкм2 3,9±0,2 2,8±0,1 <0,001

Таблица 2

Уровень продукции цитокинов in vitro тканью эндометриоидных гетеротопий с разной степенью распространения заболевания

Показатели интерлейкинов (пкг/мл) НГЭ I-II степени (n=86) НГЭ III-IV степени (n=64) Р

ИЛ1Р 78,81±4,43 81,69±3,59 >0,05

ФНОа 296,00±62,20 313,3+93,96 >0,05

ИФ^ 40,30±3,38 38,99+2,13 >0,05

ИЛ2 63,50±4,15 56,30±2,08 >0,05

ИЛ4 72,14±9,16 70,17±7,73 >0,05

ИЛ6 423,40±15,63 686,00+18,45 <0,001

ИЛ8 994,00±18,30 1258,00+15,16 <0,001

ся забор перитонеальной жидкости (ПЖ). Оценивались локализация и цвет эндометриоидных гетеротопий, степень распространения НГЭ. Эндометриоидные очаги иссекались в пределах здоровых тканей и направлялись на гистологическое исследование.

Оценка степени распространения НГЭ осуществлялась согласно классификации r-AFS (1985); все больные были разделены на две группы: I группа - 86 больных с I-II степенью, II группа - 64 больных с III-IV степенью распространения НГЭ.

Оценка пролиферативной активности клеток эпителия эндометриоидных гетеротопий проводилась согласно критериям, рекомендованным Г.Г. Автандиловым (1996): площадь ядер, плоидность клеток и активность областей организаторов ядрышек [1].

Больные II-III степени распространения НГЭ (100 женщин) были разделены на две группы: I группа - 30 больных с красными (активно пролиферирующими) эндометриоидными гетеротопиями на брюшине малого таза или их сочетанием с черными, и II группа - 70 женщин с черными гетеротопиями (без признаков активной пролиферации) или их сочетаниями с белыми (регрессирующими). При подборе этих групп на основании морфометрической оценки учитывалось достоверное отличие в снижении показателей пролиферативной активности эктопического эндометрия.

Ткань эндометриоидных гетеротопий (500 мг) измельчали до фрагментов 1 мм3, которые для удаления примеси крови дважды отмывали охлажденной до +4°С средой Хенкса и помещали в стерильную пробирку, содержащую RPMI 1640, производства АО «Биомед им. И.И. Мечникова» (Россия) с 10% ЭТС и 20 мг/мл ген-

тамицина. Полученная тканевая культура инкубировалась в течение 24 часов при 37°С и 100% влажности в атмосфере 5% СО2. После истечения срока культивирования супернатанты очищали центрифугированием при 400 g, в течение 30 мин, собирали в стерильные пластиковые пробирки типа «Эппендорф» и хранили до тестирования при -40°С, не более 3 месяцев.

Уровень ИЛ8 («ВекторБест», Россия), ИЛ1р, ИЛ2, ИЛ6, ФНОа и ИФНY («Протеиновый контур», Россия), в культуральных средах и ПЖ определяли методом твердофазового иммуноферментного анализа на планшетном фотометре «Labsystems IEMS Reader MF» (Финляндия), согласно прилагаемым к наборам методикам.

Статистическую обработку данных проводили на компьютере PENTIUM III с использованием программы «Primer Biostatistic 4.03. for Windows». Для всех показателей определяли средние значения (М), а также стандартную ошибку среднего (m). Для оценки степени достоверности различий между значениями использовали простой критерий Стью-дента (t). Различия между показателями считали достоверными при р < 0,05 и абсолютно достоверными - при р < 0,01.

Результаты исследования. При морфометрическом исследовании клеток эктопического эндометрия было установлено, что эпителиальные клетки красных эндометриоидных гетеротопий имели достоверно большую высоту (14,4± 1,2 и 9,5±1,2 мкм) и площадь ядер (15,8± 1,2 и 11,5± 1,2 мкм2), чем у черных и белых очагов наружного генитального эн-дометриоза. Плоидность эпителиальных клеток эн-

Таблица 3

Уровень продукции цитокинов in vitro тканью эндометриоидных гетеротопий с разной пролиферативной активностью клеток

Показатели интерлейкинов (пкг/мл) Высокая пролиферативная активность эпителия очагов эндо-метриоза (n=30) Низкая пролиферативная активность эпителия очагов эндомет-риоза (n=70) Р

ИЛ1Р 80,25±4,35 69,81±2,53 <0,05

ФНОа 417,50+80,80 224,00±40,63 <0,05

ИФHY 34,03±2,00 43,43±2,60 <0,05

ИЛ2 34,90±2,08 72,90+3,97 <0,001

ИЛ4 95,22+11,73 50,93+5,68 <0,001

ИЛ6 680,60±13,02 481,20+15,29 <0,001

ИЛ8 1256,00±18,85 1083,00±18,69 <0,001

Таблица 4

Уровень цитокинов в ПЖ больных НГЭ с разной степенью распространения заболевания

Показатели интерлейкинов (пкг/мл) Здоровые женщины (п=30) (1) НГЭ Р

1-11 степень

ИЛ1Р 131,6±7,2 501,7±37,9 532,6±75,2 Р2 2<0,001 Р1_3<0,001

ФНОа 8,1+1,3 44,0±3,0 58,3±3,9 Р12<0,001 Р1-3<0,001 Р2-3<0,01

ИЛ2 29,9±1,6 21,1±1,5 17,9±1,9 Р12<0,001 Р1-3<0,001

ИЛ4 60,1+5,1 58,6±2,9 63,3±3,2

ИЛ6 44,5±2,8 60,8±3,2 97,7±3,8 Р12<0,01 Р13<0,001 Р.,_з<0,001

ИЛ8 23,3+2,7 224,0±15,9 293,1±12,4 Р12<0,001 Р13<0,001 Р.,_з<0,001

ИФ^ 121,3±10,8 66,0±8,9 61,4+7,8 Р12<0,001 Р1-3<0,001

дометриоидных гетеротопий не зависела от их цвета и соответствовала диплоидному набору хромосом. В то же время в ядрах эпителия красных очагов НГЭ количество областей ядрышковых организаторов (ОЯОР) (2,9±0,2 и 2,4±0,1) и их суммарная площадь

Таким образом, согласно морфологическим критериям пролиферации клеток, предложенным ГГ. Ав-

Таблица5

Уровень цитокинов в ПЖ больных НГЭ с разной пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия

Показатели интерлейкинов (пкг/мл) Здоровые женщины (п=30) (1) НГЭ 11-111 степени Р

красные очаги

ИЛ1Р 131,6±7,2 642,1±61,0 392,2±28,0 Р12<0,001 Р13<0,001 Р2_3<0,001

ФНОа 8,1±1,3 74,2±4,3 38,1±3,1 Р12<0,001 Р13<0,001 Р2_3<0,001

ИЛ2 29,7±1,6 13,9±1,5 20,4±1,5 Р12<0,001 Р13<0,001 Р2-3<0,01

ИЛ4 60,1±5,1 63,3±3,3 58,6±2,2

ИЛ6 44,5±2,8 118,1±3,3 60,6±3,3 Р12<0,001 Р1 з<0,01 Р2_з<0,001

ИЛ8 23,3±2,7 310,6±17,8 126,1±8,7 Р12<0,001 Р13<0,001 Р2_з<0,001

ИФНY 121,3±10,8 55,5±4,1 69,6±4,2 Р13<0,001 Р13<0,001 Р2-з<0,05

тандиловым (1996), клетки эктопического эндометрия красных гетеротопий обладают большей пролиферативной активностью, чем клетки черных и белых очагов НГЭ. Эти данные позволили обосновать разделение всех больных с II-III степенью распространения НГЭ на две дополнительные группы, с учетом пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.

При определении уровня продукции цитокинов тканью эндометриоидных гетеротопий было установлено, что вне зависимости от степени распространения НГЭ ткань его очагов, инкубированная в течение 24 часов, в одинаковых условиях in vitro, продуцирует одинаковое количество ИЛ1р, ФНОа, ИЛ2, ИЛ4 и ИфНY. Единственное исключение составила повышенная продукция ИЛ6 и ИЛ8 тканью очагов НГЭ III—IV степени по сравнению с очагами I-II степени (табл. 2).

Совершенно иные результаты были получены при сравнении продукции цитокинов очагами эндометри-оза с разной пролиферативной активностью эктопического эпителия. Так, согласно полученным данным, очаги НГЭ с признаками активной пролиферации эндометриоидных клеток продуцируют достоверно большее количество ИЛ1 р, ФНОа, иЛ4, ИЛ6, ИЛ8 и достоверно меньшее количество ИЛ2 и ИФНY, чем очаги без активной пролиферации клеток (табл. 3).

При изучении уровня цитокинов в ПЖ больных НГЭ было установлено, что уровень ИЛ1р, ИЛ6, ИЛ8 и ФНОа был достоверно выше у больных НГЭ, чем у здоровых женщин, при этом степень повышения уровня ИЛ1 р не зависела от распространенности заболевания, но достоверно увеличивалась у больных с высокой пролиферативной активностью гетеротопий, а уровень ИЛ6, ИЛ8 и ФНОа возрастал как с распространением процесса, так и с увеличением пролиферативной активности гетеротопического эпителия. Подобное изменение уровня цитокинов в ПЖ может указывать на возрастание функциональной активности перитонеальных макрофагов больных НГЭ, прогрессирующее с увеличением активности клеток эндометриоидных гетеротопий. Кроме того, все вышеперечисленные цитокины обладают выраженным проангиогенным действием, инициируют неоангиогенез, а ФНОа способствует имплантации эндометриоидных клеток на мезотелии брюшины. Уровень ИЛ4 в ПЖ не зависел от степени распространения НГЭ и пролиферативной активности клеток эндометриоидных гетеротопий (табл. 4 и 5).

Содержание ИЛ2 и ИФНY в ПЖ больных НГЭ было достоверно снижено вне зависимости от степени распространения заболевания. Вместе с тем с увеличением пролиферативной активности клеток очагов эндо-метриоза уровень ИЛ2 и ИФНY в ПЖ больных женщин достоверно уменьшался. Подобные изменения в продукции цитокинов указывают на снижение активности иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в реализации неспецифической и специфической противоопухолевой цитотоксичности в перитонеальной жидкости больных НГЭ (табл. 4 и 5).

Полученные результаты позволяют утверждать, что при увеличении пролиферативной активности клеток эндометриоидных гетеротопий в очагах эндометрио-за и ПЖ увеличивается продукция факторов, обладающих проангиогенным действием (ИЛ1 р, ИЛ6 и ИЛ8), а также стимулирующих адгезию клеток эндометрия к мезотелию брюшины (ФНОа). В то же время продукция ИЛ2 и ИФНY, то есть цитокинов, обладающих прямым цитотоксическим действием на клетки опухоли, в ткани эндометриоидных гетеротопий и ПЖ снижается с увеличением их пролиферативной активности.

Заключение. Таким образом, одним из механиз-

мов прогрессирования НГЭ может быть дисбаланс в противоопухолевой и ангиогенной активности иммунной системы на локальном уровне. Дополнительным подтверждением данного предположения можно считать усугубление описанного цитокинового дисбаланса в ткани очагов НГЭ и ПЖ больных при увеличении пролиферативной активности клеток гетеротопического эндометрия и распространении НГЭ.

Литература

1. Автандилов, Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Г.Г. Автандилов // М.:РМАПО, 1996.-256 с.

2. Адамян, Л.В. Эндометриозы: Руководство для врачей.

- Изд. 2-е, перераб. и доп. / Л.В. Адамян, В.И. Кулаков, Е.Н. Андреева // М.:Медицина, 2006. - 416 с.

3. Анциферова, Ю.С. Роль цитокинов перионеальной жидкости в развитии наружного генитального эндометриоза и бесплодия, ассоциированного с эндометриозом / Ю.С. Анциферова, Л.В. Посисеева, А.Л. Шор // Акушерство и гинекология. - 2003. - № 1. - С. 41-44.

4. Махмудова, Г.М. Роль некоторых факторов перитонеальной жидкости в патогенезе эндометриоза / Г.М. Махмудова, А.В. Попов // Российский вестник акушерства и гинекологии. - 2004. - № 2. - С. 27-30.

5. Савицкий, Г.А. Перитонеальный эндометриоз и бесплодие (клинико-морфологические исследования) / Г.А. Савицкий, С.М. Горбушин // СПб.:ЭЛБИ-СПб, 2002. - 170 с.

6. Сельков, С.А. Локальная продукция цитокинов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / С.А. Сельков, Н.Л. Крамарева, О.В. Павлов, М.И. Ярмолинская // Журнал акушерства и женских болезней. - 2002.

- Т. LI, № 3. - С. 57-62.

7. Сельков, С.А. Особенности локальной продукции интерлейкинов и ростовых факторов при наружном генитальном эндометриозе / С.А. Сельков, Н.Г Солодовникова, О.В. Павлов, Д.А. Ниаури // Бюлл. эксп. биол., мед. -2005. - Т. 139, №4.- С. 439-442.

8. Сельков, С.А. Системные и локальные уровни регуляции иммунопатогенетических процессов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / С.А. Сельков, М.И. Ярмолинская, О.В. Павлов [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. - 2005. - Т. LIV, №1.

- С. 20-28.

9. Соколов, Д.И. Исследование цитокинововго профиля и ангиогенного потенциала перитонеальной жидкости больных с наружным генитальным эндометриозом / Д.И. Соколов, Н.Г Солодовникова, О.В. Павлов [и др.] // Бюлл. эксп. биол., мед. - 2005. - Т.140, №11. - С. 552-555.

10. Солодовникова, Н.Г. Исследование in vitro особенностей секреции цитокинов при наружном генитальном эндометриозе (НГЭ) / Н.Г Солодовникова, О.В. Павлов,

C.А. Сельков, Д.А. Ниаури // Мед. иммунология. - 2004.

- Т.6, № 3-5. - С. 390.

11. Сухих, ГТ. Особенности продукции цитоки-нов иммунокомпетентными клетками перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом / Г.Т. Сухих, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова [и др.] // Бюлл. эксп. биол., мед. - 2004. - Т. 137, № 6 - С. 646 - 649.

12. Dmowski, P.W. Immunology of endometriosis / P.W. Dmowski,

D.P Braun // Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynecol. - 2004.

- Vol. 18, № 2. - P. 245-263.

13. Gallinelli, A. Different concentrations of interleukins in the peritoneal fluid of women with endometriosis: relationships with lymphocyte subsets / A. Gallinelli, G. Chiossi, L. Gian-nella [et al.] // Gynecol. Endocrinol. - 2004. - Vol. 18, №3.

- P 144-151.

ОСОБЕННОСТИ ЛОКАЛЬНОГО ОБМЕНА ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

Р.В. ПАВЛОВ, Л.В. СТАРИЧЕНКО,

А.А. АКОБДЖАНяН

Представлены результаты морфометрической оценки клеток эктопического эндометрия, красных эндометриоидных гетеротопий, черных и белых очагов наружного генитального эндометриоза. При определении уровня продукции цитоки-нов тканью эндометриоидных гетеротопий было установлено, что вне зависимости от степени распространения наружного генитального эндометриоза (Hra) ткань его очагов, инкубированная в течение 24 часов в одинаковых условиях in vitro, продуцирует одинаковое количество ИЛ1р, OHOa, ИЛ2, ИЛ4 и ИФ^. Таким образом, одним из механизмов прогрессирования Hra может быть дисбаланс в противоопухолевой и ангиогенной активности иммунной системы на локальном уровне. Дополнительным подтверждением данного предположения можно считать усугубление цитокинового дисбаланса в ткани очагов Hre и в перитониальной жидкости больных при увеличении пролиферативной активности клеток гетеро-топического эндометрия и распространении Hra.

Ключевые слова: эндометриоз, цитокины, иммунология

CHARACTERISTICS OF THE LOCAL CYTOKINE METABOLISM IN PATIENTS WITH EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS

PAVLOV R.V., STARYCHENKO L.V.,

AKOBDZHANYAN A.A.

The results of morphometrical assessment of the external endometrial cells, red endometrioid heterotopias, black and white focuses of external genital endometriosis are presented in the article. Tissue of the above focuses incubated for 24 hours under equal conditions in vitro, produce the equal amounts of ILip, TNFa, IL2, IL4 and IFNy regardless of external genital endometriosis (EGE) spreading. So, EGE progressing is probably based on the disbalance in local antitumoral and angiogenic activity of the immune system. This suggestion is confirmed by aggravation of cytokine disbalance in the tissue of EGE focuses and in the peritoneal liquid of patients with increased proliferative activity of heterotopic endometrial cells and EGE spreading.

Key words: endometriosis, cytokines, immunology