Получение и характеристика моноклональных антител к меланомо-ассоциированному антигену

ток/л крови) и усиление экспрессии маркеров В-лим-фоцитов (выше 30%).

В пораженном опухолевым процессом КМ и в ПК при B-XJ1J1 и В-лимфоме в стадии лейкемизации клон аберрантных В-лимфоцитов имеет аналогичную иммупофе-нотипическую характеристику: HLA-DR CD 19* CD20’ CD5 CD20* CD22 . При этом, и в КМ, и в ПК, независимо от патологии, степень выраженности признаков клона была, по средним данным, практически одинаковой.

Для повышения диагностической информативности иммунофенотипических данных нами введем индекс экспрессии — соотношение уровней экспрессии маркеров в КМ к соответствующим показателям ПК. Показано, что при XJIJI этот индекс варьирует в пределах единицы, при В- лимфоме — существенно выше для некоторых маркерных признаков клона (см. табл. на стр. 106).

При изучении экспрессии маркеров Т-лимфоцитов при В-злокачественных лимфомах обнаружено, что в КМ, независимо от патологии, численность Т-лимфоцитов (CD3 , CD7 , CD 8 ) была в одинаковой степени резко снижена (от 11 % до 24%). В то же время, в ПК при В - лимфоме с лейкемизацией степень Т-лимфоцитопении была менее выражена (от 17% до 37%). Аналогичная закономерность выявлена для рецептора к трансферрину (CD71 ), который экспрессируется на делящихся клетках: в КМ, независимо от патологии, численность CD71 -лимфоцитов была в одинаковой степени снижена (до 20%), а в ПК наименьший уровень этого показателя выявлен при B-XJIJI.

Таким образом, одновременное проведение иммуно-фенотипирования лимфоидных клеток ПК и КМ с использованием широкой панели моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов позволило выявить дополнительные признаки дня дифференциальной диагностики В-лимфоидных опухолей с “периферическим” фенотипом -В-ХЛЛ и В-лимфома в стадии лейкемизации.

Исследование конформации Fc-фрагмента IgG больных раком мочевого пузыря методом конкурентного ИФА на белке А

Плюгачева Е. И., Веялкин И. В., Красный С. А., Маврнчев А. С.

Международный институт по радиоэкологии им. А. Д. Сахарова

Физиологическое состояние системы иммунитета играет важную роль в определении предрасположенности организма к опухолевому росту, динамике развития и течения онкологических заболеваний. В литературе имеется относительно небольшое количество сообщений о состоянии системы иммунитета у больных раком мочевого пузыря в зависимости от стадии процесса, характера и этапа комплексного лечения.

Целью данной работы было методом конкурентного ИФА на белке А из клеточной стенки St. aureus — белком, нековалентно связывающимся с Fc-фрагментом

IgG в области контакта СН2-СНЗ доменов — исследовать конформацию этого фрагмента IgG у больных раком мочевого пузыря на различных стадиях онкологического процесса; до и после проведения нм определенного вида терапии, и посмотреть, как стадия заболевания или применяемая терапия влияют на конформацию Fc-фрагмента IgG. В качестве контроля использовался донорский IgG, меченный пероксидазой хрена (IIX).

Иммуноглобулины выделяли из сыворотки осаждением 4 М (NH4)2S04 (трижды), и после диализа и течение ночи при 4'С, пропускали суммарную фракцию через ДЕАП-целлюлозу, конъюгированную с белком А. Элюировали фракции IgG 0,1 М глициновым буфером pH 3,0. Концентрация белка колебалась от4 до 8 мкг/мл. Чистота препарата определялась электрофоретпчсски в Г1ААГ. Концентрацию белка измеряли на спектрофотометре.

Нами был синтезирован конъюгат донорского IgG с пероксидазой хрена. Углеводный фрагмент перок-сидазы окисляли перйодатом натрия. Окисленная пе-роксидаза связывалась с IgG, образуя Шиффовы основания, которые восстанавливали борпщридом натрия.

Проводили конкурентное связывание IgG-ПХ н IgG сывороток больных раком мочевого пузыря с белком А. Активность пероксидазы определяли по ферментативному окислению орто-фешшендиамина. Константы ассоциации (Ка) IgG с белком А определялись по графикам Лануивера-Берка.

В результате проведенных исследований было обнаружено значительное увеличение Ка IgG к белку А у больных раком мочевого пузыря ( 18-20« 10* М'1) по сравнению с контрольной группой (4-8»10! М'1), причем чем выше стадия заболевания, тем больше различие между константами ассоциации. Также было отмечено значительное уменьшение Ка IgG к белку А у больных после полного удаления опухоли в мочевом пузыре операционным путем (ТУР) (12-13* 108 М1). Повышение Ка к белку, по-видимому, говорит об увеличении междоменно-го СН2-СНЗ расстояния в молекуле IgG, уменьшение же Ка - о более компактной структуре IgG.

Получение и характеристика моноклональных антител к меланомо-ассоциированному антигену

Полосухина Е.Р., Михайлов АД, Иванов П.К.,

Новиков К.Н., Абрамов М.Е., Степанова Е.В.,

Лукашина М.И., Заботима Т.Н., Морозова Л.Ф., Барышников А.Ю.

Российский онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Использование моноклональных антител (МКА) делает возможным четко идентифицировать опухоле-ас-социироваиные антигены. В настоящее время охарактеризовано большое количество меланомо-ассоциировап-ных антигенов (М А А) - таких, как S-100, НМВ-45, вы со-

комолекулярый меланомо-ассоциированный антиген HMW, GD2, ООЗ-ганглиозиды и другие. М ногие из этих антигенов связаны с опухолевой прогрессией, поэтому изучение их экспрессии на малигнизированных клетках имеет значение не только для дифференциальной диагностики меланомы кожи, но и для определения прогноза заболевания. Выявление МАА-антигенов, иммунных комплексов и антител к МАА в крови имеет значение при мониторинге больных меланомой.

Целью работы явилось получение моноклональных антител против меланомо-ассоциированных антигенов.

Материалы и методы: С помощью стандартных методов гибридомной технологии проведено слияние спле-ноцитов иммунизированной опухолевыми клетками метастатической меланомы мыши линии BALB/c и мие-ломной линии NS1. Отбор продуцирующих клонов и определение реактивности полученных гибридом проводили с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции, учитываемой на проточном цнтофлуоримет-ре FACScan и флуоресцентном микроскопе Opton. В качестве контрольных антител использовали МКА 225.28 (Dr. S.Ferrone) против высокомолекулярного меланомоассоциированного антигена HMW.

Результаты: Получена гибридома, стабильно продуцирующая МКА IgGl изотипа, названные ICO-218. МКА ICO-218 взаимодействуют с 90-100% клеток меланомы перевиваемых клеточных линий Melur, MS, FM4593, Colo38 и с отдельными клетками клеточной линии Вго. МКА не реагировали с клетками перевиваемых клеточных линий гематологической природы — Jurkat, KG 1, Daudi, Raji, с лимфоцитами и гранулоцита-ми здоровых доноров. Методами иммуногистохимии на криостатных срезах не выявлена специфическая реакция с опухолевыми клетками саркомы Юинга, лим-фомы желудка, рака легкого. МКА ICO-218 взаимодействовали с опухолевыми клетками 7 криостатных срезов метастазов больных меланомой, а также со 100% клеток первичной культуры меланомы, полученной из метастаза больной Т.

Антигены, узнаваемые МКА ICO-218 и МКА 225.28, имеют сходное распределение по тканям. Однако изучаемые антитела не конкурируют друг с другом при связывании с клетками-мишенями. Таким образом, МКА ICO-218 и 225.28 реагируют с разными антигенами или с различными антигенными детерминантами HMW.

Заключение: Благодаря стабильности и специфичному связыванию с клетками меланомы кожи человека полученные МКА могут быть рекомендованы для использования при диагностике малигнизированной меланомы методами иммуногистохимии. Предварительные данные позволяют предположить, что МКА ICO-218 взаимодействуют с дифференцировочным МАА. Ведется работа по выделению антигена, узнаваемого ICO-218. Изучается возможность использования полученных нами МКА в составе препаратов направленного действия.

Различия экспрессии белков теплового шока на поверхности живых и апоптозных клеток лимфомы EL-4

Пономарёв Е.Д., Тарасенко Т.Н., Сапожников А.М.

Институт биооргинической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Москва, Россия

В настоящее время накоплено много данных, свидетельствующих о существенной роли белков теплового шока (БТШ) в системе иммунологического надзора. Повышенная экспрессия БТШ сопутствует клеточному стрессу любого происхождения и наблюдается у микроорганизмов, подверженных иммунной атаке, у вируспнфицированных клеток, у многих трансформированных клеток, а также у клеток, испытывающих разнообразные повреждающие воздействия. БТШ являются протективиыми внутриклеточными протеинами, однако в ряде случаев зарегистрирована их локализация и на клеточной поверхности. Функции поверхностных БТШ практически не изучены, хотя для иммунной сис темы эти протеины могут явля ться маркерами клеток, подлежащих элиминации. Недавно было обнаружено, что БТШ экспрессируются на поверхности ти-моцитов в процессе их программированной клеточной гибели (ПКГ, апоптоза). Это явление дополняет сведения о вовлеченности БТШ в функционирование иммунной системы и инициирует вопрос о роли БТШ. локализующихся на клеточной поверхности, в ПКГТ-лимфоцнтов.

Целью данной работы был анализ взаимосвязи экспрессии поверхностных БТШ с процессом апоптоза у линии трансформированных тимоцитов EL-4. Выбор этой модели обусловлен обнаруженным нами ранее сочетанием у культивируемых in vitro клеток EL-4 спонтанного апоптоза со спонтанной экспрессией БТШ на поверхности их плазматических мембран.

Одновременную регистрацию поверхностных БТШ и апоптоза у культивируемых in vitro клеток EL-4 проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. В качестве экзогенных индукторов ПКГ использовали тепловой шок и актиномицин D.

Было установлено, что пул апоптозных клеток характеризуется повышенной экспрессией поверхностных БТШ по сравнению с пулом живых клеток EL-4. Кинетика экспрессии БТШ на клеточной поверхности в процессе ПКГ имеет выраженный максимум, соответствующий ранним стадиям апоптоза. Однако и на поздних стадиях ПКГ плотность этих протеинов у апоптозных клеток остается более высокой, чем у живых клеток. Такой характер взаимосвязи экспрессии поверхностных БТШ с процессом ПКГ в культуре клеток EL-4 наблюдался как для спонтанного, так и для индуцированного апоптоза. Существенно, что указанная кинетика экспрессии была специфична для протеинов из семейства БТШ. Плотность других белков клеточной поверхности - в частности, протеинов из семейства главного комплекса гистосовмести-мости, снижалась в течение ПКГ.