Применение ДНК-маркёров в селекции пшеницы на иммунитет

Применение ДНК-маркёров в селекции пшеницы на иммунитет

Н.А. Николаев, соискатель, М.В. Сычёва, к.б.н.,

Л.И. Краснова, д.с.-х.н., профессор, Оренбургский ГАУ

В Оренбургском ГАУ проводится селекционная работа с озимой мягкой пшеницей, сорта Оренбургская 105 и Пионерская 32 (с потенциальной урожайностью не ниже 7 т/га) пользуются коммерческим спросом в Оренбургской области. Сорт Оренбургская 105, с 2005 г. включённый в Госреестр РФ и допущенный к использованию в Оренбургской области, характеризуется повышенной зимо- и морозостойкостью и натурой зерна. Пионерская 32 — адаптивный к местным

условиям, лучший по продуктивности и засухоустойчивости сорт селекции ОГАУ, отнесён к ценной пшенице, включён в Госреестр РФ и допущен к использованию в Оренбургской области с 2006 г.

Селекция пшеницы в ОГАУ ведётся по нескольким направлениям, одно из них — селекция на устойчивость к грибным болезням. Эффективность данного направления возросла благодаря развитию ДНК-технологии, позволяющей по-новому создавать резистентные генотипы пшеницы, когда оценка и отбор селекционного материала осуществляется непосредственно

по генотипу, определённому с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мировые достижения в этой области, опубликованные в базах данных сети Интернет и научных изданиях, позволили нам начать работу по использованию молекулярных маркёров в селекции пшеницы.

Проведённая в учебно-опытном поле ОГАУ в 2007 г. полевая оценка на естественном инфекционном фоне в период эпифитотийного развития бурой листовой ржавчины показала, что все сорта озимой пшеницы, допущенные к использованию в Оренбургской области, были поражены болезнью [1], поэтому объектом нашей работы в первую очередь стали Lr (leafтай)-гены, детерминирующие устойчивость к местной популяции возбудителя бурой листовой ржавчины Puccinia recondita. Хотя возбудитель вызывает эпифитотии в регионе не каждый год, тем не менее создание сортов, устойчивых к бурой ржавчине, — наиболее экономичный и экологически безопасный метод.

По имеющимся в литературе сведениям известно более 50 генов устойчивости к бурой ржавчине во всём мире, из них более чем к 25 разработаны молекулярные маркёры. Многие из них по причине изменчивости патогена преодолены большинством рас бурой ржавчины на территории России, другие — продолжают эффективно защищать генотип сорта самостоятельно или в мульгенной комбинации.

Эффективные генетические детерминанты устойчивости к Puccinia recondita по регионам РФ указаны Всероссийским НИИ фитопатологии [2]. По Уральскому региону рекомендовано использовать в селекции следующие гены: Lr9, Lr19, Lr24, Lr29, Lr36, Lr38.

Поскольку собственные Lr-гены мягкой пшеницы почти потеряли резистентность, их источником в последнее время является генофонд дикорастущих сородичей пшеницы или исходный материал, созданный с его участием [3].

Цель настоящей работы: выявить наличие известных эффективных для данной зоны генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов рабочей коллекции пшеницы и использовать их в селекции на повышение иммунитета местного агроэкотипа мягкой пшеницы.

Материалы и методика исследований. Материалом для исследований служили сортообразцы рабочей коллекции озимой и яровой пшеницы, которые в условиях эпифитотии (2007 г.) проявили полевую устойчивость к бурой ржавчине на учебно-опытном поле ОГАУ.

Молекулярные анализы проводили в лаборатории кафедры микробиологии и заразных болезней Оренбургского ГАУ; использовали освоенные на данный момент ДНК-маркёры, сцепленные с генами Lr10, Lr21, Lr24, Lr37; ДНК-маркёры были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва) (табл. 1).

Выделение геномной ДНК проводили по СТАВ-методу из четырёхдневных проростков, пророщенных в чашках Петри на увлажнённой фильтровальной бумаге, или из свежих листьев растения.

Амплификацию проводили в термоциклёре «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Реакционная смесь включала ДНК растений (1 мкл), специфические праймеры (по 1 мкл), дезок-сирибонуклеозидтрифосфаты, буфер, фермент Taq-полимеразу, хлорид магния. Реакционную смесь доводили до 15 мкл водой без нуклеаз.

ПЦР для выявления генов Lr10 и Lr37, кодирующих устойчивость к бурой ржавчине, проводили по протоколам: 1 цикл — 94°C, 3 мин.; 35 циклов - 94°C, 45 с., 57°C, 45 с., 72°C, 30 с.; 3 мин. при 72°C и 1 цикл — 94°C, 10 мин.; 35 циклов — 94°C, 1 мин., 65°C, 1 мин., 72°C, 2 мин.; 10 мин. при 72°C соответственно. Протокол амплификации генов Lr21 и Lr24 содержал денатурацию при 94°C в течение 4 мин., затем 40 циклов, включающих 1 мин. при 92°C, 1 мин. при 56°C для Lr21 и при 60°C для Lr24, 2 мин. при 72°C, после чего проведение элонгации в течение 5 мин. при 72°C.

Продукты амплификации генов анализировали путём электрофоретического разделения в горизонтальном 1- или 2-процентном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете. В качестве маркёров молекулярного веса использовали GeneRuler 1 kbp DNA Ladder и GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). Положительное заключение о наличии гена делали при

1. Праймеры, используемые для идентификации Lr-генов

Ген Праймеры Размер продукта реакции, п.н. Литературный источник

название нуклеотидная последовательность

Lr10 F12245 / Lr10-6r2 F: GTGTAATGCATGCAGGTTCC R: AGGTGTGAGTGAGTTATGTT 227 [6]

Lr21 Lr21 F: GTACTATTGTACATCCAGCTTCAAC R: CTTGCTAGCAGTTCTAATTCTACTC 375 [3]

Lr24 J09 F: TCTAGTCTGTACATGGGGGC R: TGGCACATGAACTCCATACG 310 [4]

Lr37 VENTRIUP / LN2 F: AGGGGCTACTGACCAAGGCT R: TGCAGCTACAGCAGT ATGTACACA AAA 262 [5]

Рис. 1 - Детекция гена Lr24, кодирующего резистентность к бурой ржавчине: дорожка 1 - маркёр молекулярного веса (GeneRuler 1 kbp DNA Ladder (Fermentas, Литва)); образцы 2, 3 - специфический продукт реакции 310 п.н.

обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определённой массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс. Для документирования полученных результатов гелевые пластины фотографировали (рис. 1).

Результаты исследований. При проведении ПЦР -анализа с использованием молекулярного маркёра J09 к гену Lr24 [4] соответствующий фрагмент амплификации размером 310 п.н. выявлен у сортообразцов: 177 Р2 (Краснодар), Norkan, Siouxland 89 (США), Белянка (Саратов), Лавина (Владимир), Лютесценс 660 (Краснодар). Молекулярные маркёры к гену Lr24 не обнаружены в следующих сортообразцах: 193 Р3, Ха-зарка (Краснодар), Bersy, Bourbon (Нидерланды), Brigadier (Франция), Charmany, Dowel, F.S. 401, McNair 1587, Nelson, TAM 107, TAM 108, TAM 200 (США), Бирюза, Тулайковская 10 (Самара), Лютесценс 321 (Воронеж), Мироновская 28, Мироновская 31 (Украина).

Известно, что ген Lr24 получен в результате транслокации хромосомного сегмента пырея удлинённого (Agropyron elongatum) на хромосому 3D мягкой пшеницы. Этот ген остаётся в числе эффективных в Европе и России. Полевая оценка на опытном поле ОГАУ в 2007 г. в условиях эпи-фитотии бурой ржавчины сортообразцов озимой пшеницы, имеющих ген Lr24, подтвердила его высокую эффективность [1].

С использованием маркёра VENTRIUP / LN2 к гену Lr37 [5] характерный фрагмент размером 262 п.н. идентифицирован у сортообразцов озимой пшеницы Hussar (Англия), Renan (Франция). Ген Lr37 интрогрессирован в мягкую пшеницу на хромосому 2AS от эгилопса (Aegilops ventricosa), имеет сцепление с генами устойчивости к жёлтой (Yr17) и стеблевой (Sr38) ржавчине.

Практический интерес в селекции на иммунитет представляет коллекция интрогрессивных линий яровой мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом видов Aegilops speltoides, Aegilops triuncialis, Triticum kiharae, созданная методом отдалённой гибридизации И.Ф. Лапоч-киной в Московском НИИСХ. Ценность этой коллекции состоит в том, что её линии, как доноры, имеют широкую генетическую основу по генам устойчивости к бурой ржавчине. В результате ПЦР-анализа образцов коллекции, кроме упомянутых Lr24 и Lr37, идентифицированы гены Lr10 и Lr21 (табл. 2).

Для идентификации гена Lr10 использовали маркёр F12245 / Lr10-6r2 [6], амплифицирован-ный фрагмент размером 227 п.н. был обнаружен у пяти интрогрессивных линий коллекции. Ген Lr10 является собственным геном мягкой пшеницы (Triticum aestivum).

При идентификации гена Lr21 амплифи-цировался фрагмент размером 375 п.н. [3]. Он выявлен у шести интрогрессивных линий коллекции. Ген Lr21 интрогрессирован в пшеницу из Aegilops taushii.

Образцы с чужеродным генетическим материалом Aegilops speltoides 90/001 и 129/001 обладают комбинацией из трёх генов устойчивости, один из которых (Lr24) является высокоэффективным; образец 113/001-4 — также с тремя Lr-генами, в том числе с геном возрастной устойчивости Lr37.

С целью переноса в коммерческие сорта генов устойчивости, эффективно работающих в условиях данного эколого-географического региона, проведено скрещивание сорта Пионерская 32 с линией Лютесценс 660 — донором гена Lr24. Далее проведены беккроссные скрещивания (рис. 2) с целью увеличения в гибридном генотипе адаптивного наследственного материала сорта Пионерская 32 и уменьшения доли нас-

2. Идентифицированные гены устойчивости Lr у интрогрессивных образцов различного происхождения

Интрогрессивные образцы Происхождение образцов Идентифицируемые гены

90I001 Родина х Aegilops speltoides Lr10, Lr21, Lr24

102I001 Родина х Aegilops speltoides Lr21

113I004 Родина хAegilops МыпЫаИз Lr10, Lr 21

113I001-4 Родина х Aegilops МыпсшШ Lr10, Lr21, Lr37

120I001 Родина х ТгШеыт Шкагав Lr10, Lr37

121I001 Родина х Aegilops МыпЫаШ Lr21

129I001 РЫЬ х Aegilops speltoides х Родина Lr10, Lr21, Lr24

Л х В ^ ЛВ х Л ^ ЛАВ х Л ^ АААВ х Л ^ ААААВ

Примечание: Л — Пионерская 32, В — Лютесценс 660.

Рис. 2 - Схема скрещивания

3. Результаты идентификации гена Lr24 из свежих листьев беккроссированных растений с использованием маркёра J09

№ образца Комбинация скрещивания Результаты амплификации № делянки и растения, 2012 г.

73 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 154-1

74 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 154-2

75 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 154-3

76 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 156-1

77 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 156-2

78 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 164-1

79 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 164-2

80 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 164-3

81 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 167-1

82 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) + 167-2

83 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 167-3

84 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 172-1

85 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 172-2

86 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 172-3

87 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 279-1

88 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 279-2

89 ВС2 (Пионерская 32 х Лют 660) - 279-3

Примечание: «+» и «—» означают присутствие / отсутствие продукта реакции размером 310 п.н.

ледственности донора, как малоприспособленного к местным условиям произрастания, имеющего низкие хозяйственно ценные признаки и свойства.

После первого насыщения применили ПЦР-анализ. С его помощью находили растения, в генотипе которых присутствовал ген Lr24. Отобранные растения использовали для второго насыщения наследственным материалом сорта Пионерская 32.

Аналогично провели третье насыщение (табл. 3), после которого, как известно, доля реккурентной родительской формы (Пионерская 32) в потомстве должна составлять 93,75%. Планируется после 3-го беккросса перевести ген из гетерозиготного состояния в гомозиготное путём самоопыления, после чего из гибридной популяции отобрать константные формы, устойчивые к бурой ржавчине.

Выводы. Методом ПЦР-анализа выявлены сортообразцы рабочей коллекции пшеницы как потенциальные доноры известных Lr-генов. Осуществлён перенос эффективного для данной зоны гена Lr24 в коммерческий сорт Пионерская 32. Гены возрастной устойчивости Lr21 и

Lr37 вовлечены в селекционный процесс для повышения иммунитета у новых сортов пшеницы.

Проведённые нами первые исследования по применению молекулярных маркёров в селекции пшеницы на иммунитет показали, что их использование может существенно повысить эффективность работы селекционера.

Литература

1. Николаев Н.А. Полевая оценка сортообразцов озимой пшеницы по устойчивости к бурой ржавчине // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2011. № 4. С. 52—54.

2. Коваленко Е.Д., Жемчужина А.И., Крятева Н.Н. Иммуно-генетические методы создания болезнеустойчивых сортов зерновых культур. 1. Генетическая структура популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы // Агро XXI. 2000. № 4. С. 14—15.

3. Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И. и др. Использование фитопатологического и молекулярногенетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом // Генетика растений. 2007. Т. 43. № 8. С. 1058—1064.

4. Schachermayr G., Messmer M., Feuillet C. u dr. Identification of molecular markers linked to the Agropyron elongatum — derived leaf rust resistance gene Lr24 in wheat // Theor. Appl. Genet. 1995. № 90. С. 982—990.

5. Marker Assisted Selection in Wheat URL: http://maswheat. ucdavis.edu

6. Schachermayr G., Feuillet C., Keller B. Molecular markers for the detection of the wheat leaf rust resistance gene Lr10 in diverse genetic backgrounds // Molecular Breeding. 1997. № 3. С. 65—74.