СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЯ АЛКОГОЛЕМ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ALCOHOL ABUSE

Изобретение относится к медицине, а именно к наркологии, внутренним болезням, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для лабораторной диагностики злоупотребления алкоголем.
Известен способ диагностики злоупотребления алкоголем путем определения содержание алкоголя в крови, моче и выдыхаемом воздухе. При отсутствии диагностически значимых концентраций алкоголя в крови можно считать, что пациент не употреблял алкоголь в течение 6-8 часов [Neumann Т., Spies С. Use of biomarkers for alcohol use disorders in clinical practice. 2003 Society for the study of addiction to alcohol and other drugs, Addiction, 1998, Suppl. 2, 81-91]. Быстрое окисление алкоголя определяет необходимость измерения уровней его метаболитов. Повышенное содержание в крови ацетальдегида, молочной, яблочной и Р-оксимаслянной кислот наблюдается не позже чем через 24 часа после приема алкогольных напитков [Helander A., Eriksson С.Laboratory tests for acute alcohol consumption: results of the WHO/ISBRA Study on State and Trait Markers of Alcohol Use and Dependence. Alcohol Clin. Exp.Res., 2002, 26 (7), 1070-1077].
В клинической практике часто используется определение активности гамма-глютамилтрансферазы (ГГТ). Определение активности ГГТ является довольно дешевым и хорошо известным методом [Чернобровкина Т.В. Энзимопатии при алкоголизме. Киев, 1992, 312 с.]. В наибольших количествах этот фермент содержится в эпителии желчных канальцев, поэтому повышение активности ГГТ в крови традиционно связывают с холестатическими заболеваниями печени и билиарной системы. В этих случаях увеличение активности ГГТ, как правило, сопровождается и повышением уровня щелочной фосфатазы. Недостаток этого метода в том, что ГГТ не является строго специфичным маркером алкогольной интоксикации. Многие неалкогольные болезни печени, прием лекарственных и токсических веществ также вызывают повышение активности ГГТ. Этот фермент в значительных количествах присутствует в почках, в небольших количествах - в поджелудочной железе, тонкой кишке, клетках крови. Активность его может незначительно повышаться при сахарном диабете, почечной и сердечной недостаточности [Успенский А.Е. Объективные методы выявления употребления алкоголя. Перспективный аналитический обзор. М., 1998].
Другие методы диагностики хронической алкогольной интоксикации, как определение уровня среднего корпускулярного объема эритроцита (СКОЭ), мочевой кислоты, кетокислот, триглицеридов, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), активности ACT, АЛТ, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, обладают меньшей информативностью. Уровень ЛПВП зависит от пола, диеты, физических упражнений, приема некоторых лекарственных препаратов [Rosman A., Lieber Ch. Biochemical markers of alcohol consumption. Alcohol Health & Research World, 1990].
Известно, что хроническая алкогольная интоксикация характеризуется появлением в сыворотке крови углевод-дефицитных белков, таких, как, например, углевод-дефицитный трансферрин. При алкогольном поражении печени нарушается гликозилирование трансферрина и образуются его дефектные асиало-, моносиало-, дисиало- и трисиало-изоформы, называемые углевод-дефицитными трансферринами (УДТ, Carbohydrate-deficient transferrin CDT). УДТ (CDT) повышается у людей, употребляющих 60-80 мл алкоголя в течение не менее 8-10 дней, и обладает периодом полураспада не менее 15 дней, поэтому его определение рекомендуется для идентификации чрезмерного употребления алкоголя [Bean P. Carbohydrate-deficient transferrin: what have we learned in the last decade? American Clinical Laboratory, 2001, May 8-10]. У большинства пациентов, страдающих заболеваниями печени, уровень УДТ остается в пределах нормы, что выгодно отличает его от определения активности ГГТ, АЛТ и ACT [Das S., Vasudevan K. Should we use carbohydrate-deficient transferrin as a marker for alcohol abusers? Indian J. Clin. Biochem, 2004, 19(2), 36-44].
Известно несколько методов определения в сыворотке крови УДТ (СОТ), рекомендованных для клинической практики. Они различаются особенностями выделения десиалоформ из общего пула трансферрина и способами их последующей детекции. CDTect позволяет измерить абсолютное количество углеводдефицитного трансферрина. Определяют 0-1 сиалоформы и небольшое количество дисиалотрансферрина путем радиоиммунологического анализа после микроколоночного расщепления. %СБТ - турбидимитрический иммунологический анализ, проводимый после ионообменной хроматографии, определяет процент 0-2 сиалоформ от общего количества трансферрина (Vitala K., Lahdesmaki K., Niemela О. Comparison of the Axis %CDT TLIA and the CDTect method as laboratory tests of alcohol abuse. Clinical Chemistry, 1998, 44, 1209-1215). Метод %CDT-TIA позволяет определять процентное содержание УДТ с учетом некоторого процента трисиалотрансферрина. При проведении последнего исследования на первом этапе происходит насыщение ионами Fe3+сывороточного трансферрина, после чего трансферрин с низким содержанием сиаловой кислоты сепарируется с помощью ионно-обменной хроматографии. УДТ (CDT) определяют с помощью турбидиметрического метода с использованием антител к трансферрину. При исследовании %CDT RIA (CDTriTIA) УДТ измеряют радиоиммунологическим методом [Viitala K., Lahdesmaki K., Niemela О. Comparison of the Axis %CDT TLIA and the CDTect method as laboratory tests of alcohol abuse. Clinical Chemistry, 1998, 44, 1209-1215].
Существует несколько коммерческих тест-систем исследования УДТ. BioRad CDT, Pharmacia CDTect test, Axis-Shield CDT основаны на оценке изоформ трансферрина методом изоэлектрофокусировки/иммуноблотинга после жидкостной хроматографии высокого разрешения [Reif A., Keller Н., Schneider M. et al. Carbohydrate-deficient transferrin is elevated in catabolic female patients. Alcohol Alcohol, 2001, 36 (6), 603-607, Anttila P., Jarvi K., Latvala J. et al. Diagnostic characteristics of different carbohydrate-deficient transferrin methods in the detection of problem drinking: effects of liver disease and alcohol consumption. Alcohol Alcohol, 2003, 38 (5), 415-420]. Разработаны методы по анализу изоформ УДТ - капиллярный электрофорез и капиллярный зонный электрофорез, которые в настоящее время являются наиболее чувствительными и позволяют оценить процентное соотношение изоформ [Sillanaukee P., Lof K. et al. Comparison of different methods for detecting carbohydrate-deficient transferrin. Alcohol Clin. Exp. Res., 1994, 18, 1150-1155]. На уровень УДТ влияет прием контрацептивов. Ложноположительные результаты встречаются в редких случаях при наличии генетически обусловленной D-формы трансферрина либо при врожденном нарушении метаболизма гликопротеинов - синдроме углевод-дефицитного гликопротеина.
Определение углевод-дефицитного белка - трансферрина в последнее время является наиболее информативным, однако его широкое применение имеет ряд технических и экономических ограничений, так как требуется дорогостоящее оборудование.
Задачей настоящего изобретения является совершенствование метода лабораторной диагностики злоупотребления алкоголем, доступного для широкого использования в лабораториях поликлиник и клиник широкого профиля.
Поставленная задача решается тем, что в сыворотке крови определяют колориметрическим методом уровень белкового компонента мукопротеинов по содержанию тирозина и углеводного компонента мукопротеинов - по содержанию гексоз - орциновым методом. При увеличении коэффициента соотношения белкового и углеводного компонента мукопротеинов более чем в 40 раз диагностируют злоупотребление алкоголем.
Способ осуществляют следующим образом. Кровь (5-10 мл), взятая из локтевой вены с 8 до 9 ч, после 15-минутной инкубации при 37°C центрифугируется при 3000 об/мин в течение 10 мин, после чего отделяется сыворотка. Уровень белкового компонента мукопротеинов определяют по содержанию тирозина с помощью набора реактивов «Мукопротеины» («Hospitex diagnostics)), Швейцария). Тирозин - ароматическая аминокислота с высоким уровнем полярности, взаимодействие тирозина с реактивом Кумасси приводит к образованию хромогена (синее окрашивание), интенсивность которого используется для расчета уровня мукопротеинов. Содержание гексоз в мукопротеинах определяют орциновым методом после осаждения мукопротеинов фосфорновольфрамовой кислотой из хлорного экстракта сыворотки крови (Камышников B.C. Справочник по клинической химии. - Минск. «Беларусь» 1982. - 358 с.). Затем производят расчет соотношения уровня белкового и углеводного компонента мукопротеинов, при увеличении этого коэффициента более чем в 40 раз диагностируют злоупотребление алкоголем.
Содержание (Медиана) мукопротеинов (тирозин) и гексоз в мукопротеинах в сыворотке крови больных, злоупотребляющих алкоголем (г/л)
Показатели
Контрольная группа
Больные хроническим алкоголизмом
МП (тирозин)
11,25
15,60
Гексозы в МП
0,31
0,21
Соотношение тирозин/гексозы в МП
27,80
45,62
Пример 1. Больной М., 40 лет. Кровь из вены взята с 8 до 9 ч. В сыворотке крови с помощью набора реактивов «Мукопротеины» определили уровень белкового компонента мукопротеинов, орциновым методом определили уровень углеводного компонента в мукопротеинах. Результаты анализа: уровень мукопротеинов, определяемых по тирозину - 15,6 г/л, уровень углеводов в мукопротеинах - 0,21 г/л. Соотношение мукопротеинов (тирозин)/гексозы мукопротеинов - 15,6/0,21=74,3; следовательно, у больного сформирован алкогольный абстинентный синдром, можно поставить диагноз: алкоголизм. Клинически данному больному был поставлен диагноз: алкоголизм второй стадии.
Пример 2. Больной Г., 51 год. Кровь из вены взята с 8 до 9 ч. В сыворотке крови с помощью набора реактивов «Мукопротеины» определили уровень белкового компонента мукопротеинов, орциновым методом определили уровень углеводного компонента в мукопротеинах. Результаты анализа: уровень мукопротеинов, определяемых по тирозину - 18 г/л, уровень углеводов в мукопротеинах - 0,31 г/л. Соотношение мукопротеинов (тирозин)/гексозы мукопротеинов - 18/0,31=58,06; следовательно, у больного сформирован алкогольный абстинентный синдром, можно поставить диагноз: алкоголизм. Клинически данному больному был поставлен диагноз: алкоголизм второй стадии.