СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИИ Pasteurella multocida КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СЕРОГРУПП A, B, D, E, F В МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
METHOD OF DETECTING AND GENOTYPING BACTERIA Pasteurella multocida OF CATTLE OF SEROGROUPS A, B, D, E, F IN MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной практике для диагностики пастереллеза сельскохозяйственных животных, а также для решения научно-исследовательских задач по изучению эпизоотологии пастереллеза, оценке эффективности профилактических или лечебных мероприятий.
Pasteurella multocida - условно-патогенная грамотрицательная бактерия, постоянно обитающая на слизистой оболочки верхних дыхательных путей животных и птиц. На основании строения капсульного антигена все штаммы бактерии делятся на 5 серогрупп.
Штаммы серогруппы А и D вызывают пневмонии у крупного рогатого скота, овец, свиней.
Штаммы бактерий серогрупп В и Ε - возбудители геморрагической септицемии крупного рогатого скота и буйволов, характеризующейся острой септицемией с высокой летальностью. Болезнь распространена в Азии, Африке и на ближнем Востоке. В Азии основным ее этиологическим агентом считается серовариант В2, в Африке - Е2. Различные сероварианты группы В выделяли от диких и домашних жвачных при септических состояниях в Европе, Северной и Южной Америке и на территории бывшего СССР.
Штаммы серогруппы F выделяли при пневмонии и перитоните у телят (Griffin, D. Bovine Pasteurellosis and Other Bacterial Infections of the Respiratory Tract / D. Griffin // Vet. Clin. Food. Anim. - 2010. №26. - P. 57-71.).
До настоящего времени за рубежом для типизации штаммов и изолятов P. multocida применяются серологические методы, основанные на реакции непрямой гемагглютинации или встречного иммуноэлектрофореза с использованием типоспецифических гипериммунных сывороток (Chengappa, М.М. Identification of type D Pasteurella multocida by counter immunoelectrophoresis. / M.M. Chengappa, G.R. Carter, W.E. Bailie // J. Clin. Microbiol. - 1986. - 24(5). - P. 721-723.).
К их недостаткам следует отнести необходимость получения чистых культур. Кроме этого в процессе культивирования P. multocida на питательных средах могут возникать спонтанные мутации, приводящие к появлению безкапсульных вариантов бактерии, что приводит к невозможности их типирования по данному способу.
В нашей стране нашли применение методы несерологического типирования. Так, для типирования P. multocida серогруппы А применяется тест на выявление гиалуроновой кислоты в капсуле бактерии, а серогруппы D - акрифлавиновая проба. Нетипируемые этими методами штаммы и изоляты относят к серогруппе В (Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц. Утверждены Главным управлением ветеринарии министерства сельского хозяйства РФ №22-7/82 от 20.08.1992 г.).
К недостаткам данного способа относятся необходимость получения чистых культур P. multocida, невозможность типирования бескапсульных вариантов бактерии, а также серогрупп Ε и F, низкая специфичность.
Близкими аналогами являются способы, основанные на выявлении фрагментов генов бактерии методом ПЦР, в частности идентификация бактерии Pasteurella multocida на основе генов, регулирующих транскрипцию (Liu, D. Specific PCR identification of Pasteurella multocida based on putative transcriptional regulator genes / D. Liu, M.L. Lawrence, F.W. Austi // Journal of Microbiological Methods. - 2004. - Vol. 58. - P. 263-267), и серогруппы A по гену, отвечающему за синтез гиалуроновой кислоты (Gautam R. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by PCR assay / R. Gautam, A.A. Kumar, V.P. Singh, Vijendra P. Singh, Т.K. Dutta, S.B. Shivachandra // Res. in Vet. Science. - 2004. - Vol. 76. - P. 179-185.). Данные способы могут выявлять только вид или серогруппу A Pasteurella multocida.
Наиболее приемлемым, с точки зрения описанных недостатков и принятым за прототип, является способ, основанный на мультиплексной ПНР для типирования капсульных групп А, В, D, Е, F при помощи специфических праймеров: CAPA-F 5′- TGCCAAAATCGCAGTCAG- 3′, CAPA-R 5′- TTGCCATCATTGTCAGTG- 3′, CAPB-F 5′- CATTTATCCAAGCTCCACC- 3′, CAPB-R 5′- GCCCGAGAGTTTCAATCC- 3′, CAPD-F 5′- TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC- 3′, CAPD-R 5′- CATCTACCCACTCAACCATATCAG- 3′, CAPE-F 5′- TCCGCAGAAAATTATTGACTC- 3′, CAPE-R 5′- GCTTGCTTGATTTTGTC- 3′, CAPF-F 5′- AATCGGAGAACGCAGAAATCA- 3′, CAPF-R 5′- TTCCGCCGTCAATTACTCTG- 3′ (Arumugam, N.D., Ajam, Ν., Blackall, P.J., Asiah, N.M., Ramlan, M., Maria, J., Yuslan, S. and Thong, K.L. Capsular serotyping of Pasteurella multocida from various animal hosts - a comparison of phenotypic and genotypic methods // Tropical Biomedicine. - 2011. - Vol. 28(1). - P.55-63).
Способ используется в качестве быстрого альтернативного метода типирования и, в отличие от серологических методов, позволяет определять принадлежность к серогруппе бескапсульных вариантов бактерии. Недостатком способа является отсутствие видоспецифичных для Pasteurella multocida праймеров, низкая чувствительность и он предназначен только для типирования чистых культур.
Задачей изобретения является разработка высокоспецифичного и чувствительного способа на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего одновременно выявлять и генотипировать штаммы и изоляты бактерии Pasteurella multocida пяти серогрупп крупного рогатого скота в пробах патологического материала от больных животных, смешанных и чистых бактериальных культурах.
Поставленная задача решается тем, что в способе выявления и генотипирования бактерии Pasteurella multocida крупного рогатого скота серогрупп А, В, D, Е, F в мультиплексной полимеразной цепной реакции, включающем исследование каждой пробы в двух реакциях методом ПНР в мультиплексном варианте с электрофоретической детекцией результатов, согласно изобретения, используют специфические олигонуклеотидные праймеры комплементарные консервативному участку cap locus генома бактерии, выявление вида Pasteurella multocida осуществляют путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2 на основе образования ампликона размером 211 п.н., генотипирование серогрупп: серогруппы А путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4 и образования ампликона длиной 564 п.н., серогруппы D путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6 и образования ампликона длиной 355 п.н., серогруппы В путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8 и образования ампликона длиной 167 п.н., серогруппы Ε путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10 и образования ампликона длиной 357 п.н., серогруппы F путем амплификации участка локуса с помощью праймеров SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12 и образования ампликона длиной 257 п.н., в первой реакции выявляют вид Pasteurella multocida и генотипируют серогруппы А и D, во второй реакции генотипируют группы В, Е, F. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение синтетических олигонуклеотидных праймеров
На начальном этапе проводят анализ нуклеотидных последовательностей геномов серотипов А, В, D, Е, F бактерии P. multocida из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и определяют наиболее консервативные участки.
Таким образом для идентификации бактерии Р. multocida и генотипирования серогрупп методом ПЦР подбирают синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные консервативному участку cap locus, представленные в таблице 1. Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров проводят с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax).
Пример 2. Выявления и генотипирования бактерии Pasteurella multocida серогрупп А, В, D, Е, F при помощи специфических олигонуклеотидных праймеров в пробах патологического материала и культурах бактерий
Способ осуществляется в несколько этапов.
Этап 1. Подготовка проб патологического материала и бактериальных культур для исследования
Для исследования от павших или вынужденно убитых животных с признаками бронхопневмонии отбирают пробы внутренних органов (легких на границе нормального и измененного участка, бронхиальных и средостенных лимфатических узлов) не позднее 3-5 часов после гибели животного.
Пробы органов животных помещают в фарфоровые ступки, растирают с песком и разводят физиологическим раствором в соотношении 1/5-1/10, затем центрифугируют и надосадочную жидкость используют для выделения ДНК.
2
Бактериальные культуры инкубируют в термостате при температуре 37°С в атмосфере 5% СО на мясопептонный агар с добавлением 5% дефибрированной крови барана.
Через 24-48 часов инкубации просматривают чашки Петри с агаром на наличие типичных для пастерелл колоний (прозрачных, диаметром до 3 мм, округлых с ровными краями, слизистой консистенции, серого цвета, без гемолиза). Из этих колоний делают мазки на стекле и окрашивают их по Граму для предварительного типирования. При обнаружении в мазке грамотрицательных кокобактерий колонию отбирают для исследования в ПЦР.
9
Для этого отдельные колонии, не смешивая, снимают с поверхности агара, переносят в отдельные стерильные стеклянные пробирки, содержащие 200 мкл стерильной дистиллированной воды, перемешивают на вортексе. Взвесь бактерий разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 10 КОЕ/мл и используют для выделения ДНК.
Этап 2. Выделение ДНК из проб биоматериала или взвеси бактерий
Выделение ДНК проводят любым доступным способом, включающим лизис клеток, депротеинизацию лизата, осаждением ДНК из раствора, отмывку спиртами, высушивание и растворение ДНК в буферном растворе.
Этап 3. Постановка мультиплексной ПЦР для выявления и генотипирования бактерии Pasteurella multocida серогрупп А, В, D, Е, F
2
Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 мM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl, 25 мM KCl, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,2 мкг каждого праймера, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл выделенной ДНК.
Для первой реакции для приготовления реакционной смеси используют смесь праймеров SEQ ID NO: 1-6, для второй реакции - SEQ ID NO: 7-12.
Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 10 сек, 57°С - 15 сек, 72°С - 20 сек - 35 циклов; 72°С - 5 мин.
Этап 3. Определение размера продуктов ПЦР
Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0) по стандартной методике.
Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».
Используют маркер молекулярного веса 100 bp.
Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру ампликонов, приведенных в таблице 1. Результаты генотипирования серогрупп учитывают только при выявлении вида бактерии P. multocida в первой реакции.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно выявлять и генотипировать штаммы и изоляты бактерий P. multocida серотипов А, В, D, Е, F в пробах патологического материала от больных животных и бактериальных культурах.
Пример 3. Определение аналитической и диагностической чувствительности реакции по заявленному способу
Аналитическую чувствительность метода определяют постановкой ПЦР, где в качестве исследуемых образцов используют 10-кратные разведения положительных контрольных образцов (ΠΚΟ/P.m.-sp; ПКО/Р.m.-А, ΠΚΟ/P.m.-D, ΠΚΟ/P.m.-B, ΠΚΟ/P.m.-E и ΠΚΟ/P.m.-F), полученные путем трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli плазмидами pCR2.1, содержащими специфические ДНК вставки бактерии P. multocida.
Концентрацию плазмидной ДНК определяют с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Пересчет концентрации ДНК в количество копий проводят в программе-конвертере http://molbiol.ru/scripts/01_07.html по формулам:
олиг
3
m[g]=Q[mol] × Mw[kDa] × 10
3
m[g]=Q[mol] × <Mw> [Da] × L[kb] × 10
A
N[штук]=Q[mol] × N
c[M] × V[L]=Q[mol], где
m[g] - вес нуклеиновой кислоты;
олиг
Mw [kDa] - молекулярный вес олигонуклеотида.
<Mw> [Da] - средний молекулярный вес одного/пары оснований.
base=324.5 Da
base pair=649 Da
ribo base=340.5 Da
Q [mol] - количество нукл. кислоты;
N [копий] - количество молекул нукл. кислоты;
с [М] - молярная концентрация нукл. кислоты;
V [L] - объем, в котором растворена нукл. кислота;
L [kb] - длина нукл. кислоты;
A
23
N - Число Авогадро = 6.022045×10 [1/моль]
За аналитическую чувствительность принимают последнее разведение ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретируется как положительный. Результаты проведенных экспериментов по оценке аналитической чувствительности метода приведены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика положительных контрольных образцов и аналитическая чувствительность реакции
ПКО
Длина плазмидной, ДНК (п.н.)
Концентрация , (мкг/мл)
Количество копий ДНК , (ГЭ/мл)
Аналитическая чувствительность , (ГЭ в реакции)
ПКО/P.m.-sp
4142
2,40
5,3×10<sup>11</sup>
5,3×10
ПКО/Р.m.-А
4157
1,10
2,4×10<sup>11</sup>
2,4×10
ПКО/Р.m.-В
4098
1,34
3,0×10<sup>11</sup>
3,0×10
ΠΚΟ/P.m.-D
4286
2,25
4,8×10<sup>11</sup>
4,8×10
ПКО/Р.m.-Е
3979
1,19
2,8×10<sup>11</sup>
2,8×10<sup>2</sup>
ΠΚΟ/P.m.-F
3982
0,85
2,0×10<sup>11</sup>
2,0×10<sup>2</sup>
Минимальное количество ДНК-матриц, выявляемых в ходе реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах), в 30 мкл реакционной смеси составило 53 ГЭ на реакцию для бактерии P. multocida и от 24 до 280 ГЭ на реакцию для разных серогрупп бактерии.
11
1
Для определения диагностической чувствительности реакции по заявленному способу суточную культуру контрольных штаммов P. multocida «1231», «680», «Т-80», выращенных на мясопептонном агаре с добавлением 5% дефибрированной крови барана, переносят в бактериологическую пробирку, содержащую 1000 мкл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора, разводят до концентрации 10 КОЕ/мл, титруют методом 10-кратных разведений до разведения 10 КОЕ/мл. Результаты определения диагностической чувствительности разработанной ПЦР представлены в таблице 3.
Таблица 3
Определение диагностической чувствительности реакции при выявлении и генотипировании P. multocida
№ п/п
Серогруппа P. multocida
Штамм
Чувствительность, КОЕ/мл
P. multocida
A
В
D
Ε
F
1
А
1231
10<sup>3</sup>
10<sup>3</sup>
отр
отр
отр
отр
2
В
681
10<sup>3</sup>
отр
10<sup>3</sup>
отр
отр
отр
3
D
Т-80
10<sup>3</sup>
отр
отр
10<sup>3</sup>
отр
отр
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой аналитической и диагностической чувствительностью, позволяет с одинаковой эффективностью выявлять и генотипировать штаммы и изоляты бактерий Р. multocida серотипов А, В, D, Е, F.
Пример 4. Определение специфичности и эффекивности реакции по заявленному способу
Для определения специфичности и эффективности реакции исследовали контрольные штаммы бактерий Mannheimia haemolytica тип A1 (штамм 16), Escherichia coli (штаммы F-50, АТСС 25922), культуры бактерий P. multocida, выделенные от больных животных, а также пробы внутренних органов телят с симптомами респираторных болезней.
Результаты опытов по определению специфичности и эффективности представлены в таблице 4.
Таблица 4
Примечание: «+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат, «А», «В», «D» - положительный результат генотипирования в первой или второй реакции
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой специфичностью и эффективностью при выявлении и генотипировании бактерии Pasteurella multocida пяти серогрупп в пробах патологического материала, полученного от больных телят, культурах бактерий, выделенных на искусственных питательных средах.