Молекулярно-генетические основы патогенеза нозокомиальной пневмонии

© БАЙГОЗИНА Е.А., СОВАЛКИН В.И., ДОЛГИХ В.Т.

УДК 616.24-002-022.36-092

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА НОЗОКОМИАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ

Е.А. Байгозина, В.И. Совалкин, В.Т. Долгих Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.И.

Новиков; кафедра госпитальной терапии, зав. - д.м.н., проф. В.И. Совалкин;

кафедра патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии,

зав. - д.м.н., проф. В.Т. Долгих.

Резюме. Установлена патогенетическая значимость генетического полиморфизма регуляторной молекулы воспаления CD14 (-260) C^T. Выявлено, что генотип Т/Т ассоциируется с тяжестью течения нозокомиальной

пневмонии и риском инфицирования грамотрицательной микрофлорой респираторного тракта больных. Доказано, что аллель Т является маркёром повышенного риска неблагоприятного исхода у пациентов с нозокомиальной пневманией. Одним из механизмов, посредством которых полиморфизм гена CD14 участвует в иммунопатогенезе нозокомиальной пневмании, является гиперцитокинемия фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a), интерлейкина-1 бета (IL-1P) и рецепторного антагониста интерлейкина 1 (IL1-RA).

Ключевые слова: CD14, нозокомиальная пневмония, патогенез.

Байгозина Евгения Александровна - к.м.н., ассистент каф. госпитальной терапии ОмГМА; e-mail: pulmonolo gy5 5 @mail.ru.

Совалкин Валерий Иванович - д.м.н., проф. каф. госпитальной терапии ОмГМА; e-mail: v.sovalkin@mail.ru.

Долгих Владимир Терентьевич - д.м.н., проф. каф. патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии ОмГМА; e-mail: prof_dolgih@mail.ru.

Одним из аспектов патогенеза нозокомиальной пневмонии является оценка показателей иммунной системы, в частности, - регуляторных молекул воспаления, в реализации биологических эффектов которых ключевую роль играет генетический полиморфизм. В зависимости от индивидуального ансамбля носительства аллельных вариантов гена CD14 характер воспалительного ответа может значительно различаться между индивидуумами с полярными генотипами. К настоящему времени имеются единичные сведения о роли полиморфизма генов регуляторных молекул воспаления в иммунопатогенезе НП, однако эти данные чрезвычайно варьируют и зачастую противоречат друг другу [6], в связи с чем для понимания патогенеза НП крайне важно установить патогенетическую значимость полиморфизма гена регуляторной молекулы воспаления CD14 в формировании, тяжести течения и исходе данной пневмонии.

Материалы и методы

Молекулярно-генетические исследования выполнялись в генетической лаборатории Академического центра патологической анатомии Г осударственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия». Анализ полиморфных локусов гена CD14 (-260) C^T осуществлялся с помощью метода полимеразной цепной реакции в стандартных условиях на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Москва). TNF-a в сыворотке крови определялся с помощью набора реагентов «ProCon TNFa» фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). IL-1 в в сыворотке крови выявлялся с помощью набора реагентов «ProCon IL-1b» (Санкт-Петербург). IL-ЖА в сыворотке крови определялся с помощью набора реагентов (IL-RA-ИФА-БЕСТ) фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). В

процессе статистической обработки данных применялись методы описательной статистики; для сравнения двух независимых групп - критерий Манна-Уитни; трех независимых групп - критерий Краскела-Уоллиса; для оценки значимости различий в группах, имеющих качественные переменные, использовался хи-квадрат (х) и точный критерий Фишера. Соответствие наблюдаемых распределений частот генотипов, теоретически ожидаемых по закону Харди-Вайнберга, оценивалось по критерию %2 с помощью компьютерной программы SPSS 11.5 for Windows. Сила ассоциации оценивалась в значениях показателей отношения шансов (ОШ) по формуле: ОШ = (ad) / (bc); где: а и b - число

больных с наличием/отсутствием данного генотипа, соответственно; с и d -число здоровых лиц с наличием/отсутствием данного генотипа.

Результаты и обсуждение В проведённом нами исследовании частота генотипов полиморфизма (-260) С——Т гена CD14 в группах больных с тяжёлой и среднетяжёлой НП и здоровых доноров находилась в равновесии Харди-Вайнберга (табл. 1). При анализе варианта течения НП в зависимости от генетического полиморфизма регуляторной молекулы CD14 было выявлено, что в группе больных с тяжёлой и среднетяжёлой НП достоверно чаще встречался генотип Т/Т по сравнению с контрольной группой (р=0,014 и р=0,005 соответственно) (табл. 1).

Таблица 1

Частота генотипов гена CD14

Примечание: * - достоверность различий между группами пациентов с тяжёлой нозокомиальной пневмонией и контрольной группой по генотипам (С/С+С/Т) и Т/Т (по двустороннему критерию Фишера); (ОШ=2,42; 95% ДИ 1,23-4,77; р=0,014). Л - достоверность различий между группами пациентов со среднетяжёлой нозокомиальной пневмонией и контрольной группой по генотипам (С/С+С/Т) и Т/Т (по двустороннему критерию Фишера); (ОШ

=2,26; 95% ДИ 1,32-3,89; р=0,005).

У больных с генотипом Т/Т грамотрицательная микрофлора выявлялась в 18 (24%) случаях; а у пациентов при носительстве генотипов С/С или С/Т - в

10 (13,3%) случаях, (р=0,004). Возможно, что у гомозигот по мутантному аллелю Т гена молекулы CD14 возникал дефект антиинфекционной защиты при тяжёлой нозокомиальной пневмонии, что доказывалось выявленной в нашей работе связью между генотипом Т/Т гена CD14 и тяжестью состояния по шкале оценки органной недостаточности, связанной с сепсисом (SOFA) (ОШ=2,84; 95% ДИ 1,43-5,87; p=0,001). Несмотря на то, что рецептор CD14 не имел трансмембранного домена, необходимого для проведения внутриклеточного сигнала, его функция сводилась к связыванию липополисахаридов грамотрицательных бактерий и формированию высокоаффинного рецепторного комплекса вместе с ^П-подобными рецепторами ^R-4 [1,5]. По-видимому, у пациентов, несущих генотип Т/Т, утрачивалась способность к взаимодействию рецептора и растворимой формы CD14 (sCD14) с липополисахаридами, что ассоциировалось с более тяжёлым течением нозокомиальной пневмонии. В частности, у пациентов с вентилятор-ассоциированной пневмонией обнаруживалась зависимость между генотипом Т/Т гена CD14 и необходимостью проведения искусственной вентиляции лёгких более 72 часов (ОШ=2,91; 95% ДИ 1,18-7,56; p=0,03).

Характеристика популяции больных с тяжёлым течением НП включала анализ связи аллельного полиморфизма гена регуляторной молекулы CD14 c рядом клинических параметров пациентов (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика пациентов с тяжёлой нозокомиальной пневмонией в зависимости от аллельного полиморфизма гена CD14 (-260) С^Т

Примечание: рф - достоверность различий между группами (двусторонний критерий Фишера).

Как видно из табл. 2, в исследовании были получены достоверные различия в распространённости грамотрицательной микрофлоры среди пациентов, у которых чаще выявлялся аллель Т гена CD14: 22 (66,7%) пациента против 6 (21,4%) с аллелем С (р<0,001). Кроме того, отмечалась чёткая тенденция к

возрастанию уровня летальности к 28-м суткам пребывания в стационаре при наличии аллеля Т в группе больных с тяжёлой НП (р<0,05).

Эти данные подчёркивали роль регуляторной молекулы СD14 на этапах раннего распознавания липополисахаридов грамотрицательных патогенов и, возможно, как следствие, - развитие поздних осложнений НП, являющихся ведущей причиной летального исхода к 28-м суткам.

Одним из патогенетических механизмов полиморфизма гена CD14 являлось влияние его на продукцию ключевых провоспалительных цитокинов, в частности, TNF-a [2,4]. В нашей работе было представлено влияние полиморфизма гена CD14 на продукцию TNF-a клетками периферической крови в зависимости от генотипов - С/С, С/Т и Т/Т у больных с госпитальной пневмонией (рис. 1).

Следует отметить, что в группе здоровых доноров (контроль) не выявлялись достоверно значимые различия между генотипом CD14 и TNF-a в периферической крови (р>0,05), что обусловливалось отсутствием бактериальных стимулов. Полиморфизм в позиции (-260) С—Т гена CD14 ассоциировался с высоким уровнем сывороточного TNF-a, что было связано с возрастающим уровнем матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) TNF-a по сравнению с гомозиготами по аллелю С [2,4].

В исследовании обнаруживалась взаимосвязь между полиморфизмом (260) С—Т гена CD14 и содержанием TNF-a в сыворотке крови (ОШ=4,32; 95% ДИ 1,19-15,56; p<0,03) в группе у больных с тяжёлой нозокомиальной пневмонией.

Как видно из рис. 1, достоверность различий между группами пациентов с генотипом Т/Т по уровню содержания TNF-a в сыворотке крови статистически была значима по сравнению с гомозиготами С/С при стимуляции липополисахаридами грамотрицательных микроорганизмов. Особенно высокие значения TNF-a в сыворотке крови регистрировались при наличии в системном кровотоке липополисахаридов Pseudomonas aeruginosa, Esherichia coli и пептидогликанов Staphylococcus aureus.

(Jh

Контроль E. coli P. aeruginosa S. aureus

Рис. 1. Содержание TNF-a в сыворотке крови в зависимости от полиморфизма гена регуляторной молекулы CD14.

Примечание: * - достоверность различий между группами больных, несущих генотип Т/Т, и уровнем TNF-a в периферической крови в зависимости от вида патогенов (р=0,03).

В проведённом исследовании у пациентов с НП, вызванной грамотрицательной микрофлорой, в случае наличия генотипа Т/Т, продукция TNF-a в периферической крови также оказывалась выше по сравнению с группой больных с генотипом С/С (ОШ=0,49; 95% ДИ 0,23-0,81; p=0,01).

Нами были выявлены достоверные различия между группами больных с различными этиологическими агентами, что свидетельствовало о различном влиянии антигенных детерминант, связываемых с рецептором CD14, а именно: инфицирование грамотрицательной микрофлорой больных с

госпитальной пневмонией приводило к повышению экспрессии гена CD14 и, как следствие, - повышению его растворимой фракции.

Таким образом, в группе больных с тяжёлым течением нозокомиальной пневмонии достоверно чаще встречался генотип Т/Т гена регуляторной молекулы CD14, что приводило к риску инфицирования грамотрицательной микрофлорой, повышению синтеза цитокинов и ассоциировалось с более высоким риском летального исхода у больных с госпитальной пневмонией по сравнению с лицами-носителями генотипа С/С, что было доказано и другими исследователями [3].

В нашем исследовании оценивалась возможность влияния генотипов С/С и Т/Т на продукцию цитокинов ТКБ-а, 1Ь-1р и 1Ь-1ЯА. Полученные результаты по содержанию данных цитокинов в периферической крови в зависимости от генотипов молекулы С014 представлены на рис. 2.

Рис. 2. Уровень цитокинов в сыворотке крови у пациентов с генотипами С/С и Т/Т гена регуляторной молекулы СВ14 (-260) С^Т (достоверность различий между популяций больных с генотипами Т/Т и С/С; р<0,05).

Как видно из рис. 2, у пациентов с генотипом Т/Т гена регуляторной молекулы С014 имела место гиперцитокинемия за счет про- и противовоспалительных цитокинов, это подчеркивало ключевую роль полиморфизма С014 в иммунопатогенезе нозокомиальной пневмонии.

Таким образом, одним из ведущих патогенетических звеньев НП является изменение соотношения аллельных вариантов промоторного участка гена паттерн-распознающего рецептора СБ14 (-260) С^Т, определяющего вариабельность инициального этапа распознавания патогенов, нарушение продукции цитокинов и, в конечном итоге, - тяжесть течения и исход пневмонии.

MOLECULAR AND GENETIC PATHOGENESIS OF NOSOCOMIAL

PNEUMONIA

900

Генотип ITT Генотип CYC

T\"F-(a Tl.-lfi TT,1-RA

Заключение

E.A.Bajgozina, V.I.Sovalkin, V.T. Dolgih Omsk state medical academy Abstract. We determined the importance of genetic polymorphism in inflammation regulatory molecular CD14 (-260) C^T. It was revealed that genotype T/T associates with the severity of nosocomial pneumonia and risk of airways gram-negative microflora infection. It was proved that allele T is a marker of high risk of unfavorable outcome in the patients with nosocomial pneumonia. Hypercytokinemia of tumor necrosis factor-alfa (TNF- a), interlukine-1 beta (IL-1P) and interlukine lreceptor antagonists (IL1-RA) is one of the mechanism polymorphic gene CD14 participates in immunopathogenesis of nosocomial pneumonia.

Key words: CD14, nosocomial pneumonia, pathogenesis

Литература

1. Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А.С. Симбирцев // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 3-10.

2. Brass D.M. CD14 is an essential mediator of LPS-induced airway disease / D.M. Brass // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. - 2007. - Vol. 293. - P. 77-83.

3. Erridge C. Acinetobacter baumannii lipopolysaccharides are potent stimulators of human monocyte activation via Toll-like receptor 4 signalling / C. Erridge

// Jornal of Medical Microbiology. - 2007. - Vol. 56. - P. 165-171.

4. Frevert C.W. Effect of CD14 blockade in rabbits with Escherichia coli pneumonia and sepsis / C.W. Frevert // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. - P. 5439-5445.

5. Gao L. Recent advances in genetic predisposition to clinical acute lung injury / L. Gao // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. - 2009. - Vol. 296. -P. 713-725.

6. Schwartz D.A. Genetic analysis of sporadic and familial interstitial pneumonia / D.A. Schwartz // Proc. Am. Thorac. Soc. - 2008. - Vol. 5. - P. 343-347.