МИКРОЧАСТИЦЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АНАЛОГИ СОМАТОСТАТИНА
MICROPARTICLES CONTAINING ANALOGS OF SOMATOSTATIN

Настоящее изобретение относится к микрочастицам, включающим аналог соматостатина, и к включающим их фармацевтическим композициям.
Соматостатин представляет собой тетрадекапептид, имеющий структуру
Аналоги соматостатина, представляющие особый интерес, описаны, например, в заявках WO 97/01579 и WO 02/10192. Указанные аналоги соматостатина включают последовательность аминокислот формулы I
1
2
-(D/L)Trp-Lys-X-Х -   (I)
1
в которой X обозначает радикал формулы (а) или (б)
1
в которой R обозначает необязательно замещенный фенил, причем заместитель может представлять собой галоген, метил, этил, метоки- или этоксигруппу,
2
1
2
1
2
2
1
R обозначает -Z-CH-R, -CH-CO-O-CH-R,
1
в которой Z обозначает О или S, и
2
α
9
Х представляет собой α-аминокислоту, имеющую ароматический остаток на С-боковой цепи или аминокислотную группу, выбранную из Dab, Dpr, Dpm, His, (Bzl)HyPro, тиенил-Ala, циклогексил-Ala и трет-бутил-Аlа, причем остаток Lys указанной последовательности соответствует остатку Lys нативного соматостатина-14.
Данные соединения называют ниже соединениями, соответствующими изобретению.
Под термином аналог соматостатина, как используют в данном контексте, подразумевают линейный или циклический пептид, полученный из пептида естественного соматостатина-14, включающего последовательность формулы I, в которой дополнительно один или более аминокислотных остатков пропущены и/или заменены одним или более другим аминокислотным радикалом(ами) и/или в котором одна или более функциональных групп заменены одной или более других функциональных групп и/или одной или более групп заменено одной или несколькими другими изостерическими группами. В общем термин покрывает все модифицированные производные нативного соматостатина-14, включающие вышеуказанную последовательность формулы I, которые обладают аффинностью связывания в интервале нМ в отношении по меньшей мере одного подтипа соматостатиновых рецепторов, как определено ниже.
Предпочтительно, когда аналог соматостатина представляет собой соединение, в котором остатки в положениях 8-11 соматостатина-14 представлены последовательностью формулы I, как определено выше.
6
7
Более предпочтительно, когда аналог соматостатина представляет собой соединение, как описано выше, включающее гексапептидную структуру, причем остатки в положениях 3-6 данной гексапептидной структуры включают последовательность формулы I. Особенно предпочтительным является гексапептид соматостатина, в котором остатки в положениях 1 и 2 гексапептидной структуры могут быть любыми из известных в области техники, например, как описано A.S.Dutta в монографии Small Peptides, Vol.19, 292-354, Elsevier, 1993, или заместителями Phe и/или Phe соматостатина-14.
В частности, аналог соматостатина представляет собой соединение, в котором гексапептидная структура является циклической, например, имеющей прямую пептидную связь между α-карбонильной группой остатка в положении 6 и α-аминогруппой остатка в положении 1.
1
2
Хотя Lys, X и Х в последовательности формулы I имеют L-конфигурацию, Trp может иметь D- или L-конфигурацию. Предпочтительно, когда Trp имеет D-конфигурацию.
1
2
Х предпочтительно обозначает остаток формулы (а) или (б), причем Rпредпочтительно представляет собой
1
2
1
-Z-CH-R или
2
α
2
α
Когда Х включает ароматический остаток на С-боковой цепи, он может соответственно представлять собой природную или неприродную α-аминокислоту, например Phe, Туr, Тrр, Nal, Pal, бензотиенил-Ala, Tic и тиронин, предпочтительно Phe или Nal, более предпочтительно Phe. X предпочтительно обозначает α-аминокислоту, несущую ароматический остаток на С-боковой цепи.
1
1
Когда R обозначает замещенный фенил, он может быть соответствующим образом замещенным галогеном, метилом, этилом, метокси- или этоксигруппой, например, в орто- и/или пора-положении. Более предпочтительно, когда Rпредставляет собой незамещенный фенил.
1
Z предпочтительно обозначает О.
Репрезентативные соединения, соответствующие изобретению, представляют собой, например, соединения формулы (II)
1
2
в которой X и Х означают, как определено выше,
А представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro,
3
8
9
2-6
2-6
2-6
3а
1-4
3
3b
1-4
a
5
6
b
2
1-3
3
4
3
4a
5
6
1-4
1-4
1-4
7
1-6
8
9
1-4
2-4
2
с
2
8
9
11
2
1-3
3
2
1-5
5
6
которых R обозначает НRR-Cалкилен, гуанидин-Салкилен или Салкилен-СООН, R обозначает Н, Салкил или независимо друг от друга имеет одно из значений, приведенных для R, R обозначает Н или Салкил, R обозначает ОН или NRR, R обозначает -(CH)- или -СН(СН)-, Rобозначает Н или СН, R представляет собой необязательно замещенный по циклу бензил, каждое из R и R независимо друг от друга обозначает Н, Салкил, ω-амино-Салкилен, ω-гидрокси-Салкилен или ацил, Rпредставляет собой прямую связь или Cалкилен, каждое из R и Rнезависимо друг от друга обозначает Н, Салкил, ω-гидрокси-Салкилен, ацил или СНOН-(СНОН)-СН-, где с обозначает 0, 1, 2, 3 или 4, либо R и Rформируют совместно с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклическую группу, которая может включать дополнительный гетероатом, и R обозначает необязательно замещенный по циклу бензил, -(CH)-OH, СН-СН(ОН)- или -(CH)-NRR, и
a
ZZ обозначает природную или неприродную α-аминокислотную группу.
a
a
a
2
2
3
3
a
α
ZZ может иметь D- или L-конфигурацию. Когда ZZ представляет собой природную или неприродную α-аминокислотную группу, она соответственно может представлять собой, например Thr, Ser, Ala, Val, Ile, Leu, Nie, Hls, Arg, Lys, Nal, Pal, Туr, Тrр, необязательно замещенный по циклу Phe или N-бензил-Gly. Когда ZZ представляет собой Phe, его бензольный цикл может быть замещен, например, NH, NO, СН, ОСН или галогеном, предпочтительно в пара-положении. Когда ZZ представляет собой Phe, предпочтительно, чтобы бензольное кольцо оставалось незамещенным.
3
Когда А включает остаток аминокислоты Pro, любой заместитель, присутствующий на пролиновом цикле, например, R-NH-CO-O- и т.п., предпочтительно находится в положении 4. Данный замещенный остаток пролина может находиться в цис-форме, например
а также в транс-форме. Каждый геометрический изомер индивидуально, а также их смеси являются соединениями, соответствующими изобретению.
Когда А обозначает
8
9
2-6
2
2
где NRR образует гетероциклическую группу, данная группа может быть ароматической или насыщенной и может включать один атом азота или один атом азота и второй гетероатом, выбранный из азота и кислорода. Предпочтительно, когда гетероциклическая группа представляет собой, например, пиридил или морфолиновую группу. Салкилен в данном остатке предпочтительно является -СН-СН-.
5
6
8
9
12
12
1-4
2-4
3-6
4а
11
Любой ацил, такой как R, R, R и R, в А может быть, например RCO-, где R обозначает Н, Салкил, Салкенил, Сциклоалкил или бензил, предпочтительно метил или этил. Когда R или R в А обозначает замещенный по циклу бензил, бензильный цикл может быть замещен, как указано выше для ZZa.
Особенно предпочтительными являются соединения формулы III
в которой конфигурация в положении С-2 представляет собой (R) или (S) или их смесь и
10
11
2-6
2-6
10
11
1-4
в которой R обозначает NRR-Cалкинен или гуанидин-Салкилен, и каждое из R и R независимо друг от друга обозначают Н или Салкил, в свободной форме, в форме соли или в защищенной форме.
10
11
2-6
2
2
4
2
2
4
6
5
Предпочтительно, когда R представляет собой NRR-Cалкилен. Предпочтительными соединениями формулы III является соединения, в которых R представляет собой 2-аминоэтил, а именно цикло[{4-(NH-CH-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe] (называемое в данном контексте соединением А) и цикло[{4-(NH-CH-NH-CO-O-)Pro}-DPhg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)-Phe], в свободной форме, в форме соли или защищенной форме. Phg обозначает -HN-CH(CH)-CO- и Bzl обозначает бензил.
Представленное в изобретении соединение в защищенной форме соответствует аналогу соматостатина, в котором по меньшей мере одна из аминогрупп защищена и который при снятии защиты становится соединением формулы II или III, предпочтительно физиологически удаляемым. Подходящими аминозащитными группами являются, например, описанные в монографии "Protective Groups in Organic Synthesis", Т.W.Greene, J.Wiley & Sons NY (1981), 219-287, содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки. Примером данной аминозащитной группы является ацетил.
Соединение, соответствующее изобретению, например соединение формулы III, в частности соединение А, может находиться, например, в свободной или в форме соли. Соли включают кислотно-аддитивные соли, например, с неорганическими кислотами, полимерными кислотами или органическими кислотами, например с хлористоводородной кислотой, уксусной кислотой, молочной кислотой, аспарагиновой кислотой, бензойной кислотой, янтарной кислотой или памовой кислотой. Кислотно-аддитивные соли могут находиться в виде одно- или двухвалентных солей, например, в зависимости от того, добавлено ли 1 или 2 эквивалента кислоты. Предпочтительные соли, например, для соединения А представляют собой лактат, аспартат, бензоат сукцинат и памоат, включая моно- и дисоли, более предпочтительно дисоль аспартата и моносоль памоата.
Соединения, соответствующие изобретению, можно получить в соответствии с принятыми методами.
Как правило, соединения, соответствующие изобретению, доставляют системно, например парентерально. Однако парентеральное введение может быть очень болезненным, особенно при повторном введении. Для уменьшения до минимума числа инъекций пациенту следует вводить подходящий депо-препарат.
Обнаружено, что введение микрочастиц, включающих аналог соматостатина, например, погруженного в биосовместимый фармакологически приемлемый полимер, суспендированный в подходящем носителе, приводит к высвобождению всего или практически всего активного агента в течение длительного периода времени, например от нескольких недель до 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 4 недель.
Таким образом, настоящее изобретение представляет микрочастицы, включающие соединение, соответствующее изобретению, например, погруженные в биосовместимый фармакологически приемлемый полимер, и фармацевтический депо-препарат, включающий данные микрочастицы.
Соединение, соответствующее изобретению, может присутствовать в количестве от приблизительно 1 до приблизительно 60%, чаще от приблизительно 10 до приблизительно 50%, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 40%, даже более предпочтительно от приблизительно 25% до приблизительно 35% в пересчете на сухую массу микрочастиц.
Предпочтительно, когда представленное в изобретении соединение, используемое для получения микрочастиц, представляет собой аморфный порошок, имеющий размер частиц от приблизительно 0,1 мк до приблизительно 15 мк, предпочтительно меньше чем приблизительно 5 мк, даже более предпочтительно меньше чем приблизительно 3 мк.
Распределение по размеру частиц соединения, соответствующего изобретению, может влиять на профиль высвобождения лекарственного препарата из микрочастиц. Как правило, чем меньше размер частиц, тем ниже уровень выброса и высвобождение во время фазы диффузии, например, в течение первых 20 дней. Предпочтительно, когда распределение частиц по размеру составляет, например ×10<0,8 мк, т.е. 10% частиц меньше, чем 0,8 мк; ×50<1,5 мк, т.е. 50% частиц меньше, чем 1,5 мк или ×90<3,0 мк, т.е. 90% частиц меньше, чем 3,0 мк.
Полимерная матрица микрочастиц может представлять собой синтетический или природный полимер. Полимер может быть либо биоразрушаемым, либо небиоразрушаемым и комбинацией биоразрушаемых и небиоразрушаемых полимеров, предпочтительно биоразрушаемым.
Под термином "полимер" подразумевают гомополимер или сополимер.
Полимерную матрицу конструируют так, чтобы она разрушалась в достаточной мере, чтобы выводиться из области введения в течение от 1 до 6 месяцев после высвобождении всего или практически всего активного агента.
Подходящие полимеры включают
(а) линейные или разветвленные полиэфиры, которые представляют собой линейные цепи, расходящиеся из молекулы полиола, например глюкозы, например, такой полиэфир, как D-, L- или рацемическая полимолочная кислота, полигликолевая кислота, полигидроксимасляная кислота, поликапролактон, полиалкиленоксалат, полиалкиленгликолевые эфиры кислот цикла Кребса, например, цикла лимонной кислоты и т.п. или их комбинации,
(б) полимеры или сополимеры простых органических эфиров, ангидридов, амидов или ортоэфиров, включая данные сополимеры с другими мономерами, например полиангидрид, такой как сополимер 1,3-бис-(n-карбоксифенокси)пропана и дикислоты, например себациновой кислоты, или сополимер димера эруковой кислоты с себациновой кислотой; полиортоэфир, полученный в результате реакции ортоэфира с триодом, например 1,2,6-гексантриол, или дикетенацеталя, например 3,9-диэтилиден-2,4,8,10-тетраоксаспиро[5,5]ундекана с диолом, например 1,6-дигександиол, триэтилегликоль или 1,10-декандиол; либо полиэфирамид, полученный с использованием амид-диолового мономера, например 1,2-ди-(гидроксиацетамидо)этан или 1,10-ди-(гидроксиацетамидо)декан; либо
(в) поливиниловый спирт.
Полимеры могут быть перекрестно-сшитыми или неперекрестно-сшитыми, обычно не более 5%, как правило, менее 1%.
Предпочтительными полимерами, соответствующими изобретению, являются линейные полиэфиры и полиэфиры с разветвленной цепью. Линейные полиэфиры могут быть получены из α-гидроксикарбоновых кислот, например молочной кислоты и/или гликолевой кислоты, путем конденсации лактоновых димеров, см., например, US 3773919, содержание которого включено в данном контексте в виде ссылки. Предпочтительные полиэфирные цепи в линейных или разветвленных (звездчатых) полимерах представляют собой сополимеры молекул α-карбоновых кислот, молочной кислоты и гликолевой кислоты, или димеров лактонов. Молярное соотношение лактидтликолид полилактид-со-гликолидов в линейных или разветвленных полиэфирах составляет предпочтительно от приблизительно 75:25 до 25:75, например от 60:40 до 40:60, причем наиболее предпочтительно от 55:45 до 45:55, например от 52:48 до 48:52.
6
8
4
х
4
4
4
у
n
Линейные полиэфиры, например линейные полилактид-со-гликолиды (ПЛГ), предпочтительно используемые согласно изобретению, имеют средневесовую молекулярную массу (Mw) от приблизительно 10000 до приблизительно 500000 Д, например приблизительно 50000 Д. Данные полимеры имеют полидисперсность Mw/Mn (среднечисленная молекулярная масса), например, от 1,2 до 2. Подходящие примеры включают, например, поли(D,L-лактид-со-гликолид), например, имеющий общую формулу -[(СНO)(СНO)]- (каждое из х, у и n имеет такое значение, чтобы общая сумма была больше указанных Mw), например, коммерчески доступные препараты, например Resomers фирмы Boehringer Ingelheim, в частности Resomers RG, например Resomer RG 502, 502Н, 503, 503Н, 504, 504H.
Разветвленные полиэфиры, например, разветвленные полилактид-со-гликолиды, предпочтительно используемые согласно изобретению, можно получить с использованием полигидроксисоединений, например полиола, например глюкозы или маннита, в качестве инициатора. Данные сложные эфиры полиола известны и описаны, например, в GB 2145422 В, содержание которого включено в данном контексте в виде ссылки. Полиол содержит по меньшей мере 3 гидроксигруппы и имеет молекулярную массу до 20000 Д, причем по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 2, например в среднем 3 из гидроксигрупп полиола находятся в форме сложноэфирных групп, которые включают полилактидные или со-полилактидные цепи. Как правило, для инициации полимеризации используют 0.2% глюкозы. Разветвленные полиэфиры (Glu-ПЛГ) имеют центральную молекулу глюкозы с лучами линейных полилактидных цепей, например они имеют структуру звездчатой формы.
Разветвленные полиэфиры, имеющие центральную молекулу глюкозы с лучами линейных полилактд-со-гликолидных цепей (Glu-ПЛГ), можно получить реакцией полиола с лактидом и предпочтительно также с гликолидом при повышенной температуре в присутствии катализатора, который делает осуществимой полимеризацию с раскрытием цикла.
w
w
w
w
Разветвленные полиэфиры, имеющие центральную молекулу глюкозы с лучами линейных полилактид-со-гликолидных цепей (Glu-ПЛГ), предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу (M) в интервале от приблизительно 10000 до 200000, предпочтительно от 25000 до 100000, в частности от 35000 до 60000, например приблизительно 50000 Д, и полидисперсность, например, от 1,7 до 3,0, например от 2,0 до 2,5. Вязкости, присущие звездчатым полимерам с M 35000 или M 60000, составляют 0,36 или 0,51 дл/г соответственно в хлороформе. Звездчатый полимер с M 52000 имеет вязкость 0,475 дл/г в хлороформе.
Требующаяся скорость разложения полимеров и требующийся профиль высвобождения соединений, соответствующих изобретению, могут варьировать в зависимости от типа мономера, используется ли при этом гомо- или сополимер либо смесь полимеров.
Смесь полимеров может включать по меньшей мере два различных типа полимеров, например, как перечислено выше в пунктах (а)-(д), или два полимера одного и того же класса полимеров с различными свойствами. Например, смесь полимеров может включать полимер, имеющий среднюю по весу молекулярную массу, например, от приблизительно 30000 до приблизительно 60000 Д, например приблизительно 50000 Д, и полимер, имеющий низкую по весу молекулярную массу, например, от приблизительно 2000 до приблизительно 20000 Д, например приблизительно 10000 Д.
Предпочтительно, когда полимерная матрица включает линейный и/или разветвленный полилактид-со-гликолид. Более предпочтительно, когда полимерная матрица включает Resomer RG, звездчатый полилактид-со-гликолидный полимер со средневесовой молекулярной массой от приблизительно 10000 Д и/или звездчатый полилактид-со-гликолидный полимер со средневесовой молекулярной массой от приблизительно 50000 Д. Соотношение линейного полилактид-со-гликолида и разветвленного предпочтительно составляет от 0:100 до 100:0, например от 50:50 до 25:75.
Полимерная матрица может присутствовать в общем количестве приблизительно 40-99% от массы микрочастиц.
Микрочастицы могут, кроме того, включать агент, который может влиять на пористость микрочастиц. Таким агентом может быть, например, следующий.
а) Поливинилпирролидон, предпочтительно с молекулярной массой от приблизительно 2000 до приблизительно 20000 Д. Подходящие примеры включают такие широко известные, как Повидон К12 F со средней молекулярной массой приблизительно 2500 Д, Повидон К15 со средней молекулярной массой приблизительно 8000 Д или Повидон К 17 со средней молекулярной массой приблизительно 10000 Д. Предпочтительно, когда поливинилпирролидон присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 50%, например приблизительно 10%, от массы микрочастиц.
б) Карбоксиметилцеллюлоза натрий (КМЦ-Na) предпочтительно низкомолекулярная. Вязкость может составлять, например, до 20 сП для 2% водного раствора или вязкость от 8 до 25 мПа. Удобно, когда степень замещения составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,45, предпочтительно приблизительно 0,7. Как правило, содержание натрия составляет от приблизительно 5% до приблизительно 12%.
Предпочтительно, когда КМЦ-Na присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 20%, например приблизительно 5%, от массы микрочастиц.
в) Декстрин, например, со средней молекулярной массой, лежащей в интервале от 1000 до 50000 Д, предпочтительно 5000 Д. Предпочтительно, когда декстрин имеет тонкое распределение частиц по размеру, например ×90 меньше, чем 20 мк.
Предпочтительно, когда декстрин присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 10%, например приблизительно 5%, от массы микрочастиц.
г) Полиэтиленгликоль, например со средней по весу молекулярной массой, лежащей в интервале от приблизительно 1000 до приблизительно 10000 Д, предпочтительно от приблизительно 1000 до приблизительно 3350 Д. Подходящие примеры включают широко известные и коммерчески доступные под торговыми названиями Carbowax фирмы Dow&Union Carbide, например, с Mw 3350 Д. Полиэтленгликоль со средней по весу молекулярной массой 3350 Д имеет вязкость 76-110 сСт при 98,9±0,3°С. Полиэтиленгликоль с Mw в интервале от 1000 до 3500 Д имеет вязкости, лежащие в интервале от 16 до 123 сСт при 98,9±0,3°С.
Кроме того, микрочастицы могут включать поверхностно-активное вещество. Подходящие поверхностно-активные вещества включают неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как следующие.
а) Полоксамеры, известные также как
полиоксиэтиленполиоксипропиленовые блоксополимеры, например, имеющие молекулярную массу от приблизительно 2000 до приблизительно 8000 Д. Степень полимеризации молекулы этилена составляет, как правило, от 80 до приблизительно 110 звеньев. Примерами данных соединений, подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением, являются известные и коммерчески доступные, например, под торговым названием Pluronic F68, производимый фирмой BASF, Германия.
б) Полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана и жирной кислоты, например моно- и трилауриловый, пальмитиловый, стеариловый и олеиловый эфиры, например, типа известного и коммерчески доступного под торговым названием TWEEN, например Tween 20
[полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат], Tween 40
[полиоксиэтилен(20)сорбитанмонопальмитат], Tween 60
[полиоксиэтилен(20)сорбитанмоностеарат], Tween 80
[полиоксиэтилен(20)сорбитанмоноолеат], Tween 65
[полиоксиэтилен(20)сорбитантристеарат], Tween 85
[полиоксиэтилен(20)сорбитантриолеат], Tween 21
[полиоксиэтилен(4)сорбитанмонолаурат], Tween 61
[полиоксиэтилен(4)сорбитанмоностеарат] и Tween 81
[полиоксиэтилен(5)сорбитанмоноолеат].
Предпочтительны Tween 20 и Tween 80.
в) Эфиры сорбитана и жирных кислот, например, типа известного и коммерчески доступного под торговым названием SPAN, например, включающие монолауриловый, монопальмитиловый, моностеариловый, тристеариловый, моноолеиловый и триолеиловый эфиры сорбитана.
г) Лецитины, например, соевый фосфолипид, как, например, известный и коммерчески доступный под торговым названием Lipoid S75 фирмы Lipoid или яичный фосфолипид, как, например, известные и коммерчески доступные под торговыми названиямм Phospholipon 90 фирмы Nattermann, Epikuron 100H или Epikuron 145V, Epikuron 170 или Epikuron 200 фирмы Degussa, Bioactives.
Предпочтительно, когда используют полоксамеры, Tween 20 и/или Tween 80.
В случае, когда полимером или полимерами, используемыми для помещения в них соединения, соответствующего изобретению, является полиэфир, микрочастицы предпочтительно дополнительно включают основное соединение, такое как основная соль или основание, например основной карбонат цинка, гидроксид магния, карбонат магния или протамин, например протамин человека или протамин лососи, либо природный или синтетический полимер, несущий остатки амина, такой как полилизин или диметиламиноэтилметакрилат.
Ссылаются на обширную литературу по вопросу данных и других наполнителей и методов, упомянутых в данном контексте, см., в частности, Handbook of Pharmaceutical Excipients, в изд., под ред. Ainley Wade и Paul J.Weller, American Pharmaceutical Association, Washington, USA, and Pharmaceutical Press, London, и Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik and angrenzende Gebiete под ред. Н.Р. Fiedler, 4 изд., Editio Cantor, Aulendorfn более ранние издания, которые включены в данном контексте в виде ссылки.
Предпочтительно, когда микрочастицы, соответствующие изобретению, включают в качестве активного ингредиента только соединение, соответствующее изобретению, например соединение формулы II, предпочтительно соединение формулы III, даже более предпочтительно Соединение А. Предпочтительно, когда микрочастицы, соответствующие изобретению, включают соединение, соответствующее изобретению, например соединение формулы II или III, в форме соли памовой кислоты, даже более предпочтительно соли памовой кислоты Соединения А.
Методы, которые могут быть использованы для получения микрочастиц, соответствующих изобретению, могут быть принятыми или известными в области техники или основываться на данных методах, например, описанных в монографии L.Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3 изд., 1986, H. Sucker et al. Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, Hager's Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4 изд. (Springer Verlag, 1971), Remington's Pharmaceutical Sciences, 13 изд., (Mack Publ., Co., 1970) или более поздние издания в Е. Mathiowitz's Encyclopedia of Controlled Drug Delivery (John Wiley & Sons, Inc, 1999).
В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ получения микрочастиц, соответствующих изобретению, заключающийся в
(i) получении дисперсной органической фазы, включающем
(ia) растворение полимера или полимеров в подходящем органическом растворителе или смеси растворителей и необязательно
- растворение/диспергирование агента, влияющего на пористость, в растворе, полученном на стадии (ia), или
- добавление основной соли к раствору, полученному на стадии (ia),
- добавление поверхностно-активного вещества к раствору, полученному на стадии (ia);
(iб) суспендирование соединения, соответствующего изобретению, в растворе полимера, полученного на стадии (ia), или растворение соединения, соответствующее изобретению, в растворителе, смешивающемся с растворителем, использованном на стадии (ia), и смешивание указанного раствора с раствором полимера, или
непосредственное растворение соединения, соответствующего изобретению, в растворе полимера, или растворение соединения, соответствующего изобретению, в форме водорастворимой соли в водной фазе и эмульгирование указанного водного раствора с раствором полимера (ia);
(ii) получении непрерывной водной фазы, включающем
2
4
2
4
(iia) получение буфера для подведения рН до 7-7,5, например ацетатного или фосфатного буфера, например NaHPO и КНРO, и
(iiб) растворение стабилизатора в растворе, полученном на стадии (iia);
(iii) смешивании дисперсной органической фазы с непрерывной водной фазой, например, с помощью устройства, создающего сильные усилия сдвига, например с помощью турбинной или стационарной мешалки, с образованием эмульсии; и
(iv) отверждении микрочастиц путем выпаривания растворителя или экстракции растворителя, промывания микрочастиц, например водой, сбора и сушки микрочастицы, например посредством сублимационной сушки или сушки под вакуумом.
Подходящие органические растворители для полимеров включают, например, этилацетат, ацетон, ТГФ (тетрагидрофуран), ацетонитрил или галогенированные углеводороды, например метиленхлорид, хлороформ и гексафторизопропанол.
Подходящие примеры стабилизатора для стадии (iiб) включают
а) Поливиниловый спирт (ПВС), предпочтительно имеющий среднюю по весу молекулярную массу от приблизительно 10000 до приблизительно 150000 Д, например, приблизительно 30000 Д. Удобно, когда поливиниловый спирт имеет низкую вязкость, при динамической вязкости от приблизительно 3 до приблизительно 9 мПа при измерении в виде 4% водного раствора при 20°С или посредством DIN 53015. Соответственно, поливиниловый спирт можно получить путем гидролиза поливинилацетата. Предпочтительно, когда содержание поливинилацетата составляет от приблизительно 10 до приблизительно 90% от поливинилового спирта. Удобно, когда степень гидролиза составляет от приблизительно 85 до приблизительно 89%. Как правило, остаточное содержание ацетила составляет приблизительно 10-12%. Предпочтительные торговые марки включают Mowiol 4-88, 8-88 и 18-88, производимые фирмой Clariant AG, Швейцария.
Предпочтительно, когда поливиниловый спирт присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 5%, например приблизительно 0,5% в пересчете на массу объема непрерывной водной фазы.
б) Гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ) и/или гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ), например, образованную при реакции целлюлозы с этиленоксидом и пропиленоксидом соответственно. Имеются ГЭЦ и ГПЦ с широким диапазоном типов вязкости; предпочтительно, когда вязкость средняя. Предпочтительные торговые марки включают Natrosol фирмы Hercules Inc., например Natrosol 250MR, и Klucel фирмы Hercules Inc. Предпочтительно, когда ГЭЦ и/или ГПЦ присутствует в общем количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 5%, например приблизительно 0,5% в пересчете на массу объема непрерывной водной фазы.
в) Поливинилпирролидон, например, соответственно с молекулярной массой от приблизительно 2000 до 20000 Д. Подходящие примеры включают такие широкоизвестные, как Povidone К 12 F со средней молекулярной массой приблизительно 2500 Д, Povidone К 15 со средней молекулярной массой приблизительно 8000 Д или Povidone К 17 со средней молекулярной массой приблизительно 10000 Д. Предпочтительно, когда поливинилпирролидон присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 50%, например 10% в пересчете на массу объема непрерывной водной фазы;
г) Желатин, предпочтительно порцин или рыбный желатин. Удобно, когда желатин имеет вязкость от приблизительно 25 до приблизительно 35 сПа для 10% раствора при 20°С. Как правило, рН 10% раствора составляет от приблизительно 6 до приблизительно 7. Подходящая торговая марка имеет высокую молекулярную массу, например высокомолекулярный рыбный желатин Norland, производимый фирмой Norland Products Inc, Кранбери, Нью-Джерси, США.
Предпочтительно, когда желатин присутствует в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 5%, например приблизительно 0,5%, в пересчете на массу объема непрерывной водной фазы. Предпочтительно, когда используют поливиниловый спирт.
Предпочтительно, когда не используют желатин. Предпочтительно, когда микрочастицы не содержат желатина.
Полученные в результате микрочастицы могут иметь диаметр от нескольких субмикрон до нескольких миллиметров; например, стремятся получить диаметры максимум приблизительно 250 мк, например 10-200 мк, предпочтительно 10-130 мк, более предпочтительно 10-90 мк, даже более предпочтительно 10-60 мк, для того, чтобы облегчить прохождение через иглу для инъекций. Предпочтителен узкий интервал распределения частиц по размеру. Например, распределение частиц по размеру может быть, например, ×10<15 мк, ×50<40 мк или ×90<70 мк.
Однородность содержания микрочастиц и унифицированных доз является очень высокой. Можно получить унифицированные дозы, которые варьируют от приблизительно 75% до приблизительно 125%, например от приблизительно 85 до приблизительно 115%, например от приблизительно 90 до приблизительно 110%, или от приблизительно 95 до приблизительно 105% от теоретической дозы.
Микрочастицы в сухом виде, могут быть, например, смешаны, например, покрыты антиагломерационным агентом, или, например, покрыты слоем антиагломерационного агента, например, в предварительно наполненном шприце или флаконе.
Подходящие антиагломерационные агенты включают, например, маннит, глюкозу, декстрозу, сахарозу, хлорид натрия или водорастворимые полимеры, такие как поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль, например, с вышеописанными свойствами.
Предпочтительно, когда антиагломерационный агент присутствует в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 10%, например приблизительно 4% от массы микрочастиц.
Перед введением микрочастицы суспендируют в носителе, подходящем для инъекции.
Соответственно, настоящее изобретение, кроме того, представляет фармацевтическую композицию, включающую микрочастицы, соответствующие изобретению, в носителе. Носитель может необязательно далее включать: а) один или более смачивающих агентов и/или б) один или более агентов тоничности и/или в) один или более агентов, повышающих вязкость.
2
4
2
4
Предпочтительным является носитель на водной основе, например он может содержать воду, например деионизированную, и (необязательно) буфер для подведения рН до 7-7,5, например фосфатный буфер, такой как смесь NaHPO и КНРO, и один или более агентов а), б) и/или в), как указано выше.
Однако, когда в качестве носителя используют воду, микрочастицы, соответствующие изобретению, могут не суспендроваться и могут плавать вверху водной фазы. Для улучшения способности микрочастиц, соответствующих изобретению, к суспендированию в водной среде предпочтительно, чтобы носитель включал смачивающий агент а). Смачивающий агент выбирают так, чтобы он обеспечивал возможность быстрого и соответствующего суспендирования микрочастиц в носителе. Предпочтительно, когда микрочастицы быстро смачиваются носителем и быстро образуют в нем суспензию.
Подходящие смачивающие агенты для суспендирования микрочастиц, соответствующих изобретению, в носителе на водной основе включают неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полоксамеры, или полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана и жирных кислот, свойства которых описаны выше. Можно использовать смесь смачивающих агентов. Предпочтительно, когда смачивающий агент включает Pluronic F68, Tween 20 и/или Tween 80.
Смачивающий агент или агенты могут присутствовать в количестве от приблизительно 0,01 до приблизительно 1% от массы вводимой композиции, предпочтительно от 0,01 до 0,5%, и могут присутствовать в количестве от приблизительно 0,01 до 5 мг/мл носителя, например приблизительно 2 мг/мл.
Предпочтительно, когда носитель, кроме того, включает агент тоничности б) такой как маннит, хлорид натрия, глюкозу, декстрозу, сахарозу или глицерин. Предпочтительно, когда агент тоничности представляет собой маннит.
Количество агента тоничности выбирают, чтобы регулировать изотоничность вводимой композиции. В случае, когда агент тоничности содержится в микрочастицах, например, для уменьшения агломерации, количество агента тоничности следует понимать, как сумму обоих количеств. Например, маннит предпочтительно может составлять от приблизительно 1% до приблизительно 5% от массы вводимой композиции, предпочтительно приблизительно 4,5%.
Предпочтительно, когда носитель далее включает агент, повышающий вязкость в). Подходящий агент, повышающий вязкость, включает карбоксиметилцеллюлозу натрий (КМЦ-Na), сорбитан, поливинилпирролидон или моностеарат алюминия.
Может быть удобно использована КМЦ-Na с низкой вязкостью. Варианты осуществления могут быть, как описано выше. Как правило, используют низкомолекулярную КМЦ-Na. Вязкость может быть от приблизительно 1 до приблизительно 30 мПа, например от приблизительно 10 до приблизительно 15 мПа, при измерении в виде 1% (мас./об.) водного раствора при 25°С в вискозиметре Brookfield LVT с валом 1 при 60 об/мин или вязкость 1-15 мПа·с для раствора NaKML 7LF (низкомолекулярная) в виде 0,1-1% раствора в воде.
Можно использовать поливинилпирролидон с вышеописанными свойствами.
Агент, повышающий вязкость, например, КМЦ-Na, может присутствовать в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 2%, например приблизительно 0,7% или приблизительно 1,75% от носителя (по объему), например, в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/мл в носителе, например, приблизительно 7 мг/мл или приблизительно 17,5 мг/мл.
В следующем аспекте настоящее изобретение переставляет набор, включающий микрочастицы, соответствующие изобретению, и носитель, соответствующий изобретению. Например, набор может включать микрочастицы, содержащие точное количество вводимого соединения, соответствующего изобретению, например, как описано ниже, и приблизительно от 1 до приблизительно 5 мл, например приблизительно 2 мл носителя, соответствующего изобретению.
В одном из вариантов осуществления сухими микрочастицами, необязательно в смеси с антиагломерационным агентом, можно наполнить контейнер, например, флакон или шприц, и простерилизовать, например, при использовании γ-облучения. Перед введением микрочастицы можно суспендировать в контейнере при добавлении подходящего носителя, например вышеописанного носителя. Например, микрочастицы, необязательно в смеси с антиагломерационным агентом, агентом, повышающим вязкость, и/или агентом тоничности, и носитель суспензии могут быть раздельно помещены в двухкамерный шприц. Смесь микрочастиц с антиагломерационным агентом и/или агентом, повышающим вязкость, и/или агентом тоничности также составляет часть изобретения.
В другом варианте осуществления в стерильных условиях сухие стерилизованные микрочастицы, необязательно в смеси в антиагломерационным агентом, могут быть суспендированы в подходящем носителе, например в вышеописанном носителе, и внесены в контейнер, например флакон или шприц. Растворитель носителя, например воду, затем можно удалить, например, сублимационной сушкой или выпариванием под вакуумом, с получением смеси микрочастиц и твердых компонентов носителя в контейнере. Перед введением микрочастицы и твердые компоненты носителя можно суспендировать в контейнере при добавлении подходящего носителя, например воды, например воды для вливаний, или предпочтительно низкомолярного раствора фосфатного буфера. Например, смесь микрочастиц, необязательно антиагломерационного агента и твердых компонентов носителя, и носитель суспензии, например вода, могут быть раздельно помещены с двухкамерный шприц.
Микрочастицы и композиции, соответствующие изобретению, используют
а) для предупреждения или лечения нарушений с этиологией, включающей или ассоциированной с избытком секреции GH (гормона роста) и/или избытком IGF-1 (инсулиноподобного фактора роста-1), например при лечении акромегалии, а также при лечении сахарного диабета типа I или типа II, в особенности его осложнений, например ангиопатии, диабетической пролиферативной ретинопатии, диабетического макулярного отека, нефропатии, невропатии и феномена Дауна, в также других нарушений обмена веществ, связанных с выходом инсулина или глюкагона, например ожирения, например болезненного ожирения или гипоталамического либо гиперинсулинемического ожирения,
б) при лечении кишечно-кожного и панкреато-кожного свища, синдрома раздраженной кишки, воспалительных заболеваний, например болезни Грейва, воспалительной болезни кишки, псориаза или ревматоидного артрита, поликистозной болезни почек, демпинг-синдрома, синдрома водянистой диареи, диареи, связанной со СПИДом, диареи, вызываемой химиотерапией, острого или хронического панкреатита и опухолей, секретирующих желудочно-кишечный гормон (например, ГЭП (гастроэнтеропанкреатический)-опухолей, например, випом, глюкагоном, инсулином, карциноидов и т.п), лимфоцитарных злокачественных новообразований, например лимфом и лейкозов, гепатоцеллюларной карциномы, а также желудочно-кишечного кровотечения, например варикозного пищеводного кровотечения,
в) для предупреждения или лечения ангиогенеза, воспалительных нарушений, как указано выше, включая воспалительные глазные болезни, макулярный отек, например кистоидный макулярный отек, идиопатический кистоидный макулярный отек, эксудативную старческую макулярную дегенерации, нарушений, связанных с хориоидальной неоваскуляризацией и пролиферативной ретинопатии,
г) для предупреждения или борьбы с заболеваниями сосудистых трансплантатов, например с васкулопатий алло- или ксенотрансплантатов, например атеросклероза трансплантированного сосуда, например, в трансплантате органа, например трансплантатах сердца, легкого, комбинации сердце-легкое, печени, почки или поджелудочной железы, или для предупреждения или лечения стеноза венозного трансплантата, рестеноза и/или сосудистой окклюзии после повреждения сосуда, например, вызванного процедурами катетеризации или процедурами взятия соскоба с сосуда, такого как при подкожной транслуминальной ангиопластике, лечении лазером или при других инвазивных процедурах, которые нарушают целостность сосудистой интимы или эндотелия,
д) для лечения опухолей, экспрессирующих или кумулирующих соматостатиновый рецептор, таких как гипофизарные опухоли, например, болезнь или синдром Кушинга, гастроэнтеропанкреатические, карциноидные опухоли, опухоли центральной нервной системы, молочной железы, простаты (включая запущенный устойчивый к гормонам рак простаты), яичников и толстой кишки, мелкоклеточный рак легкого, злокачественную обструкцию кишки, параганглиомы, рак почки, нейробластомы, феохромоцитомы, медуллярные карциномы щитовидной железы, миеломы, лимфомы, лимфомы Ходжкина и не-Ходжкина, опухоли костей и их метастазы, а также аутоиммунных и воспалительных нарушений, например ревматоидного артрита, болезни Грейвса или других воспалительных глазных болезней.
Предпочтительно, когда микрочастицы и композиции, соответствующие изобретению, используют при лечении акромегалии и рака, например болезни и синдрома Кушинга, карциноидов.
Свойства микрочастиц и композиции, соответствующих изобретению, можно протестировать в стандартных тестах на животных или в клинических испытаниях.
Микрочастицы и композиции, соответствующие изобретению, хорошо переносятся.
Соединения, соответствующие изобретению, высвобождаются из микрочастиц, соответствующих изобретению, и из композиций, соответствующих изобретению, в период от нескольких недель, например приблизительно 4 недель, до 6 месяцев.
Подходящая дозировка композиций, соответствующих изобретению, конечно, будет варьировать, например, в зависимости от состояния, которое предусматривают лечить (например, типа заболевания или природы устойчивости), используемого лекарственного препарата, требуемого эффекта и метода введения.
В общем получены удовлетворительные результаты при введении, например парентеральном введении, в дозах порядка величины от приблизительно 0,2 до приблизительно 100 мг, например от 0,2 до приблизительно 35 мг, предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 100 мг соединения, соответствующего изобретению, на инъекцию в месяц или приблизительно от 0,03 до приблизительно 1,2 мг, например от 0,03 до 0,3 мг/кг массы тела животного в месяц. Таким образом, порядок величины подходящих месячных дозировок для пациентов составляет от приблизительно 0,3 мг до приблизительно 100 мг соединения, соответствующего изобретению, например соединения формулы III, например соединения А.
Следующие примеры служат для иллюстрации изобретения без каких-либо ограничений.
Примеры 1-4: микрочастицы
Поли-(D,L-лактид-со-гликолид) растворяют в количестве метиленхлорида, как показано в таблице 1. Затем раствор полимера добавляют к памоату соединения А. Полученную в результате суспензию обрабатывают с использованием устройства Ultra-Turrax в течение 1 мин.
2 л воды нагревают до 90°С. Во время нагревания добавляют по очереди соли фосфорной кислоты в количестве, как приводят в таблице 1. При 90°С добавляют ПВС 18-88 в количестве, как приводят в таблице 1. Полученный в результате раствор затем охлаждают до 20°С и дополняют водой до требуемого объема.
Смешивают суспензию полимера/лекарственного препарата и раствор ПВС/фосфата, метиленхлорид выпаривают под вакуумом и микрочастицы отфильтровывают, промывают водой (WBU) и сушат при пониженном давлении (0,1 мбар) при комнатной температуре.
Таблица 1
(Количества приведены в г)
Пример 1
Пример 2а
Пример 2б
Пример 3
Пример 4
Звездчатый полимер: поли-(D,L-лактид-со-гликолид) с M<sub>w</sub> приблизительно 50000 Д Молярное соотношение лактид:гликолид 50:50
2,266
2,555
2,555
1,977
2,555
Метиленхлорид
15,035
22,603
22,603
13,117
16,926
Памоат соединения А
1,734
1,4451
1,4452
2,023
1,445
Поливиниловый спирт (ПВС) 18-88
15,00
15,00
15,00
15,00
15,00
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
5.43
5,43
5.43
5,43
5,43
Безводный Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
22,71
22,71
22,71
22,71
22,71
Вода (WBU)
До 3,0 л
До 3,0 л
До 3,0 л
До 3,0 л
До 3,0 л
1 Распределение по размеру частиц: ×90<15 мк
2 Распределение по размеру частиц: ×90<3 мк
Примеры 5-8: микрочастицы
Таблица 2
(Количества приведены в г)
Пример 5
Пример 6
Пример 7
Пример 8
Звездчатый полимер: поли-(D,L-лактид-со-гликолид) с M<sub>w</sub> приблизительно 50000 ДМолярное соотношение лактид:гликолид 50:50
1,916
1,916
1,278
1,278
Звездчатый полимер: поли-(D,L-лактид-со-гликолид) с M<sub>w</sub> приблизительно 16500 Д Молярное соотношение лактид:гликолид 50:50
0,639
-
1,278
-
Resomer RG 502H Молярное соотношение лактид:гликолид 50:50
-
0,639
-
1,278
Метиленхлорид
16,926
16,926
16,926
16,926
Памоат соединения А
1,445
1,445
1,445
1,445
Поливиниловый спирт (ПВС) 18-88
15,00
15,00
15,00
15,00
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
5,43
5,43
5,43
5,43
Безводный Nа<sub>2</sub>НРО<sub>4</sub>
22,71
22,71
22,71
22,71
Вода (WBU)
До 3,0 л
До 3,0 л
До 3,0 л
До 3,0 л
Полимеры растворяют в количестве метиленхлорида, как показано в таблице 2. Затем раствор полимера добавляют к соли памовой кислоты соединения А. Полученную в результате суспензию обрабатывают с использованием устройства Ultra- Turrax в течение 1 мин.
2 л воды нагревают до 90°С. Во время нагревания добавляют одну за другой соли фосфорной кислоты в количестве, как приводят в таблице 2. При 90°С добавляют ПВС 18-88 в количестве, как приводят в таблице 2. Полученный в результате раствор затем охлаждают до 20°С и дополняют водой до требуемого объема.
Смешивают суспензию полимера/лекарственного препарата и раствор ПВС/фосфата, метиленхлорид выпаривают под вакуумом и микрочастицы отфильтровывают, промывают водой (WBU) и сушат при пониженном давлении (0,1 мбар) при комнатной температуре.
Пример 9: композиции носителя A-G
КМЦ-Na, маннит и Pluronic F68 в количестве, как приведено в таблице 3, растворяют в приблизительно 15 мл горячей деионизированной воды при температуре приблизительно 90°С при сильном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Полученный в результате прозрачный раствор охлаждают до 20°С и дополняют деионизированной водой до 20,0 мл.
Таблица 3
(Количества приведены в г)
А
В
С
D
Е
F
G
КМЦ-Na
0
0
0,05
0,14
0,28
0,35
0,40
Маннит
0
1,04
0,99
0,90
0,76
0,74
0,68
Pluronic F68
0,04
0,04
0,04
0,04
0,04
0,04
0,04
Носитель Е предпочтителен для использования в двухкамерном шприце.
Пример 10
384 мг или 576 мг микрочастиц, соответствующих примеру 2а и 2б, суспендируют в 2,0 мл носителя композиции D во флаконах 6R. Суспензии гомогенизируют встряхиванием в течение приблизительно 30 секунд. Восстановленную суспензию можно вводить инъекционно без каких-либо повреждений с использованием иглы номер 10.
Пример 11
240 мг микрочастиц, соответствующих примеру 2а и 2б, восстанавливают в 1 мл композиции носителя F, гомогенизируют с помощью пропеллерной мешалки при 400 об/мин в течение 1-12 час и затем подвергают сублимационной сушке в лиофилизаторе Telstar.
Восстановление лиофилизатов микрочастиц 1 мл чистой воды (WBU) приводит к быстрому и хорошему смачиванию микрочастиц, которые можно вводить инъекционно без каких-либо повреждений с использованием иглы номер 20.
Пример 12: высвобождение соединения А из микрочастиц
Микрочастицы, соответствующие примеру 2а и 2б, в количестве, соответствующем 4 мг соединения/кг массы тела кролика, суспендируют в 1 мл композиции носителя D. Суспензию гомогенизируют встряхиванием в течение приблизительно 30 сек и инъекционно вводят в левую Musculus gastronemius (икроножную мышцу, лат.) кроликов массой приблизительно 3 кг перед началом исследования, используя иглу 18G.
Образцы крови (приблизительно 1 мл) собирают в течение 55 дней. Уровни соединения А в плазме определяют, используя метод ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа). Средняя концентрация соединения А после введения приведена в таблице 4. Средняя AUC (площадь под кривой) (0-55 d), как показано, составляет 454 нг/мл d, для примера 2а, и 296 нг/мл d для примера 2б.
Таблица 4
(средняя концентрация в нг/мл)
Время после введения [дни]
0
0,021
0,042
0,083
0,167
0,25
1
2
3
6
9
Микрочастицы, соотв. примеру 2а
0
9,10
9,72
10,18
8,67
6,29
4,61
4,67
4,75
7,45
3,46
Микрочастицы, соотв. примеру 2б
0
0
0
0
0
0
0
0
0,87
1,06
0,65
Время после введения [дни]
13
16
20
23
27
30
34
37
41
44
48
55
Микрочастицы, соотв. примеру 2а
2,10
1,65
4,62
8,95
16,39
18,71
26,97
12,50
7,33
5,52
4,04
2,25
Микрочастицы, соотв. примеру 2б
0
0
7,93
15,71
18,74
16,04
8,94
6,45
3,75
2,17
1,23
0,68