ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ М971
M971 CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS

Перекрестная ссылка на родственную заявку
[0001] Данная патентная заявка претендует на приоритет предварительной патентной заявки США №61/717960, поданной 24 октября 2012 года, которая включена в данный документ во всей ее полноте посредством ссылки. Заявление о Федеральной поддержке научных исследований Настоящее изобретение было создано при поддержке Правительства с №проекта Z01 ZIA ВС 010701 Национальным институтом здоровья, Национальным институтом онкологии. Правительство имеет определенные права на изобретение.
Включение посредством ссылки материала, представленного в электронном виде
[0002] Включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки читаемый на компьютере список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с данной заявкой и определенный следующим образом: один файл размером 31786 байт ASCII (Text) с названием "714144_ST25.txt", созданный 30 августа 2013 г.
Уровень техники
[0003] Рак является проблемой общественного здравоохранения. Несмотря на успехи в лечении, такие как химиотерапия, прогноз для многих видов рака, в том числе гематологических злокачественных новообразований, может быть плохим. Например, было подсчитано, что в 2000 году в Соединенных Штатах Америки ожидалось более 45000 смертей от неходжкинской лимфомы и лейкемии (Greenlee et al., СА Cancer J. Clin., 50:7-33 (2000)). Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в дополнительных способах лечения рака, в частности, гематологических злокачественных новообразований.
Сущность изобретения
[0004] Воплощение данного изобретения предусматривает химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor, CAR), содержащий антигенсвязывающий домен с SEQ ID NO 1-6, трансмембранный домен и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга.
[0005] Другие воплощения изобретения предусматривают родственные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части и фармацевтические композиции, относящиеся к CAR согласно изобретению.
[0006] Дополнительные воплощения данного изобретения предусматривают способы обнаружения присутствия рака у млекопитающего и способы лечения или профилактики рака у млекопитающего.
Краткое описание графических материалов
51
[0007] На фиг. 1A-1G представлены графики, показывающие % лизиса целевых Cr-меченых лейкемических клеточных линий REH (A), SEM (В), NALM6-GL (С), KOPN8 (D), Daudi (Е), Raji (F) и К562 (G) эффекторными Т-клетками человека, которые были нетрансдуцированными (имитирующими, контрольными, mock; •; круги) или трансдуцированными следующими CAR: HA22-SH второго поколения версии 1 (), m971 второго поколения версии 1 (; прозрачный треугольник) или CD19-специфический CAR (; квадраты); с различным соотношением эффектора к мишени (Е: Т).
[0008] На фиг. 2А-2С представлены графики, показывающие % лизиса целевых лейкемических клеточных линий Raji (A), NALM6-GL (В) или K562 (С) эффекторными нетрансдуцированными Т-клетками (mock, •; круги), m971 второго поколения версии 1 CAR () или m971 третьего поколения CAR () с различным соотношением Е: Т.
низ
выс
[0009] На фиг. 3А-3С представлены графики, показывающие количества интерферона (IFN)-γ (пг/мл), секретируемые Т-клетками, которые были нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными одним из следующих CAR: анти-CD19, m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), m971 третьего поколения (SEQ ID NO 24), HASH22 второго поколения версии 1, HASH22 второго поколения версии 2 или HASH22 третьего поколения; при совместном культивировании с лейкемическими клеточными линиями NALM6-GL (CD22) (А), Raji (CD22) (В) или K562 (CD22-отрицательная) (С).
низ
выс
[0010] На фиг. 3D-3F представлены графики, показывающие количества интерлейкина (IL) 2 (пг/мл), секретируемые Т-клетками, которые были нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными одним из следующих CAR: анти-CD19, m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), m971 третьего поколения (SEQ ID NO 24), HASH22 второго поколения версии 1, HASH22 второго поколения версии 2 или HASH22 третьего поколения; при совместном культивировании с лейкемическими клеточными линиями NALM6-GL (CD22) (А), Raji (CD22) (В) или K562 (CD22-отрицательная) (С).
низ
выс
[0011] На фиг. 3G-3I представлены графики, показывающие количества фактора некроза опухоли (TNF) α (пг/мл), секретируемые Т-клетками, которые были нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными одним из следующих CAR: анти-CD19, m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), m971 третьего поколения (SEQ ID NO 24), HASH22 второго поколения версии 1, HASH22 второго поколения версии 2 или HASH22 третьего поколения; при совместном культивировании с лейкемическими клеточными линиями NALM6-GL (CD22) (А), Raji (CD22) (В) или K562 (С022-отрицательная) (С).
2
2
[0012] На фиг. 4А представлен график, показывающий биолюминесцентные сигналы (фотон/с/см/стерадиан), полученные в результате реакции люциферазы (трансфицированной в лейкемические клетки, которые вводили мышам) с люциферином, который вводили мышам, и измеряемые в течение 30 дней. Мышам вводили контрольные Т-клетки ("mock", нетрансдуцированные, •; круги) или Т-клетки, трансдуцированные CAR HASH22 второго поколения версии 1 (; квадраты) или т971 второго поколения версии 1 (треугольники, SEQ ID NO 23). Большие значения фотонов/с/см/стерадиан указывают на большую опухолевую массу.
[0013] На фиг. 4В представлен график, показывающий процент выживаемости мышей, получавших контрольные Т-клетки ("mock" нетрансдуцированные, квадраты) или Т-клетки, трансдуцированные CAR HASH22 второго поколения версии 1 (круги) или CAR 971 второго поколения версии 1 (треугольники, SEQ ID NO 23) в течение 30 дней, (mock в сравнении с НА22, р=0,0019;. mock в сравнении с m971, р=0,0019;. М971 в сравнении с НА22, р=0,003).
6
6
6
5
[0014] На фиг. 5 представлена таблица, показывающая биолюминесцентные изображения мышей с лейкемией через три, пять и восемь дней после введения нетрансдуцированных Т-клеток (mock) или 15×10, 5×10, 1×10 или 1×10Т-клеток, трансдуцированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR m971 второго поколения версии 2 (SEQ ID NO 22). Изменение штриховки от серого к белому показывает увеличение массы опухоли.
6
6
6
5
[0015] На фиг. 6 представлен график, показывающий общее число фотонов, испускаемых при биолюминесценции мышей, показанной на фиг.5, в течение 44 дней. Общее число фотонов количественно оценивали и наносили на график, и средние и стандартные отклонения показывали для каждой временной точки. Мышам вводили нетрансдуцированные Т-клетки (mock) (знак плюса) или 15×10 (ромб), 5×10 (цветок), 1×10 (крест) или 1×10 (звезда) Т-клеток, трансдуцированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR m971 второго поколения версии 2 (SEQ ID NO 22).
Подробное описание изобретения
[0016] Воплощение данного изобретения предусматривает химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий антигенсвязывающий домен с SEQ ID NO 1-6, трансмембранный домен и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга.
[0017] CAR представляет собой искусственно созданный гибридный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающие домены антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), связанный с доменами Т-клеточного сигналинга. Характеристики CAR включают способность перенаправлять Т-клеточную специфичность и реактивность на выбранную мишень МНС-неограниченным образом, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. МНС-неограниченное распознавание антигена дает Т-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антиген независимо от процессинга антигена, таким образом, минуя главный механизм избегания опухоли. Более того, при экспрессии в Т-клетках CAR преимущественно не димеризуются с альфа- и бета-цепями эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR).
[0018] Фразы "обладает антигенной специфичностью" и "вызывает антигенспецифический ответ", используемые в данном документе, означают, что CAR может специфически связываться и иммунологически распознавать антиген таким образом, что связывание CAR с антигеном вызывает иммунный ответ.
[0019] CAR согласно изобретению обладают антигенной специфичностью к CD22. CD22 представляет собой линиеспецифический В-клеточный антиген, принадлежащих суперсемейству иммуноглобулинов (lg). CD22 экспрессируется на 60-70% В-клеточных лимфом и лейкемий (например, В-хроническом лимфолейкозе, волосатоклеточной лейкемии, остром лимфобластном лейкозе (ALL) и лимфоме Беркитта) и не присутствует на клеточной поверхности на ранних стадиях В-клеточного развития или на стволовых клетках. Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol./Hematol., 11:267-297 (1991); Bang et al., Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005).
[0020] Без связи с конкретной теорией или механизмом, полагают, что, вызывая антигенспецифический ответ против CD22, CAR согласно изобретению вызывают одно или более чем одно из следующих явлений: нацеливание и разрушение CD22-экспрессирующих раковых клеток, уменьшение или устранение раковых клеток, облегчение инфильтрации мест(а) опухоли иммунными клетками и усиление/удлинение противораковых ответов. Поскольку CD22 не экспрессируется на ранних стадиях В-клеточного развития или на стволовых клетках, предполагается, что CAR согласно изобретению преимущественно по существу не вызывают нацеливания/уничтожения стволовых клеток и/или В-клеток на ранних стадиях развития.
[0021] Воплощение данного изобретения предусматривает CAR, содержащий антигенсвязывающий домен антитела m971 ("m971"). Антигенсвязывающий домен m971 специфически связывается с CD22. В связи с этим предпочтительное воплощение данного изобретения предусматривает CAR, содержащие антигенсвязывающий домен, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) антигенсвязывающего домена m971. Антитело m971 имеет улучшенное связывание с CD22 по сравнению с иммунотоксином НА22, а также связывается с другим эпитопом CD22. Xiao et al., mAbs 1:3, 297-303 (2009).
[0022] Антигенсвязывающий домен может содержать вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи. В одном воплощении изобретения вариабельная область тяжелой цепи содержит область CDR1, область CDR2 и область CDR3. В связи с этим антигенсвязывающий домен может содержать одну или более чем одну из CDR1-области тяжелой цепи, включающей SEQ ID NO 1; CDR2-области тяжелой цепи, включающей SEQ ID NO 2; и CDR3-области тяжелой цепи, включающей SEQ ID NO 3. Предпочтительно тяжелая цепь содержит все SEQ ID NO 1-3.
[0023] В одном воплощении изобретения вариабельная область легкой цепи может содержать CDR1-область легкой цепи, CDR2-область легкой цепи и CDR3-область легкой цепи. В связи с этим антигенсвязывающий домен может содержать одну или более чем одну из CDR1-области легкой цепи, включающей SEQ ID NO 4; CDR2-область легкой цепи, включающей SEQ ID NO 5; и CDRS-области легкой цепи, включающей SEQ ID NO 6. Предпочтительно, легкая цепь содержит все SEQ ID NO 4-6. В особенно предпочтительном воплощении антигенсвязывающий домен содержит все последовательности SEQ ID NO 1-6.
[0024] Вариабельная область легкой цепи антигенсвязывающего домена может содержать, состоять из или состоять по существу из SEQ ID NO 7. Вариабельная область тяжелой цепи антигенсвязывающего домена может содержать, состоять из или состоять по существу из SEQ ID NO 8. Соответственно, в одном из воплощений изобретения антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO 7, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность SEQ ID NO 8. Предпочтительно, антигенсвязывающий домен содержит обе SEQ ID NO 7 и 8.
[0025] В одном воплощении изобретения вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть соединены с помощью линкера. Линкер может содержать любую подходящую аминокислотную последовательность. В одном воплощении изобретения линкер может содержать, состоять или по существу состоять из SEQ ID NO 11.
[0026] В одном воплощении антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В связи с этим воплощение антигенсвязывающего домена, содержащего и вариабельную область легкой цепи, и вариабельную область тяжелой цепи, содержит, состоит из или по существу состоит из SEQ ID NO 9.
[0027] В одном воплощении антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность может быть расположена на амино-конце вариабельной области легкой цепи. Лидерная последовательность может содержать любую подходящую лидерную последовательность. В одном воплощении лидерная последовательность является последовательностью рецептора человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF). В связи с этим антигенсвязывающий домен содержит лидерную последовательность, содержащую, состоящую из или по существу состоящую из SEQ ID NO 10. В одном воплощении данного изобретения, в то время как лидерная последовательность может облегчить экспрессию CAR на поверхности клетки, наличие лидерной последовательности в экспрессированном CAR не является необходимым для того, чтобы CAR функционировал. В одном воплощении изобретения при экспрессии CAR на клеточной поверхности лидерная последовательность может быть отщеплена от CAR. Соответственно, в одном воплощении изобретения CAR не имеет лидерной последовательности.
[0028] В одном воплощении изобретения CAR содержит трансмембранный домен. В одном воплощении изобретения трансмембранный домен содержит i) CD8 и/или ii) CD28. В предпочтительном воплощении CD8 и CD28 являются человеческими. CD8 или CD28 могут содержать меньше, чем целый CD8 или CD28, соответственно. В связи с этим CAR содержит трансмембранный домен CD8, содержащий, состоящий из или состоящий по существу из SEQ ID NO 12 или 18, и/или трансмембранный домен CD28, содержащий, состоящий из или по существу состоящий из SEQ ID NO 15.
[0029] В одном воплощении изобретения CAR включает внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий один или более чем один из i) CD28, ii) CD137 и/или iii) CD3 дзета (ζ). В предпочтительном воплощении CD28, CD137 и CD3 дзета являются человеческими. CD28 является Т-клеточным маркером, важным в костимуляции Т-клеток. CD137, также известный как 4-1 ВВ, передает мощный костимулирующий сигнал Т-клеткам, стимулируя дифференцировку и удлиняя долгосрочное выживание Т-лимфоцитов. CD3ζ ассоциируется с TCR, образуя сигнал, и содержит мотив активации иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). CD28, CD137 или CD3 дзета могут содержать меньше, чем целый CD28, CD137 или CD3 дзета, соответственно. В связи с этим внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга содержит аминокислотную последовательность CD28 содержащую, состоящую из или по существу состоящую из SEQ ID NO 16 или 19, аминокислотную последовательность CD137, включающую, состоящую из или по существу состоящую из SEQ ID NO 13 или 20, и/или аминокислотную последовательность CD3 дзета, включающую, состоящую из или по существу состоящую из SEQ ID NO 14, 17 или 21.
[0030] В одном воплощении изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD28, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD28 и CD3 дзета. В связи с этим CAR может содержать каждый из SEQ ID NO 15-17. Предпочтительно, CAR включает а) каждый из SEQ ID NO 1-6 и 15-17; b) 7-8 и 15-17; с) 9 и 15-17; или d) 9-10 и 15-17.
[0031] В одном воплощении изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD28, CD137 и CD3 дзета. В связи с этим CAR может содержать каждый из SEQ ID NO 18-21. Предпочтительно, CAR включает а) каждый из SEQ ID NO 1-6 и 18-21; b) 7-8 и 18-21; с) 9 и 18-21; или d) 9-10 и 18-21.
[0032] В одном воплощении изобретения CAR содержит трансмембранный домен, содержащий CD8, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD137 и CD3 дзета. В связи с этим CAR может содержать каждый из SEQ ID NO 12-14. Предпочтительно, CAR включает а) каждый из SEQ ID NO 1-6 и 12-14; b) 7-8 и 12-14; с) 9 и 12-14; или d) 9-10 и 12-14.
[0033] Дополнительные воплощения данного изобретения предусматривают CAR, содержащие, состоящие из или по существу состоящие из любой аминокислотной последовательности, приведенной в таблице 1.
[0034] В объем данного изобретения включены функциональные части описанных CAR согласно изобретению. Термин "функциональная часть", используемый в отношении к CAR, относится к любой части или фрагменту CAR согласно изобретению, где часть или фрагмент сохраняет биологическую активность того CAR, частью которого он является (родительского CAR). Функциональные части охватывают, например, те части CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени или обнаруживать, излечивать или предотвращать заболевание в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR. В отношении родительского CAR функциональная часть может содержать, например, примерно 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% или более от родительского CAR.
[0035] Функциональная часть может содержать дополнительные аминокислоты на амино- или карбокси-конце или на обоих концах, где дополнительные аминокислоты не присутствуют в аминокислотной последовательности родительского CAR. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали биологической функции функциональной части, например, распознаванию клеток-мишеней, обнаружению рака, лечению или профилактике рака и т.д. Более предпочтительно, чтобы дополнительные аминокислоты повышали биологическую активность CAR по сравнению с биологической активностью родительского CAR.
[0036] В объем данного изобретения включены функциональные варианты описанного CAR согласно изобретению. Термин "функциональный вариант", используемый в данном документе, относится к CAR, полипептиду или белку, имеющему существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с родительским CAR, при этом функциональный вариант сохраняет биологическую активность того CAR, вариантом которого он является. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, описанные в данном документе (родительский CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR. В отношении родительского CAR функциональный вариант может быть, например, примерно на 30% идентичен, примерно на 50% идентичен, примерно на 75% идентичен, примерно на 80% идентичен, примерно на 90% идентичен, примерно на 98% идентичен или примерно на 99% идентичен аминокислотной последовательности родительского CAR.
[0037] Функциональный вариант может, например, включать аминокислотную последовательность родительского CAR по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой. Альтернативно или дополнительно, функциональные варианты могут содержать аминокислотную последовательность родительского CAR по меньшей мере с одной неконсервативной аминокислотной заменой. В этом случае предпочтительно, чтобы неконсервативная аминокислотная замена не мешала или не ингибировала биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может повышать биологическую активность функционального варианта, так что биологическая активность функционального варианта увеличивается по сравнению с родительским CAR.
[0038] Аминокислотные замены CAR согласно изобретению предпочтительно являются консервативными аминокислотными заменами. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота с определенными физическими и/или химическими свойствами заменена на другую аминокислоту с такими же или подобными химическими или физическими свойствами. Например, консервативная аминокислотная замена может быть кислой/отрицательно заряженной полярной аминокислотой, замененной на другую кислую/отрицательно заряженную полярную аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислотой с неполярной боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val и т.д.), основной/положительно заряженной полярной аминокислотой, замененной на другую основную/положительно заряженную полярную аминокислоту (например, Lys, His, Arg и т.д.), незаряженной аминокислотой с полярной боковой цепью, замененной на другую незаряженную аминокислоту с полярной боковой цепью (например, Asn, Gin, Ser, Thr, Туг и т.п.), аминокислотой с бета-разветвленной боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с бета-разветвленной боковой цепью (например, lie, Thr и Val), аминокислотой с ароматической боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с ароматической боковой цепью (например, His, Phe, Trp и Туг) и т.д.
[0039] CAR может состоять по существу из конкретной аминокислотной последовательности или последовательностей, описанных в данном документе, так что другие компоненты, например другие аминокислоты, существенно не изменяют биологическую активность функционального варианта.
[0040] CAR воплощений изобретения (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть любой длины, т.е. могут содержать любое число аминокислот, при условии, что CAR (или их функциональные части или функциональные варианты) сохраняют их биологическую активность, например способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать больные клетки у млекопитающего или лечить или предотвращать заболевание у млекопитающего и т.д. Например, CAR может быть длиной от примерно 50 до примерно 5000 аминокислот, например 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более аминокислот.
[0041] CAR воплощений изобретения (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или более чем одной природной аминокислоты. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области и включают, например, аминоциклогексанкарбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-n-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорофенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин-β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогексанкарбоновую кислоту, α-аминоциклогептанкарбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутилглицин.
[0042] CAR воплощений изобретения (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть гликозилированными, амидированными, карбоксилированными, фосфорилированными, этерифицированными, N-ацилированными, циклизованными, например, через дисульфидный мостик, или могут быть превращены в кислотно-аддитивную соль и/или, возможно, димеризованы, полимеризованы или конъюгированы.
[0043] CAR воплощений изобретения (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть получены способами, известными в данной области. CAR могут быть изготовлены с помощью любого подходящего способа изготовления полипептидов или белков. Подходящие способы синтеза полипептидов и белков de novo описаны в ссылках, таких как Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; и в патенте США 5449752. Кроме того, полипептиды и белки могут быть рекомбинантно получены с использованием нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, с помощью стандартных рекомбинантных способов. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Кроме того, некоторые из CAR согласно изобретению (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть выделены и/или очищены из источника, такого как растение, бактерия, насекомое или млекопитающее, например, крыса, человек и т.д. Способы выделения и очистки хорошо известны в данной области. Альтернативно, CAR, описанные в данном документе, могут быть коммерчески синтезированы такими компаниями как Synpep (Дублин, Калифорния), Peptide Technologies Corp. (Гейтерсберг, Мэриленд) и Multiple Peptide Systems (Сан-Диего, Калифорния). В этой связи CAR согласно изобретению может быть синтетическим, рекомбинантным, выделенным и/или очищенным.
[0044] Воплощение данного изобретения также предусматривает антитело или его антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с эпитопом CAR согласно изобретению. Антитело может представлять собой любой тип иммуноглобулина, который известен в данной области. Например, антитело может быть любого изотипа, например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и т.д. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть природным антителом, например, антителом, выделенным и/или очищенным из млекопитающего, например, мыши, кролика, козы, лошади, курицы, хомяка, человека и т.д. Альтернативно, антитело может быть генно-инженерным антителом, например, гуманизированным антителом или химерным антителом. Антитело может находиться в мономерной или полимерной форме. Кроме того, антитело может иметь любой уровень аффинности или авидности к функциональной части CAR согласно изобретению.
[0045] Способы анализа антител на способность связываться с какой-либо функциональной частью CAR согласно изобретению известны в данной области и включают любой анализ связывания "антиген-антитело", такой как, например, радиоиммуноанализ (RIA), ИФА (ELISA), вестерн-блот, иммунопреципитацию и анализы конкурентного ингибирования (см., например, Janeway et al., см. ниже, и публикацию патентной заявки США NO 2002/0197266 А1).
[0046] Подходящие способы получения антител хорошо известны в данной области. Например, стандартные гибридомные способы описаны в Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), и C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Альтернативно, в данной области известны и другие способы, такие как EBV-гибридомыные способы (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), и Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), и экспрессионные системы на основе бактериофаговых векторов (см., например, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Кроме того, способы получения антител в животных описаны, например, в патентах США 5545806, 5569825 и 5714352, а также в заявке на патент США 2002/0197266 А1.
[0047] Кроме того, для создания антитела можно использовать фаговый дисплей. В связи с этим фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены антител, могут быть получены с использованием стандартной молекулярной биологии и методик рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше). Фаг, кодирующий вариабельную область с нужной специфичностью, выбирают по специфическому связыванию с нужным антигеном и восстанавливают полное или частичное антитело, содержащее выбранный вариабельный домен. Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие восстановленное антитело, вводят в подходящую клеточную линию, такую как клетка миеломы, используемая для получения гибридомы, так что клетка секретирует антитела с характеристиками моноклональных антител (см., например, Janeway et al., см. выше, Huse et al., см. выше, и патент США NO 6265150).
[0048] Антитела могут быть получены с помощью трансгенных мышей, которые являются трансгенными по специфическим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такие способы известны в данной области и описаны, например, в патентах США 5545806 и 5569825, а также в Janeway et al., см. выше.
[0049] Способы получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны подробно, например, Janeway et al., см. выше, патентах США 5225539, 5585089 и 5693761, европейском патенте NO 0239400 В1 и патенте Великобритании NO 2188638. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием методики перекладки антитела, описанной в патенте США 5639641 и в Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).
2
[0050] Воплощение изобретения также предусматривает антигенсвязывающие части любого из антител, описанных в данном документе. Антигенсвязывающая часть может быть любой частью, которая имеет по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, например Fab, F(ab'), dsFv, sFv, димерные и тримерные антитела.
[0051] Одноцепочечный фрагмент вариабельной области (sFv), который представляет собой усеченный Fab-фрагмент, включающий вариабельный (V) домен тяжелой цепи антитела, связанный с V доменом легкой цепи антитела с помощью синтетического пептида, может быть получен с использованием обычных методик рекомбинантных ДНК (например, Janeway et al., см. выше). Аналогичным образом стабилизированные дисульфидным мостиком вариабельные фрагменты (dsFv) могут быть получены с помощью методики рекомбинантной ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Тем не менее, фрагменты антител согласно изобретению не ограничиваются этими иллюстративными типами фрагментов антител.
[0052] Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть изменены так, чтобы включать обнаруживаемую метку, такую как, например, радиоактивный изотоп, флуорофор (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ)), фермент (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
[0053] Воплощением данного изобретения также является нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из описанных в данном документе CAR (в том числе их функциональные части и функциональные варианты). Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любую из лидерных последовательностей, антигенсвязывающих доменов, трансмембранных доменов и/или внутриклеточных доменов Т-клеточного сигналинга, описанных в данном документе.
[0054] Воплощение данного изобретения предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерную последовательность и антигенсвязывающий домен (включая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи). В связи с этим нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или по существу состоять из SEQ ID NO 25.
[0055] Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из трансмембранных доменов и/или внутриклеточных доменов Т-клеточного сигналинга, описанных в данном документе. Воплощение данного изобретения предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD28, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий домен CD28, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или по существу состоять из SEQ ID NO 27. Другое воплощение изобретения предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD28, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD137, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или по существу состоять из SEQ ID NO 28. Еще одно воплощение изобретения предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, содержащий CD8, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD137, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, содержащий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может содержать, состоять из или по существу состоять из SEQ ID NO 26.
[0056] В одном воплощении изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен (в том числе вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), трансмембранный домен, включающий CD28, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD28, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может включать, состоять из или по существу состоять из обеих SEQ ID NO 25 и 27.
[0057] В одном воплощении изобретения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен (в том числе вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), трансмембранный домен, включающий CD8, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD28, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD137, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может включать, состоять из или по существу состоять из обеих SEQ ID NO 25 и 28.
[0058] В одном воплощении нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует лидерную последовательность, антигенсвязывающий домен (в том числе вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи), трансмембранный домен, включающий CD8, внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD137, и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий CD3ζ. В связи с этим нуклеиновая кислота может включать, состоять из или по существу состоять из обех SEQ ID NO 25 и 26.
[0059] Понятие "нуклеиновой кислоты", используемое в данном документе, включает "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновокислотную молекулу" и обычно означает полимер ДНК или РНК, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным, синтезированным или полученным (например, выделенным и/или очищенным) из природных источников, который может содержать природные, неприродные или измененные нуклеотиды, и который может содержать природную, неприродную или измененную межнуклеотидную связь, например, фосфорамидатную связь или фосфоротиоатную связь, вместо фосфодиэфирной, находящейся между нуклеотидами немодифицированного олигонуклеотида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота не содержит никаких вставок, делеций, инверсий и/или замен. Тем не менее, в некоторых случаях может быть подходящим, как описано в данном документе, чтобы нуклеиновая кислота включала одну или более чем одну вставку, делецию, инверсию и/или замену. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота может кодировать дополнительные аминокислотные последовательности, которые не влияют на функцию CAR и которые могут транслироваться или могут не транслироваться при экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
[0060] Нуклеиновые кислоты согласно воплощению изобретения могут быть рекомбинантными. Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к (i) молекулам, которые создаются вне живых клеток путем присоединения природных или синтетических нуклеиновокислотных сегментов к нуклеиновокислотным молекулам, которые могут реплицироваться в живой клетке, или к (ii) молекулам, которые являются результатом репликации таких молекул, которые описаны в (i) выше. В данном изобретении репликация может быть репликацией in vitro или репликацией in vivo.
6
6
6
[0061] Рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть такой, которая имеет неприродную последовательность, или такой, которая имеет последовательность, изготовленную с помощью искусственного объединения двух сегментов последовательности, в противном случае разделенных. Это искусственное сочетание часто осуществляется путем химического синтеза или, чаще, путем искусственной манипуляции с выделенными сегментами нуклеиновых кислот, например, с помощью методик генной инженерии, таких как те, которые описаны в Sambrook et al., см. выше. Нуклеиновые кислоты могут быть сконструированы на основе химического синтеза и/или ферментативных реакций лигирования с использованием процедур, известных в данной области. См., например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше. Например, нуклеиновая кислота может быть химически синтезирована с использованием природных нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, разработанных для повышения биологической стабильности молекул или для повышения физической стабильности дуплекса, формирующегося при гибридизации (например, фосфоротиоатные производные и акридин-замещенные нуклеотиды). Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для создания нуклеиновых кислот включают, но не ограничиваясь ими, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N-замещенный аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил и 2,6-диаминопурин. Альтернативно, одна или более чем одна нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть приобретена у таких компаний как Macromolecular Resources (Форт-Коллинз, Колорадо) и Synthegen (Хьюстон, Техас).
[0062] Нуклеиновая кислота может содержать любую из выделенных или очищенных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют любой из CAR или его функциональные части или функциональные варианты. Альтернативно, нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность, которая вырождена до любой из последовательностей, или комбинацию вырожденных последовательностей.
[0063] Воплощение изобретения также предусматривает выделенную или очищенную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, или нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
[0064] Нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях, может гибридизоваться в условиях высокой жесткости. Под "условиями высокой жесткости" понимают, что нуклеотидная последовательность специфически гибридизуется с целевой последовательностью (нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе) в количестве, которое обнаруживается сильнее, чем неспецифическая гибридизация. Условия высокой жесткости включают условия, которые бы позволили отличить полинуклеотид с точной комплементарной последовательностью или полинуклеотид, содержащий только несколько разрозненных несоответствий, от случайной последовательности, в которой оказалось несколько небольших областей (например, 3-10 оснований), совпадающих с данной нуклеотидной последовательностью. Такие небольшие области комплементарности легче плавятся, чем полноразмерный комплемент длиной 14-17 или более оснований, и гибридизация в условиях высокой жесткости позволяет их легко отличить. Условия относительно высокой жесткости будут включать, например, низкое содержание солей и/или высокотемпературные условия, например, примерно 0,02-0,1 М NaCl или эквивалентное этому, при температуре примерно 50-70°С. Такие условия высокой жесткости переносят малые несоответствия, если таковые имеются, между нуклеотидной последовательностью и матричной или целевой цепью и особенно подходят для обнаружения экспрессии какого-либо из CAR согласно изобретению. Обычно считается, что условия можно сделать более жесткими путем добавления возрастающих количеств формамида.
[0065] Данное изобретение также предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 70% или более, например, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99% идентична любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
[0066] В одном воплощении нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть встроены в рекомбинантный экспрессионный вектор. В связи с этим воплощение данного изобретения предусматривает рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие любую из нуклеиновых кислот согласно изобретению. Для целей данного изобретения термин "рекомбинантный экспрессионный вектор" означает генетически модифицированную олигонуклеотидную или полинуклеотидную конструкцию, которая позволяет экспрессировать мРНК, белок, полипептид или пептид клеткой-хозяином, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую мРНК, белок, полипептид или пептид, а вектор контактирует с клеткой в условиях, подходящих, чтобы иметь мРНК, белок, полипептид или пептид, экспрессированный в клетке. Векторы согласно данному изобретению не являются природными в виде целых молекул. Тем не менее, части векторов могут иметь природное происхождение. Рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут содержать любой тип нуклеотидов, в том числе, но не ограничиваясь ими, ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, синтезированными или полученными частично из природных источников, и которые могут содержать природные, неприродные или измененные нуклеотиды. Рекомбинантные экспрессионные векторы могут включать природные или неприродные межнуклеотидные связи или оба типа связей. Предпочтительно, неприродные или измененные нуклеотиды или межнуклеотидные связи не препятствуют транскрипции или репликации вектора.
[0067] В одном воплощении рекомбинантный экспрессионный вектор согласно изобретению может быть любым подходящим рекомбинантным вектором и может быть использован для трансформации или трансфекции любой подходящей клетки-хозяина. Подходящие векторы включают те, которые предназначены для размножения, для экспрессии или для того и другого, например, плазмиды и вирусы. Вектор может быть выбран из группы, включающей серию pUC (Fermentas Life Sciences, Глен-Берни (Мэриленд), серию pBluescript (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния), серию рЕТ (Novagen, Мэдисон, Висконсин), серию pGEX (Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция) и серию рЕХ (Clontech, Пало-Альто, Калифорния). Также могут быть использованы бактериофаговые векторы, такие как λGT10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. Примеры векторов для экспрессии в растениях включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). Примеры векторов для экспрессии в животных включают pEUK-CI, рМАМ и pMAMneo (Clontech). Рекомбинантный экспрессионный вектор может быть вирусным вектором, например, ретровирусным вектором или лентивирусным вектором. В некоторых воплощений вектор может быть транспозоном.
[0068] Многие методики трансфекции хорошо известны в данной области (см., например Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., см. выше; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); и Chu et al., Gene, 13: 97 (1981). Способы трансфекции включают, например, копреципитацию фосфатом кальция (например, Graham et al., см. выше); прямую микроинъекцию в культивируемые клетки (например, см. Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)); электропорацию (например, см. Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)); опосредованный липосомами перенос гена (например, см. Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), липид-опосредованную трансдукцию (например, см. Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) и доставку нуклеиновой кислоты с использованием микроснарядов высоких скоростей (см., например, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).
[0069] В одном воплощении рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут быть получены с использованием стандартных методик рекомбинантных ДНК, описанных, например, в Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше. Конструкции экспрессионных векторов, которые являются кольцевыми или линейными, могут быть изготовлены так, чтобы они содержали систему репликации, функционирующую в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Системы репликации могут быть получены, например, из ColEI, плазмиды 2 μ, λ, SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота и т.п.
[0070] Рекомбинантный экспрессионный вектор может содержать регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые специфичны для конкретного типа клетки-хозяина (например, бактерии, гриба, растения или животного), в которую вектор будет введен, при необходимости и с учетом того, основан ли вектор на ДНК или РНК. Примеры последовательностей, включающих кодоны терминации, включают SEQ ID NO 32-33. Рекомбинантный экспрессионный вектор может содержать сайты рестрикции для облегчения клонирования. Примеры последовательностей, включающих сайты рестрикции, включают SEQ ID NO 29-31.
[0071] Рекомбинантный экспрессионный вектор может включать один или более чем один маркерный ген, который позволяет отбирать трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева. Гены-маркеры включают устойчивость к биоцидным веществам, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.д., комплементацию в ауксотрофном хозяине для получения прототрофии и т.п. Подходящие гены-маркеры для экспрессионных векторов согласно изобретению включают, например, гены устойчивости к неомицину/G3418, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к гистидинолу, гены устойчивости к тетрациклину и гены устойчивости к ампициллину.
[0072] Рекомбинантный экспрессионный вектор может включать нативный или ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR (включая его функциональные части или функциональные варианты), или с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна или которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR. Выбор промоторов, например, сильного, слабого, индуцируемого, специфического к ткани или развитию, находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Аналогичным образом, объединение нуклеотидной последовательности с промотором также находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Промотор может быть невирусным промотором или вирусным промотором, например, цитомегаловирусным (CMV) промотором, промотором SV40, промотором RSV или промотором, найденным в длинном концевом повторе вируса мышиных стволовых клеток.
[0073] Рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут быть сконструированы либо для временной экспрессии, либо для стабильной экспрессии, либо для той и другой экспрессии. Кроме того, рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть сконструированы для конститутивной экспрессии или для индуцибельной экспрессии.
[0074] Кроме того, рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть сконструированы так, чтобы они включали ген самоубийства. Используемый в данном документе термин "ген самоубийства" относится к гену, который вызывает гибель клетки, экспрессирующей ген самоубийства. Ген самоубийства может быть геном, который придает чувствительность к агенту, например, лекарственному препарату, той клетке, в которой экспрессируется ген, и вызывает гибель клетки, когда клетка контактирует с этим агентом или подвергается его воздействию. Гены самоубийства известны в данной области (см., например, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) и включают, например, ген тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV), цитозиндеаминазу, фосфорилазу пуринового нуклеозида и нитроредуктазу.
[0075] В объем данного изобретения включены конъюгаты, например, биоконъюгаты, включающие любой из CAR согласно изобретению (в том числе любую из их функциональных частей или вариантов), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток-хозяев, антитела или их антигенсвязывающие части. Конъюгаты, а также способы синтеза конъюгатов в целом известны в данной области (см., например, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) и Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).
[0076] Воплощение согласно изобретению также предусматривает клетку-хозяина, содержащую любой из рекомбинантных экспрессионных векторов, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к любому типу клеток, которые могут содержать рекомбинантный экспрессионный вектор согласно изобретению. Клетка-хозяин может быть эукариотической, например, клеткой растения, животного, гриба или водоросли, либо она может быть прокариотической клеткой, например, клеткой бактерии или простейшего. Клетка-хозяин может быть культивированной клеткой или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например, человека. Клетка-хозяин может быть прикрепленной клеткой или суспензионной клеткой, т.е. клеткой, которая растет в суспензии. Подходящие клетки-хозяева известны в данной области и включают, например, клетки Е. coli DH5α, клетки яичников китайского хомячка, клетки обезьяны VERO, клетки COS, клетки HEK293 и т.п. Для амплификации или репликации рекомбинантного экспрессионного вектора клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, например, клеткой DH5α. Для получения рекомбинантного CAR клетка-хозяин может быть клеткой млекопитающего. Клетка-хозяин может быть клеткой человека. Притом что клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, может происходить из любого типа ткани и может находиться на любой стадии развития, клетка-хозяин может быть лимфоцитом периферической крови (PBL) или мононуклеарной клеткой периферической крови (РВМС). Клетка-хозяин может быть Т-клеткой.
+
+
+
+
+
+
1
2
[0077] Для целей данного изобретения Т-клетка может быть любой Т-клеткой, такой как культивированная Т-клетка, например, первичная Т-клетка или Т-клетка из культивируемой Т-клеточной линии, например, Jurkat, SupT1 и т.д., или Т-клетка, полученная от млекопитающего. Если Т-клетка получена от млекопитающего, то она может быть получена из различных источников, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, костный мозг, лимфатические узлы, вилочковую железу или другие ткани или жидкости. Т-клетки также могут быть обогащенными или очищенными. Т-клетка могут быть человеческой Т-клеткой. Т-клетка может быть Т-клеткой, выделенной из организма человека. Т-клетка может быть Т-клеткой любого типа и может находиться на любой стадии развития, включая, но не ограничиваясь ими, CD4/CD8-двойные положительные Т-клетки, CD4 Т-хелперы, например, клетки Th и Th, CD8 Т-клетки (например, цитотоксические Т-клетки), инфильтрирующие опухоль клетки, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и т.п. Т-клетка может быть CD8 Т-клеткой или CD4 Т-клеткой.
[0078] Также воплощением данного изобретения является популяция клеток, содержащих по меньшей мере одну клетку-хозяина, описанную в данном документе. Популяция клеток может быть гетерогенной популяцией, содержащей клетку-хозяина, которая содержит любой из описанных рекомбинантных экспрессионных векторов, в дополнение по меньшей мере к одной другой клетке, например, клетке-хозяину (например, Т-клетке), которая не содержит никаких рекомбинантных экспрессионных векторов, или клетке, отличающейся от Т-клетки, например, В-клетке, макрофагу, нейтрофилу, эритроциту, гепатоциту, клетке эндотелия, эпителиальной клетке, мышечной клетке, клетке головного мозга и т.д. Альтернативно, популяция клеток может быть по существу гомогенной популяцией, которая включает главным образом клетки-хозяева (например, состоит по существу из них), содержащие рекомбинантный экспрессионный вектор. Популяция также может быть клональной популяцией клеток, где все клетки популяции являются клонами одной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный экспрессионный вектор, так что все клетки популяции содержат рекомбинантный экспрессионный вектор. В одном воплощении изобретения популяция клеток является клональной популяция, содержащей клетки-хозяева с рекомбинантным экспрессионным вектором, описанным в данном документе.
[0079] CAR (в том числе их функциональные части и варианты), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева (в том числе их популяции) и антитела (в том числе их антигенсвязывающие части), которые все в совокупности далее называются "CAR-материалами согласно изобретению", могут быть выделены и/или очищены. Термин "выделенный", используемый в данном документе, означает "удаленный из природной среды". Термин "очищенный" или "выделенный" не требует абсолютной чистоты или выделения; скорее, он понимается как относительный термин. Так, например, препарат очищенной (или выделенной) клетки-хозяина является таким, в котором клетка-хозяин является более чистой, чем клетка в ее природной среде в организме. Такие клетки-хозяева могут быть получены, например, с помощью стандартных методик очистки. В некоторых воплощениях препарат клетки-хозяина очищен таким образом, что клетка-хозяин составляет по меньшей мере примерно 50%, например по меньшей мере примерно 70% от общего содержания клеток в препарате. Например, чистота может составлять по меньшей мере примерно 50%, может быть больше, чем примерно 60%, примерно 70% или примерно 80%, или может составлять примерно 100%.
[0080] CAR-материалы согласно изобретению могут быть собраны в композицию, такую как фармацевтическая композиция. В связи с этим воплощение данного изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую любой из CAR, функциональных частей, функциональных вариантов, нуклеиновых кислот, экспрессионных векторов, клеток-хозяев (в том числе их популяций) и антител (в том числе их антигенсвязывающих частей) согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции согласно изобретению, содержащие любой из CAR-материалов согласно изобретению, может содержать более чем один CAR-материал согласно изобретению, например, CAR и нуклеиновую кислоту или два или более двух различных CAR. Альтернативно, фармацевтическая композиция может содержать CAR-материал согласно изобретению в сочетании с другими фармацевтически активными агентами или лекарственными препаратами, такими как химиотерапевтические агенты, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.п. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция содержит клетку-хозяина согласно изобретению или ее популяцию.
[0081] CAR-материалы согласно изобретению могут быть представлены в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают соли, полученные из минеральных кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, а также из органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфокислота, например, п-толуолсульфокислота.
[0082] Что касается фармацевтических композиций, фармацевтически приемлемый носитель может быть любым из обычно используемых и ограничивается только физико-химическими соображениями, такими как растворимость и отсутствие реактивности с активным агентом (агентами), а также путем введения. Описанные в данном документе фармацевтически приемлемые носители, например, носители, адъюванты, эксципиенты и разбавители, хорошо известны специалистам в данной области и легко доступны. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый носитель был таким, который химически инертен по отношению к активному агенту (агентам), и таким, который не имеет вредных побочных эффектов или токсичности в условиях применения.
[0083] Выбор носителя будет определяться отчасти конкретным CAR-материалом согласно изобретению, а также конкретным способом, используемым для введения CAR-материала согласно изобретению. Соответственно, существует множество подходящих составов фармацевтической композиции согласно изобретению. Могут быть использованы консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. Возможно, может быть использована смесь из двух или более двух консервантов. Консерванты или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,0001% до примерно 2% от общего веса композиции.
[0084] Подходящие буферные агенты могут включать, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. Возможно, может быть использована смесь двух или более двух буферных агентов. Буферные агенты или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,001% до примерно 4% от общего веса композиции.
[0085] Концентрация CAR-материала согласно изобретению в фармацевтических составах может варьировать, например, от менее чем примерно 1%, как правило, на уровне или по меньшей мере примерно 10%, до примерно 20-50% или более по массе, и может быть выбрана, прежде всего, по объемам жидкости и вязкости в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
[0086] Способы получения вводимых (например, вводимых парентеральным путем) композиций известны или очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
[0087] Следующие составы для перорального, аэрозольного, парентерального (например, подкожного, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, внутрибрюшинного и интратекального) и местного введения являются только иллюстративными и никоим образом не являются ограничивающими. Для введения CAR-материалов согласно изобретению может быть использован более чем один путь, а в некоторых случаях конкретный путь может обеспечить более непосредственную и более эффективную реакцию, чем другой путь.
[0088] Составы, пригодные для перорального введения, могут содержать или состоять из (а) жидких растворов, таких как эффективное количество CAR-материала согласно изобретению, растворенное в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (b) капсул, саше, таблеток, пастилок и леденцов, каждый из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента, в виде твердых веществ или гранул; (с) порошков; (d) суспензий в соответствующей жидкости; и (е) подходящих эмульсий. Жидкие составы могут включать разбавители, такие как воду и спирты, например, этанол, бензиловый спирт и полиэтиленовые спирты, с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества. Капсульные формы могут быть в обычной жесткой или мягкой желатиновой оболочке и содержать, например, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и инертные наполнители, такие как лактозу, сахарозу, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут включать один или более чем один агент, выбранный среди лактозы, сахарозы, маннита, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, альгиновой кислоты, микрокристаллической целлюлозы, гуммиарабика, желатина, гуаровой камеди, коллоидного диоксида кремния, кроскармеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеарата кальция, стеарата цинка, стеариновой кислоты и других наполнителей, красителей, разбавителей, буферных агентов, разрыхлителей, увлажняющих агентов, консервантов, ароматизаторов и других фармакологически совместимых эксципиентов. Леденцы могут содержать CAR-материал согласно изобретению в ароматизированной форме, обычно с сахарозой и гуммиарабиком или трагакантом, также как и пастилки, содержащие CAR-материал согласно изобретению в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик, эмульсии, гели и подобные композиции, содержащие, помимо прочего, такие эксципиенты, которые известны в данной области.
[0089] Составы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. CAR-материал согласно изобретению может быть введен в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, например в виде стерильной жидкости или смеси жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водный раствор декстрозы и растворы родственных Сахаров, спирт, такой как этанол или гексадециловый спирт, гликоль, такой как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин, кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, полиэтиленгликоль 400, масла, жирные кислоты, сложные эфиры или глицериды жирных кислот, или ацетилированные глицериды жирных кислот с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как мыло или детергент, суспендирующего агента, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, или эмульгирующих агентов и других фармацевтических адъювантов.
[0090] Масла, которые могут быть использованы в парентеральных составах, включают масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения. Конкретные примеры масел включают арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное. Подходящие жирные кислоты для применения в составах для парентерального введения включают олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту. Этилолеат и изопропилмиристат являются примерами подходящих сложных эфиров жирных кислот.
[0091] Подходящие мыла для применения в составах для парентерального введения включают соли жирных кислот и щелочных металлов, аммония и триэтаноламина, и подходящие детергенты включают (а) катионные детергенты, такие как, например, диметилдиалкиламмония галогениды и алкилпиридиния галогениды, (b) анионные детергенты, такие как, например, алкила, арила и олефина сульфонаты, алкила, олефина, эфира и моноглицерида сульфаты и сульфосукцинаты, (с) неионные детергенты, такие как, например, оксиды жирных аминов, алканоламиды жирных кислот и полиоксиэтиленполипропиленовые сополимеры, (d) амфотерные детергенты, такие как, например, алкил-β-аминопропионаты и 2-алкил-имидазолина четвертичные аммониевые соли, и (е) их смеси.
[0092] Парентеральные составы, как правило, будут содержать в растворе, например, от примерно 0,5% до примерно 25% по весу CAR-материала согласно изобретению. Могут быть использованы консерванты и буферы. Для того чтобы свести к минимуму или устранить раздражение в месте инъекции, такие композиции могут содержать одно или более чем одно неионное поверхностно-активное вещество, имеющее, например, гидрофильно-липофильный баланс (HLB) от примерно 12 до примерно 17. Количество поверхностно-активного вещества в таких составах, как правило, будет находиться в диапазоне, например, от примерно 5% до примерно 15% по весу. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сложные эфиры полиэтиленгликоль сорбитана и жирных кислот, такие как сорбитан моноолеат и высокомолекулярные продукты присоединения оксида этилена к гидрофобному основанию, образованные путем конденсации пропиленоксида с пропиленгликолем. Парентеральные составы могут быть представлены в единичной дозе или в герметичных контейнерах с несколькими дозами, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в замороженном (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого эксципиента, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии, приготовленные непосредственно перед применением, могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток типа таких, которые описаны выше.
[0093] Инъекционные составы представлены в соответствии с воплощением данного изобретения. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъекционных композиций хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.В. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), и ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).
[0094] Составы для местного применения, в том числе те, которые могут быть использованы для трансдермального введения лекарства, хорошо известны специалистам в данной области и пригодны в контексте воплощений данного изобретения для нанесения на кожу. CAR-материал согласно изобретению, используемый отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, может быть сделан в виде аэрозольных составов для введения посредством ингаляции. Эти аэрозольные препараты могут находиться под давлением подходящих пропеллентов, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Они также могут быть собраны в состав в виде фармацевтических препаратов не под давлением, таких как небулайзер или атомайзер (распылитель). Такие аэрозольные препараты также могут быть использованы для распыления на слизистую оболочку.
[0095] Термин "эффективное количество" или "количество, эффективное для лечения" относится к дозе, которая является достаточной для предотвращения или лечения рака у индивидуума. Количества, эффективные для терапевтического или профилактического применения, будут зависеть, например, от стадии и тяжести заболевания или нарушения, подлежащего лечению, от возраста, массы и общего состояния здоровья пациента и от решения лечащего врача. Размер дозы также будет определяться выбранным активным агентом, способом введения, временем и частотой введения, наличием, природой и степенью любых побочных эффектов, которые могут сопровождать введение конкретного активного агента, и желаемым физиологическим эффектом. Специалистам в данной области должно быть понятно, что различные заболевания или нарушения могут потребовать длительного лечения с участием множественных введений, возможно, с использованием CAR-материалов согласно изобретению на каждом этапе или на различных этапах введения. В качестве примера и не ограничивая изобретение, доза CAR-материала согласно изобретению может составлять от примерно 0,001 до примерно 1000 мг/кг массы тела субъекта, подлежащего лечению, в день, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела/день, от примерно 0,01 мг до примерно 1 мг/кг массы тела/день. Когда CAR-материал согласно изобретению представляет собой клетку-хозяина, иллюстративной дозой клеток-хозяев может быть минимум один миллион клеток (1 мг клеток/доза). CAR-материал согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, упакованную в вирус, иллюстративная доза вируса может составлять 1 нг/доза.
[0096] В данном изобретении количество или доза вводимого CAR-материала согласно изобретению должна быть достаточной, чтобы вызвать терапевтический или профилактический ответ у субъекта или животного в течение разумного периода времени. Например, доза CAR-материала согласно изобретению должна быть достаточной для связывания с антигеном, или обнаружения, лечения или предотвращения заболевания в течение периода времени от примерно 2 ч или дольше, например, от примерно 12 до примерно 24 часов и более с момента введения. В некоторых воплощениях период времени может быть еще более долгим. Доза будет зависеть от эффективности конкретного CAR-материала согласно изобретению и от состояния животного (человека), а также от веса тела животного (человека), подлежащего лечению.
[0097] В данном изобретении для определения начальной дозы, которую следует вводить млекопитающему, может быть использован анализ, который включает, например, сравнение степени, в которой клетки-мишени подвергаются лизису и/или IFN-γ секретируется Т-клетками, экспрессирующими CAR согласно изобретению, при введении данной дозы таких Т-клеток млекопитающему, среди множества млекопитающих, каждому из которых даны разные дозы Т-клеток. Степень, в которой клетки-мишени подвергаются лизису и/или IFN-γ секретируется при введении определенной дозы, может быть проанализирована с помощью способов, известных в данной области.
[0098] В дополнение к описанным выше фармацевтическим композициям CAR-материалы согласно изобретению могут быть приготовлены в виде комплексов включения, таких как комплексы включения с циклодекстринами или липосомы.
Липосомы могут служить для нацеливания CAR-материалов согласно изобретению на конкретную ткань. Липосомы также могут быть использованы для увеличения периода полужизни CAR-материалов согласно изобретению. Многие способы доступны для получения липосом и описаны, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) и патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
[0099] Системы доставки, используемые в контексте воплощений данного изобретения, могут включать систему с отсроченным высвобождением, замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, так что доставка композиции согласно изобретению происходит заранее и в течение достаточно времени, чтобы вызвать сенсибилизацию места лечения. Композиция согласно изобретению может быть использована в сочетании с другими терапевтическими агентами или терапевтическими способами. С помощью таких систем можно избежать повторных введений композиции согласно изобретению, тем самым увеличивая удобство для субъекта и врача, и они могут быть особенно подходящими для определенных воплощений композиции данного изобретения.
[0100] Многие типы систем доставки с отсроченным высвобождением доступны и известны специалистам в данной области. Они включают системы на полимерной основе, такой как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные препараты, описаны, например, в патенте США 5075109. Системы доставки также включают неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включая стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты, или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; системы высвобождения из гидрогеля; силастические системы; системы на основе пептидов; покрытия из воска; спрессованные таблетки, полученные с использованием стандартных связующих агентов и эксципиентов; частично расплавленные имплантаты; и т.п.Конкретными примерами являются, но не ограничиваясь ими, (а) эрозивные системы, в которых активная композиция содержится внутри матрицы, как описано в патентах США NO 4452775, 4667014, 4748034 и 5239660, и (b) диффузные системы, в которых активный компонент высвобождается с регулируемой скоростью из полимера, как описано в патентах США NO 3832253 и 3854480. Кроме того, могут быть использованы системы доставки с оборудованием на основе насоса, некоторые из которых адаптированы для имплантации.
[0101] Специалист в данной области легко поймет, что CAR-материалы согласно изобретению могут быть модифицированы с помощью любого числа способов, например, так, чтобы терапевтическая или профилактическая эффективность CAR-материалов согласно изобретению увеличилась за счет этой модификации. Например, CAR-материалы согласно изобретению могут быть конъюгированы прямо или косвенно через линкер с целевой группировкой. Практика конъюгации соединений, например, CAR-материалов согласно изобретению, с целевыми группировками известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) и патент США 5087616.
[0102] Альтернативно, CAR-материалы согласно изобретению могут быть модифицированы в депо-форму, например, так, чтобы характер высвобождения CAR-материалов согласно изобретению в организм, в который их вводят, контролировался по времени и месту внутри организма (см., например, патент США 4450150). Депо-формы CAR-материалов согласно изобретению могут представлять собой, например, имплантируемую композицию, содержащую CAR-материалы согласно изобретению и пористый или непористый материал, такой как полимер, где CAR-материалы согласно изобретению инкапсулированы или диффундированы по всему материалу, и/или деградацию непористого материала. Затем депо имплантируют в нужное место в организме, и CAR-материалы согласно изобретению высвобождаются из имплантата с заданной скоростью.
[0103] Когда CAR-материалы согласно изобретению вводят с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом, этот один или более чем один дополнительный терапевтический агент может быть совместно введен млекопитающему. Под "совместным введением" понимают введение одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента и CAR-материалов согласно изобретению достаточно близко по времени, так что CAR-материалы согласно изобретению могут усиливать эффект одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента, или наоборот. В связи с этим CAR-материалы согласно изобретению могут быть введены вначале, а один или более чем один дополнительный терапевтический агент может быть введен во вторую очередь, или наоборот. Альтернативно, CAR-материалы согласно изобретению и один или более чем один дополнительный терапевтический агент могут быть введены одновременно. Иллюстративным терапевтическим агентом, который может быть совместно введен с CAR-материалами, является ИЛ-2. Считается, что ИЛ-2 усиливает терапевтический эффект CAR-материалов согласно изобретению. В способах данного изобретения, в которых клетки-хозяева или популяции клеток вводятся млекопитающему, клетки могут быть такими клетками, которые аутологичны данному млекопитающему.
[0104] Следует понимать, что фармацевтические композиции, CAR, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева или популяции клеток согласно изобретению могут быть использованы в способах лечения или профилактики заболевания у млекопитающего. Без связи с конкретной теорией или механизмом CAR согласно изобретению обладают биологической активностью, т.е. способностью распознавать антиген, например, CD22, таким образом, что CAR, когда он экспрессируется клеткой, способен опосредовать иммунный ответ против клетки, экспрессирующей антиген, например, CD22, для которого CAR является специфическим. В связи с этим воплощение данного изобретения относится к способу лечения или профилактики рака у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему CAR, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессионных векторов, клеток-хозяев, популяции клеток, антител и/или их антигенсвязывающих частей и/или фармацевтических композиций согласно изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
[0105] Воплощение данного изобретения также включает лимфоидное истощение млекопитающего перед введением CAR-материалов согласно изобретению. Примеры лимфоидного истощения включают, но не ограничиваясь ими, лимфоидное истощение путем немиелоаблативной химиотерапии, лимфоидное истощение путем миелоаблативной химиотерапии, облучение всего тела и т.д.
[0106] В способах изобретения, в которых вводят клетки-хозяева или популяции клеток, клетки могут быть клетками, которые аутологичны данному млекопитающему. Предпочтительно, клетки аутологичны данному млекопитающему.
[0107] Млекопитающее, упоминаемое в данном документе, может быть любым млекопитающим. Используемый в данном документе термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающие отряда Rodentia, такие как мыши и хомяки, и млекопитающие отряда Logomorpha, такие как кролики. Млекопитающие могут относиться к отряду Carnivora, в том числе Felines (кошки) и Canines (собаки). Млекопитающие могут относиться к отряду Artiodactyla, в том числе Bovines (коровы) и Swines (свиньи) или к отряду Perssodactyla, в том числе Equines (лошади). Млекопитающие могут относиться к отрядам Primates, Ceboids или Simoids (обезьяны) или к отряду Anthropoids (люди и человекообразные обезьяны). Предпочтительно млекопитающее является человеком.
[0108] В отношении способов согласно изобретению рак может быть любым раком, включая любой из острого лимфоцитарного рака, острой миелоидной лейкемии, альвеолярной рабдомиосаркомы, рака мочевого пузыря (например, карциномы мочевого пузыря), рака кости, рака мозга (например, медуллобластомы), рака молочной железы, рака анального отверстия, анального канала или прямой кишки, рака глаза, рака внутрипеченочного желчного протока, рака суставов, рака шеи, желчного пузыря или плевры, рака носа, полости носа или среднего уха, рака ротовой полости, рака вульвы, хронической лимфоцитарной лейкемии, хронического миелоидного рака, рака толстой кишки, рака пищевода, рака шейки матки, фибросаркомы, желудочно-кишечной карциноидной опухоли, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи), лимфомы Ходжкина, рака гортаноглотки, рака почки, рака гортани, лейкемии, несолидных опухолей, рака печени, рака легких (например, немелкоклеточного рака легких), лимфомы, злокачественной мезотелиомы, мастоцитомы, меланомы, множественной миеломы, рака носоглотки, неходжкинской лимфомы, В-хронической лимфоцитарного лейкемии, волосатоклеточной лейкемии, острой лимфоцитарной лейкемии (ALL) и лимфомы Беркитта, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака брюшины, сальника и брыжейки, рака глотки, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рака почки, рака кожи, рака тонкого кишечника, рака мягких тканей, солидных опухолей, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы и рака уретры. Предпочтительно, рак представляет собой гематологическое злокачественное образование (например, лейкемию или лимфому, в том числе, но не ограничиваясь ими, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, хроническую лимфоцитарную лейкемию, острый лимфоцитарный рак, острую миелоидную лейкемию, В-хроническую лимфоцитарную лейкемию, волосатоклеточную лейкемию, острую лимфоцитарную лейкемию (ALL) и лимфому Беркитта). Предпочтительно, рак характеризуется экспрессией CD22.
[0109] Термины "лечить" и "предотвращать", используемые в данном документе, а также слова, образующиеся из них, не обязательно означают 100% или полное излечение или предотвращение. Скорее, есть различные степени лечения или предотвращения, которые любому специалисту в данной области очевидны как имеющие потенциальное преимущество или терапевтический эффект. В этом отношении способы согласно изобретению могут предложить любой уровень лечения или предотвращения рака у млекопитающего. Кроме того, лечение или профилактика, предложенные в способе согласно изобретению, могут включать лечение или профилактику одного или более чем одного состояния или симптома заболевания, например, рака, которые нужно лечить или предотвращать. Кроме того, в данном изобретении "профилактика" может включать задержку начала заболевания или его симптома или состояния.
[0110] Другое воплощение изобретения предусматривает применение CAR, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессионных векторов, клеток-хозяев, популяций клеток, антител или их антигенсвязывающих частей или фармацевтических композиций согласно изобретению для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
[0111] Другое воплощение изобретения предусматривает способ обнаружения рака у млекопитающего, включающий: (а) контактирование образца, содержащего одну или более чем одну клетку млекопитающего, с CAR, нуклеиновыми кислотами, рекомбинантными экспрессионными векторами, клетками-хозяевами, популяцией клеток, антителами и/или их антигенсвязывающими частями согласно изобретению, и таким образом формирование комплекса, (b) и обнаружение комплекса, где его выявление свидетельствует о наличии рака у млекопитающего.
[0112] Образец может быть получен любым подходящим способом, например, путем биопсии или аутопсии. Биопсия представляет собой извлечение ткани и/или клеток из индивидуума. Такое извлечение может быть сделано для сбора ткани и/или клеток у индивидуума с целью выполнения экспериментов на удаленной ткани и/или клетках. Эти эксперименты могут включать эксперименты по определению того, имеет и/или страдает ли человек от определенного состояния или заболевания. Состояние или заболевание может быть, например, раком.
[0113] В отношении воплощения способа обнаружения рака у млекопитающего согласно изобретению, образец, содержащий клетки млекопитающего, может быть образцом, содержащим целые клетки, их лизаты или фракцию цельноклеточных лизатов, например, ядерную или цитоплазматическую фракцию, суммарную белковую фракцию или нуклеиновокислотную фракцию. Если образец содержит целые клетки, то эти клетки могут быть любыми клетками млекопитающего, например, клетками любого органа или ткани, в том числе клетками крови или эндотелиальными клетками.
[0114] В способе обнаружения согласно изобретению контактирование может иметь место in vitro или in vivo по отношению к млекопитающему. Предпочтительно, контактирование происходит in vitro.
[0115] Кроме того, обнаружение комплекса может осуществляться с помощью любого числа способов, известных в данной области. Например, TCR, полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части согласно изобретению, описанные в данном документе, могут быть помечены обнаруживаемыми метками, такими как, например, радиоактивный изотоп, флуорофор (например, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
[0116] Способы анализа CAR на способность распознавать клетки-мишени и на антигенную специфичность известны в данной области. Например, в Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999) даны способы измерения высвобождения цитокинов (например, интерферона-γ, гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF), фактора некроза опухоли (TNF-α) или интерлейкина 2 (IL-2)). Кроме того, функция CAR может быть оценена путем измерения клеточной цитотоксичности, как описано в Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).
[0117] Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, конечно, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.
Пример 1
[0118] Этот пример демонстрирует синтез анти-CD22-CAR, трансдукцию РВМС с помощью анти-CD22-CAR и анализ поверхностной экспрессии CAR на трансдуцированных РВМС.
[0119] CAR-кодирующие последовательности были синтезированы с использованием алгоритмов оптимизации кодонов (Mr. Gene GmBH, Регенсбург, Германия) и субклонированы в векторы "назначения" (как описано в Zhao et al., J. Immunol., 183(9):5563-74 (2009)), кодирующие последовательности CAR второго поколения первой версии (трансмембранный и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга CD28 и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга цепи CD3-дзета), CAR второго поколения второй версии (трансмембранный домен CD8, связанный с доменами Т-клеточного сигналинга CD137 и CD3-дзета) или CAR третьего поколения (трансмембранный домен CD8, связанный с внутриклеточными доменами Т-клеточного сигналинга CD28, CD137 и CD3-дзета), как показано в таблице А.
[0120] Супернатанты с ретровирусными векторами были созданы путем трансфекции клеток 293GP плазмидами, кодирующими ретровирусные векторы с CAR и гликопротеин оболочки RD114, со сбором культуральных супернатантов (с/н) через 48-72 ч. Культуральные супернатанты замораживали или использовали немедленно для трансдукции ОКТ3- и ИЛ-2-активированных человеческих РВМС с помощью методики "на планшете" в течение двух последовательных дней (культура лимфоцитов на планшетах, покрытых RECTRONECTIN (Takara Bio Inc., Шига, Япония) с предварительным воздействием разведений с/н, содержащих векторы, как описано ранее в Y. Zhao et al., J. Immunol., 183: 5563 (2009). Также в данном исследовании использовали ретровирусные с/н, содержащие С019-специфический CAR от стабильной клеточной линии-продуцента (Kochenderfer et al., Stood, 116: 4099 (2010)).
[0121] Экспрессию CAR на трансдуцированных Т-клетках оценивали с помощью проточной цитометрии. Для непосредственного измерения числа клеток, способных связывать CD22 за счет домена СН2СН3, использовали козлиные противочеловеческие IgG (H&L) (Invitrogen, Гранд-Айленд, Нью-Йорк). Для обнаружения CAR, кодирующих не СН2СН3, после CD22-Fc (R&D Systems) использовали IgG-Fc РЕ (Jackson ImmunoResearch, Вест Гроув, Пенсильвания). HA22SH-CAR экспрессирует короткую последовательность константного домена иммуноглобулина вместо СН2СН3. CD19-CAR был обнаружен с помощью белка L. Биотинилированный белок L (50 нг/мкл, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс), связывался, клетки промывали, затем регистрировали с помощью SA-PE (4 мкг/мл, BD Biosciences, Франклин Лейке, Нью-Джерси). Для сравнения также оценивали с/н от вектора CD19-CAR. Эксперименты с проточной цитометрией подтвердили экспрессию CAR на трансдуцированных Т-клетках. CAR второго поколения продемонстрировали повышенный уровень поверхностной экспрессии по сравнению с CAR третьего поколения, что измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI).
Пример 2
[0122] Этот пример демонстрирует экспрессию антигенов CD22 и CD19 на лейкемических клеточных линиях.
[0123] В человеческих лейкемических клеточных линиях (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji и K562) оценивали уровень экспрессии CD19 и CD22 на клеточной поверхности с использованием шариков QUANTI-BRITE РЕ (BD Biosciences) и РЕ-меченных анти-CD19- и анти-CD22-антител (таблица 2). "Число рецепторов на клетку" показывает приблизительное абсолютное число молекул на клетку на каждой из указанных клеточных линий. Данные были рассчитаны путем определения антител, связанных с клеткой (ABC), с помощью программного обеспечения CELLQUEST (BD) с инструментами анализа данных в соответствии с инструкциями производителя.
Пример 3
[0124] Этот пример демонстрирует литическую активность клеток, экспрессирующих CAR m971 второго поколения (версия 1).
51
[0125] Для определения литической активности лейкемические клеточные линии (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji и K562) метили Cr и использовали в качестве мишеней в анализах цитотоксичности. Клетки были нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными посредством CAR m971 второго поколения (версия 1) (SEQ ID NO 23), анти-CD19-CAR или HASH22 CAR второго поколения (версия 1) и были использованы в качестве эффекторных клеток в различных соотношениях эффектора к мишени в анализах цитотоксичности. Процент лизиса клеток-мишеней измерен и показан на фиг. 1A-1G.
[0126] Как показано на фиг. 1A-1G, клетки, трансдуцированные посредством CAR m971 второго поколения (версия 1) (SEQ ID NO 23), лизируют CD22-экспрессирующие лейкемические клеточные линии (REH, SEM, NALM6, KOPN8, Daudi, Raji и K562) и не лизируют неэкспрессирующую CD22 клеточную линию K562. Клетки, трансдуцированные посредством CAR m971 второго поколения (версия 1) (SEQ ID NO 23), показали превосходную литическую способность по сравнению с клетками, трансдуцированными посредством CAR HASH22 второго поколения (версия 1).
[0127] Образцы от семи пациентов с BCP-ALL были проанализированы на экспрессию CD22 и CD19. Наблюдался широкий диапазон экспрессии антигенов, что показано с помощью анализа проточной цитометрии. Некоторые пациенты показали сильную положительность на оба антигена, в то время как другие имели сниженное CD22-окрашивание. В каждом случае CD22-специфические CAR давали противолейкемическую литическую активность на третьей части лимфоцитов.
Пример 4
[0128] Этот пример демонстрирует литическую активность Т-клеток, экспрессирующих CAR m971.
высокий
низкий
51
[0129] Чтобы определить, дают ли конструкции с CAR второго или третьего поколения повышенную литическую активность, лейкемические клеточные линии Raji (CD22), NALM6-GL (СD22) или K562 (CD22-отрицательная) метили Cr и использовали в качестве мишеней в анализах цитотоксичности. Эффекторные клетки были человеческими Т-клетками, нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными посредством CAR m971 второго поколения (версия 1) (SEQ ID NO 23) или CAR m971 третьего поколения (SEQ ID NO 24). Эффекторные клетки совместно культивировали с клетками-мишенями в различных соотношениях эффектора к мишени (Е:Т). Результаты показаны на фиг. 2А-2С.
[0130] Как показано на фиг. 2А-2С, CAR m971 второго поколения продемонстрировал превосходные литическую активность по сравнению с CAR m971 третьего поколения.
Пример 5
[0131] Этот пример демонстрирует реактивность Т-клеток, экспрессирующих CAR m971.
высокий
низкий
[0132] Т-клетки, которые были нетрансдуцированными (mock) или трансдуцированными одним из следующих CAR: анти-CD19 m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), m971 третьего поколения (SEQ ID NO 24), HASH22 второго поколения версии 1, HASH22 второго поколения версии 2 или HASH22 третьего поколения, культивировали совместно с лейкемическими клеточными линиями Raji (CD22), NALM6-GL (CD22) или K562 (CD22-отрицательная), и измеряли уровни секретированного интерферона (IFN) γ, фактора некроза опухоли (TNF) α и интерлейкина (IL) 2. Результаты показаны на фиг. 3А-3I.
[0133] Как показано на фиг. 3A-3I, клетки, трансдуцированные посредством CAR m971 второго поколения версии 1, секретировали большие количества IFN-γ, IL-2 и TNF-α в ответ на совместное культивирование с CD22-экспрессирующими клеточными линиями по сравнению с CAR m971 третьего поколения.
Пример 6
[0134] Этот пример демонстрирует, что клетки, трансдуцированные посредством CAR m971, задерживают прогрессирование заболевания и удлиняют продолжительность выживания in vivo по сравнению с CAR НА22.
6
7
2
2
[0135] Иммунодефицитным мышам NOD SCID гамма (NSG) вводили в 0 день 0,5×10 NALM6-GL (NAML6, трансфицированные люциферазой). В день 3 мышам вводили 1×10 нетрансдуцированных (mock) Т-клеток или Т-клеток, трансдуцированных CAR HASH22 второго поколения, версия 1, или CAR m971 второго поколения, версия 1 (SEQ ID NO 23). Массу опухоли измеряли по биолюминесцентным сигналам на каждую мышь в виде фотонов/с/см/стерадиан при визуализации биолюминесценции с помощью прибора Xenogen MS. Мышам вводили внутрибрюшинно (i.p.) 3 мг D-люциферина (Caliper Life Sciences, Inc., Хопкинтон, Массачусетс) и через 4 минуты после инъекции анестезированных мышей визуализировали с временем экспозиции 30 секунд. Программное обеспечение LIVING IMAGE было использовано для анализа биолюминесцентных сигналов от каждой мыши в виде фотонов/с/см/стерадиан на 3, 7 и 15 дни. Интенсивность сигнала откладывали на графике в зависимости от времени, результаты показаны на фиг. 4А.
[0136] Как показано на фиг. 4А, все мыши имели эквивалентное заболевание на 3 день. У мышей, получавших Т-клетки, трансдуцированные посредством CAR m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), уменьшилась масса опухоли по сравнению с мышами, получавшими контрольные клетки или клетки, трансдуцированные посредством CAR НА22.
[0137] Выживание мышей измеряли в течение 50 дней, статистику выживания вычисляли с использованием логарифмического рангового анализа (Mantel-Cox), и результаты выживаемости приведены на фиг. 4В. Как показано на фиг. 4В, мыши, получавшие Т-клетки, трансдуцированные посредством CAR m971 второго поколения версии 1 (SEQ ID NO 23), продемонстрировали увеличение выживаемости по сравнению с мышами, получавшими контрольные клетки, трансдуцированные CAR НА22.
[0138] Чтобы определить, была ли неудача лечения результатом потери антигена, мышей умерщвляли в связи с бременем болезни в соответствии с формальным протоколом, и анализировали селезенки с помощью проточной цитометрии. До терапии высокие уровни экспрессии CAR наблюдались на HASH-28z- и m971-282-трансдуцированных Т-клетках, а клетки NALM6-GL экспрессировали и CD19, и CD22. После умерщвления селезенки сначала анализировали на экспрессию человеческого CD45 и GFP. Гейтированные GFP-положительные клетки представляли опухоль, и при дальнейшем анализе эта гейтированная популяция продолжала экспрессировать GFP. Тем не менее, все CD45-положительные и GFP-отрицательные клетки далее не экспрессировали анти-CD22-CAR. Это означает, что лейкемия продолжала экспрессировать CD22, и что CAR Т-клетки не персистировали в момент умерщвления. Когда эксперимент был повторен и мышей умерщвляли на 12-й день, когда терапевтические Т-клетки все еще оказывали влияние, они легко могли быть обнаружены в крови, селезенке и костном мозге. CAR M971-28z (второе поколение, версия 1) показал гораздо большую способность проникновения в костный мозг.
Пример 7
[0139] Этот пример демонстрирует кривую "доза-ответ" для адоптивного переноса клеток, экспрессирующих CAR m971.
6
6
6
6
5
[0140] Мышам NSG (иммунодефицитным) вводили 0,5×10 клеток NALM6-GL в день 0. В день 3 животных обследовали с помощью субстрата люциферина, чтобы подтвердить наличие лейкемии. На день 3 мышам с лейкемией вводили внутривенно (i.v.) нетрансдуцированные (mock) Т-клетки или 15×10, 5×10, 1×10 или 1×10 Т-клеток, трансдуцированных нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR m971 второго поколения версии 2 (SEQ ID NO 22). Эффективность CAR-трансдукции трансдуцированных Т-клеток составила 90%. Т-клетки стимулировали анти-CD3/CD28-шариками (1:1), культивировали в 40 ед/мл интерлейкина-2 и вводили мышам через 10 дней после первоначальной стимуляции. Мышей снова обследовали на день 5 и день 8. Результаты показаны на фиг. 5 и 6. На фиг. 5 изменение в затенении с серого до белого указывает на увеличение опухолевой массы. На фиг. 6 уменьшение фотонов указывает на увеличение опухолевой массы. Как показано на фиг. 5 и 6, полное устранение лейкемии наблюдалось на самой высокой дозе на день 8.
[0141] Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы про каждый объект ссылки было отдельно и конкретно указано, что он включен посредством ссылки и изложен в данном документе во всей его полноте.
[0142] Применение терминов в единственном числе и с указанием "по меньшей мере один" и аналогичных объектов ссылки в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей ниже формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее единственное число и множественное число, если иное не указано в данном документе или это явно не противоречит контексту. Применение термина "по меньшей мере один" с последующим списком одного или более чем одного элемента (например, "по меньшей мере один из А и В") означает один элемент, выбранный среди перечисленных элементов (А и В), или любое сочетание двух или более из перечисленных элементов (А и В), если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины "содержащий", "имеющий" и "включающий" должны быть истолкованы как неограничивающие термины (т.е. означающие "включающий, но не ограниченный этим"), если не указано иное. Указание диапазонов значений в данном документе является только способом быстрой записи с индивидуальной ссылкой на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в данном документе. Все описанные здесь способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если это явно не противоречит контексту или не указано иное. Использование в данном документе любых и всех примеров или иллюстративных выражений (например, "такой как") предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакое выражение в описании не следует толковать как указывающее на какой-либо незаявленный элемент как существенный для практики изобретения.
[0143] В данном документе описаны предпочтительные воплощения данного изобретения, включая наилучший способ, известный авторам изобретения, для осуществления данного изобретения. Вариации этих предпочтительных воплощений могут стать очевидными для специалистов в данной области после прочтения приведенного выше описания. Изобретатели ожидают, что специалисты используют такие вариации в зависимости от обстоятельств, и изобретатели подразумевают, что изобретение будет осуществлено иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета, изложенного в формуле изобретения, прилагаемой к данному документу, как предусмотрено действующим законодательством. Кроме того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариантах охватывается изобретением, если это явно не противоречит контексту или в данном описании не указано иное.