СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ ТРАНСАМИНИРОВАНИЯ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ
METHOD FOR DIAGNOSIS OF DISTURBANCE OF TRANSAMINATION IN PLACENTAL PLASMODIOTROPHOBLAST GLUTAMIC ACID IN AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRAL INFECTION IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION

1. Цель изобретения - выявить, что при обострении цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации снижается активность процесса трансаминирования глутаминовых аминокислот.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа диагностики снижения процессов трансаминирования глутаминовой кислоты, приводящего к снижению активности трансаминирования белка в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты.
3. Раскрытие изобретения
2
Аминокислоты, не использованные для синтеза белка, накапливаются в клетках в большом количестве. Они подвергаются различным ферментативным превращениям с последующим распадом. В азотистом обмене большая роль принадлежит процессам переноса одних аминокислот на другие в процессе ферментативных реакций, получивших название трансаминирования: NH-группы от L-аминокислоты переносятся на L-кетокислоту. Эти реакции катализируются ферментами трансаминазами. Коферментом трансаминаз является пиридоксаль-5-фосфат, являясь промежуточным переносчиком аминогрупп от аминокислоты на кетокислоту [1, 3-5, 8]. Из всех природных аминокислот в животных тканях с высокой скоростью дезаминируются только L-глутаминовая кислота с образованием γ-глутаминовой кислоты. Образовавшаяся γ-глутаминовая кислота [3, 6-8, 10] подвергается окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогеназы [9, 11]. В случае подавления активности глутаматтрансферазы в цитозоле накапливается большое количество аминокислот, которые нарушают синтез белка и работу конформационной упаковки аминокислот цитозоля с помощью белка теплового шока Hsp-70, что приводит к дезорганизации фетоплацентарного барьера плаценты.
4. Новая техническая задача
Определять уровень активности глутаматтрансферазы при обострении цитомегаловирусной инфекции у беременных на третьем триместре гестации с целью диагностировать характер состояния фетоплацентарного барьера во время беременности, от чего зависит нормальное развитие плода.
5. В доступной литературе по данному вопросу аналогов не отмечено.
6. Осуществление изобретения
6.1. Обследованы 45 беременных 18-25 лет (срок гестации 20-22 нед.). Основную группу составили 25 беременных с хронической ЦМВИ в стадии обострения, контрольную - 20 беременных без этой патологии. У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз (обострение ЦМВИ) устанавливался по результатам комплексного исследования периферической крови на наличие ДНК цитомегаловируса (ЦМВ), JgM или увеличение титра антител JgG в парных сыворотках (в 4 раза и более) в динамике через 10 суток, а также индекса авидности (более 65%). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в РФ, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
6.2. Верификацию ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществляли методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест», ДНК ЦМВ выявляли методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология».
6.3. Глутаматтрансферазу определяли в периферической крови с помощью наборов «Sentinel diagnostics» (Италия) на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (США).
6.4. Биохимически активность белка теплового шока Hsp-70 в гомогенате плаценты определяли с помощью наборов ELISA Kit (США) методом ИФА.
6.5. Гистохимически активность глутаматдегидрогеназы определяли на гистологических срезах плаценты по методу Лойда [2] с последующим цитофотометрическим компьютерным анализом с помощью программы Scion (США).
1
2
6.6. Статистический анализ и обработка данных проводились с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Характеристика вариационных рядов: средняя арифметическая (М), стандартная ошибка (m), коэффициент вариации 95%, доверительный интервал для средних значений М±m, где t определялось по таблице граничных значений критерия Стьюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы F=n+n-2. Для определения достоверности различий использовался непарный параметрический критерий Стьюдента. Принимались во внимание р<0,05; 0,01; 0,001. Для определения достоверности различий в случае негауссовых распределений - непараметрические критерии Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни.
В процессе исследования получены следующие результаты: при нарастании титра антител к ЦМВ до 1:1600 в третьем триместре гестации в периферической крови беременных отмечается резкое снижение активности глутаматтрансферазы до 28,3±0,98 Ед/л (контроль - 74,6±2,2 Ед/л). У здоровых беременных при содержании 74,6±2,2 Ед/л глутаматтрансферазы обеспечиваются полностью процессы трансаминирования L-аминоглутаминовой кислоты, которая в избытке может оказывать токсическое действие на ферментативные процессы (активность глутаматдегидрогеназы) и процессы конформационного построения белков цитозоля в синцитиотрофобласте с участием белка теплового шока Hsp-70. При обострении цитомегаловирусной инфекции до титра 1:1600 активность белков теплового шока Hsp-70 снижалась до 30,5±1,7 нг/мл (контроль - 52,7±1,8 нг/мл). На гистохимических срезах плаценты рожениц, перенесших обострение ЦМВИ до титра антител к 1:1600, определяли активность глутаматдегидрогеназы цитофотометрическим компьютерным методом по программе Scion (США). Отмечается, что обострение ЦМВИ приводит к снижению активности глутаматдегидрогеназы до 39,7±1,9 усл. ед. (контроль - 62,5±2,3 усл. ед.) (фигуры 1 и 2).
На фигуре 1 изображена гистохимическая реакция на глутаматдегидрогеназу в плаценте роженицы, перенесшей на третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600. Интенсивность гистохимической реакции - 39,7±1,9 усл. ед. Подсчет выполнялся методом компьютерной цитофотометрии по программе Scion (США). Увеличение - 10×100.
На фигуре 2 изображена гистохимическая реакция на глутаматдегидрогеназу в плаценте роженицы, не болевшей на всем протяжении гестации. Интенсивность гистохимической реакции - 62,5±2,3 усл. ед. Подсчет выполнялся методом компьютерной цитофотометрии по программе Scion (США). Увеличение - 10×100.
Таким образом, снижение глутаматтрансферазы в периферической крови, подавление активности белка теплового шока Hsp-70 в гомогенате синцитиотрофобласта плаценты, снижение гистохимической активности глутаматдегидрогеназы на гистологических срезах плаценты при нарастании титра антител к ЦМВ до 1:1600 приводит к дезинтеграции белкового обмена в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, влияющей на развитие плода.
Литература
1. Браунштейн А.Е., Шемякин М.М. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. М.: 1953. 393 с.
2. Лойда З., Гроссрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: 1962. 270 с.
3. Ferard G., Imbert-Bismet F., Messou D. Influence of pyridoxal phosphate in measuring aminotransferases activities in patients with virial hepatitis // Ann. Biol. Clin. 2004. V. 62, №6. P. 717-720.
4. Filipowicz A., Wolowiec S. Solubility and in vitro transdermal diffusion of riboflavin assisted by РАМАМ dendrimers // Int J. Pharm. 2011. №408. P. 152-156.
5. Filipowicz A., Wolowiec S. Bioconjugates of РАМАМ dendrimers with trans-retinal, pyridoxal, and pyridoxal phosphate // Int J. Nanomedicine. 2012. №7. P. 4819-4822.
6. Hermanussen M., Tresguerres J. Does the thrifty phenotype result from chronic glutamate intoxication a typothesis // J. Perinat. Med. 2003. V. 31. P. 311-326.
7. Kelly A., Stanley C. Disordes of glutamate metabolism // Men. Retard Dev. Disabk. Res. Rev. 2011. V. 7. P. 287-295.
8. Nichols T.W., Gaiteri C. Morton′s foot and pyridoxal 5-phosphate deficiency: genetically linked traits // Med. Hypotheses. 2014. Sep 16. V. 83, №6. P. 644-648.
9. Sookoian S., Pirola C. Alanine and aspartate aminotransferase and glutamine-cycling path way: ther roles in pathogenesis of metabolic syndrome // Word J. Gastroenterol. 2012. V. 78, №29. P. 3779-3781.
10. Stumvoll M., Perriell G., Meyer C. Role of glutamine in human carbohydrate metabolism in kidney and other tissue // Kidney Int. 1999. V. 55. P. 778-792.
11. Trebery J., Banh S., Weihrach D. Intertissu differences for the role of glutamate gehydrogenas in metabolism // Neurochem Res. 2014. V. 3, №3. P. 516-526.