СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ
METHOD FOR DETERMINING ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF PEPTIDES

Изобретение относится к экспериментальной медицине и клинической фармакологии и предназначено для исследования фармакокинетических и фармакодинамических свойств антимикробной активности различных пептидов с молекулярной массой менее 50 кДа.
В настоящее время отмечается стремительное увеличение резистентности бактерий к антимикробным препаратам, что значительно затрудняет лечение инфекционных заболеваний. Учитывая современные представления о качестве лекарств и их адаптированности к человеческому организму, наиболее предпочтительными средствами лечения являются препараты, содержащие естественные компоненты организма с известной биологической активностью. В качестве кандидатов на роль подобных препаратов являются антимикробные пептиды животного происхождения.
К началу 2000 года общее число выделенных из различных природных источников антибактериальных пептидов превысило пять сотен благодаря расширению зон скрининга пептидов практически во всех биологических объектах и перспективам их практического применения в терапевтических целях, а также возможностью использования данных об их строении для построения матриц при направленном синтезе новых эффективных лекарственных препаратов [Antimicrobial peptides: discovery, design, and novel therapeutic strategies / ed. by G. Wang // Advances in molecular and cellular microbiology, 18. CAB International, 2010. 230p].
Интересно отметить ряд общих свойств антибактериальных пептидов. Они представляют собой относительно небольшие молекулы, содержащие менее 100 аминокислотных остатков, чаще менее 40, и имеющие суммарный положительный заряд от +2 до +6 благодаря относительно большому содержанию катионных аминокислот лизина и аргинина. Важной характеристикой этих соединений является обычно высокое содержание в них остатков гидрофобных аминокислот [Nguyen L.Т., Honey Е.F., Vogel Н.J. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action // Trends Biotechnol. 2011. Vol. 29, iss. 9. P. 464-472].
Парадоксально, но впечатляющие антибактериальные свойства природных пептидов до сих пор не привлекли внимания крупных фармацевтических компаний. Большая часть доклинических и клинических исследований пептидов проводится небольшими биотехнологическими фирмами, результаты которых практически не публикуются и информация о них просачивается лишь из пресс-релизов компаний, из которых следует, что происходит активное, но скрытое от посторонних глаз внедрение результатов всестороннего изучения катионных пептидов в терапию различных патологических состояний бактериальной этиологии. Сведения об эффективности этих препаратов до полного завершения клинических испытаний публикуются чрезвычайно дозировано, подчеркивая большую коммерческую заинтересованность разработчиков новой области биотехнологии - мира низкомолекулярных пептидов.
Проведение экспериментальных фармакокинетических исследований лекарственного препарата является необходимым этапом для его дальнейшего продвижения в медицинскую практику.
В настоящее время отсутствуют методики определения антимикробной активности изучаемых пептидсодержащих препаратов в крови экспериментальных животных во времени.
Существующие в настоящее время методы направлены на определение антимикробной активности пептидов in vitro.
Известен способ определения противомикробной активности (патент RU 2 710236 С1 от 25.12.2019), в котором оценку биологической активности, в частности антибактериальной, определяют in vitro на культурах десяти бактериальных штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.
Недостатком данного способа является невозможность оценить динамику всасывания антибактериальной композиции в организме животных.
Наиболее близким способом того же назначения к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ определения противомикробной активности цельной сыворотки и фракции ее антимикробных пептидов {патент RU 2686337 от 07.03.2018). Способ определения общей противомикробной активности сыворотки крови и активности фракции антимикробных пептидов сыворотки с молекулярной массой менее 100 кДа заключается в том, что берут образцы цельной сыворотки и указанной фракции, соединяют в пробирках с суспензией микроорганизмов, инкубируют 2 часа при температуре 32 градуса на шейкере, затем центрифугируют и к полученному осадку добавляют раствор бромкрезолового пурпурного, затем вновь термостатируют при тех же условиях, центрифугируют, измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости и рассчитывают активность образцов по формуле, при этом величина указанной активности цельной сыворотки 72,7÷91,6% и величина активности низкомолекулярной фракции сыворотки 21,2÷51,4% интерпретируются как нормальные, а при величине активности цельной сыворотки ниже 72% и величине активности низкомолекулярной фракции сыворотки ниже 21% свидетельствуют о снижении указанной активности. Данный способ принят в качестве прототипа.
Признаки прототипа, совпадающие с существенными признаками заявляемого способа, заключаются в определении уровня противомикробной активности цельной сыворотки крови на тестовом штамме микроорганизмов.
Недостатком известного способа, принятого за прототип, является отсутствие возможности оценки динамики всасывания изучаемого препарата в организм животных, сложность воспроизведения.
Задачей изобретения является контроль антибактериальной активности пептидов в динамике в кровеносном русле экспериментального животного.
Поставленная задача была решена за счет того, что в известном способе определения противомикробной активности пептидов с молекулярной массой менее 50 к Да в сыворотках крови, включающем определение уровня противомикробной активности цельной сыворотки крови на тестовом штамме микроорганизмов, согласно изобретению исследуют на противомикробную активность сыворотки крови животного в динамике, для этого исследуемый образец пептида вводят внутривенно в организм экспериментального животного, через определенные промежутки времени берут кровь, из которой получают сыворотку и полученные образцы сывороток титруют против штамма St.epidermitis 33 GISK.
Признаки изобретения, отличающиеся от прототипа, в том, что исследуемый образец пептида вводят внутривенно в организм экспериментального животного; через определенные промежутки времени берут кровь, из которой получают сыворотку; полученные образцы сывороток титруют против штамма St.epidermitis 33 GISK; проводят оценку наличия изучаемого пептида в сыворотках крови животных в динамике.
Использование предлагаемого способа позволяет оценивать в динамике уровень антибактериальной активности любого биологического вещества с достаточным уровнем антибактериальной активности.
Способ осуществляют следующим образом.
Учитывая особенности лейкоцитарных антимикробных пептидов (АМП) и отсутствия методик выявления их в биологических жидкостях живого организма, нами предложен музейный штамм St.epidermitis 33 GISK в качестве референтного, который в здоровом организме не присутствует, средой его обитания является эпидермис кожи [F. Gotz Staphylococcus and bio films // Molecular microbiology, Vol. 43, P. 1367-1378].
Исследуемый образец АМП вводится в суточной дозе внутривенно в организм экспериментального животного (кролики, крысы). Далее из ушной вены у кролика или хвостовой у крысы осуществляют забор крови в количестве не менее 1,0 мл через определенное время. Затем кровь помещают в термостат для формирования сгустка крови, стерильно обводят сгусток и полученную сыворотку помещают в стерильные эпиндорфы. Для определения антибактериальной активности используют метод серийных разведений в бульоне. Тестирование проводят в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах. Методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтона определяют индивидуальные значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) для каждого из исследуемых образцов в отношении тестируемого штамма St.epidermitis 33 GISK. Контролировали чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды. Препарат вводили внутривенно в дозе 0,015 мкг/кг массы животного. Полученные результаты представлены в таблице.
Динамика антибактериальной активности препарата АМП в сыворотках крови кроликов при внутривенном введении (n=3+
Установлено, что АБПК хорошо высвобождается в венозном русле экспериментальных животных, что подтверждается определением антибактериальной активности АБПК уже через 30 мин после введения. Наиболее высокие и стабильно поддерживающие титры антибактериальной активности в сыворотке крови были отмечены через час после введения препарата. Исходя из уровня антибактериальной активности, можно говорить о том что, кинетика высвобождения АБПК приходится на 1-3 час от момента введения исследуемого препарата.