Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием
METHOD FOR PRODUCING A MEDICINAL PRODUCT EXHIBITING HEPATOPROTECTIVE AND ANTIHEPATOTOXIC ACTIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, из лекарственного растительного сырья.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Патологии гепатобилиарной системы представляют серьезную социально-экономическую и клиническую проблему по причине неуклонного роста заболеваемости. По статистике хронический гепатит встречается у 5% населения [Сакиев К.З., Батырбекова Л.С. Влияние факторов окружающей среды на состояние гепатобилиарной системы населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах // Медицина и экология. - 2015. - № 4 (77)].
Помимо вирусных и аутоиммунных заболеваний одной из основных причин поражения печени считается интоксикация организма, вызванная воздействием алкоголя, тяжелых металлов, пестицидов и других ксенобиотиков. При этом доля факторов окружающей среды в этиологии дисфункции печени может составлять от 14% до 36%. Например, у населения, проживающего на территориях, где содержание промышленных соединений и пестицидов в воде и воздухе выше норм ПДК, вероятность появления дисфункции гепатобилиарной системы в 3-4 раза выше, чем у населения, проживающего в экологически благоприятных районах [Сакиев К.З., Батырбекова Л.С. Влияние факторов окружающей среды на состояние гепатобилиарной системы населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах // Медицина и экология. - 2015. - № 4 (77)]. Также известно, что прием некоторых лекарственных препаратов может приводить к развитию лекарственно-индуцированных гепатотоксических реакций [Бибик Е.Ю. и др. Особенности фармакологических свойств современных гепатопротекторов //Морфологический альманах имени В.Г. Ковешникова. - 2019. - Т. 17. - № 4. - С. 101-110].
Комплексное воздействие на гепатобилиарную систему человека может быть обеспечено за счет использования средств растительного происхождения. Например, было показано, что механизм гепатопротекторной активности некоторых растительных экстрактов, обусловлен антиоксидантным, противовоспалительным, антистеатотическим, антиапоптотическим и антифибротическим действием фенольных соединений и терпеноидов, входящих в их состав [Domitrovic R., Potocnjak I. A comprehensive overview of hepatoprotective natural compounds: mechanism of action and clinical perspectives //Archives of toxicology. - 2016. - Vol. 90. - № 1. - p. 39-79].
Из уровня техники известно, что около 80% гепатопротекторных средств, применяемых в клинической практике, имеют растительное происхождение [Губергриц Н.Б. и др. Фармакотерапевтические эффекты и клинические возможности эталонного препарата силимарина // Фарматека. - 2012. - Т. 2. - С. 24-31.7].
Большинство растительных гепатопротекторных препаратов содержат в качестве действующего вещества силимарин - основной компонент экстракта плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.) [Мусаева Э.М. и др. Возможности фармакологической коррекции патологий гепатобилиарной системы //Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. - 2018. - № 2. - С. 221-225]. Биологически активные соединения, содержащиеся в плодах расторопши пятнистой, обладают антиоксидантным действием, препятствуют перекисному окислению липидов, оказывают противовоспалительный и антифиброзный эффект. Однако препараты на основе силимарина не рекомендуют применять для лечения заболеваний печени при холестазе. Кроме того, не была доказана эффективность силимарина при вирусном гепатите [Полунина Т.Е., Маев И.В. Применение гепатопротекторов при лечении болезней печени // Медицинский совет. - 2010. - № 3-4].
Биологически активные соединения (в том числе глицирризиновая кислота), содержащиеся в солодке голой (Glycyrrhiza glabra L.) проявляют антифибротическую, противовоспалительную и антистеатозную активность [Мехтиев С.Н., Оковитый С.В., Мехтиева О.А. Принципы выбора гепатопротекторов в практике терапевта // Журнал «Лечащий Врач». - 2018. - № 8-2016. - С. 44]. Однако из уровня техники известно, что экстракт солодки голой эффективен для лечения заболеваний печени только в составе комплексных лекарственных препаратов (например, препарат «Фосфоглив»).
Препараты на основе цветков бессмертника песчаного (Helichrysurn arenarium (L.) Moench.) применяют как желчегонное средство при желчекаменной болезни, хроническом холецистите, гепатите, дискинезии желчевыводящих протоков. Противопоказанием к применению препаратов на основе цветков бессмертника песчаного является повышенная кислотность желудка [Пастушенков А.Л., Беспалова Н.В. Лекарственные средства и лекарственное растительное сырье, содержащие биологически активные вещества, влияющие на клинико-патофизиологические и фитотерапевтические аспекты гепатобилиарной системы // Клиническая патофизиология. - 2019. - Т. 25. - № 2. - С. 65-69].
В связи с этим актуальна разработка новых эффективных средств растительного происхождения, оказывающих комплексное воздействие на гепатобилиарную систему человека за счет различных механизмов гепатопротекторного действия, а также способствующих процессам детоксикации.
Наиболее близким к заявленному способу изобретений является способ получения гепатопротекторного лекарственного препарата «Силимар» (Патент РФ № 2099076 С1 от 16.04.1996; Научно-производственное объединение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений»). Лекарственный препарат «Силимар» представляет собой сухой экстракт, получаемый в результате комплексной переработки плодов расторопши пятнистой. Фармакологическое действие препарата «Силимар» обусловлено свойствами входящих в его состав биологически активных компонентов - флаволигнанов. Способ получения препарата «Силимар» включает экстракцию жмыха расторопши пятнистой этиловым спиртом (80%) методом быстротекущей реперколяции (6 перколяторов) при постоянном перемешивании при температуре 50°С в течение 1 ч, упаривание спиртовых извлечений до водного кубового остатка, очистку петролейным эфиром для удаления остатков жирного масла и осаждение флаволигнанов раствором соляной кислоты (0,025%). Полученный сухой остаток содержит до 80% действующих веществ.
Недостатком прототипа является сложная, многостадийная, трудоемкая технология получения экстракта.
Настоящее изобретение решает техническую проблему необходимости расширении ассортимента отечественных высокоэффективных и безопасных лекарственных средств, обладающее гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием.
Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что сухой экстракт цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.), проявляет выраженную антигепатотоксическую активность.
Уровень техники содержит сведения об антиоксидантной, антибактериальной, иммуномодулирующей и гепатопротекторной активности компонентов травы цикория обыкновенного. Однако применение экстракта травы цикория обыкновенного для восстановления функций печени при острых интоксикациях тяжелыми металлами, в том числе ртутью, неизвестно.
Техническим результатом заявленного изобретения является снижение уровня билирубина, ферментов печени в крови (ЩФ, АсАТ, АдАТ) и уменьшение дистрофических изменений по типу гиалиново-капельной дистрофии при остром токсическом поражении печени тяжелыми металлами и токсическом гепатите, а также уменьшение проявления симптомов острой интоксикации тяжелыми металлами.
Указанный технический результат достигается осуществлением заявленного способа получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием. Способ включает следующие последовательные стадии: измельчение высушенной травы дикорастущего цикория обыкновенного до размера частиц 3-5 мм, трехкратная динамическая мацерация спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование объединенного извлечения, очистка органическим растворителем, таким как дихлорметан или хлороформ, и сушка при температуре 40-60°С.
Этапы получения сухого экстракта цикория обыкновенного были разработаны и подобраны с учетом требований современного типового оборудования, а также потребности пациентов и рынка в новых эффективных средствах с гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием.
Сухой экстракт цикория обыкновенного, получаемый согласно предлагаемому способу, содержит преимущественно фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновую, цикориевую) и их производные; флавоноиды (гликозиды кверцетина и кемпферола); кумарины (эскулетин, цикориин) и углеводы.
Средство, полученное в результате реализации заявленного способа, может быть использовано для получения лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний печени. Предлагаемое средство отличается высокой эффективностью в снятии симптомов острого отравления токсикантами, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска развития побочных реакций. Также к преимуществам предлагаемого однокомпонентного растительного средства можно отнести возможность его применения в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной системы.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сущность изобретения раскрывается в следующих примерах реализации заявленного способа, которые служат для иллюстрации, но не ограничивают объема притязаний.
Пример 1
Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 5 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 50% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 40°С в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (хлороформ). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 40°С.
Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 8±0,38% масс.
Пример 2
Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 4 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 60% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 50°С в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (дихлорметан). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 50°С.
Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 9±0,39% масс.
Пример 3
Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 3 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 70% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 60°С в течение 1,5 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (дихлорэтан). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 60°С.
Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 10±0,47% масс.
Таким образом, было показано, что измельчение растительного сырья до размера частиц 3-5 мм, трехкратная динамическая экстракция спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование, очистка подходящим органическим растворителем и сушка при температуре 40-60°С обеспечивает получение сухого экстракта (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 8-10% (масс).
Пример 4
Определение гепатопротекторного действия на модели токсического гепатита, вызванного введением однократно подкожно крысам тетрахлорметана.
Исследования проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01.04.2016, Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) и в соответствии с Федеральными законами от 12.04.2010 г. № 61-ФЗ (ред. от 28.11.2018 г.) «Об обращении лекарственных средств»). Животные содержались в виварии ФГБНУ ВИЛАР на стандартном рационе.
Эксперимент проводили на белых нелинейных крыс массой 200-250 г в количестве 50 особей. Подопытные животные были разделены на пять групп по 10 особей:
I группа - интактные животные,
II группа - контрольные животные, которым перед введением тетрахлорметана пять дней вводили эквивалентное количество очищенной воды в аналогичном с опытными группами в режиме внутрижелудочно,
III и IV группы - опытные, которые получали исследуемое вещество - цикория обыкновенного экстракт сухой пять дней в дозах 500 мг/кг и 100 мг/кг соответственно,
V группа животных, получавшая препарат сравнения «Силимар» в дозе 100 мг/кг, суспендированный в 1% крахмальной взвеси в течение пяти дней.
Экспериментальный гепатит у животных вызывали однократным введением 50% масляного раствора тетрахлорметана подкожно в дозе 0,4 мл на 100 г через час после последнего введения исследуемых веществ.
Через 48 часов после введения тетрахлорметана брали кровь из хвостовой вены крыс, получали сыворотку и проводили биохимический анализ. Затем изучали влияние экстракта травы цикория обыкновенного (полученного по примеру 1-3) и препарата сравнения «Силимар» на активность ферментов-маркеров морфофункционального состояния гепатоцитов в сыворотке крови крыс.
2
Крыс подвергали эвтаназии в СО камере и извлекали печень для патогистологической оценки (Таблица 1).
На основании полученных результатов (таблица 1) можно сделать вывод, что сухой экстракт травы цикория обыкновенного дикорастущего в дозах 100 и 500 мг/кг проявляет выраженное гепатопротекторное действие. Морфологическая картина органов в обеих группах (III и IV) стереотипна. Выявлен дозозависимый эффект. Действие сухого экстракта травы цикория обыкновенного дикорастущего сопоставимо с действием препарата «Силимар».
Пример 5
Влияние экстракта и препарата сравнения на активность ферментов-маркеров в сыворотке крови крыс и морфофункционального состояния гепатоцитов.
Для установления гепатопротекторной эффективности и механизма действия экстракта травы цикория обыкновенного была изучена активность индикаторных ферментов цитолитического синдрома - аланин- и аспартатаминотрансфераз (АлАт, АсАт), экскреционного фермента маркера холестаза - щелочной фосфатазы (ЩФ), а также содержание общего билирубина в условиях экспериментального тетрахлорметанового гепатита (таблица 2).
Введение подопытным животным тетрахлорметана вызвало выраженные изменения активности индикаторных ферментов цитолитического синдрома, экскреционного фермента маркера холестаза - щелочной фосфатазы, общего билирубина. Наблюдали существенное увеличение активности этих ферментов-маркеров функционального состояния печени.
Введение крысам цикория обыкновенного экстракта сухого в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг, а также препарата «Силимар» в дозе 100 мг/кг на фоне токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном, существенно снижало активность АлАТ, АсАТ, общего билирубина, щелочной фосфатазы. Действие препарата «Силимар» в дозе 100 мг/кг было сопоставимо с действием цикория обыкновенного экстракта сухого в дозе 100 мг/кг.
Таким образом, было показано, что цикория обыкновенного дикорастущего травы экстракт сухой проявляет дозозависимое гепатопротекторное действие.
Пример 6
Исследование антигепатотоксического действия на модели острого токсического поражения печени, вызванного однократным подкожным введением сулемы.
Исследования выполнены на 70 крысах Wistar (самцы), масса тела 180-200 г. Эксперименты проведены в соответствии с «Правилами лабораторной практики». Содержание, кормление и уход за животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Европейская конвенция, Страсбург, 1986).
Модель острого токсического поражения печени крыс вызывали однократным подкожным введением сулемы в дозе 3 мг/кг (≈ ЛД50 при подкожном введении сулемы белым крысам). Животные были разделены на 5 групп по 14 крыс в каждой:
I группа - интактный контроль, используемый для оценки токсического действия сулемы;
- II группа (модель) - животным однократно вводили подкожно (п/к) сулему в дозе 3 мг/кг;
III и IV группы - животным за 1 час до введения сулемы и в последующие 20 дней вводили в желудок цикория обыкновенного сухой экстракт в дозах 100 и 500 мг/кг соответственно;
V группа - животным за 1 час до введения сулемы и в последующие 20 дней вводили в желудок «Силимар» в дозе 100 мг/кг.
2
На протяжении эксперимента регистрировали основные интегральные показатели экспериментальных животных: общее состояние, поведение, динамику массы тела, гибель. На 21-е сутки опыта определяли показатели клинической биохимии сыворотки крови: общий белок, общий холестерин, триглицериды, глюкоза, общий билирубин активность ЩФ, АлАТ, АсАт, гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) на автоматическом биохимическом анализаторе крови URIT-8030 фирмы Urit Medical Electronic (Китай), при помощи наборов фирмы «Human», Германия. В конце эксперимента животных подвергали эвтаназии в СО-камере, определяли коэффициенты массы печени, проводили патогистологическую оценку печени при окрашивании срезов гематоксилином и эозином и исследовании световой микроскопией при увеличении ×100.
Под влиянием сулемы отмечали развитие токсического повреждения печени (II группа) у животных, характерное для острого отравления крыс этим гепатотропным ядом, резкое нарушение ее функционального состояния, снижение основных видов межуточного обмена, повреждение мембран гепатоцитов и их гибель. Указанные эффекты гепатотоксического действия сулемы сопровождались нарушением общего состояния животных (снижение динамики массы тела на 40%, вялость, гиподинамия, размягчение кала), гибелью 5 животных, что составляло 35,7%. Интоксикация сулемой приводила к статистически достоверному увеличению в сыворотке крови крыс уровня общего белка, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов, активности ферментов АсАТ и АлАТ, ЩФ, ГГТ. У животных II группы отмечено повышение коэффициента массы печени.
Гистологическая картина печени показала наличие дистрофии гепатоцитов, характеризующаяся гиалиново-капельной дистрофией (фиг. 9).
Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в дозах 100 (III группа) и 500 мг/кг (IV группа) улучшало общее состояние животных, предотвращало резкое снижение массы тела и двигательной активности. На 21-й день опыта снижение массы тела крыс, получавших экстракт в обеих испытанных дозах, не превышало 14-16%, по сравнению с моделью патологии.
В III группе животных была зарегистрирована гибель 4 животных, что составляло 26,8%, а IV группу - гибель 3 животных (21.4%); в V группе животных, получавших препарат сравнения «Силимар» - гибель 4 животных (26,8%). Крысы этих групп (III-V) имели опрятный внешний вид, оформленный кал, охотно поедали корм.
Введение сухого экстракта цикория обыкновенного предотвращало резкое повышение активности ряда ферментов сыворотки крови, характеризующих функциональное состояние печени, и способствовало их более быстрой нормализации, причем несколько более выраженными эти изменения были у животных, получавших максимальную дозу 500 мг/кг (табл. 3 и 4).
Выраженные антигепатотоксические свойства сухого экстракта цикория, полученного по примеру 1-3, в дозе 100 и 500 мг/кг подтверждены результатами патогистологического исследования печени экспериментальных животных. Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в дозе 100 и 500 мг/кг на фоне интоксикации сулемой показало отсутствие дистрофических изменений в гепатоцитах (фиг. 10, 11)
Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в обеих дозах способствовало сохранению относительной массы печени на уровне показателей интактного контроля (табл. 5).
Таким образом, было установлено выраженное антигепатотоксическое действие сухого экстракта цикория обыкновенного на модели острой интоксикации сулемой у крыс в дозах 100 и 500 мг/кг.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что по эффективности антигепатотоксического действия на указанной модели патологии печени сухой экстракт цикория обыкновенного в дозах 100 и 500 мг/кг соответствует препарату «Силимар».
Сулема, используемая в экспериментальной модели, обладает в целом общетоксическим действием, в отличие от тетрахлорметана, который влияет только на гепатоциты, вызывая их цитолиз.
Из результатов, приведенных в примерах, следует, что указанная техническая проблема решена - создано растительное средство на основе сухого экстракта цикория обыкновенного, способствующего снижению уровня билирубина и ферментов печени (ЩФ, АсАТ, АлАТ, ГЛТ) в крови, уменьшению дистрофических изменений по типу гиалиново-капельной дистрофии печени, а также улучшению общего самочувствия при острой интоксикации тяжелыми металлами, в том числе ртутью.