СОПОЛИМЕР-1, СПОСОБЫ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Способ получения полипептидных фракций со случайной аминокислотной последовательностью аналогичной последовательности глатирамера ацетата, которые служат в качестве маркеров молекулярной массы для глатирамера ацетата, содержащий стадии:
a) воздействие на полипептидную смесь, которая подобна Глатирамера ацетату по составу аминокислот и молярному соотношению аминокислот, гель-проникающей хроматографией (ГПХ)/эксклюзионной хроматографией (ЭХ) для получения полипептидных фракций с молекулярными массами в диапазоне от 2 кДа до 30 кДа;
b) выбор полипептидных фракций, которые будут использованы в качестве маркеров молекулярной массы, из указанных полипептидных фракций, полученных на стадии а), таким образом, что одна из фракций представляет вершину пика молекулярной массы, а другие фракции распределены по обе стороны от вершины пика молекулярной массы; и
c) определение коэффициента асимметрии пика указанных выбранных полипептидных фракций.
2. Способ по п.1, в котором указанный коэффициент асимметрии пика, выбранных полипептидных фракций, находится в диапазоне от 0,8 до 1.
3. Способ по п.1 или 2, в котором полидисперсность указанных полипептидных фракций меньше чем 1,20 или равна 1,20.
4. Способ по п.3, в котором указанная полипептидная смесь представляет собой глатирамера ацетат.
5. Способ по п.1, в котором указанную ГПХ/ЭХ проводят на колонке Superose-12 или Superdex-75, с использованием подвижной фазы, выбранной из ацетата аммония или формиата аммония с диапазоном концентрации от 0,1 до 0,3 М.
6. Способ по п.5, в котором колонка представляет собой Superose-12 (10×300 GL); загрузка колонки составляет не более чем 50 мг; и скорость потока регулируют в пределах от 0,4 до 0,6 мл/мин.
7 Способ по п.1, в котором указанные полипептидные фракции, полученные на стадии а) лиофилизируют и в котором Mp указанных выбранных фракций определяют с использованием ЭХ-РЛИКУ.
8. Способ по п.1, в котором указанные выбранные полипептидные фракции используют в качестве маркеров молекулярной массы для определения молекулярной массы партии глатирамера ацетата способом, содержащим стадии
a) калибровка колонки для ЭХ/ГПХ с использованием указанных выбранных полипептидных фракций;
b) установление взаимосвязи между временем удерживания и логарифмом молекулярной массы этих выбранных полипептидных фракций посредством калибровочной кривой;
c) проведение ЭХ/ГПХ для партии глатирамера ацетата, чья молекулярная масса должна быть определена, чтобы получить время удерживания;
d) использование соотношения между временем удерживания и логарифмом молекулярной массы для определения молекулярной массы партии Глатирамера ацетата.
9. Способ по п.8, в котором определяют вершину пика молекулярной массы партии глатирамера ацетата и в котором указанная колонка для ЭХ/ГПХ выбрана из Superose-12 или Superdex-75, и подвижная фаза выбрана из 0,1 до 0,3 М ацетата аммония или формиата аммония.
10. Способ исследования стабильности и воспроизводимости способа получения маркеров молекулярной массы, содержащий стадии:
a) получение множественного набора маркеров молекулярной массы из различных партий глатирамера ацетата/Копаксона, с помощью способа по п.1, каждый набор содержит маркеры молекулярной массы, имеющие молекулярную массу в диапазоне от 2000 до 13000 дальтон;
b) распределение маркеров молекулярной массы из каждого набора, полученного на стадии а), с использованием статистического способа рандомизации для дальнейшего выделения большего набора маркеров молекулярной массы, и
c) использование этих более крупных наборов, полученных на стадии b), в качестве маркеров молекулярной массы для определения молекулярной массы Копаксона/партии глатирамера ацетата при помощи ГПХ.
11. Способ по п.10, в котором указанные маркеры молекулярной массы обеспечивают предсказуемые результаты на основании 95% доверительного интервала, подтверждая стабильность и воспроизводимость способа получения маркеров молекулярной массы.
12. Способ по п.4, в котором указанный глатирамера ацетат получен способом, содержащим стадии:
а) обработка защищенного сополимера с примерно 7% до 20% HBr в уксусной кислоте при температуре около 25°C, в течении 21-23 ч, чтобы получить трифторацетил-сополимер;
b) обработка указанного трифторацетил-сополимера диэтиламином, чтобы получить сополимер с полностью удаленной защитной группой;
c) превращение сополимера с полностью удаленной защитной группой в глатирамера ацетат.
13. Способ получения глатирамера ацетата, содержащий стадии:
a) обработка защищенного сополимера с примерно 7% до 20% HBr в уксусной кислоте при около 25°C, в течение 21-23 ч, чтобы получить трифторацетил-сополимер;
b) обработка указанного трифторацетил-сополимера основанием, чтобы получить сополимер с полностью удаленной защитной группой;
c) превращение сополимера с полностью удаленной защитной группой в глатирамера ацетат.
14.Способ по п.13, в котором указанную обработку на стадии а) проводят при 25°C±0,2°C; указанный HBr в уксусной кислоте необязательно предварительно обрабатывают акцептором, выбранным из фенола, резорцина, тирозина, бисульфата натрия, тиосульфата натрия, нафталина, нафтола-1 или нафтола-2, и указанное основание выбирают из диэтиламина, диметиламина или диизопропиламина.
15. Способ по п.13, в котором указанное превращение сополимера с полностью удаленной защитной группой до глатирамера ацетата содержит стадии:
a) концентрирование водного раствора сополимера с полностью удаленной защитной группой до минимального объема, с использованием тангенциальной поточной фильтрации, пропусканием через кассету мембраны из полиэфирсульфона, имеющей номинальное отсечение по молекулярной массе 1 кДа;
b) промывку концентрированного раствора со стадии а) водой до достижения pH от 8 до 9, с последующей промывкой 0,3% раствора уксусной кислоты для солевого обмена, чтобы получить глатирамера ацетат; и
c) промывку глатирамера ацетата, полученного на стадии b) водой до достижения pH от 5,5 до 7, чтобы получить чистый глатирамера ацетат.
16. Способ по п. 15, в котором молекулярную массу указанного глатирамера ацетата определяют способом по п.8 и в котором указанный глатирамера ацетат имеет содержание бромированного тирозина не более чем около 0,15%, при исследовании при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой, и содержание диэтиламида не более, чем около 5000 частей на миллион (мд), при исследовании методом ионной хроматографии
17. Способ по п.16, в котором указанный глатирамера ацетат имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне 5000-9000 дальтон и в котором указанный глатирамера ацетат используют для приготовления фармацевтической композиции либо в виде лиофилизированного твердого вещества или в виде водного раствора, содержащих глатирамера ацетата в диапазоне концентраций около 25-45 мг/мл.
18. Способ по п.13, в котором глатирамера ацетат дополнительно охарактеризован пептидным картированием с использованием трипсина и карбоксипептидазы В.
19. Способ для определения характеристик глатирамера ацетата пептидным картированием с использованием трипсина и карбоксипептидазы B, содержащий стадии:
a) ферментативную обработку глатирамера ацетата с использованием трипсина, чтобы получить пептидные фрагменты с короткой длиной цепи;
b) обработку пептидных фрагментов, полученных на стадии а) карбоксипептидазой B, приводящей к дополнительной фрагментации пептидной цепи;
c) отделение и анализ пептидных фрагментов, полученных на стадии b), с использованием методики ВЭЖХ, чтобы получить хроматограмму;
d) сравнение полученной таким образом хроматограммы с хроматограммой образца для сравнения, чтобы определить структурное сходство.
20. Способ по п.19, в котором указанный образец для сравнения представляет собой Копаксон (продаваемый состав).