Способ получения биопрепаратов живых микроорганизмов с продленным сроком сохранения высокого титра жизнеспособных клеток путём иммобилизации в гели на основе силанольных производных гуминовых веществ
METHOD FOR OBTAINING BIOLOGICAL PRODUCTS OF LIVING MICROORGANISMS WITH AN EXTENDED PERIOD OF PRESERVATION OF A HIGH TITER OF VIABLE CELLS BY IMMOBILIZATION IN GELS BASED ON SILANOL DERIVATIVES OF HUMIC SUBSTANCES

Изобретение относится к области биотехнологий, в которых используются культуры живых микроорганизмов, например, биотехнологий очистки природных и техногенных объектов от загрязнений, а также пищевых биотехнологий. Более конкретно, изобретение может быть применено для стабилизации биопрепаратов, содержащих живые микроорганизмы, с целью продления сроков поддержания высокого титра живых микроорганизмов и высоких технологических свойств соответствующих биопрепаратов.
8
6-8
Для эффективного применения биопрепаратов, содержащих живые микроорганизмы, важно, чтобы концентрация жизнеспособных клеток была на уровне, достаточном для проявления целевых технологических свойств. Так, для очистки объектов окружающей среды от нефтепродуктов, биопрепараты должны иметь концентрацию углеводородокисляющих бактерий (УОБ), не ниже 10 клеток/г (RU2618699C1; Руководство…, 2018), а для реализации продуктом пробиотических свойств в нем должно содержаться клеток пробиотических бактерий не менее 10 КОЕ/мл в зависимости от типа микроорганизмов и цели их применения (Minelli, Benini, 2008).
Поскольку индивидуальные организмы не могут существовать вечно, при использовании живых микроорганизмов важно замедлить их отмирание. Для этого используют различные способы, например, высушивание препаратов, хранение при низких температурах (Сидякина, 1985), что наиболее эффективно, но удорожает стоимость и усложняет технологических процесс получения биопрепаратов. Распространенным способом сохранения микроорганизмов является иммобилизация - фиксация клеток на или в носителе с помощью физических или химических сил. Основными типами иммобилизации являются включение клеток в вещество, как правило – в гель, или прикрепление к твердой поверхности (Ефременко, 2018). Включение в плотные гели используют, когда целевым продуктом является какой-либо метаболит клеток (аминокислоты, глюкозно-фруктозные сиропы и др.), и необходимо использовать высокие объёмные концентрации клеток. Для технологий, требующих введения микроорганизмов, которые должны начать размножаться и распространяться в среде применения, важно, чтобы клетки могли покидать носитель – путем десорбции с поверхности или разрушения носителя. Например, необходимо, чтобы бактерии легко покидали носитель и равномерно распределялись по объему при биоремедиации почв и вод, при использовании в качестве заквасок при силосовании, в пищевых продуктах.
Из уровня развития техники известен способ хранения микроорганизмов, заключающийся в выращивании микроорганизмов с их последующей иммобилизацией на синтетических волокнах из капрона, полипропилена, лавсана или других (Патент РФ № 2008348). Недостатком такого способа является трудность применения суспензий таких препаратов для обработки больших объектов.
Известно множество способов иммобилизации пробиотических культур микроорганизмов в гелях (Mitropoulouet G. et all., 2013). Наиболее распространенным веществом-основой гелей является альгинат, который образует гели с достаточной плотностью и прочностью. В биотехнологиях получения различных продуктов микробного метаболизма наиболее часто используют гели из альгината и поливинилового спирта (Ефременко, 2018). Однако, при необходимости высвободить клетки перед использованием биопрепарата, эти полимеры сложно использовать по причине их прочности. Поэтому мы обратили внимание на гели, которые легко разрушаются перед или в процессе использования.
Известен способ получения геля на основе водорастворимых силанольных производных гуминовых веществ (СПГВ) (патент RU 2530024), которые модифицированы таким образом, что способны прочно сорбироваться на минеральных или органических гидроксилсодержащих веществах. Согласно способу щелочной раствор гуматов титруют неорганической кислотой до рН 3-7, после чего добавляют аминоорганосилан, выдерживают при определенной температуре, удаляют воду и используют для получения пленок. Данный способ был выбран нами как прототип по причине водорастворимости полученных композитных полимеров из СПГВ, известного свойств гуматов быть почвенными мелиорантами (Дагуров с соавт., 2005) и биологически активными добавками (RU2259147C2), а также способности гуматов повышать количество жизнеспособных бактерий при длительном хранении (Николаев с соавт., 2020). В результате модификации способа-прототипа были внесены такие изменения: использована органическая кислота (уксусная) для подкисления среды, что внесло в среду источник питания для микроорганизмов; в качестве поверхности для прикрепления геля использована поверхность живых клеток, содержащих ОН-группы, что необходимо для прикрепления геля и, одновременно – для иммобилизации микроорганизмов в нём; полученный гель использовали непосредственно в среде получения (без удаления воды) как матрицу, включающую живые бактерии разных видов.
Техническим результатом предлагаемого решения является получение нового носителя живых микроорганизмов, способного растворятся в водных средах, обеспечивающего поддержание высокого титра жизнеспособных клеток, что обусловливает повышение сроков сохранности биопрепаратов, предназначенных для хранения без дополнительного охлаждения, относительная простота получения, а также присутствие в биопрепарате веществ с дополнительными полезными технологическими и потребительскими свойствами - гуматов.
Предлагаемый способ получения иммобилизованных препаратов живых микроорганизмов включает стадию выращивания микроорганизмов, стадию приготовления геля из щёлочного растворов гуминовых веществ (ГВ) и 3-аминопропилтриалкоксисилана (АПТС) путем титрования раствором уксусной кислоты до значения рН, близкого к нейтральному, с последующим добавлением АПТС,  стадию смешения суспензии бактерий и геля, стадию выдерживании в течение нескольких часов до загустения геля. Полученный гель может храниться в течение нескольких месяцев, при этом в нем сохраняется высокий титр жизнеспособных бактерий. Перед использованием гель растворяют в водной среде и используют как источник бактерий.
В соответствии с предлагаемым способом для получения геля на основе водорастворимых силанольных производных гуминовых веществ (СПГВ) могут быть использованы различные препараты гуминовых веществ.
В соответствии с предлагаемым способом для получения СПГВ могут быть использованы аминоорганосиланы, предпочтительно, но не исключительно 3-аминопропилтриалкоксисилан.
В соответствии с предлагаемым способом для получения СПГВ могут быть использованы органические кислоты, предпочтительно, но не исключительно, уксусная кислота.
В соответствии с предлагаемым способом могут быть использованы грамположительные и грамотрицательные бактерии разных физиологических групп – например, аэробные хемоорганотрофные углеводородокисляющие бактерии и аэротолерантные молочнокислые бактерии, выращенные на оптимальных для них средах до стационарной фазы роста.
В соответствии с предлагаемым способом раствор ГВ 10-15% доводится кислотой до рН 6-7 в зависимости от свойств бактерий, к нему добавляется 2.5-5% АПТС, или рН доводится в смеси ГВ и АПТС, после чего к нейтрализованной смеси добавляется суспензия бактерий в количестве 0.4-0.5 от объема полученного раствора СПГВ и оставляется на несколько часов до загустения геля.
Полученные препараты могут храниться при условиях окружающей среды в течение нескольких месяцев и перед использованием растворяться в водных средах в необходимой пропорции.
Указанная выше совокупность признаков, включённая в три независимых пункта формулы, не известна из уровня техники. В объёме вышеуказанной совокупности признаков достигается заявленный технический результат, подтверждённый ниже.  Ни в научно-технической, ни в патентной литературе не обнаружены сведения о возможном  влиянии отличительных признаков независимых пунктов формулы (получение гелей на основе силанольных производных гуминовых веществ с применением органических кислот, введение живых микроорганизмов в такие гели в качестве твердой поверхности для прикрепления геля, использование этих гелей для продления жизнеспособности микроорганизмов) на технический результат, достигаемый при осуществлении заявленного способа.
На фиг. 1 приведён вид геля на основе СПГВ (из гумата Powhumus) после затвердения.
На фиг. 2 представлено содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) A.seifertii, иммобилизованных в гель на основе гумата Powhumus в течение 7 месяцев инкубации, где К – контрольная культура, Оп – культура в геле (опыт).
На фиг. 3 представлено содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) P.aeruginosa, иммобилизованных в гель на основе гумата Байкал в течение 3.5 месяцев инкубации (опыт) в сравнении с контролем.
На фиг. 4 представлено содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) E.faecium, иммобилизованных в гель на основе гумата Байкал в течение 28 cут инкубации (опыт) в сравнении с контролем.
На фиг. 5 представлена морфология клеток P.aeruginosa возраста 24 ч (А), 2 месяца (Б) и 2 месяца в геле на основе гумата Байкал (В). А и Б – фазовый контраст, В – окраска ДАПИ, инверсия (негатив).
2
На фиг. 6 представлены скорости дыхания (накопления СО) в культурах P.aeruginosa (А) и A.seifertii (Б) разных возрастов и при хранении в геле на основе гумата Байкал.
При создании нами предлагаемого инновационного способа стабилизации биопрепаратов (т.е. длительного поддержания высокого титра жизнеспособных клеток микроорганизмов) исходили из нескольких предпосылок: микроорганизмы, иммобилизованные в гели, обладают повышенной стрессоустойчивостью и выживаемостью по причине нахождения в состоянии, близком или идентичном к биопленочному фенотипу (Ефременко, 2018; Z’ur et al., 2016), и по этой причине остановились на гелевых биокомпозитах. Полученный гель должен быть легко растворим в водных средах перед использованием. Технология получения геля должна быть относительно простой, предпочтительно, в одном реакторе. Компоненты геля должны быть доступны, дешевы и, желательно, обладать дополнительными полезными свойствами.
Сущность способа и его техническая реализуемость иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1.
Получение геля СПГВ при использовании гумата калия и натрия, получаемого из леонардита, Powhumus (Humintech, Германия)
В качестве органосилана использовали  3-аминопропилтриэтоксисилан (АПТС) (препарат «АГМ-9», ООО «Пента 91», Россия) 1-1.5 г гумата растирали в ступке и растворяли в 10 мл дистиллированной воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, отделяли нерастворившуюся фракцию центрифугированием (5000 g, 5 минут), супернатант переливали в стакан и добавляли 0.3-0.5 мл АПТЭС при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, после чего титровали раствором  ледяной уксусной кислоты до рН 6-7. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре. В течение 2-12 часов происходило загустевание (желирование) реакционной смеси. Полученный гель был однородным, обладал умеренными прочностными свойствами – не вытекал из пробирок при их переворачивании (фиг. 1), сохранял свои свойства в течение нескольких месяцев, при добавлении воды и интенсивном перемешивании растворялся.
Пример 2.
Получение геля СПГВ при использовании гумата калия и натрия, получаемого из бурого угля, Байкал («АгроТехГумат», РФ)
В качестве органосилана использовали  АПТС того же производителя, что в примере 1. 10-15 г гумата растворяли в 100 мл дистиллированной воде при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, доводили рН до значения 6-7 ледяной уксусной кислотой, добавляли 5-10 мл водного раствора АПТЭС (50%) с рН 6-7, доведенного ледяной уксусной кислотой. Полученную смесь оставляли при комнатной температуре, в течение 2-12 часов происходило загустевание (желирование) реакционной смеси. Полученный гель был однородным, обладал умеренными прочностными свойствами – не вытекал из пробирок объёмом 20 мл при их переворачивании, сохранял свои свойства в течение нескольких месяцев, при добавлении воды и интенсивном перемешивании растворялся.
Приведенные примеры 1 и 2 доказывает техническую реализуемость предлагаемого способа получения гелей на основе СПГВ с использованием разных препаратов гуматов, уксусной кислоты и способов смешения с АПТС и способов титрования.
Пример 3. Хранение культур углеводородокисляющих бактерий и дрожжей в гелях СПГВ на основе гумата Powhumus
Культуры углеводородокисляющих бактерий (Грамположительной Rhodococcus erythropolis, Грамотрицательных Acinetobacter seifertii и Pseudomonas aeruginosa) и одного дрожжевого организма (Yarrovia lypolytica)  выращивали на среде LB до стационарной фазы роста, после чего смешивали со свежеполученным гелем на основе гумата Powhumus в пропорции 3 мл культуры и 7 мл геля, разливали по пробиркам типа Эппендорф (по 1 мл) или типа Фалькон объёмом 15 мл (5 мл геля) и хранили в течение нескольких месяцев, после чего ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе и определяли титр жизнеспособных клеток (КОЕ).
8
На фиг. 2 представлены кривые содержания жизнеспособных клеток A.seifertii, иммобилизованных в гель СПГВ на основе гумата Powhumus в течение 7 месяцев инкубации. Контрольная культура этой бактерии быстро отмирала и через 1 мес количество жизнеспособных клеток было ниже значения 10 КОЕ/мл. Клетки, включенные в силанольно-гуминовый гель в течение первого месяца продолжали размножаться, их титр вырос в несколько раз, после чего они стали отмирать со скоростью в 5 раз меньшей, чем в контроле. Через 4-7 мес хранения титр КОЕ в опытном варианте был в 150-40 раз выше, чем контрольном.
Для других культур были получены аналогичные кривые содержания КОЕ от времени в опытных и контрольных вариантах. Во всех случаях через несколько месяцев хранения титр КОЕ в опытных вариантах был выше, чем в контроле на 1-2 порядка (таблица 1).
Таблица 1. Превышение титра жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) культур R. erythropolis, A. seifertii,  P. aeruginosa и Y. lypolytica в опытном варианте над контрольным через 4 месяца хранения.
Микроорганизм
Отношения КОЕОпыт/контроль
R. erythropolis
11
A. seifertii
150
P. aeruginosa
11
Y. lypolytica
8
Пример 4. Хранение культур углеводородокисляющих бактерий в гелях СПГВ на основе гумата Байкал
Для одной из углеводородокисляющих бактерий, P.aeruginosa, было исследовано хранение в течение 3.5 мес при иммобилизации в гель на основе другого гумата, Байкал. На фиг. 3 представлены кривые титра КОЕ в контрольном варианте и при включении клеток в гель на основе 10%-ного содержания гумата. Для геля на основе 15%-ного содержания гуматов данные аналогичны и не представлены. Из фигуры 3 ясно видно, что включение в гель предотвращает отмирание клеток в течение 2 месяцев, приводит к росту числа живых клеток в 1.5 раза, тогда как за это же время в контроле титр КОЕ снизился в 40 раз.
Пример 5. Хранение культур молочнокислых бактерий в гелях СПГВ
о
Молочнокислые бактерии являются группой бактерий, важных для медицины, пищевой промышленности и биотехнологий, которая характеризуется высокими скоростями отмирания, поэтому на этой группе бактерий также было испытано хранение в гелях СПГВ. Молочнокислую бактерию Enterococcus faecium выращивали на молоке при 30С и хранили в течение 4х недель при комнатной температуре в колбах в стационарных условиях (контроль) или помещали в гель на основе гуматов Powhumus или Байкал.
На Фиг. 4 видно, что в течение 4х недель хранения титр жизнеспособных клеток снижался в контроле почти на 4 порядка. Включение в гель на основе гумата Powhumus замедляло отмирание, что обусловило превышение титра жизнеспособных клеток над контрольным вариантов в 30 раз через 4 недели хранения. Иммобилизация клеток в гель на основе гумата Байкал была менее эффективной – превышение титра КОЕ в опыте над контролем составило 6 раз, что связано с разнокачественностью препаратов гуматов, и что необходимостью учитывать при разработке способов стабилизации биопрепаратов.
Приведенные примеры №№ 3-5 доказывают техническую реализуемость предлагаемого способа хранения всех испытанных бактерий в силанольно-гуминовых гелях и высокую эффективность этого способа по поддержанию жизнеспособности клеток различных микроорганизмов в течение длительного времени.
Пример 6. Определение состояния культур бактерий, стабилизированных с применением гелей СПГВ на основе гумата Байкал, после 2 месяцев хранения
Полученные в примерах 3 и 4 результаты продемонстрировали, что клетки бактерий, включенные в гели СПГВ, в течение некоторого времени могут размножаться, что может быть обусловлено тем, что в составе гелей присутствуют органические вещества, которые могут потребляться микроорганизмами и служить источниками энергии и углерода - уксусная кислота, добавляемая как титрант (до 1.5 г/л) и этанол, образующийся в реакции этерификации (до 0.5 г/л).
О физиологическом состоянии клеток судили по двум показателям – дыхательной активности и внешнему виду культур, определяемому микроскопически.
о
Культуры P.aeruginosa и A.seifertii после 2 мес хранения в геле на основе гумата Байкал (10%) переносили в среду Раймонда без источников углерода (5% по объёму)  и инкубировали на качалке при 30С в течение 24 ч. Дыхание клеток инициировалось нагреванием и поступлением кислорода. Метаболическую активность клеток оценивали по повышению концентрации  углекислого газа в культуральной среде, что определяли путем переноса 1 мл среды в герметично закрытые флаконы (V=18 мл) с 0.2 мл фосфорной кислоты с использованием газового хроматографа Кристалл 5000 (РФ).
Микроскопические исследования проводили с использованием фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager M2, Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия. Использовали флюоресцентный краситель ДАПИ (DAPI).
После двух месяцев пребывания в геле на основе гумата Байкал культура P.aeruginosa выглядела как растущая активная – в ней доминировали удлиненные клетки, отсутствовали лизированные и разрушенные клетки (фиг. 5). Длина клеток в геле (фиг. 5 В) превосходила среднюю длину клеток активной молодой культуры (фиг. 5 А). При этом в контрольной 2-месячной культуре клетки характеризуются укороченными размерами, меньшей рефрактерностью и меньшим количеством (Фиг. 5 Б). Низкая рефрактерность является признаком лизированных или разрушенных клеток. Для A.seifertii данные аналогичны и не представлены.
Обе 2-месячные культуры, хранившиеся в геле, обнаружили более высокие скорости дыхания без добавления источника углерода, чем оба контроля, как 2-суточные, так и 2-месячной культуры (фиг. 6). Отметим, что дыхание культур могло происходить только за счет наличия эндогенных источников углерода – остатков питательной среды для молодой культуры, автолизатов клеток для старых культур, а при наличии геля – также и ацетата и этанола. Скорость дыхания культуры P.aeruginosa с гелем превышала контрольные в 2-3 раза, а A.seifertii – в 1.2-1.7 раза, что отражает выявленную микроскопически и по титру КОЕ большую сохранность культур в геле на основе гумата Байкал по сравнению с контрольной культурой.
Приведенный пример иллюстрирует механизм эффективного поддержания количества жизнеспособных клеток в культурах бактерий в гелях СПГВ при длительном хранении  – путем поддержания их в активном метаболическом состоянии, что позволяет применять такой способ хранения для широкого круга микроорганизмов.
Цитированные источники
1. Иммобилизованные клетки: биокатализаторы и процессы. Под ред. Е.Н. Ефременко. М. Риор, 2018.
2. Żur J., Wojcieszyńska D., Guzik U. Metabolic Responses of Bacterial Cells to Immobilization  Molecules. 2016 Jul; 21(7): 958.
3. Minelli E.B., Benini A. Relationship between number of bacteria and their probiotic effects // Microb. Ecol. Health Dis. 2008. V. 20. P. 180–183.
4. Руководство по проведению биологической очистки почвы,  загрязненной нефтепродуктами, в Арктических условиях. ООО «НАВЭКОСЕРВИС», 2018.  http://archive.iwlearn.net/npaarctic.iwlearn.org/Documents/demos/new/bioremed_guide.pdf
5. Mitropoulouet G., Nedovic V., Goyal A., Kourkoutas Y. Immobilization Technologies in Probiotic Food Production Journal of Nutrition and Metabolism. V. 2013, Article ID 716861| https://doi.org/10.1155/2013/716861
6. Перминова И.В., Пономаренко С.А., Воликов А.Б. Патент RU 2530024, 2014 г, Гуминовые силанольные производные, способ их получения и применения.
7. Сидякина Т. М. Консервация микроорганизмов, Пущино, 1985.
8. Дагуров А.В. Стом Д.И., Вятчина О.Ф., Балаян А.Э., Кушнарев Д.Ф. О механизме антидотного действия гуматов по отношению к нефтепродуктам. // ACTA BIOMEDICA SCIENTIFICA 2005 Т. 6. № 44. С. 143-145.
9. Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Демкина Е.В., Атрощик Е.А., Константинов А.И., Перминова И.В., Эль-Регистан Г.И. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ В ПРОЛОНГИРОВАНИИ ВЫЖИВАНИЯ ПОПУЛЯЦИИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ БАКТЕРИИ ACINETOBACTER JUNII // Микробиология. 2020. Т. 89. № 1. С. 74-87.