НОВЫЕ ШТАММЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NOVEL LACTOBACILLUS STRAINS AND USES THEREOF

Область техники
Изобретение относится к новым штаммам Lactobacillus и их применениям, в частности для консервации продуктов питания, корма для животных, фармацевтических составов и/или косметических составов.
Уровень техники и предпосылки создания изобретения
Продукты питания и корм для животных, благодаря составу питательных веществ, являются хорошими субстратами для микроорганизмов. Аналогичные соображения касаются фармацевтических и косметических составов, так как в них часто содержатся галеновые препараты или носители и вспомогательные вещества. Многие из этих микроорганизмов, в частности грибы, являются одной из наиболее частых причин порчи продуктов питания и корма для животных, а также фармацевтических или косметических составов. Особо опасными являются, главным образом, образуемые микроорганизмами токсичные и канцерогенные микотоксины, которые опасны для здоровья людей. Помимо этого, порча продуктов питания ежегодно имеет серьезные экономические последствия. Считается, что каждый день из-за бактериальной порчи уничтожается приблизительно 5-10% продуктов питания.
Чтобы избежать порчи, например, продуктов питания и корма для животных, их делают более долговечными посредством обработки химическими или биологическими консервантами или посредством добавления таких консервантов. В особенности увеличивается спрос на биологические консерванты, так как многие потребители стремятся избегать химических консервантов.
К таким биологическим консервантам относятся, например, молочнокислые бактерии. Эти бактерии обычно безвредны для человека и традиционно в течение веков используются для консервации продуктов питания. Их безопасность и безвредность определяется так называемым GRAS-статусом (в целом признан безопасным) американского FDA (Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств). Кроме того, во многих продуктах питания естественным образом уже присутствуют молочнокислые бактерии.
Механизм биоконсервации может быть обусловлен либо конкурентным ростом, либо биосинтезом антагонистических или антибактериальных метаболитов. В основном, консервирующее действие молочнокислых бактерий является следствием образования органических кислот, таких как молочная кислота. Благодаря этому, уменьшается величина pH, что ингибирует рост многих микроорганизмов.
Кроме молочной кислоты, имеется ряд других метаболитов, таких как уксусная кислота, перекись водорода, диацетил, реутерин и так называемые бактериоцины, которые играют важную роль в консервации продуктов питания и корма для животных.
Некоторые из этих метаболитов, такие как уксусная кислота и реутерин, ингибируют рост бактерий и грибов, некоторые вещества, такие как бактериоцины, ингибируют только рост бактерий, а другие вещества действуют только против грибов. В процессе исследований, касающихся противогрибковой активности молочнокислых бактерий, были идентифицированы многочисленные ингибирующие вещества: капроновая, пропионовая, масляная, уксусная, муравьиная и валериановая кислоты (Corsetti, A.G., Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1, Applied Microbiology and Biotechnology (50), pp. 253-256, (1998)), метилгидантоин и мевалонолактон (Niku-Paavola, M.L., New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum, Journal of Applied Microbiology (86), pp. 29-35, (1999)), различные жирные гидроксикислоты (Sjögren, J.M., Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14, Applied and Environmental Microbiology (69), pp. 7554-7557, (2003)), 3-фенилмолочная кислота (Lavermicocca, P.V., Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B, Applied and Environmental Microbiology (66), pp. 4084-90, (2000)) и дикетопиперазины (Niku-Paavola, см. выше). Однако некоторые белковые компоненты с противогрибковой активностью не смогли идентифицировать (Magnusson, J., Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound, Applied and Environmental Microbiology (67), pp. 1-5, (2001)).
В то время как многие метаболиты образуются во время роста клеток молочнокислых бактерий, известно, что другие образуются только после индукции. Этот механизм в целом назван аутоиндукция или "чувство кворума". Данный эффект уже известен для некоторых бактериоцинов, таких как продуцируемые Carnobacterium piscicola (Kleerebezem, М.К., A two-component signal transduction cascade in Carnobacterium piscicola LV17B: two signaling peptides and one sensor-transmitter, Peptides (22), pp. 1597-1601, (2003)), Lactobacillus sakei (Diep, D.B., The synthesis of the bacteriocin sakacin A is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system, Microbiology (146), pp. 2155-2160, (2000)), Lactobacillus plantarum (Maldonado, A.J. - D., Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture with Specific Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism, J. Bacteriol., 5 (186), pp.1556-1564 (2003)) и Enteroccoccus faecium (Nilsen, T.I., An exported inducer peptide regulates bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492, J. Bacteriol. (180), pp. 1848-1854, (1998)).
Бактерии видов Burkholderia и Pseudomonas, однако, не имеют GRAS-статуса и поэтому не могут использоваться в продуктах питания или корме для животных.
Patra Falguni и др. ("Productions of proteinaceous antifungal substances form Lactobacillus brevis NDCD 02", International Journal of Dairy Technology vol. 63, No. 1, 1 February 2010, pages 70-76) описали штамм Lactobacillus brevis, обладающий широким противогрибковым спектром действия, который может использоваться как эффективный биоконсервант и незаквасочные LAB (молочнокислые бактерии) в продуктах питания. Основным недостатком этого штамма является то, что для продуцирования противогрибковых веществ он нуждается в богатой питательными веществами среде. Например, в обезжиренном молоке продуцирование противогрибковых веществ было незначительным. Следовательно, данный штамм Lactobacillus brevis не подходит для использования в качестве пищевого консерванта в молочных продуктах.
В ЕР 2543246 раскрыто противогрибковое действие жизнеспособных бактерий штамма Lactobacillus plantarum против Penicillium и Aspergillus в покрытии сыра. Следовательно, противогрибковое действие имело место в аэробных условиях. Противогрибковое действие в анаэробных условиях не было показано. Но для использования в качестве пищевого консерванта в молочных продуктах, важно, чтобы противогрибковое действие имело место при аэробных и анаэробных условиях.
Принимая во внимание данный уровень техники, было бы желательно иметь GRAS-признанные микроорганизмы, которые образуют противогрибковые метаболиты, ингибируют рост грибов и, следовательно, могут использоваться в качестве консервантов без ограничений и недостатков современного уровня техники.
Техническая цель изобретения
Таким образом, технической целью изобретения является обеспечение микроорганизмами, которые ингибируют рост грибов и могут использоваться в продуктах питания, корме для животных, фармацевтических и/или косметических составах.
Общая характеристика изобретения и предпочтительные варианты
Указанная проблема решается с помощью признаков независимых пунктов формулы изобретения. Предпочтительные варианты настоящего изобретения представлены зависимыми пунктами формулы изобретения.
Для достижения данной технической цели в изобретении предложен микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, или его фрагмент для использования в качестве пищевого консерванта, причем молочнокислая бактерия является гетероферментативной молочнокислой бактерией и ингибирует рост по меньшей мере одного грибного организма.
С таксонометрической точки зрения, молочнокислые бактерии делятся на подгруппы Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus и Lactococcus. Предпочтительно, микроорганизм по настоящему изобретению является видом Lactobacillus. У представителей группы молочнокислых бактерий обычно отсутствуют порфирины и цитохромы, не происходит фосфорилирование с переносом электронов и, поэтому, они получают энергию только посредством субстратного фосфорилирования. То есть АТФ молочнокислых бактерий синтезируется в результате ферментации углеводов. Все молочнокислые бактерии растут в анаэробных условиях, однако, в отличие от многих анаэробов, большинство молочнокислых бактерий нечувствительны к кислороду и поэтому могут расти в его присутствии так же, как и при его отсутствии. Соответственно, бактерии по настоящему изобретению предпочтительно являются аэротолерантными анаэробными молочнокислыми бактериями, принадлежащими к роду Lactobacillus.
Способность расти в анаэробных условиях является главным преимуществом, по сравнению со штаммами, известными в настоящее время. Поэтому, теперь возможно использовать молочнокислые бактерии по настоящему изобретению в качестве пищевого консерванта не только в покрытии молочных продуктов, но также в самих продуктах, таких как молоко, йогурт или домашний сыр.
Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению не нуждаются в какой-либо специальной питательной среде для проявления противогрибковой активности. Эксперименты показали, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению также способны ингибировать рост по меньшей мере одного грибного организма в обезжиренном молоке. Следовательно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться в молочных продуктах различного вида без добавления каких-либо дополнительных питательных веществ, что было бы препятствием для использования в качестве пищевого консерванта. Благодаря этому факту микроорганизм по настоящему изобретению намного лучше по сравнению с известными микроорганизмами, в частности описанными Patra Falguni и др.
Микроорганизм, принадлежащей к группе молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно имеет палочковидную форму, варьирующуюся от длинной и тонкой до короткой изогнутой палочки, кроме того, он предпочтительно является неподвижным и/или неспорообразующим. Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению расположены поодиночке или попарно. Они предпочтительно продуцируют молочную кислоту как основной или единственный продукт ферментативного метаболизма. Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению продуцируют молочную кислоту, предпочтительно DL-изомер молочной кислоты в количестве по меньшей мере 50% от глюкозы посредством пентозофосфатного пути. Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут также продуцировать диоксид углерода и этанол. Предпочтительно, рост молочнокислых бактерий при температурах 15 или 45°C различен. Кроме того, предпочтительно, они содержат глицеринтейхоевую кислоту в клеточной стенке.
На основании вышеуказанных характеристик, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению можно классифицировать как принадлежащие к роду Lactobacillus. С помощью классических систематик, например, со ссылкой на соответствующее описание в "Определителе бактерий Берджи" (Williams & Wilkins Co., 1984), можно определить, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению принадлежат к роду Lactobacillus. Кроме того, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению можно классифицировать как принадлежащие к роду Lactobacillus с помощью известных способов, например, по характерным признакам их метаболизма, то есть посредством сравнительного анализа способности микроорганизма(ов) по настоящему изобретению метаболизировать сахара, или другими способами, описанными, например, в Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467 or Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501. Микроорганизмы no настоящему изобретению способны к метаболизированию источников Сахаров, которые являются обычными и известными для микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus. В предпочтительном варианте, однако, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению имеет характерные признаки метаболизма, выбранные из группы, состоящей из:
(i) она метаболизирует D-лактозу, но не метаболизирует L-сорбозу и/или D-сахарозу и/или D-инулин,
(ii) она метаболизирует инулин,
(iii) она метаболизирует L-сорбозу, но не метаболизирует D-лактозу и/или D-сахарозу и/или инулин, и
(iv) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу и инулин.
Предпочтительно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению имеет характерные признаки метаболизма, выбранные из группы, состоящей из:
(i) она метаболизирует D-лактозу, но не метаболизирует L-сорбозу, D-сахарозу и инулин,
(ii) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу и инулин, но не метаболизирует D-сахарозу,
(iii) она метаболизирует L-сорбозу, но не метаболизирует D-лактозу, D-сахарозу и инулин, и
(iv) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу, D-сахарозу, но не метаболизирует инулин.
Конечно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению не ограничивается метаболизированием Сахаров, указанных в вышеприведенном наборе характерных признаков метаболизма, а может обладать способностью метаболизировать другие сахара, которые обычно метаболизируются видами Lactobacillus.
Принадлежность микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus можно также определить с помощью других известных способов, например, с помощью электрофореза в геле SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) общего белка определяемых видов, и сравнения их с известными и уже охарактеризованными штаммами рода Lactobacillus. Способы получения профиля общего белка, как указано выше, а также численный анализ таких профилей хорошо известны специалистам. Однако, результаты достоверны только в случаях, когда каждая стадия процесса полностью стандартизирована. В связи с требованием обеспечения точности при определении принадлежности микроорганизма к роду Lactobacillus, стандартизованные процедуры регулярно представляются сведению публики их авторами, такими как Pot и др., как например представленные во время "семинара", организованного Европейским союзом в Гентском университете в Бельгии 12-16 сентября 1994 г. (Способы "отпечатков пальцев" для классификации и идентификации бактерий, SDS-PAGE общего клеточного белка). Программное обеспечение, используемое для анализа электрофореза в геле SDS-PAGE, имеет большое значение, так как степень корреляции между видами зависит от параметров и алгоритмов, используемых в данном программном обеспечении. Не вдаваясь в теоретические подробности, количественное сравнение зон, измеренных денситометром и нормализованных посредством компьютера, предпочтительно осуществляют с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Полученную таким образом матрицу подобия можно преобразовать с помощью алгоритма UPGMA (метод попарного невзвешенного среднего), который позволяет не только сгруппировать вместе наиболее сходные профили, но также построить дендрограмму (см. Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A.G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985).
Альтернативно, принадлежность указанных микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus можно определить в отношении рибосомной РНК в так называемом Riboprinter.RTM. Более предпочтительно, принадлежность вновь идентифицируемых видов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus подтверждена посредством сравнения нуклеотидной последовательности рибосомной 16S РНК бактерий по настоящему изобретению или их геномной ДНК, которая кодирует рибосомную 16S РНК, с последовательностями других известных в настоящее время родов и видов молочнокислых бактерий. Другой предпочтительной альтернативой для определения принадлежности вновь идентифицируемых видов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus является использование видоспецифичных PCR-праймеров (PCR-полимеразная цепная реакция), которые нацелены на спейсерную область 16S-23S рРНК. Другой предпочтительной альтернативой является RAPD-PCR (PCR с произвольно амплифицируемой полиморфной ДНК) (Nigatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001), в результате которой получают штаммоспецифическую ДНК-последовательность, которая позволяет определить принадлежность идентифицируемых микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus. Другими способами, которые могут использоваться для определения принадлежности микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus, являются полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) (Giraffa et al., Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172), определение "отпечатков пальцев" повторяющихся элементов (Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36) или анализ набора метиловых эфиров жирных кислот (FAME) бактериальных клеток (Heyrman et al., FEMS Microbial. Lett. 181 (1991), 55-62). Кроме того, лактобактерии можно определять посредством определения типа лектинов (Annuk et al., J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074) или посредством анализа белков клеточной стенки (Gatti et al., Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348).
Особенно предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к выделенной молочнокислой бактерии или ее фрагменту, полученной способом, включающим в себя:
a) обеспечение субстрата,
b) обеспечение препарата, содержащего исследуемые молочнокислые бактерии,
c) добавление препарата, содержащего молочнокислые бактерии, к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
d) добавление заданного количества спор грибов к продукту стадии с),
e) инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии d), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
f) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов,
g) выделение по меньшей мере одной молочнокислой бактерии.
Если рост грибов не наблюдается, то молочнокислая бактерия является молочнокислой бактерией по настоящему изобретению. Поэтому, предпочтительно, чтобы стадия g) осуществлялась, когда рост грибов не наблюдается.
Кроме того, если по сравнению с контрольным анализируемым образцом, для которого пропущена стадия с), наблюдается уменьшенный рост грибов, то молочнокислая бактерия также является видом по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, выражение "уменьшенный" означает уменьшение роста грибов по меньшей мере на 20%, лучше по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 90%.
Также предпочтительно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению характеризуется тем, что ее можно определить в соответствии со следующими стадиями:
A) обеспечивают субстрат,
B) обеспечивают препарат, содержащий исследуемые молочнокислые бактерии,
C) препарат, содержащий молочнокислые бактерии, добавляют к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
D) продукт стадии С) помещают в емкости для образцов, в которых формируют анализируемые образцы,
E) по меньшей мере к одному анализируемому образцу добавляют заданное количество спор грибов,
F) осуществляют инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии Е), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
G) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов. Предпочтительно, рост грибов определяют посредством съемки фотоаппаратом или
визуального осмотра анализируемого образца после стадии F) и оценки роста грибов.
Если рост грибов не наблюдается, то молочнокислая бактерия является молочнокислой бактерией по настоящему изобретению. Кроме того, если по сравнению с анализируемым контрольным образцом, для которого пропущена стадия С), наблюдается уменьшенный рост грибов, то молочнокислая бактерия также является видом по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, выражение "уменьшенный" означает уменьшение роста грибов по меньшей мере на 20%, лучше по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 90%. Количественное определение можно проводить с помощью фотосъемки при заданной настройке контраста и автоматического подсчета пикселей, относящихся к покрытой грибами поверхности, при этом находится отношение количества пикселей, относящихся к покрытой грибами поверхности, к общему количеству пикселей фотоснимка анализируемого образца. Фотоснимок предпочтительно должен быть черно-белым. В некоторых случаях может оказаться полезным окрашивание субстрата темным пигментом или красителем (который предпочтительно является микробиологически инертным), чтобы увеличить контраст грибов на субстрате, например, если субстратом является йогуртовый субстрат белого цвета и у грибов также белый цвет. В частности, анализ образцов можно проводить так, как изложено в примере 1.2, последний абзац. В качестве фотоаппарата можно использовать систему FluorChem FC2 Imaging System (Alpha Innotech/Cell Biosciences), Santa Clara, USA) со следующими настройками: время экспозиции: 100-150 мс, диафрагма: 8, настройки контраста: уровень черного: 55000, уровень белого: 60000, гамма (коэффициент контрастности): 3,0, настройки освещения: проходящий свет "включено", отраженный свет "включено", автоматическая регулировка контраста (chemi display): "включено", скорость/разрешение: нормальная/ультра. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения AlphaEaseFC.
В качестве альтернативного или дополнительного контрольного образца может использоваться образец, в который на стадии с), в отличие от вышеописанной стадии с), добавляют сорбат калия в заданном количестве, которое обычно используется в области консервации продуктов питания (например 0,2 мг на грамм). Данный контрольный образец затем может служить в качестве эталона, то есть молочнокислые бактерии по настоящему изобретению влияют на ингибирование роста грибов по меньшей мере в той же степени, что и данный контрольный образец.
Клетки являются жизнеспособными, если они удовлетворяют требованиям теста на жизнеспособность DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) GmbH, Braunschweig, Germany, при совместном культивировании в предусмотренных случаях с соответствующим субстратом, к которому клетки должны добавляться или на который они должны наноситься.
Предпочтительно, молочнокислая бактерия является живой молочнокислой бактерией. Неожиданностью было то, что живой микроорганизм по настоящему изобретению проявлял сильную противогрибковую активность, не оказывая неблагоприятного воздействия на продукт питания.
Особенно предпочтительно, молочнокислая бактерия является бактерией Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans или Lactobacillus parafarraginis.
Согласно настоящему изобретению, микроорганизмы являются молочнокислыми бактериями, принадлежащими к роду Lactobacillus, более предпочтительно к описанным в настоящем изобретении видам Lactobacillus. Еще более предпочтительно, Lactobacillus по настоящему изобретению является Lactobacillus brevis; другим предпочтительным видом Lactobacillus является L. parafarraginis. Однако, виды Lactobacillus не ограничиваются указанными. В особенно предпочтительном варианте микроорганизмы по настоящему изобретению "выделены" или "очищены". Термин "выделены" означает, что материал извлечен из его исходной окружающей среды, например из природной среды, если он имеет природное происхождение. Например, природный микроорганизм, предпочтительно вид Lactobacillus, отделенный от части или всех сопутствующих в природной системе материалов, является выделенным. Такой микроорганизм может быть частью состава и тем не менее должен считаться выделенным, если состав не является частью его природной окружающей среды.
Термин "очищены" не требует абсолютной чистоты; скорее, он служит в качестве относительного определения. Отдельные микроорганизмы, получаемые из коллекции микроорганизмов, обычно очищены до микробиологической гомогенности, то есть когда их известными способами высевают штрихом на чашках с агаром, они растут как единые колонии. Предпочтительно, чашки с агаром, которые используются для этой цели, являются селективными по отношению к видам Lactobacillus. Такие селективные чашки с агаром известны в данной области техники.
Особенно предпочтительной является молочнокислая бактерия, зарегистрированная под номером DSM 22721, или ее фрагмент, мутант и/или производное, при этом указанные фрагмент, мутант или производное сохраняют способность к ингибированию роста грибного организма.
В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения молочнокислая бактерия по настоящему изобретению выбрана из группы, состоящей из Lactobacillus brevis, имеющей DSMZ-регистрационный номер DSM 22721, или ее мутанта или производного, при этом указанные мутант или производное сохраняют способность ингибировать рост грибных организмов. Термин "Lactobacillus brevis, имеющая DSMZ-регистрационный номер" относится к клеткам микроорганизма, принадлежащего к виду Lactobacillus brevis, депонированного в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) 26 июня 2009 г. и имеющего регистрационный номер DSM 22721. DSMZ расположена по адресу: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany. Вышеупомянутое DSMZ-депонирование было организовано в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Основной проблемой пищевой промышленности является грибковое заражение продуктов питания. Известные к настоящему времени в данной области способы консервации продуктов питания, такие как использование химических веществ, могут придать продуктам питания нежелательные свойства. Кроме того, такие способы могут вызывать обеспокоенность у потребителей. Поэтому, необходимость в альтернативных способах консервации стала важной проблемой для пищевой промышленности. Следовательно, изобретение, в частности молочнокислая бактерия, зарегистрированная под номером DSM 22721, особенно важно, поскольку оно обеспечивает возможность альтернативного эффективного способа консервации продуктов питания без каких-либо побочных эффектов.
"Мутант или производное" молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно депонированных Lactobacillus brevis, имеет предпочтительно те же свойства, что и соответствующий депонированный штамм, то есть сохраняет способность ингибировать рост грибных организмов и, предпочтительно, имеет такие же ингибирующие свойства, как описано в настоящем изобретении выше. Например, указанное производное может быть создано методами генной инженерии. В контексте настоящего изобретения термин "созданный методами генной инженерии" используется в самом широком смысле в отношении известных специалистам методов модификации требуемых нуклеиновых кислот in vitro и in vivo, в которых генетическая модификация и изменение генов осуществляется посредством технологии рекомбинантных ДНК. В связи с этим указанные методы предпочтительно содержат клонирование, секвенирование и трансформацию рекомбинантных нуклеиновых кислот. Для этой цели, используются подходящие векторы, включая экспрессионные векторы для видов Lactobacillus такие как, например, описаны в ЕР-В1 506789, ЕР-В1 316677, ЕР-В1 251064, ЕР-В1-218230, ЕР-В1 133046 или WO 89/01970.
В контексте настоящего изобретения термин "молочнокислые бактерии по настоящему изобретению" также включает в себя производные, мутанты, аналоги или фрагменты, указанных микроорганизмов, например, описанную в настоящем изобретении мембранную фракцию, которые сохраняют вышеуказанную способность ингибировать рост грибных организмов. Термины "производное", "мутанты", "аналоги" и "фрагменты" описаны в другом месте настоящего изобретения.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное отличаются следующими характеристиками. Микроорганизмы показывают оптимальный рост при 30-37°С в аэробных или анаэробных условиях. При температуре выше 42°С рост не наблюдается.
Аэробное брожение Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного приводит к увеличению плотности клеток.
Культивирование Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного в стандартных условиях (например, среда MRS (Мозера-Рогоза-Шарпа), 37°С, анаэробные условия) приводит к повышению кислотности до рН 3,5-3,7.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное присутствуют в виде отдельных палочек или пар или иногда в виде коротких цепочек (2-10 мкм). В стандартных условиях они имеют тенденцию образовывать колонии, имеющие цвет от белого до кремового, с немного матовым внешним видом и слегка структурированной поверхностью.
Неожиданно, добавление молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, не изменяет текстуру или цвет продукта питания, в частности йогурта.
Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, содержат 16S рДНК со следующей последовательностью 1 (SEQ ID NO 1):
Другим преимуществом молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, состоит в том, что возможно глубокое замораживание штамма на срок по меньшей мере 6 месяцев примерно при -20°С или примерно -80°С. Бактерии остаются стабильными и не теряют своей способности ингибировать рост грибных организмов. Также возможно хранить молочнокислые бактерии по настоящему изобретению после лиофилизации (см. также фиг. 2).
Одним из преимуществ является то, что молочнокислая бактерия по настоящему изобретению, в частности зарегистрированная под номером DSM 2272, или ее фрагмент, мутант и/или производное, ингибирует рост грибов рода penicillium, в частности penicillium commune или penicillium roqueforti, рода aspergillus и рода alternaria, в частности alternaria alternata, penicillium expansum, penicillium citrinum, penicillium digitatum, penicillium italicum, scopulariopsis breviacaulis, aspergillus flavus, aspergillus parasiticus, botrytis cinerea, rhizopus sp., mucor sp., eurotium herbariorum, geotrichum candidum, cladosporium herbarum, fusarium sambucinum, phytophora infestans и sclerotinia scerotiorum.
Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к применению указанных молочнокислых бактерий или их фрагмента для получения пищевой композиции, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, при этом молочнокислые бактерии, предпочтительно живые молочнокислые бактерии, или их фрагмент добавляют к продукту питания, корму для животных, фармацевтическому или косметическому составу.
Общеизвестно, что Lactobacillus brevis использует гетероферментативный метаболизм и, следовательно, является гетероферментативной молочнокислой бактерией. Гетероферментативный метаболизм, как правило, характеризуется образованием газа и кислоты. Оба эффекта являются неблагоприятными для производства продуктов питания, фармацевтических препаратов или косметических средств. Поэтому, было очень неожиданным, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению, в частности Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или их мутант или производное, проявляют гомоферментативные свойства при культивировании в косметических или фармацевтических составах или продуктах питания, например, в молочных продуктах, предпочтительно йогурте.
Галеновый препарат фармацевтического состава по настоящему изобретению можно изготовить обычным в данной технологии способом. Приемлемыми твердыми или жидкими формами галеновых препаратов являются, например, гранулы, порошки, драже, таблетки, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, соки, суспензии или эмульсии, для изготовления которых обычно используются такие средства, как носители, разрыхлители, связующие, покрывающие, набухающие, скользящие или смазывающие агенты, вкусовые агенты, подсластители и промежуточные растворы. В качестве вспомогательных веществ могут использоваться карбонат магния, диоксид титана, лактоза, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, целлюлоза и производные, животные и растительные масла, такие как рыбий жир, подсолнечное масло, арахисовое масло или кунжутное масло, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода и одноатомные или многоатомные спирты, например, глицерин. Фармацевтический состав по настоящему изобретению может быть изготовлен посредством смешивания заданной дозы молочнокислых бактерий по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым и физиологически хорошо переносимым носителем, а также возможно с приемлемыми активными, дополнительными или вспомогательными веществами, и изготавливается в виде требуемой лекарственной формы. Носителями, в частности, являются вещества, которые выбраны из группы, содержащей мальтодекстрин, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал, в частности кукурузный крахмал, фруктозу, лактозу, декстрозу и смеси этих веществ. Состав может содержать или состоять из 0,1-95 вес. % носителя и 5-99,9 вес. % лиофилизированных молочнокислых бактерий относительно общего количества клеток и носителей.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное является гетероферментативной в стандартных условиях (например, среда для ферментации или среда MRS в анаэробных условиях). Это означает, что при культивировании в стандартных условиях организмы в процессе ферментации производят газ.
Поэтому, было очень неожиданным, что Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное проявила гомоферментативные свойства при культивировании в молочных продуктах, предпочтительно йогурте. "Стандартный йогурт" был изготовлен с использованием стандартной закваски для сбраживания при 43°C, рН 4,5-4,7, а также с использованием обезжиренного молока, в которое было добавлено сухое обезжиренное молоко. После этого йогурт хранили при 7°C. Когда к йогурту добавили Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, образование газа (пузырьки газа или выпуклая поверхность) не наблюдалось. Через 30 дней посредством HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или анализа равновесного пара определили наличие постороннего привкуса. Неожиданное проявление гомоферментативных свойств в молочных продуктах имеет преимущество в том, что в продукте отсутствует посторонний привкус.
2
2
2
2
Другим свойством Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного является то, что эти организмы не производят НО ни в стандартных условиях (среда MRS), ни в условиях ферментации. Это было проверено с помощью НО-индикаторных полосок.
Другим преимуществом является то, что в йогурте, в который добавлена Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, состав органических кислот очень стабильный. Практически не наблюдается изменение рН. Это особенно важно для использования в продуктах питания.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное показывает в йогурте статический рост."Стандартный йогурт" был изготовлен с использованием стандартной закваски для сбраживания при 43°C и с использованием обезжиренного молока, в которое было добавлено сухое обезжиренное молоко, конечная величина рН составляла 4,5-4,7. Была добавлена Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721. Полученный йогурт хранили при 7°C в течение 3 недель. Через 3 недели не наблюдалось увеличения бактерий по настоящему изобретению.
При использовании в фармацевтических или косметических составах, конечно, необходимо, чтобы состав не содержал каких-либо веществ, в частности активных веществ, которые существенно снижают жизнеспособность клеток и/или активность клеток, соединений, их фрагментов или супернатантов, используемых в соответствии с изобретением. Специалист в области соответствующих веществ или активных веществ может легко определить это с помощью теста на жизнеспособность, например, как предложено DSMZ, который осуществляют только при совместном культивировании с соответствующим веществом или активным веществом в концентрации, в которой оно присутствует в соответствующем составе. Если данный тест положительный, то клетки по настоящему изобретению могут с успехом использоваться. Если данный тест отрицательный, применение соответствующего состава исключается, так как эффект по настоящему изобретению не достигается или достигается в меньшей степени. Что касается активности, можно, например, провести анализ фармацевтического или косметического состава для определения ингибирующей активности, как описано выше, который используется для определения микроорганизма по настоящему изобретению.
Косметическими составами являются, например, шампунь, увлажняющий крем, увлажняющий лосьон, гликолевый крем, гликолевый лосьон, очищающее средство, тональный крем, тональная пудра или корректор для лица.
Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться как материал для прямого внесения. Следовательно, бактерии могут добавляться к продуктам питания, косметическим или фармацевтическим составам без каких-либо предшествующих стадий обработки. Предпочтительно, бактерии по настоящему изобретению подвергнуты криоконсервации в супернатанте, образующемся при их ферментации. Это облегчает получение продуктов и, следовательно, способствует экономии времени и снижению расходов.
Еще один предпочтительный вариант изобретения относится к пищевой композиции, содержащей продукт питания и указанные молочнокислые бактерии или их фрагменты.
2
15
6
8
12
8
10
Предпочтительно, пищевая композиция, корм для животных, фармацевтический состав или косметический состав содержит от 10 до 10, предпочтительно от 10 или 10 до 10, в частности от 10 до 10 клеток молочнокислых бактерий или их фрагментов в абсолютном количестве или на 100 г продукта питания, корма для животных или фармацевтического состава, содержащего клетки. Эти количества особенно предпочтительны, так как они позволяют очень эффективно ингибировать рост грибов, не оказывая какого-либо неблагоприятного воздействия.
Предпочтительно, молочнокислые бактерии присутствуют в концентрации 0,0001% или более. Эти концентрации особенно предпочтительны, так как они обеспечивают эффективное ингибирование роста грибов в продуктах питания.
Также предпочтительно, пищевая композиция является мясным продуктом или молочным продуктом, предпочтительно йогуртом, молоком, сыром, сливками и/или творожным сыром. Эти продукты обычно подвержены плесневению, из-за чего использование молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, особенно предпочтительно. Дополнительным преимуществом является то, что эффект ингибирования роста грибов не зависит от типа заквасочной культуры и/или сухого обезжиренного молока, используемого для изготовления молочного продукта, в частности йогурта. Поэтому молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться в различных продуктах питания, не утрачивая полезного действия.
Другой предпочтительный вариант изобретения относится к способу консервации продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, при этом указанные молочнокислые бактерии добавляют к продукту питания, корму для животного или фармацевтическому составу.
Для консервации с помощью молочнокислых бактерий по настоящему изобретению могут использоваться практически все продукты питания, корм для животных, фармацевтические или косметические составы, которые могут содержать грибные организмы, занесенные либо при изготовлении, либо в результате заражения во время хранения.
2
15
6
8
12
8
10
Предпочтительно, на 100 г продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава добавляют от 10 до 10, предпочтительно от 10 или 10 до 10, в частности от 10 до 10 клеток молочнокислых бактерий или их фрагментов.
Также предпочтительно, молочнокислые бактерии добавляют в концентрации от 0,0001% до 0,01%, предпочтительно 0,001%. Эти концентрации особенно предпочтительны, так как они обеспечивают эффективное ингибирование роста грибов в продуктах питания. При добавлении молочнокислых бактерий в концентрации 0,0001% или более, предпочтительно 0,001%, рост грибов ингибируется постоянно, так что продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав может храниться длительное время без утраты возможности предотвращать рост грибов.
Особенно предпочтительно, добавляется от 0,0001% до 0,01%, предпочтительно 0,001% гранулированной глубокозамороженной культуры Lactobacilli по настоящему изобретению, предпочтительно для ферментации йогурта. Использование гранулированной глубокозамороженной культуры Lactobacilli удобно для промышленного производства.
10
Также предпочтительно, 1 мл глубокозамороженной культуры лактобактерий содержит 0,5×10 КОЕ (колониеобразующих единиц).
Другой предпочтительный вариант изобретения относится к способу идентификации указанной молочнокислой бактерии, содержащему
h) обеспечение субстрата,
i) обеспечение препарата, содержащего исследуемые молочнокислые бактерии,
j) добавление препарата, содержащего молочнокислые бактерии, к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
k) добавление заданного количества спор грибов к продукту стадии j),
l) инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии l), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
m) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов.
Другим аспектом настоящего изобретения является аналог или фрагмент указанной молочнокислой бактерии, которая термически инактивирована или лиофилизирована, при этом указанный аналог или фрагмент сохраняет способность ингибировать рост грибных организмов. Аналог или фрагмент может, в частности, присутствовать в супернатанте культуры микроорганизмов по настоящему изобретению или фрагмента такого микроорганизма. Эту способность определяют как указано выше для определения свойств микроорганизма по настоящему изобретению.
В качестве дополнительной альтернативы для определения свойств микроорганизмов по настоящему изобретению, можно использовать анализ биорегулирования, описанный в статье P. Raspor et al., Food Technol. Biotechnol. 48 (3): 336-343 (2010), согласно которой данный анализ проводят с использованием исследуемых микроорганизмов в сравнении с контрольными экспериментами при отсутствии микроорганизма и/или контрольными экспериментами, в которых микроорганизм заменен традиционным химическим противогрибковым соединением в заданной концентрации.
Рост грибных организмов ингибируется, если при культивировании грибных организмов в отсутствие клеток по настоящему изобретению рост грибных организмов увеличивается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, по сравнению с совместным культивированием грибных организмов и клеток по настоящему изобретению в идентичных условиях культивирования, этот рост считают по плотности колоний через заданное время на среде для культивирования грибных организмов. Дополнительный специфический анализ описан выше только в качестве примера.
Могут использоваться известные специалистам праймеры, ферменты, дополнительные клетки-хозяева для клонирования промежуточных конструкций и т.п. Предпочтительно, мутанты, полученные методами генной инженерии, содержат клетки микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно депонированного вида Lactobacillus, в которые введены рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащиеся либо в бактериальной хромосоме, либо в плазмиде(ах) или содержащиеся в бактериальной хромосоме и/или в плазмиде(ах). Указанные рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно являются чужеродными для микроорганизма по настоящему изобретению. "Чужеродные" означает, что молекула полинуклеотида или нуклеиновой кислоты является либо гетерологичной по отношению к клетке-хозяину, то есть выделенной из клетки или микроорганизма с другим генетическим окружением, либо гомологичной по отношению к клетке-хозяину, но расположенной в другом генетическом окружении по сравнению с природным аналогом указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Это означает, что если молекула нуклеиновой кислоты является гомологичной по отношению к клетке-хозяину, она не находится в месте природного расположения в геноме указанной клетки-хозяина, в частности, она окружена другими генами. В этом случае полинуклеотид может находиться либо под контролем своего собственного промотора, либо под контролем гетерогенного промотора. Вектор или молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которая присутствует в клетке-хозяине, может быть интегрированной в геном клетки-хозяина или в некоторой форме находиться вне хромосомы. В связи с этим, также должно быть понятно, что молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может использоваться для восстановления или создания мутантного гена посредством гомологичной рекомбинации.
Мутант микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно мутант депонированного штамма Lactobacillus, предпочтительно получен в результате искусственной мутации. Согласно настоящему изобретению термин "получен в результате мутации" означает длительную(ые) модификацию(и) генетического материала, то есть нуклеиновых кислот, возникшую(ии), например, естественным образом или вызванную(ые) физическими средствами или химическими соединениями/веществами/агентами, такими как EMS (этилметансульфонат) или ENU (N-этил-N-нитрозомочевина). Указанные модификации включают в себя точечные мутации, такие как транзиции или трансверсии, делеции/вставки/добавление одного или нескольких оснований в нуклеиновую кислоту/ген/хромосому, в результате чего происходит модификация нуклеиновой кислоты/гена/хромосомы, что может привести, помимо прочего, к экспрессии/транскрипции/трансляции аберрантного гена или образованию неактивных генных продуктов, конститутивных активных/неактивных генных продуктов, которые могут быть причиной, например, доминантно-негативных эффектов. Предпочтительно, мутация приводит к увеличению способности к ингибированию роста грибных организмов. Таким образом, также предпочтительны мутантные клетки депонированного микроорганизма, которые содержат мутацию(ии) в требуемом(ых) гене(ах) или в которых мутация(ии) в требуемом гене(ах) индуцирована(ы) известными специалистам способами. Также известно, что мутантные или полученные методами генной инженерии бактериальные клетки можно отбирать любыми подходящими способами/по фенотипу. В контексте настоящего изобретения мутант, обладающий повышенной способностью к ингибированию роста грибных организмов, может быть исследован в соответствии со способами, описанными далее в примерах. Термин "мутант", однако, также включает в себя клетки микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно клетки депонированного микроорганизма, которые содержат естественные, спонтанные мутации в своем геноме, то есть в бактериальной хромосоме. "Спонтанные мутации" это мутации, которые возникают естественным образом, то есть без прямой генетической манипуляции человека, или под воздействием мутагена. Отбор спонтанных мутантов можно осуществлять посредством культивирования штамма и отбора требуемых вариантов, например, в соответствии с различной способностью бактерий к улучшенному росту. Способы отбора спонтанных мутантов хорошо известны (см., например, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Например, такие мутации могут возникать во время культивирования, например, во время нормального процесса клеточного деления, сопровождаемого репликацией ДНК, или во время пассирования и/или консервации мутанта микроорганизма по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу или фрагменту микроорганизма по настоящему изобретению, который термически инактивирован или лиофилизирован, при этом указанный аналог сохраняет способность к ингибированию роста грибных организмов.
В соответствии с настоящим изобретением термин "аналог микроорганизма по настоящему изобретению" включает в себя также мертвую или инактивированную клетку микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно раскрытого в настоящем изобретении вида Lactobacillus, которая больше не способна образовывать отдельную колонию на чашке, специфичной для микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus. Указанная мертвая или инактивированная клетка может иметь либо неповрежденную, либо разрушенную клеточную мембрану. Способы киллинга или инактивации клеток микроорганизма по настоящему изобретению известны в технике. В статье EI-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468 описан способ инактивации вида Lactobacillus посредством УФ-излучения. Предпочтительно, клетки микроорганизма по настоящему изобретению термически инактивированы или лиофилизированы. Лиофилизация клеток по настоящему изобретению имеет преимущество в том, что клетки можно удобно хранить и использовать, при этом сохраняется их способность к ингибированию роста грибных организмов. Кроме того, лиофилизированные клетки могут снова расти при внесении их в соответствующую жидкую или твердую среду при известных в технике условиях. Лиофилизацию осуществляют известными в технике способами. Предпочтительно, ее проводят в течение по меньшей мере 2 часов при комнатной температуре, то есть при любой температуре между 16°С и 25°С. Кроме того, лиофилизированные клетки микроорганизма по настоящему изобретению являются стабильными в течение по меньшей мере 4 недель при температуре 4°С, сохраняя способность ингибировать грибной организм, как описано выше. Термическая инактивация может быть достигнута путем инкубирования клеток микроорганизма по настоящему изобретению в течение по меньшей мере 2 часов при температуре 170°С. Кроме того, термической инактивации предпочтительно достигают путем обработки указанных клеток в автоклаве при температуре 121°С в течение по меньшей мере 20 минут в присутствии насыщенного пара при давлении атмосферы 2 бара. Альтернативно, термической инактивации клеток микроорганизма по настоящему изобретению достигают путем их замораживания клеток в течение по меньшей мере 4 недель, 3 недель, 2 недель, 1 недели, 12 часов, 6 часов, 2 часов или 1 часа при минус 20°С. Предпочтительно, по меньшей мере 70%, 75% или 80%, более предпочтительно 85%, 90% или 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97%, 98%, 99%, еще более предпочтительно 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% и наиболее предпочтительно 100% клеток аналога микроорганизма по настоящему изобретению являются мертвыми или инактивированными, однако, они все еще обладают способностью к ингибированию роста грибных организмов. Является ли аналог или фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению действительно мертвым или инактивированным, можно определить известными способами, например с помощью теста на жизнеспособность.
Термин "аналог микроорганизма по настоящему изобретению" охватывает лизаты или фракции микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно раскрытого в настоящем изобретении вида Lactobacillus. Согласно настоящему изобретению термин "лизат" означает раствор или суспензию в водной среде клеток микроорганизма по настоящему изобретению, которые разрушены. Однако, термин не должен истолковываться как каким-либо образом ограничивающий. Клеточный лизат содержит, например, макромолекулы, такие как ДНК, РНК, белки, пептиды, углеводы, липиды и т.п. и/или микромолекулы, такие как аминокислоты, сахара, жирные кислоты и т.п., или их фракции. Кроме того, указанный лизат содержит осколки клеток, которые могут иметь гладкую или зернистую структуру. Способы приготовления клеточных лизатов микроорганизма известны в технике, например, с использованием френч-пресса, мельницы для разрушения клеток со стеклянными или железными шариками или ферментативного лизиса клеток и т.п. Кроме того, лизирование клеток относится к различным известным способам раскрытия/разрушения клеток. Способ лизирования клеток не имеет большого значения, и может применяться любой способ, который позволяет осуществить лизис клеток микроорганизма по настоящему изобретению. Соответствующий способ может быть выбран специалистом, например, раскрытие/разрушение клеток может осуществляться ферментативно, химически или физически. Неограничивающими примерами ферментов и смесей ферментов являются протеазы, такие как протеиназа К, липазы или гликозидазы; неограничивающими примерами химических веществ являются ионофоры, поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат натрия, а также кислоты или основания; а неограничивающими примерами физических средств являются высокое давление, например обработка с помощью френч-пресса, а также осмотическое давление и температура, например высокая или низкая. Кроме того, может также применяться способ, в котором используется подходящее сочетание фермента (не являющегося протеолитическим ферментом), кислоты, основания и т.п. Например, клетки микроорганизма по настоящему изобретению лизировали замораживанием и размораживанием, более предпочтительно замораживанием при температурах ниже минус 70°С и размораживанием при температурах выше 30°С, в частности, замораживанием предпочтительно при температурах ниже минус 75°С и размораживанием предпочтительно при температурах выше 35°С, а наиболее предпочтительны температура замораживания ниже минус 80°С и температура размораживания выше 37°С. Также предпочтительно, что указанное замораживание/размораживание повторяют по меньшей мере 1 раз, более предпочтительно по меньшей мере 2 раза, еще более предпочтительно по меньшей мере 3 раза, особенно предпочтительно по меньшей мере 4 раза и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5 раз.
Соответственно, специалисты могут приготовить нужные лизаты, руководствуясь вышеизложенными общими пояснениями и, если необходимо, соответствующим образом модифицируя или изменяя эти способы. Предпочтительно, водная среда, используемая для описанных лизатов, является водой, физиологическим раствором или буферным раствором. Преимуществом лизата бактериальных клеток является то, что его можно легко получать и хранить с меньшими затратами, так как при этом требуется меньше технических средств.
Согласно изобретению лизатами являются также препараты или фракции молекул из вышеуказанных лизатов. Эти фракции можно получать известными специалистам способами, например, посредством хроматографии, включая, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию и хроматографию с другим хроматографическим материалом в колонке или периодические методы, а также посредством других методов фракционирования, таких как фильтрация, например, ультрафильтрация, диализ, диализ и концентрирование с разделением по размеру центрифугированием, центрифугирование в матриксе с градиентом плотности или ступенчатом матриксе, осаждение, например, аффинное осаждение, всаливание или высаливание (осаждение сульфатом аммония), осаждение спиртом, или другие методы химии белков, молекулярной биологии, биохимические, химические или физические методы разделения вышеуказанных компонентов лизатов.
"Фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению" включает в себя любую часть клетки микроорганизма по настоящему изобретению. Предпочтительно, указанным фрагментом является мембранная фракция, полученная посредством приготовления препаратов мембран. Препараты мембран микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus, могут быть получены известными способами, например способом, описанным в статьях Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-301; Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 или Stentz et al, Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 или Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154. В качестве альтернативы, также возможен цельноклеточный препарат. Предпочтительно, описанное в настоящем изобретении производное или фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению сохраняет способность к ингибированию роста грибных организмов, что подробно описано в настоящем изобретении.
Изобретение прежде всего основано на обнаружении штаммов Lactobacillus, которые способны продлить срок хранения йогурта посредством ингибирования роста грибов. Путем использования такого штамма Lactobacillus можно заменить применяемый до настоящего времени консервант сорбат калия. В экспериментах исследовалась ингибирующая активность клеток Lactobacillus по отношению к грибам видов penicillium, aspergillus и alternaria. Сначала, для определения противогрибковой активности использовались живые клетки Lactobacillus. Был идентифицирован штамм Lactobacillus (Lactobacillus brevis), который способен ингибировать рост исследуемых штаммов грибов. Бактерия была названа "антиплесневой Lactobacillus" и подана 26 июня 2009 г. в DSMZ (Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур) под номером DSM 22721.
В другом эксперименте штамм Lactobacillus тестировали в продуктах питания. Для этой цели штамм Lactobacillus вместе с йогуртовой заквасочной культурой добавили в исходную среду для приготовления йогурта. После ферментации йогурта добавили споры грибов, и хранили йогурт при 7°С. В сравнении с контрольными культурами с добавлением или без добавления сорбата калия в качестве консерванта, было обнаружено, что в культуре с Lactobacillus по настоящему изобретению достигнуто значительное увеличение срока годности, то есть рост грибов можно ингибировать на протяжении более длительного периода времени, чем с помощью сорбата калия.
Использование такого штамма Lactobacillus для консервации продуктов питания, корма для животных, фармацевтических или косметических составов имеет очевидное преимущество перед обычными способами консервации. Этот штамм является биологическим консервантом, который не изменяет запах или текстуру продукта питания.
Изобретение относится также к применению клеток микроорганизма по настоящему изобретению для получения консервированного продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, когда в продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав добавляют клетки микроорганизма, а также к способу консервации продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, когда в продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав добавляют клетки микроорганизма по настоящему изобретению
Применение клеток микроорганизма по настоящему изобретению отличается простой. В случае продуктов питания (живые) клетки или фрагменты или аналоги бактерий по настоящему изобретению добавляют в продукт питания в заданном количестве. То же относится и к корму для животных или фармацевтическим составам.
Примеры
Далее изобретение более подробно описано в Примерах, не будучи ограничено ими.
Фиг. 1 - показаны результаты Примера 2.
Фиг. 2 - показана стабильность лиофилизированных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению; стабильность измеряли в колониеобразующих единицах (кое) на грамм.
Фиг. 3 - показана стабильность глубокозамороженных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению после хранения при минус 20°С.
Фиг. 4 - показана стабильность глубокозамороженных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению после хранения при минус 80°C.
Пример 1. Ингибирование грибов в продуктах питания.
Используемые материалы:
Используемые культуры: йогуртовая заквасочная культура Yo-Mix 401 (Danisco, Denmark), Lactobacillus DSM 22721, penicillium commune, penicillium roqueforti, anternaria alternata и другие собственные изоляты, такие как aspergillus.
Используемые реагенты и среды:
Обработанное при сверхвысокой температуре гомогенизированное молоко, 1,5% жира, например, от Campina Mark Brandenburg,
Сухое обезжиренное молоко "frema Reform" от Granovita GmbH, D-87751 Heimertingen (доступен у Reformhaus Demski),
Раствор сорбата калия 20 мг/мл (VWR International GmbH, Darmstadt), стерилизованный фильтрацией,
Питательная среда YDA (дрожжевой экстракт PTU (Ohly GmbH) 25,0 г/л, D(+)-глюкозы моногидрат (Merck, Darmstadt) 20,0 г/л, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 г/л, аммоний лимоннокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, ацетат натрия (Merck, Darmstadt) 5,0 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 0,1 г/л, моногидрат сульфата марганца (II) (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, автоклавирование при 121°C в течение 20 мин, после автоклавирования рН 5,7,
Искусственная йогуртовая среда (среда YH), D(+)-глюкозы моногидрат (Merck, Darmstadt) 22,0 г/л, дрожжевой экстракт Biospringer 0207/0-MG-L (Biospringer, Maisons-Afort Cedex, France) 15 г/л, сухое обезжиренное молоко (Granovita GmbH, Heimertingen) 20 г/л, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 г/л, аммоний лимоннокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, ацетат натрия (Merck, Darmstadt) 5,0 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 0,1 г/л, моногидрат сульфата марганца (II) (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л,
Йогуртовая среда (обработанное при сверхвысокой температуре молоко (1,5% жира) + 2,0% масса/масса обезжиренного молока Bio),
Среда MRS (бульон MRS для лактобактерий (BD Difco, Augsburg) 55 г/л, рН 6,5),
Картофельно-декстрозный агар (картофельно-декстрозный бульон (BD Difco, Augsburg) 24 г/л, агар гранулированный (BD Difco, Augsburg) 1,5 г/л, рН 5,1), и
Криозащитный раствор (моногидрат глюкозы (Merck, Darmstadt) 80 г/л, пептон триптиказа (BD Difco, Augsburg) 2 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 10 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 4 г/л, нитрат натрия (Merck, Darmstadt) 6 г/л, хлорид калия (Merck, Darmstadt) 1 г/л, гептагидрат сульфата железа (II) (Merck, Darmstadt) 0,02 г/л, глицерин (85%) (Merck, Darmstadt) 200 г/л, pH 5,6).
Применяемые способы:
Приготовили заквасочные культуры посредством растворения 1 г лиофилизированной йогуртовой заквасочной культуры (Yo-Mix 401, Danisco, Denmark) в 500 мл обработанного при сверхвысокой температуре молока с низким содержанием жира и оставили ее набухать в течение 20 мин при температуре окружающей среды.
Осуществили предварительное культивирование Lactobacillus по настоящему изобретению посредством внесения 1,5 мл глубокозамороженной культуры в 9 мл питательной среды YDA с последующим инкубированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 48 ч.
Основное культивирование Lactobacillus по настоящему изобретению осуществили посредством введения осадка из 8 мл предварительной культуры в 30 мл питательной среды YDА с последующим инкубированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 ч.
Ферментацию Lactobacillus по настоящему изобретению осуществили посредством центрифугирования 28 мл основной культуры в течение 5 мин при 4500 об/мин и удалили супернатант. Полученный осадок ресуспендировали в 5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl и полностью перенесли в колбу Эрленмейера объемом 1 л с 0,5 л среды YH. После этого осуществили инкубирование в анаэробных условиях при 37°С в течение 24 ч на перемешивающем устройстве при 150 об/мин. После ферментации, величину pH довели до 5,5±0,1 с помощью 2 М раствора КОН.
Для изготовления йогурта 100 мл обработанного при сверхвысокой температуре молока (1,5% жира) + 2,0 г сухого обезжиренного молока (2% масса/масса) поместили во флакон Schott. Затем смесь нагрели до 110°C в течение 15 мин в автоклаве. После охлаждения до 42°С, добавили 0,5 мл свежеприготовленной йогуртовой заквасочной культуры. После этого осуществили инкубирование в анаэробных условиях при 42°С до достижения величины рН 4,6±0,1. Хранение до дальнейшего использования осуществлялось при 7°С.
Для получения криогенной суспензии спор грибов образец грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл криозащитной культуры, жидкий супернатант удалили и перенесли в криопробирки. Хранение криокультур осуществляли при минус 80°С.
2
Для приготовления грибов для биоанализа 0,1 мл криогенной суспензии спор грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл 0,1% раствора Tween 80. Жидкий супернатант перенесли в пробирки Falcon и хранили при 4-6°C. Разведение суспензии осуществляли с помощью дистиллированной HO до 250 спор/мл.
Биоанализ ингибирования грибов бактериями Lactobacillus на картофельно-декстрозном агаре проводили посредством нанесения 200 мкл суспензии спор с 250 спор/мл на пластинку из картофельно-декстрозного агара. После сушки в агаровой пластинке с помощью пробочного сверла просверлили 5 отверстий. С помощью пипетки внесли 40 мкл каждой из следующих смесей:
1) 24 часовая культура Lactobacillus в среде MRS,
2) супернатант 24 часовой культуры Lactobacillus в среде MRS,
3) Lactobacillus из 24 часовой культуры в MRS, гранулированные и ресуспендированные в буферном растворе PBS (→ клетки в PBS),
4) Среда MRS,
5) PBS (фосфатно-солевой буферный раствор).
Затем осуществили культивирование пластинки а анаэробных условиях при температуре окружающей среды в течение периода до 14 дней.
С целью проведения биоанализа для проверки ингибирования грибов бактериями Lactobacillus в йогурте 40 мл йогуртовой среды поместили в пробирки Falcon. Затем добавили 0,2 мл заквасочной культуры. Были подготовлены образцы:
8
1) с добавлением 1×10 клеток Lactobacillus,
2) контрольный образец А без Lactobacillus, и
3) контрольный образец В без Lactobacillus, в который после ферментации добавили 0,4 мл раствора сорбата калия.
После этого, образцы подвергли ферментации, каждый при 42°С до достижения рН=4,6±0,1 с последующим охлаждением до 7°С, 8 мл каждого из образцов поместили в 6-луночные планшеты, добавили 50 спор на образец (контрольный образец без спор), инкубировали при 7°С и осуществляли ежедневный визуальный контроль роста грибов. В качестве альтернативы визуальному контролю может осуществляться автоматизированная оценка с использованием цифрового фотоаппарата, в котором используются такие предварительно установленные настройки контраста, которые позволяют отличать грибы от нижележащего субстрата. Это позволяет осуществлять подсчет таких пикселей, яркость которых ниже или выше заданной пороговой яркости и которые, таким образом, связаны с ростом грибов. Затем, можно определить отношение количества пикселей к общему количеству пикселей, относящихся к образцу, которое является количественным показателем количества грибов, присутствующих в исследуемом образце. В качестве фотоаппарата может использоваться система FluorChem FC2 Imaging System (Alpha Innotech/Cell Biosciences), Santa Clara, USA) со следующими настройками: время экспозиции: 100-150 мс, диафрагма: 8, настройки контраста: уровень черного: 55000, уровень белого: 60000, гамма (коэффициент контрастности): 3,0, настройки освещения: проходящий свет "включено", отраженный свет "включено", автоматическая регулировка контраста (chemi display) "включено", скорость/разрешение: нормальная/ультра. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения AlphaEaseFC.
Ингибирование роста грибов клетками Lactobacillus по настоящему изобретению.
Биоанализ для проверки ингибирования роста грибов клетками Lactobacillus по настоящему изобретению в йогурте был проведен со следующими результатами. Через 7 дней при визуальном контроле наблюдался рост грибов в образцах без Lactobacillus или без сорбата калия (контрольный образец А). Через 9 дней при визуальном контроле также наблюдался рост грибов в образцах с сорбатом калия (контрольный образец В). И только через 28 дней рост грибов также наблюдался в образцах с клетками Lactobacillus по настоящему изобретению. В результате, с помощью клеток Lactobacillus по настоящему изобретению достигнуто заметное уменьшение роста грибов и, следовательно, значительное увеличение срока годности йогурта.
Пример 2.
С зараженных поверхностей йогурта собрали споры грибов и культивировали на оптимальной для грибов среде (картофельно-декстрозный агар) в оптимальных условиях (25°С, аэробные условия, 5 дней). Использование 0,1% Lactobacillus brevis DSM 22721 имело результатом полное отсутствие роста грибов (см. фиг. 1, позицию 13). Действие Lactobacillus brevis DSM 22721 является фунгицидным, а не фунгистатическим. Эксперимент также показал, что Lactobacillus brevis DSM 22721 эффективнее, чем сорбат калия (см. фиг. 1: поз. 11 - с сорбатом калия 11, поз. 10 - без сорбата калия).
Пример 3.
Приготовление суспензии спор:
Для получения криогенной суспензии спор грибов образец грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл криозащитной культуры, жидкий супернатант удалили и перенесли в криопробирки. Хранение криокультур осуществляли при минус 80°С.
6
С целью приготовления спор для биоанализа приготовили суспензию спор 5×10/мл в картофельно-декстрозном бульоне.
Приготовление клеток Lactobacillus:
2
2
Культуру Lactobacillus культивировали в среде YDA в течение 24 ч при 37°С. Затем клетки отделили посредством центрифугирования при 4000 х g, после чего клетки промыли дистиллированной водой ((dHO). После этого получили 10-кратный концентрат клеток в dHO.
Проведение анализа совместного инкубирования:
6
Для анализа совместного инкубирования 980 мкл суспензии спор P. commune, содержащей 5×10 спор/мл и 20 мкл 10-кратного концентрата Lactobacillus совместно инкубировали при 25°С в течение 24 ч в 24-луночном планшете. Скорость прорастания спор определяли в различные моменты времени посредством микроскопии образцов в камере Тома. Соответственно, оценивалось по меньшей мере 100 спор и вычислялся процент проросших спор. Споры считались проросшими в случае, когда длина проростка превышала диаметр споры.
Результаты представлены в нижеследующей Таблице в виде скорости прорастания (%) спор P. commune после совместного инкубирования с клетками Lactobacillus и без них. Ингибирование прорастания считалось значительным, если было ингибировано прорастание по меньшей мере 10% спор.