Способ трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при атрофии ретинального пигментного эпителия
METHOD OF TRANSPLANTATION OF RETINAL PIGMENT EPITHELIUM (RPE) CELLS DIFFERENTIATED FROM INDUCED HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS, WITH RETINAL PIGMENT EPITHELIUM ATROPHY

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для субретинальной трансплантации клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (далее - ИПСК-РПЭ), для лечения заболеваний сетчатки, сопровождающихся атрофией ретинального пигментного эпителия.
Многие формы заболеваний, угрожающих зрению, включая возрастную макулярную дегенерацию, вызваны дисфункцией, дегенерацией и потерей РПЭ. Варианты терапии для дегенеративных заболеваний сетчатки крайне ограничены, поэтому на современном этапе на экспериментальных моделях активно разрабатываются новые подходы для лечения данной группы офтальмологических болезней. В настоящее время, трансплантация ИПСК-РПЭ является одной из самых перспективных направлений, как в плане изучения молекулярных механизмов клеточных патологий в условиях персонифицированного подхода, так и разработки подходов к клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний сетчатки [Rao, М., Gottesfeld, J.M. (2014) Introduction to thematic minireview series: Development of human therapeutics based on induced pluripotent stem cell (iPSC) technology, The Journal of Biological Chemistry, 289, 4553-4554.; A.E. Харитонов, A.B. Сурдина, О.С. Лебедева, А.Н. Богомазова, М.А. Лагарькова. Возможности использования плюрипотентных стволовых клеток для восстановления поврежденного пигментного эпителия сетчатки глаза. ACTA NATURAE | ТОМ 10 №3 (38) 2018].
Известен способ, при котором дифференцированные ИПСК-РПЭ трансплантируют субретинально в форме суспензии клеток эквивалентом 50 тыс в глаза кроликов с индуцированной атрофией РПЭ. Предварительные результаты подтвердили безопасность этого подхода, однако данные об эффективности, включая функциональную интеграцию трансплантированных клеток, еще не были продемонстрированы [Petrus-Reurer S. et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy //Investigative ophthalmology & visual science. - 2017. - T. 58. - №. 2. - C. 1314-1322.]
Трансплантация ИПСК-РПЭ в суспензионной форме широко применяется в связи с более облегченной техникой, но находится в невыгодном положении из-за плохого выживания клеток вследствие апоптоза, так как эти клетки не находят должной механической опоры. Трансплантация клеток РПЭ на субстрате обеспечивает анатомическую интеграцию и надежное выживание клеток. До сих пор активно ведется сравнение между двумя существующими способами трансплантации клеток РПЭ с точки зрения выживаемости клеток, анатомической и функциональной интеграции [Uebersax E.D., Grindstaff R.D., Defoe D.M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: comparison of freshly isolated and subcultured cells // Exp. Eye Res. 2000. 70. (3). 381-390].
Известен способ трансплантации клеток РПЭ, дифференцированных из эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК-РПЭ), при котором в качестве каркаса используют ультратонкую и пористую полиимидную мембрану (PI), которую вместе с клетками трансплантировали в субретинальное пространство кроликов. Кролики находились под динамическим наблюдением в течение трех месяцев после оперативного вмешательства. По данным функциональных и морфологических методов исследования, несмотря на правильную локализацию PI, со временем наблюдалась потеря и отторжение трансплантированных клеток [Ilmarinen Т, Hiidenmaa H,  Nymark S, Sorkio A, Wang J-H, et al. (2015) Ultrathin Polyimide Membrane as Cell Carrier for Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium. PLoS ONE 10(11): e0143669. doi:10.1371/joumal.pone.0143669]
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ трансплантации ЭСК-РПЭ, при котором неабсорбируемый субстрат из парилена-С (CPCB-RPE1) с монослоем ЭСК-РПЭ имплантировали путем инъекции через склеротомический и ретинотомический разрез в субретинальное пространство юкатанских мини-свиней. Животных подвергали эвтаназии сразу после имплантации для изучения положения трансплантата. Хотя ультратонкие субстраты теоретически являются хорошими каркасами для субретинальной трансплантации благодаря их проницаемости, они чаще всего требуют сложных хирургических маневров, в последующем приводящих к интраоперационным и послеоперационным осложнениям [https://link.springer.com/article/10.1186/s40942-017-0095-6].
Выбор субстрата является важным параметром для культивирования и успешной трансплантации клеток РПЭ. В настоящее время ведется поиск оптимального субстрата, имитирующего структурные и функциональные свойства мембраны Бруха, обеспечивающего основу для адгезии клеток РПЭ в поляризованном монослое, экономически выгодного и безопасного в использовании.
Задачей изобретения является выбор оптимального субстрата для пересадки ИПСК-РПЭ и разработка техники их трансплантации в субретинальное пространство кроликов с моделью атрофии РПЭ.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение функциональной активности сетчатки в глазах с атрофией РПЭ, создание основы в виде подложки для обеспечения адекватной адгезии клеток РПЭ, дифференцированных из плюрипотентных стволовых клеток человека, в поляризованном монослое, что в итоге увеличивает интеграционную способность и функционирование ИПСК-РПЭ.
Технический результат достигается за счет трансплантация ИПСК-РПЭ фиксированных в виде монослоя на подложке толщиной 50 мкм, полученной методом электроспиннинга и состоящей на 50% из нановолокон гидрофильного полиуретана и на 50% из желатина, в индуцированную соответственно зоне атрофии РПЭ отслойку сетчатки через ее линейный разрез.
Способ осуществляют следующим образом.
Кроликам с атрофией ретинального пигментного эпителия (РПЭ) индуцируют отслойку сетчатки соответственно зоне атрофии РПЭ. Через линейный разрез сетчатки в зоне отслойки вводят субретинально ИПСК-РПЭ, фиксированные в виде монослоя на подложке толщиной 50 мкм, полученной методом электроспиннинга и состоящей на 50% из нановолокон гидрофильного полиуретана и на 50% из желатина.
2
Подложка для фиксации в виде монослоя были получены методом электроспиннинга. Подложка на 50% состоит из нановолокон гидрофильного полиуретана и на 50% из желатина. Проведенные исследования показали, что при культивировании на данной подложке клетки способны к формированию монослоя, обладают хорошей скоростью роста, гексагональной морфологией и быстрым накоплением пигмента. Перед посевом на подложку, клетки культивировались в среде DMEM/F12 (ПанЭко) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Gibco), 2% заменимых аминокислот (ПанЭко), 100-кратной добавки GlutaMAX (Gibco) и пенициллин/стрептопицина (50 ед/мл/50 мкг/мл) (ПанЭко) до достижения монослоя. Затем клетками засевали подложку из расчета 1:1 по площади (площадь флакона для культивирования к площади подложки, примерно 100000 кл/см). Для посева на подложку клетки промывались раствором Хэнкса (ПанЭко), инкубировались 5-7 минут в 0,05% трипсина в ЭДТА (Gibco), и центрифугировались. Перед трансплантацией подложку переносили в пробирку типа эппендорф, отмывали от среды фосфатно-солевым раствором (ПанЭко). (ISO 7198:1998, "Cardiovascular implants -- Tubular vascular prostheses". 1998).
За месяц до трансплантации ИПСК-РПЭ создавали модель атрофии РПЭ следующим образом: в субретинальное пространство кроликов на расстоянии 0.5 pd ниже диска зрительного нерва с сформированием субретинального пузыря вводили бевацизумаб в объеме 10 мкл, содержащем 0.025 мг препарата.
Типичными морфологическими признаками, наблюдаемыми при экспериментальном моделировании атрофии сетчатки являются выраженные в различной степени дистрофические изменения во всех ее слоях с нарушением гистоархитектоники и стратификации, очаги разряжения ядерных слоев и слоев нервных волокон, субатрофия и вакуолизация слоя ганглиозных клеток. Изменения пигментного эпителия представлены очагами баллонной дистрофии и деструкции с внеклеточным выпадением и депонированием глыбок пигмента, деструкция и лизис пигментных клеток с субтотальной атрофией и исчезновением слоя пигментных клеток. Соответственно зоне атрофии, на поверхности хориокапиллярного слоя обнаруживается подложка из полимерного материала, на которой визуализируются клетки пигментного эпителия.
Для проведения трансплантации животных обезболивали внутримышечным введением Золетила и Ксилазина. Мидриаз достигался закапыванием Аппамида. Операцию проводили на правом глазу, оставляя парный глаз для контроля. Перед операцией местно закапывали Вигамокс и Алкаин. Индуцировали отслойку сетчатки соответственно зоне атрофии РПЭ. Через линейный разрез сетчатки в зоне отслойки вводили субретинально ИПСК-РПЭ, фиксированные в виде монослоя на подложке толщиной 50 мкм, полученной методом электроспиннинга и состоящей на 50% из нановолокон гидрофильного полиуретана и на, 50% из желатина.
После хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор Гентамицина и Дексаметазона в дозе 3 мг/кг и 0,2 мг/кг, соответственно. В последующие 14 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор Дексаметазона 0,1%) 3 р/д. За день до оперативного вмешательства и в последующие 4 месяца, кролики получали Сандиммун неорал (раствор для приема внутрь) 100 мг/мл (с расчетом 10 мг на кг массы тела).
Экспериментальные исследования были проведены на 10 кроликах (10 глаз) породы альбино, массой 2,0 - 2,5 кг. Продолжительность эксперимента составила 4 месяца. Спустя 4 месяца животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу МинВуза СССР №724 от 13.11.184). Глазные яблоки энуклеировали целиком, после чего фиксировали в нейтральном 10% растворе формалина в течение 1 суток. После фиксации глазные яблоки разрезали на 3 колодки таким образом, чтобы зона индуцированной атрофии и подложка оказывались в центральной колодке. После стандартной гистологической проводки центральные колодки заливали в парафин. С парафиновых блоков готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Обзорное микроскопическое исследование проводили на микроскопе, оборудованном цифровой фотокамерой при увеличении х400.
Была проведена оптическая когерентная томография на обоих глазах с помощью Heidelberg Spectralis™ SD-OCT (Heidelberg Engineering, Германия) до оперативного вмешательства с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии. Далее определяемые сроки наблюдения - 2 день, 2 неделя, 1 месяц и 4 месяца после оперативного вмешательства.
Через 2 дня после оперативного вмешательства на ОКТ-изображении визуализировалась зона атрофии ретинального пигментного эпителия, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани, гиперрефлективная зона, соответствующая подложке с ИПСК-РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой и разрывом соответственно месту ретинотомии и локализации подложки. При проведении аутофлюоресенции глазного дна определялась зона гипераутофлюоресценции, соответствующая локализации подложки.
Через 2 недели, 1 месяц и 4 месяца после оперативного вмешательства, определялась подложка, плотно прилегающая к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки, отмечалось самопроизвольное закрытие разрыва. Исследование аутофлюоресценции глазного дна показало наличие зоны гиперфлюоресценции, соответствующей расположению подложки с ИПСК-РПЭ, окруженной ободком крапчатой гипофлюоресценции соответственно атрофии РПЭ.
Пример. Кролик №5. Была создана модель атрофии РПЭ, через 1 месяц проведена трансплантация ИПСК-РПЭ на подложке. Кролика подвергали эвтаназии спустя 4 месяца после имплантации и энуклеированные глаза отправляли на морфологическое исследование. На гистологическом срезе визуализируется подложка из полимерного материала, имплантированная на мембрану Бруха кролика (указана стрелкой). На поверхности полимерной подложки определяются имплантированные стволовые клетки РПЭ (обведены), склера обозначена звездочкой - Фиг. 1. До оперативного вмешательства была проведена оптическая когерентная томография на обоих глазах с целью визуализации зоны предварительно созданной атрофии - Фиг. 2. Далее определяемые сроки наблюдения - 2 день, 2 неделя, 1 месяц и 4 месяца после оперативного вмешательства. Через 2 дня после оперативного вмешательства на ОКТ-изображении визуализировалась зона атрофии ретинального пигментного эпителия и гиперрефлективная зона, соответствующая подложке с ИПСК-РПЭ с прилежащей к ней сетчаткой и разрывом соответственно месту ретинотомии и локализации подложки. При проведении аутофлюоресенции глазного дна определялась зона гипераутофлюоресценции, соответствующая локализации подложки с ИПСК-РПЭ окруженной ободком крапчатой гипофлюоресценции соответственно атрофии РПЭ - Фиг. 3. Через 2 недели, 1 месяц и 4 месяца после оперативного вмешательства определялась подложка, плотно прилегающая к сосудистой оболочке и структурам нейросенсорной сетчатки, отмечалось самопроизвольное закрытие разрыва - Фиг. 4. Проведенные исследования показали, что при трансплантации ИПСК-РПЭ, фиксированных в виде монослоя на подложке толщиной 50 мкм, полученной методом электроспиннинга и состоящей на 50% из нановолокон гидрофильного полиуретана и на 50% из желатина отмечается положительный эффект трансплантации подложки с ИПСК-РПЭ на функциональную активность сетчатки в глазах с атрофией. Имплантируемая подложка правильно интегрирована и обеспечивает основу для адгезии стволовых клеток РПЭ в поляризованном монослое, что в последующем сказывается на их дальнейшем приживлении и функционировании. Таким образом, данный способ позволяет усовершенствовать технологии трансплантации ИПСК-РПЭ на доклинических этапах исследования, что открывает новые перспективы в лечении дегенеративных заболеваний сетчатки и возможности персонифицированного подхода.