Р53 и TGFß регулируют экспрессию эмбриональной изоформы HNF4 в клетках гепатомы человека

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ 63

УДК 616.36-006.6:577.95

D.V. Alpern’2, M.V. Makarova1, O.A. Chernobelskaya1, D.I. Fleishman1, N.L. Lazarevich1

TRANSCRIPTION REGULATION OF EMBRYONIC ISOFORM OF HNF4 IN HUMAN HEPATOMA CELL LINE BY P53 AND TGFp

1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2Virology Department, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow

ABSTRACT

We study the role of p53 and Transforming growth factor P (TGFP) in transcriptional regulation of Hepatic nuclear factor 4 (HNF4a), which is regarded as the principal contributor in the process of liver cell differentiation and organogenesis. It was shown earlier that fail of HNF4a expression is associated with HCC progression both in mouse and human, while restoration of its functions leads to partial reversion of malignant phenotype. For this reason revealing of precise mechanisms of HNF4a transcription regulation could bring to better understanding of molecular basis of hepatocancerogenesis. We have found that expression of HNF4a7 isoform, specific marker of embryonic liver and dedifferentiated hepatomas, is induced in liver of adult p53 knockout mice and in HepG2 cells expressing shRNA for p53. Moreover activation of TGFp pathway in HepG2 leads to induction of alternative promoter that result in expression of HNF4a7.

Key words: liver, hepatic nuclear factor (HNF), hepatocellular carcinoma (HCC), differentiation, p53, transforming growth factor (TGFP).

Д.В. Алъперн’2, М.В. Макарова1, O.A. Чернобелъская1, Д.И. Флейшман1, Н.Л. Лазаревич1

P53 И TGFP РЕГУЛИРУЮТ ЭКСПРЕССИЮ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ИЗОФОРМЫ HNF4 В КЛЕТКАХ ГЕПАТОМЫ ЧЕЛОВЕКА

1ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Кафедра Вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

РЕЗЮМЕ

Работа посвящена изучению роли онкосупрессора р53 и трансформирующего фактора роста (TGFP) в регуляции экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора 4 (HNF4a), играющего ключевую роль в органогенезе и дифференцировке клеток печени. Ранее мы установили, что нарушение экспрессии HNF4a ассоциировано с прогрессией гепатоцеллюлярных раков мыши и человека, а восстановление функции этого фактора ведет к частичной реверсии злокачественного фенотипа. По этой причине изучение механизмов регуляции транскрипции гена HNF4a представляется важным для понимания молекулярных механизмов гепатоканце-рогенеза. Мы обнаружили, что в печени взрослых мышей и в клетках гепатомы человека инактивация опухолевого супрессора р53 приводит к индукции синтеза альтернативной изформы HNF4a, специфичной для эмбриональных клеток печени и дедифференцированных гепатом. Кроме того, в клетках гепатомы человека HepG2 активация промотора, ответственного за экспрессию дедифференцировочной изоформы HNF4a, может быть индуцирована факторами семейства TGFP.

Ключевые слова: печень, гепатоцитарный ядерный фактор (ГЯФ), гепатоцеллюлярная карцинома, диф-ференцировка, p53, трансформирующий фактор роста (TGFP).

ВВЕДЕНИЕ

В процессе развития и дифференцировки в клетке происходит интеграция многочисленных сигнальных путей, сложное взаимодействие которых позволяет

реализовать тонкую регуляцию экспрессии респон-сивных генов в ответ на внеклеточную стимуляцию. В настоящее время достаточно глубоко изучены многие сигнальные каскады и системы взаимодействий

транскрипционных факторов, регулирующих отдельные этапы клеточного цикла. Однако для формирования целостной картины событий, происходящих в клетке во время дифференцировки или, наоборот, развития злокачественного фенотипа, необходимо проследить, каким образом осуществляется взаимодействие ключевых регуляторов клеточного цикла с факторами, направляющими дифференцировку клетки в соответствии с ее тканевой специализацией.

Гепатоцитарные ядерные факторы - это группа семейств транскрипционных белков, которые образуют сложную систему взаимной регуляции и контролируют дифференцировку клеток печени [11]. Одним из центральных компонентов этой регуляторной сети является фактор HNF4a, генетический нокаут которого летален для мышиных эмбрионов [6]. В процессе нормального развития HNF4a определяет дифферен-цировку и морфогенез гепатоцитов.

Транскрипция гена HNF4a осуществляется с 2 независимых промоторов - Р1 и Р2, в результате активности которых образуются 2 группы изформ - соответственно HNF4a1 и HNF4a7 [3]. Эти группы различаются по способности активировать транскрипцию респонсивных генов, именно это обусловливает изменение спектра их экспрессии в различных органах и в зависимости от стадии онтогенеза. В эмбриональной печени доминирует изоформа HNF4a7, которая после рождения замещается изоформой HNF4a1.

Снижение уровня экспрессии HNF4a наблюдается примерно в 70 % гепатокарцином человека [1]. Падение экспрессии HNF4a при прогрессии гепатокарци-ном имеет принципиальное значение, так как приводит к дедифференцировке клеток и утрате эпителиальной морфологии, в то время, как восстановление его экспрессии в клетках линии дедифференцированной гепа-томы вызывает частичную реверсию злокачественного фенотипа и снижает скорость пролиферации опухолевых клеток [9]. Было показано, что HNF4a7 гиперэкс-прессирован во всех образцах гепатом мышей, которые по морфлогическим и биохимическим маркерам были определены как высокодифференцированные. Таким образом, экспрессия HNF4a7 свидетельствует о частичной дедифференцировке уже на ранних этапах опухолевой трансформации [1]. Однако механизмы, определяющие регуляцию экспрессии гена HNF4a, изучены недостаточно. По-видимому, подавление экспрессии HNF4a в дедифференцированных гепатокарциномах определяется действием негативных регуляторных факторов.

Настоящее исследование посвящено изучению роли опухолевого супрессора р53 и трансформирующего фактора роста бета (TGFP) в регуляции экспрессии гена HNF4a. Оба указанных фактора регулируют нормальный клеточный рост, а нарушения функций сигнальных путей, регулируемых TGFP или р53, увеличивают вероятность возникновения опухолей.

Транскрипционный фактор р53 функционирует как опухолевый супрессор, влияя на экспрессию генов регуляторов клеточного цикла, а также различных

дифференцировочных факторов [17]. Его инактивация наблюдается более, чем в половине всех опухолей.

Ранее было показано, что в печени мышей, нокаут-ных по р53, значительно повышается количество овальных клеток, морфологически схожих с гепатобла-стами - эмбриональными низкодифференцированными предшественниками гепатоцитов [8].

Цитокин TGFP известен своим плейотропным эффектом, он играет важную роль в регуляции клеточного цикла и таких процессов, как размножение клеток, диф-ференцировка, апоптоз и образование внеклеточного матрикса. Его роль в канцерогенезе противоречива, однако большинство исследователей сходятся во мнении, что TGFP подавляет рост и способность клеток к мета-стазированию в дифференцированных опухолях, но оказывает противоположное действие на низкодифференцированные инвазивные опухоли [15]. Показано, что TGFP ассоциирован с прогрессией гепатокарцином и индукцией эпителиально-мезенхимального перехода [9].

Целью нашей работы стало исследование возможной роли p53 и TGFP в регуляции экспрессии гена HNF4a. Мы показали, что в печени р53-/- мышей происходит индукция экспрессии гена HNF4a7 наряду с репрессией HNF4a1. Эксперименты на клетках культуры гепатомы человека HepG2, в которых экспрессия р53 была подавлена при помощи малых интерферирующих РНК, подтвердили наши данные об активации экспрессии гена HNF4a7 в отсутствии р53. Мы предположили, что эффект, оказываемый р53 на экспрессию HNF4a7, может быть связан с его действием на альтернативный промотор этого гена. Для проверки данной гипотезы мы клонировали фрагмент регуляторного района гена HNF4a7 размером 1000 п.н. в экспрессирующий вектор с люциферазным репортером и обнаружили, что в отсутствии р53 его активность увеличивается в 3 раза. Мы также показали, что индукция экспрессии HNF4a7 под действием TGFP также связана с активацией промотора Р2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование и трансфекция клеток линии HepG2

Клетки гепатомы человека HepG2 культивировали в среде DMEM (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone), глютамина (300 мкг/мл), пирувата натрия (110 мкг/мл), десятикратной смеси заменимых аминокислот (Sigma) и антибиотика ципрофлоксацина (10 мкг/мл) в атмосфере 5% СО2 при температуре 37 °С. Приблизительно 1 раз в 5-7 дней клетки обрабатывали трипсином и пересеивали. Трансфекцию эукариотических клеток линии HepG2 проводили с использованием трансфицирующего липосомного реагента Fugene (Roche). Для этого среду без антибиотика смешивали с реагентом Fugene, распределяли по пробиркам, в которые добавляли трансфицируемые плазмиды, и инкубировали в течение 15 мин. Полученную смесь вносили в чашки с клетками и инкубирвали в течение 24-48 ч. Для выравнивания результатов измерений активности люци-

феразы все клетки вместе с исследуемыми или контрольными плазмидами ко-трансфицировали плазмидой pRL-TK (Promega), кодирующей белок рениллу -люциферазу из организма Renilla reniformis.

Клетки исходной линии HepG2 и ее сублинии, инфицированной вектором pLSL-shp53GFP (экспрессирует миРНК к р53, любезно предоставлен профессором П.М. Чумаковым, Институт молекулярной биологии РАН), высевали на 24-луночные плашки в количестве 150 тыс. клеток на лунку. После инкубации в течение суток клеткам заменяли среду и проводили трансфекцию репортерными конструкциям.

Выделение РНК

Суммарную клеточную РНК из образцов тканей мышей или культур клеток выделяли при помощи набора для выделения РНК «Wizard SV Total RNA Isolation System» (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Ткани предварительно измельчали в парах жидкого азота в охлажденном гомогенизаторе Поттера. Качество полученной РНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле, а концентрацию измеряли спектрофотометрически.

Полимеразная цепная реакция

С полученных РНК ставили реакцию ОТ: 3 мкг РНК смешивали с 0,1 мкг случайных гексамерных олигонуклеотидов (Синтол), денатурировали при 65 °С и охлаждали на льду, затем добавляли ОТ-смесь (2 ед. обратной транскриптазы MMLV (Promega), буфер, 2 мМ дитиотритола, 0,5 ед. ингибитора рибонуклеаз и смесь дезоксинуклеотид-трифосфатов (ДНФ), по 0,5 мМ каждого) и проводили реакцию ОТ при 42 °С 30 мин, затем останавливали ОТ инактивацией ревертазы при 94 °С 5 мин и доводили объем смеси до 100 мкл.

В состав ПЦР смеси входили: 1 мкл рабочего раствора специфических праймеров (0,5 мкМ) к соответствующим генам [10], 2,5 ед. Tag-

полимеразы (Биомастер, 10000 ед/мкл), 2,5 мкл 10Х Tag-буфера без MgCl2 (Биомастер), 2,5 мМ MgCl2, 250 мкг/мкл каждого из ДНФ, 5 мкл смеси, полученной после ОТ, ^О до конечного объема 25 мкл. Для проведения ОТ-ПЦР использовали амплифика-тор T3 Thermocycler (Biometra). Проводили первичную полную денатурацию (94 °С, 3 мин), каждый из ПЦР циклов включал этапы денатурации (94 °С, 50 с), отжига праймеров (1 мин) и элонгации (72 °С, 1 мин); по окончании реакции проводили полное достраивание продукта (72 °С, 10 мин). Далее продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 1,5%-ном агарозном геле, результаты документировали с помощью фотодокументирующей системы гелей DIGI DOC-IT (UVP). Для проверки достоверности результатов ПЦР повторяли трижды, для этого использовали РНК, которую выделяли из печени нескольких животных.

Клонирование промотерного участка HNF4a7

Геномную ДНК из нормальной печени мыши линии BDF-1 выделяли по стандартному протоколу и обрабатывали эндонуклеазой рестрикции HindIII. Для амплификации фрагмента размером 960 п.о. использовали высоко процессивную ДНК полимеразу с 5’-корректирующей активностью Pwo (Roche). Амплификацию проводили в 2 этапа с использованием специфических праймеров. Праймер, отжигавшийся в 5’ области, 5’-TTGGTACCACAGAGCACCACGCATAGTAGG-3’, содержал сайт рестрикции для эндонуклеазы KpnI; 2-й праймер, 5’-CGCGTTCACACTGACCATGA-3’ был полностью комплиментарен цепи матричной ДНК. 2-й сайт KpnI находился внутри амплифици-руемой последовательности. ПЦР с 1 нг геномной ДНК вели в объеме 25 мкл, с 25 циклами полимеризации, увеличивая время элонгации каждые 10 циклов. Затем из реакционной смеси отбирали аликвоту 250 нг, которую использовали для проведения 2-го раунда ПЦР. После 8 циклов амплификации ПЦР-продукт объемом 100 мкл переосажда-ли этанолом и обрабатывали эндонуклеазой KpnI. При этом от фрагмента ДНК размером 967 п.о. с обоих концов отщеплялись фрагменты разной длины, в результате чего мы получили фрагмент регуляторного района промотора Р2 размером 934 п.о.

Вектор pGL3-Basic (Promega), содержащий репор-терный ген люциферазы из Photinus pyralis без собственного промотора, обрабатывали рестриктазой KpnI, переосаждали и обрабатывали фосфатазой креветки SAP (Fermentas).

Реакцию лигирования вектора pGL3-Basic c ам-плифицированным регуляторным участком HNF4a7 вели в объеме 10 мкл в молярном соотношении 1:3 или 1:5. Полученной смесью трансформировали клетки E. coli и высеивали на чашки с питательной средой LB, содержащей ампициллин. На последнем этапе проводили скрининг колоний методом ПЦР и рестрикционным анализом. Чтобы убедится, что вставка, клонированная в репортерную плазмиду, не содержит ошибок, было проведено секвинирова-ние вставки из отобранных после скрининга колоний. Для этого использовали сиквенсные праймеры 5’-CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCC-3’ и 5’-CAAAATAGGCTGTCCCCAGT-3’, отжигавшиеся на последовательности плазмиды, фланкирующие вставку с противоположных сторон. Секвенирова-ние проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Секвени-рование не выявило ошибок в клонированной последовательности по сравнению с последовательностью промотерного участка гена HNF4a7 (AF015275.1), содержащейся в геномном банке NCBI.

Анализ активности репортерного гена люциферазы

Активность люциферазы измеряли с помощью набора Dual-Lucifarase Reporter Assay System (Promega) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Система позволяет одновременно измерять свечение 2 различных белков: продукта гена люциферазы светлячка, кодируемого последовательностью в векторе pGL3-Basic, и продукта гена люци-феразы Renilla reniformis, находящегося в векторе pRL-TK. По степени свечения продукта люциферазы Renilla reniformis можно выравнивать образцы друг относительно друга.

Лизис клеток проводили в 100 мкл однократного лизирующего раствора (Passive Lysis Solution, Promega) в течение 15 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере. 20 мкл клеточного лизата вносили в центрифужную пробирку, в которую предварительно помещали 80 мкл раствора для определения активности люциферазы. Перемешивали 2-3 раза пипетированием, переносили в люминометр (Turner BioSystems) и измеряли интенсивность свечения лю-циферазы. В ту же пробирку добавляли раствор для измерения активности рениллы, быстро перемешивали и помещали в люминометр для измерения интенсивности свечения рениллы.

Флюоресцентная окраска препаратов

Для получения флюоресцентно окрашенных препаратов в качестве 1-х антител использовали моноклональные антитела мыши к р53 дикого типа человека (DO-1, Sigma) в разведении 1/100; моноклональные антитела мыши к HNF4a7 (H6939) или HNF4a1 (K9218) человека в разведении 1/200 (R&D systems). В качестве 2-х антител использовали антитела козла к IgG мыши с флюоресцентной меткой Alexa-Flour 488 (Invitrogen) в разведении 1/200. После фиксации клеток метанолом (20 мин, -20 °С), их инкубировали 30 мин в 1-х антителах, трижды промывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и инкубировали 30 мин со 2-ми антителами. После отмывки раствором ЗФР препараты заключали в эльванол под покровные стекла и высушивали. Препараты хранили при 4 °С в темноте.

РЕЗУЛЬТАТЫ^ В печени взрослых р53_/_ мышей происходит активация экспрессии эмбриональной изоформы HNF4a7

Для проверки предположения о возможном участии р53 в регуляции процесса дифференци-ровки клеток печени мы решили сравнить уровни экспрессии гепатоспецифических генов в нормальных и нокаутных по гену р53 мышах. Нока-утные р53—- мыши были любезно предоставлены профессором Б.П. Копниным, лаборатория цитогенетики НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Из образцов тканей печени и мышцы нормальных и нокаутных по гену р53 мышей линии C57BL [16] выделяли тотальную РНК и проводили ОТ-ПЦР. Для подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase), который примерно одинаково экспрессируется во всех типах тканей. Были исследованы уровни экспрессии функциональных генов и транскрипционных факторов печени: алъфа-

фетопротеина (АФП), алъбумина, HNF4a, HNFla, HNF1P FoxAl, FoxA2, HNF6, FTF (рис. 1). Анализ экспрессии повторяли троекратно, для этого использовали образцы тканей нескольких животных.

p53'- p53+,+

ЄАРОН АФП

Альбумин НМР4а НМР4а7 НМР4а1 НМР1а н^ір РохА1 РохА2 Н№6 РТР

Рис. 1. Анализ экспрессии гепатоспецифических генов в печени р53-/- мышей методом ОТ-ПЦР:

р53-/- - печень и мышца мышей, нокаутных по гену

р53і+

р53+/+ - печень и мышца нормальной взрослой мыши.

Реакцию с праймерами к гену ОАРБИ использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию; контроль - негативный контроль (ПЦР без обратной транскрипции).

Мы обнаружили, что экспрессии гена онкоэм-брионального белка АФП в печени взрослых р53--мышей так же, как и во взрослой печени нормальных мышей, не наблюдается. Эти данные противоречат предположению D.S. Wilkinson et al. о том, что белок р53 является репрессором транскрипции гена АФП в клетках нормальной печени мыши. Согласно исследованиям этих авторов белок р53 определяет постна-тальную репрессию гена АФП, а реактивация этого

гена в опухолях связана с изменением трансактивационных свойств белка р53, который конкурирует с ге-патоцитарными ядерными факторами за сайты связывания в промоторе гена АФП [19]. В этом случае в печени р53-/- мышей можно было бы ожидать значительного увеличения базального уровня транскрипции гена АФП. Отсутствие различий в уровне его транскрипции между образцами нормальной и р53-/- печени указывает на то, что р53 не является центральным регулятором экспрессии гена АФП в этой системе.

В этой серии экспериментов наиболее значимым изменением транскрипционной программы при инактивации р53 оказалась активация во взрослой печени р53-/- мышей транскрипции эмбриональной изоформы НОТ4а7. Согласно литературным данным в нормальной взрослой печени на долю эмбриональных изоформ приходится не более 1 % суммарного количества НОТ4а [3]. Наряду с активацией транскрипции НОТ4а7 в печени р53-/- мышей произошло снижение уровня РНК НОТ4а1. Этот факт может указывать на участие белка р53 в регуляции экспрессии гена ИНГ4а, печеньспецифического транскрипционного фактора, занимающего центральное место в контроле диффе-ренцировки гепатоцитов [11]. Следует отметить, что суммарный уровень РНК обеих изоформ НОТ4а остался неизменным. На уровень экспрессии других функциональных генов печени, таких, как альбумин, ИШ1 а, ИШ1 /3, БохА!, БохА2, ШГв и ПБ, нокаут р53 существенного влияния не оказал.

Активация экспрессии эмбриональной формы белка НОТ4а7 в печени нокаутных по гену р53 мышей представляется значимой по нескольким причинам. Во-первых, ранее в нашей лаборатории была описана активация НОТ4а7 на ранних этапах гепато-канцерогенеза [10]. Активация экспрессии НХР4а7, наблюдаемая в абсолютном большинстве образцов опухолей печени мыши и человека, позволяет рассматривать этот фактор как возможный маркер гепа-токанцерогенеза [1].

Инактивация р53 является частым событием при гепато канцерогенезе. Можно предположить, что р53 участвует в контроле дифференцировки гепатоцитов, подавляя экспрессию эмбриональной изоформы транскрипционного фактора НОТ4а в печени, которая отвечает за активацию генов, характерных для незрелых предшественников гепатоцитов [3]. В таком случае нарушение функции р53 могло бы стать причиной активации экспрессии эмбриональной изоформы НОТ4а7 при канцерогенезе и частичной дедифферен-цировке опухолевых клеток.

Инактивация р53 в культуре клеток HepG2 при помощи ми-РНК приводит к индукции экспрессии HNF4а7

Для проверки гипотезы о возможном влиянии подавления р53 на уровень экспрессии НОТ4а7 в клетках гепатоцитарного происхождения мы решили провести эксперименты по инактивации р53 в клетках

культуры гепатомы человека HepG2 и оценить уровни транскрипции 2 групп изформ НОТ4а. По литературным данным, в клетках HepG2 экспрессируется р53 дикого типа [2]. При помощи лентивирусной инфекции мы ввели в клетки линии HepG2 вектор pLSL-shp53GFP, кодирующий малые интерферирующие РНК к гену р53 и содержащий ген устойчивости к пуромицину. После инфекции проводили селекцию трансформированных клеток в среде, содержащей 2 мкг/мл пуромицина, в течение 5 дней. В норме ген р53 экспрессируется в клетках конститутивно, однако белок подвергается протеасомной деградации. Он накапливается в ответ на повреждение ДНК или другие стрессовые воздействия. Для проверки эффективности подавления синтеза р53 миРНК проводили иммуноф-люоресцентное окрашивание контрольных и трансформированных pLSL-shp53GFP клеток антителами к р53. Клетки инкубировали в среде с 0,5 мкг/мл доксо-рубицина, ДНК интеркалирующего агента, вызывающего накопление белка р53 в клетке в течение 24 ч. После этого препараты фиксировали метанолом, подвергали иммунофлюоресцентному окрашиванию с антителами к р53 и проводили подсчет количества окрашенных клеток. Эффективность подавления синтеза р53 в клетках, трансформированных pLSL-shp53GFP, по отношению к контрольным составила примерно 70 %.

Иммунофлюоресцентную окраску клеток на изоформы НОТ4а проводили с использованием антител к НОТ4а1, распознающих изоформы, транскрибирующиеся с промотора Р1, и НОТ4а7 - для изоформ, контролируемых промотором Р2 (рис. 2). Было обнаружено, что подавление функции р53 вызывает значительное увеличение количества клеток, синтезирующих НОТ4а7, в то время, как в контрольных клетках синтез эмбриональной изформы НОТ4а выявляется лишь в небольшом проценте клеток. Необходимо отметить, что уровень синтеза взрослой изоформы НОТ4а1 в клетках гепатомы HepG2 не зависел от экспрессии р53. Вероятнее всего это объясняется нарушением в клетках гепатомы какого-то сигнального пути, реализующемся в репрессии промотора Р1.

Снижение уровня р53 вызывает активацию промотора Р2 в культуре клеток HepG2

Транскрипция эмбриональных изоформ НОТ4а происходит с альтернативного промотора Р2 [3]. Чтобы проверить, влияет ли нарушение функции р53 на уровень экспрессии эмбриональной изоформы НОТ4а7 в опухолевых клетках через активацию соответствующего промотора, мы решили выяснить, будет ли инактивация р53 в культуре клеток HepG2 приводить к изменению транскрипционной активности Р2. Для этого мы клонировали промоторный участок НОТ4а7 мыши в экспрессирующий вектор pGL3-Basic (Promega), содержащий репортерный ген люци-феразы, и трансфицировали ее в клетки линии гепа-томы человека HepG2 с инактивированным при по-

68 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Рис. 2. Иммунофлюоресцентное окрашивание антителами к p53 HNF4a7 и HNF4a1 клеток гепатомы человека HepG2 (левая панель) и их производных с подавленным при помощи миРНК синтезом р53 (правая панель):

Окрашивание клеток антителами к р53 проводили с предварительной индукцией этого белка доксоруби-цином (0,5 мкг/мл) в течение 24 ч. Увеличение х200, врезки в правом верхнем углу - увеличение х400.

Рис. 3. Влияние инактивации р53 на активность регуляторного района НОТ4а7:

Изменение активности репортерного гена определяли как отношение активности люциферазы в опыте к активности в контрольном препарате, котрансфицированном той же репортерной конструкцией и вектором без миРНК. Представлены средние величины, полученные при анализе 6 проб в каждой группе эксперимента.

мощи малых интерферирующих РНК белком р53. Анализ уровней различных изоформ НОТ4а в клетках этой линии показал, что изоформа НОТ4а7 представлена в этих клетках в минорных количествах (рис. 2, 3).

В клетки вводили контрольный вектор pGL3-Bаsic, лишенный промотора, или вектор, содержащий исследуемый промоторный элемент pGL3-HNF4а7, который был сконструирован на основе pGL3-Bаsic. Измерение люциферазной активности проводили через 48 ч после трансфекции.

Инактивация р53 в клетках гепатомы человека HepG2 привела к усилению экспрессии репортерного гена в 3-4 раза (см. рис. 3). Таким образом, в клетках HepG2, как и в печени р53-/- мышей, при инактивации р53 происходит индукция транскрипции НОТ4а7, которая определяется регуляторным участком этого гена размером 934 п.о., который содержит альтернативный промотор Р2.

Биоинформатический анализ дистального регуляторного элемента Р2 мыши при помощи программного обеспечения Genomatics [5] не выявил присутствия сайтов связывания белка р53. Однако при проверке гомологичного фрагмента промотора гена НОТ4а7

человека нами был обнаружен сайт связывания белка р53. Указанная область в последовательности промотора мыши содержит несколько замен по сравнению с последовательностью регуляторного района человека, которые не позволяют программе достоверно определить этот участок как сайт связывания р53. Безусловно, однозначно интерпретировать полученные биоин-форматические данные нельзя, так как они нуждаются в экспериментальной проверке, однако они указывают на возможность связывания белка р53 с промотором Р2, которое обусловливает подавление его активности и снижение уровня экспрессии НОТ4а7.

Действие TGFpl и TGFp2 усиливает экспрессию репортерного гена под промотором НОТ4а7

Роль TGF3 в канцерогенезе до сих пор исследована недостаточно. Его повышенное содержание в крови пациентов с опухолями печени является неблагоприятным прогностическим маркером. В зависимости от внутриклеточного контекста он может выступать как в качестве опухолевого супрессора, так и в роли индуктора эпителиально-мезенхимального перехода и фактора, усиливающего инвазивность опухолевых клеток [9].

Для того чтобы выяснить, влияет ли активация сигнальных путей, регулируемых TGFp, на экспрессию гепатоцитарных ядерных факторов и маркеров дифференцировки печени, мы инкубировали клетки гепатомы HepG2 в присутствии 5 мкг/мл TGFpl или TGFp2 в течение 24 или 48 ч и анализировали экспрессию интересующих нас генов. Мы обнаружили, что эффект, оказываемый на культуру клеток гепато-мы HepG2 цитокинами семейства TGFp, сходен с изменениями, наблюдаемыми в печени р53-/- мышей -происходит активация экспрессии эмбриональной изоформы НХР4а7 и частичное подавление уровня экспрессии взрослой изоформы НХР4а1 (рис. 4).

Рис. 4. Анализ влияния цитокинов семейства TGFp на экспрессию ряда печеньспецифиче-ских генов в культуре HepG2 методом ОТ-ПЦР:

Клетки инкубировали в культуральной среде с 5 мкг/мл TGFpl (дорожки 1 и 3) и TGFp2 (дорожки 2 и 4) в течение 24 или 48 ч после чего из клеток выделяли РНК и проводили ОТ-ПЦР. Н/О - клетки, не обработанные цитокином. Реакцию с праймерами к гену ОАРБИ использовали для выравнивания количества РНК, взятого в реакцию.

гепатомы мы исследовали влияние TGFp на активность промотора Р2.

Клетки линии HepG2 были трансфицированы плазмидой pGL3-HNF4a7, несущей ген люциферазы под контролем промотора НОТ4а7 или контрольным вектором pGL3-Basic, не содержащим промотора. Ци-токины TGFpl или TGFp2 вносили в среду для культивирования до концентрации 5 мкг/мг через 24 ч после трансфекции и инкубировали в течение последующих 24 ч, после чего измеряли активность люциферазы. Оказалось, что цитокины TGFpl и TGFp2 усиливают активность промотора НОТ4а7 в 4,4 и 2,8 раза соответственно (рис. 5).

В литературе неоднократно упоминалось о возможности синергичного действия р53 и TGFp сигнальных путей [7]. Для проверки предположения о возможном участии TGFp-зависимого сигнального пути в регуляции экспрессии гена НОТ4а7 в клетках

Рис. 5. Действие цитокинов семейства TGFp на активность регуляторного района HNF4а7:

Измерение активности репортерного гена проводили относительно контролей - соответствующих плазмид, траснфицированных в клетки без добавления цитокинов TGFp.

Возможно, факторы семейства TGFP могут участвовать в контроле дифференцировочных процессов, регулируя экспрессию гепатоспецифических генов через изменение баланса гепатоцитарных транскрипционных факторов. Вопрос о том, как может осуществляться такая регуляция, пока остается открытым.

Анализируя последовательность промоторного участка гена HNF4a7 с помощью программы Genomatix, мы обнаружили в ней вероятные Smad-респонсивные элементы. Передача сигналов от TGFP-рецепторов осуществляется посредством белков семейства Smad, которые транслоцируются в ядро и, связываясь с регуляторными элементами в последовательностях ДНК, регулируют экспрессию респонсив-ных генов [13].

Продемонстрирована возможность специфического белок-белкового взаимодействия in vivo между р53

и Бшаё белками, а также способность р53 селективно усиливать экспрессию транскрипционных мишеней TGFp [7]. Реализация взаимодействия между белками р53 и Бшаё при связывании с ДНК приводит к тому, что они вносят совместный вклад в усиление транскрипции TGFp-респонсивных генов.

Однако наши данные свидетельствуют об обратной зависимости: инактивация р53 приводит к индукции экспрессии изоформы НОТ4а7, которую мы наблюдаем при действии TGFp. Таким образом, в исследуемой системе р53 не участвует в TGFp-зависимой активации транскрипции. Объяснений этому явлению может быть несколько. Во-первых, у млекопитающих существуют 2 функциональных гомолога белка р53 - р63 и р73. Эти белки начинают экспрессироваться в раннем эмбриогенезе, и их инактивация приводит к гибели эмбриона. В свою очередь, инактивация гена р53 у Хвпорж также приводит к гибели животного на ранних этапах эмбриогенеза. Таким образом, белки р63 и 73 принимают на себя часть функций р53 в раннем эмбриогенезе, именно поэтому р53-/- мышиные эмбрионы жизнеспособны. Можно предположить, что если кооперативная активация экспрессии НОТ4а7 действительно имеет место, в усиление действия TGFp вносят вклад именно эмбриональные трансактиваторы р63 и р73, тем более, что такая возможность была описана ранее [7]. Многочисленные данные указывают на то, что белок р63 участвует в поддержании низкодифференцированного состояния стволовых эпителиальных клеток [4; 14]. Кроме того, многие авторы склонны утверждать, что р53 участвует в TGFp-зависимой активации транскрипции лишь в некоторых типах клеток, в которых экспрессия р53 происходит на уровне, сравнимом с экспрессией р63 и р73 [12; 18].

В промоторе НОТ4а7 было выявлено несколько сайтов связывания различных транскрипционных факторов, влияющих на его активность. Ранее было показано, что гепатоцитарные ядерные факторы Н№6 и НОТ! в значительной степени усиливают экспрессию НОТ4а7 в печени, а кооперативное действие го-меобоксных белков рёх1 и НОТ 1а активирует экспрессию НОТ4а7 в поджелудочной железе. Есть данные о том, что изоформа НОТ4а1 выступает в роли транскрипционного репрессора НОТ4а7, связываясь с промотором Р2 [3]. Исследование экспрессии этих генов в р53-/- мышах и в культуре HepG2 при обработке цитокинами TGFp продемонстрировали корреляцию в изменении уровня их экспрессии: усиление транскрипции НОТ4а7 сопровождается снижением количества мРНК НОТ4а1. Эти данные подтверждают возможность негативной регуляции Р2 промотора белком НОТ4а1. Не исключено, что активирующее действие TGFp на Р2 промотор может быть опосредованно подавлением синтеза HNF4а1. Одновременно нельзя исключить возможности трансактивации изоформы НОТ4а1 белком р53, направленная инактивация которого ведет к индукции экспрессии НОТ4а7.

Данные о роли TGFp в регуляции дифференци-ровки в различных типах клеток достаточно проти-

воречивы. В дедифференцированных опухолях эпителиального происхождения TGFP способен индуцировать эпителиально-мезенхимальный переход [18]. Этот переход сопровождается утратой полярности, межклеточных контактов, дедифференцировкой и повышением инвазивности. Кроме того, TGFP осуществляет аутокринную стимуляцию, сопровождающуюся секрецией значительного количества ци-токина во внеклеточную среду. В этом аспекте активация экспрессии эмбриональной изоформы HNF4a7 выглядит закономерным явлением, так как она обеспечивает формирование дедифференцированного фенотипа.

Исходя из данных современных исследований очевидно, что гепатоканцерогенез обусловлен не нарушением какого-то отдельного регуляторного пути, а изменением сложной системы взаимодействий различных сигнальных каскадов и ростовых факторов (Wnt, HGF, IGF, TGFa, TGFP и др.), а также других регуляторных путей (р53, NFkB и др.). Детальное изучение механизмов регуляции этих взаимодействий представляется чрезвычайно значимым не только для получения целостной картины событий, происходящих в клетке в процессе развития, но и для выявления наиболее значимых нарушений и поиска мишеней, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях или для ранней диагностики опухолей.

Авторы выражают благодарность проф. Б.П. Копнину и П.М. Чумакову за предоставленные материалы и Е.В. Сухаревой за техническое обеспечение работ.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (07-04-01422 и 07-04-12151-офи) и грантом для поддержки ведущих научных школ РФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Флейшман Д.И. Морозова О.В., Лазаревич Н.Л. Экспрессия тканеспецифических генов в гепато-карциномах мыши различного уровня дифференци-ровки // Вестник Онкологического Научного Центра.

- 2008. - 19. - P. 22-7.

2. Bressac B., Galvin K.M., Liang T.J. et al. Abnormal structure and expression of p53 gene in human hepatocellular carcinoma // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.

- 1990. - 87. - P. 1973-7.

3. Briancon N., Bailly A., Clotman F. et al. Expression of the alpha7 isoform of hepatocyte nuclear factor (HNF) 4 is activated by HNF6/OC-2 and HNF1 and repressed by HNF4alpha1 in the liver // J. Biol. Chem. -2004. - 279. - P. 33398-408.

4. Brunner H.G., Hamel B.C., Bokhoven Hv H. P63 gene mutations and human developmental syndromes // Am. J. Med. Genet. - 2002. - 112. - P. 284-90.

5. Cartharius K., Frech K., Grote K. et al. Matln-spector and beyond: promoter analysis based on transcrip-

tion factor binding sites // Bioinformatics. - 2005. - 21. -P. 2933-42.

6. Chen W.S., Manova K., Weinstein D.C. et al. Disruption of the HNF-4 gene, expressed in visceral en-doderm, leads to cell death in embryonic ectoderm and impaired gastrulation of mouse embryos // Genes. Dev. -1994. - 8. - P. 2466-77.

7. Cordenonsi M., Dupont S., Maretto S. et al. Links between tumor suppressors: p53 is required for TGF-beta gene responses by cooperating with Smads // Cell. - 2003. - 113. - P. 301-14.

8. Dumble M.L., Knight B., Quail E.A. et al. Hepa-toblast-like cells populate the adult p53 knockout mouse liver: evidence for a hyperproliferative maturation-arrested stem cell compartment // Cell. Growth. Differ. -2001. - 12. - P. 223-31.

9. Fransvea E., Angelotti U., Antonaci S. et al. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells // Hepatology. - 2008. - 47. - P. 1557-66.

10. Lazarevich N.L., Cheremnova O.A., Varga E.V. et al. Progression of HCC in mice is associated with a downregulation in the expression of hepatocyte nuclear factors // Hepatology. - 2004. - 39. - P. 1038-47.

11. Lazarevich N.L., Fleishman D.I. Tissue-specific transcription factors in progression of epithelial tumors // Biochemistry (Mosc). - 2008. - 73. - P. 573-91.

12. Levrero M., De Laurenzi V., Costanzo A. et al. The p53/p63/p73 family of transcription factors: overlap-

ping and distinct functions // J. Cell. Sci. - 2000. - 113(Pt 10). - P. 1661-70.

13. Massague J. TGF-beta signal transduction // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - 67. - P. 753-91.

14. Mills A.A., Zheng B., Wang X.J. et al. p63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesis // Nature. - 1999. - 398. - P. 708-13.

15. Muraoka-Cook R.S., Dumont N., Arteaga C.L. Dual role of transforming growth factor beta in mammary tumorigenesis and metastatic progression // Clin. Cancer. Res. - 2005. - 11. - P. 937-43s.

16. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration // J. Biol. Chem. - 2003. - 278. - P. 27362-71.

17. Takebayashi-Suzuki K., Funami J., Tokumori D., et al. Interplay between the tumor suppressor p53 and TGF beta signaling shapes embryonic body axes in Xenopus // Development. - 2003. - 130. - P. 3929-39.

18. Valdes F., Alvarez A.M., Locascio A. et al. The epithelial mesenchymal transition confers resistance to the apoptotic effects of transforming growth factor Beta in fetal rat hepatocytes // Mol. Cancer. Res. - 2002. - 1.

- P. 68-78.

19. Wilkinson D.S., Ogden S.K., Stratton S.A. et al. A direct intersection between p53 and transforming growth factor beta pathways targets chromatin modification and transcription repression of the alpha-fetoprotein gene // Mol. Cell. Biol. - 2005. - 25. - P. 1200-12.

Поступила 16.06.2008.