ДНК-ЧИП ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОБЛИГАТНО-ПАТОГЕННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ

Область техники настоящей полезной модели
Настоящая полезная модель относится к области медицины, в частности, к диагностике инфекций, передаваемых половым путем.
Предшествующий уровень техники настоящей полезной модели
Ежедневно во всем мире около одного миллиона людей заболевают инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП). Среди ИППП выделяют «классические» инфекционные заболевания, вызываемые облигатными патогенами бактериальной природы (такие как сифилис, гонорея, урогенитальный хламидиоз), простейшими (трихомоноз), а также вирусами, которые также могут передаваться при половых контактах (генитальный герпес, вирус папилломы человека).
В диагностике ИППП в настоящее время ведущую роль играют микробиологические методы, такие как бактериоскопия и культуральное исследование. Данные методы позволяют осуществлять прямое определение возбудителя, изучать фенотипические свойства микроорганизмов, а также чувствительность патогенов к антимикробным препаратам. Однако применение микробиологических методов идентификации микроорганизмов имеет ряд недостатков: длительность анализа и трудоемкость в использовании, нестабильность качества диагностических наборов и питательных сред, связанная с отсутствием их стандартизации, субъективные критерии оценки результатов исследований, проведенных этими методами. Соблюдение всех условий, необходимых для культивирования облигатных патогенных микроорганизмов, часто оказывается недостижимым для бактериологических лабораторий дерматовенерологических лечебно-профилактических учреждений и исследовательских центров, где показатель эффективного роста этих микроорганизмов составляет 12-60% [Thayer, J. D., and J. E. Martin Jr. 1966. Improved medium selective for cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis. Public Health Rep. 81:559-562; Faur, Y. C., M.H.Weisburd, M.E.Wilson, and P.S.May P.S. 1973 A new medium for the isolation of pathogenic Neisseria (NYC medium).I. Formulation and comparisons with standard media. Health Lab. Sci. 10:44-54; Martin, J. E., J.H.Armstrong, and P.B.Smith. 1974. New system for cultivation of Neisseria gonorrhoeae. Appl. Microbiol. 27:802-805; Young, H. 1978. Cultural diagnosis of gonorrhoeae with modified New York City (MNYC) medium. Br.J. Vener. Dis. 54:36-40; Morello J.A., W.M.Janda, and G.V.Doern. 1991. Neisseria and Branhamella. In: Balows A et al., eds. Manual of clinical microbiology, 5th ed. Washington, DC, American Society for Microbiology, 258-276; Panke, E.S., L.I.Yang, P.A.Leist, P. Magevney, R.J. Fry, and R.F.Lee. 1991. Comparison of Gen-Probe DNA probe test and culture for the detection of Neisseria gonorrhoeae in endocervical specimens. J. Clin. Microbiol. 29:883-888; Young, H., and A.Moyes. 1996. An evaluation of pre-poured selective media for the isolation of Neisseria gonorrhoeae. J. Med. Microbiol. 44:253-260; Van Dyck, E., A.Z.Meheus, and P. Piot. Gonorrhoea. In: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. World Health Organization (WHO), Geneva; 1999: 1-21; Hook, E.W., and H.H.Handsfield. 1999. Gonococcal infections in the adult, p.451-466. In K.K.Holmes, P.A.Merdh, P.F.Sparling, S.M.Lemon, W.E.Stamm, P.Piot, and J.Wasserheit (ed.), Sexually Transmitted Diseases, 3rd ed. McGraw Hill Book Co., New York, N.Y.; Bignell, C. J.; European branch of the International Union against Sexually Transmitted Infection and the European Office of the World Health Organization. 2001. European guideline for the management of gonorrhoea. Int. J. STD. AIDS. 12 (suppl 3):P27-29; Janda W.M., and J.S.Knapp. 2003. Neisseria and Moraxella catarrhalis, p.585-608. In Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, et al., (eds.). Manual of clinical microbiology, 8th ed., vol.1. ASM Press, Washington, D.C., USA].
Большие затруднения возникают при культивировании в условиях бактериологической лаборатории возбудителя урогенитального хламидиоза, т.к. его культивирование требует проведения специального длительного и сложного исследования с использованием культур клеток [CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR, 2006, Vol.55. 100 p.; Banoo S, Bell D, Bossuyt P, Herring A, Mabey D, Poole F, Smith PG, Sriram N, Wongsrichanalai C, Linke R, O'Brien R, Perkins M, Cunningham J, Matsoso P, Nathanson CM, Olliaro P, Peeling RW, Ramsay A; TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec; 4 (12 Suppl):S20-32; Peeling RW., Smith PG., Bossuyt PMM. A guide for diagnostic evaluations. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec; 4 (12 Suppl):S 52-56].
С целью идентификации вируса герпеса проводят выделение вируса из крови, ликвора, содержимого везикул и других локусов (носоглотки, конъюнктивы) в культуре тканей. Чувствительность метода составляет 80-100%, специфичность - 100%. Длительность исследования составляет не менее 5 дней. Однако, вследствие трудоемкости и длительности подобных исследований, классическое вирусологическое исследование редко используется в практическом здравоохранении [Moseley RC, Corey L, Benjamin D, Winter C, Remington ML. Comparison of viral isolation, direct immunofluorescence, and indirect immunoperoxidase techniques for detection of genital herpes simplex virus infection. J Clin Microbiol. 1981 May; 13(5):913-8; Corey L, Holmes KK. Genital herpes simplex virus infections: current concepts in diagnosis, therapy, and prevention. Ann Intern Med. 1983b Jun; 98(6):973-83. Review; Lafferty WE, Krofft S, Remington M, Giddings R, Winter C, Cent A, Corey L. Diagnosis of herpes simplex virus by direct immunofluorescence and viral isolation from samples of external genital lesions in a high-prevalence population. J Clin Microbiol. 1987 Feb; 25(2):323-6; Koutsky LA, Stevens CE, Holmes KK, Ashley RL, Kiviat NB, Critchlow CW, Corey L. Underdiagnosis of genital herpes by current clinical and viral-isolation procedures. N Engl J Med. 1992 Jun 4; 326(23): 1533-9; Cone RW, Swenson PD, Hobson AC, Remington M, Corey L. Herpes simplex virus detection from genital lesions: a comparative study using antigen detection (HerpChek) and culture. J Clin Microbiol. 1993 Jul; 31(7): 1774-6; Slomka MJ, Emery L, Munday PE, Moulsdale M, Brown DW. A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes. J Med Virol. 1998 Jun; 55(2): 177-83; Langenberg AG, Corey L, Ashley RL, Leong WP, Straus SE. A prospective study of new infections with herpes simplex virus type 1 and type 2. Chiron HSV Vaccine Study Group. N Engl J Med. 1999; 341(19): 1432-8; Koenig M, Reynolds KS, Aldous W, Hickman M.Comparison of Light-Cycler PCR, enzyme immunoassay, and tissue culture for detection of herpes simplex virus. Diagn Microbiol Infect Dis. 2001 Jul; 40(3):107-10; Leach CT, Ashley RL, Baillargeon J, Jenson HB. Performance of two commercial glycoprotein G-based enzyme immunoassays for detecting antibodies to herpes simplex viruses 1 and 2 in children and young adolescents. Clin Diagn Lab Immunol. 2002 Sep; 9(5):1124-5; Scoular A. Using the evidence base on genital herpes: optimising the use of diagnostic tests and information provision. Sex Transm Infect. 2002 Jun; 78(3):160-5. Review; Subhan S, Jose RJ, Duggirala A, Hari R, Krishna P, Reddy S, Sharma S. Diagnosis of herpes simplex virus-1 keratitis: comparison of Giemsa stain, immunofluorescence assay and polymerase chain reaction. Curr Eye Res. 2004 Aug-Sep; 29(2-3):209-13].
Возбудитель сифилиса - бледная трепонема - является некультивируемым микроорганизмом; для его идентификации в исследуемом материале применяют достаточно субъективный и требующий высокой квалификации специалистов метод темнопольной микроскопии. [Овчинников Н.М. Бледная спирохета. В кн.: Венерические болезни: Рук-во для врачей). Под ред. М.П.Демьяновича, Н.М.Туранова. Москва: Медгиз; 1956: 451-465; Kennedy E.J., Creighton E.T. Darkfield microscopy for the detection and identification of Treponema pallidum. In Book: Manual of tests for syphilis. 9-th Ed. Washington: DC; 1998: 119-134; Петришина С.В. Лабораторная диагностика сифилиса. // Российский журнал кожных и венерических болезней 2004; 2:46-49; UK National Guidelines on the Management of Syphilis, 2008]. Метод ПЦР, применяемый рядом исследователей для идентификации бледной трепонемы, имеет пока лишь исследовательский статус [Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Г. Диагностика инфекционных заболеваний методом ПЦР. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 1993; 4:3-8; Артемьев М.И. и др. ПЦР-детекция Treponema pallidum в клинических материалах Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Москва; 1998; Гущин А.Е. и др. Выявление ДНК и РНК T.pallidum в плазме крови при различных стадиях сифилиса Вестник последипломного медицинского образования 2003; 2:53; Гущин А.Е. и др. Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике ранних форм сифилиса Вестник последипломного медицинского образования 2005; 1:65; Гущин А.Е. и др. Перспективы применения полимеразной цепной реакции у больных ранними формами сифилиса. Вестник дерматологии и венерологии 2009; 1:46-51; Burst J.M. et al. Sensitive Detection of Treponema pallidum by Using the Polymerase Chain Reaction. J Clin Microbiol 1991; 29(1):62-69; Grimpler E. et al. Use of polimerase chain reaction and rabbit infectivity testing to detect Treponema pallidum in amniotic fluid, fetal and neonatal sera, and cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1991; 29:1711-1718].
Следует также отметить, что при ИППП, в особенности в группах риска по заражению ИППП (лица, занимающиеся коммерческим сексом, мужчины, имеющие секс с мужчинами, социально неадаптированные подростки, лица, злоупотребляющие алкоголем, потребители инъекционных наркотиков) нередким является инфицирование сразу несколькими патогенными микроорганизмами [Козлова В.И., Пухнер А.Ф. Смешанные (ассоциированные) инфекции гениталий в кн.: Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий (Руководство для врачей) / М., 2003, С.359-365; Park J, Yoo S, Jung Y, Park E, Kwon S, Kim Y, Kirn I, Park K, Sul Y, Yu М, Lee KI, Chung BJ, Jo JH, Choi KS, Heo SJ. Trends of Sexually Transmitted Diseases during recent three years: among users of 11 Public Health Centers in Seoul. / J Korean Acad Fam Med. 1998 Feb; 19(2):150-166. Korean; I.M.C. Martin, C.A. Ison. Detection of mixed infection of Neisseria gonorrhoeae / Sex Transm Infect 2003; 79:56-58 doi:10.1136/sti.79.1.56; Kwasi Akyem Apea-Kubi, Shinya Yamaguchi, Bright Sakyi, Toshio Kisimoto, David Ofori-Adjei and Toshikatsu Hagiwara. Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis and Treponema pallidum Infection in Antenatal and Gynecological Patients at Korle-Bu Teaching Hospital, Ghana / Jpn. J. Infect. Dis., 57, 253-256, 2004].
Сочетанные поражения при ИППП, обусловленне несколькими облигатными патогенными микроорганизмами, нередко сопровождаются возникновением осложнений, изменением типичной клинической картины заболеваний, что, в свою очередь, вызывает трудности при установлении диагноза. При обследовании таких пациентов возможно одновременное выявление сразу нескольких облигатных патогенных микроорганизмов; при этом для лабораторного подтверждения диагноза требуется длительное время, связанное с применением культуральных методов исследования (при диагностике гонореи - не менее 1-2 суток; трихомониаза, урогенитального хламидиоза - не менее 2-5 суток) и различных методов исследования (бактериоскопия, культура, ПЦР).
Указанные недостатки микробиологических и других методов идентификации облигатных патогенов - возбудителей ИППП - потребовали поиска новых подходов, которые позволили бы:
- исключить из анализа стадию культивирования и, таким образом, сократить время идентификации патогенов;
- позволить осуществлять одновременную идентификацию ряда облигатных патогенов в одной пробе биологического материала.
Одним из перспективных подходов является идентификация возбудителей ИППП на ДНК-чипе, содержащем иммобилизованные на поверхности олигонуклеотидные зонды, специфичные к определяемым микроорганизмам.
Преимуществами использования ДНК-чипов для идентификации облигатных патогенов - возбудителей ИППП является:
- сокращение времени идентификации облигатных патогенных микроорганизмов за счет исключения из анализа стадии культивирования;
- возможность одновременной идентификации большого числа облигатных патогенов в биологическом материале за короткое время;
- уменьшение себестоимости комплексной идентификации возбудителей ИППП с использованием ДНК-чипов по сравнению с применением микробиологических методов;
- возможность предпочтительного использования технологии ДНК-чипов в лабораториях, применяющих для идентификации возбудителей ИППП только рутинные микробиологические методы, в особенности при отсутствии в этих учреждениях хорошо налаженной культуральной диагностики.
Раскрытие настоящей полезной модели
Сущность настоящей полезной модели заключается в едином формате исследования, позволяющем в короткие сроки (за один подход - в течение 6-и часов) в полученном от пациента биологическом материале одновременно идентифицировать 7 облигатно-патогенных микроорганизмов-возбудителей ИППП (Neisserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Herpes virus I, Herpes virus II), что позволяет повысить точность диагностики ИППП за счет расширения спектра определяемых патогенных возбудителей.
Способ предусматривает следующие стадии:
а) получение испытуемого образца биоматериала от пациента с подозрением на наличие ИППП;
б) выделение ДНК из испытуемого образца биоматериала стандартным способом;
в) амплификация генов-мишеней в испытуемом образце ДНК, полученном на стадии б), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением в состав продуктов амплификации олигонуклеотида, меченого флуорофором Су5 (Су5-dCTP). Последовательности праймеров даны в таблице 1
г) проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации, полученных на стадии в), на ДНК-чипе, представляющем собой микроскопный слайд с эпокси-модифицированной поверхностью с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными зондами, специфичными к каждому из определяемых микроорганизмов;
д) отмывку ДНК-чипа после окончания реакции гибридизации, проведенной на стадии г) и высушивание чипа;
е) регистрацию результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов;
ж) анализ полученных результатов сканирования с помощью программ, осуществляющих перевод флуоресцентных сигналов в цифровые коэффициенты.
В целях детекции указанных микроорганизмов в качестве генов-мишеней в пункте в) используют гены 16S РНК для Neisserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, фрагмент геномной ДНК Trichomonas vaginalis и ген тимидинкиназы для Herpes virus I, Herpes virus II.
В качестве положительного контроля гибридизации используют меченый продукт амплификации фрагмента генома фага λ, который гибридизуется с комплиментарным ему олигонуклеотидным зондом на микрочипе. В качестве отрицательного контроля проводят гибридизацию того же продукта с олигонуклеотидным зондом, содержащим 3 однонуклеотидных несовпадения в последовательности. В положительном контроле виден яркий сигнал, в то время как в отрицательном контроле сигнал должен быть на фоновом уровне.
Характеристика генов-мишеней микроорганизмов, праймеров для их амплификации и условий постановки ПЦР, представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Гены-мишени, использованные для амплификации выбранного спектра микроорганизмов, праймеры для их амплификации и условия постановки ПЦР
№№
Ген-мишень
Название праймера
Последовательность 5'-3'
Условия амплификации
Микроорганизм
1
16S ДНК
BAC-F
gactcctacgggaggcagcagt
29 циклов
Treponema pallidum
2
BAC-R
cgtattaccgcggctgctggca
95°С - 15 сек
Mycoplasma genitalium
3
lambda-F
ggtgaaattgccagtattct
68°С - 8 сек
Chlamydia trachomatis
4
lambda-R
cgggagatagtaattagcat
72°С - 15 сек
Neisseria gonorrhoeae
7
фрагмент геномной ДНК
T.V.-F
attgtcgaacattggtcttacc
29 циклов
Trichomonas vaginalis
8
T.V.-R
tctgtgccgtcttcaagtatgc
95°С - 15 сек
68°С - 8 сек
72°С - 15 сек
9
ген тимиди
Ger-F
ctgcgggtttatatagacg
30 циклов
95°С - 10 сек
Herpes virus I
10
нкиназы
Ger-R
cattgttatctgggcgct
56°С - 10 сек
Herpes virus II
72°С - 15 сек
ДНК-чип, на котором на стадии г) проводят реакцию гибридизации, содержит 12 ограниченных областей, каждая из которых включает 16 спотов (6 иммобилизованных зондов, соответствующих выбранным микроорганизмам, один зонд для ДНК фага λ и один отрицательный контроль в 2-х повторах по вертикали, см. рис 1 и таб.2). Одна ограниченная область предназначается для постановки одного анализируемого образца ДНК-пробы.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одной ограниченной области ДНК-чипа для одновременной идентификации облигатных патогенов-возбудителей ИППП у одного пациента, представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одном эррее
N.GON
CHL.TR
TR.PAL
T.VAG
HV-I
HV-II
M.GEN
N.GON
CHL.TR
TR.PAL
T.VAG
HV-I
HV-II
M.GEN
λ+
λ-
λ+
λ-
Примечание: M.GEN Mycoplasma genitalium, CHL.TR - Chlamydia trachomatis, N.GON - Neisseria gonorrhoeae, TR.PAL - Treponema pallidum, T.VAG - Trichomonas vaginalis, HV-I - Herpes virus I, HV-II - Herpes virus II
Исследование включает следующие стадии:
- выделение тотальной ДНК из образца биоматериала (с использованием набора для выделения «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия, № ФС 032а2002/0923-05));
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения меченых флуорофором Су5 продуктов амплификации фрагментов геномов выбранных микроорганизмов в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1;
- проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации геномов идентифицируемых микроорганизмов на ДНК-чипе;
- отмывка ДНК-чипа после окончания гибридизации и высушивание чипа;
- регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов и анализ полученных флуоресцентных сигналов на предмет наличия или отсутствия определяемых микроорганизмов в испытуемом биообразце.
Проведение полимеразной цепной реакции
2
Подготавливают 3 стерильные пробирки объемом 0,2 мл для приготовления проб для амплификации ДНК. Каждая пробирка содержит следующие реагенты: водный раствор трех нуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP) в концентрации 0,25 мкМ каждый (фирма «Силекс», Россия, кат №1310); нуклеозидтрифосфат dCTP в концентрации 0,2 мкМ (фирма «Силекс», Россия, кат №1310); нуклеозидтрифосфат dCTP, модифицированный Су5, в концентрации 0,05 мкМ (фирма «Синтол», Россия); два специфичных праймера, в концентрации 1 рМ каждый (фирма «Синтол», Россия); 1х ПЦР-буфер [раствор 0,66 М трис-HCl; 25 мМ MgCl (кат. № Т 6791, фирма «Sigma», США)]; 0.05 ед./мкл Taq-полимераза (фирма «Promega», США); 3 мкг испытуемой ДНК-пробы. В каждую пробирку добавляют деионизованную воду до конечного объема смеси 25 мкл. Далее пробирки закрывают и устанавливают в ПЦР-амплификатор. На амплификаторе запускают установленную программу (таблица 1). После окончания реакции амплификации пробирку вынимали из амплификатора.
Проведение реакции гибридизации
ДНК-чип вставляют в рамку-держатель для чипов. Сверху на чип надевают рамку-трафарет.
3
4
В одной стерильной пробирке объемом 0,5 мл смешивают содержимое трех пробирок, содержащих продукты амплификации фрагментов геномов идентифицируемых микроорганизмов и добавляют равный объем гибридизационного буфера (150 мМ NаРO, рН 8,5). Полученную смесь подвергают инкубации при 95°С в течение 3 мин с последующим быстрым охлаждением смеси при на льду в течение 2 мин после денатурации ДНК.
На поверхность одной ограниченной области ДНК-чипа вносят 40 мкл смеси денатурированных продуктов амплификации ДНК идентифицируемых микроорганизмов. Рамку-держатель закрывают крышкой. Чип инкубировали в термошейкере при температуре 42°С при вращении платформы 300 об/мин в течение 2 ч.
Регистрация и анализ результатов
После проведения анализа чип сканируют на многоканальном сканере для биочипов, активируя канал Су5. Сканированные изображения сохраняют в формате tif. Сканированные образы в формате tif открывают в специальной программе для последующей интерпретации изображения. Процедуру проводят согласно инструкции (описанию) к конкретному программному обеспечению. В данной программе вносят все необходимые параметры для точного наложения «сетки» по центру локализации спотов. Полученные результаты сохраняют в формате Excel.
Результат анализа считают валидным, если на чипе при сканировании на канале Су5 визуально наблюдают ярко флуоресцирующие споты в положениях, соответствующих положительному контролю и отсутствует сигнал в слотах с отрицательным контролем.
В заключение выдают качественный результат исследования: положительный - в случае наличия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце, отрицательный - в случае отсутствия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце.
Варианты осуществления настоящей полезной модели
Пример №1. У пациентки А. с подозрением на ИППП и с наличием соответствующих жалоб (выделения из половых путей, дизурия, наличие элементов эрозивно-язвенного характера с уплотнением в основании на гениталиях, сопутствующий регионарный-паховый-склераденит), стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы со слизистых оболочек урогенитального тракта и язвенных элементов на гениталиях). Идентификацию 7-и облигатно патогенных микроорганизмов в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.
В результате исследования биологического материала, полученного от пациентки, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Chlamydia trachomatis, T.pallidum. В результате проведенного клинико-лабораторного обследования установлен диагноз: сифилис первичный половых органов, хламидийная инфекция нижних отделов мочеполового тракта.
Пример №2. У пациента Б. с подозрением на наличие ИППП (жалобы на выделения слизисто-гнойного характера из уретры, учащение и боли при мочеиспускании, наличие мелких везикул и эрозий на головке полового члена) стандартным способом получали образцы биоматериала (соскобы со слизистых оболочек урогенитального тракта и с поверхности очагов поражения на коже). Идентификацию 7-и патогенных микроорганизмов - возбудителей ИППП в исследуемых биообразцах проводили в соответствии с предлагаемым способом.
В результате исследования биологического материала, полученного от пациента, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Herpes virus I, Herpes virus II.
На основании проведенного клинико-лабораторного обследования установлен диагноз: урогенитальный трихомониаз, хламидийная инфекция нижних отделов мочеполового тракта, герпетическая инфекция половых органов.