Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярногенетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИИ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

87

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для проведения молекулярно-генетической экспертизы по факту изнасилования в лабораторию поступили биоматериалы после проведенного медицинского аборта, установленный срок беременности 5 недель, а также образцы буккального эпителия потерпевшей и подозреваемого. Анализ отцовства усложнялся тем, что, согласно следственной версии, подозреваемый являлся биологическим отцом потерпевшей. В генетическом профиле эмбриона в данном случае предполагаются присутствие большого числа гомозиготных аллельных комбинаций. Также возможны гетерозиготные аллельные комбинации, совпадающие с аллельными комбинациями матери или отца.

Для исследования был представлен флакон, содержащий кашеобразный субстрат из крови с фрагментами мягких тканей. Содержимое банки было отфильтровано, промыто дистиллированной водой и помещено в чашку Петри. С учетом малых физических размеров эмбриона на ранних стадиях внутриутробного развития был проведен визуальный осмотр содержимого флакона для поиска фрагментов пуповины или зародышевых оболочек эмбриона. В результате визуального осмотра были выявлены два фрагмента тканевой структуры красного цвета, неравномерной окраски, в виде расслаивающихся тяжей около 2 мм в диаметре, длиной до 3—4 мм, которые могли являться фрагментами пуповины (объекты № № 1,2), и один фрагмент, имеющий вид полупрозрачной пленки 4х5 мм, который может являться фрагментом зародышевой оболочки эмбриона (объект № 3). Из обнаруженных фрагментов были сделаны вырезки. Остальные фрагменты по своему виду и структуре, вероятно, являлись свертками крови и фрагментами эндометрия.

ДНК из объектов выделяли с использованием набора PrepFiler ТМ Automated Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), на автоматической станции для выделения ДНК «AutoMate Express™ Forensic DNA Extraction System» (Applied Biosystems, США).

Анализ матричной активности ДНК из объектов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием системы количественной энзиматической амплификации Quantifiler Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США).

Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v.1.1 (Applied Biosystems, США).

Концентрация ДНК в препаратах из объектов № № 1,2 составила 82,8 и 46,6 нг/мкл, в препарате из объекта № 3—92,5 нг/мкл. Препараты ДНК были разведены до «рабочей» концентрации 0,1 нг/мкл.

Типирование полиморфных STR-локусов ядерной ДНК из объектов проводили с помощью полимеразной цепной реакции, используя наборы реагентов «AmpFlSTR Identifiler Plus' и «Globalfiler», производства фирмы «Applied Biosystems», США, в соответствии с прилагаемыми к наборам инструкциями. Реакцию амплификации проводили с помощью прибора «GeneAmp PCR system 9700» фирмы «Applied Biosystems», США. Разделение и детекцию флуоресцентно меченых амплифицированных фрагментов проводили с использованием прибора ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer и программного обеспечения производства фирмы «Applied Biosystems». Определение длин амплифицированных фрагментов и установление номеров аллелей проводили на основе внутренних стандартов длины (Size Standard GeneScan-600 LIZ) и входя-

щих в набор реагентов аллельных леддеров с помощью программного комплекса GeneMapper ID-Х.

В препаратах ДНК из объектов № № 1, 2 установлены генетические признаки потерпевшей.

В препарате ДНК из объекта № 3 установлен смешанный генетический профиль с доминированием генетических признаков потерпевшей. Минорный генетический компонент был представлен генетическим профилем эмбриона мужского генетического пола.

Нематеринские аллели в суммарном ДНК-профиле совпали с аллелями соответствующих локусов в генотипе подозреваемого. Наличие нематеринских аллелей только в 4 локусах из 21 связано с присутствием в генотипе эмбриона гомозиготных аллельных комбинаций и гетерозиготных аллельных комбинации, совпадающих с аллельными комбинациями матери. Такие данные подтверждают следственную версию о родстве на уровне родитель-ребенок между потерпевшей и подозреваемым.

Для подтверждения выявленного родства проводился анализ STR-маркеров Y-хромосомы (набор реагентов «AmpFISTR Y-Filer PCR AmplificationKit», производства фирмы «Applied Biosystems», США).

Гаплотип Y-хромосомы, выявленный в препарате ДНК из объекта № 3, полностью совпадает с гаплотипом Y-хро-мосомы подозреваемого.

ВЫВОДЫ

Таким образом, проведение молекулярно-генетиче-ской экспертизы абортивного материала, полученного на ранних сроках беременности (5 недель), возможно, хотя и сопряжено с определенными сложностями (сложность хранения биологического материала, необходимость дифференциально-морфологического анализа абортивного материала, отбор большого числа проб, анализ смешанных генетических профилей).

Возможности применения технологии лазерной микродиссекции биологических препаратов для молекулярно-генетического анализа хромосомной ДНК, методом электрофореза в пластинах полиакриламидного геля

• В. В. Рындин1, Т. А. Смагина1, к.б.н. А. Г. Кобылянский2, Д. Д. Марков2, д.м.н., проф. В. А. Клевно1

ТБУЗ МО «Бюро СМЭ»

2Центр клеточных и генных технологий федерального государственного бюджетного учреждения науки институт молекулярной генетики Российской академии

Аннотация: Статья посвящена изучению возможности типирования хромосомной ДНК по максимальному количеству STR-локусов в определенном количестве клеток, выделенных из биологических препаратов, методом лазерной микродиссекции. Определялась возможность применения этого метода для электрофореза в пластинах полиакриламидного геля. Установлено, что в виду недостаточной чувствительности использованного метода, он не может быть рекомендован к применению в молекулярно-ге-нетических лабораториях судебно-медицинских учреждений.

Ключевые слова: биологический препарат, лазерная микродиссекция, анализ хромосомной

журнал СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА наука | практика | образование

www.cудебная-медицина.рф • том 1 №2, апрель 2015