Особенности определения биоцидных свойств хитозанового полимера

УДК 544.165

С. Н. Куликов, Р. З. Хайруллин ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЦИДНЫХ СВОЙСТВ ХИТОЗАНОВОГО ПОЛИМЕРА

Ключевые слова: хитозан, биоцидная активность, химическая структура.

Рассмотрена биоцидная активность хитозана, а также особенности проведения экспериментов для ее определения. Показана необходимость наличия точной молекулярно-массовой характеристики образцов хитозана для правильной интерпретации полученных результатов.

Keywords: chitosan, biocide activity, chemical structure.

Considered biocidal activity of chitosan and especially the experiments to define it. The necessity of having precise molecular mass characteristics of the samples of chitosan for the correct interpretation of the results.

Определение антибактериальной активности веществ сводится к оценке их минимальной бактериостатической и/или минимальной

бактерицидной концентрации в отношении бактерий. Данная оценка проводится путем приготовлении в ёмкостях растворов исследуемых веществ различных концентраций, получаемых путем двукратных разведений в заранее подобранных буферных растворах с последующим добавлении в ёмкости бактериальной суспензии в жидкой питательной среде, инкубации при оптимальной для роста бактериальной культуры температуре и определению после завершения инкубации наличия или отсутствия роста культуры для оценки бактериостатического эффекта вещества и/или уменьшения количества живых клеток для оценки бактерицидного эффекта вещества.

При этом за минимальную бактериостатическую концентрацию вещества принимают ту минимальную концентрацию вещества при которой не наблюдается визуального роста бактериальной культуры - раствор не мутнеет, не появляется осадок из бактериальных клеток и т.п. За минимальную бактерицидную концентрацию принимают минимальную

концентрацию вещества при которой количество живых бактериальных клеток по сравнению с их количеством в первоначальном инокуляте уменьшается в 1000 и более раз (на 99,9 % и более) в зависимости от методических требований. Количество живых клеток определяют посредством посева аликвот суспензий на твёрдые питательные среды с последующим подсчётом выросших колоний.

Однако, имеющиеся на сегодня методы оценки минимальных бактериостатических и/или

минимальных бактерицидных концентраций веществ в отношении бактерий оказываются малопригодны для исследования антибактериальной активности хитозана, т.к. во-первых, биоцидные свойства хитозана сильно зависят от кислотности среды, что делает оценку антибактериальных свойств при одном значении рН неполной, во-вторых, молекулы хитозана, особенно его олигомерных и низкомолекулярных форм, могут различаться по значению рКа, что влечёт за собой различие в изменении антибактериальных свойств при перемене кислотности среды, в-третьих, наиболее удобная по диапазону рН и физиологически совместимая буферная система на основе солей фосфорной кислоты

не может быть использована, т.к. приводит к выпадению хитозана в осадок.

Многие из вышеприведённых особенностей физико-химических свойств хитозана, которые оказывают значительное влияние на проявление им биологической активности, в исследованиях практически не учитываются [1, 2].

Так, почти во всех работах для определения антибактериальных свойств было использовано только одно из значений рН [3-5]. Иногда берут два значения - кислое и близкое к нейтральному, как в случае определения антимикотической активности [6] или антибактериальных свойств [7]. Зачастую вообще не указывают значение рН раствора и наличие буферной системы [8]. Многие исследователи указывают только начальное значение рН, но не используют буферную систему, устанавливая определённый уровень кислотности в начале опыта [7]. Нередко при работе с бактериями используют растворы с слишком низким значением рН 4,0-5,0 [9], 5,3 [4], 5,5 [5,10], 5,6 [7], 5,8 [11]. Такой подход позволяет упростить работу с хитозаном и получить высокую эффективность антибактериального действия полимера, однако, не позволяет адекватно провести сравнительное исследование образцов, обладающих различной молекулярной массой и/или степенью дезацетилирования. Часто используют ацетатный буфер, который не позволяет создать эффективную буферную систему для нейтральных и щелочных сред [3, 4]. В редких случаях используют буфер на основе морфолинэтансульфоновой кислоты (MES) [5], который позволяет работать в широком диапазоне слабокислых значений. Нами было показано, что величина антибактериальной активности хитозана может сильно варьировать одновременно как от значения рН среды (от 5,5 до 8,0), так и от молекулярной массы образцов [12]. Для создания буфера, который мог бы обеспечить приемлемую стабильность уровня кислотности в диапазоне рН от 5,5 до 8,0 была использована буферная система на основе смеси органических кислот - MES, N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой (ACES) и 2-[трис(гидроксиметил)метиламино]-1 -этансульфоновой (TES) кислотах (рис. 1) [10, 13].

Использование комплексного MES-ACES-TES-Na буферного раствора позволяет проводить оценку биоцидной активности хитозана в широком диапазоне кислотности среды (рН от 5,5 до 8,0), который

недоступен для образования другими известными буферными системами на основе иных компонентов и подходящих для создания растворов хитозанового полимера без выпадения его в осадок.

0 1000 2000 3000 4000 5000 0,5 н. NaOH, мкл

0 1000 2000 3000 4000 5000 0,5 н. NaOH, мкл

0 1000 2000 3000 4000 5000 0,5 н. NaOH, мкл

0 1000 2000 3000 4000 5000 0,5 н. ЫаОН, мкл

Рис. 1 - Кривые титрования растворов органических кислот и их смеси раствором гидроксида натрия

Игнорирование особенностей варьирования физико-химических свойств хитозанового полимера при различной кислотности среды ведёт к результатам, в которых при использовании

единственного образца хитозана, не отражающего всё возможное разнообразие свойств этого полимера, констатируется отсутствие или незначительные антибактериальные свойства хитозана [14]. Тем не менее и такие результаты служат напоминанием об ограниченности свойств хитозанового полимера, а следовательно и возможностей его практического применения, а также невозможности a priori переносить проявление биологических свойств полимера в лабораторных опытах in vitro на использование в практической биотехнологии.

Сопоставление результатов по оценке антибактериальных и антимикотических свойств осложняется также отсутствием единства в выборе подходов к оценке антибиотических свойств полимера. Определяют количество выживших клеток в присутствии хитозана в динамике [4, 15], или рост биомассы в присутствии хитозана в среде [16], определяют минимальные ингибирующие и биоцидные концентрации. Также рядом исследователей использованы различные

концентрации клеток в начальном инокуляте: 104 [3], 105 [5], 106 [4], 107 [7] и даже 108 КОЕ/мл [17].

Серьёзной проблемой также является неполнота сведений о химической структуре взятых в эксперимент образцах хитозана, что приводит к трудностям в сопоставлении результатов, полученных разными авторами, а также не позволяет выяснить взаимосвязь физико-химических свойств полимера с его биологическими свойствами.

Так, в некоторых работах используется коммерчески доступные образцы, однако без указания молекулярной массы, но с указанием степени дезацетилирования [4, 18], либо с указанием молекулярных масс, но без указания степени дезацетилирования [19]. Некоторые авторы указывают молекулярную массу [20, 21], и/или вязкость хитозана [16], а также степени дезацетилирования. Некоторые исследователи в научных работах не приводят никаких характеристик используемого в работе хитозана или его производных [22, 23,], либо указываются неконкретные данные [24].

Многие экспериментаторы проводят исследования на сравнительно высокомолекулярных образцах (более 50 кДа) - 60 и 600 кДа [25], 70 кДа [6], 78 кДа [3], от 107 до 628 кДа [26], 140-310 кДа [5], 270 кДа [27], 300 кДа [28], 400 кДа [21], от 360 до 2506 кДа [29], от 521 до 1129 кДа [30], от 607 до 1129 кДа [31], 628 кДа [34] или с использованием олигомеров [15]. Значительно меньше работ с использованием низкомолекулярных форм хитозана с молекулярными массами менее 50 кДа [5, 26], и особенно менее 20 кДа [8], но более 2-3 кДа. В настоящее время практически отсутствуют работы по исследованию антибиотических свойств с использованием сразу нескольких образцов в диапазоне молекулярных масс от 2-3 до 20 кДа, т.е. диапазоне наиболее резких изменений физико-химических свойств хитозанового полимера при увеличении его степени полимеризации [12]. При использовании некоторых низкомолекулярных образцов хитозана можно наблюдать, что приведены неконкретные молекулярно-массовые характеристики образцов,

чаще всего в виде довольно широкого обозначения диапазона молекулярных масс [5, 8].

Немногочисленны работы по изучению биологической активности хитозанов, не относящихся к олигомерным формам, где приводятся более менее точные характеристики образцов, с подробными молекулярно-массовыми параметрами [3].

Таким образом, на основании проведённого анализа, можно сделать вывод о том, что хитозан, в отличие от классических антибиотических веществ, не имеет единственной мишени для своего действия, а его антибактериальный и противомикотический эффекты являются совокупностью нескольких возможных механизмов, складывающихся в сложный процесс, который приводит в конечном итоге к гибели клеток микроорганизмов. Фундаментальные исследования свойств хитозана и наночастиц на его основе, роли структуры в его биоцидной активности, позволят разрабатывать биотехнологию получения эффективных, безопасных и экологически безвредных биоцидных препаратов. Важным условием для успешного решения этой задачи является разработка и внедрение комплекса рекомендаций и стандартов, включающих в себя описание источников и способов получения хитозана, методики анализа физико-химических свойств образцов хитозана и подробную методологию проведения биологических

экспериментов.

Работа выполнена за счёт средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального

университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

Литература

1. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана/ С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Д.А. Долбин, Р.З. Хайруллин// Вестник Казанского технологического университета. -2007. -№6. -С.10-14.

2. Хайруллин, Р.З. Зависимость растворимости хитозана от молекулярной массы и значения рН среды/ Р.З. Хайруллин, С.Н. Куликов, В.Е. Тихонов, Е.А. Степанов, С.А. Лопатин, В.П. Варламов// Вестник Казанского технологического университета. -2010. -№7. -С.148-152.

3. Liu H., Du Y., Wang X., Sun L. 2004. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage. Int. J. Food Microbiol. 95, 147-155.

4. Helander I.M., Nurmiaho-Lassila E.L., Ahvenainen R., Rhoades J., Roller S. 2001. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria. Int. J. Food Microbiol. 71(2-3), 235-244.

5. Mellegard H., Strand S.P., Christensen B.E., Granum P.E., Hardy S.P. 2011. Antibacterial activity of chemically defined chitosans: influence of molecular weight, degree of acetylation and test organism. Int. J. Food Microbiol. 148(1), 48-54.

6. Alburquenque C., Bucarey S.A., Neira-Carrillo A., Urzua B., Hermosilla G., Tapia C.V. 2010. Antifungal activity of low molecular weight chitosan against clinical isolates of Candida spp. Med. Mycol. 48(8), 1018-1023.

7. Chung Y.C., Chen C.Y. 2008. Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan. Bioresource Technology. 99, 2806-2814.

8. Choi B.K., Kim K.Y., Yoo Y.J., Oh S.J., Choi J.H., Kim C.Y.

2001. In vitro antimicrobial activity of a chitooligosaccharide mixture against Actinobacillus actinomycetemcomitans and Streptococcus mutans. Int. J. Antimicrob. Agents. 18(6), 553557.

9. Chung Y., Su Y., Chen C., Jia G., Wang H., Wu J.C.G., Lin J. 2004. Relationship between antibacterial activity of chitosan and surface characteristics of cell wall. Acta Pharmacol. Sin. 25(7), 932-936.

10. Zheng L.-Y., Zhu J.-F. 2003. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights. Carbohydrate Polymers. 54, 527-530.

11. Eaton P., Fernandes J.C., Pereira E., Pintado M.E., Xavier Malcata F. 2008. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy. 108(10), 1128-1134.

12. Kulikov S., Tikhonov V., Blagodatskikh I., Bezrodnykh E., Lopatin S., Khairullin R., Philippova Y., Abramchuk S. 2012. Molecular weight and pH aspects of efficacy of oligochitosan against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Carbohydrate Polymers. 87, 545-550.

13. Куликов С.Н., Филиппова Ю.А., Шакирова Д.Р., Фассахов Р.С., Ильина А.В., Варламов В.П. 2012. Способ определения антибактериальной активности хитозана. Патент RU №2450022 C2.

14. Decker E.M., Weiger R., Wiech I., Heide P.E., Brecx M. 2003. Comparison of antiadhesive and antibacterial effects of antiseptics on Streptococcus sanguinis. Eur. J. Oral Sci. 111(2), 144-148.

15. Kim J.Y., Lee J.K., Lee T.S., Park W.H. 2003 Synthesis of chitooligosaccharide derivative with quaternary ammonium group and its antimicrobial activity against Streptococcus mutans. Int. J. Biol. Macromol., 32(1-2), 23-27.

16. Rhoades J., Roller S. 2000. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Appl. Environ. Microbiol. 66, 8086.

17. Tajdini F., Amini M.A., Nafissi-Varcheh N., Faramarzi M.A. 2010. Production, physiochemical and antimicrobial properties of fungal chitosan from Rhizomucor miehei and Mucor racemosus. Int. J. Biol. Macromol. 47(2), 180-183.

18. Roller S., Covill N. 1999. The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice. Int. J. Food Microbiol. 47, 67-77.

19. Hernandez-Lauzardo A.N., Bautista-Banos S., Velazquez-del Valle M.G., Mendez-Montealvo M.G., Sanchez-Rivera M.M., Bello-Perez L.A. 2008. Antigungal effects of chitosan with different molecular weights on in vitro development of Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. Carbohydr. Polym. 73, 541-547.

20. Devlieghere F., Vermeulen A., Debevere J. 2004. Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables. Food Microbiol. 21, 703-714.

21. Belalia R., Grelier S., Benaissa M., Coma V. 2008. New bioactive biomaterials based on quaternized chitosan. J. Agric. Food Chem. 56(5), 1582-1588.

22. Chen W., Jin T.Z., Gurtler J.B., Geveke D.J., Fan X. 2012. Inactivation of Salmonella on whole cantaloupe by application of an antimicrobial coating containing chitosan and allyl isothiocyanate. Int. J. Food Microbiol. 155(3), 165-170.

23. Schlievert P.M. 2007. Chitosan malate inhibits growth and exotoxin production of toxic shock syndrome-inducing Staphylococcus aureus strains and group A streptococci. Antimicrob. Agents Chemother. 51(9), 3056-3062.

24. Jena P., Mohanty S., Mallick R., Jacob B., Sonawane A. 2012. Toxicity and antibacterial assessment of chitosancoated silver nanoparticles on human pathogens and macrophage cells. Int. J. Nanomedicine. 7, 1805-1818.

25. Chen Y.M., Chung Y.C., Wang L.W., Chen K.T., Li S.Y.

2002. Antibacterial properties of chitosan in waterborne

pathogen. J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. 37(7), 1379-1390.

26. Xu Y., Fan H., Lu C., Gao G.F., Li X. 2010. Synthesis of galabiose-chitosan conjugate as potent inhibitor of Streptococcus suis adhesion. Biomacromolecules. 11(7), 1701-1704.

27. Palmeira-de-Oliveira A., Ribeiro M.P., Palmeira-de-Oliveira R., Gaspar C., Costa-de-Oliveira S., Correia I.J., Pina Vaz C., Martinez-de-Oliveira J., Queiroz J.A., Rodrigues A.G. 2010. Anti-Candida activity of a chitosan hydrogel: mechanism of action and cytotoxicity profile. Gynecol. Obstet. Invest. 70(4), 322-327.

28. Calamari S.E., Bojanich M.A., Barembaum S.R., Berdicevski N., Azcurra A.I. 2011. Antifungal and post-antifungal effects of chlorhexidine, fluconazole, chitosan and its combinations on

Candida albicans. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 16(1), 2328.

29. Krajewska B., Wydro P., Janczyk A. 2011. Probing the modes of antibacterial activity of chitosan. Effects of pH and molecular weight on chitosan interactions with membrane lipids in Langmuir films. Biomacromol. 12(11), 4144-4152.

30. Lou M.M., Zhu B., Muhammad I., Li B., Xie G.L., Wang Y.L., Li H.Y., Sun G.C. 2011. Antibacterial activity and mechanism of action of chitosan solutions against apricot fruit rot pathogen Burkholderia seminalis. Carbohydr. Res. 346(11), 1294-1301.

31. Liu H., Tian W., Li B., Wu G., Ibrahim M., Tao Z., Wang Y., Xie G., Li H., Sun G. 2012. Antifungal effect and mechanism of chitosan against the rice sheath blight pathogen, Rhizoctonia solani. Biotechnol. Lett. 34(12), 2291-2298.

© C. Н. Куликов - к.б.н, в.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; с.н.с. кафедры микробиологии Казанского федерального университета; kuliks@yandex.ru; Р. З. Хайруллин - к.б.н., доц. каф. промышленной безопасности КНИТУ, khayrullinrz@gmail.com; с.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора.

© S. N. Kulikov - Ph.D., Leading researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; scientific researcher of Department of Microbiology Kazan Federal University; kuliks@yandex.ru; R. Z. Khayrullin - Ph.D., associate professor of the Department of Industrial Safety, KNRTU; Senior Researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor; khayrullinrz@gmail.com.