Оценка антиангиогенной активности in vitro: опыт российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН

УДК 611.13/.16.018.1:616-092.4«РОНЦ»

E.Sh. Solomko, E.V. Stepanova, M.R. Lichinitser, A.Yu. Baryshnikov

THE LOOK BEYOND THE ANTIANGIOGENIC ASSAYS IN VITRO: THE EXPERIENCE OF N.N. BLOKHIN RUSSIAN CANCER

RESEARCH CENTER

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

It is generally assumed that tumor growth and metastasis depend on angiogenesis - the recruitment of new vessels into a tumor from pre-existing vessels. Based on the consideration that tumor angiogenesis passes through several phases the angiogenic and antiangiogenic in vitro assays were developed. Here, we discuss few antiangiogenic assays to be used in screening of agents with antiangiogenic activity.

Key words: angiogenesis, endothelial cells, screening.

Э.Ш. Соломко, Е.В. Степанова, М.Р. Личиницер, А.Ю. Барышников

ОЦЕНКА АНТИАНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO: ОПЫТ РОССИЙСКОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Ангиогенез, развитие новых кровеносных сосудов из уже существующей кровеносной сети, является необходимым процессом для роста злокачественных опухолей и их метастазирования. Исследователями были разработаны методы оценки ангиогенной и антиангиогенной активности различных типов веществ in vitro с учетом основных этапов формирования новых кровеносных сосудов. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина были проведены исследования для стандартизации методов оценки веществ на антиангиогенную активность с целью дальнейшего использования для скрининга антиангиогенных веществ.

Ключевые слова: ангиогенез, эндотелиальные клетки, скрининг.

Ангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов, происходящих из уже существующей кровеносной сети окружающей ткани. Было убедительно доказано, что рост опухолей зависит от ан-гиогенеза [7]. В настоящее время стали известны многие механизмы контроля ангиогенеза, появились новые подходы к его активированию и ингибированию. Было показано, что ангиогенная активность опухоли обусловлена сложным балансом между природными стимуляторами и ингибиторами ангиогенеза [7].

В опухолях находят повышенный уровень стимуляторов ангиогенеза (VEGF, bFGF, тимидин фософо-рилаза, ангиогенин и др.), тогда как уровень эндогенных ингибиторов (тромбоспондин 1, ангиостатин, эндостатин и др.) снижен [3]. Введение ингибиторов ангиогенеза (природных или синтетических) в экспериментах in vivo приводило к остановке роста опухолей и их регрессии.

В конце XX века была предложена новая стратегия лечения злокачественных новооброзований: анти-ангиогенная терапия, направленная на блокирование образования новых сосудов в опухоли [3; 8]. Одной из особенностей антиангиогенной терапии является ее цитостатический эффект. В большинстве исследований показано, что такая терапия приводит к задержке роста опухоли, а не к ее регрессии.

На сегодняшний день известно более, чем 500 соединений, имеющих антиангиогенную активность, более 40 антиангиогенных препаратов проходят различные фазы клинических испытаний. Однако поиск новых соединений, способных эффективно блокировать ангиогенез у больных злокачественными новообразованиями, продолжается.

Были разработаны методы оценки ангиогенной и антиангиогенной активности различных типов веществ in vitro и in vivo с учетом основных этапов формирова-

ния новых кровеносных сосудов. В Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина были проведены исследования для стандартизации методов оценки веществ на антиангиогенную активность.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АНТИАНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ IN VITRO

Основными клетками, вовлеченными в процессы ангиогенеза, являются эндотелиальные клетки (ЭК), выстилающие все кровеносные сосуды и формирующие полностью все капилляры. Для образования нового кровеносного сосуда ЭК сначала разрушают ба-зальную мембрану сосуда, затрудняющую дальнейшее движение клеток. Затем они мигрируют по направлению к ангиогенным стимулам, которые вырабатываются опухолевыми клетками, активированными лимфоцитами и/или макрофагами. ЭК, находящиеся за миграционным фронтом, начинают пролифери-ровать для обеспечения необходимого для образования новых сосудов количества клеток. Вновь образованные ЭК образуют трехмерную тубулярную структуру - новый кровеносный сосуд. Каждый из этих этапов: разрыв базальной мембраны, миграция, пролиферация и формирование трубочки - может являться мишенью для воздействия и быть протестирован in vitro. Эти методы (пролиферации, миграции и формирования трубочек) могут быть использованы для идентификации ангиогенных факторов роста и прямых ингибиторов ангиогенеза. Однако основные тесты для оценки ангиогенеза in vitro требуют дополнительной стандартизации и должны быть подкреплены результатами тестирования in vivo для более объективной оценки ангиогенного ответа.

Цитотоксические тесты

Цитотоксические методы позволяют определить цитотоксический или апоптотический эффект препарата. Одним из основных методов определения цито-токсичности препаратов на культурах ЭК является определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста при инкубации клеток с низкой пролифе-ративной активностью (70-90%-ный монослой) с препаратом в течение 24 ч. В дальнейшем влияние препарата на апоптоз ЭК может быть подтверждено цитоф-люрометрическими методами с использованием про-пидий йодида или анексина.

МТТ-метод определения жизнеспособности клеточных культур заключается в способности живых клеток превращать растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) в нерастворимые пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана (МТТ-Ф). Нежизнеспособные мертвые клетки такой способностью не обладают. Интенсивность превращения МТТ в МТТ-Ф отражает общий уровень дегидрогеназной активности исследуемых клеток и модулируется активностью сопряженных ферментных систем. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим

методом после его растворения в органических растворителях) характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках культуры и является косвенной количественной характеристикой активной биомассы.

Клетки 8УЕС-4-10 в высокой плотности (6х104 клеток/мл) вносили в лунки 96-луночного планшета в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина. Спустя 24 ч наносили препарат в различных концентрациях. Инкубацию с препаратом проводили 24 ч, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль.

Все остальные тесты (пролиферационный, миграционный и формирование трубочек) проводили на не-цитотоксических дозах препарата (90 % живых клеток через 24 ч). Использование этого принципа позволяет избежать ложноположительного результата, когда, например, эффект блокирования миграции на 60 % от контроля связан с гибелью 50 % ЭК в течение 24 ч.

Пролиферационные тесты

В норме кровеносные ЭК находятся в состоянии покоя и вступают в клеточный цикл только при некоторых состояниях: при развитии эмбриона, овуляции женской репродуктивной системы или заживлении раны. Напротив, ЭК в культуре активно пролифери-руют при наличии в среде специальных ростовых факторов, которые являются специфичными для различных культур ЭК.

Для определения влияния веществ на уровень пролиферативной активности ЭК часто дополнительно активируют различными стимуляторами ангиоге-неза, в частности, УЕОБ и ЬБОБ. Количество ЭК определяют непосредственным подсчетом клеток в камере Горяева, по количеству включенного Н3 тимиди-на, МТТ-тесту, тесту на включение бромдезоксиури-дина (ВМи) и т.д. На сегодняшний день основным методом оценки пролиферативной активности является МТТ-тест [11].

Клетки SVEC-4-10 вносили в низкой плотности (15х103 клеток/мл) в лунки 96-луночного планшета в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина и 20 нг/мл ЬБОБ. Спустя 24 ч наносили препарат в различных концентрациях. Инкубацию с препаратом проводим 3 дня, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль.

Оценка миграции

ЭК мигрируют с помощью процесса, называемого хемотаксисом, по направлению к градиенту ангиоген-ных стимуляторов, таких, как VEGF.

Для анализа хемтоксической активности клеток используется тест в модифицированной камере Бойде-на [1]. Этот тест модулирует процессы, происходящие in vivo в опухолях. В этом тесте ЭК высаживаются на верхнюю камеру (иногда покрытую белками матрикса: фибронектином, коллагеном или Матригелем), проницаемую для клеток (размер пор 8 мкм). ЭК клетки мигрируют в нижнюю камеру по градиенту стимулятора ангиогенеза, добавленного в нижнюю камеру. Через определенное время (обычно 6-24 ч) подсчитывается количество мигрировавших клеток. Количество клеток, окрашенных гематоксилином, подсчитывается либо с помощью компьютерных программ оценки изображения, либо непосредственно самим исследователем.

Клетки SVEC-4-10 (5х105 клеток/мл) инкубировали в бессывороточной среде ДМЕМ с добавлением нецитотоксических доз препарата в течение 30 мин при 37 °С. Затем клетки высаживались в верхнюю камеру Бойдена, нижнюю камеру покрывали средой ДМЕМ, содержащей 20%-ную эмбриональную сыворотку и 50 нг/мл bFGF. Через 12 ч клетки фиксировали и окрашивали по Лейшману. Не мигрировавшие клетки убирали с внутренней стороны камеры ватным тампоном. Под микроскопом подсчитывали количество клеток, прошедших сквозь мембрану.

Альтернативный метод оценки миграционной активности основан на миграции ЭК в «обнаженную» область, что является центральным событием заживления раны in vivo. Монослой ЭК частично удаляется, и пограничные клетки мигрируют в «обнаженную» область [10].

Клетки SVEC-4-10 (3х105 клеток/мл) вносили в лунки 24-луночного планшета в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глута-мина, и инкубировали до образования монослоя. Затем его нарушали путем соскабливания части клеток. В течение 24 ч клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 10 % FCS, 2мМ глутамина и нецитоток-сические дозы препарата. В качестве положительного контроля использовали клетки в бессыворотной среде

ДМЕМ. Результаты оценивали как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина) (рис. 1).

Использование описанных 2 методов оценки миграции позволяет отличить влияние препарата на хе-мокинез (движение клеток в ответ на изотропное распределение растворимых стимуляторов) и хемотаксис (направленное движение клеток в ответ на градиент концентрации растворимых стимуляторов) [14].

Оценка формирования капилляроподобных структур в двумерном геле

Одним из наиболее специфических тестов является оценка характеристик капилляроподобных структур (КПС), сформированных ЭК в 2- или 3-мерном геле. Формирование КПС, как было указано выше, является поздней стадией ангиогенеза (дифференци-ровкой ЭК).

Все культуры ЭК различного происхождения способны спонтанно формировать трубочки при инкубации на соответствующих компонентах внеклеточного матрикса. При образовании капиллярной сети расстояние между капиллярами варьирует от 50 до 300 мкм, что оптимально для метаболического обмена между клетками ткани и крови [6]. Способность формировать КПС является автономным свойством ЭК, т.е. клетки нуждаются во внеклеточных сигналах, разрешающих начать формирование трубочек, но не в сигналах, контролирующих этапы этого процесса [5].

КПС образуются при инкубации ЭК на коллагене или фибриновом сгустке. В настоящее время для оценки формирования КПС используется Матригель -природный матрикс базальных мембран, экстрагированный из саркомы мышей. Основным его компонентом является ламинин, затем следует коллаген IV, протеингликаны, энтактин и нидоген [4]. Он также содержит факторы роста: трансформирующий фактор роста бета, факторы роста фибробластов, тканевый

Рис. 1. Ингибирование миграции клеток §¥£€4-10 в тесте на «заживление раны»:

А - ресвератрол 10-5 М; Б - положительный контроль.

6 БИОТЕРАПИЯ

активатор плазминогена и другие. Использование Матригеля значительно ускоряет морфологическую дифференцировку ЭК в геометрические КПС, которые практически идентичны капиллярной сети, наблюдаемой in vivo [13]. Следует заметить, что не только ЭК, но и некоторые другие типы клеток (фибробласты и некоторые опухолевые клетки) способны формировать КПС на Матригеле.

Метод оценки формирования КПС заключается в инкубации ЭК в или на слое матрикса (коллагена, фибрина или Матригеля) в присутствии потенциальных стимуляторов или ингибиторов ангиогенеза. Результат формирования КПС оценивается через 4-24 ч и регистрируется на фотокамеру. Степень формирования КПС измеряется качественно или количественно, часто с использованием компьютерных программ оценки изображения.

В исследованиях использовали следующую методику постановки КПС-теста. 24-луночную плашку покрывали Матригелем (250 мкл/лунка) и инкубировали 20-30 мин при 37 °С до его полной полимеризации. Клетки SVEC-4-10 (5х105 клеток/мл) инкубировали в среде ДМЕМ с добавлением нецитотоксиче-ских доз препарата в течение 30 мин при 37 °С. Затем клетки наносили в лунки, покрытые Матригелем, и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 4-5 ч. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в среде ДМЕМ без добавления препарата. Оценивали длину трубочек и количество контактов между трубочками (рис. 2).

Таким образом, используя совокупность методов оценки ангиогенеза in vitro, мы можем оценить влияние препаратов на различные стадии этого процесса. Однако существует нерешенная проблема методов оценки ангиогенеза in vitro: ЭК не одинаковы, они различаются фенотипически и функционально.

КУЛЬТУРЫ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

ЭК активно используются в культуре клеток для исследования различных аспектов биологии ЭК и ан-гиогенеза.

В течение многих лет в большинстве исследований использовались первичные культуры эндотели-альных клеток, выделенные из аорты быка (ВАЕС) или из вены пупочного канатика человека (НиУЕС). До сих пор НиУЕС активно используются для исследований ангиогенеза. Они легко выделяются путем перфузии вены пупочного канатика трипсином. Однако основным недостатком первичных культур ЭК является их лимитированный период жизни в культуре. Также большой проблемой являются различия в ответе НиУЕС, выделенных из нескольких разных доноров, на добавление стимуляторов/ингибиторов ангио-генеза, что затрудняет стандартизацию методов ан-гиогенеза.

Путем иммротализации был получен ряд линий ЭК, которые могут культивироваться в течение длительного периода жизни (см. таблицу). В настоящее время большинство исследователей для скрининга используют иммортализованные культуры эндотели-альных клеток.

Одним из важных вопросов стандартизации методов оценки ангиогенеза является гетерогенность ЭК. Эндотелиальные клетки не одинаковы. Различают ЭК, выделенные из крупных сосудов (макроваскулярные), и ЭК, выделенные из микрокапилляров (микроваску-лярные) [13]. Кроме того, ЭК различных органов также имеют свои особенности. Различия касаются секреции матриксных металлопротеиназ (ММР), ультраструктурных различий, экспрессии антигенов, связывания лектинов, экспрессии адгезионных молекул ^САМ) и комплексов гистосовместимости (МНС). Ответ на добавление стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза также варьирует в различных культурах ЭК [2].

В работе нами используется клеточная линия SVEC4-10, полученная из регионарных лимфатических узлов мышей С3H/HeJ (Н-2к), трансформированных множественным инфицированием вирусом SV40 [12]. SVEC4-10 клетки растут без добавления эндогенных эндотелиальных ростовых факторов и компонентов экстрацеллюлярного матрикса, сохраняя при

Рис. 2. Ингибирование формирования капилляроподобных структур клетками SVEC4-10:

А - ресвератрол 10-5 М; Б - положительный контроль.

Часто используемые культуры эндотелиальных клеток

Первичные культуры Иммортализованные культуры

HUVEC ЭК вены пупочного канатика человека EA-hy-926 Иммортализованные НиУЕС

BAE ЭК аорты быка BAE-1 иммортализованные ЭК аорты быка

HAEC ЭК аорты человека SVEC4-10 ЭК регионарных лимфоузлов мыши, трансформированные вирусом SV-40

HPAEC ЭК пульмонарной артерии человека HMEC-1 иммортализованные микроваскуляр-ные эндотелиальные клетки кожи

bEnd.3 ЭК головного мозга мыши, трансформированные Т-антигеном

MS1 ЭК поджелудочной железы мыши, трансформированные вирусом SV-40

этом функциональные характеристики нормальных микроваскулярных эндотелиальных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на то, что первые результаты клинического изучения антиангиогенных препаратов не утешительны, большое количество новых соединений постоянно поступают для клинического изучения. Тесная взаимосвязь между фундаментальными и клиническими исследователями обеспечит создание новых высокоэффективных антиангиогенных препаратов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Alessandri G., Raju K., Gullino PM. Mobilization of capillary endothelium in vitro induced by effectors of angiogenesis in vivo // Cancer Res. - 1983. - 43. - P. 1790-7.

2. Auerbach R. Vascular endothelial cell differentiation: organ-specificity and selective affinities as the basis for developing anticancer strategies // Int. J. Radiat. Biol. - 1991. - 60. - P. 1-10.

3. Auerbach W, Auerbach R. Angiogenesis inhibition: a review // Pharmacol. Ther. - 1994. - 63. - P. 265-311.

4. Baatout S. Endothelial differentiation using Matrigel // Anticancer Res. - 1997. -17. - P. 451-5.

5. Folkman J., Haudenschild C. Angiogenesis in vitro // Nature - 1980. - 288. - P. 551-6.

6. Goldman D., Popel A.S. A computational study of the effect of vasomotion on oxygen transport from capillary networks // J. Theor. Biol. - 2001. - 209. - P. 189-99.

7. Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigene-sis // Cell - 1996. - 86. - P. 353-64.

8. Kerbel R., Folkman J. Clinical translation of angiogenesis inhibitors // Nature Reviews. - 2002. - 2. - P. 727-39.

9. Kolonin M, Pasqualini R, Arap W. Molecular addresses in blood vessels as targets for therapy // Curr. Opin. Chem. Biol. - 2001. - №5. - P. 308-13.

10. Lampugnani MG. Cell migration into a wounded area in vitro // Methods Mol. Biol. - 1999. - 96. - P. 177-82.

11. Lee WS., Harder JA., Yoshizumi M. et al. Progesterone inhibits arterial smooth cell proliferation // Nat. Med. - 1997. - № 3. - P. 1005-8.

12. O'Connel K., Edidin M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by SV40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal en-dothelial cells // J. Immunol. - 1990. - 144. - P. 521.

13. Risau W. and Flamme I. Vasculogenesis // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. - 1995. - № 11. - P. 73-91.

14. Zigmond S., Hirsch JG. Leukocyte locomotion and chemotaxis // J. Exp. Med. - 1973. - 137. - P. 387-410.

Поступила 12.08.2007.