нидо-Карборансодержащие бис-амиды фолиевой кислоты для доставки бора в опухолевые клетки
NIDO-CARBORAN-CONTAINING FOLIC ACID BIS-AMIDES FOR BORON DELIVERY TO TUMOR CELLS

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новым борсодержащим производным природных азагетероциклических соединений, которые обладают низкой токсичностью, способностью накапливаться в опухолевых клетках и могут найти применение в качестве агентов для бор-нейтронозахватной терапии опухолевых заболеваний.
CA: Cancer J. Clin
71
CA: Cancer J. Clin.
in press
J. Neuro-Oncol.
149
Front. Oncol
11
На сегодняшний день онкологические заболевания имеют широчайшее распространение по всему миру. Несмотря на имеющиеся успехи в области терапии опухолей, число зарегистрированных случаев рака увеличивается с каждым годом. По данным Международного агентства по изучению рака, в 2020 г. выявлено около 19,3 миллионов новых случаев заболевания раком; смертность от онкологических заболеваний достигла в 2020 г. 10 миллионов человек [Sung H. et al. . 2021, , 209]. Подходы к лечению большинства видов рака включают в себя хирургическое лечение, медикаментозную терапию, радиотерапию и комбинацию данных методов [Miller K.D. et al.  2022, . DOI: 10.3322/caac.21731]. В последнее время в качестве самостоятельного и вспомогательного метода лечения неоперабельных форм рака используется бор-нейтронозахватная терапия (БНЗТ) [Miyatake S.-I. et al.  2020, , 1; Malouff T.D. et al. . 2021, , 601820].
10
7
10
клозо
БНЗТ представляет собой современный бинарный подход к лечению опухолей. Данный метод предусматривает комбинированное использование двух компонентов: химического агента, доставляющего бор в опухолевые клетки, и облучения тепловыми или надтепловыми нейтронами. Тепловые нейтроны избирательно взаимодействуют с атомами B, вызывая их распад с испусканием альфа-частиц и ядер Li, длина пробега которых сопоставима с размером одной клетки. Избирательная доставка соединений, содержащих один или несколько атомов B, в опухолевые клетки делает возможным их избирательное повреждение под действием тепловых нейтронов. На сегодняшний день в клинике для БНЗТ используются два соединения: натриевая соль меркапто--додекаборана (борокаптат натрия, BSH) и 4-боронофенилаланин (BPA), отличающиеся низкой избирательностью биораспределения (BSH) и низким содержанием бора (BPA). Важным современным подходом к созданию новых, более эффективных, агентов для БНЗТ является получение борсодержащих аналогов биомолекул, способных избирательно транспортироваться в опухолевые клетки.
J. Pharm. Sci.
94
Drug Discovery Today
27
Pharmaceutics
14
Chem. Biol. Drug Des.
83
Radiochim. Acta
103
клозо
клозо
2005
2022
2022
2014
2015
Известно, что клетки различных видов опухолей отличаются высоким уровнем накопления фолиевой кислоты и ее производных [Hilgenbrink A.R. et al. , , 2135; Ebrahimnejad P. et al. , , 471; Martín-Sabroso C. et al. , , 14]. Фолиевая кислота использована в качестве основы потенциальных агенты доставки бора для БНЗТ [Achilli C. et al., , , 532; Kettenbach K. et al. , , 799]. Синтез конъюгатов фолиевой кислоты с дикарба--додекабораном (-карбораном), содержащих не более 11,3% бора по массе, отличается сложностью выделения и очистки. Амид фолиевой кислоты, содержащий остаток 4-аминофенилборной кислоты, обладает высокой гемотоксичностью
клозо
Cells
9
Radiat. Environ. Biophys.
58
Известны также производные птероевой кислоты, содержащие остатки -додекаборана, которые могут быть использованы в бор-нейтронозахватной терапии для лечения, прежде всего, глиом [Nakamura H. Патент JP 2019038778A (приоритет 25.08.2017); Nakagawa F. et al.  2020, , 1615; Kanemitsu T. et al.  2019, , 59]. Существенным недостатком соединений данной группы является неспособность преодолевать гематоэнцефалический барьер и необходимость интратуморального введения для терапии глиомы.
Sci. China Life Sci.
56
Nanomedicine (N. Y., NY, U. S.)
10
J. Biomed. Nanotechnol.
15
Anti-Cancer Agents Med. Chem.
6
2013
2014
2019
2006
Литературные данные свидетельствуют о том, что борсодержащие липосомы и наночастицы, содержащие остатки фолиевой кислоты, способны избирательно накапливаться в опухоли [Dai C.X. et al. , , 163; Achilli C. et al. , , 589; Singh A. et al. , , 1714]. Однако получение данных агентов доставки бора отличается высокой сложностью, требует использования дорогостоящего узкоспециализированного оборудования и тщательного физико-химического контроля на всех стадиях, а потенциальная гемотоксичность и сложность преодоления гисто-гематических барьеров осложняет использование на живых моделях [Wu G. et al. , , 167].
Наиболее близким аналогом (прототипом) нашего технического решения являются α- и γ-замещенные производные фолиевой кислоты, имеющие борсодержащий заместитель полиэдрического строения и линкерный фрагмент, пригодные для использования в бор-нейтронозахватной терапии [Ollson L.-I. et al. Патент SE 528407 C2 (приоритет 19.08.2005)].
моно
К существенным недостаткам прототипа следует относить низкий выход конечных соединений (7.5% на стадии получения -амида фолиевой кислоты) и сложная процедура их очистки, предусматривающая использование препаративной ВЭЖХ.
Задача предлагаемого изобретения – получение новой группы соединений, которые отличаются высоким содержанием бора, умеренной цитотоксичностью, способностью к транспортировке бора в опухолевые клетки и являются потенциальными препаратами для бор-нейтронозахватной терапии. Предпочтительно, чтобы растворимость соединений в воде составляла не менее 5 мг/мл, а выход при их синтезе составлял более 50% на каждой стадии.
нидо
нидо
Для решения поставленной задачи было решено проводить функционализацию фолиевой кислоты по обеим карбоксильным группам (для увеличения содержания бора и упрощения процедуры выделения и очистки соединений), а качестве борсодержащих фрагментов использовать первичные амины, содержащие остаток 7,8-дикарба--ундекаборана (-карборана), который несет отрицательный заряд и может образовывать водорастворимые соли с ионами металлов.
бис
нидо
Техническим результатом данного изобретения является создание новой группы химических соединений – -амидов фолиевой кислоты, содержащих остатки -карборана, общей формулы 1.
клозо
клозо
трет
N
N
клозо
нидо
клозо
клозо
нидо
1
2
Соединения формулы 1 могут быть получены исходя из (1,2-дикарба--додекаборан-1-ил)уксусной кислоты (2), 3-амино-1,2-дикарба--додекаборана (3) и -бутоксикарбонил-производных этилендиамина и 6-аминогексановой кислоты. Например, в результате конденсации кислоты 2 с Boc-этилендиамином методом смешанных ангидридов получен -Boc--(-карборан-1-ил)ацетилэтилендиамин (4a). В результате деборирования соединения 4a под действием фторида цезия и последующего удаления Boc-группы действием соляной кислоты получен 1-аммонио-2-(7,8-дикарба--ундекаборан-7-ил)ацетиламиноэтан (5a). Ацилирование 3-амино--карборана (3) Boc-6-аминогексановой кислотой методом смешанных ангидридов позволило получить 3-(6-Boc-аминогексаноил)амино--карборан (4b). Деборирование соединения 4b под действием фторида цезия и последующего удаления Boc-группы действием соляной кислоты давало 3-(6-аммониогексаноиламино)-7,8-дикарба--ундекаборан (5b).
бис
клозо
Конденсацией фолиевой кислоты с аминами 5a,b карбодиимидным методом в присутствии 1-гидроксибензтриазола и триэтиламина получены соответствующие -амиды фолиевой кислоты 1a,b (общий выход соединений 1a и 1b до 70% и до 51% соответственно, считая на исходные производные -карборана 2 и 3).
1a
1b
3
Растворимость конъюгатов  и  в 0,5% растворе NaHCO составляет 5,0–6,5 мг/мл, что открывает перспективы их использования для доставки бора в опухолевые клетки с целью бор-нейтронозахватной терапии.
Карборансодержащие производные фолиевой кислоты, описанные в настоящем изобретении, имеют следующие преимущества:
1. высокое содержание бора (20,9-22,0%) (позволяет использовать соединения в нетоксичных дозах и/или с природным изотопным распределением бора);
in vitro
in vivo
2. высокая растворимость в воде (5 мг/мл и выше) (делает возможным использование в опытах как , так и );
50
3. умеренная цитотоксичность (LD не менее 1,62 мг/мл для здоровых клеток) (снижает риск возникновения побочных эффектов);
6
4. способность обеспечивать накопление бора клетками, на поверхности которых имеются фолатные рецепторы (до 7,0 мкг B/10 клеток в случае глиобластомы U87 MG) (позволяет избирательно воздействовать на опухолевые клетки, в т.ч. неспособные накапливать BPA и BSH);
5. Простота получения (для очистки используется колоночная флеш-хроматография и переосаждение; нет необходимости в использовании сложных и высокотехнологичных методов, таких как препаративная ВЭЖХ).
Полученные соединения анализируют следующими методами:
1
11
13
3
3
2
3
2
J
Температуры плавления определяют на приборе SMP3 (Barloworld Scientific, UK). Удельное вращение определяют на поляриметре Perkin Elmer 341. Элементный анализ проводят на анализаторе Perkin Elmer 2400 серии II. Спектры ЯМР H, B и C регистрируют на приборе Bruker Avance 500 (рабочая частота 500, 160 и 125 МГц соответственно) в CDCl (соединение 4a) и (CD)SO (в остальных случаях) при 25°C с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта и комплекса BF×EtO в качестве внешнего стандарта. Химические сдвиги приведены в миллионных долях (м.д.), константы спин-спинового взаимодействия () – в герцах. Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) получены на приборе Bruker maXis Impact HD; ионизация электрораспылением в позитивном или негативном режимах с прямым вводом образцов, газ-носитель – азот (скорость потока 4 л/мин).
Характеристики новых соединений 1a-c, 4a,b, 5а-c приведены в примерах конкретного выполнения.
1
13
1
Структуры полученных соединений подтверждают методами масс-спектрометрии высокого разрешения, элементного анализа, спектроскопии ЯМР H и С. Индивидуальность соединений подтверждают методами ТСХ и ЯМР H.
клозо
клозо
клозо
J. Am. Chem. Soc.
103
J. Organomet. Chem.
16
(1,2-Дикарба--додекаборан-1-ил)уксусную кислоту (2) и 3-амино-1,2-дикарба--додекаборан (3) получают из 1,2-дикарба--додекаборана в соответствии с литературными методами [Haushalter R.C. et al.  1981, , 2620; Zakharkin L.I. et al.  1969, , 371].
Примеры конкретного выполнения
Пример 1.
5a
нидо
Синтез 1-аммонио-2-(7,8-дикарба--ундекаборан-7-ил)ацетиламиноэтана ().
1-
трет
-Бутоксикарбониламино-2-(1,2-дикарба-
клозо
-додекаборан-1-ил)ацетил-аминоэтан (4a)
(стадия 1).
орто
N
N
N
N
δ
δ
δ
m
z
2
3
2
4
2
2
11
28
10
2
3
1
11
13
+
11
К раствору (-карборан-1-ил)уксусной кислоты () (1,02 г, 5,02 ммоль) и -метилморфолина (0,55 мл, 5,02 ммоль) в ТГФ (42 мл), охлажденному до −12 °C, добавляют этилхлорформиат (0,48 мл, 5,02 ммоль). Смесь перемешивают при −12 °C в течение 15 мин, затем добавляют раствор -Boc-этилендиамина (0,92 г, 5,77 ммоль) и ,-диэтиланилина (1,12 г, 7,53 ммоль) в ТГФ (35 мл). Реакционную смесь перемешивают при 20 °C в течение 20 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (50 мл) и последовательно промывают 10% раствором лимонной кислоты (3 × 25 мл), насыщенным раствором NaCl (2 × 25 мл), 5% раствором NaHCO (2 × 25 мл) и водой (25 мл). Органический слой высушивают NaSO, упаривают. Остаток перекристаллизовывают из смеси гексан–EtOAc (20 : 3 мл). Выход 1,41 г (82%), бесцветный порошок, т. пл. 142 °С (гексан–EtOAc). Спектр ЯМР H:  = 1,46 (с, 9 H, Boc); 1,5–3,0 (уш. с, 9 Н, 9 × ВН); 3,05 (с, 2 Н, CH-карборан); 3,28–3,34 (м, 4 Н, 2 × CH-этилендиамин); 4,59 (с, 1 Н, СН-карборан); 4,93 (уш. с, 1 H, NH); 6,97 (c, 1 H, NH). Спектр ЯМР В{H}:  = −2,20; −5,27; −9,56 (3 B); −10,67 (2 B); −11,85; −12,75 (2 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 28,35 (3C); 39,78; 41,91; 43,42; 58,68; 69,11; 80,67; 157,66; 166,75. HRMS (ESI+): найдено / 369,2944 [M + Na]; вычислено для CHBNNaO 369,2923.
1-Аммонио-2-(7,8-дикарба-
нидо
-ундекаборан-7-ил)ацетиламиноэтан (5a)
(стадия 2).
4a
2
4
2
4
3
8
25
9
2
6
20
9
2
1
+
11
13
−
11
δ
J
J
J
δ
J
J
J
J
J
δ
m
z
К раствору соединения  (1,35 г, 3,93 ммоль) в EtOH (110 мл) добавляют CsF (1,79 г, 11,79 ммоль). Смесь кипятят с обратным холодильником (на глицериновой бане) в течение 15 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (75 мл), полученный раствор промывают водой (3 × 40 мл). Органический слой высушивают NaSO и упаривают. К остатку добавляют 1,4-диоксан (30 мл) и HCl конц. (6,6 мл, 79,15 ммоль). Смесь перемешивают при 20 °C в течение 3 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (50 мл) и воду (30 мл). Органический слой отделяют, промывают водой (2 × 20 мл), высушивают NaSO, упаривают. Выход 0,90 г (98%), бесцветная пена. Спектр ЯМР H:  = −3,0…−2,3 (уш. с, 1 H, BH); −0,7…2,7 (уш. с, 8 Н, 8 × ВН); 1,86 (с, 1 Н, CH-карборан); 2,11 (д,  = 14,7 Гц, 1 Н, H-2’B); 2,42 (д,  = 14.7 Гц, 1 Н, H-2’A); 2,78–2,87 (м, 2 Н, 2 × H-2); 3,19–3,34 (м, 2 Н, 2 × H-1); 7,64 (т, = 5,5 Гц, 1 H, NH); 7,67 (c, 3 H, NH). Спектр ЯМР В:  = −10,68 (д,  = 133,4 Гц, 2 B); −14,30 (д,  = 146,0 Гц, 1 B); −16,98…−18,70 (м, 3 B); −22,21 (д,  = 164,5 Гц, 1 B); −33,34 (д,  = 103,8 Гц, 1 B); −37,17 (д,  = 107,4 Гц, 1 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 36,39; 40,5 (уш. с); 45,19; 46,34 (уш. с); 54,43 (уш. с); 171,98. Найдено: C 36,84; H 9,43; N 10,37. Вычислено для CHBNO (M 234,54): C 36,59; H 9,60; N 10,67. HRMS (ESI−): найдено / 235,2421 [M − H]; вычислено для CHBNO 235,2419.
Пример 2.
5b
нидо
Синтез 3-(6-аммониогексаноиламино)-7,8-дикарба--ундекаборана ().
трет
клозо
3-[6-(-Бутоксикарбониламино)гексаноиламино]-1,2-дикарба--додекаборан (4b) (стадия 1).
N
орто
N
N
δ
J
δ
δ
d
m
z
3
2
4
6
6
2
2
3
2
4
6
13
33
10
2
3
1
11
13
+
11
К раствору Boc-6-аминогексановой кислоты (1,17 г, 5,07 ммоль) и -метилморфолина (0,56 мл, 5,07 ммоль) в ТГФ (50 мл), охлажденному до −12 °C, добавляют этилхлорформиат (0,49 мл, 5,07 ммоль). Смесь перемешивают при −12 °C в течение 15 мин, затем добавляют раствор 3-амино--карборана (3) (0,70 г, 4,41 ммоль) и ,-диэтиланилина (1,32 г, 8,82 ммоль) в ТГФ (25 мл). Реакционную смесь перемешивают при 20 °C в течение 20 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (50 мл) и последовательно промывают 10% раствором лимонной кислоты (3 × 25 мл), насыщенным раствором NaCl (2 × 25 мл), 5% раствором NaHCO (2 × 25 мл) и водой (25 мл). Органический слой высушивают NaSO, упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией (элюент CH–EtOAc 9 : 1). Фракции, содержащие целевое соединение, объединяют, упаривают. Остаток растворяют в CHCl (50 мл), раствор промывают 8% водным раствором NaHCO (3 × 40 мл). Органический слой высушивают NaSO, упаривают. Выход 1,46 г (89%), бесцветный порошок, т. пл. 132–133 °С. Спектр ЯМР H:  = 1,18–1,26 (м, 2 Н, 2 × H-4); 1,32–1,37 (м, 2 Н, 2 × H-3); 1,37 (с, 9 H, Boc); 1,4–2,8 (уш. с, 9 Н, 9 × ВН); 1,45–1,51 (м, 2 Н, 2 × H-5); 2,15–2,18 (м, 2 Н, 2 × H-2); 2,86–2,90 (м, 2 Н, 2 × H-6); 5,06 (с, 2 Н, 2×СН-карборан); 6,75 (т, 1 H, = 5,3 Гц, NH-6); 8,22 (c, 1 H, NH-карборан). Спектр ЯМР В{H}:  = −5,58 (3 B); −10,73; −13,46 (2 B); −15,11 (2 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 24,51; 25,84; 28,21 (3C); 29,21; 36,51; ~39,5 (перекрывается с сигналом DMSO-); 56,99 (2 C); 77,23; 155,51; 176,49. HRMS (ESI+): найдено / 375,3434 [M + H]; вычислено для CHBNO 375,3438.
нидо
3-(6-Аммониогексаноиламино)-7,8-дикарба--ундекаборан (5b) (стадия 2).
2
4
2
4
2
2
2
2
3
8
25
9
2
8
25
9
2
1
+
11
13
+
11
δ
δ
J
J
δ
m
z
К раствору соединения 4b (1,46 г, 3,93 ммоль) в EtOH (110 мл) добавляют CsF (1,79 г, 11,79 ммоль). Смесь кипятят с обратным холодильником (на глицериновой бане) в течение 15 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (75 мл), полученный раствор промывают водой (3 × 40 мл). Органический слой высушивают NaSO и упаривают. К остатку добавляют 1,4-диоксан (30 мл) и HCl конц. (6,6 мл, 79,15 ммоль). Смесь перемешивают при 20 °C в течение 3 ч, затем упаривают. К остатку добавляют EtOAc (50 мл) и воду (30 мл). Органический слой отделяют, промывают водой (2 × 20 мл), высушивают NaSO, упаривают. Остаток очищают флеш-хроматографией (элюент CHCl–EtOH 8 : 2) с последующей перекристаллизацией из смеси гексан–CHCl–MeOH 15 : 15 : 1. Выход 0,83 г (80%), бесцветный порошок, т. пл. 328–331 °С (разл.). Спектр ЯМР H:  = −3,2…−2,6 (уш. с, 1 H, BH); −0,8–2,6 (уш. с, 8 Н, 8 × ВН); 1,19–1,26 (м, 2 Н, 2 × H-4); 1,38–1,44 (м, 2 Н, 2 × H-3); 1,46–1,53 (м, 2 Н, 2 × H-5); 2,01–2,04 (м, 2 Н, 2 × H-2); 2,28 (с, 2 Н, 2 × СН-карборан); 2,74–2,77 (м, 2 Н, 2 × H-6); 6,85 (с, 1 H, NH); 7,60 (уш. c, 3 H, NH). Спектр ЯМР В:  = −9,75 (с, 1 B); −11,5…−12,3 (м, 2 B); −18,10 (д,  = 133,2 Гц, 2 B); −21,81 (д,  = 138,2 Гц, 2 B); −36,5…−38,7 (м, 2 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 24,62; 25,41; 26,83; 36,60; 38,75; 44,58 (2C); 174,86. Найдено: C 36,84; H 9,43; N 10,37. Вычислено для CHBNO (M 262,59): C 36,59; H 9,60; N 10,67. HRMS (ESI+): найдено / 287,2706 [M + Na]; вычислено для CHBNNaO 287,2697.
S
N
N
бис
нидо
1
5
Пример 3. (2)-2-[(4-{[(2-Амино-4-гидроксиптеридин-6-ил)метил]амино}фенил)-формамидо]-,--{2-[(7,8-дикарба--ундекаборан-7-ил)ацетиламино]этил}-пентандиамид, гемигидрат (1a).
N
N’
c
δ
I
J
I
J
II
J
II
J
J
δ
δ
m
z
m
z
4
2
5
2
2
2
2
31
57
18
11
6
2
31
55
18
11
6
31
56
18
11
6
−1
20
1
+
+
11
13
2−
11
2−
−
11
К раствору фолиевой кислоты дигидрата (0,37 г, 0,77 ммоль), амина 5a по примеру 1 (0,40 г, 1,69 ммоль), 1-гидроксибензтриазола гидрата (0,26 г, 1,69 ммоль) и триэтиламина (0,72 мл, 5,16 ммоль) в ДМСО (17 мл) добавляют -(3-диметиламинопропил)--этилкарбодиимида гидрохлорид (0,37 г, 1,92 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при 20 °C в течение 48 ч, затем выливают в воду (100 мл). К суспензии добавляют 1 н. NaOH (15 мл), полученный раствор последовательно промывают EtOAc (3 × 25 мл) и гексаном (25 мл). Органический слой промывают 0,5 н. NaOH (20 мл). Объединенный водный раствор подкисляют 4 н. HCl (~8 мл) до pH 1–2 и оставляли при 5–10 °C на 72 ч. Осадок отфильтровывают, сушат и очищают флеш-хроматографией (элюент BuOH–EtOH–16% водн. NHOH 5 : 7 : 3). Фракции, содержащие целевое соединение, объединяют и упаривают. Остаток промывают 1 н. HCl (15 мл), затем сушат в вакууме над PO и KOH. Аналитически чистый образец соединения 1a получают в результате обработки ацетонитрилом (13 мл на 0,5 г соединения 1a) с последующим центрифугированием (15000 мин при 10 °C, 5 мин). Выход 0,47 г (69%), темно-оранжевый порошок, т. пл. >350 °C. [α] = +1,2 (589 нм), +1,6 (578 нм), +1,4 (546 нм) ( 0,25, MeOH–ацетон 1 : 1). Спектр ЯМР H:  = −2,93…−2,39 (уш. с, 2 H, 2 × BH); −0,6–2,3 (м, 18 H, 18 × BH); 1,84 (с, 2 H, 2 × CH-карборан); 1,94–2,07 (м, 3 H, 2 × H-3 Glu и H-2B-карборан ); 2,10–2,16 (м, 2 H, 2 × H-4 Glu); 2,36 (д,  = 14,1 Гц, 1 H, H-2A-карборан ); 2,38 (д,  = 14,3 Гц, 1 H, H-2B-карборан ); 2,76 (д,  = 14,3 Гц, 1 H, H-2A-карборан ); 2,98–3,14 (м, 8 H, 4 × CH-этилендиамин); 4,25 (уш. с, 1 H, H-2 Glu); 4,60 (с, 2 H, CH-птероил); 4,5–6,5 (уш. с, 4 H, OH, NH и NH птероил); 6,64 (д,  = 8,1 Гц, 2 H, птероил); 7,40–7,44 (м, 2 H, 2 × NH); 7,67 (д,  = 8,1 Гц, 2 H, птероил); 7,83 (с, 1 H, NH); 7,91 (с, 1 H, NH); 8,06 (уш. с, 1 H, NH); 8,19 (уш. с, 2 H, NH-птероил); 8,75 (с, 1 H, CH-птероил). Спектр ЯМР В{H}:  = −37,2 (2 B); −33,4 (2 B); −22,2 (2 B); −19,0…−17,0 (уш. с, 6 B); −14,2 (2 B); −10,7 (4 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 27,31; 31,93; 38,07; 38,13; 38,46; 38,49; 45,26; 45,31; 45,70; 46,0–46,8 (уш. с, 2 C); 53,18; 54,1–55,0 (уш. с, 2 C); 111,24 (2 C); 121,68; 127,96; 129,02 (2 C); 147,54; 148,06; 150,36; 151,96; 152,22; 158,78; 166,08; 171,03; 171,07; 171,81; 171,86. Найдено: C 42,36; H 6,53; N 17,19. Рассчитано для CHBNO × 0,5HO (M 883,46): C 42,15; H 6,62; N 17,44. HRMS: найдено / 437,8040 [M − 2H]; вычислено для [CHBNO] 437,8011; найдено / 899,5944 [M − 2H + Na]; вычислено для CHBNNaO 899,5993.
Расчетное содержание бора 22,02% (по массе). Расчетное содержание бора-10 4,36% (по массе).
Пример 4. Аналогично примеру 3 получают соединение 1b из соединения 5b.
S
N
N
бис
нидо
c
δ
J
J
δ
δ
m
z
1
5
20
1
+
+
11
13
2−
11
2−
3
2
2
2
35
65
18
11
6
35
63
18
11
6
(2)-2-[(4-{[(2-Амино-4-гидроксиптеридин-6-ил)метил]амино}фенил)-формамидо]-,--{5-[(7,8-дикарба--ундекаборан-3-ил)аминокарбонил]-пентил}пентандиамид (1b). Выход 0,48 г (67%), оранжевый порошок, т. пл. 240-245 °C (разл.) (MeCN). [α] = −38,7 (578 нм); −50,3 (546 нм) ( 0,44, 1% водн. NaHCO). Спектр ЯМР H:  = −3,15…−2,72 (уш. с, 2 H, 2 × BH); −0,7–2,6 (м, 18 H, 18 × BH); 1,09–1,20 (м, 4 H, 4 × H-4 гексаноил); 1,26–1,42 (м, 8 H, 4 × H-3 и 4 × H-5 гексаноил); 1,81–1,97 (м, 2 H, 2 × H-3 Glu); 1,97–2,00 (м, 4 H, 4 × H-2 гексаноил); 2,07–2,13 (м, 2 H, 2 × H-4 Glu); 2,92–3,06 (м, 4 H, 4 × H-6 гексаноил); 4,23–4,29 (м, 1 H, H-2 Glu); 4,59 (с, 2 H, CH-птероил); 4,7–8,0 (уш. с, 4 H, NH, NH и OH птероил); 6,64 (д,  = 8,5 Гц, 2 H, птероил); 6,88 (с, 2 H, 2 × NH); 7,65 (д,  = 8,5 Гц, 2 H, птероил); 7,74–7,83 (м, 2 H, 2 × NH); 7,85–8,20 (м, 3 H, NH и NH птероил); 8,75 (с, 1 H, CH-птероил). Спектр ЯМР В{H}:  = −38,4 (2 B); −37,5 (2 B); −22,4 (уш. с, 4 B); −21,3 (2 B); −18,6 (2 B); −17,6 (2 B); −15,4…−8,6 (уш. с, 4 B). Спектр ЯМР С{H}:  = 25,58; 25,62; 26,57; 26,67; 28,16; 29,37 (2 C); 32,54; 37.33 (2 C); 38,95 (2 C); 44,72–45,44 (уш. с, 4 C); 46,19; 53,73; 111,78 (2 C); 122,27; 128,48; 129,47 (2 C); 148,01; 148,05; 150,86; 152,30; 153,01; 159,22; 166,42; 171,99; 172,08; 176,02 (2 C). Найдено: C 44,95; H 6,93; N 16,60. Рассчитано для CHBNO (M 930,56): C 45,18; H 7,04; N 16,56. HRMS: найдено / 465,8356 [M − 2H]; вычислено для [CHBNO] 465,8324.
Расчетное содержание бора 20,91% (по массе). Расчетное содержание бора-10 4,14% (по массе).
Биологическая активность
Новые соединения исследованы в федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук» (г. Новосибирск).
Культуры клеток
in vitro
Изучение цитотоксичности соединений и накопления бора клетками в опытах проводилось с использованием МТТ-теста на моделях линий клеток с диплоидным набором хромосом:
– DU-145 (карцинома предстательной железы человека);
– MDA-MB-231 (аденокарцинома молочной железы человека);
– SK-Mel 28 (меланома человека);
– T98G (глиобластома человека);
– U87 MG (глиобластома человека);
– BJ-5at (фибробласты кожи человека, здоровые клетки);
– ФЭЧ (фибробласты эмбриона человека, здоровые клетки).
Линии клеток BJ-5ta (ATCCCRL-4001™), U87 MG (ATCCHTB-14™), T98G (ATCCCRL-1690™), SK-Mel-28 (ATCCHTB-72™), MDA-MB-231 (ATCCCRM-HTB-26™), DU-145 (ATCCHTB-81™) получены из криобанка центра коллективного пользования «SPF-виварий» ФИЦ ИЦиГ СО РАН. Клетки ФЭЧ получены из коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирская обл., Россия) и хранились в криобанке центра коллективного пользования «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН.
2
Клетки культивировали в атмосфере 5% CO в питательной среде DMEM/F12 (1 : 1) (ООО «БиолоТ», Россия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, USA). Подсчет клеток проводили на автоматическом счетчике клеток Countess (Invitrogen, USA).
Тестирование цитотоксичности
МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых метаболически активных клеток восстанавливать бесцветный водорастворимый 3-(4,5-метилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимый формазан. Оптическая плотность растворенных в органических растворителях (например, диметилсульфоксиде) кристаллов формазана пропорциональна количеству метаболически активных клеток, что является адекватным показателем жизнеспособности клеток в культуре. Данный метод позволяет оценить специфическую гибель клеток, вызванную тем или иным цитотоксическим агентом.
4
исходные растворы
отрицательного контроля
Исходные растворы
исходных растворов
отрицательном контроле
1a
1b
1a,b
1a
1b
1a
1b
3
2
50
Для проведения МТТ-теста клетки засевали в 96-ячеечные планшеты в количестве 2×10 клеток на ячейку и культивировали в течение 24 ч. Готовили  соединений  и  в 0,5% водном NaHCO (концентрация 5,0 мг/мл). Для полного растворения соединений  смесь перемешивали в течение 10 мин, затем инкубировали при температуре 37 °C в течение 20 мин и обрабатывали ультразвуком (ультразвуковой гомогенизатор Sonicator Q700, Qsonica L.C.C., USA) в течение 30 минут. В качестве  использовали питательную среду без добавок.  добавляли в питательную среду с клетками в объёме 1/5 от общего объема среды в лунке, в результате чего концентрация соединений  и  в среде составляла 1.00 мг/мл. Затем готовили серию двукратных разведений  и добавляли их в питательную среду с клетками таким образом, чтобы получить питательные среды с концентрацией соединений  и  0,50, 0,25, 0,125, 0,063, 0,031, 0,016 и 0,008 мг/мл. Продолжительность инкубирования клеток составляла 3 суток при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO. Затем из каждой ячейки удаляли питательную среду, добавляли раствор MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] в питательной среде DME/F12 (1 : 1) (концентрация MTT 5 мг/мл), инкубировали в течение 4 ч, затем удаляли надосадочную жидкость и растворяли осадок формазана в ДМСО (100 мкл). Оптическую плотность полученных растворов определяли на приборе Multiskan Sky High Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) при длине волны 595 нм. Исходя из оптической плотности, определяли выживаемость клеток; выживаемость клеток в  была принята за 100%. На основе полученных данных определяли выживаемость клеток и полулетальные концентрации (LC), т. е. концентрации соединений, которые вызывают гибель 50% клеток.
50
50
Исследование токсичности каждого вещества в отношении клеток каждой линии проводили в трех параллелях; для расчета LC использовали среднее значение. Определение жизнеспособности клеток в диапазоне значения LC проводили в трех параллелях.
Выживаемость клеток (VC, %)
в присутствии исследуемого вещества рассчитывают по формуле:
где ОП – средняя оптическая плотность растворов формазана в ДМСО.
Полулетальную концентрацию соединений (LC
)
50
50
50
определяют графически по дозозависимой кривой выживаемости клеток при различных концентрациях препаратов в программе Microsoft Excel. В случаях, когда определение LC графически по дозозависимой кривой выживаемости клеток невозможно, величину LD рассчитывают в программе Microsoft Excel.
50
1a,b
В таблице 1 представлены значения LC для соединений  в отношении клеток различных опухолевых линий, а также фибробластов человека BJ-5at и ФЭЧ, рассчитанные на основании данных МТТ-теста.
50
1a,b
Таблица 1 – Экспериментальные значения LC соединений , рассчитанные на основании данных MTT-теста
Клеточная линия
Исследуемое соединение (LC<sub>50</sub>, мг/мл)
<b>1a</b>
<b>1b</b>
DU-145
0,416
0,624
MDA-MB-231
0,408
0,441
SK-Mel 28
1,188
1,221
T98G
0,372
0,961
U87 MG
0,032
0,423
BJ-5at
2,100
1,699
ФЭЧ
1,623
1,967
1a
1b
1a,b
1a
1b
2006
50
50
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
103
Конъюгаты фолиевой кислоты  и  обладали низкой токсичностью в отношении фибробластов человека (BF-5at и ФЭЧ), величина LC находилась в интервале 1,62–2,10 мг/мл. Токсичность соединений  в отношении опухолевых клеток линий DU-145, MDA-MB-231, SK-Mel 28 и T98G была умеренной (LD 0,37–1,22 мг/мл). При этом производное  отличалось несколько большей токсичностью по сравнению с соединением . Наименьшая токсичность среди опухолевых клеток наблюдалась в отношении клеток SK-Mel 28, известных тем, что экспрессируют фолатные рецепторы, но в то же время способны к выведению аналогов фолиевой кислоты из клеток [Chen K.G. et al. , , 9903].
ACS Omega
6
2021
1a
1b
Наибольшая токсичность тестируемых соединений наблюдалась в отношении клеток глиобластомы U87 MG, которые известны активной экспрессией фолатных рецепторов [McCord E. et al. , , 4111]. Инкубирование в присутствии соединения  в концентрации выше 0,03 мг/мл или соединения  в концентрации выше 0,42 мг/мл в течение 72 ч приводило к снижению выживаемость клеток U87 MG на 50% и более.
Тестирование накопления бора клетками
1a
1b
3
2
6
6
Исходные растворы соединений  и  в 0,5% водном NaHCO (концентрация 5.0 мг/мл добавляют в питательную среду, содержащую от 3×10 до 5×10 клеток, в объёме 1/10 от общего объёма среды в лунке (концентрация тестируемого соединения в среде 0.50 мг/мл в случае клеток BJ5-at, SK-Mel 28, T98G, DU-145 и MDA-MB-231) или 1/20 от общего объёма среды в лунке (концентрация тестируемого соединения в среде 0.25 мг/мл в случае клеток U87 MG). В качестве контроля используют клетки, культивируемые без добавления тестируемых соединений. Клетки инкубируют при 37 °C в атмосфере, содержащей 5% CO.
Изв. АН, Сер. хим.
2020
После инкубирования клеток в течение различного времени (10 мин, 30 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч и 8 ч) культуральную среду отделяют от клеток, клетки снимают с подложки раствором трипсин–версен (1 : 1) (Биолот, Россия) и подсчитывают количество клеток. Полученную клеточную суспензию разделяют на 3 равные части, центрифугируют (1000 об/мин, 5 мин) и отделяют клетки от супернатанта. К полученным клеткам добавляют свежеперегнанную 16 M азотную кислоту (1,0 мл), смесь выдерживают при 95±1 °C в течение 30-40 мин, затем охлаждают до 20 °C, добавляют деионизованную воду (3,0 мл). Содержание бора в полученных растворах определяют на атомно-эмиссионном спектрометре высокого разрешения с индуктивно-связанной плазмой iCAP 6500 DUO (Thermo Scientific, USA) по методике [Цыганкова А.Р. и др. , 601]. Регистрацию аналитического сигнала проводили при аксиальном обзоре плазмы для двух аналитических линий – В 249,678 нм и В 249,773 нм. Градуировочные зависимости строили с использованием сертифицированного одноэлементного раствора ионов бора ГСО 7345-96.
Исследование содержания бора в клетках каждой линии после инкубирования в присутствии карборанил-производных фолиевой кислоты проводили в трех параллелях. Результаты представлены в таблице 2.
1a,b
1b
1a
1b
2004
2010
2008
2015
2020
нидо
нидо
нидо
J. Neuro-Oncol.
68
BMC Cancer
10
J. Neuro-Oncol.
87
Radiochim. Acta
103
Cells
9
6
6
6
6
Производные фолиевой кислоты , содержащие остатки -карборана, обладали способностью доставлять бора в опухолевые клетки. В целом, инкубирование клеток в присутствии производного 3-амино--карборана  обеспечивало лучшее накопление бора клетками по сравнению с использованием производного (-карборан-7-ил)уксусной кислоты . Содержание бора в клетках глиобластомы U87 MG и аденокарциномы молочной железы MDA-MB-231 после инкубирования в присутствии соединения  достигало 7,0 и 2,5 мкг B / 10 клеток соответственно. Применяемые в клинике препараты для БНЗТ обеспечивают существенно меньший уровень накопления бора клетками глиомы (до 1,1 мкг B / 10 клеток в случае BPA [Dahlström M. et al. , , 199; Wang P. et al. , , 661] и до 0,2 мкг B / 10 клеток в случае BSH [Doi A. et al. , , 287]). Предложенные ранее агенты для БНЗТ на основе птероевой кислоты обеспечивают накопление бора клетками глиомы U87 MG и карциномы KB на уровне 1,2–1,8 мкг B / 10 клеток [Kettenbach K. et al. , , 799; Nakagawa F. et al. , , 1615]. Использование карборансодержащего производного фолиевой кислоты, описанного в прототипе, позволяло достичь накопления бора клетками глиобластомы не более 0,79 мкг B / г клеток [Ollson L.-I. et al. Патент SE 528407 C2 (приоритет 19.08.2005)].
6
1a,b
Таблица 2 – Экспериментальные значения содержания бора в клетках (мкг B/10 клеток) после инкубирования в присутствии соединений  в концентрации 0,5 мг/мл
Культура клеток
Продолжительность инкубирования, ч
Исследуемое соединение
<b>1a</b>
<b>1b</b>
DU-145
1
0,11
0,12
8
0,20
0,42
MDA-MB-231
1
0,50
2,60
8
0,48
2,53
SK-Mel 28
1
0,07
0,11
8
0,05
0,14
T98G
1
0,22
0,91
8
0,38
0,81
U87 MG<sup>*</sup>
1
0,10
3,44
8
0,10
7,01
BJ-5at
1
0,12
0,99
8
0,58
0,88
*
1a,b
Концентрация соединений  в питательной среде составляла 0,25 мг/мл.
бис
нидо
in vitro
1b
-Амиды фолиевой кислоты с двумя остатками -карборана содержат 18 атомов бора в молекуле и могут рассматриваться в качестве потенциальных агентов для БНЗТ опухолей, клетки которых экспрессируют фолатные рецепторы. Так, умеренная цитотоксичность и высокий уровень накопления соединения  клетками глиобластомы в опытах  позволяет рассчитывать на возможность использования данного производного даже с природным распределением изотопов бора для успешной реализации БНЗТ.
1
Предложен способ получения соединений общей формулы , способных доставлять бор в опухолевые клетки, содержащие фолатные рецепторы, предусматривающий использование легкодоступных реагентов, отличающийся простотой проведения синтетических операций.