Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности

Роль хорионического гонадотропина в формировании иммунологической толерантности при беременности

Д.м.н., проф. С.В. ШИРШЕВ, к.б.н. С.А. ЗАМОРИНА*

The role of chorionic gonadotropin in the formation of immunological tolerance during pregnancy

s.v. shirshev, s.a. zamorina

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Исследована роль гормона беременности хорионического гонадотропина (ХГ) в регуляции экспрессии маркера Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) Foxp3, синтеза лимфоцитами интерлейкина-4 (IL-4) и интерферона-y (IFN-y), а также секреции индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) моноцитами с оценкой их фагоцитарной и окислительной активности. Установлено, что суточная инкубация ХГ (100 МЕ/мл) с мононуклеарными клетками периферической крови (МПК) приводит к повышению процента IL-4+CD3+CD4+T-лимфоцитов, не влияя на уровень IFN-y+CD3+CD4+T-клeток, и не оказывая действия на внутриклеточную продукцию IFN-y и IL-4 в субпопуляции CD3+CD8+Т-лимфоцитов. In vitro, ХГ (10 и 100 МЕ/мл) достоверно повышает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток, усиливая активность IDO в липополисахарид-стимулированных МПК. ХГ угнетает фагоцитоз E. coli lux моноцитами, одновременно подавляя продукцию активных форм кислорода в реакции спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции. Таким образом, гормон является одним из факторов, способствующих формированию иммунологической толерантности при беременности.

Ключевые слова: беременность, хорионический гоналотропин, моноциты, Treg, IL-4, IFN-y, инлоламин-2,3-лиоксигеназа.

We have studied the role of pregnancy hormone (chorionic gonadotropin, CG) in the control of expression of Foxp3 (a marker of T-regulatory lymphocytes, Treg), synthesis of interleukin-4 (IL-4) and interferon-gamma (IFH-y) in lymphocytes, and secretion of indolamine-2,3-dioxygenase (IDO) by monocytes. Moreover, we evaluated the phagocytic and oxidative activities of these cells. It was shown that incubation of CG at a dose of 100 IU/ml with mononuclear cells from peripheral blood (MPC) resulted in a rise in the relative number of IL-4+CD3+CD4+T-lymphocytes whereas the number of IFN-y+CD3+CD4+T-cells remained unaltered; the intracellular production of IFN-y and IL-4 in the subpopulation of CD3+CD8+T-lymphocytes did not change either. In vitro, CG (10 and 100 IU/ml) significantly increased percentage of CD4+CD25 brightFoxp3+ cells and enhanced activity of indolamine-2,3-doxygenase in lipopolysaccharide-stimulated MPC. CG suppressed phagocitosis of E. coli lux+ by monocytes and simultaneously inhibited the production of active oxygen species in the reaction of spontaneous luminol-dependent chemiluminescence. Taken together, these properties of CG account for its role in the promotion of the formation of immunological tolerance during pregnancy.

Key words: pregnancy, chorionic gonadotropin, monocytes, Treg, Il-4, IFN-y, indolamine-2,3-doxygenase.

Беременность представляет собой физиологически обусловленное состояние толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду. В это время возрастает численность Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), обладающих иммуносупрессивным действием [2]. Системные иммунные реакции смещаются в сторону гуморального ответа (феномен ТИ2-девиации) за счет преимущественной секреции противовоспалительных цитокинов [1]. Помимо этого периферическая толерантность формируется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), что нарушает антифетальные клеточноопосредованные иммунные реакции матери [14].

Изучение роли гормонов беременности в качестве причин данного феномена является актуальным направлением репродуктивной иммунологии. Хорионический гонадотропин (ХГ), который про-

дуцируется во время беременности, не только играет существенную роль в регуляции стероидогенеза в плаценте и у плода [11], но и обладает иммуномо-дулирующим действием [1]. Важно отметить, что максимальная концентрация ХГ в период гестации совпадает с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (MHC) на клеточной поверхности эмбриона (7—10 нед), распознавание которых может привести к процессам иммунного отторжения [2]. ХГ способствует Т-хелперному ответу 2-го типа (Th2) [1], непосредственно связываясь с поверхностью Т-лимфоцитов [17]. Кроме того, он регулирует активность фагоцитирующих клеток [1].

Цель работы —оценить влияние ХГ на синтез Т-лимфоцитами интерлейкина-4 (IL-4) и интерфе-рона-у (IFN-y), индукцию адаптивных Treg, а также экспрессию IDO моноцитами, а также их фагоцитарную и окислительную активности.

© С.В. Ширшев, С.А. Заморина, 2011

*e-mail: mantissa7@mail.ru

Материал и методы

Исследование проводили на мононуклеарах периферической крови (МПК), выделенных из венозной крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. ХГ применяли в концентрациях 10 и 100 МЕ/мл (соответствующих уровню гормона во II—III и I триместры беременности) [18].

МПК культивировали с ХГ в среде 199 с добавлением 10% ЭТС («Sigma», США), 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США), 2 мМ L-глутамина («ICN Ph.», США) и 100 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения) в течение суток в условиях 5% СО2. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 является основным маркером Treg, количество последних оценивали как процент CD4+CD25bright Foxp3+ клеток (Anti-Human Foxp3-Alexa Fluor 488, 206D) в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов (PE/Cy5 anti-human CD4, OKT4; PE anti-human CD25, BC96).

Для оценки внутриклеточного синтеза цитоки-нов в CD3+CD4+- и ОТ3+ОТ8+-лимфоцитах использовали фикоэритрин-конъюгированные антитела к IL-4 и IFN-y («Caltag», США). Для стимуляции внутриклеточного синтеза использовали форбол-миристацетат (PMA) (50 нг/мл, «Sigma», США,) в комбинации с иономицином (50 мкг/мл, «Sigma», США), затем применяли брефелдин А (10 мкг/мл, «ICN Ph.», США), согласно стандартной методике. Измерения проводили на проточном цитофлуори-метре («Becton Dickinson», США).

Активность IDO определяли спектрофотомет-рически по изменению концентрации кинурени-на — первого стабильного метаболита триптофана [6]. Поскольку IDO продуцируется только антиген-презентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, полученные результаты интерпретировали как продукцию IDO моноцитами. МПК, стимулированные IFN-y (10 нг/мл, «Вектор Бест», Россия) или липополисахаридом (ЛПС) — 100 нг/мл («Sigma», США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана («Sigma», США) в течение 4 ч. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% три-хлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. В лунки 96-лу-ночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 (США).

Фагоцитарную активность моноцитов определяли после часовой инкубации с ХГ по степени снижения свечения люминесцентного генно-инженерного штамма фагоцитируемых бактерий E.coli lux+ с использованием люминометра Luminoskan

Ascent (Финляндия). Результаты оценивали по индексу фагоцитарной активности (ИФА), отражающего процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100х(Х1—Х2)/Х1, где Х1 — интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (бактерии), Х2 — то же опытной пробы (бактерии+фагоциты) [3].

Окислительную активность моноцитов определяли в тесте люминол-зависимой хемилюминесцен-ции (ЛЗХЛ). Для этого после часовой инкубации с ХГ измеряли интенсивность спонтанной ЛЗХЛ. Активаторами фагоцитов в стимулированном варианте ЛЗХЛ (20 мин) служили опсонизированные бактерии E.coli (штамм К-12). Для измерений использовали люминометр Luminoskan Ascent (Финляндия). Результаты выражали в относительных световых единицах — RLU (related light units).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного i-критерия Стью-дента.

Результаты и обсуждение

Учитывая значение баланса IFN-y и IL-4, продуцируемых Т-лимфоцитами, для сохранения беременности [2], в начале исследовали влияние ХГ на способность CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-лимфоцитов продуцировать данные цитокины. Как видно на рис. 1, суточная инкубация МПК (100 МЕ/мл) с ХГ приводила к повышению процента IL-4-позитивных CD3+CD4+T-клеток. В то же время гормон не влиял на внутриклеточную продукцию IFN-y и IL-4 CD3+CD8+Т-лимфоцитами, равно как и на продукцию IFN-y CD3+CD4+T-клетками. Таким образом, в концентрации, характерной для

Рис. 1. Влияние ХГ на внутриклеточный уровень цитокинов (IL-4 и INF-y) в лимфоцитах периферической крови женщин in vitro (n=9).

1 — CD4+ IFN-y1", 2 — CD4+IL-4+, 3 — CD8+ IFN-y+, 4 — CD8+IL-4+.

Здесь и на рис. 2: * — p<0,05 по отношению к контролю.

100

80

70

50

% CD4+CD25bnsthFoxp3+

Контроль

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл

ИФА, %

Рис. 2. Влияние ХГ на экспрессию Foxp3 в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов периферической крови женщин in vitro (n=9).

95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45

0 5 10 15 20 "контроль ХГ 10 МЕ/мл

25 30 мин -к - ХГ 100 МЕ/мл

Рис. 3. Влияние ХГ на фагоцитарную активность моноцитов женщин в отношении E. coli lux+ (n=8).

a — p<0,05 в отношении эффекта высокой дозы ХГ, b — то же в отношении низкой его дозы.

I триместра беременности, ХГ может являться одним из факторов, способствующих формированию иммунного ответа по ТЪ2-типу.

Далее установлено, что суточная инкубация МПК с ХГ (10 и 100 МЕ/мл) увеличивает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток в культуре (рис. 2). Так как результат оценивался после суточной инкубации, а для пролиферации естественных Treg требуется от 4 до 7 сут [8], стимулирующий эффект ХГ можно интерпретировать как способность увеличивать долю только адаптивных Treg.

Во время беременности пул Treg в периферической крови возрастает как за счет пролиферации естественных Treg, так и за счет индукции адаптивных Treg (экспрессия молекулы Foxp3) [10]. Важно отметить, что в механизме передачи сигнала участвует цАМФ [2], повышение уровня которого приводит к экспрессии молекулы Foxp3 [5]. Не исключено, что увеличение относительного количества Treg в периферической крови на ранних сроках нормальной беременности [10] связано именно с действием ХГ.

Спонтанная активность IDO в нормальных МПК практически не определяется, поэтому при оценке

влияния ХГ на активность данного фермента мы использовали стандартные индукторы — ЛПС и IFN-y [13]. ХГ (100 МЕ/мл) достоверно усиливал активность IDO в ЛПС-стимулированных МПК и не влиял на ее активность при стимуляции клеток IFN-y (табл. 1). Взаимодействие ЛПС с Toll-подобным рецептором 4 (TLR-4) вовлекает МАРК-киназный (митоген-активированная протеинкиназа) каскад с последующей активацией ядерного транскрипционного фактора NF-kB [13]. По-видимому, ХГ является коактиватором TLR4-зависимой индукции IDO.

При оценке фагоцитарной активности установлено, что ХГ угнетает фагоцитоз E.coli lux+ моноцитами периферической крови (рис. 3). Данный эффект зависел от концентрации гормона. Так, в малой концентрации (10 МЕ/мл) ХГ угнетал фагоцитарную активность только в первые 15 мин, после чего моноциты восстанавливали свою функцио-

Таблица 1. Изменение активности IDO под влиянием ХГ

Гормональное воздействие

Контроль ХГ 10, МЕ/мл ХГ 100, МЕ/мл

Концентрация кинуренина, мкМ

стимулятор IFN-y

стимулятор ЛПС

5,03+0,549 4,91+0,234 5,04+0,379

6,02+0,841 7,43+0,965 9,17+1,074*

n

Таблица 2. Влияние ХГ на ЛЗХЛ моноцитов

Гормональное воздействие п Спонтанная ЛЗХЛ, RLU

Контроль 8 0,0083+0,00039 0,043+0,0029

ХГ 10, МЕ/мл 8 0,0083+0,00078 0,044+0,0084

ХГ 100, МЕ/мл 8 0,0057+0,00059* 0,045+0,0032

Рис. 4. Роль ХГ в формировании иммунологической толерантности при физиологически протекающей беременности.

ЦТЛ — цитотоксические лимфоциты.

нальную активность, а в концентрации 100 МЕ/мл (соответствующей I триместру беременности) гормон подавлял фагоцитоз на протяжении всего исследуемого периода.

В отношении спонтанной ЛЗХЛ моноцитов, которая отражает исходный уровень окислительного метаболизма клеток, установлено, что только высокая концентрация ХГ (100 МЕ/мл) угнетает продукцию активных форм кислорода. В то же время на ЛЗХЛ стимулированных E. coli моноцитов ХГ не влиял (табл. 2).

Таким образом, ХГ подавлял фагоцитарную и окислительную активность моноцитов, оказывая более выраженный эффект в концентрации 100 МЕ/ мл, соответствующей I триместру беременности. Возможно, что снижение функциональной активности моноцитов определяет один из механизмов предупреждения антифетальных реакций и защиты собственных тканей от повреждения в этот период гестации.

На рис. 4 представлена гипотетическая схема, суммирующая полученные результаты. Гормон избирательно активирует синтез IL-4 T-клетками, настраивая их функциональную активность по ТИ2-цитокиновому типу. К этому присоединяется

способность ХГ увеличивать пул адаптивных Treg, одновременно костимулируя TLR-индуцированную активность IDO моноцитов. Известно, что при контакте молекул CTLA-4, представленных на Treg, с лигандами В7.1/2, которые экспонированы на антигенпрезентирующих клетках (моноцитах), экспрессия IDO в последних усиливается [9]. В свою очередь, клетки, экспрессирующие повышенные уровни IDO, способствуют генерации адаптивных Treg из CD4+CD25--лимфоцитов [7]. В то же время активация IDO может приводить к гибели цито-токсических лимфоцитов вследствие дефицита необходимой для их активности аминокислоты и выделения токсичных продуктов ее деградации, таких как кинуренин [15]. Важно отметить, что наиболее выраженными эффектами обладает концентрация ХГ (100 МЕ/мл), которая наблюдается в I триместре беременности, т.е. в период экспрессии антигенов MHC I класса на клеточной поверхности эмбриона, распознавание которых может привести к его отторжению.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ является одним из факторов, способствующих поддержанию иммунологической толерантности при беременности.

Выводы

1. ХГ в концентрации сопоставимой с его уровнем в I триместре беременности (100 МЕ/мл) достоверно увеличивает процент CD3+CD4+T-лимфоцитов, содержащих молекулы IL-4.

2. Гормон не оказывает влияния на внутриклеточную продукцию IFN-y и IL-4 в субпопуляции CD3+CD8+Т-лимфоцитов, равно как и на продукцию IFN-y CD3+CD4+T-клетками.

3. Независимо от концентрации ХГ достоверно повышает процент CD4+CD25brightFoxp3+ клеток in vitro, одновременно повышая активность индол-амин-2,3-диоксигеназы в ЛПС-стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови.

4. Гормон угнетает фагоцитоз E. coli lux+ моноцитами и подавляет спонтанную продукцию активных форм кислорода в реакции люминолзависимой хемилюминесценции.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

ЛИТЕРАТУРА

1. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. Т. 2. Екатеринбург 2002; 557.

2. Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. Екатеринбург: УрО РАН 2009; 582.

3. Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Никитина Н.М., Некрасова И.В. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Пат. 2292553 РФ. Опубл. 27.01.07, Бюл. №3.

4. Abrahams V.M., Kim Y.M., Straszewski S.L., Romero R., Mor G. Am J Reprod Immunol 2004; 51: 275—282.

5. Adams E.F., Lei T, Buchfelder M, Bowers C.Y, Fahlbusch R. Mol Endocrinol 1996; 4: 432—438.

6. Braun D, Longman R.S., Albert M.L. Blood 2005; 106: 2375— 2381.

7. Chen W., Liang X., Peterson A.J. et al. J Immunol 2008; 181: 5396—5404.

8. De Rosa V., Procaccini C, Pirozzi G. et al. Immunity 2007; 26: 241—255.

9. Fallarino F., Grohmann U., HwangK. W. et al. Nat Immunol 2003; 4: 1206—1212.

10. Heikkinen J., Mottonen M., Alanen A., Lassila O. Clin Exp Immunol 2004; 136: 373—378.

11. HuhtaniemiI.T., Korenbrot C.C., JaffeR.B. J Clin Endocrinol Me-tab 1977; 44: 936—941.

12. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Science 2004; 299: 1057—1061.

13. Junga I.D., Lee C.-M., Jeongb Y.-I. et al. FEBS Letters 2007; 581: 1449—1456.

14. Mellor A.L., Munn D.H. J Reprod Immunol 2001; 52: 5—13.

15. Munn D.H., Shafizadeh E, Attwood J.T. et al. J Exp Med 1999; 189: 1363—1372.

16. Sharma S., YangS.-Ch., Zhu L. et al. Cancer Res 2005; 65: 5211 — 5220.

17. Susumi Y, Yukihiko Sh, Kazno K, Atsushi O. Am J Reprod Immunol 1981; 1: 340—344.

18. Wide L. Acta Endocrinol (Kbh) 1962; 41: Suppl 70:1—100.