СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦЕФТРИАКСОНА В ТКАНЯХ ОПЕРАЦИОННОГО ПОЛЯ
METHOD FOR DETERMINING CONCENTRATION OF CEFTRIAXONE IN TISSUES OF SURGICAL FIELD

Изобретение относится к фармации, а именно к фармацевтической химии.
Цефтриаксон (6R-6-альфа, 7бета(Z)-7-2-амино-4-тиазолил (метоксиимино) ацетил амино-8-оксо-3-(1,2,5,6-тетрагидро-2-метил-5,6-диоксо-1,2,4-триазин-3-ил)тиометил-5-тиа-1 -азабицикло 4.2.0 окт-2-ен-2-карбоновая кислота (в виде динатриевой соли)) - антибиотик широкого спектра действия из группы цефалоспоринов III поколения. Основными показаниями для назначения являются: инфекции ЛОР-органов, мочевыводящих путей, центральной нервной системы, микробные поражения печени, воспалительные заболевания органов малого таза. Он также используется для периоперационной профилактики инфекционно-воспалительных осложнений у больных в хирургии, онкологии, травматологии и ортопедии, колопроктологии и других сферах хирургической деятельности. При этом эффект применения антибиотиков, и в частности цефтриаксона, определяется созданием достаточной концентрации препарата в тканях раневой зоны или иного очага воспаления. В целях повышения эффективности антибиотикопрофилактики необходимо использование современных аналитических методов, позволяющих контролировать содержание антибиотика в тканях операционного поля. Одним из таких методов является капиллярный электрофорез.
Разработанные варианты анализа цефтриаксона в биологических объектах представлены, в основном, хроматографическими методами.
Изучена возможность идентификации цефтриаксона в модельной смеси ткани печени с использованием метода ИК-спектроскопии (Безъязычная А.А., Шорманов В.К., Сипливая Л.Е. // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье», 2018; 1: 128-132). Проведены исследования по выбору способа изолирования цефтриаксона из биологического материала с последующей очисткой методом ТСХ и определением методом УФ-спектрофотометрии (Безъязычная А.А., Шорманов В.К., Сипливая Л.Е. // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Актуальные вопросы разработки и исследования новых лекарственных средств: Материалы 7 Международной научно-методической конференции "Фармобразование-2018". - Воронеж, 2018. С. 376-379). При этом методика изолирования отличалась длительностью и многостадийностью.
Ряд авторов сообщают о возможности применения высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Bhushan R., Parshad V. // Biomed Chromatogr, 1996; 10 (5): 258-260; Raju V.J., Seshagiri Rao J.V.L.N. // Chemistry, 2008; 5 (3): 427-430).
Капиллярный зонный электрофорез был применен для разделения смеси 10 цефалоспориновых антибиотиков (цефаклор, цефадроксил, цефалексин, цефазолин, цефокситин, цефуроксим, цефоперазон, цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон) в лекарственных препаратах. Разделение проводили с использованием буферного раствора, содержащего 25 мМ динатрий гидрофосфат, рН 7,00, напряжение +25 кВ, при температуре 25°С, УФ-детекция при 210 нм (Hancu G., Sasebesj A., Rusu A., Kelemen Н., Ciurba А. // Adv Pharm Bull, 2015; 5 (2): 223-229).
Концентрация цефтриаксона в количестве 1,4±1,2 мг/л определялась методом капиллярного электрофореза в мокроте больного после 6 внутривенных введений препарата через каждые 24 часа в концентрации 80 мг/кг (Klekner A., Bagyi К. et al. Clin Microbiol, 2006; 44 (9): 3418-21).
Цель предлагаемого способа - повышение объективности и надежности определения цефтриаксона в тканях операционного поля методом капиллярного электрофореза.
Поставленная цель достигается тем, что в процессе пробоподготовки в качестве извлекателя используют водный раствор натрия гидроксида рН 12,0 в количестве 0,4 мл, экстракцию проводят органической системой растворителей хлороформ и изобутанол в соотношении 3:1 в количестве 1 мл в течение 10 минут четырехкратно, реэкстракцию осуществляют буферным раствором Бриттона-Робинсона рН 12,0 в количестве 1 мл, а анализ полученного реэкстракта проводят с помощью капиллярного электрофореза, соблюдая следующие условия: система капиллярного электрофореза «Капель- 105М»; рабочий электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 12,0; ввод пробы гидродинамическим способом 30 мбар в течение 15 сек; напряжение тока: +20 кВ; длина волны - 265 нм.
Новизна предлагаемого способа заключается в пробоподготовке биологического объекта, где в качестве извлекателя применяют водный раствор натрия гидроксида рН 12,0 в количестве 0,4 мл, экстракцию проводят органической системой растворителей хлороформ и изобутанол в соотношении 3:1 в количестве 1 мл в течение 10 мин. четырехкратно, реэкстракцию осуществляют буферным раствором Бриттона-Робинсона рН 12,0 в количестве 1 мл, анализ полученного реэкстракта проводят с помощью капиллярного электрофореза при следующих условиях: система капиллярного электрофореза «Капель-105М»; рабочий электролит - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН 12,0; ввод пробы гидродинамическим способом 30 мбар в течение 15 сек.; напряжение тока: +20 кВ; длина волны - 265 нм.
Технические решения, имеющие признаки, которые совпадают с отличительными признаками предлагаемого нами способа, не выявлены, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ определения концентрации цефтриаксона осуществляется следующем образом: к 0,1 г измельченной ткани печени, предположительно содержащей от 0,1 до 20 мкг цефтриаксона добавляют 0,4 мл водного раствора натрия гидроксида (рН 12,0), перемешивают и оставляют в защищенном от света месте при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Смесь центрифугируют (6000 об./мин., 5 мин.), надосадочную жидкость отделяют, добавляют по каплям 10% раствор хлористоводородной кислоты до рН 2,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и подвергают экстракции органической системой хлороформ: изобутанол, 3:1 (1 мл × 4, 10 мин.). Эмульсию разрушают центрифугированием (6000 об./мин. 10 мин.). Органическую фазу отделяют, к объединенным экстрактам добавляют 1 мл буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 12,0, проводят реэкстрагирование в течение 10 мин. Для разрушения эмульсии смесь центрифугируют (6000 об./мин., 10 мин.). Реэкстракты отделяют, дегазируют центрифугированием (центрифуга «Mini Spin Plus», 10000 об./мин., 10 мин.) и используют для анализа цефтриаксона методом капиллярного электрофореза («Капель-105 М») в следующих условиях:
• рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН12,0;
• растворитель пробы - РЭ, разбавленный водой очищенной в 10 раз;
• ввод пробы - давлением (30 мБар × 15 сек.);
• положительный электрод со стороны введения РЭ - +20кВ;
• детекция - встроенный УФ-детектор, 265 нм;
• запись и обработку полученных электрофореграмм (ЭФГ) осуществляют с помощью программного обеспечения «Эльфоран» для Windows.
На ЭФГ рассчитывают площади пика (величины фотометрического сигнала). Результаты исследований представлены в таблице 1.
Средние величины фотометрических сигналов (площадей пиков) использовали для построения калибровочного графика:
у=а⋅х+b, где
х - измеренная концентрация цефтриаксона
у - измеренная площадь пика (величина фотометрического сигнала)
a, b - рассчитанные коэффициенты.
Рассчитанное уравнение калибровочного графика: у=0,162х-0,0187
При этом установлено, что в диапазоне концентраций цефтриаксона от 0,1 до 20,0 мкг/0,1 г печени наблюдается линейная зависимость величин фотометрического сигнала от концентраций антибиотика и аппроксимируется уравнением с коэффициентами корреляции 0,9996, что позволяет использовать данную методику для количественного определения цефтриаксона в указанном интервале концентраций.
В процессе разработки способа проводилась валидация по показателям: правильность, прецизионность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность согласно руководству ЕМЕА (Guideline on bioanalitical method validation, ЕМЕА, 2009) и Руководству по экспертизе лекарственных средств (Москва, 2013; Т. 1).
Для оценки прецизионности и правильности методики определения цефтриаксона в биологических объектах проводили 6 параллельных исследований антибиотика на уровнях концентрации: 0,1 мкг/мл; 5 мкг/мл; 20,0 мкг/мл в разработанных выше условиях. На ЭФГ определяли площади пика и по вышеприведенному уравнению калибровочного графика рассчитывали концентрацию цефтриаксона в течение 1-го и 2-го дней исследований. Для получения значений концентраций цефтриаксона были рассчитаны относительные величины стандартных отклонений (RSD, %), правильность  относительные погрешности . Результаты представлены в таблицах 2.1. и 2.2.
Представленные результаты показывают, что величины стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности соответствуют нормам нормативной документации (не более 20% для минимальной концентрации, а для остальных концентраций не превышают 15%) (см. табл. 3).
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами использования:
Пример 1. Пациенту, которому выполнена мастэктомия, за 20 минут до операции внутривенно введен 1,0 г цефтриаксона. Через 30 и 60 мин осуществляли отбор тканей операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа). Навески биологических объектов не превышали 0,1 г. Последующую пробоподготовку и анализ проводили согласно методике: к 0,1 г мелкоизмельченной ткани операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа), добавляют 0,4 мл водного раствора натрия гидроксида (рН 12,0), перемешивают и оставляют в защищенном от света месте при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Смесь центрифугируют (6000 об./мин., 5 мин.), надосадочную жидкость отделяют, добавляют по каплям 10% раствор хлористоводородной кислоты до рН 2,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и подвергают экстракции органической системой хлороформ: изобутанол, 3:1 (1 мл × 4, 10 мин.). Эмульсию разрушают центрифугированием (6000 об./мин. 10 мин.). Органическую фазу отделяют, к объединенным экстрактам добавляют 1 мл буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 12,0, проводят реэкстрагирование в течение 10 мин. Для разрушения эмульсии смесь центрифугируют (6000 об./мин., 10 мин.). Реэкстракты отделяют, дегазируют центрифугированием (центрифуга «Mini Spin Plus», 10000 об./мин., 10 мин.) и используют для анализа цефтриаксона методом капиллярного электрофореза («Капель-105 М») в следующих условиях:
• рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН12,0;
• растворитель пробы - РЭ, разбавленный водой очищенной в 10 раз;
• ввод пробы - давлением (30 мБар × 15 сек.);
• положительный электрод со стороны введения РЭ - +20кВ;
• детекция - встроенный УФ-детектор, 265 нм;
• запись и обработку полученных электрофореграмм (ЭФГ) осуществляют с помощью программного обеспечения «Эльфоран» для Windows.
На ЭФГ рассчитывают площади пика (величины фотометрического сигнала).
Результаты исследований представлены в таблице 4.
Пример 2. Пациенту, которому выполнена мастэктомия, за 20 минут до операции внутривенно введен 1,0 г цефтриаксона. Через 30 и 60 мин осуществляли отбор тканей операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа). Навески биологических объектов не превышали 0,1 г. Последующую пробоподготовку и анализ проводили согласно методике: к 0,1 г мелкоизмельченной ткани операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа), добавляют 0,4 мл водного раствора натрия гидроксида (рН 12,0), перемешивают и оставляют в защищенном от света месте при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Смесь центрифугируют (6000 об./мин., 5 мин.), надосадочную жидкость отделяют, добавляют по каплям 10% раствор хлористоводородной кислоты до рН 2,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и подвергают экстракции органической системой хлороформ: изобутанол, 3:1 (1 мл × 4, 10 мин.). Эмульсию разрушают центрифугированием (6000 об./мин. 10 мин.). Органическую фазу отделяют, к объединенным экстрактам добавляют 1 мл буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 12,0, проводят реэкстрагирование в течение 10 мин. Для разрушения эмульсии смесь центрифугируют (6000 об./мин., 10 мин.). Реэкстракты отделяют, дегазируют центрифугированием (центрифуга «Mini Spin Plus», 10000 об./мин., 10 мин.) и используют для анализа цефтриаксона методом капиллярного электрофореза («Капель-105 М») в следующих условиях:
• рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН12,0;
• растворитель пробы - РЭ, разбавленный водой очищенной в 10 раз;
• ввод пробы - давлением (30 мБар × 15 сек.);
• положительный электрод со стороны введения РЭ - +20кВ;
• детекция - встроенный УФ-детектор, 265 нм;
• запись и обработку полученных электрофореграмм (ЭФГ) осуществляют с помощью программного обеспечения «Эльфоран» для Windows.
На ЭФГ рассчитывают площади пика (величины фотометрического сигнала).
Результаты исследований представлены в таблице 5.
Пример 3. Пациенту, которому выполнена мастэктомия, за 20 минут до операции внутривенно введен 1,0 г цефтриаксона. Через 30 и 60 мин осуществляли отбор тканей операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа). Навески биологических объектов не превышали 0,1 г. Последующую пробоподготовку и анализ проводили согласно методике: к 0,1 г измельченной ткани операционного поля (фасция, подкожно жировая клетчатка, кожа), предположительно содержащей от 0,1 до 20 мкг цефтриаксона добавляют 0,4 мл водного раствора натрия гидроксида (рН 12,0), перемешивают и оставляют в защищенном от света месте при периодическом перемешивании в течение 30 мин. Смесь центрифугируют (6000 об./мин., 5 мин.), надосадочную жидкость отделяют, добавляют по каплям 10% раствор хлористоводородной кислоты до рН 2,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и подвергают экстракции органической системой хлороформ: изобутанол, 3:1 (1 мл × 4, 10 мин.). Эмульсию разрушают центрифугированием (6000 об./мин. 10 мин.). Органическую фазу отделяют, к объединенным экстрактам добавляют 1 мл буферного раствора Бриттона-Робинсона, рН 12,0, проводят реэкстрагирование в течение 10 мин. Для разрушения эмульсии смесь центрифугируют (6000 об./мин., 10 мин.). Реэкстракты отделяют, дегазируют центрифугированием (центрифуга «Mini Spin Plus», 10000 об./мин., 10 мин.) и используют для анализа цефтриаксона методом капиллярного электрофореза («Капель-105 М») в следующих условиях:
• рабочий электролит (РЭ) - буферный раствор Бриттона-Робинсона, рН12,0;
• растворитель пробы - РЭ, разбавленный водой очищенной в 10 раз;
• ввод пробы - давлением (30 мБар × 15 сек.);
• положительный электрод со стороны введения РЭ - +20кВ;
• детекция - встроенный УФ-детектор, 265 нм;
• запись и обработку полученных электрофореграмм (ЭФГ) осуществляют с помощью программного обеспечения «Эльфоран» для Windows.
На ЭФГ рассчитывают площади пика (величины фотометрического сигнала).
Результаты исследований представлены в таблице 6.
Предлагаемый способ определения концентрации цефтриаксона в тканях операционного поля применялся в лаборатории «Аналитических методов исследования» кафедры химии с курсом фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО ЯГМУ Минздрава России.