Пред- и посттранскрипционная модификация генетической информации в программе лечения мышечных дистрофий

пред- и посттранскрипционная модификация генетической информации в программе лечения мышечных дистрофий

И.А. Яковлев 12, Р.В. Деев 12, В.В. Соловьева 2, А.А. Ризванов 2, А.А. Исаев 1

1 Институт стволовых клеток человека, Москва, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Pre- and posttranscriptional genetic information modification in muscular dystrophy treatment

I.A. Yakovlev12, R.V. Deev12, V.V. Solovyеva2, A.A. Rizvanov2, A.A. Isaev1

1 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia.

2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

Сегодня имеется целый ряд геннотерапевтических методов для восстановления функции белка утраченной в результате мутации, проводится большое количество как доклинических, так и клинических исследований безопасности и эффективности препаратов-кандидатов, которые должны позволить осуществить этиотропный подход к лечению наследственных заболеваний. Одной из самых распространенных и социально значимых групп генетических болезней является мышечная дистрофия, включающая в себя такие заболевания как миодистрофия Дюшенна и дисферлинопатия. Для этих заболеваний пока не найдено эффективного метода генной терапии, несмотря на значительный объем исследований в этой области.

Настоящий обзор призван рассмотреть основные ген-нотераветические стратегии в лечении миодистрофий, а именно пред- и посттранскрипционную модификацию биосинтетической (генетической) информации и проанализировать наиболее перспективные из них.

Ключевые слова: генная терапия, мышечные дистрофии, миодистрофия Дюшенна, дисферлинопатия, клинические исследования, транс-сплайсинг, экзон-скиппинг.

Введение

С начала XXi века генная терапия (ГТ) является одной из самых бурно развивающихся отраслей современной медицины. Ее основное направление — разработка эффективных решений для лечения наследственных заболеваний, поскольку только геннотерапевтические методы позволяют воздействовать собственно на причину этих заболеваний. В совокупности с тем, что врожденная патология зачастую является причиной ранней смертности, а также инвалидизации в трудоспособном возрасте ГТ приобретает не только научную, медицинскую, но и социальную значимость. Из огромного количества наследственных заболеваний одной из наиболее распространенных является группа мышечных дистрофий, в которую входят такие тяжелые состояния как миодистрофия Дюшенна (МДД), миотоническая дистрофия, поясно-конечностные мышечные дистрофии и др.

Поиск оптимального геннотерапевтического решения для пациентов с данными заболеваниями осложняется большими размерами генов. Например, ген DYSF, кодирующий белок дисферлин, имеет размер 6243 пар нуклеотидов (п. н.) и состоит из 55 экзонов [1], ген DMD, кодирующий дистрофин, состоит из 79 экзонов и является самым большим геном в природе — 2,4 млн п. н. [2]. Это обстоятельство ставит перед исследователями проблему создания эффективной генно-терапевтической технологии, а также способа доставки терапевтиче-

е-таП: ivan@ivan-ya.ru

Nowadays, a whole range of genetherapeutic methods is being used to restore a lost protein function due to mutation, a big number of preclinical and clinical studies of potential drugs that may allow to implement an etiotropic approach is being performed. One of the most prevalent and socially significant groups of genetic pathologies is muscular dystrophy, including such diseases as Duchenne muscular dystrophy and dysfelinopathy. Despite a large number of studies in this field, there is no effective method of gene therapy for these diseases yet.

This work is intended to review main genetherapeutic methods in myodystrophy treatment, especially pre- and posttranscriptional genetic (biosynthetic) information modification, and analyze most optimal of them.

Keywords: gene therapy, muscular dystrophy, Duchenne myodystrophy, dysferlinopathy, clinical trials, trans-splicing, exon-skipping.

ских конструкций. Существует несколько подходов, позволяющих произвести восстановление функциональности мутантного белка: внесение полного гена или мини-гена (генный трансфер), коррекция генома или модификация процесса транскрипции. Каждый из методов ограничен возможностями векторов (емкость, иммуногенность, эффективность проникновения через клеточную мембрану и т.д.), а также размером гена, который необходимо редактировать или доставить в клетку. На сегодняшний день самыми безопасными и универсальными (способны трансдуцировать любые клетки на любой стадии деления) считают векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (рААВ) [3]. Основным недостатком рААВ является ограничение размера трансгена (не более 4,7 тыс. п. н.), что меньше размера генов, мутации в которых обуславливают развитие миопатий. В случае дистрофина возможно использование мини-гена или удаление участков генетической информации посредством пропуска экзонов, что позволяет получить усеченный, но функциональный белок. Для дисферлина в настоящее время не найдена возможность сохранить его работоспособность при изменении структуры, за исключением пропуска 32 экзона, когда функциональность белка была частично восстановлена [4, 5, 6]. Таким образом, в терапии миодистрофий рассматривают методы, заключающиеся в использовании сравнительно небольших молекул для редактирования генома или пост-транскрипционной генетической информации.

Методы генной терапии

Традиционно, под генной терапией понималось внедрение в клетку непосредственно какого-либо гена или мини-гена. Но учитывая то, что технологии геномного редактирования и рекомбинации РНК все чаще рассматриваются исследователями как подходы к лечению различных групп заболеваний, а некоторые методики использованы для разработок лекарственных средств и проходят клинические исследования, следует расширить понятие «генная терапия» и включить в него вышеперечисленные методы. Таким образом, генную терапию можно определить, как комплекс методов, включающий в себя внесение в клетку полного гена или его фрагмента, способы геномного редактирования и рекомбинацию РНК, общей целью которых является восстановление утраченной в результате мутации функции белка, либо создание новой функции для достижения терапевтического эффекта.

Предложенная в 1987 г. Брайаном Сауэром технология Cre-Lox-опосредованной рекомбинации позволяет инициировать экспрессию генов в клетках млекопитающих путем разрезания целевых участков ДНК с помощью Сге-рекомбиназы [7]. В 1992 г. группой ученых под руководством Пола Орбана эта технология была впервые использована для сайт-специфичной рекомбинации ДНК у мышей [8]. В 1998 г. был применен метод, основанный на работе Zn-фингерных эндонуклеаз

[15]. Количество исследований с использованием данной технологии, начиная с 2013 г., ежегодно растет двукратно (рис. 1). CRiSPR\Cas9 представляет большой интерес для научного сообщества в связи с относительной простотой применения и, по мнению исследователей, адекватной ресурсозатратностью

[16].

Редактирование процессов транскрипции и трансляции заключается в возможности воздействовать на данные процессы с целью замены синтеза мутант-ного белка на нормальный. Существует два основных метода, с помощью которых возможно модифицировать процесс экспрессии гена: экзон-скиппинг — метод пропуска экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и сплайсосомо-опосредованный

транс-сплайсинг (СОТ) — процесс сплайсинга между двумя молекулами пре-мРНК, целью которого является синтез мРНК с набором нормальных экзонов [17]. В целом ряде исследований данные методы уже доказали свою эффективность. СОТ и экзон-скип-пинг, разрабатываемые и применяемые в лечебных целях, можно обозначить как терапевтическое редактирование РНК.

800

01СЛ01<ЛСПС1(ЛСЛСЛСПОООООООООО.Ч*-(*Ч1Ч,ч,ч СТСТСТСТСПСТСЛФСПСПОООООООООООООООО ri И H d H d тНтНгЧ ri IN П П N N fN(N(N П N (N N IN (Ч N fN

^— Cre-Lox —CRISPR\Cas9

^И— ZFN —Щ— HAC

Рис. 1. Количество публикаций по основным технологиям геномного редактирования (включая Human artificial chromosome, HAC), по данным http://pubmed.com

Все методы генной терапии требуют определенной доставки терапевтических молекул непосредственно в целевую клетку. Невирусный генный трансфер, в основном, осуществляется с помощью внесения в целевые клетки плазмидного вектора, несущего геннотерапевтическую (трансгенную) информацию. Достоинствами плазмид являются неограниченный размера гена, а также отсутствие иммуногенности. Тем не менее, эффективность трансфекции при прямом введении в ткани составляет около 1% [18, 19], а экспрессия гена продолжается лишь некоторое время, что в случае коррекции наследственного заболевания требует повторного (или многократного) введения [20]. Вместе с тем, в некоторых исследованиях местное использование плазмидных векторов приводило к увеличению синтеза дис-трофина на 10% у mdx (дистрофин-дефицитных) мышей [21] и восстановлению экспрессии дистро-фина (6% — полное, 26% — частичное) у пациентов с МДД. Дистрофин-позитивные мышечные волокна были обнаружены через 24 нед. после введения вектора [22].

В большинстве исследований вирусный генный трансфер осуществляется с помощью рекомбинант-ных векторов на основе лентивируса, аденовируса, ААВ, вируса простого герпеса (ВПГ-1) и HAD вектора (Helper-dependent adenoviral vector). Наиболее

емкими являются ВПГ-1 вектор (до 100 тыс. п. н. трансгенной информации), область применения которого ограничена тропностью вируса к нервной ткани, и HAD вектор (до 37 тыс. п. н. трансгенной информации), более безопасный и стойкий в отношении длительности трансгенной экспрессии, чем аденовирус [23]. Широкое применение в генной терапии нашел ААВ вектор, что связано с крайне низкой иммуногенностью, отсутствием онкогенно-сти и длительностью экспрессии трансгена (больше года). Несмотря на небольшую емкость ААВ, являющуюся основным недостатком вектора, существуют способы обойти данное ограничение за счет двойной трансфекции участков гена, конкатамеризации, гомологичной рекомбинации [24], а также интеин-опосредованного транс-сплайсинга.

Экзон-скиппинг

Метод экзон-скиппинга (ЭС) заключается в обеспечении возможности «обойти» мутантный экзон в процессе сплайсинга и восстановить рамку считывания. Таким образом, из зрелой мРНК, и, как следствие, из белка, данная мутация будет исключена [25]. При этом, в связи с пропуском экзона, сам белок получается укороченным, поэтому данная технология будет эффективна только в том случае, когда укорочение молекулы белка не оказывает значительного влияния на его функциональность [26].

Механизм экзон-скиппинга заключается в связывании антисмысловых олигонуклеотидов (АОН), малых синтетических молекул РНК, с определенными участками целевой пре-мРНК, что и позволяет исключить из процесса сплайсинга определенные участки РНК [27].

АОН, запрограммированные на блокировку сай-ленсеров сплайсинга, коротких участков (4—18 нуклеотидов) ингибирующих сплайсинг пре-мРНК [28], также могут включить экзон в процесс сплайсинга, если он пропускается в результате мутантного экзон-скиппинга [29]. Кроме этого, они позволяют исключить считывание псевдо- и нонсенс-экзонов, включенных в ген в результате мутации [30].

Данные молекулы редко используются как самостоятельные РНК или ДНК олигонуклеотиды, в связи с тем, что они подвержены воздействию эндону-клеаз как вне клетки, так и при попадании в ядро клетки. Чтобы избежать этого, а также, для улучшения стабильности, проникновения через клеточную мембрану и накопления в ядре создаются специальные химические аналоги нуклеотидов, в состав которых входят различные компоненты, например, 2'-О-метил фосфоротиоат [31, 32]. В таком составе молекулы можно вводить напрямую в необходимую область (например, в конкретную мышцу при терапии наследственной мышечной патологии). Помимо этого используются ААВ с малыми ядерными РНК, кодирующими антисмысловую последовательность [33]. Для экзон-скиппинга также применяют мор-фолиновые олигонуклеотиды (phosphorodiamidate morpholino nucleotides, PMO), которые нашли относительно широкое применение в разработке препаратов для экзон-скиппинга при миодистрофии Дюшенна, например, конструкция Eteplirsen (AVi-4658, Sarepta Therapeutics, США). Определенный интерес представляют соединения пептидов и PMO (Pip-PMO), которые доказали свою эффективность в ряде исследований [34, 35, 36], а также, как са-

мостоятельная группа АОН, трицикло-ДНК (ТрцДНК), молекулы, состоящие из 11—15 п. н. с дополнительными атомами углерода между C(5') и C(3') [37]. ТрцДНК также считаются одними из перспективных типов АОН и являются кандидатами для дальнейших клинических исследований [38, 39].

Описано применение экзон-скиппинга для создания метода терапии спинальной мышечной атрофии (СМА). В настоящее время первую фазу клинических исследований проходит кандидат в препараты iONiS-SMNRx, созданный для пропуска участка 7 экзона у пациентов с СМА 2 типа [40]. При атаксии телеангиоэктазии эффективность эк-зон-скиппинга в лимфобластах пациентов зависела от концентрации АОН и составила 50—95%. Однако, в ходе экспериментов был обнаружен ци-тотоксический эффект из-за высоких концентраций, который проявился в снижении жизнеспособных клеток до 68% [41]. Исследования ex vivo на фибробластах пациентов при нейрофиброматозе 1 и 2 типов показали эффективность экзон-скип-пинга для восстановления сплайсинга в мутантных генах NF1 и NF2. В зависимости от типа мутации функциональность белка NF1 была восстановлена на 87—100% [42]. При нейрофиброматозе 2 типа описано восстановление функциональности белка мерлин и снижение пролиферации фибробластов на 41% через 24 ч. и на 67% через 48 ч. [43]. В исследованиях ex vivo на фибробластах пациентов при врожденном нарушении гликолизирования экзон-скиппинг привел к 100% восстановлению нормальной мРНК и повышению уровня экспрессии белка PPM2 от 9% до 23% [44]. Для терапии болезни Ниманна — Пика C типа исследователи предложили исключить приводивший к дисфункции псевдоэкзон и восстановили нормальный сплайсинг на модели клеток HeLa и фибробластов пациентов, трансфицированных мини-геном с мутацией [45]. В случае мегалэнцефалической лейкоэнцефало-патии с субкортикальными кистами 1 типа проведено исключение псевдоэкзона и восстановление нормального сплайсинга ex vivo в лимфобластах пациентов [46], а при моделировании генетического дефекта болезни Пелицеуса — Мерцбахера с использованием мутантного мини-гена, транс-фицированного в клетки OPC, отмечено восстановление нормального сплайсинга мРНК на 54% [47, 48]. В исследованиях по лечению таупатий был осуществлен успешный скиппинг 10 экзона гена MAPT на культуре клеток HEK293FT [49].

Разрабатываются геннотерапевтические подходы к лечению оссифицирующей прогрессирующей фи-бродисплазии (ОПФ), при которой даже минимальная травма мышечной такни (например, прививка) приводит к ее локальному замещению костными образованиями. Научной группой из университета Лейдена был осуществлен пропуск экзона в гене ALK2 у мышей, который обычно подвержен мутации. Инактивация рецептора ALK2 позволила значительно снизить трансдифференцировку миобластов в остеобласты в остеогенной среде in vitro, что позволяет сделать вывод о потенциальной перспективности экзон-скиппинга в терапии ОПФ [50].

Наиболее широко данная технология применятся в разработке препаратов для лечения МДД. Дис-трофин, мутации в котором ответственны за развитие МДД, сохраняет свою функциональность, если N- и С-концевые домены способны образовывать

связь цитоскелета и внеклеточного матрикса [51]. Таким образом, восстановление рамки считывания посредством удаления внутренних экзонов позволяет получить хоть и усеченный, но функциональный белок. Так как большинство мутаций в гене дистрофина происходит на ограниченных участках (например, с 45 по 53 и с 2 по 20 экзоны более чем у 50% пациентов) [52], экзон-скиппинг является оптимальным методом коррекции МДД. Исследования конструкции Eteplirsen созданной на основе PMO для пропуска экзона 51 в гене дистрофина, достигли 3 фазы клинических исследований. Еще одно вещество для экзон-скиппинга на основе 2Оме — Drisapersen (Kyndrysa), разработка компании BioMarin (США), было отклонено управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) по причине недостаточной эффективности (уровень дистрофина по данным вестерн-блоттинга после лечения был примерно равен уровню до лечения — около 0,3% от нормального уровня) [53].

Транс-сплайсинг

Существует три сплайсинга РНК: опосредованный,

основных варианта транс-эндонуклеазный, рибозимо-сплайсосомо-опосредованный

транс-сплайсинг, а также один белковый тип: инте-ин-опосредованный транс-сплайсинг.

Рибозим-опосредованный транс-сплайсинг

Транс-сплайсинговые рибозимы включают в себя гидовую последовательность, которая комплементарна участку целевой мРНК, рибозимный домен, а также 3' участок экзона, который будет транс-сплайсирован. Данное соединение катализирует разрезание участка целевой мРНК и лигирование связанного с рибозимой 3' экзона [54] (рис. 2).

Ряд исследований in vitro показал эффективность данного типа транс-сплайсинга в коррекции генетических дефектов, вызывающих серповидно-клеточную анемию, рак яичников, рак поджелудочной железы [55].

Считается, что в рибозимо-опосредованном транс-сплайсинге, остается ряд технологических недостатков, а именно: возможна только замена 3' экзона, данная реакция обратима, большинство целевых последовательностей недоступны для ри-бозимов, в связи со сложной структурной организацией и взаимодействием с большим количеством белков in vivo, a эффективности рибозимного транссплайсинга недостаточно для восстановления функции белка в моделях на животных [54].

Рис. 2. Три реакции транс-сплайсинга РНК:

А — сплайсосомо-опосредованный транс-сплайсинг (интроны представлены линиями, экзоны — прямоугольниками, точки ветвления — кругами); Б — рибозимный транс-сплайсинг;

В — эндонуклеазный транс-сплайсинг (ВСВ РНК — выступ-спираль-выступ РНК). По [54] с изм.

Эндонуклеазный и интеин-опосредованный белковый транс-сплайсинг

Эндонуклеазный и интеин-опосредованный транс-сплайсинг — наименее используемые виды транс-сплайсинга, описанные лишь в единичных исследованиях. Как и при рибозим-опосредованном транс-сплайсинге редактирование РНК проходит в цитоплазме клетки.

При эндонуклеазном транс-сплайсинге целевая мРНК и комплементарная связывающаяся последовательность формируют структуру выступ-спираль-выступ, которая распознается и разрезается эндонуклеазой. Далее, участки мРНК объединяются эндогенной лигазой (рис. 2).

Помимо РНК, белки также могут быть объектом для транс-сплайсинга. Интеин-опосредованный транс-сплайсинг осуществляется с помощью интеи-нов — белковых молекул, которые способны объединить два белка-предшественника в единую химерную молекулу (рис. 3).

А

DnaE

N-Fluc

Б

В

DnaE-c

C-Fluc

С-Flue

Полноразмерный Flue

Этот метод нашел применение в восстановлении молекул белка, кодирующий объем которых превосходит емкость векторов, используемых для доставки генетических конструкций, например, дистрофина. Также, были разработаны методы объединения частей белка Cas9, который является элементом системы коррекции генома CRiSPR\Cas9. Генетические конструкции, несущие информацию о его частях, были трансфицированы раздельно посредством рААВ, а затем объединены с помощью интеин-опос-редованного белкового транс-сплайсинга. Данный метод позволил обойти ограничение объема рААВ [56].

Сплайсосомо-опосредованный

транс-сплайсинг

В процессе, катализируемом сплайсосомой, ферментным комплексом из множества белков и 4 типов рибонуклеопротеинов [57], из пре-мРНК удаляются интроны, в результате чего формируется «зрелая» молекула мРНК. Если данная реакция идет на одной молекуле пре-мРНК, то происходит цис-сплайсинг, в случае, если процесс сплайсинга переходит с одной молекулы пре-мРНК на другую и формируется мРНК с новым составом экзонов, то данный процесс называется сплайсосомо-опосредо-ванным транс-сплайсингом, который крайне редко встречается в эукариотических клетках [58]. В клетках человека естественный транс-сплайсинг был обнаружен между копиями гена рецептора эстрогена, между разными транскриптами цитохромоксидазы, закодированными на противоположных цепях, а также между эндогенными мРНК клеток и генами аденовирусов с высоким уровнем экспрессии [59].

Индукция искусственного сплайсосомо-опосре-дованного транс-сплайсинга позволяет произвести корректировку мутаций на уровне пре-мРНК и процесса транскрипции, и соответственно, восстановить экспрессию нормального белка (см. рис. 2).

Для осуществления процесса СОТ необходимо сосуществование трех различных компонентов: сплай-сосома, целевая пре-мРНК и олигонуклеотидная пре-транс-сплайсинговая молекула (ПТМ) (или искусственная транс-сплайсинговая молекула — ИТМ [60]). Чтобы инициировать транс-сплайсинг в клетку вносятся созданные в лабораторных условиях ПТМ, дизайн которых зависит от поставленных целей: в частности, от типа реакции транс-сплайсинга и белка, который необходимо восстановить. Основными структурными элементами ПТМ являются: связывающий домен — участок, комплементарный интрону (за которым следует заменяемая последовательность; служит для осуществления связи с целевой молекулой пре-мРНК); домен сплайсинга, который служит для инициирования реакции СОТ; кодирующий домен — последовательность, которая будет внедрена в зрелую мРНК [54] (рис. 4).

Рис. 3. Интеин-опосредованный белковый транс-сплайсинг (на примере люциферазы светлячка, Fluc): А — белок 1 связан с N-концом половины интеина (DnaE-n) и N-концом Fluc (Белок 2 связан с С-концом половины DnaE (DnaE-c) и оставшимся С-участком Fluc);

Б — взаимодействие белков 1 и 2 стимулирует транс-сплайсинг между N и С половинами DnaE; В — объединение двух фрагментов люциферазы. По [54] с изм.

Донор Акцептор 1

Рис. 4. Принципиальная схема претрансплайсинговой молекулы: СС — сайт сплайсинга; ТВ — точка ветвления; ПУ — пиримидиновый участок; М — мутация

СОТ может протекать по трем основным направлениям и зависит от структуры ПТМ (рис. 5): 3' транс-сплайсинг, 5' транс-сплайсинг и замена внутреннего экзона. 3' транс-сплайсинг является наиболее изученным и активно используемым в лабораториях видом транс-сплайсинга [61, 62], когда образуется связь 3' сайта сплайсинга молекулы ПТМ с 5' сайтом мишени (целевой пре-мРНК). В своей структуре ПТМ должна иметь сайт полиаденилирова-ния (полиА), но не несет АТС-инициирующий кодон, который будет получен от пре-мРНК-мишени.

5 ' транс-сплайсинг, осуществляется в результате соединения 3' сайта мишени и 5' сайта сплайсинга молекулы ПТМ, несущей инициирующий кодон, но с отсутствием сигнала полиаденилирования. Данный тип СОТ не так широко изучен [63].

Внутренняя замена экзона, или двойной транссплайсинг, происходит с участием двойной ПТМ, имеющей как 3', так и 5' сайты сплайсинга, а также 2 связывающих домена. Данные ПТМ не содержат инициирующих старт-кодонов или сигналов полиаде-нилирования, поэтому их довольно небольшой размер (зависящий, однако, от длины последовательности, которая будет транс-сплайсирована), а также возможность заменить только необходимые экзоны, является преимуществом данного типа СОТ и позволяет трансфицировать небольшие объемы генетической информации.

В эффективности СОТ учитывается не только структура ПТМ (длина и доступность связывающего домена, сила участков сплайсинга и точки ветвления) [60, 64], но и ее концентрация, вектор доставки, а также концентрация целевых пре-мРНК.

СОТ доказал свою способность корректировать мутантные белки при различных заболеваниях. Например, при миотонической дистрофии 1 типа: плазмиды, кодирующие ПТМ были трансфицирова-ны в культуры клеток СС1_-136, содержащих мини-ген DMPK (15, 16 экзоны), уровень транс-сплайсинга составил 0,02—7,41%, данный разброс связан с различным дизайном ПТМ [60].

А 5' 3'

1 ЭКЗОН 2 ЭКЗОН 3 экзон

СТОП полиА

-К. СТАРТ

ПРОМОТЕР)Я^И-1-

МУТАЦИЯ

Эндогенная мРНК

\

3' СТОП полиА

ПРОМОТЕ^-  - •   » I I

Трансгенная конструкция

Б 5'

1 ЭКЗОН 2 ЭКЗОН 3 ЭКЗОН 3

-К СТАРТ

)ТЕР---О -

"[/ МУТАЦИЯ

ПРОМОТЕР;.^Н- - -О- - -! I-

Эндогенная мРНК

СТАРТ 5'

СТОП полиА

ПРОМОТЕР

n. СТАРТ ТЕР)С^1

V

Трансгенная конструкция

В 5' 3"

Рис. 5. Основные направления сплайсосомо-опосредованного транс-сплайсинга: А — 3' транс-сплайсинг; Б — 5' транс-сплайсинг;

В — замена внутреннего экзона (пунктирной линией отмечен экзон эндогенной мРНК,

который содержит мутацию; трансгенная конструкция (ПТМ) сдержит сайты узнавания и сплайсинга

При муковисцидозе: эпителиальные клетки дыхательных путей были трансфицированы рААВ-ПТМ, уровень экспрессии муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (белок МВТР) составлял 13,6—14,2% в сравнении с контрольной группой [65]. При гемофилии А произведено восстановление синтеза фактора 8 у нокаутных мышей посредством введения плазмид, кодирующих ПТМ в портальную вену. Активность фактора 8 сохранялась в течении 7 дней с пиком на 49—78 ч. после введения [66]. При простом буллезном эпидермоли-зе транс-сплайсинг экзонов 1—7 гена K14 позволил восстановить нормальную мРНК до уровня 15,5% от исходного [67]. При спинальной мышечной атрофии в мышиную модель, экспрессирующую две геномные копии SMN2 человека, были трансфицированы рААВ-ПТМ, что привело к увеличению продолжительности жизни на 3 дня [68, 69]. Также была показана возможность создавать терапевтические белки in vivo на примере модификации аполипопротеинов с помощью транс-сплайсинга [70] и высокая эффективность транс-сплайсинга в экспериментах на моделях онкозаболеваний (80% транс-сплайсированных РНК относительно общего количества РНК в работе по транс-сплайсингу участка Е6—Е7 ВПЧ в плазмидах, введенных в клетки нейробластомы у мышей) [71].

Эффективность СОТ также зависит и от специфичности ПТМ, которая заключается в точности связывающей последовательности. Необходимо, чтобы связывающий домен был строго комплементарен интрону, за которым будет идти процесс транссплайсинга. Наиболее оптимальным был показан размер связывающего домена в 70—150 п.н. [72].

Сплайсосомо-опосредованный транс-сплайсинг имеет значительные преимущества по сравнению с другими методами генной терапии: это возможность заменить только те участки генетических структур, в которых произошла мутация, что позволяет уменьшить объем терапевтической конструкции и использовать удобные и безопасные в применении векторы, объем которых ограничен. Также, важным является то, что СОТ происходит только в тех клетках, где находится целевая пре-мРНК, таким образом, воздействие вектора с ПТМ является более точным, а уровень синтезируемого белка остается на прежнем уровне и будет зависеть от механизмов внутренней регуляции, что, в свою очередь, позволит избежать эктопической или сверхэкспрессии, а также получить полноценный (не усеченный, как при экзон-скиппинге) белок. Метод СОТ позволяет исправлять доминантно-негативные мутации и имеет аллелеспецифичность.

СОТ нашел применение в молекулярной визуализации процесса экспрессии генов, что было показано в ряде экспериментов. В частности, в клетках нейробластомы, введенных мышам и содержащих целевую плазмиду с 5' участком ренилла люциферазы и участком Е6—Е7 ВПЧ, который обнаруживается практически во всех клетках рака шейки матки, был проведен транс-сплайсинг, в результате которого был добавлен 3' участок ренилла люциферазы и создана полноценная последовательность гена люциферазы. Активность люциферазы позволила выявить опухолевые клетки в организме мышей. Данный эксперимент показал, что СОТ имеет также и диагностический потенциал, а в качестве маркера могут быть использованы другие белки-репортеры. Этот метод также позволяет определить эффективность ПТМ и выявить наиболее оптимальный дизайн [73].

Мышечные дистрофии

Мышечные дистрофии (МД) — группа наследственных заболеваний мышечной ткани, с постепенно развивающейся дегенерацией мышц и как следствие снижением их объема и угасанием функции. Они относятся к миопатиям — сборной когорте болезней, характеризующейся первичным поражением скелетных мышц, в основе патоморфогенеза которых лежит цепь «ген-белок-функция-болезнь» [74]. Различные мутации в генах, кодирующих мышечные белки (миссенс-мутации, нонсенс-мутации, триплет-ные повторы и др.) приводят к изменению структуры гена (замене последовательности нуклеотидов, преждевременной остановке рамки считывания), и, соответственно, изменению функции белка вплоть до ее полного прекращения. Форма МД зависит не только от мутаций в генах в целом, но и от мутаций в конкретных экзонах, что и объясняет полиморфизм данной группы заболеваний. Основными белками, мутации в которых становятся причиной миодистро-фий являются: дистрофин, дисферлин, интегрины а7 и а9, кавеолин 3, кальпаин 3, коллаген Vi типа, ламины А/С, мерозин, саркогликан, селенопротеин N1, эмерин, холинкиназа р.

Наиболее часто патологические изменения затрагивают дистрофин, что является причиной развития таких заболеваний как миодистрофия Дюшен-на (МДД), болеют в среднем 1:3500 мальчиков, и миодистрофия Беккера (МДБ), распространенность которой 1:30000. МДД проявляется прогрессирующей дистрофией проксимальных мышц, псевдогипертрофией голеней, снижением функциональности дыхательных мышц и миокарда, в 30% случаев возможна задержка умственного развития, дебют заболевания приходится, как правило на возраст 2—5 лет. Клинические проявления МДБ аналогичны миодистрофии Дюшенна, но менее ярко выражены, дебют заболевания — около 20 лет. Поиск способов коррекции мутаций в гене дистрофина является одной из наиболее актуальных глобальных задач генной терапии на планете [75], что связано с высокой распространенностью, отсутствием этиотропного лечения, а также инвалидизацией и гибелью больных в трудоспособном возрасте. Основным подходом к терапии данной патологии остается экзон-скиппинг.

Менее распространенными, но также социально значимыми являются дисферлинопатии. Их общая распространенность составляет 0,5—1:200000 новорожденных [76]. Дисферлинопатиями называется группа нейромышечных заболеваний, наследуемых по аутосомно-рецессивному типу, развитие которых обусловлено мутацией в гене дисферлина, в результате чего формируется неполноценный и нефункциональный белок [77]. Дисферлин — это трансмембранный белок (230 кДа), состоящий из 2080 аминокислот. В состав макромолекулы входят следующие участки: семь С2 доменов, которые обладают способностью связывать фосфолипиды и белки Са2+-зависимым способом, играют роль в формировании функциональных димеров белка; два ysF домена, чья функция до конца не известна; один мембран-связывающий С-концевой домен [78]. Дисферлин локализуется в цитоплазматической мембране, а также в мембране эндоплазматическо-го ретикулума. Уровень синтеза дисферлина наиболее высок в поперечно-полосатой мускулатуре, в меньшем количестве в других структурах, например

в моноцитах, синтициотрофобласте плаценты, эндотелии, головном мозге, поджелудочной железе и почках [79, 80]. В отсутствии дисферлина мышечные волокна подвергаются некрозу, из-за снижения уровня репарации мембран [81, 82].

Существует два направления в терапии дисфер-линопатий: 1) патогенетическая и симптоматическая терапия, которые наиболее широко изучены и используются в клинической практике и 2) этио-тропная. Патогенетическая терапия подразумевает воздействие на 4 основных звена патогенеза: некроз мышечных волокон, воспаление, регенерация мышечных волокон и псевдогипертрофия мышечных волокон, фиброз и атрофия мышечного органа [83]. Этиотропная терапия заключается в генетической коррекции мутации в гене DYSF, с целью избежать первичного поражения мышечного волокна в связи с отсутствием или неполноценностью дисферлина.

Опыты с различными видами клеток, применяемыми в клеточной терапии (гемопоэтические стволовые клетки, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, миобласты, интерстициальные стволовые клетки мышц, индуцированные плюрипо-тентные клетки (ИПК)) не показали себя эффективными как самостоятельные терапевтические агенты [42], тем не менее, некоторые из них представляют определенный интерес для исследователей в комбинации с генными препаратами (генно-клеточная терапия). Например, аллогенная трансплантация генетически модифицированных клеток [84], которые обладают способностью мигрировать к очагам воспаления. Такой метод также позволяет избежать вирусной нагрузки при использовании ряда векторов в генной терапии, которая наряду с генно-клеточной относится к этиотропным методам лечения. Очевидно, наиболее перспективным является именно данное направление, так как оно позволит полностью или частично восстановить дисферлин и, соответственно, в той или иной степени смягчить проявления заболевания, либо, в идеальном случае, добиться полной ремиссии заболевания.

Опыт редактирования РНК для коррекции

миодистрофий

Большой интерес представляют методики терапевтического редактирования РНК: экзон-скиппинг и транс-сплайсинг. Для их применения нет необходимости использовать несколько векторов с разными генетическими конструкциями для ко-трансфекции, достаточно одного безопасного рААВ вектора, технология получения и использования которого отработана во множестве исследований. А для экзон-скип-пинга создан целый ряд химических конструкций, которые применялись в опытах по коррекции дис-трофина.

Экзон-скиппинг показал свою эффективность в опытах по разработке геннотерапевтических препаратов для мышечных дистрофий, что позволяет рассматривать этот метод как один из основных подходов в лечении дисферлинопатий. Данная технология была применена в коррекции мутации в экзоне 32. В миотубы (которые были получены из фибробла-стов пациента, транфицированных лентивирусом, несущим кодирующую Муой информацию) были введены АОН, в результате чего был получен функциональный дисферлин. Гистоморфометрический анализ мышц показал увеличение числа волокон

с центрально расположенными ядрами через месяц после введения АОН [85]. Научной группой из Канады ведется разработка технологии экзон-скиппинга в 21 и 28 экзонах, моделирование in silico позволило установить возможность осуществления данного метода. Группа ученых из Франции осуществила скип-пинг 32 экзона на мышах и изучает возможность восстановления фенотипа мышечной ткани с помощью этой методики [86].

Технология сплайсосомо-опосредованного транссплайсинга обладает определенными преимуществами перед экзон-скиппингом, так как СОТ позволяет полностью заменить мутантный экзон на нормальный, а не исключать из РНК генетические последовательности. Техника проведения СОТ, как и экзон-скиппинг, отработана во множестве исследований, что облегчает ее применение для терапии дисферлинопатий. Первый опыт применения СОТ для коррекции мутации в гене DYSF был продемонстрирован в 2014 г. во Франции. Для эксперимента in vitro использовали культуру клеток HER911 (human embryonic retinoblasts) c мини-геном дисферлина (экзоны 51—55), которую трансфицировали рААВ, содержащим кодирующую ПТМ информацию. Вестрн-блот анализ показал наличие соответствующих мини-белков во всех образцах. Далее авторы предприняли попытку произвести транс-сплайсинг in vivo у 1-месячных мышей. рААВ-ПТМ были инъецированы в большеберцовую мышцу. Однако, проведенный через месяц иммуногистохимический анализ не выявил присутствия необходимых белков в мышечной ткани. При этом были обнаружены побочные продукты в виде неидентифицированных белков, что позволило предположить способность ПТМ самостоятельно подвергаться цис-сплайсингу [87]. В 2015 г. другая научная группа из Франции осуществила замену экзонов (31—55, 32—55, 36—55, 37—55) с помощью 3' СОТ на миобластах от пациентов с ПКМД2Б, а также на мышах. ПЦР и реакция иммунопреципитации продемонстрировали наличие полноразмерных и функциональных транскриптов дисферлина как in vitro, так и in vivo [88]. Эти эксперименты показали, что СОТ имеет хороший потенциал для коррекции дисферлинопатий, и необходима дальнейшая тонкая отработка этой технологии.

Помимо терапевтического редактирования РНК рассматриваются и другие лечебные подходы. Был разработан и испытан на мышах рекомбинантный аденовирус, несущий кодон-оптимизированный ген DYSF и продемонстрирован синтез полноценного дисферлина в организме животных [89]. Чтобы смягчить течение дисферлинопатий были созданы и успешно протестированы на мышах методики по внедрению мини-гена дисферлина, содержащего только два из семи С2 домена, был получен биологически активный, частично функциональный, дисферлин [90]. На мышиных моделях, показали свою эффективность методы внесения полного гена дисферлина за счет перекрывающихся генетических конструкций посредством рААВ вектора [91] и с помощью транспозона «Спящая Красавица», который способен интегрировать генетические последовательности объемом более 10 тыс. п. н. в целевой геном [92]. Также данный метод рассматривается как способ коррекции генома мезоангиобластов ex vivo, в том числе, полученных из ИПК, для дальнейшего введения в организм пациента. Применение системы геномного редактирования CRiSPR\Cas9

уже было опробовано на т^х-мышах и показало хорошие результаты в восстановлении дистрофина [93], поэтому необходима отработка данного метода и на клетках с мутацией в гене DYSF. Эта технология позволяет, как исключить вставочные мутации, так и заменить необходимый участок для восстановления функциональности белка.

Таким образом, транс-сплайсинг и экзон-скип-пинг, с использованием рААВ и новых химических средств доставки или АОН соответственно, и учитывая накопленный опыт лабораторных и клинических исследований, следует рассматривать как наиболее оптимальные подходы в терапии миодистрофий, в частности ПКМД. Заслуживает внимания и техно-

логия CRiSPR\Cas9, но вопрос ее применимости в лечении, как наследственной мышечной патологии, так и других генетических заболеваний, остается на начальных стадиях разрешения.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-00657. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Aoki M. Dysferlinopathy. In: Pagon R.A., Adam M.P., Ardinger H.H. et al., editors. Gene Reviews. Seattle tWA): University of Washington; 2015.

2. DMD Gene (Protein Coding) http://www.genecards.org/cgi-bin/ carddisp.pl?gene = DMD.

3. Reinhard W., Russell S.J., Curiel D. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature Reviews Genetics 2007; 8: 573-87.

4. Azakir B., Di Fulvio S. Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules. J. Biol. Chem. 2012; 287(33): 27629-36.

5. Aartsma-Rus A., Singh K.H., Fokkema I.F. et al. Therapeutic exon skipping for dysferlinopathies? Eur. J. Hum. Genet. 2010; 18(8): 889-94.

6. Wein N., Avril A., Bartoli M. et al. Efficient bypass of mutations in dysferlin deficient patient cells by antisense-induced exon skipping. Hum. Mutat. 2010; 31(2): 136-42.

7. Sauer B. Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 1987; 7(6): 2087-96.

8. Orban P.C., Chui D., Marth J.D. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice. PNAS USA 1992; 89(15): 6861-5.

9. Beerli R.R., Segal D.J., Dreier B. et al. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. PNAS USA 1998; 95(25): 14628-33.

10. Moscou M.J., Bogdanove A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 2009; 326(5959): 1501.

11. Boch J., Scholze H., Schornack S. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 2009; 326(5959): 1509-12.

12. Perez-Pinera P., Kocak D.D., Vockley C.M. et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat. Methods. 2013; 10: 973.

13. Cornu T., Thibodeau-Beganny S., Guhl E. et al. DNA-binding specificity is a major determinant of the activity and toxicity of zinc-finger nucleases molecular therapy. Mol. Ther. 2008; 16(2): 352-8.

14. Owens J.B. Urschitz J., Stoytchev I. et al. Chimeric piggyBac transposases for genomic targeting in human cells. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 6978-91.

15. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339(6121): 823-6.

16. Caplan A., Parent B., Shen M. et al. No time to waste — the ethical challenges created by CRISPR. EMBO reports 2015; 16: 1421-6.

17. Koller U., Wally V., Baue J. et al. Considerations for a successful RNA trans-splicing repair of genetic disorders. Mol. Ther. Nucleic Acids 2014; 3(4): e157.

18. Kosa M., Zador E. Transfection efficiency along the regenerating soleus muscle of the rat. Mol. Biotech. 2013; 54(2): 220-7.

19. Nishikawa M., Huang L. Nonviral vectors in the new millennium: delivery barriers in gene transfer. Hum. Gene Ther. 2001; 12(8): 861-70.

20. Herweijer H., Zhang G., Subbotin V.M. et al. Time course of gene expression after plasmid DNA gene transfer to the liver. J. Gene Med. 2001; 3(3): 280-91.

21. Zhang G., Ludtke J.J., Thioudellet C. et al. Intraarterial delivery of naked plasmid DNA expressing full-length mouse dystrophin in the mdx mouse model of duchenne muscular dystrophy. Hum. Gene Ther. 2004; 15(8): 770-82.

22. Romero N.B., Braun S., Benveniste O. et al. Phase I study of dystrophin plasmid-based gene therapy in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Hum. Gene Ther. 2004; 15(11): 1065-76.

23. Bouard D., Alazard-Dany N., Cosset F-L. Viral vectors: from virology to transgene expression. Br. J. Pharmacol. 2009; 157(2): 153-65.

24. Lostal W., Bartoli M., Bourg N. et al. Efficient recovery of dysferlin deficiency by dual adeno-associated vector-mediated gene transfer. Hum. Mol. Genet. 2010; 19(10): 1897-907.

25. Aartsma-Rus A., Fokkema I., Verschuuren J. et al. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy. Hum. Mutat. 2009; 30(3): 293-9.

26. Prakash V., Moore M., Yanez-Munoz R.J. Current progress in therapeutic gene editing for monogenic diseases. Mol. Ther. 2016; 24(3): 465-74.

27. Southwell A.L., Skotte N.H., Bennett C.F. at al. Antisense oligonucleotide therapeutics for inherited neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 2012; 18: 634-43.

28. Wang Z., Xiao X., Van Nostrand E. et al. General and specific functions of exonic splicing silencers in plicing control. Molecular Cell. 2006; 23(1): 61-70.

29. Siva K., Covello G., Denti M.A. Exon-skipping antisense oligonucleotides to correct missplicing in neurogenetic diseases nucleic acid therapeutics. 2014; 24(1): 70.

30. Dhir A., Buratti E. Alternative splicing: role of pseudoexons in human disease and potential therapeutic strategies. FEBS J. 2010; 277(4): 841-55.

31. Saleh A.F., Arzumanov A.A., Gait M.J. Overview of alternative oligonucleotide chemistries for exon skipping. In: Exon Skipping. Aartsma-Rus A., editor. Methods Mol. Biol. (2012), 365-78.

32. van Deutekom J.C., Bremmer-Bout M., Janson A.A. et al. Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum. Mol. Genet. 2001; 10: 15471554.

33. Lu Q.L., Yokota T., Takeda S. et al. The status of exon skipping as a therapeutic approach to Duchenne muscular dystrophy. Therapy 2011; 19(1): 9-15.

34. Betts C., Saleh A.F., Arzumanov A.A. et al. Pip6-PMO, a new generation of peptide-oligonucleotide conjugates with improved cardiac exon skipping activity for DMD treatment. Mol. Ther. Nucleic Acids 2012; 1(8): e38.

35. Yin H., Saleh A.F., Betts C. et al. Pip5 transduction peptides direct high efficiency oligonucleotide-mediated dystrophin exon skipping in heart and phenotypic correction in mdx mice. Mol. Ther. 2011; 19(7): 1295-303.

36. Wu B., Lu P., Cloer C. et al., Long-term rescue of dystrophin expression and improvement in muscle pathology and function in dystrophic mdx mice by peptide-conjugated morpholino. Am. J. Pathol. 2012; 181(2): 392-400.

37. Oligonucleotide based therapeutics. http://synthena.com/html/ tricyclo-dna_platform.html.

38. Goyenvalle A., Griffith G., Babbs A. et al., Functional correction in mouse models of muscular dystrophy using exon-skipping tricyclo-DNA oligomers. Nat. Med. 2015; 21(3): 270-5.

39. Järver P., O'Donovan L., Gait M.J. A chemical view of oligonucleotides for exon skipping and related drug applications. Nucleic Acid Ther. 2014; 24(1): 37-47.

40. Veltrop M., Aartsma-Rus A. Antisense-mediated exon skipping: Taking advantage of a trick from Mother Nature to treat rare genetic diseases. Exp. Cell Res. 2014; 325(1): 50-5.

41. Cavalieri S., Pozzi E., Gatti R.A. et al. Deep-intronic ATM mutation detected by genomic resequencing and corrected in vitro by antisense morpholino oligonucleotide (AMO). Eur. J. Hum. Genet. 2013; 21(7): 774-8.

42. Pros E., Fernandez-Rodriguez J., Canet B. et al. Antisense therapeutics for neurofibromatosis type 1 caused by deep intronic mutations. Hum. Mutat. 2009; 30(3): 454-62.

43. Castellanos E., Rosas I., Solanes A. et al. In vitro antisense therapeutics for a deep intronic mutation causing Neurofibromatosis type 2. Eur. J. Hum. Genet. 2013; 21(7): 769-73.

44. Vega A.I., Pérez-Cerda C., Desviat L.R. et al. Functional analysis of three splicing mutations identified in the PMM2 gene:

toward a new therapy for congenital disorder of glycosylation type la. Hum. Mutat. 2009; 30(5): 795-803.

45. Rodriguez-Pascau L., Coll M.J., Vilageliu L. et al. Antisense oligonucleotide treatment for a pseudoexon-generating mutation in the NPC1 gene causing Niemann-Pick type C disease. Hum. Mutat. 2009; 30(11): e993-e1001.

46. Mancini C., Vaula G., Scalzitti L. et al. Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts type 1 (MLC1) due to a homozygous deep intronic splicing mutation (c.895-226T>G) abrogated in vitro using an antisense morpholino oligonucleotide. Neurogenetics 2012; 13(3): 205-14.

47. Regis S., Corsolini F., Grossi S. et al. Restoration of the normal splicing pattern of the PLP1 gene by means of an antisense oligonucleotide directed against an exonic mutation. PLoS One 2013; 8(9): e73633.

48. Siva K., Covello G., Denti M.A. Exon-skipping antisense oligonucleotides to correct missplicing in neurogenetic diseases nucleic acid therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2014; 24(1): 69-86.

49. Peacey E., Rodriguez L., Liu Y. et al Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 9836-49.

50. Shi S., Cai J., de Gorter D.J. et al. Antisense-oligonucleotide mediated exon skipping in activin-receptor-like kinase 2: inhibiting the receptor that is overactive in fibrodysplasia ossificans progressive. PLoS One 2013; 8(7): e69096.

51. England S.B., Nicholson L.V., Johnson M.A. et al. Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin. Nature 1990; 343: 180-2.

52. Aartsma-Rus A., Van Ommen G-J.B. Antisense-mediated exon skipping: A versatile tool with therapeutic and research applications. RNA 2007; 13: 1609-24.

53. Peripheral and Central Nervous System Drugs Advisory Committee Meeting. November 24, 2015. Drisapersen FDA Briefing Document. November 24, 2015.

54 Mitchell L.G., McGarrity G.J. Gene therapy progress and prospects: reprograming gene expression by trans-splicing. Gene Therapy 2005; 12: 1477-85.

55. Wally V., Murauer E.M., Bauer J.W. Spliceosome-mediated trans-splicing: the therapeutic cut and paste. J. Invest. Dermatol. 2012; 132: 1959-66.

56. Truong D.J., Kühner K., Kühn R. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 2015; 43(13): 6450-8.

57. Faustino N.A., Cooper T.A. Pre-mRNA splicing and human disease. Genes Dev. 2003; 17: 419-37.

58. Finta C., Zaphiropoulos P.G. Intergenic mRNA molecules resulting from trans-splicing. J. Biol. Chem. 2002; 277: 5882-90.

59. Kikumori T., Cote G.J., Gagel R.F. Naturally occurring heterologous trans-splicing of adenovirus RNA with host cellular transcripts during infection. FEBS Lett 2002; 522: 41-6.

60. Chen H.Y., Kathirvel P., Yee W.C. et al. Correction of dystrophia myotonica type 1 pre-mRNA transcripts by artificial trans-splicing. Gene Therapy 2009; 16: 211-7.

61. Yang Y., Walsh C.E. Spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Molecular Therapy 2005; 12(6): 1006-12.

62. Puttaraju M., Jamison S.F., Mansfield S.G. et al. Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 246-52.

63. Mansfield S.G., Clark R.H., Puttaraju M. et. al. 5' exon replacement and repair by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. RNA 2003: 9; 1290-7.

64. Mansfield S., Kole J., Puttaraju M. et al. Repair of CFTR mRNA by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Gene Therapy 2000; 7(22): 1885-95.

65. Liu X., Luo M., Zhang L.N. et al. Spliceosome-mediated RNA trans-splicing with recombinant adeno-associated virus partially restores cystic fibrosis transmembrane conductance regulator function to polarized human cystic fibrosis airway epithelial cells. Hum. Gene Ther. 2005; 16: 1116-23.

66. Chao H., Mansfield S.G., Bartel R.C. et al. Phenotype correction of hemophilia A mice by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Nat. Med. 2003; 9(8): 1015-9.

67. Wally V. Brunner M., Lettner T. et al. K14 mRNA reprogramming for dominant epidermolysis bullosa simplex. Hum. Mol. Genet. 2010; 19: 4715-25.

68. Coady T.H., Lorson C.L. Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 2010; 30: 126-30.

69. Shababi M., Glascock J., Lorson C.L. Combination of SMN trans-splicing and a neurotrophic factor increases the life span and body mass in a severe model of spinal muscular atrophy. Hum. Gene. Ther. 2011; 22: 135-44.

70. Wang J., Mansfield S.G., Cote C.A. et al. Trans-splicing into highly abundant albumin transcripts for production of therapeutic proteins in vivo. Mol. Ther. 2009; 17(2): 343-51.

71. Patrick M., Puttaraju M., DiPasquale J. et al. Optimizing the efficacy of spliceosome-mediated RNA trans-splicing (SMaRT) for suicide gene therapy of cervical cancer molecular therapy. Mol. Ther. 2005; 11: S115.

72. Puttaraju M., DiPasquale, J., Baker C.C. Messenger et al. RNA repair and restoration of protein function by spliceosome-mediated RNA trans-splicing. Mol. Ther. 2001; 4: 105-14.

73. Bhaumik S., Walls Z., Puttaraju M. et al. Molecular imaging of gene expression in living subjects by spliceosome-mediated RNAtrans-splicing. PNAS USA 2004; 101: 8693-8.

74. Ривер Ф., Майер П., Вальтер-Леви У. И др. [River F., Meyer P., Walther-Louvie U. et al.] Врожденные мышечные дистрофии: классификация и диагностика. Нервно-мышечные болезни. 2014; 1: 6-19.

75. Prakash V., Moore M., Yanez-Muno R.J., Current progress in therapeutic gene editing for monogenic diseases. Mol. Ther. 2016;24(3): 465-74.

76. volker S., De Waele L., Barresi R. Plasma Membrane Proteins: Dysferlin, Caveolin, PTRF /Cavin, Integrin a7, and Integrin a9. In: Goebel H.H., Sewry, C.A., Weller R.O., editors Muscle disease: pathology and genetics. 2nd ed. Basel: Neuropath Press 2013: 108-18.

77. Cai C., Weisleder N., Ko J.K. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin—3, and dysferlin. J. Biol. Chem. 2009; 284(23): 15894-902.

78. de Morree A., Hensbergen P.J., van Haagen H.H. et al. Proteomic Analysis of the Dysferlin Protein Complex Unveils Its Importance for Sarcolemmal Maintenance and Integrity. PLoS one 2010; 5(11): e13854.

79. Anderson L.V., Davison K., Moss J.A. et al. Dysferlin is a plasma membrane protein and is expressed early in human development. Hum. Mol. Genet. 1999; 8(5): 855-61.

80. Bashir R., Britton S., Strachan T., et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy type 2B. Nat. Genet. 1998; 20(1): 37-42.

81. Bansal D., Miyake K., Vogel S.S. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 2003; 423(6936): 168-72.

82. Старостина И. Г., Соловьева В. В., Юрьева К. С. и др. Дис-ферлинопатии: возможности диагностики, моделирования и генно-клеточной терапии. Гены и клетки 2013; 3(VIII): 61-71.

83. Деев Р.В., Мавликеев М.О., Бозо И.Я. и др. Генно-клеточ-ная терапия наследственных заболеваний мышечной системы: современное состояние вопроса. Гены и Клетки 2014: 4(IX): 6-33.

84. Meregalli M., Farini A., Torrente Y. Combining stem cells and exon skipping strategy to treat muscular dystrophy. Expert Opin. Biol. Ther. 2008; 8(8): 1051-61.

85. Wein N., Avril A., Bartoli M. et al. Efficient bypass of mutations in dysferlin deficient patient cells by anti-sense-induced exon skipping. Hum. Mutat. 2010; 31: 136-42.

86. Bartoli M., Chapoton M., Mathieu Y. et al. Therapeutic exon skipping for LGMD2B. Myology 2016. 2016; 56.

87. Monjaret F., Bourg N., Suel L. et al. Cis-splicing and translation of the pre-trans-splicing molecule combine with efficiency in spliceosome mediated RNA trans-splicing molecular therapy. 2014; 6(22): 1176-87.

88. Philippi S., Lorain S., Beley C. et al. Dysferlin rescue by spliceosome-mediated pre-mRNA trans-splicing targeting introns harbouring weakly defined 3' splice sites. Hum. Mol. Gen. 2015; 24(14): 4049-60.

89. Старостина И.Г., Соловьева В.В., Шевченко К.Г. и др. Создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оп-тимизированный ген дисферлина, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro. Гены и клетки 2012; 3: 25-8.

90. Allocca M., Doria M., Petrillo M. et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 2008; 118: 1955-64.

91. Pryadkina M., Lostal W., Bourg N. et al. A comparison of AAV strategies distinguishes overlapping vectors for efficient systemic delivery of the 6.2 kb dysferlin coding sequences. Mol. Ther. 2015; 2: 1-12.

92. Escobar H., Schöwel V., Spule S. et al. Full-length dysferlin transfer by the hyperactive sleeping beauty transposase restores dysferlin-deficient muscle. Mol. Ther. 2016; 5: 1-9.

93. Nelson C.E., Hakim C.H., Ousterout D.G. et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science 2016; 351(6271): 403-7.

Поступила: 15.03.2016