ФУКОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФУКОЗИЛИРОВАННЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ

1. Способ получения фукозилированного олигосахарида, включающий следующие стадии:
a) предоставление по меньшей мере одной генетически модифицированной клетки, которая генетически модифицирована с возможностью экспрессировать гетерологичную фукозилтрансферазу, причем указанная гетерологичная фукозилтрансфераза способна переносить остаток фукозы с донорного субстрата на акцепторную молекулу, при этом указанной акцепторной молекулой является лактотетраоза;
b) культивирование по меньшей мере одной генетически модифицированной клетки в присутствии по меньшей мере одного источника углерода и в условиях, подходящих для того, чтобы по меньшей мере в одной генетически модифицированной клетке осуществлялся перенос остатка фукозы с донорного субстрата на акцепторную молекулу; и
c) факультативно, выделение фукозилированного олигосахарида.
2. Способ по п. 1, где акцепторная молекула выбрана из группы, состоящей из LNT (лакто-N-тетраоза) и LNnT (лакто-N-неотетраоза).
3. Способ по п. 1 или 2, где гетерологичная фукозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, функциональных вариантов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, функциональных фрагментов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, и функциональных вариантов функциональных фрагментов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где гетерологичная фукозилтрансфераза кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей:
1) нуклеотидную последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO: 1-15;
2) нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность последовательности, составляющую по меньшей мере 80% с одной из нуклеотидных последовательностей, которая представлена любой из SEQ ID NO: 1-15, предпочтительно по всей длине последовательности;
3) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO: 16-30;
4) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с любой из аминокислотных последовательностей, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30;
5) нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный фрагмент любого из полипептидов в соответствии с 3) и 4); или
6) при этом молекула нуклеиновой кислоты гибридизуется с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с 1), 2), 3), 4) или 5), в жестких условиях.
5. Генетически модифицированная клетка для получения фукозилированного олигосахарида для применения в способе по п. 1, где указанная клетка генетически модифицирована с возможностью экспрессировать гетерологичную фукозилтрансферазу, причем указанная гетерологичная фукозилтрансфераза способна переносить остаток фукозы с донорного субстрата на акцепторную молекулу, при этом указанной акцепторной молекулой является лактотетраоза.
6. Генетически модифицированная клетка по п. 5, где гетерологичная фукозилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, функциональных вариантов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, функциональных фрагментов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30, и функциональных вариантов функциональных фрагментов полипептидов, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30.
7. Генетически модифицированная клетка по п. 6 или 7, где гетерологичная фукозилтрансфераза кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей:
1) нуклеотидную последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO: 1-15;
2) нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность последовательности, составляющую по меньшей мере 80% с одной из нуклеотидных последовательностей, которая представлена любой из SEQ ID NO: 1-15, предпочтительно по всей длине последовательности;
3) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена любой из SEQ ID NO: 16-30;
4) нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности с любой из аминокислотных последовательностей, представленных любой из SEQ ID NO: 16-30;
5) нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный фрагмент любого из полипептидов в соответствии с 3) и 4); или
6) при этом молекула нуклеиновой кислоты гибридизуется с комплементарной цепью молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с 1), 2), 3), 4) или 5), в жестких условиях.
8. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6, 7, где клетка генетически модифицирована с возможностью иметь повышенную способность к внутриклеточному продуцированию ГДФ-фукозы по сравнению с данной клеткой до подвергания ее генетической модификации, причем данная клетка предпочтительно генетически модифицирована 1) с возможностью экспрессировать ген, кодирующий бифункциональную фукозокиназу/L-фукозо-1-фосфат-гуанилтрансферазу, катализирующую образование ГДФ-фукозы из L-фукозы, или 2) с возможностью сверхэкспрессировать по меньшей мере один из генов, кодирующих фосфоманномутазу, маннозо-1-фосфат-гуанозилтрансферазу, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазу и ГДФ-L-фукозо-синтазу.
9. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6-8, где клетка генетически модифицирована с возможностью демонстрировать усиленный импорт экзогенной L-фукозы через свою клеточную мембрану, причем данная клетка предпочтительно также генетически модифицирована с возможностью экспрессировать или сверхэкспрессировать, по сравнению с клеткой-предшественником до подвергания ее генетической модификации, одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, кодирующих главный переносчик, осуществляющий облегченный транспорт, FucP из Е. coli, нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные варианты главного переносчика, осуществляющего облегченный транспорт, FucP из Е. coli, нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные фрагменты главного переносчика, осуществляющего облегченный транспорт, FucP из Е. coli, и нуклеотидных последовательностей, кодирующих функциональные варианты функциональных фрагментов главного переносчика, осуществляющего облегченный транспорт, FucP из Е. coli.
10. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6-9, где клетка также генетически модифицирована с возможностью предотвращать истощение внутриклеточного запаса ГДФ-фукозы, предпочтительно так, что экспрессия клеточного гена, кодирующего WcaJ, который катализирует первую стадию синтеза колановой кислоты, нарушена или инактивирована, или так, что нуклеотидная последовательность гена, кодирующего WcaJ, изменена, вследствие чего ферментативно неактивный полипептид кодируется измененным геном WcaJ.
11. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6-10, где клетка также генетически модифицирована так, что гены fucl и/или fucK, кодирующие L-фукозоизомеразу и L-фукулозокиназу соответственно, удалены, нуклеотидная последовательность генов fucl и/или fucK изменена для необратимой инактивации ферментативной активности соответствующего(их) полипептида(ов), или так, что экспрессия генов fucl и/или fucK нарушена.
12. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6-11, где клетка также генетически модифицирована с возможностью иметь повышенную способность синтезировать одно или более из СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты, УДФ-N-ацетилглюкозамина и УДФ-галактозы по сравнению с данной клеткой до подвергания ее генетической модификации, причем предпочтительно, чтобы указанная повышенная способность к продуцированию УДФ-N-ацетилглюкозамина, УДФ-галактозы и более предпочтительно СМР-N-ацетилнейраминовой кислоты включала сверхэкспрессию одного или более генов, кодирующих белки, имеющие активности L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфатаминотрансферазы, N-ацетил глюкозамин-1-фосфат-уридилтрансферазы/глюкозамин-1-фосфат-ацетил-трансферазы, фосфоглюкозаминмутазы, УДФ-галактозо-4'-эпимеразы, фосфоглюкомутазы, глюкозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы, глюкозамин-6-фосфат-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы, УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы, фосфоенолпируват-синтетазы, синтазы сиаловых кислот, пермеазы сиаловых кислот, синтетазы СМР-сиаловых кислот.
13. Генетически модифицированная клетка по любому из пп. 6-12, где клетка содержит:
(1) факультативно (β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу,
(2) (β-1,3-галактозилтрансферазу или β-1,4-галактозилтрансферазу; и
(3) α-1,2- и/или α-1,3-фукозилтpaнеферазу в качестве гликозилтрансферазы.
14. Способ получения фукозилированного олигосахарида, включающий следующие стадии:
а) предоставление фукозилтрансферазы в реакционную смесь, причем фукозилтрансфераза способна переносить остаток фукозы с донорного субстрата на акцепторную молекулу, при этом указанной акцепторной молекулой является лактотетраоза; и
b) приведение в контакт указанной фукозилтрансферазы с донорным субстратом, содержащим остаток фукозы, и акцепторной молекулой, при этом указанной акцепторной молекулой является лактотетраоза.
15. Применение фукозилированного олигосахарида, полученного способом по любому из пп. 1-4 или 14, для приготовления пищевой композиции, предпочтительно детской смеси.
16. Пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид, причем указанный по меньшей мере один фукозилированный олигосахарид получен способом по любому из пп. 1-4 или 14.