СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ NK-КЛЕТОК
METHOD FOR NK-CELLS CYTOTOXIC ACTIVITY DETERMINATION

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки цитотоксической активности NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови.
Известен способ определения цитотоксической активности NK-клеток по интенсивности индукции гибели клеток-мишеней перевиваемой линии К562 (Муругин В.В. Комплекс методов исследования NK-клеток в норме и при патологии // Диссертация … канд. мед. наук. Москва, 2012, стр. 134). Для мечения клеток-мишеней линии К562 используют флуоресцентный краситель 5-,6-карбоксифлуоресцеин диацетатсукцинилмидиловый эфир (КФДЭ), который образует прочную ковалентную связь с внутриклеточными белками и в используемой концентрации не влияет на жизнеспособность клеток (Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В. Иммунология. Практикум. Учебное пособие // 2010. - Р. 176). Учет флуоресценции проводится при помощи метода проточной цитофлуориметрии, позволяющего проанализировать большое количество клеток.
Недостаток способа: не учитываются особенности функциональных взаимодействий NK-клеток при различных физиологических процессах, например при беременности.
Данные литературы (Hunt J.S., Petroff M.G., McIntire R.H., Ober С. HLA-G and immune tolerance in pregnancy // FASEB J. - 2005. - Vol. 19, №7. P. 681-93) указывают на возможность образования NK-клеток децидуальной оболочки из NK-клеток периферической крови. Непосредственное взаимодействие клеток трофобласта и NK-клеток является неотъемлемым процессом, происходящим при физиологической беременности. В настоящее время малоизученным остается вопрос о характере взаимодействия клеток трофобласта и NK-клеток при беременности. При помощи существующих способов оценки цитотоксической активности NK-клеток не представляется возможным полноценно моделировать in vitro подобное взаимодействие клеток при беременности.
Техническим результатом изобретения является создание способа определения цитотоксической активности фракции NK-клеток мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта, который может быть использован для проведения мониторинга цитотоксической активности NK-клеток пациенток с физиологической беременностью, а также для исследований функциональной активности NK-клеток пациенток с патологиями беременности.
Указанный технический результат достигается тем, что в заявленном способе определения цитотоксической активности NK-клеток, включающем выделение фракции мононуклеарных клеток, содержащих NK-клетки, из периферической крови, инкубацию в культуральной среде мононуклеаров в присутствии клеток-мишеней и последующую оценку количества погибших клеток путем проточной цитофлуометрии, согласно изобретению мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в культуральной среде DMEM в течение 4 часов в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3, часть клеток трофобласта инкубируют в культуральной среде DMEM без мононуклеаров в течение 4 часов, затем определяют количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, и базовое количество нежизнеспособных и жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без мононуклеаров периферической крови, определяют цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта по формуле:
баз
баз
ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1/Х2)×100,
где ЦЭ - цитотоксическая активность NK-клеток,
X1 - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,
Х2 - количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови,
баз.
X1 - базовое количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров,
баз.
Х2 - базовое количество жизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров.
В исследование, на котором основано изобретение, было включено 89 пациентов, среди которых были 54 здоровые небеременные женщины без предшествующих беременностей в анамнезе (Группа 1), 14 здоровых мужчин (Группа 2) и 21 здоровая беременная женщина на сроке 6-7 недель.
Для каждого пациента проводили оценку цитотоксического эффекта NK-клеток в четырех повторах.
Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Statistica 10. Для сравнения полученных данных использовался U-критерий Манна-Уитни, являющийся непараметрическим аналогом t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались различия при р<0,05.
В таблице 1 для каждой группы пациентов представлены значения медианы, в фигурных скобках приведены значения верхнего и нижнего квартиля.
Установлено, что группа 1 (здоровые небеременные женщины) статистически не отличается от группы 2 (здоровые мужчины). Группа 3 (здоровые беременные женщины на сроке 6-7 недель) отличается от группы 1 (здоровые небеременные женщины).
Вероятно, выявленный с помощью предлагаемого способа сниженный цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта в группе здоровых беременных женщин в сравнении с группой здоровых небеременных женщин определяется контактами NK-клеток данных пациенток с клетками трофобласта in vivo и подавлением их цитотоксической функции.
Способ иллюстрируется фиг. 1-6, где:
на фиг. 1 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3 с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат SSC. Регион Cells содержит клетки трофобласта;
на фиг. 2 представлена двумерная гистограмма образца клеток трофобласта линии Jeg-3, неокрашенных красителем КФДЭ (отрицательный контроль), с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат FITC. Клетки спроецированы из региона Cells;
на фиг. 3 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3 с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат FITC. Регион Jeg-3 содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем КФДЭ. Клетки спроецированы из региона Cells;
на фиг. 4 представлена двумерная гистограмма относительного количества клеток трофобласта линии Jeg-3, неокрашенных красителем пропидия иодида (отрицательный контроль), с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3;
на фиг. 5 представлена двумерная гистограмма относительного количества погибших клеток трофобласта линии Jeg-3, окрашенных красителем пропидия иодида, с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3;
на фиг. 6 представлена двумерная гистограмма относительного количества погибших клеток трофобласта линии Jeg-3, окрашенных красителем пропидия иодида, после инкубации в присутствии мононуклеаров периферической крови, с координатами по оси абсцисс FSC, по оси ординат РЕ. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные красителем РЕ. Клетки спроецированы из региона Jeg-3.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Для оценки цитотоксической активности NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта используют клетки трофобласта линии Jeg-3.
I. Порядок исследования.
1. Подготовка рабочих растворов.
1.1. Культуральная среда DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия (полная культуральная среда).
1.2. Раствор Версена стерильный.
1.3. Раствор Трипсина стерильный.
1.4. Раствор градиента плотности фиколл-верографин.
1.5. Раствор Хенкса стерильный.
2. Подготовка необходимых материалов.
2.1. Планшет 96-луночный, стерильный, с крышкой, прозрачный, круглодонный.
2
2.2. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 75 см.
2.3. Камера Горяева.
2.4. Стерильные наконечники на 5 мл.
2.5. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 300 мкл, до 1000 мкл.
2.6. Конические стерильные пробирки объемом 13 мл, 15 мл, 50 мл.
2.9. Раствор пропидия иодида 1 мкг/мл, приготовленный на PBS.
3. Подготовка необходимого оборудования.
3.1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.
3.2. Набор механических дозаторов переменного объема.
3.3. Центрифуга.
3.4. Термостат.
3.5. Вортекс.
3.6. Холодильник 6+2°С.
2
3.7. СO инкубатор.
3.8. Проточный цитофлуориметр, оборудованный 488 нм лазером, датчиками прямого и непрямого светорассеяния, датчиками учета флуоресценции FITC (519 нм), РЕ (578 нм).
II. Культивирование клеток трофобласта линии Jeg-3.
Порядок работы
1. До начала процедуры прогреть стерильные контейнеры со средой для культивирования клеток трофобласта, стерильным раствором Трипсина и стерильным раствором Версена при температуре 37°С.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
3. Смешать стерильно раствор Трипсина с раствором Версена (ТВ), содержащий равные части раствора Трипсина и раствора Версена.
2
4. Аккуратно слить старую среду из флакона 75 см для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.
2
5. Добавить 5 мл ранее приготовленной среды для клеток трофобласта во флакон 75 см.
2
6. Тщательно ресуспендировать. Перенести 700 мкл среды с клетками в новый флакон 75 см и долить в него 10 мл среды для культивирования.
2
7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 7% СO при 37°С в течение 72 часов или до образования клетками 2/3 монослоя.
III. Выделение мононуклеаров из периферической крови.
1. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
2. Подогреть Хенкс и раствор градиента плотности фиколл-верографин в термостате 37°С.
3. Подписать и внести в ламинар (из расчета на анализ 1 пациента): 1 пробирку на 50 мл, 3 пробирки на 13 мл, 1 пробирку на 15 мл.
4. Внести в пробирки на 13 мл по 4 мл раствора градиента. В пробирки на 50 мл внести по 12 мл Хенкса, в пробирки для отмывки мононуклеаров внести по 10 мл Хенкса.
5. Смешать 6 мл периферической крови с теплым раствором Хенкса в соотношении 1:2.
6. Пипеткой на 1 мл аккуратно наслоить разведенную периферическую кровь на раствор градиента из расчета на 4 мл градиента по 6 мл разведенной крови.
7. Центрифугировать 400g в течение 30 мин при 22°С.
8. Стерильно внести пробирки в ламинарно-потоковый шкаф. Отобрать 4-5 мл плазмы пипеткой на 1 мл и слить ее. Собрать кольцо мононуклеаров.
9. Перенести мононуклеары в пробирку с 10 мл раствора Хенкса.
10. Центрифугировать 200g в течение 10 мин при 22°С.
11. Аккуратно слить надосадочную жидкость, добавить к мононуклеарам 3 мл раствора Хенкса, ресуспендировать.
12. Посчитать концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Добавить 10 мл раствора Хенкса.
13. Центрифугировать 200g в течение 10 мин при 22°С.
14. Аккуратно слить надосадочную жидкость. Развести клетки в культуральной среде на основе DMEM до концентрации 3 млн/мл.
15. Перенести по 100 мкл клеток в лунки круглодонных планшетов.
2
16. Инкубировать в течение 96 часов при 37°С во влажной атмосфере и 5% СO.
IV. Проведение эксперимента.
1. Подогреть культуральную среду DMEM, полную культуральную среду для клеток трофобласта линии JEG-3, раствор ТВ в термостате 37°С.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
3. Развести в 5 мл теплой культуральной среды DMEM 4 мкл КФДЭ (стоковый раствор: 4,48 ммоль/л) и ресуспендировать.
4. Аккуратно слить старую среду из флакона для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора, внести раствор красителя КФДЭ.
2
5. Инкубировать в течение 10 мин при 37°С, 7% СО.
6. Слить раствор красителя, внести 10 мл холодной культуральной среды для JEG-3 без ЭТС.
7. Повторить отмывку: слить раствор холодной культуральной среды и повторно внести 10 мл холодной культуральной среды для JEG-3.
8. Слить раствор культуральной среды.
9. Добавить во флакон для культивирования клеток трофобласта 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.
10. Внести 2 мл теплой среды для клеток трофобласта.
11. Посчитать концентрацию клеток в камере Горяева. Развести клетки в среде для клеток JEG-3 до концентрации 0,6 млн/мл.
12. Перенести по 50 мкл клеток в планшет с предварительно засеянными мононуклеарами периферической крови, ресуспендировать. Внести в 5 лунок без мононуклеаров по 150 мкл клеток JEG-3.
13. Центрифугировать планшет при 100g в течение 3 мин при 22°С.
2
14. Инкубировать пробы в течение 4 часов при 37°С, 5% СО.
15. Окрасить пробы красителем пропидия иодида. Конечная концентрация пропидия иодида должна составлять 2 мкг/мл. Оставить неокрашенной 1 пробу с клетками JEG-3.
16. Инкубировать пробы 20 минут при 4°С.
17. Добавить в пробы по 300 мкл стандартного фосфатно-солевого буфера.
V. Проведение анализа и учет результатов.
Анализ клеток проводят на проточном цитофлуориметре, оборудованном 488 нм лазером, по четырем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу FITC (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 519 нм), флуоресценции по каналу РЕ (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 578 нм). Анализируется 10000 событий. На двумерной гистограмме с координатами FSC-SSC выделяют регион Cells, содержащий клетки трофобласта (фиг. 1). Клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC (фиг. 2). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, неокрашенной раствором КФДЭ (фиг. 2). При измерении опытной пробы, окрашенной раствором КФДЭ, клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC. Определяют количество событий в квадранте Jeg-3 (фиг. 3), данное количество соответствует количеству клеток трофобласта. Затем события из квадранта Jeg-3 проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-PE. Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, неокрашенной раствором пропидия иодида (фиг. 4). При измерении опытной пробы, окрашенной растворами КФДЭ и пропидия иодида, на двумерной гистограмме с координатами FSC-PE анализируют относительное количество погибших клеток трофобласта линии Jeg-3 (клетки из квадранта Jeg-3, окрашенные красителем пропидия иодида) (фиг. 5). Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, окрашенные раствором пропидия иодида. Количество событий в квадранте Dead cells соответствует нежизнеспособным клеткам трофобласта (фиг. 5). Гибель клеток в контрольной лунке (после инкубации клеток трофобласта без мононуклеаров периферической крови) не должна превышать 30%.
Затем проводят учет количества событий в квадранте Dead cells после инкубации клеток трофобласта с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). По количеству событий в квадрантах Dead cells определяют процент нежизнеспособных клеток трофобласта.
Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови по формуле:
баз
баз
ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1/Х2)×100.
баз
баз
Параметр X1 соответствует количеству событий в гейте Dead cells после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). Параметр Х2 соответствует количеству событий в гейте Jeg-3 после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови (фиг. 6). Параметр X1 соответствует количеству событий в гейте Dead cells после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных без мононуклеаров периферической крови (фиг. 5). Параметр Х2 соответствует количеству событий в гейте Jeg-3 после измерения пробы клеток трофобласта, инкубированных без мононуклеаров периферической крови (фиг. 5).
баз
баз
Пример 1. Пациентка А. Параметр X1=959 событие. Параметр Х2=2378 события. Параметр X1=624 события. Параметр Х2=3003 событий.
баз
баз
ЦЭ=(X1/Х2)×100-(Х1/Х2)×100=(959/2378)×100-(624/3003)×100=19,5%.
Способ позволяет получить количественную оценку цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта при их взаимодействии. Оценка цитотоксического эффекта NK-клеток в отношении клеток трофобласта может быть применена для мониторинга физиологического течения беременности, а также для исследований функциональной активности NK-клеток при патологии беременности.