КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УХОДА ЗА ПОЛОСТЬЮ РТА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ORAL CARE COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к композициям для ухода за полостью рта, содержащим комплексы нарингин:цинк, а также к способам применения и получения данных композиций.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Нарингин представляет собой флаванон-гликозид, обычно встречающийся в сортах грейпфрута и цитрусовых. Документально доказано, что он проявляет положительные эффекты в отношении здорового состояния при различных путях применения, такие как виды противомикробной активности (Pereira R. et al., Molecules, 2007, 12:1352-66; Abdulmahdi A-Η. et al., Acta Chimica & Pharmaceutica Indica, 2015, 5(3): 129-42), для заживления ран (Kandhare A.D. et al., Chemico-Biological Interactions, 2014, 219: 101-12, Pereira R. et al., см. выше, Abdulmahdi A-Η. et al., см. выше), заболеваний пародонта, сахарного диабета и ревматологических нарушений (Tsui V.W.K. et al., Phytotherapy Research, 2008, 22(3): 401-406; Bharti S. et al., Planta Med, 2014,80: 437-51). Кроме того, было подтверждено, что он подавляет рост патогенов, присутствующих в пародонте, а также некоторых обычных микроорганизмов, встречающихся в полости рта in vitro (Tsui V.W.K. et al., см. выше).
[0003] Деминерализация зубов представляет собой химический процесс, при котором минералы, в основном кальций, удаляются из любой из твердых тканей, т.е. эмали, дентина и цемента (X Li et al., J. of Dentistry, 2014, 42:S12-20). Эффекты деминерализации можно обратить вспять, если есть достаточно времени для обеспечения протекания реминерализации для нейтрализации кислот в полости рта. Реминерализация является полезной для стареющего населения, которое испытывает рецессию десен, а также для пациентов с периодонтитом тяжелой степени с очевидным обнажением корня. Дополнительно реминерализация может обеспечить защиту в отношении прогрессирования развития полости. Сообщается об эффекте в отношении реминерализации флавоноидов, в том числе нарингина, в случае искусственного кариеса корня; однако было показано, что флавоноиды являются менее эффективными, чем фторид (Epasinghe D.J. et al., Australian Dental Journal, 2016, 61(2): 196-202).
[0004] Было предположено, что матриксные металлопротеиназы (ММР) играют важную роль в разрушении органической матрицы дентина после деминерализации вследствие действия бактериальных кислот.Было показано, что повышение концентрации цинка подавляет дентин-ММР-зависимое разрушение коллагена (Toledano M. et al., Caries Res., 2012, 46(3):201-207).
[0005] Ранее нарингин и цитрат цинка объединяли в составе в виде зубной пасты; см. CN 102218021, опубликованный 23.1.2013. Комплексы нарингин-металл для применения в инсектицидных композициях были описаны в WO 2015027308, опубликованном 3 марта 2015 г. Комплексы нарингин-металл ранее были раскрыты (Al-Hassani R.A. et al., Acta Chimica & Pharmaceutica Indica, 2015, 5(3): 129-42); однако при синтезе данных комплексов использовали растворы этанола, который не является оптимальным в качестве ингредиента для применения в потребительских продуктах. Следовательно, необходимы способы синтеза для улучшенного получения таких молекул.
[0006] Присутствующие на рынке продукты для ухода за полостью рта не учитывают эффекты в отношении рецессии десен. Соответственно, существует необходимость в композициях для ухода за полостью рта для лечения и/или предупреждения прогрессирования рецессии десен.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Неожиданно было обнаружено, что можно получать комплексы нарингина и цинка, характеризующиеся отношением два моля нарингина к одному молю цинка. Такие комплексы демонстрируют неожиданные физико-химические свойства, такие как повышение антибактериальной активности. Данная активность может быть полезной при применении в композициях для ухода за полостью рта.
2
[0008] В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет собой комплекс нарингин:Zn, где комплекс нарингин:Zn характеризуется молярным соотношением нарингина и цинка 2:1. В дополнительном варианте осуществления комплекс нарингин:цинк характеризуется точкой плавления выше 230°С. В дополнительных вариантах осуществления комплекс нарингин:цинк характеризуется коэффициентом диффузии от 2,8е-11 до 3,2е-11 м/с в растворе DMSO при 25°С.
[0009] В конкретном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена композиция для ухода за полостью рта, содержащая комплекс нарингин:цинк. В определенных вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может быть выбрана из группы, состоящей из зубной пасты или средства для чистки зубов, ополаскивателя для полости рта или средства для полоскания рта, геля для местного применения в полости рта и очищающего средства для зубных протезов. В определенных вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может быть выбрана из зубных лент, гранул, лака и зубного порошка.
[00010] В определенных вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать одно или более средств, выбранных из разбавителей, бикарбонатных солей, средств, регулирующих рН, поверхностно-активных веществ, регуляторов пенообразования, дополнительных загущающих средств, увлажнителей, подсластителей, ароматизаторов, пигментов, антибактериальных средств, противокариозных средств, источников фторид-ионов, средств против зубного камня или для предупреждения образования зубного камня и их смесей.
[00011] В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ улучшения здорового состояния полости рта, предусматривающий применение эффективного количества композиции для ухода за полостью рта, описанной в данном документе, по отношению к полости рта субъекта, нуждающегося в этом. В определенных вариантах осуществления здоровое состояние рта может быть выбрано из одного или более из следующего: уменьшения интенсивности или подавления образования кариеса зубов; уменьшения интенсивности, восстановления или подавления повреждений зубной эмали; уменьшения интенсивности или подавления деминерализации и обеспечения реминерализации зубов; уменьшения повышенной чувствительности зубов; уменьшения интенсивности или подавления гингивита; обеспечения заживления ран или порезов в полости рта; уменьшения уровней кислотообразующих бактерий; повышения относительных уровней аргинолитических бактерий; подавления образования микробных биопленок в полости рта; повышения и/или поддержания значения рН образования зубного налета на уровнях, соответствующих по меньшей мере рН 5,5, после приема сахаросодержащего продукта; уменьшения накопления зубного налета; лечения, ослабления или уменьшения сухости во рту; отбеливания зубов; улучшения общего здорового состояния организма, в том числе здорового состояния сердечнососудистой системы; уменьшения интенсивности эрозии зубов; обеспечения устойчивости зубов против бактерий, вызывающих кариес, и их эффектов; чистки зубов и полости рта; уменьшения воспаления и повышения уровней антиоксидантов.
[00012] В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы получения комплекса нарингин:цинк, характеризующегося молярным соотношением нарингина и цинка 2:1. В определенных вариантах осуществления способ включает стадию получения комплекса, осуществляемую с применением значения рН 7-10. В определенных вариантах осуществления способ включает смешивание нарингина и цинка при температуре 65-85°С.
[00013] В определенных вариантах осуществления способ получения комплекса нарингин:цинк 2:1 включает стадии смешивания нарингина в метаноле; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до 10,0; инкубирования реакционной смеси и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до 70°С; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до 10,0; инкубирования реакционной смеси и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до 70°С; регулирования значения рН раствора до 10,0; добавления источника цинка и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до 70°С; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до 7,0 и необязательно выделения комплекса. В определенных вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина и ZnO в воде; нагревания смеси; инкубирования смеси и необязательно выделения комплекса. В определенных вариантах осуществления способ включает смешивание нарингина в пропиленгликоле при 70°С; регулирование значения рН раствора до 9,0-10,0; добавление источника цинка в пропиленгликоле при 40-50°С и необязательно выделение комплекса.
[00014] В определенных вариантах осуществления источник Zn выбран из ацетата цинка, оксида цинка, хлорида цинка, лактата цинка, цитрата цинка или нитрата цинка. В определенных вариантах осуществления источник Zn представляет собой ацетат цинка. В определенных вариантах осуществления источник Zn представляет собой ZnO.
[00015] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой композицию, полученную или получаемую путем объединения ингредиентов, описанных для любых из предыдущих композиций и способов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[00016] На фиг. 1А представлена молекулярная структура нарингина. На фиг. 1 В представлена предполагаемая молекулярная структура комплекса нарингин:цинк 2:1.
[00017] На фиг. 2 представлен UV-VIS-спектр нарингина по сравнению с комплексом нарингин:цинк 2:1, продуктом 1 по настоящему изобретению.
[00018] На фиг. 3 представлен UV-VIS-спектр нарингина по сравнению с различными продуктами, представляющими собой комплекс нарингин:цинк 2:1, продуктами 1-6 по настоящему изобретению.
[00019] На фиг. 4 представлен UV-VIS-спектр нарингина по сравнению с различными продуктами, представляющими собой комплекс нарингин:цинк 2:1, продуктами 4-6 по настоящему изобретению.
[00020] На фиг. 5 представлен инфракрасный спектр нарингина по сравнению с комплексом нарингин:цинк 2:1, продуктом 4. Спектры смещены для ясности. Пунктирные линии применяют для сосредоточения внимания на отличия в данном диапазоне.
[00021] На фиг. 6 представлено сравнение инфракрасных вибрационных спектров для нарингина и комплексов продукта 2, продукта 4 и продукта 5. Спектры смещены для ясности.
1
[00022] На фиг. 7А схематически показан ион цинка, находящийся в координационной связи с гидроксильной группой при С5 нарингина. На фиг. 7 В представлены спектры Н ЯМР нарингина и комплексов нарингин:Zn 2:1 (продукты 1-6) в DMSO-d5. Представленные значения химического сдвига приведены относительно TMS в качестве нуля. В верхней части показана предполагаемая структурная номенклатура комплекса нарингин: Zn 2:1.
[00023] На фиг. 8 представлена гистограмма, на которой показан экспериментально полученный коэффициент диффузии нарингина и комплексов нарингин:цинк 2:1 (продукт 4 и продукт 5) в DMSO-d5.
[00024] На фиг. 9 представлено сравнение UV-Vis-спектров нарингина и комплекса нарингин:цинк 2:1, продукта 5, в неделю 0 и в неделю 6.
[00025] На фиг. 10 представлено сравнение UV-Vis-спектров нарингина и комплекса нарингин:цинк 2:1, продукта 3, в неделю 0 и в неделю 8.
[00026] На фиг. 11 представлено сравнение кривых зависимости эффекта в отношении Streptococcus sobrinus от дозы для комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка, отдельно ацетата цинка и отдельно нарингина.
[00027] На фиг. 12 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении отдельных культур S. gordonii (S.g), S. sobrinus (S.s) или сокультур S. gordonii и S. sobrinus.
[00028] На фиг. 13 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении отдельных культур S.gordonii (S.g), A. viscosus (Α.v) или сокультур S. gordonii и A. viscosus.
[00029] На фиг. 14 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении отдельных культур S. sobrinus (S.s), A. viscosus (Α.v) или сокультур S. sobrinus и A. viscosus.
[00030] На фиг. 15 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении отдельных культур А. actinomycetemcomitans (A.a), A. viscosus (Α.v) или сокультур А. actinomycetemcomitans и A. viscosus.
[00031] На фиг. 16 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении отдельных культур S. sobrinus (S. s) и A. actinomycetemcomitans (A.a) или сокультур S. sobrinus и Α. actinomycetemcomitans.
610
[00032] На фиг. 17 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении смешанных бактериальных культур при 37°С, 5% CO2, в анаэробных условиях (OD 0,1).
610
[00033] На фиг. 18 показана противомикробная активность отдельно нарингина, комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка и отдельно ацетата цинка в отношении смешанных бактериальных культур при 37°С, в аэробных условиях (OD 0,1).
[00034] На фиг. 19 представлено сравнение восполнения цинка в мягкой ткани при обработке с помощью комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка, отдельно ацетата цинка или отдельно среды-носителя. * - p<0,005.
[00035] На фиг. 20 представлено сравнение эффектов различных вариантов обработки в отношении миграции/пролиферации клеток при «заживлении ран» в анализе методом зарастания царапины с применением клеток HaCat.
[00036] На фиг. 21 представлена диаграмма, на которой показано крестовидное изображение, образованное в монослое клеток для имитации раны.
[00037] На фиг. 22 представлено сравнение кривой зависимости эффекта в отношении смешанной культуры, выращенной в анаэробных условиях, от дозы для комплекса нарингин:цинк 2:1 (продукт 5), комбинации нарингин + ацетат цинка, отдельно ацетата цинка и отдельно нарингина.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00038] Следующее описание варианта(вариантов) осуществления настоящего изобретения является по своей природе лишь иллюстративным и никоим образом не предназначено для ограничения настоящего изобретения, его практического использования или вариантов применения.
[00039] Применяемые в данном документе слова «предпочтительный» и «предпочтительно» относятся к вариантам осуществления настоящего изобретения, которые обеспечивают некоторые преимущества при определенных обстоятельствах. Однако другие варианты осуществления могут также быть предпочтительными при тех же или других обстоятельствах. Кроме того, перечисление одного или более предпочтительных вариантов осуществления не предполагает, что другие варианты осуществления не являются применимыми, и не предназначено для исключения других вариантов осуществления из объема настоящего изобретения.
[00040] По всему тексту данного документа диапазоны используются в качестве сокращенного обозначения для описания всех без исключения значений, которые находятся в пределах диапазона. В качестве граничного значения диапазона может быть выбрано любое значение в пределах диапазона.
[00041] Если не указано иное, то все значения процентного содержания компонентов композиции, приведенные в данном описании, представлены по весу в пересчете на общий вес композиции или состава, составляющий 100%.
[00042] Все ссылки, приведенные в данном документе, тем самым включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В случае конфликта определений в настоящем изобретении и в приведенной ссылке, настоящее изобретение имеет преимущественное право.
[00043] Используемый в данном документе термин «композиция для ухода за полостью рта» означает общее количество композиции, которую доставляют к поверхностям полости рта. Композиция дополнительно определена как продукт, который в ходе обычного применения не предназначен для целей системного введения конкретных терапевтических средств, намеренно проглатываемых, а, наоборот, предназначен для удерживания в полости рта на протяжении времени, достаточного для контакта практически всех поверхностей зубов и/или тканей полости рта для целей активности в полости рта. Примеры таких композиций включают без ограничения зубную пасту или средство для чистки зубов, ополаскиватель для полости рта или средство для полоскания рта, гель для местного применения в полости рта, очищающее средство для зубных протезов, зубные ленты, гранулы, лак, зубной порошок и т.п.
[00044] Используемый в данном документе термин «средство для чистки зубов» означает пасту, гель или жидкие составы, если не указано иное. Композиция в виде средства для чистки зубов может быть представлена в любой необходимой форме, такой как с полосами в глубине, с полосами на поверхности, многослойная, с гелем, окружающим пасту, или любые их комбинации. В качестве альтернативы, композиция для ухода за полостью рта может быть двухфазной, распределенной с помощью дозирующего устройства с раздельными отделениями.
[00045] Термин «средство для полоскания рта» в настоящем изобретении относится к композициям для ухода за полостью рта, которые по сути являются жидкими по природе, таким как ополаскиватель для рта, спрей или средство для полоскания. В таком препарате приемлемый для применения в полости рта носитель, как правило, имеет водную фазу, содержащую воду или смесь воды и спирта. Кроме того, в различных вариантах осуществления носитель для применения в полости рта включает увлажнитель и поверхностно-активное вещество, описанные ниже. Как правило, весовое соотношение воды и спирта находится в диапазоне значений в количестве от 1:1 до 20:1, предпочтительно от 3:1 до 10:1 и более предпочтительно от 4:1 до 6:1. Общее количество смеси вода-спирт в данном типе препарата, как правило, составляет количество от 70 до 99,9% препарата. В различных вариантах осуществления спирт, как правило, представляет собой этанол или изопропанол.
[00046] Термин «эффективное количество», используемый в данном документе, означает, что количество композиции по настоящему изобретению является достаточным количеством для достижения заданной цели, такой как, например, индуцирование или обуславливание реминерализации у субъекта.
[00047] Термины «нарингин:Zn 2:1», «комплекс нарингин:Zn 2:1», «нарингин:цинк» и «комплекс нарингин:цинк» используют взаимозаменяемо, и они относятся, если не указано иное, к комплексу по настоящему изобретению.
[00048] Если не указано иное, то все значения процентного содержания компонентов композиции, приведенные в данном описании, представлены по весу в пересчете на общий вес композиции или состава, составляющий 100%.
[00049] Если конкретно не указано иное, то ингредиенты, предназначенные для применения в композициях и составах по настоящему изобретению, представляют собой предпочтительно косметически приемлемые ингредиенты. Под термином «косметически приемлемый» подразумевается подходящий для применения в составах для местного нанесения на кожу человека. Например, косметически приемлемое вспомогательное средство представляет собой вспомогательное средство, которое является подходящим для наружного применения в количествах и концентрациях, предусмотренных в составах по настоящему изобретению, и включает, например, вспомогательные средства, которые «в целом признаны безопасными» (GRAS) Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств Соединенных Штатов Америки.
[00050] Композиции и составы, предусмотренные в данном документе, описаны и заявлены в формуле изобретения со ссылкой на их ингредиенты, как обычно принято в данной области техники. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, ингредиенты могут в некоторых случаях вступать в реакцию друг с другом, так что истинная композиция конечного состава может не соответствовать точно перечисленным ингредиентам. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение распространяется на продукт из комбинации перечисленных ингредиентов.
[00051] В настоящем изобретении предусмотрены композиции, содержащие комплекс(комплексы) нарингин:Zn, где комплекс нарингин:Zn характеризуется молярным соотношением нарингина и цинка 2:1. Данные комплексы обеспечивают уникальные характеристики, такие как повышенные значения противомикробной активности, и являются пригодными в вариантах применения для ухода за полостью рта.
[00052] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены комплексы нарингин:цинк, характеризующиеся точкой плавления, составляющей по меньшей мере 200°С, 205°С, 210°С, 215°С, 220°С, 225°С, 230°С, 235°С, 240°С, 245°С, или 250°С. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены комплексы нарингин:цинк, характеризующиеся точкой плавления, составляющей приблизительно 200°С, 205°С, 210°С, 215°С, 220°С, 225°С, 230°С, 235°С, 240°С, 245°С или 250°С.
[00053] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы получения комплекса нарингин:Zn, характеризующегося молярным соотношением нарингина и цинка 2:1. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН 7-10. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН 8-10. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН 9-10. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН, составляющем приблизительно 7. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН, составляющем приблизительно 8. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН, составляющем приблизительно 9. В определенных вариантах осуществления нарингин и источник цинка объединяют при рН, составляющем приблизительно 10.
[00054] В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 20°С до 80°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 25°С до 75°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 30°С до 70°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 35°С до 65°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 20°С до 40°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 40°С до 60°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 60°С до 80°С. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 20°С до 25°С.
[00055] В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 20°С до 80°С и рН 7-10. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 25°С до 75°С и рН 7-10. В определенных вариантах осуществления комплекс синтезируют при температуре от 30°С до 70°С и рН 7-10.
[00056] В определенных вариантах осуществления способ получения комплекса нарингин:цинк 2:1 включает стадии смешивания нарингина в метаноле; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до приблизительно 10,0; инкубирования реакционной смеси и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до приблизительно 70°С; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до приблизительно 10,0; инкубирования реакционной смеси и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до приблизительно 70°С; регулирования значения рН раствора до приблизительно 10,0; добавления источника цинка и необязательно выделения комплекса. В других вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина в воде; нагревания смеси до приблизительно 70°С; добавления источника цинка; регулирования значения рН раствора до приблизительно 7,0 и необязательно выделения комплекса. В определенных вариантах осуществления способ включает стадии смешивания нарингина и ZnO в воде; нагревания смеси; инкубирования смеси и необязательно выделения комплекса. В определенных вариантах осуществления способ включает смешивание нарингина в пропиленгликоле при приблизительно 70°С; регулирование значения рН раствора до 9,0-10,0; добавление источника цинка в пропиленгликоле при приблизительно 40-50°С и необязательно выделение комплекса.
[00057] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение композиции, содержащей комплекс нарингин:цинк 2:1, для уменьшения интенсивности и/или подавления кислотной эрозии эмали, уменьшения интенсивности или подавления рецессии десен, контроля микробного роста, чистки зубов, уменьшения образованной бактериями биопленки и зубного налета, уменьшения интенсивности гингивита, подавления кариеса зубов и образования полостей и/или уменьшения повышенной чувствительности зубов. В настоящем изобретении предусмотрено применение композиции, содержащей комплекс нарингин:цинк 2:1, для заживления ран. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение композиции, содержащей комплекс нарингин:цинк 2:1, для снижения тяжести и/или предупреждения воспаления. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрено применение композиции, содержащей комплекс нарингин:цинк 2:1, для снижения тяжести и/или предупреждения кровотечения.
[00058] В определенных вариантах осуществления комплексы нарингин:цинк включены в композиции для ухода за полостью рта. В некоторых вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может быть выбрана из группы, выбранной из зубной пасты или средства для чистки зубов, ополаскивателя для полости рта или средства для полоскания рта, геля для местного применения в полости рта и очищающего средства для зубных протезов. В некоторых вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может представлять собой зубную пасту или средство для чистки зубов. В некоторых вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может представлять собой ополаскиватель для полости рта или средство для полоскания рта. В некоторых вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта может представлять собой гель для местного применения в полости рта и очищающее средство для зубных протезов.
[00059] В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет собой способ улучшения здорового состояния полости рта, предусматривающий применение эффективного количества композиции для ухода за полостью рта, описанной в данном документе, по отношению к полости рта субъекта, нуждающегося в этом. В определенных вариантах осуществления способ включает применение композиции на основе комплекса нарингин:цинк 2:1, выбранной из группы, состоящей из зубной пасты или средства для чистки зубов, ополаскивателя для полости рта или средства для полоскания рта, геля для местного применения в полости рта и очищающего средства для зубных протезов.
[00060] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы уменьшения интенсивности и подавления кислотной эрозии эмали, уменьшения интенсивности или подавления рецессии десен, контроля микробного роста, чистки зубов, уменьшения образованной бактериями биопленки и зубного налета, уменьшения интенсивности гингивита, подавления кариеса зубов и образования полостей и уменьшения повышенной чувствительности зубов, предусматривающие применение эффективного количества композиции по настоящему изобретению, например, любой из указанных композиций, описанных в данном документе, по отношению к зубам.
[00061] Например, в настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы уменьшения интенсивности и подавления кислотной эрозии эмали, уменьшения интенсивности или подавления рецессии десен, контроля микробного роста, чистки зубов, уменьшения образованной бактериями биопленки и зубного налета, уменьшения интенсивности гингивита, подавления кариеса зубов и образования полостей и уменьшения повышенной чувствительности зубов, предусматривающие применение эффективного количества композиции по настоящему изобретению, например, любой из указанных композиций, описанных в данном документе, по отношению к полости рта и затем промывание достаточным количеством воды или водного раствора.
[00062] В определенных вариантах осуществления комплекс включен в ополаскиватель для полости рта. В некоторых вариантах осуществления ополаскиватель для полости рта содержит от 0,002% до 4% по весу цинка. В некоторых вариантах осуществления ополаскиватель для полости рта содержит от 0,005% до 0,01% по весу цинка. В некоторых вариантах осуществления ополаскиватель для полости рта содержит от 0,01% до 1% по весу цинка. В некоторых вариантах осуществления ополаскиватель для полости рта содержит от 1% до 4% по весу цинка. В некоторых вариантах осуществления любой из описанных выше ополаскивателей для полости рта содержит цинк, солюбилизированный в составе, который обеспечивает источник цинка при смешивании с содержащим нарингин раствором при применении и разбавлении слюной и/или промывании. В других вариантах осуществления источник ионов цинка и источник нарингина образуют комплекс нарингин:цинк.
[00063] В некоторых вариантах осуществления рН ополаскивателя для полости рта составляет от рН 4 до рН 8.
[00064] Некоторые варианты осуществления дополнительно содержат эффективное количество источника фторид-ионов в композиции.
[00065] В других вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрена приемлемая для перорального применения основа, содержащая ингредиенты, выбранные из одного или более буферных средств, увлажнителей, поверхностно-активных веществ, загустителей, освежителей для полости рта, ароматизирующего вещества, отдушки, красителя, антибактериальных средств, отбеливающих средств, средств, которые препятствуют прикреплению бактерий или предотвращают его, источников кальция, источников фосфата, приемлемых для применения в полости рта солей калия и анионных полимеров.
[00066] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен ополаскиватель для полости рта для применения в уменьшении интенсивности или подавлении кислотной эрозии эмали, в уменьшении интенсивности или подавлении рецессии десен, в контроле микробного роста, в чистке зубов, в уменьшении образованной бактериями биопленки и зубного налета, в уменьшении интенсивности гингивита, в подавлении кариеса зубов и образования полостей и/или в уменьшении повышенной чувствительности зубов.
[00067] В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение комплекса нарингин:цинк 2:1 для изготовления ополаскивателя для полости рта. В других вариантах осуществления предусмотрен способ лечения или уменьшения интенсивности эрозии зубной эмали, чистки зубов, уменьшения интенсивности или подавления рецессии десен, уменьшения образованной бактериями биопленки и зубного налета, уменьшения интенсивности гингивита, подавления кариеса зубов и образования полостей и/или уменьшении повышенной чувствительности зубов, предусматривающий применение ополаскивателя для полости рта, описанного в данном документе. В других вариантах осуществления предусмотрены способы, дополнительно предусматривающие стадию промывания достаточным количеством воды или водным раствором.
[00068] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ получения композиции для ухода за полостью рта, предусматривающий объединение нарингина и источника цинка в водной среде, необязательно выделение образованного таким образом комплекса в твердой форме и объединение комплекса нарингин:цинк с композицией для ухода за полостью рта. В определенных вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта представляет собой зубную пасту. В определенных вариантах осуществления для ухода за полостью рта представляет собой основу ополаскивателя для полости рта.
[00069] В различных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы (i) уменьшения повышенной чувствительности зубов, (ii) уменьшения накопления зубного налета, (iii) уменьшения интенсивности или подавления деминерализации и обеспечения реминерализации зубов, (iv) подавления образования микробных биопленок в полости рта, (v) уменьшения интенсивности или подавления гингивита, (vi) обеспечения заживления ран или порезов в полости рта, (vii) уменьшения уровней кислотообразующих бактерий, (viii) повышения относительных уровней не вызывающих кариес и/или не образующих зубной налет бактерий, (ix) уменьшения или подавления образования кариеса зубов, (х) уменьшения интенсивности, восстановления или подавления образования предкариозных повреждений эмали, например, выявляемых с помощью количественной светоиндуцированной флуоресценции (QLF) или электродиагностики кариеса (ЕСМ), (xi) лечения, ослабления или уменьшения сухости во рту, (xii) чистки зубов и полости рта, (xiii) уменьшения интенсивности эрозии, (xiv) отбеливания зубов, (xv) уменьшения накопления зубного камня и/или (xvi) обеспечения общего здорового состояния организма, в том числе здорового состояния сердечно-сосудистой системы, например, путем уменьшения возможности распространения системной инфекции через ткани полости рта, предусматривающие применение любой из указанных композиций, описанных в данном документе, по отношению к полости рта человека, нуждающегося в этом, например, один или более раз в день. В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы уменьшения интенсивности или подавления рецессии десен. В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы контроля микробного роста. В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы уменьшения образованной бактериями биопленки, неприятного запаха и/или зубного налета. В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена любая из композиций, описанных в данном документе, для применения в любом из данных способов.
[00070] Термин «активные вещества» означает соединения, которые при применении по отношению к целевой ткани обеспечивают положительный эффект или улучшение целевой ткани. Активные вещества можно доставлять в форме любых составов для ухода за полостью рта, например, зубной пасты, прозрачной пасты, геля, ополаскивателя для полости рта, порошка, крема, ленты, спрея, жевательной резинки или любых других, известных из уровня техники.
[00071] Если комплекс доставляют в форме ополаскивателя для полости рта, человек, желающий получить положительные эффекты, промывает раствором, содержащим комплекс нарингин:цинк. В определенных вариантах осуществления можно применять двухкамерную систему. В данных аспектах первая камера содержит нарингин в растворе при основном рН. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 7 10. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 7 8. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 8-9. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 9-10. Двухкамерная система также будет содержать вторую камеру, содержащую солюбилизированный источник цинка. При применении содержимое первой и второй камер смешивают вместе с получением таким образом комплекса нарингин:цинк.
[00072] В другом варианте осуществления смесь получают и непосредственно переносят в удерживающую капу, такую как капы, применяемые для удерживания отбеливающих гелей, и человек может носить капу в течение эффективного периода времени. Будут обработаны зубы, которые находятся в контакте со смесью. Для применения с удерживающей капой смесь может быть представлена в форме жидкости или геля с низкой вязкостью. В определенных вариантах осуществления комплекс составлен в композицию, содержащую полимер Carbopol, глицерин и воду.
[00073] В другом варианте осуществления исходный раствор или смесь исходного раствора с водой применяют по отношению к зубам в составе в виде геля, например, где гель может оставаться на зубе в течение продолжительного периода времени для эффективной обработки.
[00074] В другом варианте осуществления композиция по настоящему изобретению представляет собой вязкую жидкость, предпочтительно гель, который поддерживает свою консистенцию во время хранения, обеспечивая возможность нанесения продукта на поверхность зуба с помощью карандаша с мягким аппликатором или щетки. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен способ использования аппликатора для доставки композиции, где аппликатор представляет собой карандаш, и карандаш хранится в приспособлении для ухода за полостью рта. В некоторых вариантах осуществления карандаш извлекают из приспособления для ухода за полостью рта перед нанесением композиции на зуб. В некоторых вариантах осуществления композицию наносят на зуб после чистки щеткой. В некоторых вариантах осуществления композицию наносят на зуб после чистки щеткой с помощью приспособления для ухода за полостью рта.
5
2
2
2
[00075] Источник ионов цинка для синтеза комплекса может происходить из любого источника, который эффективно обеспечивает ионы Zn2+ , например, представлять собой оксид цинка, ацетат цинка, хлорид цинка, лактат цинка, четырехосновный хлорид цинка, карбонат цинка, нитрат цинка, цитрат цинка, бис-лизинат цинка и фосфат цинка. Оксид цинка представляет собой белый порошок, нерастворимый в воде. Четырехосновный хлорид цинка (TBZC) или моногидрат гидроксида-хлорида цинка представляет собой гидроксисоединение цинка с формулой Zn(OH)Cl.HO, также называемый основным хлоридом цинка, гидроксихлоридом цинка или оксихлоридом цинка. Он представляет собой бесцветное кристаллическое твердое вещество, нерастворимое в воде. Оба из данных веществ можно солюбилизировать в воде в присутствии нарингина и нагревать, таким образом обеспечивая источник ионов цинка. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления источник Zn выбран из ацетата цинка, оксида цинка, хлорида цинка, лактата цинка, цитрата цинка или нитрата цинка.
[00076] В определенных вариантах осуществления количество цинка в композиции составляет от 0,005 до 30% по весу композиции. В определенных вариантах осуществления предшественники, например, источники цинка и нарингин, присутствуют в таких количествах, чтобы при объединении в комплекс нарингин:цинк комплекс присутствовал в количестве от 0,005 до 10% по весу композиции. В любом из данных вариантов осуществления количество комплекса нарингин:цинк 2:1 можно варьировать для необходимой цели, такой как средство для чистки зубов или ополаскиватель для полости рта. В других вариантах осуществления количество комплекса нарингин:цинк 2:1 составляет от по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,2, по меньшей мере 0,3, по меньшей мере 0,4, по меньшей мере 0,5, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 до не более 10% по весу композиции. В других вариантах осуществления количество комплекса нарингин:цинк 2:1 составляет от менее 9, менее 8, менее 7, менее 6, менее 5, менее 4, менее 3, менее 2, менее 1, менее 0,5 до 0,005% по весу композиции. В других вариантах осуществления количества составляют от 0,05 до 5%, от 0,05 до 4%, от 0,05 до 3%, от 0,05 до 2%, от 0,1 до 5%, от 0,1 до 4%, от 0,1 до 3%, от 0,1 до 2%, от 0,5 до 5%, от 0,5 до 4%, от 0,5 до 3% или от 0,5 до 2% по весу композиции.
[00077] В определенных вариантах осуществления композиция является безводной. Под термином «безводный» подразумевают, что присутствует менее 5% по весу воды, необязательно от менее 4, менее 3, менее 2, менее 1, менее 0,5, менее 0,1 до 0% по весу воды.
[00078] Если они представлены в безводной композиции, предшественники, например, нарингин и источники цинка, в значительной степени не будут взаимодействовать с образованием комплекса нарингин:цинк 2:1. При контакте с достаточным количеством воды, которая может находиться в форме слюны и/или воды, применяемой для прополаскивания рта во время или после применения композиции, предшественники затем будут вступать в реакцию с образованием комплекса нарингин:цинк 2:1. В предпочтительных вариантах осуществления вода и/или слюна характеризуется рН 7-10. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 7-9. В определенных вариантах осуществления значение рН составляет 7-8.
[00079] В определенных вариантах осуществления композиции для ухода за полостью рта, содержащие комплексы нарингин:цинк, дополнительно содержат одно или более средств, выбранных из разбавителей, бикарбонатных солей, средств, регулирующих рН, поверхностно-активных веществ, регуляторов пенообразования, дополнительных загущающих средств, увлажнителей, подсластителей, ароматизаторов, пигментов, антибактериальных средств, противокариозных средств, источников фторид-ионов, средств против зубного камня или для предупреждения образования зубного камня и их смесей.
[00080] Композиция для ухода за полостью рта в соответствии с настоящим изобретением необязательно может включать другие вещества, такие как, например, очищающие средства, ароматизирующие средства, подслащивающие средства, средства, повышающие адгезию, поверхностно-активные вещества, средства, регулирующие рН, абразивы, средства, регулирующие рН, увлажнители, увлажняющие средства, средства, улучшающие вкусовые ощущения, окрашивающие средства, абразивы, консерванты, источники фторид-ионов, средства, стимулирующие выделение слюны, смягчающие вещества, модификаторы вязкости, разбавители, эмульгаторы, питательные вещества и их комбинации. Различные компоненты, которые можно добавлять в композицию для ухода за полостью рта, включают, например, подслащивающее средство, такое как сахарин или сахарин натрия, спирты, такие как этанол, источники фторид-ионов, такие как фторид натрия, а также глицерин, сорбит, полиэтиленгликоли. Полимеры, представляющие собой полоксамеры, такие как POLOXOMER 407, PLURONIC F108, (оба доступны от BASF Corporation), алкилполигликозид (APG), полисорбат, PEG40, касторовое масло, ментол и т.п.Следует понимать, что, хотя общие свойства каждой из приведенных выше категорий материалов могут отличаться, могут существовать некоторые общие свойства, и какой-либо приведенный материал может служить для нескольких целей в двух или более таких категориях материалов. Предпочтительно, такие материалы, являющиеся носителями, выбраны на основании совместимости с активными ингредиентами, обнаруженными в экстракте магнолии или его синтетических аналогах, а также с другими ингредиентами композиции.
[00081] Ароматизаторы среди таковых, применяемых в соответствии с данным документом, включают любые материал или смесь материалов, способные усиливать вкус композиции. Можно применять любой приемлемый для применения в полости рта натуральный или синтетический ароматизатор, такой как ароматизирующие масла, ароматизирующие альдегиды, сложные эфиры, спирты, подобные материалы и их комбинации. Ароматизаторы включают ванилин, шалфей, майоран, масло петрушки, масло мяты кудрявой, коричное масло, масло грушанки (метилсалицилат), масло мяты перечной, гвоздичное масло, лавровое масло, анисовое масло, эвкалиптовое масло, масла цитрусовых, фруктовые масла и эссенции, в том числе полученные из лимона, апельсина, лайма, грейпфрута, абрикоса, банана, винограда, яблока, клубники, вишни, ананаса и т.д., ароматизирующие добавки, полученные из бобов и орехов, таких как кофе, какао, кола, арахис, миндаль и т.д., адсорбированные и инкапсулированные ароматизаторы и их смеси. Также в данном документе ароматизаторы охватывают ингредиенты, которые обеспечивают аромат и/или другое органолептическое свойство во рту, включая эффекты охлаждения или нагревания. Такие ингредиенты включают ментол, ментилацетат, ментиллактат, камфору, эвкалиптовое масло, эвкалиптол, анетол, эвгенол, кассию, оксанон, [альфа]-иризон, пропенилгваетол, тимол, линалоол, бензальдегид, коричный альдегид, N-этил-п-ментан-3-карбоксамин, N,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, 3-1-ментоксипропан-1,2-диол, глицеринацеталь коричного альдегида (CGA), метанглицеринацеталь (MGA) и их смеси. Один или более ароматизаторов необязательно присутствуют в общем количестве, составляющем от 0,01% до 5%, необязательно в различных вариантах осуществления от 0,05 до 2%, от 0,1% до 2,5% и от 0,1 до 0,5%.
[00082] Подслащивающие средства среди таковых, применяемых в соответствии с данным документом, включают декстрозу, поли декстрозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, высушенный инвертный сахар, маннозу, ксилозу, рибозу, фруктозу, левулозу, галактозу, кукурузную патоку, частично гидролизованный крахмал, гидролизат гидрированного крахмала, сорбит, маннит, ксилит, мальтит, изомальт, аспартам, неотам, сахарин и их соли, сукралозу, подсластители с интенсивным вкусом на основе дипептидов, цикламаты, дигидрохальконы и их смеси.
[00083] Средства, улучшающие вкусовые ощущения, включают материалы, придающие необходимую текстуру или другие ощущения во время применения композиции по настоящему изобретению.
[00084] Окрашивающие средства среди таковых, применяемых в соответствии с данным документом, включают пигменты, красящие вещества, лаки и средства, обеспечивающие специфический блеск или отражательную способность, такие как средства, придающие эффект жемчуга. В различных вариантах осуществления окрашивающие средства способны обеспечивать белое или светлоокрашенное покрытие на поверхности зубов, действовать как индикатор расположения на поверхности зубов, которая эффективно контактировала с композицией, и/или модифицировать внешний вид, в частности, цвет и/или непрозрачность, композиции для усиления привлекательности для потребителя. Можно применять любое приемлемое для применения в полости рта окрашивающее средство, включая красящие вещества и пигменты, соответствующие FD&C, тальк, слюду, карбонат магния, карбонат кальция, силикат магния, алюмосиликат магния, диоксид кремния, диоксид титана, оксид цинка, красный, желтый, коричневый и черный оксиды железа, ферроцианид аммония и трехвалентного железа, темно-фиолетовый краситель, пигмент ультрамарин, титанированную слюду, оксихлорид висмута и их смеси. Одно или более окрашивающих средств необязательно присутствуют в общем количестве 0,001%-20%, например, 0,01%-10% или 0,1%-5%.
Активные средства
[00085] Композиции по настоящему изобретению могут содержать различные средства, которые являются активными, для защиты и увеличения прочности и целостности эмали и структуры зуба и/или уменьшения количества бактерий и связанного с этим кариозного разрушения зубов и/или заболевания десен, включая комплексы цинк-аминокислота-галогенид или в дополнение к ним. Эффективная концентрация активных ингредиентов, применяемых в данном документе, будет зависеть от конкретного средства и применяемой системы доставки. Следует понимать, что, например, зубная паста при применении, как правило, будет разбавлена водой, тогда как средство для полоскания рта, как правило, не будет разбавлено. Таким образом, эффективная концентрация активного средства в зубной пасте обычно будет в 5-15× раз выше, чем необходимо для средства для полоскания рта. Концентрация будет также зависеть от конкретных выбранных соли или полимера. Например, если активное средство представлено в форме соли, то вес соли будет зависеть от противоиона, таким образом, чем тяжелее противоион, тем больший вес соли потребуется для получения такой же концентрации активного иона в конечном продукте. Аргинин, если присутствует, может присутствовать на уровнях, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 вес. % (выраженном как вес свободного основания), например, от приблизительно 1 до приблизительно 10 вес. % для потребительской зубной пасты или от приблизительно 7 до приблизительно 20 вес. % для профессионального или отпускаемого по рецепту средства лечебно-профилактического назначения. Фторид, если присутствует, может присутствовать на уровнях, например, от приблизительно 25 до приблизительно 25000 ррт, например, от приблизительно 750 до приблизительно 2000 ррт для потребительской зубной пасты или от приблизительно 2000 до приблизительно 25000 ррт для профессионального или отпускаемого по рецепту средства лечебно-профилактического назначения. Уровни содержания антибактериальных средств могут аналогично изменяться, при этом уровни для зубной пасты могут быть, например, в от приблизительно 5 до приблизительно 15 раз больше тех, которые применяются в ополаскивателе для полости рта. Например, зубная паста, содержащая триклозан, может содержать приблизительно 0,3 вес. % триклозана. Источник фторид-ионов
[00086] Композиции для ухода за полостью рта могут дополнительно включать один или более источников фторид-ионов, например, растворимые фтористые соли. В композициях по настоящему изобретению в качестве источников растворимых фторидов можно применять широкий спектр веществ, образующих фторид-ионы. Примеры подходящих веществ, образующих фторид-ионы, можно найти в патенте США №3535421, выданном Briner и соавт.; в патенте США №4885155, выданном Parran, Jr. и соавт., и в патенте США №3678154, выданном Widder и соавт. Иллюстративные источники фторид-ионов включают без ограничения фторид двухвалентного олова, фторид натрия, фторид калия, монофторфосфат натрия, фторсиликат натрия, фторсиликат аммония, аминофторид, фторид аммония и их комбинации. В определенных вариантах осуществления источник фторид-ионов включает фторид двухвалентного олова, фторид натрия, монофторфосфат натрия, а также их смеси. В определенных вариантах осуществления композиция для ухода за полостью рта по настоящему изобретению также может содержать источник фторид-ионов или ингредиент, обеспечивающий фтор, в количествах, достаточных для обеспечения от приблизительно 25 ррт до приблизительно 25000 ррт фторид-ионов, как правило, по меньшей мере приблизительно 500 ррт, например, от приблизительно 500 до приблизительно 2000 ррт, например, от приблизительно 1000 до приблизительно 1600 ррт, например, приблизительно 1450 ррт. Соответствующий уровень содержания фторида будет зависеть от конкретного способа применения. Зубная паста для общего потребительского использования, как правило, может содержать от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 ррт, а зубная паста для детей несколько меньше. Средство для чистки зубов или покрытие для профессионального применения может содержать вплоть до приблизительно 5000 или даже приблизительно 25000 ррт фторида. Источники фторид-ионов можно добавлять в композиции по настоящему изобретению при уровне содержания от приблизительно 0,01 вес. % до приблизительно 10 вес. % в одном варианте осуществления или приблизительно 0,03 вес. % до приблизительно 5 вес. % и в другом варианте осуществления от приблизительно 0,1 вес. % до приблизительно 1 вес. % по весу композиции в другом варианте осуществления. Значения веса фтористых солей для обеспечения соответствующего уровня содержания фторид-ионов, очевидно, будут изменяться в зависимости от веса противоиона в соли.
Пенообразующие средства
[00087] Композиции для ухода за полостью рта по настоящему изобретению могут также включать средство для увеличения количества пены, которая образуется при чистке щеткой полости рта. Иллюстративные примеры средств, которые увеличивают количество пены, включают без ограничения полиоксиэтилен и определенные полимеры, в том числе без ограничения альгинатные полимеры. Полиоксиэтилен может увеличивать количество пены и густоту пены, образованной компонентом-носителем для ухода за полостью рта по настоящему изобретению. Полиоксиэтилен также широко известен как полиэтиленгликоль («PEG») или полиэтиленоксид. Полиоксиэтилены, подходящие для настоящего изобретения, будут характеризоваться молекулярной массой от приблизительно 200000 до приблизительно 7000000. В одном варианте осуществления молекулярная масса составляет от приблизительно 600000 до приблизительно 2000000 и в другом варианте осуществления - от приблизительно 800000 до приблизительно 1000000. Polyox является торговым названием высокомолекулярного полиоксиэтилена, производимого компанией Union Carbide. Полиоксиэтилен может присутствовать в количестве от приблизительно 1% до приблизительно 90%, в одном варианте осуществления от приблизительно 5% до приблизительно 50% и в другом варианте осуществления от приблизительно 10% до приблизительно 20% по весу компонента-носителя для ухода за полостью рта в композициях для ухода за полостью рта по настоящему изобретению. Количество пенообразующего средства, если оно присутствует, в композиции для ухода за полостью рта (т.е. однократная доза) составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,9% по весу, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5% по весу и в другом варианте осуществления от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,2% по весу.
Средства для предупреждения образования зубного камня
4
2
7
2
2
7
2
4
5
3
10
[00088] В различных вариантах осуществления настоящего изобретения композиции содержат средство против зубного камня (средство для предупреждения образования зубного камня). Подходящие средства против зубного камня включают без ограничения фосфаты и полифосфаты (например, пирофосфаты), полиаминопропансульфоновую кислоту (AMPS), гексаметафосфатные соли, тригидрат цитрата цинка, полипептиды, полиолефинсульфонаты, полиолефинфосфаты, дифосфонаты. Таким образом, в настоящем изобретении могут предусматриваться фосфатные соли. В конкретных вариантах осуществления данные соли представляют собой фосфатные соли щелочного металла, т.е. соли гидроксидов щелочного металла или гидроксидов щелочноземельного металла, например, соли натрия, калия или кальция. «Фосфат», используемый в данном документе, охватывает приемлемые для применения в полости рта моно- и полифосфаты, например, Р1-6-фосфаты, например, мономерные фосфаты, такие как одноосновный, двухосновный или трехосновный фосфат; димерные фосфаты, такие как пирофосфаты; и мультимерные фосфаты, например, гексаметафосфат натрия. В конкретных примерах выбранный фосфат выбран из двухосновных фосфатных солей щелочных металлов и пирофосфатных солей щелочных металлов, например, выбран из двухосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата калия, дигидрата фосфата дикальция, пирофосфата кальция, пирофосфата тетранатрия, пирофосфата тетракалия, триполифосфата натрия и смесей любых двух или более из них. Например, в конкретном варианте осуществления композиции содержат смесь пирофосфата тетранатрия (NaPO), пирофосфата кальция (CaPO) и двухосновного фосфата натрия (NaHPO), например, в количествах примерно 3-4% двухосновного фосфата натрия и примерно 0,2-1% каждого из пирофосфатов. В другом варианте осуществления композиции содержат смесь пирофосфата тетранатрия (TSPP) и триполифосфата натрия (STPP) (NaPO), например, в количестве TSPP от приблизительно 1 до 2% и STPP от приблизительно 7% до приблизительно 10%. Данные фосфаты предусмотрены в количестве, эффективном для уменьшения эрозии эмали, для способствования чистке зубов и/или для уменьшения накопления зубного камня на зубах, например, в количестве 2-20%, например, примерно 5-15% по весу композиции.
Полимеры
[00089] Композиции для ухода за полостью рта по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные полимеры для регулирования вязкости состава или повышения растворимости других ингредиентов. Данные дополнительные полимеры включают полиэтиленгликоли, сополимеры поливинилметилового эфира и малеиновой кислоты, полисахариды (например, производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлозу, или полисахаридные камеди, например, ксантановую камедь или каррагенановую камедь). Кислые полимеры, например, полиакрилатные гели, могут быть представлены в виде их свободных кислот, либо частично, либо полностью нейтрализованных водорастворимых солей щелочных металлов (например, калия и натрия) или солей аммония. Определенные варианты осуществления включают сополимеры от 1:4 до 4:1 малеинового ангидрида или кислоты с другим способным к полимеризации этиленненасыщенным мономером, например, метилвиниловым эфиром (метоксиэтиленом), характеризующимся молекулярной массой (M.W.) от приблизительно 30000 до приблизительно 1000000. Данные сополимеры доступны, например, в виде Gantrez AN 139 (M.W. 500000), AN 119 (M.W. 250000) и S-97 фармацевтической степени чистоты (M.W. 70000) от GAF Chemicals Corporation.
[00090] Другие действующие полимеры включают такие вещества, как сополимеры 1:1 малеинового ангидрида с этилакрилатом, гидроксиэтилметакрилатом, N-винил-2-пирролидоном или этиленом, причем последний доступен, например, в виде Monsanto ЕМА №1103, M.W. 10000, и ЕМА Grade 61, и сополимеры 1:1 акриловой кислоты с метил- или гидроксиэтилметакрилатом, метил- или этилакрилатом, изобутилвиниловым эфиром или N-винил-2-пирролидоном.
[00091] Как правило, подходящими являются полимеризованные олефин-или этиленненасыщенные карбоновые кислоты, содержащие активированную углерод-углеродную олефиновую двойную связь и по меньшей мере одну карбоксильную группу, т.е. кислота, содержащая олефиновую двойную связь, которая легко вступает в реакцию полимеризации, поскольку она присутствует в мономерной молекуле либо в положении альфа-бета относительно карбоксильной группы, либо как часть концевой метиленовой группы. Иллюстративными примерами таких кислот являются акриловая, метакриловая, этакриловая, альфа-хлоракриловая, кротоновая, бета-акрилоксипропионовая, сорбиновая, альфа-хлорсорбиновая, коричная, бета-стирилакриловая, муконовая, итаконовая, цитраконовая, мезаконовая, глутаконовая, аконитовая, альфа-фенилакриловая, 2-бензилакриловая, 2-циклогексилакриловая, ангеликовая, умбелловая, фумаровая, малеиновая кислоты и ангидриды. Различные другие олефиновые мономеры, способные к сополимеризации с такими карбоксильными мономерами, включают винилацетат, винилхлорид, диметилмалеат и т.п. Сополимеры содержат достаточное количество карбоксильных солевых групп для растворимости в воде.
[00092] Следующий класс полимерных средств включает композицию, содержащую гомополимеры замещенных акриламидов и/или гомополимеры ненасыщенных сульфоновых кислот и их солей, в частности, когда полимеры основаны на ненасыщенных сульфоновых кислотах, выбранных из акриламидоалкансульфоновых кислот, таких как 2-акриламид-2-метилпропансульфоновая кислота, с молекулярной массой от приблизительно 1000 до приблизительно 2000000, описанные в патенте США №4842847, выданном 27 июня 1989 года Zahid, включенном в данный документ посредством ссылки.
[00093] Другой пригодный класс полимерных средств включает полиаминокислоты, в частности, содержащие части анионных поверхностно-активных аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и фосфосерин, раскрытые в патенте США №4866161, выданном Sikes и соавт., включенном в данный документ посредством ссылки.
[00094] Могут присутствовать загустители на основе диоксида кремния, которые образуют в водной среде полимерные структуры или гели. Следует отметить, что данные загустители на основе диоксида кремния являются физически и функционально отличными от абразивов на основе диоксида кремния в виде частиц, также присутствующих в композициях, поскольку загустители на основе диоксида кремния являются очень мелкодисперсными и обеспечивают небольшое абразивное воздействие или совсем не обеспечивают его. Другие загущающие средства представляют собой карбоксивиниловые полимеры, каррагенан, гидроксиэтилцеллюлозу и водорастворимые соли простых эфиров целлюлозы, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза и натрий-карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлоза. Также можно включать природные камеди, такие как камедь карайи, аравийская камедь и трагакантовая камедь. Для дополнительного улучшения текстуры композиции в качестве компонента загущающей композиции также можно применять коллоидный алюмосиликат магния. В определенных вариантах осуществления применяют загущающие средства в количестве от приблизительно 0,5% до приблизительно 5,0% по общему весу композиции.
[00095] Композиции по настоящему изобретению могут включать анионный полимер, например, в количестве от приблизительно 0,05 до приблизительно 5%. Такие средства являются общеизвестными для применения в средстве для чистки зубов, хотя не для данного конкретного применения, пригодные в настоящем изобретении средства раскрыты в патентах США №5188821 и №5192531; и они включают синтетические анионные полимерные поликарбоксилаты, такие как сополимеры от 1:4 до 4:1 малеиновых ангидрида или кислоты с другим способным к полимеризации этиленненасыщенным мономером, предпочтительно метилвиниловым эфиром/малеиновым ангидридом с молекулярной массой (M. W.) от приблизительно 30000 до приблизительно 1000000, наиболее предпочтительно от приблизительно 300000 до приблизительно 800000. Данные сополимеры являются доступными, например, в виде Gantrez., например, AN 139 (M.W. 500000), AN 119 (M.W. 250000) и предпочтительно S-97 фармацевтической степени чистоты (M.W. 700000), доступного от ISP Technologies, Inc., Баунд Брук, штат Нью-Джерси. Средства для улучшения характеристик, если присутствуют, присутствуют в количествах, находящихся в диапазоне от приблизительно 0,05 до приблизительно 3% по весу. Другие действующие полимеры включают вещества, такие как сополимеры 1:1 малеинового ангидрида с этилакрилатом, гидроксиэтилметакрилатом, N-винил-2-пирролидоном или этиленом, причем последний доступен, например, в виде Monsanto ЕМА №1103, M. W. 10000, и ЕМА Grade 61, и сополимеры 1:1 акриловой кислоты с метил- или гидроксиэтилметакрилатом, метил- или этилакрилатом, изобутилвиниловым эфиром или N-винил-2-пирролидоном. Как правило, подходящими являются полимеризованные олефин- или этиленненасыщенные карбоновые кислоты, содержащие активированную углерод-углеродную олефиновую двойную связь и по меньшей мере одну карбоксильную группу, т.е. кислота, содержащая олефиновую двойную связь, которая легко вступает в реакцию полимеризации, поскольку она присутствует в мономерной молекуле либо в положении альфа-бета относительно карбоксильной группы, либо как часть концевой метиленовой группы. Иллюстративными примерами таких кислот являются акриловая, метакриловая, этакриловая, альфа-хлоракриловая, кротоновая, бета-акрилоксипропионовая, сорбиновая, альфа-хлорсорбиновая, коричная, бета-стирилакриловая, муконовая, итаконовая, цитраконовая, мезаконовая, глутаконовая, аконитовая, альфа-фенилакриловая, 2-бензилакриловая, 2-циклогексилакриловая, ангеликовая, умбелловая, фумаровая, малеиновая кислоты и ангидриды. Различные другие олефиновые мономеры, способные к сополимеризации с такими карбоксильными мономерами, включают винилацетат, винилхлорид, диметилмалеат и т.п. Сополимеры содержат достаточное количество карбоксильных солевых групп для растворимости в воде. Следующий класс полимерных средств включает композицию, содержащую гомополимеры замещенных акриламидов и/или гомополимеры ненасыщенных сульфоновых кислот и их солей, в частности, когда полимеры основаны на ненасыщенных сульфоновых кислотах, выбранных из акриламидоалкансуль фоновых кислот, таких как 2-акриламид-2-метилпропансульфоновая кислота, с молекулярной массой от приблизительно 1000 до приблизительно 2000000, описанные в патенте США №4842847, выданном 27 июня 1989 г. Zahid. Другой пригодный класс полимерных средств включает полиаминокислоты, содержащие части анионных поверхностно-активных аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота и фосфосерин, например, раскрытые в патенте США №4866161, выданном Sikes и соавт.
Вода
[00096] Композиции для ухода за полостью рта могут содержать значительные уровни воды. Вода, используемая при получении коммерческих композиций для ухода за полостью рта, должна быть деионизированной и не содержать органических примесей. Количество воды в композициях включает свободную воду, которую добавляют, плюс то количество, которое вводят с другими материалами.
Увлажнители
[00097] В определенных вариантах осуществления композиций для ухода за полостью рта также необходимо включать увлажнитель для предотвращения затвердевания композиции под воздействием воздуха. Определенные увлажнители могут также придавать композициям в виде средств для чистки зубов желательную сладость или аромат. Подходящие увлажнители включают пищевые многоатомные спирты, такие как глицерин, сорбит, ксилит, пропиленгликоль, а также другие полиолы и смеси данных увлажнителей. В одном варианте осуществления настоящего изобретения основной увлажнитель представляет собой глицерин, который может присутствовать на уровнях более 25%, например, 25-35%, приблизительно 30%, с 5% или меньше других увлажнителей.
Другие необязательные ингредиенты
[00098] В дополнение к описанным выше компонентам, варианты осуществления настоящего изобретения могут включать использование множества необязательных ингредиентов для чистки зубов, некоторые из которых описаны ниже. Необязательные ингредиенты включают, например, без ограничения адгезивы, вспениватели, ароматизирующие средства, подслащивающие средства, дополнительные средства для предотвращения образования зубного налета, абразивы и красящие средства. Эти и другие необязательные компоненты дополнительно описаны в патенте США №5004597, выданном Majeti, в патенте США №3959458, выданном Agrícola и соавт., и в патенте США №3937807, выданном Haefele, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
[00099] Композиция может представлять собой композицию любого типа. В определенных вариантах осуществления композиция представляет собой любую композицию, в которую требуется включить антибактериальное средство для применения по отношению к коже. Примеры таких композиций включают без ограничения композиции для личной гигиены, антиперспиранты, дезодоранты, гели для тела, гели для душа, виды брускового мыла, шампунь, кондиционеры для волос и косметические средства.
Основные аминокислоты
[000100] Основные аминокислоты, которые можно применять в композициях и способах по настоящему изобретению, включают не только встречающиеся в природе основные аминокислоты, такие как аргинин, лизин и гистидин, но также любые основные аминокислоты, содержащие карбоксильную группу и аминогруппу в молекуле, которые являются водорастворимыми и образуют водный раствор со значением рН 7 или больше.
[000101] Соответственно, основные аминокислоты включают без ограничения аргинин, лизин, серии, цитруллин, орнитин, креатин, гистидин, диаминобутановую кислоту, диаминопропионовую кислоту, их соли или их комбинации. В конкретном варианте осуществления основные аминокислоты выбраны из аргинина, цитруллина и орнитина.
[000102] В определенных вариантах осуществления основная аминокислота представляет собой аргинин, например L-аргинин, или его соль.
[000103] Подходящие соли включают соли, известные из уровня техники как фармацевтически приемлемые соли, и которые считаются, как правило, физиологически приемлемыми в представленных количествах и концентрациях. Физиологически приемлемые соли включают таковые, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислот или оснований, например, соли присоединения кислоты, образованные кислотами, которые образуют физиологически приемлемый анион, например, хлористоводородную или бромидную соли, и соли присоединения основания, образованные основаниями, которые образуют физиологически приемлемый катион, например, соли, полученные из щелочных металлов, таких как калий и натрий, или из щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний. Физиологически приемлемые соли могут быть получены с применением стандартных процедур, известных из уровня техники, например, посредством проведения реакции достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой с получением физиологически приемлемого аниона.
[000104] В определенных вариантах осуществления основная аминокислота присутствует в количестве, составляющем от 0,1% до 15%, например, от 0,1 вес. % до 10 вес. %, например, от 0,1 до 5 вес. %, например, от 0,5 вес. % до 3 вес. % по общему весу композиции, например, приблизительно 1%, 1,5%, 2%, 3%, 4%, 5% или 8%, при этом вес основной аминокислоты рассчитан для свободной формы.
Поверхностно-активные вещества
3
2
m
2
2
2
n
3
3
2
10
2
2
2
2
3
6-30
[000105] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение может содержать анионные поверхностно-активные вещества, например, водорастворимые соли моносульфатов моноглицеридов высших жирных кислот, такие как натриевая соль моносульфатированного моноглицерида гидрогенизированных жирных кислот кокосового масла, такая как Ν-метил-Ν-кокоилтаурат натрия, кокомоглицеридсульфат натрия; высшие алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат натрия; высшие алкилэфирсульфаты, например, формулы CH(CH)CH(OCHCH)OSOX, где m равняется 6-16, например 10, n равняется 1-6, например, 2, 3 или 4, и X представляет собой Na или, например, лаурет-2-сульфат натрия (CH(CH)CH(OCHCH)OSONa); высшие алкиларилсульфонаты, такие как додецилбензолсульфонат натрия (лаурилбензолсульфонат натрия); высшие алкилсульфоацетаты, такие как лаурилсульфоацетат натрия (додецилсульфоацетат натрия), сложные эфиры высших жирных кислот и 1,2-дигидроксипропансульфоната, сульфоколаурат (N-2-этиллаурат сульфоацетамида калия) и лаурилсаркозинат натрия. Под термином «высший алкил» подразумевается, например, Салкил. В конкретных вариантах осуществления анионное поверхностно-активное вещество (если присутствует) выбрано из лаурилсульфата натрия и эфира лаурилсульфата натрия. Если присутствует, анионное поверхностно-активное вещество присутствует в количестве, которое является эффективным, например, >0,001% по весу состава, но не в концентрации, при которой оно будет раздражать ткань полости рта, например, 1%, и оптимальные значения концентрации зависят от конкретного состава и конкретного поверхностно-активного вещества. В одном варианте осуществления анионное поверхностно-активное вещество присутствует в количестве от 0,03% до 5% по весу, например, 1,5%.
[000106] В другом варианте осуществления катионные поверхностно-активные вещества, пригодные в настоящем изобретении, могут быть в широком смысле определены как производные алифатических соединений четвертичного аммония, имеющих одну длинную алкильную цепь, содержащую от 8 до 18 атомов углерода, такие как лаурилтриметиламмония хлорид, цетилпиридиния хлорид, цетилтриметиламмония бромид, диизобутилфеноксиэтилдиметилбензиламмония хлорид, кокоалкилтриметиламмония нитрит, цетилпиридиния фторид и их смеси. Иллюстративные катионные поверхностно-активные вещества представляют собой фториды четвертичного аммония, описанные в патенте США №3535421, выданном Briner и соавт., включенном в данный документ посредством ссылки. Определенные катионные поверхностно-активные вещества также могут действовать в композициях в качестве гермицидов.
[000107] Иллюстративные неионогенные поверхностно-активные вещества, которые можно применять в композициях по настоящему изобретению, можно в широком смысле определить как соединения, полученные путем конденсации алкиленоксидных групп (гидрофильных по своей природе) с органическим гидрофобным соединением, которое может являться алифатическим или алкилароматическим по своей природе. Примеры подходящих неионогенных поверхностно-активных веществ включают без ограничения виды Pluronic, конденсаты полиэтиленоксида с алкилфенолами, продукты, полученные вследствие конденсации этиленоксида с продуктом реакции пропиленоксида и этилендиамина, конденсаты этиленоксида с алифатическими спиртами, третичные аминоксиды с длинной цепью, третичные фосфиноксиды с длинной цепью, диалкилсульфоксиды с длинной цепью и смеси таких материалов. В конкретном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит неионогенное поверхностно-активное вещество, выбранное из полоксамеров (например, полоксамера 407), полисорбатов (например, полисорбата 20), полиоксил-гидрогенизированных касторовых масел (например, полиоксил-40 гидрогенизированного касторового масла) и их смесей.
[000108] Иллюстративные амфотерные поверхностно-активные вещества, которые можно применять в композициях по настоящему изобретению, включают бетаины (такие как кокамидопропилбетаин), производные алифатических вторичных и третичных аминов, в которых алифатический радикал может представлять собой неразветвленную или разветвленную цепь, и в которых один из алифатических заместителей содержит приблизительно 8-18 атомов углерода, и один содержит анионную водорастворимую группу (такую как карбоксилат, сульфонат, сульфат, фосфат или фосфонат), и смеси таких материалов.
[000109] Поверхностно-активное вещество или смеси совместимых поверхностно-активных веществ могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,1% до 5%, в другом варианте осуществления от 0,3% до 3% и в другом варианте осуществления от 0,5% до 2% по общему весу композиции.
Ароматизирующие средства
[000110] Композиции для ухода за полостью рта по настоящему изобретению могут также содержать ароматизирующее средство. Ароматизирующие средства, которые применяют для практического осуществления настоящего изобретения, включают без ограничения эфирные масла и различные ароматизирующие альдегиды, сложные эфиры, спирты и аналогичные материалы, а также подсластители, такие как сахарин натрия. Примеры эфирных масел включают масла мяты колосистой, мяты перечной, грушанки, сассафраса, гвоздики, шалфея, эвкалипта, майорана, корицы, лимона, лайма, грейпфрута и апельсина. Пригодными также являются химические вещества, такие как ментол, карвон и анетол. В определенных вариантах осуществления применяют масла мяты перечной и мяты колосистой.
[000111] Ароматизирующее средство включают в композицию для ухода за полостью рта в концентрации от 0,01 до 1,5% по весу.
Хелатообразующие средства и средства против образования зубного камня
[000112] Композиции для ухода за полостью рта по настоящему изобретению также могут включать одно или более хелатообразующих веществ, способных образовывать комплекс с кальцием, обнаруженным в клеточных стенках бактерий. Связывание этого кальция ослабляет бактериальную клеточную стенку и усиливает бактериальный лизис.
[000113] Другая группа средств, подходящих для применения в качестве хелатообразующих средств и средств против образования зубного камня в настоящем изобретении, представляет собой растворимые пирофосфаты. Пирофосфатные соли, применяемые в композициях по настоящему изобретению, могут представлять собой любые пирофосфатные соли щелочных металлов. В определенных вариантах осуществления соли включают четырехзамещенный пирофосфат щелочного металла, двузамещенный пирофосфат щелочного металла, тризамещенный пирофосфат щелочного металла и их смеси, при этом щелочные металлы представляют собой натрий или калий. Соли являются пригодными как в их гидратированной, так и в негидратированной формах. Эффективное количество пирофосфатной соли, пригодной в композиции по настоящему изобретению, является, как правило, достаточным для обеспечения по меньшей мере 0,1 вес. % пирофосфатных ионов, например, от 0,1 до 3 вес.5, например, от 0,1 до 2 вес. %, например, от 0,1 до 1 вес. %, например, от 0,2 до 0,5 вес. %. Пирофосфаты также способствуют сохранению композиций посредством снижения активности воды.
[000114] При получении композиций для ухода за полостью рта иногда необходимо добавлять некоторое количество материала-загустителя с обеспечением необходимой консистенции или стабилизацией либо улучшением характеристик состава. В определенных вариантах осуществления загущающие средства представляют собой карбоксивиниловые полимеры, каррагенан, ксантановую камедь, гидроксиэтилцеллюлозу и водорастворимые соли простых эфиров целлюлозы, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза и натрий-карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлоза. Также можно включать природные камеди, такие как камедь карайи, аравийская камедь и трагакантовая камедь. Диоксид кремния также может быть доступным как загущающее средство, например, синтетический аморфный диоксид кремния. Для дополнительного улучшения текстуры композиции в качестве компонента загущающей композиции можно применять коллоидный алюмосиликат магния или мелкодисперсный диоксид кремния. В определенных вариантах осуществления применяют загущающие средства в количестве от приблизительно 0,5% до приблизительно 5,0% по общему весу композиции. Загустители могут присутствовать в количестве от 1 вес. % до 15 вес. %, от 3 вес. % до 10 вес. %, от 4 вес. % до 9 вес. %, от 5 вес. % до 8 вес. %, например, 5 вес. %, 6 вес. %, 7 вес. % или 8 вес. %.
Абразивы
[000115] Природный карбонат кальция находится в породах, таких как мел, известняк, мрамор и травертин. Он также является основным компонентом яичной скорлупы и раковин моллюсков. Абразив на основе природного карбоната кальция по настоящему изобретению представляет собой, как правило, мелкодисперсный известняк, который может быть необязательно очищенным или частично очищенным для удаления примесей. Применяемый в настоящем изобретении материал характеризуется средним размером частиц менее 10 микрон, например, 3-7 микрон, например, приблизительно 5,5 микрона. Например, мелкие частицы диоксида кремния могут характеризоваться средним размером частиц (D50) 2,5-4,5 микрона. Просто поскольку природный карбонат кальция может содержать точно не контролируемую высокую долю относительно больших частиц, которые могут неприемлемо увеличивать абразивные свойства, предпочтительно не более 0,01%, предпочтительно не более 0,004% по весу частиц не пройдут через сито 325 меш. Материал имеет прочную кристаллическую структуру и, таким образом, является более жестким и имеет более выраженные абразивные свойства, чем осажденный карбонат кальция. Насыпная плотность природного карбоната кальция составляет, например, от 1 до 1,5 г/куб. см, например, приблизительно 1,2, например, приблизительно 1,19 г/куб. см. Существуют различные полиморфы природного карбоната кальция, например, кальцит, арагонит и фатерит, при этом кальцит является предпочтительным для целей настоящего изобретения. Пример коммерчески доступного продукта, подходящего для применения в настоящем изобретении, включает Vieron 25-11 FG от GMZ.
[000116] Осажденный карбонат кальция, как правило, получают посредством кальцинирования известняка с получением оксида кальция (извести), который затем можно обратно превратить в карбонат кальция посредством реакции с диоксидом углерода в воде. Осажденный карбонат кальция имеет кристаллическую структуру, отличную от природного карбоната кальция. Он, как правило, является более хрупким и более пористым, таким образом, характеризуется более низкими абразивными свойствами и более высокой степенью поглощения воды. Для применения в настоящем изобретении частицы являются небольшими, например, характеризуются средним размером частиц 1-5 микрон, и, например, не более 0,1%, предпочтительно не более 0,05% по весу частиц, которые могут не пройти через сито 325 меш. Частицы, например, могут характеризоваться D50 3-6 микрон, например, 3,8=4,9, например, приблизительно 4,3; D50 1 4 микрона, например, 2,2-2,6 микрона, например, приблизительно 2,4 микрона, и DIO 1-2 микрона, например, 1,2-1,4, например, приблизительно 1,3 микрона. Частицы имеют относительно высокую степень поглощения воды, например, по меньшей мере 25 г/100 г, например, 30-70 г/100 г. Примеры коммерчески доступных продуктов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, например, Carbolag 15 Plus от Lagos Industria Quimica.
3
4
2
10
4
6
2
42
2
[000117] В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение может предусматривать дополнительные абразивы, содержащие кальций, например, абразив на основе фосфата кальция, например, фосфат трикальция (Са(PO)), гидроксиапатит (Са(РО)(ОН)) или дигидрат фосфата дикальция (CaHPOHO, также в некоторых случаях упоминаемый в данном документе как DiCal) или пирофосфат кальция и/или абразивы на основе диоксида кремния, метафосфат натрия, метафосфат калия, силикат алюминия, кальцинированный оксид алюминия, бентонит или другие кремнийсодержащие материалы или их комбинации.
[000118] В определенных вариантах осуществления можно применять любой вид диоксида кремния, подходящий для композиций для ухода за полостью рта, такой как виды осажденного диоксида кремния или силикагели. Например, диоксид кремния также может представлять собой мелкие частицы диоксида кремния (например, Sorbosil АС43 от PQ, Уоррингтон, Соединенное Королевство). Композиция предпочтительно содержит от 5 до 20 вес. % мелких частиц диоксида кремния, или, например, 10-15 вес. %, или, например, 5 вес. %, 10 вес. %, 15 вес. % или 20 вес. % мелких частиц диоксида кремния.
3
[000119] В другом варианте осуществления абразив может представлять собой осажденный диоксид кремния высокой очищающей способности, характеризующийся эффективностью удаления зубного налета (PCR) более 85 при тестировании при 20% загрузке, известный из уровня техники как диоксид кремния высокой очищающей способности. Диоксид кремния высокой очищающей способности обычно также характеризуется средним размером частиц d50 от 5 до 15 мкм и маслоемкостью от 40 до 120 см/100 г диоксида кремния. Эффективность очистки осажденного диоксида кремния выражают с помощью эффективности удаления зубного налета (PCR). Ее обычно измеряют при 20% загрузке диоксида кремния. Диоксид кремния высокой очищающей способности предпочтительно характеризуется значением PCR более 85. Эффективность осажденного диоксида кремния также может быть выражена со ссылкой на его абразивную характеристику с применением истирания радиоактивного дентина (RDA). В идеальном случае значения RDA для композиции для ухода за полостью рта должны находиться ниже приблизительно 250 для защиты зубной эмали/дентина. Способы проведения PCR и RDA описаны, например, в патентах США №№5939051 и 6290933 и в «In Vitro Removal of Stain With Dentifrice», G. К. Stookey et al., J. Dental Research, Vol.61, стр. 1236-9, ноябрь 1982 г. Осажденный диоксид кремния обычно характеризуется средним размером частиц d50 от 5 до 15 мкм и маслоемкостью от 40 до 120 см3/100 г диоксида кремния. Примеры осажденного диоксида кремния, характеризующегося средним размером частиц d50 от 5 до 15 мкм и маслоемкостью от 40 до 120 см3/100 г диоксида кремния, включают коммерчески доступные виды диоксида кремния, такие как Zeodent103 и Zeodent105 (Huber Silica Americas).
[000120] Композиция предпочтительно содержит от 3 до 20 вес. % осажденного диоксида кремния высокой очищающей способности, или, например, 10-15 вес. %, или, например, 5 вес. %, 10 вес. %, 15 вес. % или 20 вес. % осажденного диоксида кремния высокой очищающей способности.
[000121] Композиция также может содержать абразив на основе диоксида кремния, характеризующийся кислотным значением рН в композиции. Например, можно использовать Prophy Silica, доступный от Grace, предлагаемый как Sylodent™. Кислотный абразив на основе диоксида кремния включен в компоненты средства для чистки зубов при концентрации от приблизительно 2 до приблизительно 35% по весу; от приблизительно 3 до приблизительно 20% по весу, от приблизительно 3 до приблизительно 15% по весу, от приблизительно 10 до приблизительно 15% по весу. В определенных вариантах осуществления кислотный абразив на основе диоксида кремния может присутствовать в количестве 2-7%. В других вариантах осуществления он может присутствовать в количестве 7-15% по весу. В еще одних других вариантах осуществления он может присутствовать в количестве 15-30% по весу. Например, кислотный абразив на основе диоксида кремния может присутствовать в количестве, выбранном из 2 вес. %, 3 вес. %, 4 вес. %, 5 вес. %, 6 вес. %, 7 вес. %, 8 вес. %, 9 вес. %, 10 вес. %, 11 вес. %, 12 вес. %, 13 вес. %, 14 вес. %, 15 вес. %, 16 вес. %, 17 вес. %, 18 вес. %, 19 вес. %, 20 вес. %.
[000122] Коммерчески доступный кислотный абразив на основе диоксида кремния представляет собой Sylodent 783, доступный от W. R. Grace & Company (Балтимор, штат Мэриленд). Sylodent 783 характеризуется значением рН 3,4-4,2 при измерении в виде 5% по весу суспензии в воде. Для применения в настоящем изобретении материал на основе диоксида кремния характеризуется средним размером частиц менее 10 микрон, например, 3-7 микрон, например, приблизительно 5,5 микрона.
[000123] В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат буферное средство. Примеры буферных средств включают безводные карбонаты, такие как карбонат натрия, сесквикарбонаты, бикарбонаты, такие как бикарбонат натрия, силикаты, бисульфаты, фосфаты (например, фосфат монокалия, фосфат дикалия, трехосновный фосфат натрия, триполифосфат натрия, фосфорная кислота), цитраты (например, лимонная кислота, дигидрат цитрата тринатрия), пирофосфаты (соли натрия и калия) и их комбинации. Количество буферного средства является достаточным для получения значения рН от приблизительно 5 до приблизительно 9, предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 8 и более предпочтительно приблизительно 7 при растворении композиции в воде, в основе для средства для полоскания рта или в основе для зубной пасты. Типичные количества буферного средства составляют от приблизительно 5% до приблизительно 35%, в одном варианте осуществления от приблизительно 10% до приблизительно 30%, в другом варианте осуществления от приблизительно 15% до приблизительно 25% по общему весу композиции.
[000124] В препараты для ухода за полостью рта по настоящему изобретению можно включать различные другие материалы, такие как отбеливающие средства, консерванты, силиконы, соединения хлорофилла и/или аммонизированный материал, такой как мочевина, фосфат диаммония и их смесей. Такие вспомогательные вещества, если присутствуют, включены в препараты в количествах, которые по сути не влияют отрицательно на необходимые свойства и характеристики.
[000125] Также можно использовать любые подходящие ароматизирующее вещество или подслащивающий материал. Примеры подходящих ароматизирующих составляющих представляют собой ароматизирующие масла, например, масло мяты кудрявой, мяты перечной, грушанки, сассафраса, гвоздики, шалфея, эвкалипта, майорана, корицы, лимона и апельсина, и метилсалицилат. Подходящие подслащивающие средства включают сахарозу, лактозу, мальтозу, ксилит, цикламат натрия, периллартин, AMP (аспартилфенилаланин, метиловый сложный эфир), сахарин и т.п. Соответствующим образом, ароматизирующая добавка и подслащивающие средства могут каждый отдельно или вместе составлять от приблизительно 0,1% до 5% и больше препарата. Более того, полагают, что ароматизирующее масло способствует растворению антибактериального средства, вместе с поверхностно-активным веществом или даже в его отсутствие.
[000126] Настоящее изобретение в его аспекте, относящемся к способу, включает применение по отношению к полости рта безопасного и эффективного количества композиций, описанных в данном документе.
[000127] В следующих примерах дополнительно описаны и продемонстрированы иллюстративные варианты осуществления, входящие в объем настоящего изобретения. Примеры представлены только для иллюстрации, и их не следует толковать как ограничение настоящего изобретения, поскольку возможны различные изменения без отклонения от его сущности и объема. Специалистам в данной области техники будут понятны различные модификации настоящего изобретения, в дополнение к показанным и описанным в данном документе, и подразумевается, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Способы и материалы
[000128] Нарингин получали от Perfect Health, LLC (партия CYPD-A-01468, чистота согласно HPLC 99%, Сомерсет, штат Нью-Джерси) или Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури) кат. №71162 или N1376. Соль, представляющую собой ацетат цинка(П), получали от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури) кат. №383317.
Пример 1. Способ синтеза 1
1
[000129] Вкратце, получали 1,25е-4 моль раствора нарингина (лиганд) в 10 мл метанола (J.T. Baker, кат. №9093-03). Затем медленно добавляли 2 мл раствора ацетата цинка(II) (1,25е 4 моль) в дистиллированной воде при постоянном перемешивании. Значение рН раствора регулировали до около 10,0 с применением гидроксида натрия (50% раствор) (J.T. Baker, Сентер Валли, штат Пенсильвания, кат. №9721-02). Обеспечивали продолжение протекания реакции в течение около 4 часов при комнатной температуре. Осадок фильтровали в вакуумной системе, промывали водой и затем высушивали на воздухе. Получали комплекс нарингин:цинк, выглядевший как осадок желтоватого цвета, определяли его характеристики с применением UV-VIS, FTIR и Н ЯМР и обозначали как продукт 1.
Пример 2. Способ синтеза 2
2
2
1
[000130] Сначала получали 1,25е-4 моль раствора нарингина (лиганд) в 10 мл дважды дистиллированной HO и нагревали до около 70°С для увеличения растворимости нарингина. Затем полученный раствор фильтровали. Затем медленно добавляли 2 мл ацетата цинка(П) (1,25е 4 моль) в дважды дистиллированной воде при постоянном перемешивании. Затем значение рН раствора регулировали до около 10,0 с применением гидроксида натрия (50% раствор). Обеспечивали инкубацию реакционной смеси в течение около 2 часов. Образованный осадок собирали, промывали сначала с помощью dDHO с последующим промыванием этанолом 200 пруф. Затем осадок, выглядевший как осадок желтоватого цвета, высушивали в вакууме, собирали, определяли его характеристики с применением UV-Vis-спектроскопии, FTIR и Н ЯМР и обозначали как продукт 2.
Пример 3. Способ синтеза 3
2
2
1
[000131] Вкратце, получали 1,25е-4 моль раствора нарингина (лиганд) в 10 мл дважды дистиллированной HO и нагревали до около 70°С для увеличения растворимости нарингина. Значение рН раствора регулировали до около 10,0 с применением гидроксида натрия (50% раствор). Затем медленно добавляли 2 мл ацетата цинка(П) (1,25е-4 моль) в дважды дистиллированной воде при постоянном перемешивании. Собирали образованный осадок, выглядевший как осадок желтоватого цвета, промывали сначала с помощью dDHO с последующим промыванием этанолом 200 пруф, высушивали в вакууме, определяли характеристики с применением UV-Vis-спектроскопии, FTIR и Н ЯМР и обозначали как продукт 3.
Пример 4. Способ синтеза 4
2
2
1
[000132] Получали либо 1,25е-4 моль, либо 2,50е-4 моль раствора нарингина (лиганд) в 10 мл дважды дистиллированной HO и нагревали до около 70°С для увеличения растворимости нарингина. Полученный раствор фильтровали. Затем медленно добавляли 2 мл раствора ацетата цинка(П) (1,25е-4 моль) в дважды дистиллированной воде при постоянном перемешивании. Затем значение рН раствора регулировали до около 7,0 с применением гидроксида натрия (50% раствор). Образованный осадок собирали, промывали сначала с помощью dDHO с последующим промыванием этанолом 200 пруф. Полученный осадок, выглядевший как осадок желтоватого цвета, высушивали в вакууме, собирали, определяли характеристики с применением UV-Vis-спектроскопии, FTIR и Н ЯМР и обозначали как продукт 4 (1,25е-4 моль нарингина) и 5 (2,50е-4 моль нарингина).
Пример 5. Способ синтеза 5
[000133] Для получения продукта 6 получали 2,50е-4 моль раствора нарингина (лиганд) в 10 мл 7% раствора пропиленгликоля, предварительного нагретого до около 70°С. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что данная температура обеспечивает повышение растворимости нарингина. Смесь (слегка мутную и желтоватого цвета) постоянно перемешивали на нагретой плите для перемешивания, поддерживаемой при 45°С. В определенных вариантах осуществления диапазон температур может составлять 40-50°С.Значение рН раствора регулировали с применением гидроксида натрия до получения прозрачного раствора оранжевого цвета (рН 9-10). Затем медленно добавляли 2 мл ацетата цинка(П) (1,25е-4 моль) в 7% растворе пропиленгликоля, предварительного нагретого до около 70°С, с постоянным перемешиванием. Реакционную смесь инкубировали в течение примерно 2 часов. Образованный осадок собирали, промывали сначала с помощью (JDH2O, затем этанолом 200 пруф.
Пример 6. Определение характеристик с помощью UV-Vis
[000134] UV-Vis-спектры комплексов нарингин:цинк получали с применением планшет-ридера SpectraMax М5. Вкратце, получали 2,0% образцы комплексов нарингин:цинк или нарингина в виде исходного вещества в 100% DMSO (BDH, кат. №BDH 1115-1LP). Затем образцы подвергали серийному разведению 1:1 в 96-луночном планшете с прозрачным плоским дном так, чтобы наиболее высокая концентрация составляла 1,0% и наиболее низкая концентрация - 0,0078% в 100 мкл DMSO. Образцы подвергали спектральному сканированию от длины волны 200 нм до длины волны 500 нм. Определяли графики оптической плотности (OD) в зависимости от длины волны для всех серийных разведений, но в разделе «Результаты» представлены результаты только для разбавления 0,03125%.
1
[000135] Как показано на фиг. 2-4, свободный нарингин характеризуется максимальным пиком поглощения в водном растворе при 290 нм, соответствующим поглощению кольца А (бензоильная система), и более слабой полосой при 325 нм, соответствующей поглощению кольца В (циннамоильная система), см. Malesev et al., J. Serb. Chem. Soc, 2007, 72(10): 921-39. Для продукта 1 отмечали сдвиг полосы более слабого поглощения от 325 нм до 365 им при связывании с ацетатом цинка с образованием комплекса. Как показано на фиг. 3, продукт 2 обеспечивал небольшой сдвиг максимального пика от 290 нм до 295 нм. Более значительный сдвиг также наблюдали для более слабой полосы от 325 нм до 370 нм. Продукт 3 обеспечивал подобный профиль. Как показано на фиг. 4, оба продукта 4 и 5 проявляли подобные профили. Наблюдали сдвиг максимального пика (от 290 нм до 295 нм) и более слабой полосы (от 325 нм до 370 нм), что указывает на взаимодействие иона цинка(П) с конденсированным кольцом флаванона. Ранее сдвиг был связан с увеличенным эффектом от сопряжения, обусловленным образованием нового кольца при образовании комплекса с металлом (Malesev et al., см. выше). Данный результат соответствует результатам исследования FTIR и Н ЯМР (см. фиг. 5 - фиг. 7 В). Сдвиг максимального пика наблюдали в большинстве случаев для различных тестируемых продуктов, но не во время каждого теста. См., например, продукт 1 по сравнению с продуктом 2 в таблице 1.
Пример 7. Определение характеристик с помощью FTIR
-1
-1
[000136] Инфракрасные спектры записывали с применением спектрометра Bruker Vertex 70 FTIR, оснащенного вспомогательным прибором GladiATR для ATR с использованием кристалла алмаза (Pike technologies, Мадисон, штат Висконсин). Диапазон спектра составлял 80 4000 см, и применяли разрешение 4 см. Все измерения проводили в отношении порошкообразных образцов при комнатной температуре.
-1
-1
-1
-1
-1
[000137] На фиг. 5 показаны инфракрасные спектры свободного нарингина и комплекса, представляющего собой продукт 4. Сравнение спектральных данных показывает явно выраженные отличия в вибрационном ответе нарингина при взаимодействии с цинком. В качестве примера, инфракрасный спектр нарингина характеризуется сильной полосой около 1645 см, которую относят к валентным колебаниям карбонильной группы υ(С=0) (Pereira et al., Molecules, 2007, 12: 1352- 66; Li et al., Spectrochimica Acta Part A, 2007, 67:395-401; Yousuf et al., International Journal of Spectroscopy, 2014, Article ID 562160). В присутствии цинка данная полоса сдвинулась в красную область до 1615 см, что указывает на координацию нарингина к цинку посредством кислорода карбонила. Подобные свойства ранее наблюдали для других комплексов металл-флавоноид (Pereira et al., Li et al., Yousuf et al., см. выше). Обнаружили, что, помимо карбонильного фрагмента, 5-ОН группа является другим важным участком для хелатирования металла в производных 5-гидроксифлавона. Для комплекса, представляющего собой продукт 4, полосы, отнесенные к валентным колебаниям υ(С-O(Н)) (или С-С-О) фенольной группы, связаны с деформационными модами 5(ОН) и происходят в диапазоне 1230-1370 см Как можно видеть из фиг. 5, данные полосы демонстрируют явно выраженные частотные сдвиги и изменения относительной интенсивности по сравнению со свободным нарингином. Данные признаки вместе с энергетическим сдвигом полосы υ(С=0) при 1645 см указывают на то, что образование комплекса цинка с нарингином скорее всего происходит посредством кислорода карбонильной группы и 5-гидроксильной группы. Дополнительные сдвиги пиков и изменения интенсивности в полосах ароматических и дисахаридных звеньев продукта 4 могут возникать от перераспределения электронов на кольцах в результате образования нового кольца и конформационных изменений в глюкозиде соответственно. Наконец, дополнительная полоса, наблюдаемая около 460 см, в комплексе, представляющем собой продукт 4, может происходить от валентных колебаний v(Zn-O) (Yousuf et al., см. выше), что дополнительно поддерживает утверждение об образовании комплекса нарингин:цинк.
[000138] На фиг. 6 показано сравнение инфракрасного ответа нарингина и комплексов нарингин:цинк для продукта 2, продукта 4 и продукта 5, которые получали при условиях с различными рН и молярным соотношением. Помимо отличий в их значениях относительной интенсивности, все соединения показывают в целом подобный спектральный профиль, и сдвиги пиков указывают на их подобные структурные характеристики.
1
Пример 8. Определение характеристик с помощью Н ЯМР
1
1
1
[000139] Измерения ЯМР проводили в отношении 10 вес. % образцов нарингина или нарингин:цинк в растворах DMSO-d5. Все спектры Н ЯМР получали на спектрометре Bruker Avance 500, работающем при 500 МГц, в отношении Н при комнатной температуре. Коэффициенты диффузии нарингина и комплексов нарингин:Zn в DMSO-d5 измеряли посредством Н ЯМР-спектроскопии с импульсным градиентом магнитного поля при 25°С. Все химические сдвиги приведены в 5 (ррт) с применением TMS в качестве внутреннего стандарта.
1
[000140] Химические сдвиги Н для нарингина и комплексов нарингин:цинк представлены на фиг. 7 В и в таблице 2. А именно, пик при 12 ррт, соответствующий 5-ОН фенольной группе, отсутствует при образовании комплекса нарингин:цинк, что указывает на то, что данный участок конъюгирован с цинком. Пики, отнесенные к Н6 и Н8 кольца А, сдвигаются в область более низких частот при образовании комплекса. Без ограничения какой-либо теорией, это может быть связано с тем, что координация увеличивает планарность молекул флавоноида, и/или координация вызывает большое конформационное изменение дисахарида, тем самым увеличивая электронные плотности на кольце А с экранированием протона Н6 и Н8.
1
[000141] Неожиданно, спектры Н ЯМР, а также спектры FTIR показали, что образцы комплексов нарингин:цинк, полученные при различных соотношениях нарингина и цинка (2:1 или 1:1), были подобными.
Пример 9. Определение характеристик с помощью измерений диффузии
[000142] Измерения диффузии проводили с применением спектрометра Bruker Avance 500, оснащенного широкополосным датчиком прямого наблюдения с градиентной катушкой по z-оси с максимальной величиной градиента 72 Гс/см. Применяли последовательность импульсов двойного стимулированного эхо с биполярными градиентными импульсами и двумя очищающими градиентами. Время диффузии составляло 0,1 секунды. Продолжительность импульса градиента поля регулировали до 4 миллисекунд. Градиентные импульсы повышали посредством небольших приращений от 5 до 95% максимальной величины градиента с линейным увеличением с общим экспериментальным временем 45 минут.
[000143] Проводили эксперименты в отношении молекулярной диффузии комплекса нарингин:цинк для выявления отличий между образцами, полученными при молярных соотношениях нарингин:цинк 2:1 по сравнению с 1:1. Без ограничения какой-либо теорией предполагают, что молекулярная диффузия комплекса 2:1 должна быть медленней, чем комплекса 1:1. Наблюдаемые коэффициенты диффузии нарингина и комплексов нарингин:цинк для продукта 4 и продукта 5 кратко изложены на фиг. 8. Коэффициенты диффузии комплексов на приблизительно 25% меньше, чем коэффициенты диффузии нарингина. Также наблюдали, что коэффициенты диффузии для всех двух тестируемых комплексов нарингин:цинк были подобными, независимо от того, получали ли их при исходном смешивании молярных соотношений нарингин:цинк 1:1 или 2:1. Данные результаты указывают на то, что оба комплекса нарингин:цинк характеризуются одинаковым стехиометрическим соотношением нарингина и цинка.
[000144] Рассчитанный коэффициент диффузии применяли для установления размера молекулярных частиц с применением соотношения Стокса-Эйнштейна:
b
[000145] где г представляет собой гидродинамический радиус жесткой сферы, двигающейся в непрерывной текучей среде с вязкостью η при температуре Т, и k представляет собой постоянную Больцмана. Предполагая, что диффундирующие частицы являются сферическими, соотношение D и молекулярной массы MW может быть описано как
[000146] где ρ представляет собой эффективную молекулярную плотность молекулы, и NA представляет собой число Авогадро. Предполагая, что нарингин и комплексы нарингин:цинк, изучаемые в данном документе, имеют один и тот же упаковочный эффект и геометрию, можно оценить молекулярную массу комплекса нарингин:цинк в соответствии с известной молекулярной массой нарингина и коэффициента диффузии D в соответствии с соотношением:
MW ∝ 1/D3
[000147] Как видно из таблицы 3, обнаружили, что рассчитанное стехиометрическое соотношение нарингина и цинка на основе рассчитанной молекулярной массы составляет примерно 2:1 (нарингин:цинк).
Пример 10. Определение характеристик в отношении точки плавления
[000148] Значение точки плавления записывали на электротермическом устройстве для определения точки плавления MEL-TEMP 3.0 (Barnstead International, Дубьюк, штат Айова). Небольшие количества образцов вводили в капиллярную трубку. Трубку вводили в держатель и за образцами наблюдали из смотрового окна в отношении физических изменений. Значения температуры записывали, когда происходили изменения. Значения точки плавления для образцов кратко изложены в таблице 4. Все образцы продемонстрировали разложение в диапазоне 230-254,3°С.
Пример 11. Определение характеристик в отношении стабильности
[000149] Для начала испытаний в отношении стабильности комплекса выбранные образцы растворяли в DMSO при 2% исходного раствора для исходных спектров UV видимый свет и обеспечивали отстаивание в течение 6-8 недель при комнатной температуре. Образцы подвергали серийным разведениям 1:1 в DMSO и считывали с применением планшет-ридера SpectraMax М5. Результаты кратко изложены на фиг. 9 и фиг. 10. Сдвиги, наблюдаемые ранее для максимального пика (от 290 нм до 295 нм) и более слабой полосы (от 325 нм до 370 нм), сохранялись через 6-8 недель после получения образца.
Пример 12. Определение характеристик в отношении противомикробной активности: зона подавления
610
[000150] Противомикробную активность определяли с применением анализа типа зоны подавления в комбинации с испытанием подавления роста/токсичности. Для определения зоны подавления одну колонию Aggregatibacter actinomycetemcomitans (А.а) культивировали в примерно 30 мл бульона BHI (BD, кат. №237500), дополненного 0,5% экстрактом дрожжей (BD, кат. №210941), при 37°С и 5% CO2 в течение ночи. Получали разбавление 1:10 ночной культуры при (OD 0,5) и 100 мкл культуры переносили в асептических условиях в уравновешенные при комнатной температуре чашки TSAII (триптиказо-соевый агар с 5% крови овцы) (BD, кат.№221239) и аккуратно распределяли с применением стерильного бактериологического шпателя. Стерильный фильтровальный диск диаметром 6 мм помещали поверх чашки для культивирования с применением стерильных щипцов и вносили 5 мкл 100 мМ тестируемого соединения в DMSO в центр фильтровального диска наряду с соответствующими контролями: 1% хлоргексидин (СНХ), 3% триклозан, отдельно среда и DMSO. Обработанные чашки инкубировали в 37°С, 5% CO2 в течение 48 часов, после чего наблюдали и измеряли диаметр зоны подавления. В таблице 5 кратко изложены результаты определения активности комплекса нарингин:цинк в отношении встречающегося в полости рта патогена А.а.
[000151] Способ с применением зоны подавления обеспечивает качественные результаты в отношении противомикробной активности комплексов. Появление зоны подавления около диска является указанием на противомикробную активность тестируемого соединения, точечно нанесенного на фильтровальный диск. Встречающийся в полости рта патоген А. actinomycetemcomitans был выбран в данном документе, поскольку он считается ключевым бактериальным средством, связанным с пародонтитом агрессивной формы у взрослых субъектов молодого возраста, и приводит к формам деструктивного заболевания пародонта у взрослых (Darby et al., Periodontology 2000, 2001, 26:33-53). Данные из исследований зоны подавления указали, что при 500 нмоль комплекс нарингин:цинк показал увеличенную эффективность в уничтожении А.а по сравнению с отдельно нарингином. Отдельно DMSO не показал какого-либо уничтожения, тогда как 1% хлоргексидин показал.
50
Пример 13. Определение характеристик в отношении противомикробной активности: определение подавления роста/IC
610
610
[000152] Анализировали отдельные виды Streptococcus gordonii (S. gordonii, S.g), штамм V288 (АТСС №35105), Streptococcus sobrinus (S.sobrinus, S.s), штамм SL1[CCM 6070, CNCTC 9/89] (ATCC №33478), или Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Кроме того, смешанную культуру, содержащую Actinomyces viscosus (A. viscosus, A.v), штамм (ATCC, №43146), Lactobacillus casei (L. casei, L.c), штамм (ATCC №334), Streptococcus oralis (S. oralis, S. о), штамм (ATCC №35037), Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum, F. n), штамм (ATCC №10953), и Veilonella parvula (V. parvula, V. p), штамм (ATCC №17745), также анализировали для определения активности в отношении подавления роста/токсичности. Бактерии культивировали в течение ночи в примерно 20 мл бульона BHI (BD, кат.№237500) или поддерживали в специальной модифицированной среде BHI II в хемостате для непрерывного культивирования при 37°С соответственно. На следующий день определяли OD и растворы разбавляли до OD, составляющей 0,2 или 0,1 соответственно, для анализа.
610
[000153] Получали тестируемые образцы (нарингин, комплекс нарингин:цинк и комбинацию нарингин + ацетат цинка) в виде 200 мМ исходного раствора, после чего получали 2-кратные серийные разведения в 100% DMSO. Получали триклозан (положительный контроль) в виде 10% исходного раствора в 100% EtOH и осуществляли 3-кратные серийные разведения в 100% EtOH. Затем соответствующее количество разбавленных образцов переносили в 96-луночный прозрачный планшет так, чтобы полученная конечная концентрация тестируемых образцов находилась в диапазоне от либо 2 мМ, либо 4 мМ (наиболее высокая концентрация) до либо 0,0078 мМ, либо 0,0156 мМ (наиболее низкая концентрация соответственно) в 2% DMSO в 100 мкл среды на лунку. Концентрация триклозана (TCN) находилась в диапазоне от 0,01% до 1,67е 6% в 1% EtOH. В случае ацетата цинка, с целью имитации молярного соотношения 2:1 (лигандщинк) в комплексе нарингин:цинк конечная концентрация находилась в диапазоне от 0,7 мМ до 0,0027 мМ для образцов с 2 мМ в качестве наиболее высокой концентрации и от 1,33 мМ до 0,052 мМ для образцов с 4 мМ в качестве наиболее высокой концентрации в 2% DMSO. Затем 100 мкл бактериальной культуры при OD 0,2 вводили в лунки с тестируемыми образцами. Содержимое лунок тщательно перемешивали и инкубировали при 37°С в течение ночи. Планшеты считывали с применением планшет-ридера Envision (PerkinElmer, Уолтем, штат Массачусетс) при 610 нм. Иллюстративные результаты кратко изложены на фиг. 11.
50
50
50
[000154] Определяли IC комплекса, продукта 5 в отношении Streptococcus gordonii (S. gordonii), Streptococcus sobrinus (S. sobrinus), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), а также в отношении смешанной бактериальной культуры. Кривые зависимости ответа от дозы строили с применением GraphPad Prism 6, и иллюстративные графики представлены на фиг. 11 и 22. Определенные значения IC кратко изложены в таблице 6. Значения IC указывают, что комплекс был более эффективным, чем отдельно ацетат цинка, а также комбинация нарингин + ацетат цинка, взятые вместе. Триклозан (TCN) включали в качестве положительного контроля для подавления роста бактерий.
50
50
[000155] Комплекс проявлял противомикробные эффекты в отношении вызывающего кариес патогена S.sobrinus, комменсального патогена S.gordonii и А. actinomycetemcomitans, относящегося к патогенной микрофлоре, колонизирующей ротовую полость на поздней стадии кариеса. Данные результаты также распространялись на выращенные в хемостате смешанные бактериальные культуры. Концентрация, которая обеспечивала 50% подавление бактериального роста, находилась в диапазоне 0,1-0,37 мМ (соответствующем 122,6-453,5 ррт). Нарингин в комбинации с ацетатом цинка обеспечивал значения IC, находящиеся в диапазоне 0,65-2,10 мМ (соответствующем 496,5-1604,2 ррт). Отдельно нарингин при всех тестируемых концентрациях не продемонстрировал выявляемый противомикробный эффект в отношении тестируемых бактериальных видов. Отдельно ацетат цинка характеризовался IC, находящейся в диапазоне 0,25-1,73 мМ (соответствующем 45,9-317,5 ррт). Положительный контроль триклозан подавляет рост 50% обоих видов бактерий в диапазоне концентраций 0,00061-0.0076 мМ (соответствующем 0,18-2,2 ррт).
610
[000156] Дополнительное определение характеристик проводили в отношении планктонных микробов, присутствующих в полости рта; Streptococcus sobrinus (вызывающий кариес штамм SL1[CCM 6070, CNCTC 9/89] (ATCC кат. №33478), Streptococcus gordonii (аргинолитический штамм V288 (ATCC кат. №35105), Actinomyces viscosus), а также патогенного Aggregatibacter actinomycetemcomitans (грам -), колонизирующего на поздней стадии кариеса. Все микроорганизмы выращивали в их соответствующей питательной среде: Streptococcus sobrinus и Streptococcus gordonii в бульоне BHI (BD, кат. №237500), Aggregatibacter actinomycetemcomitans в бульоне BHI, дополненном 0,5% экстракта дрожжей (BD, кат. №210941), и Actinomyces viscosus в триптиказо-соевом бульоне (BD, кат. №211768), дополненном 0,5% экстракта дрожжей (BD, кат. №210941). Бактерий культивировали в течение ночи при 37°С, 5% CO2 в примерно 20 мл бульона для соответствующей культуры. На следующий день определяли OD и растворы разбавляли до 0,2 для анализа.
[000157] Тестируемые образцы (нарингин, комплекс нарингин:цинк и нарингин + ацетат цинка (комбинация)) получали в виде 100 мМ исходного раствора с последующим 2-кратным серийным разведением в 100% DMSO. Получали триклозан (положительный контроль) в виде 10% исходного раствора в 100% EtOH и осуществляли 3-кратные серийные разведения в 100% EtOH. Соответствующее количество разбавленных образцов переносили в 96-луночный прозрачный планшет так, чтобы полученная конечная концентрация отдельно нарингина, комплексов нарингин:цинк, нарингин + ацетат цинка (комбинация) находилась в диапазоне от 2 мМ до 0,0078 мМ (2% DMSO), и концентрация триклозана находилась в диапазоне от 0,01% до 1,7е-6% (1% EtOH) в 100 мкл среды на лунку. В случае комбинации нарингин + цинк, хотя наиболее высокая суммарная общая концентрация составляла 2 мМ, точная концентрация соответствовала нарингину (1,3 мМ) и ацетату цинка (0,7 мМ) из-за молярного соотношения составов 2:1. В случае ацетата цинка, с целью имитации состава с соотношением 2:1 (лигандщинк) как в комплексе конечная концентрация находилась в диапазоне от 0,7 мМ до 0,0027 мМ в 2% DMSO.
610
[000158] Аликвоту бактериальной культуры объемом 100 мкл при OD 0,2 вводили в лунки с тестируемыми образцами. Содержимое лунок тщательно перемешивали и планшеты инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°С с 5% С02 или без него, в зависимости от бактериальных видов. Дополнительно, также осуществляли сокультивирование различных бактериальных видов (S.s + А.а; А.а + A.v; S.s + A.v; S.g + A.v; S.g + S.s). В данном случае 50 мкл каждой бактериальной культуры использовали для общего объема 100 мкл на лунку.
[000159] Через примерно 12-13 часов обработки планшеты считывали при 610 нм с применением планшет-ридера Envision (PerkinElmer, Уолтем, штат Массачусетс). % подавления относительно контроля определяли следующим образом:
[000160] Комплекс нарингин:цинк проявляет синергетический противомикробный эффект в отношении как грам + , так и грам - планктонных бактериальных видов, присутствующих в полости рта, культивируемых отдельно или в виде сокультур с другими бактериальными видами. См. фиг. 11-18 и таблицы 6-12.
[000161] При добавлении комплекса нарингин цинк к отдельным бактериям или сокультурам бактерий получали синергетическое подавление как отдельных видов, так и сокультур бактерий. Отдельно нарингин, его комбинация с ацетатом цинка или отдельно ацетат цинка продемонстрировали небольшое подавление или не демонстрировали его совсем. Дополнительно, по-видимому, комплекс проявлял различные эффекты в отношении различных видов бактерий. В данном случае, комплекс при 0,5 мМ является более эффективным в качестве противомикробного средства в отношении S. sobrinus (84,30%, чем S. gordonii (66,35%, и в отношении сокультур обоих из них обеспечил 74,8% подавления.
[000162] При добавлении комплекса нарингин:цинк к отдельным бактериям или сокультурам бактерий получали синергетическое подавление как отдельных видов, так и сокультур бактерий. Отдельно нарингин, его комбинация с ацетатом цинка или отдельно ацетат цинка продемонстрировали небольшое подавление или не демонстрировали его совсем. Дополнительно, по-видимому, комплекс проявлял различные эффекты в отношении различных видов бактерий. В данном случае, комплекс при 0,5 мМ является более эффективным в качестве противомикробного средства в отношении S.gordonii (66,35%, чем A. viscosus (34,13%, и в отношении сокультур обоих проявлял 29,9% подавления.
[000163] При добавлении комплекса нарингин:цинк к отдельным бактериям или сокультурам бактерий получали синергетическое подавление как отдельных видов, так и сокультур бактерий. Отдельно нарингин, его комбинация с ацетатом цинка или отдельно ацетат цинка продемонстрировали небольшое подавление или не демонстрировали его совсем. Дополнительно, по-видимому, комплекс проявлял различные эффекты в отношении различных видов бактерий. В данном случае, комплекс при 0,5 мМ является более эффективным в качестве противомикробного средства в отношении S.sobrinus (84,30%, чем A. viscosus (27,07%, тогда как в отношении сокультур было показано 29,9% подавления.
[000164] При добавлении комплекса нарингин:цинк к отдельным бактериям или сокультурам бактерий получали синергетическое подавление как отдельных видов, так и сокультур бактерий. Отдельно нарингин, его комбинация с ацетатом цинка или отдельно ацетат цинка продемонстрировали небольшое подавление или не демонстрировали его совсем. Дополнительно, по-видимому, комплекс проявлял различные эффекты в отношении различных видов бактерий. В данном случае, комплекс при 0,5 мМ является более эффективным в качестве противомикробного средства в отношении A. actinomycetemcomitans (56,47%, чем A. viscosus (27,07%, тогда как в отношении сокультур обоих обеспечил 37,52% подавления.
[000165] При добавлении комплекса нарингин:цинк к отдельным бактериям или сокультурам бактерий получали синергетическое подавление как отдельных видов, так и сокультур бактерий. Отдельно нарингин, или его комбинация с ацетатом цинка, или отдельно ацетат цинка продемонстрировали небольшое подавление или не демонстрировали его совсем. Дополнительно, по-видимому, комплекс проявлял различные эффекты в отношении различных видов бактерий. В данном случае, комплекс при 0,5 мМ являлся более эффективным в качестве противомикробного средства в отношении S. sobrinus (84,30%, чем А. actinomycetemcomitans (56,47%, тогда как в отношении сокультур проявлял 79,1% подавления.
50
[000166] В качестве положительного контроля для анализа противомикробной активности одни и те же виды культур бактерий обрабатывали триклозаном в диапазоне конечной концентрации 0,01% - 1,7е 6% в 1% EtOH. С применением программного обеспечения GraphPad Prism версии 6 определили, что IC находится в диапазоне 0,00010-0,00027% (1-2,7 ррт).
[000167] Результаты, приведенные в данном документе, показывают, что противомикробную эффективность нарингина можно повысить с помощью присутствия металла - цинка в виде комплекса нарингин:цинк или в виде комбинации цинка и нарингина. Неожиданно, противомикробная эффективность увеличивается с помощью комплексов нарингин:цинк по настоящему изобретению, которые по меньшей мере частично характеризуются стехиометрическим соотношением нарингина и цинка 2:1.
610
[000168] Определение противомикробных характеристик также осуществляли в отношении растворов смешанной культуры, содержащей по меньшей мере пять присутствующих микробных видов. Смешанную культуру, содержащую Actinomyces viscosus (A. viscosus, A.v) (ATCC, №43146), Lactobacillus casei (L. casei, L.c) (ATCC №334), Streptococcus oralis (S. oralis, S.o) (ATCC №35037), Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum, F.n) (ATCC №10953) и Veilonella parvula (V. parvula, V.p) (ATCC №17745) поддерживали в специальной сложной среде (модифицированной среде BHI II) в хемостате для непрерывного культурирования при 37°С.Примерно 10 мл культуры удаляли и определяли ODeio-Анализ проводили с применением культур при двух концентрациях: 0,03 и 0,1 при OD. Тестируемые образцы (нарингин, комплекс нарингин:цинк и нарингин + ацетат цинка (комбинация)) получали в виде 100 мМ исходного раствора с последующим 2-кратным серийным разведением в 100% DMSO. Получали триклозан (положительный контроль) в виде 10% исходного раствора в 100% EtOH и осуществляли 3-кратные серийные разведения в 100% EtOH. Соответствующее количество разбавленных образцов переносили в 96-луночный прозрачный планшет так, чтобы полученная конечная концентрация отдельно нарингина, комплексов нарингин:цинк, нарингин + ацетат цинка (комбинация) находилась в диапазоне от 2 мМ до 0,0078 мМ (2% DMSO), и концентрация триклозана находилась в диапазоне от 0,01% до 1,7е-6% (1% EtOH), в 100 мкл среды ВН II (Alvarez G. et al.; АМВ Express; 2013, 3(1), doi: 10.1186/2191-0855-3-1) на лунку. В случае комбинации нарингин + ацетат цинка, хотя наиболее высокая суммарная общая концентрация составляла 2 мМ, точная концентрация соответствовала нарингину (1,3 мМ) и ацетату цинка (0,7 мМ) из-за молярного соотношения составов 2:1. В случае ацетата цинка, с целью имитации состава с соотношением 2:1 (лигандщинк) как в комплексе, вместо этого применяли конечную концентрацию, находящуюся в диапазоне от 0,7 мМ до 0,0027 мМ в 2% DMSO.
610
[000169] 100 мкл бактериальной культуры при выбранной OD (0,03 или 0,1) вводили в лунки с тестируемыми образцами. Содержимое лунок тщательно перемешивали и планшеты инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°С с 5% CO2 или без него. Через примерно 12-13 часов обработки планшет считывали с применением планшет-ридера Envision (серийный №1040984), поглощение при 610 нм. % подавления относительно контроля определяли, как описано для ранее описанных противомикробных протоколов, см. выше.
[000170] С применением культур смешанных видов авторы настоящего изобретения наблюдали, что комплекс нарингин:цинк приводил к синергетическому подавлению по сравнению с комбинацией нарингин + цинк и с отдельно ацетатом цинка независимо от того, инкубировали ли культуры с 5% CO2 или без него (см. фиг. 17, фиг. 18 и таблицу 12). Противомикробная эффективность комплекса была более высокой в отношении культур, инкубируемых в отсутствие 5% CO2 (см. таблицу 12).
[000171] Авторы настоящего изобретения наблюдали, что в культурах смешанных видов независимо от того, инкубировали ли культуры в аэробных или анаэробных условиях, общий результат представлял собой синергетический противомикробный эффект в присутствии комплекса, но не при применении его отдельных частей в отдельности или в комбинации. Однако, в аэробных условиях противомикробная эффективность комплекса практически удваивается по сравнению с культурами в анаэробных условиях (81,7% по сравнению 48,2% в случае одной и той же тестируемой концентрации.
50
[000172] В качестве положительного контроля культуры смешанных видов обрабатывали триклозаном в диапазоне концентраций 0,01%-1,7е 6% в 1% EtOH. С применением программного обеспечения GraphPad Prism версии 6 определили, что IC находится в диапазоне 0,00014-0,00022% (1,4-2,2 ррт) (данные не показаны).
Пример 14. Анализ поглощения цинка в тканях
[000173] Модели ткани EpiGingival™, применяемые для исследования поглощения цинка, приобретали у MatTek Corporation (Ашленд, штат Массачусетс, кат. № Gin-606). Все образцы получали в конечной концентрации 1% DMSO в 7% пропиленгликоля (PG). Например, 1 мМ комплекс нарингин:цинк получали в конечной концентрации 1% DMSO и 7% PG; комбинацию нарингин и ацетат цинка получали так, чтобы общая концентрация составляла 1 мМ, но состояла из 0,67 мМ нарингина и 0,33 мМ ацетата цинка в 1% DMSO и 7% PG. Ацетат цинка получали при 0,33 мМ для имитации количества цинка, присутствующего в 1 мМ комплексе нарингин:цинк. В случае контроля с отдельно средой-носителем применяли 1% DMSO в 7% PG. Все образцы уравновешивали до 37°С перед испытанием.
[000174] Исследования в отношении поглощения цинка проводили с применением моделей ткани EpiGingival™ от MatTek Corporation. Вкратце, вкладыши с тканью EpiGingival™ уравновешивали в течение ночи в 1 мл среды для анализа EpiGingival™ (поставляемой MatTek Corporation). Для испытания, работая с одним вкладышем за раз, вкладыш удаляли и помещали внутрь чистого 6-луночного планшета. Затем 1 мл тестируемого образца осторожно удаляли и вводили внутрь вкладыша и обеспечивали инкубирование в течение 2 минут. Затем образцы удаляли с применением аспиратора и ткань ополаскивали с помощью 1 мл теплой воды (37°С). Это повторяли еще 2 раза, всего осуществляли 3 промывания. В конце последней промывки убедившись, что было удалено как можно больше воды, ткань отделяли от вкладыша с помощью кончика стерильных щипцов и переносили в чистую пробирку Falcon объемом 15 мл. Способ повторяли до тех пор, пока не были обработаны все образцы ткани. Эксперименты проводили три раза, при этом каждый тестируемый образец анализировали в двух повторностях.
[000175] Расщепление ткани. Вкратце, 0,5 мл смеси 7:3 HC1/HN03 вводили в пробирку Falcon объемом 15 мл, содержащую один из обработанных образцов ткани, и обеспечивали протекание расщепления в течение ночи. На следующий день добавляли 4,5 мл воды к каждому из расщепленных образцов ткани, тщательно перемешивали и центрифугировали при 4,000 об./мин. в течение 10 минут при комнатной температуре. Прозрачную надосадочную жидкость (4,5 мл) переносили в прозрачную отмеченную пробирку Falcon и подвергали аналитическому анализу в отношении цинка.
[000176] Среднее поглощение цинка (ррт) и стандартное отклонение для образцов рассчитывали с применением Microsoft Excel 2010. Осуществляли однофакторный ANOVA для определения р-значения. Получали график зависимости среднего содержания цинка (ррт) от различных вариантов обработки (см. фиг. 19).
[000177] Комплекс нарингин:цинк (продукт 5) характеризовался значительным поглощением цинка по сравнению с комбинацией нарингин + ацетат цинка при той же молярной концентрации. Напротив, определили, что поглощение цинка для продукта 5 не является в значительной степени отличным от поглощения для отдельно ацетата цинка при той же молярной концентрации. Взятые вместе, поглощение цинка и противомикробные характеристики, без ограничения какой-либо теорией, указывают на то, что наблюдаемый синергетический противомикробный эффект может быть отражением комплекса как целого, в отличие от отдельно ацетата цинка.
Пример 15. Способ синтеза 6
1
[000178] Смешивали два моля нарингина (1,21 г) и один моль ZnO (0,081 г) в 100 мл Н20. Раствор нагревали до 80°С в течение 4 часов при энергичном перемешивании. Образовывался желтоватый порошок (1,102 г, выход 90%. Порошок промывали горячей водой (3×100 мл). После перемешивания 21,4 мг порошка в 10% HN03 получали прозрачный раствор. Определяли характеристики продукта, обозначенного как продукт 7, с применением FTIR, Н ЯМР и диффузионно-упорядоченной спектроскопии.
Пример 16. Заживление ран
2
[000179] Клеточная культура. Линию спонтанно иммортализованных кератиноцитов человека, клетки НаСаТ (AddexBio, Сан-Диего, штат Калифорния, кат.№Т0020001) культивировали во флаконах Falcon площадью 25 см со скошенным горлом для тканевой культуры (VWR, Radnor, РА, кат.№353108) с применением полной среды DMEM (Life Technologies, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, кат. №11965-092), дополненной 10% охарактеризованной FBS Hyclone (VWR, Раднор, штат Пенсильвания, кат. №1677-014) и IX пенициллином - стрептомицином (Life Technologies, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, кат. №15140122). Культуры инкубировали при 37°С и 5% CO2 до тех пор, пока клетки не достигали около 70-80% конфлюэнтности. Затем обеспечивали открепление клеток с помощью раствора трипсин - EDTA (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, кат.№Т3924) и применяли либо для выращивания, либо для проведения экспериментов.
[000180] Получение образца для анализа. Образцы получали в конечной концентрации 1% DMSO в полной среде. Затем получали следующие: нарингин при 0,1 мМ, комплекс нарингин:цинк при 0,15 мМ, ацетат цинка при 0,05 мМ и комбинацию нарингин + ацетат цинка при конечной концентрации 0,15 мМ. Применяли 1% DMSO в полной среде в качестве контроля со средой-носителем и отдельно среду в качестве положительного контроля. Каждую обработку осуществляли в четырех повторностях и брали среднее значение. Тестировали две различные партии продукта 5 при 0,15 мМ, определяли средний % роста относительно дня 0 (d0), и он представлен на фиг. 20.
[000181] Получение раны. Клетки НаСаТ при около 70-80% конфлюэнтности обрабатывали с помощью 1 мл раствора трипсин-EDTA и инкубировали при 37°С, 5% CO2 до открепления клеток от флакона. Добавляли 5 мл полной среды для остановки дальнейшей трипсинизации клеток. Суспензию клеток переносили в чистую пробирку для центрифугирования Falcon объемом 50 мл и центрифугировали при 1500 об./мин. в течение 5 минут с образованием клеточного осадка. Находящиеся в осадке клетки повторно суспендировали в 50 мл свежей полной среды и 1 мл клеточной суспензии переносили в каждую лунку 24-луночного планшета Falcon 353047 (VWR, Раднор, штат Пенсильвания). Планшеты инкубировали при 37°С, 5% CO2 до тех пор, пока клетки не достигали около 90% конфлюэнтности.
[000182] В день анализа создавали «крестовидное изображение» в асептических условиях на дне каждого из клеточных монослоев в 24-луночном планшете с применением стерильного наконечника пипетки р1000 для имитации «раны» (см. фиг. 21). Клетки дважды промывали с помощью 1 мл полной среды при аккуратном встряхивании в течение минуты и затем подпитывали с помощью 1 мл соответствующей тестовой среды.
[000183] Количественное определение клеточной ми грации/заживления раны. Для изучения эффектов различных активных вещества в отношении клеточной миграции/заживления раны размер свежеобразованной раны (размер зазора) определяли после обработки с применением инвертированного микроскопа (Olympus 1X71, Olympus Scientific Solutions Americas, Уолтем, штат Массачусетс) и программного обеспечения Cellsens Dimension 1.11 (Olympus Corporation, Уолтем, штат Массачусетс) и за ней наблюдали до полного закрытия зазора. Брали три различных измерения для каждого плеча «крестовидного» изображения раны. Всего делали 12 измерений для каждой из 24 лунок (3 считывания с верхней части, 3-е нижней части, 3-е правой части и оставшиеся 3-е левой части) (см. фиг. 21). Определяли среднее значение для каждого плеча для каждого дня исследования до заживления раны и исчезновения зазора. % клеточного роста относительно d0 (дня 0) для каждой обработки рассчитывали следующим образом:
[000184] Результаты. Как показано на фиг. 20, обработка продуктом 5 приводила к улучшенному «заживлению ран» по сравнению с обработкой отдельно нарингином, отдельно ацетатом цинка, а также комбинацией нарингина и ацетата цинка. Результаты для обработки отдельно нарингином не являлись в значительной степени отличными от результатов для ацетата цинка, комбинации как нарингина, так и ацетата цинка, обработки отдельно средой-носителем, а также средой. Сравнение среды с отдельно средой-носителем показало подавление роста в обработанных средой-носителем лунках (возможно, из-за присутствия DMSO). Неожиданно, клетки, обработанные продуктом 5, были способны восстановиться значительно лучше, чем каждый из компонентов отдельно или их комбинация. Подобные результаты наблюдали с 0,20 мМ продукта 5 (данные не показаны).
[000185] Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на варианты осуществления, специалистам в данной области техники будет понятно, что можно осуществлять различные его модификации и вариации без отступления от объема настоящего изобретения.