ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
INSECTICIDAL PROTEINS EXTRACTED FROM Bacillus BACTERIA AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение связано с новым семейством нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные белки и их инсектицидные фрагменты. В частности, настоящее изобретение связано с конкретными белками, обозначенными здесь как TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431, и их инсектицидными фрагментами, каждый из которых кодируется нуклеотидной кодирующей последовательностью, обозначенной здесь, соответственно, как tic901, tic1201, tic407, tic417, и tic431, так же как и нуклеотидной последовательностью гомологов, которая (1) кодирует инсектицидные белки и (2) гибридизуется с tic901, tic1201, tic407, tic417, и tic431 кодирующими последовательностями, в условиях гибридизации, выбранных из группы содержащей жесткие условия гибридизации и условия специфической гибридизации. Настоящее изобретение также связано с клетками хозяина, трансформированными нуклеотидными последовательностями согласно изобретению или трансформированными вариантами нуклеотидных последовательностей, на основе гена tic901, родственных генов и/или их гомологов, в частности, на основе тех последовательностей, которые были модифицированы для улучшения экспрессии в растениях. В предпочтительных воплощениях трансформированные клетки хозяина являются клетками растения.
ОСНОВЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Bacillus thuringiensis является грамм-положительной бактерией, которая продуцирует белковоподобные кристаллические включения в период споруляции. Данные кристаллические белки B.thuringiensis часто высокотоксичны для определенных насекомых. Инсектицидная активность против личинок насекомых из отряда чешуекрылых (гусеницы), двукрылых (москиты, мухи) и жесткокрылых (жуки) установлена для кристаллических белков из различных штаммов B.thuringiensis.
Присущие B.thuringiensis кристаллические белки, называемые также дельта-эндотоксинами или параспоральными кристаллами или токсическими белками, могут сильно различаться по структуре и инсектицидной активности. Данные инсектицидные белки кодируются генами, обычно локализованными на больших плазмидах размером более чем 30 мегадальтон (МДа), которые найдены в штаммах B.thuringienisis. Некоторые из токсических генов B.thuringienisis клонированы, и по их специфическим инсектицидным свойствам охарактеризованы инсектицидные кристалличекие белковые продукты. Существуют обзоры токсических генов и кристаллических белков B. thuringiensis (например, Hofte et al., 1989; Schnepf et al., 1998).
Инсектицидные свойства B.thuringiensis давно выявлены, и штаммы B.thuringiensis включали в коммерческие биологические инсектицидные продукты более сорока лет. Коммерческие инсектицидные составы B.thuringiensis обычно содержат сухие спорулированные сбраживаемые культуры B.thuringiensis, кристаллические белки которых токсичны по отношению к различным видам насекомых.
Традиционно коммерческие био-инсектицидные продукты B. thuringiensis получали из штаммов B.thuringiensis "дикого типа", то есть из очищенных культур штаммов B.thuringiensis, выделенных из природных источников. Новейшие коммерческие био-инсектицидные продукты B.thuringiensis основаны на генетически модифицированных штаммах B.thuringiensis, таких как трансконъюгатные штаммы B.thuringiensis, описанные в Патенте США № 5080897 и Патенте США № 4935353.
Различные штаммы B. thuringiensis классифицировали на основе реакции бактериального жгутика B.thuringiensis с антителами. Штамм B.thuringiensis, бактериальный жгутик которого реагирует с уникальным антителом, классифицировали как уникальный серовар (серовариант), и описано более тридцати различных сероваров или подвидов B.thuringiensis (DeBarjac and Frachon, 1990).
Каждый подвид B.thuringiensis зачастую продуцирует уникальные разновидности инсектицидных кристаллических белков. Например, подвиды B.thuringiensis kurstaki вырабатывают кристаллические белки размером приблизительно в 130 килодальтон (кДа) и в 70 кДа, которые токсичны для гусениц, в то время как подвиды B.thuringiensis tenebrionis вырабатывают кристаллический белок размером около 72 кДа, который токсичен для жуков.
Характерной чертой кристаллических белков является их способность сращиваться в форме кристаллов внутри материнской клетки B.thuringiensis. При лизисе материнской клетки белки высвобождаются во внешнюю среду в виде кристаллов. Кроме того, B.thuringiensis вырабатывают также и некристаллические белки, которые, в противоположность кристаллическим белкам, вырабатываются клетками B.thuringiensis в виде растворимых в культуральной среде белков. Выделяемые B.thuringiensis некристаллические белки включают в себя фосфолипазы, протеазы и лактомазы, которые если и обладают, то незначительной инсектицидной активностью. Однако, как было выявлено, три из секретируемых некристаллических белков B.thuringiensis, обозначаемых как Vip1, Vip2 и Vip3, токсичны в отношении жесткокрылых и чешуекрылых насекомых (Estruch et al., 1996; Патент США № 5866326; Международная заявка 94/21795; Международная заявка 96/10083). У некристаллического белка B.thuringiensis, обозначаемого как CryV, выявлена токсичность в отношении чешуекрылых насекомых (Kostichka et al., 1996). Ранее были идентифицированы некоторые из продуцируемых Bacillus thuringiensis очищенные внеклеточно секретируемые инсектицидные белковые токсины (Патент США, серийный № 5840868; Патент США, серийный № 5849870; Патент США, серийный № 5866326; Патент США, серийный № 5872212; Патент США, серийный № 5877012; Патент США, серийный № 5888801; Патент США, серийный № 6204435; Патент США, серийный № 6242669; Патент США, серийный № 6279369). Все такие штаммы, как было показано, выделяют один или более таких VIP или CryV токсичных белков или близкородственных гомологов. Как ни удивительно, авторы изобретения открыли здесь новый класс внеклеточно секретируемых инсектицидных белковых токсинов, у которых не выявлено гомологии с известными классами белков VIP или CryV.
Сравнение аминокислотных последовательностей показало, что классы белков Vip1, Vip2, Vip3, WAR, MIS и CryV не связаны с белками соглано изобретению. Следующее сравнение показало, что ни один из ста тридцати семи более или менее известных инсектицидно токсичных белков B.thuringiensis (Crickmore et al., 1998) не связан с белками согласно изобретению. Фактически не найдено значительной гомологии между последовательностями белков согласно изобретению и какой-нибудь из тысячи белковых последовательностей, содержащихся в Национальном центре Ресурсов Генома (GenBank), Santa Fe, NM. Исследования с помощью программы BLAST позволили идентифицировать только два белка в базе данных GenBank, которые предполагают возможную гомологию с TIC901. Инсектицидный белок Bacillus sphaericus Mtx2 обнаруживает только 21%-ую степень идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью из 135 последовательных аминокислот, выровненной по TIC901. Предполагаемая аминокислотная последовательность, которая может быть экспрессирована из генома вируса оспы птиц, обнаруживает только 27%-ую степень идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью из 147 последовательных аминокислот, выровненной по TIC901.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном воплощении настоящее изобретение связано с выделением и очисткой инсектицидного белка, выявлением аминокислотной последовательности, по существу представленной в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33, либо в виде предшествующих форм аминокислотных последовательностей, либо в виде зрелых и/или прошедших стадию процессинга и секретируемых форм этих аминокислотных последовательностей или родственных им аминокислотных последовательностей и их гомологов. Инсектицидная активность TIC901 и родственных белков продемонстрирована в биоанализах на колорадском картофельном жуке (ККЖ) и методом Вестерн- и Саузерн-блоттинга на корневых личинках у зерновых. В частности, белки токсичны по отношению к жесткокрылым насекомым, включая и колорадского картофельного жука (Lymantria dispar), и, как здесь показано, по отношению к кукурузным жукам (КЖ).
В другом воплощении настоящее изобретение связано также с изолированной и очищенной нуклеотидной последовательностью, то есть кодирующей последовательностью, включающей в себя нуклеотидную последовательность, представленную последовательностями SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и/или SEQ ID NO:32 и родственными им последовательностями или их гомологами. Нативная последовательность или последовательность дикого типа, кодирующая tic901, представленная в SEQ ID NO:3, кодирует нативный предшественник TIC901, пре-белок или белковый пре-токсин, обнаруживающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Организмы, вырабатывающие белок TIC901, проявляют инсектицидную активность и/или насекомоустойчивые свойства. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирующую белок из последовательности SEQ ID NO:3, соответствует белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты в положении приблизительно 367, представленному в SEQ ID NO:4. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic1201, представленной в SEQ ID NO:5, кодирует предшественник белка TIC1201, обнаруживающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирующую белок из SEQ ID NO:5, соответствует зрелому белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 и приблизительно до аминокислоты в положении 364, представленному в SEQ ID NO:6. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic407, представленной в SEQ ID NO:7, кодирует предшественник TIC407, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирущую белок из SEQ ID NO:7, и соответствует белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 367, представленной в последовательности SEQ ID NO:8. Нативная последовательность или последовательность дикого типа, кодирующая tic417, представленная в SEQ ID NO:9, кодирует предшественник TIC417, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирущую белок из SEQ ID NO:9, и соответствует белку, состоящему из аминокислот приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 364, и представленному в SEQ ID NO:10. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic431, представленной в SEQ ID NO:32, кодирует предшественник TIC431, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:33. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus thuringiensis, экспрессирующую белок из SEQ ID NO:33, соответствует белку, состоящему из аминокислот приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 364, представленную в SEQ ID NO:33. Нуклеотидная последовательность гомологов, то есть инсектицидных белков, кодируемых нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из описанных здесь последовательностей, в жестких условиях гибридизации, особо предназначены для включения в объем настоящего изобретения.
В следующем воплощении, настоящее изобретение связано с биологически чистой бактериальной культурой Bacillus thuringiensis, преобразованной плазмидным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и/или SEQ ID NO:32, и/или родственные последовательности или гомологи, которые вырабатывают инсектицидный белок и секретируют белок во внеклеточное пространство, окружающее бактериальный штамм в процессе ферментации. Образец штамма EG12450 депонировали в перманентную коллекцию культур, согласно Будапештскому Соглашению, под № NRRL B-30357.
В следующем воплощении настоящее изобретение связано также с биологически чистой культурой бактерии B.thuringiensis, обозначенной как штамм EG2158, проявляющей инсектицидную активность против жесткокрылых насекомых. Штамм B.thuringiensis EG2158 представляет собой штамма B.thuringiensis дикого типа, из которого выделена кодирующая последовательность tic901, которая депонирована в перманентной коллекции культур, согласно Будапештскому Соглашению, под № NRRL B-18213. EG2158, как показано здесь, вырабатывает по меньшей мере два инсектицидных белка, включающих в себя аминокислотные последовательности, выбранные из группы, содержащей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:10.
В следующем воплощении настоящее изобретение предоставляет вектором, включающим в себя нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, кодирующую аминокислотную последовательность TIC901, представленную в SEQ ID NO:4. Штамм Escherichia coli, содержащий вектор, включающий в себя последовательность SEQ ID NO:3, был внесен 6 февраля 2002 в Коллекцию NRRL (Northern Regional Research Lab of Agricultural Research Service Center Collection), USDA, в соответствии с условиями "Будапештского Договора о Международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры" под № NRRL B-30549. Плазмида, содержащая вышеуказанную нуклеотидную последовательность, представлена здесь как pEG1381.
В следующем воплощении настоящее изобретение связано с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, кодирующей нуклеотидную последовательность TIC901, и олигонуклеотидным сегментом, который можно пометить и использовать в качестве зонда для создания гибридов для идентификации дополнительных родственных генов, кодирующих родственные инсектицидные белки или их гомологи. Другое воплощение связано с нуклеотидными последовательностями, особо представленными здесь в качестве примера, включающими в себя последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32, каждая из которых кодирует инсектицидный белковый токсин, представленный в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33, соответственно.
Кроме того, в следующем воплощении настоящее изобретение связано с клетками растения и растениями, которые трансформируются нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок TIC901, представленный в SEQ ID NO:4, или его инсектицидный фрагмент. Нуклеотидная последовательность может быть транслирована и экспрессирована клетками растения и тканями растения в дозе, достаточной для уничтожения жесткокрылых насекомых-вредителей. В рамках настоящего изобретения рассматриваются как односемядольные, так и двусемядольные растения. Необходима модификация последовательности для достижения максимального уровня экспрессии, а также для того, чтобы усилить способность растения, содержащего последовательность, вырабатывать инсектицидные уровни белка TIC901.
Кроме того, в следующем воплощении настоящее изобретение связано со способом получения трансгенного растения, которое проявляет повышенный уровень экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901, и следовательно повышенный уровень инсектицидного белка TIC901. Таким образом, растения, трансформированные модифицированными нуклеотидными последовательностями, описанными в настоящем изобретении, проявляли улучшенные и повышенные уровни сопротивления жесткокрылым вредителям по сравнению с растениями, не содержащими нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 или родственный белок.
Из вышесказанного следует, что предложенный способ экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей белок TIC901 у растения, включающий в себя стадии встраивания в геном растительной клетки последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в направлении от 5' к 3' функциональный промотор растительной клетки, оперативно связанный с последовательностью структурной ДНК, оптимизированной для экспрессии в клетках растений, которая вызывает продуцирование последовательности РНК, кодирующей полипептидную последовательность TIC901, представленную в последовательности SEQ ID NO:4, или последовательность, имеющую степень идентичности, составляющую по меньшей мере приблизительно от 80% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 85% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 90% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 95% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 99% и выше, по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4; и 3'-нетранслируемой последовательности ДНК, которая функционирует в клетках растения, вызывая терминацию транскрипции и полиаденилирование; получение трансформированных клеток растения, содержащих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и получение из трансформированных клеток растения генетически трансформированных растений, которые экспрессируют нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC901, причем трансформированные растения являются морфологически нормальными и проявляют повышенные или улучшенные уровни резистентности к жесткокрылым вредителям по сравнению с растением, не трасформированным с целью экспрессии указанного белка.
Другое воплощение согласно изобретению связано с обеспечением антител, специфически связывающихся с эпитопами, представленными только белком TIC901 или его гомологами. Антитела могут быть использованы для идентификации присутствия белка TIC901 или его гомолога, для очищения вышеуказанного белка или гомолога, для идентификации нуклеотидной последовательности, на основании которой белок TIC901 или гомолог экспрессирован, и для использования в наборах, предназначенных для выявления белка TIC901 или его гомолога или выявления нуклеотидной последовательности, экспрессирующей вышеуказанный белок или гомолог.
В частности, преимуществом согласно изобретению является улучшение контроля устойчивости насекомым. Возможность комбинировать два или более инсектицидных агента, каждый из которых токсичен в отношении одного и того же вида насекомых-вредителей, в единую композицию, где каждый агент проявляет действие, отличное от другого инсектицидного агента, с которым его комбинируют, создает вероятность более эффективного контроля конкретных видов насекомых-вредителей посредством существенного уменьшения вероятности того, что будет развиваться устойчивость к инсектицидной композиции в популяции. Белок TIC901 согласно изобретению можно комбинировать с любыми известными инсектицидными агентами для достижения уровня контролируемой резистентности в конкретной композиции, предпочтительно посредством экспрессии комбинации инсектицидных агентов в растения. В частности, композиции белка TIC901 можно сочетать с вариантами аминокислотной последовательности Cry3 или Cry3 для достижения контроля над различными видами жесткокрылых насекомых-вредителей или с другими подходящими белками, такими как PS149B1, CryET33/34, CryET80/76, CryET70, Cry22, CryET39, CryET76, Cry5Ba, Cry6a, и Cry12a, и, сходным образом, с белками VIP, WAR или MIS, и, сходным образом, с различными инсектицидными композициями, полученными из штаммов Xenorhabdus и Photorhabdus бактерий, которые, как было показано, проявляют инсектицидную биоактивность, направленную против жесткокрылых вредителей растений. Предпочтительное использование данных композиций in planta будет направлено на улучшение экспрессии белков в те части растения, которые проявляют значительную восприимчивость к жесткокрылым насекомым-хищникам. Для защиты картофеля от ККЖ предпочтительно достигнуть высокого уровня экспрессии в листья и стебли растения. Для вида кукурузы, подверженного проволочнику и личинкам, повреждающим корни, предпочтительно достигнуть высокого уровня экспрессии в подпочвенные части растения, то есть в корневую систему растений.
Другое воплощение согласно изобретению состоит в выделении полинуклеотида, который кодирует в Bacillus thuringiensis инсектицидный токсин или его инсектицидные фрагменты, активность которых направлена против насекомых-вредителей, где токсин или инсектицидный фрагмент имеет молекулярный вес приблизительно между 36000 дальтон и приблизительно 42500 дальтон. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин или его комплемент, гибридизуется в жестких условиях с последовательностью SEQ ID NO:3. Токсин проявляет предпочтительную биологическую активность в контролировании уничтожения жесткокрылых насекомых-вредителей, предпочтительно колорадского картофельного жука и/или кукурузного жука. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин, оптимизирована для экспрессии в растениях и, по существу, кодирует токсин или его инсектицидный фрагмент, то есть кодирует ту же самую или по существу ту же самую аминокислотную последовательность, которая присутствует в нативной аминокислотной последовательности.
Другое воплощение согласно изобретению связано с трансформированными клетками-хозяевами, содержащими полинуклеотид, кодирующий инсектицидный белок согласно изобретению или его инсектицидный фрагмент. Предпочтительно, когда нуклеотидные последовательности согласно изобретению модифицированы с целью улучшения экспрессии белков согласно изобретению в предпочтительной клетке- хозяине. Клетка-хозяин согласно изобретению выбрана из группы, содержащей клетку бактерий, клетку грибов и клетку растения. Экспрессия в клетке растения может включать в себя экспрессию с целью достижения аккумуляции инсектицидного белка в цитоплазме или приводить к аккумуляции инсектицидного белка в субклеточной органелле, такой как плазмида, хлоропласт или митохондрия. Альтернативно, инсектицидный белок согласно настоящему изобретению или его инсектицидный фрагмент мог быть локализован в системе белковой секреции конкретной клетки-хозяина и в результате аккумулировать белковый продукт вне клетки и во внеклеточном пространстве вокруг клетки.
Дополнительное воплощение согласно изобретению определяет способ борьбы с заражением растения жесткокрылыми видами насекомых. Предпочтительно обеспечивали пестицидное количество инсектицидного белка согласно настоящему изобретению или его инсектицидного фрагмента, потребляемое насекомыми-вредителями с пищей. Пища может содержать часть растения, которым насекомое в норме кормится, такую как растительная ткань или растительная клетка. Инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент может быть представлен в композиции, которая наносится на поверхность растительной ткани, части растения или растительной клетки, или, более предпочтительно, может быть продуцирована системой синтеза белка клеткой и, как описано выше, аккумулирована внутри растительной клетки или секретирована из клетки растения, так что количество белкового токсина является инсектицидным количеством, достаточным для подавления насекомых-вредителей через принятие пищи или для подавления последующего роста и развития насекомых-вредителей или для гибели насекомых-вредителей. Пища, предоставляемая насекомым, может быть также искусственной пищей, содержащей токсичный белок, который равномерно распределен внутри или на наружной поверхности(тях) пищевой основы, или включена в виде градиента концентрации внутри или на наружной поверхности(тях) пищевого субстрата. Инсектицидный токсин или его фрагмент получали из нуклеотидной последовательности, которая кодируется в Bacillus thuringiensis нуклеотидной последовательностью, которая в жестких условиях гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, по существу комплементарной последовательности SEQ ID NO:3.
Настоящее изобретение также связано со способом выявления первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, где первая нуклеотидная последовательность кодирует инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент и в жестких условиях гибридизации гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью. Примерами последовательностей являются последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.
Настоящее изобретение также связано с неприродно возникающими или синтетическими нуклеотидными последовательностями, которые кодируют инсектицидный белок TIC901 или его инсектицидный фрагмент или его гомолог, где указанный белок TIC901 или его инсектицидный фрагмент или его гомолог выбраны из группы последовательностей, состоящих из последовательностей SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7. Предпочтительно, чтобы неприродно возникающая нуклеотидная последовательность или последовательности, представленные в настоящем документе, которые кодируют инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент, предусматривались для экспрессии TIC901 или родственного белка в клетках растения. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены клетки растения, трансформированные такими последовательностями. Растения, вырастающие из трансформированных клеток растения, также представлены в настоящем изобретении. Семена из трансформированных растений согласно настоящему изобретению также предусмотрены настоящим изобретением, если семена содержат последовательности, кодирующие инсектицидные белки или их инсектицидные фрагменты.
Примеры последовательностей согласно настоящему изобретению, в дополнение к родственным последовательностям SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, включают в себя по меньшей мере следующие последовательности: (1) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:5, представленную в SEQ ID NO:6 и упоминаемую в этом документе также как инсектицидный белок TIC1201; (2) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:7 и представленную в SEQ ID NO:8, также упоминаемую в настоящем документе как TIC407; (3) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:9 и представленную в последовательности SEQ ID NO:10, и также упоминаемую в настоящем документе как инсектицидный белок TIC417, и (4) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:32, представленной в SEQ ID NO:33 и также упоминаемой в настоящем документе как инсектицидный белок TIC431. Каждый из этих белков и нативные нуклеотидные последовательности B.t., кодирующие эти белки, связаны с TIC901, как описано в настоящем документе. Например, последовательность SEQ ID NO:5 является нуклеотидной последовательностью, кодирующей инсектицидный белок TIC1201, представленный в последовательности SEQ ID NO:6. Последовательность SEQ ID NO:5, как показано в настоящем документе, распознается посредством гибридизации с последовательностью SEQ ID NO:3 в жестких условиях гибридизации. Последовательность SEQ ID NO:5 кодирует белок, который проявляет токсическую биологическую активность в отношении жесткокрылых, проявляя токсичность в отношении кукурузных жуков и колорадских картофельных жуков. Каждая из последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 способна к гибридизации с остальными в условиях гибридизации, выбранных из группы, включающей в себя жесткие и условия специфической гибридизации. Каждая последовательность может также быть идентифицирована путем гибридизации с SEQ ID NO:2 в условиях, выбранных из группы, содержащей жесткие и условия специфической гибридизации. Каждая последовательность может также быть идентифицирована путем амплификации, например, с использованием олигонуклеотидной пары праймеров, представленных в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, и олигонуклеотидной пары праймеров, представленных в последовательностях SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:27. Пара праймеров, представленная в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, и пара праймеров, представленная в последовательностях SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:27, являются типичными и диагностическими критериями для идентификации присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 или родственный инсектицидный белок в препарате. Данные олигонуклеотидные пары, когда используются по одиночке или вместе, при определенных условиях амплификации и в присутствии субстрата подходящей нуклеотидной последовательности, продуцируют ампликон, содержащий от 540 до 640 пар оснований. Тепловые реакции амплификации с использованием данных праймеров пригодны для определения присутствия гена B. t., кодирующего инсектицидный белок, соответствующий TIC901, или родственный ему белок в препарате, что значительно упрощает исследование и идентификацию таких родственных последовательностей. Другие ампликоны, получаемые при использовании других пар праймеров, также представляют собой основанную на выравнивании нуклеотидную последовательность, например последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32. Области существенной идентичности аминокислотной последовательности белкам, кодируемым данными нуклеотидными последовательностями, соответствуют нуклеотидным последовательностям, которые могут быть использованы для получения комплементарных или по существу комплементарных последовательностей для применения в качестве зондов или затравок при использовании в тепловых реакциях, позволяющих определять последовательности, родственные TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431.
Вырожденные олигонуклеотидные зонды и праймеры, представленные в последовательностях SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29, дополнительно представлены как средство для идентификации любой нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок, секретируемый по меньшей мере из видов Bacillus thuringiensis, в которых нуклеотидную последовательность идентифицировали при помощи вырожденных олигонуклеотиных зондов, гибридизованных в жестких условиях с одной или более последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:32. Примеры последовательностей, идентифицируемых при помощи таких олигонуклеотидов, включают в себя последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:32, каждая из которых кодирует пептиды, представленные, соответственно, в последовательностях SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:33.
Другое воплощение включает в себя способ выявления tic901 и родственных последовательностей, кодирующих белок, в штаммах Bacillus, включающий в себя стадии культивирования штаммов Bacillus от 16 до 45 часов в обогащенном бульоне в аэробных условиях, выявления в супернатанте культуры белка, который проявляет идентичность антигену, родственному TIC901, и/или перекрестной реактивности с антителом, которое специфически связывается с одним или более белковыми пептидами или антигенами TIC901, идентификации и очищения нуклеотидной последовательности, которая кодирует выявленный белок, экспрессии белка на основании нуклеотидной последовательности и демонстрации инсектицидной активности с помощью экспрессируемого белка.
Также рассматривается набор для выявления присутствия нуклеотидных последовательностей согласно настоящему изобретению, а также их зонды, праймеры, аналоги и производные. Такой набор содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, каждая из которых предназначена для использования либо в качестве зонда для выявления присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок согласно изобретению или его фрагмента, или родственной нуклеотидной последовательности, либо для использования в комбинации с одним или более другими зондами или праймерами, входящими в этот комплект, для амплификации одной или более последовательностей согласно настоящему изобретению или родственной нуклеотидной последовательности. Такие наборы могут также - или альтернативно - содержать антитело, специфичное в отношении связывания с одним или более пептидами или белками согласно изобретению, как и реагенты для использования с зондом или антителом, и указанные наборы будут содержать также контрольные образцы для их использования с той целью, чтобы убедиться, что нуклеотиды или пептиды, идентифицируемые с помощью зонда и/или антитела и реагентов, функционируют в соответствии с инструкциями изготовителей набора. Все реагенты, необходимые для выполнения способов идентификации либо нуклеотидной последовательности, либо пептидов, должны быть упакованы вместе в наборе, согласно инструкциям по применению. Примерный набор будет содержать нуклеотидную последовательность, полученную из TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и/или TIC431, кодирующую последовательность вместе с праймерами амплификации нуклеотидной последовательности, например, представленными в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, или различными комбинациями последовательностей SEQ ID NO:23-26 и SEQ ID NO:27-29, вместе с реагентами, необходимыми для проведения реакции амплификации, вместе упакованными в указанный набор.
Следовательно, предполагается, что композиция и способы, описанные в настоящем изобретении, предоставят много преимуществ на фоне известных ранее способов, включая, в частности, те, которые были подчеркнуты выше. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет полностью новый класс инсектицидных белков и нуклеотидных последовательностей, кодирующих эти белки, которые не были ранее известны в данной области.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГУРЕ 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности белков-предшественников TIC901p, TIC407p, TIC417p, TIC1201p и TIC431p; каждая аминокислотная последовательность содержит предсказанную тридцати(30)-членную аминоконцевую аминокислотную последовательность, характерную для сигнального пептида типа II, с последующими тринадцатью дополнительтельными аминокислотами, от аминокислоты в положении тридцать один (31) до аминокислоты в положении сорок три (43) соответствующих им последовательностей, которые не представлены в зрелом белке, выделенном из использованной ферментационной среды. Подчеркнутая аминокислота в положении 44 в консенсусной последовательности представляет собой амино-концевую аминокислоту зрелого белка. Нативную нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующие затененные аминокислоты в положениях 75-83, 147-153 и 275-283, использовали в качестве основы для построения избыточных нуклеотидных зондов и праймеров, используемых для идентификации последовательностей, кодирующих эти и другие родственные инсектицидные белки из нуклеотидных последовательностей видов Bacillus.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:1 представляет собой полученную в результате деградации геля по Эдману аминокислотную последовательность очищенного инсектицидного белка приблизительно в 38 кДа, секретируемого в клеточную среду клетками EG2158 штамма B.thuringiensis, и соответствует главным образом аминокислотной последовательности, представленной в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 от положения 44 до положения 58.
SEQ ID NO:2 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда для выявления tic901 или родственной нуклеотидной последовательности, или для использования в качестве одной из пары затравок тепловой амплификации для полной или частичной амплификации tic901 или родственной нуклеотидной последовательности, и соответствует триплетам кодонов, которые предпочтительны для применения штаммом B.thuringiensis и остальными штаммами Bacillus, в которых с особой частотой используется кодон, в котором частота встречаемости А или Т в положении третьей пары оснований внутри каждого кодона смещена в сторону повышенного содержания А или Т.
SEQ ID NO:3 представляет собой нативную (также упоминаемую здесь как последовательность дикого типа)) нуклеотидную последовательность Bacillus thuringiensis, кодирующую белок TIC901. Предсказанная последовательность блока Прибнова или Шайна и Дальгарно локализована вблизи нуклеотидов 141-147. Предсказанная открытая рамка считывания, кодирующая предсказанный предшественник белка TIC901, соответствует нуклеотидам от положения 153 до положения 1253. Нуклеотиды в положениях 282-325 по существу соответствуют гавным образом последовательности олигонуклеотидного зонда, как показано в последовательности SEQ ID NO:2, который гибридизируется с комплементарными нуклеотидами 282-325, как показано в последовательности SEQ ID NO:3. Валиновый кодон ГТА в положении нуклеотидов 282-284 соответствует аминоконцевой аминокислоте в секретируемой форме TIC901.
SEQ ID NO:4 представляет собой аминокислотную последовательность TIC901 из 367 остатков, выведенную дедуктивным путем из открытой рамки считывания, представленной, в SEQ ID NO:3, от нуклеотида в положении 153 до нуклеотида в положении 1253. Полная длина аминокислотной последовательности в 367 остатков соответствует предсказанной аминокислотной последовательности белка-предшественника, экспрессируемого из нативного/дикого типа кодирующей последовательности в B.thuringiensis. Аминокислотная последовательность от остатка номер 1 до остатка 30, представленная в SEQ ID NO:4, соответствует прогнозируемому аминоконцевому сигнальному пептиду или секреторному сигнальному пептиду, который продуцируется в B.thuringiensis при экспрессии нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, за которым следует тринадцать (13) аминокислот, не присутствующих в зрелой/секретируемой форме последовательности зрелого инсектицидного белка из 324 аминокислотных остатков при экспрессии в B.thuringiensis. Аминокислотная последовательность зрелого инсектицидного белка из 324 аминокислотных остатков соответствует инсектицидно эффективной последовательности зрелого и секретируемого белка TIC901. Аминокислотная последовательность из 43 аминоконцевых остатка предположительно протеолитически отщепляется от предшественника белка либо отчасти во время транслокации через бактериальную цитоплазматическую мембрану, либо отчасти в результате действия пока еще не определенных сигнальных пептидаз или других протеиназ, которые узнают консенсусную последовательность, содержащую последовательность аминокислотных остатков XAA1-XAA2-GLN непосредственно перед точкой расщепления, высвобождая зрелый инсектицидный белок во внеклеточную окружающую среду, где XAA1 соответствует серину (SER), лизину (LYS) или аспарагину (ASN), а XAA2 соответствует глутамату (GLU) или глутамину (GLN).
SEQ ID NO:5 представляет собой нативную нуклеотидную последовательность из B. thuringiensis, кодирующую инсектицидный белок, обозначенный здесь как TIC1201. Последовательность включает 529 нуклеотидов выше предполагаемого инициирующего кодона ATG, расположенного в положении нуклеотидов 530-532. Прогнозируемая консенсусная последовательность блока Прибнова или Шайна и Дальгарно расположена выше предполагаемого инициирующего кодона ATG, от нуклеотида в положении 518 до нуклеотида в положении 524. Открытая рамка считывания, кодирующая прогнозируемый предшественник белка TIC1201, подобно TIC901, включает в себя аминоконцевую аминокислотную последовательность, соответствующую прогнозируемому сигнальному пептиду или направляющему секрецию пептиду. Прогнозируемая последовательность, кодирующая сигнальный пептид TIC1201, кодирует тридцать (30) аминокислот, после которых следует тринадцать дополнительных аминокислот, которые отсутствуют в зрелой/секретируемой форме инсектицидного белка. Данные тринадцать аминокислот являются терминальными в последовательности, кодирующей пептидазу SER-GLN-GLN, распознающую последовательность, идентичную последовательности, присутствующей в последовательности предшественника белка TIC901. Аминокислотная последовательность инсектицидного белка TIC1201, высвобождающегося в среду из штаммов B.thuringiensis, экспрессирующих данную последовательность, как было предсказано на основании кодирующей последовательности, содержит 321 аминокислотный остаток и кодируется нуклеотидной последовательностью от положения 659 до положения 1621, представленной в SEQ ID NO:5. Даже несмотря на то, что предсказанная открытая рамка считывания (ORF), кодирующая предшественник белка TIC1201, идентифицирована здесь как расположенная в пределах нуклеотидов 530-1621, возможно, что открытая рамка считывания может быть расположена от нуклеотида 437 до нуклеотида 1621. Предполагалось, что это маловероятно из-за сходства сигнального пептида с таковым белка TIC901 и отсутствия какой-либо консенсусной последовательности блока Прибнова или Шайна и Дальгарно в пределах допустимой близости к какому-нибудь инициирующему кодону ATG, расположенному выше нуклеотидов 518-524.
SEQ ID NO:6 представляет собой выведенную дедуктивным путем 395-членную аминокислотную последовательность предшественника белка TIC1201 как кодируемую нуклеотидной последовательностью от нуклеотида 530 до нуклеотида 1621, как показано в SEQ ID NO:5.
SEQ ID NO:7 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую инсектицидный белок, обозначенный в настоящем документе как TIC407.
SEQ ID NO:8 представляет собой выведенную дедуктивным путем 368-членную аминокислотную последовательность TIC407 как кодируемую нуклеотидной последовательностью от нуклеотида в положении 196 до нуклеотида в положении 1299, представленной в SEQ ID NO:7.
SEQ ID NO:9 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую инсектицидный белок, обозначенный в настоящем документе как TIC417.
SEQ ID NO:10 представляет собой выведенную дедуктивным путем 364-членную аминокислотную последовательность для TIC417 как кодируемую нуклеотидной последовательностью от нуклеотида в положении 92 до нуклеотида в положении 1173, представленной в SEQ ID NO:9.
SEQ ID NO:11 представляет собой прямую последовательность праймера тепловой амплификации, или последовательность зонда, обозначенную в настоящем документе как prJWP139, соответствующую кодирующей последовательности, представленной в SEQ ID NO:3 от нуклеотида в положении 438 до нуклеотида в положении 458, и, кроме того, соответствующую кодонам, кодирующим аминокислотную последовательность ASN-ASN-ASN-HIS-GLN-THR-ASN-ARG от аминокислотной последовательности в положении 96-103, представленной в SEQ ID NO:4, смещенную в сторону кодонов, предпочтительных для использования в последовательностях генов, полученных из Bacillus thuringiensis или других штаммов вида Bacillus, в которых кодоны в третьем положении содержат A и/или T.
SEQ ID NO:12 представляет собой обратную последовательность праймера тепловой амплификации, или последовательность зонда, обозначенную в настоящем документе как prJWP143, соответствующую обратной комплементарной кодирующей последовательности, представленной в SEQ ID NO:3 от нуклеотида в положении 978 до нуклеотида в положении 998, и, кроме того, соответствует кодонам, кодирующим аминокислотную последовательность GLN-LYS-PHE-ILE-TYR-PRO-ASN, соответствующую аминокислотам в положениях 276-282 в последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, смещенную в сторону кодонов, предпочтительных для использования в последовательностях генов, полученных из Bacillus thuringiensis или других штаммов вида Bacillus, где кодоны содержат в третьем положении A и/или T.
SEQ ID NO:13 представляет собой синтетическую, искусственную или неприродно возникающую нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант аминокислотной последовательности TIC901.
SEQ ID NO:14 представляет собой аминокислотную последовательность, выведенную в результате дедукции из кодирующей от нуклеотида в положении 1 до нуклеотида в положении 1104.
SEQ ID NO:15 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP151.
SEQ ID NO:16 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP152.
SEQ ID NO:17 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP186.
SEQ ID NO:18 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP183.
SEQ ID NO:19 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP155.
SEQ ID NO:19 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP155.
SEQ ID NO:20 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP156.
SEQ ID NO:21 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP168.
SEQ ID NO:22 представляет собой искусственную нуклеотидную последовательность для в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP170.
SEQ ID NO:23 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP200.
SEQ ID NO:24 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP201.
SEQ ID NO:25 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP202.
SEQ ID NO:26 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP203.
SEQ ID NO:27 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP204.
SEQ ID NO:28 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе, как prJWP205.
SEQ ID NO:29 представляет собой вырожденную синтетическую олигонуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда или праймера, описанную в настоящем документе как prJWP206.
SEQ ID NO:30 представляет собой фрагмент кодирующей нуклеотидной последовательности, полученный при тепловой амплификации генома EG2158 олигонуклеотидами prJWP200 и prJWP204.
SEQ ID NO:31 представляет собой аминокислотную последовательность, полученную из первично открытой рамки считывания, приведенной в SEQ ID NO:30.
SEQ ID NO:32 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую инсектицидный белок, обозначенный в настоящем документе как TIC431.
SEQ ID NO:33 представляет собой выведенную дедуктивным путем 364-членную аминокислотную последовательность для TIC431 как кодируемую нуклеотидной последовательностью от нуклеотида в положении 1 до нуклеотида в положении 1092, представленной в SEQ ID NO:32.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению, открыт новый вид нуклеотидных последовательностей, кодирующих новый вид инсектицидных белков, полученных из Bacillus thuringiensis и родственных штаммов Bacillus. Как установлено в другом разделе настоящего документа, указанные нуклеотидные кодирующие последовательности гибридизуются друг с другом в подходящих условиях гибридизации, и белки, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисыворотками, полученными против любого другого из этих белков. Выравнивание нуклеотидных последовательностей, кодирующих зрелые/секретируемые формы белков TIC1201, TIC901, TIC407, TIC417 и TIC431, позволило обнаружить, что последовательность, кодирующая фрагмент зрелого белка TIC901 (секретируемой формы TIC901 от аминокислоты в положении 44 до аминокислоты положении 367, представленной в SEQ ID NO:4), является приблизительно на 79-91 процент идентичной каждой из последовательностей, кодирующих четыре остальных зрелых белковых фрагмента, раскрытых в настоящем описании; последовательность, кодирующая предсказанный фрагмент зрелого/секретируемого белка TIC417 (от аминокислоты в положении 44 до аминокислоты в положении 364, как представлено в последовательности SEQ ID NO:10), является приблизительно на 75-95 процентов идентичной каждой из последовательностей, кодирующих три других фрагмента зрелого белка, описанных в настоящем изобретении; последовательность, кодирующая предсказанный фрагмент зрелого/секретируемого белка TIC407 (от аминокислоты в положении 44 до аминокислоты в положении 368, как показано в последовательности SEQ ID NO:8), является приблизительно на 75-82 процента идентичной каждой из последовательностей, кодирующих четыре других фрагмента зрелого белка, описанного в настоящем изобретении; последовательность, кодирующая фрагмент зрелого/секретируемого белка TIC1201 (от аминокислоты в положении 44 до аминокислоты в положении 395, как показано в последовательности SEQ ID NO:6), является приблизительно на 80-91 процент идентичной каждой из последовательностей, кодирующей четыре других зрелых фрагмента белка, описанных в настоящем изобретении; и последовательность, кодирующая фрагмент зрелого/секретируемого белка TIC431 (от аминокислоты в положении 44 до аминокислоты в положении 364, как показано в последовательности SEQ ID NO:33), является приблизительно на 75-95 процентов идентичной каждой из последовательностей, кодирующих четыре других фрагмента зрелого белка, описанного в настоящем изобретении. Белки, кодируемые каждой из этих кодирующих нуклеотидных последовательностей, проявляют ингибирующую биологическую активность в отношении видов жесткокрылых и отчасти проявляют существенную идентичность аминокислотной последовательности, а отчасти - существенное сходство с аминокислотной последовательностью, и поэтому рассматриваются как родственные инсектицидные белки. Предсказанная аминокислотная последовательность зрелой/секретируемой формы инсектицидного белка TIC417 (TIC417m) является приблизительно на 78,9 процентов идентичной соответствующей аминокислотной последовательности зрелой/секретируемой формы TIC901 (TIC901m). Предсказанная аминокислотная последовательность зрелой/секретируемой формы инсектицидного белка TIC1201 (TIC1201m) является приблизительно на 90,1 процент идентичной соответствующей аминокислотной последовательности для TIC901m, и на 80,7 процент идентичной соответствующей аминокислотной последовательности для TIC417m и TIC431m. Предсказанная аминокислотная последовательность зрелой/секретируемой формы инсектицидного белка TIC407 (TIC407m) является приблизительно на 80% идентичной соответствующему TIC901m, приблизительно на 75% идентичной соответствующему TIC417m и приблизительно на 82% идентичной соответствующему TIC1201m. Предсказанная аминокислотная последовательность зрелой/секретируемой формы инсектицидного белка TIC431 (TIC431m) приблизительно на 75% идентична зрелому TIC407, приблизительно на 79% идентична зрелому TIC901, приблизительно на 80% идентична TIC1201, и приблизительно на 95% идентична аминокислотной последовательности зрелого белка TIC417. Каждый из белков, кодируемых нуклеотидными последовательностями, раскрытыми в настоящем изобретении, может быть экспрессирован в растениях, отдельно или в различных комбинациях друг с другом или с другими ингибирующими агентами жесткокрылых насекомых, такими как белки, кристаллические белки, δ-эндотоксины, лектины, пататины и другие токсины и им подобное, для достижения возможности контролировать сопротивляемость в отношении насекомых в области, где не представлялось это возможным ранее, просто используя известные инсектицидные белки, полученные из штаммов Bacillus thuringiensis, такие как белки Cry3, VIP и/или WAR, и/или белки MIS, и различные белки-ингибиторы жесткокрылых насекомых, полученные из штаммов Bacillus latersoporous, из штаммов Bacillus sphaericus и бактериальных штаммов Xenorhabdus и Photorhabdus. Белки согласно изобретению могут быть также использованы в растениях в комбинации с другими типами инсектицидных агентов или инсектицидными токсинами для достижения трансформации растений с целью получения возможности контролировать по меньшей мере одним способом один или более видов вредителей растений, выбранных из групп, состоящих из жесткокрылых насекомых-вредителей, чешуекрылых насекомых-вредителей, жалящих и сосущих насекомых-вредителей и пр. Другие белки или контролирующие насекомых агенты, которые могут быть экспрессированы в растении в комбинации с белками согласно изобретению, включают в себя, однако не ограничиваясь ими, инсектицидные белки, направленные против чешуекрылых из штаммов Bacillus, белки Cry, полученные из штаммов Bacillus thuringiensis, Bacillus laterosporous и Bacillus sphaericus, и белки WAR, MIS и/или белки VIP, выделяемые из различных штаммов Bacillus, инсектицидные белки, полученные из Xenorhabdus и Photorhabdus бактериальных штаммов, и такие композиции, как трансгенные двухцепочечные РНК, точно направленные на подавление одного или более генов у одного или более насекомых-вредителей. Используемые в настоящем документе выражения “инсектицидный полипептид” или “инсектицидный белок” или “их инсектицидный фрагмент” относятся к полипептиду, проявляющему инсектицидные свойства, то есть полипептиду, который ингибирует рост, развитие, жизнеспособность или плодовитость насекомых-вредителей, и к инсектицидному агенту, включая все указанные составляющие, так же как и двухцепочечная РНК, направленная на подавление одного или более генов у одного или более вредителей.
Неожиданно оказалось, что белки согласно изобретению кажутся не связанными с инсектицидными белками Bacillus thuringiensis, открытыми до сих пор в данной области. Белки согласно изобретению, как показано в настоящем документе, экскретируются во внеклеточное пространство, окружающее штаммы Bacillus, откуда эти белки получают. Указанные белки, как показано в настоящем документе, значительно меньше, чем известные белки Cry, VIP, WAR и MIS, ранее известные в данной области, и они могут быть экспрессированы в течение вегетационной стадии роста изолированной и очищенной бактериальной культуры клеток. Это не похоже на экспрессию белков Cry, которые экспрессируются обычно в фазе споруляции роста и которые образуют различные кристаллические тельца в предспоре клетки.
Как станет ясно специалистам в данной области, авторы данного изобретения открыли пути выделения и очистки нуклеотидной последовательности tic901, кодирующей предшественник белка TIC901 (TIC901p), который впоследствии обрабатывают протеолитически, с высвобождением зрелого белка TIC901 (TIC901m), который проявляет ингибирующую биологическую активность против видов жесткокрылых. Авторы данного изобретения открыли пути применения последовательности tic901 как способа для идентификации множества других родственных последовательностей, каждая из которых кодирует инсектицидные белки, родственные TIC901, TIC901p и TIC901m, а также применения антител, направленных против TIC901m, в способе ELISA для определения штаммов Bt, которые продуцируют белки, родственные TIC901, экспрессируемые из кодирующих последовательностей, родственных кодирующим последовательностям TIC901.
Нуклеотидные последовательности, раскрытые в настоящей заявке и кодирующие TIC901, получены из штаммов Bacillus thuringiensis, включая штаммы EG2158, EG6489, EG6561, EG12450 и EG4653. Указанные штаммы были депонированы, в соответствии с Будапештским Договором, в Стационарной Коллекции Культур службы сельскохозяйственных исследований, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), U. S. Department of Agriculture (USDA), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604. Релевантные штаммы были депонированы в NRRL между 29 апреля 1987 и 6 февраля 2002. Штамму B.thuringiensis EG2158 был присвоен номер доступа в NRRL № NRRL B-18213; а штамму B. thuringiensis EG12450 был присвоен номер доступа в NRRL № NRRL B-30357. Нуклеотидные последовательности, родственные tic901, и аминокислотные последовательности, родственные TIC901 (включая предшественник и разновидность зрелого TIC901), которые описаны в настоящем документе, включают в себя tic1201 и кодируемый инсектицидный белок TIC1201, выделяемый и продуцируемый по меньшей мере двумя штаммами B.t., EG3618 и 86833, tic407 и кодируемый инсектицидный белок TIC407, выделяемый и продуцируемый по меньшей мере штаммом B.t. EG6618, и tic417 и кодируемый инсектицидный белок TIC417, выделяемый и продуцируемый по меньшей мере штаммами B.t. EG2158, EG6489 и EG6561, и TIC431, кодируемый по меньшей мере штаммом B.t. EG4653, но не ограничиваются ими.
Культуральный бульон, полученный из очищенного штамма B.t. EG2158, тестировали на инсектицидную активность, и было показано, что он обладает ингибирующей биологической активностью в отношении жесткокрылых насекомых, направленной против колорадского картофельного жука (ККЖ). Белок массой около 38 кДа, как было определено методом SDS-PAGE, очищенный из культурального бульона, обладал, как было показано, указанной токсичностью в отношении жесткокрылых насекомых. Этот белок был подвергнут автоматической деградации по Эдману, и в результате получили аминокислотную последовательность, предположительно содержащую 15-членную аминоконцевую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:1) белка приблизительно в 38 кДа, то есть белка TIC901m. Полуизбыточная синтетическая олигонуклеотидная последовательность (WD444; SEQ ID NO:2), соответствующая образующимся природным путем кодонам, предпочтительна для использования в последовательностях, кодирующих белок, выделенный из Bacillus thuringiensis или родственных штаммов бактерии Bacillus, то есть кодонам, предпочтительно содержащим A или T в третьем положении каждого кодона, была сконструирована для использования в качестве зонда для детектирования последовательностей-гомологов, которые могли бы осуществлять кодирование инсектицидного белка приблизительно в 38 кДа в Bacillus thuringiensis. Библиотеку нуклеотидных последовательностей создавали из очищенной из Bt-штамма EG2158 ДНК. Очищенную ДНК полностью расщепляли под действием Hind III, и фрагменты встраивали в расщепленный под действием Hind III и обработанный фосфатазой из телячьего кишечника плазмидный вектор pUC18 для создания библиотеки генома Bt-штамма EG2158. Библиотеку ДНК трансформировали в штамм E. сoli, и трансформированную смесь наносили на твердую селекционную среду. Образующиеся колонии зондировали аликвотой щелочной фосфатазы, конъюгированной с аликвотой синтетической нуклеотидной последовательности WD444 (SEQ ID NO:2). Рекомбинантный штамм E. сoli конструировали как EG12447, содержащий плазмиду pEG1379 (известную также как pMON74007), производное pUC18, которая содержала фрагмент Hind III в 8 т.п.о., изолированный из штамма EG2158 B.thuringiensis, гибридизованный с олигонуклеотидным зондом, конъюгированным со щелочной фосфотазой. Фрагмент Hind III в 8 т.п.о. в плазмиде pEG1379 определяли посредством анализа нуклеотидной последовательности на содержание полной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок TIC901p. В NRRL поступил и 6 февраля 2002 был депонирован жизнеспособный штамм EG12447, который, согласно NRRL, хранится под номером доступа № NRRL B-30549.
Была определена нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания, кодирующая инсектицидный белок 38 кДа. Открытую рамку считывания, кодирующую белок TIC901p, конструировали как tic901. Открытая рамка считывания состоит из нуклеотидной последовательности в 1101 нуклеотид (нуклеотиды 153-1253, представленные в последовательности SEQ ID NO:3), и, по прогнозу, кодирует предшественник белка, состоящий из 367 аминокислот (последовательность SEQ ID NO:4). Прогнозируемый молекулярный вес аминокислотной последовательности, выведенной дедуктивным путем из посредством открытой рамки считывания, составляет 41492 Да, что вполне приемлемо для массы секретируемого белка, составляющей, согласно оценке методом SDS-PAGE-анализа, приблизительно 38 кДа, если принять во внимание потерю массы сигнального пептида от трех до четырех кДа. По прогнозам, предшественник белка (TIC901p) имеет изоэлектрическую точку 6,368 и чистый заряд -2,102 при pH 7,0. Полный состав нуклеотидной последовательности, кодирующей предшественник белка, соответствовал 69% AT, что сопоставимо с другими кодирующими последовательностями, идентифицированными из B.thuringiensis и других штаммов Bacillus. Нуклеотидный состав кодирующей последовательности также сопоставим с таковым других генов, охарактеризованных из видов Bacillus, содержащих приблизительно 39% аденозина, приблизительно 18% гуанозина, приблизительно 30% тимидина и приблизительно 13% цитозина.
Нативная кодирующая последовательность tic901 в pEG1379, по-видимому, не способна продуцировать измеряемое количество белка TIC901m в рекомбинантной культуре E. сoli, содержащей указанную плазмиду. Это не было неожиданностью, если учесть известное отсутствие функциональности промоторов Bacillus в E.coli и различия в предпочтительности кодонов между двумя организмами. Не наблюдалось ингибирования ККЖ культуральными супернатантами штамма EG12447 или клеток, содержащих данную плазмиду. Вставку в 8 т.п.о. вырезали и помещали в челночный вектор E.coli/B.thuringiensis для формирования плазмиды pEG12450. pEG12450 трансформировали в акристаллический штамм Bacillus thuringiensis, EG10650 (Патент США № 6468523), для получения штамма EG12450. EG10650 получали из акристаллического штамма EG10368 B.thuringiensis (идентифицированного в Патенте США № 5322687) путем замены npr и apr (гены нейтральной протеиназы и кислотной протеиназы, соответственно) делеционными мутантными аллелями этих генов, соответственно, npr3 и apr1 (Патент США № 5759538). Культуральные супернатанты, полученные из EG12450, проявляли положительную ингибирующую активность в отношении колорадского картофельного жука (ККЖ). Белок, очищенный из культурального супернатанта EG12450, также проявлял положительную ингибиторную активность в отношении ККЖ. Кристаллических структур в спорулированных культурах не наблюдали, но биомасса клеточных осадков/спорулированной культуры также давала положительный ответ в тесте на ингибирующую в отношении ККЖ биологическую активность, что дает основания предполагать, что некоторое количество белка TIC901 оставалось ассоциированным со спорой/культурой или что споры, поглощаемые тестируемыми видами насекомых, прорастали в в организме насекомых и продуцировали достаточное количество инсектицидного белка TIC901, чтобы вызвать наблюдаемый эффект ингибирования.
Культуральные супернатанты и очищенный белок из штамма EG12450 также тестировали на предмет определения биологической активности против личинок, повреждающих корни зерновых. Наблюдали ингибирующую биоактивность в отношении южного кукурузного жука и западного кукурузного жука, повреждающих корни кукурузы (Diabrotica undecempunctata howardii и Diabrotica virgifera virgifera, соответственно).
Для того чтобы определить, продуцируют ли штаммы B.thuringiensis и/или B. Sphaericus внеклеточные белки, родственные TIC901, авторы настоящего изобретения исследовали, как описано в настоящем документе, различные коллекции штаммов Bacillus. В частности, клеточный осадок и израсходованная среда от 279 штаммов были обработаны и представлены в биопробах на Southern-личинках, повреждающих корни зерновых. Около одной трети штаммов продуцировали секретируемые в ростовую среду белки, которые давали положительный ответ в тесте на ингибирующую активность в отношении личинок. Приоритет был отдан тридцати шести (36) штаммам, продуцирующим внеклеточные белки, которые проявляли наибольшую эффективность ингибирования личинок. Эти штаммы подвергали затем дополнительному скринингу путем определения того, гибридизируется ли кодирующая TIC901 последовательность с последовательностями, присутствующими в геноме каждого штамма, и сравнения результатов, полученных на этих штаммах, с результатами, наблюдаемыми при опробировании штамма EG2158 с нативной кодирующей последовательностью TIC901. Результаты показаны в Таблице 1.
Таблица 1RFLP-изотипы штаммов Bacillus, продуцирующих секретируемые ККЖ инсектицидные белки
Штамм
tic901RTLP<sup>1</sup>
TIC протеин Гомолог ID
EG2158<sup>2</sup>
A
901/417
EG2211
B
<i>1201</i>
EG2874
B
<i>1201</i>
EG2904
B
<i>1201</i>
EG3109
B
<i>1201</i>
EG 3111
B
<i>1201</i>
EG 3116
B
<i>1201</i>
EG 3117
B
<i>1201</i>
EG 3119
B
<i>1201</i>
EG 3120
B
<i>1201</i>
EG 3171
B
<i>1201</i>
EG 3173
B
<i>1201</i>
EG 3177
B
<i>1201</i>
EG 3354
B
<i>1201</i>
EG 3458
B
<i>1201</i>
EG 3461
B
<i>1201</i>
EG 3618
B
1201<sup>3</sup>
EG 3619
B
<i>1201</i>
EG 3620
B
<i>1201</i>
EG 3753
B
<i>1201</i>
EG 3787
B
<i>1201</i>
EG 4189
B
<i>1201</i>
EG 4191
B
<i>1201</i>
EG 4193
B
<i>1201</i>
EG 4332<sup>4</sup>
-
EG 4834
B
<i>1201</i>
EG 5194
B
<i>1201</i>
EG 5552
-
EG 5858<sup>4</sup>
-
EG 6489
A
901/417
EG 6555
B
<i>1201</i><sup>3</sup>
EG 6561
A
901/417
EG 6564
B
<i>1201</i>
EG 6618
C
407<sup>3</sup>
EG 6890
B
<i>1201</i>
EG 10650
-
86833
B
1201
<sup>1</sup> - Суммарную ДНК, изолированную из каждого штамма, полностью расщепляли под действием Hind III и анализировали методом Саузерн-блоттинга.Буквы A, B, C или D соответствуют размеру конкретного рестрикционного фрагмента (полиморфизм), выявленного с помощью tic901 или последовательности зонда SEQ ID NO:2.
<sup>2</sup> - EG2158 также содержит 3-ий гомолог нуклеотидной последовательности, родственный tic/901, tic1201, tic407 и tic417, как показано в последовательности SEQ ID NO:30.
<sup>3</sup> - указывает на то, что полученная нуклеотидная последовательность идентифицирована только частично, но при этом полученная полностью или частично последовательность кодируют белок, на 100% идентичный указанному белку TIC.
<sup>4</sup> - означает, что, как было показано, указанные штаммы продуцируют внеклеточные вещества, которые проявляют Lygus-ингибиторную биологическую активность.
Четыре (4) из тридцати шести (36) штаммов оказались не в состоянии продуцировать нуклеотидный фрагмент, который гибридизируется с зондами VIP1 или VIP 2 (штаммы EG4332, EG5858, EG6618 и 86833) в жестких ограничивающих условиях, то есть промывание в 0,5×SSC и при 65°C. Все другие штаммы продуцировали нуклеотидный фрагмент, который гибридизовался с зондом TIC901, однако при этом наблюдались интересные вариации интенсивности гибридизационного сигнала, в частности, в отношении рестрикционного фрагмента (фрагментов) Hind III, который выявляли с помощью зонда TIC901. В основном было три рестрикционных фрагмента разных размеров (полиморфизм), которые были идентифицированы посредством гибридизации с зондом tic901. Вначале полагали, что только один из трех различных фрагментов, способных к гибридизации при данных условиях с зондом tic901, присутствует в одном из штаммов. Два полиморфизма рестрикционных фрагментов проявляли сигналы различной интенсивности при гибридизации с зондом tic901 по сравнению с сигналом, продуцируемым при гибридизации этого зонда с фрагментом гена tic901 из штамма EG2158. Этот результат позволяет предположить, что существует по меньшей мере три аллеля последовательности, кодирующей tic901, которые присутствуют в указанных тридцати шести (36) штаммах. Анализ последовательностей каждого из трех полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов, как описано в настоящем документе, позволял идентифицировать каждую из данных родственных ОРС (открытых рамок считывания), кодирующих родственный белок TIC901, содержащийся внутри каждой последовательности. Сравнение данных нуклеотидных последовательностей было произведено, как показано в настоящем документе, посредством сравнения последовательностей с нативной кодирующей последовательностью TIC901 для определения степени идентичности. Кроме того, белки, кодируемые открытыми рамками считывания TIC901 и TIC1201 и идентифицированные в указанных рестрикционных фрагментах, тестировали на инсектицидные свойства, и каждый из них проявил токсичность в отношении жесткокрылых насекомых. Следовательно, сделали предположение, что белки TIC407 и TIC417, на основе их высокой степени родства к белкам TIC901 и TIC1201, также будут проявлять инсектицидную биологическую активность. По причине значительной идентичности аминокислотных последовательностей белков TIC407, TIC417 и TIC1201 в сравнении с TIC901, указанные белки описаны в настоящем документе как варианты аминокислотных последовательностей один другого. TIC1201, например, содержит на три аминокислоты меньше, чем TIC901 и содержит последовательность из 31 аминокислоты, различающуюся в сравнении с TIC901. Следовательно, при сравнении с TIC901, другие аминокислотные последовательности TIC содержат аминокислотные вариации, которые могут вносить свой вклад в различия инсектицидного спектра и/или вирулентности и эффективности. Последующий анализ этих или других штаммов при помощи технологии тепловой амплификации с использованием пары праймеров, которые имеют вырожденность, включенную в состав их последовательностей на основе выравниваний нуклеотидных последовательностей, кодирующих TIC901, TIC407, TIC1201 и TIC417, приводит к ампликонам, которые могли бы соответствовать кодирующей TIC407 последовательности, присутствующей в геноме штаммов EG5858, EG5552 и EG4332. Эти последовательности могли не проявляться при использовании специфического блота TIC901, потому что, как было определено, последовательность TIC407 присутствовала в большом, приблизительно в 18-19 т.п.о., фрагменте Hind III, который может не иметь эффективности при переносе на мембранный блот.
in planta
in planta
Предполагается, что белки согласно изобретению будут использоваться для сельскохозяйственных целей, то есть для защиты растений от заражения насекомым-вредителем и, более конкретно, для защиты растений от заражения жесткокрылым насекомым-вредителем. Как проиллюстрировано здесь примером, белки согласно изобретению полезны для защиты растений по меньшей мере от заражения колорадским картофельным жуком и по меньшей мере от заражения кукурузным жуком. Защита растения может быть достигнута местным нанесением на растение или части растения, такие как поверхность растения, то есть листья, цветы, стволы, стебли и корни, композиции в виде порошка, спрея, пудры или эмульсии или других сельскохозяйственных наполнителей, которые содержат инсектицидно эффективное количество одного или более белков согласно изобретению. Альтернативно, сельскохозяйственный наполнитель может содержать, в дополнение к одному или более белкам согласно изобретению, один или более дополнительных инсектицидных белков, эффективных в отношении ингибирования того же самого спектра насекомых-вредителей, которые контролируются также и белками согласно изобретению, такими как белки Cry3, CryET33/34, CryET80/76, PS149B1, и другие токсические белки-двойные ингибиторы жесткокрылых, белки VIP/MIS/WAR и им подобные, и/или белки, которые эффективно контролируют полностью различный спектр насекомых-вредителей растений, такие как Cry1, Cry2, Cry9 и подобные им белки. Также в рамках настоящего изобретения сельскохозяйственные наполнители, описанные выше, могут содержать также и другие типы пестицидных композиций, такие как фунгициды и/или акарициды и им подобные. Альтернативно - и предпочтительно, чтобы растение как таковое могло быть трансформировано таким образом, чтобы оно содержало одну или более нуклеотидных последовательностей, модифицированных с целью улучшения экспрессии одного или более белков согласно изобретению  или экспрессии их инсектицидной части, отдельно или в комбинации с другими инсектицидными агентами, такими как те, что способны продуцироваться , с использованием методов молекулярной биологии, включая методы, опосредованные двунитевой РНК, для супрессии генов в клетках вредителей-мишеней.
Белки TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 являются инсектицидными соединениями, активными против жесткокрылых насекомых-вредителей, таких как ККЖ и личинки, повреждающие корни. Указанные белки, представленные в последовательностях SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33, соответственно, и их инсектицидные фрагменты, а также родственные инсектицидные белки могут быть использованы в качестве активного ингредиента в инсектицидных композициях, используемых для контролирования жесткокрылых насекомых-вредителей. В отношении белков, о которых идет речь в настоящем документе, а также ссылочных инсектицидных белков, которые являются родственными этим белкам, надо понимать, что родственные инсектицидные белки - это те, которые идентифицируются как гомологи данных белков, или те, которые идентифицируются как кодируемые нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется либо в жестких условиях гибридизации, либо в условиях специфической гибридизации со всей нативной последовательностью Bacillus thuringiensis или с ее частью, кодирующей белок TIC901, белок TIC1201, белок TIC417, белок TIC407, белок TIC431 или их инсектицидную часть. Жесткие условия, как определено в настоящем документе, включают в себя гибридизацию по меньшей мере при 42°C, с последующими двумя промывками 2×SSC, 0,1% SDS, по пять минут каждая, при комнатной температуре, с последующими двумя промывками, по тридцать минут каждая, при 65°C в 0,5×SSC, 0,1% SDS. Конечно, специалисту в данной области должно быть понятно, что из-за избыточности генетического кода многие другие последовательности также способны кодировать такие родственные белки, и эти последовательности, в том смысле, что они функционируют, экспрессируя инсектицидные белки либо в штаммах Bacillus, либо в клетках растения, считаются входящими в объем настоящего изобретения, конечно, учитывая при этом, что многие из таких избыточных кодирующих последовательностей не будут в этих условиях гибридизоваться с нативными последовательностями, кодирующими TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и/или TIC431. Следует понимать, когда речь идет о TIC901 или родственном инсектицидном белке или его инсектицидном фрагменте, или когда речь идет о нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 или родственный инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент, что TIC901 является взаимозаменяемым и неотличимым от TIC407, TIC417, TIC431 и TIC1201 и подобных им белков, включая аминокислотную последовательность, приведенную в последовательности SEQ ID NO:31, кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в последовательности SEQ ID NO:30, которая включает в себя полноразмерный инсектицидный белок, кодируемый полноразмерной кодирующей этот белок последовательностью, и часть этого белка в качестве примера приведена в виде аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31.
Некоторые нуклеотидные последовательности, которые могут быть отнесены к родственным нуклеотидным последовательностям согласно изобретению, не могут гибридизоваться в жестких условиях, но фактически гибридизуются с tic901, tic1201, tic407, tic431 и/или tic417 или родственной последовательностью при использовании условий специфической гибридизации. Такие последовательности могут кодировать белок, который по меньшей мере приблизительно на 30% идентичен аминокислотной последовательности белков согласно изобретению. Белки, обнаруживающие по меньшей мере приблизительно 30% идентичность последовательности, могут иметь также очень схожие третичные структуры, и следовательно, могут проявлять также и сходную или родственную биологическую активность. В отношении настоящего изобретения, такое сходство в третичной структуре будет распространяться также и на наличие инсектицидной биологической активности. Условия специфической гибридизации, которые дают возможность идентифицировать более отдаленные в родственном отношении нуклеотидные последовательности, включают в себя сначала гибридизацию при низкой температуре, обычно приблизительно в 40°C или около того, после чего следует промывка, как указано выше, при комнатной температуре, для удаления неспецифически связанного зонда, после чего следует экспозиция на пленке (в случаях, когда исследователи пользуются средствами введения изотопной метки) или экспозиция с иммунологическими реагентами и химическими реагентами для идентификации нуклеотидных фрагментов, которые гибридизуются со специфическим генным зондом. Указание на то, что гибридизация является неспецифической, означает, что при этом наблюдается большое количество гибридизующихся фрагментов. В случаях, когда наблюдается довольно много гибридизующихся фрагментов, блот промывали один или более раз, каждый раз при слегка более высокой температуре, чем при предыдущем промывании (например, каждое промывание может завершаться при температуре на 5°С выше, чем предыдущее) пока не будут наблюдаться только один или несколько (два или три) гибридизующихся фрагмента, и указанные один или несколько фрагментов, проявляя специфическую гибридизацию, затем могут быть клонированы и секвенированы с целью определения степени их гомологии и/или идентичности исходной последовательности зонда. Такие последовательности должны считаться особо родственными в том отношении, что они кодируют белки, имеющие родственную функцию, например инсектицидную активность, с белком, кодируемым исходной последовательностью, полученной из нуклеотидного зонда.
Считается, что функцией кодирующих последовательностей является кодирование целиком или только инсектицидной составляющей белка TIC901 или родственного ему белка, который не гибридизуется в жестких условиях. Однако такие последовательности получены из нативной нуклеотидной последовательности на основе того, что нативная нуклеотидная последовательность способна при модификации проявлять ненативную последовательность, которая, однако, все еще кодирует ту же самую или по существу ту же самую нативную аминокислотную последовательность, или что нативная аминокислотная последовательность способна, при ее использовании вместе с набором кодонов, к обратной трансляции из аминокислотной последовательности, позволяя специалисту в данной области прийти к нуклеотидной последовательности, которая кодирует белок TIC901 полностью или его инсектицидную часть, или же родственный белок. Подразумевается, что все такие последовательности входят в объем настоящего изобретения.
Инсектицидные композиции могут быть продуцированы из бактериальных штаммов, экспрессирующих белки согласно изобретению. Штамм B.thuringiensis, содержащий одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более TIC901 или родственных белков и/или по существу им эквивалентных, может быть культивирован с использованием известных стандартных питательных сред и технологий ферментации. Поскольку белки согласно изобретению преимущественно секретируются во внеклеточную среду, по завершении цикла ферментации бактерии, экспрессирующие TIC901 или его гомолог, могут быть собраны сначала путем отделения B.thuringiensis, вместе со всеми продуцируемыми ими спорами и кристаллами, от отработанного ферментационного бульона способами, хорошо известными в данной области. Восстановленные споры и кристаллы B.thuringiensis могут быть составлены в смачивающийся порошок, жидкий концентрат, гранулы, растворы, эмульсии, спрей, суспензию, пудру, пену, пасту, аэрозоль, капсулу или другой тонко или грубо разделяемый материал или пропитывающее вещество для натурального или синтетического материала, или другую композицию в смеси с подходящим наполнителем, разбавителем, адъювантом, консервантом, диспергирующим веществом, растворителем, эмульгирующим агентом, инертными наполнителями и другими компонентами, подходящими для физического или химического соединения с растениями или их частью, для их перорального поглощения патогенными для растений организмами-мишенями и для облегчения контроля над конкретными насекомыми-вредителями. Рецептурный Состав и процедуры нанесения хорошо известны в данной области.
Композицию с гранулами-приманкой, содержащую какой-либо аттрактант, а также споры и кристаллы изолятов B.thuringiensis или сконцентрированную отработанную ферментационную среду или инсектицидные белки, очищенные от спор или от отработанной ферментационной среды, или рекомбинантные микробы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие TIC901 или родственные инсектицидные белки, получаемые из описанных здесь изолятов B.thuringiensis, могут быть нанесены на среду обитания насекомых-вредителей. Приманка может быть нанесена обильно, так как токсин не оказывает действия на животных или человека. Продукт может быть составлен также в виде спрея или порошка. Насекомые-вредители переносят продукт на своих лапках или брюшках в гнездо, где другие насекомые-вредители будут подвергаться действию токсина. Изолят B.thuringiensis или рекомбинантный хозяин, экспрессирующий нуклеотидную последовательность или ген, кодирующий TIC901 или родственный белок согласно изобретению, также могут быть встроены в приманку или в источник пищи для насекомых-вредителей.
2
4
Как хорошо известно специалистом в данной области, пестицидная концентрация будет варьировать в широких пределах, в зависимости от природы конкретной композиции, в частности, от того, будет ли она представлять собой концентрат или же будет использоваться непосредственно. Пестицид будет присутствовать по меньшей мере в количестве 1% от веса и может составлять 100% веса композиции. Сухие композиции будут содержать пестицид в количестве приблизительно от 1 до 95% по весу, в то время как жидкие рецептурные составы будут в основном содержать приблизительно от 1 до 60% по весу твердого вещества, суспендированного или такого, которое может быть суспендировано в жидкой фазе. Композиции будут в основном содержать приблизительно от 10 до 10 клеток/мг или от 5 до 100 частей на миллион активного компонента инсектицидного белка, то есть белка TIC901, варианта его аминокислотной последовательности, его инсектицидной составляющей или его фрагмента или его гомолога, такого как TIC431, TIC1201, TIC417 и TIC407. Эти композиции будут наноситься в количестве приблизительно от 50 мг (жидкого или сухого вещества) до 1 кг или более на гектар. Композиции могут быть внесены в окружающую жесткокрылых насекомых-вредителей среду, то есть на растения, почву или воду посредством распыления, опыления, разбрызгивания или подобным образом, и могут также быть нанесены на поверхность семян, как то: обработка семян, покрытие семян слоем, введение в оболочку семян и/или семядоли(лей). Специалист в данной области признает также, что комбинации белков согласно изобретению, при их комбинировании вместе в композицию или рецептурный состав, могут также иметь конкретное применение и оказывать благоприятные воздействия, например, в плане охвата более широкого круга хозяев для контроля заражения насекомыми или повышения вирулентности и эффективности композиции, предназначенной для использования в качестве инсектицидного агента.
Специалистам в данной области хорошо известны способы конструирования вариантов или модификаций нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок согласно изобретению или его инсектицидный фрагмент, или вариант его инсектицидной аминокислотной последовательности, которая проявляет улучшенную инсектицидную активность по сравнению с нативной аминокислотной последовательностью, и поместить данную нуклеотидную последовательность в экспрессирующую кассету, функция которой в растениях связана с тем, чтобы вызывать транскрипцию кодирующей последовательности в матричную РНК, которая впоследствии транслируется в клетках растения, таким образом, чтобы внутри тканей растения продуцировалось инсектицидно эффективное количество инсектицидного белка. Также в данной области можно трансформировать клетку растения, предпочтительно зерно, хлопок, соевые бобы, рапс, рис, пшеницу, овес, сорго, траву, кормовое растение, фруктовое дерево, декоративный цветок, томат, картофель, морковь, капусту и клетку табака и им подобное посредством нуклеотидной последовательности, встроенной в растения в составе функциональной экспрессирующей кассеты; выбрать для клеток, которые содержат такую последовательность и экспрессированы инсектицидно эффективными количествами белка TIC901 (и/или вариантом его аминокислотной последовательности, инсектицидной составляющей или его фрагментом, или его гомологом, такими как TIC431, TIC1201, TIC417 и TIC407), и получать растения из таких трансформированных клеток. Специалисту в данной области известно применение электропорации, инфузии, баллистических методов или способов, опосредованных Agrobacterium tumefaciens, и подобных приемов для введения нуклеотидных последовательностей согласно изобретению или их модификаций в растительную клетку. Такие способы хорошо известны в данной области.
Под термином "вариант или модифицированная" в отношении нуклеотидных последовательностей подразумеваются нуклеотидные последовательности, которые кодируют одинаковые токсины или которые кодируют эквивалентные токсины, которые имеют сходную инсектицидную активность; термин "эквивалентный токсин" относится к токсину, проявляющему такую же, по существу такую же, или улучшенную биологическую активность против насекомых-мишеней-вредителей, которая присуща нативному или ссылочному токсину. Вариант последовательности или модифицированная нуклеотидная последовательность, предназначенная для применения в отношении двудольных растений, могла бы кодировать по существу ту же самую аминокислотную последовательность, что и нативная кодирующая последовательность, то есть кодирующая последовательность, существующая в природе, но при этом содержала бы в себе полный объединенный GC-состав приблизительно от 49 до 58 процентов, и при этом в ней избегали бы использования наименее предпочтительного кодона, который используется двудольными растениями, определяемого посредством компиляции частот таких предпочтений и использования из консорциума кодирующих последовательностей, полученных из одного или более конкретных видов двудольных растений, предназначенных для трансформации посредством варианта или модифицированной нуклеотидной последовательности. Вариант или модифицированная нуклеотидная последовательность, предназначенная для применения в отношении двудольных растений, могла бы кодировать по существу ту же самую аминокислотную последовательность, что и нативная кодирующая последовательность, то есть кодирующая последовательность, существующая в природе, и при этом содержала бы в себе полный объединенный GC-состав приблизительно от 52 до 64 процентов или более, и при этом в ней избегали бы использования наименее предпочтительного кодона для кодирования любой аминокислоты, что определяемого посредством компиляции частот таких предпочтений и использования из консорциума кодирующих последовательностей, полученных из одного или более конкретных видов однодольных растений, предназначенных для трансформации посредством варианта или модифицированной нуклеотидной последовательности. Под частотой использования кодона подразумевается то, какое число раз в среднем конкретный кодон используется в кодирующей последовательности. Для конкретных видов растения кодон, который предназначен для кодирования конкретной аминокислоты в образующейся аминокислотной последовательности, будет использован в среднем с некоторой относительно фиксированной частотой. Для аминокислот, кодируемых только двумя кодонами, частота кодирования составляет в основном пятьдесят на пятьдесят, то есть в половине случаев, за исключением тех случаев, когда в одном из кодонов используется существенно большее количество пуринов или пиримидинов, которые являются нетипичными для GC-состава данного конкретного вида растений. Например, для видов Bacillus кодирующие последовательности в основном состоят приблизительно на 60 и почти до 70 процентов из AT. Использование кодонов у видов Bacillus смещено в сторону использования кодонов, которые обогащены присутствием A или T в конкретном кодоне, а более конкретно в положении третьего основания любого конкретного кодона. Следовательно, кодоны, в которых в первую очередь встречаются G или C, используются у Bacillus в нативной и/или природно возникающей последовательности с намного меньшей частотой, нежели кодоны, которые содержат A или T. Следовательно, когда продуцируется вариант или модификация нуклеотидной последовательности, предназначенной для использования у конкретного растения, однодольного или двудольного, важно обращать внимание на то, что следует избегать частого использования наименее предпочтительного для данного конкретного растения кодона. Фактически для однодольных желательно, чтобы кодирующая последовательность имитировала такой уровень содержания GC, который наиболее часто встречается в нативных или природно возникающих кодирующих последовательностях в однодольных растениях; предпочтительно, чтобы GC-содержание составляло приблизительно 65% в составе первых приблизительно 10% кодирующей последовательности, чтобы GC-содержание уменьшалось приблизительно до 60% в составе следующих приблизительно 10-15% кодирующей последовательности, и чтобы GC-содержание снижалось до уровня приблизительно 50-55% к середине одной половины или более кодирующей последовательности, с последующим постепенным увеличением процентного GC-содержания приблизительно до 60-64% в последних 15-20% кодирующей последовательности. Такое процентное распределение GC-содержания приближено, насколько возможно, к распределению GC-содержания в природном гене однодольных, и следовательно, надо полагать, что синтетический или искусственно продуцируемый ген или кодирующая последовательность также должны соответствовать этой архитектуре.
Здесь "синтетическая кодирующая последовательность" или "кодирующая последовательность неприродного происхождения", кодирующие в B.thuringiensis белки TIC901 или их гомологи, или их производные в качестве инсектицидных токсинов согласно изобретению, относятся к продукту, получаемому путем любого типа генетической очистки или манипуляции, результат которой состоит в получении кодирующей последовательности, которая кодирует инсектицидный белок TIC901 или родственную аминокислотную последовательность, или гомолог, или вариант, или по существу их эквивалент, включая кодирующие последовательности, которые кодируют по меньшей мере инсектицидную часть белка TIC901, белка TIC431, белка TIC1201, белка TIC407 или белка TIC417. Данная процедура включает в себя выделение кодирующей последовательности из ее природного состояния, манипуляции с кодирующей последовательностью наподобие модификации кодона (как описано в настоящем документе), химического синтеза, такого как фосфорамидитная химия и подобное, или сайт-специфического мутагенеза (как описано в настоящем документе), укорочения кодирующей последовательности или любой другого манипуляционного или выделительного способа.
Используемый здесь "процент идентичности последовательности" определяется путем сравнением двух оптимально выровненных последовательностей в интервале рамки сравнения, где часть последовательности в рамке сравнения может включать в себя добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению со ссылочной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) при оптимальном выравнивании двух последовательностей. Процент идентичности вычисляется путем определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток совпадают в обеих последовательностях, от общего числа выровненных положений, путем деления числа выровненных положений на общее число положений в рамке сравнения и путем умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательности. Последовательность, которая идентична в каждом положении при сравнении со ссылочной последовательностью, будет идентична ссылочной последовательности, и наоборот. Первая нуклеотидная последовательность, при рассмотрении в направлении от 5' к 3', будет "комплементарной" второй или ссылочной нуклеотидной последовательности, рассматриваемой в направлении от 3' к 5', если первая нуклеотидная последовательность проявляет полную комплементарность по отношению ко второй или ссылочной последовательности. В настоящем документе говорится, что молекулы последовательности нуклеиновой кислоты проявляют "полную комплементарность", когда каждый нуклеотид одной из последовательностей при считывании от 5' к 3' комплементарен каждому нуклеотиду другой последовательности при считывании от 3' к 5'. Нуклеотидная последовательность является идентичной в каждом положении, когда считывание от 5' к 3' при сравнении со считыванием ссылочной нуклеотидной последовательности от 5' к 3' является идентичным ссылочной последовательности, и наоборот. Нуклеотидная последовательность, которая является комплементарной ссылочной нуклеотидной последовательности, будет идентична обратной комплементарной последовательности ссылочной нуклеотидной последовательности. Данные термины и объяснения хорошо известны в данной области и вполне понятны рядовым специалистам в данной области.
Используемый здесь термин "по существу гомологична" в отношении нуклеотидных последовательностей относится к нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются в жестких условиях с кодирующими последовательностями, представленными в последовательностях SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:32 или их комплементарными последовательностями. Последовательности, которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностями SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:32 или их комплементарными последовательностями, конкретно приблизительно от нуклеотида в положении 153 и приблизительно до нуклеотида в положении 1253 в последовательности SEQ ID NO:3, и более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 282 и приблизительно до нуклеотида в положении 1253 в последовательности SEQ ID NO:3; или приблизительно от нуклеотида в положении 437 и приблизительно до нуклеотида в положении 1621 в последовательности SEQ ID NO:5, более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 530 и приблизительно до нуклеотида в положении 1621 в последовательности SEQ ID NO:5, и, еще более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 659 и приблизительно до нуклеотида в положении 1621 в последовательности SEQ ID NO:5; или приблизительно от нуклеотида в положении 196 и приблизительно до нуклеотида в положении 1299 в последовательности SEQ ID NO:7, или, более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 325 и приблизительно до нуклеотида в положении 1299 в последовательности SEQ ID NO:7; или приблизительно от нуклеотида в положении 215 и приблизительно до нуклеотида в положении 1306 в последовательности SEQ ID NO:9, или, более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 344 и приблизительно до нуклеотида в положении 1306 в последовательности SEQ ID NO:9, или приблизительно от нуклеотида в положении 1 и приблизительно до нуклеотида в положении 1092, представленными, в последовательности SEQ ID NO:32, или, более конкретно, приблизительно от нуклеотида в положении 130 и приблизительно до нуклеотида в положении 1092, представленными в последовательности SEQ ID NO:32, содержат одну или более сопредельных нуклеотидных последовательностей, которые достаточно идентичны одной или более сопредельным нуклеотидным последовательностям в последовательностях SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:9, так что возможно выравнивание между двумя последовательностями, и две последовательности могут в жестких условиях образовывать водородные связи с соответствующими основаниями противоположной нити, образуя дуплексную молекулу, которая достаточно стабильна в жестких условиях в течение довольно продолжительного периода, чтобы ее можно было обнаружить способами, известными в данной области. Такие по существу гомологичные последовательности имеют степень идентичности, составляющую приблизительно от 67% и приблизительно до 70%, или более предпочтительно, приблизительно от 80% и приблизительно до 85%, или, более предпочтительно, приблизительно от 90% и приблизительно до 95%, и приблизительно до 99% или более по отношению к нуклеотидным последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:9 или их комплементарным последовательностям. Кроме того, нуклеотидные последовательности, которые кодируют инсектицидные белки, выделяемые из Bacillus thuringiensis или других штаммов вида Bacillus и подобных, и которые гибридизуются в жестких условиях с последовательностью SEQ ID NO:2, также проявляют существенную гомологию с вышеназванными нуклеотидными последовательностями, гибридизующимися в жестких условиях с последовательностью, кодирующей tic901, tic1201, tic407, tic417 и tic431, представленной в последовательности SEQ ID NO:3 или последовательностях SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32, соответственно, или их комплементарными последовательностями. Такие нуклеотидные последовательности относят здесь к гомологам последовательности SEQ ID NO:3 и подобной ей и включают в себя последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 и родственные им последовательности и их гомологи.
В применении к полипептидным последовательностям термины "идентичный по существу" или "по существу подобный" относятся к полипептидам, которые проявляют по существу идентичность аминокислотной последовательности или по существу подобие аминокислотной последовательности по отношению к ссылочной аминокислотной последовательности, фактически, как описано в настоящем документе, определенные аминокислоты можно заменить другими аминокислотами, на основании их показателей гидрофобности или гидрофильности, что приводит к белку с подобной биологической активностью, то есть получается белок с эквивалентной биологической функцией. Следовательно, аминокислотная последовательность, проявляющая по существу идентичность или по существу подобие ссылочному полипептиду или аминокислотной последовательности, будет проявлять приблизительно от 30% приблизительно до 50% идентичности аминокислотной последовательности ссылочной последовательности, более предпочтительно, приблизительно от 70% приблизительно до 80% идентичности аминокислотной последовательности по отношению к ссылочной последовательности, более предпочтительно, приблизительно от 86% приблизительно до 90% идентичности аминокислотной последовательности по отношению к ссылочной последовательности, и наиболее предпочтительно, приблизительно от 95% приблизительно до 99% идентичности аминокислотной последовательности по отношению к ссылочной полипептидной последовательности. Более конкретно, авторы настоящего изобретения имеют в виду пептиды, проявляющие инсектицидную активность, родственную пептидам согласно изобретению и проявляют по существу идентичность или по существу подобность пептидам согласно изобретению и проявляют по меньшей мере приблизительно 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и 99-процентную идентичность или сходство с ссылочными полипептидными последовательностями, как установлено в настоящем документе, и выбранные из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33.
По отношению к белкам, описанным в настоящей заявке, термины "вариант аминокислоты", или "вариант аминокислотной последовательности", или "модифицированный вариант аминокислотной последовательности" относятся к аминокислотным последовательностям, которые по существу эквивалентны аминокислотным последовательностям согласно изобретению. Например, белок, продуцируемый посредством интродукции рестрикционного сайта для удобства молекулярных манипуляций в кодирующую последовательность согласно изобретению, в результате содержит добавление или делецию одного или более кодонов без того, чтобы в ином случае приходилось производить (1) разрыв нативной кодирующей последовательности, (2) разрыв нативной открытой рамки считывания и (3) разрушение инсектицидной биологической активности белка, будет представлять собой (a) вариант аминокислотной последовательности по сравнению с нативным инсектицидным токсином, (b) аминокислотный вариант последовательности по сравнению с нативным инсектицидным токсином, или (c) модифицированный аминокислотный вариант последовательности при сравнении с нативным инсектицидным токсином. Специалистам в данной области известны другие типы модификаций, которые могут быть применены к аминокислотной последовательности согласно изобретению без нарушения биологической активности белка. Термин "разрушение" по отношению к биологической активности означает модификации нативной аминокислотной последовательности посредством вставки или делеции одной или более аминокислот, или обмена, или замены одной аминокислоты на другую, которые не уменьшают инсектицидную биологическую активность белка. Вставки, делеции и замены входят в объем настоящего изобретения, так что вариант аминокислотной последовательности проявляет инсектицидную активность, не меньшую, чем нативный инсектицидный белок. Химерные белки, описанные в настоящей заявке, слияние белков или части белков, описанные в настоящей заявке, пермутеины белков, описанные в настоящей заявке, рассмотрены здесь особенно подробно.
Белки, которые по существу эквивалентны белкам согласно изобретению, должны быть их биологическими функциональными эквивалентами. Используемая здесь фраза "биологические функциональные эквиваленты" по отношению к инсектицидным белкам согласно изобретению означает пептиды, полипептиды и белки, которые содержат последовательность или ее часть, которая подобна последовательности новых пептидов согласно изобретению, таких как белок TIC901 или его инсектицидный фрагмент, или TIC1201, TIC410, TIC407 или белок TIC431 или его инсектицидный фрагмент, и которая проявляет такие же или подобные функциональные свойства, что и полипептиды, раскрытые в настоящем изобретении, включая инсектицидную активность. Биологические эквиваленты также включают в себя пептиды, полипептиды и белки, которые реагируют, то есть специфически связываются, с антителами, направленными против эпитопов, и присутствуют в TIC901 и родственных белках, таких как TIC1201, TIC417, TIC407 и TIC431 и их инсектицидных фрагментах, и которые проявляют такую же или подобную связывающую или реакционную активность, включая моноклональные и поликлональные антитела.
Предполагается также, что белки согласно изобретению могут быть использованы для защиты двудольных растений от заражения насекомыми-вредителями. Заражение может происходить жесткокрылыми, двукрылыми, чешуекрылыми и даже клещами, мучным хрущаком и также различными насекомыми-вредителями, наносящими вред растению, проникая в ткани растения и лишая растения пищи, необходимой для роста и развития. Модификации первичной аминокислотной последовательности белков согласно изобретению приводят к появлению белка, имеющего круг хозяев, отличный от таковых нативного белка.
Белки согласно изобретению, вследствие того, что при экспрессии штаммами Bacillus они локализуются во внеклеточном пространстве, могут быть использованы для нацеливания других белков на локализацию во внеклеточном пространстве. Например, специалист в данной области знаком с фактом связывания первого белка, который в норме не секретируется во внеклеточное пространство, со вторым белком, который в норме секретируется во внеклеточное пространство, с целью локализовать первый белок во внеклеточном пространстве. Белки согласно изобретению могут быть слиты различными способами, известными в данной области, с одним или более инсектицидными токсинами, такими как кристаллические дельта-токсины, с образованием химерного белка, который нацелен на секрецию во внеклеточное пространство, окружающее конкретную хозяйскую клетку. Представляется даже, что процесс секреции сам по себе мог бы приводить к разделению двух частей белка, так чтобы два отделенных и различных инсектицидных белка высвобождались во внеклеточное пространство, окружающее конкретную клетку-хозяина. Два белка могли бы либо (1) оба проявлять токсичность в отношении одних и тех же видов насекомых-вредителей, но проявлять инсектицидную активность разными способами, либо (2) каждый из белков проявлял бы токсичность к разным видам насекомых-вредителей. Возможно, что любое количество инсектицидных белков можно связать конец-в-конец с белками согласно изобретению для формирования мультимерных химер, нацеленных на внеклеточное пространство, окружающее конкретную клетку-хозяина. Такие "другие" белки предположительно могут представлять собой зеленый флуоресцирующий белок или родственные белки и варианты, киназы и фосфатазы для модуляции клеточных сигнальных процессов, нуклеазы, липазы, толерантные гербицидные белки, экспрессируемые генами, такими как gox, различными гомологами epsps, bar и гомологами и подобными им, PhnO, NptII, Aad и подобными им. Все указанные белки могут использоваться в качестве селективных маркеров, в частности, при связывании с геном, кодирующим один или более белков согласно изобретению, для отслеживания присутствия генов, кодирующих один или более белков согласно изобретению в клетке растения или другой хозяйской клетке.
Белки согласно изобретению могут быть нацелены на импорт в субклеточные органеллы. Например, первая нуклеотидная последовательность, кодирующая нацеливающую последовательность хлоропласта или пластиды, может быть оперативно связана или слита со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей инсектицидный белок согласно изобретению для получения предшественника химерного белка, который нацелен на включение в хлоропласт или пластиду в клетке растения. Результатом экспрессии таких химерных белков будет импорт белков согласно изобретению в хлоропласт или пластиду растения и, следовательно, локализация инсектицидного токсина или его инсектицидного фрагмента в хлоропласте или пластиде. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая один или более белков согласно изобретению, может быть локализована в хлоропласте или пластиде для ее экспрессии. Локализация нуклеотидных последовательностей в пластиде или хлоропласте может привести к встраиванию нуклеотидных последовательностей в геном хлоропласта или пластиды или может привести к автономной репликации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно изобретению. В любом случае белки согласно изобретению должны быть локализованы в хлоропласте или пластиде. В связи с этим используемая здесь фраза “локализованный в хлоропласте или пластиде” относится к биологической молекуле, полинуклеотиду либо полипептиду, находящимся в пределах хлоропласта или пластиды, так что молекула, изолированная из цитоплазматической среды клеток и функционирующая в пределах цитоплазмы хлоропласта или пластиды, вызывает эффект, заявленный в настоящем изобретении. Локализация биологической молекулы в хлоропласте или пластиде может осуществляться, по отношению к полинуклеотидам, посредством искусственных механических способов, таких как электропорация, механическая микроинъекция или бомбардировка покрытыми полинуклеотидом микрочастицами, а по отношению к полипептидам - посредством секреции или импорта нацеленной на природную, синтетическую или гетерологическую пластиду или хлоропласт пептидной последовательности, функциями которой являются нацеливание, включение, вспоможение или осуществление локализации связанного полипептида в хлоропласте или пластиде.
Используемая здесь фраза “оперативно связанная” или “операбельно связанная” относится к кодирующим сегментам нуклеиноновой кислоты, соединенным в рамке считывания таким образом, что на свойства одной влияет экспрессия другой. Указанные фразы и словосочетания можно применять к аминокислотным последовательностям, которые проявляют некоторую функцию при связывании с другой аминокислотной последовательностью, например, когда сигнальный пептид связывается с представляющим интерес белком, говорят, что он оперативно связан с представляющим интерес белком для того, чтобы нацелить представляющий интерес белок на секреторный аппарат клетки-хозяина, в которой белок продуцируется, или на субклеточный компартмент, такой как эндоплазматический ретикулум, хлоропласт или пластида, митохондрия, вакуоль, ядро или ядрышко или другие субклеточные компартменты и им подобное.
По замыслу настоящего изобретения, слово “ген” относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую белок TIC901, белок TIC1201, белок TIC417, белок TIC407, белок TIC431 или их инсектицидный фрагмент, или вариант их аминокислотной последовательности, или родственный гомолог белка, или его инсектицидный фрагмент, или вариант его аминокислотной последовательности; и данная нуклеиновая последовательность оперативно связана с последовательностью промотора и с терминирующей транскрипцию последовательностью, где промотор и терминирующая транскрипцию последовательность функционируют в клетке хозяина, в которой продуцируется белок. Используемая здесь фраза "структурный ген" относится к гену, который экспрессируется для получения полипептида. Структурный ген согласно изобретению может содержать, вдобавок к промотору и последовательностям, терминирующим транскрипцию, пять нетранслируемых последовательностей-праймеров, интронных последовательностей и энхансерных элементов, функция которых в растениях, в частности производных кукурузы и других односемядольных, состоит в том, чтобы при связывании вместе в соответствующую последовательность и затем с одной или более кодирующими последовательностями согласно изобретению получали улучшение уровня экспрессии в конкретных тканях растения и, предпочтительно, в корневых тканях кукурузы.
На основе информации, полученной при изучении нуклеотидной последовательности согласно изобретению, возможно получение относительно коротких последовательностей ДНК, называемых здесь зондами или праймерами, обладающими способностью гибридизоваться с последовательностями описанных здесь отобранных полинуклеотидов. Такие зонды нуклеиновой кислоты подходящей длины получали на основе отобранных полипептидных последовательностей, кодирующих инсектицидные полипептиды согласно изобретению, например, такой последовательности, которая приведена в последовательности SEQ ID NO:2, полной или зондоспецифической части последовательности SEQ ID NO:3 приблизительно от нуклеотида 153 приблизительно до нуклеотида 1253, полной или зондоспецифической части последовательности SEQ ID NO:5 приблизительно от нуклеотида 530 и приблизительно до нуклеотида 1621, полной или зондоспецифической части последовательности SEQ ID NO:7, полной или зондоспецифической части последовательности SEQ ID NO:9, полной или зондоспецифической части последовательности SEQ ID NO:32 или полной или зондоспецифической или праймероспецифической части последовательностей, выбранных из группы, содержащей последовательности SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 и SEQ ID NO:22 и их комплементы и им подобное. Фраза "полная или зондоспецифическая часть” относится к зонду, включающему в себя по меньшей мере от 15 до 50 нуклеотидов более или менее непрерывной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы нуклеотидов, приведенных в конкретной ссылочной последовательности, такой как последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:32 и их комплементы и им подобное. Способность таких нуклеиновокислотных зондов специфически гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, кодирующей инсектицидную полипептидную последовательность, придает им конкретную ценность в различных воплощениях. Наиболее важно то, что эти зонды могут быть использованы в различных анализах по определению наличия комплементарных последовательностей в настоящем образце.
B.thuringiensis
Bacillus sphaericus
В определенных воплощениях предпочтительно использовать олигонуклеотидные праймеры. Последовательность таких праймеров сконструирована с использованием полинуклеотида согласно изобретению и предназначена для применения при выявлении, амплификации или модификации определенного сегмента инсектицидного белка, кодирующего последовательность из  или из  и им подобных, с использованием технологии тепловой амплификации. Сегменты нуклеотидных последовательностей, родственных полинуклеотидам, кодирующим инсектицидные полипептиды согласно изобретению, также могут быть выделены и охарактеризованы с использованием технологии тепловой амплификации и таких праймеров.
Для обеспечения определенных преимуществ, связанных с настоящим изобретением, использовали предпочтительную последовательность нуклеиновой кислоты для изучения или анализа гибридизации или в качестве праймера, включающего в себя последовательности, которые комплементарны непрерывному фрагменту по меньшей мере в 14-30 или более нуклеотидов полипептидной последовательности, кодирующей целиком или частично инсектицидный белок согласно изобретению, такой как представленный в последовательностях SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:32 и комплементарных им последовательностях, и им подобных.
С праймером или зондом размером по меньшей мере в 14 нуклеотидов в длину можно быть уверенным, что данный фрагмент имеет достаточную длину для формирования дуплексной молекулы, которая будет и селективной, и стабильной. Более предпочтительны молекулы, имеющие комплементарные последовательности, насчитывающие в длину более чем 14 оснований. Для увеличения стабильности и селективности гибрида, и увеличения, таким образом, качества и степени специфичности получаемых гибридных молекул, обычно отдают предпочтение конструированию молекул нуклеиновой кислоты, имеющих последовательности, комплементарные последовательностям tic901 и им подобным, состоящим из 14-20 нуклеотидов или даже длиннее, если это необходимо; или имеющих последовательности, комплементарные последовательностям tic1201 и им подобным, состоящим из 14-20 нуклеотидов или даже длиннее, если это необходимо; или имеющих последовательности, комплементарные последовательностям tic417 и им подобным, состоящим из 14-20 нуклеотидов или даже длиннее, если это необходимо; или имеющих последовательности, комплементарные последовательностям tic407 и им подобным, состоящим из 14-20 нуклеотидов или даже длиннее, если это необходимо; или имеющих последовательности, комплементарные последовательностям tic431 и им подобным, состоящим из 14-20 нуклеотидов или даже длиннее, если это необходимо. Такие фрагменты легко могут быть получены, например, путем прямого синтеза фрагмента химическими способами, с помощью технологии репродукции нуклеиновой кислоты или посредством вырезания селективных ДНК фрагментов из рекомбинантных последовательностей, локализованных в плазмидах или других векторах, содержащих подходящие включения и подходящие рестрикционные сайты.
Авторы настоящего изобретения сконструировали также вырожденные универсальные зонды и праймеры для применения при идентификации природно образующихся нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности, полученные из инсектицидных белков, которые гомологичны белкам согласно изобретению. Нуклеотидные последовательности, идентифицированные при помощи представленных зондов и праймеров, приведены в последовательностях SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29, гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, кодирующими, как указано в настоящем документе, секретируемые инсектицидные белки.
Выравнивание аминокислотных последовательностей, как показано на фигуре 1, обеспечивает основу для идентификации аминокислотных последовательностей, которые у четырех выровненных белков-предшественников являются высококонсервативными. Например, аминокислотная последовательность, как показано в SEQ ID NO:4, приблизительно от аминокислоты семьдесят пять (75) приблизительно до аминокислоты восемьдесят три (83), является последовательностью, которая консервативна и по последовательностям, и по положениям в рамках первичных последовательностей белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431. Она обозначена в настоящем документе как “первая консервативная аминокислотная последовательность”. Аминокислотная последовательность приблизительно от аминокислоты сто сорок седьмой (147) приблизительно до сто пятьдесят третьей (153), представленная в SEQ ID NO:4, также консервативна как по последовательности, так и по положению в рамках первичных последовательностей белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC431 и TIC417. Она обозначена в настоящем документе как “вторая консервативная аминокислотная последовательность”. Подобным образом, аминокислотная последовательность приблизительно от аминокислоты двести семьдесят пятой (275) приблизительно до аминокислоты двести восемьдесят третьей (283), представленная в последовательности SEQ ID NO:4, также консервативна как по последовательности, так и по положению в рамках первичных последовательностей белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC431 и TIC417. Она обозначена в настоящем документе как “третья консервативная аминокислотная последовательность”. Каждая из этих последовательностей соответствует по существу консервативным, но слегка вырожденным нуклеотидным последовательностям в соответствующей кодирующей последовательности каждого белка, который может быть использован либо в качестве последовательности зонда, либо в качестве последовательности праймера, для идентификации наличия нуклеотидного сегмента, гомологичного последовательности, включающей в себя последовательность по меньшей мере из четырнадцати оснований, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:9 или из комплементарных им последовательностей. Например, в реакции тепловой амплификации, в которой используют вырожденную праймерную последовательность, синтез которой основан на компиляции последовательностей, выбранных из последовательностей SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:9, и комплементарных им последовательностей при исследовании обратной тепловой амплификации, соответствующих последовательности, кодирующей “первую консервативную аминокислотную последовательность”, как описано выше, включает в себя двадцати шестичленный (26-mer) олигонуклеотид, соответствующий первой консервативной нуклеотидной последовательности, например, представленной в последовательности SEQ ID NO:3 приблизительно от нуклеотида в положении триста семьдесят пять (375) до нуклеотида в положении четыреста один (401), и мог быть одной из вырожденных последовательностей, которые могли бы использоваться для зондирования образца на предмет наличия гомолога нуклеотидной последовательности, соответствующего последовательности, которая гибридизуется с соответствующей последовательностью среди последовательностей SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:9. Альтернативно, можно использовать олигонуклеотидную последовательность в качестве одной из пары олигонуклеотидных праймеров в реакции тепловой амплификации для получения последовательности апликона, которая гибридизовалась бы с соответствующими последовательностями среди в одной или более последовательностей, приведенных, например, среди последовательностей, включающих в себя последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:32 и SEQ ID NO:9, в жестких условиях гибридизации.
Bacillus
Авторы данного изобретения сконструировали в связи с этим набор праймеров и зондов, которые могут использоваться либо отдельно, либо в комбинации друг с другом для идентификации последовательностей, родственных белкам согласно изобретению, включая TIC901, TIC1201, TIC407, TIC431 и TIC417, которые кодируют секреторные инсектицидные белки и которые гибридизуются с одной или более последовательностями, раскрытыми в настоящем описании, в жестких условиях гибридизации. Один набор праймеров состоит из вырожденных олигонуклеотидных последовательностей, которые соответствуют последовательностям, представленным в последовательностях SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:25. Последовательность SEQ ID NO:23 соответствует набору вырожденных олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих положениям нуклеотидов приблизительно от триста семьдесят пятого (375) приблизительно до четыреста первого (401), представленных в последовательности SEQ ID NO:3, приблизительно от нуклеотида в семьсот пятьдесят втором (752) положении приблизительно до нуклеотида в семьсот семьдесят восьмом (778) положении, представленных в SEQ ID NO:5, приблизительно от нуклеотида в триста девяносто первом (391) положении приблизительно до нуклеотида в четыреста семнадцатом (417) положении, как показано в последовательности SEQ ID NO:7, приблизительно от нуклеотида в четыреста тридцать седьмом (437) положении приблизительно до нуклеотида в четыреста шестьдесят третьем (463) положении, как показано в последовательности SEQ ID NO:9, и приблизительно от нуклеотида в двести двадцать третьем (223) положении приблизительно до нуклеотида в двести сорок девятом (249) положении, как показано в последовательности SEQ ID NO:32. Все возможные комбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующую “первую консервативную аминокислотную последовательность”, описанную здесь выше, присутствие которых с полным основанием можно ожидать в разновидностях бактерий Bacillus, приведены в последовательности SEQ ID NO:23. Последовательности SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:25 являются вырожденными олигонуклеотидными последовательностями, включающими в себя подгруппу последовательностей, соответствующих SEQ ID NO:23, и так же как и SEQ ID NO:23, они содержит кодоны, частота встречаемости которых смещена в сторону кодонов, преимущественно используемых в кодирующих последовательностях .
Bacillus
Bacillus
Второй набор праймеров и зондов, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей, как описано здесь, которые родственны последовательностям SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 и которые кодируют секретируемые инсектицидные белки, представлен вырожденными последовательностями, приведенными в последовательности SEQ ID NO:26. Данные олигонуклеотидные последовательности соответствуют области возможных нуклеотидных последовательностей, которые будут предпочтительны для видов  для кодирования аминокислотной последовательности, описанной здесь выше как “вторая консервативная аминокислотная последовательность”, и, кроме того, соответствуют положению нуклеотидов приблизительно от пятьсот девяносто первого (591) приблизительно до шестьсот одиннадцатого (611), представленных в последовательности SEQ ID NO:3, приблизительно от девятьсот шестьдесят восьмого (968) приблизительно до девятьсот восемьдесят восьмого (988), представленных в последовательности SEQ ID NO:5, приблизительно от шестьсот седьмого (607) до шестьсот двадцать седьмого (627), представленных в последовательности SEQ ID NO:7, приблизительно от шестьсот пятьдесят третьего (653) приблизительно до шестьсот семьдесят третьего (673), представленных в последовательности SEQ ID NO:9, и приблизительно от четыреста тридцать девятого (439) приблизительно до четыреста пятьдесят шестого (456), представленных в последовательности SEQ ID NO:32. Все возможные комбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующую “вторую консервативную аминокислотную последовательность”, описанную здесь выше, присутствия которых с полным основанием можно ожидать в видах Bacillus, приведены в последовательности SEQ ID NO:26, и частота встречаемости кодонов, выбранных для включения в вырожденную олигонуклеотидную последовательность, смещена в сторону кодонов, преимущественно используемых в кодирующих последовательностях .
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Таким же образом третий набор праймеров и зондов, используемый для идентификации последовательностей, как описано в настоящем документе, родственных последовательностям SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 и кодирующих секретируемые инсектицидные белки, представлен вырожденными последовательностями в SEQ ID NO:27 - SEQ ID NO:29. Данные олигонуклеотидные последовательности соответствуют ряду предполагаемых нуклеотидных последовательностей, которым будут отдавать предпочтение разновидности  для кодирования аминокислотной последовательности, описанной выше как “третья консервативная аминокислотная последовательность” и, кроме того, соответствуют обратной комплементарной нуклеотидной последовательности приблизительно от нуклеотида в положении девятьсот семьдесят пять (975) приблизительно до нуклеотида в положении одна тысяча один (1001), представленных в последовательности SEQ ID NO:3, обратной комплементарной нуклеотидной последовательности приблизительно от нуклеотида в положении одна тысяча триста пятьдесят два (1352) приблизительно до нуклеотида в положении одна тысяча триста семьдесят восемь (1378), представленных в последовательности SEQ ID NO:5, обратной комплементарной нуклеотидной последовательности приблизительно от нуклеотида в положении девятьсот девяносто один (991) приблизительно до нуклеотида в положении одна тысяча семнадцать (1017), представленных в последовательности SEQ ID NO:7, обратной комплементарной нуклеотидной последовательности приблизительно от нуклеотида в положении одна тысяча тридцать семь (1037) приблизительно до нуклеотида в положении одна тысяча шестьдесят три (1063), представленных в последовательности SEQ ID NO:9, и обратной комплементарной нуклеотидной последовательности приблизительно от нуклеотида в положении восемьсот двадцать три (823) приблизительно до нуклеотида в положении восемьсот сорок шесть (846), представленных в последовательности SEQ ID NO:32. Все возможные комбинации нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующую “третью консервативную аминокислотную последовательность”, описанную здесь выше, присутствия которых с полным основанием можно ожидать в видах , приведены в последовательности SEQ ID NO:27. Последовательности SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29 также являются вырожденными нуклеотидными последовательностями, включающими в себя подгруппы последовательностей, соответствующих SEQ ID NO:27, и так же как и SEQ ID NO:27, они содержат кодоны, частота встречаемости которых смещена в сторону кодонов, предпочтительно используемых в кодирующих последовательностях .
Любые из последовательностей, представленных последовательностями, приведенными в последовательностях от SEQ ID NO:23 и до SEQ ID NO:29, могут быть использованы в качестве зонда для идентификации присутствия в препарате нуклеиновой последовательности, которая кодирует секретируемый инсектицидный белок, родственный любому из белков, представленному здесь, в частности, нуклеиновой последовательности, которая гибридизуется с одной или более нуклеотидных последовательностей согласно изобретению, включая последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:32, но не ограничиваясь ими, и любых из нуклеиновых последовательностей, представленных здесь в качестве зондов и/или праймеров, выбранных их группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:29.
2
Альтернативно, а также предпочтительно, если различные представленные здесь комбинации зондов и праймеров в реакции тепловой амплификации будут использоваться совместно для получения одного или более ампликонов, которые являются маркером присутствия в препарате нуклеотидной последовательности, кодирующей секретируемый инсектицидный белок, родственный белкам согласно изобретению, при этом указанная нуклеиновая последовательность, кодирующая инсектицидный белок, гибридизуется с одной или более нуклеотидными последовательностями, представленными здесь и включающими в себя последовательности SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:32 или комплементарные им последовательности, в жестких условиях гибридизации. Например, комбинируя один или более нуклеотидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO:23-25, таких как праймер prJWP200 (SEQ ID NO:23), с одним или более нуклеотидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO:27-29, таких как праймер prJWP204 (SEQ ID NO:27), каждый в концентрации не менее 1 пмоль на микролитр, в реакции тепловой амплификации, при содержании 1X TAQ амплификационного буфера, 0,2 моль каждого из дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP, dTTP, dCTP, и dGTP), 2 миллимолярного MgCl, 2 единиц TAQ-полимеразы и приблизительно от десяти (10) приблизительно до ста (100) нанограммов препарата ДНК, в котором присутствует одна или более последовательностей согласно изобретению, кодирующих секретируемый инсектицидный белок или его фрагмент, в результате синтезируется фрагмент двойной спирали ДНК, который является ампликоном, содержащим приблизительно от 600 и приблизительно до 650 пар оснований, более предпочтительно, приблизительно от 615 и приблизительно до 630 пар оснований, и еще более предпочтительно, приблизительно от 623 и приблизительно до 626 пар оснований. Ампликон такого размера является маркером присутствия в препарате нуклеиновой последовательности, кодирующей целиком или частично секретируемый инсектицидный белок, родственный одному или более белкам согласно изобретению, и ампликона такого размера вполне можно ожидать, если условия цикла тепловой амплификации состоят из первичной денатурации приблизительно в течение 2 минут при 94°C, с последующими 35 циклами денатурации по 30 секунд при 94°C, 30 секунд отжига при 50°C и стадией удлинения в 45 секунд при 72°C, с последующей конечной стадией удлинения в 7 минут при 72°C. Температура отжига должна уменьшаться на 0,3°C с каждым последующим циклом, таким образом, чтобы конечная температура отжига составляла приблизительно 39,8°C. Таким образом, комбинируя один или более нуклеотидов, представленных в последовательности SEQ ID NO:26, таких как prJWP203, с одним или более праймеров, представленных в последовательностях SEQ ID NO:27-29 в подобной реакции тепловой амплификации, в результате будем иметь синтез ампликона приблизительно от 400 и приблизительно до 415 пар оснований или ампликона приблизительно от 400 и приблизительно до 415 пар оснований, или приблизительно от 405 и приблизительно до 410 пар оснований, которые являются маркером присутствия в препарате нуклеотидной последовательности, кодирующей секретируемый инсектицидный белок, родственный белкам согласно изобретению.
Соблюдая данные условия и используя праймеры, prJWP200 (SEQ ID NO:23) и prJWP204 (SEQ ID NO:27) совместно с геномом ДНК из штамма EG2158, получали в результате сегмент ампликона, приблизительно соответствующий 620 парам оснований. Произвольно, при проведении реакции амплификации, было выделено несколько индивидуальных клонов, представляющих данный сегмент, и определена нуклеотидная последовательность каждого индивидуального клона. Как и предполагалось, первая последовательность, идентичная соответствующей нуклеотидной последовательности из TIC901, идентифицирована в популяции клона (не включая праймерных последовательностей на каждом конце клона, приблизительно от нуклеотида в положении четыреста два (402) приблизительно до нуклеотида в положении девятьсот семьдесят четыре (974), как представлено в последовательности SEQ ID NO:3). Таким же образом, как и предполагалось, вторая последовательность, идентичная соответствующей нуклеотидной последовательности TIC417, идентифицирована в популяции клона (не включая праймерных последовательностей на каждом конце клона, приблизительно от нуклеотида в положении четыреста шестьдесят четыре (464) приблизительно до нуклеотида в положении тысяча тридцать шесть (1036), как представлено в последовательности SEQ ID NO:9).
Неожиданно третья последовательность (SEQ ID NO:30), которая не идентична какой-либо из последовательностей, представленных здесь, также была идентифицирована в популяции клона, однако указанная последовательность по существу подобна каждой нуклеотидной последовательности согласно изобретению, включая соответствующую кодирующую последовательность, представленную в последовательностях, кодирующих tic901, tic1201, tic407, tic417 и tic431. Как представлено здесь, было совершенно неожиданным обнаружение кодирующей последовательности tic417 в ДНК генома штамма EG2158. Однако еще более неожиданной оказалась идентификация, помимо этого, третьей нуклеотидной последовательности из генома EG2158, которая, вероятно, соответствует нуклеотидному сегменту, который кодирует еще и третий секретируемый инсектицидный белок, отличный от TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431, но который по существу подобен последовательности белков согласно изобретению и будет, соответственно, классифицирован как один из видов секретируемых инсектицидных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с одной или более последовательностями, представленными здесь, и является примером новизны и промышленной применимости вырожденных олигонуклеотидных зондов и праймеров, представленных здесь в виде примеров, для их использования при идентификации последовательностей, которые кодируют секретируемые инсектицидные белки и которые гибридизуются в жестких условиях с представленными здесь родственными кодирующими последовательностями tic901, tic1201 tic07, tic417 и tic431.
Аминокислотная последовательность, кодируемая непрерывной открытой рамкой считывания, представленной здесь в последовательности SEQ ID NO:30, и имеющей двадцати шестичленную вырожденную олигонуклеотидную последовательность, удаленную c обоих концов, 5' и 3', представлена в последовательности SEQ ID NO:31. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:31, по существу подобна аминокислотной последовательности TIC901 приблизительно от аминокислоты в положении восемьдесят пять (85) приблизительно до аминокислоты в положении двести семьдесят четыре (274), как представлено в последовательности SEQ ID NO:4, содержащей только две (2) аминокислоты, отличные от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:4, что соответствует приблизительно 98,9% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью, представленной в SEQ ID NO:4. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:31, по существу подобна аминокислотной последовательности TIC1201 приблизительно аминокислоты в положении восемьдесят пять (85) приблизительно до аминокислоты в положении двести семьдесят четыре (274), как показано в последовательности SEQ ID NO:6, содержащей только тринадцать (13) аминокислот, отличных от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:6, что соответствует приблизительно 93,2% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью в SEQ ID NO:6. Аминокислотная последовательность, представленная в последовательности SEQ ID NO:31, по существу подобна аминокислотной последовательности TIC417 приблизительно от аминокислоты в положении восемьдесят пять (85) приблизительно до аминокислоты в положении двести семьдесят четыре (274), как показано в последовательности SEQ ID NO:10, содержащей только тридцать (30) аминокислот, отличных от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:10, что соответствует приблизительно 83,7% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:31, также по существу подобна аминокислотной последовательности TIC401 приблизительно от аминокислоты в положении восемьдесят пять (85) приблизительно до аминокислоты в положении двести семьдесят четыре (274), как представлено в последовательности SEQ ID NO:8, содержащей только сорок одну (41) аминокислоту, отличную от аналогичной последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, что приблизительно соответствует 78,4% идентичности между последовательностью SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью, представленной в SEQ ID NO:8. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO:31, также по существу подобна аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:33 (TIC431).
B.thuringiensis
Настоящее изобретение также связано с экспрессирующим вектором, включающим в себя полинуклеотид согласно изобретению. Так, в одном из воплощений экспрессирующий вектор представляет собой изолированную и очищенную молекулу ДНК, оперативно связанную с кодирующим участком, который кодирует полипептид согласно изобретению, и этот кодирующий участок оперативно связан с областью терминации транскрипции, посредством чего промотор вызывает транскрипцию кодирующего участка. Кодирующий участок может включать в себя сегмент, кодирующий инсектицидный токсин согласно изобретению у , и сегмент, кодирующий пептид, нацеленный на хлоропласт или пластиду. Молекула ДНК, содержащая вектор экспрессии, может содержать также и последовательность функционального интрона, расположенную либо выше кодирующей последовательности, либо даже в пределах кодирующей последовательности, и может также содержать пять-прайм (5')-нетранслируемую лидерую последовательность (то есть UTR или 5'-UTR), расположенную между промотором и точкой инициации трансляции.
Bacillus
Bacillus thuringiensis
Bacillus
Используемые здесь в отношении элементов промотора термины “оперативно связанный" или "операбельно связанный" означают, что нуклеотидная последовательность, содержащая промотор, то есть генетический элемент, функция которого в конкретной клетке-хозяине состоит в осуществлении инициации транскрипции, присоединена к кодирующему участку таким образом, что транскрипция этого кодирующего участка контролируется и по существу регулируется данным промотором. Способы оперативного связывания промотора и кодирующего участка хорошо известны специалистам в данной области. Функция промоторов в бактерии также хорошо известна в данной области. Предпочтительные промоторы для кристаллических белков B.thuringiensis включают в себя генные промоторы sigA, sigE и sigK. С другой стороны, для экспрессии белков согласно изобретению в штаммах  могут быть использованы нативные, мутагенные, гетерогенные или рекомбинантные промоторы, полученные из  или других видов .
Поскольку нуклеотидная последовательность, кодирующая белок согласно изобретению полностью или его инсектицидную часть, используется для трансформации растения, выбирают такой промотор, который способен вызывать экспрессию кодирующей последовательности у конкретного вида растения. Функция промоторов в различных видах растений хорошо известна в данной области. Промоторы, используемые для экспрессии полипептидов в растениях, могут быть индуцируемыми, вирусными, синтетическими или конститутивными, как описано у Odell et al. (Nature 313: 810-812,1985), и/или промоторами, регулируемыми во времени, регулируемыми в пространстве и регулируемыми в пространстве-времени. Предпочтительные промоторы включают в себя усиленные промоторы CaMV35S, а также промотор FMV35S. Для оптимизации контроля над видами личинок, повреждающих корни, посредством экспрессии белков согласно изобретению в растениях необходимо достигнуть высокого уровня экспрессии указанных белков в корнях растений кукурузы. Идентифицированы и известны в данной области улучшенные корневые промоторы (Lu et al., J. Plant Phys., 2000,156 (2): 277-283; Патент США № 5837848; Патент США № 6489542). Существенная временная или пространственная регуляция связана с экспрессией гена в растении или растительной ткани под действием растительного оперативного промотора. Что касается временной регуляции, промотор может быть регулируем для экспрессии только в течение определенного времени, в течение которого клетка растения или ткань растения или даже растение в целом растет и развивается. Промотор, который способствует активной экспрессии одного или более генов только в период проращивания зерен, может служить одним из примеров временной регуляции. Другие примеры могут включать в себя промоторы, которые вызывают активную экспрессию одного или более генов только в течение периода, когда растение или растительная ткань находятся под действием света определенной интенсивности, или в периоде полной темноты. В основном временная регуляция относится к промотору, который активно экспрессируется в определенный период, но который может или не может быть полностью подавлен в другое время, таким образом, что экспрессию можно обнаружить посредством мониторинга присутствия некоторого индикатора, такого как фермент, продуцируемый при связывании кодирующей последовательности с таким промотором, или путем измерения увеличения или уменьшения некоторого генного продукта, такого как мРНК, продуцируемая в различные периоды растительного роста, дифференцировки и развития и/или в ответ на различные стимулы окружающей среды. Существенная пространственная регуляция связана главным образом с экспрессией гена, связанного с промотором, с помощью которого экспрессия происходит только в период роста и развития определенных клеток или тканей растения. Например, пространственной экспрессии тапетального промотора предположительно можно ожидать в основном в период роста и развития цветочного растения. Подобным же образом, специфический корневой или улучшенный корневой промотор предположительно должен пространственно экспрессироваться в основном из клеток корня или корневых тканей. По существу, пространственная регуляция относится к уровню экспрессии специфического промотора из конкретной ткани в конкретную ткань и также связано с уровнями экспрессии из данного или подобного промотора в другие ткани, где экспрессия может быть выявлена в тканях, отличных от данной конкретной ткани, в которой экспрессия промотора предпочтительна, но со значительно более низким уровнем экспрессии, что показано путем измерения продуцирования фермента при связывании кодирующей последовательности с промотором или путем выявления некоторого генного продукта. Промоторы могут быть также одновременно регулируемыми как во времени, так и в пространстве, на манер координационного регулирования. Другие промоторы, в частности, рассматриваемые в рамках настоящего изобретения, включают в себя, помимо прочего, но не ограничиваются ими, убиквитиновый промотор, промотор бактериальной ДНК вируса сахарного тростника, промотор большой субъединицы рибулозы бис-фосфат-карбоксилазы.
Для достижения оптимальной экспрессии нуклеотидных последовательностей неприродного происхождения в однодольных растениях в создание экспрессирующей ДНК-конструкции могут быть включены также и предпочтительные интронные последовательности. Такой интрон обычно помещают вблизи 5'-конца мРНК в пределах нетранслируемой последовательности или непосредственно ниже этой последовательности. Интрон может быть получен из группы интронов, состоящей из интрона 70 белка теплового шока (HSP; Heat Shock Protein) кукурузы (Патент США № 5424412; 1995), интрона Actl риса (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990), интрона 1 Adh (Callis et al., Genes & Develop. 1: 1183-1200, 1987) или интрона синтазы сахарозы (Vasil et al., Plant Phys. 91: 1575-1579, 1989), но не ограничиваясь ими.
Другим элементом, функция которого связана с регуляцией или модулированием экспрессии гена, является последовательность ДНК, расположенная между сайтом инициации транскрипции и началом кодирующей последовательности и названная нетранслируемой лидерной последовательностью (UTL). Для выявления оптимальных или суб-оптимальных последовательностей и создания "консенсусных" и предпочтительных лидирующих последовательностей были проведены компиляции лидерных последовательностей (Joshi, Nucl. Acids Res. 15: 9627-9640, 1987). Предполагается, что предпочтительные лидерные последовательности содержат такие последовательности, которые состоят из последовательностей, приводящих к оптимальной экспрессии связанного структурального гена, то есть к встраиванию предпочтительной консенсусной лидерной последовательности, которая увеличивает или поддерживает стабильность мРНК и предотвращает нежелательную инициацию трансляции. Выбор таких последовательностей должен быть понятен специалистам в данной области в свете настоящего открытия. Последовательности, которые получены из генов, имеющих высокий уровень экспрессии в растениях, и в частности, в кукурузе, наиболее предпочтительны. Одной из конкретно используемых лидерных последовательностей является лидерная последовательность петуньи HSP70.
Транскрипция энхансеров или дупликация энхансеров может быть использована для увеличения экспрессии. Такие энхансеры часто расположены у 5'-конца для начала транскрипции промотора, который функционирует в эукариотических клетках, но они часто могут быть встроены в прямой или обратной ориентации, 5' или 3', в кодирующую последовательность. Примеры энхансеров включают в себя элементы из промотора CaMV 35S, генов октопинсинтазы (Ellis et al., EMBO Journal 6: 11-16,1987), гена актина риса и промотора из нерастительных эукариотов (то есть дрожжей; Ma et al., Nature 334: 631-633,1988).
РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность генома ядерной ДНК от сайта, где имеет место полиаденилирование. Обычно последовательности ДНК, расположенные на несколько сот пар оснований ниже полиаденилированного сайта, служат для терминации транскрипции. Данные последовательности ДНК определяются здесь как участки терминации транскрипции. Для таких участков необходимо значительное полиаденилирование ядерной транскрибирующей матричной РНК (мРНК). Для кодирующих последовательностей, включенных в хлоропласт или пластиду или в геном хлоропласта или пластиды, терминация транскрипции мРНК подобна способам, хорошо известным при экспрессии бактериального гена. Например, как в полицистронной, так и в моноцистронной последовательности транскрипция может терминироваться посредством стержнеобразной и петлеобразной структур, подобных бактериальным rho-зависимым последовательностям.
Экспрессирующие конструкции будут, как правило, включать в себя кодирующую последовательность или ее производное, представленное в настоящем изобретении, вместе с 3'-концевой последовательностью ДНК, функция которой в качестве сигнала терминации транскрипции в конструкции, предназначенной для экспрессии из растительного ядерного генома, дает возможность полиаденилирования 3'-конца полученного в результате РНК-транскрипта. Наиболее предпочтительными 3'-элементами представляются следующие: ген нопалинсинтазы из A.tumefaciens (3'-концевой nos), терминатор транскрипта T7 из гена октопинсинтазы A.tumefaciens и ген Е9 синтазы гороха RUBISCO (3' E9), и 3' нетранслируемая последовательность терминации транскрипции и полиаденилирования. Указанные 3'-концевые регуляторные последовательности хорошо известны в данной области.
Предпочтительные векторы трансформации растения включают в себя векторы, полученные из плазмиды Ti Agrobacterium tumefaciens, так же как и обнаруженные авторами, то есть Herrera-Estrella (Nature 303: 209-213, 1983), Bevan (Nature 304: 184-187, 1983), Klee (Bio/Technol. 3: 637-642,1985) и Eur. Pat Appl. No. EP 0120516 (каждый из указанных документов включен в настоящее описание посредством ссылки).
В настоящем изобретении описаны изолированные и очищенные нуклеотидные последовательности, кодирующие инсектицидные белки, полученные из видов Bacillus, а конкретно, из видов Bacillus thuringiensis. В частности, каждый из штаммов B.thuringiensis, а именно 86833, EG2158, EG3618, EG6489, EG6561, EG6618 и EG4653, как здесь показано, продуцирует один или более растворимых инсектицидных белков, которые локализованы в культуральном супернатанте (см. Таблицу 1, исключение составляет EG4653, подробное описание которого приведено в Примере 11).
Штаммы B.thuringiensis и другие бактериальные штаммы, описанные здесь, можно культивировать, используя общепринятую среду роста и стандартную технологию ферментации. Штаммы B. thuringiensis, содержащие один или более из генов tic901, tic1201, tic407, tic417, tic431 или родственных им генов, могут, как здесь описано, подвергаться ферментации до тех пор, пока культура клеток B.thuringiensis достигнет стадии роста, при которой продуцируются белки TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 или родственные им белки.
Культуры согласно изобретению депонировали в соответствии с условиями, обеспечивающими доступ к культурам для сторон, имеющих официальное разрешение, в течение периода, пока идет рассмотрение настоящей заявки или до выдачи патента. Ясно, однако, что доступность депонента не основана на лицензии на применение препарата согласно изобретению, что не умаляет прав на патент, удостоверяемый государственным документом.
Кроме того, указанное депонирование микроорганизмов проведено согласно положению "Будапештского Договора о Международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры". Депонированные препараты культур должны храниться и быть доступными для общего пользования, согласно положению Будапештского Договора, то есть препараты культур должны храниться с необходимой осторожностью для поддержания жизнеспособности и незагрязненности в период, составляющий по меньшей мере пять лет после последнего запроса на препарат депонента, и в любом случае в период, составляющий по меньшей мере 30 (тридцать) лет после даты депонирования, или на случай патента, претендующего на описанную здесь культуру. Согласно условиям депонирования, депозитор подтверждает обязанность заменить депонент, если депозитор будет не способен предоставить препарат, когда это необходимо. Все ограничения на доступность депонента препарата культуры неизменно будут сняты после выдачи документа на патент.
Bacillus thuringiensis
TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 и родственные белки согласно изобретению, как здесь показано, продуцируются и секретируются в среду роста несколькими штаммами . Ферментация, используемая штаммами согласно изобретению, может продолжаться до стадии споруляции, когда формируются, если такое имеет место, кристаллические белки, совместно со спорами. Споры и остатки клеток могут быть отделены от супернатанта путем центрифугирования, и из использованной культуральной среды могут быть выделены инсектицидные белки согласно изобретению. Авторы иллюстрируют здесь способ осаждения сульфатом аммония как одну из возможностей концентрирования и сбора всех или большей части белков, присутствующих в использованной и осветленной культуральной среде. Тем не менее, специалист в данной области знает, что существуют другие доступные способы выделения и очистки белков согласно изобретению. Гель-фильтрация и вытеснительная хроматография - это два абсолютно доступных способа для экстракции белков непосредственно из отработанной среды. Отработанная среда, обессоленная и отфильтрованная, также может быть использована для экстракции белка посредством ионообменной хроматографии. Также может быть использована для очистки белков согласно изобретению непосредственно из среды афинная хроматография, основанная на связывании антител с белками TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 или родственными им белками.
Bacillus
Аминокислотные последовательности согласно изобретению сравнили с аминокислотными последовательностями имеющейся коммерческой базы данных белковой последовательности, при этом не было обнаружено значительной гомологии или подобия. На основании этого анализа можно заключить, что белки TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 и родственные им последовательности являются уникальными и формируют основу для введения нового и отдельного класса инсектицидных белков , потому что за белками согласно изобретению не заметили проявления сколько-нибудь значительного соответствия другим известным инсектицидным белкам.
В структуре пептидов согласно изобретению и кодирующих их ДНК-сегментах можно вызвать модификацию и изменения и получить функциональную молекулу, которая кодирует белок или пептид с желаемыми характеристиками. Биологически функциональный эквивалент пептидов, полипептидов и белков, представленных здесь, должен иметь аминокислотную последовательность, сходство которой составляет приблизительно от 65 и приблизительно до 70% или выше, или приблизительно от 80% или выше, или приблизительно от 90% или выше, по отношению к аминокислотной последовательности или соответствующей ее части в пределах фундаментальной аминокислотной последовательности TIC901, представленной в SEQ ID NO:4, или соответствующей части в пределах аминокислотных последовательностей TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431, представленных, соответственно, последовательностями SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:32 и родственными последовательностями.
Согласно настоящему изобретению, ссылка на ген tic901, кодирующий бековый токсин, включает в себя не только полную длину последовательностей, описанных в настоящем изобретении, но также и фрагменты этих последовательностей, их природные варианты, мутанты и рекомбинантные или модифицированные генно-инженерным путем производные гена tic901, включая последовательность SEQ ID NO:3. Белки, кодируемые данными последовательностями, будут сохранять по существу те же самые или еще более улучшенные характеристики инсектицидных белков, чем белок TIC901, содержащий последовательность SEQ ID NO:4. Белки согласно изобретению могут включать в себя и слитые белки, которые сохраняют по существу те же самые или еще более улучшенные характеристики инсектицидных белков, чем белок TIC901.
В некоторых примерах слитый белок может содержать, в дополнение к инсектицидным свойствам белков, представленных здесь, другую инсектицидную активность, обусловленную аминокислотной последовательностью слитого партнера. С другой стороны, кристаллографический анализ белка TIC901 или его инсектицидных вариантов может предоставить способы определения того, может ли белок являться кандидатом для конструирования промутеина, который проявляет подобную или большую инсектицидную активность, чем нативный белок TIC901 или родственный ему белок, и который преимущественно проявляет улучшенные характеристики, связанные с экспрессией в определенной хозяйской клетке, такой как растительная клетка. Такие же качества и характеристики применимы и к tic1201, tic407, и tic417, и не только к полной длине их последовательностей, выявленных в настоящем описании, но также и к фрагментам указанных последовательностей, их природным вариантам, мутантам и рекомбинантным или генетически модифицированным производным указанных генов, включающим в себя, соответственно, последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32. Белки, кодируемые указанными последовательностями, будут оставаться по существу подобными или иметь более выраженные характерные особенности инсектицидных свойств, чем белки TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431, содержащие, соответственно, последовательности SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:32.
Специалисту в данной области должно быть ясно, что нуклеотидные последовательности, кодирующие токсины, подавляющие насекомых, и в частности, токсин, направленный против жесткокрылых, могут быть получены и идентифицированы несколькими способами, описанными в настоящей заявке. Специфические последовательности и родственные последовательности, как здесь представлено, могут быть получены из изолятов, депонированных в культуральном депозитарии, как описано выше. Указанные последовательности или их инсектицидные составляющие или варианты могут быть получены синтетически, например, с использованием синтезатора нуклеотидной последовательности. Варианты кодирующих последовательностей можно легко получить, используя стандартную технику создания точковых мутаций. Таким же образом фрагменты указанных последовательностей могут быть получены при использовании коммерческих экзонуклеаз или эндонуклеаз стандартными способами. Например, для последовательного вырезания нуклеотидов от концов таких последовательностей, как представлены здесь, или из кодирующей белок последовательности, могут быть использованы такие ферменты, как Bal31 или сайт-направленный мутагенез. Таким же образом нуклеотидные последовательности, кодирующие инсектицидно активный фрагмент белка, могут быть получены при использовании различных рестрикционных ферментов, эндонуклеаз, методов тепловой амплификации и прочего. Протеиназы, такие как протеиназа K, трипсин, химотрипсин, пепсин и подобные им, могут быть использованы для направленного получения активных фрагментов указанных токсинов.
Bacillus thuringiensis
Другие токсины и нуклеотидные последовательности, кодирующие такие токсины, относящиеся к токсинам и кодирующим последовательностям согласно изобретению, могут быть получены из изолированной ДНК B.thuringiensis, B.laterosperous, B.sphaericus и родственных видов Bacillus, в комбинации с нуклеотидными последовательностями, описанными в настоящей заявке, с использование технологии, известной в данной области. Такие токсины и нуклеотидные последовательности, родственные токсинам и кодирующим последовательностям согласно изобретению, как здесь полагают, являются эквивалентом токсинов и нуклеотидных последовательностей согласно изобретению. Под "эквивалентом" подразумевается, что белок проявляет характерные свойства одного или более описанных здесь белков, включая, но не ограничиваясь перечисленным, сходство инсектицидной ингибиторной биоактивности, подобие в наборе хозяев, на которых направлена инсектицидная биоактивность, подобие в проявлении антигенных эпитопов, которые дают перекрестную реакцию с антителами, индуцированными против TIC901, TIC1201, TIC407 и TIC417 и тому подобное, включая и родственные белки, обнаруживает подобный TIC901 и родственным белкам размер, проявляет сходство в профилях и характерных чертах экспрессии, проявляет предрасположенность к локализации во внеклеточном пространстве при экспрессии в  или родственных видах бактерий, и прочее. Фраза "проявляет предрасположенность к локализации во внеклеточном пространстве" распространяется на TIC901 и родственные белки и включает в себя, не ограничиваясь перечисленным, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 и им подобные, которые продуцируются бактериальной клеткой или клеткой-хозяином в виде предшественника белка, который содержит аминокислотную последовательность, маркерную для инсектицидного белка, функция которой состоит в нацеливании инсектицидного белка на секреторный аппарат бактериальной или хозяйской клетки и которая при контакте с секреторным аппаратом подвергается протеолитическому расщеплению под действием сигнальной пептидазы, высвобождая зрелый или инсектицидный белок во внеклеточное пространство в случае грамм-положительного микроба, в перипласт в случае грамм-отрицательного микроба, и в эндоплазматический ретикулум, или секреторную визикулу, или в субклеточную органеллу, такую как митохондрия, или в хлоропласт или пластиду в случае гриба или растения или другой эукариотической клетки-хозяина. Также рассматриваются в рамках настоящего изобретения латентные нуклеотидные кодирующие последовательности.
B.thuringiensis
Существуют способы для идентификации присутствия и получения эквивалента инсектицидных токсинов, родственного пептидам, выявленным в данной работе. Например, антитела к инсектицидным токсинам, открытым и заявленным в настоящем изобретении, могут быть использованы для идентификации и выделения других токсинов из смеси белков. В частности, антитела могут быть направлены на участки токсинов, которые наиболее постоянны в пределах нового класса белков и сильно отличаются от других токсинов . Указанные антитела могут затем быть использованы для идентификации эквивалентных токсинов с характерными особенностями активности посредством иммунопреципитации, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или Вестерн-блоттинга. Антитела к токсинам, описанным в настоящей заявке, или к эквивалентам токсинов, или к фрагментам указанных токсинов, могут быть легко получены при использовании стандартных в данной области способов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные токсины, могут затем быть получены из микроорганизма или различных других источников.
Следующий способ для идентификации токсинов и генов согласно изобретению состоит в использовании олигонуклеотидных зондов. Указанные зонды являются по существу нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются в жестких условиях гибридизации с кодирующей последовательностью TIC901 или с последовательностью, родственной кодирующей последовательности TIC901. Хорошо известно в данной области, что если молекула зонда и молекула последовательности нуклеиновой кислоты гибридизуются, образуя довольно жесткую связь между двумя молекулами, вполне допустимо предположение, что две молекулы имеют существенную гомологию. Связывание зонда определяется с помощью способов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, флуоресцентный, люминесцентный, изотопный метод, иммунологический метод, метод поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии и прочие. Такой зондовый анализ представляет собой быстрый способ для идентификции кодирующих токсин генов согласно настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, используемые в качестве зондов, согласно изобретению, могут синтезироваться стандартным способом с использованием ДНК-синтезатора или другими способами, известными в данной области. Данные нуклеотидные последовательности могут также использоваться в качестве ПЦР-праймеров для амплификации нуклеотидных последовательностей согласно изобретению или их частей.
В рамках настоящего изобретения рассматриваются фрагменты и эквиваленты родственных белков, которые сохраняют по меньшей мере инсектицидную активность представленных токсинов. Также, по причине избыточности генетического кода, разные ДНК-последовательности могут кодировать аминокислотные последовательности, представленные в настоящем описании. Специалисту в данной области не составит труда создать такие альтернативные последовательности ДНК, кодирующие те же самые или по существу те же самые токсины. Такие варианты ДНК-последовательностей рассматриваются в рамках настоящего изобретения.
Хорошо известно в данной области, что определенные аминокислоты в белковой структуре могут быть заменены на другие аминокислоты без существенного уменьшения способности связывания при взаимодействии с такими структурами, как, например, антиген-связывающие области антител или связывающие сайты на молекулах субстратов. Таким образом, эта способность к взаимодействию и характер белка определяют, какую биологическую функциональную активность белка можно привнести путем замещения определенной аминокислотной последовательности и, конечно, в кодирующей её последовательности ДНК, чтобы при этом сохранить белок с подобными свойствами. Таким образом, в настоящем изобретении рассматриваются различные изменения в пептидных последовательностях описанных составов или соответствующих им последовательностях ДНК, которые кодируют указанные пептиды без существенной потери их биологической ценности или активности. Такие замены известны также в данной области как консервативные замены.
При создании таких изменений нужно принимать во внимание гидропатический индекс аминокислот. Важность гидропатического индекса аминокислоты в придании белку интерактивной биологической функции в целом понятно (Kyte and Doolittle, 1982). Общеизвестно, что соответствующее гидропатическое свойство аминокислоты вносит свой вклад во вторичную структуру образующегося белка, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами и прочим.
Для каждой аминокислоты задан гидропатический индекс на основе их гидрофобности и характеристик заряда (Kyte and Doolittle, 1982), и они следующие: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); и аргинин (-4,5).
Известно, что определенные аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими подобный гидропатический индекс или показатель и оставаться в результате белком с подобной биологической активностью, то есть с получением эквивалентного по биологической части белка. При создании таких изменений замены аминокислот, чей гидропатический индекс находится в пределах ±2, являются более предпочтительными, чем тех, чей гидропатический индекс находится в пределах ±1, а тех, чей гидропатический индекс находится в пределах ±0,5, даже еще более предпочтительными.
Понятно также, что замена подобных аминокислот может быть эффективной на основе гидрофильности. Большое среднее значение гидрофильности белка, обусловленное гидрофильностью составляющих его аминокислот, находится в соответствии с биологическим свойством белка (Патент США № 4554101).
Как детально описано в Патенте США № 4554101, аминокислотным остаткам присвоены следующие величины гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4).
Понятно, что аминокислота может быть замещена другой, имеющей подобную величину гидрофильности, и при этом может получаться биологически эквивалентный и, в частности, иммунологически эквивалентный белок. В таких заменах замещение аминокислот, чьи величины гидрофильности находятся в пределах ±2, предпочтительней тех, чьи величины гидрофильности находятся в пределах ±1, а тех, чьи величины гидрофильности находятся в пределах ±0,5, даже еще более предпочтительны.
На основании изложенного выше можно сказать, что замены аминокислоты в основном базируются на относительной схожести с аминокислотой-заместителем в боковой цепи, например, их гидрофобности, заряда, размера и прочего. Примеры замещений, которые учитывают различные отмеченные выше свойства, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин, глутамат и аспартат, серин и треонин, глутамин и аспарагин, и валин, лейцин и изолейцин.
Пептиды, полипептиды и белки, биологически и функционально эквивалентные TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431, родственным белкам и им подобным, включают в себя аминокислотные последовательности, содержащие консервативные аминокислотные замены в фундаментальной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33. В частности, в отношении последовательности SEQ ID NO:4 приблизительно от аминокислоты 44 и приблизительно до аминокислоты 367, в отношении последовательности SEQ ID NO:6 приблизительно от аминокислоты 44 приблизительно до аминокислоты 364, в отношении последовательности SEQ ID NO:8 приблизительно от аминокислоты 44 приблизительно до аминокислоты 368, в отношении последовательности SEQ ID NO:10 приблизительно от аминокислоты 44 приблизительно до аминокислоты 364, и в отношении последовательности SEQ ID NO:33 приблизительно от аминокислоты 44 приблизительно до аминокислоты 364; для таких аминокислотных последовательностей одна или более аминокислот в фундаментальной последовательности может быть замещена другой аминокислотой(ами), заряд и полярность которой подобны нативной аминокислоте, то есть консервативное аминокислотное замещение дает в результате скрытую замену.
Аминокислота для замещения в пределах фундаментальной полипептидной последовательности может быть выбрана из состава другого класса, нежели тот, которому принадлежит природная аминокислота. Аминокислоты могут быть разделены на следующие четыре группы: (1) кислые аминокислоты, (2) щелочные аминокислоты, (3) нейтральные полярные аминокислоты и (4) нейтральные неполярные аминокислоты. Типичными представителями аминокислот этих групп являются, но не ограничиваются таковыми, следующие аминокислоты: (1) кислые (отрицательно заряженные) аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, (2) щелочные (положительно заряженные) аминокислоты, такие как аргинин, гистидин и лизин, (3) нейтральные полярные аминокислоты, такие как глицин, серин, треонин, цистеин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (4) нейтральные неполярные (гидрофобные) аминокислоты, такие как аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин.
Консервативные замены аминокислоты в фундаментальных полипептидных последовательностях согласно изобретению производятся путем замещения одной аминокислоты из одной из вышеуказанных групп на другую аминокислоту из этой же группы. Биологически функциональные эквиваленты белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 и им подобных родственных последовательностей могут иметь 10 или менее консервативных замен аминокислоты, более предпочтительно, семь или менее консервативных замен аминокислоты, и еще более предпочтительно, пять или менее консервативных замен аминокислоты. Кодирующая нуклеотидная последовательность (ген, плазмидная ДНК, кДНК или синтетическая ДНК) будет, таким образом, иметь соответствующие замены основания, дающие возможность ей кодировать биологически функциональную эквивалентную форму белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 и родственных последовательностей.
Варианты аминокислотной последовательности белков согласно изобретению и родственные последовательности могут быть получены методами, хорошо известными в данной области. Например, вариант аминокислотной последовательности белка TIC901, который не секретируется во внеклеточную среду, можно получить при помощи мутагенеза нуклеотидной кодирующей последовательности TIC901 этилметансульфонатом (ЭМС). Мутанты можно также получить, используя ультрафиолетовое облучение и обработку нитрозогуанидином, способом, хорошо известным в данной области, или посредством создания кодирующей последовательности, у которой не достает всей последовательности или ее части, кодирующей аминокислотную последовательность сигнального пептида.
Сайт-специфический мутагенез является другим способом, используемым для получения отдельных пептидов или биологического и функционального эквивалента белков или пептидов, посредством специфического мутагенеза исходной ДНК. Технические приемы, таким образом, обеспечивают возможность получать и тестировать варианты последовательности, например, включая одну или более из рассматриваемых выше, посредством введения одного или более изменений нуклеотидной последовательности в ДНК. Сайт-специфический мутагенез допускает получение мутантов посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют ДНК-последовательность требуемой мутации, так же как и достаточное число примыкающих нуклеотидов, для получения праймерной последовательности достаточного размера и комплексной последовательности для формирования стабильного дуплекса на обеих сторонах последовательности, нацеленной для модификации. Обычно предпочтительным является праймер, составляющий приблизительно от 17 и приблизительно до 25 нуклеотидов в длину, по меньшей мере содержащий приблизительно от 5 и приблизительно до 10 идентичных остатков, доступных на обеих сторонах последовательности-мишени, подлежащей модификации.
Получение вариантов последовательностей выбранных сегментов пептид-кодирующих ДНК, с использованием сайт-направленного мутагенеза, обеспечивается способами получения потенциально полезных видов, и подразумевается, что получение таких вариантов последовательностей и кодирующих их ДНК-последовательностей никоим образом не ограничено способами, которые использованы для их получения. Для получения вариантов последовательности, например, рекомбинантные векторы, кодирующие желаемую пептидную последовательность, могут быть обработаны мутагенными агентами, такими как гидроксиламин.
B.thuringiensis
B.thuringiensis
Clostridium, Bacillus, Xenorhabdus
Photorhabdus
Bacillus
Кодирующая последовательность tic901 и родственные нуклеотидные последовательности, изолированные из штаммов  и представленные здесь в последовательностях SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 и им подобных, могут быть использованы как гибридизационные зонды для идентификации и выделения природных вариантов этих и родственных нуклеотидных кодирующих последовательностей из других штаммов  или из других микроорганизмов, таких как виды микробов , и . Настоящее изобретение охватывает нуклеотидные последовательности из микроорганизмов, где нуклеотидные последовательности выделяются путем гибридизации с полноразмерной нуклеотидной последовательностью  согласно изобретению или с ее частью. Белки, кодируемые такими нуклеотидными последовательностями, могут быть проверены на инсектицидную активность. Изобретение охватывает также белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями. Например, выравнивание указанных четырех нуклеотидных последовательностей обеспечивает области идентичности, которые могут быть использованы как зонды и праймеры. Также сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых данными и родственными нуклеотидными кодирующими последовательностями, обеспечивает информацию, касающуюся областей идентичности и/или существенного подобия между белками и обеспечивает основу для создания зондов и/или праймеров, которые можно применять для идентификации данных и других родственных нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие инсектицидные белки. Например, последовательности SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29 являются представителями таких зондов и праймеров и представлены здесь в Примере 10.
B. thuringiensis
Антитела, образующиеся в ответ на иммунную стимуляцию под действием белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 и подобных им или родственных белков согласно изобретению, могут продуцироваться, когда применяются стандартные иммунологические технические приемы получения поликлональной иммунной сыворотки и, если необходимо, путем иммортализации продуцирующих антитела клеток иммунизированного хозяина для получения источника моноклональных антител. Технические приемы для получения антител в ответ на любое представляющее интерес вещество хорошо известны, и описаны, например, у Harlow и Lane (1988) или, например, у Goding (1986). Например, антитела, которые связываются с эпитопами на поверхности или внутри TIC901, могут использоваться как зонды для идентификации штаммов  или других микроорганизмов, которые продуцируют варианты белка TIC901 или родственных белков, которые кодируются вариантами гена tic901 или родственного гена. Настоящее изобретение охватывает инсектицидные белки, которые перекрестно реагируют с антителами, образующимися в ответ на один или более инсектицидных белков согласно изобретению.
Антитела, получаемые в настоящем изобретении, применяются также в иммуноанализах для определения количества или присутствия белков TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 или родственного белка в биологическом препарате. Такие анализы применяют также для контроля качества продукции композиций, содержащих один или более белков согласно изобретению или родственных белков. Кроме того, антитела могут применяться для анализа эффективности получаемых одного или более рекомбинантных белков согласно изобретению или родственных белков, а также для скрининга библиотек экспрессии на присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей один или более белков согласно изобретению или кодирующих последовательностей родственного белка. Антитела применяются также в качестве аффинных лигандов для очистки и/или выделения любого одного или более из белков согласно изобретению или родственных белков. Белки согласно изобретению и белки, содержащие родственные антигенные эпитопы, могут быть получены путем экспрессии полноразмерной или частичной последовательности, кодирующей полноразмерный белок или часть белка согласно изобретению или родственный белок, в предпочтительной хозяйской клетке.
Пептиды согласно изобретению в основном, хотя не всецело, предназначены для применения в растениях, и в определенных предпочтительных воплощениях нуклеотидные последовательности, модифицированные для кодирования белков согласно изобретению в растениях, располагают в одном или более плазмидных векторах. Такие векторы могут содержать различные регуляторные механизмы и другие элементы, предназначенные для осуществления оптимальной экспрессии белков согласно изобретению в клетках растения. Данные дополнительные элементы могут включать в себя промоторы, терминаторы и интроны, как описано выше. Любой вектор, содержащий конструкцию ДНК и любые регуляторные или другие элементы, может быть выбран из группы, состоящей из искусственной хромосомы дрожжей, искусственной бактериальной хромосомы, плазмиды или космиды и тому подобного. Кроме того, экспрессирующие векторы сами по себе могут иметь различную форму. Указанные формы могут отличаться, в зависимости от целей их создания, и, вероятно, содержать в себе различные компоненты, в зависимости от того, будет ли их применение направлено на трансформацию однодольного растения или на трансформацию двудольного растения.
Bacillus
Векторы, предусмотренные в рамках настоящего изобретения, включают в себя векторы, способные содержать tic901, tic1201, tic407, tic417 или родственные композиции нуклеиновой кислоты, выявленные выше, так же как и любые другие ДНК-конструкции, которые включают в себя экспрессируемые в растении кодирующие области для других инсектицидных белков, полученных из видов .
B.thuringiensis
Bacillus
Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus laterosporous, Bacillus megaterium, или Bacillus anthracis
Нуклеотидная последовательность, кодирующая TIC901 (SEQ ID NO:3, кодирующая SEQ ID NO:4) или кодирующая родственную пептидную последовательность, такую как TIC1201 (SEQ ID NO:5, кодирующая SEQ ID NO:6), TIC407 (SEQ ID NO:7, кодирующая SEQ ID NO:8), TIC417 (SEQ ID NO:9, кодирующая SEQ ID NO:10) и TIC431 (SEQ ID NO:32, кодирующая SEQ ID NO:33), могут быть встроены в различные хозяйские микроорганизмы без экспериментальных проблем, с применением процедур, хорошо известных в области трансформации подходящих хозяйских клеток, и в условиях, позволяющих обеспечить стабильную поддержку и экспрессию встроенной нуклеотидной последовательности (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2-nd Ed., Cold Spring Harbor Press, New York). Подходящие хозяева, которые допускают экспрессию белков согласно изобретению и родственных последовательностей, включают в себя  и другие виды , такие как . Генетически видоизмененные или искусственно созданные микроорганизмы, содержащие ген, кодирующий один или более белков согласно изобретению, включающие в себя TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431 и подобные белки, могут также содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие другие токсические белки, присутствующие в том же микроорганизме; данные кодирующие последовательности могут одновременно продуцировать инсектицидные белки, отличные от белков согласно изобретению или родственных белков. В частности, было бы предпочтительней, чтобы в клетке хозяина продуцировалось два или более различных инсектицидных белка, где каждый белок токсичен в отношении одних и тех же видов насекомых-вредителей и каждый белок проявляет действие, отличное от другого (других).
B.thuringiensis
Колонизирующие растения или колонизирующие корни растений микроорганизмы могут также использоваться в качестве клеток хозяина для получения одного или более белков согласно изобретению или родственного белка. Примеры микроорганизмов-хозяев для токсических генов  включают в себя колонизирующий растения микроб Clavibacter xyli, что описано у Turner et al. (1993; Endophytes: an alternative genome for crop improvement.; International Crop Science Congress, Ames, Iowa, USA, 14-22 July 1992., pp. 555-560), и колонизирующие корни штаммы псевдомонад, как описано у Obukowicz et al. (Патент США № 5229112).
Кодирующие токсин нуклеотидные последовательности, получаемые при выделении согласно изобретению, могут быть внедрены в дикий тип микробного или растительного хозяина. Экспрессия гена токсичности приводит в результате к прямому или непрямому внутриклеточному продуцированию и поддержанию пестицида. С подходящими микробными хозяевами, например Pseudomonas, микробы могут быть доставлены к месту нахождения насекомых-вредителей, где они будут размножаться и заглатываться насекомыми-вредителями. Результатом этого является контроль над насекомыми-вредителями, проявляющийся в уменьшении повреждения растения, увеличении урожайности растения, уменьшении распространения насекомых-вредителей в локальной окружающей среде трансгенного организма, экспрессированного токсическим белком(ами), и гибелью или замедлением роста насекомых-вредителей растения, обычно без побочного действия на микробную флору, окружающую растения или трансгенный организм, экспрессирующий токсический белок(белки), и без какого бы то ни было побочного поражения окружающей среды вообще. С другой стороны, микробный хостинг токсического гена может быть обработан в условиях, которые продлевают активность токсина и стабилизируют клетку. Обработанной клеткой, которая остается токсически активной, можно затем воздействовать на окружающую среду насекомого-вредителя.
При введении гена токсина согласно изобретению или родственной кодирующей нуклеотидной последовательности посредством подходящего вектора в микробного хозяина, когда и хозяин воздействует на окружающую среду в активном состоянии, предпочтительно использование определенного типа микробных хозяев. Например, микроорганизмы-хозяева могут быть выбраны из тех, о которых известно, что они существуют в месте обитания насекомого-вредителя. Микроорганизмы-хозяева могут также существовать симбиотически с определенными видами насекомого-вредителя. Такие микроорганизмы выбраны, так как они способны успешно конкурировать в конкретной окружающей среде микроорганизмов дикого типа, обеспечивая стабильную поддержку и экспрессию гена, экспрессирующего пестицидный полипептид, и, желательно, обеспечивая улучшение защиты пестицида от деградации и инактивации, обусловленных окружающей средой.
Bacillus, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc,
Alcaligenes,
Metarhizium, Bavaria, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula
Aureobasidium.
Известно большое число микроорганизмов, обитающих в местах обитания насекомых-вредителей. Такие микроорганизмы включают в себя бактерии, водоросли и грибы. Конкретный интерес представляют такие микроорганизмы, как бактерии, то есть род и грибыто есть роди
Существует большое разнообразие способов для включения гена токсина, кодирующего токсин в микроорганизме-хозяине в условиях, позволяющих стабильно поддерживать и экспрессировать ген. Эти способы хорошо известны в данной области, и описаны, например, в Патенте США № 5135867.
B.thuringiensis
Xenorhabdus
Photorhabdus
Как указано выше,  или рекомбинантные клетки, экспрессирующие белок согласно изобретению или родственный белок-токсин, могут быть обработаны для пролонгации токсической активности и стабилизации клетки. Пестицидная микрокапсула формируется с содержанием одного или более белков согласно изобретению или одного или более родственных токсинов в структуре, которая должна быть стабильной, и ее функции состоят в защите токсина или токсинов от влияния окружающей среды при применении микрокапсулы против насекомого-вредителя. Подходящие клетки-хозяева могут быть как прокариотами, так и эукариотами, и обычно ограничиваются теми клетками, которые не продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако организмы, которые продуцируют токсичные для высших организмов вещества, могут применяться при условии, когда токсическое вещество нестабильно или уровень применения существенно занижен, чтобы избежать любой возможности интоксикации клетки млекопитающего. Конкретный интерес в качестве хозяев представляют прокариоты, также и низшие эукариоты, такие как грибы. Клетки этих организмов при обработке обычно должны быть интактными и лучше в основном в пролиферативной форме, чем в форме спор, хотя в некоторых случаях могут быть использованы и споры. Такие микрокапсулы могут также содержать один или более из белков согласно изобретению или один или более родственных белков вместе с одной или более неродственными инсектицидными белковыми композициями, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, следующие компоненты: дельта-токсины, такие как Cry1, Cry2, Cry3, Cry9, Cry22, ET70, TIC851, и/или двойные токсины, такие как ET80/76, ET33/34, PS149B1 и ET100/101 и подобные им, и инсектицидные белки или инсектицидные белковые комплексы из таких разных организмов, как и/или , или VIP, WAR, и/или белковые токсины MIS и родственные белки.
Обработка микробной клетки состоит в том, что микроб, содержащий нуклеотидную последовательность или нуклеотидный сегмент согласно изобретению или родственную кодирующую последовательность, можно обработать химическими или физическими способами или сочетанием химических и/или физических способов, и так долго, чтобы не произвести губительного воздействия на свойства токсина, что понижает способность клетки защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенизирующие агенты, в частности галогены с атомными номерами 17-80. Более конкретно, может применяться йод, в мягких условиях и в течение времени, достаточного для достижения желаемых результатов. Другие подходящие технические приемы включают в себя обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными средствами, такими как зефиранхлорид и цетилпиридинхлорид; спиртами, такими как изопропил и этанол; различными гистологическими фиксаторами, такими как Люголь-йод, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Helly (См. Humason, 1967); или комбинацией физических (тепло) и химических агентов, которые защищают и способствуют пролонгированию активности токсина, продуцируемого в клетке, при введении клетки животному-хозяину. Примерами физических способов являются коротковолновая радиация, такая как гамма-облучение и X-облучение, заморозка, УФ-облучение, лиофилизация и прочие. Способы обработки микробных клеток описаны в Патентах США №№ 4695455 и 4695462.
Клетки обычно будут иметь повышенную стабильность структуры, что увеличит их резистентность к условиям окружающей среды. Независимо от того, находится ли пестицид в про-форме или в форме предшественника, способ обработки клетки должен быть таким, чтобы не подавлялся процессинг от проформы к зрелой форме пестицида патогенным насекомым-вредителем. Например, формальдегид будет перекрестно связываться с белком и может подавлять процессинг от проформы к полипептидному пестициду. Способ обработки клетки должен способствовать сохранению по меньшей мере существенной части биологической полезности или биоактивности токсина.
Характерные особенности клетки-хозяина, выбираемой конкретно для целей производства, включают в себя легкость включения одной или более кодирующих последовательностей согласно изобретению или одной или более родственных кодирующих последовательностей в организм хозяина, который отличается наличием экспрессирующей системы, эффективности экспрессии, стабильности пестицида в клетке хозяина и наличием вспомогательных генетических возможностей. Характерные особенности клетки-хозяина при применении в качестве пестицидной микрокапсулы включают в себя защитные свойства для пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или формирование включений; выживание в водном окружении; низкий уровень токсичности для млекопитающего; привлекательность для поглощения насекомыми-вредителями; легкость в уничтожении и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Может рассматриваться также легкость в создании и управлении, экономичность, стабильность хранения и тому подобное.
Клетка-хозяин, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок согласно изобретению или родственный белок, может выращиваться в любой подходящей питательной среде, где создание ДНК обеспечивает селективное преимущество, предоставляемое селективной средой таким образом, что все или по существу все клетки удерживают нуклеотидную последовательность, кодирующую белок согласно изобретению или родственную кодирующую последовательность. Эти клетки могут быть затем собраны в соответствии с известными методиками. С другой стороны, клетки можно обработать до их сбора.
Кодирующие последовательности согласно настоящему изобретению, включая последовательности, приведенные в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32, и тому подобные могут быть использованы в качестве основы для конструирования модифицированных нуклеотидных последовательностей для введения в растительные клетки. Еще более предпочтительным является синтез не встречающейся в природе нуклеотидной последовательности, которая кодирует один или несколько белков согласно настоящему изобретению или родственный инсектицидный белок или его эквивалент, для экспрессии в растительной клетке, при этом синтез не встречающейся в природе нуклеотидной последовательности основан на аминокислотной последовательности нативного белка без обращения к нативной нуклеотидной последовательности, на основании которой рассчитана нативная аминокислотная последовательность. Экспрессия таких последовательностей в растительных клетках могла бы придать растению, состоящему из таких клеток, большую устойчивость к поражению видами жесткокрылых насекомых и тому подобных. Генетическая инженерия растений с использованием модифицированных последовательностей, кодирующих один или несколько белков согласно настоящему изобретению или родственный белок или родственную инсектицидную аминокислотную последовательность, может быть осуществлена посредством введения требуемой преобразованной для использования в растении (выражение «преобразованная для использования в растении» является синонимом слова «модифицированная» или «синтетическая») ДНК, содержащей кодирующую последовательность, в растительные ткани или клетки с использованием молекул ДНК разнообразных форм и происхождения, которые хорошо известны специалистам в области генетической инженерии растений. Примеры способов внедрения ДНК в ткань растений описаны по меньшей мере в Perlak et al. (1991).
ДНК, содержащая модифицированный ген, кодирующий белок согласно настоящему изобретению, такой как TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 или TIC431 и тому подобные или родственный инсектицидный белок, оперативно связанная с функциональным растительным промотором, может быть непосредственно доставлена в клетки или ткани растений рядом способов, включая, но не ограничивая указанным, опосредованную Agrobacterium трансформацию, вирусы растений, электропорацию, микроинъекцию, вакуум-инфильтрацию, способы слияния с липосомами и баллистические способы и тому подобные. Растительный промотор может быть конститутивным промотором; или промотор может быть временно, пространственно, химически, фотосинтетически, термически или искусственно регулируемым промотором; тканеспецифичным промотором; или даже химерным или гибридным промотором, собранным из частей других функциональных растительных промоторов. Например, промотор может представлять собой промотор 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) или его производное, функционирующее в растениях.
Нативные бактериальные гены и кодирующие последовательности часто плохо экспрессируются в трансгенных растительных клетках. Использование кодонов растениями ближе всего напоминает использование кодонов другими организмами, более высоко организованными, чем одноклеточные организмы, такие как бактерии. В нескольких сообщениях раскрыты способы улучшения экспрессии рекомбинантных генов в растениях (Murray et al., 1989, Nucleic Acids Research, Vol. 17: 477-498; Diehn et al., 1998, Plant Physiology, 117: 1433-1443; Rocher et al., 1998, Plant Phys. 117: 1445-1461). В указанных сообщениях описаны различные способы конструирования кодирующих последовательностей, чтобы представить последовательности, которые более эффективно транслируются, на основе таблиц частоты встречаемости кодонов у растений, улучшений в отклонении третьего положения в кодоне, использования рекомбинантных последовательностей, которые позволяют избегать предполагаемого полиаденилирования, или A/T-богатых доменов или консенсусных последовательностей сплайсинга интронов. Хотя указанные способы конструирования синтетических генов достойны внимания, синтетические гены согласно настоящему изобретению для экспрессии в конкретных растениях получают согласно способу Brown et al. (патент США No. 5689052).
В приведенной в настоящем описании работе используют преимущества способов усиления экспрессии в растениях одного или нескольких белков согласно настоящему изобретению и родственных инсектицидных белков, которые придают устойчивость к жесткокрылым или чешуекрылым насекомым-вредителям растений или даже патогенным нематодам, путем включения или размещения кодирующих последовательностей в геноме ядра, пластид или хлоропластов чувствительных растений. В патенте США No. 5500365 и родственных патентах описаны способы синтеза генов растений для достижения оптимальных уровней экспрессии белка, который кодируется синтезированным не встречающимся в природе или искусственным геном. Указанные способы связаны с модификацией нативных последовательностей структурных генов Bt для получения кодирующей последовательности, которая является более «подобной растительным последовательностям» и поэтому более вероятно транслируется и экспрессируется растением, однодольным или двудольным. Однако способ, который описан Brown et al. (патент США No. 5689052) обеспечивает усиленную экспрессию трансгенов предпочтительно у однодольных растений.
Таким образом, количество гена или нуклеотидной последовательности или нуклеотидного участка, кодирующего представляющий интерес полипептид, например полный белок или инсектицидную часть TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 или родственного полипептида, может быть увеличено в растениях посредством трансформации указанных растений с использованием указанных выше способов трансформации. В частности, трансформация органелл хлоропластов или пластид может давать в результате требуемые кодирующие последовательности, присутствующие в количестве приблизительно до 10000 копий на клетку в тканях, содержащих указанные субклеточные структуры органелл (McBride et al., WO 95/24492).
ДНК, кодирующая пептиды согласно настоящему изобретению и родственные белки, также может быть введена в растения с использованием способа прямого переноса ДНК в пыльцу, как описано (Zhou et al., 1983, Mol. Cell Biol., 10: 4529-4537; Hess, 1987, Intern. Rev. Cytol., 107: 367). Экспрессия кодирующих полипептиды последовательностей, например, tic901 и тому подобных, может быть получена путем инъекции ДНК в репродуктивные органы растения, как описано (Pena et al., 1987, Nature, 325: 274). ДНК также может быть инъецирована непосредственно в клетки незрелых зародышей и в регидратированные обезвоженные зародыши, как описано (Neuhaus et al., 1987, Theor. Appl. Genet., 75: 30).
После осуществления доставки экзогенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные белки согласно настоящему изобретению или родственные белки в клетки-реципиенты, следующая стадия получения трансгенного растения обычно касается идентификации трансформированных клеток для дальнейшего культивирования и регенерации растения, т.е. селекции трансформированных клеток. Как указано в настоящем описании, чтобы увеличить возможность идентификации трансформантов, может требоваться использование селектируемого или подвергаемого скринингу маркерного гена в качестве или в дополнение к представляющему интерес экспрессируемому гену. В данном случае, как правило, затем будет проводиться анализ потенциально трансформированной популяции клеток посредством воздействия на клетки агентом или агентами для селекции, или будет проводиться скрининг клеток в отношении признака требуемого маркерного гена.
Иллюстративный вариант способов идентификации трансформированных клеток заключается в воздействии на трансформированные культуры селективным агентом, таким как метаболический ингибитор, антибиотик, гербицид и тому подобное. Клетки, которые были трансформированы и имеют стабильно интегрированный маркерный ген, придающий резистентность к используемому селективному агенту, будут расти и делиться в культуре. Чувствительные клетки не будут поддаваться дальнейшему культивированию. В одном примере предпочтительный маркерный ген придает резистентность к гербициду глифосату. В том случае, когда данный ген используют в качестве селектируемого маркера, предположительно трансформированную культуру клеток обрабатывают глифосатом. При действии глифосата трансгенные клетки, содержащие рекомбинантный фермент GOX или рекомбинантный нечувствительный к глифосату фермент EPSPS, будут подвергаться дальнейшему культивированию, тогда как чувствительные или нетрансформированные клетки не будут подвергаться культивированию (патент США No. 5569834). Другим примером предпочтительной системы селектируемого маркера является система резистентности неомицинфосфотрансферазы (nptII), посредством которой придают резистентность к антибиотику канамицину, как описано в патенте США No. 5569834. И также после трансформации с использованием данной системы трансформированные клетки будут поддаваться дальнейшему культивированию при обработке канамицином, тогда как нетрансформированные клетки не будут поддаваться культивированию. Еще одна предпочтительная система селектируемого маркера заключается в применении конструкции гена, придающей резистентность к паромомицину. Применение указанного типа системы селектируемого маркера описано в патенте США No. 5424412. Другие селектируемые маркеры хорошо известны в данной области, включая без ограничения маркеры резистентности к антибиотикам, такие как nptII, tet, aad и тому подобные, phnO и другие многочисленные ацетилазы (патент США No. 6448476), различные эстеразы (6107549), барназу (Hartley, 1988), J. Mol. Biol. 202: 913), бактериальные ферменты, придающие активность глифосатоксидазы трансформированной клетке (gox) (Barry et al., 1992, Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. In: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, pp. 139-145. Singh, Flores, and Shannon Eds., American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md.) и тому подобное.
Транспластономная селекция (селекция событий трансформации пластид и хлоропластов) упрощается при использовании преимущества чувствительности хлоропластов или пластид к спектиномицину, ингибитору синтеза белка пластид или хлоропластов, но не синтеза белка цитоплазматическими рибосомами, кодируемыми ядерным геномом. Спектиномицин предотвращает накопление хлоропластных белков, требуемых для фотосинтеза, так что резистентные к спектиномицину трансформированные растительные клетки можно отличить на основе их отличия по окраске: резистентные трансформированные клетки имеют зеленую окраску, тогда как чувствительные клетки являются белыми вследствие ингибирования синтеза белков пластид. Трансформация хлоропластов или пластид подходящим бактериальным геном aad или геном, кодирующим резистентную к спектиномицину функциональную рибосомную РНК пластид или хлоропластов, обеспечивает способ селекции и поддержания транспластономных событий (Maliga, 1993, Trends in Biotechnology 11: 101-106).
Кроме того, предполагается, что для идентификации трансформированных клеток будут применимы комбинации подвергаемых скринингу и селектируемых маркеров. В некоторых типах клеток или тканей агент для селекции, такой как глифосат или канамицин, либо может не давать достаточной цитолитической активности, чтобы четко отличить трансформированные клетки, или может одинаково вызывать существенное неселективное ингибирование трансформантов и нетрансформантов, таким образом приводя к неэффективности способа селекции. Предполагается, что селекция с использованием ингибирующего рост соединения, такого как глифосат или AMPA (аминометилфосфоновая кислота), в концентрациях ниже чем концентрации, которые вызывают 100% ингибирование, с последующим скринингом растущей ткани в отношении экспрессии подвергаемого скринингу маркерного гена, такого как канамицин, может обеспечивать возможность извлекать трансформанты из типов клеток или тканей, которые не поддаются селекции, проводимой отдельно. Предполагается, что комбинации селекции и скрининга могут обеспечивать возможность идентификации трансформантов в более широком множестве типов клеток и тканей.
Развитие или регенерация растений либо из отдельных протопластов растений, либо из разных эксплантатов хорошо известны в данной области (Weissbach and Weissbach, 1988). Указанный способ регенерации и роста обычно включает в себя стадии селекции трансформированных клеток, культивирования указанных отдельных клеток на протяжении обычных стадий зародышевого развития, на протяжении стадии укоряющегося ростка. Трансгенные зародыши и семена регенерируют сходным образом. Полученные в результате трансгенные проростки с корнями затем высаживают в подходящую для роста растений среду, такую как почва.
Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный, экзогенный ген, который кодирует полный белок или инсектицидную часть TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, TIC431 или родственный полипептид, введенный в геном растения опосредованной Agrobacterium трансформацией эксплантатов листа, могут быть достигнуты способами, хорошо известными в данной области (Horsch et al., 1985). В указанном способе трансформанты культивируют в присутствии агента для селекции и в среде, которая индуцирует регенерацию проростков в трансформированную линию растений, как описано (Fraley et al., 1983). В частности, в патенте США No. 5349124 подробно описано создание генетически трансформированных клеток и растений салата-латука, которые в результате этого экспрессируют гибридные кристаллические белки, придающие таким растениям инсектицидную активность против личинок жесткокрылых.
Указанным способом обычно получают проростки в возрасте от двух до четырех месяцев и полученные проростки затем переносят в подходящую индуцирующую корни среду, содержащую селективный агент и антибиотик, чтобы предотвратить бактериальный рост. Проростки, которые дают корни в присутствии селективного агента с образованием небольших растений, затем переносят в почву или другую среду, которая обеспечивает возможность образования корней. Указанные способы варьируют в зависимости от конкретной используемой линии растений, такие вариации хорошо известны в данной области.
Предпочтительно регенерированные растения являются самоопыляющимися, чтобы получить гомозиготные трансгенные растения, или пыльцу, полученную от регенерированных растений, используют для скрещивания с выращенными из семян растениями, важными с агрономической точки зрения, предпочтительно инбредных линий. Наоборот, пыльцу от растений таких важных линий используют для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение согласно настоящему изобретению, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую требуемый инсектицидный белок согласно настоящему изобретению или родственный полипептид, культивируют, используя способы, хорошо известные специалисту в данной области.
Трансгенное растение согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере кодирующую область, кодирующую один или несколько полипептидов согласно настоящему изобретению или родственный полипептид, такой как инсектицидный фрагмент белка TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 или TIC431 или химеру указанных белков. Предпочтительное трансгенное растение дает независимое расщепление и может передавать данный ген и его активность своему потомству. Более предпочтительное трансгенное растение является гомозиготным по данному гену и передает данный ген всему своему потомству при половом размножении. Семена трансгенного растения могут быть выращены на поле или в теплице, и полученные в результате половозрелые трансгенные растения самоопыляются, давая растения для разведения гомозигот. Потомство от таких растений становится чистыми линиями, которые оценивают в отношении повышенной экспрессии трансгена B.thuringiensis.
Предпочтительны трансгенные растения, экспрессирующие более одного инсектицидного агента, при этом каждый агент является токсичным для вида-мишени насекомого-вредителя, и каждый инсектицидный агент проявляет отдельный способ действия или проявляет разные способы введения пор в эпителий средней кишки насекомого-вредителя, являющегося мишенью, либо посредством связывания с отдельными и независимыми рецепторами, либо посредством образование пор, которые измеряемо отличаются от пор, образованных другими одним или несколькими инсектицидными агентами, присутствующими в том же самом трансгенном растении. Предположительно такие растения могут быть трансформированы так, чтобы они экспрессировали по меньшей мере два или более белков согласно настоящему изобретению, или могут быть трансформированы так, чтобы они экспрессировали по меньшей мере один из белков согласно настоящему изобретению вместе с по меньшей мере одним или несколькими неродственными инсектицидными белками, включая, но не ограничивая указанным, белки дельта-эндотоксинов, такие как один или несколько из Cry1, Cry2, Cry3, Cry9, Cry22, ET70, TIC851, и/или любой один или несколько из двойных токсинов ET80/76, ET33/34, PS149B1 и ET100/101 и тому подобных и их слияний, химер и вариантов, инсектицидные белки или комплексы инсектицидных белков из таких разнообразных организмов, как Xenorhabdus и/или Photorhabdus, или белки-токсины VIP, WAR, и/или MIS и родственные белки, и/или одну или несколько трансгенных двунитевых РНК, экспрессия которых в клетки растения приводит к супрессии одного или нескольких генов у одного или нескольких насекомых-вредителей, являющихся мишенью.
0
0
0
Чтобы идентифицировать трансгенное растение, экспрессирующее высокие уровни полипептида согласно настоящему изобретению или родственного белка с предпочтительной нуклеотидной последовательности, может быть необходим скрининг выбранного трансгенного события (R поколение) в отношении инсектицидной активности и/или экспрессии гена. Это можно осуществить различными способами, хорошо известными специалистам в данной области, включая без ограничения: 1) получение небольших образцов ткани из трансгенного растения R и прямой анализ ткани в отношении активности против чувствительных насекомых параллельно с тканью, полученной из неэкспрессирующего растения в негативном контроле [например трансгенные растения кукурузы R, экспрессирующие инсектицидный фрагмент TIC901 или родственного белка, могут быть идентифицированы посредством анализа ткани листа, полученной от таких растений в отношении активности против колорадского картофельного жука (CPB, Leptinotarsa decemlineata) и южного кукурузного жука (SCR, Diabrotica undecimpunctata howardi)]; 2) исследованием экстрактов белка твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), специфичным в отношении фрагмента инсектицидного белка или родственного белка; или 3) термической амплификацией с обратной транскриптазой (также известной как ОТ-ПЦР), чтобы идентифицировать события экспрессии последовательности, кодирующей фрагмент инсектицидного белка или родственный белок.
Пестицидные агенты согласно настоящему изобретению могут быть применены отдельно или в комбинации с другими пестицидными агентами на семенах в виде компонента покрытия семян или агенты согласно настоящему изобретению могут быть получены в трансгенных семенах и объединены с другими пестицидными агентами в форме покрытия семян. Способы и композиции для покрытия семян, которые известны в данной области, применимы в том случае, когда они модифицированы добавлением одного из вариантов комбинации пестицидов согласно настоящему изобретению. Такие способы покрытия и устройства для их нанесения описаны, например, в патента США No. 5918413, 5891246, 5554445, 5389399, 5107787, 5080925, 4759945 и 4465017. Композиции для покрытия семян описаны, например, наряду с другими публикациями в патентах США No. 5939356, 5882713, 5876739, 5849320, 5834447, 5791084, 5661103, 5622003, 5580544, 5328942, 5300127, 4735015, 4634587, 4383391, 4372080, 4339456, 4272417 и 4245432.
В используемом в данном описании смысле подразумевается, что термин «биологический образец» или «образец» включает нуклеиновые кислоты, полинуклеотиды, ДНК, РНК, тРНК, кДНК и тому подобное в композиции или связанные с субстратом, что дает возможность подвергать образец анализу с помощью молекулярного зонда или термической амплификации с использованием олигонуклеотидных зондов и/или праймеров. Растение или продукт растения, либо фрукт, либо семя растения считают биологическим образцом, и любой экстракт из такого растения или продукта растения, части растения, фрукта или семени также считают биологическим образцом. Как таковые биологические образцы могут быть получены из важных с агрономической или коммерческой точки зрения продуктов и/или композиций материалов, включая без ограничения корм для животных, сырье и продукты и сопутствующие продукты из кукурузы, которые предназначены для применения в качестве продуктов питания для потребления человеком или для применения в композициях, которые предназначены для потребления человеком, включая без ограничения кукурузную муку, кукурузную муку грубого помола, кукурузную патоку, кукурузное масло, кукурузный крахмал, попкорн, кукурузную лепешку, крупяные продукты, содержащие кукурузу и кукурузные полуфабрикаты и тому подобное, и подразумевается, что образцы входят в объем настоящего изобретения, если указанные продукты и композиции материалов содержат регистрируемые количества нуклеотидных последовательностей или кодируемых ими пестицидных белков, которые приведены в данном описании.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют характерные признаки нуклеотидных последовательностей, предлагаемых в данном описании, и инсектицидную активность белков, кодируемых предлагаемыми нуклеотидными последовательностями. Кроме того, раскрыты способы и процессы практического осуществления изобретения. Однако специалистам в данной области должно быть понятно, в свете приведенного описания, что могут быть осуществлены многие изменения конкретных вариантов, которые предлагаются, и все еще получить подобный или сходный результат, не отходя от сути и не выходя за рамки объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Данный пример иллюстрирует идентификацию инсектицидного белка, секретируемого в среду B.thuringiensis штамма EG2158.
EG2158 является штаммом B.thuringiensis дикого типа, первоначально изолированным из пыли соевых бобов (Donovan et al., 1988). Во время споруляции клетки EG2158 создают кристаллы ромбовидной формы, состоящие из белка 73 кДа, идентифицированного как Cry3C. Кристаллические смеси спор EG2158 токсичны для личинок колорадского картофельного жука. Bacillus megaterium, трансформированные клонированным геном cry3C, проявляют токсичность в отношении личинок CPB, подобную штамму EG2158, что свидетельствует о том, что специфичная в отношении жесткокрылых токсичность EG2158 обусловлена кристаллическим белком Cry3C (Donovan et al., 1988). Поэтому было неожиданным, что истощенные среды, использованные для ферментации штамма EG2158, которые не содержат спор или кристаллического белка Cry3C, могут быть токсичными для CPB, так как обработанные истощенные среды не содержат достаточно спор или кристаллического белка Cry3 для проявления измеряемой инсектицидной токсичности.
2
4
2
4
Штаммы B.thuringiensis выращивали в 60 мл культуральной среды PYG при встряхивании в течение ночи при 30°C. Среда PYG состояла из 11,8 грамм пептона, 23,6 грамм дрожжевого экстракта, 4 миллиграмм глицерина, 19,4 грамм безводного KHPO и 2,2 грамм безводного KHPO на литр деионизованой воды. Культуры B.thuringiensis после ферментации в течение ночи центрифугировали при 11000×g в течение 30 минут и бесклеточные надосадки переносили в чистые колбы. В данном описании надосадки также называют истощенной средой и/или осветленной истощенной средой или осветленным надосадком.
Надосадки охлаждали до 4°C. 34 грамма сульфата аммония плюс 1 миллилитр 1 М NaOH медленно добавляли к 60 миллилитрам надосадка при перемешивании. Насыщенные сульфатом аммония надосадочные смеси центрифугировали, чтобы собрать преципитируемые белки в осадок. Осадки растворяли в 2 миллилитрах 20 мМ трис·HCl с pH 7,5. Суспензии в трис-буфере переносили в диализную трубку (предел отсечения по молекулярной массе 6000) и диализовали при 4°C против 20 мМ трис-HCl pH 7,5. Диализованные суспензии называют в данном описании диализатами растворов сульфата аммония (ASD).
Диализаты растворов сульфата аммония (ASD) тестировали по токсичности в отношении личинок колорадского жука картофеля (CPB, также формально называемого Leptinotarsa decemlineata). 50 мкл каждого ASD локально вносили в 2 мл корма для насекомых в чашку с кормом. Всего обрабатывали шестнадцать чашек с кормом в случае каждого диализата. В каждую чашку с кормом помещали по одной личинке CPB на ранней возрастной стадии и через 3 дня оценивали смертность насекомых. Выполняли многочисленные повторы указанной процедуры c несколькими разными штаммами B.thuringiensis. Диализат B.thuringiensis штамма EG2158 проявлял токсичность по отношению к личинкам CPB.
Пример 2
Данный пример иллюстрирует способы очистки инсектицидного белка, называемого в данном описании TIC901, из истощенных культуральных сред, получаемых при ферментации Bacillus thuringiensis штамма EG2158.
Белки, присутствующие в ASD EG2158, оценивали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ). 30 мкл диализата смешивали с 15 мкл буфера для солюбилизации белков Лэммли (Mol. Biol. 80: 575-599; 1973) и нагревали до 100°C в течение 5 минут. Приблизительно 25 мкл смеси наносили на 10% SDS-полиакриламидный гель. После электрофореза белки визуализировали после окрашивания Кумасси бриллиантовым синим. Результаты показали, что ASD EG2158 содержали приблизительно тридцать белков размером в диапазоне приблизительно от 20 до 120 кДа.
2 миллилитра ASD EG2158 наносили на колонку с диэтиламиноэтилом (DEAE), уравновешенную 20 мМ трис-HCl pH 7,5. Белки элюировали в колонки 20 миллилитрами градиента NaCl(от 0 до 500 мМ) в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5. Собирали фракции элюата объемом 1 миллилитр и каждую фракцию диализовали против 20 мМ трис-HCl, pH 7,5. Отдельные фракции тестировали после диализа в отношении токсичности для CPB, используя биоанализ, сходный с анализом, описанным в примере 1. Фракции, проявляющие токсичность по отношению к личинкам CPB, объединяли и диализовали. Объединенные фракции названы DEAE-токсичная фракция EG2158. Белки в DEAE-токсичной фракции EG2158 анализировали посредством SDS-ПААГ и окрашивания Кумасси. Результаты показали, что DEAE-токсичная фракция EG2158 содержала пять основных белков, а также несколько минорных белков разного размера.
2 миллилитра DEAE-токсичной фракции EG2158 наносили на колонку с четвертичным аммонием (QA), уравновешенную 20 мМ трис-HCl pH 7,5. Белок элюировали с колонки 20 миллилитрами линейного градиента NaCl (от 0 до 500 мМ) в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5. Фракции объемом 1 миллилитр собирали и диализовали отдельно снова в 20 мМ трис-HCl, pH 7,5. Диализованные фракции тестировали по токсичности в отношении личинок CPB. Фракции, демонстрирующие наибольшую токсичность в отношении CPB, объединяли. Объединенную фракцию назвали QA-токсичная фракция EG2158. Белки в QA-токсичной фракции EG2158 анализировали посредством SDS-ПААГ и окрашивания Кумасси. The результаты показали, что QA-токсичная фракция EG2158 содержала один основной белок приблизительно 38 кДа, названный TIC901, и несколько минорных видов белка разного размера. Результаты свидетельствуют, что очищенный белок 38 кДа ответственен за токсичность по отношению к CPB, наблюдаемую в образцах.
Пример 3
Данный пример иллюстрирует выделение и идентификацию нуклеотидной последовательности из EG2158, которая кодирует белок TIC901.
Белки в QA-токсичной фракции EG2158 разделяли по размеру в SDS-ПААГ без окрашивания Кумасси. Разделенные белки переносили из SDS-ПААГ на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану электроблоттингом. PVDF-мембрану красили недолго красителем Кумасси и часть мембраны, содержащую очищенный белок TIC901, вырезали чистым лезвием бритвы и подвергали автоматизированному секвенированию деградацией по Эдману. Результаты показали, что белок TIC901 содержал аминоконцевую аминокислотную последовательность, соответствующую
NH
COO-
3
-V I G P Y A E S Y I D R V Q D-, которая указана в SEQ ID NO:1.
Обще признано, что большинство белков, продуцируемых in vivo в бактериальных системах, имеют остаток метионина (M) на своем N-конце. Тот факт, что N-конец белка TIC901 не содержит аминоконцевого остатка метионина, наряду с тем фактом, что белок, как обнаружено, находится в истощенной среде, свидетельствует, что белок TIC901 может быть образован протеолитическим отщеплением сигнального пептида секреции от N-концевой области более крупного белка-предшественника.
На основании частичной аминокислотной последовательности очищенного в геле белка TIC901, которая определена деградацией по Эдману, и на основании предпочтения в использовании кодонов, наблюдаемого в нативных генах Bacillus thuringiensis, кодирующих 8-эндотоксины, сконструирован олигонуклеотидный зонд для применения в качестве зонда для выявления нуклеотидных последовательностей Bacillus thuringiensis штамма EG2158, которые могут кодировать очищенный в геле белок TIC901. Зонд идентифицировали как WD444, и он содержал последовательности, которые указаны в SEQ ID NO:2 (5'-GTA ATT GGA CCA TAT GCA GAA TCA TAT ATT GAT XGA GTA CAA GA-3', где X означает либо A, либо C).
ДНК очищали из клеток B.thuringiensis штамма EG2158 стандартными способами (например, Sambrook et al., 1989). Образец экстракта ДНК расщепляли эндонуклеазой рестрикции HindIII, подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле в буфере TAE, блоттингу на нейлоновый фильтр, и анализировали, используя Саузерн-блот с помощью смеси зондов WD444, конъюгированных с щелочной фосфатазой, в течение приблизительно 16 часов при 40°C в буфере для гибридизации в условиях от низкой до умеренной жесткости и промывали при 40°C в буфере для промывки, затем подвергали воздействию хемилюминесцентных реагентов и экспонировали с пленкой (буферы для гибридизации и промывки получали в наборе AMERSHAM/PHARMACIA BIOTECH, номер в каталоге RPN3690). Результаты показали, что зонд по-видимому специфично гибридизуется с одним HindIII-фрагментом длиной приблизительно 8 тысяч пар оснований.
Библиотеку E. coli, содержащую HindIII-фрагменты рестрикции EG2158 длиной приблизительно 8 т.п.о., конструировали в плазмиде pUC18. Рекомбинантные колонии переносили блоттингом на нейлоновые фильтры и денатурировали NaOH стандартными способами (например, Sambrook et al., 1989). Фильтры инкубировали в растворе для гибридизации со смесью меченых зондов WD444. Мембраны промывали после инкубации с зондом в условиях, сходных с условиями, описанными выше, подвергали воздействию хемилюминесцентных реагентов и экспонировали с пленкой. Идентифицировали несколько колоний, которые по-видимому специфично гибридизуются со смесью зондов WD444. Плазмидную ДНК экстрагировали из указанных нескольких колоний и анализировали с помощью Саузерн-блота, используя смесь олигонуклеотидов WD444 в качестве зонда. Результаты показали, что плазмиды состояли из вектора pUC18 плюс встроенный HindIII-фрагмент длиной приблизительно 8 т.п.о. Одна типичная плазмида была выбрана для дальнейшей характеристики и названа pEG1379 (и позже pMON74007). Очищенная колония штамма E. coli, содержащая pMON1379, названа EG12447 и депонирована в NRRL 6 февраля 2002 и снабжена номером доступа депозита NRRL B 30549.
Пример 4
Данный пример иллюстрирует экспрессию инсектицидного белка с HindIII-фрагмента длиной приблизительно 8 т.п.о. в плазмиде pEG1381 в не имеющем кристаллов штамме Bacillus thuringiensis.
Нативные гены Bacillus thuringiensis часто плохо экспрессируются в клетках-хозяевах, отличных от Bacillus, таких как E. coli. pEG518 сконструирован в виде челночного вектора Bacillus-E. coli и представляет собой химеру репликона pMM101 Bacillus (Norton et al., Plasmid 13: 211-214; 1985) и pUC18 (Yanisch-Perron et al, Gene 33: 103-119; 1985) и поэтому способен реплицироваться в E.coli и близкородственных грамотрицательных бактериях или в Bacillus и близко родственных грамположительных бактериях. pEG518 придает резистентность к антибиотику β-лактаму E.coli и родственным бактериям и резистентность к тетрациклину Bacillus и родственным бактериям, трансформированным так, чтобы они содержали производные данной конкретной плазмиды. HindIII-фрагмент длиной 8 т.п.о., присутствующий в плазмиде pMON1379, вырезали и встраивали в HindIII-сайт плазмиды pEG518. Полученной плазмидой pEG1381 путем электропорации трансформировали не образующий кристаллов и неинсектицидный штамм Bacillus thuringiensis EG10650 (NRRL, номер доступа NRRL B-30217).
(Штамм EG10650 Bacillus thuringiensis. B.thuringiensis EG10650 представляет собой производное штамма EG10368 (патент США No. 5759538; 2 июня 1998), который дефицитен по активностям нейтральной протеазы и щелочной протеазы и содержит только один известный внехромосомный плазмидный элемент размером 7,5 т.п.о. Введена делеция в гене щелочной протеазы в штамме EG10368, приводящая в результате к штамму EG EG10654 (NRRL, номер доступа NRRL B-21344). Делеция в гене нейтральной протеазы введена в штамме EG10368, приводящая в результате к штамму EG10624 (NRRL, номер доступа NRRL B-21347). Затем указанные делеции объединяли в одном штамме, получая штамм EG10650, который не содержит никаких мега-дальтонных плазмид и поэтому не способен экспрессировать любые известные инсектицидные белки, а также является дефицитным по продукции как щелочной, так и нейтральной протеаз.)
Одну колонию, представляющую собой отдельный трансформант и названную EG12450, отбирали на среде, содержащей тетрациклин, для дальнейшего анализа.
Плазмиду pEG1381 выделяли из культуры штамма EG12450, выращенной в течение ночи в присутствии тетрациклина. ДНК pEG1381 расщепляли HindIII и сравнивали посредством электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромидом этидия с HindIII-фрагментом, присутствующим в pEG1379. Обе плазмиды содержали очевидно идентичный HindIII-фрагмент длиной около 8 т.п.о.
Штаммы EG12450, EG2158 и EG10650 выращивали в течение ночи в среде PYG. Диализат раствора сульфата аммония (ASD) получали из каждого надосадка культуры, как описано в примере 1. Образцы ASD наносили на DEAE-колонку, белки элюировали с колонки и фракции собирали, как описано в примере 2. Белки в DEAE-фракциях анализировали в SDS-ПААГ и красили Кумасси бриллиантовым синим. Результаты показали, что DEAE-фракции контрольного не образующего кристаллы штамма EG10650 не содержат существенных количеств какого-либо белка, соответствующего по размеру белку TIC901, хотя присутствовали некоторые минорные белки с размером, приблизительно равным размеру белка TIC901. Напротив, DEAE-фракции, полученные из надосадков истощенных культур, в которых выращивали штамм EG2158, содержали преобладающее количество белка, соответствующего по размеру белку TIC901. DEAE-фракции, полученные из надосадков истощенных культур, в которых выращивали рекомбинантный штамм EG12450, содержали значительные количества белка, соответствующего по размеру белку TIC901, продуцируемому штаммом EG2158. Полученный результат показал, что HindIII-фрагмент размером 8 т.п.о., полученный из штамма EG2158, присутствующий в рекомбинантной плазмиде pEG1381, содержал нативный ген Bacillus thuringiensis белка, имеющего массу, приблизительно равную массе белка TIC901, изолированного из истощенной среды ферментации штамма EG2158.
Пример 5
Данный пример иллюстрирует идентификацию последовательности ДНК нативной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок TIC901, и рассчитанной аминокислотной последовательности TIC901.
HindIII-фрагмент размером приблизительно 8 т.п.о., присутствующий в плазмиде pMON1378, подвергали анализу дидезоксинуклеотидной последовательности. Часть нуклеотидной последовательности, полученная из фрагмента размером 8 т.п.о., представлена в SEQ ID NO:5. Идентифицировали открытую рамку считывания, состоящую из 1101 нуклеотида, в HindIII-фрагменте длиной приблизительно 8 т.п.о., начинающуюся с кодона метионина ATG в положении нуклеотидов 153-155 и заканчивающуюся кодоном лейцина TTG в положении нуклеотидов 1251-1253, непосредственно выше кодона терминации TAG, которая представлена в SEQ ID NO:5. Открытая рамка считывания, идентифицированная в данной нуклеотидной последовательности, состоит из 429 остатков аденозина (приблизительно 39% A), 334 остатков тимидина (приблизительно 30% T), 196 остатков гуанидина (приблизительно 18% G) и 145 остатков цитозина (приблизительно 13% C) и имеет приблизительно 69% AT и приблизительно 31% GC. Три кодона метионина представлены в пределах первых восьмидесяти четырех (84) нуклеотидов ОРС. Отличный от кодона ATG в положениях нуклеотидов 153-155, как указано в SEQ ID NO:3, второй кодон ATG в рамке с кодоном в положении 153-155 расположен в положении нуклеотидов 182-184, и еще один третий кодон ATG в рамке с указанными ранее двумя кодонами ATG расположен в положении нуклеотидов 201-203. Не обнаружили консенсусной связывающей рибосомы последовательности ни выше второго, ни выше третьего кодона ATG, однако консенсусную связывающую рибосомы последовательность идентифицировали выше первого кодона ATG, с центром приблизительно на 10 нуклеотидов выше первого ATG. Консенсусная связывающая рибосомы последовательность состоит из нуклеотидов приблизительно от 141 до 147, как указано в SEQ ID NO:3.
Аминокислотная последовательность, рассчитанная на основе данной открытой рамки считывания, состоит их 367 аминокислот, которые указаны в SEQ ID NO:4. Предполагается, что открытая рамка считывания кодирует белок-предшественник, который имеет рассчитанную молекулярную массу приблизительно 41492 дальтон. 40 аминокислот являются сильно основными (лизин и аргинин), 43 аминокислоты являются сильно кислотными (аспартат и глутамат), 113 аминокислот являются типично гидрофобными по природе (аланин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, триптофан и валин) и 122 аминокислоты являются типично полярными по природе (аспарагин, цистеин, глутамин, серин, треонин и тирозин). Белок-предшественник имеет рассчитанную изоэлектрическую точку приблизительно 6,368 и имеет рассчитанный суммарный заряд приблизительно -2,102 при pH 7,0. Предполагается, что первые тридцать (30) аминокислотных остатков, кодируемых открытой рамкой считывания, содержат аминоконцевой сигнальный пептид, который процессируется, вероятно сигнальной пептидазой типа II, высвобождая инсектицидный белок во внеклеточное пространство. Рассчитано, что указанные первые тридцать (30) аминокислотных остатков содержат аминоконцевой сигнальный пептид, на основании алгоритма Nielsen et al. (1997, Protein Engineering 10: 1-6). Не обнаружено, чтобы рассчитанный сигнальный пептид кроме аминокислотных остатков от положения тридцать один (31) до положении сорок три (43), которые указаны в SEQ ID NO:4, был связан или ассоциирован со зрелым белком, находящимся в истощенной среде, и предполагается, что он протеолитически удаляется во время прохождения через мембрану и высвобождает зрелый инсектицидный белок во внеклеточное пространство.
Нуклеотиды 130-174, которые указаны в SEQ ID NO:3, наиболее близко соответствовали последовательности зонда, представленной в SEQ ID NO:2. Нуклеотиды SEQ ID NO:2 при считывании в рамке с соответствующей кодирующей последовательностью аминокислотной последовательности TIC901 соответствовали кодонам, кодирующим аминоконцевые аминокислоты инсектицидного белка, очищенного из истощенных сред культур Bacillus thuringiensis штамма EG2158. Предположили, что аминокислоты, кодируемые рамкой считывания TIC901 на протяжении указанной области нуклеотидной последовательности, соответствуют аминокислотной последовательности из аминокислот, рассчитанных способом деградации по Эдману, инсектицидного белка, очищенного из истощенных сред культур штамма EG2158, которая представлена в SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO:1, идентична аминокислотной последовательности, рассчитанной вдоль данной области открытой рамки считывания для TIC901, за исключением того, что положение аминокислоты 12, указанное в SEQ ID NO:1, соответствует остатку аргинина, тогда как соответствующий аминокислотный остаток, рассчитанный по последовательности открытой рамки считывания в SEQ ID NO:3, соответствует остатку изолейцина в положении аминокислоты 55, как указано в SEQ ID NO:4. Полученный результат свидетельствует либо о том, что встретилась ошибка в результате анализа последовательности по Эдману белка, очищенного из истощенной культуральной среды EG2158, который, как предположили, является белком TIC901, либо о том, что присутствует более одного TIC901-подобного белка в концентрированном и очищенном образце, представленном для анализа последовательности по Эдману. Хорошо известно, что при секвенировании по Эдману нередко встречаются ошибки. Однако полученный результат в отдельности свидетельствует, что более одного гена, кодирующего внеклеточный секретируемый инсектицидный белок, может присутствовать в Bacillus thuringiensis штамма EG2158. Полный анализ указанной гипотезы приведен в данном описании, начиная с примера 9.
Большинство бактериальных белков, высвобождаемых во внеклеточные пространства, имеют тенденцию синтезироваться в виде более крупных предшественников, которые процессируются аппаратом секреции, который отщепляет часть белка-предшественника от зрелого белка, который высвобождается во внеклеточную среду. Возможно, что инсектицидный белок, обнаруживаемый в истощенных средах из культур штамма EG2158, синтезируется в штамме EG2158 в виде белка-предшественника, который направляется для секреции всеми или частью из сорока трех (43) аминокислот, рассчитанных в виде части открытой рамки считывания, которая указана в SEQ ID NO:3. Секретируемые белки, продуцируемые грамположительными и грамотрицательными бактериями, которые направляются к аппарату секреции типа II, обычно имеют секреторный или сигнальный пептид, который имеет длину приблизительно от восемнадцатого (18) до приблизительно двадцати восьми (28) - тридцати (30) или более аминокислот. Как указано выше, имеются два кодона метионина, соответствующие аминокислотным остаткам в положении восемнадцать (18) и двадцать семь (27), соответственно, которые рассчитаны на основе открытой рамки считывания, которая указана в SEQ ID NO:3, выше остатка валина (кодон в положениях нуклеотидов 282-284, которые указаны в SEQ ID NO:3), рассчитанного способом деградации по Эдману как аминоконцевая аминокислота белка TIC901. Остаток валина, указанный в SEQ ID NO:4, соответствующий рассчитанному на основе способа деградации по Эдману аминоконцевому остатку секретируемого белка, обнаруживаемого в истощенных средах из культур EG2158, расположен в положении остатка номер сорок четыре (44). Вероятно, что два проксимальных остатка метионина в аминокислотной последовательности, являющейся аминоконцевой по отношению к остатку валина в положении 44, составляют альтернативные сайты инициации трансляции для синтеза предполагаемого предшественника белка TIC901, продуцируемого в EG2158. Однако имеются очень плохие консенсусные последовательности Шайна-Далгарно выше указанных двух альтернативных кодонов инициации трансляции. Кроме того, так как белок обнаруживается в истощенных средах, то анализ рассчитанной аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидами после кодона MET в положении 153-155 с использованием алгоритмов расчета сигнального пептида, хорошо известных в данной области, показывает, что первые тридцать аминокислот хорошо подходят по установленным параметрам для аминокислотных последовательностей, которые функционируют в качестве сигнальных пептидов. Поэтому предполагается, что первый ATG в положении нуклеотидов 153-155, которые указаны в SEQ ID NO:3, является кодоном инициации транскрипции, действительно используемым Bacillus thuringiensis штамма EG2158 для экспрессии предшественника белка TIC901, который затем процессируется до зрелой формы белка, секретируемого из клетки.
Рассчитанный сигнальный пептид, который указан выше, состоит из аминокислотных остатков с первого (1) по тридцатый (30), которые указаны в SEQ ID NO:4, и имеет признаки классического сигнального пептида типа II, включая основной заряд на аминоконце, нейтрально заряженную предполагаемую альфа-спиральную область кора приблизительно от шестого (6) аминокислотного остатка до приблизительно двадцать второго (22) аминокислотного остатка (22) и консенсусную последовательность узнавания сигнальной пептидазой II Ala-Xaa-Ala от двадцать восьмого (28) остатка до тридцатого (30) остатка, которая может распознаваться как субстрат протеолитического расщепления для расщепления пептидной связи между тридцатым (30) и тридцать первым (31) аминокислотными остатками. Карбоксильный конец сигнального пептида идентифицирован как ключевая последовательность узнавания для сигнальной пептидазы, ответственной за протеолитическое отщепление сигнального пептида от белка-предшественника с высвобождением зрелого белка во внецитоплазматические пространства, т.е. периплазму или внеклеточное пространство из грамотрицательных бактерий или во внеклеточное пространство из грамположительных бактерий. Стереотипичной консенсусной последовательностью узнавания для сигнальной пептидазы II является Ala-Xaa-Ala. Правило для остатка Xaa заключается в том, что он как правило не может быть крупным или заряженным аминокислотным остатком. Напротив, три остатка вблизи аминоконцевого аминокислотного остатка (+1) в зрелом белке TIC901 не соответствуют консенсусной последовательности узнавания сигнальной пептидазой типа II. Вместо этого аминокислотной последовательностью сигнального пептида TIC901, которая может узнаваться альтернативной или неизвестной в настоящее время и/или неохарактеризованной сигнальной пептидазой, является Ser-Gln-Gln (S-Q-Q), которая как известно не характерна для какой-либо последовательности узнавания сигнальной пептидазы, наблюдаемой ранее. Альтернативно, может существовать пока еще неидентифицированная пептидаза, которая узнает общую структуру аминокислот с тридцать первой (31) по сорок третью (43), которые указаны в SEQ ID NO:4, и удаляет указанные аминокислоты, высвобождая активный инсектицидный белок в среды или другие окружающие внеклеточные пространства. Указанные последние тринадцать аминокислот с тридцать первой (31) по сорок третью (43), которые указаны в SEQ ID NO:4, могут служить для защиты от токсичности белка вплоть до его высвобождения из клетки.
Пример 6
Данный пример иллюстрирует сравнение инсектицидной биологической активности белка, очищенного из нативного штамма EG2158 Bacillus thuringiensis, с инсектицидным белком, выделенным из рекомбинантного штамма EG12450 Bacillus thuringiensis.
Получали образцы отработанных сред из-под культур штаммов EG12450, EG2158 и EG10650 и растворимые белки, присутствующие в каждом из образцов, концентрировали и подвергали DEAE-фракционированию согласно способу, приведенному в примере 3 в данном описании. Фракции, содержащие белок, соответствующий TIC901, объединяли для каждого штамма. Объединенные фракции сравнивали одновременно в биоанализе против колорадского картофельного жука. DEAE-фракции из истощенных сред EG12450 и EG2158 содержали 87 мкг/мкл и 22 мкг/мкл белка TIC901, соответственно, как измерено денситометрией в геле с использованием известных количеств БСА в качестве стандарта. Токсичность по отношению к личинкам CPB измеряли, нанося различные количества фракций на поверхность корма для насекомых в чашках, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2Смертность личинок CPB в процентах
Количество внесенной DEAE-фракции
Штамм
50 мкл
25 мкл
12,5 мкл
6,3 мкл
3,1 мкл
EG2158
97%
78%
47%
25%
19%
EG10650
3
0
6
3
9
EG12450
91
94
72
38
16
Результаты, которые представлены в таблице 2, показывают, что DEAE-фракции, содержащие белок TIC901 из штаммов B. thuringiensis EG2158 и EG12450, являются токсичными для личинок CPB. Сходные DEAE-фракции из штамма EG10650 использовали в качестве негативного контроля, и они были нетоксичными для личинок CPB. Средние стандартные ошибки не рассчитывали.
Пример 7
Данный пример иллюстрирует выделение фрагмента рестрикции NsiI-HincII размером 1,96 т.п.о., содержащего полную кодирующую область TIC901, из pEG1379, и анализ ингибирующей по отношению к кукурузному жуку-блошке биологической активности белка TIC901, изолированного из отработанных культур рекомбинантного штамма SIC8098, экспрессирующего белок TIC901 с плазмиды, содержащей NsiI-HincII-фрагмент.
NsiI-HincII-фрагмент рестрикции размером 1,96 т.п.о., содержащий полную кодирующую область TIC901, из pEG1379 субклонировали в совместимых сайтах (PstI и SmaI) в челночном векторе pEG597 B.thuringiensis-E.coli (Baum et al., 1990). Единственной открытой рамкой считывания в данном рестрикционном фрагменте, которая способна кодировать белок размера TIC901, является кодирующая последовательность, указанная в SEQ ID NO:3. Полученную в результате рекомбинантную плазмиду, названную pIC17048, вводили в образующий кристаллов штамм-хозяин EG10650 B.thuringiensis электропорацией. Рекомбинантный штамм B.thuringiensis, содержащий pIC17048, назван штаммом SIC8098.
Штаммы B.thuringiensis EG10650 и SIC8098 выращивали в 300 мл бульона Terrific (в колбах объемом 1 л) в течение 40 часов при 30°C и энергичном перемешивании. Истощенные культуры центрифугировали при 8000 об/мин и 4°C в течение 30 минут в роторе Sorvall GS3. Аликвоты надосадков культуры анализировали электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле. Штамм SIC8098 накапливает высокие уровни белка TIC901 в надосадке культуры. Оценка условий роста для EG2158 и для рекомбинантных штаммов B.thuringiensis. кодирующих TIC901, показала, что значительно более высокие количества белка TIC901 накапливались в истощенных средах в том случае, когда штаммы ферментировали при 25°C в течение сорока восьми (48) часов вместо стандартных условий при 30°C в течение восемнадцати (18) часов. Это свидетельствует о том, что белок TIC901 не может оптимально продуцироваться вплоть до достижения поздней log-фазы или ранних стационарных фаз роста.
Надосадки культур EG10650 и SIC8098 доводили до 85% насыщения сульфатом аммония при 4°C. Преципитированные белки собирали центрифугированием. Осадки белков растворяли в 10 мМ трис-HCl, 0,1 мМ EDTA, 0,005% тритоне X-100 (pH 6,8) и диализовали против 200-кратного объемного избытка такого же буфера. Нерастворимый материал осаждали центрифугированием и осветленный диализат, содержащий по существу очищенный белок TIC901, использовали непосредственно для биоанализов насекомых. Количество очищенного белка TIC901 в диализате определяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и денситометрией, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта белка. Биоанализы проводили в 96-луночных планшетах, при этом каждая лунка содержала искусственный корм для жуков-блошек. Образцы, содержащие токсин, или контрольные образцы помещали на корм, обеспечивая пропитанную токсином покрывающую поверхность. В среднем в лунку помещали одно яйцо жука-блошки. В среднем использовали двадцати четыре (24) лунки на обработку. Планшеты герметично закрывали и инкубировали в течение одной недели перед характеристикой личинок в отношении смертности и массы.
Биоанализы осуществляли против личинок как южного, так и западного кукурузного жука, используя токсин против жуков-блошек Cry3Bb (вариант аминокислотной последовательности 11231, English et. al., патент США No. 6063597) в качестве позитивного контроля. Результаты анализов показаны в таблицах 3 и 4.
Таблица 3Биоанализ TIC901 против западного кукурузного жука
Штамм-источник
Токсин, мг/мл
Средняя масса личинок
95% CI<sup>1</sup>
Значимость<sup>2</sup>
EG10650
0
0,44
0,35-0,53
Cry3Bb
0,25
0,18
0,13-0,22
*
Cry3Bb
0,50
0,15
0,10-0,20
*
Cry3Bb
1,0
0,13
0,10-0,16
*
TIC901
0,25
0,36
0,25-0,48
TIC901
0,50
0,48
0,36-0,61
TIC901
1,0
0,29
0,26-0,31
*
TIC901
2,0
0,27
0,23-0,32
*
<sup>1</sup> 95% доверительный интервал
<sup>2 </sup>Звездочка (*) указывает, что результаты значимо отличались от негативного контроля EG10650, критерий Даннета, альфа = 0,05.
Таблица 4Биоанализ TIC901 против южного кукурузного жука
Штамм-источник
Токсин, мг/мл
Средняя масса личинок
95% CI<sup>1</sup>
Значимость<sup>2</sup>
EG10650
0
0,64
0,55-0,72
Cry3Bb
0,25
0,45
0,40-0,51
*
Cry3Bb
0,50
0,42
0,39-0,44
*
Cry3Bb
1,0
0,31
0,19-0,42
*
TIC901
0,25
0,38
0,31-0,45
*
TIC901
0,50
0,33
0,20-0,45
*
TIC901
1,0
0,26
0,14-0,38
*
<sup>1</sup> 95% доверительный интервал
<sup>2 </sup>Звездочка (*) указывает, что результаты значимо отличались от негативного контроля EG10650, критерий Даннета, альфа = 0,05.
Результаты показывают, что TIC901 является активным против обоих видов жуков, но проявляет более высокую активность против вида южного кукурузного жука.
Пример 8
Данный пример иллюстрирует конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей белок TIC901, для повышенной экспрессии в растениях.
Аминокислотную последовательность белка TIC901, указанную в SEQ ID NO:4, использовали для конструирования нуклеотидной последовательности, по существу согласно Fischhoff and Perlak, патент США с регистрационным No. 5500365, и по существу согласно Brown et al., патент США с регистрационным No. 5689052. Коротко, получена таблица частоты кодонов из более чем 53000 участков последовательностей геномной ДНК кукурузы, риса и пшеницы, предположительно кодирующих последовательность белка в указанных растениях. Получили более десяти миллионов девяносто тысяч кодонов (10900000) из указанных участков последовательностей. Затем отбирали кодоны для применения в конструировании не встречающейся в природе или синтетической последовательности, кодирующей TIC901, для применения в растениях. Полученная в результате кодирующая последовательность имеет GC-состав, который сходен с последовательностями, присутствующими в растениях, и в частности, поскольку для получения таблицы использования кодонов применяли однодольные растения, кодирующая последовательность имеет большее сходство по структуре с геном однодольных, чем с геном двудольных, и поэтому предпочтительна для применения в целях экспрессии белка TIC901 или вариантов белка в видах однодольных растений. Одна из таких последовательностей для не встречающейся в природе кодирующей последовательности, предпочтительной для применения у видов однодольных, приведена в SEQ ID NO:13, а аминокислотная последовательность кодируемого белка указана в SEQ ID NO:14. Специалисту в данной области будет понятно, что SEQ ID NO:13 является одной из огромного числа кодирующих последовательностей, которые могли бы функционировать, экспрессируя инсектицидный белок у видов однодольных растений. Кроме того, специалисту в данной области также будет понятно, что синтетическая кодирующая последовательность, такая как SEQ ID NO:13, кодирующая полный белок или инсектицидную часть белка TIC901, или кодирующая инсектицидный вариант аминокислотной последовательности данного белка, состоящий из другой последовательности, отличной от последовательности, указанной в SEQ ID NO:4, но которая гибридизуется с SEQ ID NO:13 в жестких условиях гибридизации, также может входить в объем настоящего изобретения.
Пример 9
Данный пример иллюстрирует идентификацию и характеристику гомологов tic901 и пептидов, кодируемых указанными гомологами нуклеотидной последовательности, которые в значительной степени сходны и таким образом являются родственными белку TIC901.
Как указано в таблице 1, идентифицирован ряд штаммов, которые продуцировали профили внеклеточных белков, обладающих инсектицидной биологической активностью против жесткокрылых. Идентифицировали последовательность, кодирующую белок TIC901, которая приведена в качестве иллюстрации в указанных выше примерах, из плазмидной библиотеки штамма EG2158, используя в качестве зонда SEQ ID NO:2, соответствующую последовательностям, кодирующим SEQ ID NO:1, и измененную в сторону предпочтительного использования кодонов, наблюдаемого в нативных генах Bacillus thuringiensis, кодирующих δ-эндотоксины. Затем последовательность, кодирующую tic901, использовали в качестве зонда для идентификации гомологов tic901 в клонах геномной плазмидной библиотеки, полученной из геномов других штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих активностью секретируемого инсектицидного белка, с профилем ПДРФ, отличным от профиля ПДРФ, наблюдаемого в случае штамма EG2158.
Как указано в таблице 1, штамм Bacillus thuringiensis 86833 содержал гомологичную последовательность tic901, отличающуюся от последовательности штамма EG2158. Профиль секретируемого белка из штамма 86833 содержал основную полосу 38 кДа, которая сходна с полосой, создаваемой штаммом EG2158. Полученные факты вместе свидетельствуют, что штамм 86833 содержал гомолог tic901. N-концевую последовательность белка штамма 86833 определяли деградацией по Эдману и идентифицировали состоящую из пятнадцати (15) аминокислот последовательность (аминокислоты с семьдесят шестой (76) по девяносто первую (91), которые указаны в SEQ ID NO:6, которые также соответствуют остаткам 2-16 рассчитанного зрелого белка TIC1201). Аминокислотная последовательность не соответствовала никакой из известных ранее аминокислотных последовательностей, но обладала 87% идентичностью с соответствующей аминоконцевой аминокислотной последовательностью рассчитанного зрелого белка TIC901, приведенного в данном описании выше. Плазмидный клон, pJP263, полученный из экспрессирующей библиотеки ДНК Lambda ZAP, приготовленной с использованием частично расщепленной SauIIIA, отобранной по размеру суммарной ДНК штамма 86833, содержащий инсерцию приблизительно 5 тысяч пар оснований, идентифицировали с помощью анализа, по существу как описано в примере 2, с использованием ДНК tic901, меченой дигоксигенином, в условиях термической амплификации. Плазмиду pJP263 подвергали воздействию условий термической амплификации, чтобы вырезать полную вставку штамма 86833, которую затем встраивали в челночный вектор pEG597 E.coli/Bacillus. Полученную в результате плазмиду pJP274-1 использовали для трансформации не образующего кристаллов штамма EG10650, и отбирали изолят, содержащий данную плазмиду, который назван рекомбинантным штаммом SIC4018 B.thuringiensis. Штамм SIC4018 подвергали ферментации, как описано в примере 1, и белки, присутствующие в истощенных культуральных средах, концентрировали и тестировали в отношении инсектицидной активности в биоанализе и анализировали в SDS-ПААГ. Истощенные культуральные среды тестировали как позитивные по инсектицидной биоактивности в отношении жесткокрылых, и посредством анализа в SDS-ПААГ идентифицировали белок с молекулярной массой приблизительно 38 кДа как присутствующий в большом избытке в истощенных культуральных средах. Вставку в pJP274-1 секвенировали дидезокси-способом по Сэнгеру и идентифицировали одну открытую рамку считывания, которая указана в SEQ ID NO:5 от четыреста тридцать седьмого (437) нуклеотида до тысяча шестьсот двадцать первого (1621) нуклеотида. Аминокислотная последовательность предшественника инсектицидного белка, рассчитанная на основе открытой рамки считывания, представленной в SEQ ID NO:5, названа TIC1201 (SEQ ID NO:6). Также охарактеризовали нуклеотидную последовательность клона, соответствующего профилю ПДРФ «B»-типа из другого штамма, EG3618, и определили, что она содержит ОРС, идентичную по последовательности ОРС, указанной в SEQ ID NO:5.
Штамм EG6618 имел профиль ПДРФ «C»-типа, который приведен в качестве примера в таблице 1. Плазмидный клон, pJP264, полученный из экспрессирующей библиотеки ДНК Lambda ZAP, приготовленной с использованием частично расщепленной SauIIIA, отобранной по размеру суммарной ДНК из штамма EG6618, содержащий фрагмент длиной приблизительно 5 тысяч пар оснований, идентифицировали с помощью анализа по существу как описано в примере 2 с использованием ДНК tic901, меченой дигоксигенином, в условиях термической амплификации. Анализ последовательности ДНК встроенной ДНК в pJP264 показал неполную или частичную открытую рамку считывания в данном клоне, которая вероятно кодировала C-концевую частью нового ранее не охарактеризованного белка. Выравнивание данной частичной ОРС с ОРС, кодирующей TIC901, которая указана в SEQ ID NO:3, выявило, что нуклеотидная последовательность встроенной ДНК в pJP264 (нуклеотиды 481-1302, указанные в SEQ ID NO:7) кодировала пептид, рассчитанная аминокислотная последовательность которой по существу сходна с аминокислотной последовательностью, соответствующей остаткам аминокислот TIC901 96-367. Новая аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью в pJP264, проявляла приблизительно 78-процентную идентичность с аналогичной последовательностью пептида TIC901. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные пептиды, обладали приблизительно 81-процентной идентичностью. Частичная кодирующая последовательность в pJP264 соответствует положениям нуклеотидов 481-1302, которые указаны в SEQ ID NO:7, и является аналогичной кодирующей последовательности TIC901, приведенной в SEQ ID NO:3 от положения нуклеотида 438 до нуклеотида 1253. Значительная идентичность между карбоксильными концами каждого из указанных двух белков свидетельствовала, что пептид, кодируемый последовательностью в pJP264, являлся новым представителем рода инсектицидных белков, родственных белку TIC901. Поэтому данный белок назвали TIC407, а нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TIC407, названа tic407.
Предполагали, что существовала ОРС полной длины для TIC407 в геноме EG6618. Чтобы идентифицировать нуклеотидную последовательность остальной 5'-части кодирующей последовательности TIC407 образец суммарной ДНК Bacillus thuringiensis штамма EG6618 расщепляли ферментом рестрикции NdeI, продукты которого затем разбавляли и делали кольцевыми посредством лигирования, чтобы создать популяцию матриц для применения в реакции обратной термической амплификации. Фермент NdeI выбирали потому, что (1) он не разрезает встроенную последовательность в pJP264, (2) он часто делает разрезы в геноме Bacillus thuringiensis, вследствие преобладания A и T в последовательности узнавания ферментом рестрикции, и (3) Саузерн-блот-анализ ДНК EG6618 показал, что NdeI разрезает в разумных пределах вблизи концевых точек ДНК, встроенной в плазмиду pJP264, но достаточно далеко от концевых точек, чтобы включить полноразмерную ОРС, кодирующую TIC407.
Два дивергентных обратных праймера для термической амплификации получали на основе частичной нуклеотидной последовательности tic407, присутствующей в pJP264. Праймер prJWP151 (SEQ ID NO:15: CCTTTGGCAGAAACTTTAACTCC) соответствует обратному комплементу нуклеотидов 766-788, указанных в SEQ ID NO:7. Праймер prJWP152 (SEQ ID NO:16: GTGTATTCTGGTACGCATGAC) соответствует нуклеотидам 955-975, которые указаны в SEQ ID NO:7. Указанные праймеры были введены вместе с кольцевыми NdeI-матричными молекулами, описанными выше и необходимыми реагентами, буферами и полимеразой Pfu в смесь для реакции термической амплификации, состоящей из пятиминутной стадии денатурации при 95°C в течение пяти минут с последующими тридцатью циклами, состоящими из одноминутной стадии отжига при 37°C, двухминутной стадии удлинения при 55°C и одноминутной стадии денатурации при 95°C, которая заканчивается пятиминутной стадией удлинения при 55°C и вымачиванием при 4°C до того, как образцы можно обрабатывать далее. Идентифицировали один продукт термической амплификации посредством гель-электрофореза, который вырезали и клонировали в T-векторе, чтобы сконструировать плазмиду pJP300-2. Получили нуклеотидную последовательность встроенной последовательности ДНК в pJP300-2 и обеспечили достаточную нуклеотидную последовательность выше и ниже предыдущей последовательности, присутствующей в pJP264, чтобы идентифицировать полную открытую рамку считывания, кодирующую инсектицидный белок TIC407, а также расположенные выше и ниже фланкирующие последовательности. Информацию о нуклеотидной последовательности, полученную на основе pJP300-2, собирали с помощью компьютера, используя компьютерную программу для анализа последовательностей, так как последовательность, присутствующую в pJP300-2, конструировали с использованием обратной термической амплификации рестрикционного фрагмента из генома штамма EG6618, который делали кольцевым. Поэтому, чтобы подтвердить, что собранная последовательность была точной и действительно кодировала аминокислотную последовательность TIC407, конструировали сначала на основе частичной открытой рамки считывания, идентифицированной в pJP264, а затем на основе частичных последовательностей, идентифицированных в pJP300-2, два новых праймера для термической амплификации, фланкирующих открытую рамку считывания, кодирующую TIC407 (prJWP186 и prJWP183) для применения при амплификации полной кодирующей последовательности TIC407 с геномной ДНК EG6618.
Конструирование праймера prJWP186 (SEQ ID NO:17: gccggatccCTAGCTGAATATGCAGTAGATAATG) было частично основано на последовательности, идентифицированной в виде последовательности, расположенной выше открытой рамки считывания TIC407 в pJP300-2. Первые девять (9) нуклеотидов данного праймера соответствуют нуклеотидной последовательности, которая не присутствует в последовательности, наличие которой выявлено либо в pJP264, либо в pJP300-2, и также содержит последовательность, которая включает сайт рестрикции BamHI в последовательность выше ампликона, образуемого с использованием указанных праймеров. Двадцать пять (25) концевых нуклеотидов в праймере prJWP186 соответствуют последовательности, которая указана с двадцать восьмого (28) по пятьдесят второй (52) нуклеотид в SEQ ID NO:7, которая лежит выше предполагаемой последовательности инициации ATG в ОРС TIC407 и делает возможным удлинение праймера в направлении ОРС TIC407.
Конструирование праймера prJWP183 (SEQ ID NO:18: GTGGCACGTTTATAGGCCATTGTTC) было полностью основано на последовательности, рассчитанной в пределах последовательности, расположенной ниже ОРС TIC407 в pJP300-2, которая представляет собой обратный комплемент последовательности от положения нуклеотида тысяча семьсот тридцать пять (1735) до положения тысяча семьсот пятьдесят девять (1759), которые указанны в SEQ ID NO:7. Хотя нет последовательностей сайтов рестрикции, включенных в данный праймер, встречающаяся в природе последовательность узнавания для HindIII присутствует ниже ОРС TIC407, которая указана в SEQ ID NO:7 от тысяча пятисотого нуклеотида до тысяча пятьсот пятого нуклеотида (1500-1505).
Праймеры prJWP186 и prJWP183 вводили в реакцию термической амплификации вместе с образцом суммарной ДНК EG6618 и реагентами, необходимыми для осуществления реакции. Условия амплификации были сходными с условиями, описанными выше для амплификации кольцевого NdeI-образца. Выделили ампликон, содержащий 1732 нуклеотидов, соответствующих ОРС TIC407, включая фланкирующую нуклеотидную последовательность выше и ниже ОРС. Полученный ампликон клонировали в T-векторе, чтобы сконструировать pJP306-4, и получили полную нуклеотидную последовательность ампликона. Как предполагалось, нуклеотидная последовательность ампликона в pJP306-4 соответствовала нуклеотидам от двадцать восьмого (28) до тысяча семьсот пятьдесят девятого (1759), которые указаны в SEQ ID NO:7, и содержала открытую рамку считывания, представленную в SEQ ID NO:7 от положения нуклеотида сто девяносто шестого (196) до положения тысяча двести девяносто девятого (1299), кодирующую белок, состоящий из 368 аминокислот. Выравнивание нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC407, с последовательностью, кодирующей TIC901, показало, что две ОРС приблизительно на восемьдесят процентов (80%) идентичны, однако аминокислотные последовательности, рассчитанные на основании ОРС, имеют только приблизительно 74% идентичность.
Аминокислотные последовательности TIC901, TIC1201 и TIC407 выравнивали, чтобы образовать консенсусную аминокислотную последовательность. Даже хотя первичные аминокислотные последовательности существенно отличались, легко можно было идентифицировать области, идентичные в значительной степени. Две области, соответствующие аминокислотной последовательности ASN-ASN-ASN-HIS-GLN-THR-ASN-ARG в положениях аминокислотной последовательности 96-103, которые указаны в SEQ ID NO:4, и аминокислотной последовательности GLN-LYS-PHE-ILE-TYR-PRO-ASN в положениях аминокислотной последовательности 276-282, которые указаны в SEQ ID NO:4, были на 100% консервативны по первичной последовательности и положению в трех последовательностях инсектицидных белков. Нуклеотидные последовательности, кодирующие указанные белковые последовательности, в каждой соответствующей открытой рамке считывания, т.е. указанной в каждой из последовательностей в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7, (TIC901, TIC1201 и TIC407, соответственно) также были в значительной степени консервативными, обеспечивая средство идентификации других гомологичных последовательностей, кодирующих такие секретируемые инсектицидные белки, присутствующие в других Bacillus или штаммах Bacillus thuringiensis.
Получали две праймерные последовательности для термической амплификации для использования в реакции термической амплификации, предназначенной для применения при идентификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих другие гомологи трех инсектицидных белков TIC901, TIC1201 и TIC407. Последовательности праймеров для амплификации указаны в данном описании в виде (1) SEQ ID NO:11, последовательности прямого двадцати одного-мерного праймера для амплификации, названного asprJWP139, соответствующего кодирующей последовательности, указанной в SEQ ID NO:3 от положения нуклеотида 438 до положения 458, за исключением того, что нуклеотид в положении восемнадцать (18) в олигонуклеотиде дублируется, в том смысле, что данное положение включает либо аденозин, либо тимидин, что приводит к двум возможным последовательностям праймера, и (2) SEQ ID NO:12, последовательности обратного двадцатимерного праймера для амплификации, названного prJWP143, соответствующего обратному комплементу последовательности, указанной в SEQ ID NO:3 от положения нуклеотида 998 до положения 978, за исключением того, что нуклеотид в олигонуклеотиде в положении четыре (4) и/или в положении десять (10) является/являются дублированными, в том смысле, что в каждом из положений включают либо аденозиновый, либо тимидиновый нуклеотид, что приводит к четырем возможным последовательностям праймера. SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 состоят из нуклеотидной последовательности, которая скорректирована в сторону кодонов, предпочтительных для применения в генных последовательностях, полученных из Bacillus thuringiensis или других штаммов вида Bacillus, в которых кодоны содержат A и/или T в третьем положении в случае каждого кодона, представленного в последовательности.
2+
Как указано выше, идентифицированная деградацией по Эдману аминокислотная последовательность белка с молекулярной массой приблизительно 38 кДа, изолированного и очищенного из отработанных культуральных сред после ферментации с использованием штамма EG2158, отличалась по одной аминокислоте от соответствующей последовательности, в конце концов рассчитанной, исходя из открытой рамки считывания для TIC901, которая указана в SEQ ID NO:4. Предположили, что различие в аминокислотных последовательностях, наблюдаемое в случае деградации по Эдману и в случае полученной в результате аминокислотной последовательности TIC901, рассчитанной на основе ОРС tic901, может быть результатом присутствия более чем одного гена в штамме EG2158, при этом гены кодируют разные секретируемые инсектицидные белки, и каждый секретируемый белок имеет размер около 38 кДа. Фактически, если в EG2158 присутствуют два или более генов, то каждый должен присутствовать в сущности в идентичных HindIII-фрагментах, или оба могут присутствовать в одном и том же HindIII-фрагменте или один может в значительной степени отличаться от кодирующей последовательности tic901, так что он может не гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO:2, в жестких условиях гибридизации. Если каждый ген действительно кодировал гомологичный инсектицидный белок или по меньшей мере белок, который был в значительной степени сходен с белком, кодируемым другим геном, так что идентифицированные выше консервативные последовательности присутствовали в каждой кодирующей последовательности, то избыточные праймеры, такие как праймеры, указанные в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, могут обеспечивать возможность идентификации генов посредством амплификации родственных кодирующих последовательностей из общего образца в реакции термической амплификации. Например, можно ожидать, что праймеры, содержащие последовательности, которые указаны в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, продуцируют ампликон длиной приблизительно 560 пар оснований при использовании кодирующих последовательностей TIC901, TIC1201 или TIC407 в качестве матриц в образце. Чтобы проверить данную гипотезу, суммарную ДНК EG2158 использовали в качестве матрицы в реакции термической амплификации, используя праймеры для амплификации, указанные в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, в стандартных условиях реакции, включающих 10-100 нанограмм матрицы в виде бактериальной геномной ДНК, 50 пикомолей каждого праймера, 1X буфер для реакции амплификации ROCHE, содержащий конечную концентрацию дивалентных катионов Mg, равную 1,5 мМ, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) и 2,5 единицы полимеразы ROCHE TAQ в 50 мкл объема реакции, начальный цикл денатурации при 94°C в течение двух минут, тридцать (30) циклов амплификации, включающих в себя фазу денатурации при 94°C в течение одной минуты, фазу отжига при 45°C в течение двух (2) минут и фазу удлинения праймера при 72°C в течение одной (1) минуты, с последующим конечным удлинение праймера при 72°C и завершающей фазой в течение (5) минут и выдерживанием при 4°C. Кроме того, ДНК-матрицу, полученную из следующих штаммов, также использовали в параллельных реакциях термической амплификации вместе с праймерами для амплификации, указанными в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12: штамм EG10650, штамм EG4332, штамм EG5552, штамм EG5858, штамм EG6489, штамм EG6561, штамм EG3618, штамм EG6555, штамм EG6618 и штамм 86833. Образцы из каждой реакции термической амплификации анализировали гель-электрофорезом. Результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5Ампликоны, образуемые из штаммов B.thuringiensis
DNA-матрица
<i>Hind</i>III тип ПДРФ
Наличие ампликона<sup>1</sup>
EG10650
-
-
EG4332
-
-
EG5552
-
-
EG5858
-
-
EG2158
A
+
EG6489
A
+
EG6561
A
+
EG3618
B
+
EG6555
B
+
86833
B
+
EG6618
C
+
<sup>1</sup> - ампликон, образованный в реакции термической амплификации с использованием матрицы ДНК из указанного штамма, при этом праймеры для амплификации содержат последовательность, указанную в SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, в стандартных условиях, которые описаны выше.
Не выявляли ампликона в том случае, когда в качестве матрицы использовали ДНК из штаммов EG10650, EG4332, EG5552 или EG5858 вместе с конкретным набором праймеров. Полученный результат свидетельствует, что указанные штаммы не содержат нуклеотидных последовательностей, кодирующих гомолог TIC901, TIC1201 и TIC407. Однако каждый из других тестированных штаммов по-видимому образует один ампликон длиной приблизительно 560 пар оснований в пределах разрешения используемой системы геля. Ампликоны для каждого из образцов, дающих положительную реакцию в указанных условиях амплификации, клонировали в T-векторе и определяли нуклеотидную последовательность случайно отобранных клонированных ампликонов из каждой реакции термической амплификации. Каждый из штаммов EG2158, EG6489 и EG6561 продуцировали ампликон, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную соответствующей кодирующей последовательности TIC901. Штаммы EG3618 и 86833 продуцировали ампликон, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную соответствующей кодирующей последовательности TIC1201. Штамм EG6555, который является штаммом, имеющим профиль HindIII-ПДРФ типа «B», идентичный профилю, наблюдаемому в случае штаммов EG3618 и 86833, также продуцировал ампликон размером 560 пар оснований. Штамм EG6555 ранее не был полностью охарактеризован, однако, ранее было показано, что он образует ПДРФ «B»-типа, как указано в таблице 1, который соответствует фенотипу ПДРФ, проявляемому штаммом 86833, из которого выделяли TIC1201. Поэтому ожидалось, что гомолог, присутствующий в штамме EG6555, кодировал белок, в значительной степени сходный, если не идентичный белку TIC1201. Результаты анализа последовательности ампликона, полученного из EG6555, были идентичны соответствующей последовательности, полученной из штамма 86833. Как предполагалось, штамм EG6618 продуцировал ампликон, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную соответствующей кодирующей последовательности TIC407.
Неожиданно, кроме ампликонов, содержащих соответствующую последовательность tic901, получали ампликоны на основе суммарной ДНК, изолированной из EG2158, которые содержали вторую кодирующую последовательность, которая отличалась от соответствующей нуклеотидной последовательности TIC901, идентифицированной с использованием избыточного зонда, указанного в SEQ ID NO:2. Как ожидалось, один ампликон, полученный на основе ДНК EG2158, также состоял приблизительно из 560 нуклеотидов, но анализ последовательности ДНК клона привел к идентификации ОРС (нуклеотиды 377-937. которые указаны в SEQ ID NO:9), кодирующей пептидную последовательность (аминокислотная последовательность 96-282, указанная в SEQ ID NO:10), которая существенно отличалась от соответствующей пептидной последовательности TIC901. Полученный результат показал, что существовала по меньшей мере еще одна другая нуклеотидная последовательность, присутствующая в штамме EG2158, которая может кодировать гомолог белка TIC901, который можно считать другим представителем рода белков, родственных TIC901, TIC1201 и TIC407.
Чтобы полностью охарактеризовать указанную вторую последовательность, идентифицированную в ДНК штамма EG2158, конструировали обратные праймеры для термической амплификации на основе второй последовательности, которые могли бы специфично амплифицировать фланкирующие последовательности выше и ниже второй последовательности. Использовали обратную термическую амплификацию ДНК EG2158, чтобы идентифицировать полную открытую рамку считывания, содержащую указанную вторую последовательность. Сначала выбирали ферменты для применения в расщеплении ДНК EG2158, которые бы (1) не делали разреза во второй последовательности, идентифицированной выше, и (2) часто делали разрезы в ДНК Bacillus в результате наличия AT-богатой последовательности, содержащей последовательность узнавания ферментами. Принимая во внимание указанные параметры, выбрали XbaI и SpeI, но ни один из ферментов при использовании отдельно не расщеплял ДНК EG2158 на фрагменты, которые можно было бы легко сделать кольцевыми для применения в качестве матриц для обратной термической амплификации. Однако поскольку оба фермента давали совместимые 5'-перекрывающиеся концы, то двойное расщепление ДНК EG2158 с использованием обоих ферментов давало продукты достаточно небольшого размера, которые при переводе их в кольцевую форму могли быть использованы в качестве матриц для обратной термической амплификации. Обратные праймеры для амплификации конструировали на основе второй последовательности, идентифицированной выше, в частности последовательностей, в которых соответствующая последовательность tic901 (SEQ ID NO:3) и вторая последовательность имеют значительные отличия при выравнивании.
Праймер prJWP155 (SEQ ID NO:19) соответствует и является обратным комплементом второй последовательности, которая указана в SEQ ID NO:9 в пределах нуклеотидов 454-476). Праймер prJWP156 (SEQ ID NO:20) соответствует второй последовательности, которая указана в SEQ ID NO:9 в пределах нуклеотидов 692-717. Два указанных праймера использовали в реакции амплификации с дважды расщепленной, кольцевой матрицей ДНК EG2158, которая указана выше, в условиях, сходных с условиями, приведенными выше для обратной термической амплификации ДНК EG6618. Получили один ампликон, который встраивали в T-вектор, чтобы сконструировать плазмиду pJP290-1, и определяли нуклеотидную последовательность встроенного ампликона. Последовательность, полученную обратной термической амплификацией с применением данного способа, собирали, используя компьютерную программу для анализа последовательностей ДНК, и выравнивали со второй последовательностью, идентифицированной выше, чтобы сконструировать последовательность, указанную в SEQ ID NO:9, которая содержит полную открытую рамку считывания, кодирующую пептидную последовательность, названную TIC417, а также расположенную выше и ниже фланкирующую последовательность.
Чтобы подтвердить последовательность, собранную частично из второго ампликона, идентифицированного в ДНК EG2158, указанного выше, и частично из продукта реакции обратной термической амплификации с использованием праймеров prJWP155 и 156, конструировали два дополнительных праймера для термической амплификации, которые были комплементарны последовательностям, фланкирующим открытую рамку считывания, кодирующую TIC417 (prJWP168 и prJWP170). Указанные праймеры давали возможность амплифицировать полную открытую рамку считывания TIC417 вместе с короткими участками ДНК выше и ниже ОРС TC417. Праймер prJWP168 (SEQ ID NO:21) конструировали частично на основе последовательности, идентифицированной ниже или с 3'-стороны ОРС TIC417, и он функционирует, продлевая полимеризацию нуклеотидной последовательности ОРС TIC417. Первые пять нуклеотидов данного праймера соответствуют нуклеотидам, которые не присутствуют в последовательности, идентифицированной в плазмиде pJP290-land, также служат для введения сайта рестрикции HindIII при связывании с основаниями 7-8 SEQ ID NO:21. Концевые 39 нуклеотидов prJWP168 соответствуют обратному комплементу нуклеотидов 1148-1186, которые указаны в SEQ ID NO:9. Праймер prJWP170 (SEQ ID NO:22) частично конструировали на основе последовательности, идентифицированной выше или с 5'-стороны ОРС TIC417, и он функционирует, делая возможным удлинение праймера по направлению к 5'-концу ОРС TIC417. Первые 9 нуклеотидов данного праймера соответствуют нуклеотидам, которые не присутствуют в последовательности, идентифицированной в pJP290-1, и также служат для введения последовательности сайта узнавания ферментом рестрикции BamHI выше предполагаемого кодона инициации ATG в TIC417. Концевые 30 нуклеотидов данного праймера соответствуют нуклеотидам. Белок, кодируемый указанной отличающейся кодирующей последовательностью, назван TIC417. Аминокислотная последовательность, кодируемая клонированной частью ампликона TIC417, представлена в SEQ ID NO:10, и кодирующая последовательность клонированного ампликона представлена в SEQ ID NO:9. Аминокислотная последовательность TIC417 приблизительно на 85% идентична соответствующей последовательности из TIC901 и TIC1201, и приблизительно на 76% идентична соответствующей аминокислотной последовательности TIC407. Предполагается, что фрагмент белка, соответствующий кодирующей последовательности TIC417, выявленной в ампликоне TIC417, полученном на основе ДНК EG2158, является инсектицидным белком, сходным с TIC901, TIC1201 и TIC407, соответствующим белку, который экспрессируется в виде белка-предшественника, имеющего сигнальный пептид длиной приблизительно 43 аминокислотных остатка, который заканчивается консенсусной последовательностью отщепления сигнального пептида, соответствующей SER-GLN-GLN, который процессируется сигнальной пептидазой с высвобождением зрелого белка с молекулярной массой приблизительно 38 кДа плюс или минус приблизительно 2 кДа во внеклеточное пространство. Также предполагается, что зрелая аминоконцевая аминокислотная последовательность TIC417 может соответствовать аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:1, и что белок TIC417 проявляет ингибирующую виды жесткокрылых инсектицидную биологическую активность против кукурузного жука-блошки и колорадского картофельного жука.
Пример 10
Данный пример иллюстрирует конструирование и применение вырожденных зондов и праймеров для использования при идентификации встречающихся в природе нуклеотидных последовательностей, кодирующих полные белки или части инсектицидных белков, полученных на основе белков согласно настоящему изобретению или их гомологов.
На основе выравнивания аминокислотных последовательностей белков-предшественников TIC901, TIC1201, TIC407 и TIC417, которые представлены на фигуре 1, выявили ряд областей идентичности аминокислотных последовательностей и сконструировали праймеры с вырожденными олигонуклеотидными последовательностями на основе соответствующей нативной нуклеотидной кодирующей последовательности для каждого белка, принимая во внимание профиль известных инсектицидных белков Bacillus thuringiensis. Хотя существует много консервативных участков аминокислотной последовательности, которые можно выбрать при выравнивании, которое показано на фигуре 1, для конструирования вырожденных праймеров, был выбраны три участка на основе положения последовательности праймера в кодирующей области известных белков TIC и уникального размера ампликонов, которые, как можно предполагать, будут образованы в реакции термической амплификации с указанными праймерами.
Идентифицировали первую область или участок консервативной аминокислотной последовательности, соответствующий последовательности от семьдесят пятой (75) аминокислоты до восемьдесят третьей (83) аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:4, и затем выравнивали соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие данный аминокислотной участок, из каждого последовательности, указанной в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9. Использовали консенсусный участок нуклеотидной последовательности, кодирующий данный конкретный участок аминокислотной последовательности, чтобы определить пределы нуклеотидных последовательностей, содержащих последовательность прямого праймера амплификации, которая указана в SEQ ID NO:23 (prJWP200), а также два других вырожденных праймера, состоящих из сокращенных вариантов вырожденного праймера SEQ ID NO:23 (SEQ ID NO:24-25, соответствующие prJWP201 и prJWP202, соответственно).
Примером второй области или участка консервативной аминокислотной последовательности среди белков согласно настоящему изобретению является аминокислотная последовательность приблизительно от сто сорок седьмой (147) аминокислоты до приблизительно сто пятьдесят третьей (153) аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:4. Затем выравнивали нуклеотидные последовательности, кодирующие данный аминокислотный участок, из каждой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9. Использовали консенсусный участок нуклеотидной последовательности, кодирующий данный конкретный участок аминокислотной последовательности, чтобы определить пределы нуклеотидных последовательностей, содержащих последовательность прямого праймера для амплификации, которая указана в SEQ ID NO:26 (prJWP203).
Примером третьей области или участка консервативной аминокислотной последовательности среди белков согласно настоящему изобретению является аминокислотная последовательность приблизительно от двести семьдесят пятой (275) аминокислоты до приблизительно двести восемьдесят третьей (283) аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:4. Затем выравнивали нуклеотидные последовательности, кодирующие данный аминокислотный участок, из каждой из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:9. Использовали консенсусный участок нуклеотидной последовательности, кодирующий данный конкретный участок аминокислотной последовательности, чтобы определить пределы нуклеотидных последовательностей, содержащих последовательность обратного праймера для амплификации, которая указана в SEQ ID NO:27 (prJWP204), а также два других вырожденных праймера, состоящих из укороченных вариантов вырожденного праймера SEQ ID NO:27 (SEQ ID NO:28-29, соответствующие prJWP205 и prJWP206, соответственно).
Любую комбинацию праймеров prJWP200, prJWP201, prJWP202 или prJWP203 с prJWP204, prJWP205 или prJWP206 можно использовать вместе в реакции термической амплификации с матричной нуклеотидной последовательностью, кодирующей TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 или родственный секретируемый инсектицидный белок или его гомолог, чтобы получить ампликон, соответствующий участку последовательности, который гибридизуется с соответствующими последовательностями в положениях в пределах кодирующих последовательностей TIC, используемых для конструирования последовательностей праймеров prJWP200-206. Если любой из праймеров prJWP200-202 используют вместе с любым из праймеров prJWP204-206 в реакции термической амплификации с подходящей матрицей в образце, то получение ампликона размером приблизительно от 590 до приблизительно 650 пар оснований является характерным диагностическим признаком наличия одной или нескольких кодирующих последовательностей в образце, которые являются родственными последовательностям согласно данному изобретению. Как правило, диагностический ампликон с использованием праймеров в указанных пределах может состоять приблизительно из 617-626 пар оснований.
В случае применения любого из праймеров, содержащих SEQ ID NO:26 (prJWP203) вместе с любым из праймеров, содержащих SEQ ID NO:27-29 (prJWP204-206), в реакции термической амплификации с подходящей матрицей в образце, получение ампликона размером приблизительно от 390 до приблизительно 415 пар оснований является характерным диагностическим признаком наличия одой или нескольких кодирующих последовательностей в образце, которые являются родственными последовательностям согласно настоящему изобретению. Как правило, диагностический ампликон с использованием праймеров в указанных пределах может состоять приблизительно из 400-410 пар оснований.
2
Чтобы иллюстрировать применимость указанных праймеров, праймер prJWP200 (SEQ ID NO:23) объединяли в реакции термической амплификации с праймером prJWP204 (SEQ ID NO:27), каждый в концентрации по меньшей мере приблизительно 1 пикомоль на микролитр, вместе с 1X TAQ-буфером для амплификации, 0,2 моль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP, dTTP, dCTP и dGTP), 2 миллимолярный MgCl, 2 единицы полимеразы TAQ и приблизительно от десяти (10) до ста (100) нанограмм образца геномной ДНК из штамма EG2158, который как известно содержит кодирующие последовательности для TIC901 и TIC417. Условия цикла термической амплификаци заключались в начальной денатурации приблизительно в течение 2 минут при 94°C с последующими 35 циклами стадии денатурации в течение 30 секунд при 94°C, стадии отжига в течение 30 секунд при 50°C и стадии удлинения в течение 45 секунд при 72°C, затем конечной стадии удлинения в течение 7 минут при 72°C. Температуру на стадии отжига снижали по 0,3°C в каждом последующем цикле, так что конечная температура отжига составляла приблизительно 39,8°C.
Образец объемом десять микролитров анализировали в 1,2% TAE-агарозном геле и сравнивали с совместно мигрирующим лэддером из 100 пар оснований и красили бромидом этидия. Результаты свидетельствуют о продукции участка ампликона, соответствующего приблизительно 620 парам оснований. Полосу, соответствующую приблизительно 620 парам оснований, вырезали и извлекали ДНК для клонирования. Выделяли несколько независимых клонов, представляющих данный участок, и получали нуклеотидную последовательность каждого. Как ожидалось, идентифицировали первую последовательность, идентичную соответствующей нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 (не содержащую праймерных последовательностей ни на одном из концов клона, приблизительно от положения нуклеотида четыреста два (402) до положения нуклеотида приблизительно девятьсот семьдесят четыре (974), которые указаны в SEQ ID NO:3), и идентифицировали вторую последовательность, идентичную соответствующей нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC417 (не содержащую праймерных последовательностей ни на одном из концов клона, приблизительно от положения нуклеотида четыреста шестьдесят четыре (464) до положения нуклеотида приблизительно тысяча тридцать шесть (1036), которые указаны в SEQ ID NO:9).
Неожиданно также идентифицировали третью последовательность (SEQ ID NO:30), которая не была идентичной какой-либо из последовательностей, приведенных в данном описании. Однако третья последовательность была в значительной степени сходна по нуклеотидной последовательности с каждой из последовательностей, кодирующих секретируемый инсектицидный белок, указанный в данном описании, включая tic901, tic1201, tic407 и tic417. Как указано в примерах выше, было довольно неожиданным обнаружить кодирующую последовательность tic417 в геномной ДНК штамма EG2158. Еще более неожиданным было идентифицировать еще и третью нуклеотидную последовательность, которая вероятно соответствует участку нуклеотидов, который кодирует третий секретируемый инсектицидный белок штамма EG2158, который отличается от белков, указанных в данном описании выше, но который достаточно сходен по последовательности, чтобы классифицировать его как одного из представителей рода секретируемых инсектицидных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с одной или несколькими последовательностями, приведенными в данном описании, и это является иллюстрацией новизны и применимости вырожденных олигонуклеотидных зондов и праймеров, приведенных в качестве примеров в данном описании, для применения при идентификации последовательностей, которые кодируют секретируемые инсектицидные белки и которые гибридизуются в жестких условиях с родственными последовательностями, кодирующими tic901, tic1201, tic07 и tic417, которые приведены в данном описании.
Аминокислотная последовательность, кодируемая непрерывной открытой рамкой считывания, указанной в SEQ ID NO:30, в которой были делетированы 26-мерные вырожденные олигонуклеотидные последовательности как из 5'-, так и 3'-конца, указана в SEQ ID NO:31. Аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO:31, в значительной степени сходна с аминокислотной последовательностью TIC901 приблизительно от восемьдесят пятого (85) положения аминокислоты до приблизительно двести семьдесят четвертого (274) положения аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:4, имея при этом только две (2) аминокислоты, которые отличаются от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:4, что соответствует приблизительно 98,9% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью в SEQ ID NO:4. Аминокислотная последовательность, приведенная в SEQ ID NO:31, в значительной степени сходна с аминокислотной последовательностью TIC1201 приблизительно от восемьдесят пятого (85) положения аминокислоты до приблизительно двести семьдесят четвертого (274) положения аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:6, имея при этом только тринадцать (13) аминокислот, которые отличаются от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:6, что соответствует приблизительно 93,2% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью в SEQ ID NO:6. Аминокислотная последовательность, приведенная в SEQ ID NO:31, в значительной степени сходна с аминокислотной последовательностью TIC417 приблизительно от восемьдесят пятого (85) положения аминокислоты до приблизительно двести семьдесят четвертого (274) положения аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:10, имея при этом только тридцать (30) аминокислот, которые отличаются от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:10, что соответствует приблизительно 83,7% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью в SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность, приведенная в SEQ ID NO:31, также в значительной степени сходна с аминокислотной последовательностью TIC401 приблизительно от восемьдесят пятого (85) положения аминокислоты до приблизительно двести семьдесят четвертого (274) положения аминокислоты, которые указаны в SEQ ID NO:8, имея при этом сорок одну (41) аминокислоту, которые отличаются от аналогичной последовательности в SEQ ID NO:8, что соответствует приблизительно 78,4% идентичности между SEQ ID NO:31 и соответствующей последовательностью в SEQ ID NO:8.
В отличие от результатов, полученных при использовании ДНК-матрицы из штаммов EG5858, EG4332 и EG5552 вместе с набором праймеров, содержащих SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 (которые указаны в таблице 5 выше), в случае использовании набора праймеров, соответствующих праймеру prJWP200 и prJWP204, ДНК из каждого из указанных штаммов давала ампликон, последовательность которого по-видимому соответствовала последовательности, кодирующей TIC407. Соответствующая кодирующая последовательность для гомолога TIC407 может присутствовать в крупном HindIII-фрагменте в указанных штаммах и поэтому не может быть легко доступной для идентификации при осуществлении начального скрининга, который описан выше, с помощью Сайзерн-блота с использованием в качестве зонда ДНК tic901, результаты которого приведены в таблице 1.
Пример 11
Данный пример иллюстрирует идентификацию уникальных родственных TIC901 картин ПДРФ и последовательностей, кодирующих инсектицидные белки, из штаммов Bacillus, которые продуцируют в культуральном надосадке иммунологически родственный TIC901 внеклеточный белок, определяемый с использованием способов регистрации ELISA, но ДНК которых не приводит к результату при получении регистрируемых продуктов термической амплификации с использованием стандартных способов выявления tic901 термической амплификацией.
Первоначальный анализ, описанный с использованием приведенных выше примеров, основан на выявлении инсектицидной активности в надосадках культур, выращенных в течение ночи при 30°C в среде PYG с последующей регистрацией последовательностей, родственных tic901, в штаммах B. thuringiensis способом Саузерн-анализа с использованием специфичной для TIC901 последовательности. Анализировали суммарную ДНК из нескольких сотен штаммов B.thuringiensis. Создавали и сравнивали профили ПДРФ. Термическая амплификация указанных ДНК с использованием праймеров, специфичных для tic901, tic1201, tic407 и tic417, выявила, что приблизительно от двадцати до двадцати пяти процентовa штаммов Bt содержат такие родственные последовательности. Предположили, что некоторые родственные TIC901 последовательности не могут быть выявлены с использованием способов регистрации на основе ПДРФ и термической амплификации. Исходя из профилей внеклеточных белков штаммов Bt, которым обеспечивали возможность для продолжения ферментации в течение поздней log-фазы и стационарной фазы и споруляции, применимым мог быть более прямой подход с использованием иммунологических способов для выявления штаммов Bt, которые продуцировали родственные TIC901 белки.
Коллекцию культур Bt распределяли в 96-луночном формате и хранили в виде исходных штаммов в глицерине при -80°C и использовали в качестве инокулята для ферментаций в микромасштабе, перенося образцы в блоки с глубокими лунками (DWB, QUIAGEN INC). Каждый образец ферментировали в 1 миллилитре бульона terrific (TB) на лунку. DWB герметично закрывали листами пленки AIRPORE (QUIAGEN) и инкубировали при 30°C в течение от 20 до 45 часов пр встряхивании в инкубаторе HiGro (GENOMIC SOLUTIONS/GENOMIC INSTRUMENTATION SERVICES) при 300 об/мин. В конце периода ферментации в культуральный бульон добавляли двадцать пять единиц на миллилитр бензоназы (SIGMA ALDRICH), чтобы уменьшить вязкость и инкубировали при 30°C еще в течение одного часа. Твердые вещества, включая клетки и споры, удаляли центрифугированием при 1900°g в бакет-роторе при 4°C в течение тридцати минут и осветленные надосадки переносили аликвотами по 200 микролитров в неглубокие 96-луноные планшеты для хранения при -80°C и дальнейшей обработки в анализе ELISA.
Разработали способ ELISA для идентификации надосадков бульона, содержащих родственные TIC901 белки. 96-луночные планшеты NUNC Immuno MaxSorb покрывали в течение ночи 4°C 100 микролитрами на лунку разведенного 1:1000 обращенно-аффинно очищенного кроличьего поликлонального IgG-антитела против TIC901 в покрывающем буфере, содержащем 15 микромолярный карбонат натрия, 35 микромолярный бикарбонат натрия, 150 микромолярный NaCl, pH 9,6. лунки три раза промывали PBST (50 мМ K/Na-фосфат, 150 мМ NaCl, 0,05% твин 20, pH 7,4) и избыточные места связывания блокировали 250 микролитрами 1% раствора БСА в PBST в течение одного часа при комнатной температуре. Буфер для блокирования удаляли и в каждую лунку вносили 200 микролитров надосадка культуры Bt в разведении 1:75 (объем:объем) в PBST, содержащем 0,2% БСА, с последующей инкубацией при 4°C в течение ночи. Каждую лунку три раза промывали PBST, затем добавляли 200 микролитров на лунку разведенного 1:2000 биотинилированного поликлонального IgG против TIC901 в PBST, содержащем 0,2% БСА. Раствор биотинилированного антитела инкубировали два часа при комнатной температуре и три раза промывали, как описано выше. Комплексы биотинилированное антитело-родственный TIC901 белок выявляли посредством инкубации 200 микролитров на лунку разведенного 1:3000 конъюгированного с HRP стрептавидина в течение двух часов при комнатной температуре, с последующими тремя промывками в PBST и добавлением 100 микролитров на лунку субстрата пероксидазы TMP. Реакции останавливали добавлением 100 микролитров на лунку 3 М раствора фосфата. Оптическую плотность отдельных лунок измеряли при длине волны 450 нанометров и надосадки штаммов Bt, в которых выявляли содержание родственного TIC901 белка, регистрировали на основании средней оптической плотности негативных контролей плюс три стандартных отклонения.
С использованием способа ELISA идентифицировали несколько штаммов, которые демонстрировали позитивный результат в ELISA при сравнении с надосадками, полученными из культур негативных контролей, но которые также не давали результата при получении продукта термической амплификации при использовании специфичных для TIC901, TIC1201, TIC407 или TIC417 пар праймеров для амплификации. Получали геномную ДНК из одного такого позитивного в ELISA/негативного в ПЦР штамма, ранее названного штаммом Bacillus thuringiensis EG4653, и конструировали геномную экспрессирующую плазмидную библиотеку для не образующего кристаллов штамма EG10650. Плазмидную библиотеку EG10650, полученную на основе ДНК штамма EG4653, подвергали блоттингу на мембраны и анализировали с использованием кроличьего поликлонального IgG-антитела против TIC901, описанного выше. Позитивные клоны затем очищали и амплифицировали и секвенировали вставку ДНК, присутствующую в одной такой плазмиде. Полный гомологичный TIC901 белок рассчитывали на основе одной открытой рамки считывания. Гомологичный белок назван TIC431 и имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:33. SEQ ID NO:32 состоит из открытой рамки считывания, на основании которой рассчитывали аминокислотную последовательность TIC431. Выравнивание аминокислотной последовательности TIC431 с аминокислотными последовательностями TIC901 и гомологичных белков TIC1201, 407 и 417 представлено на фигуре 1. Сравнение рассчитанного зрелого TIC431m с TIC901m, TIC1201m, TIC407m и TIC417m показывает, что 431 обладает приблизительно 75% идентичностью с 407, приблизительно 79% идентичностью с 901, приблизительно 80% идентичностью с 1201 и приблизительно 95% идентичностью с 417. Поэтому предположили, что другие гомологичные TIC431 белки могут иметь обладать приблизительно от 75 до приблизительно 95% идентичностью с аминокислотными последовательностями TIC431. Рассчитанный белок-предшественник состоит из предполагаемой приблизительно 30-аминокислотной аминоконцевой последовательности, которая соответствует сигнальному пептиду, который имеет консенсусную последовательность расщепления сигнальной пептидазой типа II. Кроме того, такая же или в значительной степени сходная аминокислотная последовательность существует между последовательностью сигнального пептида и рассчитанной аминоконцевой аминокислотой зрелого пептида, начинающегося в положении аминокислоты 44, указанной в SEQ ID NO:33. Предполагается, что праймеры для термической амплификации, которые указаны в SEQ ID NO:23-26 и SEQ ID NO:27-29, совместимые с консенсусными аминокислотными последовательностями, кодируемыми нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:32 приблизительно от 223 до приблизительно 249, или приблизительно от 439 до приблизительно 456, или приблизительно от 823 до приблизительно 846, дают ампликоны, которые являются диагностическими в отношении присутствия SEQ ID NO:32, а также других гомологичных tic901 последовательностей, кодирующих инсектицидные белки.
Способ ELISA вместе со способом термической амплификации обеспечат специалисту в данной области средство для идентификации любой нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок, полученный из вида Bacillus, который обладает приблизительно от 67% до приблизительно 99% или более высокой идентичностью аминокислотной последовательности с TIC901 или гомологичной TIC901 аминокислотной последовательностью, приведенной в данном описании.
Специалисту в данной области будет понятно, что возможны другие варианты с использованием зондов и праймеров согласно настоящему изобретению, чтобы идентифицировать последовательности, кодирующие белки согласно настоящему изобретению, и чтобы идентифицировать белки согласно настоящему изобретению и родственные им белки.
Итак, в приведенной выше спецификации описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что не выходя за рамки объема и отходя от сути настоящего изобретения и без излишнего экспериментирования, настоящее изобретение может быть осуществлено в широком диапазоне эквивалентных параметров. Хотя настоящее изобретение описано в связи с его конкретными вариантами, будет понятно, что возможны дополнительные модификации. Подразумевается, что настоящее изобретение охватывает любые применения, изменения или адаптации изобретения, в общем следуют принципам изобретения. Возможны различные перестановки и комбинации элементов, предлагаемых во всех пунктах формулы изобретения, которая следует далее, и они входят в объем данного изобретения. Все публикации и патенты, упоминаемые в данном описании, включены в данное описание в виде ссылки так же, как в случае, когда указано, что каждая отдельная публикация или патент специально и отдельно включены в виде ссылки.
ССЫЛКИ
Barry et al., 1992, Inhibitors of amino acid biosynthesis: Strategies for imparting glyphosate tolerance to crop plants. In: Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, pp. 139-145. Singh, Flores, and Shannon Eds., American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md.
Baum, J. A.; Coyle, D. M.; Gilbert, M. P.; Jany, C. S.; Gawron-Burke, C., 1990 Novel cloning vectors for Bacillus thuringiensis; 1983, Applied and Environmental Microbiology 56 (II): 3420-3428.
Bevan, Nature 304:184-187.
Callis et al., 1987, Genes & Develop. 1:1183-1200.
Crickmore et al., 1998, Microbiol. Molecular Biol. Rev. 62, pp. 807-813.
DeBarjac and Frachon, 1990, Entomophaga 35, pp. 233-240.
Diehn et al., 1996, In: Genetic Engineering, Ed. J.K. Setlow, Plenum Press, New York, NY, 18:83-99.
Diehn et al., 1998, Plant Physiology, 117:1433-1443.
Donovan et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 214:365-372.
Ellis et al., 1987, EMBO Journal 6:11-16.
Estruch et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:5389-5394.
Fraley et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803.
nd
Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2 eds. Academic Press, NY, 1986.
Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Hartley, J., 1988, Mol. Biol. 202: 913.
Herrera-Estrella, 1983, Nature 303:209-213.
Hess, 1987, Intern Rev. Cytol., 107: 367.
Hofte et al., 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255,
Hotsch et al., 1985, Science, 227:1229-1231.
Humason, Gretchen L., 1967, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company.
Joshi, 1987, Nucl. Acids Res. 15:9627-9640.
Klee, 1985, Bio/Technol. 3:637-642.
Kostichka et al., 1996, J. Bacteriol. 178:2141-2144.
Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-132.
Laemmli, 1973, Mol. Biol. 80:575-599.
Lu et al., 2000, J. Plant Phys., 156:277-283.
Ma et al., 1988, Nature 334:631-633.
Maliga, 1993, Trends in Biotechnology 11:101-106.
McElroy et al., 1990, Plant Cell 2:163-171.
Murray et al., 1989, Nucl. Acids. Res., 17:477-498.
Neuhaus et al., 1987, Theor. Appl. Genet., 75:30.
Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10:1-6.
Norton et al., 1985, Plasmid 13:211-214.
Odell et al., 1985, Nature 313:810-812.
Pena et al., 1987, Nature, 325:274.
Perlak et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328.
Molecular Cloning - A Laboratory Manual.
nd
Sambrook et al., 1989,  2 Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Schnepf et al., 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:775-806.
Turner et al., 1993, Endophytes: an alternative genome for crop improvement; International Crop Science Congress, Ames, Iowa, USA, 14-22 July 1992, pp.555-560.
Vasil et al., 1989, Plant Phys. 91:1575-1579.
Yanisch-Perron et al, 1985, Gene 33:103-119.
Zhou et al., 1983, Mol. Cell Biol., 10:4529-4537.
Патент США № 6489542.
Патент США № 6448476.
Патент США № 6279369.
Патент США № 6242669.
Патент США № 6204435.
Патент США № 6107549.
Патент США № 6063597.
Патент США № 5888801.
Патент США № 5872212.
Патент США № 5877012.
Патент США № 5866326.
Патент США № 5849870.
Патент США № 5837848.
Патент США № 5759538.
Патент США № 5689052.
Патент США № 5569834.
Патент США № 5500365.
Патент США № 5424412.
Патент США № 5349124.
Патент США № 5229112.
Патент США № 5135867.
Патент США № 5080897.
Патент США № 4935353.
Патент США № 4695462.
Патент США № 4695455.
Патент США № 4554101.
W096/10083.
W094/21795.
W095/24492.
EPO 0120 516.