СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРАКТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
METHOD FOR IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS, USING PRACTICAL SPECTROSCOPY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу идентификации микроорганизмов с использованием статистических методов, например, многомерного анализа спектральных профилей или, в другом варианте, нейронных сетей, для получения данных, касающихся роста микроорганизмов, в течение очень короткого промежутка времени по сравнению с обычными способами.
В частности, изобретение основано на разработке аналитического инструмента для идентификации микроорганизмов посредством анализа спектрального профиля ATR-FTIR неизвестного образца и сравнения спектрального профиля с профилями образцов, собранных ранее и сохраненных в базе данных.
Уровень техники
ИК спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) представляет собой способ неразрушающего анализа, который позволяет получать информацию о химическом составе анализируемого образца. С начала 1990-х гг. этот способ используют для анализа биологических проб (Дием М. и др. Аналитик (27.08.2005, 129(10): 880-885)).
В то же время была показана способность способа FTIR идентифицировать и классифицировать неизвестные микроорганизмы (Helm D. et al., Journal of General Microbiology (1991, 137, 69-79) и Marley L. et al., Vibrational Spectroscopy, 26, 2, 2001, 151-159).
Различные вид, подвиды или подклассы микроорганизмов описаны посредством точного биохимического состава в терминах белков, липидов, нуклеиновых кислот и полисахаридов, что отражено в определенном колебательном спектре (ed. Griggiths and Chalmers, 2001 Handbook of vibrational spectroscopy, John Wiley & sons, New York, Volume 5).
Некоторые потенциальные приложения, предложенные на основе метода FTIR в микробиологии, включают в себя:
(i) идентификацию патогенов в области медицины и ветеринарии, например, в клинической лаборатории;
(ii) эпидемиологические исследования, предмет изучения, скрининг патогенов, проверку гигиены, объяснение инфекционных цепочек, контроль терапии и детектирования рецидивирующих инфекций;
(iii) определение характеристик и скрининг микроорганизмов из окружающей среды;
(iv) мониторинг биотехнологических процессов;
(v) контроль микробиологического качества в пищевой и фармацевтической промышленности;
(vi) сохранение собранных штаммов.
Известны способы идентификации микроорганизмов, основанные на методах сравнительного анализа спектра неизвестного образца и спектров известных видов микроорганизмов, сохраненных в базе данных.
Примеры известных способов идентификации такого типа изложены в документах US5660998A, CN103217398A, US6379920B1, WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1, WO2017/210783A1, Sousa et al., European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases (2014) 33: 1345-1353, Whittaker et al., Journal of Microbiological Methods 55 (2003) 709-716, Wang et al., International Journal of Food Microbiology 167 (2013) 293-302.
Однако во многих известных способах получение спектров выполняют в режимах пропускания, отражения или визуализации.
Например, получение в режиме пропускания или отражения изложено в US5660998 и US6379920, в то время как режимы визуализации приведены в WO2006002537A1, US9551654B2, US20170167973A1.
Эти способы имеют недостатки, связанные с тем, что полученный сигнал напрямую зависит от толщины и структуры образца, который может быть слишком толстым и вызывать насыщение, или неоднородным и вызывать искажения из-за рассеяния.
Известно также, что способы, основанные на подходах визуализации, например многопиксельные, могут иметь ограничения по разрешению для отдельных спектров из-за более низкого отношения сигнал/шум, получаемого на пиксель, по сравнению с одноточечными детекторами.
Еще одним недостатком современного уровня техники является то, что часто спектры могут представлять сигналы, обусловленные присутствием воды или других загрязняющих веществ, которые скрывают специфические сигналы микроорганизмов.
В некоторых случаях, например, в CN 103217398A, применяют процедуры сушки, но, как сказано в WO 2017/210783A1, эти процедуры могут оказывать значительное и необратимое воздействие на микроорганизмы, а также изменять их спектры.
В некоторых случаях, например, в WO 2017/210783 Al, можно прибегнуть к многократному получению для удаления компонентов воды, присутствующих в спектрах. Однако это решение имеет недостатки, связанные с большим временем анализа и большей сложностью аналитических процедур сравнения спектров.
Еще одним недостатком современного уровня техники является то, что зачастую справочная база данных содержит ограниченное число видов микроорганизмов и поэтому не охватывает широкий спектр возможных видов.
Например, база данных и соответствующий способ идентификации, описанный в CN103217398A, относятся к 13 видам бактерий.
Кроме того, с увеличением размеров справочных баз данных возникает ряд проблем, связанных с процедурами культивирования и выращивания видов микроорганизмов, с процедурами получения спектров и процедурами сравнительного анализа.
Например, по мере увеличения размера базы данных время анализа неизвестного образца также увеличивается, учитывая, что спектр неизвестного образца необходимо сравнивать с большим количеством спектров, содержащихся в базе данных.
Более того, одни и те же виды микроорганизмов могут иметь большую вариабельность спектральных характеристик, что затрудняет их сравнение со спектрами, содержащимися в базе данных.
Эта изменчивость может быть обусловлена наличием различных штаммов для каждого вида или различиями между различными культурами одного и того же вида из-за возможных вариаций химического состава питательной среды и/или условий роста.
В связи с этим возникает необходимость разработки новых способов идентификации микроорганизмов, которые могут работать для большого числа видов, подвидов или подклассов микроорганизмов, причем с большой вариабельностью справочной базы данных.
Поэтому одна из целей настоящего изобретения заключается в разработке способа идентификации микроорганизмов, который является достаточно общим для того, чтобы иметь возможность идентифицировать большое количество различных видов, подвидов или подклассов микроорганизмов с высокой способностью к различению и точностью.
Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке способа идентификации микроорганизмов, который позволяет идентифицировать различные штаммы одного и того же вида, подвида или подкласса микроорганизмов, возможно выращенных в различных культурах на различных средах или в различных условиях окружающей среды в присутствии или отсутствии биологических жидкостей.
Другая цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить точный способ идентификации микроорганизмов, который при этом требует немного времени для каждого отдельного анализа, даже в случае больших баз данных.
Другая цель настоящего изобретения заключается в создании устройства, которое может просто реализовать способ идентификации микроорганизмов, интегрируя все различные этапы анализа и инструментальные компоненты.
Заявитель разработал, испытал и осуществил настоящее изобретение для преодоления недостатков существующего уровня техники и достижения этих и других целей и преимуществ.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение изложено и охарактеризовано в независимых пунктах формулы изобретения, в то время как зависимые пункты формулы изобретения описывают другие характеристики изобретения или варианты основной изобретательской идеи.
Настоящее изобретение относится к способу идентификации микроорганизмов, и в частности к способу, позволяющему идентифицировать несколько видов, подвидов и подклассов микроорганизмов, присутствующих в неизвестном образце, сравнивая инфракрасный спектр упомянутого неизвестного образца с инфракрасными спектрами известных образцов, которые ранее были сохранены в базе данных.
Способ идентификации микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением содержит следующее:
- этап подготовки базы данных эталонных спектров, связанных с известными образцами видов, подвидов и подклассов известных микроорганизмов;
- этап создания предварительно рассчитанных моделей или эталонных библиотек, начиная с упомянутой базы данных, на основе наиболее значимых идентификационных спектральных характеристик, например связанных с информацией о формах, размерах, интенсивности и пиковых областях поглощения, а также корреляций и соотношений между интенсивностями или между различными пиковыми областями;
- один или несколько этапов отбора неизвестного образца, взятого у пациента, возможно, впоследствии выращенного на твердых или жидких средах и, возможно, также содержащего биологические жидкости;
- один или несколько этапов получения спектра неизвестного образца;
- один или несколько этапов обработки спектра неизвестного образца;
- один или несколько этапов анализа спектра неизвестного образца путем сравнения его с предварительно рассчитанными моделями, каждая из которых дает по меньшей мере некоторые показатели принадлежности, возможно, в виде процентов, неизвестного образца к одному или нескольким из упомянутых видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов, а также параметр достоверности упомянутых показателей принадлежности;
- один или несколько этапов контроля, на которых, исходя из упомянутых показателей принадлежности и упомянутого параметра достоверности, запрашивают новый этап получения спектра неизвестного образца или предоставляют конечный результат, который может содержать неуспешную идентификацию или успешную идентификацию.
В некоторых вариантах осуществления этап подготовки базы данных эталонных спектров, связанных с известными видами, подвидами или подклассами известных микроорганизмов, для каждого образца также предусматривает следующее:
- этап отбора известного образца, возможно взятого у пациентов, возможно впоследствии выращенного на твердых или жидких средах и, возможно, содержащего биологические жидкости;
- один или несколько этапов получения спектра известного образца;
- один или несколько этапов обработки спектра известного образца.
В некоторых вариантах осуществления этап подготовки базы данных может быть выполнен только один раз для создания базы данных, которая затем может быть использована для каждого последующего анализа неизвестных образцов.
В некоторых вариантах осуществления этап подготовки базы данных может также относиться к обновлению базы данных, которое должно осуществляться всякий раз, когда требуется включить в нее новые виды, подвиды или подклассы микроорганизмов, тем самым расширяя диапазон применимости способа.
Аналогичным образом, предварительно рассчитанные модели, будучи созданными, могут быть использованы для каждого последующего анализа неизвестных образцов или также могут быть обновлены каждый раз, когда требуется добавить новые виды, подвиды или подклассы микроорганизмов.
В соответствии с настоящим изобретением спектры получают с помощью устройства, содержащего спектрофотометр FTIR-ATR.
Этот режим получения имеет преимущество, которое заключается в том, что он получает спектры, независимо от толщины и морфологии образца, гарантируя высокую воспроизводимость по сравнению со способами, основанными на коэффициенте пропускания или отражения.
Кроме того, он позволяет работать на чрезвычайно малом образце, а также с применением очень простых и быстрых рабочих процедур.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения спектрофотометр FTIR-ATR содержит одноточечный детектор, который обеспечивает более хорошее отношение сигнал/шум, чем, например, многопиксельные и/или основанные на визуализации способы.
Эта характеристика также позволяет ограничить или предотвратить явления рассеяния и насыщения сигнала и гарантировать более простую подготовку образца.
В некоторых вариантах осуществления спектрофотометр имеет режим непрерывного получения информации, который облегчает очистку прибора, а также позволяет диагностировать в реальном времени наличие воды и/или других загрязняющих веществ, что позволяет ограничить недостаток современного уровня техники, при котором присутствие воды и/или загрязняющих веществ может перекрывать специфические сигналы микроорганизмов.
Предпочтительно, в соответствии с настоящим изобретением, предусмотрен спектроскопический мониторинг уровня сушки образца, так что спектр получают только при достижении заданного стандартного уровня сушки.
Таким образом, спектры, полученные с помощью этого режима, относятся к образцам, которые имеют практически одинаковые уровни сушки и поэтому более сопоставимы друг с другом.
Эта характеристика позволяет преодолеть или, по крайней мере, ограничить некоторые недостатки современного уровня техники, поскольку для удаления воды из образца не требуется никаких операций сушки в печи, что позволяет избежать возникновения необратимых воздействий на микроорганизмы и, следовательно, на соответствующие спектры.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено использование алгоритмов, которые автоматически идентифицируют наиболее значимые идентификационные спектральные характеристики образцов в предварительно установленных спектральных диапазонах.
Эта характеристика позволяет существенно сократить время, необходимое для выполнения этапа анализа, что позволяет ускорить сроки и повысить точность идентификации.
Предпочтительно, использование упомянутых предварительно рассчитанных моделей позволяет ускорить время идентификации для каждого неизвестного образца по сравнению со способами, известными в данной области техники.
Эти характеристики позволяют увеличить размер базы данных, позволяющей идентифицировать множество видов, подвидов или подклассов различных микроорганизмов, различных штаммов одного и того же вида, подвида или подсемейства, также возможно выращенных в разных культурах на разных средах или в разных условиях окружающей среды, возможно в присутствии биологических жидкостей.
Краткое описание чертежей
Эти и другие аспекты, характеристики и преимущества настоящего изобретения будут поняты со ссылкой на последующее описание, чертежи и прилагаемую формулу изобретения. Чертежи, являющиеся неотъемлемой частью описания, показывают некоторые варианты осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием предоставляют описание принципов изобретения.
Настоящее изобретение лучше описано и показано с помощью следующих чертежей, на которых:
на фиг. 1 приведено схематическое представление возможного устройства в соответствии со способом настоящего изобретения;
на фиг. 2 приведена блок-схема, на которой в качестве примера показаны этапы одного варианта осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением;
на фиг. 3a и 3b показаны экспериментальные данные, собранные с использованием способа FTIR-ATR, где на фиг. 3а показаны собранные необработанные данные, в которых каждый вид представлен своим цветом, в то время как на фиг. 3b показаны преобразованные данные;
на фиг. 4 схематически показаны зоны кластеров, полученных с помощью PCA в пространстве двух главных компонент, соответствующих спектрам различных видов микроорганизмов;
на фиг. 5 схематически показан пример зон кластеров, полученных с помощью LDA в пространстве первых двух компонент;
на фиг. 6 схематически показан пример зон кластеров, полученных с помощью PCA в пространстве двух главных компонент, соответствующих спектрам различных видов микроорганизмов;
на фиг. 7 показано: панель а) - представление пространства PCA, окрашенного как Грам (+) (светло-серый) и Грам (-) (темно-серый); панель b) - матрица неточностей, показывающая "расчетные" данные по отношению к "фактическим" данным, полученным этим способом; панель с) - результаты выполнения математического метода, примененного к вариантам осуществления, описанным в этом документе при расчете Грам-типа;
на фиг. 8 приведена матрица неточностей, полученная путем перекрестной валидации способа в соответствии с описанными в этом документе вариантами со спектрами базы данных.
Чтобы упростить понимание, где это было возможно, для указания идентичных общих элементов на чертежах использовали одни и те же ссылочные позиции. Понятно, что элементы и характеристики одного варианта могут быть включены в другие варианты осуществления без дополнительных уточнений.
Подробное описание некоторых вариантов осуществления изобретения
Теперь подробно рассмотрим различные варианты осуществления настоящего изобретения, один или несколько примеров которых приведены на прилагаемых чертежах. Каждый пример приведен в качестве иллюстрации изобретения, и их не следует понимать как его ограничение. Например, характеристики, показанные или описанные в той мере, в какой они являются частью одного варианта осуществления, могут быть приспособлены в других вариантах осуществления или в сочетании с ними для получения другого варианта осуществления. Подразумевается, что настоящее изобретение содержит все такие модификации и варианты.
Прежде чем описывать эти варианты осуществления, мы должны также уточнить, что настоящее описание не ограничено в своем применении деталями конструкции и расположения компонентов, как описано в последующем описании с использованием прилагаемых чертежей. Настоящее описание может содержать другие варианты осуществления и может быть получено или выполнено различными другими способами. Мы должны также уточнить, что фразеология и терминология, используемая в этом документе, предназначена только для описания и не может рассматриваться как ограничительная.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в этом в дальнейшем, имеют одно и то же значение, обычно понимаемое специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение.
Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в этом документе, могут быть использованы на практике или в тестах для проверки этого изобретения, способы и материалы описаны ниже в качестве примера. В случае коллизии преимущественную силу имеет настоящая заявка, содержащая определения. Материалы, способы и примеры носят чисто иллюстративный характер, и их не нужно понимать как ограничивающие.
В дальнейшем под образцом мы понимаем минимальное количество, взятое для целей анализа из большей однородной части биологического вещества, содержащего микробные организмы, например, микроорганизмы, но не только.
Иногда, при необходимости, мы будем указывать неизвестный образец или известный образец, в тех случаях, когда состав микроорганизмов биологического вещества соответственно неизвестен или известен.
В некоторых вариантах осуществления виды, подвиды и подклассы микроорганизмов могут представлять клинический интерес.
Кроме того, термин "спектр" будет использоваться применительно к набору электромагнитных излучений, совместимых с используемым инструментом получения, и поэтому выражения "инфракрасный спектр", "колебательный спектр" или ссылки на колебательные переходы или определенные конкретные спектральные диапазоны не следует понимать в ограничительном смысле в отношении применимости способа в соответствии с настоящим изобретением.
На фиг. 1 схематически показано устройство 10 для идентификации микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением.
Например, устройство содержит спектрофотометр для FTIR-спектроскопии (ИК спектроскопия с преобразованием Фурье) в режиме ATR (нарушенного полного внутреннего отражения - НПВО), то есть спектрофотометр FTIR-ATR, связанный с системой обработки и системой отображения данных.
Система обработки и система отображения могут, например, быть интегрированы в единую систему обработки и отображения и/или могут быть включены в компьютер 15, такой как, например, персональный компьютер, оснащенный экраном.
В некоторых вариантах осуществления система обработки содержит компьютерную программу, которая может быть записана на машиночитаемый носитель и которая содержит инструкции, которые могут быть выполнены в каждом случае устройством 10.
Далее, для простоты изложения, будет сделана ссылка на компьютер 15, чтобы указать набор программно-аппаратных систем, способных управлять устройством 10, а также обрабатывать и отображать данные.
Спектрофотометр FTIR-ATR, известный сам по себе в своих основных компонентах, содержит источник 13 инфракрасного излучения 17, отражающие элементы 16, элемент полного внутреннего отражения и детектор 14.
Для простоты другие компоненты спектрофотометра, такие как монохроматор, модулятор, интерферометр, не показаны на фиг. 1.
В некоторых вариантах осуществления источник 13 может представлять собой источник черного тела типа глобара.
Например, излучение 17, испускаемое источником 13, то есть падающее излучение 17а, направляют отражающими элементами 16 так, чтобы оно попадало на элемент полного внутреннего отражения.
В некоторых вариантах осуществления элементом полного внутреннего отражения может быть, например, кристалл 12.
В некоторых вариантах осуществления кристалл 12 может представлять собой кристалл 12 с высоким показателем преломления.
В некоторых вариантах осуществления кристалл 12 может быть кристаллом 12 алмаза, ZnSe, кремния или германия.
Предпочтительно, если кристалл 12 является кристаллом 12 алмаза, он обладает преимуществом, которое заключается в том, что он более прочный, чем ZnSe, кремний или германий, используемые в сопоставимых измерениях, и имеет больший диапазон прозрачности.
Отражение излучения 17 внутри кристалла 12 создает быстро затухающее поле на поверхности кристалла 12, на которой может быть определена зона 18 получения информации, на которой располагают анализируемый биологический образец.
Быстро затухающее поле может проникать на различную глубину, которая, в зависимости от случая, может достигать нескольких микрон.
В частности, диапазон глубин зависит от угла падения и длины волны падающего излучения 17а, а также показателя преломления материала, используемого для кристалла 12, и поэтому его можно считать практически постоянным для всех анализируемых образцов.
По этой причине предпочтительно режим ATR (НПВО) позволяет получать спектры, не зависящие от оптического пути излучения через образец, и, следовательно, не зависящие от толщины образца, обеспечивая более высокую воспроизводимость по сравнению с подходами, использующими пропускание или отражение.
Кроме того, этот режим позволяет ограничить или предотвратить явления рассеяния и/или насыщения сигнала, которые могут негативно сказаться на качестве спектра.
Таким образом, этот режим гарантирует большую повторяемость измерений и более простую подготовку образца.
Излучение 17, выходящее из кристалла 12 после взаимодействия с образцом, то есть исходящее излучение 17b, направляют затем с помощью отражающих элементов 16 в сторону детектора 14.
В некоторых вариантах осуществления детектор 14 может представлять собой детектор DLaTGS (Дейтерированный L-аланин, легированный триглицинсульфатом).
В альтернативных вариантах детектор 14 может представлять собой детектор DTGS.
Например, детектор 14 преобразует оптическую информацию, содержащуюся в исходящем излучении 17b, в электрические сигналы, которые передают в компьютер 15.
В некоторых вариантах устройство предназначено для получения спектров в области NIR (Ближний ИК диапазон) и/или MIR (средний ИК диапазон) и/или FIR (дальний ИК диапазон).
В некоторых вариантах устройство 10 может работать в режиме непрерывного приема, то есть отображать на экране компьютера 15 в режиме реального времени то, что получают в каждом случае в зоне 18 получения информации.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации микроорганизмов, схематически показанному на фиг. 2 и содержащему:
- этап подготовки базы данных (А1, А2, А3) эталонных спектров, связанных с известными образцами видов, подвидов и подклассов известных микроорганизмов;
- этап А4 создания предварительно рассчитанных моделей, начиная с упомянутой базы данных, на основе идентификации спектральных характеристик, наиболее значимых для каждого вида, подвида или подкласса известных микроорганизмов;
- этап B отбора неизвестного образца, взятого у пациента, возможно, выращенного впоследствии на твердых или жидких средах и, возможно, содержащего биологические жидкости;
- один или несколько этапов C получения спектра неизвестного образца;
- один или несколько этапов D обработки спектра неизвестного образца;
- один или несколько этапов анализа спектра неизвестного образца путем сравнения его с предварительно рассчитанными моделями, каждый из этапов анализа дает по меньшей мере некоторые показатели, возможно, в виде процентов, того, что неизвестный образец принадлежит к одному или нескольким из упомянутых видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов, а также параметр достоверности упомянутых показателей принадлежности;
- один или несколько этапов F контроля, на которых, начиная с упомянутых показателей принадлежности и упомянутого параметра достоверности, запрашивают новый этап получения спектра неизвестного образца или предоставляют конечный результат способа, который может содержать неудачную идентификацию J или успешную идентификацию G, H, I в соответствии с различными критериями.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения этап A подготовки базы данных может, в свою очередь, содержать:
- этап A1 отбора известного образца, возможно взятого у пациентов, возможно впоследствии выращенного на твердых или жидких средах и, возможно, содержащего биологические жидкости;
- один или несколько этапов A2 получения спектра известного образца;
- один или несколько этапов A3 обработки спектра известного образца.
В некоторых вариантах осуществления упомянутые этапы A1, A2, A3 могут повторяться каждый раз, когда требуется вставить новый образец, известный в базе данных.
В некоторых вариантах осуществления этапы отбора B, A1 образца могут предусматривать, что образец берут у пациента.
В некоторых вариантах осуществления образец, взятый у пациента, может быть подвергнут предварительной процедуре анализа, которая предусматривает добавление питательных веществ для микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления образец можно выращивать на твердой питательной среде.
В некоторых вариантах осуществления образец можно выращивать в чашках Петри.
В некоторых вариантах осуществления образец можно выращивать на жидкой питательной среде, а затем центрифугировать, получая концентрированную гранулу.
В некоторых вариантах осуществления образец можно выращивать на жидкой питательной среде или жидком бульоне для выращивания, а затем фильтровать.
В некоторых вариантах осуществления образец может быть выращен на жидкой питательной среде или жидком бульоне для выращивания, или он может быть подвергнут процедурам концентрирования или обогащения для увеличения концентрации присутствующих микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления образец может содержать биологические жидкости человеческого или животного происхождения.
В некоторых вариантах осуществления этапы C, A2 получения спектра могут предусматривать предварительный этап очистки поверхностей устройства, контактирующих с образцом, например зоны 18 получения, показанной на фиг. 1.
В некоторых вариантах осуществления можно получать фоновые спектры, например, с помощью непрерывного режима получения, чтобы проверить эффективность такой очистки, например, наблюдая исчезновение полос поглощения, связанных с примесями, осажденными на зоне 18 получения.
В некоторых вариантах осуществления этапы C, A2 получения спектра также предусматривают, что пробу образца берут и осаждают на кристалл 12 спектрофотометра, например на зоне 18 получения, с целью получения спектра.
В некоторых вариантах осуществления пробу осаждают на зоне 18 получения в твердом виде, например, удаляя и осаждая ее с помощью одноразового стержня.
В некоторых вариантах осуществления проба может быть прижата к зоне 18 получения, например, с помощью динамометрического пресса.
В некоторых вариантах осуществления уровень сушки образца контролируют спектроскопически.
В некоторых вариантах осуществления можно оценивать содержание воды, выходящей из устройства в непрерывном режиме получения, и контролируя уменьшение, вплоть до возможного полного исчезновения, полос поглощения, относящихся к спектральным характеристикам воды в соответствующих диапазонах волновых чисел.
В соответствии с настоящим изобретением спектр получают при достижении заданного стандартного уровня сушки образца.
Преимущественно, эта характеристика позволяет преодолеть или по меньшей мере ограничить проблему существующего уровня техники, при котором спектры могут иметь сигналы из-за присутствия воды, которые перекрывают или создают помехи специфическим сигналам микроорганизмов.
Эта характеристика также позволяет избежать процедур сушки образца, которые могли бы необратимо модифицировать анализируемые микроорганизмы.
Этапы получения C, A2 спектра также обеспечивают запись спектра пробы, взятой из образца.
В некоторых вариантах осуществления спектр записывают в течение предварительно определенного периода времени.
В некоторых вариантах осуществления спектр записывают в течение периода времени менее 30 секунд.
В некоторых вариантах осуществления запись спектра обеспечивает получение предварительно определенного количества последовательных спектров, которые затем усредняют для повышения отношения сигнал/шум.
В некоторых вариантах осуществления может быть получено и усреднено от 8 до 512 спектров для каждой пробы, предпочтительно от 32 до 256 для каждой пробы, еще более предпочтительно от 64 до 128 для каждой пробы.
В некоторых вариантах осуществления спектр или, возможно, среднее значение спектров отображают на экране.
Этапы D, A3 обработки спектра или среднего значения спектров могут предусматривать следующее:
- использование линейных и/или нелинейных алгоритмов интерполяции и/или подгонки (спектральный профиль);
- вычисление первой и/или второй производной спектрального профиля;
- нормализацию производных с использованием алгоритма векторной нормализации по всему спектральному диапазону;
- выбор наиболее полезных спектральных зон для классификации видов, подвидов или подклассов микроорганизмов.
-1
-1
-1
-1
Например, спектральные зоны могут содержать: диапазон 950-1280 см для нуклеиновых кислот, углеводов и полисахаридов; 1280-1480 см для крахмалов, например белков, метилов и метиленов, например липидов; 1700-1800 см для карбонильных групп, например липидов; 2800-3000 см для алифатических цепей, например липидов.
В некоторых вариантах осуществления алгоритмы искусственного обучения (машинного обучения) могут быть использованы для улучшения процесса выбора спектральных диапазонов.
Например, на фиг. 3а показаны спектры, которые могут быть собраны для различных образцов, в то время как фиг. 3b показаны обработанные спектры.
На фиг. 3а также в качестве примера показаны некоторые идентификационные спектральные характеристики, значимые для целей способа в соответствии с настоящим изобретением.
В некоторых вариантах осуществления спектральные области и идентификационные спектральные характеристики используют затем для классификации и последующей идентификации отдельных видов, подвидов или подклассов микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления предусмотрена автоматическая система распознавания, позволяющая идентифицировать спектральные диапазоны и идентифицировать спектральные характеристики, представляющие наибольший интерес.
Преимущественно наличие различных химических классов, таких как, например, нуклеиновые кислоты, липиды, белки, углеводы и другие составляющие микроорганизмов, позволяет получать характерные сигналы для каждого вида, подвида или подкласса микроорганизмов, так что можно получить расчетный способ.
Повторяя этапы A1, A2, A3 для нескольких известных образцов, можно подготовить базу данных эталонных спектров видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов.
Однако в некоторых вариантах осуществления настоящего способа также предусмотрено, что база данных может содержать спектры видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов, полученных с использованием других способов.
В некоторых вариантах осуществления база данных содержит спектры, относящиеся к мономикробным культурам, принадлежащим к различным видам, подвидам или подклассам известных микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления база данных содержит спектры, относящиеся к различным штаммам известных микроорганизмов для каждого вида, подвида или подкласса известных микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления база данных содержит спектры, относящиеся к образцам, выращенным на различных питательных средах, например, но не только, агар-агар, агар CNA, агар CLED, кровяной агар, хромогенный агар.
В некоторых вариантах осуществления база данных содержит спектры, относящиеся к образцам, выращенным в жидкофазном бульоне для выращивания, которые затем центрифугируют, фильтруют или обогащают для получения гранул или концентрированных образцов.
Предпочтительно, спектры, полученные посредством выращивания в жидком бульоне и последующего гранулирования или фильтрации, могут быть использованы в качестве стандартных эталонных спектров, так как они не содержат помех, возникающих от матриц твердофазных питательных сред.
Преимущественно измерения спектров, полученных в результате выращивания в жидком бульоне и последующего гранулирования, фильтрации или обогащения, позволяют идентифицировать спектры непосредственно в присутствии биологических жидкостей, например жидкостей организма.
Такая неоднородность и вариабельность спектров, содержащихся в базе данных, позволяет проводить общий анализ, позволяющий идентифицировать множество видов, подвидов или подклассов микроорганизмов, множество различных штаммов для каждого отдельного вида, подвида или подкласса, включая также эффекты, возникающие при выращивании на различных питательных средах.
В вариантах осуществления, в которых используют множественные получения каждого спектра, можно вставить в базу данных отдельные повторяющиеся спектры и/или усредненный спектр, рассчитанный на повторениях.
Предварительно рассчитанные модели или эталонные библиотеки, созданные или обновленные на этапе А4, могут быть основаны на наиболее значимых идентификационных спектральных характеристиках для целей анализа в выбранных спектральных диапазонах.
В некоторых вариантах осуществления наиболее значимые идентификационные спектральные характеристики могут быть связаны, например, с информацией о формах, размерах, интенсивностях и областях пиков поглощения, а также корреляциями и соотношениями между интенсивностями или между областями различных пиков.
В некоторых вариантах осуществления предварительно рассчитанные модели могут содержать перечень идентификационных спектральных характеристик, значимых для каждой известной выборки видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов.
В некоторых вариантах осуществления наиболее значимые идентификационные спектральные характеристики могут быть идентифицированы с помощью упомянутых способов статистического анализа и/или подходов, основанных на нейронных сетях и/или искусственном обучении.
Эти предварительно рассчитанные модели позволяют быстро и автоматически идентифицировать наиболее значимые идентификационные спектральные характеристики для целей сравнения.
Таким образом, каждый раз, когда сравнивают два спектра, сравнение может быть выполнено только в спектральных диапазонах и/или по отношению к спектральным характеристикам, представляющим наибольший интерес, а не по всему спектральному диапазону и/или по всем спектральным характеристикам.
-1
Например, если бы кто-то хотел сравнить во всем спектральном диапазоне спектр неизвестного образца, полученного с разрешением 1 см, с базой данных, содержащей, например, 18000 эталонных спектров, полученных с тем же разрешением, то это сравнение, выполняемое с использованием способов существующего уровня техники, потребовало бы оценки 65 миллионов точек.
Заявитель установил, что при использовании способов в соответствии с настоящим изобретением, работающих на выбранных спектральных диапазонах и с предварительно рассчитанными моделями, это сравнение может потребовать в 20-80 раз меньше оценок точек, чем в способах существующего уровня техники.
Таким образом, использование предварительно рассчитанных моделей позволяет значительно сократить время анализа для каждой неизвестной выборки даже при наличии больших баз данных.
Таким образом, эта характеристика позволяет существенно увеличить размер баз данных, чтобы они содержали большое число видов, подвидов или подклассов известных микроорганизмов, тем самым улучшая и расширяя прогностические и идентификационные возможности способа в соответствии с настоящим изобретением.
Эта характеристика также позволяет работать со спектрами даже при высоком разрешении, повышая достоверность и точность способа.
Более того, например, наличие списка может сделать излишним применение методов наименьших квадратов и/или возможных вычислений среднеквадратичных отклонений по всему диапазону волновых чисел для всех спектров.
В других вариантах осуществления предложено использовать модели искусственного обучения (машинного обучения) и искусственного интеллекта, чтобы совершенствовать систему автоматического распознавания и предварительно рассчитанные модели, постепенно по мере использования способа.
В некоторых вариантах осуществления этап E анализа предусматривает, что спектр неизвестного образца сравнивают с эталонными спектрами, содержащимися в эталонной базе данных, и/или с предварительно рассчитанными моделями.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для такого сравнения могут быть использованы статистические методы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения статистические методы могут содержать многомерный анализ, например анализ главных компонент (PCA) или линейный дискриминантный анализ (LDA), а также линейный дискриминантный частичный метод наименьших квадратов (LDPLS), квадратичный дискриминантный анализ (QD).
В некоторых вариантах осуществления для упомянутого сравнения могут быть использованы способы, приемы или алгоритмы, реализующие подходы, основанные на нейронных сетях.
В некоторых вариантах осуществления для упомянутого сравнения могут быть использованы способы, приемы или алгоритмы, реализующие подходы, основанные на искусственном обучении (машинном обучении).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения упомянутое сравнение может также обеспечивать сравнение первых и/или вторых производных спектров.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать статистические веса для взвешивания различных областей спектров различными способами.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сравнение между двумя спектрами может быть выполнено посредством определения расстояния между двумя спектрами, например с использованием методов, основанных на наименьших квадратах.
В некоторых вариантах осуществления расстояние может использоваться в качестве метрики для проведения статистического и/или хемометрического анализа.
В некоторых вариантах осуществления дисперсия между спектрами может быть использована для анализа PCA.
В некоторых вариантах осуществления этап Е анализа дает показатель, например процент, принадлежности неизвестного образца к одному или нескольким видам, подвидам или подклассам, представленным в базе данных.
В некоторых вариантах осуществления этап Е анализа дает параметр достоверности, который оценивает достоверность анализа и, в частности, показателя принадлежности.
В некоторых вариантах осуществления этап F контроля обеспечивает обработку показателя принадлежности и параметра достоверности.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, показатель принадлежности считают автоматически достоверным, если параметр достоверности анализа выше заданного уровня приемлемости. Например, если используют процентные оценки, то уровень приемлемости может быть выбран в диапазоне от 80% до 100% (блок G на фиг. 2).
В некоторых вариантах осуществления, если невозможно однозначно идентифицировать неизвестные виды, подвиды или подклассы микроорганизмов с первой попытки, то можно повторить этапы С, D, Е и F для добавления новых данных и уточнения результата анализа.
В некоторых вариантах осуществления это может быть выполнено, если параметр достоверности ниже второго заданного уровня приемлемости. Например, в вариантах осуществления, использующих показатели, выраженные в процентах, этот второй уровень может быть выбран в диапазоне от 70% до 80%.
В этом случае способ предусматривает второй этап C получения, второй этап D обработки и второй этап E анализа, которые должны быть выполнены на второй пробе, взятой из неизвестного образца.
Например, вторая проба может представлять собой другую колонию микроорганизмов, взятую из той же чашки Петри, в которой культивировали и выращивали неизвестный образец.
Если образец находится в виде гранул, то вторая проба может быть взята, например, с помощью одноразового стержня из той же концентрированной гранулы, из которой была взята первая проба.
После этого, если достоверность результата второго анализа снова ниже третьего заданного уровня приемлемости, например численно равна второму уровню приемлемости, то способ предусматривает сравнение сходства между двумя спектрами, полученными на первом этапе С получения и на втором этапе С получения.
Если установлено, что спектры аналогичны (блок II на фиг. 2), то способ в качестве результата анализа дает показатели принадлежности неизвестного образца к одному или нескольким видам, подвидам или подклассам микроорганизмов в соответствии с двумя получениями.
Если спектры оказываются несогласованными, то предусмотрено проведение третьего анализа и выполнение третьего этапа C получения, третьего этапа D обработки и третьего этапа E анализа.
Если хотя бы два из трех спектров оказались сходными (блок I на фиг. 2), то способ в качестве результата анализа дает показатели принадлежности образца к видам, подвидам или подклассам микроорганизмов из базы данных, в соответствии с двумя из трех спектров.
В противном случае (блок J на фиг. 2), отображают сообщение о неуспешной идентификации вместе со спектрами и тремя показателями принадлежности, относящимися к трем получениям.
В одном из вариантов осуществления предложена компьютерная программа или программное обеспечение, используемое для сбора данных и их анализа относительно базы данных, которая может быть записана на машиночитаемом носителе и которая содержит инструкции, которые при исполнении их устройством анализа для классификации и идентификации микроорганизмов происходит выполнение способа в соответствии с настоящим описанием.
Пример 1
Например, на фиг. 4 схематически показаны результаты компьютерного анализа A спектров, содержащихся в базе данных, в соответствии с настоящим изобретением. В частности, каждая точка на фиг. 4 соответствует спектру или среднему из полученных спектров, относящемуся к видам, подвидам или подклассам микроорганизмов, в соответствии с первыми двумя основными компонентами.
Спектры также были сгруппированы в зоны, расширение которых связано с изменчивостью спектров каждого вида, подвида или подкласса микроорганизмов, основанных на различных штаммах и/или различных питательных средах для каждого образца.
Пример 2
Например, на фиг. 5 схематически показаны результаты LDA анализа спектров, содержащихся в базе данных, в соответствии с настоящим изобретением.
В частности, каждая точка на фиг. 5 соответствует спектру или среднему из полученных спектров, относящемуся к видам, подвидам или подклассам микроорганизмов, в соответствии с первыми двумя компонентами.
Спектры также были сгруппированы в зоны, протяжение которых связано с изменчивостью спектров каждого вида, подвида или подкласса микроорганизмов, основанных на различных штаммах и/или различных питательных средах для каждого образца.
Пример 3
В одном варианте осуществления база данных в соответствии с настоящим изобретением была получена путем посева отобранных и сертифицированных микроорганизмов типа NNCCLS Atlanta в чашки Петри или на жидкую среду.
В этом варианте осуществления были получены специфические спектры для каждого отдельного микроорганизма, посеянного на чашку Петри или на жидкую среду; кроме того, каждый отдельный штамм был посеян в различные питательные среды с использованием чашек Петри от различных производителей жидких сред, чтобы проверить изменчивость спектров относительно условий роста.
Используемые среды были выбраны из следующих:
- CLED агар
- агар Макконки
- CNA агар
- кровяной агар.
Для каждого микроорганизма было получено 500 культур микроорганизмов, чтобы иметь широкое и полное тематическое исследование в отношении получения численного кластера, способного проверить корреляцию данных по сравнению с другими используемыми способами.
На фиг. 6 представлены данные, полученные в пространстве первых двух главных компонент, где каждый вид представлен своим оттенком серого.
Пример 4
В одном варианте способ в соответствии с изобретением может быть использован для предсказания типа микроорганизма по методу Грама. Пример результатов по классификации Грам + Грам показан на фиг. 7.
На панели а) на фиг. 7 показано представление пространства PCA, окрашенного как Грам+ (светло-серый) и Грам- (темно-серый).
На панели b) на фиг. 7 приведена матрица неточностей, показывающая "расчетные" данные по сравнению с "фактическими" данными, полученными с помощью способа.
На панели с) на фиг. 7 показаны результаты работы математического метода при расчете Грам-типа.
Пример 5
В одном варианте осуществления способ может быть использован для идентификации видов, подвидов или подклассов микроорганизмов. См. фиг. 8, где показана матрица неточностей, полученная в результате проверки эффективности способа со спектрами базы данных в соответствии с настоящим изобретением, в матрице можно наблюдать соответствие от 99,9% до 96% между фактическим и расчетным значением.
Ясно, что в описанные выше в способ и/или устройство могут быть внесены изменения и/или дополнения частей или этапов без отклонения от области и объема применения настоящего изобретения. Ясно также, что, хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на некоторые конкретные примеры, специалист в данной области техники, несомненно, сможет получить много других эквивалентных форм способа и/или устройства, обладающих характеристиками, изложенными в формуле изобретения, и, следовательно, все они попадают под определенную таким образом область защиты.