HRM новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 616-002.5-085.015.8-074:577.2.08

Лаврова О.И., Альварес Фигероа М.В., Творогова М.Г.

ИРМ - НОВЫЙ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии, 111123, Москва

Раннее выявление изолятов микобактерий туберкулеза (МБТ), устойчивых к противотуберкулезным препаратам (ПТП), крайне необходимо для оптимизации схемы лечения и предотвращения распространения устойчивых штаммов. В обзоре литературы рассматриваются данные о новом, быстром и недорогом методе детекции мутаций в генахМБТ, отвечающих за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Молекулярно-генетический метод HRM (high resolution melting curve analysis) основан на проведении амплификации фрагментов ДНК с последующим анализом их кривых плавления с высоким разрешением. Метод показал высокую чувствительность и специфичность. В отличие от других молекулярно-генетических методов определения резистентности МБТHRM-анализ позволяет выявлять все мутации в интересующих фрагментах генов, различать ДНКмутантного и дикого типов в их смеси, не имеет контаминационной опасности. HRM-анализ может стать основой для создания диагностических наборов с целью выявления туберкулеза с МЛУ (МЛУ-ТБ).

Ключевые слова: туберкулез; микобактерии туберкулеза; устойчивость к противотуберкулезным препаратам;

рифампицин; изониазид; метод плавления с высоким разрешением; анализ HRM; множественная лекарственная устойчивость; секвенирование; rpoB; katG; inhA; mabA; ahpC.

O.I. Lavrova, M.V. AlvaresFigeroa, M.G. Tvorogova

THE HRM-NEW MOLECULAR TECHNIQUE OF DETECTION OF PHARMACEUTICAL RESISTANCE OF MI-COBACTERIA OF TUBERCULOSIS

The central research institute of epidemiology of Rospotrebnadzor, 111123 Moscow, Russia

The early detection of isolates of mycobacterium of tuberculosis resistant to anti-tuberculosis pharmaceuticals is ultimately needed for optimization of treatment scheme and prevention of propagation of resistant strains. The literature review presents analysis of data concerning the new, fast and inexpensive technique of detection of mutations in genes of mycobacterium of tuberculosis competent for multiple medicinal resistance. The molecular genetic technique HRM (high resolution melting curve analysis) is based on implementation of amplification of DNA fragments with subsequent analysis of their curves of melting with high resolution. The technique demonstrated its high sensitivity and specificity. In contrast with other molecular genetic techniques of detection of resistance of mycobacterium of tuberculosis, the makes it possible to detect all mutations in interested fragments of genes and to distinguish DNA of mutant and wild types in their mixture. This technique has no contamination danger. The HRM-analysis can become a basis for development of diagnostic kits with purpose to detect tuberculosis with multiple medicinal resistance.

Keywords: tuberculosis, mycobacterium of tuberculosis, resistance, anti-tuberculosis pharmaceuticals, rifampicine, isonia-zid, high resolution melting curve analysis, multiple medicinal resistance, sequence analysis, rpoB, katG, inhA, mabA,ahpC.

Распространение множественной лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МЛУ МБТ) существенно угрожает усилиям здравоохранения по контролю за заболеваемостью туберкулезом. МЛУ МБТ - это устойчивость к изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия или отсутствия устойчивости к другим препаратам). Определение устойчивости МБТ культуральными методами занимает от 5 нед до 4 мес на плотных и от 10 до 52 дней на жидких питательных средах с использованием автоматических анализаторов. В течение этого времени больной получает эмпирическое противотуберкулезное лечение без индивидуального учета профиля резистентности. В настоящее время разработан ряд быстрых методов определения лекарственной чувствительности, основанных на анализе ДНК МБТ.

Быстрое выявление случаев множественной лекарственной устойчивости туберкулеза (МЛУ-ТБ) необходимо для своевременного лечения пациентов и уменьшения распространенности устойчивых к противотуберкулезным препаратам (ПТП) штаммов. Стандартные культуральные методы для определения МЛУ-ТБ - это метод абсолютных концентраций и метод пропорций [1], которые требуют много

Для корреспонденции:

Лаврова Ольга Игоревна, канд. биол. наук, науч. сотр. Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а e-mail: ilinir@mail.ru

времени, громоздки и трудоемки. В настоящее время для быстрого детектирования изолятов, устойчивых к лекарственным препаратам, внедряются новые молекулярно-гене-тические методы, такие как ПЦР в реальном времени, гибридизация ДНК в формате чипов, секвенирование [2, 3]. Сек-венирование является наиболее точным из всех методов для обнаружения мутаций, приводящих к резистентности, но оно требует специального дорогостоящего оборудования и специально обученного персонала. Гибридизация ДНК в формате чипов - относительно недорогой метод, однако в процессе анализа необходимо открывание пробирок с продуктами амплификации, что обусловливает его контаминационную опасность. Этот метод не позволяет дифференцировать ДНК мутантного и дикого типов в смеси, что снижает его диагностическую ценность. ПЦР в реальном времени - удобный метод для определения мутаций резистентности, но при его использовании можно определять только заранее внесенные в дизайн методики мутации, поэтому часть мутаций не будет выявлена, что приведет к ложноотрицательным результатам.

Описанных недостатков лишен новый метод, совмещенный с ПЦР, - анализ кривых плавления с высоким разрешением (high resolution melting curve analysis - HRM) [4]. HRM-анализ является достаточно эффективным методом молекулярной биологии для диагностики мутаций, приводящих к резистентности возбудителей инфекционных заболеваний, а также для определения мутаций - маркеров онкологических и наследственных заболеваний [5-8].

МИКРОБИОЛОГИЯ

HRM-анализ выгодно отличается от вышеперечисленных молекулярно-генетических методов: это быстрый, недорогой и несложный в исполнении метод, с помощью которого можно выявлять все мутации в интересующих фрагментах генов, а также различать ДНК мутантного и дикого типов в их смеси. Немаловажным достоинством метода является отсутствие контаминационной опасности, так как весь анализ проводится в закрытой пробирке.

Метод HRM. Новый вид анализа продуктов ПЦР, основанный на использовании интеркалирующих флюоресцентных красителей ДНК и возможностей оборудования для проведения HRM-анализа предложен в 1997 г. [9].

HRM-анализу предшествует ПЦР для амплификации фрагмента ДНК, где лежат интересующие исследователя мутации. Далее в процессе исследования ампликоны нагревают в экспериментально подобранном температурном диапазоне, зависящем от GC-состава ампликонов. При достижении температуры плавления (Tm) двуцепочечная ДНК превращается в одноцепочечную. За данным процессом можно наблюдать в реальном времени с помощью интеркалирующих красителей. Эти красители присоединяются специфично только к двуцепочечной ДНК и в этом случае дают сильный сигнал флюоресценции. В отсутствие двуцепочечной ДНК интер-калирующие красители интактны. В начале процесса HRM можно наблюдать высокий уровень флюоресценции из-за присутствия огромного количества копий двуцепочечного ампликона. Когда образец нагревается, двуцепочечная ДНК расплавляется до одноцепочечной и уровень флюоресценции падает. С помощью программного обеспечения эти данные преобразуются в график, известный как кривая плавления и показывающий уровень флюоресценции в зависимости от температуры [10]. Точка перегиба графика - Tm данного ампликона, когда 2 цепи ДНК расходятся (см. рисунок). Нормализацию кривых плавления проводят путем выбора линейных участков до и после участка плавления. Для упрощения анализа строят кривую отличия dF (флюоресценции) от dT (температуры), нормализованную по выбранному генотипу (обычно дикому типу) [10, 11].

Мутации в пределах анализируемого ПЦР-фрагмента приводят к изменениям Tm, что сдвигает кривую по оси значения температуры или даже меняет ее форму. По результатам HRM могут быть выделены 4 класса единичных нукле-отидных замен (single nucleotide polymorphism, SNP), которые характеризуются различным сдвигом Tm (см. таблицу). I класс SNP включает замены C/T и G/A, II - замены C/A и G/T. Эти 2 класса SNP легко определяются в ходе HRM, так как сдвиг Tm составляет > 0,5°С. III класс SNP определяется хуже, поскольку имеет сдвиг Tm < 0,4°С. Наибольшие трудности представляет определение посредством HRM IV класса из-за разницы Tm < 0,2°С. В этом случае расхождение кривых плавления может быть усилено до детектируемого уровня посредством уменьшения длины анализируемого ам-пликона, а также добавлением плазмидной ДНК известного генотипа к анализируемым образцам [8].

Стандартными характеристиками любого метода являются его чувствительность и специфичность. С целью определения этих характеристик принято проводить сравнение с «золотым стандартом» - культивированием МБТ на среде Левенштейна-Йенсена. Чувствительность HRM-анализа -количество изолятов, резистентных к определенному препарату по результатам HRM среди изолятов, резистентных к тому же препарату по результатам культурального исследования. Специфичность HRM-анализа - доля чувствительных изолятов, правильно определяемых с помощью HRM, среди чувствительных изолятов, обнаруженных культуральным методом. Авторы использовали для исследований в основном изоляты МБТ с известной устойчивостью и чувствительностью к лекарственным препаратам.

Выявление мутаций с помощью HRM в генах rpoB, katG, а также в промоторах генов inhA, mabA и ahpC, приводящих к устойчивости к рифампицину и изониазиду. Описаны

Кривая

Tm - точка перегиба

Фаза

плавления

Фаза постплавления

78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 Температура, °С

ДНК

высокого

Схема типичной кривой плавления разрешения (HRM).

Участки кривой плавления представляют собой переход от высокого уровня флюоресценции фазы преплавления (двойная спираль ДНК) через резкое падение флюоресценции в фазе плавления к базальному уровню флюоресценции фазы постплавления (одиночная спираль ДНК). Точка перегиба, в которой значение изменения флюоресценции наибольшее, определяется как Tm для исследуемого ДНК-фрагмента. F - интенсивность флюоресценции.

мутации, ассоциированные с МЛУ-ТБ, т.е. с устойчивостью к рифампицину и изониазиду [7]. Около 95% устойчивых к рифампицину мутаций находятся в I кластере гена rpoB, кодирующем р-субъединицу РНК полимеразы (rifampicin resistance-determining region (RRDR-регион)) [12]. Изониа-зид является пролекарством, для активации которого нужен бактериальный фермент каталаза-пероксидаза, кодируемый геном katG, мутации в котором приводят к потере активности фермента и, следовательно, к устойчивости к изониазиду. Кроме гена katG, мутации в промоторах генов mabA, ahpC и inhA также приводят к устойчивости к изониазиду [13].

Чувствительность метода HRM при исследовании устойчивости изолятов к рифампицину (мутации в гене rpoB) колеблется в пределах 89,3-98,6%, специфичность - всегда 100% [5, 8, 14-18]. При исследовании устойчивости изолятов МБТ к изониазиду (мутации в одном или нескольких генах - katG, mabA, ahpC и inhA) чувствительность составляет 80-98,1%, специфичность - 83,3-100%.

Отсутствие абсолютной (100%) чувствительности метода HRM объясняется различными причинами [15-18]. Первая причина - принадлежность мутации к III и IV классам SNP (замены A/T, G/C), которые дифференцируются с трудом из-за низкой разницы Tm. В основном такие дискорданты встречаются при мутации D516V (A/T) в I кластере гена rpoB. Разрешающую способность метода можно увеличить за счет уменьшения размера ампликона, однако в работах [5, 8, 18] использовали различные длины ампликонов - от 62 до 256 п.н. Для увеличения чувствительности метода HRM при замене A/T предложено использовать метод Cold-PCR [17]. Исследовали 126 устойчивых к рифампицину изолятов сначала с помощью HRM-анализа, при этом мутации были обнаружены у 110 изо-лятов, а затем в результате применения Cold-PCR они были обнаружены еще у 10 из оставшихся 16 изолятов. При этом чувствительность метода HRM выросла c 87 до 95%. Вторая причина чувствительности метода < 100% состоит в том, что мутации в гене rpoB лежат не в RRDR-регионе rpoB гена, а в другой области этого гена или даже в других генах [16].

При использовании HRM для определения устойчивости к изониазиду исследователи сталкиваются с той же проблемой,

Классы SNP в зависимости от сдвига температуры плавления

Класс SNP Тип замены Типичный сдвиг Tm, °C

I C/T и G/A > 0,5°С

II C/A и G/T

III C/G < 0,4°С

IV A/T < 0,2°С

что и в случае устойчивости к рифампицину. Мутации могут лежать в тех регионах гена, которые не входят в исследуемый фрагмент, а также в генах, ответственных за устойчивость к изониазиду, но не охватываемых конкретным исследованием. Это становится очевидным при проверке ДНК изолятов МБТ методом секвенирования. Тестировали устойчивость к изони-азиду у изолятов только по гену katG [15, 18]. Чувствительность HRM-анализа в данных исследованиях составила 80 и 85% соответственно. В других работах [8, 14], в которых, кроме гена katG, в анализ вводили ген inhA, чувствительность метода составила уже 90 и 95% соответственно. Включение в HRM-анализ по меньшей мере еще одного гена, ответственного за устойчивость к изониазиду, кроме katG, повышает чувствительность метода примерно на 10% [5, 8, 14, 18, 19].

В случае с рифампицином специфичность метода HRM составляет 100% [5, 8, 14, 16, 17, 19]. Относительно устойчивости к изониазиду специфичность метода может быть существенно ниже [16]. В данной работе один изолят с заменой С на Т в позиции -15 в промоторе гена ahpC был тем не менее чувствительным к изониазиаду. Объясняют данное несоответствие молчащей мутацией, когда наличие мутации не влияет на чувствительность изолята к изониазиду. Это может быть также следствием некорректного определения феноти-пической чувствительности к изониазиду у этого изолята, а также возможного наличия компенсирующих мутаций, возвращающих фенотип изолята к дикому типу.

Интересный прием для выявления с помощью HRM-анализа изолятов МБТ, устойчивых к рифампицину, применили J. da Silva и соавт. [20]. Они использовали отрицательный и положительный плазмидные контроли, т. е. встроили в плазмиду p-GEM RRDR регион гена rpoB дикого типа и мутантов. В каждую пробу, исследуемую с помощью HRM, кроме ДНК неизвестного изолята, входила плазмидная ДНК дикого типа и мутантов. После проведения HRM для каждого изолята было получено 3 или 4 группы кривых: 1) дикий тип, 2) мутация первая C526T, 3) мутация вторая C531T и 4) все остальные мутации, отличные от первой и второй (если есть у данного изолята). Такой подход увеличил разрешающую способность метода HRM до уровня метода секвенирования, т. е. до 100%.

В настоящее время некоторые компании начали выпускать для применения на практике метода HRM специальное оборудование, программное обеспечение и готовые ПЦР-смеси. Данные литературы о недостаточной чувствительности метода можно объяснить и отсутствием попыток улучшить аналитические характеристики метода, проводя тестирование с использованием различных реагентов для HRM, концентраций праймеров и матриц ДНК. Такие исследования целесообразно выполнять на практике для улучшения разрешающей способности и повышения чувствительности метода.

Несмотря на отсутствие оптимизации этапа ПЦР, чувствительность метода HRM для выявления МЛУ МБТ составила 80-98,6%, специфичность - 83,3-100%, что определяет HRM как надежный, быстрый, простой, точный и доступный метод обнаружения МБТ, устойчивых к ПТП, если учесть, что ни один из молекулярных методов детекции не имеет 100% чувствительность и специфичность. HRM-анализ является важным инструментом для персонализированного выбора противотуберкулезной терапии с целью создания диагностических наборов для определения клинических изо-лятов с МЛУ МБТ.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Pai M., Kalantri S., Pascopella L., Riley L., Reingold A.; Bacterio-phage-based assays for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: A meta-analysis. J. Infect. 2005; 51: 175-87.

2. Li W., Matsuoka M., Kai M., Thapa P., Khadge S., Hagge D. et al.; Real-time PCR and high-resolution melt analysis for rapid detection

of Mycobacterium leprae drug resistance mutations and strain types. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(3): 742-53.

3. Van Deun A., Martin A., Palomino, J. Diagnosis of drugresistant tuberculosis: reliability and rapidity of detection. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2010; 14: 131-40.

4. Lee A., Ong D., Wong J., Siu G., Yam W. High-resolution melting analysis for the rapid detection of fluoroquinolone and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 2012; 7(2): 1-8.

5. Choi G. E., Lee S. M., Yi J., Hwang S., Kim H., Lee Y. et al.; Highresolution melting curve analysis for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11): 3893-8.

6. Hoek K., Gey van Pittius N., Moolman-Smook H., Carelse-Tofa K., Jordaan A., van der Spuy G. et al. Fluorometric assay for testing rifampin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin Microbiol. 2008; 46: 1369-73.

7. Laurenzo D., Mousa S. Mechanisms of drug resistance in Mycobac-terium tuberculosis and current status of rapid molecular diagnostic testing. Acta Trop. 2011; 119 (1): 5-10.

8. Ramirez M., Cowart K., Campbell P., Morlock G., Sikes D., Winchell J., Posey J. Rapid detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by use of real-time PCR and high-resolution melt analysis. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11): 4003-9.

9. Ririe K., Rasmussen R., Wittwer C. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal. Biochem. 1997; 245(2): 154-60.

10. Wittwer C., Reed G., Gundry C., Vandersteen J.G., Pryor R.J. Highresolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen/ J. Clin. Chem. 2003; 49: 853-60.

11. Williams D., Spring L., CollinsL., Miller L., Heifets L., Gangad-haram P., Gillis T.; Contribution of rpoB mutations to development of rifamycin cross-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Anti-microb. Agents Chemother. 1998; 42: 1853-7.

12. Drobniewski F., Caws M. Molecular techniques in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and the detection of drug resistance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001; 953: 138-45.

13. Yan C. M. Rapid diagnosis of isoniazid resistant mycobacterium tuberculosis by high resolution melting (HRM) assay. Hong Kong: This thesis is submitted to Faculty of Medicine of the University of Hong Kong in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Master of Medical Sciences; 2012.

14. Chen X., Kong F., Wang Q., Li C., Zhang J., Gilbert G. Rapid detection of isoniazid, rifampin, and ofloxacin resistance in Mycobac-terium tuberculosis clinical isolates using high-resolution melting analysis. J. Clin. Microbiol. 2011; 49(10): 3450-7.

15. Nour M.S., El-Shokry M.H., Shehata I., Aziz A. Evaluation of reza-surin microtiter assay and high resolution melting curve analysis for detection of rifampicin and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Clin. Lab. 2013; 59 (7-8): 763-71.

16. Ong D., Yam W., Siu G., Lee A. Rapid detection of rifampicin and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis by high-resolution melting analysis. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4): 1047-54.

17. Pang Y., Liu G., Wang Y., Zheng S., Zhao Y. Combining COLD-PCR and high-resolution melt analysis for rapid detection of low-level, rifampin-resistant mutations in Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Meth. 2013; 93: 32-6.

18. Yadav R., Sethi S., Mewara A., Dhatwalia S., Gupta D., Sharma M. Rapid detection of rifampicin, isoniazid and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by high-resolution melting curve analysis. J. Appl. Microbiol. 2013.

19. Pietzka A. T., Indra A., Stoger A., Zeinzinger J., Konrad M., Hasen-berger P. et al. Rapid identification of multidrug-resistant Mycobac-terium tuberculosis isolates by rpoB gene scanning using high-resolution melting curve PCR analysis; Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 63: 1121-7.

20. da Silva J., Leite G., Bastos G., Lucas B., Shinohara D., Takinami J. et al. Plasmid-based controls to detect rpoB mutations in Mycobacterium tuberculosis by quantitative polymerase chain reaction-high-resolution melting. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 2013; 108(1): 106-9.

Поступила 16.01.14 Received 16.01.14