БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ КОРМОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
BIOLOGICAL PRESERVATION FOR VEGETABLE FORAGE AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, а именно к производству и консервированию кормов для крупного рогатого скота.
Основой развития животноводства является создание прочной кормовой базы для скота. Высокие темпы производства могут быть достигнуты не только за счет повышения урожайности кормовых культур, но и с помощью мероприятий по улучшению качества и снижению потери питательной ценности кормов в процессе их заготовки, переработки и длительного хранения. Положительный результат зависит от выбора эффективною способа консервирования зеленой массы. В зимний период основным сочным кормом является силос, который обеспечивает полноценное кормление, а также позволяет максимально повысить продуктивность животных. Одним из существенных недостатков заготовки такого вида корма являются значительные потери питательных веществ исходного сырья в процессе силосования, вызванные присутствием гнилостных бактерий и других нежелательных микроорганизмов. Полностью избежать этих потерь невозможно, но их можно значительно снизить за счет применяемых консервантов химического и биологического происхождения.
Известно применение органических кислот (муравьиной, пропионовой, молочной, уксусной) для консервирования трав и приготовления силоса. Однако они имеют ряд недостатков. При нарушении правил перевозки и хранен) я этих кислот (например, в неоцинкованной таре, при нарушении герметичности тары), а также при передозировании при внесении имеется опасность отравления животных. Полученный силос не является экологически чистым, может содержать сильно пахнущие компоненты, а применяемые химически препараты небезопасны для персонала.
При создании биологических консервантов для силосования зеленой массы производится целенаправленный отбор микроорганизмов которые обеспечивают за небольшой срок снижение рН силосуемой массы до необходим ого (4,2-4,3) ед. рН значения в течение 2-3 суток в результате молочнокислою брожения. Та же они ингибируют развитие нежелательной микрофлоры. Учитывая, что силосуемые травы используются в качестве корма сельскохозяйственных животных, входящие в состав заквасок микроорганизмы должны обладать пробиотическими свойствами.
Близкими техническими решениями являются: закваски на основе лактобактерий (патент на изобретение RU 2168909 C1 «Штамм бактерий Lactobacillus plantarum для силосования кормов»; опубликован: 20.06.2001 Бюл. №17), закваски на основе ассоциации штаммов молочнокислых бактерий (патент на изобретение RU 265655С2 «Способ получения закваски для силосования кормов»; опубликован: 10.12.2005 бюл. №34), биоконсервант на основе смеси штаммов бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum и Propionibacterium acidipropionici (патент на изобретение  «Новый биоконсервант для силосования кормов и способ его получения»; опубликован: 19.02.2018 Бюл. №5). Основным недостатком всех перечисленных биопрепаратов является то, что они недостаточно эффективны при уборке многолетних бобовых, бобово-злаковых трав, а также однолетних вико-овсяных травосмесей. Эти травы в настоящее время преобладают в общей системе возделывания кормовых культур; однако из-за наличия в их составе плохогидролизуемых полимеров относятся к трудносилосуемым культурам.
Целью настоящего изобретения является разработка биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур (однолетних и многолетних бобовых и злаковых).
В качестве прототипа использована композиция препаратов, представленная в патенте на изобретение RU 2705002 C2 «Композиция для получения высококачественных кормов из козлятника восточного и бобово-злаковых смесей на его основе» (опубликован: 01.11.2019 Бюл. №31). Предлагаемая композиция по патенту обеспечивает получение высококачественных объемистых кормов за счет повышения степени использования плохогидролизуемых полимеров консервируемого сырья в результате предварительного использования полиферментного препарата «Феркон», который содержит комплекс ферментов, подобранных с учетом особенностей углеводного состава многолетних бобовых трав. Это обеспечивает ферментацию сложных полисахаридов до моносахаров, необходимых для образования молочной кислоты. На следующем этапе предполагается применять бактериальные закваски, в состав которых включены молочнокислые бактерии. Таким образом, ферменты обеспечивают частичный гидролиз сложных трудноперевариваемых углеводов: целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых веществ, до глюкозы, а бактериальные молочнокислые культуры обеспечивают ее последующее быстрое и полное превращение в молочную кислоту. При этом силосуемая масса подкисляется до необходимою уровня и полученный корм сохраняется лучше.
Недостатком предлагаемой композиции является двукратное (раздельное) внесение препаратов, входящих в ее состав, что увеличивает трудозатраты при применении данной технологии получения силоса.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур (однолетних и многолетних бобовых и злаковых), с высокой антагонистической активностью, обеспечивающего подавление гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов, при внесении биопрепарата в силосуемую массу и пробиотическими свойствами.
3
Поставленная задача решается путем создания комплексного биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур, содержащего 3 части смешанных в соотношении 1:1 жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 с конечной концентрацией не 1енее 1,0⋅109 КОЕ/см и одной части полиферментного препарата.
Включение в состав штамма Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747 определяется тем, что эти микроорганизмы осуществляют гомоферментное молочнокислое брожение, то есть они образуют в основном молочную кислоту, которая составляет не менее 90% в их продуктах брожения. За счет этого они обеспечивают быстрое снижение рΗ до (3-5) ед. рН, что подавляет рост других бактерий, которые не могут развиваться в такой кислой среде. Выбор штамма Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ 3-11839 был обусловлен его пробиотическими свойствами.
3
3
3
Учитывая это, были отобраны штаммы Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747 и Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839, не относящиеся к микроорганизмам, патогенным для человека и животных, согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Для повышения эффективности предлагаемо о препарата, особенно для консервирования трудносилосуемых кормовых культур в его состав включен полиферментный комплекс, содержащий целлюлазу (активность не менее 400 ед/см), ксиланазу (активность не менее 1700 ед/см) и пектин-лиазу (активность не менее 5000 ед/см).
Приготовление биопрепарата для консервирования растительных кормов осуществлялось следующим образом.
3
Для приготовления микробных культур лактобактерий использовали жидкую питательную лактозно-мелассную среду состава, г/дм:
3
меласса - 15,0 см;
лактоза - 5,0;
3
кукурузный экстракт - 5,0 см;
дрожжевой экстракт - 2,5;
FeSO4⋅7Η2Ο - 0,05;
MnSO4⋅4Н2О - 0,05;
ацетат натрия - 5,0;
KH2PO4 - 1,8;
3
дистиллированная вода до 1,0 дм.
3
3
3
Выращивание культур, входящих в состав биопрепарата, осуществляли в указанной жидкой питательной среде в бутылях емкостью 20,0 дм. Объем жидкой питательной среды составлял 12,0 дм. В качестве посевного материала использовали смесь культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, выращенных на плотной питательной среде MRS-4. Продолжительность культивирования составляла (48±1) часов при температуре (37±1)°С без аэрации. Для создания анаэробных условий содержимое бутылей после посева продували аргоном. Культивирование лактобацилл в жидкой питательной среде обеспечивало концентрацию живых микроорганизмов не менее 4,0⋅109 КОЕ/см. На следующем этапе в аппарате-смесителе смешивали 3 части жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 (в соотношении 1:1) и одну часть полиферментного комплекса. Полученную смесь перемешивали в течение 20 миг гг.
Полученная готовая форма биопрепарата должна соответствовать следующим показателям:
- внешний вид и цвет - жидкость от светло-серого до серого цвета;
3
- содержание жизнеспособных микробных клеток - не менее 1,0⋅109 КОЕ/см;
3
- допустимое содержание посторонней микрофлоры - нe более 1,0⋅103 КОЕ/см; не допускается наличие колиформных бактерий и плесневых гриб ив;
- водородный показатель - (4,0±0,5) ед. рН.
В ходе проведения исследований проводилась оценка кислотообразующих свойств лактобацилл.
3
3
3
В колбы к 250,0 см лактозо-мелассной среды вносили 15,0 см приготовленного биопрепарата. Перед началом исследований производили измерение рΗ до внесения культуры, затем сразу после внесения. Посевы инкубировал; в течение (48±1) часов при (37±1)°С, измеряли значения рН через каждые 8 часов и делали высевы на плотную питательную среду MRS-4 для определения биологической кон нитрации на первые и вторые сутки инкубации. Кислотность среды при выращивании лактобацилл определяли по концентрации ионов водорода. Для этого пробу культуральной жидкости наливали в стаканчик емкостью 25,0 см и опускали в него стеклянный электрод рН-метра. После того как значение стабилизировалось (примерно 30 секунд) снимали показания прибора.
3
3
3
3
3
3
Кроме того, определяли активность кислотообразования лактобактерий согласно ОФС.1.7.2.0009.15. Для этого по 2,5 см регидратированных рабочих культур лактобактерий вносили в колбы вместимостью 50,0 см, содержащие 25,0 см стерильной питательной среды MRS-1. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (37±1)°С и инкубировали в течение (24±1) часов. После окончания выращивания содержимое колб перемешивали, и пробу каждого штамма в объеме 10,0 см переносили в отдельную коническую колбу объемом 100,0 см, интенсивно встряхивали для равномерного перемешивания содержимого и добавляли 2-3 капли 1% раствора фенолфталеина. Полученную суспензию титровали 0,1 Μ раствором натрия гидроксида до появления стойкого розового окрашивания и достижения рН (8,5±0,1) ед. рН, которое контролировали потенциометрически, при этом учитывали количество см 0,1 Μ раствора натрия гидроксида, пошедшей на титрование. Кислотность выражали в градусах Тернера (оТ) и вычисляли по формуле:
где:
3
3
А - количество см 0,1 Μ раствора натрия гидроксида, прошедшего на титрование 10,0 см исследуемой микробной суспензии;
3
К - поправка к титру 0,1 Μ раствора натрия гидроксида 10 - объем микробной суспензии, см.
Результаты определения кислотности среды при выращивании лактобактерий представлены в таблице 1.
Полученные результаты показали, что изучаемые штаммы лактобактерий обладают способностью активно закислять среду, что обеспечит подавление маслянокислых и других гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов при силосовании.
Также была определена активность кислотообразования лактобактерий методом кислотно-основного титрования в градусах Тернера. Полученные данные представлены в таблице 2,
Полученные результаты подтвердили, что все изучаемые штаммы лактобактерий обладают высокой активностью кислотообразования.
Была проведена и оценка антагонистической активности биопрепарата.
3
3
Оценку антагонистической активности лактобактерий осуществляли с использованием двухслойной методики по Фредерику. Для этого на чашку с потной питательной средой MRS-4 с помощью бактериологической петли наносили 0 01 см суточной бульонной культуры лактобактерий, выращенной на жидкой питатетельной среде MRS-1. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение (24-4 4) часов. Для лизиса клеток лактобацилл, выросших на питательной среде, на крышку перевернутой чашки Петри помещали фильтровальную бумагу, наливали 1,0 см хлороформа и экспонировали в течение 30 минут, далее чашку проветривали в течение (3-5) мин.
3
В качестве индикаторных культур использовали  клинических культур различных видов, в большинстве своем резистентных к различному набору антибиотиков, находящихся в коллекции микроорганизмов ФБУН ΓΗД ПМБ, Оболенск, Россия. Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых оценивали антагонистическую активность, в течение суток подращивали в мясопептонном бульоне, затем добавляли по 0.5 см3 к 2,5 см расплавленного и охлажденного до температуры (56±1)°С мясопептонного полужидкого агара, быстро перемешивали и выливали на поверхность чашек с колониями лактобацилл. Наклоняя чашку из стороны в сторону, равномерно распределяли полужидкий агар по поверхности питательной среды MRS-4. Затем посевы инкубировали в течение (24±1) ч при температуре (37±1)°С. Антагонистическая активность проявлялась образованием зон ингибирования роста тест-штаммов вокруг колоний лактобацилл.
Уровень антагонистической активности оценивали по следующим критериям: нулевая - при ширине зоны отсутствия роста до 1,0 мм, низкая - (1,1-,9) мм, средняя - (5,0-8,9) мм, высокая - 9,0 мм и более.
Оценку антагонистической активности исследуемых культур лактобактерий (Lactobacillus plantarum ПЛ-99, Lactobacillus buchneri БХ-99) осуществляли в условиях in vitro совместно с ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск. Полученные данные представлены в таблице 3. Антагонистическая активность лактобактерий обеспечивает подавление гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов, при внесении биопрепарата в силосуемую массу.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что штаммы: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 и их смесь, выращенные на среде MRS-4 и изученные по методике Фредерика обладают высокой антагонистической активностью в отношении всех культур индикаторных штаммов.
Была произведена оценка совместимости лактобацилл с полиферментным препаратом.
3
3
Для определения совместимости штаммов лактобацилл L. plantarum ПЛ-99, L. buchneri БХ-99) с полиферментным препаратом «Биоферм» проводили смешение в соотношении: 3 части культуры (75,0 см) и 1 часть фермента (25,0 см). Смеси хранили при температуре (22±2)°С и (4±2)°С. Проводили высевы на плотную питательную среду MRS-4 для определения биологической концентрации лактобацилл сразу после смешения, на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки.
Критерием отсутствия влияния полиферментного препарата служил показатель выживаемости смеси лактобактерий при хранении при различных температурных режимах в течение 30 суток. Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5.
На основании полученных результатов можно сделать заключение, что компоненты полиферментного препарата не вызывают значительно о снижения концентрации лактобактерий.
Опыты по определению эффективности консервирования с использованием разработанного биологического препарата в отношении различных видов трав, в том числе трудносилосуемых, проводили в лабораторных условиях. Лабораторный метод позволяет проводить многовариантные исследования. Опыты были заложены и проводились в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению опытов по консервированию и хранению объемистых кормов». Силос заготавливается из клевера лугового, относящегося к трудносилосуемым культурам, а так же люцерны, бобово-злаковой смеси.
3
Исходную зеленую массу измельчали до размера резки (1-2) см, обрабатывали консервантом из расчета 40,0 см на 1 т зеленой массы в соответствии с «Инструкция по применению универсального биологического препарата для к «сервирования растительных кормов» и закладывали (уплотняя) в предварительно подготовленные емкости, а затем тщательно утрамбовывали. Для закладки силоса были использованы стеклянные бутыли емкостью 0,5 дм3, оборудованные приспособлением для отведения газов брожения, выделяемых при силосовании. Используемые емкости удобны; ля заполнения и герметизации силосуемой массы. По окончании опытного периода определял ι кислотность силоса (ед. рН), содержание аммиака, количество кислот: молочной, уксусной, масляной, суммарное количество других кислот, а также содержание молочной кислоты от общей суммы кислот. Результаты проведенных испытаний представлены в таблице 6.
Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что в результате внесения в силосуемую массу разработанного биопрепарата происходит закисление всех видов исследуемых трав до величины рН (3,77-4,04) ед. рН за счет молочной кислоты, содержание которой составляет (88,53-93,65) % от суммы всех кислот.
Для оценки эффективности разработанного биологического препарата на базе Кировской лугоболотной опытной станции были проведены полевые испытания по определению консервирующей способности. Силос был заготовлен из свежескошенной и провяленной массы многолетних злаковых трав. Исходную зеленую массу измельчали до размеров резки (2-3) см и закладывали в предварительно подготовленную траншею. Силосуемую массу в траншее укладывали ровными слоями по всей длине траншеи уплотнение закладываемой массы проводили в течение всего процесса заполнения траншеи, после чего силосохранилище немедленно укрывали полиэтиленовой пленкой и прижимали ее по всей поверхности грузом. Для сохранения качества приготовленного корма соблюдались правила, которые затрудняли проникновение воздуха и прежде всего не нарушалась монолитность корма в той его части, которая в этот день не будет использована. После выемки дневной порции корма срез силоса прикрывался газонепроницаемым пологом. Для силосования растительных кормов использовали экспериментальный образец закваски на основе штаммов Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, а также полиферментного комплекса, содержащего целлюлазу, ксиланазу, пектин-лиазу. Общая активность ферментов составляет не менее 1700 ед./г.
3
3
3
Для силосования растительной массе 1,0 дм биопрепарата разводили в 24 дмводопроводной воды и после тщательно перемешивания внос ι ли в силосуемую массу. При таком способе приготовления на 1 тонну силосуемой массы приходится 1,0 дм рабочего раствора.
Оценку изменения рН в силосуемой массу проводили через один месяц после закладки и через 7 месяцев - на момент вскрытия траншеи. Результаты оценки изменения рН представлены в таблице 7.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в результате внесения разрабатываемого препарата в силосуемую массу происходило закисление корма за счет молочной и уксусной кислот. Среднесуточные надои молока при использовании этого силоса составили 24,1 кг/сутки от коровы при среднем аналогичном показателе по Кировской области 21,8 кг/сутки.
3
3
3
Также были определены потребительские свойства заявляемого биопрепарата Анализ результатов теоретической оценки показателя минимальной эффективной дозы молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающей силосование трав, свидетельствует о том, что эта величина составляет не менее 1,0⋅104 КОЕ в 1 г силосуемой массы. Для оценки минимальной эффективной дозы в одном см разработанного препарата был произведен расчет этой величины с учетом разбавления конечного продукта перед его применением. Величина минимально эффективной дозы микроорганизмов в 1,0 см закваски для силосования с учетом того, что на одну тонну зеленой массы наносят 40 см биопрепарата составляет по формуле:
Таким образом, установлено, что минимальная концентрация лактобактерий в разрабатываемом препарате для силосования трав должна быть не менее 2,5⋅108 живых микробных клеток. В свежеприготовленном продукте это значение в 40 раз больше.
Оценку изменения минимальной эффективной кон нитрации микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата, осуществляли при хранении при температуре (4±2)°С и (24±2)°С. С этой целью оценивали показатель КОЕ, который оп оделяли через 1, 3 и 6 месяцев хранения. Результаты исследований представлены в таблицах 8 и 9.
Полученные результаты показали, что при температуре хранения (4±2)°С концентрация лактобактерий через 6 месяцев остается выше минимальной эффективной концентрации, тогда как при температуре (24±2)°С концентрация лактобактерий соответствует минимально эффективной только в течение 3 месяцев в хранения.
Исходя из полученных результатов режим хранения готового универсального биопрепарата для консервирования растительных кормов - 6 месяцев при температуре (4±2)°С.