СПОСОБ АСЕПТИЧЕСКОГО ПРОЛОНГИРОВАННОГО ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВКИ АЛЛОГЕННЫХ ИМПЛАНТАТОВ, ДОНОРСКИХ ТКАНЕЙ, НА ПРИМЕРЕ ДОНОРСКОЙ РОГОВИЦЫ, В СПЕЦИАЛЬНОМ КОНТЕЙНЕРЕ С НАНОМОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ
METHOD FOR ASEPTIC PROLONGED STORAGE AND TRANSPORTATION OF ALLOGENIC IMPLANTS, DONOR TISSUES, USING AN EXAMPLE OF A DONOR CORNEA, IN A SPECIAL CONTAINER WITH NANOMODIFIED SURFACE

Изобретение относится к области медицины, а именно, асептического хранения донорских материалов, аллогенных имплантатов и может быть использовано для увеличения срока их качественного хранения и безопасной транспортировки, на примере донорской роговицы, потому что роговица глазного яблока представляет собой уникальную живую ткань, как и само глазное яблоко, происходящее и развивающееся из 3-х эмбриональных листков: эктодермального, мезодермального и эндодермального. Потому разработка способа хранения и транспортировки, на примере донорской роговицы, может быть универсальным способом хранения и транспортировки для других живых тканей.
Предложенный способ хранения донорской роговицы в начале 70-х (Summerlin W.T., Miller G.E., Harris J.E., Good R.A. "The organ-cultured cornea in an vitro study." Invest. Ophthalmol. 1973, 12, 176-80) постепенно модифицировался и совершенствовался. Так в Америке предпочтение отдавалось хранению донорской роговицы при низких температурах, а в Европе - хранению донорской роговицы в питательных средах. Питательная среда, компоненты которой непременно меняются по мере хранения в ней донорской роговицы из-за непрерывно протекающих метаболических процессов в ткани роговицы, должна периодически, через 3-5 дней заменяться свежей. К тому же питательная среда должна содержать множество компонентов для поддержания жизнеспособности донорской ткани для сохранения ее жизнеспособности (белки, жиры, гормоны, факторы роста, микроэлементы в строго определенных соотношениях), которая также может стать и источником чужеродного белка, адсорбируемого роговицей.
Известен способ хранения донорской роговицы в питательной среде, включающей добавление 2% эмбриональной бычьей сыворотки к физиологическому буферному раствору, продлевающее период стабильности клеток донорской роговицы. Однако стабильность клеток донорской роговицы, их количество остаются неизменными при таком способе хранения не более чем в течение первых 2-х недель, на протяжении последующих 2-х недель хранения таким способом, до 50% и более донорских роговиц выбраковываются. «Organ-culture preservation of human corneas». Pels E, Schuchard Y Doc Ophthalmol. 1983 Dec 15; 56(1-2): 147-53; "Cornea organ culture: effect of serum anda stabilized form of L-glutamine." M.G. Ayoubi, W.J. Armitage, D.L. Easty British Journal of Ophthalmology, 1996, 80, 740-44. Итак, способ хранения донорской роговицы, предложенный Бристольским глазным банком более 30 лет тому назад, практикуется по сей день. За этот период произошли значительные изменения в мире, науке и технике: появились новые прорывные технологии, новые дисциплины, новые материалы и даже открытия в анатомии роговицы, а значит - и ее физиологии. Установлено существование еще одного слоя роговицы, слой Дюа, названный в честь ученого Harminder Dua из Nottingham University в 2013 году, что, конечно, вносит коррективы в представления о физиологии человеческого глаза и его структур. А способ хранения остается прежним и используется более, чем 70% европейских банков, как «классический»
Наиболее близким к предложенному является способ хранения трансплантата, как обеспечивающий защиту консервируемых тканей от деформации, это US 20110281352 A1 Transplant Storage (Nov, 17, 2011) Sten Raeder, Tor Paaske Utheim, который предусматривает комплект приспособлений для хранения клеток или тканей и использования комплекса мер и различных поддерживающих метаболизм сред для хранения клеток или тканей, таких как для трансплантации или имплантации. Настоящее изобретение также относится к способу хранения клеток или тканей, включая лимбальные эпителиальные клетки, клетки конъюнктивы, эндотелиальные клетки роговицы, клетки сетчатки, клетки слизистой оболочки, эпидермальные клетки (т.е. кожи), или клетки костного мозга. Это изобретение также относится к способу предоставления лимбальных эксплантатов.
В результате исследований, проведенных Julie Albon, Andrew В. Tullo, "Apoptosis in the Endothelium of Human Corneas for Transplantation "Investigative Ophthalmology and Visual Science September 2000, Vol. 41, 2887-2893 было установлено, что потеря эндотелиальных клеток донорской роговицы в течение хранения происходит в результате апоптоза клеток и количество апоптически измененных клеток и их скопление в эндотелиальном слое соответствует складчатости донорской роговицы. Степень апоптоза зависит от возраста донора и в меньшей мере - от времени хранения донорской роговицы. Деформация роговицы и нарастающее натяжение ее структур стимулирует механические разрывы между клетками и отрывы клеток от клеточной матрицы.
Результаты исследований, проведенных в Российском онкологическом центре им. Н.Н. Блохина, выявили, что живые клетки обладают способностью ощущать кривизну поверхности, причем величина микронеровностей, на которые реагирует клетка, может быть ничтожна по сравнению с размерами самой клетки; более того, форма и функциональная активность клетки определяется рельефом поверхности, то есть, состоянием внеклеточного матрикса «How Cells Orient Themselves)) (Ровенский Ю.А., 2001). При утрате клеткой контактов с внеклеточным матриксом прерывается цепь передачи сигналов внутрь клетки, и такие клетки могут подвергаться генетически запрограммированному самоубийству - апостозу «Генетически запрограммированная смерть клетки (Агол В.И., 1996)
Упомянутый выше, более современный способ, предложенный Sten Raeder, Tor Paaske Utheim в 2011 году более эффективен для клеточных технологий и, требуя больших материальных затрат, не обеспечивает условий длительного хранения жизнеспособных тканей.
Прототипом предложенного способа является «Способ асептического хранения и транспортировки контактных и интраокулярных линз» Российский Патент RU01- /N/184 2391 от 25.02.99 Patent RU/2120807, 27.10.1998, включающий помещение контактных и интраокулярных линз в тару, внутренняя поверхность которой предварительно обработана нанесением углеродсодержащей пленки. Этот способ был первым предложением, использовавшим нанотехнологии с целью получения наномодифицированных с заданными свойствами полимерных поверхностей.
Однако прототип может решать вопрос асептического хранения искусственных материалов, но не решает проблем хранения и транспортировки жизнеспособных тканей, донорских тканей, различных аллогенных трансплантатов
Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым результатом существует причинно-следственная связь, а именно, предлагаемый нами способ направлен на решение проблем, связанных с исключением какой-либо деформации консервируемых жизнеспособных тканей, ведущей к структурным изменениям ткани, например, донорской роговицы при ее хранении и транспортировке, на достижение более длительного и качественного хранения донорской роговицы в условиях содержания в специальном контейнере - таре с наномодифицированной поверхностью. Способ, не требующий замены консервирующей среды, гарантирующий, помимо бандажных, асептических и бактерицидных свойств консервации, биосовместимость консервируемых тканей.
Т.е., в результате реализации этого способа не требуется периодической замены консервирующей среды; замена среды сама по себе является причиной клеточного стресса консервируемых тканей; способ направлен на уменьшение числа непригодных донорских роговиц (выбраковываемых по мере хранения) и повышение результатов для их последующей успешной имплантации и приживления биосовместимого трансплантата.
Вышеуказанный результат достигается тем, что в способе асептического пролонгированного хранения аллогенных имплантатов, донорских тканей, например: донорской роговицы, во флаконе с консервирующим буферным раствором с добавлением нанокластеров серебра, в отличие от способа по прототипу, донорская роговица предварительно помещается в специальный контейнер - тару, изготовленную из полимера, по форме соответствующую корнеосклеральной контактной линзе, в виде сферического сегмента, перфорированной и имеющей следующие размеры тары: диаметр 18 мм, толщина 0,3 мм, радиус кривизны 8,8 мм в центре, высота сферического сегмента 5,8-6,2 мм; торсионный край тары расплющен по всей окружности тары и имеет ширину 4 мм (по 2 мм снаружи и внутрь для формирования паза с внутренней поверхностью тары, куда укладывается край донорской роговицы; наружный выступ торсионного края контейнера, прошивается ниткой 5/0 Mersilk (Ethicon, ААН, Bristol, UK), после чего тара помещается в цилиндрический флакон объемом 120 мл с консервирующей средой, равной 100 мл. Поверхность специального контейнера - тары наномодифицирована и имеет эмпирически асферическую форму с величиной угла по всей поверхности не менее 164 градусов, такая форма кривизны поверхности обеспечивает физиологическую миграцию клеток роговицы. Необходимость строгого соблюдения формы и рельефа поверхности тары, определяется формой консервируемого материала, для выполнения бандажной функции, во избежание какой-либо ее деформации, что не упоминалось ни в одном из исследований и предложений ранее.
Обработка поверхности специального контейнера из высокомолекулярных полимерных материалов производится с использованием традиционного оборудования с планетарно вращающимися плитами, предназначенными для крепления предметов, поверхности которых наноструктурируются посредством обработки поверхности потоками ионов химически активных и/или инертных газов с последующим наномодифицированием сформированной развитой поверхности нанесением углеродсодержащих пленок: алмазоподобные, карбин, фуллерен, нанотрубы содержащие, которые могут быть комбинированными (однослойными, многослойными, монофазными, гетерофазными Для изготовления тар могут быть использованы различные полимеры: полиэтилентерефталат (PET), политетрафторэтилен (PTFE), поливинилиденфторид (PVDF). Однородность пленок составляет 95%. Варьирую методы обработки поверхности (химические, физические, электрохимические способы наномодификации поверхности), можно получить комбинированные углеродсодержащие нанопокрытия поверхностей с заданными параметрами, а значит - определенными свойствами поверхности: инертность, атомная структура, заряд на поверхности, ее рельеф, обеспечивающие такие заданные свойства поверхности как: асептические, бактерицидные свойства, биосовместимость наномодифицированной поверхности к ткани хранящейся в такой таре.
Химическая стойкость и заданные свойства наномодифицированной поверхности обеспечивают безопасность для донорских тканей и/или аллогенных имплантов при непосредственном контакте с ними. Электростатические свойства нанопокрытий таковы, что могут создавать в жидкости (в данном случае - в буферном растворе) слабую катионическую среду, которая исключает существование каких-либо контаминаций в ней.
Предпочтительно использовать пленки, толщина которых составляет от 0,01 до 1 мкм. В качестве материала для изготовления контейнера для хранения аллогенных имплантов и донорских тканей могут быть использованы полимеры с высокой адгезией на их поверхности углеродсодержащих нанопленок. Наноструктуризация полимерной поверхности и последующая ее наномодификация проводится общеизвестными способами нанотехнологий
Способ может быть иллюстрирован примерами.
Пример 1.
В специальные контейнеры - тары, по форме соответствующие корнеосклеральной контактной линзе, изготовленной из поливинилиденфлюорида (ПВДФ), поверхность которого наномодифицирована, перфорирована и имеет размеры: диаметр 18 мм, толщина 0,3 мм, радиус кривизны 8,8 в центре, сагиттальной высотой в 5,8-6,2 мм, поместили 8 донорских роговиц, иссеченных с 3-4 мм склеральным ободком. Подготовленные и помещенные таким образом донорские роговицы в специальных тарах затем поместили в цилиндрические флаконы объемом 120 мм со стерильным буферным раствором 100 мм, содержащим нанокластеры серебра. Стерильно закрытые флаконы помести в шкафы для хранения при температуре 15-17 градусов С.
После 20 дней хранения донорские роговицы, хранившиеся в специальных контейнерах с консервирующими средами, сохраняли структурность роговичной ткани и плотность эндотелиальных клеток, т.е., оставались жизнеспособными.
Пример 2.
После 8 дней хранения донорских роговиц по примеру 1, 7 донорских роговиц с удаленным эпителиальным слоем были помещены в плазму донорской крови реципиента. Через 4-5 суток после хранения донорских роговиц в специальных контейнерах помещенных в плазму реципиента, биомикроскопия донорской роговицы показала процесс ее эпитализации и сохранность эндотелиальных клеток на 4 донорских роговицах, на 3 других донорских роговицах эпитализация роговицы была неполноценной. Это расценивалось как биосовместимость первых 4-х донорских роговиц к тканям будущего реципиента и несовместимость других 3-х донорских роговиц к тканям того же реципиента.