СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА СТР-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ ГОРМОНА РОСТА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

1. Полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный карбоксиконцевым пептидом (CTP) человеческого хорионического гонадотропина, причем указанный полипептид состоит из двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу hGH и одного CTP, присоединенного к аминоконцу hGH, при этом аминокислотная последовательность указанного полипептида представлена в SEQ ID NO: 7, и при этом CTP-модифицированный полипептид hGH содержит гликозилирование в положении между 13-м и 18-м сайтами О-гликозилирования.
2. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по п.1, отличающийся тем, что указанное гликозилирование происходит на CTP-единицах, и гликозилирование у hGH отсутствует.
3. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждый CTP содержит 4, 5 или 6 O-гликанов.
4. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гликозилирование указанных CTP-единиц содержит по меньшей мере 15 O-гликанов.
5. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH содержит O-гликозилирование остатков 10, 13, 15, 21, 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262 и 268 последовательности SEQ ID NO: 7.
6. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по п.5, отличающийся тем, что профиль указанного гликозилирования человеческого CTP-модифицированного полипептида hGH дополнительно включает O-гликозилирование одного или двух остатков, выбранных из аминокислотных остатков 1-4, одного или двух остатков, выбранных из аминокислотных остатков 220-223, одного или двух остатков, выбранных из аминокислотных остатков 248-251 в последовательности SEQ ID NO: 7, или их комбинации.
7. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что O-гликановые структуры содержат сиалилированные структуры остова.
8. Человеческий CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гликозилирование в каждом из указанных сайтов О-гликозилирования содержит структуру гликанового остова, выбранную из группы, включающей моносилиалированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc), нейтральный остов 1 (Galβ1-3GalNAc), моносилиалированный остов 1 (Neu5Acα2-6(Galβ1-3) GalNAc) или дисилиалированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc),
9. Композиция, содержащая CTP-модифицированный полипептид hGH по любому из предшествующих пунктов, и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Композиция по п. 9, отличающаяся тем, что по меньшей мере около 90% CTP-модифицированных полипептидов hGH, присутствующих в композиции, гликозилированы путем присоединения О-гликанов между 13 и 18 положением.
11. Композиция по любому из пп. 9-10, отличающаяся тем, что наиболее богатая О-гликанами форма гликозилированного CTP-модифицированного полипептида hGH, присутствующая в композиции, содержит 15 O-гликанов.
12. Композиция по любому из пп. 9-11, отличающаяся тем, что по меньшей мере около 60% CTP-модифицированных полипептидов hGH, присутствующих в композиции, являются сиалилированными.
13. Композиция по любому из пп. 9-12, отличающаяся тем, что CTP-модифицированный полипептид hGH, присутствующий в композиции, содержит O-гликановую структуру с моносилиалированным остовом 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc).
14. Композиция по любому из пп. 10-13, отличающаяся тем, что основной O-гликан в композиции представляет собой моносилиалированный остов 1 (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc).
15. Композиция по любому из пп. 12-14, отличающаяся тем, что основная сиаловая кислота в композиции представляет собой Neu5Ac.
16. Композиция по любому из пп. 9-15, имеющая одну или более следующих характеристик:
i. менее или равно 100 нг/мг (ppm - частей на миллион)) белков клетки-хозяина;
ii. менее или равно 10 пг/мг ДНК;
iii. менее 50 нг/мл метотрексата;
iv. менее или равно 60 мкг/мл пропиленгликоля;
v. менее или равно 2,5 мкг/мл Тритона;
vi. менее или равно 115 пг/мл инсулина;
vii. менее 250 мкг/мл ДМСО; или
viii. менее или равно 10 КОЕ/10 мл в анализе микробиологической нагрузки.
17. Полипептид гормона роста человека (hGH), модифицированный человеческим карбокси-концевым пептидом (CTP) по любому из пп. 1-8 или композиция по любому из пп. 9-16, изготовленные при помощи способа, включающего стадии:
(a) стабильного трансфицирования заданного количества клеток при помощи вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, которая кодирует указанный CTP-модифицированный hGH; при этом указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH;
(b) получения клеточных клонов, которые сверхэкспрессируют указанный CTP-модифицированный hGH;
(c) размножения указанных клонов в растворе до заданной величины;
(d) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;
(e) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и,
(f) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора для того, чтобы получить очищенный белковый раствор, имеющий желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH;
при этом указанный полипептид состоит из двух CTP, присоединенных к карбоксильному концу hGH и одного CTP, присоединенного к аминоконцу hGH, и при этом указанный изготовленный CTP-модифицированный hGH содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.
18. Способ получения полипептида гормона роста человека (hGH), модифицированного карбоксиконцевым пептидом (CTP) человеческого хорионического гонадотропина по любому из пп. 1-8 или композиции по любому из пп. 9-16, включающий стадии:
(a) стабильного трансфицирования заданного количества клеток при помощи вектора экспрессии, содержащего кодирующую часть, которая кодирует указанный CTP-модифицированный hGH; причем указанная трансфицированная клетка экспрессирует и секретирует указанный CTP-модифицированный hGH;
(b) получения клеточных клонов, которые сверхэкспрессируют указанный CTP-модифицированный hGH;
(c) размножение указанных клонов в растворе до заданной величины;
(d) сбора указанного раствора, содержащего указанные клоны;
(e) фильтрования указанного раствора, содержащего указанные клоны, для получения отфильтрованного собранного раствора; и,
(f) очистки указанного отфильтрованного собранного раствора для того, чтобы получить очищенный белковый раствор, имеющий желаемую концентрацию CTP-модифицированного hGH;
тем самым изготавливая CTP-модифицированный hGH, причем аминокислотная последовательность изготовленного CTP-модифицированного hGH представлена в SEQ ID NO: 7.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная очистка (стадия f) указанного отфильтрованного собранного продукта включает последовательное выполнение следующих стадий, включающих:
(l) концентрирование и диафильтрацию указанного отфильтрованного собранного раствора;
(m) получение указанного отфильтрованного собранного продукта, полученного на стадии (g), и инактивацию вирусов, присутствующих в указанном отфильтрованном собранном продукте, путем инкубации в растворе, токсичном для указанных вирусов;
(n) получение указанного отфильтрованного собранного раствора со стадии (h) и очистка указанного отфильтрованного собранного раствора,
i. причем указанную очистку осуществляют путем последовательного пропускания указанного отфильтрованного собранного раствора через анионообменную колонку и колонку гидрофобного взаимодействия, после чего следует стадия концентрирования и диафильтрации,
ii. при этом после указанной очистки следует последовательное пропускание указанного отфильтрованного собранного раствора через колонку смешанного режима с гидроксиапатитом и катионообменную колонку;
(o) получение указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (ii) и физическое отделение указанного отфильтрованного собранного раствора от вирусов путем нанофильтрации;
(p) получение указанного отфильтрованного собранного раствора после стадии (j), и концентрирование и диафильтрацию указанного отфильтрованного собранного раствора для получения максимально очищенного отфильтрованного собранного продукта, содержащего указанный CTP-модифицированный hGH.