СПОСОБ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В СКАФФОЛД
METHOD OF DELIVERING BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES TO SCAFFOLD

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, биомедицинских исследованиях, клеточной биотехнологии и биоинженерии.
Важнейшей задачей тканевой инженерии является включение биоактивных веществ в структуру скаффолда для их постепенного высвобождения в процессе биорезорбции материала или регенерации ткани, восстанавливаемой с использованием скаффолда. Существует способ инкапсуляции ростовых факторов в системы лекарственной доставки, одной из которых являются липосомы. Аналогом предлагаемого изобретения может быть использование липосом в качестве контейнеров для переноса факторов роста (Monteiro N, Martins A, Reis RL, Neves NM. 2014 Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. J. R. Soc. Interface 11: 20140459. http://dx.doi.org/10.1098/rsif.2014.0459).
Однако этот способ достаточно сложен, требует соответствующего оборудования и, кроме того, существуют определенные ограничения инкапсулирования молекул в липосомы, такие как тип биоактивного агента, его конкретные физико-химические свойства и свойства самих липосом.
Системы доставки, как и сами скаффолды, должны иметь регулируемую скорость биодеградации, отсутствие токсичности и отрицательного влияния на структуру и биологические свойства клеток.
В качестве прототипа выбран способ, включающий использование в качестве контейнеров тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде (SU 1718955 A1. Способ включения водорастворимого препарата в тени эритроцитов, Ж.Ш. Жумадилов, Т.П. Генинг, 15.03.92, Бюл. №10).
Однако способ имеет следующие недостатки. Заполненные тени эритроцитов вводятся внутривенно, поэтому направленного действия препаратов на культивированные клетки скаффолда не может происходить. Системное введение факторов роста обычно является малоэффективным, а иногда и опасным вследствие их короткого времени жизни, особенно в физиологических средах, неизбирательного биораспределения, потенциальной токсичности и риска канцерогенной активности.
Таким образом, включение биоактивных веществ в тени эритроцитов и размещение их в скаффолде решает несколько основных задач: локализованная доставка оптимальной концентрации ростовых факторов внутрь имплантата, сохранение биологической активности молекул, пролонгированное высвобождение веществ из теней эритроцитов. Кроме того, в прототипе в процессе создания теней эритроцитов высвобождается лишь часть гемоглобина, что снижает емкость теней для биологически активных веществ.
Задача предлагаемого изобретения - усовершенствование способа.
Технический результат - увеличение содержания в скаффолдах ростовых факторов, создание условий для их постепенного высвобождения из контейнеров и условий для их непосредственного влияния на культивируемые клетки. Использование теней эритроцитов в качестве контейнеров - носителей ростовых факторов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем использование в качестве контейнеров тени эритроцитов, получаемых путем гипоосмотического шока нативных эритроцитов и инкубации их в растворе биологически активных веществ с последующим «замыканием» теней эритроцитов в изотонической среде, с целью максимального выхода гемоглобина и увеличения емкости теней эритроцитов для биологически активных веществ, в процессе их приготовления перед инкубацией с этими веществами, тени эритроцитов помещают в гипертонический раствор, а с целью направленного влияния их содержимого на культивируемые клетки тени эритроцитов с инкапсулированными факторами помещают в структуру скаффолда в процессе ее формирования вместе с культивируемыми клетками.
Способ доставки биологически активных веществ в скаффолд осуществляют следующим образом. Используют 1.5 мл донорских эритроцитов для приготовления теней эритроцитов. Отмывают их физиологическим раствором 2 раза путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 5 мин. Затем, добавляя в отмытые эритроциты по 10 мл ледяной дистиллированной воды, осуществляют гипоосмотический шок, центрифугируют 25 минут при 8000 об./мин, надосадочную жидкость сливают. Осадок суспензируют с 10 мл гипертонического раствора хлорида натрия (4%) для дальнейшего удаления оставшегося в тенях эритроцитов гемоглобина, центрифугируют 10 минут при 8000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Полученные тени эритроцитов инкубируют с 4 мл раствора биологически активных веществ (например, смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов) и разбавленной ледяной дистиллированной водой 1:1 в течение 20 минут при 4°C. Для «замыкания» мембраны эритроцитов восстанавливают изотоничность среды, добавляя физиологический раствор, и инкубируют в течение 30 мин при 37 С. После этого центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Оставшиеся, заполненные биологически активными веществами, тени эритроцитов отмывают от находящейся вне теней биологически активных веществ, путем добавления 8 мл 0.6% хлористого натрия и центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляют. Для дальнейших исследований используют полученные тени эритроцитов с инкапсулированными биологически активными веществами.
Полученные тени эритроцитов с инкапсулированными в них биологически активными веществами использовали при оценке эффективности предложенного способа.
Пример 1
2
2
2
2
2
2
Проведены исследования, в которых изучали влияние теней эритроцитов с инкапсулированными ростовыми факторами на жизнеспособность и пролиферативную активность культуры дермальных фибробластов человека (ДФЧ). С этой целью к питательной ростовой среде (ДМЕМ с антибиотиками и глутамином) добавляли 10% от объема среды теней эритроцитов, включающих в себя смесь телячьей эмбриональной сыворотки и лизатом тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов. В качестве положительного контроля использовали культуральную среду ДМЕМ с добавлением 10% ТЭС, отрицательный контроль - ДМЕМ без сыворотки. Культуру ДФЧ, 3-й пассаж засевали с концентрацией 10 тыс.клеток на см поверхности в чашки Петри площадью 7 см в объеме 3 мл питательной среды ДМЕМ с антибиотиками и глутамином с 10% ТЭС. Через сутки, после адгезии и распластывания клеток среду в чашках заменяли на контрольную и опытную. За ростом культуры наблюдали в течение 5 дней, после чего клетки были сняты с чашек Петри с подсчетом их концентрации на 1 см поверхности. Было установлено, что число клеток в положительном контроле (с культуральной средой DMEM содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки) через 5 суток составляло 49,233 тыс./см, а в отрицательном контроле (DMEM без телячьей сыворотки) - 13,618 тыс./см. В опыте, в котором вместо телячьей сыворотки использовались тени эритроцитов (0,3 мл) с инкапсулированной смесью сыворотки и лизатом тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов, число клеток составляло 46,265 тыс./см. Жизнеспособность клеток и в контрольных, и в опытных образцах составляла 97-99%.
В результате эксперимента показано, что включенные в тени эритроцитов факторы роста оказывают положительное влияние на пролиферативную активность ДФЧ. С помощью предлагаемого способа удается стимулировать жизнеспособность и пролиферативную активность фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах.
Пример 2
Важнейшей задачей, решаемой с помощью предлагаемого способа, является постепенное высвобождение биологически активных веществ из контейнеров. В способе прототипа показано, что высвобождение антибиотиков из теней эритроцитов происходит постепенно при их внутривенном введении. Для проверки скорости высвобождения факторов роста из теней эритроцитов в условиях in vitro проведены следующие исследования. Тени эритроцитов, полученные описанным ранее способом, инкубировали с раствором 10% альбумина, разведенного 1: 1 дистиллированной водой. Заполненные ростовыми факторами тени эритроцитов, после их «замыкания» путем создания изотоничности среды, отмывали от находящейся вне теней альбумина, путем добавления физиологического раствора и центрифугирования 10 минут при 4000 об./мин, надосадочную жидкость удаляли. Добавляли 1 мл физиологического раствора, перемешивали и центрифугировали 10 минут при 4000 об./мин. Затем измеряли оптическую плотность супернатанта против физиологического раствора при длине волны 280 нм на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия). Установлено, что через сутки из теней эритроцитов высвобождается 54,5% инкапсулированного альбумина, через двое суток - 78%, через трое суток - 98%. Таким образом, данные исследования указывают на то, что в тени эритроцитов с помощью предполагаемого способа поступает белок - альбумин, который высвобождается из них постепенно.
Пример 3
3
2
Для проверки эффективности предлагаемого способа проведены следующие исследования. Описанным выше способом получали тени эритроцитов с инкапсуляцией в них биологически активных веществ - смеси сыворотки крови и лизата тромбоцитов с добавлением фактора роста фибробластов - опыт 1. Во втором опыте использовали те же тени эритроцитов, в которых инкапсулировали, вместо биологически активных веществ, физиологический раствор. В трех пробирках размещали фибробласты в физиологическом растворе с концентрацией клеток 400 тыс./100 мкл и тщательно перемешивали их с тенями эритроцитов из опыта 1 и опыта 2. В третью пробирку вместо теней эритроцитов помещали смесь фибробластов с физиологическим раствором (контроль). Во все три пробирки добавляли по 1,25 мл раствора фибриногена (25 мг/мл), тщательно перемешивали и добавляли раствор тромбина. Немедленно заливали эти смеси на силиконированные чашки Петри. Конечная концентрация клеток в скаффолде составляла 280 клеток/мм. После полимеризации фибриногена поверх скаффолдов добавляли среду ДМЕМ + а + глутамин, а в контроле, без теней эритроцитов, еще и 10% раствор эмбриональной телячьей сыворотки. Помещали чашки Петри с полученным скаффолдом в клеточный инкубатор с 5% содержанием CO и температурой 37°C.
Количество клеток определяли через сутки с момента формирования скаффолда. Для этого от скаффолдов при помощи шаблона отделяли фрагменты площадью 0,64 см. В полученном фрагменте проводили анализ клеточной составляющей. Для визуализации ядер клеток в структуре скаффолда использовали метод флуоресцентной микроскопии, реализуемый на многофункциональном фотометре-имиджере Cytation 5 (BioTek, США). Проводили прижизненное окрашивание ядер клеток в скаффолде с применением флуорохрома Hoechst 3334 (США) обладающим высокой специфичностью к двухцепочечной молекуле ДНК (длина волны возбуждения 377 нм и длина волны эмиссии 447 нм). Окрашивание проводили в соответствии с протоколом производителя.
3
3
3
Как показали проведенные исследования, количество клеток (фибробластов) в скаффолде в контроле (без теней эритроцитов, но в присутствии в среде телячьей сыворотки), составляло 503 кл./мм, а в опыте, в котором тени эритроцитов содержали биологически активные вещества - 600 кл./мм. При этом телячья сыворотка в питательную среду не добавлялась. В опыте, в котором тени эритроцитов не содержали биологически активные вещества и в питательной среде не было телячьей сыворотки, число клеток составляло лишь 352 клетки мм.
Таким образом, с помощью предполагаемого способа доставки биологически активных веществ в скаффолд возможно пролонгированное поддержание жизнеспособности и пролиферативной активности фибробластов, мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток как в культуральной среде, так и в скаффолдах.