Комбинированная закваска для переработки растительного сырья с получением кормового белка
COMBINED LEAVEN FOR PROCESSING OF PLANT MATERIAL TO PRODUCE FODDER PROTEIN

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к бактериальной закваске для глубокой комплексной переработки различных видов растительного сырья с получением бактериального белкового вещества для кормов.
Известны различные технологии переработки органических отходов с использованием микроорганизмов, а также технологии утилизации отходов, позволяющие получать кормовой белок.
Известны технологии, в которых смешанные культуры микроорганизмов, содержащие лакто- и пропионовокислые бактерии, используют для переработки зернового сырья [1] и для переработки вторичного растительного сырья [2]. Однако в указанных работах штаммы выбраны по способности перерабатывать субстрат без учета их активности и выживаемости в желудочно-кишечном тракте животных.
Известна закваска для конверсии растительных отходов в белковые кормовые продукты, содержащие микробную биомассу [3]. Закваска состоит из одного микроорганизма, что приводит к узкому спектру ее действия и недостаточно полной конверсии исходного растительного сырья. Закваска не обеспечивает получение белкового кормового продукта с пробиотическими свойствами.
Известна закваска, содержащая штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий [4]. Закваска предназначена для культивирования на различных средах с получением кормового продукта. Известная закваска не содержит оптимально подобранных штаммов микроорганизмов, обеспечивающих эффективную переработку растительного сырья с получением при этом функционального белкового кормового продукта.
Известна закваска, содержащая штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий, позволяющая обогатить корма витамином В12 и способствующая подавлению роста условно-патогенной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте животных и позволяющая снизить падеж молодняка от инфекционных заболеваний [5]. Закваска не позволяет перерабатывать отходы производств из растительного сырья.
Известна комбинированная закваска, предназначенная для переработки различных видов растительного сырья с получением кормового продукта [6]. Закваска представляет собой консорциум микроорганизмов, включающих штаммы лакто- и пропионовокислых бактерий. В качестве растительного сырья могут быть использованы неутилизируемые отходы растениеводства. Входящие в состав закваски штаммы не проходили отбор на высокую активность и выживаемость в желудочно-кишечном тракте животных.
Наиболее близкой по технической сущности к заявленному решению является комбинированная закваска, состоящая из культур молочнокислых и пропионовокислых бактерий [7]. Известную закваску вносят в твердые или жидкие отходы производств по переработке природного сырья с получением белково-витаминного корма. В данном способе получения корма из отходов производств по переработке природного сырья используют штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий. Штаммы используют парами молочнокислые-пропионовокислые бактерии в различных сочетаниях. Недостатком выбранных сочетаний штаммов является их несистемный отбор, основанный только на их способности перерабатывать субстрат с достаточно высоким выходом биомассы и полезным набором синтезируемых веществ и компонентов, но не учитывающий способность выживания в желудочно-кишечном тракте животных, а также без учета влияния на перевариваемость и усвояемость кормов.
Целью предлагаемого изобретения является создание комбинированной функциональной закваски, которой авторы дали название ПРОЛЕС ТВЛ 001.17, для переработки различных видов растительного сырья, в том числе побочных продуктов пищевых и подобных производств (мукомольных отходов, послеспиртовой барды, пивной дробины, фруктовых и овощных жомов) для получения функционального белкового кормового продукта, содержащего легко доступные сбалансированные по аминокислотному составу белки, пробиотические микроорганизмы с целевыми функциональными свойствами, органические витамины, микро- и макроэлементы, аминокислоты.
Технический результат предложенного изобретения заключается в качественном улучшении пробиотических и питательных свойств кормов, полученных на основе созданных консорциумов с управляемыми свойствами и более широким спектром действия, а также возможность переработки отходов производств, использующих растительное сырье различной сортности, на основе безотходного, экологически чистого и энергосберегающего процесса. Повышение биологической ценности получаемого кормового белка обеспечивается за счет повышения легкости его усвоения животными и обогащения микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных живыми культурами молочнокислых и пропионовокислых бактерий, стабилизации функционирования организма.
Раскрытие изобретения
Данное изобретение связано с расширением круга консорциумов пробиотических микроорганизмов, которые могут эффективно использоваться в процессах микробного синтеза в биотехнологии для получения полноценных кормов и кормовых добавок путем переработки различных видов растительного и животного сырья.
В состав предлагаемой закваски ПРОЛЕС ТВЛ 001.17 входят штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193, и пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257.
Все указанные штаммы депонированы в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM), г. Пушкин, Санкт-Петербург.
Данные штаммы могут использоваться в различных комбинациях либо парой Lactobacillus- и Propionibacterium в соотношении 0,8:1,2, либо одновременно все штаммы в соотношении L.reuteri : L.salivarius : Pr.freudenreichii subsp. freudenreichii 0,5:0,3:1,2 как для многореакторных (раздельное культивирование микроорганизмов с последующей совместной ферментацией), так и для однореакторных (совместное культивирование с последующей совместной ферментацией) схем технологического процесса.
Все штаммы, входящие в данную композицию, прошли отбор и тестирование, включающие следующие стадии: селекция бактерий из круга естественных обитателей желудочно-кишечного тракта ряда сельскохозяйственных животных: скрининг и направленный выбор микроорганизмов, приспособленных к существованию в желудочно-кишечном тракте сельскохозяйственных животных (ЖКТ) по активности сбраживания сахаров в нормальной и кислой среде, устойчивости к экстремально кислой среде, толерантности к желчным кислотам и способности расти в их присутствии, взаимодополнительности бактериоцинов; тестирование выбранных штаммов на взаимную совместимость роста на выбранных средах и отсутствие взаимного ингибирования; тестирование выбранных штаммов на скорость, полноту сбраживания субстрата, способность продуцировать витамины группы В, синтез молочной и пропионовой кислот; тестирование выбранных штаммов на рост при низких рН; многоступенчатый пересев выбранных штаммов на средах в присутствии желчных кислот.
Таким образом отобраны штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий из числа естественных обитателей ЖКТ животных, способные к активному совместному росту в условиях, моделирующих условия ЖКТ животных, эффективно перерабатывающие, углеводсодержащее растительное сырье в функциональное белковое кормовое вещество, содержащее легко доступные сбалансированные по аминокислотному составу белки, живые пробиотические микроорганизмы с целевыми функциональными свойствами, витамины, микро/макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, являющиеся естественными консервантами полученного продукта.
Данная закваска ПРОЛЕС Т.ВЛ 001.17 является многокомпонентным консорциумом микроорганизмов, выделенных в процессе многократного пересева с изменением среды и условий выращивания, приближенных к естественным условиям в ЖКТ животных. Выделенные бактерии адаптированы к процессу усвоения и перевариваемости по мере прохождения продукта по ЖКТ животных.
Условия культивирования штаммов
Питательная среда
Среда MRS следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 2 0,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; вода очищенная - до 1000 мл.
Или среда MRS-arap следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 20,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; агар микробиологический - 7,5-14,0 г; вода очищенная - до 1000 мл.
Значение рН готовой среды:
5,5-6,5 для Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193
6,7-0,2 для Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257
Температура и продолжительность выращивания:
24-48 часа при 37°С для Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193
24-72 часа при 32°С в анаэростате для Propionibacterium freudenreichii subsp.freudenreichii RCAM04257
Примеры осуществления изобретения
Пример 1
Штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 выращивают на среде MRS следующего состава (г/л): пептон из казеина 10,0; мясной экстракт 8,0; дрожжевой экстракт 4,0; глюкоза 20,0; фосфат калия двузамещенный 2,0; твин-80 1,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 2,0; ацетат натрия 5,0; сульфат магния 0,2; сульфат марганца 0,04; вода очищенная - до 1000 мл. Или на плотной среде MRS-агар с добавлением к указанному выше составу среды MRS агара микробиологического в количестве 7,5-14 г/л. Условия выращивания: рН среды 5,5-6,5, температура 37°С, в термостате, 24-48 ч.
Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 выращивают на среде MRS или среде MRS-агар при рН 6,7-6,9, 32°С, в анаэробных условиях, 48-72 ч.
Выращенные таким образом культуры объединяют в любых пропорциях с получением комбинированной закваски. Полученные культуры также могут быть использованы для лабораторных исследований, для производственных биотехнологических процессов и для консервации на хранение.
Пример 2
Штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при pH 3,5-6,0.
Для скрининга роста бактерий при различных значениях рН измеряют поглощения (650 нм) при 37°С на приборе Biotek.
Данный тест может быть использован при селекции эффективных штаммов для активного роста на средах в условиях подкисления среды.
Проведенные исследования показали активный рост исследуемых штаммов в условиях подкисления среды.
Пример 3
Штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при рН 6,2, 37°С в течение 24 ч.
Для определения выживаемости клеток в условиях низких рН после культивирования промытые клетки переносят в фосфатный буфер с рН 2 (рН регулируют добавлением HCl) и через 1 и 2 ч методом рассева подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Для лучшего сравнения результаты выражены в логарифмических единицах КОЕ/мл. Начальная концентрация клеток у всех штаммов около 109 КОЕ/мл.
Таблица 1. Способность к выживанию штаммов в буфере с рН 2
Число клеток (log КОЕ/мл)
Штамм/время
0 h
1 h
2 h
Lactobacillus salivarius
8,95
2,55
0
Lactobacillus reuteri
8,77
8,22
8,12
Данный тест может быть использован для селекции штаммов бактерий, способных выживать в условиях, приближенных к условиям желудочно-кишечного тракта животных.
Исследования показали, что штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194 и Lactobacillus salivarius RCAM03193 способны выживать в условиях, приближенных к условиям желудочно-кишечного тракта животных.
Пример 4
Штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при рН 6,2, 37°С в течение 24 ч.
Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при рН 6,8, 32°С в течение 48 ч в анаэробных условиях.
Для определения выживаемости клеток в присутствии желчи после культивирования промытые клетки переносят в фосфатный буфер, рН 6,5 с 2 вес.% желчи. После 0, 2 и 4 ч инкубации методом рассева на среду MRS-агар рН 5,5 подсчитывают жизнеспособные клетки. Из результатов, приведенных в табл.2, видно, что данные штаммы способны перенести кратковременную экспозицию в желчи в жизнеспособном состоянии.
Таблица 2. Способность бактерий переносить экспозиции 2% желчи в среде
штамм/ время
0 час
2 часа
4 часа
Lactobacillus salivarius
1,7 × 109
9,0 × 108
6,8 × 108
Lactobacillus reuteri
3,8 × 109
7,5 × 108
3,8 × 108
Propionibacterium freudenreichii sp.
5,2 × 108
2,1 × 108
1,0 × 108
Данный тест может быть использован для селекции штаммов бактерий, способных выживать в условиях, приближенных к условиям желудочно-кишечного тракта животных.
Пример 5
Штаммы Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при рН 5,5-6,2, 37°С в течение 24 ч и в чашках Петри на среде MRS-агар, описанной в примере 1 при рН 5,5-6,2, 37°С в течение 24 ч.
Штамм Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257 выращивают на среде MRS, описанной в примере 1 при рН 6,8, 32°С в течение 48 ч в анаэробных условиях и в чашках Петри на среде MRS-агар, описанной в примере 1 при рН 6,8, 32°С в течение 48 ч в анаэробных условиях.
Совместимость штаммов определяют по величине или отсутствию зон ингибирования при внесении 10 мл инокулята ингибирующего штамма в зону роста ингибируемого штамма на агаризованной среде. Совместное культивирование проводят при 32-37°С в течение 24-48 ч в термостате.
Таблица 3. Совместное культивирование штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий при размере колоний 10-11 мм
Ингибируемые штаммы
Штаммы-ингибиторы
L. salivarius
L. reuteri
Pr. Freudenreichii
L. salivarius
N
0
0/+
L. reuteri
0
N
0
Pr. freudenreichii
0/+
0
N
«0» - отсутствие зоны ингибирования
«+» - зона появляется в 1-2 мм от края колонии, диаметр зоны 12-14 мм
Данный тест может быть использован для создания комбинированных многокомпонентных бактериальных заквасок в биотехнологии.
Пример 6
Метод селекции штаммов с заданными свойствами основан на тестировании  молочнокислых и пропионовокислых бактерий для целей выбора наиболее эффективных штаммов и учитывает показатели, приведенные в таблице 4 и 5.
Таблица 4. Тестирование  молочнокислых бактерий для выбора наиболее эффективных штаммов
Тест
Название
Результат
А
Скорость роста на стандартных средах (MRS), содержащих глюкозу, при pH 5,0, 4,0, и 3,0.
Ячейка иммунологического планшета, OD650 0,95-1,35 ед за 12 часов при pH 5,0, рост при pH 4,0 на уровне 50-70%, иногда небольшой рост при pH 3,0. Отбраковка штаммов с худшими показателями.
Б
Глубина подкисления стандартной среды (MRS), содержащей глюкозу от начальной pH 5,5, в течение 24 часов и достигаемая при этом концентрация клеток, КОЕ/мл.
Подкисление среды до pH 3,60-4,05, концентрация клеток 1,4 × 108 - 2,1 × 109 КОЕ/мл. Отбраковка штаммов с худшими показателями.
В
Глубина подкисления среды и достигаемая при этом концентрации клеток при росте на ферментолизатах пшеничной муки в течение 24 и 48 часов, КОЕ/мл.
При росте в течение 24 часов подкисление среды до pH 4,25-4,90, рост клеток от 1,5 × 108 до 8,7 × 108 КОЕ/мл, при росте в течение 48 часов подкисление среды до pH 3,80 - 4,60, рост клеток от 3,9 × 108 до 8,7 × 108 КОЕ/мл.
Г
Выживаемость после экспозиции 2 и 4 часа в среде с желчными кислотами в концентрации 2% при отсутствии субстрата.
Выживаемость после 2 часов от 20% до 100%, после 4 часов инкубации от 10% до 86-100%. Отбраковка штаммов с более низкими показателями с учетом теста D.
Д
Способность расти в присутствии субстрата при концентрации желчных кислот 0,3, 0,5 и 1%.
Рост на уровне не менее 50% от максимального. Отбраковка штаммов с более низкими показателями.
Е
Выживаемость при содержании в кислой среде pH 2,0 в течение 1 и 2 часов.
Снижение концентрации клеток после 1 часа инкубации на величины от 0 до 7 порядков, после 2 часов инкубации на величины от 5 до полной потери жизнеспособности. Отбор штаммов, которые после 1 часа инкубации сохраняют концентрации 500 КОЕ/мл и выше. Отбор кислотостойких штаммов как предпочтительных для создания функциональных заквасок.
Ж
Тест взаимного ингибирования штаммов.
Полуколичественный показатель, указывающий на взаимную дополнительность бактериоцинов и возможности сочетания разных штаммов в закваске. Применяется и в отношении ингибирования роста пропионовокислых бактерий в присутствии молочнокислых бактерий.
Таблица 5. Тестирование  пропионовокислых бактерий для выбора наиболее эффективных штаммов
Тест
Название
Результат
А
Скорость роста в пробирках в течение 24 часов на стандартной среде MRS,  анаэробно, pH 7,0.
OD650 1,5-2,5 ед за 24 часа при pH 7,0. Отбраковка штаммов с худшими показателями.
Б
Анаэробный рост при pH 7,2-7,3 и  5,5-5,7: достигаемая концентрация клеток и изменение pH.
При pH 7,2-7,3 рост клеток от 4 × 108 до 1,1 × 109, подкисление 6,3-6,5. При pH 5,5-5,7 рост клеток от 2,6 × 108 до 5,2 × 108, подкисление 5,2-5,3.
В
Выживаемость в присутствии субстрата при концентрации желчных кислот 0,3, 0,5 и 1% после 24 и 48 часов инкубации.
Выживаемость от 17% до 26% после 48-часовой инкубации в среде с субстратом, содержащей 1% желчи до 51-74% после 24-часовой инкубации. Отбраковка штаммов с худшими показателями.
Г
Ингибирование роста пропионовокислых бактерий колониями молочнокислых бактерий.
Для определения относительной совместимости в смешанных заквасках.
Данный разработанный метод может быть использован для создания комбинированных бактериальных заквасок в биотехнологии для получения кормовых продуктов.
Пример 7
Отобранные в результате тестирования штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий прошли 20-стадийный пересев на питательную среду MRS-агар, описанную в примере 1 в анаэробных условиях в присутствии 0,3% желчных кислот после 48-часовой инкубации при каждом пересеве. Полученные таким образом штаммы с закрепленными свойствами хорошего роста на заданном субстрате и способностью выживания в присутствии желчных кислот законсервированы и переданы на хранение в Ведомственную коллекцию полезных сельскохозяйственных микроорганизмов (RCAM).
Пример 8
В подготовленную питательную среду путем ферментативного гидролиза и осахаривания зернового сырья с добавлением хлорида кобальта и диаммоний фосфата и доведения рН до значения 6,7 вносят чистые культуры штаммов закваски Lactobacillus reuteri RCAM03194, Lactobacillus salivarius RCAM03193 и Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii RCAM04257. Подготовку инокулята, вносимого в полученную питательную среду, проводят способом, описанным в примере 1. Ферментацию проводят при 33-37°С в течение 24-48 ч. По окончании процесса ферментации полученную массу разделяют центрифугированием на твердую и жидкую фазы. Твердая фаза подвергается высушиванию с получением кормового белкового продукта. Полученный кормовой белковый продукт содержит 35-45% протеина, живые пробиотические микроорганизмы, аминокислоты, витамины, микро- и макроэлементы, ферментные комплексы, биологически активные компоненты, пребиотики и органические кислоты, может быть использован в качестве полноценного корма или кормовых добавок для сельскохозяйственных животных, птиц и рыб.
Источники информации
[1] RU 2391859 C2, 20.06.2010.
[2] RU 2250265 C2, 20.04.2005.
[3] US 4401680 A1, 30.08.1983.
[4] WO 0041576 A1, 20.07.2000.
[5] RU 2364406 C1, 20.08.2009. Бюл. №23.
[6] RU 2155496 C2, 10.09.2000. Бюл. №25.
[7] RU 2243678 C1, 10.01.2005. Бюл. №1.