ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ СЕМЕЙСТВА ГЕРПЕС-ВИРУСОВ
DRUG WITH HERPES VIRUS FAMILY ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, а именно к синтетическим биологически активным производным карбопентоксисульфаниловой кислоты.
Завяленное вещество имеет выраженную противовирусную активность, направленную, преимущественно, против различных вирусов семейства герпеса.
Может быть использовано в медицине, ветеринарии и косметологии, для профилактики и лечения заболеваний, связанных с семейством герпес-вирусов.
Одну из наиболее серьезных проблем современной медицины представляют вирусные инфекции, большинство из которых крайне плохо поддается лечению или вообще не имеет адекватной противовирусной терапии. Это связано как с недостаточной эффективностью существующих препаратов, так и быстрой изменчивостью возбудителей, приводящей к появлению устойчивых форм (http://www.medinfo.ru/sovety/derm/02.phtml).
Схожие проблемы актуальны и для ветеринарии.
Наиболее используемыми препаратами для лечения широко распространенных инфекций, вызванных вирусом простого герпеса, являются ацикловир - синтетический ациклический аналог дизоксигуанозина и фамвир (фамцикловир), который трансформируется в организме в активное противовирусное соединение - пенцикловир (http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_1843.htm). Каждый из этих препаратов имеет определенные недостатки. Ацикловир менее активен по отношению к вирусам герпеса второго типа, фамцикловир имеет расширенные противопоказания, однако значительная часть циркулирующих герпес-вирусов в настоящее время приобрела устойчивость к этим длительно используемым препаратам (P.A.Furman, D.M.Coen, M.H.St.Clair and P.A.Schaffer Acyclovir-resistant mutants of herpes simplex vims type 1 express altered DNA polymerase or reduced acyclovir phosphorylating activities. J. Virol., 1981, December; 3: 936-941) (копия ссылки прилагается).
В качестве прототипа выбран наиболее распространенный противогерпетический препарат - ацикловир - 2-амино-1,9-дигидро-9-[(2-гидроксиэтокси)метил]-6Н-пурин-6-он, (http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_290.htm) (копия ссылки прилагается):
.
Его недостатком является отмеченное выше обстоятельство - приобретенная устойчивость к данному препарату большой части герпес-вирусов.
Задачей настоящего изобретения является создание препарата с выраженной активностью против вирусов герпеса.
Согласно изобретению эта задача решается путем синтеза нового вещества, представляющего собой соль (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты общей формулы:
,
4
где X - Na, К, NH; лекарственное средство может содержаться в таблетках, в том числе сублингвальных, или в капсулах, или в суппозиториях, или в каплях, или в микстурах, или в мазях, кремах или других формах для нанесения на кожу и слизистые, или в орально-букальной пленке, или в спрее, или в жидкости для парентерального введения, или в жевательной резинке.
Синтез заявленного вещества осуществляется в несколько этапов.
I. Синтез амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты.
К 11,5 г (0,096 моль) фенилизоцианата, помещенного в стакан, по каплям при перемешивании прибавили 8,5 г (0,096 моль) амилового спирта. Наблюдали разогрев реакционной массы. Через 1 час смесь затвердела в виде бесцветных кристаллов. Выход амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты - около 100%.
II. Синтез хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты.
К 17,5 г (0,150 моль) хлорсульфоновой кислоты, нагретой до 30°С, при перемешивнии медленно прибавили 2,07 г (0,010 моль) амилового эфира фенилкарбаминовой кислоты, поддерживая температуры реакционной массы не выше 35°С. Затем медленно нагревали смесь до 50°С и выдерживали ее при температуре 50-55°С в течение 2 часов. Полученную сульфомассу при перемешивании вылили на лед, поддерживая температуру не выше 20°С. Осадок отфильтровали, промыли ледяной водой до рН фильтрата 7. Осадок сушили на воздухе, а затем в эксикаторе. Выход хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты около 100%.
III. Синтез (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты.
К смеси 2,2 г 2,6-дихлоранилина (0,0136 моль) и 3,23 г пиридина (0,0406 моль) при температуре 85°С порциями прибавляли 6,2 г хлорангидрида карбопентоксисульфаниловой кислоты (0,0203 моль). Затем в течение 45 мин перемешивали реакционную массу при температуре 80°С. После к массе добавляли 20 мл горячей воды, подкисляли смесь соляной кислотой до рН 3-4 и охлаждали до комнатной температуры. Полученный осадок отфильтровали, промыли водой до исчезновения запаха пиридина и высушили. После перекристаллизации из 80% этанола выход целевого продукта составил 2,5 г (40% от теоретического).
IV. Синтез конечного продукта - натриевой соли (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты.
В 5 мл этилового спирта (абс.) растворили 0,232 г едкого натра и в 30 мл этилового спирта (абс.) растворили 2,5 г (2,6-дихлорфенил)амида карбопентоксисульфаниловой кислоты. Затем смешали два раствора и перемешивали 20 минут. После отогнали этиловый спирт под вакуумом. Оставшийся осадок высушили. Выход продукта составил 2,1 г (80% от теоретического).
Синтез калиевой и аммониевой солей осуществляется аналогично.
Индивидуальность веществ доказана методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol UV-254, элюент четыреххлористый углерод - изопропанол=2:1. Структура синтезированных веществ доказана методом ПМР спектроскопии.
Таблица 1
Физико-химические характеристики целевых соединений.
Х
Т плав., °С
ПМР спектр, м.д.
NH
Ar
ОСН<sub>2</sub>
СН<sub>3</sub>, СН<sub>2</sub>
Na (I)
120
9,75; 9,9
7,2-7,7
4,1
0,9; 1,38; 1,62
К (II)
123
9,8; 10,0
7,3-7,8
4,15
0,94; 1,42; 1,65
NH<sub>4</sub> <sup>+</sup> (III)
110 (разл.)
*)
*)
4,2
0,91; 1,40; 1,63
*) Область ПМР спектра аммониевой соли в слабом поле (>7 м.д.) не является характеристичной: наблюдается один широкий сигнал, обусловленный образованием в растворе сильных водородных связей.
Противовирусная активность заявляемого вещества была определена на модели пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом простого герпеса 1 типа.
Вирус простого герпеса 1 типа (штамм ЕС) накапливали в клетках Vero, выращенных на среде MEM с добавлением 0,2% сыворотки крупного рогатого скота, 50 мкг/мл гентамицина. Титрование вируса проводили на клетках Vero, выращенных в 96-луночных планшетах. Учет разультатов проводили после появления выраженного цитопатического действия (ЦПД) в контроле вируса. Визуально оценивали степень интактности клеточного монослоя, за титр вируса принимали величину, обратную десятичному логарифму наибольшего разведения исходного материала, способного вызвать визуальные проявления ЦПД в культуре клеток (CTD50).
Для оценки вирусоингибирующего действия препаратов белые беспородные мыши весом 12-15 г (питомник «Рапполово», Ленинградская область) были заражены интраназально под легким эфирным наркозом вирусом простого герпеса в дозе 106 (CTD50)/0,05 мл. Тестируемый препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса по лечебно-профилактической схеме (за 24 и 1 час до заражения, через 24 и 48 часов после заражения животных). На третий день легкие зараженных животных извлекали, гомогенизировали в присутствии 10-кратного объема фосфатного буфера и готовили из них 10-кратные разведения от 10-1 до 10-6. Разведения гомогената легких использовали для заражения интактной культуры клеток Vero и титрования вирусного потомства. Положительным контролем служили легкие мышей, которым вместо исследуемого препарата вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, отрицательным - легкие мышей, которым по той же схеме вводили ацикловир в дозе 50 мг/кг веса. В каждой опытной группе было по 10 животных.
Материал легких также был изучен гистологически.
Таблица 2
Результаты титрования вируса.
Препарат
Титр вируса в легких мышей на 3 сутки после инфицирования, Lg CTD<sub>50</sub>
Контроль
3,6±0,15
Заявленное вещество
1,0±0,11
Ацикловир
1,4±0,34
Как видно из представленных данных, препарат обладает достоверной вирусингибирующей активностью на модели герпетической пневмонии in vivo и превосходит ацикловир в той же дозе.
Таблица 3
Морфометрические показатели динамики патологического процесса в легких инфицированных животных в условиях применения химиопрепаратов на различных сроках герпетической пневмонии.
Препарат
Срок опята (в сутках)
Количество очагов воспаления у одного животного
Площадь очага воспаления в срезе
Контроль
2
10
76±5,9
4
10
405±111,3
6
10
343±47,5
Ацикловир
2
8
55±9,4
4
3
58±14,7
6
3
24±6,4
Заявленное вещество
2
3
47±7,3
4
2
49±12,1
6
1
14±5,5
Определение активности против вирусов герпеса 1-го и 2-го типов.
Вирус простого герпеса (штамм ЕС) выращивали в культуре клеток Vero, выращенных на среде MEM с добавлением 0,2% сыворотки крупного рогатого скота и тестируемых препаратов 50 мг/л.
Таблица 4
Противовирусная активность.
Препарат
Число (%) неизмененных клеток
Вирус герпеса 1-го типа
Вирус герпеса 2-го типа
Контроль (неинфецированные клетки)
10000 (100%)
10000 (100%)
Ацикловир
7000 (65%)
7000 (70%)
Заявленное вещество
8000 (80%)
9000 (90%)
Таким образом, установлено, что противовирусная активность заявленного вещества существенно превосходит таковую у ацикловира, в особенности против вируса герпеса 2-го типа.
Заявленное вещество может содержаться в таблетках или в капсулах, или в суппозиториях, или в каплях, или в микстурах, или в мазях, кремах, или других формах для нанесения на кожу и слизистые, или в орально-букальной пленке, или в спрее, или в жидкости для парентерального введения, или в жевательной резинке.
4
Заявленное вещество проявляет, практически, одинаковую противовирусную активность при Х=Na, К или NH.