Антинематодозная композиция для ветеринарии и способ ее получения
ANTINEMATODOSIS COMPOSITION FOR VETERINARY MEDICINE AND METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, касается разработки композиции, предназначенной для лечения сельскохозяйственных и домашних животных от гельминтоза, вызываемого червями нематодного ряда, и способу ее получения.
Нематоды – круглые черви (аскариды, эзофагостомы, анкилостомы, токсокары, власоглавы, острицы и др.) являются наиболее распространенной группой гельминтов и причиной основных паразитарных заболеваний сельскохозяйственных и домашних животных, в том числе птиц, которые наносят существенный ущерб экономике и представляют опасность для человека. Это обусловлено высокой степенью восприимчивости к заболеванию, к которому даже после излечения не вырабатывается иммунитет.  Разработка лекарственных препаратов для профилактики и лечения нематодотозов, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей фармации.
Известные антигельминтные синтетические препараты по химической структуре делятся на производные этаноламина, бензимидазола, салициламида, солей пиперазина [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Новая волна. Т 2. - 2004; Червяков Д.К. и др. Лекарственные средства в ветеринарии. – М. Колос, 1977; Пат. РФ 2242976, опубл.27.12.2004; Пат.РФ 2211835, опубл.10.09.2003]. Известны также карбонилоксицианометильные производные [Пат. РФ 2296747, опубл.27.10.2005], производные милбемицина [Пат. РФ 2226531, опубл.10.04.2004; Заявка РФ 2004115744, опубл. 10.04.2005], производные тетрагидрофуроизоксазола [Пат.РФ 1586154, опубл.20.12.2006] в качестве антипаразитарных средств. Известны композиционные антигельминтные средства, включающие фенбендазол, сульфадимезин, серу и цеолит [Пат.РФ 2302864, опубл.20.07.2007], клозантел, новокаин, поливинилпирролидон [Пат. РФ 2278661, опубл.16.02.2004], альбендазол, медный купорос и ацетилцеллюлозу [Пат. РФ 2195280, опубл.27.12.2002].
Недостатками известных препаратов являются:
- побочное высокое токсическое действие на печень, нервную систему, снижение иммунитета;
- аллергические явления;
- низкая эффективность применения по назначению;
- высокие лечебные дозы;
- длительное время использования.
Производные бензофуроксанов известны из уровня техники как биологически активные соединения, обладающие широким спектром биологической активности, например, известно их использование для лечения стенокардии [Заявка РФ 2000132204, опубл. 10.11.2002; Заявка РФ 2000132206, опубл. 20.10.2002]. Также выявлена их (производных бензофуроксанов) акарицидная и бактерицидная [пат. РФ №2255935], фунгицидная [пат. РФ №2032678], и антинематодозная активность [пат. РФ №2404769, пат. РФ №2404975].
Введение в состав антигельминтных (антинематодозных) препаратов компонентов, обладающих антимикробным, противовоспалительным, пролонгированным, антиаллергенным, дезинтоксикационным действием, по мнению заявителя, приведет к созданию нового препарата, расширяющего арсенал известных средств указанного назначения.
Кроме того, композиция должна обладать противовоспалительным и успокаивающим действием на слизистую кишечника, чтобы избежать обострений и одновременно пролонгированным действием. При этом композиция должна выполнять роль мягкого сорбента для связывания токсинов, выделяемых погибающими паразитами.
Роль антимикробного и противовоспалительного компонента в составе заявленной композиции отводится 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксану, который подавляет микробную инфекцию, сопровождающую воспалительные процессы при глистных инвазиях.
Роль пролонгатора, как компонента в составе заявленной композиции, отводится активированному углю. Известно применение активированного угля, как эксципиента для пролонгированного высвобождения лекарственного средства в желудочно-кишечном тракте (например, Roivas, L. et al., Methods Find Exp Clin Pharmacol, 16(2): 125-32, 1994). Пролонгирующее действие активированного угля можно объяснить известным фактом, что адсорбция не является однонаправленным процессом, этот процесс всегда сопровождается десорбцией лекарственного средства с активированного угля.
2
2
Так, из исследованного уровня техники известно, что активированный уголь представляет собой хорошо зарекомендованное и распространенное средство для предотвращения всасывания лекарственных соединений из желудочно-кишечного тракта в случае интоксикации за счет их адсорбции и находит медицинское применение в качестве детоксикационного средства за счет высокой поглощающей способности ядов и токсинов [Dawson, Andrew. // Australian Prescriber. — 1997. — Т. 20. — С. 14—16. — doi:10.18773 /austprescr.1997.008, Водоподготовка: Справочник. // Под ред. С. Е. Беликова. М.: Аква-Терм, 2007.— 240]. Поглощающая способность активированного угля связана с пористой структурой с внутренней поверхностью примерно 500-1500 м/г и площадью поверхности, соответственно, BET примерно до 5000 м/г.
Роль компонента с дезинтоксикационным действием в заявленной антинематодозной композиции выполняет поливинилпирролидон. Механизм лечебного действия поливинилпирролидона заключается в комплексообразующей способности активно связывать токсины, образующиеся при отмирании и разрушении кутикул большого количества нематодов в организме хозяина, и выводить их из организма через кишечник. Важно отметить, что в кровеносное русло поливинилпирролидон не поступает. Клинической практикой доказано, что препарат не повреждает слизистую оболочку желудка и кишечника (и без того воспаленную от большого количества нематодов), не накапливается в организме, практически не имеет противопоказаний и побочных эффектов, то есть является полностью безопасным препаратом. Показания к применению поливинилпирролидона: токсические формы острых инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта (дизентерия, сальмонеллез и др.), пищевая токсикоинфекция (пищевое отравление), интоксикации (отравления) другого происхождения, обострения хронических энтероколита (воспаления тонкой и толстой кишки) и энтерита (воспаление тонкой кишки), печёночная недостаточность [Лекарственные средства, М.Д. Машковский, Энтеродез].
Известно, что полиэтиленгликоль 1500 (далее - ПЭГ 1500) является полимером этиленгликоля, белого цвета и маслообразного или чешуйчатого состояния. ПЭГ 1500 способствует лучшему смешиванию и растворению компонентов лекарств, усиливает действие антисептиков, местных анестетиков, гидрокортизона, сульфаниламидов и многих других. Он мало восприимчив к воздействию бактерий и обладает противовоспалительным действием, помогает ускорить заживление ран (в том числе и инфицированных), ожогов, устраняет раздражение. Он не оказывает токсического действия на организм и легко смывается водой [http:// apifitopharm/ua/kremovaja-osnova-peg 1500; British national formulary: BNF 76 (76 ed.). Pharmaceutical Press. 2018. pp. 57–58. ISBN 9780857113382].
Наиболее близким по количеству общих признаков и заявленному техническому результату, выбранным заявителем в качестве прототипа по отношению к композиции и по отношению к способу ее получения, является изобретение по патенту РФ № 2413513 «Антинематодозная композиция на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана».
Сущностью прототипа по отношению к композиции является антинематодозная композиция, содержащая н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид и 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1:10 и глюкозу как вспомогательное вещество.
Сущностью прототипа по отношению к способу является способ, заключающийся в том, что сначала получают первый компонент известной композиции - н-гексадецилтрифенил фосфоний бромид путем взаимодействия раствора гексадецилбромида и трифенилфосфина, реакционную смесь нагревают в течение 15 часов при температуре 120 С. Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают этиловым эфиром от исходных соединений. Затем получают второй компонент - 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан путем взаимодействия 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана в этиловом спирте и 3-нитроанилина в этиловом спирте. Реакционную смесь охлаждают, кристаллическую массу ярко-красного цвета отделяют и перекристаллизовывают из смеси этанол-ацетонитрил. Затем получают антинематодозную композицию и лекарственный препарат на его основе следующим образом: смешивают и растирают глюкозу, гексадецилтрифенилфосфоний бромид и 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан до получения однородного порошка красного цвета, которым наполняют облатки (дозированные закрывающиеся контейнеры из крахмала). Пероральная лекарственная форма весом 0.5 г содержит 0,025 г соли фосфония, 0.250 г 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана и 0.225 г глюкозы.
Недостатками прототипа по сравнению с заявленным техническим решением по отношению к композиции является:
- отсутствие антимикробного и противовоспалительного действия в результате отсутствия в составе прототипа антимикробного и противовоспалительного компонента 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана;
- отсутствие пролонгированного действия в результате отсутствия в составе прототипа активированного угля;
- отсутствие антиаллергенного действия в результате отсутствия в составе прототипа активированного угля;
- отсутствие дезинтоксикационного действия в результате отсутствия в составе прототипа поливинилпирролидона и активированного угля;
-   худшее смешение и растворимость компонентов в результате отсутствия в составе прототипа полиэтиленгликоля 1500;
- неудобная лекарственная форма известной композиции – облатка (крупный контейнер из крахмала около 10 мм длиной), в результате чего препарат пригоден только для крупных животных, например, коров, свиней, лошадей, и не пригоден для мелких животных, например, кошек, маленьких пород собак, норок, песцов, кроликов, кур, уток, гусей.
Недостатками прототипа по сравнению с заявленным техническим решением по отношению к способу получения является отсутствие таких действий, как:
- смешивание глюкозы и н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида;
- расплавление полиэтиленгликоля 1500 и смешивание его с 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксаном и 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксаном;
- смешивание двух описанных выше смесей;
- добавление активированного угля и поливинилпирролидона;
- пропускание смеси через сито.
Так как способ получения антинематодозной композиции по прототипу не включен в формулу прототипа, второй независимый пункт формулы составлен без ограничительной   части.
Таким образом, задачей заявленного изобретения является создание новой композиции, обладающей дополнительно антимикробным, противовоспалительным, пролонгированным, антиаллергенным, дезинтоксикационным действием и соответствующей требованиям, предъявляемым к антинематодозным препаратам – низкая токсичность (4 класс опасности), отсутствие побочных действий, низкие лечебные дозы, обеспечивающие высокую эффективность применения, краткие сроки применения, что расширяет арсенал известных средств указанного назначения.
Задача заявленного изобретения решается путем создания новой композиции, представляющей собой комбинацию биологически активных замещенных нитропроизводных бензофуроксана – 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан и 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан, н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид, активированный уголь, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль 1500 и глюкозу при весовом соотношении компонентов  5 : 5 : 1 : 10 : 10 : 10 : 9.
Техническим результатом заявленного технического решения является:
• создание антинематодозной композиции для ветеринарии, обладающей:
- антимикробным и противовоспалительным действием путем введения в состав композиции 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана;
- пролонгированным высвобождением композиции, что приводит к более эффективному, но более мягкому и менее травмирующему излечению, путем введения в состав композиции активированного угля;
- антиаллергенным действием путем введения в состав композиции активированного угля;
- дезинтоксикационным действием путем введения в состав композиции поливинилпирролидона и активированного угля;
- более удобной лекарственной формой в виде небольших гранул в результате пропускания через сито, что расширяет круг животных, способных к лечению заявленной композицией;
- лучшим смешением компонентов путем введения в состав композиции полиэтиленгликоля 1500;
- улучшенной растворимостью компонентов 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана и 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана при растворении в расплавленном полиэтиленгликоле 1500.
50
При этом заявленная композиция обладает высокой эффективностью в отношении нематодов, а также низкими лечебными дозами 0,044 – 0,047 г/кг и высоким значением ЛД3500 мг/кг, что в совокупности обеспечивает расширение арсенала известных средств указанного назначения.
• разработки способа получения заявленной композиции, имеющего, по мнению заявителя, новизну и изобретательский уровень, так как заявленная последовательность действий не выявлена заявителем из уровня техники и не выявлено влияние совокупности признаков на заявленный технический результат.
Решение поставленных задач и заявленного технического результата приводит к повышению терапевтической эффективности заявленной композиции по сравнению с прототипом.
Сущностью заявленного технического решения является антинематодозная композиция для ветеринарии, содержащая 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан, н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид, глюкозу, характеризующаяся тем, что дополнительно содержит 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан, активированный уголь, поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль 1500, при следующем соотношении компонентов, вес. ч.:
5,7-динитро-4,6-бис(3-нитрофениламино)бензофуроксан
5
4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан
5
н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид
1
активированный уголь
10
поливинилпирролидон
10
полиэтиленгликоль 1500
10
глюкоза
9
Способ получения антинематодозной композиции по п.1, заключающийся в том, что готовят первую смесь, для чего растирают 9 весовых частей глюкозы, добавляют при перемешивании 1 весовую часть н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида; затем готовят вторую смесь, для чего расплавляют при 65°С 10 весовых частей полиэтиленгликоля 1500, добавляют к нему при перемешивании 5 весовых частей 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана, 5 весовых частей 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана; далее обе смеси смешивают при 65 °С, добавляют 10 весовых частей активированного угля и 10 весовых частей поливинилпирролидона, смесь перемешивают до получения однородной массы, пропускают через сито с диаметром пор 2 мм, полученные гранулы сушат при комнатной температуре и расфасовывают.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг.1 – Фиг.4.
На Фиг.1 представлена Таблица 1, в которой приведена антимикробная активность 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана (1% раствор в воде) по сравнению с известными препаратами Chlorhexidine, Penicillin, Griseofulvin.
На Фиг.2 представлена Таблица 2, в которой приведены характеристические данные испытуемых свинок до лечения.
На Фиг.3 представлена Таблица 3, в которой приведена оценка антинематодозной активности исследованных композиций по результатам копрологических исследований фекалий свинок.
На Фиг.4 представлена Таблица 4, в которой приведена оценка антимикробного, противовоспалительного, пролонгированного, антиаллергенного, дезинтоксикационного действия исследованных композиций.
Поставленные задачи и заявленный технический результат достигается получением композиции, состоящей из 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана, 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана, н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида, поливинилпирролидона (Повидон), активированного угля, полиэтиленгликоля 1500 (ПЭГ, Макрогол) и глюкозы при их весовом соотношении 5 : 5 : 1 : 10 : 10 : 10 : 9.
Далее заявителем приведено подробное описание фармацевтического действия компонентов заявленной композиции.
5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан – генерирует NO in vivo и вызывает спастические судороги нематодов, что в итоге парализует мышечную ткань нематодов.
4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан - генерирует NO in vivo и вызывает спастические судороги нематодов, что в итоге парализует мышечную ткань нематодов. Одновременно подавляет микробную инфекцию, сопровождающую воспалительные процессы при глистных инвазиях. В Таблице 1 на Фиг.1 приведена антимикробная активность 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана (1% раствор в воде) по сравнению с известными препаратами Chlorhexidine, Penicillin, Griseofulvin. Из данных, приведенных в Таблице 1, видно, что антимикробная активность 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана значительно превышает антимикробную активность известных препаратов.
Н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид - проникает через мембраны кутикулы, что приводит к гибели нематодов и патогенной микрофлоры за счет доступности пищеварительных соков хозяина внутрь нематоды.
Активированный уголь обеспечивает как антиаллергическое и дезинтоксикационное действие, так и пролонгированное действие заявленной композиции. Поскольку антинематодозная композиция действует, в основном, путем прямого контакта с нематодами в желудочно-кишечном тракте, а именно, в основном в тонком кишечнике, очень важно, чтобы доза антинематодозной композиции оставалась в кишечнике как можно дольше, в течение более длительного времени, благодаря чему будет обеспечено пролонгированное действие.
2
2
Пролонгированное высвобождение заявленной композиции достигается путем введения в композицию активированного угля, имеющего пористую структуру с внутренней поверхностью примерно 500-1500 м/г и площадью поверхности, соответственно, BET примерно до 5000 м/г. Известно, что активированный уголь всасывает лекарственные соединения из желудочно-кишечного тракта в случае интоксикации за счет их адсорбции. Однако также хорошо известно, что адсорбция не является однонаправленным процессом, так как этот процесс всегда сопровождается десорбцией лекарственного средства с активированного угля, что использовано заявителем для обеспечения пролонгированного высвобождения заявленной композиции в желудочно-кишечном тракте.
Поливинилпирролидон обеспечивает дезинтоксикационные свойства заявленной композиции ввиду способности к комплексообразованию. Механизм лечебного действия заключается в способности активно связывать токсины, образующиеся при отмирании и разрушении кутикул большого количества нематодов в организме хозяина, и выводить их из организма через кишечник. Важно отметить, что в кровеносное русло поливинилпирролидон не поступает. Известно, что препарат не повреждает слизистую оболочку желудка и кишечника (и без того воспаленную от большого количества нематодов), не накапливается в организме, практически не имеет противопоказаний и побочных эффектов, то есть является полностью безопасным препаратом.
Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500) обеспечивает лучшее смешивание и способствует усилению растворимости гидрофобных фураксановых компонентов - 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана и 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан и загущению смеси входящих в композицию компонентов, усилению антинематодозного действия. Кроме этого, известно, что ПЭГ 1500 мало восприимчив к воздействию бактерий и обладает противовоспалительным действием, что помогает ускорить заживление ран (в том числе инфицированных), устраняет раздражение, вызванное действием нематодов. При этом он не оказывает токсического действия на организм и легко смывается водой.
Глюкоза обеспечивает маскировку вкуса, а также служит для приманивания и обманки нематодов, так как их основным питанием является глюкоза.
При этом заявитель считает, что заявленное техническое решение не является суммированием известных технических решений как в отношении композиции, так и в отношении способа ее получения, по следующим основаниям.
В отношении композиции.
Подобранный заявителем состав композиции и соотношение ее компонентов является неочевидным для специалиста из данной области техники, так как заявителем из исследованного уровня техники не выявлены составы, в которых одновременно использовались бы заявленные компоненты в заявленном соотношении и в заявленном назначении, а именно – в составе антинематодозной композиции. При этом соотношение компонентов было подобрано заявителем опытным путем.
В отношении способа.
В выявленных источниках отсутствует заявленная последовательность действий.
Далее заявителем описано получение отдельных компонентов заявленной композиции:
1. Н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид формулы I
получают по способу, описанному в [Старкс Ч.М. Межфазный катализ. Химия, катализаторы и применение / Ред. Ч.М.Старкс. М.: Химия, 1991.- 157с.]:
2. 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан формулы II получают по методике [Л.М.Юсупова, С.Ю.Гармонов, И.М.Захаров и др. Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензофуроксана. /Вестник Казанского технологического университета, 2005 г., №1, с. 103-111.]:
3. 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан формулы III получают по методике [пат. РФ №2255935. 5,7-Дизамещенный-4,6-динитро-бензофуроксан общей формулы С6N4O6(R1)2, обладающий акарицидной и бактерицидной активностью.  Гарипов Т.В.,  Спатлова Л.В., Фаляхов И.Ф.,  Юсупова Л.М.].
4. Активированный уголь, например, БАУ-А ГОСТ 6217-74, является товарным продуктом.
5. Поливинилпирролидон (Повидон), например, м. м. 360000, VWR, пищевая добавка Е 1201, является товарным продуктом.
6. Полиэтиленгликоль 1500 (ПЭГ 1500, Макрогол) фармацевтический, пищевая добавка Е 1521, является товарным продуктом.
7. Глюкоза кристаллическая медицинская, например, по ГОСТ 975-88 (производитель Днепропетровский крахмально-паточный комбинат), является товарным продуктом.
Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.
Пример 1. Синтез н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида.
К избытку 6.1 г (0.02 моль) раствора гексадецилбромида прибавляют 2.62 г (0.01 моль) трифенилфосфина. Реакционную смесь нагревают в течение 15 часов при температуре 120°С. Выпавший осадок отфильтровывают и многократно промывают этиловым эфиром от исходных соединений.
Р
31
Выход 87 %. Т.пл. 103.4 °С, Т. разл. 320.9 °С, δ= 25.8м.д.
34
48
Элементный анализ СНBr,P. Найдено,%: С 71.96; Н 8.47; P 5.83. Вычислено,%: С 71.54; Н 8.53; P 5.47.
Пример 2. Синтез 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана.
К 2.95 г (0.01 моль) 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана в 10 мл этилового спирта прибавляют по каплям 2.76 г (0.02 моль) м-нитроанилина в 15 мл этилового спирта. Через 30 минут после охлаждения реакционной смеси кристаллическую массу ярко красного цвета отделяют и перекристаллизовывают из смеси этанол : ацетонитрил (1:0,8).
Выход 78 %. Т пл. 226 °С.
18
10
8
10
Элементный анализ СНNО. Найдено,%: С 43.71; Н 1.97; N 22.34. Вычислено,%: С 43.37; Н 2.01; N 22.51.
Пример 3. Синтез 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана.
К 2.95 г (0.01 моль) 4,6-динитро-5,7-дихлорбензофуроксана в 10 мл этилового спирта прибавляют по каплям 2.18 г (0.02 моль) 4-гидроксианилина в 15 мл этилового спирта. Через 30 минут после охлаждения реакционной смеси кристаллическую массу ярко бордового цвета отделяют и перекристаллизовывают из смеси этанол : ацетонитрил (1:0,8).
Выход 85 %. Т пл. 195-196 °С  (из этилового спирта).
18
12
6
8
Элементный анализ CHNO
Найдено,%: С 48,9; Н 2,69; N 19. Вычислено,%:  C 49; H 2,7; N 19.
Пример 4. Получение антинематодозной композиции.
Этап 1. Получают первую смесь, для чего в ступку, например, фарфоровую, помещают 9 весовых частей (например, 2,25 г) глюкозы и тщательно растирают ее путем втирания в стенки ступки с целью сглаживания шершавости стенок, чтобы избежать в дальнейшем потери малых количеств (1 весовой части) н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида. Затем при перемешивании добавляют 1 весовую часть (например, 0,25 г) н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида.
Этап 2. Получают вторую смесь, для чего берут 10 весовых частей (например, 2,50 г) полиэтиленгликоля 1500, расплавляют при 65 °С, например, в термическом стакане. Далее небольшими порциями добавляют 5 весовых частей (например, 1,25 г), 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана, и 5 весовых частей (например, 1,25 г) 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана и медленно перемешивают до растворения.
Этап 3. Далее обе смеси, полученные по Этапу 1 и Этапу 2, смешивают, например, в термическом стакане, при 65 °С, добавляют 10 весовых частей (например, 2.50 г) активированного угля и 10 весовых частей (например, 2.50 г) поливинилпирролидона. Смесь перемешивают до получения однородной массы, пропускают через сито с диаметром пор, например, 2 мм. Полученные гранулы сушат при комнатной температуре. Получают заявленную композицию.
Гранулы расфасовывают в пакетики по 0.5 г, получают расфасованный лекарственный препарат.
Пероральная лекарственная доза заявленной композиции весом 0.5 г содержит:
0.05 г 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксана,
0,05 г 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан,
0.01 г н-гексадецилтрифенилфосфоний бромида,
0.1 г активированного угля,
0.1 г поливинилпирролидона,
0.1 г полиэтиленгликоля 1500,
0.09 г глюкозы
при их весовом соотношении 5 : 5 : 1 : 10 : 10 : 10 : 9.
Пример 4. Изучение антинематодозной активности в отношении смешанного гельминтоза свиней, вызванного: аскаридой Ascaris suum, эзофагостомой Oesophagostomum dentatum и власоглавом Trichocephalus suis, а также пролонгированного, антиаллергенного, дезинтоксикационного, противовоспалительного действия заявленной композиции.
Антинематодозная активность, а также антимикробное, противовоспалительное, пролонгированное, антиаллергенное, дезинтоксикационное действие заявленной композиции исследована на свинках в ООО «Колос» Тетюшского района Республики Татарстан, а также в условиях вивария кафедры паразитологии и радиобиологии ГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины». У каждой спонтанно инвазированный нематодами свинки индивидуально брали пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц нематодов по методу Фюллеборна.
На основании результатов гельминтоовоскопического исследования были отобраны 10 свинок 3-4 месячного возраста (средний вес от 23 до 25 кг) и разделены на 5 групп по 2 свинки в каждой.
При исследовании антинематодозной активности, а также антимикробного, противовоспалительного, пролонгированного, антиаллергенного, дезинтоксикационного действия заявленной композиции и ее компонентов препараты вводили свинкам перорально в виде гранул весом 0.5 г с кормом 2 раза в день – утром и вечером:
в 1-й группе - использовали заявленную композицию, состоящую из всех семи компонентов;
во 2-й группе – использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан;
в 3-й группе – использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую активированный уголь;
в 4-й группе – использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую поливинилпирролидон;
в 5-группе – использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую  полиэтиленгликоль 1500.
Характеристические данные испытуемых свинок до лечения и дозы лекарственных препаратов на курс дегельминтизации представлены в Таблице 2 на Фиг.2. Как следует из данных Таблицы 2, во всех группах картина крови характеризовалась анемией, лейкоцитопенией, эритроцитопенией.
Фекалии свинок исследовали через 1, 2, 3 и 4 недели после использования исследованных композиций.
Оценка антинематодозной активности исследованных композиций по результатам копрологических исследований фекалий свинок представлены в Таблице 3 на Фиг.3.
Оценка антимикробного, противовоспалительного, пролонгированного, антиаллергенного, дезинтоксикационного действия исследованных композиций представлены в Таблице 4 на Фиг.4.
Результаты, представленные в Таблицах 3 и 4, показывают следующее.
В 1-й группе, принимавшей заявленную композицию из всех 7 компонентов, произошла практически полная дегельминтизация свинок – по заключению патологоанатома, через 4 недели в кишечнике нематоды не обнаружены или обнаружены в незначительном количестве (27 штук в 1 г фекалий), что свидетельствует о высокой ангинематодозной активности заявленной композиции.
Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно в конце второй недели лечения у 1-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид) и дважды у 2-й свинки на 11-й и 14-й день в виде остатков кутикул эзофагостом и аскарид соответственно.
Патогенная бактериальная микрофлора в мазке из носа отсутствует, что свидетельствует об антимикробном действии заявленной композиции.
При этом процесс дегельминтизации в 1-й группе прошел в течение 5 дней с дальнейшим 3-х недельным постепенным очищением организма от остатков нематодов и мертвых яиц, что свидетельствует о пролонгированном действии заявленной композиции.
Практически отсутствовала аллергия и кашель, что свидетельствует об антиаллергенном действии заявленной композиции. Появлявшийся временно в течение 1-2-х дней небольшой кашель свидетельствовал о гибели большого количества личинок нематод в легких, а слабые, заметные лишь для специалиста аллергические реакции были связаны с одновременной гибелью большого количества нематод.
Показатели крови полностью нормализовались уже через неделю, исчезла анемия, лейкопения, эритроцитопения, что свидетельствует об отсутствии аллергического, интоксикационного, воспалительного процессов.
По сравнению со свинками 2-й, 3-й, 4-й групп и 5-й групп, в 1-й группе свинки после  дегельминтизации были наиболее активными, резвились и играли, поноса и каких-либо других побочных эффектов от приема заявленной композиции не наблюдалось. Необходимо отметить улучшение общего состояния свинок и хороший аппетит после приема заявленной композиции.
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что использование заявленной композиции, по сравнению с прототипом, показало:
- высокое антинематодное действие, сопоставимое с прототипом – по результатам лечения нематоды не обнаружены;
- антимикробное действие - показатели крови пришли после лечения в норму, патогенные кокки в микробиологическом содержимом (мазок из носа свинок) не обнаружены;
- противовоспалительное действие – лейкоциты пришли в норму уже через неделю;
- пролонгированное действие - время и, соответственно, качество излечения увеличилось по сравнению с прототипом – процесс дегельминтизации прошел в течение 5 дней с 3-х недельным очищением по сравнению с 1-2 днями с 2-х недельным очищением у прототипа;
- антиаллергенное действие - аллергия, по сравнению с прототипом, практически отсутствовала;
- дезинтоксикационное действие - показатели крови и состояние свинок полностью пришли в норму уже через неделю.
Во 2-й группе использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан, который обеспечивает антимикробное и противовоспалительное действие заявленной композиции.
В течение 4 недель произошло практически полное очищение кишечника свинок от нематод и их останков - по заключению патологоанатома, в кишечнике нематоды не обнаружены.
Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно -на шестой день у 3-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид) и у 4-й свинки на седьмой день в виде остатков кутикул эзофагостом, власоглав и аскарид соответственно. Поноса и каких-либо других побочных эффектов приема композиции не наблюдалось.
Показатели крови медленнее, чем у других свинок пришли в норму, а также в мазках из носа патогенные кокки исчезали на 2 недели дольше, что, по мнению заявителя, свидетельствует о снижении антимикробного действия композиции.
При этом процесс дегельминтизации во 2-й группе прошел в течение 5 дней с дальнейшим 3-х недельным постепенным очищением организма от остатков нематод и мертвых яиц, что свидетельствует о пролонгированном действии.
В течение 4-6 дней наблюдался кашель, в течение 3 недель наблюдалось повышенное содержание лейкоцитов в крови, что, по мнению заявителя, свидетельствует о снижении противовоспалительного действия композиции.
Аллергические реакции практически отсутствовали.
Показатели крови, кроме лейкоцитов, полностью нормализовались через 2 недели, что свидетельствует о дезинтоксикационном действии композиции.
Таким образом, по сравнению со свинками 1-й, 3-й, 4-й и 5-й групп, во 2-й группе  снизился антимикробный и противовоспалительный эффект действия композиции.
Из описанного выше можно сделать вывод, что использование композиции, не содержащей 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан, показало:
- антинематодозное действие такое же, как и в других группах – по результатам лечения нематоды не обнаружены, однако очищение свинок проходило медленнее;
- пролонгированное действие - время и, соответственно, качество излечения сопоставимы с заявленной композицией;
- антиаллергенное действие - аллергия практически отсутствовала;
- дезинтоксикационное действие - показатели крови, кроме лейкоцитов, и состояние свинок сопоставимы с заявленной композицией;
- снижение антимикробного действия - в течение двух недель в мазке из носа обнаруживали патогенные кокки;
- снижение противовоспалительного действия – лейкоциты крови пришли в норму через 3 недели по сравнению с 1 неделей у заявленной композиции.
В 3-й группе использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую активированный уголь, который обеспечивает как антиаллергическое и дезинтоксикационное действие, так и пролонгированное действие заявленной композиции.
В течение 4 недель произошло практически полное очищение кишечника свинок от нематод и их останков – по заключению патологоанатома, в кишечнике нематоды не обнаружены или обнаружены в незначительном количестве (35 штук в 1 г фекалий).
Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно – на шестой день у 5-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид) и у 6-й свинки на седьмой день в виде остатков кутикул эзофагостом, власоглав и аскарид соответственно. Поноса и каких-либо других побочных эффектов приема композиции не наблюдалось.
Патогенная бактериальная микрофлора в мазке из носа отсутствует, что свидетельствует об антимикробном действии заявленной композиции.
При этом процесс дегельминтизации в 3-й группе прошел в течение 1-2 дней (по сравнению с 5 днями в 1-й группе), с дальнейшим 2-х недельным постепенным очищением организма от остатков нематод и мертвых яиц (по сравнению с 3-х недельным в 1-й группе), что свидетельствует об отсутствии пролонгированного действия композиции, не содержащей активированный уголь.
У свинок 3-й группы в течение 2-х недель наблюдался кашель, что свидетельствует об интоксикационном и аллергическом процессах, в течение 3-х недель наблюдались сильные кожные аллергические реакции. Указанное свидетельствует об отсутствии антиаллергенного действии композиции, не содержащей активированный уголь.
Показатели крови полностью нормализовались через 2 недели, лейкоциты пришли в норму через 1-2 недели, по сравнению с 1 неделей в 1-й группе, что свидетельствует о снижении дезинтоксикационного действия.
Таким образом, по сравнению со свинками 1-й, 2-й, 4-й и 5-й групп, в 3-й группе  отсутствовал пролонгированный эффект действия композиции, были более выражены аллергия и кашель.
Из описанного выше можно сделать вывод, что использование композиции, не содержащей активированный уголь, показало:
- антинематодозное действие – по результатам лечения нематоды не обнаружены или обнаружены в единичных количествах;
- антимикробное действие - микробиологические исследования мазков из носа без патогенов;
- противовоспалительное действие – лейкоциты сопоставимы с заявленной композицией;
- отсутствие пролонгированного действия по сравнению с заявленной композицией - время и, соответственно, качество излечения уменьшилось;
- отсутствие антиаллергенное действия – наблюдалась сильная аллергия и кашель по сравнению с заявленной композицией;
- снижение дезинтоксикационного действия - показатели крови по сравнению с заявленной композицией пришли в норму через 2 недели по сравнению с 1 неделей у заявленной композиции.
В 4-й группе использовали композицию из шести  компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую поливинилпирролидон, который обеспечивает дезинтоксикационные свойства заявленной композиции ввиду способности к комплексообразованию.
В течение 4 недель произошло практически полное очищение кишечника свинок от нематод и их останков – по заключению патологоанатома, в кишечнике нематоды  не обнаружены.
Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно в конце второй недели лечения у 7-й  и 8-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид и других нематод). Свинки после дегельминтизации были активными и каких-либо других побочных эффектов приема препаратов не наблюдалось.
При этом процесс дегельминтизации в 4-й группе прошел в течение 5 дней с дальнейшим 3-х недельным постепенным очищением организма от остатков нематод и мертвых яиц, что свидетельствует о пролонгированном действии.
Патогенная бактериальная микрофлора в мазке из носа отсутствует, что свидетельствует об антимикробном действии.
В течение 5-6 дней наблюдался кашель, а также небольшие аллергические реакции, что свидетельствует об интоксикации в результате гибели большого количества личинок нематод в легких. При этом в крови содержалось повышенное количество лейкоцитов.
Показатели крови полностью пришли в норму через 2-3 недели, лейкоциты пришли в норму через 1-2 недели, по сравнению с 1 неделей у заявленной композиции, исчезла анемия, лейкопения, эритроцитопения.
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что использование композиции, не содержащей поливинилпирролидон, показало:
- антинематодозное действие – по результатам лечения нематоды не обнаружены или обнаружены в единичных количествах;
- антимикробное действие - микробиологические исследования мазков из носа без патогенов;
- противовоспалительное действие – показатели крови сопоставимы с заявленной композицией;
- пролонгированное действие - время и, соответственно, качество излечения сопоставимы с заявленной композицией;
- антиаллергенное действие - аллергия практически отсутствовала;
- снижение дезинтоксикационного действия по сравнению с заявленной композицией - показатели крови нормализовались в течение 2-3 недель по сравнению с 1 неделей у заявленной композиции, наблюдался кашель.
В 5-й группе использовали композицию из шести компонентов, аналогичную заявленной, но не содержащую полиэтиленгликоль 1500, который обеспечивает лучшее смешение и растворимость гидрофобных компонентов заявленной композиции,  способствует загущению смеси входящих в композицию веществ и усилению ее противовоспалительного действия.
В течение 4 недель произошло практически полное очищение кишечника свинок от нематод и их останков – по заключению патологоанатома, в кишечнике нематоды  не обнаружены.
Фекалии осветленного цвета пластилиновой консистенции появились однократно в конце второй недели лечения у 9-й и 10-й свинки (микроскопия выявила остатки кутикулы аскарид и других нематод).
Патогенная бактериальная микрофлора в мазке из носа отсутствует, что свидетельствует об антимикробном действии заявленной композиции.
Процесс дегельминтизации в 5-й группе прошел в течение 5 дней с дальнейшим 3-х недельным постепенным очищением организма от остатков нематодов и мертвых яиц, что свидетельствует о пролонгированном действии.
Аллергические реакции практически отсутствовали.
Показатели крови нормализовались через 3 недели, исчезла анемия, лейкопения, эритроцитопения.
При приготовлении композиции, не содержащей ПЭГ-1500, наблюдалось ухудшение смешения и растворимости компонентов композиции по сравнению с композициями в 1-4-й группах.
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что использование композиции, не содержащей полиэтиленгликоль 1500, показало:
- антинематодозное действие – по результатам лечения нематоды не обнаружены;
- антимикробное действие – микробиологические исследования мазков из носа без патогенов.
- противовоспалительное действие – лейкоциты сопоставимы с заявленной композицией;
- пролонгированное действие - время и, соответственно, качество излечения сопоставимы с заявленной композицией;
- антиаллергенное действие - аллергия практически отсутствовала;
- дезинтоксикационное действие - показатели крови, кроме лейкоцитов, и состояние свинок сопоставимы с заявленной композицией;
- ухудшение смешения и растворимости компонентов композиции при ее приготовлении.
Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что заявленная композиция обладает высоким антинематодозным действием при низких лечебных дозах 0,044 – 0,047 г/кг, в то время как препараты пиперазинового ряда используются в дозах 0.33 г/кг (в 8 раз превышают дозу заявленной композиции). При этом не наблюдается расстройств стула и других признаков кишечной инфекции.
50
Уровень острой токсичности заявленной антинематодозной композиции ЛД 3500 мг/кг на мышах в условиях внутрибрюшинного и перорального способов введения соответствует категории «относительно безвредные» - IV класс токсичности по Измерову [Измеров Н.Ф.,Саноцкий И.В.,Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении (Справочник). – М.: Медицина, 1977. – С 196-197].
При этом каждый компонент заявленной композиции вносит свой вклад в ее действие:
- 5,7-динитро-4,6-бис-(3-нитрофениламино)бензофуроксан – компонент, генерирующий NO in vivo и вызывающий спастические судороги нематод, и в итоге парализующий мышечную ткань нематод;
- 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан – компонент, генерирующий NO in vivo и вызывающий спастические судороги нематод, и в итоге парализующий мышечную ткань нематод, одновременно оказывающее антимикробное и противовоспалительное действие;
- н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид – проникающий через мембраны кутикулы компонент, приводящий к гибели нематод и патогенной микрофлоры за счет доступности пищеварительных соков хозяина внутри нематоды (что подтверждается разрушением кутикулы нематод, пластилинообразным состоянием фекалий и отсутствием нематодов в фекалиях животных или присутствием их в единичном количестве);
- активированный уголь обеспечивает пролонгированное действия заявленной композиции и ее антиаллергенные и дезинтоксикационные свойства;
- поливинилпирролидон – обеспечивает дезинтоксикационные свойства заявленной композиции;
- полиэтиленгликоль 1500 - обеспечивает лучшее смешение и растворимость компонентов, загущение смеси входящих в композицию веществ;
- глюкоза – обеспечивает маскировку вкуса и является необходимой «приманкой» для гельминта в кишечнике хозяина, так как является основным питательным веществом гельминтов.
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнуты поставленные задачи и заявленный технический результат, превышающий технический результат прототипа, а именно:
•  создана антинематодозная композиция для ветеринарии, включающая семь компонентов – 5,7-динитро-4,6-бис(3-нитрофениламино)бензофуроксан, 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксан, н-гексадецилтрифенилфосфоний бромид, активированный уголь, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль 1500 и глюкозу при их весовом соотношении 5 : 5 : 1 : 10 : 10 : 10 : 9, которая обладает:
- антимикробным и противовоспалительным действием путем введения 4,6-бис(4-гидроксифениламино)-5,7-динитробензофуроксана;
- пролонгированным высвобождением композиции, что приводит к более эффективному, но мягкому и менее травмирующему излечению путем введения в состав композиции активированного угля;
- антиаллергенным действием путем введения в состав композиции активированного угля;
- дезинтоксикационным действием путем введения в состав композиции поливинилпирролидона и активированного угля;
-   улучшенным смешением компонентов при растворении в расплавленном полиэтиленгликоле 1500;
- более удобной лекарственной формой в виде небольших гранул в результате пропускания через сито, что расширяет круг животных, способных к лечению заявленной композицией.
50
При этом заявленная композиция обладает высокой эффективностью в отношении гельминтов, а также низкими лечебными дозами 0,044 – 0,047 г/кг и высоким значением ЛД3500 мг/кг, что обеспечивает расширение арсенала известных средств указанного назначения.
• разработан способ получения заявленной композиции, имеющий новизну и изобретательский уровень, так как заявленная композиция и последовательность действий не выявлена заявителем из уровня техники и не выявлено влияние совокупности признаков на заявленный технический результат.
Решение поставленных задач и заявленного технического результата приводит к повышению терапевтической эффективности заявленной композиции по сравнению с прототипом и расширяет арсенал средств указанного назначения.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как на дату предоставления заявочных материалов заявителем из исследованного уровня техники не выявлены источники, обладающие совокупность признаков, идентичными совокупности признаков заявленного технического решения.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, т. к. совокупность заявленных признаков обеспечивает получение неочевидных для специалиста технических результатов, превышающих технический результат прототипа. Заявителем из исследованного уровня техники не выявлены составы, в которых одновременно использовались бы заявленные компоненты в заявленном соотношении и в заявленном назначении, а именно – в составе антинематодозной композиции. При этом соотношение компонентов было подобрано заявителем опытным путем. В выявленных источниках также отсутствует последовательность действий заявленного способа, следовательно, заявленный способ не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость» предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и известных приемов.