Способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте и бактериальных культур, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур с использованием составной среды для заморозки
METHOD OF PRESERVING BACTERIA IN FAECAL MICROBIOTA AND BACTERIAL CULTURES GROWN ON DENSE AGARIZED NUTRIENT OR DIFFERENTIAL MEDIA IN LOW TEMPERATURE USING COMPOSITE MEDIUM FOR FREEZING

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры человека, бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника, а также сохранения бактерий в рабочей коллекции для проведения микробиологических исследований.
Изобретение можно также отнести к области биотехнологии, в частности к способам сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека и бактерий в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации.
Предлагаемое техническое решение позволяет сохранять бактерии в фекалиях человека в естественных условиях и бактериальные культуры, выделенные из фекальной микробиоты в условиях низких температур, в том числе в условиях криоконсервации. Методика отвечает критериям высокой выживаемости бактерий - на уровне 85-90%, а также сохранения исходного соотношения различных групп микроорганизмов после размораживания.
Проблема сохранения микрофлоры человека охватывает как медицинские, так и экологические аспекты сохранения биоразнообразия микроорганизмов для последующего использования в промышленных и биомедицинских технологиях.
Самым надежным во всех отношениях способом сохранения кишечной микрофлоры человека на сегодняшний день является замораживание и сохранение симбиотических микробных сообществ в условиях низких температур, в том числе в жидком азоте.
Однако, несмотря на огромные достижения криомикробиологии, проблема замораживания и сохранения в жидком азоте сложных микробиоценозов до сих пор не решена. Отсутствие универсального метода криоконсервации для широкого спектра микроорганизмов, населяющих желудочно-кишечный тракт, делает проблему криоконсервации чрезвычайно актуальной в плане сохранения микроэкологических ресурсов человека. Уже сейчас можно однозначно сказать, что низкотемпературная консервация сложных симбиотических сообществ человека возможна, несмотря на индивидуальную вариабельность по количеству и соотношению микроорганизмов в составе микробиома в зависимости от возраста, пола, образа жизни и состояния здоровья человека.
Есть данные о замораживании микробиоты кишечника человека до криогенных температур -70°С, -196°С в криозащитных средах с глицерином, с ДМСО, природными и синтетическими полимерными веществами. Выбор криопротектора или их комбинации, а также выбор правильного режима замораживания и оттаивания лежат в основе разработки технологии сохранения микроорганизмов симбиотической микробиоты человека в условиях криоконсервации при низких температурах, рассчитанной на годы и десятилетия хранения микроэкологических ресурсов в криобанке.
В настоящее время используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания и оттаивания конкретных объектов, так как выживаемость и стойкость бактерий при замораживании в жидком азоте зависит от ряда факторов, в частности, от вида бактериальных клеток и их концентрации в суспензии, чувствительности бактерий к замораживанию и оттаиванию в зависимости от их принадлежности к таксономической группе. Немаловажное значение имеют физико-химические свойства; количественное содержание бактерий и ряд других свойств бактериальной биомассы, подлежащей замораживанию; состав защитной среды для криозамораживания (для сохранения бактерий при замораживании существенным является выбор защитной среды, природы и химического строения присутствующего в ней криопротектора и физико-химические особенности его взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фаз замораживаемых бактериальных клеток); режим охлаждения (при замораживании бактериальных клеток происходит образование микрокристаллов льда как внутри бактериальных клеток, так и снаружи, при этом характер их изменений зависит от свойств криопротектора, и, главным образом, от скорости охлаждения); режим хранения (при температуре -70°С или в жидком азоте при температуре - 196°С). При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию бактериальной клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении бактериальные клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки.
Наилучший эффект достигается обычно при замораживании в жидком азоте при температуре - 196°С. Одним из преимуществ быстрого охлаждения является условия действия концентрированных солевых растворов после выделения льда, которое занимает менее продолжительный период времени до достижения их эвтектической точки.
Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений бактериальных клеток при охлаждении, замораживании и последующем оттаивании. Механизм защитного действия криопротекторов основан на создании ими более прочной связи с молекулами воды, что препятствует формированию правильной кристаллической решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания криопротектор удаляют из бактериальных клеток путем последовательных отмываний и центрифугирования.
Известен способ замораживания бактерий в гранулах с применением стерильного расплавленного 10%-ного раствора желатина в 0,9% физиологическом растворе (NaCl). Суспензию бактериальных клеток смешивают с 10%-ным раствором желатина в отношении 1:1 для формирования при замораживании желатиновых шариков с достаточным количеством бактериальных клеток. Для создания анаэробных условий азот продувают через подготовленный раствор с клетками. Суспензию бактериальных клеток при помощи дозатора по 50 и/или 100 мкл наносят на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Получившиеся замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на сохранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (криохранилище) (см. патент РФ №2123044).
Недостатком данного способа является необходимость создания анаэробных условий путем продувания клеток через пары жидкого азота; хранение должно осуществляться только в жидком азоте, и, следовательно, требует наличия криохранилищ; при оттаивании бактериальные клетки должны быть освобождены от желатина.
Известен способ замораживания бактерий, предусматривающий отделение бактерий центрифугированием, смешивание суспензии бактериальных клеток с защитной средой в соотношении 1:1, содержащей глицерин, сахарозу, лимоннокислый натрий и замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Бактериальный концентрат, полученный таким способом, сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре не выше -18°С (см. авторское свидетельство СССР №457727). Недостаток этого изобретения заключается в том, что при оттаивании бактерий необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды. Однако при использовании этого способа криозаморозки в процессе хранения происходит слипание гранул, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.
Известен способ замораживания молочнокислых бактерий, предусматривающий смешивание в соотношении 1:1 молочнокислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимоннокислый натрий и замораживания полученной смеси в жидком азоте в виде гранул, отличием которого от предыдущего изобретения является то, что защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2. При этом дополнительно в защитную среду вводят лактозу и желатин, обеспечивающие исключение слипания гранул молочнокислых бактерий после оттаивания (см. патент РФ RU 2427624).
Недостаток этого изобретения заключается в том, что при оттаивании необходимо использовать центрифугирование для отделения бактериальных клеток от криозащитной среды, что затрудняет процесс получения исходного титра бактериальных культур.
Анализ известных технических решений из уровня техники показал, что на данный момент наиболее близких аналогов предлагаемому техническому решению не выявлено.
Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является создание оптимальных условий сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека или бактериальных культур, выделенных из фекалий человека, выращенных на плотных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур (-80°С и -196°С), для обеспечения сохранения исходного титра микроорганизмов после замораживания и оттаивания.
Технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе сохранения бактерий в фекалиях кишечника человека или бактериальных культур, выделенных из фекалий человека, выращенных в чашках Петри на плотных питательных или дифференциальных средах, помещают в стерильные условия, отбирают 0,1 г фекалий человека или бактериальные культуры, смытые ватным тампоном со всей поверхности питательной среды, помещают в криопробирки, рассчитанные на 2 мл, смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой, состоящей из: дистиллированной воды 500 мл, бактериологического сухого Европейского агара 2 г, NaCl 2,5 г, дрожжевого экстракта 1 г, L-цистеина 0,2 мг, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, декстрозы 5 г с 10% глицерином, перемешивают на вортексе в течении 2-5 минут до получения однородной массы, затем криопробирки завинчивают крышкой и помещают в соответствующее хранилище, где первоначально подвергают заморозке, а затем оставляют для хранения при низких температурах до тех пор, пока не потребуется использовать хранящийся материал, при этом оттаивание криопробирок с бактериальными культурами и фекалиями производят непосредственно перед проведением исследований, для чего требуемые для исследования образцы вынимают из низкотемпературного хранилища, размораживают в течение 45 сек. на прогретой заранее до температуры +37°С водяной бане, затем образцы вынимают из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного оттаивания.
Для создания стерильных условий используют ламинарный или анаэробный бокс.
В качестве хранилища для заморозки и хранения используют морозильную камеру с температурой от - 70°С до - 80°С или сосуд Дьюара с температурой -196°С.
Для замораживания образцы фекалий человека или бактериальных культур, выделенные из фекалий помещают в криопробирки в соотношении 1:2 с криозащитной средой. Такая пропорция используется потому, что количество микроорганизмов, снятых с чашки тампоном со всей поверхности питательной среды, помещенное в криопробирку должно быть полностью покрыто и размешано с криосредой. Для этого 0,1 г фекалий помещают в криопробирку и смешивают в соотношении 1:2 с криозащитной средой. Полученные суспензии гомогенизируют на вортексе в соответствующих каждому микроорганизму условиях: анаэробный или ламинарный бокс, затем помещают в низкотемпературный морозильник на -80°С, исключая предварительное замораживание при других более низких температурах, что обеспечивает защиту микроорганизмов от повреждающего действия замораживания, сохранность жизнеспособность разных таксономических групп микроорганизмов как в чистой культуре, так и в условиях симбиоза в фекальной микробиоте с сохранением титра; снижение риска или исключение формирования внутриклеточного льда и обезвоживания микроорганизмов в условиях низких температур.
По мере необходимости, требуемые для исследования образцы, вынимают из низкотемпературного хранилища и осуществляют размораживание путем оттаивания криопробирок с бактериальными культурами и фекалиями, которое производят непосредственно перед проведением исследований.
Содержимое аликвот (криопробирок) проверяют на наличие живых микробных клеток. Дифференциацию живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотируемых образцах микробиоты человека проводят по методу Виноградского-Брида путем прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева. Пригодные к исследованию аликвоты с образцами используют для дальнейших исследований.
Использование предлагаемого способа заморозки и разморозки обеспечивает сохранение микроорганизмов разных таксономических групп, поскольку при реализации предлагаемого способа: используется специализированная среда, в которой в качестве непроникающего криопротектора имеется панкреатический гидролизат казеина и декстроза; для восстановления культуральных и ростовых качеств бактериальных культур после заморозки в состав входит дрожжевой экстракт и L-цистеин; в качестве проникающего криопротектора используется 10% глицерин. Все перечисленные компоненты позволяют защитить микроорганизмы от повреждающего действия замораживания, а также предложенный способ заморозки и разморозки биологического материала и бактериальных культур способствует сохранению их титра, так как при использовании предложенного способа микроорганизмы имеют возможность восстановить свою жизнеспособность после замораживания. Примеры реализации способа:
Пример 1.
Суточные бактериальные культуры Escherichia coli, Escherichia coli hem+, Enterococcus faecalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Salmonella spp., Enterobacter aerogenes, E. durans, Parabacterodes mirdae, K. pneumoniae, K. oxytoca, K. varicolla, C. freundii, Enterobacter cloaceae, P.mirabilis, E. casseliflavus, Weissella confusa, S. haemolyticus, S. pasteuri, Clostridium perfringens hem+, выделенные из нативного кала, пассировались на агаризованной дифференциальной среде при температуре 37°С в течение 24 часов.
Готовили миллиардную взвесь каждой культуры по оптическому стандарту мутности. Для осуществления контроля готовили серийные разведения с дальнейшим высевом на соответствующие каждому микроорганизму плотные - дифференциальные среды. Бактерии высевали методом прямого посева по 0,1 мл на соответствующие плотные питательные среды.
В качестве криопротекторов использовали составную агаризованную среду для заморозки, состоящую из 500 мл дистиллированной воды, бактериологического сухого Европейского агара, NaCl, дрожжевого экстракта, L-цистеина; панкреатического гидролизата казеина, декстрозы и 10% глицерина.
Миллиардную взвесь каждой культуры объемом 100 мкл помещали в криопробирки, затем в эти же пробирки добавляли составную среду для заморозки в соотношении 1:2. Затем криопробирки гомогенизировали на вортексе, помещали в сосуд Дьюара на -196°С или в низкотемпературный морозильник на -70°С.
Через трое суток криопробирки вынимали, помещали на 45 секунд в подготовленную и разогретую заранее до 37°С водяную баню и затем оставляли при комнатной температуре до полного размораживания.
После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл на агаризованные среды. После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведений.
Пример 1 реализации предлагаемого способа поясняется диаграммами и графиками, показанными на фиг. 1, фиг. 2
6
На фиг. 1 - показано, что титр бактериальных культур Salmonella spp., Enterobacter aerogenes, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Parabacterodes mirabilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum после хранения при низких температурах был сохранен за счет использования криосреды и технологии заморозки и разморозки бактериальных культур. Исключение составил штамм бактерии Escherichia coli, который сохранился после разморозки в титре 10 КОЕ, что можно объяснить тем, что бактериальная смесь была недостаточно гомогенизирована со средой для замораживания на вортексе, что привело к изменению их титра при оттаивании на 3 логарифма.
На фиг. 2 - показано, что титры бактериальных культур K. pneumoniae, K. oxytoca, K. varicolla, C. freundii, P.mirabilis, Е. casselinavus, S. pasteuri, Clostridium perfringens hem+после хранения при низких температурах сохранились за счет использования криосреды и способа заморозки и разморозки бактериальных культур. Исключение составили штаммы бактерий Enterobacter cloaceae, Weissella confusa, S. haemolyticus, которые сохранились после разморозки с потерей титра на 1 lg, что можно объяснить тем, что эти бактерии были недостаточно гомогенизированы со средой для замораживания на вортексе перед процессом их заморозки, что привело к изменению их титра при оттаивании.
Предлагаемый способ сохранения бактерий, выделенных из фекальной микробиоты в условиях хранения в сосуде Дьюара на -196°С и в низкотемпературном морозильнике на -70°C с использованием составной среды для заморозки, а также в предложенном способе заморозки и разморозки, позволяет сохранить титр и увеличить возможность восстановления жизнеспособности бактерий после хранения в условиях низких температур.
Пример 2.
Проверку содержимого аликвот (криопробирок с фекалиями микробиоты) проверяли на наличие живых микробных клеток. Дифференциация живых и мертвых бактериальных клеток в аликвотах образцов фекальной микробиоты человека проводили используя метод Виноградского-Брида путем прямого подсчета живых и мертвых бактериальных клеток в гетерогенной суспензии с использованием камеры Горяева.
Исследования проводили при комнатной температуре (24-26)°С в ламинарном боксе, соблюдая правила асептики.
Пример 2 реализации предлагаемого способа поясняется диаграммой, показанной на фиг. 3
Проверка содержимого аликвот с микроорганизмами в образцах фекальной микробиоты и бактерий, выделенных из фекальной микробиоты на жизнеспособность служит дополнительным контролем к определению пригодности к дальнейшему их хранению.
На фиг. 3 - показано количество жизнеспособных клеток каждого из 11 исследуемых образцов, окрашенных с использованием красителя трипанового синего, из всей совокупности бактериальных клеток существенно выше, чем мертвых, что является достоверным и подтверждается методом математической статистики.
Пример 3
Были проведены исследования более 100 проб нативного кала и определен бактериальный состав и титр фекальной микробиоты кишечника. Для этого 0,1 г биологического материала от каждой пробы фекальной микробиоты кишечника помещался в криопробирки в соотношении 1:2 с составной криозащитной средой для заморозки, состоящей из 500 мл дистиллированной воды, 2 г бактериологического сухого Европейского агара, 2,5 г - NaCl, 1 г - дрожжевого экстракта, 0,2 мг L-цистеина, панкреатического гидролизата казеина 8,5 мг, 5 г декстрозы и 10% глицерина и гомогенизировали на вортексе, затем помещали в сосуд Дьюара на -196°С и в низкотемпературный морозильник на -70°С. Через трое суток криопробирки вынимали, помещали на 45 секунд в заранее подготовленную и разогретую до 37°С водяную баню, вынимали и оставляли при комнатной температуре до полного размораживания. После полной разморозки содержимое криопробирок гомогенизировали на вортексе и готовили бактериальные суспензии методом серийных разведений для бактериологического посева по 0,1 мл на агаризованные среды.
После суточной инкубации при 37°С посевов учитывали результаты путем подсчета выросших колоний на чашках с учетом разведений (таблица 2 - Исходный видовой состав проб фекалий перед проведением процедуры криоконсервации)
Предложенный пример доказывает, что предлагаемый способ сохранения бактерий в фекальной микробиоте в жидком азоте в сосуде Дьюара на -196°С и в низкотемпературном морозильнике на -70°C с использованием составной среды для заморозки, способа заморозки и разморозки, способствуют сохранению титра микроорганизмов, так как при использовании предложенного способа микроорганизмы имеют возможность восстановить свою жизнеспособность после замораживания, в том числе из-за постепенной разморозки.
Предлагаемый способ позволяет сохранять жизнеспособность
бактерий разных таксономических групп в фекалиях человека или бактериальных культур, выделенных из фекальной микробиоты, выращенных на плотных агаризованных питательных или дифференциальных средах в условиях низких температур, что дает возможность не только сохранить микробиоценоз в фекалиях при заморозке, но и позволит сохранить и сократить расходы на ведение рабочих коллекций микроорганизмов в микробиологических лабораториях.