СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ОЛЕАНОЛОВУЮ КИСЛОТУ, И ЕГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD OF PRODUCING TRIPEPTIDE CONTAINING OLEANOLIC ACID AND ITS THERAPEUTIC APPLICATIONS

Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящее представляет собой подачу заявки PCT, заявляющей приоритет по первоначальной индийской заявке № 201741033476, поданной 21 сентября 2017 года, подробности которой включены в данный документ посредством ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к противовозрастному трипептиду для ухода за кожей. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения трипептида, содержащего олеаноловую кислоту, и его терапевтическим применениям.
Описание предшествующего уровня техники
Кожа является самым большим и наиболее массивным органом человеческого тела. Кожа человека состоит из наружного эпидермального слоя, и дерма состоит из сосудистой соединительной ткани под эпидермисом. Эпидермис главным образом состоит из кератиноцитов, которые продуцируют кератины, промежуточные филаменты, которые обеспечивают механическую стабильность. Дерма главным образом состоит из внеклеточного матрикса (ECМ - extracellular matrix), обогащенного плотным коллагеном. ECM синтезируется, организуется и поддерживается фибробластами дермы, которые отвечают за прочность при растяжении и механические свойства кожи.
С возрастом кожа человека подвергается многим изменениям, которые включают разрушение коллагена и эластина, обвисание, образование морщин, истончение эпидермиса, уменьшение уровня меланоцитов и потеря способности к образованию меланина, сальные железы продуцируют меньше кожного сала, что приводит к потере увлажненности и сухости, потере подкожного жирового слоя, потере изоляционных свойств и объема и слабой способности к заживлению ран. Существует несколько факторов, которые вызывают преждевременное старение кожи и на которые можно воздействовать для введения постепенного старения кожи.
Пептиды участвуют во многих физиологических процессах. Пептиды в косметических продуктах, как известно, замедляют или обращают старение. Существуют разные классы пептидов, которые включают: сигнальные пептиды, пептиды - ингибиторы ферментов, пептиды, воздействующие на нейротрансмиттеры, пептиды - носители и т.д.
В настоящее время на предупреждение старения кожи в значительной степени направлены усилия промышленных предприятий в отрасли косметики, и существует потребность в продуктах, которые предотвращали бы старение кожи. В настоящее время в индустрии ухода за кожей используются синтетические пептиды, благодаря пользе, которую они приносят. Роль синтетических пептидов в старении, красоте, фотоповреждении и здоровом состоянии кожи хорошо описана в следующих документах предшествующего уровня техники:
US 6620419 B1 относится к косметическому или кожно-фармацевтическому применению пептидов для заживления, увлажнения и улучшения внешнего вида кожи во время естественного или искусственного старения (гелиодермия, загрязнение).
US 20130336904 A1 относится к новым омолаживающим пептидам, модулирующим выживаемость, и включающим их композициям.
US 20110160137 A1 относится к композиции, содержащей пептид коллагена для улучшения ухода за кожей.
Несмотря на то, что о применении синтетических пептидов для применения в уходе за кожей известно, о трипептиде: лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированном с олеаноловой кислотой, не известно в данной области. Кроме того, синтетические пептиды, которые в настоящее время используются для ухода за кожей, являются дорогими. Следовательно, существует необходимость в создании синтетического пептида, который был бы дешевле и мог бы эффективно использоваться для уменьшений всех признаков старения. Настоящее изобретение решает упомянутую выше проблему, раскрывая полезное действие трипептида: лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированного с олеаноловой кислотой, на уменьшение старения кожи.
Основная цель изобретения заключается в раскрытии способа получения трипептида, содержащего олеаноловую кислоту, обладающего омолаживающими свойствами в отношении кожи.
Другая цель изобретения заключается в раскрытии омолаживающей активности трипептида лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированного с олеаноловой кислотой, являясь противовоспалительным средством и за счет ингибирования активности коллагеназы и эластазы.
Настоящее изобретение достигает упомянутых выше целей и дополнительно связанных с ними преимуществ.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении раскрыт олеаноил-KVK трипептид для предупреждения старения кожи. Более конкретно, в изобретении раскрыты антиколлагеназная активность, антиэластазная активность, защита от УФ (ультрафиолетовое излучение), защита от окислительного стресса и другие свойства олеаноил-KVK трипептида, который помогает в предупреждении старения кожи и, таким образом, является важным продуктом по уходу за кожей.
В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения трипептида структуры 1 с SEQ. ID #1, присоединенной к олеаноловой кислоте, включающий следующие этапы: (a) обработки Boc-Lys(Cbz)-OH, где обе аминокислотные группы L-лизина защищены, бензилбромидом в ацетоне и карбонатом калия с получением Boc-Lys(Cbz)-OBzl; (b) гидролиза Boc-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (a) с получением H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl; (c) связывания H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl с этапа (b) с Boc-Val-OH в присутствии N,N'-Дициклогексилкарбодиимида, гидроксибензотриазола и триэтиламина с получением Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (d) обработки Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl, полученного на этапе (c), трифторуксусной кислотой с получением H-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (e) связывания H-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (d) с Boc-Lys(Cbz)-OH в присутствии N,N'-Дициклогексилкарбодиимида, гидроксибензотриазола и триэтиламина с получением Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (f) обработки Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (e) трифторуксусной кислотой с получением H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (g) связывания H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (f) с 3-O-ацетил-олеаноилхлоридом (синтезированным из 3-O-ацетилолеаноловой кислоты и тионилхлорида) в присутствии триэтиламина с получением (3-O-ацетил-олеаноил)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (h) гидрогенизации (3-O-ацетил-олеаноил)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (g) в присутствии палладиево-углеродного катализатора катализатора спиртовой среде с получением 3-O-Ацетил-Олеаноил-Lys-Val-Lys; (i) гидролиза ацетильной группы, используя основание, с получением трипептида SEQ. ID #1, связанного с олеаноловой кислотой,
где SEQ. ID #1 представляет собой K-V-K, и структура 1 представляет собой
такую, как представлено ниже:
Структура 1.
В одном аспекте настоящего изобретения предложен трипептид SEQ. ID #1, связанный с олеаноловой кислотой, как получено упомянутым выше способом.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи у млекопитающих, включающий этапы приведения кожи млекопитающего в контакт с эффективной концентрацией трипептида SEQ. ID #1, связанного с олеаноловой кислотой, для предупреждения старения кожи.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая трипептид SEQ. ID #1, присоединенный к олеаноловой кислоте, приготовленная с фармацевтически/косметически приемлемыми вспомогательными веществами, адъювантами, основами, разбавителями, носителями, эмоллиентами, усилителями биодоступности, антиоксидантами и консервантами, и/или включенная в составы, содержащие омолаживающие ингредиенты, и которую вводят местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыла, скрабов, эмульсий и компактных пудр.
Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего предмета изобретения будут более понятны со ссылкой на следующее описание и прилагаемую формулу изобретения. Данное краткое описание изобретения приведено для того, чтобы ввести ряд понятий в упрощенной форме. Данное краткое описание изобретения не предназначено для идентификации ключевых признаков или основных признаков заявленного предмета изобретения, как и не предназначено для использования для ограничения объема заявленного предмета изобретения.
Краткое описание чертежей
Следующие графические материалысоставляют часть настоящего описания изобретения и включены для дополнительной иллюстрации аспектов настоящего раскрытия. Раскрытие может быть лучше понято посредством ссылки на графические материалы в сочетании с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в данном документе.
На Фиг. 1 изображено графическое представление выраженного в процентах ингибирования активности коллагеназы, демонстрируемого трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 2 изображено графическое представление выраженного в процентах ингибирования активности эластазы, демонстрируемого трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 3: изображено графическое представление выраженного в процентах увеличения пролиферации фибробласта, демонстрируемого трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
Фиг. 4: На Фиг. 4a изображено графическое представление выраженного в процентах увеличения в продукции коллагена в фибробластах, демонстрируемого трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой, Фиг. 4b (Контроль) и 4c (обработка олеаноил-KVK) представляют собой графическое представление выраженного в процентах увеличения в окрашивании коллагена в фибробластах в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 5 изображено графическое представление концентрации TGF-β (transforming growth factor beta - трансформирующий фактор роста бета) в супернатанте культуры, демонстрируемого трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 6 изображено графическое представление защиты от повреждения ДНК, вызываемого УФ, демонстрируемой трипептидом лизин-валин-лизин (KVK), конъюгированным с олеаноловой кислотой. (6a) Сокращение в раннем апоптозе; (6b) сокращение в позднем апоптозе; (6c) увеличение уровня живых клеток; (6d) защита от повреждения и гибели ДНК, вызываемых УФ, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 7 изображены графики по проточной цитометрии, показывающие защиту от повреждения и гибели ДНК, вызываемых УФ, обработанных и необработанных образцов, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 8 изображено графическое представление защиты от окислительного стресса, как показано олеаноил-KVK. (8a) Выраженная в процентах утилизация АФК (активные формы кислорода), индуцируемых УФ B (средневолновое ультрафиолетовое излучение); (8b) выраженная в процентах утилизация АФК, индуцируемых тяжелыми металлами, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 9 изображено графическое представление повышенных уровней экспрессии коллагена, TGF-β и гиалуронансинтазы в фибробластах дермы человека в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 10 изображено графическое представление повышенных уровней экспрессии коллагена, эластина, TGF-β, гиалуронансинтазы и эпидермального фактора роста кератиноцитами, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
На Фиг. 11 изображено графическое представление вызываемого окислительным стрессом повышения уровня экспрессии матриксной металлопротеазы и фактора некроза опухоли кератиноцитами, и их ингибирования посредством обработки олеаноил-KVK в соответствии с воплощением настоящего раскрытия, в соответствии с воплощением настоящего раскрытия.
Описание наиболее предпочтительных воплощений
Настоящее раскрытие относится к олеаноил-трипептиду для применений в уходе за кожей.
Специалистам в данной области будет понятно, что настоящее раскрытие подвергается изменениям и модификациям, отличным от конкретно описанных изменений и модификаций. Следует понимать, что настоящее раскрытие включает все такие изменения и модификации. Раскрытие также включает все такие этапы, признаки, композиции и соединения, на которые ссылаются или указанные в данном описании изобретения, по отдельности или совместно, и всевозможные комбинации любых или большего числа из таких этапов или признаков.
Определения
Для удобства, перед дальнейшим описанием настоящего раскрытия в данном документе описаны определенные термины, используемые в описании изобретения, и примеры. Данные определения следует толковать, исходя из остальной части раскрытия, и понимать, как понимает специалист данной области. Термины, используемые в данном документе, имеют значения, признанные и известные специалистам в данной области, однако, для удобства и для полной ясности, конкретные термины и их значения изложены ниже.
Термины в единственном числе используются для ссылки на один или на более чем один (то есть, на по меньшей мере один) грамматический объект предмета изобретения.
Термины «содержит» и «содержащий» используют во включающем, открытом смысле, означая, что могут быть включены дополнительные элементы. Они не предназначены для того, чтобы рассматриваться как термин «состоит только из».
На всем протяжении данного описания изобретения, если из контекста не следует иное, слово «содержат» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», как будет подразумеваться, предполагает включение указанного элемента или этап или группы элемента или этапов, но не исключение любого другого элемента или этапа или группы элемента или этапов.
Термин «включающий» используется для обозначения «включающий, но не ограничивающийся ими». Термины «включающий» и «включающий, но не ограничивающийся ими…» используются взаимозаменяемо.
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает под ним обычный специалист в области, к которой принадлежит данное раскрытие. Несмотря на то, что на практике или при анализе данного раскрытия могут быть использованы любые способы и материалы, похожие или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном документе, теперь описываются предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки.
Фибробласты кожи претерпевают существенные изменения в своей функциональной активности, морфологии и пролиферативном потенциале во время старения. Фибробласты отвечают за поддержание внектлеточного матрикса (ECM) и физиологических состояний других слоев кожи. Количество фибробластов дермы и их способность к синтезу растворимых факторов для поддержания ECM с возрастом снижается. Это приводит к истончению кожи, потере гибкости и эластичности кожи и образованию морщин. Оценивание пролиферативного потенциала фибробластов имеет огромное значение для того, чтобы помочь врачам-косметологам создать оптимальную программу по уходу за кожей.
TGF-β путь является основным регулятор образования внеклеточного матрикса в соединительной ткани кожи человека. TGF-β увеличивает синтез коллагена, пролиферацию кератиноцитов, повышает уровень эластина и гиалурона, придает прочность и упругость, уменьшает деградацию коллагена за счет снижения уровня матриксных металлопротеаз и улучшает толщину, плотность и эластичность кожи.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ получения трипептида структуры 1 с SEQ. ID #1, присоединенной к олеаноловой кислоте, включающий следующие этапы: (a) обработки Boc-Lys(Cbz)-OH, где обе аминокислотные группы L-лизина защищены, бензилбромидом в ацетоне и карбонатом калия с получением Boc-Lys(Cbz)-OBzl; (b) гидролиза Boc-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (a) с получением H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl; (c) связывания H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl с этапа (b) сBoc-Val-OH в присутствии N,N'-Дициклогексилкарбодиимида, гидроксибензотриазола и триэтиламина с получением Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (d) обработки Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl, полученного на этапе (c), трифторуксусной кислотой с получением H-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (e) связывания H-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (d) с Boc-Lys(Cbz)-OH в присутствии N,N'-Дициклогексилкарбодиимида, гидроксибензотриазола и триэтиламина с получением Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (f) обработки Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (e) трифторуксусной кислотой с получением H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (g) связывания H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (f) с 3-O-ацетил-олеаноилхлоридом (синтезированным из 3-O-ацетилолеаноловой кислоты и тионилхлорида) в присутствии триэтиламина с получением (3-O-ацетил-олеаноил)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl; (h) гидрогенизации (3-O-ацетил-олеаноил)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl с этапа (g) в присутствии палладиево-углеродного катализатора в спиртовой среде с получением 3-O-ацетил-олеаноил-Lys-Val-Lys; (i) гидролиза ацетильной группы, используя основание, с получением трипептида SEQ. ID #1, связанного с олеаноловой кислотой,
где SEQ. ID #1 представляет собой K-V-K, и структура 1 представляет собой такую, как представлено ниже:
Структура 1.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ получения олеаноил-KVK, где основание на этапе (i) выбрано из группы, состоящей из гидроксида натрия, гидроксида лития и гидроксида калия.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен трипептид SEQ. ID #1, связанный с олеаноловой кислотой, как получено посредством способа по п. 1.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи у млекопитающих, включающий этапы приведения кожи млекопитающего в контакт с эффективной концентрацией трипептида SEQ. ID #1, связанного с олеаноловой кислотой, для предупреждения старения кожи.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где симптомы старения кожи выбраны из группы, состоящей из истончения эпидермиса, снижения уровня меланоцитов, потери способности к образованию меланина, потери коллагена и эластина, меньшего образования кожного сала из сальных желез, приводящего к потери влаги и сухости, потери подкожного жирового слоя, потери изоляционных свойств и объема, слабой способности заживления ран, обвисания кожи, сухости, неоднородности кожи и морщин.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где старение кожи предупреждают посредством ингибирования активности коллагеназы. Олеаноил-KVK демонстрировал зависимое от концентрации ингибирование фермента коллагеназа.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где старение кожи предупреждают посредством ингибирования активности коллагеназы.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где старение кожи предупреждают посредством увеличения пролиферации фибробластов кожи.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где старение кожи предупреждают посредством увеличения уровня коллагена в фибробластах кожи.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где старение кожи предупреждают посредством усиленной секреции TGF-β фибробластами кожи.
В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция, содержащая трепептид SEQ. ID #1, присоединенный к олеаноловой кислоте, приготовленная с фармацевтически/косметически приемлемыми вспомогательными веществами, адъювантами, основами, разбавителями, носителями, эмоллиентами, усилителями биодоступности, антиоксидантами и консервантами, и/или включенная в составы, содержащие омолаживающие ингредиенты, и которую вводят местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыла, скрабов, эмульсий и компактных пудр.
В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция, где указанный трипептид находится в комбинации с другими биологически активным компонентами.
В одном воплощении настоящего изобретения предложена композиция для предупреждения старения кожи, где указанная композиция защищает ДНК от повреждения и гибели ДНК. Апоптоз представляет собой физиологический процесс запрограммированной гибели клеток, включающий фрагментацию ДНК с последующей гибелью клетки. УФ-излучение может ускорять преждевременное старение и повреждение ДНК. Воздействие на клетки кожи излучения УФ B (290-320 нм) стимулирует гибель клеток и фрагментацию ДНК.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ предупреждения старения кожи, где согласно указанному способу предложена защита от окислительного стресса. Окислительный стресс главным образом вызван внешними факторами, подобно курению, загрязнению, УФ-лучам. Все данные факторы вызывают образование АФК, что приводит к окислительному стрессу и повреждению клеток.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен олеаноил-KVK в качестве противовозрастного пептида, где указанный трипептид находится в комбинации с другими биологически активными компонентами.
Несмотря на то, что предмет изобретения описан со ссылкой на конкретные воплощения, данное описание не предназначено для того, чтобы рассматриваться в ограничивающем смысле. Разные модификации раскрытых воплощений, а также альтернативные воплощения предмета изобретения станут очевидными специалистам в данной области со ссылкой на описание предмета изобретения. Таким образом, предполагается, что такие модификации могут быть сделаны без отступления от сущности и объёма настоящего предмета изобретения, как определено.
Примеры
В настоящий момент раскрытие будет проиллюстрировано действующими примерами, которые предназначены для иллюстрации работы раскрытия и не предназначены для того, чтобы толковаться ограничительно, подразумевая какие-либо ограничения в отношении объема настоящего раскрытия. Если особым образом не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такие же значения, какие обычно понимает под ними обычный специалист в области, к которой принадлежит данное раскрытие. Несмотря на то, что способы и материалы, похожие или эквивалентные способам и материалам, описанным в данном документе, могут быть использованы в практике осуществления раскрытых способов и композиций, в данном документе описаны иллюстративные способы, устройства и материалы. Следует понимать, что данное раскрытие не ограничивается конкретными способами и описанными экспериментальными условиями, по существу способы и условия могут варьировать.
Пример 1: Антиколлагеназная активность
Материалы и методы
Коллагеназа представляет собой одну из матриксных металлопротеаз, которые расщепляют коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса (ECM). ECM служит каркасом, стабилизирующим структуру кожи, и также помогает в пролиферации и метаболических функциях клеток кожи. Потеря коллагена приводит к морщинам и обвисанию кожи. Принцип анализа ингибирования коллагеназы основан на том факте, что субстрат желатин DQ™ конъюгирован с флуоресцеином - флуоресцентным соединением. В желатине DQ™ осуществляют гашение флуоресценции. Желатин DQ™ эффективно расщепляют коллагеназами с получением флуоресцентного соединения, которое может быть измерено. Повышение уровня флуоресценции пропорционально активности фермента. В присутствии антиколлагеназного соединения количество флуоресценции будет уменьшаться для фиксированной концентрации фермента и субстрата.
Материалы
Оборудование - BMG FLUOstar Optima (флуоресцентный микропланшетный ридер)
Реагенты: Фосфатный буфер (pH 7,4)

Набор для анализа фермента коллагеназа (коллагеназа Enzchek, набор для анализа желатиназы, Invitrogen, США)
Микротитрационные планшеты - 96-луночные микротитрационные планшеты (черные) - Corning, США
Анализ проводят в 96-луночном черном микротитрационном планшете. Для анализа используют Тип IV из Clostridium histolyticum с желатином DQ в качестве субстрата. Разные концентрации (15,6 - 250 мкг/мл) олеаноил-KVK предварительно инкубируют с 20 мкл субстрата - желатина (12,5 мкг/мл). Добавляют 100 мкл раствора фермента коллагеназа (конечная концентрация - 0,4 U/мл), и интенсивность флуоресценции измеряют при Em (emission - испускание): 485 нм и Ex (excitation -возбуждение): 520 нм, спустя 30 минут. Записывают активность фермента контроля (буфер).
Выраженное в процентах ингибирование рассчитывают следующим образом:
(B-BC) - (T-C)
%, Ингибирование= X100,
(B-BC)
B - Флуоресценция в присутствии фермента.
BC - Флуоресценция при отсутствии ферментативной активности
T - Флуоресценция ферментативной активности в присутствии ингибитора
C - Флуоресценция одного только ингибитора
Результаты:
50
Олеаноил-KVK демонстрировал дозозависимую антиколлагеназную активность с IC при концентрации 48,8 мкг/мл (50%-ое ингибирование ферментативной активности) (Фиг. 1). 100%-ое ингибирование ферментативной активности наблюдают при концентрации 250 мкг/мл. Результаты показали, что олеаноил-KVK может поддерживать в сохранности внеклеточный матрикс кожи и предупреждать образование морщин и обвисание кожи, предупреждая, вследствие этого, старение кожи.
Пример 2: Антиэластазная активность
Материалы и методы
Эластаза представляет собой одну из матриксных металлопротеиназ, которая расщепляет эластин и другие компоненты внеклеточного матрикса и является важной для нормального развития кожи. Если данный фермент не регулируется ингибиторными белками, это приводит к образованию морщин кожи, преждевременному старению и канцерогенезу. Анализ антиэластазной активности посредством набора для анализа эластазы Enz Chek определяет ингибирующую активность данных продуктов в отношении эластазы. Анализы проводят, используя набор для анализа эластазы EnzChek. Субстрат представляет собой растворимый эластин DQ из бычьей связки шеи. Эластин DQ метят красителем BODIPY FL. Нефлуоресцентный субстрат может быть расщеплен эластазой с получением высоко флуоресцентных фрагментов, и в присутствии ингибитора интенсивность флуоресценции гасится. Интенсивность флуоресценции измеряют в микропланшетном ридере (испускание при 485 нм и возбуждение при 520 нм).
Материалы
Оборудование - BMG FLUOstar Optima (флуоресцентный микропланшетный ридер)
Реагенты: Фосфатный буфер (pH 7,4)

Набор для анализа фермента - коллагеназы (коллагеназа Enzchek, набор для анализа желатиназы, Invitrogen, США)
Микротитрационные планшеты - 96-луночные микротитрационные планшеты (черные) - Corning, США
Анализ проводят в 96-луночном черном микротитрационном планшете. Для анализа используют фермент эластазу из поджелудочной железы свиньи и эластин DQ в качестве субстрата. Разные концентрации олеаноил-KVK предварительно инкубируют с 50 мкл субстрата - эластина (25 мкг/мл). Добавляют 100 мкл раствора фермента - эластазы (конечная концентрация - 0,1 U/мл), и интенсивность флуоресценции измеряют в условиях Em: при 485 нм и Ex: при 520 нм, спустя 30 мин. Регистрируют ферментативную активность контроля (буфер).
Выраженное в процентах ингибирование рассчитывают следующим образом:
(B-BC) - (T-C)
%, Ингибирование= X100
(B-BC)
B - Флуоресценция в присутствии фермента
BC - Флуоресценция при отсутствии ферментативной активности
T - Флуоресценция ферментативной активности в присутствии ингибитора
C - Флуоресценция собственно ингибитора
Результат
50
Олеаноил-KVK демонстрировал дозозависимую антиколлагеназную активность с IC при 62,5 мкг/мл (50%-ое ингибирование ферментативной активности) (Фиг. 2). 98%-ое ингибирование ферментативной активности наблюдают при концентрации 250 мкг/мл. Результаты показали, что олеаноил-трипептид может поддерживать в сохранности внеклеточный матрикс кожи и предупреждать образование морщин и обвисание кожи в результате ингибирования фермента эластаза, что предупреждает, таким образом, старение кожи.
Пример 3: Увеличение в пролиферации фибробласта в присутствии олеаноил-KVK
Во время старения фибробласты кожи подвергаются существенным изменениям в своей функциональной активности, морфологии и пролиферативном потенциале. Фибробласты отвечают за поддержание внеклеточного матрикса (ECM) и физиологических состояний других слоев кожи. Число фибробластов дермы и их способность синтезировать растворимые факторы с поддержанием ECM уменьшается с возрастом. Это приводит к истончению кожи, потере гибкости и эластичности кожи и образованию морщин. Оценивание пролиферативного потенциала фибробластов имеет огромное значение для помощи врачам-косметологам в создании оптимального ухода за кожей.
Материалы и методы
3
2
Фибробласты дермы человека засевают при плотности 5×10 клеток/лунка в DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium - среда Иглу, модифицированная по Дульбекко), содержащей 10 % FBS (Fetal Bovine Serum - фетальная бычья сыворотка) и антибиотики, в 96-луночный планшет и дают образоваться монослою в увлажненном инкубаторе при 37°C и атмосфере 5 % CO на протяжении 24 часов. Клетки обрабатывают разной концентрацией экстракта на протяжении 72 часов для оценки цитотоксичности. Жизнеспособность фибробластов определяют анализом SRB (на основе окрашивания сульфородамином В) (Nature protocols, 2006,1,3,2112-16). Клетки в DMEM с 0,1 % ДМСО (диметилсульфоксид) используют в качестве положительного контроля, в то время как в качестве отрицательного контроля используют среды без клеток.
Поглощение (образец) − Поглощение (отрицательный контроль)
Выраженное в процентах увеличение (%) = × 100
Поглощение (отрицательный контроль)
Результаты
Олеаноил-KVK демонстрировал дозозависимое увеличение в пролиферации фибробластов (Фиг. 3). При концентрации 12,5% происходило 42,2%-ое увеличение в пролиферации фибробластов. На Фиг. 4a и 4b предоставлено выраженное в процентах увеличение в образовании коллагена в фибробластах. Олеаноил-KVK демонстрировал 22,8%-ое увеличение в окрашивании коллагена в фибробластах. На Фиг. 5 показана концентрация TGF-β фибробластов в супернатанте культуры фибробластов. Олеаноил -KVK демонстрировал дозозависимое увеличение секреции TGF-β фибробластами.
Пример 4: Защита от УФ-излучения
Материалы и Методы
УФ B обуславливает эффект загара человеческой кожи и считается наиболее безвредным на протяжении многих лет. УФ-излучение имеет широкий спектр, находящийся в интервале от 40 до 400 нм (30-3эВ), который подразделяется на Вакуумный УФ (40-190 нм), Далекое УФ (190-220 нм), УФ C (220-290 нм), УФ B (290-320 нм) и УФ A (320-400 нм), из которых два последних являются важными с медицинской точки зрения. Существует два отличающихся подтипа УФ А-излучения. Коротковолновой УФ A (320-340 нм) и длинноволновой УФ А (340-400 нм) образуют наибольшую часть УФ А-излучения. Продолжительность воздействия УФ А обычно остается постоянным, тогда как воздействие УФ B чаще встречается летом. УФ-излучение обуславливает частое возникновение преждевременного старения кожи, называемого фотостарением, а также рак и меланому кожи. Было показано, что при УФ B-излучении в клетках и коже образуются АФК, что вызывает синтез матриксных металлопротеиназ (MMP - matrix metalloproteinase), вызывая эффекты фотостарения в коже. Действие УФ A обычно проявляется после продолжительного воздействия, даже если дозы являются низкими. Было сделано предположение, что УФ A осуществляет повышающую регуляцию образования матриксных металлопротеиназ (MMP), ферментов, которые осуществляют деградацию матриксных белков - эластина и коллагена, что, если этому не препятствовать, может приводить к заметному уменьшению эластичности кожи и повышенному образованию морщин, УФ А может проникать глубже в кожу, по сравнению с УФ B, и способствует фотостарению, фотоканцерогенезу и фотодерматозу и повышению уровня активных форм кислорода (АФК) в фибробластах и клетках, которые находятся глубже внутри кожи.
Материалы
2
Клетки: Клетки - кератиноциты человека (HaCAT) поддерживают в виде монослойной культуры в минимальной питательной среде, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Life technologies, CA, США), с добавлением 10 % (об./об.) термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS; GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life technologies) при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5 % CO.
Реагенты: минимальная питательная среда, модифицированная по Дульбекко (DMEM), Фетальная телячья сыворотка (FBS), Аннексин-FITC, набор для выявления апоптоза на основе йодида пропидия, Biovision, США.
Оборудование: проточный цитометр (BD-FACS-Celesta).
Методика
5
Клетки (3×10) предварительно обрабатывают разными концентрациями тестируемого образца на протяжении одного часа и подвергают воздействию УФ B. Клетки подвергают воздействию УФ B-лучей  в течение 10 мин и инкубируют в течение 16 часов в DMEM с 2%-й сывороткой. Клетки метят аннексином-FITC и йодидом пропидия (PE - propidium iodide) в течение 10 минут в темноте и анализируют, используя проточный цитометр (BD FACS-Celesta).
Результаты
Результаты показали, что олеаноил-трипептид защищает клетки кератиноциты от токсичности, вызываемой УФ B (Фиг. 6a, 6b, 6c и 6d) и (Фиг. 7a, 7b, 7c и 7d), и находит активное применение и приносит пользу в качестве защитного средства от УФ в косметических применениях. Как очевидно из Фиг. 6a, происходит зависимое от концентрации уменьшение в раннем апоптозе, и при концентрации 12,5 мкг/мл демонстрировалось максимальное уменьшение в раннем апоптозе. На Фиг. 6b показано зависимое от концентрации уменьшение в позднем апоптозе, похожие результаты также получают в данном случае. На Фиг. 6c показано выраженное в процентах повышение уровня живых клеток при обработке разными концентрациями олеаноил-трипепитда. Концентрация 12,5 мкг/мл демонстрировала самое большое повышение уровня живых клеток. На Фиг. 6d показана выраженная в процентах защита от вызываемого УФ повреждения и гибели ДНК. Концентрация 12,5 мкг/мл обеспечивала выраженную в процентах защиту 47,9 %.
На Фиг. 7 представлены графики проточной цитометрии, показывающие апоптотические и мертвые клетки с обработкой и без обработки. Олеаноил-KVK защищал кератиноциты от апоптоза и повреждения ДНК, вызываемого УФ B-излучением. При концентрации 12,5 мкг/мл обнаружили, что защита от повреждения клеток, вызываемого УФ, составляла 47,9 %.
Пример 5: Защита от окислительного стресса
Материалы и Методы
Клетки кожи подвергают постоянному воздействию активных форм кислорода (АФК) и окислительному стрессу от внешних и внутренних источников. УФ-излучение является наиболее важным фактором окружающей среды в развитии рака кожи и старения кожи. Окислительный стресс развивается в коже, когда вызываемое УФ образование АФК превышает способность внутреннего механизма защиты. Уменьшение окислительного стресса может быть достигнуто или снижением воздействия УФ-излучения, и/или повышением уровней антиоксидантного механизма защиты. Меланин, находящийся в коже, и антиоксидантные ферментативные реакции защищают нашу кожу от окислительного стресса. Многие исследования показали, что обработка антиоксидантами перед воздействием УФ может предупреждать окислительное повреждение биомолекул клетки.
2
Клетки: клетки - кератиноциты человека (HaCAT) поддерживают в средах для фибробластов (Gibco) при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5 % CO.
Реагенты: Среды для кератиноцитов (Gibco) DCFH-DA. Прибор: микропланшетный ридер FluoStar Optima.
Методика
2
2
2
-
-
-
Активные формы кислорода включают целый ряд молекул, которые повреждают ДНК и РНК и окисляют белки и липиды (перекисное окисление липидов). Данные реакционноспособные молекулы содержат атом/молекулу кислорода и включают HO (пероксид водорода), NO (оксид азота (II)), O (оксидный анион), пероксинитрит (ONOO), хлорноватистую кислоту (HOCl) и гидроксильный радикал (OH). 5- (и 6)-хлорметил-20, 70-дихлоргидрофлуоресцеин диацетат (CM-H2DCFDA) свободно проникает в плазматическую мембрану и гидролизуется в цитозоле с образованием карбоксилат-аниона DCFH. Окисление приводит к образованию флуоресцентного DCF, который максимально возбуждается при 495 нм и осуществляет испускание при 520 нм.
Кератиноциты засевают в количестве 50000 клеток на лунку в 96-луночные черные планшеты и дают вырасти в виде монослоя на протяжении 24 часов. Клетки предварительно обрабатывают разной концентрацией олеаноил-KVK в течение одного часа. Планшет подвергают воздействию УФ А-излучения в течение 1 часа. Свежеприготовленный реагент DCFH-DA добавляют во все лунки (2 мкг/лунка). Планшет инкубируют при 37°C в течение 30 минут. Флуоресценцию записывают при длине волны 485:520, Ex: Em, в микропланшете-ридере FluoStar Optima.
Результаты
Олеаноил-KVK обеспечивал защиту от окислительного стресса, вызываемого посторонними агентами, включая УФ-излучение и загрязняющие вещества, такими, как тяжелые металлы. Как очевидно из Фиг. 8a, при концентрации 6,25 мкг/мл олеаноил-KVK демонстрировал 17,1 % активность утилизации АФК- в ответ на стресс, вызываемый УФ. Аналогичная концентрация 12,5 % олеаноил-трипептида обеспечивает утилизацию АФК 20,4 % в ответ на стресс, вызываемый тяжелыми металлами (Фиг. 8b). Таким образом, данный олеаноил-трипептид можно использовать в качестве противозагрязнителя в косметических составах.
Пример 6: Анализ экспрессии генов
Фибробласты дермы являются важнейшими клеточными компонентами для структурной целостности кожи. Внеклеточный матрикс сдержит коллаген, эластин и гиалурон, которые определяют целостность кожи. Гиалуронан (HA - Hyaluronan) синтезируется гиалуронансинтазами, которые добавляют остатки УДФ (уридиндифосфат)-глюкозамина и УДФ-глюкуроновой кислоты к растущей полимерной цепи HA. Трансформирующий фактор роста (TGF-β) играет центральную роль в биосинтезе ECM и контролирует гомеостаз коллагена посредством регуляции как синтеза, так и деградации коллагена. Эпидермальный фактор роста стимулирует клеточный рост и индуцирует синтез коллагена. Исследуют профиль экспрессии данных генов в фибробластах дермы и кератиноцитах в присутствии олеаноил-KVK, в сравнении с необработанным контролем.
Материалы и методы
Материалы: Клетки кератиноциты дермы человека, 6-луночные микротитрационные планшеты, среда для роста фибробластов, тризол, набор для синтеза, готовая реакционная смесь с SYBR green для ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией).
Методы
Фибробласты дермы человека и кератиноциты культивируют в 6-луночных микротитрационных планшетах в присутствии 6,25 мкг/мл олеаноил-KVK на протяжении 24 часов. Необработанные клетки используют в качестве контроля. В конце периода времени инкубации клетки лизируют, и выделяют РНК.
Выделение РНК: Клетки собирают после второго прогрессирования в сутки 7 и тотальную РНК выделяют, используя способ на основе Тризола. Выделенную РНК обрабатывают ДНКазой I для удаления какой-либо загрязняющей ДНК и снова выделяют, используя выделение с помощью смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (24:25:1). Качество РНК определяют посредством проверки поглощения при 260/280 нм, используя Nanodrop (Thermo).
2
Количественная ПЦР в реальном времени: 2 мкг тотальной РНК отбирают для синтеза кДНК, используя систему синтеза первой цепи Super Script III (Life Technologies). Количественный анализ ОТ-ПЦР проводят для определения экспрессии специфичных генов бурого жира в циклере Roche Light 96 с использованием готовой реакционной смеси с SYBR Green (Thermo Scientific). β-Актин используют в качестве гена «домашнего хозяйства». Относительную представленность РНК генов нормируют по гену «домашнего хозяйства» - актину и выражают в виде дельты дельты CT (эквивалентно кратному изменению, преобразованному Log).
На Фиг. 9 показано кратное изменение в экспрессии генов в фибробластах дермы. Олеаноил-KVK повышал уровень экспрессии коллагена, TGF-β и гиалуронансинтазы в фибробластах дермы человека. На Фиг. 10 показано кратное изменение в экспрессии генов в кератиноцитах. Олеаноил-KVK повышал уровень экспрессии кератиноцитов. На Фиг. 11 показана экспрессия генов в кератиноцитах под воздействием окислительного стресса. Окислительный стресс вызывает экспрессию маркеров воспаления и металлопротеаз, вызывающих деградацию внеклеточного матрикса. Обработка олеаноил-KVK осуществляла понижающую регуляцию уровней экспрессии матриксной металлопротеазы 9 и фактора некроза опухоли α в фибробластах дермы человека.
Воспаление кожи может происходить в результате воздействия УФ или ионизирующего излучения, аллергенов или контакта с химическими раздражителями или аллергенами. Когда кожа подвергается воздействию агента воспаления, клетки в коже продуцируют воспалительный мессенджер, известный как цитокин. Данные цитокины стимулируют каскад воспалительных реакций,  который продуцируются другие цитокины, активируются клетки крови, продуцируются свободные радикалы, которые повреждают кожу.
Принцип анализа
Противовоспалительную активность исследуют, используя линию клеток моноцитов/макрофагов человека THP-1. Моноциты отвечают на липополисахариды (LPS - lipo-polysaccharide), секретируя провоспалительные цитокины. Фактор некроза опухоли (TNF-α) представляет собой один из основных цитокинов, который запускает каскад воспалительных реакций. Концентрацию TNF-α измеряют, используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA - Enzyme linked Immunosorbent assay). Уменьшение концентрации TNF-α указывает на противовоспалительную активность соединения.
Материалы
2
Клетки: THP1 - моноциты человека, приобретенные у Американской коллекции типовых культур (ATCC - American Type Culture Collection, Manassas, VA), и поддерживаемые в виде монослойной культуры в среде RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) (Life technologies, CA, США) с добавлением 10 % (об./об.) термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (FBS; GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Life technologies) при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5 % CO.
Реагенты и буферы: Липополисахарид (LPS, Sigma chemicals, США), фосфатно-солевой буферный раствор, RPMI, FBS,
Набор для ELISA: набор для ELISA TNF человека, Krishgen Biosciences, США
Способы
5
1×10 клеток THP-1 стимулируют 100 нг липополисахарида (LPS, 0,1 мкг/мл) для того, чтобы вызвать секрецию TNF-α. Клетки предварительно обрабатывают разными концентрациями олеаноил-KVK перед обработкой LPS. Клеточные супернатанты собирают через 24 часа после обработки, и секретируемый TNF-α оценивают посредством анализа цитокина посредством ELISA, как описано производителем. Нестимулированные клетки используют в качестве отрицательного контроля. Предел обнаружения составлял меньше 1 пг/мл.
Результаты
Концентрация олеаноил-KVK (мкг/мл)
%, Ингибирование
Жизнеспособность клеток
12,5
71,03
100 %
6,25
31,01
100 %
3,12
12,53
100 %
1,56
12,14
100 %
50
Заключение:Олеаноил-KVK демонстрировал противовоспалительную активность с IC 9,09мкг/мл.
Пример 7: Составы, содержащие олеаноил-KVK, для ухода за кожей
Композиция, содержащая олеаноил-KVK, может быть приготовлена с фармацевтически/косметически приемлемыми вспомогательными веществами, адъювантами, основами, разбавителями, носителями, эмоллиентами, усилителями биодоступности, антиоксидантами и консервантами, и/или включена в составы, содержащие противовозрастные ингредиенты, и введена местно в форме кремов, гелей, лосьонов, пудры, сыворотки, масла, суспензий, мазей, мыла, скрабов, эмульсий и компактных пудр.
В родственном аспекте один или более ингредиентов для ухода за кожей выбраны из группы, состоящей из альфа-липоевой кислоты, оксиресвератрола, экстракта свеклы, экстракта Boswellia serrata, β-босвеллиевых кислот, масла Boswellia serrata (босвеллия пильчатая), экстракта Centella asiatica (центелла азиатская), тритерпенов, экстракта Garcinia indica (гарциния индийская), антоцианинов, экстракта и сока Cocos nucifera (кокосовая пальма), экстракта Coleus forskohlii (колеус форсколии), форсколина, масла Coleus forskohlii, тетрагидропиперина, эллаговой кислоты, экстракта чернильного орешка, полифенолов, экстракта галангала, глицирризиновой кислоты, экстракта зеленого чая, галлата эпигаллокатехина, экстракта солодки, моноаммония глицирризината, лимоноидов, олеанолевой кислоты, олеуропеина, экстракта Piper longumine (перец длинный), пиперина, эллаговой кислоты, экстракта граната (водорастворимого), птеростильбена, ресвератрола, экстракта Pterocarpus santalinus (сандаловое дерево), экстракта розмарина, розмариновой кислоты, экстракта амлы, бета-глюкогаллина, тетрагидрокуркумина, экстракта листьев Salvia Officinalis (шалфей лекарственный), урсоловых кислот, сапонинов, экстракта семян Sesamum indicum (кунжут), сезамина и сезамолина, масла моринги масличной, экстракта семян моринги масличной, экстракта конского каштана, масла витекса обыкновенного, ксименовой кислоты, этиласкорбиновой кислоты, арганового масла, экстракта цедры лимона, масла куркумы, бета-глюканов ячменя, кофермента Q10, оливкового масла, масла авокадо и масла клюквы, но не ограничивающейся ими.
В другом родственном аспекте один или более антиоксидантов и противовоспалительных средств выбраны из группы, состоящей из витамина A, D, E, K, C, B комплекса, розмариновой кислоты, альфа-липоевой кислоты, оксиресвератрола, эллаговой кислоты, глицирризиновой кислоты, галлата эпигаллокатехина, растительных полифенолов, глабридина, масла моринги масличной, олеаноловой кислоты, олеуропеина, карнозной кислоты, уроканиновой кислоты, фитоена, липоевой кислоты, липоамида, ферритина, десферала, биллирубина, билливердина, меланинов, убихинона, убихинола, аскорбилпальмитата, магнезиум аскорбилфосфата, асорбилацетата, токоферолов и производных, таких как ацетат витамина E, мочевой кислоты, α-гликозилрутина, калалазы и супероксиддисмутазы, глутатиона, соединений селена, бутилированного гидроксианизола (BHA - butylated hydroxyanisole), бутилированного гидрокситолуола (BHT - butylated hydroxytoluene), метабисульфита натрия (SMB - sodium metabisulfite), пропилгаллата (PG - propyl gallate) и аминокислоты - цистеина, но не ограничивающейся ими.
В другом родственном аспекте один или более усилителей биодоступности выбраны из группы, состоящей из пиперина, тетрагидропиперина, кверцетина, экстракта чеснока, экстракта имбиря и нарингина, но не ограничивающейся ими.
В Таблицах 1-10 предложены иллюстративные примеры составов для ухода за кожей, содержащих олеаноил-KVK.
Таблица 1: Лосьон для ухода за кожей
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, экстракт солодки, птеростильбен, тетрагидропиперин, экстракт галангала, ниацинамид
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаВода, авобензон, октилметоксициннамат, октокрилен, бензофенон-3, октилсалицилат, глицерил стеарат SE, сорбитан стеарат и кокоат сахарозы, полисорбат 20, глицерин, цетостеариловый спирт, цетеарил оливат (и) сорбитан оливат, стеариновая кислота, изопропилмиристат, масло семян Garcinia indica, каприловый/каприновый триглицерид, пропиленгликоль, бутилоктил салицилат, циклопентасилоксан, диметиконол, диметикон, смесь кроссполимера диметикон (и) фенилтриметикона, метилизотиазолинон и феноксиэтанол, отдушка, циклотетразилоксан (и) циклопентазилоксан (и) диметикон (и) тризилоксан (и) фенилтриметикон (и) изопарафиновый углеводород, диоксид титана, гидроксид алюминия, пентаэритритил тетра-ди-трет-бутил гидроксигидроциннамат, экстракт коры Pterocarpus marsupium (птерокарпус мешковидный), токоферилацетат, акрилат/C10-30 алкил акрилатный кроссполимер, динатрия ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота)
Таблица 2: Увлажняющий крем для ухода за кожей
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKэкстракт амаранта, ниацинамид, витамин E, масло ши, оливковое масло, D-Пантенол
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаУсилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine<sup></sup>*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер)
Таблица 3: Солнцезащитный крем
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKЭкстракт галангала, ацетат витамина E
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаВода, этилгексилметоксициннамат, октокрилен, этилгексилсалицилат, бутилметоксидибензоилметан, бензофенон-3, цетилпальмитат, сорбитан стеарат и кокоат сахарозы, диоксид титана и гидроксид алюминия и стеариновая кислота,  метил глюцет - 20, цетиловый спирт, пропиленгликоль, глицерилстеарат и ПЭГ (полиэтиленгликоль) 100 стеарат, цетеарет - 20, дикаприлил карбонат,  каприловый/каприновый триглицерид, диметикон, циклотетрасилоксан (и) циклопентасилоксан (и) диметикон (и) трисилоксан (и) фенилтриметикон (и) изопарафиновый углеводород, метилизотиазолинон и феноксиэтанол, пентаэритритил тетра-ди-трет-бутил гидроксигидроциннамат, акрилат/C10-30 акрил акрилатный кроссполимер, токоферола ацетат, динатрия ЭДТА, аминометилпропанол. Усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine<sup></sup>)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер),
Таблица 4: Очищающее средство
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, экстракт солодки, птеростильбен, тетрагидропиперин, экстракт цедры лимона, экстракт папайи
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаВода, натрия кокоилглицинат, лаурил глюкозид, кокамидопропил бетаин, стеарет 21, цетиловый спирт, экстракт Carica papaya (папайя) (плод), экстракт кожуры Citrus medica limonum (лимон), стеарет 2, ПЭГ-150 Дистеарат, Пропиленгликоль, акрилат/C10-30 алкил акрилатный кроссполимер, полисорбат 20, отдушка, метилизотиазолинон и феноксиэтанол, токоферилацетат, аминометилпропанол, слюда (и) CI 77891, пентаэритритил тетра-ди-трет-бутил гидроксигидроциннамат, динатрия ЭДТА, усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine*), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер).
Таблица 5: Скраб для лица
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKЭкстракт Cocus nucifera, скраб на основе грецкого ореха, масло семян маргозы, ниацинамид, экстракт цедры лимона, ацетат витамина E
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаВода, глицерин, каприловый/каприновый триглицерид, лаурил глюкозид, сорбитан стеарат и кокоат сахарозы, изопропилмиристат, изопропилпальмитат и пентаэритритил тетраизостеарат, цетилпальмитат, стеариновая кислота, цетостеариловый спирт, CI 77891, порошок скорлупы Juglans Regia (грецкий орех), крахмал Zea Mays (кукуруза сахарная), масло семян Azadirachta Indica (ним), феноксиэтанол и метилизотиазолинон, отдушка, акрилат/C10-30 алкил акрилатный кроссполимер, аминометилпропанол, Пентаэритритил тетра-ди-трет-бутил гидроксигидроциннамат, токоферилацетат, ментол, динатрия ЭДТА, усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер).
Таблица 6: Омолаживающая сыворотка
Активные ингредиентыолеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, сок плода Cocos Nucifera (кокос), масло куркумы, аргановое масло, Lipactive IncaInchi<sup>#</sup>
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаКатионные полимеры (Galsilk 700), динатрия ЭДТА, глицерин, консерванты, неионогенное поверхностно-активное вещество (Tween 20), неионогенные солюбилизаторы и эмульгирующие средства (Cremophor RH 40), усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер), бета-глюканы ячменя, витамины
Таблица 7: Омолаживающее очищающее средство
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, сок плода Cocos Nucifera (кокос), масло куркумы, аргановое масло, Lipactive IncaInchi<sup>#</sup>
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаНиацинамид, экстракт цедры лимона, ацетат витамина E, усилители биодоступности (экстракт пиперина или тетрагидропиперина (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер)
*- зарегистрированный товарный знак корпорации Sabinsa
# - зарегистрированный товарный знак Greentech
Таблица 8: Омолаживающий уравновешивающий тоник
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, сок плода Cocos Nucifera (кокос), масло куркумы, аргановое масло, Lipactive IncaInchi<sup>#</sup>
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаТетрагидропиперин (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер)
*- Зарегистрированный торговый знак корпорации Sabinsa
# - Зарегистрированный торговый знак Greentech
Таблица 9: Омолаживающее увлажняющее средство
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKТетрагидрокуркумин, сок плода Cocos Nucifera (кокос), масло куркумы, аргановое масло, Lipactive IncaInchi<sup>#</sup>
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаБета-глюканы ячменя, ниацинамид, поликосанол, экстракт амаранта, масло авокадо и масло макадамии, тетрагидропиперин (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер)
*- Зарегистрированный торговый знак корпорации Sabinsa
# - Зарегистрированный торговый знак Greentech
Таблица 10: Омолаживающий крем
Активные ингредиентыОлеаноил-KVKКофермент Q10, тетрагидрокуркумин, экстракт Boswellia serrata
Другие ингредиенты/Вспомогательные веществаЭкстракт галангала, D-пантенол, бисаболол, тетрагидропиперин (Cosmoperine*)), отдушка, загустители (производные целлюлозы или акрилатный кроссполимер), оливковое масло, масло авакадо и масло клюквы
* - Зарегистрированный торговый знак корпорации Sabinsa
Приведенные выше составы представляют собой лишь иллюстративные примеры; любой состав, содержащий указанный выше активный ингредиент, предназначенный для указанной цели, будет считаться эквивалентным.
Другие модификации и варианты изобретения будут очевидны специалистам в данной области из изложенного выше раскрытия и идей изобретения. Таким образом, в то время, как в данном документе конкретно описаны только определенные воплощения изобретения, будет очевидно, что могут быть сделаны их многочисленные модификации, без отступления от сущности и объема изобретения. Объем изобретения нужно толковать только в связи с прилагаемой формулой изобретения.