Свойства тканеинженерных матриксов из поликапролактона, импрегнированных факторами роста VEGF и bFGF

В.В. Севостьянова 1, Y.L. Elgudin 2, G.E. Wnek 2, T. Lubysheva 2, S. Emancipator 2, А.С. Головкин1, Л.С. Барбараш 1

1 НИИ Комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, Кемерово

2 Западный резервный университет Кейза, Кливленд, США

Properties of tissue-engineering polycaprolactone matrices impregnated by VEGF and bFGF growth factors

V.V. Sevostyanova 1, Y.L. Elgudin 2, G.E. Wnek2, T. Lubysheva2, S. Emancipator 2, A.S. Golovkin 1, L.S. Barbarash 1 11nstitute for Complex Problems of Cardiovascular Disease of SB RAMS, Kemerovo 2 Case Western Reserve University, Cleveland, USA

Свойства тканеинженерных матриксов из поликапролактона, импрегнированных факторами роста VEGF и bFGF

Современный подход в создании сосудистых кондуитов малого диаметра для применения в шунтирующих операциях заключается в их «выращивании» in vivo с использованием тканеинженерных биодеградируемых полимерных матриксов. В работе оценивается возможность использования графтов, созданных методом двухфазного электроспиннинга из поликапролактона с включением в их состав VEGF и bFGF. Матриксы оценивали на изменение физико-механических и биологических свойств, после введения в полимер ростовых факторов. Было обнаружено увеличение прочности полимерных матриксов, после их импрегнации VEGF и bFGF. Пролонгированный выход биомолекул из материала в сроки до трех недель был продемонстрирован с помощью иммуноферментного анализа. Результаты подкожной имплантации изучаемых матриксов крысам популяции Wistar подтвердили сохранение биологической активности VEGF и bFGF после их выхода в окружающие ткани. Таким образом, исследование показало возможность использования PCL матриксов с VEGF и bFGF для создания сосудистых тканеинженерных графтов малого диаметра.

Ключевые слова: тканевая инженерия, электроспиннинг, поликапролактон, VEGF, bFGF.

В настоящее время основным методом хирургического лечения заболеваний, связанных с окклюзией коронарных и периферических артерий, является проведение шунтирующих операций. Для таких реконструкций принято использовать аутогенные вены и артерии в качестве наиболее доступных сосудистых графтов малого диаметра (менее 6 мм). Однако более 30% пациентов не обладают подходящими для трансплантации сосудами из-за уже перенесенных операций, либо других заболеваний [1]. Кроме того, использование аутогенных вен и артерий в большинстве случаев приводит к повторным операциям, связанным с деструктивными изменениями и закупоркой сосудов, использованных в качестве шунтов, через 4—5 лет [2]. В этой связи, в современной сердечнососудистой хирургии существует потребность в сосудистых кондуитах малого диаметра, обладающих хорошей проходимостью и долговечностью.

Современные тканеинженерные подходы к созданию элементов сердечно-сосудистой системы направлены на получение биологических кондуитов, которые могли бы соответствовать функциональным особенностям кровеносного сосуда. На сегодняшний

e-mail: sevostv@gmail.com

A contemporary approach to small vascular conduits design for bypass surgery is growing them in vivo using tissue-engineered biodegradable polymer scaffolds. The study assessed the possibility to use grafts made by two-phase electrospinning out of polycaprolactone with impregnated VEGF and bFGF. The scaffolds were tested for the alterations in physical, mechanical and biological properties after their impregnation with the growth factors. An increase in polymer graft strength was observed following their impregnation with VEGF and bFGF. ELISA showed a prolonged biomolecule release out of the scaffold within up to 3 weeks. The results of subcutaneous implantation of the scaffolds to Wistar rats demonstrated that the biological activity of VEGF and bFGF is preserved after their release into the surrounding tissues. Thus, the study showed that there is a possibility to use PCL scaffolds with VEGF and bFGF to design small vascular tissue-engineered grafts.

Key words: tissue engineering, electrospinning, polycaprolactone, VEGF, bFGF.

день, основным методом является «выращивание» кровеносных сосудов в биореакторе из аутогенных клеток человека на природных, либо синтетических матриксах [3]. Исследования в этой области уже продемонстрировали многообещающие результаты [4]. Но, тем не менее, в данном направлении остается ряд проблем, обусловленных сложностью получения необходимого количества аутогенных клеток, длительностью и эффективностью совмещения клеток и матрикса, а также опасностью иммуной реакции организма при использовании аллогенных клеточных культур.

В связи с этим начало развиваться альтернативное направление тканевой инженерии, основанное на выращивании органа in vivo, то есть непосредственно в организме пациента. Этот подход отражает идею создания органа за счет имплантации в организм тканеинженерных биодеградируемых матриксов, импрегнированных биологическими молекулами, либо лекарственными средствами для улучшения регенерации [5]. При этом матрикс является не только каркасом будущего органа, но также и системой доставки необходимых веществ [6—8].

Основываясь на данном подходе, задача по созданию сосудистых кондуитов может быть решена с помощью биосовместимых полимерных матриксов с оптимальными механическими свойствами. Одним из таких полимеров является поликапролактон (polycaprolactone, PCL) — биорезистентный синтетический материал, обладающий необходимыми прочностью и эластичностью, а также длительным периодом биодеградации с образованием нетоксичных продуктов [8, 10]. Графт из PCL может быть имплантирован в кровеносное русло, выполняя на начальном этапе роль протеза. Предполагается, что со временем графт будет заселяться клетками организма, а материал полимера в это же время будет постепенно деградировать, замещаясь межклеточным веществом, синтезируемым клетками. Возможно, импрегнирование матрикса биологическими молекулами, например факторами роста, будет способствовать быстрому формированию кровеносного сосуда.

Хотя процесс восстановления сосудов до конца не изучен, известно, что важная роль в нем отведена сосудистому эндотелиальному фактору роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), а также фактору роста фибробластов (basic fibroblast growth factor beta, bFGF). Эти два цитокина крайне важны для активации миграции и пролиферации эндотели-альных клеток, а также для стимуляции и регуляции ангиогенеза [11, 12].

Важная роль этих цитокинов для тканевой инженерии показана как в экспериментах in vitro, так и in vivo. J.L. Sharon и D.A. Puleo (2008) продемонстрировали увеличение пролиферации эндотели-альных клеток на поверхности PLGA (poly(lactide-co-glycolide) матриксов, модифицированных VEGF в экспериментах in vitro [13]. Q. Sun с соавт. (2005) имплантировали PLGA матриксы, содержащие VEGF, в область смоделированной ишемии нижних конечностей у мышей. Пролонгированная доставка VEGF с использованием полимерной системы из PLGA привела к улучшению перфузии тканей, увеличению плотности капилляров по сравнению с контролем [14].

Исследования матриксов из poly-(ester-urethane) urea (PEUU) с bFGF in vitro показали значительное увеличение пролиферации гладкомышечных клеток мышей на их поверхности после 7 сут. культивирования, по сравнению с PEUU матриксами без фактора роста [15]. X. Zhu с соавт. (2008) обнаружили улучшение пролиферации эндотелиальных клеток, культивированных на желатиновых микрочастицах, нагруженных bFGF, почти в два раза в течение 10 дней [11]. Также в исследовании in vivo было продемонстрировано увеличение плотности капилляров в желатиновом гидрогеле и PLGA матриксах, содержащих bFGF после их имплантации в ишемизирова-ные нижние конечности мышей и в зоны ишемии миокарда у свиней, соответственно [16, 17].

Совместное использование VEGF и bFGF является многообещающим подходом в регуляции функций клеток при регенеративном процессе. Значительное улучшение реваскуляризации ткани было показано P. Losi с соавт. (2010) после имплантации композитных матриксов из poly(ether)urethane-poly-dimethyl-siloxane-fibrin, нагруженных VEGF и bFGF, подкожно или в зоны ишемии конечностей крыс [18].

Предполагается, что включение VEGF и bFGF в структуру PCL-графта улучшит регенеративные свой-

ства биосовместимого и биодеградируемого ткане-инженерного сосудистого кондуита.

Целью настоящей работы явилась оценка физико-механических и биологических свойств тканеин-женерных матриксов из PCL после их импрегнации ростовыми факторами VEGF и bFGF.

Материал и методы

В работе для изготовления тканеинженерных матриксов использовали биодеградируемый синтетический полимер — PCL (Sigma-Aldrich, США), так как он обладает оптимальными для создания сосудистого графта физико-механическими свойствами, биосовместимостью и достаточно длительным периодом деградации [19].

В качестве биологически активных молекул для интегрирования в структуру материала применяли рекомбинантные VEGF и bFGF (R&D System, США).

Изготовление «чистых» PCL матриксов и содержащих биологически активные молекулы «Чистые» PCL матриксы изготавливали методом электроспиннинга при следующих условиях: 10% раствор PCL в хлороформе, напряжение на игле — + 15 кВ, скорость потока раствора — 1мл/ч, расстояние между иглой и коллектором — 15 см.

Для создания PCL матриксов, содержащих в своей структуре факторы роста VEGF или bFGF, использовали метод двухфазного электроспиннинга. Для этого 10% раствор PCL в хлороформе тщательно смешивали с раствором каждого цитокина в фос-фатно-солевом буфере в соотношении 20:1. Процесс электроспиннинга проводили при тех же условиях, что и изготовление «чистых» PCL матриксов.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) Форму и размеры полимерных волокон, а также размеры пор полученных тканеинженерных матриксов оценивали методом СЭМ. Для этого на образцы наносили золотое токопроводящее напыление толщиной в 1 Ä и затем исследовали на сканирующем электронном микроскопе 6510LV (Jeol, Япония).

Оценка физико-механических свойств матриксов Оценку физико-механических свойств проводили в условиях продольного растяжения однотипно изготовленных тканеинженерных матриксов с помощью динамического механического анализа. Образцы (n = 8 каждой группы) в виде прямоугольных полосок со стандартной длиной рабочего сегмента вырезали из изучаемого материала ткани и помещали в зажимы анализатора DMA Q800 (TA Instruments, США). По результатам испытаний рассчитывали разрушающее напряжение при растяжении и эластичность материала.

Кинетика высвобождения биологически активных молекул из матрикса

Для оценки высвобождения факторов роста из структуры полимера в процессе его деградации, образцы PCL матриксов (1x1 см2) с инкорпорированными молекулами VEGF, либо bFGF, помещали в пробирки с фосфатно-солевым буфером (Invitrogen, США) объемом 5 мл и инкубировали при 37°С и 5% СО2. Через установленные промежутки времени (12, 24, 48 ч и далее через каждые 48 ч) в течение трех

недель, из каждой пробирки отбирали по ,5 мл раствора, содержащего биологические молекулы, и восстанавливали исходный объем свежим буфером. В собранных образцах определяли количественное содержание факторов роста с использованием наборов для иммуноферментного анализа VEGF и bFGF (R&D System, США). Измерение содержания белков проводили на планшетном спектрофотометре Synergy HT (Biotek Instruments, США).

Определение биологической активности

ростовых факторов

Сохранение биоактивности молекул после высвобождения из PCL является критическим аспектом данной работы. Поэтому для определения корреляции выхода молекул с их ожидаемой биологической активностью матриксы, модифицированные VEGF или bFGF, имплантировали подкожно самцам крыс популяции Wistar (200—250 г, n = 5 в каждой группе). Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Эксперимент выполнялся в лаборатории Cleveland VA Medical Center в соответствии с протоколом, одобренным IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee, Cleveland VA Medical Center).

Операция осуществлялась под наркозом (3^ мг/кг тиопентала натрия внутрибрюшинно). Каждой крысе в подкожные карманы имплантировались один образец (1 см2, 12^ мкм) с VEGF или bFGF и один материал без факторов роста (контроль). Через 21 сут. животных выводили из эксперимента, эксплантиро-вали введенные материалы с окружающими тканями и выполняли гистологическое исследование.

Результаты и обсуждение

Характеристика PCL матриксов

Исследование физико-механических свойств PCL матриксов продемонстрировало различия в показателях прочности и эластичности между различными группами образцов. Разрушающее напряжение для «чистых» PCL матриксов составило 1,52 МПа, а для PCL+VEGF и PCL+bFGF - 3,96 и 3^ МПа соответ-

ственно. В свою очередь, относительное удлинение образцов «чистых» PCL матриксов было 87,8%, PCL+VEGF - 65,6%, PCL+bFGF - 88,3 % (табл.). Дисперсионный анализ полученных данных выявил, что образцы, содержащие в своем составе факторы роста, обладали большей прочностью, чем матриксы только из PCL.

Таким образом, результаты проведенного теста свидетельствовали об изменении свойств материала после введения в него белков в процессе электроспиннинга. Модификации с факторами роста обладают повышенной прочностью, что может приводить к увеличению стабильности тканеинженерных ма-триксов.

Изображения, полученные с помощью СЭМ, не показали существенных изменений морфологии поверхности волокон (т.е. заметных «бусин» или дефектов) в образцах с инкапсулированными белковыми молекулами по сравнению с PCL без каких-либо включений (рис. 2). Такая морфология волокон может обуславливаться тем, что диаметр водных резервуаров внутри волокна, содержащих молекулы факторов роста, меньше диаметра самого полимерного волокна. Вероятно, это происходит из-за растяжения и разрушения водных доменов в процессе электроспиннинга. Кроме того, PCL матриксы, содержащие в своей структуре VEGF или bFGF, имели диаметр полимерных волокон значительно меньший, чем матриксы из чистого PCL, изготовленные в тех же условиях. Размер PCL волокон с VEGF составил 0,418±0,262m|, а с bFGF - 0,536±0,276m|i, в свою очередь волокна полимера без факторов роста были толщиной 3,340±0,510m|.

Значительное снижение диаметра волокна может быть причиной увеличения проводимости и диэлектрической проницаемости из-за наличия солей и воды в растворе полимера. В электроспиннинге формирование, растяжение и истончение полимерного волокна обусловлено отталкиванием поверхностных зарядов. Следовательно, увеличение числа зарядов, переносимых струей полимера, способствует увеличению проводимости, что приводит к растяжению полимерной струи и истончению образующегося волокна [20].

Физико-механические свойства PCL матриксов с факторами роста VEGF, bFGF и без них

Группы Напряжение при растяжении

PCL 1,06<1,52<2,10 75,1<87,8<94.5

PCL+VEGF 2,80<3,96<4,50 46,9<65,6<78,1

PCL+bFGF 2,45<3,40<4,64 79,4<88,3<98,5

Stress vs. Strain of Scaffolds

0 20 40 60 80 100

Растяжение

Рис. 1. Результаты динамико-механического анализа PCL матриксов с факторами роста VEGF, bFGF и без них. Анализ выполнен при 2 Н/мин

В свою очередь тканеинженерные материалы, имеющие в своей структуре нановолокна, способны в лучшей степени имитировать внеклеточный ма-трикс. Достаточно высокий коэффициент отношения поверхности к объему этих матриксов способствует адгезии клеток, миграции, пролиферации и диф-ференцировке, а также обеспечивает оптимальную доставку питательных веществ к формирующейся ткани [21].

Оценка динамики выхода биологически активных молекул из PCL матриксов

Важным аспектом в создании тканеинженерных матриксов, содержащих биоактивные молекулы, является контролируемое высвобождение этих веществ из полимера в процессе его биодеградации (рис. 3).

i t i

0 12 24 48 72 96 120 168 216 264 312 360 408 456 504 552

Время, ч

900 800 700 600 500

fhhm

JiiitH

0 12 24 48 72 96 120 168 216 264 312 360 408 456 504 552 Время, ч

Рис. 3. Высвобождение VEGF и bFGF из PCL волокон в течение 3 нед.

В результате оценки выхода ростовых факторов VEGF и bFGF из PCL матриксов в течение трех недель было обнаружено, что в первые 12—24 ч происходил значительный выброс биологически активных молекул как в эксперименте с материалами, содержащими VEGF, так и bFGF. Дальнейшее повышение количества вышедших белков проходило «ступенчато» также для обоих видов матриксов.

Такая кинетика выхода инкорпорированных молекул может быть связана со следующими процессами, происходящими при деградации полимера. Во время создания материалов методом электроспиннинга белковые молекулы растворяются в фосфатно-со-левом буфере. Таким образом, после изготовления внутри полимерного волокна образуются водные резервуары с растворенными факторами роста. Кроме этого, белки располагаются и в поверхностных порах полимерных нитей. После того, как матрикс погружают в водную среду, белок с поверхности волокна смывается, открывая поры, которые связаны с внутренними резервуарами, содержащими факторы роста.

Факторы роста диффузно выходят через заполненные жидкостью поры. Этим обуславливается высокий уровень высвобождения молекул в первые часы эксперимента. Со временем полимер начинает деградировать, что приводит к увеличению подвижности полимерных цепей, раскрытию других участков волокна и облегчению диффузии белков из матрикса [22]. Так как PCL представляет собой медленно деградируемый полимер, то последующий выход факторов роста значительно замедляется (рис. 4). Гипотетически, динамика высвобождения факторов роста из структуры PCL матрикса может быть представлена следующим образом (рис. 4):

I — в полимерном волокне после изготовления материала факторы роста располагаются в резервуарах фосфатно-солевого буфера и в порах на поверхности волокна;

II — после погружения матрикса в водный раствор молекулы факторов роста вымываются из поверхностных пор; некоторые из этих пор связаны с резервуарами фосфатно-солевого буфера;

III — белки выходят через поры из внутренних резервуаров;

IV — при деградации полимера происходит увеличение подвижности полимерных цепей, что способствует дальнейшему выходу молекул из матрикса [23].

Рис. 4. Схема механизмов высвобождения факторов роста из PCL матрикса: I - исходное расположение факторов роста в структуре материала; II - вымывание белков из поверхностных пор; III - выход факторов роста через поры из внутренних резервуаров; IV - высвобождение белков при деградации матрикса

Длительность процесса выброса молекул из PCL матриксов может способствовать пролонгированной контролируемой доставке необходимых факторов роста, таких как VEGF и bFGF, в область формирования новой ткани.

Оценка биологических функций VEGF и bFGF после выхода из PCL матриксов Гистологическое исследование PCL матриксов, содержащих VEGF, либо bFGF, через 3 нед. после подкожной имплантации крысам, продемонстрировало значительное увеличение вросшей грануляционной ткани по сравнению с контрольными PCL материалами. Как и ожидалось, тип реакции был схож для материалов с VEGF и bFGF. В отличие от контрольных, в экспериментальных имплантатах наблюдался обширный внеклеточный матрикс, а также многочисленная популяция миофибробластов, при этом была менее заметна инфильтрация материалов макрофагами.

Кровеносные сосуды, в особенности капилляры, наблюдались в большем количестве в имплантатах, импрегнированных VEGF, в сравнении с матриксами, содержащими bFGF и контролем, что может объясняться более выраженным ангиогенным действием VEGF [24].

Различия в реакции организма на имплантированные «чистые» PCL матриксы и содержащие ростовые факторы может свидетельствовать о том, что белковые молекулы сохраняют свои биологические функции после высвобождения из полимерных волокон.

Рис. 5. PCL матриксы после подкожной имплантации крысам (3 нед.): 1 - PCL c VEGF; 2 - PCL с bFGF; 3 - PCL без факторов роста (контроль). Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: А х50; Б х200

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали увеличение прочности и эластичности тканеинженерных матриксов из PCL после их импрегнации VEGF и bFGF. В результате медленной биодеградации полимера, факторы роста пролонгированно высвобождались из материалов и осуществляли свои биологические функции

в зоне имплантации. Благодаря пористой структуре, оптимальным физико-механическим свойствам и медленному высвобождению биомолекул в зоне имплантации, матриксы из PCL, импрегнированные VEGF и bFGF, могут быть использованы в изготовлении тканеинженерных графтов для восстановления сосудов малого диаметра в организме пациента.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Taylor L.M., Edwards J.M., Porter J.M. Present status of reversed vein bypass grafting: five-year results of modern series. J. Vasc. Surg. 1990; 11: 193-205.

2. Бокерия Л.А., Беришвили И.И., Солнышков Л.Э. и др. Повторные операции у больных ишемической болезнью сердца — современное состояние проблемы. Бюллетень НЦССХ им. Бакулева РАМН. 2009; 10(3): 5—27.

3. Cooper K., Chun I., Colter D., inventors; Ethicon Inc., assignee. Tissue engineered blood vessels. US patent 0,275,129. 2009 Nov 5.

4. Tillman B., Yazdani S., Lee S. et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials 2009; 30: 583—8.

5. Schantz J.T., Chim H., Whiteman M. Cell guidance in tissue engineering: SDF-1 mediates site-directed homing of mesenchymal stem cells within three-dimensional polycaprolactone scaffolds. Tissue Eng. 2007; 13(11): 2615—24.

6. Kim K., Luu Y., Chang C. et al. Incorporation and controlled release of a hydrophilic antibiotic using poly(lactide-coglycolide)-based electrospun nanofibrous scaffolds. J. Controll. Release. 2004; (98): 47—56.

7. Verreck G., Chun I., Rosenblatt J. et al. Incorporation of drugs in an amorphous state into electrospun nanofibers composed of a water-insoluble, nonbiodegradable polymer. J. Controll. Release. 2003; 92: 349—60.

8. Sokolsky-Papkov M., Agashi K., Olaye A. et al. Polymer carriers for drug delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 2007; (59): 187—206.

9. Hakkarainen M. Aliphatic Polyesters: Abiotic and biotic degradation and degradation products. Advances in Polymer Science. 2002; 157: 113—8.

10. Sahoo R., Sahoo S., Sahoo S. et al. Synthesis and characterization of polycaprolactone — gelatin nanocomposites for control release anticancer drug paclitaxel. Euro. J. Sci. Res. 2011; 48(3): 527—37.

11. Zhu X., Eng M., Tabata Y. et al. Delivery of basic fibroblast growth factor from gelatin microsphere scaffold for the growth of human umbilical vein endothelial cells. Tissue Engineering: Part A. 2008; 14(12): 1939—47.

12. Thevenot P., Nair A., Shen J. et al. The effect of incorporation of SDF-1a into PLGA scaffolds on stem cell recruitment and the inflammatory response. Biomaterials 2010; 31(19): 3997—4008.

13. Sharon J.L., Puleo D.A. Immobilization of glycoproteains, such as VEGF, on biodegradable substrates. Acta Biomater. 2008; 4(4): 1016-23.

14. Sun Q., Chen R., Shen Y. et al. Sustained vascular endothelial growth factor delivery enhances angiogenesis and perfusion in ischemic hind limb. Pharm. Res. 2005; 22(7): 1110-16.

15. Guan J., Stankus J., Wagner W. Biodegradable elastomeric scaffolds with basic fibroblast growth factor release. J. Controll. Release. 2007; 120(1-2): 70-8.

16. Layman H., Spiga M., Brooks T. et al. The effect of the controlled release of basic fibroblast growth factor from ionic gelatinbased hydrogels on angiogenesis in a murine critical limb ischemic model. Biomaterials 2007; 28(16): 2646-54.

17. Wang Y. Liu X.-C., Zhao J. et al. Degradable PLGA scaffolds with basic fibroblast growth factor. Texas Heart Institute Journal 2009; 36(2): 89-97.

18. Losi P., Briganti E., Magera A. et al. Tissue response to poly(ether)urethane-polydimethylsiloxane-fibrin composite scaffolds for controlled delivery of pro-angiogenic growth factors. Biomaterials 2010; 31(21): 5336-44.

19. Bolgen N., Menceloglu Y.Z., Acatay K. et al. In vitro and in vivo degradation of non-woven materials made of poly(e-caprolactone) nanofibers prepared by electrospinning under different conditions. J. Biomat. Sci. Polym. Edit. 2005; 16(12): 1537-55.

20. Ramakrishna S., Fujihara K., Teo W. et al. An introduction to electrospinning and nanofibers. Singapore: World Scientific; 2005.

21. Cui W., Zhou Y., Chang J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 2010; (11): 1-11

22. Zong X., Ran S., Kim K.-S. et al. Structure and morphology changes during in vitro degradation of electrospun poly(glycolide-co-lactide) nanofibre membrane. Biomacromolecules 2003; (4): 416-23.

23. Smith M. Biologicaly functional scaffolds for tissue engineering and drug delivery, produced through electrostatic processing [dissertation]. Cleveland (OH): Case Western Reserve Univ.; 2010.

24. Mandriota S.J., Pepper M.S. Vascular endothelial growth factor-induced in vitro angiogenesis and plasminogen activator expression are dependent on endogenous basic fibroblast growth factor. J. Cell Sci. 1997; 110: 2293-302.

Поступила 20032012