Распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита в к аналогам нуклеозидов и нуклеотидов у инфицированных вирусом пациентов в различных регионах России

Распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В к аналогам нуклеозидов и нуклеотидов у инфицированных вирусом пациентов в различных регионах России

Т.В. Кожанова1 (vkozhanov@bk.ru), О.В. Исаева1, В.В. Клушкина1, Н.Д. Ооржак2,

Р.М. Саян3, М.Н. Алексеева4, Н.И. Миронова5, Н.И. Громова6, О.О. Знойко7,

М.Н. Цыкина8, Л.Ю. Ильченко1, К.К. Кюрегян1 (karen-kyuregyan@yandex.ru), М.И. Михайлов1

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Московская область

Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения по Республике Тыва, г. Кызыл Эрзинская инфекционная больница, Республика Тыва Медицинский институт Якутского государственного университета МУЗ «Городская клиническая больница № 2 им. В.И. Разумовского», г. Саратов Медицинский центр Управления делами Президента РФ, Москва Московский государственный медико-стоматологический университет Тамбовский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями

Резюме

Изучено распространение вариантов вируса гепатита В (ВГВ) с лекарственной устойчивостью среди лиц, инфицированных ВГВ, ранее не получавших противовирусную терапию аналогами нуклеозидов и нуклеотидов, в регионах Российской Федерации с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ.

Полученные данные о распространенности первичной лекарственной устойчивости ВГВ указывают на необходимость скрининга пациентов на наличие мутаций до начала терапии аналогами нуклеозидов и нуклеотидов. Ключевые слова: вирусный гепатит В, аналоги нуклеозидов и нуклеотидов, лекарственная резистентность

Введение

Вирусный гепатит В (ГВ) - важная медико-социальная проблема здравоохранения во всех странах мира. Это обусловлено его повсемест-

Prevalence of Primary HBV Drug Resistance to Nucleosides and Nucleotides Analogues in HBV-infected Patients in Regions of Russia

T.V. Kozhanova1 (vkozhanov@bk.ru), O.V. Isaeva1, V.V. Klushkina1, N.D. Oorghak2, R.M. Sayan3, M.N. Alekseeva4, N.I. Mironova5, N.I. Gromova6, O.O. Znoiko7, M.N. Tsikina8, L. Yu. Ilchenko1, K.K. Kyuregyan1 (karen-kyuregyan@yandex.ru), M.I. Mikhailov1

1 Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides, RAMS, Moscow Region

2 Federal Service for Supervision of Consumers Protection and Welfare of the Population of the Republic of Tuva, Kyzyl

3 Hospital of Infectious Diseases, Ersin, Tyva Republic

4 Medical Institute, Yakutsk State University

5 Hospital № 2 named V.I. Razumovsky, Saratov

6 Medical Center of President Administration, Moscow

7 Moscow State Medical and Dental University

8 Tambov Regional Center for Prevention and Treatment of AIDS and Infectious Diseases

Abstract

Studied the prevalence of primary HBV drug resistance to therapy with nucleos(t)ides analogues in treatment naive HBV-infected patients from regions of Russia with different incidence of hepatitis B. DNA HBV was tested by PCR with primers to overlapping«S/P»region of HBV genome. The sequence of HBV polymerase gene was determined for 273 isolates from treatment naive HBV-infected patients. The phylogenetic analyze of HBV sequences was made by program Mega 4.0. The significant amino acid substitutions were determined in 7 (2.9%) patients with hepatitis B: in 2 (0.8%) patients were detected mutation A181S associated with resistance to adefovir, in 4 (1.7%) cases - T184I associated with resistance to entecavir and in 1 (0.4%) patient - L199W associated with resistance to telbivudine. Some substitutions which were not described before were observed in naive HBV-infected patients in positions associated with drug resistance: T184P, M204L, S213F, L179S, L82P. Mutation M204I located in YMDD-motive was determined in 1 (3.1%) of HBV-infected individuals from healthy population of Republic Tuva. Overall prevalence of primary HBV drug resistance to therapy with nucleos(t)ides analogues was 6.2%.

Prevalence data obtained indicate that screening for primary drugs

resistance is needed before anti-HBV therapy is started.

Key words: viral hepatitis B, nucleos(t)ides analogues, drug resistance

ным распространением среди различных групп населения, многообразием клинических форм и исходов (включая циррозы печени и гепатоцел-люлярную карциному), стабильно высокими по-

1

2

казателями заболеваемости хроническим гепатитом В (ХГВ) [1].

В настоящее время эффективность противовирусной терапии ХГВ невысока, что связано с неопределенностью сроков ее проведения и короткой продолжительностью сохранения результата после лечения. Длительная терапия аналогами нуклеозидов и нукле-отидов (нуклеоз(т)идов) ассоциирована с риском формирования лекарственной устойчивости и, как следствие, прогрессированием заболевания [12, 13].

Длительное персистирование вируса гепатита В (ВГВ) и высокая частота развития спонтанных мутаций в вирусном геноме являются основой для селекции мутантных вариантов ВГВ, ассоциированных с формированием лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы (ИОТ). Некоторые спонтанно происходящие мутации генома ВГВ могут получать селективное преимущество на фоне противовирусной терапии (ПВТ). Однако мутации, связанные с лекарственной резистентностью, могут возникать и сохраняться в геноме ВГВ до начала проведения противовирусной терапии ИОТ [6, 7].

Раннее выявление вариантов ВГВ с мутациями в гене полимеразы (Р-ген), ассоциированными с развитием лекарственной устойчивости, важно для пациентов, нуждающихся в терапии нуклеоз(т)идными аналогами. Для пациентов с высоким риском прогресси-рования ГВ, особенно с коинфекцией ВИЧ, наиболее значимым становится раннее выявление таких вариантов ВГВ как до начала терапии нуклеоз(т)идными аналогами, так и в процессе лечения, когда вирусная нагрузка ВГВ может быть очень низкой и/или мутант-ные варианты ВГВ присутствуют в общей вирусной популяции в меньшей доле [9, 11].

Варианты ВГВ с мутациями в Р-гене могут обнаруживаться среди пациентов с острым гепатитом В (ОГВ) и ХГВ до начала проведения терапии нуклеоз(т)идными аналогами, такое явление на-

зывается первичной лекарственной устойчивостью. Данные о распространенности первичной резистентности ВГВ ограниченны. Поэтому в настоящее время актуальным представляется получение сведений о спектре и распространенности мутаций в гене ВГВ, связанных с лекарственной резистентностью, в регионах Российской Федерации с различной интенсивностью циркуляции ВГВ.

Цель исследования - изучить распространенность вариантов ВГВ с наличием мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью, среди лиц, инфицированных ВГВ и ранее не получавших ПВТ аналогами нуклеоз(т)идов, в регионах РФ с различной степенью интенсивности циркуляции ВГВ.

Материалы и методы

Были исследованы образцы сывороток крови, полученные от 459 пациентов с ВГВ-моноинфекцией (ОГВ и ХГВ) из регионов России с разной степенью интенсивности циркуляции ВГВ среди населения (табл. 1). Никто из включенных в исследование больных ранее не получал ПВТ.

Среди 459-ти инфицированных ВГВ пациентов мужчины составляли 53,2%, женщины - 46,8% (соотношение 1,2:1). Средний возраст больных -40,2 ± 14,8 года (от 14 до 81 года). Ни одному из них не назначались нуклеоз(т)идные аналоги.

Также нами были исследованы образцы сывороток крови (п = 644), полученные от условно здорового населения Республики Тыва - региона с высоким уровнем заболеваемости ГВ. В исследование были включены лица следующих возрастных групп: 15 - 29, 30 - 39, 40 - 49, 50 - 59 лет и старше 60. Соотношение женщин и мужчин среди обследуемых составило 3:1 (74,2 и 25,8% соответственно).

Серологические маркеры инфицирования ВГВ (HBsAg и анти-НВс) были определены с использованием иммуноферментных тест-систем «ДС-ИФА-

Таблица 1.

Распределение пациентов по регионам РФ, отличающимся разным уровнем интенсивности циркуляции вируса гепатита В

Интенсивность циркуляции ВГВ регионы рФ Количество пациентов с ГВ

Высокая Республика Саха (Якутия) 58

Республика Тыва 137

Средняя Саратовская область 49

Низкая Московская область 100

Тамбовская область 115

Таблица 2.

Детекция участка генома вируса ГВ и амплификации домена обратной транскриптазы его полимеразы

Участок генома ВГВ Последовательности Положение Направление

S/Р-ген 5'-сс gct ggt ggc tcc agt :с-3' Внешнее Прямое

S/Р-ген 5'-cca caa Пс ktt gac ata сП tcca-3' (к = g/t) Внешнее Обратное

S/Р-ген 5'-gca сас дда аП ссс дад дас :дд дда ссс Пд-3' Внутреннее Прямое

S/Р-ген 5'-дас асс аад сП дд: :ад дд: Па аа: д:а :асс-3' Внутреннее Обратное

HBsAg-0,01» и «ДC-ИФА-HBsAg-0,01-подтверждающая» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород). Для подтверждения позитивных результатов выявления HBsAg в реакции нейтрализации применяли тест-системы двух производителей: ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск (тест-система «ВектоНВс-антитела-стрип»), и НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород («ДС-анти-НВс»).

Во всех образцах сывороток крови, полученных от пациентов с ВГВ-инфекцией и лиц из группы условно здорового населения, положительных по анти-НВс и HBsAg, определяли ДНК ВГВ в полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Выделение нуклеиновых кислот из образцов сывороток крови проводили методом экстракции фенолхлороформом с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови (ООО «НПФ «ЛИТЕХ»). Определение ДНК ВГВ проводили в ПЦР с прайме-рами к консервативному участку перекрывающихся генов S и Р, кодирующих поверхностный белок и ДНК-полимеразу ВГВ (табл. 2).

Для образцов, положительных по ДНК ВГВ в ПЦР, определяли последовательность домена обратной транскриптазы ДНК-полимеразы ВГВ с целью выявления возможных мутаций в этом участке, связанных с развитием лекарственной устойчивости ВГВ. Секвенирование данного участка генома позволяет также достоверно определять генотип ВГВ. Продукт амплификации величиной 713 нт вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Секвенирование проводили с использованием набора GenomeLab Methods Development kit (Beckman Coulter Inc.) в анализаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter Inc.). Полученные последовательности сравнивали с референсными, депонированными в GenBank, соответствующими «дикому» типу ВГВ и мутантным вариантам с подтвержденной лекарственной устойчивостью к пяти нуклеоз(т)ид-ным аналогам, применяемым в настоящее время для терапии ВГВ-инфекции: ламивудину, адефовиру, энтекавиру, тенофовиру, телбивудину. Филогенетический анализ последовательностей ВГВ проводили с помощью программы Mega 4.0.

Результаты и обсуждение

При обследовании 459 пациентов с ВГВ-ин-фекцией HBsAg был выявлен в 95,2% случаев, положительный результат по определению анти-HBc получен в 100% случаев. ДНК ВГВ с наличием анти-HBc и HBsAg обнаружена у 241 человека. Полученные результаты позволили сформировать группу пациентов с репликацией ВГВ для изучения распространенности первичной лекарственной устойчивости вируса. В группу вошел 241 человек с моноинфекцией ВГВ, ранее не получавший терапии аналогами нуклеоз(т)идов.

Прямое секвенирование фрагмента генома ВГВ величиной 713 нт, соответствующего перекрывающимся участкам генов вируса S и P, позволило определить генотип и аминокислотную последовательность домена обратной транскриптазы ВГВ для всех изолятов вируса, выделенных от пациентов.

Распределение генотипов ВГВ среди пациентов было следующим: генотип D выявлен у 89,6% (216 человек), генотип А - у 8,3% (20 человек) и генотип С - у 2,1% пациентов (5 человек). Таким образом, преобладающим в наших исследованиях был генотип D, доминирующий на территории страны, генотипы А и С - минорные (рис. 1).

При анализе аминокислотных последовательностей гена полимеразы ВГВ были обнаружены две группы мутаций: значимые аминокислотные замены (мутации, описанные в литературе как обуславливающие развитие лекарственной устойчивости к терапии нуклеоз(т) идными аналогами) и замены в тех же значимых позициях гена полимеразы, но еще не описанные в литературе. Последние мутации рассматриваются как потенциально значимые, поскольку находятся в позициях Р-гена, имеющих решающее значение для диагностики лекарственной устойчивости.

У 7 (2,9%) обследованных лиц в геноме вируса были установлены значимые аминокислотные замены и у 8 (3,3%) - потенциально значимые. Общая частота выявления мутаций ВГВ, ассоциированных с первичной лекарственной резистентностью, в данной когорте пациентов составила 6,2% (15 человек). Ни в одном случае в данной группе пациентов

Рисунок 1.

Генотипическое разнообразие ВГВ в изучаемых регионах РФ

Таблица 3.

Значимые аминокислотные замены в гене полимеразы ДНК ВГВ

Мутации в гене полимеразы ВГВ Лекарственные препараты

аминокислотные замены п

2(0,8) Адефовир

Т1841 4(1,7) Энтекавир

L199W 1 (0,4) Телбивудин

Таблица 4.

Результаты выявления потенциально значимых аминокислотных замен в гене полимеразы ДНК ВГВ

Потенциально значимые аминокислотные замены, п (%) Аминокислотные замены, описанные в литературе Лекарственные препараты

^84^ 1/241 (0,4) T184S/A/I Энтекавир

L179S, 1/241 (0,4) L179P Ламивудин

S213F, 1/241 (0,4) S213T Ламивудин

M204L, 3/241 (1,2) M204I/V/S Ламивудин, энтекавир, телбивудин, тенофовир

L82P, 1/241 (0,4) L82M Ламивудин

5213Х 1/241 (0,4) S213T Ламивудин

нами не была обнаружена аминокислотная замена в YMDD-мотиве ВГВ - мутация, наиболее распространенная и связанная с развитием устойчивости к широкому спектру ИОТ (ламивудин, энтекавир, телбивудин и тенофовир). Однако при анализе ну-клеотидных последовательностей гена полимеразы ВГВ были установлены мутации, связанные с развитием первичной лекарственной резистентности к другим аналогам нуклеоз(т)идов. Спектр данных аминокислотных замен и частота их выявления приведены в таблице 3.

Помимо описанных аминокислотных замен у пациентов с ВГВ-моноинфекцией были обнаружены и потенциально значимые мутации вируса. Результаты выявления таких аминокислотных замен представлены в таблице 4.

Общая частота регистрации потенциально значимых аминокислотных замен в гене полимеразы ВГВ составила 3,3% (8 пациентов), в одном случае (0,4%) в геноме была обнаружена замена треонина на пролин в положении 184 (Т184Р). При этом, по данным литературы, в таком положении Р-гена ВГВ описаны замены треонина на изолейцин,лейцин,аденин и серин,которые обуславливают формирование резистентности к терапии энтекавиром [2, 8].

У 3-х из 241 (1,2%) пациента в геноме ВГВ была установлена замена метионина на лейцин в позиции 204, локализованная в YMDD-мотиве гена полимеразы, который является определяющим в развитии лекарственной устойчивости к терапии нуклеоз(т)идными аналогами. Однако в литературе описаны другие замены в положении 204 (М2041^^), связанные с развитием невос-

приимчивости к ламивудину, энтекавиру, телби-вудину и тенофовиру [3, 4].

В гене полимеразы ВГВ были обнаружены еще три потенциально значимых аминокислотных замены: в одном случае (0,4%) - серина на фенилаланин в положении 213 (S213F), у 1 (0,4%) пациента - лейцина на серин в положении 179 (L179S) и в одном случае (0,4%) - лейцина на пролин в положении 82 ^82Р).

По данным литературы, в положениях 213, 179 и 82 описаны другие аминокислотные замены ^213Т, И79Р, 1.82М), ассоциированные с развитием лекарственной устойчивости при терапии ламивудином [5, 10].

При обследовании 644 лиц условно здорового населения Республики Тыва HBsAg был определен в 9% случаев (58 пациентов), анти-НВс - в 70% (451 пациент) и ДНК ВГВ - в 5% (32 пациента). Необходимо отметить, что в одном случае (0,2%) был определен также маркер активной репликации вируса - HBeAg.

Филогенетический анализ последовательностей ВГВ, выделенных от 32-х позитивных по вирусной ДНК лиц, показал преобладание циркуляции генотипа D ВГВ, в частности двух его субтипов - ayw2 и ayw3, на территории Республики Тыва - 96,9% (31 человек). В одном случае (3,1%) был определен генотип А.

Среди обследованных 32 лиц с ВГВ-инфекцией в 6,3% случаев были выявлены значимые аминокислотные замены в гене полимеразы, ассоциированные с формированием лекарственной устойчивости ВГВ при терапии аналогами ну-клеотидов/нуклеозидов.

Таблица 5.

Частота выявления мутаций ВГВ, связанных с его первичной лекарственной резистентностью, у ВГВ-инфицированных пациентов

Значимые аа*-замены, n

9

* аа - аминокислотные

В одном случае (3,1%) определена замена метионина на изолейцин в позиции 204, локализованная в каталитическом С-сайте обратной транскриптазы Р-гена, в активном его участке -YMDD-мотиве, который, как уже отмечалось, является определяющим в развитии лекарственной устойчивости к терапии нуклеоз(т)идными аналогами (ламивудином,энтекавиром,телбивудином и тенофовиром). В одном случае (3,1%) была определена еще одна аминокислотная замена (А194Т), которая также описана в литературе как ассоциированная с развитием устойчивости на фоне применения тенофовира.

При анализе нуклеотидных последовательностей гена полимеразы ДНК ВГВ в популяции условно здорового населения не были выявлены мутации гена полимеразы, обуславливающие формирование резистентности к другим аналогам нуклеоз(т)идов, а также потенциально значимые мутации, которые могли бы быть связаны со снижением или отсутствием способности противовирусных препаратов ингибировать репликацию вируса.

Таким образом, частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной устойчивостью ВГВ, учитывая все выявленные, как значимые, так и потенциально значимые, замены в гене полимеразы вируса, связанные с развитием лекарственной резистентности к ИОТ, в группе пациентов с ВГВ-моноинфекцией составила 6,2%. Данные о распространенности лекарственно-устойчивых мутантных вариантов вируса среди всех обследованных лиц с ВГВ-инфекцией, ранее не получавших противовирусную терапию, представлены в таблице 5.

Выводы

Полученные результаты показали, что распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ к терапии аналогами нуклеоз(т) идов у пациентов с ВГВ-моноинфекцией в РФ составила 3,7%. Помимо мутаций в геноме ВГВ, описанных в литературе и достоверно ассоциированных с развитием лекарственной резистентности, у пациентов с ВГВ-моноинфекцией выявлены также аминокислотные замены, потенциально связанные с развитием лекарственной устойчивости, то есть ранее не описанные аминокислотные замены в значимых позициях домена обратной транскриптазы. С учетом потенциально значимых замен в геноме ВГВ распространенность первичной лекарственной устойчивости может достигать 6,2%.

Таким образом, значительная доля лиц с ВГВ-инфекцией изначально имеет резистентность к тому или иному противовирусному препарату. Принимая во внимание широкое распространение вирусного ГВ, тяжесть его течения и высокие показатели смертности от ВГВ-ассоциированных заболеваний, необходимо осуществлять полноценный скрининг на маркеры инфицирования ВГВ, а также на первичную лекарственную резистентность, результаты которого будут определять оптимальную схему терапии. С целью снижения частоты развития резистентности необходимо проводить мониторинг результатов терапии пациентов с использованием высокочувствительных и высокоспецифичных методов для выявления мутантных вариантов ВГВ до начала терапии ИОТ и в процессе ее применения. ш

Литература

1. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). - М.: ВУНМЦ Росздрава, 2003. С. 22 - 27.

2. Bozdayi A., Eyigun C., Turkyilmaz A. et al. A novel pattern (sW195a) in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S) mutation selected during lamivudine therapy and successful treatment with adefovir dipivoxil // J. Clin. Virol. 2004. V. 31. P. 76, 77.

3. Bozdayi A.M., Uzunalimog O., Turkyilmaz A.R. et al. YSDD: a novel mutation in HBV DNA polymerase confers clinical resistance to lamivudine // J. Viral Hepatitis. 2003. V. 10. P. 256 - 265.

4. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral. Hepat. 1997. V. 4. P. 11 - 20.

5. Chaudhuri V., Tayal R., Nayak B. et al. Occult hepatitis B virus infection in chronic liver disease: full-length genome and analysis of mutant surface promoter // Gastroenterol. 2004. V. 127. P. 1356 - 1371.

6. Colonno R., Rose R., Baldick C. Entecavir resistance is rare in nucle-oside naive patients with hepatitis B // Hepatol. 2006. V. 44. P. 1656 - 1665.

7. Guenther S., Fischer L., Pult I. et al. Naturally occurring variants of hepatitis B virus // Adv. Vir. Res. 1999. V. 52. P. 25 - 37.

8. Guenther S., Nelson M., Lutz T. et al. Combination of tenofovir and lamivudine versus tenofovir after lamivudine failure for therapy of hepatitis B in HIV-coinfection // AIDS. 2006. V. 20. P. 1951 - 1954.

9. Hie-Won H., Dixon J. A review of the one-year incidence of resistance to lamivudine in the treatment of chronic hepatitis B // Hepatol. Int. 2008. V. 2. P. 440 - 456.

10. Margeridon-Thermet S., Shulman S., Ahmed A. et al. Ultra-deep py-rosequencing of hepatitis B virus quasispecies from nucleoside and nucleotide reverse-transcriptase inhibitor (NRTI)-treated patients and NRTI-naive patients // J. Infect. Dis. 2009. V. 199. P. 1275 - 1285.

11. Pas S.D., Fries E., Robert A. Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays // J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. P. 2897 - 2901.

12. Younger M., Bathgate A. Review article: nucleoside analogue for the treatment of chronic hepatitis B // Aliment. Pharmacol. Ther. 2004. V. 20. P. 1211 - 1230.

13. Xu X.-W., Chen Y.-G. Current therapy with nucleoside/nucleotide analogs for patients with chronic hepatitis B // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 2006. V. 5. P. 350 - 359.