СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРА ЗДОРОВЬЯ У ОБРАЗЦОВ ПОЧВЫ, КОМПОСТОВ И ДРУГИХ ТВЕРДЫХ СУБСТРАТОВ
METHOD TO DETERMINE HEALTH PARAMETRE IN SAMPLES OF SOIL, COMPOST AND OTHER SOLID SUBSTRATES

Изобретение относится к области экологии и сельского хозяйства и может быть использовано для определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов.
Известно, что почва - это трехфазная полидисперсная система, способная создавать условия для развития в ней различных микроорганизмов, растений и животных, которые приспособились к жизни в твердофазном субстрате, осуществляя там активную жизнедеятельность (Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ «Академкнига». 2002. 282 с.).
Почва как сложная система имеет множество свойств, для описания которых ранее основное внимание исследователей уделялось качеству почвы, основанному только на ее химических и физических свойствах. Однако в последнее время стало понятно, что при описании почвы необходимо также учитывать и биологическую составляющую почвы, в том числе такой биологический и экологический параметр, как здоровье почвы (ЗП).
Для термина ЗП различные авторы дают разные определения, которые хотя и могут расходиться в деталях, но, по сути, достаточно близки друг к другу. Например, академик Российской академии сельскохозяйственных наук Соколов М.С. дает следующее определение для ЗП: «здоровье почвы определяется способностью аборигенной биоты педоценоза активно и неопределенно долго функционировать в пределах его экологической емкости. Фактологические и функциональные составляющие здоровья почвы: сбалансированное биоразнообразие, самоочищающая способность, супрессивность и др. - оцениваются и контролируются современными микробиологическими, (био)химическими, фитопатологическими и молекулярно-генетическими методами» (Интернет ссылка: http://soil.msu.ru/index.php?Itemid=218&id=1356&option=com_content&task=view. Эллиотт и Линч (1994) определяют здоровую почву как стабильную почву, с упругостью к стрессу, высоким биоразнообразием и высоким уровнем замкнутости внутренних циклов питания (Elliott, L.F., Lynch, J.M., 1994. Biodiversity and soil resilience. In: Greenland, D.J., Szabolcs, I. (Eds.), Soil Resilience and Sustainable Land Use. CAB International, Wallingford, UK, p.353-364).
Тема ЗП и определение ее параметров в последнее время активно обсуждается не только в научно-технической литературе, но и находит отражение в пока еще немногочисленных патентах.
Известен способ определения параметра ЗП по детектированию изменения последовательности в нуклеиновой кислоте по крайней мере в один нуклеотид с целью обнаружения низшей таксономической группы нематод, стратегии жизни этой группы нематод, определения биоразнообразия нематод в образце почвы, компоста и других твердых субстратов (ЕР 1613772 А2, 2006. МПК C12Q 1/68).
Наиболее близким заявляемому является известный способ определения параметра ЗП у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов путем стрессового воздействия на исследуемый образец и контрольный образец, считаемый здоровым, с последующим измерением ответной реакции образцов на стрессовое воздействие (Griffiths B.S., Bonkowski M., Royc J., Ritz K. 2001. Functional stability, substrate utilisation and biological indicators of soils following environmental impacts. Applied Soil Ecology. V.16. P.49-61) - прототип. В данном способе определяют ответную реакцию образцов по кумулятивному (суммарному) количеству выделившегося углекислого газа (УТ) за определенный интервал времени.
Недостатком известного способа является то, что при его использовании эффективность процесса определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов недостаточно высока, так как данный способ основан только на кумулятивном количестве УГ, выделенном за определенный и произвольно выбранный экспериментатором промежуток времени, и не учитывает динамики выделения УГ, свидетельствующей об активности микробиологических процессов, протекающих в исследуемых образцах. В частности, данный способ не позволяет корректно сравнивать образцы с различной исходной влажностью.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности процесса определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов путем стрессового воздействия на исследуемый образец и контрольный образец, считаемый здоровым, с последующим измерением и сравнением ответной реакции образцов на стрессовое воздействие, в качестве ответной реакции образцов используют скорость выделения УГ образцами (V) в условиях их термостатирования, при этом дополнительно строят графические зависимости V от времени, прошедшего с момента стрессового воздействия на образцы (Т), и сравнивают ширину максимальных по амплитуде пиков на их полувысоте, причем при стрессовом воздействии в виде высушивания образцов в образцы после высушивания вводят по одинаковому количеству стерильной дистиллированной воды, составляющему от 15 до 30 миллилитров (мл) на 100 грамм (г) воздушно-сухого образца, а при любом другом стрессовом воздействии на образцы перед стрессовым воздействием образцы сначала высушивают до воздушно-сухого состояния, затем в образцы вводят по одинаковому количеству стерильной дистиллированной воды, составляющему от 15 до 30 мл на 100 г воздушно-сухого образца. При этом стрессовое воздействие заключается по крайней мере в одном из видов воздействия на образцы, выбранном из группы: физическое воздействие, химическое воздействие, биологическое воздействие.
Экспериментально было установлено, что любое стрессовое воздействие на образцы почвы, компостов и других твердых субстратов вызывает появление волнообразной динамики на зависимости V от Т, причем вид данной кинетической кривой может быть как унимодальным, так и полимодальным. В отсутствие стрессового воздействия на образцы значение V почти постоянно с учетом точности ее определения.
Здоровая почва характеризуется сбалансированным биоразнообразием и оптимальной численностью функциональных групп обитающих в ней микроорганизмов и способна активно противодействовать различным стрессовым воздействиям на нее. В этой связи сравнение амплитуд максимальных пиков на зависимости V от Т у контрольного и исследуемых образцов является информативным. Если у исследуемого образца амплитуда максимального пика превышает соответствующую амплитуду пика контрольного образца, считаемого здоровым, то это может свидетельствовать о том, что состав микробного сообщества в исследуемом образце не сбалансирован, т.е. у исследуемой почвы есть проблемы со здоровьем. Если у исследуемого образца амплитуда максимального пика не достигает амплитуды пика контрольного образца, то это говорит о том, что микробное сообщество в исследуемом образце или недостаточно обильно, или недостаточно активно, т.е. супрессировано каким-либо неизвестным фактором. В обоих случаях почва нездорова.
Учет времени, прошедшего с момента появления до затухания максимального по амплитуде пика в вышеописанной колебательной динамике выделения УГ у исследуемого и контрольного образца после стрессового воздействия на них (t), также достаточно информативен. Если t у исследуемого образца превышает t у контрольного образца, считаемого здоровым, это может свидетельствовать о том, что микробное сообщество в исследуемом образце недостаточно активно (супрессировано каким-либо неизвестным фактором). Если t у исследуемого образца меньше t контрольного образца, то это может говорить о том, что микробное сообщество такого образца несбалансированно по численности и разнообразию. И в первом и во втором случае исследуемая почва не является здоровой.
Эффективность процесса определения параметра ЗП можно существенно повысить, если одновременно учесть как вклад амплитуды, так и вклад t в параметр здоровья. Мы предлагаем сравнивать у исследуемого и контрольного образца, считаемого здоровым, ширину максимального по амплитуде пика на его полувысоте на графике зависимости V от Т.
Использование скорости выделения УГ образцами в качестве ответной реакции образцов на стрессовое воздействие на них позволяет учесть вклад биологической составляющей в ЗП, поскольку выделение УГ обусловлено только жизнедеятельностью организмов, обитающих в этих образцах. Ввиду того, что выделение УГ образцами существенно зависит от температуры, измерять V необходимо в условиях термостатирования исследуемого и контрольного образцов. Если термостатирование образцов не проводить, то полученные данные могут быть некорректными и повысить эффективность процесса определения параметра ЗП не удается. Термостатирование образцов целесообразно проводить в условиях, оптимальных для жизнедеятельности мезофильных микроорганизмов, т.е. преимущественно в интервале температур от комнатной до 38°С.
Сравнение параметров именно максимальных по амплитуде вышеназванных пиков обусловлено тем, что это позволяет учесть наиболее активные, наибольшие по численности и, следовательно, наиболее значимые микробные популяции в исследуемых образцах почвы, которые и определяют ЗП.
В случае полимодальной графической зависимости V от Т на кинетической кривой при необходимости проводят экстраполяционное разделение максимального по амплитуде пика от остальных пиков, которые осуществляют традиционными для таких случаев математическими методами.
Ввиду того, что V существенно зависит не только от температуры, но и от влажности образцов, определять и сравнивать ее необходимо в условиях, максимально благоприятных для обитающих в почвах микроорганизмов. В общем случае влажности исследуемого образца почвы и контрольного образца, считаемого здоровым, могут отличаться друг от друга. Для приведения образцов в одинаковое состояние по влажности их необходимо вначале высушить до воздушно-сухого состояния, затем увлажнить до одинаковой влажности путем введения определенного количества стерильной дистиллированной воды. Подсушивание образцов именно до воздушно-сухого состояния является максимально простым и легко осуществимым воздействием на образцы даже в полевых условиях. Использование других приемов сушки образцов более трудоемко и неизбежно усложняет способ определения параметра ЗП. Продолжительность высушивания исследуемого и контрольного образцов почвы, компостов и других твердых субстратов до воздушно-сухого состояния зависит от типа образцов, их влажности и объема и может варьироваться в широких пределах, например, от двух часов и более.
Использование для увлажнения образцов именно стерильной дистиллированной воды необходимо для того, чтобы избежать нежелательного и плохо контролируемого дополнительного стрессового воздействия на образцы, обусловленного наличием в нестерильной обычной воде микроорганизмов и растворенных в ней солей, которые могут оказывать неконтролируемое воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов, обитающих в контрольном и исследуемых образцах.
Экспериментально было установлено, что оптимальное количество вводимой стерильной дистиллированной воды зависит от типа почвы и должно составлять от 15 до 30 мл на 100 г воздушно-сухого образца. Введение воды в количестве, меньшем 15 мл или большем 30 мл на 100 г воздушно-сухого образца, не позволяет создать оптимальную влажность для жизнедеятельности обитающих в образцах микроорганизмов.
В исследуемый и контрольный образец, считаемый здоровым, обязательно необходимо вводить по одинаковому количеству стерильной дистиллированной воды на 100 г воздушно-сухого образца, чтобы в каждом из образцов создать одинаковые условия для обитающих в образцах микроорганизмов. Если это не сделать, то получить сопоставимые данные по V и, как следствие, корректно определить параметр ЗП не удается.
При стрессовом воздействии на образцы в виде их высушивания стерильную дистиллированную воду в образцы необходимо вводить после стрессового воздействия на образцы перед определением зависимости V от Т. При любом другом стрессовом воздействии на образцы одинаковое количество стерильной дистиллированной воды в образцы необходимо вводить после высушивания образцов до воздушно-сухого состояния, но перед оказанием стрессового воздействия на образцы и последующего определения зависимости V от Т. При изменении вышеописанных последовательностей воздействия на образцы корректно определить параметр ЗП и повысить эффективность процесса определения этого параметра не удается.
Мы предлагаем считать исследуемый образец тем более здоровым, чем меньше отличается от нуля значение модуля дроби, в числителе которой находится разность между шириной максимального по амплитуде пика на его полувысоте у контрольного образца и у исследуемого образца, в знаменателе находится ширина пика на его полувысоте у контрольного образца. Тем самым удается получить безразмерный очень информативный параметр, свидетельствующий о ЗП. Ввиду того, что ширина вышеназванного пика на его полувысоте у исследуемого образца может как превышать ширину пика на полувысоте у контрольного образца, так и быть равной или быть меньше ее, необходимо использовать именно модуль вышеназванной дроби.
Использование именно модуля вышеуказанной дроби, а не просто модуля разницы между шириной вышеназванных пиков на их полувысоте, дает возможность устранить размерность у параметра ЗП и позволяет корректно сравнивать состояние ЗП у исследуемого и контрольного образцов.
Необходимость дополнительного построения именно графической зависимости обусловлено тем, что только она позволяет определять вышеназванную разность в ширине пиков на их полувысоте у различных образцов, а данные по зависимости V от Т, представленные в виде таблицы, такой возможности не дают.
Определять скорость выделения УГ образцами целесообразно при той же температуре, при которой проводилось термостатирование образцов. Определять V можно любым известным методом, например газохроматографически, фотоаккустически, гравиметрически и т.д. При этом масса исследуемого и контрольного образцов почвы, компоста и других твердых субстратов принципиального значения не имеет и может варьироваться в широких пределах, но быть одинаковой для сравниваемых образцов. При построении графической зависимости скорости выделения УГ образцами проводить замеры скорости выделения УГ можно с различной частотой, например, через час, но не реже одного раза в сутки. Экспериментально было установлено, что для получения полной и точной кинетической кривой проводить замеры V необходимо в течение 4-9 суток. При этом необходимо сравнивать одинаковые по происхождению образцы, например, образец исследуемой почвы необходимо сравнивать с образцом почвы, считаемой здоровой, а образец исследуемого компоста необходимо сравнивать именно с образцом компоста, считаемого здоровым. Различные по происхождению образцы сравнивать некорректно.
Ввиду того, что выделение УГ образцами существенно зависит от их влажности и температуры, сравнивать контрольные и исследуемые образцы необходимо в одинаковых условиях.
Экспериментально было установлено, что если у исследуемого образца предлагаемый параметр ЗП оказывается в интервале от 0 до 0,1, то образец считается здоровым. Если параметр ЗП превышает 0,1, но меньше 0,2, то образец считается практически здоровым. Если параметр ЗП превышает 0,2, но меньше 0,4, то образец считается умеренно нездоров. При больших значениях параметра ЗП образец нездоров.
Предлагаемый способ прост, информативен и удобен в применении даже в полевых условиях.
Преимущество предлагаемого способа поясняют следующие примеры.
Пример 1.
По 10 г исследуемой серой лесной почвы и взятой с экологически чистого участка серой лесной почвы, считаемой здоровой, высушивают на воздухе в течение 2 ч до воздушно-сухого состояния. После этого образцы помещают в герметически закрывающиеся одинаковые емкости объемом 20 мл, в которые вводят по 1,5 мл стерильной дистиллированной воды, и содержимое емкости перемешивают до однородного состояния. На образцы исследуемой и считаемой здоровой почвы оказывают стрессовое воздействие путем введения в каждый образец по 1 мл жидкого питательного субстрата, представляющего собой 0,25%-ный раствор глюкозы в дистиллированной стерильной воде. После этого содержимое емкостей вначале перемешивают до однородного состояния, затем емкости герметично закрывают газонепроницаемыми пробками и помещают в термостат, поддерживающий температуру +25°С в течение всего эксперимента. Содержание УГ в емкостях над образцами определяют путем отбора шприцом через пробку пробы газа объемом 1 мл с последующим ее введением в газовый хроматограф. Повторное определение содержания УГ в емкости над образцами проводят через час. Путем вычитания исходной концентрации УГ над образцами из концентрации УГ над образцами после их часового термостатирования определяют среднюю V за первый час эксперимента. Каждое последующее определение V осуществляют путем проведения следующих операций. Для предотвращения ретроингибирования микробиологических процессов в образцах выделяющимися из образцов газами емкости с образцами открывают, проветривают течение 10 мин, закрывают газопроницаемой, но не водопроницаемой пленкой и оставляют в термостате в течение 4 часов. По истечении этого времени на емкостях заменяют газопроницаемую пленку на крышку, герметично закрывающую емкости с образцами, и определяют вышеописанным методом содержание УГ в емкости над образцами сразу после закрытия и через один час. Среднюю V за прошедший час определяют путем вычитания концентрации УГ в емкости над образцами сразу после закрытия емкости из конечной концентрации УГ в емкости после часовой экспозиции. Аналогичным образом у исследуемого и контрольных образцов почвы определяют значения V через каждые 4 ч в течение 5 суток, после чего строят графические зависимости V от Т для контрольного и исследуемого образцов, затем у полученных графических зависимостей определяют и сравнивают ширину максимальных по амплитуде пиков на их полувысоте. У контрольного и исследуемого образцов почвы графические зависимости V от Т оказываются унимодальными, причем ширина пиков на их полувысоте у них составляет соответственно 152 ч и 204 ч. Таким образом, параметр ЗП у исследуемого образца серой лесной почвы, равный модулю дроби, в числителе которой находится разница между шириной пика на его полувысоте у контрольного образца почвы и у исследуемого образца почвы, а в знаменателе находится ширина пика на его полувысоте у контрольного образца почвы, составляет 0,34, что означает, что исследуемый образец умеренно здоров.
Пример 2.
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако, вместо образцов серой лесной почвы используют по 5 г исследуемого компоста и компоста, считаемого здоровым. После помещения компостов в емкости на образцы оказывают стрессовое воздействие путем их высушивания при 50°С в течение суток, затем в емкости вводят по 1 мл стерильной дистиллированной воды, содержимое емкостей примешивают до однородного состояния, емкости помещают в термостат, поддерживающий температуру 30°С в течение всего эксперимента, и дальнейший опыт проводят аналогично примеру 1. У исследуемого образца получают параметр ЗП, равный 0,44, что означает, что исследуемый образец компоста нездоров.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ определения параметра здоровья у образцов почвы, компостов и других твердых субстратов существенно повышает эффективность процесса определения параметра ЗП у образцов, поскольку в отличие от прототипа он более информативен и учитывает также динамику выделения УГ образцами, отражающую активность микробиологических процессов, протекающих в исследуемом и контрольном образцах.