СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ
METHOD OF PRODUCTION OF ENZYMATIC WHEY PROTEINS

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к получению очищенных гидролизатов сывороточных белков молока с высокой биологической ценностью, используемых при производстве гипоаллергенных продуктов питания для детей и взрослых, страдающих различными формами пищевой непереносимости белков молока.
Известен способ получения частичного гидролизата молочных белков (при соотношении сывороточные белки/казеин от 40/60 до 80/20), включающий гидролиз, концентрирование и сушку. Гидролиз осуществляют в одну стадию под действием смеси ферментов трипсина и химотрипсина, при этом белок предварительно термически денатурируют при (70-80)°C. Гидролиз проводят в 4-6% растворе субстрата при фермент-субстратном соотношении 0,6-0,8% при температуре (30-50)°C в течение 2-6 часов. Устанавливают исходный pH 7,5-8,0 ед. и далее в ходе процесса не pH-статируют, позволяя pH опуститься до величины 6,5-6,8 ед. Далее проводят термическую инактивацию фермента при температуре (80-90)°C, концентрирование и сушку. Гидролизат используют в продуктах непосредственно, без дальнейшей очистки. По данным иммуноферментного анализа (проводимого в варианте метода торможения непрямого иммуноферментного теста) антигенность гидролизата снижается на 75-95% в сравнении с исходным белком. (см. патент US №5405637, НКИ 426/580, 11.04.1995 г.).
Приведены исследования молекулярно-массового распределения методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке TSK, которые, однако, были получены в водно-органических средах и поэтому недостаточно адекватно отражают состав гидролизата.
Аналогичный метод получения "частичных" гидролизатов молочного белка приводится в патенте (см. патент US №5589357, НКИ 435/68.1, 31.12.1996 г.). В отличие от описанного выше способа инактивацию смеси ферментов трипсин+химитрипсин в гидролизате проводят острым паром.
Недостатки представленных выше аналогов следующие:
- дополнительно необходима стадия термической инактивации фермента, которая может приводить к ухудшению качества продукта (снижению биологической ценности из-за потери части незаменимых аминокислот);
- непосредственно после проведения гидролиза и инактивации ферментов гидролизат сушат без дополнительной очистки. Это приводит к тому, что в состав продукта попадают остаточные количества нерасщепленного белкового субстрата и компоненты ферментных препаратов, которые могут сами по себе обладать аллергенным действием, что ухудшает качество продукта и снижает возможность его использования в гипоаллергенных смесях;
4
- степень снижения антигенности получаемого продукта составляет 75-95%, что соответствует снижению в 4-20 раз. Этого крайне недостаточно для использования данного гидролизата в гипоаллергенных продуктах питания. В составе гипоаллергенных смесей профилактического назначения степень снижения антигенных свойств должна составлять 10(10.000) раз или более;
- в ходе проведения процесса производится мониторинг молекулярно-массового распределения пептидов методом эксклюзионной хроматографии на колонке TSK G-2000 SWXL. Однако при этом применяется растворитель, содержащий ацетонитрил, что может исказить результаты анализа, а именно привести к занижению содержания пептидов с молекулярными массами более 10 кДа (килодальтон), вследствие выпадения их в осадок при растворении в подвижной фазе, содержащей ацетонитрил. При этом следует отметить - степень потери белково-пептидного материала зависит от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе, что делает результаты анализа неопределенными.
Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролизата, включающий получение белкового раствора, его пастеризацию, ферментативный гидролиз панкреатином, ультрафильтрацию и диафильтрацию полученного гидролизата с разделением на фильтрат и концентрат, сушку (см. патент РФ №2375910).
Недостатками предложенного способа являются:
- Использование панкреатина, который не приводит к полному гидролизу сывороточных белков. Технология получения гидролизата сывороточных белков с использованием панкреатина трудна и затратна.
- Диафильтрация полученного раствора - лишняя стадия (удорожание способа, необходимость применения специального оборудования, большие энергозатраты).
- Применение смеси гидроксида калия и гидроксида натрия приводит к излишнему поступлению солей в гидролизат.
«Protamex» является протеазным комплексом, продуцируемым микроорганизмами рода Bacillus. Активность ферментативного препарата составляет 400 Протеолитических единиц на 1 г «Protamex» не образует горьких пептидов на любой стадии ферментативного гидролиза.
Использование «Protamex» для гидролиза сывороточных белков в заявленном способе позволяет провести гидролитическое расщепление белков до аминокислот и других составляющих компонентов, что обеспечивает лучшую усвояемость белкового компонента молочной сыворотки, а это, в свою очередь, повышает пищевую ценность готового продукта.
При этом глубина гидролиза составляет 41-72% от общего содержания белка. Это обеспечивает накопление в конечном продукте аминокислот, необходимых организму, в том числе незаменимых (триптофан, фенилаланин и тирозин, лизин, валин, изолейцин, треонин, метионин и цистеин), а также такой ценной аминокислоты, как таурин, что способствует приданию функциональных свойств конечному продукту.
Кроме того, использование фермента «Protamex», разрешенного для применения в пищевых производствах и пищевых системах, обеспечивает приятный вкус готовому продукту без наличия горечи в отличие от известных аналогичных продуктов и серо-бежевый или кремовый цвет.
«Alcalase» является ферментом, продуцируемым бактериями линии Bacillus. При гидролизе «Alcalase» протеиназой К наблюдается наименьшее остаточное содержание антигенных детерминант, однако при этом белки гидролизуются до высокого количества незаменимых аминокислот. Кроме того, использование фермента «Alcalase», разрешенного для применения в пищевых производствах и пищевых системах, обеспечивает приятный вкус готовому продукту без наличия горечи.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении ферментативного гидролизата сывороточных белков со сниженной потенциальной аллергенностью, что дает возможность его использования в гипоаллергенных смесях.
Технический результат достигается тем, что в способе получения ферментативного гидролизата сывороточных белков, включающем получение белкового раствора, его пастеризацию, ферментативный гидролиз препаратами «Protamex» или «Alcalase», ультрафильтрацию полученных гидролизатов с разделением на фильтрат и концентрат, сушку. Перед внесением ферментов начальное значение pH белкового раствора устанавливают 5% водным раствором щелочи гидроксида калия. Раствор белка получают из сухого концентрата сывороточного белка, а гидролиз ведут при температуре (40-55)°C в течение 4,0 часов, с начальным pH 7,5-8,0 ед., ультрафильтрацию гидролизата осуществляют на мембранах с пропускной способностью 10 кДа (до массовой доли сухих веществ в концентрате 20-22%, после чего полученный концентрат пастеризуют при температуре (70-80)°C в течение 30 с и сушат на распылительной сушилке.
Экспериментально было установлено, что температура гидролиза составляет (40-55)°C. Отклонение в меньшую сторону ниже 40°C нежелательно, т.к. приводит к увеличенному содержанию остающихся в реакционной смеси негидролизованных высокомолекулярных белковых структур, что снижает выход получаемого продукта, и приводит к снижению качества, повышению потенциальной аллергенности. Отклонение в большую сторону (свыше 55°C) также нежелательно, т.к. приводит к ускорению процесса термической инактивации ферментного препарата, что влечет за собой уменьшение выхода готового продукта. Кроме того, это приводит к перерасходу энергии на поддержание температуры в ходе процесса и последующее охлаждение готового продукта, что вызывает увеличение себестоимости продукта.
Проведение протеолиза «Protamex» или «Alcalase» при установлении начального pH 7,5-8,0 ед., которое в течение гидролиза постепенно снижается, позволяет не проводить в дальнейшем pH-статирование, что уменьшает количество солей, поступающих в продукт, и, следовательно, улучшает его качество.
Регулирование pH осуществляют 5%-ным раствором щелочи КОН (гидроксида калия). Ультрафильтрационная обработка гидролизата позволяет удалить высокомолекулярную фракцию (ВМФ) - негидролизованный сывороточный белок и жир.
Экспериментально было установлено, что ультрафильтрация неочищенного гидролизата на мембранах с размерами пор 10 кДа позволяет получить гидролизаты белков молочной сыворотки как с максимальным выходом, так и с требуемым снижением остаточной антигенности. Использование мембран с большими размерами пор приводит к недопустимому увеличению остаточной антигенности, а мембраны с меньшей пористостью снижают выход гидролизата.
Пастеризация продуктов необходима для улучшения их микробиологических показателей. Уменьшение температуры пастеризации ниже заявленного диапазона значений приводит к возрастанию риска микробной контаминации гидролизатов и продуктов на его основе при их последующем хранении.
Заявляемая совокупность признаков позволяет получить ферментативный гидролизат сывороточных белков повышенной биологической и пищевой ценностью, улучшенным качеством и органолептическими свойствами, сниженной потенциальной аллергенностью. Это дает возможность его использования в гипоаллергенных смесях со сниженной аллергенностью по отношению к белкам молока.
В заявляемом изобретении степень удаления нерасщепленного белка контролируется методом жидкостной хроматографии. Это позволяет получить продукты более высокого качества с меньшим содержанием нерасщепленных белков и аллергенов.
Качественные преимущества получаемых гидролизатов заключаются в следующем:
- в низкой остаточной антигенности.
Благодаря этому гидролизаты, в качестве белковых компонентов, могут быть использованы для получения продуктов для профилактического питания детей и взрослых, предрасположенных к пищевой аллергии и непереносимости белков коровьего молока;
- в высокой биологической ценности.
Сбалансированное содержание незаменимых аминокислот в составе гидролизатов обеспечивает их высокую биологическую ценность, то есть максимально эффективное усвоение в организме и способность использоваться для построения собственных белков организма.
Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков осуществляется следующим образом.
Сухой концентрат сывороточных белков (КСБ) растворяют при постоянном перемешивании в питьевой воде с температурой (40-45)°C, охлаждают и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 минут. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, охлаждают и подают на ферментативный гидролиз.
Ферментативный гидролиз раствора сывороточных белков ведут с использованием ферментных препаратов «Protamex» или «Alcalase» в течение 4,0 часов.
Ферменты «Protamex» или «Alcalase» в количестве 4% от массы сухих веществ КСБ предварительно растворяют в питьевой воде с температурой (40-50)°C до образования раствора с массовой долей сухих веществ 3-6% и при постоянном перемешивании вносят в раствор сывороточных белков. Ферментативный гидролиз ведут при температуре (40-55)°C в течение 4,0 часов.
По окончании гидролиза полученные неочищенные гидролизаты охлаждают и направляют на ультрафильтрацию.
Неочищенные гидролизаты сывороточных белков (ГСБ) разделяют на ультрафильтрационной установке с пропускной способностью мембран 10 кДа, давлении 3 атм на концентраты, содержащие высокомолекулярную фракцию (ВМФ), и фильтраты, содержащие низкомолекулярную фракцию (НМФ).
Сушку гидролизатов осуществляют при следующих режимах:
- температура воздуха на входе в сушильную башню - (150-170)°C;
- температура воздуха на выходе из сушильной башни - (70-90)°C.
Полученные сухие гидролизаты охлаждают, фасуют и направляют на хранение.
Окончательный контроль качества полученных гидролизатов осуществляется после проведения распылительной сушки хроматографическим и иммунохимическим методами. Аналитические определения проводят согласно стандартным методикам.
Следующие примеры иллюстрируют способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков.
Пример 1
1300 кг сухого концентрата сывороточных белков растворяют при перемешивании в питьевой воде (соотношение 1:2) с температурой 40°C до образования раствора с массовой долей сухих веществ (белок, жир, лактоза, соли) 10,0%, охлаждают до 4°C и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 мин. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, затем охлаждают до температуры 40°C и подают на ферментативный гидролиз.
Ферментативный гидролиз раствора сывороточных белков ведут с использованием ферментного препарата «Protamex» в течение 4,0 часов.
Перед внесением фермента однократно доводят начальное значение pH раствора сывороточных белков до 7,5-8,0% 5%-ным раствором щелочи КОН.
Фермент «Protamex» в количестве 4% от массы сухих веществ КСБ предварительно растворяют в питьевой воде с температурой (40-50)°C до образования раствора с массовой долей сухих веществ 3-6% и при постоянном перемешивании вносят в раствор сывороточных белков. Ферментативный гидролиз ведут при температуре (40-55)°C в течение 4,0 часов.
По окончании гидролиза полученный неочищенный гидролизат охлаждают до 20°C и направляют на ультрафильтрацию на мембранах с пропускной способностью 10 кДа, давлении 3 атм. (Используют полисульфоновые мембраны UF DHT 20-6338/30FF.) Гидролизат разделяют на концентрат, содержащий ВМФ, и фильтрат, содержащий НМФ.
Получают 1400 л концентрата с массовой долей сухих веществ 20,5%.
Гидролизат сгущают на вакуум-выпарной установке до массовой доли сухих веществ 40%, после чего сгущенную смесь пастеризуют при температуре (70-80)°C в течение 30 с и направляют на распылительную сушку.
Сушку сгущенного гидролизата осуществляют при следующих режимах: температура воздуха на входе в сушильную башню 170°C, температура воздуха на выходе из сушильной башни 80°C.
Получают 1040 кг гидролизата с использованием фермента «Protamex» с содержанием сухих веществ 98,0%. Выход гидролизата составил 80%.
-5
Массовая доля антигенов молочной сыворотки в гидролизате с использованием фермента «Protamex» - 3,3×10.
Пример 2
Процесс проводят аналогично примеру 1. Отличается тем, что ферментативный гидролиз раствора сывороточных белков ведут с использованием ферментного препарата «Alcalase» в течение 4,0 часов.
Получают 813 кг гидролизата с использованием фермента «Alcalase» с массовой долей сухих веществ 93,0%.
-5
Выход гидролизата составляет - 60%. Массовая доля антигенов молочной сыворотки в гидролизате с использованием фермента «Alcalase» - 4,3×10.
Пример 3
Процесс проводят аналогично примеру 1. Отличается тем, что ультрафильтрацию проводили до массовой доли сухих веществ в концентратах 25%. В результате процесс был остановлен, так как мембрана забилась макромолекулярным белковым материалом и процесс фильтрации прекратился.
Вывод: данный режим проведения процесса непригоден, так как производительность ультрафильтрации при этом резко снижается.
-5
Заявляемый способ позволяет получить ферментативный гидролизат сывороточных белков с низкой остаточной антигенностью и достаточно высоким выходом в процессе производства. В гидролизате содержание свободных аминокислот не превосходит 40%, а остаточная антигенность белков коровьего молока в составе продукта не превышает 4,3·10.
Заявляемый гидролизат можно использовать в получении продуктов профилактического и лечебного питания для больных с пищевой аллергией на белки коровьего молока