Направленный рост и миграция стромальных клеток костного мозга в культуре in vitro

ИМИ!

Оригинальные исследования

ЕЕ^ЕШ

Направленный рост и миграция стромальных клеток костного мозга в культуре in vitro

Р.В. Деев1, Н.В. Цупкина 2 Г.П. Пинаев 2

1 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

2 Институт цитологии РАН

R.V. Deev1, N.V. Tsupkina 2 G.P. Pinaev 2

1 Kirov Military Medical Academy; 2 Institute of Cytology RAS

Guided growth and migration of bone marrow stromal cells in culture in vitro

На модели in vitro подтверждена способность культуры стромальных клеток костного мозга кролика реагировать направлением миграции и роста колонии в ответ на хемотаксический стимул. В качестве источника хемотаксического стимула использованы аутогенные по отношению к культуре клеток фрагменты жизнеспособной и девитализированной пластинчатой костной ткани. Установлено. что в условиях клеточной культуры стромальные клетки в большей степени отвечают на сигналы жизнеспособной кости, что. вероятно, обусловлено продукцией биологически активных веществ клетками костного фрагмента. Невыраженная реакция культуры на присутствие девитализированной костной ткани, вероятно, обусловлена изменением свойств костной ткани после потери жизнеспособности. в частности, изменениями белков внеклеточного матрикса.

Обсуждено возможное воздействие на миграцию клеток культуры клеток различных факторов.

Ключевые слова: стромальные клетки, хемотаксис, миграция клеток, костная ткань.

Введение

В последнее время все большее внимание исследова телей привлекают возможности клеточной трансплантации для коррекции патологии скелетных тканей. Показано, что клетки с облигатной или факультативной остеогенной детер минацией (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), стромальные клетки костного мозга, остео генные клетки, остеобласты) при их трансплантации в орга низм реципиента участвуют в процессах остеогенеза. Такие сведения получены при свободных пересадках указанных клеток в область переломов и дефектов костей [1, 2]. При системном введении ядросодержащих клеток костного моз га, включающих фракцию стромальных клеток, они также демонстрируют тропность к костной ткани реципиента и про дуктивно участвуют как в репаративном (восстановительном) [3], так и в физиологическом [4, 5] костеобразовании. На использовании данного феномена основаны клинически приемлемые способы коррекции системных заболеваний костной ткани [6, 7].

Несмотря на большое количество полученных экспери ментальных и клинических данных, механизмы данного яв ления остаются недостаточно изученными.

Цель работы: в модельной системе in vitro зарегистриро вать признаки миграции или направленного роста стромаль ных клеток костного мозга в ответ на остеогенный стимул.

Материал и методы

Культуру стромальных клеток кролика получали из кост ного мозга, заключенного в гребнях подвздошных костей. Клетки высеивали в одноразовую пластиковую посуду (чаш ки Петри) из расчета 5 7x105 клеток на 1 сма площади дна. Среда имела следующий состав: DMEM (ISN, США) и F12

Using a simple model in vitro the capability of rabbit bone marrow stromal cells to respond to chemotaxic stimulus by guiding migration and growth of the colony was substantiated. As a source of chemotaxic stimulus vital and devitalized laminar bone tissue fragments autogenic to cells culture were used, t has been stated that under cellular culture conditions stromal cells respond largely to vital tissue signals which might have been due to biological active substances produced by cells of a bone fragment. Obscure-response of culture to devitalized bone tissue presence may have been due to bone tissue properties alteration after devitalization, in particular, alterations of intracellular matrix proteins.

Possible influence of different factors to cells culture migration has been discussed.

Key words: stromal cells, chemotaxis, cells migration, bone tissue.

(ISN, США) в соотношении по объему 3:1 с добавлением 20% эмбриональной коровьей сыворотки (Биолот, РФ; ISN, США), гентамицина сульфата (50 мкг/мл). Смену среды произ водили каждые 3 суток. По достижении монослоя, культуру пассировали в одноразовой посуде, на дне которой были уло жены круглые покровные стекла диаметром 1,0 см. После того, как поверхность стекол полностью покрывалась клетками, их извлекали и монтировали в новых чашках Петри точно в центре. Культуральная среда имела прежний со став. В зависимости от опыта культивирование проводили в присутствии аутогенных по отношению к клеткам жизне способных и девитализированных костных фрагментов. Девитализацию проводили путем трехкратного быстрого замораживания оттаивания. Контроль девитализации осу ществляли при помощи помещения кусочков в питательную среду и с использованием сканирующей электронной мик роскопии (СЭМ). Ни в одном случае не было обнаружено роста in vitro и целых жизнеспособных клеток. Также СЭМ подвергали жизнеспособные кусочки костей после культи вирования.

В дальнейшем опыты повторили после нанесения на дно чашек коллагенового геля, получаемого из соединительной ткани сухожилий лабораторных животных. В качестве конт роля использовали изолированную культуру стромальных клеток на покровных стеклах.

Через 1 неделю культивирования культуру фиксирова ли 4% раствором параформальдегида, окрашивали по Ро мановскому Гимза (азур ll-эозином). Состояние культуры оценивали визуально.

Подготовку препаратов костных фрагментов для ска нирующей электронной микроскопии выполняли по тра диционной методике [8]. Фиксировали 2% глютаровым альдегидом. После обезвоживания образцы покрывали

И I II II

І І І

Оригинальные исследования

медью в аппарате низкотемпературного напыления 1100.

Изучение проводили в сканирующем электронном микроско пе иЕОЬ - 35С при ускоряющим напряжении 15 кУ.

Результаты

В контроле клетки, находившиеся на покровных стеклах в центре чашек Петри, за срок наблюдения равномерно проли ферировали и мигрировали на дно чашки по всему периметру (рис. 1). Причем, на чашках, у которых дно было обработано раствором коллагена, этот процесс был более выражен. Иногда наблюдались свободные отсевы в виде дискретных единичных колоний.

При культивировании стромальных клеток с фрагментами девитализированной кости достоверных данных в пользу вли яния на рост колонии клеток не получено. Характер роста куль туры был аналогичен контролю. Культура росла центробежно от покровного стекла, лишь незначительно распространяясь

по дну культурального сосуда (см. рис. 1 А). Этот процесс был несколько более выражен в чашках, покрытых коллагено вым гелем.

При кокультивировании с фрагментами аутогенных жизнеспособных кусочков костной ткани получены иные данные. На чашках, не обработанных коллагеном, наблю дали миграцию клеток с покровных стекол на дно, преиму щественно в сторону локализации кусочка кости (см. рис. 1 В], Причем, в ряде случаев клетки формировали колонии, вытя нутые в сторону живой кости. В чашках, покрытых коллагеном, культура характеризовалась более выраженным ростом, большей площадью экспансии дна, причем, несмотря на то, что из за многочисленных дискретных колоний, являющих ся отсевами основной колонии и отсевами от сохранивших жизнеспособность клеток эксплантированного кусочка кос ти, преимущественное направление роста было сохранено -в сторону живой кости.

Рис. 1. Результаты эксперимента:

А - сторона расположения девитализированного аутогенного костного фрагмента; В - сторона расположения жизнеспособного костного фрагмента.

Окраска: по Романовскому-Гимза

I I I I I I

I I I

Оригинальные исследования

При культивировании в одной чашке и девитализиро ванного, и живого фрагмента кости клетки мигрировали преимущественно в сторону жизнеспособного кусочка (см. рис. 1 В, А).

Обсуждение

Полученные в простом модельном эксперименте дан ные дают наглядное представление о том, каким образом процессы миграции могут осуществляться in vivo. В организ ме подобные ситуации могут возникать в случаях физио логической регенерации костной ткани, когда клетки кам биального резерва естественным образом расходуются на ремоделирование кости и поддержание ее морфофункцио нального гомеостаза. При репаративной регенерации для процессов остеогенеза рекрутируются костномозговые ос теогенные клетки предшественники, входящие составной частью в строму костного мозга. Показано, что помимо ме стной миграции под воздействием паракринных факторов хемоаттракции, указанные клетки способны мигрировать посредством системного кровотока [9]. Искусственно такая ситуация воспроизводится при трансфузиях. Молекуляр ные механизмы хоуминга данных клеток требуют особого обсуждения.

В сохранивших свою жизнеспособность клетках фрагмен тов костной ткани - остеобластах, клетках периваскулярного микроокружения, заключенных в гаверсовых каналах идут активные цитофизиологические процессы. Ранее нами было показано, что эти клетки способны пролиферировать на по верхности эксплантированного костного фрагмента, миг рировать на подложку (рис. 2); синтезировать щелочную фосфатазу, свидетельствующую в данном случае об остео генной дифференцировке клеток (10]. Следует предположить, что помимо синтеза щелочной фосфатазы, клетки в данных условиях вырабатывают и ряд других биологически актив ных молекул.

Большое внимание исследователей в последнее время приковано к Stromal derived factor 1 (SDF 1). Оказалось, служащий аттрактантом для клеток различных типов, он спо собен воздействовать и на стромальные клетки в качестве ауто или паракринного регулятора. Возможно данный

фактор является стадиеспецифичным, при нарастании ос теогенной дифференцировки клеток их способность проду цировать SDF 1 снижается (11 ], вместе с тем показано, что дифференцированные остеобласты также продуцируют SDF 1 [12]. В экспериментах in vitro с остеобластами чело века, стромальными клетками костного мозга человека, мыши и крысы установлено, что ряд цитокинов индуцируют выработку SDF 1, к ним относятся IL 1р, PDGFBB, VEGF, TNF а и паратиреоидный гормон; TGF р1 — уменьшает его выработку [13], что подтверждено идентификацией раство ренного SDF 1 в культуральной среде.

Взаимодействие SDF 1 с его рецептором CXCR4 при водит к перестройкам цитоскелета клеток, благодаря ко торым становится возможной их миграция под действием хемотаксиса в локусы ремоделирования кости [13, 14]. Именно этому взаимодействию сегодня придают ведущее значение в хемоаттракции стромальных клеток.

Одним из ключевых факторов регуляции механоцитов являются костные морфогенетические белки (bone morphogenetic protein, BMP). Они вызывают дифференци ровку ММСК в клетки остеогенной линии. Сохраненный при особых условиях костный матрикс содержит факторы рос та, в частности, BMP, который является хемоаттрактантом для остеогенных клеток предшественников, что показано в условиях in vitro путем микрокиносъемки в ответ на внесе ние в культуральную систему рекомбинантного BMP 7 [15]. Аналогичный эффект вызывают BMP 2, BMP 4 в концен трации 10 нг/мл [16, 17], при этом отмечено, что rhTGF р1 и rhbFGF не обладают таким свойством. Эти данные оста ются весьма противоречивыми, так, Makhijani N.S. с соавт. (2005) показали дозозависмый положительный хемотаксис остеогенных клеток в ответ на внесение в культуральную среду трех изоформ трансформирующего фактора роста: на TGF р1 или рЗ - в чистом виде, а в ответ на TGF р2 -только в присутствии ретиноевой кислоты [18].

Фактор роста фибробластов был использован для био логически активной модификации скаффолда, позволяю щей привлекать ММСК и оптимизировать их адгезию [19]; аналогичное применение находит и костный сиалопротеин [20].

Рис. 2. Миграция стромальных клеток с фрагмента кости на дно культурального сосуда [А]. Сканирующая электронная микроскопия. Ув.: х 600

И I II II

тп

Оригинальные исследования

Еще одним фактором, стимулирующим миграцию стро мальных клеток является тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor, PDGF) [21 23]. Данный ме ханизм, по мнению исследователей, может быть реализован при рекрутировании костномозговых предшественников остеобластов для ремоделирования костной ткани. Анало гичный эффект показан для сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), чья экспрессия весьма выражена при протекании энхондрально го остеогистогенеза. С наличием этого фактора связывают привлечение и дифференцировку предшественников осте областов из стромы костного мозга (24].

В ходе наших экспериментов установлено, что культура стромальных клеток костного мозга кролика обладает свой ством реагировать особенностями роста и миграции на присутствие в культуральной системе жизнеспособной, но поврежденной костной ткани. В случае кокультивирования с девитализированной костной тканью, в которой помимо

устранения жизнеспособных клеток продуцентов биоло гически активных веществ, низкотемпературная обработ ка могла повлиять и на функциональную активность бел ков внеклеточного матрикса, культура стромальных клеток не демонстрировала изменение характера своего роста.

В присутствии жизнеспособной костной ткани клетки культуры активно мигрировали в сторону ее расположения. В случае, если дно чашки было покрыто коллагеном, клетки преимущественно не мигрировали на его поверхность, а активно пролиферировали, и колония, распространяясь центростремительно, занимала все большую площадь дна культурального сосуда. Коллаген, являясь основным белком внеклеточного матрикса соединительных тканей, представ ляет собой естественный субстрат для адгезии и пролифе рации стромальных клеток, что используется для обработки поверхностей гидрофобных носителей для клеток (скаффол дов) [25, 26].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Денисов Никольский Ю.И., Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В. Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии. М.: ОАО Типография «Новости» 2005: 336.

2. Деев Р.В. Посттравматическая регенерация костной ткани при трансплантации культуры костномозговых стромальных клеток [экспериментальное исследование). Дис. ...канд. мед. наук., СПб.; 2006: 175.

3. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Сериков В.Б. и др. Участие трансфузированных клеток костного мозга в репаративном остеогистогенезе. Цитология 2005; 46(9): 755 9.

4. DominiciM., Pritchard С., GarlitsJ.E. et al. Hematopoietic cells and osteoblasts are derived from a common marrow progenitor after bone marrow transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101(32): 11761 6.

5. Деев P.В., Цупкина H.B., Сергеев B.C. и др. Особенности физиологического и репаративного остеогенеза после трансфузии ядросодержащих клеток костного мозга. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 3(5): 54 8.

6. Horwitz Е.М., Prockop D.J., Gordon P.L. et al. Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood 2001; 97(5): 1227 31.

7. Horwitz E.M., Gordon P.L., Koo W.K. et al. Isolated allogeneic bone marrow derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99(13): 8932 7.

8. Миронов A.A., Комиссарчик Я.В., Миронов B.A. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: метод, руководство. СПб.: Наука 1994:400.

9. Илизаров Г.А., Палиенко Л.А., Шрейнер А.А., Богомяков B.C. Динамика численности костномозговых клеток, образующих колонии фибробластов в культуре, и её связь с активностью остеогенеза при репаративной регенерации в условиях удлинения конечности. Онтогенез 1983; 14(6): 617 23.

10. Гололобов В.Г., Деев Р.В., Николаенко Н.С. и др. Характеристика культуры пластинчатой костной ткани in vitro. Морфология 2004; 125: 64 8.

11. Kortesidis A., Zannettino A., Isenmann S. et al. Stromal derived factor 1 promotes the growth, survival, and development of human bone marrow stromal stem cells. Blood 2005; 105(10): 3793 801.

12. Neiva K., Sun Y.X., Taichman R.S. The role of osteoblasts in regulating hematopoietic stem cell activity and tumor metastasis. Braz. J. Med. Biol. Res. 2005; 38(10): 1449 54.

13. Jung Y., Wang J., Schneider A. et al. Regulation of SDF 1 (CXCL1 2) production by osteoblasts; a possible mechanism for stem cell homing. Bone 2006; 38(4): 497 508.

14. Lisignoli G., Toneguzzi S., Piacentini A. CXCL1 2 (SDF 1) and CXCL13 (BCA 1) chemokines significantly induce proliferation and collagen type I expression in osteoblasts from osteoarthritis patients. J. Cell Physiol. 2006; 206(1): 78 85.

15. Lee D.H., Park B.J., Lee M.S. et al. Chemotactic Migration of Human Mesenchymal Stem Cells and MC3T3 E1 Osteoblast Like Cells Induced by COS 7 Cell Line Expressing rhBMP 7. Tissue Eng. 2006; Epub. ahead of print.

16. Fiedler J., Roderer G., Gunther K.P., Brenner R.E. BMP 2, BMP 4, and PDGF bb stimulate chemotactic migration of primary human mesenchymal progenitor cells. J. Cell Biochem. 2002; 87(3): 305 12.

17. Gonnerman K.N., Brown L.S., Chu T.M. Effects of growth factors on cell migration and alkaline phosphatase release. Biomed. Sci. Instrum. 2006; 42: 605.

18. Makhijani N.S., Bischoff D.S., Yamaguchi D.T. Regulation of proliferation and migration in retinoic acid treated C3H10T1 /2 cells by TGF beta isoforms. J. Cell Physiol. 2005; 202(1): 304 13.

19. Ma Z., Gao C., Gong Y., Shen J. Cartilage tissue engineering PLLA scaffold with surface immobilized collagen and basic fibroblast growth factor. Biomaterials 2005; 26(11): 1253 9.

20. Karadag A., Fisher L.W. Bone sialoprotein enhances migration of bone marrow stromal cells through matrices by bridging MMP 2 to alpha(v)beta3 integrin. J. Bone Miner. Res. 2006; 21(10): 162736.

21. Fiedler J., Roderer G., Gunther K.P., Brenner R.E. BMP 2, BMP 4, and PDGF bb stimulate chemotactic migration of primary human mesenchymal progenitor cells. J. Cell Biochem. 2002; 87(3): 305 12.

22. Fiedler J., Etzel N., Brenner R.E. To go or not to go: Migration of human mesenchymal progenitor cells stimulated by isoforms of PDGF. J. Cell Biochem. 2004; 93(5): 990 8.

23. Celotti F., Colciago A., Negri Cesi P. et al. Effect of platelet rich plasma on migration and proliferation of SaOS 2 osteoblasts: role of platelet derived growth factor and transforming growth factor beta. Wound Repair Regen. 2006; 14(2): 195 202.

24. Fiedler J., Leucht F., Waltenberger J. VEGF A and PIGF 1 stimulate chemotactic migration of human mesenchymal progenitor cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 334(2): 561 8.

25. Швед Ю.А., Кухарева Л.В., Блинова М.И. и др. Влияние различных форм коллагеновых субстратов, прикрепленных к полимерной подложке, на рост и пролиферацию клеток кожи в культуре. Цитология 2006; 48(9): 810 1.

26. Suh Н., Hwang Y.S., Lee J.E. et al. Behavior of osteoblasts on a type I atelocollagen grafted ozone oxidized poly L lactic acid membrane. Biomaterials 2001; 22(3): 219 30.