Исследование процесса выделения каротиноидов из галофильных бактерий Halobacterium halobium

к синтезу фермента, расщепляющего лактозу. Выделение Р-галактозидазы из биомассы проводили с помощью подобранного ранее метода экстракции толуолом (таблица 2).

Из представленных данных видно, что при внесении в пермеат молочной сыворотки дополнительных источников азота и фосфора, а также дрожжевого экстракта происходит увеличение количества накопленного фермента в биомассе исследуемых культур.

Таким образом, установлено, что пермеат молочной сыворотки может являться основой при составлении питательной среды для культивирования дрожжей Klayveromyces lactis и Klayveromyces marxiamis. Данные культуры могут быть использованы как микроорганизмы-продуценты Р-галактозидазы. Дальнейшие исследования направлены на изучение способов концентрирования и очистки ферментного препарата.

Библиографические ссылки

1. Залашко М.В. Биотехнология переработки молочной сыворотки. М.: Аг-ропромиздат, 1990. С. 192.

2. Effect of compressed fluids treatment on the activity, stability and enzymatic reaction performance of P-galactosidase. / Manera A. P., Kuhn G., Polloni A., Marangoni М., Zabot G., Kalil S. J., Oliveira D., Treichel H., Oliveira V. J., Ma-zutti M.A., Maugeri F.//Food Chemistry, 2011. 125. P. 1235-1240.

3. Kippert F. A rapid permeabilization procedure for accurate quantitative determination of P-galactosidase activity in yeast cells // FEMS Microbiology Letters, 1995. Vol. 128, Issue 2. P. 201-206.

УДК 577.169 К.А. Тимошенко

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ВЫДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ ИЗ ГАЛОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ HALOBACTERIUMHALOBIUM

A comparative analysis of methods for preparing the biomass of halobacteria for the extraction. Chosen the optimal extragent, as well as time and the multiplicity of extraction. The extract of carotenoids were analyzed by column chromatography.

Проведен сравнительный анализ способов подготовки биомассы галобактерий к экстракции. Подобран оптимальный экстрагент, а так же время и кратность экстракции. Полученный экстракт каротиноидов был проанализирован методом колоночной хроматографии.

Введение.

В настоящее время растет интерес к получению производных нукле-

иновых кислот из природного сырья, среди которого наиболее перспективным является биомасса бактерий. При микробиологическом производстве после выделения первичных и вторичных метаболитов отработанная биомасса бактерий содержит значительное количество ценных химических соединений, на основе которых можно получить ценную конкурентоспособную продукцию технического, пищевого и медицинского назначения. К таким соединениям относятся, например, пигменты, липиды и белки.

В процессе выделения нуклеиновые кислоты способны образовывать устойчивые комплексы с другими метаболитами бактериальных клеток, что затрудняет процесс их очистки. Поэтому на первом этапе получения нуклеиновых кислот бактериальная биомасса должна быть максимально очищена от сопутствующих соединений.

В соответствии с вышеизложенным, в настоящей работе был исследован процесс выделения каротиноидов из галофильных бактерий На1оЪас1егтт Иа1оЫнт, биомасса которых была любезно предоставлена институтом ГосНИИГенетика.

Клетки На1оЬас1ег 'шт Иа1оЫит синтезируют такие каротиноиды, как ксантофиллы, бактериоруберин и бета-каротин. В настоящее время установлено, что каротиноиды проявляют антиоксидантную, иммуномодулирующую, противоопухолевую активности, улучшают состояние кожи, благотворно влияют на зрение. Каротиноиды обладают высокой антиоксидантной активностью, которая проявляется в торможении процессов окисления липидов и предотвращении предраковых и возрастных повреждений клеточных мембран, радиационных поражений и сердечно-сосудистых заболеваний [4].

Таким образом, широкий спектр применения каротиноидов, содержащихся в биомассе На1оЪас1егтт Иа1оЫнт, свидетельствует о целесообразности их выделения и использования в лечебных и профилактических целях.

В связи с этим целью данной работы является разработка процесса выделения смеси каротиноидов из биомассы На1оЬас1ег 'шт Иа1оЫит и определение их состава.

Результаты и обсуждение.

На первом этапе исследования был выбран способ подготовки биомассы, который обеспечивает наиболее полную экстракцию каротиноидов. В качестве объектов исследования были выбраны: суспензия бактериальной биомассы, неочищенная от питательной среды, влажная бактериальная биомасса, отмытая от питательной среды, сухая неизмельченная бактериальная биомасса и сухая измельченная бактериальная биомасса.

Для определения эффективности экстракции каротиноидов из бактериальной биомассы, в качестве экстрагента был выбран ацетон, так как анализ литературных источников показал, что ацетон обладает высокой извлекающей способностью. Эффективность экстракции определялась по величине оптической плотности полученных экстрактов при длине волны 475 нм. Кратность экстракции во всех опытах была равна 10.

В результате проведенного исследования было обнаружено, что са-

мая низкая эффективность экстракции каротиноидов наблюдается при обработке биомассы, неотмытой от питательной среды. Это связано с тем, что в ходе первого цикла экстракции в суспензии образуются устойчивые агломераты биомассы диаметром 1,5-2 мм. Однако полного извлечения каротиноидов в случае использования неочищенной от питательной среды биомассы достигнуть не удалось. Это связано с диффузионными затруднениями, возникающими из-за образования агломератов биомассы.

В результате проведенной работы было отмечено, что одновременно с экстракцией каротиноидов из клеток также извлекаются белки и нуклеиновые кислоты. Причем максимальные потери нуклеиновых компонентов наблюдаются при работе с измельченной сухой биомассой, а минимальные -при обработке влажной биомассы.

Поскольку в дальнейшем биомасса галобактерий будет использована для выделения нуклеиновых компонентов, наиболее оптимальным способом снизить потери нуклеиновых кислот при обработке бактериальной биомассы ацетоном является ее предобработка. Предварительные исследования показали, что в результате предобработки 26%-ным раствором хлорида натрия кратность экстракций, необходимая для полного извлечения каротиноидов, снижается почти в два раза. Такая концентрация соли соответствует естественной среде обитания На1оЪас1егтт Иа1оЫит, так как в водной среде клетки испытывают осмотический шок, в результате чего все эндометаболиты поступают в экстракционную среду, и разделить их в дальнейшем весьма затруднительно.

На следующем этапе исследований было определено оптимальное время предобработки биомассы. Для этого неизмельченную биомассу На1оЪас1егтт Иа1оЫит выдерживали в 26%-ном растворе хлорида натрия в течение 1 ч, 24 ч и 48 ч. В полученных экстрактах было измерено поглощение при 470 нм.

В результате проведенной работы было установлено, что наиболее полная экстракция каротиноидов наблюдается в интервале 1 - 24 ч (рис. 1). Поэтому время предобработки 1 ч было выбрано в качестве оптимального.

Следует отметить, что при такой обработке снижается не только кратность экстракции, но и длительность первой ее стадии, она составляет 10 мин. Это связано с высокой интенсивностью экстракции, в результате чего раствор быстро насыщается каротиноидами, что создает диффузионные затруднение дальнейшего выделения каротиноидов из бактериальной биомассы.

Поскольку получаемый препарат каротиноидов предполагается использовать в медицинских и пищевых целях, был подобран альтернативный экстрагент, так как ацетон является токсичным веществом. В литературных источниках указано, что в качестве таких растворителей можно использовать гексан и изопропиловый спирт. В данной работе был выбрал изопропанол, так как он обладает меньшей токсичностью.

Полученные результаты показали, что использование в качестве экстрагента изопропилового спирта ведет к удалению из клеток значительного количества белков, а выход из клеток нуклеиновых оснований наоборот ни-

же, чем при экстракции ацетоном (см. рис 2). Таким образом, при использовании изопропанола бактериальная биомасса избавляется от значительного количества белка, что облегчает дальнейшее выделение и очистку нуклеиновых кислот.

неизмельченная биомасса

неизмельченная биомасса

30 30

Время экстракции, мин

Рис. 1. Величина поглощения экстракта каротиноидов при 475 нм.

Следует обратить внимание, что изопропанол, в отличие от ацетона не обеспечивает длительное хранение каротиноидов. А именно, через 12 часов при хранении при температуре - 10 °С, в отсутствии действия света цвет полученного экстракта изменяется с ярко-красного на желтый, что свидетельствует об окислении большей части каротиноидов.

],ш

10 60 60 60 Время экстракции, мин

НК

Белок

НК

Белок

Рис. 2. Концентрация нуклеиновых компонентов и белка в экстрактах каротиноидов.

На основе анализа спектров поглощения полученных экстрактов сделан вывод о том, что оптимальная кратность экстракции каротиноидов равна двум: длительность первой составляет 10 мин, второй - 60 мин. Это связано с тем, что при проведении дальнейшей экстракции извлечение из клеток НК продолжается, что приводит к их потере, а экстракция каротиноидов затормаживается, что подтверждается отсутствием пиков поглощения на полученных кривых.

Для отделения каротиноидов от полученного экстракта был использован петролейный эфир. К полученному изопропиловому экстракту каротиноидов приливали петролейный эфир и воду, в результате чего каротино-иды переходили в петролейный эфир, при этом в тяжелой фазе оставался изопропиловый спирт, нуклеиновые компоненты и белки. Полученную двухфазную систему разделяли на делительной воронке. Тяжелая фаза может быть использована для получения белковых концентратов.

Состав каротиноидного экстракта был определен методом колоночной хроматографии. Анализ показал, что полученный экстракт содержит несколько фракций каротиноидов с максимумами поглощения 437 нм, 470 нм и 495 нм, соответственно ксантофилл, бета-каротин и бактериоруберин. Таким образом, полученный экстракт каротиноидов, после отгонки петролей-ного эфира может быть использован для получения препаратов пищевой и медицинской промышленности.

Библиографические ссылки

1. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М.: Мир, 1986. 422 с.

2. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. Том 2-й. М.: Мир, 1981. 525 с.

3. ГОСТ РФ № 51443-99. Соки фруктовые и овощные. Метод определения содержания общих каротиноидов и их фракционного состава [введен в действие 01.01.2001].

4. Исследование иммуномодулирующей и мембранотропной активности каротиноидов из туники асцидии На1осугиЫа аигагШит / Е.С. Моторя, Т.Н. Пивненко, А.К. Гажа, Л.А. Иванушко, В.Н. Воронцов, Н.М. Санина // Тихоокеанский медицинский журнал, 2009. № 3. С. 28-31.

УДК 661.183.2 : 665.7.032.53 : 547.724.1

Д.А. Дмитриева, И.В. Гераськина, В.Н. Клушин

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

ВЛИЯНИЕ ПОЛИУРЕТАНОВЫХ ОТХОДОВ НА ФОРМОВОЧНЫЕ СВОЙСТВА ПАСТ И ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

КАРБОНИЗАТОВ В ТЕХНОЛОГИИ АКТИВНЫХ УГЛЕЙ НА ТОРФЯНОЙ ОСНОВЕ

Influence of an additive to peat of products of dissolution in sulfuric acid of one of versions polyurethane a waste on forming properties of resultant raw compositions, an exit and indicators of porous structure received of them carbonized materials is investigated.

Исследовано влияние добавки к торфу продуктов растворения в серной кислоте одной из разновидностей полиуретановых отходов на формовочные свойства результиру-