СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ
METHOD FOR PREPARING ACTIVATED MONONUCLEAR LEUKOCYTES

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к способам получения активированных мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ), и может быть использовано для иммунотерапии онкологических заболеваний.
В настоящее время для адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований используют способ введения в организм активированных клеток крови. Достигнуты положительные результаты иммунотерапии интерлейкином-2 (ИЛ-2) и активированных этим препаратом лимфокинактивированных киллеров (ЛАК). ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапия используется в качестве противоопухолевого средства, особенно при лечении опухолевых серозитов (плевритов, асцитов и перикардитов), а также химиорезистентных новообразований [Давыдов М.И., Нормантович В.А., Киселевский М.В., Волков С.М. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование. Российский онкологический журнал. 2000. - №6 - с.14-17; Киселевский М.В., Блюменберг А.Г. Адоптивная иммунотерапия рака яичников. - Сборник статей, приуроченный к Европейской школе по онкологии. 2001,- с.164-176; Astul P., Viallat J.R., Laurent J.C., Bradely М., Boutin С. Intrapleural recombinant IL-2 in passive immunotherapy for malignant affusion. Chest. 1993. - Vol.103 - №1 - p.209-213; Borden E.C., Sondel P.M. Lymphokines and cytokines as cancer treatment: immunotherapy realized. Cancer. 1990. - Vol.65 - p.800-814; Ebihara Т., Koyama S. Lymphokine-activated suppressor (LAK) cells in patients with gastric carcinoma. Cancer Immunology Immunotherapy. 1989. - Vol.28 - p.218-224; Liu X., Li D., Zhang C, Ba D. Treatment of 121 patients with malignant effusion due to advanced lung cancer by intrapleural transfer of autologous or allogenic LAK cells combined with rIL-2. Medical Science Journal. 1993. - Vol.8 - p.186-189].
Известен способ получения ЛАК для терапии злокачественных новообразований путем инкубации in vitro выделенных из крови донора МНЛ с препаратами рекомбинантного интерлейкина-2 (ИЛ-2) «Ронколейкин» (Биотех, РФ) или «Пролекин» (Chiron, Голландия) в концентрации 500-3000 ME в 1 мл питательной среды в течение 48-72 ч [Биологические методы лечения онкологических заболеваний. Под ред. В.Т.ДеВита, С.Хелмана. - М.: Медицина, 2002]. Рекомендованный при терапии рака легких курс введения ЛАК, полученных этим способом, предусматривает 1-2-кратное внутриплевральное введение по 10-100 млн. клеток в течение недели в сочетании с 4-5-кратными ежедневными введениями препарата ИЛ-2 внутриплеврально по 500000-1000000 ME [Добрица В.П., Ботерашвили Н. М. и др. Современные иммуномодуляторы для клинического применения. Руководство для врачей. - С.-П.: Политехника. 2001].
Недостатками этого способа являются:
1) необходимость использования для активации лимфоцитов высоких концентраций дорогостоящих препаратов;
2) введение ЛАК, полученных этим способом, и ИЛ-2 в рекомендованных дозах и режимах онкологическим больным может вызвать негативные побочные эффекты в виде гипертермии и озноба;
3) ИЛ-2 приводит к активации и пролиферации преимущественно лимфоидного пула, не влияя на моноцитарно-макрофагальное звено.
Для повышения биодоступности, эффективности и снижения выраженности побочных эффектов цитокинотерапии, предусматривающей введение клеток крови, активированных экзогенными цитокинами, разрабатываются новые способы их получения. В частности, для этой цели создаются липосомальные и пегилированные формы препаратов цитокинов. Перспективным направлением в данной области является использование в качестве наноплатформ для биологически-активных веществ циклодекстринов (ЦД) - полисахаридов бактериального и синтетического происхождения [Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production and Processes, ed. by Shayne Cox Gad. - John Wiley&Sons Inc., 2008; Lurri В., Cerchiara Т., Bigucci F., Caponio D., Zecchi V. Bovine serum albumin nanospheres carring progesterone inclusion complexes. - Drug Delivery. 2005. - Vol.12 - p.281-287; Maestrelli F., Garsia-Fuentes M., Mura P., Alonso M.J. A new drug nanocarrier consisting of chitosan and hydroxypropylcyclodextrin. European Journal Biopharmaceutical. 2006. - Vol.69 - №2 - p.79-86].
5
5
2
Наиболее близким к предлагаемому способу получения активированных МНЛ является способ, описанный Y. Kuroki с соавт. [Kuroki Y., Ochiai Н., Kurokawa М., Niwayama S., Kishimoto С, Tazawa К., Fujimaki M. Augmentation of murine lymphokine-activated killer cell cytotoxicity by beta-cyclodextrin-benzaldehyde. Journal Cancer Research Clinical Oncology. 1991 - Vol.117 - p.109-114]. Данный способ принят за прототип. Прототип включает получение ЛАК из мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей (МНЛ СМ) линии С3Н/Не после их инкубации с комбинацией экзогенного ИЛ-2 и β-циклодекстрин-бензальдегида (β-ЦД-БА). Для освобождения от макрофагов клетки селезенки инкубировали 45 минут при t=37°C в среде RPMI-1640 (Sigma, USA), содержащей 10% суспензии кварца (KAC-2; JIMRO, Takasaki, Japan) и 10% свежей сыворотки крови C3H/He мышей. Затем суспензию клеток наслаивали на фиколл-пак (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.), центрифугировали при 3000 rpm в течение 30 мин, клетки собирали в интерфазе фиколл-пака и после двукратной отмывки средой RPMI-1640 помещали в полную питательную среду (ППС) - среду RPMI-1640, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной при t=56°C в течение 30 мин (Filtron, Victoria, Australia), 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина, 20 мкг/мл гентамицина, 2 мкг/мл фунгизона и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола. К МНЛ СМ в концентрации 5×10-6,5×10 кл/мл, культивировавшимся в ППС при t=37°C в 5% CO в течение 7 суток, однократно на 3 сутки инкубации добавляли β-ЦД-БА в дозе 200-400 мкг на 1 мл ППС и двукратно на 3 и 5 сутки инкубации ИЛ-2 в дозе 500-700 ME на 1 мл ППС. Описанный способ обеспечивал повышение противоопухолевой цитотоксической активности МНЛ селезенки здоровых животных в сравнении с инкубацией клеток с ИЛ-2 на 10-12%, в сравнении с инкубацией клеток с β-ЦД-БА на 5-7%. Цитотоксическая активность МНЛ селезенки мышей с привитой саркомой, активированных комбинацией ИЛ-2 и β-ЦД-БА, была на 15-22% выше соответствующей активности клеток, культивировавшихся с ИЛ-2 и β-ЦД-БА в монорежимах.
К недостаткам описанного способа следует отнести:
1) удаление из клеточной взвеси макрофагов и дендритных клеток - клеток-мишеней для полисахарида ЦД, что исключает возможность усиления активности эффекторов противоопухолевого иммунитета за счет костимулирующего действия активированных циклодекстрином макрофагов и дендритных клеток;
2) незначительное усиление эффекта при применении комбинации ИЛ-2 и β-ЦД-БА для стимуляции клеток здоровых мышей относительно эффекта воздействия этих веществ в монорежиме;
3) для достижения эффективности комбинации ИЛ-2/β-ЦД-БА использовали относительно высокие концентрации ее компонентов;
4) в работе использовался нефармакопейный препарат ИЛ-2;
5) способ предполагает использование относительно дорогого препарата β-циклодекстрин-бензальдегида;
6) апробация данного способа проведена только на клетках мышей линии С3Н/Не.
Задачей настоящего изобретения является создание более эффективного способа получения активированных МНЛ из крови донора или пациента.
Предлагаемый способ предусматривает следующие стадии:
а) выделение МНЛ из крови пациента или донора путем отделения их от сыворотки крови, эритроцитов и нейтрофилов;
-5
-3
б) инкубация выделенных МНЛ с комплексом ИЛ-2/ЦД, содержащим ИЛ-2 в концентрации 50-100 МЕ/мл и β-ЦД в концентрации 1×10-1×10 М в 1 мл, и получение из них активированных клеток - ИЛ-2/ЦД-МНЛ.
3
5
5
-5
-3
2
2
Способ осуществляется следующим образом: МНЛ выделяют из стабилизированной гепарином в дозе 25 ед/мл периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла (ПанЭко, РФ или Sigma, USA) плотностью 1,077 г/см центрифугированием при 400 g в течение 20-30 мин. Лимфоидные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирают пипеткой и трехкратно отмывают в среде RPMI-1640 (Sigma, USA или ПанЭко, РФ). После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждают центрифугированием при 200 g. Затем МНЛ осаждают центрифугированием, подсчитывают с использованием 5% раствора трипанового синего (ПанЭко, РФ) и ресуспендируют в ППС - среде RPMI-1640 (Sigma, USA или ПанЭко, РФ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной при t=56°C в течение 30 минут (HyClone Laboratories, Logan, UK), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (Sigma, USA или ПанЭко, РФ). Концентрация клеток в суспензии должна соответствовать 5×10-6×10 кл/мл. Для получения ИЛ-2/ЦД-МНЛ к 10 мл МНЛ добавляют 1 мл раствора комплекса ИЛ-2/ЦД, полученного при инкубации на шейкере ST-3L (Elmi, Latvia) при 800-1200 rpm в течение 45-60 минут смеси в ППС препарата «Ронколейкин» (Биотех, РФ) или «Пролекин» (Chiron, Holland) в концентрации 50-100 МЕ/мл и β-ЦД в концентрации 1×10-1×10 М в молярном соотношении 1:1, или 1:3, или 1:10. В качестве контроля берут МНЛ, активированные препаратом ИЛ-2 в концентрации, использованной в прототипе, соответствующей 500 ME в 1 мл среды культивирования. Клетки инкубируют в пластиковых флаконах объемом 100-250 мл фирмы Costar или аналогичных флаконах других фирм в CO-инкубаторе (Guan, France) в течение 18-48 ч при t=37°C в 5% CO.
high
high
high
high
high
high
МНЛ, активированные комплексом ИЛ-2/ЦД, демонстрируют более высокую цитотоксическую активность, чем ЛАК (фиг.1). В проведенных нами экспериментах в качестве клеток-мишеней были использованы клетки эритромиелоидного лейкоза человека линии К-562 (фиг.2). В отличие от ЛАК, стимулированных оптимальной (500 МЕ/мл) и субоптимальной (50 МЕ/мл) дозами ИЛ-2, и МНЛ, культивировавшихся в присутствии β-ЦД, в культуре ИЛ-2/ЦД-МНЛ появляется большое количество крупных прилипающих дендритоподобных клеток (фиг.3-6). Это подтверждают и результаты проточной цитометрии (фиг.7-10). Этот метод позволил установить особенности фенотипа ИЛ-2/ЦД-МНЛ, представленными CD25, CD58, CD3/CD16 ; CD56; CD16/CD56; HLA-DR, в сравнении с ЛАК и МНЛ (табл.).
Пример 1. Оценка противоопухолевого действия ИЛ-2/ЦД-МНЛ на клетках линии К-562
4
2
Цитотоксическую активность ЛАК и ИЛ-2/ЦД-МНЛ определяли относительно опухолевых клеток линии К-562. Опухолевые клетки (1×10 в 1 мл) инкубировали в ППС с ИЛ-2/ЦД-МНЛ и ЛАК в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных планшетах (Costar, USA) в течение 18 часов при t=37°C в 5% CO. Клетки просматривали и фотографировали с помощью инвертоскопа Axiovert (Zess, Германия). Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ и по значению оптической плотности, измеряемой на планшетном фотометре (Multiscan MS, Sweden), рассчитывали индекс цитотоксической активности (ИЦА) [Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И. МТТ - колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток. Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - №2 - с.20-23]. Как представлено на фиг.1, цитотоксическая активность ИЛ-2/ЦД-МНЛ на 20% выше по сравнению с ЛАК, полученными при инкубации МНЛ с ИЛ-2 в оптимальной дозе 500 ME в 1 мл среды культивирования.
Пример 2. Определение особенностей фенотипа ИЛ-2/ЦД-МНЛ методом проточной цитометрии (FACS-анализ).
Определение экспрессии поверхностных маркеров проводили при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (Caltag Laboratories, USA), результаты учитывали методом проточной цитофлюориметрии на проточном питометре FACScan (Becton Dickinson, USA). На МНЛ исследовали уровни экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD16; активационного антигена CD25; молекул адгезии CD56, CD58; антигенпрезентирующих молекул CD83, HLA-DR; рецептора ЛПС CD14, а также костимулирующих молекул CD80, CD11a. Гейт популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 событий в гейте. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программного пакета WINMDI 2.8.
Как следует из данных таблицы, ИЛ-2 в комплексе с ЦД в отличие от монорежима ИЛ-2 в субоптимальной концентрации приводит к увеличению экспрессии антигенов НК (CD 16), молекул адгезии (CD58; CD56) и антигенной презентации (HLA-DR), а также активационного маркера - рецептора к ИЛ-2 (CD25).
Изобретение иллюстрировано следующими фигурами.
Фиг.1 - Возрастание интенсивности индекса цитотоксической активности (ИЦА) ИЛ-2/ЦД-МНЛ в сравнении с МНЛ, ЛАК и МНЛ, активированными β-ЦД в монорежиме (ЦД-МНЛ).
Фиг.2 - Фотография интактных клеток линии К-562. Увеличение 100. Добавлен МТТ.
Фиг.3 - Фотография ЛАК, активированных ИЛ-2 в оптимальной концентрации 500 ME в 1 мл среды, после 18 ч инкубации с клетками К-562. Увеличение 100. Добавлен МТТ.
Фиг.4 - Фотография ЛАК, активированных ИЛ-2 в субоптимальной концентрации 50 ME в 1 мл среды, после 18 ч инкубации с клетками К-562. Увеличение 100. Добавлен МТТ.
Фиг.5 - Фотография МНЛ, активированными β-ЦД в монорежиме, после 18 ч инкубации с клетками К-562. Увеличение 100. Добавлен МТТ.
Фиг.6 - Фотография ИЛ-2/ЦД-МНЛ после 18 ч инкубации с клетками К-562. Увеличение 100. Добавлен МТТ.
Фиг.7 - График, отражающий уровень экспрессии поверхностных маркеров интактных МНЛ (контроль). Горизонтальная ось графика - интенсивность сигнала для данного параметра. Вертикальная ось - количество событий.
Фиг.8 - График, отражающий уровень экспрессии поверхностных маркеров ЛАК, активированных ИЛ-2 в оптимальной концентрации 500 ME в 1 мл среды. Горизонтальная ось - интенсивность сигнала для данного параметра. Вертикальная ось - количество событий.
Фиг.9 - График, отражающий уровень экспрессии поверхностных маркеров ЛАК, активированных ИЛ-2 в субоптимальной концентрации 50 ME в 1 мл среды. Горизонтальная ось - интенсивность сигнала для данного параметра. Вертикальная ось - количество событий.
Фиг.10 - График, отражающий уровень экспрессии поверхностных маркеров ИЛ-2/ЦД-МНЛ. Горизонтальная ось - интенсивность сигнала для данного параметра. Вертикальная ось - количество событий.
Таблица - Особенности фенотипа ИЛ-2/ЦД-МНЛ в сравнении с ЦД-МНЛ; интактными МНЛ; МНЛ, активированными ИЛ-2 в дозе 50 ME на 1 мл среды и ЦД при последовательном введении; ЛАК, активированными ИЛ-2 в оптимальной (500 МЕ/мл) и субоптимальной (50 МЕ/мл) концентрациях.
Технический результат
По сравнению со способом получения ЛАК, представленных только лимфоцитами, предлагаемый способ получения ИЛ-2/ЦД-МНЛ обеспечивает активацию и пролиферацию не только лимфоидных, но и антигенпрезентирующих клеток. ЦД позволяет также на порядок снизить эффективную концентрацию ИЛ-2, что может иметь клиническое значение при проведении иммунотерапии. Уменьшение дозы ИЛ-2 при сохранении клинической эффективности активированных клеток может снизить выраженность системных побочных эффектов препарата и позволит использовать иммунотерапию у ослабленных онкологических больных, в том числе у пациентов с гиперреактивным ответом на введение ИЛ-2. Использование невысоких доз дорогостоящих препаратов позволит расширить область применения ИЛ-2.
Способ получения активированных мононуклеарных лейкоцитов
Экспресcируемые молекулы
МНЛ контроль
Последовательное введение ИЛ-2 и ЦД
ЛАК (доза ИЛ-2-50 МЕ/мл)
ЛАК (доза ИЛ-2-500 МЕ/мл)
ЦД-МНЛ
ИЛ-2/ЦД-МНЛ
CD3
21,73
41,65
33.59
45.59
23,6
49,19*
CD3/CD16
0,86
7,73
11.82
16,56
6,55
22,3*
CD16
5,22
6,02
10.56
6,22
5,21
8,3
CD4
6,46
1,6
12.16
17,64
15,71
0,67
CD4/CD25
13,05
9,61
18.82
21,76
11,16
6,14
CD25
2,58
5,07
1.8
3,21
4,7
7,8*
CD58
4,18
10,89
7.56
9,32
10,64
14,45*
CD58/HLA-DR
16,01
14
16.8
20,31
16,34
12,99
HLA-DR
3,26
3,24
1.68
3,98
5,71*
5,22*
CD80
0,57
0,25
0.47
0,78
0,14
0,26
CD80/CD83
9,81
9,05
9.18
12,42
8,25
8
CD83
2,89
3,76
3
3
4,43
2,59
CD14
0,08
0,53
0.43
0,56
0,12
0,29
CD14/CD11c
31,7
14,58
10.96
13,95
9,91
13,57
CD11c
20
10,94
10.53
8,91
14,11
13,44
CD56
0,5
0
1.3
1,57
1,5
6,3*
CD56/CD16
7,82
2,2
5,1
9,1
0
12,3*
* - достоверные изменения по сравнению с контролем (p<0,05)