Исследование прогамной фазы оплодотворения ежевики с использованием метода люминесцентной микроскопии

Л.В. Голышкин Л.А. Грюнер

Н.И. Богомолова

Исследование прогамной фазы

ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ЕЖЕВИКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

УДК 634.13/. 14:581.163

Изучены особенности протекания прогамной фазы оплодотворения у ежевики при само- и перекрестном опылении (сорта Агавам и Чейни). Установлено, что указанная фаза при обоих типах опыления остается незавершенной в условиях 2009 года. Вероятно, эмбриологический анализ постгамной фазы оплодотворения ежевики позволит выяснить пути и характер получения семенного потомства в рассматриваемых опытах.

Ключевые слова: апомиксис, люминесцентная микроскопия, прогамная фаза оплодотворения, тип опыления, гибридизация, ягодные культуры

Golyshkin L.V., Grnner L.A., Bogomolova N.I. Research of progamic stage of blackberry fertilization with luminescent microscopy method. The features of course of progamic stage of blackberry fertilization have been studied at self- and cross-pollination (varieties Agawam and Chainy). It has been established that the mentioned phase at both types of pollination remains not completed in conditions of 2009. Probably an embryological analysis of the postgamic stage of blackberry fertilization will allow finding out ways and character of seed progeny obtaining in considered experiments.

Key words: apomixis, luminescent microscopy, progamic stage of fertilization, type of pollination, hybridization, berry cultures

Введение

Подрод ежевик Eubatus Focke, входящий в род Rubus L., является одним из самых полиморфных и многочисленных по видовому составу (включает более 200 видов в мировой флоре) в пределах рода. Успешно ведется и селекция этого растения, в первую очередь в США (Rubus Catalog, 1993). Несмотря на

ГолышкинЛ.В., к.б.н.; ГрюнерЛ.А., к.с.-х.н.;

Богомолова Н.И., к.с.-х.н. - ГНУ ВНИИ селекции плодовых культур Россельхозакадемии

большое разнообразие сортов и видов ежевики, регулярностью плодоношения, высокой самоплодностью большинства сортов и форм, определенной генетической стабильностью видов это растение обязано, в большой мере, возникшему в процессе эволюции механизму апомиксиса, который свойственен многим представителям подрода ежевик в виде псевдогамии, о чем упоминают отдельные авторы [11, 12]. В условиях нашей страны изучение ежевики проводилось, главным образом, в южном регионе (МОС ВИР), где находится основная её коллекция, представленная примерно 30 видами из различных районов Кавказа и 10 американскими сортами [5, 7, 8].

Изучение особенностей биологии цветения и плодоношения ежевики в указанном регионе подтвердило высокий уровень самоплодности (по% полезной завязи) для большинства её видов и сортов, за исключением ди- и триплоидов [4, 5]. Наблюдения показали, что у дикорастущих кавказских видов высокая степень самоплодности обеспечивается особой морфологией цветка и определенным таксисом тычинок по отношению к пестикам в период созревания пыльцы: тычинки плотно переплетаются с пестиками, и, таким образом, собственная пыльца приоритетно попадает на рыльца пестиков. У изученных американских сортов это явление не наблюдали, но самоплодность их была также достаточно высокой (от 30 до 80% при «искусственном» самоопылении и от 11 до 60% - при «естественном»), что объясняется образованием у ежевики большого количества пыльцы и выделением рыльцами пестиков клейкого вещества, обеспечивающего активное улавливание пыльцы. При «свободном» опылении у ежевики также, вероятно, доминирует самоопыление, что подтверждает семенное потомство от этого вида опыления, когда большинство сеянцев имеет признаки материнского растения, что показал посев семян ряда американских сортов в условиях средней полосы России (ВНИИСПК). Широко известные сорта ежевики Изобильная и Техас, по морфологическим признакам идентичные родительским американским сортам (Лукреция и Логанова ягода), также получены И.В. Мичуриным, вероятно, путем посева семян последних от свободного опыления (а, по сути - от самоопыления).

Способность к перекрестному опылению у ежевики в условиях юга нашей страны мы изучали путем кастрации цветков и последующего нанесения на рыльца пестиков пыльцы других сортов и форм. Степень завязываемости плодов была близкой к результатам самоопыления, но зависела также от плоидности опылителя: три- и пентаплоиды дали низкий процент завязи (из-за низкой фертильности пыльцы). Проведенные в средней полосе России (г. Орел, ВНИИСПК) скрещивания бесшипого малозимостойкого сорта Торнфри (в качестве материнского растения) с шиповатым зимостойким сортом Агавам (в качестве отцовского) дали в первом поколении только шиповатые формы с признаками обоих родителей, что подтвердило факт гибридизации при межсортовом (а по сути -межвидовом) скрещивании, и отсутствия при этом

проявления апомиксиса в виде растений материнского типа.

Оценка сортов и дикорастущих кавказских видов на способность к автономному апомиксису (путем кастрации цветков без последующего опыления) показала, что лишь несколько сортов (Эри, Агавам, Китта-тини) проявили склонность к завязыванию плодов без опыления, причем на незначительном уровне (0,215%) да и только в один из трех лет изучения.

Все изложенные выше факты и наблюдения косвенно указывают на то, что при самоопылении у ежевики запускается механизм, возможного апомиктиче-ского образования плодов, а при перекрестном опылении происходит гибридизация, приводящая к образованию генетически нового организма. При этом, как указывается в литературе, здесь возможен редуцированный и нередуцированный апомиксис, что может подтвердить дальнейший эмбриологический анализ [13]. Проведенное в 2009г. цитоэмбриологическое изучение прогамной фазы у ежевики было направлено на уточнение этого предположения, что является начальным этапом исследования процесса оплодотворения этого растения, имеющего существенное значение в теории и практике селекционно-генетической работы с ежевикой.

Материал и методы исследования

В опыте использовали 2 варианта опыления одновременно цветущих сортов ежевики (Агавам и сеянца сорта Чейни): 1 - самоопыление сорта Агавам и 2

- опыление кастрированных цветков сорта Агавам пыльцой сеянца сорта Чейни.

Люминесцентная микроскопия, основанная на использовании явления люминесценции с применением источников ультрафиолета, широко используется для решения различных проблем в исследованиях сельскохозяйственных культур [16, 6, 9]. Различают два вида люминесценции при облучении растительного объекта: первичную, когда природные вещества, составляющие структуру, проявляют собственную флуоресценцию, и вторичную, когда вещества флуоресцируют после обработки материала соответствующими красителями-флуорохромами [10]. В нашем случае, мы использовали вторичную флуоресценцию. Метод является строго избирательным и высоко специфическим, позволяющим выявить флуоресценцию даже весьма незначительного количества окрашиваемого вещества [14, 15]. Люминесцентно-

микроскопические исследования охватывают широкий диапазон явлений в области морфологии и цитологии растений, значительно упрощая получение результатов состояния родительских эмбриологических структур, а также взаимодействия мужского и женского начал в процессе оплодотворения [1, 2, 3].

В настоящей работе отражены результаты исследования прогамной фазы процесса оплодотворения ежевики при само- и перекрестном опылении (сортов Агавам и Чейни В работе 2009 г. использовали по 100 цветков каждой комбинации скрещивания с последующей темпоральной фиксацией опыленного мате-

риала (10,12,14,15,17 часов дня забора объекта изучения, а также 8 часов утра следующего дня, т.е. 2, 4, 6,

7, 9 и 24 часа с момента нанесения пыльцы на рыльца пестиков). Материал фиксировали в смеси Кларка (96% этиловый спирт и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). Затем завязи, освобожденные от лепестков и пыльников цветка, осторожно мацериро-вали при нагревании в насыщенном растворе едкого натра (№ОН), промывали дистиллированной водой и готовили временные давленые препараты в капле кра-сителя-флуорохрома (0,05% воднорастворимый анилиновый голубой на фосфатном буфере Серенсена при рН=7,38). Дальнейшую работу проводили непосредственно в ультрафиолете специализированного УФ-микроскопа, анализируя прогамную фазу процесса оплодотворения (с момента нанесения пыльцы на рыльце завязи до внедрения пыльцевой трубки в семяпочку). Для вторичной люминесценции использовали возбуждающие светофильтры УФС-3, СЗС-7, в качестве запирающего - ЖС-18 [9]. Фотоиллюстрации получены с использованием цветной фотокамеры типа Сапоп.

Результаты исследований

Прогамная фаза оплодотворения у ежевики в межсортовой комбинации скрещивания «Агавам х Чейни».

Темпоральный анализ роста пыльцевых трубок в тканях пестиков данной комбинации представлен на рисунках 1 и 2. Наиболее заметный рост трубок отмечается к 10 часам утра, т.е. после 2 часов с момента нанесения пыльцы на рыльца (рисунок 1А). В данном случае прорастание трубок немногочисленное и продвижение их отмечено как 5% от общей длины столбика. Семяпочки при этом активизированы в разной степени (рисунки 1Б, 2А). К 11 часам пыльцевые трубки прошли примерно 30% длины столбика (рисунок 1В). В дальнейшем картина может быть альтернативной. К 12 ч. дня ряд трубок может проявить реверсию в ходе прорастания, как видно на рисунке 1Г или к этому времени пыльцевые трубки, проходя 50% длины столбика, остаются дистально направленными (рисунок 1Д, Е). Однако, в любом из этих случаев дальнейший рост трубок не наблюдался. Таким образом, в комбинации межсортового скрещивания нормальное протекание прогамной фазы оплодотворения заканчивается к 12 часам дня. Возможно, близкородственный характер скрещивания препятствует нормальному ходу полового процесса в этой комбинации.

Прогамная фаза оплодотворения при самоопылении сорта Агавам.

В тех же условиях сбора и фиксирования материала анализировали процесс самоопыления сорта Агавам. В данном случае рост пыльцевых трубок в тканях пестика более оживленный по отношению к предыдущей комбинации, когда к 10 часам утра трубки прошли около 30% длины столбика (2Б). При этом отмечена высокая степень физиологической активности семяпочки (рисунок 2В). Однако половину пути от рыльца до семяпочки пыльцевые трубки проходят

только к 14 часам дня, т.е. несколько позднее, чем в межсортовой комбинации (рисунок 2Г). Следует отметить, что и здесь может наблюдаться картина реверсии трубки по столбику (рисунок 2Д). Во всяком случае к указанному времени, пройдя 50% длины столбика, пыльцевые трубки останавливаются в росте, и дальнейшее нормальное протекание прогамной фазы оплодотворения при самоопылении сорта Агавам не наблюдается. Если межсортовая комбинация скрещивания Агавам х Чейни по таксономической природе близкородственна, то в варианте самоопыления сорта Агавам мы принципиально имеем дело с инбридингом как еще более близкородственным взаимодействием половых начал. Возможно, учитывая склонность представителей рода Rubus к партеногене-зу/апомиксису, в изученном случае с ежевикой мы не наблюдаем полной картины традиционного полового взаимодействия мужской и женской генеративных структур.

Рисунок 1 - Прогамная фаза оплодотворения в комбинации скрещивания ежевики сортов Агавам х Чейни, УФМ, анилиновый голубой (межсортвое скрещивание). А - прорастание пыльцевого зерна на рыльце пестика; Б - активное состояние семяпочки сорта Агавам; В - прорастание пыльцевой трубки на 30% длины столбика, 11 ч. утра; Г - пыльцевая трубка прошла 50% столбика, тенденция реверса роста трубки, 12 ч. дня; Д,Е - пыльцевые трубки прошли 50% столбика, тенденция реверса отсутствует, 12 ч. дня.

Рисунок 2 - Прогамная фаза оплодотворения при скрещивании сортов Агавам х Чейни (А); при самоопылении с. Агавам ( Б - Д ), УФМ, анилиновый голубой.

А - семяпочка слабо активирована; Б - рост пыльцевых трубок в зоне рыльца и ниже до 30% длины столбика,

10 ч. утра; В - активность семяпочки высокая;

Г - пыльцевые трубки достигли 50% длины столбика, 14 ч. дня; Д - пыльцевая трубка прошла 50% длины столбика, наблюдается реверсия в её росте.

Выводы

Проведенный анализ прогамной фазы оплодотворения у ежевики позволяет в заключить следующее.

1.Ход прогамной фазы оплодотворения в межсортовом скрещивании ежевики Агавам х Чейни останавливается через 4 часа с момента нанесения пыльцы сорта Чейни на рыльца материнского растения сорта Агавам. При этом пыльцевые трубки частично проявляют тенденцию к реверсии продвижения в материнских тканях, достигая не более 50% длины столбика. Активность семяпочек к половому взаимодействию невысока.

2. Исследование прогамной фазы оплодотворения при самоопылении ежевики сорта Агавам показало, что при высокой половой активности семяпочек пыльцевые трубки приходят не более половины длины столбика через 6 часов от начала опыления.

3. Очевидно, межсортовое скрещивание данных

сортов ежевики, по природе склонной к апомикси-су/партеногенезу, препятствует нормальному протеканию полового процесса и, в частности, прогамной фазы оплодотворения. Выяснение пути получения семенного потомства в данном случае возможно лишь при анализе постгамной фазы оплодотворения, т.е. при дальнейшем эмбриологическом анализе.

Литература

1. Абрамова Л.И. Руководство по цитологической технике. 1. Некоторые цитологические методики для селекционно-генетической практики. / Абрамова Л.И., Орел Л.И., Орлова И.Н. - Л.: ВИР, 1971. - 15 С.

2. Абрамова Л.И. Цитологическая и цитоэмбрио-логическая техника (для исследования культурных растений): метод. указания / Абрамова Л.И., Орлова И.Н., Вишнякова М.А., Константинова Л.Н., Орел Л.И., Огородникова В.Ф. - Л.: ВИР, 1981. - С. 56-60.

3. Вишнякова М.А. Оценка характера взаимодействия пыльцевых зерен и пыльцевых трубок с пестиком в совместимых и несовместимых вариантах опыления: метод. указания / Вишнякова М.А. - Л.: ВИР, 1989. - С.10-14.

4. Грюнер, Л.А. Особенности самоплодности ежевики / Грюнер Л.А.// Науч.-тех. бюлл. ВИР. - 1985.

- Вып.155. - С.63-64.

5. Грюнер, Л.А. Особенности биологии и хозяйственная ценность сортов и форм ежевики в условиях Северного Кавказа: автореф. дис... канд. с.-х. наук / Грюнер Лидия Андреевна. - СПб., 1992. - 15 с.

6. Дженсен, У. Ботаническая гистохимия / Дженсен У. - М.: Мир, 1965.

7. Добренков, Е.А. Адаптивный потенциал ежевики в климатических условиях западного предгорья Северного Кавказа: автореф. дис. канд. с.-х. наук. -СПб., 2002. - 16 с.

8. Захарова, М.В. Особенности культуры ежевики на Северо-Западном Кавказе: автореф. дис. канд. с.. -х. наук. - Краснодар, 2002. - 23 с.

9. Литвак, А.И. Люминесцентная макро- и микроскопия в исследованиях плодовых культур и винограда / Литвак А.И. - Кишинев: Штиинца, 1978. - С. 64-84.

10.Люминесцентный анализ. - М.: Госиздат физ.-мат. лит-ры, 1961.

11. Мандрик, В.И.Апомиксис и половой процесс у некоторых видов рода Rubus L. / Мандрик В.И., Петрус Ю.Ю. - М.: Колос, 1976. - С. 89-100.

12. Оурецки, Д.К.. Ежевика./ Оурецки Д.К.//Селекция плодовых растений. - М: Колос, 1981.

- С. 166-181.

13. Поддубная-Арнольди, В.А. Цитоэмбриология покрытосемянных растений // Поддубная-Арнольди В.А. - М.: Наука, 1976.

14.Штруггер, З. Практикум по физиологии растительных клеток и тканей / Штруггер З. - М.: Изд-во

иностр. лит-ры, 1953.

15.Currier, H.B. Callose substances in plant cells / Currier H.B. - Amer.J.Bot., 1957. - t. 44.

16.Tswett M. Uber Reicherts Fluoreszenmikroskop und eigene damit augenstelle Beobachtungen uber Chlorophyll und Cyanophill / Tswett M. - Ber.Dtsch.Bot.Ges., 1911 - T.29.