Способ повышения продуктивности дойных коров различных генотипов гена PON1
METHOD FOR INCREASING THE PRODUCTIVITY OF DAIRY COWS OF VARIOUS GENOTYPES OF THE PON1 GENE

Изобретение относится к животноводству, в частности к способу повышения продуктивности лактирующих коров в первый период лактации, и может быть использовано для профилактики нарушений обмена веществ в организме, вызванных стресс-факторами, повышения молочной продуктивности, качества молока высокопродуктивных коров с заданными генетическими параметрами гена PON1.
Еще в конце прошлого века отечественным и зарубежным ученым было известно влияние биологически активных веществ на биохимические процессы, обеспечивающие образование ферментов, воздействующих на определенный участок ДНК, названный структурным геном, в котором заключена наследственная информация о синтезе данного фермента, активизирующего тот или иной биохимический процесс переваривания и усвоения питательных веществ, тем самым позволяя воздействовать на уровень и качество продуктивности животных [Биохимия и продуктивность животных / М.Т. Таранов - М.: «Колос». - 1976. - 240 с.; Генетика и обмен веществ / Р. Вагнер, Г. Митчелл. Перевод с англ. Э.А. Абелевой, М.П. Бельговского, Б.Н. Сидорова, В.В. Хвостовой. - М: ИЛ. - 1958. - 426 с.].
Однако, в последние годы в результате генетического улучшения молочного скота, продуктивный потенциал коров увеличился до такой степени, что нереально удовлетворить их потребность в питательных веществах, макро- и микроэлементах и витаминах. Это влечет за собой многочисленные серьезные метаболические нарушения, которые на клеточном уровне приводят к окислительному стрессу, повреждениям структуры молекулы ДНК и генным мутациям [Коденцова В.М., Вржесинская О.Α., Мазо В.М. / Витамины и окислительный стресс // Вопросы питания. - 2013. - Τ 82 №3. - С. 11-18] и преобладанию окисления над процессами восстановления, образованию свободных радикалов, тем самым повреждая структуру и функцию клеточных макромолекул, что отражается на обменных процессах и заболеваниях молочных коров [Oxidative Stress and Antioxidant Status during Transition Periodin Dairy Cows / Sharma N., Singh N.K., Singh O.P., Pandey V., Verma P.K. // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. - 2011. - 24(4). - P.479-484. DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.2011.10220].
Регулирует активность процессов окислительного стресса система актиоксидантной защиты организма, одним из факторов которой эволюционно и генетически запрограммированных для оптимизации баланса окислительных процессов, является фермент параоксоназа-1 [Age-related decrease in high-density lipoproteins antioxidant activity is due to an alteration in the PON1's free sulfhydryl groups / L.C. Jaouad, C. De Guise, H. Berrougui et al. // Atherosclerosis. - 2006. - 185(1). - P. 191-200. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2005.06.012].
Параоксоназа-1 - фермент из семейства эндогенных гидролаз, играет важную роль в защите организма человека и животных от окислительного стресса, обусловленного свойством биологического антиоксиданта и детоксикатора [Параоксоназа: молекулярно-генетические аспекты и клиническое значение / Э.А. Ефимцева, Т.Н. Челпанова // Успехи современной биологии. - 2012. - Т. 132, №3. - С. 282-296], поэтому играет важную роль во многих заболеваниях и метаболических изменениях, связанных с образованием активных форм кислорода [Serum paraoxonase 1 (PON1) activity and lipid metabolism parameters changes in different production cycle periods of Holstein-Friesian, Polish Red and Norwegian breeds / M. Kulka, J. Korodziejska-Lesisz,  // Polish Journal of Veterinary Sciences. - 2016.-Vol. 19, No. 1.-P. 165-173. DOI 10.1515/pjvs-2016-0021].
При употреблении в рационах питания кормовых добавок, содержащих антиоксиданты, активизируется экспрессия гена параокосназа-1, повышающего его антиоксидантную роль в организме, происходит защита фермента от инактивации и повышается его стабильность [Effects of green tea on serum paraoxonase/arylesterase activities in streptozotocin-induced diabetic rats / S. Tas, S. Celikler, S. Ziyanok-Ayvalik, E. Sarando, and M. Dirican // Nutrition Research, Vol. 25, Issue 12, P. 1061-1074, 2005. DOI: 10.1016 / j.nutres.2005.10.001].
В связи с этим актуальным является изыскание новых средств, снижающих свободно-радикальное окисление, способствующих активизации эндогенных антиоксидантов, нормализации физиолого-биохимического статуса и реализации генетического потенциала продуктивности у высокопродуктивных коров в стрессогенных условиях промышленного комплекса.
Для устранения этих метаболических нарушений на практике рекомендуют использовать как биологические, так и синтетические антиоксиданты различной химической природы, способные связывать свободные радикалы (активные формы кислорода) и замедлять окислительно-восстановительные процессы, а также противостоять инфекциям.
Известен широко применяемый антиокислительный агент - ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) [Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г. Зайцев, О.В. Островский // Экспериментальная фармакология. - 2003. - Τ 66 №4. - С. 66-70]. Однако недостатком данного соединения является то, что применение его в высоких дозах увеличивает образование активных метаболитов кислорода. Кроме того, продукты окислительной деструкции этого соединения подавляют ферментативную антиоксидантную систему.
В исследованиях А.В. Якимова (Влияние антиоксидантов на обмен веществ и продуктивность крупного рогатого скота: автореферат автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.04 / А.В. Якимов. - Казань, 1989. - 22 с.) установлено, что скармливание в рационах лактирующих коров ионола в дозе 2 г/гол. в сутки на фоне различного уровня энергопротеинового питания способствовало повышению молочной продуктивности на 5,0-6,2%, а массовой доли жира в молоке на 0,17-0,23%. При пересчете на 4%-ную жирность молока увеличение удоев составило 9,9-13,0%.
Недостатком является то, что в опытах не изучалось выявление оптимальной дозы ионола в рационах лактирующих коров, а использовалась лишь ориентировочная норма скармливания на фоне с низким и оптимальным уровнем энергопротеинового питания внутри одной генетической популяции.
3
В [RU 2515136 С1, 15.05.2014] раскрывается повышение молочной продуктивности и улучшение качественных показателей молока за счет нового премикса для лактирующих коров, состав которого включает витамины, микроэлементы, аминокислоты, адсорбент микотоксинов Токсфин, пробиотик и комплекс антиоксидантов в виде Луктанокса и наполнителя - рыжикового жмыха при следующем соотношении компонентов: витамин А 92 тыс. М.Е.; D - 70 тыс. М.Е.; Ε - 76 мг; медь сернокислая пятиводная - 69 мг; цинк сернокислый семиводный - 1074 мг; марганец сернокислый пятиводный - 767 мг; кобальт хлористый шестиводный - 15 мг; калий йодистый - 22 мг; селенит натрия - 3 мг; монохлоргидрат L-лизина - 6360 мг; DL-метионин - 2920 мг; токсфин - 500 мг; Бацелл - 5000 мг; луктанокс - 45 мг; рыжиковый жмых - до 1000 г.Недостатком является низкое содержание в составе витаминов, особенно витамина Ε и микроэлементов. Микроэлементы представлены в виде пяти-и семиводных соединений, которые гигроскопичны и обладают высокими реакционными свойствами, приводящими к разрушению биологически активных компонентов и стабильности премикса, что в конечном итоге не позволяет профилактировать нарушений обмена веществ и реализовать генетический потенциал животного.
В работе [Влияние антиоксидантов на продуктивность и качество молока при изменении условий содержания лактирующих коров / Н.Н. Ляушкина // Вестник Орел ГАУ. - 2011. - №4(11). - С. 51-52] подкожное введение 2,5%-го раствора антиоксиданта Эмицидина в дозе 3,0 мл на 1 голову в сутки в течение 5 дней при переводе коров с зимне-стойлового на летне-лагерное содержание позволило установить повышение молочной продуктивности и качества молока при минимальном адаптационном периоде. Кроме того, время восстановления каждой коровы от действия стрессов зависело от ее генетически обусловленных особенностей.
В статье [Взаимосвязь молочной продуктивности коров с гематологическими показателями под влиянием антиоксидантов «Е-селена» и «Бутофана» / К.И. Романов // Вестник РГАТУ. - 2018. - №1 (37). - С. 121-125] при внутримышечной инъекции комплекса антиоксидантных препаратов «Ε-селена» и «Бутофана» в дозе по 10 мл на 1 голову в сутки в течение 5-ти месяцев выявлена прямая зависимость между величиной удоя и содержанием морфологических и биохимических показателей крови, т.е. улучшение процессов гемопоэза.
Недостатками описанных в указанных источниках решений является технологии ввода препаратов в организм - внутримышечная или подкожная инъекция, что может служить дополнительным стресс-факторами и увеличивает трудоемкость способа. Инъекции препаратов в течение 5-ти дней или один раз в месяц могут дать положительные результаты только в популяциях животных со средним генетическим потенциалом.
Повышение продуктивности до 9,2% и качества молока лактирующих коров за счет корректировки липидного и минерального обмена, направленного на оптимизацию рубцового пищеварения, поддержания высокого уровня метаболизма в организме, достигается применением энергетической кормовой добавки для лактирующих коров и первотелок, в состав которой входит антиоксидант - бис((3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)пропил)-фосфонат [RU 2722509 С1, 01.06.2020]. Кормовая добавка включает в себя также активированный цеолит, полученный в трехконтурном сушильном барабане при начальной температуре 1000°С и конечной 150-200°С, и майонез с истекающим сроком годности при соотношении компонентов, мас. %: цеолит активированный - 50-60, антиоксидант - 0,1 и майонез - 39,9-49,9. Включение добавки в рацион также способствует полному раскрытию генетического потенциала, профилактике ацидоза и кетоза и продлению продуктивного долголетия коров.
Недостатком изобретения является сложность в технологии освобождения майонеза из тары (ведра, тюбики), а также короткий гарантийный срок хранения и использования готовой продукции.
Описаны способы повышения молочной продуктивности и качества молока введением в рацион сельскохозяйственных животных кормовых добавок, содержащих каротиноиды, проявляющие антиоксидантные свойства. Так, в [RU 2605200 С2, 20.12.2016] раскрывается, что повышение молочной продуктивности и жирности молока обеспечивается введением в рацион животных кормовой добавки, содержащей, мас. %: бета-каротин в желатиновых микрокапсулах - 1,0-3,0, глицинаты цинка - 0,5-1,5, железа - 0,5-1,8, марганца - 0,3-0,8, меди - 0,01-0,2, кобальта - 0,015-0,025, цеойод - 0,007-0,02, ДАФС-25 - 0,0025-0,007, аскорбиновую кислоту - 0,25-0,5, антиоксиданты альфа-токоферол ацетат - 0,5-0,9, дигидрокверцетин - 0,2, стабилизатор бутилоксианизол - 0,002, желатин -10, наполнитель крахмал - до 100.
Недостатком изобретения является его высокая стоимость производства, связанная с использованием в составе комплекса биологически активных веществ с антиоксидантными свойствами, а также органических соединений микроэлементов.
40
56
Известно влияние на повышение молочной продуктивности и качества молока коров альтернативных природным источникам каротиноидов витаминных антиоксидантных препаратов на основе бета-каротина - «Липовитам-бета», «Карток», «Карсел» [Влияние использования в рационах коров препарата с высокой биодоступностыо бета-каротина на продуктивность и технологические свойства молока / С.П. Лифанова, В.Е. Улитько // Зоотехнология. - 2014. - №8. - С. 24-25; Влияние использования антиоксидантных β-каротинсодержащих препаратов на молочную продуктивность коров / С.П. Лифанова, В.Е. Улитько, О.А. Десятов // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2015. - №4. - С. 164-167; Антиоксидантный препарат «Карток» повышает продуктивность, улучшает состав и технологические свойства молока / С.В. Тойгильдин, В.Е. Улитько, С.П. Лифанова // Мичуринкий агрономический вестник. - 2016. - №1. - С. 51-56]. Препарат «Карсел» содержит 0,18% β-каротина, бета-каротин (СН) и ДАФС-25 (диацетофенонил-селенид, содержащий 25% органическисвязанного селена). Препарат «Карток» состоит из смеси 2 г/кг β-каротина, 2,25% витамина Ε (а-токоферол). Препараты такого состава, в отличие от традиционных кормовых источников каротина, не только улучшают Α-витаминный статус, но и обладают антиоксидантными, иммуностимулирующими и антитоксическими свойствами против поступающих в организм экотоксикантов. Парентеральное применение коровам антиоксидантных препаратов «Карсел» и «Карток» усиливает метаболические процессы в их организме, в том числе и в молочной железе, что проявляется в увеличении содержания в молоке жира, белка и СОМО и в совокупности улучшает показатель его сыропригодности.
Известен способ повышения молочной продуктивности и качества молока коров генетически различных популяций пород молочно-мясного и молочного направления продуктивности [Антиоксидантный препарат «Карток» повышает продуктивность, улучшает состав и технологические свойства молока / С.В. Тойгильдин, В.Е. Улитько, С.П. Лифанова // Мичуринкий агрономический вестник. - 2016. - №1. - С. 51-56]. Способ заключается во введении подопытным коровам бестужевской и голштинской красно-пестрой породы в первый период лактации парантерально в дозе 15 мл ежедневно 15 дней комплексного витаминизированного препарата «Карток» с антиоксидантными, детоксикационными, иммуностимулирующими действиями, способствующего усилению метаболических процессов в их организме, в т.ч. и в молочной железе. Наибольшее увеличение молочной продуктивности достигается у местных коров бестужевской породы (на 9,6%) и несколько меньше у красно-пестрых голштинских особей (на 3,9%), массовая доля жира в молоке соответственно на 0,12 и 0,19 абс.% и белка на 0,05 и 0,09 абс. %. К недостаткам решения, описанного в указанном источнике, можно отнести то, что научно-хозяйственные опыты проводились на двух популяциях пород раздельно методом мини-стада и сравнивать полученные результаты между собой методически некорректно; также использование препарата путем ежедневных инъекций является технологически трудоемким и физически стрессовым.
Кроме того, к недостаткам всех вышеуказанных способов следует отнести отсутствие применения методов нутригеномных исследований для понимания на молекулярно-генетическом уровне влияния применяемых антиоксидантов на здоровье и продуктивность животных через изменение экспрессии генов.
Вопрос об использовании нутригеномики как нового инструмента для изучения влияния питания на экспрессию генов, перспективах его использования для достижения более высокой продуктивности, улучшения здоровья и сохранности животных, является актуальным уже более десятилетия, применение методов нутригеномных исследований в животноводстве дает понимание на молекулярном уровне, каково влияние обычных питательных веществ рациона на здоровье и продуктивность животных через изменение экспрессии генов [Ли В. Нутригеномика - новое направление науки // Аграрные известия. - 2011. - N2(54). - С. 54-55]. Ведутся исследования полиморфизма генов-маркеров экономически важных признаков различных видов сельскохозяйственных животных с их продуктивными и другими свойствами, например, [Studying the association of polymorphic variants of LEP, TG5, CSN3, LGB genes with signs of dairy productivity of cattle / F.F. Zinnatov, F.F. Zinnatova, A.H. Volkov, et al. // International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences. 2020. T. 11. No2. P. 1428-1432; Характеристика быков-производителей с разными генотипами диацилглицерол-о-ацилтрансферазы по происхождению / С.В. Тюлькин, Л.Р. Загидуллин, Т.М. Ахметов, и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2017. - Т. 230. - №2. - С. 155-158; Молекулярная диагностика полиморфизма генов ESR и PRLR, влияющих на репродуктивные качества свиней / И.И. Гиниятуллин, Л.А. Рахматов, Т.М. Ахметов и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2016. - Т. 225. - №1. - С. 107-108; RU 2600889 С1, 27.10.2016; Юльметьева Ю.Р., Шакиров Ш.К. / Ассоциативные связи гена тиреоглобулина с продуктивным долголетием 0 молочного скота // Молочное и мясное скотоводство. - 2020. - №1. - С. 14-19; Гайнутдинова Э.Р., Сафина Н.Ю., Шакиров Ш.К. / Воспроизводительные качества голштинского скота с разными генотипами гена глутатионпероксидаза-1 (GPX-1) // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2020. - Т. 244. - №4. – С. 65-68].
Изучена и неоднократно описана тесная взаимосвязь молочной продуктивности и физико-химических показателей молока крупного рогатого скота различных пород с особенностями полиморфизма генов, несущих в себе хозяйственно полезные признаки: каппа-казеина (CSN3), бета-лактоглобулина (BLG), пролактина (PRL), соматотропина (GH), тиреоглобулина (TG5) при сбалансированном научно обоснованном кормлении [Ярлыков Н.Г. / Влияние генотипа каппа-казеина на молочную продуктивность и сыропригодность молока коров ярославской породы. // дисс.к.с-х.н. - 2010. - 125 с.; Шакиров Ш.К., Крупин Е.О. / Нутригеномная зависимость продуктивности и качества молока коров // Молочное и мясное скотоводство. - №3. - 2015. - С. 2-4; Егорашина Е.В., Тамарова Р.В. / Оценка по молочной продуктивности коров разных пород с использованием генетических маркеров // Вестник АПК Верхневолжья. - №1 (37). - 2017. - с. 52-58; Крупин Е.О. / Нутригеномика: раскрытие генетической обусловленной зависимости между качеством молока и продуктивностью животных. // Эффективное животноводство. - №9 (139). - 2017. – С .56-58; Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф., Мачульская Е.В., Шахназарова Ю.Ю. / Перспективы использования полиморфизма гена β-казеина в селекции крупного рогатого скота молочного направления продуктивности // Молочное и мясное скотоводство. - №5. - 2018. - С. 14-16; Шевцова А.А., Климов Е.А., Ковальчук С.Н. / Обзор вариабельности генов, связанных с молочной продуктивностью крупного рогатого скота // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2018. - №11-1. - С. 194-200; Бигаева А.В. Гильманов Х.Х., Тюлькин С.В. и др. / Сыропригодность молока коров с разными генотипами каппаказеина // Сыроделие и маслоделие. - 2019. - №6. - С. 26-27; Бигаева А.В., Гильманов Х.Х., Тюлькин С.В и др. / Термоустойчивость молока коров с разными генотипами каппа-казеина // Пищевая промышленность. - 2019. - №10. - С. 59-61; Тарасова Е.И., Нотова С.В. / Гены-маркеры продуктивных характеристик молочного скота (обзор) // Животноводство и кормопроизводство. - 2020. - Т. 103. - №3. - С. 58-80; Сафина Н.Ю., Гайнутдинова Э.Р., Зиннатова Ф.Ф., Шакиров Ш.К., Шарафутдинов Г.С.// Влияние комплексных генотипов генов каппа-казеин (CSN3) и 0 бета-лактоглобулин (LGB) на молочную продуктивность голштинского скота // Аграрный научный журнал. - 2020. - №5. - С. 64-67].
Значительно меньше изучена связь молочной продуктивности и качества молока крупного рогатого скота с полиморфизмом других генов [Сафина Н.Ю. / характеристика биологической эффективности и полноценности молочной продуктивности голштинских коров-первотелок с разными генотипами лептина (LEP) // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2018. - №4. - С. 131-133; Сафина Н.Ю., Юльметьева Ю.Р., Зиннатова Ф.Ф., Шакиров Ш.К., Ахметов Т.М., Гайнутдинова Э.Р. / Характеристика молочной продуктивности и качественного состава молока голштинского скота с разными генотипами гена лактоферрин (LTF) // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2018. - Т. 236. - №4. - С. 164-169; Сафина Н.Ю., Гилемханов И.Ю., Зиннатова Ф.Ф., Шакиров Ш.К. // Характеристика молочной продуктивности коров-первотелок с разными генотипами соматотропина (GH) // Вестник Казанского государственного аграрного университета. - 2019. - Т. 14. - №3 (54). - С. 58-61; Сафина Н.Ю., Шакиров Ш.К., Фаттахова З.Ф., Гайнутдинова Э.Р. / Биохимические показатели липидного обмена и качественный состав молока коров с разными генотипами Стеарил-КоА Десатуразы (SCD1) // Ветеринария, Зоотехния и биотехнология. - 2020. - №3. - С. 94-100; Сафина Н.Ю., Шакиров Ш.К., Гайнутдинова Э.Р., Фаттахова З.Ф. / Полиморфизм гена параоксоназа-1 (PON1) и его ассоциации с хозяйственно-полезными признаками голштинского скота // Вестник Казанского государственного аграрного университета. - 2020. - Т. 15. - №3 (59). - С. 43-48].
В связи с вышесказанным актуальным является изыскание новых средств, снижающих свободно-радикальное окисление, способствующих активизации эндогенных антиоксидантов, нормализации физиолого-биохимического статуса и реализации генетического потенциала продуктивности у высокопродуктивных коров в стрессогенных условиях с учетом нового научно-практического подхода в вопросах нутригеномики.
Таким образом технологической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является расширение арсенала способов повышения молочной продуктивности и качества молока высокопродуктивных коров в первый период лактации, оптимизирующих физиолого-биохимических процессов в организме, повышающих антиоксидантную защиту организма, способствующих профилактике нарушений обмена веществ у высокопродуктивных коров.
Технический результат заключается в активации экспрессии эндогенного фермента (гена) параокосназа-1, повышающей его антиоксидантную роль в организме коров голштинской породы, что приводит как к предупреждению возникновения нарушений обмена веществ в организме животных, вызываемого антиоксидантным стрессом, так и к корректировке и оптимизации обмена веществ, и обеспечивает высокую молочную продуктивность и качество молока высокопродуктивных коров в первый период лактации.
Техническая проблема решается, и указанный технический результат достигается заявляемым способом повышения молочной продуктивности дойных коров, включающим генотипирование коров голштинской породы по локусу гена PON1, идентификацию животных с генотипами АА, GA и GG, и введение в рационы кормления животных преимущественно с генотипами GA и GG, у которых значительно сильнее проявляется экспрессия гена PON1, кодирующего молочную продуктивность и качество молока, кормовой антиоксидантной добавки - 4,4-бис(2,6-ди-трет-бутилфенол). Указанную антиоксидантную добавку в рационы кормления животных вводят в дозах 2 мкмоль (0,0008%) на 1 кг живой массы, что составляет (с учетом живой массы коров голштинской породы 600-650 кг), 0,48-0,52 (среднее 0,5) г/гол в сутки в течение первого периода лактации, которое по технологии доения длится до 100 дней.
4,4'-бис(2,6-ди-трет-бутилфенол) является липофильным органическим веществом класса фенолов, представляет собой синтетический пространственно-замещенный фенольный жирорастворимый антиоксидант, белый или слегка желтоватый кристаллический порошок, соответствующий ТУ 2492-002-40655797-2014. Коммерческое название препарата - «Бисфенол-5», относится к классу малотоксичных соединений, не обладает тератогенным и мутагенным свойствами, не влияет на размножение животных [Зенков Н. К., Фенольные биоантиоксиданты / Н.К. Зенков, Н.В. Кандалинцева, В.З. Ланкин, Е.Б. Меньщикова, А.Е. Просенко. - Новосибирск: СО РАМН. - 2003. - 328 с.]. По результатам токсико-гигиенических исследований (протокол №46155 от 8 сентября 2014 г.) бисфенол-5 в разведении 0,5 г на 10 мл растительного масла обладает слабым раздражающим действием на кожу и слизистые оболочки, не выявлено кумулятивных свойств и сенсибилизующего действия [Бисфенол-5. Экспертное заключение ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в Республике Татарстан, №46155 от 08.09.2014 / Н.Г. Мустафина]. Разработана инструкция по применению кормовой добавки «Бисфенол-5» для сельскохозяйственных животных, утвержденная начальником Главного управления ветеринарии Кабинета министров Республики Татарстан (Казань, 2020). Из [RU 2654095 С1, 16.05.2018] известно применение «Бисфенол-5» в качестве стабилизирующей добавки, вводимой в комбикорм в концентрации 0,00019-0,00152% мас. при кормлении животных и птицы с целью увеличения прироста живой массы, повышения мясной продуктивности и улучшения качества мяса. Описано также повышение интенсивности роста при введении этого препарата в рацион белых крыс [Семина О.В., Гараева Г.А., Ахмадуллин P.M., Шилов В.Н. / Влияние препарата «Бисфенол-5» на ростовые процессы белых крыс // Продовольственная самодостаточность региона в условиях импортозамещения: вопросы теории и практики. Сборник научных статей. - 2016. - Том. Выпуск 10. - С. 326-329]. Доказано, что применение препарата «Бисфенол-5» в кормлении молодняка крупного рогатого скота повышало обменные процессы в организме животных и активизировало ферментативную активность крови [Шилов В.Н., Хабибуллин Р.З., Семина О.В., Ахмадуллин P.M. / Биохимические показатели крови телочек в молочный период при использовании антиоксиданта // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2019. - Т. 240. - №4. С. 209-213], увеличивало интенсивность роста телочек в молочный период, а также содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, что свидетельствует о лучшем обмене веществ у животных и лучшем клеточном и гуморальном иммунитете [Морфологические показатели крови и интенсивность роста телочек в молочный период при использовании антиоксиданта «Бисфенол-5» // Ветеринарный врач. - 2019. - №6. - С. 58-65], в дозе 2,0-4,0 мкМоль или 0,035-0,070 мл масляного раствора антиоксиданта на 1 кг живой массы телят молочного периода повышало прирост живой массы на 11,0%, снижало расход кормов на 1 кг прироста на 0,38-0,41 ЭКЕ, достоверно увеличивалась переваримость сухого и органического вещества, протеина, жира и БЭВ [Хабибуллин Р.З. Влияние разных доз антиоксиданта «Бисфенол-5» на интенсивность роста, морфофункциональное состояние и эффективность выращивания телят в молочный период: диссертация … кандидата сельскохозяйственных наук: 06.02.08; [Место защиты: ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева»] - Саранск, 2020. - 189 с.]. Влияние препарата «Бисфенол-5» на молочную продуктивность и качество молока не известно из уровня техники.
В работе [Сафина Н.Ю., Шакиров Ш.К., Гайнутдинова Э.Р., Фаттахова З.Ф. / Полиморфизм гена параоксоназа-1 (PON1) и его ассоциации с хозяйственно-полезными признаками голштинского скота // Вестник Казанского государственного аграрного университета. - 2020. - Т. 15. - №3 (59). - С. 43-48] выявлены ассоциации разных генотипов PON1 с хозяйственно-полезными признаками коров-первотелок голштинской породы, в том числе с показателем молочной продуктивности. Показано, что наибольшей молочной продуктивностью за 305 дней лактации (7339,6 кг), выходом молочного жира (291,1 кг) и молочного белка (254,6 кг) характеризовались первотелки с генотипом GG.
Заявителем также не выявлено в предшествующем уровне техники влияние «Бисфенол-5» на достижение указанного технического результата - активацию экспрессии гена параокосназа-1, повышающую его антиоксидантную роль в организме, оптимизирующую обмен веществ, повышающую молочную продуктивность и качество молока высокопродуктивных коров в первый период лактации, - достигаемый заявляемым способом. Вышесказанное обеспечивает, на взгляд заявителя, предлагаемому техническому решению соответствие установленным законодательством критериям «новизна» и «изобретательский уровень». Способ может широко использоваться в молочном скотоводстве, потому соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Научно-хозяйственный опыт по выявлению эффективности влияния скармливания антиоксиданта «Бисфенол-5» в разрезе различных генотипов коров по гену PON1 на обменные процессы в организме, молочную продуктивность и качество молока был проведен в 2019-2020 гг. в СХПК «Племенной завод им. Ленина» Атнинского района Республики Татарстан на 96 дойных коровах голштинской породы (год включения в реестр допущенных к использованию селекционных достижений - 1993, оригинатор/патентообладатель ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» (142143, Московская область, Подольский р-н, п. Быково), требования по породе составляют: удой - 5500 кг молока за 305 дней лактации, жир - 3,6%, белок - 3,0% [данные из информационно-аналитической системы «СЕЛЭКС.Молочный скот w.6.1.0.0.» (АРМ Плинор, Россия)]; возраст 3-4 года (2-3 полные лактации).
2
Осуществляют идентификацию генотипов по гену bovine PON1 по модернизированному методу ПЦР-ПДРФ детекции [Сафина Н.Ю., Шакиров Ш.К., Гайнутдинова Э.Р., Фаттахова З.Ф. / Полиморфизм гена параоксоназа-1 (PON1) и его ассоциации с хозяйственно-полезными признаками голштинского скота // Вестник Казанского ГАУ. - 2020. - №3(59). - С. 43-48] с использованием реактивов производства компании «СибЭнзим» (Россия). Выявленный полиморфизм визуализирован и документирован в системе «Gel&Doc» (Bio-Rad, США). Частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов рассчитывают согласно методическим рекомендациям [Merkureva Е.К., Shangin-Berezovskiy G.N. Genetika s osnovami biometrii. [Genetics with the basics of biometrics]. - M.: Kolos, - 1983. Р. 400]. Значимость вариабельности между ожидаемым и наблюдаемым распределением генотипов гена PONI тестировали методом хи-квадрат Пирсона (χ) и на соответствие закону Харди-Вайнберга генетического равновесия в популяции.
В изученной популяции были идентифицированы коровы с генотипами АА (36 голов), GA (44 голов) и GG (18 голов).
Из животных в соответствии с установленными генотипами формируют группы-аналоги по возрасту, живой массе, продолжительности лактации и уровню продуктивности [Овсянников, А.И. Основы опытного дела в животноводстве / А.И. Овсянников. - Москва: Колос, 1976. - 303 с.] - опытные и контрольные, всего 6 групп (с генотипом АА: контрольная группа 16 голов, опытная - 20 голов, с генотипом GA: контрольная группа 26 голов, опытная - 18 голов, с генотипом GG контрольная группа 18 голов, опытная - 10 голов), и проводят исследования ассоциаций с хозяйственно-полезными признаками крупного рогатого скота.
В контрольных группах дойные коровы получают сбалансированный рацион без испытуемого антиоксиданта «Бисфенол-5». Животные опытных групп получают дополнительно к основному рациону антиоксидантную добавку «Бисфенол-5» в количестве 2 мкмоль на 1 кг живой массы или 0,48-0,52 г/гол. в сутки, которую смешивают с монокормом основного рациона в указанной дозе таким образом, что суточную дозу «Бисфенол-5» скармливают за 2 раза - в утреннее и вечернее кормление. Доза 2 мкмоль на 1 кг живой массы установлена как оптимальная по результатам научных исследований на телятах при введении антиоксидантного препарата «Бисфенол-5» в рацион телят и телочек в молочный период [Шилов В.Н., Хабибуллин Р.З., Семина О.В., Ахмадуллин P.M. /Влияние скармливания антиоксиданта «Бисфенол-5» на рост и развитие телочек // Международная научно-практическая конференция: «Точки роста эффективности АПК в условиях нестабильного рынка». - 23-25 мая 2018 г. - Казань. - С. 287-291; Шилов В.Н., Хабибуллин Р.З., Семина О.В., Ахмадуллин P.M. / Биохимические показатели крови телочек в молочный период при использовании антиоксиданта // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2019. - Т. 240. - №4. С. 209-213; Шилов В.Н., Хабибуллин Р.З., Семина О.В., Ахмадуллин P.M. / Морфологические показатели крови и интенсивность роста телочек в молочный период при использовании антиоксиданта «Бисфенол-5» // Ветеринарный врач. - 2019. - №6. - С. 58-65; Хабибуллин Р.З. Влияние разных доз антиоксиданта «Бисфенол-5» на интенсивность роста, морфофункциональное состояние и эффективность выращивания телят в молочный период: диссертация … кандидата сельскохозяйственных наук: 06.02.08; [Место защиты: ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева»] - Саранск, 2020. - 189 с.] и производственных испытаний на коровах.
Опыт проводят 60 дней, за период опыта рационы коров подготавливают и скармливают в виде полноценных кормосмесей (монокорма), которые имели одинаковую поедаемость. Кормовые рационы, их питательная ценность соответствовали нормам ВИЖа [Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. Справочное пособие. 3-е издание переработанное и дополненное / Под ред. А.П. Калашникова, В.И. Фисинина, В.В. Щеглова, Н.И. Клейменова. - Москва. - 2003. - 456 с.] и представлены в таблице 1.
Биохимические исследования сыворотки крови, отобранной из хвостовой вены в утренние часы до кормления, проводят на фоне скармливания препарата через 30 дней после начала опыта на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «SINNOVA BS-3000M» (Китай) с использованием готового набора реагентов (ООО «Диакон-Вет», Россия) в соответствии с инструкцией производителя.
Динамику молочной продуктивности отслеживают ежедневно (суточный удой, кг), а качественного состава молока - ежедекадно (контрольные дойки, анализ по 10 показателям).
Анализ качественного состава молока проводят на оборудовании CombiFoss™ 7, MilkoScan™ 7 RM, Fossomatic™ 7. Для измерения используют молоко, отобранное во время контрольных доек, содержащее консервант Broad Spectrum Microtabs II.
Уровень достоверности различий определяют с использованием критерия t-Стьюдента.
Результаты проведенных за период опыта биохимических исследований сыворотки крови, приведенные в таблице 2, по которым можно судить о степени метаболизма и прогнозируемом уровне молочной продуктивности животных, свидетельствуют о том, что полученные показатели у коров различных групп находились, в основном, в пределах физиологической нормы. Однако при сравнении показателей прослеживаются различия, как по группам, так и по генотипам животных.
Так, если уровень общего белка, характеризующего уровень протеинового питания, и альбуминовой фракции - пластического материала, обуславливающих возможности для синтеза белка молока из мышечной ткани животных, у коров контрольных групп находились в пределах 87,3-90,2 г/л и 34,1-42,7 г/л соответственно, то в опытных группах эти показатели составили соответственно 89,9-93,5 г/л и 37,0-46,2 г/л, что было выше на 3,0-3,6% и 8,2-8,5%. Однако, коровы с генотипами GA и GG по этим показателям превосходили животных с генотипом АА.
Мочевина является индикатором степени использования и биологической ценности перевариваемого протеина. Во всех опытных группах за период опыта наблюдалось снижение в сыворотке крови коров содержание мочевины на 9,7-33,5% по сравнению с контрольными группами, что свидетельствует об усиленном использовании протеина рациона. При этом, по-видимому, «Бисфенол-5» являлся эффективным катализатором интенсивности обмена белка.
Общеизвестно, что содержание холестерола и триглицеридов в крови характеризует интенсивность жирового обмена в организме. Нашими исследованиями установлено, что наибольшее повышение холестерола наблюдалось у коров опытной группы с генотипом АА и составило 44,8% по сравнению с контрольными значениями. Тогда как у коров с генотипами GA и GG увеличение этого показателя составило лишь в пределах 8,2-17,6%, что характеризует о незначительном сдвиге от физиологической нормы. Определенная стабильность наблюдалась у этих животных и в отношении активности фермента липазы.
Концентрация глюкозы в сыворотке крови коров во всех группах соответствовала физиологической норме и составляла 2,20-2,87 ммоль/л. Однако у опытных животных с генотипами GA и GG эти показатели были на уровне контроля с незначительными колебаниями, что свидетельствует об усиленном расходовании глюкозы в качестве источника лактозы в синтезе молока. Это особенно подтверждается повышением активности амилазы в крови животных опытной группы с генотипом GG. Так, если у подопытных коров с генотипом АА этот показатель за период опыта увеличился на 5,9%, с генотипом GA - на 5,0%, то у животных с генотипом GG на 13,7% по сравнению с контрольными значениями.
Что касается активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), катализирующих в организме важнейшие процессы, связанные с белковым обменом, и участвующих в обратимой реакции переноса аминогрупп аминокислот на кетокислоты, а также синтезе аминокислот, то использование в рационах подопытных коров антиоксиданта «Бисфенол-5» оказало влияние на увеличение АсАТ только у коров с генотипом АА и составило 26,3% по сравнению с контролем. У животных с генотипами GA и GG данные показатели существенно не изменились.
В отношении концентрации в крови ферментов АлАТ и щелочной фосфатазы, катализирующей минеральный обмен в организме, каких-либо колебаний за период опыта не выявлено. Однако уровень кальция и фосфора в крови коров различных генотипов отличался. Так, если у коров с генотипом АА при скармливании антиоксиданта происходило увеличение кальция и фосфора соответственно на 14,7 и 16,7% от контрольного уровня, то у коров опытных групп с генотипами GA и GG наблюдалось, наоборот, снижение этих показателей на 10,3-10,5% и 6,3-12,7% соответственно по сравнению с контролем. Такой спад объясняется высокой продуктивностью этих животных и интенсивным выведением их из организма с молоком.
В целом данные биохимических показателей крови свидетельствуют, что использование в качестве кормовой антиоксидантной добавки препарата «Бисфенол-5» оказало положительное влияние на биохимические показатели крови опытных животных с генотипами GA и GG.
В таблице 3 приведены показатели молочной продуктивности дойных коров с разными генотипами гена PON1, а также данные по затратам кормов и питательных веществ на единицу продукции. По результатам контрольных доек во всех опытных группах коров с разными генотипами гена PON1 отмечается увеличение среднесуточного удоя по сравнению с показателем контрольных групп на 2,30-3,12 кг или 7,4-9,5%, для животных с генотипами GA и GG увеличение было больше (на 9,1 и 9,5% соответственно), чем для коров с генотипом АА - на 7,4%).
В пересчете на базисную жирность (3,4%) максимальная разница зафиксирована у животных с генотипами GA и GG, превышающая показатель контрольных групп на 2,47-3,24 кг или на 7,9-9,2%; p ≤ 0,001 соответственно. В то же время у коров опытных групп с генотипом АА за этот период происходило снижение среднесуточного удоя на 0,57 кг или на 1,6% по сравнению с контрольными животными. При этом у групп с повышенным среднесуточным удоем выявлено снижение затрат кормов на производство 1 кг молока базисной жирности в перерасчете на обменную энергию (МДж): для генотипа GA на 7,4%, а для генотипа GG на 8,4%, на фоне увеличения этого показателя у животных с генотипом АА на 1,7%.
Похожая тенденция наблюдается при пересчете затрат кормов на производство 1 кг молока на чистую энергию лактации (NEL, МДж). В этом случае снижение затрат составило 7,5 и 9,3% для животных с генотипами GA и GG соответственно. При этом у животных с генотипом АА это значение увеличилось на 1,7% по сравнению с контрольной группой этого же генотипа. Затраты сырого протеина на единицу продукции аналогично уменьшались в группах с генотипами GA и GG, и увеличивалось в группе с генотипом АА.
Показатели качественного состава молока подопытных коров приведены в таблице 4. Установлено, что при введении в рацион кормовой антиоксидантной добавки «Бисфенол-5» на фоне увеличения среднесуточного удоя не происходило каких-либо значительных изменений в содержании массовой доли жира в молоке в группах коров с генотипами GA и GG. В то же время у животных с генотипом АА выявлено снижение этого показателя за период опыта на 0,32 абс. % по сравнению с контролем (Таблица 4).
В отношении содержания массовой доли белка в молоке коров всех групп и генотипов за период опыта существенных изменений не установлено.
При анализе выхода молочного жира и белка за период опыта выявлено относительно одинаковое увеличение этого показателя во всех группах животных с разными генотипами. Однако максимум по этому показателю установлен как у контрольных, так и у опытных групп коров с генотипом GG и составил соответственно 2328,1 и 2498,2 г, против 2024,0-2276,5 г у коров других групп и генотипов или повышение составило в пределах 9,7-15,9%.
Физико-химические свойства молока коров с разными генотипами гена PON1 приведены в таблице 5. Для коров различных групп и генотипов не установлено достоверных различий по уровню рН, содержанию лактозы и СОМО, за исключением показателей животных с генотипом GG, где этот показатель был ниже контроля на 0,27%.
За период опыта наблюдают снижение сухого вещества в молоке коров опытной группы с генотипом АА на 0,34%, против 0,08-0,20% в опытных группах коров с генотипами GA и GG по сравнению контрольными животными. Если уровень мочевины в молоке коров опытной группы с генотипом АА снизился на 2,65 ммоль/л или на 5,7% по сравнению с контрольными животными, то у коров с генотипами GA и GG за этот период уровень мочевины практически не изменился.
Концентрация кетоновых тел (ВНВ и ацетон) в молоке подопытных животных была относительно стабильной во всех опытных группах. Однако, если сравнивать эти показатели относительно контрольных животных, то происходило снижение уровня ацетона в опытных группах, получавших в рационах «Бисфенол-5», с генотипами АА и GA на 20,7 и 20,9% соответственно.
Что касается уровня соматических клеток в молоке, то у коров опытной группы с генотипом АА их количество увеличилось в 2,4 раза по сравнению с контролем. В то же время эти показатели у коров с генотипом GA и GG имели тенденцию к снижению на 10,7 и 29,4% соответственно по сравнению с показателями животных контрольных групп. В целом молоко по этому показателю было высокого качества.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что введение препарата «Бисфенол-5» детализировано нормализует физиолого-биохимические процессы в организме, повышает молочную продуктивность и качество молока дойных коров голштинской породы в разрезе различных генотипов гена PON1 и позволяет рекомендовать использовать его в рационах высокопродуктивных коров с высоким генетическим потенциалом, особенно для коров с генотипами GA и GG.
Таким образом, предлагаемый способ повышения молочной продуктивности дойных коров профилактирует нарушения обмена веществ в организме животных, стимулирует его антиоксидантный статус на генном уровне и обеспечивает селективное повышение молочной продуктивности и качества молока в разрезе различных генотипов гена PON1, что является незаменимым аспектом в повышении продуктивных качеств сельскохозяйственных животных и позволяет рекомендовать его в рационах молочных коров с высоким генетическим потенциалом.
Заявляемый способ может широко использоваться в современном молочном скотоводстве, на предприятиях, производящих продукцию на специальных комбикормах, обогащенных биологическими или синтетическими антиоксидантами.