УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕТАНОЛА И ФОРМАЛЬДЕГИДА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА METHYLOBACTERIUM DICHLOROMETHANICUM ДМ 4 ВКМ В-2191

Метанол используется в различных промышленных и технологических процессах. Российская Федерация является основным производителем и поставщиком метанола в Европе. Мировое производство метанола в настоящее время составляет 50 млн. т. в год, причем большая часть используется на химический синтез [http://methanol.ru/market/Rossijskij_rynok_metanola_v_svete_mirovyh_tenden]. Метанол применяется в качестве ингибитора гидратообразования при добыче газа. Следствием производства и применения метанола является загрязнение воды и почвы, что представляет серьезную экологическую проблему [http://www.ogbus.ru. Нефтегазовое дело, 2007]. Метанол также используется для производства формальдегида, сложных эфиров, аминов, растворителей, уксусной кислоты.
Другим широко используемым в промышленности химическим соединением является формальдегид. Ежегодное производство формальдегида составляет около 10 миллионов тонн. Половина этого объема используется для производства формальдегидных смол, применяемых в производстве строительных плит, фанеры, лакированных материалов [Gerberich H.R., Seaman G.C., 1994. Formaldehyde. Encyclopaedia of Chemical Technology, 4th ed., vol. 11. Wiley, New York, pp.929-951].
Поиск новых способов и технологий биодеградации и детекции метанола и формальдегида на основе штаммов микроорганизмов-деструкторов может решить проблему очистки окружающей среды от этих соединений. Применению биосенсорного анализа для изучения биокаталитических свойств клеток микроорганизмов посвящено большое число публикаций. Существующие разработки в области биосенсоров для детекции метанола и формальдегида основаны на сочетании ферментов или клеток микроорганизмов и амперометрических (кислородный электрод типа Кларка, медиаторные электроды) или потенциометрических преобразователей (pH-чувствительные транзисторы).
Ниже перечислены аналоги предлагаемого микробного сенсора для контроля концентрации метанола и формальдегида.
Два типа селективных биосенсоров для определения формальдегида разработаны на базе pH-чувствительных полевых транзисторов в качестве преобразователей [Korpan Y.I., Gonchar M.V., Sibirny А.А., Martelet С., El'skaya A.V., Gibson T.D., Soldatkin A.P. Development of highly selective and stable potentiometric sensors for formaldehyde determination // Biosensors and Bioelectronics. 2000. V.15. №1-2. P.77-83]. В качестве биологически чувствительных элементов были использованы алкогольоксидаза и клетки метилотрофных дрожжей, обработанные дигитонином. Время отклика составляло 10-60 и 60-120 с для ферментного и клеточного сенсоров, соответственно. Линейный диапазон детекции составлял для ферментного сенсора 5-200 мМ и 5-50 мМ для микробного. Стабильность при хранении составляла 60 и 30 дней для ферментного и микробного сенсоров, соответственно. Сенсоры обладали высокой селективностью к формальдегиду и характеризовались отсутствием отклика на первичные спирты включая метанол, а также на глицерин и глюкозу. Биосенсор медиаторного типа на основе клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha представлен в работе [Khlupova M., Kuznetsov В., Demkiv О., Gonchar M., Csöregi Ε., Shleev S.. Intact and permeabilized cells of the yeast Hansenula polymorpha as bioselective elements for amperometric assay of formaldehyde // Talanta. 2007. V.71. №2. P.934-940]. Клетки иммобилизовали включением в кальций-альгинатный гель на поверхности платиновых электродов, полученных методом трафаретной печати. В качестве медиатора использовали 2,6-дихлорфенолиндофенол. Нижний предел детекции формальдегида составлял 0.74 мМ.
2
2
2
2
2
2
2
2
В качестве прототипа использован амперометрический биосенсор на основе клеток Hansenula polymorpha. Биосенсоры на основе мутантных клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha для детекции этанола и метанола описаны Гончаром с соавт., 1998 [Gonchar M.V., Maidan М.М., Moroz О.М., Woodward J.R. Sibirny A.A. Microbial O- and HO-electrode sensors for alcohol assays based on the use of permeabilized mutant yeast cells as the sensitive bioelements // Biosens. Bioelectron 1998. V.13. P.945-952.]. Биосенсор на основе O-электрода содержал мутантные клетки с повышенной алкогольоксидазной активностью. Биосенсор, использующий в качестве преобразователя НO-электрод, содержал мутантные клетки дефицитные по каталазе, которые продуцировали НO при окислении спирта. Оба штамма были обработаны дигитонином, что позволяло значительно снизить чувствительность к глюкозе и глицерину и повысить селективность биосенсоров. Линейные диапазоны определения этанола и метанола для биосенсора на основе кислородного электрода составляли 0.2-1.2 и 0.03-0.35 мМ, соответственно. Биосенсор, основанный на детекции пероксида водорода, позволял определять этанол и метанол в диапазонах 0.4-4 мМ и 0.05-1.2 мМ, соответственно.
Таким образом, существующие разработки в области микробных биосенсоров для детекции метанола и формальдегида основаны на использовании клеток метилотрофных дрожжей. Актуальной остается задача поиска бактериальных штаммов для создания биосенсоров на их основе.
В отличие от вышеуказанного прототипа в предлагаемой модели используется бактериальный штамм Methylobacterium dichloromethanicum ДМ 4 VKM В-2191=DSMZ 6343, выделенный из активного ила [Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova Т.Р., Kuznetsov B.B. and Leisinger T. Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. - Novel Aerobic Facultatively Methylotrophic Bacteria Utilizing Dichloromethane // System. Appl. Microbiol. 2000. V.23. P.210-218]. Штамм, используемый при создании полезной модели, нечувствителен к глюкозе, обладает способностью окислять метанол, формальдегид и ряд алифатических спиртов.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель состоит в создании устройства для определения содержания метанола и формальдегида и применении в таких областях как мониторинг окружающей среды и химическая промышленность.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор позволяет исследовать кажущиеся кинетические параметры иммобилизованных клеток и обладает малым временем ответа, высокой чувствительностью и стабильностью.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения метанола и формальдегида включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM В-2191. Штамм чувствителен к наличию метанола, формальдегида и ряда алифатических спиртов и нечувствителен к наличию глюкозы.
2
4
4
2
4
4
2
4
2
6
Бактерии выращивали на среде «К», содержащей (г/л): КНРO - 2, (NH)SO - 2, NaCl - 0.5, MgSO×7HO - 0.125, FeSO×7HO - 0.002, pH 7.2, при 29°С в колбах объемом 0.75 л на качалке (180 об/мин). Культивирование проводили в колбах объемом 750 мл до необходимой плотности при 29°С и аэрация на шейкере при 190 об/мин. Инокулят вносили в количестве 1% по объему среды до конечной концентрации ~10 КОЕ/мл. Метанол вносили в стерильные среды в концентрации 0.5% (по объему).
Измерения проводили в открытой кювете. Для регистрации сигналов сенсора использовали гальваностат-потенциостат IPC2L (ООО «Кронас», Россия), подключенный к персональному компьютеру. Все измерения проводили в кювете объемом 2.0 мл при постоянном перемешивании и при температуре 20-22°С. После стабилизации базовой линии, в систему подавали раствор субстрата. В качестве базового раствора использовали 10 мМ калий-фосфатный буфер pH 7.
Для приготовления рецепторного элемента биосенсора использовали суспензию клеток бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191. Выращенные на вышеуказанной среде клетки, центрифугировали при 10000 g в течение 3 минут, затем промывали 2 раза калий-фосфатным буфером и суспендировали в определенное количество такого же буфера; 5 мкл суспензии клеток в концентрации 250 мг сырого веса/мл наносили на мембрану (3×3 мм) и подсушивали на воздухе в течение 20 минут. Затем мембрану помещали на кислородный электрод типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора на поверхности преобразователя.
Принцип анализа был основан на электрохимической детекции дыхательной активности микроорганизмов в присутствии анализируемых соединений. Изменение содержания кислорода в среде пропорционально концентрации анализируемого вещества, что и составляет основу анализа. Регистрируемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала (нА/с).
На фиг.1 представлена схема устройства для определения метанола и формальдегида. Предлагаемое устройство включает следующие элементы: биосенсор, состоящий из преобразователя-электрода Кларка (1), на котором размещен биорецептор (2), представляющий собой иммобилизованные на носителе клетки штамма бактерий M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191, а также измерительную кювету (3) и магнитную мешалку (4).
Основным аналитическим параметром биосенсора является градуировочная зависимость. Для ее построения в измерительную кювету вносили различные концентрации анализируемых соединений. На фиг.2 представлены градуировочные зависимости сенсора на основе клеток штамма M. dichloromethanicum ДМ4 VKM В-2191 для определения метанола (кривая 1) и формальдегида (кривая 2).
Основные аналитические параметры биосенсора представлены в Таблице 1. Кажущиеся кинетические константы приведены в Таблице 2.
Таблица 1.
Аналитические параметры биосенсора на основе штамма M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191.
Аналитические параметры сенсора
Субстракт
метанол
формальдегид
Чувствительность в области линейного диапазона, (нА/с)/мМ/мм<sup>2</sup>
27
27
Минимальный предел обнаружения, мМ
0.05
0.04
Диапазон детекции, мМ
0.05-2.50
0.04-2.00
Коэффициент вариации, %
8.2
Операционная стабильность без потери активности, сут
7
Таблица 2.
Кинетические константы иммобилизованных клеток M. dichloromethanicum ДМ4 VKM B-2191.
Параметры уравнения Хилла
Субстрат
метанол
формальдегид
Максимальная скорость реакции V<sub>max</sub>, нА/с
1.73
1.40
Констата Михаэлиса K<sub>M</sub>, мМ
0.57
0.50
Параметр Хилла, h
2.00
1.80
В Таблице 3 приведена субстратная специфичность штамма М. dichloromethanicum ДМ4 VКМ В-2191.
Таблица 3.
Субстратная специфичность штамма M. dicloromethanicum ДМ4 VKM В-2191.
Субстрат
Отклик сенсора, %
метанол
100
этанол
81.5
пропанол
71.6
бутанол
63.0
пентанол
17.3
изопропанол
0.0
изобутанол
0.0
изоамиловый спирт
0.5
третбутанол
0.0
глицерин
0.0
формальдегид
96.0
формиат
16.5
глюкоза
0.0
Согласно данным субстратной специфичности, штамм характеризовался наибольшими откликами на метанол, этанол, пропанол и бутанол. Отклик на формальдегид составлял 96% ответа на метанол.
В результате проведенных исследований установлены основные свойства штамма M. dicloromethanicum ДМ4 VКМ В-2191, на основании чего, предлагаемый штамм может быть рекомендован для использования в технологии производства амперометрических биосенсоров для определения концентрации метанола и формальдегида при проведении экологического мониторинга.