Люминесцентная диагностика опухолей с применением апконвертирующих наночастиц

Люминесцентная диагностика опухолей с применением апконвертирующих наночастиц

Рочева В.В.1 • Шолина Н.ВЛ 2 • Деревяшкин С.П.1 • Генералова А.НЛ 3 • Нечаев А.В.1, 4 • Хоченков Д.А.1, 2 • Семчишен В.А.1 • Хайдуков Е.В.1 • Степанова Е.В.2 • Панченко В.Я.1

Актуальность. Для повышения качества онкологических операций необходимо полностью удалить опухоль, включая метастазы, свести к минимуму повреждения здоровых тканей и сократить время операции. Современные методы детектирования, в основе которых лежит рентгеновская компьютерная томография, а также магнитно-резонансная томография, определяют опухоль, когда ее объем становится достаточно большим (содержит более 10 миллиардов клеток). В этой связи актуальной задачей представляется повышение чувствительности и разрешающей способности методов диагностики для обнаружения злокачественных новообразований на ранних этапах развития. Цель - продемонстрировать возможности применения нового класса антистоксовых люминесцентных наночастиц для глубокой высококонтрастной оптической визуализации злокачественных опухолей. Материал и методы. В работе использовались узкодисперсные апконвертирующие наночастицы размером 70-80 нм, имеющие структуру ядро/оболочка ЫаУР^УЬ^Тт^/ЫаУР^

Наночастицы обладают интенсивной полосой антистоксовой фотолюминесценции на длине волны 800 нм при возбуждении излучением на длине волны 975 нм (обе длины волны попадают в окно прозрачности биологической ткани). Коэффициент конверсии возбуждающего излучения в антистоксовую люминесценцию составлял 9%. Для увеличения времени циркуляции частиц в кровотоке малых животных наночастицы покрывались биосовместимой амфифильной полимерной оболочкой. В качестве опухолевой модели использовалась перевитая мышам эпи-дермоидная карцинома Льюиса. Результаты. Получены стабильные водные коллоиды наночастиц, покрытых амфифильным полимером, способные сохранять первичные размеры в течение как минимум месяца. Применение апконвертиру-ющих наночастиц с гидрофильной оболочкой из чередующегося сополимера малеинового ангидрида и октадецена с последующим покрытием с помощью диглицидилового эфира полиэтилен-гликоля позволило снизить неспецифическое взаимодействие наночастиц с белками плазмы

крови, что, в свою очередь, привело к увеличению времени их циркуляции в кровотоке малых животных до 1 часа. На модели карциномы легкого Льюиса, перевитой мышам, продемонстрирована прижизненная доставка апконвертиру-ющих наночастиц в опухоль с высокой степенью локализации за счет пассивного БРР-эффекта. Контраст люминесцентного сигнала в опухоли по отношению к окружающим тканям составил не менее 70%. Продемонстрирована возможность визуализации апконвертирующих наноча-стиц в глубине биоткани до 15 мм. Заключение. Методы оптической визуализации с применением антистоксовых фотолюминесцентных маркеров обеспечивают высокий контраст обнаружения опухолевых тканей в режиме реального времени, что позволяет использовать их для ин-траоперационной диагностики.

Ключевые слова: апконвертирующие наноча-стицы, оптическая люминесцентная визуализация, интраоперационная оценка границ опухоли

doi: 10.18786/2072-0505-2016-44-2-227-233

Рочева Василина Васильевна -

аспирант, мл. науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1

Шолина Наталья Валериевна - мл.

науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1; мл. науч. сотр., лаборатория биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей2 Деревяшкин Сергей Петрович -лаборант-исследователь, лаборатория нелинейной оптики поверхности

и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1

Генералова Алла Николаевна - канд. хим. наук, ст. науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1; ст. науч. сотр., лаборатория полимеров для биологии3 Нечаев Андрей Валерьевич - канд. хим. наук, лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1; доцент кафедры химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского4

Хоченков Дмитрий Александрович -

канд. биол. наук, науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1; науч. сотр., лаборатория биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей2

Семчишен Владимир Анатольевич -канд. физ.-мат. наук, вед. науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1 Хайдуков Евгений Валерьевич -канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр., лаборатория нелинейной оптики

поверхности и лазерно-плазменных процессов, отделение перспективных лазерных технологий1 * 140700, Московская область, г. Шатура, ул. Святоозерская, 1, Российская Федерация. Тел.: +7 (495) 851 08 40. Б-таИ: khaydukov@mail.ru

Степанова Евгения Владиславовна -

д-р мед. наук, вед. науч. сотр., лаборатория биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей2 Панченко Владислав Яковлевич - д-р физ.-мат. наук, академик РАН, профессор, директор1

1 ФГБУН «Институт проблем лазерных и информационных технологий» РАН; 140700, Московская область, г. Шатура, ул. Святоозерская, 1, Российская Федерация

2 ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24, Российская Федерация

3 ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН; 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Российская Федерация

4 ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»; 119571, г. Москва, проспект Вернадского, 86, Российская Федерация

Ранняя диагностика с последующим хирургическим удалением опухолевой ткани - один из наиболее эффективных методов лечения ряда онкологических заболеваний. Однако интраоперационная оценка границ хирургического вмешательства является субъективной, что может привести к неполной резекции опухоли и ее дальнейшему рецидиви-рованию [1, 2]. В целях повышения качества операций необходимо полностью удалить опухоль, включая метастазы, свести к минимуму повреждения здоровых тканей и сократить время операции. Современные методы детектирования, в основе которых лежит рентгеновская компьютерная томография, а также магнитно-резонансная томография, определяют опухоль, когда ее объем становится достаточно большим (содержит более 10 миллиардов клеток). В этой связи актуальной задачей становится повышение чувствительности и разрешающей способности методов диагностики для обнаружения злокачественных новообразований на ранних этапах развития.

Апконвертирующие наночастицы (НАФ), обладающие уникальными оптическими свойствами, считаются перспективной платформой для создания опухолевых маркеров, обеспечивающих оптическую визуализацию тканей в режиме реального времени с высокой чувствительностью и контрастом, что позволяет использовать их для интраоперационной диагностики [3, 4, 5]. Наночастицы представляют собой неорганические кристаллы NaYF4, легированные ионами эрбия и тулия (Yb3+ и Tm3+). Наночастицы нетоксичны, фотостабильны, а их поверхность позволяет создавать конъюгаты с нацеливающими модулями [6]. Длина волны возбуждения (975 нм) и пик фотолюминесценции НАФ (800 нм) находятся в ближней инфракрасной области спектра и попадают в окно прозрачности биоткани [7], а антистоксовый характер фотолюминесценции наночастиц позволяет спектрально подавить сигнал стоксовой автолюминесценции от хромофоров биоткани, что обеспечивает высокий контраст визуализации маркированных тканей [5].

Рост большинства злокачественных опухолей в значительной степени зависит от ангиоге-неза - процесса образования новых опухолевых кровеносных сосудов из уже существующих. Кровеносная система опухолей имеет ряд особенностей, отличающих ее от нормальной сосудистой сети: гиперваскуляризация, патологическая нерегулярная архитектура сосудистой сети, избыточное производство опухолевыми клетками

проангиогенных факторов (VEGF, FGF2), а также нарушения лимфатического дренажа. Сосуды опухоли обладают «дефектным» эндотелием с широкими фенестрациями (до 4 мкм), не имеют развитого мышечного слоя, имеют относительно широкий просвет, а также недостаток рецепторов для ряда вазоактивных медиаторов (ангиотен-зин II) [8, 9]. Гиперэкспрессия ряда сосудистых медиаторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов, брадикинин, простагландины, оксиды азота и матричные металлопротеиназы [10, 11], в значительной степени способствует повышенной проницаемости сосудов в тканях опухоли. Особенность сосудов опухоли, характеризующихся повышенной проницаемостью и возможностью удерживать введенные препараты и на-ночастицы, получила название EPR-эффекта (англ. enhanced permeability and retention) [12]. Наночастицы с размерами от 10 до 100 нм способны эффективно аккумулироваться в солидных опухолях благодаря аномальной структуре кровеносных сосудов и отсутствию эффективного лимфодренажа [13, 14]. Избирательное накопление наночастиц в опухолях представляется эффективным механизмом для маркирования и последующей диагностики опухолевых очагов.

Материал и методы

Синтез и оптические свойства апконвертирующих наночастиц

Наночастицы синтезированы по технологии, описанной нами ранее [15]. Были получены нано-кристаллы со структурой ядро/оболочка. Ядро -e~NaYF4, солегированное Yb3+, Tm3+ в молярном соотношении 18% : 2% соответственно, кристаллическая оболочка состояла из нелегированного NaYF4. Технология синтеза позволила получить узкодисперсные частицы размером 75 ± 5 нм, обладающие коэффициентом конверсии (отношение излученной мощности к поглощенной) 9% при интенсивности возбуждающего излучения 10 Вт/см2. На рис. 1 представлены характеристики синтезированных наночастиц.

Покрытие апконвертирующих наночастиц амфифильными полимерами

Синтез НАФ обычно проводится в среде органических растворителей, в результате формируются гидрофобные наночастицы, стабилизированные олеиновой кислотой [16]. В случае применения НАФ в качестве маркеров для оптической визуализации опухолей необходимо провести модификацию их поверхности с целью придания им гидрофильных свойств для сохранения коллоидных

А

18 16 14

ä 12

Ф

х 10

5 8 -1 6 4 2 0

f i

J L

12

11

d £ 10

7

-e- 7

m О

* 6

400 500 600 700 800 900 1000 Л, нм

0 5 10 15 20 25 30 35 40 W, Вт/см2

Рис. 1. Характеристики синтезированных наночастиц: А - спектр фотолюминесценции наночастиц со структурой ядро/оболочка МаУР4:УЬ3+Тт3+/№УР4 при возбуждении на длине волны 975 нм, на вставке: ТЕМ фотография; Б - зависимость коэффициента конверсии наночастиц от интенсивности возбуждающего излучения

свойств в живом организме. Гидрофилизацию наночастиц проводили путем формирования полимерной оболочки на поверхности НАФ за счет проникновения гидрофобных фрагментов амфи-фильного полимера (чередующегося сополимера малеинового ангидрида и октадецена, ПМАО) в оболочку олеиновой кислоты без ее удаления с поверхности наночастиц. Полимерная оболочка формируется без непосредственного воздействия агрессивных агентов (растворителей, щелочи и т.д.) на нанокристаллы и выполняет защитную функцию, предохраняя НАФ от воздействия биологической среды. Методика модификации НАФ амфифильными полимерами приведена в опубликованной нами работе [6]. Для снижения неспецифической сорбции белков крови на

ПЭГ-ДГЭ

Рис. 2. Схематическое

изображение

полимер-

модифицированной апконвертирующей наночастицы; ПЭГ-ДГЭ -

диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля, ПМАО -чередующийся сополимер малеинового ангидрида и октадецена

ПМАО

поверхности полимер-модифицированных ап-конвертирующих наночастиц был использован сшивающий агент диглицидиловый эфир полиэтиленгликоля (ПЭГ-ДГЭ), который позволил создать дополнительную внешнюю оболочку из цепей полиэтиленгликоля (рис. 2).

Оценка времени нахождения апконвертирующих наночастиц в кровотоке

Для оценки времени нахождения наночастиц в кровотоке экспериментальных животных были использованы мыши линии Balb/с (массой 20-25 г). Внутривенно (в ретроорбитальный синус) вводилось 0,15 мл 0,2% раствора наночастиц в фосфатно-солевом буфере. После внутривенной инъекции НАФ в течение 180 минут контролировалось содержание наночастиц в крови. Образцы крови для контроля брались из хвостовой вены мыши. Капля свежей крови наносилась на предметное стекло, отступая 1-2 см от края; когда она равномерно растекалась, быстрым движением шлифованного стекла под углом 35-40° делался мазок, который затем накрывался предметным стеклом. Подготовленные таким образом препараты крови исследовались с помощью разработанного нами апконверсионного люминесцентного микроскопа. Чувствительность регистрации позволяла детектировать единичные маркеры. Количество наночастиц в единице объема образца крови подсчитывалось по полученным с ап-конверсионного люминесцентного микроскопа микрофотографиям. Для уменьшения ошибки анализ каждого образца проводился в четырех различных точках.

Опухолевая модель

Прижизненная визуализация опухоли с применением НАФ была продемонстрирована на модели карциномы Льюиса (LLC) из банка опухолевых штаммов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Клетки LLC получали от ранее перевитых мышей, измельчая ткань опухоли в среде DMEM (Gibco). 0,2 мл клеточной суспензии, содержащей 2 х 106 опухолевых клеток, прививали мышам линии BDF1 (питомник «Столбовая»). Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. При достижении опухолью объема 200 мм3 животным вводили 0,15 мл 0,2% раствора наночастиц в фосфатно-солевом буфере. Для визуализации с исследуемой области удаляли волосяной покров. Эпилюминесцентные изображения регистрировались в течение 180 минут после инъекции наночастиц. Отдельные изображения

Б

9

8

Рочева В.В., Шолина Н.В., Деревяшкин С.П., Генералова А.Н., Нечаев А.В., Хоченков Д.А., Семчишен В.А., Хайдуков Е.В., Степанова Е.В., Панченко В.Я. Люминесцентная диагностика опухолей с применением апконвертирующих наночастиц

опухоли были получены post mortem через 2 часа после инъекции наночастиц.

Система визуализации апконвертирующих наночастиц в малых животных Система визуализации апконвертирующих наночастиц в малых животных (рис. 3) разработана в ИПЛИТ РАН и описана в работе [16]. Луч от непрерывного полупроводникового лазера на длине волны 975 нм сканируется согласно заданной программе по поверхности исследуемого объекта. Сканирование реализовано с применением сканирующей головки с зеркалами на гальванических драйверах Miniscan-07 фирмы Raylase (Германия). Система позволяет программно задавать область и траекторию сканирования. Плотность мощности в лазерном луче ограничивалась физиологически разрешенным уровнем и не превышала 1 Вт/см2. Экспериментально установлено, что данная плотность мощности лазерного излучения является приемлемой и не вызывает ожогов кожных покровов у малых животных. Детектирование сигнала фотолюминесценции маркированной НАФ области осуществлялось цифровой EMCCD камерой с электронным умножением Falcon фирмы Raptor (Ирландия), оснащенной объективом с числовой апертурой 0,95. Перед объективом устанавливались интерференционные светофильтры Semrock, отсекающие рассеянное излучение возбуждающего лазера.

Результаты и обсуждение

Получены стабильные водные коллоиды нано-частиц, покрытых амфифильным полимером, способные сохранять первичные размеры в течение как минимум месяца. Измерения размеров наночастиц после реакции поверхностной модификации и по истечении месяца показали, что относительная фракция агрегатов остается

Рис. 3.

Принципиальная схема системы визуализации апконвертирующих наночастиц в малых животных:

1 - лазер, 2 - зеркала сканирующей системы, 3 - БМССй камера, 4 - фильтр. Луч от непрерывного полупроводникового лазера X = 975 нм сканирует

исследуемый объект.

Детектирование

сигнала

фотолюминесценции

маркированной

области

осуществляется цифровой БМССй камерой с использованием интерференционных фильтров для отсечения возбуждающего излучения лазера

4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

незначительной и не превышает 10%. На рис. 4 выборочно представлены микрофотографии образцов крови, полученные с помощью разработанного нами апконверсионного люминесцентного микроскопа, и экспериментальная зависимость, количественно описывающая изменение концентрации наночастиц в кровотоке, начиная с 1-й минуты после введения препаратов на основе НАФ с различным покрытием.

Согласно полученным данным, НАФ, не имеющие покрытия ПЭГ-ДГЭ, быстро удаляются из системы кровообращения (почти 15-кратные потери в первые 3 минуты). Наночастицы, как правило, удаляются из кровотока благодаря ре-тикуло-эндотелиальной системе - в основном клетками Купфера в печени, а также макрофагами селезенки и почек, что приводит к их накоплению в этих органах и, соответственно, снижению концентрации НАФ в крови [10]. Покрывая частицы ПЭГ-ДГЭ, мы снижаем их адсорбцию белками крови и фагоцитоз макрофагами, что продлевает их свободную циркуляцию [11]. Использование дополнительной оболочки из ПЭГ-ДГЭ позволило снизить неспецифическое взаимодействие нано-частиц с белками крови и тем самым увеличить время их циркуляции в кровотоке малых животных до 1 часа. Увеличение времени циркуляции наночастиц в кровотоке способствует их накоплению в опухоли. НАФ с длительным временем пребывания в кровотоке пронизывают опухолевые сосуды и из-за отсутствия эффективного

9 ПМАО ПЭГ-ДГЭ ПМАО

• ч.

0 5 10 15 20 25 30 Время, минуты

Рис. 4. Зависимость изменения концентрации наночастиц от времени циркуляции наночастиц в кровотоке мыши начиная с 1-й минуты после введения препарата. Сплошная кривая - наночастицы с покрытием чередующимся сополимером малеинового ангидрида и октадецена (ПМАО), пунктирная кривая - наночастицы ПМАО с дополнительной оболочкой диглицидилового эфира полиэтиленгликоля (ПЭГ-ДГЭ). На вставке даны микрофотографии с апконверсионного люминесцентного микроскопа, демонстрирующие люминесценцию апконвертирующих наночастиц в образцах крови на 10-й минуте после введения. Исходная концентрация вводимых наночастиц одинакова. Размер наночастиц и их фотолюминесцентные свойства идентичны

Рис. 5. Демонстрация эффективности маркирования опухоли апконвертирующими наночастицами. Изображения получены in vivo через 1 час после инъекции наночастиц. Эпилюминесцентный сигнал от апконвертирующих наночастиц (А), светлопольное изображение мыши (Б), наложение эпилюминесцентного сигнала со светлопольной фотографией (В). Эпилюминесцентный сигнал от фотолюминесцентных апконвертирующих наночастиц показан красным цветом

Рис. 6. Фотография среза опухоли (А) и соответствующее люминесцентное изображение (Б). Показано, что накопление наночастиц идет на периферии опухоли, где более развита сосудистая система и меньше интерстициальное давление. Время выведения животного из эксперимента 180 минут

лимфодренажа задерживаются в патологической ткани. На рис. 5 даны изображения мыши, полученные с использованием системы оптической визуализации малых животных, демонстрирующие эффективную прижизненную доставку НАФ в опухоль.

На рис. 6 представлена фотография среза опухоли. Распределение интенсивности по сечению опухоли показывает, что наночастицы преимущественно накапливаются на границе опухоли в непосредственной близости от сосудов. Центральная область опухоли с очагами некроза остается слабо промаркированной наночастица-ми. Контраст люминесцентного сигнала в опухоли по отношению к окружающим тканям составляет не менее 70%.

Заключение

В работе продемонстрирована возможность применения апконвертирующих наночастиц для диагностики злокачественных новообразований еще на стадии формирования сосудистой системы. Синтезированы апконвертирующие наноча-стицы с размером 70-80 нм, со структурой ядро/ оболочка NaYF4:Yb3+:Tm3+/NaYF 4. Наночастицы

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 14-13-01421.

обладают интенсивной полосой фотолюминесценции на длине волны 800 нм при возбуждении излучением на длине волны 975 нм. Длина волны возбуждения и длина волны люминесценции попадают в окно прозрачности биоткани, что позволяет использовать наночастицы для оптической люминесцентной визуализации с глубины до 15 мм. Покрытие гидрофильной оболочкой ПМАО с последующим покрытием ПЭГ-ДГЭ позволило получить биосовместимые нанокомплек-сы с низким неспецифическим взаимодействием частиц и белков плазмы крови. Длительное время нахождения наночастиц в кровотоке имеет решающее значение при пассивной доставке наночастиц в опухоль. На модели эпидермоидной карциномы легкого Льюиса, перевитой мышам, показана прижизненная доставка апконверти-рующих наночастиц в опухоль за счет пассивного EPR-эффекта. Исследования, направленные на получение флуоресцентных изображений опухолей in vivo с использованием апконвертирующих наночастиц в качестве флуоресцентных меток, пока ограничиваются экспериментальными животными, однако очевидны перспективы их применения для диагностики опухолей человека. ф

Литература

1. Renton SC, Gazet JC, Ford HT, Corbishley C, Sutcliffe R. The importance of the resection margin in conservative surgery for breast cancer. Eur J Surg Oncol. 1996;22(1):17-22.

2. Schiller DE, Le LW, Cho BC, Youngson BJ, Mc-Cready DR. Factors associated with negative margins of lumpectomy specimen: potential

use in selecting patients for intraoperative radiotherapy. Ann Surg Oncol. 2008;15(3):833-42.

3. Hadjipavlou AG, Kambin P, Lander PH, Crow WN, Simmons JW. Imaging guided minimally invasive surgery for low back pain sciatica and spinal infection. Journal of Interventional Radiology. 1999;14(1):1-22.

4. van Dam GM, Themelis G, Crane LM, Harlaar NJ, Pleijhuis RG, Kelder W, Sarantopoulos A, de Jong JS, Arts HJ, van der Zee AG, Bart J, Low PS, Ntziachristos V. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-a targeting: first in-human results. Nat Med. 2011;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472.

Рочева В.В., Шолина Н.В., Деревяшкин С.П., Генералова А.Н., Нечаев А.В., Хоченков Д.А., Семчишен В.А., Хайдуков Е.В., Степанова Е.В., Панченко В.Я. Люминесцентная диагностика опухолей с применением апконвертирующих наночастиц

5. Nadort A, Sreenivasan VK, Song Z, Grebe-nik EA, Nechaev AV, Semchishen VA, Panchen-ko VY, Zvyagin AV. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013;8(5):e63292. doi: 10.1371/journal.pone.0063292.

6. Grebenik EA, Nadort A, Generalova AN, Nechaev AV, Sreenivasan VK, Khaydukov EV, Semchishen VA, Popov AP, Sokolov VI, Akhmanov AS, Zubov VP, Klinov DV, Panchen-ko VY, Deyev SM, Zvyagin AV. Feasibility study of the optical imaging of a breast cancer lesion labeled with upconversion nanoparticle biocomplexes. J Biomed Opt. 2013; 18(7) :76004. doi: 10.1117/1.JB0.18.7.076004.

7. Tromberg BJ, Shah N, Lanning R, Cerussi A, Es-pinoza J, Pham T, Svaasand L, Butler J. Noninvasive in vivo characterization of breast tumors using photon migration spectroscopy. Neoplasia. 2000;2(1-2):26-40. doi: 10.1038/ sj.neo.7900082.

8. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparti-cles: theory to practice. Pharmacol Rev. 2001;53(2):283-318.

References

1. Renton SC, Gazet JC, Ford HT, Corbishley C, Sutcliffe R. The importance of the resection margin in conservative surgery for breast cancer. Eur J Surg Oncol. 1996;22(1):17-22.

2. Schiller DE, Le LW, Cho BC, Youngson BJ, Mc-Cready DR. Factors associated with negative margins of lumpectomy specimen: potential use in selecting patients for intraoperative radiotherapy. Ann Surg Oncol. 2008;15(3): 833-42.

3. Hadjipavlou AG, Kambin P, Lander PH, Crow WN, Simmons JW. Imaging guided minimally invasive surgery for low back pain sciatica and spinal infection. Journal of Interventional Radiology. 1999;14(1):1-22.

4. van Dam GM, Themelis G, Crane LM, Har-laar NJ, Pleijhuis RG, Kelder W, Sarantopou-los A, de Jong JS, Arts HJ, van der Zee AG, Bart J, Low PS, Ntziachristos V. Intraoperative tumor-specific fluorescence imaging in ovarian cancer by folate receptor-a targeting: first in-human results. Nat Med. 2011;17(10):1315-9. doi: 10.1038/nm.2472.

5. Nadort A, Sreenivasan VK, Song Z, Grebe-nik EA, Nechaev AV, Semchishen VA, Panchen-ko VY, Zvyagin AV. Quantitative imaging of single upconversion nanoparticles in biological tissue. PLoS One. 2013;8(5):e63292. doi: 10.1371/journal.pone.0063292.

6. Grebenik EA, Nadort A, Generalova AN, Nechaev AV, Sreenivasan VK, Khaydukov EV, Semchishen VA, Popov AP, Sokolov VI, Akhmanov AS, Zubov VP, Klinov DV, Panchen-ko VY, Deyev SM, Zvyagin AV. Feasibility study

9. Maeda H. Macromolecular therapeutics in cancer treatment: the EPR effect and beyond. J Control Release. 2012;164(2):138-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2012.04.038.

10. Matsumura Y, Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 1986;46(12 Pt 1):6387-92.

11. Wu J, Akaike T, Maeda H. Modulation of enhanced vascular permeability in tumors by a bradykinin antagonist, a cyclooxygenase inhibitor, and a nitric oxide scavenger. Cancer Res. 1998;58(1):159-65.

12. Cole AJ, David AE, Wang J, Galban CJ, Yang VC. Magnetic brain tumor targeting and biodistribution of long-circulating PEG-modified, cross-linked starch-coated iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 2011;32(26):6291-301. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.05.024.

13. Noguchi Y, Wu J, Duncan R, Strohalm J, Ul-brich K, Akaike T, Maeda H. Early phase tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearance rate between tumor and normal tissues. Jpn J Cancer Res. 1998;89(3):307-14.

of the optical imaging of a breast cancer lesion labeled with upconversion nanoparticle biocomplexes. J Biomed Opt. 2013; 18(7):76004. doi: 10.1117/1.JB0.18.7.076004.

7. Tromberg BJ, Shah N, Lanning R, Cerussi A, Es-pinoza J, Pham T, Svaasand L, Butler J. Noninvasive in vivo characterization of breast tumors using photon migration spectroscopy. Neoplasia. 2000;2(1-2):26-40. doi: 10.1038/ sj.neo.7900082.

8. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long-circulating and target-specific nanoparti-cles: theory to practice. Pharmacol Rev. 2001;53(2):283-318.

9. Maeda H. Macromolecular therapeutics in cancer treatment: the EPR effect and beyond. J Control Release. 2012;164(2): 138-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2012.04.038.

10. Matsumura Y, Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 1986;46(12 Pt 1):6387-92.

11. Wu J, Akaike T, Maeda H. Modulation of enhanced vascular permeability in tumors by a bradykinin antagonist, a cyclooxygenase inhibitor, and a nitric oxide scavenger. Cancer Res. 1998;58(1):159-65.

12. Cole AJ, David AE, Wang J, Galban CJ, Yang VC. Magnetic brain tumor targeting and biodistribution of long-circulating PEG-modified, cross-linked starch-coated iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 2011;32(26):6291-301. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.05.024.

14. Cabral H, Matsumoto Y, Mizuno K, Chen Q, Murakami M, Kimura M, Terada Y, Kano MR, Mi-yazono K, Uesaka M, Nishiyama N, Kataoka K. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nat Nanotechnol. 2011;6(12):815-23. doi: 10.1038/nnano.2011.166.

15. Khaydukov EV, Semchishen VA, Semino-gov VN, Sokolov VI, Popov AP, Bykov AV, Nechaev AV, Akhmanov AS, Panchenko VYa, Zvyagin AV. Enhanced spatial resolution in optical imaging of biotissues labelled with upconversion nanoparticles using a fibre-optic probe scanning technique. Laser Phys Lett. 2014;11 (9):095602. dx.doi.org/10.1088/1612-2011/11/9/095602.

16. Хайдуков ЕВ, Рочева ВВ, Семчишен ВА, Семиногов ВН, Соколов ВИ, Звягин АВ, Ахманов АС, Панченко ВЯ, Нечаев АВ, Генералова АН, Шехтер АБ. Оптическая визуализация опухолевых тканей с применением антистоксовых наночастиц. Вестник Российского фонда фундаментальных исследований. 2014;(4):7-17.

13. Noguchi Y, Wu J, Duncan R, Strohalm J, Ul-brich K, Akaike T, Maeda H. Early phase tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearance rate between tumor and normal tissues. Jpn J Cancer Res. 1998;89(3):307-14.

14. Cabral H, Matsumoto Y, Mizuno K, Chen Q, Murakami M, Kimura M, Terada Y, Kano MR, Mi-yazono K, Uesaka M, Nishiyama N, Kataoka K. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nat Nanotechnol. 2011;6(12):815-23. doi: 10.1038/nnano.2011.166.

15. Khaydukov EV, Semchishen VA, Semino-gov VN, Sokolov VI, Popov AP, Bykov AV, Nechaev AV, Akhmanov AS, Panchenko VYa, Zvyagin AV. Enhanced spatial resolution in optical imaging of biotissues labelled with upconversion nanoparticles using a fibre-optic probe scanning technique. Laser Phys Lett. 2014;11 (9):095602. dx.doi.org/10.1088/1612-2011/11/9/095602.

16. Khaydukov EV, Rocheva VV, Semchishen VA, Seminogov VN, Sokolov VI, Zvyagin AV, Akhmanov AS, Panchenko VYa, Nechaev AV, Generalova AN, Shekhter AB. Opticheskaya vizualizatsiya opukholevykh tkaney s prime-neniem antistoksovykh nanochastits [Applications of upconversion nanoparticles in optical bioimaging of the tumor tissue]. Vest-nik Rossiyskogo fonda fundamental'nykh issledovaniy [RFBR Journal]. 2014;(4):7-17 (in Russian).

Luminescence diagnostics of tumors with upconversion nanoparticles

Rocheva V.V.1 • Sholina N.V.1- 2 • Derevyashkin S.P.1 • Generalova A.N.1- 3 • Nechaev A.V.1- 4 • Khochenkov D.A.1-2 • Semchishen V.A.1 • Khaydukov E.V.1 • Stepanova E.V.2 • Panchenko V.Ya.1

Background: To improve quality of surgery in oncology, it is necessary to completely remove the tumor, including its metastases, to minimize injury to normal tissues and to reduce duration of an intervention. Modern methods of detection based on radiological computerized tomography and magnetic resonance imaging can identify a tumor after its volume has become big enough, i.e. it contains more than 10 billion cells. Therefore, an improvement of sensitivity and resolution ability of diagnostic tools to identify early stages of malignant neoplasms seems of utmost importance. Aim: To demonstrate the potential of a new class of anti-Stokes luminescence nanoparticles for deep optical imaging with high contrast of malignant tumors. Materials and methods: Upconversion nanoparticles with narrow dispersion and a size of 70 to 80 nm, with a core/shell structure of NaYF4:Yb3+:Tm3+/NaYF4 were used in the study. The nanoparticles have an intensive band of anti-Stokes photoluminescence at a wavelength of 800 nm under irradiation with a wavelength of 975 nm (both wavelengths are within the transparency window for biological tissues). The conversion coefficient of the excitation radiation into the anti-Stokes luminescence was 9%. To increase the time during which nanoparticles can circulate in blood flow of small animals, the nanoparticles were covered by a biocompatible amphiphilic polymer shell. As a tumor model we used Lewis epidermoid carcinoma transfected

to mice. Results: We were able to obtain stable water colloids of nanoparticles covered with amphiphilic polymer that could preserve their initial size at least for one month. The use of upconversion nanoparticles with a hydrophilic shell made of intermittent maleic anhydride and octadecene co-polymer with subsequent coating with digly-cidyl polyethylene glycol ether allowed for reduction of non-specific reaction of nanoparticles with plasma proteins. In its turn, it resulted in an increased time of their circulation in blood flow of small animals for up to 1 hour. With the Lewis lung carcinoma transfected to mice model we demonstrated an in-life transportation of upconversion nanoparticles into the tumor with a high degree of localization due to a passive EPR effect. The contrast of luminescent signal in the tumor compared to adjacent tissues was at least 70%. The possibility of visualization of upconverted nanoparti-cles up to 15 mm of biological tissue was shown. Conclusion: The optical imaging techniques with anti-Stokes photoluminescent markers ensure a high contract real-time detection of tumor tissues that allows for their use for intra-operative diagnostics.

Key words: upconverted nanoparticles, optical luminescence imaging, intraoperative assessment of tumor borders

doi: 10.18786/2072-0505-2016-44-2-227-233

Rocheva Vasilina V. - PhD Student, Junior Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1

Sholina Nataliya V. - Junior Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1; Junior Research Fellow, Laboratory of Biomarkers and Mechanisms of Tumor Angiogenesis, Research Institute of Experimental Diagnostics and Tumor Therapy2

Derevyashkin Sergey P. - Research Laboratorian, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1

Generalova Alla N. - PhD (in Chemistry), Senior Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1; Senior Research Fellow, Polymers for Biology Laboratory3 Nechaev Andrey V. - PhD (in Chemistry), Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1; Associate Professor, Chair of Chemistry and Technology of Synthetic Biologically Active Substances4 Khochenkov Dmitriy A. - PhD (in Biology), Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1; Research Fellow, Laboratory of Biomarkers and Mechanisms of Tumor Angiogenesis, Research Institute of Experimental Diagnostics and Tumor Therapy2

Semchishen Vladimir A. - PhD (in Physics and Mathematics), Leading Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1

Khaydukov Evgeniy V. - PhD (in Physics and Mathematics), Senior Research Fellow, Laboratory for Nonlinear Optics of Surface and Laser-Plasma Processes, Advanced Laser Technologies Division1 * 1 Svyatoozerskaya ul., Shatura, Moskovskaya oblast', 140700, Russian Federation. Tel.: +7 (495) 851 08 40. E-mail: khaydukov@mail.ru Stepanova Evgeniya V. - MD, PhD, Leading Research Fellow, Laboratory of Biomarkers and Mechanisms of Tumor Angiogenesis, Research Institute of Experimental Diagnostics and Tumor Therapy2

Panchenko Vladislav Ya. - PhD (in Physics and Mathematics), Academician of Russian Academy of Sciences, Professor, Director1

1 Institute of Laser and Information Technologies of the Russian Academy of Sciences;

1 Svyatoozerskaya ul., Shatura, Moskovskaya oblast, 140700, Russian Federation

2 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russian Federation

3 Shemyakin - Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences; 16/10 Miklukho-Maklaya ul., Moscow, 117997, Russian Federation

4 Lomonosov Moscow University of Fine Chemical Technology; 86 Prospekt Vernadskogo, Moscow, 119571, Russian Federation