САМООРГАНИЗУЮЩИЕСЯ ПЕПТИДНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ, ПОЛЕЗНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН
SELF-ASSEMBLING PEPTIDE NANOPARTICLES EFFECTIVE AS VACCINES

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к самоорганизующимся пептидным наночастицам, содержащим эпитопы В-клеток и/или эпитопы Т-клеток. Кроме того, изобретение относится к применению таких наночастиц для вакцинации.
Предпосылки создания изобретения
Адаптивная иммунная система имеет два различных вида ответа, гуморальный иммунный ответ и клеточный иммунный ответ. Первый характеризуется антителогенезом, при котором такие антитела связываются с поверхностными эпитопами патогенов, в то время как последний характеризуется цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), которые уничтожают инфицированные клетки. Оба вида иммунного ответа дополнительно стимулируются клетками Т-хелперов, которые активируют либо В-клетки, которые вырабатывают специфические антитела, связывающие патоген, либо Т-клетки, которые являются направленными против инфицированных Т-клеток.
Специфичность взаимодействия между антителами, которые вырабатываются В-клетками, и патогеном определяется поверхностными структурами патогена, так называемыми эпитопами В-клеток, в то время как специфичность взаимодействия CTL с инфицированными клетками-мишенями осуществляется с помощью эпитопов Т-клеток, которые презентируются на поверхностных молекулах целевой клетки, так называемых молекулах класса I основного комплекса гистосовместимости (МНС I). Этот тип эпитопов Т-клеток (CTL эпитопы) представляет собой фрагменты белков из патогена, которые продуцируются инфицированной клеткой. В завершение, специфичность взаимодействия клеток Т-хелперов с соответствующей В-клеткой или CTL определяется связыванием рецепторных молекул Т-хелперных клеток с другим типом эпитопов Т-клеток (HTL эпитопами), которые презентируются классом II молекул МНС (МНС II) на В-клетках или CTL-клетках.
Связывание антитела с эпитопами В-клеток требует, чтобы эпитоп В-клетки приобретал определенную пространственную структуру, такую же структуру, что и та, которую эпитоп В-клетки имеет в естественной среде, то есть, тогда, когда он находится на поверхности патогена. Эпитоп В-клетки может состоять более чем из одной пептидной цепи и является организованным в пространственную структуру с помощью каркасной структуры белка.
Эпитопы Т-клеток, однако, не требуют наличия определенной пространственной структуры, предпочтительнее они связываются с соответствующей молекулой МНС I или МНС II весьма специфическим образом. Эпитопы CTL урезаются до размера 9 аминокислот в длину для оптимальной презентации молекулами МНС I, в то же время HTL эпитопы осуществляют подобное взаимодействие с молекулами МНС II, но могут быть длиннее, чем 9 аминокислот. В контексте данного изобретения является важным, что связывание эпитопов с молекулами МНС соответствует весьма простым правилам, то есть, только пептиды со специфическими характеристиками будут способными связываться с соответствующей молекулой МНС и, таким образом, являются полезными в качестве эпитопов. Эти характеристики были тщательно исследованы и на основе известных ценных эпитопов, были также разработаны программы прогнозирования, которые являются способными предсказывать с высокой точностью эпитопы, способные связываться с молекулами МНС. Пептидные цепочки, состоящие из нескольких таких эпитопов Т-клеток в линейной пептидной цепи, в настоящее время были сконструированы в качестве кандидатных вакцин.
В общем случае эффективная вакцина должна индуцировать сильный гуморальный, а также сильный клеточный иммунный ответ. Было продемонстрировано, что сильный гуморальный иммунный ответ может быть достигнут с помощью повторяемого антигенного дисплея эпитопов В-клеток. Вирусоподобные частицы (VLP) могут использоваться в качестве эффективного средства для презентации эпитопов В-клеток регулярным, повторяемым и жестким образом, и, таким образом, VLP в настоящее время широко используются для вакцинных конструкций. Другой подход для повторяемого антигенного дисплея был описан в патенте ЕР 1594469 В1. В этом патенте были сконструированы самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN), состоящие из тримерных и пентамерных белковых доменов олигомеризации, которые повторяемым образом демонстрируют эпитопы В-клеток на своей поверхности. Эпитопы В-клеток присоединяли на конце доменов олигомеризации для гарантии того, что эпитопы В-клеток являются презентированными на поверхности наночастиц в виде многочисленных копий. Один из наиболее часто встречающихся фрагментов олигомеризации белка представляет собой биспиральный структурный фрагмент, и этот фрагмент может эффективно использоваться для конструирования таких SAPN.
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение относится к самоорганизующимся пептидным наночастицам (SAPN), включающим эпитопы Т-клеток и/или эпитопы В-клеток. В частности, наночастицы в соответствии с изобретением состоят из агрегатов беспрерывной пептидной цепи, включающей два домена олигомеризации, связанные с помощью линкерного сегмента, где один или два домена олигомеризации имеют биспиральную структуру, которая включает эпитопы Т-клеток и/или эпитопы В-клеток в своей пептидной последовательности.
Изобретение также относится к способу вакцинации людей или животных, отличных от человека, при использовании таких самоорганизующихся пептидных наночастиц, включающих эпитопы Т-клеток и/или эпитопы В-клеток.
Краткое описание чертежей
Фигура 1: Структура мышиной МНС II молекулы I-Ad, ковалентно связанной с овальбуминовым пептидом (OVA323-339), который представляет собой HTL эпитоп для I-Ad. MHC II белок показан от вершины С-альфа линии серым цветом. Две спирали, образующие стенки сайтов связывания эпитопа, являются фланкирующими для пептида связывания. Пептид представлен шаростержневой моделью со всеми атомами черным цветом. Пептидный HTL эпитоп в своей связанной форме находится в растянутой конформации, как может быть более четко видно с использованием структуры только одного пептида в нижней части фигуры.
Фигура 2: Схематический рисунок "выровненных единиц" для тримерных и пентамерных доменов олигомеризации [с левой стороны, А)] тримерного и тетрамерного доменов олигомеризации [с правой стороны, В)], соответственно. Количество мономеров (строительные блоки) определяется наименьшим значением общего кратного (LCM) состояний олигомеризации двух доменов олигомеризации D1 и D2 строительных блоков. В выровненных единицах линкерные сегменты всех строительных блоков будут располагаться так близко друг к другу, насколько это является возможным, то есть настолько близко к центру пептидной наночастицы, насколько это является возможным и, таким образом, выровненные единицы подвергаться самосборке (самоорганизации) с образованием сферической наночастицы.
Фигура 3: Элементы внутренней симметрии додекаэдра/икосаэдра. Оси вращательной симметрии (двойная, тройная и пятикратная) показаны в виде линий, обозначенных как 2, 3 и 5. В А) мономерного строительного блока, состоящего из доменов олигомеризации D1 (слева, биспиральный домен с тройной симметрией), линкерного сегмента L (внизу) и домена олигомеризации D2 (справа; биспиральный домен с пятикратной симметрией), показаны так, что элементы внутренней симметрии доменов олигомеризации D1 и D2 накладываются на элементы симметрии многогранника. В В) демонстрируются полные биспиральные домены D1 и D2. Дополнительные объекты симметрии, полученные с помощью элементов тройной и пятикратной вращательной симметрии многогранника, демонстрируются в виде цилиндров, в то время, как исходная молекула демонстрируется как спираль, как представлено в А).
Фигура 4: Динамическое рассеяние света (DLS, А) и просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ, В) самоорганизующихся пептидных наночастиц, образованных из пептидов с последовательностью SEQ ID NO:8, Пример 1. DLS анализ показывает распределение размеров со средним диаметром частицы 32,01 нм и индексом полидисперсности 12,9% (А). ТЕМ изображения (В) показывают наночастицы того же размера, как и определено с помощью DLS.
Фигура 5: Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) самоорганизующихся пептидных наночастиц, образованных из пептидов с последовательностью SEQ ID NO:10, Пример 2. ТЕМ изображения показывают наночастицы с размером 25 нм.
Фигура 6: Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) самоорганизующихся пептидных наночастиц, образованных из пептидов с последовательностью SEQ ID NO:12, Пример 3. ТЕМ изображения показывают наночастицы с размером приблизительно от 20 до 30 нм.
Фигура 7: Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) самоорганизующихся пептидных наночастиц, образованных из пептидов с последовательностями SEQ ID NO:37 (полоска А) и SEQ ID NO:38 (полоска В), для вакцины против гриппа для человека и кур соответственно (Пример 9). ТЕМ изображения показывают наночастицы с размером приблизительно 25 нм.
Фигура 8: Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ) самоорганизующихся пептидных наночастиц, образованных из пептидов с последовательностью SEQ ID NO:41, Пример 11. ТЕМ изображения показывают наночастицы с размером приблизительно 25 нм.
Подробное описание изобретения
Мономерные строительные блоки
Самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN) образуются из совокупности мономерных строительных блоков формулы (I), состоящих из беспрерывной цепи, включающей пептидный домен олигомеризации D1, линкерный сегмент L и пептидный домен олигомеризации D2
,
m
n
где D1 представляет собой синтетический или природный пептид, обладающий тенденцией к образованию олигомеров (D1) m субъединиц D1, D2 представляет собой синтетический или природный пептид, обладающий тенденцией к образованию олигомеров (D2) n субъединиц D2, m и n каждый представляет собой цифру от 2 до 10, при условии, что m не является равным n и не является кратным n, а n не является кратным m, L представляет собой связь или короткую линкерную цепь, выбранную из необязательно замещенных атомов углерода, необязательно замещенных атомов азота, атомов кислорода, атомов серы и их комбинаций; либо D1, либо D2, либо оба D1 и D2 являются биспиральными и включают один или более эпитопов Т-клеток и/или эпитоп В-клеток в рамках домена олигомеризации и где D1, D2 и L являются необязательно дополнительно замещенными.
Пептид (или полипептид) представляет собой цепочку или последовательность аминокислот, ковалентно связанных с помощью амидных связей. Пептид может быть природным, природным модифицированным, частично синтетическим или полностью синтетическим. Под природным модифицированным, частично синтетическим или полностью синтетическим понимают тот, который не существует в природе. Термин аминокислота охватывает как существующие в природе аминокислоты, выбранные из 20 эссенциальных природных α-L-аминокислот, синтетических аминокислот, таких как α-D-аминокислоты, 6-аминогексановая кислота, норлейцин, гомоцистеин, или подобные им, а также существующие в природе аминокислоты, которые были модифицированы определенным путем для изменения некоторых свойств, таких, как заряд, например, такие, как фосфосерин или фосфотирозин, или подобные им. В производных аминокислот аминогруппа, образующая амидную связь, является алкилированной, или боковая цепь аминогруппы, группы гидрокси или тиогруппы является алкилированной или ацилированной, или боковая цепь группы карбокси является амидированной или эстерифицированной.
Короткая линкерная цепь L является выбранной из необязательно замещенных атомов углерода, необязательно замещенных атомов азота, атомов кислорода, атомов серы и их комбинаций, предпочтительно содержащих 1-60 атомов, в частности, 1-20 атомов в цепи. Такая короткая линкерная цепь представляет собой, например, цепь полиэтиленокси, цепь сахара или, предпочтительно, пептидную цепь, например, пептидную цепь, состоящую из 1-20 аминокислот, в частности, 1-6 аминокислот.
m и n каждый представляет собой число от 2 до 10, при условии, что m не является равным n и не является кратным n, а n не является кратным m. Предпочтительные комбинации m и n представляют собой комбинации, где m равно 2, а n равно 5, или m равно 3, а n равно 4 или 5, или m равно 4, а n равно 5. Кроме того, предпочтительными комбинациями m и n являются комбинации, в которых m равно 5, а n равно 2, или m равно 4 или 5, а n равно 3, или m равно 5, а n равно 4. Наиболее предпочтительными являются комбинации, в которых m или n равно 5.
Биспиральная нить представляет собой пептидную последовательность с беспрерывной моделью в основном гидрофобных остатков с интервалом в 3 и 4 остатка, которая подвергается самоорганизации с образованием мультимерной группы спиралей, как более подробно объясняется в данной заявке ниже.
"Биспиральная нить, которая включает эпитопы Т-клеток и/или В-клеток" означает, что соответствующий эпитоп является включенным в домен олигомеризации так, что аминокислотные последовательности на N-терминальном и C-терминальном концах эпитопа заставляют эпитоп адаптироваться к конформации, которая все еще является биспиральной наряду со свойствами олигомеризации домена олигомеризации, включающего эпитоп. В частности, "встроенный" исключает случай, когда эпитоп является присоединенным к любому концу биспирализованного домена олигомеризации.
В контексте этого документа термин эпитопы Т-клеток будет использоваться для отнесения как к СТ, так и HTL эпитопам.
Эпитопы Т-клеток связываются с МНС молекулами в растянутой конформации (Фигура 1). Таким образом, включение эпитопов Т-клеток в α-спиральную биспирализованную нить (сравни Фигуру 3А и Фигуру 1) не является обычной задачей белковой инженерии. В данном изобретении продемонстрировано, как эти пептидные последовательности, которые имеют растянутую конформацию, когда связываются с соответствующими молекулами МНС, могут, несмотря на это, встраиваться в α-спиральный биспирализованный домен олигомеризации.
Необязательные заместители D1, D2 и L представляют собой, например, эпитопы В-клеток, нацеливающие остатки или заместители, усиливающие адъювантные свойства наночастицы, такие, как иммуностимуляторная нуклеиновая кислота, предпочтительно, олигодезоксинуклеотид, содержащий дезоксиинозин, олигодезоксинуклеотид, содержащий дезоксиуридин, олигодезоксинуклеотид, содержащий фрагмент CG, или молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую инозин и цитидин. Другие заместители, усиливающие адъювантные свойства наночастицы, представляют собой антимикробные пептиды, такие, как катионные пептиды, представляющие собой класс иммуностимуляторных, позитивно заряженных молекул, которые могут способствовать и/или улучшать адаптивный иммунный ответ. Пример такого пептида с иммунопотенциирующими свойствами представляет собой позитивно заряженный искусственный антимикробный пептид KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:63), который индуцирует сильный адаптивный иммунитет, запускаемый специфическим белком типа 2, после иммунизации на основе первичной вакцинации - вторичной прививки (бустеризации). Специфическим нацеливающим остатком считается заместитель, который представляет собой ER-нацеливающий сигнал, то есть, сигнальный пептид, который индуцирует транспорт белка или пептида к эндоплазматическому ретикулуму (ER). Другие необязательные заместители представляют собой, например, ацильную группу, например, ацетил, связанную с аминогруппой, в частности, с N-терминальной аминокислотой, или связь амино со свободной группой карбокси C-терминальной аминокислоты с образованием карбоксамидной группы.
Необязательные заместители, например, те необязательные заместители, которые описаны в данной заявке выше, являются предпочтительно соединенными с приемлемыми аминокислотами ближе к свободному концу домена олигомеризации D1 и/или D2. При самосборке пептидной наночастицы такие заместители будут присутствовать на поверхности SAPN.
В наиболее предпочтительном воплощении заместитель имеет другую пептидную последовательность S1 и/или S2, представляющую собой простое удлинение пептидной цепи D1 - L - D2 на любом из концов или на обоих концах для получения одной комбинированной пептидной последовательности любой из форм S1 - D1 - L - D2, D1 - L - D2 - 82 или S1 - D1 - L - D2 - S2, где S1 и S2 представляют собой пептидные заместители, как определено в данной заявке выше и ниже. Заместители S1 и/или S2 считаются такими, которые предназначены для удлинения последовательности D1 - L - D2 SAPN. Любая такая пептидная последовательность S1 - D1 - L - D2, D1 - L - D2 - S2 или S1 - D1 - L - D2 - S2 может экспрессироваться в рекомбинантной системе экспрессии белка в виде одной молекулы.
Предпочтительный заместитель S1 и/или S2 представляет собой эпитоп В-клетки. Другие рассматриваемые эпитопы В-клеток представляют собой гаптеновые молекулы, такие, как углевод или никотин, которые также присоединяются к концу доменов олигомеризации D1 и/или D2, и, таким образом, будут представляться на поверхности SAPN.
Очевидно, является также возможным присоединять более одного заместителя к доменам олигомеризации D1 и/или D2. Например, рассматривая пептидную последовательность S1 - D1 - L - D2 - S2, можно сказать, что к ней может быть ковалентно присоединен другой заместитель, предпочтительно, в положении, отдаленном от линкерного сегмента L, либо ближе к концам D1 и/или D2, либо где-либо в заместителях S1 и/или S2.
Является также возможным присоединять заместитель к линкерному сегменту L. В этом случае при сборке SAPN заместитель будет располагаться во внутренней полости SAPN.
Тенденция к образованию олигомеров означает, что такие пептиды могут образовывать олигомеры в зависимости от условий, например, при условиях денатурации они могут представлять собой мономеры, в то время, как при физиологических условиях они могут образовывать, например, тримеры. При предварительно определенных условиях они приобретают одно единственное состояние олигомеризации, которое является необходимым для образования наночастиц. Однако их состояние олигомеризации может быть изменено при изменяющихся условиях, например, от димеров до тримеров при увеличивающейся концентрации соли (Burkhard P. и др., Protein Science 2000, 9:2294-2301) или от пентамеров до мономеров при понижении значения рН.
Архитектура строительного блока в соответствии с формулой (I) четко отличается от вирусных капсидных белков. Вирусные капсиды состоят либо из одного единственного белка, который образует 60 олигомеров, либо числа, кратного ему, как например, частицы вируса гепатита В (ЕР 1262555, ЕР 0201416), или более чем из одного белка, который подвергается процессу самоорганизации с образованием вирусного капсида, который может приобретать также другие геометрические структуры, отличные от икосаэдра в зависимости от типа вируса (Fender P. и др., Nature Biotechnology 1997, 15:52-56). Самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN) настоящего изобретения также четко отличаются от вирусоподобных частиц, так как они (а) являются сконструированными из белков, отличных от вирусного капсида, и (b) полость внутри наночастицы является слишком малой для того, чтобы разместить ДНК/РНК цельного вирусного генома.
Пептидные домены олигомеризации являются хорошо известными (Burkhard P. и др., Trends Cell Biol 2001, 11:82-88). Наиболее простой домен олигомеризации, вероятно, представляет собой действительно биспирализованный участок фолдинга. Этот участок олигомеризации был продемонстрирован как такой, который представляет собой димер, тример, тетрамер и пентамер. Некоторые примеры представляют собой GCN4 лейциновую застежку, фибритин, тетрабрахион и СОМР, являющиеся димерными, тримерными, тетрамерными и пентамерными биспиральными нитями, соответственно.
Один или оба домена олигомеризации D1 и D2, независимо друг от друга, являются биспирализованными доменами. Биспирализованная нить представляет собой пептидную последовательность с непрерывной моделью в основном гидрофобных остатков с интервалом в 3 и 4 остатка, обычно последовательность, состоящую из семи аминокислот (семичленный повтор) или одиннадцати аминокислот (одиннадцатичленный повтор), который подвергается самоорганизации (сборке) с образованием мультимерной группы спиралей. Биспирализованные нити с последовательностями, включающими в некоторой степени нерегулярное распределение расположенных 3 и 4 остатков, также предполагаются. Гидрофобные остатки представляют собой, в частности, гидрофобные аминокислоты Val, Ile, Leu, Met, Tyr, Phe и Trp. Преимущественно гидрофобный означает, что, по крайней мере, 50% остатков должно быть выбрано из упомянутых гидрофобных аминокислот.
Например, в предпочтительном мономерном строительном блоке формулы (I) D1 и/или D2 представляет собой пептид любой из формул
где аа означает аминокислоту или ее производную, аа(а), aa(b), aa(c), aa(d), аа(е), aa(f), и аа(g) являются одинаковыми или различными аминокислотами или их производными, предпочтительно аа(а) и aa(d) являются одинаковыми или различными гидрофобными аминокислотами или их производными; а Х представляет собой число от 2 до 20, предпочтительно 3, 4, 5 или 6.
Гидрофобные аминокислоты представляют собой Val, Ile, Leu, Met, Tyr, Phe и Trp.
Семичленный пептид представляет собой гептапептид формулы аа(а)-аа(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g) (IIa) или любую их комбинацию формул от (IIb) до (IIg).
Предпочтительными являются мономерные строительные блоки формулы (I), в которых один или два пептидных домена олигомеризации D1 или D2 представляют собой
(1) пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где Х равен 3, и аа(а) и aa(d) являются выбранными из 20 природных α-L-аминокислот, так, что сумма баллов из Таблицы 1 для этих 6 аминокислот составляет, по крайней мере, 14, и такие пептиды включают вплоть до 17 дополнительных групп из 7 членов; или
(2) пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где Х равен 3, и аа(а) и aa(d) являются выбранными из 20 природных α-L-аминокислот, так, что сумма баллов из Таблицы 1 для этих 6 аминокислот составляет, по крайней мере 12, при условии, что одна аминокислота аа(а) является заряженной аминокислотой, способной к образованию внутриспиральных солевых мостиков с аминокислотой aa(d) или аа(g) соседней семичленной группы, или что одна аминокислота aa(d) является заряженной аминокислотой, способной к образованию внутриспиральных солевых мостиков с аминокислотой аа(а) или аа(е) соседней семичленной группы, и такие пептиды включают вплоть до двух дополнительных семичленных групп. Заряженная аминокислота, способная к образованию внутриспиральных солевых мостиков с аминокислотой соседней семичленной группы, представляет собой, например, Asp или Glu, если другие аминокислоты представляют собой Lys, Arg или His, или наоборот
Таблица 1
Баллы аминокислот для определения предпочтительности
Аминокислота
Положение аа(а)
Положение aa(d)
L (Leu)
3,5
3.8
М (Met)
3,4
3.2
I (Ile)
3,9
3.0
Y (Tyr)
2,1
1,4
F (Phe)
3,0
1.2
V (Val)
4,1
1,1
Q (Gln)
-0,1
0,5
A (Ala)
0,0
0,0
W (Trp)
0,8
-0,1
N (Asn)
0,9
-0,6
H (His)
-1,2
-0,8
Т (Thr)
0,2
-1,2
K (Lys)
-0,4
-1,8
S (Ser)
-1,3
-1,8
D (Asp)
-2,5
-1,8
E (Glu)
-2,0
-2,7
R (Arg)
-0,8
-2,9
G (Gly)
-2,5
-3,6
P (Pro)
-3,0
-3,0
С (Cys)
0,2
-1,2
Также предпочтительными являются мономерные строительные блоки формулы (I), где один или два пептидных домена олигомеризации D1 или D2 являются выбранными из следующих предпочтительных пептидов:
(11) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) является выбранным из Val, Ile, Leu и Met, и их производных, и aa(d) является выбранным из Leu, Met и Ile, и их производных.
(12) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где один аа(а) представляет собой Asn, а другие аа(а) являются выбранными из Asn, Ile и Leu, a aa(d) представляет собой Leu. Такой пептид обычно представляет собой домен димеризации (m или n=2).
(13) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) и aa(d) оба представляют собой Leu или оба являются Ile. Такой пептид обычно представляет собой домен тримеризации (m или n=3).
(14) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) и aa(d) оба представляют собой Trp. Такой пептид обычно представляет собой домен пентамеризации (m или n=5).
(15) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) и aa(d) оба представляют собой Phe. Такой пептид обычно представляет собой домен пентамеризации или домен тетрамеризации (m или n=4 или 5).
(16) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) и aa(d) оба представляют собой либо Trp, либо Phe. Такой пептид обычно представляет собой домен пентамеризации (m или n=5).
(17) Пептид в соответствии с любой из формул (IIa) - (IIg), где аа(а) представляет собой либо Leu, либо Ile, и один aa(d) является Gln, а другие aa(d) являются выбранными из Gln, Leu и Met. Такой пептид потенциально может быть доменом пентамеризации (m или n=5).
Другие предпочтительные пептиды представляют собой пептиды (1), (2), (11), (12), (13), (14), (15), (16) и (17), как определено в данной заявке выше, и где дополнительно (21) по крайней мере, один аа(g) является выбранным из Asp и Glu, а аа(е) в следующей семичленной группе представляет собой Lys, Arg или His; и/или
(22) по крайней мере, один аа(g) является выбранным из Lys, Arg и His, а аа(е) в следующей семичленной группе представляет собой Asp или Glu, и/или
(23) по крайней мере, один аа(а - g) является выбранным из Lys, Arg и His, a аа(а - g) с интервалом 3 или 4 аминокислоты в последовательности представляет собой Asp или Glu. Такие пары аминокислот аа(а - g) представляют собой, например, аа(b) и аа(е) или aa(f).
Программы для прогнозирования биспирализованной нити, такие как COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber М. и др., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5) или MULTICOIL (http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi), могут предсказывать пептидные последовательности, образующие биспирализованную структуру. Таким образом, в предпочтительном мономерном строительном блоке формулы (I) D1 и/или D2 представляют собой пептид, который содержит, по крайней мере, последовательность из двух семичленных повторов, что может быть предсказано с помощью программы прогнозирования биспиральной нити COILS с получением биспиральной нити со степенью вероятности, большей чем 0,9 для всех ее аминокислот, по крайней мере, с размерами одного из окон, которые составляют 14, 21 или 28.
В более предпочтительном мономерном строительном блоке формулы (I), D1 и/или D2 представляет собой пептид, содержащий, по крайней мере, одну последовательность длиной из трех семичленных повторов, которая является предсказанным с помощью программы COILS для прогнозирования биспирализованной нити для создания биспирализованной структуры с вероятностью выше чем 0,9 для всех ее аминокислот, по крайней мере, с размерами одного из окон, которые составляют 14, 21 или 28.
В другом более предпочтительном мономерном строительном блоке формулы (I), D1 и/или D2 представляет собой пептид, содержащий, по крайней мере, две отдельные последовательности длиной из двух семичленных повторов, которая является предсказанным с помощью программы COILS для прогнозирования биспирализованной нити для создания биспирализованной структуры с вероятностью выше чем 0,9 для всех ее аминокислот, по крайней мере, размерами одного из окон, которые составляют 14, 21 или 28.
В другом предпочтительном воплощении один домен олигомеризации D1 или D2 представляет собой домен пентамеризации (m или n=5) СОМР (Malashkevich V.N. и др., Science 1996, 274:761-765) или его производную. Этот домен пентамеризации имеет последовательность LAPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVKQITFLKNTVMECDACG (SEQ ID NO:1). Небольшие модификации этого домена также предусматриваются. Такие модификации могут представлять собой, например, замену аминокислот за пределами пентамера в положениях аа(b), аа(с) или aa(f), предпочтительно в положении aa(f), на Cys с целью образования дисульфидной связи между соседними доменами. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены аминокислот для оптимизации взаимодействий на границе раздела между соседними доменами олигомеризации, такие, как гидрофобные, гидрофильные или ионные взаимодействия или ковалентные связи, подобные дисульфидным мостикам. Также предусматриваются более короткие конструкции этого домена, например, также предусматривается отсутствие C-терминального CDACG фрагмента, в котором цистеины образуют межмолекулярные дисульфидные мостики на C-терминальном конце этого домена пентамеризации. Модификация аминокислот, затрагивающая состояние олигомеризации этого домена, также предусматривается, что приводит, например, к переходу от пентамера к тетрамеру. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены аминокислот (например, на цистеин или лизин) для получения сайтов присоединения для функциональных групп.
В другом предпочтительном воплощении один домен олигомеризации D1 или D2 представляет собой домен пентамеризации (m или n=5) триптофановой застежки (Liu J и др., Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(46):16156-61) или его производную. Этот домен пентамеризации имеет последовательность SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT (SEQ ID NO:2). Небольшие модификации этого домена также предусматриваются. Такие модификации могут представлять собой, например, замену аминокислот за пределами пентамера в положениях аа(b), аа(с) или aa(f), предпочтительно в положении aa(f), на Cys с целью образования дисульфидной связи между соседними доменами. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены аминокислот для оптимизации взаимодействий на границе раздела между соседними доменами олигомеризации, такие, как гидрофобные, гидрофильные или ионные взаимодействия или ковалентные связи, подобные дисульфидным мостикам. Также предусматриваются более короткие конструкции этого домена. Модификация аминокислот, затрагивающая состояние олигомеризации этого домена, также предусматривается, это приводит, например, к переходу от домена пентамеризации к домену тетрамеризации при замене остатка сердцевины Trp на Phe. Другие мутации остатков сердцевины, такие, как описанные в Примере 10, также рассматриваются, однако, по крайней мере, 70% положений сердцевины аа(а) и aa(d) должны представлять собой либо Trp или другую ароматическую аминокислоту. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены аминокислот (например, на цистеин или лизин) для получения сайтов присоединения для функциональных групп.
В другом предпочтительном воплощении один домен олигомеризации D1 или D2 представляет собой домен тетрамеризации (m или n=4) биспирального домена тетрабрахиона (Stetefeld J. и др., Nature Structural Biology, 2000; 7(9):772-776) или его производную. Этот домен тетрамеризации имеет последовательность IINETADDIVYRLTVIIDDRYESLKNLITLRADRLMIINDNVSTILASG (SEQ ID NO:64). Последовательности биспирализованных структур характеризуются семичленным повтором из семи остатков с 3,4-гидрофобным повтором. Следующая периодичность, которая позволяет остаткам приобретать квази-эквивалентные положения после небольшого количества поворотов, составляет три оборота или 11 остатков. Основываясь на присутствии повторов из 11 остатков, C-терминальный конец поверхностного слоя гликопротеинового тетрабрахиона из гипертермофильной архебактерии Staphylothermus marinus образует биспирализованную структуру правого вращения. Это приводит к образованию стержня на основе тетрамерной спирализованной α-спирали длиной 70 нм, который прикрепляется к клеточной мембране на своем C-терминальном конце. Эта тетрамерная биспирализованная структура содержит серию HTL эпитопов (Пример 9) и, таким образом, является идеально приемлемой в качестве сердцевинного олигомера самоорганизующейся пептидной наночастицы (SAPN).
Еще в одном предпочтительном воплощении один домен олигомеризации D1 или D2 представляет собой домен тримеризации (фолдон) белка бактериофага Т4 фибритина (Tao, Y. и др., Structure 1997, 5:789-798) или его производную. Этот домен тримеризации (m или n=3) имеет последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:3). Небольшие модификации этого домена также предусматриваются. Такие модификации могут представлять собой замену Asp 9 на Cys с целью образования дисульфидной связи между соседними доменами. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены остатков для оптимизации взаимодействий на границе раздела между соседними доменами олигомеризации, такие, как гидрофобные, гидрофильные или ионные взаимодействия или ковалентные связи, подобные дисульфидным мостикам. Другие модификации поверхностных аминокислот этого домена могут включать замены аминокислот (например, на цистеин или лизин) для получения сайтов присоединения для функциональных групп.
Наиболее предпочтительными являются биспирализованные последовательности и мономерные строительные блоки, описанные в примерах.
Самоорганизующиеся пептидные наночастицы: выровненные единицы
3
5
3
4
Самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN) образуются из мономерных строительных блоков формулы (I). Если такие строительные блоки собираются вместе, то они образуют так называемые "выровненные единицы". Количество мономерных строительных блоков, которые будут объединяться вместе в такую выровненную единицу, будет определяться наименьшим общим множителем (LCM). Таким образом, если, например, два домена олигомеризации мономерного строительного блока образуют тример (D1) (m=3) и пентамер (D2) (n=5), то 15 мономеров будет образовывать выровненную единицу (Фигура 2А). Если линкерный сегмент L имеет приемлемую длину, то такая выровненная единица будет собираться в виде сферической пептидной наночастицы. Подобно этому, если два домена олигомеризации D1 и D2 мономерного строительного блока образуют тример (D1) (m=3) и тетрамер (D2) (n=4), то количество мономеров, которые являются необходимыми для образования выровненной единицы, будет составлять 12 (Фигура 2В).
Поскольку m и n не могут быть равны или кратны друг другу, то наименьший общий множитель (LCM) всегда будет большим, чем m и n.
Самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN) могут образовываться путем объединения только одной или более одной выровненной единицы (Таблица 2). Такие SAPN представляют собой топологически закрытые структуры.
Таблица 2
Возможные комбинации состояний олигомеризации
№ п/п
m
n
Тип многогранника
LCM
Кол-во выровненных единиц
Количество строительных блоков
1
5
2
Додекаэдр/икосаэдр
10
6
60
2
5
3
Додекаэдр/икосаэдр
15
4
60
3
4
3
Куб/октаэдр
12
2
24
4
3
4
Куб/октаэдр
12
2
24
5
3
5
Додекаэдр/икосаэдр
15
4
60
6
2
5
Додекаэдр/икосаэдр
10
6
60
7
5
4
Несимметричный
20
1
20
8
4
5
Несимметричный
20
1
20
Правильные многогранники
Существует пять правильных многогранников: тетраэдр, куб, октаэдр, додекаэдр и икосаэдр. Они обладают различными элементами внутренней вращательной симметрии. Тетраэдр содержит одну ось второго порядка и две оси третьего порядка, куб и октаэдр имеют оси вращательной симметрии второго, третьего и четвертого порядка, а додекаэдр и икосаэдр имеют оси вращательной симметрии второго, третьего и пятого порядка. В кубе пространственная ориентация этих осей является точно такой же, что и в октаэдре, а в додекаэдре и икосаэдре пространственная ориентация этих осей относительно друг друга является в точности одинаковой. Таким образом, для целей создания SAPN в соответствии с изобретением куб и октаэдр, а также подобному этому додекаэдр и икосаэдр, могут считаться идентичными. Куб/октаэдр строятся из 24 идентичных пространственных строительных блоков, в то время, как додекаэдр/икосаэдр строятся из 60 идентичных пространственных строительных блоков (Таблица 2). Эти строительные блоки представляют собой асимметричные единицы (AU) многогранника. Они являются трипирамидами и каждая из граней пирамиды соответствует одной из осей вращательной симметрии, таким образом, эти AU будут нести на своих гранях элементы симметрии второго, третьего, четвертого или пятого порядка, в зависимости от типа многогранника. Если эти элементы симметрии образованы из пептидных доменов олигомеризации, то такие AU конструируются из мономерных строительных блоков, как описано выше. Является достаточным выровнять два домена олигомеризации D1 и D2 вдоль двух осей симметрии AU (Фигура 3). Если эти два домена олигомеризации образуют стабильные олигомеры, то граница раздела симметрии вдоль третьей оси симметрии будет образовываться автоматически, и она может быть стабилизирована путем оптимизации взаимодействий вдоль этой границы раздела, например, гидрофобных, гидрофильных или ионных взаимодействий или ковалентных связей, таких как дисульфидные мостики.
Сборка до самоорганизующихся пептидных наночастиц (SAPN) с правильной симметрией многогранника
Для получения самоорганизующихся пептидных наночастиц (SAPN) с правильной геометрией (додекаэдр, куб), требуется более одной выровненной единицы. Например, для получнения додекаэдра из мономера, содержащего тримерные и пентамерные домены олигомеризации, необходимо 4 выровненные единицы, каждая из которых состоит из 15 мономерных строительных блоков, то есть пептидная наночастица с правильной геометрией будет состоять из 60 мономерных строительных блоков. Необходимые комбинации состояний олигомеризации двух доменов олигомеризации и количество выровненных единиц для образования любого правильного многогранника являются приведенными в Таблице 2.
Будут ли выровненные единицы также подвергаться сборке с образованием правильного многогранника, состоящего более чем из одной выровненной единицы, зависит от геометрического расположения двух доменов олигомеризации D1 и D2 по отношению друг к другу, в частности, от угла между осями вращательной симметрии двух доменов олигомеризации. Этот процесс регулируется с помощью i) взаимодействий на границе раздела между соседними доменами в наночастице, ii) длиной линкерного сегмента L, iii) формой индивидуальных доменов олигомеризации. Этот угол является большим в выровненных единицах по сравнению с размещением в правильном многограннике. Кроме того, этот угол не является идентичным в мономерных строительных блоках, в отличие от правильного многогранника. Если этот угол ограничен малыми значениями правильного многогранника (с помощью гидрофобных, гидрофильных или ионных взаимодействий или ковалентного дисульфидного мостика), и линкерный сегмент L является достаточно коротким, то данное число топологически закрытых выровненных единиц, каждая из которых содержит определенное количество мономерных строительных блоков, будет также дополнительно отжигаться с образованием правильного многогранника (Таблица 2), или включать больше мономерных строительных блоков с образованием наночастицы, в которой отсутствует строгая внутренняя симметрия многогранника.
Если угол между двумя доменами олигомеризации является достаточно малым (даже меньше, чем в правильном многограннике с икосаэдрической симметрией), то большое количество (несколько сотен) пептидных цепей может объединяться в пептидную наночастицу. Этого можно достичь путем замены двух остатков цистеина, которые размещаются на границе между двумя спиралями, как приведено в исходной модели Raman S. и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006, 2:95-102, и эти остатки будут формировать дисульфидный мостик между двумя спиралями, небольшими остатками аланина, как указано в последовательности SEQ ID NO:33. Угол между двумя спиралями можно делать меньше и, следовательно, более 60 пептидных цепей могут объединяться в виде SAPN. В такой модели SAPN имеет молекулярный вес, который составляет приблизительно 4 Мдальтон, что соответствует приблизительно 330 пептидным цепям (Пример 6).
Эпитопы Т-клеток и эпитопы В-клеток
Поскольку эпитопы Т-клеток - в отличие от эпитопов В-клеток - не нуждаются в представлении на поверхности носителя для того, чтобы вызвать иммунизацию, они могут быть встроены в сердцевину каркасной структуры SAPN, то есть, в биспиразилованную последовательность домена олигомеризации. В настоящем изобретении продемонстрировано, каким образом характеристики МНС связывания эпитопов Т-клеток, которые требуют протяженной конформации для МНС связывания (Фигура 1), могут быть соединены с характеристиками образования биспирализованной структуры, что требует наличия α-спиральной конформации для образования биспирализованной структуры, так чтобы эти эпитопы оба могли быть частью биспирализованной каркасной структуры SAPN, как и быть способными связываться с соответствующими молекулами МНС. Следует отметить, что не все биспирализованные последовательности будут способными связываться с МНС молекулами и не все эпитопы Т-клеток могут быть встроены в биспирализованную структуру. Данное изобретение обеспечивает общие правила, как выбрать приемлемые эпитопы Т-клеток и описывает пути, с помощью которых можно встроить их в конкретный биспирализованный домен олигомеризации, так что эти пептиды будут формировать SAPN. При использовании этих правил широкое разнообразие эпитопов Т-клеток может быть встроено в биспирализованную каркасную структуру SAPN.
В дополнительном аспекте данного изобретения эпитопы В-клеток, которые не являются биспирализованными, встраивают в биспирализованную последовательность SAPN домена олигомеризации путем встраивания их между двумя растянутыми участками биспирализованных сегментов, так, что цельная последовательность действует как один домен олигомеризации. Это представляет особый интерес, поскольку биспирализованная каркасная структура может обеспечить средство для ограничения конформации эпитопа В-клеток конформацией, которая является почти идентичной его нативной конформации.
Источники эпитопов Т-клеток
Для встраивания эпитопов Т-клеток в домен олигомеризации, что в заключение приводит к образованию самоорганизующихся пептидных наночастиц (SAPN), эпитопы Т-клеток могут быть выбраны из различных источников: Например, эпитопы Т-клеток могут быть определены с помощью экспериментальных способов, они являются известными из литературы, они могут быть предсказаны с помощью алгоритмов прогнозирования, которые основываются на существующих белковых последовательностях определенного патогена, или они могут быть de novo сконструированными пептидами или их комбинацией.
Существует большое количество известных эпитопов Т-клеток, доступных из научной литературы. Эти эпитопы Т-клеток могут быть выбраны из определенного патогена (например, как в Примерах 12, 13 и 14), из специфических для рака пептидных последовательностей (например, как в Примере 4), или они могут представлять собой de novo сконструированные пептиды с определенной характеристикой, например, PADRE пептид (патент США 5,736,142), который связывается со многими различными молекулами МНС II, что делает его так называемым промискуитетным (смешанным) эпитопом Т-клеток (например, как в Примере 1). Существуют общедоступными базы данных, которые содержат тысячи различных эпитопов Т-клеток, например, база данных МНС "MHCBN VERSION 4,0" (http://www. imtech.res.in/raghava/mhcbn/index.html) или база данных PDB "Protein Data Bank" ("База данных белковых структур) (http://www.rcsb.org/pdb), или другие.
Является хорошо известным и подробно описанным тот факт, что встраивание HTL эпитопов в другую неиммуногенную пептидную последовательность или присоединение ее к непептидному антигену может сделать их более иммуногенными. PanDR связывающий пептид HTL эпитопа PADRE широко используется в конструировании вакцин для малярии, болезни Альцгеймера и многих других вакцинах.
50
В соответствии с определением базы данных MHCBN (смотри выше) эпитопы Т-клеток представляют собой пептиды, которые обладают связывающими аффинностями (IC значения), меньшими, чем 50000 нМ, с молекулой МНС. Такие пептиды считаются связывающими МНС агентами. В соответствии с этим определением, по данным на август 2006, в Версии 4,0 базы данных MHCBN, следующие данные являются доступными: 20717 связывающих МНС агентов и 4022 не связывающих МНС агентов.
Приемлемые эпитопы Т-клеток могут также быть полученными при использовании алгоритмов прогнозирования. Эти алгоритмы прогнозирования могут либо сканировать существующую белковую последовательность из патогена для эпитопов Т-клеток, или они могут прогнозировать, будет ли de novo сконструированные пептиды связываться с молекулой МНС. Много таких алгоритмов прогнозирования является общедоступными по Интернету. Примеры представляют собой SVRMHCdb (http://svrmhc.umn.edu/SVRMHCdb; J. Wan и др., ВМС Bioinformatics 2006, 7:463), SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de), MHCPred (http://www.jenner.ac.uk/MHCPred), Motif Scanner (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan) или NetMHCIIpan (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan) для молекулы, связывающей МНС II, и NetMHCpan (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan) для эпитопов, связывающих МНС I.
50
50
HTL эпитопы, которые описаны в данной заявке и являются предпочтительными для конструирования, представляют собой пептидные последовательности, которые либо оцениваются с помощью биофизических способов, либо прогнозируются с помощью NetMHCIIpan для связывания с любой МНС II молекулой со связывающими аффинностями (IC значения), лучшими чем 500 нМ. Такие считаются слабыми связывающими агентами. Предпочтительно, когда эти эпитопы оцениваются с помощью биофизических способов или прогнозируются с помощью NetMHCIIpan для связывания с МНС II молекулами со значениями IC, лучшими чем 500 нМ. Такие считаются сильными связывающими агентами.
50
50
CTL эпитопы, которые описаны в данной заявке и являются предпочтительными для конструирования, представляют собой пептидные последовательности, которые либо оцениваются с помощью биофизических способов, либо прогнозируются с помощью NetMHCIIpan для связывания с любой МНС I молекулой со связывающими аффинностями (IC значения), лучшими чем 500 нМ. Такие пептиды считаются слабыми связывающими агентами. Предпочтительно, когда эти эпитопы оцениваются с помощью биофизических способов или прогнозируются с помощью NetMHCIIpan для связывания с МНС I молекулами со значениями IC, лучшими чем 50 нМ. Такие пептиды считаются сильными связывающими агентами.
Места для эпитопов Т-клеток
Эпитопы Т-клеток могут быть встроены в нескольких местах в пределах пептидной последовательности биспирализованного домена олигомеризации D1 и или D2. Для достижения этого частная последовательность с эпитопом Т-клеток должна подчиняться правилам для формирования биспирализованной структуры, а также правилам для связывания МНС. Правила для формирования биспирализованной структуры были подробно приведены выше. Правила связывания с молекулой МНС являются введенными в программы прогнозирования МНС связывания, которые используют сложные алгоритмы для прогнозирования пептидов, связывающих МНС.
Существует много различных молекул HLA, каждая из которых имеет ограничения относительно аминокислот в своей последовательности, которая будет обладать наилучшими связывающими характеристикамми. Связывающие мотивы являются подытоженными в Таблице 3. В этой Таблице мотив демонстрирует x для положений, которые могут иметь любую аминокислоту, и в квадратных скобках (список) аминокислоты, которые могут быть только в определенном положении связывающего мотива.
Таблица 3
Мотивы связывания МНС для HLA генотипов
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
А*01
xx[DE]xxxxx[Y]
SYFPEITHI
А*0101
xx[DE]xxxxx[Y]
Marsh2000
А*0201
x[L(M)]xxxxxx[V(L)]
Marsh2000
А*0201
x[LM]xxxxxx[VL]
SYFPEITHI
А*0202
x[L]xxxxxx[L]
Marsh2000
А*0202
x[L(A)]xxxxxx[LV]
SYFPEITHI
А*0204
x[L]xxxxxx[L]
Marsh2000
А*0204
x[L]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
А*0205
x[V(QL)]xxxxxx[L]
Marsh2000
А*0205
xxxxxxxx[L]
SYFPEITHI
А*0206
x[V(Q)]xxxxxxx
Marsh2000
А*0206
x[V(Q)]xxxxxx[V(L)]
SYFPEITHI
А*0207
x[L][D]xxxxx[L]
Marsh2000
А*0207
x[L]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
А*0214
x[QV]xxx[K]xx[VL]
Luscher2001
А*0214
x[VQ(L)]xxxxxx[L]
Marsh2000
А*0214
x[VQL(A)]xxxxxx[L(VM)]
SYFPEITHI
А*0217
x[L]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
А*03
x[LVM]xxxxxx[KYF]
SYFPEITHI
А*0301
x[LVM(IAST)]xxxxxx[KY(FR)]
Marsh2000
А*1101
xxxxxxxx[K]
Marsh2000
А*1101
xxxxxxxx[KR]
SYFPEITHI
А*24
x[Y(F)]xxxxxx[ILF]
SYFPEITHI
А*2402
x[YF]xxxxxx[FWIL]
Marsh2000
А*2402
x[YF]xxxxxx[LFI]
SYFPEITHI
А*2501
xxxxxxxxx[W]
Yusim2004
А*2601
x[VTIFL]xxxxxx[YF]
Marsh2000
А*2601
x[VTILF]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
А*2602
x[VTILF]xxxxxx[YFML]
Marsh2000
А*2602
x[VTILF]xxxxxx[YF(ML)]
SYFPEITHI
А*2603
x[VFILT]xxxxxx[YFML]
Marsh2000
А*2603
x[VTILF]xxxxxx[YFML]
SYFPEITHI
А*2902
x[E(M)]xxxxxx[Y(L)]
Marsh2000
А*2902
x[E(M)]xxxxxx[Y(L)]
SYFPEITHI
А*3001
x[YF(VLMIT)]xxxxxx[L(YFM)]
SYFPEITHI
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
А*3002
x[YFLV]xxxxxx[Y]
SYFPEITHI
А*3003
x[FYIVL]xxxxxx[Y]
SYFPEITHI
А*3004
xxxxxxxx[YML]
SYFPEITHI
А*3101
xxxxxxxx[R]
Marsh2000
А*3101
xxxxxxxx[R]
SYFPEITHI
А*3201
x[I]xxxxxxx[W]
Yusim2004
А*3303
xxxxxxxx[R]
Marsh2000
А*3303
xxxxxxxx[R]
SYFPEITHI
А*6601
x[TV(APLIC)]xxxxxx[RK]
SYFPEITHI
А*6801
x[VT]xxxxxx[RK]
Marsh2000
А*6801
x[VT]xxxxxx[RK]
SYFPEITHI
А*6802
x[TV]xxxxxx[VL]
Yusim2004
А*6901
x[VT(A)]xxxxxx[VL]
Marsh2000
А*6901
x[VTA]xxxxxx[VL(MQ)]
SYFPEITHI
В*07
x[P]xxxxxx[LF]
SYFPEITHI
В*0702
x[P]xxxxxx[L(F)]
Marsh2000
В*0702
x[P(V)]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
В*0703
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*0703
x[P(ND)]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
В*0705
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*0705
x[P]xxxxxx[L(F)]
SYFPEITHI
В*08
xx[K(R)]x[KR]xxx[L(FM)]
SYFPEITHI
В*0801
xx[K(R)]x[K(RH)]xxxx
Marsh2000
В*0801
xx[K(R)]xxxxxx
SYFPEITHI
В*0802
xx[K(RY)]x[K(H)]xxxx
Marsh2000
В*0802
xx{K(RY)]x[K(H)]xxxx
SYFPEITHI
В*14
x[RK]xx[RH]xxx[L]
SYFPEITHI
В*1402
x[R(K)]xx[R(H)]xxx[L]
Marsh2000
В*1501
x[Q(LMVP)]xxxxxxx[YF]
Marsh2000
В*1501
x[QL(MVP)]xxxxxxx[FY]
SYFPEITHI
В*1502
xxxxxxxx[YF(M)]
Marsh2000
В*1502
x[QLVP]xxxxxx[FYM]
SYFPEITHI
В*1503
x[QK]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
В*1508
x[P(A)]xxxxxx[YF]
Marsh2000
В*1508
x[PA]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
В*1509
x[H]xxxxxx[L(F)]
Marsh2000
В*1509
x[H]xxxxxx[LFM]
SYFPEITHI
В*1510
x[H]xxxxxx[L(F)]
SYFPEITHI
В*1512
x[Q(LM)]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
В*1513
xxxxxxxx[W]
Marsh2000
В*1513
x[LIQVPM]xxxxxx[W]
SYFPEITHI
В*1516
x[T(S)]xxxxxx[Y(IVFM)]
Marsh2000
В*1516
x[ST(F)]xxxxxx[IVYF]
SYFPEITHI
В*1517
x[TS]xxxx[L]x[Y(F)]
Marsh2000
В*1517
x[TS]xxxxxx[YFLI]
SYFPEITHI
В*1518
x[H]xxxxxx[Y(F)]
SYFPEITHI
В*18
x[E]xxxxxxx
Marsh2000
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
В*27
x[R]xxxxxxx
SYFPEITHI
В*2701
x[RQ]xxxxxx[Y]
Marsh2000
В*2701
x[RQ]xxxxxx[Y]
SYFPEITHI
В*2702
x[R]xxxxxx[FY(ILW)]
Marsh2000
В*2702
x[R]xxxxxx[FYILW]
SYFPEITHI
В*2703
x[R(M)]xxxxxxx
Marsh2000
В*2703
x[R]xxxxxx[YF(RMWL)]
SYFPEITHI
В*2704
x[R]xxxxxx[YLF]
Marsh2000
В*2704
x[R]xxxxxx[YLF]
SYFPEITHI
В*2705
x[R(K)]xxxxxxx
Marsh2000
В*2705
x[R]xxxxxx[LFYRHK(MI)]
SYFPEITHI
В*2706
x[R]xxxxxx[L]
Marsh2000
В*2706
x[R]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
В*2707
x[R]xxxxxx[L]
Marsh2000
В*2707
x[R]xxxxxx[LF]
SYFPEITHI
В*2709
x[R]xxxxxx[LVFIM]
Marsh2000
В*2710
x[R]xxxxxx[YF]
Marsh2000
В*35
x[P(AVYRD)]xxxxxx[YFMLI]
SYFPEITHI
В*3501
x[P(AV)]xxxxxxx
Marsh2000
В*3501
x[P(AVYRD)]xxxxxx[YFMLI]
SYFPEITHI
В*3503
x[P(A)]xxxxxx[ML(F)]
Marsh2000
В*3503
x[P(MILFV)]xxxxxx[ML(F)]
SYFPEITHI
В*3701
x[D(E)]xxxxx[FML][IL]
Marsh2000
В*3701
x[DE(HPGSL)]xxxxx[FML(QKYL)][IL(TENDQGH)]
SYFPEITHI
В*3801
xxxxxxxx[FL]
Marsh2000
В*3801
xxxxxxxx[FL(I)]
SYFPEITHI
В*3901
x[RH]xxxxxx[L]
Marsh2000
В*3901
x[RH]xxxxxx[L(VIM)]
SYFPEITHI
В*3902
x[KQ]xxxxxx[L]
Marsh2000
В*3902
x[KQ]xxxxxx[L(FM)]
SYFPEITHI
В*3909
x[RH(P)]xxxxxx[LF]
SYFPEITHI
В*40
x[E]xxxxxx[LWMATR]
SYFPEITHI
В*4001
x[E]xxxxxx[L]
Marsh2000
В*4001
x[E]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
В*4002
x[E]xxxxxx[IAVL]
Yusim2004
В*4006
x[E]xxxxxx[V]
Marsh2000
В*4006
x[E(P)]xxxxxx[V(AP)]
SYFPEITHI
В*4201
x[P]xxxxxx[L]
Yusim2004
В*44
x[E]xxxxxx[Y]
SYFPEITHI
В*4402
x[E]xxxxxx[YF]
Marsh2000
В*4402
x[E(MILD)]xxxxxx[FY]
SYFPEITHI
В*4403
x[E]xxxxxx[YF]
Marsh2000
В*4403
x[E(MILVD)]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
В*4601
xxxxxxxx[YF]
Marsh2000
ВМ601
x[M(I)]xxxxxx[YF]
SYFPEITHI
В*4801
x[QK]xxxxxx[L]
Marsh2000
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
В*4801
х[QK(М)]хххххх[L]
SYFPEITHI
В*5101
xxxxxxxx[FI]
Marsh2000
В*5101
x[APG(WF)]xxxxxx[VI(WMVL)]
SYFPEITHI
В*5102
x[APG]xxxxxx[IV]
Marsh2000
В*5102
x[APG]xxxxxx[IV]
SYFPEITHI
В*5103
xxxxxxxx[VIF]
Marsh2000
В*5103
x[APG(FW)]xxxxxx[VIF]
SYFPEITHI
В*5201
xxxxxxx[IV][IV]
Marsh2000
В*5201
xxxxxxx[IV(MF)][IV(MF)]
SYFPEITHI
В*5301
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*5301
x[P]xxxxxx[WFL]
SYFPEITHI
В*5401
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*5401
x[P]xxxxxxx
SYFPEITHI
В*5501
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*5501
x[P]xxxxxxx
SYFPEITHI
В*5502
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*5502
x[P]xxxxxxx
SYFPEITHI
В*5601
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*5601
x[P]xxxxxx[A(L)]
SYFPEITHI
В*5701
x[ATS]xxxxxx[FW]
Marsh2000
В*5701
x[ATS]xxxxxx[FWY]
SYFPEITHI
В*5702
x[ATS]xxxxxx[FW]
Marsh2000
В*5702
x[ATS]xxxxxx[FW]
SYFPEITHI
В*5801
x[ATS]xxxxxx[WF]
Marsh2000
В*5801
x[AST(G)]xxxxxx[FW(Y)]
SYFPEITHI
В*5802
x[ST]xxx[R]xx[F]
Marsh2000
В*5802
x[ST]xxx[R]xx[F]
SYFPEITHI
В*6701
x[P]xxxxxxx
Marsh2000
В*б701
x[P]xxxxxxx
SYFPEITHI
В*7301
x[R]xxxxxx[P]
Marsh2000
В*7301
x[R]xxxxxx[P]
SYFPEITHI
В*7801
x[PAG]xxxxxxx
Marsh2000
В*7801
x[PAG]xxxxx[A(KS)]x
SYFPEITHI
В*8101
x[P]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0102
xx[P]xxxxx[L]
Marsh2000
Cw*0102
x[AL]xxxxxx[L]
SYFPEITHI
Cw*0103
x[AL]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0202
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0203
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0301
xxxxxxxx[LFMI]
SYFPEITHI
Cw*0302
x[A]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*0303
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0304
x[A]xxxxxx[LM]
Marsh2000
Cw*0304
x[A]xxxxxx[LM]
SYFPEITHI
Cw*0305
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0306
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0307
x[A]xxxxxx[LF]
Yusim2004
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
Cw*0308
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0309
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0401
x[YP]xxxxxxx
Marsh2000
Cw*0401
x[YPF]xxxxxx[LFM]
SYFPEITHI
Cw*0402
x[YP]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0403
x[P]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0404
x[YP]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0405
x[YP]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0406
x[P]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0501
x[A]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0502
x[A]xxxxxx[LF]
Yusim2004
Cw*0601
xxxxxxxx[LIVY]
SYFPEITHI
Cw*0602
xxxxxxxx[L]
Marsh2000
Cw*0602
xxxxxxxx[LIVY]
SYFPEITHI
Cw*0603
x[ALP]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0604
x[RQ]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*0701
x[RHK]xxxxxx[Y]
Yusim2004
Cw*0702
xxxxxxxx[YFL]
SYFPEITHI
Cw*0703
x[YP]xxxxxx[YL]
Yusim2004
Cw*0704
x[RQ]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0705
x[RQ]xxxxxx[Y]
Yusim2004
Cw*0706
x[RHK]xxxxxx[Y]
Yusim2004
Cw*0707
x[RHK]xxxxxx[YL]
Yusim2004
Cw*0708
x[RQ]xxxxxx[YL]
Yusim2004
Cw*0709
x[RHK]xxxxxx[YL]
Yusim2004
Cw*0710
x[YP]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*0711
x[R]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0712
x[R]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0801
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0802
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0803
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0804
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0805
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*0806
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
Cw*1202
x[A]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1203
x[A]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1204
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1205
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1206
x[A]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1402
x[YP]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1403
x[YP]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1404
x[YP]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1502
x[A]xxxxxx[LMYF]
Yusim2004
Cw*1503
x[A]xxxxxx[LMYF]
Yusim2004
Cw*1504
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1505
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1506
x[A]xxxxxx[LM]
Yusim2004
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
Cw*1507
x[A]xxxxxx[LMY]
Yusim2004
Cw*1601
x[A]xxxxxx[FWY]
Yusim2004
Cw*1602
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1604
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1701
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1702
x[A]xxxxxx[L]
Yusim2004
Cw*1801
x[RQ]xxxxxx[LY]
Yusim2004
Cw*1802
x[RQ]xxxxxx[LY]
Yusim2004
DPA1*0102/DPB1*0201
[FLMVWY]xxx[FLMY]xx[IAMV]
SYFPEITHI
DPA1*0103/DPB1*0201
[YLVFK]xx[DSQT]x[YFWV]xx[LVI]
Marsh2000
DPA1*0103/DPB1*0201
[FLM]xxx[FL]xx[IA]
Marsh2000
DPA1*0201/DPB1*0401
[FLYM(IVA)]xxxxx[FLY(MVIA)]xx[VYI(AL)]
Marsh2000
DPA1*0201/DPB1*0401
[FLYMIVA]xxxxx[FLYMVIA]xx[VYIAL]
SYFPEITHI
DPA1*0201/DPB1*0901
[RK]xxxx[AGL]xx[LV]
Marsh2000
DPB1*0301
x[R]xxxxxxx
Marsh2000
DQA1*0101/DQB1*0501
[L]xxx[YFW]
Marsh2000
DQA1*0102/DQB1*0602
xxxxx[LIV(APST)]xx[AGST(LIVP)]
Marsh2000
DQA1*0301/DQB1*0301
xx[AGST]x[AVLI]
Marsh2000
DQA1*0301/DQB1*0301
[DEW]xx[AGST]x[ACLM]
SYFPEITHI
DQA1*0301/DQB1*0302
[RK]xxxx[AG]xx[NED]
Marsh2000
DQA1*0301/DQB1*0302
[TSW]xxxxxxx[RE]
SYFPEITHI
DQA1*0501/DQB1*0201
[FWYILV]xx[DELVIH]x[PDE(H)][ED]x[FYWVILM]
Marsh2000
DQA1*0501/DQB1*0201
[FWYILV]xx[DELVIH]x[PDEHPA][DE]x[FWYILVM]
SYFPEITHI
DQA1*0501/DQB1*0301
[FYIMLV]xxx[VLIMY]x[YFMLVI]
Marsh2000
DQA1*0501/DQB1*0301
[WYAVM]xx[A]x[AIVTS]xxx[QN]
SYFPEITHI
DQB1*0602
[AFCILMNQSTVWYDE]x[AFGILMNQSTVWYCDE][AFGILMNQSTVWY]x[LIVAPST]xx[ASTGLIVP]
SYFPEITHI
DRB1*0101
[YFWLIMVA]xx[LMAIVN]x[AGSTCP]xx[LAIVNFYMW]
Marsh2000
DRB1*0101
[YVLFIAMW]xx[LAIVMNQ]x[AGSTCP]xx[LAIVNFY]
SYFPEITHI
DRB1*0102
[ILVM]xx[ALM]x[AGSTCP]xx[ILAMYW]
Marsh2000
DRB1*0102
[ILVM]xx[ALM]x[AGSTP]xx[ILAMYW]
SYFPEITHI
DRB1*0301
[LIFMV]xx[D]x[KR(EQN)]x[L][YLF]
Marsh2000
DRB1*0301
[LIFMV]xx[D]x[KREQN]xx[YLF]
SYFPEITHI
DRB1*0301 или DRB3*0201
[FILVY]xx[DNQT]
Marsh2000
DRB1*0401
[FLV]xxxxxxx[NQST]
Marsh2000
DRB1*0401 или DRB4
[FYWILVM]xx[FWILVADE]x[NSTQHR]xx[K]
Marsh2000
DRB1*0401 или DRB4*0101
[FYW]xxxxxxx[ST]
Marsh2000
DRB1*0401 или DRB4*0101
[FYWILVM]xx[PWILVADE]x[NSTQHR][DEHKNQRSTYACILMV]x[DEHKNQRSTYACILMV]
SYFPEITHI
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
DRB1*0402 или DRB4
[VILM]xx[YFWILMRNH]x[NSTQHK]x[RKHNQP]x[H]
Marsh2000
DRB1*0402 или DRB4
[VILM]xx[YFWILMRN]x[NQSTK][RKHNQP]x[DEHLNQRSTYCILMVHA]
SYFPEITHI
DRB1*0404 или DRB4
[VILM]xx[FYWILVMADE]x[NTSQR]xx[K]
Marsh2000
DRB1*0404 или DRB4
[VILM]xx[FYWILVMADE]x[NTSQR]xx[K]
SYFPEITHI
DRB1*0405 или DRB4
[FYWVILM]xx[VILMDE]x[NSTQKD]xxx[DEQ]
Marsh2000
DRB1*0405 или DRB4
[FYWVILM]xx[VILMDE]x[NSTQKD]xxx[DEQ]
SYFPEITHI
DRB1*0405 или DRB4*0101
[Y]xxxx[VT]xxx[D]
Marsh2000
DRB1*0407 или DRB4
[FYW]xx[AVTK]x[NTDS]xxx[QN]
Marsh2000
DRB1*0407 или DRB4
[FYW]xx[AVK]x[NTDS]xxx[QN]
SYFPEITHI
DRB1*0701
[FILVY]xxxx[NST]
Marsh2000
DRB1*0701
[FYWILV]xx[DEHKNQRSTY]x[NST]xx[VILYF]
SYFPEITHI
DRB1*0801
[FILW]xxx[HKR]
Marsh2000
DRB1*0901 или DRB4*0101
[YFWL]xx[AS]
Marsh2000
DRB1*0901 или DRB4*0101
[WYFL]xx[AVS]
SYFPEITHI
DRB1*1101
[YF]xx[LVMAFY]x[RKH]xx[AGSP]
Marsh2000
DRB1*1101
[WYF]xx[LVMAFY]x[RKH]xx[AGSP]
SYFPEITHI
DRB1*1101 или DRB3*0202
[YF]xxxx[RK]x[RK]
Marsh2000
DRB1*1104
[ILV]xx[LVMAFY]x[RKH]xx[AGSP]
Marsh2000
DRB1*1104
[ILV]xx[LVMAFY]x[RKH]xx[AGSP]
SYFPEITHI
DRB1*1201 или DRB3
[ILFY(V)]x[LNM(VA)]xx[VY(FIN)]xx[YFMIV)]
Marsh2000
DRB1*1201 или DRB3
[ILFW]x[LMNVA]xx[VYFINA]xx[YFMIV]
SYFPEITHI
DRB1*1301
[IVF]xx[YWLVAM]x[RK]xx[YFAST]
Marsh2000
DRB1*1301
[ILV]xx[LVMAWY]x[RK]xx[YFAST]
SYFPEITHI
DRB1*1301 или DRB3*0101
[ILV]xxxx[RK]xx[Y]
Marsh2000
DRB1*1302
[YFVAI]xx[YWLVAM]x[RK]xx[YFAST]
Marsh2000
DRB1*1302
[YFVAI]xx[LVMAWY]x[RK]xx[YFAST]
SYFPEITHI
ОРВ1*1302 или DRB3*1301
[ILFY]xxxx[RK]xx[Y]
Marsh2000
DRB-T1501
[LVI]xx[FYI]xx[ILVMF]
Marsh2000
DRB1*1501
[LVI]xx[FYI]xx[ILVMF]
YFPEITHI
DRB1*1501 или DRB5*0101
[ILV]xxxxxxxx[HKR]
Marsh2000
DRB3*0202
[YFIL]xx[N]x[ASPDE]xx[LVISG]
Marsh2000
DRB3*0202
[YFIL]xx[N]x[ASPDE]xx[LVISG]
SYFPEITHI
DRB3*0301
[ILV]xx[N]x[ASPDE]xx[ILV]
Marsh2000
DRB3*0301
[ILV]xx[N]x[ASPDE]xx[ILV]
SYFPEITHI
DRB5*0101
[FYLM]xx[QVIM]xxxx[RK]
Marsh2000
МНС молекула
Мотив<sup>1)</sup>
Ссылка<sup>2)</sup>
DRB5*0101
[FYLM]xx[QVIM]xxxx[RK]
SYFPEITHI
<sup>1)</sup> Якорные остатки показаны в квадратных скобках. Предпочтительные, но не доминантные аминокислоты в якорных положениях, показаны в круглых скобках. Например, мотив x-[VTILF]-x-x-x-x-x-x-[YF(ML)] означает, что второе и C-терминальное положения являются якорными положениями. Доминантные аминокислоты во втором положении представляют собой V, Т, I, L, F, а при C-терминальном якорном положении доминантные аминокислоты представляют собой Y и F, в то время, как М и L являются предпочтительными, но не доминантными.
<sup>2)</sup> Marsh2000: Marsh S.G.E., Parham P. и Barber L.D., The HLA Factsbook. Academic Press, San Diego, 2000. URL: http://www.anthonynolan.com/HIG/. SYFPEITHI: The SYFPEITHI Database of МНС Ligands, Peptide Motifs and Epitope Prediction. Jan. 2003. URL: http://www.syfpeithi.de. Luscher2001: Luscher M.A. и др., Immunogenetics. 2001, 53(1):10-14. Yusim2004: Yusim K. и др., Appl Bioinformatics 2005, 4(4):217-225.
Многие МНС молекулы имеют весьма подобные связывающие мотивы и, таким образом, могут быть сгруппированы в так называемые HLA супертипы. Связывающие мотивы для этих супертипов являются подытоженными в Таблице 4.
Таблица 4
Мотивы связывания МНС для HLA супертипов
Супертип
Мотив
Генотипы
А1
x[TI(SVLM)]xxxxxx[WFY]
A*0101, A*0102, A*2501, A*2601, A*2604, A*3201, A*3601, A*4301, A*8001
А2
x[LIVMATQ]xxxxxx[LIVMAT]
A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802, A*6901
A3
x[AILMVST]xxxxxx[RK]
A*0301, A*1101, A*3101, A*3301, A*6801
А24
x[YF(WIVLMT)]xxxxxx[FI(YWLM)]
A*2301, A*2402, A*2403, A*2404, A*3001, A*3002, A*3003
В7
x[P]xxxxxx[ALIMVFWY]
B*0702, B*0703, B*0704, B*0705, B*1508, B*3501, B*3502, B*3503, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*5602, B*6701, B*7801
В27
x[RKH]xxxxxx[FLY(WMI)]
B*1401, B*1402, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*2701, B*2702, B*2703, B*2704, B*2705, B*2706, B*2707, B*2708, B*3801, B*3802, B*3901, B*3902, B*3903, B*3904, B*4801, B*4802, B*7301
В44
x[E(D)]xxxxxx[FWYLIMVA]
B*18, B*3701, B*4001, B*4006, B*4101, B*4402, B*4403, B*4501, B*4901, B*5001
В58
x[AST]xxxxxx[FWY(LIV)]
B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B*58
В62
x[QL(IVMP)]xxxxxx[FWY(MIV)]
B*1301, B*1302, B*1501, B*1502, B*1506, B*1512, B*1513, B*1514, B*1519, B*1521, B*4601, B*52
Частота встречаемости определенной аминокислоты в определенном положении эпитопа Т-клетки также может быть подытожена. Для связывания МНС положения 1, 4, 6 и 9 в эпитопе Т-клетки являются наиболее важными. Наиболее предпочтительные остатки в этих положениях приведены в Таблице 5, однако предпочтительность для определенной аминокислоты в этих положениях варьирует в значительной степени для различных молекул МНС.
Таким образом, как было упомянуто выше, связывание определенной аминокислотной последовательности с МНС молекулой может быть более точно предсказано с помощью программ, приведенных выше.
Таблица 5
Суммарная частота встречаемости аминокислот в определенных положениях эпитопов Т-клеток (получено с помощью Motif Scanner: http://hcv.lanl.gov/content/immuno/motif_scan/motif_scan)
Пол. 1
Пол. 2
Пол. 3
Пол. 4
Пол. 5
Пол. 6
Пол. 7
Пол. 8
Пол. 9
Пол.10
<u>L 37</u>
L 2
<u>V 21</u>
Н 1
S 20
M 3
K 2
Y 17
Q 4
<u>I 35</u>
M 2
<u>L 20</u>
K 1
K 17
V 3
R 2
L 14
D 3
<u>V 33</u>
N 2
<u>M 20</u>
R 1
R 17
L 3
Н 1
А 14
Е 2
<u>F 31</u>
V 2
А 20
Т 17
I 3
N 1
S 14
Н 2
Y 28
A 2
Y 15
N 16
F 2
Q 1
I 13
N 2
<u>M 16</u>
<u>I 14</u>
Q 10
K 2
Р 1
F 11
K 1
<u>W 13</u>
<u>F 11</u>
А 9
R 2
V 11
R 1
A 4
<u>W 10</u>
D 8
Н 2
Т 8
N 10
Р 8
N 2
M 7
D 10
Н 7
Q 2
K 6
Е 7
Е 6
Р 1
G 6
Q 5
G 4
D 1
N 5
K 3
V 3
Е 1
Р 4
R 3
С 3
S 1
R 4
Т 3
Y 2
Т 1
W 3
S 3
F 2
Y 1
Н 3
Н 2
I 2
А 1
Q 3
Р 1
С 1
Е 2
D 2
С 2
Из Таблицы 5 легко можно увидеть, что, например, наиболее часто встречаемыми аминокислотами в положении 1 и положении 4 являются такие, которые обнаружены в сердцевинных положениях биспирализованного семичленного повтора (обозначено с помощью подчеркивания). Положения 1 и 4 могут накладываться на положения семичленного повтора аа(а) и aa(d). Таким образом, эпитоп Т-клеток с аминокислотой L в положении 1 и аминокислотой V в положении 4 идеально находится в соответствии с биспирализованным пептидом, имеющим те же аминокислоты в сердцевинных положениях аа(а) и aa(d) семичленного повтора. Таким образом, если пептидная последовательность удовлетворяет оба требования, как в отношении ограничения мотива связывания Т-клетки, так и ограничения биспирализованного мотива семичленного повтора, она может быть встроена в домен олигомеризации SAPN. Этого можно достичь для большого количества эпитопов Т-клеток путем подгонки выравнивания пептидной последовательности, так, что мотив связывания Т-клеток перекрывается с мотивом формирования биспирализованной структуры.
Инжиниринг эпитопов Т-клеток в биспирализованную структуру
Конструирование SAPN, которая включает эпитопы Т-клеток в биспирализованном домене олигомеризации SAPN, должно быть осуществлено в три этапа. На первом этапе кандидатный эпитоп Т-клеток должен быть выбран при использовании известных эпитопов Т-клеток из литературных источников или из баз данных, или из предсказанных эпитопов Т-клеток при использовании приемлемых программ для прогнозирования эпитопов. На втором этапе сайт протеосомального расщепления должен быть встроен на C-терминальном конце CTL эпитопов. Это может быть осуществлено при использовании программы прогнозирования для протеосомальных сайтов расщепления PAProc (http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html; Hadeler K.P. и др., Math. Biosci. 2004, 188:63-79) и модификации остатков, которые непосредственно следуют за желаемым сайтом расщепления. Этот второй этап не требуется для HTL эпитопов. На третьем и наиболее важном этапе последовательность эпитопа Т-клеток должна быть выровнена с биспирализованной последовательностью, так, что это является наиболее совместимым с правилами для образования биспирализованной структуры, как описано выше. Будет ли последовательность со встроенным эпитопом Т-клетки действительно образовывать биспиральную структуру может быть предсказано, а наилучшее выравнивание между последовательностью эпитопа Т-клетки и последовательностью биспирализованного повтора может быть оптимизировано при использовании программ для прогнозирования биспирализованной структуры, таких как COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html; Gruber М. и др., J. Struct. Biol. 2006, 155(2):140-5) или MULTICOIL (http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi), которые являются доступными через Интернет.
Даже тогда, когда невозможно обнаружить приемлемое выравнивание (может быть по той причине, что эпитоп Т-клетки содержит глицин или даже пролин, который не является совместимым с биспирализованной структурой) - эпитоп Т-клетки может быть встроен в домен олигомеризации (смотри Пример 3). В этом случае эпитоп Т-клетки должен быть фланкирован сильными последовательностями, образующими биспирализованную структуру, того же состояния олигомеризации. Это будет либо стабилизировать биспирализованную структуру до достаточной степени, либо, альтернативно, это может генерировать петлеобразную структуру в пределах данного биспирализованного домена олигомеризации. Это является существенно такой же процедурой, как описано в следующем разделе для встраивания эпитопов В-клеток в последовательность биспирализованной сердцевинной структуры SAPN.
Встраивание эпитопов В-клеток в биспирализованную сердцевинную структуру
В частном аспекте настоящего изобретения встраивание в биспирализованную сердцевинную структуру SAPN небольших эпитопов В-клеток, которые не являются α-спирализованными, также предполагается. Это может быть осуществлено с помощью такой же процедуры, что и та, которая описана выше для эпитопов Т-клеток, которые не являются совместимыми с биспирализованной структурой. Структура фибритина Т4 (pdb номер доступа 1аа0 на http://www.rcsb.org/pdb/) содержит две петлевые структуры в пределах своей биспирали. Петли выпячиваются из биспирали между двумя витками спирали, так, что спиральная структура биспирали не прерывается.
В фибритине петли выходят из спирали в положении аа(b) биспирали и снова входят в спираль в положении аа(с) биспиральной последовательности. Одна из петель представляет собой короткий бета-виток, в то время как другая обладает более неправильной структурой петли. Пространство между остатками aa(b) и аа(с) в биспирали является идеально приемлемым для того, чтобы служить в качестве якорных точек для антипараллельного бета-витка пептида. Когда остатки аа(b) или аа(с) или оба из них представляют собой остатки глицина, то это позволяет придавать необходимую гибкость вторичной структуры белка для выхода и возврата альфа-спирали биспирализованной структуры.
В последовательности фибритина, приведенной выше, петлевые структуры представлены курсивом, а остатки в положениях аа(b) и аа(с) (где две петли выходят и вновь возвращаются в спираль) обозначаются путем подчеркивания. Три из этих четырех остатков являются остатками глицина. Используя это в качестве матрицы, эпитоп В-клеток, который обладает антипараллельной конформацией альфа-спирали, может встраиваться в биспиральную сердцевину SAPN. Биспирализованные структуры должны быть в достаточной мере стабильными для того, чтобы позволить осуществить встраивание таких петельных структур, таким образом, такая структура должна быть способной образовывать биспирали с обеих сторон петли. Самая маленькая автономно собирающаяся описанная последовательность биспирали имеет длину, равную двум семичленным повторам. В последовательности, представленной ниже, конец V3 эпитопа из белка gp120 ВИЧ, который представляет собой антипараллельный пептид бета-витка, является встроенным в биспираль сконструированной стабильной биспирализованной структуры с фланкирующими спиралями более чем двух семичленных повторов с обеих сторон. Таковые представляют собой очень стабильные биспирализованные фрагменты, полученные в соответствии с Burkhard P. и др., J Mol Biol 2002, 318:901-910.
Это будет ограничивать конформацию V3 петли в пределах биспирали до антипараллельной конформации бета-витка, что соответствует нативной конформации этого пептида в белке.
Предпочтительная модель
Для конструирования SAPN с самым лучшим иммунологическим профилем для данного частного применения необходимо принять в расчет следующие соображения:
Для CTL эпитопов необходим протеосомальный сайт расщепления на их C-терминальном конце. Эпитопы не должны быть подобными человеческим последовательностям для того, чтобы избежать аутоиммунного ответа - за исключением тех случаев, когда ставится цель вызвать иммунный ответ против пептида человека. Возможные примеры представляют собой специфические для опухоли CTL эпитопы Примера 4.
В соответствии с этим является предпочтительным SAPN, в которой, по крайней мере, один из эпитопов Т-клеток представляет собой CTL эпитоп, и, в частности, в котором последовательность дополнительно содержит протеосомальный сайт расщепления после CTL эпитопа.
Также предпочтительным является SAPN, в которой, по крайней мере, один из эпитопов Т-клеток представляет собой HTL эпитоп, в частности, HTL эпитоп, связывающий pan-DR. Такие HTL эпитопы, связывающие pan-DR, связываются со многими молекулами МНС класса II, как приведено в конце Таблицы 3, и, таким образом, узнаются у большинства здоровых индивидуумов, что является крайне необходимым для получения хорошей вакцины.
Также предпочтительным является SAPN, в которой последовательность D1 - L - D2 содержит серию перекрывающихся эпитопов Т-клеток, если либо D1, либо D2 является тримером (Примеры 7 и 8), тетрамером (Пример 9) или пентамером (Пример 10).
Для эпитопов В-клеток является необходимым, чтобы они были представлены на поверхности SAPN. Они могут быть или могут не быть частью биспирализованной последовательности, то есть, биспираль сама по себе может частично представлять собой эпитоп В-клетки, в зависимости от того является ли часть биспиральной структуры поверхностно доступной. Например, эпитоп В-клетки, состоящий из тримерной биспирали поверхностных белков вирусов, которые содержат оболочку, может быть представлен на поверхности SAPN и быть частью биспирализованной последовательности в одно и то же время. Пример такой модели представлен у Raman S. и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102. Биспирали любого состояния олигомеризации в общем случае являются исключительно хорошо приспособленными для того, чтобы  презентироваться SAPN специфическим для конформации образом. Биспирали являются избыточными не только в поверхностных белках вирусов, имеющих оболочку, но также, например, в геноме патогена малярии Plasmodium falciparum (Villard V. и др., PLoS ONE 2007; 2(7):e645).
Однако в общем случае эпитопы В-клеток не будут частью биспирализованных доменов олигомеризации или они могут состоять из биспирали и дополнительной части, которая не является биспиралью, как, например, тримерный адгезионный аутотранспортер (ТАА) бактерии, который обладает биспирализованным стержнем и глобулярным доменом головки, как, например, ТАА N. meningitidis.
Особый интерес представляют белки в качестве эпитопов В-клеток, которые сами по себе являются олигомерными, такие, как тримерный гемагглютинин, и тетрамерная нейраминидаза или М2 поверхностные белки вируса гриппа.
Обсуждение модели вакцины против патогена
Такая вакцина предпочтительно содержит все три типа эпитопов, эпитопы В-клеток, HTL и CTL. (1) Является предпочтительным, когда только один (или совсем мало) эпитоп В-клетки будет размещаться на одном из концов пептидных цепей. Таковой будет содержать эпитоп В-клетки на поверхности SAPN в виде повторяемого антигенного дисплея. (2) HTL эпитопы должны обладать промискуитетом в той мере, насколько это возможно. Они не должны обязательно иметь происхождение от патогена, но могут быть пептидами, которые вызывают сильный ответ Т-хелперных клеток. Примером может служить PADRE пептид. Предпочтительно, когда таковые представляют собой эпитопы Т-клеток, которые являются встроенными в D1 - L - D2 сердцевинную последовательность SAPN. (3) CTL эпитопы должны быть специфическими для патогена, они должны содержать C-терминальные протеосомальные сайты расщепления. Поскольку эпитопы Т-клеток не требуют повторяемого антигенного дисплея, то несколько различных эпитопов Т-клеток может быть встроено в один SAPN путем совместной сборки пептидных цепей, которые все имеют одну и ту же наночастицу, формирующую D1 - L - D2 сердцевину, но несут различные эпитопы Т-клеток, которые не являются частью последовательности, формирующей сердцевину, и таким образом, могут не быть встроенными в биспирализованные последовательности.
Подобным образом пептидные цепи, которые несут сигнал нацеливания на ER, то есть, сигнальный пептид, который индуцирует транспорт белка или пептида к эндоплазматическому ретикулуму (ER), могут подвергаться совместной сборке в одну и ту же SAPN для того, чтобы нести CTL эпитопы в ER для собственной презентации молекулами МНС I, поскольку перекрестная презентация не является очень эффективной у людей. Однако не является необходимым, чтобы сигнал нацеливания на ER находился на отдельной пептидной цепи, он может находиться в том же пептиде, что и CTL эпитопы. Приемлемый ER сигнальный пептид может представлять собой, например, ER нацеливающий сигнал (Е3/19K) MRYMILGLLALAAVCSA (SEQ ID NO:6).
Терапевтическая вакцина, направленная на генерацию сильного антителогенеза
Терапевтическая вакцина, направленная на генерацию сильного антителогенеза, является особенно полезной для лечения болезни Альцгеймера, гипертензии, ожирения, наркомании или воспаления. Для такой вакцины предпочтительно используется только один эпитоп В-клетки. Сильный гуморальный ответ благодаря повторяемому антигенному дисплею может быть дополнительно улучшен путем включения одного или более промискуитетных HTL эпитопов в SAPN. Предпочтительно, когда таковые представляют собой эпитопы Т-клеток, которые являются встроенными в D1 - L - D2 сердцевинную последовательность SAPN. Кроме того, должно быть настолько мало CTL эпитопов и они должны быть настолько слабо связанными, насколько это является возможным, - в частности, не против человеческого пептида, для того, чтобы избежать аутоиммунного ответа.
Терапевтическая вакцина для индукции CTL ответа, например, против рака
В этом случае не нужно использовать никакого эпитопа В-клетки. Иммунный ответ против конкретнх CTL эпитопов (например, MAGE-1,2,3; MART-1,2,3; или Her-2/neu, смотри также Пример 4) дополнительно усиливается путем включения одного или более промискуитетных HTL эпитопов в SAPN.
Самоорганизующиеся пептидные наночастицы (SAPN) в качестве адъювантов
SAPN, которая состоит из многочисленных HTL эпитопов, будет индуцировать сильный Т-хелперный иммунный ответ (смотри Пример 2). При использовании в той же дозе с любой другой вакцинной композицией это будет приводить к стимуляции иммунного ответа. Такая SAPN будет представлять собой адъювант без необходимости присутствия какого-либо CTL эпитопа или эпитопа В-клеток. Однако эпитопы В-клеток и CTL эпитопы могут комбинироваться с такой адъювантной SAPN. Кроме того, дополнительные молекулы адъюванта могут быть ковалентно слиты с SAPN в виде заместителя домена олигомеризации D1 или D2 для дополнительной стимуляции адъювантного эффекта SAPN. Особый интерес представляют собой иммуностимуляторные нуклеиновые кислоты, предпочтительно олигодезоксинуклеотид, содержащий дезоксиинозин, олигодезоксинуклеотид, содержащий дезоксиуридин, олигодезоксинуклеотид, содержащий CG мотив, инозин и цитидин, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты. Другие иммуностимуляторные молекулы представляют собой, например, антимикробные пептиды, такие, как катионные пептиды, которые представляют собой класс иммуностимуляторов, позитивно заряженные молекулы, которые являются способными усиливать и/или улучшать адаптивные иммунные ответы. Примером такого пептида с иммуностимуляторными свойствами является позитивно заряженный искусственный антимикробный пептид KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:63), который индуцирует сильный специфический для белка типа 2 адаптивный иммунитет после иммунизации на основе первично-вторичной вакцинации.
Предпочтительно, когда антигены в соответствии с изобретением являются выбранными из группы, состоящей из (а) белков, приемлемых для индукции иммунного ответа против раковой клетки; (b) белков или углеводов, приемлемых для индукции иммунного ответа против инфекционных болезней; (с) белков, приемлемых для индукции иммунного ответа против аллергенов; (d) пептидных гормонов, приемлемых для индукции иммунного ответа для лечения заболеваний человека; и (е) молекулы гаптена, приемлемой для индукции иммунного ответа для лечения наркомании и других заболеваний. Пептидные наночастицы, включающие такие белки, их пептидные фрагменты, пептиды, углеводы или гаптены могут быть приемлемыми для индукции иммунного ответа у людей, или также у сельскохозяйственных животных и домашних питомцев.
В одном предпочтительном воплощении изобретения антигены или антигенные детерминанты являются такими, которые полезны для предотвращения инфекционного заболевания. Такое лечение будет полезным для предотвращения большого разнообразия инфекционных заболеваний, которые поражают широкий спектр хозяев, например, людей, животных, отличных от человека, таких, как корова, овца, свинья, собака, кошка, других видов млекопитающих, а также видов, отличных от млекопитающих.
В частности, изобретение относится к SAPN, включающей один из следующих антигенов:
(a) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против бактерий;
(b) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против вирусов;
(c) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против паразитов;
(d) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против раковой клетки;
(e) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против аллергенов;
(f) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против зависимостей;
(g) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа против заболеваний и метаболических расстройств;
(h) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа у сельскохозяйственных животных; и
(i) антиген, приемлемый для индукции иммунного ответа у домашних питомцев.
Поддающиеся лечению инфекционные заболевания являются хорошо известными специалисту в данной области техники. Примеры включают инфекции вирусной, бактериальной или паразитарной этиологии, такие, как следующие заболевания:
амебная дизентерия, сибирская язва, инфекции, вызванные Campylobacter, ветряная оспа, холера, лихорадка Денге, дифтерия, энцефалит, лихорадка Эбола, грипп, японский энцефалит, лейшманиоз, малярия, корь, эпидемический менингит, паротит, внутрибольничные инфекции, коклюш, пневмококковая инфекция, полио (полиомиелит), коревая краснуха, опоясывающий лишай, шистоматоз, столбняк, клещевой вирусный энцефалит, трихомониаз, трипаносомоз, туберкулез, брюшной тиф, ветряная оспа, желтая лихорадка.
В частности, изобретение относится к SAPN, которая включает один из антигенов из приведенных ниже паразитов:
Campylobacter, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус ящура, Haemophilus influenzae типа b, Helicobacter pylori, вирус гепатита, вирус гепатита С, вирус гепатита Е, вирус простого герпеса, вирус иммунодефицита человека, человеческий папилломавирус, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, респираторно-синцитиальный вирус, ротавирус, круглые черви, анкилостома, вирус болезни западного Нила.
В предпочтительном аспекте изобретения предусматривается композиция для предотвращения и лечения малярии (Пример 11). Жизненный цикл малярийного паразита обеспечивает несколько стадий, на которых вмешательство может приводить к приостановке инфекционного процесса. В жизненном цикле малярийного паразита человек становится инфицированным малярией в результате укуса самки малярийного комара (Anopheles). Комар вводит свой хоботок в хозяина и при этом вводит форму спорозоита Plasmodium falciparum (или vivax), которая присутствует в слюне комара. Возможные белковые и пептидные последовательности, приемлемые для модели пептидной вакцины, могут включать последовательности из следующих белков Plasmodium: MSP-1 (большой полиморфный белок, который экспрессируется на поверхности клетки паразита), MSA1 (основной поверхностный антиген 1 мерозоита 1), CS белок (нативный белок спорозоита), белок весом 35 кДа или белок весом 55 кДа или белок весом195 кДа в соответствии с патентом США 4,735,799, АМА-1 (антиген 1 апикальной мембраны), или LSA (антиген печеночной стадии).
В предпочтительной модели один из эпитопов В-клеток представляет собой последовательность, содержащую от 8 до приблизительно 48 остатков, которые составляют В-клеточный эпитоп белка спорозоита (CS). Этот эпитоп В-клеток представляет собой участок избыточного повтора аминокислотной последовательности NANP для Plamodium falciparum. В предпочтительной модели SAPN этот В-клеточный эпитоп включает от двух до приблизительно пяти повторов последовательности аминокислотных остатков NANP или ее пермутации ANPN, NPNA и PNAN. Соответствующий участок повтора Plasmodium vivax состоит из любой из следующих в высокой степени подобных последовательностей.
Таблица 6
Последовательности CS повтора эпитопа В-клеток Plasmodium vivax
Пептид
SEQ ID NO:
GDRAAGQPA
65
GDRADGQPA
66
GDRADGQAA
67
GNGAGGQPA
68
GDGAAGQPA
69
GDRAAGQAA
70
Пептид
SEQ ID NO:
GNGAGGQAA
71
В предпочтительной модели один из эпитопов В-клеток представляет собой последовательность, содержащую от 8 до приблизительно 48 остатков в составе любой из этих последовательностей.
Специфические пептидные последовательности для модели SAPN для лечения малярии являются приведенными в трех таблицах, представленных ниже, для эпитопов В-клеток, HTL-эпитопов и CTL-эпитопов.
В Таблице 7 приведены предпочтительные биспирализованные эпитопы В-клеток Р. falciparum (Villard V. и др., PLoS ONE 2007, 2(7):е645 и Agak G.W., Vaccine (2008) 26, 1963-1971. Поскольку для эпитопов В-клеток только поверхностно доступные остатки представляют особую важность для их взаимодействия с рецептором В-клетки и продукции антител, биспирализованные остатки сердцевины в положениях аа(а) и aa(d), которые не являются поверхностными, могут быть модифицированы без изменения способности антигена вызывать образование нейтрализующих антител. Например, замена валина в положении аа(а) изолейцином не будет оказывать воздействия на общие иммунологические свойства биспирализованного эпитопа В-клеток. Таким образом, эти биспирализованные последовательности могут быть искусственно стабилизированы путем оптимизации сердцевинных остатков для наилучшего образования биспирализованной структуры и стабильности (Пример 13) без нарушения их иммунологического потенциала. В соответствии с этим, пептидные эпитопы В-клеток в одном или более из их сердцевинных остатков в положении аа(а) и/или aa(d), наряду со свойствами образования биспирализованной структуры, как описывается более подробно выше, также предусматриваются для этих эпитопов В-клеток.
Таким образом, в предпочтительной модели биспирализованный эпитоп В-клеток с модификациями одного или более своих сердцевинных положений представляет собой пептид, который содержит, по крайней мере, последовательность, которая имеет длину, равную двум семичленным повторам, и которая является спрогнозированной с помощью программы для предсказания биспирализованной структуры COILS, для образования биспирализованной нити с вероятностью более высокой чем 0,9, для всех ее аминокислот, по крайней мере, с одним окном размером 14, 21 или 28.
В другой предпочтительной модели биспирализованный эпитоп В-клеток с модификациями одного или более своих сердцевинных положений представляет собой пептид, который содержит, по крайней мере, одну последовательность длиной в три семичленных повтора, которая является спрогнозированной с помощью программы для предсказания биспирализованной структуры COILS, для образования биспирализованной нити с вероятностью более высокой чем 0,9, для всех ее аминокислот, по крайней мере, с одним окном размером 14, 21 или 28.
В другой предпочтительной модели биспирализованный эпитоп В-клеток с модификациями одного или более своих сердцевинных положений представляет собой пептид, который содержит, по крайней мере, две отдельные последовательности длиной в два семичленных повтора, которая является спрогнозированной с помощью программы для предсказания биспирализованной структуры COILS, для образования биспирализованной нити с вероятностью более высокой чем 0,9, для всех ее аминокислот, по крайней мере, с одним окном размером 14, 21 или 28.
Таблица 7
Последовательности биспирализованного эпитопа В-клеток Plasmodium falciparum
Эпитоп В-клетки
SEQ ID NO:
IKTMNTQISTLKNDVHLLNEQIDKLNNEKGTLNSKISELNVQIMDL
72
LLSKDKEIEEKNKKIKELNNDIKKL
73
ICSLTTEVMELNNKKNELIEENNKLNLVDQGKKKLKKDVEKQKKEI EKL
74
VDKIEEHILDYDEEINKSRSNLFQLKNEICSLTTEVMELNNKKNELI EENNKLNLVDQGKKKLKKDVEKQKKEIEKL
75
LDENEDNIKKMKSKIDDMEKEIKYR
76
GMNNMNGDINNIN(GDINNMN)<sub>4</sub>
77
Эпитоп В-клетки
SEQ ID NO:
KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT
78
EEIKEEIKEVKEEIKEVKEEIKEVKEEIKEVKEEIKE
79
KNDINVQLDDINVQLDDINVQLDDINIQLDEINLN
80
KIQIEEIKKETNQINKDIDHIEMNIINLKKKIEF
81
DSMNNHKDDMNNYNDNINNWESMNNYDDIMNK
82
MCELNVMENNMNNIHSNNNNISTHMDDVIE
83
KEIQMLKNQILSLEESIKSLNEFINNLKN
84
GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLNNNMNSINK
85
EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT
86
EKMNMKMEQMDMKMEKIDVNMDQMDVKMEQMDVKMEQMDVKMKRMNK
87
KNKLNKKWEQINDHINNLETNINDYNKKIKEGDSQLNNIQLQCENIEQKINKIKE
88
NEMNKEVNKMNEEVNKMNEEVNKMNEEVNKMNKEVNKMDEEVNKMNKEVNKMNK
89
QNKMENDMNIIKNDMNIMENDMNIMENDMNIIKNDMNIMEKDMNI IKNDMNIIKNNMNIIKNEMNIIKNV
90
TKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTLENDIKV
91
ENINNMDEKINNVDEQNNNMDEKINNVDEKK
92
ARDDIQкДАINKMESELINVSNEINRLD
93
EKKLDILKVNISNINNSLDKLK
94
NSLDYYKKVIIKLKNNINNMEEYTNNITNDINVLKAHID
95
PDFDAYNEKLGSISQSIDEIKKKIDNLQKEIKVANK
96
QLEEKTKQYNDLQNNMKTIKEQNEHLKNKFQSMGK
97
IIDIKKHLEKLKIEIKEKKEDLENL
98
Таблица 8 приводит предпочтительные HTL эпитопы Р. falciparum (Doolan, D.L, The Journal of Immunology, 2000, 165:1123-1137; патент США 5,114,713)
Таблица 8
Последовательности HTL эпитопа Plasmodium falciparum
Белок
HTL эпитоп
SEQ ID NO:
CSP-2
MRKLAILSVSSFLFV
99
LSA-13
LVNLLIFHINGKIIKNS
100
CSP-53
MNYYGKQENWYSLKK
101
SSP2-61
RHNWVNHAVPLAMKLI
102
SSP2-223
VKNVIGPFMKAVCVE
103
Белок
HTL эпитоп
SEQ ID NO:
CSP-375
SSVFNWNSSIGLIM
104
ЕХР-82
AGLLGNVSTVLLGGV
105
ЕХР-71
KSKYKLATSVLAGLL
106
SSP2-527
GLAYKFWPGAATPY
107
SSP2-62
HNWVNHAVPLAMKLI
108
SSP2-509
KYKIAGGIAGGLALL
109
CSP
EKKIAKMEKASSVFNW
110
CSP
EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT
111
Таблица 9 приводит предпочтительные CTL эпитопы Р. falciparum (патенты США 5,028,425, 5,972,351, 6,663,871)
Таблица 9
Последовательности CTL эпитопа Plasmodium falciparum
CTL эпитоп
HLA ограничения
SEQ ID NO:
KPNDKSLY
B35
112
KPRLELDY
B35
113
KPIVQYDNF
B35
114
ASKNKEKALII
B8
115
GIAGGLALL
A2,1
116
MNPNDPNRNV
B7
117
MINAYLDKL
A2,2
118
ISKYEDEI
B17
119
HLGNVKYLV
A2,1
120
KSLYDEHI
B58
121
LLMDCSGSI
A2,2
122
KSKDELDY
B35
123
IPSLALMLI
неизвестно
124
MPLETQLAI
неизвестно
125
MPNDPNRNV
B7
126
YLNKIQNSL
A2,1
127
MEKLKELEK
B8
128
ATSVLAGL
B58
129
В другом предпочтительном аспекте изобретения предполагается композиция для предотвращения и лечения ВИЧ (Примеры 5 и 12). Для получения анти-ВИЧ вакцины можно использовать синтетический пептид, способный вызывать выработку специфических для ВИЧ антител, при этом указанный синтетический пептид имеет аминокислотную последовательность функционального эпитопа Т-клетки или эпитопа В-клетки оболочки или gag белка, или gp120, или gp41 ВИЧ-1 для обеспечения иммунного ответа. Особый интерес представляют последовательности в рамках gp41 или gp120, которые могут индуцировать специфические для конформации нейтрализующие антитела, способные препятствовать процессу слияния, подобно известным антителам 2F5 и 4Е10, или из VS-петли gp41 или gp120. Такие последовательности, в основном, локализуются в и поблизости от HR1 и HR2 и участков кластера I и кластера II. Антитела, связывающиеся, например, с биспирализованным тримером gp41, которые индуцируются наночастицами в соответствии с изобретением, включающими этот биспирализованный тример, будут ингибировать образование "шпильки" и, таким образом, слияние вируса. Подобно этому, антитела, образованные против тримерной биспирали вируса Эбола или другого вируса с подобным процессом слияния, будут ингибировать проникновение этих вирусов в клетку.
При использовании высоко консервативных белковых последовательностей ВИЧ, как описывается у Letourneau S. и др., PLoS ONE 2007, 10:е984, CTL эпитопы были спрогнозированы с помощью SVRMHCdb (http://svrmhc.umn.edu/SVRMHCdb; Wan J. и др., ВМС Bioinformatics 2006, 7:463). Эти консервативные белковые последовательности содержат CTL эпитопы, спрогнозированные как такие, которые связываются с HLA молекулами, как приведено в Таблице 10, и представляют собой предпочтительные CTL эпитопы для модели ВИЧ вакцины на основе SAPN. Эти пептидные эпитопы содержат перекрывающиеся в значительной степени последовательности, которые могут быть объединены для создания более длинных пептидных последовательностей, несущих многочисленные CTL эпитопы в одной единственной беспрерывной пептидной цепочке (Таблица 11).
Таблица 10
Консервативные предсказанные CTL эпитопы ВИЧ
CTL эпитоп
SEQ ID NO:
HLA ограничение
PLDEGFRKY
130
А*0101
LLQLTVWGI
131
А*0201
CTL эпитоп
SEQ ID NO:
HLA ограничение
YTAFTIPSI
132
А*0202
GLNKIVRMY
133
А*0203
ILKDPVHGV
134
А*0204
YTAFTIPSI
135
А*0206
IIGRNLLTQI
136
А*0207
KGPAKLLWK
137
А*0301
VLFLDGIDK
138
А*0302
AVFIHNFKR
139
А*1101
HNFKRKGGI
140
А*3101
IVWQVDRMR
141
А*3301
SDIKWPRR
142
А*6801
YTAFTIPSI
143
А*6802
LGIPHPAGL
144
В*0702
FSVPLDEGF
145
В*3501
AVFIHNFKR
146
А11
RWIILGLNK
147
А24
AIFQSSMTK
148
A3
AVFIHNFKR
149
А31
AVFIHNFKR
150
А68
WQVMIVWQV
151
В35
YSPVSILDI
152
В51
APRKKGCWK
153
В7
LKDPVHGVY
154
А*0101
YTAFTIPSI
155
А*0201
TLNFPISPI
156
А*0203
FKRKGGIGG
157
А*0204
LLQLTVWGI
158
А*0206
EILKDPVHGV
159
А*0207
GIPHPAGLK
160
А*0301
GPAKLLWKG
161
А*1101
SQGIRKVLF
162
А*3101
SDLEIGQHR
163
А*6801
LVSQGIRKV
164
А*6802
QGIRKVLFL
165
В*0702
EEAELELAE
166
В*3501
FTIPSINNE
167
В*5301
FKRKGGIGG
168
В*5401
CTL эпитоп
SEQ ID NO:
HLA ограничение
KGPAKLLWK
169
АН
LLTQIGCTL
170
А2
KGPAKLLWK
171
A3
YTAFTIPSIN
172
А68
LWGSDLEI
173
В35
LLTQIGCTL
174
В51
DFWEVQLGI
175
А*0201
LLWKGEGAV
176
А*0202
MIVWQVDRM
177
А*0203
FPISPIETV
178
А*0204
AGLKKKKSV
179
А*0206
APRKKGCWK
180
А*0301
ISPIETVPV
181
В*0702
WEVQLGIPH
182
В*5401
AIFQSSMTK
183
А11
GIPHPAGLK
184
A3
AELELAENR
185
А31
SDIKWPRR
186
А68
LTEEAELEL
187
В35
SPAIFQSSM
188
В7
Таблица 11
Консервативные комбинированные спрогнозированные CTL эпитопы ВИЧ
Пептид
SEQ ID NO:
HLA ограничение
PLDEGFRKYTAFTIPSINNE
189
А*0101, А*0201, А*0202, А*0206, А*6802, В*3501, В*5301, А68
AVFIHNFKRKGGIGG
190
А*3101, А*1101, А11, А31, А68, В*5401, А*0204
IIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPV
191
А*0207, В51, А2, В*0702, А*0204, А*0203
DFWEVQLGIPHPAGLKKKKSV
192
А*0201, В*0702, А*0301, А*0206, В*5401, А3
LTEEAELELAENREILKDPVHGV
193
А31, В35, В*3501, А*0204, А*0101
KGPAKLLWKGEGAV
194
А*0202, А*1101, А*0301, А11, A3
Пептид
SEQ ID NO:
HLA ограничение
LVSQGIRKVLFLDGIDK
195
А*0302, А*3101, А*6801, В*0702
RWIILGLNKIVRMYSPVSILDI
196
А24, А*0203, В51
WQVMIVWQVDRMR
197
А*3301, В35, А*0203
SPAIFQSSMTK
198
АЗ,А11, В7
SDIKWPRR
199
А*6801, А68
LLQLTVWGI
200
А*0202, А*0206
APRKKGCWK
201
А*0301, В7
LYVGSDLEIGQHR
202
А*6801, В35
В другом предпочтительном аспекте изобретения предполагается композиция для предотвращения и лечения гриппа. Грипп А кодирует интегральный мембранный белок, М2, гомотетрамер, субъединица которого имеет внешний домен (М2е), состоящий из 23 аминокислотных остатков. Природный М2 белок присутствует в нескольких копиях в вирусной частице и прячется для иммунной системы за массой других поверхностных белков гемагглютинина и нейраминидазы. С другой стороны, он существует в избытке на поверхности мембраны инфицированной вирусом клетки. Последовательность М2е является высоко консервативной. Было продемонстрировано, что М2е презентируется для иммунной системы в виде тетрамера в химерном GNC4-М2е белке и при этом генерирует высоко специфический и протективный гуморальный ииммунный ответ (DeFilette М. и др., J Biol Chem 2008; 283(17):11382-11387).
М2е тетрамер представляет собой высоко консервативный эпитоп В-клетки как для штаммов вируса гриппа человека, так и для птиц (Таблицы 12 и 13). В предпочтительном воплощении настоящего изобретения он может представляться в своей нативной тетрамерной конформации, когда присоединяется к N-терминальному концу тетрамерной биспирализованной структуры из тетрабрахиона (или любой другой тетрамерной биспирализованной структуры) SAPN (Пример 9).
Таблица 12
Специфические для человека М2е последовательности
Типичный штамм
Подтип
Хозяин
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO:
A/New Caledonia/20/99
H1N1
человек
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
203
A/Aichi/470/68
H3N1
человек
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
203
A/Ann arbor/6/60
H2N2
человек
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
203
A/Berkeley/1/68
H2N2
человек
SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
203
A/Puerto Rico/8/34
H1N1
человек
SLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSDP
204
A/Wisconsin/3523/88
H1N1
человек
SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSDP
205
A/Hebei/19/95
H3N2
человек
SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSDP
204
A/Viet Nam/1203/2004
H5N1
человек
SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP
206
A/Hong Kong/156/97
H5N1
человек
SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDP
207
A/Hong Kong/1073/99
H9N2
человек
SLLTEVETLTRNGWECKCRDSSDP
208
Таблица 13
Специфические для птиц М2е последовательности
Типичный штамм
Подтип
Хозяин
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO:
A/Chicken/Nakorn-Patom/Thailand
H5N1
птицы
SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP
206
A/Thailand/1(KAN-1)/04
H5N1
птицы
SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDP
206
A/Duck/1525/81
H5N1
птицы
SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSDP
209
A/Chicken/New York/95
H7N2
птицы
SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSDP
209
A/Chicken/Hong Kong/G9/97
H9N2
птицы
SLLTEVETPTRNGWGCRCSGSSDP
210
Гемагглютинин вируса гриппа (НА) активируется путем разрезания белкового предшественника на две отдельные пептидные цепи (Steinauer D.S. и др., Virology 1999; 258:1-20). Разрезание предшественника НА молекулы НА0 является необходимым для активации вирусной инфекционности, и распределение активирующих протеаз в хозяйской клетке является одной из детерминант тропизма и, как таковой, патогенности. НА млекопитающих и непатогенных вирусов птиц расщепляются за пределами клетки, что ограничивает их распространение в хозяевах до тканей, в которых имеются приемлемые протеазы. С другой стороны, НА патогенных вирусов подвергается расщеплению внутри клетки с помощью убиквитарно существующих протеаз и, таким образом, обладает способностью инфицировать различные типы клеток и вызывать системные инфекции.
В отличие от М2е последовательности, N-терминальная часть пептида, полученного в результате разрезания, не является высоко консервативной (C-терминальная часть пептида, полученного в результате разрезания, фактически является высоко консервативной). В белке-предшественнике НА пептид, получаемый в результате разрезания, размещается на поверхности, и шесть остатков (три остатка с каждой стороны сайта разрезания), которые размещаются вокруг сайта разрезания, являются наиболее характерными для этой пептидной последовательности (выделены жирным в Таблице 14). В предпочтительной модели SAPN эти шесть остатков представляют эпитоп В-клеток, который может индуцировать антитела, которые при связывании с пептидом могут защищать белок-предшественник НА от такого разрезания.
SAPN являются идеально приемлемыми для представления множества различных последовательностей разрезания, специфических для различных типов НА (Таблица 14) путем совместной сборки пептидов, которые обладают такой же сердцевиной D1 - L - D2, формирующей SAPN, но различными эпитопами В-клеток, присоединенными к ним (Пример 15).
Таблица 14
Последовательности сайта расщепления гемагглютинина из вируса гриппа А и вируса гриппа В
Тип
Последовательность
SEQ ID NO:
Н1
SI<b>QSRGLF</b>GA
211
Н2
QI<b>ESRGLF</b>GA
212
Н3
ER<b>QTRGIF</b>GA
213
Н4
EK<b>ATRGLF</b>GA
214
Н5 консенсус 1
KR<b>KTRGLF</b>GA
215
Н5 консенсус 2
RR<b>KKRGLF</b>GA
216
Н6
QI<b>ATRGLF</b>GA
217
Тип
Последовательность
SEQ ID NO:
Н7 консенсус 1
IP<b>KGRGLF</b>GA
218
Н7 консенсус 2
KK<b>KGRGLF</b>GA
219
Н7 консенсус 3
KR<b>EKRGLF</b>GA
220
Н8
SI<b>EPKGLF</b>GA
221
Н9
AA<b>SYRGLF</b>GA
222
Н10
II<b>QGRGLF</b>GA
223
Н11
AI<b>ATRGLF</b>GA
224
Н13
AI<b>SNRGLF</b>GA
225
В
LL<b>KERGFF</b>GA
226
Например, нить гемагглютининового эпитопа В-клеток, включающая последовательности сайтов расщепления Н1, Н2, и Н3 со встроенной аспартатной аминокислотой для того, чтобы сделать последовательность более растворимой и менее основной, будет выглядеть подобно представленной ниже: SIQSRGLFGDIESRGLFGERQTRGIFG (SEQ ID NO:227).
Пептиды с такой же сердцевинной последовательностью, но различными эпитопами В-клеток или последовательностями эпитопов, могут подвергаться совместной сборке с образованием одной SAPN для получения мультивалентного SAPN иммуногена, который возможно включает все или наиболее важные (Н1, Н2, Н3, Н5, Н7 и Н9 для человеческой вакцины) последовательности Таблицы 14 (Пример 15).
В подобном подходе SAPN для вакцины против гриппа, которая состоит из шести пептидных цепей с идентичным ядром и идентичным N-терминальным эпитопом В-клетки М2е и приблизительно 20 CTL эпитопами на C-терминальном конце (три или четыре каждого на пептидную цепь), может подвергаться совместной сборке с образованием одной SAPN (Пример 14). В Таблице 15 приведены предпочтительные консервативные CTL эпитопы, описанные у Parida R. и др., Vaccine 2007, 25:7530-7539. Поскольку сердцевина этих шести пептидных цепей является идентичной, то совместная сборка этих шести пептидных цепей в единственную SAPN позволяет ввести около 20 различных CTL эпитопов в единственную SAPN.
Таблица 15
Консервативные CTL эпитопы вируса гриппа, описанные Parida R. и др.
Название белка
Пептиды
SEQ ID NO:
HLA ограничение
Матриксный белок1
IRHENRMVL
228
В 2705
Матриксный белок1
QAYQKRMGV
229
В 5101
Неструктурный белок 1
LKMPASRYL
230
Cw 0301
Неструктурный белок 1
SRYLTDMTL
231
В 2705
Неструктурный белок 1
FMLMPKQKV
232
А 0201
Неструктурный белок 2
MRMGDFHSL
233
В 2705
Неструктурный белок 2
MRMGDFHSL
233
Cw 0301
Полимераза
YLLAWKQVL
234
А 0201
Полимераза
APIEHIASM
235
Cw 0401
Полимераза
RRNYFTAEV
236
В 2705
Нуклеокапсидный белок
IQMCTELKL
237
В 2705
Нуклеокапсидный белок
AAGAAVKGV
238
В 5101
Нуклеокапсидный белок
VGTMVMELI
239
В 5101
Полимеразный основной белок 1
NPTLLFLKV
240
В 5101
Полимеразный основной белок 1
RLIDFLкДаV
241
А 0201
Полимеразный основной белок 1
MQIRGFWF
242
В 2705
Полимеразный основной белок 1
IMFSNKMAR
243
В 2705
Полимеразный основной белок 1
MFSNKMARL
244
Cw 0401
Полимеразный основной белок 2
ERNEQGQTL
245
В 2705
Полимеразный основной белок 2
VAYMLEREL
246
В 5101
Полимеразный основной белок 2
LRHFQKDAK
247
В 2705
Полимеразный основной белок 2
VRDQRGNVL
248
В 2705
В другом предпочтительном воплощении композиции в соответствии с изобретением представляют собой иммунотерапевтические средства, которые могут использоваться для лечения метаболических расстройств и заболеваний или зависимостей. Наиболее предпочтительными являются иммунотерапевтические средства для лечения болезни Альцгеймера, гипертензии, ожирения, никотиновой и кокаиновой зависимостей.
Таблица 16
Эпитопы В клеток для SAPN вакцин
Целевой антиген
Показание(я)
Никотин
Никотиновая зависимость
Кокаин
Кокаиновая зависимость
Аβ-фрагмент (Аβ)
болезнь Альцгеймера
Ангиотензин I/II (ATII/I)
Гипертензия
Белок-переносчик эфиров холестерина (СЕТР)
Гиперлипидемия
Хорионический гонадотропный гормон человека (hCG)
Управление фертильностью
Эпидермальный фактор роста (EGF)
NSC рак легких
Фоликулостимулирующий гормон (FSH)
Управление фертильностью
Гастрин
Рак поджелудочной железы
Грелин
Ожирение
Гормон, высвобождающий гонадотропин (GnRH)
Управление фертильностью
Гормон, высвобождающий гонадотропин (GnRH)
Рак предстательной железы
Her2
Рак молочной железы
IgE
Аллергическая астма
IL-1βb
Ревматоидный артрит
Интерферон α (IFNα)
ВИЧ/СПИД
Муцин
Рак
Фактор некроза опухоли α (TNFα)
Псориаз
Фактор некроза опухоли α (TNFα)
Артрит
RANKL
Остеопороз
IL-17
Рассеянный склероз
Аβ-фрагмент (Аβ) представляет собой пептид длиной 42 аминокислоты (Aβ1-42). Поскольку последовательность цельного пептида длиной 42 аминокислоты также содержит CTL эпитопы, которые могут вызывать аутоиммунные реакции, является желательным использовать только более короткие фрагменты этого пептида для конструирования вакцины, такие, как Аβ1-12, или даже такие короткие пептиды, как Аβ1-6 (патент США 7,279,165).
Подобно этому, полноразмерный белок TNFα имеет некоторые ограничения в качестве иммуногена. Локальное перепроизводство провоспалительного TNFα играет важную роль в патогенезе некоторых хронических воспалительных расстройств, включая ревматоидный артрит, псориаз и болезнь Крона. Нейтрализация TNFα моноклональными антителами (mAb, инфликсимаб, адалимумаб) или химерными растворимыми рецепторами (этанерцепт) является эффективной в лечении таких состояний, однако имеет некоторые потенциальные побочные эффекты. Она может индуцировать специфические для аллотипа или Id-специфические антитела, которые могут ограничивать долгосрочную эффективность у многих пациентов. Кроме того, поскольку количество пациентов, подвергающихся лечению, растет, то становится очевидным, что лечение с помощью антагонистов TNFα, в частности, с помощью моноклональных антител, повышает риск оппортунистических инфекций, в частности, таких, вызванных внутриклеточными паразитами, подобными Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes или Histoplasma capsulatum. Иммунизация при использовании более коротких фрагментов TNFα, включающих только остатки 4-23, как было продемонстрировано, дает возможность избежать некоторых из этих проблем (G. Spohn и др., The Journal of Immunology, 2007, 178:7450-7457). Таким образом, иммунизация с помощью TNFα 4-23 представляет собой новую эффективную терапию для ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний, что обеспечивает новый уровень безопасности для существующих способов терапии на основе TNFα. Путем селективного нацеливания только растворимой формы TNFα и недостаточного использования трансмембранной формы патогенные эффекты TNFα нейтрализуются с помощью вакцины, в то время как важные функции в отношении хозяйского ответа на внутриклеточные патогены остаются без изменений.
Помимо никотина и кокаина также в качестве молекул гаптена при создании моделей В-клеточной SAPN вакцины для лечения зависимостей могут использоваться следующие соединения: опиаты, марихуана, амфитамины, барбитураты, глутетимид, метиприлон, хлоральгидрат, метаквалон, бензодиазепины, ЛСД, антихолинергические лекарственные средства, антипсихотические лекарственные средства, триптамин, другие психомиметические лекарственные средства, седативные средства, фенциклидин, псилоцибин, летучий нитрит, и другие лекарственные средства, индуцирующие физическую зависимость и/или психологическую зависимость.
В другом предпочтительном воплощении композиции в соответствии с изобретением представляют собой иммунотерапевтические средства, которые могут использоваться для лечения аллергий. Выбор антигенов или антигенных детерминант для композиции и способа лечения аллергий будут хорошо известны специалисту в области медицины для лечения таких расстройств. Характерные примеры антигенов и антигенных детерминант такого типа включают фосфолипазу пчелиного яда А2, Bet v I (аллерген березовой пыльцы), 5 Dol m V (аллерген яда осы пятнистой) и Der p I (клещевой аллерген домашней пыли).
В другом предпочтительном воплощении композиции в соответствии с изобретением представляют собой иммунотерапевтические средства, которые могут использоваться для лечения рака. Основные виды рака для нацеленных моделей вакцин представляют собой следующие: рак мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, рак ободочной и прямой кишки, рак пищевода, глиобластому, лейкемию (острая миелогенная и хроническая миелоидная), рак печени, рак легких (немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких), лимфому (не-Ходжинскую лимфому), меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки.
Выбор антигенов или антигенных детерминант для композиции и способа лечения рака будут хорошо известны специалисту в области медицины для лечения таких расстройств. Характерные примеры антигенов и антигенных детерминант такого типа включают следующие: HER2/neu (рак молочной железы), GD2 (нейробластома), EGF-R (злокачественная глиобластома), СЕА (рак медуллярной части щитовидной железы), CD52 (лейкемия), MUC1 (экспрессируется при гематологических злокачественных перерождениях), gp100 белок или продукт гена супрессора опухоли WT1.
В Таблице 17 показаны представляющие интерес специфические для рака эпитопы Т-клеток с релевантным белком происхождения и МНС ограничением.
Таблица 17
Раковые эпитопы Т-клеток для SAPN вакцин
Пептидная последовательность
Белок
MCH ограничение
SEQ ID NO:
KCDICTDEY
Тирозиназа
A1
249
YMDGTMSQV
Тирозиназа
A2
250
MLLAYLYQL
Тирозиназа
A2
251
AFLPWHRLF,
Тирозиназа
A24
252
AFLPWHRLFL
253
SEIWRDIDF
Тирозиназа
B44
254
YLEPGPVTA
gp100/pMEL17
A2
255
KTWGQYWQV
gp100/pMEL17
A2
256
ITDQVPFSV
gp100/pMEL17
A2
257
VLYRYGSFSV
gp100/pMEL17
A2
258
LLDGTATLRL
gp100/pMEL17
A2
259
ALLAVGATK
gp100/pMEL17
A3
260
MLGTHTMEV
gp100/pMEL17
A3
261
LIYRRRLMK
gp100/pMEL17
A3
262
ALNFPGSQK
gp100/pMEL17
A3
263
AAGIGILTV
MART-1/MelanA
A2
264
ILTVILGVL
MART-1/MelanA
A2
265
MSLQRQFLR
gp75/TRP-1
A31
266
SVYDFFVWL
TRP-2
A2
267
LLGPGRPYR
TRP-2
A31, A33
268
YLSGANLNL
CEA
A2
269
KIFGSLAFL
HER-2/neu
A2
270
VMAGVGSPYV
HER-2/neu
A2
271
IISAWGIL
HER-2/neu
A2
272
LLHETDSAV
PSMA
A2
273
ALFDIESKV
PSMA
A2
274
EADPTGHSY
MAGE-1
A1
275
SLFRAVITK
MAGE-1
A3
276
SAYGEPRKL
MAGE-1
Cw*1601
277
Пептидная последовательность
Белок
МСН ограничение
SEQ ID NO:
KMVELVHFL
MAGE-2
А2
278
YLQLVFGIEV
MAGE-2
А2
279
EVDPIGHLY
MAGE-3
А1
280
FLWGPRALV
MAGE-3
А2
281
MEVDPIGHLY
MAGE-3
В44
282
AARAVFLAL
BAGE
Cw*1601
283
YRPRPRRY
GAGE-1,2
Cw6
284
VLPDVFIRC
GnT-V
А2
285
QLSLLMWIT
NY-ESO-1
А2
286
SLLMWITQC
NY-ESO-1
А2
287
ASGPGGGAPR
NY-ESO-1
А31
288
QDLTMKYQIF
Белок весом 43 кДа
А2
289
AYGLDFYIL
р15
А24
290
EAYGLDFYIL
291
SYLDSGIHF
Мутированный бета-катенин
А24
292
ETVSEQSNV
Мутированный фактор элонгации 2
А*6802
293
FPSDSWCYF
Мутированный CASP-8 (FLICE/MACH)
В35,3
294
EEKLIWLF
Продукт гена MUM-1, Мутированный в области соединения интрона/экзона
В*4402
295
Наиболее предпочтительными являются биспирализованные последовательности, B-клеточные HTL- и CTL-эпитопы, мономерные строительные блоки, SAPN и модели вакцин, описанные в примерах.
Примеры
Следующие примеры являются полезными для дополнительного объяснения изобретения, но не путем ограничения объема изобретения.
Пример 1: PADRE (P5c-8-Mal)
pan-DR эпитоп PADRE с последовательностью AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:296) встраивали в тримерную биспирализованную нить SAPN при использовании следующих критериев модели: остаток аланина (А) обладает сильной способностью к образованию альфа-спиралей. Выравнивание с сердцевинными положениями биспирали является таким, что остатки валина, триптофана и аланина находятся в положении аа(а), aa(d) и снова аа(а) модели семичленного повтора. Оставшуюся часть тримерной биспирали N-терминального и C-терминального концов до HTL эпитопа конструировали так, что последовательность является спрогнозированной как такая, которая образует очень сильную биспираль.
Последовательность этого пептида (SEQ ID NO:7) прогнозировали для образования биспирализованной структуры при использовании программы для прогнозирования COILS. Вероятность формирования биспирали составляет более 95% для всех остатков в последовательности при использовании окна из 21 аминокислоты для предсказания биспирализованной структуры (смотри Таблицу 18 выше). Таким образом, таковая представляет собой предсказанную биспираль, которая также содержит Т-клеточный эпитоп.
Является очень важным, чтобы окно включало только 14 аминокислот, предсказание падает до очень низких значений вероятности (менее чем 2%) в пределах последовательности Т-клеточного эпитопа. Больший размер окна в пределах 21 аминокислоты с высокой предсказанной предрасположенностью последовательности к образованию биспирализованной структуры на протяжении всей последовательности демонстрирует эффект фланкирующих участков на N- и C-терминальных концах T-клеточного эпитопа. Если таковые являются последовательностями, которые сильно благоприятствуют образованию биспирали, то меньшая склонность к благоприятному образованию биспирализованной структуры эпитопа Т-клетки может быть компенсирована, и цельная последовательность будет индуцировать образование биспирализованной структуры даже тогда, когда эпитоп Т-клетки не содержит очень благоприятной биспирализованной последовательности.
Таблица 18
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:7, включающей PanDR эпитоп PADRE
Аминокислота
Окно 14
Окно 21
R
1,000
0,997
L
1,000
0,997
L
1,000
0,997
А
1,000
0,997
R
1,000
0,997
L
1,000
0,997
Е
1,000
0,997
Е
1,000
0,997
L
1,000
0,997
Е
1,000
0,997
R
1,000
0,997
R
1,000
0,997
L
1,000
0,997
Е
1,000
0,997
Е
1,000
0,997
L
1,000
0,997
А
1,000
0,997
K
1,000
0,997
F
0,970
0,997
V
0,911
0,997
А
0,710
0,997
А
0,356
0,992
W
0,062
0,961
Т
0,018
0,961
L
0,034
0,956
K
0,156
0,986
А
0,156
0,986
А
0,336
0,986
А
0,649
0,986
V
0,902
0,986
D
0,992
0,986
L
0,992
0,986
Е
0,999
0,986
L
0,999
0,986
А
0,999
0,986
А
0,999
0,986
L
0,999
0,986
R
0,999
0,986
Аминокислота
Окно 14
Окно 21
R
0,999
0,986
R
0,999
0,986
L
0,999
0,986
E
0,999
0,986
E
0,999
0,986
L
0,999
0,986
A
0,999
0,986
R
0,999
0,986
Тримерную биспираль с последовательностью SEQ ID NO:7 потом включали в последовательность SAPN SEQ ID NO:8, приведенную ниже, которая состоит из His-метки, пентамерной биспирали СОМР, тримерной биспирали, состоящей из последовательности SEQ ID NO:7, включающей PADRE Т-клеточный эпитоп, и эпитоп В-клетки из CS-белка Plasmodium berghei.
Пептид с этой последовательностью экспрессировали в E.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2 (2006) 95-102. Полученную в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастицы путем методик динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). DLS анализ выявил хороший размер распределения со средним диаметром частицы 32,01 нм и показателем полидисперсности 12,9% (Фигура 4А). ТЕМ изображения (Фигура 4В) показывают наночастицы одного и того же размера, как определено с помощью DLS.
Пример 2: Р5с-6-общий
Эта биспирализованная последовательность содержит четыре перекрывающихся HTL эпитопа с последовательностями LEELERSIW, IWMLQQAAA, WMLQQAAAR, и MLQQAAARL, которые предсказываются с помощью алгоритма SVRMHC для связывания с различными молекулами МНС II DQA1*0501, DRB1*0501, DRB5*0101, и DRB1*0401, соответственно, с предсказанными связывающими аффинностями (pIC50 значения) 6,122, 8,067, 6,682, и 6,950, соответственно. Эти HTL эпитопы выравнивают с помощью биспирализованного семичленного повтора так, что они являются спрогнозированными для формирования очень сильной биспирали. Сердцевинные положения аа(а) и aa(d) биспирализованной структуры являются занятыми Leu, Leu, Ile, Leu, Ala и Leu, большинство из них представляют собой очень хорошие остатки для высокой склонности к формированию биспирали, при этом только Ala является в некоторой степени менее благоприятным.
Таким образом, последовательность пептида прогнозируется для образования биспирализованной структуры с помощью программы COILS. Вероятность образования биспирали составляет более чем 99% для всех остатков HTL эпитопов в последовательности (Таблица 19). Сравнение размеров малого и большого окна для прогнозирования биспирали вновь продемонстрировало влияние фланкирующих последовательностей для стабильности биспирали. При размере окна 28 аминокислот цельная последовательность прогнозируется для образования биспирали с вероятностью 100%, в то время, как размер окна, который составляет 14 аминокислот, демонстрирует эффект более низкой склонности к образованию биспирали эпитопов Т-клеток на N-терминальном конце с более низкими значениями предсказания для образования биспирали. Таким образом, для цельной последовательности этот пептид предсказывается как такой, который образует стабильную биспираль, включающую четыре различных HTL эпитопа.
Таблица 19
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:9, включающей четыре различных HTL эпитопа
Аминокислота
Окно 14
Окно 28
R
0,443
1,000
L
0,443
1,000
Аминокислота
Окно 14
Окно 28
L
0,443
1,000
А
0,529
1,000
R
0,713
1,000
L
0,713
1,000
E
0,713
1,000
E
0,713
1,000
L
0,713
1,000
E
0,713
1,000
R
0,713
1,000
S
0,713
1,000
I
0,713
1,000
W
0,713
1,000
M
0,903
1,000
L
0,947
1,000
Q
0,947
1,000
Q
0,947
1,000
A
0,947
1,000
A
0,947
1,000
A
0,947
1,000
R
0,947
1,000
L
0,947
1,000
E
0,947
1,000
R
0,947
1,000
A
0,947
1,000
I
0,947
1,000
N
0,947
1,000
Т
0,947
1,000
V
0,902
1,000
D
0,992
1,000
L
0,992
1,000
E
0,999
1,000
L
0,999
1,000
A
0,999
1,000
A
0,999
1,000
L
0,999
1,000
R
0,999
1,000
R
0,999
1,000
R
0,999
1,000
L
0,999
1,000
E
0,999
1,000
E
0,999
1,000
L
0,999
1,000
A
0,999
1,000
R
0,999
1,000
Тримерную биспираль потом включали в SAPN последовательность SEQ ID NO:10, которая приведена ниже и состоит из His-метки, пентамерной биспирали СОМР, тримерной биспирали SEQ ID NO:9 и эпитопа В-клеток из CS-белка Plasmodium berghei.
Пептид с этой последовательностью экспрессировали в E.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine (смотри выше). Полученную в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастицы путем методик динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). DLS анализ выявил хороший размер распределения со средним диаметром частицы 46,96 нм и показателем полидисперсности 8,7%. ТЕМ изображения (Фигура 5) показывают наночастицы с размером приблизительно 30 нм.
Пример 3: Т1с-7 вируса гриппа
Эта биспирализованная последовательность содержит два последовательных HTL эпитопа с последовательностями IRHENRMVL и YKIFKIEKG из белков М1 и нейраминидазы вируса гриппа А, соответственно. С помощью компьютерного алгоритма SVRMHC они были предсказаны как такие, которые сильно связываются с МНС II молекулами DRB1*0405 и DRB1*0401 с предсказанными связывающими аффинностями (pIC50 значения) 8,250 и 6,985, соответственно. Кроме того, в соответствии с Parida R. и др., Vaccine 2007, 25:7530-7539, первый эпитоп Т-клетки IRHENRMVL является предсказанным для связывания со многими другими HLA молекулами, а также такими, как В14, В1510, В2705, В2706, В3909, DP9, DR11, DR12, DR17, DR53 и DRB1, то есть, он представляет собой предсказанный промискуитетный эпитоп.
Наилучшее выравнивание этих HTL эпитопов с биспирализованным семичленным повтором представлено ниже (SEQ ID NO:11). Однако последовательность второго из этих эпитопов содержит неблагоприятный остаток глицина, который в целом действует как остаток, разрушающий спираль. Фланкирующие части биспирализованного тримера представляют собой относительно короткие последовательности, но такие, которые обладают сильной способностью к образованию биспирализованной структуры. Когда используется маленькое окно размером 14 аминокислот в программе предсказания биспиральной структуры COILS, то видно, что биспирализованные структуры предсказываются для обеих сторон эпитопов Т-клеток (смотри Таблицу 20, приведенную ниже). Таким образом, цельная последовательность будет снова действовать в качестве единственной собирающейся единицы и образовывать стабильную биспираль с тримерным состояние олигомеризации.
Таблица 20
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:11, включающей два HTL эпитопа из вируса гриппа А
Аминокислота
Окно 14
R
0,716
L
0,716
L
0,716
А
0,716
R
0,716
L
0,716
Е
0,716
Е
0,716
I
0,716
R
0,716
Н
0,716
Е
0,716
N
0,716
R
0,716
М
0,256
V
0,051
L
0,051
Y
0,005
K
0,005
I
0,004
F
0,001
Аминокислота
Окно 14
K
0,011
I
0,011
Е
0,028
K
0,028
G
0,028
I
0,201
N
0,252
Т
0,467
V
0,902
D
0,992
L
0,992
Е
0,999
L
0,999
А
0,999
А
0,999
L
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
L
0,999
Е
0,999
Е
0,999
L
0,999
А
0,999
R
0,999
Тримерную биспираль потом включали в SAPN последовательность SEQ ID NO:12, которая приведена ниже, состоящую из His-метки, пентамерной Trp-застежки, тримерной биспирали, как описано выше, и эпитопа В-клеток из CS-белка Plasmodium berghei.
Пептид с этой последовательностью экспрессировали в Е.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine (смотри выше). Полученную в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастицы путем методик динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). DLS анализ показал в некоторой степени более широкий размер распределения со средним диаметром частицы 57,70 нм и показателем полидисперсности 21,6%. ТЕМ изображения (Фигура 6) показывают наночастицы с размером приблизительно 30-50 нм. Некоторые из них обладают склонностью слипаться вместе, и условия сборки будут требовать небольшого усовершенствования.
Пример 4: Прогнозирование биспиралей для раковых CTL эпитопов
В следующих примерах показано, как специфические для рака эпитопы Т-клеток могут включаться в пептид, образующий SAPN. 19 различных эпитопов Т-клеток собирали в тримерную биспираль SAPN, и соответствующие способности к образованию биспирали подсчитывали для первых 10 из этих последовательностей. Хорошо видно, что способности к образованию биспирали для эпитопов Т-клеток являются ниже, но фланкирующие последовательности с очень высокими способностями к образованию биспирали будут компенсировать и индуцировать образование биспирали на протяжении всей последовательности, подобно тому, как это представлено в Примерах 1-3, приведенных ниже.
Таблица 21
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:13 - SEQ ID NO:22, включающих раковые CTL эпитопы
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16
SEQ ID NO:17
аа
Окно 14
аа
Окно 14
аа
Окно 14
аа
Окно 14
аа
Окно 14
R
1,000
R
1,000
R
0,989
R
1,000
R
1,000
L
1,000
L
1,000
L
0,989
L
1,000
L
1,000
L
1,000
L
1,000
L
0,989
L
1,000
L
1,000
А
1,000
A
1,000
A
0,989
A
1,000
A
1,000
R
1,000
R
1,000
R
0,989
R
1,000
R
1,000
L
1,000
L
1,000
L
0,989
L
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
E
0,989
E
1,000
E
1,000
Е
1,000
Е
1,000
E
0,989
E
1,000
E
1,000
L
1,000
L
1,000
L
0,989
L
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
E
0,989
E
1,000
E
1,000
R
1,000
R
1,000
R
0,989
R
1,000
R
1,000
R
1,000
R
1,000
R
0,989
R
1,000
E
1,000
L
1,000
L
1,000
L
0,989
L
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
0,989
E
1,000
A
1,000
М
0,999
Е
1,000
I
0,948
I
0,999
G
0,998
L
0,999
L
1,000
Y
0,948
L
0,999
I
0,975
L
0,999
L
1,000
R
0,948
Т
0,999
G
0,837
А
0,999
D
1,000
R
0,948
V
0,992
I
0,509
Y
0,806
G
0,996
R
0,948
I
0,839
L
0,169
L
0,806
Т
0,716
L
0,948
L
0,839
Т
0,102
Y
0,024
А
0,403
М
0,855
G
0,098
V
0,283
Q
0,547
Т
0,083
K
0,855
V
0,087
E
0,637
L
0,547
L
0,083
L
0,855
L
0,289
L
0,637
Е
0,547
R
0,025
Е
0,855
E
0,289
E
0,637
R
0,547
L
0,020
R
0,855
R
0,289
R
0,637
А
0,547
A
0,092
А
0,855
A
0,289
A
0,637
I
0,547
I
0,201
I
0,855
I
0,289
I
0,637
N
0,547
N
0,252
N
0,855
N
0,289
N
0,637
Т
0,547
Т
0,467
Т
0,855
Т
0,467
Т
0,637
V
0,902
v
0,902
V
0,902
V
0,902
V
0,902
D
0,992
D
0,992
D
0,992
D
0,992
D
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
Е
0,999
E
0,999
Е
0,999
E
0,999
E
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
А
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
А
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16
SEQ ID NO:17
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
А
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
SEQ ID NO:18
SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
R
0,997
R
1,000
R
1,000
R
0,981
R
0,761
L
0,997
L
1,000
L
1,000
L
0,993
L
0,761
L
0,997
L
1,000
L
1,000
L
0,993
L
0,761
A
0,997
A
1,000
A
1,000
A
0,993
A
0,915
R
0,997
R
1,000
R
1,000
R
0,993
R
0,915
L
0,997
L
1,000
L
1,000
L
0,993
L
0,915
E
0,997
E
1,000
E
1,000
E
0,993
E
0,915
E
0,997
E
1,000
E
1,000
E
0,993
E
0,915
L
0,997
L
1,000
L
1,000
L
0,993
L
0,915
E
0,997
E
1,000
E
1,000
E
0,993
E
0,915
R
0,997
R
1,000
R
1,000
R
0,993
R
0,915
R
0,997
R
1,000
R
1,000
L
0,993
A
0,915
M
0,997
L
1,000
L
1,000
L
0,993
L
0,915
S
0,997
E
1,000
E
1,000
H
0,993
F
0,915
L
0,963
K
1,000
I
0,998
E
0,993
D
0,997
Q
0,963
I
0,999
I
0,986
Т
0,912
I
0,997
R
0,963
F
0,983
S
0,986
D
0,912
E
0,997
Q
0,963
G
0,871
A
0,986
S
0,831
S
0,997
F
0,364
S
0,493
V
0,812
A
0,788
K
0,997
L
0,663
L
0,493
V
0,605
V
0,788
V
0,997
R
0,663
A
0,219
G
0,040
E
0,876
E
0,997
E
0,663
F
0,098
I
0,085
E
0,876
E
0,997
L
0,663
L
0,289
L
0,289
L
0,876
L
0,997
E
0,663
E
0,289
E
0,289
E
0,876
E
0,997
R
0,663
R
0,289
R
0,289
R
0,876
R
0,997
A
0,663
A
0,289
A
0,289
A
0,876
A
0,997
I
0,663
I
0,289
I
0,289
I
0,876
I
0,997
N
0,663
N
0,289
N
0,289
N
0,876
N
0,997
Т
0,663
Т
0,467
Т
0,467
Т
0,876
Т
0,982
V
0,902
V
0,902
V
0,902
V
0,902
V
0,980
D
0,992
D
0,992
D
0,992
D
0,992
D
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
L
0,992
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
SEQ ID NO:18
SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:20
SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:22
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
aa
Окно 14
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
E
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
L
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
A
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
R
0,999
Следующие последовательности аналогичным образом демонстрируют высокую способность к образованию биспирали, несмотря на то, что способность к образованию биспирали для эпитопов Т-клеток является более низкой, но фланкирующие последовательности с очень высокими способностями к образованию биспирали будут компенсировать это и индуцировать образование биспирали на протяжении всей последовательности.
Пример 5: ВИЧ-V3
Эта биспирализованная последовательность содержит антипараллельный виток пептида, который представляет собой конец V3 петли gp120 из ВИЧ. Этот пептид представляет собой хорошо известный эпитоп В-клетки ВИЧ. Его встраивали в биспирализованный семичленный повтор с помощью двух глициновых остатков в положениях аа(b) и аа(с) биспирали.
Фланкирующие части биспирализованного тримера представляют собой относительно короткие последовательности, но такие, которые обладают сильной способностью к образованию биспирали. Когда используется маленькое окно размером 14 аминокислот в программе предсказания биспиральной структуры COILS, то можно увидеть, что биспирализованные структуры предсказываются для обеих сторон эпитопов В-клеток (смотри Таблицу 22, приведенную ниже). Таким образом, цельная последовательность будет снова действовать в качестве единственной собирающейся единицы и образовывать стабильную биспираль с тримерным состоянием олигомеризации с выступающим бета-витком пептида.
Таблица 22
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:32, включающей два эпитопа В-клеток ВИЧ
Аминокислота
Окно 14
R
1,000
L
1,000
L
1,000
А
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Аминокислота
Окно 14
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
G
1,000
S
1,000
I
0,992
R
0,969
I
0,843
G
0,271
P
0,000
G
0,000
Q
0,004
Т
0,004
F
0,007
Y
0,098
A
0,396
G
0,611
V
0,927
D
0,999
L
0,999
E
1,000
L
1,000
A
1,000
A
1,000
L
1,000
R
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
E
1,000
Аминокислота
Окно 14
Е
1,000
L
1,000
А
1,000
R
1,000
Пример 6: Аналитическое ультрацентрифугирование Р5с
Пептид следующей последовательности (SEQ ID NO:33) рекомбинантно экспрессировали в стандартной экспрессионной системе Е.coli при использовании аффинной схемы очистки с His-меткой:
Эта последовательность является родственной с последовательностями из Примеров 1 и 2 (SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10), но без C-терминального конца B-клеточного эпитопа. Образовавшаяся SAPN не имеет дисульфидного мостика между двумя спиралями (подчеркнутые остатки 55 и 64, замена двух цистеинов аланином по сравнению с исходной моделью Raman S. и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102), но предпочтительно содержит вместо этого меньшую аминокислоту аланин, что позволяет установить меньшие углы между двумя спиралями и, таким образом, в SAPN встраиваются более чем 60 пептидных цепей.
Проверяли три условия для сборки наночастиц из мономерного строительного блока SEQ ID NO:33. Молекулярный вес (MB) SAPN оценивали с помощью аналитического ультрацентрифугирования: пептид растворяли при концентрации 0,42 мг/мл, 0,34 мг/мл и 0,21 мг/мл в 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7,5. Измеренные значения MB соответствуют SAPN, которая состоит из 330 мономеров, то есть, наночастице с большим количеством мономеров, чем требуется для правильного многогранника с 60 асимметрическими единицами (Таблица 23). Две спирали двух доменов олигомеризации не фиксируются дисульфидной связью в своей относительной ориентации относительно друг друга, а меньшая аминокислота аланин позволяет сделать две спирали ближе и, таким образом, угол между ними становится меньше.
Таблица 23
Аналитическое ультрацентрифугирование SEQ ID NO:33
Концентрация
MB кДа
Количество мономеров
0,42 мг/мл
4331
344
0,34 мг/мл
4128
328
0,21 мг/мл
4066
323
Пример 7: Тримерная биспираль с серией перекрывающихся подсчитанных HTL эпитопов (pan3m)
Приведенная ниже структура представляет собой пример модели тримерной биспирали, которая включает пептидные эпитопы из полимеразы вируса гепатита В, которая может подвергаться измерению в отношении связывающих аффинностей с различными МНС II молекулами (Mizukoshi Е. и др., J Immunol 2004, 173: 5863-5871). Два из этих пептидов были последовательно сконструированы в виде тримерной биспирали в соответствии с принципами, описанными в этом документе.
Измеренные связывающие аффинности пептидов, содержащихся в последовательности LQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAF из полимеразы вируса гепатита В для различных МНС II молекул, являются следующими (связывающие аффинности в нМ приведены в скобках); DRB1*0101 (2), DRB1*0301 (62), DRB1-0401 (10), DRB1*0405 (17), DRB1*0701 (173), DRB1*0802 (598), DRB1*0901 (791), DRB1*1101 (303), DRB1*1201 (397), DRB1*1302 (143), DRB1*1501 (21), DRB3*0101 (5), DRB4-0101 (7).
Последовательность пептида прогнозировали для образования биспирали с помощью программы для предсказания COILS. Вероятность формирования спирали составляет более 98% для всех остатков в последовательности (Таблица 24), таким образом, цельная последовательность является спрогнозированной для образования полностью собранной биспирали.
Таблица 24
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:34
Аминокислота
Окно 28
R
1,000
L
1,000
L
1,000
А
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Q
1,000
S
1,000
L
1,000
Т
1,000
N
1,000
L
1,000
L
1,000
S
1,000
S
1,000
N
1,000
L
1,000
S
1,000
W
1,000
L
1,000
S
1,000
L
1,000
D
0,999
V
0,996
S
0,996
А
0,996
А
0,996
F
0,996
R
0,996
R
0,996
L
0,996
Е
0,996
Аминокислота
Окно 28
Е
0,996
L
0,996
Е
0,996
А
0,996
R
0,996
V
0,996
М
0,988
Пример 8: Тримерная биспираль с серией перекрывающихся предсказанных HTL эпитопов (pan3p)
Приведенная ниже структура представляет собой пример модели тримерной биспирали, которая включает часть HTL эпитопов из последовательности SEQ ID NO:34, описанной у Mizukoshi Е. и др., J Immunol 2004, 173:5863-5871, в комбинации с последовательностью, которая представляет собой часть последовательности HTL эпитопа PADRE.
Приведенные ниже сведения представляют собой связывающие аффинности, как предсказано с помощью алгоритма NetMHCII, эпитопов, содержащихся в последовательности ARFVAAWTLKVREVERELSWLSLDVSAAF, для различных молекул класса МНС II (связывающие аффинности в нМ в скобках): DRB1*0101 (23), DRB1*0401 (72), DRB1*0405 (37), DRB1*0701 (164), DRB1*0802 (462), DRB1*0901 (440), DRB1*1101 (271), DRB1*1302 (303), DRB1*1501 (16), DRB3*0101 (60), DRB4*0101 (51). Эта последовательность содержит в некоторой степени такие же эпитопы, что и последовательность pan3m (SEQ ID NO:34), которая, как было показано, демонстрирует даже более сильное связывание с молекулами МНС II, чем предсказано с помощью программы NetMHC II (Mizukoshi Е. и др., J Immunol 2004, 173:5863-5871).
Последовательность пептида предсказывали для образования биспирали с помощью программы для прогнозирования COILS. Вероятность формирования биспирали составляет более 80% для всех остатков в последовательности (Таблица 25), за исключением 8 остатков. Таким образом, последовательность является спрогнозированной для образования полностью собранной биспирали с C-терминальным концом, расположенным немного в отдалении, который не препятствует образованию SAPN, поскольку большая часть последовательности на N-терминальном конце образует биспираль.
Таблица 25
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:35
Аминокислота
Окно 28
R
1,000
L
1,000
L
1,000
А
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
А
1,000
R
1,000
F
1,000
V
1,000
А
1,000
А
1,000
W
1,000
Т
1,000
L
1,000
K
1,000
V
1,000
R
1,000
Е
1,000
V
1,000
Е
1,000
R
1,000
Е
1,000
L
1,000
S
1,000
W
0,971
L
0,971
S
0,838
L
0,593
Аминокислота
Окно 28
D
0,532
V
0,206
S
0,070
A
0,032
A
0,011
F
0,004
R
0,004
Пример 9: Тетрамерная биспираль с серией перекрывающихся предсказанных HTL эпитопов (BN5c-M2eN)
Последовательность тетрамерной биспирали из тетрабрахиона (Stetefeld J. и др., Nature Structural Biology 2000, 7(9):772-776) характеризуется преимущественным одиннадцатичленным биспиральным повтором, вместо семичленного повтора. Следующая слабо модифицированная последовательность получена из этой тетрамерной биспирали.
Эта тетрамерная биспираль является особенно приемлемой в качестве биспиральной структуры SAPN, поскольку она содержит серию перекрывающихся предсказанных HTL эпитопов. Последовательности эпитопов YRLTVIIDD, LKNLITLRA, LITLRADRL, IINDNVSTLR, INDNVSTLRA и VSTLRALLM предсказываются с помощью алгоритма NetMHCII для связывания с различными молекулами МНС II DRB1*0101, DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0701, DRB1*1101, DRB1*1302, и DRB1*1501, соответственно, с предсказанными связывающими аффинностями (нМ) 3, 48, 78, 162, 243, 478, 12 и 420, соответственно.
Тетрамерная биспираль является также в высокой степени приемлемой для презентации эпитопов В-клеток, таких, как М2е пептид из вируса гриппа, который был создан в соответствующей модели SAPN для человеческой вакцины, с последовательностью (SEQ ID NO:37):
Пептид (SEQ ID NO:37) содержит, начиная от N-терминального конца: His-метку, М2е эпитоп В-клеток из специфического для человека штамма вируса гриппа, тетрамерную биспираль с HTL эпитопами, линкер и тримерную биспираль. Эту последовательность экспрессировали в Е.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine (смотри выше). Полученную в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастицы путем методики просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). ТЕМ изображения (Фигура 7А) показывают наночастицы с размером приблизительно 30 нм.
Кроме того, может быть продемонстрирован специфический для кур пептид М2е из вируса гриппа в своем нативном состоянии олигомеризации и конформации в виде тетрамера на тетрамерной биспирали тетрабрахиона, которую создавали в следующей модели SAPN для животной вакцины с последовательностью (SEQ ID NO:38):
Пептид с этой последовательностью (SEQ ID NO:38) экспрессировали в Е.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Он содержит, начиная от N-терминального конца: His-метку, М2е эпитоп В-клеток из специфического для кур штамма вируса гриппа, тетрамерную биспираль с HTL эпитопами, линкер и тримерную биспираль. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2006; 2:95-102 с буфером 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl и 5% глицерином. Полученные в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастицы путем методик динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). DLS анализ показал распределение размера со средним значением диаметра частицы 45 нм и показатель полидисперсности 8,9%. ТЕМ изображения (Фигура 7В) продемонстрировали наночастицы того же размера, составляющего 30 нм.
Пример 10: Пентамерная биспираль с серией перекрывающихся предсказанных HTL эпитопов
Эту последовательность прогнозировали для образования α-спирали (Н) с высокой вероятностью (в основном, наиболее высокий показатель 9) в соответствии со вторичной структурой с помощью программы для предсказания PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ - The PSIPRED Protein Structure Prediction Server). Поскольку сердцевинные положения аа(а) и aa(d) семичленного повтора биспирали представляют собой, главным образом, остатки триптофана, эта последовательность была спрогнозирована для образования пентамерной биспирали (Liu J и др., Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(46):16156-61).
Последовательность этой пентамерной биспирали содержит частично перекрывающиеся HTL эпитопы с последовательностями FVAAWTLKV, WKIWKSLWK и KSLWKAWRL, которые являются предсказанными с помощью алгоритма NetMHC II для связывания с различными молекулами МНС II DRB1*0101, DRB-T0401, DRB1*0405, DRB1*0701, DRB1*0801, DRB1*0901, DRB1*1101, DRB1*1501 и DRB5*0101, соответственно, с предсказанными связывающими аффинностями (нМ) 24, 73, 13, 120, 42, 596, 396, 6 и 13, соответственно.
Пример 11: Тримерная биспираль с HTL эпитопом Plasmodium falciparum (t811c-9-pf)
Приведенная ниже структура представляет собой пример модели тримерной биспирали, которая включает pan DR связывающий эпитоп из Plasmodium falciparum. Последовательность соответствует 17 C-терминальным аминокислотам с двумя цистеинами, замененными аланинами, которая также является известной как CS.T3 пептид (SEQ ID NO:40) из белка спрозоита CS.
В анализе клеточной пролиферации было показано, что этот CS.T3 пептид обладает pan DR активностью и является стимуляторным для DR1, DR2, DR4, DR5, DRw6, DR7 и DR9 молекул (патент США 5,114,713).
Последовательность этого пептида является предсказанной для образования биспирали при использовании программы для прогнозирования COILS. Вероятность образования биспиральной структуры составляет более 99% для всех остатков этой последовательности (Таблица 26), за исключением последних двух аминокислот. Таким образом, цельная последовательность прогнозируется как такая, которая образует полностью собранную биспираль.
Таблица 26
Способность к образованию биспирали для SEQ ID NO:40
Аминокислота
Окно 28
R
1,000
L
1,000
L
1,000
L
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
L
1,000
Е
1,000
R
1,000
R
1,000
L
1,000
Е
1,000
Е
1,000
Аминокислота
Окно 28
L
1,000
Е
1,000
K
1,000
K
1,000
I
1,000
А
1,000
K
1,000
M
1,000
Е
1,000
K
1,000
А
1,000
S
1,000
S
1,000
V
1,000
F
1,000
N
1,000
V
1,000
V
1,000
L
1,000
А
0,999
А
0,997
L
0,997
R
0,991
R
0,991
R
0,991
L
0,991
Е
0,991
Е
0,991
L
0,991
А
0,927
R
0,927
Эту биспираль (SEQ ID NO:40) использовали для модели SAPN со следующей последовательностью (SEQ ID NO:41)
Эта последовательность (SEQ ID NO 41) содержит his-метку, пентамерную триптофановую застежку, линкер, тримерную биспираль SEQ ID NO:40 и B-клеточный эпитоп Plasmodium falciparum, который представляет собой тчетырехчленный повтор (NANP) повторяемой последовательности того же белка спорозоита CS.
Пептид с этой последовательностью экспрессировали в Е.coli и очищали на колонке с никелевой аффинностью с помощью стандартных биотехнологических процедур. Повторную сборку осуществляли в соответствии с Raman S. и др., Nanomedicine (смотри выше). Полученную в результате сборки SAPN подвергали анализу на образование наночастиц путем методик динамического рассеяния света (DLS) и просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ). DLS анализ при рН 6,5 показал распределение размера со средним значением диаметра частицы 44,6 нм и показатель полидисперсности 19,6%. ТЕМ изображения (Фигура 8) показывают наночастицы с размером приблизительно 30 нм.
Пример 12: Вакцина проти ВИЧ: продукт совместной сборки HTL, CTL, В-клеточных эпитопов
Приведенная ниже структура представляет собой модель ВИЧ вакцины. Эти консервативные белковые последовательности содержат CTL эпитопы, спрогнозированные как такие, которые связываются с HLA молекулами, как приведено в Таблице 10.
Первые семь цепей CTL пептида Таблицы 10 конструировали на C-терминальном конце шести пептидных цепей с идентичным ядром и идентичным N-терминальным эпитопом В-клетки и, таким образом, осуществляли совместную сборку с образованием SAPN.
Сердцевина содержит тот же тример, что и в Примере 11, с промискуитетным HTL эпитопом Р. falciparum, связанным с Trp застежкой пентамерной биспирали, которая содержит PADRE HTL эпитоп.
Эпитоп В-клеток представляет собой проксимальный участок мембраны GP41, который обладает нейтрализующим потенциалом, как является очевидным из связывания с моноклональными нейтрализующими антителами 2F5 и 4Е10. Этот эпитоп представляет собой α-спираль в решении и удерживается в α-спиральной конформации за счет того, что является частично сконструированным в виде пентамерной биспирали. В этой модели поверхность доступных остатков (то есть, остатков, которые не являются биспирализованными сердцевинными остатками) является такой, которая связывается с антителом 4Е10.
Пример 13: Вакцина против малярии: продукт совместной сборки ядра на основе HTL-CTL-B-клеточных эпитопов, эпитопов В-клеток и CTL
Приведенная ниже структура представляет собой пример малярийной SAPN вакцины, которая состоит из шести пептидных цепей с идентичной сердцевиной и идентичного C-терминального эпитопа В-клеток, а также 18 CTL эпитопов на N-терминальном конце (по три на каждую пептидную цепь), подвергшихся совместной сборке в одну SAPN.
Сердцевина (подчеркнуто) представляет собой комбинацию тримерной биспирали, которая содержит CTL эпитоп MEKLKELEK и модифицированный эпитоп В-клеток KLRNLEEELHSLRKNLNILNEELEELT (последовательность 27 у Villard V. и др., PLoS ONE 2007, 2(7):е645), а также пентамер, представленный в Примере 10, с отличными свойствами связывания panDR. На C-терминальном конце все шесть пептидных цепей имели идентичный B-клеточный эпитоп, который представляет собой четырехчленный повтор (NANP) повторяемой последовательности белка спорозоита CS из Plasmodium falciparum. На N- терминальном конце содержится 18 различных CTL эпитопов Р. falciparum (патенты США 5,028,425, 5,972,351, 6,663,871) по три различных эпитопа на цепь. CTL-эпитопы разделены с помощью оптмизированных протеосомальных сайтов расщепления (http://www.paproc2.de/paproc1/paproc1.html; Hadeler K.P. и др., Math. Biosci. 2004, 188:63-79). Поскольку сердцевина этих шести пептидных цепей является идентичной, то совместная сборка этих шести пептидных цепей в одну SAPN позволяет встраивать приблизительно 18 различных CTL эпитопов в одну SAPN.
Пример 14: Вакцина против гриппа: продукт совместной сборки HTL-сердцевины, B-клеточного тетрамера, CTL
Приведенная ниже структура представляет собой пример SAPN для вакцины против гриппа, которая состоит из шести пептидных цепей с идентичной сердцевиной и идентичным N-терминальным эпитопом В-клеток М2е и приблизительно из 20 CTL эпитопов на C-терминальном конце (по три или четыре каждого на пептидную цепь), подвергнутых совместной сборке в одну SAPN. Сердцевина (подчеркнуто) представляет собой комбинацию тримера из Примера 7 и тетрамера из Примера 9 с отличными свойствами связывания panDR. Тетрамерный N-терминальный эпитоп В-клеток является таким же, как и в Примере 9. На C-терминальном конце размещаются консервативные CTL эпитопы, как описано у Parida R. и др., Vaccine 2007, 25:7530-7539 (Таблица 15). Поскольку сердцевина этих шести пептидных цепей является идентичной, то совместная сборка этих шести пептидных цепей в одну SAPN позволяет встраивать приблизительно 20 различных CTL эпитопов в одну SAPN.
Пример 15: Вакцина против гриппа: продукт совместной сборки HTL-сердцевины, B-клеточного тетрамера, пептида расщепления
Приведенная ниже структура представляет собой пример SAPN для вакцины против гриппа, которая состоит из трех пептидных цепей с идентичной сердцевиной и идентичным N-терминальным эпитопом В-клеток М2е и девяти эпитопов В-клеток на C-терминальном конце (по три на каждую пептидную цепь), подвергнутых совместной сборке в одну SAPN.
Сердцевина (подчеркнуто) представляет собой комбинацию тримера из Примера 8 и тетрамера из Примера 9 с отличными свойствами связывания panDR. Тетрамерный N-терминальный эпитоп В-клеток является таким же, как и в Примере 9. C-терминальные эпитопы В-клеток представляют собой такие, как в Таблице 8 для Н1, Н2, Н3, Н5 консенсусных 1, Н5 консенсусного 2, Н7 консенсусного 1, Н7 консенсусного 2, Н7 консенсусного 3, Н9 с негативными зарядами между эпитопами для того, чтобы сделать нить B-клеточного эпитопа менее позитивно заряженной.