Вклад гомеостатической пролиферации и связанных с ней процессов в восстановление популяции периферических Т-клеток в условиях лимфопении, индуцированной облучением

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.42-018.1-02:614.876]-08-092.9

А.Н. Митин, М.М. Литвина, В.В. Комогорова, Н.И. Шарова, А.А. Ярилин

ВКЛАД ГОМЕОСТАТИЧЕСКОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И СВЯЗАННЫХ С НЕЙ

процессов в восстановление популяции периферических t-клеток в условиях лимфопении, индуцированной облучением

ФГБУ - ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г Москва

В работе рассмотрены феноменология и некоторые механизмы восстановления популяции периферических Т-клеток (Т-клетки селезенки и лимфатических узлов) после действия сублетальных доз ионизирующей радиации. Существенных различий в динамике восстановления основных и минорных субпопуляций Т-клеток не выявлено. Принципиальная особенность восстановления периферических Т-клеток по сравнению с регенерацией тимуса состоит в ее непрерывности, отсутствии вторичной атрофии, что обеспечивает поддержание (пусть на сниженном уровне) защиты организма от патогенов. Из двух механизмов восстановления популяции периферических Т-лимфоцитов - тимопоэза и гомеостатической пролиферацией самих Т-клеток - в данной работе рассмотрена роль второго механизма. Показано 2-4-кратное повышение доли пролиферирующих (Ki-67+) Т-клеток на протяжении всего восстановительного периода (с 4-х по 60-е сутки после облучения), что служит проявлением гомеостатической пролиферации Т-клеток. Спектр наивных Т-клеток и Т-клеток памяти проанализирован по экспрессии маркерных молекул CD62L и CD44. Содержание наивных Т-клеток (CD62LhiCD44'°) остается ниже уровня контроля до конца периода наблюдения (60-е сутки), тогда как уровень CD44hi Т-клеток памяти достигает исходного уже на 20-е сутки, а затем превосходит его. Предполагается, что по крайней мере частично такая ситуация является следствием фенотипической конверсии наивных Т-клеток, вступающих в гомеостатическую пролиферацию, в Т-клетки памяти центрального типа (CD62LhiCD44hi), о чем свидетельствует также повышение в ходе восстановительных процессов доли CD62LhiCD44hi-клеток, слабо экспрессирующих молекулу CD49d. Эти клетки рассматриваются как суррогатные Т-клетки памяти, с накоплением которых связывают развитие в последующем аутоиммунных процессов.

Ключевые слова: Т-лимфоциты, лимфатические узлы, селезенка, ионизирующая радиация, гомеостатическая пролиферация, регенерация, проточная цитометрия

A.N. Mitin, M.M. Litvina, V.V Komogorova, N.I. Sharova, A.A. Yarilin

CONTRIBUTION OF HOMEOSTATIC PROLIFERATION AND RELATED PROCESSES TO RESTORATION OF PERIPHERAL T CELL POPULATION IN IRRADIATION INDUCED LYMPHOPENIA

National Research Centre “Institute of Immunology” FMBA of Russia, 115478, Moscow

In this study we have examined phenomenology and some mechanisms of peripheral T cells (in spleen and lymphnodes) restoration in sublethal irradiated mouse. No significant differences were detected in the restoration dynamics of main and minor T cells subpopulations. A fundamental feature of peripheral T-cells restoration in comparison with thymus regeneration is its continuity, absence of secondary athrophy, that provides (albeit on a reduced level) protection of the body from pathogens. There are two mechanisms of peripheral T cells restoration - thymopoiesis and homeostatic proliferation of T cells. In this study the role of the second mechanism was examined. It was shown 2-4-fold increase in the share of proliferating (Ki-67+) T cells during all restoration period (from 4 to 60 day after irradiation) as demonstration of homeostatic T cells proliferation. The varieties of naive and memory T cells were analyzed according to their expression of molecular markers CD62L and CD44. The number of naive Tcells (CD62LhiCD44'°) remained below the level of control until the end of observation period (60 day), while the number of CD44hi memory T cells reached the initial level already at the 20 day, and then exceeded it. It is supposed that, at least in part, this situation was the consequence of phenotypic conversion of naive T cells undergoing homeostatic proliferation in central memory T cells (CD62LhiCD44hi). This assumption is in accordance with increase in the share of CD62LhiCD44hi cells with low expression of CD49d molecule during restoration processes. These cells are considered as “surrogate” memory T cells, which accumulation is associated with the subsequent development of autoimmune processes.

Key words: T lymphocytes, lymphnodes, spleen, irradiation, homeostatic proliferation, regeneration, flow cytometry

Лимфопения, в том числе затрагивающая Т-лимфоциты, развивается при разнообразных внешних воздействиях на организм (ионизирующие излучения, химиотерапевтические

Митин Александр Николаевич (Mitin Alexander Nikolaevich), mitin@inbox.ru; Литвина Марина Михайловна (Litvina Marina Mikhailovna); Комогорова Виктория Вячеславовна (komogorova viktoria Vyacheslavovna); Шарова Нина Ивановна (Sharova Nina Ivanovna); ярилин Александр Александрович (Yarilin Alexander Alexandrovich).

препараты) и заболеваниях (вирусные инфекции, первичные иммунодефициты). Многие вопросы, связанные с восстановительными процессами в Т-клеточной популяции, были рассмотрены еще в 1970-е годы [1, 2]. Однако значимость данной проблемы со временем возрастает, что побудило нас обратиться к пересмотру феноменологии восстановления периферических Т-клеток и анализу его механизмов с учетом современных концепций, касающихся механизмов гомеостаза в Т-клеточном отделе иммунной системы [3-5], и использованием современных технологий, прежде всего проточной цитометрии.

- 242 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Известны два источника восстановления популяции периферических Т-клеток в условиях Т-клеточной лимфопении - тимопоэз и гомеостатическая пролиферация самих периферических Т-лимфоцитов [5, 6]. В данной работе мы рассматриваем лишь второй аспект проблемы, анализируемый в опытах на сублетально облученных мышах.

Цель работы состояла в изучении восстановления субпопуляций Т-клеток во вторичных лимфоидных органах (лимфатические узлы и селезенка), оценке выраженности и динамики пролиферации Т-клеток на протяжении всего периода пострадиационной регенерации и установлении связи этого процесса с особенностями спектра наивных Т-клеток/ Т-клеток памяти, которые имеют отношение к фенотипической конверсии пролиферирующих наивных Т-клеток [7, 8] - процессу, имеющему неоднозначные, в том числе патологические, последствия и служащему своеобразной платой за успешную регенерацию Т-клеток [9].

Материалы и методы. Объектом исследования стали мыши линии C57BL/6, самки массой 18-20 г, полученные из питомника РАМН «Столбовая».

Мышей подвергали воздействию у-излучения 137Cs на установке «Стебель» в дозе 4 Гр. Забой мышей и исследование органов проводили через 4, 8, 12, 20, 30 и 60 сут после облучения. Контролем служили мыши соответствующего возраста и того же помета, что и мыши, облученные в соответствующие сроки. В каждой точке исследования использовали по 6 мышей в опытной и контрольной группах.

Селезенку и лимфоузлы (по два подколенных и подмышечных) извлекали, освобождали от соединительной ткани, эритроциты селезенки лизировали буфером фирмы «eBioscience» (США). Клетки суспензировали в PBS с 1% BSA и 0,1% NaN3. Численность клеток в органе определяли путем подсчета в камере Горяева. Клетки инкубировали с моноклональными антителами (АТ) в том же буфере в течение 30 мин при 4°С. В случае определения экспрессии Ki-67 и Foxp3 после постановки поверхностных моноклональных АТ клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы «eBioscience» (США) («Foxp3 Fixation/ Peimeabilization Buffer»), согласно методическим указаниям фирмы. После этого клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте с моноклональными АТ к Ki-67 или Foxp3, снова отмывали и сразу без фиксации анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции регуляторных клеток, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson, США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.

Использовали моноклональные АТ, меченные различными флюорохромами - FITC (флюо-ресцеина изотиоцианат), PE (фи-коэритрин), APc (алофикоциа-нин), PerCP-Cy5.5 (перидинин хлорофилл протеин - цианин 5.5),

PE-cy7 (фикоэритрин - цианин 7), Alexa Fluor 647, APc-eFlu-or780. Использовали следующие комбинации моноклональных АТ фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических кон-тролей той же фирмы):

1) анти-СЭЗ- APC+анти-СШ-PE + анти-СD8-PeIСP-Сy5.5;

2) анти-СD3-PE-Сy7 + анти-CD44-PerCP-Cy5.5 + анти-СШ2-

L-APC-eFluor780 + анти-СD49d-PE + анти-Ki-67-AlexaFlu-or647;

3) анти-СШ-FITC + анти-СD8-PerСP-Сy5.5 + анти^25-APC + анти-Foxp3-PE;

4) анти-TCRgammadelta-APC + анти-СЭ4-РЕ + анти-CD8-PerCP-Cy5.5.

Статистическую обработку данных по численности клеток проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики; результаты выражали в виде M±SD, где М - средняя арифметическая, SD - стандартное отклонение. Достоверность различия сравниваемых величин оценивали с помощью /-критерия Стьюдента. Корреляцию оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона - г.

Результаты и обсуждение. ВосстановлениеТ-лим-фоцитов после сублетального облучения. Обращение к этому вопросу не являлось для нас самоцелью (хотя бы потому, что в общих чертах он давно решен [1]). Однако данные о восстановлении Т-клеток и их субпопуляций послужили базой для анализа роли пролиферации Т-клеток и конверсии их фенотипа в цепи пострадиационных событий. Эти данные отражены в табл. 1 и на рис. 1, 2.

На 4-е сутки после облучения в дозе 4 Гр достигается максимум опустошения лимфоидной ткани, в том числе снижения численности Т-лимфоцитов во вторичных лимфоидных органах. Абсолютное содержание CD3+ Т-клеток при этом снижается до 0,1 исходного, CD4+CD8- - до 0,11, а CD4-CD8+ Т-клеток - до 0,07. При этом процентное содержание Т-клеток в органах даже несколько возрастает (до 60) за счет их более высокой радиорезистентности по сравнению с таковой В-клеток, однако уже на 8-е сутки соотношение меняется на противоположное. Обращает внимание существенно более высокая радиоустойчивость регуляторных Т-клеток, чем других субпопуляций: на 4-е сутки после облучения их содержание составляет в лимфоузлах 0,33, а в селезенке 0,29 исходного.

Из данных, представленных в табл. 1 и на рис. 1, следует, что восстановительные процессы в полном объеме реализуются в течение 2 мес, однако уже к 30-м суткам содержание Т-клеток как в лимфатических узлах, так и в селезенке значимо не отличается от исходного. Тем не менее во всех случаях средние величины в этот срок ниже, чем в контроле, и их полная нормализация достигается к 60-м суткам.

Принципиально важным является непрерывный характер восстановительных процессов: какие-либо признаки вторичной атрофии популяции Т-клеток, четко наблюдаемые в тимусе с максимальным выражением на 20-е сутки [10], в лим-

Таблица 1

Восстановление в динамике численности основных популяций Т-клеток лимфоузлов и селезенки после общего у-облучения мышей в дозе 4 Гр

Показатель Необ- лученные (контроль) Сутки после облучения

4-е 8-е 12-е 20-е 30-е 60-е

Лимфатические узлы

CD3+ абс. 8,8±2,1 0,4±0,2* 0,9±0,1* 2,4±0,3* 3,8±1,1* 7,6±1,3 8,5±0,1

CD3+CD4+ абс. 4,7±1,0 0,2±0,1* 0,6±0,1* 1,5±0,2* 2,3±0,6* 4,1±0,9 4,8±0,2

CD3+CD8+ абс. 3,7±1,0 0,1±0,05* 0,3±0,03* 0,7±0,02* 1,0±0,4* 2,9±0,4 3,2±0,2

Treg абс. 0,6±0,2 0,2±0,1* нд 0,1±0,02* 0,3±0,02* 0,8±0,03 0,8±0,2

CD4+/ CD8+ 1,3±0,2 2,2±0,8 2,1±0,2* 2,5±0,2* 2,2±0,1* 1,4±0,3 1,4±0,1

Селезенка

CD3+ абс. 53,2±14,0 5,5±2,2* 20,7±3,5* 24,5±11,2* 37,9±1,9* 41,15±1,9 46,6±11,2

CD3+CD4+ абс. 27,2±6,6 3,2±1,3* 11,8±1,7* 12,8±7,2* 20,8±1,5* 19,7±3,0 24,1±6,3

CD3+CD8+ абс. 21,0±2,0 1,7±0,4* 6,1±0,8* 6,3±2,6* 11,6±1,2* 14,9±0,9 18,4±2,2

Treg абс. 2,8±0,7 0,8±0,3* нд 1,2±0,5* 1,6±0,2* 2,8±0,3 2,6±0,4

CD4+/CD8+ 1,3±0,4 2,0±0,1* 2,0±0,2* 2,0±0,03* 1,8±0,5 1,3±0,3 1,3±0,1

Примечание. Здесь и в табл. 2: численность клеток в млн; * - p<0,05.

- 243 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

4-е 12-е 20-е 28-е 36-е 44-е 52-е 60-е

CD3

- CD3+4+

CD3+8+

Рис. 1. Восстановление в динамике численности субпопуляций Т-клеток на разные сроки после облучения.

Здесь и на рис. 3, 6 по оси абсцисс - сутки после облучения; здесь и на рис. 4 по оси ординат - абсолютное количество клеток на орган, нормированное относительно необлученного контроля (M ± SD).

фатических узлах и селезенке отсутствуют. Определенное замедление темпа регенерации можно наблюдать в интервале 12-20 сут (что соответствует развитию вторичной атрофии тимуса) на кривой восстановления Т-клеток лимфатических узлов; аналогичная кривая для селезенки иллюстрирует безостановочный рост численности Т-клеток. Несмотря на это, отсутствуют серьезные основания для сомнений в непрерывном характере восстановления численности Т-клеток во всех вторичных лимфоидных органах.

Единственное исключение, вероятно, имеет место в случае регенерации у5Т-клеток, причем и в лимфоузлах, и в селезенке временное снижение численности этих клеток приходится на те же 20-е сутки. Временные точки регенерации указанных клеток в наших опытах были недостаточно нагружены, и это наблюдение (на наш взгляд, важное) требует более детального обоснования.

Кривые восстановления численности двух основных субпопуляций Т-лимфоцитов - CD4+CD8- и CD4-CD8+ Т-клеток - практически идентичны (см. рис. 1), однако во всех случаях восстановление CD4-CD8+ начиная с 12-х суток несколько отстает от восстановления CD4+CD8--клеток, что обусловливает подъем выше нормы соотношения CD4+/CD8+ (примерно до 2 против 1,3—1,5 в норме). Кривая восстановления численности регуляторных Т-клеток (CD4+Foxp3+) практически совпадает с аналогичной кривой для Т-клеток (данные в графической форме не представлены). Изменения спектра субпопуляций Т-клеток в лимфатических узлах и селезенке в процессе пострадиационной регенерации отражены на рис. 2.

Суммируя приведенный материал, констатируем, что восстановление Т-клеток и их субпопуляций во вторичных лимфоидных органах (селезенка и лимфатические узлы) происходит в целом однотипно, завершается (при дозе облучения

0-е сутки

4-е сутки

CD4 8

CD4+8

42%

Рис. 2. Круговые гистограммы, отражающие соотношение основных фракций Т-клеток на разные сроки после облучения (представлена сумма клеток лимфоузлов и селезенки.

4 Гр) к концу 2-го месяца и коренным образом отличается от динамики восстановления тимоцитов своим непрерывным характером и отсутствием вторичной атрофии. Очевидно, это является следствием подключения гомеостатических механизмов, предотвращающих сколько-нибудь длительное опустошение Т-клеточного звена лимфоидной ткани, которое чревато развитием инфекционных процессов в облученном организме.

Рис. 3. Изменение в динамике процента пролиферирующих Т-клеток на разные сроки после облучения в лимфоузлах (а) и селезенке (б). По оси ординат - процент CD3+Ki-67+ клеток (M ± SD); * - достоверные отличия относительно контроля (р < 0,05).

- 244 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

4-е 12-е 20-е 28-е 36-е 44-е 52-е 60-е

-я- CD3+62Lhi44l0 CD3+62Lhi44hi

Рис. 4. Восстановление в динамике численности наивных (CD3+ 62Lhl44l0) и Т-клеток памяти (CD3+62Lhl44hl) на разные сроки после облучения в лимфоузлах (а) и селезенке (б).

Гомеостатическая пролиферация Т-клеток в пострадиационном периоде. Существует два пути устранения дефицита Т-лимфоцитов - через формирование Т-клеток в тимусе с их последующей миграцией на периферию и через усиленную пролиферацию периферических Т-клеток, обозначаемую как гомеостатическая пролиферация [6, 11]. Тимусзависимая составляющая регенерации периферических Т-клеток будет рассмотрена нами в другой работе. Здесь же мы приведем некоторые данные, свидетельствующие об участии в восстановлении Т-клеток гомеостатической пролиферации и включении при этом некоторых дополнительных процессов.

На рис. 3 отражено в динамике изменение процентного содержания пролиферирующих Т (СБ3+)-клеток, определяемых по наличию внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67 в селезенке и лимфатических узлах на протяжении 2 мес пострадиационного восстановления. Из представленных данных следует, что уровень фоновой пролиферации Т-клеток, регистрируемой до облучения, достаточно существен: в лимфатических узлах он составляет 7,4%, в селезенке - 11,1%. Фоновая пролиферация характерна для Т-клеток памяти, но не свойственна наивным Т-клеткам.

Уже на 4-е сутки после облучения (т.е. на пике опустошения лимфоидных органов) регистрируется значимый подъем уровня пролиферации как в селезенке, так и особенно в лимфатических узлах. Реакция в лимфатических узлах проявляется сильнее в более ранний срок, чем в селезенке, при сходном уровне интенсивности. Пик пролиферации (в обоих случаях около 30% Ki-67+) наблюдали в лимфатических узлах на 8-е сутки, в селезенке на 20-е сутки после облучения. Причины определенной асинхронности во временных проявлениях пролиферации в лимфатических узлах и селезенке облученных мышей требуют особого анализа; на наш взгляд, темпы развития пролиферации определяются особенностями накопления интерлейкина-7 в Т-зонах эти органов. Отметим, что эти сроки соответствуют

млн

Кн67+.млн

Рис. 5. График, отражающий корреляцию численности центральных Т-клеток памяти (CD3+621hi44hi) и пролиферирующих Т-клеток (CD3+Ki-67+) на разные сроки после облучения в лимфоузлах (а) и селезенке (б).

По оси ординат здесь и на рис. 6 - абсолютное количество (в млн) клеток на орган. Правая ось ординат для линейного графика, левая - для столбиковых гистограмм.

разным фазам восстановления тимуса - соответственно началу экстренной и окончательной регенерации [10]. В лимфатических узлах содержание пролиферирующих клеток сохраняется повышенным (18-30%) до 30-х суток, после чего нормализуется, тогда как в селезенке оно значимо превышает норму даже на 60-е сутки после облучения.

Наблюдаемая нами пролиферация Т-клеток, развивающаяся в ответ на Т-лимфопению, естественно, должна быть трактована как гомеостатическая. Описан ряд особенностей гомеостатической пролиферации, отличающей ее от активации при иммунном ответе, - медленный темп (примерно 1-5 делений за 1-2 нед), независимость от костимуляции, отсутствие этапа активации клеток, вступающих в деление, поликлональный (т.е. фактически неадаптивный характер) характер и т.д. [5]. В классическом варианте гомеостатическая пролиферация свойственна наивным Т-клеткам, тогда как пролиферация Т-клеток памяти в аналогичных условиях имеет более комплексный характер. Нет серьезных оснований сомневаться в том, что пролиферация Т-клеток, наблюдавшаяся нами в пострадиационном периоде у мышей, представляет собой гомеостатическую пролиферацию. Хотя мы сознательно избегали обращения к деталям процесса, даже таким важным, как участие в нем CD4+ и CD8+ Т-клеток, полученной информации достаточно для заключения об исключительно важном вкладе гомеостатической пролиферации в пострадиационное восстановление популяции Т-лимфоцитов на всем его протяжении.

Спектр наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в процессе пострадиационного восстановления популяции Т-лимфоцитов. Среди особенностей гомеостатической пролиферации особого внимания заслуживает конверсия фенотипа участвующих в ней клеток. Этот феномен состоит в том,

- 245 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

млн а

Рис. 6. Изменение в динамике численности центральных (CD3+62Lhl44hl49dhl) и суррогатных Т-клеток памяти (cD3+" 62Lh‘44h‘49dl°), а также всей фракции CD3+62Lh‘44h‘-клеток на разные сроки после облучения в лимфоузлах (а) и селезенке (б).

что наивные клетки, вступившие в деление, выходят из него измененными: на их поверхности экспрессируется молекула cD44, служащая у мышей маркером Т-клеток памяти. Поскольку при этом наивные Т-клетки не утрачивают своего маркера cD62L, фенотипически (cD62LhicD44hi) они оказываются идентичными центральным клеткам памяти [7, 8, 12]. Они практически идентичны им и по своим миграционным характеристикам, при этом не выполняют защитных функций в силу поликлональности (поэтому их иногда называют суррогатными Т-клетками памяти). Накопление этих клеток,

как полагают, порождает ряд серьезных проблем вплоть до повышения риска развития аутоиммунной патологии [9]. Таким образом, проблема фенотипической конверсии наивных Т-клеток при гомеостатической пролиферации Т-клеток требует самого серьезного внимания.

В табл. 2 представлены данные о пострадиационной динамике Т-клеток, экспрессирующих четыре возможные комбинации молекул cD62L и cD44, которым соответствуют четыре варианта наивных Т-клеток/Т-клеток памяти [13]. На рис. 4 отражена в нормированной относительно контролей форме динамика изменения двух фракций, представляющих для нас непосредственный интерес, - CD62LhiCD441° (наивные Т-клетки) и CD62LhiCD44hi (центральные Т-клетки памяти). И в селезенке, и в лимфатических узлах фракция наивных клеток практически не восстанавливается; лишь к 60-м суткам отличия их численности от контроля становятся незначимыми, хотя средние величины продолжают оставаться сниженными. Напротив, численность центральных Т-клеток памяти в лимфоузлах достигает нормы уже на 20-е сутки, а позже значимо превосходит ее. В селезенке уровень центральных Т-клеток памяти не отличается значимо от такового в контроле уже начиная с 12-х суток, а на 30-е сутки превосходит его. Динамика изменения двух других фракций представляет для нас лишь побочный интерес, и мы ограничимся констатацией того, что содержание эффекторных Т-клеток памяти (CD62L1°CD44hi) восстанавливается столь же эффективно, как и центральных клеток памяти, и достигает уровня контроля к 20-м суткам в обоих лимфоидных органах.

Мы исходим из представления о связи конверсии фенотипа наивных Т-клеток с гомеостатической пролифераций, поэтому сопоставили изменение в динамике численности наивных Т-клеток и центральных Т-клеток памяти с процентом пролиферирующих Т-клеток в течение 2 мес после облучения. Оказалось, что численность CD3+Ki-67+-клеток значимо коррелирует (r=0,92 для лимфоузлов и r=0,94 для селезенки; p < 0,05) с содержанием CD62LhiCD44hi, но не CD62LhiCD441° Т-клеток (r=0,56 для лимфоузлов и r=0,6 для селезенки; p > 0,05), т.е. центральных Т-клеток памяти, а не наивных Т-клеток (рис. 5).

Представляются допустимыми две трактовки наблюдаемой закономерности: 1) в реальности пролиферируют центральные Т-клетки памяти, но не наивные Т-клетки; 2) пролиферируют наивные Т-клетки, но по завершении деления они в силу фенотипической конверсии определяются уже (по крайней мере по фенотипическим признакам) как центральные Т-клетки памяти. Как ни экзотично выглядит второе предположение, оно находит косвенное подтверждение в факте накопления в процессе пострадиационного восстановления во фракции с фенотипом центральных Т-клеток памяти клеток, слабо экспрессирующих молекулу CD49d (CD3+CD62LhiCD44hiCD49d1°) (рис. 6). Если в селезенке мы видим преобладание клеток с

Таблица 2

Восстановление в динамике численности наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в селезенке после общего у-облучения мышей в дозе 4 Гр

Показатель Необлученные (контроль) Сутки после облучения

4-е 8-е 12-е 20-е 30-е 60-е

Лимфатические узлы

CD3+62Lhi44‘° абс. 6,3±1,4 0,2±0,1* 0,3±0,1* 1,0±0,7* 2,3±0,5* 3,6±1,1* 6,2±0,1

CD3+62Lhi44hi абс. 1,8±0,4 0,1±0,1* 0,1±0,02* 0,8±0,5* 1,5±0,4 3,5±0,5* 2,7±0,5*

CD3+62Llo44hi абс. 0,6±0,3 0,1±0,03* 0,2±0,01* 0,2±0,2* 0,4±0,1* 1,0±0,3 0,6±0,1

CD3+62Lhi44l°/CD3+44hi 3,2±0,6 1,0±0,1* 0,9±0,2* 1,3±0,2* 1,4±0,1* 0,9±0,3* 2,2±0,4*

Селезенка

CD3+62Lhi44‘° абс. 26,3±8,1 1,7±0,9* 5,7±0,4* 10,3±4,9* 16,8±1,3* 14,3±4,0* 24,8±6,0

CD3+62Lhi44hi абс. 17,7±6,5 2,4±0,9* 6,0±2,2* 13,1±5,1 19,6±1,1 27,9±6,5* 23,1±6,3*

CD3+62Llo44hi абс. 14,6±7,1 1,4±0,5* 10,3±2,5 8,9±2,9 7,2±1,1* 10,9±5,4 13,8±6,1

CD3+62Lhi44l°/CD3+44hi 0,9±0,2 0,4±0,1* 0,4±0,1* 0,4±0,2* 0,7±0,05* 0,4±0,2* 0,8±0,2

- 246 -

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

указанным фенотипом над аналогами, сильно экспрессирующими CD49d, на протяжении всего периода наблюдения, то в лимфатических узлах CD49dы-варианг центральных Т-клеток памяти вообще на порядок ниже CD49d1o-варианта даже у контрольных мышей (см. рис. 6). Следует оговориться, что роль уровня экспрессии cD49d как маркера истинных и образующихся в результате конверсии фенотипа центральных Т-клеток памяти (т.е. суррогатных) недостаточно строго обоснована [14]. Однако при отсутствии других маркерных различий между названными вариантами клеток нам остается воспользоваться этим критерием.

Таким образом, результаты анализа спектра наивных Т-клеток/Т-клеток памяти в популяции Т-лимфоцитов регенерирующих лимфоидных органов свидетельствуют о высокой эффективности восстановления Т-клеток памяти и неполноценности этого процесса для наивных Т-клеток. Однако, по всей вероятности, значительный (если не основной) вклад в восстановление Т-клеток памяти (по крайней мере их центральной фракции) вносит не их пролиферация, а формирование за счет конверсии фенотипа пролиферирующих наивных Т-клеток.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований РАН; грант 11-04-01741-а.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф. Радиационное повреждение и восстановление Т-лимфоцитов. II. Динамика восстанолвения субпопуляций Т-клеток. Радиобиология. 1981; 21(2): 193-7. 10. Митин А.Н., Комогорова В.В., ЛитвинаМ.М., Шевелев С.В., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Динамика субпопуляций тимо-цитов при регенерации тимуса. Иммунология. 2012; 33(6): 297-303.

REFERENCES

1. Yarilin A.A., Polushkina E.F. Irradiation damage and restoration of T lymphocytes. II. Dynamics of restoration of T-cells subpop-ulations.Radiobiologiya. 1981; 21: 193-7 (in Russian).

2. Andreson R.E., Warner N.L. Ionizing radiation and the immune response. Adv. Immunol. 1976; 24: 215-335.

3. Goldrath A.W., Bevan M.J. Low-affinity ligands for the TCR drive proliferation of mature CD8+ T cells in lymphopenic hosts. Immunity. 1999; 11: 183-90.

4. Mahajan VS., Leskov I.B., Chen J.Z. Homeostasis of T cell diversity. Cell. Mol. Immunol. 2005; 2: 1-10.

5. WilliamsK., Hakim F.T., GressR.E. T Cell Immune Reconstitution Following Lymphodepletion. Semin Immunol. 2007; 19: 318-30.

6. Ge Q., Hu H., Eisen H.N., Chen J. Different contributions of thy-mopoiesis and homeostasis-driven proliferation to the reconstitution of naive and memory T cell compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 2989-94.

7. Cho B.K., Rao V.P., Ge Q., Eisen H.N., Chen J. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 549-56.

8. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000; 192: 557-64.

9. Gleeson P.A., Toh B.H., van Driel I.R., Organ-specific autoimmunity induced by lymphopenia. Immunol. Rev. 1996; 149: 97-125.

10. Mitin A.N., Komogorova V.V., Litvina M.M., Shevelev S.V., Sharova N.I., Yarilin A.A. Dynamics of thymocytes subpopulations during thymus regeneratin. Immunologiya. 2012; 33: 172-6 (in Russian).

11. Sprent J., Cho J.-H., Boyman O., Surh C.D. T cell homeostasis. Immunology and Cell Biology. 2008; 86: 312-9.

12. Sallusto, F., Geginat, J., Lanzavecchia, A., Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.

13. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nature. Immunology. 2011; 12: 478-84.

14. Haluszczak C., Akue F.D., Hamilton S.E. et al. The antigen-specifi c CD8 + T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 2009; 206: 435-48.

Поступила 18.07.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.018.2.063:612.112.95]:618.2

О.Л. Горбунова, С.В. Ширшев, С.А. Заморина

ВЛИЯНИЕ КИССПЕПТИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ

Лаборатория иммунорегуляции ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081, г. Пермь, ул. голева, 13; тел. (342)2808431, факс (342)2809211; e-mail: olia15_77@mail.ru

Исследовано влияние недавно открытого гормона кисспептина, который детектируется в периферической крови только в период беременности, на функциональную активность моноцитов. Выявлено, что кисспептин в концентрации, соответствующей III триместру беременности, стимулирует фагоцитарную активность моноцитов и во всех исследуемых концентрациях повышает продукцию активных форм кислорода в реакции спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции. Показано, что кисспептин в концентрации, соответствующей II триместру беременности, понижает активность внутриклеточной миелопероксидазы (МПО) моноцитов, повышая при этом активность секреторной МПО и липополисахарида индуцированной индоламин-2,3-диоксигеназы. Таким образом, впервые показано, что ранее не учитываемый гормон кисспептин является важным регулятором функций моноцитов во время беременности.

Ключевые слова: кисспептин, моноциты, фагоцитоз, люминолзависимая хемилюминесценция, миелопероксида-за, индоламин-2,3-диоксигеназа

O.L. Gorbunova, S.V Shirshev, S.A. Zamorina

KISSPEPTIN EFFECT ON MONOCYTE FUNCTIONAL ACTIVITY

- 247 -