БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА ОСНОВЕ АДАПТИРОВАННЫХ КЛЕТОК GLUCONOBACTER OXYDANS ВКМ В-1280 И КИСЛОРОДНОГО ЭЛЕКТРОДА ТИПА КЛАРКА

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды, биотехнологии, пищевой промышленности и сельского хозяйства, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Устройство может быть использовано для экспресс-определения содержания органических веществ в водных растворах.
Оперативные методы определения содержания органических веществ в водных растворах основаны на использовании биосенсорных анализаторов, в том числе устройств и биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans.
Известно устройство на основе клеток Gluconobacter oxydans BKM В-1227, преобразующее энергию микробного окисления органических соединений в электрическую (патент на полезную модель №108217).
Предложен микробный топливный элемент, использующий суспензию микробных клеток Gluconobacter cerinus BKM B-1283, окисляющих органический субстрат (патент на полезную модель №109758).
Известны биосенсоры для экспресс-определения органических веществ в водных растворах, в которых в качестве биорецептора используют иммобилизованные клетки бактерий Gluconobacter oxydans B-1280 (патенты на полезную модель №66815 и №98190). В указанных биосенсорах детектором служит кислородный электрод Кларка. При проведении анализов, в указанных устройствах с помощью электрода Кларка регистрируют изменение скорости потребления кислорода в ответ на внесение образца содержащего или глюкозу, или уксусную кислоту и этанол.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, - создание устройства для определения органических веществ в водных растворах, содержащего рецепторный элемент, чувствительность которого может быть изменена в зависимости от целей анализа.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемой полезной модели, заключается в том, что в предлагаемом устройстве биорецептор, содержащий адаптированные клетки бактерий, позволяет быстро изменить чувствительность биосенсора к определяемому веществу: увеличить ответ сенсора на определяемое вещество и уменьшить ответ на вещество-примесь, мешающее определению.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения содержания органических веществ в водных растворах включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе адаптированные клетки бактерий Gluconobacter oxydans В-1280, чувствительность которых к определяемому веществу может быть изменена.
На фиг.1 представлена схема биосенсора для определения содержания органических веществ в водных растворах путем измерения результата активирующего действия органических веществ на дыхание клеток биорецептора, где: 1 - электрод Кларка; 2 - биорецептор, содержащий иммобилизованные на носителе адаптированные клетки бактерий Gluconobacter oxydans B-1280; 3 - фиксатор.
На фиг.2 показано изменение ответа (%) биосенсора на основе адаптированных клеток бактерий Gluconobacter oxydans B-1280 по сравнению с неадаптированными клетками для различных органических веществ, где: а - ответ сенсора на основе адаптированных клеток; 6 - ответ сенсора на основе неадаптированных клеток.
Биосенсор для определения органических веществ включает электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, содержащий иммобилизованные на носителе адаптированные клетки бактерий Gluconobacter oxydans B-1280, с помощью фиксатора 3.
Для создания биорецептора используют штамм Gluconobacter oxydans B-1280, который может быть использован для детекции глюкозы в водном растворе (патент на полезную модель №66815) или этанола в присутствии уксусной кислоты (патент на полезную модель №98190).
Штамм Gluconobacter oxydans B-1280 поддерживают на жидкой среде следующего состава: сорбит - 100 г/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, вода дистиллированная - до 1 литра, - при +4°С, пересев осуществляют каждые 6 месяцев. Для получения биомассы культуру выращивают в конических колбах Эрленмейера на 750 мл, содержащих 100 мл жидкой среды указанного состава, при постоянном перемешивании и температуре 28°С в течении 18 часов. Биомассу отделяют центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин, промывают 2 раза 30 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6.6) и суспензируют в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6.6); концентрация суспензии - 100 мг влажных клеток в мл. Полученную суспензию бактериальных клеток хранят при температуре +4°С и используют для приготовления биорецептора.
Для формирования биорецептора, суспензию бактерий Giuconobacler oxydans B-1280 иммобилизуют на мембране (хроматографическая бумага Whatman GF/A) методом физической сорбции: 5 микролитров суспензии наносят на бумагу в виде капли диаметром 3-4 мм. Полученный биорецептор подсушивают на воздухе в течение 20 минут и фиксируют на измерительной поверхности кислородного электрода Кларка.
Для адаптации бактериальных клеток биорецептора, электрод с зафиксированным на нем рецептором помещают в 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 6.6), содержащий 0.01-0.1 г/л препарата Гумиком, и выдерживают в указанном растворе 18 часов при перемешивании. Затем электрод с биорецептором промывают в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6.6) в течение 30 минут и используют для определений.
Препарат Гумиком, используемый для активации бактериальных клеток биорецептора, представляет собой гумино-минсральный комплекс марки А (ТУ 2186-002-13787869-2009), выпускаемый ООО «Эмульсионные технологии» для промышленного сельского хозяйства. Это жидкость темно-коричневого цвета, плотностью 1.21 г/мл, рН 6.5-7.5, следующего состава: гумат калия 4,0-6,0%, азот 0,1-0,3%. фосфор 0,1-0,3%. калий 0,3-0,5%, микроэлементы (В, Мn, Сu, Мо, Zn, Fe, Co, Se).
Принцип определения органических веществ в водных растворах основан на измерении скорости повышения потребления кислорода адаптированными клетками штамма бактерий рецептора в результате активирующего действия органических веществ на метаболизм клеток рецептора, в основном на дыхательную цепь.
Биосенсор для определения органических веществ в водных растворах работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с зафиксированным на нем биорецептором 2, содержащим иммобилизованные на носителе и прошедшие адаптацию клетки штамма Gluconobacter oxydans В-1280, помещают в измерительную кювету с 30 мМ калий-фосфатным буфером (рН 6.6) и регистрируют силу тока, отражающую содержание кислорода в буфере (базовый уровень). Все измерения проводят при комнатной температуре и при постоянном перемешивании. Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют изменение (уменьшение) силы тока, отражающее снижение содержания кислорода в растворе. Рассчитывают максимальную скорость изменения силы тока (ответ биосенсора, dl/dt - нА/с), которая пропорциональна максимальной скорости повышения потребления кислорода. Полученную величину сравнивают с предварительно построенной калибровочной кривой, отражающей зависимость ответа биосенсора от концентрации анализируемого органического вещества, и определяют содержание вещества в растворе.
Таким образом, предлагаемый биосенсор позволяет с большей чувствительностью быстро определить содержание вещества в водном растворе и не требует больших затрат как на адаптацию клеток биорецептора, так и на изготовление биосенсора.