Восстановление диафиза трубчатых костей клеточными технологиями с применением способа аутотрансплантации сосуда
RESTORATION OF THE DIAPHYSIS OF LONG BONES BY CELLULAR TECHNOLOGY APPLYING A METHOD FOR AUTOTRANSPLANTATION OF A VESSEL

Область техники
Изобретение относится к травматологии и ортопедии, регенеративной медицине, микрохирургии, сосудистой хирургии.
Уровень техники
Костная сосудистая сеть является неотъемлемой частью кости, как органа, играет жизненно важную роль в развитии и росте кости, ремоделировании, физиологической и репаративной регенерации и гомеостазе. Важность сосудистого снабжения для костей хорошо известна ортопедам. Кровь снабжает ткани кислородом, питательными веществами и регулирующими факторами, а также удаляет продукты метаболизма, в том числе углекислый газ. Образование новых кровеносных сосудов имеет решающее значение как для развития костной ткани, так и для сращивания костных отломков при переломах при репаративной регенерации. Как восстановление кости, так и ремоделирование кости включают активацию и сложное взаимодействие между ангиогенезом и репаративным остеогенезом. Исследования показали, что ангиогенез предшествует началу остеогенеза. Действительно, сниженный или неадекватный кровоток в области регенерации связан с нарушениями заживления переломов и восстановления костной ткани на месте костных посттравматических дефектов.
Известно существование двух взаимосвязанных периостальной и внутрикостной сосудистых сетей, обеспечивающих внутриорганный кровоток костей. Периостальные сосуды, являются продолжением магистральных ветвей мышечных и фасциальных артерий, окружающих кость. Питание кости осуществляется за счёт кровеносных сосудов, проникающих в большом числе из надкостницы в наружное компактное вещество кости через многочисленные питательные отверстия. Эти сосуды образуют в надкостнице характерные сплетения, от которых в компактный слой кости проникают по каналам более мелкие ветви. Отдельные из них достигают эндоста и костного мозга. Кроме питательных артерий кость пронизывают сотни мелких сосудов, которые пересекают кортикальную ткань перпендикулярно и обеспечивают кровоснабжение между костным мозгом и надкостницей, обеспечивая единство между костным мозгом и кровеносной системой. На долю этих транскортикальных сосудов, считают, что приходится более 80% артериального и 59% венозного кровотока в длинных костях.
Кровь течет через синусоиды костного мозга, а затем выходит через многочисленные мелкие сосуды, которые разветвляются, проходя через кортекс кости. Питательная артерия (артерия Nutricia) или медуллярная, обычно сопровождается одним или двумя венами, входит в кости через питательные отверстия, проходит наклонно через кортекс диафиза кости, посылает ветвь вверх и вниз в костном мозге, который разветвляется в области эндоста - выстилающим медуллярную полость - и дают веточки соседним каналам. Питательные артерии являются наиболее очевидными кровеносными сосудами длинных трубчатых костей, проникают в кость через питательные отверстия, где они ведут в питательный канал, который простирается в медуллярную полость (полость костного мозга).
2
Известны прямые эффекты гипоксии на костную ткань, недостаток кислорода блокирует функцию остеобластов и образование кости, но вызывает взаимное увеличение остеокластогенеза и резорбции кости. Гипоксия оказывает глубокое ингибирующее действие на остеобласты. Уровень парциального давления кислорода pOв окружающей среде ниже 2% приводит к почти полной отмене образования кости первичными остеобластами (Utting JC, Robins SP, Brandao-Burch A et al . Hypoxia inhibits the growth, differentiation and bone-forming capacity of rat osteoblasts. Exp Cell Res. 2006; 312:1693-1702).
Функция остеобластов (пролиферация, дифференцировка и выработка коллагена 1 типа и подавляющего большинства компонентов органического костного матрикса, минерализация остеоида) подавляются при гипоксии; остеобласты переходят в состояние покоя. Напротив, гипоксия стимулирует образование остеокластов из мононуклеарных клеток-предшественников (в присутствии RANKL и M-CSF), что приводит к повышенной резорбции кости. Негативное влияние гипоксии усугубляется сопровождающим локальным ацидозом, который препятствует минерализации костного матрикса и стимулирует резорбцию кости зрелыми остеокластами.
2
Эти исследования также показали, что высокий (надфизиологический) уровень pO являются остеогенным и поддерживает представление о том, что формирование кости зависит от развитой сосудистой сети.
Роль сосудов в регенерации кости и заживлении переломов одна из основополагающих. Перелом или другая серьезная травма кости также нарушает нормальное кровообращение, приводя к локальной гипоксии, которая может поддерживаться последующим воспалением.
2
Общий характер активности костных клеток после перелома или остеотомии в целом согласуется с известными реакциями остеобластов и остеокластов на изменения pO: ранняя гипоксическая фаза способствует рекрутированию остеокластов, в то же время ингибируя остеобласты (которые могут выживать локально в состоянии покоя), тогда как реваскуляризация будет постепенно способствовать проявлению функций остеобластами (пролиферация, дифференцировка и формирование кости). Предшественники остеобластов также могут проникать в развивающиеся регенераты - сломанные кости вместе с инвазивными кровеносными сосудами.
Дефекты костей большого объема в результате травматических инцидентов, врожденных аномалий, инфекции или резекции опухолей представляют собой большую проблему для хирургов-ортопедов, черепно-лицевых и пластических хирургов. Существует распространенное мнение, что в идеале для восстановления полноценной кости на месте костных дефектов требуются доступные костные трансплантаты, обладающие механической прочностью, микроструктурой и функциями, максимально приближенными к нативной костной ткани. Это должно обеспечивать полную интеграцию с костными отломками, и, что важно, полностью восстановить все функции, свойственные нативной костной ткани. Таким образом, идеальный функциональный костный трансплантат должен обладать следующими характеристиками: высоким остеоиндуктивным, остеокондуктивным и ангиогенным потенциалом, биологической безопасностью, низкой травматичностью при заборе и последующей болезненности донорского участка, отсутствием ограничений по размеру, легкодоступным для хирургов, обладать длительным сроком хранения и разумной стоимостью. Хотя для реконструкции посттравматического дефекта кости использовались многочисленные стратегии, ни один из доступных в настоящее время заменителей кости не обладает всеми идеальными характеристиками.
Давно признано, что рост кости (включая эндохондральную оссификацию во время развития или посттравматической регенерации) и её восстановление напрямую зависит от выраженности васкуляризации в области дефекта. И наоборот, общеизвестно, что нарушение кровоснабжения снижает скорость роста и восстановления костной ткани, вызывает потерю костной массы, а иногда и некроз. Таким образом, ангиогенез является ключевым этапом в ходе восстановление кости. Одним из серьезных препятствий в стратегии костной инженерии является отсутствие васкуляризации внутри сконструированных костных конструкций, что приводит к в плохим интеграции и выживании тканеинженерных графтов. Медленное проникновение кровеносных сосудов реципиента в крупные инженерные тканевые трансплантаты, приводящее к гибели костных клеток в центральной области трансплантата, является основной причиной малой клинической эффективности этих «живых» костнопластических конструкций. Следовательно, эта проблема привела к повышению интереса к улучшению функциональных решений живых конструкций для осуществления костной регенерации и для улучшения результатов лечения пациентов с травматическими костными дефектами, превышающими критический размер.
in vivo
in vivo
Из уровня техники известен подход для восстановления крупных костных дефектов по принципу создания биореактора  (Ru-Lin Huang, Eiji Kobayashi, Kai Liu, Qingfeng Li/ Bone Graft Prefabrication Following the In Vivo Bioreactor Principle/ EBioMedicine. 2016 Oct; 12: 43-54, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2016.09.016). В данном документе описаны два типа васкуляризации - на основе осевого сосудистого пучка и на основе артериовенозной петли. В первом случае артерия и вена вставляются центрально внутри каркаса для транспортировки клеток-предшественников/стволовых клеток, цитокинов, кислорода и питательных веществ, а также для удаления метаболитов и продуктов распада вокруг пересаженных клеток, что приводит к васкуляризации и остеогенезу на месте имплантируемого каркаса. Результатом стратегии предварительного изготовления на основе биореактора  является костный трансплантат по осевому типу, который может быть перенесен в область дефекта кости в виде ножки или в виде свободного лоскута. Основной недостаток любой префабрикации связан с необходимостью повторного врастания регенерирующих сосудов в конструкт, наличием достаточно продолжительного периода отсутствия  доступа крови к пересаженным живым клеткам, и их гибели вследствие локальной гипоксии. Ножка крайне ограничивает мобильность такого костного трансплантата.
Недостаточности снабжения артериальной кровью и венозного оттока https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/vein-blood-flow вследствие травмы или ранее существовавшего сосудистого заболевания могут препятствовать использованию технологии построения костного трансплантата на основе осевого сосудистого пучка. В таком случае можно использовать подход на основе артериовенозной петли (AVL) для предварительного изготовления костного трансплантата. Как правило, AVL строится путем прямого микрохирургического анастомоза артерии и вены или путем вставки венозного трансплантата между артерией и веной с образованием артериовенозного свища (фистула) . Однако остеогенная способность AVL также зависит от характеристик совместно используемого биологически активного скаффолда. Кроме того, этот метод остается очень сложным, потому что большинство несущих нагрузку костных трансплантатов не подходят для моделирования нужной формы костного трансплантата или формирования необходимой формы вокруг AVL, остеогенез вокруг петли ограничен по времени, гетеротопические оссификаты подвергаются рассасыванию. Кроме того, данный подход сопровождается аномальным сбросом артериальной крови в венозную систему. Осевой сосудистый пучок неудобен для перемещения в область костного дефекта и сращение скафолда с концами костных отломков затруднено.
Таким образом, существует необходимость в разработке новых эффективных подходов к васкуляризации центральных частей костных дефектов, превышающих критические размеры, которые необходимы для создания благоприятных локальных условий для приживления пересаживаемого клеточного материала, реализации его регенеративного потенциала, и в целом для создания основополагающего условия - благоприятной локальной среды регенерации с достаточным уровнем парциального давления кислорода, необходимого для осуществления самой возможности репаративного остеогенеза - восстановления целостности костей за счет применения клеточных технологий.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является обеспечение условий васкуляризации костного регенерата, формирующегося на основе трансплантированного клеточного материала (клеточных продуктов) в сочетании с трансплантационной регенерации отломков кости в пространстве костного дефекта, размеры которого превышают критические, восстановление достаточного кровоснабжения новообразованной костной ткани и васкуляризация, обеспечивающая поддержание парциального давления кислорода, достаточного для регенеративного остеогенеза в области костного дефекта, размеры которого превышают критические.
Технический результат настоящего изобретения заключается в васкуляризации поддерживающей клеточную регенерацию остеогенных клеток, продукции ими остеоида и его достаточной минерализации, полноценном созревании костного регенерата и повышении эффективности восстановления костного дефекта, размеры которого превышают критические, за счет применения способа аутотрансплантации сосуда предшествующей трансплантацией клеточных продуктов, такая аутотрансплантация сосуда по изобретению позволяет создать зону достаточного кровоснабжения и уровня парциального давления кислорода в центральной части костного дефекта, в ситуациях, когда собственной или естественной способности сосудов к репаративной регенерации недостаточно для восстановления новой сосудистой сети больших размеров, способной обеспечить репаративный остеогенез, восстановить кровоснабжение в области значительного дефекта костной ткани. Как результат не только период восстановления сокращается, но и вообще становиться возможным процесс органотипичной регенерации костной ткани за счет трансплантации клеточных продуктов в область дефекта. Естественным путем регенерация сосудов такого размера, как правило, невозможна (у млекопитающих ограничена способность к регенеративному ангиогенезу), что делает невозможным достижение и поддержание уровня парциального давления кислорода в тканях, необходимого для остеогенеза, кость в таких ситуациях не восстанавливается. В результате применения способа аутотрансплантации сосуда по изобретению восстановление костной ткани из пересаженного клеточного материала возможно непосредственно в области дефекта и в правильном положении, причем применение способа по изобретению позволяет повысить эффективность приживления и реализации регенеративного потенциала пересаживаемых клеточных продуктов, замещающих дефекты кости.
Технический результат обеспечивается за счет создания параллельной основному сосуду артерии, которая проходит через центральную часть дефекта, временно насыщает костный регенерат и трансплантат кислородом до момента полного восстановления костного дефекта и регенерации собственного сосудистого русла, кровоснабжающего кость, восстановившую свою целостность.
Указанный технический результат достигается путем применения способа аутотрансплантации сосуда для восстановления костного дефекта субъекта, размеры которого превышают критические, включающего следующие этапы:
- забор сосуда-трансплантата подходящего размера с конечности субъекта, не имеющей дефекта;
- осуществление хирургического доступа к кости с дефектом, размеры которого превышают критические, выделение артерии, кровоснабжающей данный сегмент конечности;
- осуществление на кости с дефектом двух отверстий в кортексе кости для введения сосуда-трансплантата (большего диаметра чем вена трансплантат, по меньшей мере на 30%) под углом к передней поверхности кости, сформированные в стенке кости каналы должны быть обращены в сторону артерии, кровоснабжающей данный сегмент конечности, а размер отверстия должен превышать диаметр сосуда-трансплантата;
- две тонкие проволоки-проводники от выполненного отверстия в кости до отверстия костномозгового канала со стороны костного дефекта протягиваются через костномозговой канал с каждой из сторон навстречу друг с другом;
- сосуд-трансплантат привязывается концами к первой и второй проволокам-проводникам и растягивается, проникая в костномозговой канал и проходя вдоль всего костного дефекта по центру, а затем через отверстия в кости извлекаются два конца вены вместе с проводниками;
- наложение двух анастомозов между концами сосуда-трансплантата и артерии, кровоснабжающей данный сегмент конечности, в двух местах;
- адвентиция (наружная оболочка) сосуда-трансплантата подшивается к надкостнице у входа в одно и второе в стенки кости отверстия, для предотвращения смещений трансплантата и механического разрушения стенки сосуда краями отверстия.
В частных вариантах воплощения изобретения сосуд представляет собой вену.
В частных вариантах воплощения изобретения кость с дефектом представляет собой большеберцовую кость.
В частных вариантах воплощения изобретения на стадии формирования отверстий кость с дефектом представляет собой переднюю большеберцовую кость.
В частных вариантах воплощения изобретения артерия, кровоснабжающая данный сегмент конечности, представляет собой доступный для создания анастомозов магистральный сосуд.
В частных вариантах воплощения изобретения артерия, кровоснабжающая данный сегмент конечности, представляет собой краниальную большеберцовую артерию или артерию в области голени.
Краткое описание чертежей.
Фигура 1
. Схема осуществления применения способа аутотрансплантации сосуда по изобретению (белое пространство между опилами костей - костный дефект, превышающий критические размеры):
1. Большеберцовая кость.
2. Краниальная большеберцовой артерии (а. cranial tibial).
3. Анастомозы между веной-трансплантатом и краниальной большеберцовой артерией.
4. Отверстия в кортикале диафизов большеберцовой кости.
5. Вена-трансплантат.
6. Положение вены-трансплантата между опилами большеберцовой кости голени.
7. Мембрана.
8. Трубчатое пространство, ограниченное мембраной.
Подробное раскрытие изобретения
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
«включает»
«включающий»
В описании данного изобретения термины  и  интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
ткань
В описании данного изобретения термин «» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.
дефект
Используемый в данном документе термин «» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы. «Критический костный дефект» это повреждение кости, при котором костное сращение невозможно спонтанно, то есть при котором естественным путем кость органотипично с восстановлением своей анатомической целостности не регенерирует, а костномозговой канал закрывается замыкательными пластинами.
вена-трансплантат
Используемый в данном документе термин «» относится любая аутологичная вена подходящего размера, которая может быть забрана хирургическим путем без вреда для реципиента (вариант сосудистого трансплантата - реверсированная аутовена), в частных вариантах воплощения изобретения, большой подкожной вены бедра. В некоторых вариантах воплощения изобретения для этой цели используют резецированные артерии - внутреннюю подвздошную, глубокую артерию бедра (гомопластика).
Анастомоз
«» - буквально "соустие", означает в анатомии слияние двух кровеносных или лимфатических сосудов между собою, либо непосредственно для образования дуги или угла, либо при посредстве третьего сосуда (окольная ветвь). Если несколько сосудов соединяются между собою подобным образом на одном и том же месте, то они образуют сосудистую сеть. Такие соединения существуют на всех сосудах, но чаще всего на капиллярах, затем на лимфатических сосудах и венах, всего реже на артериях. Для патологии особенно важны артериальные А., так как ими обеспечивается кровообращение в том случае, когда главный питательный сосуд сделался непроходимым: благодаря существованию анастомозов соответственная часть без существенного ущерба получает кровь из соседних ветвей, и кровообращение в ней восстановляется (окольное кровообращение). Это обстоятельство дает хирургу смелость перевязывать идущий к целой конечности главный артериальный ствол, не опасаясь омертвения, если только перевязка производится ниже того места, где от перевязываемого ствола отходят побочные ветви: последние мало-помалу расширяются под напором крови, достигая нередко размеров закрытого сосуда. - А. называются также соединения между периферическими нервами, которые, впрочем, гораздо более редки, чем между сосудами.
Анастомоз в хирургии - созданное путём операции сообщение между сосудами, органами или полостям. Восстановление заблокированного анастомоза называется реанастомозом.
Кортекс
«» - компактное вещество кости, представленное пластинчатой костной тканью, структурной единицей которого является остеон.
бок в конец
Анастомооз «» - анастомоз, создаваемый вшиванием отводящего конца пересеченного или резецированного органа в отверстие, образованное на боковой поверхности приводящего органа (части органа).
Аутотрансплантация
аутологичная трансплантация
«» или «» - трансплантация самому себе; при ней реципиент трансплантата является его донором.
Магистральный сосуд
«» - это наиболее крупные артерии, в которых ритмически пульсирующий, изменчивый кровоток превращается в более равномерный и плавный.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Применение способа по изобретению осуществляется на модели экспериментального повреждения кости у кролика следующим образом.
Кролик погружается в медикаментозный сон. Трансплантация сосуда проводиться на 4-5 день после формирования критического дефекта кости. Производится подготовка операционного доступа и забор любой подкожной вены подходящего размера открытым или эндоскопическим методом с контрлатеральной задней конечности. Аутовенозный трансплантат промывается теплым раствором питательной среды F12 с гепарином. Осуществляется хирургический доступ к большеберцовой кости (краниальной поверхности), выделяется краниальная большеберцовая артерия. С помощью сверла на передней большеберцовой кости делается два отверстия в кортикале кости и костной ткани для введения вены-трансплантата (большего диаметра, чем вена трансплантат +30%) под углом к передней поверхности кости, сформированный в стенке кости канал должен быть обращен в сторону краниальной большеберцовой артерии (а. cranial tibial) со стороны выхода аутовены из наружных отверстий рукотворных каналов кости с дистального и проксимального отверстий. Две тонкие проволоки-проводники от выполненного отверстия в кости до отверстия костномозгового канала (это отверстия костномозгового канала на опиле кости, они ограничивают костный дефект с двух сторон) со стороны костного дефекта протягиваются через костномозговой канал с каждой из сторон навстречу друг с другом. Вена-трансплантант (венозные клапаны должны не препятствовать току артериальной крови, вена должна быть перевернута от нормального положения в конечности) привязывается концами к первой и второй проволокам-проводникам и растягивается, проникая в костномозговой канал, а затем через рукотворные отверстия в кости извлекаются два конца вены вместе с проводниками. Накладываются два сосудистых венозно-артериальных анастомоза конец в бок между концами вены-трансплантата и краниальной большеберцовой артерией в двух местах. Адвентиция вены подшивается к надкостнице у входа в одно и второе в стенки кости отверстия, для предотвращения смещений трансплантата и механического разрушения стенки сосуда краями отверстия костного канала при движении.
3
3
Далее для восстановления костного дефекта обломки большеберцовой кости оборачиваются специальной мембраной с отверстиями, создавая ограниченное мембраной пространство трубчатой формы между противоположными опилами большеберцовой кости. В пространство между мембраной и веной-трансплантатом с помощью шприца заливается аутологичная плазма, обогащенная тромбоцитами (плазма частично смешивается с кровью и клетками костного мозга из отломков костей) или альгинатный гель до вытеснения воздуха и заполнения свободного пространства. Производиться послойное ушивание раны. Костные отломки большеберцовой кости фиксируются любым аппаратом внешней фиксации или пластинами для остеосинтеза. Через 4 суток животное вводят в состояние медикаментозного сна, с помощью длинной иглы путем прокола кожного покрова в пространство, ограниченное мембраной под давлением, вводиться суспензия клеточных сфероидов - сфероидов из надкостницы + сфероидов из мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток + гранул гидроксиаппатита в соотношении 1:1:1 для максимально полного заполнения пространства. Через 6 суток дополнительно вводят 2 миллиона клеток культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на 1 см костного дефекта в 1 мл F12. Пространство между веной и стенками мембраны может в дальнейшем заполняться суспензиями клеточных трансплантатов или сфероидов для изучения и стимуляции репаративного остеогенеза. Еще через 6 суток повторяют введение клеточного трансплантата, а именно вводят 2 миллиона клеток культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на 1 см костного дефекта в 0,5 мл F12.
Без использования способа по изобретению и сосуда-трансплантата регенерирующие сосуды из окружающих параоссальных тканей подвергаются редукции к 15 суткам после операции вместе с новообразованной грануляционной тканью, парциальное давление кислорода в регенерирующих тканях падает, и его низкие уровни не позволяют поддерживать остеогенез, на месте костного дефекта формируется атипичный соединительнотканный рубец, костный регенерат не может быть сформирован в такой локальной среде из пересаженных клеточных продуктов. То есть, нужно создать локальную среду регенерации, пригодную для применения клеток и их продуктов, иначе они просто либо погибнут, либо превратятся в клетки рубца.
Пересаженный сосуд поддерживает поступление артериальной крови в центр дефекта кости и поддерживает уровень парциального напряжения кислорода в центре дефекта, достаточный для приживления клеток и репаративного остеогенеза, образует дополнительные сосуды в окружающем соединительнотканном регенерате, эти сосуды не подвергаются редукции и участвуют в остеогенезе. Пересадка сосуда существенно изменяет локальную среду регенерации, которая становится благоприятна для трансплантации биомедицинских клеточных продуктов (клеточного материала), в этих условиях возможна реализации их регенераторного потенциала и восстановление целостности кости.
Пример 2. Определение уровня парциального напряжения кислорода
2
Уровень парциального напряжения кислорода (рО) измеряли методом полярографического определения напряжения кислорода с помощью полярографического анализатора РА-2 (Чехия) с открытыми платиновыми индикаторными электродами в виде игл диаметром 0,2 мм. Иглы после калибровки вводились в обнаженный в ходе диагностической операции соединительнотканный регенерат в центре костного дефекта. Обнаружено, что на 15 сутки после формирования операционного травматического дефекта кости парциальное напряжение кислорода в центральной части костного дефекта с пересаженным сосудом согласно изобретению более, чем в 2,5 раза превышал аналогичный показатель в тканях без трансплантации сосуда.
Клеточные сфероиды.
Сфероиды согласно настоящему изобретению относятся к клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных из живых клеток путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса. В частности, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе клеток надхрящницы собственного реберного хряща субъекта. В частных вариантах воплощения изобретения размер таких сфероидов составляет 250-450 мкм. Способ получения таких сфероидов приводится ниже в примере 1.
Пример 1.
2
Для получения первичной культуры выделенные из надхрящницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
Субкультивирование монослойной культуры хондропрогениторных клеток осуществляют до третьего пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 21 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм.
Кроме того, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы измельченной аллогенной деминерализованной кости (фигура 2). В некоторых вариантах степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %, более конкретно 10 - 30 %. В частных вариантах воплощения изобретения размер таких сфероидов от 250 до 600 мкм. В частных вариантах воплощения изобретения сфероиды содержат частицы аллогенной деминерализованной кости с диаметром от 50 до 250 мкм. Способ получения таких сфероидов приводится ниже в примере 2.
Пример 2.
В качестве источника остеогенных клеток для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используется костный мозг самого пациента, который является источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При этом, в настоящем изобретении биоматериал, то есть частицы деминерализованной кости субъекта, заключены в оболочку из собственных клеток, то есть мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. С одной стороны клетки биокомпозитного сфероида взаимодействую с индуктором их дифференцировки, с другой защищают биокомпозит - аллогенную кость от быстрого лизиса, реакции организма на инородное тело.
Суспензия частиц измельченной аллогенной деминерализованной кости получали путем измельчения готовых деминерализованных костных блоков, подготовленных для клинического применения в виде костных блоков из аллогенной кости - костнопластического материала.
5
2.
3
2
2
2
Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) осуществляют следующим образом. ММСК КМ были выделены из заднего подвздошного гребня здоровых мужчин-доноров (43 ± 5 лет) путем пункции аспирационной иглы и аспирации 25 мл костного мозга в шприц-контейнер. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10 клеток на смв среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10 клеток на см и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.
Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) в условиях 3D культивирования внутри агарозных лунок диаметром 800 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром от 250 до 600 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром от 50 до 250 мкм.
В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса. Клетки и матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к механическим воздействиям. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 8 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм.
Кроме того, сфероиды по изобретению могут представлять собой клеточные сфероиды на основе аутологичных клеток надкостницы субъекта. В частности, размер таких клеточных сфероидов составляет 200-450 мкм. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 мкм. Способ получения таких сфероидов описывается ниже в примере 3.
Пример 3.
В качестве источника клеток скелетных соединительных тканей для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используются клетки внутреннего слоя надкостницы, являющиеся для скелетных соединительных тканей камбиальной зоной, поставляющей прогениторные и стволовые клетки для физиологической и репаративной регенерации, следовательно, содержащая большее количество прогенеторных клеток.
Забор клеток надкостницы осуществляется малоинвазивным методом. Проводится местная анестезия кожи, подкожной клетчатки и надкостницы. Через меленький разрез, достигаем надкостницы, с помощью иглы с физиологическим раствором отделяем надкостницу от ребра, наполняем пространство между компактной костью ребра и его надкостницей, а затем аккуратно иссекаем лоскут - надкостницу. Выделение клеток из надкостницы производили путем предварительного механического выскабливания внутреннего слоя надкостницы с последующей ферментативной диссоциацией кусочков тканей этого слоя до единичных клеток.
2
Для получения первичной культуры выделенные из надкостницы клетки высевают в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
Субкультивирование монослойной культуры прогениторных клеток скелетных соединительных тканей осуществляют до третьего - четвертого пассажа со сменой среды каждые 2-3 дня.
После последнего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,4 миллионов клеток на планшет, где в лунках из культивированных клеток начинают формироваться сфероиды.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 7 суток со сменой питательной среды каждые 2-3 дня.
2
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, с диаметром не менее 1 мм.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.