ПЛАНКТОННЫЙ ШТАММ PARACHLORELLA KESSLERI, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ
PLANKTON STRAIN PARACHLORELLA KESSLERI INTENDED FOR PRODUCTION OF FOOD PRODUCTS

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый планктонный штамм одноклеточной зеленой водоросли Parachlorella kessleri MA, предназначенный для получения пищевой продукции, использующейся как продукт питания. Штамм может являться сырьем для производства фармацевтических препаратов, биологически активных добавок. Допускается применение в ветеринарии, при биологической реабилитации водоемов и для повышения плодородия почвы.
Уровень техники
Известен штамм одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris ИФР № С-111, предназначенный для получения биомассы (патент RU 1751981) [1]. Клеточная оболочка состоит из внутреннего и внешнего слоев, причем она сравнительно толстая. Культивирование ведется в асинхронном режиме на питательной среде с использованием пшеничной соломы для получения раствора углекислого газа. Срок культивирования составляет 4 дня. Недостатками штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 являются длительный срок культивирования, который составляет четверо суток, асинхронный цикл развития клеток, прочная и сравнительно толстая клеточная оболочка.
Описан метод культивирования штамма Chlorella kessleri. В качестве питательной среды используются отходы картофельного производства без добавления минеральных солей. Наряду со значительным увеличением содержания белка происходит уменьшение количества пигментов. При добавлении минеральных солей к отходам в виде азотнокислого и фосфорнокислого калия увеличение продуктивности составляет 10-15%. Недостатком этого способа является длительный срок культивирования - 6 суток [2] (стр. 28).
Известен планктонный штамм (прототип) Chlorella vulgaris ВКПМ А1-24 GKO, предназначенный для получения биомассы (патент RU 2644653) [3]. Обладает тонкой оболочкой. Культивирование ведется в синхронном режиме на модифицированной питательной среде с включением в ее состав раствора углекислого газа, полученного с использованием зерноматериала (голозерного овса). Срок культивирования составляет одни сутки, за которые оптическая плотность суспензии достигает 1,8-2,0 D (440). Недостатками штамма Chlorella vulgaris ВКПМ Al-24 GKO являются слабо выраженная аллелопатия, неспособность противостоять динамическим нагрузкам, а также недостаточно широкий спектр использования биомассы и сравнительно длительный срок культивирования, который в общей сложности составляет сутки.
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения состоит в создании нового планктонного штамма микроводоросли для получения биомассы, использующейся как продукт питания, а также как сырье для производства фармацевтических препаратов, биологически активных добавок, в ветеринарии, при биологической реабилитации водоемов и для повышения плодородия почвы.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение планктонного штамма микроводоросли, способного активно продуцировать биомассу за один цикл культивирования на модифицированной питательной среде с включением в ее состав настоя голозерного овса на фугате коньячного спирта и картофельном соке, которая позволяет набрать нормативную оптическую плотность суспензии за 10-часовой период культивирования при комплексном освещении лампами и солнечным светом в пределах 1,8-2,0 D (440), а также повысить способность штамма предотвращать заселение культуры прочими видами водорослей.
Описание изобретения
Исходным для селекции Parachlorella kessleri MA, депонированным во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ А1-27, был штамм Chlorella kessleri ВКПМ Al-12 NF, который культивировался на питательной среде с включением в ее состав фугата зерновой послеспиртовой барды для получения раствора углекислого газа. Для сокращения срока культивирования и получения биомассы использовалось комплексное освещение культуры лампами и солнечным светом.
В результате селекции был отобран штамм, способный интенсивно наращивать биомассу за предельно короткий срок культивирования (10 часов) и соблюдающий условия монокультуры в процессе производства с хорошо выраженными аллелопатическими свойствами.
Морфологические признаки. Молодые клетки эллипсоидной формы, размером 2,0-2,5 мкм. Взрослые клетки шаровидные 7,0-9,0 мкм в диаметре. Клетки с уже сформированными автоспорами, но еще находящиеся в материнской оболочке, 7,0-11,0 мкм в диаметре. Размер готовых к делению клеток зависит от количества автоспор. Освобождение автоспор из клетки происходит путем разрыва оболочки на две доли. Хлоропласт в молодых клетках корытовидный и плотно прилегает к оболочке. Хлоропласт взрослой клетки по форме широкопоясковидный незамкнутый и выстилает  поверхности клетки. Пиреноид окружен крахмальной оберткой, состоящей из двух полусфер. Споры одинакового размера. Число спор 2-8. Чаще всего спор 8, редко 16. Число спор бывает только четное. Деление клеток синхронное. Клетки как молодые, так и взрослые темно-зеленого цвета.
На агаризированной минеральной среде при температуре 28°С на седьмой день на свету образуются выпуклые гладкие блестящие колонии с ровными краями. Диаметр колоний преимущественно 2 мм, окрашены в темно-зеленый цвет, размер клеток 4,8 мкм длиной и 4,0 мкм шириной. Цвет клеток как молодых, так и взрослых темно-зеленый.
Физиологические признаки. Штамм автотрофный, в лабораторных и производственных условиях растет на питательной среде, состоящей из минеральных и органических компонентов.
Питательная среда (1) на литр водопроводной воды при соотношении химических реактивов и комплекса органических веществ представлена следующим составом:
- Минеральные компоненты
1) нитрат аммония
0,24 г;
2) моноаммонийфосфат, 15% раствор
0,12 мл;
3) хлорид железа, 1% раствор
0,15 мл;
4) кобальт азотнокислый, 0,01% раствор
0,50 мл;
5) медь сернокислая, 0,01% раствор
0,50 мл;
6) магний сернокислый
0,20 г;
7) марганец сернокислый
0,10 г;
8) калий сернокислый, 12% раствор
0,50 мл;
- Органические компоненты
1) настой голозерного овса на фугате коньячного спирта и картофельном соке (1,0:2,0:0,5), рН 4-6
20 мл.
Для приготовления органического компонента питательной среды используют зерно голозерного овса, фугат коньячного спирта и сок картофельный в соотношении частей 1,0:2,0:0,5. Настаивают в течение одних суток при температуре 28°С. Затем полученный настой процеживают через сетчатый фильтр. Определяют рН, который должен быть 4-6. Настой вводят в культуральную среду в количестве 20 мл на один литр.
Штамм хорошо развивается, когда созданы условия комплексного освещения: лампами и солнечным светом. При этом в производственном процессе хорошо проявляются аллелопатические свойства, позволяющие строго соблюдать условия монокультуры.
При комплексном освещении температура суспензии не должна превышать 30°С, а оптимальная температура культивирования в дневное время должна быть в пределах 28-30°С, в ночное время - 23-25°С. Период освещения составляет 10 часов, за который культура набирает нормативную оптическую плотность 1,8 D (440). При комплексном освещении штамм устойчиво развивается и не зависит от сезона года.
Штамм проявляет явно выраженные антагонистические свойства уже при наборе культурой оптической плотности 0,85 D (440), при этом наступает лизис прочей альгофлоры, гибель бактерий, грибов и дрожжей. Штамм обладает повышенной стойкостью к поражению фагами.
Стойкого цикла развития у штамма нет. Выход спор из клеток осуществляется в любое время суток.
Культуральные свойства. Клетки штамма равномерно распределяются в культуральной среде, так как штамм обладает планктонными свойствами, т.е. находятся во взвешенном состоянии и свободно парят в водной толще. Клеткам свойственно равномерное распределение в культуральной среде. Штамм относится к категории пресноводных, при этом выносит соленость воды до
Штамм выращивается на питательной среде с использованием водопроводной воды. В состоянии покоя для естественного осаждения клеток требуется 1-2 месяца. Жизнеспособность клеток в культуре сохраняется при условиях хранения на рассеянном свету при комнатной температуре. Осевшие клетки можно вывести из покоя путем удаления надосадочной жидкости, добавления питательной среды, и в течение суток выдержав на рассеянном свету.
Штамм культивируется круглый год, сезонных изменений не отмечается, агглютинация не происходит, автолиз клеток не наблюдается.
При культивировании в установках штамм требователен к соблюдению биотехнологии выращивания и составу питательной среды. При достижении нормативной оптической плотности в культуре полностью усваиваются внесенные элементы питательной среды. Для культивирования штамма не требуется создания условий стерильности.
Биотехнологические свойства и особенности культивирования. Для культивирования штамма могут использоваться установки различных типов, емкости которых выполнены из стекла или органических материалов. Культивирование ведется в помещении, приспособленном для одновременного освещения лампами и солнечным светом; наиболее подходящими являются теплицы.
Культивирование штамма возможно с помощью «Установки для непрерывного выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2571939) [4] или «Установки для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей» (патент RU 2540011) [5]. Эти установки позволяют использовать как освещение лампами, так и солнечное, при этом наибольший эффект достигается при их одновременном освещении культуры. Быстрое накопление биомассы достигается в результате ускорения синтеза хлорофилла и метаболизма, для чего требуется высокая интенсивность освещения и качество света, характеризующееся его полным спектром. Поэтому для получения нормативной оптической плотности культуры затрачивается 10 часов, в результате чего за одни сутки можно получить продукцию два раза. При культивировании в ночное время в качестве дополнительного освещения используется лампа солнечного света.
Культивирование планктонного штамма Parachlorella kessleri MA с использованием в составе питательной среды настоя голозерного овса на фугате коньячного спирта и картофельном соке является основой для интенсивного набора биомассы.
Клетки в культуре хорошо переносят транспортировку на всех видах транспорта, а также выдерживают механическое перемешивание культуры, выращивание в лабораторных качалках.
Пример получения биомассы
В емкость установки по патенту 2540011 вводят маточную культуру планктонного штамма Parachlorella kessleri MA с оптической плотностью 1,8 D (440) и питательную среду (1) в соотношении 1:1. Если долгота дня менее 10 часов, то включают освещение лампами до восхода солнца, в остальной период года лампы включают с восходом солнца. Если культивирование ведется в ночное время в качестве дополнительного освещения используют лампы солнечного света. Во всех случаях период инсоляции составляет 10 часов. Температуру суспензии в емкости поддерживают на уровне 28-30°С. По завершении периода освещения лампы отключают и культуру сливают для получения биомассы, готовой к дальнейшему использованию. За 10-часовой период культивирования биомасса составляет 1,0 г/л сухого вещества, т.е., по сравнению с прототипом, время получения биомассы сокращается в два раза.
Спектр использования штамма значительно шире, чем у прототипа, и включает кроме продукта питания производство фармацевтических препаратов, биологически активных добавок, применение в ветеринарии и биологической реабилитации водоемов, а также для повышении плодородия почвы.
Таким образом, получен новый планктонный штамм Parachlorella kessleri MA, который является более продуктивным, наделенным явно выраженными аллелопатическими свойствами, использующим комплексное освещение и хорошо приспособленным к динамическим нагрузкам. Штамм имеет широкий спектр использования биомассы, которыми не обладает ни один из известных штаммов.
Источники информации
1. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987, кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris - продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.97. Бюл. №4.
2. Мельников С.С., Мананкина Е.Е. Хлорелла: физиологически активные вещества и их использование. Минск: «Навука i тэхнiка». 1991. С. 80.
3. Патент РФ 2644653 от 05 апреля 2017 г., кл. C12N 1/12. Планктонный штамм Chlorella vulgaris, предназначенный для получения пищевой биомассы. Грабарник В.Е., Карелин Н.В., Богданов Н.И. 13.02.2018. Бюл. №5.
4. Патент РФ 2571939 от 15 апреля 2015 г., кл. С12М 1/00. Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей. Богданов Н.И. 27.12.2015. Бюл. №36.
5. Патент РФ 2540011 от 10 декабря 2013, кл. С12М 1/00. Установка для выращивания планктонных водорослей и светильник установки для выращивания планктонных водорослей. Грабарник В.Е., Карелин Н.В. 27.01.2015.