АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ 5-АМИНОЛЕВУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ЛИПОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ - ГЕКСИЛОВОГО И ОКТИЛОВОГО ЭФИРОВ

УДК 632.95

АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ 5-АМИНОЛЕВУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ЛИПОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ - ГЕКСИЛОВОГО И ОКТИЛОВОГО ЭФИРОВ

СГ. Спивак*, ВС. Голубева**, ВЮ. Давыдов*, ВИ. Долтопалец*, ИВ. Тростянко*, МА Кисель*

*Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск **Центральный ботанический сад НАН Беларуси, Минск

Показано, что фитопатогенные грибы Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel. (=Botrytis cinerea Pers.) и Alternaria alternata (Fr.) Keiss различаются по чувствительности к антифунгаль-ному действию 5-аминолевулиновой кислоты и ее липофильных производных - гексилового и ок-тилового эфиров. Установлено, что липофильные производные 5-аминолевулиновой кислоты более эффективно подавляют развитие семенной грибной инфекции пшеницы, чем 5-аминолевулиновая кислота. Обработка семян пшеницы препаратами в концентрации, подавляющей развитие грибной инфекции, не снижает их жизнеспособность и существенно не влияет на рост 3-дневных проростков.

Ключевые слова: 5-аминолевулиновая кислота, липофильные производные, фитопатогенные грибы, антифунгальная активность, семена пшеницы.

Известно, что 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК) является общим метаболическим предшественником порфиринов в растениях, у животных и у микроорганизмов (Wang et al., 2003). В высоких концентрациях (более 10.0 мМ) 5-АЛК обладает свойствами биодеградабельного фотодинамического гербицида и подавляет рост растений (Rebeiz, 1984; Averina and Yaronskaya, 1991; Hotta et al., 1997b), а в низких (0.1-3.0 мМ) стимулирует рост и продуктивность риса, фасоли, картофеля и др. (Hotta et al., 1997a,1997b, Wang et al., 2003,2004; Watanabe et al., 2006), а также повышает устойчивость растений к пониженной температуре и засоленности почв (Hotta et al., 1998; Watanabe et al., 2000). Более того, недавно было обнаружено, что

помимо рострегулирующей активности 5-АЛК присуща еще и способность подавлять рост и развитие ряда фитопатоген-ных грибов (Luksiene et al., 2005,2007,2009). В то же время не исследована антифунгальная активность ее липо-фильных производных, в частности гексилового (ГЭ-АЛК) и октилового (ОЭ-АЛК) эфиров, которые не только обладают способностью к более легкому проникновению в растительные клетки, но и являются регуляторами роста и развития растений (Спивак и др., 2007).

В связи с этим целью данной работы являлось сравнительное изучение антифун-гальной активности 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК in vitro и их способности ингибировать развитие семенной инфекции пшеницы.

Методика исследований

Объектами исследования были фитопатогенные микромицеты Botrytiris cynerea Persl. (B. cynerea), Alternaria alternata (A. alternata) и семена пшеницы T. aestivum L. сорт Былина.

5-АЛК и ее липофильные производные - гексило-вый (ГЭ-АЛК) и октиловый (ОЭ-АЛК) эфиры были синтезированы в лаборатории химии липидов ИБОХ НАН Беларуси (Тростянко и др., 2009).

Изучение антифунгальной активности препаратов проводилось в чашках Петри. Предварительно простерилизованные фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0.22 мкм водные растворы 5-АЛК, Г-5-АЛК и О-5-АЛК в концентрациях 0.5 мМ, 5.0 мМ и 10.0 мМ вносили в агаризованную среду Чапека, охлажденную до 40 С, и разливали в чашки Петри. Контролем служила среда без добав-

ления препаратов. Диаметр колоний измеряли через 7 суток и оценивали ингибирование роста мицелия грибов. Расчет ингибирующей активности препаратов проводили по формуле Эбота, как процент инги-бирования роста колоний грибов, равный

100(Дк-До)/Дк, где Дк - диаметр колонии гриба в контроле, см; До -диаметр колонии гриба в опыте.

Для исследования влияния 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на развитие грибной инфекции семена инкубировали в водных растворах этих соединений 0.5 мМ, 5.0 мМ и 10.0 мМ концентраций в течение 24 часов при +15°С, затем промывали стерильной дистиллированной водой, помещали в чашки Петри на агаризованную питательную среду и проращивали при +25 С в темноте. На 7-е сутки учитывали зара-

женность семян грибами (количество инфицированных зерновок, приходящихся на 100 семян образца). Степень подавления семенной инфекции оценивали по снижению количества инфицированных семян и проростков. Результаты выражали в процентах от общего количества исследуемых семян.

Для изучения влияния 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на прорастание и рост проростков семена инкубировали в водных растворах исследуемых соединений в концентрациях 0.5 мМ, 5.0 мМ и 10.0 мМ в течение 24 часов при +15оС, промывали стерильной

дистиллированной водой, помещали в чашки Пет-рина агаризованную питательную среду и проращивали при +25оС в темноте. Длину проростков измеряли на 3-е сутки проращивания.

В контрольных опытах семена замачивали в стерильной дистиллированной воде. Эталоном в исследованиях служил химический протравитель фунда-зол (0.2% раствор), что соответствует 10.6 мМ концентрации.

Результаты представлены как средние значения трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

Результаты исследований

Одной из задач данной работы являлось сравнительное исследование способности 5-АЛК и ее липофильных производных - ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК тормозить рост колоний фитопатогенных грибов при контактном действии in vitro. Фитоэкс-пертиза семян пшеницы свидетельствует о том, что в условиях Беларуси доминирующими являются грибы родов Botrytis, Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Pénicillium и Mucor. Для исследования анти-фунгальной активности 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК in vitro в качестве тест-организмов использовали фитопатоген-ные грибы B. cynerea, A. alternate, которые культивировали на средах, содержащих исследуемые соединения в концентрациях 0.5 мМ, 5.0 мМ и 10.0 мМ, или не содержащих этих соединений.

Ингибирующий эффект 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на рост колоний был в разной степени отмечен у B. cynerea и A. alternata (табл. 1). Видно, что наиболее выраженное торможение роста колоний грибов наблюдалось при 10 мМ концентрации препаратов в питательной среде. Наиболее высокую фунгистатическую активность по отношению к B. cynerea проявил ГЭ-АЛК, который ингибирует рост колоний этого фитопатогена на 33.6% в 5.0 мМ концентрации, а наименьшую - 5-АЛК (18.2%) при 5 мМ концентрации препарата в среде. В то же время по отношению к A. alternata наиболее высокую способность подавлять рост колоний при этой же концентрации препаратов проявила 5-АЛК (56.0%), а наиболее низкую ОЭ-АЛК (7.5%). При этом ОЭ АЛК оказался более эффективен по отношению к B. cynerea,

чем к A. alternata (табл. 1). Это согласуется с данными других авторов (Luksiene et al., 2007), показавших, что чувствительность фитопатогенных грибов к ингиби-рующему действию 5-АЛК зависит от их таксономической принадлежности. В отличие от 5-АЛК, ее липофильные производные ингибировали рост колоний фито-патогенных микромицетов уже в 0.5 мМ концентрации. Представленные результаты свидетельствуют о том, что ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК в концентрациях 5.0 мМ и выше (10.0 мМ) проявляют фунгистатическую активность и оказывают выраженное сдерживающее действие на рост мицелия грибов B. cynerea и A alternata в чистой культуре.

Таблица 1. Антифунгальное действие 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на фитопатогенные грибы in vitro в зависимости от концентрации добавленных в питательную среду препаратов

Препараты Концентрация препара- Ингибирование роста колоний грибов на 7-е сутки культивирования

B. cynerea A. alternata

5-АЛК 0.5 4.0±2.4 12.3±3.4

5.0 18.2± 3.0 56.0±2.8

10.0 52.6± 3.0 81.0±4.0

ГЭ-АЛК 0.5 21.1± 2.2 25.0±2.2

5.0 33.6±3.5 42.4±2.8

10.0 40.0±3.6 54.4±3.2

ОЭ-АЛК 0.5 22.0±3.4 4.8±2.0

5.0 29.4±3.0 7.5±2.7

10.0 57.3±3.5 25.0±3.3

*В агаризованной среде Чапека, мМ.

Сравнительное исследование антифун-гального действия 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК проведено на семенах пшеницы сорта Былина. Все исследуемые соединения в различной степени подавляли развитие поверхностной семенной инфекции (рис.).

Так, ГЭ-АЛК, ОЭ-АЛК и 5-АЛК в кон-

Вестник защиты растений, 1, 2013 центрации 10.0 мМ подавляют развитие семенной инфекции на 80%, 74% и 47% соответственно. Наиболее высокую анти-фунгальную активность проявил ГЭ-АЛК. Обработка семян фундазолом в 10.6 мМ концентрации снизила их зараженность на 79.3%. Несмотря на то что 10.6 мМ препарат фундазола несколько более эффективно обеззараживает семена пшеницы, чем 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК в концентрации 5.0 мМ, следует отметить, что исследуемые соединения в этой "обеззараживающей" концентрации обеспечивают достаточно высокий уровень подавления семенной инфекции. Липофильные производные 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК обеззараживали семена более эффективно, чем 5-АЛК.

точки зрения, допустимой для обработки против семенной инфекции изученных нами видов грибов. Следует отметить, что задержка роста проростков и корней после обработки семян исследуемыми препаратами в концентрации 5.0 мМ наблюдалась лишь на начальных этапах развития.

Таблица 2. Влияние обработки семян 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на рост проростков и корней пшеницы

Концент- Длина про- Длина кор-

Препараты рация пре- ростков на 3 ней на 3-и

паратов в сутки в % к сутки в % к

среде, мМ контролю контролю

5-АЛК 5.0 10.0 89.0±2.5 58.0±2.5 86.0±2.7 56.5±3.0

ГЭ-АЛК 5.0 85.5±1.8 82.0±2.5

10.0 40.3±2.0 41.5±2.9

ОЭ-АЛК 5.0 10.0 79.0±2.4 36.0±3.0 75.0±2.0 32.5±3.0

Контроль, вода - 100.0 100.0

Фундазол 10.6 88.3±2.7 85.5±3.0

10.6 мМ 5 10 5 10 5 10 Фундазол 5-АЛК ГЭ-АЛК ОЭ-АЛК

Рис. Подавление развития семенной инфекции пшеницы 5-АЛК, Г-5-АЛК и О-5-АЛК

С целью выявления возможных отрицательных эффектов 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК на растения мы исследовали их влияние в "обеззараживающих" концентрациях на прорастание и рост проростков и корней пшеницы. Обработка семян препаратами в концентрации 10.0 мМ приводила к существенной (концентрации 5.0 мМ - меньшей) задержке роста проростков и корней (табл. 2). Из приведенных данных видно, что липофильные производные 5-АЛК тормозят рост проростков и корней в несколько большей степени, нежели 5-АЛК. Обработка семян фундазолом также сопровождалась некоторой задержкой роста проростков и корней, сопоставимой с 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК (табл. 2.).

Таким образом, 5.0 мМ "обеззараживающая" концентрация 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК является малофитотоксичной и, с этой

Обнаруженная нами способность ли-пофильных производных 5-АЛК более эффективно подавлять развитие грибной семенной инфекции может быть обусловлена их более легким проникновением в клетки грибов. Это предположение представляется наиболее вероятным, так как ранее нами было показано, что ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК значительно легче проникают в клетки листьев ячменя и проявляют ро-стрегулирующую активность в более низких концентрациях, чем 5-АЛК (Спивак и др., 2007). Возможно, снижение уровня зараженности семян и проростков обусловлено не только собственно антифунгаль-ным действием исследуемых соединений, но и повышением устойчивости самих растений пшеницы к фитопатогенной инфекции за счет активации ферментов растительной антиоксидантной системы (ЬикБ1епе еt а1., 2007) или каких-либо других защитных реакций растений. В биосинтезе тетрапирролов (гема и хлорофилла) в растениях и других организмах 5-АЛК играет ключевую роль, являясь их общим метаболическим предшественником, что, по-видимому, и обусловливает широкий спектр ее биологической активности. Биологический эффект влияния 5-АЛК на

растения в высоких концентрациях - более 10 мМ, когда она проявляет свойства фотодинамического гербицида, опосредован продуктами ее внутриклеточного метаболизма - порфиринами. Избыток про-топорфирина IX индуцирует образование активных форм кислорода, перекисное окисление мембранных липидов (Rebeiz, 1984; Averina and Yaronskaya, 1991; Hotta et al., 1997b) и, как следствие, деструкцию клеточных структур и разрушение биологической ткани. Следует отметить, что, в отличие от 5-АЛК, ее липофильные производные не индуцируют образование избытка порфиринов, так как активность эстераз в клетках растений значительно ниже, чем в клетках животных, что существенно затрудняет превращение липо-фильных эфиров в собственно 5-АЛК и, следовательно, в порфирины (Kolossov, Rebeiz, 2005). Как следствие, липофильные эфиры 5-АЛК не могут быть эффективными фотодинамическими гербицидами.

Если природа фотодинамического действия 5-АЛК экспериментально доказана, то механизм ее рострегулирующей активности в низких концентрациях (0.1-3.0 мМ) пока не установлен. Ранее мы показали, что 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК в высоких концентрациях (более 5 мМ) индуцируют в клубнях картофеля реакцию сверхчувствительности (СВЧ), которая сопровождается существенным подавле

нием биосинтеза стероидных гликоалка-лоидов уже при 0.05 мМ концентрации препаратов (Спивак и др., 2009). Ингибиро-вание биосинтеза стероидных гликоалкало-идов у растений, в частности у картофеля, в случае индукции СВЧ элиситорами и некро-тизирующими фитопатогенами обусловлено подавлением активности скваленсинтазы -ключевого белка биосинтеза стеринов у эу-кариотических организмов ^оок, Кис, 1991).

Поэтому мы полагаем, что торможение роста как растений, так и грибов 5-АЛК и ее липофильными эфирами в относительно высокой концентрации также может быть обусловлено ингибированием биосинтеза стеринов и, как следствие этого, важных стероидных биорегуляторов. Возможно, что в этот процесс также вовлечены продукты метаболизма 5-АЛК - порфирины.

Интересно отметить, что изучаемые нами патогены отличаются по чувствительности к ингибирующему действию 5-АЛК, ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК. Это может быть обусловлено особенностями мембранного транспорта и метаболизма этих соединений, а также разницей в их амфифильных свойствах. Липофильные производные 5-АЛК способны нарушать нативную структуру мембран и, тем самым, проявлять так называемую "темновую токсичность". Подобный механизм рассматривается в отношении инактивации ряда грамотрица-тельных и грамположительных бактерий под действием различных липофильных производных 5-АЛК (ЕойпоБ et а1., 2008).

Заключение

Данная работа является первым примером применения липофильных производных 5-АЛК для подавления фитопато-генной грибной семенной инфекции. В работе выявлен избирательный характер действия исследуемых соединений на рост B. cynerea и A. alternata при контактном действии in vitro. Установлено, что in vivo ГЭ-АЛК и ОЭ-АЛК более эффективно подавляют развитие грибной семенной инфекции, чем 5-АЛК, не уменьшая жизнеспособность семян, но снижая силу роста до уровня, присущего фундазолу. Следует отметить, что липо-филизация молекулы 5-АЛК позволила по-

высить ее эффективность почти в два раза.

Не исключено, что среди производных 5-АЛК при углубленном исследовании данной группы соединений могут быть найдены более эффективные и нетоксичные вещества, которые будут обладать не только длительной антифунгальной активностью, но и способствовать повышению продуктивности растений и их устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Учитывая, что оценка энергии прорастания и лабораторной всхожести (4 и 7-й день соответственно) не выявляет весь "запас" семенной инфекции, проявление

которой отмечается 2-3 недели (Хоро-шайлов, 1972), полученные результаты можно рассматривать как предварительные, что предполагает необходимость дальнейших исследований. Надо полагать, что при отсутствии вредного влияния за-

держки начального роста проростков на полевую всхожесть и продуктивность вполне реальна перспектива разработки более безопасной и экономически выгодной технологии защиты растений от семенных инфекций пшеницы.

Литература

Спивак С.Г., Яронская Е.Б., Вершиловская И.В., Давыдов В.Ю., Тростянко И.В., Долгопалец В.И., Аверина Н.Г., Кисель М.А. Стимуляция роста и развития растений ячменя липофильными эфирами 5-аминолевулиновой кислоты // Доклады НАН Беларуси, 2007, 51, 50, с. 95-99.

Спивак С.Г., Давыдов В.Ю., Санько Е.В., Долгопалец В.И., Тростянко И.В., Кисель М.А. Влияние 5-аминолевулиновой кислоты и ее липофильных производных на биосинтез фитоалексинов и стероидных глико-алкалоидов в клубнях картофеля // Матер. докл. Всероссийской конференции "Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды", Иркутск, 2009, с. 94-98.

Тростянко И.В., Долгопалец В.И., Кисель М.А., Лахвич Ф.А. Новый подход к синтезу липофильных эфи-ров 5-аминолевулиновой кислоты // Доклады НАН Беларуси, 2009, 53, 3, с. 87-89.

Хорошайлов Н.Г. Методы определения посевных качеств семян с учетом состояния их здоровья и воздействия обеззараживающих веществ // Влияние микроорганизмов и протравителей на семена. М., Колос, 1972, с.16-21.

Averina N., Yaronskaya E. Involvement of 5-aminolevulinic acid in the regulation of plant growth // Photo-synthetica, 1991, 26, p. 27-31.

Fotinos N., Convert M., Piffaretti J., Gurny R., Lange1 N. Effects on gram-negative and gram-positive bacteria mediated by 5-aminolevulinic acid and 5-aminolevulinic acid derivatives // Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, 52, 4, p. 1366-1373.

Hotta Y., Tanaka T., Takaoka H., Takeuchi Y., Komai M. New physiological effects of 5-aminolevulinic acid in plants: the increase of photosynthesis, chlorophyll content and plant growth // Biosci. Biotech. Biochem., 1997a, 61, 2, p. 2025-2028.

Hotta Y., Tanaka T., Takaoka H., Takeuchi Y., Konnai M., Khateeb A. Promotive effects of 5-aminolevulinic acid on the yield of several crops. // Plant Growth Regul., 1997b, 22, 2, p. 109-114.

Hotta Y., Tanaka T., Bingshan L., Takeuchi Y., Komai M. Improvement of cold resistance in rice seedlings by 5-aminolevulinic acid // J. Pestic. Sci., 1998, 23, p. 29-33.

Kolossov V., Rebeiz A. Chloroplast Biogenesis 91: Detection of delta-aminolevulinic acid esterase activity in higher

plant and insect tissues // Pest. Biochem. Physiol., 2005, 83, p. 9-20.

Luksiene Z., Peciulyte D., Jurkoniene S., Puras R. Inacti-vation of possible fungal food contaminants by photosensitiza-tion // Food Technology and Biotechnology, 2005, 43, p. 1-7.

Luksienéa Z., Danilcenko H., Taraseviciené Z., Anuseviciusc Z., Marozienéc A, Nivinskas H. // New approach to the fungal decontamination of wheat used for wheat sprouts: effects of aminolevulinic acid.// Int. J. Food Microbiol., 2007, 116, 1, p. 153-158.

Luksiené Z., Zukauskas A. Prospects of photosensitiza-tion in control of pathogenic and harmful micro-organisms // J. Appl. Microbiol., 2009, 107, 5, p. 1415-1424.

Rebeiz C., Montazer Z., Hoppen H., Wu S. Photodynamic herbicide. I. Concept and phenomenology // Enzyme. Microb. Technol., 1984, 6, p. 390-401.

Watanabe K., Tanaka T., Kuramochi H., Takeuchi Y. Improving salt tolerance of cotton seedling with 5-aminolevulinic acid // Plant Growth. Regul., 2000, 32. p. 97-101.

Wang L., Jiang W., Zhang Z., Yao Q., Matsui H., Ohara H. Biosynthesis and physiological activities of 5-aminolevulinic acid (ALA) and its potential application in agriculture // Plant Physiol. Commun., 2003, 39, p. 185-192.

Wang L., Jiang W., Huang B. Promotion of 5-aminolevulinic acid on photosynthesis of melon (Cucumis melon) seedling under low light and chilling stress conditions // Physiol. Plant., 2004, 121, p. 258-264.

Wang L., Jiang W., Liu H., Liu W., Kang L., Hou X. Promotion by 5-aminolevulinic acid of germination of Pakchoi (Brassica campestris ssp. chinensis var. communis Tsen et Lee) seeds under salt stress // J. Integr. Plant Biol., 2005, 47, 9, p. 1084-1091.

Watanabe K., Tanaka T., Kuramochi H., Takeuchi Y. Improving salt tolerance of cotton seedling with 5-aminolevulinic acid // Plant Growth. Regul., 2000, 32. p. 97-101.

Watanabe K., Nishihara E., Watanabe S., Tanaka T., Takahashi K., Takeuchi Y. Enhancement of growth and fruit maturity in 2-year-old Grapevines cv. Delaware by 5-aminolevulinic acid // Plant Growth. Regul., 2006, 49, 1, p. 35-42.

Zook M., Kuc J. Induction of sesquiterpene cyclase and suppression of squalene synthetase activity in elicitor treated or funga1 infected potato tuber tissue // Physiol. Mo1. Plant Pathol., 1991, 39, p. 377-390.

ANTIFUNGAL ACTIVITY OF 5-AMINOLEVULINIC ACID AND ITS LIPOPHILIC DERIVATIVES -

HEXYL AND OCTYL ETHERS S.G.Spivak, V.S.Golubeva, V.Y.Davydov, V.I. Dolgopalets, I.V. Trostyanko, V.A.Kisel This study is devoted to comparative investigation of antifungal activity of 5-ALA and its lipophilic derivatives. Presented data revealed that sensitivity of fungi belonging to different taxonomic groups to 5-ALA and its lipophilic derivatives treatment varied considerably. Lipophilic ethers were more efficient than 5-ALA for reducing fungus growth. The treatment of wheat seeds by 5-ALA and its lipophilic derivatives in fungus growth inhibition concentration showed the absence of impairing the vigour of seed germination and viability.

Keywords: 5-aminolevulinic acid, lipophilic derivative, phytopathogenic microfungus, antifungal activity, wheat seed.

C.r.CnMBaK, K.6.H., spivak@iboch.bas-net.by B.Cxo.y6eBa, h.c., B.ro.flaBbigoB, h.c., B.M.flo.rona.e^ k.x.h., m.b.tpocthhko, k.x.h., M.A.Kuce.b, g.x.H.