ТРИАЗОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗ
TRIAZOLES USED AS PROTEIN KINASE INHIBITORS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеинкиназ. Данное изобретение также предлагает фармацевтические композиции, содержащие соединения данного изобретения, и способы применения композиций для лечения различных заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Достигнутое в последнее время глубокое понимание структуры ферментов и других биологических молекул, ассоциированных с разными заболеваниями, существенно облегчает поиск новых терапевтических средств. Одним из важных классов ферментов, подвергающихся обширным исследованиям, являются протеинкиназы.
Протеинкиназы составляют большое семейство структурно-родственных ферментов, регулирующих разные процессы передачи сигнала в клетке. (См., Hardie, G. and Hanks, S. The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, CA: 1995.) Поскольку протеинкиназы обладают определенной консервативностью структуры и каталитических функций, считается, что они произошли от общего гена. Почти все киназы содержат одинаковый каталитический домен размером 250-300 аминокислот. Киназы можно подразделить на семейства в зависимости от субстратов, которые они фосфорилируют (например, протеин-тирозиновые, протеин-сериновые/треониновые, липидные и др. киназы). Идентифицированы мотивы последовательностей, которые, как правило, соответствуют каждому из указанных семейств киназ (см., например, Hanks, S.K., Hunter, T., FASEB J. 1995, 9, 576-596; Knighton et al., Science 1991, 253, 407-414; Hiles et al., Cell 1992, 70, 419-429; Kunz et al., Cell 1993, 73, 585-596; Garcia-Bustos et al., EMBO J. 1994, 13, 2352-2361).
2
2
Как правило, протеинкиназы опосредуют внутриклеточную передачу сигнала, обеспечивая перенос фосфорила от нуклеозидтрифосфата к белковому акцептору, который участвует в сигнальном пути. Указанные события фосфорилирования действуют как молекулярные механизмы включения/выключения, которые могут модулировать или регулировать целевую биологическую функцию белка. Данные события фосфорилирования в конечном счете запускаются в ответ на ряд внеклеточных и других стимулов. Примеры таких стимулов включают в себя сигналы окружающей среды и химического стресса (например, сигналы осмотического шока, теплового шока, ультрафиолетовое излучение, бактериальный эндотоксин и HO), цитокины (например, интерлейкин-1 (IL-I) и фактор некроза опухоли α (TNF-α)), факторы роста (например, колониеобразующий гранулоцитарно-макрофагальный фактор (GM-CSF) и фактор роста фибробластов (FGF)). Внеклеточный стимул может воздействовать на один или несколько клеточных ответов, связанных с клеточным ростом, миграцией, дифференциацией, секрецией гормонов, активацией факторов транскрипции, сокращением мускулатуры, метаболизмом глюкозы, регуляцией синтеза белков и регуляцией клеточного цикла.
Многие заболевания связаны с аномальными клеточными ответами, запускаемыми событиями, опосредованными протеинкиназами, как описано выше. Данные заболевания включают в себя, без ограничения, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, заболевания костей, метаболические заболевания, неврологические и нейродегенеративные заболевания, рак, сердечно-сосудистые заболевания, аллергии и астму, болезнь Альцгеймера и гормональные заболевания. Соответственно, в медицинской химии проводится интенсивный поиск ингибиторов протеинкиназ, которые являются эффективными терапевтическими средствами.
Семейство рецепторов тирозинкиназ типа III, включающих в себя Flt3, c-Kit, PDGF-рецептор и c-Fms, играет важную роль в поддержании, росте и развитии гематопоэтических и негематопоэтических клеток. [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333 and Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757.] FLT-3 и c-Kit регулируют поддержание стволовых клеток/пулов ранних предшественников, а также развитие зрелых лимфоидных и миелоидных клеток [Lyman, S, Jacobsen, S, Blood, 1998, 91, 1101-1134]. Оба рецептора содержат характеристический киназный домен, который активируется путем лиганд-опосредованной димеризации рецепторов. После активации киназный домен индуцирует аутофосфорилирование рецептора, а также фосфорилирование разных цитоплазматических белков, опосредующих распространение сигнала активации, который обеспечивает рост, дифференциацию и выживание. Некоторые из понижающих регуляторов сигнального пути, в котором участвуют рецепторы FLT-3 и c-Kit, включают в себя PLCγ, PI3-kinase, Grb-2, SHIP- и Src-родственные киназы [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Показано, что обе рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в развитии ряда гематопоэтических и негематопоэтических злокачественных заболеваний. Мутации, приводящие к лиганд-независимой активации FLT-3 и c-Kit, участвуют в развитии острого миелогенного лейкоза (AML), острого лимфолейкоза (ALL), мастоцитоза и стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST). Данные мутации включают в себя одиночные аминокислотные замены в киназном домене или внутренние тандемные дубликации, точечные мутации или делеции в рамке считывания околомембранного участка рецепторов. Помимо активирующих мутаций, лиганд-зависимая (аутокринная или паракринная) стимуляция сверхэкспрессии FLT-3 или c-Kit дикого типа может участвовать в формировании злокачественного фенотипа [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333].
c-fms кодирует рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF-1R), который экспрессируется преимущественно в линиях моноцитов/макрофагов [Dai, XM et al., Blood, 2002, 99, 111-120]. MCSF-1R и его лиганд регулируют рост и дифференциацию макрофагов. Подобно другим членам семейства, MCSF-1R содержит характеристический киназный домен, который активируется при индуцированной лигандом димеризации рецептора. MCSF-1R также экспрессируется в негематопоэтических клетках, в том числе в эпителиальных клетках молочной железы и нейронах. Мутации данного рецептора потенциально связаны с миелоидными лейкозами, а его экспрессия коррелирует с метастатическими карциномами молочной железы, яичников и эндометрия [Reilly, JT, British Journal of Haematology, 2002, 116, 744-757 and Kacinski, BM, Mol. Reprod and Devel., 1997, 46, 71-74]. Другим возможным показанием для применения антагонистов MCSF-1R является остеопороз [Teitelbaum, S, Science 2000, 289, 1504-1508].
Рецептор PDGF (PDGFR) содержит две субъединицы - PDGFR-α и PDGFR-β, которые могут образовывать гомо- или гетеродимеры при связывании с лигандом. Существует несколько лигандов PDGF: AB, BB, CC и DD. PDGFR экспрессируется ранними стволовыми клетками, мастоцитами, миелоидными клетками, мезенхимальными клетками и клетками гладкой мускулатуры [Scheijen, B, Griffin JD, Oncogene, 2002, 21, 3314-3333]. Только PDGFR-β участвует в развитии миелоидного лейкоза, как правило, в качестве партнера Tel, Huntingtin-связывающего белка (HIP1) или Rabaptin5 по транслокации. Недавно было показано, что активирующие мутации в киназном домене PDGFR-α связаны со стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта (GIST) [Heinrich, MC et al., Sciencexpress, 2003].
Циклин-зависимые киназы (CDK) представляют собой серин/треониновые протеинкиназы, состоящие из обогащенной β-складчатой структурой аминоконцевой доли и более крупной карбокси-концевой доли, которая преимущественно находится в конформации α-спирали. CDK содержат 11 субдоменов, общих для всех протеинкиназ и имеющих молекулярную массу от 33 до 44 кДа. Для полной активации киназ данного семейства, которое включает в себя CDK1, CKD2, CDK4 и CDK6, требуется фосфорилирование остатка, соответствующего Thr160 CDK2 [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].
Каждый комплекс CDK формируется из регуляторной субъединицы циклина (например, циклина A, B1, B2, D1, D2, D3 и E) и каталитической киназной субъединицы (например, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5 и CDK6). Каждая из разных пар киназа/циклин регулирует разные и специфические фазы клеточного цикла, известные как фазы G1, S, G2 и M [Nigg, E., Nature Reviews 2001, 2, 21-32; Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305].
CDK участвуют в развитии расстройств, связанных с клеточной пролиферацией, в частности, раковых заболеваний. Причиной клеточной пролиферации является прямое или косвенное нарушение регуляции цикла клеточного деления, а CDK играют ключевую роль в регуляции разных фаз данного цикла. Например, сверхэкспрессия циклина D1 обычно связана с рядом раковых заболеваний человека, включающих в себя карциномы молочной железы, толстой кишки и клеток печени, а также глиомы [Flatt, P., Pietenpol, J., Drug Metabolism Reviews 2000, 32, 283-305]. Комплекс CDK2/циклин E играет важную роль в развитии клеточного цикла от ранней фазы G1 до фазы S, а сверхэкспрессия циклина E связана с разными солидными опухолями. Следовательно, ингибиторы циклинов D1, E или ассоциированных с ними CDK можно использовать в качестве мишеней в противораковой терапии [Kaubisch, A., Schwartz, G., The Cancer Journal 2000, 6, 192-212].
CDK, особенно CDK2, также участвуют в апоптозе и развитии T-клеток. CDK2 была идентифицирована как ключевой регулятор апоптоза тимоцитов [Williams, O., et al., European Journal of Immunology 2000, 709-713]. Стимуляция киназной активности CDK2 в ответ на специфические стимулы связана с развитием апоптоза у тимоцитов. Ингибирование киназной активности CDK2 блокирует данный апоптоз и защищает тимоциты.
Помимо регуляции клеточного цикла и апоптоза CDK непосредственно участвуют в процессе транскрипции. Для репликации многих вирусов требуется присутствие CDK. Ингибиторы CDK подавляют репликацию таких вирусов, как человеческий цитомегаловирус, вирус герпеса и вирус ветряной оспы [Meijer, L., Drug Resistance Updates 2000, 3, 83-88].
Ингибиторы CDK также можно использовать для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Гиперфосфорилирование белка Tau под действием CDK5/p25 приводит к появлению спаренных спиральных филаментов (PHF), связанных с болезнью Альцгеймера [Meijer, L., Drug Resistance Updates, 2000 3, 83-88].
Другим семейством киназ, вызывающим особый интерес, являются киназы Src. Данные киназы участвуют в развитии раковых заболеваний, нарушений функции иммунной системы и заболеваний, связанных с реструктурированием костей. Общий обзор по данному семейству можно найти в Thomas and Brugge, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997, 13, 513; Lawrence and Niu, Pharmacol. Ther. 1998, 77, 81; Tatosyan and Mizenina, Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49; Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000).
Члены семейства Src включают в себя следующие восемь киназ млекопитающих: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck и Blk. Данные киназы относятся к нерецепторным протеинкиназам, молекулярная масса которых варьирует от 52 до 62 кДа. Все они имеют общую структурную организацию и содержат шесть разных функциональных доменов: домен 4 Src-гомологии (SH4), уникальный домен, домен SH3, домен SH2, каталитический домен (SH1) и C-концевой регуляторный домен. Tatosyan et al. Biochemistry (Moscow) 2000, 65, 49-58.
Опубликованные данные позволяют рассматривать киназы Src как потенциальные терапевтические мишени при разных заболеваниях человека. У мышей с дефицитом Src развивается остеопетроз, или формирование костей, вследствие подавления резорбции костей под действием остеокластов. Это позволяет предположить, что остеопороз, возникающий вследствие аномально высокой резорбции костей, можно лечить путем ингибирования Src. Soriano et al., Cell 1992, 69, 551 and Soriano et al., Cell 1991, 64, 693.
Сверхэкспрессия CSK в ревматоидных синовиоцитах и остеокластах приводит к подавлению артритической деструкции костей. Takayanagi et al., J. Clin. Invest. 1999, 104, 137. CSK, или C-концевая Src-киназа, фосфорилирует Src и, следовательно, ингибирует ее каталитическую активность. В свою очередь ингибирование Src может предотвращать деструкцию суставов, наблюдающуюся у пациентов, страдающих от ревматоидного артрита. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
Src также участвует в репликации вируса гепатита B. Транскрипция кодируемого вирусом фактора HBx активирует Src на стадии, необходимой для размножения вируса. Klein et al., EMBO J. 1999, 18, 5019, и Klein et al., Mol. Cell. Biol. 1997, 17, 6421.
В ряде исследований обнаружена связь экспрессии Src с раковыми заболеваниями, такими как рак толстой кишки, молочной железы, печени и поджелудочной железы, некоторые B-клеточные лейкозы и лимфомы. Talamonti et al., J. Clin. Invest. 1993, 91, 53; Lutz et al., Biochem. Biophys. Res. 1998 243, 503; Rosen et al., J. Biol. Chem. 1986, 261, 13754; Bolen et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1987, 84, 2251; Masaki et al., Hepatology 1998, 27, 1257; Biscardi et al., Adv. Cancer Res. 1999, 76, 61; Lynch et al., Leukemia, 1993, 7, 1416. Кроме того, показано, что экспрессия антисмысловой последовательности Src в клетках опухолей яичников и толстой кишки приводит к подавлению опухолевого роста. Wiener et al., Clin. Cancer Res., 1999, 5, 2164; Staley et al., Cell Growth Diff., 1997, 8, 269.
Другие киназы семейства Src также являются потенциальными терапевтическими мишенями. Lck участвует в T-клеточной передаче сигнала. У мышей, утративших ген Lck, наблюдается нарушение развития тимоцитов. Способность Lck активировать T-клеточный сигнальный путь позволяет предположить, что ингибиторы Lck можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Molina et al., Nature, 1992, 357, 161. Hck, Fgr и Lyn были идентифицированы как важные медиаторы интегринового сигнального пути в миелоидных лейкоцитах. Lowell et al., J. Leukoc. Biol., 1999, 65, 313. Следовательно, ингибирование данных киназных медиаторов можно использовать для лечения воспаления. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717.
Тирозинкиназа Syk играет ключевую роль в FcεRI-опосредованной дегрануляции тучных клеток и активации эозинофилов. Соответственно, киназа Syk участвует в развитии разных аллергических заболеваний, в частности, астмы. Показано, что Syk связывается с фосфорилированной гамма-цепью рецептора FcεRI через N-концевые домены SH2 и играет важную роль в нижестоящем сигнальном пути [Taylor et al., Mol. Cell. Biol. 1995, 75, 4149].
Полагают, что ингибирование апоптоза эозинофилов является ключевым механизмом развития эозинофилии крови и тканей при астме. При астме наблюдается повышающая регуляция IL-5 и GM-CSF, которые предположительно вызывают эозинофилию крови и тканей посредством ингибирования апоптоза эозинофилов. Полагают, что ингибирование апоптоза эозинофилов является ключевым механизмом развития эозинофилии крови и тканей при астме. Существуют данные (полученные с использованием антисмысловой последовательности), что киназа Syk необходима для предотвращения апоптоза эозинофилов под действием цитокинов [Yousefi et al., J Exp Med 1996, 183, 1407].
Роль Syk в FcγR-зависимом и FcγR-независимом ответе макрофагов костномозгового происхождения определяют с использованием облученных химерных мышей, преобразованных фетальными клетками печени, полученными из эмбрионов Syk -/-. У Syk-дефицитных макрофагов не индуцируется фагоцитоз в ответ на FcγR, но индуцируется нормальный фагоцитоз в ответ на комплемент [Kiefer et al., MoI Cell Biol 1998, 18, 4209]. Также было описано, что введение аэрозоля, содержащего антисмысловую последовательность Syk, подавляет экспрессию Syk и высвобождение медиаторов из макрофагов [Stenton et al., J Immunology 2000, 164, 3790].
Киназы Janus (JAK) относятся к семейству тирозинкиназ, включающему в себя JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. JAK играют ключевую роль в передаче сигналов цитокинов. Нижестоящие субстраты семейства тирозинкиназ JAK включают в себя белки, участвующие в передаче сигнала и активации транскрипции (STAT). Сигнальный путь JAK/STAT опосредует многие аномальные иммунные ответы, такие как аллергия, астма, аутоиммунные заболевания, такие как отторжение трансплантата, ревматоидный артрит, боковой амиотрофический склероз и рассеянный склероз, а также солидные злокачественные заболевания и злокачественные заболевания кроветворной системы, такие как лейкозы и лимфомы. В литературе существует обзор по фармацевтическому вмешательству в путь JAK/STAT [Frank Mol Med. 5, 432-456 (1999) & Seidel, et al., Oncogene 19, 2645-2656 (2000)].
c
c
JAK1, JAK2 и TYK2 экспрессируются повсеместно, тогда как JAK3 экспрессируется преимущественно в гематопоэтических клетках. JAK3 связывается исключительно с универсальной гамма-цепью рецепторов цитокинов (γ) и активируется IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15. Показано, что в действительности пролиферация и выживание мышиных тучных клеток, индуцируемые IL-4 и IL-9, связаны с сигнальными путями JAK3 и γ [Suzuki et al., Blood 96, 2172-2180 (2000)].
Поперечная сшивка высокоаффинных рецепторов иммуноглобулина (Ig)E в сенсибилизированных тучных клетках приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов, в том числе ряда вазоактивных цитокинов, которые вызывают острый аллергический ответ или реакцию гиперчувствительности немедленного типа (тип I) [Gordon et al., Nature 346, 274-276 (1990) & Galli, N. Engl. J. Med., 328, 257-265 (1993)]. Установлено, что JAK3 играет ключевую роль в ответах тучных клеток, опосредованных рецептором IgE, in vitro и in vivo [Malaviya, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257, 807-813 (1999)]. Кроме того, описано, что ингибирование JAK3 предотвращает реакции гиперчувствительности типа I, в том числе анафилаксию, опосредованные активацией тучных клеток [Malaviya et al., J. Biol. Chem. 274, 27028-27038 (1999)]. Направленная доставка ингибиторов JAK3 к тучным клеткам вызывает модулирование дегрануляции тучных клеток in vitro и предотвращает анафилактические реакции, опосредованные рецептором IgE/антигеном, in vivo.
В одном из последних исследований описана успешная направленная доставка JAK3, обеспечивающая подавление иммунитета и приживление аллотрансплантата. Данное исследование демонстрирует дозозависимое выживание аллотрансплантата сердца буйвола у реципиентов Wistar Furth после введения ингибиторов JAK3, что свидетельствует о возможности регуляции нежелательных иммунных ответов, наблюдающихся при реакции "трансплантат против хозяина" [Kirken, Transpl. Proc. 33, 3268-3270 (2001)].
IL-4-опосредованное STAT-фосфорилирование представляет собой механизм, участвующий в развитии ранних и поздних стадий ревматоидного артрита (RA). Повышенный уровень провоспалительных цитокинов в синовиальной оболочке и синовиальной жидкости является характерным признаком ревматоидного артрита. Показано, что в IL-4-опосредованной активации пути IL-4/STAT участвуют киназы Janus (JAK 1 и 3) и что IL-4-ассоциированные киназы JAK экспрессируются в ревматоидной синовиальной оболочке [Muller-Ladner, et al., J. Immunol. 164, 3894-3901 (2000)].
Семейный боковой амиотрофический склероз (FALS) является неизлечимым нейродегенеративным заболеванием, поражающим приблизительно 10% пациентов, страдающих от ALS. Частота выживания мышей с FALS увеличивается после введения специфического ингибитора JAK3. Это позволяет предположить, что JAK3 участвует в развитии FALS [Trieu, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 267, 22-25 (2000)].
Белки, участвующие в передаче сигнала и активации транскрипции (STAT), активируются, в числе прочих, киназами семейства JAK. Результаты проведенного в последнее время исследования свидетельствуют о возможности вмешательства в сигнальный путь JAK/STAT путем направленного воздействия специфических ингибиторов на киназы семейства JAK и использования данного механизма для лечения лейкоза [Sudbeck, et al., Clin. Cancer Res. 5, 1569-1582 (1999)]. Показано, что специфические ингибиторы JAK3 подавляют клоногенный рост JAK3-экспрессирующих клеточных линий DAUDI, RAMOS, LC1;19, NALM-6, MOLT-3 и HL-60.
Гибридные белки TEL/JAK2 вызывают миелопролиферативные заболевания у животных моделей, а введение TEL/JAK2 в гематопоэтические клеточные линии приводит к активации STAT1, STAT3, STAT5 и цитокин-независимого роста [Schwaller, et al., EMBO J. 17, 5321-5333 (1998)].
Ингибирование JAK3 и TYK2 подавляет фосфорилирование тирозина STAT3 и клеточный рост грибовидного микоза, вида Т-клеточной лимфомы кожи. Данные результаты свидетельствуют о том, что киназы семейства JAK участвуют в пути JAK/STAT, конститутивно активированном при грибовидном микозе [Nielsen, et al., Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 94, 6764-6769 (1997)]. Подобным образом показано, что у мышей при Т-клеточной лимфоме, изначально характеризующейся сверхэкспрессией LCK, STAT3, STAT5, JAK1 и JAK2 находятся в конститутивно активированном состоянии, что дополнительно свидетельствует об участии пути JAK/STAT в аномальном клеточном росте [Yu, et al., J. Immunol. 159, 5206-5210 (1997)]. Кроме того, ингибитор JAK блокирует IL-6-опосредованную активацию STAT3, что приводит к инициации апоптоза клеток миеломы [Catlett-Falcone, et al., Immunity 10, 105-115 (1999)].
Одно из важных семейств киназ включает в себя Rho-ассоциированную сверхспирализованную серин/треониновую протеинкиназу (ROCK), которая, как полагают, является эффектором Ras-родственной малой ГТФ-азы Rho. Семейство ROCK включает в себя p160ROCK (ROCK-I) (Ishizaki et al., EMBO J. 1996, 15, 1885-1893) и ROKα/Rho-киназа/ROCK-II (Leung et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 29051-29054; Matsui et al., EMBO J. 1996, 15, 2208-2216; Nakagawa et al., FEBS Lett. 1996, 392, 189-193), протеинкиназу PKN (Amano et al., Science 1996, 271, 648-650; Watanabe et al., Science 1996, 271, 645-648) и цитрон-киназу (Madaule et al., Nature, 1998, 394, 491-494; Madaule et al., FEBS Lett. 1995, 377, 243-248). Показано, что киназы семейства ROCK участвуют в осуществлении ряда функций, в том числе Rho-индуцированного образования актиновых стрессорных волокон и очагов адгезии (Leung et al., Mol Cell Biol. 1996, 16, 5313-5327; Amano et al., Science, 1997, 275, 1308-1311; Ishizaki et al., FEBS Lett. 1997, 404, 118-124), а также в таких процессах, как понижающая регуляция миозин-фосфатазы (Kimura et al., Science, 1996, 273, 245-248), активация тромбоцитов (Klages et al., J. Cell. Biol., 1999, 144, 745-754), сокращение гладкой мускулатуры аорты под действием разных стимулов (Fu et al., FEBS Lett, 1998, 440, 183-187), тромбин-индуцированные ответы клеток гладкой мускулатуры аорты (Seasholtz et al., Cir. Res., 1999, 84, 1186-1193), гипертрофия кардиомиоцитов (Kuwahara et al., FEBS Lett., 1999, 452, 314-318), сокращение гладкой мускулатуры бронхов (Yoshii et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 1999, 20, 1190-1200), сокращение гладкой мускулатуры и реорганизация цитоскелета немышечных клеток (Fukata et al., Trends in Pharm. Sci. 2001, 22, 32-39), активация регулирумых по объему анионных каналов (Nilius et al., J. Physiol, 1999, 516, 67-74), ретракция нейритов (Hirose et al., J. Cell. Biol., 1998, 141, 1625-1636), хемотаксис нейтрофилов (Niggli, FEBS Lett., 1999, 445, 69-72), заживление раны (Nobes and Hall, J. Cell. Biol., 1999, 144, 1235-1244), инвазия опухоли (Itoh et al., Nat. Med., 1999, 5, 221-225) и трансформация клеток (Sahai et al., Curr. Biol., 1999, 9, 136-145). Более конкретно, ROCK участвует в развитии таких заболеваний и расстройств, как гипертония (Satoh et al., J. Clin. Invest. 1994, 94, 1397-1403; Mukai et al., FASEB J. 2001, 15, 1062-1064; Uehata et al., Nature 1997, 389, 990-994; Masumoto et al., Hypertension, 2001, 38, 1307-1310), спазм мозговых сосудов (Sato et al., Circ. Res. 2000, 87, 195-200; Miyagi et al., J. Neurosurg. 2000, 93, 471-476; Tachibana et al., Acta Neurochir (Wien) 1999, 141, 13-19), коронароспазм (Shimokawa et al., Jpn. Cir. J. 2000, 64, 1-12; Kandabashi et al., Circulation 2000, 101, 1319-1323; Katsumata et al., Circulation 1997, 96, 4357-4363; Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Utsunomiya et al., J. Pharmacol. 2001, 134, 1724-1730; Masumoto et al., Circulation 2002, 105, 1545-1547), бронхиальная астма (Chiba et al., Comp. Biochem. Physiol. C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1995, 11, 351-357; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 1999, 127, 597-600; Chiba et al., Br. J. Pharmacol. 2001, 133, 886-890; Iizuka et al., Eur. J. Pharmacol. 2000, 406, 273-279), преждевременные роды (Niro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 230, 356-359; Tahara et al., Endocrinology 2002, 143, 920-929; Kupittayanant et al., Pflugers Arch. 2001, 443, 112-114), эректильная дисфункция (Chitaley et al., Nat. Med. 2001, 7, 119-122; Mills et al., J. Appl. Physiol. 2001, 91, 1269-1273), глаукома (Honjo et al., Arch. Ophthalmol. 2001, 1171-1178; Rao et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001, 42, 1029-1037), пролиферация клеток гладкой мускулатуры сосудов (Shimokawa et al., Cardiovasc. Res. 2001, 51, 169-177; Morishige et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 548-554; Eto et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2000, 278, H1744-H1750; Sawada et al., Circulation 2000, 101, 2030-2023; Shibata et al., Circulation 2001, 103, 284-289), гипертрофия миокарда (Hoshijima et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 7725-77230; Sah et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 31185-31190; Kuwahara et al., FEBS Lett. 1999, 452, 314-318; Yanazume et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 8618- 8625), малигнома (Itoh et al., Nat. Med. 1999, 5, 221-225; Genda et al., Hepatology 1999, 30, 1027-1036; Somlyo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 269, 652-659), повреждение, вызванное ишемией/реперфузией (Ikeda et al., J. of Surgical Res. 2003, 109, 155-160; Miznuma et al., Transplantation 2003, 75, 579-586), дисфункция эндотелия (Hernandez-Perera et al., Circ. Res. 2000, 87, 616-622; Laufs et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 24266- 24271; Eto et al., Circ. Res. 2001, 89, 583-590), болезнь Крона и колит (Segain et al., Gastroenterology 2003, 124(5), 1180-1187), разрастание нейритов (Fournier et al., J. Neurosci. 2003, 23, 1416-1423), болезнь Рейно (Shimokawa et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 2002, 39, 319-327) и атеросклероз (Retzer et al., FEBS Lett. 2000, 466, 70-74; Ishibashi et al., Biochim. Biophys. Acta 2002, 1590, 123-130). Соответственно, ингибиторы киназы ROCK можно использовать в качестве терапевтических средств для лечения заболеваний, связанных с путем киназы ROCK.
ERK2 (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами) является членом семейства киназ митоген-активируемого белка (MAP)1 млекопитающих. Киназы (MAP)1 представляют собой серин/треониновые киназы, которые опосредуют пути передачи внутриклеточных сигналов (Cobb and Goldsmith, J Biol Chem., 1995, 270, 14843; Davis, Mol. Reprod. Dev. 1995, 42, 459) и активируются митогенами и факторами роста (Bokemeyer et al., Kidney Int. 1996, 49, 1187). Члены киназного семейства MAP имеют подобные последовательности и консервативные структурные домены и, помимо ERK2, включают в себя киназы JNK (N-концевая киназа Jun) и p38. Киназы JNK и p38 активируются в ответ на провоспалительные цитокины TNF-альфа и интерлейкин-1, а также на факторы клеточного стресса, такие как тепловой шок, гиперосмолярность, ультрафиолетовое излучение, липополисахариды и ингибиторы белкового синтеза (Derijard et al., Cell 1994, 76, 1025; Han et al., Science 1994, 265, 808; Raingeaud et al., J Biol Chem. 1995, 270, 7420; Shapiro and Dinarello, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12230). ERK, наоборот, активируются под действием митогенов и факторов роста (Bokemeyer et al., Kidney Int. 1996, 49, 1187).
ERK2 представляет собой широко распространенную протеинкиназу, которая проявляет максимальную активность при фосфорилировании обоих Thr183 и Tyr185 вышестоящей киназой киназы MAP, MEK1 (Anderson et al., Nature 1990, 343, 651; Crews et al., Science 1992, 258, 478). После активации ERK2 фосфорилирует многие регуляторные белки, в том числе протеинкиназы Rsk90 (Bjorbaek et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 18848) и MAPKAP2 (Rouse et al., Cell 1994, 78, 1027) и факторы транкрипции, такие как ATF2 (Raingeaud et al., Mol. Cell Biol. 1996, 16, 1247), Elk-1 (Raingeaud et al., Mol Cell Biol 1996, 16, 1247), c-Fos (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 10952) и c-Myc (Oliver et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1995, 210, 162). ERK2 также является нижестоящей мишенью для Ras/Raf-зависимых путей (Moodie et al., Science 1993, 260, 1658) и может способствовать передаче сигналов от этих потенциально онкогенных белков. Показано, что ERK2 играет роль в отрицательном контроле роста клеток рака молочной железы (Frey and Mulder, Cancer Res. 1993, 57, 628) и что в клетках рака молочной железы человека наблюдается сверхэкспрессия ERK2 (Sivaraman et al., J Clin. Invest. 1997, 99, 1478). Активированная ERK2 также участвует в пролиферации эндотелин-стимулированных клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей, это позволяет предположить, что данная киназа играет важную роль в развитии астмы (Whelchel et al., Am. J. Respir. Cell Mol Biol. 1997, 16, 589).
Киназа-3 гликоген-синтазы (GSK-3) представляет собой серин/треониновую протеинкиназу, включающую в себя α- и β-изоформы, кодируемые разными генами [Coghlan et al., Chemistry & Biology 2000, 7, 793-803; and Kim and Kimmel, Curr. Opinion Genetics Dev., 2000 10, 508-514]. GSK-3 участвует в развитии разных заболеваний, включающих в себя диабет, болезнь Альцгеймера, заболевания ЦНС, такие как маниакально-депрессивное заболевание и нейродегенеративные заболевания, и гипертрофию кардиомиоцитов [заявки PCT №№: WO 99/65897 и WO 00/38675; и Haq et al., J. Cell Biol. 2000, 151, 117-130]. Данные заболевания связаны с аномальным функционированием некоторых клеточных сигнальных путей, опосредованных GSK-3. Обнаружено, что GSK-3 фосфорилирует ряд регуляторных белков и модулирует их активность. Данные белки включают в себя гликоген-синтазу, которая представляет собой фермент, необходимый для синтеза гликогена и ограничивающий скорость синтеза, белок Tau, ассоциированный с микротрубочками, фактор транскрипции генов β-катенин, фактор инициации трансляции e1F2B, а также АТФ-цитрат-лиазу, аксин, фактор теплового шока-1, c-Jun, c-myc, c-myb, CREB и CEPBα. Указанные белковые мишени вовлекают GSK-3 в разные аспекты клеточного метаболизма, пролиферацию, дифференциацию и развитие.
В GSK-3-опосредованном пути, который имеет отношение к лечению диабета типа II, инсулин-индуцированная передача сигнала приводит к поглощению глюкозы клеткой и синтезу гликогена. Наряду с участием в данном пути, GSK-3 также является отрицательным регулятором инсулин-индуцированного сигнала. Как правило, инсулин ингибирует GSK-3-опосредованное фосфорилирование и вызывает дезактивацию гликоген-синтазы. Ингибирование GSK-3 приводит к увеличению синтеза гликогена и поглощению глюкозы [Klein et al., PNAS 1996, 93, 8455-8459; Cross et al., Biochem. J. 1994, 303, 21-26); Cohen, Biochem. Soc. Trans. 1993, 21, 555-567; and Massillon et al., Biochem J. 1994, 299, 123-128]. Однако у диабетических пациентов с расстройством инсулинового ответа синтез гликогена и поглощение глюкозы не повышаются в присутствии относительно высоких уровней глюкозы. Это приводит к аномально высоким уровням глюкозы в крови с острыми и длительными приступами и, в конечном счете, может привести к сердечно-сосудистому заболеванию, почечной недостаточности и слепоте. У таких пациентов отсутствует нормальное инсулин-индуцированное ингибирование GSK-3. Также описано, что у пациентов с диабетом типа II наблюдается сверхэкспрессия GSK-3 [см. заявку PCT: WO 00/38675]. Следовательно, терапевтические ингибиторы GSK-3 можно использовать для лечения диабетических пациентов с нарушением ответа на инсулин.
Активность GSK-3 также связана с болезнью Альцгеймера. Данное заболевание характеризуется присутствием широко известного β-амилоидного пептида и образованием внутриклеточных нейрофибриллярных клубков. Пептиды Aβ образуются из амилоидного белка-предшественника (APP) в результате последовательного протеолиза, катализируемого аспартил-протеазой BACE2, с последующим расщеплением презенилин-зависимой γ-секретазой. Показано, что антитела против β-амилоидных бляшек способны замедлять ухудшение познавательной способности у пациентов с болезнью Альцгеймера (Hock et al., Neuron, 2003, 38, 547-554), следовательно, для лечения болезни Альцгеймера и других психотических и нейродегенеративных заболеваний можно использовать и другие стратегии снижения β-амилоидного уровня (например, с использованием средств, способных ингибировать β-амилоидный пептид). Кроме того, нейрофибриллярные клубки содержат гиперфосфорилированный белок Tau, фосфорилирование которого осуществляется по неправильным участкам, следовательно, средства, способные ингибировать гиперфосфорилирование белка Tau, можно использовать для лечения болезни Альцгеймера и других психотических и нейродегенеративных заболеваний.
Известно, что GSK-3 фосфорилирует данные неправильные участки у клеточных и животных моделей. Кроме того, показано, что ингибирование GSK-3 предотвращает гиперфосфорилирование Tau в клетках [Lovestone et al., Current Biology 1994, 4, 1077-86; and Brownlees et al., Neuroreport 1997, 8, 3251-55]. Таким образом, активность GSK-3 инициирует образование нейрофибриллярных клубков и развитие болезни Альцгеймера. Также показано, что GSK-3 способствует процессингу APP и что ингибитор GSK-3 (литиевый) подавляет образование пептидов Aβ посредством ингибирования GSK-3 (Phiel et al. Nature 2003, 423, 435-439). Следовательно, ингибиторы GSK-3 можно использовать для уменьшения числа амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, патологических признаков болезни Альцгеймера, а также для лечения других психотических и нейродегенеративных заболеваний.
Другим субстратом GSK-3 является β-катенин, который разрушается после фосфорилирования под действием GSK-3. Пониженные уровни β-катенина наблюдаются у пациентов, страдающих от шизофрении и других заболеваний, связанных с увеличением гибели нейронных клеток [Zhong et al., Nature 1998, 395, 698-702; Takashima et al., PNAS 1993, 90, 7789-93; and Pei et al., J. Neuropathol. Exp 1997, 56, 70-78].
Активность GSK-3 также связана с ударом [Wang et al., Brain Res 2000, 859, 381-5; Sasaki et al., Neurol Res 2001, 23, 588-92; Hashimoto et al., J. Biol. Chem 2002, 277, 32985-32991].
S6K
Подсемейство киназ AGC фосфорилирует субстраты по сериновым и треониновым остаткам и участвует в ряде хорошо известных сигнальных процессов, включающих в себя, без ограничения, сигнальный путь циклического АМФ, ответ на инсулин, защиту от апоптоза, сигнальный путь диацилглицерина и контролирование трансляции белков (Peterson et al., Curr. Biol 1999, 9, R521). Данное подсемейство включает в себя PKA, PKB (c-Akt), PKC, PRK1, 2, P70 и PDK.
Показано, что при некоторых типах раковых заболеваний наблюдается сверхэкспрессия AKT (также известной как PKB или Rac-PK-бета), серин/треониновой протеинкиназы, которая опосредует нормальные клеточные функции [(Khwaja, A., Nature 1999, 401, 33-34); (Yuan, Z.Q., et al., Oncogene 2000, 19, 2324-2330); (Namikawa, K., et al., J Neurosci. 2000, 20, 2875-2886)]. AKT содержит N-концевой домен плекстриновой гомологии (PH), киназный домен и C-концевой "хвостовой" участок. До настоящего момента описано три изоформы человеческой киназы AKT (AKT-1, -2 и -3) [(Cheng, J.Q., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 9267-9271); (Brodbeck, D. et at, J. Biol. Chem. 1999, 274, 9133-9136)]. Домен PH связывает 3-фосфоинозитиды, которые синтезируются с помощью фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) после стимуляции факторами роста, такими как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста нервов (NGF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) [(Kulik et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 1595-1606); (Hemmings, B.A., Science, 1997, 275, 628-630)]. Связывание липидов с доменом PH инициирует транслокацию AKT к плазматической мембране и облегчает фосфорилирование под действием других протеинкиназ, содержащих домен PH, PDK1 - по Thr308, Thr309 и Thr305 для изоформ AKT 1, 2 и 3 соответственно. Вторая, еще неизвестная, киназа требуется для фосфорилирования Ser473, Ser474 или Ser472 в C-концевых хвостовых участках AKT-1, -2 и -3 соответственно с получением полностью активированного фермента AKT.
После локализации на мембране AKT опосредует некоторые клеточные функции, в том числе метаболические эффекты инсулина (Calera, M.R. et at, J. Biol. Chem. 1998, 273, 7201-7204), индукцию дифференциации и/или пролиферации, синтез белков и стрессовые ответы (Alessi, D.R. et at, Curr. Opin. Genet. Dev. 1998, 8, 55-62).
Изменение регуляции AKT происходит при повреждениях и заболеваниях, причем наиболее важную роль оно играет при раковых заболеваниях. Первое упоминание об AKT связано с карциномами яичников человека, где повышение экспрессии AKT наблюдается в 15% случаев (Cheng, J.Q. et at, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 9267-9271). Также было обнаружено, что сверхэкспрессия AKT наблюдается в 12% случаев рака поджелудочной железы (Cheng, J. Q. et at, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 3636-3641). Показано, что сверхэкспрессия AKT происходит в 12% случаев карциномы яичников и что высокая частота амплификации AKT наблюдается в 50% случаев недифференцированных опухолей, это позволяет предположить, что AKT также может быть связана с агрессивностью опухоли (Bellacosa, et al., Int. J. Cancer 1995, 64, 280-285).
Показано, что PKA (также известная как цАМФ-зависимая протеинкиназа) регулирует многие жизненно важные функции, в том числе энергетический метаболизм, транскрипцию генов, пролиферацию, дифференциацию, репродуктивную функцию, секрецию, активность нейронов, память, сократительную способность и двигательную активность (Beebe, S.J., Semin. Cancer Biol. 1994, 5, 285-294). PKA представляет собой тетрамерный холофермент, который содержит две каталитические субъединицы, связанные с гомодимерной регуляторной субъединицей (функция которой заключается в ингибировании каталитических субъединиц). После связывания цАМФ (активации фермента) каталитические субъединицы отделяются от регуляторных субъединиц с образованием активной серин/треониновой киназы (McKnight, G.S. et al., Recent Prog. Horm. Res. 1988, 44, pp. 307). На сегодняшний день описаны три изоформы каталитической субъединицы (C-α, C-β и C-γ) (Beebe, S.J. et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 25505-25512), причем наиболее широко изучается субъединица C-α, в основном из-за того, что она экспрессируется на повышенном уровне в клетках первичных и метастатических меланом (Becker, D. et al., Oncogene 1990, 5, 1133). В настоящее время способы модулирования активности субъединицы C-α включают в себя применение антител, молекул, которые блокируют активность PKA путем воздействия на регуляторные димеры, и экспрессию антисмысловых олигонуклеотидов.
S6K
S6K
S6K
Рибосомальные протеинкиназы p70-1 и -2 также являются членами подсемейства протеинкиназ AGC и катализируют фосфорилирование и последующую активацию рибосомального белка S6, который участвует в повышающей регуляции трансляции мРНК, кодирующих компоненты аппарата белкового синтеза. Указанные мРНК содержат олигопиримидиновый фрагмент на 5'-сайте инициации транскрипции, называемый 5'TOP, который, как показано, необходим для регуляции на уровне трансляции (Volarevic, S. et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 2001, 65, 101-186). p70-зависимое фосфорилирование S6 инициируется в ответ на ряд гормонов и факторов роста, в основном, через путь PI3K (Coffer, P.J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 1994 198, 780-786), который может регулироваться mTOR, поскольку рапамицин ингибирует активность p70 и блокирует синтез белков, особенно, посредством понижающей регуляции трансляции мРНК, кодирующих рибосомальные белки (Kuo, C.J. et al., Nature 1992, 358, 70-73).
S6K
In vitro PDK1 катализирует фосфорилирование Thr252 в активационной петле каталитического домена p70, которое необходимо для осуществления активности p70 (Alessi, D.R., Curr. Biol., 1998, 8, 69-81). Исследования dp70S6K дрозофил и мышиной p70-1 с использованием рапамицина и делеции генов показали, что p70 играет ключевую роль в передаче сигналов, связанных с клеточным ростом и пролиферацией.
3-Фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа-1 (PDK1) играет ключевую роль в регуляции активности ряда киназ, принадлежащих к подсемейству протеинкиназ AGC (Alessi, D. et al., Biochem. Soc. Trans 2001, 29, 1). Данные киназы включают в себя изоформы протеинкиназы B (PKB, также известной как AKT), киназы p70 рибосомального S6 (S6K) (Avruch, J. et al., Prog. Mol. Subcell. Biol. 2001, 26, 115) и киназы p90 рибосомального S6 (Frödin, M. et al., EMBO J. 2000, 19, 2924-2934). Опосредуемая PDK1 передача сигнала активируется в ответ на инсулин и факторы роста, а также на присоединение клетки к внеклеточному матриксу (интегриновый сигнальный путь). После активации данные ферменты опосредуют разнообразные клеточные события путем фосфорилирования основных регуляторных белков, которые играют важную роль в контролировании таких процессов, как выживание, рост и пролиферация клеток, а также метаболизм глюкозы [(Lawlor, M.A. et al., J. Cell Sci. 2001, 114, 2903-2910), (Lawlor, M.A. et al., EMBO J. 2002, 21, 3728-3738)]. PDK1 представляет собой белок из 556 аминокислот, содержащий N-концевой каталитический домен и C-концевой домен плекстриновой гомологии (PH), который активирует свои субстраты путем фосфорилирования указанных киназ по активационной петле (Belham, C. et al., Curr. Biol. 1999, 9, R93-R96). При многих раковых заболеваниях человека, включая рак простаты и NSCL, наблюдается повышение функционирования сигнального пути PDK1 в результате ряда генетических событий, таких как мутации PTEN, или сверхэкспрессии некоторых ключевых регуляторных белков [(Graff, J.R., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Brognard, J., et al., Cancer Res. 2001, 61, 3986-3997)]. Возможность использования ингибирования PDK1 в качестве потенциального механизма для лечения рака была продемонстрирована путем трансфекции PTEN-отрицательной линии клеток рака человека (U87MG) антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными против PDK1. В результате достигают уменьшения уровня белка PDK1, которое приводит к снижению пролиферации и выживания клеток (Flynn, P., et al., Curr. Biol. 2000, 10, 1439-1442). Следовательно, создание ингибиторов АТФ-связывающего участка PDK1, в числе прочих способов лечения, является важной задачей для химиотерапии раковых заболеваний.
Отличия в генотипах раковых клеток обуславливают проявление следующих шести существенных изменений в клеточной физиологии: самодостаточность сигнального пути, связанного с ростом, уклонение от апоптоза, нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост, неограниченный репликационный потенциал, непрерывный ангиогенез и инвазия ткани, приводящая к метастазированию (Hanahan, D. et al., Cell 2000, 100, 57-70). PDK1 является ключевым медиатором сигнального пути PI3K, который регулирует ряд клеточных функций, включающих в себя рост, пролиферацию и выживание. Следовательно, ингибирование данного пути может влиять на четыре или более из шести признаков, необходимых для развития рака. Можно ожидать, что ингибитор PDK1 будет влиять на рост очень широкого диапазона раковых опухолей человека.
А именно, повышение уровня активности пути PBK непосредственно связано с развитием ряда раковых заболеваний человека, прогрессированием их до агрессивного рефракторного состояния (приобретенной устойчивости к химиотерапии) и плохим прогнозом. Данное повышение активности обусловлено рядом ключевых событий, включающих в себя уменьшение активности отрицательных регуляторов пути, таких как фосфатаза PTEN, активирующие мутации положительных регуляторов пути, таких как Ras, и сверхэкспрессию компонентов пути, таких как PKB, примеры включают в себя раковые заболевания мозга (глиомы), молочной железы, толстой кишки, головы и шеи, почек, легких, печени, меланому, раковые заболевания яичников, поджелудочной железы, простаты, саркому, раковые заболевания щитовидной железы [(Teng, D.H. et al., Cancer Res., 1997 57, 5221-5225), (Brognard, J. et al., Cancer Res., 2001, 61, 3986-3997), (Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 3636-3641), (Int. J. Cancer 1995, 64, 280), (Graff, J.R., Expert Opin. Ther. Targets 2002, 6, 103-113), (Am. J. Pathol. 2001, 159, 431)].
Кроме того, показано, что снижение активности пути в результате нокаута гена, нокдауна гена, доминантных отрицательных исследований и применения низкомолекулярных ингибиторов пути приводит к уменьшению многих признаков ракового фенотипа in vitro (некоторые исследования демонстрируют подобный эффект in vivo), например, к блокированию пролиферации, уменьшению жизнеспособности и чувствительности к известным химиотерапевтическим средствам в ряде клеточных линий, представляющих раковые заболевания поджелудочной железы [(Cheng, J.Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 3636-3641), (Neoplasia 2001, 3, 278)], легких [(Brognard, J. et al., Cancer Res. 2001, 61, 3986-3997), (Neoplasia 2001, 3, 278)], яичников [(Hayakawa, J. et al., Cancer Res. 2000, 60, 5988-5994), (Neoplasia 2001, 3, 278)], молочной железы (Mol. Cancer Ther. 2002, 1, 707), толстой кишки [(Neoplasia 2001, 3, 278), (Arico, S. et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 27613-27621)], шейки матки (Neoplasia 2001, 3, 278), простаты [(Endocrinology 2001, 142, 4795), (Thakkar, H. et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, 38361-38369), (Chen, X. et al., Oncogene 2001, 20, 6073-6083)] и мозга (glioblastomas) [(Flynn, P. et al., Curr. Biol., 2000, 10, 1439- 1442)].
S6K
S6K
Соответственно, существует настоятельная потребность в разработке ингибиторов протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), протеинкиназ CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, которые могут использоваться для лечения разных заболеваний или состояний, связанных с активацией протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), протеинкиназ CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, особенно с учетом того, что в настоящее время не существует удовлетворительных способов лечения для большинства из указанных заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
S6K
Было показано, что соединения данного изобретения и их фармацевтически приемлемые композиции являются эффективными ингибиторами киназ. В некоторых воплощениях указанные соединения являются эффективными ингибиторами протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), протеинкиназ CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK. В других воплощениях указанные соединения являются эффективными ингибиторами протеинкиназ FLT-3 и/или c-KIT. Данные соединения имеют общую формулу A:
1
3
4
5
6
7
где R, R, R, R, R и R описаны ниже.
Указанные соединения и их фармацевтические композиции можно использовать для лечения или предотвращения ряда заболеваний, включающих в себя, без ограничения, заболевания сердца, диабет, болезнь Альцгеймера, иммунодефицитные состояния, воспалительные заболевания, гипертонию, аллергические заболевания, аутоиммунные заболевания, деструктивные заболевания костей, такие как остеопороз, пролиферативные расстройства, инфекционные заболевания, заболевания, опосредованные иммунной системой и вирусные заболевания. Композиции также можно использовать для предотвращения гибели клеток и гиперплазии и, следовательно, для лечения или предотвращения реперфузии/ишемии при ударе, сердечных приступах и гипоксии органов. Композиции также можно использовать для предотвращения тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Композиции особенно подходят для лечения таких заболеваний, как хронический миелогенный лейкоз (CML), острый миелогенный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL), ревматоидный артрит, астма, остеоартрит, ишемия, рак (включающий в себя, без ограничения, рак яичника, рак молочной железы и рак матки), заболевание печени, в том числе ишемия печени, заболевание сердца, такое как инфаркт миокарда и острая сердечная недостаточность, патологические иммунные состояния, включающие в себя T-клеточную активацию, и нейродегенеративные заболевания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
th
th
Соединения данного изобретения включают в себя соединения, в общих чертах описанные выше, и дополнительно иллюстрируются с помощью раскрытых в данном описании классов, подклассов и типов. Если не указано иначе, в данном описании используются приведенные ниже определения. В целях данного изобретения элементы идентифицируют в соответствии с периодической системой элементов, версия CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75 Ed. Кроме того, в данном описании используются общие принципы органической химии, описанные в "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, и "March's Advanced Organic Chemistry", 5 Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, полное содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки.
Как описано в данном документе, соединения данного изобретения могут быть необязательно замещены одним или несколькими заместителями, как в общих чертах указано выше, или они могут быть представлены определенными классами, подклассами и типами данного изобретения. Следует понимать, что фразы "необязательно замещенный" и "замещенный или незамещенный" используются как взаимозаменяемые. Как правило, термин "замещенный", которому может предшествовать термин "необязательно", относится к замене радикала водорода в определенной структуре на радикал конкретного заместителя. Если не указано иначе, необязательно замещенная группа может содержать заместитель по каждому положению, по которому возможно замещение, и если в заданной структуре замещение может осуществляться более чем по одному положению и более чем одним заместителем, выбранным из конкретных групп, заместители могут быть одинаковыми или разными по каждому положению. В данном изобретении допускаются такие сочетания заместителей, которые приводят к образованию стабильных или химически возможных соединений. Термин "стабильный" в данном описании относится к соединениям, которые практически не изменяются при воздействии условий, используемых при получении, детекции, а также, предпочтительно, при извлечении и очистке данных соединений, и имеют одно или несколько целевых назначений из описанных в данном документе. В некоторых воплощениях стабильное или химически возможное соединение - это такое соединение, которое практически не изменяется в процессе хранения при температуре 40°C, или менее, в отсутствие влаги или других химически реактивных условий, в течение, по меньшей мере, одной недели.
3
8
8
12
Термин "алифатический" или "алифатическая группа" в данном описании относится к линейной (т.е. неразветвленной) или разветвленной, замещенной или незамещенной углеводородной цепи, которая является полностью насыщенной или содержит один или несколько элементов ненасыщенности, или к моноциклическому или бициклическому углеводороду, который является полностью насыщенным или содержит один или несколько элементов ненасыщенности, но не является ароматическим (в данном описании его также называют "карбоцикл" "циклоалифатическая группа" или "циклоалкил"), причем алифатическая группа имеет одну точку присоединения к остальной части молекулы. Если не указано иначе, алифатические группы содержат 1-20 алифатических атомов углерода. В некоторых воплощениях алифатические группы содержат 1-10 алифатических атомов углерода. В других воплощениях алифатические группы содержат 1-8 алифатических атомов углерода. В очередных воплощениях алифатические группы содержат 1-6 алифатических атомов углерода, и в следующих воплощениях алифатические группы содержат 1-4 алифатических атомов углерода. В некоторых воплощениях термин "циклоалифатическая группа" (или "карбоцикл", или "циклоалкил") относится к моноциклическому C-C углеводороду, или к бициклическому C-C углеводороду, который является полностью насыщенным, или который содержит один или несколько элементов ненасыщенности, но не является ароматическим, причем циклоалифатическая группа имеет одну точку присоединения к остальной части молекулы, а любой отдельный цикл в указанной бициклической системе содержит 3-7 членов. Подходящие алифатические группы включают в себя, без ограничения, линейные или разветвленные, замещенные или незамещенные алкильные, алкенильные, алкинильные группы и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил.
Термин "гетероалифатический" в данном описании относится к алифатическим группам, в которых один или два атома углерода независимо заменены одним или несколькими атомами кислорода, серы, азота, фосфора или кремния. Гетероалифатические группы могут быть замещенными или незамещенными, разветвленными или неразветвленными, циклическими или ациклическими, и включают в себя "гетероциклы", "гетероциклоалифатические" или "гетероциклические" группы.
Термин "гетероцикл", "гетероциклоалифатический" или "гетероциклический" в данном описании относится к неароматическим, моноциклическим, бициклическим или трициклическим системам, в которых один или несколько членов цикла представляют собой независимо выбранные гетероатомы. В некоторых воплощениях "гетероцикл", "гетероциклоалифатическая" или "гетероциклическая" группа содержит от трех до четырнадцати циклических атомов, в которых один или несколько членов цикла представляют собой гетероатомы, независимо выбранные из кислорода, серы, азота или фосфора, причем каждый цикл в системе содержит от 3 до 7 членов цикла.
+
Термин "гетероатом" относится к одному или нескольким элементам из кислорода, серы, азота, фосфора или кремния (включая любые окисленные формы азота, серы, фосфора или кремния; четвертичную форму любого основного азота; или замещаемый атом азота гетероциклического фрагмента, например, N (как в 3,4-дигидро-2H-пирролиле), NH (как в пирролидиниле) или NR (как в N-замещенном пирролидиниле)).
Термин "ненасыщенный" в данном описании относится к фрагменту, содержащему один или несколько элементов ненасыщенности.
Термин "алкокси" или "тиоалкил" в данном описании относится к определенной выше алкильной группе, которая присоединена к основной углеродной цепи через атом кислорода ("алкокси") или серы ("тиоалкил").
Термины "галогеналкил", "галогеналкенил" и "галогеналкокси" относятся к алкилу, алкенилу или алкокси, замещенным одним или несколькими, в зависимости от обстоятельств, атомами галогена. Термин "галоген" означает F, Cl, Br или I.
Термин "арил", используемый отдельно или как часть более крупного фрагмента, как, например, в "аралкиле", "аралкокси", или "арилоксиалкиле", относится к моноциклическим, бициклическим и трициклическим системам, содержащим всего от пяти до четырнадцати членов цикла, где, по меньшей мере, один цикл в системе является ароматическим и где каждый цикл в системе содержит от 3 до 7 членов цикла. Термины "арил" и "арильный цикл" можно использовать как взаимозаменяемые. Термин "арил" также относится к гетероарильным циклическим системам, определенным ниже.
Термин "гетероарил", используемый отдельно или как часть более крупного фрагмента, как, например, в "гетероаралкиле" или "гетероарилалкокси", относится к моноциклическим, бициклическим и трициклическим системам, содержащим всего от пяти до четырнадцати членов цикла, где, по меньшей мере, один цикл в системе является ароматическим и где каждый цикл в системе содержит от 3 до 7 членов цикла. Термины "гетероарил", "гетероарильный цикл" и "гетероароматический" можно использовать как взаимозаменяемые.
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
0-2
2
1-2
1-6
2
Арильная (в том числе аралкильная, аралкоксильная, арилоксиалкильная и т.п.) или гетероарильная (в том числе гетероаралкильная, гетероарилалкоксильная и т.п.) группа может содержать один или несколько заместителей и, следовательно, может быть "необязательно замещенной". Если в данном документе не указано иначе, подходящие заместители у ненасыщенного атома углерода арильной или гетероарильной группы обычно выбирают из группы, включающей в себя галоген; -R; -OR; -SR; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(O)N(R); -C(S)N(R); -OC(О)N(R); -OC(O)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); -P(O)R; -PO(R); -OPO(R); -(CH)NHC(O)R; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; или -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; где каждый R независимо выбран из группы, включающей в себя водород, необязательно замещенную Cалифатическую группу, незамещенный 5-6-членный гетероарильный или гетероциклический фрагмент, фенил, -О(Ph) или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют необязательно замещенный 3-12-членный насыщенный, частично ненасыщенный или полностью ненасыщенный моноциклический или бициклический фрагмент, содержащий от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы.
0
0
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
Необязательные заместители алифатической группы R могут быть выбраны из NH, NH(Cалифатической группы), N(Cалифатической группы), галогена, Салифатической группы, OH, O(Cалифатической группы), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группы), O(галогенCалифатической группы) или галогенCалифатической группы, где все указанные Cалифатические группы R являются незамещенными.
2
2
2
1-6
Алифатическая, или гетероалифатическая группа, или неароматическая гетероциклическая группа может содержать один или несколько заместителей и, следовательно, может быть "необязательно замещенной". Если в данном документе не указано иначе, подходящие заместители у насыщенного атома углерода алифатической или гетероалифатической группы, или неароматической гетероциклической группы выбраны из заместителей, перечисленных выше для ненасыщенного атома углерода арильной или гетероарильной группы, и дополнительно включают в себя =О, =S, =NNHR*, =NN(R*), =NNHC(О)R*, =NNHCO(алкил), =NNHSO(алкил) или =NR*, где каждый R* независимо выбран из водорода или необязательно замещенной Cалифатической группы.
+
+
+
+
+
+
+
+
+1
+
+
+
+
+
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1-6
2
2
1-2
Если в данном документе не указано иначе, необязательные заместители у азота неароматической гетероциклической группы, как правило, выбраны из -R, -N(R), -C(O)R, -COR, -C(O)C(O)R, -C(O)CHC(O)R, -SOR, -SON(R), -C(=S)N(R), -C(=NH)-N(R) или -NRSOR; где R обозначает водород, необязательно замещенную Cалифатическую группу, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный -О(Ph), необязательно замещенный -CH(Ph), необязательно замещенный -(CH)(Ph); необязательно замещенный -CH=CH(Ph); или незамещенную 5-6-членную гетероарильную или гетероциклическую группу, содержащую от одного до четырех гетероатомов, независимо выбранных из кислорода, азота или серы, или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют необязательно замещенный 3-12-членный насыщенный, частично ненасыщенный или полностью ненасыщенный моноциклический или бициклический фрагмент, содержащий от 0 до 4 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы.
+
+
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
Необязательные заместители у алифатической группы или фенильного цикла R выбраны из -NH, -NH(Cалифатической группы), -N(Cалифатической группы), галогена, Cалифатической группы, -OH, -О(Cалифатической группы), -NO, -CN, -COH, -CO(Cалифатической группы), -O(галогенCалифатической группы) или галоген(Cалифатической группы), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп R является незамещенной.
3
Если гетероциклил является замещенным, его заместители могут быть присоединены по замещаемым положениям как к атому углерода, так и к гетероатому. Например, если описываемая замещаемая структура представляет собой пиперазиновый цикл, а заместитель представляет собой CH, описываемое соединение может иметь структуру  или .
В одном воплощении настоящее изобретение относится к соединению формулы I:
где
X обозначает CH или N;
2
Y обозначает CH, NH, NR, O или S;
1
1-6
R обозначает водород или Cалкил;
2
R обозначает водород;
3
R обозначает необязательно замещенную арильную группу, выбранную из 5-6-членной моноциклической или 8-12-членной бициклической группы; указанная арильная группа содержит от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
5
0
1-6
1-6
2
2
1-6
2
1-4
1-4
2
2
1-6
2
R обозначает водород, -Cалифатическую группу, -CN, -OH, -О(Cалифатическую группу), -COH, -CO(Cалифатическую группу), -CON(R), -O(галогенCалифатическую группу), -галогенCалифатическую группу, -NO, -галоген, -NR  или -Cалифатическую группу, необязательно замещенную NH;
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
2
2
2
1-6
2
R обозначает водород, галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(О)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(О)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(О)N(R); -C(S)N(R); -C(=NH)-N(R), -OC(O)N(R); -OC(O)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); -(CH)NHC(O)R, =0, =S, =NNHR*, =NN(R*), =NNHC(O)R*, =NNHCO(алкил), =NNHSO(алкил) или =NR*, где каждый R независимо выбран из водорода, необязательно замещенной Cалифатической группы, незамещенной 5-6-членной гетероарильной или гетероциклической группы, фенила, -O(Ph) или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют 5-8-членную гетероциклическую, арильную или гетероарильную группу, или 3-8-членную циклоалкильную группу, содержащую от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
0
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
алифатическая группа R необязательно замещена NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), O(галогенCалифатической группой), или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной;
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
каждый R* независимо выбран из водорода или Cалифатической группы, необязательно замещенной NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), O(галогенCалифатической группой), или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной; а R обозначает водород или Cалифатическую группу, необязательно замещенную =O, =S, -NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), O(галогенCалифатической группой) или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной.
Другое воплощение данного изобретения относится к соединению формулы II:
где
X обозначает CH или N;
2
Y обозначает CH, NH, NR, O или S;
n равно 0-4;
m равно 0-4;
1
2
R обозначает водород или -N(H)R;
2
1-6
R обозначает водород или Cалифатическую группу;
3
3
7
R обозначает арильную группу, выбранную из 5-6-членной моноциклической или 8-12-членной бициклической группы; указанная арильная группа содержит от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, где каждое замещаемое положение R необязательно и независимо заменено R;
5
0
0
1-6
1-6
2
2
1-6
2
2
2
2
R обозначает водород, -Cалифатическую группу, -CN, -OH, -O(Cалифатическую группу), -COH, -CO(Cалифатическую группу), -CОN(R), -NO, -галоген, -NR , где алифатические атомы углерода в каждом замещаемом положении необязательно и независимо замещены галогеном или NH;
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
R обозначает галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(О)N(R); -C(S)N(R); -OC(О)N(R); -OC(O)R; -C(О)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); или -(CH)NHC(O)R;
4
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
2
2
2
каждый из R и R обозначает водород; галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(O)N(R); -C(S)N(R); -C(=NH)-N(R), -OC(O)N(R); -OC(О)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); -(CH)NHC(O)R, =О, =S, =NNHR*, =NN(R*), =NNHC(О)R*, =NNHCO(алкил), =NNHSO(алкил) или =NR*.
X и Y вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют шестичленный цикл, предпочтительно, содержащий 2 гетероатома, более предпочтительно - 1 гетероатом.
4
6
7
4
6
7
6
3
R, R и R могут присоединяться по любым замещаемым положениям циклов, как показано в формуле II. В случае замещенного гетероциклила R, R и R могут присоединяться по замещаемым положениям как к атому углерода, так и к гетероатому. Например, если X и Y обозначают N, а R обозначает CH, третий моноцикл в формуле II может представлять собой либо , либо
В другом воплощении данного изобретения предлагается соединение формулы (II), где
X обозначает CH или N;
2
0
Y обозначает CH, NH, NR, O или S;
n равно 0-4;
m равно 0-4;
1
2
R обозначает водород или -N(H)R;
2
1-6
R обозначает водород или Cалкил;
3
3
7
R обозначает арильную группу, выбранную из 5-6-членной моноциклической или 8-12-членной бициклической группы; причем указанная арильная группа содержит от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, где каждое замещаемое положение R необязательно и независимо заменено R;
5
0
0
1-6
1-6
2
2
1-6
2
2
R обозначает водород, -Cалифатическую группу, -CN, -OH, -O(Cалифатическую группу), -COH, -CO(Cалифатическую группу), -CON(R), -галоген или -NR , где каждое замещаемое положение алифатического атома углерода необязательно и независимо замещено галогеном;
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+
+
+
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
1-6
1-6
1-4
2
R обозначает галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(O)N(R); -C(S)N(R); -OC(О)N(R); -OC(O)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); или -(CH)NHC(O)R; где каждый R независимо выбран из водорода, необязательно замещенной Cалифатической группы, незамещенного 5-6-членного гетероарила или гетероциклической группы (при условии, что атом азота в гетероциклической группе необязательно замещен -R или -C(O)R, где R обозначает (Cалкил), предпочтительно (Cалкил)), фенил, -O(Ph), или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют 5-8-членную гетероциклическую, арильную или гетероарильную группу, или 3-8-членную циклоалкильную группу, содержащую от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы.
4
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Каждый R и R независимо обозначает галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -О(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRCOR; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(О)N(R); -OC(О)N(R); -OC(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSOR; или =О;
0
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
алифатическая группа R необязательно замещена NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп необязательно замещена галогеном;
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
R обозначает водород или Cалифатическую группу, необязательно замещенную =О, =S, -NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп необязательно замещена галогеном.
1
В соответствии с одним воплощением формулы I R обозначает водород.
1
1
2
В соответствии с одним воплощением формулы II R обозначает водород. В другом воплощении формулы II R обозначает N(H)R.
2
В соответствии с другим воплощением формулы I или II R обозначает водород.
2
В соответствии с другим воплощением формулы I или II, если X обозначает CH, то Y не является CH.
В соответствии с другим воплощением формулы I или II X обозначает N.
В соответствии с другим воплощением формулы I или II Y обозначает O.
В соответствии с другим воплощением формулы I или II Y обозначает NR.
В некоторых воплощениях формулы II m, n и p независимо обозначают 1 или 2. В другом воплощении m равно 0; в другом воплощении m равно 1. В одном воплощении n равно 0; в другом воплощении n равно 1. В другом воплощении p равно 0; в другом воплощении p равно 1. В следующем воплощении каждый из m, n и p равен 0.
4
6
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1-4
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых воплощениях формулы II каждый из R, R и R независимо обозначает галоген; Cалифатическую группу; -OR; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRCOR; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(O)N(R); -OC(O)N(R); -OC(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSOR; или два атома водорода, связанные с одним атомом углерода, заменены =О.
4
6
7
0
0
0
0
0
0
1-4
2
2
В других воплощениях каждый из R, R и R независимо обозначает галоген; Cалифатическую группу, необязательно замещенную галогеном; -OR; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRCOR; или два атома водорода, связанные с одним атомом углерода, заменены =О.
4
6
1-6
1-3
В других воплощениях R и R обозначают Cалкил или галоген, предпочтительно Cалкил, F или Cl.
7
1-6
1-6
2
1-4
В другом воплощении R обозначает галоген, -CN, Cалкил, Cалкокси, -N(R) или Cгалогеналкил.
3
3
7
В некоторых воплощениях формулы I и II R обозначает арильную группу, выбранную из 6-членной моноциклической группы, содержащей от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, где каждое замещаемое положение R необязательно заменено R.
3
3
7
В соответствии с одним воплощением R обозначает арильную группу, выбранную из 6-членной моноциклической группы, содержащей 0, 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, где каждое замещаемое положение R необязательно заменено R.
3
3
В соответствии с другим воплощением R обозначает 6-членный гетероарил, содержащий 1 или 2 гетероатома азота, предпочтительно 1 атом азота. В соответствии со следующим воплощением R обозначает 2-пиридил.
5
0
1-6
1-6
2
В одном воплощении формулы I или II R обозначает водород, галоген, OH, NR, CN, O-(Cалифатическую группу) или Cалкил, необязательно замещенный -NR.
5
1-6
2
В другом воплощении R обозначает Cалкил, необязательно замещенный -N(R).
5
5
В другом воплощении R обозначает -CN. В следующем воплощении R обозначает водород.
Одно воплощение представлено формулой I-a.
Другое воплощение представлено формулой I-b:
Другое воплощение представлено формулой I-с:
Другое воплощение представлено соединениями I-1 и I-2:
Другое воплощение представлено соединениями I-3 и I-4:
Соединения данного изобретения также включают в себя соединения, в состав которых входит цикл, содержащий X и Y, присоединенные к остальной молекуле через любой атом, не только через атом X.
В другом воплощении данное изобретение предлагает соединение формулы (III)
где
кольцо А представляет собой 3-8-членную насыщенную карбоциклическую группу;
кольцо B представляет собой 3-8-членный насыщенный или частично насыщенный цикл, который содержит от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
X обозначает CH или N;
2
Y обозначает CH, NR, O или S;
n равно 0-4;
m равно 0-4;
p равно 0-4;
1
R обозначает водород;
2
1-6
R обозначает водород или Cалифатическую группу;
3
3
7
R обозначает арильную группу, выбранную из 5-6-членной моноциклической группы или 8-12-членной бициклической группы; указанная арильная группа содержит от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы, где каждое замещаемое положение R необязательно и независимо заменено R;
5
0
0
1-6
1-6
2
2
1-6
2
2
2
2
R обозначает водород, -Cалифатическую группу, -CN, -OH, -O(Cалифатическую группу), -COH, -CO(Cалифатическую группу), -CON(R), -NO, -галоген, -NR , где каждое замещаемое положение алифатического атома углерода необязательно и независимо заменено галогеном или NH;
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
R обозначает галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(O)N(R); -C(S)N(R); -OC(О)N(R); -OC(O)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R) или -(CH)NHC(O)R;
0
+
+
+
0
0
1-6
1-6
1-4
2
где каждый R независимо выбран из водорода, необязательно замещенной Cалифатической группы, незамещенного 5-6-членного гетероарила или гетероциклической группы (при условии, что атом азота в гетероциклической группе необязательно замещен -R или -C(O)R, где R обозначает (Cалкил), предпочтительно (Cалкил)), фенил, -O(Ph), или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют 5-8-членную гетероциклическую, арильную или гетероарильную группу, или 3-8-членную циклоалкильную группу, содержащую от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
4
6
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
0-2
2
2
2
каждый из R и R независимо обозначает водород; галоген; -R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -NO; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRC(S)R; -NRC(O)N(R); -NRC(S)N(R); -NRCOR; -NRNRC(O)R; -NRNRC(O)N(R); -NRNRCOR; -C(O)C(O)R; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(S)R; -C(O)N(R); -C(S)N(R); -C(=NH)-N(R), -OC(O)N(R); -OC(О)R; -C(O)N(OR)R; -C(NOR)R; -S(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSON(R); -NRSOR; -N(OR)R; -C(=NH)-N(R); -(CH)NHC(O)R, =О, =S, =NNHR*, =NN(R*), =NNHC(О)R*, =NNHCO(алкил), =NNHSO(алкил) или =NR*, где
0
0
0
1-6
2
каждый R независимо выбран из водорода, необязательно замещенной Cалифатической группы, незамещенной 5-6-членной гетероарильной или гетероциклической группы, фенила, -O(Ph), или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют 5-8-членную гетероциклическую, арильную или гетероарильную группу, или 3-8-членную циклоалкильную группу, содержащую от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
0
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
алифатическая группа R необязательно замещена NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), О(галогенCалифатической группой) или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной;
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
каждый R* независимо выбран из водорода или Cалифатической группы, необязательно замещенной NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), O(галогенCалифатической группой) или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной; и
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
1-4
1-4
R обозначает водород или Cалифатическую группу, необязательно замещенную =О, =S, -NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), O(галогенCалифатической группой) или галоген(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп является незамещенной.
В другом воплощении данное изобретение предлагает соединение формулы III, где
2
1-6
R обозначает водород или Cалкил;
5
0
0
1-6
1-6
2
2
1-6
2
2
R обозначает водород, -Cалифатическую группу, -CN, -OH, -O(Cалифатическую группу), -COH, -CO(Cалифатическую группу), -CON(R), -галоген или -NR , где каждое замещаемое положение алифатического атома углерода необязательно и независимо заменено галогеном;
4
6
7
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
1-2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
каждый из R, R и R независимо обозначает галоген; R; -OR; -SR; 1,2-метилендиокси; 1,2-этилендиокси; фенил (Ph), необязательно замещенный R; -O(Ph), необязательно замещенный R; -(CH)(Ph), необязательно замещенный R; -CH=CH(Ph), необязательно замещенный R; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRCOR; -C(O)CHC(O)R; -COR; -C(O)R; -C(O)N(R); -OC(O)N(R); -OC(O)R; -S(O)R; -SON(R); -S(O)R; -NRSOR; или два атома водорода, связанные с одним атомом углерода, заменены =О;
0
0
0
1-6
2
где каждый R независимо выбран из водорода, необязательно замещенной Cалифатической группы, незамещенной 5-6-членной гетероарильной или гетероциклической группы, фенила, -O(Ph) или -CH(Ph), или, независимо от приведенного выше определения, два независимо выбранных R, присутствующие в составе одного заместителя или разных заместителей, вместе с атомом (атомами), к которому присоединена группа R, образуют 5-8-членную гетероциклическую, арильную или гетероарильную группу, или 3-8-членную циклоалкильную группу, содержащую от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода или серы;
0
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
алифатическая группа R необязательно замещена NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп необязательно замещена галогеном;
1-6
2
1-4
1-4
2
1-4
1-4
2
2
2
1-4
1-4
R обозначает водород или Cалифатическую группу, необязательно замещенную =О, =S, -NH, NH(Cалифатической группой), N(Cалифатической группой), галогеном, Cалифатической группой, OH, О(Cалифатической группой), NO, CN, COH, CO(Cалифатической группой), где каждая из вышеуказанных Cалифатических групп необязательно замещена галогеном.
2
В соответствии с другим воплощением формулы III R обозначает водород.
4
6
7
0
0
0
0
0
0
4
6
7
1-4
2
2
1-6
1-6
1-6
2
1-4
В соответствии с другим воплощением формулы III любой или несколько из m, n и p равны 0. В соответствии с другим воплощением каждый из R, R и R независимо обозначает галоген; Cалифатическую группу, необязательно замещенную галогеном; -OR; -CN; -N(R); -NRC(O)R; -NRCOR; или два атома водорода, связанные с одним атомом углерода, заменены =О. В следующем воплощении R и R обозначают Cалкил или галоген. В другом воплощении R обозначает галоген, -CN, Cалкил, Cалкокси, -N(R) или Cгалогеналкил.
3
3
7
3
3
В другом воплощении формулы III R обозначает арильную группу, выбранную из 6-членной моноциклической группы, содержащей от 0 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, где каждое замещаемое положение R необязательно заменено R. В следующем воплощении R обозначает 6-членную гетероарильную группу, содержащую 1 или 2 гетероатома азота. В очередном воплощении R обозначает 2-пиридил.
5
0
5
5
1-6
1-6
2
1-6
2
В соответствии с другим воплощением формулы III R обозначает водород, галоген, OH, NR, CN, О-(Cалифатическую группу) или Cалкил, необязательно замещенный -NR. В следующем воплощении R обозначает Cалкил, необязательно замещенный -N(R). В следующем воплощении R обозначает -CN или водород.
В другом воплощении формулы III кольцо А представляет собой 5-7-членную карбоциклическую группу.
В другом воплощении формулы III кольцо B представляет собой 5-7-членный насыщенный или частично насыщенный цикл. В следующем воплощении кольцо B представляет собой 5-7-членную насыщенную или частично насыщенную гетероциклическую группу.
Другие воплощения формул I, II и III представлены следующими соединениями:
Как описано выше, настоящее изобретение предлагает соединения, которые являются ингибиторами протеинкиназ и, следовательно, могут использоваться для лечения заболеваний, расстройств и состояний, включающих в себя, без ограничения, пролиферативные расстройства, сердечные расстройства, нейродегенеративные расстройства, психотические расстройства, аутоиммунные расстройства, состояния, связанные с трансплантацией органов, воспалительные расстройства, расстройства, опосредованные иммунной системой, вирусные заболевания или заболевания костей. В предпочтительных воплощениях соединения можно использовать для лечения аллергии, астмы, диабета, болезни Альцгеймера, болезни Хантингтона, болезни Паркинсона, СПИД-ассоциированной деменции, бокового амиотрофического склероза (AML, болезнь Лу Гехрига (Lou Gehrig's disease)), рассеянного склероза (MS), шизофрении, гипертрофии кардиомиоцитов, реперфузии/ишемии (например, удара), алопеции, рака, гепатомегалии, сердечно-сосудистого заболевания, включающего в себя кардиомегалию, кистозного фиброза, вирусного заболевания, аутоиммунного заболевания, атеросклероза, рестеноза, псориаза, воспаления, гипертонии, стенокардии, сужение мозговых сосудов, нарушение периферического кровообращения, преждевременных родов, артериосклероз, вазоспазма (спазма мозговых сосудов, коронароспазма), ретинопатии, эректильной дисфункции (ED), СПИДа, остеопороза, болезни Крона и колита, разрастания нейритов и болезни Рейно. В предпочтительных воплощениях заболевание, состояние или расстройства представляют собой атеросклероз, гипертонию, эректильную дисфункцию (ED), реперфузию/ишемию (например, удар) или вазоспазм (спазм мозговых сосудов и коронароспазм).
Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения предлагаются фармацевтически приемлемые композиции, которые содержат одно из описанных в данном документе соединений и, необязательно, фармацевтически приемлемые носитель, вспомогательное средство или наполнитель. В некоторых воплощениях данные композиции могут дополнительно содержать одно или несколько других терапевтических средств.
S6K
Следует понимать, что некоторые соединения настоящего изобретения можно использовать для лечения в свободном виде или, когда это целесообразно, в виде их фармацевтически приемлемых производных. В соответствии с настоящим изобретением фармацевтически приемлемые производные включают в себя, не ограничиваясь ими, фармацевтически приемлемые пролекарственные формы, соли, сложные эфиры, соли таких эфиров, или любые другие аддукты или производные, которые при введении пациенту, нуждающемуся в этом, способны предоставлять, прямо или косвенно, соединение, описанное в данном документе, или его метаболит или остаток. В данном описании термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям, которые в рамках вынесенного медицинского заключения подходят для применения в контакте с тканями человека и низших животных, не вызывая чрезмерного токсичного или раздражающего действия, аллергического ответа и т.п., кроме того, они удовлетворяют приемлемому соотношению польза/риск. Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к любой нетоксичной соли, или к соли сложного эфира соединения данного изобретения, которая при введении реципиенту способна предоставлять, прямо или косвенно, соединение данного изобретения или его метаболит или остаток, обладающий ингибиторной активностью. В данном описании термин "метаболит или остаток, обладающий ингибиторной активностью" означает, что метаболит или остаток также является ингибитором протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK.
+
1-4
4
Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны в данной области. Например, S.M. Berge et al. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, которая включена в данное описание в качестве ссылки. Фармацевтически приемлемые соли соединений данного изобретения включают в себя соли подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных кислотно-аддитивных солей являются соли аминогруппы, полученные с использованием неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и перхлорная кислота, или органических кислот, таких как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или с использованием других методов, известных в данной области, таких как обмен ионов. Другие фармацевтически приемлемые соли включают в себя адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканоат, валерат и т.п. Соли подходящих оснований включают в себя соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммония и N(Cалкил). Данное изобретение также рассматривает кватернизацию любых основных азотсодержащих групп соединений, раскрытых в данном описании. В результате такой кватернизации можно получить продукты, растворимые или диспергируемые в воде или масле. Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают в себя соли натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п. Другие фармацевтически приемлемые соли включают в себя, когда это целесообразно, нетоксичные соли аммония, четвертичного аммония и аминокатионов, полученные с использованием таких противоинов, как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, низший алкилсульфонат и арилсульфонат.
Как указано выше, фармацевтически приемлемые композиции настоящего изобретения дополнительно содержат фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные средства или среды для лекарств, которые, в соответствии с данным описанием, включают в себя любые или все растворители, разбавители или другие жидкие среды, средства, облегчающие диспергирование или суспендирование, поверхностно-активные средства, изотонические средства, загущающие или эмульгирующие средства, консерванты, твердые связующие, смазывающие средства и т.п., в зависимости от вида целевой лекарственной формы. В Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) раскрыты разные носители, используемые для получения фармацевтически приемлемых композиций, а также известные способы получения таких композиций. Применение любых традиционных сред-носителей входит в объем данного изобретения, за исключением тех случаев, когда носитель несовместим с соединениями данного изобретения и, например, вызывает нежелательный биологический эффект или вступает в имеющее вредные последствия взаимодействие с каким-либо другим компонентом (компонентами) фармацевтически приемлемой композиции. Примеры веществ, которые можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают в себя, без ограничения, ионообменные вещества, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота или сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воды, солей или электролитов, таких как протаминсульфат, динатрия гидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, ланолин, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; наполнители, такие как кокосовое масло и свечные воски; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло; сафлоровое масло; кунжутное масло; оливковое масло; кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль; эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; забуферивающие средства, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы; кроме того, по усмотрению фармацевта, в состав композиций могут входить другие нетоксичные совместимые смазывающие средства, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, средства, способствующие высвобождению, покрывающие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки, консерванты и антиоксиданты.
В следующем аспекте предлагается способ лечения или уменьшения тяжести пролиферативного расстройства, сердечного расстройства, нейродегенеративного расстройства, психотического расстройства, аутоиммунного расстройства, состояния, связанного с трансплантацией органов, воспалительного расстройства, расстройства, опосредованного иммунной системой, вирусного заболевания или заболевания костей, указанный способ включает в себя введение эффективного количества соединения или фармацевтически приемлемой композиции, содержащей соединение, субъекту, нуждающемуся в таком введении. В некоторых воплощениях настоящего изобретения "эффективное количество" соединения или фармацевтически приемлемой композиции представляет собой количество, эффективное для лечения или уменьшения тяжести пролиферативного расстройства, сердечного расстройства, нейродегенеративного расстройства, психотического расстройства, аутоиммунного расстройства, состояния, связанного с трансплантацией органов, воспалительного расстройства, расстройства, опосредованного иммунной системой, вирусного заболевания или заболевания костей. В соответствии со способом настоящего изобретения соединения и композиции можно вводить в любом количестве и с помощью любого способа введения, которые позволяют эффективно лечить или уменьшать тяжесть пролиферативного расстройства, сердечного расстройства, нейродегенеративного расстройства, аутоиммунного расстройства, состояния, связанного с трансплантацией органов, воспалительного расстройства, расстройства, опосредованного иммунной системой, вирусного заболевания или заболевания костей. Используемое количество варьируют от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, используемого средства, способа его введения и т.п. Для простоты введения и единообразия дозирования соединения данного изобретения предпочтительно вводят в виде стандартной лекарственной формы. Выражение "стандартная лекарственная форма" в данном описании относится к физически дискретной единице средства, подходящей для пациента, подлежащего лечению. Однако следует понимать, что общая дневная доза соединения и композиции настоящего изобретения назначается лечащим врачом в зависимости от медицинского заключения. Конкретный уровень эффективной дозы для любого конкретного пациента или организма зависит от ряда факторов, включающих в себя подлежащее лечению расстройство и степень тяжести расстройства; активность конкретного используемого соединения; конкретную используемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и пищевой рацион пациента; время введения, способ введения и степень выведения конкретного используемого соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства, используемые в сочетании или совместно с конкретным используемым соединением; а также другие факторы, хорошо известные в области медицины. Термин "пациент" в данном описании относится к животному, предпочтительно млекопитающему, наиболее предпочтительно, к человеку.
Фармацевтически приемлемые композиции данного изобретения можно вводить людям и другим животным перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, внутривагинально, внутрибрюшинно, местно (в виде порошков, мазей или капель), буккально, в виде перорального или назального спрея, и т.п., в зависимости от тяжести подлежащей лечению инфекции. В некоторых воплощениях соединения данного изобретения можно вводить перорально или парентерально в дозе, уровень которой составляет приблизительно от 0,01 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно приблизительно от 1 мг/кг до 25 мг/кг массы тела субъекта в день, один или несколько раз в день с получением целевого терапевтического эффекта.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают в себя, без ограничения, фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Помимо активных соединений жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, традиционно используемые в данной области, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и жирнокислотные эфиры сорбитана, а также их смеси. Кроме инертных разбавителей пероральные композиции также могут содержать вспомогательные средства, такие как увлажняющие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки.
Препараты для инъекций, например, стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, можно получить с помощью известных в данной области способов, используя подходящие диспергирующие или увлажняющие средства и суспендирующие средства. Стерильные препараты для инъекций также могут представлять собой стерильные растворы, суспензии или эмульсии в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. К пригодным для использования приемлемым средам и растворителям относятся вода, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные жирные масла. Для этой цели можно использовать любые мягкие жирные масла, в том числе моно- или диглицериды. Для получения препаратов для инъекций также используют жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Композиции для инъекций можно стерилизовать, например, путем фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, или путем включения стерилизующих средств в состав стерильной твердой композиции, которую перед использованием можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной среде для инъекций.
Чтобы продлить эффект соединения настоящего изобретения, зачастую желательно замедлить абсорбцию соединения при подкожой или внутримышечной инъекции. Этого можно достичь путем применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с плохой растворимостью в воде. В этом случае степень абсорбции соединения зависит от степени растворения, которая в свою очередь может зависеть от размера и формы кристаллов. Альтернативно замедленную абсорбцию парентерально вводимой формы соединения можно достичь путем растворения или суспендирования соединения в масляной среде. Препараты-депо для инъекций получают путем микрокапсулирования основы, содержащей соединение, в биоразрушаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. Степень высвобождения соединения можно регулировать путем изменения соотношения соединения к полимеру и природы конкретного используемого полимера. Примеры других биоразрушаемых полимеров включают в себя сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Композиции депо для инъекций также получают путем заключения соединения в липосомы или микроэмульсии, совместимые с тканями организма.
Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой свечи, которые можно получить путем смешивания соединений данного изобретения с подходящими нераздражающими наполнителями или носителями, такими как кокосовое масло, полиэтиленгликоль или свечной воск, которые являются твердыми при комнатной температуре, но жидкими при температуре тела и, следовательно, плавятся в прямой кишке или вагинальной полости, высвобождая активное соединение.
Твердые лекарственные формы для перорального введения включают в себя капсулы, таблетки, пиллюли, порошки и гранулы. Для получения таких твердых лекарственных форм активное соединение смешивают, по меньшей мере, с одним инертным, фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, таким как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или a) с наполнителями или разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремневая кислота, b) со связующими, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, c) с увлажняющими средствами, такими как глицерин, d) с дезинтегрирующими средствами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, e) с замедлителями схватывания раствора, такими как парафин, f) с ускорителями абсорбции, такими как соединения четвертичного аммония, g) с увлажняющими средствами, такими как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, h) с абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и i) со смазывающими средствами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия, а также с их смесями. В случае капсул, таблеток и пиллюль лекарственная форма также может содержать забуферивающие средства.
Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей для получения мягких и твердых заполненных желатиновых капсул с применением таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п. Такие твердые лекарственные формы, как таблетки, драже, капсулы, пиллюли и гранулы, могут иметь покрытия и оболочки, такие как энтеросолюбильное и другие покрытия, хорошо известные в области фармацевтики. Они могут необязательно содержать опалесцирующие компоненты и также могут представлять собой композицию, которая высвобождает только активный ингредиент (активные ингредиенты), или, предпочтительно, высвобождает активные ингредиенты в определенной части кишечного тракта, необязательно в замедленном режиме. Примеры используемых покрывающих композиций включают в себя полимерные вещества и воски. Твердые композиции подобного типа также можно использовать в качестве наполнителей для получения мягких и твердых заполненных желатиновых капсул с применением таких наполнителей, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярных полиэтиленгликолей и т.п.
Как указано выше, активные соединения вместе с одним или несколькими наполнителями также могут быть заключены в микрокапсулы. Твердые лекарственные формы в виде таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул могут иметь покрытия и оболочки, такие как энтеросолюбильные покрытия, покрытия, контролирующие высвобождение, и другие покрытия, хорошо известные в данной области. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может находиться в смеси с, по меньшей мере, одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Обычно такие лекарственные формы также содержат дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, смазывающие средства, используемые при таблетировании, а также другие средства, облегчающие таблетирование, такие как стеарат магния и макрокристаллическая целлюлоза. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать забуферивающие средства. Они могут необязательно содержать опалесцирующие компоненты и также могут представлять собой композицию, которая высвобождает только активный ингредиент (активные ингредиенты), или, предпочтительно, высвобождает активные ингредиенты в определенной части кишечного тракта, необязательно в замедленном режиме. Примеры используемых покрывающих композиций включают в себя полимерные вещества и воски.
Лекарственные формы для местного или чрескожного введения соединения данного изобретения включают в себя мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, порошки, растворы, спреи, лекарственные формы для ингаляции или пластыри. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и, при необходимости, с любыми подходящими консервантами или буферами. В объем данного изобретения также входят офтальмологические композиции, ушные капли и глазные капли. Кроме того, настоящее изобретение охватывает применение чрескожных пластырей, которые обладают дополнительным преимуществом, обеспечивая контролируемую доставку соединения в организм. Такие лекарственные формы можно получить путем растворения или распределения соединения в подходящей среде. Также можно использовать усилители абсорбции для повышения проникновения соединения через кожу. Скорость можно контролировать либо с помощью мембраны, регулирующей скорость, либо путем диспергирования соединения в полимерной основе или в геле.
S6K
S6K
S6K
S6K
S6K
Как в общих чертах описано выше, соединения данного изобретения можно использовать в качестве ингибиторов протеинкиназ. В одном воплощении соединения и композиции данного изобретения являются ингибиторами одной или нескольких из протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, и, следовательно, без связи с какой-либо теорией, соединения и композиции особенно пригодны для лечения или уменьшения тяжести заболевания, состояния или расстройства, связанного с активацией одной или нескольких из протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK. Если активация протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK участвует в развитии конкретного заболевания, состояния или расстройства, то заболевание, состояние или расстройство также называют "FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK-опосредованное заболевание" или симптом заболевания. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести заболевания, состояния или расстройства, связанного с активацией одной или нескольких из протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c- KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK.
S6K
S6K
S6K
S6K
S6K
Активность соединения, используемого в данном изобретении в качестве ингибитора протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, можно анализировать in vitro, in vivo или в клеточной линии. Анализы in vitro включают в себя анализы, которые позволяют определять ингибирование либо фосфорилирующей активности, либо АТФ-азной активности активированных протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK. Альтернативные анализы in vitro позволяют количественно определить способность ингибитора связывать протеинкиназы подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK. Связывание ингибитора можно измерить путем мечения ингибитора радиоактивным изотопом перед связыванием, выделения комплекса ингибитор/протеинкиназа подсемейства FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK или SYK и определения количества связанной радиоактивной метки. Альтернативно, связывание ингибитора можно определить с помощью конкурентного анализа, в котором новые ингибиторы инкубируют с протеинкиназами подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, связанными с известными лигандами, меченными радиоактивными изотопами.
i
50
i
50
S6K
S6K
В одном воплощении данное изобретение предлагает соединение формулы I, II или III, которое селективно ингибирует FLT-3 и/или c-KIT. В другом воплощении данное изобретение предлагает соединение формулы I, которое селективно ингибирует FLT-3 и/или c-KIT. В данном описании термин "селективно ингибирует" означает, что K или IC для ингибирования FLT-3 и/или c-KIT под действием соединения, по меньшей мере, в два раза ниже, чем для одной или нескольких других киназ, таких как протеинкиназы подсемейств Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK и/или SYK. В следующем воплощении соединение, которое селективно ингибирует FLT-3 и/или c-KIT, представляет собой соединение, которое ингибирует FLT-3 и/или c-KIT с K или IC, которые, по меньшей мере, в пять раз ниже, или, по меньшей мере, в десять раз ниже, чем в случае ингибирования одной или нескольких других киназ, таких как протеинкиназы подсемейств Aurora-2, FMS, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK-3, JNK, KDR, MET, SRC, ROCK и/или SYK.
S6K
S6K
S6K
Термин "ингибирует на детектируемом уровне" в данном описании означает детектируемое изменение активности протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK в образце, содержащем указанную композицию и протеинкиназы подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK, по сравнению с аналогичным образцом, содержащим протеинкиназы подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK в отсутствие указанной композиции.
Термин "FLT-3-опосредуемое заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства FLT-3. Такие состояния включают в себя, без ограничения, гематопоэтические расстройства, в частности, острый миелобластный лейкоз (AML), острый промиелоцитарный лейкоз (APL) и острый лимфолейкоз (ALL).
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести FMS-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
Термин "FMS-опосредованное заболевания" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства FMS. Такие состояния включают в себя, без ограничения, рак (включающий в себя, без ограничения, рак яичников, матки и молочной железы), воспалительные расстройства и гипертонию.
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести c-KIT-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
Термин "c-KIT-опосредованное заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства c-KIT. Такие состояния включают в себя, без ограничения, AML, хронический миелолейкоз (CML), мастоцитоз, анапластическую крупноклеточную лимфому, ALL, стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST), T-клеточную лимфому, аденокистозную карциному, ангиосаркому, карциному матки, мелкоклеточную карциному легких, рак простаты, рак яичников, карциному молочной железы, карциному щитовидной железы, злокачественную карциному, карциному прямой кишки и глиобластому.
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести CDK-2-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
Термин "CDK-2-опосредованное заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства CDK-2. Соответственно, указанные соединения можно использовать для лечения заболеваний или состояний, на развитие которых оказывает влияние активность киназы CDK-2. Такие заболевания или состояния включают в себя рак, болезнь Альцгеймера, рестеноз, ангиогенез, гломерулонефрит, цитомегаловирус, ВИЧ, герпес, псориаз, атеросклероз, алопецию и аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, вирусные инфекции, нейродегенеративные расстройства, расстройства, связанные с апоптозом тимоцитов, или пролиферативные расстройства, возникающие в результате расстройства регуляции клеточного цикла, особенно при развитии цикла от фазы G1 до фазы S.
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести GSK-3-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести Src-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
Термин "Src-опосредованное заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства Src. Такие заболевания или состояния включают в себя, без ограничения, раковые заболевания, такие как рак толстой кишки, молочной железы, печени и поджелудочной железы, аутоиммунные заболевания, такие как отторжение трансплантата, аллергии, ревматоидный артрит, лейкоз, заболевания, связанные с реструктурированием костей, такие как остеопороз, и вирусные заболевания, такие как гепатит B.
В соответствии с другим воплощением данное изобретение предлагает способ лечения или уменьшения тяжести Syk-опосредованного заболевания или состояния у пациента, включающий в себя стадию введения указанному пациенту композиции настоящего изобретения.
Термин "Syk-опосредованное заболевание" или "Syk-опосредованное состояние" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует протеинкиназа Syk. Такие состояния включают в себя, без ограничения, аллергические расстройства, особенно астму.
Термин "JAK-опосредованное заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или болезненному состоянию, в развитии которого участвует киназа семейства JAK. Такие состояния включают в себя, без ограничения, иммунные ответы, такие как аллергические реакции или реакции гиперчувствительности типа I, астму, аутоиммунные заболевания, такие как отторжение трансплантата, реакция трансплантат против хозяина, ревматоидный артрит, боковой амиотрофический склероз и рассеянный склероз, нейродегенеративные расстройства, такие как семейный боковой амиотрофический склероз (FALS), а также солидные и гематологические злокачественные заболевания, такие как лейкозы и лимфомы.
Термин "PDK1-опосредованное состояние" или "заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует PDK1. Термин "PDK1-опосредованное состояние" или "заболевание" также относится к заболеваниям или состояниям, которые можно лечить с помощью ингибитора PDK1. PDK1-опосредованные заболевания или состояния включают в себя, без ограничения, пролиферативные расстройства и рак. Предпочтительно указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы, простаты или яичников.
Термин "PKA-опосредованное состояние" или "заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует PKA. Термин "PKA-опосредованное состояние" или "заболевание" также относится к заболеваниям или состояниям, которые можно лечить ингибитором PKA. PKA-опосредованные заболевания или состояния включают в себя, без ограничения, пролиферативные расстройства и рак.
S6K
S6K
S6K
S6K
S6K
Термин "p70-опосредованное состояние" или "заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует p70. Термин "p70-опосредованное состояние" или "заболевание" также относится к заболеваниям или состояниям, которые можно лечить ингибитором p70. p70-опосредованные заболевания или состояния включают в себя, без ограничения, пролиферативные расстройства, такие как рак и туберозный склероз.
Термин "GSK-3-опосредованное заболевания" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует GSK-3. Такие заболевания или состояния включают в себя, без ограничения, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, метаболические, неврологические и нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и двигательные расстройства подкорковых узлов, хорею, дистонию, болезнь Вильсона, болезнь Пика, дегенерацию лобной доли, прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), болезнь Крейтцфельдта-Якоба, таупатологию и кортикобазальную дегенерацию (CBD)), психотические расстройства (например, шизофрению, СПИД-ассоциированную деменцию, депрессию, биполярное расстройство и боязнь), сердечно-сосудистые заболевания, аллергию, астму, диабет, боковой амиотрофический склероз (AML, болезнь Луи Гехрига), рассеянный склероз (MS), гипертрофию кардиомиоцитов, реперфузию/ишемию, удар и облысение.
Термин "ROCK-опосредованное состояние" или "заболевание" в данном описании относится к любому заболеванию или другому болезненному состоянию, в развитии которого участвует ROCK. Термин "ROCK-опосредованное состояние" или "заболевание" также относится к заболеваниям или состояниям, которые можно лечить ингибитором ROCK. Такие состояния включают в себя, без ограничения, гипертонию, стенокардию, сужение мозговых сосудов, астму, расстройство периферического кровообращения, преждевременные роды, рак, эректильную дисфункцию, артериосклероз, спазм (спазм мозговых сосудов и коронароспазм), ретинопатию (например, глаукому), воспалительные расстройства, аутоиммунные расстройства, СПИД, остеопороз, гипертрофию миокарда, повреждение, вызванное ишемией/реперфузией, и эндотелиальную дисфункцию.
В других воплощениях данное изобретение относится к способу увеличения синтеза гликогена и/или снижения уровня глюкозы в крови у пациента, нуждающегося в этом, причем упомянутый способ включает в себя введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы I, II или III. Данный способ преимущественно предназначается для диабетических пациентов.
В следующем воплощении данное изобретение относится к способу ингибирования продукции гиперфосфорилированного белка Tau у пациента, нуждающегося в этом, причем упомянутый способ включает в себя введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы I, II или III. Данный способ преимущественно предназначается для остановки или замедления развития болезни Альцгеймера.
В следующих воплощениях данное изобретение относится к способу ингибирования фосфорилирования β-катенина у пациента, нуждающегося в этом, причем упомянутый способ включает в себя введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы I, II или III. Данный способ преимущественно предназначается для лечения шизофрении.
Следует также понимать, что соединения и фармацевтически приемлемые композиции настоящего изобретения можно использовать в сочетанной терапии, то есть соединения и фармацевтически приемлемые композиции можно вводить одновременно с одним или несколькими другими подходящими лекарственными средствами или медицинскими процедурами, до них или после. При использовании конкретного сочетания терапий (лекарственных средств или процедур) следует учитывать соответствие используемых лекарственных средств и/или процедур желательному терапевтическому эффекту. Следует также понимать, что используемые терапии могут быть направлены на достижение желательного эффекта в отношении одного и того же расстройства (например, соединение данного изобретения можно вводить вместе с другим средством, используемым для лечения такого же расстройства), или они могут быть направлены на достижение разных эффектов (например, на уменьшение побочных эффектов). В данном описании дополнительные терапевтические средства, которые обычно вводят для лечения или предотвращения конкретного заболевания или состояния, упоминаются как "подходящие для лечения заболевания или состояния, подлежащего лечению".
TM
Например, химиотерапевтические средства или другие антипролиферативные средства можно использовать в сочетании с соединениями данного изобретения для лечения пролиферативных заболеваний и рака. Примерами известных химиотерапевтических средств являются, без ограничения, другие противораковые терапии или средства, пригодные для использования в сочетании с противораковыми средствами настоящего изобретения, которые включают в себя хирургию, радиотерапию (в качестве некоторых примеров можно привести гамма-облучение, нейтроннолучевую радиотерапию, электроннолучевую радиотерапию, протонную терапию, брахитерапию и системное введение радиоактивных изотопов), гормональную терапию, применение модификаторов биологического ответа (например, интерферонов, интерлейкинов и фактора некроза опухоли (TNF)), гипертермию и криотерапию, средства, уменьшающие побочные эффекты (например, противорвотные средства), и другие допущенные к применению химиотерапевтические средства, включающие в себя, без ограничения, алкилирующие средства (мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, мелфалан, ифосфамид), антиметаболиты (метотрексат), антагонисты пурина и пиримидина (6-меркаптопурин, 5-фторурацил, цитарабил, гемцитабин), веретенные яды (винбластин, винкристин, винорелбин, паклитаксел), подофиллотоксины (этопозид, иринотекан, топотекан), антибиотики (доксорубицин, блеомицин, митомицин), нитрозомочевины (кармустин, ломустин), неорганические ионы (цисплатин, карбоплатин), ферменты (аспарагиназа) и гормоны (тамоксифен, лейпролид, флутамид и мегестрол), Gleevec, адриамицин, дексаметазон и циклофосфамид. Более широкие сведения по противораковым терапиям можно найти в The Merck Manual., Seventeenth Ed. 1999, полное содержание которой включено в данное описание в качестве ссылки.
Другие примеры средств, которые также можно использовать в сочетании с ингибиторами данного изобретения, включают в себя, без ограничения: средства для лечения болезни Альцгеймера, такие как Aricept и Excelon; средства для лечения болезни Паркинсона, такие как L-DOPA/карбидопа, энтакапон, ропинрол, прамипексол, бромкриптин, перголид, тригексефендил и амантадин; средства для лечения рассеянного склероза (MS), такие как бета-интерферон (например, Avonex и Rebif), Copaxone и митоксантрон; средства для лечения астмы, такие как альбутерол и Singulair; средства для лечения шизофрении, такие как зипрекса, риспердал, сероквел и галоперидол; противовоспалительные средства, такие как кортикостероиды, блокаторы TNF, IL-1 RA, азатиоприн, циклофосфамид и сульфазалазин; иммуномодулирующие и иммунодепрессивные средства, такие как циклоспорин, такролимус, рапамицин, микофенолят мофетил, интерфероны, кортикостероиды, циклофосфамид, азатиоприн и сульфазалазин; нейротропные факторы, такие как ингибиторы ацетилхолинэстеразы, ингибиторы MAO, интерфероны, противосудорожные средства, блокаторы ионных каналов, рилузол и средства против болезни Паркинсона; средства для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, такие как бета-блокаторы, ингибиторы ACE, диуретики, нитраты, блокаторы кальциевых каналов и статины; средства для лечения заболеваний печени, такие как кортикостероиды, холестирамин, интерфероны и противовирусные средства; средства для лечения болезни крови, такие как кортикостероиды, противолейкемические средства и факторы роста; а также средства для лечения иммунодефицитного состояния, такие как гамма-глобулин.
Количество другого терапевтического средства, присутствующее в композиции данного изобретения, не должно превышать количество, которое обычно вводят в составе композиции, содержащей данное терапевтическое средство как единственный активный компонент. Предпочтительно количество другого терапевтического средства в композиции настоящего изобретения варьирует приблизительно от 50% до 100% по отношению к количеству, обычно присутствующему в композиции, содержащей данное средство как единственный терапевтически активный компонент.
Соединения данного изобретения или их фармацевтически приемлемые композиции также могут быть включены в состав композиций, используемых для покрытия имплантируемых медицинских устройств, таких как протезы, искусственные клапаны, сосудистые трансплантаты, стенты и катетеры. Соответственно, в другом аспекте настоящее изобретение включает в себя композицию для покрытия имплантируемого устройства, содержащую соединение настоящего изобретения, описанное в данном документе выше в общих чертах, а также в классах и подклассах, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства. В следующем аспекте настоящее изобретение включает в себя имплантируемое устройство, покрытое композицией, содержащей соединение настоящего изобретения, описанное в данном документе выше в общих чертах, а также в классах и подклассах, и носитель, подходящий для покрытия указанного имплантируемого устройства.
Сосудистые стенты, например, используют для преодоления рестеноза (повторного сужения просвета сосуда после повреждения). Однако у пациентов со стентами или другими имплантируемыми устройствами существует риск образования тромбов или активации тромбоцитов. Указанные нежелательные эффекты можно предотвратить или уменьшить путем предварительного покрытия устройства фармацевтически приемлемой композицией, содержащей ингибитор киназы. Подходящие покрытия и общие способы получения покрытых имплантируемых устройств описаны в патентах США 6099562; 5886026; и 5304121. Покрытия обычно представляют собой биосовместимые полимерные материалы, такие как полимерный гидрогель, полиметилдисилоксан, поликапролактон, полиэтиленгликоль, полимолочная кислота, этиленвинилацетат и их смеси. Покрытия могут быть дополнительно покрыты подходящим поверхностным покрытием из фторсиликона, полисахаридов, полиэтиленгликоля, фосфолипидов или их сочетаний, придающих композиции характеристики контролируемого высвобождения.
S6K
Другой аспект данного изобретения относится к способу ингибирования активности протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK в биологическом образце или у пациента, данный способ включает в себя введение пациенту соединения формулы I, II или III, или композиции, содержащей указанное соединение, или приведение в контакт упомянутого биологического образца с указанным соединением или композицией. Термин "биологический образец" в данном описании включает в себя, без ограничения, клеточные культуры или их экстракты; материал, полученный для биопсии от млекопитающего, или его экстракт; а также кровь, слюну, мочу, фекалии, семенную жидкость, слезы или другие жидкости организма или их экстракты.
S6K
Ингибирование активности протеинкиназ подсемейств FLT-3, FMS, c-KIT, PDGFR, JAK, AGC (например, PKA, PDK, p70-1 и -2 и PKB), CDK, GSK, SRC, ROCK и/или SYK в биологическом образце используют для разных целей, известных специалистам в данной области. Примеры таких целей включают в себя, без ограничения, переливание крови, трансплантацию органов, хранение биологических образцов и биологические анализы.
ПРИМЕРЫ
Соединения общей формулы I получают с помощью общих способов, описанных в примерах 1 и 2.
Пример 1
N3-[4-(4-Морфолин-4-илциклогексил)фенил]-1-пиридин-2-ил-1Н-[1,2,4]триазол-3,5-диамин
ВЭЖХ, метод A:
Колонка: Lighting 3 мкм, 2,1×50 мм
Градиент: от 100% B (0,1% ТФУ/1,0% MeCN/вода) до 100% D (0,1% ТФУ/MeCN) в течение 4 мин. Поддерживают D @ 100% D до 5,6 мин, затем переходят к 100% B в течение 0,4 мин, и поддерживают его в течение 1 мин.
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Синтез диметил 4-циано-4-(4-нитрофенил)гептандиоата (2);
3
2
2
4
К раствору 2-(4-нитрофенил)ацетонитрила (1) (50,12 г, 0,31 моль) в CHCN (1 л) при КТ в атмосфере N добавляют тритон-B/40% MeOH (14,5 мл, 0,03 моль), получая темно-фиолетовый раствор. Смесь нагревают с обратным холодильником, затем добавляют (в течение ~2,5 ч) метилакрилат (160 мл, 1,78 моль) и продолжают нагревание с обратным холодильником в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают и упаривают, затем разбавляют EtOAc и подкисляют 2 н. HCl. Слои разделяют, водный слой снова экстрагируют EtOAc, объединенные органические слои промывают насыщенным раствором NaCl, сушат над NaSO, фильтруют и упаривают. Очищают флэш-хроматографией на силикагеле (1 л), элюируя смесью 1:2 EtOAc:гексаны, и получают соединение 2 в виде желтого масла (88,96 г, 86%).
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 8,31 (д, 2H), 7,78 (д, 2H), 3,52 (c, 6H), 2,4 (м, 6H), 2,05 (м, 2H) м.д.
MC-FIA: 333,1 (М-Н).
ВЭЖХ (метод A): 3,484 мин.
Синтез метил 5-циано-5-(4-нитрофенил)-2-оксоциклогексанкарбоксилата (3)
2
2
2
4
К раствору соединения 2 (88,96 г, 0,27 моль) в DME (1 л) при КТ в атмосфере N добавляют (осторожно) NaH (60% в минеральном масле, 31,92 г, 0,80 моль), получая темно-фиолетовый раствор. Реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 4 ч, охлаждают и осторожно гасят HO, подкисляют 2 н. HCl и экстрагируют 2×EtOAc. Объединенные органические слои промывают насыщенным раствором NaCl, сушат над смесью активированного угля и NaSO, фильтруют через целит и упаривают, получая неочищенный продукт 3 в виде коричневого твердого вещества (83,42 г, 100%).
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 12,1 (c, 1H), 8,31 (д, 2H), 7,88 (д, 2H), 3,75 (c, 3H), 2,86 (AB квартет, 2H), 2,65 (м, 1H), 2,6 (м, 1H), 2,4 (м, 1H), 2,35 (м, 1H) м.д.
MC-FIA: 301,1 (М-Н).
ВЭЖХ (метод A): 3,729 мин.
Синтез 1-(4-нитрофенил)-4-оксоциклогексанкарбонитрила
2
2
2
4
2
Неочищенное соединение 3 (0,27 моль), NaCl (80 г, 1,37 моль) и воду (80 мл) нагревают в ДМСО (1,2 л) при 150-160°C в течение 3 ч. Растворитель отгоняют, остаток разбавляют HO и экстрагируют 3×EtOAc. Объединенные органические слои промывают 2 н. HCl, 3×HO, раствором NaCl, сушат над NaSO и упаривают. Очищают флэш-хроматографией (1 л SiO), элюируя смесью EtOAc:гексаны 1:3, затем 1:2, и получают чистый продукт 4 в виде не совсем белого твердого вещества (36,47 г, выход 56%), а также слегка загрязненный продукт 4 в виде зеленоватого твердого вещества (14,33 г, выход 22%).
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 8,31 (д, 2H), 7,92 (д, 2H), 2,74 (м, 2H), 2,5 (м, 6H) м.д.
MC-FIA: 243,2 (М-Н).
ВЭЖХ (Метод A): 3,121 мин.
Синтез 4-морфолино-1-(4-нитрофенил)циклогексанкарбонитрила (5a)
2
К раствору 1-(4-нитрофенил)-4-оксоциклогексанкарбонитрила (45,8 г, 187 ммоль) в безводном THF (560 мл) при КТ добавляют морфолин (17,2 мл, 197 ммоль). Раствор перемешивают в течение 45 мин, затем помещают в водяную баню при КТ. В течение 10 мин порциями добавляют триацетоксиборгидрид натрия (55,5 г, 260 ммоль). Через 2,5 ч растворитель удаляют в вакууме, смесь растворяют в EtOAc (400 мл) и экстрагируют 2 н. NaOH (3×75 мл). Затем через органическую фазу барботируют газообразный HCl, получая осадок, который фильтруют и промывают EtOAc (2×) и EtO (3×). Твердое вещество сушат в вакууме при 40°C в течение 18 ч и получают смесь изомеров (5a и 5c, 54,9 г, выход 84%).
Очистка изомера 5a (необходима для способа получения примера 2; не является необходимой для способа получения примера 1)
2
2
2
2
2
Смесь 5a и 5b (79,4 г) растворяют в CHCl (200 мл) и наносят на SiO (2 л), загруженный в воронку с пористым стеклянным фильтром объемом 3 л. Элюируют 13 л смеси 1:1 этилацетат:гексаны в колбы объемом 1 л, получая смесь 5a и 5b (19,77 г, выход 25%) в виде бледно-желтого твердого вещества. Затем элюируют 8 л смеси 5:95 метанол:CHCl и получают 57 г чистого изомера 5a (выход 72%).
1
6
5a: H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 8,28 (д, 2H), 7,84 (д, 2H), 3,59 (м, 4H), 2,52 (м, 4H), 2,40 (тт, 1H), 2,18 (д, 2H), 2,02 (м, 4H), 1,60 (м, 2H) м.д.
MC-FIA 316,1 (М+H).
ВЭЖХ (метод B) 2,537 мин. (100%).
1
6
5b: H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 8,30 (д, 2H), 7,82 (д, 2H), 3,59 (м, 4H), 2,38 (м, 4H), 2,28 (д, 2H), 2,26 (м, 1H), 1,94 (м, 4H), 1,74 (м, 2H) м.д.
MC-FIA 316,1 (М+H).
ВЭЖХ: 2,449 мин (100%).
Синтез транс- и цис-4-(4-морфолин-4-илциклогексил)фениламина (6а и 6b)
(Ссылки: S.B. Christensen et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 821-835; и J.A. Marshall, et al., J. Org. Chem., 1977, 42, 3309-3311.)
4
4
4
3-Горлую круглодонную колбу объемом 2 л, оборудованную верхней механической мешалкой, адаптером Клайсена с дополнительной воронкой (1 л) и холодильником с сухим льдом, сушат на огне в атмосфере азота и оставляют охлаждаться. Холодильник заряжают смесью сухой лед/2-пропанол и колбу охлаждают до -78°С с помощью смеси сухой лед/2-пропанол при положительном давлении азота. Газообразный аммиак (1 л) конденсируют в атмосфере азота. Затем в раствор загружают 26,6 г (1,16 моль) металлического натрия. Через 30 мин по каплям добавляют раствор 30 г (0,0951 моль) 4-морфолино-1-(4-нитрофенил)циклогексанкарбонитрила в безводном ТГФ (300 мл) через дополнительную воронку в течение 10 минут. После завершения добавления воронку промывают 50 мл ТГФ от остатков 4-морфолино-1-(4-нитрофенил)циклогексанкарбонитрила, реакционную смесь оставляют нагреваться до -33°С и перемешивают 5 часов. Реакционную смесь гасят, добавляя по каплям смесь NHCl/NHOH (9/1, 100 мл) при положительном давлении азота. Добавляют воду (200 мл), затем EtOAc (350 мл) и оставляют при перемешивании в течение ночи, чтобы испарился аммиак. Полученную суспензию фильтруют через целит и водный слой экстрагируют EtOAc (3×200 мл). Объединенные органические слои сушат над MgSO, фильтруют, концентрируют при пониженном давлении (на роторном испарителе) и после вакуумной сушки при КТ получают смесь 6a:6b ~5:1 в виде бледно-желтого твердого вещества (23,87 г, выход 96,4%).
1
6
Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) для 6a: 6,84 (д, 2H), 6,46 (д, 2H), 3,55 (м, 4H), 2,48 (м, 4H), 2,25 (тт, 1H), 2,22 (тт, 1H), 1,88 (д, 2H), 1,78 (д, 2H), 1,34 (м, 4H) м.д.; различимые пики для 6b: 6,86 (д, 2H), 6,49 (д, 2H), 3,60 (м, 4H), 2,37 (м, 4H) м.д.
MC-FIA 261,2 (М+H),69%).
Синтез (Z)-3-(4-(4-морфолиноциклогексил)фенил)-2-фенилизомочевины
2
2
2
3
2
2
Смесь цис- и транс-4-(4-морфолин-4-илциклогексил)фениламина 6b и 6a (20,28 г, 77,9 ммоль) и дифенилцианокарбонимидата (20,44 г, 85,6 ммоль) в диоксане (350 мл) перемешивают в атмосфере N в течение 4 дней. Реакционную смесь упаривают, затем разбавляют водой и экстрагируют 5 порциями (200 мл) CHCl. Объединенную органическую фазу промывают NaHCO и упаривают досуха, получая темно-коричневое вязкое масло. После перетирания с EtO (300 мл) получают желтовато-коричневое твердое вещество, которое затем промывают 2 порциями EtO (150 мл), получая продукт 7a в виде желтовато-коричневого твердого вещества (21,70 г, 69%).
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 10,7 (уш.с, 1H), 7,44 (т, 2H), 7,35 (д, 2H), 7,25 (м, 5H), 3,57 (м, 4H), 2,51 (м, 4H), 2,44 (тт, 1H), 2,30 (м, 1H), 1,92 (д, 2H), 1,85 (д, 2H), 1,45 (м, 2H), 1,34 (м, 2H) м.д.
3
ЖХ/MC (5-45% CHCN) 405,1 (М+H), 403,2 (М-Н).
R
t=3,4 мин.
ВЭЖХ: 2,798 мин.
Синтез N3-[4-(4-морфолин-4-илциклогексил)фенил]-1-пиридин-2-ил-1Н-[1,2,4]триазол-3,5-диамина
Раствор (Z)-3-(4-(4-морфолиноциклогексил)фенил)-2-фенилизомочевины 7a (7,00 г, 17,3 ммоль) и 2-пиридилгидразина (2,27 г, 20,8 ммоль) нагревают с обратным холодильником в изопропаноле (100 мл) в течение 2 дней. Реакционную смесь охлаждают, фильтруют и полученное твердое вещество промывают этанолом. Осадок перекристаллизовывают из диоксана, кристаллы фильтруют, суспендируют в метаноле при перемешивании в течении 1 ч, упаривают и сушат при 60°C в высоком вакууме в течение 3 дней. В результате получают чистое соединение I-3 (4,88 г, выход 67%) в виде белого твердого вещества.
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 8,92 (c, 1H), 8,40 (м, 1H), 7,97 (м, 1H), 7,68 (д, 1H), 7,63 (c, 2H), 7,51 (д, 2H), 7,20 (м, 1H), 7,09 (д, 2H), 3,57 (м, 4H), 2,50 (м, 4H), 2,37 (тт, 1H), 2,26 (тт, 2H), 1,91 (д, 2H), 1,84 (д, 2H), 1,43 (м, 2H), 1,33 (м, 2H) м.д.
3
ЖХ/MC (5-95% CHCN) 420,0 (М+H).
R
t=3,1 мин.
ВЭЖХ: 2,602 мин.
Синтез мезилата N3-[4-(4-морфолин-4-илциклогексил)фенил]-1-пиридин-2-ил-1Н-[1,2,4]триазол-3,5-диамина
2
Соединение примера 1 (128,0 г, 0,305 моль) суспендируют в диоксане (1,5 л) и нагревают при 60-70°C. В течение 10 минут по каплям добавляют метансульфоновую кислоту (19,8 мл, 0,305 моль). Перемешивание продолжают в течение 1 ч при 60-70°C и 3 ч при комнатной температуре. Твердое вещество фильтруют и промывают EtO, затем 4 раза суспендируют в метаноле, упаривают и затем сушат в высоком вакууме при 50-60°C в течение 20 ч. Процедуру суспендирования/упаривания/сушки повторяют еще раз с метанолом, затем один раз с этанолом в безуспешной попытке удалить следы диоксана из соли. Твердое вещество суспендируют в воде (1 л) и нагревают с обратным холодильником 15 мин, после чего твердое вещество отделяют от воды путем центрифугирования. Центрифугирование повторяют еще дважды. Влажное твердое вещество разбавляют этанолом, упаривают и сушат при 45-50°C в высоком вакууме, получая соединение I-3, мезилат (129,95 г), в виде белого твердого вещества. Конечный продукт содержит (по данным ЯМР) 0,3% диоксана.
1
6
H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) 9,51 (уш.с, 1H), 8,98 (c, 1H), 8,41 (м, 1H), 7,99 (м, 1H), 7,69 (д, 1H), 7,64 (c, 2H), 7,54 (д, 2H), 7,21 (м, 1H), 7,11 (д, 2H), 4,02 (д, 2H), 3,72 (т, 2H), 3,44 (д, 2H), 3,28 (м, 1H), 3,14 (м, 2H), 2,46 (м, 1H), 2,34 (c, 3H), 2,19 (м, 2H), 1,95 (м, 2H), 1,53 (м, 4H) м.д.
3
ЖХ/MC (5-95% CHCN) 420,1 (М+H).
R
t=3,2 мин.
ВЭЖХ: 2,593 мин.
Пример 2
1-(4-(5-Амино-1-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,4-триазол-3-иламино)фенил-4-морфолиноциклогексанкарбонитрил
Синтез (Z)-1-циано-3-(4-((1s,4s)-1-циано-4-морфолиноциклогексил)фенил)-2-фенилизомочевины (6)
Промежуточное соединение 5a получают по способу примера 1. Транс-4-морфолино-1-(4-нитрофенил)циклогексанкарбонитрил (20 г, 63,5 ммоль) и катализатор 10% Pd-C (750 мг) в 250 мл этанола держат в атмосфере водорода (38 фунт/кв. дюйм) в шейкере Парра в течение 2 часов. Чтобы растворить продукт, добавляют дихлорметан, 200 мл, затем катализатор отфильтровывают. Растворители выпаривают, получая транс-1-(4-аминофенил)-4-морфолин-4-илциклогексанкарбонитрил (18,1 г, 63,5 ммоль) в виде чистого желтовато-коричневого твердого вещества, которое используют без дополнительной очистки.
1
3
Н ЯМР CDC1: 7,25 (м, 2H), 6,70 (м, 2H), 3,7 (м, 6H), 2,65 (м, 4H), 2,35 (м, 1H), 2,25 (м, 2H), 2,05 (м, 2H), 1,85 (м, 4H).
FIA MC М+1, 286,0.
3
ВЭЖХ: метод 10-90% CHCN: 2,488 мин. 100%.
Раствор полученного транс-1-(4-аминофенил)-4-морфолин-4-илциклогексанкарбонитрила (18,1 г, 63,5 ммоль) и дифенилцианокарбонимидат (18,1 г, 76,2 ммоль) перемешивают в 1,4-диоксане (140 мл) при КТ в течение 24 ч. Добавляют дистиллированную воду (200 мл) и получают белый осадок, который отфильтровывают и промывают водой (100 мл), насыщенным раствором бикарбоната натрия (150 мл) и водой (200 мл). Твердое вещество сушат в эксикаторе в вакууме в течение ночи, получая указанное в заголовке соединение 6 (21,1 г, выход 78%).
1
H-ЯМР (ДМСО, 500 МГц) 7,55 (м, 4H), 7,45 (м, 2H), 7,3 (м, 3H), 3,6 (м, 4H), 2,45 (м, 4H), 2,37 (т, 1H), 2,15 (д, 2H), 2,0 (д, 2H), 1,9 (т, 2H), 1,6 (м, 2H)
t
MC+ 430,18, MC- 428,13, ВЭЖХ R=4,652 мин. (условия 10-90% ацетонитрила в течение 7,5 мин.
Синтез 1-(4-(5-амино-1-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,4-триазол-3-иламино)фенил-4-морфолиноциклогексанкарбонитрил
1-(4-(5-Амино-1-(пиридин-2-ил)-1H-1,2,4-триазол-3-иламино)фенил-4-морфолиноциклогексанкарбонитрил (73 г, 0,164 моль) добавляют к диоксану (1 л) и смесь нагревают до 60-70°C. В течение 10 минут по каплям добавляют метансульфоновую кислоту (15,8 г, 0,164 моль). Нагревательную баню удаляют и суспензию оставляют перемешиваться в течение 3 часов. Добавляют изопропанол (200 мл) и смесь фильтруют. Соль промывают изопропанолом (50 мл), затем диэтиловым эфиром (200 мл). Твердое вещество суспендируют в смеси 10% метанол-дихлорметан (500 мл) и перемешивают в течение 18 часов. Добавляют изопропанол (100 мл), твердое вещество фильтруют, промывают эфиром и получают чистый мезилат (I-4, в виде мезилата) в виде белого твердого вещества (81 г, выход 91%).
1
6
Н ЯМР: DMCO-d: 9,70 (уш.с, 1H), 9,25 (c, 1H), 8,40 (c, 1H), 7,95 (м, 1H), 7,65 (м, 3H), 7,40 (м, 2H), 7,20 (м, 1H), 4,06 (м, 2H), 3,75 (м, 2H), 3,55 (м, 2H), 3,50 (уш.с, 1H), 3,35 (м, 1Н), 3,15 (м, 2H), 2,32 (м, 7H), 1,90 (м, 2H), 1,80 (м, 2H).
FIA MC М+1 445,2
3
ЖХ-MC М+1: 445,3 1,88 мин. метод 10-90% CHCN.
3
ВЭЖХ: метод 10-90% CHCN: 4,2 мин 100%.
Соединения формул I, II и II специалист в данной области может получить с помощью способов, подобных описанным в данном документе.
Пример 3
Аналитические данные
1
Ряд других соединений формулы I получают с помощью способов, по существу подобных описанным в данном документе. Типичные характеристические данные для указанных соединений приведены ниже в таблице и включают в себя данные ВЭЖХ, ЖХ/МС (наблюдаемые), время удерживания (вр.уд.) и H ЯМР. Номера соединений соответствуют номерам соединений, указанным в данном описании.
Номер соед.
ЖХ/МС
Вр.уд.
<sup>1</sup>Н ЯМР
I-1
420,10
3,10
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 9,01 (c, 1H), 8,41 (м, 1H), 7,97 (м, 1H), 7,68 (д, 1H), 7,65 (c, 2H), 7,59 (д, 2H), 7,23 (д, 2H), 7,21 (м, 1H), 3,98 (д, 2H), 3,68 (т, 2H), 3,49 (д, 2H), 3,32 (м, 1H), 3,04 (м, 2H), 2,85 (м, 1H), 2,11 (м, 2H), 1,89 (м, 2H), 1,75 (м, 4H) м.д.
I-2
445,00
3,20
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 9,21 (c, 1H), 8,41 (м, 1H), 7,98 (м, 1H), 7,73 (д, 1H), 7,67 (м, 4H), 7,39 (д, 2H), 7,21 (м, 1H), 3,58 (м, 4H), 2,38 (м, 4H), 2,25 (м, 3H), 1,89 (м, 4H), 1,72 (м, 2H) м.д.
I-5
484,00
3,20
(ДМСО-d<sub>6</sub>, 500 МГц) 9,24 (c, 1H), 8,42 (м, 1H), 7,98 (м, 1H), 7,71 (д, 1H), 7,67 (м, 4H), 7,40 (д, 2H), 7,22 (м, 1H), 3,53 (м, 2H), 3,28 (м, 1H), 3,16 (м, 2H), 2,99 (м, 2H), 2,66 (д, 2H), 2,28 (м, 4H), 1,91 (м, 3H), 1,78 (м, 2H), 0,54 (м, 2H), 0,45 (м, 2H) м.д.
I-6
486,20
2,05
ДМСО-d<sub>6</sub>: 8,90 (c, 1H), 8,40 (м, 1H), 7,98 (м, 1H), 7,75 (м, 1H), 7,65 (c, 2H), 7,50 (м, 2H), 7,20 (м, 1H), 7,10 (м, 2H), 4,02 (c, 2H), 4,50 (м, 2H), 4,40 (м, 2H), 2,60 (м, 1H), 2,45 (м, 4H), 2,22 (c, 1H), 2,1,85 (м, 4H), 1,50 (м, 4H)
I-7
459,10
3,10
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 9,00 (c, 1H), 8,41 (м, 1H), 7,97 (м, 1H), 7,68 (д, 1H), 7,65 (c, 2H), 7,58 (д, 2H), 7,22 (м, 3H), 3,50 (м, 2H), 3,30 (м, 1H), 3,08 (м, 2H), 2,98 (м, 2H), 2,85 (м, 1H), 2,63 (м, 2H), 2,12 (м, 2H), 1,8 (м, 7H), 0,50 (м, 2H), 0,39 (м, 2H) м.д.
I-8
419,20
1,54
ДМСО-d<sub>6</sub>: 8,95 (c, 1H), 8,40 (м, 1H), 7,95 (м, 1H), 7,68 (м, 1H), 7,60 (уш.с, 2H), 7,55 (м, 2H), 7,20 (м, 1H), 7,10 (м, 2H), 5,1 (оч.уш.с, 1H), 2,85 (м, 4H), 4,60 (м, 1H), 2,50 (м, 4H), 2,20 (м, 1H), 1,90 (м, 2H), 1,80 (м, 2H), 1,45 (м, 4H)
I-9
459,10
3,10
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 8,98 (c, 1H), 8,40 (м, 1H), 7,97 (м, 1H), 7,68 (д, 1H), 7,64 (c, 2H), 7,53 (д, 2H), 7,19 (м, 1H), 7,09 (д, 2H), 3,45 (м, 2H), 3,26 (м, 1H), 3,10 (м, 2H), 2,99 (м, 2H), 2,63 (м, 3H), 2,15 (м, 2H), 1,93 (д, 2H), 1,81 (м, 1H), 1,50 (м, 4H), 0,50 (м, 2H), 0,39 (м, 2H) м.д.
I-10
447,20
1,74
MeOH-d<sub>4</sub>: 8,40 (м, 1H), 7,90 (м, 1H), 7,75 (м, 1H), 7,50 (м, 2H), 7,15 (м, 3H), 3,5-2,5 (м, 10H), 2,0 (м, 4H), 1,70 (м, 4H), 1,30 (т, 3H)
I-11
418,00
2,20
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 8,98 (c, 1H), 8,42-8,39 (м, 1H), 8,00-7,93 (м, 1H), 7,73-7,59 (м, 3H), 7,56 (д, 2H), 7,24-7,16 (м, 1H), 7,11 (д, 2H), 3,40 (д, 2H), 3,29-3,17 (м, 1H), 3,05-2,91 (м, 2H), 2,45 (м, 1H), 2,11 (м, 2H), 1,93 (д, 2H), 1,85 (д, 2H), 1,76-1,34 (м, 8H) м.д.
I-12
483,00
3,10
(500 МГц, ДМСО-d<sub>6</sub>) 8,93 (c, 1H), 7,94 (д, 2H), 7,79 (д, 2H), 7,48 (д, 2H), 7,08 (д, 2H), 6,73 (c, 2H), 3,44 (м, 2H), 3,25 (м, 2H), 3,05 (м, 2H), 2,98 (м, 1H), 2,58 (м, 2H), 2,42 (м, 1H), 2,15 (м, 2H), 1,92 (м, 2H), 1,75 (м, 1H), 1,53 (м, 4H), 0,47 (м, 2H), 0,35 (м, 2H) м.д.
I-13
561,10
2,00
ДМСО-d<sub>6</sub>: 10,60 (уш.с, 1H); 9,10 (уш.с, 1H); 8,38 (д, 1H); 7,80-8,20 (уш.с, 2H); 7,48 (д, 2H); 7,30 (м, 2H); 6,62 (м, 1H); 3,30-4,10 (м, 15H); 3,00 (м, 2H); 2,78 (м, 1H); 2,20 (м, 2H); 1,62-1,98 (м, 11H)
I-14
586,10
2,00
ДМСО-d<sub>6</sub>: 9,35 (c, 1H); 9,20 (уш.с, 1H); 8,35 (д, 1H); 7,78 (уш.с, 2H); 7,70 (д, 2H); 7,48 (д, 2H); 6,62 (д, 1H); 3,50-4,00 (м, 10H); 3,40-3,50 (м, 5H); 3,00 (м, 2H); 2,72 (м, 2H); 1,75-2,15 (м, 9H); 1,52 (м, 2H)
I-15
586,10
2,00
ДМСО-d<sub>6</sub>: 9,73 (уш.с, 1H); 9,28 (c, 1H); 8,35 (д, 1H); 7,76 (уш.с, 2H); 7,62 (д, 2H); 7,35 (д, 2H); 6,62 (д, 1H); 3,55-4,08 (м, 10H); 3,25-3,55 (м, 5H); 3,15 (м, 2H); 2,32 (м, 4H); 1,75-2,15 (м, 9H)
I-16
561,10
2,10
ДМСО-d<sub>6</sub>: 9,60 (уш.с, 1H); 9,05 (c, 1H); 8,35 (д, 1H); 7,78 (уш.с, 2H); 7,50 (д, 2H); 7,08 (д, 2H); 6,60 (д, 1H); 3,50-4,10 (м, 11H); 3,45 (м, 4H); 3,25 (м, 1H); 3,15 (м, 2H); 2,12 (м, 2H); 1,70-2,00 (м, 7H); 1,50 (м, 4H)
Пример 4
Ингибирование FLT-3
33
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность FLT-3 с помощью радиометрического анализа связывания с фильтром. Данный анализ позволяет регистрировать включение P в субстрат поли(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Анализы проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,01% БСА и 2,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 90 мкМ для АТФ и 0,5 мг/мл для pE4Y (оба получают от Sigma Chemicals, St Louis, MO). Конечная концентрация соединения обычно находится в интервале от 0,01 до 5 мкМ. Как правило, проводят 12-точечное титрование путем приготовления серийных разведений, начиная с 10 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО. Реакции проводят при комнатной температуре.
2
2
50
i
33
33
Получают два аналитических раствора. Раствор 1 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мг/мл pE4Y и 180 мкМ АТФ (содержащий 0,3 мкКи [γ-P]АТФ в каждой реакционной смеси). Раствор 2 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,02% БСА и 3 нМ FLT-3. Анализ проводят в 96-луночном планшете путем смешивания 50 мкл раствора 1 и 2,5 мкл раствора тестируемого соединения. Реакцию инициируют добавлением раствора 2. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 50 мкл 20% раствора ТХУ, содержащего 0,4 мМ АТФ. Затем все реакционные смеси переносят на фильтровальный планшет и промывают 5% ТХУ с помощью Harvester9600 от TOMTEC (Hamden, CT). Количество P, включенное в pE4y, измеряют с помощью сцинтилляционного счетчика для микропланшета Packard TopCount (Meriden, CT). Результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения Prism, получая IC или K.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют FLT-3.
Пример 5
Ингибирование c-KIT
33
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность c-KIT с помощью радиометрического анализа связывания с фильтром. Данный анализ позволяет регистрировать включение P в субстрат поли(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Анализы проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,01% БСА и 2,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 700 мкМ для АТФ и 0,5 мг/мл для pE4Y (оба получают от Sigma Chemicals, St Louis, MO). Конечная концентрация соединения обычно находится в интервале от 0,01 до 5 мкМ. Как правило, проводят 12-точечное титрование путем приготовления серийных разведений, начиная с 10 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО. Реакции проводят при комнатной температуре.
2
2
50
i
33
33
Получают два аналитических раствора. Раствор 1 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мг/мл pE4Y и 1,4 мМ АТФ (содержащий 0,5 мкКи [γ-P]АТФ в каждой реакционной смеси). Раствор 2 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,02% БСА и 25 нМ c-KIT. Анализ проводят в 96-луночном планшете путем смешивания 33 мкл раствора 1 и 1,65 мкл раствора тестируемого соединения. Реакцию инициируют добавлением 33 мкл раствора 2. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10% раствора ТХУ, содержащего 0,2 мМ АТФ. Затем все реакционные смеси переносят на фильтровальный планшет и промывают 5% ТХУ с помощью Harvester9600 от TOMTEC (Hamden, CT). Количество P, включенное в pE4y, измеряют с помощью сцинтилляционного счетчика для микропланшета Packard TopCount (Meriden, CT). Результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения Prism, получая IC или K.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют c-KIT.
Пример 6
Ингибирование GSK-3
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность GSK-3β (AA 1-420), используя стандартную твердофазную ферментную систему (Fox et al. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Реакции проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 300 мкМ NADH, 1 мМ DTT и 1,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 20 мкМ для АТФ (Sigma Chemicals, St Louis, MO) и 300 мкМ для пептида (American Peptide, Sunnyvale, CA). Реакции проводят при 30°C и концентрации GSK-3β 20 нМ. Конечные концентрации компонентов твердофазной ферментной системы составляют 2,5 мМ для фосфоенолпирувата, 300 мкМ для NADH, 30 мкг/мл для пируваткиназы и 10 мкг/мл для лактатдегидрогеназы.
Получают исходный буферный раствор для анализа, содержащий все перечисленные выше реагенты за исключением АТФ и тестируемого соединения. Исходный буферный раствор для анализа (175 мкл) инкубируют в 96-луночном планшете с 5 мкл тестируемого соединения, конечная концентрация при этом находится в интервале от 0,002 мкМ до 30 мкМ, при 30°C в течение 10 мин. Как правило, 12-точечное титрование проводят путем приготовления серийных разведений (начиная с 10 мМ исходного раствора соединения) тестируемых соединений в ДМСО в дочерних планшетах. Реакцию инициируют добавлением 20 мкл АТФ (конечная концентрация 20 мкМ). Скорость реакции определяют с помощью планшет-ридера Molecular Devices Spectramax (Sunnyvale, CA) в течение 10 мин при 30°C. Значения Ki определяют исходя из значения скорости как функции от концентрации ингибитора.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют GSK-3.
Пример 7
Ингибирование CDK-2
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность CDK-2/циклин А, используя стандартный твердофазный ферментный анализ (Fox et al. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Анализы проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES pH 7,5, 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 1,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 100 мкМ для АТФ (Sigma Chemicals) и 100 мкМ для пептида (American Peptide, Sunnyvale, CA). Реакции проводят при 30°C и концентрации CDK-2/циклин А 25 нМ. Конечные концентрации компонентов твердофазной ферментной системы составляют 2,5 мМ для фосфоенолпирувата, 350 мкМ для NADH, 30 мкг/мл для пируваткиназы и 10 мкг/мл для лактатдегидрогеназы.
i
Получают исходный буферный раствор для анализа, содержащий все перечисленные выше реагенты за исключением CDK-2/циклин А, DTT и тестируемого соединения. 56 мкл тестируемой реакционной смеси помещают в 384-луночный планшет, затем добавляют 1 мкл 2 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО (конечная концентрация соединения 30 мкМ). Планшет предварительно инкубируют в течение ~10 минут при 30°C и затем реакцию инициируют путем добавления 10 мкл фермента (конечная концентрация 25 нМ). Скорость реакции определяют с помощью планшет-ридера BioRad Ultramark (Hercules, CA) в течение времени считывания 5 минут при 30°C. Значения K определяют стандартными методами.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют CDK-2.
Пример 8
Ингибирование SRC
Соединения анализируют на способность ингибировать активность человеческой киназы Src, используя либо анализ, основанный на измерении радиоактивности, либо спектрофотометрический анализ.
Анализ A ингибирования Src: Анализ, основанный на измерении радиоактивности
33
33
33
2
3
4
3
4
i
Соединения анализируют на способность ингибировать полноразмерную рекомбинантную человеческую киназу Src (от Upstate Biotechnology, № по каталогу 14-117), экспрессированную в клетках, инфицированных бакуловирусом, и выделенную из данных клеток. Активность киназы Src определяют путем измерения включения P из АТФ в тирозин статистического полимерного субстрата полиGlu-Tyr с соотношением Glu:Tyr = 4:1 (Sigma, № по каталогу P-0275). Компоненты аналитической смеси имеют следующие конечные концентрации: 0,05M HEPES, pH 7,6, 10 мМ MgCl, 2 мМ DTT, 0,25 мг/мл BSA, 10 мкМ АТФ (1-2 мкКи P-АТФ в каждой реакционной смеси), 5 мг/мл полиGlu-Tyr и 1-2 единицы рекомбинантной человеческой киназы Src. В стандартном анализе все компоненты реакционной смеси за исключением АТФ предварительно смешивают и порциями вносят в лунки аналитического планшета. В лунки добавляют ингибиторы, растворенные в ДМСО, получая конечную концентрацию ДМСО 2,5%. Аналитический планшет инкубируют при 30°C в течение 10 мин, затем инициируют реакцию добавлением P-АТФ. Через 20 мин реакцию гасят, используя 150 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), содержащего 20 мМ NaPO. Затем образцы переносят в 96-луночный фильтровальный планшет (Whatman, UNI-Filter GF/F Glass Fiber Filter, № по каталогу 7700-3310), вставленный в вакуумный коллектор для фильтровальных планшетов. Фильтровальные планшеты промывают четыре раза 10% раствором ТХУ, содержащим 20 мМ NaPO, и затем 4 раза метанолом. После этого в каждую лунку добавляют 200 мкл сцинтилляционной жидкости. Планшеты закрывают и с помощью сцинтилляционного счетчика TopCount считают количество радиоактивности, связанное с фильтрами. Строят график зависимости включенной радиоактивности от концентрации ингибитора. Данные подгоняют к кинетической модели конкурентного ингибирования, получая значения K для каждого соединения.
Анализ B ингибирования Src: спектрофотометрический анализ
Количество АДФ, полученного из АТФ в процессе фосфорилирования субстрата полиGlu-Tyr, катализируемого человеческой рекомбинантной киназой Src, определяют с помощью твердофазного ферментного анализа (Fox et al., (1998) Protein Sci. 7, 2249). В данном анализе одна молекула NADH окисляется до NAD на каждую молекулу АДФ, образующуюся в киназной реакции. Уменьшение количества NADH можно отслеживать при 340 нм.
2
Компоненты аналитической смеси имеют следующие конечные концентрации: 0,025M HEPES, pH 7,6, 10 мМ MgCl, 2 мМ DTT, 0,25 мг/мл полиGlu-Tyr, и 25 нМ рекомбинантной человеческой киназы Src. Конечные концентрации компонентов твердофазной ферментной системы составляют 2,5 мМ для фосфоенолпирувата, 200 мкМ для NADH, 30 мкг/мл для пируваткиназы и 10 мкг/мл для лактатдегидрогеназы.
i
В стандартном анализе все компоненты реакционной смеси за исключением АТФ предварительно смешивают и порциями вносят в лунки аналитического планшета. В лунки добавляют ингибиторы, растворенные в ДМСО, получая конечную концентрацию ДМСО 2,5%. Аналитический планшет инкубируют при 30°C в течение 10 мин, затем инициируют реакцию добавлением 100 мкМ АТФ. Изменение поглощения при 340 нм со временем и скорость реакции измеряют с помощью планшет-ридера молекулярных устройств. Значения скорости в виде функции от концентрации ингибитора подгоняют к кинетической модели конкурентного ингибирования, получая значения K для каждого соединения.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют SRC.
Пример 9
Ингибирование SYK
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность SYK, используя стандартный твердофазный ферментный анализ (Fox et al. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Анализы проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES, pH 7,5, 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 1,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 200 мкМ для АТФ (Sigma Chemicals, Co.) и 4 мкМ для пептида полиGly-Tyr (Sigma Chemicals, Co.). Анализы проводят при 30°C и концентрации SYK 200 нМ. Конечные концентрации компонентов твердофазной ферментной системы составляют 2,5 мМ для фосфоенолпирувата, 300 мкМ для NADH, 30 мкг/мл для пируваткиназы и 10 мкг/мл для лактатдегидрогеназы.
i
Получают исходный буферный раствор для анализа, содержащий все перечисленные выше реагенты за исключением SYK, DTT и тестируемого соединения. 56 мкл тестируемой реакционной смеси помещают в 96-луночный планшет, затем добавляют 1 мкл 2 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО (конечная концентрация соединения 30 мкМ). Планшет предварительно инкубируют в течение ~10 минут при 30°C и затем реакцию инициируют путем добавления 10 мкл фермента (конечная концентрация 25 нМ). Скорость реакции определяют с помощью планшет-ридера BioRad Ultramark (Hercules, CA) в течение времени считывания 5 минут при 30°C и с помощью стандартных методов определяют значения K.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют SYK.
Пример 10
Ингибирование FMS
33
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность FMS с помощью радиометрического анализа связывания с фильтром. Данный анализ позволяет регистрировать включение P в субстрат поли(Glu, Tyr) 4:1 (pE4Y). Реакции проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 0,01% БСА и 2,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 90 мкМ для АТФ и 0,5 мг/мл для pE4Y (оба получают от Sigma Chemicals, St Louis, MO). Конечная концентрация соединения обычно находится в интервале от 0,01 до 5 мкМ. Как правило, проводят 12-точечное титрование путем приготовления серийных разведений, начиная с 10 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО. Реакции проводят при комнатной температуре.
2
2
50
i
33
33
Получают два аналитических раствора. Раствор 1 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 1 мг/мл pE4Y и 180 мкМ АТФ (содержащий 0,3 мкКи [γ-P]АТФ в каждой реакционной смеси). Раствор 2 содержит 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,02% БСА и 3 нМ FMS. Анализ проводят в 96-луночном планшете путем смешивания 50 мкл раствора 1 и 2,5 мкл раствора тестируемого соединения. Реакцию инициируют добавлением раствора 2. После инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 50 мкл 20% раствора ТХУ, содержащего 0,4 мМ АТФ. Затем все реакционные смеси переносят на фильтровальный планшет и промывают 5% ТХУ с помощью Harvester9600 от TOMTEC (Hamden, CT). Количество P, включенного в pE4y, измеряют с помощью сцинтилляционного счетчика для микропланшет Packard TopCount (Meriden, CT). Результаты обрабатывают с помощью программного обеспечения Prism, получая IC или K.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют FMS.
Пример 11
Анализ ингибирования Rock
2
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность ROCK I (AA 6-553), используя стандартную твердофазную ферментную систему (Fox et al. (1998) Protein Sci. 7, 2249). Реакции проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT и 1,5% ДМСО. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 45 мкМ для АТФ (Sigma Chemicals, St Louis, MO) и 200 мкМ для пептида (American Peptide, Sunnyvale, CA). Реакции проводят при 30°C и концентрации ROCK I 45 нМ. Конечные концентрации компонентов твердофазной ферментной системы составляют 2,5 мМ для фосфоенолпирувата, 350 мкМ для NADH, 30 мкг/мл для пируваткиназы и 10 мкг/мл для лактатдегидрогеназы.
Обнаружено, что некоторые соединения данного изобретения ингибируют ROCK.
Пример 12
Анализ ингибирования JAK3
2
i
Способность соединения ингибировать JAK анализируют по способу, описанному G.R. Brown, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, vol. 10, pp 575-579 следующим образом. В планшеты Maxisorb, предварительно покрытые при 4°C поли(Glu, Ala, Tyr) 6:3:1 и затем промытые забуференным фосфатом физиологическим раствором 0,05% и твином (PBST), добавляют 2 мкМ АТФ, 5 мМ MgCl и раствор соединения в ДМСО. Реакцию инициируют добавлением фермента JAK и планшеты инкубируют в течение 60 минут при 30°C. Затем планшеты промывают PBST, добавляют 100 мкл HRP-конъюгированного антитела 4G10 и инкубируют в течение 90 минут при 30°C. Планшет снова промывают PBST, добавляют 100 мкл раствора TMB, и инкубируют еще 30 минут при 30°C. Чтобы остановить реакцию, добавляют серную кислоту (100 мкл 1M раствора), планшет прочитывают при 450 нм и получают значения оптической плотности, которые используют для определения значений K.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют JAK-3.
Пример 13
Анализ ингибирования PDK-1
2
32
Соединения подвергают скринингу на способность ингибировать активность PDK-1 с помощью анализа включения радиоактивного фосфата (Pitt and Lee, J. Biomol. Screen., (1996) 1, 47). Анализы проводят в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT. Конечные концентрации субстратов в реакционной смеси составляют 40 мкМ для АТФ (Sigma Chemicals) и 65 мкМ для пептида (PDKtide, Upstate, Lake Placid, NY). Реакции проводят при 30°C и концентрации PDK-1 25 нМ в присутствии ~27,5 нКи/мкл [γ-P]АТФ (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, UK). Получают исходный буферный раствор для анализа, содержащий все перечисленные выше реагенты за исключением АТФ и тестируемого соединения. 15 мкл исходного раствора помещают в 96-луночный планшет, затем добавляют 1 мкл 0,5 мМ исходного раствора тестируемого соединения в ДМСО (конечная концентрация соединения 25 мкМ, конечная концентрация ДМСО 5%). Планшет предварительно инкубируют в течение приблизительно 10 минут при 30°C и затем реакцию инициируют путем добавления 4 мкл АТФ (конечная концентрация 40 нМ).
Реакцию останавливают через 10 минут путем добавления 100 мкл 100 мМ фосфорной кислоты, 0,01% твин-20. Фосфоцеллюлозный 96-луночный планшет (Millipore, № по каталогу MAPHNOB50) предварительно обрабатывают 100 мкл 100 мМ фосфорной кислоты, 0,01% твин-20, после чего добавляют реакционную смесь (100 мкл). Пятна оставляют впитываться в течение, по меньшей мере, 5 минут, после чего промывают (4×200 мкл 100 мМ фосфорной кислоты, 0,01% твин-20). После сушки в лунки добавляют 20 мкл сцинтилляционной смеси Optiphase 'SuperMix' (Perkin Elmer) и считают сцинтилляции (жидкостной сцинтилляционный счетчик 1450 Microbeta, Wallac).
50
Соединения, демонстрирующие более чем 50% ингибирование по сравнению со стандартными лунками, содержащими аналитическую смесь и ДМСО без тестируемого соединения, титруют, чтобы определить значения IC.
Соединения данного изобретения эффективно ингибируют PDK-1.
Авторы описали ряд воплощений данного изобретения, однако очевидно, что базовые примеры можно изменить с получением других воплощений, в которых могут применяться соединения и способы данного изобретения. Таким образом, следует понимать, что объем данного изобретения в большей степени определяется прилагающейся формулой изобретения, чем конкретными воплощениями, которые приведены выше в качестве иллюстрации.