Новый простой метод изучения хемотаксиса

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

© Коллектив авторов, 2013 г. УДК 612.017:576.3

Е. С. Нишева, А. С. Акопян,

А. В. Каган, Н. Н. Каплин, М. Майхуб

НОВЫЙ ПРОСТОЙ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ХЕМОТАКСИСА

Детская городская больница № 1, Санкт-Петербург; Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия; Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Хемотаксис (хемотропизм) определяют как характерное движение или ориентацию организма или клетки по градиенту химической концентрации в направлении химического стимула или в противоположном направлении — от химического стимула [7]. Хемотаксисом называют феномен движения соматических клеток, бактерий и других одно-или многоклеточных организмов в направлении различных химических соединений или в направлении от этих химических соединений.

Методы исследования хемотаксиса подразделяются на 4 группы: исследование хемотаксиса с помощью камеры Бойдена, метод кожного окна, метод бесклеточной зоны, микрожидкостный метод. Все эти методы технически сложны и громоздки, малейшие изменения в ходе реакции влияют на ее конечную оценку и снижают точность диагностики.

Цель работы состояла в разработке простого способа оценки хемотаксиса, пригодного для использования в любой клинической лаборатории и не требующего дорогостоящего оборудования и реактивов. При изучении нами процессов фагоцитоза пыльцевых зерен у больных с аллергическими заболеваниями нами был обнаружен неизвестный ранее феномен: у здоровых людей выявлен интенсивный хемотаксис и адгезия лейкоцитов к зернам пыльцы. В литературе было показано, что, кроме аллергенов, пыльца содержит водорастворимые компоненты, которые активируют полиморф-ноядерные лейкоциты и вызывают их хемотаксис, чем авторы и объясняют патогенез аллергического воспаления при поллинозах [9]. В опубликованных нами работах было показано, что здоровых лиц хемотаксис и адгезия были намного выше, чем у пациентов с поллинозами [1, 3], что подтверждало высказанную нами гипотезу о нарушении нормальных процессов фагоцитоза аллергенов как главной причины развития аллергических заболеваний [4]. При исследовании хемотаксиса и адгезии лейкоцитов к зернам пыльцы у пациентов с различными заболеваниями нами было выявлено снижение этих показателей у пациентов с установленными и предполагаемыми дефектами фагоцитоза [2], поэтому мы сочли возможным предложить данный способ

в качестве метода исследования хемотаксиса у различных групп больных. Способ состоит в инкубации смеси лейкоцитов и корпускулярных частиц, содержащих хемоаттрактанты, в качестве которых использовались зерна пыльцы. Смесь лейкоцитов и пыльцы инкубируется в виде горизонтального монослоя. До и после инкубации в термостате определяется количество пыльцевых зерен, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит, результаты сопоставляются с нормативными показателями у здоровых лиц и на основании этого делается заключение о наличии нарушений хемотаксиса. На предложенный нами способ подана заявка на патент и получена приоритетная справка (заявка № 2012140659 от 21.09.2012).

Опытная группа состояла из 173 пациентов в возрасте от 1 месяца до 16 лет с различными заболеваниями. С помощью предложенного нами способа и классического теста Бойдена [9] обследованы пациенты с острым аппендицитом (12), первичным перитонитом (26), рецидивирующим Фурункулезом (14), острой пневмонией (17), желе-зодефицитной анемией (8), доброкачественной ней-тропенией детского возраста (7), хроническим гас-тродуоденитом (12), хронической носоглоточной инфекцией (хронический тонзиллит, аденоидит) (15), врожденными пороками сердца (5), паховыми грыжами (14), острым гастроэнтеритом (12), острой респираторной вирусной инфекцией (16), рецидивирующим халязионом (8), хронической грануле-матозной болезнью (4), синдромом Чедиака — Хи-гаси (3). Контрольная группа в данном исследовании состояла из 36 пациентов в возрасте от 1 месяца до 16 лет без острых и хронических инфекционных и неинфекционных заболеваний, без проявления аллергии на момент обследования, т. е. практически здоровых детей.

Исследования хемотаксиса и адгезии лейкоцитов в предварительном проекте проводились с различными частицами — зернами пыльцы таких растений, как тимофеевка, сосна, береза, ольха, каштан, лещина, яблоня, лилия, одуванчик, мятлик, полынь, роза, черемуха. Были использованы также пекарские дрожжи. Однако многие из исследованных частиц имеют форму, затрудняющую учет реакции: различные выросты, шипы, впадины; лейкоциты, присоединившиеся к частице, не всегда заметны при микроскопировании. Некоторые частицы, например, дрожжи пекарские, имеют меньшие размеры, чем лейкоциты, и после адгезии к ним лейкоцитов быстро фагоцитируются, что также затрудняет учет реакции. Оптимальными частицами для проведения реакции хемотаксиса являются круглые частицы, не имеющие выростов и впадин, размер которых превышает размер лейкоцитов, в частности, зерна пыльцы тимофеевки (Phleum pratense). Эти частицы имеют округлую

форму и ровную поверхность, их размер превышает размер лейкоцитов. Согласно предложенному нами методу, хемотаксис лейкоцитов оценивают по адгезии лейкоцитов к зернам пыльцы до и после инкубации смеси лейкоцитов с пыльцевыми зернами в виде горизонтального монослоя в терсмостате. Способ осуществляют следующим образом.

У пациента берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную градуированную пластиковую небольшую пробирку (100 ед. гепарина на 1 мл крови). Следует подчеркнуть, что нельзя использовать антикоагулянты-хелаторы кальция, такие как ЭДТА, поскольку процесс хемотаксиса кальций-зависимый. В качестве пробирок используют градуированные эпиндорфы объемом 1 — 1,5 мл. Для проведения исследования у большинства пациентов достаточно 0,2 мл крови, у пациентов с нейтро-пенией — 0,4 — 0,5 мл крови для исследования. Пробирку с кровью оставляют на 1 час при комнатной температуре для спонтанного осаждения эритроцитов, при этом над осадком эритроцитов образуется слой плазмы, содержащий лейкоциты. Производят подсчет лейкоцитов в плазме, для этого отбирают из пробирки 10 мкл плазмы с лейкоцитами и смешивают ее со 190 мкл 3 %-го водного раствора уксусной кислоты, заполняют полученной смесью камеру Горяева и определяют концентрацию лейкоцитов общепринятым способом. Образцы плазмы крови, содержащие 3 — 9- 109 лейкоцитов/л пригодны для исследования сразу, а образцы плазмы крови, содержащие менее 3- 109 лейкоцитов/л или

более 9- 109 лейкоцитов/л, подвергают дополнительной обработке, чтобы стандартизовать количество лейкоцитов.

Готовят взвесь пыльцевых зерен тимофеевки следующим образом. Пыльцевые зерна разводят физиологическим раствором до такой концентрации, чтобы при смешивании плазмы крови с лейкоцитами и взвеси пыльцевых зерен в равных количествах, на 5 — 30 лейкоцитов пациента приходилось 1 пыльцевое зерно. Пыльцевые мешки от одного колоска тимофеевки, собранного в период цветения растения, разводят в 0,4 — 0,5 мл физиологического раствора и интенсивно пипетируют 20 — 30 секунд для отделения зерен пыльцы от пыльцевых мешков. Определяют концентрацию зерен пыльцы в растворе с помощью камеры Горяева аналогично определению концентрации лейкоцитов. Разводят полученную взвесь зерен пыльцы таким образом, чтобы концентрация зерен пыльцы была в 5 — 30 раз меньше, чем количество лейкоцитов у данного пациента. Полученную взвесь исследуют под микроскопом — 25 мкл взвеси зерен пыльцы помещают на предметное стекло и накрывают ее покровным стеклом 24х 24 мм, края которого смазаны вазелином для предотвращения испарения и вытекания исследуемой жидкости. Полученный на стекле препарат рассматривают под микроскопом (увеличение окуляра х 15, объектива х 25). Подсчитывают количество зерен пыльцы в 10 полях зрения и определяют среднее количество зерен пыльцы в одном поле зрения. Оптимальной является концентрация зерен пыльцы, когда в одном

Таблица 1

Характеристика обследованных пациентов и результаты исследования хемотаксиса с помощью предложенного нами метода

Заболевание Количество пациентов, обследованных заявленным нами способом Количество пациентов со сниженными показателями хемотаксиса и адгезии Количество пациентов с выявленными нарушения хемотаксиса (% от общего количества обследованных в данной группе) с помощью предложенного нами способа

до инкубации после инкубации до и после инкубации

Первичный перитонит 26 6 8 12 26

Острый аппендицит 12 1 0 0 1

Рецидивирующий фурункулез 14 3 3 8 14

Острая пневмония 17 0 0 0 0

Железодефицитная анемия 8 0 0 0 0

Доброкачественная нейтропения 7 0 0 0 0

детского возраста

Хронический гастродуоденит 12 1 0 0 1

Хроническая носоглоточная ин- 15 2 4 4 10

фекция (хронический тонзиллит,

аденоидит)

Врожденные пороки сердца 5 0 0 0 0

Неущемленные паховые грыжи 14 0 0 0 0

Острый гастроэнтерит 12 0 0 0 0

Острая респираторная вирусная 16 0 0 0 0

инфекция

Рецидивирующий халязион 8 3 2 3 8

Хроническая гранулематозная 4 1 1 2 4

болезнь

Синдром Чедиака-Хигаси 3 0 0 3 3

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

поле зрения видно 2 — 4 пыльцевых зерна, тогда при смешивании с лейкоцитами на 10 — 30 лейкоцитов пациента будет приходиться 1—2 пыльцевых зерна (5 — 30 лейкоцитов на 1 частицу).

Для оценки хемотаксиса в отдельную пробирку вносят 15 мкл плазмы крови пациента с лейкоцитами, добавляют 15 мкл рабочего раствора пыльцевых зерен, смесь осторожно перемешивают пипети-рованием и наносят 25 мкл смеси на предметное стекло, накрывают смесь покровным стеклом 24х 24 мм, края которого смазаны вазелином и сразу же микроскопируют препарат (объектив х 25, окуляр х 15). Подсчитывают 50—100 зерен пыльцы и определяют количество зерен пыльцы, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит. Полученный результат выражают в процентах. После микроскопиро-вания исследуемый препарат (стекло со смесью лейкоцитов и пыльцы) помещают в горизонтальном положении в термостат при температуре + 37 °С и выдерживают там в течение 1 часа.

После окончания инкубации микроскопируют препарат (объектив х 25, окуляр х 15). Подсчитывают 50—100 зерен пыльцы и определяют количество зерен пыльцы, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит. Полученный результат выражают в процентах. Исходные показатели хемотаксиса и адгезии в контрольной группе составляли 32 — 48 % пыльцевых зерен (частиц), присоединивших лейкоциты, показатели хемотаксиса и адгезии после 1-часовой инкубации в термостате при 1= +37 °С составляли 60 — 98 % и не зависели от возраста, пола и сезона обследования пациентов. Исходя из показателей здоровых детей, указанных ранее, хемотаксис считали нарушенным при количестве частиц, присоединивших лейкоциты, менее 32 % до инкубации или менее 60 % после инкубации.

У многих пациентов с рецидивирующими гнойно-септическими заболеваниями выявлены нарушения хемотаксиса, причем с помощью предложенного нами способа процент выявления таких больных был достоверно выше, чем с помощью метода Бойдена. Патогенез этих заболеваний связывают с нарушениями процессов фагоцитоза, однако при обследовании их в иммунологических центрах только у 15 — 30 % из них выявляются дефекты в системе фагоцитоза. С помощью предложенного нами способа дефекты важнейшего этапа процесса фагоцитоза — хемотаксиса — удалось выявить у по-

Таблица 2

Сравнительный анализ результатов оценки хемотаксиса методом Бойдена и предложенным нами методом

Заболевание Количествово обследованных Количествово пациентов с выявленными нарушениями хемотаксиса

Метод Бойдена Заявленный нами способ

Первичный перитонит 26 2(7,7 %) 26 (100 %)*

Острый аппендицит 12 0

Рецидивирующий фурункулез 14 2 (14 %) 14 (100 %)*

Острая пневмония 17 0

Железодефицитная анемия 8 0

Доброкачественная 7 - 0

нейтропения детского возраста

Хронический гастродуоденит 12 0

Хроническая носоглоточная 15 3 (20 %) 10 (67 %)*

инфекция (хронический тон-

зиллит, аденоидит)

Врожденные пороки сердца 5 0

Неущемленные паховые грыжи 14 0

Острый гастроэнтерит 12 0

Острая респираторная вирус- 16 0

ная инфекция

Рецидивирующий халязион 8 1

Хроническая гранулематозная 4 1 (25 %) 4 (100 %)*

болезнь

Синдром Чедиака-Хигаси 3 1 (33 %) 3 (100 %)*

* - р<0,05 между группами при сравнении результатов оценки хемотаксиса по методу Бойдена и с помощью предложенного нами метода.

давляющего большинства пациентов. Своевременное назначение таким пациентам иммуномодуля-торов, стимулирующих процессы фагоцитоза, у многих пациентов оказывало хороший терапевтический эффект и приводило к более быстрому выздоровлению и/или длительной ремиссии заболевания.

Таким образом, предложенный нами способ диагностики хемотаксиса позволяет повысить точность исследования по сравнению с методом Бой-дена, не требует специального оборудования, может быть использован в любой клинической лаборатории у пациентов с различными заболеваниями для выявления нарушений хемотаксиса. Постановка и учет реакции с помощью заявленного способа занимает 10—15 минут, время инкубации в термостате, занимающее 1 час, может быть использовано лаборантом для проведения других исследований. Мы надеемся, что с помощью современных технологий в ближайшем будущем будут созданы корпускулярные частицы, содержащие различные хемоаттрактанты, и с помощью предложенного нами метода удастся исследовать особенности хемотаксиса к различным опухолевым, инфекционным и прочим антигенам.

ЛИТЕРАТУРА

1. Нишева, Е. С. Дефекты фагоцитоза аллеренов у детей с аллергическими заболеваниями / Е. С. Нишева [и др.] // Материалы II Рос. науч.-практ. конф. «Аллергические заболевания — проблема XXI века». — СПб., 2009. — С. 17.

2. Нишева, Е. С. Иммунные нарушения у детей с первичным перитонитом: нарушения хемотаксиса лейкоцитов / Е. С. Нишева, А. С. Акопян, А. В. Каган // Материалы науч.-практ. конф. «Аллергические и иммунопатологические заболевания — проблема XXI века». — СПб., 2012. — С. 75 — 77.

3. Нишева, Е. С. Иммунологические механизмы специфической иммунотерапии пыльцевыми аллергенами при поллинозах у детей / Е. С. Нишева, А. В. Аввакумова, Н. Н. Каплин // Педиатр. - 2010. - № 1. - С. 52.

4. Нишева, Е. С. Новая гипотеза механизма аллергического воспаления: центральная роль макрофага / Е. С. Нишева // 9-й нац. конгр. по болезням органов дыхания: сб. резюме докл. - М., 1999. - С. 57.

5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes / S. Boyden // J. Exp. Med. - 1962. - Vol. 115. - P. 453-466.

6. http://en.wikipedia.org/wiki/Chemotaxis.

7. http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/chemo-taxis.

8. Hulkower, K. I. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery / L. I. Hulkower, R. L. Herber // Pharmaceutics. - 2011. - № 3. - Р. 107-124.

9. Traidl-Hoffmann, C. Lipid mediators from pollen act as chemoattractants and activators of polymorphonuclear granulocytes / C. Traidl-Hoffmann [et al] // J. Allergy Clin. Immunol. -2002. - № 109 (5). - Р. 831-838.

РЕЗЮМЕ

Е. С. Нишева, А. С. Акопян, А. В. Каган, Н. Н. Каплин, М. Майхуб

Новый простой метод изучения хемотаксиса

Нами предложен простой способ исследования хемотаксиса лейкоцитов, заключающийся в инкубации смеси

лейкоцитов и корпускулярных частиц, содержащих хемо-аттрактанты, в качестве которых использовались зерна пыльцы. Смесь лейкоцитов и пыльцы инкубируется в виде горизонтального монослоя. До и после инкубации в термостате определяется количество пыльцевых зерен, к которым присоединился хотя бы один лейкоцит, результаты сопоставляются с нормативными показателями у здоровых лиц и на основании этого делается заключение о наличии нарушений хемотаксиса. Способ апробирован на 173 детях с различными заболеваниями. Выявлена высокая частота нарушений хемотаксиса у детей с рецидивирующими и хроническими гнойно-септическими заболеваниями.

Ключевые слова: хемотаксис, фагоцитоз, лейкоциты, иммунитет, первичный перитонит.

SUMMARY

E. S. Nisheva, A. S. Akopyan, A. V. Kagan, N. N. Kaplin, M. Mayhub

A new simple method of studying chematoxis

We present a simple method for studying chemotaxis of leukocytes, which consists in the incubation of the mixture of leukocytes and corpuscular particles containing chemoat-tractants (we used pollen grains as such corpuscular particles). The mixture of leukocytes and pollen is incubated in a horizontal monolayer. The number of pollen grains with adhered leukocytes is calculated before and after incubation in the termostat and the results are compared with the standard for healthy people and the conclusion about chemotaxis impairment is made. The method was applied in 173 children with various diseases. A lot of children with recurrent and chronic infectious and purulent diseases had abnormal chemotaxis.

Key words: chemotaxis, phagocytosis, white blood cells, immune system, primary peritonitis.

© Е. А. Скворцова, С. В. Зверева, 2013 г. УДК 612.656

Е. А. Скворцова, С. В. Зверева

ЮВЕНИЛЬНОСТЬ В СТРУКТУРЕ ИНДИВИДНЫХ И ПСИХОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЮНОШЕЙ И ДЕВУШЕК 14-17 ЛЕТ

Кафедра анатомии человека Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова; кафедра психологии и психофизиологии ребенка Российского государственного педагогического университета имени А. И. Герцена, Санкт-Петербург

Ювенильность — это один из важнейших конституциональных признаков, который является тенденцией филогенетического развития современного человека. Понятие «ювенильность» впервые было введено Я. Я. Рогинским [9] и в дальнейшем использовалось Л. А. Рудкевичем для построе-

ния четырехкоординатной схемы конституции человека [3]. На морфологическом уровне ювениль-ность выражается в усилении мозгового черепа с одновременным ослаблением лицевого черепа [11].

Сведения о морфогенезе, типовой и индивидуальной изменчивости черепа представлены в отечественной и зарубежной литературе [2, 16]; детально описаны половые особенности черепов [15], установлены соотношения размеров головы с соматотипами [6, 12]. П. Андрик [13] на основании кефалометриче-ского и одонтоглифического исследования делает вывод о явной тенденции к перестройке формы черепа, выражающейся в редукции челюстных структур.

Таким образом, конституциональный параметр, называемый ювенилизацией, проявляется в усилении мозгового черепа (нейрокрана) и ослаблении лицевого (спланхнокрана), а также косвенно в увеличении степени искривления зубов, отсутствии диастем (промежутков между зубами), позднем прорезывании третьих моляров (зубов мудрости) и увеличении массы мозга [3, 5, 9].

В исследовании Л. А. Рудкевича (2001) доказано, что ювенильность представляет собой «молодой»