СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ СУТОЧНОГО РИТМА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ
INVESTIGATION METHOD OF DAY-AND-NIGHT RHYTHM OF CYTOGENETIC INDEXES OF WOODY PLANTS

Изобретение относится к области цитогенетики и может быть применено для прогнозирования цитогенетических показателей на основе полученных экспериментальных данных, а также выявления влияния их на другие биологические показатели.
При проведении изучения суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого и сосны обыкновенной проводили фиксацию материала для цитологических исследований в течение суток с интервалом два часа, для березы повислой через каждые три часа, после чего по описанной ранее методике изготовляли давленные микропрепараты и анализировали на них с применением светового микроскопа цитогенетические показатели семенного потомства древесных растений. В результате получали значения цитогенетических показателей в каждый из исследованных часов, строили графики зависимости по экспериментальным данным и делали вывод об изменении в течение суток цитогенетической характеристики (Калаев В.Н. Цитогенетический мониторинг загрязнения окружающей среды с использованием растительных тест-объектов: Автореф. дис… канд. биол. наук. - Воронеж, 2000. - 25 с; Вострикова Т.В. Цитоэкология березы повислой (Betula pendula Roth): Автореф. дис… канд. биол. наук. - Воронеж, 2002. - 24 с.; Дорошев С.А. Влияние антропогенных стрессоров на изменчивость цитогенетических показателей у сосны обыкновенной: Автореф. дис… канд. биол. наук. - Воронеж, 2004. - 23 с. Butorina А. К., Kalaev V.N. Diversity of Cytological Characteristics in Oak Under Normal Conditions // Diversity and Adaptation in Oak Species. Proceedings of a conference of IUFRO Working Party 2.08.05 held Oct. 12-17, 1997, College of Agricultural Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, U.S.A. - Pennsylvania, 1998. - P.46-48).
Данные способы изучения суточных ритмов цитогенетических показателей довольно трудоемки и высокозатратны, так как требуют получения большого числа экспериментальных показателей и, как следствие этого, большого расхода времени и средств.
Заявляемое изобретение основано на возможности прогнозирования цитогенетических показателей по экспериментально полученным данным.
Технический результат заключается в упрощении способа, сокращении времени и расходов на проведение цитогенетического обследования.
Технический результат достигается тем, что в способе изучения суточного ритма цитогенетического показателя древесных растений, заключающемся в фиксации материала для цитологических исследований, изготовлении микропрепарата, получении значений цитогенетических показателей, построении графической зависимости «показатель - время», по которой судят о суточном ритме данного показателя, согласно изобретению, если увеличение и уменьшение показателя в течение суток происходит не менее трех раз, то однократно получают экспериментальное значение изучаемого показателя в любом из исследуемых часов, сравнивают его значение с доверительным интервалом, вычисленным ранее на основе экспериментальных данных, и если оно попадает в этот интервал, то другие значения этого показателя в любое время суток определяют по формуле:
i
j
j
n
n
где N - степень полинома, j=1…M, где М - число точек наблюдения, а - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов (МНК), у - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x - моменты времени, в которые проводится наблюдение, у - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x - момент времени, в который проводится прогноз.
Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе МНК.
В предложенном способе на основе одного полученного экспериментального значения цитогенетического показателя проводят расчет этого показателя на весь суточный промежуток времени в рамках метода наименьших квадратов.
Нами была проведена работа по исследованию суточного ритма цитогенетических показателей березы повислой и сосны обыкновенной.
На основе полученных экспериментальных данных проводилось построение теоретической модели. Строились зависимости значений цитогенетических показателей от времени в виде гармонических функций. Для этого сначала проводилось измерение показателей в заданном временном интервале (сутки), с заданной дискретизацией (одно измерение в 2 часа). Рассчитывались коэффициенты полиномов, используемые для описания суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства деревьев березы повислой и сосны обыкновенной.
Далее на основе МНК была выведена аналитическая зависимость в виде формулы:
i
j
j
n
n
где N - степень полинома, j=1…M, где М - число точек наблюдения, а - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов (МНК), у - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x - моменты времени, в которые проводится наблюдение, у - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x - момент времени, в который проводится прогноз.
Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе МНК.
Данные, полученные на основе теоретико-экспериментальной модели, сравнивались с результатами контрольного эксперимента (сравнение результатов модели и контроля проводились с заданными требованиями по абсолютной и относительной ошибке) и рассчитывались доверительные интервалы для каждого цитогенетического показателя.
На фиг.1 - суточный ритм патологий митоза, подсчитанных без учета профазных клеток у семенного потомства березы повислой (сплошная кривая - экспериментальные данные; пунктирная линия - прогноз).
На фиг.2 - суточный ритм клеток с двумя ядрышками в ядре у семенного потомства сосны обыкновенной (сплошная кривая - экспериментальные данные; пунктирная линия - прогноз).
На фиг.3 - суточный ритм доли клеток на стадии профазы сосны обыкновенной (сплошная кривая - экспериментальные данные; пунктирная линия - прогноз).
На фиг.4 - таблица 95% доверительных интервалов для значений цитогенетических показателей сосны обыкновенной (min, max).
На фиг.5 - таблица 95% доверительных интервалов для значений ядрышковых характеристик сосны обыкновенной (min, max).
На фиг.6 - таблица 95% доверительных интервалов для значений цитогенетических показателей березы повислой (min, max).
2
2
2
Были исследованы суточные ритмы для 19 цитогенетических показателей березы повислой: Митотическая активность, %, Митотическая активность без профаз, %, Доля профаз, %, Доля метафаз, %, Доля анафаз-телофаз, %, Патологии митоза, %, Патологии митоза без профаз, %, Остаточные ядрышки, %, Площадь одиночн. ядрышек, мкм, Площ. ядрыш. "кора-сердц.", мкм, Площ. ядрыш. "кора-сердц.вакуол.", мкм, Доля клеток с ядрышк. "кора-сердц.", %, Доля кл-к с ядрышк. "кора-сердц. вакуол.", %, Доля кл-к с ядрышк. "компактн.", %, Доля клеток с 2 ядрышками, %, Доля клеток с 3 ядрышками, %, Доля клеток с 4 ядрышками, %, Доля клеток с 5 ядрышками, %, Суммарная доля многоядрышковых клеток, %.
Максимальная относительная ошибка при прогнозировании не превосходила 5% при использовании гармонических функций для описания суточных ритмов следующих цитогенетических показателей: патологии митозов без учета профазных клеток; доля клеток с ядрышками "кора-сердцевина"; доля клеток с ядрышками "кора-сердцевина вакуолизированные", суммарная доля многоядрышковых клеток.
Были исследованы возможные суточные ритмы цитогенетических показателей, характеризующих семенное потомство сосны обыкновенной из Усманского бора: Митотический индекс, %, Доля клеток на стадии профазы, %, Доля клеток на стадии метафазы, %, Доля клеток на стадии анафазы-телофазы, %, Патология митоза, %, Частота встречаемости микроядер, %, % клеток с n ядрышками в ядре.
Максимальная относительная ошибка не превосходила 5% при прогнозировании с применением гармонических функций для описания суточных ритмов следующих цитогенетических показателей: доля клеток на стадии профазы (в %), доля клеток на стадии метафазы (в %), доля клеток на стадии анафазы-телофазы (в %), % клеток с 2-мя ядрышками в ядре.
Пример
В качестве материала для цитогенетических исследований были использованы корешки проростков семян березы повислой и сосны обыкновенной (один корешок - один препарат). Изготовлено по 10 микропрепаратов корешков проростков семян березы повислой и сосны обыкновенной
По достижении корешками проростков длины 0,5 см их фиксировали в ацетоалкоголе (смесь 96%-ного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты 3:1) и хранили при температуре +4°С.
Перед приготовлением микропрепаратов материал обрабатывали по следующей схеме:
- для мацерации тканей кончики корешков помещали в 18%-ную соляную кислоту и подогревали (несколько раз до температуры 60°С);
- материал ополаскивали 45%-ной уксусной кислотой;
- заливали красителем ацетогематоксилином апикальные части корня проростков при комнатной температуре. Время нахождения в красителе - 40 минут;
- отдифференцировали от избыточного красителя дистиллированной водой.
Отрезали кончик корешка и помещали на предметное стекло в каплю жидкости Гойера. Слегка раздавливали корешок препаравальной иглой и накрывали покровным стеклом. Препарат подогревали (но не сильно) над пламенем горелки и раздавливали спичкой поверх покровного стекла, добиваясь равномерного распределения клеток на микропрепарате.
Просмотр микропрепаратов осуществляли на микроскопах LABOVAL-4, JENOVAL (Карл Цейс, Йена) при общем увеличении 40×2,5×10 и 100×2,5×10.
При исследовании препаратов учитывали общее количество просмотренных клеток (не менее 700 клеток на каждом препарате).
Используя ранее полученные результаты по исследованию суточного ритма цитогенетических показателей, для анализа по предложенному способу были отобраны цитогенетические показатели, у которых увеличение и уменьшение показателя в течение суток происходило не менее трех раз.
На основании результатов экспериментов нами было получено значение патологий митоза, подсчитанных без учета профазных клеток (%) у семенного потомства березы повислой в 8 часов утра, равное 7,0%. Это значение входит в 95% доверительный интервал значений, полученный на основании экспериментальных данных (таблица на фиг.6). Подставив в вышеуказанную формулу этот показатель и значения коэффициентов полинома для этого показателя, мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.1).
Также было получено значение доли клеток на стадии профазы (в %) у семенного потомства сосны обыкновенной в 3 часа, равное 11%. Это значение входит в 95% доверительный интервал значений, полученный на основании экспериментальных данных (таблица на фиг.4). Подставив в вышеуказанную формулу этот показатель и значения коэффициентов полинома для этого показателя, мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.3).
Для изучения ядрышковых характеристик в клетках корневой меристемы семенного потомства сосны обыкновенной производили измерение диаметра ядрышек с помощью окулярмикрометра (анализировали по 200 клеток на каждом микропрепарате).
На основании результатов экспериментов нами было получено значение процента клеток с двумя ядрышками в ядре у семенного потомства сосны обыкновенной в 5 часов, равное 5,4%. Это значение входит в 95% доверительный интервал значений, полученный на основании экспериментальных данных (таблица на фиг.5). Подставив в вышеуказанную формулу этот показатель и значения коэффициентов полинома для этого показателя, мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.2).